ES2886531T3

ES2886531T3 - Formas poliméricas de proteínas H-NOX

Info

Publication number: ES2886531T3
Application number: ES13870254T
Authority: ES
Inventors: Gregory Kapp; Laura Serwer; Moan Natacha Le; Stephen Cary
Original assignee: OMNIOX Inc
Current assignee: OMNIOX Inc
Priority date: 2013-01-07
Filing date: 2013-01-07
Publication date: 2021-12-20
Anticipated expiration: 2033-01-07
Also published as: US11117952B2; US20200017574A1; EP2941440A4; US11987614B2; US10766947B2; US20210002351A1; AU2016277631A1; CN105408354A; AU2019204253A1; AU2013204158B2; US10385116B2; EP2941440A1; JP2016508147A; EP3922643A1; EP2941440B1; CN112062861A; HK1217499A1; AU2016277631B2; US20150273024A1; US20160185839A1

Abstract

Proteína H-NOX trimérica que comprende tres monómeros, en la que cada monómero comprende un dominio de H-NOX y un dominio de trimerización.

Description

DESCRIPCIÓN

Formas poliméricas de proteínas H-NOX

Campo técnico

Esta solicitud se refiere a las proteínas H-NOX triméricas y a los métodos para usarlas para administrar oxígeno. Las proteínas H-NOX triméricas proporcionan una nueva herramienta terapéutica para administrar O²a humanos y, con fines veterinarios, a los animales.

Antecedentes de la invención

Las proteínas H-NOX (denominadas así por el dominio de unión del óxido nítrico-hemo y el oxígeno) son miembros de una familia de hemoproteínas altamente conservada y bien caracterizada (Iyer, LM et al. (2003) BMC Genomics 4 (1):5; Karow, DS et al. (2004) Biochemistry 43(31):10203-10211; Boon, EM et al. (2005) Nature Chem. Biol. 1:53-59; Boon, EM et al. (2005) Curr. Opin. Chem. Biol. 9(5):441-446; Boon, EM et al. (2005) J. Inorg. Biochem. 99(4):892-902; Cary, SP et al. (2005) Proc Natl Acad Sci USA 102(37):13064-9; Karow DS et al. (2005) Biochemistry 44(49):16266-74; Cary, SP et al. (2006) Trends Biochem Sci 31(4):231-9; Boon, EM et al. (2006) J Biol Chem 281(31):21892-902; Winger, JA et al. (2007) J Biol Chem. 282(2):897-907). Las proteínas H-NOX son neutras al óxido nítrico, a diferencia de los anteriores portadores de oxígeno basados en hemoglobina, la H-NOX no elimina el óxido nítrico circulante y, por tanto, no está asociado con efectos secundarios hipertensivos o renales. La baja reactividad intrínseca del NO (y la alta estabilidad del NO) hace que las proteínas H-NOX mutantes y de tipo natural sean sucedáneos de la sangre deseables debido a la menor probabilidad de inactivación de las proteínas H-NOX por el NO endógeno y la menor probabilidad de eliminación del NO endógeno por las proteínas H-NOX. Es importante destacar que la presencia de una tirosina de bolsillo distal en algunas proteínas H-NOX (Pellicena, P. et al. (2004) Proc Natl. Acad Sci USA 101(35):12854-12859) sugiere una alta reactividad indeseable de NO, lo que contraindica su uso como sucedáneo de la sangre. Por ejemplo, por analogía, una proteína hemoglobina de Mycobacterium tuberculosis, con una tirosina de bolsillo distal estructuralmente análoga, reacciona extremadamente rápido con el NO y se usa por el Mycobacterium para eliminar eficazmente y evitar el NO defensivo producido por un huésped infectado (Ouellet, H. et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci.USA 99(9):5902-5907). Sin embargo, se descubrió sorprendentemente que las proteínas H-NOX en realidad tienen una reactividad de NO mucho más baja que la de la hemoglobina, lo que hace posible su uso como sucedáneos de la sangre.

Se descubrió que las proteínas H-NOX que se unen al NO pero no al O²pueden convertirse en proteínas H-NOX que se unen tanto a NO como a O²por la introducción de una única mutación de aminoácido (véanse los documentos W o 2007/139791 y WO 2007/139767). Por tanto, la afinidad de las proteínas H-NOX por O²y NO y la capacidad de las proteínas H-NOX para discriminar entre los ligandos de O²y NO puede alterarse mediante la introducción de una o más mutaciones de aminoácidos, lo que permite adaptar las proteínas H-NOX para que se unan a O²o NO con las afinidades deseadas. Pueden introducirse mutaciones adicionales para alterar adicionalmente la afinidad por O²y/o NO. Por tanto, la familia de proteínas H-NOX puede manipularse para presentar propiedades cinéticas y termodinámicas mejoradas u óptimas para la administración de O². Por ejemplo, las proteínas H-NOX mutantes se han generado con constantes de disociación alteradas para la unión a O²que mejoran la utilidad de las proteínas H-NOX para una variedad de aplicaciones clínicas e industriales. La capacidad de adaptar las proteínas H-NOX para unirse y administrar O²es una vía terapéutica que aborda y supera las deficiencias principales de los portadores de O²corrientes.

Las proteínas H-NOX son de tamaño relativamente pequeño y pueden filtrarse a través de los riñones dando como resultado una semivida en circulación corta. Lo que se necesita para determinados usos terapéuticos es una H-NOX con una semivida en circulación más prolongada que pueda unirse a y administrar O²y/o NO a los tejidos distales durante períodos de tiempo suficientes. En el presente documento, se proporcionan proteínas H-NOX poliméricas con una semivida en circulación más prolongada. Además, las proteínas H-NOX se extravasan en los tumores en los que se acumulan a diferentes velocidades. Las proteínas H-NOX poliméricas están adaptadas para transportar oxígeno a través de las regiones normóxicas de los tumores y liberar oxígeno en lo profundo de las zonas hipóxicas dentro de los tumores. Esta combinación de características representa un avance significativo en el uso de transportadores de oxígeno como modificadores de los nichos hipóxicos de los tumores para aumentar la eficacia de la radioterapia, la quimioterapia y otros tratamientos contra el cáncer que dependen de la oxigenación de las células tumorales.

Breve sumario de la invención

En algunos aspectos, la invención proporciona una proteína H-NOX trimérica que comprende tres monómeros, en la que cada monómero comprende un dominio de H-NOX y un dominio de trimerización. En algunas realizaciones, los dominios de H-NOX son dominios de H-NOX homólogos. En otras realizaciones, los dominios de H-NOX son dominios de H-NOX heterólogos. En algunas realizaciones, los dominios de H-NOX se unen de manera covalente.

En algunas realizaciones de la invención, la proteína H-NOX trimérica comprende monómeros, en la que los monómeros comprenden un dominio de H-NOX y un dominio de trimerización. En algunas realizaciones, el dominio de H-NOX se une de manera covalente al dominio de trimerización. En algunas realizaciones, el extremo C-terminal del dominio de H-NOX se une de manera covalente al dominio de trimerización. En otras realizaciones, el extremo N-terminal del dominio de H-NOX se une de manera covalente al dominio de trimerización. En algunas realizaciones, los monómeros se asocian para formar la proteína H-NOX trimérica.

En algunas realizaciones de la invención, la proteína H-NOX polimérica es una proteína H-NOX trimérica. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX trimérica comprende uno o más dominios de trimerización. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX trimérica comprende tres monómeros, en la que cada monómero comprende un dominio de H-NOX y un dominio de trimerización. En algunas realizaciones, el dominio de trimerización es un dominio de trimerización de bacteriófago T4. En algunas realizaciones, el dominio de trimerización es un dominio foldon. En algunas realizaciones, el dominio foldon comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4. En algunas realizaciones, el dominio de H-NOX se une de manera covalente al dominio de trimerización. En algunas realizaciones, el extremo C-terminal del dominio de H-NOX se une de manera covalente al extremo N-terminal del dominio de trimerización. En otras realizaciones, los extremos N-terminales de los dominios de H-NOX se unen de manera covalente al extremo N-terminal del dominio de trimerización.

En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones anteriores, la proteína H-NOX trimérica no comprenden un dominio de guanilil ciclasa.

En algunas realizaciones de las realizaciones anteriores, la proteína H-NOX trimérica comprende al menos una etiqueta. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX trimérica comprende al menos una etiqueta His6.

En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones anteriores, los ligadores de aminoácidos están ubicados entre el dominio de H-NOX y/o el dominio de trimerización y/o la etiqueta. En algunas realizaciones, el ligador de aminoácidos es una secuencia Gly-Ser-Gly de una secuencia Arg-Gly-Ser.

En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones anteriores, al menos uno de los dominios de H-NOX es un dominio de H-NOX de Thermoanaerobacter tengcongensis, un dominio de H-NOX de L. pneumophilia 2, un dominio de H-NOX de Homo sapiens p1, un dominio de H-NOX de Canis lupus, un dominio de H-NOX de Rattus norvegicus p1, un dominio de H-NOX de Drosophila melanogaster p1, un dominio de H-NOX de D. melanogaster CG14885-PA, un dominio de H-NOX de Caenorhabditis elegans GCY-35, un dominio de H-NOX de Nostoc punctiforme, un dominio de H-NOX de Caulobacter crescentus, un dominio de H-NOX de Shewanella oneidensis o un dominio de H-NOX de Clostridium acetobutylicum. En algunas realizaciones, el dominio de H-NOX corresponde al dominio de H-NOX de T. tengcongensis expuesto en SEQ ID NO:2.

En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones anteriores, al menos uno de los dominios de H-NOX comprende una o más mutaciones en el bolsillo distal. En algunas realizaciones, la mutación en el bolsillo distal es una sustitución de aminoácido en un sitio correspondiente a L144 de H-NOX de T. tengcongensis. En algunas realizaciones, al menos uno de los dominios de H-NOX es un dominio de H-NOX de T. tengcongensis y al menos uno de los dominios de H-NOX de T. tengcongensis comprende una sustitución de aminoácido en la posición 144. En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácido en la posición 144 es una sustitución L144F. En algunas realizaciones, al menos dos de los dominios de H-NOX son dominios de H-NOX de T. tengcongensis y al menos dos de los dominios de H-NOX de T. tengcongensis comprenden una sustitución de aminoácido en la posición 144. En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácido de al menos uno del T. tengcongensis en la posición 144 es una sustitución L144F. En algunas realizaciones, al menos uno de los dominios de H-NOX comprende al menos dos mutaciones en el bolsillo distal. En algunas realizaciones, las al menos dos mutaciones en el bolsillo distal son sustituciones de aminoácidos en los sitios correspondientes a W9 y L144 de H-NOX de T. tengcongensis. En algunas realizaciones, al menos uno de los dominios de H-NOX es un dominio de H-NOX de T. tengcongensis y al menos uno de los dominios de H-NOX de T. tengcongensis comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 9 y 144. En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácido en la posición 9 es una sustitución W9F y la sustitución de aminoácido en la posición 144 es una sustitución L144F.

En algunas realizaciones, la proteína H-NOX trimérica comprende tres dominios de H-NOX de tipo natural de T. tengcongensis, cada uno de los dominios de H-NOX se une de manera covalente en su extremo C-terminal al extremo N-terminal de un dominio foldon de bacteriófago T4 por medio de un ligador de aminoácidos Gly-Ser-Gly. En algunas realizaciones, una etiqueta His6 se une al extremo C-terminal del dominio foldon a través de un ligador de aminoácidos Arg-Gly-Ser.

En algunas realizaciones, la proteína H-NOX trimérica comprende tres dominios de H-NOX L144F de T. tengcongensis, cada uno de los dominios de H-NOX se une de manera covalente en su extremo C-terminal al extremo N-terminal de un dominio foldon de bacteriófago T4 por medio de un ligador de aminoácidos Gly-Ser-Gly. En algunas realizaciones, una etiqueta His6 se une al extremo C-terminal del dominio foldon a través de un ligador de aminoácidos Arg-Gly-Ser.

En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones anteriores, la constante de disociación de O²de la proteína H-NOX trimérica está dentro de 2 órdenes de magnitud de la de la hemoglobina, y en la que la reactividad de NO de la proteína H-NOX es al menos 10 veces menor que la de la hemoglobina. En algunas realizaciones, la constante de disociación de O²de la proteína H-NOX trimérica es de entre aproximadamente 1 nM y aproximadamente 1000 nM a 20°C. En otras realizaciones, la constante de disociación de O²de la proteína H-NOX trimérica es de entre aproximadamente 1 |iM y aproximadamente 10 |iM a 20°C. En aún otras realizaciones, la constante de disociación de O²de la proteína H-NOX es de entre aproximadamente 10 |iM y aproximadamente 50 |iM a 20°C. En algunas realizaciones, la reactividad de NO de la proteína H-NOX trimérica es de menos de aproximadamente 700 s_1 a 20°C. En algunas realizaciones, la reactividad de NO de la proteína H-NOX trimérica es al menos 100 veces menor que la de la hemoglobina. En realizaciones adicionales, la reactividad de NO de la proteína H-NOX trimérica es al menos 1.000 veces menor que la de la hemoglobina. En algunas realizaciones, la koff para oxígeno de la proteína H-NOX trimérica es menor de o igual a aproximadamente 0,65 s_1 a 20°C. En algunas realizaciones, la koff para oxígeno de la proteína H-NOX trimérica es de entre aproximadamente 0,21 s_1 y aproximadamente 0,65 s_1 a 20°C. En algunas realizaciones, la koff para oxígeno de la proteína H-NOX es de entre aproximadamente 1,35 s_1 y aproximadamente 2,9 s_1 a 20°C. En algunas realizaciones, la velocidad de autooxidación de hemo de la proteína H-NOX trimérica es de menos de aproximadamente 1 Ir1 a 37°C.

En algunas realizaciones de las realizaciones anteriores, la proteína H-NOX trimérica es mayor de 50 kDal, mayor de 100 kDal, o mayor de 150 kDal. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX trimérica se acumula de manera preferente en uno o más tejidos en un mamífero en comparación con una proteína H-NOX monomérica correspondiente que comprende un único dominio de H-NOX tras la administración de la proteína H-NOX al animal. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX trimérica persiste en un mamífero durante 1, 2, 3, 4, 6, 12 ó 24 horas tras la administración de la proteína H-NOX al mamífero. En algunas realizaciones, se produjo el aclaramiento de menos del 10% de la H-NOX trimérica del mamífero por los riñones en el plazo de menos de aproximadamente 1 hora, 2 horas o 3 horas tras la administración de la proteína H-NOX al mamífero.

En algunas realizaciones, la proteína H-NOX trimérica comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:26 o SEQ ID NO:28.

En algunos aspectos, la invención proporciona una proteína H-NOX recombinante que comprende un dominio de H-NOX y un dominio de trimerización. En algunas realizaciones, el dominio de H-NOX se une de manera covalente al dominio de trimerización. En algunas realizaciones, el extremo C-terminal del dominio de H-NOX se une al dominio de trimerización. En otras realizaciones, el extremo N-terminal del dominio de H-NOX se une al dominio de trimerización. En algunas realizaciones, el dominio de H-NOX se une al extremo N-terminal del dominio de trimerización. En algunas otras realizaciones, el dominio de H-NOX se une al extremo C-terminal del dominio de trimerización. En algunas realizaciones, el dominio de trimerización es un dominio de trimerización. En realizaciones adicionales, el dominio de trimerización es un dominio de trimerización de bacteriófago T4. En realizaciones aún adicionales, el dominio de trimerización es un dominio foldon. En algunas realizaciones, el dominio foldon comprende SEQ ID NO:4.

En algunas realizaciones de las realizaciones anteriores, la proteína H-NOX recombinante no comprende un dominio de guanilil ciclasa.

En algunas realizaciones de las realizaciones anteriores, la proteína H-NOX recombinante comprende una etiqueta. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX recombinante comprende una etiqueta His6.

En algunas realizaciones del aspecto anterior, los ligadores de aminoácidos están ubicados entre el dominio de H-NOX y/o el dominio de trimerización y/o la etiqueta. En algunas realizaciones, el ligador de aminoácidos es una secuencia Gly-Ser-Gly de una secuencia Arg-Gly-Ser.

En algunas realizaciones de las realizaciones anteriores, el dominio de H-NOX es un dominio de H-NOX de Thermoanaerobacter tengcongensis, un dominio de H-NOX de L. pneumophilia 2, un dominio de H-NOX de Homo sapiens p1, un dominio de H-NOX de Canis lupus, un dominio de H-NOX de Rattus norvegicus p1, un dominio de H-NOX de Drosophila melanogaster p1, un dominio de H-NOX de D. melanogaster CG14885-PA, un dominio de H-NOX de Caenorhabditis elegans GCY-35, un dominio de H-NOX de Nostoc punctiforme, un dominio de H-NOX de Caulobacter crescentus, un dominio de H-NOX de Shewanella oneidensis o un dominio de H-NOX de Clostridium acetobutylicum. En algunas realizaciones, el dominio de H-NOX corresponde al dominio de H-NOX de T. tengcongensis expuesto en SEQ ID NO:2.

En algunas realizaciones de las realizaciones anteriores, el dominio de H-NOX comprende una o más mutaciones en el bolsillo distal. En algunas realizaciones, la mutación en el bolsillo distal es una sustitución de aminoácido en un sitio correspondiente a L144 de H-NOX de T. tengcongensis. En algunas realizaciones, al menos uno de los dominios de H-NOX es un dominio de H-NOX de T. tengcongensis y al menos uno de los dominios de H-NOX de T. tengcongensis comprende una sustitución de aminoácido en la posición 144. En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácido en la posición 144 es una sustitución L144F. En algunas realizaciones, al menos uno de los dominios de H-NOX comprende al menos dos mutaciones en el bolsillo distal. En algunas realizaciones, las al menos dos mutaciones en el bolsillo distal son sustituciones de aminoácidos en sitios correspondientes a W9 y L144 de H-NOX de T. tengcongensis. En algunas realizaciones, al menos uno de los dominios de H-NOX es un dominio de H-NOX de T. tengcongensis y al menos uno de los dominios de H-NOX de T. tengcongensis comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 9 y 144. En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácido en la posición 9 es una sustitución W9F y la sustitución de aminoácido en la posición 144 es una sustitución L144F.

En algunas realizaciones, la proteína H-NOX recombinante comprende un dominio de H-NOX de tipo natural de T. tengcongensis unido de manera covalente en su extremo C-terminal al extremo N-terminal de un dominio foldon de bacteriófago T4 por medio de un ligador de aminoácidos Gly-Ser-Gly. En algunas realizaciones, una etiqueta His6 se une al extremo C-terminal del dominio foldon a través de un ligador de aminoácidos Arg-Gly-Ser.

En algunas realizaciones, la proteína H-NOX recombinante comprende un dominio de H-NOX L144F de T. tengcongensis unido de manera covalente en su extremo C-terminal al extremo N-terminal de un dominio foldon de bacteriófago T4 por medio de un ligador de aminoácidos Gly-Ser-Gly. En algunas realizaciones, una etiqueta His6 se une al extremo C-terminal del dominio foldon a través de un ligador de aminoácidos Arg-Gly-Ser.

En algunas realizaciones de las realizaciones anteriores, en las que la constante de disociación de O²de la proteína H-NOX recombinante está dentro de 2 órdenes de magnitud de la de la hemoglobina, y en las que la reactividad de NO de la proteína H-NOX es al menos 10 veces menor que la de la hemoglobina. En algunas realizaciones, en las que la constante de disociación de O²de la proteína H-NOX recombinante es de entre aproximadamente 1 nM y aproximadamente 1000 nM a 20°C. En otras realizaciones, en las que la constante de disociación de O²de la proteína H-NOX recombinante es de entre aproximadamente 1 |iM y aproximadamente 10 ^M a 20°C. En aún otras realizaciones, la constante de disociación de O²de la proteína H-NOX es de entre aproximadamente 10 |iM y aproximadamente 50 |iM a 20°C. En algunas realizaciones, la reactividad de NO de la proteína H-NOX recombinante es de menos de aproximadamente 700 s_1 a 20°C. En algunas realizaciones, la reactividad de NO de la proteína H-NOX recombinante es al menos 100 veces menor que la de la hemoglobina. En realizaciones adicionales, la reactividad de NO de la proteína H-NOX recombinante es al menos 1.000 veces menor que la de la hemoglobina. En algunas realizaciones, la k f para oxígeno de la proteína H-NOX recombinante es menor de o igual a aproximadamente 0,65 s_1 a 20°C. En algunas realizaciones, la k f para oxígeno de la proteína H-NOX recombinante es de entre aproximadamente 0,21 s_1 y aproximadamente 0,65 s_1 a 20°C. En algunas realizaciones, la k f para oxígeno de la proteína H-NOX es de entre aproximadamente 1,35 s_1 y aproximadamente 2,9 s_1 a 20°C. En algunas realizaciones, la velocidad de autooxidación de hemo de la proteína H-NOX recombinante es de menos de aproximadamente 1 Ir1 a 37°C.

En algunas realizaciones del aspecto anterior, la proteína H-NOX recombinante comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:26 o SEQ ID NO:28.

En algunos aspectos, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una proteína H-NOX trimérica de una cualquiera de las realizaciones anteriores, en la que la composición farmacéutica comprende además un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es estéril. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica está esencialmente libre de endotoxina. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX recombinante comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:26 o SEQ ID NO:28.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende una proteína H-NOX trimérica que comprende tres dominios de H-NOX de tipo natural de T. tengcongensis, cada uno de los dominios de H-NOX se une de manera covalente en su extremo C-terminal al extremo N-terminal de un dominio foldon de bacteriófago T4 por medio de un ligador de aminoácidos Gly-Ser-Gly. En algunas realizaciones, una etiqueta His6 se une al extremo C-terminal del dominio foldon a través de un ligador de aminoácidos Arg-Gly-Ser.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende una proteína H-NOX trimérica que comprende tres dominios de H-NOX L144F de T. tengcongensis, cada uno de los dominios de H-NOX se une de manera covalente en su extremo C-terminal al extremo N-terminal de un dominio foldon de bacteriófago T4 por medio de un ligador de aminoácidos Gly-Ser-Gly. En algunas realizaciones, una etiqueta His6 se une al extremo C-terminal del dominio foldon a través de un ligador de aminoácidos Arg-Gly-Ser.

En algunos aspectos, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una proteína H-NOX recombinante que comprende un dominio de H-NOX y un dominio de trimerización. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende una proteína H-NOX recombinante que comprende un dominio de H-NOX y un dominio de trimerización de una cualquiera de las realizaciones anteriores. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es estéril. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica está esencialmente libre de endotoxina. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX recombinante comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:26 o SEQ ID NO:28.

En algunos aspectos, la invención proporciona una composición farmacéutica proporcionada en el presente documento para su uso en un método de administración de O²a un tumor encefálico en un individuo con un cáncer encefálico que comprende administrar una cantidad eficaz de una proteína H-NOX al individuo. En algunas realizaciones, la administración de la proteína H-NOX se usa en combinación con radioterapia o quimioterapia.

En algunos aspectos, la invención proporciona una composición farmacéutica proporcionada en el presente documento para su uso en un método de tratamiento de cáncer encefálico en un individuo con cáncer encefálico que comprende administrar una cantidad eficaz de una proteína H-NOX al individuo, y administrar una cantidad eficaz de radiación al individuo.

En algunos aspectos, la invención proporciona una composición farmacéutica proporcionada en el presente documento para su uso en un método de reducción del crecimiento de tumores encefálicos en un individuo con cáncer encefálico que comprende administrar una cantidad eficaz de una proteína H-NOX al individuo, y administrar una cantidad eficaz de radiación al individuo.

En algunas realizaciones de los aspectos anteriores, la radiación o quimioterapia se administra al individuo 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 horas después de que se administra la H-NOX. En algunas realizaciones, la radiación es radiación por rayos X. En algunas realizaciones, la radiación por rayos X se administra a de aproximadamente 0,5 gray a aproximadamente 75 gray. En algunas realizaciones, se repite la administración de la proteína H-NOX y/o la administración de la radiación. En algunas realizaciones, la administración se repite dos, tres o cuatro veces. En algunas realizaciones, la administración se repite después de una semana, dos semanas, tres semanas o cuatro semanas.

En algunas realizaciones de los aspectos anteriores, el cáncer encefálico es glioblastoma. En algunas realizaciones, el individuo es un mamífero. En algunas realizaciones, el mamífero es un humano. En otras realizaciones adicionales, el mamífero es una mascota, un animal de investigación o un animal de granja. En realizaciones adicionales, la mascota, animal de investigación o animal de granja es un perro, un gato, un caballo, un mono, un conejo, una rata, un ratón, una cobaya, un hámster, un cerdo o una vaca.

En algunas realizaciones de los aspectos anteriores, la administración de la proteína H-NOX y la radiación se usa en combinación con otra terapia.

En algunas realizaciones de los aspectos anteriores, la proteína H-NOX es una H-NOX de T. tengcongensis, una H-NOX de L. pneumophilia 2, una H-NOX de H. sapiens p1, una H-NOX de R. norvegicus p1, una H-NOX de D. melanogaster p1, una H-NOX de D. melanogaster CG14885-PA, una H-NOX de C. elegans GCY-35, una H-NOX de N. punctiforme, una H-NOX de C. crescentus, una H-NOX de S. oneidensis o una H-NOX de C. acetobutylicum. En algunos aspectos, la proteína H-NOX comprende un dominio de H-NOX correspondiente al dominio de H-NOX de T. tengcongensis expuesto en SEQ ID NO:2. En algunas realizaciones, la H-NOX comprende una o más mutaciones en el bolsillo distal. En algunas realizaciones, la mutación en el bolsillo distal es una sustitución de aminoácido en un sitio correspondiente a L144 de H-NOX de T. tengcongensis. En algunas realizaciones, la H-NOX es una H-NOX de T. tengcongensis que comprende una sustitución de aminoácido en la posición 144. En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácido en la posición 144 es una sustitución L144F. En algunas realizaciones, la H-NOX comprende al menos dos mutaciones en el bolsillo distal. En algunas realizaciones, las al menos dos mutaciones en el bolsillo distal son sustituciones de aminoácidos en los sitios correspondientes a W9 y L144 de H-NOX de T. tengcongensis. En algunas realizaciones, la H-NOX es una H-NOX de T. tengcongensis que comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 9 y 144. En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácido en la posición 9 es una sustitución W9F y la sustitución de aminoácido en la posición 144 es una sustitución L144F.

En algunas realizaciones de los aspectos anteriores, la proteína H-NOX trimérica no comprende un dominio de guanilil ciclasa.

En algunas realizaciones de los aspectos anteriores, la proteína H-NOX comprende una etiqueta. En algunos aspectos, la etiqueta es una etiqueta His6.

En algunas realizaciones de los aspectos anteriores, la constante de disociación de O²de la proteína H-NOX está dentro de 2 órdenes de magnitud de la de la hemoglobina, y en los que la reactividad de NO de la proteína H-NOX es al menos 10 veces menor que la de la hemoglobina. En algunas realizaciones, la constante de disociación de O²de la proteína H-NOX trimérica es de entre aproximadamente 1 nM y aproximadamente 1000 nM a 20°C. En otras realizaciones, la constante de disociación de O²de la proteína H-NOX es de entre aproximadamente 1 |iM y aproximadamente 10 |iM a 20°C. En aún otras realizaciones, la constante de disociación de O²de la proteína H-NOX es de entre aproximadamente 10 |iM y aproximadamente 50 |iM a 20°C. En algunas realizaciones, la reactividad de NO de la proteína H-NOX es de menos de aproximadamente 700 s_1 a 20°C. En algunas realizaciones, la reactividad de NO de la proteína H-NOX es al menos 100 veces menor que la de la hemoglobina. En realizaciones adicionales, la reactividad de NO de la proteína H-NOX es al menos 1.000 veces menor que la de la hemoglobina. En algunas realizaciones, la k f para oxígeno de la proteína H-NOX es menor de o igual a aproximadamente 0,65 s_1 a 20°C. En algunas realizaciones, la koff para oxígeno de la proteína H-NOX es de entre aproximadamente 0,21 s_1 y aproximadamente 0,65 s_1 a 20°C. En algunas realizaciones, la koff para oxígeno de la proteína H-NOX es de entre aproximadamente 1,35 s_1 y aproximadamente 2,9 s_1 a 20°C. En algunas realizaciones, la velocidad de autooxidación de hemo de la proteína H-NOX es de menos de aproximadamente 1 Ir1 a 37°C.

En algunos aspectos, la invención proporciona una composición farmacéutica proporcionada en el presente documento para su uso en un método de terapia para administrar oxígeno a un individuo que lo necesita, comprendiendo dicho método administrar al individuo una cantidad eficaz de una proteína H-NOx trimérica. En algunas realizaciones, la administración de la proteína H-NOX se usa en combinación con radioterapia o quimioterapia.

En algunos aspectos, la invención proporciona una composición farmacéutica proporcionada en el presente documento para su uso en un método para tratar cáncer en un individuo que lo necesita que comprende administrar una cantidad eficaz de una proteína H-NOX trimérica al individuo, y administrar una cantidad eficaz de radiación al individuo.

En algunos aspectos, la invención proporciona una composición farmacéutica proporcionada en el presente documento para su uso en un método para reducir el crecimiento tumoral en un individuo que lo necesita que comprende administrar una cantidad eficaz de una proteína H-NOX al individuo, y administrar una cantidad eficaz de radiación al individuo.

En algunas realizaciones de las realizaciones anteriores, el cáncer es cáncer encefálico, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal o cáncer de piel. En algunas realizaciones, el individuo es un mamífero. En realizaciones adicionales, el mamífero es un humano. En otras realizaciones adicionales, el mamífero es una mascota, un animal de investigación de laboratorio o un animal de granja. En realizaciones aún adicionales, la mascota, animal de investigación o animal de granja es un perro, un gato, un caballo, un mono, un conejo, una rata, un ratón, una cobaya, un hámster, un cerdo o una vaca.

En algunas realizaciones de los aspectos anteriores, la proteína H-NOX trimérica comprende tres dominios de H-NOX. En algunas realizaciones, tres dominios de H-NOX son dominios de H-NOX homólogos. En otras realizaciones, los dominios de H-NOX son dominios de H-NOX heterólogos.

En algunas realizaciones, los dominios de H-NOX se unen de manera covalente.

En algunas realizaciones de los aspectos anteriores, la proteína H-NOX trimérica comprende monómeros, en la que los monómeros comprenden un dominio de H-NOX y un dominio de trimerización. En algunas realizaciones, el dominio de H-NOX se une de manera covalente al dominio de trimerización. En algunas realizaciones, el extremo C-terminal del dominio de H-NOX se une de manera covalente al dominio de trimerización. En otras realizaciones, el extremo N-terminal del dominio de H-NOX se une de manera covalente al dominio de trimerización. En algunas realizaciones, los monómeros se asocian para formar la proteína H-NOX trimérica.

La proteína H-NOX trimérica comprende tres dominios de trimerización. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX trimérica comprende tres monómeros, en la que los monómeros comprenden un dominio de H-NOX y un dominio de trimerización. En algunas realizaciones, el dominio de trimerización es un dominio de trimerización de bacteriófago T4. En algunas realizaciones, el dominio de trimerización es un dominio foldon. En algunas realizaciones, el dominio foldon comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4. En algunas realizaciones, el dominio de H-NOX se une de manera covalente al dominio de trimerización. En otras realizaciones, el extremo C-terminal del dominio de H-NOX se une de manera covalente al extremo N-terminal del dominio de trimerización. En algunas realizaciones, el extremo N-terminal del dominio de H-NOX se une de manera covalente al extremo N-terminal del dominio de trimerización.

En algunas realizaciones de los aspectos anteriores, una etiqueta se une de manera covalente al extremo C-terminal del dominio de trimerización. En algunas realizaciones, una etiqueta His6 se une de manera covalente al extremo C-terminal del dominio de trimerización.

En algunas realizaciones de los aspectos anteriores, los ligadores de aminoácidos están ubicados entre el dominio de H-NOX y/o el dominio de trimerización y/o la etiqueta. En algunas realizaciones, el ligador de aminoácidos es una secuencia Gly-Ser-Gly de una secuencia Arg-Gly-Ser.

En algunas realizaciones de los aspectos anteriores, al menos uno de los dominios de H-NOX es un dominio de H-NOX de T. tengcongensis, un dominio de H-NOX de L. pneumophilia 2 , un dominio de H-NOX de H. sapiens p i, un dominio de H-NOX de C. lupus, un dominio de H-NOX de R. norvegicus p1, un dominio de H-NOX de D. melanogaster p1, un dominio de H-NOX de D. melanogaster CG14885-PA, un dominio de H-NOX de C. elegans GCY-35, un dominio de H-NOX de N. punctiforme, un dominio de H-NOX de C. crescentus, un dominio de H-NOX de S. oneidensis o un dominio de H-NOX de C. acetobutylicum. En algunas realizaciones, el dominio de H-NOX corresponde al dominio de H-NOX de T. tengcongensis expuesto en SEQ ID NO:2. En algunas realizaciones de los aspectos anteriores, la proteína H-NOX es una H-NOX de T. tengcongensis, una H-NOX de L. pneumophilia 2, una H-NOX de H. sapiens p1, una H-NOX de R. norvegicus p1, una H-NOX de D. melanogaster p1, una H-NOX de D. melanogaster CG14885-PA, una H-NOX de C. elegans GCY-35, una H-NOX de N. punctiforme, una H-NOX de C. crescentus, una H-NOX de S. oneidensis o una H-NOX de C. acetobutylicum. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX comprende un dominio de H-NOX correspondiente al dominio de H-NOX de T. tengcongensis expuesto en SEQ ID NO:2. En algunas realizaciones, la H-NOX comprende una o más mutaciones en el bolsillo distal. En algunas realizaciones, la mutación en el bolsillo distal es una sustitución de aminoácido en un sitio correspondiente a L144 de H-NOX de T. tengcongensis. En algunas realizaciones, la H-NOX es una H-NOX de T. tengcongensis que comprende una sustitución de aminoácido en la posición 144. En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácido en la posición 144 es una sustitución L144F. En algunas realizaciones, la H-NOX comprende al menos dos mutaciones en el bolsillo distal. En algunas realizaciones, las al menos dos mutaciones en el bolsillo distal son sustituciones de aminoácidos en los sitios correspondientes a W9 y L144 de H-NOX de T. tengcongensis. En algunas realizaciones, la H-NOX es una H-NOX de T. tengcongensis que comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 9 y 144. En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácido en la posición 9 es una sustitución W9F y la sustitución de aminoácido en la posición 144 es una sustitución L144F.

En algunas realizaciones, la proteína H-NOX trimérica de los métodos comprende tres dominios de H-NOX de tipo natural de T. tengcongensis, cada uno de los dominios de H-NOX se une de manera covalente en su extremo C-terminal al extremo N-terminal de un dominio foldon de bacteriófago T4 por medio de un ligador de aminoácidos Gly-Ser-Gly. En algunas realizaciones, una etiqueta His6 se une al extremo C-terminal del dominio foldon a través de un ligador de aminoácidos Arg-Gly-Ser.

En algunas realizaciones, la proteína H-NOX trimérica del método comprende tres dominios de H-NOX L144F de T. tengcongensis, cada uno de los dominios de H-NOX se une de manera covalente en su extremo C-terminal al extremo N-terminal de un dominio foldon de bacteriófago T4 por medio de un ligador de aminoácidos Gly-Ser-Gly. En algunas realizaciones, una etiqueta His6 se une al extremo C-terminal del dominio foldon a través de un ligador de aminoácidos Arg-Gly-Ser.

En algunas realizaciones de los aspectos anteriores, la proteína H-NOX trimérica es mayor de 50 kDal, mayor de 100 kDal, o mayor de 150 kDal. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX trimérica se acumula de manera preferente en uno o más tejidos en un mamífero en comparación con una proteína H-NOX monomérica correspondiente que comprende un único dominio de H-NOX tras la administración de la proteína H-NOX al animal. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX trimérica persiste en un mamífero durante 1, 2, 3, 4, 6, 12 ó 24 horas tras la administración de la proteína H-NOX al mamífero. En algunas realizaciones, se produjo el aclaramiento de menos del 10% de la H-NOX trimérica del mamífero por los riñones en el plazo de menos de aproximadamente 1 hora, 2 horas o 3 horas tras la administración de la proteína H-NOX al mamífero.

En algunos aspectos, la invención proporciona un ácido nucleico recombinante que codifica para la proteína H-NOX trimérica de cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento. En algunas realizaciones, el ácido nucleico está en un vector. La invención también proporciona una célula que comprende un ácido nucleico o vector que codifica para una proteína H-NOX trimérica o subunidad H-NOX monomérica descritas en el presente documento. En algunas realizaciones, el ácido nucleico comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:25 o SEQ ID NO:27.

También se describe en el presente documento un método de producción de una proteína H-NOX polimérica que comprende cultivar la célula que comprende un ácido nucleico que codifica para una proteína H-NOX polimérica o una subunidad H-NOX monomérica en condiciones adecuadas para la producción de la proteína H-NOX polimérica. Tal como se describe en el presente documento, el método incluye una etapa de purificar la proteína H-NOX.

En algunos aspectos, la invención proporciona kits que comprenden una proteína H-NOX trimérica proporcionada en el presente documento. En algunas realizaciones, los kits comprenden además instrucciones para el uso de la proteína H-NOX trimérica. En algunas realizaciones, los tres dominios de H-NOX son dominios de H-NOX homólogos. En otras realizaciones, los dominios de H-NOX son dominios de H-NOX heterólogos. En algunas realizaciones, los dominios de H-NOX se unen de manera covalente.

En algunas realizaciones de la invención, la proteína H-NOX trimérica del kit comprende monómeros, en la que los monómeros comprenden un dominio de H-NOX y un dominio de trimerización. En algunas realizaciones, el dominio de H-NOX se une de manera covalente al dominio de trimerización. En algunas realizaciones, el extremo C-terminal del dominio de H-NOX se une de manera covalente al dominio de trimerización. En otras realizaciones, el extremo N-terminal del dominio de H-NOX se une de manera covalente al dominio de trimerización. En algunas realizaciones, los monómeros se asocian para formar la proteína H-NOX trimérica.

En algunas realizaciones de la invención, la proteína H-NOX trimérica del kit es una proteína H-NOX trimérica. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX trimérica comprende tres monómeros, en la que los monómeros comprenden un dominio de H-NOX y un dominio de trimerización. En algunas realizaciones, el dominio de trimerización es un dominio de trimerización de bacteriófago T4. En algunas realizaciones, el dominio de trimerización es un dominio foldon. En algunas realizaciones, el dominio foldon comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4. En algunas realizaciones, el dominio de H-NOX se une de manera covalente al dominio de trimerización. En algunas realizaciones, el extremo C-terminal del dominio de H-NOX se une de manera covalente al extremo N-terminal del dominio de trimerización. En otras realizaciones, los extremos N-terminales de los dominios de H-NOX se unen de manera covalente al extremo N-terminal del dominio de trimerización.

En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones anteriores, la proteína H-NOX trimérica del kit no comprende un dominio de guanilil ciclasa.

En algunas realizaciones de las realizaciones anteriores, la proteína H-NOX trimérica del kit comprende al menos una etiqueta. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX trimérica comprende al menos una etiqueta His6.

En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones anteriores, al menos uno del dominio de H-NOX del kit es un dominio de H-NOX de Thermoanaerobacter tengcongensis, un dominio de H-NOX de L. pneumophilia 2, un dominio de H-NOX de Homo sapiens p1, un dominio de H-NOX de Canis lupus, un dominio de H-NOX de Rattus norvegicus p1, un dominio de H-NOX de Drosophila melanogaster p1, un dominio de H-NOX de D. melanogaster CG14885-PA, un dominio de H-NOX de Caenorhabditis elegans GCY-35, un dominio de H-NOX de Nostoc punctiforme, un dominio de H-NOX de Caulobacter crescentus, un dominio de H-NOX de Shewanella oneidensis o un dominio de H-NOX de Clostridium acetobutylicum. En algunas realizaciones, el dominio de H-NOX corresponde al dominio de H-NOX de T. tengcongensis expuesto en SEQ ID NO:2.

En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones anteriores, al menos uno del dominio de H-NOX del kit comprende una o más mutaciones en el bolsillo distal. En algunas realizaciones, la mutación en el bolsillo distal es una sustitución de aminoácido en un sitio correspondiente a L144 de H-NOX de T. tengcongensis. En algunas realizaciones, al menos uno de los dominios de H-NOX es un dominio de H-NOX de T. tengcongensis y al menos uno de los dominios de H-NOX de T. tengcongensis comprende una sustitución de aminoácido en la posición 144. En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácido en la posición 144 es una sustitución L144F. En algunas realizaciones, al menos dos de los dominios de H-NOX son dominios de H-NOX de T. tengcongensis y al menos dos de los dominios de H-NOX de T. tengcongensis comprenden una sustitución de aminoácido en la posición 144. En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácido de al menos uno del T. tengcongensis en la posición 144 es una sustitución L144F. En algunas realizaciones, al menos uno de los dominios de H-NOX comprende al menos dos mutaciones en el bolsillo distal. En algunas realizaciones, las al menos dos mutaciones en el bolsillo distal son sustituciones de aminoácidos en los sitios correspondientes a W9 y L144 de H-NOX de T. tengcongensis. En algunas realizaciones, al menos uno de los dominios de H-NOX es un dominio de H-NOX de T. tengcongensis y al menos uno de los dominios de H-NOX de T. tengcongensis comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 9 y 144.

