KR20110031962A

KR20110031962A - 포유류 베타 방어소를 이용한 염증 질환의 치료

Info

Publication number: KR20110031962A
Application number: KR1020117002473A
Authority: KR
Inventors: 탄자 마리아 로젠킬데 크재르; 토마스 크루즈; 페르 홀스 미긴드; 카롤린 시델만 브린치; 소렌 크재룰프; 비르기트 안델센
Original assignee: 노보자임스 아데니움 바이오테크 에이/에스
Priority date: 2008-07-18
Filing date: 2009-07-17
Publication date: 2011-03-29
Also published as: CN102159232A; BRPI0915780A2; TW201004641A; CL2011000098A1; US20100016232A1; AU2009272680A1; NZ590466A; ZA201100462B; AP2011005537A0; EA201170218A1; MX2011000569A; KR20110044863A; JP2011528332A; CA2730674A1; WO2010007165A3; AR072524A1; IL210714A0; EP2320929A2; EP2320929B1; WO2010007165A2

Abstract

본 발명은 종양 괴사 인자 알파와 관련된 병리학적 이상의 치료에서 유용성을 갖는, 포유류 베타 디펜신을 사용한 TNF-알파 활성의 억제에 대한 것이다.

Description

포유류 베타 방어소를 이용한 염증 질환의 치료{TREATMENT OF INFLAMMATORY DISEASES WITH MAMMAL BETA DEFENSINS}

서열 목록에 대한 참조

본 출원은 컴퓨터로 해독가능한 형태의 서열목록을 함유한다. 컴퓨터로 해독가능한 형태는 참조로서 본 발명에 포함된다.

본 발명은 염증과 관련된 병리학적 이상의 치료를 포함하는 다양한 장애의 치료에서 유용성을 갖는 포유류 베타 방어소의 투여에 의한 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파 또는 TNF-α) 활성의 억제에 대한 것이다.

인간 방어소

많은 다른 요소 중에서, 선천성 면역의 중요한 성분은 개별적으로 상당한 선별력을 보여주지만, 넓은 범위의 박테리아, 바이러스 및 곰팡이를 빠르게 죽일 수 있는 항균성 펩티드(AMP)이다. AMP의 생물학적 중요성은 사실상 그들의 편재하는 분포에 의해 강조되고, 그들은 아마도 모든 다세포 유기체에 의해 생산된다. 인간에서 두드러진 AMP는 방어소이다. 인간 방어소는 그들의 3개의 분자내 시스테인 이황화 결합의 위상학에 기초하여 α- 및 β-방어소로 나뉠 수 있는 작은 양이온성 펩티드이다. α-방어소는 호중성 미립자로부터 첫 번째로 분리된 것들(HNP1-4) 및 소장의 소낭에서 페네스 세포에 의해 발현되는 것들(HD5 및 HD6)로 더 나눌 수 있다. β-방어소는 피부, 기관, 위장기관, 비뇨생식계, 신장, 췌장 및 유선를 포함하는 다양한 조직 및 기관에서 상피 세포에 의해 주로 생산된다. β-방어소 패밀리의 가장 잘 특징지어진 멤버는 hBD1-3이다. 그러나, 다양한 생명정보학 수단을 사용하여, 추정의 β-방어소 상동체를 암호화하는 거의 40개의 번역틀을 인간 게놈에 주석으로 달았다. 일부 인간 방어소는 다른 것이 전염증 사이토카인 또는 외재적 미생물 산물에 의해 유도되는 것에 반하여, 구조적으로 생산된다.

인간 방어소가 그들의 직접적인 항균 활성에 추가하여 광범위한 면역조절/대안적 성질도 가지는 것이 점점 명백해지고 있다. 이들은 다양한 케모카인 및 사이토카인의 유도, 주화성 및 자가세포사멸 활성, 프로스타글란딘, 히스타민 및 루코트리엔 분비의 유도, 보체의 억제, 톨-라이크 수용체 신호전달을 통한 수지상세포 성숙의 자극 및 중성구에 의한 병원체 제거의 자극을 포함한다. 더욱이, 인간 방어소는 또한 상처 치유, 상피 및 섬유아 세포의 증식, 혈관신생 및 맥관형성에도 역할을 담당한다.

인간 방어소가 많은 감염성 및 염증 질환에서 중요한 역할을 담당한다는 증거가 증가하고 있다. 인간 방어소의 과발현은 미생물 성분 또는 외재적 전염증 사이토카인에 의한 국소적인 유도 때문인 것 같은, 염증 및/또는 감염 피부에서 종종 관찰된다. 건선에서 hBD2 및 hBD3이 과다하고, 여드름 또는 표재성 모낭염이 있는 환자의 병소 상피에서 hBD2의 유의한 상향조절이 관찰되었다. 다른 한편, hBD2 및 hBD3의 하향조절은 아토피 피부염과 관련되어 있었다. 회장 크론병은 HD5 및 HD6의 발현의 결핍과 관련하였으며, 크론병에서 hBD2-4의 결장 발현에서 하향조절된다.

사이토카인

사이토카인은 고등 진핵세포로부터 분비되는 작은 폴리펩티드이고, 세포 내 신호전달을 담당하며, 다른 세포의 성장, 분열 및 기능에 영향을 미친다. 그들은 예컨대 상응하는 수용체를 통하여 국소 또는 전신의 세포 내 조절 인자로서 역할을 하는, 강력하고 다면 발현성인 폴리펩티드이고, 그러므로 면역, 염증 및 조혈과 같은 많은 생물학적 과정에서 결정적인 열할을 담당한다. 사이토카인은 섬유아세포, 내피 세포, 상피 세포, 대식세포/단핵구, 및 림프구를 포함하는 다른 종류의 세포 타입에 의해 생산된다.

TNF-α는 다양한 병리생리학 과정에 연루되고, 숙주 방어에서와 같이 방어적이거나 자가면역에서와 같이 유해할 수 있다. TNF-α는 염증 반응을 유발하고, 지탱하는 중요 사이토카인 중 하나이고, TNF-α 불활성화는 자가면역 질환과 관련된 염증 작용의 하향조절에서 중요할 것으로 증명되었다. 감염에서, TNF-α는 대식세포에 의해 대량으로 분비되고, 그것은 부착 분자를 생산하기 위해 내피 세포를 자극시키는 것에 의해, 그리고 주화성 사이토카인인 케모카인을 생산하는 것에 의해 감염 부위로 호중구 및 대식세포의 모집을 매개한다. TNF-α는 백혈구 및 다른 염증 세포를 활성화시키는 것을 돕고, 상처입은 조직 내에서 혈관 침투성을 증가시킨다. TNF-α는 대식세포, 단핵구 및 수지상세포에 의해 주로 생산되지만, 림프구, 비만 세포, 내피 세포, 심근세포, 지방 조직, 섬유아세포 및 신경 조직을 포함하는 넓은 종류의 다른 세포 타입에 의해서도 생산된다.

최근의 항-염증 약물은 TNF-α와 결합하여 세포의 표면에서 TNF-α에 대한 수용체의 신호로부터 그것을 보호함으로써 TNF-α의 작용을 차단한다. 이 타입의 차단은 일부 심각한 부작용을 갖고, 그중 일부는 폐결핵, 패혈증 및 곰팡이 감염과 같은 감염이며, 그리고 상당히 증가된 암 발병률을 갖는다.

또한 인간 사이토카인 합성 억제 인자(CSIF)로 알려진, IL-10은 항-염증 사이토카인과 같이 면역 조절에서 중요한 선수이다. 이 사이토카인은 단핵구, 대식세포, T 세포, B 세포, 수지상세포 및 비만세포를 포함하는 몇몇의 세포에 의해 생산된다. 이 사이토카인은 면역조절 및 염증에서 다면 발현성 효과를 갖는다. 그것은 전-염증 사이토카인, Th1/Th17 세포에 의해 분비되는 사이토카인, MHC 클래스 Ⅱ Ag 및, 항원-제시 세포의 공동자극 분자 발현을 하향-조절한다. IL-10은 또한 조절 T 세포(Treg)라 불리는 T 세포의 집단에 의해 분비된다. 이들 세포는 초기 T 세포 활성화를 막지 않고; 오히려 그들은 지속된 반응 및 만성 및 잠재적으로 해로운 반응을 억제한다. 말초에서 일부 T 세포는 항원 및 IL-10 또는 TGF-β 중 어느 하나에 의해 Treg가 되도록 유도된다. IL-10에 의해 유도된 Treg는 CD4+/CD25+/Foxp3-이고 Tr1 세포로 지칭된다. 이들 세포는 IL-10의 분비에 의해 면역 반응을 억제한다. 최근의 연구는 Th17 세포의 확인과 함께 Th1/Th2/Treg 보다 T 세포 작용자 레파토리의 더 큰 다각화를 드러내었다. 이 부분 모집단은 Th1 계통으로 귀착되기 전에, 크론병, 궤양성 대장염, 건선 및 다발성 근경색증과 같은 몇몇의 자가면역 질환에서 병원성인 것으로 나타났다. Th17에 의해 분비된 사이토카인은 IL-10에 의해 또한 하향조절되고, TNF의 차단은 Th17 세포를 비활성화하는 것에 의해 건선을 예방한다. IL-10의 전체적인 활성은 항-염증이고, 그것은 몇몇의 동물 실험에서 염증 및 손상을 예방하는 것을 보여주었으나, 임상에서의 IL-10 치료는 IL-10의 투여 루트 및 그것의 생물학적 반감기에서의 곤란성 때문에 불충분한 채로 남아있다.

염증을 치료하기 위한 인간 방어소의 사용

흥미롭게도, 결장에서의 크론병이 β-방어소 hBD2 및 hBD3의 감소된 생산과 관련되어 있었던 것에 반해, 소장에서의 크론병은 페네스 세포 α-방어소 HD5 및 HD6의 감소된 수준과 관련되어 있었다(Gersemann et al., 2008; Wehkamp et al, 2005). 더욱이, 크론병의 병인에 장관 미생물총이 포함되어 있음이 설득력있게 논증되었다(Swidsinski et al., 2002). 형광 원위치 혼성화를 사용하여, 본 발명자들은 활성 크론병에서 점막-관련 및 침투성 박테리아의 급격한 증가를 관찰하였으나, 이들 박테리아는 정상의 소장 및 대장 상피에서 부재하였다. 건강한 사람에서 방어소의 적당한 수준이 장의 상피 장벽을 따라서 조성물 및 장관 박테리아의 수를 조절하는 역할을 하고, 그들이 염증을 유발시키기 위하여 점막에 부착 및 침투하는 것을 막는 것을 시사하는 이들 관찰은 가설로 함께 통합되었다(Wang et al., 2007). 다른 한편, 분비된 방어소의 방어적인 수준을 생산하는 충분한 능력이 없는 인간에서, 항균 방어 및 장관 박테리아 사이의 균형이 바뀐다. 결과적으로, 이것은 염증 상태를 유도하는 장조직 밑으로의 박테리아의 침투를 허용하고, 이는 달리 말하면 크론병으로 발달할 수 있다.

이 가설에 기초하여, WO 2007/081486은 염증성 장질환의 치료에서 몇몇 인간 방어소의 용도를 개시한다. 본 발명자들은 크론병 환자에게 장관의 적당한 위치에서 그들의 분비를 허용하는 제형으로 경구 투여된 방어소가 박테리아의 침투의 수를 감소시키고, 정상 상피 장벽 기능을 복구하며, 그리하여 염증 질환의 심각성을 감소시킬 것을 제시한다.

WO 2007/081486에 따라서, 방어소의 기능은 박테리아가 상피 조직을 침투하는 것을 막기 위하여 루멘에서 박테리아를 직접적으로 표적하여 죽이는 것이다. 즉, 방어소의 기능은 순전히 항-감염 화합물과 같다. WO/2007/081486과 관련하여, 비경구 투여된 hBD2가 마우스에서 DSS 유도된 대장염의 심각성을 감소시킬 수 있는 것은, 이 투여 루트에서 펩티드와 루멘의 박테리아가 절대 만나지 않기 때문에, 놀라운 것이다. 추가적으로, 우리는 본 발명에서 hBD2의 효과는 PBMC에 의해 분비된 전-염증 사이토카인 TNFα, IL-1β 및 IL-23의 수준의 저하인 것을 보여준다. 이들 사이토카인은 염증성 장질환을 포함하는 많은 염증 질환에서 중요한 선수로 알려져 있다. 또한 방어소는 10년 이상 그들의 항균 기능에 비해서 또한 가능한 다양한 면역조절 기능이 더 많이 알려져 있었다. 그러나, 인간 방어소의 면역 조절 성질에 대한 대다수의 연구는 그들을 첫째로 전-염증 또는 면역 향상 기능을 갖는 것으로 기술한다(예를 들면, Niyonsaba et al., 2007; Bowdish et al., 2006; Lehrer, 2004를 참조).

그러므로, 비경구 투여된 hBD2가 염증성 장질환에서 질병 심각성을 감소시킬 수 있는 것은 정말 예상하지 못했다. 첫 번째로, 비경구 투여되었을 때, hBD2는 질병을 유도하는 것에 포함된 유해한 박테리아를 만나기 위하여 장의 루멘에 절대 닿지 못할 것이다. 더욱이, 발표된 문헌의 대다수에 기초하여 혈액으로 들어간 방어소가 본 발명에서 제시된 연구에서 관찰된 것과 같이, 항-염증 보다는 전-염증 반응을 유도할 것을 예상할 것이다.

Bonoiotto M., WJ Jordan, J. Eskdale, A. Tossi, N. Antcheva, S. Crovella, ND Connell and G Gallagher. Human β-Defensin 2 Induces a Vigorous Cytokine Response in Peripheral Blood Mononuclear Cells. Antimicrobial Agents and Chemotherapy(2006), 50, 1433-1441.

Bowdish et al., Immunomodulatory properties of defensins and cathelicidins. Curr. Top. Microbiol. Immunol.(2006) 306, 27-66.

Gersemann et al., Crohn's disease--defect in innate defence. World J. Gastroenterol.(2008) 14, 5499-5503.

Lehrer R.I., Primate defensins. Nat. Rev. Microbiol.(2004) 2, 727-738.

Swidsinski et al., Mucosal flora in inflammatory bowel disease. Gastroenterology(2002) 122, 44-54.

Niyonsaba F., H. Ushio, N. Nakano, W. Ng, K. Sayama, K. Hashimoto, I. Nagaoka, K. Okumura and H. Ogawa. Antimicrobial peptides human β-defensins stimulate epidermal keratinocyte migration, proliferation and production of proinflammatory cytokines and chemokines. Journal of Investigative Dermatology(2007), 127, 594-604.

Rowland TL, SM McHugh, J Deighton, RJ Dearman, PW Ewan and I Kimber. Differential regulation by thalidomide and dexamethasone of cytokine expression in human peripheral blood mononuclear cells. Immunopharmacology(1998), 40, 11-20.

Wang et al., Host-microbe interaction: mechanisms of defensin deficiency in Crohn's disease. Expert. Rev. Anti. Infect. Ther.(2007) 5, 1049-1057.

Wehkamp et al., Reduced Paneth cell alpha-defensins in ileal Crohn's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A(2005) 102, 18129-18134.

바람직한 구체예를 이해할 목적으로서, 어떤 정의를 본 발명에서 제공한다.

본 발명에서 사용한바 용어 "TNF-알파 활성"은 널리 알려진 용어이고, 당업자에게 그것의 일상적이고 관례적인 의미를 제공하는 것이며(그리고 특정한 또는 맞춰진 의미에 제한하지 않고), 적어도 일부가 종양 괴사 인자 알파에 의해 매개된 활성 또는 효과를 제한 없이 지칭한다.

본 발명에서 사용한바 용어 "억제자"는 널리 알려진 용어이고, 및 당업자에게 그것의 일상적이고 관례적인 의미를 제공하는 것이며(그리고 특정한 또는 맞춰진 의미에 제한하지 않고), TNF-알파의 적어도 하나의 활성을 감소시킬 수 있는 분자(예컨대, 천연 또는 합성 화합물)를 제한 없이 지칭한다. 다른 단어에서, "억제자"는 억제자 없이 수행한 분석과 비교하여, 억제자를 사용하여 수행한 분석에서의 측정된 TNF-알파의 양, TNF-알파 활성, 또는 세포 밖 및/또는 세포 내에서 검출된 TNF-알파에서 통계학적으로 유의한 변화가 있을 때 활성을 변화시킨다.

일반적으로, TNF-알파 억제자는 예를 들면 TNF-알파의 분비를 감소시키는 것에 의해 TNF-알파의 생리학적 기능을 감소시키고, 따라서 TNF-알파가 병원성일 수 있을 때, 직접 또는 간접적으로 질병의 치료에 유용하다.

본 발명에서 사용한바 용어 "IL-10 활성"은 널리 알려진 용어이고, 및 당업자에게 그것의 일상적이고 관례적인 의미를 제공하는 것이며(그리고 특정한 또는 맞춰진 의미에 제한하지 않고), 적어도 일부가 인터루킨-10에 의해 매개된 활성 또는 효과를 제한없이 지칭한다.

본 발명에서 사용한바 용어 "유도자"는 널리 알려진 용어이고, 및 당업자에게 그것의 일상적이고 관례적인 의미를 제공하는 것이며(그리고 특정한 또는 맞춰진 의미에 제한하지 않고), 및 IL-10의 적어도 하나의 활성을 증가시킬 수 있는 분자(예컨대, 천연 또는 합성 화합물)를 제한 없이 지칭한다. 다른 단어에서, "유도자"는 유도자 없이 수행한 분석과 비교하여, 유도자를 사용하여 수행한 분석에서의 측정된 IL-10의 양, IL-10 활성, 또는 세포 밖 및/또는 세포 내에서 검출된 IL-10에서 통계학적으로 유의한 변화가 있을 때 활성을 변화시킨다.

일반적으로, IL-10 유도자는 IL-10의 생리학적 기능을 증가시키고, 따라서 IL-10에 의해 영향을 받는 질병의 치료에 유용하다.

용어 "변형"은 본 발명에서 인간 베타 방어소 2의 임의의 화학적 변형을 의미한다. 변형은 아미노산의 치환, 결실 및/또는 삽입 뿐 아니라, 아미노산 측쇄의 치환일 수도 있고, 아미노산 서열에서 유사한 특징을 갖는 인공 아미노산을 사용한 것일 수도 있다. 특히, 변형은 C-말단의 아미드화와 같은 아미드화일 수 있다.

본 발명에서 사용한바 용어 "방어소(Defensin)"는 항균 펩티드의 방어소 클래스에 속하는 당업자에 의해 인식된 폴리펩티드를 지칭한다. 폴리펩티드가 본 발명의 방어소인지를 결정하기 위하여, 아미노산 서열은 자유롭게 사용가능한 HMMER 소프트웨어 패키지를 사용함으로써 PFAM 데이터베이스의 은닉 마르코프 모델 프로파일(HMM 프로파일)과 비교할 수 있다.

PFAM 방어소 패밀리는 예를 들면 방어소_1 또는 "포유동물 방어소"(기탁 번호 PF00323), 및 방어소_2 또는 방어소_베타 또는 "베타 방어소"(기탁 번호 PF00711)를 포함한다.

본 발명의 방어소는 베타 방어소 클래스에 속한다. 베타 방어소 클래스로부터 나온 방어소는 시스테인 패턴과 같은 공통의 구조적 특징을 공유한다.

방어소의 예시는, 본 발명에 따라, 인간 베타 방어소 1(hBD1 ; 서열번호 1 참조), 인간 베타 방어소 2(hBD2; 서열번호 2 참조), 인간 베타 방어소 3(hBD3; 서열번호 3 참조), 인간 베타 방어소 4(hBD4; 서열번호 4 참조), 및 마우스 베타 방어소 3(mBD3; 서열번호 6 참조)을 포함한다.

