ES2620404T3

ES2620404T3 - Apoliproteína AIV como péptido antidiabético

Info

Publication number: ES2620404T3
Application number: ES12705517.6T
Authority: ES
Inventors: Patrick Tso; Sean Davidson; Stephen Woods; Fei Wang
Original assignee: University of Cincinnati
Current assignee: University of Cincinnati
Priority date: 2011-01-19
Filing date: 2012-01-19
Publication date: 2017-06-28
Anticipated expiration: 2032-01-19
Also published as: AU2012207301A1; AU2012207301A2; CN103391786B; US9051394B2; MX342020B; MX2013008374A; US20150252095A1; EA201391063A1; JP2014504601A; US9266941B2; EP2665485B1; US20140005107A1; AU2012207301A8; EA028218B1; EP2665485A1; AU2012207301B2; SG191992A1; WO2012100010A1; IL227207B; CA2823712A1

Abstract

Una apolipoproteína A-IV, o uno de sus análogos biológicamente activos, que tiene al menos 90% de identidad con la apolipoproteína A-IV, para su uso para tratar la diabetes mellitus de tipo II en un sujeto.

Description

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DESCRIPCION

Apoliprotema AIV como peptido antidiabetico Campo tecnico

La presente descripcion se refiere a compuestos y composiciones para su uso en el tratamiento de la diabetes. Mas en concreto, la presente descripcion se refiere al uso de la apolipoprotema A-IV para tratar la diabetes mellitus de tipo dos.

Antecedentes

La aparicion de la diabetes esta muy extendida, y aproximadamente 8% de la poblacion de EEUU padece diabetes. La diabetes es una enfermedad cronica caracterizada por un alto contenido de azucar en sangre debido a que el cuerpo es incapaz de producir y/o utilizar la insulina con eficacia. La diabetes puede conducir a una diversidad de complicaciones ffsicas que incluyen, pero no se limitan a insuficiencia renal, ceguera, danos nerviosos, enfermedad cardfaca, apnea del sueno y enfermedad celfaca. Por ejemplo, en EEUU, la diabetes es la principal causa de insuficiente renal, ceguera, amputacion, accidentes cerebrovasculares y ataque cardfaco. Tambien en EEUU, la diabetes es la sexta causa principal de muerte y se ha demostrado que reduce la esperanza de vida de adultos de mediana edad en aproximadamente cinco a diez anos.

La forma mas habitual de diabetes es la diabetes mellitus de tipo dos (en lo sucesivo "T2DM"). La T2DM se caracteriza por hiperglucemia, resistencia a la insulina, disfuncion de celulas p, y gluconeogenesis hepatica desregulada. Las personas que padecen T2DM sufren una perdida de secrecion de insulina estimulada por glucosa relacionada con la liberacion alterada de granulos de insulina almacenados desde las celulas p en la primera fase de la secrecion de insulina. En la segunda fase de la secrecion de insulina, las personas que padecen T2DM sufren una perdida gradual de la capacidad para sintetizar insulina activamente en respuesta a estfmulos de glucosa.

La prevalencia de la T2DM esta aumentando y, en 2002, la T2DM produjo unos costes sanitarios de mas de 130 mil millones de dolares americanos. Asf, son necesarias nuevas terapias para tratar la T2DM con eficacia.

Sumario

La presente descripcion se basa en el sorprendente descubrimiento de que la apolipoprotema A-IV es un peptido antidiabetico eficaz que esta mtimamente implicado en la resolucion de la T2DM. La apolipoprotema A-IV es una hormona intestinal clave que contribuye a la tolerancia a la glucosa posprandial y actua como un mediador, previamente no percibido, en la mejona de la tolerancia a la glucosa. Por consiguiente, en una realizacion se describen compuestos para su uso para tratar la T2DM en un sujeto que lo necesite. En particular, se describe una apolipoprotema A-IV, o uno de sus analogos biologicamente activos, que tiene al menos 90, o al menos 99% de identidad con la apolipoprotema A-IV, para su uso para tratar la diabetes de tipo II en un sujeto.

En otra realizacion, se describe una composicion farmaceutica que comprende la apolipoprotema A-IV. La composicion farmaceutica comprende una apolipoprotema A-IV, o uno de sus analogos biologicamente activos, que tiene al menos 90, o al menos 99% de identidad con la apolipoprotema A-IV, para su uso para tratar la T2DM, para disminuir los niveles de glucosa en sangre en un sujeto que lo necesite, o para restablecer sustancialmente la tolerancia a la glucosa en un sujeto.

En otra realizacion, se describen compuestos para restablecer sustancialmente la tolerancia a la glucosa en un sujeto que lo necesite, hasta un nivel normal. En particular, se describe una apolipoprotema A-IV, o uno de sus analogos biologicamente activos, que tiene al menos 90, o al menos 99% de identidad con la apolipoprotema A-IV, para su uso para restablecer sustancialmente la tolerancia a la glucosa en un sujeto. Los usos segun la descripcion pueden comprender la administracion sistemica de la apolipoprotema A-IV, o su analogo biologicamente activo.

En otra realizacion, se describen compuestos para disminuir el nivel de glucosa en sangre en un sujeto que lo necesite. En particular, se describe una apolipoprotema A-IV, o uno de sus analogos biologicamente activos, que tiene al menos 90, o al menos 99% de identidad con la apolipoprotema A-IV, para su uso para disminuir los niveles de glucosa en sangre en un sujeto que lo necesite. La apolipoprotema A-IV, o su analogo biologicamente activo, para su uso segun la descripcion puede administrarse en una dosis de 1 a 10 |ig/g, de 0,25 a 2 |ig/g, o de aproximadamente 1 |ig/g.

Estas y otras caractensticas y ventajas de estas y otras realizaciones diversas segun la presente descripcion seran mas evidentes a la vista de los dibujos, la descripcion detallada y las reivindicaciones proporcionadas en la presentes.

Breve descripcion de los dibujos

La siguiente descripcion detallada de las realizaciones de la presente descripcion puede entenderse mejor cuando se considera junto con los siguientes dibujos, en los que estructuras similares se indican con numero de referencia

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similares, y en los que:

FIG. 1 es una vista en perspectiva lateral de un dispositivo que presenta un deposito de una composicion farmaceutica y una jeringa segun una realizacion de la presente descripcion.

FIG. 2 es una grafica de la glucosa en plasma (mg/dl) en ratones macho de tipo salvaje y con la apolipoprotema A-IV inactivada con respecto al tiempo (min) para un ensayo de tolerancia a la glucosa intraperitoneal.

FIG. 3 es una grafica de la glucosa en plasma (mg/dl) con respecto al tiempo (min) para un ensayo de tolerancia a la glucosa intraperitoneal en animales de tipo salvaje y con la apolipoprotema A-IV inactivada de 16 meses de edad.

FIG. 4 es una grafica de la glucosa en plasma (mg/dl) con respecto al tiempo (min) en ratones macho con la apolipoprotema A-IV inactivada despues de la administracion intraperitoneal de apolipoprotema A-IV recombinante (|ig/g) o disolucion salina para un ensayo de tolerancia a la glucosa intraperitoneal.

FIG. 5 es una grafica de la glucosa en plasma (mg/dl) con respecto al tiempo (min) en ratones con la apolipoprotema A-IV inactivada despues de la administracion intraperitoneal de apolipoprotema A-I recombinante o disolucion salina para un ensayo de tolerancia a la glucosa intraperitoneal.