En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácido en la posición 9 es una sustitución W9F y la sustitución de aminoácido en la posición 144 es una sustitución L144F.

En algunas realizaciones, la proteína H-NOX trimérica del kit comprende tres dominios de H-NOX de tipo natural de T. tengcongensis, cada uno de los dominios de H-NOX se une de manera covalente en su extremo C-terminal al extremo N-terminal de un dominio foldon de bacteriófago T4 por medio de un ligador de aminoácidos Gly-Ser-Gly. En algunas realizaciones, una etiqueta His6 se une al extremo C-terminal del dominio foldon a través de un ligador de aminoácidos Arg-Gly-Ser.

En algunas realizaciones, la proteína H-NOX trimérica del kit comprende tres dominios de H-NOX L144F de T. tengcongensis, cada uno de los dominios de H-NOX se une de manera covalente en su extremo C-terminal al extremo N-terminal de un dominio foldon de bacteriófago T4 por medio de un ligador de aminoácidos Gly-Ser-Gly. En algunas realizaciones, una etiqueta His6 se une al extremo C-terminal del dominio foldon a través de un ligador de aminoácidos Arg-Gly-Ser.

En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones anteriores, la constante de disociación de O²de la proteína H-NOX trimérica del kit está dentro de 2 órdenes de magnitud de la de la hemoglobina, y en las que la reactividad de NO de la proteína H-NOX es al menos 10 veces menor que la de la hemoglobina. En algunas realizaciones, la constante de disociación de O²de la proteína H-NOX trimérica es de entre aproximadamente 1 nM y aproximadamente 1000 nM a 20°C. En otras realizaciones, la constante de disociación de O²de la proteína H-NOX trimérica es de entre aproximadamente 1 |iM y aproximadamente 10 |iM a 20°C. En aún otras realizaciones, la constante de disociación de O²de la proteína H-NOX es de entre aproximadamente 10 |iM y aproximadamente 50 |iM a 20°C. En algunas realizaciones, la reactividad de NO de la proteína H-NOX trimérica es de menos de aproximadamente 700 s_1 a 20°C. En algunas realizaciones, la reactividad de NO de la proteína H-NOX trimérica es al menos 100 veces menor que la de la hemoglobina. En realizaciones adicionales, la reactividad de NO de la proteína H-NOX trimérica es al menos 1.000 veces menor que la de la hemoglobina. En algunas realizaciones, la koff para oxígeno de la proteína H-NOX trimérica es menor de o igual a aproximadamente 0,65 s_1 a 20°C. En algunas realizaciones, la koff para oxígeno de la proteína H-NOX trimérica es de entre aproximadamente 0,21 s_1 y aproximadamente 0,65 s_1 a 20°C. En algunas realizaciones, la koff para oxígeno de la proteína H-NOX es de entre aproximadamente 1,35 s_1 y aproximadamente 2,9 s_1 a 20°C. En algunas realizaciones, la velocidad de autooxidación de hemo de la proteína H-NOX trimérica es de menos de aproximadamente 1 Ir1 a 37°C.

En algunas realizaciones de las realizaciones anteriores, la proteína H-NOX trimérica del kit es mayor de 50 kDal, mayor de 100 kDal, o mayor de 150 kDal. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX trimérica se acumula de manera preferente en uno o más tejidos en un mamífero en comparación con una proteína H-NOX monomérica correspondiente que comprende un único dominio de H-NOX tras la administración de la proteína H-NOX al animal. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX trimérica persiste en un mamífero durante 1, 2, 3, 4, 6, 12 ó 24 horas tras la administración de la proteína H-NOX al mamífero. En algunas realizaciones, se produjo el aclaramiento de menos del 10% de la H-NOX trimérica del mamífero por los riñones en el plazo de menos de aproximadamente 1 hora, 2 horas o 3 horas tras la administración de la proteína H-NOX al mamífero.

En algunas realizaciones, el kit comprende cualquiera de las proteínas H-NOX triméricas descritas en el presente documento. En algunas realizaciones, el kit comprende cualquiera de las subunidades H-NOX monoméricas descritas en el presente documento. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX trimérica del kit comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:26 o SEQ ID NO:28.

En algunos aspectos, la invención proporciona un artículo de manufactura que comprende una proteína H-NOX trimérica tal como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, el artículo de manufactura comprende una proteína H-NOX y una bolsa. En algunas realizaciones, la bolsa es una bolsa i.v.. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX del artículo de manufactura es para la administración de O²a un individuo que lo necesita. En algunas realizaciones, el individuo tiene un tumor encefálico. En algunas realizaciones, el tumor encefálico es un glioblastoma. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX trimérica se usa junto con radioterapia.

También se describe en el presente documento una dosis unitaria de una proteína H-NOX trimérica tal como se describe en el presente documento. Tal como se describe en el presente documento, la proteína H-NOX de la dosis unitaria es para la administración de O²a un individuo que lo necesita. Tal como se describe en el presente documento, el individuo tiene un tumor encefálico. En algunas realizaciones, el tumor encefálico es un glioblastoma. Tal como se describe en el presente documento, la proteína H-NOX trimérica se usa junto con radioterapia.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO:3) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:4) del dominio foldon de fibritina de bacteriófago T4.

La figura 2A muestra la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO:5) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) del dominio foldon de fibritina de bacteriófago T4 fusionado al extremo C-terminal de una secuencia de H-NOX L144F de Thermoanaerobacter tengcongensis y que incluye la etiqueta His6. La figura 2B muestra la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 7) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:8) del monómero H-NOX L144F-foldon sin una etiqueta His6.

La figura 3A muestra una alineación de la secuencia del ADN de la proteína quimérica de tipo natura1H-NOX-foldon-His6 de Thermoanaerobacter tengcongensis (parte superior; SEQ ID NO:9) y los datos de secuenciación del clon 3I-A (parte inferior; SEQ ID NO:5) que codifica para la variante L144F de H-NOX con las secuencias de foldon y His6 fusionadas. Se destacan la sustitución L144F y los sitios de restricción Xho I y Hind III usados para la fusión. La figura 3B muestra la secuencia de aminoácidos del monómero de tipo natural H-NOX-foldon-His6 de Thermoanaerobacter tengcongensis (SEQ ID NO:10). La figura 3C muestra la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO:11) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:12) de un monómero H-NOX-foldon de tipo natural sin una etiqueta His6. La figura 3D muestra el ácido nucleico (SEQ ID NO:25) y el aminoácido (SEQ iD NO:26) de H-NOX de Canis lupus (1-385) fusionada en el extremo C-terminal al dominio foldon del bacteriófago T4. La figura 3E muestra el ácido nucleico (SEQ ID NO:27) y el aminoácido (SEQ ID NO:28) de H-NOX de Canis lupus (1-194) fusionada en el extremo C-terminal al dominio foldon del bacteriófago T4.

La figura 4 muestra el gel de SDS-PAGE de las etapas de la purificación inicial de la proteína de fusión H-NOX-foldon. El marcador de tamaño molecular es el patrón de proteínas Novex Sharp (Invitrogen, Grand Island, NY) con la banda de 3,5 kDa que sale de la parte inferior del gel. Los carriles patrón son cantidades conocidas de proteína H-NOX monomérica marcada con His6 (23 kDa). La inducción de la fusión H-NOX-foldon puede observarse comparando los carriles 4 y 5 (el monómero de fusión tiene un peso molecular de 26,7 kDa). Las bandas dobles observadas en los carriles 11, 13, 14 y 15 resultan de DTT insuficiente en el tampón de muestra de SDS-PAGE para esta cantidad de proteína. Carril 1: marcador de tamaño molecular; Carril 2: patrón de 0,5 |ig; Carril 3: patrón de 1,0 |ig; Carril 4: preinducido; Carril 5: sobrenadante de recogida; Carril 6: sedimento de recogida: Carril 7: post. a la lisis: Carril 8; post. a la centrifugación: Carril 9: sedimento post. a la centrifugación; Carril 10: fracción no retenida en NiNTA; Carril 11: agrupación en NiNTA; Carril 12: agrupación no buena en NiNTA; Carril 13: muestra prev. a DEAE; Carril 14; agrupación post. a DEAE; Carril 15: producto final.

La figura 5 muestra un gel de SDS PAGE de las etapas en la expresión y purificación de la proteína de fusión H-NOX-foldon. La proteína de fusión H-NOX-foldon tiene una pureza >95% después de la purificación. La movilidad relativa en el gel de SDS-PAGE es consistente con un monómero de 26,7 kDa. Carril 1: Marcadores de dos colores de proteínas Precision Plus; Carril 2: preinducido; Carril 3: inducido; Carril 4: Post. a la lisis; Carril 5: Post. al calentamiento; Carril 6: Post. al centrifugado; Carril 7: fracción no retenida en la columna de Ni; Carril 8: lavado de columna de Ni; Carril 9: post. a la columna de Ni; Carril 10: prev. a la columna de DEAE; Carril 11: post. a la columna de DEAE.

La figura 6 es un gráfico que muestra datos de CL-EM desconvolucionados del análisis de la proteína de fusión H-NOX-foldon. La masa final es consistente con la masa molecular predicha de 26.677 UMA para la unidad de monómero H-NOX-foldon.

La figura 7 muestra un cromatograma de la cromatografía de exclusión molecular analítica de la proteína H-NOX-foldon. El cromatograma sigue tres longitudes de onda (254, 280 y 418 nm) para monitorizar tanto los constituyentes de proteína como de hemo. La proteína H-NOX-foldon eluye a un volumen de retención de 14,24 ml y un tamaño molecular estimado de 75,6 kDa (similar a los 80,0 kDa predichos para un trímero H-NOX-foldon).

La figura 8 muestra el análisis espectroscópico de la proteína H-NOX-foldon. La fusión del dominio foldon no interfiere con la estructura terciaria del dominio de H-NOX, la unión de la porfirina IX con la coordinación adecuada o la unión del oxígeno a la porfirina. Los picos espectrales característicos que incluyen el pico de Soret (415 nm) y los picos a/p (550-600 nm) se conservan entre el monómero H-NOX y la proteína de fusión H-NOX-foldon.

La figura 9 es un modelo de la proteína H-NOX trimerizada con el dominio foldon trimerizado en el centro. El cofactor de porfirina IX y el oxígeno unido se muestran con esferas.

La figura 10 muestra los perfiles en plasma del trímero H-NOX después de un bolo intravenoso (100 mg/kg) en dos ratas diferentes.

La figura 11 muestra que se producen anticuerpos IgG e IgM en respuesta a la dosificación de trímero H-NOX (50 mg/kg) en ratas. Anticuerpos IgG o IgM en plasma (diluidos 1:10.000) de ratas (se muestran las curvas para ratas individuales) a las que se les administró por vía intravenosa 50 mg/kg de trímero H-NOX los días 1, 3, 5 y 22. Las muestras de plasma se analizaron en un ensayo ELISA por triplicado. Promedio, /- EEM.

La figura 12 muestra que el monómero H-NOX y el trímero H-NOX se distribuyen y retienen en ratones que portan tumores derivados de colon HCT-116. A) La tinción inmunohistoquímica de tumores con anticuerpo contra proteína H-NOX mostró persistencia del trímero H-NOX en tumores durante 60 minutos en comparación con el monómero H-NOX cuyo aclaramiento se produjo parcialmente a los 60 minutos. B) Cuantificación de la intensidad de tinción de la proteína H-NOX en secciones de tumor HCT-116. N=6, todos los grupos. Valores medios /- EEM. C) Biodistribución de HNOX en tumores de sarcoma singénico RIF1.

La figura 13 muestra que el monómero H-NOX y el trímero H-NOX redujeron la hipoxia tumoral en ratones que portaban tumores derivados de colon HCT-116. A) Sección tumoral representativa de un tumor de 125 mm3 aislado de ratones tratados con vehículo, monómero H-NOX o trímero H-NOx . B) Cuantificación de la intensidad de un anticuerpo anti-pimonidazol (Hypoxyprobe-1) en secciones tumorales. N = 6, todos los grupos. Valores medios /-EEM. * indica hipoxia en todo el tumor, ** indica sin hipoxia en el tumor.

La figura 14 muestra la penetración y la oxigenación del tumor por el monómero H-NOX en ratones que portaban tumores derivados de colon HCT-116. A) Secciones tumorales teñidas con un anticuerpo anti-proteína H-NOX. B) Secciones tumorales teñidas con Hypoxyprobe-1. C) Cuantificación del Hypoxyprobe-1 en función de la distancia a la vasculatura en los tumores de seis ratones por grupo. * indica hipoxia en todo el tumor, ¥ indica sin hipoxia en el tumor.

La figura 15 muestra que el trímero H-NOX se distribuyó y retuvo en ratones que portaban un tumor de sarcoma singénico RIF-1. Imágenes de inmunofluorescencia de una sección representativa de un tumor de 400 mm3 aislado de un ratón 120 minutos después de la administración de A) 750 mg/kg de trímero H-NOX o C) tampón, y de un tumor de 800 mm3 aislado de un ratón 120 minutos después de la administración de B) 750 mg/kg de trímero H-NOX o tampón D). La tinción de la proteína H-NOX se realizó con anticuerpo anti-H-NOX. Los paneles E y F muestran la oxigenación del tumor por el trímero H-NOX en ratones que portaban un tumor de sarcoma singénico RIF-1. E) Secciones tumorales teñidas con un anticuerpo anti-pimonidazol dos horas después de la administración de H-NOX o de control de tampón. Se muestra la imagen completa del tumor. F) Secciones tumorales teñidas con anticuerpo antipimonidazol (Hypoxyprobe-1) y anticuerpo anti-CD31 (BD Bioscience) dos horas después de la administración de H-NOX o de control de tampón. Se muestran imágenes de gran aumento. G) Biodistribución de H-NOX en tumores de sarcoma singénico RIF1. Dos horas después de la inyección intravenosa, el trímero H-NOX se difunde desde la vasculatura hacia el tejido tumoral. Tinción inmunohistoquímica de secciones tumorales con anticuerpo contra H-NOX y anticuerpo contra CD31 (marcador de vasculatura, BD Bioscience). No se detecta tinción fluorescente en ratones inyectados con tampón.

La figura 16 muestra un tumor penetrado por trímero H-NOX en ratones que portaban un tumor derivado de sarcoma e hipoxia de tumor reducida. A) La membrana de imunotransferencia de tipo Western se estudió mediante sonda con un anticuerpo anti-H-NOX para la detección del trímero H-NOX, con Hypoxyprobe-1 para la detección de proteínas asociadas a hipoxia, o con un anticuerpo anti-actina para la evaluación de los niveles de proteína total. B) Cuantificación de la intensidad de tinción de pimonidazol en secciones tumorales. C) Cuantificación de la intensidad de tinción anti-HIF-1a en secciones tumorales.

La figura 17 es un panel de imágenes de inmunohistoquímica que muestra la penetración del tumor por el trímero H-NOX y la hipoxia de tumor encefálico reducida en ratones que portaban tumores encefálicos ortotópicos U251. A) Tinción de trímero H-NOX con un anticuerpo anti-H-NOX en un tumor U251 dos horas después de la administración con trímero H-NOX o solución salina (control). B) Tinción con Hypoxyprobe-1 en tumores u 251 dos horas después de la administración con trímero H-NOX o solución salina (control). Se muestran imágenes ampliadas de una parte de los tumores.

La figura 18 muestra la penetración del tumor por el trímero H-NOX y la hipoxia de tumor encefálico reducida en ratones que portaban tumores encefálicos ortotópicos U251. A) Imágenes de inmunofluorescencia de tinción con Hypoxyprobe-1 en tumores U251 dos horas después de la administración con trímero H-NOX (paneles de la derecha) o solución salina (tampón, paneles de la izquierda). B) Cuantificación de la tinción con Hypoxyprobe-1 a partir de las imágenes de inmunofluorescencia (trímero H-NOX - paneles de la derecha o solución salina - paneles de la izquierda). C) Imágenes de inmunofluorescencia de tinción de HIF-1a en tumor U251 dos horas después de la administración con trímero H-NOX o solución salina (tampón). D) Cuantificación de la tinción de HIF-1a a partir de las imágenes de inmunofluorescencia.

La figura 19 muestra la biodistribución del trímero H-NOX en un tumor encefálico ortotópico U251 y un cerebro sano. A) Tinción de trímero H-NOX con un anticuerpo anti-H-NOX en un tumor U251 dos horas después de la administración de trímero H-NOX. B) Tinción con DAPI nuclear en tumores U251 que muestran la ubicación del tumor en el cerebro. C) y D) Las imágenes ampliadas de una parte de los tumores de A) muestran un patrón difuso de H-NOX dentro del tumor y un patrón de restricción vascular fuera del tumor. E) Tinción de trímero H-NOX con un anticuerpo anti-H-NOX y tinción de la vasculatura con anticuerpo anti-CD31 (BD Bioscience) en cerebro de ratón sano.

La figura 20 muestra imágenes fluorescentes en tiempo real de monómero H-NOX o trímero H-NOX en tumores de glioblastoma ortotópico U251 de ratón. A) Se produjo el aclaramiento del monómero H-NOX en dos horas. B) El trímero H-NOX persistió en los tumores, alcanzando un máximo a las 1-4 horas. Imágenes adquiridas por IVIS; las flechas indican áreas de fluorescencia por encima de un umbral específico; los asteriscos indican el nivel máximo de intensidad de fluorescencia.

La figura 21 muestra imágenes de fluorescencia ex vivo de monómero H-NOX o trímero H-NOX en tumores de glioblastoma ortotópico BT-12 de ratón. Se resecaron cerebros con tumores BT-12 A) 30 minutos después de la administración de 750 mg/kg de monómero H-NOX, B) 60 minutos después de la administración de 750 mg/kg de monómero H-NOX, C) 60 minutos después de la administración de 750 mg/kg de trímero H-NOX, o D) 60 minutos después de la administración del vehículo.

La figura 22 muestra imágenes de fluorescencia en tiempo real del monómero H-NOX en tumores de glioblastoma ortotópico U251 de ratón. La obtención de imágenes se realizó a los A) 30 minutos, B) 60 minutos, C) 120 minutos y D) 240 minutos después de la administración del monómero H-NOX.

La figura 23 muestra imágenes de fluorescencia en tiempo real del trímero H-NOX en tumores de glioblastoma ortotópico U251 de ratón. La obtención de imágenes se realizó a los A) 30 minutos, B) 60 minutos, C) 120 minutos y D) 240 minutos después de la administración del trímero H-NOX. Las flechas indican áreas de fluorescencia; los asteriscos indican el nivel máximo de intensidad de fluorescencia.

La figura 24 muestra imágenes de fluorescencia en tiempo real del monómero H-NOX en tumores de glioblastoma ortotópico U251 de ratón. Acumulación de monómero H-NOX en el riñón a los A) 30 minutos y B) 60 minutos después de la administración del monómero H-NOX.

La figura 25 muestra imágenes de fluorescencia en tiempo real del trímero H-NOX en tumores intracraneales y espinales de glioblastoma ortotópico GBM-43 de ratón. Distribución del trímero H-NOX en la columna vertebral A) antes de la administración del trímero H-NOX y B) 0,5 horas, C) 1 hora, D) 2 horas, E) 4 horas y F) 6 horas después de la administración de trímero H-NOX.

La figura 26 muestra imágenes de fluorescencia en tiempo real del trímero H-NOX en tumores intracraneales de glioblastoma ortotópico U251 de ratón. El panel superior muestra la distribución del trímero H-NOX en el cerebro antes de la administración del trímero H-NOX (0 minutos) y a los 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas y 72 horas después de la administración del trímero H-NOX. El panel inferior muestra la distribución del monómero H-NOX.

La figura 27 muestra imágenes de bioluminiscencia en tiempo real del trímero H-NOX en tumores intracraneales y espinales de glioblastoma ortotópico U251 de ratón. Distribución del trímero H-NOX A) antes de la administración del trímero H-NOX y a los B) 30 minutos, C) 1 hora, D) 2 horas, E) 4 horas y F) 6 horas después de la administración del trímero H-NOX a una dosis de 295 mg/kg.

La figura 28 muestra imágenes de fluorescencia en tiempo real del trímero H-NOX en tumores de glioblastoma ortotópico U251 de ratón. Distribución del trímero H-NOX A) antes de la administración del trímero H-NOX y a los B) 30 minutos, C) 1 hora, D) 2 horas, E) 4 horas y F) 6 horas después de la administración del trímero H-NOX a una dosis de 30 mg/kg.

La figura 29 muestra imágenes de fluorescencia en tiempo real de la distribución de la variante del trímero H-NOX L144F en un modelo de ratón de glioblastoma ortotópico U251 que contenía pequeños tumores intracraneales. Distribución de la variante del trímero H-NOX L144F A) antes de la administración del trímero H-NOX y a los B) 30 minutos, C) 1 hora, D) 2 horas, E) 4 horas y F) 6 horas después de la administración de la variante del trímero H-NOX L144F a una dosis de 30 mg/kg. Los tumores pequeños eran 1000 veces más pequeños que los tumores grandes tal como se determina mediante la puntuación de bioluminiscencia (BLI).

La figura 30 muestra imágenes de fluorescencia de la distribución del trímero H-NOX. Imágenes de fluorescencia ex vivo de un modelo de ratón de glioblastoma ortotópico GBM43 al que se le administró A) 30 mg/kg de trímero H-NOX o B) 750 mg/kg de trímero H-NOX. Obtención de imágenes de bioluminiscencia en tiempo real en un modelo de ratón de glioblastoma ortotópico U251 que contenía C) tumores intracraneales grandes o D) tumores intracraneales pequeños después de la administración de 295 mg/kg de trímero H-NOX.

La figura 31 muestra imágenes de fluorescencia en tiempo real de la distribución del trímero H-NOX en dos modelos de ratón de tumores de glioblastoma ortotópico (U251 y GBM-43) y un modelo de un tumor teratoide/rabdoide atípico (AT/RT). Las imágenes se tomaron 60 minutos después de la administración del trímero H-NOX y se optimizó la escala de color para cada imagen.

La figura 32 muestra imágenes de fluorescencia ex vivo de la distribución de la proteína H-NOX en el hemisferio que portaba tumores de tres modelos de ratón con tumores de glioblastoma ortotópico. A) Distribución del trímero H-NOX 60 minutos después de la administración en un modelo de ratón de glioblastoma ortotópico GBM43, B) distribución del trímero H-NOX 6 días después de la administración en un modelo de ratón de glioblastoma ortotópico U251, C) distribución del monómero H-NOX 30 minutos después de la administración en un modelo de ratón de tumor teratoide/rabdoide atípico (AT/RT) BT-12, D) distribución del trímero H-NOX 60 minutos después de la administración en un modelo de ratón de AT/RT ortotópico BT-12, y E) falta de señal de proteína H-NOX 30 minutos después de la administración del vehículo en un modelo de ratón de AT/RT ortotópico BT-12.

La figura 33 es una imagen de inmunofluorescencia que muestra el escape del trímero H-NOX de la vasculatura y la difusión a través de un tumor encefálico U251 en un modelo de ratón de tumor de glioblastoma ortotópico. Las secciones tumorales se tiñeron con un anticuerpo anti-H-NOX (panel superior) y un anticuerpo anti-CD31 (vasculatura) (panel inferior).

La figura 34 muestra un ensayo ELISA de tipo sándwich del trímero H-NOX en el cerebro de ratones sanos. A) Ensayo ELISA en cerebro tras inyección intravenosa de trímero H-NOX (750 mg/kg). B) Ensayo ELISA en cerebro después de la inyección intravenosa de trímero H-NOX (200 mg/kg). C) Razón en cerebro/plasma de trímero H-NOX (750 mg/kg). D) Razón en cerebro/plasma de trímero H-NOX (200 mg/kg). El plasma y el cerebro se recogieron a los 30, 60, 90 y 120 minutos después de la administración del trímero H-NOX. N= 3, todos los grupos. Valores medios /-EEM.

La figura 35 es una serie de gráficos que muestran que el trímero H-NOX sensibilizó xenoinjertos intracraneales a la radioterapia fraccionada en un modelo de ratón U251 de glioblastoma humano. A) Puntuaciones medias de imágenes de bioluminiscencia (BLI) /- EEM de ratones en ambos grupos de tratamiento, así como de un grupo de control no tratado (sin H-NOX, sin RT). N= 9, todos los grupos. B) Puntuaciones individuales de BLI para los grupos de RT y RT trímero H-NOX el día 29 (recuadro en A). La línea muestra la media del grupo, \- EEM. Las puntuaciones de BLI de los ratones RT trímero H-NOX fueron significativamente más bajas que las de los ratones tratados solo con RT (p = 0,039, prueba de la t de Student). C) El grupo de trímero H-NOX mostró una supervivencia significativamente mejorada, en comparación con los ratones que recibieron sólo radioterapia (p = 0,025, prueba de rangos logarítmicos).

La Figura 36 es una serie de gráficos que muestran que el trímero H-NOX sensibilizó xenoinjertos intracraneales a la radioterapia fraccionada en dos modelos de ratón de glioblastoma humano. A) Porcentaje de supervivencia en un modelo de ratón de glioblastoma ortotópico U251 al que se le administró radioterapia de 2 Gy (2 Gy), variante del trímero H-NOX L144F (trímero L144F), radioterapia de 2 Gy en combinación con la variante del trímero H-NOX L144F (2 Gy trímero L144F) o tampón de tratamiento (TB). Valores de p de rangos logarítmicos: 2 Gy frente a 2 Gy trímero L144F (p = 0,158), 2 Gy frente a TB (p = 0,0612) y trímero L144F frente a TB (p = 0,326). B) Porcentaje de supervivencia en un modelo de ratón de glioblastoma ortotópico GBM43 al que se le administró radioterapia de 2 Gy (2 Gy), radioterapia de 4 Gy (4 Gy), radioterapia de 8 Gy (8 Gy), 2 ciclos de radioterapia de 4 Gy (4 Gy x 2), radioterapia de 4 Gy en combinación con trímero H-NOX (4 Gy H-NOX) o tampón de tratamiento (sin tratar). Valores de p de rangos logarítmicos: 4 Gy frente a 4 Gy H-NOX (p = 0,597), 4 Gy frente a 4 Gy x 2 (p = 0,038) y 4 Gy x 2 frente a 4 Gy H-NOX (p = 0,111).

La figura 37 muestra las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos de proteínas H-NOX. A. H-NOX de tipo natural de Thermoanaerobacter tengcongensis (SEQ ID NO:1 y 2). B. H-NOX de tipo natural de Legionella pneumophilia Orf2 (SEQ ID NO:13 y 14). C. H-NOX de tipo natural de Legionella pneumophilia Orf1 (SEQ ID NO:15 y 16). D. H-NOX de Homo sapiens p1 (1-385) (SEQ ID NO:17 y 18). E. H-NOX de Homo sapiens p2 (1-217) (SEQ ID NO:19 y 20). F. H-NOX de Rattus norvegicus p1 (SEQ ID NO:21 y 22). G. H-NOX de Rattus norvegicus p2 (SEQ ID NO:23 y 24).

Descripción detallada de la invención

La presente invención se basa en parte en el sorprendente descubrimiento de que las proteínas H-NOX triméricas se extravasan y acumulan de manera preferente en tejidos tales como el cerebro, proporcionando así una ventana de oxigenación más prolongada y una semivida en circulación más prolongada en comparación con las proteínas H-NOX monoméricas. Se ha demostrado que una proteína H-NOX trimérica que comprende tres dominios de H-NOX de Thermoanaerobacter tengcongensis y que comprende una mutación L144F es útil para administrar oxígeno al tejido tumoral hipóxico, tal como tejido tumoral de glioblastoma, mejorando así la radioterapia de cánceres. Por consiguiente, la presente invención proporciona proteínas, composiciones, kits y métodos para la administración de oxígeno; por ejemplo, como adyuvante de la radioterapia.

Definiciones

A menos que se defina de otro modo, los significados de todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento son los habitualmente entendidos por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Un experto en la técnica también apreciará que cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento también puede usarse para practicar o someter a prueba la invención.

Para su uso en el presente documento, a menos que se indique claramente lo contrario, el uso de los términos “un/uno”, “una” y similares se refiere a uno o más.

En esta solicitud, el uso de “o” significa “y/o” a menos que un experto en la técnica lo indique o entienda expresamente. En el contexto de una reivindicación dependiente múltiple, el uso de “o” se refiere a más de una reivindicación independiente o dependiente precedente.

La referencia a “aproximadamente” un valor o parámetro en el presente documento incluye (y describe) realizaciones que se refieren a ese valor o parámetro en sí mismo. Por ejemplo, la descripción que hace referencia a “aproximadamente X” incluye la descripción de “X”.

Se entiende que el aspecto y las realizaciones de la invención descritas en el presente documento incluyen “que comprende”, “que consiste” y “que consiste esencialmente en” aspectos y realizaciones.

Los términos “polipéptido” y “proteína” se usan de manera intercambiable para referirse a un polímero de residuos de aminoácido y no se limitan a una longitud mínima. Tales polímeros de residuos de aminoácido pueden contener residuos de aminoácido naturales o no naturales e incluyen, pero no se limitan a, péptidos, oligopéptidos, dímeros, trímeros y polímeros de residuos de aminoácido. Tanto las proteínas de longitud completa como los fragmentos de las mismas se incluyen en la definición. Los términos también incluyen modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilación, sialilación, acetilación, fosforilación y similares. Además, para los propósitos de la presente invención, un “polipéptido” se refiere a una proteína que incluye modificaciones, tales como deleciones, adiciones y sustituciones (generalmente de naturaleza conservadora), a la secuencia nativa, siempre que la proteína mantenga la actividad deseada. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como por mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser accidentales, tal como por mutaciones de huéspedes que producen las proteínas o errores debidos a la amplificación por PCR. Tal como se usa en el presente documento, una proteína puede incluir dos o más subunidades, asociadas de manera covalente o no covalente; por ejemplo, una proteína puede incluir dos o más monómeros asociados.

Los términos “molécula de ácido nucleico”, “ácido nucleico” y “polinucleótido” pueden usarse de manera intercambiable y se refieren a un polímero de nucleótidos. Tales polímeros de nucleótidos pueden contener nucleótidos naturales y/o no naturales e incluyen, pero no se limitan a, ADN, ARN y PNA. “Secuencia de ácido nucleico” se refiere a la secuencia lineal de nucleótidos que comprende la molécula de ácido nucleico o el polinucleótido.

Tal como se usa en el presente documento, una “proteína H-NOX” significa una proteína que tiene un dominio de H-NOX (denominado así por dominio de unión a Hemo-Óxido Nítrico y OXígeno). Una proteína H-NOX puede contener o no uno o más dominios además del dominio de H-NOX. En algunos ejemplos, una proteína H-NOX no comprende un dominio de guanilil ciclasa. Una proteína H-NOX puede comprender o no un dominio de polimerización.

Tal como se usa en el presente documento, una “proteína H-NOX polimérica” es una proteína H-NOX que comprende dos o más dominios de H-NOX. Los dominios de H-NOX pueden estar asociados de manera covalente o no covalente.

Tal como se usa en el presente documento, un “dominio de H-NOX” es la totalidad o una porción de una proteína que se une al óxido nítrico y/o al oxígeno a través de hemo. El dominio de H-NOX puede comprender hemo o puede encontrarse como una apoproproteína que es capaz de unirse a hemo. En algunos ejemplos, un dominio de H-NOX incluye seis hélices alfa, seguidas de dos hebras beta, seguidas de una hélice alfa, seguida de dos hebras beta. En algunos ejemplos, un dominio de H-NOX corresponde al dominio de H-NOX de H-NOX de Thermoanaerobacter tengcongensis expuesto en SEQ ID NO:2. Por ejemplo, el dominio de H-NOX puede ser al menos aproximadamente el 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 90%, el 95% o el 99% idéntico al dominio de H-NOX de H-NOX de Thermoanaerobacter tengcongensis expuesto en SEQ ID NO:2. En algunas realizaciones, el dominio de H-NOX puede ser el 10%-20%, el 20%-30%, el 30%-40%, el 40%-50%, el 50%-60%, el 60%-70%, el 70%-80%, el 80%-90%, el 90%-95%, el 95%-99% o el 100% idéntico al dominio de H-NOX de H-NOX de Thermoanaerobacter tengcongensis expuesto en SEQ ID NO:2.

Tal como se usa en el presente documento, un “dominio de polimerización” es un dominio (por ejemplo, un dominio polipeptídico) que fomenta la asociación de restos monoméricos para formar una estructura polimérica. Por ejemplo, un dominio de polimerización puede fomentar la asociación de dominios de H-NOX monoméricos para generar una proteína H-NOX polimérica. Un dominio de polimerización a modo de ejemplo es el dominio foldon del bacteriófago T4, que fomenta la formación de polipéptidos triméricos. Otros ejemplos de dominios de polimerización incluyen, pero no se limitan a, Arc, POZ, dominios de helicoides enrollados (incluyendo GCN4, cremalleras de leucina, Velcro), uteroglobina, colágeno, helicoides enrollados de 3 hebras (matrilina-1), trombosporinas, TRPV1-C, P53, Mnt, avadina, estreptavidina, Bcr-Abl, COMP, subunidad B de verotoxina, CamKII, RCK y dominios de la proteína de fusión sensible a N-etilmaleimida, STM3548, KaiC, TyrR, Hcp1, CcmK4, GP41, antígeno protector contra el carbunco, aerolisina, ahemolisina, proteína de unión a C4b, Mi-CK, arilsurfatasa A y proteínas de la cápside viral.

Tal como se usa en el presente documento, una “secuencia de ligador de aminoácidos” o una “secuencia de espaciador de aminoácidos” es una secuencia polipeptídica corta que puede usarse para unir dos dominios de una proteína. En algunas realizaciones, la secuencia de ligador de aminoácidos tiene una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más de diez aminoácidos de longitud. Las secuencias de ligador de aminoácidos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, una secuencia Gly-Ser-Gly y una secuencia Arg-Gly-Ser.

Tal como se usa en el presente documento, una “etiqueta His6” se refiere a un péptido que comprende seis residuos de His unidos a un polipéptido. Una etiqueta His6 puede usarse para facilitar la purificación de proteínas; por ejemplo, usando cromatografía específica para la etiqueta His6. Tras de la purificación, la etiqueta His6 puede escindirse usando una exopeptidasa.

El término “sustancialmente similar” o “sustancialmente el mismo”, tal como se usa en el presente documento, indica un grado suficientemente alto de similitud entre dos o más valores numéricos de modo que un experto en la técnica consideraría que la diferencia entre los dos o más valores es de poca o ninguna significación biológica y/o estadística en el contexto de la característica biológica medida por dicho valor. En algunas realizaciones, los dos o más valores sustancialmente similares difieren en no más de aproximadamente uno cualquiera del 5%, el 10%, el 15%, el 20%, el 25% o el 50%.

La expresión “sustancialmente reducida” o “sustancialmente diferente”, tal como se usa en el presente documento, indica un grado suficientemente alto de diferencia entre dos valores numéricos de modo que un experto en la técnica consideraría que la diferencia entre los dos valores es de significación estadística en el contexto de la característica biológica medida por dichos valores. En algunas realizaciones, los dos valores numéricos sustancialmente diferentes difieren en más de aproximadamente uno cualquiera del 10%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80% o el 90%. En alguna realización, los dos valores numéricos sustancialmente diferentes difieren en aproximadamente uno cualquiera del 10%-20%, el 20%-30%, el 30%-40%, el 40%-50%, el 50%-60%, el 60%-70%, el 70%-80%, el 80%-90%, el 90%-95%, el 95%-99% o el 100%.

Un polipéptido de “secuencia nativa” comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un polipéptido que se encuentra en la naturaleza. Por tanto, un polipéptido de secuencia nativa puede tener la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que se produce de manera natural a partir de cualquier organismo. Tal polipéptido de secuencia nativa puede aislarse de la naturaleza o puede producirse por medios recombinantes o de síntesis. El término polipéptido de “secuencia nativa” engloba específicamente formas truncadas o secretadas que se producen de manera natural del polipéptido (por ejemplo, una secuencia de dominio extracelular), formas variantes que se producen de manera natural (por ejemplo, formas sometidas a corte y empalme alternativo) y variantes alélicas que se producen de manera natural del polipéptido.

Una “variante” de polipéptido significa un polipéptido biológicamente activo que tiene al menos aproximadamente una identidad de secuencia de aminoácidos del 80% con el polipéptido de secuencia nativa después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. Tales variantes incluyen, por ejemplo, polipéptidos en los que se añaden o delecionan uno o más residuos de aminoácido en el extremo N-terminal o C-terminal del polipéptido. En algunas realizaciones, una variante tendrá una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente uno cualquiera del 80%, el 90% o el 95% con el polipéptido de secuencia nativa. En algunas realizaciones, una variante tendrá una identidad de secuencia de aminoácidos de aproximadamente uno cualquiera del 80%-90%, el 90%-95% o el 95%-99% con el polipéptido de secuencia nativa.

Tal como se usa en el presente documento, una “proteína mutante” significa una proteína con una o más mutaciones en comparación con una proteína que se encuentra en la naturaleza. En una realización, la proteína mutante tiene una secuencia que difiere de la de todas las proteínas que se encuentran en la naturaleza. En diversas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la proteína mutante es al menos aproximadamente cualquiera del 10, el 15, el 20, el 25, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90, el 95, el 97, el 98, el 99 o el 99,5% idéntica a la de la región correspondiente de una proteína que se encuentra en la naturaleza. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la proteína mutante es al menos aproximadamente cualquiera del 10%-20%, el 20%-30%, el 30%-40%, el 40%-50%, el 50%-60%, el 60%-70%, el 70%-80%, el 80%-90%, el 90%-95%, el 95%-99% o el 100% idéntica a la de la región correspondiente de una proteína que se encuentra en la naturaleza. En algunas realizaciones, la proteína mutante es un fragmento de proteína que contiene al menos aproximadamente cualquiera de 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300 ó 400 aminoácidos contiguos de una proteína de longitud completa. En algunas realizaciones, la proteína mutante es un fragmento de proteína que contiene aproximadamente cualquiera de 25-50, 50-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-300 ó 300-400 aminoácidos contiguos de una proteína de longitud completa. La identidad de secuencia puede medirse, por ejemplo, usando un software de análisis de secuencia con los parámetros predeterminados especificados en el mismo (por ejemplo, paquete de software de análisis de secuencias del Grupo de Computación Genética, Centro de Biotecnología de la Universidad de Wisconsin, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705). Este programa de software hace coincidir secuencias similares asignando grados de homología a diversos reemplazos, deleciones y otras modificaciones de aminoácidos.

Tal como se usa en el presente documento, una “mutación” significa una alteración en una secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos de referencia que se encuentra en la naturaleza. Las mutaciones de ácido nucleico a modo de ejemplo incluyen una inserción, deleción, mutación del marco de lectura, mutación silenciosa, mutación sin sentido o mutación de cambio de sentido. En algunas realizaciones, la mutación de ácido nucleico no es una mutación silenciosa. Las mutaciones de proteínas a modo de ejemplo incluyen la inserción de uno o más aminoácidos (por ejemplo, la inserción de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 aminoácidos), la deleción de uno o más aminoácidos (por ejemplo, una deleción de residuos N-terminales, C-terminales y/o internos, tal como la deleción de al menos aproximadamente cualquiera de 5, 10, 15, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300 o más aminoácidos o una deleción de aproximadamente cualquiera de 5 10, 10-15, 15-25, 25-50, 50-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-300 ó 300-400 aminoácidos), el reemplazo de uno o más aminoácidos (por ejemplo, el reemplazo de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 aminoácidos) o combinaciones de dos o más de los anteriores. La nomenclatura usada para referirse a una mutación de aminoácido particular identifica primero el aminoácido de tipo natural, seguido del número de residuo y finalmente el aminoácido sustituto. Por ejemplo, Y140L significa que la tirosina ha sido reemplazada por una leucina en el residuo número 140. Asimismo, una proteína H-NOX variante puede denominarse por las variaciones de aminoácidos de la proteína H-NOX. Por ejemplo, una proteína H-NOX Y140L de T. tengcongensis se refiere a una proteína H-NOX de T. tengcongensis en la que el residuo de tirosina en la posición número 140 se ha reemplazado por un residuo de leucina, y una proteína H-NOX W9F/Y140L de T. tengcongensis se refiere a una proteína H-NOX de T. tengcongensis en la que el residuo de triptófano en la posición 9 ha sido reemplazado por un residuo de fenilalanina y el residuo de tirosina en la posición número 140 se ha reemplazado por un residuo de leucina.

Una “mutación evolutiva conservada” es el reemplazo de un aminoácido en una proteína por un aminoácido en la posición correspondiente de otra proteína en la misma familia de proteínas.

Tal como se usa en el presente documento, “derivado de” se refiere a la fuente de la proteína en la que se introducen una o más mutaciones. Por ejemplo, una proteína que se “deriva de una proteína de mamífero” se refiere a una proteína de interés que resulta de la introducción de una o más mutaciones en la secuencia de una proteína de mamífero de tipo natural (es decir, una secuencia que se encuentra en la naturaleza).

