CN116940680A

CN116940680A - 肌肉靶向复合物及其用于治疗强直性肌营养不良的用途

Info

Publication number: CN116940680A
Application number: CN202180092429.6A
Authority: CN
Inventors: 罗梅什·R·苏布拉马尼亚; 蒂莫西·威登; 科迪·A·德雅尔丹; 斯特凡诺·扎诺蒂; 基姆·唐; 穆罕默德·T·卡塔纳尼; 布伦丹·奎因; 约翰·纳吉姆
Original assignee: Dyne Therapeutics Inc
Current assignee: Dyne Therapeutics Inc
Priority date: 2020-12-31
Filing date: 2021-12-30
Publication date: 2023-10-24

Abstract

本公开内容涉及被设计为靶向DMPK RNA的寡核苷酸(例如，反义寡核苷酸，例如间隔聚体)和涉及用于将该寡核苷酸递送至细胞(例如，肌细胞)的靶向复合物及其用途，特别是与疾病治疗相关的用途。在一些实施方案中，所述肌肉靶向剂与肌细胞上的内化细胞表面受体特异性结合。在一些实施方案中，所述分子载荷抑制DMPK的表达或活性。

Description

肌肉靶向复合物及其用于治疗强直性肌营养不良的用途

相关申请

本申请根据35 U.S.C§119(e)要求以下的权益：2021年9月17日提交的标题为“MUSCLE TARGETING COMPLEXES AND USES THEREOF FOR TREATING MYOTONIC DYSTROPHY”的美国临时申请号63/245262；2021年4月23日提交的标题为“MUSCLE TARGETINGCOMPLEXES AND USES THEREOF FOR TREATING MYOTONIC DYSTROPHY”的美国临时申请号63/179100；以及2020年12月31日提交的标题为“MUSCLE TARGETING COMPLEXES AND USESTHEREOF FOR TREATING MYOTONIC DYSTROPHY”的美国临时申请号63/133013；其各自的内容均通过引用整体并入本文。

技术领域

本申请涉及被设计为靶向DMPK RNA的寡核苷酸和涉及用于将该寡核苷酸递送至细胞(例如，肌细胞)的靶向复合物及其用途，特别是与疾病治疗相关的用途。

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背景技术

强直性肌营养不良(myotonic dystrophy，DM)是一种显性遗传的遗传疾病，其特征在于肌强直、肌肉损失或变性、肌肉功能减弱、胰岛素抵抗、心律不齐、平滑肌功能障碍和神经系统异常。DM是成年发病的肌营养不良的最常见形式，全世界发病率为全世界8000人中约1人。已经描述了该疾病的两种类型，即1型强直性肌营养不良(DM1)和2型强直性肌营养不良(DM2)。DM1是该疾病的更常见形式，其是由19号染色体上DMPK的3’非编码区中CTG三核苷酸重复的重复扩增(repeat expansion)导致的；DM2是由3号染色体上ZNF9的第一个内含子中CCTG四核苷酸重复的重复扩增导致的。在DM1患者中，CTG三核苷酸重复的重复扩增可包含大于约50至约3,000或更多的总重复，导致产生有毒的RNA重复，其能够形成以高亲和力结合必需的胞内蛋白(例如盲肌样蛋白(muscleblind-like protein))的发夹结构，从而导致蛋白质隔离(protein sequestration)和作为疾病特征的功能丧失表型。除了支持性护理和解决疾病症状的治疗之外，目前尚无用于DM1的有效治疗剂。

在一些方面中，本公开内容提供了被设计为靶向DMPK RNA的寡核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容提供了与DMPK RNA互补的寡核苷酸，其可用于降低具有疾病相关重复扩增的毒性DMPK的水平，例如，在患有或怀疑患有强直性肌营养不良的对象中。在一些实施方案中，寡核苷酸被设计为指导RNA酶H介导靶DMPK RNA的降解。在一些实施方案中，寡核苷酸被设计为指导RNA酶H介导位于细胞(例如，肌细胞(例如肌管))的核中的靶DMPK RNA的降解。在一些实施方案中，寡核苷酸被设计为指导RNA酶H介导位于细胞(例如神经系统的细胞(例如中枢神经系统(central nervous system，CNS)细胞))的核中的靶DMPK RNA的降解。在一些实施方案中，寡核苷酸被设计为具有期望的生物利用度和/或血清稳定性特性。在一些实施方案中，寡核苷酸被设计为具有期望的结合亲和力特性。在一些实施方案中，寡核苷酸被设计为具有期望的毒性特征。在一些实施方案中，寡核苷酸被设计为具有低补体激活和/或细胞因子诱导特性。

在一些实施方案中，本文中提供的寡核苷酸被设计为促进与其他分子(例如，靶向剂，例如，肌肉靶向剂)的缀合。因此，在一些方面中，本公开内容提供了靶向特定细胞类型以用于将寡核苷酸递送至这些细胞的复合物。例如，在一些实施方案中，本公开内容提供了靶向肌细胞以用于将寡核苷酸递送至这些细胞的复合物。在一些实施方案中，本文中提供的复合物对于递送抑制包含扩增的疾病相关重复的DMPK等位基因的表达或活性的分子载荷特别有用，例如，在患有或怀疑患有强直性肌营养不良的对象中。因此，在一些实施方案中，本文中提供的复合物包含与肌细胞表面上的受体特异性结合以用于将分子载荷递送至肌细胞的肌肉靶向剂(例如，肌肉靶向抗体)。在一些实施方案中，复合物通过受体介导的内化被摄取到细胞中，然后分子载荷可被释放以在细胞内部执行功能。例如，经工程化以递送寡核苷酸的复合物可以释放该寡核苷酸，使得该寡核苷酸可以抑制肌细胞中的突变体DMPK表达。在一些实施方案中，通过对连接复合物的寡核苷酸和肌肉靶向剂的共价接头进行内体切割而释放该寡核苷酸。应理解，本文中提供的寡核苷酸和/或复合物可用于多种组织和细胞类型，例如肌组织(例如，在肌细胞中)中和中枢神经系统(例如，在CNS细胞如神经元中)中。

本公开内容的一些方面提供了包含与反义寡核苷酸共价连接的肌肉靶向剂的复合物，其中反义寡核苷酸的长度为15至20个核苷酸，所述反义寡核苷酸包含SEQ ID NO：166、163、167、160、169、171、202、161、162、170、165、164、172和168的任一个中的至少15个连续核苷的互补区，并且包含5’-X-Y-Z-3’构型，其中

X包含3至5个键联的核苷，其中X中的至少一个核苷是2’-经修饰核苷；

Y包含6至10个键联的2’-脱氧核糖核苷，其中Y中的每个胞嘧啶任选且独立地是5-甲基-胞嘧啶；并且

Z包含3至5个键联的核苷，其中Z中的至少一个核苷是2’-经修饰核苷。

在一些实施方案中，肌肉靶向剂包含抗转铁蛋白受体1(transferrin receptor1，TfR1)抗体。

在一些实施方案中，反义寡核苷酸包含SEQ ID NO：179、187、180、185、189、182、191、184、174、186、190、188、177、192和181中的任一个的核苷酸序列。

在一些实施方案中，X中的每个核苷是2’-经修饰核苷和/或Z中的每个核苷是2’-经修饰核苷。在一些实施方案中，每个2’-经修饰核苷独立地是2’-4’双环核苷或非双环2’-经修饰核苷。

在一些实施方案中，X中的每个核苷是非双环2’-经修饰核苷和/或Z中的每个核苷是非双环2’-经修饰核苷。在一些实施方案中，非双环2’-经修饰核苷是2’-MOE修饰的核苷。

在一些实施方案中，X中的每个核苷是2’-4’双环核苷和/或Z中的每个核苷是2’-4’双环核苷。在一些实施方案中，2’-4’双环核苷选自LNA、cEt和ENA。

在一些实施方案中，X包含至少一个2’-4’双环核苷和至少一个非双环2’-经修饰核苷，和/或Z包含至少一个2’-4’双环核苷和至少一个非双环2’-经修饰核苷。在一些实施方案中，至少一个非双环2’-经修饰核苷是2’-MOE修饰的核苷，并且至少一个2’-4’-双环核苷选自LNA、cEt和ENA。

在一些实施方案中，反义寡核苷酸包含以下的5’-X-Y-Z-3’构型：

其中“E”是2’-MOE修饰的核糖核苷；“L”是LNA；“D”是2’-脱氧核糖核苷；并且“10”或“8”是Y中2’-脱氧核糖核苷的数目。

在一些实施方案中，反义寡核苷酸包含一个或更多个硫代磷酸酯核苷间键联。

在一些实施方案中，反义寡核苷酸中的每个核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联。

在一些实施方案中，反义寡核苷酸包含一个或更多个磷酸二酯核苷间键联。在一些实施方案中，磷酸二酯核苷间键联在X和/或Z中。

在一些实施方案中，反义寡核苷酸包含选自以下的寡核苷酸：

+C*+A*oG*oC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*oG*oU*+C*+A(SEQ ID NO：179)，+C*+A*+G*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*+U*+C*+A(SEQ ID NO：179)，oC*oA*oG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oU*oC*oA(SEQ ID NO：179)，oG*oC*oG*oU*oA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oU*oG*oC*oC*oC(SEQ ID NO：185)，oC*oC*oC*oA*oG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oU*oC*oA*oC*oA(SEQ ID NO：174)，oC*oC*oA*oU*oC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oU*oC*oC*oG*oC(SEQ ID NO：186)，+G*+U*+A*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*+U*+G*+C(SEQ ID NO：187)，+G*+U*oA*oG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*oC*oU*+G*+C(SEQ ID NO：187)，+C*+G*oU*oA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*oU*oC*+U*+G(SEQ IDNO：177)，+U*+A*oG*oA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oU*oG*+C*+C(SEQ ID NO：188)，+C*+C*oA*oG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*oA*oG*+U*+C(SEQ ID NO：180)，+A*+G*oC*oG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oU*oC*+A*+C(SEQ ID NO：181)，+A*+U*+C*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*+U*+C*+C(SEQ ID NO：189)，+C*+A*oU*oC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*oA*oA*+U*+C(SEQ ID NO：190)，+A*+U*oC*oU*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*oA*oU*+C*+C(SEQID NO：182)，+U*+C*oU*oC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oU*oC*+C*+G(SEQ ID NO：184)，oG*oU*oA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oU*oG*oC(SEQ ID NO：187)，oA*oU*oC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oU*oC*oC(SEQ ID NO：189)，+G*+C*oG*oU*oA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oU*oG*oC*+C*+C(SEQ ID NO：185)，+C*+C*oC*oA*oG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oU*oC*oA*+C*+A(SEQ ID NO：174)，+C*+C*oA*oU*oC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oU*oC*oC*+G*+C(SEQ ID NO：186)，oG*oCoG*oUoA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oUoG*oCoC*oC(SEQ ID NO：185)，oC*oCoC*oAoG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oUoC*oAoC*oA(SEQ ID NO：174)，oC*oCoA*oUoC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oUoC*oCoG*oC(SEQ ID NO：186)，oG*oCoGoUoA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oUoGoCoC*oC(SEQ ID NO：185)，oC*oCoCoAoG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oUoCoAoC*oA(SEQ ID NO：174)，oC*oCoAoUoC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oUoCoCoG*oC(SEQ ID NO：186)，oGoC*oGoU*oAdG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oUoG*oCoC(SEQ ID NO：191)和oGoC*oGoU*oAdG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oU*oG(SEQ IDNO：192)，

其中“xdC”是5-甲基-脱氧胞苷；“dN”是2’-脱氧核糖核苷；“+N”是LNA核苷；“oN”是2’-MOE修饰的核糖核苷；“oC”是5-甲基-2’-MOE-胞苷；“+C”是5-甲基-2’-4’-双环-胞苷(2’-4’亚甲基桥)；“oU”是5-甲基-2’-MOE-尿苷；“+U”是5-甲基-2’-4’-双环-尿苷(2’-4’亚甲基桥)；“*”表示硫代磷酸酯核苷间键联；以及在核苷之间不存在“*”表示磷酸二酯核苷间键联。

在一些实施方案中，抗TfR1抗体包含表2中列出的任何抗TfR1抗体的重链互补决定区1(heavy chain complementarity determining region 1，CDR-H1)、重链互补决定区2(heavy chain complementarity determining region 2，CDR-H2)、重链互补决定区3(heavy chain complementarity determining region 3，CDR-H3)、轻链互补决定区1(light chain complementarity determining region 1，CDR-L1)、轻链互补决定区2(light chain complementarity determining region 2，CDR-L2)、轻链互补决定区3(light chain complementarity determining region 3，CDR-L3)

在一些实施方案中，抗TfR1抗体包含表3中列出的任何抗TfR1抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。

在一些实施方案中，抗TfR1抗体是Fab。在一些实施方案中，Fab包含表5中列出的任何抗TfR1 Fab的重链和轻链。

在一些实施方案中，抗TfR1抗体包含：

(i)含有SEQ ID NO：27的氨基酸序列的CDR-H1、含有SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDR-H2、含有SEQ ID NO：29的氨基酸序列的CDR-H3、含有SEQ ID NO：30的氨基酸序列的CDR-L1、含有SEQ ID NO：31的氨基酸序列的CDR-L2，和含有SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CDR-L3；

(ii)含有SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR-H1、含有SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H2、含有SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H3、含有SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-L1、含有SEQ ID NO：37的氨基酸序列的CDR-L2，和含有SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CDR-L3；或者

(ii)含有SEQ ID NO：38的氨基酸序列的CDR-H1、含有SEQ ID NO：39的氨基酸序列的CDR-H2、含有SEQ ID NO：40的氨基酸序列的CDR-H3、含有SEQ ID NO：41的氨基酸序列的CDR-L1、含有SEQ ID NO：31的氨基酸序列的CDR-L2，和含有SEQ ID NO：42的氨基酸序列的CDR-L3。

在一些实施方案中，抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：76的氨基酸序列的VH和包含含有SEQ ID NO：75的氨基酸序列的VL。

在一些实施方案中，抗TfR1抗体是Fab并且包含含有SEQ ID NO：101的氨基酸序列的重链和包含含有SEQ ID NO：90的氨基酸序列的轻链。

在一些实施方案中，肌肉靶向剂和反义寡核苷酸通过接头共价连接。在一些实施方案中，接头包含缬氨酸-瓜氨酸序列。

本公开内容的另一些方面提供了降低肌细胞中DMPK表达的方法，该方法包括使肌细胞与用于促进其反义寡核苷酸内化到肌细胞中的有效量的本文中所述的复合物接触。

在一些实施方案中，降低DMPK表达包括降低肌细胞中DMPKmRNA的水平。在一些实施方案中，DMPK mRNA是突变体DMPKmRNA。

本公开内容的另一些方面提供了治疗1型强直性肌营养不良(DM1)的方法，该方法包括向有此需要的对象施用有效量的本文中所述的复合物，其中该对象具有包含疾病相关CUG重复的突变体DMPK等位基因。

在一些实施方案中，施用复合物导致DMPK mRNA降低至少30％。

本文中还提供了反义寡核苷酸，其包含选自以下的寡核苷酸：

+C*+A*oG*oC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*oG*oU*+C*+A(SEQ ID NO：179)，+C*+A*+G*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*+U*+C*+A(SEQ ID NO：179)，oC*oA*oG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oU*oC*oA(SEQ ID NO：179)，oG*oC*oG*oU*oA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oU*oG*oC*oC*oC(SEQ ID NO：185)，oC*oC*oC*oA*oG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oU*oC*oA*oC*oA(SEQ ID NO：174)，oC*oC*oA*oU*oC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oU*oC*oC*oG*oC(SEQ ID NO：186)，+G*+U*+A*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*+U*+G*+C(SEQ ID NO：187)，+G*+U*oA*oG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*oC*oU*+G*+C(SEQ ID NO：187)，+C*+G*oU*oA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*oU*oC*+U*+G(SEQ IDNO：177)，+U*+A*oG*oA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oU*oG*+C*+C(SEQ ID NO：188)，+C*+C*oA*oG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*oA*oG*+U*+C(SEQ ID NO：180)，+A*+G*oC*oG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oU*oC*+A*+C(SEQ ID NO：181)，+A*+U*+C*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*+U*+C*+C(SEQ ID NO：189)，+C*+A*oU*oC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*oA*oA*+U*+C(SEQ ID NO：190)，+A*+U*oC*oU*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*oA*oU*+C*+C(SEQID NO：182)，+U*+C*oU*oC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oU*oC*+C*+G(SEQ ID NO：184)，oG*oU*oA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oU*oG*oC(SEQ ID NO：187)，oA*oU*oC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oU*oC*oC(SEQ ID NO：189)，+G*+C*oG*oU*oA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oU*oG*oC*+C*+C(SEQ ID NO：185)，+C*+C*oC*oA*oG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oU*oC*oA*+C*+A(SEQ ID NO：174)，+C*+C*oA*oU*oC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oU*oC*oC*+G*+C(SEQ ID NO：186)，oG*oCoG*oUoA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oUoG*oCoC*oC(SEQ ID NO：185)，oC*oCoC*oAoG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oUoC*oAoC*oA(SEQ ID NO：174)，oC*oCoA*oUoC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oUoC*oCoG*oC(SEQ ID NO：186)，oG*oCoGoUoA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oUoGoCoC*oC(SEQ ID NO：185)，oC*oCoCoAoG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oUoCoAoC*oA(SEQ ID NO：174)，oC*oCoAoUoC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oUoCoCoG*oC(SEQ ID NO：186)，oGoC*oGoU*oAdG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oUoG*oCoC(SEQ ID NO：191)和oGoC*oGoU*oAdG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oU*oG(SEQ IDNO：192).

NH₂-(CH₂)₆-+C*+A*oG*oC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*oG*oU*+C*+A(SEQ ID NO：179)，NH₂-(CH₂)₆-+C*+A*+G*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*+U*+C*+A(SEQ ID NO：179)，NH₂-(CH₂)₆-oC*oA*oG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oU*oC*oA(SEQ ID NO：179)，NH₂-(CH₂)₆-oG*oC*oG*oU*oA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oU*oG*oC*oC*oC(SEQ ID NO：185)，NH₂-(CH₂)₆-oC*oC*oC*oA*oG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oU*oC*oA*oC*oA(SEQ ID NO：174)，NH₂-(CH₂)₆-oC*oC*oA*oU*oC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oU*oC*oC*oG*oC(SEQ ID NO：186)，NH₂-(CH₂)₆-+G*+U*+A*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*+U*+G*+C(SEQ ID NO：187)，NH₂-(CH₂)₆-+G*+U*oA*oG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*oC*oU*+G*+C(SEQ ID NO：187)，NH₂-(CH₂)₆-+C*+G*oU*oA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*oU*oC*+U*+G(SEQ ID NO：177)，NH₂-(CH₂)₆-+U*+A*oG*oA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oU*oG*+C*+C(SEQ ID NO：188)，NH₂-(CH₂)₆-+C*+C*oA*oG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*oA*oG*+U*+C(SEQ ID NO：180)，NH₂-(CH₂)₆-+A*+G*oC*oG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oU*oC*+A*+C(SEQ ID NO：181)，NH₂-(CH₂)₆-+A*+U*+C*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*+U*+C*+C(SEQ ID NO：189)，NH₂-(CH₂)₆-+C*+A*oU*oC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*oA*oA*+U*+C(SEQ ID NO：190)，NH₂-(CH₂)₆-+A*+U*oC*oU*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*oA*oU*+C*+C(SEQ ID NO：182)，NH₂-(CH₂)₆-+U*+C*oU*oC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oU*oC*+C*+G(SEQ ID NO：184)，NH₂-(CH₂)₆-oG*oU*oA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oU*oG*oC(SEQ ID NO：187)，NH₂-(CH₂)₆-oA*oU*oC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oU*oC*oC(SEQ ID NO：189)，NH₂-(CH₂)₆-+G*+C*oG*oU*oA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oU*oG*oC*+C*+C(SEQ ID NO：185)，NH₂-(CH₂)₆-+C*+C*oC*oA*oG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oU*oC*oA*+C*+A(SEQ ID NO：174)，NH₂-(CH₂)₆-+C*+C*oA*oU*oC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oU*oC*oC*+G*+C(SEQ ID NO：186)，NH₂-(CH₂)₆-oG*oCoG*oUoA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oUoG*oCoC*oC(SEQ ID NO：185)，NH₂-(CH₂)₆-oC*oCoC*oAoG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oUoC*oAoC*oA(SEQ ID NO：174)，NH₂-(CH₂)₆-oC*oCoA*oUoC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oUoC*oCoG*oC(SEQ ID NO：186)，NH₂-(CH₂)₆-oG*oCoGoUoA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oUoGoCoC*oC(SEQ ID NO：185)，NH₂-(CH₂)₆-oC*oCoCoAoG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oUoCoAoC*oA(SEQ ID NO：174)，NH₂-(CH₂)₆-oC*oCoAoUoC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oUoCoCoG*oC(SEQ IDNO：186)，NH₂-(CH₂)₆-oGoC*oGoU*oAdG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oUoG*oCoC(SEQ IDNO：191)和NH₂-(CH₂)₆-oGoC*oGoU*oAdG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oU*oG(SEQ IDNO：192)，

其中“xdC”是5-甲基-脱氧胞苷；“dN”是2’-脱氧核糖核苷；“+N”是LNA核苷；“oN”是2’-MOE修饰的核糖核苷；“oC”是5-甲基-2’-MOE-胞苷；“+C”是5-甲基-2’-4’-双环-胞苷(2’-4’亚甲基桥)；“oU”是5-甲基-2’-MOE-尿苷；“+U”是5-甲基-2’-4’-双环-尿苷(2’-4’亚甲基桥)；“*”表示硫代磷酸酯核苷间键联；以及在核苷之间不存在“*”表示磷酸二酯核苷间键联，并且其中在5’-NH₂-(CH₂)₆-与反义寡核苷酸之间存在磷酸二酯键联。

还提供了包含钠盐形式的本文中所述反义寡核苷酸的组合物。

附图说明

图1A至1B示出了相对于来自健康志愿者的细胞系，DM1-32F原代细胞(表达具有380个CUG重复的DMPK突变体mRNA)和DM1-CL5永生化细胞(表达具有2600个CUG重复的DMPK突变体mRNA)中DMPK mRNA的表达。图1A示出了32F细胞中的DMPK mRNA中ASO1的靶位点。图1B示出了CL5细胞中DMPK mRNA中ASO1的靶位点。

图2A至2D示出了具有与ASO1或ASO32缀合的对照抗TfR1 Fab的缀合物在DM1-32F原代细胞中降低DMPK mRNA表达、校正BIN1外显子11剪接缺陷和减少核病灶的活性。图2A示出了两种缀合物均降低了32F细胞中的DMPK mRNA表达水平。图2B示出了在缀合物处理之后，32F细胞中的BIN1外显子11剪接得到校正。图2C至2D示出了两种缀合物均减少了32F细胞中的核病灶。在图2D显示的显微术图像中，浅色圆形显示细胞核，并且DM1核内的明亮斑点(右侧三个显微术图片)显示CUG病灶。

图3A至3D示出了具有与ASO1或ASO32缀合的对照抗TfR1 Fab的缀合物在CL5细胞中降低DMPK mRNA表达、校正BIN1外显子11剪接缺陷和减少核病灶(以核病灶面积与核面积的比率侧脸)中的活性。图3A示出了两种缀合物均降低了CL5细胞中的DMPK mRNA表达水平。图3B示出了在缀合物处理之后，CL5细胞中的BIN1外显子11剪接得到校正。图3C至3D示出了两种缀合物均减少了CL5细胞中的核病灶。在图3D显示的显微术图像中，浅圆形显示细胞核，并且DM1核内的明亮斑点(右侧三个显微术图片)显示CUG病灶。

图4A至4H示出了具有与ASO32、ASO10、ASO8、ASO26和ASO1缀合的抗TfR1 Fab的缀合物在32F细胞中降低DMPK mRNA表达、校正BIN1外显子11剪接缺陷和减少核病灶(以核病灶面积与核面积的比率测量)中的活性。所有的ASO均与抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3缀合。图4A示出了32F细胞中DMPK mRNA中ASO1、ASO2和ASO32的靶位点，该DMPK mRNA具有380个CUG重复。图4B示出了受试缀合物降低了32F细胞中的DMPK mRNA表达水平。图4C示出了在缀合物处理之后，32F细胞中的BIN1外显子11剪接得到校正。图4D至4E示出了受试缀合物减少了32F细胞中的核灶面积。在图4E显示的显微术图像中，浅色圆形显示细胞核，核内的明亮斑点显示DMPK病灶。图4F示出了受试缀合物以剂量依赖性方式降低了32F细胞中的DMPK表达。图4G示出了受试缀合物以剂量依赖性方式校正了32F细胞中的BIN1错误剪接。图4H示出了受试缀合物以剂量依赖性方式减少了32F细胞中的核病灶面积。

图5A至5H示出了具有与ASO32、ASO10、ASO8、ASO26和ASO1之一缀合的抗TfR1 Fab的缀合物在CL5细胞中降低DMPK mRNA表达、校正BIN1外显子11剪接缺陷和减少核病灶(以核病灶面积与核面积的比率测量)中的活性。所有的ASO均与抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3缀合。图5A示出了CL5细胞中的DMPK mRNA中ASO1、ASO2和ASO32的靶位点，该DMPK mRNA具有2600个CUG重复。图5B示出了受试缀合物降低了CL5细胞中的DMPK mRNA表达水平。图5C示出了在缀合物处理之后，CL5细胞中的BIN1外显子11剪接得到校正。图5D至5E示出了受试缀合物减少了CL5细胞中的核病灶面积。在图5E显示的显微术图像中，浅色圆形显示核，核内的明亮斑点显示DMPK病灶。图5F示出了具有与ASO10或ASO8缀合的抗TfR1 Fab的缀合物以剂量依赖性方式降低了CL5细胞中的DMPK表达。图5G示出了受试缀合物以剂量依赖性方式校正了CL5细胞中的BIN1错误剪接。图5H显示，在所有测试剂量下，受试缀合物将CL5细胞中的核病灶面积减少至相似的水平。

图6示出了具有与ASO10、ASO8和ASO26缀合的抗TfR1 Fab的缀合物能够以剂量依赖性方式敲低横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma，RD)细胞中的DMPK表达，并且ASO1-缀合物能够以剂量依赖性方式敲低非人灵长类(non-human primate，NHP)细胞中的DMPK。所有的ASO均与抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3缀合。

图7示出了相同核碱基序列的不同化学修饰可影响DMPK靶向寡核苷酸的效力。所有的ASO均与抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3缀合。在500nM寡核苷酸浓度下，ASO32-缀合物能够将DMPK表达降低88％，ASO31-缀合物能够将DMPK表达降低70％，并且ASO30-缀合物能够将DMPK表达降低39％。

图8A至8B示出了亲本核碱基序列的不同长度和化学修饰可影响DMPK靶向寡核苷酸的效力。所有的ASO均与抗TfR1 Fab3M12-VH4/VK3缀合。图8A示出了ASO32-缀合物、ASO10-缀合物、ASO8-缀合物和ASO9-缀合物在人RD细胞中敲低DMPK的活性。图8B示出了了ASO32-缀合物、ASO11-缀合物、ASO20-缀合物、ASO26-缀合物和ASO2-缀合物在人RD细胞中敲低DMPK的活性。

图9A至9C示出了具有与ASO32缀合的抗TfR1 Fab的缀合物在表达人TfR1和含有扩增的CUG重复的人DMPK突变体的小鼠模型中降低了多种肌肉组织中的人突变体DMPK表达。图9D至9K示出了具有与ASO32缀合的抗TfR1 Fab的缀合物在表达人TfR1的小鼠模型中降低了多种肌肉组织中的小鼠DMPK表达。在图9A至9C中，ASO32与对照抗TfR1 Fab缀合。在图9D至9K中，ASO32与抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3缀合。图9A示出了ASO32-缀合物将胫骨前肌中的DMPK mRNA水平降低36％。图9B示出了ASO32-缀合物将膈肌中的DMPK mRNA水平降低46％。图9C示出了ASO32-缀合物将心脏中的人突变体DMPK降低42％。图9D示出了ASO32-缀合物将胫骨前肌中的小鼠野生型Dmpk降低79％。图9E示出了ASO32-缀合物将腓肠肌中的小鼠野生型Dmpk降低76％。图9F示出了ASO32-缀合物将心脏中的小鼠野生型Dmpk降低70％。图9G示出了ASO32-缀合物将膈肌中的小鼠野生型Dmpk降低88％。图9H至9K示出了在胫骨前肌、腓肠肌、心脏和膈肌中的ASO32分布。与载剂对照相比，所有组织均示出了提高的ASO32的水平。

图10A至10E示出了在表达人TfR1和含有扩增的CUG重复的人DMPK突变体的小鼠模型中的具有与ASO32、ASO10、ASO8缀合的抗TfR1 Fab的缀合物。ASO26和ASO1降低了多种肌肉组织中人突变体DMPK表达，并且ASO10-缀合物减少了心脏中的核病灶。ASO32与对照抗TfR1 Fab缀合。所有其他ASO均与抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3缀合。缀合物降低了心脏(图10A)、膈肌(图10B)、腓肠肌(图10C)和胫骨前肌(图10D)中的人DMPK mRNA水平。图10E示出了注射有相当于10mg/kg ASO10剂量的ASO10-缀合物的小鼠减少了心脏中的核病灶。在图10E显示的显微术图像中，圆形示出了细胞核，并且核内的暗点示出了DMPK病灶。

图11A至11D示出了具有与ASO32、ASO10、ASO8缀合的抗TfR1Fab的缀合物。尽管靶序列中有一个核苷酸错配，但ASO26和ASO1降低了小鼠模型中多种肌肉组织中的小鼠Dmpk表达，所述小鼠模型表达人TfR1和含有扩增的CUG重复的人DMPK突变体。ASO32与对照抗TfR1Fab缀合。所有其他ASO均与抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3缀合。缀合物降低了心脏(图11A)、膈肌(图11B)、腓肠肌(图11C)和胫骨前肌(图11D)中的小鼠DMPK mRNA水平。

图12A至12D分别示出了在施用包含与指定的寡核苷酸缀合的抗TfR1 Fab的缀合物之后，在心脏(图12A)、膈肌(图12B)、腓肠肌(图12C)或胫骨前肌(图12D)中的ASO10、ASO8、ASO26和ASO1的量。所有的ASO均与抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3缀合。

图13A至13D示出了在长期实验设置中，包含与ASO1缀合的对照抗TfR1 Fab的缀合物降低了小鼠模型中多种肌肉组织中的人突变体DMPK表达，所述小鼠模型表达人TfR1和含有扩增的CUG重复的人DMPK突变体二者。图13A示出了在注射之后两周，ASO1-缀合物将心脏中的人突变体DMPK敲低9％，并且在注射之后四周敲低15％。图13B示出了在注射之后两周，ASO1-缀合物将膈肌中的人突变体DMPK敲低19％，并且在注射之后四周敲低34％。图13C示出了在注射之后两周，ASO1-缀合物将腓肠肌中的人突变体DMPK敲低7％，并且在注射之后四周敲低17％。图13D示出了在注射之后两周，ASO1-缀合物将胫骨前肌中的人突变体DMPK敲低6％，并且在注射之后四周敲低0％。

图14A至14D示出了在包含与ASO1缀合的对照抗TfR1 Fab的缀合物降低了与图13A至13D中相同的小鼠模型中的小鼠Dmpk表达。图14A示出了ASO1-缀合物在注射之后两周将心脏中的小鼠Dmpk敲低8％，并且在注射之后四周敲低13％。图14B示出了ASO1-缀合物在注射之后两周将膈肌中的小鼠Dmpk敲低14％，并且在注射之后四周敲低33％。图14C示出了在注射之后两周，ASO1-缀合物将腓肠肌中的小鼠Dmpk敲低0％，并且在注射之后四周敲低6％。图14D示出了ASO1-缀合物在注射之后两周和在注射之后四周没有敲低胫骨前肌中的小鼠Dmpk。

图15A至15D分别示出了在施用包含与ASO1缀合的对照抗TfR1 Fab的缀合物之后，在心脏(图15A)、膈肌(图15B)、腓肠肌(图15C)或胫骨前肌(图15D)中的ASO1的量。

图16A至16D示出了包含与图13A至13D中相同的小鼠模型中的另一个实验设计中的对照抗TfR1 Fab缀合的ASO1的缀合物的活性。以与图13A至13D不同的剂量和频率施用缀合物。图16A示出了在注射之后5周，ASO1-缀合物将心脏中的人突变体DMPK敲低5％。图16B示出了在注射之后5周，ASO1-缀合物将膈肌中的人突变体DMPK敲低了35％。图16C示出了在注射之后5周，ASO1-缀合物显示没有敲低腓肠肌中的人突变体DMPK。图16D示出了在注射之后5周，ASO1-缀合物显示没有敲低胫骨前肌中的人突变体DMPK。

图17A至17D示出了包含与ASO1缀合的对照抗TfR1 Fab的缀合物降低了与图13A至13D中相同的小鼠模型的小鼠Dmpk表达。图17A示出了在注射之后5周，ASO1-缀合物将心脏中的小鼠Dmpk敲低13％。图17B示出了在注射之后5周，ASO1-缀合物将膈肌中的小鼠Dmpk敲低41％。图17C示出了在注射之后5周，ASO1-缀合物将腓肠肌中的小鼠Dmpk敲低5％。图17D示出了在注射之后5周，ASO1-缀合物将胫骨前肌中的小鼠Dmpk敲低10％。

图18A至18D分别示出了在施用包含与ASO1缀合的对照抗TfR1 Fab的缀合物之后，在心脏(图18A)、膈肌(图18B)、腓肠肌(图18C)或胫骨前肌(图18D)中的ASO1的量。

图19A至19D示出了包含与ASO9缀合的抗TfR1 Fab的缀合物在小鼠模型中的多种肌肉组织中降低了人突变体DMPK表达，所述小鼠模型表达人TfR1和含有扩增的CUG重复的人DMPK突变体二者。ASO9与抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3缀合。图19A示出了在注射之后两周，ASO9-缀合物将心脏中的人突变体DMPK敲低50％。图19B示出了在注射之后两周，ASO9-缀合物将膈肌中的人突变体DMPK敲低58％。图19C示出了在注射之后两周，ASO9-缀合物将胫骨前肌中的人突变体DMPK敲低30％。图19D示出了在注射之后两周，ASO9-缀合物将腓肠肌中的人突变体DMPK敲低35％。

图20A至20D示出了包含与ASO9缀合的抗TfR1 Fab的缀合物降低了与图19A至19D中相同的小鼠模型的小鼠Dmpk表达。ASO9与抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3缀合。图20A示出了在注射之后两周，ASO9-缀合物将心脏中的小鼠Dmpk敲低48％。图20B示出了在注射之后两周，ASO9-缀合物将膈肌中的小鼠Dmpk敲低68％。图20C示出了在注射之后两周，ASO9-缀合物将腓肠肌中的小鼠Dmpk敲低45％。图20D示出了在注射之后两周，ASO9-缀合物将胫骨前肌中的小鼠Dmpk敲低20％。