FIG. 6 es una grafica de la secrecion de insulina (ng/ml) con respecto al tiempo (min) en ratones con la apolipoprotema A-IV inactivada despues de la administracion intraperitoneal de apolipoprotema A-I recombinante o disolucion salina.

FIG. 7 es una grafica de la glucosa en plasma (mg/ml) con respecto al tiempo (min) en ratones de tipo salvaje y con la apolipoprotema A-IV inactivada que consumen, de modo cronico, una dieta rica en grasas en un ensayo de tolerancia a la glucosa intraperitoneal.

FIG. 8 es una grafica de la glucosa en plasma (mg/ml) con respecto al tiempo (min) en ratones con la apolipoprotema A-IV inactivada que consumen, de modo cronico, una dieta rica en grasas, despues de la administracion intraperitoneal de apolipoprotema A-IV de raton recombinante (1 |ig/g) o disolucion salina para un ensayo de tolerancia a la glucosa intraperitoneal.

FIG. 9 es una grafica de la glucosa en plasma (mg/dl) con respecto al tiempo (h) en ratones diabeticos despues de la administracion intraperitoneal de apolipoprotema A-IV de raton recombinante (1 |ig/g) o disolucion salina para un ensayo de tolerancia a la glucosa intraperitoneal.

FIG. 10 muestra los resultados de un analisis de la transferencia Western del nivel del componente de protema A amiloide en suero en ratones de tipo salvaje, ratones con la apolipoprotema A-IV inactivada, y ratones con la apolipoprotema A-I inactivada.

FIG. 11 es una grafica de la glucosa en plasma (mg/dl) en ratones hembra de tipo salvaje y con la apolipoprotema A- IV inactivada con respecto al tiempo (min) durante un ensayo de tolerancia a la glucosa intraperitoneal (IPGTT).

FIG 12 es una grafica de la glucosa en plasma (mg/dl) con respecto al tiempo (min) en ratones de tipo salvaje despues de la administracion intraperitoneal de apolipoprotema A-IV humana 1,0 |ig/g o disolucion salina durante un ensayo de tolerancia a la glucosa intraperitoneal.

FIG. 13 es una grafica de la glucosa en plasma (mg/dl) con respecto al tiempo (min) en ratones hembra de tipo salvaje despues de la administracion intraperitoneal de apolipoprotema A-IV de raton recombinante 1,0 |ig/g o disolucion salina durante un ensayo de tolerancia a la glucosa intraperitoneal.

FIG. 14 es una grafica de barras que muestre el efecto de apoA-IV humana 10 |ig/g sobre islotes humanos despolarizados con KCl 30 mM y diazoxido 250 |iM en presencia de glucosa 3 mM o 20 mM.

FIG. 15 es una protema con la secuencia de aminoacidos de la apolipoprotema A-IV humana de tipo salvaje de longitud completa (SEQ ID NO:1).

FIG. 16 es una protema con la secuencia de aminoacidos de la apolipoprotema A-IV de raton de tipo salvaje de longitud completa (SEQ ID NO:2).

FIG. 17 es una protema con la secuencia de aminoacidos de la apolipoprotema A-IV humana de tipo salvaje de longitud completa con la adicion de glicina en el extremo W-terminal (SEQ ID NO:3).

FIG. 18 es una protema con la secuencia de aminoacidos de la apolipoprotema A-IV humana que muestra las sustituciones polimorficas T347S, Q360H, y/o E165K, y la adicion opcional de glicina, alanina o valina en el extremo W-terminal (SEQ ID NO:4).

FIG.19 es un polinucleotido (SEQ ID NO:5) que codifica la apolipoprotema A-IV humana de tipo salvaje de longitud completa.

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Los expertos en la tecnica apreciaran que los elementos en las figuras se ilustran para simplificar y aclarar y no estan dibujados necesariamente a escala. Por ejemplo, las dimensiones de algunos de los elementos en las figuras pueden exagerarse con relacion a otros elementos, asf como se han retirado partes convencionales para ayudar a mejorar la comprension de las diversas realizaciones de la presente descripcion.

Descripcion detallada

En la siguiente solicitud se emplean los siguientes terminos y expresiones:

Tal como se emplea en la presente, la expresion "cantidad eficaz" describe la cantidad necesaria o suficiente para realizar un efecto biologico deseado. La cantidad eficaz para cualquier aplicacion concreta puede variar dependiendo de una diversidad de factores que incluyen, pero no se limitan a la composicion concreta que se esta administrando, el tamano del sujeto y/o la gravedad de la enfermedad y/o el trastorno que se esta tratando. En una realizacion, una "cantidad eficaz" es una dosis de aproximadamente 0,25 a 10 |ig/g de una apolipoprotema A-IV, o uno de sus analogos biologicamente activos. Como alternativa, una "cantidad eficaz" de una apoA-IV, o uno de sus analogos biologicamente activos, es de aproximadamente 1 a 10 |ig/g, de aproximadamente 0,25 a 2 |ig/g, o de aproximadamente 1 |ig/g. Una apoA-IV, o un analogo biologicamente activo, se administra una vez diaria. Como alternativa, una apoA-IV, o uno de sus analogos biologicamente activos, se administra aproximadamente 2 veces diarias. En otra alternativa, una apoA-IV, o uno de sus analogos biologicamente activos, se administra mas de dos veces diarias, por ejemplo, tres veces diarias. En otra alternativa, la apoA-IV se administra una vez cada segundo, tercer, cuarto, quinto o sexto dfa, o una vez semanal.

Tal como se emplea en la presente, la expresion "efecto biologico deseado" indica reducir los efectos, contrarrestar y/o eliminar una enfermedad o un trastorno. Por ejemplo, en el contexto de la T2DM, los efectos biologicos deseados incluyen, pero no se limitan a disminuir la glucosa en sangre, mejorar la tolerancia a la glucosa, restablecer sustancialmente la tolerancia a la glucosa hasta un nivel normal, mejorar la secrecion de insulina y/o restablecer sustancialmente la secrecion de insulina hasta un nivel normal.

Tal como se emplea en la presente, la expresion "nivel normal" describe un nivel que es sustancialmente el mismo nivel que aparecen en un sujeto que no necesita tratamiento. Por ejemplo, en el contexto del tratamiento de la T2DM, un nivel normal de glucosa en sangre es de aproximadamente 70 mg/dl a aproximadamente 130 mg/dl antes de las comidas y menor que aproximadamente 180 mg/dl aproximadamente una o dos horas despues de las comidas, o de aproximadamente 70 mg/dl a aproximadamente 100 mg/dl antes de las comidas y menor que aproximadamente 140 mg/dl aproximadamente una o dos horas despues de las comidas. En otro ejemplo, en el contexto del tratamiento de la T2DM, un nivel normal de tolerancia a la glucosa describe la capacidad del sujeto para metabolizar carbohidratos, de modo que el nivel de la glucosa en sangre es de aproximadamente 70 mg/dl a aproximadamente 130 mg/dl antes de las comidas y menor que aproximadamente 180 mg/dl aproximadamente una o dos horas despues de las comidas, o de aproximadamente 70 mg/dl a aproximadamente 100 mg/dl antes de las comidas y menor que aproximadamente 140 mg/dl aproximadamente una o dos horas despues de las comidas. En otro ejemplo, en el contexto del tratamiento de la T2DM, un nivel normal de secrecion de insulina es la cantidad requerida para mantener un nivel normal de tolerancia a la glucosa, en el que el nivel de secrecion de insulina es mayor que aproximadamente 1 ng/ml aproximadamente quince horas despues de las comidas.

