BR112014016734B1 - Composições compreendendo um peptídeo e usos de composições e peptídeos no tratamento médico - Google Patents

Abstract

PEPTÍDEOS E MÉTODOS DE USO DOS MESMOS. Nós descrevemos peptídeos e seus usos para o tratamento de doenças autoimunes, inflamatórias e metabólicas

Description

REFERÊNCIA CRUZADA PARA PEDIDOS RELACIONADOS

[1] Este pedido reivindica o benefício sob o código 35 § 119 dos Estados Unidos (e) do pedido provisório n° 61/584.517 depositado em 09 de janeiro de 2012 e pedido provisório n° 61/699.571 depositado em 11 de setembro de 2012, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência na sua totalidade.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[2] O presente pedido contém uma listagem de sequências que foi submetida em formato ASCII via EFS-Web e é aqui incorporada por referência na sua totalidade. A referida cópia ASCII, criada em 31 de dezembro de 2012, é nomeada 65292741.txt e possui 18.884 bytes de tamanho.

CAMPO DA INVENÇÃO

[3] A presente descrição apresenta peptídeos isolados e/ou sintetizados. Especificamente, o presente invento é uma classe de fragmentos peptídicos isolados e/ou sintetizados, e análogos sintéticos baseados nos fragmentos peptídicos. Os peptídeos podem ter efeitos preventivos e terapêuticos em doenças humanas e podem ser utilizados no tratamento de doenças humanas.

JUSTIFICATIVA

[4] Inibidores de serina protease (serpinas) representam uma grande família de inibidores de protease (> 1000), presente em todos os ramos da vida e envolvida em uma infinidade de processos fisiológicos. Nos mamíferos, tais como seres humanos, as serpinas são importantes para a homeostase e, apesar da existência de um certo nível de promiscuidade, cada serpina possui uma(s) serina-protease(s) cognata. Por exemplo, a alfa-1-antitripsina (AAT) e alfa-1- antiquimotripsina (ACT) inibem proteases inflamatórias, tais como a elastase, ao passo que a antitrombina inibe a trombina e desempenha um papel na coagulação.

[5] Um número de mutações específicas de AAT são manifestadas em doenças humanas, incluindo DPOC, trombose e serpinopatias (cirrose e demência). Atualmente, um pequeno número de formulações de AAT derivadas de soro humano são aprovadas pelo FDA para o tratamento de DPOC. Nesta abordagem terapêutica, AAT funciona como um inibidor de protease semelhante ao AAT endógeno.

[6] AAT é a serpina arquetípica e compartilha estrutura terciária com outras serpinas. As serpinas tem uma alça exposta de ~20 aminoácidos (aa), chamada de alça central reativa (RCL), a qual serve como atrativo para as proteases cognatas. Uma vez que a protease liga ao RCL, ele fica preso, parcialmente desenovelado e destinado a degradação. A clivagem da RCL em seu sítio P1-P1’ desencadeia o processo de inativação da protease e resulta na liberação de um pequeno peptídeo C-terminal da molécula de serpina.

RESUMO

[7] Descobrimos inesperadamente que muitos dos peptídeos C-terminal da molécula de serpina, e variantes e derivados dos mesmos, funcionam como potentes agentes anti- inflamatórios. Consequentemente, nós fornecemos composições de peptídeos, composições farmacêuticas compreendendo os peptídeos C-terminal de serpina e métodos para uso dos peptídeos para o tratamento de doenças inflamatórias e autoimunes, incluindo diabetes do tipo II, lúpus e doença do enxerto contra hospedeiro, uveíte, eczema e psoríase, fibrose cística, artrite reumatóide (AR), síndrome de radiação aguda e pacientes com queimaduras, doença inflamatória intestinal (DII) e diabetes tipo 1 de novo início.

[8] A invenção baseia-se na nossa descoberta de que um peptídeo curto, SP16 (SEQ ID NO: 1) derivado de alfa-1- antitripsina humano apresenta propriedades anti- inflamatórias e imuno-moduladoras semelhantes à muito maior proteína parental, alfa-1-antitripsina. Sem querer estar ligado por uma teoria, SP16 parece ser um interruptor geral de primeira classe para o tratamento de doenças autoimunes, inflamatórias e doenças metabólicas.

[9] Mais especificamente, demonstramos a função do peptídeo SP16, consistindo na sequência de aminoácidos VKFNKPFVFLMIEQNTK (SEQ ID NO: 1) em modelos animais bem estabelecidos de, pelo menos, diabetes tipo 2, artrite reumatóide e endotoxemia letal.

[10] Deste modo, nós fornecemos uma composição compreendendo um peptídeo isolado que compreende, consiste essencialmente em, ou que consiste da sequência de aminoácidos Xl-Zl-F-N-K-P-F-X2-Z2-X3-Z3 (SEQ ID NO: 2), em que X1 é V ou L; X2 é V, L ou M; X3 é M, I ou V; Zl é qualquer aminoácido; Z2 é uma sequência de quaisquer dois aminoácidos; e Z3 é uma sequência de quaisquer cinco aminoácidos, e em que o peptídeo isolado é constituído por 37 aminoácidos ou menos.

[11] O peptídeo pode ser modificado para aumentar a vida de prateleira e/ou biodisponibilidade utilizando uma ou mais ligações peptídicas ou aminoácidos não naturais ou por ligação a grupos peptídicos funcionais, tais como, por exemplo, polietileno glicol (PEG).

[12] A composição pode adicionalmente compreender um veículo, tal como um veículo farmaceuticamente aceitável.

[13] Os peptídeos da invenção podem ser utilizados para reduzir os níveis séricos de TNF-a em indivíduos humanos que possuam níveis de TNF-a patologicamente aumentados. Assim, a invenção fornece um método ou uso para redução dos níveis de TNF-a em um ser humano em necessidade deste, que compreende a administração a um indivíduo humano do peptídeo do invento em um veículo farmaceuticamente aceitável. Em certas modalidades, os peptídeos isolados resultam em uma diminuição de 50% ou 75% nos níveis séricos de TNF-a quando administrado em uma quantidade eficaz a um indivíduo humano em comparação com os níveis de antes da administração do polipeptídeo isolado. Em outras modalidades, o peptídeo isolado compreende adicionalmente pelo menos uma outra proteína. A combinação das pelo menos duas proteínas pode ser referido como uma proteína de fusão. A outra proteína pode ser selecionada a partir de um marcador de epítopo e um extensor de meia-vida. O peptídeo pode compreender ambos marcador de epítopo e um extensor de meia-vida.

[14] Nós também fornecemos uma composição compreendendo um peptídeo isolado consistindo essencialmente em ou consistindo da sequência X1-Z1-F-N-X2-P-F-X3-Z2-X4-Z3-X5 de aminoácidos (SEQ ID NO:3), em que X1 é V ou L; X2 é K ou R; X3 é V, L ou M; X4 é M, I ou V; X5 é K ou Q; Z1 é qualquer aminoácido; Z2 é uma sequência de quaisquer dois aminoácidos; Z3 é uma sequência de quaisquer cinco aminoácidos; e em que o peptídeo isolado provoca uma diminuição de 75% no nível sérico de TNF-a, quando administrado em uma quantidade eficaz a um indivíduo humano, em comparação com os níveis de TNF-a antes da administração do peptídeo.

[15] Em certas modalidades, o peptídeo isolado compreende a sequência de aminoácidos X1-Z1-F-N-X2-P-F-X3- Z2-X4-Z3-X5 (SEQ ID NO: 3), em que X1, X2, X3, X4, X5, Z1, Z2 e Z3 são definidos como acima e em que o peptídeo é composto de, no máximo, 35, 22 ou 21 resíduos de aminoácidos.

[16] Em certos aspectos, os peptídeos de qualquer uma das modalidades descritas aqui e em todo o relatório descritivo, compreende também pelo menos uma outra proteína. A combinação destas pelo menos duas proteínas pode ser referido como uma proteína de fusão. Especificamente, a outra proteína pode ser selecionada a partir de um marcador de epítopo e um extensor de meia-vida. Em alguns aspectos de todas as modalidades da invenção, o peptídeo isolado pode compreender ambos, marcador de epítopo e extensor de meia- vida.

[17] A descrição também fornece um peptídeo isolado consistindo essencialmente em ou consistindo da sequência de aminoácidos RFNRPFLR (SEQ ID NO: 4) e RFNKPFLR (SEQ ID NO: 5). Em certas modalidades, o peptídeo isolado provoca uma diminuição de 50% ou 75% nos níveis séricos de TNF-a quando comparado com a quantidade dos níveis séricos de TNF-a antes da administração do peptídeo, quando administrado em uma quantidade eficaz a um indivíduo humano.

[18] Em outros aspectos de todas as modalidades da invenção, o peptídeo isolado é ligado a uma outra proteína. A combinação destas proteínas pode ser referida como uma proteína de fusão. Especificamente, a outra proteína pode ser selecionada de um marcador de epítopo e um extensor de meia-vida.

[19] Em alguns aspectos de todas as modalidades da invenção, o peptídeo isolado consiste em, no máximo, 100, 35, 22, 21 ou 9 aminoácidos adicionais.

[20] Em outras modalidades, o peptídeo isolado consiste essencialmente de, ou consiste da sequência de aminoácidos de Z1-RFNRPFLR (SEQ ID NO: 6) e Z1-RFNKPFLR-Z2 (SEQ ID NO: 7), em que Z1 e Z2 são, independentemente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 6, 7, 8, 9, 10 ou entre 1 e 3, entre 1 e 5, entre 1 e 6, entre 1 e 7, entre 1 e 8, entre 1 e 9, ou entre 1 e 10 aminoácidos básicos.

[21] Em algumas modalidades, o peptídeo isolado consiste essencialmente de ou consiste da sequência de aminoácidos de RRRFNRPFLRRR (SEQ ID NO: 8) e RRRFNKPFLRRR (SEQ ID NO: 9).

[22] A divulgação também fornece uma composição compreendendo um peptídeo isolado que consiste essencialmente em, ou que consiste da sequência de aminoácidos de FNRPFL (SEQ ID NO: 10) e FNKPFL (SEQ ID NO: 11).

[23] A divulgação também fornece uma composição compreendendo um peptídeo isolado ou sintetizado, consistindo essencialmente de ou consistindo de qualquer um ou uma combinação dos seguintes peptídeos: SP40; SP43; SP46; e SP49, conforme estabelecido no quadro B, e seu uso em métodos para o tratamento de inflamação, artrite reumatóide, DPOC, fibrose cística, melhoria do controle glicêmico em indivíduos com diabetes e na prevenção e tratamento da endotoxemia, por exemplo, em vítimas de queimaduras e de indivíduos expostos a radiação aguda.

[24] Em uma modalidade, a divulgação também fornece um método para diminuição dos níveis séricos de TNF-α em comparação com a quantidade de TNF-a antes de se administrar o peptídeo ao indivíduo, que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de qualquer um dos peptídeos isolados tal como definido acima, para diminuir os níveis de TNF-a no soro em pelo menos 50%. Em uma modalidade, níveis séricos de TNF-a são reduzidos em 75% em comparação com a quantidade de TNF-a antes da administração o peptídeo. Em outras modalidades, o indivíduo é um mamífero. Em alguns aspectos de todas as modalidades da invenção, o mamífero é um ser humano.

[25] Em algumas modalidades, a divulgação fornece métodos para melhorar o controle glicêmico, ou reduzir a hiperglicemia em um indivíduo com essa necessidade que compreende a administração ao indivíduo com hiperglicemia de qualquer um dos peptídeos aqui descritos em um veículo farmaceuticamente aceitável.

[26] Em alguns aspectos de todas as modalidades da invenção, o humano tem sido diagnosticado com diabetes do tipo 2, diabetes do tipo 1 de novo início, artrite reumatóide, DPOC, fibrose cística, uveíte, eczema, psoríase, lúpus, doença do enxerto contra hospedeiro, doença inflamatória do intestino (DII), ou endotoxemia seguida da exposição à radiação aguda ou queimadura antes da administração do peptídeo.

[27] Em alguns aspectos, o humano não foi submetido a tratamento prévio com alfa antitripsina, tais como tratamento com alfa-1-antitripsina, antes do tratamento com os peptídeos de acordo com a invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[28] A Figura 1 é uma tabela que mostra as sequências e homologia de peptídeos C-terminal de serpina (SEQ ID NOS: 18-24, respectivamente, por ordem de aparecimento).

[29] A Figura 2 é uma tabela que mostra os peptídeos obtidos por truncamento (SEQ ID NOs: 25-32, 1, 33-34, 1, 33, 38-51, 10, e 8, respectivamente, por ordem de aparecimento).

[30] A Figura 3 é um gráfico de barras que mostra os níveis de TNF-a no sangue de camundongos injetados com 0,5, 0,1, 0,02 ou 0,004 mg de vários peptídeos (SP1-SP18 da esquerda para a direita no eixo do x). Cada peptídeo foi administrado em quatro concentrações diferentes. As quatro barras apresentadas para cada do peptídeo a partir da esquerda para a direita representam as concentrações da mais alta (0,5 mg) a mais baixa (0.004 mg).

[31] A Figura 4 é um gráfico de barras que mostra os níveis de TNF-a no sangue de camundongos injetados com 0,004 mg de vários peptídeos.

[32] A Figura 5 é um gráfico de linhas que mostra pontuação (contagem) cumulativa para tratamento simulado, tratamento com dexametasona e tratamento com o peptídeo (SEQ ID NO: 1, também referido como SP16) em um modelo de artrite de rato induzida por anticorpo do colágeno (CAIA).

[33] A Figura 6 é um gráfico de linhas que mostra pontuação (contagem) cumulativa para tratamento simulado, tratamento por dexametasona e tratamento com peptídeo (SEQ ID NO: 1, também referido como SP16) em um modelo de artrite de rato induzida por anticorpo do colágeno (CAIA).

[34] A Figura 7 é um gráfico que resume a sobrevivência durante um estudo de endotoxemia letal em camundongos. Os animais foram injetados com 0,6 mg/kg de SP16 (SEQ ID NO: 1) como indicado: 2 horas antes, no momento de, e/ou 0,5 horas após a indução da sepse. Sepse foi induzida por injeção com 15 mg/kg de LPS, a T=0. A sobrevivência foi monitorada nos pontos de tempo indicados. A sobrevivência em 72 horas foi de 60% no grupo que recebeu SP16 a T=-2, 0 e 0,5 horas.

[35] As Figuras 8A-8F mostram gráficos resumindo dados de um estudo em modelo de DMT2 db/db. Camundongos db/db de cinco semanas de idade foram separados em grupos de 10 animais, e injetados IP com 0,6 mg/kg de SP16 (quinzenalmente), rosiglitazona 15 mg/kg (quinzenalmente), ou veículo controle durante 5 semanas. Os níveis de HbA1c (Figura 8A) e peptídeo C (Figura 8B) foram determinados no final do estudo. Durante a última semana de estudo, um teste de tolerância à glicose foi administrado (Figura 8C). Glicose no sangue sem jejum foi medida quinzenalmente ao longo do estudo e foi significativamente reduzida nos grupos SP16 (SEQ ID NO: 1) e rosiglitazona. Os valores representam as médias, com erros padrões indicados. (*) Indica p <0,05 e (**) p <0,01, comparado com o grupo simulado por t-teste. A Figura 8D resume o grau de hiperplasia da ilhota no estudo db/db, tal como avaliado por morfometria. As Figuras 8E e 8F resumem os níveis séricos de CRP e TGF-beta no modelo db/db de diabetes tipo 2 de rato. Níveis séricos de CRP diminuidos são consistentes com o tratamento com o peptídeo promovendo um perfil de citocinas anti-inflamatório. Camundongos db/db diabéticos de oito semanas de idade foram distribuídos em grupos de 8. Grupo que recebeu solução salina (simulado) ou 0,6 mg/kg de SP16 quinzenalmente, durante 12 semanas. Os níveis reunidos de CPR e TGF-beta no soro foram determinados para cada grupo. (*) Indica p <0,05 e (**) p <0,01 em comparação com o grupo veículo controle.

[36] A Figura 9 é um gráfico que resume os dados de um estudo no modelo de artrite reumatóide de rato CAIA. O gráfico mostra pontuações de inchaço cumulativas em todas as patas no pico da doença (dia 7) para grupos de 5 animais. Camundongos Balb/c foram injetados IV com um coquetel de anticorpos colágeno (MD Biosciences) no Dia 0 e injetados IP com LPS no Dia 3. Animais controle normal não receberam injeções e serviram como linha de base para o controle livre de doença. Injeção diária de SP16 forneceu proteção equivalente à dexametasona.

[37] A Figura 10 mostra os níveis de TNF-alfa em camundongos desafiados com LPS. Na Figura 10A, os camundongos foram tratados com varredura de alanina no peptídeo SP16. Dexametasona serviu como controle positivo de "tratamento eficaz" e os peptídeos SP16, SP40, SP43, SP46 e SP49 todos reduziram os níveis de TNF-alfa mais do dexametasona. Com base nesta varredura de alanina, e sem querer estar ligado por uma teoria, parece que os aminoácidos C- e N-terminal contribuem para o efeito anti-inflamatório do peptídeo SP16. Comparar com a Figura 4, a qual mostra um gráfico que resume os níveis séricos de TNF-alfa em um modelo de inflamação do rato, o desafio com LPS, tratamento com diferentes peptídeos derivados de serpina humana. Grupos de 3 animais foram injetados com 0,2 mg/kg de peptídeo e submetidos ao desafio com LPS. Os níveis de TNF-alfa no soro foram determinadas por ELISA. Vários peptídeos forneceram o mesmo nível de proteção que 1 mg/kg de dexametasona.

[38] A Figura 11 mostra que SP16 é um agonista de TLR2. O gráfico resume os dados representativos de ensaios com uma linhagem celular indicadora projetada de TLR-2 (HEK-Blue™ mTLR2, Invivogen). As células foram incubadas com as concentrações indicadas de peptídeo, durante 24 horas. Após a ativação de TLR2, as células secretoras de fosfatase alcalina puderam ser ensaiadas. O ensaio foi feito em triplicata e as médias e desvios padrão estão representados. SP16 exibiu propriedades ligadoras de TLR-2, induzindo sinalização de TLR-2 de uma forma dependente da dose. O peptídeo controle misturado SP34 não mostrou indução de TLR2. *p <0,05, em relação ao controle misturado (SP34).

[39] A Figura 12 mostra análise da relação estrutura- atividade para SP16. O gráfico resume os dados de um experimento em que uma linhagem celular indicadora projetada de TLR-2 (HEK-Blue™ mTLR2, Invivogen) foi usada para testar o impacto da substituição de resíduos de aminoácidos do peptídeo SP16 com alanina ("varredura de alanina"). As células foram incubadas com 20 μg/ml dos peptídeos indicados durante 24 horas. Após a ativação de TLR2, as células secretam fosfatase alcalina, que pode ser doseada. O ensaio foi feito em triplicata e as médias estão representadas. As sequências dos peptídeos estão apresentadas na figura seguinte. *p <0,05, comparado com o controle misturado (SP34).

[40] A Figura 13 apresenta análise da relação estrutura e atividade para SP16. A tabela apresentando as sequências de aminoácidos (SEQ ID NOS 1, 18, 12-17, 52-56, e 51, respectivamente, por ordem de aparecimento) dos peptídeos que foram testados usando uma linhagem celular indicadora de TLR-2 (veja os dados na figura precedente). O lado direito da tabela resume o impacto dos peptídeos na sinalização por TLR-2 (* indica baixa, ***** indica alta, N/A indica que não teve impacto sobre a sinalização). Os dados sugerem que os três primeiros resíduos contribuem para a indução da sinalização por TLR-2. Se os resíduos 1-3 são substituídos por alaninas (SP37), o peptídeo mutante não tem nenhum impacto sobre o TLR2. No entanto, quando substituído individualmente (SP52-SP54), os peptídeos retém a capacidade de estimular TLR-2. Surpreendentemente, a substituição do resíduo de fenilalanina na posição 3 com um resíduo menor alanina melhora a capacidade de estimular TLR-2 em comparação com a sinalização SP16.

[41] A Figura 14 mostra um esquema dos diferentes fases de diabetes tipo II.

[42] A Figura 15 mostra um gráfico que resume os dados de um experimento com sinoviócitos humanos primários. As células foram incubadas com 10 μM dos peptídeos indicados, bem como 0, 5, 10, ou 30 ng/ml IL1b, durante 48 horas. Após a estimulação com IL1b, as células secretam a metaloprotease MMP1, que está envolvida na quebra da cartilagem na artrite. O ensaio foi feito em triplicata e as médias com desvio padrão estão representadas. SP16 diminuiu a secreção de MMP1 em comparação com os peptídeos controle misturados, a 20 ng/ml de IL1b. (*)Indica p <0,05 comparado com o peptídeo controle misturado.

[43]

DESCRIÇÃO DETALHADA

[44] A presente invenção descreve peptídeos isolados e úteis no campo do tratamento e prevenção de doenças. Especificamente, o presente invento fornece peptídeos isolados e/ou sintetizados, e análogos sintéticos à base de tais peptídeos, com efeitos preventivos e terapêuticos em doenças humanas. Por exemplo, os peptídeos podem ser usados para tratar ou prevenir inflamação, destruição de tecido autoimune, por exemplo, no lúpus e doença do enxerto contra hospedeiro, artrite reumatóide, fibrose cística, eczema, psoríase e para tratar diabetes do tipo I e do tipo II, por exemplo, para estimular a expansão da massa de células beta em um indivíduo com diabetes, para tratar a doença inflamatória do intestino, bem como para tratar ou prevenir endotoxemia após a exposição a radiação aguda e em pacientes com queimaduras.

[45] Os peptídeos aqui descritos são peptídeos C- terminal curtos isolados ou sintetizados especificamente definidos com base em serpinas e variantes e derivados dos mesmos com propriedades anti-inflamatórias surpreendentemente eficazes e com tamanho muito mais útil para aplicações terapêuticas em comparação com as proteínas serpinas nativas. Os peptídeos isolados são apresentados nas Figuras 1-2. A Figura 1 mostra as sequências de aminoácidos dos fragmentos C-terminal de uma variedade de Serpinas. Cada peptídeo é marcado com um SEQ ID NO: na coluna 2, imediatamente à esquerda do peptídeo. A Figura 2 mostra truncamento dos fragmentos C-terminal apresentados na Figura 1, bem como variantes e derivados dos mesmos. Mais uma vez, cada peptídeo é marcado com uma SEQ ID NO: na coluna 2, imediatamente ao lado do peptídeo.

[46] Verificou-se que SP16 (SEQ ID NO: 1), que é derivada a partir de alfa-antitripsina humana, apresenta propriedades anti-inflamatórias e imuno-moduladores semelhantes às da proteína parental original, alfa-1- antitripsina. SP16 parece ser um peptídeo interruptor geral de primeira classe para o tratamento de doenças autoimune, inflamatórias e metabólicas. Sem querer estar ligado por uma teoria, os peptídeos da invenção podem proporcionar um bom perfil de segurança, com base no bom perfil de segurança da proteína original, alfa-1-antitripsina. No entanto, os peptídeos da invenção são, de longe, de produção muito mais fácil e menos cara uma vez que são muito menores do que a proteína parental.

[47] Descobriu-se que os peptídeos C-terminal que resultam da clivagem da molécula de Serpina por uma das suas serina proteases cognatas têm função biológica intrínseca que é distinta da função de inibidor de protease da molécula de serpina completa, parental. Por exemplo, os peptídeos C- terminal de AAT, antiquimotripsina e Kallistatin têm graus variados de efeitos anti-inflamatórios. Com base em nossa pesquisa, nós submetemos que estes peptídeos moduladores anti-inflamatórios e/ou imunes, que são um subproduto do ciclo de vida de uma molécula de Serpina, representam um tipo de “interruptor principal” imunológico e inflamatório (homeostático).

[48] Além disso, nossos dados de linhagem celulares projetadas mostram que SP16 ativa a via de sinalização de TLR-2, mas não de TLR-4. Isto é interessante porque outro peptídeo modulador imune, DiaPep277, que não compartilha nenhuma similaridade de sequência com SP16, tem um perfil de ativação de TLR similar. Sem querer estar ligado por uma teoria, com base nestas observações, sugerimos que SP16 atua através do receptor de TLR2, e possivelmente o receptor de células T, para acionar a secreção de citocina para um perfil de citocinas anti-inflamatória Th2 (IL-4 e IL -10). Em doenças autoimunes, SP16 deve induzir a expansão das populações de células T reguladoras e, assim, deslocar a resposta inflamatória no sentido de uma resposta reguladora.

