JP2021533198A - 筋標的化複合体およびそれらの使用 - Google Patents

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Abstract

本開示の側面は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された筋標的化剤を含む複合体に関する。いくつかの態様において、筋標的化剤は、筋細胞上の内在化する細胞表面受容体へ特異的に結合する。いくつかの態様において、分子ペイロードは、筋疾患に関連する疾患アレルの活性を阻害する。いくつかの態様において、分子ペイロードは、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはRNAiオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドである。

Description

関連出願
本出願は、2018年8月2日に出願された表題「MUSCLE TARGETING COMPLEXES AND USES THEREOF」の米国仮出願第62/714,010号；2018年12月13日に出願された表題「MUSCLE TARGETING COMPLEXES AND USES THEREOF」の米国仮出願第62/779,173号；2019年5月31日に出願された表題「MUSCLE TARGETING COMPLEXES AND USES THEREOF」の米国仮出願第62/855,781号；2019年6月7日に出願された表題「MUSCLE TARGETING COMPLEXES AND USES THEREOF」の米国仮出願第62/858,925号；および2019年6月10日に出願された表題「MUSCLE TARGETING COMPLEXES AND USES THEREOF」の米国仮出願第62/859,694号の出願日の利益を主張するものである;その各内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の分野
本出願は、分子ペイロード(molecular payloads)(例として、オリゴヌクレオチド)を細胞へ送達するための標的化複合体、およびそれらの使用、とくに疾患の処置に関する使用、に関する。
配列表への言及
本出願は、電子書式で配列表と共に出願されている。配列表は、2019年7月31日に作成された、サイズが56キロバイトのD082470006WO00-SEQ.txtという表題のファイルとして提供される。電子書式の配列表中の情報はその全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる。
発明の背景
筋疾患は、生死を脅かす合併症へ繋がる筋肉衰弱および/または筋肉機能障害に、しばしば関連する。かかる疾患の多くの例が特徴づけられてきており、筋ジストロフィー(例として、デュシェンヌ型、顔面肩甲上腕型、筋強直性、および眼咽頭の)、ポンペ病、中心核ミオパチー、家族性肥大型心筋症、Laing型遠位型ミオパチー、進行性骨化性線維異形成症、フリートライヒ運動失調症、筋原線維ミオパチーおよびその他の様々な形態が含有される。これらの疾病は、一般に遺伝性であるが、自発的に生じ得る。これらの疾病は、しばしば先天性であるが、後発的に生じ得る。多くの希少な筋疾患は、優性または劣性表現型を有してもよい機能獲得型または機能喪失型突然変異に関連する、単一の遺伝子障害である。例えば、活性化突然変異(activating mutations)は、筋疾患に寄与するイオンチャネル、構造タンパク質、代謝タンパク質、およびシグナリングタンパク質をコードする遺伝子中に同定されてきた。筋疾患の遺伝的病因学の理解における進歩に拘わらず、有効な処置の選択肢は未だに限られている。
発明の概要
いくつかの側面に従うと、本開示は、筋細胞を、分子ペイロードをそれらの細胞へ送達することを目的として、標的にする複合体を提供する。いくつかの態様において、本開示の複合体は、筋疾患アレルを標的にする分子ペイロードの筋肉特異的送達を容易にさせる。例えば、いくつかの態様において、本明細書に提供される複合体は、遺伝子の発現または活性を、その遺伝子に関連する筋疾患(例として、表1の遺伝子/疾患)を有するかまたはこれを有すると疑われる対象においてモジュレートする分子ペイロードを送達するのにとくに有用である。いくつかの態様において、本明細書に提供される複合体は、分子ペイロードを筋細胞へ送達することを目的として、筋細胞の表面上の受容体へ特異的に結合する筋標的化剤(例として、筋標的化抗体)を含む。いくつかの態様において、複合体は、受容体(例として、トランスフェリン受容体)に媒介される内在化を介して細胞中へ取り入れられ、これを受け分子ペイロードは細胞内部に放出されて機能を果たしてもよい。例えば、オリゴヌクレオチドを送達するように改変された複合体は、オリゴヌクレオチドが筋疾患アレルの発現または活性をモジュレートし得るように、オリゴヌクレオチドを放出してもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、複合体のオリゴヌクレオチドと筋標的化剤とを接続する共有結合性リンカーのエンドソーム切断によって放出される。
いくつかの態様において、方法は、疾患アレルに関連する筋疾患(例として、機能獲得型疾患アレル)を有するとして診断された対象を処置するために提供される。いくつかの態様において、方法は、疾患アレルの発現または活性を阻害するように構成されている分子ペイロードへ、共有結合的に連結された筋標的化剤を含む複合体を、対象へ投与することを伴う。いくつかの態様において、筋標的化剤は、対象の筋細胞上の内在化する細胞表面受容体へ特異的に結合する。いくつかの態様において、筋疾患は、遺伝性であり、および対象の一連の家族の世代において増大した重症度を呈してもよい。いくつかの態様において、対象は、疾患アレルの遺伝分析に基づき、筋疾患を有するとして診断されてきた。いくつかの態様において、対象は、投与に先立ち、進行性筋肉衰弱および/または筋肉減少症を呈する。いくつかの態様において、対象は、投与に先立ち、筋強直症を呈する。
いくつかの側面に従って、筋疾患(例として、機能獲得型疾患アレルに関連する)を有するとして診断された対象を処置するための方法が、提供される。いくつかの態様において、方法は、疾患アレルの発現または活性を阻害するように構成されている分子ペイロードへ、共有結合的に連結された筋標的化剤を含む複合体を、対象へ投与することを含む。いくつかの態様において、筋標的化剤は、対象の筋細胞上の内在化する細胞表面受容体へ特異的に結合する。
いくつかの態様において、筋疾患は、遺伝性である。いくつかの態様において、筋疾患は、対象の一連の家族の世代において増大した重症度を呈する。いくつかの態様において、対象は、疾患アレルの遺伝分析に基づき、筋疾患を有するとして診断された。いくつかの態様において、対象は、投与に先立ち、進行性筋肉衰弱および/または筋肉減少症を呈する。いくつかの態様において、対象は、投与に先立ち、例として筋電図検査で測定可能な、筋強直症を呈する。
いくつかの態様において、筋標的化剤は、筋標的化抗体である。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、トランスフェリン受容体の細胞外エピトープへ特異的に結合する。いくつかの態様において、トランスフェリン受容体の細胞外エピトープは、トランスフェリン受容体の先端ドメインのエピトープを含む。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、配列番号1〜3のC89〜F760の範囲にある配列のエピトープへ特異的に結合する。いくつかの態様において、筋標的化抗体のトランスフェリン受容体への結合の平衡解離定数(Kd)は、10-11Mから10-6Mまでの範囲にある。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、トランスフェリン受容体のエピトープへの特異的な結合について、表2に列挙された抗体と競合する。
いくつかの態様において、筋標的化抗体は、トランスフェリン受容体のエピトープへの特異的な結合について、10-6M未満またはこれと等しいKdで競合する。いくつかの態様において、Kdは、10-11M〜10-6Mの範囲にある。
いくつかの態様において、筋標的化抗体は、トランスフェリン受容体のトランスフェリン結合部位へ特異的に結合しないか、および/または筋標的化抗体は、トランスフェリンのトランスフェリン受容体への結合を阻害しない。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、ヒト、霊長目の非ヒト動物、および齧歯類動物のトランスフェリン受容体のうち2種以上の細胞外エピトープと交差反応する。いくつかの態様において、方法は、トランスフェリン受容体に媒介される分子ペイロードの筋細胞中への内在化を促進するように構成されている。
いくつかの態様において、筋標的化抗体は、キメラ抗体であり、任意にキメラ抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、ScFv、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント、またはFvフラグメントの形態である。
いくつかの態様において、分子ペイロードは、オリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、表１に列挙された遺伝子またはこれからコードされるmRNAと相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、gapmerオリゴヌクレオチド、mixmerオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、RNAiオリゴヌクレオチド、メッセンジャーRNA(mRNA)、またはガイド配列である。
いくつかの態様において、複合体は、筋肉外非経口投与によって対象へ投与される。いくつかの態様において、複合体は、静脈内投与によって対象へ投与される。いくつかの態様において、複合体は、複合体の皮下投与によって対象へ投与される。
いくつかの側面において、複合体は、一本鎖オリゴヌクレオチドへ連結された筋標的化剤を含むように提供される。いくつかの態様において、筋標的化剤は、筋細胞上の内在化する細胞表面受容体へ特異的に結合し、およびここでオリゴヌクレオチドは、筋疾患遺伝子と相補性のある領域を含む。
いくつかの態様において、組成物は、複数の複合体を含むように提供され、各複合体は、2個、少なくとも3個またはそれ以上(例として2〜6個)のオリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結された筋標的化剤を含む。いくつかの態様において、筋標的化剤は、対象の筋細胞上の内在化する細胞表面受容体へ特異的に結合し、および各オリゴヌクレオチドは、筋疾患遺伝子と相補性のある領域を含む。
いくつかの側面において、複合体は、筋細胞内で機能する非分泌物をコードする筋疾患遺伝子の発現または活性をモジュレートするように構成されている分子ペイロードへ共有結合的に連結された筋標的化剤を含むように提供される。いくつかの態様において、筋標的化剤は、筋細胞上の内在化する細胞表面受容体へ特異的に結合する。
いくつかの態様において、筋標的化剤は、筋標的化抗体である。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、トランスフェリン受容体の細胞外エピトープへ特異的に結合する。いくつかの態様において、トランスフェリン受容体の細胞外エピトープは、トランスフェリン受容体の先端ドメインのエピトープを含む。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、配列番号1〜3のアミノ酸C89〜F760内の配列のエピトープへ特異的に結合する。いくつかの態様において、筋標的化抗体のトランスフェリン受容体への結合の平衡解離定数(Kd)は、10-11Mから10-6Mまでの範囲にある。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、トランスフェリン受容体のエピトープへの特異的な結合について、表2に列挙された抗体と競合する。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、トランスフェリン受容体のエピトープへの特異的な結合について、10-6M未満またはこれと等しいKdで競合する。いくつかの態様において、Kdは、10-11M〜10-6Mの範囲にある。
いくつかの態様において、筋標的化抗体は、トランスフェリン受容体のトランスフェリン結合部位へ特異的に結合しないか、および/またはここで筋標的化抗体が、トランスフェリンのトランスフェリン受容体への結合を阻害しない。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、ヒト、霊長目の非ヒト動物、および齧歯類動物のトランスフェリン受容体のうち2種以上の細胞外エピトープと交差反応する。
いくつかの態様において、複合体は、トランスフェリン受容体に媒介される分子ペイロードの筋細胞中への内在化を促進するように構成されている。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、キメラ抗体である。いくつかの態様において、キメラ抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。
いくつかの態様において、筋標的化抗体は、ScFv、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント、またはFvフラグメントの形態である。
いくつかの態様において、分子ペイロードは、オリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、機能獲得型疾患アレルを有する筋疾患遺伝子と相補性のある領域を含む。
いくつかの態様において、分子ペイロードは、ポリペプチドである。いくつかの態様において、ポリペプチドは、E3ユビキチンリガーゼインヒビターペプチドである。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の修飾ヌクレオチド間連結を含む。いくつかの態様において、少なくとも１個の修飾ヌクレオチド間連結は、ホスホロチオアート連結である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、Rp立体化学配置にあるか、および/またはSp立体化学配置にあるホスホロチオアート連結を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、すべてRp立体化学配置にあるか、またはすべてSp立体化学配置にあるホスホロチオアート連結を含む。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、1個以上の修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、1個以上の修飾ヌクレオチドは、2'-修飾ヌクレオチドである。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、細胞中筋疾患遺伝子によってコードされるmRNA転写産物のRNAse H媒介切断を指向するgapmerオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、gapmerオリゴヌクレオチドは、5〜15個のデオキシリボヌクレオチドの中心部を、その両脇から2〜8個ずつの修飾ヌクレオチドに挟まれて含む。
いくつかの態様において、その両脇の修飾ヌクレオチドは、2'-修飾ヌクレオチドである。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、mixmerオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、mixmerオリゴヌクレオチドは、2個以上の異なる2'修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、筋疾患遺伝子によってコードされるmRNA転写産物のRNAi媒介切断を促進するRNAiオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、長さが19〜25個のヌクレオチドの二本鎖オリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、RNAiオリゴヌクレオチドは、少なくとも1個の2'修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、各2'修飾ヌクレオチドは、2'-O-メチル、2'-フルオロ(2'-F)、2'-O-メトキシエチル(2'-MOE)、および2',4'-架橋ヌクレオチドからなる群から選択される。
いくつかの態様において、1個以上の修飾ヌクレオチドは、架橋ヌクレオチドである。いくつかの態様において、少なくとも1個の2'修飾ヌクレオチドは、2',4'-拘束2'-O-エチル(cEt)、およびロックド核酸(LNA)ヌクレオチドから選択される2',4'-架橋ヌクレオチドである。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ゲノム編集ヌクレアーゼのためのガイド配列を含む。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロジアミダイトモルホリノオリゴマーである。いくつかの態様において、筋標的化剤は、切断可能なリンカーを介して分子ペイロードへ共有結合的に連結されている。
いくつかの態様において、切断可能なリンカーは、プロテアーゼ感受性リンカー、pH感受性リンカー、およびグルタチオン感受性リンカーから選択される。いくつかの態様において、切断可能なリンカーは、プロテアーゼ感受性リンカーである。いくつかの態様において、プロテアーゼ感受性リンカーは、リソソームのプロテアーゼおよび/またはエンドソームのプロテアーゼによって切断可能な配列を含む。いくつかの態様において、プロテアーゼ感受性リンカーは、バリン-シトルリンジペプチド配列を含む。いくつかの態様において、リンカーは、4〜6の範囲にあるpHにて切断されるpH感受性リンカーである。
いくつかの態様において、筋標的化剤は、切断不能なリンカーを介して分子ペイロードへ共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、切断不能なリンカーは、アルカンリンカーである。
いくつかの態様において、筋標的化抗体は、オリゴヌクレオチドが共有結合的に連結された非天然アミノ酸を含む。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、抗体のリシン残基またはシステイン残基への抱合を介してオリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、マレイミド含有リンカーを介してシステインへ抱合されており、任意にここでマレイミド含有リンカーは、マレイミドカプロイルまたはマレイミドメチルシクロヘキサン-1-カルボキシラート基を含む。
いくつかの態様において、筋標的化抗体が、オリゴヌクレオチドが共有結合的に連結された少なくとも1個の糖部を含むグリコシル化抗体である。いくつかの態様において、糖部は、分枝マンノースである。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、1〜4個の糖部を含むグリコシル化抗体であって、前記糖部の各々は、別々のオリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結されている。
いくつかの態様において、筋標的化抗体は、全体的にグリコシル化された抗体である。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、部分的にグリコシル化された抗体である。いくつかの態様において、部分的にグリコシル化された抗体は、化学的または酵素的な手段を介して産生される。いくつかの態様において、部分的にグリコシル化された抗体は、N-またはO-グリコシル化経路中の酵素を欠乏した細胞である細胞において産生される。
いくつかの側面に従って、分子ペイロードをトランスフェリン受容体発現細胞へ送達する方法が提供される。いくつかの態様において、方法は、細胞を本明細書に提供される複合体と接触させることを含む。
いくつかの側面に従って、細胞中筋疾患遺伝子の発現または活性を阻害する方法が提供される。いくつかの態様において、方法は、細胞を本明細書に提供される複合体と、分子ペイロードの細胞への内在化を促進するのに有効な量で接触させることを含む。いくつかの態様において、細胞は、in vitroにある。いくつかの態様において、細胞は、対象にある。いくつかの態様において、対象は、ヒトである。
いくつかの側面に従って、筋疾患を有する対象を処置する方法が提供される。いくつかの態様において、方法は、有効量の本明細書に提供される複合体を対象へ投与することを含む。いくつかの態様において、筋疾患は、表1に列挙された疾患である。いくつかの態様において、筋疾患は、成人型ポンペ病、中心核ミオパチー(CNM)、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、顔面・肩甲・上腕筋ジストロフィー(FSHD)、家族性肥大型心筋症、進行性骨化性線維異形成症(FOP)、フリートライヒ運動失調症(FRDA)、封入体ミオパチー2、Laing型遠位型ミオパチー、筋原線維ミオパチー、先天性筋強直症(常染色体優性型、トムゼン病)、筋強直症ジストロフィーI型、筋強直症ジストロフィーII型、筋細管ミオパチー、眼咽頭型筋ジストロフィー、および先天性異常筋強直症から選択される疾患である。
図面の簡単な記載
図1は、ビヒクルトランスフェクションと比べた、DMPKの発現レベルにおける、DMPK(DTX-P-060)を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドでHepa1-6細胞をトランスフェクトする効果を示す、非限定的な概略図を描く;
図2Aは、DMPKアンチセンスオリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結された抗トランスフェリン受容体抗体を含む筋肉標的化複合体の、精製中に得られたHIL-HPLCトレースを示す、非限定的な概略図を描く。
図2Bは、筋肉標的化複合体のSDS-PAGE分析の非限定的な画像を描く。
図3は、DTX-P-060を含む筋肉標的化複合体(DTX-C-008)の、DMPKの発現レベルの低減能を示す非限定的な概略図を描く。
図4A〜4Eは、ビヒクル実験と比べた、DTX-P-060を含む筋肉標的化複合体(DTX-C-008)の、in vivoでマウス筋組織中DMPKの発現レベルの低減能を示す、非限定的な概略図を描く。(N=3匹のC57Bl/6 WTマウス) 図4B〜4Cは、ビヒクル実験と比べた、DTX-P-060を含む筋肉標的化複合体(DTX-C-008)の、in vivoでマウス筋組織中DMPKの発現レベルの低減能を示す、非限定的な概略図を描く。(N=3匹のC57Bl/6 WTマウス) 図4D〜4Eは、ビヒクル実験と比べた、DTX-P-060を含む筋肉標的化複合体(DTX-C-008)の、in vivoでマウス筋組織中DMPKの発現レベルの低減能を示す、非限定的な概略図を描く。(N=3匹のC57Bl/6 WTマウス)
図5A〜5Bは、DTX-P-060を含む筋肉標的化複合体(DTX-C-008)の組織選択性を示す、非限定的な概略図を描く。DTX-P-060を含む筋肉標的化複合体(DTX-C-008)は、ビヒクル実験と比べて、in vivoでマウスの脳または脾臓組織中DMPKの発現レベルを低減しない。(N=3匹のC57Bl/6 WTマウス)
図6A〜6Fは、ビヒクル実験と比べた、DTX-P-060を含む筋肉標的化複合体(DTX-C-008)の、in vivoでマウス筋組織中DMPKの発現レベルの低減能を示す、非限定的な概略図を描く。(N=5匹のC57Bl/6 WTマウス) 図6C〜6Dは、ビヒクル実験と比べた、DTX-P-060を含む筋肉標的化複合体(DTX-C-008)の、in vivoでマウス筋組織中DMPKの発現レベルの低減能を示す、非限定的な概略図を描く。(N=5匹のC57Bl/6 WTマウス) 図6E〜6Fは、ビヒクル実験と比べた、DTX-P-060を含む筋肉標的化複合体(DTX-C-008)の、in vivoでマウス筋組織中DMPKの発現レベルの低減能を示す、非限定的な概略図を描く。(N=5匹のC57Bl/6 WTマウス)
図7A〜7Lは、ビヒクル実験と比べたおよびネイキッドDMPK ASO(DTX-P-060)と比べた、DTX-P-060を含む筋肉標的化複合体(DTX-C-012)の、in vivoでカニクイザル筋組織中DMPKの発現レベルの低減能を示す、非限定的な概略図を描く。(N=3匹のオスのカニクイザル) 図7C〜7Dは、ビヒクル実験と比べたおよびネイキッドDMPK ASO(DTX-P-060)と比べた、DTX-P-060を含む筋肉標的化複合体(DTX-C-012)の、in vivoでカニクイザル筋組織中DMPKの発現レベルの低減能を示す、非限定的な概略図を描く。(N=3匹のオスのカニクイザル) 図7E〜7Fは、ビヒクル実験と比べたおよびネイキッドDMPK ASO(DTX-P-060)と比べた、DTX-P-060を含む筋肉標的化複合体(DTX-C-012)の、in vivoでカニクイザル筋組織中DMPKの発現レベルの低減能を示す、非限定的な概略図を描く。(N=3匹のオスのカニクイザル) 図7G〜7Hは、ビヒクル実験と比べたおよびネイキッドDMPK ASO(DTX-P-060)と比べた、DTX-P-060を含む筋肉標的化複合体(DTX-C-012)の、in vivoカニクイザル筋組織中DMPKの発現レベルの低減能を示す、非限定的な概略図を描く。(N=3匹のオスのカニクイザル) 図7I〜7Jは、ビヒクル実験と比べたおよびネイキッドDMPK ASO(DTX-P-060)と比べた、DTX-P-060を含む筋肉標的化複合体(DTX-C-012)の、in vivoカニクイザル筋組織中DMPKの発現レベルの低減能を示す、非限定的な概略図を描く。(N=3匹のオスのカニクイザル) 図7K〜7Lは、ビヒクル実験と比べたおよびネイキッドDMPK ASO(DTX-P-060)と比べた、DTX-P-060を含む筋肉標的化複合体(DTX-C-012)の、in vivoカニクイザル筋組織中DMPKの発現レベルの低減能を示す、非限定的な概略図を描く。(N=3匹のオスのカニクイザル)
図8A〜8Bは、ビヒクル実験と比べたおよびネイキッドDMPK ASO(DTX-P-060)と比べた、DTX-P-060を含む筋肉標的化複合体(DTX-C-012)の、in vivoでカニクイザル平滑筋組織中DMPKの発現レベルの低減能を示す、非限定的な概略図を描く。(N=3匹のオスのカニクイザル)
図9A〜9Dは、DTX-P-060を含む筋肉標的化複合体(DTX-C-012)の組織選択性を示す、非限定的な概略図を描く。DMPK-ASOを含む筋肉標的化複合体は、ビヒクル実験と比べて、in vivoでカニクイザルの肝臓、腎臓、脳、または脾臓組織中のDMPKの発現レベルを低減しない。(N=3匹のオスのカニクイザル) 図9C〜9Dは、DTX-P-060を含む筋肉標的化複合体(DTX-C-012)の組織選択性を示す、非限定的な概略図を描く。DMPK-ASOを含む筋肉標的化複合体は、ビヒクル実験と比べて、in vivoでカニクイザルの肝臓、腎臓、脳、または脾臓組織中のDMPKの発現レベルを低減しない。(N=3匹のオスのカニクイザル)
図10は、カニクイザルにおける数個の組織型にわたって、正規化されたDMPK mRNA組織発現レベルを示す。(N=3匹のオスのカニクイザル)
図11A〜11Bは、ビヒクル実験と比べたおよびネイキッドDMPK ASO(DTX-P-060)と比べた、DTX-P-060を含む筋肉標的化複合体(DTX-C-008)の、DTX-C-008で投薬後最大28日間in vivoでマウス筋組織中DMPKの発現レベルの低減能を示す、非限定的な概略図を描く。
図12は、DTX-P-060を含む筋肉標的化複合体(DTX-C-012)の単回用量は、カニクイザルにおいて安全で許容されることを示す。(N=3匹のオスのカニクイザル)
発明の詳細な記載
本開示の側面は、ある分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド、ペプチド、小分子)が筋細胞に有益な効果を有し得るものの、かかる細胞を効果的に標的にすることは難航を極めるという認識に関する。本明細書に記載のとおり、本開示は、かかる課題を克服するために、分子ペイロードへ共有結合的に連結された筋標的化剤を含む複合体を提供する。いくつかの態様において、複合体は、例として、筋疾患を有するかまたはこれを有すると疑われる対象において、筋細胞における標的遺伝子の発現または活性をモジュレートする分子ペイロードを送達するのに特に有用である。例えば、いくつかの態様において、複合体は、ポンペ病、中心核ミオパチー、進行性骨化性線維異形成症、フリートライヒ運動失調症、またはデュシェンヌ型筋ジストロフィーを含む希少な筋疾患を有する対象を処置するために有用である。いくつかの態様において、処置される疾病に応じて、かかる複合体において異なる分子ペイロードが使用されてもよい。例えば、原因となっている突然変異がスプライシング欠陥を与える場合、オリゴヌクレオチドまたは他のペイロードは、スプライシング欠陥を修正するために使用されてもよい(例として、エキソンスキッピングを阻害するまたは選択的スプライシングを促進するオリゴヌクレオチド)。原因となっている突然変異が機能獲得型アレルをもたらす場合、オリゴヌクレオチド(例として、RNAi、PMO、ASO-gapmer)は、アレルの発現または活性を阻害するために使用されてもよい。いくつかの態様において、例として、突然変異が機能喪失型アレルをもたらす場合、ペイロードは、例として、アレルの野生型バージョンを発現するために、発現コンストラクトを含んでもよい。いくつかの態様において、ペイロードは、例として遺伝子編集によって、原因となっている欠陥を修正するためのマシナリー(例として、ガイド核酸、遺伝子編集酵素をコードする発現コンストラクト)を含んでもよい。
定義された用語の記載を含む本開示のさらなる側面は、以下に提供される。
Ｉ．定義
投与する(施す)こと:
本明細書に使用されるとき、用語「投与する(施す)こと」または「投与(施し)」は、生理学的におよび/または薬理学的に有用なやり方で対象へ複合体を提供すること(例として、対象における疾病を処置すること)を意味する。
およそ:
本明細書に使用されるとき、用語「およそ」または「約」は、関心のある1つ以上の値へ適用されるとき、規定された参照値と同様の値を指す。ある態様において、用語「およそ」または「約」は、別様に述べられない限りまたは文脈から明らかでない限り(かかる数字が実行可能な値の100％を超える場合を除く)、規定された参照値のプラスマイナス(超または未満)の15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、またはこれ未満に収まる広範な値を指す。
抗体:
本明細書に使用されるとき、用語「抗体」は、少なくとも1個の免疫グロブリン可変ドメインまたは少なくとも1個の抗原決定基、例として、抗原へ特異的に結合するパラトープを包含するポリペプチドを指す。いくつかの態様において、抗体は、完全長の抗体である。いくつかの態様において、抗体は、キメラ抗体である。いくつかの態様において、抗体は、ヒト化抗体である。しかしながら、いくつかの態様において、抗体は、Fabフラグメント、F(ab')2フラグメント、Fvフラグメント、またはscFvフラグメントである。いくつかの態様において、抗体は、ラクダ科の動物の抗体に由来するナノボディー、またはサメ抗体に由来するナノボディーである。いくつかの態様において、抗体は、二重特異性抗体である。いくつかの態様において、抗体は、ヒト生殖細胞系配列を有するフレームワークを含む。別の態様において、抗体は、IgG、IgG1、IgG2、IgG2A、IgG2B、IgG2C、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgM、およびIgEの定常領域からなる群から選択される重鎖定常領域を含む。いくつかの態様において、抗体は、重(H)鎖可変領域(本明細書中VHと略される)および/または軽(L)鎖可変領域(本明細書中VLと略される)を含む。いくつかの態様において、抗体は、定常領域、例としてFc領域を含む。免疫グロブリン定常領域は、重鎖または軽鎖定常領域を指す。ヒトIgG重鎖および軽鎖定常領域アミノ酸配列およびそれらの機能的バリエーションは知られている。重鎖に関し、いくつかの態様において本明細書に記載の抗体の重鎖は、アルファ(α)、デルタ(Δ)、イプシロン(ε)、ガンマ(γ)、またはミュー(μ)重鎖であり得る。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体の重鎖は、ヒトのアルファ(α)、デルタ(Δ)、イプシロン(ε)、ガンマ(γ)、またはミュー(μ)重鎖を含み得る。具体的な態様において、本明細書に記載の抗体は、ヒトのガンマ1 CH1、CH2、および/またはCH3ドメインを含む。いくつかの態様において、VHドメインのアミノ酸配列は、ヒトガンマ(γ)重鎖定常領域のアミノ酸配列、たとえば当該技術分野において知られているいずれの配列も含む。ヒト定常領域配列の非限定例は当該技術分野において記載されており、例として、米国特許第5,693,780号および上記のKabat E Aら(1991)を参照。いくつかの態様において、VHドメインは、本明細書に提供される可変鎖定常領域のいずれかと少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または少なくとも99％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、抗体は修飾されており、例として、グリコシル化、リン酸化、SUMO化、および/またはメチル化を介して修飾されている。いくつかの態様において、抗体は、1個以上の糖または炭水化物分子へ抱合されたグリコシル化抗体である。いくつかの態様において、1個以上の糖または炭水化物分子は、N-グリコシル化、O-グリコシル化、C-グリコシル化、グリピエーション(glypiation)(GPIアンカー付着)、および/またはホスホグリコシル化を介して抗体へ抱合されている。いくつかの態様において、1個以上の糖または炭水化物分子は、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、またはグリカンである。いくつかの態様において、1個以上の糖または炭水化物分子は、分枝オリゴ糖類または分枝グリカンである。いくつかの態様において、1個以上の糖または炭水化物分子は、マンノース単位、グルコース単位、N-アセチルグルコサミン単位、N-アセチルガラクトサミン単位、ガラクトース単位、フコース単位、またはホスホ脂質単位を包含する。いくつかの態様において、抗体は、リンカーポリペプチドまたは免疫グロブリン定常領域へ連結された本開示の1個以上の抗原結合性フラグメントを含むポリペプチドを含む構築物である。リンカーポリペプチドは、ペプチド結合によって結び合わされた2個以上のアミノ酸残基を含み、1個以上の抗原結合部と連結させるために使用される。リンカーポリペプチドの例は報告されている(例として、Holliger,P.,et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448;Poljak,R.J.,et al.(1994)Structure 2:1121-1123を参照)。またさらに、抗体は、1以上の他のタンパク質またはペプチドと、抗体もしくは抗体部分との共有結合または非共有結合の結び付きによって形成される、より大きな免疫接着分子の一部であってもよい。かかる免疫接着分子の例は、四量体scFv分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用(Kipriyanov,S.M.,et al.(1995)Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101)、ならびに二価のおよびビオチン化されたscFv分子を作製するためのシステイン残基、マーカーペプチド、およびC末ポリヒスチジンタグの使用(Kipriyanov,S.M.,et al.(1994)Mol.Immunol.31:1047-1058)を包含する。
CDR:
本明細書に使用されるとき、用語「CDR」は、抗体可変配列内の相補性決定領域を指す。重鎖および軽鎖の可変領域の各々において3つのCDRがあり、これらは可変領域の各々につきCDR1、CDR2、およびCDR3と指定される。用語「CDRセット」は、本明細書に使用されるとき、抗原に結合することが可能な単一の可変領域に生じる3つのCDRの一群を指す。これらのCDRの厳密な境界は、種々の系に従い異なって定義されている。Kabat(Kabat et al.,Sequence of Proteins of Immunological Interest(国立衛生研究所,Bethesda,Md.(1987)および(1991))によって記載される系は、抗体のいずれの可変領域へも適用可能な一義的な残基ナンバリング系を提供するのみならず、3つのCDRを定義する正確な残基境界をも提供する。これらのCDRは、Kabat CDRと称されることもある。CDRの下位部(Sub-portions)は、L1、L2、およびL3、またはH1、H2、およびH3と指定されることがあり、ここで「L」および「H」は夫々、軽鎖および重鎖領域を指定する。これらの領域は、Kabat CDRと重複する境界を有するChothia CDRと称されることもある。Kabat CDRと重複するCDRを定義する他の境界は、Padlan(FASEB J.9:133-139(1995))およびMacCallum(J Mol Biol 262(5):732-45(1996))によって記載されている。さらに他のCDR境界定義は、上の系の1つに厳重に従わなくてもよいが、それでもなおKabat CDRと重複することがあり、具体的な残基もしくは残基の群またはCDR全体でさえも抗原結合に有意に影響を及ぼすものではないという予測あるいは実験的知見を踏まえ、それらは短縮または伸長されてもよい。本明細書に使用される方法は、これらの系のいずれかに従って定義されるCDRを利用してもよいが、好ましい態様はKabatまたはChothiaに定義されるCDRを使用する。
CDR接合(-grafted)抗体:
用語「CDR接合抗体」は、マウス重鎖および軽鎖可変領域を有するがマウスCDRの1以上(例として、CDR3)がヒトCDR配列に置き換えられている抗体などの、ある種からの重鎖および軽鎖可変領域配列を含むが、そのVHおよび/またはVLのCDR領域の1以上の配列が別の種のCDR配列に置き換えられている抗体を指す。
キメラ抗体:
用語「キメラ抗体」は、ヒト定常領域へ連結されたマウス重鎖および軽鎖可変領域を有する抗体などの、ある種からの重鎖および軽鎖可変領域配列と別の種からの定常領域配列を含む抗体を指す。
相補的:
本明細書に使用されるとき、用語「相補的」は、2ヌクレオチド間または2組のヌクレオチド間の正確な対形成のための能力(capacity)を指す。とりわけ、相補的は、2ヌクレオチド間または2組のヌクレオチド間に結合をもたらす水素結合対形成の程度を特徴付ける用語である。例えば、ある位置のオリゴヌクレオチドの塩基が、対応する位置の標的核酸(例として、mRNA)の塩基と水素結合することが可能である場合、そのとき塩基は、その位置にて互いに相補的であると見なされる。塩基対合は、標準的なWatson-Crick塩基対合と非Watson-Crick塩基対合(例として、Wobble塩基対合およびHoogsteen塩基対合)との両方を包含してもよい。例えば、いくつかの態様において、相補的な塩基対合として、アデノシン型塩基(A)は、チミジン型塩基(T)またはウラシル型塩基(U)に相補的であり、シトシン型塩基(C)は、グアノシン型塩基(G)に相補的であり、3-ニトロピロールまたは5-ニトロインドールなどのユニバーサル塩基は、いずれのA、C、U、またはTとハイブリダイズし得、これらと相補的であると見なされる。イノシン(I)はまた、当該技術分野においてユニバーサル塩基であるとも見なされており、いずれのA、C、U、またはTに相補的であると見なされる。
保存アミノ酸置換:
本明細書に使用されるとき、「保存アミノ酸置換」は、アミノ酸置換がなされたタンパク質の相対的な電荷またはサイズの特徴を変更しないアミノ酸置換を指す。バリアントは、当業者に知られているポリペプチド配列を変更するための方法に従って調製され得、たとえば、かかる方法をまとめた参考文献、例として、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,J.Sambrook,et al.,eds.,Fourth Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,2012、またはCurrent Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel,et al.,eds.,John Wiley & Sons,Inc.,New Yorkから見出される。アミノ酸の保存的置換は、以下の群:(a)M、I、L、V;(b)F、Y、W;(c)K、R、H;(d)A、G;(e)S、T;(f)Q、N;および(g)E、D内のアミノ酸に対してなされる置換を包含する。
共有結合的に連結された(ている):
本明細書に使用されるとき、用語「共有結合的に連結された(ている)」は、少なくとも1個の共有結合を介して一緒に連結されている2個以上の分子の特徴を指す。いくつかの態様において、2個の分子は一緒に、分子間リンカーとして働く単結合(例として、ジスルフィド結合またはジスルフィド架橋)によって共有結合的に連結され得る。しかしながら、いくつかの態様において、複数の共有結合を通して2個以上の分子を一緒に結び合わせるリンカーとして働く分子を介して、2個以上の分子は一緒に、共有結合的に連結され得る。いくつかの態様において、リンカーは、切断可能なリンカーであってもよい。しかしながら、いくつかの態様において、リンカーは、切断不能なリンカーであってもよい。
交差反応すること:
本明細書に使用されるとき、および標的化剤(例として、抗体)の文脈において、用語「交差反応すること」は、同様のタイプまたはクラスの1種より多くの抗原(例として、複数のホモログ、パラログ、もしくはオルソログの抗原)へ、同様の親和性または結合活性で特異的に結合することが可能な剤の特性を指す。例えば、いくつかの態様において、同様のタイプまたはクラスのヒトおよび霊長目の非ヒト動物の抗原(例として、ヒトトランスフェリン受容体および霊長目の非ヒト動物のトランスフェリン受容体)に対して交差反応する抗体は、ヒト抗原および霊長目の非ヒト動物の抗原へ、同様の親和性または結合活性で結合することが可能である。いくつかの態様において、抗体は、同様のタイプまたはクラスのヒト抗原および齧歯類動物抗原に対して交差反応する。いくつかの態様において、抗体は、同様のタイプまたはクラスの齧歯類動物の抗原および霊長目の非ヒト動物の抗原に対して交差反応する。いくつかの態様において、抗体は、同様のタイプまたはクラスのヒト抗原、霊長目の非ヒト動物の抗原、および齧歯類動物の抗原に対して交差反応する。
疾患アレル:
本明細書に使用されるとき、用語「疾患アレル」は、アレルが疾患と相関するおよび/またはこれに直接的にまたは間接的に寄与するまたはこれを引き起こす、遺伝子の代替的な形態(例として、突然変異型)のいずれか1つを指す。疾患アレルは、野生型(非疾患)アレルと比べて、これらに限定されないが、挿入(例として、以下に記載の疾患関連反復)、欠失、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異およびスプライス部位突然変異を含む遺伝子変更を含んでもよい。いくつかの態様において、疾患アレルは、機能喪失型突然変異を有する。いくつかの態様において、疾患アレルは、機能獲得型突然変異を有する。いくつかの態様において、疾患アレルは、活性化突然変異をコードする(例として、構成的に活性であるタンパク質をコードする)。いくつかの態様において、疾患アレルは、劣性表現型を有する劣性アレルである。いくつかの態様において、疾患アレルは、優性表現型を有する優性アレルである。
疾患関連反復:
本明細書に使用されるとき、用語「疾患関連反復」は、反復ヌクレオチド配列の数ユニットが、遺伝的疾患と相関するおよび/またはこれに直接的にまたは間接的に寄与するまたはこれを引き起こす、ゲノムの場所での反復ヌクレオチド配列を指す。疾患関連反復の各反復単位は、長さが、2、3、4、5またはそれ以上のヌクレオチドであってもよい。例えば、いくつかの態様において、疾患関連反復は、ジヌクレオチド反復である。いくつかの態様において、疾患関連反復は、トリヌクレオチド反復である。いくつかの態様において、疾患関連反復は、テトラヌクレオチド反復である。いくつかの態様において、疾患関連反復は、ペンタヌクレオチド反復である。いくつかの態様において、疾患関連反復は、CAG反復、CTG反復、CUG反復、CGG反復、CCTG反復、またはそれらのいずれかのヌクレオチド相補体を含む。いくつかの態様において、疾患関連反復は、遺伝子の非コード部分にある。しかしながら、いくつかの態様において、疾患関連反復は、遺伝子のコード領域にある。いくつかの態様において、疾患関連反復は、正常な状態から、遺伝的疾患に直接的にまたは間接的に寄与するまたはこれを引き起こす長さへ、拡張される。いくつかの態様において、疾患関連反復は、RNA(例として、RNA転写産物)にある。いくつかの態様において、疾患関連反復は、DNA(例として、染色体、プラスミド)にある。いくつかの態様において、疾患関連反復は、生殖細胞系列細胞の染色体において拡張される。いくつかの態様において、疾患関連反復は、体細胞の染色体において拡張される。いくつかの態様において、疾患関連反復は、先天性発症に関連する数多の反復単位へ拡張される。いくつかの態様において、疾患関連反復は、疾患の小児期発症に関連する数多の反復単位へ拡張される。いくつかの態様において、疾患関連反復は、疾患の成人発症に関連する数多の反復単位へ拡張される。
フレームワーク:
本明細書に使用されるとき、用語「フレームワーク」または「フレームワーク配列」は、CDRを差し引いた可変領域の残りの配列を指す。CDR配列の厳密な定義が種々の系によって決定され得ることから、フレームワーク配列の意味は、相応に異なる解釈に依存する。6つのCDR(軽鎖のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3、ならびに重鎖のCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3)もまた、軽鎖および重鎖上のフレームワーク領域を各鎖上の4つの下位領域(FR1、FR2、FR3、およびFR4)に分け、ここでCDR1はFR1とFR2との間に、CDR2はFR2とFR3との間に、CDR3はFR3とFR4との間に位置付けられる。具体的な下位領域をFR1、FR2、FR3、またはFR4と特定しないフレームワーク領域は、他によって言及されるとき、天然に存在する単一の免疫グロブリン鎖の可変領域内の組み合わされたFR(複数)を表す。本明細書に使用されるとき、FRは4つの下位領域のうち1つを表し、FR(複数)はフレームワーク領域を含有する4つの下位領域のうち2つ以上を表す。ヒト重鎖および軽鎖アクセプター配列は、当該技術分野において知られている。一態様において、当該技術分野において知られているアクセプター配列は、本明細書に開示の抗体に使用されていてもよい。
ヒト抗体:
