ES2549121T3 - Composición farmacéutica para terapia de reemplazo enzimático - Google Patents
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Abstract
Una proteína que se selecciona de (a) y (b) a continuación: (a) una proteína que tiene actividad α-galactosidasa, que comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 6 donde el aminoácido 202 de la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 6 se sustituye por ácido glutámico o ácido aspártico mientras que el aminoácido 205 de la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 6 se sustituye por leucina, valina o isoleucina; y (b) una proteína que tiene actividad α-galactosidasa y que comprende una secuencia de aminoácidos donde de uno a diez aminoácidos distintos de los aminoácidos sustituidos 202 y 205 se suprimen, sustituyen o añaden en la secuencia de aminoácidos en (a) y donde los aminoácidos 42 a 45, 59, 91 a 95, 131 a 141, 164 a 172, 206, 223 a 234, 256 a 268 y 364 en la secuencia de aminoácidos en (a) no están mutados.
Description
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La expresión “mutante de -NAGA” se refiere básicamente a cualquier mutante de -NAGA de tipo silvestre, sin limitarse a un mutante particular (mutante de aminoácido). En el presente documento, una proteína mutante que tiene serina en el aminoácido 188 sustituida por ácido glutámico, y alanina en el aminoácido 191 sustituida por leucina en la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 2) de -NAGA de tipo silvestre (y por lo tanto denominada “
La expresión “-NAGA fusionada con el péptido señal de -GAL” se refiere en general a una proteína que tiene el resto peptídico señal de -NAGA de tipo silvestre (un resto peptídico que consiste en los aminoácidos 1-17 de la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID Nº: 2) reemplazado con el resto peptídico señal de -GAL de
10 tipo silvestre (un resto peptídico que consiste en los aminoácidos 1-31 de la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID Nº: 10). En este caso, aunque el resto del péptido señal se retira, generalmente después de la secreción extracelular, tras la expresión intracelular de la proteína, de acuerdo con la presente invención, la proteína después de la secreción extracelular también puede denominarse por conveniencia “-NAGA fusionada con el péptido señal de -GAL”.
15 Las expresiones “mutante de -NAGA fusionado con el péptido señal de -GAL” y “-NAGA(S188E/A191L) fusionado con el péptido señal de -GAL” se refieren, en general, a una proteína que tiene el resto peptídico señal de un mutante de -NAGA (por ejemplo, un resto peptídico que consiste en los aminoácidos 1-17 de la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID Nº: 2; reemplazado con el resto peptídico señal de -GAL de tipo silvestre
20 (un resto peptídico que consiste en los aminoácidos 1-31 de la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID Nº: 10). En este caso, aunque el resto peptídico señal se retira, en general, después de la secreción extracelular tras la expresión intracelular de la proteína, de acuerdo con la presente invención, la proteína después de la secreción extracelular también puede denominarse por conveniencia “mutante de -NAGA fusionado con el péptido señal de -GAL” y “-NAGA(S188E/A191L) fusionada con el péptido señal de -GAL”.
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(2) Descripción del listado de secuencias
En la Tabla A indicada a continuación se muestran proteínas enzimáticas de las secuencias de nucleótidos y secuencias de aminoácidos representadas por SEC ID Nº: 1-10 en la presente descripción. En la Tabla A, la
30 expresión “cuerpo principal” se refiere a una parte que se convierte en la proteína madura sin el resto peptídico señal. El símbolo “+” representa la unión entre el péptido señal indicado y el cuerpo principal.