[49] Temos, por conseguinte, fornecer novas moléculas anti-inflamatórias a partir dos peptídeos C-terminal das moléculas de Serpina, e novas formas de desenvolvimento de moléculas anti-inflamatórias adicionais, por modificação dos fragmentos C-terminal de Serpinas.

[50] As funções anteriormente conhecidas de Serpinas estão relacionadas com a inibição da função das enzimas serina-protease. Algumas Serpinas inibem outros tipos de proteínas, e várias não têm uma função inibidora.

[51] Serpina é uma grande família de inibidores de serina proteases (> 1000) que são estruturalmente semelhantes, mas funcionalmente diversos. Eles estão envolvidos em uma variedade de processos fisiológicos e são críticos para a homeostase em mamíferos. As mutações genéticas em Serpinas individuais são manifestadas em diferentes doenças humanas, incluindo a DPOC, trombose e enfisema.

[52] Cada serpina com um papel inibidor é responsável pelo bloqueio da atividade de uma ou mais proteínas. As serpinas se ligam as suas proteínas alvo para impedir de completar qualquer reação posterior. Após a ligação a um alvo, ocorre uma mudança irreversível na estrutura da proteína serpina. Certas células reconhecem quando uma Serpina está ligada ao seu alvo e removem essas proteínas ligadas da corrente sanguínea.

[53] A alfa-1-antitripsina (AAT) é a Serpina prototípica. PROLASTIN® (Talecris), Zemaira® (Aventis Behring) e ARALAST® (Baxter) são formulações derivadas de AAT de soro humano aprovadas pelo FDA para o tratamento de DPOC. AAT está atualmente na fase de ensaios clínicos para o tratamento de diabetes tipo I de novo início, doença do enxerto contra hospedeiro e fibrose cística.

[54] Pesquisadores identificaram pelo menos 37 genes diferentes de Serpina em seres humanos. Com base na nossa pesquisa, acreditamos que fragmentos C-terminal isolados e sintetizados das proteínas de serpinas fornecem uma nova fonte de moléculas anti-inflamatórias. Assim, sugerimos que os fragmentos C-terminal de, pelo menos, as Serpinas listadas na Tabela A são úteis como moléculas anti-inflamatórias.

[55] Realizou-se ainda uma varredura de alanina que mostrou que os peptídeos SP16 modificados isolados ou sintetizados mostrados na Tabela B a seguir são particularmente eficazes na redução dos níveis de TNF-alfa em um modelo de inflamação de camundongo. Especificamente, descobrimos que, nestes fragmentos particulares, a maior parte dos três aminoácidos N-terminal e dos dois aminoácidos C-terminal parecem desempenhar um papel nas propriedades anti-inflamatórias dos peptídeos uma vez que a substituição deles parece reduzir a capacidade do peptídeos de redução nos níveis de TNF-alfa em um modelo de sepse de camundongo desafiado com LPS (Figura 10). Por conseguinte, em alguns aspectos de todas as modalidades da invenção, os peptídeos são selecionados a partir de SP40, SP43, SP46, SP49, as sequências peptídicas dos quais são apresentadas na Tabela B.

[56] A tabela B apresenta peptídeos denominados SP16; SP40; SP43; SP46; e SP49 que apresentam, particularmente, bom efeito anti-inflamatório, quando administrados a um modelo de sepse de camundongo (Ver Figura 10).

[57] De acordo com algumas modalidades e aspectos da invenção, qualquer um dos peptídeos isolados que consistem em ou consistindo essencialmente das sequências fornecidas nas SEQ ID NOs: 8, 10, 19-34, e 38-49 podem ser usados para reduzir a inflamação. Qualquer um dos peptídeos consistindo de ou consistindo essencialmente das sequências fornecidas nas SEQ ID NOs: 8, 10, 19-34, 38-49 também podem ser utilizados para reduzir TNF-a em um indivíduo. Em certas modalidades, a quantidade de TNF- a no soro é reduzida em até 50% ou mais, ou 75% ou mais, em comparação com a quantidade do mesmo no soro antes da administração do peptídeo.

[58] A Tabela C a seguir apresenta os peptídeos exemplificativos adicionais que foram usados para reduzir os níveis de TNF-alfa em camundongos submetidos a um desafio com LPS. Ver também a Figura 10B. Além disso, os peptídeos com capacidade para reduzir os níveis de TNF-alfa, conforme mostrado na Figura 10B, estão contemplados nas composições, composições farmacêuticas e métodos de uso e tratamento de condições inflamatórias da presente invenção.

[59] SP1 (SEQ ID NO: 18); SP2 (SEQ ID NO: 19); SP3 (SEQ ID NO: 20); SP4 (SEQ ID NO: 21); SP5 (SEQ ID NO: 22); SP6 (SEQ ID NO: 23); SP7 (SEQ ID NO: 24); SP8 (SEQ ID NO: 25); SP9 (SEQ ID NO: 26); SP10 (SEQ ID NO: 27); SPll (SEQID NO: 28); SP12 (SEQ ID NO: 29); SP13 (SEQ ID NO: 30); SP14 (SEQ ID NO: 31); SP15 (SEQ ID NO: 32); SP16 (SEQ ID NO: 1); SP17 (SEQ ID NO: 33); SP18 (SEQ ID NO: 34).

[60] Entende-se que a frase "que consiste essencialmente em” tem a intenção de definir o escopo dos peptídeos aos aminoácidos materiais especificados, e para incluir somente alterações ou aminoácidos adicionais que não afetem materialmente as características novas e básicas da invenção reivindicada, ou seja, a capacidade anti- inflamatória dos peptídeos curtos isolados ou sintetizados. Esta definição exclui especificamente os peptídeos que possuem a sequência completa de uma proteína Serpina, e a definição também exclui especificamente as sequências peptídicas que são iguais a, ou maiores do que 37 aminoácidos, de qualquer proteína Serpina de ocorrência natural.

[61] Sem querer estar ligado a uma teoria, também identificamos os importantes aminoácidos que abrangem a cadeia principal, e as possíveis modificações para peptídeos anti-inflamatórios como aqui fabricados. Portanto, os peptídeos isolados englobados pelas fórmulas estabelecidas a seguir são fornecidos e também podem ser utilizados para reduzir a inflamação.

[62] AAT Humano, antiquimotripsina e kallistatin são conhecidos por conter os elementos com propriedades anti- inflamatórias. No entanto, estes elementos não foram identificados anteriormente. Nós agora estabelecemos uma nova família de peptídeos derivados de Serpina humanos com potente efeito antiinflamatório usando, por exemplo, um modelo de endotoxemia de camundongo (endotoxemia induzida por LPS). Baseado na eficácia dos peptídeos no modelo de inflamação de camundongo, o tamanho do peptídeo, e o perfil de segurança da proteína original, os peptídeos baseados em AAT, os peptídeos, tais como SP16, e fragmentos e derivados dos mesmos, fornecem uma molécula nova e melhorada para tratar a inflamação em seres humanos.

[63] A Fórmula I fornece uma composição compreendendo um peptídeo que compreende, que consiste essencialmente em, ou que consiste da sequência de aminoácidos Xl-Zl-F-N-R-P- F-X2-Z2-X3-Z3-Q (SEQ ID NO: 35) e Xl-Zl-F-N-K-P-F-X2-Z2-X3- Z3 (SEQ ID NO: 2) em que X1 é V ou L; X2 é V, L ou M; X3 é M, I ou V; Zl é qualquer aminoácido; Z2 é uma sequência de quaisquer dois aminoácidos; e Z3 é uma sequência de quaisquer cinco aminoácidos, em que o peptídeo compreende 37 aminoácidos ou menos.

[64] Em certos aspectos de todas as modalidades, o peptídeo isolado provoca uma diminuição de 50% ou 75% nos níveis séricos de TNF-a comparado com os níveis séricos medidos antes da administração do peptídeo isolado, quando administrado em uma quantidade eficaz em um indivíduo humano. Em alguns aspectos de todas as modalidades da invenção, o peptídeo compreende, adicionalmente, uma proteína de fusão. A proteína de fusão pode ser selecionada a partir de um marcador de epítopo e um extensor de meia-vida, ou uma combinação dos mesmos.

[65] Em certos aspectos de todas as modalidades, o peptídeo isolado provoca uma melhoria do controle glicêmico em indivíduos diabéticos, como medido utilizando, por exemplo, teste de A1C, teste de glicose no plasma em jejum (FPG), e/ou o teste de tolerância à glicose oral (OGTT). Indivíduos pré-diabéticos normalmente pontuam igual ou superior a 5,7% para menos de 6,5% no teste A1C, enquanto diabéticos pontuam mais de 6,5% neste teste. Indivíduos pré- diabéticos também pontuam tipicamente igual ou superior a 100 mg/dl para menos de 126 mg/dl usando o teste FPG ao passo que os diabéticos pontuam superior a 126 mg/dl. Indivíduos pré-diabéticos tipicamente pontuam de 140 ou mais, para menos de 200 mg/dl usando o teste OGTT, enquanto indivíduos diabéticos pontuam superior a 200 mg/dl.

[66] A Fórmula II fornece uma composição compreendendo um peptídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo da sequência de aminoácidos X1-Z1-F-N-X2-P-F-X3-Z2-X4-Z3-X5 (SEQ ID NO: 3), em que X1 é V ou L; X2 é K ou R; X3 é V, L ou M; X4 é M, I ou V; X5 é K ou Q; Zl é qualquer aminoácido; Z2 é uma sequência de quaisquer dois aminoácidos;

[67] Z3 é uma sequência de quaisquer cinco aminoácidos; e em que o peptídeo isolado provoca uma diminuição de 75% nos níveis séricos de TNF-a em relação aos níveis de soro antes da administração do peptídeo isolado, quando administrado em uma quantidade eficaz a um indivíduo humano.

[68] Em certos modalidades, o peptídeo que compreende a sequência de aminoácidos de Xl-Zl-F-N-X2-P-F-X3-Z2-X4-Z3- X5 (SEQ ID NO: 3), tal como definido acima, inclui, no máximo, 35, 22 ou 21 resíduos de aminoácidos. Em certos aspectos de todas as modalidades da invenção, o peptídeo compreende adicionalmente uma proteína de fusão. Especificamente, a proteína de fusão pode ser selecionada a partir de um marcador de epítopo e um extensor de meia-vida, ou uma combinação dos mesmos.

[69] Em alguns aspectos de todos os métodos e usos da invenção, o peptídeo é SP16.

[70] Portanto, a invenção também fornece um peptídeo isolado que consiste em, ou que consiste essencialmente da sequência de aminoácidos RFNRPFLR (SEQ ID NO: 4) e RFNKPFLR (SEQ ID NO: 5), que pode também ser utilizado para o tratamento de inflamação. Em certas modalidades, o peptídeo provoca uma diminuição de 50% ou 75% nos níveis séricos de TNF-a em comparação com os níveis de TNF-a antes de se administrar o peptídeo isolado, quando administrado em uma quantidade eficaz a um indivíduo humano. Em alguns aspectos de todas as modalidades da invenção, o peptídeo isolado compreende adicionalmente uma proteína de fusão. Especificamente, a proteína de fusão pode ser selecionada a partir de um marcador de epítopo e um extensor de meia-vida. Em outras modalidades, o peptídeo isolado compreende, no máximo, 100, 35, 22, 21, 16 ou 9 aminoácidos. Em outras modalidades, o peptídeo isolado compreende a sequência de aminoácidos de Z1-RFNRPFLR-Z2 (SEQ ID NO: 6), e Z1-RFNKPFLR- Z2 (SEQ ID NO: 7), em que Z1 e Z2 são, independentemente, entre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 6, 7, 8, 9, 10 ou entre 1 e 3, entre 1 e 5, entre 1 e 6, entre 1 e 7, entre 1 e 8, entre 1 e 9, ou entre 1 e 10 aminoácidos básicos.

[71] Em alguns aspectos de todas as modalidades da invenção, o peptídeo isolado consiste essencialmente de, ou consiste da sequência de aminoácidos de RRRFNRPFLRRR (SEQ ID NO: 8) e RRRFNKPFLRRR (SEQ ID NO: 9). A divulgação também fornece uma composição compreendendo um peptídeo que consiste essencialmente em, ou que consiste da sequência de aminoácidos de FNRPFL (SEQ ID NO: 10) e FNKPFL (SEQ ID NO: 11).

[72] Em certas modalidades, o peptídeo isolado compreende 5 ou mais aminoácidos sequenciais da sequência de aminoácidos de FLMIEQNTK (SEQ ID NO: 36). Estes peptídeos podem ser utilizados para reduzir a inflamação ou reduzir o nível de TNF-α em um indivíduo. Em certas modalidades, a quantidade de TNF-a no soro é reduzida em comparação com a quantidade de TNF- a no soro antes da administração do peptídeo isolado. Em certas modalidades, o controle glicêmico é melhorado, conforme medido por meio de testes, tais como teste de A1C, teste de glicose no plasma em jejum (FPG), e o teste de tolerância à glicose oral (OGTT). Além disso, tanto o nível de TNF- a quanto o controle glicêmico podem ser utilizados como medida de melhoria em um indivíduo diabético.

[73] Em alguns aspectos, o método de tratamento de inflamação compreende adicionalmente a análise dos néveis séricos de TNF- a antes de se administrar o peptídeo isolado e após a administração do peptídeo isolado. Se o nível de TNF- a no soro diminui menos do que 30%, o passo de administração pode ser repetido com a mesma dose ou com uma dose maior do peptídeo em comparação com a primeira dose.

[74] Fragmentos de qualquer um dos peptídeos acima descritos podem variar em tamanho. Por exemplo, esses fragmentos podem ser 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 , 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, ou 37, aminoácidos de comprimento.

[75] Os peptídeos descritos acima são geralmente utilizados para reduzir a inflamação. Os peptídeos exercem efeitos anti-inflamatórios e imunomoduladores, e, adicionalmente, diretamente ou indiretamente, estimulam a regeneração de células beta. Em certas modalidades, estes peptídeos reduzem a inflamação através da redução da atividade ou da expressão de TNF- a. A atividade de TNF-a pode ser reduzida em 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 ou 100%. A expressão de TNF- a pode ser reduzida em 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 ou 100%. Quando administrada terapeuticamente, a composição de peptídeo tipicamente compreende adicionalmente uma solução ou veículo farmaceuticamente aceitável.

[76] Os peptídeos descritos acima também podem ser utilizados para tratar, prevenir ou melhorar os sintomas de várias patologias. Estas patologias incluem inflamação, destruição de tecido autoimune e hiperglicemia. Os peptídeos descritos acima também podem ser utilizados para estimular a expansão da massa de células beta em um indivíduo com diabetes, tratamento da fibrose cística, e no tratamento ou prevenção da endotoxemia após a exposição à radiação aguda e em pacientes com queimaduras.

[77] Deste modo, a descrição fornece adicionalmente métodos de tratamento da inflamação, compreendendo o passo de administração de qualquer um dos peptídeos aqui descritos, ou uma combinação dos mesmos a um indivíduo com necessidade de tratamento da inflamação. Em alguns aspectos, o indivíduo não foi tratado com alfa-antitripsina, antes do tratamento. Em alguns aspectos, o método compreende uma etapa de avaliação se o indivíduo tem um aumento nos níveis séricos de TNF-a e, se o indivíduo tem níveis séricos de TNF-a aumentados quando da administração do peptídeo ao indivíduo, e, se não, a não administração do peptídeo ao indivíduo.

[78] A divulgação também permite métodos de prevenção do desenvolvimento da inflamação, compreendendo o passo de administrar qualquer um dos peptídeos ou combinação dos mesmos a um indivíduo em necessidade de prevenção de inflamação. Em alguns aspectos, o indivíduo não foi tratado com alfa-antitripsina antes do tratamento. Em alguns aspectos, o método compreende um passo de avaliação se o indivíduo tem um aumento nos níveis séricos de TNF-a e, se o indivíduo tem níveis séricos de TNF-a aumentados quando da administração do peptídeo ao indivíduo, e, se não, a não administração do peptídeo ao indivíduo.

[79] A divulgação também permite métodos de impedir a destruição autoimune de tecidos compreendendo o passo de administrar qualquer um dos peptídeos, ou uma combinação dos mesmos, a um indivíduo em necessidade de prevenção da destruição de tecido autoimune. Em alguns aspectos, o indivíduo não foi tratado com alfa-antitripsina, antes do tratamento. Em alguns aspectos, o método compreende um passo de avaliação dos níveis séricos de TNF-a e, se o indivíduo tem níveis séricos de TNF-a aumentados quando da administração do peptídeo ao indivíduo, e, se não, a não administração do peptídeo ao indivíduo.

[80] A divulgação também permite métodos de melhoramento do controle glicêmico em indivíduos portadores de diabetes compreendendo o passo de administrar qualquer um dos peptídeos ou uma combinação dos mesmos a um indivíduo em necessidade de prevenção da destruição de tecido autoimune. Em alguns aspectos, o indivíduo não foi tratado com alfa- antitripsina, antes do tratamento. Em alguns aspectos, o método compreende um passo de avaliação se o indivíduo tem uma melhoria no controle glicêmico através de, por exemplo, teste de A1C, teste de glicose no plasma em jejum, e/ou o teste de tolerância à glicose por via oral ou qualquer outro ensaio conhecido para medir o funcionamento do controle glicêmico.

[81] Em uma modalidade, a revelação fornece o uso de qualquer um, ou uma combinação dos peptídeos isolados ou sintetizados para o tratamento de inflamação, e inflamação, em que o nível de TNF-a é aumentado.

[82] Em certos aspectos de todas as modalidades, a inflamação está relacionada com a diabetes do tipo 1 ou 2, artrite reumatóide ou DPOC.

[83] A invenção também fornece métodos para o tratamento e prevenção de fibrose cística e endotoxemia após exposição aguda a radiação e em pacientes com queimaduras utilizando qualquer um peptídeos da invenção ou uma combinação dos mesmos.

[84] Por conveniência, certos termos empregados em todo o pedido (incluindo relatório descritivo, exemplos, e reivindicações anexas) são definidas ao longo do relatório descritivo. A menos que definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que o normalmente entendido por um técnico no assunto ao qual este invento pertence.

[85] O termo "tipo selvagem" refere-se à sequência de polinucleotídeos de ocorrência natural que codifica uma proteína, ou uma porção da mesma, ou sequência proteica, ou uma porção da mesma, respectivamente, tal como normalmente existe in vivo.

[86] O termo "mutante" refere-se a qualquer alteração no material genético de um organismo, em particular uma mudança (isto é, deleção, substituição, adição ou alteração) na sequência de polinucleotídeos do tipo selvagem ou a qualquer alteração na sequência de uma proteína de tipo selvagem. Embora seja geralmente assumido que uma alteração no material genético resulte em uma alteração da função da proteína, o termo - "mutante" refere-se a uma alteração na sequência de uma proteína de tipo selvagem, independentemente do fato dessas mudanças provocarem alteração na função da proteína (por exemplo, aumento, diminuição, conferir uma nova função), ou seja, que a mudança não tenha nenhum efeito sobre a função da proteína (por exemplo, a mutação ou variação é silenciosa). O termo mutação é aqui utilizado alternadamente com o polimorfismo neste pedido.

[87] Os termos "polipeptídeo" e "proteína" são utilizados alternadamente para se referir a um polímero isolado de resíduos de aminoácidos e não está limitado a um comprimento mínimo a menos que definido de outro modo. Peptídeos, oligopeptídeos, dímeros, multímeros e afins, são também compostos por aminoácidos arranjados linearmente ligados através de ligações peptídicas, e sendo biologicamente produzido e isolado a partir do ambiente natural, produzido utilizando tecnologia recombinante, ou produzido sinteticamente, tipicamente utilizando aminoácidos que ocorrem naturalmente.

[88] Em alguns aspectos, o polipeptídeo ou proteína é um "polipeptídeo modificado" compreendendo aminoácidos de ocorrência não natural. Em alguns aspectos, os polipeptídeos compreendem uma combinação de aminoácidos de ocorrência natural e de ocorrência não natural, e em algumas modalidades, os peptídeos compreendem apenas aminoácidos de ocorrência não natural.

[89] Em alguns aspectos de todas as modalidades da invenção, os peptídeos ou peptídeos modificados compreendem adicionalmente modificações pós-traducionais ou co- traducionais (clivagem de peptídeo C-terminal), tais como, por exemplo, a formação de pontes dissulfeto, glicosilação, acetilação, fosforilação, clivagem proteolítica (por exemplo, a clivagem por furinas ou metaloproteases), e semelhantes, na medida em que tais alterações não afetam as propriedades anti-inflamatórias dos peptídeos isolados ou a sua capacidade para melhorar o controle glicêmico.

[90] Em alguns aspectos da invenção, o polipeptídeo é alterado. O termo "polipeptídeo alterado" refere-se a um peptídeo que inclui modificações, tais como deleções, adições e substituições (geralmente conservadoras na natureza, tal como seria conhecido para um técnico no assunto, tal como alanina), na sequência nativa, desde que a proteína mantenha a atividade desejada, isto é, a capacidade de atividade anti-inflatória para melhorar o controle glicêmico ou redução da hiperglicemia. Estas modificações podem ser deliberadas, como por meio de mutagênese sítio-dirigida, ou podem ser acidentais, tal como através de mutações dos hospedeiros artificiais, tais como bactérias, leveduras ou células de mamíferos geneticamente modificadas, que produzem as proteínas, ou erros devido à amplificação por PCR ou outras metodologias de DNA recombinante. Polipeptídeos ou proteínas são compostos por aminoácidos dispostos linearmente ligados através de ligações peptídicas, mas em contraste com os peptídeos, têm uma conformação bem definida. As proteínas, ao contrário de peptídeos, geralmente consistem de cadeias de 50 ou mais aminoácidos.

[91] O termo "peptídeo", tal como aqui utilizado, refere-se tipicamente a uma sequência de aminoácidos composta por uma única cadeia de aminoácidos ligados por ligações peptídicas. Geralmente, os peptídeos contêm, pelo menos, dois resíduos de aminoácido e possuem menos do que cerca de 50 aminoácidos de comprimento, a menos que seja definido de outra forma.

[92] O termo "peptídeo modificado" pode incluir a incorporação de aminoácidos não naturais nos peptídeos da invenção, incluindo os aminoácidos sintéticos não nativos, aminoácidos substituídos, ou um ou mais D-aminoácidos nos peptídeos (ou outros componentes da composição, com exceção para as sequências de reconhecimento de protease) é desejável em certas situações. Peptídeos contendo D-aminoácidos exibem estabilidade aumentada in vitro ou in vivo em comparação com as formas que contêm L-aminoácido. Assim, a construção de peptídeos que incorporam D-aminoácidos pode ser particularmente útil quando uma maior estabilidade intracelular ou in vivo é desejada ou requerida. Mais especificamente, D-peptídeos são resistentes a peptidases e proteases endógenas, proporcionando assim uma melhor distribuição trans-epitelial, oral e transdérmica de drogas e conjugados ligados, melhor biodisponibilidade de complexos permanentes de membrana (ver abaixo para uma discussão mais aprofundada), e meia-vidas intravascular e intersticial prolongada quando essas propriedades são desejáveis. O uso de peptídeos de isômeros-D também pode aumentar a distribuição transdérmica e trans-epitelial oral de drogas e outras moléculas ligadas a carga. Adicionalmente, D- peptídeos não podem ser processados eficientemente pelos complexos de histocompatibilidade principais de classe II, restrito às células T auxiliares, e são portanto menos susceptíveis de induzir respostas imunes humorais em todo o organismo. Peptídeos conjugados podem, portanto, ser construídos utilizando, por exemplo, formas D-isômero de sequências peptídicas penetrantes da célula, formas L- isômero de sítios de clivagem, e as formas D-isômero de peptídeos terapêuticos. Portanto, em algumas modalidades os peptídeos como divulgados compreendem aminoácidos L e D, em que não mais do que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou D- aminoácidos são incluídos. Em certos aspectos, os peptídeos compreendem mais do que 10 D-aminoácidos, e em determinados aspectos todos os aminoácidos dos peptídeos são D- aminoácidos.