Tal como se usa en el presente documento, “porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos” y “homología” con respecto a una secuencia de péptido, polipéptido o anticuerpo se definen como el porcentaje de residuos de aminoácido en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácido en la secuencia de péptido o polipéptido específica, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación con los propósitos de determinar el porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos puede lograrse de diversas maneras que están dentro de la habilidad en la técnica, por ejemplo, usando software informático disponible públicamente tal como el software BLAST, BLAST-2, ALIGN o m Eg ALIGNTM (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima en toda la longitud de las secuencias que van a compararse.

Tal como se usa en el presente documento, “koff” se refiere a una velocidad de disociación, tal como la velocidad de liberación de O²o NO a partir de una proteína. Una koff numéricamente más baja indica una velocidad de disociación más lenta.

Tal como se usa en el presente documento, “kon” se refiere a una velocidad de asociación, tal como la velocidad de unión de O²o NO a una proteína. Una kon numéricamente más baja indica una velocidad de asociación más lenta.

Tal como se usa en el presente documento, “constante de disociación” se refiere a una “constante de disociación cinética” o a una “constante de disociación calculada”. Una “constante de disociación cinética” o “Kd” es una razón de la velocidad de disociación cinética (koff) con respecto a una velocidad de asociación cinética (kon), tal como un valor de Kd determinado como un valor absoluto usando métodos convencionales (por ejemplo, métodos convencionales espectroscópicos, de flujo detenido o de fotólisis de destello) que incluyen métodos conocidos por el experto en la técnica y/o descritos en el presente documento. “Constante de disociación calculada” o “Kd calculada” se refiere a una aproximación de la constante de disociación cinética basada en una koff medida. Un valor para la kon se deriva a través de la correlación entre la koff y la Kd cinética tal como se describe en el presente documento.

Tal como se usa en el presente documento, “afinidad por oxígeno” es un término cualitativo que se refiere a la fuerza de la unión del oxígeno al resto hemo de una proteína. Esta afinidad se ve afectada tanto por la koff como por la kon para el oxígeno. Un valor de Kd para el oxígeno numéricamente más bajo significa una mayor afinidad.

Tal como se usa en el presente documento, “afinidad por NO” es un término cualitativo que se refiere a la fuerza de la unión del NO a una proteína (tal como la unión a un grupo hemo o a un oxígeno unido a un grupo hemo asociado con una proteína). Esta afinidad se ve afectada tanto por la koff como por la kon para el NO. Un valor de Kd para el NO numéricamente más bajo significa una mayor afinidad.

Tal como se usa en el presente documento, “estabilidad de NO” se refiere a la estabilidad o resistencia de una proteína a la oxidación por NO en presencia de oxígeno. Por ejemplo, la capacidad de la proteína para no oxidarse cuando se une a NO en presencia de oxígeno es indicativa de la estabilidad de NO de la proteína. En algunas realizaciones, menos de aproximadamente cualquiera del 50, el 40, el 30, el 10 o el 5% de una proteína H-NOX se oxida después de la incubación durante aproximadamente cualquiera de 1,2, 4, 6, 8, 10, 15 ó 20 horas a 20°C.

Tal como se usa en el presente documento, “reactividad de NO” se refiere a la velocidad a la que el hierro en el hemo de una proteína de unión a hemo se oxida por el NO en presencia de oxígeno. Un valor numérico más bajo para la reactividad de NO en unidades de s-1 indica una reactividad de NO más baja.

Tal como se usa en el presente documento, “velocidad de autooxidación” se refiere a la velocidad a la que se autooxida el hierro en el hemo de una proteína de unión a hemo. Una velocidad de autooxidación numéricamente más baja en unidades de s-1 indica una velocidad de autooxidación más baja.

El término “vector” se usa para describir un polinucleótido que puede modificarse por ingeniería para contener un polinucleótido o polinucleótidos clonados que pueden propagarse en una célula huésped. Un vector puede incluir uno o más de los siguientes elementos: un origen de replicación, una o más secuencias reguladoras (tales como, por ejemplo, promotores y/o potenciadores) que regulan la expresión del polipéptido de interés y/o uno o más genes marcadores seleccionables (tal como, por ejemplo, genes de resistencia a antibióticos y genes que pueden usarse en ensayos colorimétricos, por ejemplo, p-galactosidasa). El término “vector de expresión” se refiere a un vector que se usa para expresar un polipéptido de interés en una célula huésped.

Una “célula huésped” se refiere a una célula que puede ser o ha sido receptora de un vector o polinucleótido aislado. Las células huésped pueden ser células procariotas o células eucariotas. Las células eucariotas a modo de ejemplo incluyen células de mamíferos, tales como células de primates o animales no primates; células de hongos, tales como levadura; células vegetales; y células de insectos. Las células procariotas a modo de ejemplo incluyen células bacterianas; por ejemplo, células de E. coli.

El término “aislada”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula que se ha separado de al menos algunos de los componentes con los que se encuentra normalmente en la naturaleza o se produce. Por ejemplo, un polipéptido se denomina “aislado” cuando se separa de al menos algunos de los componentes de la célula en la que se produjo. Cuando una célula secreta un polipéptido después de la expresión, se considera que separar físicamente el sobrenadante que contiene el polipéptido de la célula que lo produjo es “aislar” el polipéptido. De manera similar, un polinucleótido se denomina “aislado” cuando no forma parte del polinucleótido más grande (tal como, por ejemplo, ADN genómico o ADN mitocondrial, en el caso de un polinucleótido de ADN) en el que normalmente se encuentra en la naturaleza, o se separa de al menos algunos de los componentes de la célula en la que se produjo, por ejemplo, en el caso de un polinucleótido de ARN. Por tanto, un polinucleótido de ADN que está contenido en un vector dentro de una célula huésped puede denominarse “aislado”.

Los términos “individuo” o “sujeto” se usan de manera intercambiable en el presente documento para referirse a un animal; por ejemplo, un mamífero. En algunas realizaciones, se proporcionan métodos de tratamiento de mamíferos, incluyendo, pero sin limitarse a, humanos, roedores, simios, felinos, caninos, equinos, bovinos, porcinos, ovinos, caprinos, animales de laboratorio mamíferos, animales de granja mamíferos, animales para fines deportivos mamíferos y mascotas mamíferas. En algunos ejemplos, un “individuo” o “sujeto” se refiere a un individuo o sujeto que necesita tratamiento para una enfermedad o un trastorno.

Una “enfermedad” o un “trastorno”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un estado en el que se necesita tratamiento.

El término “cáncer” se refiere a un trastorno proliferativo maligno asociado con la proliferación celular no controlada, el crecimiento celular no restringido y la muerte celular disminuida por apoptosis.

El término “tumor” se usa en el presente documento para referirse a un grupo de células que presentan niveles anómalamente altos de proliferación y crecimiento. Un tumor puede ser benigno, premaligno o maligno; las células tumorales malignas son cancerosas. Las células tumorales pueden ser células tumorales sólidas o células tumorales leucémicas. El término “crecimiento tumoral” se usa en el presente documento para referirse a la proliferación o al crecimiento por parte de una célula o células que comprenden un tumor que conduce a un aumento correspondiente del tamaño del tumor.

Tal como se usa en el presente documento, “tratamiento” es un enfoque para obtener resultados clínicos beneficiosos o deseados. “Tratamiento”, tal como se usa en el presente documento, cubre cualquier administración o aplicación de un agente terapéutico para una enfermedad en un mamífero, incluyendo un humano. Para los propósitos de esta invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, uno cualquiera o más de: alivio de uno o más síntomas, disminución de la extensión de la enfermedad, prevención o retraso de la propagación (por ejemplo, metástasis, por ejemplo metástasis al pulmón o al ganglio linfático) de la enfermedad, prevención o retraso de la recidiva de la enfermedad, retraso o ralentización de la progresión de la enfermedad, mejora del estado de la enfermedad, inhibición de la enfermedad o la progresión de la enfermedad, inhibición o ralentización de la enfermedad o su progresión, detención de su desarrollo y remisión (ya sea parcial o total). También se incluye en el término “tratamiento” una reducción de las consecuencias patológicas de una enfermedad proliferativa. Los métodos de la invención contemplan uno cualquiera o más de estos aspectos del tratamiento.

En el contexto del cáncer, el término “tratar” incluye cualquiera o todos de: inhibir el crecimiento de células tumorales o células cancerosas, inhibir la replicación de células tumorales o células cancerosas, disminuir la carga tumoral global y mejorar uno o más síntomas asociados con la enfermedad.

Los términos “ inhibición” o “inhibir” se refieren a una disminución o cese de cualquier característica fenotípica o a la disminución o cese de la incidencia, el grado o la probabilidad de esa característica. “Reducir” o “ inhibir” es disminuir, reducir o detener una actividad, función y/o cantidad en comparación con una referencia. En determinadas realizaciones, por “reducir” o “ inhibir” se entiende la capacidad de provocar una disminución global del 20% o mayor. En otra realización, por “reducir” o “ inhibir” se entiende la capacidad de provocar una disminución global del 50% o mayor. En aún otra realización, por “reducir” o “inhibir” se entiende la capacidad de provocar una disminución global del 75%, el 85%, el 90%, el 95% o el 99%.

Tal como se usa en el presente documento, “retrasar el desarrollo de una enfermedad” significa aplazar, obstaculizar, ralentizar, retrasar, estabilizar, suprimir y/o posponer el desarrollo de la enfermedad (tal como el cáncer). Este retraso puede ser de diferentes períodos de tiempo, dependiendo de los antecedentes de la enfermedad y/o del individuo que va a tratarse. Tal como resulta evidente para un experto en la técnica, un retraso suficiente o significativo puede englobar, en efecto, la prevención, ya que el individuo no desarrolla la enfermedad. Por ejemplo, puede retrasarse un cáncer en fase tardía, tal como el desarrollo de metástasis.

Una “referencia”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier muestra, patrón o nivel que se usa con propósitos de comparación. Puede obtenerse una referencia de una muestra sana y/o no enferma. En algunos ejemplos, puede obtenerse una referencia a partir de una muestra sin tratar. En algunos ejemplos, se obtiene una referencia de una muestra no enferma o no tratada de un sujeto individual. En algunos ejemplos, se obtiene una referencia de uno o más individuos sanos que no son el sujeto o paciente.

“Prevenir”, tal como se usa en el presente documento, incluye proporcionar profilaxis con respecto a la aparición o recidiva de una enfermedad en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad pero que aún no ha sido diagnosticado con la enfermedad.

Una “cantidad eficaz” de un agente se refiere a una cantidad eficaz, en las dosificaciones y durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado.

Una “cantidad terapéuticamente eficaz” de una sustancia/molécula de la invención, agonista o antagonista puede variar según factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad de la sustancia/molécula, agonista o antagonista para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es una en la que los efectos terapéuticamente beneficiosos superan cualquier efecto tóxico o perjudicial de la sustancia/molécula, agonista o antagonista. Puede administrarse una cantidad terapéuticamente eficaz en una o más administraciones.

Una “cantidad profilácticamente eficaz” se refiere a una cantidad eficaz, en las dosificaciones y durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Normalmente, pero no necesariamente, dado que se usa una dosis profiláctica en sujetos antes o en una fase más temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.

Los términos “formulación farmacéutica” y “composición farmacéutica” se refieren a una preparación que está en una forma tal que permite que la actividad biológica del/de los principio(s) activo(s) sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se le administraría la formulación. Tales formulaciones pueden ser estériles y esencialmente libres de endotoxinas.

Un “portador farmacéuticamente aceptable” se refiere a una carga, un diluyente, material encapsulante, agente auxiliar de formulación o portador sólido, semisólido o líquido no tóxico convencional en la técnica para su uso con un agente terapéutico que, juntos, comprenden una “composición farmacéutica” para la administración a un sujeto. Un portador farmacéuticamente aceptable no es tóxico para los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas y es compatible con otros componentes de la formulación. El portador farmacéuticamente aceptable es apropiado para la formulación empleada.

Una formulación “estéril” es aséptica o está esencialmente libre de microorganismos vivos y sus esporas.

La administración “en combinación con” uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye la administración simultánea (concurrente) y consecutiva o secuencial en cualquier orden.

El término “de manera concurrente” se usa en el presente documento para referirse a la administración de dos o más agentes terapéuticos, en la que al menos parte de la administración se solapa en el tiempo o cuando la administración de un agente terapéutico está dentro de un período corto de tiempo en relación con la administración del otro agente terapéutico. Por ejemplo, los dos o más agentes terapéuticos se administran con una separación de tiempo de no más de aproximadamente 60 minutos, tal como no más de aproximadamente cualquiera de 30, 15, 10, 5 ó 1 minutos.

El término “de manera secuencial” se usa en el presente documento para referirse a la administración de dos o más agentes terapéuticos, en la que la administración de uno o más agentes continúa después de interrumpir la administración de uno o más de otros agentes. Por ejemplo, la administración de los dos o más agentes terapéuticos se administra con un intervalo de tiempo de más de aproximadamente 15 minutos, tal como aproximadamente cualquiera de 20, 30, 40, 50 ó 60 minutos, 1 día, 2 días, 3 días, 1 semana, 2 semanas o 1 mes.

Tal como se usa en el presente documento, “junto con” se refiere a la administración de una modalidad de tratamiento además de otra modalidad de tratamiento. Como tal, “junto con” se refiere a la administración de una modalidad de tratamiento antes, durante o después de la administración de la otra modalidad de tratamiento al individuo.

El término “prospecto” se usa para referirse a las instrucciones habitualmente incluidas en los envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, el uso, la dosificación, administración, terapia de combinación, contraindicaciones y/o precauciones relativas al uso de tales productos terapéuticos.

Un “artículo de manufactura” es cualquier manufactura (por ejemplo, un envase o recipiente) o kit que comprende al menos un reactivo, por ejemplo, un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o un trastorno (por ejemplo, cáncer), o una sonda para detectar específicamente un biomarcador descrito en el presente documento. En determinadas realizaciones, la manufactura o el kit se promociona, distribuye o vende como una unidad para realizar los métodos descritos en el presente documento.

Proteínas H-NOX

Visión general de la familia de proteínas H-NOX

A menos que se indique lo contrario, puede usarse cualquier proteína H-NOX de tipo natural o mutante en las composiciones, los kits y métodos tal como se describen en el presente documento. Tal como se usa en el presente documento, una “proteína H-NOX” significa una proteína que tiene un dominio de H-NOX (denominado así por el dominio de unión a Hemo-óxido Nítrico y OXígeno). Una proteína H-NOX puede contener o no uno o más dominios además del dominio de H-NOX. Las proteínas H-NOX son miembros de una familia de hemoproteínas altamente conservada y bien caracterizada (Iyer, L. M. et al. (3 de febrero de 2003). BMC Genomics 4(1):5; Karow, D. S. et al. (10 de agosto de 2004). Biochemistry 43(31):10203-10211; Boon, E. M. et al. (2005). Nature Chem. Biol. 1:53-59; Boon, E. M. et al. (octubre de 2005). Curr. Opin. Chem. Biol. 9(5):441-446; Boon, E. M. et al. (2005). J. Inorg. Biochem.

99 (4): 892-902). Las proteínas H-NOX también se conocen como proteínas Pfam 07700 o proteínas HNOB (Pfam -A database of protein domain family alignments and Hidden Markov Models, Copyright (C) 1996-2006 The Pfam Consortium; g Nu LGPL Free Software Foundation, Inc., 59 Temple Place - Suite 330, Boston, MA 02111-1307, EE.UU.). En algunas realizaciones, una proteína H-NOX tiene, o se predice que tiene, una estructura secundaria que incluye seis hélices alfa, seguidas de dos hebras beta, seguidas de una hélice alfa, seguida de dos hebras beta. Una proteína H-NOX puede ser una apoproteína que es capaz de unirse a hemo o una holoproteína con hemo unido. Una proteína H-NOX puede unirse de manera covalente o no covalente a un grupo hemo. Algunas proteínas H-NOX se unen al NO pero no al O², y otras se unen tanto al NO como al O². Los dominios de H-NOX de aerobios facultativos que se han aislado se unen al NO pero no al O². Proteínas H-NOX de procariotas aeróbicos obligados, C. elegans, y D. melanogaster, se unen al NO y al O². Los mamíferos tienen dos proteínas H-NOX: p1 y p2. Una alineación de secuencias de H-NOX de ratón, de rata, de vaca y humana muestra que estas especies comparten >99% de identidad. En algunas realizaciones, el dominio de H-NOX de una proteína H-NOX o la proteína H-NOX completa es al menos aproximadamente cualquiera del 10, el 15, el 20, el 25, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90, el 95, el 97, el 98, el 99 o el 99,5% idéntica a la región correspondiente de una proteína H-NOX de Thermoanaerobacter tengcongensis que se produce de manera natural (por ejemplo, SEQ ID NO:2) o una proteína sGC que se produce de manera natural (por ejemplo, una proteína sGC p1 que se produce de manera natural). En algunas realizaciones, el dominio de H-NOX de una proteína H-NOX o la proteína H-NOX completa es al menos aproximadamente cualquiera del 10-20%, el 20-30%, el 30-40%, el 40-50%, el 50-60%, el 60-70%, el 70-80%, el 80-90%, el 90-95%, el 95-99 o el 99-99.9% idéntica a la región correspondiente de una proteína H-NOX de Thermoanaerobacter tengcongensis que se produce de manera natural (por ejemplo, SEQ ID NO: 2) o una proteína sGC que se produce de manera natural (por ejemplo, una proteína sGC p1 que se produce de manera natural). Tal como se analiza adicionalmente en el presente documento, una proteína H-NOX puede contener opcionalmente una o más mutaciones con respecto a la proteína H-NOX que se produce de manera natural correspondiente. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX incluye uno o más dominios además del dominio de H-NOX. En realizaciones particulares, la proteína H-NOX incluye uno o más dominios o la secuencia completa de otra proteína. Por ejemplo, la proteína H-NOX puede ser una proteína de fusión que incluye un dominio de H-NOX y parte o la totalidad de otra proteína, tal como albúmina (por ejemplo, albúmina sérica humana). En algunas realizaciones, sólo está presente el dominio de H-NOX. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX no comprende un dominio de guanilil ciclasa. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX comprende una etiqueta; por ejemplo, una etiqueta His6.

Proteínas H-NOX triméricas

La invención proporciona proteínas H-NOX triméricas que comprenden tres dominios de H-NOX. Los tres dominios de H-NOX pueden unirse de manera covalente o no covalente. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX trimérica comprende dominios de H-NOX homólogos. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX trimérica comprende dominios de H-NOX heterólogos; por ejemplo, los dominios de H-NOX pueden comprender variantes de aminoácidos de una especie particular de dominio de H-NOX o pueden comprender dominios de H-NOX de diferentes especies. En algunas realizaciones, al menos uno de los dominios de H-NOX de una proteína H-NOX trimérica comprende una mutación correspondiente a una mutación L144F de H-NOX de T. tengcongensis. En algunas realizaciones, al menos uno de los dominios de H-NOX de una proteína H-NOX trimérica comprende una mutación correspondiente a una mutación W9F/L144F de H-NOX de T. tengcongensis. La proteínas H-NOX triméricas comprenden tres dominios de trimerización. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX trimérica comprende tres dominios de H-NOX de T. tengcongensis. En algunas realizaciones, el dominio de H-NOX trimérico comprende tres dominios de H-NOX L144F de T. tengcongensis. En algunas realizaciones, el dominio de H-NOX trimérico comprende tres dominios de H-NOX W9F/L144F de T. tengcongensis.

La proteína H-NOX trimérica comprende tres monómeros asociados. Los monómeros pueden unirse de manera covalente o unirse de manera no covalente. En algunas realizaciones, se producen subunidades monoméricas de una proteína H-NOX trimérica en la que las subunidades monoméricas se asocian in vitro o in vivo para formar la proteína H-NOX trimérica. Los monómeros comprenden un dominio de H-NOX y un dominio de trimerización. En algunas realizaciones, el dominio de trimerización se une de manera covalente al dominio de H-NOX; por ejemplo, el extremo C-terminal del dominio de H-NOX se une de manera covalente al extremo N-terminal o al extremo C-terminal del dominio de trimerización. En otras realizaciones, el extremo N-terminal del dominio de H-NOX se une de manera covalente al extremo N-terminal o al extremo C-terminal del dominio de trimerización. En algunas realizaciones, un espaciador de aminoácidos se une de manera covalente entre el dominio de H-NOX y el dominio de trimerización. Un “espaciador de aminoácidos” y un “ligador de aminoácidos” se usan de manera intercambiable en el presente documento. En algunas realizaciones, al menos una de las subunidades monoméricas de una proteína H-NOX trimérica comprende una mutación correspondiente a una mutación L144F de H-NOX de T. tengcongensis. En algunas realizaciones, al menos una de las subunidades monoméricas de una proteína H-NOX trimérica comprende una mutación correspondiente a una mutación W9F/L144F de H-NOX de T. tengcongensis. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX trimérica es una proteína H-NOX trimérica. En algunas realizaciones, el monómero de una proteína H-NOX trimérica comprende un dominio de H-NOX y un dominio foldon del bacteriófago T4. En algunas realizaciones, el monómero de una proteína H-NOX trimérica comprende un dominio de H-NOX de T. tengcongensis y un dominio foldon. En algunas realizaciones, el monómero de una proteína H-NOX trimérica comprende un dominio de H-NOX L144F de T. tengcongensis y un dominio foldon. En algunas realizaciones, el monómero de una proteína H-NOX trimérica comprende un dominio de H-NOX W9F/L144F de T. tengcongensis y un dominio foldon. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX trimérica comprende tres monómeros, comprendiendo cada monómero un dominio de H-NOX L144F de T. tengcongensis y un dominio foldon. En algunas realizaciones, el dominio de H-NOX se une al dominio foldon con un ligador de aminoácidos; por ejemplo un ligador Gly-Ser-Gly. En algunas realizaciones, al menos un dominio de H-NOX comprende una etiqueta. En algunas realizaciones, al menos un dominio de H-NOX comprende una etiqueta His6. En algunas realizaciones, la etiqueta His6 se une al dominio foldon con un ligador de aminoácidos; por ejemplo un ligador Arg-Gly-Ser. En algunas realizaciones, todos los dominios de H-NOX comprenden una etiqueta His6. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX trimérica comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:26 o SEQ ID NO:28.

El dominio de H-NOX a modo de ejemplo de T. tengcongensis es de aproximadamente 26,7 kDal. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX trimérica tiene una masa atómica mayor que cualquiera de aproximadamente 50 kDal, 75 kDal, 100 kDal, 125 kDal a aproximadamente 150 kDal.

La invención proporciona proteínas H-NOX triméricas que muestran mayor acumulación en uno o más tejidos en un individuo en comparación con una proteína H-NOX monomérica correspondiente que comprende un único dominio de H-NOX tras la administración de la proteína H-NOX al individuo. Una proteína H-NOx correspondiente se refiere a una forma monomérica de la proteína H-NOX que comprende al menos uno de los dominios de H-NOX de la proteína H-NOX trimérica. Los tejidos de acumulación preferencial de H-NOX trimérica incluyen, pero no se limitan a, tumores y tejido con vasculatura dañada. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX trimérica persiste en un mamífero durante al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 6, 12 ó 24 horas tras la administración de la proteína H-NOX al individuo. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX trimérica persiste en un mamífero durante aproximadamente 1-2, 2-3, 3-4, 4-6, 6-12 ó 12-24 horas tras la administración de la proteína H-NOX al individuo. En algunas realizaciones, los riñones producen el aclaramiento de menos de aproximadamente el 10% de la H-NOX trimérica del mamífero en el plazo de menos de cualquiera de aproximadamente 1 hora, 2 horas o 3 horas tras la administración de la proteína H-NOX al individuo.

Fuentes de proteínas H-NOX y dominios de H-NOX

Pueden usarse proteínas H-NOX y dominios de H-NOX de cualquier género o especie en las composiciones, los kits y métodos descritos en el presente documento. En diversas realizaciones, la proteína H-NOX o los dominios de H-NOX de una proteína H-NOx trimérica es una proteína o un dominio de un mamífero (por ejemplo, un primate (por ejemplo, humano, mono, gorila, simio, lémur, etc.), un bovino, un equino, un porcino, un canino o un felino), un insecto, una levadura o una bacteria, o se deriva de una proteína de este tipo. Las proteínas H-NOX de mamífero a modo de ejemplo incluyen guanilato ciclasa soluble humana y de rata de tipo natural (tal como la subunidad p1). Los ejemplos de proteínas H-NOX incluyen proteínas H-NOX de mamífero de tipo natural, por ejemplo H. sapiens, M. musculus, C. familiaris, B. Taurus, C. lupus y R. norvegicus; y proteínas H-NOX de vertebrados no mamíferos de tipo natural, por ejemplo,. X. laevis, O. latipes, O. curivatus y F. rubripes. Los ejemplos de proteínas H-NOX de unión a NO de tipo natural de no mamíferos incluyen proteínas H-NOX de tipo natural de D. melanogaster, A. gambiae y M. sexta; los ejemplos de proteínas H-NOX de unión a O²de tipo natural de no mamíferos incluyen las proteínas H-NOX de tipo natural de C. elegans gcy-31, gcy-32, gcy-33, gcy-34, gcy-35, gcy-36 y gcy-37; D. melanogaster CG14885, CG14886 y CG4154; y M. sexta beta-3; los ejemplos de proteínas H-NOX de tipo natural de procariotas incluyen T. tengcongensis, V. cholera, V. fischerii, N. punctiforme, D. desulfuricans, L. pneumophila 1, L. pneumophila 2 y C. acetobutylicum.

Los números de registro del NCBI para proteínas H-NOX a modo de ejemplo incluyen los siguientes: Homo sapiens p i [gi:2746083], Rattus norvegicus p1 [gi:27127318], Drosophila melanogaster p1 [gi:861203], Drosophila melanogaster CG14885-PA [gi:23171476], Caenorhabditis elegans GCY-35 [gi:52782806], Nostoc punctiforme [gi:23129606], Caulobacter crescentus [gi:16127222], Shewanella oneidensis [gi:24373702], Legionella pneumophila (ORF 2) [CUCGC_272624], Clostridium acetobutylicum [gi:15896488] y Thermoanaerobacter tengcongensis [gi:20807169]. Se proporciona H-NOX de Canis lupus con número de registro de GenBank DQ008576. Las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos de las proteínas y los dominios de H-NOX se proporcionan en la figura 37.

La proteína H-NOX a modo de ejemplo también incluyen las siguientes proteínas H-NOX que se enumeran por su nombre de gen, seguido de su abreviatura de especie e identificadores de Genbank (tal como las siguientes secuencias de proteínas disponibles a partir del 21 de mayo de 2006; 22 de mayo de 2006; 21 de mayo de 2007; o 22 de mayo de 2007): Npun5905_Npu_23129606, alr2278_Ana_17229770, SO2144_Sone_24373702, Mdeg1343_Mde_23027521, VCA0720_Vch_15601476,CC2992_Ccr_16127222, Rsph2043_Rhsp_22958463 (gi:46192757), Mmc10739_Mcsp_22999020, Tar4_Tte_20807169,Ddes2822_Dde_23475919,CAC3243_Cac_15896488, gcy-31_Ce_17568389, CG14885_Dm_24647455,GUCY1B3_Hs_4504215, HpGCS-beta1_Hpul_14245738, Gycbeta100B_Dm_24651577, CG4154_Dm_24646993 (gi:NP_650424,2, gi:62484298), gcy-32_Ce_13539160, gcy-36_Ce_17568391 (gi:32566352, gi:86564713), gcy-35_Ce-17507861 (gi:71990146), gcy-37_Ce_17540904 (gi:71985505), GCY1a3_Hs_20535603, GCY1a2-Hs_899477 o GYCa-99B_Dm_729270 (gi:68067738) (Lakshminarayan et al. (2003). BMG Genomics 4:5-13). Las abreviaturas de especies usadas en estos nombres incluyen Ana - Anabaena Sp; Ccr - Caulobacter crescentus; Cac - Clostridium acetobutylicum; Dde - Desulfovibrio desulfuricans; Mcsp - Magnetococcus sp.; Mde -Microbulbifer degradans; Npu - Nostoc punctiforme; Rhsp - Rhodobacter sphaeroides; Sone - Shewanella oneidensis; Tte - Thermoanaerobacter tengcongensis; Vch - Vibrio cholerae; Ce - Caenorhabditis elegans; Dm - Drosophila melanogaster; Hpul - Hemicentrotus pulcherrimus; Hs - Homo sapiens.

Otras proteínas H-NOX a modo de ejemplo incluyen las siguientes proteínas H-NOX que se enumeran por su nombre de organismo y el número de registro de la base de datos Pfam (tal como las siguientes secuencias de proteínas disponibles a partir del 21 de mayo de 2006; 22 de mayo de 2006; 17 de mayo de 2007; 21 de mayo de 2007; o 22 de mayo de 2007): Caenorhabditis briggsae Q622M5_CAEBR, Caenorhabditis briggsae Q61P44_CAEBR, Caenorhabditis briggsae Q61R54_CAEBR, Caenorhabditis briggsae Q61V90_CAEBR, Caenorhabditis briggsae Q61A94_CAEBR, Caenorhabditis briggsae Q60TP4_CAEBR, Caenorhabditis briggsae Q60M10_CAEBR, Caenorhabditis elegans GCY37_CAEEL, Caenorhabditis elegans GCY31_CAEEL, Caenorhabditis elegans GCY36_CAEEL, Caenorhabditis elegans GCY32_CAEEL, Caenorhabditis elegans GCY35_CAEEL, Caenorhabditis elegans GCY34_CAEEL, Caenorhabditis elegans GCY33_CAEEL, Oryzias curvinotus Q7T040_ORYCU, Oryzias curvinotus Q75WF0_ORYCU, Oryzias latipes P79998_ORILA, Oryzias latipes Q7ZSZ5_ORILA, Tetraodon nigroviridis Q4SW38_TETNG, Tetraodon nigroviridis Q4RZ94_TETNG, Tetraodon nigroviridis Q4S6K5_TETNG, Fugu rubripes Q90VY5_FUGRU, Xenopus laevis Q6INK9_XENLA, Homo sapiens Q5T8J7_HUMAN, Homo sapiens GCYA2_HUMAN, Homo sapiens GCYB2_HUMAN, Homo sapiens GCYB1_HUMAN, Gorilla gorilla Q9N193_9PRIM, Pongo pygmaeus Q5RAN8_PONPY, Pan troglodytes Q9N192_PANTR, Macaca mulatta Q9N194_MACMU, Hylobates lar q 9N191_HILLA, Mus musculus Q8Bx H3_RATÓN, Mus musculus GCYB1_RATÓN, Mus musculus Q3UTI4_RATÓN, Mus musculus Q3UH83_RATÓN, Mus musculus Q6XE41_RATÓN, Mus musculus Q80YP4_RATÓN, Rattus norvegicus Q80WX7_RAT, Rattus norvegicus Q80WX8_RAT, Rattus norvegicus Q920Q1_RAT, Rattus norvegicus Q54A43_RAT, Rattus norvegicus Q80WY0_RAT, Rattus norvegicus Q80WY4_RAT, Rattus norvegicus Q8CH85_RAT, Rattus norvegicus Q80WY5_RAT, Rattus norvegicus GCYB1_RAT, Rattus norvegicus Q8CH90_RAT, Rattus norvegicus Q91XJ7_RAT, Rattus norvegicus Q80WX9_RAT, Rattus norvegicus GCYB2_RAT, Rattus norvegicus GCYA2_RAT, Canis familiaris Q4ZHR9_CANFA, Bos taurus GCYB1_BOVIN, Sus scrofa Q4ZHR7_PIG, Gryllus bimaculatus Q59HN5_GRYBI, Manduca sexta O77106_MANSE, Manduca sexta O76340_MANSE, Apis mellifera Q5UAF0_APIME, Apis mellifera Q5FAN0_APIME, Apis mellifera Q6L5L6_APIME, Anopheles gambiae str PEST Q7PYK9_ANOGA, Anopheles gambiae str PEST Q7Q9W6_ANOGA, Anopheles gambiae str PEST Q7QF31_ANOGA, Anopheles gambiae str PEST Q7PS01_ANOGA, Anopheles gambiae str PEST Q7PFY2_ANOGA, Anopheles gambiae str Q7KQ93_ANOGA, Drosophila melanogaster Q24086_DROME, Drosophila melanogaster GCYH_DROME, Drosophila melanogaster GCY8E_DROME, Drosophila melanogaster GCYDA_DROME, Drosophila melanogaster GCYDB_DROME, Drosophila melanogaster Q9VA09_DROME, Drosophila pseudoobscura Q29CE1_DROPS, Drosophila pseudoobscura Q296C7_DROPS, Drosophila pseudoobscura Q296C8_DROPS, Drosophila pseudoobscura Q29BU7_DROPS, Aplysia californica Q7YWK7_APLCA, Hemicentrotus pulcherrimus Q95Nk 5_HEMPU, Chlamydomonas reinhardtii, Q5ILC2_CHLRE, Anabaena sp Q8YUQ7_ANASP, Flavobacteria bacterium BBFL7 Q26GR8_9BACT, Psychroflexus torquis ATCC 700755 Q1Vq E5_9FLAO, gamma-proteobacteria marina HTCC2207 Q1YPJ5_9GAMM, gamma-proteobacteria marina HTCC2207 Q1YTK4_9Ga Mm , Caulobacter crescentus Q9A451_CAUCR, Acidiphilium cryptum JF-5 Q2DG60_ACICY, Rhodobacter sphaeroides Q3J0U9_RHOS4, Silicibacter pomeroyi Q5LpV1_SILPO, Paracoccus denitrificans PD1222, Q3PC67_PARDE, Silicibacter sp TM1040 Q3QNY2_9RHOB, Jannaschia sp Q28ML8_JANSC, Magnetococcus sp MC-1 Q3XT27_9PROT, Legionella pneumophila Q5WXP0_LEGPL, Legionella pneumophila Q5WTZ5_LEGPL, Legionella pneumophila Q5X268_LEGPA, Legionella pneumophila Q5X2R2_LEGPA, Legionella pneumophila subsp pneumophila Q5ZWM9_LEGPH, Legionella pneumophila subsp pneumophila Q5ZSQ8_LEGPH, Colwellia psychrerythraea Q47Y43_COLP3, Pseudoalteromonas atlantica T6c Q3CSZ5_ALTAT, Shewanella oneidensis Q8EF49_SHEON, Saccharophagus degradans Q21E20_SACD2, Saccharophagus degradans Q21ER7_SACD2, Vibrio angustum S14 Q1ZWE5_9VIBR, Vibrio vulnificus Q8DAE2_VIBVU, Vibrio alginolyticus 12G01 Q1VCP6_VIBAL, Vibrio sp DAT722 Q2FA22_9VIBR, Vibrio parahaemolyticus Q87NJ1_VIBPA, Vibrio fischeri Q5E1F5_VIBF1, Vibrio vulnificus Q7MJS8_VIBVY, Photobacterium sp SKA34 Q2C6Z5_9GAMM, Hahella chejuensis Q2SFY7_HAHCH, Oceanospirillum sp MED92 Q2BKV0_9GAMM, Oceanobacter sp RED65 Q1N035_9GAMM, Desulfovibrio desulfuricans Q310U7_De SDG, Halothermothrix orenii H 168 Q2AIW5_9FIRM, Thermoanaerobacter tengcongensis Q8RBX6_THETN, Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903 Q2ZH17_CALSA, Clostridium acetobutylicum Q97E73_CLOAB, Alkaliphilus metalliredigenes QYMF Q3C763_9CLOT, Clostridium tetani Q899J9_CLOTE y Clostridium beijerincki NCIMB 8052 Q2WVN0_CLOBE. Se predice que estas secuencias codifican para proteínas H-NOX basándose en la identificación de estas proteínas como pertenecientes a la familia de proteínas H-NOX usando la base de datos Pfam tal como se describe en el presente documento.

Pueden identificarse proteínas H-NOX, dominios de H-NOX de proteínas H-NOX triméricas y ácidos nucleicos adicionales, que pueden ser adecuados para su uso en las composiciones farmacéuticas y los métodos descritos en el presente documento, usando métodos convencionales. Por ejemplo, pueden usarse programas de predicción de estructura y/o alineación de secuencias convencionales para identificar proteínas H-NOX y ácidos nucleicos adicionales basándose en la similitud de su estructura secundaria de proteína primaria y/o predicha con la de proteínas H-NOX y ácidos nucleicos conocidos. Por ejemplo, la base de datos Pfam usa algoritmos de alineación definidos y modelos ocultos de Markov (tal como Pfam 21.0) para clasificar las proteínas en familias, tal como la familia de proteínas H-NOX (Pfam - A database of protein domain family alignments and Hidden Markov Models, Copyright (C) 1996-2006 The Pfam Consortium; GNU Lg PL Free Software Foundation, Inc., 59 Temple Place - Suite 330, Boston, MA 02111-1307, EE.UU.). También pueden usarse bases de datos convencionales tales como la base de datos swissprot-trembl (página web en “expasy.org”, Instituto Suizo de Bioinformática, Swiss-Prot group CMU -1 rue Michel Servet CH-1211 Ginebra 4, Suiza) para identificar a los miembros de la familia de proteínas H-NOX. La estructura secundaria y/o terciaria de una proteína H-NOX puede predecirse usando la configuración predeterminada de los programas de predicción de estructuras convencionales, tales como PredictProtein (630 West, 168 Street, BB217, Nueva York, N.Y.10032, EE.UU.). Alternativamente, la estructura secundaria y/o terciaria real de una proteína H-NOX puede determinarse usando métodos convencionales.

En algunas realizaciones, el dominio de H-NOX tiene el mismo aminoácido en la posición correspondiente que cualquiera de los siguientes residuos del bolsillo distal en H-NOX de T. tengcongensis: Thr4, Ile5, Thr8, Trp9, Trp67, Asn74, Ile75, Phe78, Phe82, Tyr140, Leu144 o cualquier combinación de dos o más de los anteriores. En algunas realizaciones, el dominio de H-NOX tiene una prolina o una arginina en una posición correspondiente a la de Pro115 o Arg135 de H-NOX de T. tengcongensis, respectivamente, basándose en la alineación de secuencias de sus secuencias de aminoácidos. En algunas realizaciones, el dominio de H-NOX tiene una histidina que corresponde a His 105 de H-NOX de R. norvegicus p1. En algunas realizaciones, el dominio de H-NOX tiene o se prevé que tiene una estructura secundaria que incluye seis hélices alfa, seguidas de dos hebras beta, seguidas de una hélice alfa, seguida de dos hebras beta. Se ha informado de esta estructura secundaria para las proteínas H-NOX.

Si se desea, puede someterse a prueba una proteína H-NOX o un dominio de H-NOX recientemente identificado para determinar si se une al hemo usando métodos convencionales. La capacidad de un dominio de H-NOX para funcionar como un portador de O²puede someterse a prueba determinando si el dominio de H-NOX se une al O²usando métodos convencionales, tales como los descritos en el presente documento. Si se desea, pueden introducirse una o más de las mutaciones descritas en el presente documento en el dominio de H-NOX para optimizar sus características como portador de O². Por ejemplo, pueden introducirse una o más mutaciones para alterar su constante de disociación de O², koff para el oxígeno, la velocidad de autooxidación de hemo, la reactividad de NO, la estabilidad de NO o cualquier combinación de dos o más de los anteriores. Pueden usarse técnicas convencionales como las descritas en el presente documento para medir estos parámetros.

Proteínas H-NOX mutantes

Tal como se analiza adicionalmente en el presente documento, una proteína H-NOX o un dominio de H-NOX de una proteína H-NOX trimérica puede contener una o más mutaciones, tales como una mutación que altera la constante de disociación de O², la koff para el oxígeno, la velocidad de autooxidación de hemo, la reactividad de NO, la estabilidad de NO o cualquier combinación de dos o más de los anteriores en comparación con las de la proteína de tipo natural correspondiente. En algunas realizaciones, la invención proporciona una proteína H-NOX trimérica que comprende tres dominios de H-NOX que pueden contener una o más mutaciones, tales como una mutación que altera la constante de disociación de O², la koff para el oxígeno, la velocidad de autooxidación de hemo, la reactividad de NO, la estabilidad de NO o cualquier combinación de dos o más de los anteriores en comparación con las de la proteína de tipo natural correspondiente. Los paneles de dominios de H-NOX modificados por ingeniería pueden generarse mediante mutagénesis al azar seguida de selección empírica para determinar las constantes de disociación, velocidades de disociación, reactividad de NO, estabilidad, fisiocompatibilidad o cualquier combinación de dos o más de los anteriores requeridos o deseados, en vista de la enseñanza proporcionada en el presente documento usando técnicas tal como se describen en el presente documento y, además, como las conoce el experto en la técnica. Alternativamente, la mutagénesis puede dirigirse selectivamente a regiones o residuos particulares tales como residuos de bolsillos distales evidentes a partir de la estructura tridimensional predicha o determinada experimentalmente de una proteína H-NOX (véase, por ejemplo, Boon, E. M. et al. (2005). Nature Chemical Biology 1:53-59, particularmente con respecto a las secuencias de proteínas H-NOX de tipo natural y mutantes) o residuos conservados evolutivamente identificados a partir de alineaciones de secuencias (véase, por ejemplo, Boon E.M. et al. (2005). Nature Chemical Biology 1:53-59, particularmente con respecto a las secuencias de proteínas H-NOX de tipo natural y mutantes).

