TW201004641A - Treatment of inflammatory diseases with mammal beta defensins - Google Patents

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201004641 " 六、發明說明： 序列表之參照 本申請案含有呈電腦可讀私s，丨生 ^ Λ % 項形式之序列表。該電腦可讀 形式以引用之方式併入本文中。 發明之背景 【發明之領域】 本發明係關於藉由投予哺乳類動物万防禦素而抑制腫 瘤壞死因子a (TNF.a )活性，其在治療多種病症（包括 治療與發炎相關之病理學病狀）具有效用。 【背景】 人類防禦素 在許多其他元件中，先天免疫之關鍵組分為個別顯示 相當大選擇性但集體能夠快速殺死寬範圍之細菌、病毒及 真菌之抗微生物肽（AMP )。AMP之生物重要性因其在自然 界中之普遍分布而更為突出，且其有可能由所有多細胞生 物體產生。在人類中，優勢AMP為防禦素。人類防禦素為 陽離子小肽，基於其三個分子内半胱胺酸雙硫鍵之拓撲 學，可分為α-防禦素及冷-防禦素。防禦素可進一步細 分為最早自嗜中性球顆粒分離之α_防禦素（ηνΡ1_4)及由 潘納斯細胞（Paneth cell )表現於小腸隱窩中之α防紫素 (HD5及HD6 )。/3-防禦素主要由多種組織及器官之上 細 胞產生’該等組織及器官包括皮膚、氣管、胃腸道、 尿 3 201004641 生殖系統、腎、胰及乳腺。石·防禦素家族最佳特性化之成 員為hBDl-3。然而，藉由使用多種生物資訊學工具，已在 人類基因組中註解幾乎40個編碼推定防禦素同'源物之 開放閱讀框架。一些人類防禦素係組成性產生，而其他係 由促發炎性細胞介素或外源微生物產物誘發。 已變得越來越清楚，除直接抗微生物活性外，人類防 禦素亦具有多種免疫調節/替代性質。該等性質包括誘發多 種趨化因子及細胞介素、趨化性及細胞凋亡活性、誘發前 列腺素、組織胺及白三烯之釋放、抑制補體、經由類鐸受 體信號轉導刺激樹狀細胞成熟及由嗜中性球刺激病原體清 除。此外，人類防禦素亦在傷口癒合、上皮及纖維母細胞 增殖、血管生成及血管發生中起作用。 有越來越多的證據證明人類防禦素在許多感染性及發 炎性疾病中發揮重要作用。發炎及/或感染皮膚中通常觀察 到人類防禦素之過表現，此很可能是因為由微生物組分或 内源性促發炎性細胞介素局部誘發。在牛皮癬中，hBD2及 hBD3過多，且在患有尋常痤瘡或淺表性毛囊炎之患者之病 變性上皮中，觀察到hBD2之顯著上調。另一方面，異位性 皮膚炎與hBD2及hBD3之下調相關。迴腸克羅恩氏病 (Crohn’s disease)與HD5及HD6之不足表現相關，且在結 腸克羅恩氏病中，liBD2-4之表現下調。 細胞介素 細胞介素為高級真核生物之負責細胞間信號轉導且影 響其他細胞之生長、分裂及功能的小分泌多肽。其為有效 4 201004641 之多效性多狀’其例如經由相應受體充當局部或全身性細 胞間調控因子’且因此在諸如免疫、發炎及造血之許多生 物過程中起關鍵作用。細胞介素由多樣細胞類型產生，該 #細胞類型包括纖維母細胞、内皮細胞、上皮細胞、巨喔 細胞/單核細胞及淋巴細胞。 TNF- <2涉及多種生理病原性過程且可如在宿主防禦中 具有保護性或如在自體免疫中具有有害性。TNF- α為關鍵 細胞介素之一’其引發且維持發炎反應，且已證明TNF-a 失活在下調與自體免疫疾病相關之發炎性反應中很重要。 感染後，巨噬細胞大量分泌TNF- α且TNF- α藉由刺激内皮 細胞產生黏附分子及藉由產生為趨化細胞因子之趨化因子 來介導嗜中性球及巨噬細胞募集至感染部位。TNF_ α有助 於活化白血球及其他發炎性細胞且增加損傷組織内之血管 滲透性。TNF- 主要由巨噬細胞、單核細胞及樹狀細胞產 生，而且可由多種其他細胞類型產生，該等細胞類型包括 淋巴細胞、肥大細胞、内皮細胞、心臟肌細胞、脂肪組織、 纖維母細胞及神經元組織。 當刖的抗炎藥藉由與TNF_ α結合且因此阻止TNF_ α 向細胞表面上TNF-a之受體發送信號來阻斷ΤΝρι_α之作 用。該類型之阻斷具有某些嚴重的副作用，其中一些為感 染，諸如肺結核 '敗血症及真菌感染且可能使癌症發病率 增加。 IL_ 1 〇 ’亦稱為人類細胞介素合成抑制因子（CSIF )，亦 作為抗炎細胞介素主要積極參與免疫調控。該細胞介素由 5 201004641 數種細胞類型產生’該等細胞類型包括單核細胞、巨噬細 胞、T細胞、B細胞 '樹狀細胞及肥大細胞。該細胞介素在 免疫調控及發炎作用中具有多效性效應。其下調促發炎性 細胞介素、Thl/Thl7細胞分泌之細胞介素、MHC第II類 Ag及共刺激分子於抗原呈現細胞上的表現❶IL_丨〇亦由稱 為調控T細胞（Tregs )之T細胞群體分泌。該等細胞不阻 止最初T細胞活化；相反’其抑制持續反應且阻止慢性且 潛在破壞性反應。在周邊中，某些T細胞被抗原及IL-10 或TGF-冷誘發成為Tregs。IL-10誘發之Tregs為 CD4+/CD25+/Foxp3-且稱為Trl細胞。該等細胞藉由分泌 IL-10抑制免疫反應。最近研究已揭示在鑑別Thl7細胞時T 細胞效應子譜系之多樣化大於Thl/Th2/Treg。已顯示該亞群 在先前歸因於Thl系之數種自體免疫疾病（諸如克羅恩氏 病、潰瘍性結腸炎、牛皮癖及多發性硬化）中呈病原性。 Th 17分泌之細胞介素亦被IL_丨〇下調，且阻斷tnf藉由使 Thl7細胞失活而預防牛皮癖。IL•丨〇之總體活性為抗炎性， 且已在數個動物研究中顯示預防發炎及損傷，然而因為 IL-10投藥途徑及其生物半衰期方面存在之困難，所以臨床 IL-10治療仍不適當。 使用人類防禦素治療發炎 引人關注的是，小腸克羅恩氏病與潘納斯細胞（paneth cell) a -防禦素HD5及hd6之含量降低相關，而結腸克羅 恩氏病與召-防禦素hBD2及hBD3之產生減少相關 (Gersemann 等人，2008 ; Wehkamp 等人，2005 )。此外，已強 201004641 有力地證明克羅恩氏病之發病機制中涉及勝溶微生物區 (Swidsinski等人，2002 該等研究人員藉由使用螢光原位 雜交顯示在活性克羅恩氏病中’觀察到黏膜相關且具侵襲 性之細菌之急劇増加，而正常小腸上皮及大腸上皮中無該 等細菌。綜合該等觀察結果總結得出一個假設，該假設表 明在健康人中’沿腸上皮障壁之適當含量之防禦素作用於 控制魯米那（luminal)細菌之組成及數目且使其不黏附及 入侵黏膜而引發發炎（Wang等人，2007 )。另一方面，在能 力不足以產生保護性含量之分泌防禦素的人中，抗微生物 防禦與魯米那細菌之間的平衡會改變。結果，此使得細菌 入侵基礎腸組織，從而誘發發炎性狀態，此又可能發展成 克羅恩氏病。 基於該假設，WO 2007/081486揭示數種人類防禦素在 發炎性腸疾病之治療中之用途。發明者提出以允許防禦素 在腸腔中之適當位置釋放之調配物形式經口向克羅恩氏病 患者投予的防禦素將減少入侵細菌之數目，重建正常上皮 障壁功能且因此降低發炎性疾病之嚴重性。 根據WO 2007/081486，防禦素之功能在於直接靶向且 殺死内腔中之細菌，從而阻止其入侵上皮組織。即，防紫 素完全起抗感染化合物作用。關於WO/2007/081486，令人 驚舒的是非經腸投予之hBD2能夠降低小鼠之DSS誘發之 結腸炎的嚴重性，因為藉由使用該投藥途徑，肽從未遇到 魯米那細菌。另外，吾人此處顯示hBD2之效應為減小pBMc 分泌之促發炎性細胞介素TNFa、IL-1冷及il-23之含量。 7 201004641 已知該等細胞介素主要參與到許多包括發炎性腸疾病之發 炎性疾病中中。十年多來一直已知，除抗微生物功能外， 防禦素亦具有多種免疫調節功能。然而，大部分關於人類 防禦素之免疫調節性質之著作描述其主要具有促發炎性或 免疫增強功能（參見例如Niyonsaba等人，2007 ; Bowdish 等人，2006 ; Lehrer, 2004)。 因此’非經腸投予之hBD2能夠降低發炎性腸疾病之疾 病嚴重性確實出乎意料。首先，當非經腸投予時，hBD2決 不會到達腸腔從而遇到參與誘發疾病之有害細菌。此外， 基於大部分公開之文獻，如此處所提供之著作中所觀察 到’將預期進入血流之防禦素將誘發促發炎性而非抗炎性 反應。 【發明之詳述】 為幫助理解較佳具體態樣，本文提供某些定義。 如本文所用之術語「TNF- α活性」為廣義術語且以對 一般熟習此項技術者而言為一般且習用之含義給出（且不 #限於特疋或定製之含義）JL係、才旨（但不限於）JL少部分 由腫瘤壞死因子α介導之活性或效應。 文所用之術語「抑制子」為廣義術語且以對一般 熟習此項枯你L i 而§為一般且習用之含義給出（且不侷限 於特定或定製之| 少 3義）且係指（但不限於）可降低TNF- α 之至少—種活性夕八, ^ 刀子（例如，天然或合成化合物）。換言 右在有抑制子執行之檢定中，與無抑制子執行之檢定 所量測到之TNF-a之量、TNF-o:活性或細胞外及/ 201004641 或細胞内偵測出之TNF- /7益· >4站·*+ ι*月*： »+ 「』 〜1 iNf α發生統5十上顯著的變化，則「抑 制子J改變活性。 一般而言’ ™F_a抑制子例如藉由減少TNF-α之分泌 降低TNF· α之生理功能’且因此適用於治療了胳“可直接 或間接呈病原性之疾病。 本文所用之術3吾「IL· J 〇活性」為廣義術語且以對一 般熟習此項技術者而言為_般且習用之含義㈣（且不偈 限於特定或定製之含義）且係指（但不限於）纟少部分由 介白素-10介導之活性或效應。 如本文所用之術語「誘發劑（inducer)」為廣義術語且 以對-般熟習此項技術者而言為一般且習用之含義給出 (且不侷限於特定或定製之含義）且係指（但不限於）可增 之至 > 一種活性之分子（例如，天然或合成化合 物）換3之，若在有誘發劑執行之檢定中，與無誘發劑執 行之檢定相比，所量測到之MO之量、π^1()活性或細胞 外及/或細胞内偵測出之江_1〇發生統計上顯著的變化，則 「誘發劑」改變活性。 奴而言，IL-10誘發劑增加 此適用於治療受IL_1〇影響之疾病 術浯「修飾」在本文中意謂人類万防禦素2之任何化 學修飾。修錦可為脸其絲^ 哪為胺基酸之取代、缺失及/或插入以 酸側鏈之置拖.十* & « 收丞 、，或在胺基酸序列中使用具有類似特性 天然胺基酸。註士夕 j女 化 叶3之，修飾可為醯胺化，諸如C-末端醯胺 9 201004641 如本文所用之術語「防禦素」係指熟習此項技術者公 認屬於抗微生物肽之防禦素類別之多肽。為確定多肽是否 為根據本發明之防禦素，可藉由使用免費可用之HMMER 套裝軟體將胺基酸序列與PFAM資料庫之隱馬爾可夫模型 特徵（hidd'en markov model profile )( HMM 特徵）比較。 PFAM防禦素家族例如包括防禦素-1或「哺乳類動物防 禦素」（存取號碼PF00323 )及防禦素-2或防禦素-冷或「冷 防禦素」（存取號碼PF0071 1 )。 本發明之防禦素屬於占防禦素類別。点防禦素類別之 防禦素享有共同的結構特徵，諸如半胱胺酸模式。 根據本發明之防禦素之實例包括人類万防禦素1 (hBDl ;參見SEQ ID NO: 1 )、人類冷防禦素2 ( hBD2 ;參 見 SEQ ID NO: 2)、人類；S 防禦素 3( hBD3;參見 SEQ ID NO: 3 )、人類；5防禦素4 ( hBD4 ;參見SEQ ID NO: 4 )及小鼠 冷防禦素3 ( mBD3 ;參見SEQ ID NO: 6 )。 兩個胺基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關性 由參數「一致性」描述。 出於本發明之目的，如EMBOSS套裝軟體（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等人，2000, Trends in Genetics 16: 276-277 ; http://emboss.org )、較佳3.0.0版或更新版本之尼德爾程式 (Needle program )中所實施，藉由使用尼德曼-文施算法 (Needleman-Wunsch algorithm ) ( Needleman 及 Wunsch， 1970, «/. Mo/· 48: 443-453 )確定兩個胺基酸序列之間 10 201004641 的一致性程度。視情況使用之參數為空隙開放罰分（1〇)、