Tabla A
- SEC ID Nº
- Proteína
- SEC ID Nº: 1 (secuencia de nucleótidos) SEC ID Nº: 2 (secuencia de aminoácidos)
- -NAGA ts (péptido señal de -NAGA ts + cuerpo principal de -NAGA ts)
- SEC ID Nº: 3 (secuencia de nucleótidos) SEC ID Nº: 4 (secuencia de aminoácidos)
- Mutante de -NAGA (-NAGA(S188E/A191L)) (péptido señal de -NAGA ts + cuerpo principal de mutante de -NAGA)
- SEC ID Nº: 5 (secuencia de nucleótidos) SEC ID Nº: 6 (secuencia de aminoácidos)
- Péptido señal de -GAL ts + cuerpo principal de -NAGA ts
- SEC ID Nº: 7 (secuencia de nucleótidos) SEC ID Nº: 8 (secuencia de aminoácidos)
- Péptido señal de -GAL ts + cuerpo principal de mutante de -NAGA
- SEC ID Nº: 9 (secuencia de nucleótidos) SEC ID Nº: 10 (secuencia de aminoácidos)
- -GAL ts (péptido señal de -GAL ts + cuerpo principal de -GAL ts)
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denomina enfermedad de Kanzaki), y la deficiencia de -NAGA es una causa del desarrollo de la enfermedad de Schindler y de la enfermedad de Kanzaki. En general, sin embargo, el desarrollo de la enfermedad de Schindler
- o de la enfermedad de Kanzaki, es muy poco común incluso en pacientes con enfermedad de Fabry. En consecuencia, puede decirse que casi todos los pacientes con enfermedad de Fabry tienen -NAGA normalmente. Por lo tanto, se cree que incluso cuando una proteína en la que solamente se modifica la especificidad de sustrato de -NAGA en la especificidad de sustrato de -GAL se administra como en un agente enzimático para reemplazo enzimático, la antigenicidad de la misma pocas veces aparece como si se administrara -NAGA de tipo silvestre, y por lo tanto sustancialmente no existe ninguna probabilidad de que se induzca una reacción inmunitaria adversa tal como un efecto secundario alérgico.
- (ii)
- -NAGA actúa en forma de un homodímero como -GAL pero en general, -NAGA es más estable que -GAL tras la formación de homodímeros. El modelo de estructura tridimensional construido por los presentes inventores también sostiene esta estabilidad. Específicamente, se ha confirmado que, tras la formación del dímero de la -NAGA humana, se observaron dos enlaces mediante interacción electroestática entre Asp45 y Arg350 en las dos subunidades, mientras que dichos enlaces no se observaron en -GAL. En consecuencia, se cree que, al igual que -NAGA, un mutante de -NAGA, también tiene mayor estabilidad en sangre (en plasma), en comparación con -GAL, y es muy adecuado para terapia de reemplazo enzimático. Además, si la proporción de dímero aumenta debido a la estabilidad anterior, se espera que la eficacia de captación por un lisosoma en una célula también se mejore en relación con el punto (iii) posterior. Además, es ventajoso que el efecto pueda mantenerse como una preparación enzimática durante un periodo de tiempo prolongado antes de la administración.
(iii) Es necesario que una enzima usada para terapia de reemplazo enzimático pueda captarse por un lisosoma en una célula de un órgano afectado. En general, el transporte de una membrana celular a un lisosoma se realiza mediante un receptor de M6P independiente de calcio, que reconoce la manosa-6-fosfato (M6P) presente en las partes de la cadena de azúcar de la enzima. En consecuencia, es preferible una enzima que tenga un mayor número de cadenas de azúcares (cadenas de azúcares de tipo N) que permitan la unión con el resto de M6P porque es mayor una eficacia de captación de un lisosoma. Con respecto al número de cadenas de azúcar anteriores, ha resultado evidente, mediante un análisis de estructura cristalina por rayos X, que están presentes tres cadenas de azúcares por subunidad (en tres posiciones, Asn139, Asn192 y Asn215; seis cadenas de azúcares en caso de que se forme un dímero) en -GAL. Por el contrario, en -NAGA, están presentes cinco cadenas de azúcares por subunidad (diez cadenas de azúcares en caso de que se forme un dímero) (véanse las Figuras 3 y 4). Entre estas cadenas de azúcares, tres cadenas de azúcares (en tres posiciones, Asn124, Asn177 y Asn201) corresponden a las posiciones de las cadenas de azúcares en -GAL, y otras dos cadenas de azúcares (en dos posiciones, Asn359 y Asn385) son específicas de -NAGA. En consecuencia, se cree que una eficacia de captación de -NAGA en sangre por un lisosoma en una célula de un órgano afectado es mayor que en el caso de -GAL.
A partir de los puntos de vista anteriores, los presentes inventores se han centrado en el aminoácido 188 (serina (Ser)) y el aminoácido 191 (Ala (alanina)) entre un grupo de restos de aminoácidos que constituye el sitio de unión al sustrato de -NAGA. Los presentes inventores han intentado preparar una enzima recombinante (enzima mutante) en la que la serina 188 (Ser) se sustituyó por ácido glutámico (Glu) y la alanina 191 se sustituyó por leucina (Leu). Posteriormente, esta enzima recombinante se expresó usando fibroblastos procedentes de un paciente con enfermedad de Fabry, se recogió y se analizó. Como resultado, se observó alta actividad -Gal. Además, la estabilidad de esta enzima recombinante en sangre fue significativamente mayor que la de -GAL de tipo silvestre. Usando dicha enzima recombinante con especificidad de sustrato alterada, puede proporcionarse una composición farmacéutica para tratar la enfermedad de Fabry que puede usarse eficazmente para reemplazo enzimático para tratar la enfermedad de Fabry que es superior a las composiciones farmacéuticas existentes.