用語「ヒト抗体」は、本明細書に使用されるとき、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を包含することが意図される。本開示のヒト抗体は、例えばCDR、とりわけCDR3において、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基(例として、in vitroでのランダム変異誘発もしくは部位特異的変異誘発によってか、またはin vivoでの体細胞変異によって導入された突然変異)を包含していてもよい。しかしながら、用語「ヒト抗体」は、本明細書に使用されるとき、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列上へ接合された抗体を包含することは意図されない。
ヒト化抗体:
用語「ヒト化抗体」は、非ヒト種(例として、マウス)からの重鎖および軽鎖の可変領域配列を含むが、VH配列および/またはVL配列の少なくとも一部がより「ヒト様」に、すなわち、ヒト生殖細胞系可変配列とより同様なものに変更された抗体を指す。ヒト化抗体のあるタイプは、ヒトCDR配列が非ヒトVHおよびVL配列上へ導入されて対応する非ヒトCDR配列と置き換えられたCDR接合抗体である。一態様において、ヒト化された抗トランスフェリン受容体抗体および抗原結合部分が提供される。かかる抗体は、既存のハイブリドーマ技術、これに続くin vitroの遺伝子工学を使用するヒト化(KasaianらのPCT刊行物第WO 2005/123126 A2号に開示されたものなど)を使用してマウス抗トランスフェリン受容体モノクローナル抗体を得ることによって生成されてもよい。
内在化する細胞表面受容体:
本明細書に使用されるとき、用語「内在化する細胞表面受容体」は、例として、外部刺激(例として、受容体へ結合するリガンド)の際、細胞によって内在化される細胞表面受容体を指す。いくつかの態様において、内在化する細胞表面受容体は、エンドサイトーシスによって内在化される。いくつかの態様において、内在化する細胞表面受容体は、クラスリン媒介エンドサイトーシスによって内在化される。しかしながら、いくつかの態様において、内在化する細胞表面受容体は、クラスリンに依存しない経路、例えば、食作用、マクロピノサイトーシス、カベオラ-およびラフト-媒介取り込み、またはクラスリンに依存しない構成的エンドサイトーシスなどによって内在化される。いくつかの態様において、内在化する細胞表面受容体は、細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、および/または細胞外ドメインを含み、これらは任意にさらにリガンド結合ドメインを含む。いくつかの態様において、細胞表面受容体は、リガンド結合後に細胞によって内在化されるようになる。いくつかの態様において、リガンドは、筋標的化剤または筋標的化抗体であってもよい。いくつかの態様において、内在化する細胞表面受容体は、トランスフェリン受容体である。
単離された抗体:
「単離された抗体」は、本明細書に使用されるとき、異なる抗原特異性を有する他の抗体が実質的にない抗体を指すことが意図される(例として、トランスフェリン受容体に特異的に結合する単離された抗体は、トランスフェリン受容体以外の抗原に特異的に結合する抗体が実質的にない)。しかしながら、トランスフェリン受容体複合体に特異的に結合する単離された抗体は、他の種からのトランスフェリン受容体分子などの他の抗原への交差反応性を有していてもよい。その上、単離された抗体は、他の細胞の材料および/または化学物質が実質的になくてもよい。
Kabatナンバリング:
用語「Kabatナンバリング」、「Kabat定義」、および「Kabat標識化」は本明細書中、互換的に使用される。これらの用語は、当該技術分野において認識されているが、抗体またはその抗原結合部分の重鎖および軽鎖可変領域中の他のアミノ酸残基より可変(すなわち、高可変)であるアミノ酸残基をナンバリングする系を指す(Kabat et al.(1971)Ann.NY Acad,Sci.190:382-391および、Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)。重鎖可変領域において、超可変領域は、CDR1につきアミノ酸位置31〜35、CDR2につきアミノ酸位置50〜65、およびCDR3につきアミノ酸位置95〜102に及ぶ。軽鎖可変領域において、超可変領域は、CDR1につきアミノ酸位置24〜34、CDR2につきアミノ酸位置50〜56、およびCDR3につきアミノ酸位置89〜97に及ぶ。
分子ペイロード:
本明細書に使用されるとき、用語「分子ペイロード」は、生物学的結果(biological outcome)をモジュレートするよう機能する分子または種を指す。いくつかの態様において、分子ペイロードは、筋標的化剤へ連結されているか、または筋標的化剤へ別様に結び付けられている。いくつかの態様において、分子ペイロードは、小分子、タンパク質、ペプチド、核酸、またはオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DNA配列の転写をモジュレートするよう、タンパク質の発現をモジュレートするよう、またはタンパク質の活性をモジュレートするよう機能する。いくつかの態様において、分子ペイロードは、標的遺伝子と相補性のある領域を有する鎖を含むオリゴヌクレオチドである。
筋疾患遺伝子:
本明細書に使用されるとき、用語「筋疾患遺伝子」は、筋疾患と相関するおよび/またはこれに直接的にまたは間接的に寄与するまたはこれを引き起こす、少なくとも1つの疾患アレルを有する遺伝子を指す。いくつかの態様において、筋疾患は、希少疾患であり、例として、National Center for Advancing Translational Sciences(NCATS)のプログラムであるGenetic and Rare Diseases Information Center(GARD)によって定義されるものである。いくつかの態様において、筋疾患は、200,000人未満を冒すものとして特徴づけられる希少疾患である。いくつかの態様において、筋疾患は、単一遺伝子疾患である。いくつかの態様において、筋疾患遺伝子は、表１に列挙された遺伝子である。
筋標的化剤:
本明細書に使用されるとき、用語「筋標的化剤」は、筋細胞上に発現されている抗原へ特異的に結合する分子を指す。筋細胞中または筋細胞上の抗原は、膜タンパク質、例えば、内在性膜タンパク質または表在性膜タンパク質であってもよい。典型的には、筋標的化剤は、筋細胞中への筋標的化剤(および結び付けられたいずれの分子ペイロード)の内在化を容易にさせる筋細胞上の抗原へ特異的に結合する。いくつかの態様において、筋標的化剤は、筋肉上の内在化する細胞表面受容体へ特異的に結合し、受容体媒介内在化を通して筋細胞中へ内在化されることが可能である。いくつかの態様において、筋標的化剤は、小分子、タンパク質、ペプチド、核酸(例として、アプタマー)、または抗体である。いくつかの態様において、筋標的化剤は、分子ペイロードへ連結されている。
筋標的化抗体:
本明細書に使用されるとき、用語「筋標的化抗体」は、筋細胞中または筋細胞上に見出される抗原へ特異的に結合する抗体である筋標的化剤を指す。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、筋細胞中への筋標的化抗体(および結び付けられたいずれの分子ペイロード)の内在化を容易にする筋細胞上の抗原へ特異的に結合する。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、筋細胞上に存在する、内在化する細胞表面受容体へ特異的に結合する。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、トランスフェリン受容体へ特異的に結合する抗体である。
オリゴヌクレオチド:
本明細書に使用されるとき、用語「オリゴヌクレオチド」は、長さが最大200ヌクレオチドまでのオリゴマーの核酸化合物を指す。オリゴヌクレオチドの例は、これらに限定されないが、RNAiオリゴヌクレオチド(例として、siRNA、shRNA)、マイクロRNA、gapmer、mixmer、ホスホロジアミダイトモルホリノ、ペプチド核酸、アプタマー、ガイド核酸(例として、Cas9ガイドRNA)等々を包含する。オリゴヌクレオチドは一本鎖または二本鎖であってもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、1個以上の修飾ヌクレオチド(例として、2'-O-メチル糖修飾、プリンまたはピリミジン修飾)を含んでいてもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、1個以上の修飾ヌクレオチド間連結を含んでいてもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、RpまたはSpの立体化学配置にあってもよい1個以上のホスホロチオアート連結を含んでいてもよい。
組換え抗体:
用語「組換えヒト抗体」は、本明細書に使用されるとき、組換え手段によって調製、発現、創出、もしくは単離されたすべてのヒト抗体、たとえば、宿主細胞中へトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体(本開示により詳細に記載される)、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗体(Hoogenboom H.R.,(1997)TIB Tech.15:62-70;Azzazy H.,and Highsmith W.E.,(2002)Clin.Biochem.35:425-445;Gavilondo J.V.,and Larrick J.W.(2002)BioTechniques 29:128-145;Hoogenboom H.,and Chames P.(2000)Immunology Today 21:371-378)、ヒト免疫グロブリン遺伝子トランスジェニック動物(例として、マウス)から単離された抗体(例として、Taylor,L.D.,et al.(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295;Kellermann S-A.,and Green L.L.(2002)Current Opinion in Biotechnology 13:593-597;Little M.et al(2000)Immunology Today 21:364-370を参照)、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のDNA配列とのスプライシングを伴ういずれの他の手段によって調製、発現、創出、もしくは単離された抗体を包含することが意図される。かかる組換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。しかしながら、ある態様において、かかる組換えヒト抗体は、in vitroでの変異誘発(または、ヒトIg配列トランスジェニック動物が使用されるとき、in vivoでの体細胞変異誘発)へ供され、よって、組換え抗体のVHおよびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系のVH配列およびVL配列に由来しかつこれに関するとはいえ、in vivoでのヒト抗体の生殖細胞系列レパートリー内には天然に存在しないこともある配列である。本開示の一態様は、当該技術分野において周知である技法を使用して、たとえば、これらに限定されないが、ヒトIgファージライブラリ(たとえば、JermutusらのPCT刊行物第WO 2005/007699 A2号に開示されたもの)を使用する技法を使用して生成され得るヒトトランスフェリン受容体に結合することが可能な完全ヒト抗体を提供する。
相補性のある領域:
本明細書に使用されるとき、用語「相補性のある領域」は、2つのヌクレオチド配列が生理学的な条件下(例として、細胞中)相互にアニーリングすることが可能であるような、同族の(cognate)ヌクレオチド配列(例として、標的核酸のヌクレオチド配列)に充分に相補的であるヌクレオチド配列(例として、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列)を指す。いくつかの態様において、相補性のある領域は、標的核酸の同族のヌクレオチド配列に完全に相補的である。しかしながら、いくつかの態様において、相補性のある領域は、標的核酸の同族のヌクレオチド配列に部分的に相補的(例として、少なくとも80％、90％、95％、または99％相補性)である。いくつかの態様において、相補性のある領域は、標的核酸の同族のヌクレオチド配列と比較して1個、2個、3個、または4個のミスマッチを含有する。
特異的に結合する:
本明細書に使用されるとき、用語「特異的に結合する」は、結合アッセイまたは他の結合に関する文脈(binding context)において、分子が、適切な対照から結合パートナーを区別するために使用され得る親和性または結合活性の程度での、分子の、結合パートナーへの結合能を指す。抗体に関し、用語「特異的に結合する」は、親和性または結合活性の程度で(例として、本明細書に記載のとおり、抗原への結合を通してある細胞(例として、筋細胞)への優先的な標的化を許容する程度で)、適切な参照抗原、または抗体が他の抗原から特定の抗原を区別するために使用され得る抗原と比較して、抗体が特定の抗原へ結合する能力を指す。いくつかの態様において、抗体が標的へ結合する際少なくとも約10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、またはこれ未満のKDを有する場合、抗体は標的へ特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体が、トランスフェリン受容体、例として、トランスフェリン受容体の先端ドメインのエピトープへ特異的に結合する。
対象:
本明細書に使用されるとき、用語「対象」は、哺乳動物を指す。いくつかの態様において、対象は、霊長目の非ヒト動物または齧歯類動物である。いくつかの態様において、対象は、ヒトである。いくつかの態様において、対象は、疾患を有するかまたは疾患を有すると疑われる患者/患畜(patient)、例として、ヒト患者である。いくつかの態様において、対象は、筋疾患(例として、表1に提供されたいずれかの疾患)を有するかまたはFOPを有すると疑われるヒト患者である。
トランスフェリン受容体:
本明細書に使用されるとき、用語「トランスフェリン受容体」(またTFRC、CD71、p90、またはTFR1としても知られている)は、エンドサイトーシスによる鉄取り込みを容易にするためのトランスフェリンへ結合する、内在化する細胞表面受容体を指す。いくつかの態様において、トランスフェリン受容体は、ヒト(NCBI Gene ID 7037)、霊長目の非ヒト動物(例として、NCBI Gene ID 711568もしくはNCBI Gene ID 102136007)、または齧歯類の動物(例として、NCBI Gene ID 22042)を起源としていてもよい。加えて、受容体の種々のアイソフォームをコードした複数のヒト転写産物バリアントが(例として、GenBank RefSeq受託番号:NP_001121620.1、NP_003225.2、NP_001300894.1、およびNP_001300895.1の注釈付きのものであるように)特徴付けられている。
II．複合体
本明細書に提供されるのは、標的化剤、例として、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗体を含む複合体である。いくつかの態様において、複合体は、オリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結された筋標的化抗体を含む。複合体は、単一の抗原部位に特異的に結合する抗体、または同じ抗原上もしくは異なる抗原上に存在していてもよい少なくとも2つの抗原部位へ結合する抗体を含んでいてもよい。複合体は、少なくとも1つの遺伝子、タンパク質、および/または核酸の活性あるいは機能をモジュレートするために使用されてもよい。いくつかの態様において、複合体とともに存在する分子ペイロードは、遺伝子、タンパク質、および/または核酸のモジュレーションを担う。分子ペイロードは、細胞中の遺伝子、タンパク質、および/または核酸の活性あるいは機能をモジュレートすることが可能な、小分子、タンパク質、核酸、オリゴヌクレオチド、あるいはいずれの分子実体であってもよい。いくつかの態様において、分子ペイロードは、筋細胞における筋疾患アレルを標的にするオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、複合体は、分子ペイロード(例として、筋疾患アレルを標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチド)へ共有結合的に連結された、筋標的化剤(例として、抗トランスフェリン受容体抗体)を含む。
いくつかの態様において、複合体は、分子ペイロードが表1で提供された対応する遺伝子の活性に影響する筋疾患を、処置するために有用である。例えば、疾病に応じて、分子ペイロードは、遺伝子の転写または発現をモジュレート(例として、減少、増大)、遺伝子によってコードされるタンパク質の発現をモジュレート、またはコードされたタンパク質の活性をモジュレートしてもよい。いくつかの態様において、分子ペイロードは、表1に提供された標的遺伝子と相補性のある領域を有する鎖を含むオリゴヌクレオチドである。
表1−筋疾患および対応する遺伝子のリスト
Figure 2021533198

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Ａ．筋標的化剤
本開示のいくつかの側面は、筋標的化剤、例として、分子ペイロードを筋細胞へ送達するための筋標的化剤を提供する。いくつかの態様において、かかる筋標的化剤は、例として、筋細胞上の抗原への特異的な結合を介して、筋細胞へ結合すること、および結び付けられた分子ペイロードを筋細胞へ送達することが可能である。いくつかの態様において、分子ペイロードは、筋標的化剤へ結合されて(例として、共有結合的に結合されて)おり、筋標的化剤が筋細胞上の抗原へ結合した際、例としてエンドサイトーシスを介して、筋細胞中へ内在化される。様々なタイプの筋標的化剤が本開示に従い使用されてもよいことは解されるはずである。例えば、筋標的化剤は、核酸(例として、DNAまたはRNA)、ペプチド(例として、抗体)、脂質(例として、マイクロベシクル)、または糖部(例として、多糖類)を含んでいてもよく、またはこれらからなっていてもよい。例示の筋標的化剤は本明細書中さらに詳細に記載されているが、しかしながら、本明細書に提供される例示の筋標的化剤が限定されることを意図していないことは解されるはずである。
本開示のいくつかの側面は、骨格筋、平滑筋、または心筋などの筋肉上の抗原へ特異的に結合する筋標的化剤を提供する。いくつかの態様において、本明細書に提供される筋標的化剤のいずれも、骨格筋細胞、平滑筋細胞、および/または心筋細胞上の抗原へ結合する(例として、特異的に結合する)。
筋肉特異的細胞表面認識要素(例として、細胞膜タンパク質)との相互作用によって、組織局在化と筋細胞への選択的取り込みとの両方が達成され得る。いくつかの態様において、筋肉の取り込みトランスポーターの基質である分子は、分子ペイロードを筋組織中へ送達するのに有用である。筋肉表面認識要素への結合、これに続くエンドサイトーシスは、抗体などの巨大分子さえも筋細胞へ侵入できる(enter)ようにし得る。別の例として、トランスフェリンまたは抗トランスフェリン受容体抗体へ抱合された分子ペイロードは、トランスフェリン受容体への結合を介し筋細胞によって取り入れられ得、次いで、例としてクラスリン媒介エンドサイトーシスを介し、形質膜陥入され(endocytosed)てもよい。
筋標的化剤の使用は、他の組織において効果に関連する毒性を低減しつつ、筋肉中の分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド)を濃縮するのに有用なこともある。いくつかの態様において、筋標的化剤は、対象内の別の細胞型と比較して、筋細胞中の結合された分子ペイロードを濃縮させる。いくつかの態様において、筋標的化剤は、筋細胞(例として、骨格筋細胞、平滑筋細胞、または心筋細胞)中の結合された分子ペイロードを、非筋細胞(例として、肝臓細胞、神経細胞、血液細胞、または脂肪細胞)中の量より少なくとも1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、または100倍多い量で濃縮する。いくつかの態様において、筋標的化剤へ結合された場合の分子ペイロードの対象における毒性は、これが対象へ送達されたとき、少なくとも1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％、または95％低減される。
いくつかの態様において、筋肉選択性を獲得するために、筋肉認識要素(例として、筋細胞抗原)が要されることもある。一例として、筋標的化剤は、筋肉特異的取り込みトランスポーターの基質である小分子であってもよい。別の例として、筋標的化剤は、トランスポーター媒介エンドサイトーシスを介して筋細胞へ侵入する抗体であってもよい。別の例として、筋標的化剤は、筋細胞上の細胞表面受容体へ結合するリガンドであってもよい。トランスポーターをベースとしたアプローチが細胞侵入への直通路を提供するのに対し、受容体をベースとした標的化が所望の作用部位に達するために刺激されたエンドサイトーシスを伴うこともあることは解されるはずである。
本開示に包含される筋細胞は、これらに限定されないが、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、筋芽細胞およびミオサイトを含む。
ｉ．筋標的化抗体
いくつかの態様において、筋標的化剤は、抗体である。一般に、それらの標的抗原に対する抗体の高い特異性は、筋細胞(例として、骨格筋細胞、平滑筋細胞、および/または心筋細胞)を選択的に標的にする潜在力を提供する。この特異性はまた、オフターゲット毒性(off-target toxicity)を限定することもある。筋細胞の表面抗原を標的にすることが可能である抗体の例は報告されており、かつ本開示の範囲内にある。例えば、筋細胞の表面を標的にする抗体は、Arahata K.,et al.“Immunostaining of skeletal and cardiac muscle surface membrane with antibody against Duchenne muscular dystrophy peptide”Nature 1988;333:861-3;Song K.S.,et al.“Expression of caveolin-3 in skeletal,cardiac,and smooth muscle cells.Caveolin-3 is a component of the sarcolemma and co-fractionates with dystrophin and dystrophin-associated glycoproteins”J Biol Chem 1996;271:15160-5;およびWeisbart R.H.et al.,“Cell type specific targeted intracellular delivery into muscle of a monoclonal antibody that binds myosin IIb”Mol Immunol.2003 Mar,39(13):78309に記載されている;これらの各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
ａ．抗トランスフェリン受容体抗体
本開示のいくつかの側面は、トランスフェリン受容体、例として抗トランスフェリン受容体抗体へ結合する剤は筋細胞を標的にすることが可能であるという認識に基づく。トランスフェリン受容体は、細胞膜を越えてトランスフェリンを輸送し細胞内鉄レベルの調節およびホメオスタシスに加わる内在化する細胞表面受容体である。本開示のいくつかの側面は、トランスフェリン受容体へ結合することが可能なトランスフェリン受容体結合タンパク質を提供する。結果的に、本開示の側面は、トランスフェリン受容体へ結合する結合タンパク質(例として、抗体)を提供する。いくつかの態様において、トランスフェリン受容体へ結合する結合タンパク質は、結合されたいずれの分子ペイロードと共に、筋細胞中へ内在化される。本明細書に使用されるとき、トランスフェリン受容体へ結合する抗体は、抗トランスフェリン受容体抗体と称されることもある。トランスフェリン受容体へ結合する、例として特異的に結合する抗体は、トランスフェリン受容体へ結合した際、例として受容体媒介エンドサイトーシスを通して、細胞中へ内在化されてもよい。
抗トランスフェリン受容体抗体が、知られている数種の方法論、例としてファージディスプレーを使用するライブラリ設計を使用して、産生、合成、および/または誘導体化されてもよいことは解されるはずである。例示の方法論は当該技術分野において特徴付けられており、参照により組み込まれる(Diez,P.et al.“High-throughput phage-display screening in array format”,Enzyme and microbial technology,2015,79,34-41.;Christoph M.H.and Stanley,J.R.“Antibody Phage Display:Technique and Applications”J Invest Dermatol.2014,134:2.;Engleman,Edgar(Ed.)“Human Hybridomas and Monoclonal Antibodies.”1985,Springer)。他の態様において、抗トランスフェリン抗体はこれまでに特徴付けられているかまたは開示されている。トランスフェリン受容体へ特異的に結合する抗体は当該技術分野において知られている(例として、米国特許第4,364,934号、12/4/1979出願、“Monoclonal antibody to a human early thymocyte antigen and methods for preparing same”;米国特許第8,409,573号、6/14/2006出願、“Anti-CD71 monoclonal antibodies and uses thereof for treating malignant tumor cells”;米国特許第9,708,406号、5/20/2014出願、“Anti-transferrin receptor antibodies and methods of use”;米国特許第9,611,323号、12/19/2014出願、“Low affinity blood brain barrier receptor antibodies and uses therefor”; WO 2015/098989、12/24/2014出願、“Novel anti-Transferrin receptor antibody that passes through blood-brain barrier”;Schneider C.et al.“Structural features of the cell surface receptor for transferrin that is recognized by the monoclonal antibody OKT9.”J Biol Chem.1982,257:14,8516-8522.;Lee et al.“Targeting Rat Anti-Mouse Transferrin Receptor Monoclonal Antibodies through Blood-Brain Barrier in Mouse”2000,J Pharmacol.Exp.Ther.,292:1048-1052を参照)。
いずれの適切な抗トランスフェリン受容体抗体も、本明細書に開示の複合体に使用されてよい。抗トランスフェリン受容体抗体の例は、関連する参照エピトープおよび結合エピトープも含め、表2中に列挙されている。いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体は、本明細書に提供される抗トランスフェリン受容体抗体、例として、表2中に列挙された抗トランスフェリン受容体抗体のいずれの相補性決定領域(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3)をも含む。
表2−関連する参照エピトープおよび結合エピトープ情報も包含する、抗トランスフェリン受容体抗体クローンのリスト
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Figure 2021533198


Figure 2021533198
いくつかの態様において、筋標的化剤は、抗トランスフェリン受容体抗体である。いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体は、本明細書に開示のとおりのアミノ酸配列を有するトランスフェリンタンパク質へ特異的に結合する。いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体は、トランスフェリン受容体のいずれの細胞外エピトープまたは抗体へ晒されるようになるエピトープ(先端ドメイン、トランスフェリン結合ドメイン、およびプロテアーゼ様ドメインを包含する)へ特異的に結合してもよい。いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体は、アミノ酸C89〜F760の範囲にある配列番号1〜3に提供されるとおりの、ヒトまたは霊長目の非ヒト動物のトランスフェリン受容体のアミノ酸セグメントへ結合する。いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体は、少なくとも約10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、またはこれ未満の結合親和性で特異的に結合する。本明細書において使用される抗トランスフェリン受容体抗体は、結合について、トランスフェリン受容体へ10-3M、10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、またはこれ未満で結合する他の抗トランスフェリン受容体抗体(例として、OKT9、8D3)と競合することが可能であってもよい。
NCBI配列NP_003225.2(トランスフェリン受容体タンパク質1アイソフォーム1、homo sapiens)に対応する、ヒトトランスフェリン受容体アミノ酸配列の例は、以下のとおりである:
MMDQARSAFSNLFGGEPLSYTRFSLARQVDGDNSHVEMKLAVDEEENADNNTKANVTKPKRCSGSICYGTIAVIVFFLIGFMIGYLGYCKGVEPKTECERLAGTESPVREEPGEDFPAARRLYWDDLKRKLSEKLDSTDFTGTIKLLNENSYVPREAGSQKDENLALYVENQFREFKLSKVWRDQHFVKIQVKDSAQNSVIIVDKNGRLVYLVENPGGYVAYSKAATVTGKLVHANFGTKKDFEDLYTPVNGSIVIVRAGKITFAEKVANAESLNAIGVLIYMDQTKFPIVNAELSFFGHAHLGTGDPYTPGFPSFNHTQFPPSRSSGLPNIPVQTISRAAAEKLFGNMEGDCPSDWKTDSTCRMVTSESKNVKLTVSNVLKEIKILNIFGVIKGFVEPDHYVVVGAQRDAWGPGAAKSGVGTALLLKLAQMFSDMVLKDGFQPSRSIIFASWSAGDFGSVGATEWLEGYLSSLHLKAFTYINLDKAVLGTSNFKVSASPLLYTLIEKTMQNVKHPVTGQFLYQDSNWASKVEKLTLDNAAFPFLAYSGIPAVSFCFCEDTDYPYLGTTMDTYKELIERIPELNKVARAAAEVAGQFVIKLTHDVELNLDYERYNSQLLSFVRDLNQYRADIKEMGLSLQWLYSARGDFFRATSRLTTDFGNAEKTDRFVMKKLNDRVMRVEYHFLSPYVSPKESPFRHVFWGSGSHTLPALLENLKLRKQNNGAFNETLFRNQLALATWTIQGAANALSGDVWDIDNEF(配列番号1)。
NCBI配列NP_001244232.1(トランスフェリン受容体タンパク質1、Macaca mulatta)に対応する、霊長目の非ヒト動物トランスフェリン受容体アミノ酸配列の例は、以下のとおりである:
MMDQARSAFSNLFGGEPLSYTRFSLARQVDGDNSHVEMKLGVDEEENTDNNTKPNGTKPKRCGGNICYGTIAVIIFFLIGFMIGYLGYCKGVEPKTECERLAGTESPAREEPEEDFPAAPRLYWDDLKRKLSEKLDTTDFTSTIKLLNENLYVPREAGSQKDENLALYIENQFREFKLSKVWRDQHFVKIQVKDSAQNSVIIVDKNGGLVYLVENPGGYVAYSKAATVTGKLVHANFGTKKDFEDLDSPVNGSIVIVRAGKITFAEKVANAESLNAIGVLIYMDQTKFPIVKADLSFFGHAHLGTGDPYTPGFPSFNHTQFPPSQSSGLPNIPVQTISRAAAEKLFGNMEGDCPSDWKTDSTCKMVTSENKSVKLTVSNVLKETKILNIFGVIKGFVEPDHYVVVGAQRDAWGPGAAKSSVGTALLLKLAQMFSDMVLKDGFQPSRSIIFASWSAGDFGSVGATEWLEGYLSSLHLKAFTYINLDKAVLGTSNFKVSASPLLYTLIEKTMQDVKHPVTGRSLYQDSNWASKVEKLTLDNAAFPFLAYSGIPAVSFCFCEDTDYPYLGTTMDTYKELVERIPELNKVARAAAEVAGQFVIKLTHDTELNLDYERYNSQLLLFLRDLNQYRADVKEMGLSLQWLYSARGDFFRATSRLTTDFRNAEKRDKFVMKKLNDRVMRVEYYFLSPYVSPKESPFRHVFWGSGSHTLSALLESLKLRRQNNSAFNETLFRNQLALATWTIQGAANALSGDVWDIDNEF(配列番号2)。
NCBI配列XP_005545315.1(トランスフェリン受容体タンパク質1、Macaca fascicularis)に対応する、霊長目の非ヒト動物トランスフェリン受容体アミノ酸配列の例は、以下のとおりである:
MMDQARSAFSNLFGGEPLSYTRFSLARQVDGDNSHVEMKLGVDEEENTDNNTKANGTKPKRCGGNICYGTIAVIIFFLIGFMIGYLGYCKGVEPKTECERLAGTESPAREEPEEDFPAAPRLYWDDLKRKLSEKLDTTDFTSTIKLLNENLYVPREAGSQKDENLALYIENQFREFKLSKVWRDQHFVKIQVKDSAQNSVIIVDKNGGLVYLVENPGGYVAYSKAATVTGKLVHANFGTKKDFEDLDSPVNGSIVIVRAGKITFAEKVANAESLNAIGVLIYMDQTKFPIVKADLSFFGHAHLGTGDPYTPGFPSFNHTQFPPSQSSGLPNIPVQTISRAAAEKLFGNMEGDCPSDWKTDSTCKMVTSENKSVKLTVSNVLKETKILNIFGVIKGFVEPDHYVVVGAQRDAWGPGAAKSSVGTALLLKLAQMFSDMVLKDGFQPSRSIIFASWSAGDFGSVGATEWLEGYLSSLHLKAFTYINLDKAVLGTSNFKVSASPLLYTLIEKTMQDVKHPVTGRSLYQDSNWASKVEKLTLDNAAFPFLAYSGIPAVSFCFCEDTDYPYLGTTMDTYKELVERIPELNKVARAAAEVAGQFVIKLTHDTELNLDYERYNSQLLLFLRDLNQYRADVKEMGLSLQWLYSARGDFFRATSRLTTDFRNAEKRDKFVMKKLNDRVMRVEYYFLSPYVSPKESPFRHVFWGSGSHTLSALLESLKLRRQNNSAFNETLFRNQLALATWTIQGAANALSGDVWDIDNEF(配列番号3)。
NCBI配列NP_001344227.1(トランスフェリン受容体タンパク質1、mus musculus)に対応する、マウストランスフェリン受容体アミノ酸配列の例は、以下のとおりである:
MMDQARSAFSNLFGGEPLSYTRFSLARQVDGDNSHVEMKLAADEEENADNNMKASVRKPKRFNGRLCFAAIALVIFFLIGFMSGYLGYCKRVEQKEECVKLAETEETDKSETMETEDVPTSSRLYWADLKTLLSEKLNSIEFADTIKQLSQNTYTPREAGSQKDESLAYYIENQFHEFKFSKVWRDEHYVKIQVKSSIGQNMVTIVQSNGNLDPVESPEGYVAFSKPTEVSGKLVHANFGTKKDFEELSYSVNGSLVIVRAGEITFAEKVANAQSFNAIGVLIYMDKNKFPVVEADLALFGHAHLGTGDPYTPGFPSFNHTQFPPSQSSGLPNIPVQTISRAAAEKLFGKMEGSCPARWNIDSSCKLELSQNQNVKLIVKNVLKERRILNIFGVIKGYEEPDRYVVVGAQRDALGAGVAAKSSVGTGLLLKLAQVFSDMISKDGFRPSRSIIFASWTAGDFGAVGATEWLEGYLSSLHLKAFTYINLDKVVLGTSNFKVSASPLLYTLMGKIMQDVKHPVDGKSLYRDSNWISKVEKLSFDNAAYPFLAYSGIPAVSFCFCEDADYPYLGTRLDTYEALTQKVPQLNQMVRTAAEVAGQLIIKLTHDVELNLDYEMYNSKLLSFMKDLNQFKTDIRDMGLSLQWLYSARGDYFRATSRLTTDFHNAEKTNRFVMREINDRIMKVEYHFLSPYVSPRESPFRHIFWGSGSHTLSALVENLKLRQKNITAFNETLFRNQLALATWTIQGVANALSGDIWNIDNEF(配列番号4)。
いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体は、以下のとおりの受容体のアミノ酸セグメント:
FVKIQVKDSAQNSVIIVDKNGRLVYLVENPGGYVAYSKAATVTGKLVHANFGTKKDFEDLYTPVNGSIVIVRAGKITFAEKVANAESLNAIGVLIYMDQTKFPIVNAELSFFGHAHLGTGDPYTPGFPSFNHTQFPPSRSSGLPNIPVQTISRAAAEKLFGNMEGDCPSDWKTDSTCRMVTSESKNVKLTVSNVLKE(配列番号5)へ結合し、トランスフェリン受容体とトランスフェリンおよび/またはヒトヘモクロマトーシスタンパク質(またHFEとしても知られている)との間の結合相互作用を阻害しない。
適切な方法論は、例として、組換えDNAプロトコルの使用を通じて、抗体、抗体フラグメント、もしくは抗原結合剤を得るか、および/または産生するために使用されてもよい。いくつかの態様において、抗体はまた、ハイブリドーマの生成を通しても産生されてよい(例として、Kohler, G and Milstein, C.“Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity”Nature,1975,256:495-497を参照)。関心のある抗原は、いずれの型または実体の、例として、組換え型もしくは天然に存在する型または実体の免疫原として使用されてもよい。ハイブリドーマは、標準的な方法、例としてELISAスクリーニングを使用してスクリーニングされることで、具体的な抗原を標的にする抗体を産生する少なくとも1個のハイブリドーマが見出される。抗体はまた、抗体を発現するタンパク質発現ライブラリ(例として、ファージディスプレーライブラリ)のスクリーニングを通しても産生されてよい。ファージディスプレーライブラリ設計はまた、いくつかの態様において使用されてもよい(例として、米国特許第5,223,409号、3/1/1991出願、“Directed evolution of novel binding proteins”;WO 1992/18619、4/10/1992出願、“Heterodimeric receptor libraries using phagemids”;WO 1991/17271、5/1/1991出願、“Recombinant library screening methods”;WO 1992/20791、5/15/1992出願、“Methods for producing members of specific binding pairs”;およびWO 1992/15679、2/28/1992出願、“Improved epitope displaying phage”を参照)。いくつかの態様において、関心のある抗原は、非ヒト動物、例として、齧歯類の動物またはヤギを免疫するために使用されてもよい。いくつかの態様において、次いで抗体が非ヒト動物から得られたら、任意に数多の方法論を使用し、例として組換えDNA技法を使用し、修飾してもよい。抗体産生および方法論の追加の例も当該技術分野において知られている(例として、Harlow et al.“Antibodies:A Laboratory Manual”,Cold Spring Harbor Laboratory,1988を参照)。
いくつかの態様において、抗体は修飾されている(例として、グリコシル化、リン酸化、SUMO化、および/またはメチル化を介して修飾されている)。いくつかの態様において、抗体は、1個以上の糖または炭水化物分子へ抱合されたグリコシル化抗体である。いくつかの態様において、1個以上の糖または炭水化物分子は、N-グリコシル化、O-グリコシル化、C-グリコシル化、グリピエーション(GPIアンカー付着)、および/またはホスホグリコシル化を介して、抗体へ抱合されている。いくつかの態様において、1個以上の糖または炭水化物分子は、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、またはグリカンである。いくつかの態様において、1個以上の糖または炭水化物分子は、分枝オリゴ糖類または分枝グリカンである。いくつかの態様において、1個以上の糖または炭水化物分子は、マンノース単位、グルコース単位、N-アセチルグルコサミン単位、N-アセチルガラクトサミン単位、ガラクトース単位、フコース単位、またはホスホ脂質単位を包含する。いくつかの態様において、糖分子は、約1〜10個、約1〜5個、約5〜10個、約1〜4個、約1〜3個、または約2個存在する。いくつかの態様において、グリコシル化抗体は、全体的にまたは部分的にグリコシル化されている。いくつかの態様において、抗体は、化学反応によって、または酵素的な手段によってグリコシル化されている。いくつかの態様において、抗体は、in vitroでまたは細胞(任意にN-またはO-グリコシル化経路中の酵素(例として、グリコシルトランスフェラーゼ)を欠乏していてもよい)内部でグリコシル化される。いくつかの態様において、抗体は、“Modified antibody, antibody-conjugate and process for the preparation thereof”という表題の2014年5月1日に公開された国際特許出願刊行物WO2014065661に記載のとおりの糖または炭水化物分子で官能化されている。
本開示のいくつかの側面は、トランスフェリン受容体(例として、トランスフェリン受容体の細胞外部分)へ結合するタンパク質を提供する。いくつかの態様において、本明細書に提供される抗トランスフェリン受容体抗体は、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)へ特異的に結合する。トランスフェリン受容体は、細胞膜を越えてトランスフェリンを輸送する、内在化する細胞表面受容体であって、細胞内鉄レベルの調節およびホメオスタシスに加わる。いくつかの態様において、本明細書に提供される抗トランスフェリン受容体抗体は、ヒト、霊長目の非ヒト動物、マウス、ラット等々からのトランスフェリン受容体へ特異的に結合する。いくつかの態様において、本明細書に提供される抗トランスフェリン受容体抗体は、ヒトトランスフェリン受容体へ結合する。いくつかの態様において、本明細書に提供される抗トランスフェリン受容体抗体は、ヒトトランスフェリン受容体へ特異的に結合する。いくつかの態様において、本明細書に提供される抗トランスフェリン受容体抗体は、ヒトトランスフェリン受容体の先端ドメインへ結合する。いくつかの態様において、本明細書に提供される抗トランスフェリン受容体抗体は、ヒトトランスフェリン受容体の先端ドメインへ特異的に結合する。
いくつかの態様において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つからのCDR-H(例として、CDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3)アミノ酸配列の1個以上を包含する。いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体は、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つに提供されるとおり、CDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を包含する。いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体は、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つに提供されるとおり、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を包含する。いくつかの態様において、抗トランスフェリン抗体は、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つに提供されるとおり、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を包含する。本開示はまた、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つに提供されるとおり、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、またはCDR-L3を含む分子をコードするいずれの核酸配列も包含する。いくつかの態様において、抗体重鎖および軽鎖CDR3ドメインは、抗体の抗原への結合特異性/親和性において具体的に重要な役割を果たすこともある。結果的に、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つの少なくとも重鎖および/または軽鎖CDR3を包含していてもよい。