空隙擴展罰分（0.5)及 EBLOSUM62(BLOSUM62 之 EMBOSS 版本）替代矩陣。使用尼德爾標記之「最長一致性」（使用 非簡明選項（nobrief option )獲得）之輸出作為一致性百分 比且如下計算： (相同殘基xl00) /(比對長度-比對中之空隙總數）。 出於本發明之目的’如EMBOSS套裝軟體（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等人，2000，同上；http://emboss.org )、較佳 3.0.0 版或更新 版本之尼德曼程式中所實施，藉由使用尼德曼-文施算法 (Needleman及Wunsch，1970，同上）確定兩個去氧核糖核 苷酸序列之間的一致性程度。視情況使用之參數為空隙開 放罰分（10)、空隙擴展罰分（〇·5)及EDNAFULL ( NCBI NUC4.4之EMBOSS版本）替代矩陣。使用尼德爾標記之「最 長一致性」（使用非簡明選項獲得）之輸出作為一致性百分 比且如下計算： (相同去氧核糖核苷酸χ1〇〇) / (比對長度-比對中之空 隙總數）。 如本文所用之術語「經分離變異體」或r經分離多肽」 係指自來源分離之變異體或多肽。在一方面中，如 SDS-PAGE所測定，變異體或多肽至少1%純，較佳至少5% 純’更佳至少10%純’更佳至少2〇%純，更佳至少4〇%純， 更佳至少60%純，甚至更佳至少8〇%純，且最佳至少9〇0/〇 純0 11 201004641 術語「實質上純的多肽」在本文中表示含有至多丨〇重 量％、較佳至多8重量◦/〇、更佳至多6重量％ '更佳至多5 重量％、更佳至多4重量％、更佳至多3重量％、甚至更佳 至多2重量％、最佳至多i重量％且甚至最佳至多〇 5重量 °/〇與之天然或重組相關之其他多肽物質的多肽製劑。因此， 較佳為實質上純的多肽以製劑中所存在之總多肽物質之重 量計至少92%純，較佳至少94%純，更佳至少95%純，更 佳至少96%純’更佳至少97%純，更佳至少98〇/〇純，甚至 更佳至少99%純，最佳至少99.5%純且甚至最佳1〇〇%純。 本發明之多肽較佳呈實質上純的形式。此可例如藉由由眾 所周知之重組方法或由經典純化方法製備多肽來實現。 哺乳類動物yS防禦素 本發明係關於諸如人類/5防禦素及/或小鼠万防禦素之 哺乳類動物/3防禦素之醫藥用途，其用於治療與Tnf- α之 含量增加（病原性）相關的疾病’諸如發炎性疾病。治療 較佳與降低所治療組織中之TNF- α活性相關。因此，本發 明之哺乳類動物冷防禦素亦稱為TNF- α抑制子。 在一具體態樣中’本發明之哺乳類動物万防禦素與Seq ID NO: 1 ' SEQ ID NO: 2 ' SEQ ID NO: 3 > SEQ ID NO: 4 > SEQ ID NO: 5及/或SEQ ID NO: 6中之任一胺基酸序列具 有至少80°/。、較佳至少85%、更佳至少90%且最佳至少950/〇 的一致性程度。在一較佳具體態樣中’本發明之哺乳類動 物冷防禦素與 SEQ ID NO:卜 SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3 及/或SEQ ID NO: 4中之任一胺基酸序列具有至少8〇%、較 12 201004641 佳至少85%、更佳至少90%且最佳至少95%的一致性程度β 在一更佳具體態樣中，本發明之哺乳類動物万防禦素由人 類冷防禦素1( SEQ IDNO: 1 )、人類冷防禦素2( SEQ IDNO: 2)、人類石防紫素3(SEQ IDNO: 3)、人類沒防华素4(SEQ IDNO: 4)、人類/5防禦素4之變異體（SEQ IDN0: 5)及/ 或小鼠泠防禦素3 (SEQ IDNO: 6)組成。在一甚至更佳具 體態樣中’本發明之哺乳類動物召防禦素由人類方防紫素1 (SEQ IDNO: 1 )、人類点防禦素2 ( SEQ IDNO: 2 )、人類点 防禦素3( SEQ IDNO: 3 )及/或人類；3防禦素4( SEQ IDNO: 4 )組成。 在另一具體態樣中，本發明之哺乳類動物石防禦素與 SEQ ID NO: 2之胺基酸序列具有至少80%、較佳至少85%、 更佳至少90%且最佳至少95%的一致性程度。在一較佳具 體態樣中’本發明之哺乳類動物冷防禦素由人類石防禦素2 (SEQ IONO: 2)組成。 在又一具體態樣中’本發明之哺乳類動物沒防禦素由 人類々防禦素及/或小鼠点防禦素及其功能等效變異體組 成。本發明之哺乳類動物万防禦素較佳由人類点防禦素^、 人類点防禦素2、人類点防禦素3、人類点防禦素4及小鼠 召防禦素3及其功能等效變異體組成。本發明之哺乳類動 物沒防禦素更佳由人類点防禦素2及其功能等效變異體組 成。 本發明之哺乳類動物石防禦素亦稱為較佳具體態樣之 化合物。 & 13 201004641 在本發明之前後文令，哺乳類動物（例如人類）石防 禦素之「功能等效變異體（funetiGnally ―丨咖)」 為展現與哺乳類動物（例如人類）"方禦t (諸如人類石 防禦素2)大致相同之對τ.α活性之功效的經修飾哺乳 類動物（例如人類）沒防絮素。更佳，其亦展現與哺乳類 動物（例如人類）0防禦素（諸如人類石防禦素2)大致相 同之對IL-10活性之功效。 根據本發明，哺乳類動物（例如人類）点防禦素（諸 如人類点防禦素2)之功能等效變異體與哺乳類動物（例如 人類）石防禦素胺基酸序列（諸如SEQ m N〇: 2 )相比可 包含1-5個胺基酸修飾，較佳丨_4個胺基酸修飾，更佳 個胺基酸修飾，最佳〗_2個胺基酸修飾且尤其丨個胺基酸修 飾。 胺基酸修飾性較佳較小，即不顯著影響多肽之摺疊及/ 或活性之保守性胺基酸取代或插入；單一缺失；胺基末端 或叛基末端小延伸；至多約20_25個殘基之小連接子肽；或 藉由改變淨電荷或另一功能而有利於純化之小延伸，諸如 聚組胺酸標記、抗原性抗原決定基或結合功能域。 保寸性取代之實例在以下胺基酸之群範圍内：驗性胺 基酸（精胺酸、離胺酸及組胺酸）、酸性胺基酸（麩胺酸及 天冬胺酸）、極性胺基酸（麩醯胺酸及天冬醯胺）、疏水性 胺基酸（白胺酸、異白胺酸及纈胺酸）、芳族胺基酸（苯丙 胺酸、色胺酸及路胺酸）及小胺基酸（甘胺酸、丙胺酸、 絲胺酸、蘇胺酸及曱硫胺酸）。一般不改變比活性之胺基酸 14 201004641 取代為此項技術所知且描述於例如H，Neurath及R.L. Hill, 1979，The Proteins, Academic Press，New York 中。最常發生 之交換為 Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、 Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、 Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu 及 Asp/Gly o 除20種標準胺基酸以外，亦可用非標準胺基酸（諸如 4-羥基脯胺酸、6-#-甲基離胺酸、2-胺基異丁酸、異纈胺酸 及α -曱基絲胺酸）取代野生型多肽之胺基酸殘基。可用有 限數目之非保守性胺基酸、不由遺傳密碼編碼之胺基酸及 非天然胺基酸取代胺基酸殘基。「非天然胺基酸」在蛋白質 合成後已經修飾及/或在其側鏈中具有不同於標準胺基酸之 化學結構。非天然胺基酸可化學合成且較佳自市面上購 得，且包括六氫於驗酸（pipecolic acid )、嘆吐咬甲酸、去 氫脯胺酸、3-曱基脯胺酸及4-甲基脯胺酸及3,3-二曱基脯胺 酸。 可根據諸如定點突變誘發或丙胺酸掃描突變誘發 (Cunningham 及 Wells, 1989，244: 1081-1085 )之此 項技術已知之程序鑑別哺乳類動物/5防禦素中之必需胺基 酸。在後一技術中，在分子中之每一殘基處引入單一丙胺 酸突變，且測試所得突變分子之生物活性（亦即，TNF- α 活性之抑制）以鑑別對分子活性至關重要之胺基酸殘基。 亦參見 Hilton 等人，1996, ·/. C/iem. 271: 4699-4708。 必需胺基酸之一致性亦可藉由分析與相關於哺乳類動物冷 防禦素之多肽之一致性來推斷。 15 201004641 可使用已知突變誘發、重組及/或改組方法，繼之以相 關篩選程序來進行一或多處胺基酸取代且對其進行測試， 諸如 Reidhaar-Olson 及 Sauer，1988，Science 241: 53-57· Bowie 及 Sauer，1989，iVoc. t/以 86. 2152-2156 ; WO 95/17413 或 WO 95/22625 中所揭示之方法 及程序。其他可使用之方法包括易錯PCR、噬菌體呈現（例 如，Lowman 等人，1991，30:10832-10837 ;美國專 利第5,223,4〇9號；WO 92/06204 )及定區突變誘發 (Derbyshire 等人，1986, Gene 46:145 ; Ner 等人，1988, DiVd 7:127)。 本發明之多肽之N-末端延伸宜由1至50個胺基酸、較 佳2-20個胺基酸、尤其3-15個胺基酸組成。在一具體態樣 中，N-末端肽延伸不含Arg ( R)。在另一具體態樣中，N_ 末端延伸包含下文將進一步定義之kex2或kex2樣裂解位 點。在一較佳具體態樣中’ N-末端延伸為包含至少兩個Glu (E )及/或Asp (D)胺基酸殘基之狀’諸如包含一個以下序 列之N-末端延伸：EAE、EE、DE及DD。 方法及用途 TNF- α抑制子具有多種如上所述可應用之用途。熟習 此項技術者應認識到，當相對於TNF- α對照組含量觀察到 統計上顯著的變化（減小）時，發生抑制。 發現人類/3防禦素1、人類万防禦素2、人類/3防禦素 3及人類冷防禦素4之變異體可在LPS激發細胞及LTA激 發細胞中降低TNF - α活性且誘發IL-1 〇活性。另外，發現 16 201004641 人類冷防禦素2可在LPS激發細胞及LTA激發細胞中減少 IL-23分泌；且發現小鼠冷防禦素3可降低鼠類與人類LPS 激發細胞及LTA激發細胞中之TNF活性。該等研究結果證 明所測試之哺乳類動物万防禦素展現極佳抗炎活性，尤其 在自體免疫疾病或病症中展現抗炎活性。 可使用較佳具體態樣之醫藥組成物治療由TNF- 活性 介導之病症。亦提供治療由TNF- α活性介導之病症之方 法’該治療包含向需要該治療之個體投予有效量之例如呈 醫藥組成物形式之哺乳類動物沒防禦素，諸如人類石防紫 素2。亦提供者為哺乳類動物冷防禦素（諸如人類卢防禦素 2 )，其用於製造醫藥品；及哺乳類動物泠防禦素（諸如人 類/5防禦素2)之用途，其用於製造供治療由TNF- α活性 介導之病症之用的醫藥品，例如醫藥組成物。治療包括治 療已有疾病或病症以及預防（pr〇phylaxis或preventi〇n )疾 病或病症® 在一具體態樣中’治療使得所治療組織中誘發之TNF_ α活性降低，較佳TNF-a活性降低且IL_1〇活性增加。 可用較佳具體態樣之化合物例如藉由抑制（inhibiti〇n

多發性硬化、動脈粥樣硬化、 I凤濕性關節炎、骨關節 硬皮病（全身性硬化）、 17 201004641 全身性紅斑狼瘡（SLE )、狼瘡、（急性）腎小球性腎炎、哮 喘（諸如支氣管哮喘）、慢性阻塞性肺病（C〇PD )、呼吸窘 迫症候群（ARDS )、發炎性腸疾病（例如克羅恩氏病（Crohn，s Disease ))、結腸炎（例如潰瘍性結腸炎）、血管炎、葡萄膜 炎、皮炎（例如發炎性皮炎）、異位性皮膚炎、毛髮脫落、 鼻炎（過敏性）、過敏性結膜炎、重症肌無力、硬化性皮炎、 肉狀瘤病' 牛皮癬關節炎、強直性脊椎炎、青少年特發性 關節炎、格雷夫斯病（Graves disease )、史格倫氏症候群 (Sj〇gren，s syndr〇me)及貝塞特氏病（Behcetdiseasd。 TNF-α抑制子可治療性用於組成物中，該等組成物經 調配用於經由任何習知途徑投藥，習知途徑包括腸内（例 如經頰、經口 '經鼻、經直腸）、非經腸（例如靜脈内、 顱内、腹膜内、皮下或肌肉内）或局部（例如，表皮、鼻 内或氣管内）。在其他具體態樣中，本 作為持續釋放植入物之一部分投予。田述之组成物可 :又其他具體態樣中’可利用提供冷來乾燥物穩定性 之適虽賦形劑將較佳具體態樣之組 物，且接著復水。 配馬冷凍乾燥 含有較佳具體態樣之TNF_a抑制子之 據習知方法，例如由混合、造粒、包覆、办紐 °艮 製造。 心解或凍乾過程 在另一具體態樣中，提供含有—或多 之醫藥組成物。出於投藥之目的， α制子 化合物為醫藥組成物。較佳具體態樣之醫 18 201004641 或多種較佳具體態樣之TNF- α抑制子及醫藥學上可接受之 載劑及/或稀釋劑。 TOT-α抑制子較佳在醫藥組成物中以有效治療特定病 症之量，即足以減少TNF-a含量或活性、減緩症狀及/或較 佳對患者具有可接受之毒性之量使用。對於該治療，適當 劑量當然應視例如所使用之本發明化合物之化學性質及藥 物動力學資料、個體宿主、投藥模式及接受治療之病狀之 性質及嚴重性而變化。然而，一般而言，為在例如人類之 較大哺乳類動物中獲得令人滿意的結果，指示每日劑量較 佳為約0.001 g至約Ug、更佳約〇〇1 丨〇g;或約每 公斤體重〇_〇1毫克至約每公斤體重20毫克、更佳約每公斤 體重0.1毫克至約每公斤體重10毫克，例如以至多達一天 四次之分開的劑投予。較佳具體態樣之化合物可以與TNF_ α活性之其他調節劑（例如低分子量抑制劑）通常使用之 類似投藥模式及類似劑量向例如人類之較大哺乳類動物投 予。在某些具體態樣中，較佳具體態樣之醫藥組成物可包 括TNF-o：抑制子，TNF_a抑制子之量視投藥途徑而定為每 單位劑型約〇·5 mg或低於0.5 mg至約1500 mg或超過1500 mg ’ 較佳約 〇·5、〇 6、〇 7、〇 8 或 〇 9 mg 至約 15〇、、 250 、 300 ' 350 、 400 、 450 、 500 、 600 、 700 、 800 、 900 或 1000 mg ’ 且更佳約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、 20 或 25 mg 至約 30、35、4〇、45、5〇、55、6〇、65、7〇、 75 ' 80、85、90、95或100 mg❶然而，在某些具體態樣中’ 低於或高於以上所提及之劑量的劑量有可能較佳。熟習此 19 201004641 項技術者可容易地決定適當的濃度及劑量。 熟習此項技術者熟知醫藥學上可接受之_及/或稀釋 劑。對於調配成液體溶液之組成物，可接受之載劑及/或稀 釋劑包括生理食鹽水及無菌水，且可視情況包括抗氧化 劑、緩衝劑、抑菌劑及其他常見添加劑。組成物亦可調配 成丸劑、膠囊、顆粒劑、錠劑（包覆或未包覆）、（可注射） 溶液、固體溶液、懸浮液' 分散液、固態分㈣（例如呈 安瓶、小瓶、乳膏、凝膠、糊狀物'吸人劑粉末、發泡體、 酊劑、唇紊、液滴、喷霧劑或栓劑形式）。調配物可含有（除 -或多種TNF-a抑制子及其他視情況選用之活性成分外） 載劑、填充劑、崩解劑、流動調節劑、糖及甜味劑、芳香 劑、防腐齊j、穩定劑、潤濕劑、乳化劑、增溶劑、調節滲 透壓之鹽、緩衝劑、稀釋劑、分散劑及表面活性劑、黏合 劑、潤滑劑及/或此項技術已知之其他醫藥賦形劑。熟習i 項技術者可進一步以適當方式且根據公認操作法（''諸如 Remington Pharmaceutical Sciences, Gennaro Mack

