JP2024503609A - 筋緊張性ジストロフィーを処置するための筋標的化複合体およびその使用 - Google Patents

筋緊張性ジストロフィーを処置するための筋標的化複合体およびその使用 Download PDF

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Abstract

本出願は、DMPK RNAを標的にするよう設計されたオリゴヌクレオチド(例として、gapmerなどのアンチセンスオリゴヌクレオチド)、およびオリゴヌクレオチドを細胞(例として、筋細胞)へ送達するための標的化複合体、ならびにそれらの使用、特に疾患の処置に関する使用に関する。いくつかの態様において、筋標的化剤は、筋細胞上の内在化している細胞表面受容体へ特異的に結合する。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DMPKの発現または活性を阻害する。

Description

関連出願
本出願は、2021年9月17日出願の「MUSCLE TARGETING COMPLEXES AND USES THEREOF FOR TREATING MYOTONIC DYSTROPHY」と題する米国仮出願第63/245262号の;2021年4月23日出願の「MUSCLE TARGETING COMPLEXES AND USES THEREOF FOR TREATING MYOTONIC DYSTROPHY」と題する米国仮出願第63/179100号の;および2020年12月31日出願の「MUSCLE TARGETING COMPLEXES AND USES THEREOF FOR TREATING MYOTONIC DYSTROPHY」と題する米国仮出願第63/133013号の、35 U.S.C§119(e)下での利益を主張するものである;これら各々の内容はそれら全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる。
本発明の分野
本出願は、DMPK RNAを標的にするよう設計されたオリゴヌクレオチドおよびそのオリゴヌクレオチドを細胞(例として、筋細胞)へ送達するための標的化複合体、ならびにその使用、特に疾患の処置に関する使用に関する。
EFS-WEBを介しテキストファイルとして提出された配列表への言及
本出願は配列表を含有する。これはEFS-WebからASCIIフォーマットで提出されており、その全体が参照によってここに組み込まれる。2021年12月30日に作成された該ASCIIコピーはD082470046WO00-SEQ-ZJGという名称であり、サイズは177,748バイトである。
背景
筋強直性ジストロフィー(DM)は、筋強直症、筋肉の喪失または変性、筋肉機能の低下、インスリン抵抗性、心不整脈、平滑筋機能不全、および神経学的異常に特徴付けられる優性遺伝性疾患である。DMは成人発症型筋ジストロフィーの最も一般的な形態であり、世界中で約8000人に1人の世界発生率である。筋緊張性ジストロフィー1型(DM1)および筋緊張性ジストロフィー2型(DM2)の2種類の疾患が報告されている。この疾患のより一般的な形態であるDM1は、19番染色体上のDMPKの3'非コード領域にあるCTGトリヌクレオチド反復の反復拡張に起因し;DM2は、3番染色体上のZNF9の最初のイントロンにあるCCTGテトラヌクレオチド反復の反復拡張に起因する。DM1患者(DM1 patients)において、約50から約3,000以上の総反復を含む可能性があるCTGトリヌクレオチド反復の反復拡張は、必須の細胞内タンパク質、例として、muscleblind様タンパク質と高い親和性で結合するヘアピン構造を形成できる有毒なRNA反復の生成に繋がり、これは疾患の特徴である、タンパク質隔離(sequestration)および機能喪失の表現型をもたらす。疾患の症状に対処するための支持療法および処置を除いて、DM1の有効な治療法は現在利用可能ではない。
概要
いくつかの側面において、本開示は、DMPK RNAを標的にするよう設計されたオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの態様において、本開示は、例として筋強直性ジストロフィーを有するかまたはこれを有すると疑われる対象における、疾患関連反復拡張を有する有毒なDMPKのレベルを低減させるのに有用なDMPK RNAと相補的なオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、標的DMPK RNAのRNAe H媒介分解へ向かうによう設計されている。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、細胞(例として、筋細胞、例として、筋管)の核中に存在する標的DMPK RNAのRNAe H媒介分解へ向かうによう設計されている。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、細胞(例として、神経系の細胞(例として、中枢神経系(CNS)細胞))の核中に存在する標的DMPK RNAのRNAe H媒介分解へ向かうによう設計されている。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、所望のバイオアベイラビリティおよび/または血清-安定性という特性を有するよう設計されている。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、所望の結合親和性という特性を有するよう設計されている。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、所望の毒性プロファイルを有するよう設計されている。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、低い補体活性化および/またはサイトカイン誘導という特性を有するよう設計されている。
いくつかの態様において、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドは、他の分子(例として、標的化剤、例として、筋標的化剤)への抱合が容易になるよう設計されている。結果的に、いくつかの側面において、本開示は、特定の細胞型を、オリゴヌクレオチドをそれら細胞へ送達することを目的として、標的にする複合体を提供する。例えば、いくつかの側面において、本開示は、筋細胞を、オリゴヌクレオチドをそれら細胞へ送達することを目的として、標的にする複合体を提供する。いくつかの態様において、本明細書に提供される複合体は、拡張された疾患関連反復を含むDMPKアレルの発現または活性を、例として筋強直性ジストロフィーを有するかまたはこれを有すると疑われる対象において阻害する分子ペイロードを送達するのにとくに有用である。したがって、いくつかの態様において、本明細書に提供される複合体は、分子ペイロードを筋細胞へ送達することを目的として、筋細胞の表面上の受容体へ特異的に結合する筋標的化剤(例として、筋標的化抗体)を含む。いくつかの態様において、複合体は、受容体に媒介される内在化を介して細胞中へ取り入れられ、これを受け分子ペイロードは細胞内部に放出されて機能を果たしてもよい。例えば、オリゴヌクレオチドを送達するように改変された複合体は、オリゴヌクレオチドが筋細胞における突然変異体DMPK発現を阻害し得るように、オリゴヌクレオチドを放出してもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、複合体のオリゴヌクレオチドと筋標的化剤とを接続する共有結合性リンカーのエンドソーム切断によって放出される。本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドおよび/または複合体が、複数の組織および細胞型(筋組織内の細胞型など)において(例として、筋細胞において)、ならびに中枢神経系において(例として、ニューロンなどのCNS細胞において)有用であり得ることは理解されるはずである。
本開示のいくつかの側面は、アンチセンスオリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結されている筋標的化剤を含む複合体を提供するが、ここでアンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが15～20ヌクレオチドであり、かつ配列番号166、163、167,160、169、171、202、161、162、170、165、164、172、および168のいずれか1つの少なくとも15の連続したヌクレオシドに対する相補性の領域を含み、かつ5'-X-Y-Z-3'配置を含み、ここで
Xは、3-5連結ヌクレオシドを含み、ここでX中のヌクレオシドの少なくとも1つは、2'-修飾ヌクレオシドである;
Yは、6-10連結2'-デオキシリボヌクレオシドを含み、ここでY中の各シトシンは、任意におよび独立に、5-メチル-シトシンである;および
Zは、3-5連結ヌクレオシドを含み、ここでZ中のヌクレオシドの少なくとも1つは、2'-修飾ヌクレオシドである。
いくつかの態様において、筋標的化剤は、抗トランスフェリン受容体1(TfR1)抗体を含む。
いくつかの態様において、配列番号179、187、180、185、189、182、191、184、174、186、190、188、177、192、および181のいずれか1つのヌクレオチド配列を含む。
いくつかの態様において、X中の各ヌクレオシドは、2'-修飾ヌクレオシドであり、および/またはZ中の各ヌクレオシドは、2'-修飾ヌクレオシドである。いくつかの態様において、各2'-修飾ヌクレオシドは、独立して、2'-4'二環式ヌクレオシドまたは非二環式2'-修飾ヌクレオシドである。
いくつかの態様において、X中の各ヌクレオシドは、非二環式2'-修飾ヌクレオシドであり、および/またはZ中の各ヌクレオシドは、非二環式2'-修飾ヌクレオシドである。いくつかの態様において、非二環式2'-修飾ヌクレオシドは、2'-MOE修飾ヌクレオシドである。
いくつかの態様において、X中の各ヌクレオシドは、2'-4'二環式ヌクレオシドであり、および/またはZ中の各ヌクレオシドは、2'-4'二環式ヌクレオシドである。いくつかの態様において、2'-4'二環式ヌクレオシドは、LNA、cEt、およびENAから選択される。
いくつかの態様において、Xは、少なくとも1つの2'-4'二環式ヌクレオシドおよび少なくとも1つの非二環式2'-修飾ヌクレオシドを含み、および/またはZは、少なくとも1つの2'-4'二環式ヌクレオシドおよび少なくとも1つの非二環式2'-修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの態様において、少なくとも1つの非二環式2'-修飾ヌクレオシドは、2'-MOE修飾ヌクレオシドであり、ならびに少なくとも1つの2'-4'二環式ヌクレオシドは、LNA、cEt、およびENAから選択される。
いくつかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の5'-X-Y-Z-3'配置:
を含み、
ここで「E」は、2'-MOE修飾リボヌクレオシドである;「L」は、LNAである;「D」は、2'-デオキシリボヌクレオシドである;および「10」または「8」は、Y中の2'-デオキシリボヌクレオシド数である。
いくつかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、1以上のホスホロチオアートヌクレオシド間連結を含む。
いくつかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチド中の各ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結である。
いくつかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、1以上のホスホジエステルヌクレオシド間連結を含む。いくつかの態様において、ホスホジエステルヌクレオシド間連結は、X中および/またはZ中にある。
いくつかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下:
から選択されるオリゴヌクレオチドを含み、
ここで「xdC」は、5-メチル-デオキシシチジンである;「dN」は、2'-デオキシリボヌクレオシドである;「+N」は、LNAヌクレオシドである;「oN」は、2'-MOE修飾リボヌクレオシドである;「oC」は、5-メチル-2'-MOE-シチジンである;「+C」は、5-メチル-2'-4'-二環式-シチジン(2'-4'メチレン架橋)である;「oU」は、5-メチル-2'-MOE-ウリジンである;「+U」は、5-メチル-2'-4'-二環式-ウリジン(2'-4'メチレン架橋)である;「*」は、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結を指し示す;およびヌクレオシド間に「*」が存在しないことは、ホスホジエステルヌクレオシド間連結を指し示す。
いくつかの態様において、抗TfR1抗体は、表2に列挙される抗TfR1抗体のいずれかの重鎖相補性決定領域1(CDR-H1)、重鎖相補性決定領域2(CDR-H2)、重鎖相補性決定領域3(CDR-H3)、軽鎖相補性決定領域1(CDR-L1)、軽鎖相補性決定領域2(CDR-L2)、軽鎖相補性決定領域3(CDR-L3)を含む。
いくつかの態様において、抗TfR1抗体は、表3に列挙される抗TfR抗体のいずれかの重鎖可変領域(VH)および軽鎖可変領域(VL)を含む。
いくつかの態様において、抗TfR1抗体は、Fabである。いくつかの態様において、Fabは、表5に列挙される抗TfR1 Fabのいずれかの重鎖および軽鎖を含む。
いくつかの態様において、抗TfR1抗体は、以下:
(ｉ)配列番号27のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号28のアミノ酸配列を含むCDR-H2、配列番号29のアミノ酸配列を含むCDR-H3、配列番号30のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号31のアミノ酸配列を含むCDR-L2、および配列番号32のアミノ酸配列を含むCDR-L3;
(ii)配列番号33のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号34のアミノ酸配列を含むCDR-H2、配列番号35のアミノ酸配列を含むCDR-H3、配列番号36のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号37のアミノ酸配列を含むCDR-L2、および配列番号32のアミノ酸配列を含むCDR-L3;または
(ii)配列番号38のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号39のアミノ酸配列を含むCDR-H2、配列番号40のアミノ酸配列を含むCDR-H3、配列番号41のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号31のアミノ酸配列を含むCDR-L2、および配列番号42のアミノ酸配列を含むCDR-L3
を含む。
いくつかの態様において、抗TfR1抗体は、配列番号76のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号75のアミノ酸配列を含むVLを含む。
いくつかの態様において、抗TfR1抗体は、Fabであり、かつ配列番号101のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、筋標的化剤およびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、リンカーを介して共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、リンカーは、バリン-シトルリン配列を含む。
本開示の他の側面は、筋細胞中のDMPK発現を低減させる方法を提供し、方法は、筋細胞を、アンチセンスオリゴヌクレオチドの筋細胞への内在化を促進するのに有効な量の本明細書に記載の複合体と接触させることを含む。
いくつかの態様において、DMPK発現を低減させることは、筋細胞中DMPK mRNAのレベルを低減させることを含む。いくつかの態様において、DMPK mRNAは、突然変異DMPK mRNAである。
本開示の他の側面は、筋強直症ジストロフィー1型(DM1)を処置する方法を提供し、方法は、本明細書に記載の有効量の複合体を、これを必要とする対象へ投与することを含み、ここで対象は、疾患関連CUG反復を含む突然変異DMPKアレルを有する。
いくつかの態様において、複合体の投与は、DMPK mRNAの少なくとも30％の低減をもたらす。
本明細書にさらに提供されるのは、以下:
から選択されるオリゴヌクレオチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
ここで「xdC」は、5-メチル-デオキシシチジンである;「dN」は、2'-デオキシリボヌクレオシドである;「+N」は、LNAヌクレオシドである;「oN」は、2'-MOE修飾リボヌクレオシドである;「oC」は、5-メチル-2'-MOE-シチジンである;「+C」は、5-メチル-2'-4'-二環式-シチジン(2'-4'メチレン架橋)である;「oU」は、5-メチル-2'-MOE-ウリジンである;「+U」は、5-メチル-2'-4'-二環式-ウリジン(2'-4'メチレン架橋)である;「*」は、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結を指し示す;およびヌクレオシド間に「*」が存在しないことは、ホスホジエステルヌクレオシド間連結を指し示す。
いくつかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下:
から選択されるオリゴヌクレオチドを含み、
ここで「xdC」は、5-メチル-デオキシシチジンである;「dN」は、2'-デオキシリボヌクレオシドである;「+N」は、LNAヌクレオシドである;「oN」は、2'-MOE修飾リボヌクレオシドである;「oC」は、5-メチル-2'-MOE-シチジンである;「+C」は、5-メチル-2'-4'-二環式-シチジン(2'-4'メチレン架橋)である;「oU」は、5-メチル-2'-MOE-ウリジンである;「+U」は、5-メチル-2'-4'-二環式-ウリジン(2'-4'メチレン架橋)である;「*」は、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結を指し示す;およびヌクレオシド間に「*」が存在しないことは、ホスホジエステルヌクレオシド間連結を指し示し、ならびに
ここでホスホジエステル連結は、5'-NH2-(CH2)6-とアンチセンスオリゴヌクレオチドとの間に存在する。
ナトリウム塩の形態の、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物もまた、提供される。
図面の簡単な記載
図1A～1Bは、健常ボランティアに由来する細胞株と比べた、DM1-32F初代細胞(380のCUG反復を有するDMPK突然変異mRNAを発現する)およびDM1-CL5不死化細胞(2600のCUG反復を有するDMPK突然変異mRNAを発現する)におけるDMPK mRNAの発現を示す。図1Aは、32F細胞におけるDMPK mRNA中のASO1の標的部位を示す。図1Bは、CL5細胞におけるDMPK mRNA中のASO1の標的部位を示す。
図2A～2Dは、DM1-32F初代細胞において、DMPK mRNA発現の低減、BIN1エキソン11スプライシング欠陥の修正、および核内フォーカスの低減における、ASO1またはASO32へ抱合された対照抗TfR1 Fabを有する抱合体の活性を示す。図2Aは、両抱合体とも、32F細胞においてDMPK mRNA発現レベルを低減したことを示す。図2Bは、BIN1エキソン11のスプライシングが、32F細胞において抱合体の処置後に修正されたことを示す。 図2C～2Dは、両抱合体とも、32F細胞において核内フォーカスを低減したことを示す。図2Dに示される顕微鏡画像において、明るい円形は細胞核を示し、DM1細胞の核内の輝点(右3つの顕微鏡パネル)は、CUGフォーカスを示す。
図3A～3Dは、CL5細胞において、DMPK mRNA発現の低減、BIN1エキソン11スプライシング欠陥の修正、および核内フォーカスの低減(核内フォーカス面積の核面積に対する比率として測定された)における、ASO1またはASO32へ抱合された対照抗TfR1 Fabを有する抱合体の活性を示す。図3Aは、両抱合体とも、CL5細胞においてDMPK mRNA発現レベルを低減したことを示す。 図3Bは、BIN1エキソン11のスプライシングが、CL5細胞において抱合体の処置後に修正されたことを示す。図3C～3Dは、両抱合体とも、CL5細胞において核内フォーカスを低減したことを示す。図3Dに示される顕微鏡画像において、明るい円形は細胞核を示し、DM1細胞の核内の輝点(右3つの顕微鏡パネル)は、CUGフォーカスを示す。
図4A～4Hは、32F細胞において、DMPK mRNA発現の低減、BIN1エキソン11スプライシング欠陥の修正、および核内フォーカスの低減(核内フォーカス面積の核面積に対する比率として測定された)における、ASO32、ASO10、ASO8、ASO26、およびASO1へ抱合された抗TfR1 Fabを有する抱合体の活性を示す。すべてのASOを、抗TfR1 Fab 3M12 - VH4/VK3へ抱合させた。図4Aは、32F細胞において、380のCUG反復を有するDMPK mRNA中のASO1、ASO2、およびASO32の標的部位を示す。図4Bは、試験された抱合体が、32F細胞においてDMPK mRNA発現レベルを低減したことを示す。図4Cは、BIN1エキソン11のスプライシングが、32F細胞において抱合体の処置後に修正されたことを示す。 図4D～4Eは、試験された抱合体が、32F細胞において核内フォーカスの面積を低減したことを示す。図4Eに示される顕微鏡画像において、明るい円形は細胞核を示し、核内の輝点はDMPKフォーカスを示す。図4Fは、試験された抱合体が、32F細胞においてDMPK発現を用量依存的に低減したことを示す。 図4Gは、試験された抱合体が、32F細胞においてBIN1のミススプライシング(mis-splicing)を用量依存的に修正したことを示す。図4Hは、試験された抱合体が、32F細胞において核内フォーカスの面積を用量依存的に低減したことを示す。
図5A～5Hは、CL5細胞において、DMPK mRNA発現の低減、BIN1エキソン11スプライシング欠陥の修正、および核内フォーカスの低減(核内フォーカス面積の核面積に対する比率として測定された)における、ASO32、ASO10、ASO8、ASO26、およびASO1のうち1つへ抱合された抗TfR1 Fabを有する抱合体の活性を示す。すべてのASOを、抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3へ抱合させた。図5Aは、CL5細胞において、2600のCUG反復を有するDMPK mRNA中のASO1、ASO2、およびASO32の標的部位を示す。 図5Bは、試験された抱合体が、CL5細胞においてDMPK mRNA発現レベルを低減したことを示す。図5Cは、BIN1エキソン11のスプライシングが、CL5細胞において抱合体の処置後に修正されたことを示す。 図5D～5Eは、試験された抱合体が、CL5細胞において核内フォーカスの面積を低減したことを示す。図5Eに示される顕微鏡画像において、明るい円形は細胞核を示し、核内の輝点はDMPKフォーカスを示す。図5Fは、ASO10またはASO8へ抱合された抗TfR1 Fabを有する抱合体が、CL5細胞においてDMPK発現を用量依存的に低減したことを示す。 図5Gは、試験された抱合体が、CL5細胞においてBIN1のミススプライシングを用量依存的に修正したことを示す。図5Hは、ことを示す試験された抱合体が、CL5細胞において核内フォーカスの面積を、試験されたすべての用量で同様のレベルまで低減した。
図6は、ASO10、ASO8、およびASO26へ抱合された抗TfR1 Fabを有する抱合体が、横紋筋肉腫(RD)細胞においてDMPK発現を用量依存的にノックダウンすることができ、ASO1-抱合体が、霊長目の非ヒト動物(NHP)細胞においてDMPKを用量依存的にノックダウンすることができたことを示す。すべてのASOを、抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3へ抱合させた。
図7は、同じ核酸塩基配列の種々の化学的改変が、DMPK標的化オリゴヌクレオチドの効能に影響を及ぼし得ることを示す。すべてのASOを、抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3へ抱合させた。500nMのオリゴ濃度にて、ASO32-抱合体は、DMPK発現を88％低減することができ、ASO31-抱合体は、DMPK発現を70％低減することができ、ASO30-抱合体は、DMPK発現を39％低減することができた。
図8A～8Bは、親の核酸塩基配列の種々の長さおよび化学的改変が、DMPK標的化オリゴヌクレオチドの効能に影響を及ぼし得ることを示す。すべてのASOを、抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3へ抱合させた。図8Aは、ヒトRD細胞において、DMPKのノックダウンにおけるASO32-抱合体、ASO10-抱合体、ASO8-抱合体、およびASO9-抱合体の活性を示す。図8Bは、ヒトRD細胞において、DMPKのノックダウンにおけるASO32-抱合体、ASO11-抱合体、ASO20-抱合体、ASO26-抱合体、およびASO2-抱合体の活性を示す。
図9A～9Cは、ASO32へ抱合された抗TfR1 Fabを有する抱合体が、ヒトTfR1と拡張されたCUG反復を内包するヒトDMPK突然変異体とを発現するマウスモデルの様々な筋組織において、ヒト突然変異DMPK発現を低減したことを示す。図9D～9Kは、ASO32へ抱合された抗TfR1 Fabを有する抱合体が、ヒトTfR1を発現するマウスモデルの様々な筋組織においてマウスDMPK発現を低減したことを示す。図9A～9Cにおいて、ASO32を、対照抗TfR1 Fabへ抱合させた。図9D～9Kにおいて、ASO32を、抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3へ抱合させた。図9Aは、ASO32-抱合体が、前脛骨筋においてDMPK mRNAレベルを36％低減したことを示す。図9Bは、ASO32-抱合体が、横隔膜においてDMPK mRNAレベルを46％低減したことを示す。図9Cは、ASO32-抱合体が、心臓においてヒト突然変異DMPKを42％低減したことを示す。 図9Dは、ASO32-抱合体が、前脛骨筋においてマウス野生型Dmpkを79％低減したことを示す。図9Eは、ASO32-抱合体が、腓腹筋においてマウス野生型Dmpkを76％低減したことを示す。図9Fは、ASO32-抱合体が、心臓においてマウス野生型Dmpkを70％低減したことを示す。図9Gは、ASO32-抱合体が、横隔膜においてマウス野生型Dmpkを88％低減したことを示す。 図9H～9Kは、前脛骨筋、腓腹筋、心臓、および横隔膜におけるASO32分布を示す。すべての組織が、ビヒクル対照と比較して増大したASO32レベルを示した。
図10A～10Eは、ヒトTfR1と拡張されたCUG反復を内包するヒトDMPK突然変異体とを発現するマウスモデルにおいて、ASO32、ASO10、ASO8、ASO26、およびASO1へ抱合された抗TfR1 Fabを有する抱合体が、様々な筋組織においてヒト突然変異DMPK発現を低減したこと、ならびにASO10-抱合体が、心臓において核内フォーカスを低減したことを示す。ASO32を、対照抗TfR1 Fabへ抱合させた。他のすべてのASOを、抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3へ抱合させた。抱合体は、心臓(図10A)、横隔膜(図10B)、腓腹筋(図10C)、および前脛骨筋(図10D)においてヒトDMPK mRNAレベルを低減した。 図10A～10Eは、ヒトTfR1と拡張されたCUG反復を内包するヒトDMPK突然変異体とを発現するマウスモデルにおいて、ASO32、ASO10、ASO8、ASO26、およびASO1へ抱合された抗TfR1 Fabを有する抱合体が、様々な筋組織においてヒト突然変異DMPK発現を低減したこと、ならびにASO10-抱合体が、心臓において核内フォーカスを低減したことを示す。ASO32を、対照抗TfR1 Fabへ抱合させた。他のすべてのASOを、抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3へ抱合させた。抱合体は、心臓(図10A)、横隔膜(図10B)、腓腹筋(図10C)、および前脛骨筋(図10D)においてヒトDMPK mRNAレベルを低減した。 図10Eは、ASO10-抱合体がASO10の10mg/kgに相当する用量にて注射されたマウスが、心臓において核内フォーカスを低減したことを示す。図10Eに示される顕微鏡画像において、円形は細胞核を示し、核内の濃い点は、DMPKフォーカスを示す。
図11A～11Dは、ASO32、ASO10、ASO8へ抱合された抗TfR1 Fabを有する抱合体を示す。ASO26およびASO1は、ヒトTfR1と拡張されたCUG反復を内包するヒトDMPK突然変異体とを発現するマウスモデルの様々な筋組織において、標的配列中に1ヌクレオチドミスマッチがあるにもかかわらず、マウスDmpk発現を低減した。ASO32を、対照抗TfR1 Fabへ抱合させた。他のすべてのASOを、抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3へ抱合させた。抱合体が、心臓(図11A)、横隔膜(図11B)、腓腹筋(図11C)、および前脛骨筋(図11D)においてマウスDMPK mRNAレベルを低減した。 図11A～11Dは、ASO32、ASO10、ASO8へ抱合された抗TfR1 Fabを有する抱合体を示す。ASO26およびASO1は、ヒトTfR1と拡張されたCUG反復を内包するヒトDMPK突然変異体とを発現するマウスモデルの様々な筋組織において、標的配列中に1ヌクレオチドミスマッチがあるにもかかわらず、マウスDmpk発現を低減した。ASO32を、対照抗TfR1 Fabへ抱合させた。他のすべてのASOを、抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3へ抱合させた。抱合体が、心臓(図11A)、横隔膜(図11B)、腓腹筋(図11C)、および前脛骨筋(図11D)においてマウスDMPK mRNAレベルを低減した。
図12A～12Dは、心臓(図12A)、横隔膜(図12B)、腓腹筋(図12C)、または前脛骨筋(図12D)において、指し示されたオリゴヌクレオチドへ抱合された抗TfR1 Fabを含有する抱合体の投与後のASO10、ASO8、ASO26、およびASO1の量を夫々示す。すべてのASOを、抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3へ抱合させた。 図12A～12Dは、心臓(図12A)、横隔膜(図12B)、腓腹筋(図12C)、または前脛骨筋(図12D)において、指し示されたオリゴヌクレオチドへ抱合された抗TfR1 Fabを含有する抱合体の投与後のASO10、ASO8、ASO26、およびASO1の量を夫々示す。すべてのASOを、抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3へ抱合させた。
図13A～13Dは、長期的な実験的設定において、ASO1へ抱合された対照抗TfR1 Fabを含有する抱合体が、ヒトTfR1と拡張されたCUG反復を内包するヒトDMPK突然変異体との両方を発現するマウスモデルの様々な筋組織においてヒト突然変異DMPK発現を低減したことを示す。図13Aは、ASO1-抱合体が、心臓においてヒト突然変異DMPKを、注射から2週間後に9％および注射から4週間後に15％ノックダウンしたことを示す。図13Bは、ASO1-抱合体が、横隔膜においてヒト突然変異DMPKを、注射から2週間後に19％および注射から4週間後に34％ノックダウンしたことを示す。図13Cは、ASO1-抱合体が、腓腹筋においてヒト突然変異DMPKを注射から2週間後に7％および注射から4週間後に17％ノックダウンしたことを示す。図13Dは、ASO1-抱合体が、前脛骨筋においてヒト突然変異DMPKを、注射から2週間後に6％および注射から4週間後に0％ノックダウンしたことを示す。
図14A～14Dは、ASO1へ抱合された対照抗TfR1 Fabを含有する抱合体が、図13A～13Dのと同じマウスモデルにおいてマウスDmpk発現を低減したことを示す。図14Aは、ASO1-抱合体が、心臓においてマウスDmpkを、注射から2週間後に8％および注射から4週間後に13％ノックダウンしたことを示す。図14Bは、ASO1-抱合体が、横隔膜においてマウスDmpkを、注射から2週間後に14％および注射から4週間後に33％ノックダウンしたことを示す。 図14Cは、ASO1-抱合体が、腓腹筋においてマウスDmpkを、注射から2週間後に0％および注射から4週間後に6％ノックダウンしたことを示す。図14Dは、ASO1-抱合体が、前脛骨筋においてマウスDmpkを、注射から2週間後および注射から4週間後にノックダウンしなかったことを示す。
図15A～15Dは、心臓(図15A)、横隔膜(図15B)、腓腹筋(図15C)、または前脛骨筋(図15D)の夫々において、ASO1へ抱合された対照抗TfR1 Fabを含有する抱合体の投与後のASO1の量を示す。
図16A～16Dは、図13A～13Dのと同じマウスモデルの別の実験的設計において、ASO1へ抱合された対照抗TfR1 Fabを含有する抱合体の活性を示す。抱合体を、図13A～13Dのと比較して異なる用量および頻度にて投与した。図16Aは、ASO1-抱合体が、心臓においてヒト突然変異DMPKを注射から5週間後に5％ノックダウンしたことを示す。図16Bは、ASO1-抱合体が、横隔膜においてヒト突然変異DMPKを注射から5週間後に35％ノックダウンしたことを示す。図16Cは、ASO1-抱合体が、腓腹筋においてヒト突然変異DMPKを注射から5週間後にノックダウンしないようであったことを示す。図16Dは、ASO1-抱合体が、前脛骨筋においてヒト突然変異DMPKを注射から5週間後にノックダウンしないようであったことを示す。
図17A～17Dは、ASO1へ抱合された対照抗TfR1 Fabを含有する抱合体が、図13A～13Dのと同じマウスモデルにおいてマウスDmpk発現を低減したことを示す。図17Aは、ASO1-抱合体が、心臓においてマウスDmpkを注射から5週間後に13％ノックダウンしたことを示す。図17Bは、ASO1-抱合体が、横隔膜においてマウスDmpkを注射から5週間後に41％ノックダウンしたことを示す。 図17Cは、ASO1-抱合体が、腓腹筋においてマウスDmpkを注射から5週間後に5％ノックダウンしたことを示す。図17Dは、ASO1-抱合体が、前脛骨筋においてマウスDmpkを注射から5週間後に10％ノックダウンしたことを示す。
図18A～18Dは、心臓(図18A)、横隔膜(図18B)、腓腹筋(図18C)、または前脛骨筋(図18D)の夫々において、ASO1へ抱合された対照抗TfR1 Fabを含有する抱合体の投与後のASO1の量を示す。
図19A～19Dは、ヒトTfR1と拡張されたCUG反復を内包するヒトDMPK突然変異体との両方を発現するマウスモデルの様々な筋組織において、ASO9へ抱合された抗TfR1 Fabを含有する抱合体が、ヒト突然変異DMPK発現を低減したことを示す。ASO9を、抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3へ抱合させた。図19Aは、ASO9-抱合体が、心臓においてヒト突然変異DMPKを注射から2週間後に50％ノックダウンしたことを示す。図19Bは、ASO9-抱合体が、横隔膜においてヒト突然変異DMPKを注射から2週間後に58％ノックダウンしたことを示す。図19Cは、ASO9-抱合体が、前脛骨筋においてヒト突然変異DMPKを注射から2週間後に30％ノックダウンしたことを示す。図19Dは、ASO9-抱合体が、腓腹筋においてヒト突然変異DMPKを注射から2週間後に35％ノックダウンしたことを示す。
図20A～20Dは、ASO9へ抱合された抗TfR1 Fabがを含有する抱合体、図19A～19Dのと同じマウスモデルにおいてマウスDmpk発現を低減したことを示す。ASO9を、抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3へ抱合させた。図20Aは、ASO9-抱合体が、心臓においてマウスDmpkを注射から2週間後に48％ノックダウンしたことを示す。図20Bは、ASO9-抱合体が、横隔膜においてマウスDmpkを注射から2週間後に68％ノックダウンしたことを示す。 図20Cは、ASO9-抱合体が、腓腹筋においてマウスDmpkを注射から2週間後に45％ノックダウンしたことを示す。図20Dは、ASO9-抱合体が、前脛骨筋においてマウスDmpkを注射から2週間後に20％ノックダウンしたことを示す。
図21A～21Dは、心臓(図21A)、横隔膜(図21B)、腓腹筋(図21C)、または前脛骨筋(図21D)の夫々において、ASO9へ抱合された抗TfR1 Fabを含有する抱合体の投与後のASO9の量を示す。ASO9を、抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3へ抱合させた。
図22A～22Dは、ASO1へ抱合された対照抗TfR1 Fabを含有する抱合体が、霊長目の非ヒト動物Cynomolgus macaque(cyno)の様々な筋組織においてDMPK発現を低減したことを示す。図22Aは、ASO1-抱合体が、心臓においてDMPKを注射から7週間後に10％ノックダウンしたことを示す。図22Bは、ASO1-抱合体が、横隔膜においてDMPKを注射から7週間後にノックダウンしないようであったことを示す。図22Cは、ASO1-抱合体が、腓腹筋においてDMPKを注射から7週間後に29％ノックダウンしたことを示す。図22Dは、ASO1-抱合体が、前脛骨筋においてDMPKを注射から7週間後に31％ノックダウンしたことを示す。
図23A～23Dは、cynoの心臓(図23A)、横隔膜(図23B)、腓腹筋(図23C)、または前脛骨筋(図23D)の夫々において、ASO1へ抱合された対照抗TfR1 Fabを含有する抱合体の投与から2週間後のASO1の量を示す。
図24A～24Dは、ASO10へ抱合された抗TfR1 Fabを含有する抱合体が、ヒトTfR1と拡張されたCUG反復を内包するヒトDMPK突然変異体との両方を発現するマウスモデルの様々な筋組織において、ヒト突然変異DMPK発現を低減したことを示す。ASO10を、抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3へ抱合させた。図24Aは、ASO10-抱合体が、試験されたすべての用量にて、心臓においてヒト突然変異DMPKを注射から28日後にノックダウンしたことを示す。図24Bは、ASO10-抱合体が、試験されたすべての用量にて、横隔膜においてヒト突然変異DMPKを注射から28日後にノックダウンしたことを示す。図24Cは、ASO10-抱合体が、試験されたすべての用量にて、腓腹筋においてヒト突然変異DMPKを注射から28日後にノックダウンしたことを示す。図24Dは、ASO10-抱合体が、試験されたすべての用量にて、前脛骨筋においてヒト突然変異DMPKを注射から28日後にノックダウンしたことを示す。
図25A～25Hは、ASO10へ抱合された抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3を含有する抱合体がASO10の10mg/kgに相当する用量にて注射されたマウスにおいて、ASO10が核へ送達されたこと、およびASO10-抱合体が、核に閉じ込められた突然変異ヒトDMPK mRNAの蓄積を低減したことを示す。ASO10-抱合体を、ヒトTfR1と拡張されたCUG反復を内包するヒトDMPK突然変異体との両方を発現するマウスモデルにおいて試験した。図25Aは、突然変異ヒトDMPKが、ビヒクル対照が注射されたマウスからの腓腹筋の細胞成分分画(subcellular fractionation)による筋細胞の核に閉じ込められたことを示す。図25Bは、Malat1を核RNAマーカーとして使用したことを示す。図25Cは、Birc5を細胞質RNAマーカーとして使用したことを示す。 図25Dは、Gapdhを細胞質RNAマーカーとして使用したことを示す。図25Eは、核タンパク質マーカーであるヒストンH3が、核画分にしか存在しないことを示す。 図25Fは、細胞質タンパク質マーカーであるGAPDHが、細胞質画分にしか存在しないことを示す。図25Gは、ASO10が、全組織抽出物において突然変異ヒトDMPKを低減させたことを示す。 図25Hは、ASO10が、腓腹筋の筋細胞の核画分において突然変異ヒトDMPKを低減させたことを示す。
図26A～26Hは、ASO10またはASO26へ抱合された抗TfR1 Fabを含有する抱合体が、Cynomolgus macaque(cyno)において野生型DMPKを低減したことを示す。ASO10またはASO26を、抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3へ抱合させた。図26A～26Dは、ASO10が、心臓、横隔膜、腓腹筋、および前脛骨筋において、用量依存的に存在したことを示す。図26E～26Hは、ASO26が、心臓、横隔膜、腓腹筋、および前脛骨筋において、用量依存的に存在したことを示す。 図26A～26Hは、ASO10またはASO26へ抱合された抗TfR1 Fabを含有する抱合体が、Cynomolgus macaque(cyno)において野生型DMPKを低減したことを示す。ASO10またはASO26を、抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3へ抱合させた。図26A～26Dは、ASO10が、心臓、横隔膜、腓腹筋、および前脛骨筋において、用量依存的に存在したことを示す。図26E～26Hは、ASO26が、心臓、横隔膜、腓腹筋、および前脛骨筋において、用量依存的に存在したことを示す。
図27A～27Dは、抗TfR1 Fab ASO10へ抱合されたを含有する抱合体が、霊長目の非ヒト動物の心臓と骨格筋との両方において活性があったこと、およびASO26へ抱合された抗TfR1 Fabを含有する抱合体が、骨格筋において活性があったことを示す。ASO10またはASO26を、抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3へ抱合させた。図27Aは、ASO10-抱合体が、心臓において活性があったこと、およびASO26-抱合体が、心臓において活性を有さないようであったことを示す。図27Bは、ASO10-抱合体とASO26-抱合体との両方とも、横隔膜において活性があったことを示す。 図27Cは、ASO10-抱合体とASO26-抱合体との両方とも、腓腹筋において活性があったことを示す。図27Dは、ASO10-抱合体とASO26-抱合体との両方とも、前脛骨筋において活性があったことを示す。
図28A～28Dは、心臓、横隔膜、腓腹筋、および前脛骨筋において、ASO10またはASO26へ抱合された抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3を含有する抱合体のDMPKノックダウン活性を示す。ASO10-抱合体またはASO26-抱合体を、ASO10またはASO26の10mg/kgに相当する用量にて、ヒトTfR1と拡張されたCUG反復を内包するヒトDMPK突然変異体との両方を発現するマウスへ投与した。図28Aは、ASO10-抱合体が、心臓において活性があったこと、およびASO26-抱合体が、心臓において活性がなかったようであったことを示す。図28Bは、ASO10-抱合体とASO26-抱合体との両方とも、横隔膜において活性があったことを示す。 図28Cは、ASO10-抱合体とASO26-抱合体との両方とも、腓腹筋において活性があったことを示す。図28Dは、ASO10-抱合体とASO26-抱合体との両方とも、前脛骨筋において活性があったことを示す。
図29A～29Dは、ヒトTfR1と拡張されたCTG反復を内包する2コピーの突然変異ヒトDMPK導入遺伝子との両方を発現するマウスの心臓(図29A)、横隔膜(図29B)、前脛骨筋(図29C)、および腓腹筋(図29D)において、ASO10へ抱合された抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3を含有する抱合体の、ヒトDMPK RNAノックダウン能を示す。
図30A～30Bは、ヒトTfR1と拡張されたCTG反復を内包する2コピーの突然変異ヒトDMPK導入遺伝子との両方を発現し、かつASO10へ抱合された抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3で処置されたマウスにおける、心筋線維の核中の低減されたDMPKフォーカスを示す。図30Aは、DMPKフォーカスのsituハイブリダイゼーション染色および筋原線維の蛍光染色を受けた試料の代表的な画像を示す(挿入パネル)。図30Aに示される顕微鏡画像において、明るい円形は細胞核を示し、核内の輝点はDMPKフォーカスを示す。図30Bは、DMPKフォーカスの定量化を示す。
図31は、ヒトTfR1と拡張されたCTG反復を内包する2コピーの突然変異ヒトDMPK導入遺伝子との両方を発現するマウス(hTfR1/DMSXLマウス)の心臓における、ASO10へ抱合された抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3を含有する抱合体のスプライシング修正活性を示す。Ldb3エキソン11、Mbnl2エキソン6、およびNfixエキソン7のスプライシングに基づく複合スプライシング指標(Composite splicing indices)が、ビヒクル対照で処置された対照マウス(「hTfR1 - PBS」)、ビヒクル対照で処置されたhTfR1/DMSXLマウス(「hTfR1/DMSXL - PBS」)、および抗TfR1 Fab-ASO10抱合体で処置されたhTfR1/DMSXLマウス(「hTfR1/DMSXL - 抱合体」)につき示される。
図32は、ヒトTfR1と拡張されたCTG反復を内包する2コピーの突然変異ヒトDMPK導入遺伝子との両方を発現するマウス(hTfR1/DMSXLマウス)の横隔膜における、ASO10へ抱合された抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3を含有する抱合体のスプライシング修正活性を示す。Bin1エキソン11、Insrエキソン11、Ldb3エキソン11、およびNfixエキソン7のスプライシングに基づく複合スプライシング指標が、ビヒクル対照で処置された対照マウス(「hTfR1 - PBS」)、ビヒクル対照で処置されたhTfR1/DMSXLマウス(「hTfR1/DMSXL - PBS」)、および抗TfR1 Fab-ASO10抱合体で処置されたhTfR1/DMSXLマウス(「hTfR1/DMSXL - 抱合体」)につき示される。
図33は、ヒトTfR1と拡張されたCTG反復を内包する2コピーの突然変異ヒトDMPK導入遺伝子との両方を発現するマウス(hTfR1/DMSXLマウス)の前脛骨筋における、ASO10へ抱合された抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3を含有する抱合体のスプライシング修正活性を示す。Bin1エキソン11、Ldb3エキソン11、Mbnl2エキソン6、およびNfixエキソン7のスプライシングに基づく複合スプライシング指標が、ビヒクル対照で処置された対照マウス(「hTfR1 - PBS」)、ビヒクル対照で処置されたhTfR1/DMSXLマウス(「hTfR1/DMSXL - PBS」)、および抗TfR1 Fab-ASO10抱合体で処置されたhTfR1/DMSXLマウス(「hTfR1/DMSXL - 抱合体」)につき示される。
図34は、ヒトTfR1と拡張されたCTG反復を内包する2コピーの突然変異ヒトDMPK導入遺伝子との両方を発現するマウス(hTfR1/DMSXLマウス)の腓腹筋における、ASO10へ抱合された抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3を含有する抱合体のスプライシング修正活性を示す。Mbnl2エキソン6、Nfixエキソン7、およびTtnエキソン313のスプライシングに基づく複合スプライシング指標が、ビヒクル対照で処置された対照マウス(「hTfR1 - PBS」)、ビヒクル対照で処置されたhTfR1/DMSXLマウス(「hTfR1/DMSXL - PBS」)、および抗TfR1 Fab-ASO10抱合体で処置されたhTfR1/DMSXLマウス(「hTfR1/DMSXL - 抱合体」)につき示される。
図35は、DM1患者の筋管および野生型霊長目の非ヒト動物(NHP)の筋管におけるDMPKノックダウンが、ASO10へ共有結合的に連結されている抗TfR1 Fab 3M12-VH4/Vk3を含有する抱合体とのインキュベーションの結果生じることを示す。結果は、ビヒクルのみで処置されたDM1患者筋管またはNHP筋管の発現に対し正規化されて示される。データは、1条件あたりn=4の再現につき平均値+標準偏差として示される。統計値を一元配置分散分析(one-wayANOVA)によって算出した(*、P＜0.05、**、P＜0.01)。
詳細な記載
本開示のいくつかの側面は、DMPK RNAを標的にするよう設計されたオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの態様において、本開示は、例として筋強直性ジストロフィーを有するかまたはこれを有すると疑われる対象における、疾患関連反復拡張を有する有毒なDMPKのレベルを低減させるのに有用なDMPK RNAと相補的なオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、標的DMPK RNAのRNAe H媒介分解へ向かうによう設計されている。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、細胞(例として、筋細胞、例として、筋管)の核中に存在する標的DMPK RNAのRNAe H媒介分解へ向かうによう設計されている。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、細胞(例として、神経系の細胞(例として、中枢神経系(CNS)細胞))の核中に存在する標的DMPK RNAのRNAe H媒介分解へ向かうによう設計されている。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、所望のバイオアベイラビリティおよび/または血清-安定性という特性を有するよう設計されている。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、所望の結合親和性という特性を有するよう設計されている。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、所望の毒性プロファイルを有するよう設計されている。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、低い補体活性化および/またはサイトカイン誘導という特性を有するよう設計されている。
いくつかの側面において、本開示は、本明細書に記載のDMPK標的化オリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結されている筋標的化剤を含む複合体を、オリゴヌクレオチドの筋細胞への有効な送達のために提供する。いくつかの態様において、複合体は、拡張した疾患関連反復を含むDMPKアレルを標的とし、DM1を有する対象を治療するために提供される。いくつかの態様において、本明細書で提供される複合体は、拡張した疾患関連反復を含むDMPKアレルの発現を阻害するオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。別の例として、複合体は、疾患関連DMPK mRNAのMuscleblind様タンパク質(例として、MBNL1、2、および/または(例として、および)3)への結合を妨害するオリゴヌクレオチドを含んでいてもよく、それによって、疾患関連DMPKアレルの毒性効果を低減する。
定義された用語の記載を包含する本開示のさらなる側面は、下に提供される。
Ｉ．定義
投与する(施す)こと:
本明細書に使用されるとき、用語「投与する(施す)こと」または「投与(施し)」は、生理学的におよび/または薬理学的に有用なやり方で対象へ複合体を提供すること(例として、対象における疾病を処置すること)を意味する。
およそ:
本明細書に使用されるとき、用語「およそ」または「約」は、関心のある1つ以上の値へ適用されるとき、規定された参照値と同様の値を指す。ある態様において、用語「およそ」または「約」は、別様に述べられない限りまたは文脈から明らかでない限り(かかる数字が実行可能な値の100％を超える場合を除く)、規定された参照値のプラスマイナス(超または未満)の15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、またはこれ未満に収まる広範な値を指す。
抗体:
本明細書に使用されるとき、用語「抗体」は、少なくとも1つの免疫グロブリン可変ドメインまたは少なくとも1つの抗原決定基、例として、抗原へ特異的に結合するパラトープを包含するポリペプチドを指す。いくつかの態様において、抗体は、完全長の抗体である。いくつかの態様において、抗体は、キメラ抗体である。いくつかの態様において、抗体は、ヒト化抗体である。しかしながら、いくつかの態様において、抗体は、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント、Fvフラグメント、またはscFvフラグメントである。いくつかの態様において、抗体は、ラクダ科の動物の抗体に由来するナノボディー、またはサメ抗体に由来するナノボディーである。いくつかの態様において、抗体は、二重特異性抗体である。いくつかの態様において、抗体は、ヒト生殖細胞系配列を有するフレームワークを含む。別の態様において、抗体は、IgG、IgG1、IgG2、IgG2A、IgG2B、IgG2C、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgM、およびIgEの定常領域からなる群から選択される重鎖定常領域を含む。いくつかの態様において、抗体は、重(H)鎖可変領域(本明細書中VHと略される)、および/または(例として、および)、軽(L)鎖可変領域(本明細書中VLと略される)を含む。いくつかの態様において、抗体は、定常領域、例としてFc領域を含む。免疫グロブリン定常領域は、重鎖または軽鎖定常領域を指す。ヒトIgG重鎖および軽鎖定常領域アミノ酸配列およびそれらの機能的バリエーションは知られている。重鎖に関し、いくつかの態様において本明細書に記載の抗体の重鎖は、アルファ(α)、デルタ(Δ)、イプシロン(ε)、ガンマ(γ)、またはミュー(μ)重鎖であり得る。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体の重鎖は、ヒトのアルファ(α)、デルタ(Δ)、イプシロン(ε)、ガンマ(γ)、またはミュー(μ)重鎖を含み得る。具体的な態様において、本明細書に記載の抗体は、ヒトのガンマ1 CH1ドメイン、CH2ドメイン、および/または(例として、および)、CH3ドメインを含む。いくつかの態様において、VHドメインのアミノ酸配列は、ヒトガンマ(γ)重鎖定常領域のアミノ酸配列、たとえば当該技術分野において知られているいずれの配列も含む。ヒト定常領域配列の非限定例は当該技術分野において記載されており、例として、米国特許第5,693,780号および上記のKabat E Aら(1991)を参照。いくつかの態様において、VHドメインは、本明細書に提供される可変鎖定常領域のいずれかと少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または少なくとも99％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、抗体は修飾されており、例として、グリコシル化、リン酸化、SUMO化、および/または(例として、および)、メチル化を介して修飾されている。いくつかの態様において、抗体は、1以上の糖または炭水化物分子へ抱合されたグリコシル化抗体である。いくつかの態様において、1以上の糖または炭水化物分子は、N-グリコシル化、O-グリコシル化、C-グリコシル化、グリピエーション(glypiation)(GPIアンカー付着)、および/または(例として、および)、ホスホグリコシル化を介して抗体へ抱合されている。いくつかの態様において、1以上の糖または炭水化物分子は、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、またはグリカンである。いくつかの態様において、1以上の糖または炭水化物分子は、分枝オリゴ糖類または分枝グリカンである。いくつかの態様において、1以上の糖または炭水化物分子は、マンノース単位、グルコース単位、N-アセチルグルコサミン単位、N-アセチルガラクトサミン単位、ガラクトース単位、フコース単位、またはホスホ脂質単位を包含する。いくつかの態様において、抗体は、リンカーポリペプチドまたは免疫グロブリン定常領域へ連結された本開示の1以上の抗原結合性フラグメントを含むポリペプチドを含む構築物である。リンカーポリペプチドは、ペプチド結合によって結び合わされた2以上のアミノ酸残基を含み、1以上の抗原結合部と連結させるために使用される。リンカーポリペプチドの例は報告されている(例として、Holliger,P.,et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448;Poljak,R.J.,et al.(1994)Structure 2:1121-1123を参照)。またさらに、抗体は、1以上の他のタンパク質またはペプチドと、抗体もしくは抗体部分との共有結合または非共有結合の結び付きによって形成される、より大きな免疫接着分子の一部であってもよい。かかる免疫接着分子の例は、四量体scFv分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用(Kipriyanov,S.M.,et al.(1995)Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101)、ならびに二価のおよびビオチン化されたscFv分子を作製するためのシステイン残基、マーカーペプチド、およびC末ポリヒスチジンタグの使用(Kipriyanov,S.M.,et al.(1994)Mol.Immunol.31:1047-1058)を包含する。
CDR:
本明細書に使用されるとき、用語「CDR」は、抗体可変配列内の相補性決定領域を指す。典型的な抗体分子は、重鎖可変領域(VH)および軽鎖可変領域(VL)を含み、これらは通常、抗原結合に関与する。VHおよびVL領域は、「フレームワーク領域」(「FR」)として知られるより保存された領域が散在する、「相補性決定領域」(「CDR」)としても知られる超可変領域にさらに細分することができる。各VHおよびVLは、典型的には、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4で配置された3つのCDRおよび4つのFRで構成される。フレームワーク領域およびCDRの範囲は、当技術分野で公知の方法論を使用して、例えば、Kabat定義、IMGT定義、Chothia定義、AbM定義、および/または(例として、および)接触定義によって正確に同定され得、これらはすべて当技術分野で周知である。例として、Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242;IMGT(登録商標),the international ImMunoGeneTics information system(登録商標)http://www.imgt.org,Lefranc,M.-P.et al.,Nucleic Acids Res.,27:209-212(1999);Ruiz,M.et al.,Nucleic Acids Res.,28:219-221(2000);Lefranc,M.-P.,Nucleic Acids Res.,29:207-209(2001);Lefranc,M.-P.,Nucleic Acids Res.,31:307-310(2003);Lefranc,M.-P.et al.,In Silico Biol.,5,0006(2004)［Epub］,5:45-60(2005);Lefranc,M.-P.et al.,Nucleic Acids Res.,33:D593-597(2005);Lefranc,M.-P.et al.,Nucleic Acids Res.,37:D1006-1012(2009);Lefranc,M.-P.et al.,Nucleic Acids Res.,43:D413-422(2015);Chothia et al.,(1989)Nature 342:877;Chothia,C.et al.(1987)J.Mol.Biol.196:901-917,Al-lazikani et al(1997)J.Molec.Biol.273:927-948;およびAlmagro,J.Mol.Recognit.17:132-143(2004)を見よ。hgmp.mrc.ac.ukおよびbioinf.org.uk/absも見よ。本明細書で使用される場合、CDRは、当技術分野で公知の任意の方法によって定義されるCDRを指し得る。同じCDRを有する2つの抗体は、同じ方法、例えばIMGT定義によって決定される場合、2つの抗体がそのCDRの同じアミノ酸配列を有することを意味する。
重鎖および軽鎖の可変領域の各々において3つのCDRがあり、これらは可変領域の各々につきCDR1、CDR2、およびCDR3と指定される。用語「CDRセット」は、本明細書に使用されるとき、抗原に結合することが可能な単一の可変領域に生じる3つのCDRの一群を指す。これらのCDRの厳密な境界は、種々の系に従い異なって定義されている。Kabat(Kabat et al.,Sequence of Proteins of Immunological Interest(国立衛生研究所,Bethesda,Md.(1987)および(1991))によって記載される系は、抗体のいずれの可変領域へも適用可能な一義的な残基ナンバリング系を提供するのみならず、3つのCDRを定義する正確な残基境界をも提供する。これらのCDRは、Kabat CDRと称されることもある。CDRの下位部(Sub-portions)は、L1、L2、およびL3、またはH1、H2、およびH3と指定されることがあり、ここで「L」および「H」は夫々、軽鎖および重鎖領域を指定する。これらの領域は、Kabat CDRと重複する境界を有するChothia CDRと称されることもある。Kabat CDRと重複するCDRを定義する他の境界は、Padlan(FASEB J.9:133-139(1995))およびMacCallum(J Mol Biol 262(5):732-45(1996))によって記載されている。さらに他のCDR境界定義は、上の系の1つに厳重に従わなくてもよいが、それでもなおKabat CDRと重複することがあり、具体的な残基もしくは残基の群またはCDR全体でさえも抗原結合に有意に影響を及ぼすものではないという予測あるいは実験的知見を踏まえ、それらは短縮または伸長されてもよい。本明細書に使用される方法は、これらの系のいずれかに従って定義されるCDRを利用してもよい。CDR定義系の例は、表1に提供される。
表1．CDR定義
1 IMGT(登録商標), the international ImMunoGeneTics information system(登録商標), imgt.org, Lefranc, M.-P. et al., Nucleic Acids Res., 27:209-212 (1999)
2 Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242
3 Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))
CDR接合(-grafted)抗体:
用語「CDR接合抗体」は、マウス重鎖および軽鎖可変領域を有するがマウスCDRの1以上(例として、CDR3)がヒトCDR配列に置き換えられている抗体などの、ある種からの重鎖および軽鎖可変領域配列を含むが、そのVHおよび/またはVLのCDR領域の1以上の配列が別の種のCDR配列に置き換えられている抗体を指す。
キメラ抗体:
用語「キメラ抗体」は、ヒト定常領域へ連結されたマウス重鎖および軽鎖可変領域を有する抗体などの、ある種からの重鎖および軽鎖可変領域配列と別の種からの定常領域配列を含む抗体を指す。
相補的:
本明細書に使用されるとき、用語「相補的」は、2ヌクレオシド間または2組のヌクレオシド間の正確な対形成のための能力(capacity)を指す。とりわけ、相補的は、2ヌクレオシド間または2組のヌクレオシド間に結合をもたらす水素結合対形成の程度を特徴付ける用語である。例えば、ある位置のオリゴヌクレオチドの塩基が、対応する位置の標的核酸(例として、mRNA)の塩基と水素結合することが可能である場合、そのとき塩基は、その位置にて互いに相補的であると見なされる。塩基対合は、標準的なWatson-Crick塩基対合と非Watson-Crick塩基対合(例として、Wobble塩基対合およびHoogsteen塩基対合)との両方を包含してもよい。例えば、いくつかの態様において、相補的な塩基対合として、アデノシン型塩基(A)は、チミジン型塩基(T)またはウラシル型塩基(U)に相補的であり、シトシン型塩基(C)は、グアノシン型塩基(G)に相補的であり、3-ニトロピロールまたは5-ニトロインドールなどのユニバーサル塩基は、いずれのA、C、U、またはTとハイブリダイズし得、これらと相補的であると見なされる。イノシン(I)はまた、当該技術分野においてユニバーサル塩基であるとも見なされており、いずれのA、C、U、またはTに相補的であると見なされる。
保存アミノ酸置換:
本明細書に使用されるとき、「保存アミノ酸置換」は、アミノ酸置換がなされたタンパク質の相対的な電荷またはサイズの特徴を変更しないアミノ酸置換を指す。バリアントは、当業者に知られているポリペプチド配列を変更するための方法に従って調製され得、たとえば、かかる方法をまとめた参考文献、例として、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,J.Sambrook,et al.,eds.,Fourth Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,2012、またはCurrent Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel,et al.,eds.,John Wiley ＆ Sons,Inc.,New Yorkから見出される。アミノ酸の保存的置換は、以下の群:(a)M、I、L、V;(b)F、Y、W;(c)K、R、H;(d)A、G;(e)S、T;(f)Q、N;および(g)E、D内のアミノ酸に対してなされる置換を包含する。
共有結合的に連結されている:
本明細書に使用されるとき、用語「共有結合的に連結されている」は、少なくとも1つの共有結合を介して一緒に連結されている2以上の分子の特徴を指す。いくつかの態様において、2つの分子は一緒に、分子間リンカーとして働く単結合(例として、ジスルフィド結合またはジスルフィド架橋)によって共有結合的に連結され得る。しかしながら、いくつかの態様において、複数の共有結合を通して2以上の分子を一緒に結び合わせるリンカーとして働く分子を介して、2以上の分子は一緒に、共有結合的に連結され得る。いくつかの態様において、リンカーは、切断可能なリンカーであってもよい。しかしながら、いくつかの態様において、リンカーは、切断不能なリンカーであってもよい。
交差反応すること:
本明細書に使用されるとき、および標的化剤(例として、抗体)の文脈において、用語「交差反応すること」は、同様のタイプまたはクラスの1種より多くの抗原(例として、複数のホモログ、パラログ、もしくはオルソログの抗原)へ、同様の親和性または結合活性で特異的に結合することが可能な剤の特性を指す。例えば、いくつかの態様において、同様のタイプまたはクラスのヒトおよび霊長目の非ヒト動物の抗原(例として、ヒトトランスフェリン受容体および霊長目の非ヒト動物のトランスフェリン受容体)に対して交差反応する抗体は、ヒト抗原および霊長目の非ヒト動物の抗原へ、同様の親和性または結合活性で結合することが可能である。いくつかの態様において、抗体は、同様のタイプまたはクラスのヒト抗原および齧歯類動物抗原に対して交差反応する。いくつかの態様において、抗体は、同様のタイプまたはクラスの齧歯類動物の抗原および霊長目の非ヒト動物の抗原に対して交差反応する。いくつかの態様において、抗体は、同様のタイプまたはクラスのヒト抗原、霊長目の非ヒト動物の抗原、および齧歯類動物の抗原に対して交差反応する。
疾患関連反復:
本明細書に使用されるとき、用語「疾患関連反復」は、反復ヌクレオチド配列の数ユニットが、DM1などの遺伝的疾患と相関する、および/または(例として、および)、これに直接的にもしくは間接的に寄与する、またはこれを引き起こす、ゲノムの場所での反復ヌクレオチド配列を指す。疾患関連反復の各反復単位は、長さが、2、3、4、5またはそれ以上のヌクレオチドであってもよい。例えば、いくつかの態様において、疾患関連反復は、ジヌクレオチド反復である。いくつかの態様において、疾患関連反復は、トリヌクレオチド反復である。いくつかの態様において、疾患関連反復は、テトラヌクレオチド反復である。いくつかの態様において、疾患関連反復は、ペンタヌクレオチド反復である。いくつかの態様において、疾患関連反復は、CAG反復、CTG反復、CUG反復、CGG反復、CCTG反復、またはそれらのいずれかのヌクレオチド相補体を含む。いくつかの態様において、疾患関連反復は、遺伝子の非コード部分にある。しかしながら、いくつかの態様において、疾患関連反復は、遺伝子のコード領域にある。いくつかの態様において、疾患関連反復は、正常な状態から、遺伝的疾患に直接的にまたは間接的に寄与するまたはこれを引き起こす長さへ、拡張される。いくつかの態様において、疾患関連反復は、RNA(例として、RNA転写産物)にある。いくつかの態様において、疾患関連反復は、DNA(例として、染色体、プラスミド)にある。いくつかの態様において、疾患関連反復は、生殖細胞系列細胞の染色体において拡張される。いくつかの態様において、疾患関連反復は、体細胞の染色体において拡張される。いくつかの態様において、疾患関連反復は、先天性発症に関連する数多の反復単位へ拡張される。いくつかの態様において、疾患関連反復は、疾患の小児期発症に関連する数多の反復単位へ拡張される。いくつかの態様において、疾患関連反復は、疾患の成人発症に関連する数多の反復単位へ拡張される。DM1において、DMPKの3'非翻訳領域(3'-UTR)中のCTG単位のトリヌクレオチド反復領域は、疾患に関連する。正常なDMPKアレルは、約5～約37のCTG反復単位を含むのに対して、DM1患者においては、CTG反復領域の長さは、有意に増加されており、トリヌクレオチド反復が最大で数百または数千まである。
DMPK:
本明細書で使用されるとき、用語「DMPK」は、セリン/スレオニンプロテインキナーゼであるミオトニンプロテインキナーゼ(筋強直性ジストロフィー(myotonic dystrophy)プロテインキナーゼまたは筋強直性ジストロフィー(dystrophia myotonica)プロテインキナーゼとしても知られる)をコードする遺伝子を指す。この酵素の基質には、ミオゲニン、L型カルシウムチャネルのベータサブユニット、およびホスホレンマンが含まれ得る。いくつかの態様において、DMPKは、ヒト(Gene ID:1760)、非ヒト霊長動物(例として、Gene ID:456139、Gene ID:715328)、または齧歯動物遺伝子(例として、Gene ID:13400)であり得る。ヒトにおいて、DMPKの3'非コード非翻訳領域におけるCTG反復拡張拡は、筋緊張性ジストロフィーI型(DM1)に関連している。加えて、受容体の種々のアイソフォームをコードする複数のヒト転写産物バリアント(例として、GenBank RefSeq受託番号:NM_001081563.2、NM_004409.4、NM_001081560.2、NM_001081562.2、NM_001288764.1、NM_001288765.1、およびNM_006128の注釈付きのものであるように)が特徴付けられている。
DMPKアレル:
本明細書で使用されるとき、用語「DMPKアレル」は、DMPK遺伝子の代替形態(例として、野生型または突然変異体形態)のいずれか1つを指す。いくつかの態様において、DMPKアレルは、その正常かつ典型的な機能を保持する野生型ミオトニンプロテインキナーゼをコードし得る。いくつかの態様において、DMPKアレルは、1以上の疾患関連反復拡張を含み得る。いくつかの態様において、正常な対象は、5～37の範囲の反復単位を含む２つのDMPKアレルを有する。いくつかの態様において、DM1を有する対象におけるCTG反復単位の数は、約50～約3,000の範囲にあるかまたはこれより多く、反復の数が多いほど、疾患の重症度が高くなる。いくつかの態様において、軽症のDM1対象は、50～150の範囲の反復単位を有する少なくとも1つのDMPKアレルを有する。いくつかの態様において、古典的DM1を有する対象は、100～1,000またはそれ以上の範囲の反復単位を有する少なくとも1つのDMPKアレルを有する。いくつかの態様において、先天性発症型のDM1を有する対象は、2,000を超える反復単位を含む少なくとも１つのDMPKアレルを有し得る。
フレームワーク:
本明細書に使用されるとき、用語「フレームワーク」または「フレームワーク配列」は、CDRを差し引いた可変領域の残りの配列を指す。CDR配列の厳密な定義が種々の系によって決定され得ることから、フレームワーク配列の意味は、相応に異なる解釈に依存する。6つのCDR(軽鎖のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3、ならびに重鎖のCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3)もまた、軽鎖および重鎖上のフレームワーク領域を各鎖上の4つの下位領域(FR1、FR2、FR3、およびFR4)に分け、ここでCDR1はFR1とFR2との間に、CDR2はFR2とFR3との間に、CDR3はFR3とFR4との間に位置付けられる。具体的な下位領域をFR1、FR2、FR3、またはFR4と特定しないフレームワーク領域は、他によって言及されるとき、天然に存在する単一の免疫グロブリン鎖の可変領域内の組み合わされたFR(複数)を表す。本明細書に使用されるとき、FRは4つの下位領域のうち1つを表し、FR(複数)はフレームワーク領域を含有する4つの下位領域のうち2つ以上を表す。ヒト重鎖および軽鎖アクセプター配列は、当該技術分野において知られている。一態様において、当該技術分野において知られているアクセプター配列は、本明細書に開示の抗体に使用されていてもよい。
ヒト抗体:
用語「ヒト抗体」は、本明細書に使用されるとき、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を包含することが意図される。本開示のヒト抗体は、例えばCDR、とりわけCDR3において、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基(例として、in vitroでのランダム変異誘発もしくは部位特異的変異誘発によってか、またはin vivoでの体細胞変異によって導入された突然変異)を包含していてもよい。しかしながら、用語「ヒト抗体」は、本明細書に使用されるとき、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列上へ接合された抗体を包含することは意図されない。
ヒト化抗体:
用語「ヒト化抗体」は、非ヒト種(例として、マウス)からの重鎖および軽鎖の可変領域配列を含むが、VH配列および/または(例として、および)VL配列の少なくとも一部がより「ヒト様」に、すなわち、ヒト生殖細胞系可変配列とより同様なものに変更された抗体を指す。ヒト化抗体のあるタイプは、ヒトCDR配列が非ヒトVHおよびVL配列上へ導入されて対応する非ヒトCDR配列と置き換えられたCDR接合抗体である。一態様において、ヒト化された抗TfR1抗体および抗原結合部分が提供される。かかる抗体は、既存のハイブリドーマ技術、これに続くin vitroの遺伝子工学を使用するヒト化(KasaianらのPCT刊行物第WO 2005/123126 A2号に開示されたものなど)を使用してマウス抗TfR1モノクローナル抗体を得ることによって生成されてもよい。
内在化する(Internalizing)細胞表面受容体:
本明細書に使用されるとき、用語「内在化する細胞表面受容体」は、例として、外部刺激(例として、受容体へ結合するリガンド)の際、細胞によって内在化される細胞表面受容体を指す。いくつかの態様において、内在化する細胞表面受容体は、エンドサイトーシスによって内在化される。いくつかの態様において、内在化する細胞表面受容体は、クラスリン媒介エンドサイトーシスによって内在化される。しかしながら、いくつかの態様において、内在化する細胞表面受容体は、クラスリンに依存しない経路、例えば、食作用、マクロピノサイトーシス、カベオラ-およびラフト-媒介取り込み、またはクラスリンに依存しない構成的エンドサイトーシスなどによって内在化される。いくつかの態様において、内在化する細胞表面受容体は、細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、および/または(例として、および)、細胞外ドメインを含み、これらは任意にさらにリガンド結合ドメインを含む。いくつかの態様において、細胞表面受容体は、リガンド結合後に細胞によって内在化されるようになる。いくつかの態様において、リガンドは、筋標的化剤または筋標的化抗体であってもよい。いくつかの態様において、内在化する細胞表面受容体は、トランスフェリン受容体である。
単離された抗体:
「単離された抗体」は、本明細書に使用されるとき、異なる抗原特異性を有する他の抗体が実質的にない抗体を指すことが意図される(例として、トランスフェリン受容体に特異的に結合する単離された抗体は、トランスフェリン受容体以外の抗原に特異的に結合する抗体が実質的にない)。しかしながら、トランスフェリン受容体複合体に特異的に結合する単離された抗体は、他の種からのトランスフェリン受容体分子などの他の抗原への交差反応性を有していてもよい。その上、単離された抗体は、他の細胞の材料および/または(例として、および)化学物質が実質的になくてもよい。
Kabatナンバリング:
用語「Kabatナンバリング」、「Kabat定義」、および「Kabat標識化」は本明細書中、互換的に使用される。これらの用語は、当該技術分野において認識されているが、抗体またはその抗原結合部分の重鎖および軽鎖可変領域中の他のアミノ酸残基より可変(すなわち、高可変)であるアミノ酸残基をナンバリングする系を指す(Kabat et al.(1971)Ann.NY Acad,Sci.190:382-391および、Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)。重鎖可変領域において、超可変領域は、CDR1につきアミノ酸位置31～35、CDR2につきアミノ酸位置50～65、およびCDR3につきアミノ酸位置95～102に及ぶ。軽鎖可変領域において、超可変領域は、CDR1につきアミノ酸位置24～34、CDR2につきアミノ酸位置50～56、およびCDR3につきアミノ酸位置89～97に及ぶ。
分子ペイロード:
本明細書に使用されるとき、用語「分子ペイロード」は、生物学的結果(biological outcome)をモジュレートするよう機能する分子または種を指す。いくつかの態様において、分子ペイロードは、筋標的化剤へ連結されているか、または筋標的化剤へ別様に結び付けられている。いくつかの態様において、分子ペイロードは、小分子、タンパク質、ペプチド、核酸、またはオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DNA配列の転写をモジュレートするよう、タンパク質の発現をモジュレートするよう、またはタンパク質の活性をモジュレートするよう機能する。いくつかの態様において、分子ペイロードは、標的遺伝子に対する相補性の領域を有する鎖を含むオリゴヌクレオチドである。
筋標的化剤:
本明細書に使用されるとき、用語「筋標的化剤」は、筋細胞上に発現されている抗原へ特異的に結合する分子を指す。筋細胞中または筋細胞上の抗原は、膜タンパク質、例えば、内在性膜タンパク質または表在性膜タンパク質であってもよい。典型的には、筋標的化剤は、筋細胞中への筋標的化剤(および結び付けられたいずれの分子ペイロード)の内在化を容易にさせる筋細胞上の抗原へ特異的に結合する。いくつかの態様において、筋標的化剤は、筋肉上の内在化する細胞表面受容体へ特異的に結合し、受容体媒介内在化を通して筋細胞中へ内在化されることが可能である。いくつかの態様において、筋標的化剤は、小分子、タンパク質、ペプチド、核酸(例として、アプタマー)、または抗体である。いくつかの態様において、筋標的化剤は、分子ペイロードへ連結されている。
筋標的化抗体:
本明細書に使用されるとき、用語「筋標的化抗体」は、筋細胞中または筋細胞上に見出される抗原へ特異的に結合する抗体である筋標的化剤を指す。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、筋細胞中への筋標的化抗体(および結び付けられたいずれの分子ペイロード)の内在化を容易にする筋細胞上の抗原へ特異的に結合する。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、筋細胞上に存在する、内在化する細胞表面受容体へ特異的に結合する。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、トランスフェリン受容体へ特異的に結合する抗体である。
筋強直性ジストロフィー(DM):
本明細書で使用されるとき、用語「筋強直性ジストロフィー(DM)」は、筋肉の喪失、筋肉の衰弱、筋肉の機能に特徴付けられるDMPK遺伝子またはCNBP(ZNF9)遺伝子の突然変異によって引き起こされる遺伝性疾患を指す。筋緊張性ジストロフィー1型(DM1)および筋緊張性ジストロフィー2型(DM2)の2種類の疾患が報告されている。DM1は、DMPKの3'非コード領域のCTGトリヌクレオチド反復の拡張に関連している。DM2は、ZNF9の最初のイントロンにあるCCTGテトラヌクレオチド反復の拡張に関連している。DM1およびDM2の両者において、ヌクレオチド拡張は、重要な細胞内タンパク質、例として、muscleblind様タンパク質に高い親和性で結合するヘアピン構造を形成することができる有毒なRNA反復に繋がる。筋強直性ジストロフィー、疾患の遺伝的根拠、および関連する症状は、当技術分野で報告されている(例として、Thornton, C.A., “Myotonic Dystrophy” Neurol Clin. (2014), 32(3): 705-719.;およびKonieczny et al. “Myotonic dystrophy: candidate small molecule therapeutics” Drug Discovery Today (2017), 22:11を参照)。いくつかの態様において、対象は、先天性筋強直性ジストロフィーと呼ばれるDM1のバリエーションを持って生まれる。先天性筋強直性ジストロフィーの症状は、出生時から存在し、すべての筋肉の衰弱、呼吸障害、内反足、発達遅滞、および知的障害を含む。DM1は、Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM)エントリ#160900に関連付けられる。DM2は、OMIMエントリ#602668に関連付けられる。
オリゴヌクレオチド:
本明細書に使用されるとき、用語「オリゴヌクレオチド」は、長さが最大200ヌクレオチドまでのオリゴマーの核酸化合物を指す。オリゴヌクレオチドの例は、これらに限定されないが、RNAiオリゴヌクレオチド(例として、siRNA、shRNA)、マイクロRNA、gapmer、mixmer、ホスホロジアミダートモルホリノ、ペプチド核酸、アプタマー、ガイド核酸(例として、Cas9ガイドRNA)等々を包含する。オリゴヌクレオチドは一本鎖または二本鎖であってもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、1以上の修飾ヌクレオシド(例として、2'-O-メチル糖修飾、プリンまたはピリミジン修飾)を含んでいてもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、1以上の修飾ヌクレオシド間連結を含んでいてもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、RpまたはSpの立体化学配置にあってもよい1以上のホスホロチオアート連結を含んでいてもよい。
組換え抗体:
用語「組換えヒト抗体」は、本明細書に使用されるとき、組換え手段によって調製、発現、創出、もしくは単離されたすべてのヒト抗体、たとえば、宿主細胞中へトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体(本開示により詳細に記載される)、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗体(Hoogenboom H.R.,(1997)TIB Tech.15:62-70;Azzazy H.,and Highsmith W.E.,(2002)Clin.Biochem.35:425-445;Gavilondo J.V.,and Larrick J.W.(2002)BioTechniques 29:128-145;Hoogenboom H.,and Chames P.(2000)Immunology Today 21:371-378)、ヒト免疫グロブリン遺伝子トランスジェニック動物(例として、マウス)から単離された抗体(例として、Taylor,L.D.,et al.(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295;Kellermann S-A.,and Green L.L.(2002)Current Opinion in Biotechnology 13:593-597;Little M.et al(2000)Immunology Today 21:364-370を参照)、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のDNA配列とのスプライシングを伴ういずれの他の手段によって調製、発現、創出、もしくは単離された抗体を包含することが意図される。かかる組換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。しかしながら、ある態様において、かかる組換えヒト抗体は、in vitroでの変異誘発(または、ヒトIg配列トランスジェニック動物が使用されるとき、in vivoでの体細胞変異誘発)へ供され、よって、組換え抗体のVHおよびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系のVH配列およびVL配列に由来しかつこれに関するとはいえ、in vivoでのヒト抗体の生殖細胞系列レパートリー内には天然に存在しないこともある配列である。本開示の一態様は、当該技術分野において周知である技法を使用して、たとえば、これらに限定されないが、ヒトIgファージライブラリ(たとえば、JermutusらのPCT刊行物第WO 2005/007699 A2号に開示されたもの)を使用する技法を使用して生成され得るヒトトランスフェリン受容体に結合することが可能な完全ヒト抗体を提供する。
相補性の領域:
本明細書に使用されるとき、用語「相補性の領域」は、2つのヌクレオチド配列が生理学的な条件下(例として、細胞中)相互にアニーリングすることが可能であるような、同族の(cognate)ヌクレオチド配列(例として、標的核酸のヌクレオチド配列)に充分に相補的であるヌクレオチド配列(例として、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列)を指す。いくつかの態様において、相補性の領域は、標的核酸の同族のヌクレオチド配列に完全に相補的である。しかしながら、いくつかの態様において、相補性の領域は、標的核酸の同族のヌクレオチド配列に部分的に相補的(例として、少なくとも80％、90％、95％、または99％相補性)である。いくつかの態様において、相補性の領域は、標的核酸の同族のヌクレオチド配列と比較して1、2、3、または4つのミスマッチを含有する。
特異的に結合する:
本明細書に使用されるとき、用語「特異的に結合する」は、結合アッセイまたは他の結合に関する文脈(binding context)において、分子が、適切な対照から結合パートナーを区別するために使用され得る親和性または結合活性の程度での、分子の、結合パートナーへの結合能を指す。抗体に関し、用語「特異的に結合する」は、親和性または結合活性の程度で(例として、本明細書に記載のとおり、抗原への結合を通してある細胞(例として、筋細胞)への優先的な標的化を許容する程度で)、適切な参照抗原、または抗体が他の抗原から特定の抗原を区別するために使用され得る抗原と比較して、抗体が特定の抗原へ結合する能力を指す。いくつかの態様において、抗体が標的へ結合する際少なくとも約10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、またはこれ未満のKDを有する場合、抗体は標的へ特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体が、トランスフェリン受容体、例として、トランスフェリン受容体の先端ドメインのエピトープへ特異的に結合する。
対象:
本明細書に使用されるとき、用語「対象」は、哺乳動物を指す。いくつかの態様において、対象は、霊長目の非ヒト動物または齧歯類動物である。いくつかの態様において、対象は、ヒトである。いくつかの態様において、対象は、疾患を有するかまたは疾患を有すると疑われるペイシェント(patient)、例として、ヒト患者(human patient)である。いくつかの態様において、対象は、疾患関連反復拡張、例としてDMPKアレルに起因する疾患を有するかまたはこれを有すると疑われるヒト患者である。
トランスフェリン受容体:
本明細書に使用されるとき、用語「トランスフェリン受容体」(またTFRC、CD71、p90、またはTFR1としても知られている)は、エンドサイトーシスによる鉄取り込みを容易にするためのトランスフェリンへ結合する、内在化する細胞表面受容体を指す。いくつかの態様において、トランスフェリン受容体は、ヒト(NCBI Gene ID 7037)、霊長目の非ヒト動物(例として、NCBI Gene ID 711568もしくはNCBI Gene ID 102136007)、または齧歯類の動物(例として、NCBI Gene ID 22042)を起源としていてもよい。加えて、受容体の種々のアイソフォームをコードした複数のヒト転写産物バリアントが(例として、GenBank RefSeq受託番号:NP_001121620.1、NP_003225.2、NP_001300894.1、およびNP_001300895.1の注釈付きのものであるように)特徴付けられている。
2'-修飾ヌクレオシド:
本明細書に使用されるとき、用語「2'-修飾ヌクレオシド」および「2'-修飾リボヌクレオシド」は互換的に使用され、2'位にて修飾された糖部分を有するヌクレオシドを指す。いくつかの態様において、2'-修飾ヌクレオシドは、2'-4'二環式ヌクレオシドであり、ここで糖の2'および4'位は架橋されている(例として、メチレン、エチレン、または(S)-拘束エチル架橋による)。いくつかの態様において、2'-修飾ヌクレオシドは非二環式2'-修飾ヌクレオシドであり、例えばここで糖部分の2'位は置換されている。2'-修飾ヌクレオシドの非限定例は、以下:2'デオキシ、2'-フルオロ(2'-F)、2'-O-メチル(2'-O-Me)、2'-O-メトキシエチル(2'-MOE)、2'-O-アミノプロピル(2'-O-AP)、2'-O-ジメチルアミノエチル(2'-O-DMAOE)、2'-O-ジメチルアミノプロピル(2'-O-DMAP)、2'-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2'-O-DMAEOE)、2'-O-N-メチルアセトアミド(2'-O-NMA)、ロックド核酸(LNA、メチレン架橋核酸)、エチレン架橋核酸(ENA)、および(S)-拘束エチル架橋核酸(cEt)を包含する。いくつかの態様において、本明細書に記載の2'-修飾ヌクレオシドは高親和性修飾ヌクレオシドであり、2'-修飾ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドは、未修飾のオリゴヌクレオチドと比べて標的配列に対する増大した親和性を有する。2'-修飾ヌクレオシドの構造の例は、下に提供される:
これらの例は、ホスファート基で示されているが、いずれのヌクレオシド間連結も、2'-修飾ヌクレオシド間に企図される。
II．複合体
本明細書にさらに提供されるのは、標的化剤、例として、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗体を含む複合体である。いくつかの態様において、複合体は、オリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結された筋標的化抗体を含む。複合体は、単一の抗原部位に特異的に結合する抗体、または同じ抗原上もしくは異なる抗原上に存在していてもよい少なくとも2つの抗原部位へ結合する抗体を含んでいてもよい。
複合体は、少なくとも1つの遺伝子、タンパク質、および/または(例として、および)、核酸の活性あるいは機能をモジュレートするために使用されてもよい。いくつかの態様において、複合体内に存在する分子ペイロードは、遺伝子、タンパク質、および/または(例として、および)、核酸のモジュレーションを担う。分子ペイロードは、細胞中の遺伝子、タンパク質、および/または(例として、および)、核酸の活性あるいは機能をモジュレートすることが可能な、小分子、タンパク質、核酸、オリゴヌクレオチド、あるいはいずれの分子実体であってもよい。いくつかの態様において、分子ペイロードは、筋細胞における疾患関連反復を標的にするオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、分子ペイロードは、CNS細胞において疾患関連反復を標的にするオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、分子ペイロードは、疾患関連反復を標的にしないオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、分子ペイロードは、細胞(例として、筋細胞もしくはCNS細胞)における3'-非翻訳領域、イントロン領域、またはエキソン領域などの、DMPK転写産物(例として、pre-mRNAもしくはmRNA)のコード領域あるいは非コード領域を標的にするオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、複合体は、分子ペイロード(例として、疾患関連反復(例として、DMPKアレル)を含む核酸などのDMPKを標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチド)へ共有結合的に連結された、筋標的化剤(例として、抗TfR1抗体)を含む。
Ａ．筋標的化剤
本開示のいくつかの側面は、筋標的化剤、例として、分子ペイロードを筋細胞へ送達するための筋標的化剤を提供する。いくつかの態様において、かかる筋標的化剤は、例として、筋細胞上の抗原への特異的な結合を介して、筋細胞へ結合すること、および結び付けられた分子ペイロードを筋細胞へ送達することが可能である。いくつかの態様において、分子ペイロードは、筋標的化剤へ結合されて(例として、共有結合的に結合されて)おり、筋標的化剤が筋細胞上の抗原へ結合した際、例としてエンドサイトーシスを介して、筋細胞中へ内在化される。様々なタイプの筋標的化剤が本開示に従い使用されてもよいこと、およびいずれの筋肉の標的(例として、筋肉表面タンパク質)も、本明細書に記載のいずれのタイプの筋標的化剤によっても標的にされ得ることは、解されるはずである。例えば、筋標的化剤は、小分子、核酸(例として、DNAまたはRNA)、ペプチド(例として、抗体)、脂質(例として、マイクロベシクル)、または糖部(例として、多糖類)を含んでいてもよく、またはこれらからなっていてもよい。例示の筋標的化剤は本明細書中さらに詳細に記載されているが、しかしながら、本明細書に提供される例示の筋標的化剤が限定されることを意図していないことは解されるはずである。
本開示のいくつかの側面は、骨格筋、平滑筋、または心筋などの筋肉上の抗原へ特異的に結合する筋標的化剤を提供する。いくつかの態様において、本明細書に提供される筋標的化剤のいずれも、骨格筋細胞、平滑筋細胞、および/または(例として、および)、心筋細胞上の抗原へ結合する(例として、特異的に結合する)。
筋肉特異的細胞表面認識要素(例として、細胞膜タンパク質)との相互作用によって、組織局在化と筋細胞への選択的取り込みとの両方が達成され得る。いくつかの態様において、筋肉の取り込みトランスポーターの基質である分子は、分子ペイロードを筋組織中へ送達するのに有用である。筋肉表面認識要素への結合、これに続くエンドサイトーシスは、抗体などの巨大分子さえも筋細胞へ侵入できるようにし得る。別の例として、トランスフェリンまたは抗TfR1抗体へ抱合された分子ペイロードは、トランスフェリン受容体への結合を介し筋細胞によって取り入れられ得、次いで、例としてクラスリン媒介エンドサイトーシスを介し、形質膜陥入され(endocytosed)てもよい。
筋標的化剤の使用は、他の組織において効果に関連する毒性を低減しつつ、筋肉中の分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド)を濃縮するのに有用なこともある。いくつかの態様において、筋標的化剤は、対象内の別の細胞型と比較して、筋細胞中の結合された分子ペイロードを濃縮させる。いくつかの態様において、筋標的化剤は、筋細胞(例として、骨格筋細胞、平滑筋細胞、または心筋細胞)中の結合された分子ペイロードを、非筋細胞(例として、肝臓細胞、神経細胞、血液細胞、または脂肪細胞)中の量より少なくとも1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、または100倍多い量で濃縮する。いくつかの態様において、筋標的化剤へ結合された場合の分子ペイロードの対象における毒性は、これが対象へ送達されたとき、少なくとも1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％、または95％低減される。
いくつかの態様において、筋肉選択性を獲得するために、筋肉認識要素(例として、筋細胞抗原)が要されることもある。一例として、筋標的化剤は、筋肉特異的取り込みトランスポーターの基質である小分子であってもよい。別の例として、筋標的化剤は、トランスポーター媒介エンドサイトーシスを介して筋細胞へ侵入する抗体であってもよい。別の例として、筋標的化剤は、筋細胞上の細胞表面受容体へ結合するリガンドであってもよい。トランスポーターをベースとしたアプローチが細胞侵入への直通路を提供するのに対し、受容体をベースとした標的化が所望の作用部位に達するために刺激されたエンドサイトーシスを伴うこともあることは解されるはずである。
ｉ．筋標的抗体
いくつかの態様において、筋標的化剤は、抗体である。一般に、それらの標的抗原に対する抗体の高い特異性は、筋細胞(例として、骨格筋細胞、平滑筋細胞、および/または(例として、および)、心筋細胞)を選択的に標的にする潜在力を提供する。この特異性はまた、オフターゲット毒性(off-target toxicity)を限定することもある。筋細胞の表面抗原を標的にすることが可能である抗体の例は報告されており、かつ本開示の範囲内にある。例えば、筋細胞の表面を標的にする抗体は、Arahata K.,et al.“Immunostaining of skeletal and cardiac muscle surface membrane with antibody against Duchenne muscular dystrophy peptide”Nature 1988;333:861-3;Song K.S.,et al.“Expression of caveolin-3 in skeletal,cardiac,and smooth muscle cells.Caveolin-3 is a component of the sarcolemma and co-fractionates with dystrophin and dystrophin-associated glycoproteins”J Biol Chem 1996;271:15160-5;およびWeisbart R.H.et al.,“Cell type specific targeted intracellular delivery into muscle of a monoclonal antibody that binds myosin IIb”Mol Immunol.2003 Mar,39(13):78309に記載されている;これら各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
ａ．抗トランスフェリン受容体(TfR)抗体
本開示のいくつかの側面は、トランスフェリン受容体、例として抗トランスフェリン受容体抗体へ結合する剤は筋細胞を標的にすることが可能であるという認識に基づく。トランスフェリン受容体は、細胞膜を越えてトランスフェリンを輸送し細胞内鉄レベルの調節およびホメオスタシスに加わる内在化する細胞表面受容体である。本開示のいくつかの側面は、トランスフェリン受容体へ結合することが可能なトランスフェリン受容体結合タンパク質を提供する。結果的に、本開示の側面は、トランスフェリン受容体へ結合する結合タンパク質(例として、抗体)を提供する。いくつかの態様において、トランスフェリン受容体へ結合する結合タンパク質は、結合されたいずれの分子ペイロードと共に、筋細胞中へ内在化される。本明細書に使用されるとき、トランスフェリン受容体へ結合する抗体は、トランスフェリン受容体抗体、抗トランスフェリン受容体抗体、または抗TfR1抗体と互換的に称されることもある。トランスフェリン受容体へ結合する、例として特異的に結合する抗体は、トランスフェリン受容体へ結合した際、例として受容体媒介エンドサイトーシスを通して、細胞中へ内在化されてもよい。
抗TfR1抗体が、知られている数種の方法論、例としてファージディスプレーを使用するライブラリ設計を使用して、産生、合成、および/または(例として、および)、誘導体化されてもよいことは解されるはずである。例示の方法論は当該技術分野において特徴付けられており、参照により組み込まれる(Diez,P.et al.“High-throughput phage-display screening in array format”,Enzyme and microbial technology,2015,79,34-41.;Christoph M.H.and Stanley,J.R.“Antibody Phage Display:Technique and Applications”J Invest Dermatol.2014,134:2.;Engleman,Edgar(Ed.)“Human Hybridomas and Monoclonal Antibodies.”1985,Springer)。他の態様において、抗TfR1抗体はこれまでに特徴付けられているかまたは開示されている。トランスフェリン受容体へ特異的に結合する抗体は当該技術分野において知られている(例として、米国特許第4,364,934号、12/4/1979出願、“Monoclonal antibody to a human early thymocyte antigen and methods for preparing same”;米国特許第8,409,573号、6/14/2006出願、“Anti-CD71 monoclonal antibodies and uses thereof for treating malignant tumor cells”;米国特許第9,708,406号、5/20/2014出願、“Anti-transferrin receptor antibodies and methods of use”;米国特許第9,611,323号、12/19/2014出願、“Low affinity blood brain barrier receptor antibodies and uses therefor”;WO 2015/098989、12/24/2014出願、“Novel anti-Transferrin receptor antibody that passes through blood-brain barrier”;Schneider C.et al.“Structural features of the cell surface receptor for transferrin that is recognized by the monoclonal antibody OKT9.”J Biol Chem.1982,257:14,8516-8522.;Lee et al.“Targeting Rat Anti-Mouse Transferrin Receptor Monoclonal Antibodies through Blood-Brain Barrier in Mouse”2000,J Pharmacol.Exp.Ther.,292:1048-1052を参照)。
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、高い特異性および親和性でトランスフェリン受容体に結合する。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、トランスフェリン受容体のいずれかの細胞外エピトープまたは抗体に対して暴露されるようになるエピトープに特異的に結合する。いくつかの態様において、本明細書に提供される抗TfR1抗体はヒト、霊長目の非ヒト動物、マウス、ラットなどからのトランスフェリン受容体に特異的に結合する。いくつかの態様において、本明細書に提供される抗TfR1抗体はヒトトランスフェリン受容体に結合する。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、配列番号105～108で提供されるヒトまたは霊長目の非ヒト動物トランスフェリン受容体のアミノ酸セグメントに結合する。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、トランスフェリン受容体の頂点ドメインにはない、配列番号105で表されるとおりのヒトトランスフェリン受容体のアミノ酸90～96に対応するアミノ酸セグメントに結合する。
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体(例として、下の表2中の抗TfRクローン8)は、TfR1中のエピトープに結合するが、ここでエピトープは、配列番号105のアミノ酸214～241および/またはアミノ酸354～381における残基を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、配列番号105のアミノ酸214～241およびアミノ酸354～381における残基を含むエピトープに結合する。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、配列番号105で表されるとおりのヒトTfR1の残基Y222、T227、K231、H234、T367、S368、S370、T376、およびS378の1以上を含むエピトープに結合する。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、配列番号105で表されるとおりのヒトTfR1の残基Y222、T227、K231、H234、T367、S368、S370、T376、およびS378を含むエピトープに結合する。
