JP5990102B2 - ホスホ−6−マンノースへのマンノース−1−ホスホ−6−マンノース結合の加水分解 - Google Patents
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Description
本願は、2009年9月29日に提出した米国出願第61/246,847号に対する優先権を主張する。この先願の開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
本発明は、糖タンパク質におけるマンノース−1−ホスホ−6−マンノース結合を加水分解する方法に関し、特に、マンノース−1−ホスホ−6−マンノース結合を加水分解して糖タンパク質におけるホスホ−6−マンノース残基をキャップ除去するためのマンノシダーゼの使用に関する。
現在開発中の多くのバイオ医薬品(例えば、組換えタンパク質)の生産には、高性能発現系が要求される。これらバイオ医薬品の多くの生物活性は、それらの翻訳後修飾(例えば、リン酸化または糖鎖付加)に依存する。酵母に基づく発現系は、遺伝的改変の簡便性と、タンパク質を分泌および修飾する能力を有する微生物の発酵とを組み合わせる。しかし、酵母細胞において生産された組換え糖タンパク質は、主として不均一な高マンノースおよびハイパーマンノースグリカン構造を提示し、これはタンパク質機能、下流のプロセシングおよびその後の治療用途、特に糖鎖付加が生物学的に重要な役割を果たす場合に有害となり得る。
本発明は、少なくとも一部には、糖タンパク質におけるマンノース−1−ホスホ−6−マンノース結合を加水分解することのできるマンノシダーゼの発見に基づく。このようなものとしてマンノシダーゼを用いて、キャップ除去された末端マンノース−6−リン酸残基を含有する糖タンパク質を得ることができる。このような糖タンパク質を得るためのin vitroおよびin vivo方法が、本明細書に記載されている。遺伝的に操作されている細胞をこの方法に用いて、キャップ除去された末端マンノース−6−リン酸残基を有する標的分子を生産することができる。
(項目1)
オリゴ糖におけるマンノース−6−リン酸残基をキャップ除去するための方法であって、
a)マンノース−1−ホスホ−6−マンノース結合を有する該オリゴ糖を提供するステップと、
b)該オリゴ糖を、該マンノース−1−ホスホ−6−マンノース結合をホスホ−6−マンノースに加水分解することのできるマンノシダーゼと接触させるステップと、
を含む、方法。
(項目2)
前記マンノシダーゼが、配列番号50の残基1〜774に示されるアミノ酸配列に対して、または配列番号50に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記マンノシダーゼが、配列番号50の残基1〜774に示されるアミノ酸配列に対して、または配列番号50に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記マンノシダーゼが、配列番号50の残基1〜774に示されるアミノ酸配列に対して、または配列番号50に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも98%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記マンノシダーゼに関して、最小触媒中心に位置するアミノ酸側鎖中の原子の三次元タンパク質座標が図33における等価原子の座標の1.5Å偏差内に収まる、項目1に記載の方法。
(項目6)
前記マンノシダーゼが、(i)GVGXXGXGGモチーフ(式中、XはGly、Ala、Ser、ThrまたはCysである)、(ii)VRXEモチーフ(式中、XはPro以外の任意のアミノ酸である)、(iii)X 1 YQGX 2 モチーフ(式中、X 1 はLeu、Ile、Val、Ala、Phe、TyrまたはMetであり、X 2 はThr、SerまたはAsnである)または(iv)GDXGN(式中、XはPro以外の任意のアミノ酸であり得る)を有するアミノ酸配列を含む、項目1に記載の方法。
(項目7)
前記接触させるステップが、精製されたマンノシダーゼ、組換えマンノシダーゼ、該組換えマンノシダーゼを含有する細胞溶解産物または該組換えマンノシダーゼを含有する真菌細胞を用いて行われる、項目1〜6のうちいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
前記オリゴ糖がタンパク質に連結している、項目1〜7のうちいずれか一項に記載の方法。
(項目9)
前記タンパク質が、真菌生物において発現されたヒトタンパク質である、項目7に記載の方法。
(項目10)
前記真菌生物が、Yarrowia lipolyticaまたはArxula adeninivoransである、項目9に記載の方法。
(項目11)
前記真菌生物がメチロトローフ酵母である、項目9に記載の方法。
(項目12)
前記メチロトローフ酵母が、Pichia pastoris、Pichia methanolica、Oogataea minutaまたはHansenula polymorphaである、項目11に記載の方法。
(項目13)
前記真菌生物が糸状菌である、項目9に記載の方法。
(項目14)
前記糸状菌が
からなる群から選択される、項目13に記載の方法。
(項目15)
前記タンパク質が、病原体タンパク質、リソソームタンパク質、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、抗体もしくはその抗原結合性断片または融合タンパク質である、項目8に記載の方法。
(項目16)
前記リソソームタンパク質がリソソーム酵素である、項目15に記載の方法。
(項目17)
前記リソソーム酵素がリソソーム貯蔵障害(LSD)に関連する、項目16に記載の方法。
(項目18)
前記LSDが、ファブリ病、ムコ多糖症I型、ファーバー病、ゴーシェ病、GM1ガングリオシドーシス、テイ・サックス病、サンドホフ病、GM2活性化因子疾患、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ニーマン・ピック病、シャイエ病、ハンター病、サンフィリポ病、モルキオ病、マロトー・ラミー病、ヒアルロニダーゼ欠損症、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシドーシス、マンノシドーシス、シンドラー病、シアリドーシス1型、ポンペ病、濃化異骨症、セロイドリポフスチン沈着症、コレステロールエステル貯蔵病、ウォルマン病、多種スルファターゼ欠損症、ガラクトシアリドーシス、ムコリピドーシス、シスチン症、シアル酸貯蔵病、マリネスコ・シェーグレン症候群を伴うカイロミクロン停滞病、ヘルマンスキー・プドラック症候群、チェディアック・東症候群、ダノン病または幸福顔貌骨異形成症である、項目17に記載の方法。
(項目19)
前記LSDがポンペ病またはファブリ病である、項目18に記載の方法。
(項目20)
前記マンノシダーゼがターゲティング配列を含む、項目1〜6のうちいずれか一項に記載の方法。
(項目21)
末端ホスホ−6−マンノース残基を有する標的タンパク質を生産する方法であって、
マンノース−1−ホスホ−6−マンノース結合をホスホ−6−マンノースに加水分解することのできるマンノシダーゼをコードする核酸を含むように遺伝的に操作されている真菌細胞を提供するステップと、
該細胞に、標的タンパク質をコードする核酸を導入するステップと、