图21A至21D分别示出了在施用包含与ASO9缀合的抗TfR1 Fab的缀合物之后，心脏(图21A)、膈肌(图21B)、腓肠肌(图21C)或胫骨前肌(图21D)中的ASO9的量。ASO9与抗TfR1Fab 3M12-VH4/VK3缀合。

图22A至22D示出了包含对照抗TfR1 Fab缀合的ASO1的缀合物降低了非人灵长类食蟹猴(Cynomolgus macaque，cyno)的多种肌肉组织中的DMPK表达。图22A示出了在注射之后7周，ASO1-缀合物将心脏中的DMPK敲低10％。图22B示出了在注射之后7周，ASO1-缀合物显示没有敲低膈肌中的DMPK。图22C示出了在注射之后7周，ASO1-缀合物将腓肠肌中的DMPK敲低29％。图22D示出了在注射之后7周，ASO1-缀合物将胫骨前肌中的DMPK敲低31％。

图23A至23D分别示出了在施用包含与ASO1缀合的对照抗TfR1 Fab的缀合物两周之后，在食蟹猴中的心脏(图23A)、膈肌(图23B)、腓肠肌(图23C)或胫骨前肌(图23D)中的ASO1的量。

图24A至24D示出了包含与ASO10缀合的抗TfR1 Fab的缀合物在小鼠模型中的多种肌肉组织中降低了人突变体DMPK的表达，所述小鼠模型表达人TfR1和含有扩增的CUG重复的人DMPK突变体二者。ASO10与抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3缀合。图24A示出了在注射之后28天测试的所有剂量下，ASO10-缀合物敲低了心脏中的人突变体DMPK。图24B示出了在注射之后28天测试的所有测量下，ASO10-缀合物敲低了膈肌中的人突变体DMPK。图24C示出了在注射之后28天测试的所有测量下，ASO10-缀合物敲低了腓肠肌中的人突变体DMPK。图24D示出了在注射之后28天测试的所有测量下，ASO10-缀合物敲低了胫骨前肌中的人突变体DMPK。

图25A至25H示出了，在以相当于10mg/kg ASO10的剂量注射包含与ASO10缀合的抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3的缀合物的小鼠中，ASO10被递送至核，并且ASO10-缀合物减少了核中捕获的突变体人DMPK mRNA的积累。ASO10-缀合物在表达人TfR1和含有扩增的CUG重复的人DMPK突变体二者的小鼠模型中进行了测试。图25A示出了，通过来自注射有载剂对照的小鼠的腓肠肌的亚细胞分级(subcellular fractionation)，突变体人DMPK被捕获在肌细胞核中。图25B示出了Malat1被用作核RNA标志物。图25C示出了Birc5被用作胞质RNA标志物。图25D示出了Gapdh被用作胞质RNA标志物。图25E示出了核蛋白标志物组蛋白H3仅存在于核级分中。图25F示出了胞质蛋白标志物GAPDH仅存在于胞质级分中。图25G示出了ASO10降低了总组织提取物中的突变体人DMPK。图25H示出了ASO10降低了腓肠肌细胞核级分中的突变体人DMPK。

图26A至26H示出了包含与ASO10或ASO26缀合的抗TfR1 Fab的缀合物降低了食蟹猴(cyno)中的野生型DMPK。ASO10或ASO26与抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3缀合。图26A至26D示出了ASO10以剂量依赖性方式存在于心脏、膈肌、腓肠肌和胫骨前肌中。图26E至26H示出了ASO26以剂量依赖性方式存在于心脏、膈肌、腓肠肌和胫骨前肌中。

图27A至27D示出了包含与ASO10缀合的抗TfR1 Fab的缀合物在非人灵长类的心脏和骨骼肌二者中是有活性的，并且包含与ASO26缀合的抗TfR1 Fab的缀合物在骨骼肌中是有活性的。ASO10或ASO26与抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3缀合。图27A示出了ASO10-缀合物在心脏中是有活性的，并且ASO26-缀合物显示在心脏中不具有活性。图27B示出了ASO10-缀合物和ASO26-缀合物二者在膈肌中均是有活性的。图27C示出了ASO10-缀合物和ASO26-缀合物二者在腓肠肌中均是有活性的。图27D示出了ASO10-缀合物和ASO26-缀合物二者在胫骨前肌中均是有活性的。

图28A至28D示出了在心脏、膈肌、腓肠肌和胫骨前肌中包含与ASO10或ASO26缀合的抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3的缀合物的DMPK敲低活性。将ASO10-缀合物或ASO26-缀合物以相当于10mg/kg ASO10或ASO26的剂量施用于表达人TfR1和含有扩增的CUG重复的人DMPK突变体二者的小鼠。图28A示出了ASO10-缀合物在心脏中是有活性的，并且ASO26-缀合物显示在心脏中是无活性的。图28B示出了ASO10-缀合物和ASO26-缀合物二者在膈肌中均是有活性的。图28C示出了ASO10-缀合物和ASO26-缀合物二者在腓肠肌中均是有活性的。图28D示出了ASO10-缀合物和ASO26-缀合物二者在胫骨前肌中均是有活性的。

图29A至29D示出了包含与ASO10缀合的抗TfR1 Fab3M12-VH4/VK3的缀合物在小鼠中的心脏(图29A)、膈肌(图29B)、胫骨前肌(图29C)和腓肠肌(图29D)中敲低人DMPK RNA的能力，所述小鼠表达人TfR1和两个拷贝的含有扩增的CTG重复的突变体人DMPK转基因二者。

图30A至30B示出了小鼠的心肌纤维的核中减少的DMPK病灶，所述小鼠表达人TfR1和两个拷贝的含有扩增的CTG重复的突变体人DMPK转基因二者并且用与ASO10缀合的抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3处理。图30A示出了DMPK病灶的原位杂交染色和肌纤维的荧光染色之后样品的代表性图像(插图)。在图30A显示的显微术图像中，浅色圆形显示细胞核，并且核内的明亮斑点显示DMPK病灶。图30B示出了DMPK病灶的量化。

图31示出了包含与ASO10缀合的抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3的缀合物在表达人TfR1和两个拷贝的含有扩增的CTG重复的突变体人DMPK转基因二者的小鼠(hTfR1/DMSXL小鼠)的心脏中的剪接校正活性。示出了用载剂对照处理的对照小鼠(“hTfR1-PBS”)、用载剂对照处理的hTfR1/DMSXL小鼠(“hTfR1/DMSXL-PBS”)和用抗TfR1 Fab-ASO10缀合物处理的hTfR1/DMSXL小鼠(“hTfR1/DMSXL-缀合物”)的基于Ldb3外显子11、Mbnl2外显子6和Nfix外显子7的剪接的复合剪接指数。

图32示出了包含与ASO10缀合的抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3的缀合物在表达人TfR1和两个拷贝的含有扩增的CTG重复的突变体人DMPK转基因二者的小鼠(hTfR1/DMSXL小鼠)的膈肌中的剪接校正活性。示出了用载剂对照处理的对照小鼠(“hTfR1-PBS”)、用载剂对照处理的hTfR1/DMSXL小鼠(“hTfR1/DMSXL-PBS”)和用抗TfR1 Fab-ASO10缀合物处理的hTfR1/DMSXL小鼠(“hTfR1/DMSXL-缀合物”)的基于Bin1外显子11、Insr外显子11、Ldb3外显子11和Nfix外显子7剪接的复合剪接指数。

图33示出了包含与ASO10缀合的抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3的缀合物在表达人TfR1和两个拷贝的含有扩增的CTG重复的突变体人DMPK转基因二者的小鼠(hTfR1/DMSXL小鼠)的胫骨前肌中的剪接校正活性。示出了用载剂对照处理的对照小鼠(“hTfR1-PBS”)、用载剂对照处理的hTfR1/DMSXL小鼠(“hTfR1/DMSXL-PBS”)和用抗TfR1 Fab-ASO10缀合物处理的hTfR1/DMSXL小鼠(“hTfR1/DMSXL-缀合物”)的基于Bin1外显子11、Ldb3外显子11、Mbnl2外显子6和Nfix外显子7剪接的复合剪接指数。

图34示出了包含与ASO10缀合的抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3的缀合物在表达人TfR1和两个拷贝的含有扩增的CTG重复的突变体人DMPK转基因二者的小鼠(hTfR1/DMSXL小鼠)的腓肠肌中的剪接校正活性。示出了用载剂对照处理的对照小鼠(“hTfR1-PBS”)、用载剂对照处理的hTfR1/DMSXL小鼠(“hTfR1/DMSXL-PBS”)和用抗TfR1 Fab-ASO10缀合物处理的hTfR1/DMSXL小鼠(“hTfR1/DMSXL-缀合物”)的基于Mbnl2外显子6、Nfix外显子7和Ttn外显子313剪接的复合剪接指数。

图35示出了在DM1患者肌管和野生型非人灵长类(NHP)肌管中由与缀合物一起孵育引起的DMPK敲低，所述缀合物包含与ASO10共价连接的抗TfR1 Fab 3M12-VH4/Vk3。示出的结果对仅用载剂处理的DM1患者肌管或NHP肌管中的表达进行了归一化。数据示出了为每个条件下n＝4次重复的平均值+标准偏差。通过单因素ANOVA计算数据(*，P＜0.05，**，P＜0.01)。

具体实施方式

本公开内容的一些方面提供了被设计为靶向DMPK RNA的寡核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容提供了与DMPK RNA互补的寡核苷酸，其可用于降低具有疾病相关的重复扩增的毒性DMPK的水平，例如，在患有或怀疑患有强直性肌营养不良的对象中。在一些实施方案中，寡核苷酸被设计为指导RNA酶H介导靶DMPK RNA的降解。在一些实施方案中，寡核苷酸被设计为指导RNA酶H介导位于细胞(例如，肌细胞(例如肌管))的核中的靶DMPK RNA的降解。在一些实施方案中，寡核苷酸被设计为指导RNA酶H介导位于细胞(例如神经系统的细胞(例如中枢神经系统(central nervous system，CNS)细胞))的核中的靶DMPK RNA的降解。在一些实施方案中，寡核苷酸被设计为具有期望的生物利用度和/或血清稳定性特性。在一些实施方案中，寡核苷酸被设计为具有期望的结合亲和力特性。在一些实施方案中，寡核苷酸被设计为具有期望的毒性特征。在一些实施方案中，寡核苷酸被设计为具有低补体激活和/或细胞因子诱导特性。

在一些方面中，本公开内容提供了包含与本文中所述的DMPK靶向寡核苷酸共价连接的肌肉靶向剂的复合物，用于将寡核苷酸有效递送至肌细胞。在一些实施方案中，提供了用于靶向包含扩增的疾病相关重复的DMPK等位基因的复合物，以治疗患有DM1的对象。在一些实施方案中，本文中提供的复合物可包含抑制含有扩增的疾病相关重复的DMPK等位基因表达的寡核苷酸。作为另一个实例，复合物可包含干扰疾病相关的DMPK mRNA与肌盲样蛋白(例如，MBNL1，2和/或(例如，和)3)结合的寡核苷酸，从而降低疾病相关的DMPK等位基因的毒性作用。

下面提供了本公开内容的另一些方面，包括对限定的术语的描述。

I.定义

施用：本文中使用的术语“施用”意指以生理和/或(例如，和)药理学上可用的方式向对象提供复合物(例如，以治疗对象中的病症)。

大约：本文中使用的术语“大约”或“约”，如应用于一个或更多个目的值时，是指类似于陈述的参考值的值。在某些实施方案中，术语“大约”或“约”是指落入陈述的参考值的任一方向上(大于或小于)15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、或更小以内的值的范围，除非另有说明或在其他情况下从上下文中可以明显看出(除非这样的数字超过可能值的100％)。

抗体：本文中使用的术语“抗体”是指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域或至少一个抗原决定簇(例如，与抗原特异性结合的互补位(paratope))的多肽。在一些实施方案中，抗体是全长抗体。在一些实施方案中，抗体是嵌合抗体。在一些实施方案中，抗体是人源化抗体。然而，在一些实施方案中，抗体是Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段或scFv片段。在一些实施方案中，抗体是来源于骆驼科抗体的纳米抗体或来源于鲨鱼抗体的纳米抗体。在一些实施方案中，抗体是双抗体。在一些实施方案中，抗体包含具有人种系序列的框架。在另一个实施方案中，抗体包含选自IgG、IgG1、IgG2、IgG2A、IgG2B、IgG2C、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgM和IgE恒定结构域的重链恒定结构域。在一些实施方案中，抗体包含重(H)链可变区(在本文中简称为VH)和/或(例如，和)轻(L)链可变区(在本文中简称为VL)。在一些实施方案中，抗体包含恒定结构域，例如Fc区。免疫球蛋白恒定结构域是指重链或轻链恒定结构域。人IgG重链和轻链恒定结构域氨基酸序列及其功能变异是已知的。关于重链，在一些实施方案中，本文中所述的抗体的重链可以是alpha(α)、delta(Δ)、epsilon(ε)、gamma(γ)或mu(μ)重链。在一些实施方案中，本文中所述的抗体的重链可包含人alpha(α)、delta(Δ)、epsilon(ε)、gamma(γ)或mu(μ)重链。在一个具体实施方案中，本文中所述的抗体包含人γ1CH1、CH2和/或(例如，和)CH3结构域。在一些实施方案中，VH结构域的氨基酸序列包含人gamma(γ)重链恒定区的氨基酸序列，例如本领域已知的任何。人恒定区序列的非限制性实例已在本领域中描述，例如，参见美国专利No.5,693,780和Kabat E A etal.，(1991)同上。在一些实施方案中，VH结构域包含与本文中提供的任何可变链恒定区具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，对抗体进行修饰，例如，通过糖基化、磷酸化、SUMO化(sumoylation)和/或(例如，和)甲基化进行修饰。在一些实施方案中，抗体是与一个或更多个糖或碳水化合物分子缀合的糖基化抗体。在一些实施方案中，一个或更多个糖或碳水化合物分子通过N-糖基化、O-糖基化、C-糖基化、糖基磷脂酰肌醇化(GPI锚定附着)和/或(例如，和)磷酸糖基化(phosphoglycosylation)与抗体缀合。在一些实施方案中，一个或更多个糖或碳水化合物分子是单糖、二糖、寡糖或聚糖。在一些实施方案中，一个或更多个糖或碳水化合物分子是支化的寡糖或支化的聚糖。在一些实施方案中，一个或更多个糖或碳水化合物分子包含甘露糖单元、葡萄糖单元、N-乙酰葡糖胺单元、N-乙酰半乳糖胺单元、半乳糖单元、岩藻糖单元或磷脂单元。在一些实施方案中，抗体是包含多肽的构建体，所述多肽包含与接头多肽或免疫球蛋白恒定结构域连接的一个或更多个本公开内容的抗原结合片段。接头多肽包含通过肽键连接的两个或更多个氨基酸残基，并且用于连接一个或更多个抗原结合部分。接头多肽的一些实例已有报道(参见，例如，Holliger，P.，et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448；Poljak，R.J.，et al.(1994)Structure 2：1121-1123)。另外，抗体可以是更大的免疫黏附分子的一部分，免疫黏附分子通过抗体或抗体部分与一个或更多个其他蛋白质或肽的共价或非共价缔合而形成。这样的免疫黏附分子的一些实例包括使用链霉亲和素核芯区域来制备四聚体scFv分子(Kipriyanov，S.M.，et al.(1995)Human Antibodies andHybridomas 6：93-101)，以及使用半胱氨酸残基、标记肽和C端多组氨酸标签来制备二价和生物素化的scFv分子(Kipriyanov，S.M.，et al.(1994)Mol.Immunol.31：1047-1058)。

CDR：本文中使用的术语“CDR”是指抗体可变序列内的互补决定区。典型的抗体分子包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其通常参与抗原结合。VH区和VL区可进一步细分为高变区，也称为“互补决定区”(“complementarity determining region，CDR”)，其中散布有更保守的称为“框架区”(“framework region，FR”)的区域。每个VH和VL通常由三个CDR和四个FR构成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。可使用本领域已知的方法，例如通过Kabat定义、IMGT定义、Chothia定义、AbM定义和/或(例如，和)接触定义(所有这些都是本领域公知的)来精确鉴定框架区和CDR的范围。参见，例如Kabat，E.A.，et al.(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIHPublication No.91-3242；the international ImMunoGeneTics informationhttp：//www.imgt.org，Lefranc，M.-P.et al.，Nucleic Acids Res.，27：209-212(1999)；Ruiz，M.et al.，Nucleic Acids Res.，28：219-221(2000)；Lefranc，M.-P.，Nucleic Acids Res.，29：207-209(2001)；Lefranc，M.-P.，Nucleic Acids Res.，31：307-310(2003)；Lefranc，M.-P.et al.，In Silico Biol.，5，0006(2004)[Epub]，5：45-60(2005)；Lefranc，M.-P.et al.，Nucleic Acids Res.，33：D593-597(2005)；Lefranc，M.-P.et al.，Nucleic Acids Res.，37：D1006-1012(2009)；Lefranc，M.-P.et al.，NucleicAcids Res.，43：D413-422(2015)；Chothia et al.，(1989)Nature 342：877；Chothia，C.etal.(1987)J.Mol.Biol.196：901-917；Al-lazikani et al(1997)J.Molec.Biol.273：927-948；以及Almagro，J.Mol.Recognit.17：132-143(2004)。还参见hgmp.mrc.ac.uk和bioinf.org.uk/abs。本文中使用的CDR可以是指由本领域已知的任何方法定义的CDR。具有相同CDR的两种抗体意指这两种抗体的该CDR的氨基酸序列相同，如通过相同的方法(例如IMGT定义)确定的。

重链和轻链的每个可变区中有三个CDR，对于每个可变区分别称为CDR1、CDR2和CDR3。本文中使用的术语“CDR组”是指出现在单个可变区内的能够结合抗原的三个CDR的组。这些CDR的确切边界已根据不同的系统进行了不同的定义。Kabat描述的系统(Kabat etal.，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes ofHealth，Bethesda，Md.(1987)and(1991))不仅提供了适用于抗体的任何可变区的明确的残基编号系统，而且还提供了定义三个CDR的精确残基边界。这些CDR可被称为Kabat CDR。CDR的子部分可被指定为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别指定轻链和重链区域。这些区域可称为Chothia CDR，其具有与Kabat CDR重叠的边界。Padlan(FASEB J.9：133-139(1995))和MacCallum(J Mol Biol 262(5)：732-45(1996))已经描述了定义与Kabat CDR重叠的CDR的其他边界。另一些CDR边界定义可能并不严格遵循上述系统之一，但仍与KabatCDR重叠，尽管可根据预测或者根据特定残基或残基的组或甚至整个CDR不会显著影响抗原结合的实验发现来缩短或延长它们。本文中使用的方法可利用根据这些系统中的任何一个定义的CDR。表1中提供了CDR定义系统的一些实例。

表1.CDR定义

	IMGT¹	Kabat²	Chothia³
				CDR-H1	27-38	31-35	26-32
CDR-H2	56-65	50-65	53-55
				CDR-H3	105-116/117	95-102	96-101
CDR-L1	27-38	24-34	26-32
				CDR-L2	56-65	50-56	50-52
CDR-L3	105-116/117	89-97	91-96

¹ the international ImMunoGeneTics information/>imgt.org，Lefranc.M.-P.et al.，Nucleic Acids Res.，27：209-212(1999)

²Kabat et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIH PublicationNo.91-3242

³Chothia et al.，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))

CDR接枝抗体(CDR-grafted antibody)：术语“CDR接枝抗体”是指包含来自一个物种的重链和轻链可变区序列但是其中VH和/或(例如，和)VL的一个或更多个CDR区的序列被来自另一物种的CDR序列替代的抗体，例如具有鼠重链和轻链可变区并且其中一个或更多个鼠CDR(例如，CDR3)已被人CDR序列替代的抗体。

嵌合抗体：术语“嵌合抗体”是指包含来自一个物种的重链和轻链可变区序列和来自另一物种的恒定区序列的抗体，例如具有与人恒定区连接的鼠重链和轻链可变区的抗体。

互补：本文中使用的术语“互补”是指在两个核苷或两组核苷之间精确配对的能力。特别地，互补是表征氢键配对引起两个核苷或两组核苷之间结合的程度的术语。例如，如果寡核苷酸的一个位置处的碱基能够与靶核酸(例如，mRNA)的相应位置处的碱基进行氢键合，则认为在该位置处碱基彼此互补。碱基配对可包括规范的沃森-克里克碱基配对和非沃森-克里克碱基配对(例如，Wobble碱基配对和Hoogsteen碱基配对)二者。例如，在一些实施方案中，对于互补碱基配对，腺苷型碱基(A)与胸苷型碱基(T)或尿嘧啶型碱基(U)互补，胞嘧啶型碱基(C)与鸟苷型碱基(G)互补，并且通用碱基如3-硝基吡咯或5-硝基吲哚可与任何A、C、U或T杂交并被认为是互补的。肌苷(I)在本领域中也被认为是通用碱基，并且被认为与任何A、C、U或T互补。

保守氨基酸替换：本文中使用的“保守氨基酸替换”是指不改变进行氨基酸替换的蛋白质的相对电荷或尺寸特征的氨基酸替换。可以根据本领域普通技术人员已知的用于改变多肽序列的方法来制备变体，所述方法例如可以在汇编这样的方法的参考文献中找到：例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，J.Sambrook，et al.，eds.，FourthEdition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，2012，或Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel，et al.，eds.，John Wiley&Sons，Inc.，New York。氨基酸的保守替换包括在以下组内的氨基酸之间进行的替换：(a)M、I、L、V；(b)F、Y、W；(c)K、R、H；(d)A、G；(e)S、T；(f)Q、N；和(g)E、D。

共价连接：本文中使用的术语“共价连接”是指两个或更多个分子通过至少一个共价键连接在一起的特征。在一些实施方案中，两个分子可以通过充当分子之间的接头的单键例如二硫键或二硫桥共价连接在一起。然而，在一些实施方案中，两个或更多个分子可以通过充当接头的分子共价连接在一起，该接头通过多个共价键将两个或更多个分子连接在一起。在一些实施方案中，接头可以是可切割接头。然而，在一些实施方案中，接头可以是不可切割接头。

交叉反应性：如本文中使用以及在靶向剂(例如，抗体)的情况下，术语“交叉反应性”是指物质能够以相似亲和力或亲合力与相似类型或类别的超过一种抗原(例如，多个同源物、旁系同源物或直系同源物的抗原)特异性结合的性质。例如，在一些实施方案中，对相似类型或类别的人和非人灵长类抗原(例如，人转铁蛋白受体和非人灵长类转铁蛋白受体)具有交叉反应性的抗体能够以相似亲和力或亲合力与人抗原和非人灵长类抗原结合。在一些实施方案中，抗体对相似类型或类别的人抗原和啮齿动物抗原具有交叉反应性。在一些实施方案中，抗体对相似类型或类别的啮齿动物抗原和非人灵长类抗原具有交叉反应性。在一些实施方案中，抗体对相似类型或类别的人抗原、非人灵长类抗原和啮齿动物抗原具有交叉反应性。

疾病相关重复：本文中使用的术语“疾病相关重复”是指在基因组位置处的重复核苷酸序列，其中重复核苷酸序列的单元的数目与遗传疾病(例如DM1)相关和/或者(例如，和)直接或间接促成或造成遗传疾病(例如DM1)。疾病相关重复的每个重复单元的长度可以是2、3、4、5个或更多个核苷酸。例如，在一些实施方案中，疾病相关重复是二核苷酸重复。在一些实施方案中，疾病相关重复是三核苷酸重复。在一些实施方案中，疾病相关重复是四核苷酸重复。在一些实施方案中，疾病相关重复是五核苷酸重复。在一些实施方案中，一些实施方案，疾病相关重复包含CAG重复、CTG重复、CUG重复、CGG重复、CCTG重复、或其任何的核苷酸互补序列。在一些实施方案中，疾病相关重复在基因的非编码部分中。然而，在一些实施方案中，疾病相关重复在基因的编码区。在一些实施方案中，疾病相关重复从正常状态扩增至直接或间接促成或造成遗传疾病的长度。在一些实施方案中，疾病相关重复在RNA(例如，RNA转录物)中。在一些实施方案中，疾病相关重复在DNA(例如，染色体、质粒)中。在一些实施方案中，疾病相关重复在生殖细胞的染色体中扩增。在一些实施方案中，疾病相关重复在体细胞的染色体中扩增。在一些实施方案中，疾病相关重复扩增至与疾病的先天性发作相关的重复单元数目。在一些实施方案中，疾病相关重复扩增至与儿童期疾病发作相关的重复单元数目。在一些实施方案中，疾病相关重复扩增至与成年疾病发作相关的重复单元数目。在DM1中，DMPK 3’非翻译区(3’-UTR)CTG单元的三核苷酸重复区是疾病相关的。正常的DMPK等位基因包含约5至约37个CTG重复单元，而在患有DM1的患者中，CTG重复区的长度显著增加，达到数百或数千个三核苷酸重复。

DMPK：本文中使用的术语“DMPK”是指编码作为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的肌强直蛋白激酶(myotonin-protein kinase)(也称为强直性营养不良蛋白激酶或营养不良性肌强直蛋白激酶)的基因。该酶的底物可包括肌细胞生成蛋白(myogenin)、L型钙通道的β亚基以及phosphorlemman。在一些实施方案中，DMPK可以是人基因(基因ID：1760)、非人灵长类基因(例如，基因ID：456139、基因ID：715328)或啮齿动物基因(例如，基因ID：13400)。在人中，DMPK的3’非编码、非翻译区中的CTG重复扩增与I型强直性肌营养不良(DM1)相关。另外，已经表征了编码不同的蛋白质同种型的多种人转录物变体(例如，如以以下GenBankRefSeq登录号进行注释：NM_001081563.2、NM_004409.4、NM_001081560.2、NM_001081562.2、NM_001288764.1、NM_001288765.1和NM_001288766.1)。

DMPK等位基因：本文中使用的术语“DMPK等位基因”是指DMPK基因的任一种替代形式(例如，野生型或突变体形式)。在一些实施方案中，DMPK等位基因可编码保留其正常和典型功能的野生型肌强直蛋白激酶。在一些实施方案中，DMPK等位基因可包含一个或更多个疾病相关重复扩增。在一些实施方案中，正常对象具有两个包含5至37个重复单元的DMPK等位基因。在一些实施方案中，患有DM1的对象中CTG重复单元的数目为约50至约3,000或更多，重复数目越高导致疾病严重性越高。在一些实施方案中，轻度受影响的DM1对象具有至少一个具有50至150个重复单元的DMPK等位基因。在一些实施方案中，患有经典DM1的对象具有至少一个具有100至1,000或更多个重复单元的DMPK等位基因。在一些实施方案中，患有先天性发作DM1的对象可具有至少一个包含多于2,000个重复单元的DMPK等位基因。

框架：本文中使用的术语“框架”或“框架序列”是指可变区减去CDR的剩余序列。由于CDR序列的确切定义可通过不同的系统确定，因此框架序列的含义相应地具有不同解释。六个CDR(轻链的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3和重链的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)也将轻链和重链上的框架区分为每条链上的四个子区域(FR1、FR2、FR3和FR4)，其中CDR1位于FR1和FR2之间，CDR2位于FR2和FR3之间，并且CDR3位于FR3和FR4之间。在未将特定子区域指定为FR1、FR2、FR3或FR4的情况下，其他人提到的框架区代表单个天然存在的免疫球蛋白链的可变区内的组合的FR。如本文所使用的，FR代表四个子区域之一，并且FRs代表构成框架区的四个子区域中的两个或更多个。人重链和轻链接受体序列是本领域已知的。在一个实施方案中，本领域已知的接受体序列可用于本文中公开的抗体中。

人抗体：本文中使用的术语“人抗体”旨在包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本公开内容的人抗体可包含不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR中，特别是在CDR3中。然而，本文中使用的术语“人抗体”不意图包括其中来源于另一哺乳动物物种(例如小鼠)种系的CDR序列已接枝到人框架序列上的抗体。

人源化抗体：术语“人源化抗体”是指包含来自非人物种(例如，小鼠)的重链和轻链可变区序列但是其中VH和/或(例如，和)VL序列的至少一部分已被改变为更加“人样”(即，更类似于人种系可变序列)的抗体。一种类型的人源化抗体是CDR接枝抗体，其中人CDR序列被引入非人VH和VL序列中以替代相应的非人CDR序列。在一个实施方案中，提供了人源化抗TfR1抗体和抗原结合部分。这样的抗体可以通过使用传统的杂交瘤技术获得鼠抗TfR1单克隆抗体随后使用体外基因工程化进行人源化来产生，例如在Kasaian et al的PCT公开No.WO 2005/123126 A2中公开的那些。

内化细胞表面受体：本文中使用的术语“内化细胞表面受体”是指例如在外部刺激(例如，配体与受体结合)下被细胞内化的细胞表面受体。在一些实施方案中，内化细胞表面受体通过内吞作用内化。在一些实施方案中，内化细胞表面受体通过网格蛋白介导的内吞作用内化。然而，在一些实施方案中，内化细胞表面受体通过不依赖于网格蛋白的途径内化，所述途径例如如吞噬作用、巨胞饮作用、小窝和筏介导的摄取或组成型网格蛋白非依赖性内吞作用。在一些实施方案中，内化细胞表面受体包含胞内结构域、跨膜结构域和/或(例如，和)胞外结构域，其可任选地还包含配体结合结构域。在一些实施方案中，细胞表面受体在配体结合后被细胞内化。在一些实施方案中，配体可以是肌肉靶向剂或肌肉靶向抗体。在一些实施方案中，内化细胞表面受体是转铁蛋白受体。

分离的抗体：本文中使用的“分离的抗体”旨在指代基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合转铁蛋白受体的分离的抗体基本上不含特异性结合转铁蛋白受体以外的抗原的抗体)。然而，特异性结合转铁蛋白受体复合物的分离的抗体可能与其他抗原(例如来自其他物种的转铁蛋白受体分子)具有交叉反应性。此外，分离的抗体可基本上不含其他细胞材料和/或(例如，和)化学物质。

Kabat编号：术语“Kabat编号”、“Kabat定义和“Kabat标记”在本文中可互换使用。在本领域中公认的这些术语是指对抗体或其抗原结合部分的重链和轻链可变区中的比其他氨基酸残基更加可变(即高变)的氨基酸残基进行编号的系统(Kabat et al.(1971)Ann.NY Acad，Sci.190：382-391以及，Kabat，E.A.，et al.(1991)Sequences of Proteinsof Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and HumanServices，NIH Publication No.91-3242)。对于重链可变区，CDR1的高变区为第31至35位氨基酸，CDR2的高变区为第50至65位氨基酸，并且CDR3的高变区为第95至102位氨基酸。对于轻链可变区，CDR1的高变区为第24至34位氨基酸，CDR2的高变区为第50至56位氨基酸，并且CDR3的高变区为第89至97位氨基酸。

分子载荷：本文中使用的术语“分子载荷”是指发挥调节生物学结局作用的分子或物质。在一些实施方案中，分子载荷与肌肉靶向剂连接或以其他方式缔合。在一些实施方案中，分子载荷是小分子、蛋白质、肽、核酸或寡核苷酸。在一些实施方案中，分子载荷发挥调节DNA序列的转录、调节蛋白质的表达或调节蛋白质的活性的作用。在一些实施方案中，分子载荷是寡核苷酸，其包含具有靶基因的互补区的链。

肌肉靶向剂：本文中使用的术语“肌肉靶向剂”是指与肌细胞上表达的抗原特异性结合的分子。肌细胞内或其上的抗原可以是膜蛋白，例如整合膜蛋白或外周膜蛋白。通常来说，肌肉靶向剂与肌细胞上的抗原特异性结合，这有助于将肌肉靶向剂(和任何缔合的分子载荷)内化到肌细胞中。在一些实施方案中，肌肉靶向剂与肌肉上的内化细胞表面受体特异性结合，并且能够通过受体介导的内化而内化到肌细胞中。在一些实施方案中，肌肉靶向剂是小分子、蛋白质、肽、核酸(例如，适配体)、或抗体。在一些实施方案中，肌肉靶向剂与分子载荷连接。

肌肉靶向抗体：本文中使用的术语“肌肉靶向抗体”是指为与存在于肌细胞内或其上的抗原特异性结合的抗体的肌肉靶向剂。在一些实施方案中，肌肉靶向抗体与肌细胞上的抗原特异性结合，这有助于将肌肉靶向抗体(和任何缔合的分子载荷)内化到肌细胞中。在一些实施方案中，肌肉靶向抗体与存在于肌细胞上的内化细胞表面受体特异性结合。在一些实施方案中，肌肉靶向抗体是与转铁蛋白受体特异性结合的抗体。

强直性肌营养不良(DM)：本文中使用的术语“强直性肌营养不良(DM)”是指由DMPK基因或CNBP(ZNF9)基因中的突变引起的遗传疾病，其特征在于肌肉损失、肌肉变弱和肌肉功能。已经描述了该疾病的两种类型，即1型强直性肌营养不良(DM1)和2型强直性肌营养不良(DM2)。DM1与DMPK的3’非编码区中CTG三核苷酸重复的扩增相关。DM2与ZNF9的第一个内含子中CCTG四核苷酸重复的扩增相关。在DM1和DM2二者中，核苷酸扩增导致毒性RNA重复，其能够形成以高亲和力结合关键的胞内蛋白(例如，盲肌样蛋白)的发夹结构。强直性肌营养不良、该疾病的遗传基础以及相关症状在本领域中有描述(参见，例如，Thornton，C.A.，“Myotonic Dystrophy”Neurol Clin.(2014)，32(3)：705-719.；以及Konieczny et al.“Myotonic dystrophy：candidate small molecule therapeutics”Drug DiscoveryToday(2017)，22：11)。在一些实施方案中，对象出生时患有称为先天性强直性肌营养不良的DM1变异。先天性强直性肌营养不良的症状从出生开始就存在，并且包括所有肌肉无力、呼吸困难、畸形足、发育迟缓和智力障碍。DM1与在线人孟德尔遗传(Online MendelianInheritance in Man)(OMIM)Entry#160900相关。DM2与OMIM Entry#602668相关。

寡核苷酸：本文中使用的术语“寡核苷酸”是指长度长至200个核苷酸的寡聚核酸化合物。寡核苷酸的一些实例包括但不限于RNAi寡核苷酸(例如，siRNA、shRNA)、微RNA、间隔聚体、混合聚体、磷酸二酰胺吗啉代、肽核酸、适配体、指导核酸(例如，Cas9指导RNA)等。寡核苷酸可以是单链或双链。在一些实施方案中，寡核苷酸可包含一个或更多个经修饰核苷(例如，2’-O-甲基糖修饰、嘌呤或嘧啶修饰)。在一些实施方案中，寡核苷酸可包含一个或更多个经修饰核苷间键联。在一些实施方案中，寡核苷酸可包含一个或更多个硫代磷酸酯键联，其可为Rp或Sp立体化学构型。