En algunas realizaciones de la invención, la proteína H-NOX mutante o el dominio de H-NOX mutante de una proteína H-NOX trimérica tiene una secuencia que difiere de la de todas las proteínas o dominios de H-NOX que se encuentran en la naturaleza. En diversas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la proteína mutante es al menos aproximadamente cualquiera del 10, el 15, el 20, el 25, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90, el 95, el 97, el 98, el 99 o el 99,5% idéntica a la de la región correspondiente de una proteína H-NOX que se encuentra en la naturaleza. En diversas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la proteína mutante es aproximadamente el 10-20%, el 20-30%, el 30-40%, el 40-50%, el 50-60%, el 60-70%, el 70-80%, el 80-90%, el 90-95%, el 95-99% o el 99,5% idéntica a la de la región correspondiente de una proteína H-NOX que se encuentra en la naturaleza. En algunas realizaciones, la proteína mutante es un fragmento de proteína que contiene al menos aproximadamente cualquier de 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300 ó 400 aminoácidos contiguos de una proteína de longitud completa. En algunas realizaciones, la proteína mutante es un fragmento de proteína que contiene 25-50, 50-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-300 ó 300 400 aminoácidos contiguos de una proteína de longitud completa. La identidad de secuencia puede medirse, por ejemplo, usando un software de análisis de secuencias con los parámetros predeterminados especificados en el mismo (por ejemplo, paquete de software de análisis de secuencias del Grupo de Computación Genética, Centro de Biotecnología de la Universidad de Wisconsin, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705). Este programa de software hace coincidir secuencias similares asignando grados de homología a diversos reemplazos, deleciones y otras modificaciones de aminoácidos.

En algunas realizaciones de la invención, la proteína H-NOX mutante o el dominio de H-NOX mutante de una proteína H-NOX trimérica comprende la inserción de uno o más aminoácidos (por ejemplo, la inserción de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 aminoácidos). En algunas realizaciones de la invención, la proteína H-NOX mutante o el dominio de H-NOX mutante comprende la deleción de uno o más aminoácidos (por ejemplo, una deleción de residuos N-terminales, C-terminales y/o internos, tal como la deleción de al menos aproximadamente cualquiera de 5, 10, 15, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300 o más aminoácidos o una deleción de 5-10, 10-15, 15-25, 25-50, 50-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200 300 ó 300-400 aminoácidos). En algunas realizaciones de la invención, la proteína H-NOX mutante o el dominio de H-NOX mutante comprende el reemplazo de uno o más aminoácidos (por ejemplo, el reemplazo de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 aminoácidos) o combinaciones de dos o más de los anteriores. En algunas realizaciones, una proteína mutante tiene al menos una alteración de aminoácidos en comparación con una proteína que se encuentra en la naturaleza. En algunas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico mutante codifica para una proteína que tiene al menos una alteración de aminoácidos en comparación con una proteína que se encuentra en la naturaleza. En algunas realizaciones, el ácido nucleico no es una versión degenerada de un ácido nucleico que se encuentra en la naturaleza que codifica para una proteína con una secuencia de aminoácidos idéntica a una proteína que se encuentra en la naturaleza.

En algunas realizaciones, la mutación en la proteína H-NOX o en el dominio de H-NOX de una proteína H-NOX trimérica son mutaciones conservadas evolutivamente (también denominadas mutaciones de clase I). En la tabla 1A se enumeran ejemplos de mutaciones de clase I. En la tabla 1A, las mutaciones están numeradas/anotadas según la secuencia de p1 H-NOX humana, pero son análogas para todas las secuencias de H-NOX. Por tanto, la posición correspondiente en cualquier otra proteína H-NOX puede mutarse al residuo indicado. Por ejemplo, Phe4 de p1 H-NOX humana puede mutar a una tirosina ya que otras proteínas H-NOX tienen una tirosina en esta posición. El residuo de fenilalanina correspondiente puede mutarse a una tirosina en cualquier otra proteína H-NOX. En realizaciones particulares, la una o más mutaciones se limitan a residuos conservados evolutivamente. En algunas realizaciones, la una o más mutaciones pueden incluir al menos una mutación conservada evolutivamente y al menos una mutación conservada no evolutivamente. Si se desea, estas proteínas H-NOX mutantes se someten a una selección empírica de constantes de disociación de NO/O², reactividad de NO, estabilidad y fisiocompatibilidad en vista de las enseñanzas proporcionadas en el presente documento

Tabla 1A. Mutaciones de clase I de H-NOX a modo de ejemplo que seleccionan como diana residuos conservados evolutivamente

F4Y Q30G I145Y

F4L E33P I145H

H7G N61G K151E

A8E C78H I157F

L9W A109F E183F

En algunas realizaciones, la mutación es una mutación en el bolsillo distal, tal como la mutación de un residuo en la hélice alfa A, D, E o G (Pellicena, P. et al. (31 de agosto de 2004). Proc Natl. Acad Sci USA 101 (35): 12854-12859).

En la tabla 1B se enumeran mutaciones en el bolsillo distal a modo de ejemplo (también denominadas mutaciones de clase II). En la tabla 1B, las mutaciones están numeradas/anotadas según la secuencia de p i H-NOX humana, pero son análogas para todas las secuencias de H-NOX. Debido a que varias sustituciones proporcionan mutaciones viables en cada residuo mencionado, el residuo en cada posición indicada puede cambiarse a cualquier otro aminoácido que se produce de manera natural o no natural (denominado “X”). Tales mutaciones pueden producir proteínas H-NOX con una variedad de características de afinidad, estabilidad y reactividad deseadas.

Tabla 1B. Mutaciones de clase II de H-NOX a modo de ejemplo que seleccionan como diana residuos en el bolsillo distal

V8X M73X I145X

L9X F77X I149X

F70X C78X

En realizaciones particulares, la mutación es una mutación en el bolsillo distal del hemo. Tal como se describe en el presente documento, un determinante molecular crucial que evita la unión de O²en los miembros que se unen al NO de la familia H-NOX es la falta de un donante de enlace de H en el bolsillo distal del hemo. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la mutación altera el enlace de H entre el dominio de H-NOX y el ligando dentro del bolsillo distal. En algunas realizaciones, la mutación interrumpe un donante de enlace de H del bolsillo distal y/o confiere unión de ligando O²reducida en relación con el dominio de H-NOX de tipo natural correspondiente. Los residuos en el bolsillo distal a modo de ejemplo incluyen Thr4, Ile5, Thr8, Trp9, Trp67, Asn74, Ile75, Phe78, Phe82, Tyr140 y Leu144 de H-NOX de T. tengcongensis y los residuos correspondientes en cualquier otra proteína H-NOX. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX o el dominio de H-NOX de una proteína H-NOX trimérica comprende una o más mutaciones en el bolsillo distal. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX o el dominio de H-NOX de una proteína H-NOX trimérica comprende una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más de diez mutaciones en el bolsillo distal. En algunas realizaciones, la mutación en el bolsillo distal corresponde a una mutación L144F de H-NOX de T. tengcongensis. En algunas realizaciones, la mutación en el bolsillo distal es una mutación L144F de H-NOX de T. tengcongensis. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX o el dominio de H-NOX de una proteína H-NOX trimérica comprende dos mutaciones en el bolsillo distal. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX o el dominio de H-NOX de una proteína H-NOX trimérica corresponde a una mutación W9F/L144F de H-NOX de T. tengcongensis. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX o el dominio de H-NOX de una proteína H-NOX trimérica es una mutación W9F/L144F de H-NOX de T. tengcongensis.

Los residuos que no se encuentran en el bolsillo distal también pueden afectar a la estructura tridimensional del grupo hemo; esta estructura afecta, a su vez, a la unión de O²y NO al hierro en el grupo hemo. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la proteína H-NOX o el dominio de H-NOX de una proteína H-NOX trimérica tiene una o más mutaciones fuera del bolsillo distal. Los ejemplos de residuos que pueden mutar pero que no están en el bolsillo distal incluyen Pro115 y Arg135 de H-NOX de T. tengcongensis. En algunas realizaciones, la mutación está en el bolsillo proximal que incluye His105 como un residuo que se une al hierro del hemo.

En algunas realizaciones, cuando están presentes dos o más mutaciones, al menos una mutación está en el bolsillo distal y al menos una mutación está fuera del bolsillo distal (por ejemplo, una mutación en el bolsillo proximal). En algunas realizaciones, todas las mutaciones están en el bolsillo distal.

Para reducir la inmunogenicidad de la proteína H-NOX o los dominios de H-NOX derivados de fuentes distintas de los humanos, los aminoácidos en una proteína H-NOX o un dominio de H-NOX pueden mutar a los aminoácidos correspondientes en una H-NOX humana. Por ejemplo, uno o más aminoácidos en la superficie de la estructura terciaria de una proteína H-NOX o un dominio de H-NOX no humanos pueden mutar al aminoácido correspondiente en una proteína H-NOX o un dominio de H-NOX humanos. En algunas variaciones, la mutación de uno o más aminoácidos de superficie puede combinarse con la mutación de dos o más residuos en el bolsillo distal, la mutación de uno o más residuos fuera del bolsillo distal (por ejemplo, una mutación en el bolsillo proximal) o combinaciones de dos o más de los anteriores.

La invención también se refiere a cualquier combinación de mutación descrita en el presente documento, tal como mutaciones dobles, triples o múltiples superiores. Por ejemplo, pueden realizarse combinaciones de cualquiera de las mutaciones descritas en el presente documento en la misma proteína H-NOX. Obsérvese que esta invención también abarca mutaciones en posiciones equivalentes en otras proteínas H-NOX de mamíferos o no mamíferos. Las proteínas H-NOX mutantes o los dominios de H-NOX mutantes a modo de ejemplo comprenden una o más mutaciones que confieren unión de ligando O²o NO alterada en relación con el dominio de H-NOX de tipo natural correspondiente y son operativos como un portador de gases en sangre de O²de mamífero fisiológicamente compatible.

El número de residuo de una mutación indica la posición en la secuencia de la proteína H-NOX particular que se describe. Por ejemplo, I5A de T. tengcongensis se refiere al reemplazo de isoleucina por alanina en la quinta posición en H-NOX de T. tengcongensis. Puede producirse la misma mutación de isoleucina a alanina en el residuo correspondiente en cualquier otra proteína H-NOX o dominio de H-NOX (este residuo puede ser o no el quinto residuo en la secuencia de otras proteínas H-NOX). Dado que las secuencias de aminoácidos de los dominios de p i H-NOX de mamíferos difieren como máximo en dos aminoácidos, también se espera que las mutaciones que producen proteínas H-NOX o dominios de H-NOX mutantes deseables cuando se introducen en proteínas p1 H-NOX de rata de tipo natural produzcan proteínas H-NOX o dominios de H-NOX mutantes deseables cuando se introducen en proteínas p1 H-NOX o dominios de H-NOX de tipo natural de otros mamíferos, tales como humanos.

En algunas realizaciones, la proteína H-NOX es un trímero que comprende tres dominios de H-NOX L144F de T. tengcongensis y tres dominios foldon. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX es un trímero que comprende tres dominios de H-NOX W9F/L144F de T. tengcongensis y tres dominios foldon. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX es un trímero que comprende tres dominios de H-NOX de tipo natural de T. tengcongensis y tres dominios foldon.

Modificaciones a proteínas H-NOX

Cualquiera de las proteínas H-NOX de tipo natural o mutante, incluyendo las proteínas H-NOX triméricas, puede modificarse y/o formularse usando métodos convencionales para mejorar las aplicaciones terapéuticas o industriales. Por ejemplo, y particularmente cuando se aplica a proteínas H-NOX modificadas por ingeniería heterólogas, se conocen en la técnica una variedad de métodos para aislar tales agentes a partir de la inmunovigilancia, incluyendo reticulación, pegilación, la decoración con hidratos de carbono, etc. (por ejemplo, Rohlfs, R. J. et al. (15 de mayo de 1998). J. Biol. Chem. 273(20):12128-12134; Migita, R. et al. (junio de 1997). J. Appl. Physiol. 82(6):1995-2002; Vandegriff, K. D. et al. (15 de agosto de 2004). Biochem J. 382 (Parte 1): 183-189, particularmente con respecto a la modificación de proteínas), así como otras técnicas conocidas por el experto en la técnica. La fusión de una proteína H-NOX, incluyendo una proteína H-NOX trimérica, con una proteína humana tal como la albúmina sérica humana puede aumentar la semivida sérica, la viscosidad y la presión oncótica coloidal. En algunas realizaciones, una proteína H-NOX se modifica durante o después de su síntesis para disminuir su inmunogenicidad y/o aumentar su tiempo de retención en plasma. Las proteínas H-NOX también pueden encapsularse (tal como encapsulación dentro de liposomas o nanopartículas).

En algunas realizaciones, la proteína H-NOX comprende una o más etiquetas; por ejemplo, para ayudar en la purificación de la proteína H-NOX. Los ejemplos de etiquetas incluyen, pero no se limitan a, His6, FLAG, GST y MBP. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX comprende una o más etiquetas His6. La una o más etiquetas His6 pueden retirarse antes del uso de la proteína H-NOX trimérica; por ejemplo, mediante tratamiento con una exopeptidasa. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX es un trímero que comprende tres dominios de H-NOX L144F de T. tengcongensis, tres dominios foldon y tres etiquetas His6. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX es un trímero que comprende tres dominios de H-NOX W9F/L144F de T. tengcongensis, dominios foldon y tres etiquetas His6. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX es un trímero que comprende tres dominios de H-NOX de tipo natural de T. tengcongensis, tres dominios foldon y tres etiquetas His6.

Dominios de trimerización

En algunos aspectos, la invención proporciona proteínas H-NOX triméricas que comprenden tres dominios de H-NOX y tres dominios de trimerización. Los dominios de trimerización se usan para unir tres dominios de H-NOX para formar una proteína H-NOX trimérica. En la técnica se conocen los dominios de trimerización, tales como: foldon de fibritina del bacteriófago T4, Arc, POZ, dominios de helicoides enrollados (incluyendo GCN4, cremalleras de leucina, Velcro), uteroglobina, colágeno, helicoides enrollados de 3 hebras (matrilina-1), trombosporinas, TRPV1-C, P53, Mnt, avadina, estreptavidina, Bcr-Abl, COMP, subunidad B de verotoxina, CamKII, RCK y dominios de la proteína de fusión sensible a N-etilmaleimida, STM3548, KaiC, TyrR, Hcp1, CcmK4, GP41, antígeno protector contra el carbunco, aerolisina, ahemolisina, proteína de unión a C4b, Mi-CK, arilsurfatasa A y proteínas de la cápside viral. Los dominios de trimerización pueden estar unidos de manera covalente o no covalente a los dominios de H-NOX. En algunas realizaciones, un dominio de trimerización se une a un dominio de H-NOX para formar una subunidad monomérica de manera que se asocian los dominios de trimerización de una pluralidad de subunidades monoméricas para formar un dominio de H-NOX trimérico. En algunas realizaciones, el extremo C-terminal de un dominio de H-NOX se une al extremo N-terminal de un dominio de trimerización. En otras realizaciones, el extremo N-terminal de un dominio de H-NOX se une al extremo N-terminal de un dominio de trimerización. En aún otras realizaciones, el extremo C-terminal de un dominio de H-NOX se une al extremo C-terminal de un dominio de trimerización. En algunas realizaciones, el extremo N-terminal de un dominio de H-NOX se une al extremo C-terminal de un dominio de trimerización.

Pueden usarse ligadores para unir un dominio de trimerización a un dominio de H-NOX; por ejemplo, por ejemplo, ligadores de aminoácidos. En algunas realizaciones, un ligador que comprende uno cualquiera de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más de diez aminoácidos puede colocarse entre el dominio de trimerización y el dominio de H-NOX. Los ligadores a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, ligadores Gly-Ser-Gly y Arg-Gly-Ser.

Dominio de trimerización de fibritina del bacteriófago T4

Un dominio de trimerización a modo de ejemplo es el dominio foldon del bacteriófago T4. El gen wac del bacteriófago T4 codifica para la proteína fibritina, una proteína de 486 aminoácidos con un dominio de trimerización C-terminal (residuos 457-483) (Efimov, V. P. et al. (1994) J Mol Biol 242:470-486). El dominio es capaz de trimerizar la fibritina tanto in vitro como in vivo (Boudko, S. P. et al. (2002) Eur J Biochem 269:833-841; Letarov, A. V., et al., (1999) Biochemistry (Mosc) 64:817-823; Tao, Y., et al., (1997) Structure 5:789-798). El dominio de trimerización aislado de 27 residuos, a menudo denominado “dominio foldon”, se ha usado para construir trímeros quiméricos en varias proteínas diferentes (incluyendo las glicoproteínas de la envoltura del VIH (Yang, X. et al., (2002) J Virol 76:4634-4642), adhesinas adenovirales (Papanikolopoulou, K. et al., (2004) J Biol Chem 279:8991-8998; Papanikolopoulou, K. et al. (2004) J Mol Biol 342:219-227), colágeno (Zhang, C. et al. (2009) Biotechnol Prog 25:1660-1668), fago P22 gp26 (Bhardwaj, A. et al. (2008) Protein Sci 17:1475-1485) y la glicoproteína del virus de la rabia (Sissoeff, L. et al. (2005) J Gen Virol 86:2543-2552). En la figura 1 se muestra una secuencia a modo de ejemplo del dominio foldon y se proporciona mediante la SEQ ID NO:4.

El dominio foldon aislado se pliega en una única estructura de horquilla p y se trimeriza en una estructura de hélice p que involucra tres horquillas (Guthe, S. et al. (2004) J Mol Biol 337:905-915). La estructura del dominio foldon sólo ha sido determinada por RMN (Guthe, S. et al. (2004) J Mol Biol 337:905-915) y las estructuras de varias proteínas trimerizadas con el dominio foldon se han resuelto mediante cristalografía de rayos X (Papanikolopoulou, K. et al., (2004) J Biol Chem 279:8991-8998; Stetefeld, J. et al. (2003) Structure 11:339-346; Yokoi, N. et al. (2010) Small 6:1873-1879). El dominio se pliega y trimeriza rápidamente, lo que reduce la posibilidad de productos intermedios de plegamiento incorrecto o productos de oligomerización fuera de la ruta (Guthe, S. et al. (2004) J Mol Biol 337:905-915). El dominio foldon es muy estable, capaz de mantener la estructura terciaria y la oligomerización en >10% de SDS, clorhidrato de guanidina 6,0 M u 80°C (Bhardwaj, A. et al. (2008) Protein Sci 17:1475-1485; Bhardwaj, A. et al. (2007) J Mol Biol 371:374-387), y puede mejorar la estabilidad de las secuencias fusionadas al dominio foldon (Du, C. et al. (2008) Appl Microbiol Biotechnol 79:195-202).

En algunas realizaciones, el extremo C-terminal de un dominio de H-NOX se une al extremo N-terminal de un dominio foldon. En otras realizaciones, el extremo N-terminal de un dominio de H-NOX se une al extremo N-terminal de un dominio foldon. En aún otras realizaciones, el extremo C-terminal de un dominio de H-NOX se une al extremo C-terminal de un dominio foldon. En algunas realizaciones, el extremo N-terminal de un dominio de H-NOX se une al extremo C-terminal de un dominio foldon.

En algunas realizaciones, se usan ligadores para unir un dominio foldon a un dominio de H-NOX. En algunas realizaciones, un ligador que comprende uno cualquiera de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más de diez aminoácidos puede colocarse entre el dominio de trimerización y el dominio de H-NOX. Los ligadores a modo de ejemplo incluyen, pero no se limita a, los ligadores Gly-Ser-Gly y Arg-Gly-Ser. En algunas realizaciones, la invención proporciona una proteína H-NOX trimérica que comprende desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal: un dominio de H-NOX de T. tengcongensis, un ligador de aminoácidos Gly-Ser-Gly y un dominio foldon. En algunas realizaciones, la invención proporciona una proteína H-NOX trimérica que comprende desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal: un dominio de H-NOX de T. tengcongensis, un ligador de aminoácidos Gly-Ser-Gly, un dominio foldon, un ligador de aminoácidos Arg-Gly-Ser y una etiqueta His6. En algunas realizaciones, el dominio de H-NOX de T. tengcongensis comprende una mutación L144F. En algunas realizaciones, el dominio de H-NOX de T. tengcongensis comprende una mutación W9F y una mutación L144F. En algunas realizaciones, el dominio de H-NOX de T. tengcongensis es un dominio de H-NOX de tipo natural.

Subunidades monoméricas del dominio de H-NOX

En un aspecto, la invención proporciona proteínas H-NOX monoméricas recombinantes (es decir, subunidades de H-NOX monoméricas de proteínas H-NOX triméricas) que pueden asociarse para formar proteínas H-NOX triméricas. En algunas realizaciones, la invención proporciona proteínas H-NOX recombinantes que comprenden un dominio de H-NOX tal como se describe en el presente documento y un dominio de trimerización. El dominio de H-NOX y el dominio de trimerización pueden unirse de manera covalente o unirse de manera no covalente. En algunas realizaciones, el extremo C-terminal de un dominio de H-NOX de la proteína H-NOX monomérica recombinante se une al extremo N-terminal de un dominio de trimerización. En otras realizaciones, el extremo N-terminal de un dominio de H-NOX de la proteína H-NOX monomérica recombinante se une al extremo N-terminal de un dominio de trimerización. En aún otras realizaciones, el extremo C-terminal de un dominio de H-NOX de la proteína H-NOX monomérica recombinante se une al extremo C-terminal de un dominio de trimerización. En algunas realizaciones, el extremo N-terminal de un dominio de H-NOX de la proteína H-NOX monomérica recombinante se une al extremo C-terminal de un dominio de trimerización. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX monomérica recombinante no comprende un dominio de guanilil ciclasa.

En algunas realizaciones, la proteína H-NOX monomérica comprende un dominio de H-NOX de tipo natural. En algunas realizaciones de la invención, la proteína H-NOX monomérica comprende una o más mutaciones en el dominio de H-NOX. En algunas realizaciones, la una o más mutaciones altera la constante de disociación de O², la koff para el oxígeno, la velocidad de autooxidación de hemo, la reactividad de NO, la estabilidad de NO o cualquier combinación de dos o más de los anteriores en comparación con las del dominio de H-NOX de tipo natural correspondiente. En algunas realizaciones, la mutación es una mutación en el bolsillo distal. En algunas realizaciones, la mutación comprende una mutación que no está en el bolsillo distal. En algunas realizaciones, la mutación en el bolsillo distal corresponde a una mutación en L144 de T. tengcongensis (por ejemplo, una mutación L144F). En algunas realizaciones, la proteína H-NOX monomérica recombinante comprende dos mutaciones en el bolsillo distal correspondientes a una mutación en W9 y una en L144 de T. tengcongensis (por ejemplo, una mutación W9F/L144F).

En algunos aspectos, la invención proporciona proteínas H-NOX monoméricas recombinantes que se asocian para formar proteínas H-NOX triméricas. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX recombinante comprende un dominio de H-NOX y un dominio de trimerización. En algunas realizaciones, el dominio de trimerización es un dominio foldon tal como se comenta en el presente documento. En algunas realizaciones, el dominio de H-NOX es un dominio de H-NOX de T. tengcongensis. En algunas realizaciones, el extremo C-terminal del dominio de H-NOX de T. tengcongensis se une de manera covalente al extremo N-terminal del dominio foldon. En algunas realizaciones, el extremo C-terminal del dominio de H-NOX de T. tengcongensis se une de manera covalente al extremo C-terminal del dominio foldon. En algunas realizaciones, el dominio de T. tengcongensis es un dominio de H-NOX L144F. En algunas realizaciones, el dominio T. tengcongensis es un dominio de H-NOX W9F/L144F. En algunas realizaciones, el dominio T. tengcongensis es un dominio de H-NOX de tipo natural.

En algunas realizaciones, el dominio de H-NOX se une de manera covalente al dominio de trimerización usando una secuencia de ligador de aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia de ligador de aminoácidos tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más de diez aminoácidos de longitud. Las secuencias de ligador de aminoácidos incluyen, pero no se limitan a, una secuencia Gly-Ser-Gly y una secuencia Arg-Gly-Ser. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX trimérica es una H-NOX trimérica tal como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX monomérica comprende lo siguiente desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal: un dominio de H-NOX L144F de T. tengcongensis, una secuencia de ligador de aminoácidos Gly-Ser-Gly y un dominio foldon. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX monomérica comprende lo siguiente desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal: un dominio de H-NOX W9F/L144F de T. tengcongensis, una secuencia de ligador de aminoácidos Gly-Ser-Gly y un dominio foldon. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX monomérica comprende lo siguiente desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal: un dominio de H-NOX de tipo natural de T. tengcongensis, una secuencia de ligador de aminoácidos Gly-Ser-Gly y un dominio foldon.

En algunas realizaciones, la proteína H-NOX monomérica recombinante comprende una etiqueta; por ejemplo, una etiqueta His6, una FLAG, una GST o una MBP. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX monomérica recombinante comprende una etiqueta His6. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX monomérica recombinante no comprende una etiqueta. En algunas realizaciones, la etiqueta (por ejemplo, una etiqueta His6) se une de manera covalente al dominio de trimerización usando una secuencia de espaciador de aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia de ligador de aminoácidos tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más de diez aminoácidos de longitud. Las secuencias de ligador de aminoácidos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, una secuencia Gly-Ser-Gly y una secuencia Arg-Gly-Ser. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX trimérica comprende tres dominios de H-NOX, tres secuencias de trimerización y tres etiquetas His6, en la que el dominio de H-NOX se une de manera covalente al dominio de trimerización a través de una secuencia de ligador de aminoácidos y el dominio de trimerización se une de manera covalente a la etiqueta His6 a través de una secuencia de ligador de aminoácidos. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX monomérica comprende lo siguiente desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal: un dominio de H-NOX L144F de T. tengcongensis, una secuencia de ligador de aminoácidos Gly-Ser-Gly, un dominio foldon, una secuencia de ligador Arg-Gly-Ser y una etiqueta His6. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX monomérica comprende lo siguiente desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal: un dominio de H-NOX W9F/L144F de T. tengcongensis, una secuencia de ligador de aminoácidos Gly-Ser-Gly, un dominio foldon, una secuencia de ligador Arg-Gly-Ser y una etiqueta His6. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX monomérica comprende lo siguiente desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal: un dominio de H-NOX de tipo natural de T. tengcongensis, una secuencia de ligador de aminoácidos Gly-Ser-Gly, un dominio foldon, una secuencia de ligador Arg-Gly-Ser y una etiqueta His6.

En algunas realizaciones, la proteína H-NOX monomérica recombinante comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:12.

Características de proteínas H-NOX de tipo natural y mutantes

Tal como se describe en el presente documento, se han generado una gran cantidad de proteínas H-NOX mutantes diversas, incluyendo las proteínas H-NOX triméricas, que proporcionan intervalos de constantes de disociación de NO y O², koff de O², reactividad y estabilidad de NO. Para proporcionar portadores de gases en sangre operativos, las proteínas H-NOX pueden usarse para reemplazar funcionalmente o complementar a los portadores de O²endógenos, tales como la hemoglobina. En algunas realizaciones, las proteínas H-NOX triméricas se usan para administrar O²al tejido tumoral hipóxico (por ejemplo, un glioblastoma) como adyuvante de la radioterapia o quimioterapia. Por consiguiente, en algunas realizaciones, una proteína H-NOX tiene una velocidad de asociación de O², velocidad de disociación de O², constante de disociación para la unión de O², estabilidad de NO, reactividad de NO, velocidad de autooxidación, tiempo de retención en plasma o cualquier combinación de dos o más de los anteriores similares o mejorados en comparación con un portador de O²endógeno, tal como la hemoglobina. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX es una proteína H-NOX trimérica. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX trimérica comprende tres monómeros, comprendiendo cada monómero un dominio de H-NOX L144F de T. tengcongensis y un dominio foldon. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX trimérica es una proteína H-NOX trimérica que comprende tres monómeros, comprendiendo cada monómero un dominio de H-NOX W9F/L144F de T. tengcongensis y un dominio foldon. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX trimérica comprende tres monómeros, comprendiendo cada monómero un dominio de H-NOX L144f de T. tengcongensis y un dominio foldon.

En diversas realizaciones, la koff para el O²para una proteína H-NOX trimérica es de entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 200 s-1 a 20°C, tal como de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 200 s-1, de aproximadamente 0. 1 a 100 s-1, de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 16,0 s-1, de aproximadamente 1,35 a aproximadamente 23,4 s-1, de aproximadamente 1,34 a aproximadamente 18 s-1, de aproximadamente 1,35 a aproximadamente 14,5 s-1, de aproximadamente 0,21 a aproximadamente 23,4 s-1, de aproximadamente 1,35 a aproximadamente 2,9 s-1, de aproximadamente 2 a aproximadamente 3 s-1, de aproximadamente 5 a aproximadamente 15 s-1 o de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1 s-1. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX tiene una koff para el oxígeno que es menor de o igual a aproximadamente 0,65 s-1 a 20°C (tal como entre aproximadamente 0,21 s-1 y aproximadamente 0,65 s-1 a 20°C).

En diversas realizaciones, la kon para el O²para una proteína H-NOX trimérica es de entre aproximadamente 0,14 y aproximadamente 60 i iM 'V a 20°C, tal como de aproximadamente 6 a aproximadamente 60 iiiti'V , de aproximadamente 6 a 12 i iM 'V , de aproximadamente 15 a aproximadamente 60 i iM 'V , de aproximadamente 5 a aproximadamente 18 |iM's_1 o de aproximadamente 6 a aproximadamente 15 i iM 'V .

En diversas realizaciones, la Kd cinética o calculada para la unión de O²mediante una proteína H-NOX trimérica es de entre aproximadamente 1 nM y 1 mM, de aproximadamente 1 |iM a aproximadamente 10 |iM o de aproximadamente 10 |iM a aproximadamente 50 |iM. En algunas realizaciones, la Kd calculada para la unión de O²es una cualquiera de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 2 |iM, de aproximadamente 2 |iM a aproximadamente 1 mM, de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 |iM, de aproximadamente 9 |iM a aproximadamente 50 |iM, de aproximadamente 100 |iM a aproximadamente 1 mM, de aproximadamente 50 nM a aproximadamente 10 |iM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 50 |iM, de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1,9 |iM, de aproximadamente 150 nM a aproximadamente 1 |iM o de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 255 nM, de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 2 |iM, de 20 nM a aproximadamente 75 nM, de aproximadamente 1 |iM a aproximadamente 2 |iM, de aproximadamente 2 |iM a aproximadamente 10 |iM, de aproximadamente 2 |iM a aproximadamente 9 |iM o de aproximadamente 100 nM a 500 nM a 20°C. En algunas realizaciones, la Kd cinética o calculada para la unión de O²es de menos de aproximadamente cualquiera de 100 nM, 80 nM, 50 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM o 10 nM a 20°C.

En diversas realizaciones, la Kd cinética o calculada para la unión de O²mediante una proteína H-NOX trimérica está dentro de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 veces la de la hemoglobina en las mismas condiciones (tal como a 20°C), tal como entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 10 veces o entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 2 veces la de la hemoglobina en las mismas condiciones (tal como a 20°C). En diversas realizaciones, la Kd cinética o calculada para la unión de NO mediante una proteína H-NOX está dentro de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 veces la de la hemoglobina en las mismas condiciones (tal como a 20°C), tal como entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 10 veces o entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 2 veces la de la hemoglobina en las mismas condiciones (tal como a 20°C).

En algunas realizaciones, se oxida menos de aproximadamente cualquiera del 50, el 40, el 30, el 10 o el 5% de una proteína H-NOX trimérica después de la incubación durante aproximadamente cualquiera de 1, 2, 4, 6, 8, 10, 15 ó 20 horas a 20°C.

En diversas realizaciones, la reactividad de NO de una proteína H-NOX trimérica es de menos de aproximadamente 700 s-1 a 20°C, tal como menos de aproximadamente 600 s-1, 500 s-1, 400 s-1, 300 s-1, 200 s-1, 100 s-1, 75 s-1, 50 s-1, 25 s-1, 20 s-1, 10 s-1, 50 s-1, 3 s-1, 2 s-1, 1,8 s-1, 1,5 s-1, 1,2 s-1, 1,0 s-1, 0,8 s-1, 0,7 s-1 o 0,6 s-1 a 20°C. En diversas realizaciones, la reactividad de NO de una proteína H-NOX es de entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 600 s'1 a 20°C, tal como entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 400 s-1, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 100 s-1, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 50 s-1, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 10 s-1, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 s-1 o de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 2,1 s-1 a 20°C. En diversas realizaciones, la reactividad de una proteína H-NOX es de al menos aproximadamente 10, 100, 1.000 ó 10.000 veces menor que la de la hemoglobina en las mismas condiciones, tal como a 20°C.

En diversas realizaciones, la velocidad de autooxidación de hemo de una proteína H-NOX trimérica es de menos de aproximadamente 1,0 h'1 a 37°C, tal como menos de aproximadamente cualquiera de 0,9 h'1, 0,8 h'1, 0,7 h'1, 0,6 h'1, 0,5 h'1, 0,4 h'1, 0,3 h'1, 0,2 h'1, 0,1 h'1 o 0,05 h'1 a 37 C. En diversas realizaciones, la velocidad de autooxidación de hemo de una proteína H-NOX es de entre aproximadamente 0,006 y aproximadamente 5,0 h'1 a 37°C, tal como de aproximadamente 0,006 a aproximadamente 1,0 h'1, de 0,006 a aproximadamente 0,9 h'1 o de aproximadamente 0,06 a aproximadamente 0,5 h'1 a 37°C.

En diversas realizaciones, una proteína H-NOX trimérica mutante tiene (a) una constante de disociación de O²o NO, velocidad de asociación (kon para el O²o NO) o velocidad de disociación (koff para el O²o NO) dentro de 2 órdenes de magnitud de la de la hemoglobina, (b) tiene una afinidad por NO más débil (por ejemplo, al menos aproximadamente 10 veces, 100 veces o 1000 veces más débil) que la de sGC p1, respectivamente, (c) una reactividad de NO con el O²unido al menos 1000 veces menos que la de la hemoglobina, (d) un tiempo de retención en plasma in vivo al menos 2, 10, 100 ó 1000 veces mayor que el de la hemoglobina o (e) cualquier combinación de dos o más de los anteriores.

Los portadores de O²adecuados a modo de ejemplo proporcionan constantes de disociación dentro de dos órdenes de magnitud de la de la hemoglobina, es decir, entre aproximadamente 0,01 y 100 veces, tal como entre aproximadamente 0,1 y 10 veces o entre aproximadamente 0,5 y 2 veces la de la hemoglobina. Pueden usarse una variedad de técnicas establecidas para cuantificar las constantes de disociación, tales como las técnicas descritas en el presente documento (Boon, E. M. et al. (2005). Nature Chem. Biol. 1:53-59; Boon, E. M. et al. (octubre 2005). Curr. Opin. Chem. Biol. 9(5):441-446; Boon, E. M. et al. (2005). J. Inorg. Biochem. 99(4):892-902), Vandegriff, K. D. et al. (15 de agosto de 2004). Biochem J. 382 (Parte 1): 183-189, particularmente con respecto a la medición de constantes de disociación), así como las conocidas por el experto en la técnica. Los portadores de O²a modo de ejemplo proporcionan una reactividad de NO baja o minimizada de la proteína H-NOX con el O²unido, tal como una reactividad de NO menor que la de la hemoglobina. En algunas realizaciones, la reactividad de NO es mucho menor, tal como al menos aproximadamente 10, 100, 1.000 ó 10.000 veces menor que la de la hemoglobina. Pueden usarse una variedad de técnicas establecidas para cuantificar la reactividad de NO (Boon, E. M. et al. (2005). Nature Chem. Biol. 1:53-59; Boon, E. M. et al. (octubre de 2005). Curr. Opin. Chem. Biol. 9(5):441-446; Boon, E. M. et al. (2005). J. Inorg. Biochem.

99(4):892-902), Vandegriff, K. D. et al. (15 de agosto de 2004). Biochem J. 382(Parte 1):183-189, particularmente con respecto a la medición de la reactividad de NO), así como las conocidas por el experto en la técnica. Ya que la H-NOX de tipo natural de T. tengcongensis tiene una reactividad de NO tan baja, otras proteínas H-NOX de tipo natural y proteínas H-NOX mutantes pueden tener una reactividad de NO baja similar. Por ejemplo, H-NOX Y140H de T. tengcongensis tiene una reactividad de NO similar a la de H-NOX de tipo natural de T. tengcongensis.

Además, los portadores de O²adecuados proporcionan una estabilidad alta o maximizada, particularmente estabilidad in vivo. Pueden usarse una variedad de métricas de estabilidad, tales como la estabilidad oxidativa (por ejemplo, estabilidad a la autooxidación u oxidación por NO), estabilidad a la temperatura y estabilidad in vivo. Pueden usarse una variedad de técnicas establecidas para cuantificar la estabilidad, tales como las técnicas descritas en el presente documento (Boon, E. M. et al. (2005). Nature Chem. Biol. 1:53-59; Boon, E. M. et al. (octubre de 2005). Curr. Opin. Chem. Biol. 9(5):441-446; Boon, E. M. et al. (2005). J. Inorg. Biochem. 99(4):892-902), así como las conocidas por el experto en la técnica. Para la estabilidad in vivo en plasma, sangre o tejido, las métricas a modo de ejemplo de estabilidad incluyen el tiempo de retención, la tasa de aclaramiento y la semivida media. Se espera que las proteínas H-NOX de organismos termófilos sean estables a altas temperaturas. En diversas realizaciones, los tiempos de retención en plasma son al menos aproximadamente 2, 10, 100 ó 1000 veces mayores que los de la hemoglobina (por ejemplo, Bobofchak, K. M. et al. (agosto de 2003). Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 285(2):H549-H561). Tal como apreciará el experto en la técnica, los sucedáneos de la sangre basados en hemoglobina están limitados por el rápido aclaramiento de la hemoglobina libre de células del plasma debido a la presencia de receptores para la hemoglobina que eliminan la hemoglobina libre de células del plasma. Dado que no hay receptores para las proteínas H-NOX en el plasma, se espera que las proteínas H-NOX de tipo natural y mutantes tengan un tiempo de retención en plasma más prolongado que el de la hemoglobina. Si se desea, el tiempo de retención en plasma puede aumentarse pegilando o reticulando una proteína H-NOX o fusionando una proteína H-NOX con otra proteína usando métodos convencionales (tales como los descritos en el presente documento y los conocidos por el experto en la técnica).

En diversas realizaciones, la proteína H-NOX trimérica tiene una constante de disociación de O²entre aproximadamente 1 nM y aproximadamente 1 mM a 20°C y una reactividad de NO al menos aproximadamente 10 veces menor que la de la hemoglobina en las mismas condiciones, tal como a 20°C. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX tiene una constante de disociación de O²entre aproximadamente 1 nM y aproximadamente 1 mM a 20°C y una reactividad de NO de menos de aproximadamente 700 s_1 a 20°C (por ejemplo, menos de aproximadamente 600 s-1, 500 s-1, 100 s-1, 20 s_1 o 1,8 s_1 a 20°C). En algunas realizaciones, la proteína H-NOX tiene una constante de disociación de O²dentro de 2 órdenes de magnitud de la de la hemoglobina y una reactividad de NO al menos aproximadamente 10 veces menor que la de la hemoglobina en las mismas condiciones, tal como a 20°C. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX tiene una koff para el oxígeno entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 200 s_1 a 20°C y una reactividad de NO al menos aproximadamente 10 veces menor que la de la hemoglobina en las mismas condiciones, tal como a 20°C. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX tiene una koff para el oxígeno que es de menos de aproximadamente 0,65 s_1 a 20°C (tal como entre aproximadamente 0,21 s_1 y aproximadamente 0,64 s_1 a 20°C) y una reactividad de NO al menos aproximadamente 10 veces menor que la de la hemoglobina en las mismas condiciones, tal como a 20°C. En algunas realizaciones de la invención, la constante de disociación de O²de la proteína H-NOX es de entre aproximadamente 1 nM y aproximadamente 1 |iM (1000 nM), de aproximadamente 1 |iM a aproximadamente 10 |iM o de aproximadamente 10 |iM a aproximadamente 50 |iM. En realizaciones particulares, la constante de disociación de O²de la proteína H-NOX es de entre aproximadamente 2 nM y aproximadamente 50 |iM, de aproximadamente 50 nM a aproximadamente 10 |iM, de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1,9 |iM, de aproximadamente 150 nM a aproximadamente 1 |iM o de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 255 nM a 20°C. En diversas realizaciones, la constante de disociación de O²de la proteína H-NOX es de menos de aproximadamente 80 nM a 20°C, tal como entre aproximadamente 20 nM y aproximadamente 75 nM a 20°C. En algunas realizaciones, la reactividad de NO de la proteína H-NOX es al menos aproximadamente 100 veces menor o aproximadamente 1.000 veces menor que la de la hemoglobina en las mismas condiciones, tal como a 20°C. En algunas realizaciones, la reactividad de NO de la proteína H-NOX es de menos de aproximadamente 700 s-1 a 20°C, tal como menos de aproximadamente 600 s-1, 500 s-1, 400 s-1, 300 s-1, 200 s-1, 100 s-1, 75 s-1, 50 s-1, 25 s-1, 20 s-1, 10 s-1, 50 s-1, 3 s-1, 2 s-1, 1,8 s-1, 1,5 s-1, 1,2 s-1, 1,0 s-1, 0,8 s-1, 0,7 s-1 o 0,6 s-1 a 20°C. En algunas realizaciones, la koff para el oxígeno de la proteína H-NOX es de entre 0,01 y 200 s-1 a 20°C, tal como de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 200 s-1, de aproximadamente 0,1 a 100 s-1, de aproximadamente 1,35 a aproximadamente 23,4 s-1, de aproximadamente 1,34 a aproximadamente 18 s-1, de aproximadamente 1,35 a aproximadamente 14,5 s-1, de aproximadamente 0,21 a aproximadamente 23,4 s-1, de aproximadamente 2 a aproximadamente 3 s-1, de aproximadamente 5 a aproximadamente 15 s-1 o de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1 s-1. En algunas realizaciones, la constante de disociación de O²de la proteína H-NOX es de entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 1,9 |iM a 20°C y la koff para el oxígeno de la proteína H-NOX es de entre aproximadamente 1,35 s-1 y aproximadamente 14,5 s-1 a 20°C. En algunas realizaciones, la velocidad de autooxidación de hemo de la proteína H-NOX es de menos de aproximadamente 1 h-1 a 37°C, tal como menos de aproximadamente cualquiera de 0,9 h-1, 0,8 h-1, 0,7 h-1, 0,6 h-1, 0,5 h-1, 0,4 h-1, 0,3 h-1, 0,2 h-1 o 0,1 h-1. En algunas realizaciones, la koff para el oxígeno de la proteína H-NOX es de entre aproximadamente 1,35 s-1 y aproximadamente 14,5 s-1 a 20°C y la velocidad de autooxidación de hemo de la proteína H-NOX es de menos de aproximadamente 1 h-1 a 37°C. En algunas realizaciones, la koff para el oxígeno de la proteína H-NOX es de entre aproximadamente 1,35 s-1 a aproximadamente 14,5 s-1 a 20°C y la reactividad de NO de la proteína H-NOX es de menos de aproximadamente 700 s-1 a 20°C (por ejemplo, menos de aproximadamente 600 s-1, 500 s-1, 100 s-1, 20 s-1 o 1,8 s-1 a 20°C). En algunas realizaciones, la velocidad de autooxidación de hemo de la proteína H-NOX es de menos de aproximadamente 1 h-1 a 37°C y la reactividad de NO de la proteína H-NOX es de menos de aproximadamente 700 s-1 a 20°C (por ejemplo, menos de aproximadamente 600 s-1, 500 s-1, 100 s-1, 20 s-1 o 1,8 s-1 a 20°C).