[93] Em ainda um outro aspecto, os peptídeos ou fragmentos ou derivados dos mesmos, podem ser "peptídeos retro-inversos". Um "peptídeo retro-inverso" refere-se a um peptídeo com uma inversão do sentido da ligação peptídica em pelo menos uma posição, isto é, a inversão da extremidade amino- e carboxi- terminais em relação à cadeia lateral do aminoácido. Assim, um análogo retro-inverso tem extremidades invertidas e direção revertidas de ligações peptídicas enquanto mantêm aproximadamente a topologia das cadeias laterais como na sequência do peptídeo nativo. O peptídeo retro-inverso pode conter L-aminoácidos ou D-aminoácidos, ou uma mistura de L-aminoácidos e D-aminoácidos, até todos os aminoácidos sendo o D-isômero. Peptídeos análogos retro- inversos parciais são polipeptídeos em que apenas uma parte da sequência está revertida e substituída com resíduos de aminoácidos enantioméricos. Uma vez que o pedaço retro- invertido de tal análogo tenha extremidades amino e carbóxi terminais invertidas, os resíduos de aminoácidos que flanqueiam a parte retro-invertida são substituídos por análogos de cadeia lateral geminai-diaminometano e malonatos alfa-substituído, respectivamente. Formas retro-inversas de peptídeos penetrantes de células funcionam tão eficientemente na translocação através de uma membrana como as formas naturais. Síntese de análogos de peptídeos retro- inversos são descritos em Bonelli, F. e cols., Int J Pept Protein Res. 24 (6):553-6 (1984); Verdini, A e Viscomi, G. C, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 :697-701 (1985); e Patente dos Estados Unidos No. 6.261.569, que são aqui incorporadas na sua totalidade por referência. Os processos para a síntese em fase sólida de análogos retro-inversos de peptídeos parciais têm sido descritos (EP 97994-B), que também está aqui incorporado na sua totalidade por referência.

[94] Os termos "homologia", "identidade" e "similaridade" referem-se ao grau de semelhança de sequências entre dois peptídeos ou entre duas moléculas de ácido nucleico otimamente alinhadas. Homologia e identidade podem ser determinadas comparando uma posição em cada sequência que pode ser alinhada para fins de comparação. Por exemplo, é baseado na utilização de um software de homologia padrão na posição padrão, tal como o programa BLAST, versão 2.2.14. Quando uma posição equivalente nas sequências comparadas está ocupada pela mesma base ou aminoácido, então as moléculas são idênticas nessa posição; quando o sítio equivalente é ocupado por resíduos de aminoácido similar (por exemplo, semelhante na natureza estérica e/ou electrônica, tal como, por exemplo, substituições de aminoácidos conservativas), então as moléculas podem ser referidas como homólogas (semelhantes) naquela posição. Expressão como uma percentagem de homologia/similaridade ou identidade refere-se a uma função do número de aminoácidos idênticos ou similares nas posições partilhadas pelas sequências em comparação, respeitosamente. Uma sequência que é "não relacionada" ou "não homóloga" compartilha menos de 40% de identidade, embora preferencialmente menos do que 25% de identidade com as sequências aqui reveladas.

[95] Conforme aqui utilizado, o termo "identidade de sequência" significa que duas sequências de polinucleotídeos ou de aminoácidos são idênticas (ou seja, em uma base de nucleótido por nucleótido ou resíduo por resíduo) sobre uma janela de comparação. O termo "percentagem de identidade de sequência" é calculado por comparação de duas sequências otimamente alinhadas sobre uma janela de comparação, determinando o número de posições nas quais a base de ácido nucleico (por exemplo, A, T. C, G. U. ou I) ou resíduo ocorre em ambas as sequências, para originar o número de posições emparelhadas, dividindo pelo número de posições emparelhadas pelo número total de posições na janela de comparação (ou seja, o tamanho da janela), e multiplicando o resultado por 100 para dar a percentagem de identidade de sequência.

[96] O termo "identidade substancial", tal como aqui utilizado denota uma característica de uma sequência de polinucleotídeo ou aminoácido, em que o polinucleotídeo ou aminoácido compreende uma sequência que tem pelo menos 85% de identidade de sequência, de preferência pelo menos 90% a 95% de identidade de sequência, mais geralmente pelo menos 99% de identidade de sequência, em comparação com uma sequência de referência ao longo de uma janela de comparação de pelo menos 18 posições de nucleotídeos (6 aminoácidos), frequentemente sobre uma janela de pelo menos 24-48 posições de nucleotídeos (8-16 aminoácidos), em que a percentagem de identidade de sequência é calculada por comparação da sequência de referência com a sequência que pode incluir deleções ou adições cujo total de 20 por cento ou menos da sequência de referência sobre a janela de comparação. A sequência de referência pode ser um subconjunto de uma sequência maior. O termo "similaridade", quando utilizado para descrever um polipeptídeo, é determinado através da comparação da sequência de aminoácidos e os aminoácidos conservados substitutos de um polipeptídeo com a sequência de um segundo polipeptídeo.

[97] Conforme aqui usado, os termos "homólogo" ou "homólogos" são usados alternadamente, e, quando utilizado para descrever um polinucleotídeo ou polipeptídeo, indicam que dois polinucleotídeos ou polipeptídeos, ou sequências designadas dos mesmos, quando otimamente alinhadas e comparadas, por exemplo utilizando o programa BLAST, versão 2.2.14 com parâmetros predefinidos para o alinhamento (ver adiante) são idênticas, com inserções ou deleções apropriadas de nucleotídeos ou inserções ou deleções de aminoácidos, em pelo menos 70% dos nucleotídeos, geralmente de cerca de 75% a 99 %, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 98 a 99% dos nucleotídeos. O termo "homólogo" ou "homólogos", tal como aqui utilizado refere-se também a homologia com respeito à estrutura e/ou função. No que diz respeito à homologia de sequência, as sequências são homólogas, se forem, pelo menos 50%, pelo menos 60, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% idêntica, pelo menos 97% idêntica, ou pelo menos 99% idênticos. Determinação dos homólogos dos genes ou peptídeos da presente invenção pode ser facilmente determinada pelo técnico no assunto.

[98] O termo "substancialmente homólogo" refere-se a sequências que são pelo menos 90%, pelo menos 95% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica ou pelo menos 99% idêntica. As sequências homólogas podem ser o mesmo gene funcional em espécies diferentes. Determinação dos homólogos dos genes ou peptídeos da presente invenção pode ser facilmente determinada pelo técnico no assunto.

[99] Para comparação de sequências, tipicamente uma sequência atua como sequência de referência, para a qual as sequências de teste são comparadas. Quando usando um algoritmo de comparação de sequências, as sequências teste e de referência são introduzidas em um computador, são designadas coordenadas de subsequência, se necessário, e os parâmetros do programa do algoritmo de sequência são designados. O algoritmo de comparação de sequências calcula então a percentagem de identidade de sequência(s) para a(s) sequência(s) teste relativa à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa designados.

[100] O alinhamento ótimo de sequências para comparação pode ser realizado, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), que é aqui incorporada por referência), pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443-53 (1970), que é aqui incorporada por referência), pelo método de busca de similaridade de Pearson e Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85:2444-48 (1988), que é aqui incorporada por referência), por implementações computadorizadas destes algoritmos (por exemplo, GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no pacote de software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wisconsin), ou por inspeção visual. (Ver, em geral Ausubel e cols. (Eds.), Current Protocols in Molecular Biology, 4 ed., John Wiley and Sons, Nova Iorque (1999)).

[101] Um exemplo de um algoritmo útil é PILEUP. O PILEUP cria um alinhamento de múltiplas sequências a partir de um grupo de sequências relacionadas utilizando alinhamentos progressivos, pareados, para mostrar a identidade de sequência por cento. É possível também gerar uma árvore ou dendograma mostrando as relações de agrupamento utilizadas para criar o alinhamento. O PILEUP utiliza uma simplificação do método de alinhamento progressivo de Feng e Doolittle (J. Mol. Evol. 25:351-60 (1987), que é aqui incorporada por referência). O método utilizado é similar ao método descrito por Higgins e Sharp (Comput. Appl. Biosci. 5:151-53 (1989), que é aqui incorporada por referência). O programa pode alinhar até 300 sequências, cada uma com um comprimento máximo de 5.000 nucleotídeos ou aminoácidos. O procedimento de alinhamento múltiplo começa com o alinhamento pareado das duas sequências mais semelhantes, produzindo um agrupamento de duas sequências alinhadas. Este conjunto é então alinhado para a próxima sequência ou um conjunto de sequências alinhadas mais relacionados. Dois grupos de sequências estão alinhados por uma simples extensão do alinhamento pareado de duas sequências individuais. O alinhamento final é alcançado por uma série de alinhamentos progressivos, pareados. O programa é executado através da designação de sequências específicas e suas coordenadas de aminoácido ou nucleotídeo para regiões de comparação de sequência e designando os parâmetros do programa. Por exemplo, uma sequência de referência pode ser comparada a outras sequências teste para determinar o percentual de identidade de sequência da sequência utilizando os seguintes parâmetros: peso do intervalo por defeito (3,00), peso do comprimento do intervalo por defeito (0.10), e intervalos finais ponderados.

[102] Um outro exemplo de um algoritmo que é adequado para determinar a percentagem de identidade de sequência e similaridade de sequências é o algoritmo BLAST, que é descrito por Altschul e cols. (J. Mol. Biol. 215:403410 (1990), que é aqui incorporada por referência).(Ver também Zhang e cols, Nucleic Acid Res. 26:3986-90 (1998);. Altschul e cols, Nucleic Acid Res. 25:3389-402 (1997), que são aqui incorporados por referência.). Software para a realização de análises BLAST está disponível ao público através do website do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (National Center for Biotechnology Information) na internet. Este algoritmo envolve primeiramente identificar pares de sequência de alta pontuação (HSPs), identificando palavras curtas de comprimento W na sequência de consulta, que correspondem ou satisfazem alguma pontuação limiar positiva de valor T quando alinhadas com uma palavra do mesmo comprimento em uma sequência da base de dados. T é referido como o limite da pontuação da palavra vizinha (Altschul e cols. (1990), supra). Estes acertos iniciais de palavras vizinhas funcionam como sementes para iniciar buscas para encontrar HSP mais longas que as contenham. Os acertos de palavras são então estendidos em ambas as direções ao longo de cada sequência, tão longe quanto a pontuação de alinhamento cumulativo pode ser aumentada. Extensão dos acertos de palavra em cada direção é interrompida quando: a pontuação de alinhamento cumulativo cai pela quantidade X do seu valor máximo atingido; a pontuação cumulativa vai para zero ou abaixo, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamento de resíduos com pontuação negativa; ou a extremidade de qualquer sequência é atingida. Os parâmetros do algoritmo BLAST W, T, e X determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLAST utiliza como padrão um comprimento de palavra (W) de 11, a matriz de pontuação BLOSUM62 (ver Henikoff e Henikoff, Proc Natl Acad Sci EUA 89: 10915-9 (1992), que é aqui incorporada por referência) alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 e uma comparação de ambas as cadeias.

[103] Em adição ao cálculo da percentagem de identidade de sequência, o algoritmo BLAST realiza também uma análise estatística da similaridade entre duas sequências (ver, por exemplo, Karlin e Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90:5873-77 (1993), que é aqui incorporado por referência). Uma medida de similaridade fornecida pelo algoritmo BLAST é a probabilidade da menor soma (P (N)), que fornece uma indicação da probabilidade de correspondência entre duas sequências de nucleotídeos ou de aminoácidos que ocorreria por acaso. Por exemplo, uma sequência de aminoácidos é considerada similar a uma sequência de ácidoaminos de referência se a probabilidade da menor soma em uma comparação entre o aminoácido teste para o aminoácido de referência é menor do que cerca de 0,1, mais tipicamente menor do que cerca de 0,01, e mais tipicamente menor do que cerca de 0,001.

[104] O termo "variante" como aqui utilizado refere-se a um peptídeo ou ácido nucleico que difere do polipeptídeo ou ácido nucleico por uma ou mais deleções, adições, substituições ou modificações da cadeia lateral de aminoácidos, ou ácidos nucleicos, retendo ainda uma ou mais funções específicas ou atividades biológicas da molécula que ocorre naturalmente. As substituições de aminoácidos incluem alterações na qual um aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido diferente de ocorrênica natural ou um resíduo de aminoácido não convencional. Tais substituições podem ser classificadas como "conservativas", caso em que um resíduo de aminoácido contido em um polipeptídeo é substituído por outro aminoácido de ocorrência natural de característica semelhante quer em relação à polaridade, a funcionalidade ou o tamanho da cadeia lateral. Tais substituições conservativas são bem conhecidas na técnica. Substituições contidas pela presente invenção podem também ser "não conservativas", em que um resíduo de aminoácido que está presente em um peptídeo é substituído por um aminoácido que tem propriedades diferentes, tais como aminoácidos de ocorrência natural de um grupo diferente (por exemplo, substituição de um aminoácido carregado ou hidrofóbico com alanina), ou, alternativamente, em que um aminoácido de ocorrência natural é substituído por um aminoácido não- convencional. Em algumas modalidades as substituições de aminoácidos são conservativas. Também contidos dentro do termo variante, quando usado com referência a um polinucleotídeo ou polipeptídeo, refere-se a um polinucleotídeo ou polipeptídeo que pode variar em termos de estrutura primária, secundária ou terciária, quando comparado a um polinucleotídeo ou polipeptídeo de referência, respectivamente (por exemplo, em comparação com um polinucleotídeo ou polipeptídeo de tipo selvagem).

[105] As variantes também podem ser polinucleotídeos ou polipeptídeos sintéticos, recombinantes ou quimicamente modificados isolados ou gerados através de métodos bem conhecidos na técnica. As variantes podem incluir mudanças conservativas e não conservativas de aminoácidos, tal como descrito abaixo. Alterações polinucleotídicas podem resultar em substituições de aminoácidos, adições, deleções, fusões e truncagens no polipeptídeo codificado pela sequência de referência. As variantes também podem incluir inserções, deleções ou substituições de aminoácidos, incluindo inserções e substituições de aminoácidos e outras moléculas) que normalmente não ocorrem na sequência peptídica que é a base da variante, por exemplo, mas não se limitando a inserção de ornitina que normalmente não ocorrem em proteínas humanas. O termo "substituição conservativa", quando se descreve um polipeptídeo, se refere a uma mudança na composição de aminoácidos do polipeptídeo que não altere substancialmente a atividade do polipeptídeo. Por exemplo, uma substituição conservativa refere-se à substituição de um resíduo de aminoácido por um resíduo de aminoácido diferente, que tem propriedades químicas similares. Substituições de aminoácidos conservativas incluem a substituição de uma leucina por uma isoleucina ou valina, um aspartato com um glutamato, ou uma treonina com uma serina.

[106] "Substituições de aminoácidos conservativas" resultam da substituição de um aminoácido por outro com propriedades estruturais e/ou químicas semelhantes, tais como a substituição de uma leucina por uma isoleucina ou valina, um aspartato com um glutamato, ou uma treonina com uma serina. Assim, uma "substituição conservativa" de uma sequência de aminoácidos particular, refere-se a substituição destes aminoácidos que não são críticos para a atividade do polipeptídeo ou a substituição de aminoácidos com outros aminoácidos que possuem propriedades semelhantes (por exemplo, ácidos, básicos, carregados positivamente ou negativamente , polar ou não-polar, etc), de modo que a substituição de até mesmo aminoácidos críticos não reduz a atividade do peptídeo, (isto é, a capacidade do peptídeo para penetrar a barreira hemato-encefálica (BBB)). Tabelas de substituições conservativas que fornecem aminoácidos funcionalmente semelhantes são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, um dos seis grupos seguintes contêm cada um aminoácidos que são substituições conservativas entre si: 1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T); 2) Ácido aspártico (D), ácido glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); e 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W). (Ver também Creighton, Proteins, WH Freeman and Company (1984), incorporado por referência na sua totalidade.) Em algumas modalidades, substituições individuais, deleções ou adições que alteram, adicionam ou excluem um único aminoácido, ou uma pequena porcentagem de aminoácidos pode também ser considerada "substituições conservativas" se a modificação não reduz a atividade do peptídeo. As inserções ou deleções são tipicamente na faixa de cerca de 1 a 5 aminoácidos. Os aminoácidos conservativos de escolha podem ser selecionados com base na localização do aminoácido a ser substituído no peptídeo, por exemplo, se o aminoácido está no exterior do peptídeo e exposto a solventes, ou no interior e não exposto a solventes.

[107] Em modalidades alternativas, pode-se selecionar o aminoácido que irá substituir um aminoácido existente com base na localização do aminoácido existente, ou seja, a sua exposição a solventes (por exemplo, se o aminoácido está exposto a solventes ou está presente na superfície externa do peptídeo ou polipeptídeo, em comparação com os aminoácidos localizados internamente não expostos a solventes). Seleção de tais substituições conservativas de aminoácidos são bem conhecidas na técnica, por exemplo, como divulgado em Dordo e cols., J. Mol. Biol, 1999, 217, 721-739 e Taylor e cols, J. Theor. Biol. 119 (1986); 205-218 e S. French e B. Robson, J. Mol. Evol. 19 (1983) 171. Em consequência, pode-se selecionar substituições de aminoácidos conservativas adequadas para aminoácidos no exterior de uma proteína ou peptídeo (isto é, os aminoácidos expostos ao solvente), por exemplo, mas não limitado a, as seguintes substituições podem ser utilizadas: a substituição de Y com F, T com S ou K, P com A, E com D ou Q, N com D ou G, R com K, G com N ou A, T com S ou K, D com N ou E, I com L ou V, F com Y, S com T ou A, R com K, G com N ou A, K com R, A com S, K ou P.

[108] Em modalidades alternativas, também é possível selecionar substituições de aminoácidos conservativas adequadas para aminoácidos contidos no interior de uma proteína ou um peptídeo, por exemplo, pode- se utilizar as substituições de aminoácidos conservativas adequadas no interior de uma proteína ou peptídeo (ou seja, os aminoácidos não são expostos a um solvente), por exemplo, mas não limitado a, pode-se utilizar as seguintes substituições conservativas: em que Y é substituído com F, T com A ou S, I com L ou V, W com Y, M com L, N com D, G com A, T com A ou S, D com N, I com L ou V, F com Y ou L, S com A, ou T e A com S, G, T, ou V. Em algumas modalidades, substituições de aminoácidos conservativas estão também contidas dentro do termo variantes.

[109] O termo "derivado", tal como aqui utilizado refere-se a peptídeos que foram quimicamente modificados, por exemplo, mas não limitados a, tais como por técnicas de ubiquitinação, marcação, peguilação (derivatização com polietilenoglicol), lipidação, glicosilação ou adição de outros moléculas. Uma molécula também é um "derivado" de uma outra molécula quando contém porções químicas adicionais que não fazem normalmente parte da molécula. Tais porções podem melhorar a solubilidade da molécula, absorção, meia-vida biológica, etc As porções podem, em alternativa, diminuir a toxicidade da molécula, eliminar ou atenuar qualquer efeito colateral indesejável da molécula, etc. As porções capazes de mediar tais efeitos são divulgados em Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18a edição, AR Gennaro, ed., MackPubl., Easton, PA (1990), aqui incorporado, por referência, na sua totalidade.

[110] Deste modo, em certos aspectos de todas as modalidades da invenção, os peptídeos da invenção compreendem os derivados de peptídeos, tais como peptídeos peguilados.

[111] O termo "funcional" quando utilizado em conjunto com "derivado" ou "variante" refere-se a um peptídeo da invenção, que possui uma atividade biológica (tanto funcional ou estrutural) que é substancialmente semelhante a atividade biológica da entidade ou molécula que é um derivado funcional ou variante funcional deste, isto é, atividade anti-inflamatória, no contexto dos peptídeos aqui descritos. O termo derivado funcional destina-se a incluir os fragmentos, análogos ou derivados químicos de uma molécula.

[112] A expressão "inserção" ou "deleção" é tipicamente na faixa de cerca de 1 a 5 aminoácidos. A variação permitida pode ser determinada experimentalmente através da produção do peptídeo sintético, enquanto fazendo sistematicamente inserções, deleções ou substituições de nucleotídeos na sequência, utilizando técnicas de DNA recombinante.

[113] O termo "substituição" quando se refere a um peptídeo, refere-se a uma mudança de um aminoácido por uma entidade diferente, por exemplo, outro aminoácido ou outra porção de aminoácido. As substituições podem ser substituições conservativas ou não conservativas.

[114] Um "análogo" de uma molécula tal como um peptídeo refere-se a uma molécula semelhante em função, quer à molécula inteira ou a um fragmento do mesmo. O termo "análogo" também se destina a incluir espécies alélicas e variantes induzidas. Análogos tipicamente diferem dos peptídeos que ocorrem naturalmente em uma ou algumas posições, muitas vezes em virtude de substituições conservativas. Os análogos apresentam tipicamente pelo menos 80 ou 90% de identidade de sequência com os peptídeos naturais. Alguns análogos também incluem os aminoácidos não naturais ou modificações N ou C-terminal de aminoácidos. Exemplos de aminoácidos não naturais são, por exemplo, mas não limitados a; aminoácidos dissubstituídos, aminoácidos de N-alquila, ácido láctico, 4-hidroxiprolina, gama- carboxiglutamato, ε-N,N,N-trimetil-lisina, ε-N-acetil- lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3- -metil-histidina, 5-hidroxilisina, o-N-metilarginina. Os fragmentos e análogos podem ser testados quanto à eficácia profilática ou terapêutica em modelos de animais transgênicos, tal como descrito abaixo.

[115] O termo "ligado covalentemente" significa que se juntou, quer diretamente ou indiretamente (por exemplo, através de um ligante), por uma ligação química covalente. Em alguns aspectos de todas as modalidades da invenção, os peptídeos de fusão são ligados de forma covalente.

[116] O termo "proteína de fusão", tal como aqui utilizado, refere-se a uma proteína recombinante de duas ou mais proteínas. As proteínas de fusão podem ser produzidas, por exemplo, por uma sequência de ácido nucleico que codifica para uma proteína que é ligada ao ácido nucleico que codifica para uma outra proteína de tal modo que elas constituem uma única face aberta de leitura que pode ser traduzida nas células em um único polipeptídeo que contém todas os proteínas pretendidas. A ordem de disposição das proteínas pode variar. As proteínas de fusão podem incluir um marcador de epítopo, ou um extensor de meia-vida. Marcadores de epítopo incluem biotina, marcador FLAG, c-myc, hemaglutinina, 6 His (SEQ ID NO: 37), digoxigenina, FITC, Cy3, Cy5, proteína fluorescente verde, marcadores de epítopo V5, GST, β-galactosidase, AU1, AU5, e avidina. Extensores de meia-vida incluem domínio Fc e albumina sérica.

[117] O termo "sujeito" e "indivíduo" e "paciente" são aqui utilizados alternadamente, e referem-se a um animal, por exemplo um animal humano ou não-humano (por exemplo, um mamífero), para os quais o tratamento, incluindo o tratamento profilático, com uma composição farmacêutica, tal como aqui divulgado, é fornecida. O termo "indivíduo" como aqui utilizado refere-se a humanos e animais não-humanos. O termo "animais não-humanos" inclui todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos, como os primatas não-humanos, (principalmente grandes primatas), ovelhas, cães, roedores (por exemplo, camundongo ou o rato), cobaias, cabras, porcos, gatos, coelhos, vacas, e não mamíferos tais como aves, anfíbios, répteis, etc. Em uma outra modalidade, o indivíduo é humano. Em uma outra modalidade, o indivíduo é um animal experimental ou um substituto animal como um modelo de doença. Mamíferos não-humanos incluem mamíferos, como os primatas não-humanos, primatas (principalmente grandes primatas), ovelhas, cães, roedores (por exemplo, camundongo ou rato), cobaias, cabras, porcos, gatos, coelhos e vacas. Em alguns aspectos, o animal não-humano é um animal de companhia, tal como um cão ou um gato.

[118] "Tratamento" de uma doença ou condição em um indivíduo, ou "tratamento" de um paciente com uma doença ou condição refere-se a submeter o indivíduo a um tratamento farmacêutico, por exemplo, a administração de um fármaco, de tal forma que pelo menos um sintoma da doença ou condição é reduzido ou estabilizado. Tipicamente, quando o peptídeo é administrado terapeuticamente para o tratamento, é administrado a um indivíduo que apresenta um ou mais sintomas de inflamação.