を含み、該細胞が、該末端ホスホ−6−マンノース残基を含む該標的タンパク質を生産する、方法。
(項目22)
前記マンノシダーゼに関して、最小触媒中心に位置するアミノ酸側鎖中の原子の三次元タンパク質座標が図33における等価原子の座標の1.5Å偏差内に収まる、項目21に記載の方法。
(項目23)
前記マンノシダーゼが、a)配列番号50のアミノ酸1〜774に対して、もしくは配列番号50のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列、または(b)(i)GVGXXGXGGモチーフ(式中、XはGly、Ala、Ser、ThrまたはCysである)、(ii)VRXEモチーフ(式中、XはPro以外の任意のアミノ酸である)、(iii)X 1 YQGX 2 モチーフ(式中、X 1 はLeu、Ile、Val、Ala、Phe、TyrまたはMetであり、X 2 はThr、SerまたはAsnである)もしくは(iv)GDXGN(式中、XはPro以外の任意のアミノ酸であり得る)を有するアミノ酸配列を含む、項目21に記載の方法。
(項目24)
前記真菌細胞が、マンノシルリン酸化を促進することのできるポリペプチドをコードする核酸をさらに含む、項目21〜23のうちいずれか一項に記載の方法。
(項目25)
前記真菌細胞が、OCH1活性を欠損するように遺伝的に操作されている、項目21〜24のうちいずれか一項に記載の方法。
(項目26)
前記マンノシダーゼが、C.cellulans、Streptomyces coelicolorまたはStreptomyces lividansのマンノシダーゼである、項目21〜25のうちいずれか一項に記載の方法。
(項目27)
真菌生物において末端ホスホ−6−マンノース残基を有する標的タンパク質を生産する方法であって、
a)マンノース−1−ホスホ−6−マンノース結合をホスホ−6−マンノースに加水分解することのできるマンノシダーゼをコードする核酸を含むように遺伝的に操作されており、標的タンパク質をコードする核酸をさらに含む真菌細胞を提供するステップと、
b)該末端ホスホ−6−マンノース残基を有する該標的タンパク質を単離するステップと、
を含む、方法。
(項目28)
前記マンノシダーゼに関して、最小触媒中心に位置するアミノ酸側鎖中の原子の三次元タンパク質座標が図33における等価原子の座標の1.5Å偏差内に収まる、項目27に記載の方法。
(項目29)
前記マンノシダーゼが、(i)配列番号50のアミノ酸1〜774に対して、もしくは配列番号50に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列、または(ii)(i)GVGXXGXGGモチーフ(式中、XはGly、Ala、Ser、ThrまたはCysである)、(ii)VRXEモチーフ(式中、XはPro以外の任意のアミノ酸である)、(iii)X 1 YQGX 2 モチーフ(式中、X 1 はLeu、Ile、Val、Ala、Phe、TyrまたはMetであり、X 2 はThr、SerまたはAsnである)もしくは(iv)GDXGN(式中、XはPro以外の任意のアミノ酸であり得る)を有するアミノ酸配列を含む、項目27に記載の方法。
(項目30)
前記標的タンパク質および前記マンノシダーゼが同時分泌される、項目27〜29のうちいずれか一項に記載の方法。
(項目31)
末端ホスホ−6−マンノース残基を含む糖タンパク質を生産するように遺伝的に操作されている単離された真菌細胞であって、マンノシダーゼをコードする核酸を含み、該真菌細胞における前記マンノシダーゼの発現が、該末端ホスホ−6−マンノース残基を含む糖タンパク質を生産する、真菌細胞。
(項目32)
前記マンノシダーゼに関して、最小触媒中心に位置するアミノ酸側鎖中の原子の三次元タンパク質座標が図33における等価原子の座標の1.5Å偏差内に収まる、項目31に記載の真菌細胞。
(項目33)
前記マンノシダーゼが、a)配列番号50のアミノ酸1〜774に対して、もしくは配列番号50のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列、またはb)(i)GVGXXGXGGモチーフ(式中、XはGly、Ala、Ser、ThrまたはCysである)、(ii)VRXEモチーフ(式中、XはPro以外の任意のアミノ酸である)、(iii)X 1 YQGX 2 モチーフ(式中、X 1 はLeu、Ile、Val、Ala、Phe、TyrまたはMetであり、X 2 はThr、SerまたはAsnである)もしくは(iv)GDXGN(式中、XはPro以外の任意のアミノ酸であり得る)を有するアミノ酸配列を含む、項目31に記載の真菌細胞。
(項目34)
マンノシルリン酸化を促進することのできるポリペプチドをコードする核酸をさらに含む、項目31〜33のうちいずれか一項に記載の真菌細胞。
(項目35)
OCH1活性を欠損するように遺伝的に操作されている、項目31〜33のうちいずれか一項に記載の真菌細胞。
(項目36)
マンノシルリン酸化を促進することのできるポリペプチドをコードする核酸をさらに含み、OCH1活性を欠損するように遺伝的に操作されている、項目31〜33のうちいずれか一項に記載の真菌細胞。
(項目37)
糖タンパク質である標的タンパク質をコードする核酸をさらに含む、項目31〜36のうちいずれか一項に記載の真菌細胞。
(項目38)
前記標的タンパク質がヒトタンパク質である、項目31〜36のうちいずれか一項に記載の真菌細胞。
(項目39)
前記標的タンパク質が、病原体タンパク質、リソソームタンパク質、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、抗体もしくはその抗原結合性断片または融合タンパク質である、項目38に記載の真菌細胞。
(項目40)
前記リソソームタンパク質がリソソーム酵素である、項目39に記載の真菌細胞。
(項目41)
前記リソソーム酵素が酸性アルファグルコシダーゼまたはアルファガラクトシダーゼである、項目40に記載の真菌細胞。
(項目42)
前記標的タンパク質が、LSDに関連するタンパク質である、項目38に記載の真菌細胞。
(項目43)
前記LSDが、ファブリ病、ムコ多糖症I型、ファーバー病、ゴーシェ病、GM1ガングリオシドーシス、テイ・サックス病、サンドホフ病、GM2活性化因子疾患、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ニーマン・ピック病、シャイエ病、ハンター病、サンフィリポ病、モルキオ病、マロトー・ラミー病、ヒアルロニダーゼ欠損症、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシドーシス、マンノシドーシス、シンドラー病、シアリドーシス1型、ポンペ病、濃化異骨症、セロイドリポフスチン沈着症、コレステロールエステル貯蔵病、ウォルマン病、多種スルファターゼ欠損症、ガラクトシアリドーシス、ムコリピドーシス、シスチン症、シアル酸貯蔵病、マリネスコ・シェーグレン症候群を伴うカイロミクロン停滞病、ヘルマンスキー・プドラック症候群、チェディアック・東症候群、ダノン病または幸福顔貌骨異形成症である、項目42に記載の真菌細胞。
(項目44)
Yarrowia lipolyticaまたはArxula adeninivorans細胞である、項目31〜43のうちいずれか一項に記載の真菌細胞。
(項目45)
マンノシルリン酸化を促進することのできる前記ポリペプチドが、MNN4ポリペプチドである、項目32に記載の真菌細胞。
(項目46)
