JP2024501872A - 顔面肩甲上腕筋ジストロフィーを処置するための筋標的化複合体およびそれらの使用 - Google Patents

顔面肩甲上腕筋ジストロフィーを処置するための筋標的化複合体およびそれらの使用 Download PDF

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Abstract

本開示の側面は、DUX4 RNAを標的にするよう設計されたオリゴヌクレオチド(例として、siRNAなどのRNAiオリゴヌクレオチド)、およびそのオリゴヌクレオチドを細胞(例として、筋細胞)へ送達するための標的化複合体、ならびにそれらの使用、特に疾患(例として、FSHD)の処置に関する使用に関する。

Description

関連出願
本出願は、35 U.S.C.§119(e)の下、「MUSCLE-TARGETING COMPLEXES AND USES THEREOF FOR TREATING FACIOSCAPULOHUMERAL MUSCULAR DYSTROPHY」という表題の、2020年12月31日に出願された米国仮出願第63/133,156号および「MUSCLE-TARGETING COMPLEXES AND USES THEREOF FOR TREATING FACIOSCAPULOHUMERAL MUSCULAR DYSTROPHY」という表題の、2021年4月29日に出願された米国仮出願第63/181,439号(これら各々の内容は、それら全体が参照されることにより本明細書に組み込まれる)に対して利益を主張するものである。
本発明の分野
本出願は、DUX4 RNAを標的にするよう設計されたオリゴヌクレオチドおよび分子ペイロード(molecular payloads)(例として、オリゴヌクレオチド)を細胞へ送達するための標的化複合体、ならびにそれらの使用に、特に疾患の処置に関する使用に関する。
EFS-WEBを介しテキストファイルとして提出された配列表への言及
本出願は配列表を含有する。これはEFS-WebからASCIIフォーマットで提出されており、その全体が参照によってここに組み込まれる。2021年12月30日に作成された該ASCIIコピーはD082470047WO00-SEQ-ZJGという名称であり、サイズは708,513バイトである。
背景
筋ジストロフィー(MD)は、進行性の衰弱および筋肉量の減少を特徴とする一群の疾患である。これらの疾患は、健康な筋組織を形成するのに必要なタンパク質をコードする遺伝子における突然変異によって引き起こされる。顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー(FSHD)は、主に顔、肩甲骨、上腕の筋肉に影響する優性遺伝型のMDである。FSHDの他の症状は、腹筋の衰弱、網膜の異常、難聴、ならびに関節の痛みおよび炎症を包含する。FSHDは、成人および子供の両方に影響する9種類のMDの中で最も多く見られ、世界中での発生率は約8,300人に1人である。FSHDは、機能が知られていないタンパク質であるダブルホメオボックス4(DUX4)の異常な産生によって引き起こされる。DUX4タンパク質をコードするDUX4遺伝子は、4番染色体上のD4Z4反復領域中に所在して、典型的には胎児の発生においてのみ発現し、その後それは、DUX4遺伝子を取り囲んで緻密化させるD4Z4反復の過剰メチル化によって抑え込まれる。FSHDの2つのタイプ、1型および2型が記載されている。約95%のケースを占める1型は、4番染色体上のD4Z4反復の欠失に関連する。罹患していない個体は一般に4番染色体のサブテロメア領域中に並んだ10を超える反復を有するのに対し、FSHDの最も一般的な形態(FSHD1)はアレイの10反復よりも少数への収縮によって引き起こされ、骨格筋中のDUX4のエピジェネティックな抑え込みの減少および変化に富んだ発現に関連する。4q染色体の2つのアレルのバリアント（4qAおよび4qB）が、D4Z4の遠位領域に存在する。4qAは機能的ポリアデニル化コンセンサス部位とシスにある。4qAアレル上の収縮は、DUX4転写産物がポリアデニル化され、安定なタンパク質に翻訳されるので、病原性である。約5%のケースを占める2型FSHDは、18番染色体上のSMCHD1遺伝子の突然変異に関連する。疾患の症状に対処するための支持療法および処置以外に、FSHDの有効な治療法はない。
概要
いくつかの側面において、本開示は、DUX4 RNAを標的にするよう設計されたオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの態様において、本開示は、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー(FSHD)の病的状態(筋萎縮症、炎症、ならびに減少した分化能および酸化ストレスを包含する)の特色に関連するDUX4 mRNAおよび/またはタンパク質のレベルを低減するのに有用である、DUX4 RNAと相補的なオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの態様において、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドは、DUX4 RNAのRNAi媒介分解に向ける(direct)よう設計されている。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DUX4 RNA分解のためにRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)を効率的に関与させるが、またオフターゲット効果も低減させるよう設計されている。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DUX4 RNAおよび/またはタンパク質のレベルを低減するよう設計されている。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、所望のバイオアベイラビリティおよび/または血清安定性という特性を有するよう設計されている。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、所望の結合親和性という特性を有するよう設計されている。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、所望の毒性および/または免疫原性プロファイルを有するよう設計されている。
いくつかの側面に従うと、本開示は、分子ペイロード(例として、本明細書に記載のDUX4-標的化オリゴヌクレオチド)を筋細胞(例として、初代筋芽細胞)へ送達することを目的として、それらの細胞を標的にする複合体を提供する。いくつかの態様において、本明細書に提供される複合体は、例として、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー(FSHD)を有するかまたはこれを有すると疑われる対象においてDUX4の発現または活性を阻害する分子ペイロードを送達するのに特に有用である。したがって、いくつかの態様において、本明細書に提供される複合体は、分子ペイロードを筋細胞へ送達することを目的として、筋細胞の表面上の受容体へ特異的に結合する筋標的化剤(例として、筋標的化抗体)を含む。いくつかの態様において、複合体は、受容体に媒介される内在化を介して細胞中へ取り入れられ、これを受け分子ペイロードは細胞内部に放出されて機能を果たしてもよい。例えば、オリゴヌクレオチドを送達するように改変された複合体は、オリゴヌクレオチドが筋細胞中のDUX4遺伝子発現を阻害することができるように、オリゴヌクレオチドを放出してもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、複合体のオリゴヌクレオチドと筋標的化剤とを接続する共有結合性リンカーのエンドソーム切断によって放出される。
本開示のいくつかの側面は、double homeobox 4(DUX4)mRNAを標的にするオリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結されている筋標的化剤を含む複合体を提供するが、ここでオリゴヌクレオチドは、長さが18～25ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、かつ配列番号356、501、1398、494、509、224、1320、561、225、226、261、265、320、341、343、388、466、483、552、560、601、921、942、953、1294、1296、1301、1321、1322、1323、1324、1325、1373、1394、1395、1523、1531、1548、1558、および1561で表されるとおりの標的配列に対する相補性の領域を含み、ならびにここで相補性の領域は、長さが少なくとも16の連続したヌクレオシドである。
いくつかの態様において、筋標的化剤は、抗トランスフェリン受容体(TfR)抗体である。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、RNAiオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、配列番号3035、3040、3061、3039、3041、3027、3052、3044、3028、3029、3030、3031、3032、3033、3034、3036、3037、3038、3042、3043、3045、3046、3047、3048、3049、3050、3051、3053、3054、3055、3056、3057、3058、3059、3060、3062、3063、3064、3065、および3066のいずれか1つのヌクレオチド配列を含む。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖に相補的である少なくとも18の連続したヌクレオシドを含むセンス鎖をさらに含む。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、1以上の修飾ヌクレオシドを含む。
いくつかの態様において、1以上の修飾ヌクレオシドは、2'修飾ヌクレオチドであり、任意にここで1以上の2'修飾ヌクレオシドは、以下:2'-フルオロ(2'-F)、2'-O-メチル(2'-O-Me)、2'-O-メトキシエチル(2'-MOE)、2'-O-アミノプロピル(2'-O-AP)、2'-O-ジメチルアミノエチル(2'-O-DMAOE)、2'-O-ジメチルアミノプロピル(2'-O-DMAP)、2'-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2'-O-DMAEOE)、2'-O-N-メチルアセトアミド(2'-O-NMA)から選択される。
いくつかの態様において、各2'修飾ヌクレオチドは、2'-O-メチルまたは2'-フルオロ(2'-F)である。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、1以上のホスホロチオアートヌクレオシド間連結を含む。
いくつかの態様において、1以上のホスホロチオアートヌクレオシド間連結は、オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖上に存在する。
いくつかの態様において、アンチセンス鎖の3'末での2ヌクレオシド間の連結は、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結である。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドの1以上のシチジンは、2'-修飾5-メチル-シチジンであり、任意にここで2'-修飾5-メチル-シチジンは、2'-O-Me修飾5-メチル-シチジンまたは2'-F修飾5-メチル-シチジンである。
いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、表8に列挙される配列番号3035、3040、3061、3039、3041、3027、3052、3044、3028、3029、3030、3031、3032、3033、3034、3036、3037、3038、3042、3043、3045、3046、3047、3048、3049、3050、3051、3053、3054、3055、3056、3057、3058、3059、3060、3062、3063、3064、3065、および3066の修飾バージョンから選択される。
いくつかの態様において、センス鎖は、表8に列挙される配列番号2995、3000、3021、2999、3001、2987、3012、3004、2988、2989、2990、2991、2992、2993、2994、2996、2997、2998、3002、3003、3005、3006、3007、3008、3009、3010、3011、3013、3014、3015、3016、3017、3018、3019、3020、3022、3023、3024、3025、および3026の修飾バージョンから選択される。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、表8に列挙されるsiRNAから選択されるsiRNA分子である。
いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、表9に列挙される配列番号3040、3061、3027、3037、3039、3041、3044、および3052の修飾バージョンから選択される。
いくつかの態様において、センス鎖は、表9に列挙される配列番号3000、3021、2987、2997、2999、3001、3004、および3012の修飾バージョンから選択される。
いくつかの態様において、RNAiオリゴヌクレオチドは、表9に列挙されるsiRNAから選択されるsiRNA分子である。
いくつかの態様において、抗TfR抗体は、表2に列挙される抗TfR抗体のいずれかの重鎖相補性決定領域1(CDR-H1)、重鎖相補性決定領域2(CDR-H2)、重鎖相補性決定領域3(CDR-H3)、軽鎖相補性決定領域1(CDR-L1)、軽鎖相補性決定領域2(CDR-L2)、軽鎖相補性決定領域3(CDR-L3)を含む。
いくつかの態様において、抗TfR抗体は、表3に列挙される抗TfR抗体のいずれかの重鎖可変領域(VH)および軽鎖可変領域(VL)を含む。
いくつかの態様において、抗TfR抗体は、Fabであり、任意にここでFabは、表5に列挙される抗TfR Fabのいずれかの重鎖および軽鎖を含む。
いくつかの態様において、抗TfR抗体は、以下:
(ｉ)配列番号27のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号28のアミノ酸配列を含むCDR-H2、配列番号29のアミノ酸配列を含むCDR-H3、配列番号30のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号31のアミノ酸配列を含むCDR-L2、および配列番号32のアミノ酸配列を含むCDR-L3;
(ii)配列番号33のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号34のアミノ酸配列を含むCDR-H2、配列番号35のアミノ酸配列を含むCDR-H3、配列番号36のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号37のアミノ酸配列を含むCDR-L2、および配列番号32のアミノ酸配列を含むCDR-L3;または
(ii)配列番号38のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号39のアミノ酸配列を含むCDR-H2、配列番号40のアミノ酸配列を含むCDR-H3、配列番号41のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号31のアミノ酸配列を含むCDR-L2、および配列番号42のアミノ酸配列を含むCDR-L3
を含む。
いくつかの態様において、抗TfR抗体は、配列番号76のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号75のアミノ酸配列を含むVLを含む。
いくつかの態様において、抗TfR抗体は、Fabであり、かつ配列番号101のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、筋標的化剤およびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、リンカーを介して共有結合的に連結されており、任意にここでリンカーは、バリン-シトルリン配列を含む。
さらに本明細書に提供されるのは、筋細胞中のDUX4発現を低減させる方法であって、方法は、筋細胞を、オリゴヌクレオチドの筋細胞への内在化を促進するのに有効な量の本明細書に記載の複合体と接触させることを含む。
さらに本明細書に提供されるのは、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー(FSHD)を処置する方法であって、方法は、請求項1～18のいずれか一項に記載の有効量の複合体を、これを必要とする対象へ投与することを含み、ここで対象は、DUX4タンパク質の異常な産生を有する。
本開示の他の側面は、以下:
アンチセンス鎖:5'-fCfUmCfUmCfAmUfUmCfUmGfAmAfAmCfCmAfAmAfUmC*fU*mG-3'(配列番号3035)
センス鎖:5'-mGmAfUmUfUmGfGmUfUmUfCmAfGmAfAmUfGmAfGmAfG-3'(配列番号2995);
アンチセンス鎖:5'-fUfGmGfAmAfAmGfCmGfAmUfCmCfUmUfCmUfCmAfAmA*fG*mG-3'(配列番号3040)
センス鎖:5'-mUmUfUmGfAmGfAmAfGmGfAmUfCmGfCmUfUmUfCmCfA-3'(配列番号3000);
アンチセンス鎖:5'-fCfCmGfGmUfAmUfUmCfUmUfCmCfUmCfGmCfUmGfAmG*fG*mG-3'(配列番号3061)
センス鎖:5'-mCmUfCmAfGmCfGmAfGmGfAmAfGmAfAmUfAmCfCmGfG-3'(配列番号3021);
アンチセンス鎖:5'-fCfGmAfUmCfCmUfUmCfUmCfAmAfAmGfGmCfUmCfGmG*fA*mG-3'(配列番号3039)
センス鎖:5'-mCmCfGmAfGmCfCmUfUmUfGmAfGmAfAmGfGmAfUmCfG-3'(配列番号2999);
アンチセンス鎖:5'-fGfCmGfAmUfGmCfCmUfGmGfAmAfAmGfCmGfAmUfCmC*fU*mU-3'(配列番号3041)
センス鎖:5'-mGmGfAmUfCmGfCmUfUmUfCmCfAmGfGmCfAmUfCmGfC-3'(配列番号3001);
アンチセンス鎖:5'-fGfUmCfCmAfAmAfCmGfAmGfUmCfUmCfCmGfUmCfGmC*fC*mG-3'(配列番号3027)
センス鎖:5'-mGmCfGmAfCmGfGmAfGmAfCmUfCmGfUmUfUmGfGmAfC-3'(配列番号2987);
アンチセンス鎖:5'-fUfUmCfUmAfGmGfAmGfAmGfGmUfUmGfCmGfCmCfUmG*fC*mU-3'(配列番号3052)
センス鎖:5'-mCmAfGmGfCmGfCmAfAmCfCmUfCmUfCmCfUmAfGmAfA-3'(配列番号3012);
アンチセンス鎖:5'-fCfUmGfAmAfUmCfCmUfGmGfAmCfUmCfCmGfGmGfAmG*fG*mC-3'(配列番号3044)
センス鎖:5'-mCmUfCmCfCmGfGmAfGmUfCmCfAmGfGmAfUmUfCmAfG-3'(配列番号3004);
アンチセンス鎖:5'-fUfCmCfGmCfUmCfAmAfAmGfCmAfGmGfCmUfCmGfCmA*fG*mG-3'(配列番号3031)
センス鎖:5'-mUmGfCmGfAmGfCmCfUmGfCmUfUmUfGmAfGmCfGmGfA-3'(配列番号2991);
アンチセンス鎖:5'-fAfCmCfAmAfAmUfCmUfGmGfAmCfCmCfUmGfGmGfCmU*fC*mC-3'(配列番号3034)
センス鎖:5'-mAmGfCmCfCmAfGmGfGmUfCmCfAmGfAmUfUmUfGmGfU-3'(配列番号2994);
アンチセンス鎖:5'-fGfGmAfAmUfGmCfCmGfAmUfGmGfCmCfUmGfGmGfCmC*fA*mG-3'(配列番号3032)
センス鎖:5'-mGmGfCmCfCmAfGmGfCmCfAmUfCmGfGmCfAmUfUmCfC-3'(配列番号2992);
アンチセンス鎖:5'-fCfAmAfAmUfCmUfGmGfAmCfCmCfUmGfGmGfCmUfCmC*fG*mG-3'(配列番号3033)
センス鎖:5'-mGmGfAmGfCmCfCmAfGmGfGmUfCmCfAmGfAmUfUmUfG-3'(配列番号2993);
アンチセンス鎖:5'-fGfGmAfCmUfCmCfGmGfGmAfGmGfCmCfCmGfUmCfUmC*fU*mC-3'(配列番号3042)
センス鎖:5'-mGmAfGmAfCmGfGmGfCmCfUmCfCmCfGmGfAmGfUmCfC-3'(配列番号3002);
アンチセンス鎖:5'-fCfUmCfAmAfAmGfCmAfGmGfCmUfCmGfCmAfGmGfGmC*fC*mU-3'(配列番号3030)
センス鎖:5'-mGmCfCmCfUmGfCmGfAmGfCmCfUmGfCmUfUmUfGmAfG-3'(配列番号2990);
アンチセンス鎖:5'-fAfUmUfCmCfCmGfCmCfGmGfUmGfCmUfGmCfCmUfCmA*fG*mC-3'(配列番号3036)
センス鎖:5'-mUmGfAmGfGmCfAmGfCmAfCmCfGmGfCmGfGmGfAmAfU-3'(配列番号2996);
アンチセンス鎖:5'-fAfUmGfCmCfCmAfGmGfAmAfAmGfAmAfUmGfGmCfAmG*fU*mU-3'(配列番号3065)
センス鎖:5'-mCmUfGmCfCmAfUmUfCmUfUmUfCmCfUmGfGmGfCmAfU-3'(配列番号3025);
アンチセンス鎖:5'-fGfUmUfUmCfUmAfGmGfAmGfAmGfGmUfUmGfCmGfCmC*fU*mG-3'(配列番号3054)
センス鎖:5'-mGmGfCmGfCmAfAmCfCmUfCmUfCmCfUmAfGmAfAmAfC-3'(配列番号3014);
アンチセンス鎖:5'-fUfCmCfGmUfUmUfCmUfAmGfGmAfGmAfGmGfUmUfGmC*fG*mC-3'(配列番号3057)
センス鎖:5'-mGmCfAmAfCmCfUmCfUmCfCmUfAmGfAmAfAmCfGmGfA-3'(配列番号3017);
アンチセンス鎖:5'-fGfAmAfAmCfUmCfCmGfGmGfCmUfCmGfCmCfAmGfGmA*fG*mC-3'(配列番号3049)
センス鎖:5'-mUmCfCmUfGmGfCmGfAmGfCmCfCmGfGmAfGmUfUmUfC-3'(配列番号3009);
アンチセンス鎖:5'-fAfAmGfAmAfUmGfGmCfAmGfUmUfCmUfCmCfGmCfGmG*fU*mG-3'(配列番号3064)
センス鎖:5'-mCmCfGmCfGmGfAmGfAmAfCmUfGmCfCmAfUmUfCmUfU-3'(配列番号3024);
アンチセンス鎖:5'-fCfGmUfUmUfCmUfAmGfGmAfGmAfGmGfUmUfGmCfGmC*fC*mU-3'(配列番号3055)
センス鎖:5'-mGmCfGmCfAmAfCmCfUmCfUmCfCmUfAmGfAmAfAmCfG-3'(配列番号3015);
アンチセンス鎖:5'-fGfGmUfCmCfAmAfAmCfGmAfGmUfCmUfCmCfGmUfCmG*fC*mC-3'(配列番号3028)
センス鎖:5'-mCmGfAmCfGmGfAmGfAmCfUmCfGmUfUmUfGmGfAmCfC-3'(配列番号2988);
アンチセンス鎖:5'-fGfCmGfGmUfGmUfGmGfAmGfUmCfUmCfUmCfAmCfCmG*fG*mG-3'(配列番号3063)
センス鎖:5'-mCmGfGmUfGmAfGmAfGmAfCmUfCmCfAmCfAmCfCmGfC-3'(配列番号3023);
アンチセンス鎖:5'-fUfAmUfUmCfUmUfCmCfUmCfGmCfUmGfAmGfGmGfGmU*fG*mC-3'(配列番号3059)
センス鎖:5'-mAmCfCmCfCmUfCmAfGmCfGmAfGmGfAmAfGmAfAmUfA-3'(配列番号3019);
アンチセンス鎖:5'-fGfGmGfUmCfCmAfAmAfCmGfAmGfUmCfUmCfCmGfUmC*fG*mC-3'(配列番号3029)
センス鎖:5'-mGmAfCmGfGmAfGmAfCmUfCmGfUmUfUmGfGmAfCmCfC-3'(配列番号2989);
アンチセンス鎖:5'-fUfUmUfCmUfAmGfGmAfGmAfGmGfUmUfGmCfGmCfCmU*fG*mC-3'(配列番号3053)
センス鎖:5'-mAmGfGmCfGmCfAmAfCmCfUmCfUmCfCmUfAmGfAmAfA-3'(配列番号3013);
アンチセンス鎖:5'-fCfAmGfAmAfAmCfUmCfCmGfGmGfCmUfCmGfCmCfAmG*fG*mA-3'(配列番号3050)
センス鎖:5'-mCmUfGmGfCmGfAmGfCmCfCmGfGmAfGmUfUmUfCmUfG-3'(配列番号3010);
アンチセンス鎖:5'-fAfAmAfGmGfCmUfCmGfGmAfGmGfAmGfCmAfGmGfGmC*fG*mG-3'(配列番号3038)
センス鎖:5'-mGmCfCmCfUmGfCmUfCmCfUmCfCmGfAmGfCmCfUmUfU-3'(配列番号2998);
アンチセンス鎖:5'-fGfCmUfUmUfUmGfCmCfCmGfGmGfUmGfCmGfGmAfGmG*fC*mC-3'(配列番号3047)
センス鎖:5'-mCmCfUmCfCmGfCmAfCmCfCmGfGmGfCmAfAmAfAmGfC-3'(配列番号3007);
アンチセンス鎖:5'-fCfCmUfGmUfCmCfCmGfGmGfUmGfCmCfUmGfGmCfCmC*fU*mU-3'(配列番号3045)
センス鎖:5'-mGmGfGmCfCmAfGmGfCmAfCmCfCmGfGmGfAmCfAmGfG-3'(配列番号3005);
アンチセンス鎖:5'-fUfGmAfAmUfCmCfUmGfGmAfCmUfCmCfGmGfGmAfGmG*fC*mC-3'(配列番号3043)
センス鎖:5'-mCmCfUmCfCmCfGmGfAmGfUmCfCmAfGmGfAmUfUmCfA-3'(配列番号3003);
アンチセンス鎖:5'-fGfGmGfAmUfGmCfCmCfAmGfGmAfAmAfGmAfAmUfGmG*fC*mA-3'(配列番号3066)
センス鎖:5'-mCmCfAmUfUmCfUmUfUmCfCmUfGmGfGmCfAmUfCmCfC-3'(配列番号3026);
アンチセンス鎖:5'-fGfAmGfUmCfUmCfUmCfAmCfCmGfGmGfCmCfUmAfGmA*fC*mC-3'(配列番号3062)
センス鎖:5'-mUmCfUmAfGmGfCmCfCmGfGmUfGmAfGmAfGmAfCmUfC-3'(配列番号3022);
アンチセンス鎖:5'-fCfCmGfUmUfUmCfUmAfGmGfAmGfAmGfGmUfUmGfCmG*fC*mC-3'(配列番号3056)
センス鎖:5'-mCmGfCmAfAmCfCmUfCmUfCmCfUmAfGmAfAmAfCmGfG-3'(配列番号3016);
アンチセンス鎖:5'-fCfGmGfUmCfCmUfCmCfCmGfGmCfUmUfUmUfGmCfCmC*fG*mG-3'(配列番号3048)
センス鎖:5'-mGmGfGmCfAmAfAmAfGmCfCmGfGmGfAmGfGmAfCmCfG-3'(配列番号3008);
アンチセンス鎖:5'-fCfCmAfGmCfGmAfGmGfAmGfCmCfUmGfAmGfGmGfUmG*fG*mG-3'(配列番号3046)
センス鎖:5'-mCmAfCmCfCmUfCmAfGmGfCmUfCmCfUmCfGmCfUmGfG-3'(配列番号3006);
アンチセンス鎖:5'-fGfCmUfUmCfCmAfGmCfGmAfGmGfCmGfGmCfCmUfCmU*fU*mC-3'(配列番号3058)
センス鎖:5'-mAmGfAmGfGmCfCmGfCmCfUmCfGmCfUmGfGmAfAmGfC-3'(配列番号3018);
アンチセンス鎖:5'-fGfGmGfCmGfGmUfCmUfGmGfGmAfUmCfCmGfGmUfGmA*fC*mG-3'(配列番号3037)
センス鎖:5'-mUmCfAmCfCmGfGmAfUmCfCmCfAmGfAmCfCmGfCmCfC-3'(配列番号2997);
アンチセンス鎖:5'-fGfUmAfUmUfCmUfUmCfCmUfCmGfCmUfGmAfGmGfGmG*fU*mG-3'(配列番号3060)
センス鎖:5'-mCmCfCmCfUmCfAmGfCmGfAmGfGmAfAmGfAmAfUmAfC-3'(配列番号3020);および
アンチセンス鎖:5'-fUfGmCfUmGfCmAfGmAfAmAfCmUfCmCfGmGfGmCfUmC*fG*mC-3'(配列番号3051)
センス鎖:5'-mGmAfGmCfCmCfGmGfAmGfUmUfUmCfUmGfCmAfGmCfA-3'(配列番号3011)
から選択されるsiRNAオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを提供する;
ここで「m」は、2'-O-メチル(2'-O-Me)修飾ヌクレオシドを指し示す;「f」は、2'-フルオロ(2'-F)修飾ヌクレオシドを指し示す;「*」は、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結を指し示す;および2ヌクレオシド間に「*」が存在しないことは、ホスホジエステルヌクレオシド間連結を指し示す。
本発明の他の側面は、以下:
アンチセンス鎖:5'-fUfGmGfAmAfAmGfxCmGfAmUfCmCfUmUfCmUfCmAfAmA*fG*mG-3'(配列番号3040)
センス鎖:5'-mUmUfUmGfAmGfAmAfGmGfAmUfxCmGfCmUfUmUfCmCfA-3'(配列番号3000);
アンチセンス鎖:5'-fCfxCmGfGmUfAmUfUmCfUmUfCmCfUmxCfGmCfUmGfAmG*fG*mG-3'(配列番号3061)
センス鎖:5'-mCmUfCmAfGmxCfGmAfGmGfAmAfGmAfAmUfAmCfxCmGfG-3'(配列番号3021);
アンチセンス鎖:5'-fGfUmCfCmAfAmAfxCmGfAmGfUmCfUmCfxCmGfUmxCfGmC*fxC*mG-3'(配列番号3027)
センス鎖:5'-mGmxCfGmAfxCmGfGmAfGmAfCmUfxCmGfUmUfUmGfGmAfC-3'(配列番号2987);
アンチセンス鎖:5'-fGfGmGfxCmGfGmUfCmUfGmGfGmAfUmCfxCmGfGmUfGmA*fxC*mG-3'(配列番号3037)
センス鎖:5'-mUmCfAmCfxCmGfGmAfUmCfCmCfAmGfAmCfxCmGfCmCfC-3'(配列番号2997);
アンチセンス鎖:5'-fxCfGmAfUmCfCmUfUmCfUmCfAmAfAmGfGmCfUmxCfGmG*fA*mG-3'(配列番号3039)
センス鎖:5'-mCmxCfGmAfGmCfCmUfUmUfGmAfGmAfAmGfGmAfUmxCfG-3'(配列番号2999);
アンチセンス鎖:5'-fGfxCmGfAmUfGmCfCmUfGmGfAmAfAmGfxCmGfAmUfCmC*fU*mU-3'(配列番号3041)
センス鎖:5'-mGmGfAmUfxCmGfCmUfUmUfCmCfAmGfGmCfAmUfxCmGfC-3'(配列番号3001);
アンチセンス鎖:5'-fCfUmGfAmAfUmCfCmUfGmGfAmCfUmCfxCmGfGmGfAmG*fG*mC-3'(配列番号3044)
センス鎖:5'-mCmUfCmCfxCmGfGmAfGmUfCmCfAmGfGmAfUmUfCmAfG-3'(配列番号3004);および
アンチセンス鎖:5'-fUfUmCfUmAfGmGfAmGfAmGfGmUfUmGfxCmGfCmCfUmG*fC*mU-3'(配列番号3052)
センス鎖:5'-mCmAfGmGfxCmGfCmAfAmCfCmUfCmUfCmCfUmAfGmAfA-3'(配列番号3012)
から選択されるsiRNAオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを提供する;
ここで「m」は、2'-O-メチル(2'-O-Me)修飾ヌクレオシドを指し示す;「f」は、2'-フルオロ(2'-F)修飾ヌクレオシドを指し示す;「mxC」は、2'-O-Me修飾5-メチル-シチジンを指し示す;「fxC」は、2'-F修飾5-メチル-シチジンを指し示す;「*」は、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結を指し示す;および2ヌクレオシド間に「*」が存在しないことは、ホスホジエステルヌクレオシド間連結を指し示す。
本発明の他の側面は、double homeobox 4(DUX4) mRNAを標的にするオリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結されている筋標的化剤を含む複合体を提供するが、ここでオリゴヌクレオチドは、長さが18～25ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、かつ配列番号163～1574で表されるとおりの標的配列に対する相補性の領域を含み、およびここで相補性の領域は、長さが少なくとも16の連続したヌクレオシドである。いくつかの態様において、筋標的化剤は、抗トランスフェリン受容体(TfR)抗体である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、RNAiオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、配列番号1575～2986のいずれか1つのヌクレオチド配列を含む。
図面の簡単な記載
図1は、siRNAで細胞をトランスフェクトする効果を示す非限定的な概略図を描く。
図2は、siRNAを含む筋標的化複合体の活性を示す非限定的な概略図を描く。
図3A～3Bは、ビヒクル処置された対照と比べたin vivoでのマウス筋組織(腓腹筋および心臓)におけるsiRNAを含む筋標的化複合体の活性を示す非限定的な概略図を描く。(N=4匹のC57BL/6 WTマウス)
図4A～4Eは、siRNAを含む筋標的化複合体の組織選択性を示す非限定的な概略図を描く。 図4A～4Eは、siRNAを含む筋標的化複合体の組織選択性を示す非限定的な概略図を描く。 図4A～4Eは、siRNAを含む筋標的化複合体の組織選択性を示す非限定的な概略図を描く。
図5A～5Bは、Hepa1-6細胞中のDUX4 mRNA発現のノックダウンにおける、表8に列挙されるDUX4標的化siRNAの活性を示す。図5Aは、Hepa1-6細胞が2nMまたは10nMの指し示される各siRNAで処置されたときの、DUX4 mRNAのノックダウンにおけるsiRNAの活性を示す。 図5Bは、176pMのIC50値を生じるsiRNA9の用量応答曲線を示す。
図6A～6Hは、表8に列挙される特定のDUX4標的化siRNAで様々な濃度にてAB1080不死化FSHD患者由来筋管をトランスフェクションした後のMBD3L2 mRNAの低減を示す用量応答曲線である。試験されたsiRNAは、siRNA9(図6A);siRNA14(図6B);siRNA35(図6C)、siRNA13(図6D)、siRNA15(図6E)、siRNA1(図6F)、siRNA26(図6G)、およびsiRNA18(図6H)である。 図6A～6Hは、表8に列挙される特定のDUX4標的化siRNAで様々な濃度にてAB1080不死化FSHD患者由来筋管をトランスフェクションした後のMBD3L2 mRNAの低減を示す用量応答曲線である。試験されたsiRNAは、siRNA9(図6A);siRNA14(図6B);siRNA35(図6C)、siRNA13(図6D)、siRNA15(図6E)、siRNA1(図6F)、siRNA26(図6G)、およびsiRNA18(図6H)である。 図7は、抗TfR Fab 3M12 VH4/Vκ3が共有結合的に連結されたsiRNA9、siRNA14、またはsiRNA35(表8中のsiRNA9、siRNA14、siRNA35に対応する)を含有するsiRNA抱合体とインキュベーションした後のAB1080不死化FSHD患者由来筋管における3つのDUX4トランスクリプトームマーカー(MBD3L2、TRIM43、およびZSCAN4)の複合mRNAレベルを示す。抗TfR Fabは、リンカーを介して各siRNAのセンス鎖の3'末へ共有結合的に連結されており、対応するアンチセンス鎖はセンス鎖へアニールした。
詳細な記載
本開示のいくつかの側面は、DUX4 RNAを標的にするよう設計されたオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの態様において、本開示は、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー(FSHD)の病的状態(筋萎縮症、炎症における、ならびに減少した分化能および酸化ストレスを包含する)の特色に関連するDUX4 mRNAおよび/またはタンパク質のレベルを低減するのに有用である、DUX4 RNAと相補的なオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの態様において、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドは、DUX4 RNAのRNAi媒介分解に向けるよう設計されている。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DUX4 RNA分解のためにRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)を効率的に関与させるが、またオフターゲット効果も低減させるよう設計されている。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DUX4 RNAおよび/またはタンパク質のレベルを低減するよう設計されている。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、所望のバイオアベイラビリティおよび/または血清安定性という特性を有するよう設計されている。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、所望の結合親和性という特性を有するよう設計されている。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、所望の毒性および/または免疫原性プロファイルを有するよう設計されている。
いくつかの側面において、本開示は、オリゴヌクレオチドの筋細胞への有効な送達のためのDUX4標的化オリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結されている筋標的化剤を含む複合体を提供する。いくつかの態様において、複合体は、例として、希少な筋疾患を有するかまたはこれを有すると疑われる対象において、筋細胞における標的遺伝子の発現または活性を阻害する分子ペイロードを送達するのに特に有用である。例えば、いくつかの態様において、複合体は、FSHDを有する対象を処置するためにDUX4を標的にするために提供される。いくつかの態様において、本明細書に提供される複合体は、4番染色体上の1以上のD4Z4反復の欠失を有する対象におけるDUX4の発現を阻害するオリゴヌクレオチドを含む。
定義された用語の記載を含む本開示のさらなる側面は、以下に提供される。
Ｉ．定義
投与する(施す)こと:
本明細書に使用されるとき、用語「投与する(施す)こと」または「投与(施し)」は、生理学的におよび/または薬理学的に有用なやり方で対象へ複合体を提供すること(例として、対象における疾病を処置すること)を意味する。
およそ:
本明細書に使用されるとき、用語「およそ」または「約」は、関心のある1つ以上の値へ適用されるとき、規定された参照値と同様の値を指す。ある態様において、用語「およそ」または「約」は、別様に述べられない限りまたは文脈から明らかでない限り(かかる数字が実行可能な値の100％を超える場合を除く)、規定された参照値のプラスマイナス(超または未満)の15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、またはこれ未満に収まる広範な値を指す。
抗体:
本明細書に使用されるとき、用語「抗体」は、少なくとも1つの免疫グロブリン可変ドメインまたは少なくとも1つの抗原決定基、例として、抗原へ特異的に結合するパラトープを包含するポリペプチドを指す。いくつかの態様において、抗体は、完全長の抗体である。いくつかの態様において、抗体は、キメラ抗体である。いくつかの態様において、抗体は、ヒト化抗体である。しかしながら、いくつかの態様において、抗体は、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント、Fvフラグメント、またはscFvフラグメントである。いくつかの態様において、抗体は、ラクダ科の動物の抗体に由来するナノボディー、またはサメ抗体に由来するナノボディーである。いくつかの態様において、抗体は、二重特異性抗体である。いくつかの態様において、抗体は、ヒト生殖細胞系配列を有するフレームワークを含む。別の態様において、抗体は、IgG、IgG1、IgG2、IgG2A、IgG2B、IgG2C、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgM、およびIgEの定常領域からなる群から選択される重鎖定常領域を含む。いくつかの態様において、抗体は、重(H)鎖可変領域(本明細書中VHと略される)、および/または(例として、および)、軽(L)鎖可変領域(本明細書中VLと略される)を含む。いくつかの態様において、抗体は、定常領域、例としてFc領域を含む。免疫グロブリン定常領域は、重鎖または軽鎖定常領域を指す。ヒトIgG重鎖および軽鎖定常領域アミノ酸配列およびそれらの機能的バリエーションは知られている。重鎖に関し、いくつかの態様において本明細書に記載の抗体の重鎖は、アルファ(α)、デルタ(Δ)、イプシロン(ε)、ガンマ(γ)、またはミュー(μ)重鎖であり得る。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体の重鎖は、ヒトのアルファ(α)、デルタ(Δ)、イプシロン(ε)、ガンマ(γ)、またはミュー(μ)重鎖を含み得る。具体的な態様において、本明細書に記載の抗体は、ヒトのガンマ1 CH1ドメイン、CH2ドメイン、および/または(例として、および)、CH3ドメインを含む。いくつかの態様において、VHドメインのアミノ酸配列は、ヒトガンマ(γ)重鎖定常領域のアミノ酸配列、たとえば当該技術分野において知られているいずれの配列も含む。ヒト定常領域配列の非限定例は当該技術分野において記載されており、例として、米国特許第5,693,780号および上記のKabat E Aら(1991)を見よ。いくつかの態様において、VHドメインは、本明細書に提供される可変鎖定常領域のいずれかと少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または少なくとも99％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、抗体は修飾されている(例として、グリコシル化、リン酸化、SUMO化、および/または(例として、および)、メチル化を介して修飾されている)。いくつかの態様において、抗体は、1以上の糖または炭水化物分子へ抱合されたグリコシル化抗体である。いくつかの態様において、1以上の糖または炭水化物分子は、N-グリコシル化、O-グリコシル化、C-グリコシル化、グリピエーション(GPIアンカー付着)、および/または(例として、および)、ホスホグリコシル化を介して、抗体へ抱合されている。いくつかの態様において、1以上の糖または炭水化物分子は、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、またはグリカンである。いくつかの態様において、1以上の糖または炭水化物分子は、分枝オリゴ糖類または分枝グリカンである。いくつかの態様において、1以上の糖または炭水化物分子は、マンノース単位、グルコース単位、N-アセチルグルコサミン単位、N-アセチルガラクトサミン単位、ガラクトース単位、フコース単位、またはホスホ脂質単位を包含する。いくつかの態様において、抗体は、リンカーポリペプチドまたは免疫グロブリン定常領域へ連結された本開示の1以上の抗原結合性フラグメントを含むポリペプチドを含む構築物である。リンカーポリペプチドは、ペプチド結合によって結び合わされた2以上のアミノ酸残基を含み、1以上の抗原結合部と連結させるために使用される。リンカーポリペプチドの例は報告されている(例として、Holliger,P.,et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448;Poljak,R.J.,et al.(1994)Structure 2:1121-1123を見よ)。またさらに、抗体は、1以上の他のタンパク質またはペプチドと、抗体もしくは抗体部分との共有結合または非共有結合の結び付きによって形成される、より大きな免疫接着分子の一部であってもよい。かかる免疫接着分子の例は、四量体scFv分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用(Kipriyanov,S.M.,et al.(1995)Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101)、ならびに二価のおよびビオチン化されたscFv分子を作製するためのシステイン残基、マーカーペプチド、およびC末ポリヒスチジンタグの使用(Kipriyanov,S.M.,et al.(1994)Mol.Immunol.31:1047-1058)を包含する。
CDR:
本明細書に使用される場合、用語「CDR」は、抗体可変配列内の相補性決定領域を指す。典型的な抗体分子は、重鎖可変領域(VH)および軽鎖可変領域(VL)を含み、これらは通常、抗原結合に関与する。VHおよびVL領域は、「フレームワーク領域」(「FR」)として知られるより保存された領域が散在する、「相補性決定領域」(「CDR」)としても知られる超可変領域にさらに細分することができる。各VHおよびVLは、典型的には、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4で配置された3つのCDRおよび4つのFRで構成される。フレームワーク領域およびCDRの範囲は、当技術分野で公知の方法論を使用して、例えば、Kabat定義、IMGT定義、Chothia定義、AbM定義、および/または(例として、および)接触定義によって正確に同定され得、これらはすべて当技術分野で周知である。例として、Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242;IMGT(登録商標),the international ImMunoGeneTics information system(登録商標)imgt.org,Lefranc,M.-P.et al.,Nucleic Acids Res.,27:209-212(1999);Ruiz,M.et al.,Nucleic Acids Res.,28:219-221(2000);Lefranc,M.-P.,Nucleic Acids Res.,29:207-209(2001);Lefranc,M.-P.,Nucleic Acids Res.,31:307-310(2003);Lefranc,M.-P.et al.,In Silico Biol.,5,0006(2004)［Epub］,5:45-60(2005);Lefranc,M.-P.et al.,Nucleic Acids Res.,33:D593-597(2005);Lefranc,M.-P.et al.,Nucleic Acids Res.,37:D1006-1012(2009);Lefranc,M.-P.et al.,Nucleic Acids Res.,43:D413-422(2015);Chothia et al.,(1989)Nature 342:877;Chothia,C.et al.(1987)J.Mol.Biol.196:901-917,Al-lazikani et al(1997)J.Molec.Biol.273:927-948;およびAlmagro,J.Mol.Recognit.17:132-143(2004)を見よ。hgmp.mrc.ac.ukおよびbioinf.org.uk/absも見よ。本明細書で使用される場合、CDRは、当技術分野で公知の任意の方法によって定義されるCDRを指し得る。同じCDRを有する2つの抗体は、同じ方法、例えばIMGT定義によって決定される場合、2つの抗体がそのCDRの同じアミノ酸配列を有することを意味する。
重鎖および軽鎖の可変領域の各々において3つのCDRがあり、これらは可変領域の各々につきCDR1、CDR2、およびCDR3と指定される。用語「CDRセット」は、本明細書に使用されるとき、抗原に結合することが可能な単一の可変領域に生じる3つのCDRの一群を指す。これらのCDRの厳密な境界は、種々の系に従い異なって定義されている。Kabat(Kabat et al.,Sequence of Proteins of Immunological Interest(国立衛生研究所,Bethesda,Md.(1987)および(1991))によって記載される系は、抗体のいずれの可変領域へも適用可能な一義的な残基ナンバリング系を提供するのみならず、3つのCDRを定義する正確な残基境界をも提供する。これらのCDRは、Kabat CDRと称されることもある。CDRの下位部(Sub-portions)は、L1、L2、およびL3、またはH1、H2、およびH3と指定されることがあり、ここで「L」および「H」は夫々、軽鎖および重鎖領域を指定する。これらの領域は、Kabat CDRと重複する境界を有するChothia CDRと称されることもある。Kabat CDRと重複するCDRを定義する他の境界は、Padlan(FASEB J.9:133-139(1995))およびMacCallum(J Mol Biol 262(5):732-45(1996))によって記載されている。さらに他のCDR境界定義は、上の系の1つに厳重に従わなくてもよいが、それでもなおKabat CDRと重複することがあり、具体的な残基もしくは残基の群またはCDR全体でさえも抗原結合に有意に影響を及ぼすものではないという予測あるいは実験的知見を踏まえ、それらは短縮または伸長されてもよい。本明細書で使用される方法は、これらの系のいずれかに従って定義されたCDRを利用してよい。CDR定義系の例が表1に示される。
表1．CDR定義
1 IMGT(登録商標),the international ImMunoGeneTics information system(登録商標),imgt.org,Lefranc,M.-P.et al.,Nucleic Acids Res.,27:209-212(1999)
2 Kabat et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242
3 Chothia et al.,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))
CDR接合(-grafted)抗体:
用語「CDR接合抗体」は、マウス重鎖および軽鎖可変領域を有するがマウスCDRの1以上(例として、CDR3)がヒトCDR配列に置き換えられている抗体などの、ある種からの重鎖および軽鎖可変領域配列を含むが、そのVHおよび/またはVLのCDR領域の1以上の配列が別の種のCDR配列に置き換えられている抗体を指す。
キメラ抗体:
用語「キメラ抗体」は、ヒト定常領域へ連結されたマウス重鎖および軽鎖可変領域を有する抗体などの、ある種からの重鎖および軽鎖可変領域配列と別の種からの定常領域配列を含む抗体を指す。
相補的(な):
本明細書に使用されるとき、用語「相補的(な)」は、2ヌクレオチド間または2組のヌクレオチド間の正確な対形成のための能力(capacity)を指す。とりわけ、相補的(な)は、2ヌクレオチド間または2組のヌクレオチド間に結合をもたらす水素結合対形成の程度を特徴付ける用語である。用語「相補的(な)」はまた、2ヌクレオシド間または2組のヌクレオシド間の正確な対形成のための能力(capacity)を指すこともある。とりわけ、相補的(な)は、2ヌクレオシド間または2組のヌクレオシド間に結合をもたらす水素結合対形成の程度を特徴付ける用語である。例えば、ある位置のオリゴヌクレオチドの塩基が、対応する位置の標的核酸(例として、mRNA)の塩基と水素結合することが可能である場合、そのとき塩基は、その位置にて互いに相補的であると見なされる。塩基対合は、標準的なWatson-Crick塩基対合と非Watson-Crick塩基対合(例として、Wobble塩基対合およびHoogsteen塩基対合)との両方を包含してもよい。例えば、いくつかの態様において、相補的な塩基対合として、アデノシン型塩基(A)は、チミジン型塩基(T)またはウラシル型塩基(U)に相補的であり、シトシン型塩基(C)は、グアノシン型塩基(G)に相補的であり、3-ニトロピロールまたは5-ニトロインドールなどのユニバーサル塩基は、いずれのA、C、U、またはTとハイブリダイズし得、これらと相補的であると見なされる。イノシン(I)はまた、当該技術分野においてユニバーサル塩基であるとも見なされており、いずれのA、C、U、またはTに相補的であると見なされる。
保存アミノ酸置換:
本明細書に使用されるとき、「保存アミノ酸置換」は、アミノ酸置換がなされたタンパク質の相対的な電荷またはサイズの特徴を変更しないアミノ酸置換を指す。バリアントは、当業者に知られているポリペプチド配列を変更するための方法に従って調製され得、たとえば、かかる方法をまとめた参考文献、例として、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,J.Sambrook,et al.,eds.,Fourth Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,2012、またはCurrent Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel,et al.,eds.,John Wiley & Sons,Inc.,New Yorkから見出される。アミノ酸の保存的置換は、以下の群:(a)M、I、L、V;(b)F、Y、W;(c)K、R、H;(d)A、G;(e)S、T;(f)Q、N;および(g)E、D内のアミノ酸に対してなされる置換を包含する。
共有結合的に連結された(ている):
本明細書に使用されるとき、用語「共有結合的に連結された(ている)」は、少なくとも1つの共有結合を介して一緒に連結されている2以上の分子の特徴を指す。いくつかの態様において、2つの分子は一緒に、分子間リンカーとして働く単結合(例として、ジスルフィド結合またはジスルフィド架橋)によって共有結合的に連結され得る。しかしながら、いくつかの態様において、複数の共有結合を通して2以上の分子を一緒に結び合わせるリンカーとして働く分子を介して、2以上の分子は一緒に、共有結合的に連結され得る。いくつかの態様において、リンカーは、切断可能なリンカーであってもよい。しかしながら、いくつかの態様において、リンカーは、切断不能なリンカーであってもよい。
交差反応すること:
本明細書に使用されるとき、および標的化剤(例として、抗体)の文脈において、用語「交差反応すること」は、同様のタイプまたはクラスの1種より多くの抗原(例として、複数のホモログ、パラログ、もしくはオルソログの抗原)へ、同様の親和性または結合活性で特異的に結合することが可能な剤の特性を指す。例えば、いくつかの態様において、同様のタイプまたはクラスのヒトおよび霊長目の非ヒト動物の抗原(例として、ヒトトランスフェリン受容体および霊長目の非ヒト動物のトランスフェリン受容体)に対して交差反応する抗体は、ヒト抗原および霊長目の非ヒト動物の抗原へ、同様の親和性または結合活性で結合することが可能である。いくつかの態様において、抗体は、同様のタイプまたはクラスのヒト抗原および齧歯類動物抗原に対して交差反応する。いくつかの態様において、抗体は、同様のタイプまたはクラスの齧歯類動物の抗原および霊長目の非ヒト動物の抗原に対して交差反応する。いくつかの態様において、抗体は、同様のタイプまたはクラスのヒト抗原、霊長目の非ヒト動物の抗原、および齧歯類動物の抗原に対して交差反応する。
DUX4:
本明細書に使用されるとき、用語「DUX4」は、胎児の発生の間におよび成人男性の精巣において一般に発現するタンパク質であるダブルホメオボックス4をコードする遺伝子を指す。いくつかの態様において、DUX4は、ヒト(Gene ID: 100288687)、非ヒト霊長目の非ヒト動物(例として、Gene ID: 750891、Gene ID: 100405864)、または齧歯類動物の遺伝子(例として、Gene ID: 306226)であってもよい。ヒトにおいて、胎児の発生および精巣以外でのDUX4遺伝子の発現は、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーに関連する。加えて、種々のタンパク質アイソフォームをコードした複数のヒト転写産物バリアントが(例として、GenBank RefSeq受託番号: NM_001293798.2、NM_001306068.2、NM_001363820.1の注釈付きのものであるように)特徴付けられている。
顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー(FSHD):
本明細書に使用されるとき、用語「顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー(FSHD)」は、主に顔、肩甲骨、および上腕の筋肉における筋肉量の減少および筋萎縮を特徴とする、DUX4遺伝子またはSMCHD1遺伝子における突然変異によって引き起こされる遺伝的疾患を指す。疾患の2つのタイプ、1型および2型が記載されている。1型は、DUX4遺伝子を含有する4番染色体上のD4Z4反復領域中の欠失に関連する。いくつかの態様において、1型は、DUX4遺伝子を含有する4番染色体アレルのバリアント4qA上のD4Z4反復領域中の欠失に関連する。2型は、SMCHD1遺伝子における突然変異に関連する。1型および2型FSHDの両方が、胎児の発生の後でかつ精巣以外でのDUX4タンパク質の異常な産生を特徴とする。顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、疾患の遺伝的根拠、および関連する症状は、当該技術分野において記載されている。(例として、Campbell,A.E.,et al.,"Facioscapulohumeral dystrophy:Activating an early embryonic transcriptional program in human skeletal muscle" Human Mol Genet.(2018);およびTawil,R."Facioscapulohumeral muscular dystrophy"Handbook Clin.Neurol.(2018),148:541-548を見よ。)FSHD1型は、Online Mendelian Inheritance in Man(OMIM)Entry # 158900に関連する。FSHD2型は、OMIM Entry #158901に関連する。
フレームワーク:
本明細書に使用されるとき、用語「フレームワーク」または「フレームワーク配列」は、CDRを差し引いた可変領域の残りの配列を指す。CDR配列の厳密な定義が種々の系によって決定され得ることから、フレームワーク配列の意味は、相応に異なる解釈に依存する。6つのCDR(軽鎖のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3、ならびに重鎖のCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3)もまた、軽鎖および重鎖上のフレームワーク領域を各鎖上の4つの下位領域(FR1、FR2、FR3、およびFR4)に分け、ここでCDR1はFR1とFR2との間に、CDR2はFR2とFR3との間に、CDR3はFR3とFR4との間に位置付けられる。具体的な下位領域をFR1、FR2、FR3、またはFR4と特定しないフレームワーク領域は、他によって言及されるとき、天然に存在する単一の免疫グロブリン鎖の可変領域内の組み合わされたFR(複数)を表す。本明細書に使用されるとき、FRは4つの下位領域のうち1つを表し、FR(複数)はフレームワーク領域を含有する4つの下位領域のうち2つ以上を表す。ヒト重鎖および軽鎖アクセプター配列は、当該技術分野において知られている。一態様において、当該技術分野において知られているアクセプター配列は、本明細書に開示の抗体に使用されていてもよい。
ヒト抗体:
用語「ヒト抗体」は、本明細書に使用されるとき、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を包含することが意図される。本開示のヒト抗体は、例えばCDR、とりわけCDR3において、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基(例として、in vitroでのランダム変異誘発もしくは部位特異的変異誘発によってか、またはin vivoでの体細胞変異によって導入された突然変異)を包含していてもよい。しかしながら、用語「ヒト抗体」は、本明細書に使用されるとき、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列上へ接合された抗体を包含することは意図されない。
ヒト化抗体:
用語「ヒト化抗体」は、非ヒト種(例として、マウス)からの重鎖および軽鎖の可変領域配列を含むが、VH配列および/または(例として、および)VL配列の少なくとも一部がより「ヒト様」に、すなわち、ヒト生殖細胞系可変配列とより同様なものに変更された抗体を指す。ヒト化抗体のあるタイプは、ヒトCDR配列が非ヒトVHおよびVL配列上へ導入されて対応する非ヒトCDR配列と置き換えられたCDR接合抗体である。一態様において、ヒト化された抗トランスフェリン受容体抗体および抗原結合部分が提供される。かかる抗体は、既存のハイブリドーマ技術、これに続くin vitroの遺伝子工学を使用するヒト化(KasaianらのPCT刊行物第WO 2005/123126 A2号に開示されたものなど)を使用してマウス抗トランスフェリン受容体モノクローナル抗体を得ることによって生成されてもよい。
内在化する細胞表面受容体:
本明細書に使用されるとき、用語「内在化する細胞表面受容体」は、例として、外部刺激(例として、受容体へ結合するリガンド)の際、細胞によって内在化される細胞表面受容体を指す。いくつかの態様において、内在化する細胞表面受容体は、エンドサイトーシスによって内在化される。いくつかの態様において、内在化する細胞表面受容体は、クラスリン媒介エンドサイトーシスによって内在化される。しかしながら、いくつかの態様において、内在化する細胞表面受容体は、クラスリンに依存しない経路、例えば、食作用、マクロピノサイトーシス、カベオラ-およびラフト-媒介取り込み、またはクラスリンに依存しない構成的エンドサイトーシスなどによって内在化される。いくつかの態様において、内在化する細胞表面受容体は、細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、および/または(例として、および)、細胞外ドメインを含み、これらは任意にさらにリガンド結合ドメインを含む。いくつかの態様において、細胞表面受容体は、リガンド結合後に細胞によって内在化されるようになる。いくつかの態様において、リガンドは、筋標的化剤または筋標的化抗体であってもよい。いくつかの態様において、内在化する細胞表面受容体は、トランスフェリン受容体である。
単離された抗体:
「単離された抗体」は、本明細書に使用されるとき、異なる抗原特異性を有する他の抗体が実質的にない抗体を指すことが意図される(例として、トランスフェリン受容体に特異的に結合する単離された抗体は、トランスフェリン受容体以外の抗原に特異的に結合する抗体が実質的にない)。しかしながら、トランスフェリン受容体複合体に特異的に結合する単離された抗体は、他の種からのトランスフェリン受容体分子などの他の抗原への交差反応性を有していてもよい。その上、単離された抗体は、他の細胞の材料および/または(例として、および)化学物質が実質的になくてもよい。
Kabatナンバリング:
用語「Kabatナンバリング」、「Kabat定義」、および「Kabat標識化」は本明細書中、互換的に使用される。これらの用語は、当該技術分野において認識されているが、抗体またはその抗原結合部分の重鎖および軽鎖可変領域中の他のアミノ酸残基より可変(すなわち、高可変)であるアミノ酸残基をナンバリングする系を指す(Kabat et al.(1971)Ann.NY Acad,Sci.190:382-391および、Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)。重鎖可変領域において、超可変領域は、CDR1につきアミノ酸位置31～35、CDR2につきアミノ酸位置50～65、およびCDR3につきアミノ酸位置95～102に及ぶ。軽鎖可変領域において、超可変領域は、CDR1につきアミノ酸位置24～34、CDR2につきアミノ酸位置50～56、およびCDR3につきアミノ酸位置89～97に及ぶ。
分子ペイロード:
本明細書に使用されるとき、用語「分子ペイロード」は、生物学的結果(biological outcome)をモジュレートするよう機能する分子または種を指す。いくつかの態様において、分子ペイロードは、筋標的化剤へ連結されているか、または別様に結び付けられている。いくつかの態様において、分子ペイロードは、小分子、タンパク質、ペプチド、核酸、またはオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DNA配列の転写をモジュレートするよう、タンパク質の発現をモジュレートするよう、またはタンパク質の活性をモジュレートするよう機能する。いくつかの態様において、分子ペイロードは、標的遺伝子に対する相補性の領域を有する鎖を含むオリゴヌクレオチドである。
筋標的化剤:
本明細書に使用されるとき、用語「筋標的化剤」は、筋細胞上に発現されている抗原へ特異的に結合する分子を指す。筋細胞中または筋細胞上の抗原は、膜タンパク質、例えば、内在性膜タンパク質または表在性膜タンパク質であってもよい。典型的には、筋標的化剤は、筋細胞中への筋標的化剤(および結び付けられたいずれの分子ペイロード)の内在化を容易にさせる筋細胞上の抗原へ特異的に結合する。いくつかの態様において、筋標的化剤は、筋肉上の内在化する細胞表面受容体へ特異的に結合し、受容体媒介内在化を通して筋細胞中へ内在化されることが可能である。いくつかの態様において、筋標的化剤は、小分子、タンパク質、ペプチド、核酸(例として、アプタマー)、または抗体である。いくつかの態様において、筋標的化剤は、分子ペイロードへ連結されている。
筋標的化抗体:
本明細書に使用されるとき、用語「筋標的化抗体」は、筋細胞中または筋細胞上に見出される抗原へ特異的に結合する抗体である筋標的化剤を指す。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、筋細胞中への筋標的化抗体(および結び付けられたいずれの分子ペイロード)の内在化を容易にする筋細胞上の抗原へ特異的に結合する。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、筋細胞上に存在する、内在化する細胞表面受容体へ特異的に結合する。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、トランスフェリン受容体へ特異的に結合する抗体である。
オリゴヌクレオチド:
本明細書に使用されるとき、用語「オリゴヌクレオチド」は、長さが最大200ヌクレオチドまでのオリゴマーの核酸化合物を指す。オリゴヌクレオチドの例は、これらに限定されないが、RNAiオリゴヌクレオチド(例として、siRNA、shRNA)、マイクロRNA、gapmer、mixmer、ホスホロジアミダイトモルホリノ、ペプチド核酸、アプタマー、ガイド核酸(例として、Cas9ガイドRNA)等々を包含する。オリゴヌクレオチドは一本鎖または二本鎖であってもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、1以上の修飾ヌクレオチド(例として、2'-O-メチル糖修飾、プリンまたはピリミジン修飾)を含んでいてもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、1以上の修飾ヌクレオシド(例として、2'-O-メチル糖修飾、プリンまたはピリミジン修飾)を含んでいてもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、1以上の修飾ヌクレオチド間連結を含んでいてもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、1以上の修飾ヌクレオシド間連結を含んでいてもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、RpまたはSpの立体化学配置にあってもよい1以上のホスホロチオアート連結を含んでいてもよい。
組換え抗体:
用語「組換えヒト抗体」は、本明細書に使用されるとき、組換え手段によって調製、発現、創出、もしくは単離されたすべてのヒト抗体、たとえば、宿主細胞中へトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体(本開示により詳細に記載される)、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗体(Hoogenboom H.R.,(1997)TIB Tech.15:62-70;Azzazy H.,and Highsmith W.E.,(2002)Clin.Biochem.35:425-445;Gavilondo J.V.,and Larrick J.W.(2002)BioTechniques 29:128-145;Hoogenboom H.,and Chames P.(2000)Immunology Today 21:371-378)、ヒト免疫グロブリン遺伝子トランスジェニック動物(例として、マウス)から単離された抗体(例として、Taylor,L.D.,et al.(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295;Kellermann S-A.,and Green L.L.(2002)Current Opinion in Biotechnology 13:593-597;Little M.et al(2000)Immunology Today 21:364-370を見よ)、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のDNA配列とのスプライシングを伴ういずれの他の手段によって調製、発現、創出、もしくは単離された抗体を包含することが意図される。かかる組換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。しかしながら、ある態様において、かかる組換えヒト抗体は、in vitroでの変異誘発(または、ヒトIg配列トランスジェニック動物が使用されるとき、in vivoでの体細胞変異誘発)へ供され、よって、組換え抗体のVHおよびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系のVH配列およびVL配列に由来しかつこれに関するとはいえ、in vivoでのヒト抗体の生殖細胞系列レパートリー内には天然に存在しないこともある配列である。本開示の一態様は、当該技術分野において周知である技法を使用して、たとえば、これらに限定されないが、ヒトIgファージライブラリ(たとえば、JermutusらのPCT刊行物第WO 2005/007699 A2号に開示されたもの)を使用する技法を使用して生成され得るヒトトランスフェリン受容体に結合することが可能な完全ヒト抗体を提供する。
相補性の領域:
本明細書に使用されるとき、用語「相補性の領域」は、2つのヌクレオチド配列が生理学的な条件下(例として、細胞中)相互にアニーリングすることが可能であるような、同族の(cognate)ヌクレオチド配列(例として、標的核酸のヌクレオチド配列)に充分に相補的であるヌクレオチド配列(例として、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列)を指す。いくつかの態様において、相補性の領域は、標的核酸の同族のヌクレオチド配列に完全に相補的である。しかしながら、いくつかの態様において、相補性の領域は、標的核酸の同族のヌクレオチド配列に部分的に相補的(例として、少なくとも80％、90％、95％、または99％相補性)である。いくつかの態様において、相補性の領域は、標的核酸の同族のヌクレオチド配列と比較して1、2、3、または4つのミスマッチを含有する。
特異的に結合する:
本明細書に使用されるとき、用語「特異的に結合する」は、結合アッセイまたは他の結合に関する文脈(binding context)において、分子が、適切な対照から結合パートナーを区別するために使用され得る親和性または結合活性の程度での、分子の、結合パートナーへの結合能を指す。抗体に関し、用語「特異的に結合する」は、親和性または結合活性の程度で(例として、本明細書に記載のとおり、抗原への結合を通してある細胞(例として、筋細胞)への優先的な標的化を許容する程度で)、適切な参照抗原、または抗体が他の抗原から特定の抗原を区別するために使用され得る抗原と比較して、抗体が特定の抗原へ結合する能力を指す。いくつかの態様において、抗体が標的へ結合する際少なくとも約10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、またはこれ未満のKDを有する場合、抗体は標的へ特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体が、トランスフェリン受容体、例として、トランスフェリン受容体の先端ドメインのエピトープへ特異的に結合する。
対象:
本明細書に使用されるとき、用語「対象」は、哺乳動物を指す。いくつかの態様において、対象は、霊長目の非ヒト動物または齧歯類動物である。いくつかの態様において、対象は、ヒトである。いくつかの態様において、対象は、疾患を有するかまたは疾患を有すると疑われる患者/患畜(patient)、例として、ヒト患者である。いくつかの態様において、対象は、FSHDを有するかまたはこれを有すると疑われるヒト患者である。
トランスフェリン受容体:
本明細書に使用されるとき、用語「トランスフェリン受容体」(またTFRC、CD71、p90、TFR、またはTFR1としても知られている)は、エンドサイトーシスによる鉄取り込みを容易にするためのトランスフェリンへ結合する、内在化する細胞表面受容体を指す。いくつかの態様において、トランスフェリン受容体は、ヒト(NCBI Gene ID 7037)、霊長目の非ヒト動物(例として、NCBI Gene ID 711568もしくはNCBI Gene ID 102136007)、または齧歯類の動物(例として、NCBI Gene ID 22042)を起源としていてもよい。加えて、受容体の種々のアイソフォームをコードした複数のヒト転写産物バリアントが(例として、GenBank RefSeq受託番号:NP_001121620.1、NP_003225.2、NP_001300894.1、およびNP_001300895.1の注釈付きのものであるように)特徴付けられている。
2'修飾ヌクレオシド:
本明細書に使用されるとき、用語「2'修飾ヌクレオシド」および「2'修飾リボヌクレオシド」は互換的に使用され、2'位にて修飾された糖部分を有するヌクレオシドを指す。いくつかの態様において、2'修飾ヌクレオシドは、2'-4'二環式ヌクレオシドであり、ここで糖の2'および4'位は架橋されている(例として、メチレン、エチレン、または(S)-拘束エチル架橋による)。いくつかの態様において、2'修飾ヌクレオシドは非二環式2'修飾ヌクレオシドであり、例えばここで糖部分の2'位は置換されている。2'修飾ヌクレオシドの非限定例は、以下:2'デオキシ、2'-フルオロ(2'-F)、2'-O-メチル(2'-O-Me)、2'-O-メトキシエチル(2'-MOE)、2'-O-アミノプロピル(2'-O-AP)、2'-O-ジメチルアミノエチル(2'-O-DMAOE)、2'-O-ジメチルアミノプロピル(2'-O-DMAP)、2'-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2'-O-DMAEOE)、2'-O-N-メチルアセトアミド(2'-O-NMA)、ロックド核酸(LNA、メチレン架橋核酸)、エチレン架橋核酸(ENA)、および(S)-拘束エチル架橋核酸(cEt)を包含する。いくつかの態様において、本明細書に記載の2'修飾ヌクレオシドは高親和性修飾ヌクレオシドであり、2'修飾ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドは、未修飾のオリゴヌクレオチドと比べて標的配列に対する増大した親和性を有する。2'修飾ヌクレオシドの構造の例は、下に提供される:
これらの例は、ホスファート基で示されているが、いずれのヌクレオシド間連結も、2'-修飾ヌクレオシド間に企図される。
II．複合体
本明細書に提供されるのは、標的化剤、例として、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗体を含む複合体である。いくつかの態様において、複合体は、オリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結された筋標的化抗体を含む。複合体は、単一の抗原部位に特異的に結合する抗体、または同じ抗原上もしくは異なる抗原上に存在していてもよい少なくとも2つの抗原部位へ結合する抗体を含んでいてもよい。
複合体は、少なくとも1つの遺伝子、タンパク質、および/または(例として、および)、核酸の活性あるいは機能をモジュレートするために使用されてもよい。いくつかの態様において、複合体とともに存在する分子ペイロードは、遺伝子、タンパク質、および/または(例として、および)、核酸のモジュレーションを担う。分子ペイロードは、細胞中の遺伝子、タンパク質、および/または(例として、および)、核酸の活性あるいは機能をモジュレートすることが可能な、小分子、タンパク質、核酸、オリゴヌクレオチド、あるいはいずれの分子実体であってもよい。いくつかの態様において、分子ペイロードは、筋細胞におけるDUX4を標的にするオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、複合体は、分子ペイロード(例として、DUX4を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチド)へ共有結合的に連結された、筋標的化剤(例として、抗トランスフェリン受容体抗体)を含む。
Ａ．筋標的化剤
本開示のいくつかの側面は、筋標的化剤、例として、分子ペイロードを筋細胞へ送達するための筋標的化剤を提供する。いくつかの態様において、かかる筋標的化剤は、例として、筋細胞上の抗原への特異的な結合を介して、筋細胞へ結合すること、および結び付けられた分子ペイロードを筋細胞へ送達することが可能である。いくつかの態様において、分子ペイロードは、筋標的化剤へ結合されて(例として、共有結合的に結合されて)おり、筋標的化剤が筋細胞上の抗原へ結合した際、例としてエンドサイトーシスを介して、筋細胞中へ内在化される。様々なタイプの筋標的化剤が本開示に従って使用されてもよいことは解されるはずである。また、いずれの筋標的(例として、筋表面タンパク質)も、本明細書に記載の筋標的化剤のいずれのタイプによっても標的にされ得ることも解されるはずである。例えば、筋標的化剤は、核酸(例として、DNAまたはRNA)、ペプチド(例として、抗体)、脂質(例として、マイクロベシクル)、または糖部(例として、多糖類)を含んでいてもよく、またはこれらからなっていてもよい。いくつかの態様において、筋標的化剤は、小分子を含むか、または小分子からなることもある。例示の筋標的化剤は本明細書中さらに詳細に記載されているが、しかしながら、本明細書に提供される例示の筋標的化剤が限定されることを意図していないことは解されるはずである。
本開示のいくつかの側面は、骨格筋、平滑筋、または心筋などの筋肉上の抗原へ特異的に結合する筋標的化剤を提供する。いくつかの態様において、本明細書に提供される筋標的化剤のいずれも、骨格筋細胞、平滑筋細胞、および/または(例として、および)、心筋細胞上の抗原へ結合する(例として、特異的に結合する)。
筋肉特異的細胞表面認識要素(例として、細胞膜タンパク質)との相互作用によって、組織局在化と筋細胞への選択的取り込みとの両方が達成され得る。いくつかの態様において、筋肉の取り込みトランスポーターの基質である分子は、分子ペイロードを筋組織中へ送達するのに有用である。筋肉表面認識要素への結合、これに続くエンドサイトーシスは、抗体などの巨大分子さえも筋細胞へ侵入できるようにし得る。別の例として、トランスフェリンまたは抗トランスフェリン受容体抗体へ抱合された分子ペイロードは、トランスフェリン受容体への結合を介し筋細胞によって取り入れられ得、次いで、例としてクラスリン媒介エンドサイトーシスを介し、形質膜陥入され(endocytosed)てもよい。
筋標的化剤の使用は、他の組織において効果に関連する毒性を低減しつつ、筋肉中の分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド)を濃縮するのに有用なこともある。いくつかの態様において、筋標的化剤は、対象内の別の細胞型と比較したとき、筋細胞中の結合された分子ペイロードを濃縮させる。いくつかの態様において、筋標的化剤は、筋細胞(例として、骨格筋細胞、平滑筋細胞、または心筋細胞)中の結合された分子ペイロードを、非筋細胞(例として、肝臓細胞、神経細胞、血液細胞、または脂肪細胞)中の量より少なくとも1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、または100倍多い量で濃縮する。いくつかの態様において、筋標的化剤へ結合された場合の分子ペイロードの対象における毒性は、これが対象へ送達されたとき、少なくとも1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％、または95％低減される。
いくつかの態様において、筋肉選択性を獲得するために、筋肉認識要素(例として、筋細胞抗原)が要されることもある。一例として、筋標的化剤は、筋肉特異的取り込みトランスポーターの基質である小分子であってもよい。別の例として、筋標的化剤は、トランスポーター媒介エンドサイトーシスを介して筋細胞へ侵入する抗体であってもよい。別の例として、筋標的化剤は、筋細胞上の細胞表面受容体へ結合するリガンドであってもよい。トランスポーターをベースとしたアプローチが細胞侵入への直通路を提供するのに対し、受容体をベースとした標的化が所望の作用部位に達するために刺激されたエンドサイトーシスを伴うこともあることは解されるはずである。
ｉ．筋標的抗体
いくつかの態様において、筋標的化剤は抗体である。一般に、それらの標的抗原に対する抗体の高い特異性は、筋細胞(例として、骨格筋細胞、平滑筋細胞、および/または(例として、および)、心筋細胞)を選択的に標的にする潜在力を提供する。この特異性はまた、オフターゲット毒性(off-target toxicity)を限定することもある。筋細胞の表面抗原を標的にすることが可能である抗体の例は報告されており、かつ本開示の範囲内にある。例えば、筋細胞の表面を標的にする抗体は、Arahata K.,et al."Immunostaining of skeletal and cardiac muscle surface membrane with antibody against Duchenne muscular dystrophy peptide"Nature 1988;333:861-3;Song K.S.,et al."Expression of caveolin-3 in skeletal,cardiac,and smooth muscle cells.Caveolin-3 is a component of the sarcolemma and co-fractionates with dystrophin and dystrophin-associated glycoproteins"J Biol Chem 1996;271:15160-5;およびWeisbart R.H.et al.,"Cell type specific targeted intracellular delivery into muscle of a monoclonal antibody that binds myosin IIb"Mol Immunol.2003 Mar,39(13):783-9に記載されている;これら各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
ａ．抗トランスフェリン受容体(TfR)抗体
本開示のいくつかの側面は、トランスフェリン受容体、例として抗トランスフェリン受容体抗体へ結合する剤は筋細胞を標的にすることが可能であるという認識に基づく。トランスフェリン受容体は、細胞膜を越えてトランスフェリンを輸送し細胞内鉄レベルの調節およびホメオスタシスに加わる内在化する細胞表面受容体である。本開示のいくつかの側面は、トランスフェリン受容体へ結合することが可能なトランスフェリン受容体結合タンパク質を提供する。結果的に、本開示の側面は、トランスフェリン受容体へ結合する結合タンパク質(例として、抗体)を提供する。いくつかの態様において、トランスフェリン受容体へ結合する結合タンパク質は、結合されたいずれの分子ペイロードと共に、筋細胞中へ内在化される。本明細書に使用されるとき、トランスフェリン受容体へ結合する抗体は、トランスフェリン受容体抗体、抗トランスフェリン受容体抗体、または抗TfR抗体と互換的に称されることもある。トランスフェリン受容体へ結合する、例として特異的に結合する抗体は、トランスフェリン受容体へ結合した際、例として受容体媒介エンドサイトーシスを通して、細胞中へ内在化されてもよい。
抗TfR抗体が、知られている数種の方法論、例としてファージディスプレーを使用するライブラリ設計を使用して、産生、合成、および/または(例として、および)、誘導体化されてもよいことは解されるはずである。例示の方法論は当該技術分野において特徴付けられており、参照により組み込まれる(Diez,P.et al."High-throughput phage-display screening in array format",Enzyme and microbial technology,2015,79,34-41.;Christoph M.H. and Stanley,J.R."Antibody Phage Display:Technique and Applications"J Invest Dermatol.2014,134:2.;Engleman,Edgar(Ed.)"Human Hybridomas and Monoclonal Antibodies."1985,Springer)。他の態様において、抗TfR抗体はこれまでに特徴付けられているかまたは開示されている。トランスフェリン受容体へ特異的に結合する抗体は当該技術分野において知られている(例として、米国特許第4,364,934号、12/4/1979出願、"Monoclonal antibody to a human early thymocyte antigen and methods for preparing same";米国特許第8,409,573号、6/14/2006出願、"Anti-CD71 monoclonal antibodies and uses thereof for treating malignant tumor cells";米国特許第9,708,406号、5/20/2014出願、"Anti-transferrin receptor antibodies and methods of use";米国特許第9,611,323号、12/19/2014出願、"Low affinity blood brain barrier receptor antibodies and uses therefor";WO 2015/098989、12/24/2014出願、"Novel anti-Transferrin receptor antibody that passes through blood-brain barrier";Schneider C.et al."Structural features of the cell surface receptor for transferrin that is recognized by the monoclonal antibody OKT9."J Biol Chem.1982,257:14,8516-8522.;Lee et al."Targeting Rat Anti-Mouse Transferrin Receptor Monoclonal Antibodies through Blood-Brain Barrier in Mouse"2000,J Pharmacol.Exp.Ther.,292:1048-1052を見よ)。
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体は、高い特異性および親和性でトランスフェリン受容体に結合する。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体は、トランスフェリン受容体のいずれかの細胞外エピトープまたは抗体に対して暴露されるようになるエピトープに特異的に結合する。いくつかの態様において、本明細書に提供される抗TfR抗体はヒト、霊長目の非ヒト動物、マウス、ラットなどからのトランスフェリン受容体に特異的に結合する。いくつかの態様において、本明細書に提供される抗TfR抗体はヒトトランスフェリン受容体に結合する。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体は、配列番号105～108で提供されるヒトまたは霊長目の非ヒト動物トランスフェリン受容体のアミノ酸セグメントに結合する。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体は、トランスフェリン受容体の頂点ドメインにはない、配列番号105で表されるとおりのヒトトランスフェリン受容体のアミノ酸90～96に対応するアミノ酸セグメントに結合する。
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体(例として、下の表2中の抗TfRクローン8)は、TfR1中のエピトープに結合するが、ここでエピトープは、配列番号105のアミノ酸214～241および/またはアミノ酸354～381における残基を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、配列番号105のアミノ酸214～241およびアミノ酸354～381における残基を含むエピトープに結合する。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、配列番号105で表されるとおりのヒトTfR1の残基Y222、T227、K231、H234、T367、S368、S370、T376、およびS378の1以上を含むエピトープに結合する。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、配列番号105で表されるとおりのヒトTfR1の残基Y222、T227、K231、H234、T367、S368、S370、T376、およびS378を含むエピトープに結合する。
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体(例として、下の表2中の3M12およびそのバリアント)は、TfR1中のエピトープに結合するが、ここでエピトープは、配列番号105のアミノ酸258～291および/またはアミノ酸358～381における残基を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体(例として、下の表2中の3M12およびそのバリアント)は、配列番号105のアミノ酸258～291およびアミノ酸358～381のアミノ酸における残基を含むエピトープに結合する。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体(例として、下の表2中の3M12およびそのバリアント)は、配列番号105で表されるとおりのヒトTfR1の残基K261、S273、Y282、T362、S368、S370、およびK371の1以上を含むエピトープに結合する。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体(例として、下の表2中の3M12およびそのバリアント)は、配列番号105で表されるとおりのヒトTfR1の残基K261、S273、Y282、T362、S368、S370、およびK371を含むエピトープに結合する。
NCBI配列NP_003225.2(トランスフェリン受容体タンパク質1アイソフォーム1、homo sapiens)に対応するヒトトランスフェリン受容体アミノ酸配列の例は、以下のとおりである:
MMDQARSAFSNLFGGEPLSYTRFSLARQVDGDNSHVEMKLAVDEEENADNNTKANVTKPKRCSGSICYGTIAVIVFFLIGFMIGYLGYCKGVEPKTECERLAGTESPVREEPGEDFPAARRLYWDDLKRKLSEKLDSTDFTGTIKLLNENSYVPREAGSQKDENLALYVENQFREFKLSKVWRDQHFVKIQVKDSAQNSVIIVDKNGRLVYLVENPGGYVAYSKAATVTGKLVHANFGTKKDFEDLYTPVNGSIVIVRAGKITFAEKVANAESLNAIGVLIYMDQTKFPIVNAELSFFGHAHLGTGDPYTPGFPSFNHTQFPPSRSSGLPNIPVQTISRAAAEKLFGNMEGDCPSDWKTDSTCRMVTSESKNVKLTVSNVLKEIKILNIFGVIKGFVEPDHYVVVGAQRDAWGPGAAKSGVGTALLLKLAQMFSDMVLKDGFQPSRSIIFASWSAGDFGSVGATEWLEGYLSSLHLKAFTYINLDKAVLGTSNFKVSASPLLYTLIEKTMQNVKHPVTGQFLYQDSNWASKVEKLTLDNAAFPFLAYSGIPAVSFCFCEDTDYPYLGTTMDTYKELIERIPELNKVARAAAEVAGQFVIKLTHDVELNLDYERYNSQLLSFVRDLNQYRADIKEMGLSLQWLYSARGDFFRATSRLTTDFGNAEKTDRFVMKKLNDRVMRVEYHFLSPYVSPKESPFRHVFWGSGSHTLPALLENLKLRKQNNGAFNETLFRNQLALATWTIQGAANALSGDVWDIDNEF(配列番号105)。
NCBI配列NP_001244232.1(トランスフェリン受容体タンパク質1、Macaca mulatta)に対応する、霊長目の非ヒト動物トランスフェリン受容体アミノ酸配列の例は、以下のとおりである:
MMDQARSAFSNLFGGEPLSYTRFSLARQVDGDNSHVEMKLGVDEEENTDNNTKPNGTKPKRCGGNICYGTIAVIIFFLIGFMIGYLGYCKGVEPKTECERLAGTESPAREEPEEDFPAAPRLYWDDLKRKLSEKLDTTDFTSTIKLLNENLYVPREAGSQKDENLALYIENQFREFKLSKVWRDQHFVKIQVKDSAQNSVIIVDKNGGLVYLVENPGGYVAYSKAATVTGKLVHANFGTKKDFEDLDSPVNGSIVIVRAGKITFAEKVANAESLNAIGVLIYMDQTKFPIVKADLSFFGHAHLGTGDPYTPGFPSFNHTQFPPSQSSGLPNIPVQTISRAAAEKLFGNMEGDCPSDWKTDSTCKMVTSENKSVKLTVSNVLKETKILNIFGVIKGFVEPDHYVVVGAQRDAWGPGAAKSSVGTALLLKLAQMFSDMVLKDGFQPSRSIIFASWSAGDFGSVGATEWLEGYLSSLHLKAFTYINLDKAVLGTSNFKVSASPLLYTLIEKTMQDVKHPVTGRSLYQDSNWASKVEKLTLDNAAFPFLAYSGIPAVSFCFCEDTDYPYLGTTMDTYKELVERIPELNKVARAAAEVAGQFVIKLTHDTELNLDYERYNSQLLLFLRDLNQYRADVKEMGLSLQWLYSARGDFFRATSRLTTDFRNAEKRDKFVMKKLNDRVMRVEYYFLSPYVSPKESPFRHVFWGSGSHTLSALLESLKLRRQNNSAFNETLFRNQLALATWTIQGAANALSGDVWDIDNEF(配列番号106)。
NCBI配列XP_005545315.1(トランスフェリン受容体タンパク質1、Macaca fascicularis)に対応する、霊長目の非ヒト動物トランスフェリン受容体アミノ酸配列の例は、以下のとおりである:
MMDQARSAFSNLFGGEPLSYTRFSLARQVDGDNSHVEMKLGVDEEENTDNNTKANGTKPKRCGGNICYGTIAVIIFFLIGFMIGYLGYCKGVEPKTECERLAGTESPAREEPEEDFPAAPRLYWDDLKRKLSEKLDTTDFTSTIKLLNENLYVPREAGSQKDENLALYIENQFREFKLSKVWRDQHFVKIQVKDSAQNSVIIVDKNGGLVYLVENPGGYVAYSKAATVTGKLVHANFGTKKDFEDLDSPVNGSIVIVRAGKITFAEKVANAESLNAIGVLIYMDQTKFPIVKADLSFFGHAHLGTGDPYTPGFPSFNHTQFPPSQSSGLPNIPVQTISRAAAEKLFGNMEGDCPSDWKTDSTCKMVTSENKSVKLTVSNVLKETKILNIFGVIKGFVEPDHYVVVGAQRDAWGPGAAKSSVGTALLLKLAQMFSDMVLKDGFQPSRSIIFASWSAGDFGSVGATEWLEGYLSSLHLKAFTYINLDKAVLGTSNFKVSASPLLYTLIEKTMQDVKHPVTGRSLYQDSNWASKVEKLTLDNAAFPFLAYSGIPAVSFCFCEDTDYPYLGTTMDTYKELVERIPELNKVARAAAEVAGQFVIKLTHDTELNLDYERYNSQLLLFLRDLNQYRADVKEMGLSLQWLYSARGDFFRATSRLTTDFRNAEKRDKFVMKKLNDRVMRVEYYFLSPYVSPKESPFRHVFWGSGSHTLSALLESLKLRRQNNSAFNETLFRNQLALATWTIQGAANALSGDVWDIDNEF(配列番号107)。
NCBI配列NP_001344227.1(トランスフェリン受容体タンパク質1、Mus musculus)に対応する、マウストランスフェリン受容体アミノ酸配列の例は、以下のとおりである:
MMDQARSAFSNLFGGEPLSYTRFSLARQVDGDNSHVEMKLAADEEENADNNMKASVRKPKRFNGRLCFAAIALVIFFLIGFMSGYLGYCKRVEQKEECVKLAETEETDKSETMETEDVPTSSRLYWADLKTLLSEKLNSIEFADTIKQLSQNTYTPREAGSQKDESLAYYIENQFHEFKFSKVWRDEHYVKIQVKSSIGQNMVTIVQSNGNLDPVESPEGYVAFSKPTEVSGKLVHANFGTKKDFEELSYSVNGSLVIVRAGEITFAEKVANAQSFNAIGVLIYMDKNKFPVVEADLALFGHAHLGTGDPYTPGFPSFNHTQFPPSQSSGLPNIPVQTISRAAAEKLFGKMEGSCPARWNIDSSCKLELSQNQNVKLIVKNVLKERRILNIFGVIKGYEEPDRYVVVGAQRDALGAGVAAKSSVGTGLLLKLAQVFSDMISKDGFRPSRSIIFASWTAGDFGAVGATEWLEGYLSSLHLKAFTYINLDKVVLGTSNFKVSASPLLYTLMGKIMQDVKHPVDGKSLYRDSNWISKVEKLSFDNAAYPFLAYSGIPAVSFCFCEDADYPYLGTRLDTYEALTQKVPQLNQMVRTAAEVAGQLIIKLTHDVELNLDYEMYNSKLLSFMKDLNQFKTDIRDMGLSLQWLYSARGDYFRATSRLTTDFHNAEKTNRFVMREINDRIMKVEYHFLSPYVSPRESPFRHIFWGSGSHTLSALVENLKLRQKNITAFNETLFRNQLALATWTIQGVANALSGDIWNIDNEF(配列番号108)。
いくつかの態様において、抗TfR抗体は、以下のとおりの受容体のアミノ酸セグメント:FVKIQVKDSAQNSVIIVDKNGRLVYLVENPGGYVAYSKAATVTGKLVHANFGTKKDFEDLYTPVNGSIVIVRAGKITFAEKVANAESLNAIGVLIYMDQTKFPIVNAELSFFGHAHLGTGDPYTPGFPSFNHTQFPPSRSSGLPNIPVQTISRAAAEKLFGNMEGDCPSDWKTDSTCRMVTSESKNVKLTVSNVLKE(配列番号109)へ結合し、トランスフェリン受容体とトランスフェリンおよび/または(例として、および)ヒトヘモクロマトーシスタンパク質(またHFEとしても知られている)との間の結合相互作用を阻害しない。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体は、配列番号109のエピトープには結合しない。
適切な方法論は、例として、組換えDNAプロトコルの使用を通じて、抗体、抗体フラグメント、もしくは抗原結合剤を得るか、および/または(例として、および)、産生するために使用されてもよい。いくつかの態様において、抗体はまた、ハイブリドーマの生成を通しても産生されてよい(例として、Kohler, G and Milstein,C."Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity"Nature,1975,256:495-497を見よ)。関心のある抗原は、いずれの型または実体の、例として、組換え型もしくは天然に存在する型または実体の免疫原として使用されてもよい。ハイブリドーマは、標準的な方法、例としてELISAスクリーニングを使用してスクリーニングされることで、具体的な抗原を標的にする抗体を産生する少なくとも1つのハイブリドーマが見出される。抗体はまた、抗体を発現するタンパク質発現ライブラリ(例として、ファージディスプレーライブラリ)のスクリーニングを通しても産生されてよい。ファージディスプレーライブラリ設計はまた、いくつかの態様において使用されてもよい(例として、米国特許第5,223,409号、3/1/1991出願、"Directed evolution of novel binding proteins";WO 1992/18619、4/10/1992出願、"Heterodimeric receptor libraries using phagemids";WO 1991/17271、5/1/1991出願、"Recombinant library screening methods";WO 1992/20791、5/15/1992出願、"Methods for producing members of specific binding pairs";およびWO 1992/15679、2/28/1992出願、"Improved epitope displaying phage"を見よ)。いくつかの態様において、関心のある抗原は、非ヒト動物、例として、齧歯類の動物またはヤギを免疫するために使用されてもよい。いくつかの態様において、次いで抗体が非ヒト動物から得られたら、任意に数多の方法論を使用し、例として組換えDNA技法を使用し、修飾してもよい。抗体産生および方法論の追加の例も当該技術分野において知られている(例として、Harlow et al."Antibodies:A Laboratory Manual",Cold Spring Harbor Laboratory,1988を見よ)。
いくつかの態様において、抗体は修飾されている(例として、グリコシル化、リン酸化、SUMO化、および/または(例として、および)、メチル化を介して修飾されている)。いくつかの態様において、抗体は、1以上の糖または炭水化物分子へ抱合されたグリコシル化抗体である。いくつかの態様において、1以上の糖または炭水化物分子は、N-グリコシル化、O-グリコシル化、C-グリコシル化、グリピエーション(GPIアンカー付着)、および/または(例として、および)、ホスホグリコシル化を介して、抗体へ抱合されている。いくつかの態様において、1以上の糖または炭水化物分子は、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、またはグリカンである。いくつかの態様において、1以上の糖または炭水化物分子は、分枝オリゴ糖類または分枝グリカンである。いくつかの態様において、1以上の糖または炭水化物分子は、マンノース単位、グルコース単位、N-アセチルグルコサミン単位、N-アセチルガラクトサミン単位、ガラクトース単位、フコース単位、またはホスホ脂質単位を包含する。いくつかの態様において、糖分子は、約1～10、約1～5、約5～10、約1～4、約1～3、または約2つ存在する。いくつかの態様において、グリコシル化抗体は、全体的にまたは部分的にグリコシル化されている。いくつかの態様において、抗体は、化学反応によって、または酵素的な手段によってグリコシル化されている。いくつかの態様において、抗体は、in vitroでまたは細胞(任意にN-またはO-グリコシル化経路中の酵素(例として、グリコシルトランスフェラーゼ)を欠乏していてもよい)内部でグリコシル化される。いくつかの態様において、抗体は、"Modified antibody, antibody-conjugate and process for the preparation thereof"という表題の2014年5月1日に公開された国際特許出願刊行物WO2014065661に記載のとおりの糖または炭水化物分子で官能化されている。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、表2～7のいずれか1つから選択される抗TfR抗体のいずれか1つのVLドメインおよび/または(例として、および)VHドメインを含み、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、またはIgY免疫グロブリン分子、いずれかのクラス(例として、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2)、またはいずれかのサブクラス(例として、IgG2aおよびIgG2b)の免疫グロブリン分子の定常領域のアミノ酸配列を含む定常領域を含む。ヒト定常領域の非限定例は当該技術分野において記載されており、例として、上述のKabat E A et al.(1991)を見よ。
いくつかの態様において、トランスフェリン受容体に結合する薬剤、例として抗TfR抗体は、筋細胞を標的とすることができ、および/または(例として、および)血液脳関門を通過する薬剤の輸送を媒介する。トランスフェリン受容体は、細胞膜を越えてトランスフェリンを輸送し細胞内鉄レベルの調節およびホメオスタシスに加わる内在化する細胞表面受容体である。本開示のいくつかの側面は、トランスフェリン受容体へ結合することが可能なトランスフェリン受容体結合タンパク質を提供する。トランスフェリン受容体へ結合する、例として特異的に結合する抗体は、トランスフェリン受容体へ結合した際、例として受容体媒介エンドサイトーシスを通して、細胞中へ内在化されてもよい。
いくつかの側面では、トランスフェリン受容体に高い特異性および親和性で結合する抗体が本明細書で提供される。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体は、トランスフェリン受容体のいずれかの細胞外エピトープまたは抗体に対して暴露されるようになるエピトープに特異的に結合する。いくつかの態様において、本明細書に提供される抗TfR抗体はヒト、霊長目の非ヒト動物、マウス、ラットなどからのトランスフェリン受容体に特異的に結合する。いくつかの態様において、本明細書に提供される抗TfR抗体はヒトトランスフェリン受容体に結合する。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体は、配列番号105～108で提供されるヒトまたは霊長目の非ヒト動物トランスフェリン受容体のアミノ酸セグメントに結合する。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体は、トランスフェリン受容体の頂点ドメインにはない、配列番号105で表されるとおりのヒトトランスフェリン受容体のアミノ酸90～96に対応するアミノ酸セグメントに結合する。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体は、TfR1に結合するが、TfR2には結合しない。
いくつかの態様において、抗TFR抗体は、少なくとも約10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、またはより小さい結合親和性(例として、Kdによって指し示される)によってTfR1(例として、ヒトまたは霊長目の非ヒト動物TfR1)に特異的に結合する。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体はサブナノモル範囲のKDによってTfR1に結合する。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体はトランスフェリン受容体1(TfR1)に選択的に結合するが、トランスフェリン受容体2(TfR2)には結合しない。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体はヒトTfR1およびカニクイTfR1に結合するが(例として、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、またはより小さいKdによる)、マウスTfR1には結合しない。抗TfR抗体の親和性および結合動態は、バイオセンサ技術(例として、OCTETまたはBIACORE)を包含するがこれらに限定されないいずれか好適な方法を使用して試験され得る。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体のいずれか1つの結合は、TfR1へのトランスフェリン結合と競合も阻害もしない。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体のいずれか1つの結合は、TfR1に対するHFE-ベータ2-ミクログロブリン結合と競合も阻害もしない。
抗TfR抗体の非限定例が表2に提供される。
表2．抗TfR抗体の例
＊突然変異の位置は、突然変異を含有する夫々のVH配列のKabatナンバリングに従う。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、表2において提供される抗TfR抗体のいずれか1つのバリアントである。いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、表2において提供される抗TfR抗体のいずれか1つにおけるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3と同じであるCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含み、ヒト化重鎖可変領域および/または(例として、および)軽鎖可変領域を含む。
本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体のアミノ酸配列の例は表3に提供される。
表3．抗TfR抗体の可変領域
＊突然変異の位置は、突然変異を含有する夫々のVH配列のKabatナンバリングに従う。
＊＊Kabatナンバリング系に従うCDRは太字である。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、表3に提供される抗TfR抗体のいずれか1つのCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含むVHを含み、かつ表3に提供される夫々のVHと比較したときフレームワーク領域中に1以上の(例として、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上の)アミノ酸バリエーションを含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本開示の抗TfR抗体は、表3に提供される抗TfR抗体のいずれか1つのCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含むVLを含み、かつ表3に提供される夫々のVLと比較したときフレームワーク領域中に1以上の(例として、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上の)アミノ酸バリエーションを含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、表3に提供される抗TfR抗体のいずれか1つのCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含むVHを含み、かつ表3に提供される夫々のVHと比較したときフレームワーク領域中に少なくとも70％(例として、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％)同一のアミノ酸配列を含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本開示の抗TfR抗体は、表3に提供される抗TfR抗体のいずれか1つのCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含むVLを含み、かつ表3に提供される夫々のVLと比較したときフレームワーク領域中に少なくとも70％(例として、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％)同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、配列番号69のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号70のアミノ酸配列を含むVLを含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、配列番号71のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号70のアミノ酸配列を含むVLを含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、配列番号72のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号70のアミノ酸配列を含むVLを含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、配列番号73のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号74のアミノ酸配列を含むVLを含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、配列番号73のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号75のアミノ酸配列を含むVLを含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、配列番号76のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号74のアミノ酸配列を含むVLを含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、配列番号76のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号75のアミノ酸配列を含むVLを含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、配列番号77のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号78のアミノ酸配列を含むVLを含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、配列番号79のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号80のアミノ酸配列を含むVLを含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、配列番号77のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号80のアミノ酸配列を含むVLを含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、配列番号154のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号155のアミノ酸配列を含むVLを含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体は、完全長IgGであり、これはヒト抗体からの重鎖定常領域および軽鎖定常領域を包含し得る。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体のいずれかの重鎖は、重鎖定常領域(CH)またはそのある部分(例として、CH1、CH2、CH3、またはそれらの組み合わせ)を含み得る。重鎖定常領域は、いずれの好適な起源、例として、ヒト、マウス、ラット、またはウサギに属し得る。特定の一例において、重鎖定常領域は、ヒトIgG(ガンマ重鎖)、例として、IgG1、IgG2、またはIgG4からのものである。ヒトIgG1定常領域の例は、下に与えられる:
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号81)。
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体のいずれかの重鎖は、突然変異体ヒトIgG1定常領域を含む。例えば、ヒトIgG1のCH2ドメイン上のLALA突然変異の導入(ヒンジ下部残基Leu234 Leu235をAla234およびAla235によって置き換えるように突然変異させられたmAb b12に由来する突然変異体)は、Fcγ受容体結合を低減することが公知である(Bruhns,P.,et al.(2009)およびXu,D.et al.(2000))。突然変異体ヒトIgG1定常領域は下で提供される(突然変異は太字かつ下線付き):
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体のいずれかの軽鎖はさらに、軽鎖定常領域(CL)を含み得、これは当該技術分野において知られているいずれかのCLであり得る。いくつかの例において、CLは、カッパ軽鎖である。他の例において、CLは、ラムダ軽鎖である。いくつかの態様において、CLはカッパ軽鎖であって、その配列は下に与えられる:
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号83)。