En algunas realizaciones, la viscosidad de la disolución de proteína H-NOX, incluyendo una disolución de proteína H-NOX trimérica, es de entre 1 y 4 centipoise (cP). En algunas realizaciones, la presión oncótica coloidal de la disolución de proteína H-NOX es de entre 20 y 50 mmHg.

Medición de la unión de O? y/o NO

Un experto en la técnica puede determinar fácilmente las características de unión de oxígeno y óxido nítrico de cualquier proteína H-NOX, incluyendo una proteína H-NOX polimérica, tal como una proteína H-NOX trimérica, mediante métodos conocidos en la técnica y mediante los métodos a modo de ejemplo no limitativos descritos a continuación.

K^dcinética:: razón de koff con respecto a kon

El valor de Kd cinética se determina para las proteínas H-NOX de tipo natural y mutantes, incluyendo las proteínas H-NOX triméricas, esencialmente tal como se describe en Boon, E.M. et al. (2005). Nature Chemical Biology 1:53-59, particularmente con respecto a la medición de velocidades de asociación de O², velocidades de disociación de O², constantes de disociación para la unión de O², velocidades de autooxidación y velocidades de disociación de NO.

kon (Velocidad de asociación de O²)

La asociación de O²al hemo se mide usando fotólisis de destello a 20°C. No es posible eliminar por destello el complejo FeII-O²como resultado de la cinética de recombinación geminada muy rápida; así, el complejo FeII-CO se somete a fotólisis de destello con luz láser a 560 nm (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA), produciendo el producto intermedio Fe1 con número de coordinación 5, para el que la unión de O²molecular se sigue a diversas longitudes de onda. Las muestras de proteínas se preparan mediante reducción anaerobia con ditionito 10 mM, seguido de desalación en una columna PD-10 (Millipore, Inc., Billerica, MA). A continuación, las muestras se diluyen hasta hemo 20 |iM en tampón TEA 50 mM, NaCl 50 mM, pH 7,5 en una cubeta de cuarzo de atmósfera controlada, con un tamaño de 100 |il a 1 ml y una longitud de trayectoria de 1 cm. Se hace fluir gas CO sobre el espacio de cabeza de esta cubeta durante 10 minutos para formar el complejo FeII-CO, cuya formación se verifica mediante espectroscopia UV-visible (máximo de Soret: 423 nm). A continuación, esta muestra se usa para medir la cinética de reunión de CO después de la fotólisis de destello mientras todavía está bajo 1 atmósfera de gas CO, o se abre y se agita al aire durante 30 minutos para oxigenar completamente el tampón antes de la fotólisis de destello para observar los acontecimientos de reunión de 0 ². La asociación de O²al hemo se monitoriza a múltiples longitudes de onda en función del tiempo. Estos trazos se ajustan con una sola exponencial usando el software Igor Pro (Wavemetrics, Inc., Oswego, OR; versión más reciente de 2005). Esta velocidad es independiente de la longitud de onda de observación, pero depende de la concentración de O². La espectroscopia UV-visible se usa en todo momento para confirmar todos los complejos y productos intermedios (Cary 3K, Varian, Inc. Palo Alto, CA). Los datos de absorción transitoria se recopilan usando los instrumentos descritos en Dmochowski, I. J. et al. (31 de agosto de 2000). J Inorg Biochem. 81(3):221-228, particularmente con respecto a la instrumentación. El instrumento tiene un tiempo de respuesta de 20 ns y los datos se digitalizan a 200 megamuestras s-1.

koff (velocidad de disociación de O²)

Para medir la koff, se diluyen complejos FeII-O²de proteína (hemo 5 |iM) en tampón anaerobio TEA 50 mM, NaCI 50 mM, pH 7,5 y se mezclan rápidamente con un mismo volumen del mismo tampón (anaerobio) que contiene diversas concentraciones de ditionito y/o gas CO saturante. Los datos se obtienen en un espectrofotómetro de flujo detenido HI-TECH Scientific SF-61 equipado con un baño de temperatura constante Neslab RTE-100 ajustado a 20°C (TGK Scientific LTD., Bradford On Avon, Reino Unido). La disociación de O²del hemo se monitoriza como un aumento en la absorbancia a 437 nm, un máximo en el espectro de diferencia de Fe1 - FeII-O², o a 425 nm, un máximo en el espectro de diferencia de Fe1 - FeII-CO. Los trazos finales se ajustan a una sola exponencial usando el software que forma parte del instrumento. Cada experimento se realiza un mínimo de seis veces y las velocidades resultantes se promedian. Las velocidades de disociación medidas son independientes de la concentración de ditionito e independientes de la saturación de CO como trampa para las especies reducidas, con y sin ditionito 10 mM presente.

K^dcinética

La Kd cinética se determina calculando la razón de koff con respecto a kon usando las mediciones de koff y kon descritas anteriormente.

K^dcalculada

Para medir la Kd calculada, se representan gráficamente los valores para la koff y Kd cinética que se obtienen tal como se describió anteriormente. Una relación lineal entre koff y la Kd cinética está definida por la ecuación (y=mx+b). A continuación, se interpolaron los valores de koff a lo largo de la línea para derivar la Kd calculada usando Excel: MAC 2004 (Microsoft, Redmond, WA). En ausencia de una kon medida, esta interpolación proporciona una forma de relacionar koff con Kd.

Velocidad de autooxidación

Para medir la velocidad de autooxidación, se reducen de manera anaerobia las muestras de proteínas, luego se diluyen en hemo 5 |iM en tampón aerobio TEA 50 mM, NaCl 50 mM, pH 7,5. Luego se incuban estas muestras en un espectrofotómetro Cary 3E equipado con un baño de temperatura constante Neslab RTE-100 ajustado a 37°C y se realiza un barrido de manera periódica (Cary 3E, Varian, Inc., Palo Alto, CA). La velocidad de autooxidación se determina a partir de la diferencia entre el máximo y el mínimo en el espectro de diferencia de FeIII - FeII representado gráficamente en función del tiempo y se ajusta con una sola exponencial usando Excel: MAC 2004 (Microsoft, Redmond, WA).

Velocidad de reacción con NO

La reactividad de NO se mide usando proteínas purificadas (H-NOX, H-NOX trimérica, hemoglobina de Homo sapiens (Hs Hb), etc.) preparadas a 2 |iM en tampón A y NO preparado a 200 |iM en tampón A (tampón A: Hepes 50 mM, pH 7,5, NaCl 50 mM). Los datos se obtienen en un espectrofotómetro de flujo detenido HI-TECH Scientific SF-61 equipado con un baño de temperatura constante Neslab RTE-100 ajustado a 20°C (TGK Scientific LTD., Bradford On Avon, Reino Unido). La proteína se mezcla rápidamente con NO a una razón de 1:1 con un tiempo de integración de 0,00125 s. Las longitudes de onda de cambio máximo se ajustan a una sola exponencial usando el software que forma parte del espectrómetro, que esencialmente mide la etapa limitativa de la velocidad de oxidación por NO. Los productos finales de la reacción son férricos-NO para las proteínas H-NOX y férricos-acuosos para la Hs Hb.

Mediciones de p50

51 se desea, el valor de p50 para proteínas H-NOX mutantes o de tipo natural puede medirse tal como se describe por Guarnone, R. et al. (septiembre/octubre de 1995). Haematologica 80(5):426-430, particularmente con respecto a la medición de valores de p50. El valor de p50 se determina usando un analizador HemOx. La cámara de medición comienza con el 0% de oxígeno y se eleva lentamente, de forma incremental, hacia el 100% de oxígeno. Una sonda de oxígeno en la cámara mide el % de saturación de oxígeno. Una segunda sonda (luz UV-Vis) mide dos longitudes de onda de absorción, sintonizadas con los picos alfa y beta de los espectros UV-Vis de la hemoproteína (por ejemplo, una proteína tal como H-NOX complejada con hemo). Estos picos de absorción aumentan linealmente a medida que la hemoproteína se une al oxígeno. A continuación, se representa gráficamente el cambio porcentual desde no unido hasta el 100% unido frente a los valores de % de oxígeno para generar una curva. El p50 es el punto de la curva en el que el 50% de la hemoproteína se une al oxígeno.

Específicamente, el analizador Hemox (TCS Scientific Corporation, New Hope, PA) determina la curva de disociación de oxihemoproteína (ODC) al exponer 50 |il de sangre o hemoproteína a una presión parcial creciente de oxígeno y desoxigenarla con gas nitrógeno. Un electrodo de oxígeno de Clark detecta el cambio en la tensión del oxígeno, que se registra en el eje x de un registrador x-y. El aumento resultante en la fracción de oxihemoproteína se monitoriza simultáneamente mediante espectrofotometría de longitud de onda dual a 560 nm y 576 nm y se muestra en el eje y. Se extraen muestras de sangre de la vena antemedial, se anticoagulan con heparina y se mantienen a 4°C en hielo húmedo hasta el ensayo. Se diluyen cincuenta |il de sangre completa en 5 |il de disolución Hemox, un tampón proporcionado por el fabricante que mantiene el pH de la disolución a un valor de 7,4±0,01. Se introduce el tampón de muestra en una cubeta que forma parte del analizador Hemox y se equilibra la temperatura de la mezcla y se lleva a 37°C; a continuación, se oxigena la muestra al 100% con aire. Después del ajuste del valor de pO²se desoxigena la muestra con nitrógeno; durante el procedimiento de desoxigenación, se registra la curva en papel milimetrado. El valor de p50 se extrapola en el eje x como el punto en el que la saturación de O²es del 50% usando el software que forma parte del analizador Hemox. El tiempo necesario para un registro completo es de aproximadamente 30 minutos.

Ácidos nucleicos H-NOX

La invención también presenta ácidos nucleicos que codifican para cualquiera de las proteínas H-NOX mutantes, H-NOX triméricas o subunidades de proteínas H-NOX monoméricas recombinantes tal como se describen en el presente documento.

En realizaciones particulares, el ácido nucleico incluye un segmento o la secuencia completa de ácido nucleico de cualquiera de los ácidos nucleicos que codifican para una proteína H-NOX o un dominio de H-NOX. En algunas realizaciones, el ácido nucleico incluye al menos aproximadamente 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 o más nucleótidos contiguos de un ácido nucleico H-NOX y contiene una o más mutaciones (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, ⁶, 7, ⁸, 9 ó 10 mutaciones) en comparación con el ácido nucleico H-NOX del que se deriva. En diversas realizaciones, un ácido nucleico H-NOX mutante contiene menos de aproximadamente 20, 15, 12, 10, 9, ⁸, 7, ⁶, 5, 4, 3 ó 2 mutaciones en comparación con el ácido nucleico H-NOX del que se deriva. La invención también presenta variantes degeneradas de cualquier ácido nucleico que codifique para una proteína H-NOX mutante.

En algunas realizaciones, el ácido nucleico incluye ácidos nucleicos que codifican para tres dominios de H-NOX. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos que incluyen tres dominios de H-NOX se unen de manera que una proteína H-NOX trimérica se expresa a partir del ácido nucleico. En realizaciones adicionales, el ácido nucleico incluye ácidos nucleicos que codifican para uno o más dominios triméricos. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos que incluyen los tres dominios de H-NOX y el uno o más dominios de trimerización se unen de manera que una proteína H-NOX trimérica se expresa a partir del ácido nucleico.

En algunas realizaciones, el ácido nucleico incluye un segmento o la secuencia completa de ácido nucleico de cualquier ácido nucleico que codifica para un dominio de trimerización. En algunas realizaciones, el ácido nucleico comprende un ácido nucleico que codifica para un dominio de H-NOX y un dominio de trimerización. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica para un dominio de H-NOX y el ácido nucleico que codifica para un dominio de trimerización se unen de manera que el polipéptido producido es una proteína de fusión que comprende un dominio de H-NOX y un dominio de trimerización.

En algunas realizaciones, el ácido nucleico comprende un ácido nucleico que codifica para una o más etiquetas His⁶. En algunas realizaciones, el ácido nucleico comprendía además ácidos nucleicos que codifican para secuencias de ligador situadas entre ácidos nucleicos que codifican para el dominio de H-NOX, el dominio de trimerización y/o una etiqueta His⁶.

En algunas realizaciones, la invención proporciona un ácido nucleico que codifica para un dominio de H-NOX y un dominio foldon. En algunas realizaciones, el dominio de H-NOX es un dominio de H-NOX de T. thermoanaerobacter. En algunas realizaciones, el dominio de H-NOX es un dominio de H-NOX de tipo natural de T. thermoanaerobacter. En algunas realizaciones, el dominio de H-NOX es un dominio de H-NOX L144F de T. thermoanaerobacter. En algunas realizaciones, el dominio de H-NOX es un dominio de H-NOX W9F/L144F de T. thermoanaerobacter.

En algunas realizaciones, la invención proporciona ácidos nucleicos que codifican para lo siguiente de 5' a 3': un dominio de H-NOX L144F de T. tengcongensis, una secuencia de ligador de aminoácidos Gly-Ser-Gly y un dominio foldon. En algunas realizaciones, la invención proporciona ácidos nucleicos que codifican para lo siguiente de 5' a 3': un dominio de H-NOX W9F/L144F de T. tengcongensis, una secuencia de ligador de aminoácidos Gly-Ser-Gly y un dominio foldon. En algunas realizaciones, la invención proporciona ácidos nucleicos que codifican para lo siguiente de 5' a 3': un dominio de H-NOX de tipo natural de T. tengcongensis, una secuencia de ligador de aminoácidos Gly-Ser-Gly y un dominio foldon.

En algunas realizaciones, la invención proporciona ácidos nucleicos que codifican para lo siguiente de 5' a 3': un dominio de H-NOX L144F de T. tengcongensis, una secuencia de ligador de aminoácidos Gly-Ser-Gly, un dominio foldon, una secuencia de ligador Arg-Gly-Ser y una etiqueta His⁶. En algunas realizaciones, la invención proporciona ácidos nucleicos que codifican para lo siguiente de 5' a 3': un dominio de H-NOX W9F/L144F de T. tengcongensis, una secuencia de ligador de aminoácidos Gly-Ser-Gly, un dominio foldon, una secuencia de ligador Arg-Gly-Ser y una etiqueta His⁶. En algunas realizaciones, la invención proporciona ácidos nucleicos que codifican para lo siguiente de 5' a 3': un dominio de H-NOX de tipo natural de T. tengcongensis, una secuencia de ligador de aminoácidos Gly-Ser-Gly, un dominio foldon, una secuencia de ligador Arg-Gly-Ser y una etiqueta His⁶.

En algunas realizaciones, el ácido nucleico comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:11.

También se describe en el presente documento una célula o población de células que contiene al menos un ácido nucleico que codifica para una proteína H-NOX mutante descrita en el presente documento. Las células a modo de ejemplo incluyen células de insecto, vegetales, de levaduras, bacterianas y de mamífero. Estas células son útiles para la producción de proteínas H-NOX mutantes usando métodos convencionales, tales como los descritos en el presente documento.

También se describe en el presente documento una célula que comprende un ácido nucleico que codifica para un dominio de H-NOX y un dominio foldon. Tal como se describe en el presente documento, el dominio de H-NOX es un dominio de H-NOX de T. thermoanaerobacter. Tal como se describe en el presente documento, el dominio de H-NOX es un dominio de H-NOX de tipo natural de T. thermoanaerobacter. Tal como se describe en el presente documento, el dominio de H-NOX es un dominio de H-NOX L144F de T. thermoanaerobacter. Tal como se describe en el presente documento, el dominio de H-NOX es un dominio de H-NOX W9F/L144F de T. thermoanaerobacter. Tal como se describe en el presente documento, la invención proporciona una célula que comprende un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO:5, SEQ iD NO:7, Se Q ID NO:9 o SEQ ID NO:11.

Formulaciones de proteínas H-NOX

Cualquier proteína H-NOX de tipo natural o mutante, incluyendo proteínas H-NOX triméricas, descrita en el presente documento puede usarse en la formulación de composiciones farmacéuticas o no farmacéuticas. En algunas realizaciones, las formulaciones comprenden una proteína H-NOX trimérica que comprende tres monómeros, en la que cada monómero comprende un dominio de H-NOX y un dominio de trimerización de manera que las proteínas H-NOX monoméricas se asocian in vitro o in vivo para producir una proteína H-NOX trimérica. Tal como se comenta adicionalmente a continuación, estas formulaciones son útiles en una variedad de aplicaciones terapéuticas e industriales.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica incluye una o más proteínas H-NOX mutantes o de tipo natural descritas en el presente documento, incluyendo proteínas H-NOX triméricas, y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los portadores o excipientes farmacéuticos convencionales tales como soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones tales como emulsión de aceite/agua y diversos tipos de agentes humectantes. Los diluyentes a modo de ejemplo para la administración parenteral o en aerosol son solución salina tamponada con fosfato o solución salina normal (0,9%). Las composiciones que comprenden tales portadores se formulan mediante métodos convencionales bien conocidos (véanse, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edición, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; y Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20a Ed. Mack Publishing, 2000, particularmente con respecto a las formulaciones). En algunas realizaciones, las formulaciones son estériles. En algunas realizaciones, las formulaciones están esencialmente libres de endotoxina.

Aunque puede emplearse cualquier portador adecuado conocido por los expertos habituales en la técnica en las composiciones farmacéuticas de esta invención, el tipo de portador variará dependiendo del modo de administración. Las composiciones pueden formularse para cualquier manera apropiada de administración, incluyendo, por ejemplo, administración intravenosa, intraarterial, intravesicular, por inhalación, intraperitoneal, intrapulmonar, intramuscular, subcutánea, intratraqueal, transmucosa, intraocular, intratecal o transdérmica. Para la administración parenteral, tal como inyección subcutánea, el portador puede incluir, por ejemplo, agua, solución salina, alcohol, una grasa, una cera o un tampón. Para la administración oral, puede emplearse cualquiera de los portadores anteriores o un portador sólido, tal como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, sacarosa o carbonato de magnesio. También pueden usarse microesferas biodegradables (por ejemplo, polilactato poliglicolato) como portadores.

En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas incluyen un tampón (por ejemplo, solución salina tamponada neutra, solución salina tamponada con fosfato, etc.), un hidrato de carbono (por ejemplo, glucosa, manosa, sacarosa, dextrano, etc.), un antioxidante, un agente quelante (por ejemplo, EDTA, glutatión, etc.), un conservante, otro compuesto útil para unir y/o transportar oxígeno, un componente inactivo (por ejemplo, un estabilizador, una carga, etc.) o combinaciones de dos o más de los anteriores. En algunas realizaciones, la composición se formula como un liofilizado. Las proteínas H-NOX también pueden encapsularse dentro de liposomas o nanopartículas usando tecnología bien conocida. Otras formulaciones a modo de ejemplo que pueden usarse para proteínas H-NOX se describen, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.os 6.974.795 y 6.432.918, particularmente con respecto a las formulaciones de proteínas.

Las composiciones descritas en el presente documento pueden administrarse como parte de una formulación de liberación sostenida (por ejemplo, una formulación tal como una cápsula o una esponja que produce una liberación lenta del compuesto después de la administración). Generalmente, tales formulaciones pueden prepararse usando tecnología bien conocida y administrarse, por ejemplo, mediante implantación oral, rectal o subcutánea, o mediante implantación en el sitio objetivo deseado. Las formulaciones de liberación sostenida pueden contener una proteína HNOX dispersada en una matriz portadora y/o contenida dentro de un depósito rodeado por una membrana de control de velocidad. Los portadores para su uso en tales formulaciones son biocompatibles y también pueden ser biodegradables. En algunas realizaciones, la formulación proporciona un nivel relativamente constante de liberación de proteína H-NOX. La cantidad de proteína H-NOX contenida en una formulación de liberación sostenida depende del sitio de implantación, la velocidad y duración esperada de liberación y la naturaleza del estado que va a tratarse o prevenirse.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica contiene una cantidad eficaz de una proteína H-NOX de tipo natural o mutante. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica contiene una cantidad eficaz de una proteína H-NOX trimérica que comprende dos o más dominios de H-NOX de tipo natural o mutantes. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica contiene una cantidad eficaz de una proteína H-NOX monomérica recombinante que comprende un dominio de H-NOX de tipo natural o mutante y un dominio de trimerización tal como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, la formulación comprende una proteína H-NOX trimérica que comprende tres monómeros, comprendiendo cada monómero un dominio de H-NOX L144F de T. tengcongensis y un dominio foldon. En algunas realizaciones, la formulación comprende una proteína H-NOX trimérica que comprende tres monómeros, comprendiendo cada monómero un dominio de H-NOX W9F/L144F de T. tengcongensis y un dominio foldon. En algunas realizaciones, la formulación comprende una proteína H-NOX trimérica que comprende tres monómeros, comprendiendo cada monómero un dominio de H-NOX L144F de T. tengcongensis y un dominio foldon.

Una dosis a modo de ejemplo de hemoglobina como sucedáneo de la sangre es de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 5 gramos o más de hemoglobina extracelular por kilogramo de peso corporal del paciente. Por tanto, en algunas realizaciones, una cantidad eficaz de una proteína H-NOX para la administración a un humano está entre unos pocos gramos y más de aproximadamente 350 gramos. Otras dosis a modo de ejemplo de una proteína H-NOX incluyen aproximadamente cualquiera de 4,4, 5, 10 ó 13 G/DL (donde G/DL es la concentración de la disolución de proteína H-NOX antes de la infusión en la circulación) a una velocidad de infusión apropiada, tal como aproximadamente 0,5 ml/min (véase, por ejemplo, Winslow, R. Capítulo 12 en Blood Sustitutes). Se apreciará que el contenido unitario de principios activos contenidos en una dosis individual de cada forma de dosificación no necesita constituir en sí una cantidad eficaz, ya que la cantidad eficaz necesaria podría alcanzarse mediante el efecto combinado de una pluralidad de administraciones. La selección de la cantidad de una proteína H-NOX para su inclusión en una composición farmacéutica depende de la forma de dosificación utilizada, el estado que va a tratarse y el propósito particular que se logrará según la determinación del experto habitual en la técnica en el campo.

Las composiciones a modo de ejemplo incluyen proteínas H-NOX recombinantes modificadas por ingeniería genética, que pueden aislarse o purificarse, que comprenden una o más mutaciones que confieren colectivamente unión de ligando O²o NO alterada en relación con la correspondiente proteína H-NOX de tipo natural, y operativa como portador de gas en sangre de mamífero fisiológicamente compatible. Por ejemplo, proteínas H-NOx mutantes tal como se describen en el presente documento. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX es una proteína H-NOX trimérica. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX es una proteína H-NOX monomérica recombinante que comprende un dominio de H-NOX de tipo natural o mutante y un dominio de trimerización tal como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, la composición comprende una proteína H-NOX trimérica que comprende tres monómeros, comprendiendo cada monómero un dominio de H-NOX L144F de T. tengcongensis y un dominio foldon. En algunas realizaciones, la composición comprende una proteína H-NOX trimérica que comprende tres monómeros, comprendiendo cada monómero un dominio de H-NOX W9F/L144F de T. tengcongensis y un dominio foldon. En algunas realizaciones, la composición comprende una proteína H-NOX trimérica que comprende tres monómeros, comprendiendo cada monómero un dominio de H-NOX L144F de T. tengcongensis y un dominio foldon.

Para reducir o prevenir una respuesta inmunitaria en sujetos humanos a los que se les administra una composición farmacéutica, pueden usarse proteínas o dominios de H-NOX humanos (o bien proteínas humanas de tipo natural o bien proteínas humanas en las que se han introducido una o más mutaciones) u otras proteínas o dominios de H-NOX no antigénicos (por ejemplo, proteínas H-NOX de mamífero). Para reducir o eliminar la inmunogenicidad de proteínas H-NOX derivadas de fuentes distintas de humanos, pueden mutarse aminoácidos en una proteína H-NOX o un dominio de H-NOX a los aminoácidos correspondientes en una H-NOX humana. Por ejemplo, pueden mutarse uno o más aminoácidos en la superficie de la estructura terciaria de una proteína H-NOX no humana al aminoácido correspondiente en una proteína H-NOX humana.

Aplicaciones terapéuticas de proteínas H-NOX

Cualquiera de las proteínas H-NOX de tipo natural o mutantes, incluyendo proteínas H-NOX triméricas, o composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden usarse en aplicaciones terapéuticas.

Pueden seleccionarse proteínas H-NOX particulares, incluyendo proteínas H-NOX triméricas, para tales aplicaciones basándose en la velocidad de asociación de O², velocidad de disociación de O², constante de disociación para la unión de O², estabilidad de NO, reactividad de NO, velocidad de autooxidación, tiempo de retención en plasma o cualquier combinación de dos o más de los anteriores deseados para la indicación particular que va a tratarse. Pueden usarse proteínas H-NOX en un método para tratar una enfermedad cardiovascular, enfermedad neurológica, hipoxia tumoral, pérdida de sangre o heridas. Por ejemplo, una proteína H-NOX de unión a O²puede usarse en la mayoría de situaciones en las que se utilizan actualmente sucedáneos de glóbulos rojos o del plasma. Específicamente, puede usarse una proteína H-NOX como sucedáneos de glóbulos rojos para un método de tratamiento de traumatismo (por ejemplo, en el campo de batalla, socorro en caso de desastre o accidentes), hemorragias, choque hemorrágico, cirugía (por ejemplo, cirugía de aneurisma abdominal, cirugía ortopédica tal como cirugía de artroplastia de cadera, o cualquier otra cirugía que produce alta pérdida de sangre), hemodilución, usos de aumento de sangre (por ejemplo, que complementa la autodonación) y cualquier otra situación en la que se pierda volemia o se reduzca la capacidad de transporte de O². Los ejemplos de aplicaciones de cicatrización de heridas incluyen la cicatrización de heridas posteriores a la radiación (por ejemplo, efecto del oxígeno hiperbárico), cicatrización posquirúrgica, cicatrización de úlceras diabéticas y quemaduras.

Una H-NOX trimérica de unión a oxígeno también puede usarse para aumentar temporalmente la administración de O²durante o después de la donación previa de sangre autóloga antes de la devolución de la sangre autóloga al individuo (tal como un reemplazo de sangre que se extrae durante procedimientos quirúrgicos en los que la sangre del individuo se extrae y se guarda para reinfusión al final de la cirugía o durante la recuperación). En algunas realizaciones, las proteínas H-NOX también funcionan como sucedáneos de volumen simples que proporcionan presión oncótica debido a la presencia de la molécula grande de proteína H-NOX.

Debido a que la distribución en la vasculatura de las proteínas H-NOX extracelulares no está limitada por el tamaño de los glóbulos rojos, las proteínas H-NOX triméricas de la presente invención pueden usarse para administrar O²a áreas que los glóbulos rojos no pueden penetrar. Estas áreas pueden incluir cualquier área de tejido que se encuentre aguas abajo de obstrucciones al flujo de glóbulos rojos, tales como áreas aguas abajo de uno o más trombos, oclusiones de drepanocitos, oclusiones arteriales, oclusiones vasculares periféricas, globos de angioplastia, instrumentos quirúrgicos, tejidos que están sufriendo por falta de oxígeno o son hipóxicos, y similares. Además, todos los tipos de isquemia tisular pueden tratarse usando proteínas H-NOX. Tales isquemias tisulares incluyen, por ejemplo, isquemia perioperatoria, accidente cerebrovascular, accidente cerebrovascular emergente, crisis isquémicas transitorias, aturdimiento e hibernación miocárdicos, angina de pecho aguda o inestable, angina de pecho emergente e infarto de miocardio (por ejemplo, infarto de miocardio con elevación del segmento ST). Otras indicaciones cardiovasculares a modo de ejemplo que pueden tratarse usando proteínas H-NOX incluyen cardioplejía y anemia drepanocítica. Las indicaciones objetivo a modo de ejemplo incluyen estados de deficiencia funcional de hemoglobina, tal como cuando un sucedáneo de la sangre o portador de O²está indicado, incluyendo la pérdida de sangre, hipoxia, etc.

Las proteínas H-NOX, incluyendo las proteínas H-NOX triméricas, también pueden usarse como adyuvante de la radiación o quimioterapia para el tratamiento del cáncer. En algunas realizaciones, se usa una proteína H-NOX como adyuvante de radioterapia en tumores sólidos (por ejemplo, individuos con mal pronóstico premetastásico) o como adyuvante de la terapia TFD en tumores de superficie (por ejemplo, cáncer de colon, pulmón o piel, o cáncer en otra superficie o ubicación accesible). Las proteínas H-NOX pueden usarse para tratar la anemia proporcionando una capacidad adicional de transporte de oxígeno en un paciente que padece anemia. Las indicaciones neurológicas a modo de ejemplo incluyen accidente cerebrovascular isquémico, traumatismo craneoencefálico y lesión de la médula espinal. Los métodos y las composiciones son aplicables a situaciones tanto agudas (que proporcionan oxígeno rápido a los tejidos o a un sitio específico, por ejemplo, infarto agudo de miocardio, oxigenación tisular aguda local o sistémica o transfusión de sangre) como crónicas (por ejemplo, recuperación posaguda de infarto de miocardio).

En un aspecto particular, la invención proporciona una composición farmacéutica proporcionada en el presente documento para su uso en métodos de administración de O²a tumores encefálicos (por ejemplo, un glioblastoma). En algunas realizaciones, la administración de H-NOX se usa como adyuvante de la radioterapia o quimioterapia. En algunas realizaciones, la invención proporciona una composición farmacéutica proporcionada en el presente documento para su uso en un métodos para tratar un cáncer encefálico (por ejemplo, un glioblastoma) en un individuo administrando una cantidad eficaz de una proteína H-NOX y administrando una cantidad eficaz de radiación al individuo. En algunas realizaciones, la invención proporciona una composición farmacéutica proporcionada en el presente documento para su uso en métodos para reducir el crecimiento de tumores encefálicos (por ejemplo, crecimiento de glioblastoma) en un individuo administrando una cantidad eficaz de una proteína H-NOX y administrando una cantidad eficaz de radiación al individuo. La proteína H-NOX es una proteína H-NOX trimérica. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX trimérica comprende uno o más dominios de H-NOX que comprenden una mutación en una posición correspondiente a L144 de H-NOX de T. tengcongensis. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX trimérica comprende uno o más dominios de H-NOX que comprenden una mutación correspondiente a una mutación L144F de H-NOX de T. tengcongensis. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX trimérica comprende uno o más dominios de H-NOX que comprenden una mutación en las posiciones correspondientes a W9 y L144 de H-NOX de T. tengcongensis. En algunas realizaciones, la proteína H-NOx trimérica comprende uno o más dominios de H-NOX que comprenden mutaciones correspondientes a una mutación W9F/L144F de H-NOX de T. tengcongensis. En algunas realizaciones, el dominio de H-NOX es un dominio de H-NOX humano. En algunas realizaciones, el dominio de H-NOX es un dominio de H-NOX canino. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX trimérica comprende un dominio de H-NOX L144F de T. tengcongensis. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX trimérica comprende un dominio de H-NOX W9F/L144F de T. tengcongensis y un dominio foldon.

En diversas realizaciones, la invención presenta una composición farmacéutica proporcionada en el presente documento para su uso en un método de administración de O²a un individuo (por ejemplo, un mamífero, tal como un primate (por ejemplo, un humano, un mono, un gorila, un simio, un lémur, etc.), un bovino, un equino, un porcino, un canino o un felino) administrando a un individuo que lo necesita una proteína H-NOX de tipo natural o mutante, incluyendo una proteína H-NOX trimérica, en una cantidad suficiente para administrar O²al individuo. En algunas realizaciones, la invención proporciona una composición farmacéutica proporcionada en el presente documento para su uso en métodos de transporte o administración de gas en sangre a un individuo, tal como un mamífero, que comprende la etapa de administrar (por ejemplo, transfundir, etc.) a la sangre del individuo (por ejemplo, un mamífero) una o más de las composiciones de H-NOX. En la técnica se conocen métodos para administrar portadores de O²a sangre o tejidos (por ejemplo, sangre o tejidos de mamíferos). En diversas realizaciones, la proteína H-NOX es una apoproteína que es capaz de unirse a hemo o es una holoproteína con hemo unido. La proteína H-NOX puede tener o no hemo unido antes de la administración de la proteína H-NOX al individuo. En algunas realizaciones, el O²se une a la proteína H-NOX antes de administrarse al individuo. En otras realizaciones, el O²no se une a la proteína H-NOX antes de la administración de la proteína al individuo, y la proteína H-NOX transporta O²de una ubicación en el individuo a otra ubicación en el individuo.

Se espera que las proteínas H-NOX mutantes y de tipo natural, incluyendo las proteínas H-NOX triméricas, con una Kd relativamente baja para el O²(tal como menos de aproximadamente 80 nM o menos de aproximadamente 50 nM) sean particularmente útiles para tratar tejidos con baja tensión de oxígeno (tales como tumores, algunas heridas u otras áreas en las que la tensión de oxígeno es muy baja, tal como una p50 por debajo de 1 mmHg). La alta afinidad de tales proteínas H-NOX por el O²puede aumentar el tiempo que el O²permanece unido a la proteína H-NOX, reduciendo así la cantidad de O²que se libera antes de que la proteína H-NOx alcance el tejido que va a tratarse.

En algunas realizaciones, para la administración directa de una proteína H-NOX con O²unido a un sitio particular en el cuerpo (tal como un glioblastoma), la koff para el O²es más importante que el valor de Kd valor porque el O²ya está unido a la proteína (lo que hace que la kon sea menos importante) y el oxígeno necesita ser liberado en o cerca de un sitio particular en el cuerpo (a una velocidad influenciada por la koff). En algunas realizaciones, la koff también puede ser importante cuando las proteínas H-NOX están en presencia de glóbulos rojos en la circulación, donde facilitan la difusión de O²de los glóbulos rojos, y tal vez prolongando la capacidad de los glóbulos rojos diluidos para transportar O²a puntos adicionales de la vasculatura.

En algunas realizaciones, para la administración de una proteína H-NOX que circula en el torrente circulatorio de un individuo, la proteína H-NOx se une al O²en los pulmones y libera O²en uno o más sitios del cuerpo. Para algunas de estas aplicaciones, el valor de Kd es más importante que la koff ya que la unión a O²está en o cerca del equilibrio. En algunas formas de realización de hemodilución extrema, la Kd es más importante que la koff cuando la proteína H-NOX es el portador primario de O²porque la proteína H-NOX se unirá y liberará O²continuamente a medida que se transporta a través de la circulación. Dado que la hemoglobina tiene una p50 de 14 mmHg, los glóbulos rojos (que actúan como condensadores) tienen una p50 de ~30 mmHg y los HBOC se han desarrollado con intervalos entre 5 mmHg y 90 mmHg, el intervalo óptimo de Kd para las proteínas H-NOX puede estar, por tanto, entre ~2 mmHg y ~100 mmHg para algunas aplicaciones.

Las proteínas H-NOX triméricas también pueden usarse para la obtención de imágenes. En particular, la obtención de imágenes óptica (por ejemplo, tomografía de coherencia óptica; véase, por ejemplo, Villard, J. W. (2002). Circulation 105:1843-1849; particularmente con respecto a la tomografía de coherencia óptica) está ofuscada por los eritrocitos. La perfusión con una disolución de H-NOX permite obtener imágenes más claras de la circulación y las paredes de los vasos porque la proteína H-NOX es mucho más pequeña que los eritrocitos.

Las proteínas H-NOX, incluyendo las proteínas H-NOX triméricas, y las composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse a un individuo por cualquier medio convencional, tal como mediante administración oral, tópica, intraocular, intratecal, intrapulmonar, intratraqueal o en aerosol; por adsorción transdérmica o por membranas mucosas; o mediante inyección (por ejemplo, inyección subcutánea, intravenosa, intraarterial, intravesicular o intramuscular). Las proteínas H-NOX también pueden incluirse en disoluciones parenterales de gran volumen para su uso como sucedáneos de la sangre. En realizaciones a modo de ejemplo, la proteína H-NOX se administra a la sangre (por ejemplo, administración a un vaso sanguíneo tal como una vena, una arteria o un capilar), una herida, un tumor, un tejido hipóxico o un órgano hipóxico del individuo.

En algunas realizaciones, se usa una formulación de liberación continua sostenida de la composición. Puede producirse la administración de una proteína H-NOX, por ejemplo, durante un período de segundos a horas dependiendo del propósito de la administración. Por ejemplo, como vehículo de administración de sangre, una evolución temporal a modo de ejemplo de administración es lo más rápida posible. Otras evoluciones temporales a modo de ejemplo incluyen aproximadamente 10, 20, 30, 40, 60, 90 ó 120 minutos. Las velocidades de infusión a modo de ejemplo para disoluciones de H-NOX como sucedáneos de la sangre son de aproximadamente 30 ml/hora a aproximadamente 13.260 ml/hora, tal como de aproximadamente 100 ml/hora a aproximadamente 3.000 ml/hora. Una dosis total a modo de ejemplo de proteína H-NOX es de aproximadamente 900 mg/kg administrada durante ^{2 0}minutos a 13.260 ml/hora. Una dosis total a modo de ejemplo de proteína H-NOX para un cerdo es de aproximadamente 18,9 gramos.

Las frecuencias de dosificación a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, al menos 1, 2, 3, 4, 5, ⁶ó 7 veces (es decir, diariamente) a la semana. En algunas realizaciones, se administra una proteína H-NOX al menos 2, 3, 4 ó ⁶veces al día. Por ejemplo, la proteína H-NOX puede administrarse durante un período de unos pocos días o semanas. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX se administra durante un período más largo, tal como unos pocos meses o años. La frecuencia de dosificación de la composición puede ajustarse durante el transcurso del tratamiento basándose en el criterio del médico que la administra.

En algunas realizaciones de la invención, la proteína H-NOX trimérica se usa como adyuvante de la radioterapia o quimioterapia. Por ejemplo, para el tratamiento del glioblastoma. En algunas realizaciones, la H-NOX se administra al individuo al menos 1, 2, 3, 4, 5 ó ⁶horas antes de la administración de la radiación o quimioterapia. En algunas realizaciones, la radiación es una irradiación de rayos X. En algunas realizaciones, la dosis de irradiación de rayos X es cualquiera de aproximadamente 0,5 gy a aproximadamente 75 gy. En algunas realizaciones, el ciclo de administración de H-NOX y la administración de radiación se repiten una, dos, tres, cuatro, cinco o seis veces. En algunas realizaciones, el ciclo de administración de H-NOX y la administración de radiación se repiten después de uno cualquiera de aproximadamente una semana, dos semanas, tres semanas, cuatro semanas, cinco semanas o seis semanas. En algunas realizaciones, la administración de H-NOX y la radioterapia se usan junto con otra terapia; por ejemplo, una quimioterapia.

Tal como se indicó anteriormente, la selección de las cantidades de dosificación para las proteínas H-NOX depende de la forma de dosificación utilizada, la frecuencia y el número de administraciones, el estado que va a tratarse y el propósito particular que debe lograrse según la determinación del experto en la técnica en el campo. En algunas realizaciones, una cantidad eficaz de una proteína H-NOX para la administración a humanos está entre unos pocos gramos y más de 350 gramos.