いくつかの例において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体のいずれも、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のうち1つからのCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、および/またはCDR-L3配列のいずれかと実質的に同様の1以上のCDR(例として、CDR-HまたはCDR-L)配列を有する。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体のVH(例として、CDR-H1、CDR-H2、もしくはCDR-H3)領域、および/またはVL(例として、CDR-L1、CDR-L2、もしくはCDR-L3)領域に沿う1以上のCDRの位置は、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)への免疫特異的結合が維持される(例として、実質的に維持される、例えば、それが由来する元の抗体の結合に対して少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％維持される)限り、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つのアミノ酸位置によって変動し得る。例えば、いくつかの態様において、本明細書に記載のいずれの抗体のCDRを定義する位置は、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)への免疫特異的結合が維持される(例として、実質的に維持される、例えば、それが由来する元の抗体の結合に対して少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％維持される)限り、CDRのN末および/またはC末の境界をシフトすることによって、本明細書に記載の抗体のいずれか1つのCDR位置と比べ1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つのアミノ酸位置によって変動し得る。別の態様において、本明細書に記載の抗体のVH(例として、CDR-H1、CDR-H2、もしくはCDR-H3)領域、および/またはVL(例として、CDR-L1、CDR-L2、もしくはCDR-L3)領域に沿う1以上のCDRの長さは、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)への免疫特異的結合が維持される(例として、実質的に維持される、例えば、それが由来する元の抗体の結合に対して少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％維持される)限り、1、2、3、4、5アミノ酸、またはそれより多くのアミノ酸によって変動し(例として、より短くまたはより長くなり)得る。
結果的に、いくつかの態様において、本明細書に記載のCDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、および/またはCDR-H3は、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)への免疫特異的結合が維持される(例として、実質的に維持される、例えば、それが由来する元の抗体の結合に対して少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％維持される)限り、本明細書に記載のCDR(例として、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかからのCDR)の1以上より、1、2、3、4、5アミノ酸、またはそれより多くのアミノ酸の差で短くてもよい。いくつかの態様において、本明細書に記載のCDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、および/またはCDR-H3は、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)への免疫特異的結合が維持される(例として、実質的に維持される、例えば、それが由来する元の抗体の結合に対して少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％維持される)限り、本明細書に記載のCDR(例として、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかからのCDR)の1以上より、1、2、3、4、5アミノ酸、またはそれより多くのアミノ酸の差で短くてもよい。いくつかの態様において、本明細書に記載のCDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、および/またはCDR-H3のアミノ部分は、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)への免疫特異的結合が維持される(例として、実質的に維持される、例えば、それが由来する元の抗体の結合に対して少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％維持される)限り、本明細書に記載のCDR(例として、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかからのCDR)の1以上と比較して1、2、3、4、5アミノ酸、またはそれより多くのアミノ酸の差で伸長され得る。CDR-H2、および/またはCDR-H3のカルボキシ部分は、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)への免疫特異的結合が維持される(例として、実質的に維持される、例えば、それが由来する元の抗体の結合に対して少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％維持される)限り、本明細書に記載のCDR(例として、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかからのCDR)の1以上と比較して1、2、3、4、5アミノ酸、またはそれより多くのアミノ酸の差で伸長され得る。いくつかの態様において、本明細書に記載のCDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、および/またはCDR-H3のアミノ部分は、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)への免疫特異的結合が維持される(例として、実質的に維持される、例えば、それが由来する元の抗体の結合に対して少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％維持される)限り、本明細書に記載のCDR(例として、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかからのCDR)の1以上と比較して1、2、3、4、5アミノ酸、またはそれより多くのアミノ酸の差で短縮され得る。いくつかの態様において、本明細書に記載のCDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、および/またはCDR-H3のカルボキシ部分は、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)への免疫特異的結合が維持される(例として、実質的に維持される、例えば、それが由来する元の抗体の結合に対して少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％維持される)限り、本明細書に記載のCDR(例として、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかからのCDR)の1以上と比較して1、2、3、4、5アミノ酸、またはそれより多くのアミノ酸の差で短縮され得る。いずれの方法も使用されて、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)への免疫特異的結合が、例えば、結合アッセイおよび当該技術分野において記載されている条件を使用して、維持されるかどうかが解明され得る。
いくつかの例において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体のいずれも、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つと実質的に同様の1以上のCDR(例として、CDR-HまたはCDR-L)配列を有する。例えば、抗体は、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)への免疫特異的結合が維持される(例として、実質的に維持される、例えば、それが由来する元の抗体の結合に対して少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％維持される)限り、本明細書に提供されるCDR(例として、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかからのCDR)のいずれか1つにおいて対応するCDR領域と比較して、最大5、4、3、2、または1アミノ酸残基バリエーションまでを含有する表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかからの1以上のCDR配列(単数または複数)を包含していてもよい。いくつかの態様において、本明細書に提供されるCDRのいずれかにおけるアミノ酸バリエーションのいずれも、保存的なバリエーションであってもよい。保存的なバリエーションは、その残基が、例えば結晶構造に基づき決定されるとおりの、トランスフェリン受容体タンパク質(例として、ヒトトランスフェリン受容体タンパク質)との相互作用に関与しなさそうな位置にて、CDR中へ導入され得る。本開示のいくつかの側面は、本明細書に提供される重鎖可変(VH)および/または軽鎖可変(VL)ドメインの1以上を含む抗トランスフェリン受容体抗体を提供する。いくつかの態様において、本明細書に提供されるVHドメインのいずれも、本明細書に提供されるCDR-H配列(例として、CDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3)の(例えば、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つにおいて提供されるCDR-H配列のいずれか)1以上を包含する。いくつかの態様において、本明細書に提供されるVLドメインのいずれも、本明細書に提供されるCDR-L配列(例として、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3)の(例えば、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つにおいて提供されるCDR-L配列のいずれか)1以上を包含する。
いくつかの態様において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどのいずれの抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖可変ドメインおよび/または軽鎖可変ドメインも包含するいずれの抗体も包含する。いくつかの態様において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどのいずれの抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖可変および軽鎖可変の対も包含するいずれの抗体も包含する。
本開示の側面は、本明細書に記載の抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかと相同の重鎖可変(VH)および/または軽鎖可変(VL)ドメインアミノ酸配列を有する抗トランスフェリン受容体抗体を提供する。いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体は、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどのいずれの抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖可変配列および/またはいずれの軽鎖可変配列と少なくとも75％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一の重鎖可変配列または軽鎖可変配列を含む。いくつかの態様において、相同の重鎖可変および/または軽鎖可変アミノ酸配列は、本明細書に提供されるCDR配列のいずれかの範囲内での変動はない。例えば、いくつかの態様において、配列バリエーションの程度(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)は、本明細書に提供されるCDR配列のいずれも除外する重鎖可変および/または軽鎖可変配列の範囲内で生じてもよい。いくつかの態様において、本明細書に提供される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれも、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどのいずれの抗トランスフェリン受容体抗体のフレームワーク配列と少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％同一のフレームワーク配列を含む重鎖可変配列および軽鎖可変配列を含む。
いくつかの態様において、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)へ特異的に結合する抗トランスフェリン受容体抗体は、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかのCDR-Lドメイン(CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3)のいずれもまたは本明細書に提供されるCDR-Lドメインバリアントを含む、軽鎖可変VLドメインを含む。いくつかの態様において、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)へ特異的に結合する抗トランスフェリン受容体抗体は、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどのいずれの抗トランスフェリン受容体抗体のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む、軽鎖可変VLドメインを含む。いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体は、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどのいずれの抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖可変領域配列のフレームワーク領域の1つ、2つ、3つ、または4つを含む、軽鎖可変(VL)領域配列を含む。いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体は、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどのいずれの抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖可変領域配列のフレームワーク領域の1つ、2つ、3つ、または4つと少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、または100％同一の軽鎖可変領域配列のフレームワーク領域の1つ、2つ、3つ、または4つを含む。いくつかの態様において、該アミノ酸配列に由来する軽鎖可変フレームワーク領域は、最大10アミノ酸までの置換、欠失、および/または挿入、好ましくは最大10アミノ酸までの置換の存在を別にした該アミノ酸配列からなる。いくつかの態様において、該アミノ酸配列に由来する軽鎖可変フレームワーク領域は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10アミノ酸残基が、対応する霊長目の非ヒト動物またはヒトの軽鎖可変フレームワーク領域中の類似した位置に見出されるアミノ酸と置換された該アミノ酸配列からなる。
いくつかの態様において、トランスフェリン受容体へ特異的に結合する抗トランスフェリン受容体抗体は、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどのいずれの抗トランスフェリン受容体抗体のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む。いくつかの態様において、抗体はさらに、ヒトもしくは霊長目の動物の抗体のVLに由来する1つ、2つ、3つ、または4つすべてのVLフレームワーク領域を含む。本明細書に記載の軽鎖CDR配列との併用のための選択される抗体の霊長目の動物またはヒトの軽鎖フレームワーク領域は、例えば、非ヒト親抗体の軽鎖フレームワーク領域と、少なくとも70％(例として、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、または少なくとも99％)の同一性を有し得る。選択される霊長目の動物またはヒトの抗体は、その軽鎖相補性決定領域において、本明細書に提供される抗体のいずれか(例として、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか)の軽鎖相補性決定領域のアミノ酸に対し、同じ数または実質的に同じ数のアミノ酸を有し得る。いくつかの態様において、霊長目の動物またはヒトの軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸残基は、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどのいずれの抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖フレームワーク領域と少なくとも75％同一性、少なくとも80％同一性、少なくとも85％同一性、少なくとも90％同一性、少なくとも95％同一性、少なくとも98％同一性、少なくとも99％(またはこれを超える)同一性を有する、天然の霊長目の動物またはヒトの抗体軽鎖フレームワーク領域からのものである。いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体はさらに、ヒト軽鎖可変カッパサブファミリーに由来する1つ、2つ、3つ、または4つすべてのVLフレームワーク領域を含む。いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体はさらに、ヒト軽鎖可変ラムダサブファミリーに由来する1つ、2つ、3つ、または4つすべてのVLフレームワーク領域を含む。
いくつかの態様において、本明細書に提供される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれも、軽鎖定常領域をさらに含む軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの態様において、軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ軽鎖定常領域である。いくつかの態様において、カッパまたはラムダ軽鎖定常領域は、哺乳動物から、例として、ヒト、サル、ラット、またはマウスからのものである。いくつかの態様において、軽鎖定常領域は、ヒトカッパ軽鎖定常領域である。いくつかの態様において、軽鎖定常領域は、ヒトラムダ軽鎖定常領域である。本明細書に提供される軽鎖定常領域のいずれも、本明細書に提供される軽鎖定常領域のいずれかのバリアントであってもよいことは解されるはずである。いくつかの態様において、軽鎖定常領域は、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどのいずれの抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖定常領域のいずれかと少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体は、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどの、いずれの抗トランスフェリン受容体抗体でもある。
いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体は、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどのいずれの抗トランスフェリン受容体抗体のアミノ酸配列を含むVLドメインを含み、ここで定常領域は、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、もしくはIgY免疫グロブリン分子、またはヒトIgG、IgE、IgM、IgD、IgA、もしくはIgY免疫グロブリン分子の定常領域のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体は、VLドメイン、またはVLドメインのバリアントのいずれか、およびVHドメイン、またはVHドメインバリアントのいずれかを含み、ここでVLおよびVHドメイン、またはそれらのバリアントは、同じ抗体クローンからものであり、ここで定常領域は、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、もしくはIgY免疫グロブリン分子、いずれのクラス(例として、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2)またはいずれのサブクラス(例として、IgG2aおよびIgG2b)の免疫グロブリン分子の定常領域のアミノ酸配列を含む。ヒト定常領域の非限定例は当該技術分野において記載されており、例として、上記のKabat E Aら(1991)を参照。
いくつかの態様において、本開示の抗体は、相対的に高い親和性で、例として、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、またはこれより低いKDで、標的抗原(例として、トランスフェリン受容体)に結合し得る。例えば、抗トランスフェリン受容体抗体は、5pMと500nMとの間の、例として50pMと100nMとの間の、例として500pMと50nMとの間の親和性で、トランスフェリン受容体タンパク質(例として、ヒトトランスフェリン受容体)へ結合し得る。本開示はまた、トランスフェリン受容体タンパク質(例として、ヒトトランスフェリン受容体)への結合について、本明細書に記載の抗体のいずれかと競合し、かつ50nM以下(例として、20nM以下、10nM以下、500pM以下、50pM以下、または5pM以下)の親和性を有する抗体も包含する。抗トランスフェリン受容体抗体の親和性および結合速度論は、これらに限定されないがバイオセンサ技術(例として、OCTETまたはBIACORE)を包含するいずれか好適な方法を使用して試験され得る。
いくつかの態様において、本開示の抗体は、相対的に高い親和性で、例として、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、またはこれより低いKDで、標的抗原(例として、トランスフェリン受容体)へ結合し得る。例えば、抗トランスフェリン受容体抗体は、5pMと500nMとの間の、例として50pMと100nMとの間の、例として500pMと50nMとの間の親和性で、トランスフェリン受容体タンパク質(例として、ヒトトランスフェリン受容体)へ結合し得る。本開示はまた、トランスフェリン受容体タンパク質(例として、ヒトトランスフェリン受容体)への結合について、本明細書に記載の抗体のいずれかと競合し、かつ50nM以下(例として、20nM以下、10nM以下、500pM以下、50pM以下、または5pM以下)の親和性を有する抗体も包含する。抗トランスフェリン受容体抗体の親和性および結合速度論は、これらに限定されないがバイオセンサ技術(例として、OCTETまたはBIACORE)を包含するいずれか好適な方法を使用して試験され得る。
いくつかの態様において、筋標的化剤は、抗トランスフェリン受容体抗体(例として、国際出願刊行物WO 2016/081643(参照により本明細書に組み込まれる)に記載のとおりの抗体およびそのバリアント)である。
種々の定義系に従う抗体の重鎖および軽鎖CDRは、表1.1中に提供される。種々の定義系、例として、Kabat定義、Chothia定義、および/またはContact定義は記載されている。例として、(例として、Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242,Chothia et al.,(1989)Nature 342:877;Chothia,C.et al.(1987)J.Mol.Biol.196:901-917,Al-lazikani et al(1997)J.Molec.Biol.273:927-948;およびAlmagro,J.Mol.Recognit.17:132-143(2004)。またhgmp.mrc.ac.ukおよびbioinf.org.uk/absも参照)を参照。
表1.1 マウス抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖および軽鎖CDR
Figure 2021533198
重鎖可変ドメイン(VH)および軽鎖可変ドメイン配列もまた提供される:
VH
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPTNGRTNYIEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGTRAYHYWGQGTSVTVSS(配列番号33)
VL
DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRASDNLYSNLAWYQQKQGKSPQLLVYDATNLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDFGTYYCQHFWGTPLTFGAGTKLELK(配列番号34)
いくつかの態様において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、表1.1中に示されるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3と同じCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含む。代替的にまたは加えて、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、表1.1中に示されるCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3と同じCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、表1.1に示されるとおりのCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3と比較したとき、合わせてわずか5アミノ酸バリエーション(例として、わずか5、4、3、2、または1アミノ酸バリエーション)を含有するCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含む。「合わせて」は、3つの重鎖CDRすべてにおけるアミノ酸バリエーションの総数が、定義された範囲内にあることを意味する。代替的にまたは加えて、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、表1.1に示されるとおりのCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3と比較したとき、合わせてわずか5アミノ酸バリエーション(例として、わずか5、4、3、2または1アミノ酸バリエーション)を含有するCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含んでいてもよい。
いくつかの態様において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、CDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含むが、これらのうち少なくとも1つは、表1.1に示されるとおりの相当する(counterpart)重鎖CDRと比較したとき、わずか3アミノ酸バリエーション(例として、わずか3、2、または1アミノ酸バリエーション)を含有する。代替的にまたは加えて、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含んでいてもよいが、これらのうち少なくとも1つは、表1.1に示されるとおりの相当する軽鎖CDRと比較したとき、わずか3アミノ酸バリエーション(例として、わずか3、2、または1アミノ酸バリエーション)を含有する。
いくつかの態様において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、CDR-L3を含むが、これは、表1.1に示されるとおりのCDR-L3と比較したとき、わずか3アミノ酸バリエーション(例として、わずか3、2、または1アミノ酸バリエーション)を含有する。いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、表1.1に示されるとおりのCDR-L3と比較したとき、1アミノ酸バリエーションを含有するCDR-L3を含む。いくつかの態様において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、QHFAGTPLT(配列番号31、KabatおよびChothiaの定義系に従う)またはQHFAGTPL(配列番号32、Contact定義系に従う)のCDR-L3を含む。いくつかの態様において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、表1.1中に示されるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3と同じCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、およびCDR-L2を含み、かつQHFAGTPLT(配列番号31、KabatおよびChothiaの定義系に従う)またはQHFAGTPL(配列番号32、Contact定義系に従う)のCDR-L3を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、合わせて、表1.1に示されるとおりの重鎖CDRと少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、または98％)同一の重鎖CDRを含む。代替的にまたは加えて、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、合わせて、表1.1に示されるとおりの軽鎖CDRと少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、または98％)同一の軽鎖CDRを含む。
いくつかの態様において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、配列番号33のアミノ酸配列を含むVHを含む。代替的にまたは加えて、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、配列番号34のアミノ酸配列を含むVLを含む。
いくつかの態様において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、配列番号33で表されるとおりのVHと比較したとき、わずか20アミノ酸バリエーション(例として、わずか20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1アミノ酸バリエーション)を含有するVHを含む。代替的にまたは加えて、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、配列番号34で表されるとおりのVLと比較したとき、わずか15アミノ酸バリエーション(例として、わずか20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、9、8、7、6、5、4、3、2、または1アミノ酸バリエーション)を含有するVLを含む。
いくつかの態様において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、配列番号33で表されるとおりのVHと少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、または98％)同一のアミノ酸配列を含むVHを含む。代替的にまたは加えて、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、配列番号34で表されるとおりのVLと少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、または98％)同一のアミノ酸配列を含むVLを含む。
いくつかの態様において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、ヒト化抗体(例として、抗体のヒト化されたバリアント)である。いくつかの態様において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、表1.1中に示されるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3と同じCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含み、かつヒト化された重鎖可変領域および/またはヒト化された軽鎖可変領域を含む。
ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域(CDR)からのその残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種(ドナー抗体)のCDRからの残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。いくつかの態様において、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。さらにまた、ヒト化抗体は、レシピエント抗体から見出されない残基も、移入された(imported)CDRまたはフレームワーク配列から見出されない残基も含んでいてもよいが、抗体の性能をさらに洗練および最適化するために包含される残基を含むこともある。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも1つの、典型的には2つの可変ドメインのすべてを実質的に含むであろうが、前記可変ドメインにおいて、CDR領域のすべてまたは実質的にすべてが、非ヒト免疫グロブリンのCDR領域に対応し、かつFR領域のすべてまたは実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のFR領域である。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン(典型的には、ヒト免疫グロブリンの)定常領域またはドメイン(Fc)の少なくとも一部も含むであろう。抗体は、WO 99/58572に記載のとおりに修飾されたFc領域を有していてもよい。ヒト化抗体の他の形態は、元の抗体に関して変更された1以上のCDR(1、2、3、4、5、6)を有しており、これらはまた、元の抗体からの1以上のCDRに由来する1以上のCDRとも呼ばれる。ヒト化抗体はまた、親和性成熟も伴うことがある。
いくつかの態様において、ヒト化は、CDR(例として、表1.1に示されるとおりの)をIGKV1-NL1*01およびIGHV1-3*01ヒト可変ドメイン中へ接合させることによって達成される。いくつかの態様において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、位置9、13、17、18、40、45、および70での1以上のアミノ酸置換(配列番号34で表されるとおりのVLと比較したとき)、および/または位置1、5、7、11、12、20、38、40、44、66、75、81、83、87、および108での1以上のアミノ酸置換(配列番号33で表されるとおりのVHと比較したとき)を含むヒト化されたバリアントである。いくつかの態様において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、位置9、13、17、18、40、45、および70のすべてでのアミノ酸置換(配列番号34で表されるとおりのVLと比較したとき)、および/または位置1、5、7、11、12、20、38、40、44、66、75、81、83、87、および108のすべてでのアミノ酸置換(配列番号33で表されるとおりのVHと比較したとき)を含むヒト化されたバリアントである。
いくつかの態様において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、ヒト化抗体であって、配列番号34で表されるとおりのVLの位置43および48での残基を含有する。代替的にまたは加えて、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、ヒト化抗体であって、配列番号33で表されるとおりのVHの位置48、67、69、71、および73での残基を含有する。
本開示に従い使用されてもよいヒト化抗体の例の、VHおよびVLアミノ酸配列は、以下に提供される:
ヒト化されたVH
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQRLEWIGEINPTNGRTNYIEKFKSRATLTVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGTRAYHYWGQGTMVTVSS(配列番号35)
ヒト化されたVL
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASDNLYSNLAWYQQKPGKSPKLLVYDATNLADGVPSRFSGSGSGTDYSLKINSLQSEDFGTYYCQHFWGTPLTFGAGTKLELK(配列番号36)
いくつかの態様において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、配列番号35のアミノ酸配列を含むVHを含む。代替的にまたは加えて、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、配列番号36のアミノ酸配列を含むVLを含む。
いくつかの態様において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、配列番号35で表されるとおりのVHと比較したとき、わずか20アミノ酸バリエーション(例として、わずか20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1アミノ酸バリエーション)を含有するVHを含む。代替的にまたは加えて、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、配列番号36で表されるとおりのVLと比較したとき、わずか15アミノ酸バリエーション(例として、わずか20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、9、8、7、6、5、4、3、2、または1アミノ酸バリエーション)を含有するVLを含む。
いくつかの態様において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、配列番号35で表されるとおりのVHと少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、または98％)同一のアミノ酸配列を含むVHを含む。代替的にまたは加えて、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、配列番号36で表されるとおりのVLと少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、または98％)同一のアミノ酸配列を含むVLを含む。
いくつかの態様において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、位置43および48の1以上でのアミノ酸置換(配列番号34で表されるとおりのVLと比較したとき)、および/または位置48、67、69、71、および73の1以上でのアミノ酸置換(配列番号33で表されるとおりのVHと比較したとき)を含むヒト化されたバリアントである。いくつかの態様において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、S43Aおよび/またはV48L突然変異(配列番号34で表されるとおりのVLと比較したとき)、および/またはA67V、L69I、V71R、およびK73T突然変異の1以上(配列番号33で表されるとおりのVHと比較したとき)を含むヒト化されたバリアントである。
いくつかの態様において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、位置9、13、17、18、40、43、48、45、および70の1以上でのアミノ酸置換(配列番号34で表されるとおりのVLと比較したとき)、および/または位置1、5、7、11、12、20、38、40、44、48、66、67、69、71、73、75、81、83、87、および108の1以上でのアミノ酸置換(配列番号33で表されるとおりのVHと比較したとき)を含むヒト化されたバリアントである。
いくつかの態様において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、ヒト抗体からの重鎖定常領域および軽鎖定常領域を包含し得るキメラ抗体である。キメラ抗体は、第1の種からの可変領域または一部の可変領域、および第2の種からの定常領域を有する抗体を指す。典型的には、これらのキメラ抗体において、軽鎖と重鎖との両方の可変領域は、ある種の哺乳動物(例として、マウス、ウサギ、およびラットなどの非ヒト哺乳動物)に由来する抗体の可変領域を模倣する一方で、定常部は、ヒトなどの別の哺乳動物に由来する抗体中の配列と相同である。いくつかの態様において、アミノ酸修飾は、可変領域および/または定常領域においてなされ得る。
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗トランスフェリン受容体抗体は、ヒト抗体からの重鎖定常領域および軽鎖定常領域を包含し得るキメラ抗体である。キメラ抗体は、第1の種からの可変領域または一部の可変領域、および第2の種からの定常領域を有する抗体を指す。典型的には、これらのキメラ抗体において、軽鎖と重鎖との両方の可変領域は、ある種の哺乳動物(例として、マウス、ウサギ、およびラットなどの非ヒト哺乳動物)に由来する抗体の可変領域を模倣する一方で、定常部は、ヒトなどの別の哺乳動物に由来する抗体中の配列と相同である。いくつかの態様において、アミノ酸修飾は、可変領域および/または定常領域においてなされ得る。
いくつかの態様において、本明細書に記載のとおりの抗トランスフェリン受容体抗体のいずれの重鎖も、重鎖定常領域(CH)またはこの一部(例として、CH1、CH2、CH3、またはそれらの組み合わせ)を含んでいてもよい。重鎖定常領域は、いずれの好適な起源、例として、ヒト、マウス、ラット、またはウサギに属し得る。特定の一例において、重鎖定常領域は、ヒトIgG(ガンマ重鎖)、例として、IgG1、IgG2、またはIgG4からのものである。例示のヒトIgG1定常領域は、下に与えられる:
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号37)
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗トランスフェリン受容体抗体のいずれの軽鎖も、軽鎖定常領域(CL)をさらに含んでいてもよいが、これは当該技術分野において知られているいずれのCLでもあり得る。いくつかの例において、CLは、カッパ軽鎖である。他の例において、CLは、ラムダ軽鎖である。いくつかの態様において、CLはカッパ軽鎖であって、その配列は下に与えられる:
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP(配列番号38)
他の抗体の重鎖および軽鎖定常領域は当該技術分野において周知であり、例として、IMGTデータベース(www.imgt.org)において、またはwww.vbase2.org/vbstat.php.にて提供されるものであるが、これらの両方とも、参照により本明細書に組み込まれる。
記載される抗トランスフェリン受容体抗体の、例示の重鎖および軽鎖アミノ酸配列は、下に提供される:
重鎖(VH+ヒトIgG1定常領域)
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPTNGRTNYIEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGTRAYHYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号39)
軽鎖(VL+カッパ軽鎖)
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPTNGRTNYIEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGTRAYHYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP(配列番号40)
重鎖(ヒト化VH+ヒトIgG1定常領域)
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQRLEWIGEINPTNGRTNYIEKFKSRATLTVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGTRAYHYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号41)
軽鎖(ヒト化VL+カッパ軽鎖)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASDNLYSNLAWYQQKPGKSPKLLVYDATNLADGVPSRFSGSGSGTDYSLKINSLQSEDFGTYYCQHFWGTPLTFGAGTKLELKASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP(配列番号42)
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗トランスフェリン受容体抗体は、配列番号39と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、または98％)同一のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。代替的にまたは加えて、本明細書に記載の抗トランスフェリン受容体抗体は、配列番号40と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、または98％)同一のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗トランスフェリン受容体抗体は、配列番号39のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。代替的にまたは加えて、本明細書に記載の抗トランスフェリン受容体抗体は、配列番号40のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、配列番号39で表されるとおりの重鎖と比較したとき、わずか20アミノ酸バリエーション(例として、わずか20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1アミノ酸バリエーション)を含有する重鎖を含む。代替的にまたは加えて、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、配列番号40で表されるとおりの軽鎖と比較したとき、わずか15アミノ酸バリエーション(例として、わずか20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、9、8、7、6、5、4、3、2、または1アミノ酸バリエーション)を含有する軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗トランスフェリン受容体抗体は、配列番号41と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、または98％)同一のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。代替的にまたは加えて、本明細書に記載の抗トランスフェリン受容体抗体は、配列番号42と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、または98％)同一のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗トランスフェリン受容体抗体は、配列番号41のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。代替的にまたは加えて、本明細書に記載の抗トランスフェリン受容体抗体は、配列番号42のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、配列番号39で表されるとおりのヒト化抗体の重鎖と比較したとき、わずか20アミノ酸バリエーション(例として、わずか20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1アミノ酸バリエーション)を含有する重鎖を含む。代替的にまたは加えて、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、配列番号40で表されるとおりのヒト化抗体の軽鎖と比較したとき、わずか15アミノ酸バリエーション(例として、わずか20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、9、8、7、6、5、4、3、2、または1アミノ酸バリエーション)を含有する軽鎖を含む。
いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体は、無傷の抗体(完全長抗体)の抗原結合性フラグメント(FAB)である。無傷の抗体(完全長抗体)の抗原結合性フラグメントは、定型的な方法を介して調製され得る。例えば、F(ab')2フラグメントは、抗体分子のペプシン消化によって産生され得、Fabフラグメントは、F(ab')2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成され得る。本明細書に記載の抗トランスフェリン受容体抗体の例示のFABアミノ酸配列は、下に提供される:
重鎖FAB(VH+一部のヒトIgG1定常領域)
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPTNGRTNYIEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGTRAYHYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP(配列番号43)
重鎖FAB(ヒト化VH+一部のヒトIgG1定常領域)
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQRLEWIGEINPTNGRTNYIEKFKSRATLTVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGTRAYHYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP(配列番号44)
本明細書に記載の抗トランスフェリン受容体抗体は、これらに限定されないが、無傷の(すなわち、完全長)抗体、それらの抗原結合性フラグメント(Fab、Fab'、F(ab')2、Fvなどの)、単一鎖抗体、二重特異性抗体、またはナノボディーを包含する、いずれの抗体の形態でもあり得る。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗トランスフェリン受容体抗体は、scFvである。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗トランスフェリン受容体抗体は、scFv-Fab(例として、一部の定常領域と縮合されたscFv)である。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗トランスフェリン受容体抗体は、定常領域(例として、配列番号39で表されるとおりのヒトIgG1定常領域)と縮合されたscFvである。
ｂ．他の筋標的化抗体
いくつかの態様において、筋標的化抗体は、ヘモジュベリン(hemojuvelin)、カベオリン-3、デュシェンヌ型筋ジストロフィーペプチド、ミオシンIib、またはCD63に特異的に結合する抗体である。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、筋原性前駆体タンパク質に特異的に結合する抗体である。例示の筋原性前駆体タンパク質は、限定せずに、ABCG2、M-カドヘリン/カドヘリン-15、カベオリン-1、CD34、FoxK1、インテグリンアルファ7、インテグリンアルファ7ベータ1、MYF-5、MyoD、ミオゲニン、NCAM-1/CD56、Pax3、Pax7、およびPax9を包含する。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、骨格筋タンパク質に特異的に結合する抗体である。例示の骨格筋タンパク質は、限定せずに、アルファ-サルコグリカン、ベータ-サルコグリカン、カルパインインヒビター、クレアチンキナーゼMM/CKMM、eIF5A、エノラーゼ2/ニューロン特異的エノラーゼ、イプシロン-サルコグリカン、FABP3/H-FABP、GDF-8/ミオスタチン、GDF-11/GDF-8、インテグリンアルファ7、インテグリンアルファ7ベータ1、インテグリンベータ1/CD29、MCAM/CD146、MyoD、ミオゲニン、ミオシン軽鎖キナーゼインヒビター、NCAM-1/CD56、およびトロポニンIを包含する。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、平滑筋タンパク質に特異的に結合する抗体である。例示の平滑筋タンパク質は、限定せずに、アルファ-平滑筋アクチン、VE-カドヘリン、カルデスモン/CALD1、カルポニン1、デスミン、ヒスタミンH2 R、モチリンR/GPR38、トランスジェリン(Transgelin)/TAGLN、およびビメンチンを包含する。しかしながら、追加の標的への抗体が本開示の範囲内であること、および本明細書に提供される標的の例示のリストが限定することを意図していないことは解されるはずである。
ｃ．抗体特色/変更
いくつかの態様において、保存的突然変異は、例えば結晶構造に基づき決定されるとき、その残基が標的抗原(例として、トランスフェリン受容体)との相互作用に関与しそうにない位置にて、抗体配列(例として、CDRまたはフレームワーク配列)中へ導入され得る。いくつかの態様において、1、2個以上の突然変異(例として、アミノ酸置換)は、血清半減期、補体結合、Fc受容体結合、および/または細胞への抗原依存的細胞傷害性などの、抗体の1以上の機能特性を変更させるために、本明細書に記載の筋標的化抗体のFc領域中(例として、Kabatナンバリング系(例として、KabatのEUインデックス)に従うナンバリングで、CH2ドメイン(ヒトIgG1の残基231〜340)中、および/またはCH3ドメイン(ヒトIgG1の残基341〜447)中、および/またはヒンジ領域中)へ導入される。
いくつかの態様において、1、2個以上の突然変異(例として、アミノ酸置換)は、ヒンジ領域中のシステイン残基の数が、例として米国特許第5,677,425号に記載のとおり変動(例として、増大または減少)され得るように、Fc領域(CH1ドメイン)のヒンジ領域中へ導入される。CH1ドメインのヒンジ領域中のシステイン残基の数は、例として、軽鎖および重鎖の会合(assembly)を容易にさせるため、または抗体の安定性を変更(例として、増大もしくは減少)するため、またはリンカー抱合を容易にさせるため、変更され得る。
いくつかの態様において、1、2個以上の突然変異(例として、アミノ酸置換)は、抗体の、エフェクター細胞表面上のFc受容体(例として、活性化されたFc受容体)への親和性を増加または減少させるため、本明細書に記載の筋標的化抗体のFc領域中(例として、Kabatナンバリング系(例として、KabatのEUインデックス)に従うナンバリングで、CH2ドメイン(ヒトIgG1の残基231〜340)中、および/またはCH3ドメイン(ヒトIgG1の残基341〜447)中、および/またはヒンジ領域中)へ導入される。抗体のFc受容体への親和性を増大または減少させる抗体のFc領域中の突然変異、およびかかる突然変異をFc受容体中またはそのフラグメント中へ導入するための技法は、当業者に知られている。抗体のFc受容体への親和性を変更するためになされ得る、抗体のFc受容体中の突然変異の例は、例として、Smith P et al.,(2012)PNAS 109:6181-6186、米国特許第6,737,056号、ならびに国際刊行物第WO 02/060919号;第WO 98/23289号;および第WO 97/34631号(これらは参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。
いくつかの態様において、1、2個以上のアミノ酸突然変異(すなわち、置換、挿入、または欠失)は、in vivoでの抗体の半減期を変更(例として、増加または減少)させるため、IgG定常領域またはそのFcRn-結合フラグメント(好ましくは、Fcまたはヒンジ-Fcドメインフラグメント)中へ導入される。例えば、in vivoでの抗体の半減期を変更(例として、増加または減少)させるであろう突然変異について、例として、国際刊行物第WO 02/060919号;第WO 98/23289号;および第WO 97/34631号;ならびに米国特許第5,869,046号、第6,121,022号、第6,277,375号、および第6,165,745号を参照。
いくつかの態様において、1、2個以上のアミノ酸突然変異(すなわち、置換、挿入、または欠失)は、in vivoでの抗トランスフェリン受容体抗体の半減期を減少させるため、IgG定常領域またはそのFcRn-結合フラグメント(好ましくは、Fcまたはヒンジ-Fcドメインフラグメント)中へ導入される。いくつかの態様において、1、2個以上のアミノ酸突然変異(すなわち、置換、挿入、または欠失)は、in vivoでの抗体の半減期を増加させるため、IgG定常領域またはそのFcRn-結合フラグメント(好ましくは、Fcまたはヒンジ-Fcドメインフラグメント)中へ導入される。いくつかの態様において、抗体は、KabatのEUインデックス(上記のKabat E Aら(1991))に従うナンバリングで第2定常(CH2)ドメイン(ヒトIgG1の残基231〜340)中および/または第3定常(CH3)ドメイン(ヒトIgG1の残基341〜447)中に、1個以上のアミノ酸突然変異(例として、置換)を有し得る。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体のIgG1定常領域は、KabatにあるようなEUインデックスに従ってナンバリングされた位置252におけるメチオニン(M)からチロシン(Y)への置換、位置254におけるセリン(S)からトレオニン(T)への置換、および位置256におけるトレオニン(T)からグルタミン酸(E)への置換を含む。米国特許第7,658,921(これは、参照により本明細書に組み込まれる)を参照。「YTE突然変異体」と称されるこのタイプの突然変異IgGは、同じ抗体の野生型バージョンと比較して4倍増大した半減期を発揮したことが示されている(Dall'Acqua W F et al.,(2006)J Biol Chem 281:23514-24を参照)。いくつかの態様において、抗体は、KabatにあるようなEUインデックスに従ってナンバリングされた位置251〜257、285〜290、308〜314、385〜389、および428〜436でのアミノ酸残基の、1、2、3以上のアミノ酸置換を含むIgG定常領域を含む。
いくつかの態様において、1、2以上のアミノ酸置換は、抗トランスフェリン受容体抗体のエフェクター機能(単数または複数)を変更するため、IgG定常領域Fc領域中へ導入される。自身への親和性が変更されたエフェクターリガンドは、例えば、Fc受容体または補体のC1構成要素であり得る。このアプローチは、米国特許第5,624,821号および第5,648,260号においてさらに詳細に記載される。いくつかの態様において、定常領域ドメインの欠失または不活化(点突然変異または他の手段を通して)は、循環抗体のFc受容体への結合を低減し、それによって腫瘍局在化を増大し得る。定常領域を欠失または不活化し、それによって腫瘍局在化を増大させる突然変異の記載については、例として、米国特許第5,585,097号および第8,591,886号を参照。いくつかの態様において、1以上のアミノ酸置換は、Fc領域上の潜在的なグリコシル化部位を除去するため(これによってFc受容体への結合が低減されることもある)、本明細書に記載の抗体のFc領域中へ導入されてもよい(例として、Shields R L et al.,(2001)J Biol Chem 276:6591-604を参照)。
いくつかの態様において、本明細書に記載の筋標的化抗体の定常領域中の1以上のアミノ酸残基は、抗体が変更されたClq結合および/または低減もしくは消失された補体依存性細胞傷害性(CDC)を有し得るように、異なるアミノ酸残基に置き換えられ得る。このアプローチは、米国特許第6,194,551号(Idusogieら)においてさらに詳細に記載されている。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体のCH2ドメインのN末領域中の1以上のアミノ酸残基は変更されて、それによって抗体の補体結合能を変更する。このアプローチは、国際刊行物第WO 94/29351号においてさらに記載されている。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体のFc領域は、抗体の、細胞への抗体依存性細胞傷害性(ADCC)の媒介能を増大させるため、および/または抗体のFcγ受容体への親和性を増大させるため、修飾されている。このアプローチは、国際刊行物第WO 00/42072号においてさらに記載されている。
いくつかの態様において、本明細書に提供される抗体の重鎖および/または軽鎖可変ドメイン(単数または複数)配列(単数または複数)は、本明細書の他の箇所に記載されるとおり、例えば、CDR接合抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、もしくは複合ヒト抗体、または抗原結合性フラグメントを生成するために使用され得る。当業者によって理解されるとおり、本明細書に提供される抗体のいずれかに由来するいずれのバリアント、CDR接合抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または複合抗体は、本明細書に記載の組成物および方法に有用であってもよく、バリアント、CDR接合抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または複合抗体が、これが由来する元の抗体と比べて、トランスフェリン受容体への少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％以上の結合を有し得るように、トランスフェリン受容体への特異的結合能を維持するであろう。
いくつかの態様において、本明細書に提供される抗体は、所望の特性を抗体へ付与する突然変異を含む。例えば、ネイティブなIgG4 mAbに生じることが知られているFabアーム交換(Fab-arm exchange)に起因する潜在的合併症を回避するため、本明細書に提供される抗体は、安定化「Adair」突然変異を含んでいてもよく(Angal S.,et al.,“A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human (IgG4) antibody”,Mol Immunol 30,105-108;1993)、ここでセリン228(EUナンバリング;残基241 Kabatナンバリング)は、IgG1様ヒンジ配列をもたらすプロリンへ変換されている。結果的に、抗体のいずれも、安定化「Adair」突然変異を包含していてもよい。
本明細書に提供されるとおり、本開示の抗体は、任意に、定常領域またはその一部を含んでいてもよい。例えば、VLドメインは、そのC末端にて、軽鎖定常領域様CκまたはCλへ付着されていてもよい。同様に、VHドメインまたはその一部は、すべてのまたは一部の重鎖様IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgM、およびいずれのアイソタイプのサブクラスへ付着されていてもよい。抗体は、好適な定常領域を包含していてもよい(例えば、Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,No.91-3242,National Institutes of Health Publications,Bethesda,Md.(1991)を参照)。したがって、本開示の範囲内の抗体は、いずれの好適な定常領域と組み合わされて、VHおよびVLドメイン、またはその抗原結合部を包含していてもよい。
ii．筋標的化ペプチド
本開示のいくつかの側面は、筋標的化ペプチドを筋標的化剤として提供する。特定の細胞型へ結合する短いペプチド配列(例として、長さが5〜20アミノ酸のペプチド配列)は記載されている。例えば、細胞標的化ペプチドは、Vines e.,et al.,A.“Cell-penetrating and cell-targeting peptides in drug delivery”Biochim Biophys Acta 2008,1786:126-38;Jarver P.,et al.,“In vivo biodistribution and efficacy of peptide mediated delivery”Trends Pharmacol Sci 2010;31:528-35;Samoylova T.I.,et al.,“Elucidation of muscle-binding peptides by phage display screening”Muscle Nerve 1999;22:460-6;米国特許第6,329,501号、2001年12月11日発行、表題“METHODS AND COMPOSITIONS FOR TARGETING COMPOUNDS TO MUSCLE”;およびSamoylov A.M.,et al.,“Recognition of cell-specific binding of phage display derived peptides using an acoustic wave sensor.”Biomol Eng 2002;18:269-72に記載されている;これら各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。特定の細胞表面抗原(例として、受容体)と相互作用するようにペプチドを設計することによって、所望される組織、例として、筋肉への選択性が獲得され得る。骨格筋標的化が調査されており、広範な分子ペイロードが送達されることができる。巨大な抗体またはウイルス粒子についての実際上の不利な点の多くが存在しないこれらのアプローチは、筋組織への高選択性を有していてもよい。結果的に、いくつかの態様において、筋標的化剤は、長さが4アミノ酸から50アミノ酸までの筋標的化ペプチドである。いくつかの態様において、筋標的化ペプチドは、長さが4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50アミノ酸である。筋標的化ペプチドは、ファージディスプレーなどの数種の方法のいずれかを使用して生成され得る。
いくつかの態様において、筋標的化ペプチドは、他のある細胞と比較して、筋細胞において過剰発現されているかまたは相対的に高度に発現されている、内在化する細胞表面受容体(例として、トランスフェリン受容体)へ結合してもよい。いくつかの態様において、筋標的化ペプチドは、トランスフェリン受容体を標的にしてもよい(例として、トランスフェリン受容体へ結合してもよい)。いくつかの態様において、トランスフェリン受容体を標的にするペプチドは、天然に存在するリガンド、例として、トランスフェリンのセグメントを含んでいてもよい。いくつかの態様において、トランスフェリン受容体を標的にするペプチドは、米国特許第6,743,893号、11/30/2000出願、「RECEPTOR-MEDIATED UPTAKE OF PEPTIDES THAT BIND THE HUMAN TRANSFERRIN RECEPTOR」に記載のとおりである。いくつかの態様において、トランスフェリン受容体を標的にするペプチドは、Kawamoto, M. et al,“A novel transferrin receptor-targeted hybrid peptide disintegrates cancer cell membrane to induce rapid killing of cancer cells.”BMC Cancer.2011 Aug 18;11:359に記載のとおりである。いくつかの態様において、トランスフェリン受容体を標的にするペプチドは、米国特許第8,399,653号、5/20/2011出願、「TRANSFERRIN/TRANSFERRIN RECEPTOR-MEDIATED SIRNA DELIVERY」に記載のとおりである。
上述のとおり、筋標的化ペプチドの例は報告されている。例えば、筋肉特異的ペプチドは、表面へプタペプチドを提示するファージディスプレーライブラリを使用して同定された。一例として、アミノ酸配列ASSLNIA(配列番号6)を有するペプチドは、in vitroでC2C12マウス筋管へ結合し、かつin vivoでマウス筋組織へ結合した。結果的に、いくつかの態様において、筋標的化剤は、アミノ酸配列ASSLNIA(配列番号6)を含む。このペプチドは、肝臓、腎臓、および脳への結合が低減された、マウスへの静脈内注射後の心筋組織および骨格筋組織への結合について改善された特異性を発揮した。追加の筋肉特異的ペプチドがファージディスプレーを使用して同定されている。例えば、DMDへの処置という文脈において、12アミノ酸ペプチドが、筋標的化のためのファージディスプレーライブラリによって同定された。Yoshida D.,et al.,“Targeting of salicylate to skin and muscle following topical injections in rats.”Int J Pharm 2002;231:177-84を参照;この内容全体はこれによって参照により組み込まれる。ここで、配列SKTFNTHPQSTP(配列番号7)を有する12アミノ酸ペプチドが同定され、この筋標的化ペプチドは、ASSLNIA(配列番号6)ペプチドと比べてC2C12細胞への改善された結合を示した。
他の細胞型より筋肉(例として、骨格筋)に対して選択的なペプチドを同定するためのいずれの追加の方法はin vitroでの選択を包含し、これはGhosh D.,et al.,“Selection of muscle-binding peptides from context-specific peptide-presenting phage libraries for adenoviral vector targeting”J Virol 2005;79:13667-72に記載されている;この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。ランダム12-merペプチドファージディスプレーライブラリを非筋細胞型の混合物とプレインキュベートすることによって、非特異的細胞バインダーが選出された。選択ラウンド(rounds of selection)を受けて、12アミノ酸ペプチドTARGEHKEEELI(配列番号8)が最も頻繁に現れた。結果的に、いくつかの態様において、筋標的化剤は、アミノ酸配列TARGEHKEEELI(配列番号8)を含む。
筋標的化剤は、アミノ酸含有分子またはペプチドであってもよい。筋標的化ペプチドは、筋細胞から見出されたタンパク質受容体へ優先的に結合するタンパク質の配列に対応していてもよい。いくつかの態様において、筋標的化ペプチドは、ペプチドが筋細胞を優先的に標的にし得るように、疎水性アミノ酸(例として、バリン)の性質(propensity)を高く含有する。いくつかの態様において、筋標的化ペプチドは、これまでに特徴付けも開示もされていない。これらのペプチドは、数種の方法論のいずれか、例として、ファージディスプレードペプチドライブラリ、1ビーズ・1化合物(one-bead one-compound)ペプチドライブラリ、または位置走査性(positional scanning)合成ペプチドコンビナトリアルライブラリを使用して、想起、産生、合成、および/または誘導体化されてもよい。例示の方法論は当該技術分野において特徴付けされており、参照により組み込まれる(Gray,B.P.and Brown,K.C.“Combinatorial Peptide Libraries:Mining for Cell-Binding Peptides”Chem Rev.2014,114:2,1020-1081.;Samoylova,T.I.and Smith,B.F.“Elucidation of muscle-binding peptides by phage display screening.”Muscle Nerve,1999,22:4.460-6)。いくつかの態様において、筋標的化ペプチドはこれまでに開示されている(例として、Writer M.J.et al.“Targeted gene delivery to human airway epithelial cells with synthetic vectors incorporating novel targeting peptides selected by phage display.”J. Drug Targeting. 2004;12:185;Cai,D.“BDNF-mediated enhancement of inflammation and injury in the aging heart.”Physiol Genomics.2006,24:3,191-7.;Zhang,L.“Molecular profiling of heart endothelial cells.”Circulation,2005,112:11,1601-11.;McGuire,M.J.et al.“In vitro selection of a peptide with high selectivity for cardiomyocytes in vivo.”J Mol Biol.2004,342:1,171-82を参照)。例示の筋標的化ペプチドは、以下の群のアミノ酸配列を含む:CQAQGQLVC(配列番号9)、CSERSMNFC(配列番号10)、CPKTRRVPC(配列番号11)、WLSEAGPVVTVRALRGTGSW(配列番号12)、ASSLNIA(配列番号6)、CMQHSMRVC(配列番号13)、およびDDTRHWG(配列番号14)。いくつかの態様において、筋標的化ペプチドは、約2〜25アミノ酸、約2〜20アミノ酸、約2〜15アミノ酸、約2〜10アミノ酸、または約2〜5アミノ酸を含んでいてもよい。筋標的化ペプチドは、天然に存在するアミノ酸、例として、システイン、アラニン、または天然に存在しないアミノ酸、もしくは修飾アミノ酸を含んでいてもよい。天然に存在しないアミノ酸は、β-アミノ酸、ホモ-アミノ酸、プロリン誘導体、3-置換アラニン誘導体、線形コアアミノ酸(linear core amino acids)、N-メチルアミノ酸、および当該技術分野において知られているその他のアミノ酸を包含する。いくつかの態様において、筋標的化ペプチドは線状であってもよい;他の態様において、筋標的化ペプチドは環状(例として、二環式)であってもよい(例として、Silvana,M.G.et al.Mol.Therapy,2018,26:1,132-147を参照)。
iii．筋標的化受容体リガンド
筋標的化剤は、リガンド、例として、受容体タンパク質へ結合するリガンドであってもよい。筋標的化リガンドは、筋細胞によって発現される内在化する細胞表面受容体へ結合するタンパク質、例として、トランスフェリンであってもよい。結果的に、いくつかの態様において、筋標的化剤は、トランスフェリン、またはトランスフェリン受容体へ結合するその誘導体である。筋標的化リガンドは、代替的に、小分子、例として、他の細胞型と比べて優先的に筋細胞を標的にする親油性小分子であってもよい。筋細胞を標的にしてもよい例示の親油性小分子は、コレステロール、コレステリル、ステアリン酸、パルミチン酸、オレイン酸、オレイル、リノレン酸、リノール酸、ミリスチン酸、ステロール、ジヒドロテストステロン、テストステロン誘導体、グリセリン、アルキル鎖、トリチル基、およびアルコキシ酸を含む化合物を包含する。
iv．筋標的化アプタマー
筋標的化剤は、他の細胞型と比べて優先的に筋細胞を標的にするアプタマー、例としてRNAアプタマーであってもよい。いくつかの態様において、筋標的化アプタマーはこれまでに特徴付けも開示もされていない。これらのアプタマーは、数種の方法論のいずれか、例として、指数関数的濃縮によるリガンドの体系的進化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)を使用して、想起、産生、合成、および/または誘導体化されてもよい。例示の方法論は当該技術分野において特徴付けされており、参照により組み込まれる(Yan,A.C. and Levy,M.“Aptamers and aptamer targeted delivery” RNA biology,2009,6:3,316-20.;Germer,K.et al.“RNA aptamers and their therapeutic and diagnostic applications.”Int.J.Biochem.Mol.Biol.2013;4:27-40)。いくつかの態様において、筋標的化アプタマーはこれまでに開示されている(例として、Phillippou,S.et al.“Selection and Identification of Skeletal-Muscle-Targeted RNA Aptamers.”Mol Ther Nucleic Acids.2018,10:199-214.;Thiel,W.H.et al.“Smooth Muscle Cell-targeted RNA Aptamer Inhibits Neointimal Formation.”Mol Ther.2016,24:4,779-87を参照)。例示の筋標的化アプタマーは、A01B RNAアプタマーおよびRNA Apt 14を包含する。いくつかの態様において、アプタマーは、核酸をベースとしたアプタマー、オリゴヌクレオチドアプタマー、またはペプチドアプタマーである。いくつかの態様において、アプタマーは、約5〜15kDa、約5〜10kDa、約10〜15kDa、約1〜5Da、約1〜3kDa、またはこれより小さいものであってもよい。
ｖ．他の筋標的化剤
筋細胞(例として、骨格筋細胞)を標的にするための1つのストラテジーは、筋線維鞘上に発現されたトランスポータータンパク質などの筋肉トランスポータータンパク質の基質を使用することである。いくつかの態様において、筋標的化剤は、筋組織に特異的な流入トランスポーターの基質である。いくつかの態様において、流入トランスポーターは、骨格筋組織に特異的である。骨格筋の筋線維鞘上に発現されるトランスポーターの二大クラスは、(1)骨格筋組織からの流出に容易にさせる、アデノシン三リン酸(ATP)結合カセット(ABC)スーパーファミリー、および(2)基質の骨格筋中への流入を容易にし得る、溶質輸送体(solute carrier)(SLC)スーパーファミリーである。いくつかの態様において、筋標的化剤は、トランスポーターのABCスーパーファミリーまたはSLCスーパーファミリーへ結合する基質である。いくつかの態様において、トランスポーターのABCまたはSLCスーパーファミリーへ結合する基質は、天然に存在する基質である。いくつかの態様において、トランスポーターのABCまたはSLCスーパーファミリーへ結合する基質は、天然に存在しない基質、例えば、トランスポーターのABCまたはSLCスーパーファミリーへ結合するその合成誘導体である。
いくつかの態様において、筋標的化剤は、トランスポーターのSLCスーパーファミリーの基質である。SLCトランスポーターは、平衡型であるか、または基質の輸送を駆動させる膜にわたって創出されたプロトンもしくはナトリウムのイオン勾配を使用するかのいずれかである。骨格筋への高発現を有する例示のSLCトランスポーターは、限定せずに、SATTトランスポーター(ASCT1;SLC1A4)、GLUT4トランスポーター(SLC2A4)、GLUT7トランスポーター(GLUT7;SLC2A7)、ATRC2トランスポーター(CAT-2;SLC7A2)、LAT3トランスポーター(KIAA0245;SLC7A6)、PHT1トランスポーター(PTR4;SLC15A4)、OATP-Jトランスポーター(OATP5A1;SLC21A15)、OCT3トランスポーター(EMT;SLC22A3)、OCTN2トランスポーター(FLJ46769;SLC22A5)、ENTトランスポーター(ENT1;SLC29A1およびENT2;SLC29A2)、PAT2トランスポーター(SLC36A2)、およびSAT2トランスポーター(KIAA1382;SLC38A2)を包含する。これらのトランスポーターは、基質の骨格筋中への流入を容易にさせることで、筋標的化のための好機を提供し得る。
いくつかの態様において、筋標的化剤は、平衡型ヌクレオシドトランスポーター2(ENT2)トランスポーターの基質である。他のトランスポーターと比べて、ENT2は、骨格筋において最高発現するmRNAの1つを有する。ヒトENT2(hENT2)は、脳、心臓、胎盤、胸腺、膵臓、前立腺、および腎臓などのほとんどの体器官に発現されるものの、とくに骨格筋に豊富である。ヒトENT2は、その基質の取り込みを、それらの濃度勾配に応じて容易にさせる。ENT2は、広範なプリンおよびピリミジン核酸塩基を輸送することによってヌクレオシドホメオスタシスを維持する役割を果たす。hENT2トランスポーターは、イノシンを除くすべてのヌクレオシド(アデノシン、グアノシン、ウリジン、チミジン、およびシチジン)に対して低親和性を有する。結果的に、いくつかの態様において、筋標的化剤は、ENT2基質である。例示のENT2基質は、限定せずに、イノシン、2',3'-ジデオキシイノシン、およびクロファラビンを包含する。いくつかの態様において、本明細書に提供される筋標的化剤のいずれも、分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチドペイロード)に関連する。いくつかの態様において、筋標的化剤は、分子ペイロードへ共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、筋標的化剤は、分子ペイロードへ非共有結合的に連結されている。
いくつかの態様において、筋標的化剤は、ナトリウムイオン依存性の高親和性カルニチントランスポーターである有機カチオン/カルニチントランスポーター(OCTN2)の基質である。いくつかの態様において、筋標的化剤は、カルニチン、ミルドロネート、アセチルカルニチン、またはOCTN2へ結合するそのいずれかの誘導体である。いくつかの態様において、カルニチン、ミルドロネート、アセチルカルニチン、またはそれらの誘導体は、分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチドペイロード)へ共有結合的に連結されている。
筋標的化剤は、筋細胞を標的にする少なくとも1つの可溶性形態で存在するタンパク質であるタンパク質であってもよい。いくつかの態様において、筋標的化タンパク質は、鉄過剰およびホメオスタシスに関与するタンパク質ヘモジュベリン(またrepulsive guidance molecule Cまたはヘモクロマトーシスタイプ2タンパク質としても知られている)であってもよい。いくつかの態様において、ヘモジュベリンは、完全長もしくはフラグメントであっても、または機能的ヘモジュベリンタンパク質と少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％配列同一性をもつ突然変異体であってもよい。いくつかの態様において、ヘモジュベリン突然変異体は、可溶性フラグメントであってもよく、N末シグナリングを欠いていてもよく、および/またはC末アンカードメイン(anchoring domain)を欠いていてもよい。いくつかの態様において、ヘモジュベリンは、GenBank RefSeq受託番号NM_001316767.1、NM_145277.4、NM_202004.3、NM_213652.3、またはNM_213653.3の注釈付きのものであってもよい。ヘモジュベリンがヒト、霊長目の非ヒト動物、または齧歯類の動物を起源とするものであってもよいことは解されるはずである。
Ｂ．分子ペイロード
本開示のいくつかの側面は、分子ペイロード、例として、生物学的結果(例として、DNA配列の転写、タンパク質の発現、またはタンパク質の活性)をモジュレートするための分子ペイロードを提供する。いくつかの態様において、分子ペイロードは、筋標的化剤へ連結されているか、または別様に結び付けられている。いくつかの態様において、かかる分子ペイロードは、例として、結び付けられた筋標的化剤による筋細胞への送達を受けた筋細胞中の核酸またはタンパク質への特異的結合を介して、筋細胞を標的にすることが可能である。様々なタイプの筋標的化剤が本開示に従って使用されてもよいことは解されるはずである。例えば、分子ペイロードは、オリゴヌクレオチド(例として、アンチセンスオリゴヌクレオチド)、ペプチド(例として、疾患に関連する筋細胞中の核酸もしくはタンパク質に結合するペプチド)、タンパク質(例として、疾患に関連する筋細胞中の核酸もしくはタンパク質に結合するタンパク質)、または小分子(例として、疾患に関連する筋細胞中の核酸もしくはタンパク質の機能をモジュレートする小分子)を含んでいてもよく、またはこれらからなっていてもよい。いくつかの態様において、分子ペイロードは、表１で提供された遺伝子に相補性のある領域を有する鎖を含むオリゴヌクレオチドである。例示の分子ペイロードは本明細書にさらに詳細に記載されているが、しかしながら、本明細書に提供される例示の分子ペイロードが限定されることを意図していないことは解されるはずである。
いくつかの態様において、少なくとも1(例として、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも10)の分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド)は、筋標的化剤へ連結されている。いくつかの態様において、筋標的化剤へ連結されたすべての分子ペイロードは、同じであり、例として同じ遺伝子を標的にする。いくつかの態様において、筋標的化剤へ連結されたすべての分子ペイロードは、異なっており、例えば分子ペイロードは、同じ標的遺伝子の異なる部分を標的にしてもよく、または分子ペイロードは、少なくとも2つの異なる標的遺伝子を標的にしてもよい。いくつかの態様において、筋標的化剤は、同じであるいくつかの分子ペイロードおよび異なるいくつかの分子ペイロードへ連結されてもよい。
本開示はまた、複合体の少なくとも80％(例として、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％)が同数の分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド)へ連結された筋標的化剤を含む、複数の複合体を含む組成物を提供する。
ｉ．オリゴヌクレオチド
いずれの好適なオリゴヌクレオチドも、分子ペイロードとして、本明細書に記載のとおり使用されてよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、mRNAの分解を引き起こすよう設計されていてもよい(例として、オリゴヌクレオチドは、分解を引き起こすgapmer、siRNA、リボザイム、またはアプタマーであってもよい)。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、mRNAの翻訳を遮断するよう設計されていてもよい(例として、オリゴヌクレオチドは、翻訳を遮断するmixmer、siRNA、またはアプタマーであってもよい)。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、mRNAの分解を引き起こしてその翻訳を遮断するよう設計されていてもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、酵素(例として、遺伝子編集酵素)の活性に向かわせるためのガイド核酸(例として、ガイドRNA)であってもよい。オリゴヌクレオチドの他の例は本明細書に提供されている。いくつかの態様において、一方のフォーマット(format)からの機能的配列(例として、アンチセンス鎖配列)を他方のフォーマットへ組み込むことによって、あるフォーマットのオリゴヌクレオチド(例として、アンチセンスオリゴヌクレオチド)が、別のフォーマット(例として、siRNAオリゴヌクレオチド)へ好適に適応されてもよいことは解されるはずである。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、表1で提供された標的遺伝子と相補性のある領域を含んでもよい。さらなる非限定例は、表1の選択された遺伝子について、以下提供される。
DMPK/DM1
いくつかの態様において、DMPKを標的にするために、例としてDM1の処置のために、有用なオリゴヌクレオチドの例は、Compound And Method For Treating Myotonic Dystrophyという表題の2010年1月1日に公開された米国特許出願刊行物20100016215A1号；Modulation Of Dystrophia Myotonica-Protein Kinase (DMPK) Expressionという表題の2010年7月19日に公開された米国特許出願刊行物20130237585A1号；「Antisense Conjugates For Decreasing Expression Of Dmpk」という表題の2015年3月5日に公開された米国特許出願刊行物20150064181A1号；「Peptide-Linked Morpholino Antisense Oligonucleotides For Treatment Of Myotonic Dystrophy」という表題の2015年8月27日に公開された米国特許出願刊行物20150238627A1号；Pandey, S.K. et al. “Identification and Characterization of Modified Antisense Oligonucleotides Targeting DMPK in Mice and Nonhuman Primates for the Treatment of Myotonic Dystrophy Type 1” J. of Pharmacol Exp Ther, 2015, 355:329-340.; Langlois, M. et al. “Cytoplasmic and Nuclear Retained DMPK mRNAs Are Targets for RNA Interference in Myotonic Dystrophy Cells” J. Biological Chemistry, 2005, 280:17, 16949-16954.; Jauvin, D. et al. “Targeting DMPK with Antisense Oligonucleotide Improves Muscle Strength in Myotonic Dystrophy Type 1 Mice”, Mol. Ther: Nucleic Acids, 2017, 7:465-474.; Mulders, S.A. et al. “Triplet-repeat oligonucleotide-mediated reversal of RNA toxicity in myotonic dystrophy” PNAS, 2009, 106:33, 13915-13920.; Wheeler, T.M. et al., “Targeting nuclear RNA for in vivo correction of myotonic dystrophy” Nature, 2012, 488(7409):111-115.;および「Compounds And Methods For Modulation Of Dystrophia Myotonica-Protein Kinase (Dmpk) Expression」という表題の2016年10月20日に公開された米国特許出願刊行物20160304877A1に提供され、これらの各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
DMPK遺伝子編集を促進するためのオリゴヌクレオチドの例は、「Genetic Correction Of Myotonic Dystrophy Type 1」という表題の2017年3月3日に公開された米国特許出願刊行物20170088819A1号;および、「Materials And Methods For Treatment Of Myotonic Dystrophy Type 1 (DM1) And Other Related Disorders」という表題の2018年4月1日に公開された国際特許出願刊行物WO18002812A1号を包含し、これらの各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMPKの突然変異型、例えば、Botta A. et al. “The CTG repeat expansion size correlates with the splicing defects observed in muscles from myotonic dystrophy type 1 patients.” J Med Genet. 2008 Oct;45(10):639-46.;およびMachuca-Tzili L. et al. “Clinical and molecular aspects of the myotonic dystrophies: a review.” Muscle Nerve. 2005 Jul;32(1):1-18.(これらの各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる)で報告された突然変異型と、相補性のある領域を有してもよい。
いくつかの態様において、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドは、DMPKを標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチド標的化は、参照により本明細書に組み込まれる「Compounds And Methods For Modulation Of Dystrophia Myotonica-Protein Kinase (DMPK) Expression」という表題の2016年10月20日に公開された米国特許出願刊行物US20160304877A1号に記載された、DMPKを標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチド(例として、Gapmer)のいずれか1つである。いくつかの態様において、DMPK標的化オリゴヌクレオチドは、Genbank受託番号NM_001081560.2で表されるまたはGenbank受託番号NG_009784.1で表されるDMPK遺伝子配列の領域を標的にする。