두 아미노산 서열 사이 또는 두 뉴클레오티드 서열 사이의 관련성은 매개변수 "동일성"으로써 기술하였다.

본 발명의 목적을 위해서, 두 아미노산 서열 간의 동일성의 정도는 EMBOSS 패키지(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16: 276-277; http://emboss.org)의 Needle 프로그램, 바람직하게는 3.0.0 또는 그 이후의 버전에서 수행되는 바와 같이, Needleman-Wunsch 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. MoI. Biol. 48: 443-453)을 사용하여 결정된다. 사용된 선택적 매개 변수는 10의 갭 오픈 벌점, 0.5의 갭 연장 벌점 및 EBLOSUM62(BLOSUM62의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스이다. Needle 표지된 "최장 동일성"(-nobrief 옵션을 사용하여 얻어짐)의 출력을 퍼센트 동일성으로서 사용하며, 하기와 같이 계산된다:

(동일한 잔기×100)/(배열 길이-배열 중 갭의 전체 수)

본 발명의 목적을 위하여, 두 디옥시리보뉴클레오티드 서열 사이의 동일성의 정도는 EMBOSS 패키지(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000; http://emboss.org), 바람직하게는 3.0.0 또는 그 이후의 버전의 Needle 프로그램에서 수행되는 바와 같이, Needleman-Wunsch 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970)을 사용하여 결정된다. 사용된 선택적 매개 변수는 10의 갭 오픈 벌점, 0.5의 갭 연장 벌점 및 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스이다. Needle 표지된 "최장 동일성"(-nobrief 옵션을 사용하여 얻어짐)의 출력을 퍼센트 동일성으로서 사용하며, 하기와 같이 계산된다:

(동일한 디옥시리보뉴클레오티드×100)/(배열 길이-배열 중 갭의 전체 수).

본 발명에서 사용한바 용어 "분리된 변이체" 또는 "분리된 폴리펩티드"는 공급원으로부터 분리된 변이체 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 한 측면에서, SDS-PAGE로 결정할 때, 적어도 1% 순수한, 바람직하게는 5% 순수한, 더욱 바람직하게는 적어도 10% 순수한, 더욱 바람직하게는 적어도 20% 순수한, 더욱 바람직하게는 적어도 40% 순수한, 더욱 더 바람직하게는 적어도 60% 순수한, 한층 더 바람직하게는 적어도 80% 순수한, 가장 바람직하게는 적어도 90% 순수한 폴리펩티드를 말한다.

본 발명에서 용어 "실질적으로 순수한 폴리펩티드"는 최대 10 중량%, 바람직하게는 최대 8 중량%, 더욱 바람직하게는 최대 6 중량%, 더욱 바람직하게는 최대 5 중량%, 더욱 바람직하게는 최대 4 중량%, 더욱 바람직하게는 최대 3 중량%, 더욱 더 바람직하게는 최대 2 중량%, 한층 더 바람직하게는 최대 1 중량%, 가장 바람직하게는 0.5 중량%로 자연적 또는 재조합적으로 연결된 다른 폴리펩티드 물질을 포함하는 폴리펩티드 제제를 나타낸다. 따라서, 상기 실질적으로 순수한 폴리펩티드는 제제에서 존재하는 전체 폴리펩티드 물질 중에서 적어도 92 중량% 순수한, 바람직하게는 적어도 94 중량% 순수한, 더욱 바람직하게는 적어도 95% 순수한, 더욱 바람직하게는 적어도 96 중량% 순수한, 더욱 바람직하게는 적어도 97 중량% 순수한, 더 바람직하게는 적어도 98 중량% 순수한, 더욱 더 바람직하게는 적어도 99 중량% 순수한, 한층 더 바람직하게는 적어도 99.5 중량% 순수한 및 가장 바람직하게는 100 중량% 순수한 것이 바람직하다. 본 발명의 폴리펩티드는 실질적으로 순수한 형태인 것이 바람직하다. 이는 예를 들면, 잘 알려진 재조합 방법 또는 고전적 정제 방법에 의해 폴리펩티드를 제조함으로써 이루어질 수 있다.

포유류 베타 방어소

본 발명은 염증성 질환과 같은 TNF-알파의 증가된(병원성) 수준과 관련된 질병의 치료에서, 인간 베타 방어소 및/또는 마우스 베타 방어소와 같은 포유류 베타 방어소의 약학적 용도에 관한 것이다. 치료는 바람직하게는 처리된 조직에서 감소된 TNF-알파 활성과 관련된다. 따라서 본 발명의 포유류 베타 방어소는 또한 TNF-알파 억제자로서 지칭된다.

한 구체예에서, 본 발명의 포유류 베타 방어소는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 및/또는 서열번호 6 중 임의의 아미노산 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 및 가장 바람직하게는 적어도 95%의 동일성의 정도를 갖는다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 포유류 베타 방어소는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및/또는 서열번호 4 중 임의의 아미노산 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 및 가장 바람직하게는 적어도 95%의 동일성의 정도를 갖는다. 더 바람직한 구체예에서, 본 발명의 포유류 베타 방어소는 인간 베타 방어소 1(서열번호 1), 인간 베타 방어소 2(서열번호 2), 인간 베타 방어소 3(서열번호 3), 인간 베타 방어소 4(서열번호 4), 인간 베타 방어소 4의 변이체(서열번호 5) 및/또는 마우스 베타 방어소 3(서열번호 6)으로 구성된다. 한층 더 바람직한 구체예에서, 본 발명의 포유류 베타 방어소는 인간 베타 방어소 1(서열번호 1), 인간 베타 방어소 2(서열번호 2), 인간 베타 방어소 3(서열번호 3) 및/또는 인간 베타 방어소 4(서열번호 4)로 구성된다.

다른 구체예에서, 본 발명의 포유류 베타 방어소는 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 및 가장 바람직하게는 적어도 95%의 동일성의 정도를 갖는다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 포유류 베타 방어소는 인간 베타 방어소 2(서열번호 2)로 구성된다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 포유류 베타 방어소는 인간 베타 방어소 1, 인간 베타 방어소 2, 인간 베타 방어소 3, 인간 베타 방어소 4 및 마우스 베타 방어소 3, 및 이의 기능적으로 동등한 변이체로 구성된다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 포유류 베타 방어소는 인간 베타 방어소 2, 및 이의 기능적으로 동등한 변이체로 구성된다.

본 발명의 포유류 베타 방어소는 또한 바람직한 구체예의 화합물로서 지칭된다.

본 발명의 문맥에서, 포유류(예컨대 인간) 베타 방어소의 "기능적으로 동등한 변이체"는 인간 베타 방어소 2와 같은 포유류(예컨대 인간) 베타 방어소 같이 TNF-알파 활성에서 대략 동일한 효과를 나타내는 변형된 포유류(예컨대 인간) 베타 방어소이다. 더욱 바람직하게는, 그것은 또한 인간 베타 방어소 2와 같은 포유류(예컨대 인간) 베타 방어소 같은 IL-10 활성에 대략 동일한 효과를 나타낸다.

본 발명에 따라, 인간 베타 방어소 2와 같은 포유류(예컨대 인간) 베타 방어소의 기능적으로 동등한 변이체는 서열번호 2와 같은 포유류(예컨대 인간) 베타 방어소 아미노산 서열과 비교하여 1-5 아미노산 변형, 바람직하게는 1-4 아미노산 변형, 더욱 바람직하게는 1-3 아미노산 변형, 가장 바람직하게는 1-2 아미노산 변형, 및 특히 하나의 아미노산 변형을 포함할 수 있다.

바람직하게는, 아미노산 변형은 중요하지 않은 변화인데, 즉 폴리펩티드의 접힘 및/또는 활성에 유의한 영향을 주지 않는 보존적 아미노산 치환 또는 삽입; 단일 결실; 작인 아미노-말단 또는 카르복실-말단의 연장; 20-25개 이하 잔기의 작은 링커 펩티드; 또는 순전하 또는 폴리-히스티딘 태그, 항원성 에피토프 또는 결합 도메인과 같은 다른 기능을 바꾸는 것을 통해 정제를 촉진하는 작은 연장과 같은 부수적 성질의 것이다.

보존적 치환의 예시는 염기성 아미노산(아르기닌, 리신 및 히스티딘), 산성 아미노산(글루탐산 및 아스파르트산), 극성 아미노산(글루타민 및 아스파라긴), 소수성 아미노산(루신, 이소루신 및 발린), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 트립토판 및 티로신), 및 소형 아미노산(글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌 및 메티오닌)의 그룹 내에 있다. 일반적으로 특정 활성을 바꾸지 않는 아미노산 치환은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면, H. Neurath and R. L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, New York에 의해 설명된다. 가장 흔하게 발생하는 교환은 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, 및 Asp/Gly이다.

20개의 표준 아미노산 외에도, 비표준 아미노산(예컨대 4-하이드록시프롤린, 6-N-메틸 리신, 2-아미노이소부티르산, 이소발린, 및 알파-메틸 세린)이 야생형의 폴리펩티드의 아미노산 잔기에 대해 치환될 수 있다. 제한적인 수의 비보존적 아미노산, 유전자 암호에 의해 코딩되지 않는 아미노산, 및 인공 아미노산이 아미노산 잔기 대신에 치환될 수 있다. "인공 아미노산"은 단백질 합성 후에 변형될 수 있고, 및/또는 표준 아미노산의 것과는 다른 측쇄내 화학 구조를 가질 수 있다. 인공 아미노산은 화학적으로 합성될 수 있고, 바람직하게는 시판되는 것일 수도 있으며, 피페콜릭산, 티아졸리딘 카르복실산, 디하이드로프롤린, 3- 및 4-메틸프롤린, 및 3,3-다이메틸프롤린을 포함한다.

포유류 베타 방어소에서의 필수 아미노산은 위치지정 돌연변이유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이유발(Cunningham 및 Wells, 1989, Science 244: 1081-1085)과 같은 당업계에 공지된 과정에 따라서 확인될 수 있다. 후자의 기술에서, 단일 알라닌 돌연변이를 분자의 모든 잔기에 도입하되, 결과로 생성된 돌연변이 분자를 분자의 활성에 결정적인 아미노산 잔기를 확인하기 위하여 생물학적 활성(즉, TNF-알파 활성의 억제)에 대하여 시험한다. 또한, 문헌(Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708)을 참조하라. 또한, 필수아미노산의 동일성은 포유류 베타 방어소와 관련된 폴리펩티드와의 동일성 분석으로부터 추측될 수 있다.

돌연변이유발, 재조합, 및/또는 셔플링에 이어서 문헌(Reidhaar-Olson 및 Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie 및 Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. ScL USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; 또는 WO 95/22625)에 개시된 것들과 같은 관련 스크리닝 과정의 공지된 방법을 사용하여 단일 또는 다중 아미노산 치환을 만들고 시험할 수 있다. 오류-취약 PCR, 파지 디스플레이(예를 들면, Lowman et al., 1991, Biochem. 30:10832-10837; 미국 특허 번호. 5,223,409; WO 92/06204), 및 영역지정 돌연변이(Derbyshire et al., 1986, Gene 46:145; Ner et al., 1988, DNA 7:127)를 포함하는 다른 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드의 N-말단 연장은 적합하게는 1 내지 50 아미노산, 바람직하게는 2-20 아미노산, 특히 3-15 아미노산으로 구성될 수 있다. 한 구체예에서, N-말단 펩티드 연장은 Arg(R)을 함유하지 않는다. 다른 구체예에서, N-말단 연장은 아래에서 더 설명되겠지만 kex2 또는 kex2-유사 절단 위치를 포함한다. 바람직한 구체예에서, N-말단 연장은 서열: EAE, EE, DE 및 DD 중 하나를 포함한 N-말단 연장과 같은 적어도 두 개의 Glu(E) 및/또는 Asp(D) 아미노산 잔기를 포함한 펩티드이다.

방법 및 용도

TNF-알파 억제자는 앞에서 언급한 것과 같은 다양한 적용가능한 용도를 갖는다. 당업자는 TNF-알파 대조군 수준으로부터 통계학적으로 유의한 변화량(감소)이 관찰되었을 때, 억제가 일어날 것임을 인식할 것이다.

인간 베타 방어소 1, 인간 베타 방어소 2, 인간 베타 방어소 3, 및 인간 베타 방어소 4의 변이체가 LPS- 및 LTA-자극 세포에서 TNF-알파 활성을 감소시키고, IL-10 활성은 증가시키는 것을 발견하였다. 나아가, 인간 베타 방어소 2가 LPS- 및 LTA-자극 세포에서 IL-23 분비를 감소시키는 것을 발견하였고; 그리고 마우스 베타 방어소 3이 쥣과 및 인간 LPS- 및 LTA-자극 세포 모두에서 TNF 활성을 감소시키는 것을 발견하였다. 이들 발견은 시험한 포유류 베타 방어소가 뛰어난 항-염증 활성, 특히 자가면역 질환 또는 장애에서 항-염증 활성을 나타내는 것을 뒷받침한다.

바람직한 구체예의 약학적 조성물은 TNF-알파 활성에 의해 매개되는 장애를 치료하는데 사용할 수 있다. 예컨대 약학적 조성물의 형태로 인간 베타 방어소 2와 같은 포유류 베타 방어소의 효과량을 이런 치료가 필요한 피험체에 투여하는 단계를 포함하는 TNF-알파 활성에 의해 매개되는 장애의 치료 방법을 또한 제공한다. 또한 TNF-알파 활성에 의해 매개되는 장애의 치료를 위해, 약제의 제조를 위한 인간 베타 방어소 2와 같인 포유류 베타 방어소, 약제, 예컨대, 약학적 조성물의 제조를 위한 포유류 베타 방어소의 용도를 또한 제공한다. 치료는 가지고 있는 질병 또는 장애의 치료뿐만 아니라 질병 또는 장애의 의과 예방(예방)도 포함한다.

한 구체예에서, 치료는 치료한 조직에서 감소된 TNF-알파 활성, 바람직하게는 감소된 TNF-알파 활성 및 증가된 IL-10 활성을 초래한다.

예컨대, TNF-알파 활성의 억제 또는 억압에 의해 바람직한 구체예의 화합물로 치료할 수 있는 질병 또는 장애는 TNF-알파 활성에 의해 매개되는 것들을 포함한다. 바람직하게는, 이들 장애의 치료는 감소된 TNF-알파 활성및/또는 증가된 IL-10 활성으로부터 이로울 수 있다. 이런 질병 또는 장애는 염증 질환 또는 장애, 알러지성 질환, 및 자가면역 질환를 포함한다. 더욱 구체적으로, 장애 또는 질병은 류마티스성 관절염, 골관절염, 다발성 경화증, 동맥경화증, 경피증(전신성 경화), 전신성 홍반성 낭창(SLE), 낭창,(급성) 사구체신염, 기관지 천식과 같은 천식, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 호흡 장애 증후군(ARDS), 염증성 장질환(예컨대, 크론병), 대장염(예컨대, 궤양성 대장염), 맥관염, 포도관염, 피부염(예컨대, 염증성 피부염), 아토피 피부염, 탈모증, 코카타르(비염), 알레르기성 결막염, 중증 근무력증, 경화성 피부염, 유육종증, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 소아 특발성 관절염, 그레이브스병, 쇼그렌 증후군, 및 베체트병을 포함한다.

TNF-알파 억제자는 장(예컨대, 입, 구강, 코, 직장), 비경구(예컨대, 정맥, 두개 내, 복강 내, 피하, 또는 근육 내), 또는 국소(예컨대, 경피, 코 안, 또는 기관지 내)를 포함하는 임의의 고전적인 루트에 의한 투여를 위해 제형된 조성물에서 치료적으로 사용할 수 있다. 다른 구체예 내에서, 본 발명에서 기술한 조성물은 서방형 이식물의 일부로서 투여될 수 있다.

또 다른 구체예 내에서, 바람직한 구체예의 조성물은 재수화 후, 동결건조물과 같은 안정성을 제공하는 적절한 첨가제를 사용하여 동결건조물로 제형화될 수 있다.

바람직한 구체예의 TNF-알파 억제자를 함유하는 약학적 조성물은 고전적인 방법, 예컨대, 혼합, 입자화, 코팅, 용해 또는 동결건조 과정에 따라 제조할 수 있다.

다른 구체예에서, 하나 이상의 TNF-알파 억제자를 함유하는 약학적 조성물을 제공한다. 투여 목적을 위해, 바람직한 구체예의 화합물은 약학적 조성물로 제형화될 수 있다. 바람직한 구체예의 약학적 조성물은 바람직한 구체예의 하나 이상의 TNF-알파 억제자 및 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석액를 포함한다.

TNF-알파 억제자는 약학적 조성물에서 특정 장애를 치료하는데 효과적인 양, 즉, 감소된 TNF-알파 수준 또는 활성, 징후를 달성하는데 충분한, 및/또는 바람직하게는 환자에게 허용가능한 독성을 갖는 양으로 사용하는 것이 바람직하다. 이런 치료를 위해, 적절한 투여량은 물론, 예를 들면, 본 발명에서 사용한 화합물의 화학적 성질 및 약동학적 데이터, 개별 숙주, 투여 방법 및 치료할 이상의 성질 및 심각성에 의존하여 바뀔 것이다. 그러나, 일반적으로, 보다 큰 포유류, 예를 들면 인간에서 만족스러운 결과를 위하여, 지시된 하루 투여량은 바람직하게는 약 0.001 g 내지 약 1.5 g, 더욱 바람직하게는 약 0.01 g 내지 1.0 g; 또는 약 0.01 mg/kg 체중 내지 약 20 mg/kg 체중, 더욱 바람직하게는 약 0.1 mg/kg 체중 내지 약 10 mg/kg 체중이고, 예를 들면, 하루 네 번까지 나누어진 투여량으로 투여하였다. 바람직한 구체예의 화합물은 TNF-알파 활성의 다른 매개 물질, 예컨대, 저분자량 억제자를 인습적으로 사용하는 것 보다, 비슷한 투여량으로 비슷한 투여 방법에 의해 보다 큰 포유류, 예를 들면 인간에게 투여할 수 있다.

어떤 구체예에서, 바람직한 구체예의 약학적 조성물는 투여 루트에 의존하여 단위 제형 당 약 0.5 mg 또는 미만 내지 약 1500 mg 또는 이상의 양, 바람직하게는 약 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 또는 0.9 mg 내지 약 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000 mg, 및 더욱 바람직하게는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 또는 25 mg 내지 약 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 mg으로 TNF-알파 억제자를 포함할 수 있다. 어떤 구체예에서, 그러나, 상술한 것들보다 더 낮거나 더 높은 투여량도 바람직할 수 있다. 적절한 농도 및 투여량은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석액은 당업자에게 잘 알려져 있다. 액체 용액으로 형성된 조성물에 있어서, 허용가능한 담체 및/또는 희석액은 살린 및 멸균수를 포함하고, 선택적으로 항산화제, 버퍼, 세균 발육 저지제 및 다른 일반 첨가물을 포함할 수 있다. 또한, 조성물은 환약, 캡슐, 과립, 타블렛(코팅 또는 비코팅),(주사가능한) 용액, 고체 용액, 부유액, 분산, 고체 분산(예컨대, 앰풀, 바이알, 크림, 겔, 풀, 흡입 파우더, 거품, 팅크, 립스틱, 점적약, 스프레이, 또는 좌약의 형태에서)으로서 제형화될 수 있다. 제형은 당업계에 알려진 것과 같이(하나 이상의 TNF-알파 억제자 및 다른 추가적 활성 성분에 추가하여) 담체, 충전재, 붕해제, 다공판, 당 및 감미제, 방향제, 방부제, 안정제, 습윤제, 유제, 가용화제, 삼투압을 조절하기 위한 염, 버퍼, 희석액, 분산제 및 표면-활성제, 결합제, 윤활유, 및/또는 다른 약학적 첨가제를 함유할 수 있다. 당업자는 나아가 적절한 방법에서, 그리고 문헌(Remington 's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1990)에서 기재된 것들과 같이 용인된 입자대로 TNF-알파 억제자를 제형화할 수 있다.

