MX2011000569A - Tratamiento de enfermedades inflamatorias con beta-defensinas de mamifero. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a la supresión de la actividad del TNF-alfa con beta-defensinas de mamífero, la cual tiene utilidad en el tratamiento de condiciones patológicas que están asociadas con el factor de necrosis tumoral alfa.

Description

MIENTO DE ENFERMEDADES INFLAMATORIAS CON BETA-DE DE MAMIFERO de la Invención La presente invención se refiere a la supr Ctividad del factor de necrosis tumoral alfa (TN ) por medio de la administración de beta-defen fero, la cual tiene utilidad en el tratamiento dad de trastornos, incluyendo el tratami iciones patológicas que están asociadas mación. edentes de la Invención sinas de humano Entre muchos otros elementos, los component a inmunidad innata son los péptidos antimic s, por sus siglas en inglés) que muestran individ furo de cisteína intramoleculares. Las oc-de n subdividirse adicionalmente en aquellas ron primero de los gránulos de neutrófilos (H ias que son expresadas por las células de Panet as del intestino delgado (HD5 y HD6) . Las ß-de roducidas principalmente por las células epitel s tejidos y órganos incluyendo la piel, tráquea ointestinal , sistema urogenital, ríñones, pán ulas mamarias. Los miembros mejor caracterizad ia de las ß-defensinas son hBDl-3. Sin zando varias herramientas bioinformáticas casi 4 ectura abiertos que codifican homólogos putativ sinas han sido notados en el genoma humano. Al defensinas de humano son producidas ras que otras son inducidas por c flamatorias o productos microbianos exógenos. a eliminación de agentes patógenos por neut onalmente, las defensinas de humano también de pel en la curación de heridas, proliferación de liales y fibroblastos, angiogénesis y vasculogén Existe evidencia creciente de que las defen o desempañan un papel importante en muchas enfe ciosas e inflamatorias. La sobreexpresión de de mano se observa frecuentemente en la piel infla tada muy probablemente debido a la inducción l nentes microbianos o citocinas proinfla enas . En la psoriasis, la hBD2 y la h abundantes y en el epitelio lesional de pacie vulgar o foliculitis superficial se ha obser ación por incremento significativa de la hBD2. , la regulación por decremento de la hBD2 y la asociada con la dermatitis atópica. La enfermed os receptores correspondientes, actúan como adores intercelulares locales o sistémicos y desempeñan papeles cruciales en muchos gicos, tales como inmunidad, inflamac opoyesis. Las citocinas son producidas por de células que incluyen fibroblastos, eliales, células epiteliales, macrófagos/mono citos .

El TNF- está implicado en varios fisiológicos y puede ser ya sea protector, sa del hospedante, o perjudicial, como inmunidad. El TNF- es una de las citocinas e cadena y mantiene la respuesta de inflamaci tivación del TNF- ha resultado ser important lación por decremento de reacciones inflamato ? asociadas con enfermedades autoinmunes . as dendríticas, pero también por una amplia var tipos de células que incluyen células li citos, células endoteliales , miocitos cardíacos so, fibroblastos y tejido neuronal.

Los fármacos anti- inflamatorios actuales cción del TNF-ot al enlazarse a éste y en cons ir la señalización de los receptores para el TNF uperficie de las células. Este tipo de bloqu os efectos colaterales serios, de los cuales alg cciones tales como tuberculosis, sepsis e inf ales y una posible incidencia incrementada de cán La IL-10, también conocida como el factor i a síntesis de citocinas de humano (CSIF, por su inglés) , también es un protagonista principa lación inmune como una citocina anti- inflamator cina es producida por varios tipos de cél riblemente, inhiben una respuesta sostenida y p respuestas crónicas y potencialmente dañinas, eria, algunas células T son inducidas para por un antígeno y ya sea la IL-10 o el TGF-ß. L idas por la IL-10 son CD4+/CD25+/Foxp3 - y son r células Trl . Estas células suprimen las re es por medio de la secreción de la IL-10. Los ntes han revelado una mayor diversificac torio de efectores de células T que las Thl/Th2/ dentificación de las células Thl7. Se ha most subpoblación es patógena en varias enfe nmunes, tal como la enfermedad de Crohn, ativa, psoriasis y esclerosis múltiple, at amente al linaje de Thl . Las citocinas secret también son reguladas por decremento por la IL eo del TNF previene la psoriasis por medio -defensinas HD5 y HD6 de las células de Paneth, la enfermedad de Crohn en el colon ha sido asoc producción reducida de las ß-defensinas hBD2 emann y colaboradores, 2008; Wehkamp y colab . Adicionalmente , la implicación de la mi ica en la patogénesis de la enfermedad de Crohn trada convincentemente (Swidsinski y colabo ) . Utilizando la hibridización in situ de flúore investigadores mostraron que en la enfermedad a se observó un incremento drástico de las b ivas y asociadas con la mucosa, mientras q rias están ausentes en el epitelio normal del i do y grueso. Juntas estas observaciones se han i na hipótesis, la cual sugiere que en las ables un nivel apropiado de defensinas a la lar ra del epitelio intestinal actúa para contr fermedad de Crohn.

Con base en esta hipótesis, el docum 081486 da a conocer el uso de varias defens o en el tratamiento de la enfermedad in matoria. Los inventores sugirieron que las de istradas por la ruta oral a pacientes de la en rohn, en una formulación que permitía su liber ciones apropiadas en el lumen intestinal, redu o de bacterias invasivas, restablecería una fu ra epitelial normal y, de esta manera, redu dad de la enfermedad in lamatoria.

De acuerdo con el documento WO 2007/081 ón de las defensinas es centrarse directamente inar las bacterias en el lumen para impedir que ej ido epitelial. Es decir, la función de las de eramente como un compuesto anti- infeccioso . En matorias que incluyen la enfermedad in matoria . Se ha sabido durante más de una década sinas además de sus funciones antimicrobianas n un rango de funciones inmunomoduladoras . Sin ran mayoría del trabajo sobre las propied ación inmune de las defensinas de humano las que tienen principalmente funciones pro-inflama adoras del sistema inmune (Véase por ejemplo, N aboradores , 2007; Bowdish y colaboradores, 2006; .

Por lo tanto, es verdaderamente inesperad administrada por la ruta parenteral sea capaz de ravedad de la enfermedad en la enfermedad in matoria. Ante todo, cuando se administra por teral, la hBD2 nunca alcanzaría el lumen intesti trar las bacterias dañinas que están involucrad te documento .

El término "actividad del TNF-alfa" como se ste documento es un término amplio y se rcionar su significado ordinario y acostumbrado na de experiencia ordinaria en el campo (y no ado a un significado especial o individualiza re sin limitación a una actividad o efecto med ños en parte por el factor de necrosis tumoral a El término "supresor" como se utiliza ento es un término amplio y se le debe proporc Íficado ordinario y acostumbrado para una pe riencia ordinaria en el campo (y no debe ser li ignificado especial o individualizado) y se ref tación a una molécula (por ejemplo, un compuesto ntético) que puede disminuir por lo menos una TNF-alfa. En otras palabras, un "supresor" a eno, directa o indirectamente.

El término "actividad de la IL-10" como se ste documento es un término amplio y se rcionar su significado ordinario y acostumbrado na de experiencia ordinaria en el campo (y no ado a un significado especial o individualizad re sin limitación a una actividad o efecto med ños en parte por la interleucina- 10.

El término "inductor" como se utiliza ento es un término amplio y se le debe proporc ificado ordinario y acostumbrado para una pe ienda ordinaria en el campo (y no debe ser li ignificado especial o individualizado) y se ref ación a una molécula (por ejemplo, un compuesto tético) que puede incrementar por lo menos una a a IL-10. En otras palabras, un "inductor" a El término "modificación" significa entó cualquier modificación química de un sina 2 de humano. La(s) modificación (es) pued tución (es) , supresión (es) y/o inserción (es) ácido(s) así como también reemplazo (s) de c al (es) de aminoácidos; o el uso de aminoác ales con características similares en la secu ácidos. En particular, la(s) modificación (es) midaciones, tal como amidación de la C-terminal.

El término "defensina" como se utiliza ento se refiere a polipéptidos reconocidos na experta en el campo como que pertenecen a la sinas de péptidos antimicrobianos. Para determin éptido es una defensina de acuerdo con la inven encia de aminoácidos se puede comparar con los modelo oculto de Markov (perfiles del HMM) de la omo el patrón de cisteína.

Los ejemplos de defensinas, de acuerdo ción, incluyen la beta-defensina 1 de human la SEC ID N0:1), beta-defensina 2 de human la SEC ID NO: 2), beta-defensina 3 de human la SEC ID N0:3), beta-defensina 4 de human la SEC ID NO: 4) y beta-defensina 3 de rató la SEC ID NO: 6) .

La relación entre dos secuencias de amino dos secuencias de nucleótidos es descrita netro "identidad" .

Para los propósitos de la presente inven de identidad entre dos secuencias de aminoá rmina utilizando el algoritmo de Needlema leman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol . 48: 443-453) ementa en el programa Needle del paquete EMBOSS entidad y se calcula de la siguiente manera: duos Idénticos x 100 )/ (Longitud de Alineamient de Huecos en el Alineamiento) Para los propósitos de la presente inven de identidad entre dos secuenci irribonucleótidos se determina utilizando el a edleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, supra) menta en el programa Needle del paquete EMBOSS European Molecular Biology Open Software Suite, oradores, 2000, supra; http://emboss.org), prefer ersión 3.0.0 o posterior. Los parámetros opcion tilizan son la penalización por apertura de huec ización por extensión de hueco de 0.5 y la m tución EDNAFULL (versión EMBOSS de NCBI NUC4 tado de la "identidad más larga" etiquetada d nida utilizando la opción -nobrief) se utiliza preferiblemente por lo menos 40% pur riblemente por lo menos 60% puro, a riblemente por lo menos 80% puro y mu riblemente por lo menos 90% puro, como se cleter de SDS-PAGE.