2. Proteína
Una proteína de la presente invención es una proteína que puede usarse como un elemento activo de una composición farmacéutica descrita posteriormente de la invención para tratar la enfermedad de Fabry, especialmente una enzima mutante de -N-acetilgalactosaminidasa (-NAGA).
Más específicamente, las proteínas descritas en el presente documento son proteínas de (1a) o (1b) posteriores, preferentemente una proteína de (1c) posterior.
(1a) una proteína que ha adquirido actividad -galactosidasa (-GAL) alterando la estructura del sitio activo (en particular, el sitio de unión a un sustrato) o -NAGA de tipo silvestre, preferentemente una proteína que tiene la especificidad de sustrato de -GAL. (1b) una proteína de (1a) anterior con un péptido señal. En este caso, el tipo de péptido señal no está particularmente limitado, y puede ser un péptido señal derivado de -NAGA de tipo silvestre u otra proteína. (1c) una proteína de (1b) anterior, en la que el péptido señal deriva de -GAL de tipo silvestre.
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[En la fórmula de reacción (2), cuando el sustrato es un compuesto natural, R2 representa “un grupo derivado de un complejo de azúcar”, y cuando el sustrato es un compuesto sintético, R2 representa “un grupo 4-metilumbeliferilo”].
Se ha publicado información sobre la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 2) de la subunidad de -NAGA de tipo silvestre (homodímero) y se ha publicado información sobre la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº: 1) que codifica la secuencia de aminoácidos anterior, por ejemplo, como “número de referencia: NM_000262” de GenBank, y se ha registrado en “número de entrada: NAGAB_HUMAN”, número de referenciar: P17050” con Swiss-Prot (disponible en http://tw.expasy.org/uniprot/). De forma similar, se ha publicado información sobre la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 10) de la subunidad de -GAL de tipo silvestre (homodímero) e información sobre la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº: 9) que codifica la secuencia de aminoácidos anterior, por ejemplo, como “número de referencia: NP_000160” de GenBank, y registrada en “nombre de entrada” AGAL_HUMAN”, número de referencia: P06280” con Swiss-Prot (disponible en http://tw.expasy.org/uniprot/).
Una proteína de la invención es una proteína de (a) o (b) a continuación.
- (a)
- una proteína que tiene actividad -galactosidasa, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 6, donde el aminoácido 202 se sustituye por ácido glutámico o ácido aspártico y el aminoácido 205 se sustituye por leucina, valina o isoleucina en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID Nº: 6; o
- (b)
- una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que de uno a diez aminoácidos distintos de los aminoácidos sustituidos 202 y 205 se suprimen, sustituyen o añaden a las secuencias de aminoácidos descritas en (a) anterior, y donde los aminoácidos 42 a 45, 59, 91 a 95, 131 a 141, 164 a 172, 206, 223 a 234, 256 a 268 y 364 en la secuencias de aminoácidos en (a) no están mutados y que tiene actividad -galactosidasa.
La secuencia de aminoácidos representada por SEC ID Nº: 6 es una secuencia de aminoácidos (con un total de 425 aminoácidos) en la que los aminoácidos 1-17, correspondientes al resto peptídico señal, se alteran por el resto peptídico señal de -GAL de tipo silvestre en una secuencia de aminoácidos compuesta de 411 aminoácidos que constituyen -NAGA de tipo silvestre, que es una proteína denominada de fusión. En este caso, el resto peptídico señal de la -GAL de tipo silvestre, como se ha descrito ya anteriormente, es un resto peptídico de los aminoácidos 1-31 entre la secuencia de aminoácidos que constituye la -GAL de tipo silvestre representada por SEC ID Nº: 10.
En la secuencia de aminoácidos que constituye la proteína de (a) anterior, los restos de aminoácidos 188 y 191 son cada uno de los aminoácidos que constituyen los sitios de unión al sustrato.
Un ejemplo particularmente preferible de la proteína descrita en (a) incluye una proteína en la que “el aminoácido 202” es ácido glutámico mientras que “el aminoácido 205” es leucina. Un ejemplo preferible de dicha proteína incluye una proteína (-NAGA(S202E/A205L) fusionada con el péptido señal de -GAL) que tiene la serina 202 sustituida por ácido glutámico y la alanina 205 sustituida por leucina en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID Nº: 6.