Publishing公司，Easton，PA 199〇中描述之操作法）調配 TNF - α抑制子。 TNF-α抑制子可單獨使用或以與—種、兩種或超過兩 種其他醫藥化合物或藥物及/或一或多種醫藥學上可接受之 賦形劑之組合療法使用。 在較佳具體態樣中，TNF_a抑制子與所使用之習知藥 物組合提供以治療TNF_a病原性或TNF a在疾病進展中 發揮關鍵或其他仙之疾病或病狀。在尤其較佳具體態樣 20 201004641 2，提供包含一或多種TNF_a抑制子以及一或多種其他醫 藥化合物之醫藥組成物，該一或多種TNF- α抑制子包括（但 人於）較佳具體態樣之化合物，該一或多種其他醫藥化 、口物包括（但不限於）治療哮喘或其他呼吸道疾病、糖尿 病、關節炎或其他發炎性疾病、免疫病症或TNF_a為病原 ^生之/、他疾病或病症的藥物。 種例樣之―子可單獨用於或與-或多 % 於治療發炎或相關疾病之藥劑之其他醫藥活性 链撼用於醫藥治療。該等其他醫藥活性劑包括例如類固 TNF 激素、其他發炎性細胞介素之抑制劑（例如抗 體、抗…體、抗IFN_r抗體）及其他細胞介 、組人1L l RA或IL_10)及其他TNF_a抑制劑。 配物二！ 括兩種或超過兩種醫藥活性劑在同-調 活性劑例如^用且^獨立調配物中之兩種或超過兩種醫藥 組；及醫趣 藥之說明書在同一包裝中出售的套 堂的自活性劑分開包裝但提供同時或連續投藥之說明 春的目由組合。甘 或同時投藥之^ '组組件可包括診斷劑、檢定、連續 式之說明金及二固劑型、復原醫藥組成物之束乾或濃縮形 舉例而言==質、投予醫藥活性劑之裝置及其類似物。 化合物之第-C包裝’其包含為較佳具體態樣之 明書。亦提種第二藥物以及組合投藥之說 物以及與n 樂包裝’其包含較佳具體態樣之化合 種醫藥包裳。：第二藥物組合投藥之說明書。亦提供- 、包含至少一種第二藥物以及與本發明化合 21 201004641 物組合投藥之說明書。 用根據較佳具體態樣之組合治療與由組合中之任一組 分單獨治療相比可提供改善或優良效果。舉例而言，可使 用包含一定量之較佳具體態樣之化合物及一定量之第二藥 物的醫藥組合，其中該等量適於產生協同治療性效應。亦 提供-種提高較佳具體態樣之化合物之治療性效用的方 法，該方法包含例如相伴或依次共投予治療有效量之較佳 具體態樣之化合物及第二藥物。亦提供一種提高第二藥物 之治療性效用的方法，該方法包含例如相伴或依次共投予 治療有效量之較佳具體態樣之化合物及第二藥物。本發明 與作為組合搭配物之第二藥物的組合可由例如以上關於較 佳具體態樣之化合物陳述之任何習知途徑投予。第二藥物 可以適當劑量投丨，例士口與單一治療所使用之齊！量範圍類 似的劑量範圍或例如在協同作用之情況下，甚至低於習知 劑量範圍》 &適的第一藥物包括化學治療藥尤其任何除較佳具 體態樣之TNF-α抑制子以外的化學治療劑。該等第二藥物 可包括例如抗炎藥及/或免疫調節藥及其類似物。 可與較佳具體態樣之化合物組合使用之抗炎藥及/或免 疫調節藥包括例如mT0R抑制劑，包括雷帕黴素 〔rapamycin)’例如4〇-〇_(2·羥基乙基）_雷帕黴素、Μ•去氧 雷帕黴素、16-0-取代雷帕黴素（諸如16_戊2-快基氧基·”_ 去氧雷帕黴素、16.戊·2·炔基氧基_卯或R)二氫_雷帕徽 素、•戊·2·块基氧基_32(S冑R)_二氫·4(μ〇·(2經基乙基）_ 22 201004641 雷帕黴素）、4〇-[3_經基_2-(經基-iEtaethyUi曱基丙酸醋]_ 雷帕黴素（亦稱為CCI779 )、40_erh〇i_(四唑基）·雷帕黴素（亦 稱為ABT5 78 )、所謂雷帕黴素類似物（rapai〇g )如Μτ國 際申請案第WO 98/02441號、pCt國際申請案第w〇 01/143 87號及PCT國際申請案第WO 03/64383號中所揭示 之類似物（諸如AP23573 )及以名稱TAFA_93及碧歐莫司 (biolinms)(碧歐莫司A9)揭示之化合物；鈣調神經鱗酸 酶抑制劑’例如環孢素A或FK 506 ;具有免疫抑制性質之 子囊黴素’例如ABT-281、ASM981 ;皮質類固醇；環鱗醯 胺；硫唑嘌呤；來氟米特（leflunomide );咪唑立賓 (mizoribine);黴酚酸或鹽；黴酚酸嗎啉乙酯；15_去氧斯匹 胍素（15-deoxyspergualine)或其免疫抑制劑同源物、類似 物或衍生物；bcr-abl酷胺酸激酶抑制劑；c-kit受體路胺酸 激酶抑制劑；PDGF受體酪胺酸激酶抑制劑，例如格列衛 (Gleevec)(伊馬替尼（imatinib)) ; p38 MAP 激酶抑制劑、 VEGF受體酪胺酸激酶抑制劑、PKC抑制劑，例如PcT國 際申請案第WO 02/38561號或PCT國際申請案第w〇 03/82859號中所揭示之抑制劑，例如實施例56或70之化 合物；JAK3激酶抑制劑’例如N-苯曱基-3,4-二羥基_亞节 基氰基乙醯胺α -氰基-(3,4-二羥基）]-N-苯甲基肉桂酿胺 (Tyrphostin AG 490)、靈菌紅素 25-C( PNUI 56804)、[4-(4，-羥基苯基）胺基-6,7-二甲氧基喹唑啉](WHI-PI 31 )、[4_(3'-溴-4、羥基苯基）-胺基-6,7-二曱氧基喹唑啉](WHI-PI 54)、 [4-(3·，5-二溴-4'-羥基苯基）-胺基-6,7-二甲氧基喹唑啉] 23 201004641 (WHI-P97)、KRX-211、3-{(3R，4R)-4-甲基-3-[曱基-(7Η·吡 咯幷[2,3-d]嘧啶-4-基）-胺基]-哌啶-1-基}-3-側氧基 -prorhoionitrile (呈游離形式或醫藥學上可接受之鹽形式 (例如單檸檬酸鹽）（亦稱為CP-690,550))或PCT國際申請 案第 W0 2004/052359號或 PCT國際申請案第 WO 2005/066156號中所揭示之化合物；SIP受體激動劑或調節 劑，例如視情況經填酸化之FTY720或其類似物，例如視情 況經磷酸化之2-胺基-2-[4-(3-苯甲氧基苯基硫基）-2-氣苯基] 乙基-1，3-丙二醇或1-{4-[1-(4-環己基-3-三氟甲基-苯甲氧 基亞胺基）-乙基]-2-乙基-苯甲基}-吖丁啶-3-曱酸或其醫藥 學上可接受之鹽；免疫抑制單株抗體，例如白血球受體之 單株抗體，例如 Blys/BAFF 受體、MHC、CD2、CD3、CD4、 CD7、CD8、CD25、CD28、CD40、CD45、CD52、CD58、 CD80、CD86、IL-12受體、IL-17受體、IL-23受體或其配 位體；其他免疫調節化合物，例如具有CTLA4或其突變體 之細胞外域之至少一部分的重組結合分子，例如與非 CTLA4蛋白質序列連接之CTLA4或其突變體之至少細胞外 部分，例如CTLA41g (例如指定為ATCC 68629 )或其突變 體，例如LEA29Y ;黏附分子抑制劑，例如LFA-1拮抗劑、 ICAM-1或ICAM-3拮抗劑、VCAM-4拮抗劑或VLA-4拮抗 劑、CCR9拮抗劑、MIF抑制劑、5-胺基水楊酸鹽（5-ASA) 劑，諸如柳氮續胺0比唆（sulfasalazine )、Azulfidine®、 Asacol®、Dipentum®、Pentasa®、Rowasa®、Canasa® ' Colazal®，例如含美沙拉秦（mesalamine )藥物，例如美色 24 201004641 明ί與二素之:合;™F_a抑制劑或抑制子，例如除本發 體，…制劑或抑制子以外，諸如結合T N F - «之抗 '央利昔單抗（infliximab ) ( Remicade® )、氧化氮 釋放型非類固醇抗炎藥（NSAID)，例如包括⑽抑制型 NO供體型藥物（CIN〇D);鱗酸二醋酶，例如Pd·抑制 劑、卡斯蛋白酶抑制劑；「多功能抗炎」_( mf趟），例 如細胞内嶙_ A2 (cPLA2)抑制劑，諸如與葡糖胺聚糖 連接之膜錨定磷脂酶A2抑制劑。 在其他較佳具體態樣中，一或多種較佳具體態樣之 TNF- 〇：抑制化合物與一或多種非類固醇抗炎藥（nSAID ) 或治療關節炎或其他發炎性疾病之其他醫藥化合物組合提 供。較佳化合物包括（但不限於）塞來昔布（ceUc〇xib ); 羅非昔布（rofecoxib ); NSAID，例如阿司匹林（aspirin )、 塞來曰布、二水楊酸膽驗鎮（choline magnesium tri salicylate )、雙氯芬酸钟（diclofenac potassium )、雙氣芬酸 鈉（diclofenac sodium)、二氣尼柳（diflunisal)、依託度酸 (etodolac )、非諾洛芬 （fenoprofen )、氟比洛芬 (flurbiprofen )、布洛芬（ibuprofen )、吲哚美辛 (indomethacin )、酮基布洛芬（ketoprofen )、酮洛酸 (ketorolac )、甲芬那酸（melenamic acid )、萘丁美 _ (nabumetone )、萘普生（naproxen)、萘普生納（naproxen sodium )、。惡丙。秦（oxaprozin )、0比羅昔康（piroxicam )、羅 非昔布、雙水揚酸鹽（salsalate )、舒林酸（sulindac)、及 托美丁（ tolmetin );及皮質類固醇（corticosteroid) ’例如 25 201004641 皮質酮（cortisone )、氫化可的松（hydrocortisone ) '曱普 賴蘇穠（methylprednisolone)、普賴松（Prednisone)、普賴 蘇穠（prednisolone )、倍他米松（betamethesone )、二丙酸 倍氣米松（beclomethasone dipropionate )、布地縮松 (budesonide )、地塞松填酸鈉(dexamethasone sodium phosphate )、氟尼縮松（flunisolide )、丙酸氟替卡松 (fluticasone propionate )、曲安奈德(triamcinolone acetonide )、倍他米松（betamethasone )、膚輕松 (fluocinolone )、醋酸氟輕松（fluocinonide )、二丙酸倍他 米松（betamethasone dipropionate )、戊酸倍他米松 (betamethasone valerate )、地奈德（desonide )、去經米松 (desoximetasone )、膚輕松(fluocinolone ) ' 曲安西龍 (triamcinolone)、曲安奈德(triamcinolone acetonide)、丙 酸氯氟美松 （clobetasol propionate ) 及地塞松 (dexamethasone)。 在尤其較佳具體態樣中，一或多種TNF- ck抑制化合物 與一或多種/3刺激劑、吸入皮質類固醇、抗組織胺劑、激 素或治療哮喘、急性呼吸窘迫或其他呼吸道疾病之其他醫 藥化合物組合提供。較佳化合物包括（但不限於）沒刺激 劑，例如通常開具之支氣管擴張藥；吸入皮質類固醇，例 如倍氣米松、氟替卡松、曲安西龍、莫米松（mometasone ) 及普賴松形式（諸如普賴松、普賴蘇穠及曱普賴蘇穠）；抗 組織胺劑，例如阿紮他啶（azatadine )、卡比沙明/偽麻黃鹼 (carbinoxamine/pseudoephedrine)、西替利嗪（cetirizine)、 26 201004641 赛庚啶 （cyproheptadine )、 右氣苯那敏 (dexchlorpheniramine)、非索非那定（fex〇fenadine)、洛拉 他啶（loratadine )、異丙嗪（proinethazine )、曲吡那明 (tripelennamine )、溴苯那敏（brompheniramine )、氯苯那敏 (cholopheniramine )、氣馬斯汀（clemastine )、苯海拉明 (diphenhydramine );及激素，例如腎上腺素0 在尤其較佳具體態樣中，一或多種TNF- 〇:抑制化合物 與一或多種麻醉劑組合提供’該一或多種麻醉劑例如乙 醇、布比卡因（bupivacaine)、氣普魯卡因（chl〇roprocaine)、 左布比卡因（levobupivacaine )、利多卡因（lidocaine )、甲 哌卡因（mepivacaine )、普魯卡因（procaine )、羅哌卡因 (ropivacaine )、丁卡因（tetracaine )、去氟烧（desflurane )、 異氟烧（isoflurane )、開他敏（ketamine )、丙泊酚 (propofol )、七氟烷（sevoflurane )、可待因（codeine )、芬 太尼（fentanyl )、氫嗎啡酮（hydromorphone )、麻卡因 (marcaine )、η底替咬（meperidine )、美沙酮（methadone )、 嗎啡（morphine )、經考酮（oxycodone )、瑞芬太尼 (remifentanil )、舒芬太尼（sufentanil )、布托啡諾 (butorphanol )、納布勻卜（nalbuphine )、曲馬多（tramadol )、 苯佐卡因（benzocaine )、狄步卡因（dibucaine )、氣乙院（ethyl chloride )、 木卡因 （xylocaine ) 及非那0比咬 (phenazopyridine) ° 在尤其較佳具體態樣中，一或多種TNF- α抑制化合物 與治療腸激躁疾病之醫藥化合物（諸如硫唑嘌呤或皮質類 27 201004641 固醇）組合提供於醫藥組成物中。 在尤其較佳具體態樣中，一或多種TNF_ α抑制化合物 與免疫抑制化合物組合提供於醫藥組成物中，在尤其較佳 具體態樣中，一或多種TNF_ α抑制與一或多種治療自體免 疫病症之藥物組合提供，該一或多種藥物例如生物反應調 節劑，諸如依那西普（etanercept)、英利昔單抗；及抑制或 干擾腫瘤壞死因子之其他化合物。 在尤其較佳具體態樣中，一或多種TNF_ α抑制化合物 與類固醇組合提供，類固醇包括皮質類固醇，例如皮質酮、 氫化可的松'甲普賴蘇穠、普賴松、普賴蘇穠、倍他米松、 二丙酸倍氣米松、布地縮松、地塞松磷酸鈉、氟尼縮松、 丙酸氟替卡松、曲安奈德、倍他米松、膚輕松、醋酸氟輕 松、二丙酸倍他米松、戊酸倍他米松、地奈德'去羥米松、 膚輕松、曲安西龍、曲安奈德、丙酸氣氟美松及地塞松。 在某些疾病之治療中，用TNF- α抑制子與麻醉劑組合 治療患者可能較有益’該麻醉劑例如乙醇、布比卡因、氯 普魯卡因、左布比卡因、利多卡因、曱η辰卡因、普魯卡因、 羅哌卡因、丁卡因、去氟烷、異氟烷、開他敏、丙泊酚、 七氟烷、可待因、芬太尼、氫嗎啡酮、麻卡因、哌替啶、 美沙酮、嗎啡、羥考酮、瑞芬太尼、舒芬太尼、布托啡諾、 納布啡、曲馬多、苯佐卡因、狄步卡因、氣乙烷、木卡因 及非那ntt»定。 試管内合成 諸如人類万防禦素2之哺乳類動物点防禦素可使用此 28 201004641 項技術已知之習知方法由試管内合成製備。可利用多種商 業合成裝置’例如Applied Bi〇systems公司、Beckman等之 自動合成儀。藉由使用合成儀，彳用非天然胺基酸、尤其 D-異構物（或D·形式）（例如D_丙胺酸及〇_異白胺酸）、非 對映異構物、具有不同長度或官能基之側鍵及其類似物取 代天然存在之胺基酸。特定序列及製備方式將由適宜性、 經濟、所需純度及其類似因素決定。 可提供與包含適宜鍵結官能基之多種肽或蛋白質之化 學鍵聯，該等官能基對於酿胺或經取代胺形纟（例如還原 胺基化）言為胺基，對於硫喊或二硫化物形成而言為硫 醇基，對於醯胺形成而言為羧基及其類似物。 必要時，合成期間或表現期間可向肽中引入多個允許 與其他分子或表面鍵聯之基。因此，可使用+耽胺酸製 得硫醚，組胺酸用於鍵聯金屬離子錯合物，羧基用於形成 醯胺或酯，胺基用於形成醯胺及其類似物。 亦可根據重組合成之習知方法分離且純化哺乳類動物 召防$素。洛解產物可由表現宿主製備，且溶解產物可使 用HPLC、排阻層析、凝膠電泳、親和層析或其他純化技術 純化。 本發明之其他方面及具體態樣概述如下： 申4專利範圍第1〇項一種哺乳類動物冷防禦素，其 ㈣治療選自由以下者所組成之群組之發炎性疾病或病 症.類風濕性關節炎、骨關節炎、多發性硬化、動脈粥樣 硬皮病（全身性硬化）、狼瘡、全身性紅斑狼瘡（SLE )、 29 201004641 (急性）腎小球性腎炎、哮喘、慢性阻塞性肺病（c〇pD)、 呼吸窘迫症候群（ARDS )、血管炎、葡萄瞑炎、皮炎、異 位性皮膚炎、毛髮脫落、鼻炎（過敏性）、過敏性結膜炎、 重症肌無力、硬皮病、肉狀瘤病、牛皮癬關節炎、強直性 脊椎炎、青少年特發性關節炎、格雷夫斯病 '史格倫氏症 候群及貝塞特氏病。 申請專利範圍第11項·如申請專利範圍第第1〇項之哺 乳類動物β防禦素’其係非經腸投予。 申请專利範圍第12項·如申請專利範圍第第丨丨項之哺 乳類動物/3防禦素，其係皮下或靜脈内投予。 申請專利範圍帛13項.如申請專利範圍第帛1〇至12 項中任-項之哺乳類動物万防㈣，其為人㈣防紫素。 申請專利範圍第14項.如申請專利範圍第第1〇至13 項中任-項之哺乳類動物“禦素，其與seqidn〇:卜 SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3 或 SEQ m NQ: * 之胺基酸序 列具有至少80%之一致性。 申請專利範圍第15項.如申請專利範圍第帛10至14 項中任-項之哺乳類動物石防禦素，其為人類Μ禦素卜 人類万防紫素2、人類^禦素3或人類β防禦素4。 申請專利範圍第16項.如申請專利範圍第第1〇至15 項中任-項之哺乳類動物$防禦素，其與SEQiDN〇:k 胺基酸序列具有至少80%之一致性。 申清專利範圍第17項·如申請專利範圍第第1〇至16 項中任-項之哺乳類動物万防禦素，其為人类”防禦素2。 30 201004641 申句專利範圍第18項·如申請專利範圍第第10至17 項中任$之_乳類動物石防紫素，其中在所治療組織中 TNF- α活性降低。 本發明由下列實施例進一步描述，該等實施例不應理 解為限制本發明之範_。 實施例 實施例1 人類彡防禦素2( hBD2 )之抗炎活性 在測試hBD2之免疫調節效應期間，出乎意料地觀察到 hBD2具有巨大的抗炎潛能。在人類PBMC培養物中，可觀 察到用hBD2治療對Lps、LTA或肽聚糖刺激培養物之細胞 介素分布產生重大影響。先前已觀察到hBD2能夠誘發促發 炎性細胞介素及趨化因子IL-6、IL-1冷、RANTES、IP-10 及 IL-8 (Niyonsaba 等人，2007 ; Boniotto M.等人，2006)。 此處，吾人顯示hBD2對兩種促發炎性細胞介素TNF 及1L-1召具有下調潛能；且hBD2在S旨多醣（LPS )、脂鱗 壁酸（LTA )或肽聚糖（PGN )誘發發炎性刺激後亦誘發 IL-10。IL-10為潛在抗炎細胞介素且因此所得hBD2之效應 為抗炎效應。人類PBMC、單核細胞細胞株及類樹狀細胞株 (dendritoid cell line )已觀察到該結果。 材料及方法： hBD2之產生