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体(例として、下の表2中の3M12およびそのバリアント)は、TfR1中のエピトープに結合するが、ここでエピトープは、配列番号105のアミノ酸258～291および/またはアミノ酸358～381における残基を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体(例として、下の表2中の3M12およびそのバリアント)は、配列番号105のアミノ酸258～291およびアミノ酸358～381のアミノ酸における残基を含むエピトープに結合する。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体(例として、下の表2中の3M12およびそのバリアント)は、配列番号105で表されるとおりのヒトTfR1の残基K261、S273、Y282、T362、S368、S370、およびK371の1以上を含むエピトープに結合する。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体(例として、下の表2中の3M12およびそのバリアント)は、配列番号105で表されるとおりのヒトTfR1の残基K261、S273、Y282、T362、S368、S370、およびK371を含むエピトープに結合する。
NCBI配列NP_003225.2(トランスフェリン受容体タンパク質1アイソフォーム1、homo sapiens)に対応する、ヒトトランスフェリン受容体アミノ酸配列の例は、以下のとおりである:
MMDQARSAFSNLFGGEPLSYTRFSLARQVDGDNSHVEMKLAVDEEENADNNTKANVTKPKRCSGSICYGTIAVIVFFLIGFMIGYLGYCKGVEPKTECERLAGTESPVREEPGEDFPAARRLYWDDLKRKLSEKLDSTDFTGTIKLLNENSYVPREAGSQKDENLALYVENQFREFKLSKVWRDQHFVKIQVKDSAQNSVIIVDKNGRLVYLVENPGGYVAYSKAATVTGKLVHANFGTKKDFEDLYTPVNGSIVIVRAGKITFAEKVANAESLNAIGVLIYMDQTKFPIVNAELSFFGHAHLGTGDPYTPGFPSFNHTQFPPSRSSGLPNIPVQTISRAAAEKLFGNMEGDCPSDWKTDSTCRMVTSESKNVKLTVSNVLKEIKILNIFGVIKGFVEPDHYVVVGAQRDAWGPGAAKSGVGTALLLKLAQMFSDMVLKDGFQPSRSIIFASWSAGDFGSVGATEWLEGYLSSLHLKAFTYINLDKAVLGTSNFKVSASPLLYTLIEKTMQNVKHPVTGQFLYQDSNWASKVEKLTLDNAAFPFLAYSGIPAVSFCFCEDTDYPYLGTTMDTYKELIERIPELNKVARAAAEVAGQFVIKLTHDVELNLDYERYNSQLLSFVRDLNQYRADIKEMGLSLQWLYSARGDFFRATSRLTTDFGNAEKTDRFVMKKLNDRVMRVEYHFLSPYVSPKESPFRHVFWGSGSHTLPALLENLKLRKQNNGAFNETLFRNQLALATWTIQGAANALSGDVWDIDNEF(配列番号105)。
NCBI配列NP_001244232.1(トランスフェリン受容体タンパク質1、Macaca mulatta)に対応する、霊長目の非ヒト動物トランスフェリン受容体アミノ酸配列の例は、以下のとおりである:
MMDQARSAFSNLFGGEPLSYTRFSLARQVDGDNSHVEMKLGVDEEENTDNNTKPNGTKPKRCGGNICYGTIAVIIFFLIGFMIGYLGYCKGVEPKTECERLAGTESPAREEPEEDFPAAPRLYWDDLKRKLSEKLDTTDFTSTIKLLNENLYVPREAGSQKDENLALYIENQFREFKLSKVWRDQHFVKIQVKDSAQNSVIIVDKNGGLVYLVENPGGYVAYSKAATVTGKLVHANFGTKKDFEDLDSPVNGSIVIVRAGKITFAEKVANAESLNAIGVLIYMDQTKFPIVKADLSFFGHAHLGTGDPYTPGFPSFNHTQFPPSQSSGLPNIPVQTISRAAAEKLFGNMEGDCPSDWKTDSTCKMVTSENKSVKLTVSNVLKETKILNIFGVIKGFVEPDHYVVVGAQRDAWGPGAAKSSVGTALLLKLAQMFSDMVLKDGFQPSRSIIFASWSAGDFGSVGATEWLEGYLSSLHLKAFTYINLDKAVLGTSNFKVSASPLLYTLIEKTMQDVKHPVTGRSLYQDSNWASKVEKLTLDNAAFPFLAYSGIPAVSFCFCEDTDYPYLGTTMDTYKELVERIPELNKVARAAAEVAGQFVIKLTHDTELNLDYERYNSQLLLFLRDLNQYRADVKEMGLSLQWLYSARGDFFRATSRLTTDFRNAEKRDKFVMKKLNDRVMRVEYYFLSPYVSPKESPFRHVFWGSGSHTLSALLESLKLRRQNNSAFNETLFRNQLALATWTIQGAANALSGDVWDIDNEF(配列番号106)。
NCBI配列XP_005545315.1(トランスフェリン受容体タンパク質1、Macaca fascicularis)に対応する、霊長目の非ヒト動物トランスフェリン受容体アミノ酸配列の例は、以下のとおりである:
MMDQARSAFSNLFGGEPLSYTRFSLARQVDGDNSHVEMKLGVDEEENTDNNTKANGTKPKRCGGNICYGTIAVIIFFLIGFMIGYLGYCKGVEPKTECERLAGTESPAREEPEEDFPAAPRLYWDDLKRKLSEKLDTTDFTSTIKLLNENLYVPREAGSQKDENLALYIENQFREFKLSKVWRDQHFVKIQVKDSAQNSVIIVDKNGGLVYLVENPGGYVAYSKAATVTGKLVHANFGTKKDFEDLDSPVNGSIVIVRAGKITFAEKVANAESLNAIGVLIYMDQTKFPIVKADLSFFGHAHLGTGDPYTPGFPSFNHTQFPPSQSSGLPNIPVQTISRAAAEKLFGNMEGDCPSDWKTDSTCKMVTSENKSVKLTVSNVLKETKILNIFGVIKGFVEPDHYVVVGAQRDAWGPGAAKSSVGTALLLKLAQMFSDMVLKDGFQPSRSIIFASWSAGDFGSVGATEWLEGYLSSLHLKAFTYINLDKAVLGTSNFKVSASPLLYTLIEKTMQDVKHPVTGRSLYQDSNWASKVEKLTLDNAAFPFLAYSGIPAVSFCFCEDTDYPYLGTTMDTYKELVERIPELNKVARAAAEVAGQFVIKLTHDTELNLDYERYNSQLLLFLRDLNQYRADVKEMGLSLQWLYSARGDFFRATSRLTTDFRNAEKRDKFVMKKLNDRVMRVEYYFLSPYVSPKESPFRHVFWGSGSHTLSALLESLKLRRQNNSAFNETLFRNQLALATWTIQGAANALSGDVWDIDNEF(配列番号107)。
NCBI配列NP_001344227.1(トランスフェリン受容体タンパク質1、mus musculus)に対応する、マウストランスフェリン受容体アミノ酸配列の例は、以下のとおりである:
MMDQARSAFSNLFGGEPLSYTRFSLARQVDGDNSHVEMKLAADEEENADNNMKASVRKPKRFNGRLCFAAIALVIFFLIGFMSGYLGYCKRVEQKEECVKLAETEETDKSETMETEDVPTSSRLYWADLKTLLSEKLNSIEFADTIKQLSQNTYTPREAGSQKDESLAYYIENQFHEFKFSKVWRDEHYVKIQVKSSIGQNMVTIVQSNGNLDPVESPEGYVAFSKPTEVSGKLVHANFGTKKDFEELSYSVNGSLVIVRAGEITFAEKVANAQSFNAIGVLIYMDKNKFPVVEADLALFGHAHLGTGDPYTPGFPSFNHTQFPPSQSSGLPNIPVQTISRAAAEKLFGKMEGSCPARWNIDSSCKLELSQNQNVKLIVKNVLKERRILNIFGVIKGYEEPDRYVVVGAQRDALGAGVAAKSSVGTGLLLKLAQVFSDMISKDGFRPSRSIIFASWTAGDFGAVGATEWLEGYLSSLHLKAFTYINLDKVVLGTSNFKVSASPLLYTLMGKIMQDVKHPVDGKSLYRDSNWISKVEKLSFDNAAYPFLAYSGIPAVSFCFCEDADYPYLGTRLDTYEALTQKVPQLNQMVRTAAEVAGQLIIKLTHDVELNLDYEMYNSKLLSFMKDLNQFKTDIRDMGLSLQWLYSARGDYFRATSRLTTDFHNAEKTNRFVMREINDRIMKVEYHFLSPYVSPRESPFRHIFWGSGSHTLSALVENLKLRQKNITAFNETLFRNQLALATWTIQGVANALSGDIWNIDNEF(配列番号108)。
いくつかの態様において、抗TfR1抗体は、以下のとおりの受容体のアミノ酸セグメント:FVKIQVKDSAQNSVIIVDKNGRLVYLVENPGGYVAYSKAATVTGKLVHANFGTKKDFEDLYTPVNGSIVIVRAGKITFAEKVANAESLNAIGVLIYMDQTKFPIVNAELSFFGHAHLGTGDPYTPGFPSFNHTQFPPSRSSGLPNIPVQTISRAAAEKLFGNMEGDCPSDWKTDSTCRMVTSESKNVKLTVSNVLKE(配列番号109)へ結合し、トランスフェリン受容体とトランスフェリンおよび/または(例として、および)ヒトヘモクロマトーシスタンパク質(またHFEとしても知られている)との間の結合相互作用を阻害しない。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、配列番号109のエピトープには結合しない。
適切な方法論は、例として、組換えDNAプロトコルの使用を通じて、抗体、抗体フラグメント、もしくは抗原結合剤を得るか、および/または(例として、および)、産生するために使用されてもよい。いくつかの態様において、抗体はまた、ハイブリドーマの生成を通しても産生されてよい(例として、Kohler, G and Milstein,C.“Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity”Nature,1975,256:495-497を参照)。関心のある抗原は、いずれの型または実体の、例として、組換え型もしくは天然に存在する型または実体の免疫原として使用されてもよい。ハイブリドーマは、標準的な方法、例としてELISAスクリーニングを使用してスクリーニングされることで、具体的な抗原を標的にする抗体を産生する少なくとも1つのハイブリドーマが見出される。抗体はまた、抗体を発現するタンパク質発現ライブラリ(例として、ファージディスプレーライブラリ)のスクリーニングを通しても産生されてよい。ファージディスプレーライブラリ設計はまた、いくつかの態様において使用されてもよい(例として、米国特許第5,223,409号、3/1/1991出願、“Directed evolution of novel binding proteins”;WO 1992/18619、4/10/1992出願、“Heterodimeric receptor libraries using phagemids”;WO 1991/17271、5/1/1991出願、“Recombinant library screening methods”;WO 1992/20791、5/15/1992出願、“Methods for producing members of specific binding pairs”;およびWO 1992/15679、2/28/1992出願、“Improved epitope displaying phage”を参照)。いくつかの態様において、関心のある抗原は、非ヒト動物、例として、齧歯類の動物またはヤギを免疫するために使用されてもよい。いくつかの態様において、次いで抗体が非ヒト動物から得られたら、任意に数多の方法論を使用し、例として組換えDNA技法を使用し、修飾してもよい。抗体産生および方法論の追加の例も当該技術分野において知られている(例として、Harlow et al.“Antibodies:A Laboratory Manual”,Cold Spring Harbor Laboratory,1988を参照)。
いくつかの態様において、抗体は修飾されている(例として、グリコシル化、リン酸化、SUMO化、および/または(例として、および)、メチル化を介して修飾されている)。いくつかの態様において、抗体は、1以上の糖または炭水化物分子へ抱合されたグリコシル化抗体である。いくつかの態様において、1以上の糖または炭水化物分子は、N-グリコシル化、O-グリコシル化、C-グリコシル化、グリピエーション(GPIアンカー付着)、および/または(例として、および)、ホスホグリコシル化を介して、抗体へ抱合されている。いくつかの態様において、1以上の糖または炭水化物分子は、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、またはグリカンである。いくつかの態様において、1以上の糖または炭水化物分子は、分枝オリゴ糖類または分枝グリカンである。いくつかの態様において、1以上の糖または炭水化物分子は、マンノース単位、グルコース単位、N-アセチルグルコサミン単位、N-アセチルガラクトサミン単位、ガラクトース単位、フコース単位、またはホスホ脂質単位を包含する。いくつかの態様において、糖分子は、約1～10、約1～5、約5～10、約1～4、約1～3、または約2つ存在する。いくつかの態様において、グリコシル化抗体は、全体的にまたは部分的にグリコシル化されている。いくつかの態様において、抗体は、化学反応によって、または酵素的な手段によってグリコシル化されている。いくつかの態様において、抗体は、in vitroでまたは細胞(任意にN-またはO-グリコシル化経路中の酵素(例として、グリコシルトランスフェラーゼ)を欠乏していてもよい)内部でグリコシル化される。いくつかの態様において、抗体は、“Modified antibody, antibody-conjugate and process for the preparation thereof”と題する2014年5月1日に公開された国際特許出願刊行物WO2014065661に記載のとおりの糖または炭水化物分子で官能化されている。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、表2～7のいずれか1つから選択される抗TfR1抗体のいずれか1つのVLドメインおよび/または(例として、および)VHドメインを含み、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、またはIgY免疫グロブリン分子、いずれかのクラス(例として、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2)、またはいずれかのサブクラス(例として、IgG2aおよびIgG2b)の免疫グロブリン分子の定常領域のアミノ酸配列を含む定常領域を含む。ヒト定常領域の非限定例は当該技術分野において記載されている。例として、Kabat E A et al.,(1991)上記を参照。
いくつかの態様において、トランスフェリン受容体に結合する薬剤、例として抗TfR1抗体は、筋細胞を標的とすることができ、および/または(例として、および)、血液脳関門を通過する薬剤の輸送(例として、CNS細胞へ)を媒介する。トランスフェリン受容体は、細胞膜を越えてトランスフェリンを輸送し細胞内鉄レベルの調節およびホメオスタシスに加わる内在化する細胞表面受容体である。本開示のいくつかの側面は、トランスフェリン受容体へ結合することが可能なトランスフェリン受容体結合タンパク質を提供する。トランスフェリン受容体へ結合する、例として特異的に結合する抗体は、トランスフェリン受容体へ結合した際、例として受容体媒介エンドサイトーシスを通して、細胞中へ内在化されてもよい。
いくつかの態様では、トランスフェリン受容体に高い特異性および親和性で結合するヒト化抗体が本明細書で提供される。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、トランスフェリン受容体のいずれかの細胞外エピトープ、または抗体に対して暴露されるようになるエピトープに特異的に結合する。いくつかの態様において、本明細書に提供される抗TfR1抗体はヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラットなどからのトランスフェリン受容体に特異的に結合する。いくつかの態様において、本明細書に提供される抗TfR1抗体は、ヒトトランスフェリン受容体に結合する。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、配列番号105～108に提供されるような、ヒトまたは非ヒト霊長類トランスフェリン受容体のアミノ酸セグメントに結合する。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、トランスフェリン受容体の先端ドメインにはない、配列番号105に示されるヒトトランスフェリン受容体のアミノ酸90～96に対応するアミノ酸セグメントに結合する。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、TfR1に結合するが、TfR2には結合しない。
いくつかの態様において、抗TfR1抗体は、少なくとも約10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、またはより小さい結合親和性(例として、Kdによって指し示される)によってTfR1(例として、ヒトまたは霊長目の非ヒト動物TfR1)に特異的に結合する。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体はサブナノモル範囲のKDによってTfR1に結合する。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体はトランスフェリン受容体1(TfR1)に選択的に結合するが、トランスフェリン受容体2(TfR2)には結合しない。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体はヒトTfR1およびカニクイTfR1に結合するが(例として、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、またはより小さいKdによる)、マウスTfR1には結合しない。抗TfR抗体の親和性および結合動態は、バイオセンサ技術(例として、OCTETまたはBIACORE)を包含するがこれらに限定されないいずれか好適な方法を使用して試験され得る。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体のいずれか1つの結合は、TfR1へのトランスフェリン結合と競合も阻害もしない。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体のいずれか1つの結合は、TfR1に対するHFE-ベータ2-ミクログロブリン結合と競合も阻害もしない。
抗TfR1抗体の非限定例は表2に提供される。
表2．抗TfR1抗体の例
Figure 2024503609000009
Figure 2024503609000010
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、表2に提供される抗TfR1抗体のいずれか1つのバリアントである。いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、表2に提供される抗TfR1抗体のいずれか1つにおけるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3と同じ、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含み、かつ重鎖可変領域および/または(例として、および)軽鎖可変領域を含む。
本明細書に記載の抗TfR1抗体のアミノ酸配列の例は、表3に提供される。
表3．抗TfR1抗体の可変領域
Figure 2024503609000012
Figure 2024503609000013
Figure 2024503609000014
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、表3に提供される抗TfR1抗体のいずれか1つのCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含むVHを含み、かつ表3に提供される夫々のVHと比較したときフレームワーク領域中に1以上の(例として、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上の)アミノ酸バリエーションを含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本開示の抗TfR1抗体は、表3に提供される抗TfR1抗体のいずれか1つのCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含むVLを含み、かつ表3に提供される夫々のVLと比較したときフレームワーク領域中に1以上の(例として、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上の)アミノ酸バリエーションを含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、表3に提供される抗TfR1抗体のいずれか1つのCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含むVHを含み、かつ表3に提供される夫々のVHと比較したときフレームワーク領域中に少なくとも70％(例として、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％)同一のアミノ酸配列を含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本開示の抗TfR1抗体は、表3に提供される抗TfR1抗体のいずれか1つのCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含むVLを含み、かつ表3に提供される夫々のVLと比較したときフレームワーク領域中に少なくとも70％(例として、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％)同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、配列番号69のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号70のアミノ酸配列を含むVLを含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、配列番号71のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号70のアミノ酸配列を含むVLを含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、配列番号72のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号70のアミノ酸配列を含むVLを含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、配列番号73のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号74のアミノ酸配列を含むVLを含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、配列番号73のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号75のアミノ酸配列を含むVLを含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、配列番号76のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号74のアミノ酸配列を含むVLを含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、配列番号76のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号75のアミノ酸配列を含むVLを含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、配列番号77のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号78のアミノ酸配列を含むVLを含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、配列番号79のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号80のアミノ酸配列を含むVLを含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、配列番号77のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号80のアミノ酸配列を含むVLを含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、配列番号154のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号155のアミノ酸配列を含むVLを含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、ヒト抗体からの重鎖定常領域および軽鎖定常領域を包含し得る完全長IgGである。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体のいずれかの重鎖は、重鎖定常領域(CH)またはそのある部分(例として、CH1、CH2、CH3、またはそれらの組み合わせ)を含み得る。重鎖定常領域は、いずれかの好適な起源、例えばヒト、マウス、ラット、またはウサギであり得る。1つの具体的な例では、重鎖定常領域はヒトIgG(ガンマ重鎖)、例えばIgG1、IgG2、またはIgG4からである。ヒトIgG1定常領域の例は、下に与えられる:
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号81)。
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体のいずれかの重鎖は、突然変異体ヒトIgG1定常領域を含む。例えば、ヒトIgG1のCH2ドメイン上のLALA突然変異の導入(ヒンジ下部残基Leu234 Leu235をAla234およびAla235によって置き換えるように突然変異させられたmAb b12に由来する突然変異体)は、Fcγ受容体結合を低減することが公知である(Bruhns,P.,et al.(2009)およびXu,D.et al.(2000))。突然変異体ヒトIgG1定常領域は下で提供される(突然変異は太字かつ下線付き):
(配列番号82)。
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体のいずれかの軽鎖定常領域は、当該技術分野において知られているいずれかの軽鎖定常領域であり得る。いくつかの例では、カッパ軽鎖またはラムダ軽鎖である。いくつかの態様において、軽鎖定常領域はカッパ軽鎖であり、この配列は下に提供される:
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号83)。
他の抗体の重鎖および軽鎖の定常領域は当該技術分野において周知であり、例として、IMGTデータベース(imgt.org)において、またはwww.vbase2.org/vbstat.php.にて提供されるものであるが、これらの両方とも参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、表3に列挙されるVHまたはそれらのいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号81または配列番号82と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％同一である重鎖定常領域を含む重鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、表3に列挙されるVHまたはそれらのいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号81または配列番号82と比較して25アミノ酸バリエーション以下(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1アミノ酸バリエーション以下)を含有する重鎖定常領域を含む重鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、表3に列挙されるVHまたはそれらのいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号81で表されるとおりの重鎖定常領域を含む重鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、表3に列挙されるVHまたはそれらのいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号82で表されるとおりの重鎖定常領域を含む重鎖を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、表3に列挙されるVLまたはそれらのいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号83と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％同一である軽鎖定常領域を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、表3に列挙されるVLまたはそれらのいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号83と比較して25アミノ酸バリエーション以下(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1アミノ酸バリエーション以下)を含有する軽鎖定常領域を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、表3に列挙されるVLまたはそれらのいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号83で表されるとおりの軽鎖定常領域を含む軽鎖を含む。
記載される抗TfR1抗体のIgG重鎖および軽鎖アミノ酸配列の例は、下の表4に提供される。
表4．抗TfR1 IgGの例の重鎖および軽鎖の配列
Figure 2024503609000017
Figure 2024503609000018
Figure 2024503609000019
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、配列番号84、86、87、88、91、92、94、および156のいずれか1つで表されるとおりの重鎖と比較して、25アミノ酸バリエーション以下(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1アミノ酸バリエーション以下)を含有する重鎖を含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本開示の抗TfR1抗体は、配列番号85、89、90、93、95、および157のいずれか1つで表されるとおりの軽鎖と比較して、25アミノ酸バリエーション以下(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1アミノ酸バリエーション以下)を含有する軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、配列番号84、86、87、88、91、92、94、および156のいずれか1つと少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、配列番号85、89、90、93、95、および157のいずれか1つと少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、配列番号84、86、87、88、91、92、94、および156のいずれか1つのアミノ酸配列を含む重鎖を含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、配列番号85、89、90、93、95、および157のいずれか1つのアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、配列番号84のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、配列番号86のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、配列番号87のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、配列番号88のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号89のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、配列番号88のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、配列番号91のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号89のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、配列番号91のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、配列番号92のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号93のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、配列番号94のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号95のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、配列番号92のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号95のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、配列番号156のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号157のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、抗TfR1抗体は、無傷の抗体(全長抗体)のFabフラグメント、Fab'フラグメント、またはF(ab')2フラグメントである。無傷の抗体(全長抗体)の抗原結合フラグメントは、定型的な方法を介して(例として、組み換え的に、または全長IgGの重鎖定常領域をパパインなどの酵素を使用して消化することによって)調製され得る。例えば、F(ab')2フラグメントは、抗体分子のペプシンまたはパパイン消化によって生じ得、Fabフラグメントは、F(ab')2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって産生され得る。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体のFabフラグメント上の重鎖定常領域は、以下:
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT(配列番号96)のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、表3に列挙されるVHまたはそれらのいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号96と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％同一である重鎖定常領域を含む重鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、表3に列挙されるVHまたはそれらのいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号96と比較して25アミノ酸バリエーション以下(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1アミノ酸バリエーション以下)を含有する重鎖定常領域を含む重鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、表3に列挙されるVHまたはそれらのいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号96で表されるとおりの重鎖定常領域を含む重鎖を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、表3に列挙されるVLまたはそれらのいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号83と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％同一である軽鎖定常領域を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、表3に列挙されるVLまたはそれらのいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号83と比較して25アミノ酸バリエーション以下(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1アミノ酸バリエーション以下)を含有する軽鎖定常領域を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、表3に列挙されるVLまたはそれらのいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号83で表されるとおりの軽鎖定常領域を含む軽鎖を含む。
記載される抗TfR1抗体のFab重鎖および軽鎖アミノ酸配列の例は、下の表5に提供される。
表5．抗TfR1 Fabの例の重鎖および軽鎖の配列
Figure 2024503609000021
Figure 2024503609000022
Figure 2024503609000023
Figure 2024503609000024
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、配列番号97～103、158、および159のいずれか1つで表されるとおりの重鎖と比較して、25アミノ酸バリエーション以下(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1アミノ酸バリエーション以下)を含有する重鎖を含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本開示の抗TfR1抗体は、配列番号85、89、90、93、95、および157のいずれか1つで表されるとおりの軽鎖と比較して、25アミノ酸バリエーション以下(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1アミノ酸バリエーション以下)を含有する軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、配列番号97～103、158、および159のいずれか1つと少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、配列番号85、89、90、93、95、および157のいずれか1つと少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、配列番号97～103、158、および159のいずれか1つのアミノ酸配列を含む重鎖を含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、配列番号85、89、90、93、95、および157のいずれか1つのアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、配列番号97のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、配列番号98のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、配列番号99のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、配列番号100のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号89のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、配列番号100のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、配列番号101のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号89のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、配列番号101のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、配列番号102のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号93のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、配列番号103のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号95のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、配列番号102のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号95のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、配列番号158のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号157のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、配列番号159のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号157のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
他の知られている抗TfR1抗体
当該技術分野において知られているいずれか他の適切な抗TfR1抗体は、本明細書に開示の複合体において筋標的化剤として使用され得る。知られている抗TfR1抗体(関連する参考文献および結合エピトープを包含する)の例は、表6に列挙される。いくつかの態様において、抗TfR1抗体は、本明細書に提供される抗TfR1抗体、例として、表6に列挙される抗TfR1抗体のいずれかの相補性決定領域(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3)を含む。
表6 - 関連する参考文献および結合エピトープ情報を包含する、抗TfR1抗体クローンのリスト。
Figure 2024503609000026
Figure 2024503609000027
Figure 2024503609000028
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、表6から選択される抗TfR1抗体のいずれか1つからのCDR-H(例として、CDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3)アミノ酸配列の1以上を包含する。いくつかの態様において、抗TfR1抗体は、表6から選択される抗TfR1抗体のいずれか1つについて提供されるとおりのCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を包含する。いくつかの態様において、抗TfR1抗体は、表6から選択される抗TfR1抗体のいずれか1つについて提供されるとおりのCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を包含する。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、表6から選択される抗TfR1抗体のいずれか1つなどの、いずれかの抗TfR1抗体の重鎖可変ドメインおよび/または(例として、および)軽鎖可変ドメインを包含するいずれかの抗体を包含する。いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、表6から選択される抗TfR1抗体のいずれか1つなどのいずれかの抗TfR1抗体の重鎖可変および軽鎖可変ペアを包含するいずれかの抗体を包含する。
本開示の側面は、本明細書に記載のもののいずれかと相同な重鎖可変(VH)および/または(例として、および)軽鎖可変(VL)ドメインアミノ酸配列を有する抗TfR1抗体を提供する。いくつかの態様において、抗TfR1抗体は、表6から選択される抗TfR1抗体のいずれか1つなどのいずれかの抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖可変配列および/またはいずれかの軽鎖可変配列と少なくとも75％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一である重鎖可変配列または軽鎖可変配列を含む。いくつかの態様において、相同な重鎖可変および/または(例として、および)軽鎖可変アミノ酸配列は、本明細書に提供されるCDR配列のいずれかにおいては変動しない。例えば、いくつかの態様において、配列バリエーションの程度(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)は、本明細書に提供されるCDR配列のいずれかを排除する重鎖可変および/または(例として、および)軽鎖可変配列内において生起し得る。いくつかの態様において、本明細書に提供される抗TfR1抗体のいずれかは、表6から選択される抗TfR1抗体のいずれか1つなどのいずれかの抗TfR1抗体のフレームワーク配列と少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％同一であるフレームワーク配列を含む重鎖可変配列および軽鎖可変配列を含む。
本開示に従い使用されてもよいトランスフェリン受容体抗体の例は、国際出願刊行物WO 2016/081643(参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。この抗体のアミノ酸配列は表7に提供される。
表7．知られている抗TfR1抗体の例の重鎖および軽鎖のCDR
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、表7に示されるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3と同じであるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本開示の抗TfR1抗体は、表7に示されるCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3と同じであるCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、CDR-L3を含み、これは表7に示されるとおりのCDR-L3と比較したとき3アミノ酸バリエーション以下(例として、3、2、または1アミノ酸バリエーション以下)を含有する。いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、表7に示されるとおりのCDR-L3と比較したとき1アミノ酸バリエーションを含有するCDR-L3を含む。いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、QHFAGTPLT(配列番号126)(KabatおよびChothia定義系に従う)またはQHFAGTPL(配列番号127)(Contact定義系に従う)のCDR-L3を含む。いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、表7に示されるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3と同じであるCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、およびCDR-L2を含み、QHFAGTPLT(配列番号126)KabatおよびChothia定義系に従う)またはQHFAGTPL(配列番号127)Contact定義系に従う)のCDR-L3を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、表7に示される重鎖CDRと、合わせて少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、または98％)同一である重鎖CDRを含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本開示の抗TfR1抗体は、表7に示される軽鎖CDRと、合わせて少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、または98％)同一である軽鎖CDRを含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、配列番号124のアミノ酸配列を含むVHを含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本開示の抗TfR1抗体は、配列番号125のアミノ酸配列を含むVLを含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、配列番号128のアミノ酸配列を含むVHを含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本開示の抗TfR1抗体は、配列番号129のアミノ酸配列を含むVLを含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR1抗体は、配列番号128で表されるとおりのVHと比較したとき、25アミノ酸バリエーション以下(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1アミノ酸バリエーション以下)を含有するVHを含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本開示の抗TfR1抗体は、配列番号129で表されるとおりのVLと比較したとき、15アミノ酸バリエーション以下(例として、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、9、8、7、6、5、4、3、2、または1アミノ酸バリエーション以下)を含有するVLを含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載のとおりの抗TfR1抗体のいずれの重鎖も、重鎖定常領域(CH)またはこの一部(例として、CH1、CH2、CH3、またはそれらの組み合わせ)を含んでいてもよい。重鎖定常領域は、いずれの好適な起源、例として、ヒト、マウス、ラット、またはウサギに属し得る。特定の一例において、重鎖定常領域は、ヒトIgG(ガンマ重鎖)、例として、IgG1、IgG2、またはIgG4からのものである。ヒトIgG1定常領域の例は、下に与えられる:
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号81)。
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体のいずれの軽鎖も、軽鎖定常領域(CL)をさらに含んでいてもよいが、これは当該技術分野において知られているいずれのCLでもあり得る。いくつかの例において、CLは、カッパ軽鎖である。他の例において、CLは、ラムダ軽鎖である。いくつかの態様において、CLはカッパ軽鎖であって、その配列は下に与えられる:
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号83)。
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、配列番号132のアミノ酸配列を含む重鎖を含むキメラ抗体である。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、配列番号133のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、配列番号134のアミノ酸配列を含む重鎖を含む完全ヒト抗体である。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、配列番号135のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、抗TfR1抗体は、無傷の抗体(完全長抗体)の抗原結合性フラグメント(Fab)である。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1 Fabは、配列番号136のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本明細書に記載の抗TfR1 Fabは、配列番号133のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1 Fabは、配列番号137のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本明細書に記載の抗TfR Fabは、配列番号135のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