La proteína descrita en (b) no está limitada siempre que incluya una secuencia de aminoácidos en la que 1-10, y preferentemente aproximadamente 1-5 aminoácidos distintos del aminoácido o los aminoácidos localizados en el sitio o los sitios sustituidos se suprimen, sustituyen o añaden en una cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en (a) incluidas en la proteína descrita en (a) anterior, y tiene actividad -GAL. En el presente documento, la expresión “el sitio sustituido” se refiere al resto de aminoácido 202 (siempre que la secuencia de aminoácidos esté limitada a la secuencia de aminoácidos descrita en (a) y el resto de aminoácido 205 (siempre que la secuencia de aminoácidos esté limitada a la secuencia de aminoácidos descrita en (a)) entre los 425 restos de aminoácidos que constituyen la secuencias de aminoácidos descritas en (i) a (iii) anteriores.
Obsérvese que es importante que la proteína descrita en (b) anterior sea una proteína que pueda mostrar de forma estable actividad -GAL. Por lo tanto, por ejemplo, los restos de aminoácidos que se cree que son importantes para rendimiento de unión (rendimiento de unión a sustrato) con un resto de -galactosa de un sustrato de -GAL y la reactividad catalítica al sustrato son preferentemente restos de aminoácidos que no están mutados (suprimidos, sustituidos o añadidos) a partir de las secuencias de aminoácidos descritas en (i) a (iii). En particular, dichos restos de aminoácidos incluyen restos de aminoácidos 42-45, 91-95, 131-141, 164-172, 206, 223-234 y 256-268 (en particular, los ácidos aspárticos 170 y 231 (Asp: D) en el sitio catalítico) entre los 425 restos de aminoácidos que constituyen las secuencias de aminoácidos descritas en (a) anterior.
De forma similar, los restos de aminoácidos que se cree que son importantes para formar un homodímero también están preferentemente no mutados (suprimidos, sustituidos o añadidos) a partir de las secuencias de aminoácidos descritas en (a) anterior. Los ejemplos preferibles de dichos restos de aminoácidos incluyen los restos de aminoácidos 59 y 364 (específicamente, el ácido aspártico 59 (Asp: D) y la arginina 364 (Arg: R)) entre los 425 restos de aminoácidos que constituyen las secuencias de aminoácidos descritas en (a) anterior.
Además, los restos de aminoácidos que son sitios de unión a cadena de azúcar tipo N también están preferentemente no mutados (suprimidos, sustituidos o añadidos) a partir de las secuencias de aminoácidos
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En el presente documento, la explicación para el ADN descrito anteriormente se aplica de forma similar a los nucleótidos que representan un codón de cada uno de los aminoácidos anteriores.
Un ejemplo particularmente preferible del ADN descrito en (2a) anterior incluye ADN en el que “los nucleótidos que representan un codón de ácido glutámico o ácido aspártico” son nucleótidos que representan un codón de ácido glutámico, y “los nucleótidos que representan un codón de leucina, valina o isoleucina” son nucleótidos que representan un codón de leucina. Un ejemplo preferible de dicho ADN es ADN compuesto de una secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº: 7) en la que los nucleótidos 604-606 que representan un codón de serina se sustituyen por nucleótidos que representan un codón de ácido glutámico (“agc” → ”gag”), y los nucleótidos 613-615 que representan un codón de alanina se sustituyen por nucleótidos que representan un codón de leucina (“gcc” → “ctc”) en la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID Nº: 5. En este ejemplo, los nucleótidos 604-606 después de la sustitución no están limitados y pueden ser nucleótidos distintos de “gag” mencionado anteriormente siempre que representen un codón de ácido glutámico. De forma similar, los nucleótidos 613-615 después de la sustitución no están limitados y pueden ser nucleótidos distintos de “ctc” mencionado anteriormente siempre que representen un codón de leucina.
Con respecto a la preparación de dicho mutante de ADN de tipo sustituido, es válida la explicación para el ADN descrito anteriormente de forma similar.
El ADN descrito en (2b) anterior puede obtenerse de una biblioteca de ADNc o una biblioteca genómica por un método de hibridación conocido usando ADN descrito en (2a). El ADN compuesto de una secuencia de nucleótidos complementaria de este ADN, o un fragmento de la misma como una sonda. Con respecto al tipo, procedimiento y las condiciones de la hibridación así como cada biblioteca, es válida la explicación para el ADN descrito anteriormente de forma similar.