重组抗体：本文中使用的术语“重组人抗体”旨在包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体(在本公开内容中更详细地描述)，从重组、组合人抗体文库分离的抗体(Hoogenboom H.R.，(1997)TIB Tech.15：62-70；Azzazy H.，and Highsmith W.E.，(2002)Clin.Biochem.35：425-445；Gavilondo J.V.，and Larrick J.W.(2002)BioTechniques 29：128-145；Hoogenboom H.，and Chames P.(2000)Immunology Today 21：371-378)，从人免疫球蛋白基因转基因的动物(例如，小鼠)分离的抗体(参见例如Taylor，L.D.，et al.(1992)Nucl.Acids Res.20：6287-6295；Kellermann S-A.，and Green L.L.(2002)Current Opinion inBiotechnology 13：593-597；Little M.et al(2000)Immunology Today 21：364-370)，或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他方式制备、表达、产生或分离的抗体。这样的重组人抗体具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，对这样的重组人抗体进行体外诱变(或当使用人Ig序列转基因的动物时，进行体内体细胞诱变)，并且因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，尽管其来源于人种系VH和VL序列并与之相关，但可能不是体内人抗体种系库中天然存在的。本公开内容的一个实施方案提供了能够结合人转铁蛋白受体的完全人抗体，其可使用本领域公知的技术产生，例如但不限于使用人Ig噬菌体文库，例如Jermutus et al.的PCT公开No.WO 2005/007699 A2中公开的那些。

互补区：本文中使用的术语“互补区”是指与例如靶核酸的同源核苷酸序列充分互补的例如寡核苷酸的核苷酸序列，使得两个核苷酸序列能够在生理条件下(例如，在细胞中)彼此退火。在一些实施方案中，互补区与靶核酸的同源核苷酸序列完全互补。然而，在一些实施方案中，互补区与靶核酸的同源核苷酸序列部分互补(例如，至少80％、90％、95％或99％互补)。在一些实施方案中，与靶核酸的同源核苷酸序列相比，互补区包含1、2、3或4个错配。

特异性结合：本文中使用的术语“特异性结合”是指分子以一定程度的亲和力或亲合力与结合伴侣结合的能力，该亲和力或亲合力使得分子能够用于在结合测定或其他结合环境中将结合伴侣与合适的对照区分开。关于抗体，术语“特异性结合”是指与合适的一种或更多种参考抗原相比，抗体以一定程度的亲和力或亲合力与特异性抗原结合的能力，该亲和力或亲合力使得抗体能够用于将特异性抗原与其他抗原区分开，例如至允许通过与如本文中所述的抗原结合而优先靶向某些细胞(例如，肌细胞)的程度。在一些实施方案中，如果抗体与靶标结合的KD为至少约10^-4M、10^-5M、10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M、10^- ¹²M、10^-13M或更小，则抗体与靶标特异性结合。在一些实施方案中，抗体与转铁蛋白受体(例如，转铁蛋白受体的顶端结构域(apical domain)的表位)特异性结合。

对象：本文中使用的术语“对象”是指哺乳动物。在一些实施方案中，对象是非人灵长类或啮齿动物。在一些实施方案中，对象是人。在一些实施方案中，对象是患者，例如患有或怀疑患有疾病的人患者。在一些实施方案中，对象是患有或怀疑患有由疾病相关重复扩增(例如，在DMPK等位基因中)引起的疾病的人患者。

转铁蛋白受体：本文中使用的术语“转铁蛋白受体”(也称为TFRC、CD71、p90或TFR1)是指结合转铁蛋白以促进通过内吞作用摄取铁的内化细胞表面受体。在一些实施方案中，转铁蛋白受体可以是人来源的(NCBI基因ID 7037)、非人灵长类来源的(例如，NCBI基因ID 711568或NCBI基因ID 102136007)或啮齿动物来源的(例如，NCBI基因ID 22042)。另外，已经表征了编码受体的不同同种型的多种人转录物变体(例如，如以以下GenBankRefSeq登录号注释的：NP_001121620.1、NP_003225.2、NP_001300894.1和NP_001300895.1)。

2’-经修饰核苷：本文中使用的术语“2’-经修饰核苷”和“2’-经修饰核糖核苷”可互换使用，并且是指在2’位置具有经修饰糖部分的核苷。在一些实施方案中，2’-经修饰核苷是2’-4’双环核苷，其中糖的2’和4’位置是桥联的(例如，通过亚甲基、亚乙基或(S)-约束性乙基桥联)。在一些实施方案中，2’-经修饰核苷是非双环的2’-经修饰核苷，例如，其中糖部分的2’位置被取代。2’-经修饰核苷的一些非限制性实例包括：2’-脱氧、2’-氟(2’-F)、2’-O-甲基(2’-O-Me)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、2’-O-二甲基氨基乙基氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)、锁核酸(LNA，亚甲基桥联核酸)、亚乙基桥联核酸(ENA)和(S)-约束性乙基桥联核酸(cEt)。在一些实施方案中，本文中所述的2’-经修饰核苷是高亲和力的经修饰核苷和寡核苷酸，其包含相对于未经修饰的寡核苷酸而对靶序列具有提高的亲和力的2’-经修饰核苷。下面提供了2’-经修饰核苷之结构的一些实例：

这些实例显示带有磷酸基团，但是任何核苷间键联都考虑在2’-经修饰核苷之间。

II.复合物

本文中还提供了包含与分子载荷共价连接的靶向剂(例如，抗体)的复合物。在一些实施方案中，复合物包含与寡核苷酸共价连接的肌肉靶向抗体。复合物可包含特异性结合单个抗原位点或结合可存在于相同或不同抗原上的至少两个抗原位点的抗体。

复合物可用于调节至少一种基因、蛋白质和/或(例如，和)核酸的活性或功能。在一些实施方案中，存在于复合物内的分子载荷负责基因、蛋白质和/或(例如，和)核酸的调节。分子载荷可以是能够调节细胞中基因、蛋白质和/或(例如，和)核酸的活性或功能的小分子、蛋白质、核酸、寡核苷酸或任何分子实体。在一些实施方案中，分子载荷是靶向肌细胞中疾病相关重复的寡核苷酸。在一些实施方案中，分子载荷是靶向CNS细胞中疾病相关重复的寡核苷酸。在一些实施方案中，分子载荷是不靶向疾病相关重复的寡核苷酸。在一些实施方案中，分子载荷是这样的寡核苷酸，其靶向DMPK转录物(例如，前mRNA或mRNA)的编码或非编码区，例如细胞(例如，肌细胞或CNS细胞)中的3’-非翻译区、内含子区或外显子区。

在一些实施方案中，复合物包含与分子载荷(例如，靶向DMPK的反义寡核苷酸，例如包含疾病相关重复(例如，DMPK等位基因)的核酸)共价连接的肌肉靶向剂，例如抗TfR1抗体。

A.肌肉靶向剂

本公开内容的一些方面提供了肌肉靶向剂，例如用于将分子载荷递送至肌细胞。在一些实施方案中，这样的肌肉靶向剂能够例如通过与肌细胞上的抗原特异性结合而与肌细胞结合，并且将缔合的分子载荷递送至肌细胞。在一些实施方案中，分子载荷与肌肉靶向剂结合(例如，共价结合)，并且在肌肉靶向剂与肌细胞上的抗原结合后内化到肌细胞中，例如通过内吞作用。应理解，根据本公开内容可以使用多种类型的肌肉靶向剂并且任何肌肉靶标(例如，肌肉表面蛋白)都可被本文中所述的任何类型的肌肉靶向剂靶向。例如，肌肉靶向剂可包含小分子、核酸(例如，DNA或RNA)、肽(例如，抗体)、脂质(例如，微泡(microvesicle))或糖部分(例如，多糖)，或者由其组成。示例性的肌肉靶向剂在本文中进一步详细描述，然而，应理解，本文中提供的示例性肌肉靶向剂并不意味着是限制性的。

本公开内容的一些方面提供了与肌肉(例如骨骼肌、平滑肌或心肌)上的抗原特异性结合的肌肉靶向剂。在一些实施方案中，本文中提供的任何肌肉靶向剂均与骨骼肌细胞、平滑肌细胞和/或(例如，和)心肌细胞上的抗原结合(例如，与之特异性结合)。

通过与肌肉特异性细胞表面识别元件(例如，细胞膜蛋白)相互作用，可实现组织定位和选择性摄取到肌细胞中二者。在一些实施方案中，作为肌肉摄取转运体之底物的分子可用于将分子载荷递送到肌肉组织中。与肌肉表面识别元件结合之后是胞吞作用，其可允许甚至大分子(例如，抗体)进入肌细胞。作为另一个实例，与转铁蛋白或抗TfR1抗体缀合的分子载荷可通过与转铁蛋白受体结合而被肌细胞摄取，然后可例如通过网格蛋白介导的内吞作用被内吞。

肌肉靶向剂的使用可用于将分子载荷(例如，寡核苷酸)集中在肌肉中，同时降低与其他组织中的作用相关的毒性。在一些实施方案中，与对象内的另一种细胞类型相比，肌肉靶向剂将结合的分子载荷集中在肌细胞中。在一些实施方案中，肌肉靶向剂将结合的分子载荷以是非肌细胞(例如，肝、神经元、血液或脂肪细胞)中的量的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100倍高的量集中在肌细胞(例如，骨骼肌、平滑肌或心肌细胞)中。在一些实施方案中，当分子载荷在与肌肉靶向剂结合时递送至对象时，其在对象中的毒性降低至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％或95％。

在一些实施方案中，为了实现肌肉选择性，可能需要肌肉识别元件(例如，肌细胞抗原)。作为一个实例，肌肉靶向剂可以是为肌肉特异性摄取转运体之底物的小分子。作为另一个实例，肌肉靶向剂可以是通过转运体介导的内吞作用进入肌细胞的抗体。作为另一个实例，肌肉靶向剂可以是与肌细胞上的细胞表面受体结合的配体。应理解，尽管基于转运体的方法为细胞进入提供了直接途径，但是基于受体的靶向可能涉及刺激的胞吞作用以达到期望的作用部位。

i.肌肉靶向抗体

在一些实施方案中，肌肉靶向剂是抗体。通常来说，抗体对其靶抗原的高特异性提供了用于选择性靶向肌细胞(例如，骨骼肌、平滑肌和/或(例如，和)心肌细胞)的潜力。这种特异性也可以限制脱靶毒性。能够靶向肌细胞表面抗原的抗体的一些实例已经报道并且在本公开内容的范围内。例如，靶向肌细胞表面的抗体在以下中有描述：Arahata K.，et al.“Immunostaining of skeletal and cardiac muscle surface membrane with antibodyagainst Duchenne muscular dystrophy peptide”Nature 1988；333：861-3；Song K.S.，et al.“Expression of caveolin-3 in skeletal，cardiac，and smooth musclecells.Caveolin-3 is a component of the sarcolemma and co-fractionates withdystrophin and dystrophin-associated glycoproteins”J Biol Chem 1996；271：15160-5；以及Weisbart R.H.et al.，“Cell type specific targeted intracellulardelivery into muscle of a monoclonal antibody that binds myosin IIb”MolImmunol.2003 Mar，39(13)：78309；其各自的全部内容均通过引用并入本文。

a.抗转铁蛋白受体(TfR)抗体

本公开内容的一些方面是基于这样的认识：与转铁蛋白受体结合的物质(例如，抗转铁蛋白受体抗体)能够靶向肌细胞。转铁蛋白受体是内化细胞表面受体，其转运转铁蛋白穿过细胞膜并参与胞内铁水平的调节和稳态。本公开内容的一些方面提供了能够与转铁蛋白受体结合的转铁蛋白受体结合蛋白。因此，本公开内容的一些方面提供了与转铁蛋白受体结合的结合蛋白(例如，抗体)。在一些实施方案中，与转铁蛋白受体结合的结合蛋白与任何结合的分子载荷一起被内化到肌细胞中。本文中使用的与转铁蛋白受体结合的抗体可以可互换地称为转铁蛋白受体抗体、抗转铁蛋白受体抗体或抗TfR1抗体。与转铁蛋白受体结合(例如，特异性结合)的抗体可在与转铁蛋白受体结合后例如通过受体介导的内吞作用而被内化到细胞中。

应理解，可使用数种已知的方法(例如使用噬菌体展示的文库设计)来产生、合成和/或(例如，和)衍生抗TfR1抗体。示例性方法已经在本领域中表征并且通过引用并入(Díez，P.et al.“High-throughput phage-display screening in array format”，Enzymeand microbial technology，2015，79，34-41.；Christoph M.H.and Stanley，J.R.“Antibody Phage Display：Technique and Applications”J Invest Dermatol.2014，134：2.；Engleman，Edgar(Ed.)“Human Hybridomas and Monoclonal Antibodies.”1985，Springer)。在另一些实施方案中，抗TfR1抗体先前已被表征或公开。与转铁蛋白受体特异性结合的抗体是本领域中已知的(参见，例如1979年12月4日提交的美国专利No.4,364,934，“Monoclonal antibody to a human early thymocyte antigen and methods forpreparing same”；2006年6月14日提交的美国专利No.8,409,573，“Anti-CD71 monoclonalantibodies and uses thereoffor treating malignant tumor cells”；2014年5月20日提交的美国专利No.9,708,406，“Anti-transferrin receptor antibodies and methodsof use”；2014年12月19日提交的US 9,611,323，“Low affinity blood brain barrierreceptor antibodies and uses therefor”；2014年12月24日提交的WO2015/098989，“Novel anti-Transferrin receptor antibody that passes through blood-brainbarrier”；Schneider C.et al.“Structural features of the cell surface receptorfor transferrin that is recognized by the monoclonal antibody OKT9.”J BiolChem.1982，257：14，8516-8522.；Lee et al.“Targeting Rat Anti-Mouse TransferrinReceptor Monoclonal Antibodies through Blood-Brain Barrier in Mouse”2000，JPharmacol.Exp.Ther.，292：1048-1052)。

在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1抗体以高特异性和亲和力与转铁蛋白受体结合。在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1抗体与转铁蛋白受体的任何胞外表位或暴露于抗体的表位特异性结合。在一些实施方案中，本文中提供的抗TfR1抗体与来自人、非人灵长类、小鼠、大鼠等的转铁蛋白受体特异性结合。在一些实施方案中，本文中提供的抗TfR1抗体与人转铁蛋白受体结合。在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1抗体与人或非人灵长类转铁蛋白受体的氨基酸区段(如SEQ ID NO：105至108中提供的)结合。在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1抗体与这样的氨基酸区段结合：对应于人转铁蛋白受体(如SEQ ID NO：105中所示)的第90至96位氨基酸，其不在转铁蛋白受体的顶端结构域中。

在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1抗体(例如，下表2中的抗TfR克隆8)结合TfR1中的表位，其中所述表位包含SEQ ID NO：105的第214至241位氨基酸和/或第354至381位氨基酸中的残基。在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1抗体结合包含SEQ ID NO：105的第214至241位氨基酸和第354至381位氨基酸中的残基的表位。在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1抗体结合包含SEQ ID NO：105中所示的人TfR1的一个或更多个残基Y222、T227、K231、H234、T367、S368、S370、T376和S378的表位。在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1抗体结合包含SEQ ID NO：105中所示的人TfR1的残基Y222、T227、K231、H234、T367、S368、S370、T376和S378的表位。

在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1抗体(例如，下表2中的3M12及其变体)结合TfR1中的表位，其中所述表位包含SEQ ID NO：105的第258至291位氨基酸和/或第358至381位氨基酸中的残基。在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1抗体(例如，下表2中的3M12及其变体)结合包含SEQ ID NO：105的第258至291位氨基酸和第358至381位氨基酸中的残基的表位。在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1抗体(例如，下表2中的3M12及其变体)结合包含SEQ ID NO：105中所示的人TfR1的一个或更多个残基K261、S273、Y282、T362、S368、S370和K371的表位。在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1抗体(例如，下表2中的3M12及其变体)结合包含SEQ ID NO：105中所示的人TfR1的残基K261、S273、Y282、T362、S368、S370和K371的表位。

对应于NCBI序列NP_003225.2(转铁蛋白受体蛋白1同种型1，智人)的示例性人转铁蛋白受体氨基酸序列如下：

对应于NCBI序列NP_001244232.1(转铁蛋白受体蛋白1，恒河猴(Macacamulatta))的示例性非人灵长类转铁蛋白受体氨基酸序列如下：

对应于NCBI序列XP_005545315.1(转铁蛋白受体蛋白1，食蟹猴(Macacafascicularis))的示例性非人灵长类转铁蛋白受体氨基酸序列如下：

对应于NCBI序列NP_001344227.1(转铁蛋白受体蛋白1，小家鼠(Mus musculus))的示例性小鼠转铁蛋白受体氨基酸序列如下：

在一些实施方案中，抗TfR1抗体与如下的受体氨基酸区段结合：

并且不抑制转铁蛋白受体与转铁蛋白和/或(例如，和)人血色素沉着蛋白(humanhemochromatosis protein，也称为HFE)之间的结合相互作用。在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1抗体不与SEQ ID NO：109中的表位结合。

可使用适当的方法来获得和/或(例如，和)产生抗体、抗体片段或抗原结合剂，例如，通过使用重组DNA方案。在一些实施方案中，也可通过杂交瘤的产生来产生抗体(参见，例如，Kohler，G and Milstein，C.“Continuous cultures of fused cells secretingantibody of predefined specificity”Nature，1975，256：495-497)。目的抗原可以以任何形式或实体(例如，重组或天然存在的形式或实体)用作免疫原。使用标准方法(例如ELISA筛选)筛选杂交瘤，以发现至少一种产生靶向特定抗原之抗体的杂交瘤。也可通过筛选表达抗体的蛋白质表达文库(例如，噬菌体展示文库)来产生抗体。在一些实施方案中，也可使用噬菌体展示文库设计(参见，例如，1991年3月1日提交的美国专利No 5,223,409，“Directed evolution of novel binding proteins”；1992年4月10日提交的WO 1992/18619，“Heterodimeric receptor libraries using phagemids”；1991年5月1日提交的WO1991/17271，“Recombinant library screening methods”；1992年5月15日提交的WO1992/20791，“Methods for producing members of specific binding pairs”；1992年2月28日提交的WO 1992/15679，“Improved epitope displaying phage”)。在一些实施方案中，目的抗原可用于对非人动物，例如啮齿动物或山羊进行免疫接种。在一些实施方案中，然后从非人动物获得抗体，并且可任选地使用多种方法(例如，使用重组DNA技术)对其进行修饰。抗体产生的其他实例和方法是本领域已知的(参见，例如Harlow et al.“Antibodies：A Laboratory Manual”，Cold Spring Harbor Laboratory，1988.)。

在一些实施方案中，对抗体进行修饰，例如，通过糖基化、磷酸化、SUMO化和/或(例如，和)甲基化进行修饰。在一些实施方案中，抗体是与一个或更多个糖或碳水化合物分子缀合的糖基化抗体。在一些实施方案中，一个或更多个糖或碳水化合物分子通过N-糖基化、O-糖基化、C-糖基化、糖基磷脂酰肌醇化(GPI锚定附着)和/或(例如，和)磷酸糖基化与抗体缀合。在一些实施方案中，一个或更多个糖或碳水化合物分子是单糖、二糖、寡糖或聚糖。在一些实施方案中，一个或更多个糖或碳水化合物分子是支化的寡糖或支化的聚糖。在一些实施方案中，一个或更多个糖或碳水化合物分子包含甘露糖单元、葡萄糖单元、N-乙酰葡糖胺单元、N-乙酰半乳糖胺单元、半乳糖单元、岩藻糖单元或磷脂单元。在一些实施方案中，存在约1至10、约1至5、约5至10、约1至4、约1至3或约2个糖分子。在一些实施方案中，糖基化抗体是完全或部分糖基化的。在一些实施方案中，通过化学反应或通过酶促手段使抗体糖基化。在一些实施方案中，抗体在体外或细胞内被糖基化，其可任选地缺少N-或O-糖基化途径中的酶，例如糖基转移酶。在一些实施方案中，用糖或碳水化合物分子对抗体进行官能化，如2014年5月1日公开的标题为“Modified antibody，antibody-conjugate and processfor the preparation thereof”的国际专利申请公开WO2014065661中所述。

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含选自表2至7中任一项的任一种抗TfR1抗体的VL结构域和/或(例如，和)VH结构域，并且包含恒定区，所述恒定区包含IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的任何类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或任何亚类(例如，IgG2a和IgG2b)的恒定区的氨基酸序列。本领域中描述了人恒定区的一些非限制性实例，例如参见上文Kabat E A et al.，(1991)。

在一些实施方案中，与转铁蛋白受体结合的物质，例如抗TfR1抗体，能够靶向肌细胞和/或(例如，和)介导物质穿过血脑屏障(例如，到CNS细胞)的转运。转铁蛋白受体是将转铁蛋白转运通过细胞膜并参与胞内铁水平的调节和稳态的内化细胞表面受体。本公开内容的一些方面提供了能够结合转铁蛋白受体的转铁蛋白受体结合蛋白。与转铁蛋白受体结合(例如，特异性结合)的抗体可在与转铁蛋白受体结合之后被内化至细胞中，例如通过受体介导的胞吞作用而被内化至细胞中。

在一些方面中，本文中提供了以高特异性和亲和力与转铁蛋白受体结合的抗体。在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1抗体与转铁蛋白受体的任何胞外表位或暴露于抗体的表位特异性结合。在一些实施方案中，本文中提供的抗TfR1抗体与来自人、非人灵长类、小鼠、大鼠等的转铁蛋白受体特异性结合。在一些实施方案中，本文中提供的抗TfR1抗体与人转铁蛋白受体结合。在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1抗体与如SEQ ID NO：105至108中提供的人或非人灵长类转铁蛋白受体的氨基酸区段结合。在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1抗体与这样的氨基酸区段结合：对应于如SEQ ID NO：105中所示的人转铁蛋白受体的第90至96位氨基酸，其不在转铁蛋白受体的顶端结构域中。在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1抗体与TfR1结合但与不TfR2结合。

在一些实施方案中，抗TFR1抗体以至少约10^-4M、10^-5M、10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M、10^-12M、10^-13M或更小的结合亲和力(例如，如Kd所示)特异性结合TfR1(例如，人或非人灵长类TfR1)。在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1抗体以亚纳摩范围的KD与TfR1结合。在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1抗体选择性地与转铁蛋白受体1(TfR1)结合但不与转铁蛋白受体2(TfR2)结合。在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1抗体与人TfR1和食蟹猴TfR1结合(例如，Kd为10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M、10^-12M、10^-13M或更小)，但不与小鼠TfR1结合。抗TfR1抗体的亲和力和结合动力学可使用任何合适的方法测试，包括但不限于生物传感器技术(例如，OCTET或BIACORE)。在一些实施方案中，本文中所述的任一种抗TfR1抗体的结合不竞争或抑制转铁蛋白与TfR1的结合。在一些实施方案中，本文中所述的任一种抗TfR1抗体的结合不竞争或抑制HFE-β-2-微球蛋白与TfR1的结合。

表2中提供了抗TfR1抗体的非限制性实例。

表2.抗TfR1抗体的一些实例

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*突变位置根据包含突变的相应VH序列的Kabat编号

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体是表2中提供的任一种抗TfR1抗体的变体。在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含与表2中提供的任一种抗TfR1抗体中的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3相同的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，并且包含重链可变区和/或(例如，和)轻链可变区。

表3中提供了本文中所述的抗TfR1抗体的氨基酸序列的一些实例。

表3.抗TfR1抗体的可变区

/>

*突变位置根据包含突变的相应VH序列的Kabat编号

**根据Kabat编号系统的CDR被加粗

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含VH，所述VH包含表3中提供的任一种抗TfR1抗体的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且与表3中提供的相应VH相比，在框架区中包含一个或更多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)氨基酸变异。作为替代或补充(例如，补充)，本公开内容的抗TfR1抗体包含VL，所述VL包含表3中提供的任一种抗TfR1抗体的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，并且与表3中提供的相应VL相比，在框架区中包含一个或更多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)氨基酸变异。

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含VH，所述VH包含表3中提供的任一种抗TfR1抗体的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且与表3中提供的相应VH相比在框架区中包含具有至少70％(例如，至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％)同一性的氨基酸序列。作为替代或补充(例如，补充)，本公开内容的抗TfR1抗体包含VL，所述VL包含表3中提供的任一种抗TfR1抗体的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，并且与表3中提供的相应VL相比包含具有至少70％(例如，至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％)同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：69的氨基酸序列的VH和包含含有SEQ ID NO：70的氨基酸序列的VL。

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：71的氨基酸序列的VH和包含含有SEQ ID NO：70的氨基酸序列的VL。

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：72的氨基酸序列的VH和包含含有SEQ ID NO：70的氨基酸序列的VL。

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：73的氨基酸序列的VH和包含含有SEQ ID NO：74的氨基酸序列的VL。

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：73的氨基酸序列的VH和包含含有SEQ ID NO：75的氨基酸序列的VL。

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：76的氨基酸序列的VH和包含含有SEQ ID NO：74的氨基酸序列的VL。

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：76的氨基酸序列的VH和包含含有SEQ ID NO：75的氨基酸序列的VL。

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：77的氨基酸序列的VH和包含含有SEQ ID NO：78的氨基酸序列的VL。

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：79的氨基酸序列的VH和包含含有SEQ ID NO：80的氨基酸序列的VL。

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：77的氨基酸序列的VH和包含含有SEQ ID NO：80的氨基酸序列的VL。

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：154的氨基酸序列的VH和包含含有SEQ ID NO：155的氨基酸序列的VL。

在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1抗体是全长IgG，其可包含来自人抗体的重恒定区和轻恒定区。在一些实施方案中，本文中所述的任何抗TfR1抗体的重链可包含重链恒定区(CH)或其一部分(例如，CH1、CH2、CH3或其组合)。重链恒定区可具有任何合适的来源，例如人、小鼠、大鼠或兔。在一个具体实例中，重链恒定区来自人IgG例如IgG1、IgG2或IgG4(γ重链)。以下给出了人IgG1恒定区的一个实例：

在一些实施方案中，本文中所述的任何抗TfR1抗体的重链包含突变体人IgG1恒定区。例如，已知在人IgG1的CH2结构域中引入LALA突变(来源于mAb b12的突变体，其已突变以用Ala234和Ala235替换较低的铰链残基Leu234 Leu235)降低了Fcγ受体结合(Bruhns，P.，et al.(2009)和Xu，D.et al.(2000))。以下提供了突变体人IgG1恒定区(突变加粗并带有下划线)：

在一些实施方案中，本文中所述的任何抗TfR1抗体的轻链可还包含轻链恒定区(CL)，其可以是本领域已知的任何CL。在一些实例中，CL是κ轻链。在另一些实例中，CL是λ轻链。在一些实施方案中，CL是κ轻链，以下提供了其序列：

其他抗体重链和轻链恒定区是本领域公知的，例如在IMGT数据库(imgt.org)或vbase2.org/vbstat.php.中提供的那些，二者均通过引用并入本文。

在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1抗体包含重链，所述重链包含表3中所列出的任一种VH或其任意变体以及与SEQ ID NO：81或SEQ ID NO：82具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的重链恒定区。在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1抗体包含重链，所述重链包含表3中所列出的任一种VH或其任意变体以及与SEQID NO：81或SEQ ID NO：82相比包含不超过25个氨基酸变异(例如，不超过25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)的重链恒定区。在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1抗体包含重链，所述重链包含表3中所列出的任一种VH或其任意变体以及SEQ ID NO：81中所示的重链恒定区。在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1抗体包含重链，所述重链包含表3所中列出的任一种VH或其任意变体以及SEQID NO：82中所示的重链恒定区。

在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1抗体包含轻链，所述轻链包含表3中所列出的任一种VL或其任意变体以及与SEQ ID NO：83具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的轻链恒定区。在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1抗体包含轻链，所述轻链包含表3中所列出的任一种VL或其任意变体以及与SEQ ID NO：83相比包含不超过25个氨基酸变异(例如，不超过25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)的轻链恒定区。在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1抗体包含轻链，所述轻链包含表3中所列出的任一种VL或其任意变体以及SEQ IDNO：83中所示的轻链恒定区。

下表4中提供了所述抗TfR1抗体的IgG重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列的一些实例。

表4.抗TfR1 IgG的实例的重链序列和轻链序列

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*突变位置根据包含突变的相应VH序列的Kabat编号

**根据Kabat编号系统的CDR被加粗；VH/VL序列带有下划线

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含重链，所述重链与SEQ ID NO：84、86、87、88、91、92、94和156中任一个所示的重链相比，包含不超过25个氨基酸变异(例如，不超过25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)。作为替代或补充(例如，补充)，本公开内容的抗TfR1抗体包含轻链，所述轻链与SEQ ID NO：85、89、90、93、95和157中任一个所示的轻链相比包含不超过25个氨基酸变异(例如，不超过25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)。

在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1抗体包含重链，所述重链包含与SEQ IDNO：84、86、87、88、91、92、94和156中的任一个具有至少75％(例如，75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列。作为替代或补充(例如，补充)，本文中所述的抗TfR1抗体包含轻链，所述轻链包含与SEQ ID NO：85、89、90、93、95和157中的任一个具有至少75％(例如，75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：84、86、87、88、91、92、94和156中任一个的氨基酸序列的重链。作为替代或补充(例如，补充)，本文中所述的抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：85、89、90、93、95和157中任一个的氨基酸序列的轻链。

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：84的氨基酸序列的重链和包含含有SEQ ID NO：85的氨基酸序列的轻链。

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：86的氨基酸序列的重链和包含含有SEQ ID NO：85的氨基酸序列的轻链。

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：87的氨基酸序列的重链和包含含有SEQ ID NO：85的氨基酸序列的轻链。

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：88的氨基酸序列的重链和包含含有SEQ ID NO：89的氨基酸序列的轻链。

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：88的氨基酸序列的重链和包含含有SEQ ID NO：90的氨基酸序列的轻链。

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：91的氨基酸序列的重链和包含含有SEQ ID NO：89的氨基酸序列的轻链。

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：91的氨基酸序列的重链和包含含有SEQ ID NO：90的氨基酸序列的轻链。

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：92的氨基酸序列的重链和包含含有SEQ ID NO：93的氨基酸序列的轻链。

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：94的氨基酸序列的重链和包含含有SEQ ID NO：95的氨基酸序列的轻链。

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：92的氨基酸序列的重链和包含含有SEQ ID NO：95的氨基酸序列的轻链。

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：156的氨基酸序列的重链和包含含有SEQ ID NO：157的氨基酸序列的轻链。

在一些实施方案中，抗TfR1抗体是完整抗体(全长抗体)的Fab片段、Fab’片段或F(ab’)₂片段。完整抗体(全长抗体)的抗原结合片段可以通过常规方法制备(例如，重组地制备或通过使用酶如木瓜蛋白酶消化全长IgG的重链恒定区来制备)。例如，F(ab’)₂片段可通过胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化抗体分子产生，并且Fab片段可通过还原F(ab’)₂片段的二硫桥产生。在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1抗体的Fab片段中的重链恒定区包含以下氨基酸序列：

在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1抗体包含重链，所述重链包含表3中所列出的任一种VH或其任意变体以及与SEQ ID NO：96具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的重链恒定区。在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1抗体包含重链，所述重链包含表3中列出的任一种VH或其任意变体以及与SEQ ID NO：96相比包含不超过25个氨基酸变异(例如，不超过25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)的重链恒定区。在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1抗体包含重链，所述重链包含表3中列出的任一种VH或其任意变体以及SEQ ID NO：96中所示的重链恒定区。

下表5中提供了所述抗TfR1抗体的Fab重链和轻链氨基酸序列的一些实例。

表5.抗TfR1 Fab实例的重链和轻链序列

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*突变位置根据包含突变的相应VH序列的Kabat编号

**根据Kabat编号系统的CDR被加粗；VH/VL序列带有下划线

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含重链，所述重链与SEQ ID NO：97至103、158和159中的任一个中所示的重链相比包含不超过25个氨基酸变异(例如，不超过25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)。作为替代或补充(例如，补充)，本公开内容的抗TfR1抗体包含轻链，所述轻链与SEQID NO：85、89、90、93、95和157中的任一个中所示的轻链相比不超过25个氨基酸变异(例如，不超过25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)。

在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1抗体包含重链，所述重链包含与SEQ IDNO：97至103、158和159中的任一个具有至少75％(例如，75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列。作为替代或补充(例如，补充)，本文中所述的抗TfR1抗体包含轻链，所述轻链包含与SEQ ID NO：85、89、90、93、95和157中的任一个具有至少75％(例如，75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO：97至103、158和159中任一个的氨基酸序列。作为替代或补充(例如，补充)，本文中所述的抗TfR1抗体包含轻链，所述轻链包含SEQ ID NO：85、89、90、93、95和157中任一个的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：97的氨基酸序列的重链和包含含有SEQ ID NO：85的氨基酸序列的轻链。

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：98的氨基酸序列的重链和包含含有SEQ ID NO：85的氨基酸序列的轻链。

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：99的氨基酸序列的重链和包含含有SEQ ID NO：85的氨基酸序列的轻链。

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：100的氨基酸序列的重链和包含含有SEQ ID NO：89的氨基酸序列的轻链。

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：100的氨基酸序列的重链和包含含有SEQ ID NO：90的氨基酸序列的轻链。

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：101的氨基酸序列的重链和包含含有SEQ ID NO：89的氨基酸序列的轻链。

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：101的氨基酸序列的重链和包含含有SEQ ID NO：90的氨基酸序列的轻链。

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：102的氨基酸序列的重链和包含含有SEQ ID NO：93的氨基酸序列的轻链。

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：103的氨基酸序列的重链和包含含有SEQ ID NO：95的氨基酸序列的轻链。

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：102的氨基酸序列的重链和包含含有SEQ ID NO：95的氨基酸序列的轻链。

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：158的氨基酸序列的重链和包含含有SEQ ID NO：157的氨基酸序列的轻链。

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：159的氨基酸序列的重链和包含含有SEQ ID NO：157的氨基酸序列的轻链。

其他已知的抗TfR1抗体

本领域中已知的任何其他合适的抗TfR1抗体均可用作本文中公开的复合物中的肌肉靶向剂。表6中列出了已知抗TfR1抗体的实例，包括相关参考文献和结合表位。在一些实施方案中，抗TfR1抗体包含本文中提供的任何抗TfR1抗体(例如表6中列出的抗TfR1抗体)的互补决定区(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)。

表6-抗TfR1抗体克隆的列表，包括相关参考文献和结合表位信息。

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在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含来自选自表6的任一种抗TfR1抗体的一个或更多个CDR-H(例如，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TfR1抗体包含如针对选自表6的任一种抗TfR1抗体所提供的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，抗TfR1抗体包含如针对选自表6的任一种抗TfR1抗体所提供的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包括包含任何抗TfR1抗体(例如选自表6的任一种抗TfR1抗体)的重链可变结构域和/或(例如，和)轻链可变结构域的任何抗体。在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包括包含任何抗TfR1抗体(例如选自表6的任一种抗TfR1抗体)的重链可变和轻链可变对的任何抗体。