本明細書に記載の抗TfR1抗体は、これらに限定されないが、無傷の(すなわち、完全長)抗体、それらの抗原結合性フラグメント(Fab、Fab'、F(ab')2、Fvなどの)、単一鎖抗体、二重特異性抗体、またはナノボディーを包含する、いずれの抗体の形態でもあり得る。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、scFvである。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、scFv-Fab(例として、一部の定常領域と融合されたscFv)である。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、定常領域(例として、配列番号81で表されるとおりのヒトIgG1定常領域)と融合されたscFvである。
いくつかの態様において、保存的突然変異は、例えば結晶構造に基づき決定されるとき、その残基が標的抗原(例として、トランスフェリン受容体)との相互作用に関与しそうにない位置にて、抗体配列(例として、CDRまたはフレームワーク配列)中へ導入され得る。いくつかの態様において、1、2つ以上の突然変異(例として、アミノ酸置換)は、血清半減期、補体結合、Fc受容体結合、および/または(例として、および)細胞への抗原依存的細胞傷害性などの、抗体の1以上の機能特性を変更させるために、本明細書に記載の抗TfR1抗体のFc領域中(例として、Kabatナンバリング系(例として、KabatのEUインデックス)に従うナンバリングで、CH2ドメイン(ヒトIgG1の残基231～340)中、および/または(例として、および)CH3ドメイン(ヒトIgG1の残基341～447)中、および/または(例として、および)ヒンジ領域中)へ導入される。
いくつかの態様において、1、2つ以上の突然変異(例として、アミノ酸置換)は、ヒンジ領域中のシステイン残基の数が、例として米国特許第5,677,425号に記載のとおり変動(例として、増大または減少)され得るように、Fc領域(CH1ドメイン)のヒンジ領域中へ導入される。CH1ドメインのヒンジ領域中のシステイン残基の数は、例として、軽鎖および重鎖の集合(assembly)を容易にさせるため、または抗体の安定性を変更(例として、増大もしくは減少)するため、またはリンカー抱合を容易にさせるため、変更され得る。
いくつかの態様において、1、2以上の突然変異(例として、アミノ酸置換)は、抗体の、エフェクター細胞表面上のFc受容体(例として、活性化されたFc受容体)への親和性を増加または減少させるため、本明細書に記載の筋標的化抗体のFc領域中(例として、Kabatナンバリング系(例として、KabatのEUインデックス)に従うナンバリングで、CH2ドメイン(ヒトIgG1の残基231～340)中、および/または(例として、および)CH3ドメイン(ヒトIgG1の残基341～447)中、および/または(例として、および)ヒンジ領域中)へ導入される。抗体のFc受容体への親和性を増大または減少させる抗体のFc領域中の突然変異、およびかかる突然変異をFc受容体中またはそのフラグメント中へ導入するための技法は、当業者に知られている。抗体のFc受容体への親和性を変更するためになされ得る、抗体のFc受容体中の突然変異の例は、例として、Smith P et al.,(2012)PNAS 109:6181-6186、米国特許第6,737,056号、ならびに国際公開第WO 02/060919号;第WO 98/23289号;および第WO 97/34631号(これらは参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。
いくつかの態様において、1、2以上のアミノ酸突然変異(すなわち、置換、挿入、または欠失)は、in vivoでの抗体の半減期を変更(例として、増加または減少)させるため、IgG定常領域またはそのFcRn-結合フラグメント(好ましくは、Fcまたはヒンジ-Fcドメインフラグメント)中へ導入される。例えば、in vivoでの抗体の半減期を変更(例として、増加または減少)させるであろう突然変異について、例として、国際公開第WO 02/060919号;第WO 98/23289号;および第WO 97/34631号;ならびに米国特許第5,869,046号、第6,121,022号、第6,277,375号、および第6,165,745号を見よ。
いくつかの態様において、1、2以上のアミノ酸突然変異(すなわち、置換、挿入、または欠失)は、in vivoでの抗TfR1抗体の半減期を減少させるため、IgG定常領域またはそのFcRn-結合フラグメント(好ましくは、Fcまたはヒンジ-Fcドメインフラグメント)中へ導入される。いくつかの態様において、1、2以上のアミノ酸突然変異(すなわち、置換、挿入、または欠失)は、in vivoでの抗体の半減期を増加させるため、IgG定常領域またはそのFcRn-結合フラグメント(好ましくは、Fcまたはヒンジ-Fcドメインフラグメント)中へ導入される。いくつかの態様において、抗体は、KabatのEUインデックス(上記のKabat E Aら(1991))に従うナンバリングで第2定常(CH2)ドメイン(ヒトIgG1の残基231～340)中および/または(例として、および)第3定常(CH3)ドメイン(ヒトIgG1の残基341～447)中に、1以上のアミノ酸突然変異(例として、置換)を有し得る。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体のIgG1定常領域は、KabatにあるようなEUインデックスに従ってナンバリングされた位置252におけるメチオニン(M)からチロシン(Y)への置換、位置254におけるセリン(S)からトレオニン(T)への置換、および位置256におけるトレオニン(T)からグルタミン酸(E)への置換を含む。米国特許第7,658,921号(これは、参照により本明細書に組み込まれる)を見よ。「YTE突然変異体」と称されるこのタイプの突然変異IgGは、同じ抗体の野生型バージョンと比較して4倍増大した半減期を発揮したことが示されている(Dall'Acqua W F et al.,(2006)J Biol Chem 281:23514-24を見よ)。いくつかの態様において、抗体は、KabatにあるようなEUインデックスに従ってナンバリングされた位置251～257、285～290、308～314、385～389、および428～436でのアミノ酸残基の、1、2、3以上のアミノ酸置換を含むIgG定常領域を含む。
いくつかの態様において、1、2またはそれ以上のアミノ酸置換は、抗TfR1抗体のエフェクター機能(単数または複数)を変更するため、IgG定常領域Fc領域中へ導入される。自身への親和性が変更されたエフェクターリガンドは、例えば、Fc受容体または補体のC1構成要素であり得る。このアプローチは、米国特許第5,624,821号および第5,648,260号においてさらに詳細に記載される。いくつかの態様において、定常領域ドメインの欠失または不活化(点突然変異または他の手段を通して)は、循環抗体のFc受容体への結合を低減し、それによって腫瘍局在化を増大し得る。定常領域を欠失または不活化し、それによって腫瘍局在化を増大させる突然変異の記載については、例として、米国特許第5,585,097号および第8,591,886号を見よ。いくつかの態様において、1以上のアミノ酸置換は、Fc領域上の潜在的なグリコシル化部位を除去するため(これによってFc受容体への結合が低減されることもある)、本明細書に記載の抗体のFc領域中へ導入されてもよい(例として、Shields R L et al.,(2001)J Biol Chem 276:6591-604を見よ)。
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体の定常領域中の1以上のアミノは、抗体が変更されたC1q結合および/または(例として、および)低減もしくは消失された補体依存性細胞傷害性(CDC)を有し得るように、異なるアミノ酸残基に置き換えられ得る。このアプローチは、米国特許第6,194,551号(Idusogie et al)においてさらに詳細に記載されている。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体のCH2ドメインのN末領域中の1以上のアミノ酸残基は変更されて、それによって抗体の補体結合能を変更する。このアプローチは、国際刊行物第WO 94/29351号においてさらに記載されている。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体のFc領域は、抗体の、細胞への抗体依存性細胞傷害性(ADCC)の媒介能を増大させるため、および/または(例として、および)、抗体のFcγ受容体への親和性を増大させるため、修飾されている。このアプローチは、国際刊行物第WO 00/42072号においてさらに記載されている。
いくつかの態様において、本明細書に提供される抗体の重鎖および/または(例として、および)軽鎖可変ドメイン(単数または複数)配列(単数または複数)は、本明細書の他の箇所に記載されるとおり、例えば、CDR接合抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、もしくは複合ヒト抗体、または抗原結合性フラグメントを生成するために使用され得る。当業者によって理解されるとおり、本明細書に提供される抗体のいずれかに由来するいずれのバリアント、CDR接合抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または複合抗体は、本明細書に記載の組成物および方法に有用であってもよく、バリアント、CDR接合抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または複合抗体が、これが由来する元の抗体と比べて、トランスフェリン受容体への少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％以上の結合を有し得るように、トランスフェリン受容体への特異的結合能を維持するであろう。
いくつかの態様において、本明細書に提供される抗体は、所望の特性を抗体へ付与する突然変異を含む。例えば、ネイティブなIgG4 mAbに生じることが知られているFabアーム交換(Fab-arm exchange)に起因する潜在的合併症を回避するため、本明細書に提供される抗体は、安定化「Adair」突然変異を含んでいてもよく(Angal S.,et al.,「A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human(IgG4)antibody」,Mol Immunol 30,105-108;1993)、ここでセリン228(EUナンバリング;残基241 Kabatナンバリング)は、IgG1様ヒンジ配列をもたらすプロリンへ変換されている。結果的に、抗体のいずれも、安定化「Adair」突然変異を包含していてもよい。
いくつかの態様において、抗体は修飾されている(例として、グリコシル化、リン酸化、SUMO化、および/または(例として、および)、メチル化を介して修飾されている)。いくつかの態様において、抗体は、1以上の糖または炭水化物分子へ抱合されたグリコシル化抗体である。いくつかの態様において、1以上の糖または炭水化物分子は、N-グリコシル化、O-グリコシル化、C-グリコシル化、グリピエーション(GPIアンカー付着)、および/または(例として、および)、ホスホグリコシル化を介して、抗体へ抱合されている。いくつかの態様において、1以上の糖または炭水化物分子は、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、またはグリカンである。いくつかの態様において、1以上の糖または炭水化物分子は、分枝オリゴ糖類または分枝グリカンである。いくつかの態様において、1以上の糖または炭水化物分子は、マンノース単位、グルコース単位、N-アセチルグルコサミン単位、N-アセチルガラクトサミン単位、ガラクトース単位、フコース単位、またはホスホ脂質単位を包含する。いくつかの態様において、糖分子は、約1～10、約1～5、約5～10、約1～4、約1～3、または約2つ存在する。いくつかの態様において、グリコシル化抗体は、全体的にまたは部分的にグリコシル化されている。いくつかの態様において、抗体は、化学反応によって、または酵素的な手段によってグリコシル化されている。いくつかの態様において、抗体は、in vitroでまたは細胞(任意にN-またはO-グリコシル化経路中の酵素(例として、グリコシルトランスフェラーゼ)を欠乏していてもよい)内部でグリコシル化される。いくつかの態様において、抗体は、「Modified antibody,antibody-conjugate and process for the preparation thereof」と題する2014年5月1日に公開された国際特許出願公開WO2014065661に記載のとおりの糖または炭水化物分子で官能化されている。
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体のいずれか1つは、重鎖および/または(例として、および)軽鎖配列上にシグナルペプチド(例として、N末端シグナルペプチド)を含み得る。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、VHおよびVL配列のいずれか1つ、IgG重鎖および軽鎖配列のいずれか1つ、または本明細書に記載のF(ab')重鎖および軽鎖配列のいずれか1つを含み、さらにシグナルペプチド(例として、N末端シグナルペプチド)を含む。いくつかの態様において、シグナルペプチドはMGWSCIILFLVATATGVHS(配列番号104)のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、本明細書に提供される抗体は、1以上の翻訳後修飾を有し得る。いくつかの態様においては、ピログルタミン酸形成(ピロGlu)ともまた呼ばれるN末端環化が、産生の間にN末端グルタミン酸(Glu)および/またはグルタミン(Gln)残基において抗体に生じ得る。そのため、N末のグルタミン酸残基またはグルタミン残基を含む配列を有することが特定された抗体は、翻訳後修飾の結果として生じるピログルタミン酸形成を経た抗体を網羅することが解されるはずである。いくつかの態様において、ピログルタミン酸形成は、重鎖配列に生じる。いくつかの態様において、ピログルタミン酸形成は軽鎖配列に生じる。
ｂ．他の筋標的抗体
いくつかの態様において、筋標的化抗体は、ヘモジュベリン(hemojuvelin)、カベオリン-3、デュシェンヌ型筋ジストロフィーペプチド、ミオシンIib、またはCD63に特異的に結合する抗体である。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、筋原性前駆体タンパク質に特異的に結合する抗体である。例示の筋原性前駆体タンパク質は、限定せずに、ABCG2、M-カドヘリン/カドヘリン-15、カベオリン-1、CD34、FoxK1、インテグリンアルファ7、インテグリンアルファ7ベータ1、MYF-5、MyoD、ミオゲニン、NCAM-1/CD56、Pax3、Pax7、およびPax9を包含する。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、骨格筋タンパク質に特異的に結合する抗体である。例示の骨格筋タンパク質は、限定せずに、アルファ-サルコグリカン、ベータ-サルコグリカン、カルパインインヒビター、クレアチンキナーゼMM/CKMM、eIF5A、エノラーゼ2/ニューロン特異的エノラーゼ、イプシロン-サルコグリカン、FABP3/H-FABP、GDF-8/ミオスタチン、GDF-11/GDF-8、インテグリンアルファ7、インテグリンアルファ7ベータ1、インテグリンベータ1/CD29、MCAM/CD146、MyoD、ミオゲニン、ミオシン軽鎖キナーゼインヒビター、NCAM-1/CD56、およびトロポニンIを包含する。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、平滑筋タンパク質に特異的に結合する抗体である。例示の平滑筋タンパク質は、限定せずに、アルファ-平滑筋アクチン、VE-カドヘリン、カルデスモン/CALD1、カルポニン1、デスミン、ヒスタミンH2 R、モチリンR/GPR38、トランスジェリン(Transgelin)/TAGLN、およびビメンチンを包含する。しかしながら、追加の標的への抗体が本開示の範囲内であること、および本明細書に提供される標的の例示のリストが限定することを意図していないことは解されるはずである。
ｃ．抗体の特色/変更
いくつかの態様において、保存的突然変異は、例えば結晶構造に基づき決定されるとき、その残基が標的抗原(例として、トランスフェリン受容体)との相互作用に関与しそうにない位置にて、抗体配列(例として、CDRまたはフレームワーク配列)中へ導入され得る。いくつかの態様において、1、2以上の突然変異(例として、アミノ酸置換)は、血清半減期、補体結合、Fc受容体結合、および/または(例として、および)細胞への抗原依存的細胞傷害性などの、抗体の1以上の機能特性を変更させるために、本明細書に記載の筋標的化抗体のFc領域中(例として、Kabatナンバリング系(例として、KabatのEUインデックス)に従うナンバリングで、CH2ドメイン(ヒトIgG1の残基231～340)中、および/または(例として、および)CH3ドメイン(ヒトIgG1の残基341～447)中、および/または(例として、および)ヒンジ領域中)へ導入される。
いくつかの態様において、1、2以上の突然変異(例として、アミノ酸置換)は、ヒンジ領域中のシステイン残基の数が、例として米国特許第5,677,425号に記載のとおり変動(例として、増大または減少)され得るように、Fc領域(CH1ドメイン)のヒンジ領域中へ導入される。CH1ドメインのヒンジ領域中のシステイン残基の数は、例として、軽鎖および重鎖の会合(assembly)を容易にさせるため、または抗体の安定性を変更(例として、増大もしくは減少)するため、またはリンカー抱合を容易にさせるため、変更され得る。
いくつかの態様において、1、2以上の突然変異(例として、アミノ酸置換)は、抗体の、エフェクター細胞表面上のFc受容体(例として、活性化されたFc受容体)への親和性を増加または減少させるため、本明細書に記載の筋標的化抗体のFc領域中(例として、Kabatナンバリング系(例として、KabatのEUインデックス)に従うナンバリングで、CH2ドメイン(ヒトIgG1の残基231～340)中、および/または(例として、および)CH3ドメイン(ヒトIgG1の残基341～447)中、および/または(例として、および)ヒンジ領域中)へ導入される。抗体のFc受容体への親和性を増大または減少させる抗体のFc領域中の突然変異、およびかかる突然変異をFc受容体中またはそのフラグメント中へ導入するための技法は、当業者に知られている。抗体のFc受容体への親和性を変更するためになされ得る、抗体のFc受容体中の突然変異の例は、例として、Smith P et al.,(2012)PNAS 109:6181-6186、米国特許第6,737,056号、ならびに国際刊行物第WO 02/060919号;第WO 98/23289号;および第WO 97/34631号(これらは参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。
いくつかの態様において、1、2以上のアミノ酸突然変異(すなわち、置換、挿入、または欠失)は、in vivoでの抗体の半減期を変更(例として、増加または減少)させるため、IgG定常領域またはそのFcRn-結合フラグメント(好ましくは、Fcまたはヒンジ-Fcドメインフラグメント)中へ導入される。例えば、in vivoでの抗体の半減期を変更(例として、増加または減少)させるであろう突然変異について、例として、国際刊行物第WO 02/060919号;第WO 98/23289号;および第WO 97/34631号;ならびに米国特許第5,869,046号、第6,121,022号、第6,277,375号、および第6,165,745号を参照。
いくつかの態様において、1、2以上のアミノ酸突然変異(すなわち、置換、挿入、または欠失)は、in vivoでの抗トランスフェリン受容体抗体の半減期を減少させるため、IgG定常領域またはそのFcRn-結合フラグメント(好ましくは、Fcまたはヒンジ-Fcドメインフラグメント)中へ導入される。いくつかの態様において、1、2以上のアミノ酸突然変異(すなわち、置換、挿入、または欠失)は、in vivoでの抗体の半減期を増加させるため、IgG定常領域またはそのFcRn-結合フラグメント(好ましくは、Fcまたはヒンジ-Fcドメインフラグメント)中へ導入される。いくつかの態様において、抗体は、KabatのEUインデックス(上記のKabat E Aら(1991))に従うナンバリングで第2定常(CH2)ドメイン(ヒトIgG1の残基231～340)中および/または(例として、および)第3定常(CH3)ドメイン(ヒトIgG1の残基341～447)中に、1以上のアミノ酸突然変異(例として、置換)を有し得る。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体のIgG1定常領域は、KabatにあるようなEUインデックスに従ってナンバリングされた位置252におけるメチオニン(M)からチロシン(Y)への置換、位置254におけるセリン(S)からトレオニン(T)への置換、および位置256におけるトレオニン(T)からグルタミン酸(E)への置換を含む。米国特許第7,658,921(これは、参照により本明細書に組み込まれる)を参照。「YTE突然変異体」と称されるこのタイプの突然変異IgGは、同じ抗体の野生型バージョンと比較して4倍増大した半減期を発揮したことが示されている(Dall'Acqua W F et al.,(2006)J Biol Chem 281:23514-24を参照)。いくつかの態様において、抗体は、KabatにあるようなEUインデックスに従ってナンバリングされた位置251～257、285～290、308～314、385～389、および428～436でのアミノ酸残基の、1、2、3以上のアミノ酸置換を含むIgG定常領域を含む。
いくつかの態様において、1、2以上のアミノ酸置換は、抗トランスフェリン受容体抗体のエフェクター機能(単数または複数)を変更するため、IgG定常領域Fc領域中へ導入される。自身への親和性が変更されたエフェクターリガンドは、例えば、Fc受容体または補体のC1構成要素であり得る。このアプローチは、米国特許第5,624,821号および第5,648,260号においてさらに詳細に記載される。いくつかの態様において、定常領域ドメインの欠失または不活化(点突然変異または他の手段を通して)は、循環抗体のFc受容体への結合を低減し、それによって腫瘍局在化を増大し得る。定常領域を欠失または不活化し、それによって腫瘍局在化を増大させる突然変異の記載については、例として、米国特許第5,585,097号および第8,591,886号を参照。いくつかの態様において、1以上のアミノ酸置換は、Fc領域上の潜在的なグリコシル化部位を除去するため(これによってFc受容体への結合が低減されることもある)、本明細書に記載の抗体のFc領域中へ導入されてもよい(例として、Shields R L et al.,(2001)J Biol Chem 276:6591-604を参照)。
いくつかの態様において、本明細書に記載の筋標的化抗体の定常領域中の1以上のアミノ酸残基は、抗体が変更されたC1q結合および/または(例として、および)低減もしくは消失された補体依存性細胞傷害性(CDC)を有し得るように、異なるアミノ酸残基に置き換えられ得る。このアプローチは、米国特許第6,194,551号(Idusogieら)においてさらに詳細に記載されている。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体のCH2ドメインのN末領域中の1以上のアミノ酸残基は変更されて、それによって抗体の補体結合能を変更する。このアプローチは、国際刊行物第WO 94/29351号においてさらに記載されている。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体のFc領域は、抗体の、細胞への抗体依存性細胞傷害性(ADCC)の媒介能を増大させるため、および/または(例として、および)、抗体のFcγ受容体への親和性を増大させるため、修飾されている。このアプローチは、国際刊行物第WO 00/42072号においてさらに記載されている。
いくつかの態様において、本明細書に提供される抗体の重鎖および/または(例として、および)軽鎖可変ドメイン(単数または複数)配列(単数または複数)は、本明細書の他の箇所に記載されるとおり、例えば、CDR接合抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、もしくは複合ヒト抗体、または抗原結合性フラグメントを生成するために使用され得る。当業者によって理解されるとおり、本明細書に提供される抗体のいずれかに由来するいずれのバリアント、CDR接合抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または複合抗体は、本明細書に記載の組成物および方法に有用であってもよく、バリアント、CDR接合抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または複合抗体が、これが由来する元の抗体と比べて、トランスフェリン受容体への少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％以上の結合を有し得るように、トランスフェリン受容体への特異的結合能を維持するであろう。
いくつかの態様において、本明細書に提供される抗体は、所望の特性を抗体へ付与する突然変異を含む。例えば、ネイティブなIgG4 mAbに生じることが知られているFabアーム交換(Fab-arm exchange)に起因する潜在的合併症を回避するため、本明細書に提供される抗体は、安定化「Adair」突然変異を含んでいてもよく(Angal S.,et al.,“A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human (IgG4) antibody”,Mol Immunol 30,105-108;1993)、ここでセリン228(EUナンバリング;残基241 Kabatナンバリング)は、IgG1様ヒンジ配列をもたらすプロリンへ変換されている。結果的に、抗体のいずれも、安定化「Adair」突然変異を包含していてもよい。
本明細書に提供されるとおり、本開示の抗体は、任意に、定常領域またはその一部を含んでいてもよい。例えば、VLドメインは、そのC末端にて、軽鎖定常領域様CκまたはCλへ付着されていてもよい。同様に、VHドメインまたはその一部は、すべてのまたは一部の重鎖様IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgM、およびいずれのアイソタイプのサブクラスへ付着されていてもよい。抗体は、好適な定常領域を包含していてもよい(例えば、Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,No.91-3242,National Institutes of Health Publications,Bethesda,Md.(1991)を参照)。したがって、本開示の範囲内の抗体は、いずれの好適な定常領域と組み合わされて、VHおよびVLドメイン、またはその抗原結合部を包含していてもよい。
ii．筋標的化ペプチド
本開示のいくつかの側面は、筋標的化ペプチドを筋標的化剤として提供する。特定の細胞型へ結合する短いペプチド配列(例として、長さが5～20アミノ酸のペプチド配列)は記載されている。例えば、細胞標的化ペプチドは、Vines e.,et al.,A.“Cell-penetrating and cell-targeting peptides in drug delivery”Biochim Biophys Acta 2008,1786:126-38;Jarver P.,et al.,“In vivo biodistribution and efficacy of peptide mediated delivery”Trends Pharmacol Sci 2010;31:528-35;Samoylova T.I.,et al.,“Elucidation of muscle-binding peptides by phage display screening”Muscle Nerve 1999;22:460-6;米国特許第6,329,501号、2001年12月11日発行、表題“METHODS AND COMPOSITIONS FOR TARGETING COMPOUNDS TO MUSCLE”；およびSamoylov A.M.,et al.,“Recognition of cell-specific binding of phage display derived peptides using an acoustic wave sensor.”Biomol Eng 2002;18:269-72に記載されている;これら各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。特定の細胞表面抗原(例として、受容体)と相互作用するようにペプチドを設計することによって、所望される組織、例として、筋肉への選択性が獲得され得る。骨格筋標的化が調査されており、広範な分子ペイロードが送達されることができる。巨大な抗体またはウイルス粒子についての実際上の不利な点の多くが存在しないこれらのアプローチは、筋組織への高選択性を有していてもよい。結果的に、いくつかの態様において、筋標的化剤は、長さが4アミノ酸から50アミノ酸までの筋標的化ペプチドである。いくつかの態様において、筋標的化ペプチドは、長さが4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50アミノ酸である。筋標的化ペプチドは、ファージディスプレーなどの数種の方法のいずれかを使用して生成され得る。
いくつかの態様において、筋標的化ペプチドは、他のある細胞と比較して、筋細胞において過剰発現されているかまたは相対的に高度に発現されている、内在化する細胞表面受容体(例として、トランスフェリン受容体)へ結合してもよい。いくつかの態様において、筋標的化ペプチドは、トランスフェリン受容体を標的にしてもよい(例として、トランスフェリン受容体へ結合してもよい)。いくつかの態様において、トランスフェリン受容体を標的にするペプチドは、天然に存在するリガンド、例として、トランスフェリンのセグメントを含んでいてもよい。いくつかの態様において、トランスフェリン受容体を標的にするペプチドは、米国特許第6,743,893号、11/30/2000出願、「RECEPTOR-MEDIATED UPTAKE OF PEPTIDES THAT BIND THE HUMAN TRANSFERRIN RECEPTOR」に記載のとおりである。いくつかの態様において、トランスフェリン受容体を標的にするペプチドは、Kawamoto, M. et al,“A novel transferrin receptor-targeted hybrid peptide disintegrates cancer cell membrane to induce rapid killing of cancer cells.”BMC Cancer.2011 Aug 18;11:359に記載のとおりである。いくつかの態様において、トランスフェリン受容体を標的にするペプチドは、米国特許第8,399,653号、5/20/2011出願、「TRANSFERRIN/TRANSFERRIN RECEPTOR-MEDIATED SIRNA DELIVERY」に記載のとおりである。
上述のとおり、筋標的化ペプチドの例は報告されている。例えば、筋肉特異的ペプチドは、表面へプタペプチドを提示するファージディスプレーライブラリを使用して同定された。一例として、アミノ酸配列ASSLNIA(配列番号205)を有するペプチドは、in vitroでC2C12マウス筋管へ結合し、かつin vivoでマウス筋組織へ結合した。結果的に、いくつかの態様において、筋標的化剤は、アミノ酸配列ASSLNIA(配列番号205)を含む。このペプチドは、肝臓、腎臓、および脳への結合が低減された、マウスへの静脈内注射後の心筋組織および骨格筋組織への結合について改善された特異性を発揮した。追加の筋肉特異的ペプチドがファージディスプレーを使用して同定されている。例えば、DMDへの処置という文脈において、12アミノ酸ペプチドが、筋標的化のためのファージディスプレーライブラリによって同定された。Yoshida D.,et al.,“Targeting of salicylate to skin and muscle following topical injections in rats.”Int J Pharm 2002;231:177-84を参照;この内容全体はこれによって参照により組み込まれる。ここで、配列SKTFNTHPQSTP(配列番号206)を有する12アミノ酸ペプチドが同定され、この筋標的化ペプチドは、ASSLNIA(配列番号205)ペプチドと比べてC2C12細胞への改善された結合を示した。
他の細胞型より筋肉(例として、骨格筋)に対して選択的なペプチドを同定するためのいずれの追加の方法はin vitroでの選択を包含し、これはGhosh D.,et al.,“Selection of muscle-binding peptides from context-specific peptide-presenting phage libraries for adenoviral vector targeting”J Virol 2005;79:13667-72に記載されている;この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。ランダム12-merペプチドファージディスプレーライブラリを非筋細胞型の混合物とプレインキュベートすることによって、非特異的細胞バインダーが選出された。選択ラウンド(rounds of selection)を受けて、12アミノ酸ペプチドTARGEHKEEELI(配列番号207)が最も頻繁に現れた。結果的に、いくつかの態様において、筋標的化剤は、アミノ酸配列TARGEHKEEELI(配列番号140)を含む。
筋標的化剤は、アミノ酸含有分子またはペプチドであってもよい。筋標的化ペプチドは、筋細胞から見出されたタンパク質受容体へ優先的に結合するタンパク質の配列に対応していてもよい。いくつかの態様において、筋標的化ペプチドは、ペプチドが筋細胞を優先的に標的にし得るように、疎水性アミノ酸(例として、バリン)の性質を高く含有する。いくつかの態様において、筋標的化ペプチドは、これまでに特徴付けも開示もされていない。これらのペプチドは、数種の方法論のいずれか、例として、ファージディスプレードペプチドライブラリ、1ビーズ・1化合物(one-bead one-compound)ペプチドライブラリ、または位置走査性(positional scanning)合成ペプチドコンビナトリアルライブラリを使用して、想起、産生、合成、および/または(例として、および)、誘導体化されてもよい。例示の方法論は当該技術分野において特徴付けされており、参照により組み込まれる(Gray,B.P.and Brown,K.C.“Combinatorial Peptide Libraries:Mining for Cell-Binding Peptides”Chem Rev.2014,114:2,1020-1081.;Samoylova,T.I.and Smith,B.F.“Elucidation of muscle-binding peptides by phage display screening.”Muscle Nerve,1999,22:4.460-6)。いくつかの態様において、筋標的化ペプチドはこれまでに開示されている(例として、Writer M.J.et al.“Targeted gene delivery to human airway epithelial cells with synthetic vectors incorporating novel targeting peptides selected by phage display.”J.Drug Targeting.2004;12:185;Cai,D.“BDNF-mediated enhancement of inflammation and injury in the aging heart.”Physiol Genomics.2006,24:3,191-7.;Zhang,L.“Molecular profiling of heart endothelial cells.”Circulation,2005,112:11,1601-11.;McGuire,M.J.et al.“In vitro selection of a peptide with high selectivity for cardiomyocytes in vivo.”J Mol Biol.2004,342:1,171-82を参照)。例示の筋標的化ペプチドは、以下の群のアミノ酸配列を含む:CQAQGQLVC(配列番号208)、CSERSMNFC(配列番号209)、CPKTRRVPC(配列番号210)、WLSEAGPVVTVRALRGTGSW(配列番号211)、ASSLNIA(配列番号205)、CMQHSMRVC(配列番号212)、およびDDTRHWG(配列番号213)。いくつかの態様において、筋標的化ペプチドは、約2～25アミノ酸、約2～20アミノ酸、約2～15アミノ酸、約2～10アミノ酸、または約2～5アミノ酸を含んでいてもよい。筋標的化ペプチドは、天然に存在するアミノ酸、例として、システイン、アラニン、または天然に存在しないアミノ酸、もしくは修飾アミノ酸を含んでいてもよい。天然に存在しないアミノ酸は、β-アミノ酸、ホモ-アミノ酸、プロリン誘導体、3-置換アラニン誘導体、線形コアアミノ酸(linear core amino acids)、N-メチルアミノ酸、および当該技術分野において知られているその他のアミノ酸を包含する。いくつかの態様において、筋標的化ペプチドは線状であってもよい;他の態様において、筋標的化ペプチドは環状(例として、二環式)であってもよい(例として、Silvana,M.G.et al.Mol.Therapy,2018,26:1,132-147を参照)。
iii．筋標的化受容体リガンド
筋標的化剤は、リガンド、例として、受容体タンパク質へ結合するリガンドであってもよい。筋標的化リガンドは、筋細胞によって発現される内在化する細胞表面受容体へ結合するタンパク質、例として、トランスフェリンであってもよい。結果的に、いくつかの態様において、筋標的化剤は、トランスフェリン、またはトランスフェリン受容体へ結合するその誘導体である。筋標的化リガンドは、代替的に、小分子、例として、他の細胞型と比べて優先的に筋細胞を標的にする親油性小分子であってもよい。筋細胞を標的にしてもよい例示の親油性小分子は、コレステロール、コレステリル、ステアリン酸、パルミチン酸、オレイン酸、オレイル、リノレン酸、リノール酸、ミリスチン酸、ステロール、ジヒドロテストステロン、テストステロン誘導体、グリセリン、アルキル鎖、トリチル基、およびアルコキシ酸を含む化合物を包含する。
iv．筋標的化アプタマー
筋標的化剤は、他の細胞型と比べて優先的に筋細胞を標的にするアプタマー、例としてRNAアプタマーであってもよい。いくつかの態様において、筋標的化アプタマーはこれまでに特徴付けも開示もされていない。これらのアプタマーは、数種の方法論のいずれか、例として、指数関数的濃縮によるリガンドの体系的進化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)を使用して、想起、産生、合成、および/または(例として、および)、誘導体化されてもよい。例示の方法論は当該技術分野において特徴付けされており、参照により組み込まれる(Yan,A.C. and Levy,M.“Aptamers and aptamer targeted delivery” RNA biology,2009,6:3,316-20.;Germer,K.et al.“RNA aptamers and their therapeutic and diagnostic applications.”Int.J.Biochem.Mol.Biol.2013;4:27-40)。いくつかの態様において、筋標的化アプタマーはこれまでに開示されている(例として、Phillippou,S.et al.“Selection and Identification of Skeletal-Muscle-Targeted RNA Aptamers.”Mol Ther Nucleic Acids.2018,10:199-214.;Thiel,W.H.et al.“Smooth Muscle Cell-targeted RNA Aptamer Inhibits Neointimal Formation.”Mol Ther.2016,24:4,779-87を参照)。例示の筋標的化アプタマーは、A01B RNAアプタマーおよびRNA Apt 14を包含する。いくつかの態様において、アプタマーは、核酸をベースとしたアプタマー、オリゴヌクレオチドアプタマー、またはペプチドアプタマーである。いくつかの態様において、アプタマーは、約5～15kDa、約5～10kDa、約10～15kDa、約1～5Da、約1～3kDa、またはこれより小さいものであってもよい。
ｖ．他の筋標的化剤
筋細胞(例として、骨格筋細胞)を標的にするための1つのストラテジーは、筋線維鞘上に発現されたトランスポータータンパク質などの筋肉トランスポータータンパク質の基質を使用することである。いくつかの態様において、筋標的化剤は、筋組織に特異的な流入トランスポーターの基質である。いくつかの態様において、流入トランスポーターは、骨格筋組織に特異的である。骨格筋の筋線維鞘上に発現されるトランスポーターの二大クラスは、(1)骨格筋組織からの流出に容易にさせる、アデノシン三リン酸(ATP)結合カセット(ABC)スーパーファミリー、および(2)基質の骨格筋中への流入を容易にし得る、溶質輸送体(solute carrier)(SLC)スーパーファミリーである。いくつかの態様において、筋標的化剤は、トランスポーターのABCスーパーファミリーまたはSLCスーパーファミリーへ結合する基質である。いくつかの態様において、トランスポーターのABCまたはSLCスーパーファミリーへ結合する基質は、天然に存在する基質である。いくつかの態様において、トランスポーターのABCまたはSLCスーパーファミリーへ結合する基質は、天然に存在しない基質、例えば、トランスポーターのABCまたはSLCスーパーファミリーへ結合するその合成誘導体である。
いくつかの態様において、筋標的化剤は、トランスポーターのSLCスーパーファミリーを標的にする本明細書に記載のいずれの筋標的化剤(例として、抗体、核酸、小分子、ペプチド、アプタマー、脂質、糖部)でもある。いくつかの態様において、筋標的化剤は、トランスポーターのSLCスーパーファミリーの基質である。SLCトランスポーターは、平衡型であるか、または基質の輸送を推進させる膜にわたって創出されたプロトンもしくはナトリウムのイオン勾配を使用するかのいずれかである。骨格筋への高発現を有する例示のSLCトランスポーターは、限定せずに、SATTトランスポーター(ASCT1;SLC1A4)、GLUT4トランスポーター(SLC2A4)、GLUT7トランスポーター(GLUT7;SLC2A7)、ATRC2トランスポーター(CAT-2;SLC7A2)、LAT3トランスポーター(KIAA0245;SLC7A6)、PHT1トランスポーター(PTR4;SLC15A4)、OATP-Jトランスポーター(OATP5A1;SLC21A15)、OCT3トランスポーター(EMT;SLC22A3)、OCTN2トランスポーター(FLJ46769;SLC22A5)、ENTトランスポーター(ENT1;SLC29A1およびENT2;SLC29A2)、PAT2トランスポーター(SLC36A2)、およびSAT2トランスポーター(KIAA1382;SLC38A2)を包含する。これらのトランスポーターは、基質の骨格筋中への流入を容易にさせることで、筋標的化のための好機を提供し得る。
いくつかの態様において、筋標的化剤は、平衡型ヌクレオシドトランスポーター2(ENT2)トランスポーターの基質である。他のトランスポーターと比べて、ENT2は、骨格筋において最高発現するmRNAの1つを有する。ヒトENT2(hENT2)は、脳、心臓、胎盤、胸腺、膵臓、前立腺、および腎臓などのほとんどの体器官に発現されるものの、とくに骨格筋に豊富である。ヒトENT2は、その基質の取り込みを、それらの濃度勾配に応じて容易にさせる。ENT2は、広範なプリンおよびピリミジン核酸塩基を輸送することによってヌクレオシドホメオスタシスを維持する役割を果たす。hENT2トランスポーターは、イノシンを除くすべてのヌクレオシド(アデノシン、グアノシン、ウリジン、チミジン、およびシチジン)に対して低親和性を有する。結果的に、いくつかの態様において、筋標的化剤は、ENT2基質である。例示のENT2基質は、限定せずに、イノシン、2',3'-ジデオキシイノシン、およびクロファラビンを包含する。いくつかの態様において、本明細書に提供される筋標的化剤のいずれも、分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチドペイロード)に関連する。いくつかの態様において、筋標的化剤は、分子ペイロードへ共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、筋標的化剤は、分子ペイロードへ非共有結合的に連結されている。
いくつかの態様において、筋標的化剤は、ナトリウムイオン依存性の高親和性カルニチントランスポーターである有機カチオン/カルニチントランスポーター(OCTN2)の基質である。いくつかの態様において、筋標的化剤は、カルニチン、ミルドロネート、アセチルカルニチン、またはOCTN2へ結合するそのいずれかの誘導体である。いくつかの態様において、カルニチン、ミルドロネート、アセチルカルニチン、またはそれらの誘導体は、分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチドペイロード)へ共有結合的に連結されている。
筋標的化剤は、筋細胞を標的にする少なくとも1つの可溶性形態で存在するタンパク質であるタンパク質であってもよい。いくつかの態様において、筋標的化タンパク質は、鉄過剰およびホメオスタシスに関与するタンパク質ヘモジュベリン(またrepulsive guidance molecule Cまたはヘモクロマトーシスタイプ2タンパク質としても知られている)であってもよい。いくつかの態様において、ヘモジュベリンは、完全長もしくはフラグメントであっても、または機能的ヘモジュベリンタンパク質と少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％配列同一性をもつ突然変異体であってもよい。いくつかの態様において、ヘモジュベリン突然変異体は、可溶性フラグメントであってもよく、N末シグナリングを欠いていてもよく、および/または(例として、および)、C末アンカードメイン(anchoring domain)を欠いていてもよい。いくつかの態様において、ヘモジュベリンは、GenBank RefSeq受託番号NM_001316767.1、NM_145277.4、NM_202004.3、NM_213652.3、またはNM_213653.3の注釈付きのものであってもよい。ヘモジュベリンがヒト、霊長目の非ヒト動物、または齧歯類の動物を起源とするものであってもよいことは解されるはずである。
Ｂ．分子ペイロード
本開示のいくつかの側面は、分子ペイロード、例として、DMPK RNAを標的にして、DMPKの発現または活性をモジュレートするよう設計されたオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの態様において、DMPKの発現または活性をモジュレートすることは、DMPK RNAおよび/または(例として、および)タンパク質のレベルを低減することを含む。いくつかの態様において、DMPK RNAは、疾患に関連し、例として、疾患関連反復拡張を有するかまたは疾患関連反復拡張を有するアレルからコードされている。いくつかの態様において、DMPK RNAは、CUG反復拡張を含むか、またはそれがコードされるアレルは、CTG反復拡張を含む。いくつかの態様において、本開示は、例として筋強直性ジストロフィーを有するかまたはこれを有すると疑われる対象における、疾患関連反復拡張を有する有毒なDMPKのレベルを低減させるのに有用なDMPK RNAと相補的なオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、標的DMPK RNAのRNAe H媒介分解へ向かうによう設計されている。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、細胞(例として、筋細胞、例として、筋管)の核中に存在する標的DMPK RNAのRNAe H媒介分解へ向かうによう設計されている。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、細胞(例として、CNS細胞(例として、ニューロン))の核中に存在する標的DMPK RNAのRNAe H媒介分解へ向かうによう設計されている。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、所望のバイオアベイラビリティおよび/または血清-安定性という特性を有するよう設計されている。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、所望の結合親和性という特性を有するよう設計されている。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、所望の毒性プロファイルを有するよう設計されている。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、低い補体活性化および/またはサイトカイン誘導という特性を有するよう設計されている。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載の筋標的化剤へ連結されているか、またはそうでなければそれへ結び付けられている。いくつかの態様において、かかるオリゴヌクレオチドは、例として、筋細胞におけるDMPK配列への特異的な結合、これに続く、結び付けられた筋標的化剤による筋細胞への送達を介して、筋細胞においてDMPKを標的にすることが可能である。様々なタイプの筋標的化剤が本開示に従って使用されてもよいことは解されるはずである。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、疾患関連反復拡張を含むDMPKアレルに対する相補性の領域を含む。DMPK RNAを標的にする例示のオリゴヌクレオチドは、本明細書にさらに詳細に記載されているが、しかしながら、本明細書に提供される例示の分子ペイロードが、限定されることを意図していないことは解されるはずである。
ｉ．オリゴヌクレオチド
いくつかの態様において、本明細書に記載のDMPK標的化オリゴヌクレオチドは、DMPK mRNAのRNase H媒介分解を引き起こすよう設計されている。いくつかの態様において、一方のフォーマット(format)からの機能的配列(例として、アンチセンス鎖配列)を他方のフォーマットへ組み込むことによって、あるフォーマットのオリゴヌクレオチド(例として、アンチセンスオリゴヌクレオチド)が、別のフォーマット(例として、siRNAオリゴヌクレオチド)へ好適に適応されてもよいことは解されるはずである。
DMPKを標的にするために有用なオリゴヌクレオチドの例は、Compound And Method For Treating Myotonic Dystrophyと題する2010年1月1日に公開された米国特許出願刊行物20100016215A1号;Modulation Of Dystrophia Myotonica-Protein Kinase(DMPK)Expressionと題する2010年7月19日に公開された米国特許出願刊行物20130237585A1号;「Antisense Conjugates For Decreasing Expression Of Dmpk」と題する2015年3月5日に公開された米国特許出願刊行物20150064181A1号;「Peptide-Linked Morpholino Antisense Oligonucleotides For Treatment Of Myotonic Dystrophy」と題する2015年8月27日に公開された米国特許出願刊行物20150238627A1号;および「Compounds And Methods For Modulation Of Dystrophia Myotonica-Protein Kinase (Dmpk) Expression」と題する2016年10月20日に公開された米国特許出願刊行物20160304877A1に提供され、これら各々の内容全体は本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ヒトDMPK遺伝子配列(Gene ID 1760; NM_001081560.2)の例である、以下に表される配列に対する相補性の領域を有していてもよい:
AGGGGGGCTGGACCAAGGGGTGGGGAGAAGGGGAGGAGGCCTCGGCCGGCCGCAGAGAGAAGTGGCCAGAGAGGCCCAGGGGACAGCCAGGGACAGGCAGACATGCAGCCAGGGCTCCAGGGCCTGGACAGGGGCTGCCAGGCCCTGTGACAGGAGGACCCCGAGCCCCCGGCCCGGGGAGGGGCCATGGTGCTGCCTGTCCAACATGTCAGCCGAGGTGCGGCTGAGGCGGCTCCAGCAGCTGGTGTTGGACCCGGGCTTCCTGGGGCTGGAGCCCCTGCTCGACCTTCTCCTGGGCGTCCACCAGGAGCTGGGCGCCTCCGAACTGGCCCAGGACAAGTACGTGGCCGACTTCTTGCAGTGGGCGGAGCCCATCGTGGTGAGGCTTAAGGAGGTCCGACTGCAGAGGGACGACTTCGAGATTCTGAAGGTGATCGGACGCGGGGCGTTCAGCGAGGTAGCGGTAGTGAAGATGAAGCAGACGGGCCAGGTGTATGCCATGAAGATCATGAACAAGTGGGACATGCTGAAGAGGGGCGAGGTGTCGTGCTTCCGTGAGGAGAGGGACGTGTTGGTGAATGGGGACCGGCGGTGGATCACGCAGCTGCACTTCGCCTTCCAGGATGAGAACTACCTGTACCTGGTCATGGAGTATTACGTGGGCGGGGACCTGCTGACACTGCTGAGCAAGTTTGGGGAGCGGATTCCGGCCGAGATGGCGCGCTTCTACCTGGCGGAGATTGTCATGGCCATAGACTCGGTGCACCGGCTTGGCTACGTGCACAGGGACATCAAACCCGACAACATCCTGCTGGACCGCTGTGGCCACATCCGCCTGGCCGACTTCGGCTCTTGCCTCAAGCTGCGGGCAGATGGAACGGTGCGGTCGCTGGTGGCTGTGGGCACCCCAGACTACCTGTCCCCCGAGATCCTGCAGGCTGTGGGCGGTGGGCCTGGGACAGGCAGCTACGGGCCCGAGTGTGACTGGTGGGCGCTGGGTGTATTCGCCTATGAAATGTTCTATGGGCAGACGCCCTTCTACGCGGATTCCACGGCGGAGACCTATGGCAAGATCGTCCACTACAAGGAGCACCTCTCTCTGCCGCTGGTGGACGAAGGGGTCCCTGAGGAGGCTCGAGACTTCATTCAGCGGTTGCTGTGTCCCCCGGAGACACGGCTGGGCCGGGGTGGAGCAGGCGACTTCCGGACACATCCCTTCTTCTTTGGCCTCGACTGGGATGGTCTCCGGGACAGCGTGCCCCCCTTTACACCGGATTTCGAAGGTGCCACCGACACATGCAACTTCGACTTGGTGGAGGACGGGCTCACTGCCATGGAGACACTGTCGGACATTCGGGAAGGTGCGCCGCTAGGGGTCCACCTGCCTTTTGTGGGCTACTCCTACTCCTGCATGGCCCTCAGGGACAGTGAGGTCCCAGGCCCCACACCCATGGAACTGGAGGCCGAGCAGCTGCTTGAGCCACACGTGCAAGCGCCCAGCCTGGAGCCCTCGGTGTCCCCACAGGATGAAACAGCTGAAGTGGCAGTTCCAGCGGCTGTCCCTGCGGCAGAGGCTGAGGCCGAGGTGACGCTGCGGGAGCTCCAGGAAGCCCTGGAGGAGGAGGTGCTCACCCGGCAGAGCCTGAGCCGGGAGATGGAGGCCATCCGCACGGACAACCAGAACTTCGCCAGTCAACTACGCGAGGCAGAGGCTCGGAACCGGGACCTAGAGGCACACGTCCGGCAGTTGCAGGAGCGGATGGAGTTGCTGCAGGCAGAGGGAGCCACAGCTGTCACGGGGGTCCCCAGTCCCCGGGCCACGGATCCACCTTCCCATCTAGATGGCCCCCCGGCCGTGGCTGTGGGCCAGTGCCCGCTGGTGGGGCCAGGCCCCATGCACCGCCGCCACCTGCTGCTCCCTGCCAGGGTCCCTAGGCCTGGCCTATCGGAGGCGCTTTCCCTGCTCCTGTTCGCCGTTGTTCTGTCTCGTGCCGCCGCCCTGGGCTGCATTGGGTTGGTGGCCCACGCCGGCCAACTCACCGCAGTCTGGCGCCGCCCAGGAGCCGCCCGCGCTCCCTGAACCCTAGAACTGTCTTCGACTCCGGGGCCCCGTTGGAAGACTGAGTGCCCGGGGCACGGCACAGAAGCCGCGCCCACCGCCTGCCAGTTCACAACCGCTCCGAGCGTGGGTCTCCGCCCAGCTCCAGTCCTGTGATCCGGGCCCGCCCCCTAGCGGCCGGGGAGGGAGGGGCCGGGTCCGCGGCCGGCGAACGGGGCTCGAAGGGTCCTTGTAGCCGGGAATGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGGGGGGATCACAGACCATTTCTTTCTTTCGGCCAGGCTGAGGCCCTGACGTGGATGGGCAAACTGCAGGCCTGGGAAGGCAGCAAGCCGGGCCGTCCGTGTTCCATCCTCCACGCACCCCCACCTATCGTTGGTTCGCAAAGTGCAAAGCTTTCTTGTGCATGACGCCCTGCTCTGGGGAGCGTCTGGCGCGATCTCTGCCTGCTTACTCGGGAAATTTGCTTTTGCCAAACCCGCTTTTTCGGGGATCCCGCGCCCCCCTCCTCACTTGCGCTGCTCTCGGAGCCCCAGCCGGCTCCGCCCGCTTCGGCGGTTTGGATATTTATTGACCTCGTCCTCCGACTCGCTGACAGGCTACAGGACCCCCAACAACCCCAATCCACGTTTTGGATGCACTGAGACCCCGACATTCCTCGGTATTTATTGTCTGTCCCCACCTAGGACCCCCACCCCCGACCCTCGCGAATAAAAGGCCCTCCATCTGCCCAAAGCTCTGGA(配列番号130)。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、マウスDMPK遺伝子配列(Gene ID 13400;NM_001190490.1)の例である、以下に表される配列に対する相補性の領域を有していてもよい:
GAACTGGCCAGAGAGACCCAAGGGATAGTCAGGGACGGGCAGACATGCAGCTAGGGTTCTGGGGCCTGGACAGGGGCAGCCAGGCCCTGTGACGGGAAGACCCCGAGCTCCGGCCCGGGGAGGGGCCATGGTGTTGCCTGCCCAACATGTCAGCCGAAGTGCGGCTGAGGCAGCTCCAGCAGCTGGTGCTGGACCCAGGCTTCCTGGGACTGGAGCCCCTGCTCGACCTTCTCCTGGGCGTCCACCAGGAGCTGGGTGCCTCTCACCTAGCCCAGGACAAGTATGTGGCCGACTTCTTGCAGTGGGTGGAGCCCATTGCAGCAAGGCTTAAGGAGGTCCGACTGCAGAGGGATGATTTTGAGATTTTGAAGGTGATCGGGCGTGGGGCGTTCAGCGAGGTAGCGGTGGTGAAGATGAAACAGACGGGCCAAGTGTATGCCATGAAGATTATGAATAAGTGGGACATGCTGAAGAGAGGCGAGGTGTCGTGCTTCCGGGAAGAAAGGGATGTATTAGTGAAAGGGGACCGGCGCTGGATCACACAGCTGCACTTTGCCTTCCAGGATGAGAACTACCTGTACCTGGTCATGGAATACTACGTGGGCGGGGACCTGCTAACGCTGCTGAGCAAGTTTGGGGAGCGGATCCCCGCCGAGATGGCTCGCTTCTACCTGGCCGAGATTGTCATGGCCATAGACTCCGTGCACCGGCTGGGCTACGTGCACAGGGACATCAAACCAGATAACATTCTGCTGGACCGATGTGGGCACATTCGCCTGGCAGACTTCGGCTCCTGCCTCAAACTGCAGCCTGATGGAATGGTGAGGTCGCTGGTGGCTGTGGGCACCCCGGACTACCTGTCTCCTGAGATTCTGCAGGCCGTTGGTGGAGGGCCTGGGGCAGGCAGCTACGGGCCAGAGTGTGACTGGTGGGCACTGGGCGTGTTCGCCTATGAGATGTTCTATGGGCAGACCCCCTTCTACGCGGACTCCACAGCCGAGACATATGCCAAGATTGTGCACTACAGGGAACACTTGTCGCTGCCGCTGGCAGACACAGTTGTCCCCGAGGAAGCTCAGGACCTCATTCGTGGGCTGCTGTGTCCTGCTGAGATAAGGCTAGGTCGAGGTGGGGCAGACTTCGAGGGTGCCACGGACACATGCAATTTCGATGTGGTGGAGGACCGGCTCACTGCCATGGTGAGCGGGGGCGGGGAGACGCTGTCAGACATGCAGGAAGACATGCCCCTTGGGGTGCGCCTGCCCTTCGTGGGCTACTCCTACTGCTGCATGGCCTTCAGAGACAATCAGGTCCCGGACCCCACCCCTATGGAACTAGAGGCCCTGCAGTTGCCTGTGTCAGACTTGCAAGGGCTTGACTTGCAGCCCCCAGTGTCCCCACCGGATCAAGTGGCTGAAGAGGCTGACCTAGTGGCTGTCCCTGCCCCTGTGGCTGAGGCAGAGACCACGGTAACGCTGCAGCAGCTCCAGGAAGCCCTGGAAGAAGAGGTTCTCACCCGGCAGAGCCTGAGCCGCGAGCTGGAGGCCATCCGGACCGCCAACCAGAACTTCTCCAGCCAACTACAGGAGGCCGAGGTCCGAAACCGAGACCTGGAGGCGCATGTTCGGCAGCTACAGGAACGGATGGAGATGCTGCAGGCCCCAGGAGCCGCAGCCATCACGGGGGTCCCCAGTCCCCGGGCCACGGATCCACCTTCCCATCTAGATGGCCCCCCGGCCGTGGCTGTGGGCCAGTGCCCGCTGGTGGGGCCAGGCCCCATGCACCGCCGTCACCTGCTGCTCCCTGCCAGGATCCCTAGGCCTGGCCTATCCGAGGCGCGTTGCCTGCTCCTGTTCGCCGCTGCTCTGGCTGCTGCCGCCACACTGGGCTGCACTGGGTTGGTGGCCTATACCGGCGGTCTCACCCCAGTCTGGTGTTTCCCGGGAGCCACCTTCGCCCCCTGAACCCTAAGACTCCAAGCCATCTTTCATTTAGGCCTCCTAGGAAGGTCGAGCGACCAGGGAGCGACCCAAAGCGTCTCTGTGCCCATCGCGCCCCCCCCCCCCCCCCACCGCTCCGCTCCACACTTCTGTGAGCCTGGGTCCCCACCCAGCTCCGCTCCTGTGATCCAGGCCTGCCACCTGGCGGCCGGGGAGGGAGGAACAGGGCTCGTGCCCAGCACCCCTGGTTCCTGCAGAGCTGGTAGCCACCGCTGCTGCAGCAGCTGGGCATTCGCCGACCTTGCTTTACTCAGCCCCGACGTGGATGGGCAAACTGCTCAGCTCATCCGATTTCACTTTTTCACTCTCCCAGCCATCAGTTACAAGCCATAAGCATGAGCCCCCTATTTCCAGGGACATCCCATTCCCATAGTGATGGATCAGCAAGACCTCTGCCAGCACACACGGAGTCTTTGGCTTCGGACAGCCTCACTCCTGGGGGTTGCTGCAACTCCTTCCCCGTGTACACGTCTGCACTCTAACAACGGAGCCACAGCTGCACTCCCCCCTCCCCCAAAGCAGTGTGGGTATTTATTGATCTTGTTATCTGACTCACTGACAGACTCCGGGACCCACGTTTTAGATGCATTGAGACTCGACATTCCTCGGTATTTATTGTCTGTCCCCACCTACGACCTCCACTCCCGACCCTTGCGAATAAAATACTTCTGGTCTGCCCTAAA (配列番号131)。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、例として、ヒト、マウスおよび非ヒト種から選択される、複数の種のDMPK遺伝子配列に対する相補性の領域を有していてもよい。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMPKの突然変異型、例えば、Botta A. et al.“The CTG repeat expansion size correlates with the splicing defects observed in muscles from myotonic dystrophy type 1 patients.”J Med Genet.2008 Oct;45(10):639-46.;およびMachuca-Tzili L. et al.“Clinical and molecular aspects of the myotonic dystrophies: a review.”Muscle Nerve.2005 Jul;32(1):1-18.(これら各々の内容全体は本明細書に組み込まれる)で報告された突然変異型に対する相補性の領域を有してもよい。
いくつかの態様において、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドは、DMPKを標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチド標的化は、参照により本明細書に組み込まれる「Compounds And Methods For Modulation Of Dystrophia Myotonica-Protein Kinase (DMPK) Expression」と題する2016年10月20日に公開された米国特許出願刊行物US20160304877A1号に記載された、DMPKを標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチド(例として、Gapmer)のいずれか1つである。いくつかの態様において、DMPK標的化オリゴヌクレオチドは、Genbank受託番号NM_001081560.2(配列番号130)で表されるまたはGenbank受託番号NG_009784.1で表されるDMPK遺伝子配列の領域を標的にする。
いくつかの態様において、DMPK標的化オリゴヌクレオチドは、配列番号130中の少なくとも10の一続きのヌクレオチド(例として、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18、少なくとも20、またはそれ以上の一続きのヌクレオチド)である標的領域に相補的な領域を含むヌクレオチド配列を含む。
いくつかの態様において、DMPK標的化オリゴヌクレオチドは、gapmerモチーフを含む。「gapmer」は、RNase H切断を支持する複数のヌクレオチドを有する内部領域が、1以上のヌクレオチドを有する外部領域の間に位置されるキメラのアンチセンス化合物を意味し、ここで内部領域を含むヌクレオチドは、ヌクレオチドまたは外部領域を含むヌクレオチドとは化学的に別個である。内部領域は「gapセグメント」と称され得、および外部領域は「wingセグメント」と称され得る。いくつかの態様において、DMPK標的化オリゴヌクレオチドは、1以上の修飾ヌクレオチド、および/または(例として、および)1以上の修飾ヌクレオシド間連結を含む。いくつかの態様において、ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオアート連結である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、完全なホスホロチオアート主鎖を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、cET末を伴うDNA gapmer(例として、3-10-3;cET-DNA-cET)である。いくつかの態様において、DMPK標的化オリゴヌクレオチドは、1以上の6'-(S)-CH3二環式ヌクレオチド、1以上のβ-D-2'-デオキシリボヌクレオチド、および/または(例として、および)1以上の5メチル-シトシンヌクレオチドを含む。
ａ．オリゴヌクレオチドサイズ/配列
オリゴヌクレオチドは、例としてフォーマットに応じて、様々な異なる長さのものであってもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、長さが7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75ヌクレオチドであるか、またはこれより長い。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、長さが8～50ヌクレオチド、長さが8～40ヌクレオチド、長さが8～30ヌクレオチド、長さが10～15ヌクレオチド、長さが10～20ヌクレオチド、長さが15～25ヌクレオチド、長さが21～23ヌクレオチド等々である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、長さが15～20ヌクレオチドまたは長さが20～25ヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本開示の目的上オリゴヌクレオチドの相補的な核酸配列は、前記配列の標的分子(例として、mRNA)への結合が標的(例として、mRNA)の正常な機能に干渉して活性の喪失(例として、翻訳の阻害)または発現の喪失(例として、標的mRNAの分解)を引き起こしたとき、かつ非特異的結合の回避が所望される条件下、例として、in vivoアッセイまたは治療処置のケースおよびin vitroアッセイのケースにおける生理学的な条件下、アッセイがストリンジェンシー(stringency)の好適な条件下で実施される条件下で、前記配列の非標的配列への非特異的結合を回避するのに充分な程度の相補性があるとき、標的核酸に特異的にハイブリダイズ可能であるか、または標的核酸に特異的である。よって、いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、標的核酸の連続したヌクレオチドに少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または100％相補的であってもよい。いくつかの態様において、相補的なヌクレオチド配列は、標的核酸に特異的にハイブリダイズ可能であるか、または標的核酸に特異的であるその標的の配列に100％相補的である必要はない。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、標的核酸と比べて1以上のミスマッチ核酸塩基を含む。いくつかの態様において、標的に関する活性は、かかるミスマッチによって低減されるが、非標的に関する活性は、より大きく(by a greater amount)低減される(すなわち、標的核酸に対する選択性は増大し、かつオフターゲット効果は減少する)。いくつかの態様において、標的核酸は、pre-mRNA分子またはmRNA分子である。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、長さが8～15、8～30、8～40、または10～50、または5～50、または5～40ヌクレオチドの範囲にある標的核酸に対する相補性の領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、長さが15～20または20～25ヌクレオチドの範囲にある核酸を標的にする相補性の領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドの、標的核酸に対する相補性の領域は、長さが5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50ヌクレオチドである。いくつかの態様において、相補性の領域は、標的核酸の少なくとも連続した8ヌクレオチドと相補的である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、標的核酸の一部の連続したヌクレオチドと比較して1、2または3塩基ミスマッチを含有していてもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、15塩基にわたり最大3ミスマッチまで、または10塩基にわたり最大2ミスマッチまで有していてもよい。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号173～192および196～201のいずれか1つを含む配列の少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20の一続きのヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号173～192および196～201のいずれか1つを含む配列を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号173～192および196～201のいずれか1つの少なくとも12または少なくとも15の一続きのヌクレオチドと少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、または97％配列同一性を共有する配列を含む。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号160～172および193～195のいずれか1つで表されるヌクレオチド配列に対する相補性の領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号160～172および193～195のいずれか1つで表されるヌクレオチド配列に対して相補的である少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチド(例として、連続したヌクレオチド)を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号160～172および193～195のいずれか1つの少なくとも12または少なくとも15の一続きのヌクレオチドと少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％;99％、または100％相補的である配列を含む。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチド(例として、表8に列挙されるオリゴヌクレオチド)のいずれか1つの標的配列に対して相補的である(例として、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または100％)。いくつかの態様において、かかる標的配列は、表8または表17に列挙されるオリゴヌクレオチドに対して100％相補的である。
いくつかの態様において、核酸塩基ウラシルのC5位置でのメチル化がチミンを形成することは解されるはずである。よって、いくつかの態様において、C5メチル化ウラシル(もしくは5-メチル-ウラシル)を有するヌクレオチドまたはヌクレオシドは、チミンヌクレオチドまたはヌクレオシドとして等価に同定されてもよい。
いくつかの態様において、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチド(例として、表8に列挙されるオリゴヌクレオチド)のいずれか1つのチミン塩基(T)の1以上は、独立におよび任意に、ウラシル塩基(U)であってもよく、および/または、Uのいずれか1以上は、独立におよび任意に、Tであってもよい。
ｂ．オリゴヌクレオチド修飾:
本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、修飾されていてもよく、例として、修飾された糖部、修飾されたヌクレオシド間連結、修飾ヌクレオチド、および/またはそれらの組み合わせを含む。加えて、いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、以下の特性の1以上を呈してもよい:選択的スプライシングを媒介しない;免疫刺激性ではない;ヌクレアーゼ抵抗性である;非修飾オリゴヌクレオチドと比較して改善された細胞取り込みを有する;細胞または哺乳動物への毒性がない;改善されたエンドソームの内部への出口(exit)を細胞中に有する;TLR刺激を最小限に抑える;または、パターン認識受容体を回避する。本明細書に記載のオリゴヌクレオチドの修飾された化学的性質またはフォーマットのいずれも、互いに組み合わせられ得る。例えば、1、2、3、4、5、またはこれより多くの異なるタイプの修飾が、同じオリゴヌクレオチド内に包含され得る。
いくつかの態様において、修飾が組み込まれるオリゴヌクレオチドを、ネイティブなオリゴデオキシヌクレオチド分子またはオリゴリボヌクレオチド分子よりヌクレアーゼ消化に耐性があるようにさせる、特定のヌクレオチド修飾が使用されてもよい;これらの修飾されたオリゴヌクレオチドは、非修飾オリゴヌクレオチドより長時間無傷で存続する。修飾されたオリゴヌクレオチドの特定例は、修飾された主鎖、例えば、ホスホロチオアート、ホスホトリエステル、メチルホスホナート、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間連結、または短鎖ヘテロ原子のもしくは複素環式の糖間連結などの修飾されたヌクレオシド間連結を含むものを包含する。結果的に、本開示のオリゴヌクレオチドは、修飾、例として、ヌクレオチド修飾の組み込みなどによる核酸分解に対して安定化され得る。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの2～10、2～15、2～16、2～17、2～18、2～19、2～20、2～25、2～30、2～40、2～45ヌクレオチド、またはこれより多いヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである、長さが最大50ヌクレオチドまでまたは最大100ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドであってもよい。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの2～10、2～15、2～16、2～17、2～18、2～19、2～20、2～25、2～30ヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである、長さが8～30ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであってもよい。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの2～4、2～5、2～6、2～7、2～8、2～9、2～10、2～11、2～12、2～13、2～14ヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである、長さが8～15ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであってもよい。任意に、オリゴヌクレオチドは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10ヌクレオチドを除き、どのヌクレオチドも修飾されていてもよい。オリゴヌクレオチド修飾は本明細書にさらに記載されている。
ｃ．修飾ヌクレオシド
いくつかの態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、糖の2'位において修飾された少なくとも1つのヌクレオシドを含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは少なくとも1つの2'修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチド上のヌクレオシドのすべては2'修飾ヌクレオシドである。
修飾ヌクレオチド、例として、2'-デオキシ、2'-フルオロ(2'-F)、2'-O-メチル(2'-O-Me)、2'-O-メトキシエチル(2'-O-MOE)、2'-O-アミノプロピル(2'-O-AP)、2'-O-ジメチルアミノエチル(2'-O-DMAOE)、2'-O-ジメチルアミノプロピル(2'-O-DMAP)、2'-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2'-O-DMAEOE)、または2'-O--N-メチルアセトアミド(2'-O--NMA)の修飾ヌクレオシドを包含する。
いくつかの態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、1以上の2'-4'二環式ヌクレオシドを含むが、前記ヌクレオシド中リボース環は、その環中2個の原子を接続する(例として、メチレン(LNA)架橋、エチレン(ENA)架橋、または(S)-拘束エチル(cEt)架橋を介して、2'-O原子を4'-C原子へ接続する)架橋部分を含む。LNAの例は、2008年4月17日に公開され「RNA Antagonist Compounds For The Modulation Of PCSK9」と題する国際特許出願刊行物WO/2008/043753(この内容は、その全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる)に記載されている。本明細書に開示のオリゴヌクレオチドに使用されてもよい他の修飾は、エチレン架橋核酸(ENA)を包含する。ENAは、これらに限定されないが、2'-O,4'-C-エチレン架橋核酸を包含する。ENAの例は、2005年5月12日に公開され「APP/ENA Antisense」と題する国際特許刊行物第WO 2005/042777号;Morita et al.,Nucleic Acid Res.,Suppl 1:241-242,2001;Surono et al.,Hum.Gene Ther.,15:749-757,2004;Koizumi,Curr.Opin.Mol.Ther.,8:144-149,2006;およびHorie et al.,Nucleic Acids Symp.Ser(Oxf),49:171-172,2005に提供されており、これらの開示はそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。cEtの例は、米国特許7,101,993;7,399,845および7,569,686に提供されており、これら各々はそれら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、以下の米国特許または特許出願刊行物のうち1つに開示された修飾ヌクレオシドを含む:米国特許7,399,845、2008年7月15日発行、表題「6-Modified Bicyclic Nucleic Acid Analogs」;米国特許7,741,457、2010年6月22日発行、表題「6-Modified Bicyclic Nucleic Acid Analogs」;米国特許8,022,193、2011年9月20日発行、表題「6-Modified Bicyclic Nucleic Acid Analogs」;米国特許7,569,686、2009年8月4日発行、表題「Compounds And Methods For Synthesis Of Bicyclic Nucleic Acid Analogs」;米国特許7,335,765、2008年2月26日発行、表題「Novel Nucleoside And Oligonucleotide Analogues」;米国特許7,314,923、2008年1月1日発行、表題「Novel Nucleoside And Oligonucleotide Analogues」;米国特許7,816,333、2010年10月19日発行、表題「Oligonucleotide Analogues And Methods Utilizing The Same」および米国刊行物第2011/0009471号、現在米国特許8,957,201、2015年2月17日発行、表題「Oligonucleotide Analogues And Methods Utilizing The Same」、すべての用途において(for all purposes)、これら各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの修飾ヌクレオシドも有さないオリゴヌクレオチドと比較して、1℃、2℃、3℃、4℃、または5℃の範囲にあるオリゴヌクレオチドのTmの増大をもたらす少なくとも1つの修飾ヌクレオシドを含む。オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシドを有さないオリゴヌクレオチドと比較して、合計で2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、またはこれを超える温度の範囲にあるオリゴヌクレオチドのTmの増大をもたらす複数の修飾ヌクレオシドを有していてもよい。
オリゴヌクレオチドは、異なる種類のヌクレオシドのミックスを含み得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、2'-デオキシリボヌクレオシドまたはリボヌクレオシドおよび2'-フルオロ修飾ヌクレオシドのミックスを含み得る。オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオシドまたはリボヌクレオシドおよび2'-O-Me修飾ヌクレオシドのミックスを含み得る。オリゴヌクレオチドは、2'-フルオロ修飾ヌクレオシドおよび2'-O-メチル修飾ヌクレオシドのミックスを含み得る。オリゴヌクレオチドは、架橋ヌクレオシドおよび2'-フルオロまたは2'-O-メチル修飾ヌクレオシドのミックスを含み得る。オリゴヌクレオチドは、非二環式2'-修飾ヌクレオシド(例として、2'-O-MOE)および2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNA、ENA、cEt)のミックスを含み得る。オリゴヌクレオチドは、2'-フルオロ修飾ヌクレオシドおよび2'-O-Me修飾ヌクレオシドのミックスを含み得る。オリゴヌクレオチドは、2'-4'二環式ヌクレオシドおよび2'MOE、2'-フルオロ、または2'-O-Me修飾ヌクレオシドのミックスを含み得る。オリゴヌクレオチドは、非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOE、2'-フルオロ、または2'-O-Me)および2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNA、ENA、cEt)のミックスを含み得る。
オリゴヌクレオチドは、異なる種類の交互のヌクレオシドを含み得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、交互の2'-デオキシリボヌクレオシドまたはリボヌクレオシドおよび2'-フルオロ修飾ヌクレオシドを含み得る。オリゴヌクレオチドは、交互のデオキシリボヌクレオシドまたはリボヌクレオシドおよび2'-O-Me修飾ヌクレオシドを含み得る。オリゴヌクレオチドは、交互の2'-フルオロ修飾ヌクレオシドおよび2'-O-Me修飾ヌクレオシドを含み得る。オリゴヌクレオチドは、交互の架橋ヌクレオシドおよび2'-フルオロまたは2'-O-メチル修飾ヌクレオシドを含み得る。オリゴヌクレオチドは、交互の非二環式2'-修飾ヌクレオシド(例として、2'-O-MOE)および2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNA、ENA、cEt)を含み得る。オリゴヌクレオチドは、交互の2'-4'二環式ヌクレオシドおよび2'-MOE、2'-フルオロ、または2'-O-Me修飾ヌクレオシドを含み得る。オリゴヌクレオチドは、交互の非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOE、2'-フルオロ、または2'-O-Me)および2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNA、ENA、cEt)を含み得る。
いくつかの態様においては、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、5'-ビニルホスホン酸修飾、1以上の無塩基残基、および/または1以上の逆向きの無塩基残基を含む。
ｄ．ヌクレオシド間連結/主鎖
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオアートまたは他の修飾ヌクレオシド間連結を含有していてもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結を、少なくとも2ヌクレオシドの間に含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結を、すべてのヌクレオシド間に含む。例えば、いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド間連結を、ヌクレオチド配列の5'末または3'末の、第1の、第2の、および/または(例として、および)、第3のヌクレオシド間連結にて含む。
使用されてもよい、リンを含有する連結は、これらに限定されないが、正常な3'-5'連結、これらの2'-5'連結類似体を有する、ホスホロチオアート、キラルのホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホナート(3'アルキレンホスホナートおよびキラルのホスホナートを含む)、ホスフィナート、ホスホロアミダート(3'-アミノホスホロアミダートおよびアミノアルキルホスホロアミダートを含む)、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびにボラノホスファートと、逆方向の極性を有するこれら(ここでヌクレオシド単位の隣接する対は3'-5'から5'-3'へまたは2'-5'から5'-2'へ連結されている)とを包含する;米国特許第3,687,808号;第4,469,863号;第4,476,301号;第5,023,243号;第5,177,196号;第5,188,897号;第5,264,423号;第5,276,019号;第5,278,302号;第5,286,717号;第5,321,131号;第5,399,676号;第5,405,939号;第5,453,496号;第5,455,233号;第5,466,677号;第5,476,925号;第5,519,126号;第5,536,821号;第5,541,306号;第5,550,111号;第5,563,253号;第5,571,799号;第5,587,361号;および第5,625,050号を参照。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、メチレン(メチルイミノ)またはMMI主鎖;アミド主鎖(De Mesmaeker et al.Ace.Chem.Res.1995,28:366-374を参照);モルホリノ主鎖(SummertonおよびWeller、米国特許第5,034,506号を参照);またはペプチド核酸(PNA)主鎖(ここでオリゴヌクレオチドのホスホジエステル主鎖がポリアミド主鎖に置き換えられており、ヌクレオチドがポリアミド主鎖のアザ窒素原子へ直接的または間接的に結合されている、Nielsen et al.,Science 1991,254,1497を参照)などのヘテロ原子主鎖を有していてもよい。
ｅ．立体特異的オリゴヌクレオチド
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間のリン原子はキラルであり、およびオリゴヌクレオチドの特性はキラルのリン原子の立体配置に基づき調整される。いくつかの態様において、適切な方法は、立体制御されたやり方(例として、Oka N, Wada T, Stereocontrolled synthesis of oligonucleotide analogs containing chiral internucleotidic phosphorus atoms.Chem Soc Rev.2011 Dec;40(12):5829-43に記載のとおりの)でP-キラルオリゴヌクレオチド類似体を合成するために使用されてもよい。いくつかの態様において、実質的にすべてのSpホスホロチオアート糖間連結または実質的にすべてのRpホスホロチオアート糖間連結のいずれかによって一緒に結び合わされたヌクレオシド単位を含む、ホスホロチオアート含有オリゴヌクレオチドが提供される。いくつかの態様において、実質的にキラル純粋な糖間連結を有するかかるホスホロチオアートオリゴヌクレオチドは、例えば、1996年12月12日に発行された米国特許5,587,261(この内容は全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる)に記載されるとおり、酵素合成または化学合成によって調製される。いくつかの態様において、キラル制御されたオリゴヌクレオチドは、標的核酸の選択的切断パターンを提供する。例えば、いくつかの態様において、キラル制御されたオリゴヌクレオチドは、例えば、2017年2月2日に公開された表題「CHIRAL DESIGN」の米国特許出願刊行物20170037399 A1(この内容は全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる)に記載のとおり、核酸の相補的な配列内に単一の切断部位を提供する。
ｈ．Gapmer
いくつかの態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、gapmerである。gapmerオリゴヌクレオチドは一般に、ギャップ領域Yを囲むフランキング(flanking)領域としてXおよびZをもつ式5'-X-Y-Z-3'を有する。いくつかの態様において、式5'-X-Y-Z-3'のフランキング領域Xは、X領域、フランキング配列X、5'ウイング領域X、または5'ウイングセグメントともまた言われる。いくつかの態様において、式5'-X-Y-Z-3'のフランキング領域ZはZ領域、フランキング配列Z、3'ウイング領域Z、または3'ウイングセグメントともまた言われる。いくつかの態様において、式5'-X-Y-Z-3'のギャップ領域YはY領域、Yセグメント、またはギャップセグメントYともまた言われる。いくつかの態様において、ギャップ領域Yの各ヌクレオシドは2'-デオキシリボヌクレオシドであり、5'ウイング領域Xも3'ウイング領域Zもいずれかの2'-デオキシリボヌクレオシドを含有しない。いくつかの態様において、gapmerオリゴヌクレオチドは、表8に提供される標的配列(例として、配列番号160～172のいずれか1つ)の、少なくとも15の連続したヌクレオシド(例として、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、もしくは20の連続したヌクレオシド)に対する相補性の領域を含むか、および/または、表8に提供されるアンチセンス配列、gapmer配列、もしくはASO構造(例として、配列番号173～192のいずれか1つ)のヌクレオチド配列の、少なくとも15の連続したヌクレオシド(例として、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、もしくは20の連続したヌクレオシド)を含むが、ここで各チミン塩基(T)は、独立におよび任意に、ウラシル塩基(U)に置き換えられていてもよく、および各Uは、独立におよび任意に、Tに置き換えられていてもよい。
いくつかの態様において、Y領域は、RNAse HなどのRNAseをリクルートすることができる一続きのヌクレオチド、例えば6つ以上のDNAヌクレオチドの領域である。いくつかの態様において、gapmerは標的核酸に結合し、この点において、RNAseがリクルートされ、それから標的核酸を切断し得る。いくつかの態様において、Y領域は、高親和性修飾ヌクレオシド、例えば1から6つの高親和性修飾ヌクレオシドを含む領域XおよびZによって5'および3'両方をフランキングされる。高親和性修飾ヌクレオシドの例は、2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOE、2'O-Me、2'-F)または2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNA、cEt、ENA)を包含するが、これらに限定されない。いくつかの態様において、フランキング配列XおよびZは長さが1～20ヌクレオチド、1～8ヌクレオチド、または1～5ヌクレオチドであり得る。フランキング配列XおよびZは類似の長さまたは非類似の長さであり得る。いくつかの態様において、ギャップセグメントYは、長さが5～20ヌクレオチド、5～15ヌクレオチド、5～12ヌクレオチド、または6～10ヌクレオチドのヌクレオチド配列であり得る。
いくつかの態様において、gapmerオリゴヌクレオチドのギャップ領域は、DNAヌクレオチドに加えて、効率的なRNase H作用にとって許容されることが知られている修飾ヌクレオチド、例えばC4'置換ヌクレオチド、非環状ヌクレオチド、およびアラビノ型ヌクレオチドを含有し得る。いくつかの態様において、ギャップ領域は1以上の未修飾のヌクレオシド間連結を含む。いくつかの態様において、一方または両方のフランキング領域は、各々独立して、1以上のホスホロチオアートヌクレオシド間連結(例として、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結または他の連結)を少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、またはより多くのヌクレオチド間に含む。いくつかの態様において、ギャップ領域および2つのフランキング領域は、各々が独立して、修飾されたヌクレオシド間連結(例として、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結または他の連結)を少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、またはより多くのヌクレオチド間に含む。
gapmerは適切な方法を使用して生じ得る。gapmerの調製を教示する代表的な米国特許、米国特許公開、およびPCT公開は、米国特許第5,013,830号;第5,149,797号;第5,220,007号;第5,256,775号;第5,366.878号;第5,403,711号;第5,491,133号;第5,565,350号;第5,623,065号;第5,652,355号;第5,652,356号;第5,700,922号;第5,898,031号;第7,015,315号;第7,101,993号;第7,399,845号;第7.432,250号;第7,569,686号;第7,683,036号;第7,750,131号;第8,580,756号;第9,045,754号;第9,428.534号;第9,695,418号;第10,017,764号;第10,260,069号;第9.428,534号;第8,580,756号;米国特許公開第US20050074801号、第US20090221685号;第US20090286969号、第US20100197762号、および第US20110112170号;PCT公開第W02004069991号;第W02005023825号;第W02008049085号および第W02009090182号;ならびに欧州特許第EP2,149,605号を包含するが、これらに限定されない。これら各々はその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、gapmerは長さが10～40ヌクレオシドである。例えば、gapmerは長さが10～40、10～35、10～30、10～25、10～20、10～15、15～40、15～35、15～30、15～25、15～20、20～40、20～35、20～30、20～25、25～40、25～35、25～30、30～40、30～35、または35～40ヌクレオシドであり得る。いくつかの態様において、gapmerは長さが10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、または40ヌクレオシドである。
いくつかの態様において、gapmer上のギャップ領域Yは長さが5～20ヌクレオシドである。例えば、ギャップ領域Yは長さが5～20、5～15、5～10、10～20、10～15、または15～20ヌクレオシドであり得る。いくつかの態様において、ギャップ領域Yは長さが5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオシドである。いくつかの態様において、ギャップ領域Yの各ヌクレオシドは2'-デオキシリボヌクレオシドである。いくつかの態様において、ギャップ領域Yのすべてのヌクレオシドが2'デオキシリボヌクレオシドである。いくつかの態様において、ギャップ領域Yのヌクレオシドの1つ以上は修飾ヌクレオシドである(例として、2'修飾ヌクレオシド、例えば本明細書に記載のもの)。いくつかの態様において、ギャップ領域Yの1以上のシトシンは任意に5-メチルシトシンである。いくつかの態様において、ギャップ領域Yの各シトシンは5-メチルシトシンである。
いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)およびgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)は、独立して1～20ヌクレオシドの長さである。例えば、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)およびgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)は、独立して1～20、1～15、1～10、1～7、1～5、1～3、1～2、2～5、2～7、3～5、3～7、5～20、5～15、5～10、10～20、10～15、または15～20ヌクレオシドの長さであり得る。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)およびgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)は、独立して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオシドの長さである。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)およびgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)は同じ長さである。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)およびgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)は異なる長さである。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)はgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)よりも長い。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)はgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)よりも短い。
いくつかの態様において、gapmerは、5-10-5、4-12-4、3-14-3、2-16-2、1-18-1、3-10-3、2-10-2、1-10-1、2-8-2、4-6-4、3-6-3、2-6-2、4-7-4、3-7-3、2-7-2、4-8-4、3-8-3、2-8-2、1-8-1、2-9-2、1-9-1、2-10-2、1-10-1、1-12-1、1-16-1、2-15-1、1-15-2、1-14-3、3-14-1、2-14-2、1-13-4、4-13-1、2-13-3、3-13-2、1-12-5、5-12-1、2-12-4、4-12-2、3-12-3、1-11-6、6-11-1、2-11-5、5-11-2、3-11-4、4-11-3、1-17-1、2-16-1、1-16-2、1-15-3、3-15-1、2-15-2、1-14-4、4-14-1、2-14-3、3-14-2、1-13-5、5-13-1、2-13-4、4-13-2、3-13-3、1-12-6、6-12-1、2-12-5、5-12-2、3-12-4、4-12-3、1-11-7、7-11-1、2-11-6、6-11-2、3-11-5、5-11-3、4-11-4、1-18-1、1-17-2、2-17-1、1-16-3、1-16-3、2-16-2、1-15-4、4-15-1、2-15-3、3-15-2、1-14-5、5-14-1、2-14-4、4-14-2、3-14-3、1-13-6、6-13-1、2-13-5、5-13-2、3-13-4、4-13-3、1-12-7、7-12-1、2-12-6、6-12-2、3-12-5、5-12-3、1-11-8、8-11-1、2-11-7、7-11-2、3-11-6、6-11-3、4-11-5、5-11-4、1-18-1、1-17-2、2-17-1、1-16-3、3-16-1、2-16-2、1-15-4、4-15-1、2-15-3、3-15-2、1-14-5、2-14-4、4-14-2、3-14-3、1-13-6、6-13-1、2-13-5、5-13-2、3-13-4、4-13-3、1-12-7、7-12-1、2-12-6、6-12-2、3-12-5、5-12-3、1-11-8、8-11-1、2-11-7、7-11-2、3-11-6、6-11-3、4-11-5、5-11-4、1-19-1、1-18-2、2-18-1、1-17-3、3-17-1、2-17-2、1-16-4、4-16-1、2-16-3、3-16-2、1-15-5、2-15-4、4-15-2、3-15-3、1-14-6、6-14-1、2-14-5、5-14-2、3-14-4、4-14-3、1-13-7、7-13-1、2-13-6、6-13-2、3-13-5、5-13-3、4-13-4、1-12-8、8-12-1、2-12-7、7-12-2、3-12-6、6-12-3、4-12-5、5-12-4、2-11-8、8-11-2、3-11-7、7-11-3、4-11-6、6-11-4、5-11-5、1-20-1、1-19-2、2-19-1、1-18-3、3-18-1、2-18-2、1-17-4、4-17-1、2-17-3、3-17-2、1-16-5、2-16-4、4-16-2、3-16-3、1-15-6、6-15-1、2-15-5、5-15-2、3-15-4、4-15-3、1-14-7、7-14-1、2-14-6、6-14-2、3-14-5、5-14-3、4-14-4、1-13-8、8-13-1、2-13-7、7-13-2、3-13-6、6-13-3、4-13-5、5-13-4、2-12-8、8-12-2、3-12-7、7-12-3、4-12-6、6-12-4、5-12-5、3-11-8、8-11-3、4-11-7、7-11-4、5-11-6、6-11-5、1-21-1、1-20-2、2-20-1、1-20-3、3-19-1、2-19-2、1-18-4、4-18-1、2-18-3、3-18-2、1-17-5、2-17-4、4-17-2、3-17-3、1-16-6、6-16-1、2-16-5、5-16-2、3-16-4、4-16-3、1-15-7、7-15-1、2-15-6、6-15-2、3-15-5、5-15-3、4-15-4、1-14-8、8-14-1、2-14-7、7-14-2、3-14-6、6-14-3、4-14-5、5-14-4、2-13-8、8-13-2、3-13-7、7-13-3、4-13-6、6-13-4、5-13-5、1-12-10、10-12-1、2-12-9、9-12-2、3-12-8、8-12-3、4-12-7、7-12-4、5-12-6、6-12-5、4-11-8、8-11-4、5-11-7、7-11-5、6-11-6、1-22-1、1-21-2、2-21-1、1-21-3、3-20-1、2-20-2、1-19-4、4-19-1、2-19-3、3-19-2、1-18-5、2-18-4、4-18-2、3-18-3、1-17-6、6-17-1、2-17-5、5-17-2、3-17-4、4-17-3、1-16-7、7-16-1、2-16-6、6-16-2、3-16-5、5-16-3、4-16-4、1-15-8、8-15-1、2-15-7、7-15-2、3-15-6、6-15-3、4-15-5、5-15-4、2-14-8、8-14-2、3-14-7、7-14-3、4-14-6、6-14-4、5-14-5、3-13-8、8-13-3、4-13-7、7-13-4、5-13-6、6-13-5、4-12-8、8-12-4、5-12-7、7-12-5、6-12-6、5-11-8、8-11-5、6-11-7、または7-11-6の5'-X-Y-Z-3'を含む。数は5'-X-Y-Z-3'gapmerのX、Y、およびZ領域のヌクレオシド数を指し示す。
いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)またはgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)の1以上のヌクレオシドは、修飾ヌクレオシド(例として、高親和性修飾ヌクレオシド)である。いくつかの態様において、修飾ヌクレオシド(例として、高親和性修飾ヌクレオシド)は2'-修飾ヌクレオシドである。いくつかの態様において、2'-修飾ヌクレオシドは2'-4'二環式ヌクレオシドまたは非二環式2'修飾ヌクレオシドである。いくつかの態様において、高親和性修飾ヌクレオシドは、2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNA、cEt、またはENA)または非二環式2'-修飾ヌクレオシド(例として、2'-フルオロ(2'-F)、2'-O-メチル(2'-O-Me)、2'-O-メトキシエチル(2'-MOE)、2'-O-アミノプロピル(2'-O-AP)、2'-O-ジメチルアミノエチル(2'-O-DMAOE)、2'-O-ジメチルアミノプロピル(2'-ODMAP)、2'-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2'-O-DMAEOE)、または2'-O-N-メチルアセトアミド(2'-O-NMA))である。
いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)の1以上のヌクレオシドは高親和性修飾ヌクレオシドである。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)の各ヌクレオシドは高親和性修飾ヌクレオシドである。いくつかの態様において、gapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)の1以上のヌクレオシドは高親和性修飾ヌクレオシドである。いくつかの態様において、gapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)の各ヌクレオシドは高親和性修飾ヌクレオシドである。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)の1以上のヌクレオシドは高親和性修飾ヌクレオシドであり、gapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)の1以上のヌクレオシドは高親和性修飾ヌクレオシドである。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)の各ヌクレオシドは高親和性修飾ヌクレオシドであり、gapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)の各ヌクレオシドは高親和性修飾ヌクレオシドである。
いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)は、gapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)と同じ高親和性ヌクレオシドを含む。例えば、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)およびgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)は、1以上の非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)を含み得る。別の例では、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)およびgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)は、1以上の2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)を含み得る。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)およびgapmerの3'ウイング領域(5'-XY-Z-3'式のZ)の各ヌクレオシドは、非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)である。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)およびgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)の各ヌクレオシドは、2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)である。
いくつかの態様において、gapmerは5'-X-Y-Z-3'配置を含み、XおよびZは、独立して、長さが1～7(例として、1、2、3、4、5、6、または7)ヌクレオシドであり、Yは、長さが6～10(例として、6、7、8、9、または10)ヌクレオシドであり、X中およびZ中の各ヌクレオシドは、非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)であり、Y中の各ヌクレオシドは、2'デオキシリボヌクレオシドである。いくつかの態様において、gapmerは、5'-X-Y-Z-3'配置を含み、ここでXおよびZは、独立して、長さが1～7(例として、1、2、3、4、5、6、または7)ヌクレオシドであり、Yは、長さが6～10(例として、6、7、8、9、または10)ヌクレオシドであり、X中およびZ中の各ヌクレオシドは、2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)であり、ならびにY中の各ヌクレオシドは、2'-デオキシリボヌクレオシドである。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式中のX)は、gapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式中のZ)とは(as)異なる高親和性ヌクレオシドを含む。例えば、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式中のX)は、1以上の非二環式2'-修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)を含んでいてもよく、gapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式中のZ)は、1以上の2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)を含んでいてもよい。別の例において、gapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式中のZ)は、1以上の非二環式2'-修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)を含んでいてもよく、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式中のX)は、1以上の2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)を含んでいてもよい。
いくつかの態様において、gapmerは、5'-X-Y-Z-3'配置を含み、ここでXおよびZは、独立して、長さが1～7(例として、1、2、3、4、5、6、または7)ヌクレオシドであり、Yは、長さが6～10(例として、6、7、8、9、または10)ヌクレオシドであり、ここでX中の各ヌクレオシドは、非二環式2'-修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)であり、Z中の各ヌクレオシドは、2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)であり、およびY中の各ヌクレオシドは、2'-デオキシリボヌクレオシドである。いくつかの態様において、gapmerは、5'-X-Y-Z-3'配置を含み、ここでXおよびZは、独立して、長さが1～7(例として、1、2、3、4、5、6、または7)ヌクレオシドであり、Yは、長さが6～10(例として、6、7、8、9、または10)ヌクレオシドであり、ここでX中の各ヌクレオシドは、2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)であり、Z中の各ヌクレオシドは、非二環式2'-修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)であり、およびY中の各ヌクレオシドは、2'-デオキシリボヌクレオシドである。
いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式中のX)は、1以上の非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-OMe)および1以上の2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)を含む。いくつかの態様において、gapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式中のZ)は、1以上の非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)および1以上の2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)を含む。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式中のX)と、gapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式中のZ)との両方とも、1以上の非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-OMe)および1以上の2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)を含む。
いくつかの態様において、gapmerは5'-X-Y-Z-3'配置を含み、XおよびZは、独立して、長さが2～7(例として、2、3、4、5、6、または7)ヌクレオシドであり、Yは、長さが6～10(例として、6、7、8、9、または10)ヌクレオシドであり、X(最も5'の位置は位置1である)の位置1、2、3、4、5、6、または7のすべてではないが少なくとも1つ(例として、1、2、3、4、5、または6)は、非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)であり、XおよびZ両方のヌクレオシドの残りは2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)であり、Yの各ヌクレオシドは、2'デオキシリボヌクレオシドである。いくつかの態様において、gapmerは5'-X-Y-Z-3'配置を含み、XおよびZは、独立して長さが2～7(例として、2、3、4、5、6、または7)ヌクレオシドであり、Yは、長さが6～10(例として、6、7、8、9、または10)ヌクレオシドであり、Z(最も5'の位置は位置1である)の位置1、2、3、4、5、6、または7のすべてではないが少なくとも1つ(例として、1、2、3、4、5、または6)は、非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)であり、XおよびZ両方のヌクレオシドの残りは2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)であり、Yの各ヌクレオシドは2'デオキシリボヌクレオシドである。いくつかの態様において、gapmerは5'-X-Y-Z-3'配置を含み、XおよびZは独立して長さが2～7(例として、2、3、4、5、6、または7)ヌクレオシドであり、Yは長さが6～10(例として、6、7、8、9、または10)ヌクレオシドであり、Xの位置1、2、3、4、5、6、または7のすべてではないが少なくとも1つ(例として、1、2、3、4、5、または6)およびZの位置(最も5'の位置は位置1である)のすべてではないが位置(例として、1、2、3、4、5、または6)1、2、3、4、5、6、または7の少なくとも1つが、非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)であり、XおよびZ両方のヌクレオシドの残りは2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)であり、Yの各ヌクレオシドは2'デオキシリボヌクレオシドである。
非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)および2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)のミックスをgapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)および/またはgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)に有するgapmer配置の非限定例は、以下:BBB-(D)n-BBBAA;KKK-(D)n-KKKAA;LLL-(D)n-LLLAA;BBB-(D)n-BBBEE;KKK-(D)n-KKKEE;LLL-(D)n-LLLEE;BBB-(D)n-BBBAA;KKK-(D)n-KKKAA;LLL-(D)n-LLLAA;BBB-(D)n-BBBEE;KKK-(D)n-KKKEE;LLL-(D)n-LLLEE;BBB-(D)n-BBBAAA;KKK-(D)n-KKKAAA;LLL-(D)n-LLLAAA;BBB-(D)n-BBBEEE;KKK-(D)n-KKKEEE;LLL-(D)n-LLLEEE;BBB-(D)n-BBBAAA;KKK-(D)n-KKKAAA;LLL-(D)n-LLLAAA;BBB-(D)n-BBBEEE;KKK-(D)n-KKKEEE;LLL-(D)n-LLLEEE;BABA-(D)n-ABAB;KAKA-(D)n-AKAK;LALA-(D)n-ALAL;BEBE-(D)n-EBEB;KEKE-(D)n-EKEK;LELE-(D)n-ELEL;BABA-(D)n-ABAB;KAKA-(D)n-AKAK;LALA-(D)n-ALAL;BEBE-(D)n-EBEB;KEKE-(D)n-EKEK;LELE-(D)n-ELEL;ABAB-(D)n-ABAB;AKAK-(D)n-AKAK;ALAL-(D)n-ALAL;EBEB-(D)n-EBEB;EKEK-(D)n-EKEK;ELEL-(D)n-ELEL;ABAB-(D)n-ABAB;AKAK-(D)n-AKAK;ALAL-(D)n-ALAL;EBEB-(D)n-EBEB;EKEK-(D)n-EKEK;ELEL-(D)n-ELEL;AABB-(D)n-BBAA;BBAA-(D)n-AABB;AAKK-(D)n-KKAA;AALL-(D)n-LLAA;EEBB-(D)n-BBEE;EEKK-(D)n-KKEE;EELL-(D)n-LLEE;AABB-(D)n-BBAA;AAKK-(D)n-KKAA;AALL-(D)n-LLAA;EEBB-(D)n-BBEE;EEKK-(D)n-KKEE;EELL-(D)n-LLEE;BBB-(D)n-BBA;KKK-(D)n-KKA;LLL-(D)n-LLA;BBB-(D)n-BBE;KKK-(D)n-KKE;LLL-(D)n-LLE;BBB-(D)n-BBA;KKK-(D)n-KKA;LLL-(D)n-LLA;BBB-(D)n-BBE;KKK-(D)n-KKE;LLL-(D)n-LLE;BBB-(D)n-BBA;KKK-(D)n-KKA;LLL-(D)n-LLA;BBB-(D)n-BBE;KKK-(D)n-KKE;LLL-(D)n-LLE;ABBB-(D)n-BBBA;AKKK-(D)n-KKKA;ALLL-(D)n-LLLA;EBBB-(D)n-BBBE;EKKK-(D)n-KKKE;ELLL-(D)n-LLLE;ABBB-(D)n-BBBA;AKKK-(D)n-KKKA;ALLL-(D)n-LLLA;EBBB-(D)n-BBBE;EKKK-(D)n-KKKE;ELLL-(D)n-LLLE;ABBB-(D)n-BBBAA;AKKK-(D)n-KKKAA;ALLL-(D)n-LLLAA;EBBB-(D)n-BBBEE;EKKK-(D)n-KKKEE;ELLL-(D)n-LLLEE;ABBB-(D)n-BBBAA;AKKK-(D)n-KKKAA;ALLL-(D)n-LLLAA;EBBB-(D)n-BBBEE;EKKK-(D)n-KKKEE;ELLL-(D)n-LLLEE;AABBB-(D)n-BBB;AAKKK-(D)n-KKK;AALLL-(D)n-LLL;EEBBB-(D)n-BBB;EEKKK-(D)n-KKK;EELLL-(D)n-LLL;AABBB-(D)n-BBB;AAKKK-(D)n-KKK;AALLL-(D)n-LLL;EEBBB-(D)n-BBB;EEKKK-(D)n-KKK;EELLL-(D)n-LLL;AABBB-(D)n-BBBA;AAKKK-(D)n-KKKA;AALLL-(D)n-LLLA;EEBBB-(D)n-BBBE;EEKKK-(D)n-KKKE;EELLL-(D)n-LLLE;AABBB-(D)n-BBBA;AAKKK-(D)n-KKKA;AALLL-(D)n-LLLA;EEBBB-(D)n-BBBE;EEKKK-(D)n-KKKE;EELLL-(D)n-LLLE;ABBAABB-(D)n-BB;AKKAAKK-(D)n-KK;ALLAALLL-(D)n-LL;EBBEEBB-(D)n-BB;EKKEEKK-(D)n-KK;ELLEELL-(D)n-LL;ABBAABB-(D)n-BB;AKKAAKK-(D)n-KK;ALLAALL-(D)n-LL;EBBEEBB-(D)n-BB;EKKEEKK-(D)n-KK;ELLEELL-(D)n-LL;ABBABB-(D)n-BBB;AKKAKK-(D)n-KKK;ALLALLL-(D)n-LLL;EBBEBB-(D)n-BBB;EKKEKK-(D)n-KKK;ELLELL-(D)n-LLL;ABBABB-(D)n-BBB;AKKAKK-(D)n-KKK;ALLALL-(D)n-LLL;EBBEBB-(D)n-BBB;EKKEKK-(D)n-KKK;ELLELL-(D)n-LLL;EEEK-(D)n-EEEEEEEE;EEK-(D)n-EEEEEEEEE;EK-(D)n-EEEEEEEEEE;EK-(D)n-EEEKK;K-(D)n-EEEKEKE;K-(D)n-EEEKEKEE;K-(D)n-EEKEK;EK-(D)n-EEEEKEKE;EK-(D)n-EEEKEK;EEK-(D)n-KEEKE;EK-(D)n-EEKEK;EK-(D)n-KEEK;EEK-(D)n-EEEKEK;EK-(D)n-KEEEKEE;EK-(D)n-EEKEKE;EK-(D)n-EEEKEKE;およびEK-(D)n-EEEEKEKを包含し;「A」は、2'修飾ヌクレオシドを表す;「B」は、2'-4'二環式ヌクレオシドを表す;「K」は、拘束エチルヌクレオシド(cEt)を表す;「L」は、LNAヌクレオシドを表す;「E」は、2'-MOE修飾リボヌクレオシドを表す;「D」は、2'デオキシリボヌクレオシドを表す;「n」は、ギャップセグメント(5'-X-Y-Z-3'配置のY)の長さを表し、1～20の間の整数である。
いくつかの態様において、本明細書に記載のgapmerのいずれか1つは、1以上の修飾されたヌクレオシド連結(例として、ホスホロチオアート連結)をX、Y、およびZ領域の各々に含む。いくつかの態様において、本明細書に記載のgapmerのいずれか1つにおける各ヌクレオシド間連結はホスホロチオアート連結である。いくつかの態様において、X、Y、およびZ領域の各々は、独立して、ホスホロチオアート連結およびホスホジエステル連結のミックスを含む。いくつかの態様において、ギャップ領域Yの各ヌクレオシド間連結はホスホロチオアート連結であり、5'ウイング領域Xはホスホロチオアート連結およびホスホジエステル連結のミックスを含み、3'ウイング領域Zはホスホロチオアート連結およびホスホジエステル連結のミックスを含む。
DMPK標的化オリゴヌクレオチドの非限定例は、表8に提供される。
表8．DMPK標的化オリゴヌクレオチド(ASO)の例
いくつかの態様において、本明細書に記載のDMPK標的化オリゴヌクレオチドは、長さが15～20ヌクレオシド(例として、15、16、17、18、19、または20ヌクレオシド)であり、配列番号160～172および193～195のいずれか1つの、少なくとも15の連続したヌクレオシド(例として、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、または20の連続したヌクレオシド)に対する相補性の領域を含み、かつ5'-X-Y-Z-3'配置を含むが、ここでXは、3～5(例として、3、4、または5)の連結したヌクレオシドを含み、ここでX中のヌクレオシドの少なくとも1つは、2'-修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOE修飾ヌクレオシド、2'-O-Me修飾ヌクレオシド、LNA、cEt、またはENA)である;Yは、6～10(例として、6、7、8、9、または10)の連結した2'-デオキシリボヌクレオシドを含み、ここでY中の各シトシンは、任意におよび独立に、5-メチル-シトシンである;およびZは、3～5(例として、3、4、または5)の連結したヌクレオシドを含み、ここでZ中のヌクレオシドの少なくとも1つは、2'-修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOE修飾ヌクレオシド、2'-O-Me修飾ヌクレオシド、LNA、cEt、またはENA)である。
いくつかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号174、177、179～182、および184～192のいずれか1つのヌクレオチド配列の、少なくとも15の連続したヌクレオシド(例として、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、または20の連続したヌクレオシド)を含み、かつ5'-X-Y-Z-3'配置を含むが、ここでXは、3～5(例として、3、4、または5)の連結したヌクレオシドを含み、ここでX中のヌクレオシドの少なくとも1つは、2'-修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOE修飾ヌクレオシド、2'-O-Me修飾ヌクレオシド、LNA、cEt、またはENA)である;Yは、6～10(例として、6、7、8、9、または10)の連結した2'-デオキシリボヌクレオシドを含み、ここでY中の各シトシンは、任意におよび独立して、5-メチル-シトシンである;およびZは、3～5(例として、3、4、または5)の連結したヌクレオシドを含み、ここでZ中のヌクレオシドの少なくとも1つは、2'-修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOE修飾ヌクレオシド、2'-O-Me修飾ヌクレオシド、LNA、cEt、またはENA)である。いくつかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列の各チミン塩基(T)は、独立におよび任意に、ウラシル塩基(U)に置き換えられていてもよく、ならびに各Uは、独立におよび任意に、Tに置き換えられていてもよい。
いくつかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号174、177、179～182、および184～192のいずれか1つのヌクレオチド配列を含み、かつ5'-X-Y-Z-3'配置を含むが、ここでXは、3～5(例として、3、4、または5)の連結したヌクレオシドを含み、ここでX中のヌクレオシドの少なくとも1つは、2'-修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOE修飾ヌクレオシド、2'-O-Me修飾ヌクレオシド、LNA、cEt、またはENA)である;Yは、6～10(例として、6、7、8、9、または10)の連結した2'-デオキシリボヌクレオシドを含み、ここでY中の各シトシンは、任意におよび独立して、5-メチル-シトシンである;およびZは、3～5(例として、3、4、または5)の連結したヌクレオシドを含み、ここでZ中のヌクレオシドの少なくとも1つは、2'-修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOE修飾ヌクレオシド、2'-O-Me修飾ヌクレオシド、LNA、cEt、またはENA)である。いくつかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列の各チミン塩基(T)は、独立におよび任意に、ウラシル塩基(U)に置き換えられていてもよく、ならびに各Uは、独立におよび任意に、Tに置き換えられていてもよい。
いくつかの態様において、X中の各ヌクレオシドは、2'-修飾ヌクレオシドであるか、および/または(例として、および)、Z中の各ヌクレオシドは、2'-修飾ヌクレオシドである。いくつかの態様において、2'-修飾ヌクレオシドは、2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNA、cEt、もしくはENA)、または非二環式2'-修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOE修飾ヌクレオシドもしくは2'-O-Me修飾ヌクレオシド)である。
いくつかの態様において、X中の各ヌクレオシドは、非二環式2'-修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOE修飾ヌクレオシド)であるか、および/または(例として、および)、Z中の各ヌクレオシドは、非二環式2'-修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOE修飾ヌクレオシド)である。いくつかの態様において、X中の各ヌクレオシドは、2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNA、cEt、もしくはENA)であるか、および/または(例として、および)、Z中の各ヌクレオシドは、2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNA、cEt、もしくはENA)である。
いくつかの態様において、Xは、少なくとも1つの2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNA、cEt、もしくはENA)、および少なくとも1つの非二環式2'-修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOE修飾ヌクレオシドまたは2'-O-Me修飾ヌクレオシド)を含むか、および/または(例として、および)、Zは、少なくとも1つの2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNA、cEt、もしくはENA)、および少なくとも1つの非二環式2'-修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOE修飾ヌクレオシドもしくは2'-O-Me修飾ヌクレオシド)を含む。
いくつかの態様において、DMPK標的化オリゴヌクレオチドは、1以上のホスホロチオアートヌクレオシド間連結を含む。いくつかの態様において、DMPK標的化オリゴヌクレオチド中の各ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結である。いくつかの態様において、DMPK標的化オリゴヌクレオチドは、1以上のホスホジエステルヌクレオシド間連結を含み、任意にここでホスホジエステルヌクレオシド間連結は、X中および/またはZ中にある。いくつかの態様において、DMPK標的化オリゴヌクレオチドは、1以上のホスホロチオアートヌクレオシド間連結および1以上のホスホジエステルヌクレオシド間連結を含む。いくつかの態様において、DMPK標的化オリゴヌクレオチドは、1つのホスホジエステルヌクレオシド間連結(PO)、2つのPO、3つのPO、4つのPO、5つのPO、6つのPO、7つのPO、8つのPO、9つのPO、10のPO、11のPO、12のPO、13のPO、14のPO、15のPO、16のPO、17のPO、18のPO、19のPO、20のPO、21のPO、22のPO、23のPO、24のPO、25のPO、26のPO、27のPO、28のPO、または29のPOを含み、かつ残存するヌクレオシド間連結は、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結(PS)である。例えば、20ヌクレオチドのDMPK標的化オリゴヌクレオチドは、1 POおよび18 PS、2 POおよび17 PS、3 POおよび16 PS、4 POおよび15 PS、5 POおよび14 PS、6 POおよび13 PS、7 POおよび12 PS、8 POおよび11 PS、9 POおよび10 PS、10 POおよび9 PS、11 POおよび8 PS、12 POおよび7 PS、13 POおよび6 PS、14 POおよび5 PS、15 POおよび4 PS、16 POおよび3 PS、17 POおよび2 PS、または18 POおよび1 PSを含んでいてもよい。いくつかの態様において、gap領域Y中の各ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結であり、Xは、1以上のホスホロチオアートヌクレオシド間連結および1以上のホスホジエステルヌクレオシド間連結を含み、ならびにZは、1以上のホスホロチオアートヌクレオシド間連結および1以上のホスホジエステルヌクレオシド間連結を含む。いくつかの態様において、gap領域Y中の各ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結であり、X中の各ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結であり、ならびにZは、1以上のホスホロチオアートヌクレオシド間連結および1以上のホスホジエステルヌクレオシド間連結を含む。いくつかの態様において、gap領域Y中の各ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結であり、Xは、1以上のホスホロチオアートヌクレオシド間連結および1以上のホスホジエステルヌクレオシド間連結を含み、ならびにZ中の各ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結である。例えば、DMPK標的化オリゴヌクレオチドは、ミックスされたホスホジエステル/ホスホロチオアート主鎖を有するウィング領域XおよびZと、全てホスホロチオアートの主鎖を有するgap領域Yとを含んでいてもよく、あるいはミックスされたホスホジエステル/ホスホロチオアート主鎖を有する一方のウィング領域(すなわち、XまたはZ)、全てホスホロチオアートの主鎖を有する他方のウィング領域、および全てホスホロチオアートの主鎖を有するgap領域Yを含んでいてもよい。いくつかの態様において、gap領域Yは、1以上のホスホロチオアートヌクレオシド間連結および1以上のホスホジエステルヌクレオシド間連結を含み、ウィング領域XおよびYは、各々独立して、全てホスホロチオアートの主鎖を有するかまたは1以上のホスホロチオアートヌクレオシド間連結および1以上のホスホジエステルヌクレオシド間連結を含むかのいずれかである。例えば、DMPK標的化オリゴヌクレオチドは、ミックスされたホスホジエステル/ホスホロチオアート主鎖を有するウィング領域XおよびZと、ミックスされたホスホジエステル/ホスホロチオアート主鎖を有するgap領域Yとを含んでいてもよい。
いくつかの態様において、以下の式で表されるアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供される:
(L)X1(E)X2(L)X3(D)X4(L)X5(E)X6(L)X7:
ここで各(L)は、2'-4'二環式ヌクレオシドであり、
ここで各(E)は、非二環式2'-修飾ヌクレオシドであり、
ここで各(D)は、2'-デオキシリボヌクレオシドであり、
ここでX1は、独立して、対応するLの数を表す0から5までの整数であり、
ここでX2は、独立して、対応するEの数を表す0から5までの整数であり、
ここでX3は、独立して、対応するLの数を表す0から5までの整数であり、
ここでX4は、独立して、Dの数を表す5から12までの整数であり、
ここでX5は、独立して、対応するLの数を表す0から5までの整数であり、
ここでX6は、独立して、対応するEの数を表す0から5までの整数であり、
ここでX7は、独立して、対応するLの数を表す0から5までの整数であり、ならびに
ここでX1、X2、およびX3の少なくとも1つは、1～5の範囲にあり、かつX5、X6、およびX7の少なくとも1つは、1～5の範囲にある。
いくつかの態様において、X1、X3、X5、およびX7は、各0であり、かつX2およびX6は、独立して、1、2、3、4、または5である。
いくつかの態様において、X1、X2、X5、およびX6は、各0であり、かつX3およびX7は、独立して、1、2、3、4、または5である。
いくつかの態様において、X3およびX5は、各0であり、かつX1、X2、X6およびX7は、独立して、1、2、3、4、または5である。
いくつかの態様において、X1およびX7は、各0であり、かつX2、X3、X5およびX6は、独立して、1、2、3、4、または5である。
いくつかの態様において、X4は、5、6、7、8、9、または10である。
いくつかの態様において、2'-4'二環式ヌクレオシドは、LNA、cEt、およびENAのヌクレオシドから選択される。いくつかの態様において、非二環式2'-修飾ヌクレオシドは、2'-MOE修飾ヌクレオシドまたは2'-OMe修飾ヌクレオシドである。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結、ホスホジエステルヌクレオシド間連結、またはそれらの組み合わせによって一緒に結び合わされている。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、各ヌクレオシドを結び合わせるホスホロチオアートヌクレオシド間連結のみを含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つのホスホロチオアートヌクレオシド間連結を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオアートおよびホスホジエステルヌクレオシド間連結のミックスを含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、2'-デオキシリボヌクレオシドの各ペアを結び合わせるホスホロチオアートヌクレオシド間連結と、残存するヌクレオシドを結び合わせるホスホロチオアートおよびホスホジエステルヌクレオシド間連結のミックスとのみを含む。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、以下の5'-X-Y-Z-3'配置:
を含み、ここで「E」は、2'-MOE修飾リボヌクレオシドである;「L」は、LNAである;「D」は、2'-デオキシリボヌクレオシドである;および「10」または「8」は、Y中の2'-デオキシリボヌクレオシド数であり、ならびにここでオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結、ホスホジエステルヌクレオシド間連結、またはそれらの組み合わせを含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載のDMPK標的化オリゴヌクレオチドのいずれか1つにおいて、X中および/またはZ中の各シチジン(例として、2'-修飾シチジン)は、任意におよび独立に、5-メチル-シチジンであり、および/またはX中および/またはZ中の各ウリジン(例として、2'-修飾ウリジン)は、任意におよび独立に、5-メチル-ウリジンである。
いくつかの態様において、DMPK標的化オリゴヌクレオチドは、表8に列挙されるASO 1～29から選択される。いくつかの態様において、DMPK標的化オリゴヌクレオチドのいずれか1つは、例として、ナトリウム、カリウム、マグネシウムの塩として、塩の形態にあり得る。
いくつかの態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド(例として、表8に列挙されるオリゴヌクレオチド)のいずれか1つの5'または3'ヌクレオシド(例として、末端ヌクレオシド)は、任意にスペーサーを介して、アミン基へ抱合されている。いくつかの態様において、スペーサーは、脂肪族部分を含む。いくつかの態様において、スペーサーは、ポリエチレングリコール部分を含む。いくつかの態様において、ホスホジエステル連結は、オリゴヌクレオチドのスペーサーと5'または3'ヌクレオシドとの間に存在する。いくつかの態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド(例として、表8に列挙されるオリゴヌクレオチド)のいずれかの5'または3'ヌクレオシド(例として、末端ヌクレオシド)は、スペーサーへ抱合されているが、前記スペーサーは、置換もしくは非置換の脂肪族、置換もしくは非置換のヘテロ脂肪族、置換もしくは非置換のカルボシクリレン、置換もしくは非置換のヘテロシクリレン、置換もしくは非置換のアリーレン、置換もしくは非置換のヘテロアリーレン、-O-、-N(RA)-、-S-、-C(=O)-、-C(=O)O-、-C(=O)NRA-、-NRAC(=O)-、-NRAC(=O)RA-、-C(=O)RA-、-NRAC(=O)O-、-NRAC(=O)N(RA)-、-OC(=O)-、-OC(=O)O-、-OC(=O)N(RA)-、-S(O)2NRA-、-NRAS(O)2-、またはそれらの組み合わせである;各RAは、独立して、水素、または置換もしくは非置換のアルキルである。ある態様において、スペーサーは、置換もしくは非置換のアルキレン、置換もしくは非置換のヘテロシクリレン、置換もしくは非置換のヘテロアリーレン、-O-、-N(RA)-、または-C(=O)N(RA)2、あるいはそれらの組み合わせである。
いくつかの態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド(例として、表8に列挙されるオリゴヌクレオチド)のいずれか1つの5'または3'ヌクレオシドは、式-NH2-(CH2)n-(式中nは、1から12までの整数である)で表される化合物へ抱合されている。いくつかの態様において、nは、6、7、8、9、10、11、または12である。いくつかの態様において、ホスホジエステル連結は、オリゴヌクレオチドの式NH2-(CH2)n-で表される化合物と5'または3'ヌクレオシドとの間に存在する。いくつかの態様において、式NH2-(CH2)6-で表される化合物は、6-アミノ-1-ヘキサノール(NH2-(CH2)6-OH)とオリゴヌクレオチドの5'ホスファートとの間の反応を介してオリゴヌクレオチドへ抱合されている。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、例としてアミン基を介し、標的化剤、例として抗TfR1抗体などの筋標的化剤へ抱合されている。
Ｃ．リンカー
本明細書に記載の複合体は一般に、本明細書に記載の抗TfR1抗体のいずれか1つを分子ペイロードへ接続するリンカーを含む。リンカーは、少なくとも1つの共有結合を含む。いくつかの態様において、リンカーは、抗TfR1抗体を分子ペイロードへ接続する単結合、例として、ジスルフィド結合またはジスルフィド架橋であってもよい。しかしながら、いくつかの態様において、リンカーは、複数の共有結合を通して、本明細書に記載の抗TfR1抗体のいずれか1つを分子ペイロードへ接続していてもよい。いくつかの態様において、リンカーは、切断可能なリンカーであってもよい。しかしながら、いくつかの態様において、リンカーは、切断不能なリンカーであってもよい。リンカーは一般に、in vitroおよびin vivoで安定しており、ある細胞環境において安定していてもよい。加えて、一般にリンカーは、抗TfR1抗体または分子ペイロードのいずれかの機能特性に負の影響を及ぼさない。リンカー合成の例および方法は、当該技術分野において知られている(例として、Kline,T.et al.“Methods to Make Homogenous Antibody Drug Conjugates.”Pharmaceutical Research,2015,32:11,3480-3493.;Jain,N.et al.“Current ADC Linker Chemistry”Pharm Res.2015,32:11,3526-3540.;McCombs,J.R. and Owen,S.C.“Antibody Drug Conjugates:Design and Selection of Linker,Payload and Conjugation Chemistry”AAPS J.2015,17:2,339-351.を参照)。
リンカーの前駆体は、典型的には、抗TfR1抗体と分子ペイロードとの両方へ付着できる2つの異なる反応性の高い種を含有しているであろう。いくつかの態様において、2つの異なる反応性の高い種は、求核試薬および/または(例として、および)求電子試薬であってもよい。いくつかの態様において、リンカーは、抗TfR1抗体のリジン残基またはシステイン残基への抱合を介して、抗TfR1抗体へ接続されている。いくつかの態様において、リンカーは、マレイミド含有リンカーを介して抗TfR1抗体のシステイン残基へ接続されており、ここで任意に、マレイミド含有リンカーは、マレイミドカプロイルまたはマレイミドメチルシクロヘキサン-1-カルボキシラート基を含む。いくつかの態様において、リンカーは、3-アリールプロピオニトリル官能基を介して、抗TfR1抗体のシステイン残基またはチオール官能化分子ペイロードへ接続されている。いくつかの態様において、リンカーは、抗TfR1抗体のリジン残基へ接続されている。いくつかの態様において、リンカーは、アミド結合、カルバマート結合、ヒドラジド、トリアゾール、チオエーテル、またはジスルフィド結合を介して、抗TfR1抗体および/または(例として、および)分子ペイロードへ接続されている。
ｉ．切断可能なリンカー
切断可能なリンカーは、プロテアーゼ感受性リンカー、pH感受性リンカー、またはグルタチオン感受性リンカーであってもよい。これらのリンカーは一般に、細胞内のみで切断可能であって、好ましくは、細胞外環境において、例として、筋細胞またはCNS細胞の細胞外において安定している。
プロテアーゼ感受性リンカーは、プロテアーゼ酵素活性によって切断可能である。これらのリンカーは、典型的にはペプチド配列を含んでおり、長さが2～10アミノ酸、約2～5アミノ酸、約5～10アミノ酸、約10アミノ酸、約5アミノ酸、約3アミノ酸、または約2アミノ酸であってもよい。いくつかの態様において、ペプチド配列は、天然に存在するアミノ酸、例として、システイン、アラニン、または天然に存在しないかもしくは修飾されたアミノ酸を含んでいてもよい。天然に存在しないアミノ酸は、β-アミノ酸、ホモ-アミノ酸、プロリン誘導体、3-置換アラニン誘導体、線形コアアミノ酸、N-メチルアミノ酸、および当該技術分野において知られているその他のアミノ酸を包含する。いくつかの態様において、プロテアーゼ感受性リンカーは、バリン-シトルリンまたはアラニン-シトルリンの配列を含む。いくつかの態様において、プロテアーゼ感受性リンカーは、リソソームのプロテアーゼ、例として、カテプシンB、および/またはエンドソームのプロテアーゼによって切断され得る。
pH感受性リンカーは、高または低pH環境において容易に分解される共有結合の連結である。いくつかの態様において、pH感受性リンカーは、4～6の範囲にあるpHにて切断されてもよい。いくつかの態様において、pH感受性リンカーは、ヒドラゾンまたは環状アセタールを含む。いくつかの態様において、pH感受性リンカーは、エンドソームまたはリソソーム内で切断される。
いくつかの態様において、グルタチオン感受性リンカーは、ジスルフィド部を含む。いくつかの態様において、グルタチオン感受性リンカーは、細胞内部でのグルタチオン種とのジスルフィド交換反応によって切断される。いくつかの態様において、ジスルフィド部はさらに、少なくとも1アミノ酸、例としてシステイン残基を含む。
いくつかの態様において、リンカーは、Val-citリンカー(例として、US米国特許6,214,345(参照により本明細書に組み込まれる)に記載されるとおり)である。いくつかの態様において、抱合前のval-citリンカーは、以下の構造:
有する。
いくつかの態様において、抱合後のval-citリンカーは、以下の構造:
有する。
いくつかの態様において、Val-citリンカーは、反応性の化学的部分(例として、クリックケミストリー抱合のためのSPAAC)へ付着される。いくつかの態様においては、クリックケミストリー抱合前に、反応性の高い化学的部分(例として、クリックケミストリー抱合のためのSPAAC)へ付着されるval-citリンカーは、以下の構造:
を有し、ここでnは0～10のいずれかの数である。いくつかの態様において、nは3である。
いくつかの態様において、反応性の高い化学的部分(例として、クリックケミストリー抱合のためのSPAAC)へ付着されるval-citリンカーは、(例として、異なる化学的部分を介して)分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド)へ抱合される。いくつかの態様において、反応性の高い化学的部分(例として、クリックケミストリー抱合のためのSPAAC)へ付着され、分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド)へ抱合されるval-citリンカーは(クリックケミストリー抱合前に)、以下の構造:
を有し、ここでnは0～10のいずれかの数である。いくつかの態様において、nは3である。
いくつかの態様においては、分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド)へのの抱合後、val-citリンカーは、以下の構造:
を含み、ここでnは0～10のいずれかの数であり、およびここでmは0～10のいずれかの数である。いくつかの態様において、nは3であり、およびmは4である。
ii．切断不能リンカー
いくつかの態様において、切断不能なリンカーが使用されてもよい。一般に、切断不能なリンカーは、細胞環境または生理環境において容易に分解され得ない。いくつかの態様において、切断不能なリンカーは、任意に置換されていてもよいアルキル基を含むが、ここで置換は、ハロゲン、ヒドロキシル基、酸素種、および他の一般的な置換を包含していてもよい。いくつかの態様において、リンカーは、任意に置換されていてもよいアルキル、任意に置換されていてもよいアルキレン、任意に置換されていてもよいアリーレン、ヘテロアリーレン、少なくとも1つの非天然アミノ酸を含むペプチド配列、トランケートされたグリカン、酵素的に分解され得ない糖(単数もしくは複数)、アジド、アルキン-アジド、LPXT配列を含むペプチド配列、チオエーテル、ビオチン、ビフェニル、反復単位のポリエチレングリコールもしくは等価な化合物、酸エステル、酸アミド、スルファミド、および/または(例として、および)、アルコキシ-アミンリンカーを含んでいてもよい。いくつかの態様において、ソルターゼ媒介ライゲーションは、LPXT配列を含む抗TfR1抗体を(G)n配列を含む分子ペイロードへ連結するために利用されるであろう(例として、Proft T.Sortase-mediated protein ligation:an emerging biotechnology tool for protein modification and immobilization.Biotechnol Lett.2010,32(1):1-10を参照)。
いくつかの態様において、リンカーは、置換されたアルキレン、任意に置換されていてもよいアルケニレン、任意に置換されていてもよいアルキニレン、任意に置換されていてもよいシクロアルキレン、任意に置換されていてもよいシクロアルケニレン、任意に置換されていてもよいアリーレン、N、O、およびSから選択される少なくとも1個のヘテロ原子をさらに含む任意に置換されていてもよいヘテロアリーレン;N、O、およびSから選択される少なくとも1個のヘテロ原子をさらに含む任意に置換されていてもよいヘテロシクリレン;イミノ、任意に置換されていてもよい窒素種、任意に置換されていてもよい酸素種O、任意に置換されていてもよい硫黄種、またはポリ(アルキレンオキシド)、例として、ポリエチレンオキシドまたはポリプロピレンオキシドを含んでいてもよい。
iii．リンカー抱合
いくつかの態様において、リンカーは、ホスファート、チオエーテル、エーテル、炭素-炭素、カルバマート、もしくはアミド結合を介して抗TfR1抗体および/または(例として、および)分子ペイロードへ接続されている。いくつかの態様において、リンカーは、リン酸塩またはホスホロチオアート基、例として、オリゴヌクレオチド主鎖の末端のホスファートを通してオリゴヌクレオチドへ接続されている。いくつかの態様において、リンカーは、抗TfR1抗体上に存在するリジン残基またはシステイン残基を通して、抗TfR1抗体へ接続されている。
いくつかの態様において、リンカーは、トリアゾールを形成するアジドとアルキンとの間のシクロ付加反応によって、抗TfR抗体および/または(例として、および)分子ペイロードへ接続されており、ここでアジドおよびアルキンは、抗TfR抗体、分子ペイロード、またはリンカー上に位置付けられていてもよい。いくつかの態様において、アルキンは、環状アルキン、例としてシクロオクチンであってもよい。いくつかの態様において、アルキンは、ビシクロノニン(またビシクロ[6.1.0]ノニンまたはBCNとしても知られている)または置換ビシクロノニンであってもよい。いくつかの態様において、シクロオクタンは、2011年11月3日に公開の国際特許出願刊行物WO2011136645、表題「Fused Cyclooctyne Compounds And Their Use In Metal-free Click Reactions」に記載のとおりである。いくつかの態様において、アジドは、アジドを含む糖または炭水化物分子であってもよい。いくつかの態様において、アジドは、6-アジド-6-デオキシガラクトースまたは6-アジド-N-アセチルガラクトサミンであってもよい。いくつかの態様において、アジドを含む糖または炭水化物分子は、2016年10月27日に公開の国際特許出願刊行物WO2016170186、表題「Process For The Modification Of A Glycoprotein Using A Glycosyltransferase That Is Or Is Derived From A β(1,4)-N-Acetylgalactosaminyltransferase」に記載のとおりである。いくつかの態様において、トリアゾールを形成するアジドとアルキンとの間のシクロ付加反応(ここでアジドまたはアルキンは、抗TfR1抗体、分子ペイロード、またはリンカー上に位置付けられていてもよい)は、2014年5月1日に公開の国際特許出願刊行物WO2014065661、表題「Modified antibody, antibody-conjugate and process for the preparation thereof」;または2016年10月27日に公開の国際特許出願刊行物WO2016170186、表題「Process For The Modification Of A Glycoprotein Using A Glycosyltransferase That Is Or Is Derived From A β(1,4)-N-Acetylgalactosaminyltransferase」に記載のとおりである。
いくつかの態様において、リンカーはさらに、スペーサー、例として、ポリエチレングリコールスペーサーまたはアシル/カルバモイルスルファミドスペーサー、例として、HydraSpace(商標)スペーサーを含む。いくつかの態様において、スペーサーは、Verkade,J.M.M.et al.,“A Polar Sulfamide Spacer Significantly Enhances the Manufactur能力, St能力, and Therapeutic Index of Antibody-Drug Conjugates”,Antibodies,2018,7,12に記載のとおりである。