いくつかの態様において、DMPK標的化オリゴヌクレオチドは、Genbank受託番号NM_001081560.2中の少なくとも10個の連続的なヌクレオチド(例として、少なくとも10個、少なくとも12個、少なくとも14個、少なくとも16個、またはそれ以上の連続的なヌクレオチド)である標的領域に相補的な領域を含むヌクレオチド配列を含む。
いくつかの態様において、DMPK標的化オリゴヌクレオチドは、gapmerモチーフを含む。「gapmer」は、RNase H切断を支持する複数のヌクレオチドを有する内部領域が、1個以上のヌクレオチドを有する外部領域の間に位置されるキメラのアンチセンス化合物を意味し、ここで内部領域を含むヌクレオチドは、ヌクレオチドまたは外部領域を含むヌクレオチドとは化学的に別個である。内部領域は「gapセグメント」と称され得、および外部領域は「wingセグメント」と称され得る。いくつかの態様において、DMPK標的化オリゴヌクレオチドは、1個以上の修飾ヌクレオチド、および/または1個以上の修飾ヌクレオチド間連結を含む。いくつかの態様において、ヌクレオチド間連結は、ホスホロチオアート連結である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、完全なホスホロチオアート主鎖を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、cET末端を伴うDNA gapmer(例として、3-10-3；cET-DNA-cET)である。いくつかの態様において、DMPK標的化オリゴヌクレオチドは、1以上の6'-(S)-CH3二環式ヌクレオチド、1以上のβ-D-2'-デオキシリボヌクレオチド、および/または1以上の5-メチルシトシンヌクレオチドを含む。
DUX4/FSHD
いくつかの態様において、DUX4を標的にするために、例として、FSHDの処置のために、有用なオリゴヌクレオチドの例は、「AGENTS USEFUL IN TREATING FACIOSCAPULOHUMERAL MUSCULAR DYSTROPHY」という表題の2017年2月2日に公開された米国特許番号9,988,628号；「RECOMBINANT VIRUS PRODUCTS AND METHODS FOR INHIBITING EXPRESSION OF DUX4」という表題の2014年10月30日に公開された米国特許番号9,469,851号；「AGENTS USEFUL IN TREATING FACIOSCAPULOHUMERAL MUSCULAR DYSTROPHY」という表題の2012年9月6日に公開された米国特許出願刊行物20120225034号；「MORPHOLINO TARGETING DUX4 FOR TREATING FSHD」という表題の2013年8月15日に公開されたPCT特許出願刊行物番号WO 2013/120038号；Chen et al., “Morpholino-mediated Knockdown of DUX4 Toward Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy Therapeutics,” Molecular Therapy, 2016, 24:8, 1405-1411.；およびAnsseau et al., “Antisense Oligonucleotides Used to Target the DUX4 mRNA as Therapeutic Approaches in Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy (FSHD),” Genes, 2017, 8, 93.に提供され、これらの各々の内容全体は本明細書に組み込まれる。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、標的DUX4遺伝子またはmRNAとハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチド、モルホリノ、siRNA、shRNA、または別のヌクレオチドである。
いくつかの態様において、例として、FSHDの処置のために、オリゴヌクレオチドは、2015年にCurr Opin Genet Devで公開されたDaxinger, et al., “Genetic and Epigenetic Contributors to FSHD,” Lim J-W, et al., DICER/AGO-dependent epigenetic silencing of D4Z4 repeats enhanced by exogenous siRNA suggests mechanisms and therapies for FSHD Hum Mol Genet. 2015 Sep 1; 24(17): 4817-4828(これらの各々の内容全体は本明細書に組み込まれる)におけるとおり、低メチル化され縮小されたD4Z4反復と相補性のある領域を有してもよい。
DNM2/CNM
いくつかの態様において、DNM2を標的にするために、例として、CNMの処置のために、有用なオリゴヌクレオチドの例は、「DYNAMIN 2 INHIBITOR FOR THE TREATMENT OF DUCHENNE'S MUSCULAR DYSTROPHY」という表題の2018年5月24日に公開された米国特許出願刊行物番号20180142008号、および「ALLELE-SPECIFIC SILENCING THERAPY FOR DYNAMIN 2-RELATED DISEASES」という表題の2018年6月7日に公開されたPCT出願刊行物番号WO 2018/100010A1号に提供されている。例えば、いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DNM2発現と特異的に干渉するRNAi、アンチセンス核酸、siRNA、またはリボザイムである。DNM2を標的にするための有用なオリゴヌクレオチドの他の例は、2018年4月4日にMol. Ther.で公開されたTasfaout, et al., “Single Intramuscular Injection of AAV-shRNA Reduces DNM2 and Prevents Myotubular Myopathy in Mice,”およびTasfaout, et al., “Antisense oligonucleotide-mediated Dnm2 knockdown prevents and reverts myotubular myopathy in mice,” Nature Communications volume 8, Article number: 15661 (2017)に提供されている。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DNM2 mRNAを効率的に標的にするshRNAまたはモルホリノである。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、2015年7月にMol. Cell Biol.で公開されたTodaka, et al. “Overexpression of NF90-NF45 Represses Myogenic MicroRNA Biogenesis, Resulting in Development of Skeletal Muscle Atrophy and Centronuclear Muscle Fibers”におけるとおり、miR-133活性に耐性がある野生型DNM2をコードする。DNM2を標的するために有用なオリゴヌクレオチドのさらなる例は、2013年にPLoS Oneで公開されたGibbs, et al., “Two Dynamin-2 Genes are Required for Normal Zebrafish Development”に提供され、これらの各々の内容全体は本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、例として、CNMの処置のために、オリゴヌクレオチドは、2012年にHum. Mutat.で公開されたBoehm et al, 「Mutation Spectrum in the Large GTPase Dynamin 2, and Genotype-Phenotype Correlation in Autosomal Dominant Centronuclear Myopathy」(この内容全体は本明細書に組み込まれる)におけるとおり、CNMに関連するDNM2における突然変異体と相補性のある領域を有してもよい。
ポンペ病
いくつかの態様において、例として、ポンペ病の処置のために、オリゴヌクレオチドは、van der Wal, et al., “GAA Deficiency in Pompe Disease is Alleviated by Exon Inclusion in iPSC-Derived Skeletal Muscle Cells,” Mol Ther Nucleic Acids. 2017 Jun 16; 7: 101-115(この内容全体は本明細書に組み込まれる)におけるとおり、GAA疾患アレル中にエキソン2封入を媒介する。結果的に、いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、GAA疾患アレルと相補性のある領域を有してもよい。
いくつかの態様において、例として、ポンペ病の処置のために、RNAiまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、例えば、2017年にMol Ther Nucleic Acidsで公開されたClayton, et al., “Antisense Oligonucleotide-mediated Suppression of Muscle Glycogen Synthase 1 Synthesis as an Approach for Substrate Reduction Therapy of Pompe Disease,” または「INHIBITING OR DOWNREGULATING GLYCOGEN SYNTHASE BY CREATING PREMATURE STOP CODONS USING ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES」という表題の2017年6月29日に公開された米国特許出願刊行物番号2017182189号(これらの内容は参照により本明細書に組み込まれる)において報告されたように、筋細胞中の野生型GYS1の発現を抑制するために利用される。結果的に、いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、RefSeq番号NM_002103.4に対応するヒトGYS1配列および/またはRefSeq番号NM_030678.3に対応するマウスGYS1配列である配列と、相補性のある領域を有するアンチセンス鎖を有してもよい。
ACVR1/FOP
例えば、FOPの処置のために、ACVR1を標的にするのに有用なオリゴヌクレオチドの例は、米国特許出願2009/0253132、10/8/2009公開、“Mutated ACVR1 for diagnosis and treatment of fibrodyplasia ossificans progressiva (FOP)”;WO 2015/152183、10/8/2015公開、“Prophylactic agent and therapeutic agent for fibrodysplasia ossificans progressive”;Lowery,J.W.et al, “Allele-specific RNA Interference in FOP-Silencing the FOP gene”,GENE THERAPY,vol.19,2012,pages 701-702;Takahashi,M.et al.“Disease-causing allele-specific silencing against the ALK2 mutants, R206H and G356D, in fibrodysplasia ossificans progressiva”Gene Therapy(2012)19,781-785;Shi,S.et al.“Antisense-Oligonucleotide Mediated Exon Skipping in Activin-Receptor-Like Kinase 2: Inhibiting the Receptor That Is Overactive in Fibrodysplasia Ossificans Progressiva”Plos One,July 2013,Vol8:7,e69096.;米国特許出願2017/0159056、6/8/2017公開、“Antisense oligonucleotides and methods of use thereof”;米国特許第8,859,752号、10/4/2014発行、“SIRNA-based therapy of Fibrodyplasia Ossificans Progressiva (FOP)”;WO2004/094636、11/4/2004公開、“Effective sirna knock-down constructs”に提供されているが、これら各々の内容はそれら全体が本明細書に組み込まれる。
FXN/フリートライヒ運動失調症
いくつかの態様において、FXNを標的にするためにおよび/またはそうでなければフラタキシン欠乏症を補償するために、例として、フリートライヒ運動失調症の処置のために、有用なオリゴヌクレオチドの例は、Li, L. et al “Activating frataxin expression by repeat-targeted nucleic acids” Nat. Comm. 2016, 7:10606.；WO 2016/094374、6/16/2016公開、「Compositions and methods for treatment of friedreich's ataxia.」；WO 2015/020993、2/12/2015公開、「RNAi COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATMENT OF FRIEDREICH'S ATAXIA」；WO 2017/186815、11/2/2017公開、「Antisense oligonucleotides for enhanced expression of frataxin」；WO 2008/018795、2/14/2008公開、「Methods and means for treating dna repeat instability associated genetic disorders」；米国特許出願2018/0028557、2/1/2018公開、「Hybrid oligonucleotides and uses thereof」；WO 2015/023975、2/19/2015公開、「Compositions and methods for modulating RNA」；WO 2015/023939、2/19/2015公開、「Compositions and methods for modulating expression of frataxin」；米国特許出願2017/0281643、10/5/2017公開、「Compounds and methods for modulating frataxin expression」；Li L. et al., “Activating frataxin expression by repeat-targeted nucleic acids” Nature Communications, 2016年2月4日公開;およびLi L. et al. “Activation of Frataxin Protein Expression by Antisense Oligonucleotides Targeting the Mutant Expanded Repeat” Nucleic Acid Ther. 2018 Feb;28(1):23-33.に提供され、これらの各々の内容全体は本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドペイロードは、例として、米国特許第9,593,330号、6/9/2011出願、「Treatment of frataxin (FXN) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to FXN」(この内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる)において開示されたように、FXN発現を阻害する天然アンチセンス転写産物の発現を阻害するために構成される(例として、gapmerまたはRNAiオリゴヌクレオチドとして)。
FXN遺伝子編集を促進するためのオリゴヌクレオチドの例は、WO 2016/094845、6/16/2016公開、「Compositions and methods for editing nucleic acids in cells utilizing oligonucleotides」；WO 2015/089354、6/18/2015公開、「Compositions and methods of use of CRISPR-Cas systems in nucleotide repeat disorders」；WO 2015/139139、9/24/2015公開、「CRISPR-based methods and products for increasing frataxin levels and uses thereof」;およびWO 2018/002783、1/4/2018公開、「Materials and methods for treatment of Friedreich ataxia and other related disorders」を包含し、これらの各々の内容全体は本明細書に組み込まれる。
非FXN遺伝子、例としてFXNの後成的調節因子、の標的化を通じてFXN遺伝子発現を促進するためのオリゴヌクレオチドの例は、WO 2015/023938、2/19/2015公開、「Epigenetic regulators of frataxin」を包含し、この内容全体は本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ヒト由来のFXN遺伝子(Gene ID 2395；NC_000009.12)および/またはマウス由来のFXN遺伝子(Gene ID 14297；NC_000085.6)として規定される配列と、相補性のある領域を有してもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、例えば、例として、Montermini, L. et al. “The Friedreich ataxia GAA triplet repeat: premutation and normal alleles.” Hum. Molec. Genet., 1997, 6: 1261-1266.; Filla, A. et al. “The relationship between trinucleotide (GAA) repeat length and clinical features in Friedreich ataxia.” Am. J. Hum. Genet. 1996, 59: 554-560.; Pandolfo, M. Friedreich ataxia: the clinical picture. J. Neurol. 2009, 256, 3-8.(これらの各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる)において報告されたように、FXNの突然変異型と相補性のある領域を有してもよい。
DMD/ジストロフィン異常症
DMDを標的にするための有用なオリゴヌクレオチドの例は、「MULTIPLE EXON SKIPPING COMPOSITIONS FOR DMD」という表題の2010年5月27日に公開された米国特許出願刊行物US20100130591A1号；「MEANS AND METHOD FOR INDUCING EXON-SKIPPING」という表題の2013年1月29日に登録された米国特許第8,361,979号；「METHOD FOR EFFICIENT EXON (44) SKIPPING IN DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY AND ASSOCIATED MEANS」という表題の2012年3月8日に公開された米国特許出願刊行物20120059042号；「EXON SKIPPING COMPOSITIONS FOR TREATING MUSCULAR DYSTROPHY」という表題の2014年11月6日に公開された米国特許出願刊行物20140329881号；「ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES FOR INDUCING EXON SKIPPING AND METHODS OF USE THEREOF」という表題の2012年7月31日に登録された米国特許第8,232,384；「METHODS AND MEANS FOR EFFICIENT SKIPPING OF EXON 45 IN DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY PRE-MRNA」という表題の2012年1月26日に公開された米国特許出願刊行物20120022134A1；「ADENO-ASSOCIATED VIRAL VECTOR FOR EXON SKIPPING IN A GENE ENCODING A DISPENSABLE DOMAN PROTEIN」という表題の2012年3月29日に公開された米国特許出願刊行物20120077860；「OLIGOMERS」という表題の2012年12月4日に登録された米国特許第8,324,371号；「ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES」という表題の2015年7月14日に登録された米国特許第9,078,911号；「ANTISENSE NUCLEIC ACIDS」という表題の2015年7月14日に登録された米国特許第9,079,934号；「MIR-31 IN DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY THERAPY」という表題の2015年5月19日に登録された米国特許第9,034,838号;および「OLIGONUCLEOTIDE COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF」という表題の2017年4月13日に公開された国際特許刊行物WO2017062862A3に提供され、これらの各々の内容全体は本明細書に組み込まれる。
DMD遺伝子編集を促進するためのオリゴヌクレオチドの例は、「METHODS OF MODIFYING THE DYSTROPHIN GENE AND RESTORING DYSTROPHIN EXPRESSION AND USES THEREOF」という表題の2018年3月29日に公開された国際特許刊行物WO2018053632A1；「MODIFICATION OF THE DYSTROPHIN GENE AND USES THEREOF」という表題の2017年3月30日に公開された国際特許刊行物WO2017049407A1；「CRISPR/CAS-RELATED METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY AND BECKER MUSCULAR DYSTROPHY」という表題の2016年10月6日に公開された国際特許刊行物WO2016161380A1；「THERAPEUTIC TARGETS FOR THE CORRECTION OF THE HUMAN DYSTROPHIN GENE BY GENE EDITING AND METHODS OF USE」という表題の2017年6月8日に公開された国際特許刊行物WO2017095967；「MATERIALS AND METHODS FOR TREATMENT OF DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY」という表題の2017年5月4日に公開された国際特許刊行物WO2017072590A1；「PREVENTION OF MUSCULAR DYSTROPHY BY CRISPR/CPF1-MEDIATED GENE EDITING」という表題の2018年5月31日に公開された国際特許刊行物WO2018098480A1；、「RNA-Guided Systems for In Vivo Gene Editing」という表題の2017年9月21日に公開された米国特許出願刊行物US20170266320A1；「PREVENTION OF MUSCULAR DYSTROPHY BY CRISPR/CAS9-MEDIATED GENE EDITING」という表題の2016年2月18日に公開された国際特許刊行物WO2016025469A1；「RNA-GUIDED GENE EDITING AND GENE REGULATION」という表題の2016年7月14日に公開された米国特許出願刊行物2016/0201089;および「MEGANUCLEASE VARIANTS CLEAVING A DNA TARGET SEQUENCE FROM THE DYSTROPHN GENE AND USES THEREOF」という表題の2013年6月6日に公開された米国特許出願刊行物2013/0145487を包含し、これらの各々の内容全体は本明細書に組み込まれる。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、例として、ヒト、マウスおよび非ヒト種から選択される、複数の種のDMD遺伝子配列と相補性のある領域を有してもよい。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、突然変異体DMDアレル、例えば、フレームシフトおよび不適当なRNAスプライシング/プロセシングに繋がるヒト中DMDのエキソン1〜79のいずれかにおける少なくとも1個の突然変異を伴うDMDアレル、と相補性のある領域を有してもよい。
MYH7/肥大性心筋症
ペイロードとして、例として、MYH7を標的にするための、有用なオリゴヌクレオチドの例は、Inhibitors of MYH7B and Uses Thereofという表題の2018年4月5日に公開された米国特許出願刊行物20180094262；Oligonucleotides and Methods for Treatment of Cardiomyopathy Using RNA Interferenceという表題の2016年12月1日に公開された米国特許出願刊行物20160348103；「Allele-specific RNA Silencing for the Treatment of Hypertrophic Cardiomyopathy」という表題の2016年8月18日に公開された米国特許出願刊行物20160237430；「Inhibitors of MYH7B and Uses Thereof」という表題の2016年2月4日に公開された米国特許出願刊行物20160032286；「MicroRNA Inhibitors Comprising Locked Nucleotides」という表題の2014年7月3日に公開された米国特許出願刊行物20140187603；「Dual Targeting of miR-208 and miR-499 in the Treatment of Cardiac Disorders」という表題の2014年6月26日に公開された米国特許出願刊行物20140179764；「Compositions and Methods to Treat Muscular and Cardiovascular Disorders」という表題の2012年5月10日に公開された米国特許出願刊行物20120114744に提供され、これらの各々の内容全体は本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、lncRNAまたはmRNAを、例として分解のために、標的にしてもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、例として分解のために、ミスマッチ修復経路に関与するタンパク質をコードする核酸、例として、MSH2、MutLアルファ、MutSベータ、MutLアルファを標的にしてもよい。ミスマッチ修復経路に関与するタンパク質(かかるタンパク質をコードするmRNAは、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドによって標的にされてもよい)の非限定例は、Iyer,R.R.et al.,“DNA triplet repeat expansion and mismatch repair”Annu Rev Biochem.2015;84:199-226;およびSchmidt M.H. and Pearson C.E.,“Disease-associated repeat instability and mismatch repair”DNA Repair(Amst).2016 Feb;38:117-26に記載されている。
ａ．オリゴヌクレオチドサイズ/配列
オリゴヌクレオチドは、例としてフォーマットに応じて、様々な異なる長さのものであってもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、長さが7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75ヌクレオチドであるか、またはこれより長い。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、長さが8〜50ヌクレオチド、長さが8〜40ヌクレオチド、長さが8〜30ヌクレオチド、長さが10〜15ヌクレオチド、長さが10〜20ヌクレオチド、長さが15〜25ヌクレオチド、長さが21〜23ヌクレオチド等々である。
いくつかの態様において、本開示の目的上オリゴヌクレオチドの相補的な核酸配列は、前記配列の標的分子(例として、mRNA)への結合が標的(例として、mRNA)の正常な機能に干渉して活性の喪失(例として、翻訳の阻害)または発現の喪失(例として、標的mRNAの分解)を引き起こしたとき、かつ非特異的結合の回避が所望される条件下、例として、in vivoアッセイまたは治療処置のケースおよびin vitroアッセイのケースにおける生理学的な条件下、アッセイがストリンジェンシー(stringency)の好適な条件下で実施される条件下で、前記配列の非標的配列への非特異的結合を回避するのに充分な程度の相補性があるとき、標的核酸に特異的にハイブリダイズ可能であるか、または標的核酸に特異的である。よって、いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、標的核酸の連続したヌクレオチドに少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または100％相補的であってもよい。いくつかの態様において、相補的なヌクレオチド配列は、標的核酸に特異的にハイブリダイズ可能であるか、または標的核酸に特異的であるその標的の配列に100％相補的である必要はない。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、長さが8〜15、8〜30、8〜40、または10〜50、または5〜50、または5〜40ヌクレオチドの範囲にある標的核酸と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドの、標的核酸と相補性のある領域は、長さが5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50ヌクレオチドである。いくつかの態様において、相補性のある領域は、標的核酸の少なくとも連続した8ヌクレオチドと相補的である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、標的核酸の一部の連続したヌクレオチドと比較して1、2または3塩基ミスマッチを含有していてもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、15塩基にわたり最大3ミスマッチまで、または10塩基にわたり最大2ミスマッチまで有していてもよい。
ｂ．オリゴヌクレオチド修飾:
本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、修飾されていてもよく、例として、修飾された糖部、修飾されたヌクレオシド間連結、修飾ヌクレオチド、および/またはそれらの組み合わせを含む。加えて、いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、以下の特性の1以上を呈してもよい:選択的スプライシングを媒介しない;免疫刺激性ではない;ヌクレアーゼ抵抗性である;非修飾オリゴヌクレオチドと比較して改善された細胞取り込みを有する;細胞または哺乳動物への毒性がない;改善されたエンドソームの内部への出口(exit)を細胞中に有する;TLR刺激を最小限に抑える;または、パターン認識受容体を回避する。本明細書に記載のオリゴヌクレオチドの修飾された化学的性質またはフォーマットのいずれも、互いに組み合わせられ得る。例えば、1、2、3、4、5、またはこれより多くの異なるタイプの修飾が、同じオリゴヌクレオチド内に包含され得る。
いくつかの態様において、修飾が組み込まれるオリゴヌクレオチドを、ネイティブなオリゴデオキシヌクレオチド分子またはオリゴリボヌクレオチド分子よりヌクレアーゼ消化に耐性があるようにさせる、特定のヌクレオチド修飾が使用されてもよい;これらの修飾されたオリゴヌクレオチドは、非修飾オリゴヌクレオチドより長時間無傷で存続する。修飾されたオリゴヌクレオチドの特定例は、修飾された主鎖、例えば、ホスホロチオアート、ホスホトリエステル、メチルホスホナート、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間連結、または短鎖ヘテロ原子のもしくは複素環式の糖間連結などの修飾されたヌクレオシド間連結を含むものを包含する。結果的に、本開示のオリゴヌクレオチドは、修飾、例として、ヌクレオチド修飾の組み込みなどによる核酸分解に対して安定化され得る。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの2〜10、2〜15、2〜16、2〜17、2〜18、2〜19、2〜20、2〜25、2〜30、2〜40、2〜45ヌクレオチド、またはこれより多いヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである、長さが最大50ヌクレオチドまでまたは最大100ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドであってもよい。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの2〜10、2〜15、2〜16、2〜17、2〜18、2〜19、2〜20、2〜25、2〜30ヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである、長さが8〜30ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであってもよい。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの2〜4、2〜5、2〜6、2〜7、2〜8、2〜9、2〜10、2〜11、2〜12、2〜13、2〜14ヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである、長さが8〜15ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであってもよい。任意に、オリゴヌクレオチドは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10ヌクレオチドを除き、どのヌクレオチドも修飾されていてもよい。オリゴヌクレオチド修飾は本明細書にさらに記載されている。
ｃ．修飾ヌクレオチド
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、2'-修飾ヌクレオチド、例として、2'-デオキシ、2'-デオキシ-2'-フルオロ、2'-O-メチル、2'-O-メトキシエチル(2'-O-MOE)、2'-O-アミノプロピル(2'-O-AP)、2'-O-ジメチルアミノエチル(2'-O-DMAOE)、2'-O-ジメチルアミノプロピル(2'-O-DMAP)、2'-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2'-O-DMAEOE)、または2'-O--N-メチルアセトアミド(2'-O--NMA)を包含する。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは少なくとも1個の2'-O-メチル-修飾ヌクレオチドを包含し得、いくつかの態様において、ヌクレオチドのすべてが2'-O-メチル修飾を包含する。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、リボース環が環中2原子を接続する(例として、2'-O原子を4'-C原子へ接続する)架橋部分を含む、修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは「ロックド」されており、例として、リボース環が2'-O原子と4'-C原子とを接続するメチレン架橋によって「ロックド」されている修飾ヌクレオチドを含む。LNAの例は、2008年4月17日に公開され「RNA Antagonist Compounds For The Modulation Of PCSK9」という表題の国際特許出願刊行物WO/2008/043753(この内容は、その全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる)に記載されている。
本明細書に開示のオリゴヌクレオチドに使用されてもよい他の修飾は、エチレン架橋核酸(ENA)を包含する。ENAは、これらに限定されないが、2'-O,4'-C-エチレン架橋核酸を包含する。ENAの例は、2005年5月12日に公開され「APP/ENA Antisense」という表題の国際特許刊行物第WO 2005/042777号;Morita et al.,Nucleic Acid Res.,Suppl 1:241-242,2001;Surono et al.,Hum. Gene Ther.,15:749-757,2004;Koizumi,Curr. Opin. Mol. Ther.,8:144-149,2006;およびHorie et al.,Nucleic Acids Symp. Ser(Oxf),49:171-172,2005に提供されており、これらの開示はそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ロックド核酸(LNA)ヌクレオチド、拘束エチル(cEt)ヌクレオチド、またはエチレン架橋核酸(ENA)ヌクレオチドなどの架橋ヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、以下の米国特許または特許出願刊行物のうち1つに開示された修飾ヌクレオチドを含む:米国特許7,399,845、2008年7月15日発行、表題「6-Modified Bicyclic Nucleic Acid Analogs」;米国特許7,741,457、2010年6月22日発行、表題「6-Modified Bicyclic Nucleic Acid Analogs」;米国特許8,022,193、2011年9月20日発行、表題「6-Modified Bicyclic Nucleic Acid Analogs」;米国特許7,569,686、2009年8月4日発行、表題「Compounds And Methods For Synthesis Of Bicyclic Nucleic Acid Analogs」;米国特許7,335,765、2008年2月26日発行、表題「Novel Nucleoside And Oligonucleotide Analogues」;米国特許7,314,923、2008年1月1日発行、表題「Novel Nucleoside And Oligonucleotide Analogues」;米国特許7,816,333、2010年10月19日発行、表題「Oligonucleotide Analogues And Methods Utilizing The Same」および米国刊行物第2011/0009471号、現在米国特許8,957,201、2015年2月17日発行、表題「Oligonucleotide Analogues And Methods Utilizing The Same」、すべての用途において(for all purposes)、これら各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、糖の2'位置にて修飾された少なくとも1ヌクレオチド、好ましくは2'-O-アルキル、2'-O-アルキル-O-アルキル、または2'-フルオロ-修飾ヌクレオチドを含む。他の好ましい態様において、RNA修飾は、ピリミジン、脱塩基残基、またはRNAの3'末端での逆方向(inverted)塩基のリボース上に2'-フルオロ、2'-アミノ、および2'O-メチル修飾を包含する。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも1個の修飾ヌクレオチドも有さないオリゴヌクレオチドと比較して、1℃、2℃、3℃、4℃、または5℃の範囲にあるオリゴヌクレオチドのTmの増大をもたらす少なくとも1個の修飾ヌクレオチドを有していてもよい。オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドを有さないオリゴヌクレオチドと比較して、合計で2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、またはこれを超える温度の範囲にあるオリゴヌクレオチドのTmの増大をもたらす複数の修飾ヌクレオチドを有していてもよい。
オリゴヌクレオチドは、異なる種類のヌクレオチドを互い違いにさせることを含んでもよい。例えば、オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドと2'-フルオロ-デオキシリボヌクレオチドとを互い違いにさせることを含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドと2'-O-メチルヌクレオチドとを互い違いにさせることを含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、2'-フルオロヌクレオチドと2'-O-メチルヌクレオチドとを互い違いにさせることを含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、架橋ヌクレオチドと2'-フルオロまたは2'-O-メチルヌクレオチドとを互い違いにさせることを含んでもよい。
ｄ．ヌクレオチド間連結/主鎖
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオアートまたは他の修飾ヌクレオチド間連結を含有していてもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結を、少なくとも2個のヌクレオチド間に含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結を、すべてのヌクレオチド間に含む。例えば、いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド間連結を、ヌクレオチド配列の5'または3'末端の、第1の、第2の、および/または第3のヌクレオシド間連結にて含む。
使用されてもよい、リンを含有する連結は、これらに限定されないが、正常な3'-5'連結、これらの2'-5'連結類似体を有する、ホスホロチオアート、キラルのホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホナート(3'アルキレンホスホナートおよびキラルのホスホナートを含む)、ホスフィナート、ホスホロアミダート(3'-アミノホスホロアミダートおよびアミノアルキルホスホロアミダートを含む)、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびにボラノホスファートと、逆方向の極性を有するこれら(ここでヌクレオシド単位の隣接する対は3'-5'から5'-3'へまたは2'-5'から5'-2'へ連結されている)とを包含する;米国特許第3,687,808号;第4,469,863号;第4,476,301号;第5,023,243号;第5,177,196号;第5,188,897号;第5,264,423号;第5,276,019号;第5,278,302号;第5,286,717号;第5,321,131号;第5,399,676号;第5,405,939号;第5,453,496号;第5,455,233号;第5,466,677号;第5,476,925号;第5,519,126号;第5,536,821号;第5,541,306号;第5,550,111号;第5,563,253号;第5,571,799号;第5,587,361号;および第5,625,050号を参照。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、メチレン(メチルイミノ)またはMMI主鎖;アミド主鎖(De Mesmaeker et al. Ace.Chem.Res.1995,28:366-374を参照);モルホリノ主鎖(SummertonおよびWeller、米国特許第5,034,506号を参照);またはペプチド核酸(PNA)主鎖(ここでオリゴヌクレオチドのホスホジエステル主鎖がポリアミド主鎖に置き換えられており、ヌクレオチドがポリアミド主鎖のアザ窒素原子へ直接的または間接的に結合されている、Nielsen et al.,Science 1991,254,1497を参照)などのヘテロ原子主鎖を有していてもよい。
ｅ．立体特異的オリゴヌクレオチド
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間のリン原子はキラルであり、およびオリゴヌクレオチドの特性はキラルのリン原子の立体配置に基づき調整される。いくつかの態様において、適切な方法は、立体制御されたやり方(例として、Oka N, Wada T, Stereocontrolled synthesis of oligonucleotide analogs containing chiral internucleotidic phosphorus atoms. Chem Soc Rev.2011 Dec;40(12):5829-43に記載のとおりの)でP-キラルオリゴヌクレオチド類似体を合成するために使用されてもよい。いくつかの態様において、実質的にすべてのSpホスホロチオアート糖間連結または実質的にすべてのRpホスホロチオアート糖間連結のいずれかによって一緒に結び合わされたヌクレオシド単位を含む、ホスホロチオアート含有オリゴヌクレオチドが提供される。いくつかの態様において、実質的にキラル純粋な糖間連結を有するかかるホスホロチオアートオリゴヌクレオチドは、例えば、1996年12月12日に発行された米国特許5,587,261(この内容は全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる)に記載されるとおり、酵素合成または化学合成によって調製される。いくつかの態様において、キラル制御されたオリゴヌクレオチドは、標的核酸の選択的切断パターンを提供する。例えば、いくつかの態様において、キラル制御されたオリゴヌクレオチドは、例えば、2017年2月2日に公開された表題「CHIRAL DESIGN」の米国特許出願刊行物20170037399 A1(この内容は全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる)に記載のとおり、核酸の相補的な配列内に単一の切断部位を提供する。