El término "polipéptido sustancialment a en este documento una preparación de polipép ene a lo sumo 10%, preferiblemente a lo sumo riblemente a lo sumo 6%, más preferiblemente a más preferiblemente a lo sumo 4%, más preferibl umo 3%, aún más preferiblemente a lo sumo 2%, m riblemente a lo sumo 1% y aún mucho más preferi sumo 0.5% en peso de otro material de polipéptid se asocia de manera nativa o recombinante . Por l refiere que el polipéptido sustancialmente puro eños 92% puro, preferiblemente por lo menos 94% p . Esto se puede realizar, por ejemplo, al pre éptido por medio de métodos recombinantes bien c medio de métodos de purificación clásicos, -defensinas de mamífero La presente invención se refiere céuticos de beta-defensinas de mamífero, tal -defensinas de humano y/o beta-defensinas de rató miento de enfermedades asociadas con mentados (patógenos) del TNF-alfa, tale rmedades inflamatorias. El tratamiento está riblemente con una actividad reducida del TNF tejidos tratados. De esta manera, las beta-def n fero de la invención también son referid esores del TNF-alfa.

En una modalidad, las beta-defensinas de a invención tienen un grado de identidad de por ácidos de la SEC ID N0:1, SEC ID NO : 2 , SEC ID ID N0:4. En una modalidad más preferida, la sinas de mamífero de la invención consisten de sina 1 de humano (SEC ID N0:1), beta-defensi o (SEC ID N0:2), beta-defensina 3 de humano ), beta-defensina 4 de humano (SEC ID N0:4), una a beta-defensina 4 de humano (SEC ID NO: 5) y sina 3 de ratón (SEC ID NO: 6) . En una modalidad rida, las beta-defensinas de mamífero de la i isten de la beta-defensina 1 de humano (SEC I -defensina 2 de humano (SEC ID N0:2), beta-defens o (SEC ID NO : 3 ) y/o beta-defensina 4 de humano ) · En otra modalidad, las beta-defensinas de a invención tienen un grado de identidad de por referiblemente por lo menos 85%, más referi beta-defensinas de mamífero consisten de l sina 1 de humano, beta-defensina 2 de human sina 3 de humano, beta-defensina 4 de humano sina 3 de ratón y variantes funcionalmente equ as mismas. Más preferiblemente, las beta-defen ero de la invención consisten de la beta-defens o y variantes funcionalmente equivalentes de la Las beta-defensinas de mamífero de la i ién son referidas como compuestos de las mod ridas .

En el contexto de la presente invenci iante funcionalmente equivalente" de una beta-d amífero (por ejemplo de humano) es una beta-ficada de mamífero (por ejemplo de humano) qu imadamente el mismo efecto sobre la actividad que la beta-defensina de mamífero (por eje riblemente 1-4 modificaciones de aminoácid riblemente 1-3 modificaciones de aminoácidos, m riblemente 1-2 modificaciones de aminoácido icular una modificación de aminoácido, en compara ecuencia de aminoácidos de la beta-defensina de ejemplo de humano), tal como la SEC ID NO: 2.

Preferiblemente, las modificaciones de ami de carácter menor, es decir que son sustitu rciones de aminoácidos conservadoras que no ificativamente el plegamiento y/o activid éptido; supresiones individuales; extensiones O- o carboxilo-terminales ; un péptido conector pe a aproximadamente 20-25 residuos; o una extensión facilita la purificación al cambiar la carga net ión, tal como una etiqueta de poli -histidina , un génico o un dominio de enlace. y son descritas, por ejemplo, por H. Neurath , 1979, In, The Proteins, Academic Press, Nueva Y cambios que ocurren más comúnmente son Ala/Ser, lu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, ly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, al, Ala/Glu y Asp/Gly.

Además de los 20 aminoácidos estánd ácidos no estándar (tales como 4 -hidroxiproli -lisina, ácido 2 -aminoisobutírico, isovalina -serina) pueden ser sustituidos por resi ácidos de un polipéptido de tipo silvestre. U ado de aminoácidos no conservadores, aminoácido codificados por el código genético y aminoá ales pueden ser sustituidos por residuos de amin "aminoácidos no naturales" han sido modificados a síntesis de proteínas y/o tienen una estructura ida al sitio o mutagénesis de exploración de ingham y Wells, 1989, Science 244: 1081-1085) . a técnica, las mutaciones individuales de al ducen en cada residuo en la molécula y las m tes, resultantes se someten a prueba por la a gica (es decir, supresión de la actividad del T identificar los residuos de aminoácidos que son la actividad de la molécula. Véase también oradores, 1996, J. Biol . Chem. 271: 4699-47 idades de los aminoácidos esenciales también pu idas a partir del análisis de identida éptidos los cuales están relacionados con l sinas de mamífero.

Las sustituciones de aminoácidos indivi iples se pueden hacer y se pueden someter izando métodos conocidos de mutagénesis, recom yshire y colaboradores, 1986, Gene 46:145; oradores, 1988, DNA 7:127) .

Una extensión N-terminal de los polipéptid ción puede consistir adecuadamente de 1 ácidos, preferiblemente 2-20 aminoácidos, espec aminoácidos. En una modalidad, la extensión de minal no contiene una Arg (R) . En otra modal sión N-C-terminalomprende un sitio de escisión ar a kex2 como será definido adicionalme nte. En una modalidad preferida, la extensión N- péptido, que comprende por lo menos dos res ácidos de Glu (E) y/o Asp (D) , tal como una exte inal que comprende una de las siguientes secuenci E y DD. os y Usos Los supresores del TNF-alfa tienen una var as desafiadas con LPS y LTA. Además, se descubri defensina 2 de humano reduce la secreción de la as desafiadas con LPS y LTA; y se descubrió que sina 3 de ratón reduce la actividad del TNF en de murino como de humano desafiadas con LPS descubrimientos confirman que las beta-defen ero sometidas a prueba exhiben una excelente a inflamatoria, en particular una actividad matoria en enfermedades o trastornos autoinmunes Las composiciones farmacéuticas de las mod ridas se pueden utilizar para tratar trasto s son mediados por la actividad del TNF-alfa. Ta rcionan métodos para tratar trastornos los cu dos por la actividad del TNF-alfa, tratamiento ende administrar a un sujeto necesitado miento una cantidad efectiva de una beta-defe a enfermedad o trastorno existente, así como ta laxis (prevención) de una enfermedad o trastorno En una modalidad, el tratamiento da por r actividad reducida del TNF-alfa en los tejidos t riblemente una actividad reducida del TNF-alf idad incrementada de la IL-10.

Las enfermedades o trastornos, los cuale tratados con los compuestos de las mod ridas, por ejemplo por medio de la inhib sión de la actividad del TNF-alfa, incluyen aque s son mediados por la actividad del T eriblemente , el tratamiento de esos trastorn ficiarse de la actividad reducida del TNF-a idad incrementada de la IL-10. Estas enferm tornos incluyen enfermedades o trastornos infla rmedades alérgicas y enfermedades autoinmun rativa) , vasculitis, uveítis, dermatitis (por atitis inflamatoria), dermatitis atópica, a tis (alérgica) , conjuntivitis alérgica, miasteni erodermatitis , sarcoidosis, artritis pso dilitis anquilosante, artritis idiopática rmedad de Graves, síndrome de Sjogren y enfer et .

Los supresores del TNF-alfa se pueden péuticamente en composiciones formuladas nistración por cualquier ruta convencional, i la ruta enteral (por ejemplo, bucal, oral, al) , parenteral (por ejemplo, intravenosa, intr aperitoneal , subcutánea o intramuscular) o tóp plo, epicutánea, intranasal o intratraqueal ) . D s modalidades, las composiciones descritas mento se pueden administrar como parte de un imp ejemplo, por medio de procesos de mezclado, gra rimiento, disolución o liofilización .

En otra modalidad, se proporcionan compo céuticas que contienen uno o más supresóres . Para los propósitos de administración, los co las modalidades preferidas se pueden formul siciones farmacéuticas. Las composiciones farma as modalidades preferidas comprenden uno o más su TNF-alfa de las modalidades preferidas y un port ente farmacéuticamente aceptable.

El supresor del TNF-alfa se emplea preferi omposiciones farmacéuticas en una cantidad la tiva para tratar un trastorno particular, es d cantidad que es suficiente para lograr inuidos del TNF-alfa o actividad, sínt eriblemente con toxicidad aceptable para el p riblemente de aproximadamente 0.01 g a 1.0 imadamente 0.01 mg/kg de peso corporal a aproxim mg/kg de peso corporal, más preferibleme imadamente 0.1 mg/kg de peso corporal a aproxim /kg de peso corporal, por ejemplo, administrada idas hasta cuatro veces al día. Los compuestos idades preferidas se pueden administrar a mamíf es, por ejemplo los humanos, por medio de istración similares en dosificaciones simi ias utilizadas convencionalmente con otros med ejemplo, inhibidores de bajo peso molecular, idad del TNF-alfa.