本公开内容的一些方面提供了抗TfR1抗体，其具有与本文中所述的那些中的任何同源的重链可变(VH)和/或(例如，和)轻链可变(VL)结构域氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TfR1抗体包含与任何抗TfR1抗体(例如选自表6的任一种抗TfR1抗体)的重链可变序列和/或任何轻链可变序列具有至少75％(例如80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的重链可变序列或轻链可变序列。在一些实施方案中，同源重链可变和/或(例如，和)轻链可变氨基酸序列在本文中提供的任何CDR序列内均不变化。例如，在一些实施方案中，序列变异的程度(例如，75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)可发生在不包括本文中提供的任何CDR序列的重链可变和/或(例如，和)轻链可变序列中。在一些实施方案中，本文中提供的任何抗TfR1抗体包含重链可变序列和轻链可变序列，其包含与任何抗TfR1抗体(例如选自表6的任一种抗TfR1抗体)的框架序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的框架序列。

根据本公开内容可使用的转铁蛋白受体抗体的实例描述于国际申请公开WO2016/081643中，其通过引用并入本文。该抗体的氨基酸序列在表7中提供。

表7.已知的抗TfR1抗体的实例的重链和轻链CDR

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在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含与表7中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3相同的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。作为替代或补充(例如，补充)，本公开内容的抗TfR1抗体包含与表7所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3相同的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含CDR-L3，其与表7中所示的CDR-L3相比包含不超过3个氨基酸变异(例如，不超过3、2或1个氨基酸变异)。在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含CDR-L3，其与表7中所示的CDR-L3相比包含一个氨基酸变异。在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含QHFAGTPLT(SEQ ID NO：126)的CDR-L3(根据Kabat和Chothia定义系统)或QHFAGTPL(SEQ ID NO：127)的CDR-L3(根据Contact定义系统)。在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含与表7中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3相同的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1和CDR-L2，并且包含QHFAGTPLT(SEQ IDNO：126)的CDR-L3(根据Kabat和Chothia定义系统)或QHFAGTPL(SEQ ID NO：127)的CDR-L3(根据Contact定义系统)。

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含重链CDR，其共同与表7中所示的重链CDR具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％或98％)同一性。作为替代或补充(例如，补充)，本公开内容的抗TfR1抗体包含轻链CDR，其共同与表7所示的轻链CDR具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％或98％)同一性。

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：124的氨基酸序列的VH。作为替代或补充(例如，补充)，本公开内容的抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：125的氨基酸序列的VL。

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：128的氨基酸序列的VH。作为替代或补充(例如，补充)，本公开内容的抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：129的氨基酸序列的VL。

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体包含VH，所述VH与SEQ ID NO：128中所示的VH相比包含不超过25个氨基酸变异(例如，不超过25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)。作为替代或补充(例如，补充)，本公开内容的抗TfR1抗体包含VL，所述VL与SEQ ID NO：129中所示的VL相比包含不超过15个氨基酸变异(例如，不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)。

在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR1抗体是全长IgG1抗体，其可包含来自人抗体的重恒定区和轻恒定区。在一些实施方案中，本文中所述的任何抗TfR1抗体的重链可包含重链恒定区(CH)或其一部分(例如，CH1、CH2、CH3或其组合)。重链恒定区可具有任何合适的来源，例如人、小鼠、大鼠或兔。在一个具体实例中，重链恒定区来自人IgG例如IgG1、IgG2或IgG4(γ重链)。以下给出了人IgG1恒定区的一个实例：

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在一些实施方案中，本文中所述的任何抗TfR1抗体的轻链还包含轻链恒定区(CL)，其可以是本领域已知的任何CL。在一些实例中，CL是κ轻链。在另一些实例中，CL是λ轻链。在一些实施方案中，CL是κ轻链，以下提供了其序列：

在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1抗体是嵌合抗体，其包含含有SEQ IDNO：132的氨基酸序列的重链。作为替代或补充(例如，补充)，本文中所述的抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：133的氨基酸序列的轻链。

在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1抗体是包含重链的完全人抗体，所述重链包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列。作为替代或补充(例如，补充)，本文中所述的抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：135的氨基酸序列的轻链。

在一些实施方案中，抗TfR1抗体是完整抗体(全长抗体)的抗原结合片段(Fab)。在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1 Fab包含含有SEQ ID NO：136的氨基酸序列的重链。作为替代或补充(例如，补充)，本文中所述的抗TfR1 Fab包含含有SEQ ID NO：133的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1 Fab包含含有SEQ ID NO：137的氨基酸序列的重链。作为替代或补充(例如，补充)，本文中所述的抗TfR1 Fab包含含有SEQ IDNO：135的氨基酸序列的轻链。

本文中所述的抗TfR1抗体可为任何抗体形式，包括但不限于完整(即，全长)抗体、其抗原结合片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、单链抗体、双特异性抗体或纳米抗体。在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1抗体是scFv。在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1抗体是scFv-Fab(例如，与恒定区的一部分融合的scFv)。在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1抗体是与恒定区(例如，SEQ ID NO：81中所示的人IgG1恒定区)融合的scFv。

在一些实施方案中，可在残基不太可能参与与靶抗原(例如，转铁蛋白受体)相互作用的位置(例如，如基于晶体结构确定的)处将保守突变引入抗体序列(例如，CDR或框架序列)中。在一些实施方案中，将一个、两个或更多个突变(例如，氨基酸替换)引入本文中所述的抗TfR1抗体的Fc区(例如，在CH2结构域(人IgG1的第231至340位残基)和/或(例如，和)CH3结构域(人IgG1的第341至447位残基)和/或(例如，和)铰链区中，根据Kabat编号系统(例如，Kabat中的EU索引)编号)，以改变抗体的一种或更多种功能特性，例如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或(例如，和)抗原依赖性细胞毒性。

在一些实施方案中，将一个、两个或更多个突变(例如，氨基酸替换)引入Fc区(CH1结构域)的铰链区中，使得铰链区中的半胱氨酸残基的数目改变(例如，增加或减少)，如例如美国专利No.5,677,425中所述。可改变CH1结构域的铰链区中半胱氨酸残基的数目，例如以促进轻链和重链的组装，或改变(例如，提高或降低)抗体的稳定性或促进接头缀合。

在一些实施方案中，将一个、两个或更多个突变(例如，氨基酸替换)引入本文中所述的肌肉靶向抗体的Fc区(例如，在CH2结构域(人IgG1的第231至340位残基)和/或(例如，和)CH3结构域(人IgG1的第341至447位残基)和/或(例如，和)铰链区中，根据Kabat编号系统(例如，Kabat中的EU索引)编号)，以提高或降低抗体对效应细胞表面上Fc受体(例如，激活的Fc受体)的亲和力。降低或提高抗体对Fc受体的亲和力的抗体Fc区中突变以及将这样的突变引入Fc受体或其片段的技术是本领域技术人员已知的。可被进行以改变抗体对Fc受体的亲和力的抗体Fc受体中突变的一些实例描述于以下中：例如Smith P et al.，(2012)PNAS 109：6181-6186，美国专利No.6,737,056，以及国际公开No.WO 02/060919、WO 98/23289、和WO 97/34631，其通过引用并入本文。

在一些实施方案中，将一个、两个或更多个氨基酸突变(即，替换、插入或缺失)引入IgG恒定结构域或其FcRn结合片段(优选地，Fc或铰链-Fc结构域片段)中以改变(例如，降低或提高)抗体在体内的半衰期。参见例如国际公开No.WO 02/060919、WO 98/23289和WO97/34631，以及美国专利No.5,869,046、6,121,022、6,277,375和6,165,745，例如将改变(例如，降低或提高)抗体在体内的半衰期的突变。

在一些实施方案中，将一个、两个或更多个氨基酸突变(即，替换、插入或缺失)引入IgG恒定结构域或其FcRn结合片段(优选地，Fc或铰链-Fc结构域片段)中以降低体内抗TfR1抗体的半衰期。在一些实施方案中，将一个、两个或更多个氨基酸突变(即，替换、插入或缺失)引入IgG恒定结构域或其FcRn结合片段(优选地，Fc或铰链-Fc结构域片段)中以提高抗体在体内的半衰期。在一些实施方案中，抗体可在第二恒定(CH2)结构域(人IgG1的第231至340位残基)和/或(例如，和)第三恒定(CH3)结构域(人IgG1的第341至447位残基)(根据Kabat中的EU索引(Kabat E A et al.，(1991)同上)编号)中具有一个或更多个氨基酸突变(例如，替换)。在一些实施方案中，本文中所述的抗体的IgG1的恒定区包含在第252位处的甲硫氨酸(M)至酪氨酸(Y)替换，在第254位处的丝氨酸(S)至苏氨酸(T)替换，以及在第256位处的苏氨酸(T)至谷氨酸(E)替换，所述位置根据Kabat中的EU索引编号。参见美国专利No.7,658,921，其通过引用并入本文。这种类型的突变体IgG(称为“YTE突变体”)已显示出与同一抗体的野生型形式相比半衰期提高4倍(参见Dall’Acqua W F et al.，(2006)JBiol Chem 281：23514-24)。在一些实施方案中，抗体包含IgG恒定结构域，该结构域包含在第251至257、285至290、308至314、385至389和428至436位处的氨基酸残基的一个、两个、三个或更多个氨基酸替换，所述位置根据Kabat中的EU索引编号。

在一些实施方案中，将一个、两个或更多个氨基酸替换引入IgG恒定结构域Fc区中，以改变抗TfR1抗体的效应子功能。对其的亲和力被改变的效应配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。该方法在美国专利No.5,624,821和5,648,260中有更详细的描述。在一些实施方案中，恒定区结构域的缺失或失活(通过点突变或其他方式)可降低循环抗体的Fc受体结合，从而提高肿瘤定位。对于使恒定结构域缺失或失活从而提高肿瘤定位的突变的描述，参见例如美国专利No.5,585,097和8,591,886。在一些实施方案中，可将一个或更多个氨基酸替换引入本文中所述的抗体的Fc区中，以去除Fc区上潜在的糖基化位点，这可降低Fc受体结合(参见，例如Shields R L et al.，(2001)J Biol Chem 276：6591-604)。

在一些实施方案中，可将本文中所述的抗TfR1抗体的恒定区中的一个或更多个氨基替换为不同的氨基酸残基，使得抗体具有改变的C1q结合和/或(例如，和)降低或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。这种方法在美国专利No.6,194,551(Idusogie et al)中有更详细的描述。在一些实施方案中，改变本文中所述的抗体的CH2结构域的N端区域中的一个或更多个氨基酸残基，从而改变抗体的固定补体的能力。这种方法在国际公开No.WO 94/29351中有进一步描述。在一些实施方案中，对本文中所述的抗体的Fc区进行修饰以提高抗体的介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或(例如，和)提高抗体对Fcγ受体的亲和力。这种方法在国际公开No.WO 00/42072中有进一步描述。

在一些实施方案中，本文中提供的抗体的重链和/或(例如，和)轻链可变结构域序列可用于产生例如CDR接枝、嵌合、人源化或复合的人抗体或抗原结合片段，如本文中其他地方所述。如本领域普通技术人员所理解的，来源于本文中提供的任何抗体的任何变体(CDR接枝、嵌合、人源化或复合的抗体)可用于本文中所述的组合物和方法中，并将保持特异性结合转铁蛋白受体的能力，从而使得相对于其所来源原始抗体，变体(CDR接枝、嵌合、人源化或复合的抗体)具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或更多的与转铁蛋白受体的结合。

在一些实施方案中，本文中提供的抗体包含赋予抗体以期望性质的突变。例如，为了避免归因于已知与天然IgG4 mAb发生的Fab臂交换而引起的潜在并发症，本文中提供的抗体可包含稳定性‘Adair’突变(Angal S.，et al.，“A single amino acid substitutionabolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human(IgG4)antibody，”MolImmunol 30，105-108；1993)，其中第228位(EU编号，根据Kabat编号为第241位残基)丝氨酸转化为脯氨酸，从而产生了IgG1样铰链序列。因此，任何抗体都可包含稳定性‘Adair’突变。

在一些实施方案中，对抗体进行修饰，例如，通过糖基化、磷酸化、SUMO化和/或(例如，和)甲基化进行修饰。在一些实施方案中，抗体是与一个或更多个糖或碳水化合物分子缀合的糖基化抗体。在一些实施方案中，一个或更多个糖或碳水化合物分子通过N-糖基化、O-糖基化、C-糖基化、糖基磷脂酰肌醇化(GPI锚定附着)和/或(例如，和)磷酸糖基化与抗体缀合。在一些实施方案中，一个或更多个糖或碳水化合物分子是单糖、二糖、寡糖或聚糖。在一些实施方案中，一个或更多个糖或碳水化合物分子是支化的寡糖或支化的聚糖。在一些实施方案中，一个或更多个糖或碳水化合物分子包含甘露糖单元、葡萄糖单元、N-乙酰葡糖胺单元、N-乙酰半乳糖胺单元、半乳糖单元、岩藻糖单元或磷脂单元。在一些实施方案中，存在约1至10、约1至5、约5至10、约1至4、约1至3或约2个糖分子。在一些实施方案中，糖基化抗体是完全或部分糖基化的。在一些实施方案中，通过化学反应或通过酶促手段使抗体糖基化。在一些实施方案中，抗体在体外或细胞内被糖基化，其可任选地缺少N-或O-糖基化途径中的酶，例如糖基转移酶。在一些实施方案中，用糖或碳水化合物分子对抗体进行官能化，如2014年5月1日公开的标题为“Modified antibodyantibody-conjugate and processfor the preparation thereof”的国际专利申请公开WO2014065661中所述。

在一些实施方案中，本文中所述的任一种抗TfR1抗体可在重链序列和/或(例如，和)轻链序列中包含信号肽(例如，N端信号肽)。在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1抗体包含VH和VL序列中的任一种、IgG重链序列和轻链序列中的任一种、或者本文中所述的F(ab’)重链序列和轻链序列中的任一种，并且还包含信号肽(例如，N端信号肽)。在一些实施方案中，信号肽包含氨基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ ID NO：104)。

在一些实施方案中，本文中提供的抗体可具有一种或更多种翻译后修饰。在一些实施方案中，也称为焦谷氨酸形成(pyro-Glu)的N端环化可在产生期间在抗体的N端谷氨酸(Glu)和/或谷氨酰胺(Gln)残基处发生。因此，应理解指定为具有包含N端谷氨酸或谷氨酰胺残基的序列的抗体涵盖已经历由翻译后修饰引起的焦谷氨酸形成的抗体。在一些实施方案中，焦谷氨酸形成发生在重链序列中。在一些实施方案中，焦谷氨酸形成发生在轻链序列中。

b.其他肌肉靶向抗体

在一些实施方案中，肌肉靶向抗体是特异性结合血幼素(hemojuvelin)、小窝蛋白-3、迪谢内肌营养不良肽(Duchenne muscular dystrophy peptide)、肌球蛋白IIb或CD63的抗体。在一些实施方案中，肌肉靶向抗体是特异性结合肌原性前体蛋白的抗体。一些示例性的肌原性前体蛋白包括但不限于ABCG2、M-钙黏着蛋白/钙黏着蛋白-15、小窝蛋白-1、CD34、FoxK1、整联蛋白α7、整联蛋白α7β1、MYF-5、MyoD、肌细胞生成蛋白、NCAM-1/CD56、Pax3、Pax7和Pax9。在一些实施方案中，肌肉靶向抗体是特异性结合骨骼肌蛋白的抗体。一些示例性的骨骼肌蛋白包括但不限于α-肌聚糖蛋白(alpha-Sarcoglycan)、β-肌聚糖蛋白、钙蛋白酶抑制剂、肌酸激酶MM/CKMM、eIF5A、烯醇化酶2/神经元特异性烯醇化酶、ε-肌聚糖蛋白、FABP3/H-FABP、GDF-8/肌生成抑制蛋白、GDF-11/GDF-8、整联蛋白α7、整联蛋白α7β1、整联蛋白β1/CD29、MCAM/CD146、MyoD、肌细胞生成蛋白、肌球蛋白轻链激酶抑制剂、NCAM-1/CD56和肌钙蛋白I。在一些实施方案中，肌肉靶向抗体是特异性结合平滑肌蛋白的抗体。一些示例性的平滑肌蛋白包括但不限于α-平滑肌肌动蛋白、VE-钙黏着蛋白、钙调蛋白结合蛋白/CALD1、钙调理蛋白1、结蛋白(Desmin)、组胺H2R、胃动素R/GPR38、转凝蛋白/TAGLN、和波形蛋白。然而，应当理解，针对其他靶标的抗体在本公开内容的范围内，并且本文中提供的靶标的示例性列表并不意味着是限制性的。

c.抗体特征/改变

在一些实施方案中，可在残基不太可能参与与靶抗原(例如，转铁蛋白受体)相互作用的位置(例如，如基于晶体结构确定的)处将保守突变引入抗体序列(例如，CDR或框架序列)中。在一些实施方案中，将一个、两个或更多个突变(例如，氨基酸替换)引入本文中所述的肌肉靶向抗体的Fc区(例如，在CH2结构域(人IgG1的第231至340位残基)和/或(例如，和)CH3结构域(人IgG1的第341至447位残基)和/或(例如，和)铰链区中，根据Kabat编号系统(例如，Kabat中的EU索引)编号)，以改变抗体的一种或更多种功能特性，例如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或(例如，和)抗原依赖性细胞毒性。

在一些实施方案中，将一个、两个或更多个氨基酸突变(即，替换、插入或缺失)引入IgG恒定结构域或其FcRn结合片段(优选地，Fc或铰链-Fc结构域片段)中以改变(例如，降低或提高)抗体在体内的半衰期。参见例如国际公开No.WO 02/060919、WO 98/23289和WO97/34631，以及美国专利No.5,869,046、6，121,022、6,277,375；和6，165,745，例如将改变(例如，降低或提高)抗体在体内的半衰期的突变。

在一些实施方案中，将一个、两个或更多个氨基酸突变(即，替换、插入或缺失)引入IgG恒定结构域或其FcRn结合片段(优选地，Fc或铰链-Fc结构域片段)中以降低体内抗转铁蛋白受体抗体的半衰期。在一些实施方案中，将一个、两个或更多个氨基酸突变(即，替换、插入或缺失)引入IgG恒定结构域或其FcRn结合片段(优选地，Fc或铰链-Fc结构域片段)中以提高抗体在体内的半衰期。在一些实施方案中，抗体可在第二恒定(CH2)结构域(人IgG1的第231至340位残基)和/或(例如，和)第三恒定(CH3)结构域(人IgG1的第341至447位残基)(根据Kabat中的EU索引(Kabat E A et al.，(1991)同上)编号)中具有一个或更多个氨基酸突变(例如，替换)。在一些实施方案中，本文中所述的抗体的IgG1的恒定区包含在第252位处的甲硫氨酸(M)至酪氨酸(Y)替换，在第254位处的丝氨酸(S)至苏氨酸(T)替换，以及在第256位处的苏氨酸(T)至谷氨酸(E)替换，所述位置根据Kabat中的EU索引编号。参见美国专利No.7,658,921，其通过引用并入本文。这种类型的突变体IgG(称为“YTE突变体”)已显示出与同一抗体的野生型形式相比半衰期提高4倍(参见Dall’Acqua W F et al.，(2006)J Biol Chem 281：23514-24)。在一些实施方案中，抗体包含IgG恒定结构域，该结构域包含在第251至257、285至290、308至314、385至389和428至436位处的氨基酸残基的一个、两个、三个或更多个氨基酸替换，所述位置根据Kabat中的EU索引编号。

在一些实施方案中，将一个、两个或更多个氨基酸替换引入IgG恒定结构域Fc区中，以改变抗转铁蛋白受体抗体的效应子功能。对其的亲和力被改变的效应配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。该方法在美国专利No.5,624,821和5,648,260中有更详细的描述。在一些实施方案中，恒定区结构域的缺失或失活(通过点突变或其他方式)可降低循环抗体的Fc受体结合，从而提高肿瘤定位。对于使恒定结构域缺失或失活从而提高肿瘤定位的突变的描述，参见例如美国专利No.5,585,097和8,591,886。在一些实施方案中，可将一个或更多个氨基酸替换引入本文中所述的抗体的Fc区中，以去除Fc区上潜在的糖基化位点，这可降低Fc受体结合(参见，例如Shields R L et al.，(2001)J Biol Chem 276：6591-604)。

在一些实施方案中，可将本文中所述的肌肉靶向抗体的恒定区中的一个或更多个氨基替换为不同的氨基酸残基，使得抗体具有改变的C1q结合和/或者(例如，和)降低或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。这种方法在美国专利No.6,194,551(Idusogie et al)中有更详细的描述。在一些实施方案中，改变本文中所述的抗体的CH2结构域的N端区域中的一个或更多个氨基酸残基，从而改变抗体的固定补体的能力。这种方法在国际公开No.WO94/29351中有进一步描述。在一些实施方案中，对本文中所述的抗体的Fc区进行修饰以提高抗体的介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或(例如，和)提高抗体对Fcγ受体的亲和力。这种方法在国际公开No.WO 00/42072中有进一步描述。

如本文中所提供，本公开内容的抗体可任选地包含恒定区或其一部分。例如，VL结构域可在其C端连接至轻链恒定结构域，如Cκ或Cλ。类似地，VH结构域或其一部分可连接至如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM(以及任何同种型亚类)的重链的全部或一部分。抗体可包括合适的恒定区(参见，例如，Kabat et al.，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，No.91-3242，National Institutes of Health Publications，Bethesda，Md.(1991))。因此，在本公开内容范围内的抗体可包含与任何合适的恒定区组合的VH和VL结构域或其抗原结合部分。

ii.肌肉靶向肽

本公开内容的一些方面提供了肌肉靶向肽作为肌肉靶向剂。已描述了与特定细胞类型结合的短肽序列(例如，长度为5至20个氨基酸的肽序列)。例如，细胞靶向肽已在以下中进行了描述：Vines e.，et al.，A.“Cell-penetrating and cell-targeting peptidesin drug delivery”Biochim Biophys Acta 2008，1786：126-38；Jarver P.，et al.，“Invivo biodistribution and efficacy of peptide mediated delivery”TrendsPharmacol Sci 2010；31：528-35；Samoylova T.I.，et al.，“Elucidation of muscle-binding peptides by phage display screening”Muscle Nerve 1999；22：460-6；美国专利No.6,329,501，其于2001年12月11日授权，标题为“METHODS AND COMPOSITIONS FORTARGETING COMPOUNDS TO MUSCLE”；以及Samoylov A.M.，et al.，“Recognition of cell-specific binding of phage display derived peptides using an acoustic wavesensor.”Biomol Eng 2002；18：269-72；其各自的全部内容均通过引用并入本文。通过设计肽与特定的细胞表面抗原(例如，受体)相互作用，可实现对所期望组织例如肌肉的选择性。已研究了骨骼肌靶向并且能够递送一系列分子载荷。这些方法可对肌肉组织具有高度选择性，而没有大的抗体或病毒颗粒的许多实际缺点。因此，在一些实施方案中，肌肉靶向剂是长度为4至50个氨基酸的肌肉靶向肽。在一些实施方案中，肌肉靶向肽的长度为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。可使用数种方法中的任一种(例如噬菌体展示)来产生肌肉靶向肽。

在一些实施方案中，肌肉靶向肽可与和某些其他细胞相比在肌细胞中过表达或相对高地表达的内化细胞表面受体，例如转铁蛋白受体结合。在一些实施方案中，肌肉靶向肽可靶向转铁蛋白受体(例如，与之结合)。在一些实施方案中，靶向转铁蛋白受体的肽可包含天然存在配体(例如转铁蛋白)的区段。在一些实施方案中，靶向转铁蛋白受体的肽如2000年11月30日提交的美国专利No.6,743,893，“RECEPTOR-MEDIATED UPTAKE OF PEPTIDESTHAT BIND THE HUMAN TRANSFERRIN RECEPTOR”中所述。在一些实施方案中，靶向转铁蛋白受体的肽如Kawamoto，M.et al，“A novel transferrin receptor-targeted hybridpeptide disintegrates cancer cell membrane to induce rapid killing of cancercells.”BMC Cancer.2011 Aug 18；11：359中所述。在一些实施方案中，靶向转铁蛋白受体的肽如2011年5月20日提交的美国专利No.8,399,653，“TRANSFERRIN/TRANSFERRINRECEPTOR-MEDIATED SIRNA DELIVERY”中所述。

如上所讨论，已报道了肌肉靶向肽的一些实例。例如，使用呈递表面七肽的噬菌体展示文库鉴定了肌肉特异性肽。作为一个实例，具有氨基酸序列ASSLNIA(SEQ ID NO：205)的肽在体外与C2C12鼠肌管结合，并且在体内与小鼠肌肉组织结合。因此，在一些实施方案中，肌肉靶向剂包含氨基酸序列ASSLNIA(SEQ ID NO：205)。该肽在小鼠中进行静脉内注射之后展示出提高的与心脏和骨骼肌组织结合的特异性，以及降低的与肝、肾和脑的结合。使用噬菌体展示已鉴定了另外的肌肉特异性肽。例如，通过噬菌体展示文库鉴定了12个氨基酸的肽用于在DMD治疗的情况下进行肌肉靶向。参见Yoshida D.，et al.，“Targeting ofsalicylate to skin and muscle following topical injections in rats.”Int JPharm 2002；231：177-84；其全部内容在此通过引用并入。在此，鉴定了具有序列SKTFNTHPQSTP(SEQ ID NO：206)的12个氨基酸的肽，并且该肌肉靶向肽相对于ASSLNIA(SEQID NO：205)肽显示出提高的与C2C12细胞的结合。

用于鉴定相对于其他细胞类型而对肌肉(例如，骨骼肌)具有选择性的肽的另一方法包括体外选择，这已在Ghosh D.，et al.，“Selection of muscle-binding peptidesfrom context-specific peptide-presenting phage libraries for adenoviralvector targeting”J Virol 2005；79：13667-72中进行了描述；其全部内容通过引用并入本文。通过将随机的12聚体(12-mer)肽噬菌体展示文库与非肌细胞类型的混合物预孵育选择出了非特异性细胞结合物。在数轮选择之后，12个氨基酸的肽TARGEHKEEELI(SEQ ID NO：207)最频繁地出现。因此，在一些实施方案中，肌肉靶向剂包含氨基酸序列TARGEHKEEELI(SEQ ID NO：207)。

肌肉靶向剂可以是含氨基酸的分子或肽。肌肉靶向肽可对应于优先与肌细胞中发现的蛋白质受体结合的蛋白质序列。在一些实施方案中，肌肉靶向肽包含高倾向性的疏水性氨基酸，例如缬氨酸，使得该肽优先靶向肌细胞。在一些实施方案中，肌肉靶向肽是先前未表征或公开过的。可使用数种方法中的任一种(例如噬菌体展示肽文库、单珠单化合物肽文库或位置扫描合成肽组合文库)来构思、产生、合成和/或(例如，和)衍生这些肽。示例性方法已在本领域中表征并通过引用并入(Gray，B.P.and Brown，K.C.“CombinatorialPeptide Libraries：Mining for Cell-Binding Peptides”Chem Rev.2014，114：2，1020-1081.；Samoylova，T.I.and Smith，B.F.“Elucidation of muscle-binding peptides byphage display screening.”Muscle Nerve，1999，22：4.460-6.)。在一些实施方案中，先前已公开了肌肉靶向肽(参见，例如Writer M.J.et al.“Targeted gene delivery to humanairway epithelial cells with synthetic vectors incorporating novel targetingpeptides selected by phage display.”J.Drug Targeting.2004；12：185；Cai，D.“BDNF-mediated enhancement of inflammation and injury in the aging heart.”PhysiolGenomics.2006，24：3，191-7.；Zhang，L.“Molecular profiling of heart endothelialcells.”Circulation，2005，112：11，1601-11.；McGuire，M.J.et al.“In vitro selectionof a peptide with high selectivity for cardiomyocytes in vivo.”J MolBiol.2004，342：1，171-82.)。示例性的肌肉靶向肽包含以下组的氨基酸序列：CQAQGQLVC(SEQ ID NO：208)，CSERSMNFC(SEQ ID NO：209)，CPKTRRVPC(SEQ ID NO：210)，WLSEAGPVVTVRALRGTGSW(SEQ ID NO：211)，ASSLNIA(SEQ ID NO：205)，CMQHSMRVC(SEQ IDNO：212)，和DDTRHWG(SEQ ID NO：213)。在一些实施方案中，肌肉靶向肽可包含约2至25个氨基酸、约2至20个氨基酸、约2至15个氨基酸、约2至10个氨基酸或约2至5个氨基酸。肌肉靶向肽可包含天然存在的氨基酸例如半胱氨酸、丙氨酸或者非天然存在或经修饰氨基酸。非天然存在的氨基酸包括β-氨基酸、高氨基酸(homo-amino acid)、脯氨酸衍生物、3-经取代的丙氨酸衍生物、线性核心氨基酸、N-甲基氨基酸和本领域中已知的其他氨基酸。在一些实施方案中，肌肉靶向肽可以是线性的；在另一些实施方案中，肌肉靶向肽可以是环状的，例如双环的(参见，例如Silvana，M.G.et al.Mol.Therapy，2018，26：1，132-147.)。

iii.肌肉靶向受体配体

肌肉靶向剂可以是配体，例如与受体蛋白结合的配体。肌肉靶向配体可以是蛋白质，例如与由肌细胞表达的内化细胞表面受体结合的转铁蛋白。因此，在一些实施方案中，肌肉靶向剂是转铁蛋白或与转铁蛋白受体结合的转铁蛋白衍生物。肌肉靶向配体可替代地是小分子，例如相对于其他细胞类型而优先靶向肌细胞的亲脂性小分子。可靶向肌细胞的一些示例性亲脂性小分子包括包含以下的化合物：胆固醇、胆固醇基、硬脂酸、棕榈酸、油酸、油烯基、亚麻烯(linolene)、亚油酸、肉豆蔻酸、甾醇类、二氢睾酮、睾酮衍生物、甘油、烷基链、三苯甲基类和烷氧基酸。

iv.肌肉靶向适配体

肌肉靶向剂可以是适配体，例如RNA适配体，其相对于其他细胞类型而优先靶向肌细胞。在一些实施方案中，肌肉靶向适配体是先前未表征或公开过的。可使用数种方法中的任一种(例如通过指数富集的配体的系统进化)来构思、产生、合成和/或(例如，和)衍生这些适配体。示例性方法已在本领域中表征并通过引用并入(Yan，A.C.and Levy，M.“Aptamers and aptamer targeted delivery”RNA biology，2009，6：3，316-20.；Germer，K.et al.“RNA aptamers and their therapeutic and diagnostic applications.”Int.J.Biochem.Mol.Biol.2013；4：27-40.)。在一些实施方案中，先前已公开了肌肉靶向适配体(参见，例如Phillippou，S.et al.“Selection and Identification of Skeletal-Muscle-Targeted RNA Aptamers.”Mol Ther Nucleic Acids.2018，10：199-214.；Thiel，W.H.et al.“Smooth Muscle Cell-targeted RNA Aptamer Inhibits NeointimalFormation.”Mol Ther.2016，24：4，779-87.)。示例性的肌肉靶向适配体包括A01B RNA适配体和RNA Apt 14。在一些实施方案中，适配体是基于核酸的适配体、寡核苷酸适配体或肽适配体。在一些实施方案中，适配体可以是约5kDa至15kDa、约5kDa至10kDa、约10kDa至15kDa、约1至5Da、约1至3kDa或更小。

v.其他肌肉靶向剂

用于靶向肌细胞(例如，骨骼肌细胞)的一种策略是使用肌转运体蛋白(例如在肌膜上表达的转运体蛋白)的底物。在一些实施方案中，肌肉靶向剂是对肌肉组织具有特异性的流入转运体的底物。在一些实施方案中，流入转运体对骨骼肌组织具有特异性。两类主要的转运体在骨骼肌肌膜上表达：(1)三磷酸腺苷(ATP)结合盒(ABC)超家族，其促进从骨骼肌组织流出和(2)溶质运载体(SLC)超家族，其可促进底物流入骨骼肌中。在一些实施方案中，肌肉靶向剂是与转运体的ABC超家族或SLC超家族结合的底物。在一些实施方案中，与转运体的ABC或SLC超家族结合的底物是天然存在的底物。在一些实施方案中，与转运体的ABC或SLC超家族结合的底物是非天然存在的底物，例如，与转运体的ABC或SLC超家族结合的其合成衍生物。

在一些实施方案中，肌肉靶向剂是本文中所述的靶向转运体的SLC超家族的任何肌肉靶向剂(例如，抗体、核酸、小分子、肽、适配体、脂质、糖部分)。在一些实施方案中，肌肉靶向剂是转运体的SLC超家族的底物。SLC转运体是平衡型的，或者使用跨膜而产生的质子或钠离子梯度来驱动底物的转运。具有高骨骼肌表达的示例性SLC转运体包括但不限于SATT转运体(ASCT1；SLC1A4)、GLUT4转运体(SLC2A4)、GLUT7转运体(GLUT7；SLC2A7)、ATRC2转运体(CAT-2；SLC7A2)、LAT3转运体(KIAA0245；SLC7A6)、PHT1转运体(PTR4；SLC15A4)、OATP-J转运体(OATP5A1；SLC21A15)、OCT3转运体(EMT；SLC22A3)、OCTN2转运体(FLJ46769；SLC22A5)、ENT转运体(ENT1；SLC29A1和ENT2；SLC29A2)、PAT2转运体(SLC36A2)和SAT2转运体(KIAA1382；SLC38A2)。这些转运体可促进底物流入骨骼肌中，为肌肉靶向提供机会。

在一些实施方案中，肌肉靶向剂是平衡型核苷转运体2(equilibrativenucleoside transporter 2，ENT2)转运体的底物。相对于其他转运体，ENT2在骨骼肌中具有最高的mRNA表达之一。虽然人ENT2(hENT2)在大多数身体器官例如脑、心脏、胎盘、胸腺、胰腺、前列腺和肾中表达，但其在骨骼肌中特别丰富。人ENT2根据其浓度梯度促进其底物的吸收。ENT2通过转运广泛范围的嘌呤和嘧啶核苷碱基在维持核苷稳态中发挥作用。hENT2转运体对除肌苷之外的所有核苷(腺苷、鸟苷、尿苷、胸苷和胞苷)均具有低的亲和力。因此，在一些实施方案中，肌肉靶向剂是ENT2底物。示例性的ENT2底物包括但不限于肌苷、2’，3’-二脱氧肌苷和氯法拉滨(calofarabine)。在一些实施方案中，本文中提供的任何肌肉靶向剂均与分子载荷(例如，寡核苷酸载荷)缔合。在一些实施方案中，肌肉靶向剂与分子载荷共价连接。在一些实施方案中，肌肉靶向剂与分子载荷非共价连接。