前記MNN4ポリペプチドが、Yarrowia lipolytica、S.cerevisiae、Ogataea minuta、Pichia pastorisまたはC.albicansのポリペプチドである、項目45に記載の真菌細胞。
(項目47)
マンノシルリン酸化を促進することのできる前記ポリペプチドが、P.pastoris PNO1ポリペプチドである、項目46に記載の真菌細胞。
(項目48)
前記マンノシダーゼが、C.cellulans、Streptomyces coelicolorまたはStreptomyces lividansのマンノシダーゼである、項目31〜47のうちいずれか一項に記載の真菌細胞。
(項目49)
前記マンノシダーゼが分泌シグナルを含む、項目31〜47のうちいずれか一項に記載の真菌細胞。
(項目50)
前記マンノシダーゼが、前記マンノシダーゼを細胞内区画にターゲッティングするためのターゲティングシグナルを含む、項目31〜47のうちいずれか一項に記載の真菌細胞。
(項目51)
前記マンノシダーゼが、分泌シグナルおよび前記マンノシダーゼを細胞内区画にターゲッティングするためのターゲティングシグナルを含む、項目31〜47のうちいずれか一項に記載の真菌細胞。
(項目52)
Yarrowia lipolytica、Pichia pastoris、Hansenula polymorpha、Arxula adeninivorans、Pichia methanolica、Oogataea minutaまたはAspergillus nigerの細胞の実質的に純粋な培養物であって、前記細胞は、その相当数が末端ホスホ−6−マンノース残基を含む糖タンパク質を生産するように遺伝的に操作されており、マンノース−1−ホスホ−6−マンノース結合をホスホ−6−マンノースに加水分解することのできるマンノシダーゼをコードする核酸を含む、培養物。
(項目53)
前記マンノシダーゼに関して、最小触媒中心に位置するアミノ酸側鎖中の原子の三次元タンパク質座標が図33における等価原子の座標の1.5Å偏差内に収まる、項目52に記載の培養物。
(項目54)
前記マンノシダーゼが、a)配列番号50のアミノ酸1〜774に対して、もしくは配列番号50のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列、またはb)(i)GVGXXGXGGモチーフ(式中、XはGly、Ala、Ser、ThrまたはCysである)、(ii)VRXEモチーフ(式中、XはPro以外の任意のアミノ酸である)、(iii)X 1 YQGX 2 モチーフ(式中、X 1 はLeu、Ile、Val、Ala、Phe、TyrまたはMetであり、X 2 はThr、SerまたはAsnである)もしくは(iv)GDXGN(式中、XはPro以外の任意のアミノ酸であり得る)を有するアミノ酸配列を含む、項目52に記載の培養物。
(項目55)
前記細胞が、マンノシルリン酸化を促進することのできるポリペプチドをコードする核酸をさらに含む、項目52〜54のうちいずれか一項に記載の培養物。
(項目56)
前記細胞が、OCH1活性を欠損するように遺伝的に操作されている、項目55に記載の培養物。
(項目57)
項目1〜30のうちいずれか一項に記載の方法によって生産された、末端ホスホ−6−マンノース残基を含む単離された糖タンパク質。
(項目58)
糖タンパク質を含む組成物であって、該糖タンパク質におけるN−グリカンの少なくとも47%が末端ホスホ−6−マンノース残基を有する、組成物。
(項目59)
前記糖タンパク質におけるN−グリカンの少なくとも50%が末端ホスホ−6−マンノース残基を有する、項目58に記載の組成物。
(項目60)
前記糖タンパク質におけるN−グリカンの少なくとも75%が末端ホスホ−6−マンノース残基を有する、項目58に記載の組成物。
(項目61)
前記糖タンパク質におけるN−グリカンの少なくとも90%が末端ホスホ−6−マンノース残基を有する、項目58に記載の組成物。
本発明の他の特色および利点は、次の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
本文書は、オリゴ糖における末端マンノース−1−ホスホ−6−マンノース結合を加水分解することのできるマンノシダーゼポリペプチドをコードする単離された核酸と、オリゴ糖における末端マンノース−1−ホスホ−6−マンノース結合を加水分解することのできる単離されたマンノシダーゼとを提供する。用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は本明細書において互換的に用いられ、cDNA、ゲノムDNA、合成DNAおよび核酸アナログを含有するDNA(またはRNA)等、RNAとDNA両方を意味する。ポリヌクレオチドはいかなる三次元構造であってもよい。核酸は、二本鎖であっても、一本鎖(すなわち、センス鎖またはアンチセンス鎖)であってもよい。ポリヌクレオチドの非限定的な例として、遺伝子、遺伝子断片、エクソン、イントロン、伝令RNA(mRNA)、転移RNA、リボソームRNA、siRNA、マイクロRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、核酸プローブおよびプライマーならびに核酸アナログが挙げられる。
本明細書に記載されているマンノシダーゼは、組換えにより生産し、in vitroで用いてオリゴ糖における末端M6P残基をキャップ除去することができる。マンノシダーゼを組換えにより生産するため、マンノシダーゼポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結したプロモーターを含有するベクターを用いる。本明細書において、「プロモーター」は、遺伝子を転写させるDNA配列を意味する。プロモーターがRNAポリメラーゼによって認識され、次にポリメラーゼが転写を開始する。このように、プロモーターは、RNAポリメラーゼによって直接的に結合される、あるいはその動員に関与するDNA配列を含有する。プロモーター配列は「エンハンサー(enhancer)領域」を包含することもできるが、エンハンサー領域とは、タンパク質(すなわち、トランス作用因子:転写因子一式のようなもの)と結合して、遺伝子集団における遺伝子の転写レベルを増強(enhance)することのできる(この名称の由来)1または複数のDNA領域である。エンハンサーは、通常、コード領域の5’末端にあるが、プロモーター配列から離間していてもよく、また、例えば遺伝子のイントロン領域内または遺伝子コード領域の3’にあってもよい。
本明細書に記載されている遺伝的に操作されている細胞を用いて、キャップ除去されたM6P残基を含有する標的分子を生産することができる。例えば、細胞に基づく方法は、マンノシダーゼをコードする核酸を包含するように、遺伝的に操作されている真菌細胞に、標的分子をコードする核酸を導入するステップを包含することができ、該細胞は、キャップ除去された末端M6P残基を含有する標的分子を生産する。一部の実施形態では、マンノシダーゼおよび標的分子をコードする核酸は、マンノシダーゼおよび標的分子が同時分泌されるような分泌配列を含有する。