重組產生hBD2。將編碼hBD2之合成DNA片段（DNA 31 201004641 2.0)選瘦於ρΕΤ-32(+)表現載體（Novagen)中。所得質體 編碼轉譯融合肽，該轉譯融合肽含有N_末端硫氧還蛋白部 分，繼之以his-標記、腸激酶裂解位點且最後為hBD2肽。 將表現質體轉型於大腸桿菌（五.coh·)菌株BL21中。 在含有100微克/毫升胺苄青黴素之TB-甘油中稀釋該 菌株之隔夜培養物100倍且在37。(：下生長至OD600為約8 且用0.5 mM IPTG誘發3小時，此後藉由離心收集細胞。 使用標準方案在Ni-NTA珠粒（QIAGEN)上純化his標記 之trx-hBD2融合肽。接著將his-標記純化融合肽透析於腸 激酶緩衝劑（50 mM tris-HCl ( pH 7.5 ) 、1 mM CaCl2)中 隔夜，且用腸激酶裂解以釋放成熟hBD2。使用Source 15 S 基質（Amersham Biosciences )由陽離子交換層析進一步純 化hBD2肽。使用MALDI-TOF質譜驗證hBD2之修正分子 量。 使用相同方案產生mBD3 (參見實施例4 )。 接著使用與LC-MS及NMR光譜學聯結之胰蛋白酶分 解驗證hBD2分子之適當摺疊及二硫橋拓撲學。 由製備型RP-HPLC在低pH值下自hBD2及mBD3製 劑移除内毒素，且由LAL檢定（Endosafe KTA2 )測定内毒 素含量且發現含量低於檢定之偵測極限（〇.〇5 EU/mg )。為 確定低於内毒素檢定之偵測極限之含量不能刺激PBMC，作 極有效脂多醣（大腸桿菌，0111:B4，Sigma L4391 )之刺 激滴定曲線。極低含量之該LPS ( 0.06 ng/ml )能夠刺激 PBMC產生可彳貞測之細胞介素。 32 201004641

分離及刺激PBMC 自健康志願者（經丹麥相關倫理委員會批准）抽取末 梢血液《用RPMI ln (v/v)稀釋肝素化血液且在抽取後2 小時内，使之進行^⑺丨丨密度離心。自個別供體之上層收集 血漿且保持在冰上直至其以2%用於培養基中（自體培養 基）。將經分離PBMC再懸浮於自體培養基中且接種於96 孔培養板中，每孔255,000個細胞，總體積為2〇〇微升。以 100、10或1私g/ml hBD2單獨刺激或與0.6 ng/mL或2〇 ng/mL LPS (大腸桿菌，〇iii:B4，Sigma L4391 ) 、1.25 " g/ml脂麟壁酸（LTA )(來自枯草桿菌u以⑽…），叫邮 L3265)或40 Ag/ml肽聚糖（PGN)(來自金黃色葡萄球 菌（& awreMs )，Sigma 77140 ) —起刺激相同供體之pbmc。 在最初實驗中針對3種不同供體優化用於刺激之濃度，對 於LPS，使用兩種不同濃度以確保其處於有可能調節之細胞 介素含量。在一些實驗中，用地塞松及吲哚美辛單獨以及 與LPS或LTA —起處理PBMC作為下調發炎性細胞介素之 對照組。在37°C下培育24小時後收集上清液，且儲存在_8〇 °C下直至量測細胞介素。在所有實驗中由阿拉馬藍（Alamar Blue) ( Biosource ’ DALL 1100)量測生存力，且在一些狀 況下亦根據製造商之說明書由MTS ( Promega )量測生存 力，且在一些實驗中’亦藉由以Nucleocounter計數細胞來 判斷。 培養及刺激MUTZ-3 將衍生自人類骨髓白血病之細胞株MUTZ-3 ( DSMZ， 33 201004641