他の抗体の重鎖および軽鎖定常領域は当該技術分野において周知であり、例として、IMGTデータベース(www.imgt.org)において、またはwww.vbase2.org/vbstat.php.にて提供されるものであるが、これらの両方とも参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体は、表3に列挙されるとおりのVHまたはそれらいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号81もしくは配列番号82と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％同一である重鎖定常領域を含む重鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体は、表3に列挙されるとおりのVHまたはそれらいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号81もしくは配列番号82と比較したときわずか25アミノ酸バリエーション(例として、わずか25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1アミノ酸バリエーション)を含有する重鎖定常領域を含む重鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体は、表3に列挙されるとおりのVHまたはそれらいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号81で表されるとおりの重鎖定常領域を含む重鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体は、表3に列挙されるとおりのVHまたはそれらいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号82で表されるとおりの重鎖定常領域を含む重鎖を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体は、表3に列挙されるとおりのVLまたはそれらいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号83と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％同一である軽鎖定常領域を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体は、表3に列挙されるとおりのVLまたはそれらいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号83と比較したとき25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有する軽鎖定常領域を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体は、表3に列挙されるとおりのVLまたはそれらいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号83で表されるとおりの軽鎖定常領域を含む軽鎖を含む。
記載される抗TfR抗体のIgG重鎖および軽鎖アミノ酸配列の例は、下の表4に提供される。
表4．抗TfR Fabsの例の重鎖および軽鎖配列
＊突然変異の位置は、突然変異を含有する夫々のVH配列のKabatナンバリングに従う。
＊＊Kabatナンバリング系に従うCDRは太字である;VH/VL配列は下線が付される。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、配列番号84、86、87、88、91、92、94、および156のいずれか1つに示される重鎖と比較したとき、25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有する重鎖を含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本開示の抗TfR抗体は、配列番号85、89、90、93、95、および157のいずれか1つに示される軽鎖と比較したとき、25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有する軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体は、配列番号84、86、87、88、91、92、94、および156のいずれか1つと少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本明細書に記載の抗TfR抗体は、配列番号85、89、90、93、95、および157のいずれか1つと少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体は、配列番号84、86、87、88、91、92、94、および156のいずれか1つのアミノ酸配列を含む重鎖を含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本明細書に記載の抗TfR抗体は、配列番号85、89、90、93、95、および157のいずれか1つのアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、配列番号84のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、配列番号86のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、配列番号87のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、配列番号88のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号89のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、配列番号88のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、配列番号91のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号89のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、配列番号91のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、配列番号92のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号93のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、配列番号94のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号95のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、配列番号92のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号95のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、配列番号156のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号157のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、抗TfR抗体は、無傷の抗体(全長抗体)のFabフラグメント、Fab'フラグメント、またはF(ab')2フラグメントである。無傷の抗体(全長抗体)の抗原結合フラグメントは定型的な方法によって(例として、組換えで、または全長IgGの重鎖定常領域をパパインなどの酵素を使用して消化することによって)調製され得る。例えば、F(ab')2フラグメントは抗体分子のペプシンまたはパパイン消化によって産生され得、FabフラグメントはF(ab')2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成され得る。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体のFabフラグメント上の重鎖定常領域は、以下:ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT(配列番号96)のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体は、表3に列挙されるとおりのVHまたはそれらいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号96と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％同一である重鎖定常領域を含む重鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体は、表3に列挙されるとおりのVHまたはそれらいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号96と比較したとき25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有する重鎖定常領域を含む重鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体は、表3に列挙されるとおりのVHまたはそれらいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号96で表されるとおりの重鎖定常領域を含む重鎖を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体は、表3に列挙されるとおりのVLまたはそれらいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号83と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％同一の軽鎖定常領域を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体は、表3に列挙されるとおりのVLまたはそれらいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号83と比較したとき25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有する軽鎖定常領域を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体は、表3に列挙されるとおりのVLまたはそれらいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号83で表される軽鎖定常領域を含む軽鎖を含む。
記載される抗TfR抗体のFab重鎖および軽鎖アミノ酸配列の例は、下の表5に提供される。
表5．抗TfR Fabsの例の重鎖および軽鎖配列
＊突然変異の位置は、突然変異を含有する夫々のVH配列のKabatナンバリングに従う。
＊＊Kabatナンバリング系に従うCDRは太字である;VH/VL配列は下線が付される。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、配列番号97～103、158、および159のいずれか1つで表されるとおりの重鎖と比較したとき、25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有する重鎖を含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本開示の抗TfR抗体は、配列番号85、89、90、93、95、および157のいずれか1つで表されるとおりの軽鎖と比較したとき25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有する軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体は、配列番号97～103、158、および159のいずれか1つと少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本明細書に記載の抗TfR抗体は、配列番号85、89、90、93、95、および157のいずれか1つと少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体は、配列番号97～103、158、および159のいずれか1つのアミノ酸配列を含む重鎖を含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本明細書に記載の抗TfR抗体は、配列番号85、89、90、93、95、および157のいずれか1つのアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、配列番号97のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、配列番号98のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、配列番号99のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、配列番号100のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号89のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、配列番号100のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、配列番号101のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号89のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、配列番号101のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、配列番号102のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号93のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、配列番号103のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号95のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、配列番号102のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号95のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、配列番号158のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号157のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、配列番号159のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号157のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
他の知られている抗TfR抗体
当該技術分野において知られているいずれか他の適切な抗TfR抗体は、本明細書に開示の複合体において筋標的化剤として使用され得る。知られている抗TfR抗体(関連する参考文献および結合エピトープを包含する)の例は、表6に列挙される。いくつかの態様において、抗TfR抗体は、本明細書に提供される抗TfR抗体、例として、表6に列挙される抗TfR抗体のいずれかの相補性決定領域(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3)を含む。
表6 - 関連する参考文献および結合エピトープ情報を包含する、抗TfR抗体クローンのリスト
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、表6から選択される抗TfR抗体のいずれか1つからのCDR-H(例として、CDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3)アミノ酸配列の1以上を包含する。いくつかの態様において、抗TfR抗体は、表6から選択される抗TfR抗体のいずれか1つについて提供されるとおりのCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を包含する。いくつかの態様において、抗トランスフェリン抗体は、表6から選択される抗TfR抗体のいずれか1つについて提供されるとおりのCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を包含する。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、表6から選択される抗TfR抗体のいずれか1つなどの、いずれかの抗TfR抗体の重鎖可変ドメインおよび/または(例として、および)軽鎖可変ドメインを包含するいずれかの抗体を包含する。いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、表6から選択される抗TfR抗体のいずれか1つなどのいずれかの抗TfR抗体の重鎖可変および軽鎖可変ペアを包含するいずれかの抗体を包含する。
本開示の側面は、本明細書に記載のもののいずれかと相同な重鎖可変(VH)および/または(例として、および)軽鎖可変(VL)ドメインアミノ酸配列を有する抗TfR抗体を提供する。いくつかの態様において、抗TfR抗体は、表6から選択される抗TfR抗体のいずれか1つなどのいずれかの抗TfR抗体の重鎖可変配列および/またはいずれかの軽鎖可変配列と少なくとも75％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一である重鎖可変配列または軽鎖可変配列を含む。いくつかの態様において、相同な重鎖可変および/または(例として、および)軽鎖可変アミノ酸配列は、本明細書に提供されるCDR配列のいずれかにおいては変動しない。例えば、いくつかの態様において、配列バリエーションの程度(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)は、本明細書に提供されるCDR配列のいずれかを排除する重鎖可変および/または(例として、および)軽鎖可変配列内において生起し得る。いくつかの態様において、本明細書に提供される抗TfR抗体のいずれかは、表6から選択される抗TfR抗体のいずれか1つなどのいずれかの抗TfR抗体のフレームワーク配列と少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％同一であるフレームワーク配列を含む重鎖可変配列および軽鎖可変配列を含む。
本開示に従い使用されてもよいトランスフェリン受容体抗体の例は、国際出願刊行物WO 2016/081643(参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。この抗体のアミノ酸配列は表7に提供される。
表7．知られている抗TfRの例の重鎖および軽鎖のCDR
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、表7に示されるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3と同じであるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本開示の抗TfR抗体は、表7に示されるCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3と同じであるCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体はCDR-L3を含むが、これは表7に示されるとおりのCDR-L3と比較したとき3以下のアミノ酸バリエーション(例として、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有する。いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、表7に示されるとおりのCDR-L3と比較したとき1アミノ酸バリエーションを含有するCDR-L3を含む。いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、QHFAGTPLT(配列番号126)(KabatおよびChothia定義系に従う)またはQHFAGTPL(配列番号127)(Contact定義系に従う)のCDR-L3を含む。いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、表7に示されるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3と同じであるCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、およびCDR-L2を含み、QHFAGTPLT(配列番号126)(KabatおよびChothia定義系に従う)またはQHFAGTPL(配列番号127)(Contact定義系に従う)のCDR-L3を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、表7に示されるとおりの重鎖CDRと、合わせて少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、または98％)同一である重鎖CDRを含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本開示の抗TfR抗体は、表7に示されるとおりの軽鎖CDRと、合わせて少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、または98％)同一である軽鎖CDRを含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、配列番号124のアミノ酸配列を含むVHを含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本開示の抗TfR抗体は、配列番号125のアミノ酸配列を含むVLを含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、配列番号128のアミノ酸配列を含むVHを含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本開示の抗TfR抗体は、配列番号129のアミノ酸配列を含むVLを含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、配列番号128で表されるとおりのVHと比較したとき、25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有するVHを含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本開示の抗TfR抗体は、配列番号129で表されるとおりのVLと比較したとき、15以下のアミノ酸バリエーション(例として、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有するVLを含む。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、ヒト抗体からの重鎖定常領域および軽鎖定常領域を包含し得る完全長IgG1抗体である。いくつかの態様において、本明細書に記載のとおりの抗TfR抗体のいずれの重鎖も、重鎖定常領域(CH)またはこの一部(例として、CH1、CH2、CH3、またはそれらの組み合わせ)を含んでいてもよい。重鎖定常領域は、いずれの好適な起源、例として、ヒト、マウス、ラット、またはウサギに属し得る。特定の一例において、重鎖定常領域は、ヒトIgG(ガンマ重鎖)、例として、IgG1、IgG2、またはIgG4からのものである。ヒトIgG1定常領域の例は、下に与えられる:
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号81)。
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体のいずれの軽鎖も、軽鎖定常領域(CL)をさらに含んでいてもよいが、これは当該技術分野において知られているいずれのCLでもあり得る。いくつかの例において、CLは、カッパ軽鎖である。他の例において、CLは、ラムダ軽鎖である。いくつかの態様において、CLはカッパ軽鎖であって、その配列は下に与えられる:
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号83)。
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体は、配列番号132のアミノ酸配列を含む重鎖を含むキメラ抗体である。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本明細書に記載の抗TfR抗体は、配列番号133のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体は、配列番号134のアミノ酸配列を含む重鎖を含む完全ヒト抗体である。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本明細書に記載の抗TfR抗体は、配列番号135のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、抗TfR抗体は、無傷の抗体(完全長抗体)の抗原結合性フラグメント(Fab)である。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR Fabは、配列番号136のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本明細書に記載の抗TfR Fabは、配列番号133のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR Fabは、配列番号137のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本明細書に記載の抗TfR Fabは、配列番号135のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
本明細書に記載の抗TfR抗体は、これらに限定されないが、無傷の(すなわち、完全長)抗体、それらの抗原結合性フラグメント(Fab、Fab'、F(ab')2、Fvなどの)、単一鎖抗体、二重特異性抗体、またはナノボディーを包含する、いずれの抗体の形態でもあり得る。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体は、scFvである。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体は、scFv-Fab(例として、一部の定常領域と縮合されたscFv)である。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体は、定常領域(例として、配列番号81で表されるとおりのヒトIgG1定常領域)と縮合されたscFvである。
いくつかの態様において、保存的突然変異は、例えば結晶構造に基づき決定されるとき、その残基が標的抗原(例として、トランスフェリン受容体)との相互作用に関与しそうにない位置にて、抗体配列(例として、CDRまたはフレームワーク配列)中へ導入され得る。いくつかの態様において、1、2以上の突然変異(例として、アミノ酸置換)は、血清半減期、補体結合、Fc受容体結合、および/または(例として、および)細胞への抗原依存的細胞傷害性などの、抗体の1以上の機能特性を変更させるために、本明細書に記載の筋標的化抗体のFc領域中(例として、Kabatナンバリング系(例として、KabatのEUインデックス)に従うナンバリングで、CH2ドメイン(ヒトIgG1の残基231～340)中、および/または(例として、および)CH3ドメイン(ヒトIgG1の残基341～447)中、および/または(例として、および)ヒンジ領域中)へ導入される。
いくつかの態様において、1、2以上の突然変異(例として、アミノ酸置換)は、ヒンジ領域中のシステイン残基の数が、例として米国特許第5,677,425号に記載のとおり変動(例として、増大または減少)され得るように、Fc領域(CH1ドメイン)のヒンジ領域中へ導入される。CH1ドメインのヒンジ領域中のシステイン残基の数は、例として、軽鎖および重鎖の会合(assembly)を容易にさせるため、または抗体の安定性を変更(例として、増大もしくは減少)するため、またはリンカー抱合を容易にさせるため、変更され得る。
いくつかの態様において、1、2以上の突然変異(例として、アミノ酸置換)は、抗体の、エフェクター細胞表面上のFc受容体(例として、活性化されたFc受容体)への親和性を増加または減少させるため、本明細書に記載の筋標的化抗体のFc領域中(例として、Kabatナンバリング系(例として、KabatのEUインデックス)に従うナンバリングで、CH2ドメイン(ヒトIgG1の残基231～340)中、および/または(例として、および)CH3ドメイン(ヒトIgG1の残基341～447)中、および/または(例として、および)ヒンジ領域中)へ導入される。抗体のFc受容体への親和性を増大または減少させる抗体のFc領域中の突然変異、およびかかる突然変異をFc受容体中またはそのフラグメント中へ導入するための技法は、当業者に知られている。抗体のFc受容体への親和性を変更するためになされ得る、抗体のFc受容体中の突然変異の例は、例として、Smith P et al.,(2012)PNAS 109:6181-6186、米国特許第6,737,056号、ならびに国際刊行物第WO 02/060919号;第WO 98/23289号;および第WO 97/34631号(これらは参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。
いくつかの態様において、1、2以上のアミノ酸突然変異(すなわち、置換、挿入、または欠失)は、in vivoでの抗体の半減期を変更(例として、増加または減少)させるため、IgG定常領域またはそのFcRn-結合フラグメント(好ましくは、Fcまたはヒンジ-Fcドメインフラグメント)中へ導入される。例えば、in vivoでの抗体の半減期を変更(例として、増加または減少)させるであろう突然変異について、例として、国際刊行物第WO 02/060919号;第WO 98/23289号;および第WO 97/34631号;ならびに米国特許第5,869,046号、第6,121,022号、第6,277,375号、および第6,165,745号を見よ。
いくつかの態様において、1、2以上のアミノ酸突然変異(すなわち、置換、挿入、または欠失)は、in vivoでの抗TfR抗体の半減期を減少させるため、IgG定常領域またはそのFcRn-結合フラグメント(好ましくは、Fcまたはヒンジ-Fcドメインフラグメント)中へ導入される。いくつかの態様において、1、2以上のアミノ酸突然変異(すなわち、置換、挿入、または欠失)は、in vivoでの抗体の半減期を増加させるため、IgG定常領域またはそのFcRn-結合フラグメント(好ましくは、Fcまたはヒンジ-Fcドメインフラグメント)中へ導入される。いくつかの態様において、抗体は、KabatのEUインデックス(上記のKabat E Aら(1991))に従うナンバリングで第2定常(CH2)ドメイン(ヒトIgG1の残基231～340)中および/または(例として、および)第3定常(CH3)ドメイン(ヒトIgG1の残基341～447)中に、1以上のアミノ酸突然変異(例として、置換)を有し得る。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体のIgG1定常領域は、KabatにあるようなEUインデックスに従ってナンバリングされた位置252におけるメチオニン(M)からチロシン(Y)への置換、位置254におけるセリン(S)からトレオニン(T)への置換、および位置256におけるトレオニン(T)からグルタミン酸(E)への置換を含む。米国特許第7,658,921(これは、参照により本明細書に組み込まれる)を見よ。「YTE突然変異体」と称されるこのタイプの突然変異IgGは、同じ抗体の野生型バージョンと比較したとき4倍増大した半減期を発揮したことが示されている(Dall'Acqua W F et al.,(2006)J Biol Chem 281:23514-24を見よ)。いくつかの態様において、抗体は、KabatにあるようなEUインデックスに従ってナンバリングされた位置251～257、285～290、308～314、385～389、および428～436でのアミノ酸残基の、1、2、3以上のアミノ酸置換を含むIgG定常領域を含む。
いくつかの態様において、1、2以上のアミノ酸置換は、抗TfR抗体のエフェクター機能(単数または複数)を変更するため、IgG定常領域Fc領域中へ導入される。自身への親和性が変更されたエフェクターリガンドは、例えば、Fc受容体または補体のC1構成要素であり得る。このアプローチは、米国特許第5,624,821号および第5,648,260号においてさらに詳細に記載される。いくつかの態様において、定常領域ドメインの欠失または不活化(点突然変異または他の手段を通して)は、循環抗体のFc受容体への結合を低減し、それによって腫瘍局在化を増大し得る。定常領域を欠失または不活化し、それによって腫瘍局在化を増大させる突然変異の記載については、例として、米国特許第5,585,097号および第8,591,886号を見よ。いくつかの態様において、1以上のアミノ酸置換は、Fc領域上の潜在的なグリコシル化部位を除去するため(これによってFc受容体への結合が低減されることもある)、本明細書に記載の抗体のFc領域中へ導入されてもよい(例として、Shields R L et al.,(2001)J Biol Chem 276:6591-604を見よ)。
いくつかの態様において、本明細書に記載の筋標的化抗体の定常領域中の1以上のアミノ酸残基は、抗体が変更されたClq結合および/または(例として、および)低減もしくは消失された補体依存性細胞傷害性(CDC)を有し得るように、異なるアミノ酸残基に置き換えられ得る。このアプローチは、米国特許第6,194,551号(Idusogieら)においてさらに詳細に記載されている。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体のCH2ドメインのN末領域中の1以上のアミノ酸残基は変更されて、それによって抗体の補体結合能を変更する。このアプローチは、国際刊行物第WO 94/29351号においてさらに記載されている。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体のFc領域は、抗体の、細胞への抗体依存性細胞傷害性(ADCC)の媒介能を増大させるため、および/または(例として、および)、抗体のFcγ受容体への親和性を増大させるため、修飾されている。このアプローチは、国際刊行物第WO 00/42072号においてさらに記載されている。
いくつかの態様において、本明細書に提供される抗体の重鎖および/または(例として、および)軽鎖可変ドメイン(単数または複数)配列(単数または複数)は、本明細書の他の箇所に記載されるとおり、例えば、CDR接合抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、もしくは複合ヒト抗体、または抗原結合性フラグメントを生成するために使用され得る。当業者によって理解されるとおり、本明細書に提供される抗体のいずれかに由来するいずれのバリアント、CDR接合抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または複合抗体は、本明細書に記載の組成物および方法に有用であってもよく、バリアント、CDR接合抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または複合抗体が、これが由来する元の抗体と比べて、トランスフェリン受容体への少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％以上の結合を有し得るように、トランスフェリン受容体への特異的結合能を維持するであろう。
いくつかの態様において、本明細書に提供される抗体は、所望の特性を抗体へ付与する突然変異を含む。例えば、ネイティブなIgG4 mAbに生じることが知られているFabアーム交換(Fab-arm exchange)に起因する潜在的合併症を回避するため、本明細書に提供される抗体は、安定化「Adair」突然変異を含んでいてもよく(Angal S.,et al.,"A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human (IgG4) antibody",Mol Immunol 30,105-108;1993)、ここでセリン228(EUナンバリング;残基241 Kabatナンバリング)は、IgG1様ヒンジ配列をもたらすプロリンへ変換されている。結果的に、抗体のいずれも、安定化「Adair」突然変異を包含していてもよい。
いくつかの態様において、抗体は修飾されている(例として、グリコシル化、リン酸化、SUMO化、および/または(例として、および)、メチル化を介して修飾されている)。いくつかの態様において、抗体は、1以上の糖または炭水化物分子へ抱合されたグリコシル化抗体である。いくつかの態様において、1以上の糖または炭水化物分子は、N-グリコシル化、O-グリコシル化、C-グリコシル化、グリピエーション(GPIアンカー付着)、および/または(例として、および)、ホスホグリコシル化を介して、抗体へ抱合されている。いくつかの態様において、1以上の糖または炭水化物分子は、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、またはグリカンである。いくつかの態様において、1以上の糖または炭水化物分子は、分枝オリゴ糖類または分枝グリカンである。いくつかの態様において、1以上の糖または炭水化物分子は、マンノース単位、グルコース単位、N-アセチルグルコサミン単位、N-アセチルガラクトサミン単位、ガラクトース単位、フコース単位、またはホスホ脂質単位を包含する。いくつかの態様において、糖分子は、約1～10、約1～5、約5～10、約1～4、約1～3、または約2つ存在する。いくつかの態様において、グリコシル化抗体は、全体的にまたは部分的にグリコシル化されている。いくつかの態様において、抗体は、化学反応によって、または酵素的な手段によってグリコシル化されている。いくつかの態様において、抗体は、in vitroでまたは細胞(任意にN-またはO-グリコシル化経路中の酵素(例として、グリコシルトランスフェラーゼ)を欠乏していてもよい)内部でグリコシル化される。いくつかの態様において、抗体は、"Modified antibody, antibody-conjugate and process for the preparation thereof"という表題の2014年5月1日に公開された国際特許出願刊行物WO2014065661に記載のとおりの糖または炭水化物分子で官能化されている。
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体のいずれか1つは、重鎖および/または(例として、および)軽鎖配列上にシグナルペプチド(例として、N末シグナルペプチド)を含み得る。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、VHおよびVL配列のいずれか1つ、IgG重鎖および軽鎖配列のいずれか1つ、または本明細書に記載のFab重鎖および軽鎖配列のいずれか1つを含み、さらにシグナルペプチド(例として、N末シグナルペプチド)を含む。いくつかの態様において、シグナルペプチドはMGWSCIILFLVATATGVHS(配列番号104)のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、本明細書に提供される抗体は、1以上の翻訳後修飾を有し得る。いくつかの態様においては、ピログルタミン酸形成(ピロGlu)ともまた呼ばれるN末環化が、産生の間にN末グルタミン酸(Glu)および/またはグルタミン(Gln)残基において抗体に生じ得る。したがって、N末グルタメートまたはグルタミン残基を含む配列を有すると特定される抗体は、翻訳後修飾に起因するピログルタメート形成を経た抗体を包含すると解されるべきである。いくつかの態様において、ピログルタミン酸形成は、重鎖配列に生じる。いくつかの態様において、ピログルタミン酸形成は軽鎖配列に生じる。
ｂ．他の筋標的抗体
いくつかの態様において、筋標的化抗体は、ヘモジュベリン(hemojuvelin)、カベオリン-3、デュシェンヌ型筋ジストロフィーペプチド、ミオシンIIb、またはCD63に特異的に結合する抗体である。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、筋原性前駆体タンパク質に特異的に結合する抗体である。例示の筋原性前駆体タンパク質は、限定せずに、ABCG2、M-カドヘリン/カドヘリン-15、カベオリン-1、CD34、FoxK1、インテグリンアルファ7、インテグリンアルファ7ベータ1、MYF-5、MyoD、ミオゲニン、NCAM-1/CD56、Pax3、Pax7、およびPax9を包含する。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、骨格筋タンパク質に特異的に結合する抗体である。例示の骨格筋タンパク質は、限定せずに、アルファ-サルコグリカン、ベータ-サルコグリカン、カルパインインヒビター、クレアチンキナーゼMM/CKMM、eIF5A、エノラーゼ2/ニューロン特異的エノラーゼ、イプシロン-サルコグリカン、FABP3/H-FABP、GDF-8/ミオスタチン、GDF-11/GDF-8、インテグリンアルファ7、インテグリンアルファ7ベータ1、インテグリンベータ1/CD29、MCAM/CD146、MyoD、ミオゲニン、ミオシン軽鎖キナーゼインヒビター、NCAM-1/CD56、およびトロポニンIを包含する。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、平滑筋タンパク質に特異的に結合する抗体である。例示の平滑筋タンパク質は、限定せずに、アルファ-平滑筋アクチン、VE-カドヘリン、カルデスモン/CALD1、カルポニン1、デスミン、ヒスタミンH2 R、モチリンR/GPR38、トランスジェリン(Transgelin)/TAGLN、およびビメンチンを包含する。しかしながら、追加の標的への抗体が本開示の範囲内であること、および本明細書に提供される標的の例示のリストが限定することを意図していないことは解されるはずである。
ｃ．抗体の特色/変更
いくつかの態様において、保存的突然変異は、例えば結晶構造に基づき決定されるとき、その残基が標的抗原(例として、トランスフェリン受容体)との相互作用に関与しそうにない位置にて、抗体配列(例として、CDRまたはフレームワーク配列)中へ導入され得る。いくつかの態様において、1、2以上の突然変異(例として、アミノ酸置換)は、血清半減期、補体結合、Fc受容体結合、および/または(例として、および)細胞への抗原依存的細胞傷害性などの、抗体の1以上の機能特性を変更させるために、本明細書に記載の筋標的化抗体のFc領域中(例として、Kabatナンバリング系(例として、KabatのEUインデックス)に従うナンバリングで、CH2ドメイン(ヒトIgG1の残基231～340)中、および/または(例として、および)CH3ドメイン(ヒトIgG1の残基341～447)中、および/または(例として、および)ヒンジ領域中)へ導入される。
いくつかの態様において、1、2以上の突然変異(例として、アミノ酸置換)は、ヒンジ領域中のシステイン残基の数が、例として米国特許第5,677,425号に記載のとおり変動(例として、増大または減少)され得るように、Fc領域(CH1ドメイン)のヒンジ領域中へ導入される。CH1ドメインのヒンジ領域中のシステイン残基の数は、例として、軽鎖および重鎖の会合(assembly)を容易にさせるため、または抗体の安定性を変更(例として、増大もしくは減少)するため、またはリンカー抱合を容易にさせるため、変更され得る。
いくつかの態様において、1、2以上の突然変異(例として、アミノ酸置換)は、抗体の、エフェクター細胞表面上のFc受容体(例として、活性化されたFc受容体)への親和性を増加または減少させるため、本明細書に記載の筋標的化抗体のFc領域中(例として、Kabatナンバリング系(例として、KabatのEUインデックス)に従うナンバリングで、CH2ドメイン(ヒトIgG1の残基231～340)中、および/または(例として、および)CH3ドメイン(ヒトIgG1の残基341～447)中、および/または(例として、および)ヒンジ領域中)へ導入される。抗体のFc受容体への親和性を増大または減少させる抗体のFc領域中の突然変異、およびかかる突然変異をFc受容体中またはそのフラグメント中へ導入するための技法は、当業者に知られている。抗体のFc受容体への親和性を変更するためになされ得る、抗体のFc受容体中の突然変異の例は、例として、Smith P et al.,(2012)PNAS 109:6181-6186、米国特許第6,737,056号、ならびに国際刊行物第WO 02/060919号;第WO 98/23289号;および第WO 97/34631号(これらは参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。
いくつかの態様において、1、2以上のアミノ酸突然変異(すなわち、置換、挿入、または欠失)は、in vivoでの抗体の半減期を変更(例として、増加または減少)させるため、IgG定常領域またはそのFcRn-結合フラグメント(好ましくは、Fcまたはヒンジ-Fcドメインフラグメント)中へ導入される。例えば、in vivoでの抗体の半減期を変更(例として、増加または減少)させるであろう突然変異について、例として、国際刊行物第WO 02/060919号;第WO 98/23289号;および第WO 97/34631号;ならびに米国特許第5,869,046号、第6,121,022号、第6,277,375号、および第6,165,745号を見よ。
いくつかの態様において、1、2以上のアミノ酸突然変異(すなわち、置換、挿入、または欠失)は、in vivoでの抗トランスフェリン受容体抗体の半減期を減少させるため、IgG定常領域またはそのFcRn-結合フラグメント(好ましくは、Fcまたはヒンジ-Fcドメインフラグメント)中へ導入される。いくつかの態様において、1、2以上のアミノ酸突然変異(すなわち、置換、挿入、または欠失)は、in vivoでの抗体の半減期を増加させるため、IgG定常領域またはそのFcRn-結合フラグメント(好ましくは、Fcまたはヒンジ-Fcドメインフラグメント)中へ導入される。いくつかの態様において、抗体は、KabatのEUインデックス(上記のKabat E Aら(1991))に従うナンバリングで第2定常(CH2)ドメイン(ヒトIgG1の残基231～340)中および/または(例として、および)第3定常(CH3)ドメイン(ヒトIgG1の残基341～447)中に、1以上のアミノ酸突然変異(例として、置換)を有し得る。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体のIgG1定常領域は、KabatにあるようなEUインデックスに従ってナンバリングされた位置252におけるメチオニン(M)からチロシン(Y)への置換、位置254におけるセリン(S)からトレオニン(T)への置換、および位置256におけるトレオニン(T)からグルタミン酸(E)への置換を含む。米国特許第7,658,921(これは、参照により本明細書に組み込まれる)を見よ。「YTE突然変異体」と称されるこのタイプの突然変異IgGは、同じ抗体の野生型バージョンと比較したとき4倍増大した半減期を発揮したことが示されている(Dall'Acqua W F et al.,(2006)J Biol Chem 281:23514-24を見よ)。いくつかの態様において、抗体は、KabatにあるようなEUインデックスに従ってナンバリングされた位置251～257、285～290、308～314、385～389、および428～436でのアミノ酸残基の、1、2、3以上のアミノ酸置換を含むIgG定常領域を含む。
いくつかの態様において、1、2以上のアミノ酸置換は、抗トランスフェリン受容体抗体のエフェクター機能(単数または複数)を変更するため、IgG定常領域Fc領域中へ導入される。自身への親和性が変更されたエフェクターリガンドは、例えば、Fc受容体または補体のC1構成要素であり得る。このアプローチは、米国特許第5,624,821号および第5,648,260号においてさらに詳細に記載される。いくつかの態様において、定常領域ドメインの欠失または不活化(点突然変異または他の手段を通して)は、循環抗体のFc受容体への結合を低減し、それによって腫瘍局在化を増大し得る。定常領域を欠失または不活化し、それによって腫瘍局在化を増大させる突然変異の記載については、例として、米国特許第5,585,097号および第8,591,886号を見よ。いくつかの態様において、1以上のアミノ酸置換は、Fc領域上の潜在的なグリコシル化部位を除去するため(これによってFc受容体への結合が低減されることもある)、本明細書に記載の抗体のFc領域中へ導入されてもよい(例として、Shields R L et al.,(2001)J Biol Chem 276:6591-604を見よ)。
いくつかの態様において、本明細書に記載の筋標的化抗体の定常領域中の1以上のアミノ酸残基は、抗体が変更されたClq結合および/または(例として、および)低減もしくは消失された補体依存性細胞傷害性(CDC)を有し得るように、異なるアミノ酸残基に置き換えられ得る。このアプローチは、米国特許第6,194,551号(Idusogieら)においてさらに詳細に記載されている。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体のCH2ドメインのN末領域中の1以上のアミノ酸残基は変更されて、それによって抗体の補体結合能を変更する。このアプローチは、国際刊行物第WO 94/29351号においてさらに記載されている。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体のFc領域は、抗体の、細胞への抗体依存性細胞傷害性(ADCC)の媒介能を増大させるため、および/または(例として、および)、抗体のFcγ受容体への親和性を増大させるため、修飾されている。このアプローチは、国際刊行物第WO 00/42072号においてさらに記載されている。
いくつかの態様において、本明細書に提供される抗体の重鎖および/または(例として、および)軽鎖可変ドメイン(単数または複数)配列(単数または複数)は、本明細書の他の箇所に記載されるとおり、例えば、CDR接合抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、もしくは複合ヒト抗体、または抗原結合性フラグメントを生成するために使用され得る。当業者によって理解されるとおり、本明細書に提供される抗体のいずれかに由来するいずれのバリアント、CDR接合抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または複合抗体は、本明細書に記載の組成物および方法に有用であってもよく、バリアント、CDR接合抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または複合抗体が、これが由来する元の抗体と比べて、トランスフェリン受容体への少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％以上の結合を有し得るように、トランスフェリン受容体への特異的結合能を維持するであろう。
いくつかの態様において、本明細書に提供される抗体は、所望の特性を抗体へ付与する突然変異を含む。例えば、ネイティブなIgG4 mAbに生じることが知られているFabアーム交換(Fab-arm exchange)に起因する潜在的合併症を回避するため、本明細書に提供される抗体は、安定化「Adair」突然変異を含んでいてもよく(Angal S.,et al.,"A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human (IgG4) antibody",Mol Immunol 30,105-108;1993)、ここでセリン228(EUナンバリング;残基241 Kabatナンバリング)は、IgG1様ヒンジ配列をもたらすプロリンへ変換されている。結果的に、抗体のいずれも、安定化「Adair」突然変異を包含していてもよい。
本明細書に提供されるとおり、本開示の抗体は、任意に、定常領域またはその一部を含んでいてもよい。例えば、VLドメインは、そのC末端にて、軽鎖定常領域様CκまたはCλへ付着されていてもよい。同様に、VHドメインまたはその一部は、すべてのまたは一部の重鎖様IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgM、およびいずれのアイソタイプのサブクラスへ付着されていてもよい。抗体は、好適な定常領域を包含していてもよい(例えば、Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,No.91-3242,National Institutes of Health Publications,Bethesda,Md.(1991)を見よ)。したがって、本開示の範囲内の抗体は、いずれの好適な定常領域と組み合わされて、VHおよびVLドメイン、またはその抗原結合部を包含していてもよい。
ii．筋標的化ペプチド
本開示のいくつかの側面は、筋標的化ペプチドを筋標的化剤として提供する。特定の細胞型へ結合する短いペプチド配列(例として、長さが5～20アミノ酸のペプチド配列)は記載されている。例えば、細胞標的化ペプチドは、Vines e.,et al.,A."Cell-penetrating and cell-targeting peptides in drug delivery"Biochim Biophys Acta 2008,1786:126-38;Jarver P.,et al.,"In vivo biodistribution and efficacy of peptide mediated delivery"Trends Pharmacol Sci 2010;31:528-35;Samoylova T.I.,et al.,"Elucidation of muscle-binding peptides by phage display screening"Muscle Nerve 1999;22:460-6;米国特許第6,329,501号、2001年12月11日発行、表題"METHODS AND COMPOSITIONS FOR TARGETING COMPOUNDS TO MUSCLE";およびSamoylov A.M.,et al.,"Recognition of cell-specific binding of phage display derived peptides using an acoustic wave sensor."Biomol Eng 2002;18:269-72に記載されている;これら各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。特定の細胞表面抗原(例として、受容体)と相互作用するようにペプチドを設計することによって、所望される組織、例として、筋肉への選択性が獲得され得る。骨格筋標的化が調査されており、広範な分子ペイロードが送達されることができる。巨大な抗体またはウイルス粒子についての実際上の不利な点の多くが存在しないこれらのアプローチは、筋組織への高選択性を有していてもよい。結果的に、いくつかの態様において、筋標的化剤は、長さが4アミノ酸から50アミノ酸までの筋標的化ペプチドである。いくつかの態様において、筋標的化ペプチドは、長さが4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50アミノ酸である。筋標的化ペプチドは、ファージディスプレーなどの数種の方法のいずれかを使用して生成され得る。
いくつかの態様において、筋標的化ペプチドは、他のある細胞と比較して、筋細胞において過剰発現されているかまたは相対的に高度に発現されている、内在化する細胞表面受容体(例として、トランスフェリン受容体)へ結合してもよい。いくつかの態様において、筋標的化ペプチドは、トランスフェリン受容体を標的にしてもよい(例として、トランスフェリン受容体へ結合してもよい)。いくつかの態様において、トランスフェリン受容体を標的にするペプチドは、天然に存在するリガンド、例として、トランスフェリンのセグメントを含んでいてもよい。いくつかの態様において、トランスフェリン受容体を標的にするペプチドは、米国特許第6,743,893号、11/30/2000出願、「RECEPTOR-MEDIATED UPTAKE OF PEPTIDES THAT BIND THE HUMAN TRANSFERRIN RECEPTOR」に記載のとおりである。いくつかの態様において、トランスフェリン受容体を標的にするペプチドは、Kawamoto,M.et al,"A novel transferrin receptor-targeted hybrid peptide disintegrates cancer cell membrane to induce rapid killing of cancer cells."BMC Cancer.2011 Aug 18;11:359に記載のとおりである。いくつかの態様において、トランスフェリン受容体を標的にするペプチドは、米国特許第8,399,653号、5/20/2011出願、「TRANSFERRIN/TRANSFERRIN RECEPTOR-MEDIATED SIRNA DELIVERY」に記載のとおりである。
上述のとおり、筋標的化ペプチドの例は報告されている。例えば、筋肉特異的ペプチドは、表面へプタペプチドを提示するファージディスプレーライブラリを使用して同定された。一例として、アミノ酸配列ASSLNIA(配列番号3071)を有するペプチドは、in vitroでC2C12マウス筋管へ結合し、かつin vivoでマウス筋組織へ結合した。結果的に、いくつかの態様において、筋標的化剤は、アミノ酸配列ASSLNIA(配列番号3071)を含む。このペプチドは、肝臓、腎臓、および脳への結合が低減された、マウスへの静脈内注射後の心筋組織および骨格筋組織への結合について改善された特異性を発揮した。追加の筋肉特異的ペプチドがファージディスプレーを使用して同定されている。例えば、DMDへの処置という文脈において、12アミノ酸ペプチドが、筋標的化のためのファージディスプレーライブラリによって同定された。Yoshida D.,et al.,"Targeting of salicylate to skin and muscle following topical injections in rats."Int J Pharm 2002;231:177-84を見よ;この内容全体はこれによって参照により組み込まれる。ここで、配列SKTFNTHPQSTP(配列番号3072)を有する12アミノ酸ペプチドが同定され、この筋標的化ペプチドは、ASSLNIA(配列番号3071)ペプチドと比べてC2C12細胞への改善された結合を示した。
他の細胞型より筋肉(例として、骨格筋)に対して選択的なペプチドを同定するためのいずれの追加の方法はin vitroでの選択を包含し、これはGhosh D.,et al.,"Selection of muscle-binding peptides from context-specific peptide-presenting phage libraries for adenoviral vector targeting"J Virol 2005;79:13667-72に記載されている;この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。ランダム12-merペプチドファージディスプレーライブラリを非筋細胞型の混合物とプレインキュベートすることによって、非特異的細胞バインダーが選出された。選択ラウンド(rounds of selection)を受けて、12アミノ酸ペプチドTARGEHKEEELI(配列番号3073)が最も頻繁に現れた。結果的に、いくつかの態様において、筋標的化剤は、アミノ酸配列TARGEHKEEELI(配列番号3073)を含む。
