ES2637286T3 - Tratamiento oral de la enfermedad inflamatoria intestinal - Google Patents

Abstract

Una beta defensina de mamífero para su uso en el mantenimiento de un sujeto que padece de una enfermedad inflamatoria intestinal en remisión, comprendiendo dicho método administrar por vía oral una cantidad terapéuticamente eficaz de una beta defensina de mamífero a dicho sujeto en remisión.

Description

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de las citocinas y quimiocinas proinflamatorias y/o citocinas antiinflamatorias que la beta defensina de mamífero (p. ej., ser humano). En una realización de la presente divulgación, el efecto sobre la actividad de las citocinas proinflamatorias y antiinflamatorias se mide como se describe en el documento WO 2010/007166, en los Ejemplos 4 y 6. El efecto puede medirse en una célula humana seleccionada del grupo que consiste en CMSP humanas, células

5 dendríticas derivadas de monocitos CD14+ humanas, una línea celular de monocitos humana y células dendríticas inmaduras humanas, preferentemente CMSP humanas.

De acuerdo con la presente divulgación, una variante funcionalmente equivalente de un beta defensina de mamífero

(p. ej., ser humano) puede comprender 1-5 modificaciones de aminoácido, preferentemente 1-4 modificaciones de aminoácido, más preferentemente 1-3 modificaciones de aminoácido, muy preferentemente 1-2 modificación (o modificaciones) de aminoácido y en particular una modificación de aminoácido, comparada con la secuencia de aminoácidos de la beta defensina de mamífero (p. ej., ser humano). Preferentemente, comparada con la beta defensina humana 2, que tiene la SEQ ID NO: 2.

15 El término "modificación" significa en el presente documento cualquier modificación química de una beta defensina de mamífero (p. ej., ser humano). La modificación (o modificaciones) puede ser una sustitución (o sustituciones), una deleción (o deleciones) y/o una inserción (o inserciones) del aminoácido (o aminoácidos), así como el reemplazo (o reemplazos) de la cadena (o cadenas) lateral del aminoácido; o el uso de aminoácidos no naturales con características similares en la secuencia de aminoácidos. En particular, la modificación (o modificaciones) pueden ser amidaciones, tales como la amidación del extremo C.

Preferentemente, las modificaciones de aminoácidos son de naturaleza menor, es decir sustituciones o inserciones de aminoácido conservativas que no afectan de forma significativa al plegamiento y/o la actividad del polipéptido; deleciones únicas; pequeñas extensiones amino o carboxilo terminales; o una pequeña extensión que facilite la

25 purificación cambiando la carga neta u otra función, tal como una etiqueta de polihistidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión. En una realización de la presente divulgación, la pequeña extensión, tal como una etiqueta de polihistidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión, está unido a la beta defensina de mamífero (p. ej., ser humano) a través de un pequeño péptido enlazador de hasta aproximadamente 20-25 restos y dicho enlazador puede contener un sitio de escisión para una enzima de restricción. El alineamiento de Clustal W en la Figura 4 o la Figura 5 puede utilizarse para predecir qué restos de aminoácidos pueden sustituirse sin afectar de forma sustancial a la actividad biológica de la proteína. Las secuencias se alinearon utilizando Clustal W 2.1 (http://www.genome.ip/tools/clustalw/) y los siguientes parámetros: Penalización de apertura de hueco: 10, Penalización de extensión de hueco: 0,05, Transición de Peso: NO, Restos Hidrófilos para proteínas: GPSNDQE, Huecos Hidrófilos: SÍ,

35 Matriz de peso: BLOSUM (para PROTEIN).

Las sustituciones dentro del siguiente grupo (Clustal W, grupo de conservación “fuerte”) deben considerarse sustituciones conservativas dentro del significado de la presente divulgación -STA, NEQK, NHQK, NDEQ, QHRK, MILV, MILF, HY, FYW.

Las sustituciones dentro del siguiente grupo (Clustal W, grupo de conservación "débil") deben considerarse sustituciones semiconservativas dentro del significado de la presente divulgación -CSA, ATV, SAG, STNK, STPA, SGND, SNDEQK, NDEQHK, NEQHRK, VLIM, HFY.

45 Los ejemplos de sustituciones conservativas son sustituciones hechas dentro del grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparagina), aminoácidos hidrófobos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina), y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina). Se conocen en la técnica sustituciones de aminoácidos que en general no alteran la actividad específica y se describen, por ejemplo, en H. Neurath y R.L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, Nueva York. Los intercambios que se producen de forma más común son Ala/Ser, Val/lle, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/lle, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly.