本文書は、本明細書に記載されている遺伝的に操作されている細胞のうちいずれかの実質的に純粋な培養物も提供する。本明細書において、遺伝的に操作されている細胞の「実質的に純粋な培養物」は、培養物の生細胞全数の約40%未満(すなわち、約35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%未満またはさらにそれ以下)が、遺伝的に操作されている細胞以外、例えば細菌、真菌(酵母等)、マイコプラズマまたは原生生物の細胞以外の生細胞である、細胞培養物である。この文脈における用語「約」は、関連するパーセンテージが、指定のパーセンテージのプラスマイナス15%パーセントとなり得ることを指す。よって、例えば約20%は、17%から23%であり得る。遺伝的に操作されている細胞のこのような培養物は、細胞および増殖、保存または輸送培地を包含する。培地は、液体、半固体(例えば、ゼラチン状培地)または凍結状であり得る。培養物は、液体培地中または半固体培地中/上で増殖する、あるいは凍結保存または輸送培地等、保存または輸送培地において保存または輸送される細胞を包含する。培養物は、培養容器もしくは保存容器または基盤(例えば、培養皿、フラスコもしくはチューブまたは保存バイアルもしくはチューブ)内に置かれる。
キャップ除去された末端M6P残基を有する分子は、多種多様な代謝障害の治療に用いることができる。代謝障害は、個々のヒト(または動物)細胞内のエネルギー生産に影響を与える障害である。一部は食事、毒素、感染等の結果「後天性」となり得るが、多くの代謝障害は遺伝性である。遺伝性代謝障害は、先天性代謝異常としても公知のものである。一般に、遺伝性代謝障害は、細胞の代謝過程のいくつかのステップに必要な酵素の欠落または不適切な構築をもたらす遺伝的欠陥に起因する。最大クラスの代謝障害は、炭水化物代謝障害、アミノ酸代謝障害、有機酸代謝障害(有機酸血症)、脂肪酸酸化およびミトコンドリア代謝障害、ポルフィリン代謝障害、プリンまたはピリミジン代謝障害、ステロイド代謝障害、ミトコンドリア機能障害、ペルオキシソーム機能障害ならびにリソソーム貯蔵障害(LSD)である。
キャップ除去されたM6P残基を有する標的分子は、治療上有効量の該分子および1または複数のアジュバント、賦形剤、担体および/または希釈剤を含有する医薬組成物に組み入れることができる。容認できる希釈剤、担体および賦形剤は、通常、レシピエントの恒常性(例えば、電解質バランス)に有害な影響を与えない。容認できる担体は、生体適合性、不活性または生体吸収性の塩、緩衝剤、オリゴ糖または多糖、ポリマー、粘性改善剤、防腐剤その他を包含する。例示的な担体の1つは、生理食塩水(0.15M NaCl、pH7.0〜7.4)である。別の例示的な担体は、50mMリン酸ナトリウム、100mM塩化ナトリウムである。医薬組成物の製剤および投与の技法に関するさらなる詳細は、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences(Maack Publishing Co.、ペンシルベニア州イーストン)に見出すことができる。補足的な活性化合物が組成物に組み入れられてもよい。
より高度なリン酸化N−グリカンを有するYarrowia lipolytica株の作出
Y.lipolyticaにおけるグリカンのリン酸化を上方制御するため、株MTLY60を、それぞれ別個の発現ベクターに入れられたMNN4遺伝子の2個の追加コピーで形質転換した。MNN4遺伝子は、酵母におけるグリカンのリン酸化の増加に関与する。図1は、pYLTmAXプラスミドの模式図を含有し、これにMNN4遺伝子がクローニングされてpYLTmAXMnn4が作製され、このプラスミドはTEFプロモーターの制御下におけるMNN4オープンリーディングフレームを含有する。1個はhp4dプロモーターの制御下にあり、もう1個はTEF1プロモーターの制御下にある、MNN4遺伝子の2個の追加コピーを含有する株を作出した。株MTLY60Δoch1(MNN4の野生型1コピー)、株MTLY60Δoch1+Hp4dMNN4(MNN4のWT1コピー+追加1コピー)および株MTLY60Δoch1+Hp4dMNN4+TEFMNN4(Mnn4のWT1コピー+追加2コピー)からN−グリカンを調製し、DNAシーケンサー支援(DSA)フルオロフォア支援炭水化物電気泳動(FACE)によりアッセイした。Callewaertら、Glycobiology 11巻(4号):275〜281頁(2001年)を参照されたし。図2における結果に基づき、一リン酸化ピークは追加コピー1個を有する株において上方制御され、二重リン酸化ピークが出現すると推定することができる。追加コピー2個を有する株において、二重リン酸化ピークはより高く、中性Man8GlcNAc2糖ピークはより低かった。
真菌起源のリン酸化グリカン上に存在するキャップ形成したマンノース残基をキャップ除去できるマンノシダーゼ活性の同定
酵母および糸状菌による糖のリン酸化は、マンノース−ホスホ−マンノースジエステル結合を生じる(図3)。リン酸がモノエステル結合した構造を得るため、リン酸を高マンノースグリカン構造のマンノースの6位に取り付けたままマンノース−リン酸結合を加水分解することのできるマンノシダーゼが要求される。Chibaら、Glycobiology、12巻(12号):821〜8頁(2002年)は、Cellulomonas種由来のマンノシダーゼが、マンノースをデキャッピングできることを示す。しかし、Chibaらは、マンノシダーゼタンパク質を部分的にしか精製できず、タンパク質をコードする遺伝子を同定することができなかった。
マンノシダーゼの部分的な精製およびさらなる同定
マンノシダーゼを精製するため、1Lの培地B(Bagiyanら、Eur.J.Biochem.249巻(1号):286〜92頁(1997年))または培地A(Chibaら、2002年、上記参照)においてC.cellulansを増殖させた。表1を参照されたし。その後、40%および80%硫酸アンモニウムにより培地を沈殿させ、SDS−PAGEにより試料を分析した。硫酸アンモニウム画分を、1mM CaCl2を含む20mMリン酸NaバッファーpH6.5で透析し、次にMNN4過剰発現株由来のオリゴ糖における活性を試験した(実施例1)。
全ゲノム配列決定に基づく所望の配列を有するマンノシダーゼの同定
所望の活性をコードしているマンノシダーゼ遺伝子を同定するため、Titanium454配列決定(Eurofins MWG Operon)を用いてC.cellulansのゲノムを配列決定した。高GC含量のため、配列決定は部分的(1.96メガベース)でしかなく、クオリティーが低い(低い平均コンティグサイズしかない)。エマルジョンPCR(emPCR)におけるループ形成の原因となるゲノムの高GC含量は、欠失および非常に短い配列をもたらす。
in vitroまたはin vivoマンノースデキャッピングのためのマンノシダーゼの異種発現
マンノシダーゼによる酵母型リン酸化のデキャッピングを可能にするため、治療用途のタンパク質が発現される宿主と異なる宿主において異種で、あるいは同一真菌宿主において発現されなければならない。後者の事例において、タンパク質は同時分泌することができる、あるいは細胞内区画(例えば、ゴルジ体または小胞体)にターゲッティングすることができる。これは、発現ベクターにおいてプロモーターの後に作動可能に連結した遺伝子(標的宿主に対してコドン最適化されていても最適化されていなくてもよい)をクローニングすることによって達成することができる。マンノシダーゼは、エピトープタグをタグ付けして、これにより容易な検出および精製を可能にする、あるいはそれ自身として発現することができる。タンパク質は、細菌細胞のペリプラズムにおいて分泌することができる、あるいは細胞内で発現することができる。真菌宿主において発現する場合、配列は、分泌シグナルもしくはタンパク質を細胞内区画にターゲッティングするターゲティングシグナルまたはその両方を含有することができる。表3は、真菌生物における発現のための分泌およびターゲティングシグナルの一覧表を含有する。このような発現ベクターの例を図13に示す。