筋標的化剤は、アミノ酸含有分子またはペプチドであってもよい。筋標的化ペプチドは、筋細胞から見出されたタンパク質受容体へ優先的に結合するタンパク質の配列に対応していてもよい。いくつかの態様において、筋標的化ペプチドは、ペプチドが筋細胞を優先的に標的にし得るように、疎水性アミノ酸(例として、バリン)の性質(propensity)を高く含有する。いくつかの態様において、筋標的化ペプチドは、これまでに特徴付けも開示もされていない。これらのペプチドは、数種の方法論のいずれか、例として、ファージディスプレードペプチドライブラリ、1ビーズ・1化合物(one-bead one-compound)ペプチドライブラリ、または位置走査性(positional scanning)合成ペプチドコンビナトリアルライブラリを使用して、想起、産生、合成、および/または(例として、および)、誘導体化されてもよい。例示の方法論は当該技術分野において特徴付けされており、参照により組み込まれる(Gray,B.P.and Brown,K.C."Combinatorial Peptide Libraries:Mining for Cell-Binding Peptides"Chem Rev.2014,114:2,1020-1081.;Samoylova,T.I.and Smith,B.F."Elucidation of muscle-binding peptides by phage display screening."Muscle Nerve,1999,22:4.460-6)。いくつかの態様において、筋標的化ペプチドはこれまでに開示されている(例として、Writer M.J.et al."Targeted gene delivery to human airway epithelial cells with synthetic vectors incorporating novel targeting peptides selected by phage display."J.Drug Targeting.2004;12:185;Cai,D."BDNF-mediated enhancement of inflammation and injury in the aging heart."Physiol Genomics.2006,24:3,191-7.;Zhang,L."Molecular profiling of heart endothelial cells."Circulation,2005,112:11,1601-11.;McGuire,M.J.et al."In vitro selection of a peptide with high selectivity for cardiomyocytes in vivo."J Mol Biol.2004,342:1,171-82を見よ)。例示の筋標的化ペプチドは、以下の群のアミノ酸配列を含む:CQAQGQLVC(配列番号3074)、CSERSMNFC(配列番号3075)、CPKTRRVPC(配列番号130)、WLSEAGPVVTVRALRGTGSW(配列番号3076)、ASSLNIA(配列番号3071)、CMQHSMRVC(配列番号3077)、およびDDTRHWG(配列番号131)。いくつかの態様において、筋標的化ペプチドは、約2～25アミノ酸、約2～20アミノ酸、約2～15アミノ酸、約2～10アミノ酸、または約2～5アミノ酸を含んでいてもよい。筋標的化ペプチドは、天然に存在するアミノ酸、例として、システイン、アラニン、または天然に存在しないアミノ酸、もしくは修飾アミノ酸を含んでいてもよい。天然に存在しないアミノ酸は、β-アミノ酸、ホモ-アミノ酸、プロリン誘導体、3-置換アラニン誘導体、線形コアアミノ酸(linear core amino acids)、N-メチルアミノ酸、および当該技術分野において知られているその他のアミノ酸を包含する。いくつかの態様において、筋標的化ペプチドは線状であってもよい;他の態様において、筋標的化ペプチドは環状(例として、二環式)であってもよい(例として、Silvana,M.G.et al.Mol.Therapy,2018,26:1,132-147を見よ)。
iii．筋標的化受容体リガンド
筋標的化剤は、リガンド、例として、受容体タンパク質へ結合するリガンドであってもよい。筋標的化リガンドは、筋細胞によって発現される内在化する細胞表面受容体へ結合するタンパク質、例として、トランスフェリンであってもよい。結果的に、いくつかの態様において、筋標的化剤は、トランスフェリン、またはトランスフェリン受容体へ結合するその誘導体である。筋標的化リガンドは、代替的に、小分子、例として、他の細胞型と比べて優先的に筋細胞を標的にする親油性小分子であってもよい。筋細胞を標的にしてもよい例示の親油性小分子は、コレステロール、コレステリル、ステアリン酸、パルミチン酸、オレイン酸、オレイル、リノレン酸、リノール酸、ミリスチン酸、ステロール、ジヒドロテストステロン、テストステロン誘導体、グリセリン、アルキル鎖、トリチル基、およびアルコキシ酸を含む化合物を包含する。
iv．筋標的化アプタマー
筋標的化剤は、他の細胞型と比べて優先的に筋細胞を標的にするアプタマー、例としてRNAアプタマーであってもよい。いくつかの態様において、筋標的化アプタマーはこれまでに特徴付けも開示もされていない。これらのアプタマーは、数種の方法論のいずれか、例として、指数関数的濃縮によるリガンドの体系的進化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)を使用して、想起、産生、合成、および/または(例として、および)、誘導体化されてもよい。例示の方法論は当該技術分野において特徴付けされており、参照により組み込まれる(Yan,A.C. and Levy,M."Aptamers and aptamer targeted delivery" RNA biology,2009,6:3,316-20.;Germer,K.et al."RNA aptamers and their therapeutic and diagnostic applications."Int.J.Biochem.Mol.Biol.2013;4:27-40)。いくつかの態様において、筋標的化アプタマーはこれまでに開示されている(例として、Phillippou,S.et al."Selection and Identification of Skeletal-Muscle-Targeted RNA Aptamers."Mol Ther Nucleic Acids.2018,10:199-214.;Thiel,W.H.et al."Smooth Muscle Cell-targeted RNA Aptamer Inhibits Neointimal Formation."Mol Ther.2016,24:4,779-87を見よ)。例示の筋標的化アプタマーは、A01B RNAアプタマーおよびRNA Apt 14を包含する。いくつかの態様において、アプタマーは、核酸をベースとしたアプタマー、オリゴヌクレオチドアプタマー、またはペプチドアプタマーである。いくつかの態様において、アプタマーは、約5～15kDa、約5～10kDa、約10～15kDa、約1～5Da、約1～3kDa、またはこれより小さいものであってもよい。
ｖ．他の筋標的化剤
筋細胞(例として、骨格筋細胞)を標的にするための1つのストラテジーは、筋線維鞘上に発現されたトランスポータータンパク質などの筋肉トランスポータータンパク質の基質を使用することである。いくつかの態様において、筋標的化剤は、筋組織に特異的な流入トランスポーターの基質である。いくつかの態様において、流入トランスポーターは、骨格筋組織に特異的である。骨格筋の筋線維鞘上に発現されるトランスポーターの二大クラスは、(1)骨格筋組織からの流出に容易にさせる、アデノシン三リン酸(ATP)結合カセット(ABC)スーパーファミリー、および(2)基質の骨格筋中への流入を容易にし得る、溶質輸送体(solute carrier)(SLC)スーパーファミリーである。いくつかの態様において、筋標的化剤は、トランスポーターのABCスーパーファミリーまたはSLCスーパーファミリーへ結合する基質である。いくつかの態様において、トランスポーターのABCまたはSLCスーパーファミリーへ結合する基質は、天然に存在する基質である。いくつかの態様において、トランスポーターのABCまたはSLCスーパーファミリーへ結合する基質は、天然に存在しない基質、例えば、トランスポーターのABCまたはSLCスーパーファミリーへ結合するその合成誘導体である。
いくつかの態様において、筋標的化剤は、トランスポーターのSLCスーパーファミリーを標的にする本明細書に記載のいずれの筋標的化剤(例として、抗体、核酸、小分子、ペプチド、アプタマー、脂質、糖部)でもある。いくつかの態様において、筋標的化剤は、トランスポーターのSLCスーパーファミリーの基質である。SLCトランスポーターは、平衡型であるか、または基質の輸送を推進させる膜にわたって創出されたプロトンもしくはナトリウムのイオン勾配を使用するかのいずれかである。骨格筋への高発現を有する例示のSLCトランスポーターは、限定せずに、SATTトランスポーター(ASCT1;SLC1A4)、GLUT4トランスポーター(SLC2A4)、GLUT7トランスポーター(GLUT7;SLC2A7)、ATRC2トランスポーター(CAT-2;SLC7A2)、LAT3トランスポーター(KIAA0245;SLC7A6)、PHT1トランスポーター(PTR4;SLC15A4)、OATP-Jトランスポーター(OATP5A1;SLC21A15)、OCT3トランスポーター(EMT;SLC22A3)、OCTN2トランスポーター(FLJ46769;SLC22A5)、ENTトランスポーター(ENT1;SLC29A1およびENT2;SLC29A2)、PAT2トランスポーター(SLC36A2)、およびSAT2トランスポーター(KIAA1382;SLC38A2)を包含する。これらのトランスポーターは、基質の骨格筋中への流入を容易にさせることで、筋標的化のための好機を提供し得る。
いくつかの態様において、筋標的化剤は、平衡型ヌクレオシドトランスポーター2(ENT2)トランスポーターの基質である。他のトランスポーターと比べて、ENT2は、骨格筋において最高発現するmRNAの1つを有する。ヒトENT2(hENT2)は、脳、心臓、胎盤、胸腺、膵臓、前立腺、および腎臓などのほとんどの体器官に発現されるものの、とくに骨格筋に豊富である。ヒトENT2は、その基質の取り込みを、それらの濃度勾配に応じて容易にさせる。ENT2は、広範なプリンおよびピリミジン核酸塩基を輸送することによってヌクレオシドホメオスタシスを維持する役割を果たす。hENT2トランスポーターは、イノシンを除くすべてのヌクレオシド(アデノシン、グアノシン、ウリジン、チミジン、およびシチジン)に対して低親和性を有する。結果的に、いくつかの態様において、筋標的化剤は、ENT2基質である。例示のENT2基質は、限定せずに、イノシン、2',3'-ジデオキシイノシン、およびクロファラビンを包含する。いくつかの態様において、本明細書に提供される筋標的化剤のいずれも、分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチドペイロード)に関連する。いくつかの態様において、筋標的化剤は、分子ペイロードへ共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、筋標的化剤は、分子ペイロードへ非共有結合的に連結されている。
いくつかの態様において、筋標的化剤は、ナトリウムイオン依存性の高親和性カルニチントランスポーターである有機カチオン/カルニチントランスポーター(OCTN2)の基質である。いくつかの態様において、筋標的化剤は、カルニチン、ミルドロネート、アセチルカルニチン、またはOCTN2へ結合するそのいずれかの誘導体である。いくつかの態様において、カルニチン、ミルドロネート、アセチルカルニチン、またはそれらの誘導体は、分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチドペイロード)へ共有結合的に連結されている。
筋標的化剤は、筋細胞を標的にする少なくとも1つの可溶性形態で存在するタンパク質であるタンパク質であってもよい。いくつかの態様において、筋標的化タンパク質は、鉄過剰およびホメオスタシスに関与するタンパク質ヘモジュベリン(またrepulsive guidance molecule Cまたはヘモクロマトーシスタイプ2タンパク質としても知られている)であってもよい。いくつかの態様において、ヘモジュベリンは、完全長もしくはフラグメントであっても、または機能的ヘモジュベリンタンパク質と少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％配列同一性をもつ突然変異体であってもよい。いくつかの態様において、ヘモジュベリン突然変異体は、可溶性フラグメントであってもよく、N末シグナリングを欠いていてもよく、および/または(例として、および)、C末アンカードメイン(anchoring domain)を欠いていてもよい。いくつかの態様において、ヘモジュベリンは、GenBank RefSeq受託番号NM_001316767.1、NM_145277.4、NM_202004.3、NM_213652.3、またはNM_213653.3の注釈付きのものであってもよい。ヘモジュベリンがヒト、霊長目の非ヒト動物、または齧歯類の動物を起源とするものであってもよいことは解されるはずである。
Ｂ．分子ペイロード
本開示のいくつかの側面は、分子ペイロード、例としてDUX4の発現または活性をモジュレートするためにDUX4 RNAを標的にするよう設計されたオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの態様において、本開示は、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー(FSHD)の病的状態(筋萎縮症、炎症、ならびに減少した分化能および酸化ストレスを包含する)の特色に関連するDUX4 mRNAおよび/またはタンパク質のレベルを低減するのに有用である、DUX4 RNAと相補的なオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの態様において、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドは、DUX4 RNAのRNAi媒介分解に向けるよう設計されている。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DUX4 RNA分解のためにRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)を効率的に関与させるが、またオフターゲット効果も低減させるよう設計されている。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、所望のバイオアベイラビリティおよび/または血清安定性という特性を有するよう設計されている。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、所望の結合親和性という特性を有するよう設計されている。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、所望の毒性および/または免疫原性プロファイルを有するよう設計されている。
いくつかの態様において、DUX4標的化オリゴヌクレオチドは、DUX4 RNAに対する相補性の領域を有する鎖を含む。例示のオリゴヌクレオチドは、本明細書にさらに詳細に記載されているが、しかしながら、本明細書に提供される例示のオリゴヌクレオチドが限定することを意図していないことは解されるはずである。
ｉ．オリゴヌクレオチド
いくつかの態様において、本明細書に提供されるDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、DUX4 mRNAのRNAi媒介分解を引き起こすよう設計されている。いくつかの態様において、本明細書に提供されるDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、DUX4 mRNAに相補的なアンチセンス鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドは、二本鎖オリゴヌクレオチド(例として、siRNA)を形成するセンス鎖をさらに含む。いくつかの態様において、一方のフォーマット(format)からの機能的配列(例として、アンチセンス鎖配列)を他方のフォーマットへ組み込むことによって、あるフォーマットのオリゴヌクレオチド(例として、アンチセンスオリゴヌクレオチド)が、別のフォーマット(例として、siRNAオリゴヌクレオチド)へ好適に適応されてもよいことは解されるはずである。
いずれの好適なオリゴヌクレオチドも、分子ペイロードとして、本明細書に記載のとおり使用されてよい。DUX4を標的にするために有用なオリゴヌクレオチドの例は、「AGENTS USEFUL IN TREATING FACIOSCAPULOHUMERAL MUSCULAR DYSTROPHY」という表題の2017年2月2日に公開された米国特許番号9,988,628号;「RECOMBINANT VIRUS PRODUCTS AND METHODS FOR INHIBITING EXPRESSION OF DUX4」という表題の2014年10月30日に公開された米国特許番号9,469,851号;「AGENTS USEFUL IN TREATING FACIOSCAPULOHUMERAL MUSCULAR DYSTROPHY」という表題の2012年9月6日に公開された米国特許出願刊行物20120225034号;「MORPHOLINO TARGETING DUX4 FOR TREATING FSHD」という表題の2013年8月15日に公開されたPCT特許出願刊行物番号WO 2013/120038号;Chen et al.,"Morpholino-mediated Knockdown of DUX4 Toward Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy Therapeutics,"Molecular Therapy, 2016,24:8,1405-1411.;およびAnsseau et al.,"Antisense Oligonucleotides Used to Target the DUX4 mRNA as Therapeutic Approaches in Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy (FSHD),"Genes, 2017,8,93.に提供され、これら各々の内容全体は本明細書に組み込まれる。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、標的DUX4遺伝子またはmRNAとハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチド、モルホリノ、siRNA、shRNA、または別のオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、以下のとおりに表されるとおりの配列に対する相補性の領域を有する:下のとおりのNCBI配列NM_001293798.2(配列番号160)またはNCBI配列:NM_001306068.3(配列番号161)に対応するヒトDUX4、および/または(例として、および)下のとおりのNCBI配列NM_001081954.1(配列番号162)に対応するマウスDUX4。他の非限定的な例示のヒトDUX4 mRNAは、NCBI配列:NM_033178、GenBank受託番号FJ439133、AF117653、HM101229、HM101230、HM101232、HM101233、HM101234、HM101235、HM101240、HM101241、HM101242、HM101243、HM101244、HM101245、HM101246、HM101247、HM101248、HM101249、HM101250、HM101251およびHM190160、HM190161、HM190162、HM190163、HM190164、HM190165、HM190166、HM190167、HM190168、HM190169、HM190170、HM190171、HM190172、HM190173、HM190174、HM190175、HM190176、HM190177、HM190178、HM190179、HM190180、HM190181、HM190182、HM190183、HM190184、HM190185、HM190186、HM190187、HM190188、HM190189、HM190190、HM190191、HM190192、HM190193、HM190194、HM190195、HM190196を包含するが、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、2015年にCurr Opin Genet Devで公開されたDaxinger,et al.,"Genetic and Epigenetic Contributors to FSHD,"Lim J-W,et al.,DICER/AGO-dependent epigenetic silencing of D4Z4 repeats enhanced by exogenous siRNA suggests mechanisms and therapies for FSHD Hum Mol Genet.2015 Sep 1;24(17):4817-4828(これら各々の内容全体は本明細書に組み込まれる)におけるとおり、低メチル化され縮小されたD4Z4反復に対する相補性の領域を有してもよい。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ヒトDUX4遺伝子配列の例(NM_001293798.2)(配列番号160)である以下のとおり表される配列に対する相補性の領域を有してもよい:
ATGGCCCTCCCGACACCCTCGGACAGCACCCTCCCCGCGGAAGCCCGGGGACGAGGACGGCGACGGAGACTCGTTTGGACCCCGAGCCAAAGCGAGGCCCTGCGAGCCTGCTTTGAGCGGAACCCGTACCCGGGCATCGCCACCAGAGAACGGCTGGCCCAGGCCATCGGCATTCCGGAGCCCAGGGTCCAGATTTGGTTTCAGAATGAGAGGTCACGCCAGCTGAGGCAGCACCGGCGGGAATCTCGGCCCTGGCCCGGGAGACGCGGCCCGCCAGAAGGCCGGCGAAAGCGGACCGCCGTCACCGGATCCCAGACCGCCCTGCTCCTCCGAGCCTTTGAGAAGGATCGCTTTCCAGGCATCGCCGCCCGGGAGGAGCTGGCCAGAGAGACGGGCCTCCCGGAGTCCAGGATTCAGATCTGGTTTCAGAATCGAAGGGCCAGGCACCCGGGACAGGGTGGCAGGGCGCCCGCGCAGGCAGGCGGCCTGTGCAGCGCGGCCCCCGGCGGGGGTCACCCTGCTCCCTCGTGGGTCGCCTTCGCCCACACCGGCGCGTGGGGAACGGGGCTTCCCGCACCCCACGTGCCCTGCGCGCCTGGGGCTCTCCCACAGGGGGCTTTCGTGAGCCAGGCAGCGAGGGCCGCCCCCGCGCTGCAGCCCAGCCAGGCCGCGCCGGCAGAGGGGATCTCCCAACCTGCCCCGGCGCGCGGGGATTTCGCCTACGCCGCCCCGGCTCCTCCGGACGGGGCGCTCTCCCACCCTCAGGCTCCTCGCTGGCCTCCGCACCCGGGCAAAAGCCGGGAGGACCGGGACCCGCAGCGCGACGGCCTGCCGGGCCCCTGCGCGGTGGCACAGCCTGGGCCCGCTCAAGCGGGGCCGCAGGGCCAAGGGGTGCTTGCGCCACCCACGTCCCAGGGGAGTCCGTGGTGGGGCTGGGGCCGGGGTCCCCAGGTCGCCGGGGCGGCGTGGGAACCCCAAGCCGGGGCAGCTCCACCTCCCCAGCCCGCGCCCCCGGACGCCTCCGCCTCCGCGCGGCAGGGGCAGATGCAAGGCATCCCGGCGCCCTCCCAGGCGCTCCAGGAGCCGGCGCCCTGGTCTGCACTCCCCTGCGGCCTGCTGCTGGATGAGCTCCTGGCGAGCCCGGAGTTTCTGCAGCAGGCGCAACCTCTCCTAGAAACGGAGGCCCCGGGGGAGCTGGAGGCCTCGGAAGAGGCCGCCTCGCTGGAAGCACCCCTCAGCGAGGAAGAATACCGGGCTCTGCTGGAGGAGCTTTAGGACGCGGGGTCTAGGCCCGGTGAGAGACTCCACACCGCGGAGAACTGCCATTCTTTCCTGGGCATCCCGGGGATCCCAGAGCCGGCCCAGGTACCAGCAGACCTGCGCGCAGTGCGCACCCCGGCTGACGTGCAAGGGAGCTCGCTGGCCTCTCTGTGCCCTTGTTCTTCCGTGAAATTCTGGCTGAATGTCTCCCCCCACCTTCCGACGCTGTCTAGGCAAACCTGGATTAGAGTTACATCTCCTGGATGATTAGTTCAGAGATATATTAAAATGCCCCCTCCCTGTGGATCCTATAG
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ヒトDUX4遺伝子配列の例(NM_001306068.3)(配列番号161)である以下のとおり表される配列に対する相補性の領域を有してもよい:
ATGGCCCTCCCGACACCCTCGGACAGCACCCTCCCCGCGGAAGCCCGGGGACGAGGACGGCGACGGAGACTCGTTTGGACCCCGAGCCAAAGCGAGGCCCTGCGAGCCTGCTTTGAGCGGAACCCGTACCCGGGCATCGCCACCAGAGAACGGCTGGCCCAGGCCATCGGCATTCCGGAGCCCAGGGTCCAGATTTGGTTTCAGAATGAGAGGTCACGCCAGCTGAGGCAGCACCGGCGGGAATCTCGGCCCTGGCCCGGGAGACGCGGCCCGCCAGAAGGCCGGCGAAAGCGGACCGCCGTCACCGGATCCCAGACCGCCCTGCTCCTCCGAGCCTTTGAGAAGGATCGCTTTCCAGGCATCGCCGCCCGGGAGGAGCTGGCCAGAGAGACGGGCCTCCCGGAGTCCAGGATTCAGATCTGGTTTCAGAATCGAAGGGCCAGGCACCCGGGACAGGGTGGCAGGGCGCCCGCGCAGGCAGGCGGCCTGTGCAGCGCGGCCCCCGGCGGGGGTCACCCTGCTCCCTCGTGGGTCGCCTTCGCCCACACCGGCGCGTGGGGAACGGGGCTTCCCGCACCCCACGTGCCCTGCGCGCCTGGGGCTCTCCCACAGGGGGCTTTCGTGAGCCAGGCAGCGAGGGCCGCCCCCGCGCTGCAGCCCAGCCAGGCCGCGCCGGCAGAGGGGATCTCCCAACCTGCCCCGGCGCGCGGGGATTTCGCCTACGCCGCCCCGGCTCCTCCGGACGGGGCGCTCTCCCACCCTCAGGCTCCTCGGTGGCCTCCGCACCCGGGCAAAAGCCGGGAGGACCGGGACCCGCAGCGCGACGGCCTGCCGGGCCCCTGCGCGGTGGCACAGCCTGGGCCCGCTCAAGCGGGGCCGCAGGGCCAAGGGGTGCTTGCGCCACCCACGTCCCAGGGGAGTCCGTGGTGGGGCTGGGGCCGGGGTCCCCAGGTCGCCGGGGCGGCGTGGGAACCCCAAGCCGGGGCAGCTCCACCTCCCCAGCCCGCGCCCCCGGACGCCTCCGCCTCCGCGCGGCAGGGGCAGATGCAAGGCATCCCGGCGCCCTCCCAGGCGCTCCAGGAGCCGGCGCCCTGGTCTGCACTCCCCTGCGGCCTGCTGCTGGATGAGCTCCTGGCGAGCCCGGAGTTTCTGCAGCAGGCGCAACCTCTCCTAGAAACGGAGGCCCCGGGGGAGCTGGAGGCCTCGGAAGAGGCCGCCTCGCTGGAAGCACCCCTCAGCGAGGAAGAATACCGGGCTCTGCTGGAGGAGCTTTAGGACGCGGGGTTGGGACGGGGTCGGGTGGTTCGGGGCAGGGCGGTGGCCTCTCTTTCGCGGGGAACACCTGGCTGGCTACGGAGGGGCGTGTCTCCGCCCCGCCCCCTCCACCGGGCTGACCGGCCTGGGATTCCTGCCTTCTAGGTCTAGGCCCGGTGAGAGACTCCACTCCGCGGAGAACTGCCTTTCTTTCCTGGGCATCCCGGGGATCCCAGAGCCGGCCCAGGTACCAGCAGACCTGCGCGCAGTGCGCACCCCGGCTGACGTGCAAGGGAGCTCGCTGGCCTCTCTGTGCCCTTGTTCTTCCGTGAAATTCTGGCTGAATGTCTCCCCCCACCTTCCGACGCTGTCTAGGCAAACCTGGATTAGAGTTACATCTCCTGGATGATTAGTTCAGAGATATATTAAAATGCCCCCTCCCTGTGGATCCTATAG.
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、マウスDUX4遺伝子配列の例(配列番号162)(NM_001081954.1)である以下のとおり表される配列に対する相補性の領域を有してもよい:
ATGGCAGAAGCTGGCAGCCCTGTTGGTGGCAGTGGTGTGGCACGGGAATCCCGGCGGCGCAGGAAGACGGTTTGGCAGGCCTGGCAAGAGCAGGCCCTGCTATCAACTTTCAAGAAGAAGAGATACCTGAGCTTCAAGGAGAGGAAGGAGCTGGCCAAGCGAATGGGGGTCTCAGATTGCCGCATCCGCGTGTGGTTTCAGAACCGCAGGAATCGCAGTGGAGAGGAGGGGCATGCCTCAAAGAGGTCCATCAGAGGCTCCAGGCGGCTAGCCTCGCCACAGCTCCAGGAAGAGCTTGGATCCAGGCCACAGGGTAGAGGCATGCGCTCATCTGGCAGAAGGCCTCGCACTCGACTCACCTCGCTACAGCTCAGGATCCTAGGGCAAGCCTTTGAGAGGAACCCACGACCAGGCTTTGCTACCAGGGAGGAGCTGGCGCGTGACACAGGGTTGCCCGAGGACACGATCCACATATGGTTTCAAAACCGAAGAGCTCGGCGGCGCCACAGGAGGGGCAGGCCCACAGCTCAAGATCAAGACTTGCTGGCGTCACAAGGGTCGGATGGGGCCCCTGCAGGTCCGGAAGGCAGAGAGCGTGAAGGTGCCCAGGAGAACTTGTTGCCACAGGAAGAAGCAGGAAGTACGGGCATGGATACCTCGAGCCCTAGCGACTTGCCCTCCTTCTGCGGAGAGTCCCAGCCTTTCCAAGTGGCACAGCCCCGTGGAGCAGGCCAACAAGAGGCCCCCACTCGAGCAGGCAACGCAGGCTCTCTGGAACCCCTCCTTGATCAGCTGCTGGATGAAGTCCAAGTAGAAGAGCCTGCTCCAGCCCCTCTGAATTTGGATGGAGACCCTGGTGGCAGGGTGCATGAAGGTTCCCAGGAGAGCTTTTGGCCACAGGAAGAAGCAGGAAGTACAGGCATGGATACTTCTAGCCCCAGCGACTCAAACTCCTTCTGCAGAGAGTCCCAGCCTTCCCAAGTGGCACAGCCCTGTGGAGCGGGCCAAGAAGATGCCCGCACTCAAGCAGACAGCACAGGCCCTCTGGAACTCCTCCTCCTTGATCAACTGCTGGACGAAGTCCAAAAGGAAGAGCATGTGCCAGTCCCACTGGATTGGGGTAGAAATCCTGGCAGCAGGGAGCATGAAGGTTCCCAGGACAGCTTACTGCCCCTGGAGGAAGCAGTAAATTCGGGCATGGATACCTCGATCCCTAGCATCTGGCCAACCTTCTGCAGAGAATCCCAGCCTCCCCAAGTGGCACAGCCCTCTGGACCAGGCCAAGCACAGGCCCCCACTCAAGGTGGGAACACGGACCCCCTGGAGCTCTTCCTCTATCAACTGTTGGATGAAGTCCAAGTAGAAGAGCATGCTCCAGCCCCTCTGAATTGGGATGTAGATCCTGGTGGCAGGGTGCATGAAGGTTCGTGGGAGAGCTTTTGGCCACAGGAAGAAGCAGGAAGTACAGGCCTGGATACTTCAAGCCCCAGCGACTCAAACTCCTTCTTCAGAGAGTCCAAGCCTTCCCAAGTGGCACAGCGCCGTGGAGCGGGCCAAGAAGATGCCCGCACTCAAGCAGACAGCACAGGCCCTCTGGAACTCCTCCTCTTTGATCAACTGCTGGACGAAGTCCAAAAGGAAGAGCATGTGCCAGCCCCACTGGATTGGGGTAGAAATCCTGGCAGCATGGAGCATGAAGGTTCCCAGGACAGCTTACTGCCCCTGGAGGAAGCAGCAAATTCGGGCAGGGATACCTCGATCCCTAGCATCTGGCCAGCCTTCTGCAGAAAATCCCAGCCTCCCCAAGTGGCACAGCCCTCTGGACCAGGCCAAGCACAGGCCCCCATTCAAGGTGGGAACACGGACCCCCTGGAGCTCTTCCTTGATCAACTGCTGACCGAAGTCCAACTTGAGGAGCAGGGGCCTGCCCCTGTGAATGTGGAGGAAACATGGGAGCAAATGGACACAACACCTATCTGCCTCTCACTTCAGAAGAATATCAGACTCTTCTAGATATGCTCTGA.
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、例として、ヒト、マウスおよび非ヒト種から選択される、複数の種のDUX4遺伝子配列に対する相補性の領域を有してもよい。いくつかの態様において、非ヒト種は、カニクイザルである。
ｉ．オリゴヌクレオチドのサイズ/配列
オリゴヌクレオチドは、例としてフォーマットに応じて、様々な異なる長さのものであってもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、長さが7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75ヌクレオチドであるか、またはこれより長い。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、長さが8～50ヌクレオチド、長さが8～40ヌクレオチド、長さが8～32ヌクレオチド、長さが10～15ヌクレオチド、長さが10～20ヌクレオチド、長さが15～25ヌクレオチド、長さが21～23ヌクレオチド等々である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、長さが8～32ヌクレオチド、15～29ヌクレオチド、15～27ヌクレオチド、15～20ヌクレオチド、20～25ヌクレオチド、21～27ヌクレオチド、23～27ヌクレオチド、25～30ヌクレオチド、または25～32ヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本開示の目的上オリゴヌクレオチドの相補的な核酸配列は、前記配列の標的分子(例として、mRNA)への結合が標的(例として、mRNA)の正常機能に干渉して活性の喪失(例として、翻訳の阻害)または発現の喪失(例として、標的mRNAの分解)を引き起こしたとき、かつ非特異的結合の回避が所望される条件下、例として、in vivoアッセイまたは治療処置のケースおよびin vitroアッセイのケースにおける生理学的な条件下、アッセイがストリンジェンシー(stringency)の好適な条件下で実施される条件下で、前記配列の非標的配列への非特異的結合を回避するのに充分な程度の相補性があるとき、標的核酸に特異的にハイブリダイズ可能であるか、または標的核酸に特異的である。よって、いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、標的核酸の連続したヌクレオチドに少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または100％相補的であってもよい。いくつかの態様において、相補的なヌクレオチド配列は、標的核酸に特異的にハイブリダイズ可能であるか、または標的核酸に特異的であるその標的の配列に100％相補的である必要はない。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、標的核酸と比べて1以上のミスマッチ核酸塩基を含む。いくつかの態様において、標的に関する活性は、かかるミスマッチによって低減されるが、非標的に関する活性は、より大きく(by a greater amount)低減される(すなわち、標的核酸に対する選択性は増大し、かつオフターゲット効果は減少する)。いくつかの態様において、標的核酸は、pre-mRNA分子またはmRNA分子である。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、長さが8～15、8～30、8～40、または10～50、または5～50、または5～40ヌクレオチドの範囲にある標的核酸に対する相補性の領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、長さが8～32、15～29、15～27、21～27、23～27ヌクレオチドの範囲にある標的核酸に対する相補性の領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、長さが15～29、15～27、15～20、20～25、21～27、23～27、25～27、または25～32ヌクレオチドの範囲にある標的核酸に対する相補性の領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドの、標的核酸に対する相補性の領域は、長さが5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50ヌクレオチドである。いくつかの態様において、相補性の領域は、標的核酸の少なくとも連続した8ヌクレオチドと相補的である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、標的核酸の一部の連続したヌクレオチドと比較して1、2、または3塩基ミスマッチを含有していてもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、15塩基にわたり最大3ミスマッチまで、または10塩基にわたり最大2ミスマッチまで有していてもよい。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号1575～2986および3027～3066のいずれか1つを含む配列の少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号1575～2986および3027～3066のいずれか1つを含む配列を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号1575～2986および3027～3066のいずれか1つの少なくとも12または少なくとも15の連続したヌクレオチドと、少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、または97％の配列同一性を共有する配列を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号3027～3066のいずれか1つを含む配列の少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号3027～3066のいずれか1つを含む配列を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号3027～3066のいずれか1つの少なくとも12または少なくとも15の連続したヌクレオチドと、少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、または97％の配列同一性を共有する配列を含む。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号163～1574のいずれか1つで表されるとおりの標的配列に対する相補性の領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号2987～3026のいずれか1つで表されるとおりの標的配列に対する相補性の領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号163～1574のいずれか1つで表されるとおりの標的配列の少なくとも12または少なくとも15の連続したヌクレオチドと、少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％;99％、または100％相補的である相補性の領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号2987～3026のいずれか1つで表されるとおりの標的配列の少なくとも12または少なくとも15の連続したヌクレオチドと、少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％;99％、または100％相補的である相補性の領域を含む。いくつかの態様において、相補性の領域は、長さが少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも19、または少なくとも20のヌクレオチドである。いくつかの態様において、相補性の領域は、長さが8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20のヌクレオチドである。いくつかの態様において、相補性の領域は、長さが8～20、10～20、または15～20ヌクレオチドの範囲にある。いくつかの態様において、相補性の領域は、その標的配列の全部または一部と完全に相補的である。いくつかの態様において、相補性の領域は、1、2、3、またはそれより多くのミスマッチを包含する。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチド(例として、表8に列挙されるオリゴヌクレオチド)のいずれか1つの標的配列に対し(例として、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または100％)相補的である。いくつかの態様において、かかる標的配列は、表8に列挙されるオリゴヌクレオチドに対して100％相補的である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチド(例として、表9に列挙されるオリゴヌクレオチド)のいずれか1つの標的配列に対し(例として、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または100％)相補的である。いくつかの態様において、かかる標的配列は、表9に列挙されるオリゴヌクレオチドに対して100％相補的である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチド(例として、配列番号1575～2986および3027～3066のいずれか1つを含むオリゴヌクレオチド)のいずれか1つの標的配列に対し(例として、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または100％)相補的である。いくつかの態様において、かかる標的配列は、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド(例として、配列番号1575～2986および3027～3066のいずれか1つを含むオリゴヌクレオチド)に対して100％相補的である。
いくつかの態様において、核酸塩基ウラシルのC5位置でのメチル化がチミンを形成することは解されるはずである。よって、いくつかの態様において、C5メチル化ウラシル(もしくは5-メチル-ウラシル)を有するヌクレオチドまたはヌクレオシドは、チミンヌクレオチドまたはヌクレオシドとして等価に同定されてもよい。
いくつかの態様において、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドのいずれか1つにおけるチミン塩基(T)の1以上は、独立におよび任意に、ウラシル塩基(U)であってもよく、および/またはUのいずれか1以上は、独立におよび任意に、Tであってもよい。いくつかの態様において、表8または表9に列挙されるオリゴヌクレオチドのいずれか1つにおけるチミン塩基(T)の1以上は、独立におよび任意に、ウラシル塩基(U)であってもよく、および/またはUのいずれか1以上は、独立におよび任意に、Tであってもよい。
ｂ．オリゴヌクレオチド修飾:
本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、修飾されていてもよく、例として、修飾された糖部、修飾されたヌクレオシド間連結、修飾ヌクレオチド、および/またはそれらの組み合わせを含む。加えて、いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、以下の特性の1以上を呈してもよい:選択的スプライシングを媒介しない;免疫刺激性ではない;ヌクレアーゼ抵抗性である;非修飾オリゴヌクレオチドと比較して改善された細胞取り込みを有する;細胞または哺乳動物への毒性がない;改善されたエンドソームの内部への出口(exit)を細胞中に有する;TLR刺激を最小限に抑える;または、パターン認識受容体を回避する。本明細書に記載のオリゴヌクレオチドの修飾された化学的性質またはフォーマットのいずれも、互いに組み合わせられ得る。例えば、1、2、3、4、5、またはこれより多くの異なるタイプの修飾が、同じオリゴヌクレオチド内に包含され得る。
いくつかの態様において、修飾が組み込まれるオリゴヌクレオチドを、ネイティブなオリゴデオキシヌクレオチド分子またはオリゴリボヌクレオチド分子よりヌクレアーゼ消化に耐性があるようにさせる、特定のヌクレオチド修飾が使用されてもよい;これらの修飾されたオリゴヌクレオチドは、非修飾オリゴヌクレオチドより長時間無傷で存続する。修飾されたオリゴヌクレオチドの特定例は、修飾された主鎖、例えば、ホスホロチオアート、ホスホトリエステル、メチルホスホナート、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間連結、または短鎖ヘテロ原子のもしくは複素環式の糖間連結などの修飾されたヌクレオシド間連結を含むものを包含する。結果的に、本開示のオリゴヌクレオチドは、修飾、例として、ヌクレオチド修飾の組み込みなどによる核酸分解に対して安定化され得る。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの2～10、2～15、2～16、2～17、2～18、2～19、2～20、2～25、2～30、2～40、2～45ヌクレオチド、またはこれより多いヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである、長さが最大50ヌクレオチドまでまたは最大100ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドであってもよい。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの2～10、2～15、2～16、2～17、2～18、2～19、2～20、2～25、2～30ヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである、長さが8～30ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであってもよい。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの2～4、2～5、2～6、2～7、2～8、2～9、2～10、2～11、2～12、2～13、2～14ヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである、長さが8～15ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであってもよい。任意に、オリゴヌクレオチドは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10ヌクレオチドを除き、どのヌクレオチドも修飾されていてもよい。オリゴヌクレオチド修飾は本明細書にさらに記載されている。
ｃ．修飾ヌクレオシド
いくつかの態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、糖の2'位において修飾された少なくとも1つのヌクレオシドを含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは少なくとも1つの2'修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチド上のヌクレオシドのすべては2'修飾ヌクレオシドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、1以上の非二環式2'-修飾ヌクレオチド、例として、2'-デオキシ、2'-フルオロ(2'-F)、2'-O-メチル(2'-O-Me)、2'-O-メトキシエチル(2'-O-MOE)、2'-O-アミノプロピル(2'-O-AP)、2'-O-ジメチルアミノエチル(2'-O-DMAOE)、2'-O-ジメチルアミノプロピル(2'-O-DMAP)、2'-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2'-O-DMAEOE)、または2'-O--N-メチルアセトアミド(2'-O-NMA)の修飾ヌクレオシドを包含する。
いくつかの態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、1以上の2'-4'二環式ヌクレオシドを含むが、前記ヌクレオシド中リボース環は、その環中2個の原子を接続する(例として、メチレン(LNA)架橋、エチレン(ENA)架橋、または(S)-拘束エチル(cEt)架橋を介して、2'-O原子を4'-C原子へ接続する)架橋部分を含む。LNAの例は、2008年4月17日に公開され「RNA Antagonist Compounds For The Modulation Of PCSK9」という表題の国際特許出願刊行物WO/2008/043753(この内容は、その全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる)に記載されている。ENAの例は、2005年5月12日に公開され「APP/ENA Antisense」という表題の国際特許刊行物第WO 2005/042777号;Morita et al.,Nucleic Acid Res.,Suppl 1:241-242,2001;Surono et al.,Hum.Gene Ther.,15:749-757,2004;Koizumi,Curr.Opin.Mol.Ther.,8:144-149,2006;およびHorie et al.,Nucleic Acids Symp.Ser(Oxf),49:171-172,2005に提供されており、これらの開示はそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。cEtの例は、米国特許7,101,993;7,399,845および7,569,686に提供されており、これら各々はそれら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、以下の米国特許または特許出願刊行物のうち1つに開示された修飾ヌクレオシドを含む:米国特許7,399,845、2008年7月15日発行、表題「6-Modified Bicyclic Nucleic Acid Analogs」;米国特許7,741,457、2010年6月22日発行、表題「6-Modified Bicyclic Nucleic Acid Analogs」;米国特許8,022,193、2011年9月20日発行、表題「6-Modified Bicyclic Nucleic Acid Analogs」;米国特許7,569,686、2009年8月4日発行、表題「Compounds And Methods For Synthesis Of Bicyclic Nucleic Acid Analogs」;米国特許7,335,765、2008年2月26日発行、表題「Novel Nucleoside And Oligonucleotide Analogues」;米国特許7,314,923、2008年1月1日発行、表題「Novel Nucleoside And Oligonucleotide Analogues」;米国特許7,816,333、2010年10月19日発行、表題「Oligonucleotide Analogues And Methods Utilizing The Same」および米国刊行物第2011/0009471号、現在米国特許8,957,201、2015年2月17日発行、表題「Oligonucleotide Analogues And Methods Utilizing The Same」、すべての用途において(for all purposes)、これら各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの修飾ヌクレオシドも有さないオリゴヌクレオチドと比較して、1℃、2℃、3℃、4℃、または5℃の範囲にあるオリゴヌクレオチドのTmの増大をもたらす少なくとも1つの修飾ヌクレオシドを含む。オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシドを有さないオリゴヌクレオチドと比較して、合計で2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、またはこれを超える温度の範囲にあるオリゴヌクレオチドのTmの増大をもたらす複数の修飾ヌクレオシドを有していてもよい。
オリゴヌクレオチドは、異なる種類のヌクレオシドのミックスを含んでいてもよい。例えば、オリゴヌクレオチドは、2'-デオキシリボヌクレオシドまたはリボヌクレオシドおよび2'-フルオロ修飾ヌクレオシドのミックスを含んでいてもよい。オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオシドまたはリボヌクレオシドおよび2'-O-Me修飾ヌクレオシドのミックスを含んでいてもよい。オリゴヌクレオチドは、2'-フルオロ修飾ヌクレオシドおよび2'-O-Me修飾ヌクレオシドのミックスを含んでいてもよい。オリゴヌクレオチドは、架橋ヌクレオシドおよび2'-フルオロまたは2'-O-メチル修飾ヌクレオシドのミックスを含んでいてもよい。オリゴヌクレオチドは、非二環式2'-修飾ヌクレオシド(例として、2'-O-MOE)および2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNA、ENA、cEt)のミックスを含んでいてもよい。オリゴヌクレオチドは、2'-フルオロ修飾ヌクレオシドおよび2'-O-Me修飾ヌクレオシドのミックスを含んでいてもよい。オリゴヌクレオチドは、2'-4'二環式ヌクレオシドおよび2'MOE、2'-フルオロ、または2'-O-Me修飾ヌクレオシドのミックスを含んでいてもよい。オリゴヌクレオチドは、非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOE、2'-フルオロ、または2'-O-Me)および2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNA、ENA、cEt)のミックスを含んでいてもよい。
オリゴヌクレオチドは、異なる種類の交互のヌクレオシドを含んでいてもよい。例えば、オリゴヌクレオチドは、交互の2'-デオキシリボヌクレオシドまたはリボヌクレオシドおよび2'-フルオロ修飾ヌクレオシドを含んでいてもよい。オリゴヌクレオチドは、交互のデオキシリボヌクレオシドまたはリボヌクレオシドおよび2'-O-Me修飾ヌクレオシドを含んでいてもよい。オリゴヌクレオチドは、交互の2'-フルオロ修飾ヌクレオシドおよび2'-O-Me修飾ヌクレオシドを含んでいてもよい。オリゴヌクレオチドは、交互の架橋ヌクレオシドおよび2'-フルオロまたは2'-O-メチル修飾ヌクレオシドを含んでいてもよい。オリゴヌクレオチドは、交互の非二環式2'-修飾ヌクレオシド(例として、2'-O-MOE)および2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNA、ENA、cEt)を含んでいてもよい。オリゴヌクレオチドは、交互の2'-4'二環式ヌクレオシドおよび2'-MOE、2'-フルオロ、または2'-O-Me修飾ヌクレオシドを含んでいてもよい。オリゴヌクレオチドは、交互の非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOE、2'-フルオロ、または2'-O-Me)および2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNA、ENA、cEt)を含んでいてもよい。
いくつかの態様においては、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、5'-ビニルホスホナート修飾、1以上の脱塩基残基、および/または1以上の逆向きの(inverted)脱塩基残基を含む。
ｄ．ヌクレオシド間連結/主鎖
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオアートまたは他の修飾ヌクレオシド間連結を含有していてもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結を、少なくとも2ヌクレオシドの間に含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結を、すべてのヌクレオシド間に含む。例えば、いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド間連結を、ヌクレオチド配列の5'または3'末の、第1の、第2の、および/または(例として、および)、第3のヌクレオシド間連結にて含む。