El ADN para hibridar tiene una secuencia de nucleótidos que tiene una homología de preferentemente al menos 40% o más, más preferentemente 60% o más, aún más preferentemente 90% o más, particularmente preferentemente 95% o más y más preferentemente 99% o más con la secuencia de nucleótidos del ADN descrito en (2a) anterior.
Además, en el ADN descrito en (2b) anterior, los nucleótidos son iguales que los nucleótidos en el sitio sustituido anteriormente en la posición correspondiente.
En el presente documento, la expresión “sitio sustituido” se refiere a un sitio de la sustitución de nucleótidos realizada en una cualquiera de las secuencias de nucleótidos descritas en (2a) anterior. Específicamente, la expresión se refiere a un sitio de nucleótidos (triplete) que representa un codón alterado resultante de la sustitución de nucleótidos. Más específicamente, la expresión “sitio sustituido” se refiere a los nucleótidos 604-606 (siempre que la secuencia de nucleótidos esté limitada a las secuencias de nucleótidos descritas en (2a)), y los nucleótidos 613615 (siempre que la secuencia de nucleótidos esté limitada a las secuencias de nucleótidos descritas en (2a)) entre los 1.275 nucleótidos que constituyen las secuencias de nucleótidos descritas en (2a).
Además, los “nucleótidos” en la expresión “nucleótidos correspondientes a los nucleótidos en el sitio sustituido” se refieren a nucleótidos (triplete) que se sitúan opuestos a nucleótidos (triplete) complementarios de los nucleótidos en el sitio sustituido en un híbrido preparado hibridando el ADN descrito en (2b) anterior con una cadena complementaria del ADN descrito en (2a) anterior. Por ejemplo, cuando la secuencia de nucleótidos del ADN descrito en (2b) anterior no tiene una mutación tal como deleción o adición, en comparación con el ADN descrito en (2a) (es decir, cuando las longitudes (los números de nucleótidos) de ambos ADN son iguales), los nucleótidos 604606 y/o los nucleótidos 613-615 de la secuencia de nucleótidos del ADN descrito en (2b) son los “nucleótidos” en la expresión “nucleótidos correspondientes a los nucleótidos en el sitio sustituido”.
Es importante que el ADN descrito en (2b) anterior sea ADN que codifique una proteína que tenga actividad -GAL. Por lo tanto, por ejemplo, nucleótidos que representan un codón de un resto de aminoácido que se cree que es importante para el rendimiento de unión (rendimiento de unión a sustrato) con un resto de -galactosa de un sustrato de -GAL y la reactividad catalítica al sustrato son preferentemente nucleótidos que no están mutados (suprimidos, sustituidos o añadidos) a partir de las secuencias de nucleótidos descritas en (2a). Los ejemplos preferibles de dichos nucleótidos de las secuencias de nucleótidos descritas en (2a) incluyen los nucleótidos 124-135 (4 codones), 271-285 (5 codones), 391-423 (11 codones), 490-516 (9 codones), 616-618 (1 codón), 667-702 (12 codones) y 766804 (13 codones) entre las secuencias de nucleótidos descritas en (i) a (iii) anteriores. Entre estos nucleótidos, los nucleótidos 508-510 y 691-693, que representan codones de restos de aminoácidos en un sitio catalítico, son particularmente preferibles.
Además, en el ADN descrito en (2b) anterior, los nucleótidos que representan un codón de un resto de aminoácido que se cree que es importante para formar un homodímero también están preferentemente no mutados (suprimidos, sustituidos o añadidos) a partir de las secuencias de nucleótidos descritas en (2a). Los ejemplos preferibles de dichos nucleótidos de las secuencias de nucleótidos descritas en (2a) incluyen los nucleótidos 175-177 y 1.090
1.092 entre las secuencias de nucleótidos.
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célula HeLa, germen de trigo, levadura en gemación o E. coli. El extracto celular puede, sin limitación, concentrarse
o diluirse tras su uso, o se puede usar sin tratamiento adicional.
El extracto celular puede obtenerse, por ejemplo, por ultrafiltración, diálisis o precipitación con polietilenglicol (PEG).