C.cellulansグリコシルヒドロラーゼ(GH)ファミリー92酵素のクローニングおよび活性
CcMan1〜CcMan5のコドン最適化された核酸を、E.coliベクターである、Spyシグナル配列を含有するpLSH36および/またはペリプラズム発現のためのDsbAシグナル配列を含有するpLSAH36にクローニングした。pLSH36およびpLSAH36は両者共に、ポリヒスチジンタグおよび精製においてHis6タグの除去に用いられ得るマウスカスパーゼ3部位を有するコードされたポリペプチドを生じた。図19は、pLSH36およびpLSAH36ベクターの模式図ならびにC.cellulans GH92遺伝子をベクターに導入するためのクローニング戦略を含有する。クローニング後、異なるマンノシダーゼをE.coli BL21+pICa2発現株に形質転換した。光学密度(OD)が0.5〜1になるまで形質転換株を増殖させ、1mMイソプロピルβ−D−1−チオガラクトピラノシド(IPTG)で誘導した。様々な細胞画分(培地、ペリプラズム、可溶性および不溶性画分)を単離し、SDS PAGEおよび抗His6抗体を用いたウエスタンブロッティングにより解析した。CcMan1、CcMan2およびCcMan3に関し、発現は全画分において検出された。CcMan4およびCcMan5に関し、発現は可溶性画分において最も高く、ある程度の発現は他の画分においても検出された。
CcMan5およびそのファミリー92相同ドメインの生産および精製
発現ベクターpLSAHCcMan5およびpLSAHCcMan5ドメインで形質転換されたE.coli株BL21コドン+pICA2において、組換えCCman5(配列番号20のヌクレオチド1〜4995)およびCCMan5ドメイン(配列番号20のヌクレオチド1〜2322)を発現させた。λpL−プロモーターの制御下においてIPTGにより発現を誘導した(国際公開第98/48025号パンフレットおよび国際公開第04/074488号パンフレットを参照)。pLSAHの説明に関しては、実施例6および図19を参照されたし。アンピシリン(100μg/ml)および1%グリセロールを補充したLB培地を備える20リットル発酵槽に1/100播種する前に、アンピシリン(100μg/ml)およびカナマイシン(50μg/ml)を補充したルリア・ベルターニ(Luria Bertani)(LB)培地において、形質転換された細菌を28℃で一晩増殖させた。最初の攪拌および気流はそれぞれ200rpmおよび1.5l/分であり、自動的に適応されてpO2を30%に維持する。温度は28℃に維持した。光学密度がA600nm=1.0になるまで細胞を増殖させ、20℃で移し、1mM IPTGの添加によって発現を一晩誘導した。次に、細胞を回収し、−20℃で凍結した。解凍後、50mM NaH2PO4、pH8.0、300mM NaCl、1mM PMSFおよび10μg/ml DNaseI中に3ml/gの濃度にて細胞を穏やかに再懸濁した。細胞懸濁液を1時間4℃で攪拌することによってペリプラズム画分を調製し、18,000×gで30分間遠心分離によって単離した。全ステップは4℃で実施した。50mMイミダゾールの入った同じバッファーによる追加的な洗浄ステップの後、20mM NaH2PO4、pH7.4、300mM NaCl、20mMイミダゾール、0.1%CHAPSで平衡化した20mlのNi−セファロース6FFカラム(GE Healthcare)に清澄な上清をアプライした。20mM NaH2PO4、pH7.4、20mM NaCl、400mMイミダゾール、0.1%CHAPSでカラムを溶出した。溶出画分を20mM Tris、pH8.0、0.1%CHAPSで1/10希釈し、14mlのSource15Qカラム(GE Healthcare)上にロードし、夾雑物を除去した。平衡化の後、10カラム容量の20mM Tris、0.1%CHAPS中の0〜1M NaClに及ぶ直線的勾配により、対象のタンパク質を溶出した。CcMan5およびCcMan5ドメイン含有画分を、ランニング溶液としてPBSを用いてHiLoad26/60Superdex200prep grade上にさらに注入した。SDS−PAGEおよび抗His6抗体を用いたウエスタンブロッティングにより、得られた画分を解析した。最後に、BCAアッセイ(Pierce)を用いて濃度を決定した。全長CcMan5タンパク質の精製収量は20Lの発酵から5.7mgであり、CcMan5ファミリー92ドメインに関しては110mgであり、これは、ファミリー92ドメイン単独がより高い収量で生産および精製できることを示す。実施例6に示されるMnn4単離糖において、精製されたCcMan5ドメインの活性を試験した。デキャッピングされた糖プロファイルを得た。
CcMan5ドメインの構造
E.coli BL21(DE3)ペリプラズムにおいて、N末端6×Hisタグから始まり、その後、DsbAリーダー配列の後に9アミノ酸リンカー(VGPGSDEVD、配列番号21)が続く融合産物としてCcMan51〜774(配列番号50の残基1〜774、配列番号20のヌクレオチド1〜2322によってコードされる;その天然のリーダー配列を除去した後の成熟タンパク質に相当)を発現した。100μg/mlのカナマイシンおよび100μg/mlのアンピシリンを含有するM9培地において28℃で細胞を培養した。OD600値0.4において、1mM IPTGを添加することによってCcMan51〜774発現を誘導し、培養物を18℃で一晩さらに増殖させた。一晩の培養から得られた細胞を遠心分離により回収し、洗浄し、20mM Tris/HCl pH8.0、20%ショ糖、5mM EDTAおよび0.1mg/mlリゾチームを含有するバッファーにより20分間4℃でインキュベートし、スフェロプラストを作製した。20,000×g、20分間の遠心分離によりスフェロプラストからペリプラズムタンパク質を単離した。金属イオンアフィニティークロマトグラフィー(HisTrap HP、GE Healthcare、50mM Tris−HCl pH8.0、150mM NaClを含有するバッファーにおいてローディングし、最大400mMのイミダゾール勾配を用いて溶出)、イオン交換クロマトグラフィー(HiTrap Q FF、GE Healthcare、バッファー:20mM Tris−HCl pH8.0、40mM NaClおよび最大1MのNaCl勾配)および疎水性相互作用クロマトグラフィー(HiTrap Phenyl HP、GE Healthcare、ローディングバッファー:20mM Tris−HCl pH8.0、10mM NaCl、1M (NH4)2SO4、最大0mMの(NH4)2SO4勾配を用いて溶出)によりペリプラズム抽出物からCcMan51〜774を精製した。
Y.lipolyticaにおけるαガラクトシダーゼAの発現
プレおよびプロ配列を含まないヒトα−ガラクトシダーゼAをコードする核酸を、Y.lipolyticaに対してコドン最適化してMyc−Hisタグを付加しつつ合成した。lip2遺伝子のプレ配列の後に、得られた配列をインフレームでクローニングした。コドン最適化されたヌクレオチド配列のヌクレオチド配列(配列番号22)は図26Aに示され、アミノ酸配列(配列番号23)は図26Bに提示されている。
Y.lipolyticaにおけるヒトアルファグルコシダーゼの発現