使用されてもよい、リンを含有する連結は、これらに限定されないが、通常の3'-5'連結、これらの2'-5'連結類似体を有する、ホスホロチオアート、キラルのホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホナート(3'アルキレンホスホナートおよびキラルのホスホナートを含む)、ホスフィナート、ホスホロアミダート(3'-アミノホスホロアミダートおよびアミノアルキルホスホロアミダートを含む)、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびにボラノホスファートと、逆方向の極性を有するこれら(ここでヌクレオシド単位の隣接する対は3'-5'から5'-3'へまたは2'-5'から5'-2'へ連結されている)とを包含する;米国特許第3,687,808号;第4,469,863号;第4,476,301号;第5,023,243号;第5,177,196号;第5,188,897号;第5,264,423号;第5,276,019号;第5,278,302号;第5,286,717号;第5,321,131号;第5,399,676号;第5,405,939号;第5,453,496号;第5,455,233号;第5,466,677号;第5,476,925号;第5,519,126号;第5,536,821号;第5,541,306号;第5,550,111号;第5,563,253号;第5,571,799号;第5,587,361号;および第5,625,050号を見よ。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、メチレン(メチルイミノ)またはMMI主鎖;アミド主鎖(De Mesmaeker et al.Ace.Chem.Res.1995,28:366-374を見よ);モルホリノ主鎖(SummertonおよびWeller、米国特許第5,034,506号を見よ);またはペプチド核酸(PNA)主鎖(ここでオリゴヌクレオチドのホスホジエステル主鎖がポリアミド主鎖に置き換えられており、ヌクレオチドがポリアミド主鎖のアザ窒素原子へ直接的または間接的に結合されている、Nielsen et al.,Science 1991,254,1497を見よ)などのヘテロ原子主鎖を有していてもよい。
ｅ．立体特異的オリゴヌクレオチド
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間のリン原子はキラルであり、およびオリゴヌクレオチドの特性はキラルのリン原子の立体配置に基づき調整される。いくつかの態様において、適切な方法は、立体制御されたやり方(例として、Oka N, Wada T, Stereocontrolled synthesis of oligonucleotide analogs containing chiral internucleotidic phosphorus atoms.Chem Soc Rev.2011 Dec;40(12):5829-43に記載のとおりの)でP-キラルオリゴヌクレオチド類似体を合成するために使用されてもよい。いくつかの態様において、実質的にすべてのSpホスホロチオアート糖間連結または実質的にすべてのRpホスホロチオアート糖間連結のいずれかによって一緒に結び合わされたヌクレオシド単位を含む、ホスホロチオアート含有オリゴヌクレオチドが提供される。いくつかの態様において、実質的にキラル純粋な糖間連結を有するかかるホスホロチオアートオリゴヌクレオチドは、例えば、1996年12月12日に発行された米国特許5,587,261(この内容は全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる)に記載されるとおり、酵素合成または化学合成によって調製される。いくつかの態様において、キラル制御されたオリゴヌクレオチドは、標的核酸の選択的切断パターンを提供する。例えば、いくつかの態様において、キラル制御されたオリゴヌクレオチドは、例えば、2017年2月2日に公開された表題「CHIRAL DESIGN」の米国特許出願刊行物20170037399 A1(この内容は全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる)に記載のとおり、核酸の相補的な配列内に単一の切断部位を提供する。
ｆ．モルホリノ
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、モルホリノをベースとした化合物であってもよい。モルホリノをベースとしたオリゴマー化合物は、Dwaine A.Braasch and David R.Corey,Biochemistry,2002,41(14),4503-4510);Genesis,volume 30,issue 3,2001;Heasman,J.,Dev.Biol.,2002,243,209-214;Nasevicius et al.,Nat.Genet.,2000,26,216-220;Lacerra et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,2000,97,9591-9596;および1991年7月23日発行の米国特許第5,034,506号に記載されている。いくつかの態様において、モルホリノをベースとしたオリゴマー化合物は、ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー(PMO)(例として、Iverson,Curr.Opin.Mol.Ther.,3:235-238,2001;およびWang et al.,J.Gene Med.,12:354-364,2010に記載のとおりである;これらの開示はそれら全体が参照により本明細書に組み込まれる)。
ｈ．Gapmer
いくつかの態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、gapmerである。gapmerオリゴヌクレオチドは一般に、ギャップ領域Yを囲むフランキング(flanking)領域としてXおよびZをもつ式5'-X-Y-Z-3'を有する。いくつかの態様において、式5'-X-Y-Z-3'のフランキング領域Xは、X領域、フランキング配列X、5'ウイング領域X、または5'ウイングセグメントともまた言われる。いくつかの態様において、式5'-X-Y-Z-3'のフランキング領域ZはZ領域、フランキング配列Z、3'ウイング領域Z、または3'ウイングセグメントともまた言われる。いくつかの態様において、式5'-X-Y-Z-3'のギャップ領域YはY領域、Yセグメント、またはギャップセグメントYともまた言われる。いくつかの態様において、ギャップ領域Yの各ヌクレオシドは2'-デオキシリボヌクレオシドであり、5'ウイング領域Xも3'ウイング領域Zもいずれかの2'-デオキシリボヌクレオシドを含有しない。
いくつかの態様において、Y領域は、RNAse HなどのRNAseをリクルートすることができる一続きのヌクレオチド、例えば6つ以上のDNAヌクレオチドの領域である。いくつかの態様において、gapmerは標的核酸に結合し、この点において、RNAseがリクルートされ、それから標的核酸を切断し得る。いくつかの態様において、Y領域は、高親和性修飾ヌクレオシド、例えば1から6つの高親和性修飾ヌクレオシドを含む領域XおよびZによって5'および3'両方をフランキングされる。高親和性修飾ヌクレオシドの例は、2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOE、2'O-Me、2'-F)または2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNA、cEt、ENA)を包含するが、これらに限定されない。いくつかの態様において、フランキング配列XおよびZは長さが1～20ヌクレオチド、1～8ヌクレオチド、または1～5ヌクレオチドであり得る。フランキング配列XおよびZは類似の長さまたは非類似の長さであり得る。いくつかの態様において、ギャップセグメントYは、長さが5～20ヌクレオチド、5～15、12ヌクレオチド、または6～10ヌクレオチドのヌクレオチド配列であり得る。
いくつかの態様において、gapmerオリゴヌクレオチドのギャップ領域は、DNAヌクレオチドに加えて、効率的なRNase H作用にとって許容されることが知られている修飾ヌクレオチド、例えばC4'置換ヌクレオチド、非環状ヌクレオチド、およびアラビノ型ヌクレオチドを含有し得る。いくつかの態様において、ギャップ領域は1以上の未修飾のヌクレオシド間連結を含む。いくつかの態様において、一方または両方のフランキング領域は、各々独立して、1以上のホスホロチオアートヌクレオシド間連結(例として、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結または他の連結)を少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、またはより多くのヌクレオチド間に含む。いくつかの態様において、ギャップ領域および2つのフランキング領域は、各々が独立して、修飾されたヌクレオシド間連結(例として、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結または他の連結)を少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、またはより多くのヌクレオチド間に含む。
gapmerは適切な方法を使用して産生され得る。gapmerの調製を教示する代表的な米国特許、米国特許公開、およびPCT公開は、米国特許第5,013,830号;第5,149,797号;第5,220,007号;第5,256,775号;第5,366.878号;第5,403,711号;第5,491,133号;第5,565,350号;第5,623,065号;第5,652,355号;第5,652,356号;第5,700,922号;第5,898,031号;第7,015,315号;第7,101,993号;第7,399,845号;第7.432,250号;第7,569,686号;第7,683,036号;第7,750,131号;第8,580,756号;第9,045,754号;第9,428.534号;第9,695,418号;第10,017,764号;第10,260,069号;第9.428,534号;第8,580,756号;米国特許公開第US20050074801号、第US20090221685号;第US20090286969号、第US20100197762号、および第US20110112170号;PCT公開第W02004069991号;第W02005023825号;第W02008049085号および第W02009090182号;ならびに欧州特許第EP2,149,605号を包含するが、これらに限定されない。これら各々はその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、gapmerは長さが10～40ヌクレオシドである。例えば、gapmerは長さが10～40、10～35、10～30、10～25、10～20、10～15、15～40、15～35、15～30、15～25、15～20、20～40、20～35、20～30、20～25、25～40、25～35、25～30、30～40、30～35、または35～40ヌクレオシドであり得る。いくつかの態様において、gapmerは長さが10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、または40ヌクレオシドである。
いくつかの態様において、gapmer上のギャップ領域Yは長さが5～20ヌクレオシドである。例えば、ギャップ領域Yは長さが5～20、5～15、5～10、10～20、10～15、または15～20ヌクレオシドであり得る。いくつかの態様において、ギャップ領域Yは長さが5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオシドである。いくつかの態様において、ギャップ領域Yの各ヌクレオシドは2'-デオキシリボヌクレオシドである。いくつかの態様において、ギャップ領域Yのすべてのヌクレオシドが2'デオキシリボヌクレオシドである。いくつかの態様において、ギャップ領域Yのヌクレオシドの1つ以上は修飾ヌクレオシドである(例として、2'修飾ヌクレオシド、例えば本明細書に記載のもの)。いくつかの態様において、ギャップ領域Yの1以上のシトシンは任意に5-メチルシトシンである。いくつかの態様において、ギャップ領域Yの各シトシンは5-メチルシトシンである。
いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)およびgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)は、独立して1～20ヌクレオシドの長さである。例えば、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)およびgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)は、独立して1～20、1～15、1～10、1～7、1～5、1～3、1～2、2～5、2～7、3～5、3～7、5～20、5～15、5～10、10～20、10～15、または15～20ヌクレオシドの長さであり得る。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)およびgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)は、独立して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオシドの長さである。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)およびgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)は同じ長さである。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)およびgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)は異なる長さである。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)はgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)よりも長い。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)はgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)よりも短い。
いくつかの態様において、gapmerは、5-10-5、4-12-4、3-14-3、2-16-2、1-18-1、3-10-3、2-10-2、1-10-1、2-8-2、4-6-4、3-6-3、2-6-2、4-7-4、3-7-3、2-7-2、4-8-4、3-8-3、2-8-2、1-8-1、2-9-2、1-9-1、2-10-2、1-10-1、1-12-1、1-16-1、2-15-1、1-15-2、1-14-3、3-14-1、2-14-2、1-13-4、4-13-1、2-13-3、3-13-2、1-12-5、5-12-1、2-12-4、4-12-2、3-12-3、1-11-6、6-11-1、2-11-5、5-11-2、3-11-4、4-11-3、1-17-1、2-16-1、1-16-2、1-15-3、3-15-1、2-15-2、1-14-4、4-14-1、2-14-3、3-14-2、1-13-5、5-13-1、2-13-4、4-13-2、3-13-3、1-12-6、6-12-1、2-12-5、5-12-2、3-12-4、4-12-3、1-11-7、7-11-1、2-11-6、6-11-2、3-11-5、5-11-3、4-11-4、1-18-1、1-17-2、2-17-1、1-16-3、1-16-3、2-16-2、1-15-4、4-15-1、2-15-3、3-15-2、1-14-5、5-14-1、2-14-4、4-14-2、3-14-3、1-13-6、6-13-1、2-13-5、5-13-2、3-13-4、4-13-3、1-12-7、7-12-1、2-12-6、6-12-2、3-12-5、5-12-3、1-11-8、8-11-1、2-11-7、7-11-2、3-11-6、6-11-3、4-11-5、5-11-4、1-18-1、1-17-2、2-17-1、1-16-3、3-16-1、2-16-2、1-15-4、4-15-1、2-15-3、3-15-2、1-14-5、2-14-4、4-14-2、3-14-3、1-13-6、6-13-1、2-13-5、5-13-2、3-13-4、4-13-3、1-12-7、7-12-1、2-12-6、6-12-2、3-12-5、5-12-3、1-11-8、8-11-1、2-11-7、7-11-2、3-11-6、6-11-3、4-11-5、5-11-4、1-19-1、1-18-2、2-18-1、1-17-3、3-17-1、2-17-2、1-16-4、4-16-1、2-16-3、3-16-2、1-15-5、2-15-4、4-15-2、3-15-3、1-14-6、6-14-1、2-14-5、5-14-2、3-14-4、4-14-3、1-13-7、7-13-1、2-13-6、6-13-2、3-13-5、5-13-3、4-13-4、1-12-8、8-12-1、2-12-7、7-12-2、3-12-6、6-12-3、4-12-5、5-12-4、2-11-8、8-11-2、3-11-7、7-11-3、4-11-6、6-11-4、5-11-5、1-20-1、1-19-2、2-19-1、1-18-3、3-18-1、2-18-2、1-17-4、4-17-1、2-17-3、3-17-2、1-16-5、2-16-4、4-16-2、3-16-3、1-15-6、6-15-1、2-15-5、5-15-2、3-15-4、4-15-3、1-14-7、7-14-1、2-14-6、6-14-2、3-14-5、5-14-3、4-14-4、1-13-8、8-13-1、2-13-7、7-13-2、3-13-6、6-13-3、4-13-5、5-13-4、2-12-8、8-12-2、3-12-7、7-12-3、4-12-6、6-12-4、5-12-5、3-11-8、8-11-3、4-11-7、7-11-4、5-11-6、6-11-5、1-21-1、1-20-2、2-20-1、1-20-3、3-19-1、2-19-2、1-18-4、4-18-1、2-18-3、3-18-2、1-17-5、2-17-4、4-17-2、3-17-3、1-16-6、6-16-1、2-16-5、5-16-2、3-16-4、4-16-3、1-15-7、7-15-1、2-15-6、6-15-2、3-15-5、5-15-3、4-15-4、1-14-8、8-14-1、2-14-7、7-14-2、3-14-6、6-14-3、4-14-5、5-14-4、2-13-8、8-13-2、3-13-7、7-13-3、4-13-6、6-13-4、5-13-5、1-12-10、10-12-1、2-12-9、9-12-2、3-12-8、8-12-3、4-12-7、7-12-4、5-12-6、6-12-5、4-11-8、8-11-4、5-11-7、7-11-5、6-11-6、1-22-1、1-21-2、2-21-1、1-21-3、3-20-1、2-20-2、1-19-4、4-19-1、2-19-3、3-19-2、1-18-5、2-18-4、4-18-2、3-18-3、1-17-6、6-17-1、2-17-5、5-17-2、3-17-4、4-17-3、1-16-7、7-16-1、2-16-6、6-16-2、3-16-5、5-16-3、4-16-4、1-15-8、8-15-1、2-15-7、7-15-2、3-15-6、6-15-3、4-15-5、5-15-4、2-14-8、8-14-2、3-14-7、7-14-3、4-14-6、6-14-4、5-14-5、3-13-8、8-13-3、4-13-7、7-13-4、5-13-6、6-13-5、4-12-8、8-12-4、5-12-7、7-12-5、6-12-6、5-11-8、8-11-5、6-11-7、または7-11-6の5'-X-Y-Z-3'を含む。数は5'-X-Y-Z-3'gapmerのX、Y、およびZ領域のヌクレオシド数を指し示す。
いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)またはgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)の1以上のヌクレオシドは、修飾ヌクレオシドである(例として、高親和性修飾ヌクレオシド)。いくつかの態様において、修飾ヌクレオシド(例として、高親和性修飾ヌクレオシド)は2'修飾ヌクレオシドである。いくつかの態様において、2'修飾ヌクレオシドは2'-4'二環式ヌクレオシドまたは非二環式2'修飾ヌクレオシドである。いくつかの態様において、高親和性修飾ヌクレオシドは、2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNA、cEt、またはENA)または非二環式2'-修飾ヌクレオシド(例として、2'-フルオロ(2'-F)、2'-O-メチル(2'-O-Me)、2'-O-メトキシエチル(2'-MOE)、2'-O-アミノプロピル(2'-O-AP)、2'-O-ジメチルアミノエチル(2'-O-DMAOE)、2'-O-ジメチルアミノプロピル(2'-ODMAP)、2'-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2'-O-DMAEOE)、または2'-O-N-メチルアセトアミド(2'-O-NMA))である。
いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)の1以上のヌクレオシドは高親和性修飾ヌクレオシドである。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)の各ヌクレオシドは高親和性修飾ヌクレオシドである。いくつかの態様において、gapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)の1以上のヌクレオシドは高親和性修飾ヌクレオシドである。いくつかの態様において、gapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)の各ヌクレオシドは高親和性修飾ヌクレオシドである。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)の1以上のヌクレオシドは高親和性修飾ヌクレオシドであり、gapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)の1以上のヌクレオシドは高親和性修飾ヌクレオシドである。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)の各ヌクレオシドは高親和性修飾ヌクレオシドであり、gapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)の各ヌクレオシドは高親和性修飾ヌクレオシドである。
いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)は、gapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)と同じ高親和性ヌクレオシドを含む。例えば、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)およびgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)は、1以上の非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)を含み得る。別の例では、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)およびgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)は、1以上の2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)を含み得る。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)およびgapmerの3'ウイング領域(5'-XY-Z-3'式のZ)の各ヌクレオシドは、非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)である。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)およびgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)の各ヌクレオシドは、2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)である。
いくつかの態様において、gapmerは5'-X-Y-Z-3'構成を含み、XおよびZは独立して長さが1～7(例として、1、2、3、4、5、6、または7)ヌクレオシドであり、Yは長さが6～10(例として、6、7、8、9、または10)ヌクレオシドであり、XおよびZの各ヌクレオシドは非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)であり、Yの各ヌクレオシドは2'デオキシリボヌクレオシドである。いくつかの態様において、gapmerは5'-X-Y-Z-3'構成を含み、XおよびZは独立して長さが1～7(例として、1、2、3、4、5、6、または7)ヌクレオシドであり、Yは長さが6～10(例として、6、7、8、9、または10)ヌクレオシドであり、XおよびZの各ヌクレオシドは2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)であり、Yの各ヌクレオシドは2'デオキシリボヌクレオシドである。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)はgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)とは(as)異なる高親和性ヌクレオシドを含む。例えば、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)は1以上の非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)を含み得、gapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)は1以上の2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)を含み得る。別の例では、gapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)は1以上の非二環式2'-修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)を含み得、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)は1以上の2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)を含み得る。
いくつかの態様において、gapmerは5'-X-Y-Z-3'構成を含み、XおよびZは独立して長さが1～7(例として、1、2、3、4、5、6、または7)ヌクレオシドであり、Yは長さが6～10(例として、6、7、8、9、または10)ヌクレオシドであり、Xの各ヌクレオシドは非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)であり、Zの各ヌクレオシドは2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)であり、Yの各ヌクレオシドは2'-デオキシリボヌクレオシドである。いくつかの態様において、gapmerは5'-X-Y-Z-3'構成を含み、XおよびZは独立して長さが1～7(例として、1、2、3、4、5、6、または7)ヌクレオシドであり、Yは長さが6～10(例として、6、7、8、9、または10)ヌクレオシドであり、Xの各ヌクレオシドは2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)であり、Zの各ヌクレオシドは非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'MOEまたは2'-O-Me)であり、Yの各ヌクレオシドは2'-デオキシリボヌクレオシドである。
いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)は1以上の非二環式2'-修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-OMe)および1以上の2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)を含む。いくつかの態様において、gapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)は1以上の非二環式2'-修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)および1以上の2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)を含む。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)およびgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)の両方とも、1以上の非二環式2'-修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-OMe)および1以上の2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)を含む。
いくつかの態様において、gapmerは5'-X-Y-Z-3'構成を含み、XおよびZは独立して長さが2～7(例として、2、3、4、5、6、または7)ヌクレオシドであり、Yは長さが6～10(例として、6、7、8、9、または10)ヌクレオシドであり、X(最も5'の位置は位置1である)の位置1、2、3、4、5、6、または7のすべてではないが少なくとも1つ(例として、1、2、3、4、5、または6)は非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)であり、XおよびZ両方のヌクレオシドの残りは2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)であり、Yの各ヌクレオシドは2'デオキシリボヌクレオシドである。いくつかの態様において、gapmerは5'-X-Y-Z-3'構成を含み、XおよびZは独立して長さが2～7(例として、2、3、4、5、6、または7)ヌクレオシドであり、Yは長さが6～10(例として、6、7、8、9、または10)ヌクレオシドであり、Z(最も5'の位置は位置1である)の位置1、2、3、4、5、6、または7のすべてではないが少なくとも1つ(例として、1、2、3、4、5、または6)は、非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)であり、XおよびZ両方のヌクレオシドの残りは2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)であり、Yの各ヌクレオシドは2'デオキシリボヌクレオシドである。いくつかの態様において、gapmerは5'-X-Y-Z-3'構成を含み、ここでXおよびZは、独立して、長さが2～7(例として、2、3、4、5、6、または7)ヌクレオシドであり、Yは、長さが6～10(例として、6、7、8、9、または10)ヌクレオシドであり、ここでXの位置1、2、3、4、5、6、または7のすべてではないが少なくとも1つ(例として、1、2、3、4、5、または6)と、Z(最も5'の位置は位置1である)のすべてではないが、1、2、3、4、5、6、または7の位置(例として、1、2、3、4、5、または6)の少なくとも1つの位置とが、非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)であり、XおよびZ両方のヌクレオシドの残りは2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)であり、Yの各ヌクレオシドは2'デオキシリボヌクレオシドである。
非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)および2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)のミックスをgapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)および/またはgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)に有するgapmer構成の非限定例は、以下:BBB-(D)n-BBBAA;KKK-(D)n-KKKAA;LLL-(D)n-LLLAA;BBB-(D)n-BBBEE;KKK-(D)n-KKKEE;LLL-(D)n-LLLEE;BBB-(D)n-BBBAA;KKK-(D)n-KKKAA;LLL-(D)n-LLLAA;BBB-(D)n-BBBEE;KKK-(D)n-KKKEE;LLL-(D)n-LLLEE;BBB-(D)n-BBBAAA;KKK-(D)n-KKKAAA;LLL-(D)n-LLLAAA;BBB-(D)n-BBBEEE;KKK-(D)n-KKKEEE;LLL-(D)n-LLLEEE;BBB-(D)n-BBBAAA;KKK-(D)n-KKKAAA;LLL-(D)n-LLLAAA;BBB-(D)n-BBBEEE;KKK-(D)n-KKKEEE;LLL-(D)n-LLLEEE;BABA-(D)n-ABAB;KAKA-(D)n-AKAK;LALA-(D)n-ALAL;BEBE-(D)n-EBEB;KEKE-(D)n-EKEK;LELE-(D)n-ELEL;BABA-(D)n-ABAB;KAKA-(D)n-AKAK;LALA-(D)n-ALAL;BEBE-(D)n-EBEB;KEKE-(D)n-EKEK;LELE-(D)n-ELEL;ABAB-(D)n-ABAB;AKAK-(D)n-AKAK;ALAL-(D)n-ALAL;EBEB-(D)n-EBEB;EKEK-(D)n-EKEK;ELEL-(D)n-ELEL;ABAB-(D)n-ABAB;AKAK-(D)n-AKAK;ALAL-(D)n-ALAL;EBEB-(D)n-EBEB;EKEK-(D)n-EKEK;ELEL-(D)n-ELEL;AABB-(D)n-BBAA;BBAA-(D)n-AABB;AAKK-(D)n-KKAA;AALL-(D)n-LLAA;EEBB-(D)n-BBEE;EEKK-(D)n-KKEE;EELL-(D)n-LLEE;AABB-(D)n-BBAA;AAKK-(D)n-KKAA;AALL-(D)n-LLAA;EEBB-(D)n-BBEE;EEKK-(D)n-KKEE;EELL-(D)n-LLEE;BBB-(D)n-BBA;KKK-(D)n-KKA;LLL-(D)n-LLA;BBB-(D)n-BBE;KKK-(D)n-KKE;LLL-(D)n-LLE;BBB-(D)n-BBA;KKK-(D)n-KKA;LLL-(D)n-LLA;BBB-(D)n-BBE;KKK-(D)n-KKE;LLL-(D)n-LLE;BBB-(D)n-BBA;KKK-(D)n-KKA;LLL-(D)n-LLA;BBB-(D)n-BBE;KKK-(D)n-KKE;LLL-(D)n-LLE;ABBB-(D)n-BBBA;AKKK-(D)n-KKKA;ALLL-(D)n-LLLA;EBBB-(D)n-BBBE;EKKK-(D)n-KKKE;ELLL-(D)n-LLLE;ABBB-(D)n-BBBA;AKKK-(D)n-KKKA;ALLL-(D)n-LLLA;EBBB-(D)n-BBBE;EKKK-(D)n-KKKE;ELLL-(D)n-LLLE;ABBB-(D)n-BBBAA;AKKK-(D)n-KKKAA;ALLL-(D)n-LLLAA;EBBB-(D)n-BBBEE;EKKK-(D)n-KKKEE;ELLL-(D)n-LLLEE;ABBB-(D)n-BBBAA;AKKK-(D)n-KKKAA;ALLL-(D)n-LLLAA;EBBB-(D)n-BBBEE;EKKK-(D)n-KKKEE;ELLL-(D)n-LLLEE;AABBB-(D)n-BBB;AAKKK-(D)n-KKK;AALLL-(D)n-LLL;EEBBB-(D)n-BBB;EEKKK-(D)n-KKK;EELLL-(D)n-LLL;AABBB-(D)n-BBB;AAKKK-(D)n-KKK;AALLL-(D)n-LLL;EEBBB-(D)n-BBB;EEKKK-(D)n-KKK;EELLL-(D)n-LLL;AABBB-(D)n-BBBA;AAKKK-(D)n-KKKA;AALLL-(D)n-LLLA;EEBBB-(D)n-BBBE;EEKKK-(D)n-KKKE;EELLL-(D)n-LLLE;AABBB-(D)n-BBBA;AAKKK-(D)n-KKKA;AALLL-(D)n-LLLA;EEBBB-(D)n-BBBE;EEKKK-(D)n-KKKE;EELLL-(D)n-LLLE;ABBAABB-(D)n-BB;AKKAAKK-(D)n-KK;ALLAALLL-(D)n-LL;EBBEEBB-(D)n-BB;EKKEEKK-(D)n-KK;ELLEELL-(D)n-LL;ABBAABB-(D)n-BB;AKKAAKK-(D)n-KK;ALLAALL-(D)n-LL;EBBEEBB-(D)n-BB;EKKEEKK-(D)n-KK;ELLEELL-(D)n-LL;ABBABB-(D)n-BBB;AKKAKK-(D)n-KKK;ALLALLL-(D)n-LLL;EBBEBB-(D)n-BBB;EKKEKK-(D)n-KKK;ELLELL-(D)n-LLL;ABBABB-(D)n-BBB;AKKAKK-(D)n-KKK;ALLALL-(D)n-LLL;EBBEBB-(D)n-BBB;EKKEKK-(D)n-KKK;ELLELL-(D)n-LLL;EEEK-(D)n-EEEEEEEE;EEK-(D)n-EEEEEEEEE;EK-(D)n-EEEEEEEEEE;EK-(D)n-EEEKK;K-(D)n-EEEKEKE;K-(D)n-EEEKEKEE;K-(D)n-EEKEK;EK-(D)n-EEEEKEKE;EK-(D)n-EEEKEK;EEK-(D)n-KEEKE;EK-(D)n-EEKEK;EK-(D)n-KEEK;EEK-(D)n-EEEKEK;EK-(D)n-KEEEKEE;EK-(D)n-EEKEKE;EK-(D)n-EEEKEKE;およびEK-(D)n-EEEEKEKを包含し;「A」ヌクレオシドは2'修飾ヌクレオシドを含み;「B」は2'-4'二環式ヌクレオシドを表し;「K」は-拘束エチルヌクレオシド(cEt)を表し;「L」はLNAヌクレオシドを表し;「E」は2'-MOE修飾リボヌクレオシドを表し;「D」は2'デオキシリボヌクレオシドを表し;「n」はギャップセグメント(5'-X-Y-Z-3'構成のY)の長さを表し、1～20の間の整数である。
いくつかの態様において、本明細書に記載のgapmerのいずれか1つは、1以上の修飾されたヌクレオシド連結(例として、ホスホロチオアート連結)をX、Y、およびZ領域の各々に含む。いくつかの態様において、本明細書に記載のgapmerのいずれか1つにおける各ヌクレオシド間連結はホスホロチオアート連結である。いくつかの態様において、X、Y、およびZ領域の各々は、独立して、ホスホロチオアート連結およびホスホジエステル連結のミックスを含む。いくつかの態様において、ギャップ領域Yの各ヌクレオシド間連結はホスホロチオアート連結であり、5'ウイング領域Xはホスホロチオアート連結およびホスホジエステル連結のミックスを含み、3'ウイング領域Zはホスホロチオアート連結およびホスホジエステル連結のミックスを含む。
ｉ．RNA干渉(RNAi)
いくつかの態様において、本明細書に提供されるDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、低分子干渉RNAまたはサイレンシングRNAとしても知られている、低分子干渉RNA(siRNA)の形態であってもよい。siRNAは、二本鎖RNA分子の類であって、細胞中のRNA干渉(RNAi)経路を介した分解のために核酸(例として、mRNA)を標的にする、典型的には長さが約20～25塩基対である。siRNA分子の特異性は、アンチセンス鎖分子のその標的RNAへの結合によって決定されてもよい。有効なsiRNA分子は一般に、より長いsiRNAもまた有効であり得るが、細胞中の非特異的なRNA干渉経路の引き金を、インターフェロン応答を介して引くことを防止するため、長さが30～35未満の塩基対である。いくつかの態様において、siRNA分子は長さが7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50塩基対、またはより多くである。いくつかの態様において、siRNA分子は長さが8～30塩基対、長さが10～15塩基対、長さが10～20塩基対、長さが15～25塩基対、長さが19～21塩基対、長さが21～23塩基対である。いくつかの態様において、siRNA分子は、長さが8～32塩基対、長さが8～29塩基対、長さが8～27塩基対、長さが15～32塩基対、長さが15～29塩基対、長さが15～27塩基対、長さが21～31塩基対、長さが21～29塩基対、長さが21～27塩基対、長さが21～23塩基対、長さが23～32塩基対、長さが23～29塩基対、または長さが23～27塩基対である。
適切な標的RNA配列の選択を受けて、すべてのまたは一部の標的配列に相補的なヌクレオチド配列、すなわちアンチセンス配列を含むsiRNA分子は、適切な方法(例として、PCT刊行物第WO2004/016735号;および米国特許刊行物第2004/0077574号および第2008/0081791号を見よ)を使用して設計および調製され得る。
siRNA分子は、二本鎖(すなわち、アンチセンス鎖と相補的センス鎖とを含むdsRNA分子)または一本鎖(すなわち、アンチセンス鎖だけを含むssRNA分子)であり得る。siRNA分子は、自己相補的センスおよびアンチセンス鎖を有する、二重鎖、非対称二重鎖、ヘアピン、または非対称ヘアピン2次構造を含み得る。いくつかの態様において、本明細書に記載のDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖およびセンス鎖を含むsiRNAである。
いくつかの態様において、siRNA分子のアンチセンス鎖は長さが7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50ヌクレオチド、またはより多くである。いくつかの態様において、アンチセンス鎖は長さが8～50ヌクレオチド、長さが8～40ヌクレオチド、長さが8～30ヌクレオチド、長さが10～15ヌクレオチド、長さが10～20ヌクレオチド、長さが15～25ヌクレオチド、長さが19～21ヌクレオチド、長さが21～23ヌクレオチドである。いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、長さが8～32ヌクレオチド、長さが8～29ヌクレオチド、長さが8～27ヌクレオチド、長さが15～32ヌクレオチド、長さが15～29ヌクレオチド、長さが15～27ヌクレオチド、長さが21～31ヌクレオチド、長さが21～29ヌクレオチド、長さが21～27ヌクレオチド、長さが21～23ヌクレオチド、長さが23～32ヌクレオチド、長さが23～29ヌクレオチド、または長さが23～27ヌクレオチドである。
いくつかの態様において、siRNA分子のセンス鎖は長さが7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50ヌクレオチド、またはより多くである。いくつかの態様において、センス鎖は長さが8～50ヌクレオチド、長さが8～40ヌクレオチド、長さが8～30ヌクレオチド、長さが10～15ヌクレオチド、長さが10～20ヌクレオチド、長さが15～25ヌクレオチド、長さが19～21ヌクレオチド、長さが21～23ヌクレオチドである。いくつかの態様において、センス鎖は、長さが8～32ヌクレオチド、長さが8～29ヌクレオチド、長さが8～27ヌクレオチド、長さが15～32ヌクレオチド、長さが15～29ヌクレオチド、長さが15～27ヌクレオチド、長さが21～31ヌクレオチド、長さが21～29ヌクレオチド、長さが21～27ヌクレオチド、長さが21～23ヌクレオチド、長さが23～32ヌクレオチド、長さが23～29ヌクレオチド、または長さが23～27ヌクレオチドである。
いくつかの態様において、siRNA分子は、DUX4 mRNA上の標的領域に対する相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの態様において、相補性の領域は、DUX4 mRNA上の標的領域に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または100％相補的である。いくつかの態様において、標的領域は、DUX4 mRNA上の一続きのヌクレオチドの領域である。いくつかの態様において、標的RNA配列について特異的にハイブリダイゼーション可能または特異的であるためには、相補的なヌクレオチド配列は、その標的のものに対して100％相補的である必要はない。
いくつかの態様において、siRNA分子はDUX4 RNA配列に対する相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含み、相補性の領域は長さが8～15、8～30、8～40、または10～50、または5～50、または5～40ヌクレオチドの範囲である。いくつかの態様において、相補性の領域は長さが5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50ヌクレオチドである。いくつかの態様において、相補性の領域は、DUX4 RNA配列の少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、またはより多くの一続きのヌクレオチドと相補的である。いくつかの態様において、相補性の領域は、DUX4 RNA配列の相補的な部分と比較して1、2、3、4、または5塩基以下のミスマッチを含有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、相補性の領域は、15塩基にわたり最大3つまでのミスマッチ、または10塩基にわたり最大2つまでのミスマッチを有するヌクレオチド配列を含む。
いくつかの態様において、siRNA分子は、配列番号163～1574のいずれか1つで表されるとおりの標的配列に対し(例として、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または100％)相補的であるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの態様において、siRNA分子は、長さが18～25ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、かつ配列番号163～1574のいずれか1つで表されるとおりの標的配列に対し、少なくとも15ヌクレオチド(例として、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、または少なくとも19ヌクレオチド)の相補性の領域を含む。
いくつかの態様において、siRNA分子は、配列番号2987～3026のいずれか1つで表されるとおりの標的配列に対し(例として、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または100％)相補的であるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの態様において、siRNA分子は、長さが18～25ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、かつ配列番号2987～3026のいずれか1つで表されるとおりの標的配列に対し、少なくとも15ヌクレオチド(例として、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、または少なくとも19ヌクレオチド)の相補性の領域を含む。
いくつかの態様において、siRNA分子は、配列番号1575～2986および3027～3066のいずれか1つで表されるとおりのオリゴヌクレオチドと少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または100％同一のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの態様において、siRNA分子は、長さが18～25ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、かつ配列番号1575～2986および3027～3066のいずれか1つで表されるとおりのオリゴヌクレオチドの、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、または少なくとも19の連続したヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、siRNA分子は、配列番号3027～3066のいずれか1つで表されるとおりのオリゴヌクレオチドと少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または100％同一のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの態様において、siRNA分子は、配列番号3027～3066のいずれか1つで表されるとおりのオリゴヌクレオチドの、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、または少なくとも23の連続したヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含む。
二本鎖siRNAは、同じ長さまたは異なる長さのセンスRNA鎖およびアンチセンスRNA鎖を含んでいてもよい。二本鎖siRNA分子はまた、ステムループ構造の単一オリゴヌクレオチド(ここでsiRNA分子の自己相補的センスおよびアンチセンス領域は、核酸ベースのまたは非核酸ベースのリンカー(単数または複数)を用いて連結されている)、ならびに2以上のループ構造と自己相補的センスおよびアンチセンス鎖を含むステムとを有する環状一本鎖RNA(ここで環状RNAは、in vivoまたはin vitroのいずれかで処理されてRNAiを媒介することが可能な活性siRNA分子を生成し得る)からも会合され得る。よって小さいヘアピンRNA(shRNA)分子もまた、本明細書に企図される。これらの分子は、逆相補的(センス)配列に加えて、特定のアンチセンス配列を含み、典型的にはスペーサーまたはループ配列によって分離されている。スペーサーまたはループの切断は、(任意に、片鎖または両鎖の3'末端および/または(例として、および)5'末端から1、2、3以上のヌクレオチドの付加または除去をもたらすこともある追加のプロセシングステップにより)一本鎖RNA分子およびその逆相補体を、それらがアニールしてdsRNA分子を形成し得るように提供する。スペーサーは、スペーサーの切断(および任意に、これに続く、片鎖または両鎖の3'末端および/または(例として、および)5'末端から1、2、3、4、もしくはこれより多いヌクレオチドの付加または除去をもたらすこともあるプロセシングステップ)に先立ちアンチセンス配列とセンス配列とをアニールさせて二本鎖構造体(またはステム)を形成させるのに充分な長さであり得る。スペーサー配列は、2つの相補的ヌクレオチド配列領域間に置かれた無関係なヌクレオチド配列であってもよく、前記領域はアニールして二本鎖核酸になったらshRNAを含むことになる。
siRNA分子の全体的な長さは、設計されたsiRNA分子のタイプに応じて、約14ヌクレオチドから約100ヌクレオチドまで変動し得る。一般に、約14と約50との間のこれらヌクレオチドは、RNA標的配列に相補的である、すなわちsiRNA分子の特定のアンチセンス配列を構成する。例えば、siRNAが二本鎖siRNAまたは一本鎖siRNAであるとき、長さは約14ヌクレオチドから約50ヌクレオチドまで変動し得るが一方、siRNAがshRNAまたは環状分子であるとき、長さは約40ヌクレオチドから約100ヌクレオチドまで変動し得る。
siRNA分子は、分子の一方の末端にて3'突出を含んでいてもよい。他方の末端は平滑末端であっても、または突出(5'または3')も有していてよい。siRNA分子が分子の両末端にて突出を含むとき、突出の長さは、同じであっても、または異なっていてもよい。一態様において、本開示のsiRNA分子は、分子の両末端上に約1～約3(例として、1、2、3)ヌクレオチドの3'突出を含む。いくつかの態様において、siRNA分子は約1～約3(例として、1、2、3)ヌクレオチドの3'突出をセンス鎖に含む。いくつかの態様において、siRNA分子は約1～約3(例として、1、2、3)ヌクレオチドの3'突出をアンチセンス鎖に含む。いくつかの態様において、siRNA分子は約1～約3ヌクレオチドの3'突出をセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方に含む。
いくつかの態様において、siRNA分子は、1以上の修飾ヌクレオチド(例として、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはより多く)を含む。いくつかの態様において、siRNA分子は、1以上の修飾ヌクレオチドおよび/または(例として、および)1以上の修飾ヌクレオシド間連結を含む。いくつかの態様において、修飾ヌクレオチドは、修飾された糖部分(例として、2'修飾ヌクレオチド)である。いくつかの態様において、siRNA分子は、1以上の2'修飾ヌクレオチド、例として、2'-デオキシ、2'-フルオロ(2'-F)、2'-O-メチル(2'-O-Me)、2'-O-メトキシエチル(2'-MOE)、2'-O-アミノプロピル(2'-O-AP)、2'-O-ジメチルアミノエチル(2'-O-DMAOE)、2'-O-ジメチルアミノプロピル(2'-O-DMAP)、2'-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2'-O-DMAEOE)、または2'-O-N-メチルアセトアミド(2'-O--NMA)を含む。いくつかの態様において、siRNA分子の各ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド(例として、2'-修飾ヌクレオチド)である。いくつかの態様において、siRNA分子は、1以上の2'-O-メチル修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、siRNA分子は、1以上の2'-F修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、siRNA分子は、1以上の2'-O-メチルおよび2'-F修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、siRNA分子は、ホスホロチオアートまたは他の修飾されたヌクレオチド間連結を含有する。いくつかの態様において、siRNA分子は、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結を含む。いくつかの態様において、siRNA分子は、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結を少なくとも2つのヌクレオチド間に含む。いくつかの態様において、siRNA分子は、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結をすべてのヌクレオチド間に含む。例えば、いくつかの態様において、siRNA分子は、修飾ヌクレオチド間連結をsiRNA分子の5'末端または3'末端の第1の、第2の、および/または(例として、および)第3のヌクレオシド間連結に含む。
いくつかの態様において、修飾されたヌクレオチド間連結はリン含有連結である。いくつかの態様において、使用され得るリン含有連結は、通常の3'-5'連結を有するホスホロチオアート、キラルホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、3'アルキレンホスホナートおよびキラルホスホナートを含むメチルおよび他のアルキルホスホナート、ホスフィナート、3'-アミノホスホロアミダートおよびアミノアルキルホスホロアミダートを含むホスホロアミダート、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびボラノホスファート、これらの2'-5'連結アナログ、ならびにヌクレオシド単位の隣接するペアが3'-5'対5'-3'または2'-5'対5'-2'で連結される逆向きの極性を有するものを包含するが、これらに限定されない;米国特許第3,687,808号;第4,469,863号;第4,476,301号;第5,023,243号;第5,177,196号;第5,188,897号;第5,264,423号;第5,276,019号;第5,278,302号;第5,286,717号;第5,321,131号;第5,399,676号;第5,405,939号;第5,453,496号;第5,455,233号;第5,466,677号;第5,476,925号;第5,519,126号;第5,536,821号;第5,541,306号;第5,550,111号;第5,563,253号;第5,571,799号;第5,587,361号;および第5,625,050号を見よ。
本明細書に記載のsiRNA分子の修飾されたケミストリーまたはフォーマットのいずれかは、互いと組み合わせられ得る。例えば、1、2、3、4、5、またはより多くの異なる型の修飾が同じsiRNA分子上に包含され得る。
いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、1以上の修飾ヌクレオチド(例として、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはより多く)を含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、1以上の修飾ヌクレオチドおよび/または(例として、および)1以上の修飾されたヌクレオチド間連結を含む。いくつかの態様において、修飾ヌクレオチドは、修飾された糖部分(例として、2'修飾ヌクレオチド)を含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、1以上の2'修飾ヌクレオチド、例として、2'-デオキシ、2'-フルオロ(2'-F)、2'-O-メチル(2'-O-Me)、2'-O-メトキシエチル(2'-MOE)、2'-O-アミノプロピル(2'-O-AP)、2'-O-ジメチルアミノエチル(2'-O-DMAOE)、2'-O-ジメチルアミノプロピル(2'-O-DMAP)、2'-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2'-O-DMAE0E)、または2'-O-N--メチルアセトアミド(2'-O--NMA)を含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド(例として、2'修飾ヌクレオチド)である。いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、1以上の2'-O-メチル修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、1以上の2'-F修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、1以上の2'-O-メチルおよび2'-F修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、ホスホロチオアートまたは他の修飾されたヌクレオチド間連結を含有する。いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結を含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結を少なくとも2つのヌクレオチド間に含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結をすべてのヌクレオチド間に含む。例えば、いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、修飾ヌクレオチド間連結をsiRNA分子の5'末端または3'末端の第1の、第2の、および/または(例として、および)第3のヌクレオシド間連結に含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖の3'末での2ヌクレオシド間の連結は、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結である。