ｆ．モルホリノ
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、モルホリノをベースとした化合物であってもよい。モルホリノをベースとしたオリゴマー化合物は、Dwaine A.Braasch and David R.Corey,Biochemistry,2002,41(14),4503-4510);Genesis,volume 30,issue 3,2001;Heasman,J.,Dev.Biol.,2002,243,209-214;Nasevicius et al.,Nat.Genet.,2000,26,216-220;Lacerra et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,2000,97,9591-9596;および1991年7月23日発行の米国特許第5,034,506号に記載されている。いくつかの態様において、モルホリノをベースとしたオリゴマー化合物は、ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー(PMO)(例として、Iverson,Curr.Opin.Mol.Ther.,3:235-238,2001;およびWang et al.,J.Gene Med.,12:354-364,2010に記載のとおり;これらの開示はこれら全体が参照により本明細書に組み込まれる)。
ｇ．ペプチド核酸(PNA)
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位の糖とヌクレオシド間連結(主鎖)との両方とも、新規な基に置き換えられている。いくつかの態様において、塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持されている。かかるオリゴマー化合物の1つである、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸(PNA)と称される。PNA化合物中のオリゴヌクレオチドの糖-主鎖は、アミド含有主鎖、例えば、アミノエチルグリシン主鎖に置き換えられている。核酸塩基は保持されており、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子へ直接的または間接的に結合されている。PNA化合物の調製を報告する代表的な刊行物は、これらに限定されないが、米国特許第5,539,082号;第5,714,331号;および第5,719,262号(これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる)を包含する。PNA化合物のさらなる教示は、Nielsen et al.,Science,1991,254,1497-1500から見出され得る。
ｈ．Gapmer
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、gapmerである。gapmerオリゴヌクレオチドは一般に、式5'-X-Y-Z-3'を有し、gap領域Yを囲む両脇の(flanking)領域としてXおよびZをもつ。いくつかの態様において、Y領域は、連続した一続きのヌクレオチド、例として、少なくとも6DNAヌクレオチドの領域であって、RNAse HなどのRNAseを動員することが可能である。いくつかの態様において、gapmerは、RNAseが動員され次いで標的核酸を切断し得るポイントにて、標的核酸へ結合する。いくつかの態様において、Y領域は、高親和性修飾ヌクレオチド、例として、1〜6個の修飾ヌクレオチドを含む領域XおよびZによって、5'と3'との両方から挟まれている(flanked)。修飾ヌクレオチドの例は、これらに限定されないが、2'MOEまたは2'OMe、またはロックド核酸塩基(LNA)を包含する。両脇の配列XおよびZは、いくつかの態様において、長さが1〜20ヌクレオチド、1〜8ヌクレオチド、または1〜5ヌクレオチドであってもよい。両脇の配列XおよびZは、同様の長さであってもよく、または同様の長さでなくてもよい。gapセグメントYは、いくつかの態様において、長さが5〜20ヌクレオチド、6〜12ヌクレオチド、または6〜10ヌクレオチドのヌクレオチド配列であってもよい。
いくつかの態様において、gapmerオリゴヌクレオチドのgap領域は、C4'-置換ヌクレオチド、非環式ヌクレオチド、およびアラビノから構成される(arabino-configured)ヌクレオチドなどのDNAヌクレオチドに加えて、効率的なRNase H作用を及ぼす条件を満たす(acceptable)ことが知られている修飾ヌクレオチドを含有していてもよい。いくつかの態様において、gap領域は、1以上の非修飾ヌクレオシド間を含む。いくつかの態様において、片脇または両脇の(one or both flanking)領域は、各々独立して、1以上のホスホロチオアートヌクレオシド間連結(例として、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結または他の連結)を、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個の、またはこれより多いヌクレオチド間に含む。いくつかの態様において、gap領域および2つの脇の(two flanking)領域は、各々独立して、修飾ヌクレオシド間連結(例として、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結または他の連結)を、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個の、またはこれより多いヌクレオチド間に含む。
gapmerは、適切な方法を使用して産生されてもよい。gapmerの調製を教示する代表的な米国特許、米国特許刊行物、およびPCT刊行物は、これらに限定されないが、米国特許第5,013,830号;第5,149,797号;第5,220,007号;第5,256,775号;第5,366,878号;第5,403,711号;第5,491,133号;第5,565,350号;第5,623,065号;第5,652,355号;第5,652,356号;第5,700,922号;第5,898,031号;第7,432,250号;および第7,683,036号;米国特許刊行物第US20090286969号、第US20100197762号、および第US20110112170号;およびPCT刊行物第WO2008049085号および第WO2009090182号を包含し、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ｉ．Mixmer
いくつかの態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、mixmerであってもよく、またはmixmer配列パターンを含んでいてもよい。一般に、mixmerは、天然に存在するヌクレオチドと天然に存在しないヌクレオチドとの両方を含むオリゴヌクレオチドであるか、または2つの異なるタイプの天然に存在しないヌクレオチドを、典型的には互い違いなパターンで含むオリゴヌクレオチドである。Mixmerは一般に、非修飾オリゴヌクレオチドより高い結合親和性を有し、標的分子に特異的に結合する、例として、標的分子上の結合部位を遮断するために使用されてもよい。一般に、mixmerは、RNAseを標的分子へ動員させず、よって標的分子の切断を促進しない。RNAse Hを動員することが可能ではない、かかるオリゴヌクレオチドは記載されており、例えば、WO2007/112754またはWO2007/112753を参照。
いくつかの態様において、mixmerは、ヌクレオチド類似体と天然に存在するヌクレオチドとの反復パターン、もしくは1タイプのヌクレオチド類似体ともう1タイプのヌクレオチド類似体との反復パターンを含むか、またはこれらからなる。しかしながら、mixmerは、反復パターンを含む必要がなく、その代わりに、修飾ヌクレオチドと天然に存在するヌクレオチドとのいずれの配置も、または1タイプの修飾ヌクレオチドともう1タイプの修飾ヌクレオチドとのいずれの配置も含むことができる。反復パターンは、実例として、2ヌクレオチド毎または3ヌクレオチド毎に、LNAなどの修飾ヌクレオチドであってもよく、残りのヌクレオチドは、DNAなどの天然に存在するヌクレオチドであるか、あるいは2'MOEもしくは2'フルオロ類似体などの2'置換ヌクレオチド類似体、または本明細書に記載のいずれの他の修飾ヌクレオチドである。LNA単位などの修飾ヌクレオチドの反復パターンが、固定された位置にて−例として5'末または3'末にて、修飾ヌクレオチドと組み合わされてもよいことは認識されている。
いくつかの態様において、mixmerは、5個より多く、4個より多く、3個より多く、または2個より多く連続した、DNAヌクレオチドなどの天然に存在するヌクレオチドの領域を含まない。いくつかの態様において、mixmerは、少なくとも2個連続したLNAなどの、少なくとも2個連続した修飾ヌクレオチドからなる領域を少なくとも含む。いくつかの態様において、mixmerは、少なくとも3個連続したLNAなどの、少なくとも3個連続した修飾ヌクレオチドからなる領域を少なくとも含む。
いくつかの態様において、mixmerは、7個より多く、6個より多く、5個より多く、4個より多く、3個より多く、または2個より多く連続した、LNAなどのヌクレオチド類似体の領域を含まない。いくつかの態様において、LNA単位は、本明細書に言及されたヌクレオチド類似体などの他のヌクレオチド類似体に置き換えられていてもよい。
Mixmerは、非限定例におけるLNAヌクレオチドおよび2'-O-メチルヌクレオチドなどの親和性増強修飾ヌクレオチドの混合物を含むよう設計されていてもよい。いくつかの態様において、mixmerは、修飾ヌクレオシド間連結(例として、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結または他の連結)を、少なくとも2個の、少なくとも3個の、少なくとも4個の、少なくとも5個の、またはこれより多くのヌクレオチド間に含む。
mixmerは、いずれの好適な方法を使用しても産生されてよい。mixmerの調製を教示する代表的な米国特許、米国特許刊行物、およびPCT刊行物は、米国特許刊行物第US20060128646号、第US20090209748号、第US20090298916号、第US20110077288号、および第US20120322851号、および米国特許第7687617号を包含する。
いくつかの態様において、mixmerは、1以上のモルホリノヌクレオチドを含む。例えば、いくつかの態様において、mixmerは、1以上の他のヌクレオチド(例として、DNA、RNAヌクレオチド)または修飾ヌクレオチド(例として、LNA、2'-O-メチルヌクレオチド)と(例として、互い違いなやり方で)混合されたモルホリノヌクレオチドを含んでいてもよい。
いくつかの態様において、mixmerは、例えば、Touznik A.,et al.,LNA/DNA mixmer-based antisense oligonucleotides correct alternative splicing of the SMN2 gene and restore SMN protein expression in type 1 SMA fibroblasts Scientific Reports,volume 7,Article number:3672(2017), Chen S.et al.,Synthesis of a Morpholino Nucleic Acid (MNA)-Uridine Phosphoramidite, and Exon Skipping Using MNA/2'-O-Methyl Mixmer Antisense Oligonucleotide,Molecules 2016,21,1582(これら各々の内容は参照により本明細書に組み込まれる)に報告されるとおり、スプライス修正(splice correcting)またはエキソンスキッピングに有用である。
ｊ．RNA干渉(RNAi)
いくつかの態様において、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドは、低分子干渉RNAまたはサイレンシングRNAとしても知られている、低分子干渉RNA(siRNA)の形態であってもよい。siRNAは、二本鎖RNA分子の類であって、細胞中のRNA干渉(RNAi)経路を介した分解のために核酸(例として、mRNA)を標的にする、典型的には長さが約20〜25塩基対である。siRNA分子の特異性は、アンチセンス鎖分子のその標的RNAへの結合によって決定されてもよい。有効なsiRNA分子は一般に、より長いsiRNAもまた有効であり得るが、細胞中の非特異的なRNA干渉経路の引き金を、インターフェロン応答を介して引くことを防止するため、長さが30〜35個未満の塩基対である。
適切な標的RNA配列の選択を受けて、すべてのまたは一部の標的配列に相補的なヌクレオチド配列、すなわちアンチセンス配列を含むsiRNA分子は、適切な方法(例として、PCT刊行物第WO2004/016735号;および米国特許刊行物第2004/0077574号および第2008/0081791号を参照)を使用して設計および調製され得る。
siRNA分子は、二本鎖(すなわち、アンチセンス鎖および相補的センス鎖を含むdsRNA分子)または一本鎖(すなわち、アンチセンス鎖だけを含むssRNA分子)であり得る。siRNA分子は、自己相補的センスおよびアンチセンス鎖を有する、二重鎖、非対称二重鎖、ヘアピン、または非対称ヘアピン2次構造を含み得る。
二本鎖siRNAは、同じ長さまたは異なる長さのRNA鎖を含んでいてもよい。二本鎖siRNA分子はまた、ステムループ構造の単一オリゴヌクレオチド(ここでsiRNA分子の自己相補的センスおよびアンチセンス領域は、核酸ベースのまたは非核酸ベースのリンカー(単数または複数)を用いて連結されている)、ならびに2以上のループ構造と自己相補的センスおよびアンチセンス鎖を含むステムとを有する環状一本鎖RNA(ここで環状RNAは、in vivoまたはin vitroのいずれかで処理されてRNAiを媒介することが可能な活性siRNA分子を生成し得る)からも会合され得る。よって小さいヘアピンRNA(shRNA)分子もまた、本明細書に企図される。これらの分子は、逆相補的(センス)配列に加えて、特定のアンチセンス配列を含み、典型的にはスペーサーまたはループ配列によって分離されている。スペーサーまたはループの切断は、(任意に、片鎖または両鎖の3'末端および/または5'末端から1、2、3個以上のヌクレオチドの付加または除去をもたらすこともある追加のプロセシングステップにより)一本鎖RNA分子およびその逆相補体を、それらがアニールしてdsRNA分子を形成し得るように提供する。スペーサーは、スペーサーの切断(および任意に、これに続く、片鎖または両鎖の3'末端および/または5'末端から1、2、3、4、もしくはこれより多いヌクレオチドの付加または除去をもたらすこともあるプロセシングステップ)に先立ちアンチセンス配列とセンス配列とをアニールさせて二本鎖構造体(またはステム)を形成させるのに充分な長さであり得る。スペーサー配列は、2つの相補的ヌクレオチド配列領域間に置かれた無関係なヌクレオチド配列であってもよく、前記領域はアニールして二本鎖核酸になったらshRNAを含むことになる。
siRNA分子の全体的な長さは、設計されたsiRNA分子のタイプに応じて、約14ヌクレオチドから約100ヌクレオチドまで変動し得る。一般に、これらのヌクレオチドの約14個と約50個との間は、RNA標的配列に相補的である、すなわちsiRNA分子の特定のアンチセンス配列を構成する。例えば、siRNAが二本鎖siRNAまたは一本鎖siRNAであるとき、長さは約14ヌクレオチドから約50ヌクレオチドまで変動し得るが一方、siRNAがshRNAまたは環状分子であるとき、長さは約40ヌクレオチドから約100ヌクレオチドまで変動し得る。
siRNA分子は、分子の一方の末端にて3'突出を含んでいてもよく、他方の末端は平滑末端であっても、または突出(5'または3')も有していてよい。siRNA分子が分子の両末端にて突出を含むとき、突出の長さは、同じであっても、または異なっていてもよい。一態様において、本開示のsiRNA分子は、分子の両末端上に約1〜約3ヌクレオチドの3'突出を含む。
ｋ．マイクロRNA(miRNA)
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、マイクロRNA(miRNA)であってもよい。マイクロRNA(「miRNA」と称される)は、標的RNA転写産物上の相補的な部位へ結合することによって遺伝子発現を制御する調節性分子の類に属する、小さいノンコーディングRNAである。典型的には、miRNAは、巨大なRNA前駆体(pri-miRNAと呼ばれる)から生成されるが、前記前駆体は核中で処理されておよそ70ヌクレオチドpre-miRNAになり、これが折り畳まれて不完全なステムループ構造体になる。これらのpre-miRNAは、典型的には、細胞質内で追加のプロセシングステップを経るが、前記細胞質内の長さが18〜25ヌクレオチドの成熟miRNAは、RNase III酵素であるDicerによってpre-miRNAヘアピンの片側から切除される。
本明細書に使用されるとき、miRNAは、pri-miRNA、pre-miRNA、成熟miRNA、そのバリアントのフラグメントを包含するmiRNAは、または成熟miRNAの生物活性を保持するそのバリアントのフラグメントを包含する。一態様において、miRNAのサイズ範囲は、21ヌクレオチドから170ヌクレオチドまでであり得る。一態様において、miRNAのサイズ範囲は、長さが70ヌクレオチドから170ヌクレオチドまでである。別の態様において、長さが21ヌクレオチドから25ヌクレオチドまでの成熟miRNAが使用され得る。
ｌ．アプタマー
いくつかの態様において、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドは、アプタマーの形態であってもよい。一般に、分子ペイロードの文脈において、アプタマーは、細胞中の小分子、タンパク質、核酸などの標的へ特異的に結合するいずれの核酸でもある。いくつかの態様において、アプタマーは、DNAアプタマーまたはRNAアプタマーである。いくつかの態様において、核酸アプタマーは、一本鎖のDNAまたはRNA(ssDNAまたはssRNA)である。一本鎖核酸アプタマーが、ヘリックスおよび/またはループ構造を形成してもよいことは理解されるべきである。核酸アプタマーを形成する核酸は、天然に存在するヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、炭化水素リンカー(例として、アルキレン)もしくはポリエーテルリンカー(例として、PEGリンカー)が1以上のヌクレオチド間に挿入された天然に存在するヌクレオチド、炭化水素もしくはPEGリンカーが1以上のヌクレオチド間に挿入された修飾ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含んでいてもよい。アプタマーおよびアプタマーを産生する方法を記載する例示の刊行物および特許は、例として、Lorsch and Szostak,1996;Jayasena,1999;米国特許第5,270,163号;第5,567,588号;第5,650,275号;第5,670,637号;第5,683,867号;第5,696,249号;第5,789,157号;第5,843,653号;第5,864,026号;第5,989,823号;第6,569,630号;第8,318,438号およびPCT出願WO 99/31275を包含するが、これら各々は参照により本明細書に組み込まれる。
ｍ．リボザイム
いくつかの態様において、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドは、リボザイムの形態であってもよい。リボザイム(リボ核酸酵素)は、タンパク質酵素の作用と同様の特定の生化学的反応を実施することが可能な分子、典型的にはRNA分子である。リボザイムは、これらがハイブリダイズしているRNA分子(mRNA、RNA含有基質、lncRNA、およびリボザイム自体など)中の特定のホスホジエステル連結での切断能を包含する酵素活性をもつ分子である。
リボザイムは、数種の物理的構造の1つを取り得、これらの1つが「ハンマーヘッド」と呼ばれる。ハンマーヘッド型リボザイムは、保存された9塩基を含有する触媒コア、二本鎖ステムおよびループ構造(ステムループII)、ならびに触媒コアを囲む両脇の標的RNA領域に相補的な2つの領域から構成される。両脇の領域によって、リボザイムは、二本鎖ステムIおよびIIIを形成することで標的RNAへ特異的に結合することができる。切断は、3',5'-リン酸ジエステルから2',3'-環状リン酸ジエステルへのエステル交換反応による特定のリボヌクレオチド三塩基(triplet)の次に、cis(すなわち、ハンマーヘッドモチーフを含有する同じRNA分子の切断)で、またはtrans(リボザイムを含有するもの以外のRNA基質の切断)で生じる。理論によって拘束されることは望まないが、この触媒活性は、リボザイムの触媒領域中に高度に保存された特定の配列が存在することを要すると考えられている。
リボザイム構造中の修飾はまた、様々な分子の非コア部分の、非ヌクレオチド分子との置換または置き換えも包含する。例えば、Benselerら(J.Am.Chem.Soc.(1993)115:8483-8484)は、ハンマーヘッド様分子を開示しており、ここでステムIIの2塩基対およびループIIの4ヌクレオチドすべてが、ヘキサエチレングリコール、プロパンジオール、ビス(トリエチレングリコール)ホスファート、トリス(プロパンジオール)ビスホスファート、またはビス(プロパンジオール)ホスファートを基にする非ヌクレオシドリンカーに置き換えられていた。Maら(Biochem.(1993)32:1751-1758;Nucleic Acids Res.(1993)21:2585-2589)は、TARリボザイムヘアピンの6ヌクレオチドループを、エチレングリコールに関する非ヌクレオチドリンカーに置き換えた。Thomsonら(Nucleic Acids Res.(1993)21:5600-5603)は、ループIIを、長さが13、17、および19原子の線状の非ヌクレオチドリンカーに置き換えた。
リボザイムオリゴヌクレオチドは、周知の方法(例として、PCT刊行物WO9118624;WO9413688;WO9201806;およびWO92/07065;ならびに米国特許5436143および5650502を参照)を使用して調製され得るか、または商業的供給源(例として、US Biochemicals)から購入され得、所望の場合、細胞中ヌクレアーゼによる分解に対するオリゴヌクレオチドの耐性を増大させるためにヌクレオチド類似体を組み込み得る。リボザイムは、例として、市販の合成機(例として、Applied Biosystems,Inc.またはMilligenによって製造された)の使用による、いずれの知られているやり方で合成されてもよい。リボザイムはまた、従来の手段によって、組換えベクターにおいても産生されてよい。Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(Current edition)を参照。リボザイムRNA配列は、例えば、T7またはSP6などのRNAポリメラーゼを使用することによる従来法で、合成されてもよい。
ｎ．ガイド核酸
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ガイド核酸、例として、ガイドRNA(gRNA)分子である。一般に、ガイドRNAは、(1)Cas9などの、核酸をプログラムできるDNA結合タンパク質(napDNAbp)へ結合する骨格(scaffold)配列、および(2)gRNAが、核酸をプログラムできるDNA結合タンパク質をDNA標的配列に近づけるために結合するDNA標的配列(例として、ゲノムDNA標的)を定義するヌクレオチドスペーサー部分から構成される低分子合成RNAである。いくつかの態様において、napDNAbpは、核酸をプログラムできるタンパク質に、標的DNA配列(例として、標的ゲノムDNA配列)を標的にさせる1以上のRNA(単数または複数)と(例として、これと結合して、またはこれと結び付いて)複合体を形成する、核酸をプログラムできるタンパク質である。いくつかの態様において、核酸プログラム可能なヌクレアーゼは、RNAとの複合体にあるとき、ヌクレアーゼ:RNA複合体と称されることもある。ガイドRNAは、2以上のRNAの複合体として、または単一のRNA分子として存在し得る。
単一のRNA分子として存在するガイドRNA(gRNA)は、単一のガイドRNA(sgRNA)と称されることもあるが、gRNAはまた、単一分子または2以上の分子の複合体のいずれかとして存在するガイドRNAを指すためにも使用される。典型的には、単一のRNA種として存在するgRNAは、2つのドメインを含む:(1)標的核酸(すなわち、Cas9複合体の標的への結合に向かわせる)との相同性を共有するドメイン;および(2)Cas9タンパク質に結合するドメイン。いくつかの態様において、ドメイン(2)は、tracrRNAとして知られている配列に対応し、ステムループ構造を含む。いくつかの態様において、ドメイン(2)は、Jinek et al.,Science 337:816-821(2012)(この内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる)に提供されるとおり、tracrRNAと同一または相同である。
いくつかの態様において、gRNAは、ドメイン(1)および(2)の2以上を含み、伸長(extended)gRNAと称されることもある。例えば、伸長gRNAは、本明細書に記載のとおり、2以上のCas9タンパク質に結合し、および2以上の別個の領域での標的核酸に結合するであろう。gRNAは、ヌクレアーゼ/RNA複合体の該標的部位への結合を媒介する標的部位に相補的なヌクレオチド配列を含み、ヌクレアーゼ:RNA複合体の配列特異性を提供する。いくつかの態様において、RNAをプログラムできるヌクレアーゼは、(CRISPR関連系)Cas9エンドヌクレアーゼ、例えば、Streptococcus pyogenesからのCas9(Csn1)である(例として、“Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes.”Ferretti J.J.,McShan W.M.,Ajdic D.J.,Savic D.J.,Savic G.,Lyon K.,Primeaux C.,Sezate S.,Suvorov A.N.,Kenton S.,Lai H.S.,Lin S.P.,Qian Y.,Jia H.G.,Najar F.Z.,Ren Q.,Zhu H.,Song L.,White J.,Yuan X.,Clifton S.W.,Roe B.A.,McLaughlin R.E.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:4658-4663(2001);“CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III.”Deltcheva E.,Chylinski K.,Sharma C.M.,Gonzales K.,Chao Y.,Pirzada Z.A.,Eckert M.R.,Vogel J.,Charpentier E.,Nature 471:602-607(2011);および“A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.”Jinek M.,Chylinski K.,Fonfara I.,Hauer M.,Doudna J.A.,Charpentier E.Science 337:816-821(2012)(これら各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる)を参照。
ｏ．スプライス変更オリゴヌクレオチド
いくつかの態様において、本開示のオリゴヌクレオチド(例として、モルホリノを包含するアンチセンスオリゴヌクレオチド)は、スプライシングを標的にする。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、エキソンスキッピングを誘導することおよび遺伝子内の読み取りフレームを修復することによって、スプライシングを標的にする。非限定例として、オリゴヌクレオチドは、フレームシフト突然変異をコードするエキソンおよび/または未熟終止コドンをコードするエキソンのスキッピングを誘導してもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、スプライス部位のスプライソソーム認識をブロッキングすることにより、エキソンスキッピングを誘導してもよい。いくつかの態様において、エキソンスキッピングは、参照タンパク質と比べて、トランケートされたが機能的なタンパク質(例として、以下に記載された、トランケートされたが機能的なDMDタンパク質)をもたらす。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、特定のエキソン(例として、以下に記載された、SMN2遺伝子のエキソン7)の封入を促進する。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、スプライス部位阻害配列を標的にすることによって、エキソンの封入を誘導してもよい。RNAスプライシングは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)および脊髄性筋萎縮症(SMA)を包含する筋疾患に関与してきた。
ジストロフィン(DMD)をコードする遺伝子における変更(例として、欠失、点突然変異、および複製)は、DMDを引き起こす。これらの変更は、フレームシフト突然変異および/またはナンセンス突然変異へ繋がり得る。いくつかの態様において、本開示のオリゴヌクレオチドは、1以上のDMDエキソン(例として、エキソン8、エキソン43、エキソン44、エキソン45、エキソン50、エキソン51、エキソン52、エキソン53、および/またはエキソン55)のスキッピングを促進し、機能的なトランケートされたタンパク質をもたらす。例として、2013年7月16日に公開された米国特許第8,486,907および2014年9月18日に公開された米国20140275212を参照のこと。
SMAにおいて、機能的SMN1の喪失がある。SMN2遺伝子はSMN1に対するパラログであるが、SMN2遺伝子の選択的スプライシングは、主としてエキソン7のスキッピング、およびこれに続くSMN1喪失について補償し得ないトランケートされたSMNタンパク質の産生へ繋がる。いくつかの態様において、本開示のオリゴヌクレオチドは、SMN2エキソン7の封入を促進する。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、SMN2スプライス部位阻害配列を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドである(例として、2010年11月23日に公開された米国特許番号7,838,657を参照のこと)。
ｐ．マルチマー
いくつかの態様において、分子ペイロードは、リンカーによって接続された2以上のオリゴヌクレオチドのマルチマー(例として、コンカテマー)を含んでいてもよい。このように、いくつかの態様において、複合体/抱合体のオリゴヌクレオチドの負荷(loading)は、標的化剤上の利用可能な連結部位(例として、抗体上の利用可能なチオール部位)を超えて増大され得るか、または具体的なペイロード負荷量に達するよう別様に整え得る。マルチマー中のオリゴヌクレオチドは、同じかまたは異なり得る(例として、異なる遺伝子、もしくは同じ遺伝子上の異なる部位、またはそれらの産物を標的にする)。
いくつかの態様において、マルチマーは、切断可能なリンカーによって一緒に連結された2以上のオリゴヌクレオチドを含む。しかしながら、いくつかの態様において、マルチマーは、切断不能なリンカーによって一緒に連結された2以上のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、マルチマーは、一緒に連結された2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはこれより多くのオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、マルチマーは、一緒に連結された2〜5、2〜10、または4〜20オリゴヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、マルチマーは、(線状配置において)末端間(end-to-end)で連結された2以上のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、マルチマーは、オリゴヌクレオチドベースのリンカー(例として、ポリ-dTリンカー、塩基性リンカー)を介して、末端間で連結された2以上のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、マルチマーは、あるオリゴヌクレオチドの3'末端へ連結された、別のオリゴヌクレオチドの5'末端を含む。いくつかの態様において、マルチマーは、あるオリゴヌクレオチドの3'末端へ連結された、別のオリゴヌクレオチドの3'末端を含む。いくつかの態様において、マルチマーは、あるオリゴヌクレオチドの5'末端へ連結された、別のオリゴヌクレオチドの5'末端を含む。またさらに、いくつかの態様において、マルチマーは、分枝リンカーによって一緒に連結された複数のオリゴヌクレオチドを含む分枝構造を含み得る。
本明細書に提供される複合体に使用されてもよいマルチマーのさらなる例は、例えば、2015年11月5日に公開され、Methods of delivering multiple targeting oligonucleotides to a cell using cleavable linkersという表題の米国特許出願第2015/0315588 A1号;2015年9月3日に公開され、Multimeric Oligonucleotide Compoundsという表題の米国特許出願第2015/0247141 A1号;2011年6月30日に公開され、Immunostimulatory Oligonucleotide Multimersという表題の米国特許出願第US 2011/0158937 A1号;および1997年12月2日に発行され、Triplex-Forming Antisense Oligonucleotides Having Abasic Linkers Targeting Nucleic Acids Comprising Mixed Sequences Of Purines And Pyrimidinesという表題の米国特許第5,693,773号に開示されており、これら各々の内容はそれら全体が参照されることにより本明細書に組み込まれる。
ii．小分子:
いずれの好適な小分子も、本明細書に記載のとおり、分子ペイロードとして使用されてもよい。非限定例は、表1の選択された遺伝子について、以下提供される。
DMPK/DM1
いくつかの態様において、例として、DMの処置のために、小分子は、「Compounds And Methods For Myotonic Dystrophy Therapy」という表題の2016年2月25日に公開された米国特許出願刊行物2016052914A1に記載されたとおりである。小分子ペイロードのさらなる例は、Lopez-Morato M, et al., Small Molecules Which Improve Pathogenesis of Myotonic Dystrophy Type 1, (Review) Front. Neurol., 18 May 2018に提供される。例えば、いくつかの態様において、小分子は、フェニルブタゾン、ケトプロフェン、ISOX、またはボリノスタットなどのMBNL1上方調節因子である。いくつの態様において、小分子は、マニュマイシンAなどのH-Ras経路インヒビターである。いくつかの態様において、小分子は、Ro-318220、C16、C51、メトホルミン、AICAR、塩化リチウム、TDZD-8またはBioなどのタンパク質キナーゼモジュレーターである。いくつかの態様において、小分子は、ハルミンなどの植物性アルカロイドである。いくつかの態様において、小分子は、ペンタミジン、プロパミジン、へプタミジン(heptamidiine)またはアクチノマイシンDなどの転写インヒビターである。いくつかの態様において、小分子は、例えば、Jones K, et al., GSK3β mediates muscle pathology in myotonic dystrophy. J Clin Invest. 2012 Dec;122(12):4461-72;およびWei C, et al., GSK3β is a new therapeutic target for myotonic dystrophy type 1. Rare Dis. 2013; 1: e26555;およびPalomo V, et al., Subtly Modulating Glycogen Synthase Kinase 3 β: Allosteric Inhibitor Development and Their Potential for the Treatment of Chronic Diseases. J Med Chem. 2017 Jun 22;60(12):4983-5001(これらの各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる)に開示されたとおり、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3ベータ(GSK3B)のインヒビターである。いくつかの態様において、小分子は、Gonzalez AL, et al., In silico discovery of substituted pyrido[2,3-d]pyrimidines and pentamidine-like compounds with biological activity in myotonic dystrophy models. PLoS One. 2017 Jun 5;12(6):e0178931(この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる)に開示されたとおり、置換ピリド[2,3-d]ピリミジンおよびペンタミジン様化合物である。いくつかの態様において、小分子は、例えば、Zhange F, et al., A flow cytometry-based screen identifies MBNL1 modulators that rescue splicing defects in myotonic dystrophy type I. Hum Mol Genet. 2017 Aug 15;26(16):3056-3068(この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる)に開示されたとおり、MBNL1モジュレーターである。
DUX4/FSHD
いくつかの態様において、例として、FSHDの処置のために、小分子ペイロードは、「METHODS OF TREATING MUSCULAR DYSTROPHY」という表題の2017年11月30日に公開された米国特許出願刊行物20170340606に記載されたとおり、または「INHIBITION OF DUX4 EXPRESSION USING BROMODOMAIN AND EXTRA-TERMINAL DOMAIN PROTEIN INHIBITORS (BETi)」という表題の2018年2月22日に公開された米国特許出願刊行物20180050043に記載されたとおりである。小分子ペイロードのさらなる例は、Bosnakovski, D., et al., High-throughput screening identifies inhibitors of DUX4-induced myoblast toxicity, Skelet Muscle, Feb 2014, およびChoi. S., et al., “Transcriptional Inhibitors Identified in a 160,000-Compound Small-Molecule DUX4 Viability Screen,” Journal of Biomolecular Screening, 2016に提供される。例えば、いくつかの態様において、小分子は、SHC351、SHC540、SHC572などの転写インヒビターである。いくつかの態様において、小分子は、インテグリンなどの別のタンパク質の産生または活性を増大させるSTR00316である。いくつかの態様において、小分子は、JQ1、PF1-1、I-BET-762、I-BET-151、RVX-208、またはCPI-0610などのブロモドメインインヒビター(BETi)である。
DNM/CNM
いくつかの態様において、例として、CNMの処置のために、小分子は、CNMの処置のために、「DYNAMIN 2 INHIBITOR FOR TREATMENT OF CENTRONUCLEAR MYOPATHIES」という表題の2016年9月15日に公開された米国特許出願刊行物番号20160264976に記載されたとおりである。例えば、いくつかの態様において、小分子は、3-ヒドロキシナフタレン-2-カルボン酸(3,4-ジヒドロキシベンジリデン)ヒドラジド、3-ヒドロキシ-N'-[(2,4,5-トリヒドロキシフェニル)メチリデン]ナフタレン-2-カルボヒドロ-アジドからなる群から選択される。いくつかの態様において、小分子は、「COMPOSITION AND METHOD FOR MUSCLE REPAIR AND REGENERATION」という表題の2018年1月4日に公開された米国特許出願刊行物番号20180000762に記載されたとおりである。いくつかの態様において、小分子は、4-[(E)-2-[5,6,7,8-テトラヒドロ-5,5,8,8-テトラメチル-3-(1H-ピラゾール-1-イルメチル-)-2-ナフタレニル]-エテニル]-安息香酸などのレチノイド受容体アゴニストである。いくつかの態様において、小分子は、「METHODS, COMPOUNDS, AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF MUSCULOSKELETAL DISEASES」という表題の2017年5月4日に公開された米国特許出願刊行物番号20170119748に記載されたとおりである。上記これらの刊行物の各々の内容全体は、本願明細書に組み込まれる。
ポンペ病
いくつかの態様において、例として、ポンペ病の処置のために、小分子は、「METHOD FOR TREATMENT OF POMPE DISEASE USING 1-DEOXYNOJIRIMYCIN DERIVATIVES」という表題の2016年2月25日に公開された米国特許出願刊行物番号20160051528に記載されたとおり、Ｎ-ブチル-DNJ、N-メチル-DNJ、またはN-シクロプロピルメチル-DNJなどの1-デオキシノジリマイシン(DNJ)誘導体である。いくつかの態様において、小分子DNJ誘導体は、GAAの活性を増大するための分子シャペロンとして使用される。いくつかの態様において、非阻害性酸性アルファグルコシダーゼシャペロンML247小分子は、2011年12月にProbe Reports from NIH Molecular Librariesで公開されたMarugan, et al., “Discovery, SAR, and Biological Evaluation of a Non-Inhibitory Chaperone for Acid Alpha Glucosidase”におけるとおり、利用される。例えば、小分子シャペロンML247は、PD関連GAAアレルまたは野生型GAAアレルの活性を増大するために利用される。上記これらの刊行物の各々の内容全体は、本願明細書に組み込まれる。
FXN/フリートライヒ運動失調症
いくつかの態様において、例として、フリートライヒ運動失調症の処置のために、小分子は、Herman D. et al. “Histone deacetylase inhibitors reverse gene silencing in Friedreich's ataxia.” Nat Chem Biol. 2006;2:551-558に記載のとおりである。いくつかの態様において、小分子は、Rai, M. et al. “HDAC inhibitors correct frataxin deficiency in a Friedreich ataxia mouse model.” PLoS One. 2008 Apr 9; 3(4):e1958に記載のとおりである。小分子ペイロードのさらなる例は、Richardson, T.E. et al, “Therapeutic strategies in Friedreich's Ataxia”, Brain Res. 2013 Jun 13; 1514: 91-97; Zeier Z et al. “Bromodomain inhibitors regulate the C9ORF72 locus in ALS” Exp Neurol. 2015 Sep;271:241-50.; およびGottesfeld J.M. “Small molecules affecting transcription in Friedreich ataxia.” Pharmacol Ther. 2007 Nov;116(2):236-48に提供される。例えば、いくつかの態様において、小分子は、ヒストンデアセチラーゼのインヒビターであり、例として、BML-210および化合物106である。いくつかの態様において、小分子は、17β-エストラジオールまたはメチレンブルーである。いくつかの態様において、小分子は、疾患関連反復および/またはR-ループを標的に(例として、これに結合)する。いくつかの態様において、小分子は、WO 2004/003565、1/8/2004公開、「A screening method and compounds for treating friedreich ataxia」に記載されたとおりである。いくつかの態様において、小分子は、グルタチオンペルオキシダーゼ模倣物である。
DMD/ジストロフィン異常症