Braunschweig，Germany)維持在補充有2〇%〔體積/體積 (Wv)〕胎牛企清（Sigma F6178)及 40 ng/ml rhGM-CSF (R&D Systems 215-GM-050)的 a_MEM (Sigma M4526 ) 中。該等祖細胞位於以下說明之單核細胞細胞株中且該等 單核細胞經100、10或1 /z g/ml hBD2單獨刺激或與LPS 或L T A —起刺激。 樹狀細胞分化 為產生類樹狀細胞株，使人類骨髓白血病細胞株 MUTZ-3 (ΙχΙΟ5 個細胞/毫升）在 rhGM-CSF ( 150 ng/ml) 及rhlL-4 ( 50 ng/ml )存在下分化成不成熟DC歷時7天。 每2-3天更換培養基。進一步在hBD2存在或不存在下用 LPS或LTA刺激分化之細胞株以探索hBD2對樹狀細胞之 效應。 細胞介素量測 在FACSarray流式細胞計數儀上根據製造商之說明書 (BD )用人類發炎細胞計數珠粒陣列（cbA )由流式細胞 計數量測上清液中細胞介素之產生《量測以下細胞介素： IL-8、IL-1 召、IL-10、TNF、IL-12 p70、IL-6。在一些實驗 中’根據製造商之說明書由R&D systems之ELIS A套組 (IL-1 〇、TNF- 〇:、IL-1 /5 )量測細胞介素。 數據分析 所有實驗執行至少兩次，顯示代表性結果。所呈現之 數據可以平均值+/-標準偏差（SD )表示。由變異數為治療 (hBD2、地塞松等）及刺激（LPS、LTA、肽聚糖等）之雙 34 201004641 因子（2-way)ANOVA，接著由邦弗朗尼事後檢驗（Bonferroni post-test)確定統計顯著性，如表圖例中所報導。p < 0.05 視為差異顯著。 結果 測試hBD2對經或未經LPS及LTA治療之人類PBMC 之效應（表1、2及3)。hBD2之治療使得所有三個測試濃 度之刺激培養物中之TNF顯著下調（表1)，該下調對〇.6 ng/ml之LPS而言及對LTA而言係呈劑量依賴型。對於IL-1 沒’主要在最高劑量下觀察到下調（表2)。引人關注的是 IL-10劑量依賴性顯著上調（表3) ^促發炎性細胞介素之 下調及抗炎細胞介素之誘發顯示hBD2之極強抗炎潛能。由 兩種不同檢定量測生存力以排除hBD2歸因於細胞毒性效 應之抗炎效應。在表4及表5中，可見hBD2不對細胞產生 細胞毒性效應’所觀察到之效應為歸因於導致細胞增殖之 LPS或LTA之刺激的刺激效應。因此，hBD2不對該等細胞 產生細胞毒性效應。 在表6、7及8中，由ELISA而不是由流式細胞計數以 細胞計數珠粒陣列分析另一供體之上清液中之細胞介素， 此處觀察到相同結果，但檢定之靈敏度較低且偵測極限高 得多，且因此效應不顯著。 為測試另一類鐸受體配位體，研究hBD2對肽聚糖刺激 之PBMC的效應（表9及1〇)。觀察到相同結果：TNF劑 量依賴性下調且IL_10劑量依賴性誘發。 作為TNF下調之陽性對照組，在檢定中測試兩種抗炎 35 201004641 化口物’地塞松及十木美辛。選擇漢度以使化合物無毒且 為由於培養基中之溶解度可達成之濃度。經lta刺激後， 僅弓ί木美辛抑帝J TNF (表11 )，而地塞松有效下調tnf產 生’ IL-Ιβ亦觀察到相同結果（表13)"引η朵美辛為cop 及COX.2抑㈣Μ詩治療輕度至中度疼痛之非類固醇 抗炎藥（NSAID)且有助於減輕關節炎之症狀且地塞松為 主要用於治療I炎性病症之合成糖皮質激素且其在極低劑 量下對促發炎性細胞介素具有極有效的下調效應（R〇wiand 等人，！998 ) ’對於TNF_a及IL_1/S，吾人亦觀察到相同 結果》hBD2與該兩種抗炎化合物一樣有效或比其有效。 在表14及15中，顯示hBD2對單核細胞細胞株中之下 調TNF及樹狀細胞的效應，對PBMC亦觀察到相同結果。 經hBD2及LPS或hBD2及LTA刺激之樹狀細胞亦誘發 IL-10 (結果表中未示）。 為排除hBD2與LPS或LTA之結合引起TNF及IL-1沒 之下調，測试hBD2對合成配位體（pam3csK4 ( TLR2-TLR1 配位體）’ InvivoGen tlrt-pms )所致之PBMC刺激的效應。 在經該配位體刺激後，hBD2亦能夠下調TNF，表明Lps或 LTA之中和不會引起所觀察到的效應（結果表中未示）。 此外’含有TNF- α及IL- α之細胞介素混合物以及hBD2對 樹狀細胞之刺激與僅細胞介素混合物之刺激相比對1L _ 1点 及IL-8及IL-6具有下調效應。顯然，未分析到歸因於tnf_ α之刺激之對TNF的效應（結果表中未示）。 表1 .在hBD2存在及不存在下經LPS或LTA處理後， 36 201004641 自人類末稍血液單核細胞（PBMC )產生TNF，所有樣本針 對相同供體測試，出自5種供體之代表性實驗。在FACSarray 上由細胞計數珠粒陣列（CBA )量測TNF，***指由雙因子 ANOVA分析（各數據集之N =約200 )，與各自對照組（粗 體）相比，p<0.001。 TNF, pg/ml (SD) 對照組 hBD2 100 pg/ml hBD2 10 jxg/ml hBD2 1 pg/ml 培養基 7.3 (5.9) 2.9 (5.1) 2.6 (6.6) 4.2 (10.7) LPS 1708.6 634.2 1076.4 944.8 0.6 ng/ml (428.3) (226.1)*** (278.0)*** (326.6)*** LPS 2572.1 1733.9 1306.6 1526.9 20 ng/ml (581.1) (461.3)*** (375.0)*** (444.2)*** LTA 1097.4 375.2 494.7 711.5 1 ·25 gg/ml (293.8) (114.2)*** (158.1)*** (282.5)*** 表2 :在hBD2存在及不存在下經LPS或LTA處理後， 自人類末稍血液單核細胞（PBMC)產生IL-1/3，所有樣本 針對相同供體測試，出自5種供體之代表性實驗。在 FACSarray上由細胞計數珠粒陣列（CBA)量測IL-1 /3，*** 指由雙因子ANOVA分析（各數據集之N =約200)，ρ<0·0(Η。 IL-1/3, pg/ml (SD) 對照組 hBD2 100 pg/ml hBD2 10 pg/ml hBD2 1 pg/ml 培養基 4.2 (4.7) 5.3 (7.1) 3.8 (5.8) 4.1 (51.0) LPS 1734.3 811.0 1949.8 1436.2 0.6 ng/ml (347.0) (454.4)*** (396.4)*** (429.7)*** LPS 2629.5 1502.1 2273.9 1889.3 20 ng/ml (533.7) (407.5)*** (486.5)*** (504.8)*** LTA 748.5 538.3 935.3 986.7 37 201004641 1.25 ^g/ml (172.4) (137.3)*** (238.0)*** (738.7)*** 表3 :在hBD2存在及不存在下經LPS或LTA處理後， 自人類末稍血液單核細胞（PBMC)產生IL-10，所有樣本 針對相同供體測試，出自5種供體之代表性實驗。在 FACSarray上由細胞計數珠粒陣列（CBA)量測IL-10，*** 指由雙因子ANOVA分析（各數據集之N =約200 )， p<0.001 ， **指 ρ<0·01 ， *指 ρ<0.5 。 IL-10, pg/ml (SD) 對照組 hBD2 100 pg/ml hBD2 10 pg/ml hBD2 1 pg/ml 培養基 2.09 (8.65) 2.9 (4.6) 1.6 (4.1) 2.09 (4.3) LPS 63.15 232.7 325.7 97.2 0.6 ng/ml (302.5) (61.5)*** (88.2)*** (31.1)* LPS 70.4 383.3 355.8 111.3 20 ng/ml (22.8) (133.6)*** (99.5)*** (38.8)** LTA 14.0 175.6 136.6 39.9 1.25 /ig/ml (226.1) (57.0)*** (44.7)*** (16.9) 表4 :由MTS檢定量測之24小時刺激後PBMC之生存 力。由雙因子ANOVA，接著由邦弗朗尼事後檢驗檢驗，各 列中具有不同下標字母之值差異顯著。 生存力，MTS (Abs 490 nm (SD)) 對照組 hBD2 100 pg/ml hBD2 10 pg/ml hBD2 1 pg/ml 培養基 1.4 (0.2) 1.2 (0.05)3 1.5 (0.2)a 1.3 (0.2) LPS 0.6 ng/ml 1.6 (0.02) 1.6 (0.1)ab 2.0 (0.2)b 1.5 (0.2) 38 201004641 LPS 1.5 1.9 1.8 1.6 20 ng/ml (0.1) (0.2)b (0.3)ab (0.3) 表5 :由阿拉馬藍（Alamar Blue)量測之PBMC生存 力，出自5種不同供體之5個實驗中之一個代表性實驗。 由雙因子ANOVA，接著由邦弗朗尼事後檢驗檢驗，各列中 具有不同上標字母之值及各行中具有不同上標數字之值差 異顯著。 生存力，阿拉馬 對照組 hBD2 hBD2 hBD2 藍（RFU(SD)) 100 pg/ml 10 μ^/ναΐ 1 jttg/ml 培養基 4097130 3950053 3683369 4064143 (166631) (34466)3 (355296)a (104634) LPS 4279424 4831188 4664362 4230588 0.6 ng/ml (336188) (67646)b (147776)b (139745) LPS 4604671 4765256 4623818 4561739 20 ng/ml (125840) (41383)b (56643)b (138852) LTA 4018914 4664185 4677870 4148294 1.25 pg/ml (632833)1 (154023)b，2 (10199)b，2 (182730)12 表6 :經hBD2、LTA、LPS或其組合刺激後PBMC之 TNF- <2分泌。由ELISA量測TNF- a，nd :未 <貞測到，檢定 之偵測極限為0.01 ng/m卜*指與各自對照組相比，p<0.05， **指與各自對照組相比，ρ<〇.〇1。 TNF_% ng/ml (SD) 對照組 hBD2 100 /ig/ml hBD2 10 μ^ιηΐ hBD2 1 Mg/ml 培養基 nd nd nd nd LPS 0.99 0.41 0.59 0.70 0.6 ng/ml (0.27) (0.03)** (0.08)* (0.18) LPS 1.44 0.53 0.49 1.18 20 ng/ml (0.31) (0.01)** (0.05)** (0.42) 39 201004641 LTA 0.90 0.21 0.27 0.65 1.25 pg/ml (0.32) (0.05)* (0.04)* (0.29) 表7 :經hBD2、LTA、LPS或其組合刺激後，PBMC 之IL-10分泌，由ELISA量測TNF- a，nd :未偵測到，檢 定之彳貞測極限為0.03 ng/mL。 IL-10, ng/ml 對照組 hBD2 hBD2 hBD2 (SD) 100 /ig/ml 10 jLtg/ml 1 /ig/ml 培養基 nd nd nd nd LPS nd 0.14 0.04 nd 0.6 ng/ml (0.04) (0.0) LPS nd 0.46 0.34 nd 20 ng/ml (0.04) (0.04) LTA nd nd nd nd 1.25 μ^ιηΐ 表8 :經hBD2、LTA、LPS或其組合刺激後，PBMC 之IL-1冷分泌，由ELISA量測TNF- a，nd :未偵測到，檢 定之偵測極限為0.016 ng/mL，**指與各自對照組相比， p<0.0 1。 IL-ljS, ng/ml (SD) 對照組 hBD2 100 jUg/ml hBD2 10 /xg/ml hBD2 1 /xg/ml 培養基 nd nd nd nd LPS 0.318 0.275 0.268 0.237 0.6 ng/ml (0.087) (0.015) (0.039) (0.007) LPS 0.920 0.395 0.354 0.638 20 ng/ml (0.267) (0.033)** (0.013)** (0.159) LTA 0.291 0.281 0.193 0.224 1.25 μ§/τη1 (0.092) (0.059) (0.019) (0.030) 40 201004641 表9 :在hBD2存在及不存在下，經PGN處理後，自人 類末稍血液單核細胞（PBMC )產生TNF，所有樣本針對相 同供體測試。在FACS array上由細胞計數珠粒陣列（CB A ) 量測TNF，***指由雙因子ANOVA分析（各數據集之N = 約200 )，與各自對照組相比，ρ<0·001。 TNF, pg/ml (SD) 對照組 hBD2 100 pg/ml hBD2 10 pg/ml hBD2 1 μ§/τη\ 培養基 0.0 (4.0) 3.6 (5.3) 3.7 (6.2) 3.4 (5.2) PGN 40 pg/ml 1099.1 (251.6) 274.9 (71.6)*** 362.0 (97.7)*** 809.9 (246.7)*** 表10 :在liBD2存在及不存在下，經PGN處理後，自 人類末稍血液單核細胞（PBMC)產生IL-10，所有樣本針 對相同供體測試。在FACS array上由細胞計數珠粒陣列 (CBA)量測TNF，***指由雙因子ANOVA分析（各數據 集之N =約200)，與各自對照組相比，p<0.001。 IL-10, pg/ml 對照組 hBD2 hBD2 hBD2 (SD) 100 pg/ml 10 pg/ml 1 pg/ml 培養基 0.0 (4.1) 3.0 (9.6) 3.6 (13.1) 3.0 (4.8) PGN 381.3 1054.2 523.4 337.8 40 pg/ml (92.3) (179.3)*** (111.5)*** (89.1) 表11 :在hBD2或抑制TNF之兩種不同對照組（地塞 松及吲哚美辛）存在及不存在下，經LPS或LTA處理後， 41 201004641 自人類末稍血液單核細胞（PBMC )產生TNF ;所有樣本針 對相同供體測試。在FACSarray上由細胞計數珠粒陣列 (CBA )量測TNF，由雙因子ANOVA分析（各數據集之N =約200 )，與各自對照組（粗體）相比，加下劃線之值顯 著減小。 TNF, ng/ml 培養基 LPS LPS LTA (SD) 0.6 ng/ml 20 ng/ml 1.25 pg/ml 對照組 0.0 1.43 2.84 6.72 (0.0) (0.05) (0.07) (0.14) 地塞松 0.0 0.038 1.69 1.75 35 ng/ml (0.0) (0.004) (0.05) (0.05) 地塞松 0.0 0.30 0.91 2.05 3.5 ng/ml (0·0) (0.01) (0.03) (0.06) 地塞松 0.0 0.61 6.04 4.73 0.35 ng/ml (0·0) (0.02) (0-14) (0.10) 吲哚美辛 0.0 1.71 2.70 5.80 7.2 ug/ml (0.0) (0.07) (0.07) (0.13) 吲哚美辛 0.0 1.56 7.54 5.50 0.72 ug/ml (0_0) (0.04) (0.17) (0.13) hBD2 0.0 0.003 0.000 0.11 1000 (0·0) (0.002) (0.002) (0.01) hBD2 0.0 0.000 0.038 1.15 100 jug/ml (0.0) (0.002) (0.003) (0.04) hBD2 0.0 0.20 0.35 2.33 10 pg/ml (0.0) (0.01) (0.01) (0.06) hBD2 0.0 0.17 6.24 3.90 1 jitg/ml (0·0) (0.01) (0.14) (0.10) 表12 :在hBD2或抗炎效應之兩種不同對照組（地塞 松及吲哚美辛）存在及不存在下，經LPS或LTA處理後， 自人類末稍血液單核細胞（PBMC)產生IL-10 ;所有樣本 42 201004641 針對相同供體測試。在FACS array上由細胞細胞珠粒陣列 (CBA)量測IL-10，由雙因子ANOVA分析（各數據集之 N =約200 )，與各自對照組（粗體）相比，加下劃線之值 顯著增加。 IL-10, pg/ml 培養基 LPS LPS LTA (SD) 0.6 ng/ml 20 ng/ml 1.25 pg/ml 對照組 0.0 53.9 123.4 170.1 (218.8) (3.1) (4.6) (5.5) 地塞松 0.0 100.4 152.5 175.2 35 ng/ml (1.4) (3.8) (5.2) (6.6) 地塞松 2.7 64.6 122.8 112.5 3.5 ng/ml (1.9) (3.3) (4.7) (3.9) 地塞松 3.9 46.8 197.1 126.6 0.35 ng/ml (1.9) (2.8) (7.2) (4.7) 吲哚美辛 0.0 45.7 77.9 90.4 7.2 ug/ml (1_5) (2.5) (3.6) (4.9) 吲哚美辛 0.0 37.3 108.0 84.9 0.72 ug/ml (1.4) (19.6) (4.4) (3.5) hBD2 0.0 30.8 50.5 465.2 1000 pg/ml (1.6) (2.6) (3.2) (16.3) hBD2 0.0 173.5 885.2 766.0 100 /xg/ml (4.9) (5.7) (22.2) (21.7) hBD2 3.9 165.1 497.5 355.8 10 pg/ml (1.7) (5.6) (13.5) (9.4) hBD2 0.0 42.7 207.0 142.1 1 pg/ml (1.9) (2.8) (6.9) (4.9) 表13 :在hBD2或抗炎效應之兩種不同對照組（地塞 松及吲哚美辛）存在及不存在下，經LPS或LTA處理後， 自人類末稍血液單核細胞（PBMC)產生IL-1召；所有樣本 針對相同供體測試。在FACS array上由細胞計數珠粒陣列 43 201004641 (CBA)量測IL-l /3，由雙因子ANOVA分析（各數據集之 N =約200 )，與各自對照組（粗體）相比，加下劃線之值 顯著減小。 IL-1/3, ng/ml 培養基 LPS LPS LTA (SD) 0.6 ng/ml 20 ng/ml 1.25 μ§/πι1 對照組 0.00 3.96 6.58 11.47 (0.06) (0.18) (0.23) (0.38) 地塞松 0.00 1.00 2.32 3.98 35 ng/ml (0.00) (0.03) (0.07) (0.14) 地塞松 0.00 1.90 3.58 5.22 3.5 ng/ml (0.00) (0.06) (0.12) (0.19) 地塞松 0.01 23 5.56 7.91 0.35 ng/ml (0.00) (0.09) (0.18) (0.28) 吲哚美辛 0.04 4.1 6.12 8.91 7.2 ug/ml (0.00) (0.13) (0.23) (0.30) 吲哚美辛 0.01 3.1 6.46 7.53 0.72 ug/ml (0.00) (0.18) (0.22) (0.31) hBD2 0.01 0.53 1.19 4.43 1000 μ^ιηΐ (0.00) (0.02) (0.08) (0.14) hBD2 0.00 0.38 1.67 9.12 100 μ§/ηύ (0.00) (0.01) (0.05) (0.32) hBD2 0.06 1.13 3.58 11.0 10 pg/ml (0.00) (0.04) (0.12) (0.37) hBD2 0.01 1.83 4.91 8.87 1 μξ/ml (0.00) (0.06) (0.19) (0.29) 表14 :在hBD2存在及不存在下，經LPS或LTA處理 後自人類單核細胞細胞株（MUTZ-3 )之上清液中產生TNF。 在FACSarray上由細胞計數珠粒陣列（CBA )量測TNF，* 指由雙因子ANOVA分析（各數據集之N =約200 )，與各 自對照組相比，p<0.05，**指與各自對照組相比，ρ<0·01。 44 201004641 TNF, pg/ml 對照組 hBD2 hBD2 hBD2 (SD) 100 pg/ml 10 pg/ml 1 pg/ml 培養基 0.00 0.00 2.60 2.21 (5.56) (5.47) (7.17) (7.88) LPS 6.38 3.93 3.93 6.61 1.5 pg/ml (9.28) (6.63)* (6.93)* (9.17) LTA 5.28 2.64 3.76 1.75 1,5 pg/ml (9.75) (29.19)* (7.72) (6.96)** 表15 :在hBD2存在及不存在下，經LPS或LTA (產 生成熟樹狀細胞（D C ))刺激之不成熟樹狀細胞之上清液 中產生TNF。在FACSarray上由細胞計數珠粒陣列（CBA ) 量測TNF，*指由雙因子ANOVA分析（各數據集之N =約 200)，與各自對照組相比，顯著減小之p<〇.〇5，**指與各 自對照組相比，顯著減小之p<0.01。 TNF, pg/ml 對照組 hBD2 hBD2 hBD2 (SD) 100 pg/ml 10 pg/ml 1 pg/ml 培養基 0.00 0.00 1.89 4.64 (1.74) (1.83) (2.15) (10.26) LPS 23.73 7.66 13.8 18.04 1·5 pg/ml (3.28) (2.51)*** (2.33)*** (2.89)*** LTA 3.78 5.22 2.76 0.00 1.5 pg/ml P.26) (2.25) (2.27)* (1.98)*** 實施例2 hBDl、hBD2、hBD3及hBD4變異體之抗炎活性 基本上如實施例1中所述進行實施例2。下表中所示之 化合物rhBD2為重組hBD2,其與實施例1中所使用之hBD2 一致。 45 201004641 下表中所示之化合物hBDl、hBD2、hBD3及hBD4變 異體係利用化學合成製備及自Peptide institute公司獲得。 重組hBD2 ( rhBD2 )之胺基酸序列與化學合成製備之 hBD2之胺基酸序列一致。 下表中所示之hBD4變異體由hBD4之胺基酸3-39組 成，且胺基酸序列以SEQ ID NO: 5顯示。 在各表中，所有樣本針對對相同供體測試。SD意謂標 準偏差。 結果 表16:在人類yS防禦素、地塞松或英利昔單抗存在及 不存在下，經LPS治療後，自人類末稍血液單核細胞 (PBMC )產生TNF。在FACSarray上由細胞計數珠粒陣列 (CBA)量測TNF，*指由雙因子ANOVA分析且由邦弗朗 尼事後檢驗與未處理細胞相比，P<〇.〇5，**指ρ<〇·〇1，*** 指 ρ<0.001 ° 測試化合物 培養基 LPS 20 ng/ml LPS 0.6 ng/ml TNF pg/ml (SD) 對照組之 % TNF pg/ml (SD) TNF pg/ml (SD) 對照組之 % 培養基 1 2164 728 100% 100% 100% (未處理） (1) (632) (156) rhBD2 0 167 74 - 8% 10% 40 μ^πιΐ ⑼ (17)*** (5)*** rhBD2 0 260 125 _ 12% 17% 10 pg/ml ⑼ (29)*** (20)** rhBD2 1 - 918 42% 196 27% 46 201004641 1 pg/ml ⑼ (373)*** (104)** hBDl 40 pg/ml 0 (〇) - 999 (116)*** 46% 91 (8)** 13% hBDl 10 pg/ml 0 Ο) - 1311 (417)*** 61% 203 (20)** 28% hBDl 1 pg/ml 1 (1) - 1395 (201)*** 64% 474 (187) 65% hBD2 40 pg/ml 0 ⑼ - 52 (71)*** 2% 176 (103)** 24% hBD2 10 pg/ml 0 (〇) - 132 (179)*** 6% 304 (108)* 42% hBD2 1 pg/ml 0 ⑼ - 411 (581)*** 19% 242 (30)* 33% HBD-3 1 pg/ml 0 (〇) - 451 (24)*** 21% 528 (98) 73% hBD4變異體 10 μ§/πι1 0 ⑼ - 139 (6)*** 6% 211 (22)** 29% hBD4變異體 1 pg/ml 0 (〇) - 778 (27)*** 36% 468 (59) 64% 地塞松 0 (〇) - 635 (163)*** 29% 47 ⑻; 6% 英利昔單抗 0 (〇) - 0 (〇)*** 0% 0 (〇)*** 0% 表17:在人類冷防禦素、地塞松或英利昔單抗存在及 不存在下，經LPS治療後，自人類末稍血液單核細胞 (PBMC)產生IL-10。在FACSarray上由細胞計數珠粒陣 列（CBA)量測IL-10，*指由雙因子ANOVA分析且由邦弗 朗尼事後檢驗與未處理細胞相比，ρ<〇.〇5，**指p<0.(H，*** 47 201004641 指 p<0.001 ° 測試化合物 培養基 LPS 20 ng/ml LPS 0.6 ng/ml IL-10 pg/ml (SD) 對照組之 % IL-10 pg/ml (SD) IL-10 pg/ml (SD) 對照組之 % 培養基 (未處理） 0 ⑼ 100% 111 (3) 100% 66 (5) 100% rhBD2 40 pg/ml 0 ⑼ _ 281 252% 108 (4)* 162% rhBD2 10 pg/ml 0 ⑼ - 243 (38)*** 218% 103 (14)* 155% rhBD2 1 pg/ml 0 ⑼ - 126 (14) 113% 72 (9) 108% hBDl 40 pg/ml 0 ⑼ - 113 (5) 102% 69 (4) 104% hBDl 10 pg/ml 0 ⑼ - 100 (l) 90% 76 (13) 114% hBDl 1 pg/ml 0 ⑼ - 95 (17) 85% 71 ⑹ 108% hBD2 40 pg/ml 0 ⑼ - 323 (〇)*** 290% 131 (13)+++ 197% hBD2 10 pg/ml 0 ⑼ - 240 (〇)*** 215% 86 ⑹ 130% hBD2 1 pg/ml 0 ⑼ - 123 ⑼ 110% 53 (5) 80% hBD3 1 pg/ml 0 ⑼ - 152 (72)* 137% 71 (2) 107% hBD4變異體 10 pg/ml 0 ⑼ - 187 168% 92 (17) 139% hBD4變異體 0 - 175 157% 90 136% 48 201004641 1 pg/ml ⑼ (14) 地塞松 0 ⑼ - 75 ⑹* 67% 47 (3) 70% 英利昔單抗 0 ⑼ - 63 {!)** 56% 46 (9) 69% 表18:在人類石防禦素、地塞松或英利昔單抗存在及 不存在下，經LPS治療後，自人類末稍血液單核細胞 (PBMC )產生IL-1 0。在FACSarray上由細胞計數珠粒陣 列（CBA)量測IL-1 /3，***指由雙因子ANOVA分析且由 邦弗朗尼事後檢驗與未處理細胞相比，p<〇.001。 測試化合物 培養基 LPS 20 ng/ml LPS 0.6 ng/ml IL-Ιβ pg/ml (SD) 對照組之 % IL-Ιβ pg/ml (SD) IL-Ιβ pg/ml (SD) 對照組 之％ 培養基 (未處理） 0 ⑼ 100% 2544 026) 100% 741 (93) 100% rhBD2 40 pg/ml 0 ⑼ - 395 (25)*** 16% 124 17% rhBD2 10 pg/ml 0 ⑼ - 624 (37)*** 25% 214 氺氺氺 29% rhBD2 1 pg/ml 0 ⑼ - 1480 (154)*** 58% 284 (15)*** 38% hBDl 40 μ§/ιη1 0 ⑼ - 1599 (14)*** 63% 302 41% hBDl 10 pg/ml 0 ⑼ - 1913 (53)*** 75% 401 54% hBDl 1 pg/ml 0 (〇) - 2087 (157)*** 82% 512 (45)** 69% 49 201004641 hBD2 40 pg/ml 1 (i) - 316 (〇)*** 12% 159 (2)*** 21% hBD2 10 pg/ml 0 ⑼ - 589 (〇)*** 23% 238 (124)*** 32% hBD2 1 pg/ml 0 ⑼ - 1569 (〇)*** 62% 312 (28)*** 42% hBD3 1 pg/ml 0 ⑼ - 568 (126)*** 22% 331 (23)*** 45% hBD4變異體 10 pg/ml 0 ⑼ - 463 (40)*** 18% 163 (5)*** 22% hBD4變異體 1 μξ/ml 0 ⑼ - 1004 (24)*** 40% 286 (11)*** 39% 地塞松 0 ⑼ - 1120 (220)*** 44% 104 ⑻*** 14% 英利昔單抗 0 ⑼ - 2704 ⑼ 106% 636 (81) 86% 測試hBDl、hBD2、hBD3及hBD4變異體對經或未經 LPS治療之人類PBMC之效應（表16、17及18)。為進行 比較，在各情況中包括rhBD2。 對所有防禦素而言，TNF下調。IL-1冷分泌之減小可與 TNF相當，但不如TNF明顯。對hBD2及hBD4變異體而言， IL-1 0之分泌劑量依賴性顯著增強。 亦測試10 " g/ml及40 /z g/ml之hBD3，且亦測試 40 // g/ml之hBD4變異體；然而，因為兩種分子在該等濃 度下對細胞有毒，所以不可能區分毒性效應與抗炎效應。 作為TNF下調之陽性對照組，在該情況中包括兩種抗 炎化合物，地塞松及英利昔單抗。 50 201004641 結論 所有所測試之人類沒防禦素均顯示抗炎潛能。 資施例3 衍生自人類單核細胞之樹狀細胞及人類pBMc之 IL-23的減少 基本上如關於人類PBMC之實施例1中所述進行實施 例3，然而’讀數為IL 23，而不是i石及m 此外’亦研究rhBD2對衍生自人類單核細胞之樹狀細胞之 效應。 衍生自單核細胞之樹狀細胞（DC )之產生 根據Romani等人最初描述之修改方案製備DC。簡言 之’藉由Ficoll-pague ( GE_healthcare )梯度離心自健康供 體之白血球層純化末稍血液單核細胞（PBmc)。根據製造 商之說明書藉由經磁性珠粒（Dynai，invitr〇gen )陽性選擇 CD14 +細胞自pbmc分離單核細胞。在6孔板之RPMI/2% 人類AB血清重組人類重組顆粒球巨噬細胞群落刺激因子 (GM-CSF ’ 20 ng/ml )及 IL-4 ( 20 ng/ml ) ( PeproTech ) 中培養CD 14+單核細胞6天，2天及5天後補給培養基/細 胞介素。培養6天後’於96孔板中再培養不成熟DC，濃 度為ΙχΙΟ6個細胞/毫升，且不予處理或用混合物及/或hBD2 再處理24小時。以四種濃度一式四份測試hBD2。使用含 有LPS ( 100 ng/ml)及IFN-τ ( 20 ng/ml)之促發炎混合物 分析hBD2之抑制hDC成熟變為促發炎表型之能力。在混 合物之前20小時，添加地塞松作為具有已驗證之臨床抗炎 51 201004641 活性之化合物的陽性對 野狀組。在添加混合物之前*小 與hBD2 —起培育。 J吋