En algunas realizaciones, se administran dos o más proteínas H-NOX triméricas diferentes de manera simultánea, secuencial o concurrente. En algunas realizaciones, otro compuesto o terapia útil para la administración de O²se administra de manera simultánea, secuencial o concurrente con la administración de una o más proteínas H-NOX.

Otras aplicaciones terapéuticas a modo de ejemplo para las que pueden usarse proteínas H-NOX se describen, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.os 6.974.795 y 6.432.918, particularmente con respecto a las aplicaciones terapéuticas para portadores de O².

Kits con proteínas H-NOX

También se proporcionan artículos de manufactura y kits que incluyen cualquiera de las proteínas H-NOX descritas en el presente documento, incluyendo las proteínas H-NOX triméricas, y un envase adecuado. En algunas realizaciones, la invención incluye un kit con (i) una proteína H-NOX (tal como una proteína H-NOX de tipo natural o mutante proporcionada en el presente documento o formulaciones de la misma tal como se proporcionan en el presente documento) y (ii) instrucciones para usar el kit para administrar O²a un individuo. En diversas realizaciones, la invención presenta un kit con (i) una proteína H-NOX (tal como una proteína H-NOX de tipo natural o mutante proporcionada en el presente documento o formulaciones de la misma tal como se proporcionan en el presente documento) y (ii) instrucciones para usar el kit para cualquiera de los usos industriales descritos en el presente documento (por ejemplo, uso de una proteína H-NOX como patrón de referencia para instrumentación analítica que necesite un patrón de referencia de este tipo, mejora del crecimiento celular en cultivo celular manteniendo o aumentando los niveles de O² in vitro, adición de O²a una disolución o eliminación de O²de una disolución).

En algunas realizaciones, se proporcionan kits para su uso en el tratamiento de cáncer encefálico (por ejemplo, glioblastoma). En algunas realizaciones, el kit comprende una proteína H-NOX trimérica. En algunas realizaciones, el kit comprende una cantidad eficaz de una proteína H-NOX trimérica que comprende tres dominios de H-NOX de tipo natural o mutantes. En algunas realizaciones, el kit comprende una cantidad eficaz de una proteína H-NOX monomérica recombinante que comprende un dominio de H-NOX de tipo natural o mutante y un dominio de trimerización tal como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, el kit comprende una proteína H-NOX trimérica que comprende tres monómeros, comprendiendo cada monómero una mutación correspondiente a una mutación L144F de H-NOX de T. tengcongensis y un dominio de trimerización. En algunas realizaciones, el kit comprende una proteína H-NOX trimérica que comprende tres monómeros, comprendiendo cada monómero una mutación correspondiente a una mutación de W9F/L144F de H-NOX de T. tengcongensis y un dominio de trimerización. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX trimérica comprende dominios de H-NOX humanos. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX trimérica comprende dominios de H-NOX caninos. En algunas realizaciones, el kit comprende una proteína H-NOX trimérica que comprende tres monómeros, comprendiendo cada monómero un dominio de H-NOX L144F de T. tengcongensis y un dominio foldon. En algunas realizaciones, el kit comprende una proteína H-NOX trimérica que comprende tres monómeros, comprendiendo cada monómero un dominio de H-NOX W9F/L144F de T. tengcongensis y un dominio foldon. En algunas realizaciones, el kit comprende una proteína H-NOX trimérica que comprende tres monómeros, comprendiendo cada monómero un dominio de H-NOX L144F de T. tengcongensis y un dominio foldon.

En la técnica se conocen envases adecuados para las composiciones descritas en el presente documento, e incluyen, por ejemplo, viales (por ejemplo, viales sellados), recipientes, ampollas, botellas, frascos, envases flexibles (por ejemplo, bolsas de plástico o Mylar selladas) y similares. Estos artículos de manufactura pueden esterilizarse y/o sellarse adicionalmente. También se describen formas de dosificación unitarias que comprenden las composiciones descritas en el presente documento. Estas formas de dosificación unitarias pueden almacenarse en un envase adecuado en dosificaciones unitarias únicas o múltiples y también pueden esterilizarse y sellarse adicionalmente. Las instrucciones suministradas en los kits de la invención suelen ser instrucciones escritas en una etiqueta o un prospecto (por ejemplo, una hoja de papel incluida en el kit), pero también son aceptables instrucciones legibles por máquina (por ejemplo, instrucciones llevadas en un disco de almacenamiento magnético u óptico). Las instrucciones relacionadas con el uso de proteínas H-NOX generalmente incluyen información sobre la dosificación, la pauta posológica y la vía de administración para el tratamiento o uso industrial previsto. El kit puede comprender además una descripción de la selección de un tratamiento o individuo adecuado.

Los recipientes pueden ser dosis unitarias, envases a granel (por ejemplo, envases multidosis) o dosis subunitarias. Por ejemplo, también pueden proporcionarse kits que contengan dosificaciones suficientes de proteínas H-NOX divulgadas en el presente documento para proporcionar un tratamiento eficaz para un individuo durante un período prolongado, tal como aproximadamente una semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, ⁶semanas, ⁸semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses, ⁶meses, 7 meses, ⁸meses, 9 meses o más. Los kits también pueden incluir múltiples dosis unitarias de proteínas H-NOX e instrucciones de uso y envasadas en cantidades suficientes para su almacenamiento y uso en farmacias, por ejemplo, farmacias hospitalarias y farmacias de formulación magistral. En algunas realizaciones, el kit incluye una composición seca (por ejemplo, liofilizada) que puede reconstituirse, resuspenderse o rehidratarse para formar generalmente una suspensión acuosa estable de proteína H-NOX.

Métodos a modo de ejemplo para la producción de proteínas H-NOX

También se describen en el presente documento métodos para la producción de cualquiera de las proteínas H-NOX poliméricas descritas en el presente documento. El método implica cultivar una célula que tiene un ácido nucleico que codifica para una proteína H-NOX polimérica en condiciones adecuadas para la producción de la proteína H-NOX polimérica. Tal como se describe en el presente documento, la H-NOX polimérica también se purifica (tal como purificación de la proteína H-NOX a partir de células o del medio de cultivo). Tal como se describe en el presente documento, el método implica cultivar una célula que tiene un ácido nucleico que codifica para una proteína H-NOX monomérica que comprende un dominio de H-NOX y un dominio de polimerización. A continuación, los monómeros se asocian in vivo o in vitro para formar una proteína H-NOX polimérica. Una proteína H-NOX polimérica que comprende dominios de H-NOX heterólogos puede generarse introduciendo de manera conjunta dos o más ácidos nucleicos que codifican para proteínas H-NOX monoméricas con los dominios de H-NOX deseados y en la que en las dos o más proteínas H-NOX monoméricas comprenden el mismo dominio de polimerización.

Tal como se describe en el presente documento, una proteína H-NOX polimérica que comprende dominios de H-NOX heterólogos se prepara preparando por separado proteínas H-NOX poliméricas que comprenden subunidades H-NOX monoméricas homólogas que comprenden los dominios de H-NOX deseados y un dominio de trimerización común. Las diferentes proteínas H-NOX homólogas se mezclan a una razón deseada de subunidades H-NOX heterólogas, las proteínas H-NOX triméricas homólogas se disocian (por ejemplo, por calor, desnaturalizante, alto contenido de sal, etc.), luego se permite que se asocien para formar proteínas H-NOX triméricas heterólogas. La mezcla de proteínas H-NOX triméricas heterólogas puede purificarse adicionalmente mediante selección para determinar la presencia de las subunidades deseadas a la razón deseada. Por ejemplo, cada monómero de H-NOX diferente puede tener una etiqueta distinta para ayudar a purificar proteínas H-NOX triméricas heterólogas e identificar y cuantificar las subunidades heterólogas.

Tal como se indicó anteriormente, se conocen las secuencias de varias proteínas y ácidos nucleicos H-NOX de tipo natural y pueden usarse para generar dominios y ácidos nucleicos H-NOX mutantes de la presente invención. Las técnicas para la mutación, expresión y purificación de proteínas H-NOX recombinantes se han descrito por, por ejemplo, Boon, E.M. et al. (2005). Nature Chemical Biology 1:53-59 y Karow, D. S. et al. (10 de agosto de 2004). Biochemistry 43(31):10203-10211, particularmente con respecto a la mutación, expresión y purificación de proteínas H-NOX recombinantes. Estas técnicas u otras técnicas convencionales pueden usarse para generar cualquier proteína H-NOX mutante.

En particular, las proteínas H-NOX mutantes descritas en el presente documento pueden generarse mediante varios métodos que se conocen en la técnica. La mutación puede producirse a nivel de aminoácidos por modificación química de un aminoácido o a nivel de codones por alteración de la secuencia de nucleótidos que codifica para un aminoácido dado. La sustitución de un aminoácido en cualquier posición dada en una proteína puede lograrse alterando el codón que codifica para ese aminoácido. Esto puede lograrse mediante mutagénesis dirigida al sitio usando, por ejemplo: (i) la técnica de Amersham (kit de mutagénesis de Amersham, Amersham, Inc., Cleveland, Ohio) basada en los métodos de Taylor, J.W. et al. (20 de diciembre de 1985). Nucleic Acids Res. 13(24):8749-8764; Taylor, J.W. et al. (20 de diciembre de 1985). Nucleic Acids Res. 13(24):8765-8785; Nakamaye, K. L. et al. (22 de diciembre de 1986). Nucleic Acids Res. 14(24):9679-9698; y Dente et al. (1985). en DNA Cloning, Glover, Ed., IRL Press, páginas 791-802, (ii) el kit de Promega (Promega Inc., Madison, Wis.) o (iii) el kit de Biorad (Biorad Inc., Richmond, CA), basado en los métodos de Kunkel, T. A. (enero de 1985). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82(2):488-492; Kunkel, T. A. (1987). Methods Enzymol. 154:367-382; Kunkel, patente estadounidense n.° 4.873.192, particularmente con respecto a la mutagénesis de proteínas. La mutagénesis también puede lograrse mediante otros medios comercialmente disponibles o no comerciales, tales como los que utilizan mutagénesis dirigida al sitio con oligonucleótidos mutantes.

La mutagénesis dirigida al sitio también puede lograrse usando mutagénesis basada en PCR tal como la descrita en Zhengbin et al. (1992). páginas 205-207 en PCR Methods and Applications, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York; Jones, D. H. et al. (febrero de 1990). Biotechniques ⁸(2):178-183; Jones, D. H. et al. (enero de 1991). Biotechniques 10(1):62-66, particularmente con respecto a la mutagénesis de proteínas. La mutagénesis dirigida al sitio también puede lograrse usando mutagénesis en casete con técnicas que son conocidas por los expertos en la técnica.

Puede incorporarse un ácido nucleico H-NOX mutante y/o un dominio de trimerización en un vector, tal como un vector de expresión, usando técnicas convencionales. Por ejemplo, pueden usarse enzimas de restricción para escindir el ácido nucleico H-NOX mutante y el vector. A continuación, pueden unirse los extremos compatibles del ácido nucleico H-NOX mutante escindido y del vector escindido. El vector resultante puede insertarse en una célula (por ejemplo, una célula de insecto, una célula vegetal, una célula de levadura o una célula bacteriana) usando técnicas convencionales (por ejemplo, electroporación) para la expresión de la proteína H-NOX codificada.

En particular, se han expresado proteínas heterólogas en varios sistemas de expresión biológicos, tales como células de insectos, células vegetales, células de levaduras y células bacterianas. Por tanto, puede utilizarse cualquier sistema de expresión de proteínas biológico adecuado para producir grandes cantidades de proteína H-NOX recombinante. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX (por ejemplo, una proteína H-NOX mutante o de tipo natural) es una proteína aislada.

Si se desea, las proteínas H-NOX pueden purificarse usando técnicas convencionales. En algunas realizaciones, la proteína está al menos aproximadamente un 60% en peso libre de otros componentes que están presentes cuando se produce la proteína. En diversas realizaciones, la proteína es al menos aproximadamente el 75%, el 90% o el 99% en peso pura. Puede obtenerse una proteína purificada, por ejemplo, mediante purificación (por ejemplo, extracción) de una fuente natural, un sistema de expresión recombinante o una mezcla de reacción para síntesis química. Los métodos a modo de ejemplo de purificación incluyen inmunoprecipitación, cromatografía en columna tal como cromatografía de inmunoafinidad, purificación por inmunoafinidad con perlas magnéticas y selección con un anticuerpo unido a placa, así como otras técnicas conocidas por el experto en la técnica. La pureza puede analizarse mediante cualquier método apropiado, por ejemplo, mediante cromatografía en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida o análisis por HPLC. En algunas realizaciones, la proteína purificada se incorpora a una composición farmacéutica de la invención o se usa en un método de la invención. La composición farmacéutica de la invención puede tener aditivos, portadores u otros componentes además de la proteína purificada.

En algunas realizaciones, la proteína H-NOX trimérica comprende una o más etiquetas His⁶. Una proteína H-NOX que comprende al menos una etiqueta His⁶puede purificarse usando cromatografía; por ejemplo, usando cromatografía de afinidad por Ni2+. Después de la purificación, puede retirarse la etiqueta His⁶; por ejemplo, usando una exopeptidasa. En algunas realizaciones, la invención proporciona una proteína H-NOX trimérica purificada, en la que la proteína H-NOX trimérica se purificó mediante el uso de una etiqueta His⁶. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX purificada se trata con una exopeptidasa para retirar las etiquetas His⁶.

Ejemplos

Los ejemplos, que pretenden ser puramente a modo de ejmplo de la invención y, por tanto, no deben considerarse que limitan la invención de ninguna manera, también describen y detallan aspectos y realizaciones de la invención comentados anteriormente. Los ejemplos no pretenden representar que los experimentos a continuación son todos o los únicos experimentos realizados. A menos que se indique lo contrario, la temperatura está en grados centígrados y la presión es igual o cercana a la atmosférica.

Ejemplo 1. Creación y expresión de una proteína H-NOX trimerizada

Para aumentar la semivida en circulación de la proteína H-NOX, se diseñó una proteína de fusión quimérica para combinar la secuencia de H-NOX de Thermoanaerobacter tengcongensis con el dominio de trimerización de la proteína fibritina de bacteriófago T4. Esta estrategia de fusión produce un aumento de más de 3 veces en el peso molecular y es completamente modular (el dominio de trimerización podría añadirse a cualquier secuencia de H-NOX e incluso usarse para combinar múltiples secuencias de H-NOX en una sola molécula de trímero).

Fusión del dominio foldon a H-NOX

El dominio foldon se fusionó genéticamente al extremo C-terminal de una secuencia de H-NOX de Thermoanaerobacter tengcongensis que usa un ligador de tres aminoácidos (Gly-Ser-Gly) entre el sitio de restricción Xho I en el extremo C-terminal de la secuencia de H-NOX y la glicina inicial del dominio foldon. Se añadió una etiqueta de purificación de proteína His⁶al extremo C-terminal del dominio foldon usando un ligador de tres aminoácidos (Arg-Gly-Ser) entre el foldon y la etiqueta His⁶. La secuencia de aminoácidos y ADN de la proteína de fusión completa se muestra en la figura 2. La proteína de fusión de longitud completa codifica para una proteína de 229 aminoácidos con un peso molecular de 26.677 UMA (como monómero).

Construcción de la secuencia de la proteína de fusión H-NOX-foldon

La construcción de la secuencia de fusión H-NOX-foldon se diseñó para usar endonucleasas de restricción para cortar el segmento de ADN que codifica para His⁶y detener el codón del plásmido H-NOX original y reemplazarlo con un casete que codifica para la secuencia de foldon, etiqueta His⁶y codón de terminación. Se adquirió a Dn que codifica para el dominio foldon, etiqueta His⁶y codón de terminación flanqueado por sitios de enzimas de restricción (Xho I en el extremo 5' y Hind III en el extremo 3' después de la etiqueta His⁶y el codón de terminación) de GenScript (Piscataway, NJ). La secuencia se proporcionó en el vector de clonación GenScript pUC57.

Las enzimas de restricción Xho I y Hind III se usaron para digerir el plásmido pUC57 para liberar el fragmento foldon-His⁶(147 pares de bases de longitud). El vector pCW que codifica para la variante L144F de H-NOX de Thermoanaerobacter tengcongensis también se digirió con Xho I y Hind III para retirar el fragmento de 48 pares de bases que codifica para la etiqueta His⁶y el codón de terminación de la secuencia H-NOX. Los fragmentos deseados de las reacciones de digestión de restricción se aislaron mediante electroforesis preparativa en gel de agarosa y los fragmentos de ADN se purificaron a partir de la agarosa. Los fragmentos que codifican para la secuencia de H-n Ox y foldon-etiqueta His⁶se unieron usando ligasa T4 y la reacción de ligamiento se usó para transformar células competentes de E. coli. La secuenciación con un cebador de secuenciación específico de pCW confirmó que uno de los clones de E. coli (clon 3I-A) coincidía con la secuencia de fusión deseada y codificó para la proteína quimérica H-NOX-foldon-His⁶completa (la figura 3A muestra los datos de secuenciación alineados con la secuencia deseada). La secuencia del clon 3I-A se renombró como v01-f002 para designar el vector pCW (v01) que codifica para la secuencia L144F H-NOX (002) con el dominio foldon fusionado (f). Las secuencias de tipo natural de monómeros H-NOX-foldon de T. thermoanaerobacter con y sin etiquetas His⁶y la secuencia de monómeros H-NOX-foldon de C. lupus se presentan en la figura 3.

Expresión y purificación de la proteína de fusión H-NOX-foldon

El plásmido v01-f002 derivado del vector original pCW (Gegner, JA y Dahlquist, FW (1991) Proc Natl Acad Sci USA ^{8 8}, 750-75; Muchmore, DC et al. (1989) Methods Enzymol 177: 44-73.) codifica para la expresión del marco de lectura abierto f002 por los promotores múltiples tac (híbrido trp-lac). El plásmido v01-f002 se transformó en una cepa RP523 competente de E. coli (Li, JM et al., (1988) J Bacteriol 170:1021-1025) para la expresión eficaz de la proteína H-NOX unida a hemo. La expresión se sometió a prueba en un intervalo de temperaturas de inducción (37°C, 30°C, 18°C) y también en células Rosetta2 (Merck Millipore, Darmstadt, Alemania).

Se logró una expresión robusta del plásmido v01-f002 en células RP523 usando un cultivo iniciador inicial durante la noche de caldo Luria complementado con ¹⁰⁰mg/l de ampicilina y 30 mg/l de hemina cultivada a 30°C. A continuación, se usó el cultivo iniciador para inocular el cultivo de expresión de ⁶l de caldo Terrific complementado con 100 mg/l de ampicilina, 30 mg/l de hemina y glucosa al 1,5%. El cultivo de expresión se hizo crecer a 30°C hasta una DO⁶⁰⁰de -0,5 y luego se indujo la expresión de proteínas mediante la adición de IPTG hasta una concentración final de 0,1 mM. La expresión se continuó a 30°C durante la noche (24,5 horas de inducción) antes de que las células se recogieran por centrifugación y se congelaran a -80°C para su purificación.

La proteína de fusión se purificó a partir del sedimento celular expresado usando una etapa de tratamiento térmico y dos etapas de cromatografía. En primer lugar, el sedimento celular expresado se resuspendió en fosfato de sodio 50 mM, NaCl 500 mM, imidazol 20 mM y tampón de glicerol al 5% a pH 7,9. La disolución se homogeneizó usando un homogeneizador EmulsiFlex C-50 (Avestin, Ottawa, Canadá) para lisar las células bacterianas. El lisado celular se calentó durante 15 minutos a 75°C para precipitar proteínas no termoestables. El precipitado se retiró mediante centrifugación a 27.000 g durante 15 minutos para obtener un sobrenadante clarificado. El sobrenadante clarificado se aplicó a una columna HisTrap FastFlow (GE, Piscataway, NJ) para unir la proteína de fusión etiquetada con His⁶. La proteína unida se eluyó con un tampón de fosfato de sodio 50 mM, NaCl 500 mM, imidazol 250 mM y tampón de glicerol al 5% a pH 7,9. La proteína eluida se sometió a intercambio de tampón en un tampón de trietanolamina 30 mM, NaCl 50 mM, pH 7,4 para su aplicación a una columna DEAE Sepharose FastFlow (GE, Piscataway, NJ). La proteína de fusión H-NOX-foldon fluyó a través de la columna DEAE mientras que los contaminantes de la célula huésped y la endotoxina se retuvieron en la columna. A continuación, la proteína de fusión H-NOX-foldon pudo concentrarse para su almacenamiento a -80°C. En la figura 4 se muestra un gel de SDS-PAGE que muestra la proteína de fusión H-NOX-foldon en cada etapa del procedimiento de purificación desde la purificación inicial.

Caracterización de la proteína de fusión H-NOX-foldon purificada

Se han usado varias técnicas para caracterizar la proteína H-NOX-foldon purificada. La pureza de la proteína purificada final se ha analizado mediante SDS-PAGE (véanse las figuras 4 y 5). La electroforesis en gel muestra que la proteína de fusión H-NOX-foldon tiene una pureza >95% después del tratamiento térmico y dos etapas de cromatografía. En el gel de SDS-PAGE desnaturalizante, la fusión H-NOX-foldon se corre como un monómero con una movilidad consistente con un peso molecular monomérico de 26,7 kDa.

Se han obtenido estimaciones más cuantitativas del tamaño de la proteína de fusión usando CL-EM para determinar la masa exacta de la unidad monomérica y cromatografía de exclusión molecular analítica para estimar el tamaño y la dispersión del trímero en la disolución tampón convencional. La figura ⁶muestra el análisis CL-EM de la proteína de fusión H-NOX-foldon. La masa derivada de CL-EM de 26.678 UMA es consecuente con la masa predicha de 26.677 UMA para la fusión monomérica H-NOX-foldon. La figura 7 muestra la cromatografía de exclusión molecular analítica usando una columna Superdex 200 10/300 GL (GE, Piscataway, NJ) y un tampón de trietanolamina 30 mM, NaCl 50 mM, pH 7,4. En las condiciones analíticas de SEC, la fusión de H-NOX-foldon debe permanecer trimerizada y el volumen de retención resultante es coherente con el peso molecular predicho de 80,0 kDa para el trímero H-NOX-foldon.

La espectroscopia de hemoproteínas se usa para caracterizar la naturaleza de los ligandos unidos y el estado de oxidación del átomo de hierro en el hemo. El análisis espectroscópico UV-vis de la proteína de H-NOX-foldon muestra que la fusión del dominio foldon no altera el espectro de H-NOX característico. Los picos espectrales característicos que incluyen el pico de Soret (415 nm) y los picos a/p (550-600 nm) se conservan entre el monómero H-NOX y la proteína de fusión H-NOX-foldon e indican que la fusión H-NOX-foldon une el cofactor hemo y el gas oxígeno diatómico de una manera similar al monómero H-NOX original (figura ⁸).

Se ha construido un modelo estructural del trímero H-NOX-foldon usando las estructuras cristalinas del dominio foldon (1V1H) y el monómero H-NOX de Thermoanaerobacter tengcongensis (1U4H) que se encuentra en el banco de datos de proteínas RCSB (figura 9).

Ejemplo 2. Producción de un panel de trímeros H-NOX que demuestra una semivida prolongada y un intervalo de afinidades por oxígeno.

Mediante el uso de un diseño computacional basado en la estructura, los aminoácidos H-NOX se mutaron sistemáticamente para crear un panel de variantes del monómero H-NOX que se unen al oxígeno con una gama de afinidades. Se determinó que se produjo el aclaramiento de los pequeños monómeros H-NOX de 23 kDa del aparato circulatorio de la rata con una semivida de 30 minutos. Se planteó la hipótesis de que al elevar el peso molecular por encima del límite de filtración renal, la semivida en circulación de la proteína H-NOX podría posiblemente aumentar y, por tanto, permitir una oxigenación sostenida durante períodos más prolongados. Para determinar si el aumento del peso molecular podría aumentar la semivida en circulación de la proteína H-NOX, se generaron variantes de H-NOX con pesos moleculares mayores mediante la trimerización de monómeros H-NOX que habían tenido éxito en la oxigenación del tejido hipóxico. Para generar un panel de variantes trimerizadas, un pequeño motivo de trimerización de aminoácidos de la proteína fibritina denominado dominio “foldon” se unió genéticamente al extremo C-terminal de varios monómeros H-NOX con diferentes afinidades de oxígeno que varían desde 1 hasta 20 mmHg. El panel incluía trímeros H-NOX ensamblados con H-NOX de tipo natural, variante L144F de H-NOX, variante L144F de H-NOX sin etiqueta His⁶en el extremo C-terminal, variante L144F/L189C de H-NOX, variante L144F de H-NOX sin ligador entre H-NOX y foldon, variante L144F de H-NOX con un ligador de tres aminoácidos entre H-NOX y foldon, variante de H-NOX con un ligador de nueve aminoácidos entre H-NOX y foldon, o variante de W9F/L144F de H-NOX. El dominio foldon consistía en 27 residuos de aminoácidos, GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO:4), correspondientes a los residuos de aminoácidos 457 a 483 en la fibritina y tenía una masa predicha de 3,08 kDa. Tal como se describió anteriormente, se ha demostrado previamente que el dominio foldon aumenta la estabilidad de la proteína y se ha usado ampliamente para trimerizar proteínas tanto in vitro como in vivo. En resumen, un plásmido que contiene el gen que codifica para el dominio foldon con sitios de restricción XhoI y HindIII en los extremos 5' y 3', respectivamente, se digirió con las enzimas de restricción XhoI y HindIII para clonar el gen del dominio foldon en un plásmido que codifica para un monómero de proteína H-NOX. Después de la expresión del plásmido en células bacterianas (E. coli), la proteína H-NOX foldon se purificó y se sometió a prueba para verificar la trimerización de los monómeros H-NOX foldon en trímeros H-NOX foldon (por ejemplo, trímero H-NOX). Para la purificación, las células bacterianas se lisaron con lisozima y se homogeneizaron. El sobrenadante se recogió y se trató térmicamente a 75°C durante 15 minutos antes de la centrifugación a 14 krpm en un rotor JA-17 para retirar la proteína insoluble. La H-NOX foldon soluble se unió a una columna HisTrap (IMAC) y se eluyó con imidazol, y las muestras eluidas se sometieron a intercambio de tampón para proporcionar una muestra de proteína en un tampón bajo en sal sin imidazol. Las proteínas contaminantes adicionales de la muestra se retiraron sometiendo la muestra de proteína a una columna de intercambio iónico DEAE y las muestras de proteína eluidas se concentraron antes del análisis. Se usó espectroscopía de masas y cromatografía de exclusión molecular para verificar el peso molecular monomérico (aproximadamente 26,7 kDa) y el peso molecular trimérico (aproximadamente 80,1 kDa), respectivamente. Cada variante trimerizada se sometió a prueba para determinar si cumplía con los parámetros bioquímicos que incluyen: peso molecular homogéneo, afinidades de unión a oxígeno entre 1 y 20 mmHg tal como se mide mediante koff e interpolando valores de kon conocidos para llegar a las Kd que corresponden a mmHg. La koff para los homotrímeros es esencialmente la misma que para los monómeros correspondientes cuando se mide por koff, reactividad mínima de óxido nítrico (NO), bajas velocidades de autooxidación y tiempo de persistencia en circulación de 3 horas o más (tabla 2). Se usó espectroscopía para determinar la naturaleza del gas unido en STP y se usó espectroscopía de flujo detenido para determinar la constante de velocidad cinética para la disociación de oxígeno. A partir del análisis, se identificaron trímeros H-NOX con afinidades de oxígeno de 2 |iM, una afinidad que posiblemente podría permitir la liberación de oxígeno en tejidos con bajos niveles de oxígeno. Los trímeros H-NOX también demostraron una reactividad de óxido nítrico de aproximadamente menos de ¹| iM 'V ¹que se consideró mínima en comparación con la hemoglobina que tiene una reactividad de óxido nítrico de 58 | iM 'V ¹que previamente se ha demostrado que es vasoactivo y tóxico.

Tabla 2. Propiedades bioquímicas y de aclaramiento de trímeros H-NOX polimerizados

Los trímeros se produjeron con alta pureza y bajos niveles de endotoxinas para estudios de aclaramiento en ratas. Los trímeros H-NOX se formularon para inyección in vivo en un tampón fisiológico de NaCl 150 mM, tampón HEPES 25 mM (pH 7,4) y se concentraron a 100 mg/ml para su uso en dosis de hasta 100 mg/kg. Para verificar los tiempos de persistencia en circulación prolongados de los trímeros H-NOX, cada uno de los candidatos a trímero se sometieron a prueba usando un grupo de cuatro ratas Wister macho. La anestesia se indujo en una cámara de inducción con isoflurano al 2-3% en N²O:O²(2:1) y se mantuvo con isoflurano al 1-1,5% a través de un cono nasal. La profundidad adecuada de la anestesia se evaluó por la falta de retirada al pellizco de las extremidades traseras y la pérdida del reflejo ciego del ojo. Los animales recibieron 40 mg/kg de cefazolina sódica mediante inyección intraperitoneal y 0,1 mg/kg de buprenorfina subcutánea. Un día antes de la prueba de aclaramiento, se implantaron quirúrgicamente catéteres en la arteria y la vena femoral en cada animal para permitir la inyección y la extracción de sangre, respectivamente. Se inyectaron candidatos a trímeros H-NOX en el tiempo 0 a una dosis de 100 mg/kg mediante inyección de bolo intravenoso en el catéter venoso. Se recogieron aproximadamente 250 |il de sangre del catéter arterial de cada rata a los 5 min, 30 min, 1 h, 1,5 h, 2 h, 3 h, 4 h, ⁶h, ⁸h y 24 h después de la inyección del trímero H-NOX candidato o control de tampón. La sangre extraída se procesó para suero y plasma y posteriormente se analizó la presencia de trímero H-NOX usando ensayos ELISA y SDS-PAGE con un anticuerpo policlonal contra la proteína H-NOX.

Tabla 3: parámetros farmacocinéticos de monómero y trimero HNOX y cuando se administran como un bolo intravenoso ^{( 1 00}mg/kg) a una rata

ND - no determinado

Además de la medición del tiempo de aclaramiento para cada trímero, también se controló la seguridad preliminar en los animales. Un estudio de seguridad similar a las Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL) con monómero H-NOX no mostró acontecimientos adversos o inmunitarios importantes a las 48 horas, incluso a la dosis máxima factible de 1 g/kg. Los trímeros H-NOX candidatos se sometieron a prueba de manera similar monitorizando la toxicidad grave, el análisis bioquímico de la sangre y los anticuerpos antiterapéuticos hasta 4 semanas después de la inyección inicial. Para las pruebas de seguridad preliminares, a grupos de seis ratones se les administró trímeros H-NOX candidatos o control de tampón en el tiempo 0 a una dosis de 750 mg/kg mediante inyección en bolo intravenoso en la vena de la cola. Se extrajeron muestras de sangre de la vena yugular de cada rata antes de la administración de los trímeros H-NOX y se compararon con la sangre extraída cada semana durante hasta cuatro semanas después de la administración de los trímeros H-NOX. La sangre extraída se procesó para suero y plasma y posteriormente se sometió a análisis de química clínica y producción de anticuerpos antiterapéuticos tal como se detecta mediante ELISA. Todos los animales se observaron diariamente para monitorizar cualquier evidencia de toxicidad grave.

Los perfiles en plasma del trímero H-NOX después de un bolo intravenoso (100 mg/kg) en dos ratas diferentes se muestran en la figura 10. Las respuestas de anticuerpos IgG e IgM después de la administración del trímero H-NOX se muestran en la figura ^{1 1}.

Ejemplo 3. Identificación de candidatos a trímeros H-NOX que demuestran penetración en el tejido cerebral y reducción de hipoxia en modelos de ratón in vivo de isquemia.

Los candidatos a trímeros H-NOX con una semivida en circulación de al menos 3 horas se sometieron a prueba en un modelo de roedor de oclusión temporal de MCA (tMCAO) de accidente cerebrovascular isquémico para la identificación de los trímeros H-NOX que perfunden y persisten en el tejido cerebral. Cada uno de los candidatos al trímero principal de H-NOX se sometió a prueba usando un grupo de 24 ratas Wister macho. La anestesia se indujo en una cámara de inducción con isoflurano al 2-3% en N²O:O²(2:1) y se mantuvo con isoflurano al 1-1,5% a través de un cono nasal. La profundidad adecuada de la anestesia se evaluó por la falta de retirada al pellizco de las extremidades traseras y la pérdida del reflejo ciego del ojo. Los animales recibieron 40 mg/kg de cefazolina sódica mediante inyección intraperitoneal y 0,1 mg/kg de buprenorfina subcutánea. La oclusión temporal de la arteria cerebral media se inició en el día 0 utilizando una técnica quirúrgica basada en suturas convencional. En resumen, se realizó una incisión en la piel sobre la arteria carótida común derecha (CCA) para permitir el pinzamiento temporal de la CCA y la ligadura de un segmento distal de la arteria carótida externa (ECA). Se insertó una sutura de nailon a través de la ECA proximal y se hizo avanzar hacia la arteria carótida interna (ICA) para ocluir el flujo sanguíneo al cerebro. Se retiró el clip de la CCA y se cerró la incisión en la piel con grapas quirúrgicas y se permitió que el animal se despertara. Se infundió una dosis de 750 mg/kg de un candidato a trímero H-NOX mediante inyección en la vena de la cola en ratas 30 minutos después de la oclusión de la arteria cerebral media. Para analizar la hipoxia tisular, el marcador de hipoxia pimonidazol se inyectó por vía intraperitoneal a 60 mg/kg aproximadamente 15 minutos después de la inyección de trímero H-NOX para marcar de manera irreversible el tejido isquémico. La oclusión se liberó 30 minutos después de la infusión de trímero H-NOX proporcionando anestesia a las ratas, reabriendo la herida y retirando la sutura intravascular de la ECA antes de volver a cerrar la herida para proporcionar un total de 1 hora de oclusión antes de la reperfusión. Para analizar la distribución tisular de los trímeros H-NOx y cuantificar la reducción de la hipoxia, las ratas se sacrificaron a las 2, 4, 12 y 24 horas después de la reperfusión (N = ⁶ratas por trímero H-NOX por punto de tiempo) y se extrajeron tejido cerebral y sangre. Los cerebros de los animales sacrificados se seccionaron y se tiñeron para determinar la distribución de H-NOX y la hipoxia tisular mediante el uso de un anticuerpo policlonal contra H-NOX y un anticuerpo Hydroxyprobe contra el marcador de hipoxia de pimonidazol (Hydroxyprobe International), respectivamente, para el análisis inmunohistoquímico posterior. Las imágenes se tomaron utilizando un microscopio equipado con una cámara y se cuantificó la tinción. Se sabe que la isquemia y la reperfusión desencadenan la muerte de las células neuronales e inician respuestas inflamatorias que dan como resultado un daño posisquémico. Como criterios de valoración secundarios, la apoptosis se midió en el tejido cerebral mediante la tinción del ensayo TUNEL (Roche) y el recuento de células TUNEL positivas, y mediante la tinción de marcadores apoptóticos que incluyen Caspasa-1, -3, Bax y Bcl-2 escindidas. Se realizaron análisis bioquímicos de la sangre en muestras tomadas en múltiples puntos de tiempo para evaluar la reducción de marcadores inflamatorios y cualquier efecto hematopoyético y sistémico debido al uso de candidatos a trímeros H-NOX. La regulación por incremento de citocinas proinflamatorias incluyendo TNFa, IL-1a, IL-Ip IL-⁶, MCP-1, Rantes y MIP se cuantificaron a partir de suero de rata usando ELISA (kit Signosis Rat Inflammation ELISA) y RT-PCR. Se identificaron candidatos a trímeros H-NOX que penetraron en el tejido isquémico y que redujeron significativamente la hipoxia.

Ejemplo 4: los trímeros H-NOX redujeron el volumen de infarto y mejoraron las respuestas neurológicas en modelos de ratón in vivo de isquemia.

Los candidatos a trímero H-NOX que demostraron penetración en el tejido cerebral y redujeron la hipoxia tisular se evaluaron adicionalmente en el modelo de roedor con accidente cerebrovascular tMCAO de rata con un enfoque en evaluaciones clínicamente relevantes en puntos de tiempo extendidos después de isquemia y reperfusión. Cada uno de los candidatos al trímero principal de H-NOX se sometió a prueba usando un grupo de 12 ratas Wister macho. La anestesia se indujo en una cámara de inducción con isoflurano al 2-3% en N²O:O²(2:1) y se mantuvo con isoflurano al 1-1,5% a través de un cono nasal. La profundidad adecuada de la anestesia se evaluó por la falta de retirada al pellizco de las extremidades traseras y la pérdida del reflejo ciego del ojo. Los animales recibieron 40 mg/kg de cefazolina sódica mediante inyección intraperitoneal y 0,1 mg/kg de buprenorfina subcutánea. La oclusión temporal de la arteria cerebral media se inició en el día 0 usando una técnica quirúrgica basada en suturas convencional. En resumen, se realizó una incisión en la piel sobre la arteria carótida común derecha (CCA) para permitir el pinzamiento temporal de la CCA y la ligadura de un segmento distal de la arteria carótida externa (ECA). Se insertó una sutura de nailon a través de la ECA proximal y se hizo avanzar hacia la arteria carótida interna (ICA) para ocluir el flujo sanguíneo al cerebro. Se retiró el clip de la CCA y se cerró la incisión en la piel con grapas quirúrgicas y se permitió que el animal se despertara. Se infundió una dosis de 750 mg/kg de un candidato a trímero H-NOX o un control de tampón mediante inyección en la vena de la cola en ratas 30 minutos después del comienzo de la oclusión de la arteria cerebral media. La oclusión se liberó 30 minutos después de la infusión de trímero H-NOX proporcionando anestesia a las ratas, reabriendo la herida y retirando la sutura intravascular del ECA antes de volver a cerrar la herida para proporcionar un total de 1 hora de oclusión antes de la reperfusión. Para las pruebas neurológicas, cada animal se evaluó a las 72 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas y 4 semanas después de la reperfusión. Los animales se evaluaron en busca de déficits neurológicos puntuando en una escala de 0 a 4, donde 0 indica que no hay déficit, 1 indica que no puede extenderse una extremidad anterior cuando se colocan, 2 indica que se mueve en círculos, 3 indica debilidad unilateral y 4 indica la falta de actividad motora espontánea, tal como se describió anteriormente. Ver Borlongan, C.V., et al., (1998) Exp Neurol., 149:310-321, que se incorpora en el presente documento en su totalidad como referencia. Cuatro semanas después de la reperfusión, se sacrificaron los animales y se recogió tejido cerebral para la tinción con H&E y el posterior análisis histológico para evaluar el volumen de infarto. Para las mediciones del volumen de infarto, se fotografiaron siete secciones de cada cerebro animal (+4,7, 2,7, 0,7, -1,3, -3,3, -5,3 y -7,3, en comparación con el bregma, respectivamente) con una cámara digital. El área de infarto de cada corte se cuantificó mediante Image J usando el “método indirecto” (área del hemisferio contralateral [izquierdo] intacto - área de las regiones intactas del hemisferio ipsilateral [derecho]) para corregir el edema cerebral. Las áreas de infarto se sumaron entre los cortes y se multiplicaron por el grosor del corte para obtener el volumen total de infarto, que se expresó como un porcentaje del volumen hemisférico contralateral intacto. Se midió el volumen de infarto para compararlo con los animales de control con tampón y se compararon las puntuaciones de cada grupo mediante ANOVA y la prueba de rango múltiple de Newman-Keuls con un nivel de significanción de 0,05. Las evaluaciones a largo plazo de hasta 4 semanas después de la reperfusión aseguraron que cualquier mejora en la función neurológica o reducción en el volumen de infarto se debió a un efecto neuroprotector de la proteína H-NOX y no simplemente a un retraso en la aparición de las consecuencias neurológicas debido a la lenta maduración del infarto.

Ejemplo 5. Las proteínas H-NOX demostraron penetración tumoral y oxigenación en un modelo de ratón in vivo de cáncer.

El oxígeno es un factor crítico que mejora el daño del ADN inducido por la radiación y la destrucción de tumores. Los niveles bajos de oxígeno o la hipoxia dentro de los tumores sólidos pueden mitigar los efectos terapéuticos de la terapia contra tumores. Por ejemplo, en las regiones hipóxicas del tumor, se ha encontrado que la radioterapia es tres veces menos eficaz en comparación con las regiones tumorales con niveles normales de oxígeno. Como resultado, muchos pacientes con tumores que contienen regiones de hipoxia a menudo muestran respuestas incompletas a la terapia convencional contra tumores y tienen un mal pronóstico de supervivencia. Se ha observado la correlación de la hipoxia con malos resultados en los pacientes en una amplia gama de tumores que surgen de, entre otros, cánceres de próstata, sarcoma, páncreas, cabeza y cuello, cuello uterino y cerebro. Véanse Moeller, BJ et al. (2007) Cancer Metastasis Rev 26:241-248; Vaupel, P, (2004) Semin Radiat Oncol, 14:198-206; Varlotto, J, et al. (2005) Int JRadiat Oncol Biol Phys, 63:25-36; Rockwell, S, et al. (2009) Curr Mol Med. 9:442-458; que se incorporan en el presente documento en su totalidad como referencia.