3コピーのヒトアルファグルコシダーゼ(酸性アルファグルコシダーゼ(GAA)または酸性マルターゼEC3.2.1.3としても公知の)および2コピーのY.lipolytica MNN4遺伝子を含有するY.lipolytica株OXYY1589を構築した。株OXY1589の遺伝子型は、次の通りである。
株OXYY1589の流加培養
株OXYY1589(実施例10)からhuGAAを生産させるため、10L攪拌タンクを用いた作業容量6〜8リットルの流加プロセスを確立した。このプロセスは2段階に分かれる。
2)制限されたオレイン酸供給による誘導による産物生成。
組換えhuGAA(rhGAA)の精製
深層濾過により培養(実施例11を参照)後の上清を清澄化した。次に、その結果得られた材料を、20mMリン酸ナトリウムpH6および100mM NaClに対して10kDa MWCOメンブレン(Millipore)によりTFFおよびダイアフィルトレーションすることによって20倍に濃縮した。
Y.lipolytica株において発現したより高度にリン酸化したN−グリカンを有する糖タンパク質における、異種発現したCcMan5のリン酸キャップ除去活性
Y.lipolytica株OXYY1589においてhuGAAを発現させ、高度にリン酸化したN−グリカン構造を有する糖タンパク質を得た(実施例10を参照)。実施例12に記載されている通りにhuGAAを精製した。
キャップ除去活性を有する可能性のあるホモログの同定
同様の予測触媒部位トポロジーおよび機能性を有する他のGH92ファミリーメンバーを同定するため、ワールドワイドウェブのcazy.org/GH92_all.htmlから発掘した、精選されたGH92ファミリーメンバーを、CcMan5ドメイン配列を用いてNCBIの非重複タンパク質配列データベースにおいてBlastp検索することによって得られた上位500ヒットとして解析した。その後、これら392配列は、多重配列アライメントパッケージMUSCLE(Log予想による多重配列比較(MUltiple Sequence Comparison by Log−Expectation))のためのインプットとして用いるが、これは「系統発生」距離(最も近縁から最も遠縁)の順序で配列のランク付けも行う。
Bacteroides thetaiotaomicron由来のGH92グリコシダーゼにおけるリン酸キャップ除去活性の存在
Bacteroides thetaiotaomicron由来の23ファミリーGH92α−マンノシダーゼの酵素分析は、Zhu, Y.ら、2010年、上記参照、によって報告された。一部変種は非常に低い活性を掲示するが、α1,2−、α1,4−、α1,3−またはα1,6−マンノシダーゼ活性を有する酵素がこの酵素群に存在する。2種のα−1,2マンノシダーゼ(Bt3990およびBt2199)の三次元構造は、α1,2−マンノシダーゼ活性に特徴的なモチーフ、すなわち、Bt3990におけるHis584−Glu585およびTrp99であると思われる主要アミノ酸残基の同定を可能にした。B.thetaiotaomicron由来の3種のGH92酵素、Bt3530(Genbank nr AAO78636.1)、Bt3965(Genbank nr AAO79070.1)およびBt3994(Genbank nr AAO79099.1)のリン酸化N−グリカン(実施例1に記載されているMNN4糖)における活性を試験した。これらの酵素は、低いα1,4−マンノシダーゼ活性を示し、His−GluおよびPro−Trpモチーフを欠く。
本発明をその詳細な説明と併せて記載してきたが、前述の記載は説明を目的としており、本発明の範囲の限定を目的とするものではなく、これは添付の特許請求の範囲によって規定されている。他の態様、利点および修正は、次の特許請求の範囲内でなされる。
Claims (17)
- オリゴ糖におけるマンノース−6−リン酸残基をキャップ除去するための方法であって、
a)マンノース−1−ホスホ−6−マンノース結合を有する該オリゴ糖を提供するステップと、
b)該オリゴ糖を、該マンノース−1−ホスホ−6−マンノース残基をホスホ−6−マンノースに加水分解することのできるマンノシダーゼと接触させるステップと、
を含み、ここで、該マンノシダーゼが、グリコシルヒドロラーゼファミリー92のメンバーであり、そして、該マンノシダーゼが、配列番号50の残基1〜774または配列番号50を含む、方法。 - 以下に列挙する特徴のうちの1つ以上を有する、請求項1に記載の方法:
(I)前記マンノシダーゼが、以下の特徴のうちの1つ以上を有する:
a)該マンノシダーゼが、配列番号50の残基1〜774のN末端または配列番号50のN末端に、配列番号15の残基1〜15をさらに含む;
b)該マンノシダーゼが、該マンノシダーゼを細胞内区画にターゲッティングするためのターゲティング配列を含む;
(II)前記接触させるステップが、精製されたマンノシダーゼ、組換えマンノシダーゼ、該組換えマンノシダーゼを含有する細胞溶解産物または該組換えマンノシダーゼを含有する真菌細胞を用いて行われる;
(III)前記オリゴ糖がタンパク質に連結している;
(IV)該オリゴ糖がタンパク質に連結しており、かつ、該タンパク質が、真菌生物において発現されるヒトタンパク質である;
(V)該オリゴ糖がタンパク質に連結しており、かつ、該タンパク質が真菌生物において発現されるヒトタンパク質であり、かつ、該真菌生物が、
a)Yarrowia lipolyticaまたはArxula adeninivorans;
b)メチロトローフ酵母;
c)Pichia pastoris、Pichia methanolica、Oogataea minutaまたはHansenula polymorphaであるメチロトローフ酵母;
d)糸状菌;
e)
から選択される;
(VI)該オリゴ糖がタンパク質に連結しており、かつ、該タンパク質が、病原体タンパク質、リソソームタンパク質、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、抗体もしくはその抗原結合性断片または融合タンパク質である;
(VII)該オリゴ糖がタンパク質に連結しており、かつ、該タンパク質が真菌生物において発現されるヒトタンパク質であり、かつ、該タンパク質が、病原体タンパク質、リソソームタンパク質、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、抗体もしくはその抗原結合性断片または融合タンパク質である;
(VIII)該オリゴ糖がタンパク質に連結しており、かつ、該タンパク質がリソソーム酵素である;
(IX)該オリゴ糖がタンパク質に連結しており、かつ、該タンパク質が真菌生物において発現されるヒトタンパク質であり、かつ、該タンパク質がリソソーム酵素である;
(X)該オリゴ糖がタンパク質に連結しており、かつ、該タンパク質がリソソーム貯蔵障害(LSD)に関連するリソソーム酵素である;
(XI)該オリゴ糖がタンパク質に連結しており、かつ、該タンパク質が真菌生物において発現されるヒトタンパク質であり、かつ、該タンパク質がリソソーム貯蔵障害(LSD)に関連するリソソーム酵素である;