いくつかの態様において、小分子は、突然変異体DMDアレルからのmRNA発現のエキソンスキッピングを増強する。いくつかの態様において、小分子は、「IDENTIFICATION OF SMALL MOLECULES THAT FACILITATE THERAPEUTIC EXON SKIPPING」という表題の2014年3月20日に公開された米国特許出願刊行物US20140080896A1に記載されたとおりである。小分子ペイロードのさらなる例は、「Identification of structurally similar small molecules that enhance therapeutic exon skipping」という表題の2018年5月29日に登録された米国特許第9,982,260号に提供されている。例えば、いくつかの態様において、小分子は、ペルフェナジン、フルペンチキソール、ズクロペンチキソールまたはコリナンテイン(corynanthine)などのエキソンスキッピングのエンハンサーである。いくつかの態様において、エキソンスキッピングの小分子エンハンサーは、リアノジン受容体またはカルモジュリンを阻害する。いくつかの態様において、小分子は、マニュマイシンAなどのH-Ras経路インヒビターである。いくつかの態様において、小分子は、終止コドンのサプレッサーであり、およびリボソームを未熟終止コドンに脱感作させる。いくつかの態様において、小分子は、2013年6月25日に公開されたMcElroy S.P. et al. “A Lack of Premature Termination Codon Read Through Efficacy of PTC124 (Ataluren) in a Diverse Array of Reporter Assays.” PLOS Biologyに記載されたとおり、アタルレンである。いくつかの態様において、小分子は、例として、Manzur, A.Y. et al. “Glucocorticoid corticosteroids for Duchenne muscular dystrophy”に記載されたとおり、コルチコステロイドである。いくつかの態様において、小分子は、ユートロフィンなどのジストロフィンの機能を置き換え得る遺伝子の発現および/または活性を上方調節する。いくつかの態様において、ユートロフィンモジュレーターは、「TREATMENT OF DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY」という表題の2007年8月16日に公開された国際刊行物番号WO2007091106および/または、「COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY」という表題の2017年10月5日に公開された国際刊行物番号WO/2017/168151に記載されたとおりである。
MYH7/肥大性心筋症
いくつかの態様において、小分子は、Therapies for Cardiomyopathyという表題の2016年4月21日に公開された米国特許出願刊行物20160106771などの、MYH7遺伝子の発現をモジュレートする5-アザシチジンまたは5-アザ-2'-デオキシシチジンなどの低メチル化剤であり；いくつかの態様において、小分子は、Treatment for Myopathyという表題の2018年7月5日に公開された米国特許出願刊行物20180185478などの、ニフロキサジド、ケトプロフェン、スルファサラジン、5,15-ジフェニルポルフィリン、またはAG490などのJAK-STATインヒビターであり；いくつかの態様において、小分子は、Tang, W., et al. “Modulating Beta-Cardiac Myosin Function at the Molecular and Tissue Levels,” Front. Physiol. 2016 (7): 659(これらのいずれの内容全体は参照により本明細書に組み込まれる)におけるとおり、ADPの解離を変えない一方でミオシン収縮の力を低減させるパラ-ニトロブレッビスタチン(para-Nitroblebbistatin)である。
iii．ペプチド/タンパク質
いずれの好適なペプチドまたはタンパク質も、本明細書に記載のとおりの分子ペイロードとして使用されてもよい。いくつかの態様において、タンパク質は、酵素である(例として、酸性アルファ-グルコシダーゼ、例として、GAA遺伝子によってコードされるもの)。これらのペプチドまたはタンパク質は、数種の方法論、例として、ファージディスプレードペプチドライブラリ、1ビーズ・1化合物ペプチドライブラリ、または位置走査性合成ペプチドコンビナトリアルライブラリを使用して産生、合成、および/または誘導体化されてもよい。例示の方法論は、当該技術分野において特徴づけられてきており、参照により組み込まれる(Gray, B.P. and Brown, K.C. “Combinatorial Peptide Libraries: Mining for Cell-Binding Peptides” Chem Rev. 2014, 114:2, 1020-1081.; Samoylova, T.I. and Smith, B.F. “Elucidation of muscle-binding peptides by phage display screening.” Muscle Nerve, 1999, 22:4. 460-6.)。
非限定例は、表1の選択された遺伝子について、以下提供される。
DMPK/DM1
ペプチドまたはタンパク質ペイロードは、例として、DM1の処置のために、核酸(例として疾患関連反復)またはタンパク質(例として筋細胞中に見られるMBNL1)へ優先的に結合するタンパク質の配列に相当してもよい。いくつかの態様において、ペプチドは、米国特許出願2018/0021449、1/25/2018公開、「Antisense conjugates for decreasing expression of DMPK」に記載されたとおりである。いくつかの態様において、ペプチドは、Garcia-Lopez et al., “In vivo discovery of a peptide that prevents CUG-RNA hairpin formation and reverses RNA toxicity in myotonic dystrophy models”, PNAS July 19, 2011. 108 (29) 11866-11871に記載されたとおりである。いくつかの態様において、ペプチドまたはタンパク質は、疾患関連反復、例としてRNA CUG反復拡張を、標的に(例として、結合)してもよい。
いくつかの態様において、例として、DM1の処置のために、ペプチドまたはタンパク質は、MBNLタンパク質、例として、MBNL1のフラグメントを含む。いくつかの態様において、ペプチドまたはタンパク質は、少なくとも1つのジンクフィンガーを含む。いくつかの態様において、ペプチドまたはタンパク質は、約2〜25アミノ酸、約2〜20アミノ酸、約2〜15アミノ酸、約2〜10アミノ酸、または約2〜5アミノ酸を含んでいてもよい。ペプチドまたはタンパク質は、天然に存在するアミノ酸、例として、システイン、アラニン、または非天然に存在しないか、もしくは修飾されたアミノ酸を含んでいてもよい。天然に存在しないアミノ酸は、β-アミノ酸、ホモ-アミノ酸、プロリン誘導体、3-置換アラニン誘導体、線形コアアミノ酸、N-メチルアミノ酸、および当該技術分野において知られているその他のアミノ酸を包含する。いくつかの態様において、ペプチドは、線状であってもよい;他の態様において、ペプチドは、環状、例として二環式であってもよい。
DUX4/FSHD
いくつかの態様において、例として、FSHDの処置のために、ペプチドまたはタンパク質は、DUX4発現を阻害するDME1またはDME2エンハンサーへ、例として、アクチベーターの結合をブロッキングすることによって、結合してもよい。
DNM2/CNM
いくつかの態様において、例として、CNMの処置のために、ペプチドは、「DYNAMIN 2 INHIBITOR FOR TREATMENT OF CENTRONUCLEAR MYOPATHIES」という表題の2016年9月15日に公開された米国特許出願刊行物番号20160264976に記載されたとおり、アミノ酸配列QVPSRPNRAPを伴うダイナミンインヒビターペプチドである。
ポンペ病
いくつかの態様において、例として、ポンペ病の処置のために、分子ペイロードは、「METHODS AND ORAL FORMULATIONS FOR ENZYME REPLACEMENT THERAPY OF HUMAN LYSOSOMAL AND METABOLIC DISEASES」という表題の2016年12月1日に公開された米国特許出願刊行物番号20160346363、「METHODS AND MATERIALS FOR TREATMENT OF POMPE'S DISEASE」という表題の2016年9月29日に公開された米国特許出願刊行物番号 20160279254、または、「METHODS AND MATERIALS FOR TREATMENT OF POMPE'S DISEASE」という表題の2013年9月19日に公開された米国特許出願刊行物番号 20130243746におけるとおり、酸性アルファ-グルコシダーゼまたは野生型GAAタンパク質またはその活性フラグメントなどのタンパク質または酵素である。いくつかの態様において、酸性アルファ-グルコシダーゼまたは野生型GAAタンパク質は、対象のGAA活性を増大させる。いくつかの態様において、酸性アルファ-グルコシダーゼまたは野生型GAAタンパク質は、GAA遺伝子によってコードされる。
ACVR1/FOP
いくつかの態様において、例として、FOPの処置のために、ペプチドまたはタンパク質は、調節性SMAD6および7またはそれらのフラグメントなどのBMPインヒビターである。ペプチドまたはタンパク質の追加の例は、Cappato, S. et al. “The Horizon of a Therapy for Rare Genetic Diseases: A “Druggable” Future for Fibrodysplasia Ossificans Progressiva” Int. J. Mol. Sci. 2018, 19(4), 989に包含される。上記の各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
FXN/フリートライヒ運動失調症
いくつかの態様において、例として、フリートライヒ運動失調症の処置のために、ペプチドは、米国特許第8,815,230号、8/30/2010出願、「Methods for treating Friedreich's ataxia with interferon gamma」に記載されたとおりである。いくつかの態様において、ペプチドは、Britti, E. et al. “Frataxin-deficient neurons and mice models of Friedreich ataxia are improved by TAT-MTScs-FXN treatment.” J Cell Mol Med. 2018 Feb;22(2):834-848に記載されたとおりである。いくつかの態様において、ペプチドは、Zhao, H. et al., “Peptide SS-31 upregulates frataxin expression and improves the quality of mitochondria: implications in the treatment of Friedreich ataxia”, Sci Rep. 2017 Aug 29;7(1):9840に記載されたとおりである。いくつかの態様において、ペプチドは、Vyas, P.M. et al. “A TAT-frataxin fusion protein increases lifespan and cardiac function in a conditional Friedreich's ataxia mouse model”, Hum Mol Genet. 2012 Mar 15;21(6):1230-47に記載されたとおりである。いくつかの態様において、ペプチドまたはタンパク質は、疾患関連反復、例としてGAA反復拡張を標的に(例として、結合)してもよい。
DMD/ジストロフィン異常症
いくつかの態様において、例として、デュシェンヌ型筋ジストロフィーなどのジストロフィン異常症の処置のために、ペプチドは、突然変異体DMDアレルから発現されるmRNAにおけるエキソンスキッピングを容易にさせてもよい。いくつかの態様において、ペプチドは、機能的ジストロフィンの発現、および/またはジストロフィンの代わりに機能することができるタンパク質の発現を促進してもよい。いくつかの態様において、ペイロードは、ジストロフィンの機能的フラグメント、例として、機能的ジストロフィンタンパク質のアミノ酸セグメント、であるタンパク質である。
iv．核酸構築物
いずれの好適な遺伝子発現コンストラクトも、本明細書に記載のとおりの分子ペイロードとして使用されてもよい。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、ベクターまたはcDNAフラグメントであってもよい。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、メッセンジャーRNA(mRNA)であってもよい。いくつかの態様において、本明細書に使用されるmRNAは、修飾されたmRNA、例として、2014年4月24日に発行の米国特許8,710,200、表題「Engineered nucleic acids encoding a modified erythropoietin and their expression」に記載されるとおりのものであってもよい。いくつかの態様において、mRNAは、5'メチルcapを含んでいてもよい。いくつかの態様において、mRNAは、ポリAテール、任意に長さが最大160ヌクレオチドまでのものを含んでいてもよい。遺伝子発現コンストラクトは、筋疾患において欠乏するタンパク質の配列をコードしていてもよい。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、筋細胞の核内に発現されていてもよく、例として、過剰発現されていてもよい。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、筋疾患において欠乏する遺伝子をコードしていてもよい。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、少なくとも1つのジンクフィンガーを含むタンパク質をコードする。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、表1の遺伝子に結合するタンパク質をコードする。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、表1の遺伝子によってコードされるタンパク質(例として、突然変異タンパク質)の発現の低減へ繋がるタンパク質をコードする。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、遺伝子編集酵素をコードする。分子ペイロードとして使用されてもよい核酸構築物の追加例は、2017年9月19日に公開の国際特許出願刊行物WO2017152149A1、表題「CLOSED-ENDED LINEAR DUPLEX DNA FOR NON-VIRAL GENE TRANSFER」;2014年10月7日に発行の米国特許8,853,377B2、表題「MRNA FOR USE IN TREATMENT OF HUMAN GENETIC DISEASES」;および2014年9月2日に発行の米国特許US8822663B2、「ENGINEERED NUCLEIC ACIDS AND METHODS OF USE THEREOF」に提供されており、これら各々の内容はこれらの全体を参照により本明細書に組み込まれる。
さらなる非限定例は、表1の選択された遺伝子/疾患について、以下提供される。
DMPK/DM1
いくつかの態様において、例として、DMの処置のために、遺伝子発現コンストラクトは、MBNLタンパク質、例としてMBNL1、をコードする。
DUX4/FSHD
いくつかの態様において、例として、FSHDの処置のために、遺伝子発現コンストラクトは、オリゴヌクレオチド(例として、DUX4を標的にするshRNA)またはDUX4の発現を下方調節するタンパク質(例として、DUX4発現を阻害するために、例として、アクチベーターの結合をブロッキングすることによって、DME1またはDME2エンハンサーへ結合するペプチドまたはタンパク質)をコードする。
DNM2/CNM
いくつかの態様において、例として、CNM1の処置のために、遺伝子発現コンストラクトは、突然変異体DNM2タンパク質の発現を下方調節するかまたは野生型DNM2を発現するタンパク質の、配列をコードしてもよい。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、DNM2の発現を阻害するオリゴヌクレオチド(例として、shRNA)をコードする。しかしながら、いくつかの態様において、発現コンストラクトは、Trochet D., et al., Reprogramming the Dynamin 2 mRNA by Spliceosome-mediated RNA Trans-splicing Mol Ther Nucleic Acids. 2016 Sep; 5(9): e36(この内容は参照により本明細書に組み込まれる)に記載されたとおり、突然変異DNM2-mRNAを初期化するために使用されてもよいスプライソソーム媒介性RNAトランススプライシング構成要素をコードする。
ポンペ病
いくつかの態様において、例として、ポンペ病の処置のために、遺伝子発現コンストラクトは、野生型GAAタンパク質をコードする。遺伝子発現コンストラクトは、ACVR1遺伝子の減少した発現またはGYS1タンパク質の減少した活性に繋がるタンパク質の配列をコードしてもよい。いくつかの態様において、例として、ポンペ病の処置のために、遺伝子発現コンストラクトは、GYS1の発現を阻害するオリゴヌクレオチド(例として、shRNA)をコードする。
ACVR1/FOP
遺伝子発現コンストラクトは、ACVR1遺伝子の減少した発現またはACVR1タンパク質の減少した活性に繋がるタンパク質の配列をコードしてもよい。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、ACVR1の発現をネガティブに調節する後成的調節因子の発現における低減に繋がるタンパク質、例として、ヒストン脱アセチル化酵素、をコードする。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、ACVR1の発現を阻害するオリゴヌクレオチド(例として、shRNA)をコードする。
FXN/フリートライヒ運動失調症
遺伝子発現コンストラクトは、フラタキシンの増大した発現に繋がるタンパク質の配列をコードしてもよい。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、筋細胞の核内で発現、例として過剰発現、されてもよい。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、フラタキシンをコードする。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、FXNの発現をネガティブに調節する後成的調節因子の機能を阻害するタンパク質、例として、ヒストン脱アセチル化酵素、をコードする。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、GAAトリヌクレオチドの疾患関連反復拡張へ結合するタンパク質をコードする。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、FXNの発現をネガティブに調節する後成的調節因子の発現における低減に繋がるタンパク質、例として、ヒストン脱アセチル化酵素をコードする。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、遺伝子編集酵素をコードする。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、エリスロポエチンをコードする(例として、Miller, J.L. et al, “Erythropoietin and small molecule agonists of the tissue-protective erythropoietin receptor increase FXN expression in neuronal cells in vitro and in FXN-deficient KIKO mice in vivo”, Neuropharmacology. 2017 Sep 1;123:34-45を参照のこと)。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、インターフェロンガンマをコードする(例として米国特許第8,815,230、8/30/2010出願、「Methods for treating Friedreich's ataxia with interferon gamma」を参照のこと)。
DMD/ジストロフィン異常症
遺伝子発現コンストラクトは、ジストロフィンタンパク質、ジストロフィンフラグメント、ミニ-ジストロフィン、ユートロフィンタンパク質、またはジストロフィンと共通の機能を共有するいずれのタンパク質の配列をコードしてもよい。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、筋細胞の核内で発現、例として、過剰発現、されてもよい。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、少なくとも1のジンクフィンガーを含むタンパク質をコードする。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、ジストロフィン、またはジストロフィンと機能を共有するタンパク質、例として、ユートロフィン、の発現を促進するタンパク質をコードする。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、遺伝子編集酵素をコードする。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、「Optimized mini-dystrophin genes and expression cassettes and their use」という表題の2017年12月28日に公開された米国 特許出願刊行物US20170368198A1；Duan D. “Myodys, a full-length dystrophin plasmid vector for Duchenne and Becker muscular dystrophy gene therapy.” Curr Opin Mol Ther 2008;10:86-94;およびTang, Y. et al., “AAV-directed muscular dystrophy gene therapy” Expert Opin Biol Ther. 2010 Mar;10(3):395-408に開示された発現カセットに記載されたとおりであり、これらの各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
Ｃ．リンカー
本明細書に記載の複合体は一般に、筋標的化剤を分子ペイロードへ接続するリンカーを含む。リンカーは、少なくとも1つの共有結合を含む。いくつかの態様において、リンカーは、筋標的化剤を分子ペイロードへ接続する単結合、例として、ジスルフィド結合またはジスルフィド架橋であってもよい。しかしながら、いくつかの態様において、リンカーは、複数の共有結合を通して、筋標的化剤を分子ペイロードへ接続していてもよい。いくつかの態様において、リンカーは、切断可能なリンカーであってもよい。しかしながら、いくつかの態様において、リンカーは、切断不能なリンカーであってもよい。リンカーは一般に、in vitroおよびin vivoで安定しており、ある細胞環境において安定していてもよい。加えて、一般にリンカーは、筋標的化剤または分子ペイロードのいずれかの機能特性に負の影響を及ぼさない。リンカー合成の例および方法は、当該技術分野において知られている(例として、Kline,T.et al.“Methods to Make Homogenous Antibody Drug Conjugates.”Pharmaceutical Research,2015,32:11,3480-3493.;Jain,N.et al.“Current ADC Linker Chemistry”Pharm Res.2015,32:11,3526-3540.;McCombs,J.R. and Owen,S.C.“Antibody Drug Conjugates:Design and Selection of Linker,Payload and Conjugation Chemistry”AAPS J.2015,17:2,339-351.を参照)。
リンカーの前駆体は、典型的には、筋標的化剤と分子ペイロードとの両方へ付着できる2つの異なる反応性の高い種を含有しているであろう。いくつかの態様において、2つの異なる反応性の高い種は、求核試薬および/または求電子試薬であってもよい。いくつかの態様において、リンカーは、筋標的化剤のリシン残基またはシステイン残基への抱合を介して、筋標的化剤へ接続されている。いくつかの態様において、リンカーは、マレイミド含有リンカーを介して筋標的化剤のシステイン残基へ接続されており、ここで任意に、マレイミド含有リンカーは、マレイミドカプロイルまたはマレイミドメチルシクロヘキサン-1-カルボキシラート基を含む。いくつかの態様において、リンカーは、3-アリールプロピオニトリル官能基を介して、筋標的化剤のシステイン残基またはチオール官能化分子ペイロードへ接続されている。いくつかの態様において、リンカーは、アミド結合、ヒドラジド、トリアゾール、チオエーテル、またはジスルフィド結合を介して、筋標的化剤および/または分子ペイロードへ接続されている。
ｉ．切断可能なリンカー
切断可能なリンカーは、プロテアーゼ感受性リンカー、pH感受性リンカー、またはグルタチオン感受性リンカーであってもよい。これらのリンカーは一般に、細胞内のみで切断可能であって、好ましくは、細胞外環境において、例として、筋細胞の細胞外において安定している。
プロテアーゼ感受性リンカーは、プロテアーゼ酵素活性によって切断可能である。これらのリンカーは、典型的にはペプチド配列を含んでおり、長さが2〜10アミノ酸、約2〜5アミノ酸、約5〜10アミノ酸、約10アミノ酸、約5アミノ酸、約3アミノ酸、または約2アミノ酸であってもよい。いくつかの態様において、ペプチド配列は、天然に存在するアミノ酸、例として、システイン、アラニン、または天然に存在しないかもしくは修飾されたアミノ酸を含んでいてもよい。天然に存在しないアミノ酸は、β-アミノ酸、ホモ-アミノ酸、プロリン誘導体、3-置換アラニン誘導体、線形コアアミノ酸、N-メチルアミノ酸、および当該技術分野において知られているその他のアミノ酸を包含する。いくつかの態様において、プロテアーゼ感受性リンカーは、バリン-シトルリンまたはアラニン-シトルリンのジペプチド配列を含む。いくつかの態様において、プロテアーゼ感受性リンカーは、リソソームのプロテアーゼ、例として、カテプシンB、および/またはエンドソームのプロテアーゼによって切断され得る。
pH感受性リンカーは、高または低pH環境において容易に分解される共有結合の連結である。いくつかの態様において、pH感受性リンカーは、4〜6の範囲にあるpHにて切断されてもよい。いくつかの態様において、pH感受性リンカーは、ヒドラゾンまたは環状アセタールを含む。いくつかの態様において、pH感受性リンカーは、エンドソームまたはリソソーム内で切断される。
いくつかの態様において、グルタチオン感受性リンカーは、ジスルフィド部を含む。いくつかの態様において、グルタチオン感受性リンカーは、細胞内部でのグルタチオン種とのジスルフィド交換反応によって切断される。いくつかの態様において、ジスルフィド部はさらに、少なくとも1アミノ酸、例としてシステイン残基を含む。
いくつかの態様において、リンカーは、Val-citリンカー(例として、US米国特許6,214,345(参照により本明細書に組み込まれる)に記載されるとおり)である。いくつかの態様において、抱合前のval-citリンカーは、以下の構造を有する:
Figure 2021533198
いくつかの態様において、抱合後のval-citリンカーは、以下の構造を有する:
Figure 2021533198
ii．切断不能リンカー
いくつかの態様において、切断不能なリンカーが使用されてもよい。一般に、切断不能なリンカーは、細胞環境または生理環境において容易に分解され得ない。いくつかの態様において、切断不能なリンカーは、任意に置換されていてもよいアルキル基を含むが、ここで置換は、ハロゲン、ヒドロキシル基、酸素種、および他の一般的な置換を包含していてもよい。いくつかの態様において、リンカーは、任意に置換されていてもよいアルキル、任意に置換されていてもよいアルキレン、任意に置換されていてもよいアリーレン、ヘテロアリーレン、少なくとも1個の非天然アミノ酸を含むペプチド配列、トランケートされたグリカン、酵素的に分解され得ない糖(単数もしくは複数)、アジド、アルキン-アジド、LPXT配列(配列番号15)を含むペプチド配列、チオエーテル、ビオチン、ビフェニル、反復単位のポリエチレングリコールもしくは等価な化合物、酸エステル、酸アミド、スルファミド、および/またはアルコキシ-アミンリンカーを含んでいてもよい。いくつかの態様において、ソルターゼ媒介ライゲーションは、LPXT配列を含む筋標的化剤を(G)n配列を含む分子ペイロードへ連結するために利用されるであろう(例として、Proft T.Sortase-mediated protein ligation:an emerging biotechnology tool for protein modification and immobilization.Biotechnol Lett.2010,32(1):1-10を参照)。いくつかの態様において、リンカーは、LPXTG配列(配列番号16)を含み、ここでXは、いずれのアミノ酸である。
いくつかの態様において、リンカーは、置換されたアルキレン、任意に置換されていてもよいアルケニレン、任意に置換されていてもよいアルキニレン、任意に置換されていてもよいシクロアルキレン、任意に置換されていてもよいシクロアルケニレン、任意に置換されていてもよいアリーレン、N、O、およびSから選択される少なくとも1個のヘテロ原子をさらに含む任意に置換されていてもよいヘテロアリーレン;N、O、およびSから選択される少なくとも1個のヘテロ原子をさらに含む任意に置換されていてもよいヘテロシクリレン;イミノ、任意に置換されていてもよい窒素種、任意に置換されていてもよい酸素種O、任意に置換されていてもよい硫黄種、またはポリ(アルキレンオキシド)、例として、ポリエチレンオキシドまたはポリプロピレンオキシドを含んでいてもよい。
iii．リンカー抱合
いくつかの態様において、リンカーは、ホスファート、チオエーテル、エーテル、炭素-炭素、もしくはアミド結合を介して筋標的化剤および/または分子ペイロードへ接続されている。いくつかの態様において、リンカーは、リン酸塩またはホスホロチオアート基、例として、オリゴヌクレオチド主鎖の末端のホスファートを通してオリゴヌクレオチドへ接続されている。いくつかの態様において、リンカーは、筋標的化剤上に存在するリシン残基またはシステイン残基を通して、筋標的化剤、例として抗体へ接続されている。
いくつかの態様において、リンカーは、トリアゾールを形成するアジドとアルキンとの間のシクロ付加反応によって、筋標的化剤および/または分子ペイロードへ接続されており、ここでアジドおよびアルキンは、筋標的化剤、分子ペイロード、またはリンカー上に位置付けられていてもよい。いくつかの態様において、アルキンは、環状アルキン、例としてシクロオクチンであってもよい。いくつかの態様において、アルキンは、ビシクロノニン(またビシクロ[6.1.0]ノニンまたはBCNとしても知られている)または置換ビシクロノニンであってもよい。いくつかの態様において、シクロオクタンは、2011年11月3日に公開の国際特許出願刊行物WO2011136645、表題「Fused Cyclooctyne Compounds And Their Use In Metal-free Click Reactions」に記載のとおりである。いくつかの態様において、アジドは、アジドを含む糖または炭水化物分子であってもよい。いくつかの態様において、アジドは、6-アジド-6-デオキシガラクトースまたは6-アジド-N-アセチルガラクトサミンであってもよい。いくつかの態様において、アジドを含む糖または炭水化物分子は、2016年10月27日に公開の国際特許出願刊行物WO2016170186、表題「Process For The Modification Of A Glycoprotein Using A Glycosyltransferase That Is Or Is Derived From A β(1,4)-N-Acetylgalactosaminyltransferase」に記載のとおりである。いくつかの態様において、トリアゾールを形成するアジドとアルキンとの間のシクロ付加反応(ここでアジドおよびアルキンは、筋標的化剤、分子ペイロード、またはリンカー上に位置付けられていてもよい)は、2014年5月1日に公開の国際特許出願刊行物WO2014065661、表題「Modified antibody, antibody-conjugate and process for the preparation thereof」;または2016年10月27日に公開の国際特許出願刊行物WO2016170186、表題「Process For The Modification Of A Glycoprotein Using A Glycosyltransferase That Is Or Is Derived From A β(1,4)-N-Acetylgalactosaminyltransferase」に記載のとおりである。
いくつかの態様において、リンカーはさらに、スペーサー、例として、ポリエチレングリコールスペーサーまたはアシル/カルバモイルスルファミドスペーサー、例として、HydraSpace(商標)スペーサーを含む。いくつかの態様において、スペーサーは、Verkade,J.M.M.et al.,“A Polar Sulfamide Spacer Significantly Enhances the Manufactur能力, St能力, and Therapeutic Index of Antibody-Drug Conjugates”,Antibodies,2018,7,12に記載のとおりである。
いくつかの態様において、リンカーは、求ジエン体とジエン/ヘテロ-ジエンとの間のディールス・アルダー反応によって、筋標的化剤および/または分子ペイロードへ接続されるが、ここで求ジエン体およびジエン/ヘテロ-ジエンは、筋標的化剤、分子ペイロード、またはリンカー上に位置付けられていてもよい。いくつかの態様において、リンカーは、他のペリ環状反応、例として、エン反応によって、筋標的化剤および/または分子ペイロードへ接続される。いくつかの態様において、リンカーは、アミド、チオアミド、またはスルホンアミド結合反応によって、筋標的化剤および/または分子ペイロードへ接続される。いくつかの態様において、リンカーは、リンカーと筋標的化剤および/または分子ペイロードとの間に存在するオキシム基、ヒドラゾン基、またはセミカルバジド基を形成する縮合反応によって、筋標的化剤および/または分子ペイロードへ接続される。
いくつかの態様において、リンカーは、求核試薬(例として、アミン基またはヒドロキシル基)と求電子試薬(例として、カルボン酸またはアルデヒド)との間の抱合体付加反応によって、筋標的化剤および/または分子ペイロードへ接続される。いくつかの態様において、リンカーと筋標的化剤または分子ペイロードとの間の反応に先立ち、求核試薬はリンカー上に存在していてもよく、求電子試薬は筋標的化剤または分子ペイロード上に存在していてもよい。いくつかの態様において、リンカーと筋標的化剤または分子ペイロードとの間の反応に先立ち、求電子試薬はリンカー上に存在していてもよく、求核試薬は筋標的化剤または分子ペイロード上に存在していてもよい。いくつかの態様において、求電子試薬は、アジド、ケイ素中心、カルボニル、カルボン酸、無水物、イソシアナート、チオイソシアナート、スクシニミジルエステル、スルホスクシニミジルエステル、マレイミド、アルキルハロゲン化物、アルキル擬ハロゲン化物、エポキシド、エピスルフィド、アジリジン、アリール、活性化リン中心、および/または活性化硫黄中心であってもよい。いくつかの態様において、求核試薬は、任意に置換されていてもよいアルケン、任意に置換されていてもよいアルキン、任意に置換されていてもよいアリール、任意に置換されていてもよいヘテロシクリル、ヒドロキシル基、アミノ基、アルキルアミノ基、アニリド(anilido)基、またはチオール基であってもよい。
Ｄ．抗体-分子ペイロード複合体の例
他の本開示の側面は、本明細書に記載の分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド)のいずれかへ共有結合的に連結された、本明細書に記載のいずれか1つの筋標的化剤(例として、抗トランスフェリン受容体抗体)を含む複合体を提供する。いくつかの態様において、筋標的化剤(例として、抗トランスフェリン受容体抗体)は、リンカーを介して分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド)へ共有結合的に連結されている。本明細書に記載のリンカーのいずれも、使用されてもよい。いくつかの態様において、リンカーは、オリゴヌクレオチドの5'末端、3'末端、または内部へ連結されている。いくつかの態様において、リンカーは、チオール反応性の連結を介して(例として、抗体中のシステインを介して)抗体へ連結されている。
Val-citリンカーを介してオリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結された抗トランスフェリン受容体抗体を含む複合体の例示の構造は、下に提供される:
Figure 2021533198
ここでリンカーは、オリゴヌクレオチドの5'末端、3'末端、または内部へ連結されており、およびここでリンカーは、チオール反応性の連結を介して(例として、抗体中のシステインを介して)抗体へ連結されている。
抗体は、種々の化学量論でオリゴヌクレオチドへ連結され得ることが解されるはずであって、前記特性は薬物抗体比(DAR)と称されることもあり、ここで「薬物」はオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、1つのオリゴヌクレオチドが抗体へ連結されている(DAR=1)。いくつかの態様において、2つのオリゴヌクレオチドが抗体へ連結されている(DAR=2)。いくつかの態様において、3つのオリゴヌクレオチドが抗体へ連結されている(DAR=3)。いくつかの態様において、4つのオリゴヌクレオチドが抗体へ連結されている(DAR=4)。いくつかの態様において、各々が異なるDARを有する異なる複合体の混合物が提供される。いくつかの態様において、かかる混合物中の複合体の平均DARは、1〜3、1〜4、1〜5以上の範囲にあってもよい。DARは、オリゴヌクレオチドを抗体上の種々の部位へ抱合させることによって、および/またはマルチマーを抗体上の1以上の部位へ抱合させることによって、増大されてもよい。例えば、2のDARは、単一オリゴヌクレオチドを抗体上の2つの異なる部位へ抱合させることによって、または二量体オリゴヌクレオチドを抗体の単一部位へ抱合させることによって、達成されてもよい。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、オリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結された抗トランスフェリン受容体抗体(例として、本明細書に記載のとおりの抗体またはそのいずれのバリアント)を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、リンカー(例として、Val-citリンカー)を介してオリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結された抗トランスフェリン受容体抗体(例として、本明細書に記載のとおりの抗体またはそのいずれのバリアント)を含む。いくつかの態様において、リンカー(例として、Val-citリンカー)は、オリゴヌクレオチドの5'末端、3'末端、または内部へ連結されている。いくつかの態様において、リンカー(例として、Val-citリンカー)は、チオール反応性の連結を介して(例として、抗体中のシステインを介して)、抗体(例として、本明細書に記載のとおりの抗体またはそのいずれのバリアント)へ連結されている。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、オリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結された抗トランスフェリン受容体抗体を含むが、ここで抗トランスフェリン受容体抗体は、表1.1中に示されるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3と同じCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3;ならびに表1.1中に示されるCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3と同じCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、オリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結された抗トランスフェリン受容体抗体を含むが、ここで抗トランスフェリン受容体抗体は、配列番号33のアミノ酸配列を有するVHおよび配列番号34のアミノ酸配列を有するVLを含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、オリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結された抗トランスフェリン受容体抗体を含むが、ここで抗トランスフェリン受容体抗体は、配列番号35のアミノ酸配列を有するVHおよび配列番号36のアミノ酸配列を有するVLを含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、オリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結された抗トランスフェリン受容体抗体を含むが、ここで抗トランスフェリン受容体抗体は、配列番号39のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号40のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、オリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結された抗トランスフェリン受容体抗体を含むが、ここで抗トランスフェリン受容体抗体は、配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号42のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、リンカー(例として、Val-citリンカー)を介してオリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結された抗トランスフェリン受容体抗体を含むが、ここで抗トランスフェリン受容体抗体は、表1.1中に示されるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3と同じCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3;ならびに表1.1中に示されるCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3と同じCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、リンカー(例として、Val-citリンカー)を介してオリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結された抗トランスフェリン受容体抗体を含むが、ここで抗トランスフェリン受容体抗体は、配列番号33のアミノ酸配列を有するVHおよび配列番号34のアミノ酸配列を有するVLを含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、リンカー(例として、Val-citリンカー)を介してオリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結された抗トランスフェリン受容体抗体を含むが、ここで抗トランスフェリン受容体抗体は、配列番号35のアミノ酸配列を有するVHおよび配列番号36のアミノ酸配列を有するVLを含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、リンカー(例として、Val-citリンカー)を介してオリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結された抗トランスフェリン受容体抗体を含むが、ここで抗トランスフェリン受容体抗体は、配列番号39のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号40のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、リンカー(例として、Val-citリンカー)を介してオリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結された抗トランスフェリン受容体抗体を含むが、ここで抗トランスフェリン受容体抗体は、配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号42のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、Val-citリンカーを介してオリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結された抗トランスフェリン受容体抗体を含むが、ここで抗トランスフェリン受容体抗体は、表1.1中に示されるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3と同じCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3;ならびに表1.1中に示されるCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3と同じCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含み、およびここで複合体は、以下の構造を含む:
Figure 2021533198
ここでリンカーVal-citリンカーは、オリゴヌクレオチドの5'末端、3'末端、または内部へ連結されており、およびここでVal-citリンカーは、チオール反応性の連結を介して(例として、抗体中のシステインを介して)、抗体(例として、本明細書に記載のとおりの抗体またはそのいずれのバリアント)へ連結されている。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、Val-citリンカーを介してオリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結された抗トランスフェリン受容体抗体を含むが、ここで抗トランスフェリン受容体抗体は、配列番号33のアミノ酸配列を有するVHおよび配列番号34のアミノ酸配列を有するVLを含み、およびここで複合体は、以下の構造を含む:
Figure 2021533198