[119] O termo "prevenção" é usado em conecção à prevenção dos sintomas ou o retardamento do desenvolvimento dos sintomas do tempo de estado assintomático. Tipicamente, quando o peptídeo é administrado preventivamente, é administrado a um indivíduo que não apresenta os sintomas de inflamação iminentes. Normalmente, o indivíduo está em risco de desenvolver a inflamação, tais como diabetes ou DPOC, devido ao histórico familiar, resultados laboratoriais, testes genéticos ou estilo de vida. Em alguns aspectos, a "prevenção" refere-se a administração dos peptídeos à vítimas de queimaduras ou de pessoas que tenham sido submetidas a exposição a radiação aguda antes do desenvolvimento de endotoxemia nestes indivíduos, que estão em risco de desenvolvimento de endotoxemia, como resultado de danos nos tecidos causados por queimaduras ou radiação.

[120] O termo "liga-se especificamente" ou "ligação específica" significa um composto ou um anticorpo que reconhece e se liga a um polipeptídeo desejado, mas que não reconhece substancialmente e se liga a outras moléculas em uma amostra, por exemplo, uma amostra biológica, que inclui naturalmente um polipeptídeo da invenção. A ligação específica pode ser caracterizada por uma constante de dissociação de, pelo menos, cerca de 1x10-6 M ou menor. Em outras modalidades, a constante de dissociação é, pelo menos, cerca de 1x10-7 M, 1x10-8 M, ou 1x10-9 M. Os métodos para determinar se as duas moléculas se ligam especificamente são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, diálise de equilíbrio, ressonância de plasma de superfície, e semelhantes.

[121] O termo "isolado" entende-se que o polipeptídeo foi separado a partir de qualquer meio natural, tal como um fluido corporal, por exemplo, sangue, e separado dos outros componentes que acompanham naturalmente o peptídeo.

[122] Por “isolado” ou "substancialmente puro" significa um polipeptídeo que foi separado e purificado até, pelo menos, algum grau a partir dos componentes que o acompanham naturalmente. Tipicamente, um polipeptídeo é substancialmente puro quando está pelo menos cerca de 60%, ou pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, ou mesmo pelo menos cerca de 99%, por peso, livre de proteínas e moléculas orgânicas de ocorrência natural com a qual está naturalmente associado. Por exemplo, um polipeptídeo substancialmente puro pode ser obtido por extração a partir de uma fonte natural, por expressão de um ácido nucleico recombinante em uma célula que normalmente não expressa a proteína, ou por síntese química.

[123] O termo "redução" ou "inibição" utilizada no contexto do nível de, por exemplo, os níveis de TNF-alfa refere-se à redução da quantidade de proteína na amostra biológica, tal como sangue ou amostra de tecido, uma célula, um extrato celular, ou um sobrenadante celular. Por exemplo, um tal decréscimo pode ser devido à reduzida estabilidade de RNA, transcrição, ou tradução, aumento da degradação da proteína ou RNA de interferência. De preferência, esta redução é de pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, ou mesmo pelo menos cerca de 90% em comparação com um valor de referência.

[124] O termo "valor de referência", no âmbito das reivindicações e do pedido refere-se tipicamente a um nível anormalmente elevado de TNF-alfa encontrado em um indivíduo afetado com ou sofrendo de inflamação. O valor de referência é tipicamente a quantidade de TNF-alfa no indivíduo antes da administração do peptídeo da invenção. Em alguns aspectos de todas as modalidades em relação ao controle glicêmico, o termo "valor de referência" refere-se aos valores numéricos utilizados para medir o controle glicêmico em um indivíduo. Há uma série de testes que podem ser utilizados para determinar se, por exemplo, um indivíduo humano é afetado com pré-diabetes. Tais testes incluem, por exemplo, o teste de A1C, teste de glicose no plasma em jejum (FPG), e o teste de tolerância à glicose oral (OGTT). Exemplos de valores de referência que utilizam estes métodos seguem: os indivíduos pré-diabéticos normalmente apresentam pontuação igual ou superior a 5,7% para menos de 6,5% no teste A1C, enquanto diabéticos pontuam mais de 6,5% neste teste. Indivíduos pré- diabéticos também pontuam tipicamente igual ou superior a 100 mg/dl para menos de 126 mg/dl usando o teste FPG ao passo que os diabéticos apresentam pontuação superior a 126 mg/dl. Indivíduos pré-diabéticos tipicamente pontuam mais de 140 para menos de 200 mg/dl através do teste OGTT enquanto indivíduos diabéticos apresentam pontuação superior a 200 mg/dl. Assim, referindo-se a um valor de referência normoglicêmico, pode-se utilizar os seguintes números de corte quando a medição é realizada utilizando os testes acima mencionados: teste A1C — inferior a 5,7%; teste FPG, inferior a 100 mg/dl; e OGTT inferior a 140 mg/dl.

[125] Por um "aumento" na expressão ou atividade de um gene ou proteína significa uma variação positiva do nível de ácido nucleico ou atividade da proteína em uma célula, extrato celular, ou um sobrenadante celular. Por exemplo, um tal aumento pode ser devido a um aumento da estabilidade do RNA, transcrição, ou tradução, ou diminuição da degradação de proteínas. De preferência, este aumento é, pelo menos, 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 100%, pelo menos cerca de 200 % ou até cerca de 500% ou mais superior ao nível de expressão ou atividade sob condições controle.

[126] O termo "recombinante", como aqui usado para descrever uma molécula de ácido nucleico, significa um polinucleotídeo de origem genômica, DNAc, viral, semi- sintético, e/ou sintético, o qual, em virtude da sua origem ou manipulação, não está associada com a totalidade ou uma porção do polinucleotídeo com o qual está associado na natureza. O termo recombinante conforme utilizado em relação a uma proteína ou polipeptídeo, significa um polipeptídeo produzido por expressão de um polinucleotídeo recombinante. O termo recombinante como utilizado com respeito a uma célula hospedeira siginifica uma célula hospedeira em que um polinucleotídeo recombinante tenha sido introduzido. Recombinante também é aqui utilizado para referir-se, com referência ao material (por exemplo, uma célula, um ácido nucleico, uma proteína, ou um vetor) que o material tenha sido modificado pela introdução de um material heterólogo (por exemplo, uma célula, um ácido nucleico, uma proteína, ou um vetor).

[127] O termo "vetor" refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual tenha sido ligado; um plasmídeo é uma espécie do gênero contido por "vetor". O termo "vetor" refere-se tipicamente a uma sequência de ácido nucleico contendo uma origem de replicação e outras entidades necessárias para a replicação e/ou a manutenção em uma célula hospedeira. Os vetores capazes de direcionar a expressão de genes e/ou sequência de ácido nucleico ao qual estão ligados operacionalmente, são aqui referidos como "vetores de expressão". Em geral, vetores de expressão de uso são muitas vezes sob a forma de "plasmídeos", que se referem a voltas de DNA de cadeia dupla circular que, em sua forma vetorial não estão ligados ao cromossomo e, normalmente, compreendem entidades para a expressão estável ou transitória ou do DNA codificado. Outros vetores de expressão podem ser utilizados nos métodos, por exemplo, tal como aqui descrito, mas não estão limitados a, plasmídeos, epissomas, cromossomas artificiais bacterianos, cromossomas artificiais de levedura, bacteriófagos ou vetores virais, e tais vetores podem integrar no genoma do hospedeiro ou replicar de forma autónoma em uma célula particular. Um vetor pode ser um vetor de DNA ou RNA. Outras formas de vetores de expressão conhecidos pelos peritos no assunto, que servem a funções equivalentes também podem ser utilizados, por exemplo, vetores extracromossômicos auto-replicantes ou vetores que se integram em um genoma hospedeiro. Os vetores preferidos são aqueles capazes de replicação autônoma e/ou expressão de ácidos nucleicos aos quais estão ligados. Os vetores capazes de dirigir a expressão de genes aos quais estão operacionalmente ligados, são aqui referidos como "vetores de expressão".

[128] O termo "vetores virais" refere-se à utilização de vírus ou vetores associados a vírus como transportadores de uma construção de ácido nucleico para uma célula. As construções podem ser integradas e embaladas em genomas virais defeituosos não replicantes, como adenovírus, vírus adeno-associado (AAV), ou vírus do herpes simplex (HSV), ou outros, incluindo vetores lentivirais e retrovirais, por infecção ou transdução em células. O vetor pode ou não ser incorporado no genoma da célula. As construções podem incluir sequências virais para transfecção, se desejado. Alternativamente, a construção pode ser incorporada em vetores capazes de replicação epissômica, por exemplo, a vetores de EPV e EBV.

[129] Os artigos "um" e "uma" são aqui utilizados para se referir a um ou a mais do que um (isto é, pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, "um elemento" significa um elemento ou mais de um elemento. Exceto nos exemplos operativos, ou onde indicado em contrário, todos os números que expressam quantidades de ingredientes ou condições de reação aqui utilizados devem ser entendidos como modificados em todos os casos pelo termo "cerca de". O termo "cerca de" quando usado em conexão com percentagens pode significar 1%. A presente invenção é ainda explicada em detalhe pelos exemplos que se seguem, mas o escopo da invenção não deve ser limitada aos mesmos.

[130] Deve ser entendido que esta invenção não está limitada à metodologia, protocolos e reagentes, etc, específicos aqui descritos e, como tal, podem variar. A terminologia aqui utilizada é para o propósito de descrever apenas modalidades particulares, e não se destina a limitar o escopo da presente invenção, que é definida somente pelas reivindicações. Outras características e vantagens da invenção serão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada, desenhos, e reivindicações.

Os métodos de tratamento da invenção

[131] Um aspecto da presente invenção refere-se à utilização dos peptídeos aqui descritos e os mutantes, variantes, análogos ou derivados dos mesmos. Especificamente, estes métodos referem-se a administração de qualquer um dos peptídeos, tal como aqui descritos ou suas modificações farmaceuticamente aceitáveis em um veículo farmaceuticamente aceitável a um indivíduo, por exemplo, um mamífero em necessidade do mesmo, por exemplo, um ser humano, ou seja, um indivíduo que tenha inflamação ou ou destruição autoimune dos tecidos, ou um indivíduo com hiperglicemia, ou controle glicêmico comprometido, tal como um indivíduo com diabetes tipo 2, e na necessidade de proteger e/ou estimular a expansão da massa de células beta, ou um indivíduo diagnosticado com fibrose cística, ou um indivíduo em alto risco de desenvolver a endotoxemia, como resultado de queimaduras ou de exposição a radiação aguda. Além disso, oferecemos tratamento de lúpus e doença enxerto versus hospedeiro, uveíte, eczema, psoríase, IBD, e diabetes do tipo I de novo início.

[132] Descrições clínicas destas doenças são bem conhecidos. Em alguns aspectos, o humano é primeiro diagnosticado como tendo um ou mais dos sintomas da doença, antes de se administrar um ou mais dos peptídeos da invenção. Em algumas modalidades, o humano não foi previamente administrado com AAT como um tratamento para os sintomas.

[133] Por exemplo, temos mostrado em modelos pré- clínicos de camundongos estabelecidos para as doenças humanas, incluindo diabetes tipo II (db/db), artrite reumatóide (CAIA) e endotoxemia letal que, por exemplo, o peptídeo SP16 melhora significativamente os sintomas.

[134] Nós também fornecemos evidências de que, por exemplo, o peptídeo SP16 pode ser administrado com segurança usando estudos de segurança pré-clínicos bem estabelecidos. Por exemplo, também têm sido mostrado usando ensaio FastPatch que, por exemplo, o peptídeo SP16 não afeta a atividade hERG e também não fomos capazes de identificar qualquer acesso em estudo de filtragem de receptor humano (GenSEP Explorer) para o peptídeo SP16.

[135] Os camundongos db/db apresentam um receptor da leptina defeituoso que prejudica sua capacidade de regular o apetite eo metabolismo. Os animais se tornam obesos na idade de 3-4 semanas, e inicialmente mostram resistência à insulina, que é seguido por hiperglicemia em cerca de 4-8 semanas de idade. Hiperglicemia grave é acompanhada por esgotamento das células beta produtoras de insulina das ilhotas pancreáticas e morte por 10 meses de idade.

[136] Os modeos de animais db/db modelam as diferentes fases do Diabetes Tipo II em humanos (Figura 14). Nós demonstrámos que os peptídeos da invenção proporcionam benefícios nas fases precoce e tardia da doença. Por exemplo, nós mostramos que SP 16 melhora o controle glicêmico no modelo db/db.

[137] A glicose no sangue e os níveis de HbAlc mostraram que o tratamento com SP16 reduz hiperglicemia e melhora o controle glicêmico. Neste estudo, camundongos db/db pré-diabéticos de cinco semanas de idade foram distribuídos em grupos de 10. Os grupos receberam solução salina (veículo controle), SP16 O,6 mg/kg duas vezes por semana ou 25 mg/kg de Rosiglitazona duas vezes por semana. Níveis de glicose no sangue fora do jejum foram determinadas duas vezes por semana com o uso de um glicosímetro. Níveis de HbA1c foram determinadas usando o monitor "AlcNow". Os valores representam as médias de cada grupo. (**) Indica p<0,01 (*) indica p<0,05 comparado ao grupo veículo controle (T-test). Ver a Figura 8A. Sabe-se também que o valor de normalização alvo para pacientes humanos com diabetes também é verdadeiro para o camundongo normal, estabelecendo, assim, os resultados a partir do modelo de camundongo diretamente relevante para a diabetes tipo II humana.

[138] As Figuras 8B e 8D exemplificam um gráfico que resume os níveis séricos de peptídeo C (8B) e hiperplasia das ilhotas (8D) no modelo do camundongo db/db de diabetes tipo II. Níveis aumentados de peptídeo C no soro são consistentes com a função melhorada das células β nos grupos tratados. Camundongos pré-diabéticos db/db de cinco semanas de idade foram distribuídos em grupos de 10. Grupos receberam solução salina (simulado), SP16 0,6 mg/kg ou de rosiglitazona 25 mg/kg duas vezes por semana. Níveis reunidos de peptídeo C no soro foram determinados para cada grupo. (*) Indica p<0,05 e (**) p<0,01 em comparação com o veículo controle.

[139] Também foi demonstrado que SP16 reduziu os níveis séricos de CRP quando comparado ao veículo controle (Figura 8E). Níveis de CRP diminuidos são consistentes com a redução da inflamação no grupo de camundongos tratado com SP16. Do mesmo modo, o aumento dos níveis de TGF-beta em camundongos tratados com SP16 são consistentes com a promoção de um perfil de citocinas anti-inflamatórias pelo tratamento com peptídeo (Figura 8F). Nós distribuimos camundongos db/db diabéticos de oito semanas de idade em 8 grupos. Grupos receberam solução salina (simulado) ou SP16 a 0,6 mg/kg quinzenalmente durante 12 semanas. Os níveis agrupados de CRP e TGF-beta no soro foram determinados para cada grupo. (*) Indica p<0,05 e (**) p<0,01 em comparação com o grupo veículo controle.

[140] O modelo pré-clínico de artrite reumatóide CAIA é uma breve estudo em que a artrite é induzida nos camundongos Balb/c. No Dia 0, os animais são injetados por via intravenosa com um coquetel de anticorpos de colágeno (MD Biosciences), que inicia a destruição autoimune do colágeno nas articulações. No Dia 3, de uma injeção de LPS intra-peritoneal é utilizada para exacerbar a reação autoimune e inflamação. A leitura neste modelo é o inchaço da pata e avaliação histológica da erosão das articulações. A doença geralmente começa a reduzir após 7-10 dias.

[141] Nós demonstramos que SP16 mostra eficácia no modelo de camundongo pré-clínico CAIA. Especificamente, nós medimos pontuação de inchaço cumulativas em todas as patas no auge da doença (dia 7) para grupos de 5 animais. Camundongos Balb/c foram injetados IV com um coquetel de anticorpos de colágeno (MD Biosciences) no Dia 0 e injetados com LPS IP no Dia 3. Controle de animais normal que não recebeu injeção serviu como controle de linha de base livre de doença. Injeção diária de 12 μg/dia de SP16, forneceu uma proteção equivalente à dexametasona e injeções de 12 μg uma vez a cada 3 dias reduziu a inflamação em quase 50% em comparação com o tratamento com o veículo controle. Ver, por exemplo, a Figura 9.

[142] Também foi mostrado que SP16 reduz a secreção de metaloproteinase-1 de matriz (MMP-1) em um ensaio baseado em célula que refletindo os resultados a partir do modelo vivo CAIA para a artrite reumatóide. As células foram incubadas com 10 μM dos peptídeos indicados, bem como 0, 5, 10, ou 30 ng/ml IL1b, durante 48 horas. Após a estimulação com IL1b, as células secretam a metaloprotease MMP1, que está envolvida na quebra da matriz extracelular na artrite. O ensaio foi feito em triplicata e as médias com desvios padrão estão representados. SP16 reduziu a secreção de MMP1 em comparação com os peptídeos controle misturados, a 20 ng/ml de IL1b. (*) Indica p<0,05 comparado com o peptídeo controle misturado. Ver, por exemplo, a Figura 15.

[143] Utilizou-se o modelo de endotoxemia letal como um indicador para a proteção contra sepse durante a síndrome de radiação aguda. O lipopolissacarídeo (LPS) é uma endotoxina purificada a partir de bactérias gram- negativas. Em animais, o LPS provoca uma resposta imunológica forte, como evidenciado pelo aumento dos níveis de citocinas pro-inflamatórias no soro e letalidade em doses elevadas. Em síndrome de radiação aguda, bactérias gram- negativas vazando do sistema gastrointestinal contribuem para uma síndrome de resposta inflamatória sistêmica e letalidade. No modelo animal, o peptídeo foi administrado no tempo T = -2 horas, T = 0 hora ou T = 0,5 hora. LPS foi injetado em T = 0 horas. Nós mostramos que SP16 aumenta a sobrevida em endotoxemia letal permitindo-nos extrapolar que o peptídeo poderia proporcionar tratamento em vítimas humanas de queimaduras ou na síndrome de radiação aguda humana. Grupos de 10 animais foram injetados, como indicado, durante 2 horas antes, no momento, e/ou 0,5 horas após a indução de endotoxemia letal. A endotoxemia foi induzido por injecão de LPS a 15 mg/kg. A sobrevivência foi monitorizada em intervalos de tempo de 4, 8, 24, 28, 32, 48, 52, 56 e 72 horas (Figura 7).

[144] Portanto, em um aspecto nós fornecemos métodos para o tratamento de diabetes tipo II, artrite reumatóide e endotoxemia causada por queimaduras e/ou radiação que compreende a administração a um paciente humano em necessidade do mesmo de uma composição que compreende pelo menos um dos peptídeos de acordo com a invenção. Em alguns aspectos, o peptídeo compreende SP16.

[145] Demonstrámos que os peptídeos da invenção, por exemplo, SP16 são agonistas de receptor do tipo Toll 2 (toll like receptor-2, TLR-2). Assim, e sem querer estar ligado por uma teoria, os peptídeos, tais como SP16, agem como uma droga anti-inflamatória através da promoção de um perfil de citocina anti-inflamatório. Além disso, sem querer estar limitado por uma teoria, os peptídeos, tais como SP16, também podem atuar como imunomoduladores induzindo expansão de células tolerogênicas e células reguladoras T de proteção (T-regs). Além disso, sem se pretender ficar limitado por uma teoria, os peptídeos, tais como SP16, também pode regular negativamente as respostas autoimunes sem induzir supressores imunológicos gerais, proporcionando assim um tratamento superior para as doenças autoimunes, em comparação com a maior parte dos tratamentos atualmente disponíveis que geralmente suprimem o sistema imunológico expondo os indivíduos tratados ao risco de infecções durante o tratamento com os agentes imunossupressores gerais.

[146] Como os peptídeos são derivados a partir de AAT, e tendo em vista os resultados dos modelos in vivo e in vitro , é razoável esperar que a maior parte dos efeitos terapêuticos de AAT se apliquem também aos peptídeos da invenção, tais como SP16. Especificamente, AAT tem sido mostrado como modulador da proliferação de células T e a ativação de NF-kappa-B; diminuir a interação célula-alvo de NK; inibir ativação de serina proteases da sinalização EGFR/TLR-4 das células epiteliais; estar envolvido na expressão gênica induzida por TNF-alfa e apoptose ou células endoteliais; evitar hemólise de glóbulos vermelhos por E. coli, diminuir a contagem de eusinófilos circulantes; inibir a quimiotaxia de neutrófilos, NADHP oxidase e sinalização ANCA; inibe liberação de citocinas de monócitos e macrófagos e regulação da expressão de CD14, e inibir a liberação de histamina dos mastócitos; e modulação da proliferação de células B e produção de citocinas.

[147] Portanto, em algumas modalidades, são fornecidos métodos para a modulação da proliferação de células T e a ativação de NF-kappa-B; evitar a interação célula-alvo NK; inibir ativação de serina proteases da sinalização EGFR/TLR-4 de células epiteliais; modular a expressão gênica de TNF-alfa e a apoptose ou células endoteliais; prevenir a hemólise de glóbulos vermelhos por E. coli, diminuição da contagem de eusinófilos circulante; inibição da quimiotaxia de neutrófilos, NADHP oxidase e sinalização ANCA; inibição da liberação de citocinas por monócitos e macrófagos e regulação da expressão de CD14, e inibição da liberação de histamina por mastócitos; e modular a proliferação de células B e a produção de citocinas que compreende a etapa de administrar a um indivíduo humano uma composição que compreende pelo menos um dos peptídeos da invenção. Em alguns aspectos, o peptídeo é SP16, o qual pode compreender um ou mais modificações tipicamente realizadas para melhorar a biodisponibilidade e/ou vida de prateleira dos peptídeos, como peguilação e semelhantes.

[148] Também realizamos um ensaio de otimização do peptídeo usando uma varredura de alanina com o ensaio TLR- 2. Os dados foram obtidos através de um experimento com uma linha celular indicadora projetada de TLR-2 (HEK-BLUE™ mTLR2, Invivogen). As células foram incubadas com 20 μg/ml dos peptídeos indicados durante 24 horas. Após a ativação de TLR2, as células secretam fosfatase alcalina, que pode ser medida. O ensaio foi feito em triplicata e as médias estão apresentadas. O peptídeo SP34 é um controle de peptídeo misturado (amarelo) e PAM (Pam3CSK4; vermelho) é um controle positivo. Ver, por exemplo, a Figura 12.

[149] A tabela a seguir apresenta os resultados de um ensaio para perfil farmacocinético do SP16.

[150] Na realização do ensaio, três ratos normais foram injetados por via intravenosa com 5 mg/kg de SP16 e a concentração plasmática de SP16 foi determinada em 8 pontos de tempo após a injeção. Para cada ponto de tempo, os níveis de SP16 foram determinadas por LC/MS/MS e os valores foram utilizados para calcular a Cmax (2,5 μg/ml) e Tl/2 (1,9 horas). O ensaio foi realizado por Apredica, Boston, MA. Deste modo, determinou-se que SP16 tem uma meia-vida de 1,9 horas, em camundongos normais.

[151] O perfil de segurança de SP16 também incluiu dados hERG. O ensaio de hERG FastPatch mostrou que SP16 não inibe hERG em até a dose de 25 μM. Estes dados prevêm que SP16 não terá problemas de segurança cardíaca em humanos. O estudo foi realizado por Apredica, Boston, MA.

[152]

[153] Além disso, também foi realizado um perfil usando filtrado de receptor humano. O painel GenSEP Explorer contém 111 alvos de ensaio in vitro cuidadosamente selecionados para avaliar as atividades biológicas de drogas/químicos. Categorias de ensaio incluem GPCRs, canais iônicos voltagem-dependentes, canais iônicos bloqueados por ligante, transportadores de neurotransmissor, receptores nucleares e esteróides, bem como um conjunto diversificado de alvos bioquímicos incluindo fosfodiesterases, cinases e outras enzimas relevantes. O estudo foi realizado por Caliper LifeSciences, e os resultados estão resumidos na tabela abaixo. Parece que SP16 não apresentou nenhum efeito sobre os 111 receptores humanos, indicando que SP16 tem um excelente perfil de segurança humano.

[154] Em virtude do perfil de segurança de SP16, é razoável extrapolar que os outros fragmentos peptídicos aqui fornecidos também seriam seguros para a administração em humanos.