在一些实施方案中，肌肉靶向剂是有机阳离子/肉碱转运体(OCTN2)的底物，所述有机阳离子/肉碱转运体是钠离子依赖性的高亲和力肉碱转运体。在一些实施方案中，肌肉靶向剂是肉碱、米屈肼(mildronate)、乙酰肉碱或与OCTN2结合的其任意衍生物。在一些实施方案中，肉碱、米屈肼、乙酰肉碱或其衍生物与分子载荷(例如，寡核苷酸载荷)共价连接。

肌肉靶向剂可以是蛋白质，该蛋白质是以靶向肌细胞的至少一种可溶性形式存在的蛋白质。在一些实施方案中，肌肉靶向蛋白可以是血幼素(也称为排斥性导向分子C或血色素沉着症2型蛋白)，所述血幼素是参与铁超负荷和稳态的蛋白。在一些实施方案中，血幼素可以是全长或片段，或者与功能性血幼素蛋白具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的突变体。在一些实施方案中，血幼素突变体可以是可溶性片段，可缺乏N端信号传导，和/或(例如，和)缺乏C端锚定结构域。在一些实施方案中，血幼素可以以GenBank RefSeq登录号NM_001316767.1、NM_145277.4、NM_202004.3、NM_213652.3或NM_213653.3进行注释。应当理解，血幼素可以是人、非人灵长类或啮齿动物来源的。

B.分子载荷

本公开内容的一些方面提供了分子载荷，例如，被设计为靶向DMPK RNA以调节DMPK的表达或活性的寡核苷酸。在一些实施方案中，调节DMPK的表达或活性包括降低DMPKRNA和/或(例如，和)蛋白质的水平。在一些实施方案中，DMPK RNA是疾病相关的，例如，具有疾病相关重复扩增，或者是由具有疾病相关重复扩增的等位基因编码。在一些实施方案中，DMPK RNA包含CUG重复扩增，或者编码它的等位基因包含CTG重复扩增。在一些实施方案中，本公开内容提供了与DMPK RNA互补的寡核苷酸，其可用于降低具有疾病相关重复扩增的毒性DMPK的水平，例如在患有或怀疑患有强直性肌营养不良的对象中。在一些实施方案中，寡核苷酸被设计为指导RNA酶H介导靶DMPK RNA的降解。在一些实施方案中，寡核苷酸被设计为指导RNA酶H介导位于细胞(例如，肌细胞(例如肌管))的核中的靶DMPK RNA的降解。在一些实施方案中，寡核苷酸被设计为指导RNA酶H介导位于细胞(例如，CNS细胞(例如神经元))的核中的靶DMPK RNA的降解。在一些实施方案中，寡核苷酸被设计为具有期望的生物利用度和/或血清稳定性特性。在一些实施方案中，寡核苷酸被设计为具有期望的结合亲和力特性。在一些实施方案中，寡核苷酸被设计为具有期望的毒性特征。在一些实施方案中，寡核苷酸被设计为具有低补体激活和/或细胞因子诱导特性。

在一些实施方案中，寡核苷酸与本文中所述的肌肉靶向剂连接或以其他方式缔合。在一些实施方案中，这样的寡核苷酸能够靶向肌细胞中的DMPK，例如在通过缔合的肌肉靶向剂递送至肌细胞之后通过与肌细胞中的DMPK序列特异性结合。应理解，根据本公开内容可使用多种类型的肌肉靶向剂。在一些实施方案中，寡核苷酸包含含有疾病相关重复扩增的DMPK等位基因的互补区。示例性的靶向DMPK RNA的寡核苷酸在本文中进一步详细描述，然而，应理解，本文中提供的示例性分子载荷并不意味着是限制性的。

i.寡核苷酸

在一些实施方案中，本文中所述的DMPK靶向寡核苷酸被设计为引起RNA酶H介导的DMPK mRNA的降解。应理解，在一些实施方案中，可以通过将功能序列(例如，反义链序列)从一种格式并入另一种格式来使一种格式的寡核苷酸(例如，反义寡核苷酸)适当地适应于另一种格式(例如，siRNA寡核苷酸)。

可用于DMPK靶向的寡核苷酸的一些实例在以下中提供：美国专利申请公开20100016215A1，其于2010年1月1日公开，标题为Compound And Method For TreatingMyotonic Dystrophy；美国专利申请公开20130237585A1，其于2010年7月19日公开，Modulation Of Dystrophia Myotonica-Protein Kinase(DMPK)Expression；美国专利申请公开20150064181A1，其于2015年3月5日公开，标题为“Antisense Conjugates ForDecreasing Expression Of Dmpk”；美国专利申请公开20150238627A1，其于2015年8月27日公开，标题为“Peptide-Linked Morpholino Antisense Oligonucleotides ForTreatment Of Myotonic Dystrophy”；和美国专利申请公开20160304877A1，其于2016年10月20日公开，标题为“Compounds And Methods For Modulation Of DystrophiaMyotonica-Protein Kinase(Dmpk)Expression”，其各自的内容整体并入本文。

在一些实施方案中，寡核苷酸可具有针对如下所示序列的互补区，所述序列是示例人DMPK基因序列(基因ID 1760；NM_001081560.2)：

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在一些实施方案中，寡核苷酸可具有针对如下所示序列的互补区，所述序列是示例小鼠DMPK基因序列(基因ID 13400；NM_001190490.1)。

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在一些实施方案中，寡核苷酸可具有针对多种物种(例如，选自人、小鼠和非人物种)的DMPK基因序列的互补区。

在一些实施方案中，寡核苷酸可具有DMPK的突变体形式(例如，如在以下中报道的突变体形式)之互补区：Botta A.et al.“The CTG repeat expansion size correlateswith the splicing defects observed in muscles from myotonic dystrophy type 1patients.”J Med Genet.2008 Oct；45(10)：639-46.；和Machuca-Tzili L.et al.“Clinical and molecular aspects of the myotonic dystrophies：a review.”MuscleNerve.2005 Jul；32(1)：1-18.；其各自的内容通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，本文中提供的寡核苷酸是靶向DMPK的反义寡核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸靶向是靶向DMPK的任一种反义寡核苷酸(例如，间隔聚体)，如美国专利申请公开US20160304877A1中所述，其于2016年10月20日公开，标题为“Compounds AndMethods For Modulation Of Dystrophia Myotonica-Protein Kinase(DMPK)Expression，”其通过引用并入本文)。在一些实施方案中，DMPK靶向寡核苷酸靶向如Genbank登录No.NM_001081560.2中所示的DMPK基因序列(SEQ ID NO：130)或如Genbank登录No.NG_009784.1中所示的DMPK基因序列的区域。

在一些实施方案中，DMPK靶向寡核苷酸包含含有靶区域之互补区的核苷酸序列，所述靶区域是SEQ ID NO：130中的至少10个连续核苷酸(例如，至少10个、至少12个、至少14个、至少16个、至少18个、至少20个或更多个连续核苷酸)。

在一些实施方案中，DMPK靶向寡核苷酸包含间隔聚体基序。“间隔聚体”意指这样的嵌合反义化合物：其中具有多个支持RNA酶H切割的核苷酸的内部区域位于具有一个或更多个核苷酸的外部区域之间，其中包含内部区域的核苷酸在化学上不同于包含外部区域的一个或更多个核苷酸。内部区域可被称为“间隔区段”并且外部区域可被称为“翼区段”。在一些实施方案中，DMPK靶向寡核苷酸包含一个或更多个经修饰核苷酸，和/或者(例如，和)一个或更多个经修饰核苷间键联。在一些实施方案中，核苷间键联是硫代磷酸酯键联。在一些实施方案中，寡核苷酸包含完整的硫代磷酸酯主链。在一些实施方案中，寡核苷酸是具有cET末端的DNA间隔聚体(例如，3-10-3；cET-DNA-cET)。在一些实施方案中，DMPK靶向寡核苷酸包含一个或更多个6’-(S)-CH₃生物环核苷酸、一个或更多个β-D-2’-脱氧核糖核苷酸和/或者(例如，和)一个或更多个5-甲基-胞嘧啶核苷酸

a.寡核苷酸大小/序列

寡核苷酸可具有多种不同的长度，例如，取决于格式。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度为7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75或更多个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度为8至50个核苷酸、长度为8至40个核苷酸、长度为8至30个核苷酸、长度为10至15个核苷酸、长度为10至20个核苷酸、长度为15至25个核苷酸、长度为21至23个核苷酸，等。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度为15至20个核苷酸或长度为20至25个核苷酸。

在一些实施方案中，当寡核苷酸的互补核酸序列与靶分子(例如，mRNA)的结合干扰靶标(例如，mRNA)的正常功能导致丧失活性(例如，抑制翻译)或表达(例如，降解靶mRNA)，并且具有足够程度的互补性以避免在以下情况下的该序列与非靶标序列的非特异性结合时，出于本公开内容的目的，寡核苷酸的互补核酸序列与靶核酸可特异性地杂交或对靶核酸具有特异性：在其中期望避免非特异性结合的条件下，例如在生理条件下在体内测定或治疗性处理的情况下，以及在体外测定的情况下，在其中在合适的严格条件下进行测定的条件下。因此，在一些实施方案中，寡核苷酸可与靶核酸的连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补。在一些实施方案中，互补核苷酸序列不需要与其所靶向的100％互补来与靶核酸可特异性地杂交或对靶核酸具有特异性。在某些实施方案中，寡核苷酸包含一个或更多个相对于靶核酸错配的核碱基。在某些实施方案中，与靶标相关的活性因这样的错配而降低，但与非靶标相关的活性降低的量更大(即，对靶核酸的选择性提高并且脱靶效应降低)。在一些实施方案中，靶核酸是前mRNA分子或mRNA分子。

在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶核酸之互补区，所述互补区的长度为8至15、8至30、8至40或10至50、或5至50或5至40个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶核酸之互补区，所述互补区的长度为15至20或20至25个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸与靶核酸的互补区的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。在一些实施方案中，互补区与靶核酸的至少8个连续核苷酸互补。在一些实施方案中，与靶核酸的连续核苷酸部分相比，寡核苷酸可包含1、2或3个碱基错配。在一些实施方案中，寡核苷酸在15个碱基上可具有至多3个错配，或在10个碱基上具有至多2个错配。

在一些实施方案中，寡核苷酸包含含有SEQ ID NO：173至192和196至201中任一个的序列的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含含有SEQ ID NO：173至192和196至201中任一个的序列。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO：173至192和196至201中任一个的至少12个或至少15个连续核苷酸共享至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％序列同一性的序列。

在一些实施方案中，寡核苷酸包含SEQ ID NO：160至172和193至195中任一个所示的核苷酸序列的互补区。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO：160至172和193至195中任一个所示的核苷酸序列互补的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸(例如，连续核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO：160至172和193至195中任一个的至少12个或至少15个连续核苷酸具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％互补性的序列。

在一些实施方案中，寡核苷酸与本文中提供的任一种寡核苷酸(例如，表8中列出的寡核苷酸)的靶序列互补(例如，至少85％、至少90％、至少95％或100％互补)。在一些实施方案中，这样的靶序列与表8中列出的寡核苷酸100％互补。

在一些实施方案中，应理解在C5位处核碱基尿嘧啶的甲基化形成胸腺嘧啶。因此，在一些实施方案中，具有C5甲基化尿嘧啶(或5-甲基-尿嘧啶)的核苷酸或核苷可以等同地鉴定为胸腺嘧啶核苷酸或核苷。

在一些实施方案中，本文中提供的任一种寡核苷酸(例如，表8列出的寡核苷酸)中的任意一个或更多个胸腺嘧啶碱基(T)可独立地且任选地是尿嘧啶碱基(U)，和/或者任意一个或更多个U可独立地且任选地是T。

b.寡核苷酸修饰：

本文中所述的寡核苷酸可被修饰，例如，包含经修饰糖部分、经修饰核苷间键联、经修饰核苷酸和/或(例如，和)其组合。另外，在一些实施方案中，寡核苷酸可表现出以下特性中的一种或更多种：不介导选择性剪接；不是免疫刺激性的；具有核酸酶抗性；与未经修饰寡核苷酸相比具有提高的细胞摄取；对细胞或哺乳动物无毒；提高了在细胞中内部排出内体；使TLR刺激最小化；或避免模式识别受体。本文中所述的寡核苷酸的任何经修饰的化学组成(chemistry)或形式可彼此组合。例如，同一寡核苷酸内可包含一种、两种、三种、四种、五种或更多种不同类型的修饰。

在一些实施方案中，可使用某些核苷酸修饰，所述核苷酸修饰使并入它们的寡核苷酸比天然寡脱氧核苷酸或寡核糖核苷酸分子对核酸酶消化更具抗性；这些经修饰寡核苷酸比未经修饰寡核苷酸完整存活更长的时间。经修饰寡核苷酸的一些具体实例包括含有经修饰的主链(backbone)的那些，例如经修饰核苷间键联，例如硫代磷酸酯键联、磷酸三酯键联、甲基膦酸酯键联、短链烷基键联或环烷基糖间键联或短链杂原子键联或杂环糖间键联。因此，本公开内容的寡核苷酸可例如通过并入修饰例如核苷酸修饰而稳定化以抵抗溶核降解。

在一些实施方案中，寡核苷酸的长度可以是多至50个或多至100个核苷酸，其中寡核苷酸的2至10、2至15、2至16、2至17、2至18、2至19、2至20、2至25、2至30、2至40、2至45或更多个核苷酸是经修饰核苷酸。寡核苷酸的长度可以是8至30个核苷酸，其中寡核苷酸的2至10、2至15、2至16、2至17、2至18、2至19、2至20、2至25、2至30个核苷酸是经修饰核苷酸。寡核苷酸的长度可以是8至15个核苷酸，其中寡核苷酸的2至4、2至5、2至6、2至7、2至8、2至9、2至10、2至11、2至12、2至13、2至14个核苷酸是经修饰核苷酸。任选地，寡核苷酸可具有除1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个经修饰核苷酸之外的每个核苷酸。寡核苷酸修饰在本文中进一步描述。

c.经修饰核苷

在一些实施方案中，本文中所述的寡核苷酸包含在糖的2’位置处经修饰的至少一个核苷。在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个2’-经修饰核苷。在一些实施方案中，寡核苷酸中的所有核苷均是2’-经修饰核苷。

在一些实施方案中，本文中所述的寡核苷酸包含一个或更多个非双环2’-经修饰核苷，例如2’-脱氧、2’-氟(2’-F)、2’-O-甲基(2’-O-Me)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、2’-O-二甲基氨基乙基氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)修饰的核苷。

在一些实施方案中，本文中所述的寡核苷酸包含一个或更多个2’-4’双环核苷，其中核糖环包含连接环中的两个原子的桥联部分，例如，通过亚甲基(LNA)桥联、亚乙基(ENA)桥联或(S)-约束性乙基(cEt)桥联将2’-O原子与4’-C原子连接。LNA的一些实例描述于国际专利申请公开WO/2008/043753中，其于2008年4月17日公开，并且标题为“RNA AntagonistCompounds For The Modulation Of PCSK9”，其内容通过引用整体并入本文。ENA的一些实例在以下中提供：国际专利公开No.WO 2005/042777，其于2005年5月12日公开，并且标题为“APP/ENA Antisense”；Morita et al.，Nucleic Acid Res.，增刊1：241-242，2001；Suronoet al.，Hum.Gene Ther.，15：749-757，2004；Koizumi，Curr.Opin.Mol.Ther.，8：144-149，2006以及Horie et al.，Nucleic Acids Symp.Ser(Oxf)，49：171-172，2005；其公开内容通过引用整体并入本文。cEt的一些实例在以下中提供：美国专利7,101,993、7,399,845和7,569,686，其各自通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，寡核苷酸包含在以下美国专利或专利申请公开之一中公开的经修饰核苷：美国专利7,399,845，其于2008年7月15日授权，并且标题为“6-ModifiedBicyclic Nucleic Acid Analogs”；美国专利7,741,457，其于2010年6月22日授权，并且标题为“6-Modified Bicyclic Nucleic Acid Analogs”；美国专利8,022,193，其于2011年9月20日授权，并且标题为“6-Modified Bicyclic Nucleic Acid Analogs”；美国专利7,569,686，其于2009年8月4日授权，并且标题为“Compounds And Methods For SynthesisOf Bicyclic Nucleic Acid Analogs”；美国专利7,335,765，其于2008年2月26日授权，并且标题为“Novel Nucleoside And Oligonucleotide Analogues”；美国专利7,314,923，其于2008年1月1日授权，并且标题为“Novel Nucleoside And OligonucleotideAnalogues”；美国专利7,816,333，其于2010年10月19日授权，并且标题为“Oligonucleotide Analogues And Methods Utilizing The Same”和美国公开号2011/0009471，现在为美国专利8,957,201，其于2015年2月17日授权，并且标题为“Oligonucleotide Analogues And Methods Utilizing The Same”，其各自的全部内容出于所有目的通过引用并入本文。

在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个经修饰核苷，其导致所述寡核苷酸与不具有至少一个经修饰核苷的寡核苷酸相比，Tm提高1℃、2℃、3℃、4℃或5℃。寡核苷酸可具有多个经修饰核苷，其导致所述寡核苷酸与不具有经修饰核苷的寡核苷酸相比，Tm总体提高2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃或更高。

寡核苷酸可包含不同种类的核苷的混合物。例如，寡核苷酸可包含2’-脱氧核糖核苷或核糖核苷和2’-氟修饰核苷的混合物。寡核苷酸可包含脱氧核糖核苷或核糖核苷和2’-O-Me修饰核苷的混合物。寡核苷酸可包含2’-氟修饰核苷和2’-O-Me修饰核苷的混合物。寡核苷酸可包含桥接的核苷和2’-氟或2’-O-甲基修饰核苷的混合物。寡核苷酸可包含非双环2’-经修饰核苷(例如，2’-O-MOE)和2’-4’-双环核苷(例如，LNA、ENA、cEt)的混合物。寡核苷酸可包含2’-氟修饰核苷和2’-O-Me修饰核苷的混合物。寡核苷酸可包含2’-4’双环核苷和2’-MOE、2’-氟或2’-O-Me修饰核苷的混合物。寡核苷酸可包含非双环2’-经修饰核苷(例如，2’-MOE、2’-氟或2’-O-Me)和2’-4’双环核苷(例如，LNA、ENA、cEt)的混合物。

寡核苷酸可包含不同种类的替代核苷。例如，寡核苷酸可包含替代的2’-脱氧核糖核苷或核糖核苷和2’-氟修饰核苷。寡核苷酸可包含替代的脱氧核糖核苷或核糖核苷和2’-O-Me修饰核苷。寡核苷酸可包含替代的2’-氟修饰核苷和2’-O-Me修饰核苷。寡核苷酸可包含替代的桥联核苷和2’-氟或2’-O-甲基核苷。寡核苷酸可包含替代的非双环2’-经修饰核苷(例如，2’-O-MOE)和2’-4’-双环核苷(例如，LNA、ENA、cEt)。寡核苷酸可包含替代的2’-4’双环核苷和2’-MOE、2’-氟或2’-O-Me修饰核苷。寡核苷酸可包含替代的非双环2’-经修饰核苷(例如，2’-MOE、2’-氟或2’-O-Me)和2’-4’双环核苷(例如，LNA、ENA、cEt)。

在一些实施方案中，本文中所述的寡核苷酸包含5’-乙烯基膦酸酯修饰、一个或更多个无碱基残基和/或一个或更多个倒置无碱基残基。

d.核苷间键联/主链

在一些实施方案中，寡核苷酸可包含硫代磷酸酯键联或其他经修饰核苷间键联。在一些实施方案中，寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷间键联。在一些实施方案中，寡核苷酸在至少两个核苷之间包含硫代磷酸酯核苷间键联。在一些实施方案中，寡核苷酸在所有核苷之间均包含硫代磷酸酯核苷间键联。例如，在一些实施方案中，寡核苷酸在核苷酸序列的5’或3’末端的第一、第二和/或(例如，和)第三核苷间键联处包含经修饰核苷间键联。

可使用的含磷的键联包括但不限于：硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基膦酸酯和包含3’亚烷基膦酸酯的其他烷基膦酸酯、以及手性膦酸酯、次膦酸酯、包含3’-氨基磷酰胺酯和氨基烷基磷酰胺酯的磷酰胺酯、硫羰基磷酰胺酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯和具有正常3’-5’键联的硼烷磷酸酯、这些的2’-5’连接类似物、以及其中相邻的核苷单元对连接在3’-5’到5’-3’或2’-5’到5’-2’的具有相反极性的那些；参见美国专利no：3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；和5,625,050.

在一些实施方案中，寡核苷酸可具有杂原子主链，例如亚甲基(甲基亚氨基)或MMI主链；酰胺主链(参见De Mesmaeker et al.Ace.Chem.Res.1995，28：366-374)；吗啉代主链(参见Summerton and Weller，美国专利No.5,034,506)；或肽核酸(peptide nucleicacid，PNA)主链(其中寡核苷酸的磷酸二酯主链被聚酰胺主链替换，核苷酸与聚酰胺主链的氮杂氮原子直接或间接结合，参见Nielsen et al.，Science 1991，254，1497)。

e.立体特异性寡核苷酸

在一些实施方案中，寡核苷酸的核苷酸间磷原子是手性的，并且基于手性磷原子的构型调节寡核苷酸的特性。在一些实施方案中，可使用适当方法来以立体控制的方式合成P-手性寡核苷酸类似物(例如，如Oka N，Wada T，Stereocontrolled synthesis ofoligonucleotide analogs containing chiral internucleotidic phosphorusatoms.Chem Soc Rev.2011 Dec；40(12)：5829-43中所述)。在一些实施方案中，提供了含硫代磷酸酯的寡核苷酸，其包含通过基本上所有的Sp或基本上所有的Rp硫代磷酸酯糖间键联连接在一起的核苷单元。在一些实施方案中，具有基本上手性纯糖间键联的这样的硫代磷酸酯寡核苷酸通过酶或化学合成制备，如例如于1996年12月12日授权的美国专利5,587,261中所述，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸提供了靶核酸的选择性切割模式。例如，在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸在核酸的互补序列内提供了单个位点切割，如例如美国专利申请公开20170037399 A1中所述，其于2017年2月2日公开，标题为“CHIRAL DESIGN”，其内容通过引用整体并入本文。

h.间隔聚体

在一些实施方案中，本文中所述的寡核苷酸是间隔聚体。间隔聚体寡核苷酸通常具有式5’-X-Y-Z-3’，其中X和Z作为围绕间隔区Y的侧翼区。在一些实施方案中，式5’-X-Y-Z-3’的侧翼区X也称为X区、侧翼序列X、5’翼区X或5’翼区段。在一些实施方案中，式5’-X-Y-Z-3’的侧翼区Z也称为Z区、侧翼序列Z、3’翼区Z或3’翼区段。在一些实施方案中，式5’-X-Y-Z-3’的间隔区Y也称为Y区、Y区段或间隔区段Y。在一些实施方案中，间隔区Y中的每个核苷是2’-脱氧核糖核苷，并且5’翼区X或3’翼区Z均不包含任何2’-脱氧核糖核苷。在一些实施方案中，间隔聚体寡核苷酸包含表8中提供的靶序列(例如，SEQ ID NO：160至172中的任一个)的至少15个连续核苷(例如，至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个连续核苷)的互补区和/或者包含表8中提供的反义序列、间隔聚体序列或ASO结构的核苷酸序列(例如，SEQ ID NO：173至192中的任一个)的至少15个连续核苷(例如，至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个连续核苷)，其中每个胸腺嘧啶碱基(T)可独立地且任选地用尿嘧啶碱基(U)替换，并且每个U可以独立地且任选地用T替换。

在一些实施方案中，Y区是核苷酸的连续延伸，例如，6个或更多个DNA核苷酸的区域，其能够募集RNA酶(例如RNA酶H)。在一些实施方案中，间隔聚体与靶核酸结合，在该点处RNA酶被募集并随后可切割靶核酸。在一些实施方案中，Y区5’和3’二者的侧翼是包含高亲和力经修饰核苷，例如1至6个高亲和力经修饰核苷的X和Z区。高亲和力经修饰核苷的一些实例包括但不限于2’-经修饰核苷(例如，2’-MOE、2’O-Me、2’-F)或2’-4’双环核苷(例如，LNA、cEt、ENA)。在一些实施方案中，侧翼序列X和Z的长度可以是1至20个核苷酸、1至8个核苷酸或1至5个核苷酸。侧翼序列X和Z可具有相似长度或不同长度。在一些实施方案中，间隔区段Y可以是长度为5至20个核苷酸、5至15个核苷酸、5至12个核苷酸或6至10个核苷酸的核苷酸序列。

在一些实施方案中，除DNA核苷酸之外，间隔聚体寡核苷酸的间隔区可包含已知可被接受用于高效的RNA酶H作用的经修饰核苷酸，例如C4’-取代的核苷酸、无环核苷酸和阿拉伯糖(arabino)构型的核苷酸。在一些实施方案中，间隔区包含一个或更多个未经修饰的核苷间键联。在一些实施方案中，一个或两个侧翼区在至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或更多个核苷酸之间各自独立地包含一个或更多个硫代磷酸酯核苷间键联(例如，硫代磷酸酯核苷间键联或其他键联)。在一些实施方案中，间隔区和两个侧翼区在至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或更多个核苷酸之间各自独立地包含经修饰核苷间键联(例如，硫代磷酸酯核苷间键联或其他键联)。

可使用适当的方法产生间隔聚体。教导制备间隔聚体的代表性美国专利、美国专利出版物和PCT出版物包括但不限于：美国专利No.5,013,830；5,149,797；5,220,007；5,256,775；5,366,878；5,403,711；5,491,133；5,565,350；5,623,065；5,652,355；5,652,356；5,700,922；5,898,031；7,015,315；7,101,993；7,399,845；7,432,250；7,569,686；7,683,036；7,750,131；8,580,756；9,045,754；9,428,534；9,695,418；10,017,764；10,260,069；9,428,534；8,580,756；美国专利公开No.US20050074801，US20090221685；US20090286969，US20100197762，和US20110112170；PCT公开No.WO2004069991；WO2005023825；WO2008049085和WO2009090182；以及EP专利No.EP2,149,605，其各自通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，间隔聚体的长度为10至40个核苷。例如，间隔聚体的长度可以是10至40、10至35、10至30、10至25、10至20、10至15、15至40、15至35、15至30、15至25、15至20、20至40、20至35、20至30、20至25、25至40、25至35、25至30、30至40、30至35或35至40个核苷。在一些实施方案中，间隔聚体的长度是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷。

在一些实施方案中，间隔聚体中的间隔区Y的长度为5至20个核苷。例如，间隔区Y的长度可以是5至20、5至15、5至10、10至20、10至15或15至20个核苷。在一些实施方案中，间隔区Y的长度是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷。在一些实施方案中，间隔区Y中的每个核苷是2’-脱氧核糖核苷。在一些实施方案中，间隔区Y中的所有核苷均是2’-脱氧核糖核苷。在一些实施方案中，间隔区Y中的一个或更多个核苷是经修饰核苷(例如，2’经修饰核苷，例如本文中所述的那些)。在一些实施方案中，间隔区Y中的一个或更多个胞嘧啶任选地是5-甲基-胞嘧啶。在一些实施方案中，间隔区Y中的每个胞嘧啶是5-甲基-胞嘧啶。

在一些实施方案中，间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)和间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)独立地为1至20个核苷长。例如，间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)和间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)可独立地为1至20、1至15、1至10、1至7、1至5、1至3、1至2、2至5、2至7、3至5、3至7、5至20、5至15、5至10、10至20、10至15或15至20个核苷长。在一些实施方案中，间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)和间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷长。在一些实施方案中，间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)和间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)的长度相同。在一些实施方案中，间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)和间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)的长度不同。在一些实施方案中，间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)比间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)长。在一些实施方案中，间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)比间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)短。

在一些实施方案中，间隔聚体包含以下的5’-X-Y-Z-3’：5-10-5，4-12-4，3-14-3，2-16-2，1-18-1，3-10-3，2-10-2，1-10-1，2-8-2，4-6-4，3-6-3，2-6-2，4-7-4，3-7-3，2-7-2，4-8-4，3-8-3，2-8-2，1-8-1，2-9-2，1-9-1，2-10-2，1-10-1，1-12-1，1-16-1，2-15-1，1-15-2，1-14-3，3-14-1，2-14-2，1-13-4，4-13-1，2-13-3，3-13-2，1-12-5，5-12-1，2-12-4，4-12-2，3-12-3，1-11-6，6-11-1，2-11-5，5-11-2，3-11-4，4-11-3，1-17-1，2-16-1，1-16-2，1-15-3，3-15-1，2-15-2，1-14-4，4-14-1，2-14-3，3-14-2，1-13-5，5-13-1，2-13-4，4-13-2，3-13-3，1-12-6，6-12-1，2-12-5，5-12-2，3-12-4，4-12-3，1-11-7，7-11-1，2-11-6，6-11-2，3-11-5，5-11-3，4-11-4，1-18-1，1-17-2，2-17-1，1-16-3，1-16-3，2-16-2，1-15-4，4-15-1，2-15-3，3-15-2，1-14-5，5-14-1，2-14-4，4-14-2，3-14-3，1-13-6，6-13-1，2-13-5，5-13-2，3-13-4，4-13-3，1-12-7，7-12-1，2-12-6，6-12-2，3-12-5，5-12-3，1-11-8，8-11-1，2-11-7，7-11-2，3-11-6，6-11-3，4-11-5，5-11-4，1-18-1，1-17-2，2-17-1，1-16-3，3-16-1，2-16-2，1-15-4，4-15-1，2-15-3，3-15-2，1-14-5，2-14-4，4-14-2，3-14-3，1-13-6，6-13-1，2-13-5，5-13-2，3-13-4，4-13-3，1-12-7，7-12-1，2-12-6，6-12-2，3-12-5，5-12-3，1-11-8，8-11-1，2-11-7，7-11-2，3-11-6，6-11-3，4-11-5，5-11-4，1-19-1，1-18-2，2-18-1，1-17-3，3-17-1，2-17-2，1-16-4，4-16-1，2-16-3，3-16-2，1-15-5，2-15-4，4-15-2，3-15-3，1-14-6，6-14-1，2-14-5，5-14-2，3-14-4，4-14-3，1-13-7，7-13-1，2-13-6，6-13-2，3-13-5，5-13-3，4-13-4，1-12-8，8-12-1，2-12-7，7-12-2，3-12-6，6-12-3，4-12-5，5-12-4，2-11-8，8-11-2，3-11-7，7-11-3，4-11-6，6-11-4，5-11-5，1-20-1，1-19-2，2-19-1，1-18-3，3-18-1，2-18-2，1-17-4，4-17-1，2-17-3，3-17-2，1-16-5，2-16-4，4-16-2，3-16-3，1-15-6，6-15-1，2-15-5，5-15-2，3-15-4，4-15-3，1-14-7，7-14-1，2-14-6，6-14-2，3-14-5，5-14-3，4-14-4，1-13-8，8-13-1，2-13-7，7-13-2，3-13-6，6-13-3，4-13-5，5-13-4，2-12-8，8-12-2，3-12-7，7-12-3，4-12-6，6-12-4，5-12-5，3-11-8，8-11-3，4-11-7，7-11-4，5-11-6，6-11-5，1-21-1，1-20-2，2-20-1，1-20-3，3-19-1，2-19-2，1-18-4，4-18-1，2-18-3，3-18-2，1-17-5，2-17-4，4-17-2，3-17-3，1-16-6，6-16-1，2-16-5，5-16-2，3-16-4，4-16-3，1-15-7，7-15-1，2-15-6，6-15-2，3-15-5，5-15-3，4-15-4，1-14-8，8-14-1，2-14-7，7-14-2，3-14-6，6-14-3，4-14-5，5-14-4，2-13-8，8-13-2，3-13-7，7-13-3，4-13-6，6-13-4，5-13-5，1-12-10，10-12-1，2-12-9，9-12-2，3-12-8，8-12-3，4-12-7，7-12-4，5-12-6，6-12-5，4-11-8，8-11-4，5-11-7，7-11-5，6-11-6，1-22-1，1-21-2，2-21-1，1-21-3，3-20-1，2-20-2，1-19-4，4-19-1，2-19-3，3-19-2，1-18-5，2-18-4，4-18-2，3-18-3，1-17-6，6-17-1，2-17-5，5-17-2，3-17-4，4-17-3，1-16-7，7-16-1，2-16-6，6-16-2，3-16-5，5-16-3，4-16-4，1-15-8，8-15-1，2-15-7，7-15-2，3-15-6，6-15-3，4-15-5，5-15-4，2-14-8，8-14-2，3-14-7，7-14-3，4-14-6，6-14-4，5-14-5，3-13-8，8-13-3，4-13-7，7-13-4，5-13-6，6-13-5，4-12-8，8-12-4，5-12-7，7-12-5，6-12-6，5-11-8，8-11-5，6-11-7或7-11-6.