En el contexto del nivel de glucosa en sangre, el termino "restablecer" describe el cambio del nivel de glucosa en sangre de un sujeto hasta un nivel normal. De modo similar, en el contexto de la tolerancia a la glucosa, el termino "restablecer" describe el cambio de la tolerancia a la glucosa de un sujeto hasta un nivel normal. Ademas, en el contexto de la secrecion de insulina, "restablecer" describe el cambio de la secrecion de insulina de un sujeto hasta un nivel normal.

En el contexto de la apolipoprotema A-IV, la expresion "fragmento biologicamente activo" describe un fragmento de la apolipoprotema A-IV que es capaz de realizar un efecto biologico deseado en un sujeto con T2DM. La expresion "analogo biologicamente activo" describe un analogo de una apolipoprotema A-IV que es capaz de realizar un efecto biologico deseado en un sujeto con T2DM. En un ejemplo, un efecto biologico deseado es restablecer la tolerancia a la glucosa en ratones con apoA-IV inactivada, segun se describe en el 2. Otro ejemplo de un efecto biologico deseado es provocar una disminucion estadfsticamente significativa de los niveles anomalos de glucosa en un modelo animal de T2DM, tal como el modelo de raton descrito en el ejemplo 7.

Tal como se emplea en la presente, el termino "obeso" describe un trastorno en el que un sujeto tiene un peso muy por encima del peso normal. En un ejemplo espedfico, el termino "obeso" describe un trastorno en el que un sujeto tiene un peso de mas de aproximadamente 20% por encima de su peso ideal y/o presenta un mdice de masa corporal de aproximadamente treinta o mas de aproximadamente treinta. En otra realizacion, el sujeto que se esta tratando esta obeso; en otra realizacion, el sujeto que se esta tratando no esta obeso; y en otra realizacion, el sujeto que se esta tratando tiene un peso corporal normal.

Las realizaciones de la presente descripcion se refieren a compuestos para su uso para tratar la T2DM en un sujeto que lo necesite, y composiciones farmaceuticas para su uso para tratar la T2DM.

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En una realizacion, se describen compuestos y composiciones para su uso para tratar la diabetes. En una realizacion concreta, se describe una apolipoprotema A-IV (en lo sucesivo "apoA-IV"), o uno de sus analogos biologicamente activos, para su uso para tratar la T2DM en un sujeto que lo necesite.

En una realizacion, los compuestos y las composiciones son eficaces para disminuir el nivel de glucosa en sangre en un sujeto. En un ejemplo concreto, los compuestos son eficaces para disminuir el nivel de glucosa en sangre en un sujeto en aproximadamente 20 al 50%. En otro ejemplo, los compuestos son eficaces para disminuir el nivel de glucosa en sangre en un sujeto en aproximadamente 40%. En otro ejemplo, los compuestos son eficaces para restablecer sustancialmente el nivel de glucosa en sangre hasta un nivel normal.

En otra realizacion, los compuestos y las composiciones para su uso para tratar la T2DM son eficaces para restablecer sustancialmente la tolerancia a la glucosa de un sujeto hasta un nivel normal. En un ejemplo concreto, los compuestos y las composiciones restablecen sustancialmente la tolerancia a la glucosa de un sujeto hasta un nivel normal dentro de aproximadamente dos horas despues de la administracion de una dosis de una apoA-IV, o uno de sus analogos biologicamente activos. En otro ejemplo, la tolerancia a la glucosa de un sujeto se restablece sustancialmente hasta un nivel normal durante aproximadamente ocho a doce horas.

En otro ejemplo, los compuestos y las composiciones son eficaces para restablecer sustancialmente la secrecion de insulina hasta un nivel normal. En un ejemplo concreto, el tratamiento es eficaz para restablecer sustancialmente la secrecion de insulina hasta un nivel normal dentro de aproximadamente dos horas despues de la administracion de una dosis de una apoA-IV, o uno de sus analogos biologicamente activos. En otro ejemplo, la secrecion de insulina se restablece sustancialmente hasta un nivel normal durante aproximadamente ocho a doce horas. En otro ejemplo, el tratamiento es eficaz para disminuir el nivel de protema C reactiva.

En una realizacion, una apoA-IV, o uno de sus analogos biologicamente activos, se administra de modo sistemico. La administracion sistemica de la apoA-IV, o de uno de sus analogos, se selecciona del grupo que consiste en la administracion oral, subcutanea, intravenosa, intramuscular e intraperitoneal.

En otra realizacion, se describe una composicion farmaceutica. En una realizacion concreta, la composicion farmaceutica comprende una apoA-IV, o uno de sus analogos biologicamente activos. En otra realizacion, la apoA- IV, o uno de sus analogos, se formula para la administracion a un sujeto para el tratamiento de la T2DM. En esta realizacion concreta, el tratamiento comprende administrar una cantidad eficaz de la composicion farmaceutica al sujeto.

Una "apolipoprotema A-IV" (tambien denominada en la presente "apoA-IV") se refiere a una apoA-IV de mairnfero e incluye la apoA-IV de longitud completa y los fragmentos biologicamente activos de apoA-IV. La apoA-IV humana de longitud completa es una protema de 376 aminoacidos (SEQ ID NO:1), cuya secuencia de aminoacidos se muestra en FIG. 15; la secuencia de aminoacidos de la apoA-IV de raton de longitud completa (SEQ ID NO:2) se muestra en FIG. 16. La expresion "apolipoprotema A-IV" tambien incluye el analogo conocido en el que se anade una glicina al extremo W-terminal de la apolipoprotema A-IV de la secuencia humana de longitud completa (SEQ ID NO:3, tal como se muestra en FIG. 17), y sus analogos que presentan sustituciones conservativas para la glicina W-terminal (tal como alanina y valina). Una "apolipoprotema A-IV" tambien incluye sus formas polimorficas, que incluyen las sustituciones T347S, Q360H, o E165K en la secuencia humana representada por SEQ ID NO:1, o las correspondientes posiciones de SEQ ID NO:3. Asf, "apolipoprotema A-IV" incluye la protema de SEQ ID NO:4, mostrada en FIG. 18.

Un analogo biologicamente activo de la apolipoprotema A-IV tiene al menos 90, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con una apolipoprotema A-IV. Tal como se ha descrito en el parrafo anterior, una apolipoprotema A-IV incluye la apolipoprotema A-IV de mamffero de longitud completa (por ejemplo, humana o de mamffero), sus formas polimorficas, las protemas de SEQ ID NO:3 y 4, y los fragmentos biologicamente activos de cualquiera de las anteriores. Las variaciones en los aminoacidos de los analogos biologicamente activos seran preferiblemente sustituciones conservativas con relacion a las secuencias de tipo salvaje. Una "sustitucion conservativa" es la sustitucion de un aminoacido por otro aminoacido que tiene la misma carga electronica neta y aproximadamente el mismo tamano y forma. Los restos aminoacidos con cadenas laterales de aminoacidos alifaticas o alifaticas sustituidas tienen aproximadamente el mismo tamano cuando el numero total de carbonos y heteroatomos en sus cadenas laterales se diferencia en no mas de aproximadamente cuatro. Tienen aproximadamente la misma forma cuando el numero de ramificaciones en sus cadenas laterales se diferencia en no mas de una. Se consideran que los restos aminoacidos con grupos fenilo o fenilo sustituido en sus cadenas laterales tienen aproximadamente el mismo tamano y forma. A continuacion, se listan cinco grupos de aminoacidos. La sustitucion de un resto aminoacido por otro resto aminoacido del mismo grupo produce una sustitucion conservativa:

Grupo I: glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, cistema, y aminoacidos no naturales con cadenas laterales alifaticas C1-C4 o alifaticas C1-C4 sustituidas con hidroxilo (de cadena lineal o monorramificadas).