ここでリンカーVal-citリンカーは、オリゴヌクレオチドの5'末端、3'末端、または内部へ連結されており、およびここでVal-citリンカーは、チオール反応性の連結を介して(例として、抗体中のシステインを介して)、抗体(例として、本明細書に記載のとおりの抗体またはそのいずれのバリアント)へ連結されている。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、Val-citリンカーを介してオリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結された抗トランスフェリン受容体抗体を含むが、ここで抗トランスフェリン受容体抗体は、配列番号35のアミノ酸配列を有するVHおよび配列番号36のアミノ酸配列を有するVLを含み、およびここで複合体は、以下の構造を含む:
Figure 2021533198
ここでリンカーVal-citリンカーは、オリゴヌクレオチドの5'末端、3'末端、または内部へ連結されており、およびここでVal-citリンカーは、チオール反応性の連結を介して(例として、抗体中のシステインを介して)、抗体(例として、本明細書に記載のとおりの抗体またはそのいずれのバリアント)へ連結されている。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、Val-citリンカーを介してオリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結された抗トランスフェリン受容体抗体を含むが、ここで抗トランスフェリン受容体抗体は、配列番号39のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号40のアミノ酸配列を有する軽鎖を含み、およびここで複合体は、以下の構造を含む:
Figure 2021533198
ここでリンカーVal-citリンカーは、オリゴヌクレオチドの5'末端、3'末端、または内部へ連結されており、およびここでVal-citリンカーは、チオール反応性の連結を介して(例として、抗体中のシステインを介して)、抗体(例として、本明細書に記載のとおりの抗体またはそのいずれのバリアント)へ連結されている。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、Val-citリンカーを介してオリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結された抗トランスフェリン受容体抗体を含むが、ここで抗トランスフェリン受容体抗体は、配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号42のアミノ酸配列を有する軽鎖を含み、およびここで複合体は、以下の構造を含む:
Figure 2021533198
ここでリンカーVal-citリンカーは、オリゴヌクレオチドの5'末端、3'末端、または内部へ連結されており、およびここでVal-citリンカーは、チオール反応性の連結を介して(例として、抗体中のシステインを介して)、抗体(例として、本明細書に記載のとおりの抗体またはそのいずれのバリアント)へ連結されている。
III．製剤
本明細書に提供される複合体は、いずれの好適なやり方でも製剤化されていてよい。一般に、本明細書に提供される複合体は、医薬への使用に好適なやり方で製剤化されている。例えば、複合体は、分解を最小限に抑え、送達および/または取り込みを容易にする製剤を使用して、対象へ送達され得るか、あるいは、製剤中の複合体へ別の有益な特性を提供する。いくつかの態様において、本明細書に提供されるのは、複合体および薬学的に許容し得る担体を含む組成物である。かかる組成物は、対象の標的細胞周囲の環境中または対象の全身のいずれかへ投与されたとき充分量の複合体が標的筋細胞に侵入できるように、好適に製剤化され得る。いくつかの態様において、複合体は、リン酸緩衝生理食塩溶液などの緩衝溶液中、リポソーム中、ミセル構造体中、およびカプシド中に製剤化される。
いくつかの態様において、組成物が、本明細書に提供される複合体の1以上の構成要素(例として、筋標的化剤、リンカー、分子ペイロード、またはこれらのいずれか1つの前駆体分子)を個別に包含していてもよいことは解されるはずである。
いくつかの態様において、複合体は、水中または水性溶液(例として、pH調整された水)中に製剤化される。いくつかの態様において、複合体は、塩基性緩衝水性溶液(例として、PBS)中に製剤化される。いくつかの態様において、本明細書に開示のとおりの製剤は、賦形剤を含む。いくつかの態様において、賦形剤は、組成物へ、改善された安定性、改善された吸収、改善された可溶性、および/または活性成分の治療増強を付与する。いくつかの態様において、賦形剤は、緩衝剤(例として、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、トリス塩基、もしくは水酸化ナトリウム)、またはビヒクル(例として、緩衝溶液、ワセリン、ジメチルスルホキシド、または鉱油)である。
いくつかの態様において、複合体またはその構成要素(例として、オリゴヌクレオチドまたは抗体)は、その貯蔵寿命を延長するため凍結乾燥され、次いで使用(例として、対象への投与)前に溶液にさせられる。結果的に、本明細書に記載の複合体またはその構成要素を含む組成物中の賦形剤は、凍結保護剤(lyoprotectant)(例として、マンニトール、ラクトース、ポリエチレングリコール、もしくはポリビニルピロリドン)、または崩壊温度修飾因子(例として、デキストラン、フィコール、もしくはゼラチン)であってもよい。
いくつかの態様において、医薬組成物は、その意図された投与ルートに適合するよう製剤化されている。投与ルートの例は、非経口投与、例として、静脈内投与、皮内投与、皮下投与を包含する。典型的には、投与ルートは、静脈内投与または皮下投与である。いくつかの態様において、投与ルートは、筋肉外非経口投与である。
注射剤への使用に好適な医薬組成物は、滅菌水性溶液(ここで水に可溶性である)または分散溶液、および滅菌注射剤溶液または分散溶液の即時調製のための滅菌粉末を包含する。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等)、および好適なそれらの混合物を含有する溶媒または分散媒体であり得る。いくつかの態様において、製剤は、組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、および塩化ナトリウムを包含する。滅菌注射剤溶液は、要求量の複合体を、上に列挙された成分の1つまたはそれらの組み合わせとともに、選択された溶媒に組み込むこと、要求に応じ、これに続き濾過滅菌することによって調製され得る。
いくつかの態様において、組成物は、活性成分(単数または複数)のパーセンテージが組成物全体の重量または体積の約1％と約80％以上との間であってもよいが、少なくとも約0.1％の複合体もしくはその構成要素を含有していてもよい。可溶性、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与ルート、産物の貯蔵寿命などの因子、ならびに他の薬理学的留意事項は、かかる医薬製剤を調製する当業者によって企図されるであろう。そのため様々な投薬量および処置計画が所望されることもある。
IV．使用の方法/処置
本明細書に記載のとおりの分子ペイロードへ共有結合した(covalently to)筋標的化剤を含む複合体は、FOPを標的にするのに有効である。いくつかの態様において、複合体は、典型的FOPまたは非典型的FOPを処置するのに有効である。いくつかの態様において、FOPは、ACVR1タンパク質中の突然変異、例として、R206H、Q207E、G328R、G328W、G328E、G356D、R375P、ΔP197〜F198へ繋がるACVR1遺伝子中の突然変異に関連する。
いくつかの態様において、対象は、ヒト対象、霊長目の非ヒト動物対象、齧歯類動物対象、またはいずれの好適な哺乳類の動物対象であってもよい。いくつかの態様において、対象は、表1に提供された筋疾患を有してもよい。
本開示の側面は、本明細書に記載のとおりの有効量の複合体を対象へ投与することを伴う方法を包含する。いくつかの態様において、分子ペイロードへ共有結合した筋標的化剤を含む複合体を含む有効量の医薬組成物は、処置を必要とする対象へ投与され得る。いくつかの態様において、本明細書に記載のとおりの複合体を含む医薬組成物は、静脈内投与を包含してもよい好適なルートによって、例として、ボーラスとして、またはある期間にわたる連続注入によって、投与されてもよい。いくつかの態様において、静脈内投与は、筋肉内の、腹腔内の、脳脊髄内の(intracerebrospinal)、皮下の、関節内の、滑液嚢内の、または髄腔内のルートによって実施されてもよい。いくつかの態様において、医薬組成物は、固体形態、水性形態、または液体形態であってもよい。いくつかの態様において、水性または液体形態は、噴霧されてもよく、または凍結乾燥されてもよい。いくつかの態様において、噴霧形態または凍結乾燥形態は、水性または液体溶液で再構成されてもよい。
静脈内投与のための組成物は、植物油、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、乳酸エチル、炭酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、エタノール、およびポリオール(グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等)などの様々な担体を含有していてもよい。静脈内注射のための水可溶性抗体は点滴法によって投与され得、これによって抗体および薬学的に許容し得る賦形剤を含有する医薬製剤が注入される。薬学的に許容し得る賦形剤は、例えば、5％デキストロース、0.9％生理食塩水、リンガー溶液、または他の好適な賦形剤を包含していてもよい。筋肉内用調製物、例として、抗体の好適な可溶性の塩形態の滅菌製剤は、注射用水、0.9％生理食塩水、または5％グルコース溶液などの医薬賦形剤に溶解されて投与され得る。
いくつかの態様において、分子ペイロードへ共有結合した筋標的化剤を含む複合体を含む医薬組成物は、部位特異的または局部的な送達技法を介して投与される。これらの技法の例は、複合体の埋め込み型デポー供給源、局部送達カテーテル、部位特異的担体、直接注射、または直塗り(direct application)を包含する。
いくつかの態様において、分子ペイロードへ共有結合した筋標的化剤を含む複合体を含む医薬組成物は、治療効果を対象に付与する有効濃度にて投与される。有効量は、当業者によって認識されるとおり、疾患の重症度、処置される対象の特有な特徴、例として、年齢、体調、健康状態、または重量、処置時間、いずれの併用治療の性質、投与ルート、および関連因子に応じて変動する。これらの関連因子は当業者に知られており、わずかな定型的実験法で対処され得る。いくつかの態様において、有効濃度は、患者に安全であるとみなされる最大用量である。いくつかの態様において、有効濃度は、最大限の効き目を提供する、実行可能な最低濃度であろう。
経験的考察、例として、対象における複合体の半減期は一般に、処置のために使用される医薬組成物の濃度の決定に寄与するであろう。投与頻度は、処置の効き目を最大化するために経験的に決定かつ調整されてもよい。
一般に、本明細書に記載の複合体のいずれかの投与について、当初の候補投薬量は、上に記載の因子、例として、安全性または効き目に応じて、約1〜100mg/kgであってもよく、またはこれより多くてもよい。いくつかの態様において、処置は、一度施されるであろう。いくつかの態様において、処置は、毎日、隔週、毎週、隔月、毎月、または対象へ最大の効き目を提供しつつ安全性へのリスクを最小に抑えるいずれの時間間隔にて、施されるであろう。一般に、効き目ならびに処置および安全性へのリスクは、処置過程を通してずっと監視されることもある。
処置の効き目は、いずれか好適な方法を使用して査定されてもよい。いくつかの態様において、処置の効き目は、FOPに関連する症状の評価または所見によって査定されてもよい。いくつかの態様において、FOPに関連する症状は、筋組織の骨との漸進的な置き換え、制限された運動、可動性の喪失、および/または呼吸困難および摂食困難を包含することもある。
いくつかの態様において、本明細書に記載の分子ペイロードへ共有結合した筋標的化剤を含む複合体を含む医薬組成物は、対照(例として、処置に先立つ遺伝子発現のベースラインレベル)と比べて、標的遺伝子の活性または発現を少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、または少なくとも95％阻害するのに充分な有効濃度にて、対象へ投与される。
いくつかの態様において、本明細書に記載の分子ペイロードへ共有結合した筋標的化剤を含む複合体を含む医薬組成物の対象への単回用量または投与は、少なくとも1〜5日間、1〜10日間、5〜15日間、10〜20日間、15〜30日間、20〜40日間、25〜50日間、またはこれより長い期間、標的遺伝子の活性または発現を阻害するのに充分である。いくつかの態様において、本明細書に記載の分子ペイロードへ共有結合した筋標的化剤を含む複合体を含む医薬組成物の対象への単回用量または投与は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12週間、標的遺伝子の活性または発現を阻害するのに充分である。いくつかの態様において、本明細書に記載の分子ペイロードへ共有結合した筋標的化剤を含む複合体を含む医薬組成物の対象への単回用量または投与は、少なくとも1、2、3、4、5、または6カ月間、標的遺伝子の活性または発現を阻害するのに充分である。
いくつかの態様において、医薬組成物は、分子ペイロードへ共有結合した筋標的化剤を含む、1種より多くの複合体を含んでいてもよい。いくつかの態様において、医薬組成物は、対象、例として、筋疾患(例として、表1で提供された筋疾患)を有するヒト対象の処置のためのいずれか他の好適な治療剤をさらに含んでいてもよい。いくつかの態様において、他の治療剤は、本明細書に記載の複合体の有効性を増強または補完するものであってもよい。いくつかの態様において、他の治療剤は、本明細書に記載の複合体とは異なる症状または疾患を処置するよう機能してもよい。
例
例1:トランスフェクトされたアンチセンスオリゴヌクレオチドでのDMPKの標的化
DMPK(DTX-P-060)の野生型および突然変異アレルの両方を標的にするgapmerアンチセンスオリゴヌクレオチドを、不死化細胞株中DMPKの発現レベル低減能について、in vitroで試験した。手短に言えば、Hepa1-6細胞に、リポフェクタミン2000で製剤化されたDTX-P-060(100nM)をトランスフェクトした。DMPK発現レベルを、トランスフェクションを受けてから72時間評価した。ビヒクル(リン酸緩衝生理食塩水)を培養中Hepa1-6細胞へ送達して細胞を72時間維持した、対照実験もまた実施した。図1に示されるとおり、DTX-P-060はDMPK発現レベルを対照と比較して〜90％低減させたことがわかった。
例2:筋標的化複合体でのDMPKの標的化
カテプシン切断可能なリンカーを介して、抗トランスフェリン受容体抗体であるDTX-A-002(RI7 217 (Fab))へ共有結合的に連結された、例1(DTX-P-060)に使用されたDMPK ASOを含む筋標的化複合体を生成した。
手短に言えば、マレイミドカプロイル-L-バリン-L-シトルリン-p-アミノベンジルアルコールp-ニトロフェニルカーボネート(MC-Val-Cit-PABC-PNP)リンカー分子を、アミドカップリング反応を使用して、NH2-C6-DTX-P-060へカップリングした。過剰なリンカーおよび有機溶媒をゲル浸透クロマトグラフィーによって除去した。次いで、精製されたVal-Cit-リンカー-DTX-P-060を、チオール-反応性の抗トランスフェリン受容体抗体(DTX-A-002)へカップリングした。
抗体カップリング反応の産物を疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC-HPLC)へ供した。図2Aは、SDS-PAGEによって決定されたとおり、トレース(垂直線によって示される)の画分B7-C2がASO対抗体の比1または2を含有した、結果のHIC-HPLCトレースを示す。これらの画分をプールして、DTX-C-008と称される最終的な筋標的化複合体に到達した。濃度測定はDTX-C-008がASO対抗体の平均比1.48を有したことを確認し、およびSDS-PAGEは86.4％の純度(図2B)を明らかにした。
同じアプローチを使用して、Val-Citリンカーを介して、IgG2a (Fab)抗体(DTX-C-007)へ共有結合的に連結された例1(DTX-P-060)で使用されたDMPK ASOを含む対照複合体を生成した。
次いで、精製されたDTX-C-008を細胞内在化およびDMPKの阻害について試験した。トランスフェリン受容体の相対的に高い発現レベルを有するHepa1-6細胞を、ビヒクル対照、DTX-C-008(100nM)、またはDTX-C-007(100nM)の存在下で72時間インキュベートした。72時間インキュベーションの後、細胞を単離してDMPKの発現レベルについてアッセイした(図3)。DTX-C-008で処置された細胞は、ビヒクル対照で処置された細胞と比べて、DMPK発現の〜65％の低減を実証した。その一方で、DTX-C-007で処置された細胞は、ビヒクル対照(DMPK発現における低減無し)に匹敵するDMPK発現レベルを有した。これらのデータは、DTX-C-008の抗トランスフェリン受容体抗体が複合体の細胞内在化を可能にし、それによってDMPK ASOがDMPKの発現を阻害できることを示唆する。
例3:筋標的化複合体でのマウス筋組織中DMPKの標的化
例2に記載の筋標的化複合体であるDTX-C-008を、マウス組織中DMPKの阻害について試験した。C57BL/6野生型マウスに、単回用量のビヒクル対照、DMPK-1(3mg/kgのRNA)、DTX-C-008(3mg/kgのRNA、抗体抱合体20mg/kgに相当する)、またはDTX-C-007(3mg/kgのRNA、抗体抱合体20mg/kgに相当する)を静脈内注射した。例1に記載のDTX-P-060、DMPK ASOを対照として使用した。各実験条件を3匹の個々のC57BL/6野生型マウスにおいて再現した。注射から7日後にマウスを安楽死させ、細分して単離された組織型とした。続いて個々の組織試料をDMPKの発現レベルについてアッセイした(図4A〜4Eおよび5A〜5B)。
DTX-C-008複合体で処置されたマウスは、様々な骨格、心、および平滑筋組織におけるDMPK発現の低減を実証した。例えば、図4A〜4Eに示されるとおり、DMPK発現レベルは、ビヒクル対照で処置されたマウスと比べて、腓腹筋(50％低減)、心臓(30％低減)、食道(45％低減)、前脛骨筋(47％低減)、およびヒラメ筋(31％低減)組織において有意に低減された。その一方で、DTX-C-007複合体で処置されたマウスは、アッセイされたすべての筋組織型について、ビヒクル対照(DMPK発現における低減無し)に匹敵するDMPK発現レベルを有した。
DTX-C-008複合体で処置されたマウスは、脾臓および脳組織などの非筋組織においてDMPK発現の無変化を実証した(図5Aおよび5B)。
これらのデータは、DTX-C-008の抗トランスフェリン受容体抗体がin vivoマウスモデルで複合体の筋肉特異的組織中への細胞内在化を可能にし、それによってDMPK ASOが阻害するDMPKの発現を阻害できることを示唆している。これらのデータは、DTX-C-008複合体が、筋組織を特異的に標的にすることが可能であることをさらに実証する。
例4:筋標的化複合体でのマウス筋組織中DMPKの標的化
例2に記載の筋標的化複合体であるDTX-C-008を、マウス組織中DMPKの用量依存性阻害について試験した。C57BL/6野生型マウスに、単回用量のビヒクル対照(リン酸緩衝生理食塩水、PBS)、DTX-P-060(10mg/kgのRNA)、DTX-C-008(3mg/kgまたは10mg/kgのRNA、ここで3mg/kgは、抗体抱合体20mg/kgに相当する)、またはDTX-C-007(3mg/kgまたは10mg/kgのRNA、ここで3mg/kgは、抗体抱合体20mg/kgに相当する)を静脈内注射した。例1に記載のDMPK ASOであるDTX-P-060を対照として使用した。各実験条件を5匹の個々のC57BL/6野生型マウスにおいて再現した。注射から7日の期間後に、マウスを安楽死させ、細分して単離された組織型とした。続いて個々の組織試料をDMPKの発現レベルについてアッセイした(図6A〜6F)。
DTX-C-008複合体で処置されたマウスは、様々な骨格筋組織におけるDMPK発現の低減を実証した。図6A〜6Fに示されるとおり、DMPK発現レベルは、ビヒクル対照で処置されたマウス、前脛骨筋(3mg/kgおよび10mg/kgのDTX-C-008について夫々、58％および75％低減)、ヒラメ筋(3mg/kgおよび10mg/kgのDTX-C-008について夫々、55％および66％低減)、長指伸筋(EDL)(3mg/kgおよび10mg/kgのDTX-C-008について夫々、52％および72％低減)、腓腹筋(3mg/kgおよび10mg/kgのDTX-C-008について夫々、55％および77％低減)、心臓(3mg/kgおよび10mg/kgのDTX-C-008について夫々、19％および35％低減)、および横隔膜(3mg/kgおよび10mg/kgのDTX-C-008について夫々、53％および70％低減)組織において、優位に低減された。注目すべきことに、アッセイされたすべての筋組織型は、3mg/kg抗体抱合体と比べて、10mg/kg抗体抱合体でDMPKレベルのより大きな低減を伴う、DMPKの用量依存性阻害を経験した。
その一方で、対照DTX-C-007複合体で処置されたマウスは、アッセイされたすべての筋組織型について、ビヒクル対照(DMPK発現における低減無し)に匹敵するDMPK発現レベルを有した。これらのデータは、DTX-C-008の抗トランスフェリン受容体抗体がin vivoマウスモデルで複合体の筋肉特異的組織中への細胞内在化を可能にし、それによってDMPK ASOがDMPKの発現を阻害できることを示唆している。これらのデータは、DTX-C-008複合体が、DMPKの用量依存性阻害のために、筋組織を特異的に標的にすることが可能であることをさらに実証する。
例5:筋標的化複合体でのカニクイザル筋組織中DMPKの標的化
DTX-P-060(DTX-C-012)を含む筋標的化複合体を、例2に記載の方法を使用して、生成および精製した。DTX-C-012は、カテプシン切断可能なVal-Citリンカーを介して、DMPKを標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドであるDTX-P-060へ共有結合的に連結されたヒト抗トランスフェリン抗体を含む複合体である。HIC-HPLC精製に続き、濃度測定は、DTX-C-012がASO対抗体の平均比1.32を有したことを確認し、およびSDS-PAGEは92.3％の純度を明らかにした。
DTX-C-012をオスのカニクイザル組織中DMPKの用量依存性阻害について試験した。オスのカニクイザル(19-31月齢；2〜3kg)に、0日目に単回用量の生理食塩水対照、DTX-P-060(ネイキッドDMPK ASO)(10mg/kgのRNA)、またはDTX-C-012(10mg/kgのRNA)を静脈内注射した。各実験条件を3匹の個々のオスのカニクイザルにおいて再現した。注射から7日目に、組織生検材料(筋組織を含有する)を採取した。DMPK mRNA発現レベル、ASO検出アッセイ、血清臨床化学、組織組織学、臨床所見、および体重を分析した。サルを14日目に安楽死させた。
生理食塩水対照と比べて、DTX-C-012を使用するDMPK mRNA発現の有意なノックダウン(KD)がヒラメ筋、深指屈筋、および咬筋において、夫々39％KD、62％KD、および41％KDで観察された(図7A〜7C)。DMPK mRNA発現DTX-C-012の堅固なノックダウンが、腓腹筋(62％KD；図7D)、EDL(29％KD；図7E)、前脛骨筋筋肉(23％KD；図7F)、横隔膜(54％KD；図7G)、舌(43％KD；図7H)、心臓筋肉(36％KD；図7I)、四頭筋(58％KD；図7J)、上腕二頭筋(51％KD；図7K)、および三角筋(47％KD；図7L)においてさらに観察された。平滑筋におけるDMPK mRNA発現DTX-C-012のノックダウンが、腸においてもまた、空腸十二指腸末端で63％KD(図8A)および回腸で70％KDを伴って、観察された(図8B)。注目すべきことに、ネイキッドDMPK ASO(すなわち、筋標的化剤へ連結されていない)であるDTX-P-060は、アッセイされたすべての筋組織型について、ビヒクル対照(すなわち、DMPK発現がほとんどまたはまったく低減されない)と比べて、DMPK発現レベルにおいて最小限の効果を有した。DTX-C-012複合体で処置されたサルは、肝臓、腎臓、脳、および脾臓組織などの非筋組織においてDMPK発現の無変化を実証した(図9A〜9D)。追加の組織を、カニクイザルにおける数個の組織型にわたって正規化されたDMPK mRNA組織発現レベルを示す図10において描かれたとおり、調べた。(N=3匹のオスのカニクイザル)
安楽死に先立ち、すべてのサルを、網状赤血球レベル、血小板レベル、ヘモグロビン発現、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)発現、アスパルタートアミノトランスフェラーゼ(AST)発現、および血液尿素窒素(BUN)レベルについて、投薬後2、7、および14日目に試験した。図12に示されるとおり、抗体-オリゴヌクレオチド複合体を投与したサルは、実験の全期間を通して、正常な網状赤血球レベル、血小板レベル、ヘモグロビン発現、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)発現、アスパルタートアミノトランスフェラーゼ(AST)発現、および血液尿素窒素(BUN)レベルを有した。これらのデータは、DTX-P-060を含む複合体の単回用量が、カニクイザルにおいて安全で許容されることを示す。
これらのデータは、DTX-C-012複合体の抗トランスフェリン受容体抗体が
in vivoカニクイザルモデルで複合体の筋肉特異的組織中への細胞内在化を可能にし、それによってDMPK ASO(DTX-P-060)がDMPKの発現を阻害できることを示唆している。これらのデータは、DTX-C-012複合体が、DMPKの用量依存性阻害のために、非筋組織に実質的な影響を与えることなく、筋組織を特異的に標的にすることが可能であることをさらに実証する。これは、ネイキッドDMPK ASO(すなわち、筋標的化剤へ連結されていない)であるDTX-P-060の、in vivoカニクイザルモデルの筋組織中DMPKの発現の限定的な阻害能との直接的な対比である。
例6:筋標的化複合体でのマウス筋組織中DMPKの標的化
例2に記載の筋標的化複合体、DTX-C-008を、マウス組織中DMPKの時間依存性阻害について試験した。C57BL/6野生型マウスに、表2に記載されたとおり、単回用量のビヒクル対照(生理食塩水)、DTX-P-060(10mg/kgのRNA)、またはDTX-C-008(10mg/kgのRNA)を静脈内注射し、所定期間後に安楽死させた。安楽死に続き、マウスを細分し単離された組織型とし、続いて組織試料をDMPKの発現レベルについてアッセイした(図11A〜11B)。
表2−実験条件
Figure 2021533198

DTX-C-008複合体で処置されたマウスは、群9〜12(注射および安楽死の間3〜28日)のすべてについて、ビヒクルと比べて、腓腹筋(図11A)および前脛骨筋(図11B)において、DMPK発現のおよそ50％低減を実証した。DTX-P-060ネイキッドオリゴヌクレオチドで処置されたマウスは、DMPK発現における有意な低減を実証しなかった。
等価物および専門用語
本明細書に好適に説明して記載される本開示は、本明細書に具体的に開示されていない、いずれの要素(単数もしくは複数)、限界(単数もしくは複数)が存在しない中でも実践され得る。よって、例えば、本明細書の各場合において、用語「〜を含む(comprising)」、「本質的に〜からなる(consisting essentially of)」、および「〜からなる」のいずれかは、他の2つの用語のいずれかに置き換えられていてもよい。採用された用語および表現は、記載する用語として使用されるが、限定する用語としては使用されず、かかる用語および表現を、示され記載される特色またはそれらの一部のいずれの等価物を除くよう使用する意図はないが、本開示の範囲内で様々な修飾が実行可能であることは認識される。よって、本開示は好ましい態様によって具体的に開示されているが、本明細書に開示された任意の特色、概念の修飾およびバリエーションが当業者によって再分類されてもよいこと、およびかかる修飾およびバリエーションが本開示の範囲内にあるとみなされることは、理解されるはずである。
加えて、本開示の特色または側面が、マーカッシュ群または他の代替群の観点から記載される場合、当業者は、それによって本開示がまた、マーカッシュ群または他の群のいずれか個々のメンバーまたは下位群のメンバーの観点からも記載されていることを認識するであろう。
いくつかの態様において、配列表に提示される配列が、オリゴヌクレオチドまたは他の核酸の構造を記載する際に触れられてもよいことは解されるはずである。かかる態様において、実際のオリゴヌクレオチドまたは他の核酸は、特定の配列と比較して、特定の配列と本質的に同じかまたは同様の相補的特性を保持しながら、1以上の代替ヌクレオチド(例として、DNAヌクレオチドのRNA相当物もしくはRNAヌクレオチドのDNA相当物)、および/または1以上の修飾ヌクレオチド、および/または1個以上の修飾ヌクレオチド間連結、および/または1以上の他の修飾を有していてもよい。
用語「a」および「an」および「the」ならびに同様の指示語(referent)の使用は、本発明を記載するという文脈において(とくに以下のクレームの文脈において)、本明細書に別様に指示されていない限り、または文脈によって明確に矛盾しない限り、単数形と複数形との両方をカバーするよう解釈されるべきである。用語「〜を含む」、「〜を有する(having)」、「〜を包含する(including)」、および「〜を含有する(containing)」は、別様に注記されていない限り、オープンエンドな(open-ended)用語(すなわち、「〜を包含するが、これらに限定されない」を意味する)として解釈されるべきである。本明細書の値の範囲の列挙は、本明細書に別様に指し示されていない限り、範囲内に収まる別々の各値を個々に指す簡単な方法として役立つことをただ単に意図するものであって、別々の各値は本明細書に個々に列挙された場合であっても本明細書中へ組み込まれたものである。本明細書に記載のすべての方法は、本明細書に別様に指示されていない限り、または文脈によって明確に矛盾しない限り、いずれか好適な順序で実施され得る。本明細書に提供されるありとあらゆる例または例示の言葉(例として、「〜などの(such as)」)の使用は、ただ単に本発明をより良く説明することを意図し、別様に主張されていない限り、本発明の範囲に制限を課すことはない。本明細書中の言葉は、主張されていないどの要素も、本発明の実践に対し不可欠なものとして指し示さないとして解釈されるはずである。
本発明の態様は本明細書に記載されている。これらの態様のバリエーションは、上記の記載を読んだ上で当業者に明らかとなることもある。
本発明者らは、当業者に、かかるバリエーションを必要に応じて採用することを期待し、本発明者らは、本発明が、本明細書に具体的に記載されるものと別様に実施されることも意図する。結果的に、本発明は、適用法によって許容されるとおりの、本明細書に添付のクレームに記載の主題のすべての修飾および等価物を包含する。その上、上記要素のいずれかの組み合わせは、それらの実行可能なすべてのバリエーションにおいて、本明細書に別様に指し示されていない限り、または文脈によって明確に矛盾しない限り、本発明によって網羅される。当業者は、わずかな定型的実験法を使用して、本明細書に記載の本発明の特定の態様との多くの等価物を認識するか、またはこれを確かめることができるであろう。かかる等価物は、以下のクレームによって網羅されることが意図される。

Claims (91)

  1. 機能獲得型疾患アレルに関連する筋疾患を有するとして診断された対象を処置するための方法であって、方法は、疾患アレルの発現または活性を阻害するように構成されている分子ペイロードへ共有結合的に連結された筋標的化剤を含む複合体を、対象へ投与することを含み、ここで筋標的化剤は、対象の筋細胞上の内在化する細胞表面受容体へ特異的に結合する、前記方法。
  2. 筋疾患が、遺伝性である、請求項1に記載の方法。
  3. 筋疾患が、対象の一連の家族の世代において増大した重症度を呈する、請求項1または2に記載の方法。
  4. 対象が、疾患アレルの遺伝分析に基づき、筋疾患を有するとして診断された、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
  5. 対象が、投与に先立ち、進行性筋肉衰弱および/または筋肉減少症を呈する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
  6. 対象が、投与に先立ち、例として筋電図検査で測定可能な、筋強直症を呈する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
  7. 筋標的化剤が、筋標的化抗体である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
  8. 筋標的化抗体が、トランスフェリン受容体の細胞外エピトープへ特異的に結合する、請求項7に記載の方法。
  9. トランスフェリン受容体の細胞外エピトープが、トランスフェリン受容体の先端ドメインのエピトープを含む、請求項8に記載の方法。
  10. 筋標的化抗体が、配列番号1〜3のC89〜F760の範囲にある配列のエピトープへ特異的に結合する、請求項8または9に記載の方法。
  11. 筋標的化抗体のトランスフェリン受容体への結合の平衡解離定数(Kd)が、10-11Mから10-6Mまでの範囲にある、請求項8〜10のいずれか一項に記載の方法。
  12. 筋標的化抗体が、トランスフェリン受容体のエピトープへの特異的な結合について、表2に列挙された抗体と競合する、請求項8〜11のいずれか一項に記載の方法。
  13. 筋標的化抗体が、トランスフェリン受容体のエピトープへの特異的な結合について、10-6M未満またはこれと等しいKdで競合する、請求項12に記載の方法。
  14. Kdが、10-11M〜10-6Mの範囲にある、請求項13に記載の方法。
  15. 筋標的化抗体が、トランスフェリン受容体のトランスフェリン結合部位へ特異的に結合しないか、および/または筋標的化抗体が、トランスフェリンのトランスフェリン受容体への結合を阻害しない、請求項7〜14のいずれか一項に記載の方法。
  16. 筋標的化抗体が、ヒト、霊長目の非ヒト動物、および齧歯類動物のトランスフェリン受容体のうち2種以上の細胞外エピトープと交差反応する、請求項7〜15のいずれか一項に記載の方法。
  17. 方法が、トランスフェリン受容体に媒介される分子ペイロードの筋細胞中への内在化を促進するように構成されている、請求項7〜16のいずれか一項に記載の方法。
  18. 筋標的化抗体が、キメラ抗体であり、任意にキメラ抗体が、ヒト化モノクローナル抗体である、請求項7〜17のいずれか一項に記載の方法。
  19. 筋標的化抗体が、ScFv、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント、またはFvフラグメントの形態である、請求項7〜18のいずれか一項に記載の方法。
  20. 分子ペイロードが、オリゴヌクレオチドである、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
  21. オリゴヌクレオチドが、表１に列挙された遺伝子またはこれからコードされるmRNAと相補性のある領域を含む、請求項20に記載の方法。
  22. オリゴヌクレオチドが、gapmerオリゴヌクレオチド、mixmerオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、RNAiオリゴヌクレオチド、メッセンジャーRNA(mRNA)、またはガイド配列である、請求項20または21に記載の方法。
  23. 複合体が、筋肉外非経口投与によって対象へ投与される、請求項1〜22のいずれか一項に記載の方法。
  24. 複合体が、静脈内投与によって対象へ投与される、請求項23に記載の方法。
  25. 複合体が、複合体の皮下投与によって対象へ投与される、請求項23に記載の方法。
  26. 一本鎖オリゴヌクレオチドへ連結された筋標的化剤を含む複合体であって、ここで筋標的化剤は、筋細胞上の内在化する細胞表面受容体へ特異的に結合し、およびここでオリゴヌクレオチドは、筋疾患遺伝子と相補性のある領域を含む、前記複合体。
  27. 複数の複合体を含む組成物であって、各複合体は、少なくとも3個のオリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結された筋標的化剤を含み、ここで筋標的化剤は、対象の筋細胞上の内在化する細胞表面受容体へ特異的に結合し、およびここで各オリゴヌクレオチドは、筋疾患遺伝子と相補性のある領域を含む、前記組成物。
  28. 筋細胞内で機能する非分泌物をコードする筋疾患遺伝子の発現または活性をモジュレートするように構成されている分子ペイロードへ、共有結合的に連結された筋標的化剤を含む複合体であって、ここで筋標的化剤は、筋細胞上の内在化する細胞表面受容体へ特異的に結合する、前記複合体。
  29. 筋標的化剤が、筋標的化抗体である、請求項28に記載の複合体。
  30. 筋標的化抗体が、トランスフェリン受容体の細胞外エピトープへ特異的に結合する、請求項29に記載の複合体。
  31. トランスフェリン受容体の細胞外エピトープが、トランスフェリン受容体の先端ドメインのエピトープを含む、請求項30に記載の複合体。
  32. 筋標的化抗体が、配列番号1〜3のアミノ酸C89〜F760内の配列のエピトープへ特異的に結合する、請求項30または31に記載の複合体。
  33. 筋標的化抗体のトランスフェリン受容体への結合の平衡解離定数(Kd)が、10-11Mから10-6Mまでの範囲にある、請求項30〜32のいずれか一項に記載の複合体。
  34. 筋標的化抗体が、トランスフェリン受容体のエピトープへの特異的な結合について、表1に列挙された抗体と競合する、請求項30〜33のいずれか一項に記載の複合体。
  35. 筋標的化抗体が、トランスフェリン受容体のエピトープへの特異的な結合について、10-6M未満またはこれと等しいKdで競合する、請求項34に記載の複合体。
  36. Kdが、10-11M〜10-6Mの範囲にある、請求項35に記載の複合体。
  37. 筋標的化抗体が、トランスフェリン受容体のトランスフェリン結合部位へ特異的に結合しないか、および/または筋標的化抗体が、トランスフェリンのトランスフェリン受容体への結合を阻害しない、請求項30〜36のいずれか一項に記載の複合体。
  38. 筋標的化抗体が、ヒト、霊長目の非ヒト動物、および齧歯類動物のトランスフェリン受容体のうち2種以上の細胞外エピトープと交差反応する、請求項30〜37のいずれか一項に記載の複合体。
  39. 複合体が、トランスフェリン受容体に媒介される分子ペイロードの筋細胞中への内在化を促進するように構成されている、請求項30〜38のいずれか一項に記載の複合体。
  40. 筋標的化抗体が、キメラ抗体である、請求項29〜39のいずれか一項に記載の複合体。
  41. キメラ抗体が、ヒト化モノクローナル抗体である、請求項40に記載の複合体。
  42. 筋標的化抗体が、ScFv、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント、またはFvフラグメントの形態である、請求項29〜41のいずれか一項に記載の複合体。
  43. 分子ペイロードが、オリゴヌクレオチドである、請求項28〜42のいずれか一項に記載の複合体。
  44. オリゴヌクレオチドが、機能獲得型疾患アレルを有する筋疾患遺伝子と相補性のある領域を含む、請求項43に記載の複合体。
  45. 分子ペイロードが、ポリペプチドである、請求項28〜42のいずれか一項に記載の複合体。
  46. ポリペプチドが、E3ユビキチンリガーゼインヒビターペプチドである、請求項45に記載の複合体。
  47. オリゴヌクレオチドが、少なくとも1個の修飾ヌクレオチド間連結を含む、請求項43または44に記載の複合体。
  48. 少なくとも1個の修飾ヌクレオチド間連結が、ホスホロチオアート連結である、請求項47に記載の複合体。
  49. オリゴヌクレオチドが、Rp立体化学配置にあるか、および/またはSp立体化学配置にあるホスホロチオアート連結を含む、請求項48に記載の複合体。
  50. オリゴヌクレオチドが、すべてRp立体化学配置にあるか、またはすべてSp立体化学配置にあるホスホロチオアート連結を含む、請求項49に記載の複合体。
  51. オリゴヌクレオチドが、1個以上の修飾ヌクレオチドを含む、請求項43、44または47〜50のいずれか一項に記載の複合体。
  52. 1個以上の修飾ヌクレオチドが、2'-修飾ヌクレオチドである、請求項51に記載の複合体。
  53. オリゴヌクレオチドが、細胞中筋疾患遺伝子によってコードされるmRNA転写産物のRNAse H媒介切断を指向するgapmerオリゴヌクレオチドである、請求項43、44または47〜52のいずれか一項に記載の複合体。
  54. gapmerオリゴヌクレオチドが、5〜15個のデオキシリボヌクレオチドの中心部を、その両脇から2〜8個ずつの修飾ヌクレオチドに挟まれて含む、請求項53に記載の複合体。
  55. その両脇の修飾ヌクレオチドが、2'-修飾ヌクレオチドである、請求項54に記載の複合体。
  56. オリゴヌクレオチドが、mixmerオリゴヌクレオチドである、請求項43、44または47〜52のいずれか一項に記載の複合体。
  57. mixmerオリゴヌクレオチドが、2個以上の異なる2'修飾ヌクレオチドを含む、請求項56に記載の複合体。
  58. オリゴヌクレオチドが、筋疾患遺伝子によってコードされるmRNA転写産物のRNAi媒介切断を促進するRNAiオリゴヌクレオチドである、請求項43、44または47〜52のいずれか一項に記載の複合体。
  59. RNAiオリゴヌクレオチドが、長さが19〜25個のヌクレオチドの二本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項58に記載の複合体。
  60. RNAiオリゴヌクレオチドが、少なくとも1個の2'修飾ヌクレオチドを含む、請求項58または59に記載の複合体。
  61. 各2'修飾ヌクレオチドが、2'-O-メチル、2'-フルオロ(2'-F)、2'-O-メトキシエチル(2'-MOE)、および2',4'-架橋ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項52、55、57または60のいずれか一項に記載の複合体。
  62. 1個以上の修飾ヌクレオチドが、架橋ヌクレオチドである、請求項51に記載の複合体。
  63. 少なくとも1個の2'修飾ヌクレオチドが、2',4'-拘束2'-O-エチル(cEt)、およびロックド核酸(LNA)ヌクレオチドから選択される2',4'-架橋ヌクレオチドである、請求項52、55、57または60のいずれか一項に記載の複合体。
  64. オリゴヌクレオチドが、ゲノム編集ヌクレアーゼのためのガイド配列を含む、請求項43、44または47〜52のいずれか一項に記載の複合体。
  65. オリゴヌクレオチドが、ホスホロジアミダイトモルホリノオリゴマーである、請求項43、44または47〜52のいずれか一項に記載の複合体。
  66. 筋標的化剤が、切断可能なリンカーを介して分子ペイロードへ共有結合的に連結されている、請求項28〜65のいずれか一項に記載の複合体。
  67. 切断可能なリンカーが、プロテアーゼ感受性リンカー、pH感受性リンカー、およびグルタチオン感受性リンカーから選択される、請求項66に記載の複合体。
  68. 切断可能なリンカーが、プロテアーゼ感受性リンカーである、請求項67に記載の複合体。
  69. プロテアーゼ感受性リンカーが、リソソームのプロテアーゼおよび/またはエンドソームのプロテアーゼによって切断可能な配列を含む、請求項68に記載の複合体。
  70. プロテアーゼ感受性リンカーが、バリン-シトルリンジペプチド配列を含む、請求項68に記載の複合体。
  71. リンカーが、4〜6の範囲にあるpHにて切断されるpH感受性リンカーである、請求項67に記載の複合体。
  72. 筋標的化剤が、切断不能なリンカーを介して分子ペイロードへ共有結合的に連結されている、請求項28〜65のいずれか一項に記載の複合体。
  73. 切断不能なリンカーが、アルカンリンカーである、請求項72に記載の複合体。
  74. 筋標的化抗体が、オリゴヌクレオチドが共有結合的に連結された非天然アミノ酸を含む、請求項29〜73のいずれか一項に記載の複合体。
  75. 筋標的化抗体が、抗体のリシン残基またはシステイン残基への抱合を介してオリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結されている、請求項29〜74のいずれか一項に記載の複合体。
  76. 筋標的化抗体が、マレイミド含有リンカーを介してシステインへ抱合されており、任意にマレイミド含有リンカーが、マレイミドカプロイルまたはマレイミドメチルシクロヘキサン-1-カルボキシラート基を含む、請求項75に記載の複合体。
  77. 筋標的化抗体が、オリゴヌクレオチドが共有結合的に連結された少なくとも1個の糖部を含むグリコシル化抗体である、請求項29〜76のいずれか一項に記載の複合体。
  78. 糖部が、分枝マンノースである、請求項77に記載の複合体。
  79. 筋標的化抗体が、1〜4個の糖部を含むグリコシル化抗体であって、前記糖部の各々が、別々のオリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結されている、請求項77または78に記載の複合体。
  80. 筋標的化抗体が、全体的にグリコシル化された抗体である、請求項77に記載の複合体。
  81. 筋標的化抗体が、部分的にグリコシル化された抗体である、請求項77に記載の複合体。
  82. 部分的にグリコシル化された抗体が、化学的または酵素的な手段を介して産生される、請求項81に記載の複合体。
  83. 部分的にグリコシル化された抗体が、N-またはO-グリコシル化経路中の酵素を欠乏した細胞である細胞において産生される、請求項81に記載の複合体。
  84. 分子ペイロードをトランスフェリン受容体発現細胞へ送達する方法であって、方法が、細胞を請求項29〜83のいずれか一項に記載の複合体と接触させることを含む、前記方法。
  85. 細胞中筋疾患遺伝子の発現または活性を阻害する方法であって、方法が、細胞を請求項29〜83のいずれか一項に記載の複合体と、分子ペイロードの細胞への内在化を促進するのに有効な量で接触させることを含む、前記方法。
  86. 細胞が、in vitroにある、請求項85に記載の方法。
  87. 細胞が、対象にある、請求項85に記載の方法。
  88. 対象が、ヒトである、請求項87に記載の方法。
  89. 筋疾患を有する対象を処置する方法であって、方法が、有効量の請求項29〜83のいずれか一項に記載の複合体を対象へ投与することを含む、前記方法。
  90. 筋疾患が、表１に列挙された疾患である、請求項89に記載の方法。
  91. 筋疾患が、成人型ポンペ病、中心核ミオパチー(CNM)、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、顔面・肩甲・上腕筋ジストロフィー(FSHD)、家族性肥大型心筋症、進行性骨化性線維異形成症(FOP)、フリートライヒ運動失調症(FRDA)、封入体ミオパチー2、Laing型遠位型ミオパチー、筋原線維ミオパチー、先天性筋強直症(常染色体優性型、トムゼン病)、筋強直症ジストロフィーI型、筋強直症ジストロフィーII型、筋細管ミオパチー、眼咽頭型筋ジストロフィー、および先天性異常筋強直症からなる群から選択される疾患である、請求項89に記載の方法。
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