TNF-알파 억제자는 단독으로, 또는 하나, 두 개, 또는 그 이상의 다른 약학적 화합물 또는 약물 물질, 및/또는 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 첨가제와 함께 병용 요법에서 사용될 수 있다.

바람직한 구체예에서, TNF-알파가 병원성이거나, 또는 TNF-알파가 질병 과정에서 주축의 또는 다른 역할을 담당할 때, TNF-알파 억제자는 질병 또는 이상을 치료하기 위해 사용된 고전적 약물과 조합하여 존재한다. 특히 바람직한 구체예에서, 약학적 조성물은 TNF-알파가 병원성일 때, 천식 또는 다른 호흡기 질환, 당뇨, 관절염 또는 다른 염증 질환, 면역 장애, 또는 다른 질병 또는 장애의 치료를 위한 약물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 선택적인 약학적 화합물과의 조합된 바람직한 구체예의 화합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 TNF-알파 억제자를 포함하여 제공된다.

바람직한 구체예의 TNF-알파 억제자는 약학적 치료를 위하여 단독으로 또는 예컨대, 면역 또는 관련 질병의 치료에서 유용한 제제와 같은 하나 이상의 다른 약학적 활성제와 조합하여 사용할 수 있다. 이런 다른 약학적 활성제는 예컨대, 스테로이드, 글루코코르티코이드, 다른 염증 사이토카인의 억제자(예컨대, 항-TNF-알파 항체, 항-IL-1 항체, 항-IFN-감마 항체), 및 IL-1 RA 또는 IL-10과 같은 다른 사이토카인, 및 다른 TNF-알파 억제자를 포함한다.

병용 요법은 두 개 이상의 약학적 활성제가 동일한 제형 내에 있는 고정된 조합을 포함할 수 있고; 분리된 제형에 두 개 이상의 약학적 활성제를 동일한 포장에서 예컨대, 공동-투여를 위한 지침서와 함께 파는 키트; 그리고 약학적 활성제가 분리되어 포장되어 있지만, 동시 또는 순차적 투여를 위한 지침서를 제공하는 자유 조합을 포함할 수 있다. 다른 키트 성분은 진단, 분석, 순차적 또는 동시 투여를 위한 다중 제형, 약학적 조성물의 동결건조 또는 농축 형태를 재구성하기 위한 지침서 및 물질, 약학적 활성제를 투여하기 위한 기구, 등을 포함할 수 있다. 예를 들면, 약학적 포장은 , 결합된 투여를 위한 지침서에 따라 바람직한 구체예의 화합물인 일차 약물 물질 및 적어도 하나의 이차 약물 물질을 포함하여 제공한다. 또한, 약학적 포장은 적어도 하나의 이차 약물 물질과 함께 결합된 투여를 위하여 지침서에 따른 바람직한 구체예의 화합물을 포함하여 제공한다. 또한, 본 발명의 화합물과 함께 결합된 투여를 위한 지침서에 따른 적어도 하나의 이차 약물 물질을 포함하는 약학적 포장을 제공한다.

바람직한 구체예에 따른 조합을 사용한 치료는 조합의 각각의 단독 성분에 의한 치료와 비교하여 개량되거나 뛰어난 결과를 제공할 수 있다. 예를 들면, 바람직한 화합물의 양 및 이차 약물 물질의 양을 포함하는 약학적 조합을 사용할 수 있고, 양은 상승적 치료 효과를 생산하기에 적절한 양이다. 예컨대, 바람직한 구체예의 화합물 및 이차 약물 물질의 치료적 효과량을 동시에 또는 순차적으로 공동-투여하는 단계를 포함하는, 바람직한 구체예의 화합물의 치료적 유용성을 개선하기 위한 방법을 또한 제공한다. 본 발명의 조합 및 조합 파트너로서 이차 약물 물질은 임의의 고전적인 루트에 의해, 예를 들면 바람직한 구체예의 화합물에 대해서 앞에서 준비한 것과 같이 투여될 수 있다. 이차 약물은 예컨대 단일 처리에 사용할 수 있는 것들과 유사한 투여 범위 또는 예컨대, 상승 작용의 경우에서, 고전적 투여 범위 이하의 적절한 투여량으로 투여할 수 있다.

적당한 이차 약물 물질은 화학치료 약물, 특히 바람직한 구체예의 TNF-알파 억제자와 다른 임의의 화학치료제를 포함한다. 이런 이차 약물 물질은 예컨대, 항-염증 및/또는 면역조절 약물, 등을 포함할 수 있다.

바람직한 구체예의 화합물과 함께 조합하여 사용할 수 있는 항-염증 및/또는 면역조절 약물은 예컨대, 예컨대 40-O-(2-하이드록시에틸)-라파마이신, 32-디옥소라파마이신, 16-펜트-2-이닐록시-32-디옥소라파마이신, 16-펜트-2-이닐록시-32(S 또는 R)-디하이드로-라파마이신, 16-펜트-2-이닐록시-32(S 또는 R)-디하이드로-40-O-(2-하이드록시에틸)-라파마이신, 40-[3-하이드록시-2-(하이드록시-iEta에틸)-2-메틸프로판올레이트]-라파마이신(또한 CCI779로도 알려짐)과 같은 16-0-치환 라파마이신을 포함하는 mTOR 억제자, AP23573과 같은 PCT 국제 출원 번호 WO 98/02441, PCT 국제 출원 번호 WO 01/14387, 및 PCT 국제 출원 번호 WO 03/64383에서 개시된 것 같은 라파로그라고 불리는 40-에로이-(테트라졸일)-라파마이신(또한 ABT578로도 알려짐), 및 TAFA-93 및 바이오리무스(바이오리무스 A9)의 명칭 하에서 개시된 화합물; 칼시뉴린 억제자, 예컨대, 사이클로스포린 A 또는 FK 506; 면역-억제 성질을 갖는 것, 예컨대, ABT-281, ASM981; 코르티코스테로이드; 사이클로포스파미드; 아자티오프렌; 레플루노미드; 미조리빈; 마이코페놀산 또는 염; 미코페놀레이트 모페틸; 15-디옥시스페르구아린 또는 이의 면역억제 상동체, 유사체 또는 유도체; bcr-abl 티로신 키나아제 억제자; c-키트 수용체 티로신 키나아제 억제자; PDGF 수용체 티로신 키나아제 억제자, 예컨대, 글리벡(이마티닙); p38 MAP 키나아제 억제자, VEGF 수용체 티로신 키나아제 억제자, 예컨대, PCT 국제 출원 번호 WO 02/38561 또는 PCT 국제 출원 번호 WO 03/82859에서 개시된 것과 같은 PKC 억제자, 예컨대, 실시예 56 또는 70의 화합물; 자유형 또는 약학적으로 허용가능한 염 형태의 JAK3 키나아제 억제자, 예컨대, 모노-시트레이트(또한 CP-690,550로 불림), 또는 PCT 국제 출원 번호 WO 2004/052359 또는 PCT 국제 출원 번호 WO 2005/066156에서 개시된 것 같은 화합물, 예컨대, N-벤질-3,4-디하이드록시-벤질리덴-시아노아세트아미드 알파-시아노-(3,4-디하이드록시)-]N-벤질시나마미드(티르포스틴 AG 490), 프로디지오신 25-C(PNUI 56804), [4-(4'-하이드록시페닐)-아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린](WHI-PI 31), [4-(3'-브로모-4'-하이드록실페닐)-아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린](WHI-PI 54), [4-(3',5-디브로모-4'-하이드록실페닐)-아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린] WHI-P97, KRX-211, 3-{(3R,4R)-4-메틸-3-[메틸-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-아르니노]-피프크리딘-l-일}-3-옥소-프로로이오니트릴(prorhoionitrile); SIP 수용체 작용제 또는 조절자, 예컨대, 선택적으로 인산화된 FTY720 또는 이들의 유사체, 예컨대, 선택적으로 인산화된 2-아미노-2-[4-(3-벤질옥시페닐티오)-2-클로로페닐]에틸-1,3-프로판디올 또는 l-{4-[l-(4-사이클로헥실-3-트리플루오로메틸-벤질옥시이미노)-에틸]2-에틸-벤질}-아제티딘-3-카르복실산 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염; 면역억제 단일클론 항체, 예컨대, 백혈구 수용체에 대한 단일클론 항체, 예컨대, Blys/BAFF 수용체, MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD25, CD28, CD40, CD45, CD52, CD58, CD80, CD86, IL-12 수용체, IL-17 수용체, IL-23 수용체 또는 그들의 리간드; 다른 면역조절 화합물, 예컨대, CTLA4 또는 이의 돌연변이의 세포 밖 도메인의 적어도 일부를 갖는 재조합 결합 분자, 예컨대, 비-CTLA4 단백질 서열에 이어진 CTLA4 또는 이의 돌연변이의 세포 밖 도메인의 적어도 일부, 예컨대, CTLA4lg(예를 들면, 지정된 ATCC 68629) 또는 이의 돌연변이, 예컨대, LEA29Y; 부착 분자 억제자, 예컨대, LFA-I 길항제, ICAM-I or-3 길항제, VCAM-4 길항제 또는 VLA-4 길항제, CCR9 길항제, MIF 억제자, 설프아자라진, Azulfidine®, Asacol®, Dipentum®, Pentasa®, Rowasa®, Canasa®, Colazal®과 같은 5-아미노살리실레이트(5-ASA) 제제, 예컨대, 메살라민을 함유하는 약물; 예컨대, 헤파린과 결합된 메살라진; TNF-알파 억제자 또는 억압자, 예컨대, TNF-알파에 결합하는 항체, 예컨대, 인플릭시맙(Remicade), 예컨대, COX-억제 NO-제공 약물(CINOD)을 포함하는 산화 질소 분비 비-스테로이드성 항-염증 약물(NSAID)과 같은 본 발명과 다른 것들; 포스포디에스테라아제, 예컨대, PDE4B-억제자, 카스파아제 억제자, '다기능성 항-염증' 약물(MFAID), 예컨대, 글리코스아미노글리칸에 연결된 막-부착 포스포리파아제 A2 억제자와 같은 시토졸 포스포리파아제 A2(cPLA2) 억제자를 포함한다.

다른 바람직한 구체예에서, 바람직한 구체예의 하나 이상의 TNF-알파 억제 화합물은 하나 이상의 비스테로이드성 항-염증 약물(NSAID) 또는 관절염 또는 다른 염증 질환의 치료를 위한 다른 약학적 화합물과 조합하여 존재한다. 바람직한 화합물은 셀레콕십; 로페콕십; NSAID, 예를 들면, 아스피린, 셀레콕십, 콜린 마그네슘 트리 살리실레이트, 디클로페낙 포타슘, 디클로페낙 소듐, 디플루니살, 에토도락, 페노프로펜, 이부프로펜, 인도메타신, 케토프로펜, 케토로락, 멜레남산, 나부메톤, 나프록센, 나프록센 소듐, 옥사프로진, 피록시캄, 로페콕십, 살사레이트, 설린닥, 및 톨메틴; 및 코르티코스테로이드, 예를 들면, 코르티손, 하이드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니손, 프레드니솔론, 베타메테손, 베클로메타손 디프로피오네이트, 부데소니드, 덱사메타손 소듐 포스페이트, 플루니솔리드, 플루티카손 프로피오네이트, 트리암시놀론 아세토니드, 베타메타손, 플루오시놀론, 플루오시노니드, 베타메타손 디프로피오네이트, 베타메타손 발레레이트, 데소니드, 데스옥시메타손, 플루오시놀론, 트리암시놀론, 트리암시놀론 아세토니드, 클로베타솔 프로피오네이트, 및 덱사메타손을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

특히 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 TNF-알파 억제 화합물은 천식, 급성 호흡 곤란, 또는 다른 호흡기 질환의 치료를 위해 하나 이상의 베타 흥분제, 흡입 코르티코스테로이드, 항히스타민, 호르몬, 또는 다른 약학적 화합물과 조합하여 존재한다. 바람직한 화합물은 베타 흥분제, 예를 들면, 일반적으로 규정된 기관지 확장제; 흡입 코르티코스테로이드, 예를 들면, 베클로메타손, 플루티카손, 트리암시놀론, 모메타손, 및 프레드니손, 프레드니솔론, 및 메틸프레드니솔론과 같은 프레드니손의 형태; 항히스타민, 예를 들면, 아자타딘, 카르비녹사민/슈도에페드린, 세티리진, 사이프로헵타딘, 덱스클로르페니라민, 펙소페나딘, 로라타딘, 프로메타진, 트리펠렌아민, 브롬페니라민, 클로로페니라민, 클레마스틴, 디펜하이드라민; 및 호르몬, 예를 들면, 에피네프린을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

특히 바람직한 구체예, 하나 이상의 TNF-알파 억제 화합물은 하나 이상의 마취제, 예컨대, 에탄올, 부피바카인, 클로로프로카인, 레보부피바카인, 리도카인, 메피바카인, 프로카인, 로피바카인, 테트라카인, 데스플루란, 이소플루란, 케타민, 프로포폴, 세보플루란, 코데인, 펜타닐, 하이드로모르폰, 마르카인, 메페리딘, 메타돈, 모르핀, 옥시코돈, 레미펜타닐, 수펜타닐 부토르판올, 날부핀, 트라마돌, 벤조카인, 디부카인, 에틸 클로라이드, 자일로카인, 및 페나조피리딘과 조합하여 존재한다.

특히 바람직한 구체예, 하나 이상의 TNF-알파 억제 화합물은 조성물에서 아자티오프린 또는 코르티코스테로이드과 같은 염증성 장질환의 치료하기 위한 약학적 조성물과 조합하여 존재한다.

특히 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 TNF-알파 억제 화합물은 약학적 조성물에서 면역억제 화합물과 조합하여 존재한다. 특히 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 TNF-알파 억제 화합물은 자가면역 장애를 치료하기 위한 하나 이상의 약물, 예를 들면 에타네르셉트, 인플릭시맙, 및 종양 괴사 인자를 억제하거나 간섭하는 다른 화합물과 같은 생물 반응 변경자와 조합하여 존재한다.

특히 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 TNF-알파 억제 화합물은 코르티코스테로이드, 예를 들면, 코르티손, 하이드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니손, 프레드니솔론, 베타메타손, 베클로메타손 디프로피오네이트, 부데소니드, 덱사메타손 소듐 포스페이트, 플루니솔리드, 플루티카손 프로피오네이트, 트리암시놀론 아세토니드, 베타메타손, 플루오시놀론, 플루오시노니드, 베타메타손 디프로피오네이트, 베타메타손 발레레이트, 데소니드, 데스옥시메타손, 플루오시놀론, 트리암시놀론, 트리암시놀론 아세토니드, 클로베타솔 프로피오네이트, 및 덱사메타손을 포함하는 스테로이드와 조합하여 존재한다.

어떤 질병의 치료에서, 그것은 마취제, 예를 들면, 에탄올, 부피바카인, 클로로프로카인크, 레보부피바카인, 리도카인크, 모피바카인, 프로카인, 로피바카인, 테트라카인, 데스플루란, 이소플루란, 케타민, 프로포폴, 세보플루란, 코데인, 펜타닐, 하이드로모르폰, 마르카인, 메페리딘, 메타돈, 모르핀, 옥시코돈, 레미펜타닐, 수펜타닐 부토르판올, 날부핀, 트라마돌, 벤조카인, 디부카인, 에틸 클로라이드, 자일로카인, 및 페나조피리딘과 조합하여 TNF-알파 억제자와 함께 환자를 치료하는데 유익할 수 있다.

시험관내 합성

인간 베타 방어소 2와 같은 포유류 베타 방어소는 당업계에 공지된 종래 방법을 사용하여 시험관내 합성에 의하여 제조될 수 있다. 다양한 상업적 합성 장치, 예를 들면 Applied Biosystems Inc., Beckman 등에 의한 자동 합성기가 이용가능하다. 합성기를 사용하면, 자연적으로 발생하는 아미노산은 비천연 아미노산, 특히 D-이성질체(또는 D-형태) 예를 들면, D-알라닌 및 D-이소루신, 부분입체이성질체, 다른 길이 또는 기능성을 가진 측쇄 등으로 치환될 수 있다. 특정 서열 및 제조 방식은 편리성, 경제성, 요구되는 순도 등에 의하여 결정될 것이다.

아미드 또는 치환된 아민 형성, 예를 들면, 환원성 아민화를 위한 아미노기, 티올에테르 또는 이황화물 형성을 위한 티올기, 아미드 형성을 위한 카르복실기 등과 같은 결합을 위한 편리한 기능을 포함하는 화학결합은 다양한 펩티드 또는 단백질에 제공될 수 있다.

원하는 경우, 다른 분자 또는 표면에 대한 결합을 허용하는 다양한 기를 합성하는 동안 또는 발현하는 동안 펩티드에 도입할 수 있다. 따라서, 티오에테르를 만들기 위해 시스테인, 금속 이온 복합체에 연결하기 위해 히스티딘, 아미드 또는 에스테르를 형성하기 위해 카르복실기, 아미드를 형성하기 위해 아미노기 등을 사용할 수 있다.

포유류 베타 방어소는 또한 재조합 합성의 전통적 방법에 따라서 분리되고 정제될 수 있다. 용해물은 발현 숙주의 것을 제조할 수 있으며, 용해물은 HPLC, 배제 크로마토그래피, 겔 전기영동, 친화성 크로마토그래피, 또는 다른 정제 기술을 사용하여 정제될 수 있다.

본 발명의 나아간 측면 및 구체예는 하기에서 약술한다:

청구항 10. 류마티스성 관절염, 골관절염, 다발성 경화증, 동맥경화증, 경피증(전신성 경화), 낭창, 전신성 홍반성 낭창(SLE),(급성) 사구체신염, 천식, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 호흡 장애 증후군(ARDS), 맥관염, 포도관염, 피부염, 아토피 피부염, 탈모증, 코카타르(비염), 알레르기성 결막염, 중증 근무력증, 경피증, 유육종증, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 소아 특발성 관절염, 그레이브스병, 쇼그렌 증후군, 및 베체트병으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 염증 질환 또는 장애의 치료를 위한 포유류 베타 방어소.

청구항 11. 청구항 10에 있어서, 경구로 투여되는 것을 특징으로 하는 포유류 베타 방어소.

청구항 12. 청구항 11에 있어서, 피하 또는 정맥으로 투여되는 것을 특징으로 하는 포유류 베타 방어소.

청구항 13. 청구항 10-12 중 어느 한 항에 있어서, 인간 베타 방어소인 것을 특징으로 하는 포유류 베타 방어소.

청구항 14. 청구항 10-13 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 포유류 베타 방어소

청구항 15. 청구항 10-14항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 베타 방어소 1, 인간 베타 방어소 2, 인간 베타 방어소 3, 또는 인간 베타 방어소 4인 것을 특징으로 하는 포유류 베타 방어소

청구항 16. 청구항 10-15 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 포유류 베타 방어소.

청구항 17. 청구항 10-16 중 어느 한 항에 있어서, 인간 베타 방어소 2인 것을 특징으로 하는 포유류 베타 방어소

청구항 18. 청구항 10-17 중 어느 한 항에 있어서, 처리된 조직에서 TNF-알파 활성이 감소되는 것을 특징으로 하는 포유류 베타 방어소

본 발명은 다음 실시예에 의하여 더 설명되는데, 이것은 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 고려되어서는 안된다.