Grupo II: acido glutamico, acido aspartico y aminoacidos no naturales con cadenas laterales alifaticas C1-C4 sustituidas con carboxilo (no ramificadas o un punto de ramificacion).

Grupo III: lisina, ornitina, arginina y aminoacidos no naturales con cadenas laterales alifaticas C1-C4 sustituidas con

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amina o guanidino (no ramificadas o un punto de ramificacion).

Grupo IV: glutamina, asparagina y aminoacidos no naturales con cadenas laterales alifaticas C1-C4 sustituidas con amida (no ramificadas o un punto de ramificacion).

Grupo V: fenilalanina, fenilglicina, tirosina y triptofano.

Una apolipoprotema A-IV, o uno de sus analogos biologicamente activos, puede estar glicosilada o no glicosilada. La preparacion de apolipoprotemas A-IV de raton y humanas no glicosiladas recombinantes se describe en el ejemplo 11. La secuencia polinucleotfdica de la apolipoprotema humana de tipo salvaje de longitud completa (SEQ ID NO:1) se muestra como SEQ ID NO:4 en la figura 18. La apolipoprotema A-IV empleada en los ejemplos 1-10 no esta glicosilada. La apoA-IV puede prepararse segun un metodo conocido en el campo de la biologfa molecular. Por ejemplo, la apoA-IV puede prepararse por medio de tecnicas de clonacion moleculares tradicionales.

Los ratones con apolipoprotema A-IV inactivada utilizados en los ejemplos se generaron segun los procedimientos descritos en J. Lipid Res., septiembre de 1997, 38(9):1782-94.

En una realizacion concreta, la composicion farmaceutica puede comprender ademas un vehmulo farmaceuticamente aceptable. Los vehmulos farmaceuticamente aceptables incluyen una amplia gama de diluyentes conocidos (es decir, disolventes), cargas, agentes extensores, ligantes, agentes suspensores, disgregantes, tensioactivos, lubricantes, excipientes, agentes humectantes y similares, que se emplean habitualmente en este campo. La composicion farmaceutica es preferiblemente acuosa, es decir, es una formulacion lfquida, y preferiblemente comprende agua apirogena. Estos vehmulos pueden emplearse por sf solos o en combinacion, segun la forma de la preparacion farmaceutica. La preparacion resultante puede incorporar, si es necesario, uno o mas agentes solubilizantes, tampones, conservantes, colorantes, perfumes, aromatizantes y similares, que se emplean con profusion en el campo de las preparaciones farmaceuticas.

La apolipoprotema A-IV, o uno de sus analogos biologicamente activos, puede formularse en una forma de dosificacion seleccionada del grupo que consiste en comprimidos, capsulas, granulos, pfldoras, inyecciones, disoluciones, emulsiones, suspensiones y jarabes. La forma y la via de administracion para la composicion farmaceutica no estan limitadas y pueden seleccionarse de modo adecuado. Por ejemplo, los comprimidos, las capsulas, los granulos, las pfldoras, los jarabes, las disoluciones, las emulsiones y las suspensiones pueden administrarse por via oral. Ademas, pueden administrarse inyecciones (por ejemplo, subcutaneas, intravenosas, intramusculares e intraperitoneales) por via intravenosa solas o en combinacion con un reconstituyente convencional que contenga glucosa, aminoacidos y/o similares, o pueden administrarse solas por via intramuscular, intracutanea, subcutanea y/o intraperitoneal.

La composicion farmaceutica de la invencion para tratar la T2DM puede prepararse segun un metodo conocido en la tecnica farmaceutica de esta tipo, empleando un vehmulo farmaceuticamente aceptable. Por ejemplo, las formas orales, tales como comprimidos, capsulas, granulos, pfldoras y similares, se preparan segun metodos conocidos empleando excipientes tales como sacarosa, lactosa, glucosa, almidon, manitol y similares; ligantes, tales como jarabe, goma arabiga, sorbitol, tragacanto, metilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares; disgregantes, tales como almidon, carboximetilcelulosa o su sal de calcio, celulosa microcristalina, polietilenglicol y similares; lubricantes, tales como talco, estearato de magnesio, estearato de calcio, sflice y similares; y agentes humectantes, tales como laurato de sodio, glicerol y similares.

Pueden prepararse inyecciones, disoluciones, emulsiones, suspensiones, jarabes y similares segun un metodo conocido y de modo adecuado empleando disolventes para disolver el ingrediente activo, tales como alcohol etilico, alcohol isopropflico, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, polietilenglicol, aceite de sesamo y similares; tensioactivos, tales como ester de acido graso de sorbitano, ester de acido graso de polioxietilensorbitano, ester de acido graso de polioxietileno, polioxietileno de aceite de ricino hidrogenado, lecitina y similares; agentes suspensores, tales como derivados de celulosa que incluyen carboximetilcelulosa sodio, metilcelulosa y similares, gomas naturales, que incluyen tragacanto, goma arabiga y similares; y conservantes, tales como esteres del acido parahidroxibenzoico, cloruro de benzalconio, sales del acido sorbico y similares.

La proporcion del ingrediente activo que va a contener la composicion farmaceutica de la invencion para tratar la diabetes puede seleccionarse, de modo adecuado, de un amplio intervalo.

En una realizacion concretar, el sujeto que necesita tratamiento para la T2DM es un mairnfero. El mamffero puede seleccionarse del grupo que consiste en seres humanos, primates no humanos, caninos, felinos, murinos, bovinos, equinos, porcinos, y lagomorfos. En una realizacion concreta, el mamffero es un ser humano. En otra realizacion, la apoA-IV, o uno de sus analogos biologicamente activos, puede administrarse a un sujeto para el tratamiento de la T2DM, en el que el sujeto esta obeso. Como alternativa, la apoA-IV puede administrarse a un sujeto para el tratamiento de la T2DM, en el que el sujeto no esta obeso.

Remitiendose a FIG. 1, se describe un dispositivo 1. El dispositivo 1 comprende un deposito 10 de la composicion farmaceutica previamente analizada. El deposito 10 comprende un vial 12. El vial 12 puede estar formado de cualquier material que no inhiba la funcion de la composicion farmaceutica. Por ejemplo, el vial 12 puede

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comprender vidrio y/o plastico. Ademas, el vial 12 puede comprender un septo 14 que puede ser atravesado con una aguja, a traves del cual puede retirarse la composicion farmaceutica. Durante el uso, el septo 14 del vial es atravesado por la aguja 22 de una jeringa 20, la composicion farmaceutica se retira por medio de la jeringa 20 del vial 12, y la composicion farmaceutica se administra mediante inyeccion a un sujeto que lo necesite.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos no limitantes ilustran las composiciones de la presente descripcion y la forma en que pueden utilizarse.