細胞介素ELISA 收集細胞培養物上清液且儲存在_帆下。由標準爽心 ELISA使用可自市面上騰得之抗體及標準物根據製造商之 方案（eBi〇science)量測江23之量。 MTT檢定 使用基於MTT之細胞生長測定套組作為48小時後細 胞存活之手段以評估是否有細胞嚴重受媒劑、混合物或 咖2處理影響，且根據製造商之方案（Sigma)進行。 統計分析 所有實驗執行至少兩次，顯示代表性結果。所呈現之 數據可以平均值+/·標準偏差（SEM)表示。由變異數為治 療（hBD2、地塞松等）及刺激（Lps、LTA、肽聚糖等）之 雙因子ANOVA，接著由邦弗朗尼事後檢驗確定統計顯著 性’如表圖例中所報導。p < 〇 〇5視為差異顯著。 結果 表19 :經培養基（未刺激）或lps及IFN- r刺激且經 培養基（未處理）、hB D2或地塞松處理之衍生自人類CD14+ 單核細胞之樹狀細胞上清液中的IL-23 ( pg/ml )，平均值 (SEM ) ，N = 4,出自三個中之一個代表性供體。*指由雙 因子ANOVA分析且由邦弗朗尼事後檢驗與未處理細胞相 比，p<0.05 ’ **指 ρ<〇.〇ι，_指 p<0 〇〇1。nd :未偵測到 (低於偵測極限）。 52 201004641 IL-23 pg/ml (SEM) 未刺激 LPS (100 ng/ml)及 IFN-γ (20 ng/ml) 未處理 375 3569 (96) (130) hBD2 nd 3833 1 pg/ml (88) hBD2 451 3308 10 pg/ml (121) (169)* hBD2 nd 3042 30 pg/ml (46)*** hBD2 nd 2145 100 pg/ml (202)*** 地塞松 424 1147 1 μΜ (38) (268)*** 表 20 :經培養基（對照組）、0·6 ng/ml LPS、20 ng/ml LPS或5 " g/ml LTA刺激且經hBD2、地塞松或英利昔單 抗處理之人類PBMC上清液中的IL-23 ( pg/ml )，平均值 (SEM ) 。*指由單因子ANOVA分析且由杜氏多重比較 (Dunnett's Multiple Comparison)事後檢驗與未處理細胞 相比，p<0.05，**指 ρ<0·01，***指 ρ<0·001。 IL-23 pg/ml (SEM) 對照組 LPS 0.6 ng/ml LPS 20 ng/ml LTA 5 pg/ml 對照組 257 553 510 762 (未處理） ⑺ ⑹ (5) (20) hBD2 218 338 263 383 53 201004641 1 pg/ml (5) (10)** (5)** po)** hBD2 211 462 295 438 10 pg/ml (4) (2)* (1)** (9)** hBD2 207 484 488 810 100 pg/ml ⑷ ⑺ (8) (30) 地塞松 222 202 192 223 3.5 ng/ml (5) (5)** (1)** (1)** 英利昔單抗 227 356 373 349 1 pg/ml (10) (10)** (2)** (1)** 如表19中所示，hBD2劑量依賴性顯著抑制IL-23自衍 生自人類CD 14 +單核細胞之樹狀細胞之分泌。 對於人類PBMC，IL-23分泌亦顯著得到抑制（表20 )。 對該等細胞，存在相反劑量依賴性，當測試較低劑量之hBD2 時，發現其為鐘形劑量-反應抑制曲線（資料圖中未示）。 此顯示hBD2可藉由抑制IL-23分泌在慢性自體免疫病 狀中具有抑制效應，因為IL-23為發炎反應之重要部分。 Thl7細胞之存活及增殖係視IL-23而定，且已顯示Thl7細 胞在數種諸如克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、牛皮癬及多發 性硬化之自體免疫疾病中呈病原性。 實施例4 小鼠/3防禦素3 ( mBD3 )使TNF自PBMC之分泌減少 基本上如關於人類PBMC之實施例1中所述進行實施 例4。使用與實施例1中hBD2之產生所使用之相同方案製 備小鼠/3防禦素3 ( mBD3 ) 。mBD3之胺基酸序列顯示於 SEQ ID NO: 6中。如下所述製備小鼠PBMC。 54 201004641 分離及刺激小鼠末稍血液單核細胞（PBMC ) 自十隻NMRI小鼠之血液中分離小鼠末稍血液單核細 胞。簡言之’用RPMI 1/1 ( v/v)稀釋肝素化血液且在抽取 後2小時内，使之進行Fic〇ii密度離心。自上層收集血漿且 捨棄。將經分離PBMC再懸浮於培養基（具有1 %青黴素及 鏈黴素及1% L-麩醯胺酸之RPMI 1640 ( Gibco，42401 )) 中，且接種於96孔培養板中，每孔1 15.500個細胞，總計 200 卜用 100、1〇 或 1 仁 g/ml hBD2 或 mBD3 (小鼠沒 防禦素3)單獨刺激或與20 ng/ml LPS(大腸桿菌，〇ι11:Β4， Sigma L4391 ) —起刺激相同供體之pbMC。向經或未經LPS 刺激之培養物中添加3.5 ng/ml地塞松。在37。(：下培育24 小時後收集上清液，且储存在_ 8 〇 «C下直至量測細胞介素。 在FACSarray流式細胞計數儀上根據製造商之說明書 (BD)用小鼠發炎細胞計數珠粒陣列（cba)由流式細胞 計數量測上清液中細胞介素之產生。 收集上清液後，由阿拉馬藍（Bi〇source DALL 11 〇〇 ) 量測生存力。 結果 表21 :在hBD2存在及不存在下，經Lps處理後，自 人類末稍血液單核細胞（PBMC )產生TNF，所有樣本針對 相同供體測試，出自兩種供體中之代表性實驗。在 FACSarray上由細胞計數珠粒陣列（CBA)量測ΤΝρ，*** 指由雙因子AN0VA分析（N=2)，與各自對照組相比， ρ<0·001 〇 55 201004641 TNF pg/ml (SEM) 培養基 LPS 20 ng/ml 培養基 5 Ο) 1353 (140) mBD3 2 384 1 pg/ml ⑼ mBD3 2 51 10 pg/ml ⑼ ⑴*** mBD3 39 166 100 pg/ml (19) (17)*** hBD2 3 633 1 pg/ml ⑼ (110)*** hBD2 2 359 10 pg/ml ⑼ (10)*** hBD2 2 342 100 pg/ml ⑼ (34)*** 地塞松 1 460 3.5 ng/ml ⑼ (29)… 英利昔單抗 0 1 1 pg/ml ⑼ 表22 :在mBD3存在及不存在下，經LPS處理後，自 小鼠末稍血液單核細胞（PBMC )產生TNF，所有樣本針對 相同供體測試，出自兩種供體中之代表性實驗。在 FACSarray上由細胞計數珠粒陣列（CBA)量測TNF，*** 指由雙因子ANOVA分析（N =2 )，與各自對照組相比， p<0.00 1。 56 201004641 TNF pg/ml (SEM) 培養基 LPS 20 ng/ml 培養基 578 (3) 2063 (77) mBD3 347 1600 1 pg/ml (32) (47)*** mBD3 180 297 10 pg/ml ⑼ mBD3 182 195 100 pg/ml (5) 地塞松 94 328 3.5 ng/ml (3) 英利昔單抗 530 2119 1 pg/ml (4) (31) 如表21中所示，小鼠/3防禦素3 ( mBD3 )以與hBD2 及地塞松相同之程度下調TNF自人類PBMC之分泌。mBD3 亦下調TNF自小鼠PBMC之分泌（表22 )。 因此，在該情況中，mBD3展現極佳抗炎活性。 實施例5 10天右旋糖聚糖硫酸納（dextran sodium su丨phate， DSS )誘發之結腸炎小鼠模型 以下研究之目的在於確定人類召防禦素2在經口投予 右旋糖聚糖硫酸鈉（DSS )而誘發之急性（1 0天）發炎性 腸疾病（結腸炎）小鼠模型中的抗炎活性。 DSS結腸炎小鼠模型為研究發炎性腸疾病之公認模 57 201004641 型，如以下文獻中所述：Kawada等人，「Insights from advances in research of chemically induced experimental models of human inflammatory bowel disease」，World J. Gastroenterol.，第 13 卷（42)，第 5581-5593 頁（2007);及 Wirtz 及 Neurath， 「Mouse models of inflammatory bowel disease」，Advanced Drug Delivery Reviews，第 59 卷（11)， 1073-1083 (2007)。 材料 測試項目 人類/3防禦素2 ( hBD2 );參見以上實施例1。 甲普賴蘇穠21-半丁二酸鹽（「普賴蘇穠」） PBS 緩衝劑（GIBCO) 實驗動物 研究中使用雄性C57BL/6小鼠（Harlan Interfauna Ibdrica，Barcelona, Spain)，因為其為已證明當經l〇天投 予2°/。DSS之飲用水溶液時罹患顯著結腸發炎的物種及性 別。 鑑別 由尾巴上的數字及字母代碼鑑別動物。另外，由指示 動物數目及性別、測試項目代碼或名稱、劑量濃度、投藥 途仏處理時間、組編號、研究代碼及研究指導者之名字 的顏色編碼卡鑑別各籠。 體重 研究起始當天，動物之平均體重為22.4±0.16g。 58 201004641 適應（檢疫） 研究起始之前最少7天，在與主要研究相同之條件下。 安置 到達時，隨機分開動物且安置於具有不鏽鋼蓋之聚碳 酸酯籠（E 型，Charles River，255x405x197 mm)中。 根據性別以每籠5隻動物將動物分組安置於具有控制 之溫度（22±2 C )、光照（12/12小時光照/黑暗）、空氣壓 力、空氣更新次數及相對濕度（30 — 70%)之動物房中。 所有籠底面上均具有鑛屑（Lignocel 3-4 ; Harlan Interfauna IbSrica，Spain)作為褥草。 食物及水 讓所有小鼠自由取食乾燥粒狀標準齧齒動物膳食 (Teklad Global 2014 ’ Harlafi Interfauna Iberica，Spain)。 於瓶中提供可自由取得的水。週期性分析供應至動物 房内之自來水以檢查其組成且彳貞測可能的污染物（化學物 質及微生物）。 設備及材料 設備 • 賽多利斯（Sartorius) BP 2100型動物天平 • 手術解剖設備 • 艾本德（Eppendorf) 5415C離心機 •尼康（Nikon) Eclipse E600FN 顯微鏡 • 胡克-圖克（Hook & Tucker )儀器旋轉混合器 • IKA UltraTurrax 均質機 59 201004641 • 赛多利斯BP 22 1 S型分析天平 • ELIS A 微板讀取器（Labsystems Multiskan EX ) 材料及試劑： • 無菌拋棄式注射器（1 ml) • 無菌蝴蝶型25G輸液器 • 麻醉劑（開他敏（Ketamine ) /曱苯嗟。秦（Xylazine )) • 局部麻醉乳膏（EMLA，Astra Zeneca ) • 右旋糖聚糖硫酸鈉 30.000-50.000 Da ( MP Biomedicals ) • 磷酸鹽緩衝生理食鹽水（PBS ; Sigma) • 中性緩衝福馬林（VWR ) • 牛血清白蛋白（Sigma) • 蛋白酶抑制劑混合物（Sigma ) • 小鼠 TNF- a ELISA 套組（GE Healthcare ) 實驗方案 研究設計 將動物分成5個實驗組。各組由10隻雄性動物組成： A組：用對照組媒劑（Pbs) ( i.v_)處理 B 組：用 hBD2 ( 0.1 mg/kg，i_v.)處理 C 組：用 hBD2 ( 1 mg/kg，i.v.)處理 D 組：用 hBD2 ( 10 mg/kg，i.v.)處理 E組：用甲普賴蘇樣（1 mg/kg，p.o.)處理 以隨機方式將動物分配至所有實驗組中。各籠中最多 安置5隻小鼠（根據指令86/6〇9/EEC )。在到達實驗室時 201004641 及投予測試項目之前稱重所有動物。 測試物質之投予 藉由使用無菌針（25G)以每公斤體重5毫升之給藥體 積以緩漫推；主形式經由尾巴靜脈靜脈内投予對照組媒劑及 B動物連續1 0天每天（每24小時）接受一次劑量之 相應測試項目（hBD2、普賴蘇穠或對照組媒劑）。 以每a斤體重5毫升之給藥體積經口給予劑量為1毫 克“斤之普賴蘇穠，、給藥攝生法與hBD2相同。 實驗程序 誘發結腸炎 藉由用2。/。DSS補充飲用水7天在小鼠中诱發結腸炎。 第1天，稱重所有小鼠且根據其實驗組加以標記。使 各龍之飲用瓶裝滿Dss溶液，確保所有瓶蓋適當安裝且沒 有一個堵塞。 第3天，排空瓶中之任何剩餘溶液且再用新鮮溶 液裝滿。 第5天，再次重複該程序。 第8天，捨棄任何剩餘溶液且用高應滅菌水更換。 2天後’即第1〇天，犧牲動物。 臨床評定（疾病活性指數） 每曰臨床較DSS處理動物，減以下參數計算驗證 臨床疾病活性指數（DAI):糞便财、直腸出▲存在與: 及體重減輕’該指數在〇至4範圍内： 參數 DAI評分 61 201004641