[155] Em uma modalidade, os métodos de tratamento aqui descritos, compreendem ainda a seleção ou diagnóstico de um indivíduo que tem qualquer uma das condições acima descritas, por exemplo, uma inflamação resultante de antes da administração de um peptídeo, tal como aqui revelado, ou um mutante, variante, análogo ou derivado do mesmo, para tratar desse modo a condição ou disfunção, tal como a inflamação. Essa seleção é realizada pelo técnico no assunto por um número de métodos disponíveis, por exemplo, a avaliação dos sintomas que são aqui descritos. Por exemplo, pode-se avaliar a quantidade de TNF-alfa no indivíduo para determinar a quantidade de inflamação presente no indivíduo. No caso da diabetes, pode-se medir o controle glicêmico usando os níveis bem definidos de glicose no sangue. Em alguns aspectos de todas as modalidades da invenção, os peptídeos podem ser administrados a indivíduos em fase pré-diabética para prevenir o desenvolvimento da diabetes tipo 2. Há uma série de testes que podem ser utilizados para determinar se, por exemplo, um indivíduo humano é afetado com pré-diabetes. Tais testes incluem, por exemplo, o teste de AIC, teste de glicose no plasma em jejum (FPG), e o teste de tolerância à glicose oral (OGTT). Indivíduos pré-diabéticos normalmente apresentam pontuação igual ou superior a 5,7% para menos de 6,5% no teste AIC, enquanto diabéticos pontuam mais de 6,5% neste teste. Indivíduos pré-diabéticos também pontuam tipicamente igual ou superior a 100 mg/dl para menos de 126 mg/dl por meio do teste de FPG ao passo que os diabéticos apresentam pontuação superior a 126 mg/dl. Indivíduos pré-diabéticos tipicamente pontuam pelo ou mais de 140 para menos de 200 mg/dl através do teste OGTT enquanto indivíduos diabéticos apresentam pontuação superior a 200 mg/dl. Assim, um método de prevenção da diabetes de acordo com a presente invenção pode compreender a administração do peptídeo a um indivíduo que tenha sido previamente diagnosticado como pré-diabético, por exemplo, utilizando qualquer um dos métodos acima descritos. Em alguns aspectos, o método compreende a identificação de diabetes do tipo 2 no indivíduo e, em seguida, a administração do peptídeo sintético da presente invenção ao indivíduo.

[156] Em alguns aspectos de todas as modalidades, pode-se utilizar a proteína C-reativa, como um marcador para a inflamação ou eficácia do tratamento. Proteína C-reativa (PCR) é usada para detectar a inflamação se houver uma forte suspeita de lesão do tecido ou infecção em algum lugar no corpo. CRP serve como um marcador geral de infecção e inflamação e pode ser usado para avaliar doença inflamatória aguda ou crônica em um indivíduo. Uma quantidade elevada ou crescente de CRP no sangue sugere a presença de inflamação. Em indivíduos suspeitos de terem uma infecção bacteriana grave, um CRP elevado sugere a presença de um. Em pessoas com condições inflamatórias crônicas, altos níveis de CRP sugerem irrompimento ou que o tratamento não foi eficaz. A concentração normal no soro humano saudável é geralmente menor do que 10 mg/L, aumentando ligeiramente com o envelhecimento. Níveis mais elevados são encontrados em mulheres grávidas tardias, inflamação leve e infecções virais (10-40 mg/L), inflamação ativa, infecção bacteriana (40-200 mg/L), infecções bacterianas graves e queimaduras (> 200 mg/L). Em alguns aspectos, o termo "valor de referência" refere-se às medidas de CRP, quando o CRP é utilizado como um teste de diagnóstico para a inflamação.

[157] Em alguns aspectos, o indivíduo pode portar uma mutação genética diagnosticada, por exemplo, tal como quando o indivíduo é diagnosticado com fibrose cística (FC). FC é uma doença autossômica recessiva causada por mutações no gene da proteína reguladora de condutância transmembranar da fibrose cística (CFTR). Em alguns aspectos, a invenção fornece um método de primeira identificação de CF provocado por mutação no indivíduo e, em seguida, administração do peptídeo sintético da invenção sobre o indivíduo. Atualmente 1.913 mutações têm sido descritas na base de dados publicamente disponível de FC mantida pelo Centro de Fibrose Cística do Hospital Hospital for Sick Children, em Toronto, no Canadá. Muitas vezes, o teste é utilizado para analisar as mutações mais comuns, tais como DF508. A história dos pais e origem étnica podem fornecer pistas para os tipos de mutações que pode-se rastrear em uma criança afetada. Diagnóstico da FC também pode incluir a detecção de pele gosto salgado, o baixo crescimento e pouco ganho de peso, apesar de uma ingestão normal de alimentos, o acúmulo de muco pegajoso e espesso, infecções pulmonares frequentes e tosse ou falta de ar. Os machos podem ser inférteis devido à ausência congênita dos vasos deferentes. Os sintomas geralmente aparecem na infância e adolescência, como obstrução intestinal devido ao íleo meconial em recém-nascidos. À medida que as crianças crescem, elas devem exercitar para liberar o muco nos alvéolos. Células epiteliais ciliadas no paciente tem uma proteína mutada que leva à produção de muco viscoso de forma anormal.

[158] Em alguns aspectos, o indivíduo é diagnosticado com queimaduras e, portanto, em risco elevado de desenvolvimento de endotoxemia relacionada com queimadura, e posteriormente, os peptídeos da invenção podem ser administrados ao indivíduo para evitar o desenvolvimento de endotoxemia. Em alguns aspectos, a vítima de queimaduras não têm e não foi tratada para condições inflamatórias, diabetes, DPOC ou FC. Em alguns aspectos, o indivíduo foi exposto a radiação e apresenta lesão aguda por radiação, e, subsequentemente, os peptídeos da presente invenção podem ser administrados ao indivíduo para evitar o desenvolvimento de endotoxemia. Em alguns aspectos, o indivíduo tem sinais ou sintomas de endotoxemia e os peptídeos da invenção podem ser administrados também a tal indivíduo. Após a exposição a radiação ionizante, se a dose é suficientemente alta, bactérias gram-negativas vazam do sistema gastro-intestinal e podem causar a endotoxemia (sepse). Foi demonstrado que os peptídeos melhoram a sobrevivência durante a endotoxemia letal induzido em um modelo de camundongo. Assim, baseado nestes resultados, podemos concluir que os peptídeos também podem ser utilizados em seres humanos em risco de uma condição similar, a saber, a endotoxemia ou sepse, como resultado de queimaduras ou exposição aguda à radiação.

[159] O tratamento bem sucedido ou eficaz é evidenciada pela melhoria de um ou mais sintomas da doença ou disfunção, como aqui discutido. A administração de um peptídeo, tal como aqui revelado, ou um mutante, variante, análogo ou derivado do mesmo, em um indivíduo com essa necessidade é esperado para prevenir ou retardar o desenvolvimento de condições e disfunções físicas aqui descritos (por exemplo, as decorrentes de inflamação ou de destruição autoimune de tecido a ou ao melhoramento de uma condição por estimulação da expansão de massa de células beta em um indivíduo com diabetes). O termo "prevenção" é usado para referir uma situação em que um indivíduo não tem ainda a condição específica a ser prevenida, o que significa que não se manifestou em qualquer forma apreciável. A prevenção inclui a prevenção ou retardamento do aparecimento e/ou gravidade de um sintoma, (incluindo, quando o indivíduo já tem um ou mais sintomas de uma outra condição). Prevenção é realizada geralmente em um indivíduo que está em risco de desenvolvimento de uma condição ou disfunção física. Esses indivíduos são ditos como em necessidade de prevenção. Por exemplo, a redução nos níveis de TNF-alfa em comparação com os níveis de antes da administração dos peptídeos da invenção, seria uma evidênica de tratamento bem sucedido. Melhoria no controle glicêmico é uma outra maneira de mostrar que o tratamento teve um efeito. Além disso, se o teste AIC, teste de glicose no plasma em jejum (FPG), e o teste de tolerância oral à glicose (OGTT), mostram que os testes pré-diabéticos resultam em níveis pré-diabéticos, pode-se concluir que a prevenção da diabetes no indivíduo pré-diabético foi bem sucedida. Além disso, se uma vítima de queimaduras ou um indivíduo exposto a lesão por radiação aguda não desenvolve a endotoxemia ou os sinais e sintomas de endotoxemia são leves a administração do peptídeo pode ser considerado como tendo um efeito preventivo.

[160] Em uma modalidade, os métodos de prevenção aqui descritos, compreendem ainda a seleção de um tal indivíduo em risco de uma condição, por exemplo, as decorrentes de inflamação ou destruição autoimune de tecido ou uma condição melhorada por estimulação da expansão de massa de células beta em um indivíduo com diabetes, ou indivíduo que tem queimaduras graves ou sofreu lesão aguda causada por radiação e é, portanto, susceptível à endotoxemia, ou um indivíduo que é fumante e, portanto, susceptível de DPOC, ou disfunção física, tal como aqui descrito, antes de se administrar um peptídeo ou um mutante, variante, análogo ou derivado do mesmo, no indivíduo, para impedir desse modo, a condição ou disfunção. Essa seleção é realizada pelo técnico no assunto por um número de métodos disponíveis. Por exemplo, a avaliação dos fatores de risco ou diagnóstico de uma doença, que é conhecido por causar a condição ou disfunção, ou tratamento ou terapia conhecida por causar a condição ou disfunção. Indivíduos que tenham uma doença ou lesão ou uma história familiar relevante que é conhecida por contribuir para a condição são geralmente considerados de maior risco.

[161] Conforme aqui usado, os termos "tratar" ou "tratamento" ou "tratando" referem-se a medidas de tratamento terapêutico, em que o objetivo é prevenir ou retardar o desenvolvimento da doença, tais como a redução de pelo menos um efeito ou sintoma uma condição, doença ou desordem associada com inflamação. O tratamento geralmente é "eficaz" se um ou mais sintomas são melhorados ou marcadores clínicos, tais como níveis de TNF-alfa, CRP, glicose sanguínea e/ou HbAlc, estão dentro dos valores normais, ou mais próximos dos valores normais de referência do que dos valores anormais refletindo inflamação ou controle glicêmico deficiente, dependendo da condição, tal como o termo é aqui definido. Alternativamente, o tratamento é "eficaz", se a progressão de uma doença é retardada, a exibição de um sintoma ou de um marcador para a doença é reduzida. Isto é, o "tratamento" inclui a melhoria dos sintomas ou marcadores, retardando o progresso ou retardando o agravamento de pelo menos um sintoma que poderia ser esperado na ausência de tratamento. Os resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não estão limitados a, alívio de um ou mais sintoma(s), diminuição da extensão da doença, estabilização (ou seja, não agravamento) do estado da doença, atraso ou retardamento da progressão da doença, melhoria ou paliação do estado de doença. "Tratamento" também pode significar prolongamento da sobrevivência, em comparação com a sobrevivência esperada se não receber o tratamento. Aqueles que necessitam de tratamento incluem os pacientes com um ou mais dos sintomas de inflamação, tais como os sintomas associados com a artrite reumatóide, a DPOC ou diabetes, incluindo diabetes de Tipo 1 e Tipo 2. Em alguns aspectos de todas as modalidades da invenção, o indivíduo necessitado de tratamento sofre de fibrose cística ou foi indivíduo a queimaduras ou a radiação aguda e está, assim, em um risco elevado de desenvolver a endotoxemia.

[162] Os níveis de TNF-alfa pode ser avaliados, por exemplo, utilizando qualquer número de kits de ELISA comerciais prontamente disponíveis. Teste de AIC, FPG e OGTT são comumente usados para avaliar o controle glicêmico no diagnóstico e tratamento do diabetes e pré-diabetes.

[163] Em alguns aspectos, a invenção refere-se a métodos de prevenção da inflamação através da administração dos peptídeos, tal como descrito, a um indivíduo ainda não apresentando os sintomas de inflamação. Por exemplo, os peptídeos podem ser administrados a um indivíduo com alto risco de desenvolver diabetes ou diagnosticado com pré- diabetes, uma condição definida por aumento nos níveis de açúcar no sangue, mas níveis que ainda não são considerados diabéticos, mas ainda não tendo diabetes para ajudar no retardamento do desenvolvimento ou a prevenção do desenvolvimento de diabetes desde a fase de pré-diabético.

[164] Antes das pessoas desenvolverem diabetes tipo 2, elas quase sempre apresentam "pré-diabetes" - níveis de glicose no sangue que são mais altos do que o normal, mas ainda não altos o suficiente para ser diagnosticado como diabetes. Uma pesquisa recente mostrou que alguns danos a longo prazo para o corpo, especialmente o coração e o sistema circulatório, podem já estar ocorrendo durante a pré- diabetes. Há uma série de testes que podem ser utilizados para determinar se, por exemplo, um indivíduo humano é afetado com pré-diabetes. Tais testes incluem, por exemplo, o teste de AIC, teste de glicose no plasma em jejum (FPG), e o teste de tolerância à glicose oral (OGTT). Indivíduos pré-diabéticos normalmente apresentam pontuação igual ou superior a 5,7% para menos de 6,5% no teste AIC, enquanto diabéticos pontuam mais de 6,5% neste teste. Indivíduos pré- diabéticos também pontuam tipicamente igual ou superior a 100 mg/dl para menos de 126 mg/dl por meio do teste de FPG ao passo que os diabéticos apresentam pontuação superior a 126 mg/dl. Indivíduos pré-diabéticos tipicamente pontuam pelo ou mais de 140 para menos de 200 mg/dl utilizando o teste OGTT enquanto indivíduos diabéticos apresentam pontuação acima de 200 mg/dl. Assim, um método de prevenção da diabetes de acordo com a presente invenção pode compreender a administração do peptídeo a um indivíduo que tenha sido diagnosticado como pré-diabético, por exemplo, utilizando qualquer um dos métodos acima descritos.

[165] O termo "quantidade eficaz", tal como aqui utilizado refere-se à quantidade de uma composição farmacêutica compreendendo um ou mais peptídeos como aqui revelado, ou um mutante, variante, análogo ou derivado do mesmo, para diminuir, pelo menos um ou mais dos sintomas da doença ou desordem, e refere-se a uma quantidade suficiente de composição farmacológica para proporcionar o efeito desejado. A frase "quantidade terapeuticamente eficaz", tal como aqui utilizado, significa uma quantidade suficiente da composição para tratar uma desordem, com uma razoável razão risco/benefício aplicável a qualquer tratamento médico. O termo "quantidade terapeuticamente eficaz", portanto, refere-se a uma quantidade de composição, tal como aqui divulgado, que é suficiente para efetuar uma redução terapêutica ou profilática em um sintoma ou marcador clínico associado com o aumento dos níveis de inflamação ou hiperglicemia quando administrada a um indivíduo que tem anemia, anemia típica de inflamação ou diabetes do tipo I. Tipicamente, a redução de mais de 20% de um marcador de uma doença, tal como um marcador da inflamação, por exemplo, o TNF-alfa, é indicativo de um tratamento eficaz. Em alguns casos, a redução de mais do que 50% ou mais do que 75% da quantidade de níveis de TNF-alfa no indivíduo antes da administração dos peptídeos da invenção é indicativo de um tratamento eficaz.

[166] Uma redução terapeuticamente ou profilaticamente significativa em um sintoma é, por exemplo, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60% , pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 100%, pelo menos cerca de 125%, pelo menos cerca de 150% ou mais em um parâmetro medido quando comparado a um indivíduo não tratado ou controle ou o estado do indivíduo, antes da administração do peptídeo. Parâmetros medidos ou mensuráveis incluem marcadores clinicamente detectáveis de doença, por exemplo, níveis elevados ou deprimidos de um marcador biológico, tal como TNF-alfa, assim como os parâmetros relacionados a uma escala clinicamente aceitável de sintomas ou marcadores de inflamação. Será entendido, no entanto, que a utilização diária total das composições e formulações como aqui divulgadas serão decididos pelo médico assistente dentro do âmbito do bom julgamento médico. A quantidade exata necessária irá variar, dependendo de fatores tais como o tipo de doença a ser tratada, sexo, idade e peso do paciente.

[167] Com referência ao tratamento de um indivíduo com inflamação, a destruição de tecido autoimune ou diabetes tipo I, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" refere- se à quantidade que é segura e suficiente para atrasar o desenvolvimento de um ou mais dos sintomas e resulta na diminuição da quantidade de um marcador da inflamação, por exemplo, as concentrações de CRP ou de TNF-a, ou a melhoria dos níveis de glicose no sangue nos pacientes em comparação com a quantidade do marcador inflamatório ou níveis de glicose no sangue antes da administração do peptídeo. A quantidade pode, assim, melhorar ou causar uma diminuição em pelo menos um sintoma de inflamação, destruição autoimune de tecidos ou diabetes do tipo I ou retardar o curso da progressão da doença, tais como estabilizar os níveis de glicose no sangue. A quantidade eficaz para o tratamento de uma doença depende do tipo de doença, da espécie a ser tratada, a idade e condição geral do indivíduo, do modo de administração e assim por diante. Assim, não é possível especificar exatamente a "quantidade eficaz". No entanto, para qualquer caso, uma "quantidade eficaz" adequada pode ser determinada por um técnico no assunto utilizando apenas experimentação de rotina. A eficácia do tratamento pode ser avaliada por um médico especializado no assunto, por exemplo, a eficácia pode ser avaliada em modelos animais conhecidos de inflamação (por exemplo, modelo de LPS), a destruição autoimune de tecidos (por exemplo, modelo CAIA) ou diabetes (por exemplo, modelo de camundongo db/db). Ao utilizar um modelo animal experimental, a eficácia do tratamento é evidenciada quando uma redução em um sintoma de inflamação, destruição autoimune de tecidos ou hiperglicemia é demonstrada contra os animais não tratados.

[168] Conforme aqui usado, os termos "administração de" e "introdução" são utilizados aqui alternadamente e referem-se à colocação de agentes terapêuticos, tais como um ou mais peptídeos, como aqui revelado, ou um mutante, variante, análogo ou derivado do mesmo, para um indivíduo por um método ou via que resulta na distribuição de tais agente(s) em um local desejado. Os compostos podem ser administrados por qualquer via apropriada que resulta em um tratamento eficaz no paciente.

[169] O um ou mais peptídeos, como aqui revelado, ou um mutante, variante, análogo ou derivado do mesmo, pode ser administrado por qualquer via conhecida na técnica ou aqui descrita, por exemplo, por via oral, parenteral (por exemplo, por via intravenosa ou intramuscular), intraperitoneal, retal, cutânea, nasal, vaginal, inalante, pele (emplastro), ou ocular. Os um ou mais peptídeos, como aqui revelado, ou um mutante, variante, análogo ou derivado do mesmo, pode ser administrado em qualquer dose ou regime de dose. Pode-se também usar bombas, tal como as utilizadas para a administração de insulina.

Dosagem

[170] Em relação aos métodos terapêuticos da invenção, não se pretende que a administração de um ou mais peptídeos como aqui revelado, ou um mutante, variante, análogo ou derivado do mesmo, seja limitado a um modo particular de administração, dosagem ou frequência de administração; a presente invenção contempla todos os modos de administração, incluindo intramuscular, intravenoso, intraperitoneal, intravesicular, intra-articular, intralesional, subcutânea, ou qualquer outra via suficiente para fornecer uma dose adequada para tratar a desordem relacionada com inflamação. O agente terapêutico pode ser administrado ao paciente em uma dose única ou em múltiplas doses. Quando múltiplas doses são administradas, as doses podem ser separados uma da outra por, por exemplo, por uma hora, três horas, seis horas, oito horas, um dia, dois dias, uma semana, duas semanas ou de um mês. Por exemplo, a terapêutica pode ser administrado por, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20, ou mais semanas. É para ser entendido que, para qualquer indivíduo particular, os regimes de dosagem específicos devem ser ajustados ao longo do tempo de acordo com a necessidade individual e o julgamento profissional da pessoa que administra ou supervisiona a administração das composições. Por exemplo, a dosagem do agente terapêutico pode ser aumentada se a dose menor não proporciona uma atividade terapêutica suficiente.

[171] Embora o médico assistente decidirá em última análise, a quantidade apropriada e regime de dosagem, a quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais peptídeos, como aqui revelado ou um mutante, variante, análogo ou derivado do mesmo, pode ser fornecida a uma dose de 0,0001, 0,01, 0,01 0,1, 1, 5, 10, 25, 50, 100, 500, ou 1.000 mg/kg ou μg/kg. As doses eficazes podem ser extrapoladas a partir de curvas de dose-resposta derivadas a partir de modelos in vitro ou animais bioensaios ou sistemas de teste.

[172] As dosagens para um paciente particular ou indivíduo podem ser determinadas por um técnico no assunto utilizando considerações convencionais, (por exemplo, por meio de um protocolo farmacológico convencional apropriado). Um médico pode, por exemplo, prescrever uma dose relativamente baixa no início, aumentando subsequentemente a dose até que uma resposta adequada é alcançada. A dose administrada a um paciente é suficiente para efetuar uma resposta terapêutica benéfica no paciente ao longo do tempo, ou, por exemplo, para reduzir os sintomas, ou outra atividade apropriada, dependendo da aplicação. A dose é determinada pela eficácia da formulação em particular, e a atividade, estabilidade e meia-vida no soro de um ou mais peptídeos como aqui revelado, ou um mutante, variante, análogo ou derivado do mesmo, e a condição do paciente, bem como o peso corporal ou área de superfície do paciente a ser tratada. O tamanho da dose também é determinada pela existência, natureza, e extensão de qualquer efeitos colaterais adversos que acompanham a administração de um vetor particular, formulação, ou semelhantes, em um paciente particular. As composições terapêuticas que compreendem um ou mais peptídeos como aqui revelado ou um mutante, variante, análogo ou derivado do mesmo, são opcionalmente testados em um ou mais modelos animais apropriados de doenças in vitro e/ou in vivo , tais como modelos de inflamação ou diabetes, para confirmar a eficácia, o metabolismo do tecido, e para estimativa de dose, de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Em particular, as dosagens podem ser inicialmente determinadas pela atividade, estabilidade ou outras medidas adequadas de tratamento versus não-tratamento (por exemplo, a comparação de modelos animais ou de células tratados vs não tratados), em um ensaio relevante. As formulações são administradas em uma taxa determinada pela LD50 da formulação relevante, e/ou a observação de qualquer efeitos colaterais de um ou mais peptídeos como aqui revelado, ou um mutante, variante, análogo ou derivado do mesmo. A administração pode ser realizada por meio de doses únicas ou divididas.

[173] A fim de determinar a quantidade eficaz de um ou mais peptídeos, como aqui revelado ou um mutante, variante, análogo ou derivado do mesmo, a ser administrada no tratamento ou profilaxia da doença, o médico avalia os níveis plasmáticos circulantes, toxicidade da formulação, e a progressão doença.

[174] A eficácia e toxicidade do composto pode ser determinada por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas celulares ou animais experimentais, por exemplo, ED50 (a dose é eficaz em 50% da população) e LD50 (a dose é letal para 50% da população). A proporção de dose de efeitos tóxicos para terapêuticos é o índice terapêutico, e ele pode ser expresso como a razão, LD50/ED50. São preferidas as composições farmacêuticas que exibem índices terapêuticos grandes.

[175] Estes compostos podem ser administrados a seres humanos e outros animais para terapia por qualquer via de administração adequada que funcione para pequenos peptídeos, incluindo oralmente, nasalmente, como por exemplo, um pulverizador, retalmente, intravaginalmente, parentéricamente, intracisternalmente e tópicamente, como por pós, pomadas ou gotas, incluindo bucalmente e sublingualmente.

[176] Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da invenção podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que é eficaz para alcançar a resposta terapêutica desejada para um paciente particular, composição, e modo de administração, sem ser tóxico para o indivíduo.

[177] O nivel de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores, incluindo a atividade do composto particular da presente invenção utilizado, ou do éster, sal ou amida do mesmo, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto particular a ser utilizado, a duração do tratamento, outras drogas, compostos e/ou materiais utilizados em combinação com o composto particular utilizado, a idade, sexo, peso, condição, saúde geral e história médica anterior do paciente a ser tratado, e fatores semelhantes bem conhecidos nas técnica médica.