(XII)該オリゴ糖がタンパク質に連結しており、かつ、該タンパク質がリソソーム貯蔵障害(LSD)に関連するリソソーム酵素であり、かつ、該リソソーム貯蔵障害(LSD)が、ファブリ病、ムコ多糖症I型、ファーバー病、ゴーシェ病、GM1ガングリオシドーシス、テイ・サックス病、サンドホフ病、GM2活性化因子疾患、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ニーマン・ピック病、シャイエ病、ハンター病、サンフィリポ病、モルキオ病、マロトー・ラミー病、ヒアルロニダーゼ欠損症、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシドーシス、マンノシドーシス、シンドラー病、シアリドーシス1型、ポンペ病、濃化異骨症、セロイドリポフスチン沈着症、コレステロールエステル貯蔵病、ウォルマン病、多種スルファターゼ欠損症、ガラクトシアリドーシス、ムコリピドーシス、シスチン症、シアル酸貯蔵病、マリネスコ・シェーグレン症候群を伴うカイロミクロン停滞病、ヘルマンスキー・プドラック症候群、チェディアック・東症候群、ダノン病または幸福顔貌骨異形成症である;
(XIII)該オリゴ糖がタンパク質に連結しており、かつ、該タンパク質が真菌生物において発現されるヒトタンパク質であり、かつ、該タンパク質がリソソーム貯蔵障害(LSD)に関連するリソソーム酵素であり、かつ、該LSDが、ファブリ病、ムコ多糖症I型、ファーバー病、ゴーシェ病、GM1ガングリオシドーシス、テイ・サックス病、サンドホフ病、GM2活性化因子疾患、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ニーマン・ピック病、シャイエ病、ハンター病、サンフィリポ病、モルキオ病、マロトー・ラミー病、ヒアルロニダーゼ欠損症、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシドーシス、マンノシドーシス、シンドラー病、シアリドーシス1型、ポンペ病、濃化異骨症、セロイドリポフスチン沈着症、コレステロールエステル貯蔵病、ウォルマン病、多種スルファターゼ欠損症、ガラクトシアリドーシス、ムコリピドーシス、シスチン症、シアル酸貯蔵病、マリネスコ・シェーグレン症候群を伴うカイロミクロン停滞病、ヘルマンスキー・プドラック症候群、チェディアック・東症候群、ダノン病または幸福顔貌骨異形成症である;
(XIV)該オリゴ糖がタンパク質に連結しており、かつ、該タンパク質がポンペ病またはファブリ病に関連するリソソーム酵素である;
(XV)該オリゴ糖がタンパク質に連結しており、かつ、該タンパク質が真菌生物において発現されるヒトタンパク質であり、かつ、該タンパク質がポンペ病またはファブリ病に関連するリソソーム酵素である。 - キャップ除去されたホスホ−6−マンノース残基を有する標的タンパク質を生産する方法であって、
マンノース−1−ホスホ−6−マンノース残基をホスホ−6−マンノースに加水分解することのできるマンノシダーゼをコードする核酸を含みそして発現するように遺伝的に操作されている真菌細胞を提供するステップであって、該マンノシダーゼが、グリコシルヒドロラーゼファミリー92のメンバーであり、そして、該マンノシダーゼが、配列番号50の残基1〜774または配列番号50を含む、ステップと、
該細胞に、標的タンパク質をコードする核酸を導入するステップと、
を含み、該細胞が、該細胞において発現された該発現されたマンノシダーゼによって該標的上のマンノース−1−ホスホ−6−マンノース残基がホスホ−6−マンノース残基に変換された該標的タンパク質を生産する、方法。 - 以下に列挙した特徴のうちの1つ以上を有する、請求項3に記載の方法:
(I)前記真菌細胞が、マンノシルリン酸化を促進することのできるポリペプチドをコードする核酸をさらに含む;
(II)該真菌細胞が、OCH1活性を欠損するように遺伝的に操作されている;
(III)前記マンノシダーゼが、C.cellulans、Streptomyces coelicolorまたはStreptomyces lividansのマンノシダーゼである。 - 真菌生物においてキャップ除去されたホスホ−6−マンノース残基を有する標的タンパク質を生産する方法であって、
a)マンノース−1−ホスホ−6−マンノースをホスホ−6−マンノースに加水分解することのできるマンノシダーゼをコードする核酸を含みそして発現するように遺伝的に操作されており、標的タンパク質をコードする核酸をさらに含む真菌細胞を提供し、ここで、該マンノシダーゼが、グリコシルヒドロラーゼファミリー92のメンバーであり、そして、該マンノシダーゼが、配列番号50の残基1〜774または配列番号50を含み、該細胞において発現された該発現されたマンノシダーゼによって該標的上のマンノース−1−ホスホ−6−マンノース残基がホスホ−6−マンノース残基に変換されているステップと、
b)該キャップ除去されたホスホ−6−マンノース残基を有する該標的タンパク質を単離するステップと、
を含む、方法。 - 前記標的タンパク質および前記マンノシダーゼが前記細胞により分泌される、請求項5に記載の方法。
- キャップ除去されたホスホ−6−マンノース残基を含む糖タンパク質を生産するように遺伝的に操作されている単離された真菌細胞であって、マンノシダーゼをコードする核酸を含み、該真菌細胞における前記マンノシダーゼの発現が、該キャップ除去されたホスホ−6−マンノース残基を含む糖タンパク質の生産をもたらし、ここで、該マンノシダーゼが、グリコシルヒドロラーゼファミリー92のメンバーであり、そして、該マンノシダーゼが、配列番号50の残基1〜774または配列番号50を含む、真菌細胞。
- 以下に列挙した特徴のうちの1つ以上を有する、請求項7に記載の真菌細胞:
(I)該真菌細胞が、マンノシルリン酸化を促進することのできるポリペプチドをコードする核酸をさらに含む;
(II)該真菌細胞が、OCH1(外鎖伸長)活性を欠損するように遺伝的に操作されている;
(III)該真菌細胞が、マンノシルリン酸化を促進することのできるポリペプチドをコードする核酸を含み、OCH1活性を欠損するように遺伝的に操作されている;
(IV)該真菌細胞が、糖タンパク質である標的タンパク質をコードする核酸をさらに含む;
(V)該真菌細胞が、糖タンパク質である標的タンパク質をコードする核酸をさらに含み、かつ、該標的タンパク質がヒトタンパク質である;
(VI)該真菌細胞が、糖タンパク質である標的タンパク質をコードする核酸をさらに含み、かつ、該標的タンパク質が、病原体タンパク質、リソソームタンパク質、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、抗体もしくはその抗原結合性断片または融合タンパク質である;
(VII)該真菌細胞が、糖タンパク質である標的タンパク質をコードする核酸をさらに含み、かつ、該標的タンパク質がヒトタンパク質であり、かつ、該標的タンパク質が、病原体タンパク質、リソソームタンパク質、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、抗体もしくはその抗原結合性断片または融合タンパク質である;
(VIII)該真菌細胞が、糖タンパク質である標的タンパク質をコードする核酸をさらに含み、かつ、該標的タンパク質がリソソーム酵素である;
(IX)該真菌細胞が、糖タンパク質である標的タンパク質をコードする核酸をさらに含み、かつ、該標的タンパク質がヒトタンパク質であり、かつ、該標的タンパク質がリソソーム酵素である;
(X)該真菌細胞が、糖タンパク質である標的タンパク質をコードする核酸をさらに含み、かつ、該標的タンパク質がリソソーム酵素である酸性アルファグルコシダーゼまたはアルファガラクトシダーゼである;
(XI)該真菌細胞が、糖タンパク質である標的タンパク質をコードする核酸をさらに含み、かつ、該標的タンパク質がヒトタンパク質であり、かつ、該標的タンパク質がリソソーム酵素である酸性アルファグルコシダーゼまたはアルファガラクトシダーゼである;