En ciertas modalidades, las compo céuticas de las modalidades preferidas pueden sor(es) del TNF-alfa en una cantidad de aproxim mg o menos a aproximadamente 1500 mg o más por ntraciones y dosificaciones apropiadas pue minadas fácilmente por una persona experta en el Los portadores y/o diluyentes farmacéut ables son conocidos para aquellas personas exp ampo. Para las composiciones formuladas como so das, los portadores y/o diluyentes aceptables ión salina y agua estéril y pueden incluir opcio xidantes, amortiguadores, bacteriostatos y vos comunes. Las composiciones también se lar como pildoras, cápsulas, gránulos, biertas o no recubiertas) , soluciones (inyec iones sólidas, suspensiones, dispersiones, disp as (por ejemplo, en la forma de ampolletas, fra s, geles, pastas, polvo para inhalador, espumas, es labiales, gotas, pulverizaciones o supositor lación puede contener (además de uno o más su puede formular adicionalmente los supresores de una manera apropiada y . de acuerdo con las p adas, tales como aquellas descritas en Rem aceutical Sciences, Gennaro, Ed. , ack Publish n, PA 1990.

Los supresores del TNF-alfa se pueden o en terapias de combinación con uno, do iestos farmacéuticos o sustancias de fármaco di on uno o más excipientes farmacéuticamente acept En las modalidades preferidas, el supresor está presente en combinación con fármacos conven se utilizan para tratar enfermedades o condic el TNF-alfa es patógeno o en donde el peña un papel esencial u otro papel en el proce medad. En las modalidades particularmente prefer rcionan composiciones f rmacéuticas que comprend ridas se pueden utilizar para el tra céutico solos o en combinación con uno o más céuticamente activos diferentes, por ejemplo, ta es que son útiles en el tratamiento de la infla medades asociadas. Estos otros agentes farmacéut os incluyen, por ejemplo, esteroides, glucocort idores de otras citocinas inflamatorias (por uerpos anti-TNF-alfa, anticuerpos anti-IL-1, ant -IFN-gamma) y otras citocinas tales como IL-1 RA os inhibidores del TNF-alfa.

Las terapias de combinación pueden inaciones fijas, en las cuales dos o más céuticamente activos están en la misma forrr en los cuales dos o más agentes farmacéut os en formulaciones separadas son vendidos en ete, por ejemplo, con instrucciones para os y similares. Por ejemplo, se proporciona un céutico que comprende una primera sustancia de al es un compuesto de las modalidades preferid enos una segunda sustancia de fármaco, ju ucciones para la administración combinada. Ta rciona un paquete farmacéutico que compr esto de las modalidades preferidas jun ucciones para la administración combinada con una segunda sustancia de fármaco. Tam rciona un paquete farmacéutico que comprende una segunda sustancia de fármaco jun ucciones para la administración combinada esto de la presente invención.

El tratamiento con combinaciones de acuerdo lidades preferidas puede proporcionar mejoramien itado superior en comparación con los tratamie idad terapéuticamente efectiva de un compuesto lidades preferidas y una segunda sustancia de ién se proporciona un método para mejorar la éutica de una segunda sustancia de fármaco que c inistrar, por ejemplo, de manera concomitan encía, una cantidad terapéuticamente efectiva esto de las modalidades preferidas y una ancia de fármaco. Una combinación de la nción y una segunda sustancia de fármaco añero de combinación se pueden administrar por c convencional, por ejemplo como se expone ante un compuesto de las modalidades preferidas. Un aco se puede administrar en dosificaciones piado/ por ejemplo, en rangos de dosificación ?? similares a aquellos utilizados para el tr vidual o, por ejemplo, en el caso de la sinergia nación con los compuestos de las modalidades pr yen por ejemplo inhibidores de mTOR, incluye icinas, por ejemplo 40-O- (2-hidroxietil) -rapamic orapamicina, rapamicinas 16 -O-sustituidas tales - 2 - iniloxi - 32 -desoxorapamicina , 16 -pent - 2 - iniloxi hidro-rapamicina , 16-pent-2-iniloxi-32 (S o R) -- (2 -hidroxietil) -rapamicina, 40- [3-hidroxi-2 - ( til) -2 -metilpropanoato] -rapamicina (también CCI779) , 40-eroi- (tetrazolil) -rapamicina ida como ABT578) , los comúnmente llamados rapálo lo, como se da a conocer en la Solicitud Inte PCT No. WO 98/02441, Solicitud Internacional del 01/14387 y Solicitud Internacional del PCT 383, tal como AP23573 y compuestos dados a cono ombre de TAFA-93 y biolimus (biolimus A9) ; inhibi ineurina, por ejemplo, ciclosporina A o tora de VEGF, inhibidores de PKCr por ejemplo co nocer en la Solicitud Internacional del PCT 561 o la Solicitud Internacional del PCT 859, por ejemplo, el compuesto del Ejemplo 5 idores de cinasa JAK3 , por ejemplo alfa-cia roxi )] N-bencilcinamamida de N-bencil-3 , 4 -di iden-cianoacetamida (Tirfostina AG 490) , prod (PNUI 56804) , [4 - (4 ' -hidroxifenil ) -an oxiquinazolina] (WHI-PI 31), [4-(3'-b xilfenil) -amino- , 7-dimetoxiquinazolina] (WHI- ' , 5 -dibromo-4 ' -hidroxilfenil ) -amino-6 , 7- oxiquinazolina] WHI-P97, KRX-211, 3 - { ( 3R, 4R) -4 -il- (7H-pirro] o [2 , 3-d] pirimidin-4 - il ) -amino] -piper -oxo-proroionitrilo, en forma libre o en una farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, mono ién denominado CP-690,550) o un compuesto como lónales inmunosupresores, por ejemplo, ant lonales para receptores de leucocitos, por eje tor de Blys/BAFF, MHC, CD2 , CD3 , CD4 , CD7, CD , CD40, CD45, CD52, CD58, CD80, CD86, receptor d tor de IL-17, receptor de IL-23 o sus ligando estos inmunomoduladores , por ejemplo una mol e recombinante que tiene por lo menos una por io extracelular de CTLA4 o un mutante del mi lo, por lo menos una porción extracelular de CT te del mismo unida a una secuencia de proteína e CTLA4, por ejemplo, CTLA4lg (por ejemplo desi 68629) o un mutante del mismo, por ejemplo idores de moléculas de adhesión, por onistas de LFA-I, antagonistas de ICAM-I onistas de VCAM-4 o antagonistas de VLA-4, anta CR9, inhibidores de MIF, agentes de 5-aminosalici yen fármacos donadores de NO que exhiben COX (CI siglas en inglés) ; fosfodiesterasa, por idores de PDE4B, inhibidores de caspasa, fármaco matorios multifuncionales" (MFAIDs, por sus s s) , por ejemplo, inhibidores de fosfolipasa ci cPLA2) , tales como inhibidores de fosfolipasa A2 mbrana vinculados con glicosaminoglicanos .

En otras modalidades preferidas, uno estos que inhiben el TNF-alfa de las mod eridas están presentes en combinación con un acos anti- inflamatorios no esteroidales (NSAIDs) uestos farmacéuticos para tratar la artritis rmedades inflamatorias. Los compuestos p uyen, pero no están limitados a, celecoxib; ro DS, por .ejemplo, aspirina, celecoxib, tri-salic na-magnesio, diclofenaco potásico, diclofenaco inonida, dipropionato de betametasona, vale etasona, desonida, desoximetasona, . fluoc cinolona, acetonida de triamcinolona, propio tasol y dexametasona.

En las modalidades particularmente preferi s compuestos que inhiben el TNF-alfa están pres nación con uno o más estimulantes beta, corticos nhalación, antihistaminas , hormonas u otros co céuticos para tratar el asma, insuficiencia resp u otras enfermedades respiratorias. Los co ridos incluyen, pero no están limitados a, esti , por ejemplo, broncodilatores prescritos com costeroides de inhalación, por ejemplo, beclom icasona, triamcinolona, mometasona y formas de pr como prednisona, prednisolona y metilpredn istaminas, por ejemplo, az urano, quetamina, propofol, sevoflurano, ñilo, hidromorfona, marcaína, meperidina, m na, oxicodona, remifentanilo, sufentanilo, but fina, tramadol, benzocaína, dibucaína, cloruro d aína y fenazopiridina .

En las modalidades particularmente preferi s compuestos que inhiben el TNF-alfa están pres nación con compuestos farmacéuticos para tr medad de intestino irritable, tales como azati icosteroides , en una composición farmacéutica.

En las modalidades particularmente preferi s compuestos que inhiben el TNF-alfa están pres inación con compuestos inumosupresores en una com céutica. En las modalidades particularmente pre o más compuestos que inhiben el TNF-alfa están p combinación con uno o más fármacos para tr metasona, budesonida, fosfato sódico de dexam solida, propionato de fluticasona, aceton cinolona, betametasona , fluocinolona, fluoc pionato de betametasona, valerato de betam ida, desoximetasona, fluocinolona, triamc nita de triamcinolona, propionato de clobe netasona .

En el tratamiento de ciertas enfermedade benéfico tratar al paciente con un supresor del combinación con un anestésico, por ejemplo, acaína, cloroprocainc, levobupi acaína, li acaína, procaína, ropivacaína, tetracaína, des lurano, quetamina, propofol, sevoflurano, anilo, hidromorfona, marcaína, meperidina, ina, oxicodona, remifentanilo, sufentanilo, but fina, tramadol, benzocaína, dibucaína, cloruro n natural pueden ser sustituidos por aminoác ales, particularmente D- isómeros (o D-form ío D-alanina y D- isoleucina, diastereoisómeros , ales que tienen diferentes longitudes o funcion imilares. La secuencia particular y la ma ración serán determinadas por conveniencia, e a requerida y similares.