Además de los 20 aminoácidos convencionales, pueden sustituirse restos de aminoácidos de un polipéptido silvestre

55 por aminoácidos no convencionales (tales como 4-hidroxiprolina, 6-N-metil lisina, ácido 2-aminoisobutírico, isovalina y alfa-metil serina). Pueden sustituirse restos de aminoácido por un número limitado de aminoácidos no conservativos, aminoácidos que no están codificados por el código genético y aminoácidos no naturales. Se han modificado “aminoácidos no naturales” tras la síntesis proteica y/o tienen una estructura química en su cadena (o sus cadenas) lateral distinta de la de los aminoácidos convencionales. Los aminoácidos no naturales pueden sintetizarse de forma química, preferentemente están disponibles en el mercado, e incluyen ácido pipecólico, ácido tiazolidincarboxílico, deshidroprolina, 3-y 4-metilprolina, y 3,3-dimetilprolina.

Los aminoácidos esenciales en una beta defensina de mamífero pueden identificarse de acuerdo con procedimientos conocidos en la materia, tales como mutagénesis dirigida o mutagénesis de rastreo con alanina 65 (Cunningham y Wells, 1989, Science 244:1081-20 1085). En la última técnica, se introducen mutaciones de alaninas individuales en cada resto de la molécula y se analiza la actividad biológica de las moléculas mutantes resultantes

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En los polvos, el transportador es un sólido finamente dividido que es una mezcla con el componente activo finamente dividido. En los comprimidos, el componente activo está mezclado con el transportador, que tiene la capacidad de unión necesaria, en proporciones adecuadas y compactados en la forma y el tamaño deseados. Los transportadores adecuados son el carbonato de magnesio, estearato de magnesio, talco, azúcar, lactosa, pectina,

5 dextrina, almidón, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, una cera de bajo punto de fusión, manteca de cacao y similares.

Las gotas, de acuerdo con la presente divulgación, pueden comprender soluciones o suspensiones acuosas u oleosas, estériles o no estériles, y pueden prepararse disolviendo el principio activo en una solución acuosa

10 adecuada, de forma opcional incluyendo un agente bactericida y/o fúngico, y/o cualquier otro conservante adecuado, y de forma opcional incluyendo un tensioactivo. Los disolventes adecuados para la preparación de una solución oleosa incluyen glicerol, alcohol diluido y propilenglicol.

Las emulsiones pueden prepararse en soluciones en soluciones acuosas de propilenglicol o pueden contener

15 agentes emulsionantes tales como lecitina, monooleato de sorbitán o goma arábiga. Las soluciones acuosas pueden prepararse disolviendo el componente activo en agua y añadiendo colorantes, saborizantes, estabilizantes y agentes espesantes.

Las suspensiones acuosas pueden prepararse dispersando el componente activo finamente dividido en agua con

20 material viscoso, tal como gomas naturales o sintéticas, resinas, metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio y otros agentes de suspensión bien conocidos.

La formulación puede contener (además de un beta defensina de mamífero y otros principios activos optativos) transportadores, cargas, disgregantes, acondicionadores de flujo, azúcares y edulcorantes, fragancias,

25 conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, solubilizantes, sales para regular la presión osmótica, tampones, diluyentes, agentes dispersantes y tensioactivos, aglutinantes, lubricantes y/u otros excipientes farmacéuticos conocidos en la técnica.

Un experto en la técnica puede formular adicionalmente las beta defensinas de mamífero de una manera apropiada,

30 en conformidad con las prácticas aceptadas, tales como las descritas en Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1990.

Una beta defensina de mamífero, tal como una beta defensina humana, puede utilizarse sola, o en terapias de combinación con otros uno, dos o más compuestos farmacéuticos o sustancias farmacológicas, y/o con uno o más

35 excipientes farmacéuticamente aceptables.

Síntesis in vitro

Las beta defensinas de mamífero pueden prepararse mediante síntesis in vitro, utilizando métodos convencionales

40 como se conoce en la técnica. Están disponibles diversos aparatos de síntesis comerciales, por ejemplo el sintetizador automatizado de Applied Biosystems Inc., Beckman, etc. Utilizando sintetizadores, pueden sustituirse los aminoácidos de origen natural por aminoácidos no naturales, en particular D isómeros (o formas D), por ejemplo Dalanina y D-isoleucina, diastereoisómeros, cadenas laterales que tienen distintas longitudes o funcionalidades, y similares. La secuencia particular y la manera de preparación se determinará según la conveniencia, la rentabilidad,

45 la pureza requerida, y similares.