Como alternativa, dicha síntesis de proteínas sin células puede realizarse usando un kit disponible en el mercado. Los ejemplos del kit incluyen un kit de reactivo PROTEIOS™ (Toyobo Co., Ltd.), Sistema TNT™ (Promega), un dispositivo de síntesis PG-Mate™ (Toyobo Co., Ltd.) y RTS (Roche Diagnostics K.K.).
La proteína diana producida por síntesis de proteínas sin células puede purificarse como se ha descrito anteriormente seleccionando apropiadamente medios tales como cromatografía.
6. Composición farmacéutica para tratar enfermedad de Fabry
(i) Composición farmacéutica como agente enzimático usado para reemplazo enzimático o similares
Como se ha descrito anteriormente, la proteína de la presente invención puede ejercer diversos excelentes efectos con respecto al tratamiento de enfermedad de Fabry, y por lo tanto puede usarse preferentemente como un elemento activo de una composición farmacéutica para tratar la enfermedad de Fabry (un agente terapéutico para enfermedad de Fabry). En otras palabras, una composición farmacéutica para tratar enfermedad de Fabry puede comprender la proteína anteriormente descrita de la presente invención. Preferentemente, la composición farmacéutica está específicamente en una forma de un agente enzimático que puede usarse para terapia de reemplazo enzimático.
La proteína de la presente invención, que actúa como un elemento activo en la composición farmacéutica, puede usarse, sin limitación, en forma de una sal, un hidrato o similares, según sea necesario, o en un estado modificado químicamente de forma apropiada teniendo en cuenta la estabilidad del almacenamiento (particularmente para mantener la actividad enzimática) como un agente terapéutico.
La composición farmacéutica puede contener componentes distintos de la proteína de la presente invención. Los ejemplos de los otros componentes incluyen diversos tipos de componentes farmacéuticamente aceptables (tales como diversos tipos de vehículo farmacológicamente aceptables) que se requieren de acuerdo con el uso (la realización de uso) de la composición farmacéutica. Los otros componentes pueden estar contenidos apropiadamente de modo que los efectos conseguidos por la proteína de la presente invención y similares no se alteren.
En caso de que la composición farmacéutica se use como un agente enzimático para reemplazo enzimático, la relación de mezcla de la proteína de la presente invención y los tipos y relaciones de mezcla de otros componentes usados pueden determinarse de forma apropiada de acuerdo con un método para preparar un agente enzimático conocido para reemplazo enzimático (en particular, un agente enzimático usado para terapia de reemplazo enzimático para enfermedad de Fabry).
El método para administrar la composición farmacéutica no está limitado. Cuando la composición farmacéutica es un agente enzimático usado para reemplazo enzimático, se usa en general administración parenteral tal como goteo intravenoso. Puede prepararse una preparación farmacéutica que puede usarse en diversos métodos de administración tales como administración parenteral seleccionando y usando de forma apropiada un excipiente, una carga, un diluyente, un aglutinante, un humectante, un disgregante, un lubricante, un tensioactivo, un dispersante, un tampón, un conservante, un solubilizador, un antiséptico, un agente saporífero, un lenitivo, un agente estabilizante, un agente de isotonicidad o similares, todos los cuales se usan en general en la producción de medicinas de acuerdo con un método rutinario.
La forma de la composición farmacéutica no está limitada. Cuando la composición farmacéutica es un agente enzimático usado para reemplazo enzimático, se usa en general una inyección intravenosa (incluyendo infusión por goteo). Por ejemplo, la composición farmacéutica puede proporcionarse en forma de, por ejemplo, una ampolla de una única dosis o un recipiente multidosis.
En general, la dosificación de la composición farmacéutica puede determinarse de forma apropiada en un amplio intervalo teniendo en cuenta la relación de mezcla del elemento activo en la preparación farmacéutica así como la edad y el peso corporal del sujeto (paciente) al que se va a administrar la composición farmacéutica, el tipo, la condición y similares de la enfermedad, además de la vía de administración, el número de administraciones, el periodo de administración y similares. En particular, en caso de que la composición farmacéutica sea un agente enzimático para reemplazo enzimático, el número de dosis es preferentemente de aproximadamente uno cada dos o cuatro semanas, mientras que la cantidad del mismo por dosis es tal que la proteína o similar (enzima recombinante) de la presente invención, como un elemento activo, se administra, por ejemplo, para preferentemente de aproximadamente 0,1 a 10 mg/kg, más preferentemente de aproximadamente 0,1 a 5 mg/kg, y aún más preferentemente de aproximadamente 0,2 a 1 mg/kg en relación con el peso corporal de un paciente.