실시예

실시예 1

인간 베타 방어소 2(hBD2)의 항-염증 활성

면역조절 효과에 대하여 hBD2를 실험하는 동안, hBD2가 굉장한 항-염증 가능성을 가진 것을 뜻밖에 관찰하였다. 인간 PBMC 배양에서, hBD2의 처리는 LPS, LTA 또는 펩티도글리칸 자극 배양의 사이토카인 프로파일에 큰 영향력을 가지는 것을 관찰하였다. hBD2가 전염증 사이토카인 및 케모카인 IL-6, IL-1β, RANTES, IP-10 및 IL-8을 유도할 수 있음이 이전에 관찰된 바 있다(Niyonsaba et al. 2007, Boniotto M. et al. 2006).

여기서 본 발명자들은 TNF 및 IL-1β, 두 개의 전염증 사이토카인의 가능성을 하향조절하고, 또한 리포폴리사카라이드(LPS), 리포테이코산(LTA) 또는 펩티도글리칸(PGN)을 사용한 염증 자극의 유도에서 IL-10을 유도하는 것을 보았다. IL-10은 잠재적인 항-염증 사이토카인이므로, hBD2의 결과적인 효과는 항-염증이다. 이것을 인간 PBMC, 단핵구 세포주 및 수지상 세포주에서 관찰하였다.

재료 및 방법

hBD2의 생산

hBD2를 재조합적으로 생산하였다. hBD2를 암호화하는 합성 DNA 절편(DNA 2.0)을 pET-32(+) 발현 벡터(Novagen)에 클로닝하였다. 결과적인 플라스미드는 N-말단 티오레독신 부분에 이어서 his-표지, 엔테로키나아제 절단 부위 및 hBD2 펩티드를 함유하는 번역 융합 펩티드를 암호화한다. 발현 플라스미드는 E. coli 균주 BL21에 형질도입하였다.

이 균주의 밤샘 배양액을 100 μg/ml의 앰피실린을 함유하는 TB-글리세롤에 100배 희석하였고, 37℃에서 대략 8의 OD600까지 키운 다음, 0.5 mM의 IPTG로 3시간 동안 유도시킨 후, 원심분리하여 세포를 수득하였다. his-표지된 trx-hBD2 융합 펩티드를 표준 프로토콜을 사용하여 Ni-NTA 비드(QIAGEN)로 정제하였다. his-표지 정제 융합 펩티드를 순차적으로 엔테로키나아제 버퍼(50 mM tris-HCl pH 7.5, 1 mM CaCl₂)에서 밤새 투석한 다음, 성숙 hBD2를 분비하기 위해 엔테로키나아제로 절단하였다. hBD2 펩티드는 출처 15 S matrix(Amersham Biosciences)를 이용한 양이온-교환 크로마토그래피에 의해 더 정제하였다. hBD2의 정확한 분자량을 MALDI-TOF 질량 분석을 사용하여 입증하였다.

mBD3의 생산(실시예 4 참조)을 동일한 프로토콜을 사용하여 수행하였다.

hBD2 분자의 적절한 접힘 및 이황화-결합 위상학을 LC-MS 및 NMR 분광기와 결부된 트립신 효소적분해를 사용하여 순차적으로 입증하였다.

내독소를 낮은 pH에서의 예비 RP-HPLC에 의해 hBD2 및 mBD3 표본으로부터 제거하였고, 내독소의 성분을 LAL 분석(Endosafe KTA2)에 의해 결정하였으며, 수준이 분석의 검출 한계 이하인 것을 찾았다(0.05 EU/mg). 내독소 분석의 검출 한계 이하의 수준이 PBMC를 자극할 수 없음을 확인하기 위하여, 매우 강력한 리포폴리사카라이드(E. coli, 0111 :B4, Sigma L4391)를 사용한 자극의 적정 곡선을 수행하였다. 이 LPS의 매우 낮은 수준(0.06 ng/ml)이 검출가능한 사이토카인을 생산하도록 PBMC를 자극할 수 있었다.

PBMC의 분리 및 자극

말초혈액을 건강한 지원자로부터 뽑았다(덴마크의 관련 윤리 위원회의 승인을 받음). 헤파린 처리된 혈액을 RPMI에 1/1 v/v로 희석하였고, 뽑은 지 2시간 내에 Ficoll 밀도 원심분리시켰다. 혈장을 개별 제공자의 상부로부터 수득하였고, 그것을 배양 배지에서 2%로 사용할 때까지 얼음에 두었다(자가 배양 배지). 분리된 PBMC를 자가 배양 배지에 재현탁한 다음 웰당 255.000개 세포로 전체 200 μl로 96-웰 배양 플레이트에 시딩하였다. 동일한 제공자로부터 나온 PBMC를 100, 10 또는 1 μg/ml의 hBD2 단독으로 또는, 0.6 ng/ml 또는 20 ng/ml의 LPS(E. coli, 0111:B4, Sigma L4391), 1.25 μg/ml리포테이코산(LTA)(B. subtilis에서 나옴, Sigma L3265) 또는 40 μg/ml의 펩티도글리칸(PGN)(S. aureus에서 나옴, Sigma 77140)과 함께 자극시켰다. 자극을 위해 사용한 농도는 초기 실험에서 3명의 다른 제공자에서 최적화하였고, 조절할 수 있는 사이토카인 농도를 확신하기 위하여 LPS에 대하여 두 개의 다른 농도를 사용하였다. 일부 실험에서 PBMC를 덱사메타손 및 인도메타신을 단독으로 또는 LPS 또는 LTA와 함께 염증 사이토카인의 하향조절에서의 대조군으로서 처치하였다. 상청액을 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음 회수하였고, 사이토카인 측정까지 -80℃에서 보관하였다. 생존능을 모든 실험에서 Alamar Blue(Bio출처, DALL 1100)에 의하거나, 일부 경우에서는 또한 MTS(Promega)에 의해 제조사의 지침서에 따라 측정하였고, 일부 실험에서 또한 핵계수기(Nucleocounter)를 통한 세포의 계수에 의해 판단하였다.

MUTZ-3의 배양 및 자극

인간 골수양 백혈병-유래 세포주 MUTZ-3(DSMZ, Braunschweig, 독일)을 20% [부피/부피(v/v)] 우태아 혈청(Sigma F6178) 및 40 ng/ml rhGM-CSF(R&D Systems 215-GM-050)로 보충한 a-MEM(Sigma M4526)에서 유지하였다. 이 전구체 세포는 하기에서 표시된 단핵구 세포주이며, 이들 단핵구를 100, 10 또는 1 μg/ml의 hBD2 단독으로 또는, LPS 또는 LTA와 함께 자극시켰다.

수지상세포 분화

수지상 세포주를 생산하기 위하여, 인간 골수양 백혈병 세포주 MUTZ-3(1×105 세포 밖/ml)를 미숙한 DC로 rhGM-CSF(150 ng/ml) 및 rhIL-4(50 ng/ml)의 존재하에서 7일 동안 분화시켰다. 배지를 매 2-3일 마다 교체하였다. 분화된 세포주는 수지상 세포에서의 hBD2의 효과를 크게하기 위해 hBD2가 있거나 없이 LPS 또는 LTA 중 어느 하나로 더 자극시켰다.

사이토카인 측정.

상청액에서 사이토카인 생산은 FACS어레이 유세포 분석기에서 제조사의 지침서에 따라(BD) 인간 면역 혈구계산 비드 어레이(CBA)를 사용한 유세포 분석에 의해 측정하였다. 하기 사이토카인을 측정하였다: IL-8, IL-1β, IL-10, TNF, IL-12 p70, IL-6. 일부 실험에서, 사이토카인을 R&D systems(IL-10, TNF-α, IL-1β)에서 나온 ELISA 키트에 의해 제조사의 지침서에 따라 측정하였다.

데이터 분석

모든 실험은 나타낸 대표적인 결과를 포함하여 적어도 두 번 수행하였다. 나타낸 데이터는 평균 더하기/빼기 표준 편차(SD)로 명시하였다. 통계학적 유의성은 표 범례에서 보고한 것같이 처리한 것 및 자극(LPS, LTA, 펩티도글리칸, 등)을 사용한 2-way ANOVA에 이은 본페로니 사후 검정에 의해 결정하였다. 차이는 p<0.05에 대하여 유의한 것으로 여겨졌다.

결과

hBD2의 효과를 LPS 및 LTA가 있거나 없이 처리된 인간 PBMC에서 시험하였다(표 1, 2 및 3). hBD2를 사용한 처리는 모든 세 개의 시험 농도에 대하여 자극된 배양에서 TNF의 유의한 하향조절을 제공하였고(표 1), 하향조절은 0.6 ng/ml의 LPS에 대하여, 그리고 LTA에 대하여 투여량 의존적이었다. IL-1β에 대하여, 하향조절은 가장 높은 투여량에서 대개 관찰되었다(표 2). 흥미롭게도, IL-10은 유의하게 및 투여량-의존적으로 상향조절되었다(표 3). 전염증 사이토카인의 하향조절 및 항-염증 사이토카인의 유도는 hBD2의 매우 강력한 항-염증 잠재력을 보여준다. 생존능은 hBD2의 항-염증 효과가 세포독성 효과 때문인 것을 배제하기 위하여, 두 가지 다른 분석에 의해 측정되었다. 표 4 및 5에서 hBD2가 세포에서 세포독성 효과를 갖지 않는 것을 볼 수 있고, 관찰된 효과는 세포의 증식으로 이어지는 LPS 또는 LTA를 사용한 자극에 기인한 자극 효과이다. 그러므로 hBD2는 이들 세포에서 세포독성 효과를 갖지 않는다.

표 6, 7 및 8에서, 다른 제공자로부터 나온 상청액을 유세포분석에 의한 혈구계산 비드 어레이 대신에 ELISA를 통해 사이토카인에 대하여 분석하였고, 여기에서 비록 분석의 감도가 낮고 검출 한계가 많이 높아 효과가 유의하진 않았지만, 동일한 것이 관찰되었다.

또 다른 톨-라이크 수용체 리간드를 시험하기 위하여, 펩티도글리칸으로 자극된 PBMC에서 hBD2의 효과를 조사하였다(표 9 및 10). 동일한 것이 관찰되었다: TNF는 투여량-의존적으로 하향조절되고, IL-10은 투여량-의존적으로 유도된다.

TNF의 하향조절에 대한 양성 대조군으로서, 두 가지 항-염증 화합물, 덱사메타손 및 인도메타신을 분석에서 시험하였다. 농도를 선별하고, 그래서 화합물은 독성이 아니고, 배지에서의 용해도에 의해 달성가능한 농도이다. 오직 인도메타신이 LTA를 사용한 자극 후에 TNF를 억제하였고(표 11), 그에 반해 덱사메타손은 효과적으로 TNF 생산을 하향조절하였고, 동일한 것이 IL-1β에 대하여 관찰되었다(표 13). 인도메타신은 COX-1 및 COX-2 억제자이고 통증을 완화하고 관절염의 징후를 경감시키는 것을 돕기 위해 가볍게 처리하는데 사용되는 비스테로이드성 항염증 약물(NSAID)이고, 덱사메타손은 염증 장애의 치료에서 일차적으로 사용되는 합성 글루코코르티코이드이고, 그것은 매우 낮은 투여량에서 전염증 사이토카인의 매우 강력한 하향 조절 효과를 가지며(Rowland et al. 1998), 우리가 TNF-α 및 IL-1β에 대하여 또한 관찰할 수 있다.

표 14 및 15에서, 단핵구 세포주 및 수지상세포에서 TNF의 하향조절에서 hBD2의 효과를 나타내고, 동일한 것을 PBMC에 대한 것이었던 것과 같이 관찰한다. IL-10은 또한 hBD2 및 LPS 또는 hBD2 및 LTA를 사용하여 자극된 수지상세포에 대하여 유도되었다(결과를 보여주지 않음).

LPS 또는 LTA에 대한 hBD2의 결합이 TNF 및 IL-1β의 하향조절을 유발하는 것을 배제하기 위하여, 합성 리간드(Pam3CSK4(TLR2-TLR1 리간드)를 사용한 PBMC의 자극에서 hBD2의 효과를 시험하였다. hBD2는 오히려 이 리간드를 사용한 자극 후에 TNF를 하향조절할 수 있었고, 그것은 LPS 또는 LTA의 중화가 관찰된 효과에 책임이 없음을 가리키는 것이다(결과를 보여주지 않음). 더욱이, hBD2와 함께 TNF-α 및 IL-α를 함유하는 사이토카인 칵테일을 사용한 수지상세포의 자극은 사이토카인 칵테일을 단독으로 사용한 자극과 비교하여 IL-1β 및 IL-8 및 IL-6에서 하향조절 효과를 가졌다. TNF-α를 사용한 자극에 대하여 명백하게 TNF에서 효과없음을 분석할 수 있었다(결과를 보여주지 않음).

hBD2가 있거나 없이 LPS 또는 LTA로 처리한 후 인간 말초혈액 단핵 세포(PBMC)로부터의 TNF 생산, 모든 샘플을 동일한 제공자에게서 시험함, 5명의 제공자를 뺀 대표적인 실험. TNF는 FACS어레이에서 혈구계산 비드 어레이(CBA)에 의해 측정됨, 각각의 대조군과 비교하여 *** p<0.001(진하게), 2-way ANOVA에 의해 분석됨(N=각각의 데이터 세트에 대하여 대략 200).

TNF, pg/ml (SD)	대조군	hBD2 100 g/ml	hBD2 10 g/ml	hBD2 1 g/ml
배지	7.3 (5.9)	2.9 (5.1)	2.6 (6.6)	4.2 (10.7)
LPS 0.6 ng/ml	1708.6 (428.3)	634.2 (226.1)***	1076.4 (278.0)***	944.8 (326.6)***
LPS 20 ng/ml	2572.1 (581.1)	1733.9 (461.3)***	1306.6 (375.0)***	1526.9 (444.2)***
LTA 1.25 μg/ml	1097.4 (293.8)	375.2 (114.2)***	494.7 (158.1)***	711.5 (282.5)***

hBD2가 있거나 없이 LPS 또는 LTA로 처리한 후 인간 말초혈액 단핵 세포(PBMC)로부터의 IL-1β 생산, 모든 샘플을 동일한 제공자에게서 시험함, 5명의 제공자를 뺀 대표적인 실험. IL-1β는 FACS어레이에서 혈구계산 비드 어레이(CBA)에 의해 측정됨, *** p<0,001 2-way ANOVA에 의해 분석됨(N=각각의 데이터 세트에 대하여 대략 200).

IL-1β, pg/ml (SD)	대조군	hBD2 100 g/ml	hBD2 10 g/ml	hBD2 1 g/ml
배지	4.2 (4.7)	5.3 (7.1)	3.8(5.8)	4.1 (51.0)
LPS 0.6 ng/ml	1734.3 (347.0)	811.0 (454.4)***	1949.8 (396.4)***	1436.2 (429.7)***
LPS 20 ng/ml	2629.5 (533.7)	1502.1 (407.5)***	2273.9 (486.5)***	1889.3 (504.8)***
LTA 1.25 μg/ml	748.5 (172.4)	538.3 (137.3)***	935.3 (238.0)***	986.7 (738.7)***

hBD2가 있거나 없이 LPS 또는 LTA로 처리한 후 인간 말초혈액 단핵 세포(PBMC)로부터의 IL-10 생산, 모든 샘플을 동일한 제공자에게서 시험함, 5명의 제공자를 뺀 대표적인 실험. IL-10은 FACS어레이에서 혈구계산 비드 어레이(CBA)에 의해 측정됨, *** p<0,001, ** p<0,01, * p<0,5 2-way ANOVA에 의해 분석됨(N=각각의 데이터 세트에 대하여 대략 200).

IL-10, pg/ml (SD)	대조군	hBD2 100 g/ml	hBD2 10 g/ml	hBD2 1 g/ml
배지	2.09 (8.65)	2.9 (4.6)	1.6 (4.1)	2.09 (4.3)
LPS 0.6 ng/ml	63.15 (302.5)	232.7 (61.5)***	325.7 (88.2)***	97.2 (31.1)*
LPS 20 ng/ml	70.4 (22.8)	383.3 (133.6)***	355.8 (99.5)***	111.3 (38.8)**
LTA 1.25 μg/ml	14.0 (226.1)	175.6 (57.0)***	136.6 (44.7)***	39.9 (16.9)

자극한지 24시간 후에 PBMC 생존능을 MTS 분석에 의해 측정함. 2-way ANOVA에 이은 본페로니 사후 검정에 의해 검사한, 열을 지어 아래에 기입한 다른 문자를 갖는 값은 유의하게 다르다.

생존능, MTS (흡광도 490 nm(SD))	대조군	hBD2 100 g/ml	hBD2 10 g/ml	hBD2 1 g/ml
배지	1.4 (0.2)	1.2 (0.05)^a	1.5 (0.2)^a	1.3 (0.2)
LPS 0.6 ng/ml	1.6 (0.02)	1.6 (0.1)^ab	2.0 (0.2)^b	1.5 (0.2)
LPS 20 ng/ml	1.5 (0.1)	1.9 (0.2)^b	1.8 (0.3)^ab	1.6 (0.3)

PBMC 생존능을 Alamar Blue에 의해 측정함, 5명의 다른 제공자로부터 5개를 제외한 하나의 대표적인 실험. 2-way ANOVA에 이은 본페로니 사후 검정에 의해 검사한, 종대로 아래에 기입한 다른 문자를 갖는 값은 유의하게 다르다.

생존능, Alamar Blue(RFU(SD))	대조군	hBD2 100 μg/ml	hBD2 10 μg/ml	hBD2 1 μg/ml
배지	4097130 (166631)	3950053 (34466)^a	3683369 (355296)^a	4064143 (104634)
LPS 0.6 ng/ml	4279424 (336188)	4831188 (67646)^b	4664362 (147776)^b	4230588 (139745)
LPS 20 ng/ml	4604671 (125840)	4765256 (41383)^b	4623818 (56643)^b	4561739 (138852)
LTA 1.25 g/ml	4018914 (632833)¹	4664185 (154023)^b,2	4677870 (10199)^b,2	4148294 (182730)¹²

hBD2, LTA, LPS 또는 이들의 조합을 사용한 자극 후에 PBMC로부터의 TNF-알파 분비. TNF-알파는 ELISA에 의해 측정됨, nd: 검출 불가능, 분석의 검출 한계 0.01 ng/ml, 각각의 대조군과 비교하여 * p<0.05, 각각의 대조군과 비교하여 ** p<0.01

TNF-α, ng/ml (SD)	대조군	hBD2 100 μg/ml	hBD2 10 g/ml	hBD2 1 μg/ml
배지	nd	nd	nd	nd
LPS 0.6 ng/ml	0.99 (0.27)	0.41 (0.03)**	0.59 (0.08)*	0.70 (0.18)
LPS 20 ng/ml	1.44 (0.31)	0.53 (0.01)**	0.49 (0.05)**	1.18 (0.42)
LTA 1.25 g/ml	0.90 (0.32)	0.21 (0.05)*	0.27 (0.04)*	0.65 (0.29)

hBD2, LTA, LPS 또는 이들의 조합을 사용한 자극 후에 PBMC로부터의 IL-10 분비, TNF-알파는 ELISA에 의해 측정됨, nd: 검출 불가능, 분석의 검출 한계 0.03 ng/ml

IL-10, ng/ml (SD)	대조군	hBD2 100 μg/ml	hBD2 10 μg/ml	hBD2 1 μg/ml
배지	nd	nd	nd	nd
LPS 0.6 ng/ml	nd	0.14 (0.04)	0.04 (0.0)	nd
LPS 20 ng/ml	nd	0.46 (0.04)	0.34 (0.04)	nd
LTA 1.25 g/ml	nd	nd	nd	nd

hBD2, LTA, LPS 또는 이들의 조합을 사용한 자극 후에 PBMC로부터의 IL-1β 분비, TNF-알파는 ELISA에 의해 측정됨, nd: 검출 불가능, 분석의 검출 한계 0.016 ng/ml, 각각의 대조군과 비교하여 ** p<0.01

IL-1β, g/ml (SD)	대조군	hBD2 100 μg/ml	hBD2 10 μg/ml	hBD2 1 μg/ml
배지	nd	nd	nd	nd
LPS 0.6 ng/ml	0.318 (0.087)	0.275 (0.015)	0.268 (0.039)	0.237 (0.007)
LPS 20 ng/ml	0.920 (0.267)	0.395 (0.033)**	0.354 (0.013)**	0.638 (0.159)
LTA 1.25 g/ml	0.291 (0.092)	0.281 (0.059)	0.193 (0.019)	0.224 (0.030)

hBD2가 있거나 없이 PGN으로 처리한 후 인간 말초혈액 단핵 세포(PBMC)로부터의 TNF 생산; 모든 샘플을 동일한 제공자에게서 시험함. TNF는 FACS어레이에서 혈구계산 비드 어레이(CBA)에 의해 측정됨, 각각의 대조군과 비교하여 *** p<0.001, 2-way ANOVA에 의해 분석됨(N=각각의 데이터 세트에 대하여 대략 200).