这些数字表示5’-X-Y-Z-3’间隔聚体中X、Y和Z区中的核苷数目。

在一些实施方案中，间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)或间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)中的一个或更多个核苷是经修饰核苷(例如，高亲和力经修饰核苷)。在一些实施方案中，经修饰核苷(例如，高亲和力经修饰核苷)是2’-经修饰核苷。在一些实施方案中，2’-经修饰核苷是2’-4’双环核苷或非双环2’-经修饰核苷。在一些实施方案中，高亲和力经修饰核苷是2’-4’双环核苷(例如，LNA、cEt或ENA)或非双环2’-经修饰核苷(例如2’-氟(2’-F)、2’-O-甲基(2’-O-Me)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、2’-O-二甲基氨基乙基氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA))。

在一些实施方案中，间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)中的一个或更多个核苷是高亲和力经修饰核苷。在一些实施方案中，间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)中的每个核苷是高亲和力经修饰核苷。在一些实施方案中，间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)中的一个或更多个核苷是高亲和力经修饰核苷。在一些实施方案中，间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)中的每个核苷是高亲和力经修饰核苷。在一些实施方案中，间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)中的一个或更多个核苷是高亲和力经修饰核苷，并且间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)中的一个或更多个核苷是高亲和力经修饰核苷。在一些实施方案中，间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)中的每个核苷是高亲和力经修饰核苷，并且间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)中的每个核苷是高亲和力经修饰核苷。

在一些实施方案中，间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)包含与间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)相同的高亲和力核苷。例如，间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)和间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)可包含一个或更多个非双环2’-经修饰核苷(例如，2’-MOE或2’-O-Me)。在另一个实例中，间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)和间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)可包含一个或更多个2’-4’双环核苷(例如，LNA或cEt)。在一些实施方案中，间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)和间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)中的每个核苷是非双环2’-经修饰核苷(例如，2’-MOE或2’-O-Me)。在一些实施方案中，间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)和间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)中的每个核苷是2’-4’双环核苷(例如，LNA或cEt)。

在一些实施方案中，间隔聚体包含5’-X-Y-Z-3’构型，其中X和Z的长度独立地为1至7个(例如，1、2、3、4、5、6或7个)核苷，并且Y的长度为6至10个(例如，6、7、8、9或10个)核苷，其中X和Z中的每个核苷是非双环2’-经修饰核苷(例如，2’-MOE或2’-O-Me)，并且Y中的每个核苷是2’-脱氧核糖核苷。在一些实施方案中，间隔聚体包含5’-X-Y-Z-3’构型，其中X和Z的长度独立地为1至7个(例如，1、2、3、4、5、6或7个)核苷，并且Y的长度为6至10个(例如，6、7、8、9或10个)核苷，其中X和Z中的每个核苷是2’-4’双环核苷(例如，LNA或cEt)，并且Y中的每个核苷是2’-脱氧核糖核苷。在一些实施方案中，间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)包含与间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)不同的高亲和力核苷。例如，间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)可包含一个或更多个非双环2’-经修饰核苷(例如，2’-MOE或2’-O-Me)，并且间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)可包含一个或更多个2’-4’双环核苷(例如，LNA或cEt)。在另一个实例中，间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)可包含一个或更多个非双环2’-经修饰核苷(例如，2’-MOE或2’-O-Me)，并且间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)可包含一个或更多个2’-4’双环核苷(例如，LNA或cEt)。

在一些实施方案中，间隔聚体包含5’-X-Y-Z-3’构型，其中X和Z的长度独立地为1至7个(例如，1、2、3、4、5、6或7个)核苷，并且Y的长度为6至10个(例如，6、7、8、9或10个)核苷，其中X中的每个核苷是非双环2’-经修饰核苷(例如，2’-MOE或2’-O-Me)，Z中的每个核苷是2’-4’双环核苷(例如，LNA或cEt)，并且Y中的每个核苷是2’-脱氧核糖核苷。在一些实施方案中，间隔聚体包含5’-X-Y-Z-3’构型，其中X和Z的长度独立地为1至7个(例如，1、2、3、4、5、6或7个)核苷，并且Y的长度为6至10个(例如，6、7、8、9或10个)核苷，其中X中的每个核苷是2’-4’双环核苷(例如，LNA或cEt)，Z中的每个核苷是非双环2’-经修饰核苷(例如，2’-MOE或2’-O-Me)，并且Y中的每个核苷是2’-脱氧核糖核苷。

在一些实施方案中，间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)包含一个或更多个非双环2’-经修饰核苷(例如，2’-MOE或2’-O-Me)和一个或更多个2’-4’双环核苷(例如，LNA或cEt)。在一些实施方案中，间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)包含一个或更多个非双环2’-经修饰核苷(例如，2’-MOE或2’-O-Me)和一个或更多个2’-4’双环核苷(例如，LNA或cEt)。在一些实施方案中，间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)和间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)二者均包含一个或更多个非双环2’-经修饰核苷(例如，2’-MOE或2’-O-Me)和一个或更多个2’-4’双环核苷(例如，LNA或cEt)。

在一些实施方案中，间隔聚体包含5’-X-Y-Z-3’构型，其中X和Z的长度独立地为2至7个(例如，2、3、4、5、6或7个)核苷，并且Y的长度为6至10个(例如，6、7、8、9或10个)核苷，其中X中第1、2、3、4、5、6或7位(最5’的位置是第1位)中的至少一个但不是全部(例如，1、2、3、4、5或6个)是非双环2’-经修饰核苷(例如，2’-MOE或2’-O-Me)，其中X和Z二者中的剩余核苷是2’-4’双环核苷(例如，LNA或cEt)，并且其中Y中的每个核苷是2’脱氧核糖核苷。在一些实施方案中，间隔聚体包含5’-X-Y-Z-3’构型，其中X和Z的长度独立地为2至7个(例如，2、3、4、5、6或7个)核苷，并且Y的长度为6至10个(例如，6、7、8、9或10个)核苷，其中Z中第1、2、3、4、5、6或7位(最5’的位置是第1位)中的至少一个位置但不是全部(例如，1、2、3、4、5或6个)是非双环2’-经修饰核苷(例如，2’-MOE或2’-O-Me)，其中X和Z二者中的剩余核苷是2’-4’双环核苷(例如，LNA或cEt)，并且其中Y中的每个核苷是2’脱氧核糖核苷。在一些实施方案中，间隔聚体包含5’-X-Y-Z-3’构型，其中X和Z的长度独立地为2至7个(例如，2、3、4、5、6或7个)核苷，并且Y的长度为6至10个(例如，6、7、8、9或10个)核苷，其中X中第1、2、3、4、5、6或7位中的至少一个但不是全部(例如，1、2、3、4、5或6个)和Z中第1、2、3、4、5、6或7位(最5’的位置是第1位)中的至少一个位置但不是全部(例如，1、2、3、4、5或6个)是非双环2’-经修饰核苷(例如，2’-MOE或2’-O-Me)，其中X和Z二者中的剩余核苷是2’-4’双环核苷(例如，LNA或cEt)，并且其中Y中的每个核苷是2’脱氧核糖核苷。

在间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)和/或间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)中具有非双环2’-经修饰核苷(例如，2’-MOE或2’-O-Me)和2’-4’双环核苷(例如，LNA或cEt)的混合物的间隔聚体构型的一些非限制性实例包括：BBB-(D)n-BBBAA；KKK-(D)n-KKKAA；LLL-(D)n-LLLAA；BBB-(D)n-BBBEE；KKK-(D)n-KKKEE；LLL-(D)n-LLLEE；BBB-(D)n-BBBAA；KKK-(D)n-KKKAA；LLL-(D)n-LLLAA；BBB-(D)n-BBBEE；KKK-(D)n-KKKEE；LLL-(D)n-LLLEE；BBB-(D)n-BBBAAA；KKK-(D)n-KKKAAA；LLL-(D)n-LLLAAA；BBB-(D)n-BBBEEE；KKK-(D)n-KKKEEE；LLL-(D)n-LLLEEE；BBB-(D)n-BBBAAA；KKK-(D)n-KKKAAA；LLL-(D)n-LLLAAA；BBB-(D)n-BBBEEE；KKK-(D)n-KKKEEE；LLL-(D)n-LLLEEE；BABA-(D)n-ABAB；KAKA-(D)n-AKAK；LALA-(D)n-ALAL；BEBE-(D)n-EBEB；KEKE-(D)n-EKEK；LELE-(D)n-ELEL；BABA-(D)n-ABAB；KAKA-(D)n-AKAK；LALA-(D)n-ALAL；BEBE-(D)n-EBEB；KEKE-(D)n-EKEK；LELE-(D)n-ELEL；ABAB-(D)n-ABAB；AKAK-(D)n-AKAK；ALAL-(D)n-ALAL；EBEB-(D)n-EBEB；EKEK-(D)n-EKEK；ELEL-(D)n-ELEL；ABAB-(D)n-ABAB；AKAK-(D)n-AKAK；ALAL-(D)n-ALAL；EBEB-(D)n-EBEB；EKEK-(D)n-EKEK；ELEL-(D)n-ELEL；AABB-(D)n-BBAA；BBAA-(D)n-AABB；AAKK-(D)n-KKAA；AALL-(D)n-LLAA；EEBB-(D)n-BBEE；EEKK-(D)n-KKEE；EELL-(D)n-LLEE；AABB-(D)n-BBAA；AAKK-(D)n-KKAA；AALL-(D)n-LLAA；EEBB-(D)n-BBEE；EEKK-(D)n-KKEE；EELL-(D)n-LLEE；BBB-(D)n-BBA；KKK-(D)n-KKA；LLL-(D)n-LLA；BBB-(D)n-BBE；KKK-(D)n-KKE；LLL-(D)n-LLE；BBB-(D)n-BBA；KKK-(D)n-KKA；LLL-(D)n-LLA；BBB-(D)n-BBE；KKK-(D)n-KKE；LLL-(D)n-LLE；BBB-(D)n-BBA；KKK-(D)n-KKA；LLL-(D)n-LLA；BBB-(D)n-BBE；KKK-(D)n-KKE；LLL-(D)n-LLE；ABBB-(D)n-BBBA；AKKK-(D)n-KKKA；ALLL-(D)n-LLLA；EBBB-(D)n-BBBE；EKKK-(D)n-KKKE；ELLL-(D)n-LLLE；ABBB-(D)n-BBBA；AKKK-(D)n-KKKA；ALLL-(D)n-LLLA；EBBB-(D)n-BBBE；EKKK-(D)n-KKKE；ELLL-(D)n-LLLE；ABBB-(D)n-BBBAA；AKKK-(D)n-KKKAA；ALLL-(D)n-LLLAA；EBBB-(D)n-BBBEE；EKKK-(D)n-KKKEE；ELLL-(D)n-LLLEE；ABBB-(D)n-BBBAA；AKKK-(D)n-KKKAA；ALLL-(D)n-LLLAA；EBBB-(D)n-BBBEE；EKKK-(D)n-KKKEE；ELLL-(D)n-LLLEE；AABBB-(D)n-BBB；AAKKK-(D)n-KKK；AALLL-(D)n-LLL；EEBBB-(D)n-BBB；EEKKK-(D)n-KKK；EELLL-(D)n-LLL；AABBB-(D)n-BBB；AAKKK-(D)n-KKK；AALLL-(D)n-LLL；EEBBB-(D)n-BBB；EEKKK-(D)n-KKK；EELLL-(D)n-LLL；AABBB-(D)n-BBBA；AAKKK-(D)n-KKKA；AALLL-(D)n-LLLA；EEBBB-(D)n-BBBE；EEKKK-(D)n-KKKE；EELLL-(D)n-LLLE；AABBB-(D)n-BBBA；AAKKK-(D)n-KKKA；AALLL-(D)n-LLLA；EEBBB-(D)n-BBBE；EEKKK-(D)n-KKKE；EELLL-(D)n-LLLE；ABBAABB-(D)n-BB；AKKAAKK-(D)n-KK；ALLAALLL-(D)n-LL；EBBEEBB-(D)n-BB；EKKEEKK-(D)n-KK；ELLEELL-(D)n-LL；ABBAABB-(D)n-BB；AKKAAKK-(D)n-KK；ALLAALL-(D)n-LL；EBBEEBB-(D)n-BB；EKKEEKK-(D)n-KK；ELLEELL-(D)n-LL；ABBABB-(D)n-BBB；AKKAKK-(D)n-KKK；ALLALLL-(D)n-LLL；EBBEBB-(D)n-BBB；EKKEKK-(D)n-KKK；ELLELL-(D)n-LLL；ABBABB-(D)n-BBB；AKKAKK-(D)n-KKK；ALLALL-(D)n-LLL；EBBEBB-(D)n-BBB；EKKEKK-(D)n-KKK；ELLELL-(D)n-LLL；EEEK-(D)n-EEEEEEEE；EEK-(D)n-EEEEEEEEE；EK-(D)n-EEEEEEEEEE；EK-(D)n-EEEKK；K-(D)n-EEEKEKE；K-(D)n-EEEKEKEE；K-(D)n-EEKEK；EK-(D)n-EEEEKEKE；EK-(D)n-EEEKEK；EEK-(D)n-KEEKE；EK-(D)n-EEKEK；EK-(D)n-KEEK；EEK-(D)n-EEEKEK；EK-(D)n-KEEEKEE；EK-(D)n-EEKEKE；EK-(D)n-EEEKEKE；和EK-(D)n-EEEEKEK；其中“A”表示2’-经修饰核苷；“B”表示2’-4’双环核苷；“K”表示约束性乙基核苷(cEt)；“L”表示LNA核苷；以及“E”表示2’-MOE修饰的核糖核苷；“D”表示2’-脱氧核糖核苷；“n”表示间隔区段(5’-X-Y-Z-3’构型中的Y)的长度并且是1至20的整数。

在一些实施方案中，本文中所述的任一种间隔聚体在X、Y和Z区的每一个中包含一个或更多个经修饰核苷键联(例如，硫代磷酸酯键联)。在一些实施方案中，本文中所述的任一种间隔聚体中的每个核苷间键联是硫代磷酸酯键联。在一些实施方案中，X、Y和Z区各自独立地包含硫代磷酸酯键联和磷酸二酯键联的混合物。在一些实施方案中，间隔区Y中的每个核苷间键联是硫代磷酸酯键联，5’翼区X包含硫代磷酸酯键联和磷酸二酯键联的混合物，并且3’翼区Z包含硫代磷酸酯键联和磷酸二酯键联的混合物。

表8中提供了DMPK靶向寡核苷酸的一些非限制性实例。

表8.DMPK靶向寡核苷酸(ASO)的一些实例

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*“E”是2’-MOE修饰的核糖核苷；“L”是LNA核苷；“D”是2’-脱氧核糖核苷；“10”或“8”是Y中2’-脱氧核糖核苷的数目；“PS”是硫代磷酸酯核苷间键联；并且“PO”是磷酸二酯核苷间键联

**“xdC”是5-甲基-脱氧胞苷；“dN”是2’-脱氧核糖核苷；“+N”是LNA核苷；“oN”是2’-MOE修饰的核糖核苷；“oC”是5-甲基-2’-MOE-胞苷；“+C”是5-甲基-2’-4’-双环-胞苷(2’-4’亚甲基桥)；“oU”是5-甲基-2’-MOE-尿苷；“+U”是5-甲基-2’-4’-双环-尿苷(2’-4’亚甲基桥)；“*”表示硫代磷酸酯核苷间键联；核苷之间不存在“*”表示磷酸二酯核苷间键联；并且NH₂-(CH₂)₆-和5’末端核苷之间的键联任选地是磷酸二酯键联。

表8中提供的任何一个序列和/或结构中的每个胸腺嘧啶碱基(T)可以独立地和任选地被尿嘧啶碱基(U)替换，并且每个U可以独立地和任选地被T替换。表8中列出的靶序列包含Ts，但考虑了DMPK靶向寡核苷酸与RNA和/或DNA的结合。

在一些实施方案中，本文中所述的DMPK靶向寡核苷酸的长度为15至20个核苷(例如，15、16、17、18、19或20个核苷)，包含SEQ ID NO：160至172和193至195中任一个的至少15个连续核苷(例如，至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个连续核苷)的互补区，并且包含5’-X-Y-Z-3’构型，其中X包含3至5(例如，3、4或5)个连接的核苷，其中X中的至少一个核苷是2’-经修饰核苷(例如，2’-MOE修饰的核苷、2’-O-Me修饰的核苷、LNA、cEt或ENA)；Y包含6至10(例如6、7、8、9或10)个连接的2’-脱氧核糖核苷，其中Y中的每个胞嘧啶任选地且独立地是5-甲基-胞嘧啶；并且Z包含3至5(例如3、4或5)个连接的核苷，其中Z中的至少一个核苷是2’-经修饰核苷(例如2’-MOE修饰的核苷、2’-O-Me修饰的核苷、LNA、cEt或ENA)。

在一些实施方案中，反义寡核苷酸包含SEQ ID NO：174、177、179至182和184至192中任一个的核苷酸序列的至少15个连续核苷(例如，至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个连续核苷)，并且包含5’-X-Y-Z-3’构型，其中X包含3至5(例如，3、4或5)个连接的核苷，其中X中的至少一个核苷是2’-经修饰核苷(例如，2’-MOE修饰的核苷、2’-O-Me修饰的核苷、LNA、cEt或ENA)；Y包含6至10(例如6、7、8、9或10)个连接的2’-脱氧核糖核苷，其中Y中的每个胞嘧啶任选地且独立地是5-甲基-胞嘧啶；并且Z包含3至5(例如3、4或5)个连接的核苷，其中Z中的至少一个核苷是2’-经修饰核苷(例如2’-MOE修饰的核苷、2’-O-Me修饰的核苷、LNA、cEt或ENA)。在一些实施方案中，反义寡核苷酸的核苷酸序列的每个胸腺嘧啶碱基(T)可独立地且任选地用尿嘧啶碱基(U)替换，并且每个U可独立地且任选地用T替换。

在一些实施方案中，反义寡核苷酸包含SEQ ID NO：174、177、179至182和184至192中任一个核苷酸序列并且包含5’-X-Y-Z-3’构型，其中X包含3至5(例如3、4或5)个连接的核苷，其中X中的至少一个核苷是2’-经修饰核苷(例如2’-MOE修饰的核苷、2’-O-Me修饰的核苷、LNA、cEt或ENA)；Y包含6至10(例如6、7、8、9或10)个连接的2’-脱氧核糖核苷，其中Y中的每个胞嘧啶任选地且独立地是5-甲基-胞嘧啶；并且Z包含3至5(例如3、4或5)个连接的核苷，其中Z中的至少一个核苷是2’-经修饰核苷(例如2’-MOE修饰的核苷、2’-O-Me修饰的核苷、LNA、cEt或ENA)。在一些实施方案中，反义寡核苷酸的核苷酸序列的每个胸腺嘧啶碱基(T)可独立地且任选地用尿嘧啶碱基(U)替换，并且每个U可独立地且任选地用T替换。

在一些实施方案中，X中的每个核苷是2’-经修饰核苷和/或(例如，和)Z中每个核苷是2’-经修饰核苷。在一些实施方案中，2’-经修饰核苷是2’-4’双环核苷(例如，LNA、cEt或ENA)或非双环2’-经修饰核苷(例如，2’-MOE修饰的核苷或2’-O-Me修饰的核苷)。

在一些实施方案中，X中的每个核苷是非双环2’-经修饰核苷(例如，2’-MOE修饰的核苷)和/或(例如，和)Z中的每个核苷是非双环2’-经修饰核苷(例如，2’-MOE修饰的核苷)。在一些实施方案中，X中的每个核苷是2’-4’双环核苷(例如，LNA、cEt或ENA)和/或(例如，和)Z中的每个核苷是2’-4’双环核苷(例如，LNA、cEt或ENA)。

在一些实施方案中，X包含至少一个2’-4’双环核苷(例如，LNA、cEt或ENA)和至少一个非双环2’-经修饰核苷，例如，2’-MOE修饰的核苷或2’-O-Me修饰的核苷，和/或(例如，和)Z包含至少一个2’-4’双环核苷(例如，LNA、cEt或ENA)和至少一个非双环2’-经修饰核苷(例如，2’-MOE修饰的核苷或2’-O-Me修饰的核苷。

在一些实施方案中，DMPK靶向寡核苷酸包含一个或更多个硫代磷酸酯核苷间键联。在一些实施方案中，DMPK靶向寡核苷酸中的每个核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联。在一些实施方案中，DMPK靶向寡核苷酸包含一个或更多个磷酸二酯核苷间键联，任选地其中磷酸二酯核苷间键联在X和/或Z中。在一些实施方案中，DMPK靶向寡核苷酸包含一个或更多个硫代磷酸酯核苷间键联和一个或更多个磷酸二酯核苷间键联。在一些实施方案中，DMPK靶向寡核苷酸包含1磷酸二酯核苷间键联

(PO)，2PO，3PO，4PO，5PO，6PO，7PO，8PO，9PO，10PO，11PO，12PO，13PO，14PO，15PO，16PO，17PO，18PO，19PO，20PO，21PO，22PO，23PO，24PO，25PO，26PO，27PO，28PO或29PO

并且剩余核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联(PS)。例如，20个核苷酸的DMPK靶向寡核苷酸可包含1PO和18PS、2PO和17PS、3PO和16PS、4PO和15PS、5PO和14PS、6PO和13PS、7PO和12PS、8PO和11PS、9PO和10PS、10PO和9PS、11PO和8PS、12PO和7PS、13PO和6PS、14PO和5PS、15PO和4PS、16PO和3PS、17PO和2PS或18PO和1PS。在一些实施方案中，间隔区Y中的每个核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联，X包含一个或更多个硫代磷酸酯核苷间键联和一个或更多个磷酸二酯核苷间键联，并且Z包含一个或更多个硫代磷酸酯核苷间键联和一个或更多个磷酸二酯核苷间键联。在一些实施方案中，间隔区Y中的每个核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联，X中的每个核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联，并且Z包含一个或更多个硫代磷酸酯核苷间键联和一个或更多个磷酸二酯核苷间键联。在一些实施方案中，间隔区Y中的每个核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联，X包含一个或更多个硫代磷酸酯核苷间键联和一个或更多个磷酸二酯核苷间键联，并且Z中的每个核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联。例如，DMPK靶向寡核苷酸可包含具有混合磷酸二酯/硫代磷酸酯主链的翼区X和Z以及具有完全硫代磷酸酯主链的间隔区Y，或者可包含具有混合磷酸二酯/硫代磷酸酯主链的一个翼区(即，X或Z)，具有完全硫代磷酸酯主链的另一个翼区和具有完全硫代磷酸酯主链的间隔区Y。在一些实施方案中，间隔区Y包含一个或更多个硫代磷酸酯核苷间键联和一个或更多个磷酸二酯核苷间键联，并且翼区X和Y各自独立地具有完全硫代磷酸酯主链或者包含一个或更多个硫代磷酸酯核苷间键联和一个或更多个磷酸二酯核苷间键联。例如，DMPK靶向寡核苷酸可包含具有混合磷酸二酯/硫代磷酸酯主链的翼区X和Z以及具有混合磷酸二酯/硫代磷酸酯主链的间隔区Y。

在一些实施方案中，提供了下式的反义寡核苷酸：(L)_X1(E)_X2(L)_X3(D)_X4(L)_X5(E)_X6(L)_X7：

其中每个(L)是2’-4’双环核苷，

其中每个(E)是非双环2’-经修饰核苷，

其中每个(D)是2’-脱氧核糖核苷，

其中X1独立地是0至5的整数，其表示相应L的实例数，

其中X2独立地是0至5的整数，其表示相应E的实例数，

其中X3独立地是0至5的整数，其表示相应L的实例数，

其中X4独立地是5至12的整数，其表示D的实例数，

其中X5独立地是0至5的整数，其表示相应L的实例数，

其中X6独立地是0至5的整数，其表示相应E的实例数，

其中X7独立地是0至5的整数，其表示相应L的实例数，并且

其中X1、X2和X3中的至少一个在1至5的范围内，并且X5、X6和X7中的至少一个在1至5的范围内。

在一些实施方案中，X1、X3、X5和X7各自为0，并且X2和X6独立地是1、2、3、4或5。

在一些实施方案中，X1、X2、X5和X6各自为0，并且X3和X7独立地是1、2、3、4或5。

在一些实施方案中，X3和X5各自为0，并且X1、X2、X6和X7独立地是1、2、3、4或5。

在一些实施方案中，X1和X7各自为0，并且X2、X3、X5和X6独立地是1、2、3、4或5。

在一些实施方案中，X4是5、6、7、8、9或10。

在一些实施方案中，2’-4’双环核苷选自LNA、cEt和ENA核苷。在一些实施方案中，非双环2’-经修饰核苷是2’-MOE修饰的核苷或2’-OMe修饰的核苷。

在一些实施方案中，寡核苷酸的核苷通过硫代磷酸酯核苷间键联、磷酸二酯核苷间键联或其组合连接在一起。在一些实施方案中，寡核苷酸仅包含连接每个核苷的硫代磷酸酯核苷间键联。在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个硫代磷酸酯核苷间键联。在一些实施方案中，寡核苷酸包含硫代磷酸酯和磷酸二酯核苷间键联的混合物。在一些实施方案中，寡核苷酸仅包含连接每对2’-脱氧核糖核苷的硫代磷酸酯核苷间键联，以及连接剩余核苷的硫代磷酸酯与磷酸二酯核苷间键联的混合物。

在一些实施方案中，寡核苷酸包含以下的5’-X-Y-Z-3’构型：

其中“E”是2’-MOE修饰的核糖核苷；“L”是LNA；“D”是2’-脱氧核糖核苷；并且“10”或“8”是Y中2’-脱氧核糖核苷的数目，其中寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷间键联、磷酸二酯核苷间键联或其组合。

在一些实施方案中，在本文中所述的任一种DMPK靶向寡核苷酸中，X和/或Z中的每个胞苷(例如，2’-经修饰胞苷)任选地且独立地为5-甲基-胞苷，和/或者X和/或Z中的每个尿苷(例如，2’-经修饰尿苷)任选地且独立地为5-甲基-尿苷。

在一些实施方案中，DMPK靶向寡核苷酸选自表8中列出的ASO 1至29。在一些实施方案中，任一种DMPK靶向寡核苷酸可以是盐形式，例如作为钠盐、钾盐或镁盐。

在一些实施方案中，本文中所述的任一种寡核苷酸(例如，表8中列出的寡核苷酸)的5’或3’核苷(例如，末端核苷)与胺基缀合，任选地通过间隔基。在一些实施方案中，间隔基包含脂族部分。在一些实施方案中，间隔基包含聚乙二醇部分。在一些实施方案中，磷酸二酯键联存在于间隔基与寡核苷酸的5’或3’核苷之间。在一些实施方案中，本文中所述的任何寡核苷酸(例如，表8中列出的寡核苷酸)的5’或3’核苷(例如，末端核苷)与间隔基缀合，所述间隔基是经取代或未经取代的脂族、经取代或未经取代的杂脂族、经取代或未经取代的亚碳环基、经取代或未经取代的亚杂环基、经取代或未经取代的亚芳基、经取代或未经取代的亚杂芳基、-O-，-N(R^A)-，-S-，-C(＝O)-，-C(＝O)O-，-C(＝O)NR^A-，-NR^AC(＝O)-，-NR^AC(＝O)R^A-，-C(＝O)R^A-，-NR^AC(＝O)O-，-NR^AC(＝O)N(R^A)-，-OC(＝O)-，-OC(＝O)O-，-OC(＝O)N(R^A)-，-S(O)₂NR^A-，-NR^AS(O)₂-，或其组合；每个R^A独立地是氢或者经取代或未经取代的烷基。在某些实施方案中，间隔基是经取代或未经取代的亚烷基、经取代或未经取代的亚杂环基、经取代或未经取代的亚杂芳基、-O-、-N(R^A)-或-C(＝O)N(R^A)₂、或其组合。

在一些实施方案中，本文中所述的任一种寡核苷酸(例如，表8中列出的寡核苷酸)的5’或3’核苷与式-NH₂-(CH₂)_n-化合物缀合，其中n为1至12的整数。在一些实施方案中，n是6、7、8、9、10、11或12。在一些实施方案中，磷酸二酯键联存在于在式-NH₂-(CH₂)_n-化合物与寡核苷酸的5’或3’核苷之间。在一些实施方案中，式-NH₂-(CH₂)₆-化合物通过6-氨基-1-己醇(NH₂-(CH₂)₆-OH)与寡核苷酸的5’磷酸之间的反应与寡核苷酸缀合。

在一些实施方案中，寡核苷酸例如通过胺基与靶向剂，例如肌肉靶向剂(例如抗TfR1抗体)缀合。

C.接头

本文中所述的复合物通常包含连接本文中所述的任一种抗TfR1抗体与分子载荷的接头。接头包含至少一个共价键。在一些实施方案中，接头可以是连接抗TfR1抗体与分子载荷的单键，例如二硫键或二硫桥。然而，在一些实施方案中，接头可通过多个共价键连接本文中所述的任一种抗TfR1抗体与分子载荷。在一些实施方案中，接头可以是可切割接头。然而，在一些实施方案中，接头可以是不可切割接头。接头通常在体外和体内是稳定的，并且在某些细胞环境中可以是稳定的。另外，通常来说接头不负面影响抗TfR1抗体或分子载荷的功能特性。接头合成的实例和方法是本领域中已知的(参见，例如Kline，T.et al.“Methods to Make Homogenous Antibody Drug Conjugates.”PharmaceuticalResearch，2015，32：11，3480-3493.；Jain，N.et al.“Current ADC Linker Chemistry”Pharm Res.2015，32：11，3526-3540.；McCombs，J.R.and Owen，S.C.“Antibody DrugConjugates：Design and Selection of Linker，Payload and Conjugation Chemistry”AAPS J.2015，17：2，339-351.)。

接头的前体通常将包含允许与抗TfR1抗体和分子载荷二者连接的两种不同的反应性物质。在一些实施方案中，两种不同的反应性物质可以是亲核体和/或(例如，和)亲电体。在一些实施方案中，接头通过与抗TfR1抗体的赖氨酸残基或半胱氨酸残基缀合而与抗TfR1抗体连接。在一些实施方案中，接头通过含马来酰亚胺的接头与抗TfR1抗体的半胱氨酸残基连接，其中任选地，含马来酰亚胺的接头包含马来酰亚胺基己酰基或马来酰亚胺基甲基环己烷-1-羧酸根基团。在一些实施方案中，接头通过3-芳基丙腈官能团与抗TfR1抗体的半胱氨酸残基或巯基官能化的分子载荷连接。在一些实施方案中，接头与抗TfR1抗体的赖氨酸残基连接。在一些实施方案中，接头通过酰胺键、氨基甲酸酯键、酰肼、三唑、硫醚或二硫键与抗TfR1抗体和/或(例如，和)分子载荷连接。

i.可切割接头

可切割接头可以是蛋白酶敏感性接头、pH敏感性接头或谷胱甘肽敏感性接头。这些接头通常仅在胞内可切割，并且优选在胞外环境，例如肌细胞或CNS细胞胞外中稳定。

蛋白酶敏感性接头可通过蛋白酶酶活性切割。这些接头通常包含肽序列，并且长度可为2至10个氨基酸、约2至5个氨基酸、约5至10个氨基酸、约10个氨基酸、约5个氨基酸、约3个氨基酸或约2个氨基酸。在一些实施方案中，肽序列可包含天然存在的氨基酸(例如半胱氨酸、丙氨酸)或者非天然存在的或经修饰的氨基酸。非天然存在的氨基酸包括β-氨基酸、高氨基酸、脯氨酸衍生物、3-经取代的丙氨酸衍生物、线性核心氨基酸、N-甲基氨基酸和本领域已知的其他氨基酸。在一些实施方案中，蛋白酶敏感性接头包含缬氨酸-瓜氨酸或丙氨酸-瓜氨酸序列。在一些实施方案中，蛋白酶敏感性接头可被溶酶体蛋白酶(例如组织蛋白酶B(cathepsin B))和/或(例如，和)内体蛋白酶切割。

pH敏感性接头是在高或低pH环境中容易降解的共价键联。在一些实施方案中，pH敏感性接头可在4至6的pH下被切割。在一些实施方案中，pH敏感性接头包含腙或环缩醛。在一些实施方案中，pH敏感性接头在内体或溶酶体内被切割。

在一些实施方案中，谷胱甘肽敏感性接头包含二硫化物部分。在一些实施方案中，谷胱甘肽敏感性接头通过与细胞内的谷胱甘肽物质进行二硫化物交换反应来切割。在一些实施方案中，二硫化物部分还包含至少一种氨基酸，例如半胱氨酸残基。

在一些实施方案中，接头是Val-cit接头(例如，如美国专利6,214,345中所述，其通过引用并入本文)。在一些实施方案中，在缀合之前，val-cit接头具有以下结构：

在一些实施方案中，在缀合之后，val-cit接头具有以下结构：

在一些实施方案中，Val-cit接头与反应性化学部分(例如，用于点击化学缀合的SPAAC)连接。在一些实施方案中，在点击化学缀合之前，与反应性化学部分(例如，用于点击化学缀合的SPAAC)连接的val-cit接头具有以下结构：

其中n是0至10的任意数字。在一些实施方案中，n是3。

在一些实施方案中，与反应性化学部分(例如，用于点击化学缀合的SPAAC)连接的val-cit接头与分子载荷(例如，寡核苷酸)缀合(例如，通过不同的化学部分缀合)。在一些实施方案中，与反应性化学部分(例如，用于点击化学缀合的SPAAC)连接并与分子载荷(例如，寡核苷酸)缀合的val-cit接头具有以下结构(在点击化学缀合之前)：

其中n是0至10的任意数字。在一些实施方案中，n是3。

在一些实施方案中，在与分子载荷(例如，寡核苷酸)缀合之后，val-cit接头包含以下结构：

其中n是0至10的任意数字，并且其中m是0至10的任意数字。在一些实施方案中，n是3并且m是4。

ii.不可切割接头

在一些实施方案中，可使用不可切割接头。通常来说，不可切割接头在细胞或生理环境中不容易被降解。在一些实施方案中，不可切割接头包含任选经取代的烷基，其中所述取代可包括卤素、羟基、氧物质和其他常见的取代。在一些实施方案中，接头可包含任选经取代的烷基、任选经取代的亚烷基、任选经取代的亚芳基、亚杂芳基、包含至少一种非天然氨基酸的肽序列、截短的聚糖、不能被酶降解的一种或更多种糖、叠氮化物、炔-叠氮化物、包含LPXT序列的肽序列、硫醚、生物素、联苯、聚乙二醇或等同化合物的重复单元、酸性酯、酰胺、磺酰胺和/或(例如，和)烷氧基-胺接头。在一些实施方案中，分选酶介导的连接将用于共价连接包含LPXT序列的抗TfR1抗体与包含(G)_n序列的分子载荷(参见，例如ProftT.Sortase-mediated protein ligation：an emerging biotechnology tool forprotein modification and immobilization.Biotechnol Lett.2010，32(1)：1-10.)。

在一些实施方案中，接头可包含经取代的亚烷基、任选经取代的亚烯基、任选经取代的亚炔基、任选经取代的亚环烷基、任选经取代的亚环烯基、任选经取代的亚芳基、还包含至少一个选自N、O和S的杂原子的任选经取代的亚杂芳基；还包含至少一个选自N、O和S的杂原子的任选经取代的亚杂环基；亚氨基、任选经取代的氮物质、任选经取代的氧物质O、任选经取代的硫物质或聚(环氧烷烃)，例如聚环氧乙烷或聚环氧丙烷。

iii.接头缀合

在一些实施方案中，接头通过磷酸酯、硫醚、醚、碳-碳、氨基甲酸酯、或酰胺键与抗TfR1抗体和/或(例如，和)分子载荷连接。在一些实施方案中，接头通过磷酸酯或硫代磷酸酯基团例如寡核苷酸主链的末端磷酸酯与寡核苷酸连接。在一些实施方案中，接头通过抗TfR1抗体上存在的赖氨酸或半胱氨酸残基与该抗TfR1抗体连接。