La unión química puede proporcionarse a diversos péptidos o proteínas que comprenden funcionalidades convenientes para el enlazamiento, tales como grupos amino para la formación de amidas o de aminas sustituidas, por ejemplo aminación reductora, grupos tiol para la formación de tioéter o disulfuros, grupos carboxilo para la

50 formación de amida, y similares.

Si se desea, pueden introducirse diversos grupos en el péptido durante la síntesis o durante la expresión, que permitan la unión a otras moléculas o a una superficie. Por lo tanto, las cisteínas pueden utilizarse para fabricar tioéteres, histidinas para la unión a un complejo de iones metálicos, grupos carboxilo para la formación de amidas o

55 ésteres, grupos amino para la formación de amidas y similares.

Las beta defensinas de mamífero, o los equivalentes funcionales de las mismas, también pueden aislarse y purificarse en conformidad con los métodos convencionales de síntesis recombinante. La síntesis recombinante puede realizarse utilizando vectores de expresión apropiados y un sistema de expresión eucariótico. Puede

60 prepararse una solución del hospedador de expresión y el medio y las defensinas presentes purificarse utilizando HPLC, cromatografía de exclusión, electroforesis en gel, cromatografía de afinidad u otra técnica de purificación. Los métodos para expresión recombinante de la beta defensina humana 2 en E. coli se divulgan en el documento WO 2010/007166 (Novozymes).

65 Dosificaciones

10

En las composiciones farmacéuticas se emplea preferentemente una beta defensina de mamífero, tal como una beta defensina humana, en una cantidad que sea eficaz para tratar una enfermedad intestinal inflamatoria, preferentemente con una toxicidad aceptable para el paciente. Para tal tratamiento, la dosificación apropiada variará, por supuesto, dependiendo, por ejemplo, de la naturaleza química y de los datos de farmacocinética del compuesto 5 de la presente divulgación utilizada, el hospedador individual, el modo de administración y la naturaleza y gravedad de las afecciones para tratar. Sin embargo, en general, para resultados satisfactorios en mamíferos grandes, por ejemplo seres humanos, una dosificación diaria indicada es preferentemente de aproximadamente 0,0001 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, más preferentemente de aproximadamente 0,001 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal; tal como 0,005 mg/kg de peso corporal a 5 10 mg/kg de peso corporal, más preferentemente de aproximadamente 0,01 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, preferentemente de aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, por ejemplo, administrado en dosis divididas hasta una, dos, tres o cuatro veces al día. Los compuestos de las realizaciones preferentes de la presente divulgación pueden administrarse a mamíferos grandes, por ejemplo seres humanos mediante modos similares de administración a

15 dosificaciones similares a las utilizadas de forma convencional.

En una realización de la presente divulgación, la dosificación diaria es preferentemente de 0,0001-10 mg/kg de peso corporal, más preferentemente 0,001-10 mg/kg de peso corporal, más preferentemente 0,005-5 mg/kg de peso corporal.

20 En determinadas realizaciones de la presente divulgación, las composiciones farmacéuticas de las realizaciones preferentes de la presente divulgación pueden incluir una beta defensina de mamífero, tal como una beta defensina humana, en una cantidad de aproximadamente 0,5 mg o menos a aproximadamente 1.500 mg o más por forma farmacéutica unitaria dependiendo de la vía de administración, preferentemente de aproximadamente 0,5, 0,6, 0,7,

25 0,8 o 0,9 mg a aproximadamente 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 o 1.000 mg, y más preferentemente de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 o 25 mg a aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 mg. En determinadas realizaciones de la presente divulgación, sin embargo, pueden ser preferentes dosificaciones menores o mayores que las mencionadas anteriormente. Un experto en la materia puede determinar fácilmente las concentraciones y dosificaciones apropiadas.

30 En una realización de la presente divulgación, la beta defensina de mamífero se administra al menos una vez al día, tal como al menos dos veces al día, por ejemplo al menos 3 veces al día, tal como al menos 4 veces al día.

La presente divulgación se describirá adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no deben considerarse 35 limitantes del ámbito de la divulgación.

Ejemplos

Ejemplo 1

40 Modelo de colitis inducida por Dextrano Sulfato de sodio (DSS) de 10 días en el ratón.

El objetivo del siguiente estudio era determinar la actividad antiinflamatoria de la beta defensina humana 2 en un modelo agudo (10 días) de enfermedad intestinal inflamatoria (colitis) inducida por la administración oral de dextrano 45 sulfato de sodio (DSS) en el ratón.