Para determinar la capacidad de las proteínas H-NOX para penetrar en los tumores, se les inyectó a grupos de ⁶ratones que portaban tumores subcutáneos derivados de colon HCT116 a través de la vena de la cola con 750 mg/kg de un monómero H-NOX, 750 mg/kg de un trímero H-NOX L144F de T. tengcongensis o control de solución salina. Los ratones se sacrificaron posteriormente a los 30 minutos o 60 minutos después de la inyección. Los tumores se resecaron, se seccionaron, se tiñeron con un anticuerpo anti-H-NOX y se obtuvieron imágenes de la intensidad de tinción de H-NOX (figura 12A). La cuantificación de las secciones de tumor HCT-116 teñidas demostró que el monómero H-NOX L144F de T. tengcongensis de 23 kDa se acumuló en los tumores a los 30 minutos y presentó un aclaramiento parcial a los 60 minutos (figura 12B). En comparación, el trímero H-NOX L144F de 80 kDa se acumuló en los tumores a los 30 minutos y continuó persistiendo en los tumores 60 minutos después de la inyección con un pico de acumulación las 4 horas después de la inyección (figura 12B). Dos horas después de la inyección intravenosa, el trímero H-NOX se difunde desde la vasculatura hacia el tejido tumoral (figura 12C). Tinción inmunohistoquímica de secciones tumorales con anticuerpo contra H-NOX y anticuerpo contra CD31 (marcador de vasculatura, BD Bioscience). No se detecta tinción fluorescente en ratones inyectados con tampón.

Para determinar si las proteínas H-NOX redujeron la hipoxia en los tumores, se les inyectó a grupos de ⁶ratones que portaban tumores subcutáneos derivados de colon HCT116 a través de la vena de la cola con 750 mg/kg de un monómero H-NOX L144F, 750 mg/kg de un trímero H-NOX L144F o control de solución salina. Antes de la eutanasia, a los ratones se les administró el marcador de hipoxia pimonidazol a través de inyección intraperitoneal y el marcador de vasculatura activo DiOC⁷³a través de inyección intravenosa. Los tumores se recogieron a los 30 minutos o 60 minutos después de la inyección de proteína H-NOX y se analizaron mediante inmunohistoquímica para pimonidazol con anticuerpo monoclonal Hydroxyprobe-1 y vasculatura total con anticuerpo anti-CD31 (figura 13A). La cuantificación de las secciones tumorales HCT-116 teñidas demostró que, al contrario que los ratones tratados con el control, el monómero H-NOX de 23 kDa disminuyó la hipoxia 30 minutos después de la inyección pero que no hubo recuperación en la hipoxia 60 minutos después de la inyección (figura 13B). En comparación, el trímero H-NOX L144F de 80 kDa no pareció reducir la hipoxia 30 minutos después de la inyección, pero redujo sustancialmente la hipoxia 60 minutos después de la inyección (figura 13B). Experimentos adicionales confirmaron que en ratones que portan tumores subcutáneos derivados de colon HCT116, el monómero H-NOX se distribuyó por todo el tejido tumoral (figura 14A, panel inferior) y alivió la hipoxia tumoral a distancias lejanas de la vasculatura tal como se detectó mediante el anticuerpo anti-pimonidazol (figura 14B, panel inferior). La tinción con Hypoxyprobe-1 (anticuerpo anti-pimonidazol) se cuantificó en tejido tumoral aislado de seis ratones por la cantidad de tinción en función de la distancia a la vasculatura. Se encontró que la tinción promedio con Hypoxyprobe-1 se redujo desde aproximadamente 13 |iM en ratones tratados con solución salina a 5 |iM en ratones tratados con monómero H-NOX a una distancia de aproximadamente 150 |im del vaso sanguíneo más cercano (figura 14C). Estos resultados se confirmaron adicionalmente en ratones que portaban xenoinjertos de sarcoma RIF-1 murino.

A los ratones que portaban tumores de sarcoma RIF-1 se les inyectó a través de la vena de la cola con 750 mg/kg de trímero H-NOX L144F de T. tengcongensis o control de solución salina. Antes de la eutanasia, a los ratones se les administró pimonidazol, un marcador de hipoxia, mediante inyección intraperitoneal. Se recogieron los tumores 120 minutos después de la inyección del trímero H-NOX L144F y se analizaron mediante obtención de imágenes de inmunofluorescencia para la distribución del trímero H-NOX (figura 15), o mediante inmunotransferencia de tipo Western para pimonidazol con anticuerpo monoclonal Hydroxyprobe-1, factor 1 inducible por hipoxia (HIF-1a) con anticuerpo anti-HIF-1a, proteína H-NOX con un anticuerpo anti-H-NOX y proteína total con anticuerpo anti-actina (figura 16). La tinción por inmunofluorescencia demostró la distribución del trímero H-NOX L144F en secciones tumorales preparadas a partir de grandes tumores aislados de aproximadamente 400 mm³y 800 mm³de tamaño (figura 15). El análisis de inmunotransferencia de tipo Western de lisados celulares de tumores recogidos de ratones tratados demostró que el trímero H-NOX L144F se localizaba en el tejido tumoral y que estos tumores tenían aductos de proteína de pimonidazol disminuidos en comparación con los ratones no tratados (figura 16A). La cuantificación de las inmunotransferencias de tipo Western confirmó además niveles bajos de aductos de proteína de pimonidazol así como niveles bajos de proteína HIF-1a en los tumores de ratones tratados en comparación con ratones tratados con solución salina (figuras 16B y 16C).

Ejemplo ⁶. Las proteínas H-NOX demostraron penetración tumoral y oxigenación en un modelo de ratón in vivo de glioblastoma.

Para caracterizar adicionalmente la capacidad de las proteínas H-NOX para penetrar en el tejido tumoral, se usaron tres modelos de ratón de glioblastoma para evaluar la distribución de monómero H-NOX L144f de T. tengcongensis y trímero H-NOX L144F de T. tengcongensis en tumores cerebrales. Las células BT-12, una línea de tumor cerebral infantil teratoide/rabdoide atípico infantil que es altamente invasivo en la columna vertebral, se utilizaron para generar un modelo de ratón de glioblastoma infantil, las células GBM-43 se usaron para generar un modelo radiorresistente de glioblastoma adulto, y se usaron células U251 para generar un modelo hipóxico de glioblastoma adulto. Los modelos de ratón de glioblastoma se generaron tal como se describió previamente. Véase Ozawa, T, et al., (2010) J Vis Exp, 13 de julio;(41) que se incorpora en su totalidad en el presente documento como referencia. En resumen, se recogieron células BT-12, células U251 o células GBM-42 para inyección intracraneal y se resuspendieron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) a una concentración de aproximadamente 1 * 10⁸células por ml. Los ratones se anestesiaron mediante inyección intraperitoneal (i.p.) de ketamina (100 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg). La profundidad de la anestesia se monitorizó antes de la primera incisión, así como a intervalos regulares durante el procedimiento, usando el reflejo de retirada pedia pellizcando la almohadilla de la pata en ambas patas. Se realizó una incisión sagital de 1 cm a lo largo del cuero cabelludo y se expusieron las líneas de sutura del cráneo. Se creó un pequeño orificio mediante punción con una aguja de 25 g, a 3 mm lateral y 0,5 mm anterior del bregma. Usando una jeringa Hamilton estéril (Stoelting), se inyectaron 3 * 10⁵células en 3 |il a una profundidad de 3 mm durante un período de 60 segundos. Después de la inyección, la jeringa se mantuvo en su lugar durante 1 minuto y luego se retiró lentamente. El cráneo se limpió con peróxido de hidrógeno al 3% y luego se selló con cera ósea antes de cerrar el cuero cabelludo usando grapas quirúrgicas de 7 mm (Stoelting). Los ratones recibieron una inyección subcutánea de 0,1 mg/kg de buprenorfina, se colocaron sobre una almohadilla térmica y se monitorizaron hasta que recuperaron la movilidad para su uso en estos estudios.

Para determinar si los trímeros H-NOX L144F podían penetrar en el tejido cerebral, se les inyectó a los ratones que portaban tumores encefálicos ortotópicos U251 a través de la vena de la cola 750 mg/kg de monómero H-NOX L144F de T. tengcongensis o 750 mg/kg de trímero H-NOX L144F de T. tengcongensis. Antes de la eutanasia, se administró a los ratones el marcador de hipoxia pimonidazol mediante inyección intraperitoneal. Para el análisis de inmunohistoquímica, los cerebros se aislaron, seccionaron y tiñeron para pimonidazol con anticuerpo monoclonal Hydroxyprobe-1, factor 1 inducible por hipoxia (HIF-1a) con anticuerpo anti-HIF-1a, proteína H-NOX con un anticuerpo anti-H-NoX y proteína HLA-ABC con un anticuerpo anti-HLA-ABC (clon de anticuerpo monoclonal de rata NvusBiological #YTH862.2) aproximadamente dos horas después de la administración de la proteína H-NOX. Un conjunto de muestras de tejido cerebral se tiñó adicionalmente con anticuerpos secundarios conjugados con anticuerpo anti-IgG de conejo conjugado con FITC (canal verde) fabricado por Jackson ImmunoResearch y DAPI para la obtención de imágenes por inmunofluorescencia. Los ratones tratados con trímero H-NOX demostraron un aumento de la tinción para H-NOX en comparación con los ratones tratados con control, lo que indica que el trímero H-NOX penetró en el tejido cerebral (figura 17A). Además, la disminución de la tinción para pimonidazol con anticuerpo monoclonal Hydroxyprobe-1 mostró que la administración de trímero H-NOX redujo sustancialmente la hipoxia 60 minutos después de la inyección (figura 17B). Se observó además una disminución de la tinción para pimonidazol y la proteína HIF-1a en imágenes de inmunofluorescencia (figuras 18A y 18C). La cuantificación de las imágenes de inmunofluorescencia demostró niveles bajos de tinción con pimonidazol así como niveles bajos de tinción con proteína HIF-1a en los tumores de ratones tratados con trímero H-NOX L144F en comparación con ratones tratados con solución salina (figuras 18B y 18D).

La figura 19 muestra la biodistribución del trímero H-NOX en un tumor encefálico ortotópico U251 y un cerebro sano. La obtención de imágenes fluorescentes del trímero H-NOX a gran aumento muestran una difusión débil fuera de los vasos en el cerebro sano.

Comparar los tiempos de penetración y retención entre el monómero H-NOX L144 F de T. tengcongensis y el trímero H-NOX L144F de T. tengcongensis, se les inyectó a ratones que portaban tumores encefálicos ortotópicos a través de la vena de la cola 750 mg/kg de monómero H-NOX marcado con Alexa-647 o con 750 mg/kg de trímero H-NOX marcado con Alexa-647 y se sometieron a obtención de imágenes por bioluminiscencia en diversos puntos de tiempo. Se generaron proteínas H-NOX marcadas con Alexa-647 para confirmar la excitación por fluorescencia y los espectros de emisión de proteínas H-NOX marcadas por fluorescencia de la siguiente manera.

La proteína purificada, el monómero de proteína H-NOX, el trímero H-NOX o BSA (Sigma, usado como control), se descongelaron en hielo y se intercambió el tampón en tampón de marcado sin endotoxinas (HEPES 50 mM, NaCl 50 mM, pH 8,0) usando casetes de diálisis sin endotoxinas (Pierce Slide-A-Lyzer, MWCO de 7 kDa). La concentración de proteína después de la diálisis en el tampón de marcado se determinó mediante espectroscopía UV-vis. Se preparó colorante Alexa 647 (ácido carboxílico Alexa Fluor® 647, éster succinimidílico, Invitrogen # A-20006) inmediatamente antes de la adición a las reacciones de marcado. El colorante se calentó hasta temperatura ambiente y luego se disolvió en DMSO a una concentración final de 10 mg/ml. La mezcla se agitó con vórtex durante 10 segundos y luego se añadió colorante a cada reacción de marcado. Las reacciones de marcado usaron una variedad de razones proteína:colorante para controlar el alcance del marcado de Alexa. Las reacciones consistieron en proteína (en tampón de marcado) y colorante para una concentración final de DMSO del 5-10%. Las reacciones se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente (protegidas de la luz) con agitación moderada. Después de la reacción, se eliminó el colorante Alexa libre mediante diálisis extensa en tampón de formulación sin endotoxinas (trietanolamina 30 mM, NaCl 50 mM, pH 7,4) usando casetes de diálisis sin endotoxinas (Pierce Slide-A-Lyzer, valor de corte de MWCO de 7 kDa).

Después de la diálisis en el tampón de formulación, se determinó la concentración de proteína y el alcance del marcado mediante espectroscopía UV-vis usando la absorbancia intrínseca de H-NOX (a 280 y 415 nm) y colorante Alexa (653 nm) para determinar la razón molar de colorante con respecto a proteína después del marcado. La fluorescencia de la proteína marcada se analizó mediante excitación a 647 nm para recoger un espectro de emisión. El espectro de emisión de la proteína marcada fue consistente con los datos publicados y los datos de Invitrogen. La proteína marcada se analizó adicionalmente mediante cromatografía de exclusión molecular para asegurar que el marcado no afectara al estado de oligomerización de la proteína. La contaminación final por endotoxina en la proteína marcada se determinó usando el ensayo Charles River LAL Gel Clot (sensibilidad de 0,03 UE/ml).

Para obtener imágenes por bioluminiscencia, los ratones se anestesiaron mediante inyección i.p. de ketamina (100 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg), y luego se les inyectó por i.p. 33,3 mg de D-luciferina (sal de potasio, Gold Biotechnology, St. Louis, MO, EE.UU.) disuelto en solución salina estéril. La bioluminiscencia del tumor se determinó 10 minutos después de la inyección de luciferina, usando el sistema IVIS Lumina (Caliper Life Sciences, Alameda, CA, EE. UU.) y el software LivingImage, como la suma de los recuentos de fotones por segundo en las regiones de interés definidas por un valor umbral inferior del 25% de intensidad máxima de píxeles. La adquisición de imágenes no fue invasiva y la temperatura corporal del animal se mantuvo usando una plataforma de obtención de imágenes calentada. Para los ratones BT-12 tratados con monómero H-NOX o trímero H-NOX, la obtención de imágenes se realizó a las 0, 0,5, 1, 2 y 4 horas después de la inyección. Para los ratones GBM-41 tratados con monómeros H-NOX o trímeros H-NOX, la obtención de imágenes se realizó a las 0, 0,5, 1, 2, 4 y ⁶horas después de la inyección. Para los ratones U251 tratados con monómeros H-NOX o trímeros H-NOX, la obtención de imágenes se realizó a las 0, 0,5, 1, 2, 4, ⁶y 72 horas después de la inyección. Se ha demostrado previamente que la bioluminiscencia del tumor es directamente proporcional al volumen del tumor en ratones que portan xenoinjertos de GB ortotópicos. Véase Moeller, BJ et al., (2007) Cancer Metastasis Rev, 26:241-248, que se incorpora en el presente documento en su totalidad como referencia. La comparación de la biodistribución del trímero y monómero H-NOX demostró que en el modelo de glioblastoma de ratón BT-12, tanto el monómero H-NOX L144F (figura 20A) como los trímeros H-NOX L144F (figura 20B) penetraron en los tumores cerebrales. El trímero H-NOX tuvo un tiempo de retención significativamente más largo en los tumores en comparación con los monómeros H-NOX. Mientras que el monómero H-NOX se eliminó en gran medida de los tumores a las 2 horas (figura 20A), el trímero H-NOX continuó acumulándose en los tumores durante varias horas (figura 20B). La localización intracraneal de H-NOX fue confirmada por obtención de imágenes ex vivo de tejido cerebral aislado de ratones 30 y 60 minutos después de la inyección con el monómero H-NOX (figuras 21A y 18B) y 60 minutos después de la inyección con el trímero H-NOX (figura 21C). La visualización adicional por bioluminiscencia a los 30, 60, 120 y 240 minutos después de la inyección demostró que el monómero H-NOX (figura 22) y el trímero H-NOX (figura 23) también se localizaron en colonias metastásicas en la columna vertebral. Mientras que el monómero H-NOX se acumuló sustancialmente en la columna vertebral a los 30 minutos (figura 22A) en comparación con el trímero H-NOX (figura 23A), se eliminó en gran medida a las 2 horas (figuras 22B-D) mientras que el trímero H-NOX continuó acumulándose en la columna vertebral durante varias horas (figuras 23B-D). Al usar una cantidad menor de proteína marcada y aumentar la intensidad de la señal, se reveló que el monómero H-NOX se acumulaba en los riñones con el tiempo, lo que sugiere una vía de eliminación (figura 24).

La acumulación de trímeros H-NOX L144F en el cerebro y la columna vertebral se confirmó en los modelos de ratón GBM-43 (figura 25) y U251 (figura 26). La localización de los trímeros H-NOX L144F se investigó adicionalmente en ratones U251 a los que se les inyectó una dosis más alta de trímero H-NOX de 295 mg/kg y una dosis más baja de 30 mg/kg. Las obtención imágenes por bioluminiscencia a las 0, 0,5, 1,2, 4 y ⁶horas después de la inyección demostraron que el trímero H-NOX L144F se acumuló en los tumores encefálicos de los ratones en las concentraciones altas y bajas de la administración del trímero H-NOX (figuras 27 y 28, respectivamente). En comparación, la localización de un trímero H-NOX ensamblado a partir de una variante L144F del monómero H-NOX no se acumuló en tumores encefálicos pequeños tal como lo demuestran las imágenes de bioluminiscencia a las 0, 0,5, 1,2, 4 y ⁶horas después de la inyección con 30 mg/kg (figura 29). La obtención de imágenes por bioluminiscencia ex vivo del cerebro aislado de ratones tratados con 30 mg/kg de trímero H-NOX L144F (figura 30A) o 750 mg/kg de trímero L144F (figura 30B) mostraron que la cantidad de proteína H-NOX en una sola dosis tuvo poco efecto sobre la localización de H-NOX en tumores intracraneales. Además, la obtención de imágenes por bioluminiscencia en tiempo real de ratones que portaban tumores grandes (figura 30C) o pequeños (figura 30D) mostraron que después de la administración de 295 mg/kg de trímero H-NOX L144F, el trímero se distribuyó a los tumores intracraneales independientemente del tamaño del tumor (figura 30B). La obtención de imágenes por bioluminiscencia en tiempo real y ex vivo de tres modelos de glioblastoma de ratón, GBM, U251 y BT-12, demostraron que el trímero H-NOX L144F se distribuyó a tumores intracraneales y tumores espinales en los tres modelos (figuras 31 y 32). La obtención de imágenes por inmunofluorescencia de una sección tumoral teñida con anticuerpos contra la proteína H-NOX y la vasculatura mostraron que el trímero H-NOX L144F salió de la vasculatura y se difundió por todo el tumor encefálico (figura 33). En general, estos datos identificaron proteínas H-NOX con perfiles de biodistribución tumoral clínicamente relevantes.

Para verificar el reparto de los trímeros H-NOX entre el plasma y el cerebro, se sometió a prueba el trímero L144F usando un grupo de tres ratones hembra FVB (figura 34). Los trímeros H-NOX candidatos se inyectaron en el tiempo 0 a una dosis de 200 y 750 mg/kg mediante inyección de bolo intravenoso en la vena de la cola. A los 30 minutos, 1 hora, 1,5 horas y 2 horas después de la inyección del trímero H-NOX candidato o control de tampón, se sacrificaron los ratones. Se extrajo aproximadamente un ml de sangre mediante punción intracardíaca y se extrajo el cerebro. La sangre extraída se procesó para obtener plasma y se lisaron muestras de cerebro para extraer proteínas. Posteriormente se analizaron el plasma y el cerebro para determinar la presencia de trímero H-NOX usando un ensayo ELISA con un anticuerpo policlonal contra la proteína H-NOX.

Ejemplo 7. Los trímeros H-NOX potenciaron los efectos de la radiación sobre modelos de ratón in vivo de glioblastoma.

Para determinar si la oxigenación de los tumores hipóxicos debido a la penetración de H-NOX podría mejorar la destrucción del tumor inducida por la radiación, se realizaron estudios en grupos de 10 ratones U251 atímicos que portaban tumores de glioblastoma intracraneal para evaluar los efectos de la radioterapia (RT) en presencia de trímero de H- NOX. Los ratones se trataron con tres fracciones de radioterapia a 2 Gy por fracción los días 15, 17 y 20 después de la implantación del tumor, con o sin la administración de 750 mg/kg con trímero H-NOX L144F de T. tengcongensis marcado con Alexa-647 administrado mediante inyección intravenosa. Los ratones se monitorizaron hasta el día 29 y se sometieron a obtención de imágenes por bioluminiscencia los días 15, 17, 20, 22, 24 y 29. Las puntuaciones medias de obtención de imágenes por bioluminiscencia (BLI) determinadas para cada grupo de tratamiento demostraron que las dosis múltiples de trímero H-NOX L144F dieron como resultado retrasos estadísticamente significativos en el crecimiento tumoral (figuras 35A y 35B) y a pesar de la naturaleza agresiva y levemente hipóxica de los tumores ortotópicos U251 tratados, la supervivencia de los animales también mejoró significativamente en los grupos tratados con H-NOX L144F (figura 35C). También se recogieron tumores para tinción y análisis inmunohistoquímicos.

El efecto del trímero H-NOX L144F de T. tengcongensis sobre la radioterapia del glioblastoma humano se investigó adicionalmente en dos modelos de ratón que portaban tumores de glioblastoma intracraneal, U251 y GBM43. En un estudio, grupos de 10 ratones U251 atímicos hembras que portaban tumores de glioblastoma intracraneal se trataron con ¹) tampón de tratamiento solo, ²) tampón de tratamiento en combinación con una dosis única de radiación de ²Gy (configuración del irradiador = 0,81; la tasa de dosis del irradiador de cesio fue de 247 CGy/min), 3) 750 mg/kg de trímero H-NOX L144F por vía i.v. sola, o 4) trímero H-NOX L144F en combinación con una dosis única de radiación de 2 Gy (configuración del irradiador = 0,81; la tasa de dosis del irradiador de cesio fue de 247 CGy/min). Los ratones que recibieron el tratamiento de combinación se irradiaron 2 horas después de la administración del trímero H-NOX L144F en la porción supratentorial del cerebro. El tratamiento para todos los ratones comenzó 14 días después de la inyección intracraneal de ratones con 3,0 * 10⁵células U251. Se encontró que la supervivencia de los animales aumentó en las cohortes que recibieron el tratamiento de combinación de trímero H-NOX L144F y radiación de 2 Gy (figura 36A). En otro estudio, grupos de 10 ratones GBM43 que portaban tumores de glioblastoma intracraneal se trataron con ¹) radioterapia de ²Gy; ²) radioterapia de 4 Gy; 3) radioterapia de ⁸Gy; 4) ²ciclos de radioterapia de 4 Gy; 5) radioterapia de 4 Gy en combinación con trímero H-NOX L144F; o ⁶) tampón de tratamiento. Los ratones que recibieron el tratamiento de combinación se irradiaron de 1 a 1,5 horas después de la administración del trímero H-NOX y los ratones que recibieron múltiples dosis de RT tuvieron la administración de RT separada por 4 días. El tratamiento con radiación se administró en la porción supratentorial del cerebro para todos los grupos de RT. El tratamiento para todos los ratones comenzó 7 días después de la implantación del tumor. Se encontró que la supervivencia de los animales en las cohortes que recibieron el tratamiento de combinación de trímero H-NOX L144F y radiación de 4 Gy fue similar a la supervivencia de los animales en las cohortes que recibieron el tratamiento de 4 Gy solo (figura 36B).

Ejemplo ⁸. Prueba de toxicología de proteínas H-NOX.

Para evaluar el perfil de seguridad de los monómeros H-NOX en previsión de estudios de toxicología que permitan IND, se llevó a cabo un estudio preliminar de toxicología similar a las BPL en ratas Sprague-Dawley en una Organización de investigación por contrato independiente acreditada por la FDA (MPI Research Laboratories). No se detectaron acontecimientos adversos ni diferencias con el control con las dosis de 100 y 300 mg/kg de monómero H-NOX L144F de T. tengcongensis 48 horas después de la inyección (i.v.). A la dosis máxima factible de 1000 mg/kg, se observaron algunos signos leves de toxicidad (tabla 4). Los recuentos elevados de glóbulos blancos a las 48 horas probablemente se debieron a trazas de endotoxina presentes en la formulación de la proteína y estos niveles se redujeron 100 veces en series de producción para estudios adicionales. En un estudio separado, se les ineyctó a ratas 50 mg/kg de monómero H-NOX L144F o trímero H-NOX L144F y se siguió hasta el día 32. Se generaron anticuerpos antiterapéuticos tanto IgM como IgG, sin embargo, no hubo casos de choque anafiláctico, independientemente de la variante de H-NOX o del número de dosis (hasta 4 dosis sometidas a prueba).

Tabla 4. El monómero H-NOX fue bien tolerado en ratas.

Ejemplo 9. Caracterización de las pautas posológicas mínimas de trímero H-NOX en modelos animales in vivo de glioblastoma.

Para informar mejor sobre el diseño de los estudios de toxicidad y los estudios clínicos que permiten IND, los niveles de dosis y las pautas posológicas de un trímero H-NOX principal se caracterizan usando un modelo de ratón con glioblastoma U251. Los resultados de estos estudios se validan en modelos animales adicionales de glioblastoma para informar mejor sobre la selección de pacientes.

Identificar la dosis mínima eficaz de trímero H-NOX principal que mejora la RT

Para minimizar los acontecimientos adversos en pacientes que reciben el trímero H-NOX principal y para cuantificar la farmacodinámica (PD) del trímero H-NOX principal en tumores oxigenantes y radiosensibilizantes, la dosis mínima eficaz (MED) del trímero H-NOX se identifica en el modelo de ratón con glioblastoma U251. Los estudios preliminares demostraron que a una dosis de 750 mg/kg de trímero H-NOX resultó en una reducción sustancial de la hipoxia tumoral dos horas después de la administración (figuras 17A y 17B) y que este efecto fue suficiente para mejorar significativamente las respuestas tumorales a la RT (figura 35). Otros estudios de tumores de xenoinjerto demostraron que el trímero H-NOX se acumulaba en los tumores en dosis tan bajas como 10 mg/kg, lo que establece un amplio intervalo potencial para una dosis eficaz. Para identificar una MED de trímero H-NOX, se usan dosificaciones que oscilan desde 7,5 mg/kg hasta 750 mg/kg para potenciar las respuestas tumorales a la RT.

Para identificar la MED del trímero H-NOX, se comparan los efectos radiosensibilizantes de las dosis de 75 mg/kg y 7,5 mg/kg frente a la dosis eficaz previamente establecida de 750 mg/kg (tabla 5). La eficacia se somete a prueba contra un modelo de ratón ortotópico de GB, usando la línea celular de GB humana U251 modificada con luciferasa. Se usa una cohorte de 10 ratones para seguir el crecimiento tumoral mediante obtención de imágenes por bioluminiscencia y para seguir la supervivencia. Se usan tres cohortes adicionales de 3 ratones cada una para examinar los mecanismos moleculares detrás de la acción del trímero H-NOX, incluyendo la localización del trímero H-NOX por inmunohistoquímica y ELISA cuantitativo, oxigenación tumoral por inmunohistoquímica usando EF5 como marcador de hipoxia y evaluación del daño del ADN por inmunohistoquímica usando tinción con yH2AX (tabla 5).

Para estos estudios, las células U251 se resuspenden en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) a una concentración de aproximadamente 1 * 10⁸células por ml. Se anestesian ratones atímicos mediante inyección intraperitoneal (i.p.) de ketamina (100 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg). Se realiza una incisión sagital de 1 cm a lo largo del cuero cabelludo y se crea un pequeño orificio mediante punción con una aguja de 25 g, a 3 mm lateral y 0,5 mm anterior del bregma. Usando una jeringa Hamilton estéril (Stoelting), se inyectan 3 * 10⁵células en un volumen de 3 |il a una profundidad de 3 mm durante un período de 60 segundos. Después de la inyección, se retira la jeringa y se sella el cráneo con cera ósea antes de cerrar el cuero cabelludo con grapas quirúrgicas de 7 mm (Stoelting). Véase Ozawa, T et al., (2010) J Vis Exp, 13de julio;(41). Los ratones reciben una inyección subcutánea de 0,1 mg/kg de buprenorfina y se monitorizan hasta que recuperan la movilidad. Entre 21 y 25 días después de la implantación del tumor, se administra trímero H-NOX a la dosificación indicada para cada cohorte mediante inyección en la vena de la cola dos horas antes de la RT, que se administra a 2 Gy/dosis a todo el cerebro de manera supratentorial (tabla ⁶). Para la administración de RT de cerebro completo, se usa una fuente de Cs¹³⁷que libera una tasa de dosis de aproximadamente 280 cGy/min y los ratones se irradian durante un período de tiempo que da como resultado 2 Gy.

Tabla 5. Cohortes para estudios de reducción escalonada de la dosis de trímero H-NOX

Todas las pautas de RT consisten en 3 dosis semanales de 2 Gy/dosis

El crecimiento tumoral no invasivo se controla mediante obtención de imágenes por bioluminiscencia a lo largo del curso del estudio. Para obtener imágenes por bioluminiscencia, los ratones se anestesian mediante inyección i.p. de ketamina (100 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg), y luego se les inyecta por vía i.p. 33,3 mg de D-luciferina (sal de potasio, Gold Biotechnology, St. Louis, MO, EE.UU.) disuelta en solución salina estéril. La bioluminiscencia del tumor se determina 10 minutos después de la inyección de luciferina, usando el sistema IVIS Lumina (Caliper Life Sciences, Alameda, CA, EE.UU.) y el software LivingImage, como la suma de los recuentos de fotones por segundo en las regiones de interés definidas por un valor de umbral inferior del 25% de intensidad máxima de píxeles. Para el análisis de supervivencia, los ratones se sacrifican cuando el peso corporal disminuye en más del 15% o cuando se observan déficits neurológicos (Neficacia, tabla 5).

Para investigar la oxigenación del tumor, o la reducción de la hipoxia, y la localización del trímero H-NOX en el tumor, a tres ratones de cada grupo de dosificación se les inyecta e F5 10 mM, un biomarcador clínico de hipoxia, por vía intravenosa y se sacrifican inmediatamente después de la RT para el análisis IHC en secciones de cerebro completo (Nhipoxia e ihc de trímero h-nox, tabla 5). Una cohorte adicional de tres ratones se sacrifica inmediatamente después de la RT y los tumores se resecan para el análisis del contenido de trímero H-NOX mediante ELISA cuantitativo (Nelisa de trímero h-nox, tabla 5). Dos horas después de la finalización de la RT, se sacrifica una cohorte adicional de tres ratones para el análisis del daño del ADN por IHC de yH2AX en secciones de cerebro completo (Nihc de daño en el adn, tabla 5). Para el análisis de eficacia de RT y el análisis molecular de hipoxia, localización de tumores y daño en el ADN, el análisis estadístico se realiza mediante ANOVA con pruebas de la t emparejadas posteriores y un cambio en P < 0,05 se considera estadísticamente significativo. Para el análisis de supervivencia, se usa la prueba de rangos logarítmicos con un alfa de dos colas igual a 0,05 para una potencia del ^{8 8}% para detectar un tamaño del efecto de 1,5. El tamaño del efecto se define como la diferencia en la supervivencia media dividida entre la desviación estándar dentro del tratamiento.

Correlacionar el tiempo de residencia del trímero H-NOX principal y la oxigenación en tumores con radiosensibilización

Para informar mejor sobre el perfil clínico objetivo de los trímeros H-NOX, se investiga la longevidad de los efectos oxigenantes del trímero H-NOX en los tumores que dan como resultado radiosensibilización. La RT se administra en un intervalo de puntos de tiempo basado en el intervalo de tiempo máximo de localización del tumor intracraneal del trímero H-NOX (figura 26), y usando la MED del trímero H-NOX, el período de tiempo entre la administración del trímero H-NOX y la RT es variada (tabla ⁶). De manera similar a los estudios para determinar la MED del trímero H-NOX, se evalúan varios parámetros farmacodinámicos tales como la distribución del trímero H-NOX en el tejido tumoral, la reducción de la hipoxia, el daño del ADN, el retraso del crecimiento tumoral y la supervivencia general mejorada.

Tabla ⁶. Cohortes para la duración de los estudios de radiosensibilización

Todas las pautas de RT consisten en 3 dosis semanales de 2 Gy/dosisReproducibilidad de radiosensibilización mediada por trímeros H-NOX en clases adicionales de GB

Se estudian tres subclases de GB clínicas definidas molecularmente para la radiosensibilización mediada por el trímero H-NOX. Los modelos de xenoinjerto derivados de líneas celulares (GBM43, GBM⁶y GBM14) de estas tres subclases se establecen tal como se describió anteriormente. Véanse Verhaak et al., (2010) Cancer Cell, 17:98-110 y Phillips et al., (2006) Cancer Cell, 9:157-173. En resumen, para la producción de estos tres modelos de ratón, los tumores subcutáneos de estos tres tipos de cáncer se trituran con un bisturí y se someten a tres rondas de paso a través de un filtro de poros de 40 |im, con centrifugación después de cada ronda de filtrado con una velocidad creciente de 158 x g, 355 x g, 631 * g a 10 minutos cada una. Después de la ronda final de centrifugación, las células se resuspenden en 1 ml de medio DMEM estéril, se cuentan y se diluyen hasta 1 * 10⁸células/ml para inyección intracraneal. Además, la radiosensibilización mediada por el trímero H-NOx se estudia en un modelo inmunocompetente de GB (GL261), que replica el sistema inmunitario intacto en pacientes con GB. Para la producción del modelo de ratón GL261, la recogida e inyección de células tumorales se realiza de manera similar al modelo U251 usando una línea celular de ratón GB que es singénica con ratones C57BL/6. Véase Newcomb et al., (2006) Cell Cycle, (5):93-99. Para las pruebas de eficacia se usan cuatro grupos experimentales para cada modelo de tumor (tabla 7). Al igual que con el modelo U251, el inicio del tratamiento se produce cuando el modelo tumoral está completo en un 75%, con un día promedio de supervivencia que refleja un 100% de finalización. De manera similar a los estudios para determinar la MED del trímero H-NOX, se evalúan parámetros farmacodinámicos tales como la distribución del trímero H-NOX en el tejido tumoral, la reducción de la hipoxia, el daño del ADN, el retraso del crecimiento tumoral y la supervivencia general mejorada.

Tabla 7. Cohortes para estudios en modelos de GB adicionales

Todas las pautas de RT consisten en 3 dosis semanales de 2 Gy/dosisEjemplo 10. Caracterización farmacodinámica de la toxicidad de dosis única del trímero H-NOX en modelos animales in vivo de glioblastoma.

Para justificar la selección de especies para los estudios de toxicidad de GLP que permiten IND y para informar sobre los ensayos clínicos de fase 1b, se realizan estudios exploratorios de toxicidad sin BPL y de Pd de GB en ratas (roedores) y perros (no roedores). Como el trímero H-NOx no se une ni reacciona con una diana específica para humanos, la FDA acepta especies que no sean primates.

Estudio de toxicidad de búsqueda de dosis única sin BPL en ratas

Para identificar la dosis máxima tolerada (MTD) y caracterizar la toxicidad y el perfil toxicocinético (TK) del trímero H-NOX, se realiza un estudio de dosis única sin BPL en ratas Sprague-Dawley (SD).

Se asignan ratas SD macho y hembra de al menos ⁶a ⁸semanas de edad a 5 grupos de estudio (tabla ⁸). Cada animal recibe vehículo o trímero H-NOX mediante administración lenta en bolo i.v. (4-5 minutos) en la vena de la cola a volúmenes de hasta 10 ml/kg. Los animales se dosifican un grupo a la vez con 3 días entre cada dosis. Los niveles de dosis del trímero H-NOX oscilan desde la MED aproximada hasta la dosis máxima factible. Se toman muestras de plasma a intervalos regulares después de la dosificación para evaluar la farmacocinética (PK) en plasma del trímero H-NOX. Los puntos de tiempo para los análisis toxicocinéticos se basan en los resultados de PK. Las dosis se administran de manera volumétrica, basándose en el peso corporal más reciente del animal. Las observaciones clínicas, el peso corporal, el consumo de alimentos y la patología clínica se revisan antes de seleccionar la siguiente dosis (tabla 9). Un período de recuperación de hasta 14 días permite evaluar la persistencia, la aparición retardada y la recuperación de cualquier acontecimiento de toxicidad.

Tabla ⁸. Cohortes para toxicidad de dosis única en ratas

Tabla 9. Mediciones y observaciones para estudio de toxicidad de dosis única en ratas

Evaluar la distribución tumoral del trímero H-NOX y la PD en un modelo de rata de GB

Para verificar que la distribución tumoral de H-NOX y la reducción de la hipoxia es similar en ratas y ratones, se evalúa la distribución del tumor y la PD del trímero H-NOX en el modelo de glioma 9L de rata. Para producir el modelo de glioma 9L de rata, se implantan células de glioma 9L intracranealmente en ratas Wistar tal como se describió previamente. Véase Stojiljkovic et al., (2003) J. Neurooncol, (63):1-7. En resumen, las células 9L, una línea celular de glioma de rata, se recogen para inyección intracraneal mediante tripsinización en monocapa y se resuspenden en DMEM a una concentración de 4 * 10⁴células en 5 |il. La anestesia se induce mediante inyección i.p. de ketamina 10 mM y 7,5 mg/kg de xilacina. Se realiza una incisión sagital de 2 cm a lo largo del cuero cabelludo y se crea un orificio de trepanación usando un pequeño torno a 3 mm lateral y 0,5 mm anterior del bregma. Mediante el uso de una jeringa Hamilton estéril (Stoelting), se inyectan 5 * 10⁵células en 10 |il a una profundidad de 4,5 mm a lo largo de un período de 60 segundos. Después de la inyección, se retira la jeringa y se sella el cráneo con cera ósea antes de cerrar el cuero cabelludo usando grapas quirúrgicas de 7 mm (Stoelting). El trímero H-NOX se administra a las ratas mediante inyección en la vena de la cola usando una aguja de 27 g en un volumen de dosificación que no excede los 10 ml/kg. Una hora después de la administración del trímero H-NOX, las ratas reciben una dosis 10 mM del marcador de hipoxia EF5 por vía intravenosa. Dos horas después de la administración de H-NOX, las ratas se sacrifican y los cerebros con tumores se recogen para la localización del trímero H-NOX y la cuantificación de la hipoxia mediante análisis inmunohistoquímico o para la cuantificación del trímero H-NOX mediante ELISA (tabla 10).

Tabla 10. Cohortes para estudios de oxigenación y biodistribución de trímero H-NOX en ratas.

Estudio de toxicidad de búsqueda de dosis única sin BLP en caninos

La toxicidad y toxicocinética del trímero H-NOX se investiga en perros Beagle. En resumen, los perros Beagle machos y hembras de al menos 5 meses de edad se asignan a 4 grupos de dosificación (tabla 11). Los niveles de dosis del trímero H-NOX oscilan desde la MED aproximada, como el equivalente calculado en esta especie, hasta la dosis máxima factible. Cada animal recibe trímero H-NOX mediante un bolo i.v. lento a través de la vena cefálica. Se toman muestras de plasma a intervalos regulares después de la dosificación para evaluar la farmacocinética (PK) en plasma del trímero H-NOX. Los puntos de tiempo para los análisis toxicocinéticos se basan en los resultados de PK. Las dosis se administran de manera volumétrica, basándose en el peso corporal más reciente del animal. Las observaciones clínicas, pesos corporales, consumo de alimentos y patología clínica se revisan antes de seleccionar la siguiente dosis (tabla 12). Un período de recuperación de hasta 14 días permite evaluar la persistencia, la aparición retardada y la recuperación de cualquier acontecimiento de toxicidad. Los análisis estadísticos se realizan usando Graph Pad Prism (Versión 4.03). Las comparaciones se realizan entre el vehículo y los grupos de estudio del trímero H-NOX en cada punto de tiempo de análisis de datos correspondiente usando o bien procedimientos estadísticos paramétricos (por ejemplo, análisis de varianza de medidas repetidas seguido de la prueba de la t de comparación múltiple de Dunnett) o no paramétricos (por ejemplo, prueba de Friedman y prueba de comparaciones múltiples a posteriori de Dunn). La elección de estadísticas paramétricas o no paramétricas se basa en si los grupos comparados satisfacen la homogeneidad del criterio de varianza. Las diferencias entre el vehículo y el tratamiento con trímero H-NOX se indican como p <0,05.