TNF, pg/ml (SD)	대조군	hBD2 100 g/ml	hBD2 10 g/ml	hBD2 1 g/ml
배지	0.0 (4.0)	3.6 (5.3)	3.7 (6.2)	3.4 (5.2)
PGN 40 g/ml	1099.1 (251.6)	274.9 (71.6)***	362.0 (97.7)***	809.9 (246.7)***

hBD2가 있거나 없이 PGN으로 처리한 후 인간 말초혈액 단핵 세포(PBMC)로부터의 IL-10 생산; 모든 샘플을 동일한 제공자에게서 시험함. TNF는 FACS어레이에서 혈구계산 비드 어레이(CBA)에 의해 측정됨, 각각의 대조군과 비교하여 *** p<0.001, 2-way ANOVA에 의해 분석됨(N=각각의 데이터 세트에 대하여 대략 200).

IL-10, pg/ml (SD)	대조군	hBD2 100 g/ml	hBD2 10 g/ml	hBD2 1 g/ml
배지	0.0 (4.1)	3.0 (9.6)	3.6 (13.1)	3.0 (4.8)
PGN 40 g/ml	381.3 (92.3)	1054.2 (179.3)***	523.4 (111.5)***	337.8 (89.1)

hBD2가 있거나 없이 LPS 또는 LTA 또는, TNF의 억제에 대한 두개의 다른 대조군(덱사메타손 및 인도메타신)으로 처리한 후 인간 말초혈액 단핵 세포(PBMC)로부터의 TNF 생산 ; 모든 샘플을 동일한 제공자에게서 시험함. TNF는 FACS어레이에서 혈구계산 비드 어레이(CBA)에 의해 측정됨, 밑줄친 값은 각각의 대조군과 비교하여 유의하게 감소함(진하게), 2-way ANOVA에 의해 분석됨(N=각각의 데이터 세트에 대하여 대략 200).

TNF, ng/ml (SD)	배지	LPS 0.6 ng/ml	LPS 20 ng/ml	LTA 1.25 g/ml
대조군	0.0 (0.0)	1.43 (0.05)	2.84 (0.07)	6.72 (0.14)
덱사메타손 35 ng/ml	0.0 (0.0)	0.038 (0.004)	1.69 (0.05)	1.75 (0.05)
덱사메타손 3.5 ng/ml	0.0 (0.0)	0.30 (0.01)	0.91 (0.03)	2.05 (0.06)
덱사메타손 0.35 ng/ml	0.0 (0.0)	0.61 (0.02)	6.04 (0.14)	4.73 (0.10)
인도메타신 7.2 ug/ml	0.0 (0.0)	1.71 (0.07)	2.70 (0.07)	5.80 (0.13)
인도메타신 0.72 ug/ml	0.0 (0.0)	1.56 (0.04)	7.54 (0.17)	5.50 (0.13)
hBD2 1000 g/ml	0.0 (0.0)	0.003 (0.002)	0.000 (0.002)	0.11 (0.01)
hBD2 100 μg/ml	0.0 (0.0)	0.000 (0.002)	0.038 (0.003)	1.15 (0.04)
hBD2 10 g/ml	0.0 (0.0)	0.20 (0.01)	0.35 (0.01)	2.33 (0.06)
hBD2 1 μg/ml	0.0 (0.0)	0.17 (0.01)	6.24 (0.14)	3.90 (0.10)

hBD2가 있거나 없이 LPS 또는 LTA 또는, 항염증 효과에 대한 두개의 다른 대조군(덱사메타손 및 인도메타신)으로 처리한 후 인간 말초혈액 단핵 세포(PBMC)로부터의 IL-10 생산; 모든 샘플을 동일한 제공자에게서 시험함. IL-10은 FACS어레이에서 혈구계산 비드 어레이(CBA)에 의해 측정됨, 밑줄친 값은 각각의 대조군에 비교하여 유의하게 증가함(진하게), 2-way ANOVA에 의해 분석됨(N=각각의 데이터 세트에 대하여 대략 200).

IL-10, pg/ml (SD)	배지	LPS 0.6 ng/ml	LPS 20 ng/ml	LTA 1.25 g/ml
대조군	0.0 (218.8)	53.9 (3.1)	123.4 (4.6)	170.1 (5.5)
덱사메타손 35 ng/ml	0.0 (1.4)	100.4 (3.8)	152.5 (5.2)	175.2 (6.6)
덱사메타손 3.5 ng/ml	2.7 (1.9)	64.6 (3.3)	122.8 (4.7)	112.5 (3.9)
덱사메타손 0.35 ng/ml	3.9 (1.9)	46.8 (2.8)	197.1 (7.2)	126.6 (4.7)
인도메타신 7.2 ug/ml	0.0 (1.5)	45.7 (2.5)	77.9 (3.6)	90.4 (4.9)
인도메타신 0.72 ug/ml	0.0 (1.4)	37.3 (19.6)	108.0 (4.4)	84.9 (3.5)
hBD2 1000 g/ml	0.0 (1.6)	30.8 (2.6)	50.5 (3.2)	465.2 (16.3)
hBD2 100 μg/ml	0.0 (4.9)	173.5 (5.7)	885.2 (22.2)	766.0 (21.7)
hBD2 10 g/ml	3.9 (1.7)	165.1 (5.6)	497.5 (13.5)	355.8 (9.4)
hBD2 1 μg/ml	0.0 (1.9)	42.7 (2.8)	207.0 (6.9)	142.1 (4.9)

hBD2가 있거나 없이 LPS 또는 LTA 또는, 항염증 효과에 대한 두개의 다른 대조군(덱사메타손 및 인도메타신)으로 처리한 후 인간 말초혈액 단핵 세포(PBMC)로부터의 IL-1β 생산; 모든 샘플을 동일한 제공자에게서 시험함. IL-1β는 FACS어레이에서 혈구계산 비드 어레이(CBA)에 의해 측정됨, 밑줄친 값은 각각의 대조군과 비교하여 유의하게 감소함(진하게), 2-way ANOVA에 의해 분석됨(N=각각의 데이터 세트에 대하여 대략 200).

IL-1β, ng/ml (SD)	배지	LPS 0.6 ng/ml	LPS 20 ng/ml	LTA 1.25 g/ml
대조군	0.00 (0.06)	3.96 (0.18)	6.58 (0.23)	11.47 (0.38)
덱사메타손 35 ng/ml	0.00 (0.00)	1.00 (0.03)	2.32 (0.07)	3.98 (0.14)
덱사메타손 3.5 ng/ml	0.00 (0.00)	1.90 (0.06)	3.58 (0.12)	5.22 (0.19)
덱사메타손 0.35 ng/ml	0.01 (0.00)	2.9 (0.09)	5.56 (0.18)	7.91 (0.28)
인도메타신 7.2 ug/ml	0.04 (0.00)	4.1 (0.13)	6.12 (0.23)	8.91 (0.30)
인도메타신 0.72 ug/ml	0.01 (0.00)	3.1 (0.18)	6.46 (0.22)	7.53 (0.31)
hBD2 1000 g/ml	0.01 (0.00)	0.53 (0.02)	1.19 (0.08)	4.43 (0.14)
hBD2 100 μg/ml	0.00 (0.00)	0.38 (0.01)	1.67 (0.05)	9.12 (0.32)
hBD2 10 g/ml	0.06 (0.00)	1.13 (0.04)	3.58 (0.12)	11.0 (0.37)
hBD2 1 μg/ml	0.01 (0.00)	1.83 (0.06)	4.91 (0.19)	8.87 (0.29)

hBD2가 있거나 없이 LPS 또는 LTA로 처리한 후 인간 단핵구 세포주(MUTZ-3)로부터 나온 상청액에서의 TNF 생산. TNF는 FACS어레이에서 혈구계산 비드 어레이(CBA)에 의해 측정됨, 각각의 대조군과 비교하여 * p<0.05, 각각의 대조군과 비교하여 ** p<0.01, 2-way ANOVA에 의해 분석됨(N=각각의 데이터 세트에 대하여 대략 200).

TNF, pg/ml (SD)	대조군	hBD2 100 g/ml	hBD2 10 g/ml	hBD2 1 g/ml
배지	0.00 (5.56)	0.00 (5.47)	2.60 (7.17)	2.21 (7.88)
LPS 1.5 g/ml	6.38 (9.28)	3.93 (6.63)*	3.93 (6.93)*	6.61 (9.17)
LTA 1.5 g/ml	5.28 (9.75)	2.64 (29.19)*	3.76 (7.72)	1.75 (6.96)**

hBD2가 있거나 없이 LPS 또는 LTA을 사용하여 자극한 미숙한 수지상세포(성숙한 DC를 생성하기 위해)로부터 나온 상청액에서의 TNF 생산. TNF는 FACS어레이에서 혈구계산 비드 어레이(CBA)에 의해 측정됨, 각각의 대조군과 비교하여 유의하게 감소함 * p<0.05, 각각의 대조군과 비교하여 유의하게 감소함 *** p<0.01, 2-way ANOVA에 의해 분석됨(N=각각의 데이터 세트에 대하여 대략 200).

TNF, pg/ml (SD)	대조군	hBD2 100 g/ml	hBD2 10 g/ml	hBD2 1 g/ml
배지	0.00 (1.74)	0.00 (1.83)	1.89 (2.15)	4.64 (10.26)
LPS 1.5 g/ml	23.73 (3.28)	7.66 (2.51)***	13.8 (2.33)***	18.04 (2.89)***
LTA 1.5 g/ml	3.78 (2.26)	5.22 (2.25)	2.76 (2.27)*	0.00 (1.98)***

실시예 2

hBD1, hBD2, hBD3, 및 hBD4 변이체의 항-염증 활성

실시예 2는 본질적으로 실시예 1에서 기재된 것과 같이 수행하였다. 하기 표에서 나타낸 것과 같은 화합물 rhBD2는 재조합 hBD2이고, 이것은 실시예 1에서 사용된 hBD2와 동일하다.

하기 표에서 보여준 것과 같은 화합물 hBD1, hBD2, hBD3 및 hBD4 변이체는 화학 합성을 사용하여 제조하였고, Peptide Institute Inc.로부터 얻었다.

재조합 hBD2(rhBD2)의 아미노산 서열은 화학 합성에 의해 제조된 hBD2의 아미노산 서열과 동일하다.

하기 표에서 보여준 hBD4 변이체는 hBD4의 아미노산 3-39로 구성되고, 아미노산 서열은 서열번호 5와 같이 나타낸다.

각각의 표에서, 모든 샘플은 동일한 제공자에서 시험하였다. SD는 표준 편차를 의미한다.

결과

인간 베타 방어소, 덱사메타손 또는 인플릭시맙이 있거나 없이 LPS로 처리한 후 인간 말초혈액 단핵 세포(PBMC)로부터의 TNF 생산. TNF는 FACS어레이에서 혈구계산 비드 어레이(CBA)에 의해 측정됨, * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 2-way ANOVA에 의해 분석하였고, 본페로니 사후검정에 의해 비-처리 세포와 비교함.

시험 화합물	배지		LPS 20 ng/ml		LPS 0.6 ng/ml
시험 화합물	TNF pg/ml (SD)	대조군의 %	TNF pg/ml (SD)	대조군의 %	TNF pg/ml (SD)	대조군의 %
배지 (비처리)	1 (1)	100%	2164 (632)	100%	728 (156)	100%
rhBD2 40 g/ml	0 (0)	-	167 (17)***	8%	74 (5)***	10%
rhBD2 10 g/ml	0 (0)	-	260 (29)***	12%	125 (20)**	17%
rhBD2 1 g/ml	1 (0)	-	918 (373)***	42%	196 (104)**	27%
hBD1 40 g/ml	0 (0)	-	999 (116)***	46%	91 (8)**	13%
hBD1 10 g/ml	0 (1)	-	1311 (417)***	61%	203 (20)**	28%
hBD1 1 g/ml	1 (1)	-	1395 (201)***	64%	474 (187)	65%
hBD2 40 g/ml	0 (0)	-	52 (71)***	2%	176 (103)**	24%
hBD2 10 g/ml	0 (0)	-	132 (179)***	6%	304 (108)*	42%
hBD2 1 g/ml	0 (0)	-	411 (581)***	19%	242 (30)*	33%
HBD-3 1 g/ml	0 (0)	-	451 (24)***	21%	528 (98)	73%
hBD4 변이체 10 g/ml	0 (0)	-	139 (6)***	6%	211 (22)**	29%
hBD4 변이체 1 g/ml	0 (0)	-	778 (27)***	36%	468 (59)	64%
덱사메타손	0 (0)	-	635 (163)***	29%	47 (8)***	6%
인플릭시맙	0 (0)	-	0 (0)***	0%	0 (0)***	0%

인간 베타 방어소, 덱사메타손 또는 인플릭시맙이 있거나 없이 LPS로 처리한 후 인간 말초혈액 단핵 세포(PBMC)로부터의 IL-10 생산. IL-10은 FACS어레이에서 혈구계산 비드 어레이(CBA)에 의해 측정됨, * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 2-way ANOVA에 의해 분석하였고, 본페로니 사후검정에 의해 비-처리 세포와 비교함.

시험 화합물	배지		LPS 20 ng/ml		LPS 0.6 ng/ml
시험 화합물	IL-10 pg/ml (SD)	대조군의 %	IL-10 pg/ml (SD)	대조군의 %	IL-10 pg/ml (SD)	대조군의 %
배지 (비처리)	0 (0)	100%	111 (3)	100%	66 (5)	100%
rhBD2 40 g/ml	0 (0)	-	281 (9)***	252%	108 (4)*	162%
rhBD2 10 g/ml	0 (0)	-	243 (38)***	218%	103 (14)*	155%
rhBD2 1 g/ml	0 (0)	-	126 (14)	113%	72 (9)	108%
hBD1 40 g/ml	0 (0)	-	113 (5)	102%	69 (4)	104%
hBD1 10 g/ml	0 (0)	-	100 (1)	90%	76 (13)	114%
hBD1 1 g/ml	0 (0)	-	95 (17)	85%	71 (6)	108%
hBD2 40 g/ml	0 (0)	-	323 (0)***	290%	131 (13)***	197%
hBD2 10 g/ml	0 (0)	-	240 (0)***	215%	86 (6)	130%
hBD2 1 g/ml	0 (0)	-	123 (0)	110%	53 (5)	80%
hBD3 1 g/ml	0 (0)	-	152 (72)*	137%	71 (2)	107%
hBD4 변이체 10 g/ml	0 (0)	-	187 (9)***	168%	92 (17)	139%
hBD4 변이체 1 g/ml	0 (0)	-	175 (8)***	157%	90 (14)	136%
덱사메타손	0 (0)	-	75 (6)*	67%	47 (3)	70%
인플릭시맙	0 (0)	-	63 (7)**	56%	46 (9)	69%

인간 베타 방어소, 덱사메타손 또는 인플릭시맙이 있거나 없이 LPS로 처리한 후 인간 말초혈액 단핵 세포(PBMC)로부터의 IL-1β 생산. IL-1β는 FACS어레이에서 혈구계산 비드 어레이(CBA)에 의해 측정됨, *** p<0.001 2-way ANOVA에 의해 분석하였고, 본페로니 사후검정에 의해 비-처리 세포와 비교함.

시험 화합물	배지		LPS 20 ng/ml		LPS 0.6 ng/ml
시험 화합물	IL-1β pg/ml (SD)	대조군의 %	IL-1β pg/ml (SD)	대조군의 %	IL-1β pg/ml (SD)	대조군의 %
배지 (비처리)	0 (0)	100%	2544 (226)	100%	741 (93)	100%
rhBD2 40 g/ml	0 (0)	-	395 (25)***	16%	124 (11)***	17%
rhBD2 10 g/ml	0 (0)	-	624 (37)***	25%	214 (7)***	29%
rhBD2 1 g/ml	0 (0)	-	1480 (154)***	58%	284 (15)***	38%
hBD1 40 g/ml	0 (0)	-	1599 (14)***	63%	302 (3)***	41%
hBD1 10 g/ml	0 (0)	-	1913 (53)***	75%	401 (17)***	54%
hBD1 1 g/ml	0 (0)	-	2087 (157)***	82%	512 (45)**	69%
hBD2 40 g/ml	1 (1)	-	316 (0)***	12%	159 (2)***	21%
hBD2 10 g/ml	0 (0)	-	589 (0)***	23%	238 (124)***	32%
hBD2 1 g/ml	0 (0)	-	1569 (0)***	62%	312 (28)***	42%
hBD3 1 g/ml	0 (0)	-	568 (126)***	22%	331 (23)***	45%
hBD4 변이체 10 g/ml	0 (0)	-	463 (40)***	18%	163 (5)***	22%
hBD4 변이체 1 g/ml	0 (0)	-	1004 (24)***	40%	286 (11)***	39%
덱사메타손	0 (0)	-	1120 (220)***	44%	104 (8)***	14%
인플릭시맙	0 (0)	-	2704 (0)	106%	636 (81)	86%

hBD1, hBD2, hBD3 및 hBD4 변이체의 효과를 LPS를 처리하거나 처리하지 않은 인간 PBMC에서 시험하였다(표 16, 17 및 18). 비교를 위해, rhBD2를 각각의 구성에 포함시켰다.

TNF는 모든 방어소에 대하여 하향조절되었다. IL-1β 분비의 감소는 TNF만큼 현저하진 않지만, TNF와 맞먹었다. IL-10의 분비는 hBD2 및 hBD4 변이체에 대하여 유의하게 그리고 투여량-의존적으로 향상되었다.

hBD3은 또한 10 μg/ml 및 40 μg/ml에서 시험하였고, hBD4 변이체는 또한 40 μg/ml에서 시험하였다; 그러나, 두 분자는 이들 농도에서 세포에 독성이 있어서, 독성 및 항-염증 효과 사이를 구별하는 것이 불가능했다.

TNF의 하향조절에 대한 양성 대조군으로서, 두 개의 항-염증 화합물, 덱사메타손 및 인플릭시맙을 구성에 포함시켰다.

결론

모든 시험된 인간 베타 방어소는 항-염증 가능성을 보였다.