いくつかの態様において、修飾ヌクレオチド間連結は、リン含有連結である。いくつかの態様において、使用され得るリン含有連結は、通常の3'-5'連結を有するホスホロチオアート、キラルホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、3'アルキレンホスホナートおよびキラルホスホナートを含むメチルおよび他のアルキルホスホナート、ホスフィナート、3'-アミノホスホロアミダートおよびアミノアルキルホスホロアミダートを含むホスホロアミダート、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびボラノホスファート、これらの2'-5'連結アナログ、ならびにヌクレオシド単位の隣接するペアが3'-5'対5'-3'または2'-5'対5'-2'で連結される逆向きの極性を有するものを包含するが、これらに限定されない;米国特許第3,687,808号;第4,469,863号;第4,476,301号;第5,023,243号;第5,177,196号;第5,188,897号;第5,264,423号;第5,276,019号;第5,278,302号;第5,286,717号;第5,321,131号;第5,399,676号;第5,405,939号;第5,453,496号;第5,455,233号;第5,466,677号;第5,476,925号;第5,519,126号;第5,536,821号;第5,541,306号;第5,550,111号;第5,563,253号;第5,571,799号;第5,587,361号;および第5,625,050号を見よ。
本明細書に記載のアンチセンス鎖の修飾されたケミストリーまたはフォーマットのいずれかは、互いと組み合わせられ得る。例えば、1、2、3、4、5、またはより多くの異なる型の修飾が同じアンチセンス鎖上に包含され得る。
いくつかの態様において、センス鎖は、1以上の修飾ヌクレオチド(例として、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはより多く)を含む。いくつかの態様において、センス鎖は、1以上の修飾ヌクレオチドおよび/または(例として、および)1以上の修飾されたヌクレオチド間連結を含む。いくつかの態様において、修飾ヌクレオチドは、修飾された糖部分(例として、2'修飾ヌクレオチド)を含む。いくつかの態様において、センス鎖は、1以上の2'修飾ヌクレオチド、例として、2'-デオキシ、2'-フルオロ(2'-F)、2'-O-メチル(2'-O-Me)、2'-O-メトキシエチル(2'-MOE)、2'-O-アミノプロピル(2'-O-AP)、2'-O-ジメチルアミノエチル(2'-O-DMAOE)、2'-O-ジメチルアミノプロピル(2'-O-DMAP)、2'-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2'-O-DMAE0E)、または2'-O-N--メチルアセトアミド(2'-O--NMA)を含む。いくつかの態様において、センス鎖の各ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド(例として、2'-修飾ヌクレオチド)である。いくつかの態様において、センス鎖は、1以上のホスホロジアミダートモルホリノを含む。いくつかの態様において、センス鎖は、ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー(PMO)である。いくつかの態様において、センス鎖は、1以上の2'-O-メチル修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、センス鎖は、1以上の2'-F修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、センス鎖は、1以上の2'-O-メチルおよび2'-F 修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、センス鎖は、ホスホロチオアートまたは他の修飾されたヌクレオチド間連結を含有する。いくつかの態様において、センス鎖は、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結を含む。いくつかの態様において、センス鎖は、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結を少なくとも2つのヌクレオチド間に含む。いくつかの態様において、センス鎖は、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結をすべてのヌクレオチド間に含む。例えば、いくつかの態様において、センス鎖は、修飾されたヌクレオチド間連結をsiRNA分子の5'末もしくは3'末の、第1の、第2の、および/または(例として、および)第3のヌクレオシド間連結に含む。いくつかの態様において、修飾されたヌクレオチド間連結は、リン含有連結である。いくつかの態様において、使用され得るリン含有連結は、通常の3'-5'連結を有するホスホロチオアート、キラルホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、3'アルキレンホスホナートおよびキラルホスホナートを含むメチルおよび他のアルキルホスホナート、ホスフィナート、3'-アミノホスホロアミダートおよびアミノアルキルホスホロアミダートを含むホスホロアミダート、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびボラノホスファート、これらの2'-5'連結アナログ、ならびにヌクレオシド単位の隣接するペアが3'-5'対5'-3'または2'-5'対5'-2'で連結される逆向きの極性を有するものを包含するが、これらに限定されない;米国特許第3,687,808号;第4,469,863号;第4,476,301号;第5,023,243号;第5,177,196号;第5,188,897号;第5,264,423号;第5,276,019号;第5,278,302号;第5,286,717号;第5,321,131号;第5,399,676号;第5,405,939号;第5,453,496号;第5,455,233号;第5,466,677号;第5,476,925号;第5,519,126号;第5,536,821号;第5,541,306号;第5,550,111号;第5,563,253号;第5,571,799号;第5,587,361号;および第5,625,050号を見よ。
本明細書に記載のセンス鎖の修飾されたケミストリーまたはフォーマットのいずれかは、互いと組み合わせられ得る。例えば、1、2、3、4、5、またはより多くの異なる型の修飾が同じセンス鎖上に包含され得る。
いくつかの態様において、siRNA分子のアンチセンスまたはセンス鎖は、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)ローディングを増強または低減する修飾を含む。いくつかの態様において、siRNA分子のアンチセンス鎖はRISCローディングを増強する修飾を含む。いくつかの態様において、siRNA分子のセンス鎖は、RISCローディングを低減およびオフターゲット効果を低減する修飾を含む。いくつかの態様において、siRNA分子のアンチセンス鎖は2'-O-メトキシエチル(2'-MOE)修飾を含む。その全体が参照によって本明細書に組み込まれるSong et al.,(2017)Mol Ther Nucleic Acids 9:242-250に記載されているとおり、切断部位における2'-O-メトキシエチル(2'-MOE)基の追加は、修飾鎖の指向的なRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)ローディングを容易化することによって、siRNAの特異性およびサイレンシング活性両方を改善する。いくつかの態様において、siRNA分子のアンチセンス鎖は2'-OMe-ホスホロジチオアート修飾を含み、これは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるWu et al.(2014)Nat Commun 5:3459に記載されているとおり、RISCローディングを増大させる。
いくつかの態様において、siRNA分子のセンス鎖は5'モルホリノを含み、これは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるKumar et al.,(2019)Chem Commun(Camb)55(35):5139-5142に記載されているとおり、センス鎖のRISCローディングを低減ならびにアンチセンス鎖選択およびRNAi活性を改善する。いくつかの態様において、siRNA分子のセンス鎖は、合成RNA様高親和性ヌクレオチドアナログのロックド核酸(LNA)によって修飾される。これは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるElman et al.,(2005)Nucleic Acids Res.33(1):439-447に記載されているとおり、センス鎖のRISCローディングを低減し、RISCへのアンチセンス鎖組み込みをさらに増強する。いくつかの態様において、siRNA分子のセンス鎖は5'アンロックド核酸(UNA)修飾を含み、これは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるSnead et al.,(2013)Mol Ther Nucleic Acids 2(7):e103に記載されているとおり、センス鎖のRISCローディングを低減し、アンチセンス鎖のサイレンシング力価(potentcy)を改善する。いくつかの態様において、siRNA分子のセンス鎖は5-ニトロインドール修飾を含み、これは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるZhang et al.,(2012)Chembiochem 13(13):1940-1945に記載されているとおり、センス鎖のRNAi力価を減少させ、オフターゲット効果を低減する。いくつかの態様において、センス鎖は2'-O'メチル(2'-O-Me)修飾を含み、これは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるZheng et al.,FASEB (2013)27(10):4017-4026に記載されているとおり、センス鎖のRISCローディングおよびオフターゲット効果を低減する。いくつかの態様において、siRNA分子のセンス鎖はモルホリノ、2'-MOE、または2'-O-Me残基によって完全に置換され、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるKole et al.,(2012)Nature reviews.Drug Discovery 11(2):125-140に記載されているとおり、RISCによって認識されない。いくつかの態様において、siRNA分子のアンチセンス鎖は2'-MOE修飾を含み、センス鎖は2'-O-Me修飾を含む(例として、Song et al.,(2017)Mol Ther Nucleic Acids 9:242-250を見よ)。いくつかの態様においては、少なくとも1つ(例として、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも10)のsiRNA分子が(例として、共有結合的に)筋標的化剤に連結される。いくつかの態様において、筋標的化剤は、核酸(例として、DNAまたはRNA)、ペプチド(例として、抗体)、脂質(例として、マイクロベシクル)、または糖部分(例として、多糖)を含み得るか、またはそれからなり得る。いくつかの態様において、筋標的化剤は抗体である。いくつかの態様において、筋標的化剤は抗トランスフェリン受容体抗体である(例として、表2～7に提供される抗TfR抗体のいずれか1つ)。いくつかの態様において、筋標的化剤はsiRNA分子のセンス鎖の5'末に連結され得る。いくつかの態様において、筋標的化剤はsiRNA分子のセンス鎖の3'末に連結され得る。いくつかの態様において、筋標的化剤はsiRNA分子のセンス鎖に内部で連結され得る。いくつかの態様において、筋標的化剤はsiRNA分子のアンチセンス鎖の5'末に連結され得る。いくつかの態様において、筋標的化剤はsiRNA分子のアンチセンス鎖の3'末に連結され得る。いくつかの態様において、筋標的化剤はsiRNA分子のアンチセンス鎖に内部で連結され得る。
DUX4標的化siRNAの非限定例は、表8に提供される。
表8．DUX4標的化オリゴヌクレオチド†
「m」は、2'-O-メチル(2'-O-Me)修飾ヌクレオシドを指し示す;「f」は、2'-フルオロ(2'-F)修飾ヌクレオシドを指し示す;「*」は、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結を指し示す;および2ヌクレオシド間に「*」が存在しないことは、ホスホジエステルヌクレオシド間連結を指し示す。
†表8に提供されるオリゴヌクレオチドおよび/または標的配列のいずれか1つにおける各ウラシル塩基(U)は、独立におよび任意に、チミン塩基(T)に置き換えられていてもよく、および/または各Tは、独立におよび任意に、Uに置き換えられていてもよい。表8に列挙される標的配列はTを含有しているが、DUX4標的化オリゴヌクレオチドのRNAおよび/またはDNAへの結合は企図される。
＾標的配列開始位置は、NM_001293798.2(配列番号160)中にある
さらなる修飾DUX4標的化siRNAの追加の非限定例は、表9に提供される。
表9．追加のDUX4標的化オリゴヌクレオチド†
「m」は、2'-O-メチル(2'-O-Me)修飾ヌクレオシドを指し示す;「f」は、2'-フルオロ(2'-F)修飾ヌクレオシドを指し示す;「mxC」は、2'-O-Me修飾5-メチル-シチジンを指し示す;「fxC」は、2'-F修飾5-メチル-シチジンを指し示す;「*」は、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結を指し示す;および2ヌクレオシド間に「*」が存在しないことは、ホスホジエステルヌクレオシド間連結を指し示す。
†表8に提供されるオリゴヌクレオチドおよび/または標的配列のいずれか1つにおける各ウラシル塩基(U)は、独立におよび任意に、チミン塩基(T)に置き換えられていてもよく、および/または各Tは、独立におよび任意に、Uに置き換えられていてもよい。表9に列挙される標的配列はTを含有しているが、DUX4標的化オリゴヌクレオチドのRNAおよび/またはDNAへの結合は企図される。
＾標的配列開始位置は、NM_001293798.2(配列番号160)中にある
いくつかの態様において、DUX4標的化オリゴヌクレオチドは、長さが18～25ヌクレオシド(例として、18、19、20、21、22、23、24、または25ヌクレオシド)であるアンチセンス鎖を含み、かつ配列番号224～226、261、265、320、341、343、356、388、466、483、494、501、509、552、560、561、601、921、942、953、1294、1296、1301、1320～1325、1373、1394、1395、1398、1523、1531、1548、1558、および1561のいずれか1つで表されるとおりの標的配列に対する相補性の領域を含み、ここで相補性の領域は、長さが少なくとも16ヌクレオチド(例として、16、17、18、または19ヌクレオチド)である。いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、長さが21ヌクレオチドであり、かつ配列番号224～226、261、265、320、341、343、356、388、466、483、494、501、509、552、560、561、601、921、942、953、1294、1296、1301、1320～1325、1373、1394、1395、1398、1523、1531、1548、1558、および1561のいずれか1つで表されるとおりの標的配列に対する相補性の領域を含み、ここで相補性の領域は、長さが19ヌクレオチドである。いくつかの態様において、相補性の領域は、その標的配列の全部または一部と完全に相補性がある。いくつかの態様において、相補性の領域は、1、2、3、またはそれ以上のミスマッチを包含する。
いくつかの態様において、DUX4標的化オリゴヌクレオチドは、配列番号3027～3066のいずれか1つのヌクレオチド配列の少なくとも15(例として、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、または少なくとも20)の連続したヌクレオシドを含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの態様において、DUX4標的化オリゴヌクレオチドは、配列番号2987～3026のいずれか1つのヌクレオチド配列の少なくとも15(例として、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、または少なくとも20)の連続したヌクレオシドを含むセンス鎖をさらに含む。
いくつかの態様において、DUX4標的化オリゴヌクレオチドは、配列番号3027～3066のいずれか1つのヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの態様において、DUX4標的化オリゴヌクレオチドは、配列番号2987～3026のいずれか1つのヌクレオチド配列を含むセンス鎖をさらに含む
いくつかの態様において、DUX4標的化オリゴヌクレオチドは、配列番号3027～3066のいずれか1つのヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖と、配列番号2987～3026のいずれか1つのヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖とを含む二本鎖オリゴヌクレオチド(例として、siRNA)であり、ここでアンチセンス鎖および/または(例として、および)は、1以上の修飾ヌクレオシド(例として、2'-修飾ヌクレオシド)を含む。いくつかの態様において、1以上の修飾ヌクレオシドは、2'-O-Meおよび2'-F修飾ヌクレオシドから選択される。
いくつかの態様において、DUX4標的化オリゴヌクレオチドは、配列番号3027～3066のいずれか1つのヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖と、配列番号2987～3026のいずれか1つのヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖とを含む二本鎖オリゴヌクレオチド(例として、siRNA)であり、ここでアンチセンス鎖中の各ヌクレオシドおよび/または(例として、および)センス鎖中の各ヌクレオシドは、2'-O-Meおよび2'-F修飾ヌクレオシドから選択される2'-修飾ヌクレオシドである。
いくつかの態様において、DUX4標的化オリゴヌクレオチドは、配列番号3027～3066のいずれか1つのヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖と、配列番号2987～3026のいずれか1つのヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖とを含む二本鎖オリゴヌクレオチド(例として、siRNA)であり、ここでアンチセンス鎖中の各ヌクレオシドおよびセンス鎖中の各ヌクレオシドは、2'-O-Meおよび2'-F修飾ヌクレオシドから選択される2'-修飾ヌクレオシドであり、ならびにここでアンチセンス鎖および/または(例として、および)センス鎖は各々、1以上のホスホロチオアートヌクレオシド間連結を含む。いくつかの態様において、センス鎖は、いずれのホスホロチオアートヌクレオシド間連結も含まず(センス鎖中のすべてのヌクレオシド間連結が、ホスホジエステルヌクレオシド間連結である)、およびアンチセンス鎖は、1、2、または3つのホスホロチオアートヌクレオシド間連結を含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、2つのホスホロチオアートヌクレオシド間連結を含み、任意にここで、アンチセンス鎖の3'末での2ヌクレオシド間の連結は、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結であり、かつアンチセンス鎖中の残りのヌクレオシド間連結は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結である。
いくつかの態様において、DUX4標的化オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖は、(5'→3'):
fNfNmNfNmNfNmNfNmNfNmNfNmNfNmNfNmNfNmNfNmN*fN*mN
の構造を含み、ここで「mN」は、2'-O-メチル(2'-O-Me)修飾ヌクレオシドを指し示す;「fN」は、2'-フルオロ(2'-F)修飾ヌクレオシドを指し示す;「*」は、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結を指し示す;および2ヌクレオシド間に「*」が存在しないことは、ホスホジエステルヌクレオシド間連結を指し示す。
いくつかの態様において、DUX4標的化オリゴヌクレオチドのセンス鎖は、(5'→3'):
mNmNfNmNfNmNfNmNfNmNfNmNfNmNfNmNfNmNfNmNfN
の構造を含み、ここで「mN」は、2'-O-メチル(2'-O-Me)修飾ヌクレオシドを指し示す;「fN」は、2'-フルオロ(2'-F)修飾ヌクレオシドを指し示す;および2ヌクレオシド間に「*」が存在しないことは、ホスホジエステルヌクレオシド間連結を指し示す。
いくつかの態様において、本明細書に記載のとおりのDUX標的化siRNのいずれか1つにおいて、センス鎖およびアンチセンス鎖のシチジン(C)の1以上(例として、1、2、3、4、5、6、7、またはそれより多く)は、2'-修飾5-メチル-シチジン(例として、2'-O-Me修飾5-メチル-シチジンまたは2'-F修飾5-メチル-シチジン)である。いくつかの態様において、本明細書に記載のとおりのDUX標的化siRNのいずれか1つにおいて、センス鎖のシチジン(C)の1以上(例として、1、2、3、4)、および/またはアンチセンス鎖のシチジン(C)の1以上(例として、1、2、3、4)は、2'-修飾5'メチル-シチジン(例として、2'-O-Me修飾5-メチル-シチジンまたは2'-F修飾5-メチル-シチジン)である。
いくつかの態様において、センスおよび/またはアンチセンス鎖のシチジンCGモチーフは、2'-修飾5-メチル-シチジン(例として、2'-O-Me修飾5-メチル-シチジンまたは2'-F修飾5-メチル-シチジン)である。いくつかの態様において、センス鎖の1以上(例として、1、2、3、4)のCGモチーフのシチジンは、2'-修飾5-メチル-シチジン(例として、2'-O-Me修飾5-メチル-シチジンまたは2'-F修飾5-メチル-シチジン)である。いくつかの態様において、アンチセンス鎖の1以上(例として、1、2、3、4)CGモチーフのシチジンは、2'-修飾5-メチル-シチジン(例として、2'-O-Me修飾5-メチル-シチジンまたは2'-F修飾5-メチル-シチジン)である。いくつかの態様において、センス鎖の1以上(例として、1、2、3、4)のCGモチーフのシチジンは、2'-修飾5-メチル-シチジン(例として、2'-O-Me修飾5-メチル-シチジンまたは2'-F修飾5-メチル-シチジン)である;およびアンチセンス鎖の1以上(例として、1、2、3、4)のCGモチーフのシチジンは、2'-修飾5-メチル-シチジン(例として、2'-O-Me修飾5-メチル-シチジンまたは2'-F修飾5-メチル-シチジン)である。
いくつかの態様において、DUX4標的化オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖は、表8に列挙される配列番号3027～3066の修飾バージョンから選択される。いくつかの態様において、DUX4標的化オリゴヌクレオチドのセンス鎖は、表8に列挙される配列番号2987～3026の修飾バージョンから選択される。いくつかの態様において、DUX4標的化オリゴヌクレオチドは、表8に列挙されるsiRNAから選択されるsiRNAである。
いくつかの態様において、DUX4標的化オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖は、表9に列挙される配列番号3027、3037、3039、3040、3041、3044、3052、および3061のいずれか1つの修飾バージョンから選択される。いくつかの態様において、のセンス鎖 DUX4標的化オリゴヌクレオチドは、表9に列挙される配列番号2987、2997、2999、3000、3001、3004、3012、および3021のいずれか1つの修飾バージョンから選択される。いくつかの態様において、DUX4標的化オリゴヌクレオチドは、表9に列挙されるsiRNAから選択されるsiRNAである。
いくつかの態様において、DUX4標的化オリゴヌクレオチド(例として、表8中のsiRNAから選択されるDUX4標的化siRNA)のいずれか1つは、例として、ナトリウム、カリウム、マグネシウムの塩として、塩の形態にあり得る。いくつかの態様において、DUX4標的化オリゴヌクレオチド(例として、表9中のsiRNAから選択されるDUX4標的化siRNA)のいずれか1つは、例として、ナトリウム、カリウム、マグネシウムの塩として、塩の形態にあり得る。
いくつかの態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド(例として、表8に列挙されるオリゴヌクレオチド)のいずれか1つの5'または3'ヌクレオシド(例として、末端ヌクレオシド)は、任意にスペーサーを介して、アミン基へ抱合されている。いくつかの態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド(例として、表9に列挙されるオリゴヌクレオチド)のいずれか1つの5'または3'ヌクレオシド(例として、末端ヌクレオシド)は、任意にスペーサーを介して、アミン基へ抱合されている。いくつかの態様において、スペーサーは、脂肪族部分を含む。いくつかの態様において、スペーサーは、ポリエチレングリコール部分を含む。いくつかの態様において、ホスホジエステル連結は、オリゴヌクレオチドのスペーサーと5'または3'ヌクレオシドとの間に存在する。いくつかの態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド(例として、表8に列挙されるオリゴヌクレオチド)のいずれかの5'または3'ヌクレオシド(例として、末端ヌクレオシド)は、スペーサーへ抱合されているが、前記スペーサーは、置換もしくは非置換の脂肪族、置換もしくは非置換のヘテロ脂肪族、置換もしくは非置換のカルボシクリレン、置換もしくは非置換のヘテロシクリレン、置換もしくは非置換のアリーレン、置換もしくは非置換のヘテロアリーレン、-O-、-N(RA)-、-S-、-C(=O)-、-C(=O)O-、-C(=O)NRA-、-NRAC(=O)-、-NRAC(=O)RA-、-C(=O)RA-、-NRAC(=O)O-、-NRAC(=O)N(RA)-、-OC(=O)-、-OC(=O)O-、-OC(=O)N(RA)-、-S(O)2NRA-、-NRAS(O)2-、またはそれらの組み合わせである;各RAは、独立して、水素、または置換もしくは非置換のアルキルである。いくつかの態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド(例として、表9に列挙されるオリゴヌクレオチド)のいずれかの5'または3'ヌクレオシド(例として、末端ヌクレオシド)は、スペーサーへ抱合されているが、前記スペーサーは、置換もしくは非置換の脂肪族、置換もしくは非置換のヘテロ脂肪族、置換もしくは非置換のカルボシクリレン、置換もしくは非置換のヘテロシクリレン、置換もしくは非置換のアリーレン、置換もしくは非置換のヘテロアリーレン、-O-、-N(RA)-、-S-、-C(=O)-、-C(=O)O-、-C(=O)NRA-、-NRAC(=O)-、-NRAC(=O)RA-、-C(=O)RA-、-NRAC(=O)O-、-NRAC(=O)N(RA)-、-OC(=O)-、-OC(=O)O-、-OC(=O)N(RA)-、-S(O)2NRA-、-NRAS(O)2-、またはそれらの組み合わせである;各RAは、独立して、水素、または置換もしくは非置換のアルキルである。ある態様において、スペーサーは、置換もしくは非置換のアルキレン、置換もしくは非置換のヘテロシクリレン、置換もしくは非置換のヘテロアリーレン、-O-、-N(RA)-、または-C(=O)N(RA)2、あるいはそれらの組み合わせである。
いくつかの態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド(例として、表8に列挙されるオリゴヌクレオチド、センスもしくはアンチセンス鎖)のいずれか1つの5'または3'ヌクレオシドは、式-NH2-(CH2)n-(式中nは、1から12までの整数である)で表される化合物へ抱合されている。いくつかの態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド(例として、表9に列挙されるオリゴヌクレオチド、センスもしくはアンチセンス鎖)のいずれか1つの5'または3'ヌクレオシドは、式-NH2-(CH2)n-(式中nは、1から12までの整数である)で表される化合物へ抱合されている。いくつかの態様において、nは、6、7、8、9、10、11、または12である。いくつかの態様において、ホスホジエステル連結は、オリゴヌクレオチド(例として、表8に列挙されるオリゴヌクレオチド、センスもしくはアンチセンス鎖)の式NH2-(CH2)n-で表される化合物と5'または3'ヌクレオシドとの間に存在する。いくつかの態様において、ホスホジエステル連結は、オリゴヌクレオチド(例として、表9に列挙されるオリゴヌクレオチド、センスもしくはアンチセンス鎖)の式NH2-(CH2)n-で表される化合物と5'または3'ヌクレオシドとの間に存在する。いくつかの態様において、式NH2-(CH2)6-で表される化合物は、6-アミノ-1-ヘキサノール(NH2-(CH2)6-OH)とオリゴヌクレオチドの5'ホスファート(例として、センスまたはアンチセンス鎖の5'ホスファート)との間の反応を介してオリゴヌクレオチドへ抱合されている。いくつかの態様において、式NH2-(CH2)6-で表される化合物は、6-アミノ-1-ヘキサノール(NH2-(CH2)6-OH)とオリゴヌクレオチドの3'ホスファート(例として、センスまたはアンチセンス鎖の3'ホスファート)との間の反応を介してオリゴヌクレオチドへ抱合されている。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、例としてアミン基を介し、標的化剤、例として抗TfR抗体などの筋標的化剤へ抱合されている。
Ｃ．リンカー
本明細書に記載の複合体は一般に、本明細書に記載の抗TfR抗体のいずれか１つを分子ペイロードへ接続するリンカーを含む。リンカーは、少なくとも1つの共有結合を含む。いくつかの態様において、リンカーは、抗TfR抗体を分子ペイロードへ接続する単結合、例として、ジスルフィド結合またはジスルフィド架橋であってもよい。しかしながら、いくつかの態様において、リンカーは、複数の共有結合を通して、本明細書に記載の抗TfR抗体のいずれか１つを分子ペイロードへ接続していてもよい。いくつかの態様において、リンカーは、切断可能なリンカーであってもよい。しかしながら、いくつかの態様において、リンカーは、切断不能なリンカーであってもよい。リンカーは一般に、in vitroおよびin vivoで安定しており、ある細胞環境において安定していてもよい。加えて、一般にリンカーは、抗TfR抗体または分子ペイロードのいずれかの機能特性に負の影響を及ぼさない。リンカー合成の例および方法は、当該技術分野において知られている(例として、Kline,T.et al."Methods to Make Homogenous Antibody Drug Conjugates."Pharmaceutical Research,2015,32:11,3480-3493.;Jain,N.et al."Current ADC Linker Chemistry"Pharm Res.2015,32:11,3526-3540.;McCombs,J.R. and Owen,S.C."Antibody Drug Conjugates:Design and Selection of Linker,Payload and Conjugation Chemistry"AAPS J.2015,17:2,339-351.を見よ)。
リンカーの前駆体は、典型的には、抗TfR抗体と分子ペイロードとの両方へ付着できる2つの異なる反応性の高い種を含有しているであろう。いくつかの態様において、2つの異なる反応性の高い種は、求核試薬および/または(例として、および)求電子試薬であってもよい。いくつかの態様において、リンカーは、抗TfR抗体のリシン残基またはシステイン残基への抱合を介して、抗TfR抗体へ接続されている。いくつかの態様において、リンカーは、マレイミド含有リンカーを介して抗TfR抗体のシステイン残基へ接続されており、ここで任意に、マレイミド含有リンカーは、マレイミドカプロイルまたはマレイミドメチルシクロヘキサン-1-カルボキシラート基を含む。いくつかの態様において、リンカーは、3-アリールプロピオニトリル官能基を介して、抗TfR抗体のシステイン残基またはチオール官能化分子ペイロードへ接続されている。いくつかの態様において、リンカーは、抗TfR抗体のリシン残基へ接続されている。いくつかの態様において、リンカーは、アミド結合、カルバマート結合、ヒドラジド、トリアゾール、チオエーテル、またはジスルフィド結合を介して、抗TfR抗体および/または(例として、および)分子ペイロードへ接続されている。
ｉ．切断可能なリンカー
切断可能なリンカーは、プロテアーゼ感受性リンカー、pH感受性リンカー、またはグルタチオン感受性リンカーであってもよい。これらのリンカーは一般に、細胞内のみで切断可能であって、好ましくは、細胞外環境において、例として、筋細胞の細胞外において安定している。
プロテアーゼ感受性リンカーは、プロテアーゼ酵素活性によって切断可能である。これらのリンカーは、典型的にはペプチド配列を含んでおり、長さが2～10アミノ酸、約2～5アミノ酸、約5～10アミノ酸、約10アミノ酸、約5アミノ酸、約3アミノ酸、または約2アミノ酸であってもよい。いくつかの態様において、ペプチド配列は、天然に存在するアミノ酸、例として、システイン、アラニン、または天然に存在しないかもしくは修飾されたアミノ酸を含んでいてもよい。天然に存在しないアミノ酸は、β-アミノ酸、ホモ-アミノ酸、プロリン誘導体、3-置換アラニン誘導体、線形コアアミノ酸(linear core amino acids)、N-メチルアミノ酸、および当該技術分野において知られているその他のアミノ酸を包含する。いくつかの態様において、プロテアーゼ感受性リンカーは、バリン-シトルリン配列またはアラニン-シトルリン配列を含む。いくつかの態様において、プロテアーゼ感受性リンカーは、リソソームのプロテアーゼ、例として、カテプシンB、および/またはエンドソームのプロテアーゼによって切断され得る。
pH感受性リンカーは、高または低pH環境において容易に分解される共有結合の連結である。いくつかの態様において、pH感受性リンカーは、4～6の範囲にあるpHにて切断されてもよい。いくつかの態様において、pH感受性リンカーは、ヒドラゾンまたは環状アセタールを含む。いくつかの態様において、pH感受性リンカーは、エンドソームまたはリソソーム内で切断される。
いくつかの態様において、グルタチオン感受性リンカーは、ジスルフィド部を含む。いくつかの態様において、グルタチオン感受性リンカーは、細胞内部でのグルタチオン種とのジスルフィド交換反応によって切断される。いくつかの態様において、ジスルフィド部はさらに、少なくとも1アミノ酸、例としてシステイン残基を含む。
いくつかの態様において、リンカーは、Val-citリンカー(例として、US米国特許6,214,345(参照により本明細書に組み込まれる)に記載されるとおり)である。いくつかの態様において、抱合前のval-citリンカーは、以下の構造:
を有する。
いくつかの態様において、抱合後のval-citリンカーは、以下の構造:
を有する。
いくつかの態様において、Val-citリンカーは、反応性の化学的部分(例として、クリックケミストリー抱合のためのSPAAC)へ付着される。いくつかの態様においては、クリックケミストリー抱合前に、反応性の高い化学的部分(例として、クリックケミストリー抱合のためのSPAAC)へ付着されるval-citリンカーは、以下の構造:
を有し、式中、nは0～10のいずれかの数である。いくつかの態様において、nは3である。
いくつかの態様において、反応性の高い化学的部分(例として、クリックケミストリー抱合のためのSPAAC)へ付着されるval-citリンカーは、(例として、異なる化学的部分を介して)分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド)へ抱合される。いくつかの態様において、反応性の高い化学的部分(例として、クリックケミストリー抱合のためのSPAAC)へ付着され、分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド)へ抱合されるval-citリンカーは(クリックケミストリー抱合前に)、式(A)で表される構造:
を有し、式中nは0～10のいずれかの数である。いくつかの態様において、nは3である。
いくつかの態様においては、分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド)への抱合後、val-citリンカーは、式(B)で表される構造:
を含み、式中nは0～10のいずれかの数であり、ここでmは0～10のいずれかの数である。いくつかの態様において、nは3であり、およびmは4である。
ii．切断不能なリンカー
いくつかの態様において、切断不能なリンカーが使用されてもよい。一般に、切断不能なリンカーは、細胞環境または生理環境において容易に分解され得ない。いくつかの態様において、切断不能なリンカーは、任意に置換されていてもよいアルキル基を含むが、ここで置換は、ハロゲン、ヒドロキシル基、酸素種、および他の一般的な置換を包含していてもよい。いくつかの態様において、リンカーは、任意に置換されていてもよいアルキル、任意に置換されていてもよいアルキレン、任意に置換されていてもよいアリーレン、ヘテロアリーレン、少なくとも1つの非天然アミノ酸を含むペプチド配列、トランケートされたグリカン、酵素的に分解され得ない糖(単数もしくは複数)、アジド、アルキン-アジド、LPXT配列を含むペプチド配列、チオエーテル、ビオチン、ビフェニル、反復単位のポリエチレングリコールもしくは等価な化合物、酸エステル、酸アミド、スルファミド、および/または(例として、および)、アルコキシ-アミンリンカーを含んでいてもよい。いくつかの態様において、ソルターゼ媒介ライゲーションは、LPXT配列を含む抗TfR抗体を(G)n配列を含む分子ペイロードへ連結するために利用されるであろう(例として、Proft T.Sortase-mediated protein ligation:an emerging biotechnology tool for protein modification and immobilization.Biotechnol Lett.2010,32(1):1-10を見よ)。
いくつかの態様において、リンカーは、置換されたアルキレン、任意に置換されていてもよいアルケニレン、任意に置換されていてもよいアルキニレン、任意に置換されていてもよいシクロアルキレン、任意に置換されていてもよいシクロアルケニレン、任意に置換されていてもよいアリーレン、N、O、およびSから選択される少なくとも1個のヘテロ原子をさらに含む任意に置換されていてもよいヘテロアリーレン;N、O、およびSから選択される少なくとも1個のヘテロ原子をさらに含む任意に置換されていてもよいヘテロシクリレン;イミノ、任意に置換されていてもよい窒素種、任意に置換されていてもよい酸素種O、任意に置換されていてもよい硫黄種、またはポリ(アルキレンオキシド)、例として、ポリエチレンオキシドまたはポリプロピレンオキシドを含んでいてもよい。
いくつかの態様において、リンカーは、以下の構造:
を有するビス-PFP単分散(monodidispersed)PEGを含んでいてもよく、ここでnは、1～10である。
iii．リンカー抱合
いくつかの態様において、リンカーは、ホスファート、チオエーテル、エーテル、炭素-炭素、カルバマート、もしくはアミド結合を介して抗TfR抗体および/または(例として、および)分子ペイロードへ接続されている。いくつかの態様において、リンカーは、リン酸塩またはホスホロチオアート基、例として、オリゴヌクレオチド主鎖の末端のホスファートを通してオリゴヌクレオチドへ接続されている。いくつかの態様において、リンカーは、抗TfR抗体上に存在するリシン残基またはシステイン残基を通して、抗TfR抗体へ接続されている。
いくつかの態様において、リンカーは、トリアゾールを形成するアジドとアルキンとの間のシクロ付加反応によって、抗TfR抗体および/または(例として、および)分子ペイロードへ接続されており、ここでアジドおよびアルキンは、抗TfR抗体、分子ペイロード、またはリンカー上に位置付けられていてもよい。いくつかの態様において、アルキンは、環状アルキン、例としてシクロオクチンであってもよい。いくつかの態様において、アルキンは、ビシクロノニン(またビシクロ[6.1.0]ノニンまたはBCNとしても知られている)または置換ビシクロノニンであってもよい。いくつかの態様において、シクロオクタンは、2011年11月3日に公開の国際特許出願刊行物WO2011136645、表題「Fused Cyclooctyne Compounds And Their Use In Metal-free Click Reactions」に記載のとおりである。いくつかの態様において、アジドは、アジドを含む糖または炭水化物分子であってもよい。いくつかの態様において、アジドは、6-アジド-6-デオキシガラクトースまたは6-アジド-N-アセチルガラクトサミンであってもよい。いくつかの態様において、アジドを含む糖または炭水化物分子は、2016年10月27日に公開の国際特許出願刊行物WO2016170186、表題「Process For The Modification Of A Glycoprotein Using A Glycosyltransferase That Is Or Is Derived From A β(1,4)-N-Acetylgalactosaminyltransferase」に記載のとおりである。いくつかの態様において、トリアゾールを形成するアジドとアルキンとの間のシクロ付加反応(ここでアジドおよびアルキンは、抗TfR抗体、分子ペイロード、またはリンカー上に位置付けられていてもよい)は、2014年5月1日に公開の国際特許出願刊行物WO2014065661、表題「Modified antibody, antibody-conjugate and process for the preparation thereof」;または2016年10月27日に公開の国際特許出願刊行物WO2016170186、表題「Process For The Modification Of A Glycoprotein Using A Glycosyltransferase That Is Or Is Derived From A β(1,4)-N-Acetylgalactosaminyltransferase」に記載のとおりである。
いくつかの態様において、リンカーはさらに、スペーサー、例として、ポリエチレングリコールスペーサーまたはアシル/カルバモイルスルファミドスペーサー、例として、HydraSpace(商標)スペーサーを含む。いくつかの態様において、スペーサーは、Verkade,J.M.M.et al.,"A Polar Sulfamide Spacer Significantly Enhances the Manufactur能力, St能力, and Therapeutic Index of Antibody-Drug Conjugates",Antibodies,2018,7,12に記載のとおりである。
いくつかの態様において、リンカーは、求ジエン体とジエン/ヘテロ-ジエンとの間のディールス・アルダー反応によって、抗TfR抗体および/または(例として、および)分子ペイロードへ接続されるが、ここで求ジエン体およびジエン/ヘテロ-ジエンは、抗TfR抗体、分子ペイロード、またはリンカー上に位置付けられていてもよい。いくつかの態様において、リンカーは、他のペリ環状反応、例として、エン反応によって、抗TfR抗体および/または(例として、および)分子ペイロードへ接続される。いくつかの態様において、リンカーは、アミド、チオアミド、またはスルホンアミド結合反応によって、抗TfR抗体および/または(例として、および)分子ペイロードへ接続される。いくつかの態様において、リンカーは、リンカーと抗TfR抗体および/または(例として、および)分子ペイロードとの間に存在するオキシム基、ヒドラゾン基、またはセミカルバジド基を形成する縮合反応によって、抗TfR抗体および/または(例として、および)分子ペイロードへ接続される。
いくつかの態様において、リンカーは、求核試薬(例として、アミン基またはヒドロキシル基)と求電子試薬(例として、カルボン酸、カーボナート、またはアルデヒド)との間の抱合体付加反応によって、抗TfR抗体および/または(例として、および)分子ペイロードへ接続される。いくつかの態様において、リンカーと抗TfR抗体または分子ペイロードとの間の反応に先立ち、求核試薬はリンカー上に存在していてもよく、求電子試薬は抗TfR抗体または分子ペイロード上に存在していてもよい。いくつかの態様において、リンカーと抗TfR抗体または分子ペイロードとの間の反応に先立ち、求電子試薬はリンカー上に存在していてもよく、求核試薬は抗TfR抗体または分子ペイロード上に存在していてもよい。いくつかの態様において、求電子試薬は、アジド、ペンタフルオロフェニル、ケイ素中心、カルボニル、カルボン酸、無水物、イソシアナート、チオイソシアナート、スクシニミジルエステル、スルホスクシニミジルエステル、マレイミド、アルキルハロゲン化物、アルキル擬ハロゲン化物、エポキシド、エピスルフィド、アジリジン、アリール、活性化リン中心、および/または(例として、および)、活性化硫黄中心であってもよい。いくつかの態様において、求核試薬は、任意に置換されていてもよいアルケン、任意に置換されていてもよいアルキン、任意に置換されていてもよいアリール、任意に置換されていてもよいヘテロシクリル、ヒドロキシル基、アミノ基、アルキルアミノ基、アニリド基、またはチオール基であってもよい。
いくつかの態様において、反応性の高い化学的部分(例として、クリックケミストリー抱合のためのSPAAC)へ付着されるval-citリンカーは、以下の構造:
によって抗TfR抗体へ抱合されており、ここでmは0～10のいずれかの数である。いくつかの態様において、mは4である。
いくつかの態様において、反応性の高い化学的部分(例として、クリックケミストリー抱合のためのSPAAC)へ付着されるval-citリンカーは、式(G)で表される構造:
(G)
を有する抗TfR抗体に抱合されており、式中mは0～10のいずれかの数である。いくつかの態様において、mは4である。式(G)中の抗TfR1抗体に隣接して示されるアミドが、リシンイプシロンアミンなどのアミンとの抗TfR1抗体の反応の結果生じることは理解されるはずである。
いくつかの態様において、反応性の高い化学的部分(例として、クリックケミストリー抱合のためのSPAAC)へ付着され、抗TfR抗体へ抱合されるval-citリンカーは、式(F)で表される構造:
(F)
を有し、式中、nは0～10のいずれかの数であり、ここでmは0～10のいずれかの数である。いくつかの態様において、nは3であり、および/または(例として、および)mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、式(F)で表される構造を含む化合物へ共有結合的に連結され、それによって式(D)で表される構造を含む複合体が形成される。式(F)中の抗TfR1抗体に隣接して示されるアミドが、リシンイプシロンアミンなどのアミンとの抗TfR1抗体の反応の結果生じることは理解されるはずである。
いくつかの態様においては、抗体と分子ペイロードとを連結するval-citリンカーは、式(C)で表される構造:
を有し、式中nは0～10のいずれかの数であり、ここでmは0～10のいずれかの数である。いくつかの態様において、nは3であり、および/または(例として、および)mは4である。いくつかの態様において、nは3であり、および/または(例として、および)mは4である。いくつかの態様において、Xは抗体のNH(例として、リシンのアミン基からのNH)、S(例として、システインのチオール基からのS)またはO(例として、セリン、トレオニン、またはチロシンのヒドロキシル基からのO)である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、式(D)で表される構造:
を有し、式中nは0～10のいずれかの数であり、ここでmは0～10のいずれかの数である。いくつかの態様において、nは3であり、および/または(例として、および)mは4である。
構造式(A)、(B)、(C)、および(D)中L1は、いくつかの態様において、置換もしくは非置換の脂肪族、置換もしくは非置換のヘテロ脂肪族、置換もしくは非置換のカルボシクリレン、置換もしくは非置換のヘテロシクリレン、置換もしくは非置換のアリーレン、置換もしくは非置換のヘテロアリーレン、-O-、-N(RA)-、-S-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-C(＝O)NRA-、-NRAC(＝O)-、-NRAC(＝O)RA-、-C(＝O)RA-、-NRAC(＝O)O-、-NRAC(＝O)N(RA)-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-OC(＝O)N(RA)-、-S(O)2NRA-、-NRAS(O)2-、またはそれらの組み合わせであるスペーサーであり、ここで各RAは、独立して、水素、または置換もしくは非置換のアルキルである。いくつかの態様において、L1は、
であり、ここでL2は、
であり、ここでaは、式(A)、(B)、(C)、および(D)で表されるカルバマート部分へ直接連結されている部位を標識する;およびbは、オリゴヌクレオチドへ共有結合的に(直接的にまたは追加の化学部分を介して)連結されている部位を標識する。
いくつかの態様において、L1は、以下:
であり、aは、式(A)、(B)、(C)、および(D)で表されるカルバマート部分へ直接連結されている部位を標識する;およびbは、オリゴヌクレオチドへ共有結合的に(直接的にまたは追加の化学部分を介して)連結されている部位を標識する。
いくつかの態様において、L1は、
であり、ここでxは、0～10である。例えば、いくつかの態様において、xは、3、4、5、または6である。いくつかの態様において、L1は、
である。いくつかの態様において、L1は、
である。
いくつかの態様において、L1は、
である。
いくつかの態様において、L1は、
であり、ここでyは、0～10である。例えば、いくつかの態様において、yは、3、4、5、または6である。
いくつかの態様において、L1は、オリゴヌクレオチドの5'ホスファートへ連結されている。いくつかの態様において、L1の、オリゴヌクレオチドの5'ホスファートへの連結は、L1とオリゴヌクレオチドとの間にホスホジエステル結合を形成する。
いくつかの態様において、L1は、オリゴヌクレオチドの3'ホスファートへ連結されている。いくつかの態様において、L1の、オリゴヌクレオチドの3'ホスファートへの連結は、L1とオリゴヌクレオチドとの間にホスホジエステル結合を形成する。
いくつかの態様において、L1は、任意である(例として、存在する必要はない)。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体のいずれか1つは、式(E)で表される構造:
を有し、式中nは0～15(例として、3)であり、mは0～15(例として、4)である。
Ｃ．抗体-分子ペイロード複合体の例
さらに本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド)のいずれかへ共有結合的に連結されている本明細書に記載のいずれか1つの抗TfR抗体を含む複合体の非限定例である。いくつかの態様において、抗TfR抗体(例として、表2～7に提供される抗TfR抗体のいずれか1つ)は、リンカーを介して分子ペイロード(例として、配列番号163～3066のいずれか1つのヌクレオチド配列の少なくとも12(例として、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、または少なくとも19)の連続したヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド)へ共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、抗TfR抗体(例として、表2～7に提供される抗TfR抗体のいずれか1つ)は、リンカーを介して分子ペイロード(例として、表8に提供されるオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチド)へ共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、抗TfR抗体(例として、表2～7に提供される抗TfR抗体のいずれか1つ)は、リンカーを介して分子ペイロード(例として、表9に提供されるオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチド)へ共有結合的に連結されている。本明細書に記載のリンカーのいずれも使用され得る。いくつかの態様において、分子ペイロードがオリゴヌクレオチドである場合、リンカーは、センス鎖もしくはアンチセンス鎖の5'末、3'末、または内部へ連結されている。いくつかの態様において、分子ペイロードは、siRNA、リンカーは、センス鎖の5'末へ連結されている。いくつかの態様において、リンカーは、抗TfR抗体へ、チオール反応性連結を介して(例として、抗TfR抗体中のシステインを介して)連結されている。いくつかの態様において、リンカー(例として、Val-citリンカー)は、抗体(例として、本明細書に記載の抗TfR抗体)へ、アミン基を介して(例として、抗体中のリシンを介して)連結されている。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4標的化オリゴヌクレオチド(例として、表8に列挙されるDUX4標的化オリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4標的化オリゴヌクレオチド(例として、表9に列挙されるDUX4標的化オリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4標的化siRNAのセンス鎖である。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4標的化siRNAのアンチセンス鎖である。いくつかの態様において、分子ペイロードは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むDUX4標的化siRNAである。
Val-citリンカーを介して分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR抗体を含む複合体の構造の例は、下に提供される:
ここでリンカーは、抗体へ、チオール反応性連結を介して(例として、抗体中のシステインを介して)連結されている。いくつかの態様において、分子ペイロードは、配列番号163～3066のいずれか1つのヌクレオチド配列の少なくとも12(例として、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、または少なくとも19)の連続したヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、分子ペイロードは、配列番号163～3066のいずれか1つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA(例として、表8に列挙される標的配列)中の標的配列に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであって、任意にここでアンチセンス鎖は、表8に列挙されるアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA(例として、表9に列挙される標的配列)中の標的配列に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであって、任意にここでアンチセンス鎖は、表9に列挙されるアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。
Val-citリンカーを介して分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR抗体を含む複合体の構造の別の例は、下に提供される:
ここでnは、0～10の間の数字であり、ここでmは、0～10の間の数字であり、ここでリンカーは、抗体へ、(例として、リシン残基上の)アミン基を介して連結されており、および/または(例として、および)、ここでリンカーは、センス鎖またはアンチセンス鎖へ(例として、5'末、3'末、もしくは内部にて)連結されている。いくつかの態様において、リンカーは、抗体へリシンを介して連結されており、リンカーは、オリゴヌクレオチドへ5'末にて連結されており、nは、3であり、およびmは、4である。いくつかの態様において、分子ペイロードは、配列番号163～3066のいずれか1つのヌクレオチド配列の少なくとも12(例として、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、または少なくとも19)のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、分子ペイロードは、配列番号163～3066のいずれか1つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA(例として、表8に列挙される標的配列)中の標的配列に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、表8に列挙されるアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA(例として、表9に列挙される標的配列)中の標的配列に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、表9に列挙されるアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。いくつかの態様において、L1は、本明細書に記載のスペーサーのいずれか1つである。