El modelo de ratón de colitis por DSS es un modelo bien reconocido para el estudio la enfermedad intestinal inflamatoria, como se describe en Kawada et al. "Insights from advances in research of chemically induced experimental models of human inflammatory bowel disease", World 15 J. Gastroenterol., Vol. 13 (42), pág. 5581

50 5593 (2007); y Wirtz y Neurath "Mouse models of inflammatory bowel disease", Advanced Drug Delivery Reviews, Vol. 59 (11), 1073-1083 (2007).

Materiales

55 Artículos de ensayo

Beta defensina humana 2 (hBD2); 21-hemisuccinato de metilprednisolona ("Prednisolona"), tampón PBS (GIBCO).

Animales de experimentación

60 En el estudio se utilizaron ratones C57BL/6 machos (Harlan Interfauna Ibérica, Barcelona, España), dado que esta es una especie y sexo que ha demostrado desarrollar una inflamación significativa del colon cuando se le administra una solución de DSS al 2 % en el agua de bebida durante un período de 10 días.

65 Identificación

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Los animales se identificaron mediante códigos alfanuméricos en sus colas. De forma adicional, cada jaula se identificó mediante una tarjeta codificada mediante color que indicaba el número y sexo de los animales, el código o nombre del artículo de ensayo, el nivel de dosis, la vía de administración, el período de tratamiento, el número de grupo, el código del estudio y el nombre del director del estudio.

5

Peso

El peso corporal promedio de los animales en el día del inicio del estudio era de 22,4 ± 0,16 g.

10 Aclimatación

Un mínimo de 7 días antes del inicio del estudio, en las mismas condiciones que las del estudio principal.

Alojamiento

15 A la llegada, los animales se separaron y alojaron al azar en jaulas de policarbonato (E-Type, Charles River, 255x405x197 mm) con tapas de acero inoxidable. Los animales se alojaron en grupos de cinco animales por caja de acuerdo con su sexo, en animalarios con temperatura controlada (22 ± 2 ºC), iluminación (12/12 horas de luz/oscuridad), presión de aire, número de renovaciones de aire y humedad relativa (30-70 %). Todas las jaulas

20 tenían serrín (Lignocel 3-4, Harlan Interfauna Ibérica, España) en el suelo como cama. Todos los ratones tenían acceso libre a una alimentación para roedores convencional seca en gránulos (Teklad Global 2014, Harlan Interfauna Ibérica, España). El agua se proporcionó a voluntad en botellas. El suministro de agua de grifo a los animalarios se analizó de forma periódica para comprobar su composición y para detectar posibles contaminantes (químicos y microbiológicos).

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Equipamiento y materiales

Equipamiento:

30 Balanza para animales de Sartorius Mod. BP 2.100 Equipamiento de disección quirúrgico Centrífuga Eppendorf 5415 C Microscopio de Nikon Eclipse E600FN Mezclador rotatorio de Hook & Tucker instruments

35 Homogeneizador IKA Ultra Turrax Balanza analítica de Sartorius Mod. BP 221S

Materiales y reactivos:

40 Jeringas desechables estériles (1 ml) Conjunto de infusión de aguja palomilla 25 G estéril Anestésico (Ketamina/Xilazina) Crema anestésica tópica (EMLA, Astra Zeneca) Dextrano Sulfato de Sodio 30.000-50.000 Daltons (MP Biomedicals)

45 Solución salina tamponada con fosfato (PBS; Sigma) Formalina neutra tamponada (VWR)

Protocolo experimental

50 Diseño del estudio: los animales se dividieron en 5 grupos experimentales. Cada grupo consistió en 10 machos: Grupo A: Tratado con vehículo de control (PBS) v.o., dos veces al día. Grupo B: Tratado con metilprednisolona (1 mg/kg v.o. dos veces al día). Grupo C: Tratado con hBD2 (0,05 mg/kg v.o. dos veces al día). Grupo D: Tratado con hBD2 (0,5 mg/kg v.o. al día). Grupo E: Tratado con hBD2 (5 mg/kg v.o., al día). En todos los grupos experimentales la asignación de los animales se realizó de una manera aleatoria. Se alojó un máximo de 5 ratones en cada jaula (de

55 acuerdo con la Directiva 86/609/EEC). A su llegada al laboratorio y antes de la administración de los artículos de ensayo todos los animales se pesaron.