실시예 3

인간 단핵구-유도 수지상세포 및 인간 PBMC로부터 나온 IL-23의 저하

실시예 3은 인간 PBMC에 대하여 본질적으로 실시예 1에서 기재된 것과 같이 수행하였다; 그러나, 해독된 정보는 TNF, IL-1β 및 IL-10 대신에 IL-23이었다. 더욱이 인간 단핵구-유도 수지상세포에서 rhBD2의 효과를 또한 조사하였다.

단핵구-유도 수지상세포(DC)의 생성

DC는 원래 Romani et al에 의해 기술되었던, 변형된 프로토콜에 따라서 제조하였다. 간략하면, 말초혈액 단핵 세포(PBMC)를 Ficoll-pague(GE-healthcare) 기울기 중에서 원심분리에 의해 건강한 제공자의 연막으로부터 정제하였다. 단핵구는 자성비드(Dynal, Invitrogen)를 통한 CD14+ 세포의 양성 선별에 의해 PBMC로부터 제조사의 지침서에 따라 분리하였다. CD14+ 단핵구는 RPMI/2% 인간 AB 혈청 재조합 인간 재조합 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF, 20 ng/ml) 및 IL-4(20 ng/ml)(PeproTech)에서 6일 동안 6-웰 플레이트에서 배양하였고, 2일 및 5일 후에 배지/사이토카인을 보충하였다. 배양한지 6일 후, 미숙한 DC를 1×10⁶ 세포/ml의 농도로 96-웰 플레이트에서 재배양하고, 칵테일 및/또는 hBD2를 처리하지 않거나 처리하여 24시간 동안 더 방치하였다. hBD2는 네 가지 농도에서 4번 거듭하여 시험하였다. hBD2는 LPS(100 ng/ml) 및 IFN-γ(20 ng/ml)가 함유된 전염증 칵테일을 사용하여 전염증 표현형으로의 hDC-성숙을 억제하는 그것의 능력에 대하여 분석하였다. 덱사메타손은 임상적 항-염증 활성이 증명된 화합물을 위한 양성 대조군으로서 칵테일을 넣기 20시간 전에 첨가하였다. hBD2와의 배양은 칵테일을 넣기 4시간 전에 끝냈다.

사이토카인 ELISA

세포 배양 상청액을 수득한 뒤 -80℃에 저장하였다. IL-23의 양은 시판하는 항체를 사용한 표준 샌드위치 ELISA에 의해 제조사의 프로토콜에 따라 측정하였다(eBioscience).

MTT 분석

MTT 기반 세포 성장 결정 키트를 임의의 세포가 비히클, 칵테일 또는 hBD2에 의해 심각하게 영향을 받는지 여부를 평가하기 위하여 48시간 후에 세포 생존의 측정에 사용하였고, 제조사의 프로토콜에 따라 행하였다(Sigma).

통계적 분석

모든 실험은 나타낸 대표적인 결과를 포함하여 적어도 두 번 수행하였다. 나타낸 데이터는 평균 더하기/빼기 표준 편차(SD)로 명시하였다. 통계학적 유의성은 표 범례에서 보고한 것같이 처리한 변수(hBD2, 덱사메타존, 등) 및 자극(LPS, LTA, 펩티도글리칸, 등)을 사용한 2-way ANOVA에 이은 본페로니 사후 검정에 의해 결정하였다. 차이는 p<0.05에 대하여 유의한 것으로 여겨졌다.

결과

배지(비자극), 또는 LPS 및 IFN-γ 중 어느 하나로 자극시키고, 배지(비처리), hBD2 또는 덱사메타손 중 어느 하나를 처리한 인간 CD14+ 단핵구-유도 수지상세포의 상청액에서의 IL-23(pg/ml), 평균(SEM), N=4, 세 명 중에서 한명의 대표적인 제공자를 뺌. * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 2-way ANOVA에 의해 분석하였고, 본페로니 사후검정에 의해 비-처리 세포와 비교함. nd: 검출되지 않음(검출 한계 미만).

IL-23 pg/ml (SEM)	비자극	LPS(100 ng/ml) 및 IFN-γ(20 ng/ml)
비처리	375 (96)	3569 (130)
hBD2 1 g/ml	nd	3833 (88)
hBD2 10 g/ml	451 (121)	3308 (169)*
hBD2 30 g/ml	nd	3042 (46)***
hBD2 100 g/ml	nd	2145 (202)***
덱사메타손 1 M	424 (38)	1147 (268)***

배지(대조군), 0.6 ng/ml LPS, 20 ng/ml LPS 또는 5 μg/ml LTA 중 어느 하나로 자극시키고, hBD2, 덱사메타손 또는 인플릭시맙 중 어느 하나를 처리한 인간 PBMC의 상청액에서의 IL-23(pg/ml), 평균(SEM). * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 1-way ANOVA에 의해 분석하였고, 던넷 다중 비교 사후검정에 의해 비-처리 세포와 비교함.

IL-23 pg/ml (SEM)	대조군	LPS 0.6 ng/ml	LPS 20 ng/ml	LTA 5 g/ml
대조군 (비처리)	257 (7)	553 (6)	510 (5)	762 (20)
hBD2 1 g/ml	218 (5)	338 (10)**	263 (5)**	383 (20)**
hBD2 10 g/ml	211 (4)	462 (2)*	295 (1)**	438 (9)**
hBD2 100 g/ml	207 (4)	484 (7)	488 (8)	810 (30)
덱사메타손 3.5 ng/ml	222 (5)	202 (5)**	192 (1)**	223 (1)**
인플릭시맙 1 g/ml	227 (10)	356 (10)**	373 (2)**	349 (1)**

표 19에서 나타낸 것과 같이, hBD2는 인간 CD14+ 단핵구-유도 수지상세포에서 유의하게 그리고 투여량-의존적으로 IL-23 분비를 억제한다.

인간 PBMC에 대하여, IL-23 분비도 유의하게 억제되었다(표 20). 이들 세포에서 hBD2의 낮은 투여량을 시험하였을 때, 반비례하는 투여량-의존성이어서, 벨-모양 투여량-반응 억제 곡선이 되는 것을 찾았다(데이터를 보여주지 않음).

이것은 hBD2가 IL-23이 염증 반응의 중요한 부분인 것과 같이, IL-23 분비의 억제에 의해 만성 자가면역 이상에서 억제 효과를 가질 수 있음을 보여준다. Th17 세포는 그들의 생존 및 확장에 대하여 IL-23에 의존적이고, Th17 세포는 크론병, 궤양성 대장염, 건선 및 다발성 경화증과 같은 몇몇의 자가면역 질환에서 병원성인 것을 보여주었다.

실시예 4

마우스 베타 방어소 3(mBD3)를 사용한 PBMC에서 나온 TNF 분비의 저하

실시예 4는 인간 PBMC에 대하여 본질적으로 실시예 1에서 기재된 것과 같이 수행하였다. 마우스 베타 방어소 3(mBD3)는 실시예 1에서 hBD2의 생산을 위해 사용된 것과 동일한 프로토콜을 사용하여 제조하였다. mBD3의 아미노산 서열은 서열번호 6에서 보여준다. 마우스 PBMC를 하기에서 기술한 것과 같이 제조하였다.

마우스 말초혈액 단핵 세포(PBMC)의 분리 및 자극

마우스 말초혈액 단핵 세포를 10마리의 NMRI 마우스의 혈액으로부터 분리하였다. 요컨대, 헤파린 처리된 혈액을 RPMI에 1/1 v/v로 희석하였고, 뽑은 지 2시간 내에 Ficoll 밀도 원심분리시켰다. 혈장을 상부로부터 수득한 후 버렸다. 분리된 PBMC를 배양 배지(RPMI 1640(Gibco, 42401) w/1% 페니실린 및 스트렙토마이신 및 1% L-글루타민)에 재현탁한 다음 웰당 115.500개 세포로 전체 200 μl로 96-웰 배양 플레이트에 시딩하였다. 동일한 제공자로부터 나온 PBMC를 100, 10 또는 1 μg/ml의 hBD2 또는 mBD3(마우스 베타 방어소 3) 단독으로 또는, 20 ng/ml LPS(E. coli, 0111 :B4, Sigma L4391)과 함께 자극시켰다. 덱사메타손을 LPS 자극이 있거나 없이 배양액에 3.5 ng/ml로 첨가하였다. 상청액을 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음 회수하였고, 사이토카인 측정까지 -80℃에서 보관하였다.

상청액에서 사이토카인 생산은 FACS어레이 유세포 분석기에서 제조사의 지침서에 따라(BD) 마우스 면역 혈구계산 비드 어레이(CBA)를 사용한 유세포 분석에 의해 측정하였다.

생존능을 상청액을 수득한 후 Alamar Blue(Bio출처, DALL 1100)에 의해 측정하였다.

결과

hBD2가 있거나 없이 LPS를 처리한 후 인간 말초혈액 단핵 세포(PBMC)로부터의 TNF 생산, 모든 샘플을 동일한 제공자에게서 시험함, 두 명의 제공자에서 대표적인 실험을 뺌. TNF는 FACS어레이에서 혈구계산 비드 어레이(CBA)에 의해 측정됨, *** p<0.001 각각의 대조군과 비교하여, 2-웨이 ANOVA(N=2)에 의해 분석됨.

TNF pg/ml (SEM)	배지	LPS 20 ng/ml
배지	5 (1)	1353 (140)
mBD3 1 g/ml	2 (0)	384 (11)***
mBD3 10 g/ml	2 (0)	51 (1)***
mBD3 100 g/ml	39 (19)	166 (17)***
hBD2 1 g/ml	3 (0)	633 (110)***
hBD2 10 g/ml	2 (0)	359 (10)***
hBD2 100 g/ml	2 (0)	342 (34)***
덱사메타손 3.5 ng/ml	1 (0)	460 (29)***
인플릭시맙 1 g/ml	0 (0)	1 (0)***

mBD3이 있거나 없이 LPS로 처리한 후 마우스 말초혈액 단핵 세포(PBMC)로부터의 TNF 생산, 모든 샘플을 동일한 제공자에게서 시험함, 두 명의 제공자에서 대표적인 실험을 뺌. TNF는 FACS어레이에서 혈구계산 비드 어레이(CBA)에 의해 측정됨, *** p<0.001 각각의 대조군과 비교하여, 2-웨이 ANOVA(N=2)에 의해 분석됨.

TNF pg/ml (SEM)	배지	LPS 20 ng/ml
배지	578 (3)	2063 (77)
mBD3 1 g/ml	347 (32)	1600 (47)***
mBD3 10 g/ml	180 (0)	297 (9)***
mBD3 100 g/ml	182 (5)	195 (6)***
덱사메타손 3.5 ng/ml	94 (3)	328 (8)***
인플릭시맙 1 g/ml	530 (4)	2119 (31)

표 21에서 보여준 것과 같이, 마우스 베타 방어소 3(mBD3)은 hBD2 및 덱사메타손과 같이 동일하게 영향을 주기 위하여 인간 PBMC에서 나온 TNF의 분비를 하향조절하고 있다. mBD3은 또한 마우스 PBMC의 TNF의 분비를 하향조절한다(표 22).

따라서, 이 구성에서, mBD3은 우수한 항-염증 활성을 나타낸다.

실시예 5

마우스 10-일 덱스트란 소듐 설페이트(DSS)-유도 대장염 모델.

하기 연구의 목적은 마우스에서 덱스트란 소듐 설페이트(DSS)의 구강 투여에 의해 유도된 염증성 장질환(대장염)의 급성(10-일) 모델에서 인간 벵타 방어소 2의 항-염증 활성을 결정하는 것이다.

DSS 대장염 마우스 모델은 문헌(Kawada et al. "Insights from advances in research of chemically induced experimental models of human inflammatory bowel disease", World J. Gastroenterol., Vol. 13(42), pp. 5581-5593(2007); and Wirtz and Neurath "Mouse models of inflammatory bowel disease", Advanced Drug Delivery Reviews, Vol. 59(11), 1073-1083(2007))에서 기재된 것과 같이 염증성 장질환을 연구하기 위하여 잘 알려진 모델이다.

재료

시험 항목

인간 베타 방어소 2(hBD2); 상기 실시예 1을 참조하라.

메틸프레드니솔론 21-헤미숙시네이트("프레드니솔론")

PBS 버퍼(GIBCO)

실험 동물

수컷 C57BL/6 마우스(Harlan lnterfauna Iberica, Barcelona, 스페인)를, 이것이 10일의 기간에 걸쳐 식수에서 DDS의 2% 용액을 투여하였을 때 결장의 유의한 염증을 발달시키는 것으로 증명된 종 및 성별인 바, 본 발명에서 사용하였다.

확인

동물은 그들의 꼬리의 숫자 및 문자 코드에 의해 확인하였다. 추가적으로 각각의 케이지는 동물의 수 및 성별, 시험 항목 코드 또는 이름, 투여량 수준, 투여 경로, 처리 기간, 그룹 수, 연구 관리자 이름을 가리키는 색깔-암호 코드에 의해 확인하였다.

체중

연구 시작일의 동물의 평균 체중은 22.4±0.16 g이었다.

환경 순응(격리)

주요 연구와 동일한 조건 하에서, 연구를 시작하기 전 최소 7일

주거지

도착하였을 때, 동물을 스테인리스 스틸 뚜껑이 있는 폴리카보네이트 케이지(E-Type, Charles River, 255×405×197 mm)에 임의로 분리하여 수용하였다. 동물은 그들의 성별에 따라 케이지당 5마리의 그룹으로 조절된 온도(22±2℃), 빛(12/12시간 명/암), 기압, 환기 횟수 및 상대 습도(30-70%)인 동물 방에 수용되었다. 모든 케이지의 바닥에는 깔짚으로서 톱밥(Lignocel 3-4; Harlan lnterfauna Iberica, 스페인)이 있었다.

사료 및 식수

모든 마우스는 건조한, 작은 알로된 표준 설치류 사료에 자유롭게 접근하였다(Teklad Global 2014; Harlan lnterfauna Iberica, 스페인).

물은 병에서 임의로 제공하였다. 동물 방에 제공되는 수도꼭지에서 받은 맹물을 그것의 조성물을 체크하고 가능한 오염물(화학적 및 미생물학적)을 검출하기 위하여 정기적으로 분석하였다.

기구 및 재료

기구:

· 동물 저울 Sartorius Mod. BP 2100

· 외과 해부 기구

· Eppendorf 5415C 원심분리기

· Nikon Eclipse E600FN 현미경

· Hook & Tucker 기계 교반기(instruments rotamixer)

· IKA UltraTurrax 균질기

· Sartorius Mod. BP 221 S 분석 저울

· ELISA 마이크로플레이트 리더 Labsystems Multiskan EX

재료 및 시약:

· 멸균 1회용 주사기(1 ml)

· 멸균 버터플라이 25G 주입 세트

· 마취제(케타민/자일라진)

· 국소 마취 크림(EMLA, Astra Zeneca)

· 덱스트란 소듐 설페이트 30.000-50.000 Da(MP Biomedicals)

· 인산염 버퍼 살린(PBS; Sigma)

· 중성 버퍼 포르말린(VWR)

· 우혈청 알부민(Sigma)

· 프로테아제 억제자 칵테일(Sigma)

· 마우스 TNF-α ELISA 키트(GE Healthcare)

실험 프로토콜

연구 설계

동물을 5개의 실험 그룹으로 나누었다. 각 그룹은 10마리의 수컷으로 구성되었다:

그룹 A: 대조군 비히클(PBS)로 처리 i.v.

그룹 B: hBD2로 처리(0.1 mg/kg i.v.)

그룹 C: hBD2로 처리(1 mg/kg i.v.)

그룹 D: hBD2로 처리(10 mg/kg i.v.)

그룹 E: 메틸프레드니솔론으로 처리(1 mg/kg p.o.)

모든 실험 그룹의 동물 배정은 무작위 방법으로 행하였다. 최대 5 마리 마우스가 각각의 케이지에 수용되었다(명령 86/609/EEC에 따라서). 모든 동물은 그들이 실험실에 도착하였을 때, 그리고 시험 항목의 투여 전에 체중을 쟀다.

시험 물질의 투여

대조군 비히클 및 hBD2를 느린 정맥 주사로 5 ml/kg 체중의 투여 부피에서 멸균 바늘(25G)을 사용하여 꼬리 정맥을 통해 정맥으로 투여하였다. 동물은 연속적인 10일 동안 상응하는 시험 항목(hBD2, 프레드니솔론 또는 대조군 비히클)을 하루 한번(매 24시간) 투여 받았다.

프레드니솔론은 hBD2와 동일한 투여 요법으로 5 ml/kg 체중의 투여 부피에서 1 mg/kg의 투여량으로 구강으로 주어졌다.

실험 절차

대장염의 유도

대장염을 마우스에서 그들의 식수에 DSS 2%를 7일 동안 보충하는 것에 의해 유도하였다. 1일 째에 모든 마우스의 체중을 잰 다음 그들의 실험 그룹에 따라 표시하였다. 각각의 케이지의 음수 병을 DSS 용액으로 채웠고, 모든 병 뚜껑을 적당히 올렸고, 아무것도 혼잡하지 않게 확실히 하였다.

3일 째에 병에 남아있는 임의의 용액을 비우고 신선한 DSS 용액을 다시 채워주었다. 이 절차를 5일 째에 반복하였다.

8일 째에 임의의 남아있는 용액을 제거하고, 멸균된 물로 대신하였다.

동물을 10일 째에서 2일 후에 희생시켰다.

임상 평가(질병 활성 점수)

DSS-처리 동물의 매일의 임상 평가를 하기 매개 변수에 따라 0 내지 4의 범위의 허가된 임상 질병 활성 점수(DAI)의 계산으로 수행하였다: 대변 굳기, 직장 출혈의 존재 또는 부재 및 체중 감소:

매개 변수 DAI 점수

체중의 변화: <1% 0

1-5% 1

5-10% 2

10-15% 3

>15% 4

직장 출혈: 음성 0

양성 4

대변 굳기: 정상 0

묽은 변 2

설사 4

체중 감소를 원래(1일 째)의 체중 및 각각의 실험일(2-10)에서의 실제 체중 사이의 차이를 백분율로 계산하였다.

설사의 양상은 항문 털에 붙은 점액/배설물 물질로서 정의한다. 직장 출혈은 가시적인 혈액/점액을 함유하는 설사 또는 심한 직장 출혈로서 정의한다. 각각의 날의 DAI의 최대 점수는 12이다.

혈액 채취

두 개의 혈액 샘플을 연구 진행 동안 두 번의 분리된 시기에서 각각의 동물로부터 수득하였다: 1일 째 및 5일 째. 혈액 샘플을 각각의 시기에 시험 항목의 투여 후 2시간 후에 복재 정맥을 찔러 Microvette CB-300 마이크로튜브로 얻었다. 이 혈액 추출 방법은 마취제 또는 진통제를 필요로 하지 않고, 동물에게 최소의 스트레스를 준다(Hem et al., 1998). 추가적으로 말단 혈액 샘플을 시험 항목을 투여한지 두 시간 후에 복부 대정맥으로부터 마지막 날 모든 동물에게서 얻었다.

혈액 샘플을 응고시키게 한 다음 3000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였고, 결과의 혈청을 저장을 위해 -80℃에서 얼렸다.

안락사 및 결장 샘플의 수집

10일 째에서, 대조군 비히클, hBD2 또는 프레드니솔론을 마지막으로 투여한지 2시간 후, 동물을 마취제의 과다 투여에 의해 죽였다. 그들의 결장을 제거하였고, 맹장을 제거한 후 그들의 길이 및 체중을 측정하였다.