Ejemplo 1: Intolerancia a la glucosa de ratones con ApoA-IV inactivada

Protocolo experimental. Se obtuvieron ratones macho con apoA-IV inactivada ("knockout", en lo sucesivo "KO"). Ratones de tipo salvaje ("wild-type", en lo sucesivo "WT") actuaron como controles. Los ratones ApoA-IV KO y WT se obtuvieron de una colonia mantenida en University of Cincinnati (Cincinnati, OH). Los ratones ApoA-IV KO y WT fueron alimentados con una dieta de pienso. Antes de realizar los ensayos de tolerancia a la glucosa, los ratones ApoA-IV KO y los ratones WT se dejaron en ayunas durante cinco horas. En los ensayos de tolerancia a la glucosa, los ratones apoA-IV KO y los ratones WT recibieron una inyeccion por via intraperitoneal con una dosis de aproximadamente 2 mg/g de peso corporal de glucosa, y se midio la glucosa en plasma aproximadamente 0, 15, 30, 60, y 120 minutos despues de la inyeccion de glucosa. Los ensayos de tolerancia a la glucosa se realizaron dos veces, una vez a los tres meses de edad y, de nuevo, a los dieciseis meses de edad.

Resultados experimentales. Tal como se muestra en FIG. 2, ratones apoA-IV KO son intolerantes a la glucosa con relacion a los ratones WT. De modo espedfico, FIG. 2 demuestra que los niveles de glucosa en plasma en ratones WT fueron mas bajos que los niveles de glucosa en plasma en ratones apoA-IV KO durante dos horas despues de la inyeccion intraperitoneal de glucosa. Aunque no se pretenda limitacion alguna por la teona, la implicacion de estos estudios es que la apoA-IV es necesaria para la homeostasis normal de la glucosa (al menos en machos). Ademas, tal como se muestra en FIG. 3, los ratones apoA-IV KO mostraron una mayor intolerancia a la glucosa cuando se ensayan a los dieciseis meses de edad. De modo espedfico, FIG. 3 demuestra que los niveles de glucosa en plasma en ratones apoA-IV KO ensayados a los dieciseis meses de edad fueron mayores que los niveles de glucosa en plasma en ratones apoA-IV KO ensayados a los tres meses de edad. Aunque no se pretenda limitacion alguna por la teona, la implicacion de estos estudios es que la tolerancia a la glucosa de ratones apoA-IV KO empeora con la edad.

Experimento con ratones hembra de tipo salvaje y con ApoA-IV inactivada

Ratones hembra de tipo salvaje y con ApoA-IV inactivada fueron sometidos al mismo ensayo de intolerancia a la glucosa intraperitoneal que el empleado para los ratones macho apoA-IV KO y WT, tal como se describio anteriormente en este ejemplo 1. Los resultados se muestran en la figura 11. Los ratones hembra apoA-IV -/-, cuando se exponen por via intraperitoneal a la glucosa, presentan unos mayores niveles de glucosa en plasma, comparado con los animales hembra WT, pero las diferencias no fueron significativas. Por otra parte, los machos sf presentan una diferencia significativa entre los animales WT y KO.

Ejemplo 2: Restablecimiento de la tolerancia a la glucosa en ratones con ApoA-IV inactivada

Protocolo experimental. Tras demostrar que los ratones apoA-IV KO son intolerantes a la glucosa, se realizaron una serie de estudios en profundidad para determinar si la administracion de apoA-IV a ratones apoA-IV KO restablecena la tolerancia a la glucosa hasta un nivel normal. De modo espedfico, se realizaron una serie de estudios para determinar no solo la cantidad de apoAIV que se va a administrar, sino tambien el momento optimo en el que administrar la apoA-IV antes de realizar los ensayos de tolerancia a la glucosa.

Ratones macho ApoA-IV KO recibieron una inyeccion por via intraperitoneal con unas dosis de aproximadamente 0,25, 0,5, 1, y 2 |ig/g en peso de apoA-IV. Los ratones ApoA-IV KO tambien recibieron una inyeccion por via intraperitoneal de disolucion salina como control. Despues de la inyeccion de apoA-IV de raton o disolucion salina, se realizaron los ensayos de tolerancia a la glucosa en los ratones de tres meses de edad, tal como se analizo previamente. De modo espedfico, los ensayos de tolerancia a la glucosa se realizaron aproximadamente dos horas despues de la inyeccion de apoA-IV o disolucion salina. Los resultados experimentales indican que el momento optimo para restablecer la tolerancia a la glucosa en ratones apoA-IV KO resulta ser cuando se administra apoA-IV aproximadamente dos horas antes de realizar los ensayos de tolerancia a la glucosa.

Resultados experimentales. Tal como se muestra en FIG. 4, la administracion de apoA-IV a ratones apoA-IV KO restablece la tolerancia a la glucosa hasta un nivel normal. De modo espedfico, FIG. 4 demuestra que los niveles de glucosa en plasma en ratones apoA-IV KO que recibieron una inyeccion de apoA-IV fueron menores que los niveles de glucosa en plasma en ratones apoA-IV Ko que recibieron una inyeccion de disolucion salina. Ademas, tal como se muestra en FIG. 4, los niveles de glucosa en plasma en ratones apoA-IV KO que recibieron una inyeccion de apoA-IV fueron los mas bajos en los ratones apoA-IV KO inyectados con la dosis mas alta de apoA-IV; de modo similar, los niveles de glucosa en plasma en ratones apoA-IV KO que recibieron una inyeccion de apoA-IV fueron los mas altos en los ratones apoA-IV KO inyectados con la dosificacion mas baja de apoA-IV. Por consiguiente, se

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descubrio que el grado de mejona de la tolerancia a la glucosa depende de la dosis de apoA-IV administrada y, cuando se administran las dosis mas altas, se consigue una tolerancia a la glucosa mejorada.

Ejemplo 3: Especificidad de la ApoA-IV para restablecer la tolerancia a la glucosa en ratones con ApoA-IV inactivada

Protocolo experimental. Para evaluar la especificidad de la apoA-IV, se administro apolipoprotema AI (en lo sucesivo "apoA-I") a ratones apoA-IV KO. La ApoA-I es una protema fabricada por las celulas epiteliales del intestino delgado que tambien producen apoA-IV. La ApoA-I comparte muchas de las funciones de la apoA-IV. Ratones ApoA-IV KO recibieron una inyeccion por via intraperitoneal con una dosis de 1 |ig/g en peso de apoA-I. Ratones ApoA-IV KO tambien recibieron una inyeccion por via intraperitoneal de disolucion salina como control. Despues de la inyeccion de apoA-I o disolucion salina, se realizaron los ensayos de tolerancia a la glucosa en los ratones de tres meses de edad, tal como se analizo previamente. De modo espedfico, los ensayos de tolerancia a la glucosa se realizaron aproximadamente dos horas despues de la inyeccion de apoA-I o disolucion salina.

Resultados experimentales. Tal como se muestra en FIG. 5, la administracion de apoA-I a ratones apoA-IV KO no restablece ni mejora la tolerancia a la glucosa.