抗体は、種々の化学量論で分子ペイロードへ連結され得ることが解されるはずであって、前記特性は薬物抗体比(DAR)と称されることもあり、ここで「薬物」は分子ペイロードである。いくつかの態様において、1つの分子ペイロードが抗体へ連結されている(DAR=1)。いくつかの態様において、2つの分子ペイロードが抗体へ連結されている(DAR=2)。いくつかの態様において、3つの分子ペイロードが抗体へ連結されている(DAR=3)。いくつかの態様において、4つの分子ペイロードが抗体へ連結されている(DAR=4)。いくつかの態様において、各々が異なるDARを有する異なる複合体の混合物が提供される。いくつかの態様において、かかる混合物中の複合体の平均DARは、1～3、1～4、1～5以上の範囲にあってもよい。DARは、分子ペイロードを抗体上の種々の部位へ抱合させることによって、および/または(例として、および)、マルチマーを抗体上の1以上の部位へ抱合させることによって、増大されてもよい。例えば、2のDARは、単一分子ペイロードを抗体上の2つの異なる部位へ抱合させることによって、または二量体分子ペイロードを抗体の単一部位へ抱合させることによって、達成されてもよい。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結されている本明細書に記載の抗TfR抗体(例として、表2～7に提供される抗体)を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへリンカー(例として、Val-citリンカー)を介して共有結合的に連結されている本明細書に記載の抗TfR抗体(例として、表2～7に提供される抗体)を含む。いくつかの態様において、リンカー(例として、Val-citリンカー)は、抗体(例として、本明細書に記載の抗TfR抗体)へ、チオール反応性連結を介して(例として、抗体中のシステインを介して)連結されている。いくつかの態様において、リンカー(例として、Val-citリンカー)は、抗体(例として、本明細書に記載の抗TfR抗体)へ、アミン基を介して(例として、抗体中のリシンを介して)連結されている。いくつかの態様において、分子ペイロードは、配列番号163～3066のいずれか1つのヌクレオチド配列の少なくとも12(例として、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、または少なくとも19)のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、分子ペイロードは、配列番号163～3066のいずれか1つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、配列番号163～1574のいずれか1つで表されるとおりの標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、配列番号1575～986のいずれか1つで表されるとおりのアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、表8に列挙される標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、表8に列挙されるアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、表9に列挙される標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、表9に列挙されるアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結されている抗TfR抗体を含み、ここで抗TfR抗体は、表2に列挙される抗体のいずれか1つのCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、配列番号163～1574のいずれか1つで表されるとおりの標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、配列番号1575～1986のいずれか1つで表されるとおりのアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、表8に列挙される標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、表8に列挙されるアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、表9に列挙される標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、表9に列挙されるアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結されている抗TfR抗体を含み、ここで抗TfR抗体は、配列番号69、配列番号71、または配列番号72のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号70のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、配列番号163～1574のいずれか1つで表されるとおりの標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、配列番号1575～1986のいずれか1つで表されるとおりのアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、表8に列挙される標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、表8に列挙されるアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、表9に列挙される標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、表9に列挙されるアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結されている抗TfR抗体を含み、ここで抗TfR抗体は、配列番号73または配列番号76のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号74のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、配列番号163～1574のいずれか1つで表されるとおりの標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、配列番号1575～1986のいずれか1つで表されるとおりのアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、表8に列挙される標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、表8に列挙されるアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、表9に列挙される標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、表9に列挙されるアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結されている抗TfR抗体を含み、ここで抗TfR抗体は、配列番号73または配列番号76のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号75のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、配列番号163～1574のいずれか1つで表されるとおりの標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、配列番号1575～1986のいずれか1つで表されるとおりのアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、表8に列挙される標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、表8に列挙されるアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、表9に列挙される標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、表9に列挙されるアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結されている抗TfR抗体を含み、ここで抗TfR抗体は、配列番号77のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号78のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、配列番号163～1574のいずれか1つで表されるとおりの標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、配列番号1575～1986のいずれか1つで表されるとおりのアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、表8に列挙される標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、表8に列挙されるアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、表9に列挙される標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、表9に列挙されるアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結されている抗TfR抗体を含み、ここで抗TfR抗体は、配列番号77または配列番号79のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号80のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、配列番号163～1574のいずれか1つで表されるとおりの標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、配列番号1575～1986のいずれか1つで表されるとおりのアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、表8に列挙される標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、表8に列挙されるアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、表9に列挙される標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、表9に列挙されるアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結されている抗TfR抗体を含み、ここで抗TfR抗体は、配列番号154のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号155のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、配列番号163～1574のいずれか1つで表されるとおりの標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、配列番号1575～1986のいずれか1つで表されるとおりのアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、表8に列挙される標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、表8に列挙されるアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、表9に列挙される標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、表9に列挙されるアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。
いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4標的化オリゴヌクレオチド(例として、表8に列挙されるDUX4標的化オリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4標的化オリゴヌクレオチド(例として、表9に列挙されるDUX4標的化オリゴヌクレオチド)である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結されている抗TfR抗体を含み、ここで抗TfR抗体は、配列番号84、配列番号86、または配列番号87のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、配列番号163～1574のいずれか1つで表されるとおりの標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、配列番号1575～1986のいずれか1つで表されるとおりのアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、表8に列挙される標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、表8に列挙されるアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、表9に列挙される標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、表9に列挙されるアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結されている抗TfR抗体を含み、ここで抗TfR抗体は、配列番号88または配列番号91のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号89のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、配列番号163～1574のいずれか1つで表されるとおりの標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、配列番号1575～1986のいずれか1つで表されるとおりのアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、表8に列挙される標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、表8に列挙されるアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、表9に列挙される標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、表9に列挙されるアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結されている抗TfR抗体を含み、ここで抗TfR抗体は、配列番号88または配列番号91のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、配列番号163～1574のいずれか1つで表されるとおりの標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、配列番号1575～1986のいずれか1つで表されるとおりのアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、表8に列挙される標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、表8に列挙されるアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、表9に列挙される標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、表9に列挙されるアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結されている抗TfR抗体を含み、ここで抗TfR抗体は、配列番号92または配列番号94のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号95のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、配列番号163～1574のいずれか1つで表されるとおりの標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、配列番号1575～1986のいずれか1つで表されるとおりのアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、表8に列挙される標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、表8に列挙されるアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、表9に列挙される標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、表9に列挙されるアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結されている抗TfR抗体を含み、ここで抗TfR抗体は、配列番号92のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号93のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、配列番号163～1574のいずれか1つで表されるとおりの標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、配列番号1575～1986のいずれか1つで表されるとおりのアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、表8に列挙される標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、表8に列挙されるアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、表9に列挙される標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、表9に列挙されるアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結されている抗TfR抗体を含み、ここで抗TfR抗体は、配列番号156のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号157のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、配列番号163～1574のいずれか1つで表されるとおりの標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、配列番号1575～1986のいずれか1つで表されるとおりのアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、表8に列挙される標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、表8に列挙されるアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、表9に列挙される標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、表9に列挙されるアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結されている抗TfR抗体を含み、ここで抗TfR抗体は、配列番号97、配列番号98、または配列番号99のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号85のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、配列番号163～1574のいずれか1つで表されるとおりの標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、配列番号1575～1986のいずれか1つで表されるとおりのアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、表8に列挙される標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、表8に列挙されるアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、表9に列挙される標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、表9に列挙されるアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結されている抗TfR抗体を含み、ここで抗TfR抗体は、配列番号100または配列番号101のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号89のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、配列番号163～1574のいずれか1つで表されるとおりの標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、配列番号1575～1986のいずれか1つで表されるとおりのアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、表8に列挙される標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、表8に列挙されるアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、表9に列挙される標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、表9に列挙されるアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結されている抗TfR抗体を含み、ここで抗TfR抗体は、配列番号100または配列番号101のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、配列番号163～1574のいずれか1つで表されるとおりの標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、配列番号1575～1986のいずれか1つで表されるとおりのアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、表8に列挙される標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、表8に列挙されるアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、表9に列挙される標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、表9に列挙されるアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結されている抗TfR抗体を含み、ここで抗TfR抗体は、配列番号102のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号93のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、配列番号163～1574のいずれか1つで表されるとおりの標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、配列番号1575～1986のいずれか1つで表されるとおりのアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、表8に列挙される標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、表8に列挙されるアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、表9に列挙される標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、表9に列挙されるアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結されている抗TfR抗体を含み、ここで抗TfR抗体は、配列番号102または配列番号103のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号95のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、配列番号163～1574のいずれか1つで表されるとおりの標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、配列番号1575～1986のいずれか1つで表されるとおりのアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、表8に列挙される標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、表8に列挙されるアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、表9に列挙される標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、表9に列挙されるアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結されている抗TfR抗体を含み、ここで抗TfR抗体は、配列番号158または配列番号159のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号157のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、配列番号163～1574のいずれか1つで表されるとおりの標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、配列番号1575～1986のいずれか1つで表されるとおりのアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、表8に列挙される標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、表8に列挙されるアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4 mRNA中の標的配列(例として、表9に列挙される標的配列)に対し少なくとも16ヌクレオチドの相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含むDUX4標的化オリゴヌクレオチドであり、任意にここでアンチセンス鎖は、表9に列挙されるアンチセンス配列のいずれか1つの少なくとも16の連続したヌクレオチドを含み、任意にここでDUX4標的化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖へハイブリダイズするセンス鎖をさらに含む。
いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4標的化オリゴヌクレオチド(例として、表8に列挙されるDUX4標的化オリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DUX4標的化オリゴヌクレオチド(例として、表9に列挙されるDUX4標的化オリゴヌクレオチド)である。
本明細書に記載の複合体の例のいずれかにおいて、いくつかの態様において、抗TfR抗体は、式(C):
で表される構造を有する分子ペイロードへ連結されており、ここでnは、3であり、mは、4であり、Xは、NH(例として、リシンのアミン基からのNH)であり、およびL1は、本明細書に記載のスペーサーのいずれか1つである。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、DUX4標的化オリゴヌクレオチド(例として、表8に列挙されるDUX4標的化オリゴヌクレオチドのセンスもしくはアンチセンス鎖)の3'末または5'末へ抗TfR抗体中のリシンを介して共有結合的に連結されている抗TfR抗体を含み、ここで抗TfR抗体は、表2に列挙される抗体のいずれか1つのCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含み、ここで複合体は、式(D):
で表される構造を有し、ここでnは、3であり、およびmは、4であり、ならびにここでL1は、本明細書に記載のスペーサーのいずれか1つである。いくつかの態様において、抗TfR抗体は、DUX4標的化オリゴヌクレオチドのセンス鎖の5'末へ共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、抗TfR抗体は、DUX4標的化オリゴヌクレオチドのセンス鎖の3'末へ共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、L1は、
である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、DUX4標的化オリゴヌクレオチド(例として、表8に列挙されるDUX4標的化オリゴヌクレオチドのセンスもしくはアンチセンス鎖)の3'末または5'末へ抗TfR抗体中のリシンを介して共有結合的に連結されている抗TfR抗体を含み、ここで抗TfR抗体は、表3に列挙される抗体のいずれか1つのVHおよびVLを含み、ここで複合体は、式(D):
で表される構造を有し、ここでnは、3であり、およびmは、4であり、ならびにここでL1は、本明細書に記載のスペーサーのいずれか1つである。いくつかの態様において、抗TfR抗体は、DUX4標的化オリゴヌクレオチドのセンス鎖の5'末へ共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、抗TfR抗体は、DUX4標的化オリゴヌクレオチドのセンス鎖の3'末へ共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、L1は、
である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、DUX4標的化オリゴヌクレオチド(例として、表8に列挙されるDUX4標的化オリゴヌクレオチドのセンスもしくはアンチセンス鎖)の3'末または5'末へ抗TfR抗体中のリシンを介して共有結合的に連結されている抗TfR抗体を含み、ここで抗TfR抗体は、表4に列挙される抗体のいずれか1つの重鎖および軽鎖を含み、ここで複合体は、式(D):
で表される構造を有し、ここでnは、3であり、およびmは、4であり、ならびにここでL1は、本明細書に記載のスペーサーのいずれか1つである。いくつかの態様において、抗TfR抗体は、DUX4標的化オリゴヌクレオチドのセンス鎖の5'末へ共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、抗TfR抗体は、DUX4標的化オリゴヌクレオチドのセンス鎖の3'末へ共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、L1は、
である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、DUX4標的化オリゴヌクレオチド(例として、表8に列挙されるDUX4標的化オリゴヌクレオチドのセンスもしくはアンチセンス鎖)の3'末または5'末へ抗TfR Fab中のリシンを介して共有結合的に連結されているFabである抗TfR抗体を含み、ここで抗TfR Fabは、表5に列挙される抗体のいずれか1つの重鎖および軽鎖を含み、ここで複合体は、式(D):
で表される構造を有し、ここでnは、3であり、およびmは、4であり、ならびにここでL1は、本明細書に記載のスペーサーのいずれか1つである。いくつかの態様において、抗TfR抗体は、DUX4標的化オリゴヌクレオチドのセンス鎖の5'末へ共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、抗TfR抗体は、DUX4標的化オリゴヌクレオチドのセンス鎖の3'末へ共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、L1は、
である。
いくつかの態様において、L1は、オリゴヌクレオチドの3'ホスファートへ連結されている。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、DUX4標的化オリゴヌクレオチド(例として、表9に列挙されるDUX4標的化オリゴヌクレオチドのセンスもしくはアンチセンス鎖)の3'末または5'末へ抗TfR抗体中のリシンを介して共有結合的に連結されている抗TfR抗体を含み、ここで抗TfR抗体は、表2に列挙される抗体のいずれか1つのCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含み、ここで複合体は、式(D):
で表される構造を有し、ここでnは、3であり、およびmは、4であり、ならびにここでL1は、本明細書に記載のスペーサーのいずれか1つである。いくつかの態様において、抗TfR抗体は、DUX4標的化オリゴヌクレオチドのセンス鎖の5'末へ共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、抗TfR抗体は、DUX4標的化オリゴヌクレオチドのセンス鎖の3'末へ共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、L1は、
である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、DUX4標的化オリゴヌクレオチド(例として、表9に列挙されるDUX4標的化オリゴヌクレオチドのセンスもしくはアンチセンス鎖)の3'末または5'末へ抗TfR抗体中のリシンを介して共有結合的に連結されている抗TfR抗体を含み、ここで抗TfR抗体は、表3に列挙される抗体のいずれか1つのVHおよびVLを含み、ここで複合体は、式(D):
で表される構造を有し、ここでnは、3であり、およびmは、4であり、ならびにここでL1は、本明細書に記載のスペーサーのいずれか1つである。いくつかの態様において、抗TfR抗体は、DUX4標的化オリゴヌクレオチドのセンス鎖の5'末へ共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、抗TfR抗体は、DUX4標的化オリゴヌクレオチドのセンス鎖の3'末へ共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、L1は、
である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、DUX4標的化オリゴヌクレオチド(例として、表9に列挙されるDUX4標的化オリゴヌクレオチドのセンスもしくはアンチセンス鎖)の3'末または5'末へ抗TfR抗体中のリシンを介して共有結合的に連結されている抗TfR抗体を含み、ここで抗TfR抗体は、表4に列挙される抗体のいずれか1つの重鎖および軽鎖を含み、ここで複合体は、式(D):
で表される構造を有し、ここでnは、3であり、およびmは、4であり、ならびにここでL1は、本明細書に記載のスペーサーのいずれか1つである。いくつかの態様において、抗TfR抗体は、DUX4標的化オリゴヌクレオチドのセンス鎖の5'末へ共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、抗TfR抗体は、DUX4標的化オリゴヌクレオチドのセンス鎖の3'末へ共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、L1は、
である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、DUX4標的化オリゴヌクレオチド(例として、表9に列挙されるDUX4標的化オリゴヌクレオチドのセンスもしくはアンチセンス鎖)の3'末または5'末へ抗TfR Fab中のリシンを介して共有結合的に連結されているFabである抗TfR抗体を含み、ここで抗TfR Fabは、表5に列挙される抗体のいずれか1つの重鎖および軽鎖を含み、ここで複合体は、式(D):
で表される構造を有し、ここでnは、3であり、およびmは、4であり、ならびにここでL1は、本明細書に記載のスペーサーのいずれか1つである。いくつかの態様において、抗TfR抗体は、DUX4標的化オリゴヌクレオチドのセンス鎖の5'末へ共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、抗TfR抗体は、DUX4標的化オリゴヌクレオチドのセンス鎖の3'末へ共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、L1は、
である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、DUX4標的化オリゴヌクレオチド(例として、表8もしくは表9に列挙されるDUX4標的化オリゴヌクレオチドのセンスもしくはアンチセンス鎖)の3'末または5'末へ抗TfR抗体中のリシンを介して共有結合的に連結されている抗TfR抗体を含み、ここで抗TfR抗体は、以下:
(ｉ)配列番号27のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号28のアミノ酸配列を含むCDR-H2、配列番号29のアミノ酸配列を含むCDR-H3、配列番号30のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号31のアミノ酸配列を含むCDR-L2、および配列番号32のアミノ酸配列を含むCDR-L3;
(ii)配列番号33のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号34のアミノ酸配列を含むCDR-H2、配列番号35のアミノ酸配列を含むCDR-H3、配列番号36のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号37のアミノ酸配列を含むCDR-L2、および配列番号32のアミノ酸配列を含むCDR-L3;または
(ii)配列番号38のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号39のアミノ酸配列を含むCDR-H2、配列番号40のアミノ酸配列を含むCDR-H3、配列番号41のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号31のアミノ酸配列を含むCDR-L2、および配列番号42のアミノ酸配列を含むCDR-L3
を含み、ここで複合体は、式(D):
で表される構造を有し、ここでnは、3であり、およびmは、4であり、ならびにここでL1は、本明細書に記載のスペーサーのいずれか1つである。いくつかの態様において、抗TfR抗体は、DUX4標的化オリゴヌクレオチドのセンス鎖の5'末へ共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、抗TfR抗体は、DUX4標的化オリゴヌクレオチドのセンス鎖の3'末へ共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、L1は、
である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、DUX4標的化オリゴヌクレオチド(例として、表8もしくは表9に列挙されるDUX4標的化オリゴヌクレオチドのセンスもしくはアンチセンス鎖)の3'末または5'末へ抗TfR抗体中のリシンを介して共有結合的に連結されている抗TfR抗体を含み、ここで抗TfR抗体は、配列番号76のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号75のアミノ酸配列を含むVLを含み、ここで複合体は、式(D):
で表される構造を有し、ここでnは、3であり、およびmは、4であり、ならびにここでL1は、本明細書に記載のスペーサーのいずれか1つである。いくつかの態様において、抗TfR抗体は、DUX4標的化オリゴヌクレオチドのセンス鎖の5'末へ共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、抗TfR抗体は、DUX4標的化オリゴヌクレオチドのセンス鎖の3'末へ共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、L1は、
である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、DUX4標的化オリゴヌクレオチド(例として、表8もしくは表9に列挙されるDUX4標的化オリゴヌクレオチドのセンスもしくはアンチセンス鎖)の3'末または5'末へ抗TfR Fab中のリシンを介して共有結合的に連結されているFabである抗TfR抗体を含み、ここで抗TfR Fabは、配列番号101のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、ここで複合体は、式(D):
で表される構造を有し、ここでnは、3であり、およびmは、4であり、ならびにここでL1は、本明細書に記載のスペーサーのいずれか1つである。いくつかの態様において、抗TfR抗体は、DUX4標的化オリゴヌクレオチドのセンス鎖の5'末へ共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、抗TfR抗体は、DUX4標的化オリゴヌクレオチドのセンス鎖の3'末へ共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、L1は、
である。
いくつかの態様において、L1は、オリゴヌクレオチドの5'ホスファートへ連結されている。いくつかの態様において、L1の、オリゴヌクレオチドの5'ホスファートへの連結は、L1とオリゴヌクレオチドとの間にホスホジエステル結合を形成する。
いくつかの態様において、L1は、オリゴヌクレオチドの3'ホスファートへ連結されている。いくつかの態様において、L1の、オリゴヌクレオチドの3'ホスファートへの連結は、L1とオリゴヌクレオチドとの間にホスホジエステル結合を形成する。
III．製剤
本明細書に提供される複合体は、いずれの好適なやり方でも製剤化されていてよい。一般に、本明細書に提供される複合体は、医薬への使用に好適なやり方で製剤化されている。例えば、複合体は、分解を最小限に抑え、送達および/または(例として、および)取り込みを容易にする製剤を使用して、対象へ送達され得るか、あるいは、製剤中の複合体へ別の有益な特性を提供する。いくつかの態様において、本明細書に提供されるのは、複合体および薬学的に許容し得る担体を含む組成物である。かかる組成物は、対象の標的細胞周囲の環境中または対象の全身のいずれかへ投与されたとき充分量の複合体が標的筋細胞に侵入できるように、好適に製剤化され得る。いくつかの態様において、複合体は、リン酸緩衝生理食塩溶液などの緩衝溶液中、リポソーム中、ミセル構造体中、およびカプシド中に製剤化される。
いくつかの態様において、組成物が、本明細書に提供される複合体の1以上の構成要素(例として、筋標的化剤、リンカー、分子ペイロード、またはこれらのいずれか1つの前駆体分子)を個別に包含していてもよいことは解されるはずである。
いくつかの態様において、複合体は、水中または水性溶液(例として、pH調整された水)中に製剤化される。いくつかの態様において、複合体は、塩基性緩衝水性溶液(例として、PBS)中に製剤化される。いくつかの態様において、本明細書に開示のとおりの製剤は、賦形剤を含む。いくつかの態様において、賦形剤は、組成物へ、改善された安定性、改善された吸収、改善された可溶性、および/または(例として、および)、活性成分の治療増強を付与する。いくつかの態様において、賦形剤は、緩衝剤(例として、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、トリス塩基、もしくは水酸化ナトリウム)、またはビヒクル(例として、緩衝溶液、ワセリン、ジメチルスルホキシド、もしくは鉱油)である。
いくつかの態様において、複合体またはその構成要素(例として、オリゴヌクレオチドまたは抗体)は、その貯蔵寿命を延長するため凍結乾燥され、次いで使用(例として、対象への投与)前に溶液にさせられる。結果的に、本明細書に記載の複合体またはその構成要素を含む組成物中の賦形剤は、凍結保護剤(lyoprotectant)(例として、マンニトール、ラクトース、ポリエチレングリコール、もしくはポリビニルピロリドン)、または崩壊温度修飾因子(例として、デキストラン、フィコール、もしくはゼラチン)であってもよい。
いくつかの態様において、医薬組成物は、その意図された投与ルートに適合するよう製剤化されている。投与ルートの例は、非経口投与、例として、静脈内投与、皮内投与、皮下投与を包含する。典型的には、投与ルートは、静脈内投与または皮下投与である。
注射剤への使用に好適な医薬組成物は、滅菌水性溶液(ここで水に可溶性である)または分散溶液、および滅菌注射剤溶液または分散溶液の即時調製のための滅菌粉末を包含する。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等)、および好適なそれらの混合物を含有する溶媒または分散媒体であり得る。いくつかの態様において、製剤は、組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、および塩化ナトリウムを包含する。滅菌注射剤溶液は、要求量の複合体を、上に列挙された成分の1つまたはそれらの組み合わせとともに、選択された溶媒に組み込むこと、要求に応じ、これに続き濾過滅菌することによって調製され得る。
いくつかの態様において、組成物は、活性成分(単数または複数)のパーセンテージが組成物全体の重量または体積の約1％と約80％以上との間であってもよいが、少なくとも約0.1％の複合体もしくはその構成要素を含有していてもよい。可溶性、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与ルート、産物の貯蔵寿命などの因子、ならびに他の薬理学的留意事項は、かかる医薬製剤を調製する当業者によって企図されるであろう。そのため様々な投薬量および処置計画が所望されることもある。
IV．使用の方法/処置
本明細書に記載のとおりの分子ペイロードへ共有結合的に連結された筋標的化剤を含む複合体は、FSHDを処置するのに有効である。いくつかの態様において、複合体は、1型FSHDを処置するのに有効である。いくつかの態様において、複合体は、2型FSHDを処置するのに有効である。いくつかの態様において、FSHDは、DUX4遺伝子を含有する4番染色体上のD4Z4反復の欠失に関連する。いくつかの態様において、FSHDは、SMCHD1遺伝子における突然変異に関連する。
いくつかの態様において、対象は、ヒト対象、霊長目の非ヒト動物対象、齧歯類動物対象、またはいずれの好適な哺乳類の動物対象であってもよい。いくつかの態様において、対象は、筋強直性ジストロフィーを有してもよい。いくつかの態様において、対象は、胎児の発生および精巣以外でのDUX4遺伝子の上昇した発現を有する。いくつかの態様において、対象は、1型または2型の顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーを有する。いくつかの態様において、FSHDを有する対象は、SMCHD1遺伝子における突然変異を有する。いくつかの態様において、FSHDを有する対象は、4番染色体上のD4Z4反復領域における欠失突然変異を有する。
本開示の側面は、本明細書に記載のとおりの有効量の複合体を対象へ投与することを伴う方法を包含する。いくつかの態様において、分子ペイロードへ共有結合的に連結された筋標的化剤を含む複合体を含む有効量の医薬組成物は、処置を必要とする対象へ投与され得る。いくつかの態様において、本明細書に記載のとおりの複合体を含む医薬組成物は、静脈内投与を包含してもよい好適なルートによって、例として、ボーラスとして、またはある期間にわたる連続注入によって、投与されてもよい。いくつかの態様において、静脈内投与は、筋肉内の、腹腔内の、脳脊髄内の(intracerebrospinal)、皮下の、関節内の、滑液嚢内の、または髄腔内のルートによって実施されてもよい。いくつかの態様において、医薬組成物は、固体形態、水性形態、または液体形態であってもよい。いくつかの態様において、水性または液体形態は、噴霧されてもよく、または凍結乾燥されてもよい。いくつかの態様において、噴霧形態または凍結乾燥形態は、水性または液体溶液で再構成されてもよい。
静脈内投与のための組成物は、植物油、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、乳酸エチル、炭酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、エタノール、およびポリオール(グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等)などの様々な担体を含有していてもよい。静脈内注射のための水可溶性抗体は点滴法によって投与され得、これによって抗体および薬学的に許容し得る賦形剤を含有する医薬製剤が注入される。薬学的に許容し得る賦形剤は、例えば、5％デキストロース、0.9％生理食塩水、リンガー溶液、または他の好適な賦形剤を包含していてもよい。筋肉内用調製物、例として、抗体の好適な可溶性の塩形態の滅菌製剤は、注射用水、0.9％生理食塩水、または5％グルコース溶液などの医薬賦形剤に溶解されて投与され得る。
いくつかの態様において、分子ペイロードへ共有結合的に連結されたた筋標的化剤を含む複合体を含む医薬組成物は、部位特異的または局部的な送達技法を介して投与される。これらの技法の例は、複合体の埋め込み型デポー供給源、局部送達カテーテル、部位特異的担体、直接注射、または直塗り(direct application)を包含する。
いくつかの態様において、分子ペイロードへ共有結合的に連結された筋標的化剤を含む複合体を含む医薬組成物は、治療効果を対象に付与する有効濃度にて投与される。有効量は、当業者によって認識されるとおり、疾患の重症度、処置される対象の特有な特徴、例として、年齢、体調、健康状態、または重量、処置時間、いずれの併用治療の性質、投与ルート、および関連因子に応じて変動する。これらの関連因子は当業者に知られており、わずかな定型的実験法で対処され得る。いくつかの態様において、有効濃度は、患者に安全であるとみなされる最大用量である。いくつかの態様において、有効濃度は、最大限の効き目を提供する、実行可能な最低濃度であろう。
経験的考察、例として、対象における複合体の半減期は一般に、処置のために使用される医薬組成物の濃度の決定に寄与するであろう。投与頻度は、処置の効き目を最大化するために経験的に決定かつ調整されてもよい。
一般に、本明細書に記載の複合体のいずれかの投与について、当初の候補投薬量は、上に記載の因子、例として、安全性または効き目に応じて、約1～100mg/kgであってもよく、またはこれより多くてもよい。いくつかの態様において、処置は、一度施されるであろう。いくつかの態様において、処置は、毎日、隔週、毎週、隔月、毎月、または対象へ最大の効き目を提供しつつ安全性へのリスクを最小に抑えるいずれの時間間隔にて、施されるであろう。一般に、効き目ならびに処置および安全性へのリスクは、処置過程を通してずっと監視されることもある。
処置の効き目は、いずれかの好適な方法を使用して査定されてもよい。いくつかの態様において、処置の効き目は、主に顔、肩甲骨、および上腕の筋肉における筋肉量の減少および筋萎縮を包含する、FSHDに関連する症状の所見の評価によって査定されてもよい。
いくつかの態様において、本明細書に記載の分子ペイロードへ共有結合的に連結された筋標的化剤を含む複合体を含む医薬組成物は、対照(例として、処置に先立つ遺伝子発現のベースラインレベル)と比べて、標的遺伝子の活性または発現を少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、または少なくとも95％阻害するのに充分な有効濃度にて、対象へ投与される。
いくつかの態様において、本明細書に記載の分子ペイロードへ共有結合的に連結された筋標的化剤を含む複合体を含む医薬組成物の対象への単回用量または投与は、少なくとも1～5日間、1～10日間、5～15日間、10～20日間、15～30日間、20～40日間、25～50日間、またはこれより長い期間、標的遺伝子の活性または発現を阻害するのに充分である。いくつかの態様において、本明細書に記載の分子ペイロードへ共有結合的に連結された筋標的化剤を含む複合体を含む医薬組成物の対象への単回用量または投与は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12週間、標的遺伝子の活性または発現を阻害するのに充分である。いくつかの態様において、本明細書に記載の分子ペイロードへ共有結合的に連結された筋標的化剤を含む複合体を含む医薬組成物の対象への単回用量または投与は、少なくとも1、2、3、4、5、または6カ月間、標的遺伝子の活性または発現を阻害するのに充分である。
いくつかの態様において、医薬組成物は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された筋標的化剤を含む、1種より多くの複合体を含んでいてもよい。いくつかの態様において、医薬組成物は、対象、例として、FSHDを有するヒト対象の処置のためのいずれか他の好適な治療剤をさらに含んでいてもよい。いくつかの態様において、他の治療剤は、本明細書に記載の複合体の有効性を増強または補完するものであってもよい。いくつかの態様において、他の治療剤は、本明細書に記載の複合体とは異なる症状または疾患を処置するよう機能してもよい。
例
例1: トランスフェクトされたアンチセンスオリゴヌクレオチドでの遺伝子発現の標的化
ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)を標的にするsiRNAを、不死化細胞株中HPRTの発現レベル低減能について、in vitroで試験した。手短に言えば、Hepa1-6細胞に、リポフェクタミン2000で製剤化された対照siRNA(siCTRL;100nM)またはHPRTを標的にするsiRNA(siHPRT;100nM)のいずれかをトランスフェクトした。HPRT発現レベルを、トランスフェクションを受けてから48時間評価した。ビヒクル(リン酸緩衝生理食塩水)を培養中Hepa1-6細胞へ送達して細胞を48時間維持した、対照実験もまた実施した。図1に示されるとおり、HPRT siRNAはHPRT発現レベルを対照と比較して約90％低減させたことがわかった。使用されるsiRNAの配列が表6に示される。
表10．siHPRTおよびsiCTRLの配列
*小文字 - 2'O-Meリボヌクレオシド;大文字 - 2'フルオロリボヌクレオシド;s - ホスホロチオアート連結
例2: 筋標的化複合体でのHPRTの標的化
切断不能なN-ガンマ-マレイミドブチリル-オキシスクシンイミドエステル(GMBS)リンカーを介して、抗トランスフェリン受容体抗体であるDTX-A-002へ共有結合的に連結された、例1(siHPRT)に使用されたHPRT siRNAを含む筋標的化複合体を生成した。DTX-A-002は、RI7 217 抗TfR1 Fabである。
手短に言えば、GMBSリンカーを乾燥DMSOに溶解し、水性条件下のアミド結合形成を通してsiHPRTのセンス鎖の3'末端へカップリングした。反応の完了をカイザー(Kaiser)試験によって検証した。過剰なリンカーおよび有機溶媒をゲル浸透クロマトグラフィーによって除去した。次いで、精製されたsiHPRTのマレイミド官能化センス鎖を、マイケル付加反応を使用してDTX-A-002抗体へカップリングした。
次いで、抗体カップリング反応の産物を疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC-HPLC)精製へ供した。DTX-A-002抗体へ共有結合的に付着された1つまたは2つのsiHPRT分子を含む抗TfR-siHPRT複合体を精製した。濃度測定によって、精製された複合体の試料は1.46の平均siHPRT抗体比を有することが確認された。SDS-PAGE分析によって、精製された複合体の試料の＞90％は1つまたは2つのいずれかのsiHPRT分子へ連結されたDTX-A-002を含むことが実証された。
上に記載されたのと同じ方法を使用して、GMBSリンカーを介してIgG2a(Fab)抗体(DTX-A-003)へ共有結合的に連結された、例1(siHPRT)に使用されたHPRT siRNAを含む対照IgG2a-siHPRT複合体を生成した。濃度測定によってDTX-C-001(IgG2a-siHPRT複合体)は1.46の平均siHPRT抗体比を有することが確認され、SDS-PAGEによって、精製された対照複合体の試料の＞90％は1つまたは2つのいずれかのsiHPRT分子へ連結されたDTX-A-003を含むことが実証された。
次いで抗TfR-siHPRT複合体を、細胞の内在化およびin celluloでのHPRTの阻害について試験した。相対的に高発現レベルのトランスフェリン受容体を有するHepa1-6細胞を、ビヒクル(リン酸緩衝生理食塩水)、IgG2a-siHPRT(100nM)、抗TfR-siCTRL(100nM)、または抗TfR-siHPRT(100nM)の存在下72時間インキュベートした。72時間のインキュベーション後に細胞を単離し、HPRTの発現レベルについてアッセイした(図2)。抗TfR-siHPRTで処置された細胞は、HPRT発現がビヒクル対照で処置された細胞およびIgG2a-siHPRT複合体と比べて～50％低減されたことが実証された。その一方で、IgG2a-siHPRTまたは抗TfR-siCTRLのいずれかで処置された細胞は、ビヒクル対照(HPRT発現がまったく低減されない)に匹敵するHPRT発現レベルを有していた。これらのデータは、抗TfR-siHPRTの抗トランスフェリン受容体抗体が複合体の細胞の内在化を可能にし、それによってsiHPRTがHPRTの発現を阻害できることを示唆している。
例3: 筋標的化複合体でのマウス筋組織中HPRTの標的化
例2に記載の筋標的化複合体、抗TfR-siHPRTを、マウス組織中HPRTの阻害について試験した。C57BL/6野生型マウスに、単回用量のビヒクル対照(リン酸緩衝生理食塩水);siHPRT(2mg/kgのsiRNA);IgG2a-siHPRT(2mg/kgのsiRNA、抗体複合体9mg/kgに相当する);または抗TfR-siHPRT(2mg/kgのsiRNA、抗体複合体9mg/kgに相当する)を静脈内注射した。各実験条件を4匹の個々のC57BL/6野生型マウスにおいて再現した。注射から3日後にマウスを安楽死させ、細分して単離された組織型とした。続いて個々の組織試料をHPRTの発現レベルについてアッセイした(図3A～3Bおよび4A～4E)。
抗TfR-siHPRT複合体で処置されたマウスは、siHPRT対照で処置されたマウスと比べて、腓腹筋(31％低減;p＜0.05)および心臓(30％低減;p＜0.05)においてHPRT発現が低減されたことを実証した(図3A～3B)。その一方で、IgG2a-siHPRT複合体で処置されたマウスは、アッセイされたすべての筋組織型について、siHPRT対照(HPRT発現がほとんどまたはまったく低減されない)に匹敵するHPRT発現レベルを有していた。
抗TfR-siHPRT複合体で処置されたマウスは、脳、肝臓、肺、腎臓、および脾臓組織などの非筋組織においてHPRT発現がまったく変化しないことを実証した(図4A～4E)。
これらのデータは、抗TfR-siHPRT複合体の抗トランスフェリン受容体抗体がin vivoマウスモデルで複合体の筋肉特異的組織中への細胞内在化を可能にし、それによってsiHPRTがHPRTの発現を阻害できることを示唆している。これらのデータは、本開示の抗TfR-オリゴヌクレオチド複合体が、筋組織を特異的に標的にすることが可能であることをさらに実証する。
例4: DUX4標的化siRNA
siRNA標的化DUX4参照mRNAを設計した。参照DUX4 mRNAは、NM_001293798.2(配列番号160)である。標的領域は、参照DUX4 mRNAの連続した19ヌクレオチドを包含する。標的配列は配列番号163～1574で表され、これらの標的配列を標的にするアンチセンス配列は配列番号1575～2986で表される。
In silico分析を、設計された配列に対し実施し、様々なパラメータを適用して、これに続くsiRNA設計のための候補となる標的配列およびアンチセンス配列を選択した。これに続く研究のために40のsiRNAを設計した。これらを表8に列挙する。40の合成siRNAは、2'-O-メチル(2'-O-Me)および2'-フルオロ(2'-F)修飾をホスホロチオアートヌクレオシド間連結とともに含有する。