Formulação de composições farmacêuticas - "veículos farmaceuticamente aceitáveis"

[178] A administração de um ou mais peptídeos como aqui revelado, ou um mutante, variante, análogo ou derivado do mesmo, pode ser feita por qualquer meio adequado que resulte em uma concentração de proteína que trata a doença. O composto pode estar contido em qualquer quantidade apropriada em qualquer substância veículo adequado, e está geralmente presente em uma quantidade de 1-95%, em peso, do peso total da composição. A composição pode ser fornecida em uma forma de dosagem que é adequada para a via de administração oral, parenteral (por exemplo, por via intravenosa ou intramuscular), intraperitoneal, retal, cutânea, nasal, vaginal, por inalação, a pele (emplastro), ou ocular. Assim, a composição pode estar na forma de, por exemplo, comprimidos, cápsulas, pílulas, pós, granulados, suspensões, emulsões, soluções, géis incluindo hidrogéis, pastas, pomadas, cremes, emplastros, poções, dispositivos de entrega osmótica, supositórios, enemas, injetáveis, implantes, pulverizadores ou aerossóis. As composições farmacêuticas podem ser formuladas de acordo com a prática farmacêutica convencional (ver, por exemplo, Remington:. The Science and Practice of Pharmacy, 20a edição, 2000, ed AR Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, Filadélfia e Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick e JC Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, Nova Iorque, incorporadas, aqui, por referência na sua totalidade).

[179] As composições farmacêuticas de acordo com a invenção podem ser formuladas para liberar o composto ativo imediatamente após a administração ou em qualquer momento ou período de tempo predeterminado após a administração. Estes últimos tipos de composições são geralmente conhecidas como formulações de libertação controlada, que incluem (i) formulações que criam substancialmente concentrações constantes do agente(s) da invenção dentro do corpo durante um período prolongado de tempo; (ii) formulações que após um intervalo de tempo predeterminado criam substancialmente concentrações constantes do agente(s) da invenção dentro do corpo durante um período prolongado de tempo; (iii) formulações que sustentam a ação do agente(s) durante um período de tempo predeterminado através da manutenção de um nível relativamente eficaz, constante do agente(s) no corpo com concomitante minimização de efeitos colaterais indesejáveis associados com flutuações no nível plasmático da agente(s) (padrão cinético “dente de serra”); (iv) formulações que localizam a ação do agente(s), por exemplo, colocação espacial de uma composição de liberação controlada adjacente a, ou no tecido ou órgão doentes; (v) formulações que permitam atingir a conveniência de dosagem, por exemplo, a administração da composição, uma vez por semana ou uma vez a cada duas semanas; e (vi) formulações que têm como alvo a ação do agente(s) usando veículos ou derivados químicos para distribuição do agente terapêutico em um tipo de célula alvo em particular. A administração da proteína na forma de uma formulação de libertação controlada é especialmente preferida para compostos que têm uma janela de absorção estreita no aparelho gastrointestinal ou uma meia-vida biológica relativamente curta.

[180] Qualquer um de uma série de estratégias podem ser aplicadas a fim de obter a liberação controlada em que a taxa de liberação supera a taxa de metabolismo do composto em questão. Em um exemplo, a liberação controlada é obtida através da seleção apropriada de vários parâmetros e ingredientes de formulação, incluindo, por exemplo, vários tipos de composições e revestimentos de liberação controlada. Assim, a proteína é formulada com excipientes apropriados em uma composição farmacêutica que, por administração, libera a proteína de uma forma controlada. Exemplos incluem comprimidos de unidade única ou múltipla ou composições de cápsulas, soluções oleosas, suspensões, emulsões, microcápsulas, complexos moleculares, microesferas, nanopartículas, emplastros e lipossomas.

[181] Conforme aqui usado, as frases "administração parentérica" e "administrado parentericamente", tal como aqui utilizado, significa modos de administração outro que administração entérica e tópica, usualmente por injeção , e inclui, sem limitação, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intraventricular, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, sub capsular, subaracnóide, intraspinal, intracerebrospinal e intrasternal. As frases "administração sistêmica", "administrada sistemicamente", "administração periférica" e "administrado perifericamente", como aqui utilizado, significa a administração de outras composições terapêuticas diretamente em um tumor de tal modo que ele entra no sistema do animal e, assim, é indivíduo ao metabolismo e outros processos semelhantes.

[182] A frase "farmaceuticamente aceitável" é aqui utilizada para referir aqueles compostos, materiais, composições e/ou formas de dosagem que são, dentro do âmbito do bom julgamento médico, adequados para utilização em contato com os tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica, ou outro problema ou complicação, proporcionando uma razoável relação risco/benefício. A frase "veículo farmaceuticamente aceitável", tal como aqui utilizado, significa um material farmaceuticamente aceitável, composição ou veículo, tal como um enchimento líquido ou sólido, diluente, excipiente, solvente ou material de encapsulamento, envolvido na manutenção da atividade ou em carregar ou transportar os agentes indivíduos a partir de um órgão, ou porção do corpo, para outro órgão, ou porção do corpo. Além de ser "farmaceuticamente aceitável" tal como o termo é aqui definido, cada veículo deve ser também "aceitável" no sentido de serem compatíveis com os outros ingredientes da formulação. A formulação farmacêutica compreendendo um ou mais peptídeos como aqui revelado, ou um mutante, variante, análogo ou derivado do mesmo, em combinação com um ou mais ingredientes farmaceuticamente aceitáveis. O veículo pode ser na forma de um diluente sólido, semi-sólido ou líquido, creme ou uma cápsula. Estas preparações farmacêuticas são um objeto adicional da invenção. Normalmente, a quantidade de compostos ativos está entre 0,1-95%, em peso, da preparação, preferencialmente entre 0,2-20%, em peso, nas preparações para uso parenteral e, preferencialmente, entre 1 e 50%, em peso, em preparações para administração oral. Para a utilização clínica dos métodos da presente invenção, composição de distribuição direcionada da invenção é formulada em composições farmacêuticas ou formulações farmacêuticas para administração parenteral, por exemplo, intravenosa; mucosa, por exemplo, intranasal; enteral, por exemplo, oral; tópica, por exemplo, transdérmica; ocular, por exemplo, através de escarificação córnea ou outro modo de administração. A composição farmacêutica contém um composto da invenção em combinação com um ou mais ingredientes farmaceuticamente aceitáveis. O veículo pode ser na forma de um diluente sólido, semi-sólido ou líquido, creme ou uma cápsula.

[183] O termo "veículos farmaceuticamente aceitáveis" destina-se a incluir todos os solventes, diluentes, ou outro veículo líquido, auxiliares de dispersão ou de suspensão, agentes tensoativos, agentes isotônicos, agentes espessantes ou emulsionantes, conservantes, ligantes sólidos, lubrificantes e similares, como adequado para a forma de dosagem particular desejada. Tipicamente, esses compostos são veiculados ou transportados de um órgão, ou porção do corpo, para outro órgão, ou porção do corpo. Cada veículo deve ser "aceitável" no sentido de serem compatíveis com os outros ingredientes da formulação e não prejudicial para o paciente. Alguns exemplos de materiais que podem servir como veículoa farmaceuticamente aceitáveis incluem: açúcares, tais como lactose, glicose e sacarose; amidos, tais como amido de milho e amido de batata; celulose, e seus derivados funcionais, tais como carboximetilcelulose de sódio, etilcelulose e acetato de celulose; goma adragante em pó; malte; gelatina; talco; excipientes, tais como manteiga de cacau e ceras para supositório; óleos, tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de açafrão, óleo de gergelim, óleo de oliva, óleo de milho e óleo de soja; glicóis, tais como propileno glicol; polióis, tais como glicerina, sorbitol, manitol e polietileno glicol; ésteres, tais como oleato de etila e laureato de etila; ágar; agentes tamponantes, tais como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; ácido algínico; água apirogênica; solução salina isotônica; solução de Ringer; álcool etílico; soluções de tampão fosfato; e outras substâncias compatíveis não-tóxicas empregadas em formulações farmacêuticas.

[184] O termo "composição farmacêutica", conforme aqui utilizado, refere-se a composições ou formulações que geralmente compreendem um excipiente, tal como um veículo farmaceuticamente aceitável que é convencional na técnica e que é adequada para administração a mamíferos, e, preferencialmente, humanos ou células humanas. Tais composições podem ser especificamente formuladas para administração através de uma ou mais de um número de vias, incluindo mas não se limitando a, oral, parenteral, ocular, intravenosa, intra-arterial, subcutânea, intranasal, sublingual, intra-espinal, intracerebroventricular, e semelhantes. Além disso, as composições para administração tópica (por exemplo, mucosa oral, mucosa respiratória) e/ou administração oral, podem formar soluções, suspensões, comprimidos, pílulas, cápsulas, formulações de liberação controlada, enxaguatórios bucais, ou pós, como conhecidos na técnica estão descritos aqui. As composições também podem incluir estabilizantes e conservantes. Para exemplos de veículos, estabilizantes e adjuvantes, Universidade de Ciências da Filadélfia (2005) Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparations, 21 ed.

[185] Em certas modalidades, os compostos da presente invenção podem conter um ou mais grupos funcionais acídicos e, assim, são capazes de formar sais farmaceuticamente aceitáveis com bases farmaceuticamente aceitáveis. O termo "sais farmaceuticamente aceitáveis, ésteres, amidas e pró-fármacos", conforme aqui utilizado, refere-se àqueles sais de carboxilato, adição de sais de aminoácido, ésteres, amidas e pró-fármacos das compostos da presente invenção que são, dentro do âmbito do bom julgamento médico, adequados para utilização em contato com os tecidos de pacientes sem indevida toxicidade, irritação, resposta alérgica, e semelhantes, proporcionando uma razoável relação risco/benefício, e eficaz para a utilização pretendida dos compostos da invenção. O termo "sais" refere-se a adição de sais de compostos de ácidos orgânicos ou inorgânicos, relativamente não-tóxicos, da presente invenção. Estes sais podem ser preparados in situ durante o isolamento e purificação finais dos compostos ou fazendo reagir separadamente o composto purificado na sua forma de base livre com um ácido orgânico ou inorgânico adequado e isolando o sal assim formado. Estes podem incluir cátions baseados nos metais alcalinos e alcalino-terrosos, tais como sódio, lítio, potássio, cálcio, magnésio e semelhantes, bem como amônio não tóxico, amônio quaternário, e cátions de amina, incluindo, mas não limitados a, amônio, tetrametilamônio, tetraetila de amônio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, trietilamina, etilamina, e semelhantes (ver, por exemplo, Berge SM, e cols. (1977) J. Pharm. Sci. 66, 1, a qual é aqui incorporado por referência).

[186] O termo "ésteres farmaceuticamente aceitáveis" refere-se aos produtos esterificados, relativamente não tóxicos, dos compostos da presente invenção. Estes ésteres podem ser preparados in situ durante o isolamento e purificação finais dos compostos, ou fazendo reagir separadamente o composto purificado na sua forma de ácido livre ou hidroxila, com um agente de esterificação adequado. Os ácidos carboxílicos podem ser convertidos em ésteres através do tratamento com um álcool na presença de um catalisador. O termo é ainda pretendido incluir grupos de hidrocarboneto inferior capazes de serem solvatados em condições fisiológicas, por exemplo, ésteres de alquila, metila, etila e os ésteres de propilo.

[187] Conforme aqui utilizado, os "sais ou pró- fármacos farmaceuticamente aceitáveis" são sais ou pró- fármacos que são, dentro do âmbito do bom julgamento médico, adequados para utilização em contato com os tecidos dos pacecientes sem indevida toxicidade, irritação, resposta alérgica, e semelhantes, proporcionando uma razoável relação risco/benefício, e eficaz para a utilização pretendida.

[188] O termo "pró-fármaco" refere-se a compostos que são rapidamente transformados in vivo para produzir os um ou mais peptídeos funcionalmente ativos, conforme aqui revelado, ou um mutante, variante, análogo ou derivado do mesmo. Uma discussão aprofundada é fornecida em T. Higachi e V. Stella, "Pro-drugs as Novel Delivery Systems", Vol.. 14 do A.C.S. Symposium Series, e em Bioreversible Carriers in: Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association e Pergamon Press, 1987, ambos os quais são aqui incorporados por referência. Tal como aqui utilizado, um pró-fármaco é um composto que, após administração in vivo, é metabolizado ou de outro modo convertido para a forma biologicamente, farmaceuticamente ou terapeuticamente ativa do composto. Um pró-fármaco de um ou mais peptídeos conforme aqui revelado, ou um mutante, variante, análogo ou derivado do mesmo, pode ser concebido para alterar a estabilidade metabólica ou as características de transporte de um ou mais peptídeos como aqui revelado, ou um mutante, variante, análogo ou derivado do mesmo, para mascarar efeitos colaterais ou toxicidade, para melhorar o sabor de um composto ou alterar outras características ou propriedades de um composto. Em virtude do conhecimento dos processos farmacodinâmicos e do metabolismo do fármaco in vivo, uma vez que uma forma farmaceuticamente ativa de um ou mais peptídeos como aqui revelado, ou um mutante, variante, análogo ou derivado do mesmo, os técnicos na técnica farmacêutica, geralmente podem conceber pro-fármacos do composto (ver, por exemplo, Nogrady (1985) Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, Nova Iorque, páginas 388-392). Os procedimentos convencionais para a seleção e preparação de pró-fármacos apropriados são descritos, por exemplo, em "Design of Prodrugs", ed. H. Bundgaard, Elsevier, 1985. Exemplos apropriados de pró-fármacos incluem os ésteres de metila, etila e glicerol do ácido correspondente.

Composições parentéricas

[189] A composição farmacêutica pode ser administrada por via parenteral por injeção, infusão ou implantação (subcutânea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, ou afins) em formas de dosagem, formulações, ou por meio de dispositivos de distribuição apropriados ou implantes contendo convencional, não tóxico, veículos e adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis. A formulação e preparação de tais composições são bem conhecidos pelos técnicos em formulação farmacêutica.

[190] As composições para utilização parenteral podem ser fornecidas em formas de dosagem unitária (por exemplo, em ampolas de dose única), ou em frascos contendo várias doses e em que pode ser adicionado um conservante adequado (veja abaixo). A composição pode estar na forma de uma solução, uma suspensão, uma emulsão, um dispositivo de infusão ou um dispositivo de distribuição para implantação, ou pode ser apresentada como um pó seco para ser reconstituído com água ou outro veículo adequado antes da utilização. Independentemente do agente(s) ativo, a composição pode incluir veículos e/ou excipientes parentericamente aceitáveis adequados. O agente(s) ativo pode ser incorporados em microesferas, microcápsulas, nanopartículas, lipossomas ou semelhantes, para liberação controlada. Além disso, a composição pode incluir agentes de suspensão, solubilização, estabilização, agentes de ajuste de pH, agentes de ajuste de tonicidade, e/ou agentes dispersantes.

[191] Conforme indicado acima, as composições farmacêuticas de acordo com a invenção pode estar em uma forma adequada para injeção estéril. Para preparar uma tal composição, o agente(s) ativo apropriado é dissolvido ou suspenso em um veículo líquido parentericamente aceitável. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser utilizados estão a água, água ajustada para um pH adequado por adição de uma quantidade apropriada de ácido hidroclorídrico, hidróxido de sódio ou um tampão adequado, 1,3-butanodiol, solução de Ringer, solução de dextrose e solução isotônica de cloreto de sódio. A formulação aquosa também pode conter um ou mais conservantes (por exemplo, metila, etila ou n-propila, p-hidroxibenzoato). Nos casos em que um dos compostos é apenas fracamente ou ligeiramente solúvel em água, um agente de melhora na dissolução ou solubilização pode ser adicionado, ou o solvente pode incluir 10-60% w/w de propilenoglicol ou semelhante.

[192] Os agentes molhantes, emulsificantee lubrificantes, tais como lauril sulfato de sódio e estearato de magnésio, bem como agentes corantes, agentes de liberação, agentes de revestimento, edulcorantes, aromatizantes e perfumantes, conservantes e antioxidantes podem também estar presentes nas composições.

[193] Os exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, hidrocloreto de cisteína, bissulfato de sódio, metabisulfato de sódio, sulfito de sódio e semelhantes; antioxidantes solúveis em óleo, tais como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propila, alfa-tocoferol, e semelhantes; e agentes quelantes de metais, tais como ácido cítrico, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, e semelhantes.

[194] As formulações da presente invenção incluem as que são adequadas para administração intravenosa, oral, nasal, tópica, transdérmica, bucal, sublingual, retal, vaginal e/ou parenteral. As formulações podem ser convenientemente apresentadas em forma de dosagem única e podem ser preparadas por qualquer métodos bem conhecidos na técnica de farmácia. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material veículo para produzir uma forma de dosagem única será geralmente a quantidade do composto que produz um efeito terapêutico.

[195] Os métodos de preparação destas formulações ou composições incluem o passo de associar um composto da presente invenção com o veículo e, opcionalmente, um ou mais ingredientes acessórios. Em geral, as formulações são preparadas por associação uniforme e íntima de um composto da presente invenção com veículos líquidos ou veículos sólidos finamente divididos, ou ambos, e então, se necessário, moldando o produto.

[196] As formulações da invenção adequadas para administração oral podem ser na forma de cápsulas, hóstias, pílulas, comprimidos, pastilhas (utilizando uma base aromatizada, geralmente sacarose e acácia ou adragante), pós, grânulos, ou como uma solução ou uma suspensão em um líquido aquoso ou não-aquoso, ou como uma emulsão líquida óleo-em-água ou água-em-óleo, ou como um elixir ou xarope, ou como pastilhas (utilizando uma base inerte, tal como gelatina e glicerina, ou sacarose e acácia) e/ou como lavagens da boca e semelhantes, cada uma contendo uma quantidade pré-determinada de um composto da presente invenção como um ingrediente ativo. Um composto da presente invenção pode também ser administrado como um bolus, electuário ou pasta.

[197] As composições farmacêuticas desta invenção adequadas para administração parentérica compreendem um ou mais peptídeos, como aqui revelado ou um mutante, variante, análogo ou derivado do mesmo, em combinação com um ou mais soluções, dispersões, suspensões ou emulsões aquosas ou não aquosas isotônicos estéreis farmaceuticamente aceitáveis, ou pós estéreis que podem ser reconstituídos em soluções injetáveis ou dispersões estéreis imediatamente antes do uso, que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos, solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue do receptor pretendido ou agentes de suspensão ou espessantes.

[198] Os exemplos de veículos aquosos e não aquosos adequados que podem ser utilizados nas composições farmacêuticas compreendendo um ou mais peptídeos, como aqui revelado, ou um mutante, variante, análogo ou derivado do mesmo, incluem água, etanol, polióis (tais como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol, e semelhantes), e misturas adequadas dos mesmo, óleos vegetais, tais como azeite, e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etila. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersões, e pela utilização de surfactantes.

[199] Estas composições também podem conter adjuvantes tais como conservantes, agentes molhantes, agentes emulsificantes e agentes dispersantes. A prevenção da ação de microorganismos pode ser assegurada pela inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico e semelhantes. Pode também ser desejável incluir agentes isotônicos, tais como açúcares, cloreto de sódio, e semelhantes nas composições. Além disso, a absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser alcançada pela inclusão de agentes que retardam a absorção tais como monoestearato de alumínio e gelatina.

[200] Em alguns casos, a fim de prolongar o efeito de uma droga, é desejável retardar a absorção da droga a partir da injeção subcutânea ou intramuscular. Isto pode ser conseguido pela utilização de uma suspensão líquida de material cristalino ou amorfo tendo fraca solubilidade em água. A razão da absorção da droga depende então da sua velocidade de dissolução que, por sua vez, pode depender do tamanho do cristal e da forma cristalina. Alternativamente, a absorção retardada de uma forma de droga administrada parentericamente é conseguida por dissolução ou suspensão da droga em um veículo oleoso.

[201] As formas de depósito injetáveis são feitas pela formação de matrizes microencapsuladas dos compostos em polímeros biodegradáveis, tais como poliláctido- poliglicólido. Dependendo da proporção de droga para polímero e da natureza do polímero particular utilizado, a velocidade de liberação do fármaco pode ser controlada. Exemplos de outros polímeros biodegradáveis incluem poli(ortoésteres) e poli(anidridos). As formulações de depósito injetáveis são também preparadas por aprisionamento do fármaco, tais como um ou mais peptídeos como aqui revelado, ou um mutante, variante, análogo ou derivado do mesmo, em lipossomas ou microemulsões que são compatíveis com o tecido corporal.

[202] Independentemente da via de administração selecionada, os compostos da presente invenção, que podem ser utilizados em uma forma hidratada adequada, e/ou composição farmacêutica da presente invenção, são formulados em formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis por métodos convencionais conhecidos dos técnicos do assunto.

Composições parenterais de liberação controlada

[203] As composições parenterais de liberação controlada podem estar na forma de suspensões aquosas, microesferas, microcápsulas, microesferas magnéticas, soluções oleosas, suspensões oleosas ou emulsões. A composição também pode ser incorporada em veículos biocompatíveis, lipossomas, nanopartículas, implantes ou dispositivos de infusão.

[204] Os materiais para utilização na preparação de microesferas e/ou microcápsulas são, por exemplo, polímeros biodegradáveis/bioerodíveis tais como poligalactia poli- (cianoacrilato de isobutila), poli(2-hidroxietil-L- glutamnina), poli(ácido láctico), ácido poliglicólico, e misturas dos mesmos. Veículos biocompatíveis que podem ser usados ao formular uma formulação parenteral de liberação controlada são carbohidratos (por exemplo, dextranos), proteínas (por exemplo, albumina), lipoproteínas ou anticorpos. Os materiais para utilização em implantes podem ser não biodegradáveis (por exemplo, polidimetil siloxano) ou biodegradável (por exemplo, poli(caprolactona), poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico) ou poli(orto- ésteres)) ou combinações dos mesmos.

Formas de dosagem sólidas para uso oral

[205] As formulações para utilização oral incluem comprimidos contendo o ingrediente(s) ativo em uma mistura com excipientes farmaceuticamente aceitáveis não-tóxicos, e tais formulações são conhecidos pelos técnicos no assunto (por exemplo, Patente dos EUA Nos: 5.817.307; 5.824.300; 5.830.456; 5.846.526; 5.882.640; 5.910.304; 6.036.949; 6.036.949; e 6.372.218, aqui incorporadas por referência). Estes excipientes podem ser, por exemplo, diluentes inertes ou agentes de enchimento (por exemplo, sacarose, sorbitol, açúcar, manitol, celulose microcristalina, amidos incluindo amido de batata, carbonato de cálcio, cloreto de sódio, lactose, fosfato de cálcio, sulfato de cálcio, ou fosfato de sódio); agentes de granulação e de desintegração (por exemplo, derivados de celulose incluindo celulose microcristalina, amidos incluindo amido de batata, croscarmelose de sódio, alginatos, ou ácido algínico); agentes de ligação (por exemplo, sacarose, glicose, sorbitol, acácia, ácido algínico, alginato de sódio, gelatina, amido, amido pré-gelatinizado, celulose microcristalina, silicato de alumínio e magnésio, carboximetilcelulose de sódio, metilcelulose, hidroxipropil metilcelulose, etilcelulose, polivinilpirrolidona ou polietilenoglicol); e agentes lubrificantes, deslizantes e anti-adesivos (por exemplo, estearato de magnésio, estearato de zinco, ácido esteárico, sílicas, óleos vegetais hidrogenados, ou talco). Outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis podem ser corantes, agentes aromatizantes, plastificantes, umectantes, agentes tamponantes, e semelhantes.

[206] Os comprimidos podem ser não revestidos ou podem ser revestidos por técnicas conhecidas, opcionalmente para retardar a desintegração e absorção no trato gastrointestinal e assim proporcionar uma ação controlada durante um período mais longo. O revestimento pode ser adaptado para libertar a proteína em um padrão pré- determinado (por exemplo, a fim de conseguir uma formulação de liberação controlada) ou pode ser adaptada para não libertar o agente(s) até depois da passagem do estômago (revestimento entérico). O revestimento pode ser um revestimento de açúcar, um revestimento de película (por exemplo, baseado em hidroxipropil metilcelulose, metilcelulose, hidroxietilcelulose de metila, hidroxipropilcelulose, carboximetilcelulose, copolímeros de acrilato, polietilenoglicóis e/ou polivinilpirrolidona), ou um revestimento entérico (por exemplo, à base de copolímero de ácido metacrílico, ftalato de celulose acetato, ftalato de hidroxipropil metilcelulose, acetato succinato de hidroxipropilmetilcelulose, acetato ftalato de polivinilo, goma-laca, e/ou etilcelulose). Além disso, um material de retardamento tal como, por exemplo, monoestearato de glicerila ou diestearato de glicerila, pode ser empregado.