1-5% 5-10% 10-15% 0 1 2

从取初體重（第 八） 與實驗每天（第2-U)天）之負 k瓶置之間的差異百分 ^〜貝 刀此冲算體重減輕。 腹瀉之出現係定義爲數 Ψ 為黏液^便物質黏附於肛毛。直壤 出血係定義為合右·卜心 且旗 \我# 3頁可見血液/黏 DAT ^ ^ ， 译欣乞腹潙或大體直腸出血〇 母穴之* DAI之最南評分為12。 取血樣 第=期間在兩個不同的時間自各動物—樣 5天。在各時間，在投予測試項目後2小時 刺隱靜脈獲得血樣於MiCrovette CB-300微管中。音 企液抽取法；a 不需要麻醉劑或止痛劑且在動物中 力（Hem等人19Qjn 座生最小』 寻人，1998 )。另外，在研究之最後—天， 試項目投予德2丨性 方在>1 血樣。 灸小時，自所有動物之腹部腔靜脈獲得最楚 使盗樣凝結，且隨後在3000 rpm下離心10分鐘卫 力下冷象所得血清以便储存。 在’ 安樂死及收集結腸樣本 天’最後一次投予對照組媒劑、hBD2弗蕃姑_ 穠後兩小時，以、ββ 及普賴穌 ^ 乂過劑量麻醉劑殺死動物。移出其社腸 62 201004641 在切除盲腸後量測結腸之長度及重量β 自各動物獲取結腸之兩部分（近端及遠端）且於中性 緩衝福馬林中防腐保存以用於根據以下評分系統進行後續 組織學分析（蘇木精（haematoxylin)及伊紅（eosin)染色 劑）： 評分 性狀 未觀察到變化 ----- 〇 ff艾袞f，極少上皮細胞增生或無上皮細胞增生。1 ί且與賴侧，極小2 炎性細胞制物，有時透壁，通常與潰瘍_，中度上皮細胞增生3 發炎性細胞浸麟，通f透壁且與潰瘍_，_的上皮細胞增生及黏蛋4 明顯的透壁發炎，嚴重潰瘍且腸腺損傷。_ 5 結腸組織樣本中TNF- α濃度之測定 再自各動物獲得結腸樣本且於含有丨％牛血清白蛋白 (BSA )及蛋白酶抑制劑混合物（丨毫升/2〇公克組織）之 PBSU00毫克組織/毫升PBS)中均質化。隨後在i4〇〇rpm 下離心勻質物10分鐘，且將上清液儲存在_2〇它下以接著由 特異性酶免疫檢定（ELIS A )測定TNF- α濃度。 結果 疾病活性指數評分 表23 ;第1天至第10天期間，疾病活性指數（〇ΑΙ ) 評分進展。特定日期之與對照（媒劑）紐值之顯著差異顯 示為*Ρ<0·05; **P<〇.〇1 (非參數數據使用克魯斯凱沃利斯 檢驗（Kruskal-Wallis Test))。 63 201004641 測試項目 數據 DAI評分 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 A組 平均值 0.00 1.10 1.30 3.20 2.90 對照組媒劑i.v. S.E.M. 0.00 0.31 0.37 0.36 0.31 B組 平均值 0.00 0.20 0.80 2.90 2.80 hBD2 0.1 mg/kg i.v. S.E.M. 0.00 0.13 0.20 0.10 0.13 C組 平均值 0.00 0.00 0.22 2.22 2.44 hBD2 1 mg/kg i.v. S.E.M. 0.00 0.00 0.22 0.15 0.18 D組 平均值 0.00 0.60 1.00 3.67 3.11 hBD2 10 mg/kg i.v. S.E.M. 0.00 0.22 0.44 0.24 0.26 E組 平均值 0.00 0.10 0.00 2.60 2.50 普賴蘇穠 1 mg/kg p.o. S.E.M. 0.00 0.10 0.00 0.22 0.22 表23 (續） 測試項目 數據 DAI評分 第6天 第7天 第8天 第9天 第9天 A組 平均值 3.10 4.10 5.90 8.90 10.90 對照組媒劑i.v. S.E.M. 0.31 0.69 1.26 1.02 0.62 B組 hBD2 平均值 3.20 1.44** 2.11* 3,89** 6.44* 0.1 mg/kg i.v. S.E.M. 0.20 0.38 0.20 0.35 0.85 C組 平均值 2.89 2.22 3.67 5.22 6.44* hBD2 1 mg/kg i.v. S.E.M. 0.20 0.43 0.80 0.83 1.08 D組 平均值 3.22 2.11 4.11 6.78 7.33 hBD2 10 mg/kg i.v. S.E.M. 0.28 0.31 0.93 1.20 1.33 E組 平均值 2.60 3.10 2.50* 3.80* 4.90** 普賴蘇穠 1 mg/kg p.o. S.E.M. 0.27 0.96 0.43 0.98 0.91 組織學評估 64 201004641 自各動物獲取結腸之兩部分（近端及遠端），處理以 用於組織學分析（蘇木精及伊紅染色劑）且根據上述組織 學評分系統由不知情之觀察者評分。 結腸組織樣本中TNF- α濃度之測定 再自各動物獲得結腸樣本且於含有1%牛血清白蛋白 (BSA )及蛋白酶抑制劑混合物（1毫升/20公克組織）之 PBS( 100毫克組織/毫升PBS)中均質化。隨後在14000 rpm 下離心勻質物1 0分鐘，且將上清液儲存在-20°C下以接著由 特異性酶免疫檢定（ELIS A )測定TNF- α濃度。 表24 :組織學評分、結腸重量及長度及結腸TNF- α濃 度。與對照（媒劑）組值之組織學評分差異顯示為*ρ<0·05 ; **ρ<0·01 (非參數數據使用克魯斯凱-沃利斯檢驗）。 測試項目 數據 組織學評分 近端結腸 組織學評分 遠端結腸 結腸TNF-α濃度 (pg/g組織） Α組 平均值 4.20 4.50 1664 對照組媒劑i.v. S.E.M. 0.25 0.22 227 B組 平均值 2.22** 3.67 1185 hBD2 0.1 mg/kg i.v. S.E.M. 0.43 0.47 205 C組 平均值 2.89* 4.13 1457 hBD2 1 mg/kg i.v. S.E.M. 0.35 0.35 211 D組 平均值 2.89* 4.78 1212 hBD2 10 mg/kg i.v. S.E.M. 0.39 0.15 211 E組 平均值 2.80* 3.70 1833 普賴蘇穠 1 mg/kg p.o. S.E.M. 0.51 0.42 414 統計分析 65 201004641 使用統計程式Graphpad Instat 3評估結果之統計顯著 性。由用於不成對數據之克魯斯凱··沃利斯檢驗加允許多重 比較之杜氏事後檢驗（post-test Dunn)評估各組疾病活性 指數及組織學評分之間的差異。ρ<〇·05之值視為顯著。 結論 結果證明’第7天（1 ·44±0.38測試項目對4· ι±〇·69媒 劑，ρ<0.01 )、第8天（2.11±0.2測試項目對5 9土i 26媒劑； p<0.05)、第9天（3·89±0.35測試項目對8 9+1 〇2媒劑； Ρ<〇·〇1 )及第10天（6.44±0.85測試項目對1〇 9+〇 62媒劑； Ρ<〇.〇5) ’所測試之最低劑量（0.lmg/kgiv )之⑽…顯 著降低DSS投予所誘發之疾病活性指數的增加。 用中劑量hBD2 ( 1 mg/kg i.v.)連續處理1〇天使得疾 病活性指數評分明顯減小，但此僅在第1〇天較顯著（64'4 ±1.08 測試項目對 10.9±0.62 媒劑；p<〇 〇5)。 與第10天關於疾病活性指數獲得之結果類似，各動物 之近端結腸之組織學分析揭示低劑量hBD2處理使組織學 破壞評分極顯著地減小（2.22±〇_43測試項目對4·2±〇.25媒 劑；ρ<0.01 )。此外，中劑量及高劑量之hBD2以及普賴蘇 穠亦觀察到組織學損傷之顯著減輕（分別為2 89 + 〇35、 2.89+0.39及2·8±0.5;ρ<0.05)β相比之下，在遠端結腸中， 雖然在經低劑量及中㈣hBD2以及普賴蘇穠處理之動物 中可觀察到組織學損傷明顯減輕，但此在統計上並不顯 著。在經高劑量hBD2處理之動物中，未能觀察到減輕。 類似地，雖然用低劑量及中劑量hBD2處理使得結腸 66 201004641 TNF· α含量明顯減小’但該明顯減小在統計上並不顯著。 本研究中所獲得之結果證明晴在1〇天處理期後於 誘發之DSS結腸炎小鼠模型中的抗炎活性。然而，該抗炎 活性似乎在所使用之較低劑量之hBD2 (每天〇 i , ι.ν.)下較明顯且隨著劑量遞增至研究中所使用之最高劑量 (每天10 mg/kg’i.v.)而逐步損失。此外，最低劑量之 之抗炎效應可與劑量為每天！ mg/kg之普賴蘇穠（p 〇.)的 抗炎效應相當或甚至高於（例如，組織學評分）劑量為每 天1 mg/kg之普賴蘇穠（p.〇)的抗炎效應。 實施例6 10天右旋糖聚糖硫酸鈉（DSS)誘發之結腸炎小鼠模 型 基本上如實施例5中所述進行實施例6t>差異如下所示。 體重 研究起始當天，動物之平均體重為19.74±0·09 g (平均 值士SEM)。 研究設計 將動物分成9個實驗組。各組由1 〇隻雄性動物組成： A組：用對照組媒劑（pbs，i.v.)處理 B組：用hBD2 ( 1 mg/kg，i v )處理’每天一次 C 組：用 hBD2 ( 〇. 1 mg/kg，i.v.)處理，每天—次 D 組.用 hBD2 (O.oimg/kg，i.v·)處理’每天一次 E 組：用 hBD2 ( 〇·〇〇 1 mg/kg，i,v·)處理，每天一次 F 組·用 hBD2 (0.1 mg/kg，i.v. + s.c.)處理’每天兩 67 201004641 次 G 組·用 hBD2 ( 0.1 mg/kg，i.v.)處理，每隔一天一 次 Η組·用甲普賴蘇複（1 mg/kg，p.o.)處理 J組·用甲普賴蘇穠（10 mg/kg，ρ_〇·)處理 以隨機方式將動物分配至所有實驗組中。各籠中最多 安置5隻小鼠（根據指令86/6〇9/EEC )。在到達實驗室時 及投予測試化合物及參考化合物之前稱重所有動物。 測試項目之投予 藉由使用無菌針（25G)以每公斤體重5毫升之給藥體 積以緩慢推注形式（經15秒之時間）經由尾巴靜脈靜脈内 投予對照組媒劑及hBD2。 A組至E組中之動物連續1〇天每天（每24小時）接 受--人劑量之相應測試項目（hBD2、普賴蘇穠或對照組媒 劑）。 F組中之動物接受一次靜脈内劑量及另一皮下劑量（靜 脈内劑量後12小時）之相應測試項目，連續1〇天。 G組中之動物連續1〇天每隔—天接受一次劑量之相應 測試項目。 以每公斤體重5毫升之給藥體積經口給予劑量為1 mg/kg(H組）及1〇mg/kg(J組）甲普賴蘇穠，每天一次， 連續10天。 取血樣 在研究之最後天’在測試項目投予後2小時，自所 68 201004641 有動物之腹部腔靜脈獲得最終血樣。 使血樣凝結，且隨後在3000 rpm下離心10分鐘，且在 -8 0°C下冷凍所得血清以用於後續分析。 結果 疾病活性指數評分 表25 :第1天至第10天期間，疾病活性指數（DAI) 評分進展。特定日期之與對照（媒劑）組值之顯著差異顯 示為*ρ<0.05 ; **ρ<0·01 (非參數數據使用克魯斯凱-沃利斯 檢驗）。第6天至第10天顯示於下一頁中。 測試項目 數據 DA1評分 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 Α組 平均值 0.00 0.00 0.10 0.10 0.20 對照組媒劑i.v. S.E.M. 0.00 0.00 0.10 0.10 0.13 B組 平均值 0.00 0.10 0.20 0.40 0.30 hBD2 1 mg/kg i.v. S.E.M. 0.00 0.10 0.13 0.16 0.21 C組 平均值 0.00 0.44 0.89 0.56 0.78 hBD2 0.1 mg/kg i.v. S.E.M. 0.00 0.18 0.42 0.29 0.28 D組 平均值 0.00 0.00 0.30 0.40 1.60 hBD2 0.01 mg/kg i.v. S.E.M. 0.00 0.00 0.15 0.16 0.43 E組 平均值 0.00 0.00 0.10 0.20 0.40 hBD2 0.001 mg/kg i.v. S.E.M. 0.00 0.00 0.10 0.13 0.16 F組 平均值 0.00 0.30 0.70 0.70 0.60 hBD2 0.1 mg/kg 每天兩次i.v.+s.c. S.E.M. 0.00 0.21 0.30 0.34 0.16 G組 hBD2 平均值 0.00 0.20 0,40 0.50 0.50 0.1 mg/kg i.v. 每兩天 S.E.M. 0.00 0.13 0.22 0.17 0.17 H組 平均值 0.00 0.50 0.50 0.40 1.10 普賴蘇穠 1 mg/kg p.o. S.E.M. 0.00 0.17 0.17 0.16 0.18 69 201004641 J組 平均值 0.00 0.30 0.70 0.80 1.30 普賴蘇穠 10 mg/kgp.o. S.E.M. 0.00 0.15 0.21 0.20 0.21 表25 (續） 測試項目 數據 DAI評分 第6天 第7天 第8天 第9天 第10天 A組 平均值 6.90 9.67 11.11 11.67 11.00 對照組媒劑i.v. S.E.M. 1.02 0.33 0.31 0.17 0.65 B組 平均值 2.30* 4.40* 6.89 5.00* 5.78* hBD2 1 mg/kg i.v. S.E.M. 1.00 1.03 1.41 0.60 0.70 C組 平均值 1.56** 4.13* 5.43* 6.29* 6.86 hBD2 0.1 mg/kg i.v. S.E.M. 0.73 0.83 1.13 1.64 1.14 D組 hBD2 平均值 2.70 6.50 6.20* 4,60*** 5.20** 0.01 mg/kg i.v. S.E.M. 1.08 1.28 1.06 0.98 0.87 E組 平均值 3.40 7.11 8.56 5.89** 6.67 hBD2 0.001 mg/kg i.v. S.E.M. 1.32 1.38 1.06 1.63 1.30 F組 平均值 0.70*** 3.50** 4.00*** 2.90*** 4.50*** hBD2 0.1 mg/kg S.E.M. 0.30 0.89 1.17 0.55 0.62 每天兩次i.v.+s.c. G組 平均值 2.90 6.50 8.70 7.50 6.56 hBD2 0.1 mg/kg i.v. 每兩天 S.E.M. 1.12 1.11 1.25 0.93 0.99 H組 平均值 3.80 5.90 6.40 5.60* 5.60* 普賴蘇穠 1 mg/kg p.o. S.E.M. 0.98 1.16 0.88 0.88 0.65 J組 平均值 2.00 3.20** 4.80** 5.20* 4.00*** 普賴蘇穠 10 mg/kg p.o. S.E.M. 0.30 0.73 0.53 0.61 0.00 組織學評估 自各動物獲取結腸之兩部分（近端及遠端），處理以 70 201004641 用於組織學分析（蘇木精及伊紅染色劑），且根據上述評 分系統由不知情之觀察者評分。 表26 :組織學評分、結腸重量及長度及結腸TNF- α濃 度。與對照（媒劑）組值之組織學評分差異顯示為*ρ<0·05 ; **ρ<0.01 (非參數數據使用克魯斯凯-沃利斯檢驗）。 測試項目 數據 組織學評分 近端結腸 組織學評分 遠端結腸 Α組 平均值 2.44 4.67 對照組媒劑i.v. S.E.M. 0.34 0.17 B組 平均值 1.78 3.56 hBD2 1 mg/kg i.v. S.E.M. 0.36 0.38 C組 hBD2 平均值 1.71 3.14* 0.1 mg/kg i.v. S.E.M. 0.18 0.40 D組 hBD2 平均值 1.70 3.10** 0.01 mg/kg i.v. S.E.M. 0.26 0.23 E組 hBD2 平均值 1.44 3.56 0.001 mg/kg i.v. S.E.M. 0.24 0.18 F組 平均值 1.30* 2.90*** hBD2 0.1 mg/kg 每天兩次i.v.+s.c. S.E.M. 0.21 0.23 G組 hBD2 平均值 1.56 3.56 0.1 mg/kg i.v. S.E.M. 0.24 0.29 每兩天 H組 平均值 1.40 3.00*** 普賴蘇穠 1 mg/kg p.o. S.E.M. 0.22 0.00 J組 平均值 1.40 2.70*** 普賴蘇穠 10 mg/kg p.o. S.E.M. 0.16 0.21 統計分析 71 201004641 使用統計程式Graphpad Instat 3評估結果之統計顯著 性。由用於不成對數據之克魯斯凱-沃利斯檢驗+用於多重比 較之杜氏事後檢驗評估各組疾病活性指數及組織學評分之 間的差異。ρ<〇· 05之值視為顯著。在上表中，與相應對照 (媒劑）組比較之顯著差異表示為：* ρ<〇 〇5，** ρ<〇 ()1， *** ρ<0.001。 結論 本研究之目的在於確定hBD2在經口投予右旋糖聚糖 硫酸納（DSS，2%)誘發之急性（1〇天）發炎性腸疾病（結 腸炎）小鼠模型中的抗炎活性。 本研究中所獲得之結果進一步證明hBD2在1〇天處理 期後於誘發之DSS結腸炎小鼠模型中的抗炎活性。該抗炎 活性似乎在每天兩次（每12小時）靜脈内與皮下投予〇」 mg/kg劑量之hBD2後較明顯。此外，該劑量之hBD2所觀 察到之抗炎效應可與經口給予之1 nxg/kg或1 〇 mg/kg劑量 之普賴蘇穠的抗炎效應相當或甚至高於（疾病活性指數與 組織學評分兩方面）經口給予之1 mg/kg或1 〇 mg/kg劑量 之普賴蘇穠的抗炎效應。 實施例7 評估膠原蛋白誘發之類風濕性關節炎模型中之人類泠 防禦素2 以下研究之目的在於確定人類；S防禦素2在膠原蛋白 誘發之類風濕性關節炎小鼠模型中之抗炎活性。 測試系統 72 201004641 物種/品系：小鼠/DBA/l 來源：Harlan，UK 性別：雄性 動物數目：η = 50 年齡：幼年成鼠，研究起始時為6-8週齡 體重：膠原蛋白誘發時研究動物之重量差異不超過平 均體重之+20%。 動物健康狀況··到達時檢查該研究中所使用之動物之 健康狀態。僅使健康的動物適應實驗室條件且用於研究中。 適應：至少7天》 安置：適應期間及給藥後，將動物安置於入口受限之 齧齒動物設施中且分組飼養於配備有硬底且填充创花作為 鋪墊材料之聚丙烯籠（45 cmx25 cmxl3 cm)中，每組最多 10隻小鼠。每週更換籠一次。 食物及水：向動物提供可自由取得的商業齧齒動物膳 食且動物可自由獲取經由具有不鏽鋼吸管（sippertube)之 聚乙烯瓶供應至各籠之飲用水。至少每3週更換採水航。 每週更換水3次。 環境：設定自動控制之環境條件維持在2〇_24它下，相 對濕度（RH )為30_7〇%，12/12小時光照/黑暗循環，且研 究房内每小時換氣㈣次。由人工量測與控制電腦每天監 測溫度及RH。由控制電腦監測光照循環。 鑑別：給予動物唯-的動物鑑別耳編號。該編號亦呈 現在各籠前端可見之籠卡上。籠卡亦含有研究編號。 73 201004641 隨機性：將動物隨機分配至實驗組中。 終止：研究結束時，藉由吸入o2/co2使存活動物安樂 死，接著放血。 理由：選擇小鼠，因為其代表該實驗動物模型之精選 物種。小鼠之DBA/1品系高度易罹患膠原蛋白誘發之關節 炎（CIA)。 材料 人類）S防禦素2 ( hBD2 );參見實施例1 地塞松（Sigma，目錄號D1756) 第 II型牛膠原蛋白（MD Biosciences，目錄號 804001314) 完全弗氏佐劑（CFA ) ( MD Biosciences，目錄號 501009703 ) PBS(PAA，目錄號 H15-002 ) 測試組之構造 表27 :測試組及處理 組規模 組編號 測試化合物 途徑 劑量 體積 攝生法 n=10 A 媒劑對照組 IV Omg/kg 5 mL/kg 每天一次 n=10 B 地塞松 IP 1 mg/kg 5 mL/kg 每天一次 n=10 C hBD2 IV 10 mg/kg 5 mL/kg 每天一次 n=10 D hBD2 IV 1 mg/kg 5 mL/kg 每天一次 n=10 E hBD2 IV 0.1 mg/kg 5 mL/kg 每天一次 IV :靜脈内 IP :腹膜内 74 201004641 測試程序 關節炎誘發 研究第〇天（研究開始）’在輕度異氟烷麻醉下使用 塑膠注射器使所有動物於尾巴中皮内注射0.1瓜1第Η型膠 原蛋白/CFA乳液（每隻小鼠200微克膠原蛋白）。注射位 置位於離尾巴根部約1 crn之大致尾距離處。第21天，藉 由腹膜内注射膠原蛋白及PBS膠原蛋白激發動物（每隻小 鼠200微克）。 處理 研究第14天開始處理且整個期間繼續每天一次。研究 第42天’終止所有存活小鼠。 投藥途徑： (i) hBD2 :靜脈内 (ii) 地塞松：腹膜内 (iii) 媒劑對照組：靜脈内 劑量及體積劑量（亦參見表27 ): (〇 hBD2 : 10、1 或 0.1 mg/kg，5 mL/kg (ii)地塞松：1 mg/kg，5 mL/kg (出）媒劑對照組.〇 mg/kg，5 mL/kg 止痛：研究期間不使用止痛劑β 觀察及檢查 關節炎反應 研九第〇天、第14天、第21天及此後每週5次直至 研九終止，檢查小鼠之外周關節中之致關節炎抗原反應 75 201004641 (arthritogenic response)的病徵。根據按嚴重性之遞增順 序之0-4量表報導各爪之關節炎反應，如下所示： 關節炎評分_等級 無反應，正常: 〇""" 踩/腕之輕度但明確的發紅及腫脹或無論感染足趾之數目，限於個別足1 趾明顯發紅及腫脹： 踩/腕中度至重度發紅及腫脹： 2 包括足趾之整個爪發紅及腫脹： 3 涉及多個關節之最大程度的肢體發炎： 4 臨床病徵 第0天、第14天、第21天及此後每週5次進行細緻 臨床檢查並加以記錄。觀察結果包括皮膚、毛皮、眼睛、 黏膜之變化、分泌及排泄（例如腹瀉）之發生及自主活動 (例如流淚、流延、立毛、瞳孔大小、不尋常呼吸模式）。 亦記錄步態、姿勢及對處理之反應之變化以及奇怪行為、 顫抖、抽搐、睡覺及昏迷之存在。 第14天之前，每天監測小鼠之任何不尋常行為。 體重 研究第0天、第14天、第21天及此後每週5次直至 研究終止，在關節炎誘發前即刻測定動物之個體體重。 實驗關節炎之量測 研究第0天、第14天、第21天及此後每週5次藉由 使用針盤卡尺（dial caliper) ( Kroeplin，Munich，Germany) 以mm為單位量測各動物之兩後爪厚度（左側及右側，恰在 足墊下方與跟骨上方）的相對變化。 研究終止 76 201004641 研究第42天，終止所有小鼠。 樣本收集 研究終止時，在吸入〇2/C〇2後，自所有剩餘研究動物 獲得最終血樣。由各樣本製備血清且儲存在-20°C下。另外， 收集左侧前爪及後爪且儲存於福馬林中，且收集右側前爪 及後爪且快速冷凍以用於可能的關節RNA分析。 人道終點 人道地使可發現處於瀕死狀態之動物及顯示重度疼痛 且忍受重度痛苦病徵之動物安樂死。另外，人道地使顯示 體重比最初體重測定值減小超過20%之動物安樂死。出於 人道原因’亦選出總關節炎評分為12或超過12之小鼠。 藉由吸入〇2/C〇2使所有動物安樂死，接著放血。自所有研 究動物獲得爪樣本及最終血樣。 統計分析 評估主要基於關節炎評分之平均值及爪厚度量度。適 當時，應用適當的統計方法分析數據以確定處理效應之顯 著性。使用ANOVA，接著使用吐基事後分析（Tukey p〇st h〇c analysis ) ( Excel之Winstat 2〇〇5」）評定處理組之間的統 計學差異。 因關節炎嚴重性而 為不因移除高評分 時之臨床評分繼續 根據内政部（Home Office)規定， 選出總臨床評分等於或大於12之小鼠。 小鼠而人為曲解數據，將該等小鼠終止 用於剩餘研究分析中。 動物照顧及使用處理 77 201004641 根據英國内敌部 本研究^ 關於科學程序 中使用動物之規定執行 結果 表28 : 42不由· η 太觀察期期間確定出之膠原蛋白誘發之雄性 關知炎小鼠的平均臨床關節炎評分。*p<〇 〇5顯著不 同於媒劑組。 ~-- 研究天 數 數據 A组 媒鋼 B組 地塞松 1 mg/kg C组 hBD2 10 mg/kg D組 hBD2 1 mg/kg E組 hBD2 0.1 mg/kg 0 平均關節炎評 分 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 SEM 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 14 平均關節炎評 分 0.1 0.4 1.7 0.6 1.2 SEM 0.1 0.2 0.6 0.3 0.5 21 平均關節炎評 分 3.2 0.0 3.1 2.1 3-2 SEM 1.2 0.0 1.1 0.8 1.3 22 平均關節炎評 分 3.4 0.0 4.3 2.3 3.6 SEM 1.1 0.0 1.1 0.8 1.4 23 平均關節炎評 分 3.4 0.0 3.3 2.0 3.2 SEM 1.1 0.0 1.2 0.7 1,3 26 平均關節炎評 分 4.4 0.0* 4.1 2.0 3.7 SEM 1.1 0.0 1.2 0.7 1.3 27 平均關節炎評 分 4.8 0.0* 4.1 2.0 4.1 SEM 1.2 0.0 1,3 0.7 1.3 28 平均關節炎評 分 5.3 0.0* 4.1 2.3 4.4 SEM 1.1 0.0 1.2 0.8 L3 29 平均關節炎評 分 6.3 0.0* 4.4 2.4 5.0 SEM 1.1 0.0 1.3 0.8 1.3 30 平均關節炎評 分 6.8 0.0* 4.9 2.7 5.9 SEM 1.1 0.0 1.3 0.9 1.5 78 201004641 33 平均關節炎 分 7.4 0.0* 4.8 4.0 7.3 SEM 1.1 0.0 1.2 0.9 34 平均關節炎評 分 7.3 0.0* 4.9 4.1 1.4 7.8 —1.3 SEM 平均關節炎評 1.1 -------- 0.0 1.1 35 分 7.5 0.0* 4.9 4.0 8.0 SEM 1.0 0.0 1.2 1.1 1 0 36 平均關知炎評 分 6.8 0.0* 4.8 4.1 8.2 SEM 0.9 0.0 1.1 1.1 37 平均關節炎評 分 7.4 0.0* 4.7 4.2 1.1 一_ 一 8.7 SEM _ 0.9 0.0 1.1 1.1 平均關節炎評 --- -- 40 分 8.2 0.0* 5.0 4.7* 9.0 SEM 0.8 0.0 1.0 1.2 41 平均關節炎評 分 8.5 0.0* 4.8* 5.2 0.8 — _ 8 S SEM 0.7 0.0 1 Λ 1-U ---- 1 1.1 L 0.8 結論 記錄研究第14天以來所有組之關節炎反應。媒劑處理 小鼠之平均總關節炎評分（表28)之峰值在研究第Μ天為 = 0.72。、經10mg/kgh觀處理之小鼠（匕組）之平均總 關知炎評分的峰值在研究第4〇天為5〇±1 〇4。自第U天直 究結束，該組之平均關節炎評分與媒劑處理小鼠相比 較低，然而僅在研究第41天時顯著。 經1 mg/kg hBD2處理之^ a 、 坪八μ A j鼠（D組）之平均總關節炎 評刀的峰值在研究第41天為 究社φ 、" 5.2±1.U且自第21天直至研 九結束與媒劑處理組相比— I ^ 耳較低，然而僅在第40天時顯 著°與媒劑處理組相比，用〇 ’