いくつかの態様において、リンカーは、求ジエン体とジエン/ヘテロ-ジエンとの間のディールス・アルダー反応によって、抗TfR1抗体および/または(例として、および)分子ペイロードへ接続されるが、ここで求ジエン体およびジエン/ヘテロ-ジエンは、抗TfR1抗体、分子ペイロード、またはリンカー上に位置付けられていてもよい。いくつかの態様において、リンカーは、他のペリ環状反応、例として、エン反応によって、抗TfR1抗体および/または(例として、および)分子ペイロードへ接続される。いくつかの態様において、リンカーは、アミド、チオアミド、またはスルホンアミド結合反応によって、抗TfR1抗体および/または(例として、および)分子ペイロードへ接続される。いくつかの態様において、リンカーは、リンカーと抗TfR1抗体および/または(例として、および)分子ペイロードとの間に存在するオキシム基、ヒドラゾン基、またはセミカルバジド基を形成する縮合反応によって、抗TfR1抗体および/または(例として、および)分子ペイロードへ接続される。
いくつかの態様において、リンカーは、求核試薬(例として、アミン基またはヒドロキシル基)と求電子試薬(例として、カルボン酸、カーボナート、またはアルデヒド)との間の抱合体付加反応によって、抗TfR1抗体および/または(例として、および)分子ペイロードへ接続される。いくつかの態様において、リンカーと抗TfR1抗体または分子ペイロードとの間の反応に先立ち、求核試薬はリンカー上に存在していてもよく、求電子試薬は抗TfR1抗体または分子ペイロード上に存在していてもよい。いくつかの態様において、リンカーと抗TfR1抗体または分子ペイロードとの間の反応に先立ち、求電子試薬はリンカー上に存在していてもよく、求核試薬は抗TfR1抗体または分子ペイロード上に存在していてもよい。いくつかの態様において、求電子試薬は、アジド、ペンタフルオロフェニル、ケイ素中心、カルボニル、カルボン酸、無水物、イソシアナート、チオイソシアナート、スクシニミジルエステル、スルホスクシニミジルエステル、マレイミド、アルキルハロゲン化物、アルキル擬ハロゲン化物、エポキシド、エピスルフィド、アジリジン、アリール、活性化リン中心、および/または(例として、および)、活性化硫黄中心であってもよい。いくつかの態様において、求核試薬は、任意に置換されていてもよいアルケン、任意に置換されていてもよいアルキン、任意に置換されていてもよいアリール、任意に置換されていてもよいヘテロシクリル、ヒドロキシル基、アミノ基、アルキルアミノ基、アニリド基、またはチオール基であってもよい。
いくつかの態様において、反応性の高い化学的部分(例として、クリックケミストリー抱合のためのSPAAC)へ付着されるval-citリンカーは、以下の構造:
によって抗TfR1抗体へ抱合されており、ここでmは0～10のいずれかの数である。いくつかの態様において、mは4である。
いくつかの態様において、反応性の高い化学的部分(例として、クリックケミストリー抱合のためのSPAAC)へ付着されるval-citリンカーは、以下の構造:
(G)
を有する抗TfR1抗体に抱合されており、ここでmは0～10のいずれかの数である。いくつかの態様において、mは4である。式(G)中の抗TfR1抗体に隣接して示されるアミドが、リシンイプシロンアミンなどのアミンとの抗TfR1抗体の反応の結果生じることは理解されるはずである。
いくつかの態様において、反応性の高い化学的部分(例として、クリックケミストリー抱合のためのSPAAC)へ付着され、抗TfR1抗体へ抱合されるval-citリンカーは、以下の構造:
(F)
を有し、ここでnは0～10のいずれかの数であり、ここでmは0～10のいずれかの数である。いくつかの態様において、nは3であり、および/または(例として、および)mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、式(F)で表される構造を含む化合物へ共有結合的に連結され、それによって式(D)で表される構造を含む複合体が形成される。式(F)中の抗TfR1抗体に隣接して示されるアミドが、リシンイプシロンアミンなどの抗TfR1抗体のアミンとの反応の結果生じることは理解されるはずである。
いくつかの態様において、抗TfR1抗体と連結するval-citリンカーおよび分子ペイロードは、以下の構造:
を有し、ここでnは0～10のいずれかの数であり、ここでmは0～10のいずれかの数である。いくつかの態様において、nは3であり、および/または(例として、および)mは4である。いくつかの態様において、nは3であり、および/または(例として、および)mは4である。いくつかの態様において、Xは、NH(例として、リジンのアミン基からのNH)、S(例として、システインのチオール基からのS)、O(セリン、トレオニン、またはチロシンのヒドロキシル基からのO)である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、以下の構造:
を有し、ここでnは0～10のいずれかの数であり、ここでmは0～10のいずれかの数である。いくつかの態様において、nは、3であり、およびmは、4である。
構造式(A)、(B)、(C)、および(D)中、L1は、いくつかの態様において、置換もしくは非置換の脂肪族、置換もしくは非置換のヘテロ脂肪族、置換もしくは非置換のカルボシクリレン、置換もしくは非置換のヘテロシクリレン、置換もしくは非置換のアリーレン、置換もしくは非置換のヘテロアリーレン、-O-、-N(RA)-、-S-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-C(＝O)NRA-、-NRAC(＝O)-、-NRAC(＝O)RA-、-C(＝O)RA-、-NRAC(＝O)O-、-NRAC(＝O)N(RA)-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-OC(＝O)N(RA)-、-S(O)2NRA-、-NRAS(O)2-、またはそれらの組み合わせであるスペーサーであるが、ここで各RAは、独立して、水素、または置換もしくは非置換のアルキルである。いくつかの態様において、L1は、
であり、ここでL2は、
であるが、ここでaは、式(A)、(B)、(C)、および(D)のカルバマート部分へ直接連結されている部位を標識する;ならびにbは、オリゴヌクレオチドへ(直接的にまたは追加の化学的部分を介して)共有結合的に連結されている部位を標識する。
いくつかの態様において、L1は、以下:
であるが、ここでaは、式(A)、(B)、(C)、および(D)のカルバマート部分へ直接連結されている部位を標識する;ならびにbは、オリゴヌクレオチドへ(直接的にまたは追加の化学的部分を介して)共有結合的に連結されている部位を標識する。
いくつかの態様において、L1は、
である。
いくつかの態様において、L1は、オリゴヌクレオチドの5'ホスファートへ連結される。

いくつかの態様において、L1の、オリゴヌクレオチドの5'ホスファートへの連結は、L1とオリゴヌクレオチドとの間にホスホジエステル結合を形成する。
いくつかの態様において、L1は、任意である(例として、存在する必要はない)。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体のいずれか1つは、以下の構造:
Figure 2024503609000052
 を有し、式中nは0～15(例として、3)であり、mは0～15(例として、4)である、
Ｃ．抗体-分子ペイロード複合体の例
本明細書に記載の分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド)のいずれかへ共有結合的に連結された、本明細書に記載のいずれか1つの抗TfR1抗体を含む複合体の非限定的な例が、本明細書でさらに提供される。いくつかの態様において、抗TfR1抗体(例として、表2～7に提供される抗TfR1抗体のいずれか1つ)は、リンカーを介して分子ペイロード(例として、表8に提供されるオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチド)へ共有結合的に連結される。本明細書に記載のリンカーのいずれも、使用されてもよい。いくつかの態様において、分子ペイロードがオリゴヌクレオチドである場合、リンカーは、オリゴヌクレオチドの5'末、3'末、または内部へ連結されている。いくつかの態様において、リンカーは、チオール反応性の連結を介して(例として、抗TfR1抗体中のシステインを介して)抗TfR1抗体へ連結されている。いくつかの態様において、リンカー(例として、Val-citリンカー)は、抗体(例として、本明細書に記載の抗TfR1抗体)へアミン基を介して(例として、抗体中のリジンを介して)連結されている。いくつかの態様において、分子ペイロードは、オリゴヌクレオチド(例として、表8に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチド)である。
Val-citリンカーを介して分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR1抗体を含む複合体の構造の例は、下に提供される:
Figure 2024503609000053
 ここでリンカーは、チオール反応性の連結を介して(例として、抗体中のシステインを介して)抗体へ連結されている。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DMPK標的化オリゴヌクレオチド(例として、表8に列挙されるDMPK標的化オリゴヌクレオチド)である。
Val-citリンカーを介して分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR1抗体を含む複合体の構造の別の例は、下に提供される:
Figure 2024503609000054
 ここでnは0～10の間の数であり、ここでmは0～10の間の数であり、ここでリンカーはアミン基(例として、リジン残基上の)を介して抗体へ連結され、および/または(例として、および)リンカーはオリゴヌクレオチドへ(例として、5'端、3'端にて、または内部に)連結される。いくつかの態様において、リンカーはリジンを介して抗体へ連結され、リンカーはオリゴヌクレオチドに5'端にて連結され、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、分子ペイロードは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むオリゴヌクレオチドであって、リンカーは、センス鎖またはアンチセンス鎖へ5'末または3'末にて連結されている。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DMPK標的化オリゴヌクレオチド(例として、表8に列挙されるDMPK標的化オリゴヌクレオチド)である。
いくつかの態様において、L1は、
である。式(D)中の抗TfR1抗体に隣接して示されるアミドが、リシンイプシロンアミンなどの抗TfR1抗体のアミンとの反応の結果生じることは理解されるはずである。
抗体は、種々の化学量論で分子ペイロードへ連結され得ることが解されるはずであって、前記特性は薬物抗体比(DAR)と称されることもあり、ここで「薬物」は分子ペイロードである。いくつかの態様において、1つの分子ペイロードが抗体へ連結されている(DAR=1)。いくつかの態様において、2つの分子ペイロードが抗体へ連結されている(DAR=2)。いくつかの態様において、3つの分子ペイロードが抗体へ連結されている(DAR=3)。いくつかの態様において、4つの分子ペイロードが抗体へ連結されている(DAR=4)。いくつかの態様において、各々が異なるDARを有する異なる複合体の混合物が提供される。いくつかの態様において、かかる混合物中の複合体の平均DARは、1～3、1～4、1～5以上の範囲にあってもよい。DARは、分子ペイロードを抗体上の種々の部位へ抱合させることによって、および/または(例として、および)、マルチマーを抗体上の1以上の部位へ抱合させることによって、増大されてもよい。例えば、2のDARは、単一分子ペイロードを抗体上の2つの異なる部位へ抱合させることによって、または二量体分子ペイロードを抗体の単一部位へ抱合させることによって、達成されてもよい。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードに共有結合的に連結された本明細書に記載の抗TfR1抗体(例として、表2～7に提供される抗体)を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、リンカー(例として、Val-citリンカー)を介して分子ペイロードに共有結合的に連結された、本明細書に記載の抗TfR1抗体(例として、表2～7に提供される抗体)を含む。いくつかの態様において、リンカー(例として、Val-citリンカー)は、チオール反応性の連結を介して(例として、抗体中のシステインを介して)、抗体(例として、本明細書に記載される抗TfR1抗体)へ連結されている。いくつかの態様において、リンカー(例として、Val-citリンカー)は、抗体(例として、本明細書に記載の抗TfR1抗体)へアミン基を介して(例として、抗体中のリジンを介して)連結されている。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR1抗体を含み、抗TfR1抗体は、表2に列挙される抗体のいずれか1つのCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DMPK標的化オリゴヌクレオチド(例として、表8に列挙されるDMPK標的化オリゴヌクレオチド)である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR1抗体を含み、抗TfR1抗体は、配列番号69、配列番号71、または配列番号72のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号70のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DMPK標的化オリゴヌクレオチド(例として、表8に列挙されるDMPK標的化オリゴヌクレオチド)である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR1抗体を含み、抗TfR1抗体は、配列番号73または配列番号76のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号74のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DMPK標的化オリゴヌクレオチド(例として、表8に列挙されるDMPK標的化オリゴヌクレオチド)である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR1抗体を含み、抗TfR1抗体は、配列番号73または配列番号76のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号75のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DMPK標的化オリゴヌクレオチド(例として、表8に列挙されるDMPK標的化オリゴヌクレオチド)である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR1抗体を含み、抗TfR1抗体は、配列番号77のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号78のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DMPK標的化オリゴヌクレオチド(例として、表8に列挙されるDMPK標的化オリゴヌクレオチド)である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR1抗体を含み、抗TfR1抗体は、配列番号77または配列番号79のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号80のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DMPK標的化オリゴヌクレオチド(例として、表8に列挙されるDMPK標的化オリゴヌクレオチド)である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR1抗体を含み、抗TfR1抗体は、配列番号154のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号155のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DMPK標的化オリゴヌクレオチド(例として、表8に列挙されるDMPK標的化オリゴヌクレオチド)である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR1抗体を含み、抗TfR1抗体は、配列番号84、配列番号86、または配列番号87のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号85のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DMPK標的化オリゴヌクレオチド(例として、表8に列挙されるDMPK標的化オリゴヌクレオチド)である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR1抗体を含み、抗TfR1抗体は、配列番号88または配列番号91のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号89のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DMPK標的化オリゴヌクレオチド(例として、表8に列挙されるDMPK標的化オリゴヌクレオチド)である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR1抗体を含み、抗TfR1抗体は、配列番号88または配列番号91のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号90のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DMPK標的化オリゴヌクレオチド(例として、表8に列挙されるDMPK標的化オリゴヌクレオチド)である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR1抗体を含み、抗TfR1抗体は、配列番号92または配列番号94のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号95のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DMPK標的化オリゴヌクレオチド(例として、表8に列挙されるDMPK標的化オリゴヌクレオチド)である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR1抗体を含み、抗TfR1抗体は、配列番号92のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号93のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DMPK標的化オリゴヌクレオチド(例として、表8に列挙されるDMPK標的化オリゴヌクレオチド)である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR1抗体を含み、抗TfR1抗体は、配列番号156のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号157のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DMPK標的化オリゴヌクレオチド(例として、表8に列挙されるDMPK標的化オリゴヌクレオチド)である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR1抗体を含み、抗TfR1抗体は、配列番号97、配列番号98、または配列番号99のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号85のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DMPK標的化オリゴヌクレオチド(例として、表8に列挙されるDMPK標的化オリゴヌクレオチド)である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR1抗体を含み、抗TfR1抗体は、配列番号100または配列番号101のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号89のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DMPK標的化オリゴヌクレオチド(例として、表8に列挙されるDMPK標的化オリゴヌクレオチド)である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR1抗体を含み、抗TfR1抗体は、配列番号100または配列番号101のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号90のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DMPK標的化オリゴヌクレオチド(例として、表8に列挙されるDMPK標的化オリゴヌクレオチド)である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR1抗体を含み、抗TfR1抗体は、配列番号102のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号93のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DMPK標的化オリゴヌクレオチド(例として、表8に列挙されるDMPK標的化オリゴヌクレオチド)である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR1抗体を含み、抗TfR1抗体は、配列番号102または配列番号103のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号95のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DMPK標的化オリゴヌクレオチド(例として、表8に列挙されるDMPK標的化オリゴヌクレオチド)である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR1抗体を含み、抗TfR1抗体は、配列番号158または配列番号159のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号157のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DMPK標的化オリゴヌクレオチド(例として、表8に列挙されるDMPK標的化オリゴヌクレオチド)である。
本明細書に記載の複合体の例のいずれかにおいて、いくつかの態様において、抗TfR1抗体は、以下の構造:
を有する分子ペイロードへ連結されており、ここでnは、3であり、mは、4であり、Xは、NH(例として、リシンのアミン基からのNH)であり、およびL1は、
である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、抗TfR1抗体中のリシンを介して、DMPK標的化オリゴヌクレオチド(例として、表8に列挙されるDMPK標的化オリゴヌクレオチド)の5'末へ共有結合的に連結されている抗TfR1抗体を含むが、ここで抗TfR1抗体は、表2に列挙される抗体のいずれか1つのCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含み、ここで複合体は、以下の構造:
Figure 2024503609000058
 を有し、ここでnは、3であり、およびmは、4であり、ならびにここでL1は、
である。式(D)中の抗TfR1抗体に隣接して示されるアミドが、リシンイプシロンアミンなどの抗TfR1抗体のアミンとの反応の結果生じることは理解されるはずである。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、抗TfR1抗体中のリシンを介して、DMPK標的化オリゴヌクレオチド(例として、表8に列挙されるDMPK標的化オリゴヌクレオチド)の5'末へ共有結合的に連結されている抗TfR1抗体を含むが、ここで抗TfR1抗体は、表3に列挙される抗体のいずれか1つのVHおよびVLを含み、ここで複合体は、以下の構造:
Figure 2024503609000060
 を有し、ここでnは、3であり、およびmは、4であり、ならびにここでL1は、
である。式(D)中の抗TfR1抗体に隣接して示されるアミドが、リシンイプシロンアミンなどの抗TfR1抗体のアミンとの反応の結果生じることは理解されるはずである。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、抗TfR1抗体中のリシンを介して、DMPK標的化オリゴヌクレオチド(例として、表8に列挙されるDMPK標的化オリゴヌクレオチド)の5'末へ共有結合的に連結されている抗TfR1抗体を含むが、ここで抗TfR1抗体は、表4に列挙される抗体のいずれか1つの重鎖および軽鎖を含み、ここで複合体は、以下の構造:
Figure 2024503609000062
 を有し、ここでnは、3であり、およびmは、4であり、ならびにここでL1は、
である。式(D)中の抗TfR1抗体に隣接して示されるアミドが、リシンイプシロンアミンなどの抗TfR1抗体のアミンとの反応の結果生じることは理解されるはずである。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、抗TfR1 Fab中のリシンを介して、DMPK標的化オリゴヌクレオチド(例として、表8に列挙されるDMPK標的化オリゴヌクレオチド)の5'末へ共有結合的に連結されている抗TfR1 Fabを含むが、ここで抗TfR1 Fabは、表5に列挙される抗体のいずれか1つの重鎖および軽鎖を含み、ここで複合体は、以下の構造:
Figure 2024503609000064
 を有し、ここでnは、3であり、およびmは、4であり、ならびにここでL1は、
である。式(D)中の抗TfR1抗体に隣接して示されるアミドが、リシンイプシロンアミンなどの抗TfR1抗体のアミンとの反応の結果生じることは理解されるはずである。
いくつかの態様において、L1は、オリゴヌクレオチドの5'ホスファートへ連結される。
いくつかの態様において、L1は、任意である(例として、存在する必要はない)。
III．製剤
本明細書に提供される複合体は、いずれの好適なやり方でも製剤化されていてよい。一般に、本明細書に提供される複合体は、医薬への使用に好適なやり方で製剤化されている。例えば、複合体は、分解を最小限に抑え、送達および/または(例として、および)取り込みを容易にする製剤を使用して、対象へ送達され得るか、あるいは、製剤中の複合体へ別の有益な特性を提供する。いくつかの態様において、本明細書に提供されるのは、複合体および薬学的に許容し得る担体を含む組成物である。かかる組成物は、対象の標的細胞周囲の環境中または対象の全身のいずれかへ投与されたとき充分量の複合体が標的筋細胞に侵入できるように、好適に製剤化され得る。かかる組成物は、対象の標的細胞が置かれている環境中または全身的のいずれかへ投与されたとき充分な量の複合体が標的CNS細胞へ侵入できるように、好適に製剤化され得る。いくつかの態様において、複合体は、リン酸緩衝生理食塩溶液などの緩衝溶液中、リポソーム中、ミセル構造体中、およびカプシド中に製剤化される。
いくつかの態様において、組成物が、本明細書に提供される複合体の1以上の構成要素(例として、筋標的化剤、リンカー、分子ペイロード、またはこれらのいずれか1つの前駆体分子)を個別に包含していてもよいことは解されるはずである。
いくつかの態様において、複合体は、水中または水性溶液(例として、pH調整された水)中に製剤化される。いくつかの態様において、複合体は、塩基性緩衝水性溶液(例として、PBS)中に製剤化される。いくつかの態様において、本明細書に開示のとおりの製剤は、賦形剤を含む。いくつかの態様において、賦形剤は、組成物へ、改善された安定性、改善された吸収、改善された可溶性、および/または(例として、および)、活性成分の治療増強を付与する。いくつかの態様において、賦形剤は、緩衝剤(例として、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、トリス塩基、もしくは水酸化ナトリウム)、またはビヒクル(例として、緩衝溶液、ワセリン、ジメチルスルホキシド、または鉱油)である。
いくつかの態様において、複合体またはその構成要素(例として、オリゴヌクレオチドまたは抗体)は、その貯蔵寿命を延長するため凍結乾燥され、次いで使用(例として、対象への投与)前に溶液にさせられる。結果的に、本明細書に記載の複合体またはその構成要素を含む組成物中の賦形剤は、凍結保護剤(lyoprotectant)(例として、マンニトール、ラクトース、ポリエチレングリコール、もしくはポリビニルピロリドン)、または崩壊温度修飾因子(例として、デキストラン、フィコール、もしくはゼラチン)であってもよい。
いくつかの態様において、医薬組成物は、その意図された投与ルートに適合するよう製剤化されている。投与ルートの例は、非経口投与、例として、静脈内投与、皮内投与、皮下投与を包含する。典型的には、投与ルートは、静脈内投与または皮下投与である。
注射剤への使用に好適な医薬組成物は、滅菌水性溶液(ここで水に可溶性である)または分散溶液、および滅菌注射剤溶液または分散溶液の即時調製のための滅菌粉末を包含する。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等)、および好適なそれらの混合物を含有する溶媒または分散媒体であり得る。いくつかの態様において、製剤は、組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、および塩化ナトリウムを包含する。滅菌注射剤溶液は、要求量の複合体を、上に列挙された成分の1つまたはそれらの組み合わせとともに、選択された溶媒に組み込むこと、要求に応じ、これに続き濾過滅菌することによって調製され得る。
いくつかの態様において、組成物は、活性成分(単数または複数)のパーセンテージが組成物全体の重量または体積の約1％と約80％以上との間であってもよいが、少なくとも約0.1％の複合体もしくはその構成要素を含有していてもよい。可溶性、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与ルート、産物の貯蔵寿命などの因子、ならびに他の薬理学的留意事項は、かかる医薬製剤を調製する当業者によって企図されるであろう。そのため様々な投薬量および処置計画が所望されることもある。
IV．使用の方法/処置
本明細書に記載のとおりの分子ペイロードへ共有結合的に連結された筋標的化剤を含む複合体は、筋緊張性ジストロフィーを処置するのに有効である。いくつかの態様において、複合体は、筋緊張性ジストロフィー1型(DM1)を処置するのに有効である。いくつかの態様において、DM1は、DMPKの3'非コード領域にあるCTG/CUGトリヌクレオチド反復の拡張に関連する。いくつかの態様において、ヌクレオチド拡張は、重要な細胞内タンパク質、例として、muscleblind様タンパク質に高い親和性で結合するヘアピン構造を形成することができる有毒なRNA反復に繋がる。
いくつかの態様において、対象は、ヒト対象、霊長目の非ヒト動物対象、齧歯類動物対象、またはいずれの好適な哺乳類の動物対象であってもよい。いくつかの態様において、対象は、筋緊張性ジストロフィーを有していてもよい。いくつかの態様において、対象は、任意で、疾患関連反復を含有していてもよいDMPKアレルを有する。いくつかの態様において、対象は、約2～10反復単位、約2～50反復単位、約2～100反復単位、約50～1,000反復単位、約50～500反復単位、約50～250反復単位、約50～100反復単位、約500～10,000反復単位、約500～5,000反復単位、約500～2,500反復単位、約500～1,000反復単位、または約1,000～10,000反復単位を含む、拡張した疾患関連反復を有するDMPKアレルを有していてもよい。いくつかの態様において、対象は、DM1の症状、例として筋委縮または筋肉の喪失を患っている。いくつかの態様において、対象は、DM1の症状を患っていない。いくつかの態様において、対象は、先天性筋緊張性ジストロフィーを有する。
本開示の側面は、本明細書に記載のとおりの有効量の複合体を対象へ投与することを伴う方法を包含する。いくつかの態様において、分子ペイロードへ共有結合的に連結された筋標的化剤を含む複合体を含む有効量の医薬組成物は、処置を必要とする対象へ投与され得る。いくつかの態様において、本明細書に記載のとおりの複合体を含む医薬組成物は、静脈内投与を包含してもよい好適なルートによって、例として、ボーラスとして、またはある期間にわたる連続注入によって、投与されてもよい。いくつかの態様において、静脈内投与は、筋肉内の、腹腔内の、脳脊髄内の(intracerebrospinal)、皮下の、関節内の、滑液嚢内の、または髄腔内のルートによって実施されてもよい。いくつかの態様において、医薬組成物は、固体形態、水性形態、または液体形態であってもよい。いくつかの態様において、水性または液体形態は、噴霧されてもよく、または凍結乾燥されてもよい。いくつかの態様において、噴霧形態または凍結乾燥形態は、水性または液体溶液で再構成されてもよい。
静脈内投与のための組成物は、植物油、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、乳酸エチル、炭酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、エタノール、およびポリオール(グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等)などの様々な担体を含有していてもよい。静脈内注射のための水可溶性抗体は点滴法によって投与され得、これによって抗体および薬学的に許容し得る賦形剤を含有する医薬製剤が注入される。薬学的に許容し得る賦形剤は、例えば、5％デキストロース、0.9％生理食塩水、リンガー溶液、または他の好適な賦形剤を包含していてもよい。筋肉内用調製物、例として、抗体の好適な可溶性の塩形態の滅菌製剤は、注射用水、0.9％生理食塩水、または5％グルコース溶液などの医薬賦形剤に溶解されて投与され得る。
いくつかの態様において、分子ペイロードへ共有結合的に連結されたた筋標的化剤を含む複合体を含む医薬組成物は、部位特異的または局部的な送達技法を介して投与される。これらの技法の例は、複合体の埋め込み型デポー供給源、局部送達カテーテル、部位特異的担体、直接注射、または直塗り(direct application)を包含する。
いくつかの態様において、分子ペイロードへ共有結合的に連結された筋標的化剤を含む複合体を含む医薬組成物は、治療効果を対象に付与する有効濃度にて投与される。有効量は、当業者によって認識されるとおり、疾患の重症度、処置される対象の特有な特徴、例として、年齢、体調、健康状態、または重量、処置時間、いずれの併用治療の性質、投与ルート、および関連因子に応じて変動する。これらの関連因子は当業者に知られており、わずかな定型的実験法で対処され得る。いくつかの態様において、有効濃度は、ペイシェントに安全であるとみなされる最大用量である。いくつかの態様において、有効濃度は、最大限の効き目を提供する、実行可能な最低濃度であろう。
経験的考察、例として、対象における複合体の半減期は一般に、処置のために使用される医薬組成物の濃度の決定に寄与するであろう。投与頻度は、処置の効き目を最大化するために経験的に決定かつ調整されてもよい。
処置の効き目は、いずれか好適な方法を使用して査定されてもよい。いくつかの態様において、処置の効き目は、DM1に関連する症状、例として、筋萎縮または筋力衰弱、被験者の自己申告結果の測定、例として、可動性、セルフケア、通常の活動、疼痛/不快感、および不安/抑うつを通して、または生活の質の指標、例として寿命により、所見の評価によって査定されてもよい。
いくつかの態様において、本明細書に記載の分子ペイロードへ共有結合的に連結された筋標的化剤を含む複合体を含む医薬組成物は、対照(例として、処置に先立つ遺伝子発現のベースラインレベル)と比べて、標的遺伝子の活性または発現を少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、または少なくとも95％阻害するのに充分な有効濃度にて、対象へ投与される。
いくつかの態様において、本明細書に記載の分子ペイロードへ共有結合的に連結された筋標的化剤を含む複合体を含む医薬組成物の対象への単回用量または投与は、少なくとも1～5日間、1～10日間、5～15日間、10～20日間、15～30日間、20～40日間、25～50日間、またはこれより長い期間、標的遺伝子の活性または発現を阻害するのに充分である。いくつかの態様において、本明細書に記載の分子ペイロードへ共有結合的に連結された筋標的化剤を含む複合体を含む医薬組成物の対象への単回用量または投与は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、または24週間、標的遺伝子の活性または発現を阻害するのに充分である。いくつかの態様において、本明細書に記載の分子ペイロードへ共有結合的に連結された筋標的化剤を含む複合体を含む医薬組成物の対象への単回用量または投与は、少なくとも1～5、1～10、2～5、2～10、4～8、4～12、5-10、5～12、5～15、8～12、8～15、10～12、10～15、10～20、12～15、12～20、15～20、または15-25週間、標的遺伝子の活性または発現を阻害するのに充分である。いくつかの態様において、本明細書に記載の分子ペイロードへ共有結合的に連結された筋標的化剤を含む複合体を含む医薬組成物の対象への単回用量または投与は、少なくとも1、2、3、4、5、または6カ月間、標的遺伝子の活性または発現を阻害するのに充分である。
いくつかの態様において、医薬組成物は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された筋標的化剤を含む、1種より多くの複合体を含んでいてもよい。いくつかの態様において、医薬組成物は、対象、例として、DM1を有するヒト対象の処置のためのいずれか他の好適な治療剤をさらに含んでいてもよい。いくつかの態様において、他の治療剤は、本明細書に記載の複合体の有効性を増強または補完するものであってもよい。いくつかの態様において、他の治療剤は、本明細書に記載の複合体とは異なる症状または疾患を処置するよう機能してもよい。
例
例1．DMPK標的化オリゴヌクレオチド(ASO)へ抱合された抗TfR1 Fabを含有する抱合体のIn vitro活性
横紋筋肉腫(RD)および32F細胞におけるDMPK mRNA発現の低減と、380のCTG反復を含有する突然変異DMPK mRNAを発現するDM1-32F初代細胞(32F細胞;Cook MyoSite,Pittsburg,PA)におけるBIN1エキソン11スプライシング欠陥の修正とにおける、表8に列挙されるDMPK標的化オリゴヌクレオチド(ASO)の活性を決定するために、in vitro実験を行った(図1A)。すべてのASOを、抗TfR1 Fab (3M12-VH4/VK3)へ抱合させた。
RD細胞を増殖させて(expanded)、20000細胞/ウェルの密度にて96ウェルプレート中へ播種した。細胞を37Cにて終夜回復させた。翌日、培地を換えて細胞を500nM ASOに相当する抱合体で処置し、72時間インキュベートした。72時間後、PureLink Pro 96 RNA抽出キットを使用して全RNAを抽出し、qScript cDNA合成キットを使用してcDNAを生成した。cDNAを使用し、Taqman PCRを使用する総DMPKのノックダウンを査定した。データをPPIB発現に対して正規化し、2-ΔΔCt方法を使用してビヒクルのみの対照と比較したDMPKノックダウンを決定した。データは、標準偏差とともに平均値としてプロットされている。
DM1 32F初代細胞を解凍して回復させ、次いで96ウェルプレート中、成長培地中50000細胞/ウェルの密度にて播種し、次いで終夜回復させた。次の日、成長培地を低血清分化培地へ換え、細胞を100nM ASOに相当する抱合体で処置した。細胞を10日間インキュベートし、次いでQiagen MiRNeasy抽出キットを使用して全RNAを回収し、qScript cDNA合成キットを使用してcDNAを合成した。
cDNAを使用して、Taqman PCRを使用する総DMPKのノックダウンを査定した。データをPPIB発現に対して正規化し、2-ΔΔCt方法を使用してビヒクルのみの対照と比較したDMPKノックダウンを決定した。データは、標準偏差とともにDMPKノックダウンの平均値％として提示されている(表9)。加えて、DM1媒介異常スプライシングの修飾を、多重化Taqman qPCRを使用して評価することで、異常にスプライシングされた転写産物と正常な転写産物とを評価した。これらのデータは、正常なものに対する異常にスプライシングされたものの平均比率として、標準偏差とともに提示されている(表9)。1の比率は、DM1患者筋管で処置されたビヒクル対照と比較したとき、異常スプライシングに変化がないことを意味する。1より大きな比率は、より多くの転写産物が野生型スプライシングパターンを有することを意味する。1未満の比率は、より多くの転写産物がDM1媒介スプライシングパターンを有することを意味する。
表9．DMPKノックダウンおよびBIN1エキソン11スプライシング欠陥修正
例2．患者由来の細胞における、DMPK標的化ASOへ抱合された抗TfR1 Fabを含有する抱合体のIn vitro活性
380のCTG反復を含有する突然変異DMPK mRNAを発現するDM1-32F初代細胞(32F細胞;Cook MyoSite,Pittsburg,PA)(図1A)と、2600のCTG反復を含有する突然変異DMPK mRNAを発現するDM1-CL5不死化細胞(CL5細胞)(図1B)とにおいて、DMPK mRNA発現の低減、BIN1エキソン11スプライシング欠陥の修正、および核内フォーカスの低減(核内フォーカス面積の核面積に対する比率として測定された)における、DMPK標的化オリゴヌクレオチドASO1の活性を決定するために、in vitro実験を行った。ASO1は、DM1-32F細胞およびDM1-CL5細胞において突然変異DMPK mRNAを低減することができることを最初に確認したが、RT-PCRに従うと健常細胞においてはDMPK mRNAレベルに影響を及ぼさなかった(図1A～1B)。
ASO1またはASO 32へ抱合された対照抗TfR1 Fabを含有する抱合体を、32F細胞において、DMPK mRNA発現の低減、BIN1エキソン11スプライシング欠陥の修正、および核内フォーカスの低減(核内フォーカス面積の核面積に対する比率として測定された)におけるその能力について試験した。記載のとおり(参照により本明細書に組み込まれる、Arandel et al., Disease Models ＆ Mechanisms 2017 10: 487-497)、32F細胞を156,000細胞/cm2の密度にて播種して24時間回復させ、分化培地へ移して筋管形成を誘導し、続いてASO32-抱合体およびASO1-抱合体へ500nMのペイロード濃度にて曝露させた。並行して、ビヒクルPBSへ曝露させた培養物は陰性対照として働いた。細胞を10日間の培養後に回収した。
遺伝子発現の分析には、細胞をQiagen miRNAeasyキットによる全RNA抽出のためにQiazolによって収集した。精製されたRNAを逆転写し、DMPK、PPIB、BIN1転写産物、およびエキソン11を含有するBIN1 mRNAアイソフォームのレベルを、特異的なTaqManアッセイ(ThermoFisher)によるqRT-PCRによって決定した。DMPK発現のLogの倍率変化を2-ΔΔCT法に従って計算した。PPIBを参照遺伝子として、ビヒクルへ暴露された細胞を対照群として使用した。エキソン11を含有するBIN1アイソフォームレベルのLogの倍率変化を2-ΔΔCT法に従って計算した。BIN1を参照遺伝子として、ビヒクルへ暴露された細胞を対照群として使用した。
突然変異体DMPKの核のフォーカスの面積を測定するために、細胞を4％ホルマリンによって固定し、0.1％Triton X-100によって透過処理し、Cy5フルオロフォア(PNA Bio)へ抱合されたCAGペプチド核酸プローブと70℃でハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーション緩衝液および2×SSC溶液による複数の洗浄後に、核をDAPIによって対比染色した。画像を400×の拡大率で共焦点顕微鏡法によって収集し、フォーカス面積を、DAPIシグナルの面積内に含有されるCy5シグナルの面積として測定した。データは、核内フォーカス面積の核面積に対する比率として表現した。
結果は、ASO32-抱合体またはASO1-抱合体の単回用量が、低減された突然変異DMPK発現(図2A)、修正されたBIN1エキソン11スプライシング欠陥(図2B)、およびおよそ40％低減された核内フォーカス(図2C～2D)をもたらしたことを示す。
CL5細胞に対しても同様の実験を実施し、結果は、ASO32-抱合体またはASO1-抱合体の単回用量が、低減された突然変異DMPK発現(図3A)、修正されたBIN1エキソン11スプライシング欠陥(図3B)をもたらしたこと、およびASO32-抱合体が核内フォーカスをおよそ30％低減したものの、ASO1-抱合体が核内フォーカスをおよそ3％低減したことを示す(図3C～3D)。
さらに、ASO32、ASO10、ASO8、ASO26、およびASO1などの他のDMPK標的化オリゴヌクレオチドへ抱合された抗TfR1 Fab (3M12-VH4/VK3)を含有する抱合体も、32F細胞において、DMPK mRNA発現の低減、BIN1エキソン11スプライシング欠陥の修正、および核内フォーカスの低減におけるそれらの活性について試験した(図4A)。実験は上に記載のとおり実施した。
結果は、ASO32-抱合体、ASO10-抱合体、ASO8-抱合体、ASO26-抱合体またはASO1-抱合体の単回用量が、低減された突然変異DMPK発現(図4B)、修正されたBIN1エキソン11スプライシング欠陥(図4C)、およびおよそ少なくとも20％低減された核内フォーカスをもたらしたことを示す(図4D～4E)。図4Fは、ASO32-抱合体、ASO10-抱合体、ASO8-抱合体、ASO26-抱合体、およびASO1-抱合体が、32F細胞においてDMPK発現を用量依存的に低減することができたことを示す(細胞をDMPK標的化オリゴヌクレオチド-抱合体へ14nM、45nM、および150nMのASO濃度にて曝露した)。図4Gは、ASO32-抱合体、ASO10-抱合体、ASO8-抱合体、ASO26-抱合体、およびASO1-抱合体が、32F細胞においてBIN1エキソン11スプライシング欠陥を用量依存的に修正することができたことを示す(細胞をDMPK標的化オリゴヌクレオチド-抱合体へ14nM、45nM、および150nMのASO濃度にて曝露した)。図4Hは、ASO32-抱合体、ASO10-抱合体、ASO8-抱合体、ASO26-抱合体、およびASO1-抱合体は、32F細胞においてCUGフォーカスを用量依存的に低減することができたことを示す(細胞をDMPK標的化オリゴヌクレオチド-抱合体へ14nM、45nM、および150nMのASO濃度にて曝露した)。
同様の実験をCL5細胞においても実施した(図5A)。この実験において、試験されたすべてのDMPK標的化オリゴヌクレオチドを、抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3へ抱合させた。実験を上に記載のとおり実施した。
結果は、ASO32-抱合体、ASO10-抱合体、ASO8-抱合体、ASO26-抱合体、またはASO1-抱合体の単回用量が、低減された突然変異DMPK発現(図5B)、および修正されたBIN1エキソン11スプライシング欠陥(図5C)をもたらしたことを示す。ASO32-抱合体、ASO10-抱合体、およびASO8-抱合体は、核内フォーカスをおよそ30％低減し、ASO26-抱合体は、核内フォーカスをおよそ10％低減し、ASO1-抱合体は、核内フォーカスを低減しないようであった(図5D～5E)。図5Fは、ASO32-抱合体、ASO10-抱合体、ASO8-抱合体、ASO26-抱合体、およびASO1-抱合体が、CL5細胞においてDMPK発現を用量依存的に低減することができたことを示す(細胞をDMPK標的化オリゴヌクレオチド-抱合体へ14nM、45nM、および150nMのASO濃度にて曝露した)。図5Gは、ASO32-抱合体、ASO10-抱合体、ASO8-抱合体、ASO26-抱合体、およびASO1-抱合体が、CL5細胞においてBIN1エキソン11スプライシング欠陥を用量依存的に修正することができたことを示す(細胞をDMPK標的化オリゴヌクレオチド-抱合体へ14nM、45nM、および150nMのASO濃度にて曝露した)。図5Hは、ASO32-抱合体、ASO10-抱合体、およびASO8-抱合体が、CL5細胞においてCUGフォーカスを用量依存的に低減することができたことを示す。ASO26-抱合体は、最も高い濃度にて核内フォーカスを低減し、ASO1-抱合体は、核内フォーカスを低減しないようであった(細胞をDMPK標的化オリゴヌクレオチド-抱合体へ14nM、45nMおよび150nMのASO濃度にて曝露した)。
その上、ASO10-抱合体、ASO8-抱合体、ASO26-抱合体は、横紋筋肉腫(RD)細胞においてDMPK発現を用量依存的にノックダウンすることができ、ASO1-抱合体は、霊長目の非ヒト動物(NHP)細胞においてDMPKを用量依存的にノックダウンすることができた(細胞をASOへ4nM、20nM、100nM、または500nMにて曝露した)(図6)。すべてのASOを、抗TfR1 Fab 3M12 - VH4/VK3へ抱合させた。
例3．DMPK標的化オリゴヌクレオチドの化学的改変は、オリゴヌクレオチドへ抱合された抗TfR1 Fabを含有する抱合体の効能に影響を及ぼす
種々の化学的改変が、如何にしてDMPK標的化オリゴヌクレオチドの効能に影響を及ぼし得るかを試験するために、種々の化学的改変パターンを有するツールDMPK標的化オリゴヌクレオチドASO32を、DMPK発現の低減におけるそれらの活性について試験した。ASO30、ASO31、およびASO32は、同じヌクレオチド配列を有するが、異なる修飾パターンを含有する(表8を見よ)。横紋筋肉腫(RD)細胞を接触させることに先立ち、すべてのオリゴヌクレオチドを抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3へ抱合させた。細胞を、ASO32-抱合体、ASO31-抱合体、またはASO30-抱合体と4nM、20nM、100nM、または500nMのASO濃度にて接触させ、DMPK発現のノックダウンにおけるオリゴヌクレオチド能を決定するためにDMPK発現レベルを評価した。試験されたすべてのオリゴヌクレオチド-抱合体が、DMPK発現を用量依存的に低減することができた。500nMのオリゴ濃度にて、ASO32-抱合体は、DMPK発現を88％低減することができ、ASO31-抱合体は、DMPK発現を70％低減することができ、ASO30-抱合体は、DMPK発現を39％低減することができた(図7)。
他のDMPK標的化オリゴヌクレオチドにおいても同様の実験を実施し、長さおよび異なる化学的改変がオリゴヌクレオチドの効能に影響を及ぼすことを示す。この実験において、ASO32、ASO2、ASO8、ASO9、ASO10、ASO11、ASO20、およびASO26へ抱合された抗TfR1 Fab (3M12 - VH4/VK3)を含有する抱合体を試験した。ASO32、ASO2、ASO8、ASO9、ASO10、ASO11、ASO20、およびASO26は、修飾パターンが異なるgapmerである(表8を見よ)。ヒトRD細胞を、ASO32-抱合体、ASO10-抱合体、ASO8-抱合体、ASO9-抱合体、ASO11-抱合体、ASO20-抱合体、ASO26-抱合体、およびASO2-抱合体へ4nM、20nM、100nM、または500nMのASO濃度にて曝露させ、DMPK発現のノックダウンにおけるオリゴヌクレオチド能を決定するためにDMPK発現レベルを評価した。試験されたすべてのオリゴヌクレオチド-抱合体が、DMPK発現を用量依存的に低減することができた。500nMのオリゴ濃度にて、ASO10-抱合体は、DMPK発現をおよそ80％低減することができ、ASO8-抱合体は、DMPK発現をおよそ70％低減することができ、ASO9-抱合体は、DMPK発現をおよそ60％低減することができ(図8A)、ASO11-抱合体は、DMPK発現をおよそ40％低減することができ、ASO20-抱合体は、DMPK発現をおよそ40％低減することができ、ASO26-抱合体は、DMPK発現をおよそ30％低減することができ、およびASO2-抱合体は、DMPK発現をおよそ40％低減することができた(図8B)。
またhTfR1 ELISA実験も実行し、ASO10-抱合体(EC50 11nM ASO相当)、ASO8-抱合体(EC50 29nM ASO相当)、ASO26-抱合体(EC50 1nM ASO相当)、およびASO1-抱合体(EC50 17nM ASO相当)のEC50を測定した。
例4．DM1マウスモデルにおける、DMPK標的化オリゴヌクレオチドへ抱合された抗TfR1 Fabを含有する抱合体のIn vivo活性
様々なDMPK標的化オリゴヌクレオチドへ抱合された抗TfR1 Fabを含有する抱合体を、ヒトTfR1と拡張されたCUG反復を内包するヒトDMPK突然変異体との両方を発現するマウスモデルにおいて試験した。最初の実験において、ASO32を対照抗TfR1 Fabへ抱合させ、抱合体を10mg/kg ASO32に相当する用量にて、静脈内注射によってマウスへ第0日および第7日にて投与した。マウスを第14日にてサクリファイスし、ヒト突然変異DMPK発現を様々な筋組織において評価した。結果は、ASO32-抱合体が、ヒト突然変異DMPKを前脛骨筋において36％(図9A)、横隔膜において46％(図9B)、心臓において42％(図9C)低減したことを示す。