在一些实施方案中，接头通过叠氮化物和炔烃之间的环加成反应与抗TfR1抗体和/或(例如，和)分子载荷连接以形成三唑，其中叠氮化物和炔烃可位于抗TfR1抗体、分子载荷或接头上。在一些实施方案中，炔烃可以是环炔烃，例如环辛炔。在一些实施方案中，炔烃可以是双环壬炔(也称为双环[6.1.0]壬炔或BCN)或经取代的双环壬炔。在一些实施方案中，环辛炔如国际专利申请公开WO2011136645中所述，其于2011年11月3日公开，标题为“Fused Cyclooctyne Compounds And Their Use In Metal-free Click Reactions"。在一些实施方案中，叠氮化物可以是包含叠氮化物的糖或碳水化合物分子。在一些实施方案中，叠氮化物可以是6-叠氮基-6-脱氧半乳糖或6-叠氮基-N-乙酰半乳糖胺。在一些实施方案中，包含叠氮化物的糖或碳水化合物分子如国际专利申请公开WO2016170186中所述，其于2016年10月27日公开，标题为“Process For The Modification Of A GlycoproteinUsing A Glycosyltransferase That Is Or Is Derived From A β(1，4)-N-Acetylgalactosaminyltransferase”。在一些实施方案中，在叠氮化物和炔烃之间进行环加成反应以形成三唑，其中叠氮化物或炔烃可位于抗TfR1抗体、分子载荷或接头上，如以下中所述：国际专利申请公开WO2014065661，其于2014年5月1日公开，标题为“Modifiedantibody，antibody-conjugate and process for the preparation thereof”；或国际专利申请公开WO2016170186，其于2016年10月27日公开，标题为“Process For TheModification Of A Glycoprotein Using A Glycosyltransferase That Is Or IsDerived From Aβ(1，4)-N-Acetylgalactosaminyltransferase”。

在一些实施方案中，接头还包含间隔基，例如聚乙二醇间隔基或酰基/胺甲酰基磺酰胺间隔基，例如HydraSpace^TM间隔基。在一些实施方案中，间隔基如Verkade，J.M.M.etal.，“A Polar Sulfamide Spacer Significantly Enhances the Manufacturability，Stability，and Therapeutic Index of Antibody-Drug Conjugates”，Antibodies，2018，7，12中所述。

在一些实施方案中，接头通过亲二烯体和二烯/杂二烯之间的第尔斯-阿尔德反应(Diels-Alder reaction)与抗TfR1抗体和/或(例如，和)分子载荷连接，其中亲二烯体和二烯/杂二烯可位于抗TfR1抗体、分子载荷或接头上。在一些实施方案中，接头通过其他周环反应(pericyclic reaction)，例如烯反应与抗TfR1抗体和/或(例如，和)分子载荷连接。在一些实施方案中，接头通过酰胺、硫代酰胺或磺酰胺键合反应与抗TfR1抗体和/或(例如，和)分子载荷连接。在一些实施方案中，接头通过缩合反应与抗TfR1抗体和/或(例如，和)分子载荷连接，以形成存在于接头和抗TfR1抗体和/或(例如，和)分子载荷之间的肟、腙或氨基脲基团。

在一些实施方案中，接头通过亲核体(例如胺或羟基)和亲电体(例如羧酸、碳酸或醛)之间的共轭加成反应与抗TfR1抗体和/或(例如，和)分子载荷连接。在一些实施方案中，在进行接头和抗TfR1抗体或分子载荷之间的反应之前，亲核体可存在于接头上并且亲电体可存在于抗TfR1抗体或分子载荷上。在一些实施方案中，在进行接头和抗TfR1抗体或分子载荷之间的反应之前，亲电体可存在于接头上并且亲核体可存在于抗TfR1抗体或分子载荷上。在一些实施方案中，亲电体可以是叠氮化物、五氟苯基、硅中心、羰基、羧酸、酸酐、异氰酸酯、硫代异氰酸酯、琥珀酰亚胺酯、磺基琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺、烷基卤化物、烷基假卤化物、环氧化物、环硫化物、氮丙啶、芳基、活化的磷中心和/或(例如，和)活化的硫中心。在一些实施方案中，亲核体可以是任选经取代的烯烃、任选经取代的炔烃、任选经取代的芳基、任选经取代的杂环基、羟基、氨基、烷基氨基、苯胺基或硫醇基。

在一些实施方案中，与反应性化学部分(例如，用于点击化学缀合的SPAAC)连接的val-cit接头通过以下结构与抗TfR1抗体缀合：

其中m是0至10的任意数字。在一些实施方案中，m是4。

在一些实施方案中，与反应性化学部分(例如，用于点击化学缀合的SPAAC)连接的val-cit接头与抗TfR1抗体缀合，其具有以下结构：

其中m是0至10的任意数字。在一些实施方案中，m是4。应理解的是，在式(G)中示出的与抗TfR1抗体相邻的酰胺是由与抗TfR1抗体的胺(例如赖氨酸ε胺)的反应产生的。

在一些实施方案中，与反应性化学部分(例如，用于点击化学缀合的SPAAC)连接并与抗TfR1抗体缀合的val-cit接头具有以下结构：

其中n是0至10的任意数字，其中m是0至10的任意数字。在一些实施方案中，n是3和/或(例如，和)m是4。在一些实施方案中，寡核苷酸与包含式(F)结构的化合物共价连接，从而形成包含式(D)结构的复合物。应该理解的是，在式(F)中示出的与抗TfR1抗体相邻的酰胺是由与抗TfR1抗体的胺(例如赖氨酸ε胺)的反应产生的。

在一些实施方案中，连接抗TfR1抗体和分子载荷的val-cit接头具有以下结构：

其中n是0至10的任意数字，其中m是0至10的任意数字。在一些实施方案中，n是3和/或(例如，和)m是4。在一些实施方案中，n是3和/或(例如，和)m是4。在一些实施方案中，X是抗体的NH(例如，来自赖氨酸的胺基的NH)、S(例如，来自半胱氨酸的硫醇基的S)或O(例如，来自丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸的羟基的O)。

在一些实施方案中，本文中所述的复合物具有以下结构：

其中n是0至10的任意数字，其中m是0至10的任意数字。在一些实施方案中，n是3并且m是4。

在一些实施方案中，在结构式(A)、(B)、(C)和(D)中，L1是间隔基，所述间隔基是经取代或未经取代的脂族、经取代或未经取代的杂脂族、经取代或未经取代的亚碳环基、经取代或未经取代的亚杂环基、经取代或未经取代的亚芳基、经取代或未经取代的亚杂芳基、-O-，-N(R^A)-，-S-，-C(＝O)-，-C(＝O)O-，-C(＝O)NR^A-，-NR^AC(＝O)-，-NR^AC(＝O)R^A-，-C(＝O)R^A，-NR^AC(＝O)O-，-NR^AC(＝O)N(R^A)-，-OC(＝O)-，-OC(＝O)O-，-OC(＝O)N(R^A)-，-S(O)₂NR^A-，-NR^AS(O)₂-，或其组合。在一些实施方案中，L1是

其中L2是

其中a标记与式(A)、(B)、(C)和(D)的氨基甲酸酯部分直接连接的位点；以及b标记与寡核苷酸共价连接(直接或通过另外的化学部分进行连接)的位点。

在一些实施方案中，L1是

在一些实施方案中，L1与寡核苷酸的5’磷酸连接。在一些实施方案中，L1与寡核苷酸的5’磷酸的连接在L1与寡核苷酸之间形成磷酸二酯键。

在一些实施方案中，L1是任选的(例如，不是必要存在的)。

在一些实施方案中，本文中所述的任一种复合物具有以下结构：

其中n是0至15(例如3)并且m是0至15(例如4)。

C.抗体-分子载荷复合物的一些实例

本文中还提供了包含与本文中所述的任何分子载荷(例如，寡核苷酸)共价连接的任一种本文中所述的抗TfR1抗体的复合物的一些非限制性实例。在一些实施方案中，抗TfR1抗体(例如，表2至表7中提供的任一种抗TfR1抗体)通过接头与分子载荷(例如，寡核苷酸，例如表8中提供的寡核苷酸)共价连接。可使用本文中所述的任何接头。在一些实施方案中，如果分子载荷是寡核苷酸，则接头与寡核苷酸的5’末端、3’末端或内部连接。在一些实施方案中，接头通过硫醇反应性键联(例如，通过抗TfR1抗体中的半胱氨酸)与抗TfR1抗体连接。在一些实施方案中，接头(例如，Val-cit接头)通过胺基(例如，通过抗体中的赖氨酸)与抗体(例如，本文中所述的抗TfR1抗体)连接。在一些实施方案中，分子载荷是DMPK靶向寡核苷酸(例如，表8中列出的DMPK靶向寡核苷酸)。

以下提供了复合物的结构的一个实例，其包含通过Val-cit接头与分子载荷共价连接的抗TfR1抗体：

其中接头通过硫醇反应性键联(例如，通过抗体中的半胱氨酸)与抗体连接。在一些实施方案中，分子载荷是DMPK靶向寡核苷酸(例如，表8中列出的DMPK靶向寡核苷酸)。

以下提供了复合物的结构的另一个实例，其包含通过Val-cit接头与分子载荷共价连接的抗TfR1抗体：

其中n是0至10的数字，其中m是0至10的数字，其中接头通过胺基(例如，赖氨酸残基上的)与抗体连接，和/或(例如，和)其中接头与寡核苷酸(例如，在5’末端、3’末端或内部)连接。在一些实施方案中，接头通过赖氨酸与抗体连接，接头在5’末端与寡核苷酸连接，n是3并且m是4。在一些实施方案中，分子载荷是DMPK靶向寡核苷酸(例如，表8中列出的DMPK靶向寡核苷酸)。在一些实施方案中，L1是应理解的是，在式(D)中示出的与抗TfR1抗体相邻的酰胺是由与抗TfR1抗体的胺(例如赖氨酸ε胺)的反应产生的。

应理解，抗体可与具有不同化学计量的分子载荷连接，该特性可被称为药物抗体比(drug to antibody ratio，DAR)，其中“药物”是分子载荷。在一些实施方案中，一个分子载荷与一个抗体连接(DAR＝1)。在一些实施方案中，两个分子载荷与一个抗体连接(DAR＝2)。在一些实施方案中，三个分子载荷与一个抗体连接(DAR＝3)。在一些实施方案中，四个分子载荷与一个抗体连接(DAR＝4)。在一些实施方案中，提供了不同复合物的混合物，每种复合物具有不同的DAR。在一些实施方案中，这样的混合物中的复合物的平均DAR可在1至3、1至4、1至5或更大的范围内。可通过将分子载荷缀合至抗体上的不同位点和/或(例如，和)通过将多聚体缀合至抗体上的一个或更多个位点来提高DAR。例如，可通过将单个分子载荷缀合至抗体上的两个不同位点或通过将二聚体分子载荷缀合至抗体的单个位点来实现DAR为2。

在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含与分子载荷共价连接的本文中所述的抗TfR1抗体(例如，表2至7中提供的抗体)。在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含通过接头(例如，Val-cit接头)与分子载荷共价连接的本文中所述的抗TfR1抗体(例如，表2至7中提供的抗体)。在一些实施方案中，接头(例如，Val-cit接头)通过硫醇反应性键联(例如，通过抗体中的半胱氨酸)与抗体(例如，本文中所述的抗TfR1抗体)连接。在一些实施方案中，接头(例如，Val-cit接头)通过胺基(例如，通过抗体中的赖氨酸)与抗体(例如，本文中所述的抗TfR1抗体)连接。在一些实施方案中，分子载荷是DMPK靶向寡核苷酸(例如，表8中列出的DMPK靶向寡核苷酸)。

在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含与分子载荷共价连接的抗TfR1抗体，其中所述抗TfR1抗体包含表2中列出的任一种抗体的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，分子载荷是DMPK靶向寡核苷酸(例如，表8中列出的DMPK靶向寡核苷酸)。

在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含与分子载荷共价连接的抗TfR1抗体，其中所述抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：72的氨基酸序列的VH和包含含有SEQ ID NO：70的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，分子载荷是DMPK靶向寡核苷酸(例如，表8中列出的DMPK靶向寡核苷酸)。

在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含与分子载荷共价连接的抗TfR1抗体，其中所述抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：73或SEQ ID NO：76的氨基酸序列的VH和包含含有SEQ ID NO：74的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，分子载荷是DMPK靶向寡核苷酸(例如，表8中列出的DMPK靶向寡核苷酸)。

在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含与分子载荷共价连接的抗TfR1抗体，其中所述抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：73或SEQ ID NO：76的氨基酸序列的VH和包含含有SEQ ID NO：75的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，分子载荷是DMPK靶向寡核苷酸(例如，表8中列出的DMPK靶向寡核苷酸)。

在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含与分子载荷共价连接的抗TfR1抗体，其中所述抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：77的氨基酸序列的VH和包含含有SEQ ID NO：78的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，分子载荷是DMPK靶向寡核苷酸(例如，表8中列出的DMPK靶向寡核苷酸)。

在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含与分子载荷共价连接的抗TfR1抗体，其中所述抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：77或SEQ ID NO：79的氨基酸序列的VH和包含含有SEQ ID NO：80的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，分子载荷是DMPK靶向寡核苷酸(例如，表8中列出的DMPK靶向寡核苷酸)。

在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含与分子载荷共价连接的抗TfR1抗体，其中所述抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：154的氨基酸序列的VH和包含含有SEQ IDNO：155的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，分子载荷是DMPK靶向寡核苷酸(例如，表8中列出的DMPK靶向寡核苷酸)。

在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含与分子载荷共价连接的抗TfR1抗体，其中所述抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86或SEQ ID NO：87的氨基酸序列的重链和包含含有SEQ ID NO：85的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，分子载荷是DMPK靶向寡核苷酸(例如，表8中列出的DMPK靶向寡核苷酸)。

在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含与分子载荷共价连接的抗TfR1抗体，其中所述抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：88或SEQ ID NO：91的氨基酸序列的重链和包含含有SEQ ID NO：89的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，分子载荷是DMPK靶向寡核苷酸(例如，表8中列出的DMPK靶向寡核苷酸)。

在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含与分子载荷共价连接的抗TfR1抗体，其中所述抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：88或SEQ ID NO：91的氨基酸序列的重链和包含含有SEQ ID NO：90的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，分子载荷是DMPK靶向寡核苷酸(例如，表8中列出的DMPK靶向寡核苷酸)。

在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含与分子载荷共价连接的抗TfR1抗体，其中所述抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：92或SEQ ID NO：94的氨基酸序列的重链和包含含有SEQ ID NO：95的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，分子载荷是DMPK靶向寡核苷酸(例如，表8中列出的DMPK靶向寡核苷酸)。

在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含与分子载荷共价连接的抗TfR1抗体，其中所述抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：92的氨基酸序列的重链和包含含有SEQ IDNO：93的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，分子载荷是DMPK靶向寡核苷酸(例如，表8中列出的DMPK靶向寡核苷酸)。

在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含与分子载荷共价连接的抗TfR1抗体，其中所述抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：156的氨基酸序列的重链和包含含有SEQ IDNO：157的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，分子载荷是DMPK靶向寡核苷酸(例如，表8中列出的DMPK靶向寡核苷酸)。

在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含与分子载荷共价连接的抗TfR1抗体，其中所述抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98或SEQ ID NO：99的氨基酸序列的重链和包含含有SEQ ID NO：85的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，分子载荷是DMPK靶向寡核苷酸(例如，表8中列出的DMPK靶向寡核苷酸)。

在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含与分子载荷共价连接的抗TfR1抗体，其中所述抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：100或SEQ ID NO：101的氨基酸序列的重链和包含含有SEQ ID NO：89的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，分子载荷是DMPK靶向寡核苷酸(例如，表8中列出的DMPK靶向寡核苷酸)。

在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含与分子载荷共价连接的抗TfR1抗体，其中所述抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：100或SEQ ID NO：101的氨基酸序列的重链和包含含有SEQ ID NO：90的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，分子载荷是DMPK靶向寡核苷酸(例如，表8中列出的DMPK靶向寡核苷酸)。

在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含与分子载荷共价连接的抗TfR1抗体，其中所述抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：102的氨基酸序列的重链和包含含有SEQ IDNO：93的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，分子载荷是DMPK靶向寡核苷酸(例如，表8中列出的DMPK靶向寡核苷酸)。

在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含与分子载荷共价连接的抗TfR1抗体，其中所述抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：102或SEQ ID NO：103的氨基酸序列的重链和包含含有SEQ ID NO：95的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，分子载荷是DMPK靶向寡核苷酸(例如，表8中列出的DMPK靶向寡核苷酸)。

在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含与分子载荷共价连接的抗TfR1抗体，其中所述抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：158或SEQ ID NO：159的氨基酸序列的重链和包含含有SEQ ID NO：157的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，分子载荷是DMPK靶向寡核苷酸(例如，表8中列出的DMPK靶向寡核苷酸)。

在本文中所述的任何示例性复合物中，在一些实施方案中，抗TfR1抗体与具有以下结构的分子载荷连接：

其中n是3，m是4，X是NH(例如，来自赖氨酸的胺基的NH)，并且L1是

在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含通过抗TfR1抗体中的赖氨酸与DMPK靶向寡核苷酸(例如，表8中列出的DMPK靶向寡核苷酸)的5’末端共价连接的抗TfR1抗体，其中所述抗TfR1抗体包含表2中列出的任一种抗体的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中所述复合物具有以下结构：

其中n是3，m是4，并且其中L1是应理解的是，在式(D)中示出的与抗TfR1抗体相邻的酰胺是由与抗TfR1抗体的胺(例如赖氨酸ε胺)的反应产生的。

在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含通过抗TfR1抗体中的赖氨酸与DMPK靶向寡核苷酸(例如，表8中所列的DMPK靶向寡核苷酸)的5’末端共价连接的抗TfR1抗体，其中所述抗TfR1抗体包含表3中列出的任一种抗体的VH和VL，其中所述复合物具有以下结构：

在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含通过抗TfR1抗体中的赖氨酸与DMPK靶向寡核苷酸(例如，表8中列出的DMPK靶向寡核苷酸)的5’末端共价连接的抗TfR1抗体，其中所述抗TfR1抗体包含表4中列出的任一种抗体的重链和轻链，其中所述复合物具有以下结构：

在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含通过抗TfR1抗体中的赖氨酸与DMPK靶向寡核苷酸(例如，表8中列出的DMPK靶向寡核苷酸)的5’末端共价连接的抗TfR1 Fab，其中所述抗TfR1 Fab包含表5中列出的任一种抗体的重链和轻链，其中所述复合物具有以下结构：

在一些实施方案中，L1与寡核苷酸的5’磷酸连接。

在一些实施方案中，L1是任选的(例如，不是必要存在的)。

III.制剂

本文中提供的复合物可以以任何合适的方式配制。通常来说，本文中提供的复合物以适用于药物用途的方式配制。例如，可使用使降解最小化、促进递送和/或(例如，和)摄取或者为制剂中的复合物提供另外的有益特性的制剂将复合物递送至对象。在一些实施方案中，本文中提供了包含复合物和可药用载体的组合物。这样的组合物可适当地配制，使得当施用于对象时，无论是施用至靶细胞的直接环境中或全身性施用，足够量的复合物都能进入靶肌细胞。这样的组合物可适当地配制，使得当施用于对象时，无论是施用至靶细胞的直接环境中或全身性施用，足够量的复合物都能进入靶CNS细胞。在一些实施方案中，复合物被配制在缓冲溶液例如磷酸盐缓冲盐水溶液、脂质体、胶束结构和衣壳中。

应理解，在一些实施方案中，组合物可分别包含本文中提供的复合物的一种或更多种组分(例如，肌肉靶向剂、接头、分子载荷或它们中任一者的前体分子)。

在一些实施方案中，复合物被配制在水或水溶液(例如，用pH调节的水)中。在一些实施方案中，复合物被配制在碱性缓冲水溶液(例如，PBS)中。在一些实施方案中，本文中公开的制剂包含赋形剂。在一些实施方案中，赋形剂赋予组合物以改善的稳定性、改善的吸收、改善的溶解性和/或(例如，和)活性成分的治疗性增强。在一些实施方案中，赋形剂是缓冲剂(例如，柠檬酸钠、磷酸钠、tris碱或氢氧化钠)或载剂(例如，缓冲溶液、矿脂(petrolatum)、二甲基亚砜或矿物油)。

在一些实施方案中，将复合物或其组分(例如，寡核苷酸或抗体)冻干用于延长其保质期，并随后在使用(例如，施用于对象)之前制成溶液。因此，包含本文中所述的复合物或其组分的组合物中的赋形剂可以是冻干保护剂(例如，甘露醇、乳糖、聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮)或崩解温度调节剂(例如，右旋糖酐、ficoll或明胶)。

在一些实施方案中，药物组合物被配制成与其预期施用途径相容。施用途径的一些实例包括肠胃外施用，例如静脉内、皮内、皮下施用。通常来说，施用途径是静脉内或皮下的。

适用于可注射使用的药物组合物包含无菌水溶液(在具有水溶性时)或分散体，以及用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，及其合适的混合物。在一些实施方案中，组合物中的制剂包含等张剂，例如糖、多元醇例如甘露醇、山梨醇以及氯化钠。无菌可注射溶液可通过将所需量的复合物与以上列举的成分之一或组合(根据需要)一起并入选定的溶剂中，然后过滤灭菌来制备。

在一些实施方案中，组合物可包含至少约0.1％的复合物或其组分，或者更多，尽管活性成分的百分比可为总组合物的重量或体积的约1％至约80％或更多。本领域技术人员将考虑制备这样的药物制剂的因素例如溶解性、生物利用度、生物学半衰期、施用途径、产品保质期以及其他药理学考虑因素，并且因此多种剂量和治疗方案可以是期望的。

IV.使用/治疗方法

包含与本文中所述的分子载荷共价连接的肌肉靶向剂的复合物在治疗强直性肌营养不良中是有效的。在一些实施方案中，复合物在治疗1型强直性肌营养不良(DM1)中是有效的。在一些实施方案中，DM1与DMPK的3’非编码区中CTG/CUG三核苷酸重复的扩增相关。在一些实施方案中，核苷酸扩增导致能够形成发夹结构的毒性RNA重复，所述发夹结构以高亲和力结合关键的胞内蛋白，例如盲肌样蛋白。

在一些实施方案中，对象可以是人对象、非人灵长类对象、啮齿动物对象或任何合适的哺乳动物对象。在一些实施方案中，对象可患有强直性肌营养不良。在一些实施方案中，对象具有可任选地包含疾病相关重复的DMPK等位基因。在一些实施方案中，对象可具有DMPK等位基因，所述DMPK等位基因具有扩增的疾病相关重复，所述扩增的疾病相关重复包含约2至10个重复单元、约2至50个重复单元、约2至100个重复单元、约50至1,000个重复单元、约50至500个重复单元、约50至250个重复单元、约50至100个重复单元、约500至10,000个重复单元、约500至5,000个重复单元、约500至2,500个重复单元、约500至1,000个重复单元或约1,000至10,000个重复单元。在一些实施方案中，对象患有DM1的症状，例如肌肉萎缩或肌肉损失。在一些实施方案中，对象不患有DM1的症状。在一些实施方案中，对象患有先天性强直性肌营养不良。

本公开内容的一个方面包括涉及向对象施用有效量的本文中所述的复合物的方法。在一些实施方案中，可向有治疗需要的对象施用有效量的包含含有与分子载荷共价连接的肌肉靶向剂的复合物的药物组合物。在一些实施方案中，可通过合适的途径施用包含如本文中所述的复合物的药物组合物，所述途径可包括静脉内施用，例如作为推注(bolus)或通过在一段时间内的连续输注。在一些实施方案中，可通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内或鞘内途径进行静脉内施用。在一些实施方案中，药物组合物可以是固体形式、水性形式或液体形式。在一些实施方案中，可将水性或液体形式雾化或冻干。在一些实施方案中，雾化或冻干形式可用水溶液或液体溶液重构。

用于静脉内施用的组合物可包含多种载体，例如植物油、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、豆蔻酸异丙酯、乙醇以及多元醇(甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)。对于静脉内注射，水溶性抗体可通过滴注方法施用，通过该方法输注包含抗体和生理学上可接受的赋形剂的药物制剂。生理上可接受的赋形剂可包括，例如5％右旋糖、0.9％盐水、林格液(Ringer’s solution)或其他合适的赋形剂。可将肌内制剂，例如抗体的合适可溶性盐形式的无菌制剂溶解在药用赋形剂例如注射用水、0.9％盐水或5％葡萄糖溶液中并施用。

在一些实施方案中，包含含有与分子载荷共价连接的肌肉靶向剂的复合物的药物组合物通过位点特异性或局部递送技术施用。这些技术的一些实例包括复合物的可植入储库源、局部递送导管、位点特异性载体、直接注射或直接应用。

在一些实施方案中，包含含有与分子载荷共价连接的肌肉靶向剂的复合物的药物组合物以赋予对象治疗作用的有效浓度施用。如本领域技术人员所公认的，有效量根据疾病的严重程度、所治疗对象的独特特征(例如年龄、身体状况、健康或体重)、治疗的持续时间、任何同时治疗的性质、施用途径和相关因素而变化。这些相关因素是本领域技术人员已知的，并且仅通过常规实验即可解决。在一些实施方案中，有效浓度是被认为对患者安全的最大剂量。在一些实施方案中，有效浓度将是提供最大效力的最低的可能浓度。

经验考虑因素(例如复合物在对象中的半衰期)通常将有助于确定用于治疗的药物组合物的浓度。施用频率可凭经验确定和调整以使治疗效力最大化。

可使用任何合适的方法评估治疗的效力。在一些实施方案中，治疗的效力可如下进行评估：通过对与DM1相关的症状(例如肌肉萎缩或肌无力)的观察结果进行的评价，通过对象的自我报告结局(例如移动性、自我护理、日常活动、疼痛/不适和焦虑/抑郁)的测度，或通过生活质量指标(例如寿命)。

在一些实施方案中，将包含含有与分子载荷共价连接的肌肉靶向剂的本文中所述的复合物的药物组合物以相对于对照(例如治疗之前基因表达的基线水平)足以抑制至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的靶基因活性或表达的有效浓度施用于对象。

在一些实施方案中，向对象单次给药或施用包含含有与分子载荷共价连接的肌肉靶向剂的本文中所述的复合物的药物组合物足以抑制靶基因的活性或表达持续至少1至5天、1至10天、5至15天、10至20天、15至30天、20至40天、25至50天或更多天。在一些实施方案中，向对象单次给药或施用包含含有与分子载荷共价连接的肌肉靶向剂的本文中所述的复合物的药物组合物足以抑制靶基因的活性或表达持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20或24周。在一些实施方案中，向对象单次给药或施用包含含有与分子载荷共价连接的肌肉靶向剂的本文中所述的复合物的药物组合物足以抑制靶基因的活性或表达持续至少1至5、1至10、2至5、2至10、4至8、4至12、5至10、5至12、5至15、8至12、8至15、10至12、10至15、10至20、12至15、12至20、15至20或15至25周。在一些实施方案中，向对象单次给药或施用包含含有与分子载荷共价连接的肌肉靶向剂的本文中所述的复合物的药物组合物足以抑制靶基因的活性或表达持续至少1、2、3、4、5或6个月。

在一些实施方案中，药物组合物可包含多于一种包含与分子载荷共价连接的肌肉靶向剂的复合物。在一些实施方案中，药物组合物还可包含用于治疗对象(例如，患有DM1的人对象)的任何其他合适的治疗剂。在一些实施方案中，其他治疗剂可增强或补充本文中所述复合物的效力。在一些实施方案中，其他治疗剂可发挥功能来治疗不同于本文中所述复合物的症状或疾病。

实施例

实施例1.包含与DMPK靶向寡核苷酸(ASO)缀合的抗TfR1 Fab的缀合物的体外活性

进行体外实验以确定表8中列出的DMPK靶向寡核苷酸(ASO)在降低横纹肌肉瘤(RD)和32F细胞中的DMPK mRNA表达以及校正DM1-32F原代细胞(32F细胞；Cook MyoSite，Pittsburg，PA)(其表达包含380个CTG重复的突变体DMPK mRNA)中的BIN1外显子11剪接缺陷中的活性(图1A)。所有的ASO均与抗TfR1 Fab(3M12-VH4/VK3)缀合。

将RD细胞扩增并以20000个细胞/孔的密度接种到96孔板中。将细胞在37℃下过夜回收。第二天，更换培养基并将细胞用500nM ASO当量的缀合物处理并使其孵育72小时。在72小时之后，使用PureLink Pro 96 RNA提取试剂盒提取总RNA并使用qScript cDNA合成试剂盒产生cDNA。使用Taqman PCR将cDNA用于评估总DMPK敲低。将数据归一化为PPIB表达并使用2^-ΔΔCt法来确定仅与载剂对照相比的DMPK敲低。将数据绘制为平均值与标准偏差。

将DM1 32F原代细胞解冻并使其恢复，然后以50000细胞/孔的密度接种到生长培养基中的96孔板中，然后使其恢复过夜。第二天，将生长培养基更换成低血清分化培养基并用100nM ASO当量的缀合物处理细胞。使细胞孵育10天，然后使用Qiagen MiRNeasy提取试剂盒收获总RNA并使用qScript cDNA合成试剂盒合成cDNA。

使用Taqman PCR将cDNA用于评估总DMPK敲低。将数据归一化为PPIB表达并使用2^-ΔΔCt法来确定仅与载剂对照相比的DMPK敲低。数据表示为DMPK敲低的平均值％与标准偏差(表9)。另外，使用多重Taqman qPCR评价DM1介导的异常剪接的修饰以评价异常剪接和正常转录物。将这些数据表示为异常剪接与正常剪接的平均值比率与标准偏差(表9)。比率为1意指与用载剂对照处理的DM1患者肌管相比，异常剪接没有变化。比率大于1意指着更多的转录物具有野生型剪接模式。比率小于1意指着更多的转录物具有DM1介导的剪接模式。

表9.DMPK敲低和BIN1外显子11剪接缺陷校正

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实施例2.包含与DMPK靶向ASO缀合的抗TfR1 Fab的缀合物在患者来源细胞中的体外活性

进行体外实验以确定DMPK靶向寡核苷酸ASO1在以下细胞中降低DMPK mRNA表达、校正BIN1外显子11剪接缺陷和降低核病灶(以核病灶面积与核面积的比率测量)的活性：表达含有380个CTG重复的突变体DMPK mRNA的DM1-32F原代细胞(32F细胞；Cook MyoSite，Pittsburg，PA)(图1A)和表达含有2600个CTG重复的突变体DMPK mRNA的DM1-CL5永生化细胞(CL5细胞)(图1B)。根据RT-PCR，首次证实ASO1能够降低DM1-32F细胞和DM1-CL5细胞中的突变体DMPK mRNA，但不影响健康细胞中的DMPK mRNA水平(图1A至1B)。

测试了包含与ASO1或ASO32缀合的对照抗TfR1 Fab的缀合物在32F细胞中降低DMPK mRNA表达、校正BIN1外显子11剪接缺陷和减少核病灶(以核病灶面积与核面积的比率测量)的能力。如(Arandel et al.，Disease Models&Mechanisms 2017 10：487-497，通过引用并入本文中)所述，将32F细胞以156,000细胞/cm²的密度接种，使其恢复24小时，转移至分化培养基以诱导肌管形成，并随后暴露于载荷浓度为500nM的ASO32-缀合物和ASO1-缀合物。将暴露于载剂PBS的平行培养物用作阴性对照。在培养10天之后收获细胞。

为了分析基因表达，将细胞用Qiazol收集用于使用Qiagen miRNAeasy试剂盒提取总RNA。对经纯化的RNA进行逆转录并通过利用特异性TaqMan测定(ThermoFisher)的qRT-PCR来确定DMPK、PPIB、BIN1转录物和包含外显子11的BIN1 mRNA同种型的水平。使用PPIB作为参照基因并将暴露于载剂的细胞作为对照组根据2^-ΔΔCT法计算DMPK表达中的log倍数变化。使用BIN1作为参照基因并将暴露于载剂的细胞作为对照组根据2^-ΔΔCT法计算包含外显子11的BIN1同种型的水平的log倍数变化。

为了测量突变体DMPK核病灶的面积，将细胞在4％福尔马林中固定，用0.1％Triton X-100透化并在70℃下与和Cy5荧光团(PNA Bio)缀合的CAG肽-核酸探针杂交。在杂交缓冲液和2×SSC溶液中多次洗涤之后，用DAPI对核进行复染。通过共聚焦显微术以400×放大倍率收集图像，并将病灶面积以包含在DAPI信号面积内的Cy5信号面积测量。数据表示为核病灶面积与核面积的比率。

结果显示单剂量的ASO32-缀合物或ASO1-缀合物导致降低的突变体DMPK表达(图2A)、校正的BIN1外显子11剪接缺陷(图2B)和约40％减少的核病灶(图2C至2D)。

对CL5细胞进行类似实验并且结果显示单剂量的ASO32-缀合物或ASO1-缀合物导致降低的突变体DMPK表达(图3A)、校正的BIN1外显子11剪接缺陷(图3B)，并且ASO32-缀合物将核病灶减少约30％，而ASO1-缀合物将核病灶减少约3％(图3C至3D)。

此外，测试了包含与另一些DMPK靶向寡核苷酸(例如ASO32、ASO10、ASO8、ASO26和ASO1)缀合的抗TfR1 Fab(3M12-VH4/VK3)的缀合物在32F细胞中降低DMPK mRNA表达、校正BIN1外显子11剪接缺陷和减少核病灶中的活性(图4A)。如上所述进行该实验。

结果显示单剂量的ASO32-缀合物、ASO10-缀合物、ASO8-缀合物、ASO26-缀合物或ASO1-缀合物导致降低的突变体DMPK表达(图4B)、校正的BIN1外显子11剪接缺陷(图4C)和约至少20％减少的核病灶(图4D至4E)。图4F显示ASO32-缀合物、ASO10-缀合物、ASO8-缀合物、ASO26-缀合物和ASO1-缀合物能够以剂量依赖性方式降低32F细胞中的DMPK表达(将细胞暴露于ASO浓度为14nM、45nM和150nM的DMPK靶向寡核苷酸-缀合物)。图4G显示ASO32-缀合物、ASO10-缀合物、ASO8-缀合物、ASO26-缀合物和ASO1-缀合物能够以剂量依赖性方式校正32F细胞中的BIN1外显子11剪接缺陷(将细胞暴露于ASO浓度为14nM、45nM和150nM的DMPK靶向寡核苷酸-缀合物)。图4H显示ASO32-缀合物、ASO10-缀合物、ASO8-缀合物、ASO26-缀合物和ASO1-缀合物能够以剂量依赖性方式减少32F细胞中的CUG病灶(将细胞暴露于ASO浓度为14nM、45nM和150nM的DMPK靶向寡核苷酸-缀合物)。

对CL5细胞进行了类似的实验(图5A)。在该实验中，所有受试的DMPK靶向寡核苷酸均与抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3缀合。如上所述进行该实验。