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En la presente invención, la proteína (enzima recombinante) de la presente invención, que actúa como un elemento activo, es excelente en su estabilidad en sangre y la eficacia de captación de la misma por una célula de un órgano afectado es alta. Por lo tanto, incluso cuando la proteína se usa en una cantidad menor que una proteína convencional, el efecto del reemplazo enzimático puede ser igual que o más fuerte que el conseguido con la proteína convencional. Además, dado que los efectos secundarios alérgicos son insignificantes, las cargas físicas, mentales y económicas en los pacientes pueden reducirse notablemente.
(ii) Composición farmacéutica como agente terapéutico génico
Como se ha descrito anteriormente, el gen de la presente invención codifica una proteína de la presente invención que puede producir diversos efectos excelentes con respecto al tratamiento de enfermedad de Fabry, y por lo tanto puede usarse como un elemento activo de una composición farmacéutica para tratar enfermedad de Fabry (un agente terapéutico para enfermedad de Fabry (un agente terapéutico génico)). Es decir, una composición farmacéutica para tratar la enfermedad de Fabry, puede comprender el gen anteriormente descrito de la presente invención.
En caso de que se use la composición farmacéutica como un agente terapéutico génico, puede emplearse un método en el que el gen se administra directamente por inyección, o un método en el que se administra un vector que incorpora un ácido nucleico. Los ejemplos del vector incluyen un vector adenoviral, un vector de virus adenoasociado, un vector del virus del herpes, un vector de virus vaccinia, un vector retroviral y un vector de lentivirus. Usando estos vectores virales, el agente terapéutico génico puede administrarse eficazmente. También puede usarse un kit de transferencia génica disponible en el mercado (por ejemplo, nombre del producto: AdenoExpress, fabricado por Clontech).
Además, en caso de que se use la composición farmacéutica como un agente terapéutico génico, la composición puede introducirse en un retículo endoplásmico de fosfolípidos tal como un liposoma, y el retículo endoplásmico puede administrarse. Específicamente, un retículo endoplásmico que conserva un gen de la presente invención se introduce en una célula predeterminada por un método de lipofección. La célula resultante se administra después, por ejemplo, por vía intravenosa o por vía intraarterial. Como alternativa, dicha célula puede administrarse localmente a un órgano afectado por enfermedad de Fabry. Por ejemplo, en caso de que la composición farmacéutica se administre a un adulto, la dosis es preferentemente de aproximadamente 0,1 mg/kg a 1.000 mg/kg y más preferentemente de aproximadamente 1 g/kg a 100 mg/kg al día en relación con el peso corporal del paciente.
7. Método de tratamiento de enfermedad de Fabry
Un método de tratamiento de enfermedad de Fabry puede comprender administrar la composición farmacéutica descrita anteriormente a un paciente con enfermedad de Fabry. También se describe en el presente documento el uso de la composición farmacéutica para tratar enfermedad de Fabry, y el uso de la composición farmacéutica o la proteína de la presente invención para producir un fármaco para tratar la enfermedad de Fabry.
La composición farmacéutica usada en el método terapéutico descrito en el presente documento puede ser una composición farmacéutica que contenga una proteína de la presente invención (“sección 6 (i)” anterior), una composición farmacéutica que contiene un gen de la presente (“sección 6 (ii)” anterior), o una combinación de estas composiciones farmacéuticas que pueden seleccionarse apropiadamente, sin limitación, teniendo en cuenta el estado del paciente, la presencia o ausencia de efectos secundarios adversos, el efecto de administración y similares. Aquí, cada una de las composiciones farmacéuticas para administrar a un paciente con enfermedad de Fabry se administra preferentemente en la realización de uso como un agente enzimático para reemplazo enzimático o como un agente terapéutico génico descrito anteriormente.
En particular, cuando las composiciones farmacéuticas se usan en combinación como se ha descrito anteriormente, por ejemplo, la proporción de dosificación, el número de dosis y el periodo de administración de cada una de las composiciones farmacéuticas pueden determinarse de forma apropiada para ajustare a cada paciente. Por ejemplo, un método preferible y dosis para administración de cada una de las composiciones farmacéuticas y similares son como se ha descrito anteriormente.
La presente invención se describirá ahora más específicamente por medio de Ejemplos, pero la presente invención no se limita a los mismos.