Se puede proporcionar la unión química dos o proteínas que comprenden funcion nientes para el enlace, tales como grupos amino ción de amida o amina sustituida, por ejemplo a tiva, grupos tiol para la formación de ti furo, grupos carboxilo para la formación de a s * Si se desea, se pueden introducir varios g éptido durante la síntesis o durante la expré , cromatografía de exclusión, electroforesis tografía de afinidad u otra técnica de purific Los aspectos y modalidades adicionales nte invención se resumen a continuación: Reivindicación 10. Una beta-defensina de el tratamiento de una enfermedad o t matorio seleccionado del grupo que consi itis reumatoide, osteoartritis , esclerosis m rosclerosis , escleroderma (esclerosis sis S , lupus eritematoso sistémico erulonefritis (aguda), asma, enfermedades pu ructivas crónicas (COPD) , síndrome de insuf iratoria (ARDS) , vasculitis, uveítis, der atitis atópica, alopecia, rinitis (al untivitis alérgica, miastenia grave, esclerod oidosis, artritis psoriática, espo ualquiera de las reivindicaciones 10-12, la eta-defensina de humano.

Reivindicación 14. La beta-defensina de alquiera de las reivindicaciones 10-13, la cu lo menos 80% de identidad con las secuen ácidos de la SEC ID NO : 1 , SEC ID NO : 2 , SEC I ID NO: 4.

Reivindicación 15. La beta-defensina de ualquiera de las reivindicaciones 10-14, la cu -defensina 1 de humano, beta-defensina 2 de -defensina 3 de humano o beta-defensina 4 de hut Reivindicación 16. La beta-defensina de t alquiera de las reivindicaciones 10-15, la cu lo menos 80% de identidad con la secue oácidos de la SEC ID NO : 2.

Reivindicación 17. La beta-defesina de t PLOS PLO 1 vidad anti - inflamatoria de la be ta- de fensin o (hBD2) Durante la prueba de la hBD2 por los nomoduladores se observó inesperadamente que un enorme potencial ant i - inflamatorio . ivos de PBMC humanas se observó que el tra hBD2 tuvo gran influencia sobre el pe einas de cultivos estimulados con LPS, idoglicano. Se ha observado previamente que capaz de inducir las citocinas y qui nflamatorias IL-6, IL-?ß, RANTES, IP-10 onsaba y colaboradores 2007, Boniotto boradores 2006) .

En este punto se muestra que la hBD2 t IALES Y METODOS cción de hBD2 La hBD2 se produjo de manera recombina ento de ADN sintético (ADN 2.0) que codificaba lonó en el vector de expresión pET-32 (+) (Nova ido resultante codificó un péptido de fu cción que contenía una parte de tiorredoxina N- da por una etiqueta de his, un sitio de esc ocinasa y finalmente el péptido de hBD2. El plá sión se transformó en la cepa de E. coli BL21.

Un' cultivo durante toda la noche de esta ó 100 veces en TB-glicerol que contenía 100 ilina y se desarrolló a una OD600 de aproximadam y se indujo con 0.5 mM de IPTG durante 3 horas o cual las células se recolectaron por medi ifugación. El péptido de fusión de trx-hBD2 et trometría de masas MALDI-TOF.

La producción de mBD3 (véase el Ejemplo 4) o utilizando un protocolo idéntico.

La topología de plegamiento y conexión de d iada de la molécula de hBD2 se verificó subsecue izando la digestión tríptica acoplada con troscopía de NMR.

La endotoxina se retiró de las prepara y mBD3 por medio de la RP-HPLC preparativa en un contenido de endotoxina se determinó por medi o de LAL (Endosafe KTA2MR) y se descubrió que inferior al límite de detección del ensayo (0.05 evaluar que los niveles inferiores al lí cción del ensayo de endotoxina no fueran ca ular las PBMC, se realizaron curvas de titulaci ulación con un lipopolisacárido muy potente ( arte superior de donadores individuales y se hielo hasta que se utilizó al 2% en el medio de io de cultivo autologo) . Las PBMC aisl spendieron en un medio de cultivo autologo y se s lacas de cultivo de 96 pocilios con 255,000 cél lio en un total de 200 µ? . Las PBMC del mismo do ularon con 100, 10 o 1 µg/ml de hBD2 ya sea sola LPS a 0.6 ng/ml o 20 ng/ml {E. coli, 0111 :B 1) , ácido lipoteicoico (LTA) a 1.25 g/ml ilis, Sigma L3265) o peptidoglicano (PGN) a 40 µ ureus, Sigma 77140) . Las concentraciones utiliza stimulación se optimizaron en 3 diferentes dona rimentos iniciales, para el LPS se utiliza entraciones diferentes para asegurarse de est l de citocina que sea posible modular. En rimentos, las PBMC se trataron con Dexamet spositivo Nucleocounter . vo y estimulación de MUTZ-3 La línea de células derivadas de leucemia as MUTZ-3 (DSMZ, Braunschweig , Alemania) se ma (Sigma M4526) , complementado con 20% de suer [volumen/volumen (v/v) ] (Sigma F6178) y 40 -CSF (R&D Systems 215-GM-050) . Estas células prog en la siguiente línea de células de monocitos tos monocitos se estimularon con 100, 10 o 1 ya sea sola o junto con LPS o LTA. enciación de células dendríticas Para generar una línea de células dendritoi s de células de leucemia mieloide humanas MUT élulas/ml) se diferenciaron durante 7 días en p hGM-CSF (150 ng/ml) y rhIL-4 (50 ng/ml) en DCs in edio se intercambió cada 2-3 días. La línea de , IL-10, TNF, IL-12, p70, IL-6. En algunos exper itocinas se midieron por medio de kits de ELIS ms (IL-10, TNF- , IL-?ß) de acuerdo c ucciones del fabricante. sis de datos Todos los experimentos se realizaron por eces, con los resultados representativos que se m atos presentados se expresan como una desviación enos de la media (SD) . La significación estadí minó por medio de un análisis ANOVA de 2 vías bles que son tratamiento (hBD2, dexametasona, etc ulación (LPS, LTA, peptidoglicano, etcétera) seg s-prueba de Bonferroni como se reporta en las ley tablas. Las diferencias se consideraron signif p<0.05.

TADOS mento significativamente y de manera dependient (Tabla 3) . La regulación por decremento de flamatorias y la inducción de citocinas anti-infl ran un potencial anti-inflamatorio muy fuerte de iabilidad se midió por medio de dos diferentes en de excluir que los efectos anti-inflamatorios de debido a efectos citotóxicos. En las Tablas 4 y 5 var que la hBD2 no tiene un efecto citotóxico s as, los efectos observados son efectos estimulador estimulación con LPS o LTA que conduce a la prol as células. Por lo tanto, la hBD2 no tiene u óxico sobre esas células.

En las Tablas 6, 7 y 8, los sobrenadantes or se analizaron por las citocinas por medi o ELISA en lugar de por medio de una orden as citométricas mediante la citometría de flujo y Como un control positivo sobre la regula mento del TNF, dos compuestos anti-infla etasona e indometacina, se sometieron a prueb o. Las. concentraciones se seleccionan de modo estos no sean tóxicos y sea una concentración o a la solubilidad en el medio. La indometac ió el TNF (Tabla 11) después de la estimulación as que la dexametasona reguló por decremento d iva la producción de TNF, lo mismo se observó para a 13) . La indometacina es un inhibidor de COX-1 fármaco anti- inflamatorio no esteroidal (NSAID) tratar el dolor de ligero a moderado y para ar síntomas de la artritis y la dexametason corticoide sintético que se utiliza principalmen miento de trastornos inflamatorios y tiene un e ación por decremento muy potente sobre las ltados no mostrados) .

A fin de excluir que el enlace de la hBD2 A causa la regulación por decremento del TNF y l sometió a prueba el efecto de la hBD2 s ulación de PBMC con un ligando sintético ( ndo de TLR2-TLR1) , InvivoGen tlrt-pms) . La hBD2 capaz de regular por decremento el TNF despué ulación con este ligando, lo que indica ralización de LPS o LTA no es responsable de rvado (resultados no mostrados) . Además, la esti élulas dendríticas con un cóctel de citocina que e IL-Cl junto con la hBD2 tuvo un efecto de re decremento sobre la IL-?ß e IL-8 e IL-6 *comparad ulación con un cóctel de citocina solo. Obvíam udo analizar un efecto sobre el TNF, debi ulación con TNF-a (resultados no mostrados) .

F, pg/ml hBD2 hBD2 Control (SD) 100 µ9/Gp? 10 µ?/?t?? 1 7.3 2.9 2.6 Medio (5.9) (5.1 ) (6.6) LPS 1708.6 634.2 1076.4 6 ng/ml (428.3) (226.1 )*** (278.0)*** (3 LPS 2572.1 1733.9 1306.6 1 0 ng/ml (581 .1 ) (461.3)*** (375.0)*** (4 LTA 1097.4 375.2 494.7 5 µ9/?t?? (293.8) (1 14.2)*** (158.1 )*** (2 2. Producción de IL-?ß de células mononucl re periférica humanas (PBMC) después del tratami 0 LTA con y sin hBD2 , todas las muestras se some a en el mismo donador, . experimento representat ores . IL-?ß medida por medio de una Ordenación d étricas (CBA) en un citómetro de flujo FACSarr 001 analizado por ANOVA de 2 vías (N= aproximadam cada conjunto de dat 1 ß, pg/ml hBD2 hBD2 Control a en el mismo donador, experimento represéntat ores. IL-10 medida por medio de una Ordenación d étricas (CBA) en un citómetro de flujo FACSarr 01 ** p<0.01/ * p<0.5 analizado por A OVA de 2 imadamente 200 para cada conjunto de datos) . 4. Viabilidad de PBMC después de 24 horas de esti a por medio de un ensayo de MTS. Los valores qu letra subíndice diferente en las fil ficativamente diferentes sometidos a prueba por 5 . Viabilidad de PBMC medida por medio de Azul Al imento representativo de 5 de 5 donadores diferen es que tienen una letra superíndice diferente en las alores que tienen un número superíndice diferent as son significativamente diferentes sometidos a p de ANOVA de 2 vías seguido por la pos-prueba de Bonf Secreción de TNF-alfa de PBMC después de la est BD2, LTA, LPS o combinaciones de los mismos, TNF-al edio de ELISA, nd: no detectable, límite de detecc 7. Secreción de IL-10 de PBMC después ulación con hBD2 , LTA, LPS o combinaciones s, TNF-alfa medido por medio de ELISA, table, límite de detección en el ensayo 0 . 03 ng/ Secreción de IL-?ß de PBMC después ulación con hBD2 , LTA, LPS o combinaciones s, TNF-alfa medido por medio de ELISA, a 9. Producción de TNF de células mononucle re periférica humanas (PBMC) despué amiento con PGN, con y sin hBD2 ; todas las n ometieron a prueba en el mismo donador. TNF medio de una Ordenación de Perlas Citóm ) en un citómetro de flujo FACSarrayMR, *** arado con el control respectivo, analiz O de ANOVA de 2 vías (N= aproximadamente 2 conjunto de datos) .