Ejemplo 4: Mecanismo de restablecimiento de la tolerancia a la glucosa en ratones con ApoA-IV inactivada

Protocolo experimental. Para evaluar el mecanismo mediante el cual la ApoA-IV mejora la tolerancia a la glucosa en ratones apoA-IV KO, se midio la secrecion de insulina inducida por glucosa en ratones apoA-IV KO. De modo mas espedfico, se midio la secrecion de insulina inducida por glucosa durante los ensayos de tolerancia a la glucosa en ratones de tres meses de edad, tal como se analizo previamente. En este estudio, ratones apoA-IV KO recibieron una inyeccion por via intraperitoneal con una dosis de aproximadamente 1 |ig/g en peso de apoA-IV de raton dos horas antes de realizar los ensayos de tolerancia a la glucosa. Ratones ApoA-IV KO recibieron una inyeccion de disolucion salina aproximadamente dos horas antes de realizar los ensayos de tolerancia a la glucosa como control.

Resultados experimentales. Tal como se muestra en FIG. 6, la fase I de secrecion de insulina no aparecio en ratones apoA-IV KO que recibieron una inyeccion de disolucion salina. Sin embargo, tal como se muestra en FIG. 6, la fase I de secrecion de insulina fue restablecida en ratones apoA-IV KO cuando se inyecto por via intraperitoneal apoA-IV dos horas antes de realizar los ensayos de tolerancia a la glucosa.

Ejemplo 5: Eficacia de la ApoA-IV en ratones con ApoA-IV inactivada y de tipo salvaje que consumen dietas ricas en grasas

Protocolo experimental. Ratones ApoA-IV KO y WT fueron alimentados de forma cronica con dietas experimentales nutricionalmente completas semipurificadas ricas en grasas (AIN-93M) obtenidas en Dyets (Bethlehem, PA) durante 10 semanas. Las dietas de alto contenido en grasas contema aproximadamente 20 g de grasas (de modo concreto, aproximadamente 19 g de grasa de mantequilla y 1 g de aceite de soja para proporcionar los acidos grasos esenciales) por 100 g de dieta. Los ratones apoA-IV KO y WT fueron alojados en jaulas de tubo individuales con un lecho de mazorcas de mafz en un vivario con temperatura (aproximadamente 22 + 1°C) e iluminacion (aproximadamente 12 h de luz/12 de oscuridad) controladas. Los ensayos de tolerancia a la glucosa se realizaron en los ratones de tres meses de edad, tal como se analizo previamente. Antes de realizar los ensayos de tolerancia a la glucosa, los ratones ApoA-IV KO y los ratones WT se dejaron en ayunas durante cinco horas. En los ensayos de tolerancia a la glucosa, los ratones apoA-IV KO y los ratones WT recibieron una inyeccion por via intraperitoneal con una dosis de aproximadamente 2 mg/g de peso corporal de glucosa

Resultados experimentales. Tal como se muestra en FIG. 7, los ratones apoA-IV KO mostraron mayor intolerancia a la glucosa, con relacion a los ratones WT. De modo espedfico, FIG. 7 demuestra que los niveles de glucosa en plasma en ratones WT fueron mas bajos que los niveles de glucosa en plasma en ratones apoA-IV KO durante dos horas despues de la inyeccion intraperitoneal de glucosa.

Ejemplo 6: Restablecimiento de la tolerancia a la glucosa en ratones con ApoA-IV inactivada y ratones de tipo salvaje que consumen dietas ricas en grasas

Protocolo experimental. Se realizaron una serie de estudios relacionados con la administracion de apoA-IV a ratones apoA-IV KO y WT que consumen dietas ricas en grasas durante 14 semanas a los tres meses de edad (20% en peso de grasa, 19% de grasa de mantequilla, y 1% de aceite de cartamo). De modo espedfico, ratones apoA-IV KO y WT recibieron una inyeccion por via intraperitoneal con una dosis de aproximadamente 1 |ig/g de peso corporal de apoA-IV de raton. Los ratones ApoA-IV KO y WT tambien recibieron una inyeccion por via intraperitoneal de disolucion salina como control. Despues de la inyeccion de apoA-IV o disolucion salina, se realizaron los ensayos de tolerancia a la glucosa. De modo espedfico, los ensayos de tolerancia a la glucosa se realizaron aproximadamente dos horas despues de la inyeccion de apoA-IV o disolucion salina.

Resultados experimentales. Tal como se muestra en FIG. 8, la administracion de apoA-IV a ratones apoA-IV KO mejoro significativamente la tolerancia a la glucosa. De modo espedfico, FIG. 8 demuestra que los niveles de glucosa en plasma en ratones apoA-IV KO que recibieron una inyeccion de apoA-IV fueron mas bajos que los niveles de glucosa en plasma en ratones apoA-IV KO que recibieron una inyeccion de disolucion salina [la frase

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anterior es redundante, puesto que la siguiente frase describe lo mismo]. Aunque no se incluyen los datos en la presente, tambien se descubrio que la administracion de apoA-IV a ratones WT que consumen, de modo cronico, una dieta rica en grasas, tambien mejora significativamente la tolerancia a la glucosa.

Ejemplo 7: Restablecimiento de la tolerancia a la glucosa en ratones con T2DM

Protocolo experimental. Para confirmar que la apoA-IV es eficaz para estimular la tolerancia a la glucosa en animales con T2DM, se obtuvieron ratones heterocigoticos KK Cg-A/J (en lo sucesivo "Cg-A/J") de Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine). Los ratones Cg-A/J desarrollan hiperglucemia, hiperinsulinemia, obesidad e intolerancia a la glucosa a las ocho semanas de edad. La principal causa de la diabetes en estos ratones es la resistencia a la insulina producida por las interacciones poligenicas con la mutacion Ay, que codifica la protema relacionada con el agutf y antagonista del receptor de melanocortina-IV. Los ratones Cg-A/J recibieron una dieta de pienso. Ademas, se produjo un notable aumento en la glucosa en sangre desde las diez hasta las catorce semanas de ser alimentados con dieta de pienso.

A las catorce semanas de edad, los ratones Cg-A/J recibieron apoA-IV de raton (aproximadamente 1 |ig/g de peso corporal) o disolucion salina (como control) por medio de una inyeccion intraperitoneal. Despues se determino la glucosa en plasma a aproximadamente 0, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 11, y 24 horas.

Resultados experimentales. Tal como se muestra en FIG. 9, la apoA-IV produce un efecto notable en la disminucion del nivel de azucar en sangre en ratones Cg-A/J, con relacion al control de disolucion salina. Aunque los ratones Cg- A/J que recibieron una inyeccion de disolucion salina mantuvieron un nivel de glucosa en plasma constante a lo largo de las 24 horas del periodo de estudio, los ratones Cg-A/J que recibieron una inyeccion de apoA-IV experimentaron una disminucion de la glucosa en plasma durante mas de 10 horas y, durante la mayor parte de este periodo, el nivel de glucosa en plasma fue comparable con el de los animales C57BL/6J que los inventores habfan estado estudiando. A partir de este estudio, se concluyo que la administracion de apoA-IV es eficaz para disminuir la glucosa en plasma en ratones Cg-A/J.