Administración de la sustancia de ensayo

60 El vehículo de control y hBD2 se administraron por vía oral con el uso de un catéter estéril en un volumen de dosificación de 10 ml/kg de peso corporal. En todos los grupos los animales recibieron 2 dosis diarias (a las 9.00 h y a las 17.00 h) del correspondiente artículo de ensayo (de ensayo, de referencia o vehículo) durante 10 días consecutivos (1-10 días experimentales).

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hBD2 5 mg/kg

Día

NZ39000 DAI IAE de Vehículo Significación estadística frente al vehículo

3

0,5±0,27 2,6±0,7 P<0,05

4

0,6±0,27 2,6±0,75 P<0,05

5

l,8±0,76 4,4±0,72 P<0,05

6

1,4±0,6 4,4±0,72 P<0,05

7

2,1±0,96 5,7±0,92 P<0,05

8

5,4±0,87 9,2±0,25 P<0,01

9

5,2±0,76 10,2±0,57 P<0,001

10

5,6±0,48 11,6±0,4 P<0,001

Prednisolona 1 mg/kg

Día

NZ39000 DAI IAE de Vehículo Significación estadística frente al vehículo

6

7±0,33 11,6±0,4 P<0,01

También se observó una reducción significativa tanto para el colon proximal como para el distal (Figuras 2 y 3). 5

5. Conclusiones

Los resultados demuestran que la hBD2 administrada por vía oral en las dosis analizadas reduce significativamente el aumento en el Índice de Actividad de la Enfermedad inducido por la administración de DSS en el día 6, 7, 8, 9 y 10 10, para 0,05 mg/kg, en el día 6, 9 y 10 para 0,5 mg/kg y en el día 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 a 5 mg/kg. De forma similar, los resultados obtenidos con el índice de la actividad de la enfermedad, el análisis histológico de los cólones proximal y distal de cada animal en el día 10 reveló una reducción muy significativa de la puntuación de daño histológico mediante hBD2 administrado por vía oral. El efecto fue más pronunciado en los cólones proximales que en los distales. En el presente estudio, el tratamiento con el artículo de ensayo hBD2 dio como resultado una 15 inhibición significativa del índice de actividad de la enfermedad (IAE) cuando se administró de forma diaria, a 3 concentraciones de dosis por vía oral. Se sabe que el artículo de referencia (prednisolona) tiene un efecto supresor del apetito significativo en ratones (y se administró dos veces cada día), que puede a su vez dar como resultado un efecto significativo sobre el peso corporal de los animales no relacionado con la gravedad de la enfermedad. Para tomar este efecto en consideración, se llevó a cabo una puntuación de IAE adicional sin el efecto del cambio en el 20 peso corporal, solo se utilizaron como parámetros medibles la consistencia de las deposiciones y la hemorragia rectal. En este caso, el artículo de ensayo hBD2 también demostró una actividad antiinflamatoria muy significativa, como lo hizo el artículo de referencia prednisolona. La administración de dextrano sulfato de sodio dio como resultado una inflamación significativa y la lesión del tejido colónico de los animales, como se evidenció tras el examen histológico. Esta lesión fue más pronunciada en el corte distal del colon en comparación con el corte 25 proximal. El tratamiento con el artículo de ensayo hBD2 dos veces al día, a 3 concentraciones de dosis, dio como resultado una reducción significativa de este daño histológico en el colon proximal. De forma similar, el tratamiento con el artículo de ensayo hBD2 dos veces al día, en las concentraciones de dosis intermedia y alta, también dio como resultado una reducción significativa del daño histológico en el colon distal. El tratamiento con prednisolona a una dosis de 1 mg/kg v.o. dos veces al día (Grupo B) también redujo de forma significativa la lesión histológica 30 inducida por DSS en el colon proximal y distal. Los resultados también muestran un aumento significativo del peso corporal en los animales tratados con la dosis alta del artículo de ensayo en el día 10 (P<0,05), en comparación con el grupo de control. Este resultado sugeriría una mejora del estado de salud general de los animales en los grupos de artículos de ensayo mencionados, lo que conduce a una menor pérdida de peso corporal (p. ej., por comer más, por una diarrea menor, etc.). Los animales tratados con prednisolona (grupo B) muestran una disminución 35 significativa del peso corporal a partir del día 2 hasta la finalización del estudio. Como se mencionó anteriormente, esta disminución del peso corporal no puede tomarse como un indicio del estado de salud general de los animales

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Claims (1)

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