F, pg/ml hBD2 hBD2 Control (SD) 100 µ9/pt?? 0 µg/p\ 1 0.0 3.6 3.7 Medio (4.0) (5.3) (6.2) PGN 1099.1 274.9 362.0 0 µ9 ?p l (251.6) (71.6)*** (97.7)*** (2 11. Producción de TNF de células mononucle re periférica humanas (PBMC) después del tra LPS o TLA, con y sin hBD2 o dos controles di la inhibición de TNF (Dexametasona e Indome S las muestras se sometieron a prueba en e dor. TNF medido por medio de una Ordenación d étricas (CBA) en un citómetro de flujo FACSarr res subrayados están reducidos significat arados con el control respectivo (en n izados por medio de ANOVA de 2 vías (N= aproxim para cada conjunto de datos) .

NF, ng/ml LPS LPS NF, ng/ml LPS LPS Medio (SD) 0.6 ng/ml 20 ng/ml 1 . hBD2 0.0 0.003 0.000 00 (0.0) (0.002) (0.002) hBD2 0.0 0.000 0.038 00 µ9/?t?? (0.0) (0.002) (0.003) hBD2 0.0 0.20 0.35 10 µ?/??? (0.0) (0.01 ) (0.01 ) hBD2 0.0 0.17 6.24 1 µ9/?t?? (0.0) (0.01 ) (0.14) 12. Producción de IL-10 de células mononucl e periférica humanas (PBMC) después del tratami o LTA, con y sin hBD2 o dos controles diferen os anti- inflamatorios (Dexametasona e Indome S las muestras se sometieron a prueba en e or. IL-10 medida por medio de una Ordenación d étricas (CBA) en un citómetro de flujo FACSarr res subrayados están incrementados significat arados con el control res ectivo (en ne rita) a -10, pg/ml LPS LPS Medio (SD) 0.6 ng/ml 20 ng/ml 1 . ametasona 2.7 64.6 122.8 .5 ng/ml (1.9) (3.3) (4.7) ametasona 3.9 46.8 197.1 .35 ng/ml (1 -9) (2.8) (7.2) ometacina 0.0 45.7 77.9 .2 ug/ml (1.5) (2.5) (3.6) ometacina 0.0 37.3 108.0 .72 ug/ml (1.4) (19.6) (4.4) hBD2 0.0 30.8 50.5 000 g/ml (1.6) (2.6) (3.2) hBD2 0.0 173.5 885.2 00 µg/ml (4.9) (5.7) (22.2) hBD2 3.9 165.1 497.5 10 µg/ml (1 .7) (5.6) (13.5) idos significati amente comparados con el ctivo (en negrita) , analizados por medio de ANOVA proximadamente 200 para cada conjunto de datos) . -1 ß, ng/ml LPS LPS Medio (SD) 0.6 ng/ml 20 ng/ml 1. 0.00 3.96 6.58 Control (0.06) (0.18) (0.23) ametasona 0.00 1 .00 2.32 5 ng/ml (0.00) (0.03) (0.07) ametasona 0.00 1.90 3.58 .5 ng/ml (0.00) (0.06) (0.12) ametasona 0.01 Z9 5.56 .35 ng/ml (0.00) (0.09) (0.18) ometacina 0.04 4.1 6.12 .2 ug/ml (0.00) (0.13) (0.23) ometacina 0.01 3.1 6.46 .72 ug/ml (0.00) (0.18) (0.22) hBD2 0.01 0.53 1 .19 000 µg ml (0.00) (0.02) (0.08) hBD2 0.00 0.38 1 .67 00 µg/ml (0.00) (0.01 ) (0.05) ctivo, analizado por medio de ANOVA de 2 v imadamente 200 para cada conjunto de datos) . 15. Producción de TNF en sobrenadantes de íticas inmaduras estimuladas con LPS o LTA (para aduras) , con y sin hBD2. TNF medido por medio ación de Perlas Citométricas (CBA) en un citó FACSarray4 , * reducido significativamente rado con el control respectivo, *** ificativamente p<0.01 comparado con el ectivo, analizado por medio de ANOVA de 2 L0 2 idad anti-inflamatoria de hBDl, hBD2, hBD3 y una va El Ejemplo 2 se llevó a cabo esencialmente ibe en el Ejemplo 1. El compuesto rhBD2, como se muest s posteriores, es la hBD2 recombinante, la cual es idén utilizada en el Ejemplo 1.

Los compuestos hBDl, hBD2, hBD3 y una variante se muestra en las tablas posteriores, se prepararon u ntesis química y se obtuvieron de Peptide Institute Inc La secuencia de aminoácidos de la hBD2 rec 2) es idéntica a la secuencia de aminoácidos de rada por medio de la síntesis química.

La variante de hBD4 mostrada en las tablas po ste de los aminoácidos 3-39 de la hBD4 y la sec ácidos se muestra como la SEC ID NO: 5. de las pos -pruebas de Bonferroni.

LPS LP Medio puesto de 20 ng/ml 0.6 n prueba TNF %de TNF %de TNF pg/ml (SD) control pg/ml (SD) control pg/ml (SD) Medio 1 2164 728 100% 100% o tratado) (1) (632) (156) rhBD2 0 167 74 - 8% 0 µ?/?t?? (0) (5)*** rhBD2 0 260 125 - 12% 0 g/ml (0) (29)*** (20)** rhBD2 1 918 196 - 42% 1 µ?/?t?? (0) (373)*** (104)** hBD1 0 999 91 - 46% 0 µ9/Gp? (0) (116)*** (8)** hBD1 0 1311 203 - 61% 0 µg/ml (1) (417)*** (20)** hBD1 1 1395 474 - 64% 1 9/??? (1) (201)*** (187) hBD2 0 52 176 - 2% 0 µ9Gp? (0) (71)*** (103)** hBD2 0 132 304 - 6% 17. Producción de IL-10 de células mononucl e periférica humanas (PBMC) después del tratami con y sin beta-defensinas de humano, dexamet ximab. IL-10 medida por medio de una Ordena s Citométricas (CBA) en un citómetro d rrayé, * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 a medio de A OVA de 2 vías y comparado con cé das por medio de las pos-pruebas de Bonferroni .

LPS LP Medio mpuesto de 20 ng/ml 0.6 n prueba IL-10 % de IL-10 % de IL-10 pg/ml (SD) control pg/ml (SD) control pg/ml (SD) Medio 0 1 1 1 66 100% 100% o tratado) (0) (3) (5) rhBD2 0 281 108 - 252% 40 µ?/?t?? (0) (9)*** (4)* rhBD2 0 243 103 - 218% 10 µ9/G?? (0) (38)*** (14)* rhBD2 0 126 72 - 1 13% Producción de IL-?ß de células mononucleares érica humanas (PBMC) después del tratamiento con L eta-defensinas de humano, dexametasona o Inflixim a por medio de una Ordenación de Perlas Citométri citómetro de flujo FACSarray^, *** p<0 . 001 anali de ANOVA de 2 vías y comparado con células no tra de las pos-pruebas de Bonferroni .

LPS L El TNF se reguló por decremento para to sinas. La reducción en la secreción de IL rable al TNF, aunque no tan pronunciada como el ción de IL-10 se mejoró significativamente y d diente de la dosis para la hBD2 y la variante de La hBD3 también se sometió a prueba en dos y 40 g/ml y la variante de hBD4 también se s a en dosis de 40 µg/ml; sin embargo, puesto q ulas fueron tóxicas para las células e ntraciones , no fue posible diferenciar entre os y anti- inflamatorios .