Tabla 11. Cohortes para estudio de toxicidad de dosis única en caninos

Tabla 12. Mediciones y observaciones para estudio de toxicidad de dosis única en caninos

Evaluar la distribución tumoral del trímero H-NOX y la PD en un modelo canino de GB

Para confirmar que la distribución del tumor y la oxigenación observadas en modelos de GB de roedores es representativa de tumores similares a los tumores humanos, se lleva a cabo un ensayo de tipo fase ¹b en caninos con GB para medir la acumulación de trímero H-NOX en tumores encefálicos espontáneos y para cuantificar los cambios en hipoxia usando una sonda de PET en tiempo real clínicamente relevante para la hipoxia (y puede usarse una sonda de PET; por ejemplo, ¹⁸F-EF5 de ¹⁸F-MISO). Se inscribieron en el estudio diez perros propiedad del cliente (a los que se hace referencia en el presente documento como “pacientes caninos”) con GB espontáneo. En general, los pacientes caninos reciben una dosis única de trímero H-NOX acompañada de exploraciones por PET con ¹⁸F-EF5 previas y posteriores para evaluar cualquier cambio en la hipoxia tumoral resultante del tratamiento con trímero H-NOX. Los perros que no tienen tumores hipóxicos (definidos como una razón tumor:cerebro normal ²,⁰) se eliminan del estudio antes de la administración del trímero H-NOX. Los pacientes caninos con tumores suficientemente hipóxicos se programan para el tratamiento con trímero H-NOX no menos de 72 horas después de la exploración por PET inicial. El trímero H-NOX se administra como una inyección i.v. en bolo en un volumen de dosificación que no excede los 10 ml/kg. Los niveles de dosificación del trímero H-NOX comienzan en MED y aumentan escalonadamente según un diseño de aumento escalonado de dosis de 3 3. El aumento escalonado de la dosis se detiene después de 3 niveles de dosis o cuando se alcanza la toxicidad limitativa de la dosis en 1 o más perros. Dos horas después de la administración del trímero H-NOX, los pacientes caninos se someten a una segunda exploración por PET y se puntúa la hipoxia tumoral. Para las exploraciones por PET, la comida se retiene durante 12 horas antes de la anestesia. Se coloca un catéter intravenoso en cada paciente canino y se induce la anestesia con 10-25 mg/kg de tiopental o ⁶mg/kg de propofol y se mantiene con isoflurano al 1-5% en oxígeno. Se administra ¹⁸F-EF5 poco después de inducir la anestesia y la exploración por PET/TAC se inicia una hora después de la administración de ¹⁸F-EF5. Para los pacientes caninos que se someten a cirugía como parte del tratamiento habitual, una parte del tumor resecado se reserva para el análisis del contenido de trímero H-NOx . Para evaluar la localización del tumor con el trímero H-NOX, los tumores resecados se evalúan mediante IHC o ELISA cuantitativo usando anticuerpos contra la proteína H-NOX y pimonidazol. Se obtienen pequeñas cantidades de sangre completa antes de la dosis y a las 24 horas, 48 horas y 14 días después de la administración del trímero H-NOX para el análisis de parámetros de seguridad tal como la dosis máxima tolerada y para analizar la presencia de anticuerpos antiterapéuticos. Los datos de seguridad se toman antes de la dosificación y 14 días después de la dosificación. En este estudio se usan biomarcadores de hipoxia adicionales, tal como el cobre (II) (diacetil-bis (N4-metiltiosemicarbazona)) (⁶⁴Cu-ATSM).

Radiosensibilización mediada por trímero H-NOX en caninos

Utilizando la información de los estudios de toxicidad de dosis única en caninos, la radiosensibilización mediada por el trímero H-NOX se estudia adicionalmente en estos animales. Los perros Beagle machos y hembras de al menos 5 meses de edad se asignan a grupos de dosificación que consisten en tratamiento con trímero H-NOX o con vehículo con o sin radioterapia de dosis alta en una única fracción de ⁸Gy. Los tumores se resecan en estos pacientes caninos para analizar el contenido de trímero H-NOX. Para la localización de tumores con trímero H-NOX, los tumores resecados se evalúan mediante IHC o ELISA cuantitativa usando anticuerpos contra la proteína H-NOX y pimonidazol. En este estudio se utilizan biomarcadores de hipoxia adicionales, tal como ⁶⁴Cu-ATSM.

Ejemplo 11. Producción BPF de trímeros H-NOX.

Se investiga el desarrollo del trímero H-NOX, incluyendo la producción BPFa, las pruebas de seguridad de BPL y la preparación reglamentaria necesaria para obtener la aprobación de la FDA para el inicio de ensayos clínicos.

Fabricación BPF de trímero H-NOX candidato

Se producen grandes cantidades (por ejemplo, cantidades en kilogramos) de proteína de BPF para respaldar las pruebas de toxicología, los estudios de PD en ratas y caninos y los ensayos clínicos. Las líneas celulares, los plásmidos y las condiciones de crecimiento del cultivo necesarias para hacer crecer las células y crear los bancos de células de BPF se proporcionan en el presente documento. También se proporcionan en el presente documento métodos para la producción de trímero H-NOX a partir de fermentación de 4 l con DO que alcanzan hasta 115. Los métodos para la purificación de proteínas del trímero H-NOX que pueden generar hasta 1 g de proteína del trímero H-NOX purificada a partir de 12 l de cultivo celular se proporcionan adicionalmente en el presente documento. También se proporcionan en el presente documento ensayos de control de calidad para el trímero H-NOX, incluyendo, pero sin limitarse a, SDS-PAGE, análisis espectral UV/Vis, CL-EM, SEC analítico, SEC-HPLC, pruebas de endotoxinas, pruebas de filtración para materiales particulados, pruebas de contaminación viral y tasas de liberación de oxígeno para determinar su eficacia. También se proporcionan en el presente documento sistemas para la producción de trímero H-NOX que incluyen, pero no se limitan a, sistemas de microrreactores, equipos de escala de procesos, bombas y filtros. El trímero H-NOX se somete a pruebas y validación de QC/QA antes de su lanzamiento para estudios preclínicos y clínicos.

Prueba de toxicidad de BPF de trímero H-NOX en ratas y perros

Los estudios de toxicidad de BPF se realizan según las directrices de ICH S⁶(R1) y S9. Según las directrices de la ICH, las pruebas de toxicología se realizan en una especie de roedor (rata Sprague-Dawley) y no roedor (perro Beagle). Para el estudio de dosis repetidas de siete días en ratas, se asignan ratas macho y hembra Sprague-Dawley a cuatro grupos de tratamiento (tabla 14). Los niveles de dosis del trímero H-NOX oscilan desde la m Ed aproximada hasta la dosis máxima factible o la dosis máxima tolerada. Cada animal recibe vehículo o trímero H-NOX mediante la administración lenta de un bolo i.v. en la vena de la cola a volúmenes de hasta 10 ml/kg. Las dosis se administran de manera volumétrica basándose en el peso corporal más reciente del animal. A los animales se les administra una dosis una vez al día durante 7 días consecutivos. Los animales designados para la necropsia terminal (hasta las primeras 10 ratas/sexo/grupo) se someten a la necropsia el día ⁸. Los animales designados para la necropsia de recuperación (hasta las últimas 5 ratas/sexo/grupo) se someten a 7 días de dosificación seguidos de 7 días de recuperación y se realiza la necropsia el día 15 para evaluar la toxicidad y la toxicocinética del trímero H-NOX. Se monitorizan los parámetros de toxicidad convencionales, incluyendo la evaluación de órganos vitales (aparatos respiratorio, cardiovascular y sistema nervioso central) (tabla 15).

Tabla 14. Cohortes para el estudio de toxicidad de BPF en ratas

Tabla 15. Mediciones y observaciones para el estudio de toxicidad de BPF en ratas

Para el estudio de dosis repetidas de 7 días en perros, los perros beagle machos y hembras de raza pura de al menos 5 meses de edad se asignan a 4 grupos (tabla 16). Los niveles de dosis del trímero H-NOX oscilan desde la MED aproximada hasta la dosis máxima factible o la dosis máxima tolerada. Cada animal recibe vehículo o trímero H-NOX mediante la administración lenta de un bolo i.v. en la vena cefálica en volúmenes de hasta 10 ml/kg. Los animales reciben vehículo o trímero H-NOX una vez al día durante 7 días consecutivos. Los animales designados para la necropsia terminal (hasta los 3 primeros caninos/sexo/grupo) se someten a la necropsia el día ⁸. Los animales designados para la necropsia de recuperación (hasta los 2 últimos caninos/sexo/grupo) se someten a 7 días de dosificación seguidos de 7 días de recuperación y se realiza la necropsia el día 15 para evaluar la toxicidad y la toxicocinética del trímero H-NOX. Se monitorizan los parámetros de toxicidad convencionales, incluyendo la evaluación de órganos vitales (aparatos respiratorio, cardiovascular y sistema nervioso central) (tabla 17). La seguridad cardíaca se evalúa como parte de este estudio mediante la monitorización de electrocardiogramas (ECG) durante la fase de dosificación.

Tabla 16. Cohortes para el estudio de toxicidad de BPF en caninos

Tabla 17. Mediciones y observaciones para el estudio de toxicidad de BPF en caninos

Además, dado que el trímero H-NOX es una proteína terapéutica nueva, se realiza un estudio de seguridad cardíaca independiente en caninos para monitorizar los efectos sobre la función cardíaca y la vasoactividad. Se dosificaron cuatro perros Beagle machos sometidos previamente a tratamiento (de 9 a 18 kg), previamente implantados con dispositivos de radiotelemetría (DSI: TL11M2-D70-PCT) mediante inyección i.v. en bolo. A los caninos se les administra vehículo y 3 niveles de dosis de trímero H-NOX usando una pauta posológica ascendente o de cuadrado latino (tabla 18). Cada animal recibe 1 de 4 dosis (en un orden predeterminado) una vez a la semana (días 1, ⁸, 15 y 22 de la fase de dosificación). Las dosis se eligen en base a los estudios realizados previamente en caninos. Todos los animales se observan con frecuencia para detectar signos de reacciones clínicamente relevantes al trímero H-NOX o al vehículo el día de la dosificación, y luego se observan junto a la jaula al menos una vez al día durante la fase de vida del estudio. Se registran los parámetros hemodinámicos (presión arterial, frecuencia cardíaca y electrocardiograma [ECG] de derivación II). El registro comienza al menos 1 hora antes de la dosificación y continúa durante al menos 24 horas después de la dosificación. Los parámetros evaluados incluyen; tensión arterial sistólica, diastólica y media, frecuencia cardíaca, intervalos PR, QRS, QT y RR, duración del QRS e intervalos QT corregidos QTcVW y QTcI (tabla 19). Los datos se inspeccionan visualmente para determinar su precisión y los valores se tabulan en 10 puntos de tiempo predeterminados según la farmacocinética del artículo de prueba. Se añade una inspección visual de todas las formas de onda del ECG para determinar alteraciones en el ritmo y la morfología de la forma de onda. El análisis estadístico de los datos hemodinámicos y de ECG se realiza usando Graph Pad Prism (Versión 4.03). Las comparaciones se hacen entre los grupos de tratamiento con vehículo y trímero H-NOX en cada punto de tiempo de análisis de datos correspondiente utilizando o bien procedimientos estadísticos paramétricos (por ejemplo, análisis de varianza de medidas repetidas seguido de la prueba de la t de comparación múltiple de Dunnett) o bien no paramétricos (por ejemplo, prueba de Friedman y prueba de comparaciones múltiples a posteriori de Dunn). La elección de estadísticas paramétricas o no paramétricas se basa en si los grupos comparados satisfacen la homogeneidad del criterio de varianza. Las diferencias entre tratamiento con vehículo y con trímero H-NOX se indican como p <0,05.

Tabla 18. Cohortes para el estudio de telemetría cardiovascular en caninos

Tabla 19. Mediciones y observaciones para el estudio de telemetría cardiovascular en caninos

Ejemplo 11. Ensayos clínicos de fase 1 para el uso de trímero H-NOX en pacientes con glioblastoma.

Se lleva a cabo un estudio de fase 1b para evaluar la seguridad del trímero H-NOX, la biodistribución en tumores y la reducción de la hipoxia en pacientes con GB recurrente. Se lleva a cabo un segundo estudio de fase 1b para evaluar la seguridad del trímero H-NOX en pacientes con diagnóstico reciente de GB.

Ensayo de fase 1b en pacientes con GB recurrente

El primer ensayo de fase 1b es un estudio de aumento escalonado de punto final dirigido a una dosis única para pacientes con Gb recurrente que son candidatos para una segunda resección. Este estudio proporciona orientación en cuanto a la selección de un nivel de dosis y una vía de administración en una población clínicamente relevante. Se incluyen en el estudio veinte pacientes con GB recurrente que cumplen los criterios de inclusión y exclusión.

Criterios de inclusión:

1. Son elegibles pacientes con evidencia mediante obtención de imágenes de GB recurrente que planean tener una resección repetida como parte de la atención convencional.

2. Los pacientes son elegibles si el diagnóstico histológico original fue glioma de evolución lenta y un diagnóstico histológico posterior es GB.

3. Todos los pacientes deben firmar un consentimiento informado que indique que conocen la naturaleza de investigación de este estudio. Los pacientes deben haber firmado una autorización para la divulgación de su información médica protegida. Los pacientes deben registrarse en una base de datos antes del tratamiento con el fármaco del estudio.

4. Los pacientes deben tener 18 años o más y una esperanza de vida> ⁸semanas.

5. Los pacientes deben tener un estado funcional de Karnofsky de > 60.

⁶. En el momento del registro: los pacientes deben haberse recuperado de los efectos tóxicos de la terapia previa: >28 días de cualquier agente en investigación, >28 días de la terapia citotóxica previa, >14 días de vincristina, >42 días de nitrosoureas, >21 días de administración de procarbazina y >7 días para agentes no citotóxicos, por ejemplo, interferón, tamoxifeno, talidomida, ácido cis-retinoico, etc. Cualquier pregunta relacionada con la definición de agentes no citotóxicos debe dirigirse al presidente del estudio.

7. Los pacientes deben tener una función adecuada de la médula ósea (WBC > 3000/|il, ANC > 1500/mm3, recuento de plaquetas de > 100.000/mm³y hemoglobina > 10 g/dl), función hepática adecuada (SGOT y bilirrubina < 2 veces el LSN) y función renal adecuada (creatinina < 1,5 mg/dl) antes de iniciar la terapia. Estas pruebas deben realizarse dentro de los 14 días anteriores al registro. Es posible que no se alcance el nivel de elegibilidad para la hemoglobina mediante transfusión.

⁸. Los pacientes deben haber mostrado evidencia radiográfica inequívoca de progresión del tumor mediante IRM o TAC. Debe realizarse una exploración dentro de los 14 días anteriores al registro y con una dosis de esteroides que se haya mantenido estable durante al menos 5 días. Si se aumenta la dosis de esteroides entre la fecha de la obtención de imágenes y el registro, se requiere una nueva RM/TAC inicial. El mismo tipo de exploración, es decir, IRM o TAC deben usarse durante todo el período de tratamiento del protocolo para la medición del tumor.

9. Los pacientes pueden haber recibido tratamiento para cualquier número de recidivas previas.

10. Las mujeres en edad fértil deben tener una prueba de embarazo de B-HCG negativa documentada en los 14 días anteriores al registro.

Criterios de exclusión:

1. Los pacientes no deben haber recibido terapia previa con bevacizumab (Avastin), otros agentes VEGF o VEGFR, u otros agentes considerados como agentes antiangiogénicos.

2. Se excluye a cualquier paciente con evidencia de PET de baja fracción hipóxica (razón SUVtumor/SUVcerebelo 2,0).

3. Se excluye a cualquier paciente en terapia con fármacos antihipertensivos.

4. Los pacientes no deben tener ninguna enfermedad médica importante que, en opinión del investigador, no pueda controlarse adecuadamente con la terapia apropaida o que comprometa la capacidad del paciente para tolerar esta terapia.

5. No son elegibles los pacientes con antecedentes de cualquier otro cáncer (excepto cáncer de piel no melanoma o carcinoma in situ del cuello uterino), a menos que estén en remisión completa y no reciban ninguna terapia para esa enfermedad durante un mínimo de 3 años.

⁶. Los pacientes no deben tener una infección activa o una enfermedad médica intercurrente grave.

7. Los pacientes no deben tener ninguna enfermedad que enmascare la toxicidad o altere peligrosamente el metabolismo del fármaco.

Los pacientes de este estudio reciben trímero H-NOX solo, sin otra terapia concurrente. Hay cuatro niveles de dosis con niveles de dosificación exactos determinados a partir de niveles identificados como bien tolerados en estudios de toxicología preclínica, y se aumentan de manera escalonada según un diseño 3 3. Los puntos de detención y los aumentos escalonados de dosis se basan principalmente en la reducción de la hipoxia, debido a la baja toxicidad esperada de una única dosis de trímero H-NOX. Según las pruebas preliminares de toxicidad de la proteína H-NOX, se espera que haya poca o ninguna toxicidad asociada con el trímero H-NOX. Sin embargo, si se observa toxicidad limitante de la dosis (DLT), los criterios para el aumento escalonado se cambian inmediatamente para basarse en la DLT y las reglas de aumento escalonado basadas en un diseño convencional 3 3. Las DLT para el estudio se definen como cualquiera de los siguientes acontecimientos que pueden atribuirse al trímero H-NOX:

1. Trombocitopenia de grado 3

2. Anemia de grado 4 y/o neutropenia de grado 4

3. Cualquier toxicidad no hematológica de grado 3, excluyendo la alopecia.

Para evaluar la actividad biológica del trímero H-NOX, los pacientes se someten a una exploración por PET con ¹⁸F-EF5 72 horas antes de la dosificación del trímero H-NOX. La exploración por PET permite cuantificar la fracción hipóxica, caracterizada como la razón entre el valor de captación convencional (SUV) del tumor y el SUV del cerebelo (cerebro normal) y establece los niveles iniciales de hipoxia tumoral antes de la cirugía. Se excluyen los pacientes con niveles bajos de hipoxia (tal como se definen por una razón tumor:cerebro normal por debajo de ²,⁰). Los pacientes con tumores suficientemente hipóxicos reciben una única dosis de H-NOX por vía intravenosa y una segunda exploración por PET con ¹⁸F-EF5 dos horas después de la dosificación del trímero H-NOX para evaluar los cambios en la fracción hipóxica. Se puntúa la segunda exploración por PET y se registra cualquier cambio con respecto a la exploración inicial. Un cambio en la fracción hipóxica de al menos el 15% se considera clínicamente prometedor y constituye un cambio “positivo”, mientras que un cambio inferior al 15% se considera un cambio “negativo”. Las resecciones quirúrgicas planificadas se realizan dentro de las 24 horas posteriores a la dosificación del trímero H-NOX. Los tumores resecados se examinan mediante inmunohistoquímica cuantitativa (IHC) para determinar la penetración del trímero H-NOX, así como IHC cuantitativa para la tinción con EF5 para confirmar los resultados de la PET. Los datos de distribución del trímero H-NOX se confirman mediante ELISA cuantitativo, usando muestras de tejido homogeneizadas, cuando sea posible. Todas las pruebas de seguridad de laboratorio clínico de rutina (por ejemplo, función hepática, función renal, CBC) se realizan antes de la dosificación y 24 horas, 48 horas y 14 días después de la dosificación. Las muestras de sangre de cada uno de estos puntos de tiempo se utilizan para determinar la farmacocinética (PK) en plasma, así como para evaluar la presencia de anticuerpos antiterapéuticos (ATA). El criterio de valoración principal incluye la seguridad de un único agente y los criterios de valoración secundarios incluyen la PK tumoral, la reducción de la hipoxia y el tiempo hasta la producción de ATA.

Ensayo de fase 1b en pacientes con GB recién diagnosticado

El segundo ensayo de fase 1b es un estudio clásico de aumento escalonado de dosis 3 3 que combina el trímero H-NOX con el tratamiento habitual actual para el GB recién diagnosticado. Después del diagnóstico y una resección inicial, los pacientes con GB reciben actualmente aproximadamente 60 Gy en RT fraccionada junto con temozolomida (TMZ), una quimioterapia oral que alquila el ADN. Dado que el mecanismo de acción del trímero H-NOX implica la reducción de la hipoxia en los tumores sólidos, sólo los pacientes con resecciones parciales (es decir, subtotal) se inscriben en el estudio. Se incluyen en el estudio veinte pacientes con GB recién diagnosticado que cumplen los criterios de inclusión y exclusión.

Criterios de inclusión:

1. Los pacientes con GB intracraneal recién diagnosticado y probado histológicamente serán elegibles para este protocolo.

2. Los pacientes deben tener una fracción hipóxica significativa en la obtención de imágenes por PET con ¹⁸F-EF5 que debe realizarse antes de comenzar la terapia.3

3 La enfermedad residual y evaluable después de la resección de GB recién diagnosticado es obligatoria para la elegibilidad en el estudio. Para evaluar mejor la extensión de la enfermedad residual posoperatoria, se debe realizar una TAC/IRM no más tarde de 96 horas en el período inmediatamente tras la operación o al menos 4 semanas después de la operación, dentro de los 14 días anteriores al registro. Si la exploración de 96 horas es más de 14 días antes del registro, es necesario repetir la exploración. Si se aumenta la dosis de esteroides entre la fecha de la obtención de imágenes y el registro, se requiere una nueva TAC/IRM inicial con una dosificación de esteroides estable durante al menos 5 días.

4. La biopsia o resección debe haberse realizado no más de 5 semanas antes del tratamiento.

5. Todos los pacientes deben firmar un consentimiento informado que indique que conocen la naturaleza de investigación de este estudio. Los pacientes deben haber firmado una autorización para la divulgación de su información médica protegida. Los pacientes deben registrarse en una base de datos antes del tratamiento con el fármaco del estudio.

⁶. Los pacientes deben tener 18 años o más y una esperanza de vida> ⁸semanas.

7. Los pacientes deben tener un estado funcional de Karnofsky de > 60.

⁸. Los pacientes deben tener una función adecuada de la médula ósea (WBC> 3000/|il, ANC > 1500/mm3, recuento de plaquetas > 100.000/mm³y hemoglobina> 10 g/dl), función hepática adecuada (SGOT y bilirrubina < 2 veces el LSN) y función renal adecuada (creatinina < 1,5 mg/dl) antes de iniciar la terapia. Estas pruebas deben realizarse en los 14 días anteriores al registro. Es posible que NO se alcance el nivel de elegibilidad para la hemoglobina mediante transfusión.

9. Las mujeres en edad fértil deben tener una prueba de embarazo de B-HCG negativa documentada en los 14 días anteriores al registro.

10. Los pacientes no deben haber recibido terapia con fármacos citotóxicos, terapia con fármacos no citotóxicos o terapia con fármacos experimentales para los tumores encefálicos. Se excluirán los pacientes que recibieron polifespan 20 con obleas de implante de carmustina (Gliadel) en el momento de la resección original.

11. Los pacientes deben planificar comenzar la radioterapia cerebral parcial al día siguiente de comenzar con el trímero H-NOX y la temozolomida. La radioterapia debe realizarse en un sitio asociado de modo que un oncólogo radioterápico pueda garantizar que la radiación pueda realizarse según se especifica en este protocolo. La radioterapia debe administrarse mediante haz externo a un campo cerebral parcial en fracciones diarias de 1,8 a 2,0 Gy, hasta una dosis total planificada para el tumor de 59,4 a 61,0 Gy. No se permitirá la radiocirugía estereotáctica (por ejemplo, el tratamiento con bisturí de rayos gamma) ni la braquiterapia.

12. Los pacientes deben estar dispuestos a renunciar a otros tratamientos farmacológicos citotóxicos y no citotóxicos contra el tumor mientras reciben tratamiento con trímero H-NOX y temozolomida.

13. Los pacientes masculinos y femeninos con potencial reproductivo deben usar un método anticonceptivo aprobado, si corresponde (por ejemplo, dispositivo intrauterino [DIU], píldoras anticonceptivas o dispositivo de barrera) durante el tratamiento del estudio y durante 3 meses después de la interrupción del tratamiento del estudio. Las mujeres en edad fértil deben tener una prueba de embarazo con beta-HCG negativa documentada en los 14 días anteriores al tratamiento. Si se usan condones como anticonceptivo de barrera, debe añadirse un agente espermicida para garantizar que no se produzca un embarazo. Si una mujer queda embarazada o sospecha que está embarazada mientras participa en este estudio, debe informar a su médico responsable de inmediato.

Criterios de exclusión:

1. Los pacientes no deben haber recibido previamente una terapia concurrente con bevacizumab (Avastin), otros agentes VEGF o VEGFR, u otros agentes considerados como agentes antiangiogénicos.

2. La evidencia de una fracción hipóxica baja mediante la PET con ¹⁸F-EF5 dará lugar a la exclusión.

3. Se excluye a cualquier paciente en tratamiento con fármacos antihipertensivos.

4. Los pacientes no deben tener ninguna enfermedad médica importante que, en opinión del investigador, no pueda controlarse adecuadamente con la terapia apropiada o que comprometa la capacidad del paciente para tolerar esta terapia.

⁸. Se excluyen aquellos pacientes con resección total macroscópica.

9. El paciente no debe haber recibido radioterapia craneal previa.

Se realiza una exploración por PET con ¹⁸F-EF5 inicial y los pacientes con tumores normóxicos (definidos como una razón tumor:cerebro normal < 2,0) se eliminan del estudio. A partir del primer día de la terapia de RT, los pacientes reciben una dosis de trímero H-NOX por vía intravenosa dos horas antes de la RT. Para minimizar las posibilidades de una reacción alérgica a la proteína H-NOX trimérica, la dosificación se limita a los primeros 5 días de RT, cuando el tumor residual es el mayor. Este régimen continúa diariamente durante 5 días, con niveles de dosis que aumentan según un diseño 3+3. Las toxicidades se clasifican tal como se describe en el primer estudio de fase 1b con modificaciones a la definición de DLT. DLT se define como cualquiera de los siguientes acontecimientos que se producen en la semana 10 del estudio y son atribuibles al trímero H-NOX solo o al trímero H-NOX dosificado en combinación con TMZ y RT:

1. Cualquier trombocitopenia de grado 3 o 4, anemia de grado 4 o neutropenia de grado 4 que dure más de 7 días.

2. Cualquier neutropenia febril.

3. Cualquier toxicidad no hematológica de grado 3 o superior, excluyendo la alopecia, a pesar de la terapia médica máxima. La toxicidad no hematológica, tal como erupción cutánea, náuseas, vómitos y diarrea, solo se considerará una DLT si permanece de grado 3 o superior a pesar de la terapia médica máxima.

4. Cualquier cambio cutáneo de grado 4 inducido por radiación.

La terapia de tratamiento habitual actual para GB que consiste en RT concurrente y temozolomida provoca toxicidades limitativas de la dosis en aproximadamente 1 de cada ⁶pacientes. El aumento escalonado de la dosis del trímero H-NOX por cohorte continúa siempre que la dosis produzca una DLT en < 1 de 3 pacientes o < 2 de ⁶pacientes si se aumenta el tamaño de la cohorte. El tamaño de la cohorte es ligeramente superior al tamaño más convencional de 3 pacientes debido a la frecuencia relativamente alta de toxicidades conocidas y esperadas durante el tratamiento con RT y temozolomida. Si una cohorte de dosificación no tiene 3 pacientes evaluables inscritos debido a abandonos o si 3 de ⁶pacientes experimentan una DLT, entonces se inscriben hasta 3 pacientes adicionales en la cohorte de uno en uno (tabla ^{2 0}).

Tabla 20. Reglas de aumento escalonado de dosis para el segundo estudio de fase 1b

Después de completar la dosificación del trímero H-NOX, se evalúa a los pacientes semanalmente para determinar acontecimientos adversos durante la fase de radiación/TMZ concurrente (generalmente un período de seis semanas). Se hará un seguimiento de los pacientes durante 12 meses y se determinará la supervivencia libre de progresión a los ⁶y 12 meses después del tratamiento. La MTD del trímero H-NOX es una dosis en la que menos de o igual a un tercio de los pacientes experimentan DLT. La MTD se basa en las DLT observadas durante el transcurso de la radiación y TMZ concurrentes, y se define para su uso en estudios de fase 2 posteriores. El criterio de valoración principal incluye la seguridad en combinación con el tratamiento habitual y el criterio de valoración secundario incluye el tiempo hasta la producción de ATA y PFS-12.

Debido a la baja toxicidad esperada del trímero H-NOX, el primer estudio de fase 1b puede encontrar una dosis biológicamente adecuada, es decir, una dosis que produce una tasa de respuesta del 80%. Se implementará un diseño de proporción [4/6] con una respuesta binaria de cambio de fracción hipóxica positiva/negativa. Véase Brown et al., (2010) Int J Radiat Oncol Biol Phys 78:323-327. Este diseño asegura que si la tasa de respuesta real asociada con una dosis es baja (definida en este caso como 0,3) hay una alta probabilidad de aumentar de manera escalonada a la siguiente dosis; mientras que una alta tasa de respuesta real (definida como ⁰,⁸) da como resultado una baja probabilidad de que aumente de manera escalonada adicionalmente. Las cohortes de 3 se usan para el aumento escalonado siempre que se observen < 1/3 respuestas. Cuando se observan > 2/3 respuestas, la cohorte se ampliará a ⁶. El aumento escalonado continúa si se observan < 3/6 respuestas. La dosis recomendada para el segundo ensayo de fase 1b es la dosis que alcanza > 4/6 respuestas o el nivel de dosis máximo, es decir, 100 mg/kg. Si la dosis de partida de 5 mg/kg alcanza > 4/6 respuestas, se investigan dosis más bajas para determinar la actividad suficiente. A diferencia de los diseños convencionales de toxicidad, si está claro que no se cumplen los criterios de respuesta para interrumpir una dosis determinada (es decir, se han observado 0/2 o 2/5 respuestas) se producirá un aumento escalonado temprano a una dosis más alta. La probabilidad de realizar un aumento escalonado cuando la tasa verdadera = 0,3 es 0,94, mientras que la probabilidad de realizar un aumento escalonado cuando la tasa verdadera es 0,8 es 0,15. Se usan un mínimo de 9 y un máximo de 24 pacientes dados los cuatro niveles de dosis.

Si se observan toxicidades, los ensayos se cambian de un estudio de aumento escalonado de punto final objetivo a uno basado en DLT. Como tal, la MTD se basa en la evaluación de la DLT durante las dos semanas después del tratamiento con el trímero H-NOX y se define como la dosis a la que menos de un tercio de los pacientes experimenta una DLT; es decir, la MTD es el nivel de dosis en el que 0/3 o 1/6 pacientes experimentan DLT y la siguiente dosis más alta tiene al menos 2/3 o 2/6 pacientes que experimentan DLT. Si la DLT, tal como se definió anteriormente, no se logra en ninguna cohorte hasta un nivel de dosis de ^{10 0}mg/kg, no hay aumento escalonado adicional.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Proteína H-NOX trimérica que comprende tres monómeros, en la que cada monómero comprende un dominio de H-NOX y un dominio de trimerización.

2. Proteína H-NOX trimérica según la reivindicación 1, en la que los dominios de H-NOX son dominios de H-NOX homólogos.

3. Proteína H-NOX trimérica según la reivindicación 1 ó 2, en la que cada monómero comprende el dominio de H-NOX unido de manera covalente al dominio de trimerización.

4. Proteína H-NOX trimérica según la reivindicación 3, en la que los monómeros se asocian para formar la proteína H-NOX trimérica; y en la que en cada monómero el extremo C-terminal del dominio de H-NOX se une de manera covalente al dominio de trimerización.

5. Proteína H-NOX trimérica según la reivindicación 3, en la que los monómeros se asocian para formar la proteína H-NOX trimérica; y en la que en cada monómero el extremo N-terminal del dominio de H-NOX se une de manera covalente al dominio de trimerización.

6. Proteína H-NOX trimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que el dominio de trimerización es un dominio foldon de fibritina de bacteriófago T4.

7. Proteína H-NOX trimérica según la reivindicación ⁶, en la que el dominio foldon comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4:

Gly ^{T y r} lie Pro Glu Ala Pro ^{A r g} Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg ^Lys

1 5 10 15

Asp Gly Glu ^{T r p} Val Leu Leu Ser ^{T h r Ph e} Leu

20 25 .

8. Proteína H-NOX trimérica según la reivindicación ⁶ó 7, en la que el dominio de H-NOX en cada monómero se fusiona a través de un ligador de aminoácidos al dominio foldon de fibritina de bacteriófago T4.

9. Proteína H-NOX trimérica según la reivindicación ⁸, en la que el ligador de aminoácidos tiene tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez aminoácidos de longitud.

10. Proteína H-NOX trimérica según la reivindicación 9, en la que el ligador de aminoácidos tiene tres aminoácidos de longitud.

11. Proteína H-NOX trimérica según la reivindicación 9, en la que el ligador de aminoácidos es un ligador Gly-Ser-Gly.

12. Proteína H-NOX trimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en la que al menos uno de los dominios de H-NOX es un dominio de H-n Ox de Thermoanaerobacter tengcongensis, un dominio de H-NOX de L. pneumophilia 2, un dominio de H-NOX de Homo sapiens p1, un dominio de H-NOX de Rattus norvegicus p1, un dominio de H-NOX de Canis lupus, un dominio de H-NOX de Drosophila melanogaster p1, un dominio de H-NOX de D. melanogaster CG14885-PA, un dominio de H-NOX de Caenorhabditis elegans GCY-35, un dominio de H-NOX de Nostoc punctiforme, un dominio de H-NOX de Caulobacter crescentus, un dominio de H-NOX de Shewanella oneidensis o un dominio de H-NOX de Clostridium acetobutylicum, que contiene opcionalmente una o más mutaciones.

13. Proteína H-NOX trimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en la que el dominio de H-NOX corresponde al dominio de H-NOX de T. tengcongensis expuesto en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2:

Met Lys Gly Thr lie Val Gly Thr Trp He Lys Thr LeuArg Asp Leu

1 5 10 15

Tyr Gly AsaAsp Val Val Asp Glu S©3TLeuLysSer Val Gly Trp Glu

20 25 30

Pro Asp Arg Val lie Thr Pro Leu biu Asp Ile Asp AspAsp GluVal

35 40 45

Arg Arg Xle PheAla Lys Val Ser Glu LysThr Gly Lys Asn Val Asn

50 55 60

Glu lie Trp Arg Glu Val GlyArg Gln Asn lie Lys Thr Phe SerGlu

65 70 75 80

Trp Phe Pro Ser Tyr Phe AlaGly Arg Arg Leu Val Asn,Phe LeuMet

85 90 95

Met Met AspGlu Val His Leu Gln Leu ThrLy Met He Lys Gly Ala

100 105 110

Thr Pro Pro Arg Leu lie Ala Lys Pro Val Ala Lys AspAla He Glu

115 120 125

Met Glu Tyr Val Ser Lys ArgLys Met Tyr Asp Tyr Pheleu Gly Leu

130 135 140

_{lie Glu Gly Ser Ser Lys Phe Phe Lys Glu Glu lie}WwewSsJ**r.<_{Val Glu Glu}

145 150 155 160

Val Glu Arg Gly Glu lys Asp Gly Phe SerArg Leu Lys Val Arg He

165 170 175

Lys PheLys AsnPro Val PheGlu

180

que contiene opcionalmente una o más mutaciones.

14. Proteína H-NOX trimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en la que al menos uno de los dominios de H-NOX comprende una o más mutaciones en el bolsillo distal.

15. Proteína H-NOX trimérica según la reivindicación 14, en la que la mutación en el bolsillo distal es una sustitución de aminoácido en un sitio correspondiente a L144 de H-NOX de T. tengcongensis.

16. Proteína H-NOX trimérica según la reivindicación 14, en la que al menos uno de los dominios de H-NOX es un dominio de H-NOX de T. tengcongensis que comprende una sustitución de aminoácido en la posición 144.

17. Dominio de H-NOX trimérico según la reivindicación 16, en el que la sustitución de aminoácido en la posición 144 es una sustitución L144F.

18. Proteína H-NOX trimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en la que cada monómero comprende un dominio de H-NOX de T. tengcongensis que comprende una sustitución L144F.

19. Proteína H-NOX trimérica según la reivindicación 1, en la que cada monómero H-NOX comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8:

Met Lys Gly Thr lie Val Gly Thr Trp lie Lys Thr LeuArg AspLeu

1 5 10 15

Tyr Gly Asn AspVal Val Asp Glu SerLeu Lys Ser Val Gly Trp Glu

20 25 30

Pro AspArg Val lie Thr Pro LeuGlu Asp lie Asp Asp Asp GluVal

35 40 45

Arg Arg lie Phe Ala Lys Val Ser Glu Lys Thr Gly Lys Asn Val Asn

50 55 60

Glu lie Trp Arg Glu Val Gly Arg Gln Asn lie Lys Thr Phe Ser Glu

65 70 75 80

Trp PhePro Ser Tyr Phe Ala GlyArg Arg Leu Val AsnPhe LeuMet

85 90 95

Met Met Asp GluVal His Leu GlnLeu Thr Lys Met lie Lys GlyAla

100 105 110

Thr Pro Pro Arg Leu lie Ala Lys Pro Val Ala Lys AspAla lie Glu

115 120 125

Met GluTyr Val Ser Lys Arg LysMet TyrAsp Tyr PheLeu Gly Phe

130 135 140

lie Glu Gly Ser SerLys Phe PheLysGlu Glu lie Ser Val Glu Glu

145 150 155 160

Val GluArg Gly Glu Lys Asp Gly Phe SerArg LeuLys Val Arg lie

165 170 175

Lys PheLys AsnPro Val Phe Glu Tyr Lys Lys AsnLeuGlu Gly Ser

180 185 190

Gly Gly Tyr lie Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg

195 200 205

Lys AspGly Glu Trp Val Leu Leu SerThr Phe Leu

210 215 220

Proteína H-NOX trimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 14-18, en la que al menos uno de los dominios de H-NOX comprende al menos dos mutaciones en el bolsillo distal, en la que una mutación adicional en el bolsillo distal es una sustitución de aminoácido en un sitio correspondiente a W9 de H-NOX de T. tengcongensis, en la que la proteína H-NOX es una H-NOX de T. tengcongensis y la sustitución de aminoácido en la posición 9 es una sustitución W9F.

Proteína H-NOX trimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1-20, en la que la proteína H-NOX se caracteriza por uno o más de los siguientes:

a) la constante de disociación de O²de la proteína H-NOX trimérica está dentro de 2 órdenes de magnitud de la de la hemoglobina, y en la que la reactividad de NO de la proteína H-NOX trimérica es al menos 10 veces menor que la de la hemoglobina,

b) la constante de disociación de O2 de la proteína H-NOX trimérica es de entre aproximadamente 1 nM y aproximadamente 1000 nM a 20°C,

c) en la que la constante de disociación de O2 de la proteína H-NOX trimérica es de entre aproximadamente 1 nM y aproximadamente 1000 nM a 20°C,

d) la reactividad de NO de la proteína H-NOX trimérica es de menos de aproximadamente 700 s-1 a 20°C, e) la reactividad de NO de la proteína H-NOX trimérica es al menos 100 veces menor que la de la hemoglobina f) la koff para oxígeno de la proteína H-NOX trimérica es menor de o igual a aproximadamente 0,65 s-1 a 20°C, o

g) en la que la velocidad de autooxidación de hemo de la proteína H-NOX trimérica es de menos de aproximadamente 1 h-1 a 37°C.

Proteína H-NOX trimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1-21, en la que la proteína H-NOX trimérica se acumula de manera preferente en uno o más tejidos en un mamífero en comparación con una proteína H-NOX monomérica correspondiente que comprende un único dominio de H-NOX tras la administración de la proteína H-NOX al animal; o

en la que se produjo el aclaramiento de menos del 10% de la H-NOX trimérica del mamífero por los riñones en el plazo de menos de aproximadamente 1 hora, 2 horas o 3 horas tras la administración de la proteína H-NOX al mamífero.

23. Proteína H-NOX trimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1-22, en la que cada monómero se pegila.

24. Composición farmacéutica que comprende una proteína H-NOX trimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1-23, en la que la composición comprende además un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.

25. Composición farmacéutica según la reivindicación 24, para su uso en un método de terapia para administrar oxígeno a un mamífero que lo necesita.

26. Composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 25, en la que la composición farmacéutica es para su uso en un método para administrar O²a un tumor encefálico en un mamífero con un cáncer encefálico.

27. Composición farmacéutica según la reivindicación 24, para su uso en un método para tratar, en un mamífero que lo necesita, enfermedad cardiovascular, enfermedad neurológica, hipoxia tumoral, pérdida de sangre, una herida, traumatismo, hemorragia, choque hemorrágico, cirugía que produce alta pérdida de sangre, hemodilución, hipovolemia, una herida posrradiación, una herida posquirúrgica, úlcera diabética, una herida por quemadura, trombos, anemia drepanocítica, oclusiones de drepanocitos, oclusiones arteriales, oclusiones vasculares periféricas, isquemia perioperatoria, accidente cerebrovascular, accidente cerebrovascular isquémico, accidente cerebrovascular emergente, crisis isquémicas transitorias, aturdimiento e hibernación miocárdicos, angina de pecho aguda o inestable, angina de pecho emergente, infarto de miocardio, cardioplejia, cáncer, cáncer como un tratamiento complementario con radiación o quimioterapia, traumatismo craneoencefálico, lesión de la médula espinal o anemia.

28. Composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 27, en la que el cáncer es cáncer encefálico, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal o cáncer de piel.

29. Composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 26-28, en la que el cáncer encefálico es glioblastoma.

30. Composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 25-29, en la que la proteína H-NOX se formula para su uso con radiación.

31. Composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 25-29, en la que la proteína H-NOX se formula para su uso con quimioterapia.

32. Composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 25-31, en la que el mamífero es un humano.

33. Composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 25-32, en la que la composición farmacéutica se administra mediante inyección intravenosa.

34. Kit que comprende la proteína H-NOX trimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1-23, en un vial sellado.

35. Bolsa intravenosa que comprende la proteína H-NOX trimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1-23.