DualGloレポーター-プラスミドを、siRNAをスクリーニングするために設計した。プラスミドは、レポータールシフェラーゼの3'-UTR中にヒトDUX4 mRNAをコードする配列を含有する。
40のsiRNAの各々(2nMまたは10nMの濃度にて)およびDualGloレポータープラスミドを、Hepa1-6細胞中へ共トランスフェクトした。すべてのトランスフェクションを各データポイントにつき四通りに行った。トランスフェクションから24時間後に、ウミシイタケルシフェラーゼおよびホタルルシフェラーゼ(トランスフェクションの効き目について正規化する)活性を決定した。siRNA活性を、対照siRNAで処置された細胞と比べて算出した。各siRNAのノックダウン活性を図5Aに示す。図5A中のsiRNA番号は、表8中のsiRNA番号に対応する。
また用量応答曲線もsiRNA No.9について生成した(上に記載のアッセイと同じアッセイを使用するが10の異なるsiRNA濃度(0.38pM、1.52pM、6.10pM、24.41pM、97.65pM、0.39nM、1.56nM、6.25nM、25nM、100nM)を使用した表8中のsiRNA9に対応する)。siRNA9は176pMというIC50値を有する。(図5B)。
例5: FSHD患者筋管におけるDUX4標的化siRNAの活性
DUX4標的化siRNAを、FSHD患者筋管においてMBD3L2 mRNAをノックダウンするそれら活性について試験した。MBD3L2は、DUX4トランスクリプトームマーカーである。リポフェクタミン2000で処方されたビヒクル対照(リン酸緩衝生理食塩水)またはDUX4標的化siRNA(siRNA9、siRNA14、siRNA35、siRNA13、siRNA15、siRNA1、siRNA26、およびsiRNA18から選択される)のいずれかの、0.2pMから200nMまで(0.2pM、2pM、20pM、0.2nM、2nM、20nM、および200nM)の濃度を変動させて、AB1080(C6)不死化FSHD患者由来筋管をトランスフェクトした。siRNA番号は、表8中のsiRNA番号に対応する。トランスフェクション後、細胞を5日間維持した。続いてMBD3L2 mRNA発現レベルを処置された筋管において測定した。MBD3L2 mRNAの低減に係る用量応答曲線を図6A～6Hに示す。
例6: FSHD患者筋管におけるDUX4標的化siRNA抱合体の活性
DUX4標的化siRNAへ共有結合的に連結されている抗TfR Fab 3M12 VH4/Vκ3を含有する抱合体の活性を、AB1080不死化FSHD患者由来筋管において試験した。抱合体において、抗TfR Fabは、リンカーを介して各siRNAのセンス鎖の3'末へ共有結合的に連結されており、対応するアンチセンス鎖はセンス鎖へアニールする。試験されたsiRNAは、siRNA9、siRNA14、またはsiRNA35である(表8中のsiRNA9、siRNA14、siRNA35に対応する)。
AB1080(C6)不死化FSHD患者由来筋管を、siRNA抱合体で10日間、siRNAの1pM、1nM、または100nMに相当する濃度にて処置した。cDNAを、TaqMan Fast Advanced Cells-to-Ct Kit(Thermo Fisher Scientific)で細胞から得た。3つのDUX4トランスクリプトームマーカーであるMBD3L2(Hs00544743_m1)、TRIM43(Hs00299174_m1)、ZSCAN4(Hs00537549_m1)と、RPL13A(Hs04194366_g1)とのレベルを、qPCRを介し、特定のTaqManアッセイ(Thermo Fisher Scientific)で分析した。2ステップ増幅反応およびサイクル閾値(Ct)の決定のための蛍光測定を、QuantStudio 7器械(Thermo Fisher Scientific)上で行った。FSHD1細胞におけるFSHD複合スコアを、3つのDUX4トランスクリプトームマーカー(MBD3L2、TRIM43、およびZSCAN4)を使用して算出したが、ここでΔCt=(3つのDUX4マーカーの平均Ct)-(RPL13Aの平均Ct)、ΔΔCt=ΔCt(処置)-ΔCt(ビヒクル)、FSHD複合=2-ΔΔCT*100(％)(図7を見よ)。結果は、試験されたsiRNA抱合体が、FSHD患者由来筋管において試験されたDUX4トランスクリプトームマーカーの低減を達成したこと、および100nMのsiRNAに相当する抱合体での処置が、試験されたDUX4トランスクリプトームマーカーの約50％低減を達成したことを示す。
例6に係るsiRNAおよび抗体の抱合プロトコル
以下のプロトコルを使用し、例6において試験されたsiRNA抱合体を作製した。抗TfR Fab 3M12 VH4/Vκ3へ共有結合的に連結されているsiRNA9、siRNA14、siRNA35(表8中のsiRNA9、siRNA14、およびsiRNA35に対応する)を含有する抱合体を生成した。抱合体は、下に示されるとおりの1ステップ反応または2ステップ反応によって生成してもよい。
材料:
アジド-PEG3-vc-PABC-PFPリンカー: MW=773.79
アジド-PEG8-PFPエステルリンカー: MW=633.6
BCN-PEG4-PFPリンカー: MW=607.6
抗TfR1 Fab 3M12 VH4/Vκ3: MW=47968
siRNA9、siRNA 14、およびsiRNA35(表8中のsiRNA9、siRNA14、およびsiRNA35に対応する)
2ステップ反応:
PBS中の抗TfR Fab 3M12 VH4/Vκ3(5～6mg/ml)、1xBCN(DMA中20mg/ml、32.9mM)、および10％DMAを混合し、室温にて少なくとも5時間インキュベートして抗TfR Fab 3M12 VH4/Vκ3-BCN中間体が生成された。次いで抗体-BCN中間体を、NAP(商標)カラムを使用して精製し、PBS中へ溶離した。
試験された各siRNAのセンス鎖を、50mg/mlの濃度(UV吸光度で確認された濃度)まで水に溶解した。4xアジド-リンカー(DMA中20mg/ml)、50xトリブチルアミン(4.2M)、および70％DMAをセンス鎖溶液中へ加え、室温にて終夜インキュベートすることでアジド-センス鎖中間体が生成された。インキュベーション後、1/10体積の3M NaClおよび3体積の冷イソプロパノールアルコール(IPA)を反応混合物中へ加えた。反応混合物を-80℃冷凍庫中に30分間置き、これに続き4500rpmにて25分間回転させた。アジド-センス鎖中間体を含有するペレットを70％エタノールで2回洗浄し(ペレットは洗浄の最中、ピペットチップで持ち上げられた)、PBSに約40mg/mlの最終濃度(UV吸光度で確認された濃度)まで溶解した。
アジド-siRNA二重鎖中間体を生成するため、試験された各siRNAのアンチセンス鎖を、PBSに50mg/mlの濃度(UV吸光度で確認された濃度)まで溶解した。アジド-センス鎖中間体および対応するアンチセンス鎖を1:1比率にて混合した。アニーリングにつき、300～500mlの水をガラスビーカー中、煮沸するまで加熱し、アジド-センス鎖中間体およびアンチセンス鎖混合物を含有する管を煮沸水浴中へ5分間置き、ベンチ上で室温まで冷却させながら水浴中に放置した。各siRNAのアニーリング効率をUPLC SECカラムで測定した。
最後に、抗TfR Fab 3M12 VH4/Vκ3-BCN中間体(UV-Visによって測定されたとおりのPBS中4～5mg/mlの濃度にて)を、1.5x(標的化DAR1)のアジド-siRNA二重鎖中間体と混合し、室温にて終夜インキュベートすることで抗TfR Fab-siRNA抱合体が生成された。
1ステップ反応:
抗TfR Fab 3M12 VH4/Vκ3の緩衝剤を50mM EPPS(8.0のpH)へ交換し、約10mg/mlの濃度まで濃縮した。
試験された各siRNAのセンス鎖を水に50mg/mlの濃度(UV吸光度で確認された濃度)まで溶解した。4xアジド-リンカー(DMA中20mg/ml)、50xトリブチルアミン(4.2M)、および70％DMAをセンス鎖溶液中へ加え、室温にて終夜インキュベートすることでアジド-センス鎖中間体が生成された。インキュベーション後、1/10体積の3M NaClおよび3体積の冷イソプロパノールアルコール(IPA)を反応混合物中へ加えた。反応混合物を-80℃冷凍庫中に30分間置き、これに続き4500rpmにて25分間回転させた。アジド-センス鎖中間体を含有するペレットを70％エタノールで2回洗浄し(ペレットは洗浄の最中、ピペットチップで持ち上げられた)、PBSに約40mg/mlの最終濃度(UV吸光度で確認された濃度)まで溶解した。
アジド-siRNA二重鎖中間体を生成するため、試験された各siRNAのアンチセンス鎖を、PBSに50mg/mlの濃度(UV吸光度で確認された濃度)まで溶解した。アジド-センス鎖中間体および対応するアンチセンス鎖を1:1比率にて混合した。アニーリングにつき、300～500mlの水をガラスビーカー中、煮沸するまで加熱し、アジド-センス鎖中間体およびアンチセンス鎖混合物を含有する管を煮沸水浴中へ5分間置き、ベンチ上で室温まで冷却させながら水浴中に放置した。各siRNAのアニーリング効率をUPLC SECカラムで測定した。
BCN-アジド-siRNA二重鎖中間体を生成するため、30mM MES(pH5.0)中のアジド-siRNA二重鎖中間体溶液を、氷上の同じ体積のDMA中へゆっくり加えた。次いで4x BCN(DMA中20mg/ml)をアジド-siRNA二重鎖中間体/DMA混合物中へゆっくり加え、室温にて3～3.5時間インキュベートすることでBCN-アジド-siRNA二重鎖中間体が生成された。UPLC C18カラムを使用して反応の完了をチェックした。
BCN-アジド-siRNA二重鎖中間体を単離するため、1/10体積の3M NaClおよび3体積の冷IPAを反応混合物中へ加えて-80℃冷凍庫中に30分間置き、これに続き4500rpmにて25分間回転させた。BCN-アジド-siRNA二重鎖中間体を含有するペレットを70％エタノールで2回洗浄し(ペレットは洗浄の最中、ピペットチップで持ち上げられた)、20mM MES(pH5.0)に約20mg/mlの最終濃度(UV吸光度で確認された濃度)まで溶解した。
最後に、抗TfR Fab 3M12 VH4/Vκ3を、1x(標的化DAR1)のBCN-アジド-siRNA二重鎖中間体と混合し、室温にて終夜インキュベートすることで抗TfR Fab-siRNA抱合体が生成された。
TSKゲルsuperQ-5PWカラムによる精製:
2ステップ反応または1ステップ反応のいずれかを使用して生成された抗TfR Fab-siRNA抱合体を、下の方法を使用して精製した。
50mM EPPS(8.0のpH)中の粗抱合反応産物を5カラム体積(cv)の10mM Tris(8.0のpH)で希釈した。試料を、1ml TSKゲルsuperQ-5PWカラム上へ樹脂1ml当たり10mg未満の抱合体にて、0.5ml/分にてロードした。カラムを5～6cvの緩衝剤A(20mM Tris、pH8.0)で1ml/分にて洗浄した。次いで抱合体を、79％の緩衝剤A(20mM Tris、pH8.0)および21％緩衝剤B(20mM Tris(pH8.0)+1.5M NaCl)を含有する15～20cvの溶離緩衝剤で1ml/分にて溶離した。次いで溶離された抱合体の緩衝剤をPBSへ交換し、＞5mg/mlの濃度まで濃縮した。
追加の態様
1．double homeobox 4(DUX4)mRNAを標的にするRNAiオリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結されている筋標的化剤を含む複合体であって、ここでRNAiオリゴヌクレオチドは、長さが18～25ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、かつ配列番号163～1574で表されるとおりの標的配列に対する相補性の領域を含み、およびここで相補性の領域は、長さが少なくとも16の連続したヌクレオシドである。
2．筋標的化剤は、抗トランスフェリン受容体(TfR)抗体である、態様1の複合体。
3．アンチセンス鎖は、配列番号1575～2986および3027～3066のいずれか1つのヌクレオチド配列を含む、態様1または態様2の複合体。
4．アンチセンス鎖は、配列番号3027～3066のいずれか1つのヌクレオチド配列を含む、態様1または態様2の複合体。
5．RNAiオリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖に相補的な少なくとも18の連続したヌクレオシドを含むセンス鎖をさらに含む、態様1～4のいずれか1つの複合体。
6．RNAiオリゴヌクレオチドは、1以上の修飾ヌクレオシドを含む、態様1～5のいずれか1つの複合体。
7．1以上の修飾ヌクレオシドは、2'修飾ヌクレオチドであり、任意にここで1以上の2'修飾ヌクレオシドは、以下:2'-フルオロ(2'-F)、2'-O-メチル(2'-O-Me)、2'-O-メトキシエチル(2'-MOE)、2'-O-アミノプロピル(2'-O-AP)、2'-O-ジメチルアミノエチル(2'-O-DMAOE)、2'-O-ジメチルアミノプロピル(2'-O-DMAP)、2'-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2'-O-DMAEOE)、2’-O-N-メチルアセトアミド(2'-O-NMA))から選択される、態様6の複合体。
8．各2'修飾ヌクレオチドは、2'-O-メチルまたは2'-フルオロ(2'-F)である、態様7の複合体。
9．RNAiオリゴヌクレオチドは、1以上のホスホロチオアートヌクレオシド間連結を含む、態様1～8のいずれか1つの複合体。
10．1以上のホスホロチオアートヌクレオシド間連結は、RNAiオリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖上に存在する、態様9の複合体。
11．アンチセンス鎖の3'末での2ヌクレオシド間の連結は、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結である、態様11の複合体。
12．アンチセンス鎖は、表8に列挙される配列番号3027～3066の修飾バージョンから選択される、態様1～12のいずれか1つの複合体。
13．センス鎖は、表8に列挙される配列番号2987～3026の修飾バージョンから選択される、態様5～12のいずれか1つの複合体。
14．RNAiオリゴヌクレオチドは、表8に列挙されるsiRNAから選択されるsiRNA分子である、態様1～13の複合体。
15．抗TfR抗体は、表2に列挙される抗TfR抗体のいずれかの重鎖相補性決定領域1(CDR-H1)、重鎖相補性決定領域2(CDR-H2)、重鎖相補性決定領域3(CDR-H3)、軽鎖相補性決定領域1(CDR-L1)、軽鎖相補性決定領域2(CDR-L2)、軽鎖相補性決定領域3(CDR-L3)を含む、態様2～14のいずれか1つの複合体。
16．抗TfR抗体は、表3に列挙される抗TfR抗体のいずれかの重鎖可変領域(VH)および軽鎖可変領域(VL)を含む、態様2～14のいずれか1つの複合体。
17．抗TfR抗体は、Fabであり、任意にここでFabは、表5に列挙される抗TfR Fabのいずれかの重鎖および軽鎖を含む、態様2～14のいずれか1つの複合体。
18．筋標的化剤およびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、リンカーを介して共有結合的に連結されており、任意にここでリンカーは、バリン-シトルリンジペプチドを含む、態様1～17のいずれか1つの複合体。
19．筋細胞においてDUX4発現を低減させる方法であって、方法は、筋細胞を、RNAiオリゴヌクレオチドの筋細胞への内在化を促進するのに有効な量の、態様1～18のいずれか1つの複合体と接触させることを含む。
20．顔面肩甲上腕筋ジストロフィー(FSHD)を処置する方法であって、方法は、態様1～18のいずれか1つの有効量の複合体を、これを必要とする対象へ投与することを含み、ここで対象は、DUX4タンパク質の異常な産生を有する。
21．以下:
アンチセンス鎖:5'-fUfCmCfGmCfUmCfAmAfAmGfCmAfGmGfCmUfCmGfCmA*fG*mG-3'(配列番号3031)
センス鎖:5'-mUmGfCmGfAmGfCmCfUmGfCmUfUmUfGmAfGmCfGmGfA-3'(配列番号2991);
アンチセンス鎖:5'-fAfCmCfAmAfAmUfCmUfGmGfAmCfCmCfUmGfGmGfCmU*fC*mC-3'(配列番号3034)
センス鎖:5'-mAmGfCmCfCmAfGmGfGmUfCmCfAmGfAmUfUmUfGmGfU-3'(配列番号2994);
アンチセンス鎖:5'-fGfGmAfAmUfGmCfCmGfAmUfGmGfCmCfUmGfGmGfCmC*fA*mG-3'(配列番号3032)
センス鎖:5'-mGmGfCmCfCmAfGmGfCmCfAmUfCmGfGmCfAmUfUmCfC-3'(配列番号2992);
アンチセンス鎖:5'-fCfAmAfAmUfCmUfGmGfAmCfCmCfUmGfGmGfCmUfCmC*fG*mG-3'(配列番号3033)
センス鎖:5'-mGmGfAmGfCmCfCmAfGmGfGmUfCmCfAmGfAmUfUmUfG-3'(配列番号2993);
アンチセンス鎖:5'-fGfGmAfCmUfCmCfGmGfGmAfGmGfCmCfCmGfUmCfUmC*fU*mC-3'(配列番号3042)
センス鎖:5'-mGmAfGmAfCmGfGmGfCmCfUmCfCmCfGmGfAmGfUmCfC-3'(配列番号3002);
アンチセンス鎖:5'-fGfCmGfAmUfGmCfCmUfGmGfAmAfAmGfCmGfAmUfCmC*fU*mU-3'(配列番号3041)
センス鎖:5'-mGmGfAmUfCmGfCmUfUmUfCmCfAmGfGmCfAmUfCmGfC-3'(配列番号3001);
アンチセンス鎖:5'-fCfUmCfAmAfAmGfCmAfGmGfCmUfCmGfCmAfGmGfGmC*fC*mU-3'(配列番号3030)
センス鎖:5'-mGmCfCmCfUmGfCmGfAmGfCmCfUmGfCmUfUmUfGmAfG-3'(配列番号2990);
アンチセンス鎖:5'-fAfUmUfCmCfCmGfCmCfGmGfUmGfCmUfGmCfCmUfCmA*fG*mC-3'(配列番号3036)
センス鎖:5'-mUmGfAmGfGmCfAmGfCmAfCmCfGmGfCmGfGmGfAmAfU-3'(配列番号2996);
アンチセンス鎖:5'-fCfUmCfUmCfAmUfUmCfUmGfAmAfAmCfCmAfAmAfUmC*fU*mG-3'(配列番号3035)
センス鎖:5'-mGmAfUmUfUmGfGmUfUmUfCmAfGmAfAmUfGmAfGmAfG-3'(配列番号2995);
アンチセンス鎖:5'-fAfUmGfCmCfCmAfGmGfAmAfAmGfAmAfUmGfGmCfAmG*fU*mU-3'(配列番号3065)
センス鎖:5'-mCmUfGmCfCmAfUmUfCmUfUmUfCmCfUmGfGmGfCmAfU-3'(配列番号3025);
アンチセンス鎖:5'-fGfUmUfUmCfUmAfGmGfAmGfAmGfGmUfUmGfCmGfCmC*fU*mG-3'(配列番号3054)
センス鎖:5'-mGmGfCmGfCmAfAmCfCmUfCmUfCmCfUmAfGmAfAmAfC-3'(配列番号3014);
アンチセンス鎖:5'-fUfCmCfGmUfUmUfCmUfAmGfGmAfGmAfGmGfUmUfGmC*fG*mC-3'(配列番号3057)
センス鎖:5'-mGmCfAmAfCmCfUmCfUmCfCmUfAmGfAmAfAmCfGmGfA-3'(配列番号3017);
アンチセンス鎖:5'-fGfUmCfCmAfAmAfCmGfAmGfUmCfUmCfCmGfUmCfGmC*fC*mG-3'(配列番号3027)
センス鎖:5'-mGmCfGmAfCmGfGmAfGmAfCmUfCmGfUmUfUmGfGmAfC-3'(配列番号2987);
アンチセンス鎖:5'-fGfAmAfAmCfUmCfCmGfGmGfCmUfCmGfCmCfAmGfGmA*fG*mC-3'(配列番号3049)
センス鎖:5'-mUmCfCmUfGmGfCmGfAmGfCmCfCmGfGmAfGmUfUmUfC-3'(配列番号3009);
アンチセンス鎖:5'-fAfAmGfAmAfUmGfGmCfAmGfUmUfCmUfCmCfGmCfGmG*fU*mG-3'(配列番号3064)
センス鎖:5'-mCmCfGmCfGmGfAmGfAmAfCmUfGmCfCmAfUmUfCmUfU-3'(配列番号3024);
アンチセンス鎖:5'-fCfGmUfUmUfCmUfAmGfGmAfGmAfGmGfUmUfGmCfGmC*fC*mU-3'(配列番号3055)
センス鎖:5'-mGmCfGmCfAmAfCmCfUmCfUmCfCmUfAmGfAmAfAmCfG-3'(配列番号3015);
アンチセンス鎖:5'-fGfGmUfCmCfAmAfAmCfGmAfGmUfCmUfCmCfGmUfCmG*fC*mC-3'(配列番号3028)
センス鎖:5'-mCmGfAmCfGmGfAmGfAmCfUmCfGmUfUmUfGmGfAmCfC-3'(配列番号2988);
アンチセンス鎖:5'-fGfCmGfGmUfGmUfGmGfAmGfUmCfUmCfUmCfAmCfCmG*fG*mG-3'(配列番号3063)
センス鎖:5'-mCmGfGmUfGmAfGmAfGmAfCmUfCmCfAmCfAmCfCmGfC-3'(配列番号3023);
アンチセンス鎖:5'-fUfUmCfUmAfGmGfAmGfAmGfGmUfUmGfCmGfCmCfUmG*fC*mU-3'(配列番号3052)
センス鎖:5'-mCmAfGmGfCmGfCmAfAmCfCmUfCmUfCmCfUmAfGmAfA-3'(配列番号3012);
アンチセンス鎖:5'-fUfAmUfUmCfUmUfCmCfUmCfGmCfUmGfAmGfGmGfGmU*fG*mC-3'(配列番号3059)
センス鎖:5'-mAmCfCmCfCmUfCmAfGmCfGmAfGmGfAmAfGmAfAmUfA-3'(配列番号3019);
アンチセンス鎖:5'-fGfGmGfUmCfCmAfAmAfCmGfAmGfUmCfUmCfCmGfUmC*fG*mC-3'(配列番号3029)
センス鎖:5'-mGmAfCmGfGmAfGmAfCmUfCmGfUmUfUmGfGmAfCmCfC-3'(配列番号2989);
アンチセンス鎖:5'-fCfUmGfAmAfUmCfCmUfGmGfAmCfUmCfCmGfGmGfAmG*fG*mC-3'(配列番号3044)
センス鎖:5'-mCmUfCmCfCmGfGmAfGmUfCmCfAmGfGmAfUmUfCmAfG-3'(配列番号3004);
アンチセンス鎖:5'-fUfUmUfCmUfAmGfGmAfGmAfGmGfUmUfGmCfGmCfCmU*fG*mC-3'(配列番号3053)
センス鎖:5'-mAmGfGmCfGmCfAmAfCmCfUmCfUmCfCmUfAmGfAmAfA-3'(配列番号3013);
アンチセンス鎖:5'-fCfAmGfAmAfAmCfUmCfCmGfGmGfCmUfCmGfCmCfAmG*fG*mA-3'(配列番号3050)
センス鎖:5'-mCmUfGmGfCmGfAmGfCmCfCmGfGmAfGmUfUmUfCmUfG-3'(配列番号3010);
アンチセンス鎖:5'-fAfAmAfGmGfCmUfCmGfGmAfGmGfAmGfCmAfGmGfGmC*fG*mG-3'(配列番号3038)
センス鎖:5'-mGmCfCmCfUmGfCmUfCmCfUmCfCmGfAmGfCmCfUmUfU-3'(配列番号2998);
アンチセンス鎖:5'-fGfCmUfUmUfUmGfCmCfCmGfGmGfUmGfCmGfGmAfGmG*fC*mC-3'(配列番号3047)
センス鎖:5'-mCmCfUmCfCmGfCmAfCmCfCmGfGmGfCmAfAmAfAmGfC-3'(配列番号3007);
アンチセンス鎖:5'-fCfCmUfGmUfCmCfCmGfGmGfUmGfCmCfUmGfGmCfCmC*fU*mU-3'(配列番号3045)
センス鎖:5'-mGmGfGmCfCmAfGmGfCmAfCmCfCmGfGmGfAmCfAmGfG-3'(配列番号3005);
アンチセンス鎖:5'-fUfGmAfAmUfCmCfUmGfGmAfCmUfCmCfGmGfGmAfGmG*fC*mC-3'(配列番号3043)
センス鎖:5'-mCmCfUmCfCmCfGmGfAmGfUmCfCmAfGmGfAmUfUmCfA-3'(配列番号3003);
アンチセンス鎖:5'-fGfGmGfAmUfGmCfCmCfAmGfGmAfAmAfGmAfAmUfGmG*fC*mA-3'(配列番号3066)
センス鎖:5'-mCmCfAmUfUmCfUmUfUmCfCmUfGmGfGmCfAmUfCmCfC-3'(配列番号3026)
アンチセンス鎖:5'-fGfAmGfUmCfUmCfUmCfAmCfCmGfGmGfCmCfUmAfGmA*fC*mC-3'(配列番号3062)
センス鎖:5'-mUmCfUmAfGmGfCmCfCmGfGmUfGmAfGmAfGmAfCmUfC-3'(配列番号3022);
アンチセンス鎖:5'-fCfCmGfUmUfUmCfUmAfGmGfAmGfAmGfGmUfUmGfCmG*fC*mC-3'(配列番号3056)
センス鎖:5'-mCmGfCmAfAmCfCmUfCmUfCmCfUmAfGmAfAmAfCmGfG-3'(配列番号3016);
アンチセンス鎖:5'-fCfGmGfUmCfCmUfCmCfCmGfGmCfUmUfUmUfGmCfCmC*fG*mG-3'(配列番号3048)
センス鎖:5'-mGmGfGmCfAmAfAmAfGmCfCmGfGmGfAmGfGmAfCmCfG-3'(配列番号3008);
アンチセンス鎖:5'-fCfCmGfGmUfAmUfUmCfUmUfCmCfUmCfGmCfUmGfAmG*fG*mG-3'(配列番号3061)
センス鎖:5'-mCmUfCmAfGmCfGmAfGmGfAmAfGmAfAmUfAmCfCmGfG-3'(配列番号3021);
アンチセンス鎖:5'-fCfCmAfGmCfGmAfGmGfAmGfCmCfUmGfAmGfGmGfUmG*fG*mG-3'(配列番号3046)
センス鎖:5'-mCmAfCmCfCmUfCmAfGmGfCmUfCmCfUmCfGmCfUmGfG-3'(配列番号3006);
アンチセンス鎖:5'-fGfCmUfUmCfCmAfGmCfGmAfGmGfCmGfGmCfCmUfCmU*fU*mC-3'(配列番号3058)
センス鎖:5'-mAmGfAmGfGmCfCmGfCmCfUmCfGmCfUmGfGmAfAmGfC-3'(配列番号3018);
アンチセンス鎖:5'-fUfGmGfAmAfAmGfCmGfAmUfCmCfUmUfCmUfCmAfAmA*fG*mG-3'(配列番号3040)
センス鎖:5'-mUmUfUmGfAmGfAmAfGmGfAmUfCmGfCmUfUmUfCmCfA-3'(配列番号3000);
アンチセンス鎖:5'-fCfGmAfUmCfCmUfUmCfUmCfAmAfAmGfGmCfUmCfGmG*fA*mG-3'(配列番号3039)
センス鎖:5'-mCmCfGmAfGmCfCmUfUmUfGmAfGmAfAmGfGmAfUmCfG-3'(配列番号2999);
アンチセンス鎖:5'-fGfGmGfCmGfGmUfCmUfGmGfGmAfUmCfCmGfGmUfGmA*fC*mG-3'(配列番号3037)
センス鎖:5'-mUmCfAmCfCmGfGmAfUmCfCmCfAmGfAmCfCmGfCmCfC-3'(配列番号2997);
アンチセンス鎖:5'-fGfUmAfUmUfCmUfUmCfCmUfCmGfCmUfGmAfGmGfGmG*fU*mG-3'(配列番号3060)
センス鎖:5'-mCmCfCmCfUmCfAmGfCmGfAmGfGmAfAmGfAmAfUmAfC-3'(配列番号3020);および
アンチセンス鎖:5'-fUfGmCfUmGfCmAfGmAfAmAfCmUfCmCfGmGfGmCfUmC*fG*mC-3'(配列番号3051)
センス鎖:5'-mGmAfGmCfCmCfGmGfAmGfUmUfUmCfUmGfCmAfGmCfA-3'(配列番号3011)
から選択されるsiRNAオリゴヌクレオチド;
ここで「m」は、2'-O-メチル(2'-O-Me)である;「f」は、2'-フルオロ(2'-F)である;「*」は、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結を指し示す;およびヌクレオシド間に「*」が存在しないことは、ホスホジエステル連結を指し示す。
等価物および専門用語
例証的に本明細書に記載された開示は、好適には、本明細書に具体的には開示されないいずれかの要素(単数または複数)、限定(単数または複数)の非存在下において実施され得る。それゆえに、例えば、本出願の各事例において、用語「含む」、「から本質的になる」、および「からなる」のいずれかは、他の2つの用語のどちらかによって置き換えられ得る。採用された用語および表現は、限定ではなく記載の用語として使用され、かかる用語および表現の使用には(that in)、示されるおよび記載される特徴のいずれかの等価物またはそれらの部分を排除する意図はなく、種々の改変が本開示の範囲内で可能であることが認識される。それゆえに、本開示は好ましい態様によって具体的に開示されたが、本明細書に開示される概念の任意の特徴、改変、および変形が当業者によって頼られ得ることと、かかる改変および変形は本開示の範囲内であると考慮されることとは理解されるべきである。
加えて、本開示の特徴または側面がマーカッシュ群または代替物の他の群分けとして記載されるところでは、当業者は、本開示がそれによってマーカッシュ群または他の群のいずれかの個々の構成員または構成員のサブグループとしてもまた記載されることを認識するであろう。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドまたは他の核酸の構造を記載する際には、配列表で提示される配列が参照され得ることは了解されるべきである。かかる態様において、実際のオリゴヌクレオチドまたは他の核酸は、指定された配列と本質的に同じかまたは類似の相補的な特性を保持しながら、指定された配列と比較して、1以上の代替的なヌクレオチド(例として、DNAヌクレオチドのRNAカウンターパート、またはRNAヌクレオチドのDNAカウンターパート)および/または(例として、および)1以上の修飾ヌクレオチドおよび/または(例として、および)1以上の修飾されたヌクレオチド間連結および/または(例として、および)1以上の他の改変を有し得る。
本発明を記載する文脈における(特に次の請求項の文脈における)用語「a」および「an」および「the」ならびに類似のレファレントの使用は、本明細書に別様に指し示されないかまたは文脈によって明瞭に否定されない限り、単数および複数両方をカバーすると解釈されるべきである。用語「含む」、「有する」、「包含する」、および「含有する」は、別様に指摘されない限り、開放型の用語として解釈されるべきである(すなわち、「包含するが、これらに限定されない」を意味する)。本明細書における値の範囲の記載は、本明細書に別様に指し示されない限り、単に、範囲内に収まる各別個の値を個々に参照する簡略な方法として働くことを意図され、各別個の値は、それが本明細書に個々に記載される場合のように本明細書に組み込まれる。本明細書に別様に指し示されないかまたは別様には文脈によって明瞭に否定されない限り、本明細書に記載のすべての方法はいずれかの好適な順序で行われ得る。別様に請求されない限り、本明細書に提供されるいずれかのおよびすべての例または例示的な文言(例として、「などの」)の使用は、単に本発明をより良く解き明かすことを意図され、本発明の範囲に限定を課さない。本明細書のいかなる文言も、いずれかの請求されない要素を本発明の実施にとって必須であると指し示すものと解釈されるべきではない。
本発明の態様が本明細書に記載されている。それらの態様の変形は、先述の記載を読むことによって当業者には明らかになり得る。
本発明者は当業者がかかる変形を適当に採用することを予期し、本発明者は本発明が本明細書に具体的に記載されるとおりとは別様に実施されることを意図する。したがって、本発明は、然るべき法律によって許可される本明細書に添付される請求項に記載される主題のすべての改変および等価物を包含する。その上、それらのすべての可能な変形における上に記載された要素のいずれかの組み合わせは、本明細書に別様に指し示されないかまたは別様に文脈によって明瞭に否定されない限り、本発明によって包摂される。当業者は、本明細書に記載の本発明の具体的な態様の多くの等価物を認識するか、またはせいぜい定型的な実験作業によって確かめる能力があるであろう。かかる等価物は次の請求項によって包摂されることを意図される。

Claims (33)

  1. double homeobox 4(DUX4)mRNAを標的にするオリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結されている筋標的化剤を含む複合体であって、
    ここでオリゴヌクレオチドが、長さが18～25ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、かつ配列番号356、501、1398、494、509、224、1320、561、225、226、261、265、320、341、343、388、466、483、552、560、601、921、942、953、1294、1296、1301、1321、1322、1323、1324、1325、1373、1394、1395、1523、1531、1548、1558、および1561で表されるとおりの標的配列に対する相補性の領域を含み、ならびに
    ここで相補性の領域が、長さが少なくとも16の連続したヌクレオシドである、前記複合体。
  2. 筋標的化剤が、抗トランスフェリン受容体(TfR)抗体である、請求項1に記載の複合体。
  3. オリゴヌクレオチドが、RNAiオリゴヌクレオチドである、請求項1または請求項2に記載の複合体。
  4. アンチセンス鎖が、配列番号3035、3040、3061、3039、3041、3027、3052、3044、3028、3029、3030、3031、3032、3033、3034、3036、3037、3038、3042、3043、3045、3046、3047、3048、3049、3050、3051、3053、3054、3055、3056、3057、3058、3059、3060、3062、3063、3064、3065、および3066のいずれか1つのヌクレオチド配列を含む、請求項1または請求項2に記載の複合体。
  5. オリゴヌクレオチドが、アンチセンス鎖に相補的である少なくとも18の連続したヌクレオシドを含むセンス鎖をさらに含む、請求項1～4のいずれか一項に記載の複合体。
  6. オリゴヌクレオチドが、1以上の修飾ヌクレオシドを含む、請求項1～5のいずれか一項に記載の複合体。
  7. 1以上の修飾ヌクレオシドが、2'修飾ヌクレオチドであり、
    任意にここで1以上の2'修飾ヌクレオシドが、以下:2'-フルオロ(2'-F)、2'-O-メチル(2’-O-Me)、2'-O-メトキシエチル(2'-MOE)、2'-O-アミノプロピル(2'-O-AP)、2'-O-ジメチルアミノエチル(2'-O-DMAOE)、2'-O-ジメチルアミノプロピル(2'-O-DMAP)、2'-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2'-O-DMAEOE)、2'-O-N-メチルアセトアミド(2'-O-NMA)から選択される、請求項6に記載の複合体。
  8. 各2'修飾ヌクレオチドが、2'-O-メチルまたは2'-フルオロ(2'-F)である、請求項7に記載の複合体。
  9. オリゴヌクレオチドが、1以上のホスホロチオアートヌクレオシド間連結を含む、請求項1～8のいずれか一項に記載の複合体。
  10. 1以上のホスホロチオアートヌクレオシド間連結が、オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖上に存在し、
    任意にここでアンチセンス鎖の3'末端での2ヌクレオシド間の連結が、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結である、請求項9に記載の複合体。
  11. オリゴヌクレオチドの1以上のシチジンが、2'-修飾5-メチル-シチジンであり、
    任意にここで2'-修飾5-メチル-シチジンが、2'-O-Me修飾5-メチル-シチジンまたは2'-F修飾5-メチル-シチジンである、請求項1～10のいずれか一項に記載の複合体。
  12. アンチセンス鎖が、表8に列挙される配列番号3035、3040、3061、3039、3041、3027、3052、3044、3028、3029、3030、3031、3032、3033、3034、3036、3037、3038、3042、3043、3045、3046、3047、3048、3049、3050、3051、3053、3054、3055、3056、3057、3058、3059、3060、3062、3063、3064、3065、および3066の修飾バージョンから選択される、請求項1～11のいずれか一項に記載の複合体。
  13. センス鎖が、表8に列挙される配列番号2995、3000、3021、2999、3001、2987、3012、3004、2988、2989、2990、2991、2992、2993、2994、2996、2997、2998、3002、3003、3005、3006、3007、3008、3009、3010、3011、3013、3014、3015、3016、3017、3018、3019、3020、3022、3023、3024、3025、および3026の修飾バージョンから選択される、請求項5～12のいずれか一項に記載の複合体。
  14. オリゴヌクレオチドが、表8に列挙されるsiRNAから選択されるsiRNA分子である、請求項1～13のいずれか一項に記載の複合体。
  15. アンチセンス鎖が、表9に列挙される配列番号3040、3061、3027、3037、3039、3041、3044、および3052の修飾バージョンから選択される、請求項1～11のいずれか一項に記載の複合体。
  16. センス鎖が、表9に列挙される配列番号3000、3021、2987、2997、2999、3001、3004、および3012の修飾バージョンから選択される、請求項5～11および15のいずれか一項に記載の複合体。
  17. オリゴヌクレオチドが、表9に列挙されるsiRNAから選択されるsiRNA分子である、請求項1～11および15～16のいずれか一項に記載の複合体。
  18. 抗TfR抗体が、表2に列挙される抗TfR抗体のいずれかの重鎖相補性決定領域1(CDR-H1)、重鎖相補性決定領域2(CDR-H2)、重鎖相補性決定領域3(CDR-H3)、軽鎖相補性決定領域1(CDR-L1)、軽鎖相補性決定領域2(CDR-L2)、軽鎖相補性決定領域3(CDR-L3)を含む、請求項2～17のいずれか一項に記載の複合体。
  19. 抗TfR抗体が、表3に列挙される抗TfR抗体のいずれかの重鎖可変領域(VH)および軽鎖可変領域(VL)を含む、請求項2～17のいずれか一項に記載の複合体。
  20. 抗TfR抗体が、Fabであり、
    任意にここでFabが、表5に列挙される抗TfR Fabのいずれかの重鎖および軽鎖を含む、請求項2～17のいずれか一項に記載の複合体。
  21. 抗TfR抗体が、以下:
    (ｉ) 配列番号27のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号28のアミノ酸配列を含むCDR-H2、配列番号29のアミノ酸配列を含むCDR-H3、配列番号30のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号31のアミノ酸配列を含むCDR-L2、および配列番号32のアミノ酸配列を含むCDR-L3;
    (ii) 配列番号33のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号34のアミノ酸配列を含むCDR-H2、配列番号35のアミノ酸配列を含むCDR-H3、配列番号36のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号37のアミノ酸配列を含むCDR-L2、および配列番号32のアミノ酸配列を含むCDR-L3;または
    (ii) 配列番号38のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号39のアミノ酸配列を含むCDR-H2、配列番号40のアミノ酸配列を含むCDR-H3、配列番号41のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号31のアミノ酸配列を含むCDR-L2、および配列番号42のアミノ酸配列を含むCDR-L3
    を含む、請求項2～20のいずれか一項に記載の複合体。
  22. 抗TfR抗体が、配列番号76のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号75のアミノ酸配列を含むVLを含む、請求項21に記載の複合体。
  23. 抗TfR抗体が、Fabであって、かつ配列番号101のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項22に記載の複合体。
  24. 筋標的化剤およびアンチセンスオリゴヌクレオチドが、リンカーを介して共有結合的に連結されており、
    任意にここでリンカーが、バリン-シトルリン配列を含む、請求項1～23のいずれか一項に記載の複合体。
  25. 筋細胞中のDUX4発現を低減させる方法であって、方法が、筋細胞を、オリゴヌクレオチドの筋細胞への内在化を促進するのに有効な量の、請求項1～24のいずれか一項に記載の複合体と接触させることを含む、前記方法。
  26. DUX4発現を低減させることが、DUX4タンパク質および/またはmRNAのレベルを低減させることを含む、請求項25に記載の方法。
  27. 顔面肩甲上腕筋ジストロフィー(FSHD)を処置する方法であって、方法が、請求項1～24のいずれか一項に記載の有効量の複合体を、これを必要とする対象へ投与することを含み、ここで対象が、DUX4タンパク質の異常な産生を有する、前記方法。
  28. 以下:
    アンチセンス鎖:5'-fCfUmCfUmCfAmUfUmCfUmGfAmAfAmCfCmAfAmAfUmC*fU*mG-3'(配列番号3035)
    センス鎖:5'-mGmAfUmUfUmGfGmUfUmUfCmAfGmAfAmUfGmAfGmAfG-3'(配列番号2995);
    アンチセンス鎖:5'-fUfGmGfAmAfAmGfCmGfAmUfCmCfUmUfCmUfCmAfAmA*fG*mG-3'(配列番号3040)
    センス鎖:5'-mUmUfUmGfAmGfAmAfGmGfAmUfCmGfCmUfUmUfCmCfA-3'(配列番号3000);
    アンチセンス鎖:5'-fCfCmGfGmUfAmUfUmCfUmUfCmCfUmCfGmCfUmGfAmG*fG*mG-3'(配列番号3061)
    センス鎖:5'-mCmUfCmAfGmCfGmAfGmGfAmAfGmAfAmUfAmCfCmGfG-3'(配列番号3021);
    アンチセンス鎖:5'-fCfGmAfUmCfCmUfUmCfUmCfAmAfAmGfGmCfUmCfGmG*fA*mG-3'(配列番号3039)
    センス鎖:5'-mCmCfGmAfGmCfCmUfUmUfGmAfGmAfAmGfGmAfUmCfG-3'(配列番号2999);
    アンチセンス鎖:5'-fGfCmGfAmUfGmCfCmUfGmGfAmAfAmGfCmGfAmUfCmC*fU*mU-3'(配列番号3041)
    センス鎖:5'-mGmGfAmUfCmGfCmUfUmUfCmCfAmGfGmCfAmUfCmGfC-3'(配列番号3001);
    アンチセンス鎖:5'-fGfUmCfCmAfAmAfCmGfAmGfUmCfUmCfCmGfUmCfGmC*fC*mG-3'(配列番号3027)
    センス鎖:5'-mGmCfGmAfCmGfGmAfGmAfCmUfCmGfUmUfUmGfGmAfC-3'(配列番号2987);
    アンチセンス鎖:5'-fUfUmCfUmAfGmGfAmGfAmGfGmUfUmGfCmGfCmCfUmG*fC*mU-3'(配列番号3052)
    センス鎖:5'-mCmAfGmGfCmGfCmAfAmCfCmUfCmUfCmCfUmAfGmAfA-3'(配列番号3012);
    アンチセンス鎖:5'-fCfUmGfAmAfUmCfCmUfGmGfAmCfUmCfCmGfGmGfAmG*fG*mC-3'(配列番号3044)
    センス鎖:5'-mCmUfCmCfCmGfGmAfGmUfCmCfAmGfGmAfUmUfCmAfG-3'(配列番号3004);
    アンチセンス鎖:5'-fUfCmCfGmCfUmCfAmAfAmGfCmAfGmGfCmUfCmGfCmA*fG*mG-3'(配列番号3031)
    センス鎖:5'-mUmGfCmGfAmGfCmCfUmGfCmUfUmUfGmAfGmCfGmGfA-3'(配列番号2991);
    アンチセンス鎖:5'-fAfCmCfAmAfAmUfCmUfGmGfAmCfCmCfUmGfGmGfCmU*fC*mC-3'(配列番号3034)
    センス鎖:5'-mAmGfCmCfCmAfGmGfGmUfCmCfAmGfAmUfUmUfGmGfU-3'(配列番号2994);
    アンチセンス鎖:5'-fGfGmAfAmUfGmCfCmGfAmUfGmGfCmCfUmGfGmGfCmC*fA*mG-3'(配列番号3032)
    センス鎖:5'-mGmGfCmCfCmAfGmGfCmCfAmUfCmGfGmCfAmUfUmCfC-3'(配列番号2992);
    アンチセンス鎖:5'-fCfAmAfAmUfCmUfGmGfAmCfCmCfUmGfGmGfCmUfCmC*fG*mG-3'(配列番号3033)
    センス鎖:5'-mGmGfAmGfCmCfCmAfGmGfGmUfCmCfAmGfAmUfUmUfG-3'(配列番号2993);
    アンチセンス鎖:5'-fGfGmAfCmUfCmCfGmGfGmAfGmGfCmCfCmGfUmCfUmC*fU*mC-3'(配列番号3042)
    センス鎖:5'-mGmAfGmAfCmGfGmGfCmCfUmCfCmCfGmGfAmGfUmCfC-3'(配列番号3002);
    アンチセンス鎖:5'-fCfUmCfAmAfAmGfCmAfGmGfCmUfCmGfCmAfGmGfGmC*fC*mU-3'(配列番号3030)
    センス鎖:5'-mGmCfCmCfUmGfCmGfAmGfCmCfUmGfCmUfUmUfGmAfG-3'(配列番号2990);
    アンチセンス鎖:5'-fAfUmUfCmCfCmGfCmCfGmGfUmGfCmUfGmCfCmUfCmA*fG*mC-3'(配列番号3036)
    センス鎖:5'-mUmGfAmGfGmCfAmGfCmAfCmCfGmGfCmGfGmGfAmAfU-3'(配列番号2996);
    アンチセンス鎖:5'-fAfUmGfCmCfCmAfGmGfAmAfAmGfAmAfUmGfGmCfAmG*fU*mU-3'(配列番号3065)
    センス鎖:5'-mCmUfGmCfCmAfUmUfCmUfUmUfCmCfUmGfGmGfCmAfU-3'(配列番号3025);
    アンチセンス鎖:5'-fGfUmUfUmCfUmAfGmGfAmGfAmGfGmUfUmGfCmGfCmC*fU*mG-3'(配列番号3054)
    センス鎖:5'-mGmGfCmGfCmAfAmCfCmUfCmUfCmCfUmAfGmAfAmAfC-3'(配列番号3014);
    アンチセンス鎖:5'-fUfCmCfGmUfUmUfCmUfAmGfGmAfGmAfGmGfUmUfGmC*fG*mC-3'(配列番号3057)
    センス鎖:5'-mGmCfAmAfCmCfUmCfUmCfCmUfAmGfAmAfAmCfGmGfA-3'(配列番号3017);
    アンチセンス鎖:5'-fGfAmAfAmCfUmCfCmGfGmGfCmUfCmGfCmCfAmGfGmA*fG*mC-3'(配列番号3049)
    センス鎖:5'-mUmCfCmUfGmGfCmGfAmGfCmCfCmGfGmAfGmUfUmUfC-3'(配列番号3009);
    アンチセンス鎖:5'-fAfAmGfAmAfUmGfGmCfAmGfUmUfCmUfCmCfGmCfGmG*fU*mG-3'(配列番号3064)
    センス鎖:5'-mCmCfGmCfGmGfAmGfAmAfCmUfGmCfCmAfUmUfCmUfU-3'(配列番号3024);
    アンチセンス鎖:5'-fCfGmUfUmUfCmUfAmGfGmAfGmAfGmGfUmUfGmCfGmC*fC*mU-3'(配列番号3055)
    センス鎖:5'-mGmCfGmCfAmAfCmCfUmCfUmCfCmUfAmGfAmAfAmCfG-3'(配列番号3015);
    アンチセンス鎖:5'-fGfGmUfCmCfAmAfAmCfGmAfGmUfCmUfCmCfGmUfCmG*fC*mC-3'(配列番号3028)
    センス鎖:5'-mCmGfAmCfGmGfAmGfAmCfUmCfGmUfUmUfGmGfAmCfC-3'(配列番号2988);
    アンチセンス鎖:5'-fGfCmGfGmUfGmUfGmGfAmGfUmCfUmCfUmCfAmCfCmG*fG*mG-3'(配列番号3063)
    センス鎖:5'-mCmGfGmUfGmAfGmAfGmAfCmUfCmCfAmCfAmCfCmGfC-3'(配列番号3023);
    アンチセンス鎖:5'-fUfAmUfUmCfUmUfCmCfUmCfGmCfUmGfAmGfGmGfGmU*fG*mC-3'(配列番号3059)
    センス鎖:5'-mAmCfCmCfCmUfCmAfGmCfGmAfGmGfAmAfGmAfAmUfA-3'(配列番号3019);
    アンチセンス鎖:5'-fGfGmGfUmCfCmAfAmAfCmGfAmGfUmCfUmCfCmGfUmC*fG*mC-3'(配列番号3029)
    センス鎖:5'-mGmAfCmGfGmAfGmAfCmUfCmGfUmUfUmGfGmAfCmCfC-3'(配列番号2989);
    アンチセンス鎖:5'-fUfUmUfCmUfAmGfGmAfGmAfGmGfUmUfGmCfGmCfCmU*fG*mC-3'(配列番号3053)
    センス鎖:5'-mAmGfGmCfGmCfAmAfCmCfUmCfUmCfCmUfAmGfAmAfA-3'(配列番号3013);
    アンチセンス鎖:5'-fCfAmGfAmAfAmCfUmCfCmGfGmGfCmUfCmGfCmCfAmG*fG*mA-3'(配列番号3050)
    センス鎖:5'-mCmUfGmGfCmGfAmGfCmCfCmGfGmAfGmUfUmUfCmUfG-3'(配列番号3010);
    アンチセンス鎖:5'-fAfAmAfGmGfCmUfCmGfGmAfGmGfAmGfCmAfGmGfGmC*fG*mG-3'(配列番号3038)
    センス鎖:5'-mGmCfCmCfUmGfCmUfCmCfUmCfCmGfAmGfCmCfUmUfU-3'(配列番号2998);
    アンチセンス鎖:5'-fGfCmUfUmUfUmGfCmCfCmGfGmGfUmGfCmGfGmAfGmG*fC*mC-3'(配列番号3047)
    センス鎖:5'-mCmCfUmCfCmGfCmAfCmCfCmGfGmGfCmAfAmAfAmGfC-3'(配列番号3007);
    アンチセンス鎖:5'-fCfCmUfGmUfCmCfCmGfGmGfUmGfCmCfUmGfGmCfCmC*fU*mU-3'(配列番号3045)
    センス鎖:5'-mGmGfGmCfCmAfGmGfCmAfCmCfCmGfGmGfAmCfAmGfG-3'(配列番号3005);
    アンチセンス鎖:5'-fUfGmAfAmUfCmCfUmGfGmAfCmUfCmCfGmGfGmAfGmG*fC*mC-3'(配列番号3043)
    センス鎖:5'-mCmCfUmCfCmCfGmGfAmGfUmCfCmAfGmGfAmUfUmCfA-3'(配列番号3003);
    アンチセンス鎖:5'-fGfGmGfAmUfGmCfCmCfAmGfGmAfAmAfGmAfAmUfGmG*fC*mA-3'(配列番号3066)
    センス鎖:5'-mCmCfAmUfUmCfUmUfUmCfCmUfGmGfGmCfAmUfCmCfC-3'(配列番号3026);
    アンチセンス鎖:5'-fGfAmGfUmCfUmCfUmCfAmCfCmGfGmGfCmCfUmAfGmA*fC*mC-3'(配列番号3062)
    センス鎖:5'-mUmCfUmAfGmGfCmCfCmGfGmUfGmAfGmAfGmAfCmUfC-3'(配列番号3022);
    アンチセンス鎖:5'-fCfCmGfUmUfUmCfUmAfGmGfAmGfAmGfGmUfUmGfCmG*fC*mC-3'(配列番号3056)
    センス鎖:5'-mCmGfCmAfAmCfCmUfCmUfCmCfUmAfGmAfAmAfCmGfG-3'(配列番号3016);
    アンチセンス鎖:5'-fCfGmGfUmCfCmUfCmCfCmGfGmCfUmUfUmUfGmCfCmC*fG*mG-3'(配列番号3048)
    センス鎖:5'-mGmGfGmCfAmAfAmAfGmCfCmGfGmGfAmGfGmAfCmCfG-3'(配列番号3008);
    アンチセンス鎖:5'-fCfCmAfGmCfGmAfGmGfAmGfCmCfUmGfAmGfGmGfUmG*fG*mG-3'(配列番号3046)
    センス鎖:5'-mCmAfCmCfCmUfCmAfGmGfCmUfCmCfUmCfGmCfUmGfG-3'(配列番号3006);
    アンチセンス鎖:5'-fGfCmUfUmCfCmAfGmCfGmAfGmGfCmGfGmCfCmUfCmU*fU*mC-3'(配列番号3058)
    センス鎖:5'-mAmGfAmGfGmCfCmGfCmCfUmCfGmCfUmGfGmAfAmGfC-3'(配列番号3018);
    アンチセンス鎖:5'-fGfGmGfCmGfGmUfCmUfGmGfGmAfUmCfCmGfGmUfGmA*fC*mG-3'(配列番号3037)
    センス鎖:5'-mUmCfAmCfCmGfGmAfUmCfCmCfAmGfAmCfCmGfCmCfC-3'(配列番号2997);
    アンチセンス鎖:5'-fGfUmAfUmUfCmUfUmCfCmUfCmGfCmUfGmAfGmGfGmG*fU*mG-3'(配列番号3060)
    センス鎖:5'-mCmCfCmCfUmCfAmGfCmGfAmGfGmAfAmGfAmAfUmAfC-3'(配列番号3020);および
    アンチセンス鎖:5'-fUfGmCfUmGfCmAfGmAfAmAfCmUfCmCfGmGfGmCfUmC*fG*mC-3'(配列番号3051)
    センス鎖:5'-mGmAfGmCfCmCfGmGfAmGfUmUfUmCfUmGfCmAfGmCfA-3'(配列番号3011)
    から選択されるsiRNAオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド;ここで
    「m」が、2'-O-メチル(2'-O-Me)修飾ヌクレオシドを指し示す;
    「f」が、2'-フルオロ(2'-F)修飾ヌクレオシドを指し示す;
    「*」が、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結を指し示す;および
    2ヌクレオシド間に「*」が存在しないことが、ホスホジエステルヌクレオシド間連結を指し示す、前記オリゴヌクレオチド。
  29. 以下:
    アンチセンス鎖:5'-fUfGmGfAmAfAmGfxCmGfAmUfCmCfUmUfCmUfCmAfAmA*fG*mG-3'(配列番号3040)
    センス鎖:5'-mUmUfUmGfAmGfAmAfGmGfAmUfxCmGfCmUfUmUfCmCfA-3'(配列番号3000);
    アンチセンス鎖:5'-fCfxCmGfGmUfAmUfUmCfUmUfCmCfUmxCfGmCfUmGfAmG*fG*mG-3'(配列番号3061)
    センス鎖:5'-mCmUfCmAfGmxCfGmAfGmGfAmAfGmAfAmUfAmCfxCmGfG-3'(配列番号3021);
    アンチセンス鎖:5'-fGfUmCfCmAfAmAfxCmGfAmGfUmCfUmCfxCmGfUmxCfGmC*fxC*mG-3'(配列番号3027)
    センス鎖:5'-mGmxCfGmAfxCmGfGmAfGmAfCmUfxCmGfUmUfUmGfGmAfC-3'(配列番号2987);
    アンチセンス鎖:5'-fGfGmGfxCmGfGmUfCmUfGmGfGmAfUmCfxCmGfGmUfGmA*fxC*mG-3'(配列番号3037)
    センス鎖:5'-mUmCfAmCfxCmGfGmAfUmCfCmCfAmGfAmCfxCmGfCmCfC-3'(配列番号2997);
    アンチセンス鎖:5'-fxCfGmAfUmCfCmUfUmCfUmCfAmAfAmGfGmCfUmxCfGmG*fA*mG-3'(配列番号3039)
    センス鎖:5'-mCmxCfGmAfGmCfCmUfUmUfGmAfGmAfAmGfGmAfUmxCfG-3'(配列番号2999);
    アンチセンス鎖:5'-fGfxCmGfAmUfGmCfCmUfGmGfAmAfAmGfxCmGfAmUfCmC*fU*mU-3'(配列番号3041)
    センス鎖:5'-mGmGfAmUfxCmGfCmUfUmUfCmCfAmGfGmCfAmUfxCmGfC-3'(配列番号3001);
    アンチセンス鎖:5'-fCfUmGfAmAfUmCfCmUfGmGfAmCfUmCfxCmGfGmGfAmG*fG*mC-3'(配列番号3044)
    センス鎖:5'-mCmUfCmCfxCmGfGmAfGmUfCmCfAmGfGmAfUmUfCmAfG-3'(配列番号3004);および
    アンチセンス鎖:5'-fUfUmCfUmAfGmGfAmGfAmGfGmUfUmGfxCmGfCmCfUmG*fC*mU-3'(配列番号3052)
    センス鎖:5'-mCmAfGmGfxCmGfCmAfAmCfCmUfCmUfCmCfUmAfGmAfA-3'(配列番号3012)
    から選択されるsiRNAオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド;ここで
    「m」が、2'-O-メチル(2'-O-Me)修飾ヌクレオシドを指し示す;
    「f」が、2'-フルオロ(2'-F)修飾ヌクレオシドを指し示す;
    「mxC」が、2'-O-Me修飾5-メチル-シチジンを指し示す;
    「fxC」が、2'-F修飾5-メチル-シチジンを指し示す;
    「*」が、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結を指し示す;および
    2ヌクレオシド間に「*」が存在しないことが、ホスホジエステルヌクレオシド間連結を指し示す、前記オリゴヌクレオチド。
  30. double homeobox 4(DUX4)mRNAを標的にするオリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結されている筋標的化剤を含む複合体であって、
    ここでオリゴヌクレオチドが、長さが18～25ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、かつ配列番号163～1574で表されるとおりの標的配列に対する相補性の領域を含み、および
    ここで相補性の領域が、長さが少なくとも16の連続したヌクレオシドである、前記複合体。
  31. 筋標的化剤が、抗トランスフェリン受容体(TfR)抗体である、請求項30に記載の複合体。
  32. オリゴヌクレオチドが、RNAiオリゴヌクレオチドである、請求項30または請求項31に記載の複合体。
  33. アンチセンス鎖が、配列番号1575～2986のいずれか1つのヌクレオチド配列を含む、請求項30～32のいずれか一項に記載の複合体。
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