Como un control positivo sobre la regula mento del TNF, dos compuestos anti-inflam etasona e Infliximab, se incluyeron en la config USION Todas las beta-defensinas de humano som ación de células dendríticas derivadas de monocitos Las DCs se prepararon de acuerdo con un p icado que fue descrito originalmente por R oradores. En resumen, las células . mononucle e periférica (PBMCs) se purificaron de citarias de donadores saludables por medio ifugación sobre un gradiente de Ficoll-pagu hcare) . Los monocitos se aislaron de PBMC por elección positiva de células CD14+ por medio d ticas (Dynal, Invitrogen) de acuerdo c ucciones del fabricante. Los monocitos C varon en placas de 6 pocilios en RPMI/2% de f ulación de colonias de granulocitos-ma binante, humano de Suero AB Humano (GM-CSF, 20 (20 ng/ml) (Pepro Tech) durante 6 días, reabastec /citocinas después de 2 y 5 días. Después de 6 ivo para un compuesto con actividad anti- infla ca, comprobada. La incubación con hBD2 se r antes de la adición del cóctel. de citocina Los sobrenadantes de cultivo de cél ectaron y se almacenaron a -80°C. Las cantidade e midieron por medio del ensayo ELISA sándwich, zando anticuerpos y estándares comerc nibles de acuerdo con los protocolos del fa science) . o de MTT Un kit de determinación de crecimiento de o en MTT se utilizó como una medida de la super élulas después de 48 horas a fin de evaluar si a células fue afectada gravemente por el tratami culos, cóctel o hBD2 y se realizó de acuerdo a de Bonferroni como se reporta en las leyenda s. Las diferencias se consideran significativas TADOS 19. IL-23 (pg/ml). en sobrenadantes de íticas derivadas de monocitos CD14+ humanas est a sea un medio (no estimuladas) o LPS e IFN-? y ya sea un medio (no tratadas) , hBD2 o Dexarr edio (SEM) , N=4 , un donador representativo 0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 analizado por medio vías y comparado con células no tratadas por pos-pruebas de Bonferroni. nd: no detectado (de te de detección) .

IL-23 LPS (100 ng/ml) e No estimulado pg/ml (SEM) IFN-? (20 ng/ml) 375 3569 No tratado (96) (130) 5 µ?/p?? de LTA y tratadas c Infliximab, promedio (SEM) . * 0.001 analizado por medio de ANOVA células no tratadas por medio de a de Comparación Múltiple de Dunnett.

Como se muestra en la Tabla 19, la hBD2 Esto muestra que la hBD2 podría tener u sor en una condición autoinmune crónica por med sión de la secreción de IL-23, ya que la IL-23 importante de la respuesta inflamatoria. Las son dependientes de IL-23 para su superviv sión y se ha mostrado que las células Thl7 son p rias enfermedades autoinmunes, tal como la enfer , colitis ulcerativa, psoriasis y esclerosis mul LO 4 ción de la secreción de TNF de PBMCs con beta-d ratón (mBD3) El Ejemplo 4 se llevó a cabo esencialmente ibe en el Ejemplo 1 para las PBMCs humanas. sina 3 de ratón (mBD3) se preparó utilizando colo que aquel que se utilizó para la producción después de la extracción. El plasma se recolec superior y se desechó. Las PBMC aisl pendieron en medio de cultivo (RPMI 1640^ (Gibco icilina al 1% y estreptomicina y L-Glutamina al aron en placas de cultivo de 96 pocilios con as por pocilio en un total de 200 µ? . Las PBMC d or se estimularon con 100, 10 o 1 9/p?1 de hBD -defensina 3 de ratón) ; ya sea sola o junto con S (E. coli, 0111:64, Sigma L4391) . La dexamet ó en una dosis de 3.5 ng/ml a los cultivos c ulación con LPS . Los sobrenadantes se reco és de la incubación a 37 °C durante 24 hor enaron a -80°C hasta la medición de la citocina.

La producción de citocina en los sobrenad por medio de la citometría de flujo con una or erlas citométricas de inflamación de ratón ( l mismo donador, experimento representativo ores. TNF medido por medio de una Ordenación d étricas (CBA) en un citómetro de flujo FACSarr 01 comparado con el control respectivo, anali de A OVA de 2 vías (N=2 ) .

TNF LPS Medio pg/ml (SEM) 20 ng/ml 5 1353 Medio ) (140) mBD3 2 384 1 µg/p^\ (0) (1 1 )*** mBD3 2 51 10 µ9/pp? (0) (1 )*** mBD3 39 166 100 g/m\ (19) (17)*** hBD2 3 633 1 µ?/pa? (0) (1 10)*** hBD2 2 359 10 µ?pt?? (0) (10)*** hBD2 2 342 ores . TNF medido por medio de una Ordena s Citométricas (CBA) en un citómetro d arrayMR, *** p<0.001 comparado con el ectivo, analizado por medio de ANOVA de 2 vías Por consiguiente, en esta configuración, e una excelente actividad anti-inflamatoria . LO 5 lo de colitis inducida por Dextrano- Sulfato ) durante 10 Días en el ratón El objetivo del siguiente estudio fue de ctividad ant i - inflamatoria de la beta-defensi o en un modelo agudo (10 días) de en stinal inflamatoria (colitis) inducida nistración oral de dextrano- sulfato de sodio atón .

El modelo de ratón de colitis inducida por D o bien reconocido para estudiar la enfermedad i matoria, como se describe en Kawada y colab ghts from advances in research of chemically imental models of human inflammatory bowel les Experimentales Los ratones macho C57BL/6 (Harían In ica, Barcelona, España) se utilizaron en el est ésta es una especie y sexo que se ha demost rolla una inflamación significativa del colon c istra una solución al 2% de DSS en el agua te un periodo de 10 días. tificación Los animales se identificaron por número y letras en sus colas. Adicionalmente, cada j tifico por una tarjeta codificada por color que i ro y sexo de los animales, el código o no culo de prueba, nivel de dosis, ruta de adminis odo de tratamiento, número de grupo, código de e re del director del estudio.

Charles River, 255x405x197mm) con tapas d dable. Los animales se alojaron en grupos les por jaula de acuerdo con su sexo, en habi animales con temperatura controlada ( nación (12/12 horas de luz/oscuridad) , presión d o de renovaciones del aire y humedad relativa ( las jaulas tuvieron aserrín (Lignocel 3-4; fauna Ibérica, España) sobre el piso como cama. a y Agua Todos los ratones tuvieron acceso libre a u roedor estándar, granulada, seca (Teklad Glob n Interfauna Ibérica, España) . El agua se propor um en botellas. El suministro de agua del gri aciones de los animales se analiza periódicame icar su composición y para detectar minantes (químicos y microbiológicos) .

Lector de microplacas de ELISA Labsystems M EXMR íales y Reactivos: Jeringas desechables estériles (1 mi) Aparato de infusión estéril Butterfly 25GMR Anestesia (Quetamina/Xilazina) Crema Anestésica tópica (EMLA, Astra Zeneca) Dextrano-Sulfato de Sodio 30,000-50,000 Biomedicals) Solución Salina Amortiguada con Fosfato (PBS; Formalina Amortiguada, Neutra (V R) Albúmina de Suero Bovino (Sigma) Cóctel Inhibidor de Proteasa (Sigma) Kit de ELISA de TNF-a de ratón (GE Healthcare) COLO EXPERIMENTAL o del estudio es se alojó en cada jaula (según la D 9/EEC) . Todos los animales se pesaron con su a atorio y antes de la administración de los artí a . istración de la Sustancia de Prueba El control de vehículo y la hBD2 se admin la ruta intravenosa por vía de la vena de la col de una jeringa estéril (25G) en un vol icación de 5 ml/kg de peso corporal como un bol animales recibieron una dosis diaria (cada 24 ho ulo de prueba correspondiente (hBD2 , prednis ol de vehículo) durante 10 días isolona se administró por la ruta oral en una do en un volumen de dosificación de 5 ml/kg ral, en el mismo régimen de dosificación que la DIMIENTO EXPERIMENTAL de DSS . Este procedimiento se repitió nuevamen 5. En el Día 8, cualquier solución restante se d eemplazó por agua tratada en autoclave. Los añi ificaron 2 días después en el Día 10. ación Clínica (Indice de Actividad de la Enferme La valoración clínica diaria de los dos con DSS se llevó a cabo, con el cálculo de u ctividad de la Enfermedad (DAI, por sus siglas en ÍCO, validado que variaba de 0 a 4 de acuerdo Íentes parámetros: consistencia de las heces, pre cia de sangrado rectal y pérdida de peso: etro registro d io en el Peso Corporal: <1% 1 -5% 5-10% 10-15% La aparición de diarrea se defin material fecal adherente al pellejo anal. El l se define como diarrea que contiene le/moco o sangrado rectal grave. El registro má ada día es 12. de Muestras de Sangre Dos muestras de sangre se obtuvieron de cad s ocasiones separadas durante el curso del estudi y en el Día 5. Las muestras de sangre se obtuv ocasión en míerotubos Microvette CB-BOO por med ón de la vena safena 2 horas después de la admi'ni rtículo de prueba. Este método de extracción de s ere anestésicos o analgésicos y produce un estré s animales (Hem y colaboradores, 1998) . Adició uestra de sangre terminal se obtuvo de todos los ésico. Sus colones se retiraron y su longitud y después de la exclusión del intestino ciego.

Dos secciones (próxima y distal) del c on de cada animal y se conservaron en f iguada neutra para el análisis histológico sub ión con hematoxilina y eosina) de acuerdo ente sistema de registro: ripción cambios observados ltrados de células inflamatorias de la mucosa, rcidos, mínimos, con o sin hiperplasia epitelial ma . ltrados de células inflamatorias esparcidos a sos, ligeros, algunas veces que se extienden ro de la submucosa y asociados con erosiones, con rplasia epitelial mínima a ligera y agotamiento ucina mínimo a ligero de células calciformes. minación de la Concentración del TNF-alfa en Mué o Colónico Una muestra adicional de colon se obtuvo l y se homogenizó en PBS (100 mg de tejido/ml contenían albúmina de suero bovino al 1% (BS l inhibidor de proteasa (1 ml/20 g de teji enado luego se centrifugó a 1400 rpm durante 10 sobrenadante se almacenó a -20 °C para la deter cuente de la concentración del TNF- por medi oensayo de enzimas específico (ELISA) .