결장의 두 개의 절개물을 각각의 동물로부터 취하였고, 이후의 하기 득점 시스템에 따른 조직학적 분석을 위해 중성 버퍼 포르말린에서 저장하였다:

서술 점수

변화가 관찰되지 않음. 0

최소의 상피 과형성이 있거나 없는, 최소의 산발적인 점막의 염증성

세포 침투. 1

때때로 점막하 조직안으로 뻗어있고, 짓무름을 동반하며, 최소의 가벼운

상피 과형성 및 최소의 배상세포로부터의 가벼운 뮤신 고갈이 있는,

가벼운 산재 내지 널리 퍼진 염증성 세포 침투. 2

때때로 경벽이고, 종종 궤양을 동반하며, 보통의 상피 과형성 및

뮤신 고갈이 있는, 가벼운 내지 보통의 염증성 세포 침투. 3

종종 경벽이고 및 궤양을 동반하며, 두드러진 상피 과형성 및 큐신

고갈이 있는, 두드러진 염증성 세포 침투. 4

심각한 궤양 및 장샘의 손실이 있는 두드러진 경벽 염증. 5

결장 조직 샘플에서 TNF-알파 농도의 결정

결장의 추가적인 샘플을 각각의 동물로부터 얻었고, 1% 우혈청 알부민(BSA) 및 프로테아제 억제자 칵테일(1 ml/20g 조직)을 함유하는 PBS(100 mg 조직/ml PBS)에 균질 현탁하였다. 균질 현탁액을 이후 1400 rpm에서 10분 동안 원심분리하였고, 상청액을 이후의 특이적 효소 면역분석(ELISA)에 의한 TNF-α 농도의 결정을 위해 -20℃에서 저장하였다.

결과

질병 활성 인덱스 점수

1일 내지 10일 동안의 질병 활성인덱스(DAI) 점수 진행. *p<0.05; **p<0.01로서 주어진 날에서 대조군(비히클) 그룹 값과 유의한 차이를 보였음(비-매개변수 데이터에 대한 크루스칼-왈리스 검정).

시험 항목	데이터	DAI 점수
시험 항목	데이터	1일 째	2일 째	3일 째	4일 째	5일 째
그룹 A 대조군 비히클 i.v.	평균 S.E.M.	0.00 0.00	1.10 0.31	1.30 0.37	3.20 0.36	2.90 0.31
그룹 B hBD2 0.1 mg/kg i.v.	평균 S.E.M.	0.00 0.00	0.20 0.13	0.80 0.20	2.90 0.10	2.80 0.13
그룹 C hBD2 1 mg/kg i.v.	평균 S.E.M.	0.00 0.00	0.00 0.00	0.22 0.22	2.22 0.15	2.44 0.18
그룹 D hBD2 10 mg/kg i.v.	평균 S.E.M.	0.00 0.00	0.60 0.22	1.00 0.44	3.67 0.24	3.11 0.26
그룹 E 프레드니솔론 1 mg/kg p.o.	평균 S.E.M.	0.00 0.00	0.10 0.10	0.00 0.00	2.60 0.22	2.50 0.22
시험 항목	데이터	DAI 점수
시험 항목	데이터	6일 째	7일 째	8일 째	9일 째	10일 째
그룹 A 대조군 비히클 i.v.	평균 S.E.M.	3.10 0.31	4.10 0.69	5.90 1.26	8.90 1.02	10.90 0.62
그룹 B hBD2 0.1 mg/kg i.v.	평균 S.E.M.	3.20 0.20	1.44** 0.38	2.11* 0.20	3.89** 0.35	6.44* 0.85
그룹 C hBD2 1 mg/kg i.v.	평균 S.E.M.	2.89 0.20	2.22 0.43	3.67 0.80	5.22 0.83	6.44* 1.08
그룹 D hBD2 10 mg/kg i.v.	평균 S.E.M.	3.22 0.28	2.11 0.31	4.11 0.93	6.78 1.20	7.33 1.33
그룹 E 프레드니솔론 1 mg/kg p.o.	평균 S.E.M.	2.60 0.27	3.10 0.96	2.50* 0.43	3.80* 0.98	4.90** 0.91

조직 평가

결장의 두 개의 절개물(근위 및 원위)을 각각의 동물로부터 취하여, 조직학적 분석(헤마톡실린 및 에오신 염색)을 진행하였고, 상술한 조직학적 득점 시스템에 따라 블라인드 관찰자에 의해 점수 매겨졌다.

결장 조직 샘플에서 TNF-α 농도의 결정

결장의 추가적인 샘플을 각각의 동물로부터 얻었고, 1% 우혈청 알부민(BSA) 및 프로테아제 억제자 칵테일(1 ml/20 g 조직)을 함유하는 PBS(100 mg 조직/ml PBS)에 균질 현탁하였다. 균질 현탁액을 이후 1400 rpm에서 10분 동안 원심분리하였고, 상청액을 이후의 특이적 효소 면역분석(ELISA)에 의한 TNF-α 농도의 결정을 위해 -20℃에서 저장하였다.

조직학적 점수, 결장 체중 및 길이, 및 결장 TNF-α 농도. *p<0.05; **p<0.01로서 대조군(비히클) 그룹 값과 유의한 차이를 보였음(비-매개변수 데이터에 대한 크루스칼-왈리스 검정).

시험 항목	데이터	조직학적 점수 근위 결장	조직학적 점수 원위 결장	결장 TNF-α 농도 (pg/g 조직)
그룹 A 대조군 비히클 i.v.	평균 S.E.M.	4.20 0.25	4.50 0.22	1664 227
그룹 B hBD2 0.1 mg/kg i.v.	평균 S.E.M.	2.22** 0.43	3.67 0.47	1185 205
그룹 C hBD2 1 mg/kg i.v.	평균 S.E.M.	2.89* 0.35	4.13 0.35	1457 211
그룹 D hBD2 10 mg/kg i.v.	평균 S.E.M.	2.89* 0.39	4.78 0.15	1212 211
그룹 E 프레드니솔론 1 mg/kg p.o.	평균 S.E.M.	2.80* 0.51	3.70 0.42	1833 414

통계 분석

결과의 통계학적 유의성을 통계 프로그램 Graphpad lnstat 3을 사용하여 평가하였다. 질병 활성 점수 및 조직학적 점수에 대한 그룹 사이의 차이를 쌍이 없는 데이터에 대한 크루스칼-왈리스 검정+ 다중 비교를 허용하기 위한 사후 검정 Dunn 에 의해 평가하였다. 유의하게 p<0.05의 값을 얻었다.

결론

결과는 시험한 가장 낮은 투여량(0.1 mg/kg i.v.)에서 hBD2가 7일 째(1.44±0.38 시험 항목 vs. 4.1±0.69 비히클; p<0.01), 8일 째(2.11±0.2 시험 항목 vs. 5.9±1.26 비히클; p<0.05), 9일 째(3.89±0.35 시험 항목 vs. 8.9±1.02 비히클; p<0.01) 및 10일 째(6.44±0.85 시험 항목 vs. 10.9±0.62 비히클; p<0.05)에서 DSS 투여에 의해 유도된 질병 활성 점수의 증가를 유의하게 감소시키는 것을 증명한다.

연속적인 10일 동안 hBD2의 중간 투여량(1 mg/kg i.v.)으로의 처리는 질병 활성 인덱스 점수의 명백한 감소를 야기하였으나 이것은 오직 10일째에서만 유의했다(6.44±1.08 시험 항목 vs. 10.9±0.62 비히클; p<0.05).

10일 째에서의 질병 활성 점수와 함께 얻은 결과와 유사하게 각각의 동물의 근위 결장의 조직학적 분석은 hBD2의 낮은 투여량으로의 처리에 의해 조직학적 손상 점수의 매우 유의한 감소를 나타냈다(2.22±0.43 시험 항목 vs. 4.2±0.25 비히클; p<0.01). 더욱이, 조직학적 손상의 유의한 감소는 또한 hBD2의 중간 및 높은 투여량뿐만 아니라 프레드니솔론에서도 관찰되었다(2.89±0.35; 2.89±0.39 및 2.8±0.5 각각; p<0.05). 반대로, 원위 결장에서-hBD2의 낮은 및 중간 투여량뿐만 아니라 프레드니솔론으로 처리한 동물에서 조직학적 손상의 명백한 감소를 관찰할 수 있었지만-이것은 통계학적으로 유의하지 않았다. hBD2의 높은 투여량으로 처리한 동물에서 감소를 관찰할 수 없었다. 유사하게, hBD2의 낮은 및 중간 투여량으로의 처리는 결장 TNF-알파 수준에서 명백한 감소를 야기하였으나, 이 명백한 감소는 통계학적으로 유의하지 않았다.

본 연구에서 얻은 결과는 10일의 처리 기간 후에 마우스에서 유도된 DSS 대장염의 모델에서 hBD2의 항-염증 활성을 증명한다. 그러나 이 항-염증 활성은 사용한 hBD2의 더 낮은 투여량(0.1 mg/kg/일 i.v.)에서 더 명백한 것으로 나타났고, 본 연구에서 사용한 가장 높은 투여량(10 mg/kg/일 i.v.)까지 증가하는 투여량에 따라 점차 사라졌다. 더욱이, hBD2의 가장 낮은 투여량의 항-염증 효과는 1 mg/kg/일 p.o.의 투여량에서 프레드니솔론의 것과 유사하거나 더 뛰어났다(예컨대 조직학적 점수).

실시예 6

마우스 10-일 덱스트란 소듐 설페이트(DSS)-유도 대장염 모델

실시예 6은 본질적으로 실시예 5에서 기재된 것과 같이 수행하였다 차이는 아래에서 나타낸다.

체중

연구 시작일의 동물의 평균 체중은 19.74±0.09 g이었다(평균±SEM).

연구 설계

동물을 9개 실험 그룹으로 나누었다. 각 그룹은 10마리의 수컷으로 구성되었다:

그룹 A: 대조군 비히클(PBS)로 처리 i.v.

그룹 B: hBD2로 처리(1 mg/kg i.v.)-하루 한 번

그룹 C: hBD2로 처리(0.1 mg/kg i.v.)-하루 한 번

그룹 D: hBD2로 처리(0.01 mg/kg i.v.)-하루 한 번

그룹 E: hBD2로 처리(0.001 mg/kg i.v.)-하루 한 번

그룹 F: hBD2로 처리(0.1 mg/kg i.v. + s.c.)-하루 두 번

그룹 G: hBD2로 처리(0.1 mg/kg i.v.)-매 2일째

그룹 H: 메틸프레드니솔론으로 처리(1 mg/kg p.o.)

그룹 J: 메틸프레드니솔론으로 처리(10 mg/kg p.o.)

모든 실험 그룹의 동물 배정은 무작위 방법으로 행하였다. 최대 5 마리 마우스가 각각의 케이지에 수용되었다(명령 86/609/EEC에 따라서). 모든 동물은 그들이 실험실에 도착하였을 때, 그리고 시험 및 참조 화합물의 투여 전에 체중을 쟀다.

시험 항목의 투여

대조군 비히클 및 hBD2를 느린 정맥 주사(15초 이상의 기간)로 5 ml/kg 체중의 투여 부피에서 멸균 바늘(25G)을 사용하여 꼬리 정맥을 통해 정맥으로 투여하였다.

그룹 A 내지 E의 동물은 연속적인 10일 동안 상응하는 시험 항목(hBD2, 프레드니솔론 또는 대조군 비히클)을 하루 한번(매 24시간) 투여 받았다.

그룹 F의 동물은 연속적인 10일 동안 상응하는 시험 항목을 투여량을 i.v.로 한번, 또 다른 투여량을 s.c.(i.v. 투여한지 12시간 후)로 투여 받았다.

그룹 G의 동물은 연속적인 10일 동안 상응하는 시험 항목을 매 2일마다 한번 투여 받았다.

프레드니솔론은 연속적인 10일 동안 5 ml/kg 체중의 투여 부피에서 1 mg/kg(그룹 H) 및 10 mg/kg(그룹 J)의 투여량으로 하루 한 번 구강으로 주어졌다.

혈액 채취

말단 혈액 샘플을 시험 항목을 투여한지 두 시간 후에 복부 대정맥으로부터 연구 마지막 날에 모든 동물에게서 얻었다.

혈액 샘플을 응고시키게 한 다음 3000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였고, 결과의 혈청을 이후의 분석을 위해 -80℃에서 얼렸다.

결과

질병 활성 인덱스 점수

1일 내지 10일 동안의 질병 활성인덱스(DAI) 점수 진행. *p<0.05; **p<0.01로서 주어진 데이터에서 대조군(비히클) 그룹 값과 유의한 차이를 보였음(비-매개변수 데이터에 대한 크루스칼-왈리스 검정). 6일 내지 10일째는 다음 페이지에서 보여준다.

시험 항목	데이터	DAI 점수
시험 항목	데이터	1일 째	2일 째	3일 째	4일 째	5일 째
그룹 A 대조군 비히클 i.v.	평균 S.E.M.	0.00 0.00	0.00 0.00	0.10 0.10	0.10 0.10	0.20 0.13
그룹 B hBD2 1 mg/kg i.v.	평균 S.E.M.	0.00 0.00	0.10 0.10	0.20 0.13	0.40 0.16	0.30 0.21
그룹 C hBD2 0.1 mg/kg i.v.	평균 S.E.M.	0.00 0.00	0.44 0.18	0.89 0.42	0.56 0.29	0.78 0.28
그룹 D hBD2 0.01 mg/kg i.v.	평균 S.E.M.	0.00 0.00	0.00 0.00	0.30 0.15	0.40 0.16	1.60 0.43
그룹 E hBD2 0.001 mg/kg i.v.	평균 S.E.M.	0.00 0.00	0.00 0.00	0.10 0.10	0.20 0.13	0.40 0.16
그룹 F hBD2 0.1 mg/kg 하루 두 번i.v.+s.c.	평균 S.E.M.	0.00 0.00	0.30 0.21	0.70 0.30	0.70 0.34	0.60 0.16
그룹 G hBD2 0.1 mg/kg i.v.매 2일	평균 S.E.M.	0.00 0.00	0.20 0.13	0.40 0.22	0.50 0.17	0.50 0.17
그룹 H 프레드니솔론 1 mg/kg p.o.	평균 S.E.M.	0.00 0.00	0.50 0.17	0.50 0.17	0.40 0.16	1.10 0.18
그룹 J 프레드니솔론 10 mg/kg p.o.	평균 S.E.M.	0.00 0.00	0.30 0.15	0.70 0.21	0.80 0.20	1.30 0.21
시험 항목	데이터	DAI 점수
시험 항목	데이터	6일 째	7일 째	8일 째	9일 째	10일 째
그룹 A 대조군 비히클 i.v.	평균 S.E.M.	6.90 1.02	9.67 0.33	11.11 0.31	11.67 0.17	11.00 0.65
그룹 B hBD2 1 mg/kg i.v.	평균 S.E.M.	2.30* 1.00	4.40* 1.03	6.89 1.41	5.00* 0.60	5.78* 0.70
그룹 C hBD2 0.1 mg/kg i.v.	평균 S.E.M.	1.56** 0.73	4.13* 0.83	5.43* 1.13	6.29* 1.64	6.86 1.14
그룹 D hBD2 0.01 mg/kg i.v.	평균 S.E.M.	2.70 1.08	6.50 1.28	6.20* 1.06	4.60*** 0.98	5.20** 0.87
그룹 E hBD2 0.001 mg/kg i.v.	평균 S.E.M.	3.40 1.32	7.11 1.38	8.56 1.06	5.89** 1.63	6.67 1.30
그룹 F hBD2 0.1 mg/kg 하루 두 번i.v.+s.c.	평균 S.E.M.	0.70*** 0.30	3.50** 0.89	4.00*** 1.17	2.90*** 0.55	4.50*** 0.62
그룹 G hBD2 0.1 mg/kg i.v. 매 2일	평균 S.E.M.	2.90 1.12	6.50 1.11	8.70 1.25	7.50 0.93	6.56 0.99
그룹 H 프레드니솔론 1 mg/kg p.o.	평균 S.E.M.	3.80 0.98	5.90 1.16	6.40 0.88	5.60* 0.88	5.60* 0.65
그룹 J 프레드니솔론 10 mg/kg p.o.	평균 S.E.M.	2.00 0.30	3.20** 0.73	480** 0.53	5.20* 0.61	4.00*** 0.00

조직 평가

결장의 두 개의 절개물(근위 및 원위)을 각각의 동물로부터 취하여, 조직학적 분석(헤마톡실린 및 에오신 염색)을 진행하였고, 상술한 득점 시스템에 따라 블라인드 관찰자에 의해 점수 매겨졌다.

시험 항목	데이터	조직학적 점수 근위 결장	조직학적 점수 원위 결장
그룹 A 대조군 비히클 i.v.	평균 S.E.M.	2.44 0.34	4.67 0.17
그룹 B hBD2 1 mg/kg i.v.	평균 S.E.M.	1.78 0.36	3.56 0.38
그룹 C hBD2 0.1 mg/kg i.v.	평균 S.E.M.	1.71 0.18	3.14* 0.40
그룹 D hBD2 0.01 mg/kg i.v.	평균 S.E.M.	1.70 0.26	3.10** 0.23
그룹 E hBD2 0.001 mg/kg i.v.	평균 S.E.M.	1.44 0.24	3.56 0.18
그룹 F hBD2 0.1 mg/kg 하루 두 번i.v.+s.c.	평균 S.E.M.	1.30* 0.21	2.90*** 0.23
그룹 G hBD2 0.1 mg/kg i.v. 매 2일	평균 S.E.M.	1.56 0.24	3.56 0.29
그룹 H 프레드니솔론 1 mg/kg p.o.	평균 S.E.M.	1.40 0.22	3.00*** 0.00
그룹 J 프레드니솔론 10 mg/kg p.o.	평균 S.E.M.	1.40 0.16	2.70*** 0.21

통계 분석

결과의 통계학적 유의성을 통계 프로그램 Graphpad lnstat 3을 사용하여 평가하였다. 질병 활성 점수 및 조직학적 점수에 대한 그룹 사이의 차이를 쌍이 없는 데이터에 대한 크루스칼-왈리스 검정+ 다중 비교를 위한 사후 검정 Dunn 에 의해 평가하였다. 유의하게 p<0.05의 값을 얻었다. 상기 테이블에서, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001로서 상응하는 대조군(비히클) 그룹과 대조한 유의한 차이를 나타낸다.

결론

본 연구의 목적은 마우스에서 구강 덱스트란 소듐 설페이트(DSS, 2%)의 투여에 의해 유도된 염증성 장질환(대장염)의 급성(10-일) 모델에서 hBD2의 항-염증 활성을 결정하기 위한 것이었다.

본 연구에서 얻어진 결과는 10일의 처리 기간 후 마우스에서 유도된 DSS 대장염의 모델에서 hBD2의 항-염증 활성을 더 증명한다. 이 항-염증 활성은 정맥 및 피하 투여 모두에서 0.1 mg/kg의 투여량으로 하루 두 번(매 12시간)의 hBD2 투여 후에 더욱 명백한 것을 나타낸다. 더욱이, hBD2의 이 투여량으로 관찰된 항-염증 효과는 구강으로 주어진 1 mg/kg 또는 10 mg/kg의 투여량에서의 프레드니솔론의 것과 유사하거나 더 뛰어났다(질병 활성 점수 및 조직학적 점수 모두에서).

실시예 7

콜라겐-유도 류마티스성 관절염 모델에서 인간 베타 방어소 2의 평가

하기 연구의 목적은 마우스 콜라겐-유도 류마티스성 관절염 모델에서 인간 베타 방어소 2의 항-염증 활성을 결정하기 위한 것이다.