组、# 用0.1 mg/kg hBD2處理小鼠（E 組）並不顯著降低平均總關鲚 _卽炎評分。該組之平均評分之 79 201004641 峰值在研究第40天為9.0±0.77。自研究第26天直至研究結 束，地塞松處理組（B組）中之小鼠與媒劑處理組相比顯示 顯著較低的關節炎評分。 為確保研究早期因關節炎嚴重性而選出之小鼠去除不 會人為曲解數據，將該等小鼠之關節炎評分繼續用於分析 中直至研究終止。 參考文獻

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<110> Novozymes A/S

<120〉使用哺乳類動物β防禦素的發炎性疾病的治療 <130> 11464.204-WO <160> 6

<170> Patentln 3.5|S <210> 1 <211> 36 <212> PRT <213>智慧人 <220> <221> mat 一肽 <222> (1)7. (36) <400> 1

Asp His Tyr Asn Cys Val Ser Ser Gly Gly Gin Cys Leu Tyr Ser Ala 15 10 15

Cys Pro lie Phe Thr Lys lie Gin Gly Thr Cys Tyr Arg Gly Lys Ala 20 25 30

Lys Cys Cys Lys 35 <210> 2 <211> 41 <2X2> PRT <213> 智慧人 <220> <221〉 mat 一狀 <222〉 (1)7. ¢41) <400> 2

Gly lie Gly Asp Pro Val Thr Cys Leu Lys Ser Gly Ala He Cys His 15 10 15

Pro Val Phe Cys Pro Arg Arg Tyr Lys Gin lie Gly Thr Cys Gly Leu 20 25 30

Pro Gly Thr Lys Cys Cys Lys Lys Pro 35 40 <210> 3 <211> 45 <212> PRT <213>智慧人 <220> <221> mat—狀 <222> (1)7.(45) 3 <400> 1 201004641

Gly lie lie Asn Thr Leu Gin Lys Tyr Tyr Cys Arg Val Arg Gly Gly 15 10 15

Arg Cys Ala Val Leu Ser Cys Leu Pro Lys Glu Glu Gin Thr Gly Lys 20 25 30

Cys Ser Thr Arg Gly Arg Lys Cys Cys Arg Arg Lys Lys 35 40 45 <210> 4 <211> 50 <212> PRT <213>智慧人 <220> <221> <222> (1)7.(50) <400> 4

Glu Phe Glu Leu Asp Arg lie Cys Gly Tyr Gly Thr Ala Arg Cys Arg 15 10 15

Lys Lys Cys Arg Ser Gin Glu Tyr Arg lie Gly Arg Cys Pro Asn Thr 20 25 30

Tyr Ala Cys Cys Leu Arg Lys Trp Asp Glu Ser Leu Leu Asn Arg Thr 35 40 45

Lys Pro 50 <210> 5 <211〉 37 <212> PRT <213>人造 <220> <223> *SEQ ID 1^0:4之胺基酸3-39所組成的1180-4變異體 <220> <221> mat 一狀 <222> (1)7.(37) <400> 5

Glu Leu Asp Arg lie Cys Gly Tyr Gly Thr Ala Arg Cys Arg Lys Lys 15 10 15

Cys Arg Ser Gin Glu Tyr Arg lie Gly Arg Cys Pro Asn Thr Tyr Ala 20 25 30

Cys Cys Leu Arg Lys 35 <210> 6 <211〉 40

<212> PRT 201004641 <213> 小鼠（Mus musculus} <220> <221> mat一肽 <222> (1)7.(40) <400> 6

Lys lie Asn Asn Pro Val Ser Cys Leu Arg Lys Gly Gly Arg Cys Trp 1 5 v 10 15

Asn Arg Cys lie Gly Asn Thr Arg Gin lie Gly Ser Cys Gly Val Pro 20 25 30

Phe Leu Lys Cys Cys Lys Arg Lys 35 40 3

Claims (1)

1. ¥ 201004641 七、申請專利範圍： 1.一種哺乳類動物石防禦素之用途，其用於製造供治療 選自由以下者所組成之群組之發炎性疾病或病症之用的醫 藥品：類風濕性關節炎、骨關節炎、多發性硬化、動脈粥 樣硬化、硬皮病（全身性硬化）、狼瘡、全身性紅斑狼瘡 CSLE)、（急性）冑小球性腎炎、哮喘、慢性阻塞性肺病 (COPD)、呼吸窘迫症候群（ARDS)、血管炎、葡萄膜 炎、皮炎、異位性皮膚炎、毛髮脫落、鼻炎（過敏性）、 過敏性結膜炎、重症肌無力、硬化性皮炎、肉狀瘤病、牛 皮癬關節炎、強直性脊椎炎、青少年特發性關節炎、格雷 夫斯病（Graves disease)、史格倫氏症候群（sj〇gren's syndrome)、及貝塞特氏病（Behcet disease )。 2·如申請專利範圍第1項之用途，其中該醫藥品係非經 腸投予。 3. 如申請專利範圍第2項之用途，其中該醫藥品係皮下 或靜脈内投予。 4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之用途，其中該 哺乳類動物/5防禦素係以約每公斤體重〇 〇〇 1毫克至約每 公斤體重10毫克、較佳約每公斤體重〇〇1毫克至約每公斤 體重10毫克之每日劑量投予。 5·如申請專利範圍第1至4項中任一項之用途’其中該 哺乳類動物/S防禦素為人類石防禦素。 6.如申請專利範圍第1至5項中任一項之用途，其中該 哺乳類動物/5防禦素與seQ IDNO: 1、SEQ ID N〇: 2、SEQ 1 201004641 IDNO: 3或SEQ ID N〇: 4之胺基酸序列具有至少8〇%之 致性。 士申睛專利範圍第1至6項中任一項之用途’其中該 人類々防禦素為人類召防禦素1、人類；5防禦素2、人類/3 防禦素3或人類冷防禦素4。 8.如申請專利範圍第1至7項中任一項之用途’其中該 °甫乳類動物沒防禦素與SEQ ID NO: 2之胺基酸序列具有至 少80%之一致性。 9·如申請專利範圍第1至8項中任一項之用途，其中該 哺乳類動物点防禦素為人類卢防禦素2。 1〇.如申請專利範圍第1至9項中任一項之用途，其中 在所治療之組織中TNF_ α活性降低。 種…療哺乳類動物組織中之發炎性疾病或病症的 方法其包含向有需要之哺乳類動物投予有效量之哺乳類 動物泠防禦素，其中該發炎性疾病或病症係選自由以下者 所組成之群組.類風濕性關節炎、骨關節炎、多發性硬化、 動脈粥樣硬化、硬皮病（全身性硬化）、全身性紅斑狼瘡 (SLE)、狼瘡、（急性）腎小球性腎炎、哮喘（諸如支氣 管哮喘）、慢性阻塞性肺病（c〇pD)、呼吸窘迫症候群 (ARDS )'發炎性腸疾病（例如克羅恩氏病（Cr〇hn,s 一））、結腸炎（例如潰瘍性結腸炎）、血管炎、葡 萄膜炎、纟炎（例如發炎性皮炎）、異位性皮膚炎、毛髮 脫落、鼻炎（過敏性）、過敏性結膜炎、重症肌無力、硬 化性皮炎、肉狀瘤广丙、牛皮癖關節炎、強直性脊椎炎、青 201004641 少年特發性關節炎、格雷夫斯病 塞特氏病。 又格倫氏症候群、及貝 2.如申印專利範圍第11項之方 降低所户疼知磁丄 决其中該有效量有效 丨幸低所/口療組織中之TNF- α活性。 13.如申請專利範圍第丨丨項 ^ ^ m m ^ 万法，其中該人類/9防禦 素非腸杈予，諸如皮下或靜脈内投予。 14_如申請專利範圍第u項之 5防御去总 夂方法，其中該哺乳類動物 “素係以約每公斤體重G.G1毫克至約每公斤體重㈣ f、較佳約每公斤體重〇1毫克至約每公斤體重1〇毫克之 每曰劑量投予。 15.如申請專利範圍第丨丨項之方法，其令該哺乳類動物 冷防禦素為人類点防禦素。 1 6.如申請專利範圍第11項之方法，其中該哺乳類動物 沒防紫素與 SEQ IDNO: 1、SEQ IDNO: 2、SEQ IDNO: 3 或 SEQ IDNO: 4之胺基酸序列具有至少8〇%之一致性。 17.如申請專利範圍第丨丨項之方法，其中該哺乳類動物 点防紫素與SEQ ID NO·· 2之胺基酸序列具有至少80%之一 致性。 18.如申請專利範圍第丨丨項之方法，其中該人類万防紫 素為人類石防禦素i、人類石防禦素2、人類0防禦素3或 人類冷防禦素4。 八、圖式： (無） 3