(XII)該真菌細胞が、糖タンパク質である標的タンパク質をコードする核酸をさらに含み、かつ、該標的タンパク質が、LSDに関連する;
(XIII)該真菌細胞が、糖タンパク質である標的タンパク質をコードする核酸をさらに含み、かつ、該標的タンパク質がヒトタンパク質であり、かつ、該標的タンパク質がLSDに関連する;
(XIV)該真菌細胞が、糖タンパク質である標的タンパク質をコードする核酸をさらに含み、かつ、該標的タンパク質が、ファブリ病、ムコ多糖症I型、ファーバー病、ゴーシェ病、GM1ガングリオシドーシス、テイ・サックス病、サンドホフ病、GM2活性化因子疾患、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ニーマン・ピック病、シャイエ病、ハンター病、サンフィリポ病、モルキオ病、マロトー・ラミー病、ヒアルロニダーゼ欠損症、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシドーシス、マンノシドーシス、シンドラー病、シアリドーシス1型、ポンペ病、濃化異骨症、セロイドリポフスチン沈着症、コレステロールエステル貯蔵病、ウォルマン病、多種スルファターゼ欠損症、ガラクトシアリドーシス、ムコリピドーシス、シスチン症、シアル酸貯蔵病、マリネスコ・シェーグレン症候群を伴うカイロミクロン停滞病、ヘルマンスキー・プドラック症候群、チェディアック・東症候群、ダノン病または幸福顔貌骨異形成症に関連する;
(XV)該真菌細胞が、糖タンパク質である標的タンパク質をコードする核酸をさらに含み、かつ、該標的タンパク質がヒトタンパク質であり、かつ、該標的タンパク質が、ファブリ病、ムコ多糖症I型、ファーバー病、ゴーシェ病、GM1ガングリオシドーシス、テイ・サックス病、サンドホフ病、GM2活性化因子疾患、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ニーマン・ピック病、シャイエ病、ハンター病、サンフィリポ病、モルキオ病、マロトー・ラミー病、ヒアルロニダーゼ欠損症、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシドーシス、マンノシドーシス、シンドラー病、シアリドーシス1型、ポンペ病、濃化異骨症、セロイドリポフスチン沈着症、コレステロールエステル貯蔵病、ウォルマン病、多種スルファターゼ欠損症、ガラクトシアリドーシス、ムコリピドーシス、シスチン症、シアル酸貯蔵病、マリネスコ・シェーグレン症候群を伴うカイロミクロン停滞病、ヘルマンスキー・プドラック症候群、チェディアック・東症候群、ダノン病または幸福顔貌骨異形成症に関連する;
(XVI)該真菌細胞が、Yarrowia lipolyticaまたはArxula adeninivorans細胞である;
(XVII)該真菌細胞が、マンノシルリン酸化を促進することのできるポリペプチドをコードする核酸をさらに含み、該ポリペプチドが、MNN4ポリペプチドである;
(XVIII)該真菌細胞が、マンノシルリン酸化を促進することのできるポリペプチドをコードする核酸をさらに含み、該ポリペプチドが、Yarrowia lipolytica、S.cerevisiae、Ogataea minuta、Pichia pastorisまたはC.albicansのMNN4ポリペプチドである;
(XIX)該真菌細胞が、マンノシルリン酸化を促進することのできるポリペプチドをコードする核酸をさらに含み、該ポリペプチドが、P.pastoris PNO1ポリペプチドである;
(XX)前記マンノシダーゼが、C.cellulans、Streptomyces coelicolorまたはStreptomyces lividansのマンノシダーゼである;
(XXI)該マンノシダーゼが分泌シグナルを含む;
(XXII)該マンノシダーゼが、該マンノシダーゼを細胞内区画にターゲッティングするためのターゲティングシグナルを含む;
(XXIII)該マンノシダーゼが、分泌シグナルおよび該マンノシダーゼを細胞内区画にターゲッティングするためのターゲティングシグナルを含む;
(XXIV)該真菌細胞が、単離された形態にある。 - Yarrowia lipolytica、Pichia pastoris、Hansenula polymorpha、Arxula adeninivorans、Pichia methanolica、Oogataea minutaまたはAspergillus nigerの細胞を含む実質的に純粋な培養物であって、該細胞は、キャップ除去されたホスホ−6−マンノース残基を含む糖タンパク質を生産するように遺伝的に操作されており、マンノース−1−ホスホ−6−マンノースをホスホ−6−マンノースに加水分解することのできるマンノシダーゼをコードする核酸を含み、ここで、該マンノシダーゼが、グリコシルヒドロラーゼファミリー92のメンバーであり、そして、該マンノシダーゼが、配列番号50の残基1〜774または配列番号50を含む、培養物。
- 以下に列挙した特徴のうちの1つ以上を有する、請求項9に記載の培養物:
(I)前記細胞が、マンノシルリン酸化を促進することのできるポリペプチドをコードする核酸をさらに含む;
(II)該細胞が、OCH1活性を欠損するように遺伝的に操作されている。 - 配列番号50の残基1〜774、または配列番号50を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、該ポリペプチドは、マンノース−1−ホスホ−6−マンノースをホスホ−6−マンノースに加水分解することができる、ポリペプチド。
- 請求項11に記載のポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が、配列番号50の残基1〜774のN末端または配列番号50のN末端に、配列番号15の残基1〜15をさらに含む、ポリペプチド。
- 核酸であって、
(a)請求項11または12に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;または
(b)該ヌクレオチド配列の相補体
を含む、核酸。 - 請求項13に記載の核酸であって、
(I)前記ヌクレオチド配列が、配列番号50の残基1〜774または配列番号50をコードする;または
(II)該ヌクレオチド配列が、配列番号14のヌクレオチド46〜2322または配列番号14のヌクレオチド46〜4995を含む;または
(III)該ヌクレオチド配列が、配列番号14のヌクレオチド46〜2322または配列番号14のヌクレオチド46〜4995を含み、かつ、配列番号14のヌクレオチド46〜2322の5’または配列番号14のヌクレオチド46〜4995の5’に、配列番号14のヌクレオチド1〜45をさらに含む、
核酸。 - 請求項11または12に記載のポリペプチドをコードする請求項13または14に記載の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項15に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 請求項11または12に記載のポリペプチドを作製する方法であって、請求項16に記載の宿主細胞を培養するステップと、培養物から該ポリペプチドを単離するステップとを含む、方法。
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