시험 시스템

종/계통: 마우스 / DBA/1

출처: Harlan, 영국

성별: 수컷

동물의 수: n = 50

연령: 젊은 성체, 연구 개시에서 6-8주령.

체중: 콜라겐 유도 시점에서 실험 동물의 체중 변화량은 평균 체중의 ±20%를 넘지 않았다 .

동물 건강: 본 연구에 사용된 동물의 건강 상태를 도착하였을 때 검사하였다. 오직 건강한 동물만이 실험실 조건에 적응하였고, 본 연구에 사용하였다.

환경 순응: 적어도 7일.

주거지: 환경 순응에 이은 투여 동안, 동물은 접근 제한 설치류 설비안에 수용하였고, 고체 바닥으로 맞춰지고 베딩 재료로 대팻밥이 채워진 폴리프로필렌 케이스(45 cm×25 cm×13 cm)에서 최대 10마리의 마우스 그룹으로 부양하였다. 케이스는 일주일에 한번 바뀌었다.

사료 및 식수: 동물은 시판하는 설치류 사료를 임의로 제공받았고, 스테인리스 스틸 빨대 튜브가 있는 폴리에틸렌 병을 통해 각각의 케이지에 공급된 식수에 자유롭게 접근하였다. 식수 병은 적어도 매 3주마다 바꿔주었다. 식수는 일주일에 세 번 바꿔주었다.

환경: 자동적으로 조절된 환경 조건은 연구실에서 30-70%의 상대습도(RH), 12/12시간 명/암 주기 및 10-30번의 환기/시간과 함께 20-24℃의 온도를 유지하도록 맞춰졌다. 온도 및 RH는 매뉴얼 측정 및 조절 컴퓨터 모두에 의해 매일 관리하였다.

확인: 동물에게 독특한 동물 확인 귀 번호를 주었다. 이 번호는 또한 각각의 케이지의 앞에 보이도록 케이지 카드에도 나타냈다. 또한 케이지 카드는 연구 번호를 함유하였다.

무작위 배정: 동물은 무작위로 실험 그룹에 배정되었다.

종결: 연구의 종결에서 살아있는 동물은 O₂/CO₂ 흡입에 이은 출혈에 의해 안락사시켰다.

정당성: 마우스는 이 실험 동물 모델을 위해 선택한 종에서 기술한 것으로부터 선택되었다. 마우스의 DBA/1 계통은 콜라겐-유도 관절염(CIA)에 매우 쉽게 걸린다.

재료

인간 베타 방어소 2(hBD2); 실시예 1을 참조하라

덱사메타손(Sigma, cat. no. D1756)

우 타입 Ⅱ 콜라겐(MD Biosciences, cat. no. 804001314)

완전 후룬즈 아주번트(CFA)(MD Biosciences, cat. no. 501009703)

PBS(PAA, cat no.시간 15-002)

시험 그룹의 구성

시험 그룹 및 처리.

그룹 크기	그룹 번호	시험 화합물	경로	투여량	부피	요법
n=10	A	비히클 대조군	IV	0 mg/kg	5 mL/kg	하루 한 번
n=10	B	덱사메타손	IP	1 mg/kg	5 mL/kg	하루 한 번
n=10	C	hBD2	IV	10 mg/kg	5 mL/kg	하루 한 번
n=10	D	hBD2	IV	1 mg/kg	5 mL/kg	하루 한 번
n=10	E	hBD2	IV	0.1 mg/kg	5 mL/kg	하루 한 번

IV: 정맥

IP: 복강 내

시험 절차

관절염 유도

모든 동물은 연구의 0일째에서 플라스틱 주사기를 사용하여 가벼운 이소플루란 마취하에서 꼬리를 통한 피내 주사로 0.1 ml 타입 Ⅱ 콜라겐/CFA 에멀전(마우스당 200 μg 콜라겐)을 받았다. 주사 위치는 대략 꼬리의 기저로부터 꼬리 쪽 방향으로 약 1 cm에 있었다. 콜라겐 챌린지(200 μg/마우스)는 21일 째에서 콜라겐 및 PBS의 IP 주사에 의해 동물에게 제공하였다.

처리

처리는 연구 14일 째에서 시작하여 끝까지 하루 한번 계속되었다. 모든 살아있는 마우스는 연구 42일째에서 종결시켰다.

투여 경로:

(ⅰ) hBD2: 정맥

(ⅱ) 덱사메타손: 복강 내

(ⅲ) 비히클 대조군: 정맥

투여량 및 부피 투여량(또한 표 27을 참조하라):

(ⅰ) hBD2: 5 mL/kg에서 10, 1 또는 0.1 mg/kg

(ⅱ) 덱사메타손: 5 mL/kg에서 1 mg/kg

(ⅲ) 비히클 대조군: 5 mL/kg에서 0 mg/kg

무통각: 연구 동안 진통제를 사용하지 않았다.

관찰 및 검사

관절염 반응

마우스를 연구 0, 14, 21일 째, 그리고 그 이후 매주 5번씩 연구가 끝날 때까지 말단 관절에서 관절염 유발 반응의 사인에 대하여 검사하였다. 관절염 반응은 하기에 보여준 것과 같이 심각성의 오름 차순으로 0-4의 규모에 따라 각각의 발에 대하여 기록하였다.

관절염 점수 등급

반응 없음, 정상: 0

가볍지만 분명한 발목/손목의 붉기 및 팽창 또는 영향을 받은

손가락의 수에 상관없이 개별 손가락에 제한된 명백한 붉기 및

팽창 : 1

발목/손목의 중간 정도로 심각한 붉기 및 팽창: 2

손가락을 포함하는 저체 발의 붉기 및 팽창: 3

다수의 관절을 포함하여 최대로 염증을 일으킨 사지: 4

임상 증상

0, 14, 21일 째에서, 그리고 그 이후 매주 5번씩, 신중한 임상 시험을 수행하고 기록하였다. 관찰은 피부, 털, 눈, 점막, 분비 및 배설물(예컨대 설사) 및 자율신경계 활성(예컨대 눈물흘림, 침흘림, 털세움, 눈동자 크기, 유별난 호흡 패턴)의 발생에서의 변화를 포함하였다. 또한 걷는 모양, 자세 및 핸들링에 대한 반응에서의 변화뿐만 아니라 기괴한 행동, 떨림, 수면 및 혼수상태의 존재를 기록하였다.

14일째 전에 마우스를 모든 유별난 행동에 대하여 매일 관찰하였다.

체중

동물의 개별 체중의 결정은 연구 0, 14, 21일 째, 그리고 그 이후 매주 5번씩 연구가 끝날 때까지 관절염 유도 전에 짧게 행하였다.

실험 관절염의 측정

각각의 동물의 모든 뒷발의 두께(왼쪽 및 오른쪽, 발바닥 바로 아래 및 상기 발꿈치뼈)의 상대적 변화를 연구 0, 14, 21일 째, 그리고 그 이후 매주 5번씩 다이얼 캘리퍼스(Kroeplin, Munich, 독일)를 사용하여 측정하였다.

연구 종결

모든 마우스는 연구 42일 째에 종결하였다.

샘플 수집

연구 종결에 따른 O₂/CO₂ 흡입에서, 말단 혈액 샘플을 모든 남아있는 시험 동물로부터 얻었다. 혈청을 각각의 샘플로부터 준비하였고, -20℃에 저장하였다. 게다가, 왼쪽 앞발 및 뒷발을 수집하여 포르말린에 저장하였고, 오른쪽 앞발 및 뒷발을 수집하여 가능한 관절 RNA 분석을 위해 재빨리 얼렸다.

인도적인 실험종료

빈사상태의 조건에서 발견된 동물 및 심각한 통증을 보이고 심각한 곤란의 사인을 참는 동물을 인도적으로 안락사하였다. 게다가 초기 체중 결정보다 20%이상 체중의 감소를 보이는 동물도 인도적으로 안락사하였다. 12 이상의 전체 관절염 점수를 갖는 마우스를 인도적인 이유로 또한 추려내었다. 모든 동물은 O₂/CO₂ 흡입에 이은 출혈에 의해 안락사시켰다. 발 샘플 및 말단 혈액 샘플을 모든 실험 동물로부터 얻었다.

통계 분석

평가는 관절염 점수 및 발 두게 측정에 대한 평균 값에 일차적으로 기반을 두었다. 적절한 곳에서, 적절한 통계적 방법에 의한 데이터 분석을 치료 효과의 유의성을 결정하기 위하여 적용하였다. ANOVA에 이은 터키 사후 분석(엑셀에 대하여 Winstat 2005.1)을 처리 그룹 사이의 통계적 차이를 평가하기 위하여 사용하였다.

정부 규정에 따라서, 전체 임상 점수가 12와 같거나 더 큰 마우스를 관절염 심각성에 기인하여 추려내었다. 종결에서 이들 마우스의 임상 점수를 데이터가 높은 점수의 마우스의 제거에 의해 인위적으로 편향되지 않게 하기 위하여 연구의 남아있는 것들에 대한 분석으로 이월하였다.

동물 관리 및 사용 보고서

이 연구는 과학적 처치에서 동물의 사용을 위한 영국 정부의 규정에 따라 수행하였다.

결과

콜라겐 유도된 수컷 DBA/1 관절염 마우스에서 42일의 관찰 기간동안 결정된 평균 임상 관절염 점수. * p<0.05 비히클 그룹과 유의하게 다름

연구일	데이터	그룹 A 비히클	그룹 B 덱사메타손 1 mg/kg	그룹 C hBD2 10 mg/kg	그룹 D hBD2 1 mg/kg	그룹 E hBD2 0.1 mg/kg
0	평균 관절염 점수 SEM	0.0 0.0	0.0 0.0	0.0 0.0	0.0 0.0	0.0 0.0
14	평균 관절염 점수 SEM	0.1 0.1	0.4 0.2	1.7 0.6	0.6 0.3	1.2 0.5
21	평균 관절염 점수 SEM	3.2 1.2	0.0 0.0	3.1 1.1	2.1 0.8	3.2 1.3
22	평균 관절염 점수 SEM	3.4 1.1	0.0 0.0	4.3 1.1	2.3 0.8	3.6 1.4
23	평균 관절염 점수 SEM	3.4 1.1	0.0 0.0	3.3 1.2	2.0 0.7	3.2 1.3
26	평균 관절염 점수 SEM	4.4 1.1	0.0* 0.0	4.1 1.2	2.0 0.7	3.7 1.3
27	평균 관절염 점수 SEM	4.8 1.2	0.0* 0.0	4.1 1.3	2.0 0.7	4.1 1.3
28	평균 관절염 점수 SEM	5.3 1.1	0.0* 0.0	4.1 1.2	2.3 0.8	4.4 1.3
29	평균 관절염 점수 SEM	6.3 1.1	0.0* 0.0	4.4 1.3	2.4 0.8	5.0 1.3
30	평균 관절염 점수 SEM	6.8 1.1	0.0* 0.0	4.9 1.3	2.7 0.9	5.9 1.5
33	평균 관절염 점수 SEM	7.4 1.1	0.0* 0.0	4.8 1.2	4.0 0.9	7.3 1.4
34	평균 관절염 점수 SEM	7.3 1.1	0.0* 0.0	4.9 1.2	4.1 1.1	7.8 1.3
35	평균 관절염 점수 SEM	7.5 1.0	0.0* 0.0	4.9 1.2	4.0 1.1	8.0 1.3
36	평균 관절염 점수 SEM	6.8 0.9	0.0* 0.0	4.8 1.1	4.1 1.1	8.2 1.1
37	평균 관절염 점수 SEM	7.4 0.9	0.0* 0.0	4.7 1.1	4.2 1.1	8.7 1.1
40	평균 관절염 점수 SEM	8.2 0.8	0.0* 0.0	5.0 1.0	4.7* 1.2	9.0 0.8
41	평균 관절염 점수 SEM	8.5 0.7	0.0* 0.0	4.8* 1.0	5.2 1.1	8.8 0.8

결론

관절염 반응은 연구 14일 째부터 모든 그룹에서 기록되었다. 비히클 처리된 마우스에 대한 전체 관절염 점수의 평균은 연구 41일 째에 8.5±0.72에 달했다. 10 mg/kg의 hBD2로 처리한 마우스(그룹 C)에서 전체 관절염 점수의 평균은 연구 40일 째에 5.0±1.04에 달했다. 이 그룹의 평균 관절염 점수는 23일부터 연구가 끝날 때까지 비히클 처리 마우스에 비해 낮았지만, 연구 41일 째에서 오직 유의하였다.

1 mg/kg의 hBD2로 처리한 마우스(그룹 D)에서 전체 관절염 점수의 평균은 연구 41일 째에 5.2±1.1에 달했고, 21일부터 연구가 끝날 때까지 비히클 처리 그룹에 비해 일관되게 낮았지만, 40일 째에서 유일하게 유의하였다. 0.1 mg/kg의 hBD2로 처리한 마우스(그룹 E)는 비히클 처리 그룹과 비교한 전체 관절염 점수의 평균이 유의하게 낮지 않았다. 이 그룹의 평균 점수는 연구 40일 째에 9.0±0.77에 달했다. 덱사메타손 처리 그룹의 마우스는 연구 26일부터 연구가 끝날 때까지 비히클 처리 그룹과 비교하여 유의하게 낮은 관절염 점수를 나타내었다.

관절염의 심각성 때문에 연구 초기에 추려낸 마우스의 제거가 데이터를 인위적으로 편향시키지 않았음을 보증하기 위해, 이런 마우스로부터 나온 관절염 점수를 연구 종결까지 분석에서 이월시켰다.

<110> Novozymes A/S <120> Treatment of inflammatory diseases with mammal beta defensins <130> 11P0117 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 36 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(36) <223> mat_peptide <400> 1 Asp His Tyr Asn Cys Val Ser Ser Gly Gly Gln Cys Leu Tyr Ser Ala 1 5 10 15 Cys Pro Ile Phe Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg Gly Lys Ala 20 25 30 Lys Cys Cys Lys 35 <210> 2 <211> 41 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(41) <223> mat_peptide <400> 2 Gly Ile Gly Asp Pro Val Thr Cys Leu Lys Ser Gly Ala Ile Cys His 1 5 10 15 Pro Val Phe Cys Pro Arg Arg Tyr Lys Gln Ile Gly Thr Cys Gly Leu 20 25 30 Pro Gly Thr Lys Cys Cys Lys Lys Pro 35 40 <210> 3 <211> 45 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(45) <223> mat_peptide <400> 3 Gly Ile Ile Asn Thr Leu Gln Lys Tyr Tyr Cys Arg Val Arg Gly Gly 1 5 10 15 Arg Cys Ala Val Leu Ser Cys Leu Pro Lys Glu Glu Gln Thr Gly Lys 20 25 30 Cys Ser Thr Arg Gly Arg Lys Cys Cys Arg Arg Lys Lys 35 40 45 <210> 4 <211> 50 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(50) <223> mat_peptide <400> 4 Glu Phe Glu Leu Asp Arg Ile Cys Gly Tyr Gly Thr Ala Arg Cys Arg 1 5 10 15 Lys Lys Cys Arg Ser Gln Glu Tyr Arg Ile Gly Arg Cys Pro Asn Thr 20 25 30 Tyr Ala Cys Cys Leu Arg Lys Trp Asp Glu Ser Leu Leu Asn Arg Thr 35 40 45 Lys Pro 50 <210> 5 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hBD-4 variant consisting of amino acids 3-39 of SEQ ID NO 4 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(37) <223> mat_peptide <400> 5 Glu Leu Asp Arg Ile Cys Gly Tyr Gly Thr Ala Arg Cys Arg Lys Lys 1 5 10 15 Cys Arg Ser Gln Glu Tyr Arg Ile Gly Arg Cys Pro Asn Thr Tyr Ala 20 25 30 Cys Cys Leu Arg Lys 35 <210> 6 <211> 40 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(40) <223> mat_peptide <400> 6 Lys Ile Asn Asn Pro Val Ser Cys Leu Arg Lys Gly Gly Arg Cys Trp 1 5 10 15 Asn Arg Cys Ile Gly Asn Thr Arg Gln Ile Gly Ser Cys Gly Val Pro 20 25 30 Phe Leu Lys Cys Cys Lys Arg Lys 35 40

Claims

류마티스성 관절염, 골관절염, 다발성 경화증, 동맥경화증, 경피증(전신성 경화), 낭창, 전신성 홍반성 낭창(SLE),(급성) 사구체신염, 천식, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 호흡 장애 증후군(ARDS), 맥관염, 포도관염, 피부염, 아토피 피부염, 탈모증, 코카타르(비염), 알레르기성 결막염, 중증 근무력증, 경피증, 유육종증, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 소아 특발성 관절염, 그레이브스병, 쇼그렌 증후군, 및 베체트병으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 염증 질환 또는 장애의 치료를 위한 약제의 제조에서 포유류 베타 방어소의 용도.
제 1항에 있어서, 약제는 비경구로 투여되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 2항에 있어서, 약제는 피하 또는 정맥으로 투여되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 1-3항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류 베타 방어소는 약 0.001 mg/kg 체중 내지 약 10 mg/kg 체중, 바람직하게는 약 0.01 mg/kg 체중 내지 약 10 mg/kg 체중의 하루 투여량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 1-4항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류 베타 방어소는 인간 베타 방어소인 것을 특징으로 하는 용도.
제 1-5항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류 베타 방어소는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 용도.
제 1-6항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 베타 방어소는 인간 베타 방어소 1, 인간 베타 방어소 2, 인간 베타 방어소 3, 또는 인간 베타 방어소 4인 것을 특징으로 하는 용도.
제 1-7항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류 베타 방어소는 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 용도.
제 1-8항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류 베타 방어소는 인간 베타 방어소 2인 것을 특징으로 하는 용도.
제 1-9항 중 어느 한 항에 있어서, 처리된 조직에서 TNF-알파 활성이 감소되는 것을 특징으로 하는 용도.
효과량의 포유류 베타 방어소를 이를 필요로 하는 포유류에게 투여하는 단계를 포함하고, 염증 질환 및 장애가 류마티스성 관절염, 골관절염, 다발성 경화증, 동맥경화증, 경피증(전신성 경화), 전신성 홍반성 낭창(SLE), 낭창,(급성) 사구체신염, 기관지 천식과 같은 천식, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 호흡 장애 증후군(ARDS), 염증성 장질환(예컨대, 크론병), 대장염(예컨대, 궤양성 대장염), 맥관염, 포도관염, 피부염(예컨대, 염증성 피부염), 아토피 피부염, 탈모증, 코카타르(비염), 알레르기성 결막염, 중증 근무력증, 경화성 피부염, 유육종증, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 소아 특발성 관절염, 그레이브스병, 쇼그렌 증후군, 및 베체트병으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 포유동물 조직에서 염증 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
제 11항에 있어서, 효과량은 처된 조직에서 TNF-알파 활성을 감소시키는데 효과적인 것을 특징으로 하는 방법.
제 11항에 있어서, 인간 베타 방어소는 피하 또는 정맥과 같은 비경구로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 11항에 있어서, 포유류 베타 방어소는 약 0.01 mg/kg 체중 내지 약 10 mg/kg 체중, 바람직하게는 약 0.1 mg/kg 체중 내지 약 10 mg/kg 체중의 하루 투여량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 11항에 있어서, 포유류 베타 방어소는 인간 베타 방어소인 것을 특징으로 하는 방법.
제 11항에 있어서, 포유류 베타 방어소는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제 11항에 있어서, 포유류 베타 방어소는 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제 11항에 있어서, 인간 베타 방어소는 인간 베타 방어소 1, 인간 베타 방어소 2, 인간 베타 방어소 3, 또는 인간 베타 방어소 4인 것을 특징으로 하는 방법.