[207] As composições sólidas de comprimidos podem incluir um revestimento adaptado para proteger a composição de alterações químicas não desejadas, (por exemplo, degradação química anterior a liberação das substâncias ativas). O revestimento pode ser aplicado sobre a forma de dosagem sólida de uma maneira semelhante àquela descrita em Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, supra.

[208] As composições da invenção podem ser misturados ao comprimido, ou podem ser particionadas. Em um exemplo, um primeiro agente está contido no interior do comprimido, e um segundo agente está no exterior, de tal modo que uma porção substancial do segundo agente é liberado antes da liberação do primeiro agente.

[209] As formulações para utilização oral podem também ser apresentadas na forma de comprimidos mastigáveis, ou como cápsulas de gelatina dura em que o ingrediente ativo é misturado com um diluente sólido inerte (por exemplo, amido de batata, lactose, celulose microcristalina, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio ou caulino), ou como cápsulas de gelatina mole em que o ingrediente ativo está misturado com água ou um meio oleoso, por exemplo, óleo de amendoim, parafina líquida, ou azeite de oliva. Pós e granulados podem ser preparados utilizando os ingredientes mencionados acima, em comprimidos e cápsulas de uma maneira convencional, utilizando, por exemplo, um misturador, um aparelho de leito fluidizado, ou equipamento de pulverização de secagem.

[210] Em formas de dosagem sólidas da invenção para administração oral (cápsulas, comprimidos, pílulas, drageias, pós, grânulos e semelhantes), o ingrediente ativo é misturado com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis, tais como citrato de sódio ou fosfato bicálcico, e/ou qualquer um dos seguintes: agentes de enchimento ou extensores, tais como amidos, lactose, sacarose, glicose, manitol, e/ou ácido silícico; ligantes, tais como, por exemplo, carboximetilcelulose, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarose e/ou acácia; umectantes, tais como glicerol; agentes de desintegração, tais como ágar- ágar, carbonato de cálcio, amido de batata ou de tapioca, ácido algínico, certos silicatos, e carbonato de sódio; agentes de retardamento de solução, tais como parafina; aceleradores de absorção, tais como compostos de amônio quaternário; agentes molhantes tais como, por exemplo, álcool cetílico e monoestearato de glicerol; absorventes, tais como caulino e argila de bentonite; lubrificantes, tal talco, estearato de cálcio, estearato de magnésio, polietilenoglicóis sólidos, lauril sulfato de sódio, e misturas dos mesmos; e agentes corantes. No caso de cápsulas, comprimidos e pílulas, as composições farmacêuticas podem também conter agentes tamponantes. As composições sólidas de um tipo semelhante podem também ser utilizados como enchimentos em cápsulas de gelatina mole e dura utilizando excipientes tais como lactose ou açúcares do leite, bem como polietilenoglicóis de elevado peso molecular e semelhantes.

[211] Um comprimido pode ser feito por compressão ou moldagem, opcionalmente com um ou mais ingredientes acessórios. Os comprimidos prensados podem ser preparados utilizando ligante (por exemplo, gelatina ou hidroxipropilmetil celulose), lubrificante, diluente inerte, conservante, desintegrante (por exemplo, glicolato de amido de sódio ou carboximetilcelulose de sódio de ligação cruzada), um agente de superfície ativo ou de dispersão. Os comprimidos moldados podem ser feitos por moldagem em uma máquina adequada de uma mistura do composto em pó humedecido com um diluente líquido inerte.

[212] Os comprimidos, e outras formas de dosagem sólidas das composições farmacêuticas da presente invenção, tal como drageias, cápsulas, pílulas e grânulos, podem opcionalmente serem marcados ou preparados com revestimentos e invólucros, tais como revestimentos entéricos e outros revestimentos bem conhecidos na técnica de formulação farmacêutica. Eles também podem ser formulados de modo a proporcionar a liberação lenta ou controlada do ingrediente ativo neles contido usando, por exemplo, hidroxipropilmetil celulose em proporções variadas para fornecer o perfil de liberação desejado, outras matrizes poliméricas, lipossomas e/ou microesferas. Eles podem ser esterilizados, por exemplo, filtração através de um filtro de retenção de bactérias, ou por incorporação de agentes esterilizantes na forma de composições sólidas estéreis que podem ser dissolvidas em água estéril, ou algum outro meio injetável estéril imediatamente antes da utilização. Estas composições podem também opcionalmente conter agentes opacificantes e podem ser de uma composição que libera o ingrediente(s) ativo apenas, ou preferencialmente, em uma certa porção do trato gastrointestinal, opcionalmente, de uma forma retardada. Os exemplos de incorporação de composições que podem ser utilizadas incluem substâncias poliméricas e ceras. O ingrediente ativo também pode estar em forma micro- encapsulada, se apropriado, com um ou mais dos excipientes acima descritos. Em um aspecto, uma solução de resolvina e/ou protectina ou precursor ou análogo do mesmo pode ser administrado na forma de gotas para os olhos para a neovascularização ocular ou gotas para os ouvidos para tratar a otite.

[213] As formas de dosagem líquidas para administração oral dos compostos da invenção incluem emulsões, microemulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixires farmaceuticamente aceitáveis.

[214] Em adição ao ingrediente ativo, as formas de dosagem líquidas podem conter diluentes inertes vulgarmente utilizados na técnica, tais como, por exemplo, água ou outros solventes, agentes de solubilização e emulsificantes, tais como álcool etílico, álcool isopropílico, carbonato de etila , acetato de etila, álcool benzílico, benzoato de benzilo, propilenoglicol, 1,3-butilenoglicol, óleos (em particular, de semente de algodão, amendoim, milho, gérmen, azeite de oliva, óleo de rícino e óleos de gergelim), glicerol, álcool tetra-hidrofurílico, polietilenoglicóis e ésteres de ácidos graxos de sorbitano, e misturas dos mesmos. Além dos diluentes inertes, as composições orais podem também incluir adjuvantes tais como agentes molhantes, agentes emulsificantes e de suspensão, edulcorantes, aromatizantes, corantes, perfumantes e agentes conservantes.

[215] As suspensões, em adição aos compostos ativos, podem conter agentes de suspensão como, por exemplo, álcoois isoestearílicos etoxilados, polioxietileno sorbitol e ésteres de sorbitano, celulose microcristalina, metahidróxido de alumínio, bentonite, ágar-ágar e tragacanto, e misturas dos mesmos.

[216] Formas de dosagem para administração tópica ou transdérmica de um ou mais peptídeos como aqui revelado, ou um mutante, variante, análogo ou derivado do mesmo, incluem pós, pulverizador, pomadas, pastas, cremes, loções, géis, soluções, emplastros e inalantes. O composto ativo pode ser misturado sob condições estéreis com um veículo farmaceuticamente aceitável, e com quaisquer conservantes, tampões ou propelentes que possam ser necessários.

[217] As pomadas, pastas, cremes e géis podem conter, em adição a um composto ativo da invenção, excipientes, tais como gorduras animais e vegetais, óleos, ceras, parafinas, amido, tragacanto, derivados de celulose, polietilenoglicóis, silicones, bentonitas, ácido silícico, talco e óxido de zinco, ou misturas dos mesmos. Os pós e pulverizadores podem conter, em adição a um composto da invenção, excipientes tais como lactose, talco, ácido silícico, hidróxido de alumínio, silicatos de cálcio e pó de poliamida, ou misturas destas substâncias. Os pulverizadores podem conter adicionalmente propelentes habituais, tais como clorofluorohidrocarbonetos e hidrocarbonetos não substituídos voláteis, tais como butano e propano.

[218] Os emplastros transdérmicos têm a vantagem adicional de fornecer a liberação controlada dos compostos (resolvinas e/ou protectinas e/ou precursores ou análogos dos mesmos) da presente invenção para o corpo. Tais formas de dosagem podem ser feitas dissolvendo ou dispersando o composto no meio adequado. Potenciadores de absorção podem também ser usados para aumentar o fluxo do composto através da pele. A velocidade de tal fluxo pode ser controlada quer proporcionando uma membrana de controle de velocidade ou dispersando o composto ativo em uma matriz de polímero ou gel. Em outro aspecto, os polímeros biodegradáveis ou absorvíveis podem proporcionar liberação estendida, geralmente dos agentes de polipeptídeos. Os benefícios potenciais de um aumento da meia-vida ou liberação prolongada de um agente terapêutico são claras. Uma vantagem potencial da liberação localizada é a capacidade de atingir doses ou concentrações muito mais elevadas localmente, por maiores períodos de tempo, em relação à ampla administração sistêmica, com o potencial de também evitar possíveis efeitos colaterais indesejáveis que podem ocorrer com a administração sistêmica.

[219] Matriz polimérica bioabsorvível adequada para a distribuição de um ou mais peptídeos como aqui revelado, ou um mutante, variante, análogo ou derivado do mesmo, pode ser selecionado a partir de uma variedade de polímeros bioabsorvíveis sintéticos, os quais são descritos extensivamente na literatura. Tal bioabsorvível sintético, polímeros biocompatíveis, que podem liberar proteínas ao longo de várias semanas ou meses, podem incluir, por exemplo, os ácidos poli-a-hidroxi (por exemplo, polilactidos, poliglicólidos e seus copolímeros), polianidridos, poliortoésteres, copolímeros em bloco de polietileno glicol segmentado e polibutileno tereftalato (Polyactive™), polímeros derivados de tirosina ou poli(éster-amidas). Polímeros bioabsorvíveis adequados para ser usados na fabricação dos materiais de distribuição de fármacos e implantes são discutidos por exemplo, na Patente dos EUA. Nos 4.968.317, 5.618.563, entre outras, e em "Biomedical polymers", editado por SW Shalaby, Carl Hanser Verlag, Munique, Viena, Nova York, 1994 e em muitas referências citadas nas publicações acima. O polímero bioabsorvível particular que deve ser selecionado dependerá do paciente particular que está sendo tratado.

Terapia gênica

[220] Um ou mais peptídeos como aqui descrito, ou um mutante, variante, análogo ou derivado do mesmo, pode ser eficazmente utilizado no tratamento por terapia gênica. Ver, em geral, por exemplo, Patente dos EUA. No. 5.399.346, que é aqui incorporada por referência. O princípio geral é o de introduzir o polinucleotídeo em uma célula-alvo de um paciente.

[221] A entrada na célula é facilitada por meio de técnicas adequadas conhecidas na técnica, tais como o fornecimento de polinucleotídeo na forma de um vetor adequado, ou encapsulamento do polinucleotídeo em um lipossoma.

[222] Um modo desejado de terapia gênica consiste em fornecer o polinucleotídeo de tal maneira que ele vai replicar dentro da célula, aumentando e prolongando o efeito desejado. Assim, o polinucleotídeo é operacionalmente ligado a um promotor adequado, tal como o promotor natural do gene correspondente, um promotor heterólogo que é intrinsecamente ativo nas células do fígado, neural, do osso, de músculo, da pele, articulações, ou cartilagem, ou de um promotor heterólogo, que pode ser induzido por um agente adequado.

[223] Os vetores de expressão compatíveis com células eucariotas, preferencialmente os compatíveis com células de vertebrados, podem ser utilizados para produzir construções recombinantes para a expressão de um ou mais peptídeos, como aqui revelado ou um mutante, variante, análogo ou derivado do mesmo, incluindo proteínas de fusão com um ou mais peptídeos como aqui revelado, ou um mutante, variante, análogo ou derivado do mesmo. Os vetores de expressão de células eucarióticas são bem conhecidos na técnica e estão disponíveis a partir de várias fontes comerciais. Tipicamente, tais vetores são fornecidos contendo sítios de restrição convenientes para inserção do segmento de DNA desejado. Estes vetores podem ser vetores virais, tais como adenovírus, vírus adeno-associados, vírus da varíola, tal como um orthopox (vaccinia e vaccinia atenuado), poxvírus aviário, lentivírus, vírus da leucemia murina de Moloney, etc. Como alternativa, os vetores de expressão de plasmídeo podem ser utilizados.

[224] Os sistemas de vetores virais que podem ser utilizados na presente invenção incluem, mas não estão limitados a: (a) vetores de adenovirus; (b) vetores retrovirais; (c) vetores de vírus adeno-associados; (d) vetores de vírus herpes simplex; (e) vetores SV40; (f) vetores de vírus polioma; (g) vetores de papilomavírus; (h) vetores de picornavirus; (i) vetores de poxvirus tal como um orthopox, por exemplo, vetores do vírus vaccinia ou avipox, por exemplo, varíola dos canários ou varíola aviária; e (j) um adenovírus dependente do ajudante ou covarde. Em uma modalidade preferida, o vetor é um adenovírus. Vírus com replicação defeituosa também pode ser vantajoso.

[225] O vetor pode ou não ser incorporado no genoma das células. As construções podem incluir sequências virais para transfecção, se desejado. Alternativamente, a construção pode ser incorporada em vetores capazes de replicação episomal, por exemplo, vetores de EPV e EBV.

[226] O termo "ligado operacionalmente" entende-se que uma molécula de ácido nucleico e uma ou mais sequências reguladoras (por exemplo, um promotor) estão ligados de tal maneira a permitir a expressão e/ou secreção do produto (por exemplo, uma proteína) da molécula de ácido nucleico quando as moléculas apropriadas (por exemplo, proteínas ativadoras da transcrição) são ligados às sequências reguladoras. Dito de outra forma, o termo "ligado operacionalmente" como aqui utilizado, refere-se à relação funcional das sequências de ácido nucleico com sequências de regulação de nucleotídeos, tais como promotores, potenciadores, locais de paragem da transcrição e tradução e outras sequências sinal. Por exemplo, a ligação operativa de sequências de ácidos nucleicos, tipicamente DNA, a uma sequência reguladora ou a região do promotor refere-se a relação física e funcional entre o DNA e a sequência reguladora ou promotor de tal forma que a transcrição de tal DNA é iniciada a partir da sequência regulatória ou promotor, por uma RNA polimerase que especificamente reconhece, se liga e transcreve o DNA. De forma a optimizar a expressão e/ou a transcrição in vitro, pode ser necessário modificar a sequência reguladora para a expressão do ácido nucleico ou DNA no tipo celular para a qual é expressa. O desejo de, ou necessidade de, tal modificação pode ser determinada empiricamente. Um polinucleotídeo ligado operacionalmente para ser expresso inclui, tipicamente, um sinal de início apropriado (por exemplo, ATG) e mantém a estrutura de leitura correta para permitir a expressão da sequência de polinucleotídeo sob o controle da sequência de controle de expressão, e produção do polipeptídeo codificado desejado pela sequência de polinucleotídeo.

[227] Conforme aqui usado, os termos "promotor" ou "região promotora" ou "elemento promotor", como aqui definidos, refere-se a um segmento de sequência de ácido nucleico, tipicamente, mas não se limitando a DNA ou RNA, ou análogos dos mesmos, que controla a transcrição da sequência de ácido nucleico ao qual está ligado operacionalmente. A região promotora inclui sequências específicas que são suficientes para o reconhecimento da RNA polimerase, ligação e iniciação de transcrição. Esta porção da região promotora é referida como promotor. Além disso, a região promotora inclui sequências que modulam esse reconhecimento, ligação e atividade de iniciação de transcrição da RNA polimerase. Estas sequências podem ser de atuação ds ou pode ser responsível a fatores de atuação trans. Promotores, dependendo da natureza da regulação, podem ser constitutivos ou regulados.

[228] O termo "sequências reguladoras" é utilizado alternadamente com "elementos reguladores" e aqui refere-se a um segmento de elemento de ácido nucleico, tipicamente, mas não limitado a DNA ou RNA, ou análogos dos mesmos, que modula a transcrição da sequência de ácido nucleico para a qual está ligada operacionalmente, e, assim, atuam como moduladores da transcrição. As sequências reguladoras modulam a expressão do gene e/ou a sequência de ácido nucleico à qual eles estão operativamente ligados. Sequência reguladora contem muitas vezes "elementos reguladores", que são sequências de ácido nucleico que são os domínios de ligação da transcrição e que são reconhecidos pelos domínios de ligação de ácidos nucleicos de proteínas de transcrição e/ou de fatores de transcrição, repressores ou intensificadores, etc. Sequências reguladoras típicas incluem, mas não estão limitados a, promotores de transcrição, promotores induzíveis e elementos de transcrição, uma sequência de funcionamento para controlar a transcrição opcional, uma sequência adequada que codifica o sítio de ligação ribosomal RNAm, e sequências para controlar o término da transcrição e/ou tradução. Incluído no termo "elementos reguladores" estão sequências de ácidos nucleicos, tais como sinais de iniciação, intensificadores e promotores, que induzem ou controlam transcrição de sequências codificadoras de proteínas com as quais estão operacionalmente ligadas. Em alguns exemplos, a transcrição de um gene recombinante está sob o controle de uma sequência promotora (ou outra sequência reguladora transcricional) que controla a expressão do gene recombinante em um tipo celular na qual a expressão é pretendida. Também será compreendido que o gene recombinante pode estar sob o controle de sequências reguladoras transcricionais que são as mesmas ou que são diferentes daquelas sequências que controlam a transcrição da forma de ocorrência natural de uma proteína. Em alguns casos, a sequência do promotor é reconhecida pela maquinaria sintética da célula, ou a maquinaria sintética introduzida, necessária para iniciar a transcrição de um gene específico.

[229] Sequências regulatórias podem ser uma única sequência reguladora ou várias sequências regulatórias, ou sequências reguladoras modificados ou fragmentos dos mesmos. Sequências regulatórias modificadas são sequências regulatórias onde a sequência de ácido nucleico foi alterada ou modificada por algum meio, por exemplo, mas não limitado a, mutação, metilação, etc.

[230] As sequências reguladoras úteis nos métodos aqui descritos são elementos promotores que são suficientes para tornar a expressão do gene dependente de promotor controlável para tipos específicos de células, ou tecidos específicos ou induzível por de sinais ou agentes externos (por exemplo, intensificadores ou repressores específicos); tais elementos podem estar localizados em regiões 5'ou 3' do gene nativo, ou dentro de um intron.

[231] Conforme aqui utilizado, o termo "promotor específico de tecido" significa uma sequência de ácido nucleico que serve como um promotor, isto é, regula a expressão de uma sequência de ácido nucleico selecionada ligada operativamente ao promotor, e que afeta seletivamente a expressão da sequência de ácido nucleico selecionada em células específicas de um tecido.

[232] Em algumas modalidades, pode ser vantajosa a expressão direta de um ou mais peptídeos, tal como aqui divulgado, ou um mutante, variante, análogo ou derivado do mesmo, de uma maneira específica para tecidos ou células. A expressão específica em músculo pode ser alcançada, por exemplo, usando o promotor MKC de músculo esquelético (tal como divulgado no Pedido de Patente americano WO2007/100722, que é aqui incorporado por referência), ou outros promotores específicos do músculo, tais como a cadeia pesada de a- miosina, cadeia leve de miosina 2 (que é específica para músculo esquelético (Shani e cols, Nature, 314;. 283-86, 1985), região de controle do gene hormônio de liberação gonadotrófica que é ativo no hipotálamo (Mason e cols, Science, 234 ; 1372-1378, 1986), e promotor SM22a de músculo liso, que são todos comumente conhecidos na técnica.

[233] O termo "promotor constitutivamente ativo" refere-se ao promotor de um gene que é expresso em todos os momentos dentro de uma dada célula. Os promotores exemplares para utilização em células de mamíferos incluem citomegalovírus (CMV), e para utilização em células procariotas incluem os promotores do bacteriófago T7 e T3, e semelhantes. O termo "promotor induzível" refere-se ao promotor de um gene que pode ser expresso em resposta a um dado sinal de, por exemplo adição ou redução de um agente. Exemplos não-limitativos de um promotor indutível são os promotores “tet-on" e "tet-off”, ou promotores que são regulados em um tipo específico de tecido.

[234] Em uma modalidade específica, vetores virais que contêm sequências de ácidos nucleicos que codificam um ou mais peptídeos como aqui revelado ou um mutante, variante, análogo ou derivado do mesmo, são utilizados. Por exemplo, um vetor retroviral pode ser usado (ver Miller e cols. Meth. Enzymol. 217:581-599 (1993)). Estes vetores retrovirais contém os componentes necessários para o acondicionamento correto do genoma viral e a integração no DNA da célula hospedeira. Mais detalhes sobre vetores retrovirais podem ser encontrados em Boesen e cols., Biotherapy 6:291-302 (1994), que descreve o uso de um vetor retroviral para a distribuição do gene mdrl de células-tronco hematopoiéticas a fim de tornar as células tronco mais resistentes a quimioterapia. Outras referências que ilustram o uso de vetores retrovirais em terapia gênica são: Clowes e cols, J. Clin. Invist. 93:644-651 (1994); Kiem e cols, Blood 83: 14671473 (1994); Salmons e Gunzberg, Human Gene Therapy 4: 129141 (1993); e Grossman e Wilson, Curr. Opin. In Genetics ad Devel. 3: 110-114 (1993).

[235] A produção de um vetor retroviral recombinante portador de um gene de interesse é tipicamente realizada em duas fases. Primeiro, a sequência que codifica um ou mais peptídeos como aqui revelado, ou um mutante, variante, análogo ou derivado do mesmo, pode ser inserido num vetor retroviral que contém as sequências necessárias para a expressão eficiente de os reguladores do metabolismo (incluindo o promotor e/ou elementos intensificadores que pode ser fornecida pelas repetições terminais longas do vírus (LTRs) ou por um promotor/intensificador interno e sinais de processamento relevantes), sequências necessárias para o empacotamento eficiente do RNA viral em virions infecciosos (por exemplo, um sinal de empacotamento (Psi), um sítio de ligação do iniciador RNAt (-PBS), uma sequência regulatória 3’ necessária para a transcrição inversa (+PBS)), e um LTR viral). As LTR contêm sequências necessárias para a associação do RNA genômico viral, transcriptase reversa e de integrase, funções e sequências envolvidas em direcionar a expressão do RNA genômico a ser embalado em partículas virais.

[236] Em seguida à construção do vetor retroviral recombinante, o DNA vetor é introduzido em uma linha celular de empacotamento. Linha celular de empacotamento fornece as proteínas virais necessárias em trans para o empacotamento do RNA genômico viral em partículas virais tendo a gama de hospedeiro desejada (por exemplo, as proteínas do núcleo viral codificado (gag), polimerase (pol) e do envelope (env)). A gama de hospedeiros é controlada, em parte, pelo tipo de produto gênico do envelope expresso na superfície da partícula viral. Linha celular de empacotamento pode expressar produtos gênicos do envelope ecotrópicos, anfotrópicos e xenotrópicos. Alternativamente, a linha celular de empacotamento pode carecer de sequências que codificam para uma proteína do envelope viral (env). Neste caso, a linha celular de empacotamento pode empacotar o genoma viral em partículas que não possuem uma proteína associada à membrana (por exemplo, uma proteína env). Para produzir partículas virais contendo uma proteína associada a membrana que permite a entrada do vírus na célula, a linha celular de empacotamento contendo as sequências do retrovírus podem ser transfectadas com sequências que codificam para uma proteína associada à membrana (por exemplo, a proteína G do vírus da estomatite vesicular (VSV)). A célula de empacotamento transfectada pode então produzir as partículas virais que contêm as proteínas associadas à membrana expressas pela linha celular de empacotamento transfectada; estas partículas virais que contêm RNA genómico viral derivado de um vírus encapsidado pelas proteínas do envelope de outro vírus são ditos ser partículas virais pseudotipadas.