さらに、ASO32へ抱合された抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3を含有する抱合体を、ヒトTfR1を発現するマウスモデルにおいて試験した。ASO32-抱合体は、マウス野生型dmpkを前脛骨筋において79％(図9D)、腓腹筋において76％(図9E)、心臓において70％(図9F)、横隔膜において88％(図9G)低減した。前脛骨筋、腓腹筋、心臓、および横隔膜におけるASO32分布を図9H～9Kに示す。すべての組織は、ビヒクル対照を比較して増大したレベルのASO32を示した。
ASO10、ASO8、ASO26、およびASO1を、ヒトTfR1と拡張されたCUG反復を内包するヒトDMPK突然変異体との両方を発現する上に記載のと同じマウスモデルにおいて試験した。ASO32は対照として包含されており、これを対照抗TfR1 Fabへ抱合させた。ASO10、ASO8、ASO26、およびASO1を、抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3へ抱合させた。マウスにオリゴヌクレオチドを第0日および第7日にて注射し、第14日にてサクリファイスした。実験群は以下を包含する:(ｉ)ビヒクル対照を、ヒトTfR1を発現するマウスへ注射した(n=4);(ii)ビヒクル対照を、ヒトTfR1と拡張されたCUG反復を内包するヒトDMPK突然変異体との両方を発現するマウスへ注射した(n=10);(iii)ASO10-抱合体を、2x9.7mg/kgのASO10に相当する用量にて、ヒトTfR1と拡張されたCUG反復を内包するヒトDMPK突然変異体との両方を発現するマウスへ注射した(n=6);(iv)ASO8-抱合体を、2x9.2mg/kgのASO8に相当する用量にて、ヒトTfR1と拡張されたCUG反復を内包するヒトDMPK突然変異体との両方を発現するマウスへ注射した(n=5);(ｖ)ASO26-抱合体を、2x12.3mg/kgのASO26に相当する用量にて、ヒトTfR1と拡張されたCUG反復を内包するヒトDMPK突然変異体との両方を発現するマウスへ注射した(n=6);および(vi)ASO1-抱合体を、2x12.7mg/kgのASO1に相当する用量にて、ヒトTfR1と拡張されたCUG反復を内包するヒトDMPK突然変異体との両方を発現するマウスへ注射した(n=6)。マウスをサクリファイスしたら、ヒト突然変異DMPK発現を様々な筋組織において評価した。図10Aは、ASO32-抱合体が、心臓においてヒト突然変異DMPKを42％低減し、ASO10-抱合体が、心臓においてヒト突然変異DMPKを60％低減し、ASO8-抱合体が、心臓においてヒト突然変異DMPKを67％低減し、ASO26-抱合体が、心臓においてヒト突然変異DMPKを49％低減した;およびASO1-抱合体が、心臓においてヒト突然変異DMPKを15％低減したことを示す。図10Bは、ASO32-抱合体が、横隔膜においてヒト突然変異DMPKを46％低減し、ASO10-抱合体が、横隔膜においてヒト突然変異DMPKを56％低減した、ASO8-抱合体が、横隔膜においてヒト突然変異DMPKを58％低減し、ASO26-抱合体が、横隔膜においてヒト突然変異DMPKを38％低減した;およびASO1-抱合体が、横隔膜においてヒト突然変異DMPKを35％低減したことを示す。図10Cは、ASO32-抱合体が、腓腹筋においてヒト突然変異DMPKを25％低減し、ASO10-抱合体が、腓腹筋においてヒト突然変異DMPKを39％低減し、ASO8-抱合体が、腓腹筋においてヒト突然変異DMPKを42％低減し、ASO26-抱合体が、腓腹筋においてヒト突然変異DMPKを26％低減した;およびASO1-抱合体は、腓腹筋においてヒト突然変異DMPKを低減しないようであったことを示す。図10Dは、ASO32-抱合体が、前脛骨筋においてヒト突然変異DMPKを36％低減し、ASO10-抱合体が、前脛骨筋においてヒト突然変異DMPKを54％低減し、ASO8-抱合体が、前脛骨筋においてヒト突然変異DMPKを51％低減し、ASO26-抱合体が、前脛骨筋においてヒト突然変異DMPKを52％低減した;およびASO1-抱合体が、前脛骨筋においてヒト突然変異DMPKを6％低減したことを示す。さらに、10mg/kgのASO10に相当する用量にて投与されたASO10-抱合体は、マウスにおいて、心臓における核内フォーカスを低減した(図10E)。
さらに、試験されたオリゴヌクレオチドとマウス野生型Dmpkとの間に1ヌクレオチドミスマッチがあるにもかかわらず、オリゴは、上に記載のマウスモデルにおいてマウスDmpk発現を低減することができた。図11Aは、ASO32-抱合体が、心臓においてマウスDmpkを73％低減し、ASO10-抱合体が、心臓においてマウスDmpkを47％低減し、ASO8-抱合体が、心臓においてマウスDmpkを53％低減し、ASO26-抱合体が、心臓においてマウスDmpkを38％低減した;およびASO1-抱合体が、心臓においてマウスDmpkを12％低減したことを示す。図11Bは、ASO32-抱合体が、横隔膜においてマウスDmpkを75％低減し、ASO10-抱合体が、横隔膜においてマウスDmpkを51％低減し、ASO8-抱合体が、横隔膜においてマウスDmpkを27％低減し、ASO26-抱合体が、横隔膜においてマウスDmpkを32％低減した;およびASO1-抱合体が、横隔膜においてマウスDmpkを40％低減したことを示す。図11Cは、ASO32-抱合体が、腓腹筋においてマウスDmpkを69％低減し、ASO10-抱合体が、腓腹筋においてマウスDmpkを33％低減し、ASO8-抱合体が、腓腹筋においてマウスDmpkを22％低減し、ならびにASO26-抱合体およびASO1-抱合体は、腓腹筋においてマウスDmpkを低減しないようであったことを示す。図11Dは、ASO32-抱合体が、前脛骨筋においてマウスDmpkを68％低減し、ASO10-抱合体が、前脛骨筋においてマウスDmpkを40％低減し、ASO8-抱合体が、前脛骨筋においてマウスDmpkを32％低減し、ASO26-抱合体が、前脛骨筋においてマウスDmpkを28％低減した;およびASO1-抱合体は、前脛骨筋においてマウスDmpkを低減しないようであったことを示す。
オリゴヌクレオチドの組織曝露をハイブリダイゼーションELISA(参照により本明細書に組み込まれる、Burki et al., Nucleic Acid Ther. 2015 Oct;25(5):275-84)によって試験し、組織中のASOのレベルをグラフ化した。図12A～12Dは、注射から2週間後の心臓、横隔膜、腓腹筋、または前脛骨筋の夫々における、ASO10、ASO8、ASO26、およびASO1の量を示す。
ASO1へ抱合された対照抗TfR1 Fabを含有する抱合体の長期的な効果を、ヒトTfR1と拡張されたCUG反復を内包するヒトDMPK突然変異体との両方を発現する同じマウスモデルにおいて試験した。第0日および第7日にてマウスにASO1-抱合体を10mg/kgのASO1に相当する用量にて注射した。いくつかのマウスを注射から2週間後にサクリファイスし、残りを注射から4週間後にサクリファイスした。ヒト突然変異DMPKおよびマウスDmpk発現レベルを様々な筋組織において試験した。図13Aは、ASO1-抱合体が、心臓においてヒト突然変異DMPKを、注射から2週間後に9％、注射から4週間後に15％ノックダウンしたことを示す。図13Bは、ASO1-抱合体が、横隔膜においてヒト突然変異DMPKを、注射から2週間後に19％、注射から4週間後に34％ノックダウンしたことを示す。図13Cは、ASO1-抱合体が、腓腹筋においてヒト突然変異DMPKを、注射から2週間後に7％、注射から4週間後に17％ノックダウンしたことを示す。図13Dは、ASO1-抱合体が、前脛骨筋においてヒト突然変異DMPKを、注射から2週間後に6％、注射から4週間後に0％ノックダウンしたことを示す。図14Aは、ASO1-抱合体が、心臓においてマウスDmpkを、注射から2週間後に8％、注射から4週間後に13％ノックダウンしたことを示す。図14Bは、ASO1-抱合体が、横隔膜においてマウスDmpkを、注射から2週間後に14％、注射から4週間後に33％ノックダウンしたことを示す。図14Cは、ASO1-抱合体が、腓腹筋においてマウスDmpkを、注射から2週間後に0％、注射から4週間後に6％ノックダウンしたことを示す。図14Dは、ASO1-抱合体が、前脛骨筋においてマウスDmpkを注射から2週間後および注射から4週間後にノックダウンしなかったことを示す。心臓、横隔膜、腓腹筋、および前脛骨筋における注射から4週間後のASO1の量を図15A～15Dに示す。
さらに、ASO1へ抱合された対照抗TfR1 Fabを含有する抱合体を、ヒトTfR1と拡張されたCUG反復を内包するヒトDMPK突然変異体との両方を発現する同じマウスモデルにおいて試験したが、異なる注射/サクリファイスのスケジュールを使用した。この実験において、ASO1-抱合体を12.7mg/kgのASO1に相当する用量にて、マウスに第0日、第7日、第14日、および第21日にて注射した。マウスを注射から5週間後にサクリファイスした。ヒト突然変異DMPKおよびマウスDmpk発現レベルを様々な筋組織において試験した。図16Aは、ASO1-抱合体が、心臓においてヒト突然変異DMPKを、注射から5週間後に5％ノックダウンしたことを示す。図16Bは、ASO1-抱合体が、横隔膜においてヒト突然変異DMPKを、注射から5週間後に35％ノックダウンしたことを示す。図16Cは、ASO1-抱合体は、腓腹筋においてヒト突然変異DMPKを注射から5週間後にノックダウンしないようであったことを示す。図16Dは、ASO1-抱合体は、前脛骨筋においてヒト突然変異DMPKを注射から5週間後にノックダウンしないようであったことを示す。図17Aは、ASO1-抱合体が、心臓においてマウスDmpkを、注射から5週間後に13％ノックダウンしたことを示す。図17Bは、ASO1-抱合体が、横隔膜においてマウスDmpkを、注射から5週間後に41％ノックダウンしたことを示す。図17Cは、ASO1-抱合体が、腓腹筋においてマウスDmpkを、注射から5週間後に5％ノックダウンしたことを示す。図17Dは、ASO1-抱合体が、前脛骨筋においてマウスDmpkを、注射から5週間後に10％ノックダウンしたことを示す。心臓、横隔膜、腓腹筋、および前脛骨筋における注射から5週間後のASO1の量を図18A～18Dに示す。
ASO9へ抱合された抗TfR1 Fab (3M12-VH4/VK3)を含有する抱合体を、ヒトTfR1と拡張されたCUG反復を内包するヒトDMPK突然変異体との両方を発現する同じマウスモデルにおいて、DMPK発現を低減するそれらの効能について試験した。ASO9-抱合体を10mg/kgのASO9に相当する用量にて、マウスへ第0日および第7日にて注射した。マウスを注射から2週間後にサクリファイスした。ヒト突然変異DMPKおよびマウスDmpk発現レベルを様々な筋組織において試験した。図19Aは、ASO9-抱合体が、心臓においてヒト突然変異DMPKを、注射から2週間後に50％ノックダウンしたことを示す。図19Bは、ASO9-抱合体が、横隔膜においてヒト突然変異DMPKを、注射から2週間後に58％ノックダウンしたことを示す。図19Cは、ASO9-抱合体が、前脛骨筋においてヒト突然変異DMPKを、注射から2週間後に30％ノックダウンしたことを示す。図19Dは、ASO9-抱合体が、腓腹筋においてヒト突然変異DMPKを注射から2週間後に35％ノックダウンしたことを示す。図20Aは、ASO9-抱合体が、心臓においてマウスDmpkを、注射から2週間後に48％ノックダウンしたことを示す。図20Bは、ASO9-抱合体が、横隔膜においてマウスDmpkを、注射から2週間後に68％ノックダウンしたことを示す。図20Cは、ASO9-抱合体が、腓腹筋においてマウスDmpkを、注射から2週間後に45％ノックダウンしたことを示す。図20Dは、ASO9-抱合体が、前脛骨筋においてマウスDmpkを、注射から2週間後に20％ノックダウンしたことを示す。心臓、横隔膜、腓腹筋、および前脛骨筋における注射から2週間後のASO9の量を図21A～21Dに示す。
ASO10へ抱合された抗TfR1 Fab(3M12-VH4/VK3)を含有する抱合体を、ヒトTfR1と拡張されたCUG反復を内包するヒトDMPK突然変異体との両方を発現するマウスモデルにおいて、DMPK発現を低減するそれらの効能について試験した。ASO10抱合体を、5mg/kg、10mg/kg、または20mg/kgのASO10に相当する用量にて、マウスへ尾静脈注射を介して第0日に注射した。マウスを注射から28日後にもサクリファイスした。ヒト突然変異DMPK発現レベルを様々な筋組織において試験した。図24Aは、ASO10-抱合体が、試験されたすべての用量にて、心臓においてヒト突然変異DMPKを注射から28日後にノックダウンしたことを示す。図24Bは、ASO10-抱合体が、試験されたすべての用量にて、横隔膜においてヒト突然変異DMPKを注射から28日後にノックダウンしたことを示す。図24Cは、ASO10-抱合体が、試験されたすべての用量にて、腓腹筋においてヒト突然変異DMPKを注射から28日後にノックダウンしたことを示す。図24Dは、ASO10-抱合体が、試験されたすべての用量にて、前脛骨筋においてヒト突然変異DMPKを注射から28日後にノックダウンしたことを示す。
さらに、ASO10-抱合体が10mg/kgのASO10に相当する用量にて注射されたマウスにおいて、細胞成分分画、これに続く核画分における遺伝子発現の分析は、ASO10が核へ送達されたこと、およびASO10-抱合体が、核に閉じ込められた突然変異ヒトDMPK mRNAの蓄積を低減したことを示した。ビヒクル対照が注射されたマウスからの腓腹筋の細胞成分分画は、突然変異ヒトDMPKが筋細胞の核に閉じ込められたことを示した(図25A)。Malat1を核RNAマーカーとして使用し(図25B)、Birc5およびGapdhを細胞質RNAマーカーとして使用した(図25Cおよび図25D)。画分の純度を、核タンパク質マーカーおよび細胞質タンパク質マーカーに関するウェスタンブロッティングによって確認した - 核タンパク質マーカーであるヒストンH3は、核画分にしか存在せず(図25E)、細胞質タンパク質マーカーであるGAPDHは、細胞質画分にしか存在しなかった(図25F)。ASO10-抱合体が注射されたマウスからの腓腹筋の細胞成分分画は、ASO10が、全組織抽出物において突然変異ヒトDMPKを低減させたこと(図25G)、ノックダウンが、腓腹筋筋細胞の核画分において確固たるものであったこと(図25H)を示した。
例5．Cynomolgus macaqueにおける、DMPK標的化オリゴヌクレオチドへ抱合された抗TfR1 Fabを含有する抱合体のIn vivo活性
ASO1へ抱合された対照抗TfR1 Fabを含有する抱合体もまた、霊長目の非ヒト動物(NHP)Cynomolgus macaque(cyno)において試験した。Cynoを、第0日および第7日にて、ASO1-抱合体で10mg/kgのASO1に相当する用量にて処置し、注射から7週間後にサクリファイスした。DMPK発現を様々な筋組織において試験した。図22Aは、ASO1-抱合体が、心臓においてDMPKを注射から7週間後に10％ノックダウンしたことを示す。図22Bは、ASO1-抱合体は、横隔膜においてDMPKを注射から7週間後にノックダウンしないようであったことを示す。図22Cは、ASO1-抱合体が、腓腹筋においてDMPKを注射から7週間後に29％ノックダウンしたことを示す。図22Dは、ASO1-抱合体が、前脛骨筋においてDMPKを注射から7週間後に31％ノックダウンしたことを示す。心臓、横隔膜、腓腹筋、および前脛骨筋における注射から7週間後のASO1の量を、図23A～23Dに示す。
ASO10またはASO26へ抱合された抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3を含有する抱合体もまた、Cynomolgus macaque(cyno)において試験した。cynoに、ASO10-抱合体またはASO26-抱合体を1mg/kg、5mg/kg、もしくは10mg/kgのASO10またはASO26に相当する用量にて夫々、静脈内注入によって投与した。cynosを投与から28日後にサクリファイスした。心臓、横隔膜、腓腹筋、および前脛骨筋においてASOの組織レベルを評価した。結果は、ASO10およびASO26が用量依存的に組織に存在していたことを示した(ASO10については図26A～26D、ASO26については図26E～26H)。野生型cyno DMPK発現レベルを様々な筋組織において試験した。データは、ASO10-抱合体が、心臓、横隔膜、腓腹筋、および前脛骨筋においてcyno野生型DMPKを低減させたことから、ASO10-抱合体が、霊長目の非ヒト動物の心臓細胞と骨格筋細胞との両方において活性があったことを示した(図27A～27D)。ASO26は骨格筋においては活性があったが、心臓においては活性がないようであった(図27A～27D)。10mg/kgのオリゴヌクレオチドに相当する用量でのASO10-抱合体およびASO26-抱合体に係るデータもまた、ASO32へ抱合された対照抗TfR1抗体と一緒にグラフ化したが、これは、ASO10-抱合体が、心組織および骨格筋組織にわたってDMPKをノックダウンする確固たる活性を有していたのに対し、ASO26抱合体は、骨格筋組織においてDMPKをノックダウン活性があることを示す(図28A～28D)。
例6．抗TfR1 Fab-ASO10抱合体の反復投薬から4週間後での、hTfR1/DMSXLホモ接合マウスにおける有毒なヒトDMPKの持続したノックダウン
DMPK標的化オリゴヌクレオチドASO10へ共有結合的に連結されている抗TfR1 Fab(3M12 VH4/Vk3)を含有する抱合体(「抗TfR1 Fab-ASO10抱合体」)を、ヒトTfR1と拡張されたCUG反復を内包する2コピーの突然変異ヒトDMPK導入遺伝子との両方を発現するマウスモデル(hTfR1/DMSXLマウス)において試験した。マウスに、第0日および第7日にて、ビヒクル対照(PBS)または10mg/kg ASO10に相当する用量の抗TfR1 Fab-ASO10抱合体のいずれかを投与した。マウスを第28日(最初の用量の抗TfR1 Fab-ASO10抱合体の投与を受けてから4週間)にてサクリファイスし、および組織を収集した。RNAを抽出して、選択された組織試料を固定し、パラフィンで包埋して薄片にし、次いでin situハイブリダイゼーションへ供した。RNA試料の逆転写-定量的ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)を実施して、ヒトDMPKおよび内部対照としてのマウスPpib(ペプチジルプロリルイソメラーゼ)を測定した。DMPK発現を、幾何平均値+/-標準偏差として図29A～29Dに示す(n=6～9)。有意性をスチューデントt検定によって査定した(**** P＜0.0001)。
図29Aは、抗TfR1 Fab-ASO10抱合体が、心臓においてDMPK発現を、PBSで処置されたマウスと比べて49％ノックダウンしたことを示す。図29Bは、抗TfR1 Fab-ASO10抱合体が、横隔膜においてDMPK発現を、PBSで処置されたマウスと比べて40％ノックダウンしたことを示す。図29Cは、抗TfR1 Fab-ASO10抱合体が、前脛骨筋においてDMPK発現を、PBSで処置されたマウスと比べて49％ノックダウンしたことを示す。図29Dは、抗TfR1 Fab-ASO10抱合体が、腓腹筋においてDMPK発現を、PBSで処置されたマウスと比べて44％ノックダウンしたことを示す。
図30Aおよび30Bは、抗TfR1 Fab-ASO10抱合体が、筋原線維の核内DMPKフォーカスを低減させたことを示す。図30Aは、in situハイブリダイゼーションによる、低減されたDMPKフォーカスを示し、図30Bは、蛍光顕微鏡画像におけるDMPKフォーカスの定量化を示すが、このことは抱合体が、フォーカス面積を49％低減させたことを実証する。データは、平均値+/-標準偏差(n=7)として提示されている。有意性をt検定によって査定した(*P＜0.05)。
これらの結果は、抗TfR1 Fab-ASO10抱合体の投与が、心筋および骨格筋において、ヒト有毒DMPKの確固たる持続したノックダウンへ繋がることを実証する。
例7．hTfR1/DMSXLホモ接合マウスにおける抗TfR1 Fab-ASO10抱合体によるスプライシング欠陥の修正
DMPK標的化オリゴヌクレオチドASO10へ共有結合的に連結されている抗TfR1 Fab(3M12 VH4/Vk3)を含有する抱合体(抗TfR1 Fab-ASO10抱合体)を、ヒトTfR1と拡張されたCUG反復を内包する2コピーの突然変異ヒトDMPK導入遺伝子の両方を発現するマウスモデル(「hTfR1/DMSXL」)において試験した。これらのマウスは、DM1に悩む患者に観察されるのと一致するスプライシング欠陥を現わすことが知られている(Huguet,et al.(2012)PLOS Genetics 8(11):e1003043)。マウスへ、第0日および第7日に、ビヒクル対照(「hTfR1/DMSXL - PBS」)または10mg/kg ASO10に相当する用量の抗TfR1 Fab-ASO10抱合体(「hTfR1/DMSXL - 抱合体」)のいずれかを投与した。ヒトTfR1のみを発現し突然変異ヒトDMPK導入遺伝子は発現しないマウス(hTfR1マウス)であってPBSで処置された前記マウス(「hTfR1 - PBS」)を、hTfR1/DMSXLマウスにおけるスプライシング表現型の程度を定義しかつスプライシングの際の抱合体の効果の大きさを査定する別の対照として使用した。マウスを第28日(最初の用量の抗TfR1 Fab-ASO10抱合体の投与を受けてから4週間)にてサクリファイスし、組織を収集してRNAを抽出した。逆転写-定量的ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)を実施して、ヒトおよびマウスにおけるDM1進行最中にミススプライシングされることが知られている、RNA一式におけるエキソンインクルージョン(exon inclusion)を測定した(Nakamori,et al.(2013)Ann.Neurol.74(6):862-872; Huguet,et al.(2012)PLOS Genetics 8(11):e1003043)。エキソンインクルージョンを、各スプライシングRNAマーカーについて、正規化されたパーセントスプライスドイン(percent spliced in)(PSI)として算出し、複合スプライシング指標(composite splicing indices)を、心臓(図31)、横隔膜(図32)、前脛骨筋(図33)、および腓腹筋(図34)において、スプライシングマーカーから正規化PSI値を使用して算出した。複合スプライシング指標を、これまでに記載されたとおりに(Tanner MK,et al.(2021)Nucleic Acids Res.49:2240-2254)算出し、平均値+/-標準偏差として示す。
図31は、抗TfR1 Fab-ASO10抱合体が、複合スプライシング指標データによって実証されるとおり、hTfR1/DMSXLマウスの心臓組織においてスプライシングを修正したことを示す。複合スプライシング指標データを生成するのに使用された正規化PSI値は、抗TfR1 Fab-ASO10抱合体での処置による、hTfR1/DMSXLマウスの心臓組織におけるMbnl2エキソン6(E6)およびNfix E7スプライシングの修正を示したが、Ldb3 E11スプライシングの修正は示さなかった。図31に示される複合スプライシング指標データは、Ldb3 E11、Mbnl2 E6、およびNfix E7のスプライシングデータに基づくものであった;Bin1 E11、Dtna E12、Insr E11、およびMbnl2 E5は含まれなかったが、これは心臓組織におけるそれらの正規化PSI値が、hTfR1マウスと比べてhTfR1/DMSXLマウスにおいて、試験された実験条件下で変わらなかったからである。
図32は、抗TfR1 Fab-ASO10抱合体が、複合スプライシング指標データによって実証されるとおり、hTfR1/DMSXLマウスの横隔膜組織においてスプライシングを修正したことを示す。複合スプライシング指標データを生成するのに使用された正規化PSI値は、抗TfR1 Fab-ASO10抱合体での処置による、hTfR1/DMSXLマウスの横隔膜組織におけるBin1 E11、Insr E11、Ldb3 E11、およびNfix E7のスプライシングの修正を示した。図32に示される複合スプライシング指標データは、Bin1 E11、Insr E11、Ldb3 E11、およびNfix E7のスプライシングデータに基づくものであった;Dtna E12、Mbnl2 E5、Mbnl2 E6、およびTtn E313は含まれなかったが、これは横隔膜組織におけるそれらの正規化PSI値が、hTfR1マウスと比べてhTfR1/DMSXLマウスにおいて、試験された実験条件下で変わらなかったからである。
図33は、抗TfR1 Fab-ASO10抱合体が、複合スプライシング指標データによって実証されるとおり、hTfR1/DMSXLマウスの前脛骨筋組織においてスプライシングを修正したことを示す。複合スプライシング指標データを生成するのに使用された正規化PSI値は、抗TfR1 Fab-ASO10抱合体での処置による、hTfR1/DMSXLマウスの前脛骨筋組織におけるBin1 E11、Ldb3 E11、およびNfix E7のスプライシングの修正を示したが、Mbnl2 E6スプライシングの修正は示さなかった。図33に示される複合スプライシング指標データは、Bin1 E11、Ldb3 E11、Mbnl2 E6、およびNfix E7のスプライシングデータに基づくものであった;Dtna E12、Insr E11、Mbnl2 E5、およびTtn E313は含まれなかったが、これは前脛骨筋組織におけるそれらの正規化PSI値が、hTfR1マウスと比べてhTfR1/DMSXLマウスにおいて、試験された実験条件下で変わらなかったからである。
図34は、抗TfR1 Fab-ASO10抱合体が、複合スプライシング指標データによって実証されるとおり、hTfR1/DMSXLマウスの腓腹筋組織においてスプライシングを修正したことを示す。複合スプライシング指標データを生成するのに使用された正規化PSI値は、抗TfR1 Fab-ASO10抱合体での処置による、hTfR1/DMSXLマウスの横隔膜組織におけるMbnl2 E6、Nfix E7、およびTtn E313のスプライシングの修正を示した。図34に示される複合スプライシング指標データは、Mbnl2 E6、Nfix E7、およびTtn E313のスプライシングデータに基づくものであった;Din1 E11、Dtna E12、Insr E11、Ldb3 E11、およびMbnl2 E5は含まれなかったが、これは腓腹筋組織におけるそれらの正規化PSI値が、hTfR1マウスと比べてhTfR1/DMSXLマウスにおいて、試験された実験条件下で変わらなかったからである。
これらの結果は、抗TfR1 Fab-ASO10抱合体の投与が、心筋および骨格筋においてDM1スプライシング欠陥の修正を容易にすることを実証する。
例8．霊長目の非ヒト動物およびDM1患者の筋管におけるDMPKノックダウン
DMPK標的化オリゴヌクレオチドASO10へ共有結合的に連結されている抗TfR1 Fab(3M12 VH4/Vk3)を含有する抱合体(抗TfR1 Fab-ASO10抱合体)を、ヒトDM1患者筋管(32F細胞)において、および霊長目の非ヒト動物(NHP)筋管において試験した。使用されたDM1患者筋管は、380のCUG反復を含有する突然変異DMPK mRNAと野生型DMPK mRNAとの両方を発現する。使用されたNHP筋管は、野生型DMPKのみを発現する。
DM1患者細胞またはNHP細胞を成長培地中、96ウェルプレート中1ウェルあたり50,000細胞の密度にて播種し、終夜回復させた。次の日、成長培地を低血清分化培地へ換え、細胞を、125nM、250nM、または500nM ASO10に相当する濃度での抱合体で処置した。細胞を10日間インキュベートし、次いで全RNAの供給源としての粗細胞ライセートとともにCells-to-Ctキットを使用してcDNAを合成した。
cDNAを使用し、Taqman PCRを使用する総DMPKのノックダウンを査定した。データをPPIB発現に対して正規化し、2-ΔΔCt方法を使用して、PBSで処置された対照(「ビヒクル」)と比較したDMPKノックダウンを決定した。図35に示されるデータは、種がマッチしたビヒクル対照+標準偏差と比べて平均DMPK発現として提示されている(1条件あたりn=4の再現)。
結果は、抗TfR1 Fab-ASO10抱合体が、生理学的に適切な濃度にて処置されたとき、WT NHP筋管とDM1患者筋管との両方において、DMPK発現のノックダウンを達成したこと、DM1患者細胞(380のCUG反復を含有するDMPK mRNAと野生型DMPK mRNAとの両方を発現する)におけるDMPK発現のノックダウンの方がNHP細胞(野生型DMPK mRNAのみを発現する)と比較して大きかったことを示す(図35)。125nMのASO10に相当する濃度にて、抱合体は、ビヒクルのみの対照比べて、NHP筋管においておよそ40％DMPKノックダウン、DM1患者筋管においておよそ65％DMPKノックダウンを達成した。250nMのASO10に相当する濃度にて、抱合体は、ビヒクルのみの対照と比べて、NHP筋管においておよそ45％DMPKノックダウン、DM1患者筋管においておよそ80％DMPKノックダウンを達成した。500nMのASO10に相当する濃度にて、抱合体は、ビヒクルのみの対照と比べて、NHP筋管においておよそ60％DMPKノックダウン、DM1患者筋管においておよそ90％DMPKノックダウンを達成した。
これらの結果は、DMPK標的化オリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結されている抗TfR1 Fabを含有する抱合体が、野生型DMPK mRNAと突然変異DMPK mRNA(拡張されたCUG反復あり)との両方を発現するヒト筋管の方が、野生型DMPKを発現するカニクイザル筋管と比べてより大きなDMPKのノックダウンを達成し得ることを指し示す。
追加の態様
1．疾患関連反復を含むDMPKアレルの発現または活性を阻害するよう構成されている、アンチセンスオリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結されている筋標的化剤を含む複合体であって、ここでアンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが15～20ヌクレオチドであり、配列番号160～172および202のいずれか1つの少なくとも15の連続したヌクレオシドに対する相補性の領域を含み、かつ5'-X-Y-Z-3'配置を含み、ここで
Xが、3-5連結ヌクレオシドを含み、ここでX中のヌクレオシドの少なくとも1つは、2'-修飾ヌクレオシドである;
Yが、6-10連結2'-デオキシリボヌクレオシドを含み、ここでY中の各シトシンは、任意におよび独立に、5-メチル-シトシンである;および
Zが、3-5連結ヌクレオシドを含み、ここでZ中のヌクレオシドの少なくとも1つは、2'-修飾ヌクレオシドである。
2．筋標的化剤は、抗トランスフェリン受容体1(TfR1)抗体を含む、態様1の複合体。
3．ここでアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号174、177、179～182、および184～192のいずれか1つのヌクレオチド配列を含む、態様1または態様2の複合体。
4．X中の各ヌクレオシドは、2'-修飾ヌクレオシドであり、および/またはZ中の各ヌクレオシドは、2'-修飾ヌクレオシドであり、任意にここで各2'-修飾ヌクレオシドは、独立して、2'-4'二環式ヌクレオシドまたは非二環式2'-修飾ヌクレオシドである、態様1～3のいずれか1つの複合体。
5．X中の各ヌクレオシドは、非二環式2'-修飾ヌクレオシドであり、および/またはZ中の各ヌクレオシドは、非二環式2'-修飾ヌクレオシドであり、任意にここで非二環式2'-修飾ヌクレオシドは、2'-MOE修飾ヌクレオシドである、態様1～4のいずれか1つの複合体。
6．X中の各ヌクレオシドは、2'-4'二環式ヌクレオシドであり、および/またはZ中の各ヌクレオシドは、2'-4'二環式ヌクレオシドであり、任意にここで2'-4'二環式ヌクレオシドは、LNA、cEt、およびENAから選択される、態様1～4のいずれか1つの複合体。
7．Xは、少なくとも1つの2'-4'二環式ヌクレオシドおよび少なくとも1つの非二環式2'-修飾ヌクレオシドを含み、および/またはZは、少なくとも1つの2'-4'二環式ヌクレオシドおよび少なくとも1つの非二環式2'-修飾ヌクレオシドを含み、任意にここで少なくとも1つの非二環式2'-修飾ヌクレオシドは、2'-MOE修飾ヌクレオシドであり、および少なくとも1つの2'-4'二環式ヌクレオシドが、LNA、cEt、およびENAから選択される、態様1～4のいずれか1つの複合体。
8．アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の5'-X-Y-Z-3'配置:
を含み、ここで「E」は、2'-MOE修飾リボヌクレオシドである;「L」は、LNAである;「D」は、2'-デオキシリボヌクレオシドである;および「10」または「8」は、Y中の2'-デオキシリボヌクレオシド数である、態様1～7のいずれか1つの複合体。
9．アンチセンスオリゴヌクレオチドは、1以上のホスホロチオアートヌクレオシド間連結を含む、態様1～8のいずれか1つの複合体。
10．アンチセンスオリゴヌクレオチド中の各ヌクレオシド間連結が、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結である、態様1～9のいずれか1つの複合体。
11．アンチセンスオリゴヌクレオチドが、1以上のホスホジエステルヌクレオシド間連結を含み、任意にここでホスホジエステルヌクレオシド間連結が、X中および/またはZ中にある、態様1～9のいずれか1つの複合体。
12．アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下:
から選択されるが、ここで「xdC」は、5-メチル-デオキシシチジンである;「dN」は、2'-デオキシリボヌクレオシドである;「+N」は、LNAヌクレオシドである;「oN」は、2'-MOE修飾リボヌクレオシドである;「oC」は、5-メチル-2'-MOE-シチジンである;「+C」は、5-メチル-2'-4'-二環式-シチジン(2'-4'メチレン架橋)である;「oU」は、5-メチル-2'-MOE-ウリジンである;「+U」は、5-メチル-2'-4'-二環式-ウリジン(2'-4'メチレン架橋)である;「*」は、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結を指し示す;およびヌクレオシド間に「*」が存在しないことは、ホスホジエステルヌクレオシド間連結を指し示す、態様1～3のいずれか1つの複合体。
13．抗TfR1抗体は、表2に列挙される抗TfR1抗体のいずれかの重鎖相補性決定領域1(CDR-H1)、重鎖相補性決定領域2(CDR-H2)、重鎖相補性決定領域3(CDR-H3)、軽鎖相補性決定領域1(CDR-L1)、軽鎖相補性決定領域2(CDR-L2)、軽鎖相補性決定領域3(CDR-L3)を含む、態様2～12のいずれか1つの複合体。
14．抗TfR1抗体は、表3に列挙される抗TfR1抗体のいずれかの重鎖可変領域(VH)および軽鎖可変領域(VL)を含む、態様2～13のいずれか1つの複合体。
15．抗TfR1抗体は、Fabであり、任意にここでFabは、表5に列挙される抗TfR1 Fabのいずれかの重鎖および軽鎖を含む、態様2～13のいずれか1つの複合体。
16．筋標的化剤およびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、リンカーを介して共有結合的に連結されており、任意にここでリンカーは、バリン-シトルリンジペプチドを含む、態様1～15のいずれか1つの複合体。
17．筋細胞中DMPKの発現を低減させる方法であって、方法は、筋細胞を、アンチセンスオリゴヌクレオチドの筋細胞への内在化を促進するのに有効な量の態様1～16のいずれか1つの複合体と接触させることを含む。
18．筋強直症ジストロフィー1型(DM1)を処置する方法であって、方法は、態様1～16のいずれか1つの有効量の複合体を、これを必要とする対象へ投与することを含む。
19．複合体の投与は、DMPK mRNAの少なくとも30％の低減をもたらす、態様18の方法。
20．複合体の投与は、対象における筋細胞の核において突然変異DMPK mRNAの低減をもたらす、態様18の方法。
21．以下:
から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチドであるが、ここで「xdC」は、5-メチル-デオキシシチジンである;「dN」は、2'-デオキシリボヌクレオシドである;「+N」は、LNAヌクレオシドである;「oN」は、2'-MOE修飾リボヌクレオシドである;「oC」は、5-メチル-2'-MOE-シチジンである;「+C」は、5-メチル-2'-4'-二環式-シチジン(2'-4'メチレン架橋)である;「oU」は、5-メチル-2'-MOE-ウリジンである;「+U」は、5-メチル-2'-4'-二環式-ウリジン(2'-4'メチレン架橋)である;「*」は、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結を指し示す;およびヌクレオシド間に「*」が存在しないことは、ホスホジエステルヌクレオシド間連結を指し示す。
22．アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下:
から選択されるが、
ここで「xdC」は、5-メチル-デオキシシチジンである;「dN」は、2'-デオキシリボヌクレオシドである;「+N」は、LNAヌクレオシドである;「oN」は、2'-MOE修飾リボヌクレオシドである;「oC」は、5-メチル-2'-MOE-シチジンである;「+C」は、5-メチル-2'-4'-二環式-シチジン(2'-4'メチレン架橋)である;「oU」は、5-メチル-2'-MOE-ウリジンである;「+U」は、5-メチル-2'-4'-二環式-ウリジン(2'-4'メチレン架橋)である;「*」は、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結を指し示す;およびヌクレオシド間に「*」が存在しないことは、ホスホジエステルヌクレオシド間連結を指し示す、ならびに
ここでホスホジエステル連結は、5'-NH2-(CH2)6-とアンチセンスオリゴヌクレオチドとの間に存在する、態様21のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
23．態様21または態様22のアンチセンスオリゴヌクレオチドをナトリウム塩の形態で含む、組成物。
等価物および専門用語
例証的に本明細書に記載された開示は、好適には、本明細書に具体的には開示されないいずれかの要素(単数または複数)、限定(単数または複数)の非存在下において実施され得る。それゆえに、例えば、本出願の各事例において、用語「含む」、「から本質的になる」、および「からなる」のいずれかは、他の2つの用語のどちらかによって置き換えられ得る。採用された用語および表現は、限定ではなく記載の用語として使用され、かかる用語および表現の使用には(that in)、示されるおよび記載される特徴のいずれかの等価物またはそれらの部分を排除する意図はなく、種々の改変が本開示の範囲内で可能であることが認識される。それゆえに、本開示は好ましい態様によって具体的に開示されたが、本明細書に開示される概念の任意の特徴、改変、および変形が当業者によって頼られ得ることと、かかる改変および変形は本開示の範囲内であると考慮されることとは理解されるべきである。
加えて、本開示の特徴または側面がマーカッシュ群または代替物の他の群分けとして記載されるところでは、当業者は、本開示がそれによってマーカッシュ群または他の群のいずれかの個々の構成員または構成員のサブグループとしてもまた記載されることを認識するであろう。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドまたは他の核酸の構造を記載する際には、配列表で提示される配列が参照され得ることは了解されるべきである。かかる態様において、実際のオリゴヌクレオチドまたは他の核酸は、指定された配列と本質的に同じかまたは類似の相補的な特性を保持しながら、指定された配列と比較して、1以上の代替的なヌクレオチド(例として、DNAヌクレオチドのRNAカウンターパート、またはRNAヌクレオチドのDNAカウンターパート)および/または(例として、および)1以上の修飾ヌクレオチドおよび/または(例として、および)1以上の修飾されたヌクレオチド間連結および/または(例として、および)1以上の他の改変を有し得る。
本発明を記載する文脈における(特に次の請求項の文脈における)用語「a」および「an」および「the」ならびに類似のレファレントの使用は、本明細書に別様に指し示されないかまたは文脈によって明瞭に否定されない限り、単数および複数両方をカバーすると解釈されるべきである。用語「含む」、「有する」、「包含する」、および「含有する」は、別様に指摘されない限り、開放型の用語として解釈されるべきである(すなわち、「包含するが、これらに限定されない」を意味する)。本明細書における値の範囲の記載は、本明細書に別様に指し示されない限り、単に、範囲内に収まる各別個の値を個々に参照する簡略な方法として働くことを意図され、各別個の値は、それが本明細書に個々に記載される場合のように本明細書に組み込まれる。本明細書に別様に指し示されないかまたは別様には文脈によって明瞭に否定されない限り、本明細書に記載のすべての方法はいずれかの好適な順序で行われ得る。別様に請求されない限り、本明細書に提供されるいずれかのおよびすべての例または例示的な文言(例として、「などの」)の使用は、単に本発明をより良く解き明かすことを意図され、本発明の範囲に限定を課さない。本明細書のいかなる文言も、いずれかの請求されない要素を本発明の実施にとって必須であると指し示すものと解釈されるべきではない。
本発明の態様が本明細書に記載されている。それらの態様の変形は、先述の記載を読むことによって当業者には明らかになり得る。
本発明者は当業者がかかる変形を適当に採用することを予期し、本発明者は本発明が本明細書に具体的に記載されるとおりとは別様に実施されることを意図する。したがって、本発明は、然るべき法律によって許可される本明細書に添付される請求項に記載される主題のすべての改変および等価物を包含する。その上、それらのすべての可能な変形における上に記載された要素のいずれかの組み合わせは、本明細書に別様に指し示されないかまたは別様に文脈によって明瞭に否定されない限り、本発明によって包摂される。当業者は、本明細書に記載の本発明の具体的な態様の多くの等価物を認識するか、またはせいぜい定型的な実験作業によって確かめる能力があるであろう。かかる等価物は次の請求項によって包摂されることを意図される。

Claims (28)

  1. アンチセンスオリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結されている筋標的化剤を含む複合体であって、
    ここでアンチセンスオリゴヌクレオチドが、長さが15～20ヌクレオチドであり、かつ配列番号166、163、167,160、169、171、202、161、162、170、165、164、172、および168のいずれか1つの少なくとも15の連続したヌクレオシドに対する相補性の領域を含み、かつ5'-X-Y-Z-3'配置を含み、ここで
    Xが、3-5連結ヌクレオシドを含み、ここでX中のヌクレオシドの少なくとも1つが、2'-修飾ヌクレオシドである;
    Yが、6-10連結2'-デオキシリボヌクレオシドを含み、ここでY中の各シトシンが、任意におよび独立に、5-メチル-シトシンである;ならびに
    Zが、3-5連結ヌクレオシドを含み、ここでZ中のヌクレオシドの少なくとも1つが、2'-修飾ヌクレオシドである、前記複合体。
  2. 筋標的化剤が、抗トランスフェリン受容体1(TfR1)抗体を含む、請求項1に記載の複合体。
  3. アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号179、187、180、185、189、182、191、184、174、186、190、188、177、192、および181のいずれか1つのヌクレオチド配列を含む、請求項1または請求項2に記載の複合体。
  4. X中の各ヌクレオシドが、2'-修飾ヌクレオシドであり、および/またはZ中の各ヌクレオシドが、2'-修飾ヌクレオシドであり、
    任意にここで各2'-修飾ヌクレオシドが、独立して、2'-4'二環式ヌクレオシドまたは非二環式2'-修飾ヌクレオシドである、請求項1～3のいずれか一項に記載の複合体。
  5. X中の各ヌクレオシドが、非二環式2'-修飾ヌクレオシドであり、および/またはZ中の各ヌクレオシドが、非二環式2'-修飾ヌクレオシドであり、
    任意にここで非二環式2'-修飾ヌクレオシドが、2'-MOE修飾ヌクレオシドである、請求項1～4のいずれか一項に記載の複合体。
  6. X中の各ヌクレオシドが、2'-4'二環式ヌクレオシドであり、および/または
    Z中の各ヌクレオシドが、2'-4'二環式ヌクレオシドであり、
    任意にここで2'-4'二環式ヌクレオシドが、LNA、cEt、およびENAから選択される、請求項1～4のいずれか一項に記載の複合体。
  7. Xが、少なくとも1つの2'-4'二環式ヌクレオシドおよび少なくとも1つの非二環式2'-修飾ヌクレオシドを含み、および/または
    Zが、少なくとも1つの2'-4'二環式ヌクレオシドおよび少なくとも1つの非二環式2'-修飾ヌクレオシドを含み、
    任意にここで少なくとも1つの非二環式2'-修飾ヌクレオシドが、2'-MOE修飾ヌクレオシドであり、および少なくとも1つの2'-4'二環式ヌクレオシドが、LNA、cEt、およびENAから選択される、請求項1～4のいずれか一項に記載の複合体。
  8. アンチセンスオリゴヌクレオチドが、以下の5'-X-Y-Z-3'配置:
    を含み、
    ここで「E」は、2'-MOE修飾リボヌクレオシドである;「L」は、LNAである;「D」は、2'-デオキシリボヌクレオシドである;および「10」または「8」は、Y中の2'-デオキシリボヌクレオシド数である、請求項1～7のいずれか一項に記載の複合体。
  9. アンチセンスオリゴヌクレオチドが、1以上のホスホロチオアートヌクレオシド間連結を含む、請求項1～8のいずれか一項に記載の複合体。
  10. アンチセンスオリゴヌクレオチド中の各ヌクレオシド間連結が、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結である、請求項1～9のいずれか一項に記載の複合体。
  11. アンチセンスオリゴヌクレオチドが、1以上のホスホジエステルヌクレオシド間連結を含み、任意にここでホスホジエステルヌクレオシド間連結が、X中および/またはZ中にある、請求項1～9のいずれか一項に記載の複合体。
  12. アンチセンスオリゴヌクレオチドが、以下:
    から選択されるオリゴヌクレオチドを含み、
    ここで「xdC」は、5-メチル-デオキシシチジンである;「dN」は、2'-デオキシリボヌクレオシドである;「+N」は、LNAヌクレオシドである;「oN」は、2'-MOE修飾リボヌクレオシドである;「oC」は、5-メチル-2'-MOE-シチジンである;「+C」は、5-メチル-2'-4'-二環式-シチジン(2'-4'メチレン架橋)である;「oU」は、5-メチル-2'-MOE-ウリジンである;「+U」は、5-メチル-2'-4'-二環式-ウリジン(2'-4'メチレン架橋)である;「*」は、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結を指し示す;およびヌクレオシド間に「*」が存在しないことは、ホスホジエステルヌクレオシド間連結を指し示す、請求項1～3のいずれか一項に記載の複合体。
  13. 抗TfR1抗体が、表2に列挙される抗TfR1抗体のいずれかの重鎖相補性決定領域1(CDR-H1)、重鎖相補性決定領域2(CDR-H2)、重鎖相補性決定領域3(CDR-H3)、軽鎖相補性決定領域1(CDR-L1)、軽鎖相補性決定領域2(CDR-L2)、軽鎖相補性決定領域3(CDR-L3)を含む、請求項2～12のいずれか一項に記載の複合体。
  14. 抗TfR1抗体が、表3に列挙される抗TfR1抗体のいずれかの重鎖可変領域(VH)および軽鎖可変領域(VL)を含む、請求項2～13のいずれか一項に記載の複合体。
  15. 抗TfR1抗体が、Fabであり、任意にここでFabが、表5に列挙される抗TfR1 Fabのいずれかの重鎖および軽鎖を含む、請求項2～13のいずれか一項に記載の複合体。
  16. 抗TfR1抗体が、以下:
    (ｉ)配列番号27のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号28のアミノ酸配列を含むCDR-H2、配列番号29のアミノ酸配列を含むCDR-H3、配列番号30のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号31のアミノ酸配列を含むCDR-L2、および配列番号32のアミノ酸配列を含むCDR-L3;
    (ii)配列番号33のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号34のアミノ酸配列を含むCDR-H2、配列番号35のアミノ酸配列を含むCDR-H3、配列番号36のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号37のアミノ酸配列を含むCDR-L2、および配列番号32のアミノ酸配列を含むCDR-L3;または
    (ii)配列番号38のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号39のアミノ酸配列を含むCDR-H2、配列番号40のアミノ酸配列を含むCDR-H3、配列番号41のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号31のアミノ酸配列を含むCDR-L2、および配列番号42のアミノ酸配列を含むCDR-L3
    を含む、請求項2～13のいずれか一項に記載の複合体。
  17. 抗TfR1抗体が、配列番号76のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号75のアミノ酸配列を含むVLを含む、請求項16に記載の複合体。
  18. 抗TfR1抗体が、Fabであり、かつ配列番号101のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項17に記載の複合体。
  19. 筋標的化剤およびアンチセンスオリゴヌクレオチドが、リンカーを介して共有結合的に連結されており、任意にここでリンカーが、バリン-シトルリンジペプチドを含む、請求項1～18のいずれか一項に記載の複合体。
  20. 筋細胞中DMPKの発現を低減させる方法であって、方法が、筋細胞を、アンチセンスオリゴヌクレオチドの筋細胞への内在化を促進するのに有効な量の請求項1～19のいずれか一項に記載の複合体と接触させることを含む、前記方法。
  21. DMPK発現を低減させることが、筋細胞中DMPK mRNAのレベルを低減させることを含み、
    任意にここでDMPK mRNAが、突然変異DMPK mRNAである、請求項20に記載の方法。
  22. 筋強直症ジストロフィー1型(DM1)を処置する方法であって、方法が、請求項1～19のいずれか一項に記載の有効量の複合体を、これを必要とする対象へ投与することを含む、前記方法。
  23. 対象が、疾患関連CUG反復を含む突然変異DMPKアレルを有する、請求項22に記載の方法。
  24. 複合体の投与が、DMPK mRNAの少なくとも30％の低減をもたらす、請求項22または請求項23に記載の方法。
  25. 複合体の投与が、対象における筋細胞の核中の突然変異DMPK mRNAの低減をもたらす、請求項23または請求項24に記載の方法。
  26. 以下:
    から選択されるオリゴヌクレオチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、
    ここで「xdC」は、5-メチル-デオキシシチジンである;「dN」は、2'-デオキシリボヌクレオシドである;「+N」は、LNAヌクレオシドである;「oN」は、2'-MOE修飾リボヌクレオシドである;「oC」は、5-メチル-2'-MOE-シチジンである;「+C」は、5-メチル-2'-4'-二環式-シチジン(2'-4'メチレン架橋)である;「oU」は、5-メチル-2'-MOE-ウリジンである;「+U」は、5-メチル-2'-4'-二環式-ウリジン(2'-4'メチレン架橋)である;「*」は、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結を指し示す;およびヌクレオシド間に「*」が存在しないことは、ホスホジエステルヌクレオシド間連結を指し示す、前記アンチセンスオリゴヌクレオチド。
  27. アンチセンスオリゴヌクレオチドが、以下:
    から選択されるオリゴヌクレオチドを含み、
    ここで「xdC」は、5-メチル-デオキシシチジンである;「dN」は、2'-デオキシリボヌクレオシドである;「+N」は、LNAヌクレオシドである;「oN」は、2'-MOE修飾リボヌクレオシドである;「oC」は、5-メチル-2'-MOE-シチジンである;「+C」は、5-メチル-2'-4'-二環式-シチジン(2'-4'メチレン架橋)である;「oU」は、5-メチル-2'-MOE-ウリジンである;「+U」は、5-メチル-2'-4'-二環式-ウリジン(2'-4'メチレン架橋)である;「*」は、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結を指し示す;およびヌクレオシド間に「*」が存在しないことは、ホスホジエステルヌクレオシド間連結を指し示し、ならびに
    ここでホスホジエステル連結が、5'-NH2-(CH2)6-とアンチセンスオリゴヌクレオチドとの間に存在する、請求項26に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  28. 請求項26または請求項27に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドをナトリウム塩の形態で含む、組成物。
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