Ejemplo 8: Nivel de componente P amiloide en suero en ratones ApoA-IV KO, ApoA-I KO, y WT

Protocolo experimental. Se realizaron una serie de estudio para determinar el nivel del componente de protema A amiloide en suero A (en lo sucesivo "SAP") en ratones apoA-IV KO, apoA-I KO, y WT con dietas aterogenicas. Los ratones apoA-IV KO, apoA-I KO, y WT se obtuvieron en the University of Cincinnati. El SAP es una forma serica del componente P amiloide (en lo sucesivo "AP"), una protema pentamera de 25 kDa que se identifico por primera vez como el constituyente pentagonal de depositos patologicos in vivo denominados amiloides. El SAP se comporta como una protema C reactiva en seres humanos. De modo espedfico, se determino el nivel de SAP en plasma en ratones apoA-IV KO, apoA-I KO, y WT en ratones apoA-IV KO, apoA-I KO, y WT despues de 12 semanas de dieta aterogenica. El nivel de SAP en plasma se determino mediante un analisis de la transferencia Western.

Resultados experimentales. Tal como se muestra en FIG. 10, el nivel de SAP en ratones apoA-IV KO (que se corresponde con los ratones numero 1, 8, y 10) aumenta con relacion al nivel de SAP en ratones apoA-I KO (que se corresponde con los ratones numero 28, 29, y 30) y ratones WT (que se corresponde con los ratones numero 19, 20, y 25).

Con el fin de describir y definir la presente descripcion, se hace notar que los terminos "aproximadamente" y "sustancialmente" se emplean en la presente para representar el grado inherente de incertidumbre que puede atribuirse a cualquier comparacion cuantitativa, valor, medicion u otra representacion. Los terminos "aproximadamente" y "sustancialmente" tambien se emplean en la presente para representar el grado en que una representacion cuantitativa puede variar con respecto a una referencia mencionada sin que se produzca un cambio en la funcion basica del asunto en cuestion.

La anterior descripcion y los dibujos solo deben considerarse ilustrativos de ejemplos de realizaciones, que llevan a cabo las caractensticas y las ventajas de la presente descripcion. Pueden realizarse modificaciones y sustituciones en las caractensticas y las etapas descritas sin apartarse de la intencion y el alcance de la presente descripcion. Por consiguiente, no debe considerarse que la descripcion esta limitada a la anterior descripcion y a los dibujos, sino que solo esta limitada por el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplo 8: La ApoA-IV humana disminuye los niveles de glucosa en sangre en ratones de tipo salvaje sometidos a un ensayo de tolerancia a la glucosa intraperitoneal

Protocolo experimental. Se realizaron estudios para determinar si la administracion de apoA-IV humana a ratones de tipo salvaje afectana a los niveles de glucosa en sangre en ratones sometidos a un ensayo de tolerancia a la glucosa.

Ratones de tipo salvaje de tres meses de edad recibieron una inyeccion por via intraperitoneal con unas dosis de aproximadamente 1 |ig/g en peso de apoA-IV humana. Como control, otro grupo de ratones de tipo salvaje recibio una inyeccion por via intraperitoneal de disolucion salina. Despues de la inyeccion de apoA-IV humana o disolucion salina, se realizaron los ensayos de tolerancia a la glucosa. De modo espedfico, los ensayos de tolerancia a la

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glucosa se realizaron aproximadamente dos horas despues de la inyeccion de apoA-IV o disolucion salina y despues de cinco horas de ayuno. Se recolecto sangre de la cola y se midio con un glucometro.

Resultados experimentales. Tal como se muestra en la figura 12, la apoA-IV humana resulto eficaz para disminuir la glucosa en sangre en ratones de tipo salvaje sometidos a un ensayo de tolerancia a la glucosa.

Ejemplo 9: Efecto de la ApoA-IV de raton en ratones hembra de tipo salvaje sometidos a un ensayo de tolerancia a la glucosa intraperitoneal

Protocolo experimental. Se realizaron estudios para determinar si la administracion de apoA-IV de raton a ratones hembra de tipo salvaje afectana a los niveles de glucosa en sangre en ratones sometidos a un ensayo de tolerancia a la glucosa.

Ratones hembra de tipo salvaje de tres meses de edad recibieron una inyeccion por via intraperitoneal con unas dosis de aproximadamente 1 |ig/g en peso de apoA-IV de raton. Como control, otro grupo de ratones hembra de tipo salvaje recibio una inyeccion por via intraperitoneal de disolucion salina. Despues de la inyeccion de apoA-IV humana o disolucion salina, se realizaron los ensayos de tolerancia a la glucosa. De modo espedfico, los ensayos de tolerancia a la glucosa se realizaron aproximadamente dos horas despues de la inyeccion de apoA-IV o disolucion salina y despues de cinco horas de ayuno. Se recolecto sangre de la cola y se midio con un glucometro.

Resultados experimentales. Tal como se muestra en la figura 13, la apoA-IV de raton resulto eficaz para disminuir la glucosa en sangre en ratones hembra de tipo salvaje sometidos a un ensayo de tolerancia a la glucosa.

Ejemplo 10: La ApoA-IV humana estimula la liberacion de insulina en islotes humanos

Los islotes humanos de alta pureza fueron suministrados por University of Virginia, Axon Cells. Los islotes se cultivaron en RPMI 1640, que contema FBS al 10% y glucosa 11 mM a 37°C en una atmosfera humidificada de 95% de aire y 5% de CO2 durante 48 horas. Despues se preincubaron cuatro grupos de islotes 50 IEQ a 37°C durante 1 h en KRB normal (NaCl 129 mM, KCl 4,8 mM, CaCh 2,5 mM, MgSO4 1,2 mM, KH2PO4 1,2 mM, NaHCOa 5 mM, HEPES 10 mM y BSA al 0,2%) que contema glucosa 3,0 mM. Los islotes en los dos primeros grupos despues se incubaron en kRb normal que contema glucosa 3,0 mM durante una hora en presencia o en ausencia de A-IV humana 10 |ig/ml y despues se incubaron con glucosa 20 mM durante una hora mas en presencia o en ausencia de A-IV humana 10 |ig/ml. Los islotes en los dos ultimos grupos se incubaron en KRB KCl 30mM (NaCl 103,8 mM, KCl 30 mM, CaCl2 2,5 mM, MgSO4 1,2 mM, KH2PO4 1,2 mM, NaHCOa 5 mM, HEPES 10 mM y BSA al 0,2%) mas diazoxido 250 |imol/l que contema glucosa 3,0 mM durante una hora en presencia o en ausencia de A-IV humana 10 |ig/ml y despues se incubaron con glucosa 20 mM durante una hora mas en presencia o en ausencia de A-IV humana 10 |ig/ml. Los medios se recolectaron al final de cada incubacion de una hora. Los niveles de insulina se midieron con un kit de ELISA (Millipore).

Tal como puede observarse en FIG. 14, cuando los islotes humanos fueron maximamente despolarizados por KCl 30 mM mas diazoxido 250 |iM, la hA-IV 10 |ig/ml mostro un significativo efecto estimulante sobre la secrecion de insulina.