[237] Os adenovírus são outros vetores virais que podem ser utilizados em terapia gênica. Os adenovírus são veículos especialmente atraentes de liberação de genes para o epitélio respiratório. Os adenovírus infectam naturalmente o epitélio respiratório onde causam uma doença leve. Outros alvos para os sistemas de distribuição baseados em adenovirus são o fígado, o sistema nervoso central, as células endoteliais, e músculo. Os adenovírus têm a vantagem de serem capazes de infectar células que não se dividem. Kozarsky e Wilson, Current Opinion in Genetics and Development 3:499503 (1993) apresentam uma revisão em terapia gênica baseada em adenovírus. Bout e cols., Human Gene Therapy 5:3-10 (1994) demonstraram o uso de vetores de adenovírus para transferência de genes para o epitélio respiratório de macacos rhesus. Outro vetor viral preferido é um vírus da varíola, tal como um vírus vaccinia, por exemplo, um vaccinia atenuado, tais como Vírus Modificado Ancara (MVA) ou NYVCA, um poxvírus aviário, como a varíola aviária ou de canário. Outros exemplos do uso de adenovírus em terapia gênica podem ser encontrados em Rosenfeld e cols, Science 252:431-434 (1991).; Rosenfeld e cols, Cell 68:143-155 (1992); Mastrangeli e cols., J. Clin. Invest. 91:225-234 (1993); Publicação PCT W094/12649; e Wang e cols., Gene Therapy 2:775-783 (1995). Em outra modalidade, vetores lentivirais são usados, tais como vetores baseados em HIV descritos na Patente dos EUA Nos. 6.143.520; 5.665.557; e 5.981.276, que são aqui incorporadas por referência. O uso de vírus adeno- associado (AAV) também está contemplado (Walsh e cols. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 (1993) e Patente dos EUA. No. 5.436.146, que são aqui incorporadas por referência).

[238] Uma outra abordagem para a terapia genética envolve a transferência de um gene para as células em cultura de tecidos, por métodos tais como eletroporação, lipofecção, transfecção mediada por fosfato de cálcio, ou infecção viral. Geralmente, o método de transferência inclui a transferência de um marcador selecionável para as células. As células são, então, colocados sob a seleção para isolar as células que tenham captado e expressam o gene transferido. Estas células são depois distribuidas a um paciente.

[239] A Patente dos EUA No. 5.676.954 (que é aqui incorporada por referência) relata a injeção de material genético em camundongos complexado a transportadores de lipossomas catiônicos. Patentes dos EUA Nos. 4.897.355, 4.946.787, 5.049.386, 5.459.127, 5.589.466, 5.693.622, 5.580.859, 5.703.055, e a publicação internacional No. WO 94/9469 (que são aqui incorporados por referência) fornecem lípidos catiónicos para utilização em transfecção de DNA em células e mamíferos. As patentes dos EUA Nos 5.589.466, 5.693.622, 5.580.859, 5.703.055, e a publicação internacional No. WO 94/9469 (que são aqui incorporados por referência) fornecem métodos para a distribuição de complexos DNA-lípido catiónico em mamíferos. Tais complexos de lípidos catiónicos ou nanopartículas podem também ser utilizadas para distribuir proteína.

[240] Um gene ou uma sequência de ácido nucleico pode ser introduzida em uma célula alvo por qualquer método adequado. Por exemplo, uma ou mais construções de peptídeos, como aqui revelados, ou um mutante, variante, análogo ou derivado do mesmo, podem ser introduzidas em uma célula por transfecção (por exemplo, transfecção com fosfato de cálcio ou mediada por DEAE-dextrano), lipofecção, eletroporação, micro-injeção (por exemplo, por injeção directa de DNA nu), biobalística, infecção com um vetor viral contendo um transgene muscular relacionada, fusão celular, transferência de genes mediada por cromossomo, transferência de genes mediada por microcélula, transferência nuclear, e semelhantes. Um ácido nucleico que codifica um ou mais peptídeos como aqui revelado, ou um mutante, variante, análogo ou derivado do mesmo, pode ser introduzido nas células por eletroporação (ver, por exemplo, Wong e Neumann, Biochem. Biophys. Res. Commun. 107:584-87(1982)) e biobalística, por exemplo, uma pistola de gene (gene gun); Johnston e Tang, Métodos Cell Biol 43 Pt A :353-65 (1994), Fynan e cols, Proc Natl Acad Sci EUA 90: 11478 - 82 (1993)).

[241] Em certas modalidades, uma sequência do gene ou do ácido nucleico que codifica um ou mais peptídeos, como aqui revelado ou um mutante, variante, análogo ou derivado do mesmo, pode ser introduzido nas células alvo por transfecção ou lipofecção. Os agentes adequados para transfecção ou lipofecção incluem, por exemplo, fosfato de cálcio, DEAE-dextrano, lipofectina, lipfectamina, DIMRIE C, Superfect, e Effectin (Qiagen), unifectin, maxifectin, DOTMA, DOGS (Transfectam; dioctadecilamidoglicilspermina), DOPE (l,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DOTAP (l,2-dioleoil-3-trimetilamônio propano), DDAB (brometo de dimetil dioctadecil amônio), DHDEAB (brometo de N,N-di-n- hexadecil-N,N-dihidroxietil amônio), HDEAB (brometo de N-n- hexadecil-N,N-dihidróximetil amônio), polibreno, poli (etilenoimina) (PEI), e semelhantes. (Ver, por exemplo, Banerjee e cols., Med. Chem 42:4292-99 (1999); Godbey e cols, Gene Ther. 6: 1380-1388 (1999); Kichler e cols, Gene Ther. 5:855-60 (1998); Birchaa e cols., J. Pharm 183: 195-207 (1999), que são aqui incorporado por referência na sua totalidade).

[242] Os métodos conhecidos na técnica para a distribuição terapêutica de agentes, tais como proteínas e/ou ácidos nucleicos, podem ser utilizados para a distribuição de um polipeptídeo ou ácido nucleico que codifica um ou mais peptídeos como aqui revelado ou um mutante, variante, análogo ou derivado do mesmo, por exemplo, transfecção celular, terapia gênica, administração direta com um veículo de entrega ou veículo farmaceuticamente aceitável, entrega indireta pelo fornecimento de células recombinantes compreendendo um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de fusão alvo da invenção.

[243] Vários sistemas de distribuição são conhecidos e podem ser utilizados para administrar diretamente os polipeptídeos terapêuticos, tais como um ou mais peptídeos como aqui revelado, ou um mutante, variante, análogo ou derivado do mesmo, e/ou um ácido nucleico que codifica um ou mais peptídeos como aqui divulgado, ou um mutante, variante, análogo ou derivado do mesmo, por exemplo, por encapsulação em lipossomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capazes de expressar o composto, e endocitose mediada por receptor (ver, por exemplo, Wu e Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Métodos de introdução podem ser entéricos ou parentéricos e incluem, mas não estão limitados as vias intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intranasal, pulmonar, intra-oculares, epidural, e oral. Os agentes podem ser administrados por qualquer via conveniente, por exemplo por infusão ou injeção de bolus, por absorção através de revestimentos epiteliais ou mucocutâneos (por exemplo, mucosa oral, retal e intestinal, etc.) e pode ser administrada em conjunto com outros agentes biologicamente ativos. A administração pode ser sistêmica ou local.

[244] Em uma modalidade especifica, pode ser desejável administrar as composições farmacêuticas da invenção localmente à área com necessidade de tratamento; isto pode ser conseguido, por exemplo, e não como forma de limitação, por infusão local durante a cirurgia, aplicação tópica, por exemplo, por injeção, por meio de um cateter, ou por meio de um implante, o implante sendo de um material poroso, não-poroso, ou gelatinoso, incluindo membranas, tais como membranas sialásticas, fibras ou substitutos de pele comerciais.

[245] Em uma outra modalidade, o agente ativo pode ser administrado em uma vesícula, em particular um lipossoma (ver Langer (1990) Science 249: 1527-1533). Em ainda outra modalidade, o agente ativo pode ser distribuido em um sistema de liberação controlada. Em uma modalidade, uma bomba pode ser usada (ver Langer (1990) supra). Em uma outra modalidade, materiais poliméricos podem ser usados (ver Howard e cols. (1989) J. Neurosurg 71: 105).

[246] Deste modo, uma ampla variedade de vetores e construções de transferência de genes/terapia gênica são conhecidas na técnica. Estes vetores são facilmente adaptados para utilização nos métodos da presente invenção. Pela manipulação apropriada utilizando técnicas de DNA recombinante/biologia molecular para inserir um polipeptídeo operativamente ligado codificando o segmento de ácido nucleico no vetor de expressão/distribuição selecionado, muitos vetores equivalentes para a prática dos métodos aqui descritos podem ser gerados.

Outras modalidades

[247] A partir da descrição anterior, será evidente que variações e modificações podem ser feitas na invenção aqui descrita para adotar vários usos e condições. Tais modalidades estão também dentro do âmbito das reivindicações seguintes.

[248] A divulgação também contempla um artigo de fabricação que é um recipiente rotulado para fornecer um ou mais peptídeos como aqui descrito, ou um mutante, variante, análogo ou derivado do mesmo. Um artigo de fabricação compreende material embalado e um agente farmacêutico de um ou mais peptídeos como aqui revelado, ou um mutante, variante, análogo ou derivado do mesmo, contidos dentro do material embalado.

[249] O agente farmacêutico em um artigo de fabricação é qualquer uma das composições da presente invenção adequada para proporcionar uma ou mais peptídeos como aqui revelado, ou um mutante, variante, análogo ou derivado do mesmo e formulado em uma forma farmaceuticamente aceitável, tal como descrito aqui de acordo com as indicações descritas. Assim, a composição pode compreender um ou mais peptídeos como aqui revelado, ou um mutante, variante, análogo ou derivado do mesmo, ou uma molécula de DNA que é capaz de expressar tal peptídeo.

[250] O artigo de fabricação contém uma quantidade de agente farmacêutico suficiente para a utilização no tratamento de uma condição indicada aqui, seja em dosagem única ou múltiplas dosagens. O material de embalagem compreende uma etiqueta que indica a utilização do agente farmacêutico contido no seu interior.

[251] O rótulo pode incluir adicionalmente as instruções de uso e informações relacionadas que possam ser necessárias para a comercialização. O material de embalagem pode incluir recipiente(s) para armazenamento do agente farmacêutico.

[252] Conforme aqui utilizado, o termo material de embalagem refere-se a um material tal como vidro, plástico, papel, película e semelhantes capazes de manter dentro de dispositivos fixos um agente farmacêutico. Assim, por exemplo, o material de embalagem pode ser frascos de plástico ou de vidro, envelopes laminados e recipientes semelhantes, utilizados para conter uma composição farmacêutica, incluindo o agente farmacêutico.

[253] Em modalidades preferidas, o material de embalagem inclui um rótulo que é uma expressão tangível que descreve o conteúdo do artigo de fabricação e o uso do agente farmacêutico contido no seu interior.

EXEMPLOS Exemplo 1. Teste do potencial anti-inflamatório em um modelo de sepse camundongo.

[254] A capacidade das drogas de peptídeos foi testada quanto ao seu potencial para a redução de citocinas inflamatórias após o tratamento com o lipopolissacarídeo bacteriano purificado (LPS) - um componente principal da parede celular bacteriana de bactérias Gram-negativas. Um modelo de inflamação foi utilizado onde os camundongos foram injetados com LPS, o que induziu uma resposta imunológica transitória e um aumento de citocinas inflamatórias do soro. A resposta imune atinge o auge após 90 minutos e desaparece ao fim de 24 horas. Os níveis séricos de marcadores inflamatórios chaves foram comparados entre os camundongos tratados e não tratados com LPS 90 minutos após a injeção.

[255] Nós projetamos 18 peptídeos diferentes com base na sequência hAAT (Acesso # AAB59371) que foram sintetizados usando química FMOC convencional. Para avaliar o potencial anti-inflamatório e terapêutico in vivo, os peptídeos foram testados em um modelo de camundongo desafiado com lipopolissacarídeo (LPS) com os níveis séricos de TNFa como indicador. Utilizando dexametasona como referência, grupos de 3 animais foram injetados IP com 0,2 mg/kg de peptídeo 2 horas antes do desafio com LPS, e os níveis de TNFa no soro foram determinados 30 minutos após o desafio com LPS, por meio de ELISA. O peptídeo com melhor desempenho reduziu os níveis séricos de TNFa equivalentes aos obtidos com 1 mg/kg de dexametasona. Em seguida, versões encurtadas deste peptídeo foram sintetizadas, testadas no modelo de camundongo desafiado com LPS, e um peptídeo de 17 aminoácidos, SP16, surgiu como um candidato principal para o desenvolvimento de caracterização posterior. Em seguida, SP16 foi testado em um modelo de endotoxemia letal, que modela a endotoxemia, após a exposição a radiação aguda, onde bactérias gram-negativas que vazam do sistema gastrointestinal podem provocar endotoxemia letal. Neste experimento, o tratamento com peptídeos melhorou a sobrevivência (Figura 7). In vitro, SP16 reduz a ativação de NFkB induzida por LPS em células THP1, consistente com o efeito anti-inflamatório in vivo.

[256] Os camundongos foram injetados com 0,5, 0,1, 0,02 e 0,004 mg de cada peptídeo. Os camundongos foram também tratados com dexametasona, como um controle positivo, e veículo, como um controle negativo. Duas horas após cada cacmundongo foi injetado com LPS. As amostras foram coletadas 90 minutos após a injeção de LPS.

[257] Os resultados estão apresentados nas Figuras 3 e 4. A Figura 3 mostra os níveis de TNF-a do sangue em camundongos injetados com cada quantidade de cada um dos peptídeos. A Figura 4 mostra apenas os resultados para os camundongos injetados com 0,004 mg de cada peptídeo.

[258] Os resultados mostram que os peptídeos aqui descritos são eficazes na diminuição dos níveis de TNF-α e, portanto, são eficazes na redução da inflamação em indivíduos mamíferos.

Exemplo 2: Peptídeos da varredura de alanina em modelo de sepse camundongo.

[259] Para avaliar o efeito dos diferentes aminoácidos do peptídeo SP16 no efeito imunomodulador, foi feita uma varredura de alanina. Os diferentes peptídeos na varredura de alanina estão apresentados na Tabela B. A Figura 10 mostra que ambos os peptídeos alanina-substituídos C- e N-terminal, onde os três aminoácidos da extremidade foram substituidos com alanina, perderam a maior parte da sua capacidade de reduzir níveis de TNF-alfa. Os peptídeos em que a substituição ocorreu dentro dos aminoácidos 4-14 de SP16, pareceram manter e melhorar um pouco a sua capacidade de reduzir os níveis de TNF-alfa em relação ao controle com dexametasona. O modelo de camundongo LPS é um modelo estabelecido para a sepse em humanos e, assim, podemos concluir que os peptídeos em que os aminoácidos 1-3 e 15-17 estão presentes, podem ser efetivamente utilizado em seres humanos para tratar ou prevenir a sepse em condições, tais como queimaduras ou radiação aguda, que exponha os seres humanos a um risco elevado de desenvolver a endotoxemia.

Exemplo 3. Teste do potencial anti-inflamatório em artrite induzida por anticorpo de colágeno (CAIA) modelo de artrite reumatóide.

[260] A habilidade das drogas peptídicas foi testada para o seu potencial de reduzir a inflamação e edema de pata em um modelo de artrite de camundongo: o modelo CAIA. Camundongos Balb/c foram injetados com um coquetel de anticorpos de colágeno no Dia 0 e receberam um impulso de LPS no dia 3. Em seguida ao impulso de LPS, o inchaço da pata foi pontuado para cada pata. Para os resultados apresentados na Figura 5, os animais foram doseados com 0,2 mg/kg do peptídeo estabelecido na SEQ ID NO: l (também referida como SP16), diariamente. Na Figura 6, camundongos Balb/c foram injetados por via intravenosa com um coquetel de anticorpos de colágeno (MD Biosciences) no Dia 0 e injetados intraperitonealmente com LPS no Dia 3. Inchaço da pata foi determinado nos dias 0, 3, 4, 5, 6 e 7, e o gráfico mostra pontuações cumulativas para todas as patas de cada grupo experimental de 5 animais. Controle não tratado não recebeu o coquetel CAIA ou LPS. O grupo simulado recebeu tanto o coquetel de anticorpos e quanto o impulso de LPS. A dexametasona foi administrada diariamente a 1 mg/kg. O peptídeo estabelecido em SEQ ID NO: l foi dissolvido em água e administrado por via intraperitoneal a 0,6 mg/kg diariamente, ou uma dose única de 0,6 mg/kg no dia 3.

[261] A Figura 9 mostra a eficiênica de SP16 no modelo pré-clínico de AR em camundongo CAIA. O gráfico resume os dados de um estudo no modelo do camundongo CAIA AR. O gráfico mostra pontuações de inchaço cumulativas em todas as patas no pico da doença (dia 7) para os grupos de 5 animais. Camundongos Balb/c foram injetados por via intravenosa com um coquetel de anticorpos de colágeno (MD Biosciences) no Dia 0 e injetados intraperitonealmente com LPS no Dia 3. Controle de animal normal não recebeu injeções e serviu como linha de base controle livre de doença. Mostramos que a injeção diária de SP16 fornece proteção equivalente à dexametasona.

[262] Conforme mostrado nas Figuras 5, 6, e 9, o peptídeo: VKFNKPFVFLMIEQNTK (SEQ ID NO: l) é um agente anti- inflamatório e/ou imuno-modulador eficaz no modelo de sepse.

Exemplo 4: SP16 melhora o controle glicêmico no modelo db/db de diabetes tipo II.

[263] Encorajados pelos dados de sepse e AR, nós hipotetizamos se SP16 poderia proteger camundongos db/db, um modelo de diabetes tipo II (DM2), da perda de células b induzida por glicose- e lipotoxicidade, e reduzir a resistência à insulina (25, 39). Para testar esta hipótese, um estudo foi projetado e executado em animais db/db. Começamos um estudo no modelo db/db de DM2, porque é mais fácil de conduzir (devido ao momento e início sincronizado de detecção de diabetes) e, portanto, com melhor custo efetivo do que um estudo em camundongos NOD.

[264] No modelo db/db, o tratamento com SP16 resultou em redução na glicose do sangue sem jejum e os níveis de HbAlc, aumento dos níveis de peptídeo C e uma melhora na tolerância à glicose (Figura 8). Glicose no sangue não em jejum e tolerância à glicose foram melhorados em relação ao grupo controle de veículo, embora o grupo rosiglitazona tenha apresentado melhores valores que o grupo SP16. Juntos, esses dados mostram que o tratamento com SP16 melhorou o controle glicêmico em um modelo estabelecido de diabetes tipo II.

[265] Estes dados, juntamente com os resultados de sepse e AR, mostram que SP16 possui as propriedades anti- inflamatórias e imuno-moduladoras da proteína parental original hAAT, assim fornecendo um custo muito mais eficaz como forma de tratamento uma vez que o tamanho do fragmento peptídico recém descoberto é significativamente menor do que hAAT.

Exemplo 5: Peptídeo SP16 é um agonista de receptor do tipo Toll 2

[266] Receptor do tipo Toll 2 (TLR-2) desempenha um papel no sistema imune e é um membro da família de receptor do tipo Toll (TLR), que desempenha um papel fundamental no reconhecimento de patógenos e ativação da imunidade inata. Gene de TLR-2 é expresso mais abundantemente em leucócitos do sangue periférico, e tem sido mostrado mediar a resposta do hospedeiro a bactérias Gram-positivas e levedura através da estimulação da NF-kappaB.

[267] Nossos dados de linhagens celulares projetadas mostram que SP16 ativa a via de sinalização de TLR-2, mas não TLR-4. Isto é interessante porque outro peptídeo imuno modulador, DiaPep277, que não compartilha nenhuma similaridade de sequência com SP16, tem um perfil de ativação de TLR similar. Sem querer estar ligado por uma teoria, com base nestas observações, sugerimos que SP16 atua através do receptor TLR2, e possivelmente pelo receptor de células T, para dirigir a secreção de citocina para um perfil de citocinas anti-inflamatória Th2 (IL-4 e IL-10). Em doenças autoimunes, SP16 é previsto induzir a expansão das populações de células T reguladoras e, assim, deslocar a resposta inflamatória no sentido de uma resposta reguladora.

[268] Especificamente, a Figura 11 mostra que SP16 é um agonista de TLR2. O gráfico resume os dados de um experimento com uma linhagem celular projetada de TLR2 indicadora (HEK-BLUE™ mTLR2, Invivogen). As células foram incubadas com as concentrações indicadas de peptídeo, durante 24 horas. Após a ativação de TLR2, as células secretam fosfatase alcalina, que pode ser doseada. O ensaio foi feito em triplicata e as médias com desvios padrão estão representados. SP16 exibiu propriedades de ligação a TLR-2, induzindo sinalização de TLR-2 de uma forma dependente da dose. Um peptídeo misturado de controle (SP34) não apresentou indução de TLR2. * p<0,05, comparado com o controle misturado (SP34).

[269] A Figura 12 mostra a análise da relação estrutura-atividade para SP16. O gráfico resume os dados de experimentos em que uma linhagem celular projetada de TLR2 indicadora (HEK-Blue™ mTLR2, Invivogen) foi usada para testar o impacto da substituição de resíduos de aminoácidos do peptídeo SP16 com alanina ("varredura de alanina"). As células foram incubadas com 20 μg/ml dos peptídeos indicados durante 24 horas. Após a ativação de TLR2, as células secretaram fosfatase alcalina, que pode ser doseada. O ensaio foi feito em triplicata e as médias estão representadas. As sequências de peptídeos estão apresentadas na figura seguinte. *p<0,05, comparado com o controle misturado (SP34).

[270] A Figura 13 mostra a análise da relação estrutura-atividade para SP16. A tabela apresenta as sequências de aminoácidos dos peptídeos que foram testados usando uma linhagem celular indicadora de TLR-2 (ver dados apresentados na Figura 12). O lado direito da tabela resume o impacto dos peptídeos na sinalização por TLR-2 sinalização (* indica baixa, ***** indica alta, N/A não teve impacto sobre a sinalização).

[271] Os dados sugerem que os três primeiros resíduos contribuem para a indução da sinalização por TLR- 2. Se os resíduos 1-3 são substituídos por alaninas (SP37), o peptídeo mutante não tem nenhum impacto sobre TLR2. No entanto, quando substituídos individualmente (SP52-SP54), os peptídeos retêm a capacidade de estimular TLR-2. Surpreendentemente, a substituição do resíduo de fenilalanina na posição 3 com um resíduo menor de alanina melhora a capacidade de estimular a sinalização TLR-2 em comparação com SP16.

Claims (11)

1. Composição caracterizada pelo fato de que compreende um peptídeo consistindo na sequência de aminoácidos de VKFNKPFVFLMIEQNTK (SEQ ID NO: 1), RRRVKFNKPFVFLMIEQNTKRRR (SEQ ID NO: 38), RRRVKFNKPFVFLMRRR (SEQ ID NO: 39), RRRLRFNRPFLVVIRRR (SEQ ID NO: 43), ou RRRVRFNRPFLMIIRRR (SEQ ID NO: 47); água e outro veículo farmaceuticamente aceitável.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o peptídeo compreende adicionalmente pelo menos um segundo peptídeo ou proteína selecionados do grupo que consiste em biotina, um marcador FLAG, c-myc, hemaglutinina, His6, digoxigenina, FITC, Cy3, Cy5, proteína fluorescente verde, um marcador de epítopo V5, GST, β-galactosidase, AU1, AU5, avidina, um domínio Fc e albumina sérica.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o peptídeo e o segundo peptídeo ou proteína formam uma fusão.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizada pelo fato de que pelo menos o segundo peptídeo ou proteína é um epítopo marcador ou um extensor de meia-vida, ou ambos.

5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o peptídeo compreende um ou mais D-aminoácidos.

6. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato que o peptídeo é composto por 35 resíduos de aminoácidos, 22 resíduos de aminoácidos, 21 resíduos de aminoácidos, ou menos.

7. Uso de qualquer um dos peptídeos conforme descritos em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 ou de qualquer combinação dos mesmos caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de hiperglicemia pela melhora do controle glicêmico.

8. Uso de qualquer um dos peptídeos conforme descritos em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 ou de qualquer combinação dos mesmos caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de exposição a queimaduras ou radiação pela redução de risco de endotoxemia.

9. Uso de um peptídeo que reduz os níveis de TNF-α em um indivíduo, em que o peptídeo é selecionado de qualquer um dos peptídeos conforme descritos em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 ou de qualquer combinação dos mesmos, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de inflamação.

10. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de diabetes do tipo II, lúpus, doença do enxerto contra hospedeiro, uveíte, eczema, psoríase, fibrose cística, artrite reumatóide, síndrome de radiação aguda, queimaduras, doença inflamatória do intestino e diabetes tipo I de novo início.

11. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de fibrose cística.