TADOS tro del Indice de Actividad de la Enfermedad 23. Progreso del registro del Indice de Activid rmedad (DAI) durante el Día 1 al Día 10. Las dif ificativas de los valores del grupo de control ( na fecha determinada se muestran como *p<0.05; registro ulo de prueba Datos del DAI Dia l Día 2 Día 3 Día 4 Grupo E S.E.M. 0.00 0.10 0.00 2.60 rednisolona Media 0.00 0.10 0.00 0.22 mg/kg p.o. 23 (continuación) registro del DAI culo de prueba Datos Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Grupo A S.E.M. 3.10 4.10 5.90 8.90 ol de vehículo i.v. Media 0.31 0.69 1.26 1 .02 Grupo B S.E.M. 3.20 1.44** 2.11 * 3.89** hBD2 Media 0.20 0.38 0.20 0.35 .1 mg/kg i.v.

Grupo C S.E.M. 2.89 2.22 3.67 5.22 hBD2 Media 0.20 0.43 0.80 0.83 1 mg/kg i.v.

Grupo D S.E.M. 3.22 2.11 4.11 6.78 hBD2 Media 0.28 0.31 0.93 1.20 0 mg/kg i.v.

Grupo E * * rminación de la concentración del TNF-g en mué o colónico Una muestra adicional de colon se obtuvo de ca homogenizó en PBS (100 mg de tejido/ml de PBS) que ina de suero bovino al 1% (BSA) y un cóctel inhi asa (1 ml/20 g de tejido) . El homogenado luego se c 00 rpm durante 10 minutos y el sobrenadante se alm para la determinación subsecuente de la concentra c por medio de un inmunoensayo de enzimas específico 24. Registros histológicos, peso y longitud del ntración del TNF-a en el colon. Las diferencias tros hitológicos de los valores del grupo de eulo) se muestran como *p<0.05; **p<0.01 (Prueba de s para datos no paramétricos) .

Registro de Registro de Conce tículo de prueba Datos Histología Histología TNF-a Colon Próximo Colon Distal (pg/g SIS ESTADISTICO La significación estadística de · los resul ó utilizando el programa estadístico Graphpad I iferencia entre grupos para el índice de activid medad y el registro histológico se evaluó por rueba de Kruskal-Wallis para datos no apareados rueba de Dunn para permitir múltiples comparaci de p<0.05 se tomó como significativo.

USIONES Los resultados demuestran que la hBD2 en baja sometida a prueba (0.1 mg/kg i.v.) Íicativamente el incremento del Indice de Acti fermedad inducido por la administración de DSS e i.44±0.38 artículo de prueba vs . 4.1±0.69 v 1), día 8 (2.11+0.2 artículo de prueba vs . ulo; p<0.05), día 9 (3.89±0.35 artículo de pr e de Actividad de la Enfermedad en el día sis histológico de los colones próximos de cad o una reducción muy significativa del registro lógico por medio del tratamiento con la dosis (2.22±0.43 artículo de prueba vs . 4.2±0.25 v 1) . Además, una reducción significativa de l lógica también se observó con las dosis inte de hBD2 , así como también con la pred +0.35; 2.89+0.39 y 2.8+0.5 respectivamente; p<0 aste, en el colon distal - aunque una reducción a lesión histológica se pudo observar en los dos con la dosis baja e intermedia de hBD2 , ién con la prednisolona - ésta no fue signi ísticamente. No se pudo observar una reducció les que fueron tratados con la dosis alta larmente, el tratamiento con las dosis baja e in e gradualmente con el incremento de las dosis s más alta utilizada en el estudio (10 mg/kg/dí s, el efecto anti-inflamatorio de la dosis más es comparable o aún mayor (por ejemplo lógico) que aquel de la prednisolona en una do /día p.o.

PLO 6 lo de colitis inducida por Dextrano-Sulfato ) durante 10 días en el ratón El Ejemplo 6 se llevó a cabo esencialme escribe en el Ejemplo 5. Las diferencias se i inuación .

El peso corporal promedio de los animale del inicio del estudio fue 19.74 ± 0.09 g F: Tratado con hBD2 (0.1 mg/kg i.v. + s.c. S al día G: Tratado con hBD2 (0.1 mg/kg i.v.) - cada o H: Tratado con metilprednisolona (1 mg/kg p.o. o J: Tratado con metilprednisolona (10 mg/kg p.o La asignación de los animales en todos lo rimentales se realizó de manera aleatorizada . U ratones se alojaron en cada jaula (según la D 09/EEC) . Todos los animales se pesaron con su a ratorio y antes de la administración de los co rueba y de referencia. nistración de los artículos de prueba El control de vehículo y la hBD2 se admin la ruta intravenosa por vía de la vena de col artículo de prueba correspondiente durante ecut ivos .

Los animales en el grupo G recibieron u dos días del artículo de prueba corresp nte 10 días consecutivos.

La metilprednisolona se administró por en una dosis de 1 mg/kg (grupo H) y 10 mg/kg ( n volumen de dosificación de 5 ml/kg de peso c vez al día durante 10 días consecutivos. de Muestras de Sangre Una muestra de sangre terminal se obtuvo animales en el último día del estudio de la v minal 2 horas después de la administración del rueba .

Las muestras de sangre se dejaron coa o se centrifugaron a 3000 rpm durante 10 minu aramétricos ) . Del Día 6 al Día 10 se muestr íente página. registro del DAI ículo de prueba Datos Dia l . Día 2 Día 3 Día 4 Grupo A S.E.M. 0.00 0.00 0.10 0.10 rol de vehículo i.v. Media 0.00 0.00 0.10 0.10 Grupo B S.E.M. 0.00 0.10 0.20 0.40 hBD2 Media 0.00 0.10 0.13 0.16 1 mg/kg i.v.

Grupo C S.E.M. 0.00 0.44 0.89 0.56 hBD2 Media 0.00 0.18 0.42 0.29 0.1 mg/kg i.v.

Grupo D S.E.M. 0.00 0.00 0.30 0.40 hBD2 Media 0.00 0.00 0.15 0.16 .01 mg/kg i.v.

Grupo E S.E.M. 0.00 0.00 0.10 0.20 hBD2 Media 0.00 0.00 0.10 0.13 .001 mg/kg i.v.

Grupo F hBD2 S.E.M. 0.00 0.30 0.70 0.70 0.1 rri k Media 0.00 0.21 0.3 .34 25 (continuación) registro del DAI ículo de prueba Datos Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Grupo A S.E.M. 6.90 9.67 11.11 11.67 ol de vehículo i.v. Media 1.02 0.33 0.31 0.17 Grupo B S.E.M. 2.30* 4.40* 6.89 5.00* hBD2 Media 1.00 1.03 1.41 0.60 1 mg/kg i.v.

Grupo C S.E.M. 1.56** 4.13* 5.43* 6.29* hBD2 Media 0.73 0.83 1.13 1.64 .1 mg/kg i.v.

Grupo D S.E.M. 2.70 6.50 6.20* 4.60*** hBD2 Media 1.08 1.28 1.06 0.98 .01 mg/kg i.v.

Grupo E S.E.M. 3.40 7.11 8.56 5.89** hBD2 Media 1.32 1.38 1.06 1.63 001 mg/kg i.v.

Grupo F hBD2 S.E.M. 0.70*** 3.50** 4.00*** 2.90*** 0.1 mg/kg Media 0.30 0.89 1.17 0.55 ces al día i.v.+s.c.

Grupo G hBD2 S.E.M. 2.90 6.50 8.70 7.50 ematoxilina y eosina) y fueron registradas por un o de acuerdo con el sistema de registro descrito anteri 26. Registros histológicos, peso y longitud del ntración del TNF-a en el colon. Las diferencia tros histológicos de los valores del grupo de CUIO) se muestran como *p< 0 . 05 ; **p< 0 . 01 (P al-Wallis para datos no paramétricos ) .

Registro de Histología Registro de Histolo ículo de prueba Datos Colon Próximo Colon Distal Grupo A S.E.M. 2.44 4.67 ol de vehículo i.v. Media 0.34 0.17 Grupo B S.E.M. 1.78 3.56 hBD2 Media 0.36 0.38 1 mg/kg i.v.

Grupo C S.E.M. 1.71 3.14* hBD2 Media 0.18 0.40 .1 mg/kg i.v.

Grupo D S.E.M. 1.70 3.10** hBD2 Media 0.26 0.23 .01 mg/kg i.v.

Grupo E S.E.M. 1.44 3.56 hBD2 SIS ESTADISTICO La significación estadística de los resul ó utilizando el programa estadístico Graphpad I ferencia entre los grupos para el índice de acti nfermedad y el registro histológico se evaluó p prueba de Kruskal-Wallis para datos no apareado a de Dunn para múltiples comparaciones . Un 5 se tomó como significativo. En las tablas ant diferencias significativas contra el grupo de CUIO) correspondiente se indican como: .01, ***p<0.001.

USIONES El objetivo del presente estudio fue deter idad anti-inflamatoria de la hBD2 en un modelo a ) de enfermedad intestinal inflamatoria ( cida por la administración oral de dextrano-su inflamatorio observado con esta dosis de rable, o aún mayor (tanto sobre el Indice de A Enfermedad como el registro histológico) , que rednisolona en una dosis de 1 mg/kg o 1 istrada por la ruta oral.

LO 7 ación de la Beta-Defensina 2 de Humano en el M tis Reumatoide Inducida por Colágeno El objetivo del siguiente estudio fue deter idad anti - inflamatoria de la beta-defensina 2 d modelo de artritis reumatoide inducida por col tón.