Ejemplo 11: Preparacion de ApoA-IV no glicosilada

Se introdujo el ADNc de apoA-IV humana y de raton en un vector de mantenimiento pSP65, y se introdujo un sitio de restriccion Afl III inmediatamente 5' de la secuencia codificadora para la protema de apoA-IV madura. El gen se extrajo del vector de mantenimiento y se acoplo en el vector de expresion pET30. La construccion se transfecto en celulas de E. coli BL-21 (DE3) y se cultivo en cultivos Luria-Bertani suplementados con kanamicina (30 |ig/ml) a 37°C. Despues de la induccion de la smtesis de la protema de apoA-IV en las celulas, las celulas se recolectaron y se sonicaron. La protema de ApoA-IV del lisado se purifico mediante una cromatograffa en columna de afinidad de union a His y dialisis. La protema de apoA-IV resultante se diluyo hasta una concentracion final de 1,0 mg/ml en disolucion salina.

Claims

REIVINDICACIONES

1. - Una apolipoprotema A-IV, o uno de sus analogos biologicamente activos, que tiene al menos 90% de identidad con la apolipoprotema A-IV, para su uso para tratar la diabetes mellitus de tipo II en un sujeto.
2. - Una apolipoprotema A-IV, o uno de sus analogos biologicamente activos, que tiene al menos 90% de identidad 5 con la apolipoprotema A-IV, para su uso para disminuir el nivel de glucosa en sangre en un sujeto que lo necesite.
3. - Una apolipoprotema A-IV, o uno de sus analogos biologicamente activos, que tiene al menos 90% de identidad con la apolipoprotema A-IV, para su uso para restablecer sustancialmente la tolerancia a la glucosa en un sujeto.
4. - Una apolipoprotema A-IV, o uno de sus analogos biologicamente activos, para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que su analogo biologicamente activo tiene al menos 99% de identidad con la

10 apolipoprotema A-IV;

preferiblemente cuando el sujeto es un ser humano.
5. - Una apolipoprotema A-IV, o uno de sus analogos biologicamente activos, para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que la secuencia de aminoacidos de la apolipoprotema A-IV es:

X^SADQVATVMWDYFSQLSNNAKEAVEHLQKSELTQQLNALFQDKLGEVNTYAG

DLQKKLVPFATELHERLAKDSEKLKEEIGKELEELRARLLPHANEVSQKIGDNLREL

QQRLEPYADQLRTQVNTQAEQLRRQLTPYAQRMERVLRENADSLQASLRPHADX2

LKAKIDQNVEELKGRLTPYADEFKVKIDQTVEELRRSLAPYAQDTQEKLNHQLEGL

TFQMKKNAEELKARISASAEELRQRLAPLAEDVRGNLRGNTEGLQKSLAELGGHL

DQQVEEFRRRVEPYGENFNKALVQQMEQLRQKLGPHAGDVEGHLSFLEKDLRDK

VNSFFSTFKEKESQDKX3LSLPELEQQQEQX4QEQQQEQVQMLAPLES (SEQ ID

NO:4)

15 en la que X es G, A, V o esta ausente;

X2 es E o K;

X3 es T o S; y X4 es Q o H.
6. - Una apolipoprotema A-IV, o uno de sus analogos biologicamente activos, para su uso en el metodo de una 20 cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que la apolipoprotema A-IV es una apolipoprotema A-IV humana de

longitud completa;

preferiblemente en la que la secuencia de aminoacidos de la apolipoprotema A-IV es:

EVSADQVATVMWDYFSQLSNNAKEAVEHLQKSELTQQLNALFQDKLGEVNTYAGD

LQKKLVPFATELHERLAKDSEKLKEEIGKELEELRARLLPHANEVSQKIGDNLRELQQ

RLEPYADQLRTQVNTQAEQLRRQLTPYAQRMERVLRENADSLQASLRPHADELKAK

IDQNVEELKGRLTPYADEFKVKIDQTVEELRRSLAPYAQDTQEKLNHQLEGLTFQMK

KNAEELKARISASAEELRQRLAPLAEDVRGNLRGNTEGLQKSLAELGGHLDQQVEE

FRRRVEPYGENFNKALVQQMEQLRQKLGPHAGDVEGHLSFLEKDLRDKVNSFFST

FKEKESQDKTLSLPELEQQQEQQQEQQQEQVQMLAPLES (SEQ ID NO:1).

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7. - Una apolipoprotema A-IV, o uno de sus analogos biologicamente activos, para su uso en el metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que la secuencia de aminoacidos de la apolipoprotema A-IV es:

GEVSADQVATVMWDYFSQLSNNAKEAVEHLQKSELTQQLNALFQDKLGEVNTYAG

DLQKKLVPFATELHERLAKDSEKLKEEIGKELEELRARLLPHANEVSQKIGDNLRELQ

QRLEPYADQLRTQVNTQAEQLRRQLTPYAQRMERVLRENADSLQASLRPHADELK

AKIDQNVEELKGRLTPYADEFKVKIDQTVEELRRSLAPYAQDTQEKLNHQLEGLTFQ

MKKNAEELKARISASAEELRQRLAPLAEDVRGNLRGNTEGLQKSLAELGGHLDQQV

EEFRRRVEPYGENFNKALVQQMEQLRQKLGPHAGDVEGHLSFLEKDLRDKVNSFF

STFKEKESQDKTLSLPELEQQQEQQQEQQQEQVQMLAPLES (SEQ ID NO:3).
8. - Una apolipoprotema A-IV, o uno de sus analogos biologicamente activos, para su uso en el metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que la apolipoprotema A-IV esta glicosilada; o en la que la apolipoprotema A-IV no esta glicosilada.
9. - Una apolipoprotema A-IV, o uno de sus analogos biologicamente activos, para su uso en el metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que la apolipoprotema A-IV se administra de modo sistemico;

preferiblemente, en la que la administration sistemica de la apolipoprotema A-IV, o de uno de sus analogos biologicamente activos, se selecciona del grupo que consiste en la administracion oral, subcutanea, intravenosa, intramuscular, e intraperitoneal.
10. - Una apolipoprotema A-IV, o uno de sus analogos biologicamente activos, para su uso en el metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en la que la apolipoprotema A-IV se administra en una dosis de 1 a 10 p,g/g; o en la que la apolipoprotema A-IV, o uno de sus analogos biologicamente activos, se administra en una dosis de 0,25 a 2 p,g/g; o en la que la apolipoprotema A-IV, o uno de sus analogos biologicamente activos, se administra en una dosis de aproximadamente 1 ^g/g.
11. - Una apolipoprotema A-IV, o uno de sus analogos biologicamente activos, para su uso en el metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en la que la apolipoprotema A-IV se administra una vez diaria; o en la que la apolipoprotema A-IV, o uno de sus analogos biologicamente activos, se administra aproximadamente 2 veces diarias.
12. - Una composition farmaceutica que comprende la apolipoprotema A-IV, o uno de sus analogos biologicamente activos, de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, para su uso para tratar la diabetes mellitus de tipo II en un sujeto, o para disminuir los niveles de glucosa en sangre en un sujeto que lo necesite, o para restablecer sustancialmente la tolerancia a la glucosa en un sujeto.
13. - La composicion farmaceutica para su uso segun la reivindicacion 12, en la que la composicion farmaceutica comprende ademas un vehfculo o un diluyente farmaceuticamente aceptable.
14. - La composicion farmaceutica para su uso segun la reivindicacion 12 o 13, en la que la composicion farmaceutica es una formulation lfquida.
15. - La composicion farmaceutica para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 12-14, en la que la composicion farmaceutica es una formulacion acuosa;

preferiblemente, en la que la formulacion acuosa es apirogena.