[Ejemplo 1]
<Selección del sitio de mutación para introducir en -N-acetilgalactosaminidasa (-NAGA)>
Para diseñar una nueva enzima en la que la especificidad de sustrato de -NAGA humana se altera por una especificidad de sustrato similar a la de -GAL humana, los sitios de mutación (posición de aminoácidos) para introducir en -NAGA humana se determinaron por comparación y estudio usando modelos estructurales
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tridimensionales de las proteínas. Los procedimientos y resultados de la determinación se describen específicamente a continuación.
1. Datos usados
Se usaron los datos de secuencia de aminoácidos de -NAGA humana y -GAL humana registrados con Swiss-Prot como se muestra posteriormente (véase Tabla 1). Se usaron los datos de estructuras tridimensionales de las proteínas -NAGA de pollo y -GAL humana registradas en el Banco de Datos de Proteínas (PDB) como se muestra posteriormente (véase Tabla 2).
(1) Datos de secuencias de aminoácidos Base de datos usada: Swiss-Prot (http://tw.expasy.org/uniprot/)
Tabla 1 nombre de la entrada número de referencia
-NAGA Humana NAGAB_HUMAN P17050 -GAL Humana AGAL_HUMAN P06280
(2) Datos estructurales tridimensionales de proteínas
Base de datos usada: Banco de Datos de Proteínas (PDB) (http://www.rcsb.org/pdb/) Tabla 2
PDB ID
-NAGA de Pollo 1KTC (véase *1 posterior) -GAL Humana 1R47 (véase *2 posterior)
*1: Garman SC et al., Structure (Camb), 2002, 10(3): 425-34. *2: Garman SC et al., J. Mol. Biol., 2004, 19; 337(2): 319-35.
- 2.
- Construcción del modelo estructural tridimensional de -NAGA humana
Se construyó un modelo de estructura tridimensional de -NAGA humana basándose en la estructura de -NAGA de pollo usando un método existente, un método de modelización de homología (véase Sutcliffe MJ et al., Prot. Eng., 1987, 1, 377-84; y Sutcliffe MJ et al., Prot. Eng., 1987, 1, 385-92). La estructura de -NAGA de pollo (complejo sustrato) registrada en la PDB se usó como una estructura de un molde usado para modelización de homología. El grado de coincidencia (identidad) de aminoácidos entre -NAGA humana y -NAGA de pollo es del 75%, lo que satisface la condición (identidad 30%) para construir un modelo estructural por el método de modelización de homología. La construcción de un modelo estructural por el método de modelización de homología se realizó usando software existente MODELLER (disponible mediante acceso a la Web de MODELLER CBSU (http://cbsuapps.tc.cornell.edu/modeller.aspx)). Además, se construyó un modelo de un complejo sustrato de -NAGA humana adaptando un sustrato unido a -NAGA de pollo en el modelo estructural construido de -NAGA humana de acuerdo con la posición del sustrato.
- 3.
- Comparación de estructuras tridimensionales que contribuyen a la especificidad de sustrato de -GAL humana y la de -NAGA humana
La estructura tridimensional de -NAGA humana es similar a la de -GAL humana, y los dominios catalíticos tanto de -NAGA humana como de -GAL humana tienen una estructura de barril ()8. Los restos de aminoácidos (restos catalíticos) requeridos para acción catalítica presente en los sitios activos (incluyendo sitio catalítico y un sitio de unión a sustrato) se localizan en el lado C terminal de cada cadena de la estructura de barril ()8. En las Figuras 1, 2A y 2B, las estructurales tridimensionales de -NAGA humana y -GAL humana se muestran como un modelo de lazo, y los restos de aminoácidos en los sitios catalíticos y el sitio de unión al sustrato en cada una de las estructuras se muestran como un modelo de barras. Para comparar las relaciones posicionales entre el sustrato y los restos en el sitio catalítico y el sitio de unión al sustrato en la estructura, se superpuso la estructura de -NAGA en la estructura de -GAL por el método de superposición desarrollado por Kabsch (véase Kabsch W. et al., Acta Crystallogr; 1976: A32, 827-828; y Kabsch W. et al., Acta Crystallogr; 1978: A34, 922-923). Posteriormente, en el modelo estructural de -NAGA humana, se seleccionaron restos de aminoácidos implicados en la unión del sustrato extrayendo restos de aminoácidos adyacentes al sustrato. Los resultados se muestran en la Tabla 3. La columna derecha de la Tabla 3 muestra 14 restos de aminoácidos seleccionados de -NAGA humana, y la columna izquierda muestra restos de aminoácidos en -GAL humana que corresponden posicionalmente a esos 14 restos de aminoácidos.
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