?? DE PRUEBA cíes/Cepa : Ratón/DBA/ 1 te : Harían, Reino Unido ro: Macho aclimatizaron a las condición laboratorio y se utilizaron en el est atización : Por lo menos 7 días. miento: Durante la aclimatización y despué dosificación, los animales se alojaro de una instalación para roedores d limitado y se mantuvieron en grupo ratones máximo, en jaulas de polip (45 cm x 25 cm x 13 cm) , equipadas co sólidos y rellenas con virutas de mad material de lecho. Las jaulas se C una vez a la semana. nto y Agua: A los animales se les proporcionó ad una dieta para roedores comercial libre al agua potable, suministrada jaula por vía de botellas de polieti habitación del estudio. La temperatura se supervisaron diariamente por medio mediciones manuales como la comput control . El ciclo de luz fue supervi la computadora de control . ificación: A los animales se les proporcionó u único en la oreja de identificac animal . Este número también apareció tarjeta de la jaula, visible al f cada jaula. La tarjeta de la jaula contenía el número de estudio. orización: Los animales se asignaron de manera a a los grupos experimentales. inación: Al final del estudio los sobrevivientes se sometieron a la e por medio de la inhalación de 02/C02, eno Tipo II de Bovino (MD Biosciences, no. 01314) ante Completo de Freund (CFA) (MD Biosciences, 501009703) ( PAA, no. de cat . H15-002) ITUCION DE LOS GRUPOS DE PRUEBA a 27. Grupos de prueba y tratamientos intravenosa intra eritoneal eno (200 µg/ratón) se presentó a los anima de la inyección IP de colágeno y PBS en el Dí amiento Los tratamientos se comenzaron en el día io y continuaron una vez al día hasta el fina ratones sobrevivientes se sacrificaron en el dio 42. de Administración: hBD2 : Intravenosa Dexametasona : Intraperitoneal ) Control de Vehículo: Intravenosa s y Dosificación en Volumen (véase también l hBD2 : 10, 1 o 0.1 mg/kg a 5 Dexametasona: 1 mg/kg a 5 mL/kg ) Control de Vehículo: 0 mg/kg a 5 mL/kg ia de 0-4 en orden ascendente de gravedad tra a continuación: stro de Artritis reacción, normal: jecimiento ligero, pero definido e hinchamiento de llo/muñeca o enrojecimiento aparente e hinchamient tado a dedos individuales, sin importar el númer edos afectados : jecimiento de moderado a grave e hinchamiento de llo/muñeca: jecimiento e hinchamiento de la pata complet uyendo los dedos : bro inflamado al máximo con involucramiento d iples articulaciones: s clínicos En el Día 0, 14, 21 y des ués cinco veces a l Antes del día 14, los ratones se sup amente por cualquier comportamiento inusual .

Corporales La determinación de los pesos corporales indivi les se realizó poco antes de la inducción de la Ar ía 0, 14, 21 y después cinco veces a la semana nación del estudio. ión de la Artritis Experimental El cambio relativo en el espesor de ambas patas ierda y derecha, justo debajo de la planta de l a del hueso calcáneo) de cada animal se midió en de estudio 0, 14, 21 y después cinco veces a zando un calibrador de dial (Kroeplin, Munich, Aleman nación del Estudio Todos los ratones se sacrificaron en el día d s Finales Humanitarios Los animales encontrados en una condición mo nimales que mostraban dolor grave y signos perdu tia grave se sometieron a la eutanasia de manera hum s, los animales que mostraban una disminución ral mayor que 20% de la determinación inicial ral se sometieron a la eutanasia de manera humanit es con un registro artrítico total de 12 o superio leccionaron por razones humanitarias. Todos los an ieron a la eutanasia por medio de la inhalación d do por el desangramiento. Las muestras de las pat ras de sangre terminal se obtuvieron de todos los an io .

SIS ESTADISTICO La evaluación se basó principalmente en los s para los registros de artritis y las mediciones de co de esos ratones en la terminación se continú sis para el resto del estudio a fin de que los dat aran artificialmente por la remoción de los ra tro alto.

RACION DE CUIDADO Y USO DE LOS ANIMALES Este estudio se realizó de acuerdo1 con las reg inisterio Interior del Reino Unido para el uso de an dimientos científicos.

TADOS 28. Registros clínicos medios de artritis dét te el periodo de observación de 42 días en el ratón DBA/l inducido por colágeno. *p<0.05 significa ente del grupo de Vehículo Grupo B Grupo C Grupo D Grupo A Datos Dexametasona hBD2 hBD2 Vehículo 1 mg/kg 10 mg/kg 1 mg/kg Registro 3.4 0.0 3.3 2.0 Artrítico Medio 1 .1 0.0 1.2 0.7 SEM Registro 4.4 0.0* 4.1 2.0 Artrítico Medio 1.1 0.0 1 .2 0.7 SEM Registro 4.8 0.0* 4.1 2.0 Artrítico Medio 1 .2 0.0 1 .3 0.7 SEM Registro 5.3 0.0* 4.1 2.3 Artrítico Medio 1 .1 0.0 1 .2 0.8 SEM Registro 6.3 0.0* 4.4 2.4 Artrítico Medio 1 .1 0.0 1 .3 0.8 SEM Registro 6.8 0.0* 4.9 2.7 Artrítico Medio 1 .1 0.0 1.3 0.9 SEM Registro 7.4 0.0* 4.8 4.0 Artrítico Medio 1.1 0.0 1 .2 0.9 Grupo B Grupo C Grupo D e Grupo A Datos Dexametasona hBD2 hBD2 io Vehículo 1 mg/kg 10 mg/kg 1 mg/kg Registro 8.2 0.0* 5.0 4.7* Artrítico Medio 0.8 0.0 1.0 1 .2 SEM Registro 8.5 0.0* 4.8* 5.2 Artrítico Medio 0.7 0.0 1.0 1 .1 SEM USION Las reacciones artríticas se observaron en t s desde el día de estudio 14. Los registros totale rtritis (Tabla 28 ) para los ratones tratados con zaron un punto máximo en 8 . 5 ± 0 . 72 en el día de es egistros totales medios de artritis en ratones tra en una dosis de 10 mg/kg (Grupo C) alcanzaron o en 5 . 0 ± 1 . 04 en el día de estudio 40 . Los s de artritis en este grupo fueron más bajos en co íes con hBD2 en una dosis de 0.1 mg/kg (Grup nuyó significativamente los registros totales m tis en comparación con , el grupo tratado con vehí tro medio en este grupo alcanzó un punto máximo en el día de estudio 40. Los ratones en el grupo dexametasona (Grupo B) exhibieron un registro ficativamente más bajo en comparación con el grupo vehículo desde el día de estudio 26 hasta el f io.

Para asegurar que la remoción de los cionados al principio del estudio debido a la gra tritis no desviara artificialmente los datos, los tritis de estos ratones se pospusieron en el análi rminación del estudio.

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Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como ante ma como propiedad lo contenido en las si ndicaciones : 1. El uso de una beta-defensina de mamífe actura de un medicamento para el tratamiento medad inflamatoria o trastorno seleccionado d consiste de artritis reumatoide, osteoa rosis múltiple, arterosclerosis, escl lerosis sistémica) , lupus, lupus eritomatoso s ) , glomerulonefritis (aguda) , asma, enfe nares obstructivas crónicas (COPD) , sínd ficiencia respiratoria (ARDS) , vasculitis, titis, dermatitis atópica, alopecia, rinitis (al ntivitis alérgica, miastenia grave, escleroder ndicaciones 1-3, en donde la beta-defensina de dministra en una dosificación diaria de aproxim mg/kg de peso corporal a aproximadamente 10 corporal, preferiblemente de aproximadamente 0. so corporal a aproximadamente 10 mg/kg de peso c 5. El uso de conformidad con cualquiera ndicaciones 1-4, en donde la beta-defensina de a beta-defensina de humano. 6. El uso de conformidad con cualquiera ndicaciones 1-5, en donde la beta-defensina de por lo menos 80% de identidad con las secue ácidos de la SEC ID NO : 1 , SEC ID NO: 2, SEC ID NO :4. 7. El uso de conformidad con cualquiera indicaciones 1-6, en donde la beta-defensina de h eta-defensina 1 de humano, beta-defensina 2 de ndicaciones 1-9, en donde la actividad del TNF e en los tej idos tratados . 11. Un método para tratar una e matoria o trastorno en tejidos de mamíferos, cara e comprende administrar a un mamífero necesitado beta-defensina de mamífero en una cantidad efec la enfermedad inflamatoria o trastorno se selecc que consiste de artritis reumatoide, osteo rosis múltiple, arterosclerosis, escleroderma (e mica) , lupus eritomatoso sistémico (SLE) , rulonefritis (aguda) , asma, tal como asma b medades pulmonares obstructivas crónicas (COPD) , nsuficiencia respiratoria (ARDS) , enfermedad i matoria (por ejemplo, enfermedad de Crohn) , coli lo, colitis ulcerativa) , vasculitis, uveítis, d ejemplo, dermatitis inflamatoria) , dermatitis caracterizado porque la beta-defensina de hu istra por la ruta parenteral, tal como la ruta su ravenosa . 14. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque la beta-defensina de mamí istra en una dosificación diaria de aproximadame de peso corporal a aproximadamente 10 mg/kg ral, preferiblemente de aproximadamente 0.1 mg/kg ral a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal. 15. El método de conformidad con la reivi caracterizado porque la beta-defensina de mamífer defensina de humano. 16. El método de conformidad con la reivi caracterizado porque la beta-defensina de mamífe o menos 80% de identidad con las secuencias de ami SEC ID NO:l, SEC ID NO : 2 , SEC ID NO : 3 O SEC ID NO