结果显示，单剂量的ASO32-缀合物、ASO10-缀合物、ASO8-缀合物、ASO26-缀合物或ASO1-缀合物导致降低的突变体DMPK表达(图5B)和校正的BIN1外显子11剪接缺陷(图5C)。ASO32-缀合物、ASO10-缀合物和ASO8-缀合物将核病灶减少约30％，ASO26-缀合物将核病灶减少约10％，而ASO1-缀合物显示没有减少核病灶(图5D至5E)。图5F显示ASO32-缀合物、ASO10-缀合物、ASO8-缀合物、ASO26-缀合物和ASO1-缀合物能够以剂量依赖性方式降低CL5细胞中的DMPK表达(将细胞暴露于ASO浓度为14nM、45nM和150nM的DMPK靶向寡核苷酸-缀合物)。图5G显示ASO32-缀合物、ASO10-缀合物、ASO8-缀合物、ASO26-缀合物和ASO1-缀合物能够以剂量依赖性方式校正CL5细胞中的BIN1外显子11剪接缺陷(将细胞暴露于ASO浓度为14nM、45nM和150nM的DMPK靶向寡核苷酸-缀合物)。图5H显示ASO32-缀合物、ASO10-缀合物和ASO8-缀合物能够以剂量依赖性方式减少CL5细胞中的CUG病灶。ASO26-缀合物在最高浓度下减少了核病灶，而ASO1-缀合物显示没有减少核病灶(将细胞暴露于ASO浓度为14nM、45nM和150nM的DMPK靶向寡核苷酸-缀合物)。

此外，ASO10-缀合物、ASO8-缀合物、ASO26-缀合物能够以剂量依赖性方式敲低横纹肌肉瘤(RD)细胞中的DMPK表达，并且ASO1-缀合物能够以剂量依赖性方式敲低非人灵长类(NHP)细胞中的DMPK(将细胞暴露于4nM、20nM、100nM或500nM的ASO)(图6)。所有的ASO均与抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3缀合。

实施例3.DMPK靶向寡核苷酸的化学修饰影响了包含与寡核苷酸缀合的抗TfR1Fab的缀合物的效力

为了测试不同的化学修饰如何影响DMPK靶向寡核苷酸的效力，测试了具有不同化学修饰模式的工具DMPK靶向寡核苷酸ASO32在降低DMPK表达中的活性。ASO30、ASO31和ASO32具有相同的核苷酸序列，但包含不同的修饰模式(参见表8)。在接触横纹肌肉瘤(RD)细胞之前，所有的寡核苷酸均与抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3缀合。将细胞在ASO浓度为4nM、20nM、100nM或500nM下与ASO32-缀合物、ASO31-缀合物或ASO30-缀合物接触，并评价DMPK表达水平以确定寡核苷酸敲低DMPK表达的能力。所有测试的寡核苷酸-缀合物均能够以剂量依赖性方式降低DMPK表达。在500nM寡核苷酸浓度下，ASO32-缀合物能够将DMPK表达降低88％，ASO31-缀合物能够将DMPK表达降低70％，并且ASO30-缀合物能够将DMPK表达降低39％(图7)。

在另一些DMPK靶向寡核苷酸中进行了类似的实验，以显示长度和不同的化学修饰影响寡核苷酸的效力。在该实验中，测试了包含与ASO32、ASO2、ASO8、ASO9、ASO10、ASO11、ASO20和ASO26缀合的抗TfR1Fab(3M12-VH4/VK3)的缀合物。ASO32、ASO2、ASO8、ASO9、ASO10、ASO11、ASO20和ASO26是具有不同修饰模式的间隔聚体(参见表8)。将人RD细胞暴露于ASO浓度为4nM、20nM、100nM或500nM的ASO32-缀合物、ASO10-缀合物、ASO8-缀合物、ASO9-缀合物、ASO11-缀合物、ASO20-缀合物、ASO26-缀合物和ASO2-缀合物，并评价DMPK表达水平以确定寡核苷酸敲低DMPK表达的能力。所有测试的寡核苷酸-缀合物均能够以剂量依赖性方式降低DMPK的表达。在500nM寡核苷酸浓度下，ASO10-缀合物能够将DMPK表达降低约80％，ASO8-缀合物能够将DMPK表达降低约70％，ASO9-缀合物能够将DMPK表达降低约60％(图8A)，ASO11-缀合物能够将DMPK表达降低约40％，ASO20-缀合物能够将DMPK表达降低约40％，ASO26-缀合物能够将DMPK表达降低约30％，并且ASO2-缀合物能够将DMPK表达降低约40％(图8B)。

还进行hTfR1 ELISA实验以测量ASO10-缀合物(EC₅₀11nM ASO当量)、ASO8-缀合物(EC₅₀29nM ASO当量)、ASO26-缀合物(EC₅₀1nM ASO当量)和ASO1-缀合物(EC₅₀17nM ASO当量)的EC₅₀。

实施例4.DM1小鼠模型中的包含与DMPK靶向寡核苷酸缀合的抗TfR1 Fab的缀合物的体内活性

在小鼠模型中测试了包含与多种DMPK靶向寡核苷酸缀合的抗TfR1 Fab的缀合物，所述小鼠模型表达人TfR1和含有扩增的CUG重复的人DMPK突变体二者。在第一个实验中，将ASO32与对照抗TfR1 Fab缀合，并在第0天和第7天将缀合物以相当于10mg/kg ASO32的剂量通过静脉注射施用于小鼠。在第14天处死小鼠，并评价多种肌肉组织中人突变体DMPK的表达。结果显示ASO32-缀合物将胫骨前肌中的人突变体DMPK降低36％(图9A)，膈肌中的人突变体DMPK降低46％(图9B)以及心脏中的人突变体DMPK降低42％(图9C)。

此外，在表达人TfR1的小鼠模型中测试了包含抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3缀合的ASO32的缀合物。ASO32-缀合物将胫骨前肌中的小鼠野生型dmpk降低79％(图9D)，腓肠肌中的小鼠野生型dmpk降低76％(图9E)，心脏中的小鼠野生型dmpk降低70％(图9F)以及膈肌中的小鼠野生型dmpk降低88％(图9G)。图9H至9K示出了胫骨前肌、腓肠肌、心脏和膈肌中的ASO32分布。与载剂对照相比，所有组织均显示ASO32水平提高。

在上述同一小鼠模型中测试了ASO10、ASO8、ASO26和ASO1，所述小鼠模型表达人TfR1和含有扩增的CUG重复的人DMPK突变体二者。将ASO32作为对照包括在内，并与对照抗TfR1 Fab缀合。将ASO10、ASO8、ASO26和ASO1与抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3缀合。在第0天和第7天向小鼠注射寡核苷酸，并在第14天将其处死。实验组包括：(i)向表达人TfR1的小鼠注射的载剂对照(n＝4)；(ii)向表达人TfR1和含有扩增的CUG重复的人DMPK突变体二者的小鼠注射的载剂对照(n＝10)；(iii)以相当于2×9.7mg/kg ASO10的剂量，向表达人TfR1和含有扩增的CUG重复的人DMPK突变体二者的小鼠注射的ASO10-缀合物(n＝6)；(iv)以相当于2×9.2mg/kg ASO8的剂量，向表达人TfR1和含有扩增的CUG重复的人DMPK突变体二者的小鼠注射的ASO8-缀合物(n＝5)；(v)以相当于2×12.3mg/kg ASO26的剂量，向表达人TfR1和含有扩增的CUG重复的人DMPK突变体二者的小鼠注射的ASO26-缀合物(n＝6)；和(vi)以相当于2×12.7mg/kg ASO1的剂量，向表达人TfR1和含有扩增的CUG重复的人DMPK突变体二者的小鼠注射的ASO1-缀合物(n＝6)。一旦小鼠被处死，即在多种肌肉组织中评价人突变体DMPK表达。图10A显示，ASO32-缀合物将心脏中的人突变体DMPK降低42％，ASO10-缀合物将心脏中的人突变体DMPK降低60％，ASO8-缀合物将心脏中的人突变体DMPK降低67％，ASO26-缀合物将心脏中的人突变体DMPK降低49％；并且ASO1-缀合物将心脏中的人突变体DMPK降低15％。图10B显示，ASO32-缀合物将膈肌中的人突变体DMPK降低46％，ASO10-缀合物将膈肌中的人突变体DMPK降低56％，ASO8-缀合物将膈肌中的人突变体DMPK降低58％，ASO26-缀合物将膈肌中的人突变体DMPK降低38％；并且ASO1-缀合物将膈肌中的人突变体DMPK降低35％。图10C显示，ASO32-缀合物将腓肠肌中的人突变体DMPK降低25％，ASO10-缀合物将腓肠肌中的人突变体DMPK降低39％，ASO8-缀合物将腓肠肌中的人突变体DMPK降低42％，ASO26-缀合物将腓肠肌中的人突变体DMPK降低26％；并且ASO1-缀合物显示没有降低腓肠肌中的人突变体DMPK。图10D显示ASO32-缀合物将胫骨前肌中的人突变体DMPK降低36％，ASO10-缀合物将胫骨前肌中的人突变体DMPK降低54％，ASO8-缀合物将胫骨前肌中的人突变体DMPK降低51％，ASO26-缀合物将胫骨前肌中的人突变体DMPK降低52％；并且ASO1-缀合物将胫骨前肌中的人突变体DMPK降低6％。此外，以相当于10mg/kg ASO10的剂量施用的ASO10-缀合物减少了小鼠心脏中的核病灶(图10E)。

此外，尽管受试的寡核苷酸和鼠野生型Dmpk之间存在一个核苷酸错配，但寡核苷酸能够降低上述小鼠模型中的鼠Dmpk表达。图11A显示ASO32-缀合物将心脏中的小鼠Dmpk降低73％，ASO10-缀合物将心脏中的小鼠Dmpk降低47％，ASO8-缀合物将心脏中的小鼠Dmpk降低53％，ASO26-缀合物将心脏中的小鼠Dmpk降低38％；并且ASO1-缀合物将心脏中的小鼠Dmpk降低12％。图11B显示ASO32-缀合物将膈肌中的小鼠Dmpk降低75％，ASO10-缀合物将膈肌中的小鼠Dmpk降低51％，ASO8-缀合物将膈肌中的小鼠Dmpk降低27％，ASO26-缀合物将膈肌中的小鼠Dmpk降低32％；并且ASO1-缀合物将膈肌中的小鼠Dmpk降低40％。图11C显示ASO32-缀合物将腓肠肌中的小鼠Dmpk降低69％，ASO10-缀合物将腓肠肌中的小鼠Dmpk降低33％，ASO8-缀合物将腓肠肌中的小鼠Dmpk降低22％，并且ASO26-缀合物和ASO1-缀合物显示没有降低腓肠肌中的小鼠Dmpk。图11D显示，ASO32-缀合物将胫骨前肌中的小鼠Dmpk降低68％，ASO10-缀合物将胫骨前肌中的小鼠Dmpk降低40％，ASO8-缀合物将胫骨前肌中的小鼠Dmpk降低32％，ASO26-缀合物将胫骨前肌中的小鼠Dmpk降低28％；并且ASO1-缀合物显示没有降低胫骨前肌中的小鼠Dmpk。

通过杂交ELISA(Burki et al.，Nucleic Acid Ther.2015 Oct；25(5)：275-84，通过引用并入本文中)测试寡核苷酸的组织暴露，并对组织中的ASO水平作图。图12A至12D分别示出了在注射之后两周，心脏、膈肌、腓肠肌或胫骨前肌中的ASO10、ASO8、ASO26和ASO1的量。

在表达人TfR1和含有扩增的CUG重复的人DMPK突变体二者的同一小鼠模型中，测试了包含与ASO1缀合的对照抗TfR1 Fab的缀合物的长期作用。在第0天和第7天向小鼠注射相当于10mg/kg ASO1的剂量的ASO1-缀合物。在注射之后两周处死一些小鼠，并且在注射之后四周处死其余小鼠。在多种肌肉组织中测试了人突变体DMPK和鼠Dmpk表达水平。图13A显示ASO1-缀合物在注射之后两周将心脏中的人突变体DMPK敲低9％，并且在注射之后四周敲低15％。图13B显示ASO1-缀合物在注射之后两周将膈肌中的人突变体DMPK敲低19％，并且在注射之后四周敲低34％。图13C显示ASO1-缀合物在注射之后两周将腓肠肌中的人突变体DMPK敲低7％，并且在注射之后四周敲低17％。图13D显示ASO1-缀合物在注射之后两周将胫骨前肌中的人突变体DMPK敲低6％，并且在注射之后四周敲低0％。图14A显示ASO1-缀合物在注射之后两周将心脏中的小鼠Dmpk敲低8％，并且在注射之后四周敲低13％。图14B显示ASO1-缀合物在注射之后两周将膈肌中的小鼠Dmpk敲低14％，并且在注射之后四周敲低33％。图14C显示ASO1-缀合物在注射之后两周将腓肠肌中的小鼠Dmpk敲低0％，并且在注射之后四周敲低6％。图14D显示ASO1-缀合物在注射之后两周和在注射之后四周没有敲低胫骨前肌中的小鼠Dmpk。在注射之后4周心脏、膈肌、腓肠肌和胫骨前肌中ASO1的量显示在图15A至15D中。

此外，在同一小鼠模型中测试了包含与ASO1缀合的对照抗TfR1 Fab的缀合物，所述小鼠模型表达人TfR1和含有扩增的CUG重复的人DMPK突变体二者，但使用不同的注射/处死方案。在该实验中，在第0天、第7天、第14天和第21天，将ASO1-缀合物以相当于12.7mg/kgASO1的剂量向小鼠注射。在注射之后五周处死小鼠。在多种肌肉组织中测试了人突变体DMPK和小鼠Dmpk表达水平。图16A显示在注射之后五周，ASO1-缀合物将心脏中的人突变体DMPK敲低5％。图16B显示在注射之后五周，ASO1-缀合物将膈肌中的人突变体DMPK敲低35％。图16C显示在注射之后五周，ASO1-缀合物显示没有敲低腓肠肌中的人突变体DMPK。图16D显示在注射之后五周，ASO1-缀合物显示没有敲低胫骨前肌中的人突变体DMPK。图17A显示在注射之后五周，ASO1-缀合物将心脏中的小鼠Dmpk敲低13％。图17B显示在注射之后五周，ASO1-缀合物将膈肌中的小鼠Dmpk敲低41％。图17C显示在注射之后五周，ASO1-缀合物将腓肠肌中的小鼠Dmpk敲低5％。图17D显示在注射之后五周，ASO1-缀合物将胫骨前肌中的小鼠Dmpk敲低10％。在注射之后五周心脏、膈肌、腓肠肌和胫骨前肌中ASO1的量显示在图18A至18D中。

测试了包含与ASO9缀合的抗TfR1 Fab(3M12-VH4/VK3)的缀合物在表达人TfR1和含有扩增的CUG重复的人DMPK突变体二者的同一小鼠模型中降低DMPK表达的效力。在第0天和第7天将ASO9-缀合物以相当于10mg/kg ASO9的剂量向小鼠注射。在注射之后两周处死小鼠。在多种肌肉组织中测试了人突变体DMPK和小鼠Dmpk表达水平。图19A显示在注射之后两周，ASO9-缀合物将心脏中的人突变体DMPK敲低50％。图19B显示在注射之后两周，ASO9-缀合物将膈肌中的人突变体DMPK敲低58％。图19C显示在注射之后两周，ASO9-缀合物将胫骨前肌中的人突变体DMPK敲低30％。图19D显示在注射之后两周，ASO9-缀合物将腓肠肌中的人突变体DMPK敲低35％。图20A显示在注射之后两周，ASO9-缀合物将心脏中的小鼠Dmpk敲低48％。图20B显示在注射之后两周，ASO9-缀合物将膈肌中的小鼠Dmpk敲低68％。图20C显示在注射之后两周，ASO9-缀合物将腓肠肌中的小鼠Dmpk敲低45％。图20D显示在注射之后两周，ASO9-缀合物将胫骨前肌中的小鼠Dmpk敲低20％。在注射之后2周心脏、膈肌、腓肠肌和胫骨前肌中ASO9的量显示在图21A至21D中。

测试了包含与ASO10缀合的抗TfR1 Fab(3M12-VH4/VK3)的缀合物在表达人TfR1和含有扩增的CUG重复的人DMPK突变体二者的小鼠模型中降低DMPK表达的效力。在第0天通过尾静脉注射将ASO10缀合物以相当于5mg/kg、10mg/kg或20mg/kg ASO10的剂量向小鼠注射。在注射之后28天处死小鼠。在多种肌肉组织中测试了人突变体DMPK表达水平。图24A显示，在注射之后28天测试的所有测量下，ASO10-缀合物敲低了心脏中的人突变体DMPK。图24B显示在注射之后28天测试的所有测量下，ASO10-缀合物敲低了膈肌中的人突变体DMPK。图24C显示在注射之后28天测试的所有剂量下，ASO10-缀合物敲低了腓肠肌中的人突变体DMPK。图24D显示在注射之后28天测试的所有测量下，ASO10-缀合物敲低了胫骨前肌中的人突变体DMPK。

此外，亚细胞分级随后小鼠的核级分中的基因表达的分析显示，ASO10递送至核并且ASO10-缀合物减少了被捕获在核中的突变体人DMPK mRNA的积累，所述小鼠注射有相当于10mg/kg ASO10的剂量ASO10-缀合物。来自注射有载剂对照的小鼠的腓肠肌的亚细胞分级显示，突变体人DMPK被捕获在肌细胞的核中(图25A)。将Malat1用作核RNA标志物(图25B)，并且将Birc5和Gapdh用作胞质RNA标志物(图25C和图25D)。通过用于核和胞质蛋白标志物的western印迹来确认该级分的纯度——核蛋白标志物组蛋白H3仅存在于核级分中(图25E)，并且胞质蛋白标志物GAPDH仅存在于胞质级分中(图25F)。来自注射有ASO10-缀合物的小鼠的腓肠肌的亚细胞分级显示，ASO10降低了总组织提取物中的突变体人DMPK(图25G)，并且在腓肠肌细胞的核级分中的敲低是稳健的(图25H)。

实施例5.包含与DMPK靶向寡核苷酸缀合的抗TfR1 Fab的缀合物在食蟹猴中的体内活性

还在非人灵长类(NHP)食蟹猴(cyno)中测试了包含与ASO1缀合的对照抗TfR1 Fab的缀合物。在第0天和第7天用剂量相当于10mg/kg ASO1的ASO1-缀合物处理食蟹猴，并在注射之后7周处死。在多种肌肉组织中测试了DMPK表达。图22A显示在注射之后七周，ASO1-缀合物将心脏中的DMPK敲低10％。图22B显示在注射之后七周，ASO1-缀合物显示没有敲低膈肌中的DMPK。图22C显示在注射之后七周，ASO1-缀合物将腓肠肌中的DMPK敲低29％。图22D显示在注射之后七周，ASO1-缀合物将胫骨前肌中的DMPK敲低31％。在注射之后7周心脏、膈肌、腓肠肌和胫骨前肌中ASO1的量显示在图23A至23D中。

还在食蟹猴(cyno)中测试了包含与ASO10或ASO26缀合的抗TfR1 Fab 3M12-VH4/VK3的缀合物。将剂量相当于1mg/kg、5mg/kg或10mg/kg的ASO10或ASO26的ASO10-缀合物或ASO26-缀合物通过静脉输注分别施用于食蟹猴。在施用之后28天处死食蟹猴。评价心脏、膈肌、腓肠肌和胫骨前肌中的ASO组织水平。结果显示，ASO10和ASO26以剂量依赖性方式存在于组织中(图26A至26D为ASO10，以及图26E至26H为ASO26)。在多种肌肉组织中测试了野生型食蟹猴DMPK表达水平。数据显示ASO10-缀合物在非人灵长类的心脏和骨骼肌细胞二者中均是有活性的，因为ASO10-缀合物降低了心脏、膈肌、腓肠肌和胫骨前肌中的野生型DMPK(图27A至27D)。ASO26在骨骼肌中是有活性的，但在心脏中显示是无活性的(图27A至27D)。将剂量相当于10mg/kg寡核苷酸的ASO10缀合物和ASO26-缀合物的数据也与和对照抗TfR1抗体缀合的ASO32一起作图，以显示ASO10-缀合物在敲低心肌和骨骼肌组织中的DMPK中具有稳健活性，而ASO26缀合物在敲低骨骼肌组织中的DMPK中是有活性的(图28A至28D)。

实施例6.在重复给药抗TfR1 Fab-AS010-缀合物之后4周时hTfR1/DMSXL纯合小鼠中毒性人DMPK的持续敲低

在小鼠模型中测试了包含与DMPK靶向寡核苷酸ASO10共价连接的抗TfR1 Fab(3M12 VH4Nk3)的缀合物(“抗TfR1 Fab-ASO10缀合物”)，所述小鼠模型表达人TfR1和两个拷贝的含有扩增的CUG重复的突变体人DMPK转基因二者(hTfR1/DMSXL小鼠)。在第0天和第7天向小鼠施用载剂对照(PBS)或10mg/kg ASO10当量剂量的抗TfR1 Fab-ASO10-缀合物。在第28天(在施用第一剂量的抗TfR1 Fab-ASO10缀合物之后4周)处死小鼠，并收集组织。提取RNA并将所选的组织样品进行固定，石蜡包埋并切片，然后进行原位杂交。进行RNA样品的逆转录-定量聚合酶链反应(RT-qPCR)以测量人DMPK和小鼠Ppib(肽基脯氨酰基异构酶)(作为内部对照)。DMPK表达在图29A至29D中显示为几何平均值+/-标准偏差(n＝6至9)。通过Student’s t检验评估显著性(****P＜0.0001)。

图29A显示，相对于经PBS处理的小鼠，抗TfR1 Fab-ASO10缀合物将心脏中的DMPK表达敲低49％。图29B显示，相对于经PBS处理的小鼠，抗TfR1 Fab-ASO10缀合物将膈肌中的DMPK表达敲低40％。图29C显示，相对于经PBS处理的小鼠，抗TfR1 Fab-ASO10缀合物将胫骨前肌中的DMPK表达敲低49％。图29D显示，相对于经PBS处理的小鼠，抗TfR1 Fab-ASO10缀合物将腓肠肌中的DMPK表达敲低44％。

图30A和30B显示抗TfR1 Fab-ASO10缀合物减少了肌纤维核内的DMPK病灶。图30A通过原位杂交示出了减少的DMPK病灶以及图30B示出了荧光显微术图像中DMPK病灶的量化，这表明缀合物将病灶面积减少了49％。数据表示为平均值+/-标准偏差(n＝7)。通过t检验评估显著性(*P＜0.05)。

这些结果表明，施用抗TfR1 Fab-ASO10缀合物导致心肌和骨骼肌中人毒性DMPK的稳健且持续的敲低。

实施例7.抗TfR1 Fab-ASO10缀合物对hTfR1/DMSXL纯合小鼠中剪接缺陷的校正

在小鼠模型中测试了包含与DMPK靶向寡核苷酸ASO10共价连接的抗TfR1 Fab(3M12 VH4/Vk3)的缀合物(抗TfR1 Fab-ASO10-缀合物)，所述小鼠模型表达人TfR1和两个拷贝的含有扩增的CUG重复的突变体人DMPK转基因二者(“hTfR1/DMSXL”)。已知这些小鼠表现出与在患有DM1的患者中观察到的一致的剪接缺陷(Huguet，et a1.(2012)PLOSGenetics 8(11)：e1003043)。在第0天和第7天，向小鼠施用载剂对照(“htfR1/DMSXL-PBS”)或10mg/kg ASO10当量剂量的抗TfR1 Fab-ASO10缀合物(“hTfR1/DMSXL-缀合物”)。将仅表达人TfR1但不表达突变体人DMPK转基因的小鼠(hTfR1小鼠)和用PBS处理的小鼠(“hTfR1-PBS”)用作另一对照，以确定hTfR1/DMSXL小鼠中剪接表型的程度并评估缀合物对剪接的影响程度。在第28天(在施用第一剂量的抗TfR1 Fab-ASO10缀合物之后4周)处死小鼠，收集组织并提取RNA。进行逆转录-定量聚合酶链反应(RT-qPCR)以测量已知在人和小鼠的DM1进展期间被错误剪接的一组RNA中的外显子包涵(Nakamori，et al.(2013)Ann.Neurol.74(6)：862-872；Huguet，et al.(2012)PLOS Genetics 8(11)：e1003043)。将外显子包涵计算作为每个剪接RNA标志物的归一化的剪接百分比(percent spliced in，PSI)，并使用来自心脏(图31)、膈肌(图32)、胫骨前肌(图33)和腓肠肌(图34)中的剪接标志物的经归一化PSI值来计算复合剪接指数。复合剪接指数如前所述计算(Tanner MK，et al.(2021)Nucleic AcidsRes.49：2240-2254)，并显示为平均值+/-标准偏差。

图31示出了抗TfR1 Fab-ASO10缀合物校正了hTfR1/DMSXL小鼠心脏组织中的剪接，如复合剪接指数数据所示。用于产生复合剪接指数数据的经归一化PSI值显示出用抗TfR1 Fab-ASO10-缀合物的处理对hTfR1/DMSXL小鼠的心脏组织中的Mbnl2外显子6(E6)和Nfix E7剪接的校正，但未显示Ldb3E11剪接的校正。图31中示出的复合剪接指数数据基于Ldb3 E11、Mbnl2 E6和Nfix E7剪接数据；Bin1 E11、Dtna E12、Insr E11和Mbnl2 E5没有包括在内，因为在测试的实验条件下，相对于hTfR1小鼠，它们在心脏组织中的经归一化PSI值在hTfR1/DMSXL小鼠中没有改变。

图32示出了抗TfR1 Fab-ASO10缀合物校正了hTfR1/DMSXL小鼠的膈肌组织中的剪接，如复合剪接指数数据所示。用于产生复合剪接指数数据的经归一化PSI值显示出用抗TfR1 Fab-ASO10缀合物的处理对hTfR1/DMSXL小鼠的膈肌组织中的Bin1 E11、Insr E11、Ldb3 E11和Nfix E7剪接的校正。图32中示出的复合剪接指数数据基于Bin1 E11、InsrE11、Ldb3 E11和Nfix E7剪接数据；Dtna E12、Mbnl2 E5、Mbnl2 E6和Ttn E313不包括在内，因为在测试的实验条件下，相对于hTfR1小鼠，它们在膈肌组织中的经归一化PSI值在hTfR1/DMSXL小鼠中没有改变。

图33示出了抗TfR1 Fab-ASO10缀合物校正了hTfR1/DMSXL小鼠胫骨前肌组织中的剪接，如复合剪接指数数据所示。用于产生复合剪接指数数据的经归一化PSI值显示出用抗TfR1 Fab-ASO10缀合物的处理对hTfR1/DMSXL小鼠的胫骨前肌组织中的Bin1 E11、Ldb3E11和Nfix E7剪接的校正，但未显示Mbnl2 E6剪接的校正。图33中示出的复合剪接指数数据基于Bin1 E11、Ldb3 E11、Mbnl2 E6和Nfix E7剪接数据；Dtna E12、Insr E11、Mbnl2 E5和Ttn E313不包括在内，因为在测试的实验条件下，相对于hTfR1小鼠，它们在胫骨前肌组织中的经归一化PSI值在hTfR1/DMSXL小鼠中没有改变。

图34示出了抗TfR1 Fab-ASO10缀合物校正了hTfR1/DMSXL小鼠的腓肠肌组织中的剪接，如复合剪接指数数据所示。用于产生复合剪接指数数据的经归一化PSI值显示出用抗TfR1 Fab-ASO10缀合物的处理对hTfR1/DMSXL小鼠的腓肠肌组织中的Mbnl2 E6、Nfix E7和Ttn E313剪接的校正。图34中示出的复合剪接指数数据基于Mbnl2 E6、Nfix E7和Ttn E313剪接数据；Bin1 E11、Dtna E12、Insr E11、Ldb3 E11和Mbnl2 E5不包括在内，因为在测试的实验条件下，相对于hTfR1小鼠，它们在腓肠肌组织中的经归一化PSI值在hTfR1/DMSXL小鼠中没有改变。

这些结果表明抗TfR1 Fab-ASO10缀合物的施用有助于心肌和骨骼肌中的DM1剪接缺陷的校正。

实施例8.非人灵长类和DM1患者肌管中的DMPK敲低

在人DM1患者肌管(32F细胞)和非人灵长类(NHP)肌管中测试了包含与DMPK靶向寡核苷酸ASO10共价连接的抗TfR1 Fab(3M12 VH4/Vk3)的缀合物(抗TfR1 Fab-ASO10缀合物)。使用的DM1患者肌管表达含有380个CUG重复的突变体DMPK mRNA和野生型DMPK mRNA二者。使用的NHP肌管仅表达野生型DMPK。

将DM1患者细胞或NHP细胞以50,000个细胞/孔的密度接种到生长培养基中的96孔板中并使其其过夜恢复。第二天，将生长培养基更换成低血清分化培养基，并用浓度相当于125nM、250nM或500nM ASO10的缀合物处理细胞。将细胞孵育10天，然后使用Cells-to-Ct试剂盒合成cDNA，其中将粗细胞裂解物作为总RNA的来源。

将cDNA用于使用Taqman PCR评估总DMPK敲低。将数据归一化为PPIB表达，并使用2^-ΔΔCt法来确定与PBS处理的对照(“载剂”)相比的DMPK敲低。图35中显示的数据表示为相对于物种匹配的载剂对照的平均值DMPK表达+标准偏差(每种条件n＝4个重复)。

结果显示，当以生理相关浓度处理时，抗TfR1 Fab-ASO10缀合物在WT NHP肌管和DM1患者肌管二者中均实现了DMPK表达的敲低，其中与NHP细胞(仅表达野生型DMPK mRNA)相比，在DM1患者细胞(表达含有380个CUG重复的DMPK mRNA和野生型DMPK mRNA二者)中DMPK表达的敲低程度更高(图35)。在125nM的ASO10的等效浓度下，相对于仅载剂的对照，缀合物在NHP肌管中实现了约40％DMPK敲低，并且在DM1患者肌管中实现了约65％DMPK敲低。在250nM的ASO10等效浓度下，相对于仅载剂的对照，缀合物在NHP肌管中实现了约45％DMPK敲低，并且在DM1患者肌管中实现了约80％DMPK敲低。在500nM的ASO10等效浓度下，相对于仅载剂的对照，缀合物在NHP肌管中实现了约60％DMPK敲低，并且在DM1患者肌管中实现了约90％DMPK敲低。

这些结果表明，相对于表达野生型DMPK的食蟹猴肌管，包含与DMPK靶向寡核苷酸共价连接的抗TfR1 Fab的缀合物可在表达野生型DMPK mRNA和突变体DMPK mRNA(具有扩增的CUG重复)的人肌管中实现更大程度的DMPK敲低。

另外的实施方案

1.复合物，其包含与反义寡核苷酸共价连接的肌肉靶向剂，所述反义寡核苷酸被配置成用于抑制包含疾病相关重复的DMPK等位基因的表达或活性，其中所述反义寡核苷酸的长度为15至20个核苷酸，所述反义寡核苷酸包含SEQ ID NO：160至172和202的任一个的至少15个连续核苷的互补区，并且包含5’-X-Y-Z-3’构型，其中

2.实施方案1所述的复合物，其中所述肌肉靶向剂包含抗转铁蛋白受体1(TfR1)抗体。

3.实施方案1或实施方案2所述的复合物，其中反义寡核苷酸包含SEQ ID NO：174、177、179至182和184至192中的任一个的核苷酸序列。

4.实施方案1至3中任一项所述的复合物，其中X中的每个核苷是2’-经修饰核苷和/或Z中的每个核苷是2’-经修饰核苷，任选地其中每个2’-经修饰核苷独立地是2’-4’双环核苷或非双环2’-经修饰核苷。

5.实施方案1至4中任一项所述的复合物，其中X中的每个核苷是非双环2’-经修饰核苷和/或Z中的每个核苷是非双环2’-经修饰核苷，任选地其中非双环2’-经修饰核苷是2’-MOE修饰的核苷。

6.实施方案1至4中任一项所述的复合物，其中X中的每个核苷是2’-4’双环核苷和/或Z中的每个核苷是2’-4’双环核苷，任选地其中2’-4’双环核苷选自LNA、cEt和ENA。

7.实施方案1至4中任一项所述的复合物，其中X包含至少一个2’-4’双环核苷和至少一个非双环2’-经修饰核苷，和/或Z包含至少一个2’-4’双环核苷和至少一个非双环2’-经修饰核苷，任选地其中至少一个非双环2’-经修饰核苷是2’-MOE修饰的核苷，并且至少一个2’-4’双环核苷选自LNA、cEt和ENA。

8.实施方案1至7中任一项所述的复合物，其中所述反义寡核苷酸包含以下的5’-X-Y-Z-3’构型：

9.实施方案1至8中任一项所述的复合物，其中所述反义寡核苷酸包含一个或更多个硫代磷酸酯核苷间键联。

10.实施方案1至9中任一项所述的复合物，其中所述反义寡核苷酸中的每个核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联。

11.实施方案1至9中任一项所述的复合物，其中反义寡核苷酸包含一个或更多个磷酸二酯核苷间键联，任选地其中所述磷酸二酯核苷间键联在X和或Z中。

12.实施方案1至3中任一项所述的复合物，其中所述反义寡核苷酸选自：

+C*+A*oG*oC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*oG*oU*+C*+A(SEQ ID NO：179)，

+C*+A*+G*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*+U*+C*+A(SEQ ID NO：179)，

oC*oA*oG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oU*oC*oA(SEQ ID NO：179)，

oG*oC*oG*oU*oA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oU*oG*oC*oC*oC(SEQ IDNO：185)，

oC*oC*oC*oA*oG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oU*oC*oA*oC*oA(SEQ IDNO：174)，

oC*oC*oA*oU*oC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oU*oC*oC*oG*oC(SEQ IDNO：186)，

+G*+U*+A*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*+U*+G*+C(SEQ ID NO：187)，

+G*+U*oA*oG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*oC*oU*+G*+C(SEQ ID NO：187)，

+C*+G*oU*oA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*oU*oC*+U*+G(SEQ ID NO：177)，

+U*+A*oG*oA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oU*oG*+C*+C(SEQ ID NO：188)，

+C*+C*oA*oG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*oA*oG*+U*+C(SEQ ID NO：180)，

+A*+G*oC*oG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oU*oC*+A*+C(SEQ ID NO：181)，

+A*+U*+C*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*+U*+C*+C(SEQ ID NO：189)，

+C*+A*oU*oC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*oA*oA*+U*+C(SEQ ID NO：190)，

+A*+U*oC*oU*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*oA*oU*+C*+C(SEQ ID NO：182)，

+U*+C*oU*oC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oU*oC*+C*+G(SEQ ID NO：184)，

oG*oU*oA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oU*oG*oC(SEQ ID NO：187)，

oA*oU*oC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oU*oC*oC(SEQ ID NO：189)，

+G*+C*oG*oU*oA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oU*oG*oC*+C*+C(SEQ IDNO：185)，

+C*+C*oC*oA*oG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oU*oC*oA*+C*+A(SEQ IDNO：174)，

+C*+C*oA*oU*oC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oU*oC*oC*+G*+C(SEQ IDNO：186)，

oG*oCoG*oUoA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oUoG*oCoC*oC(SEQ ID NO：185)，

oC*oCoC*oAoG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oUoC*oAoC*oA(SEQ ID NO：174)，

oC*oCoA*oUoC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oUoC*oCoG*oC(SEQ ID NO：186)，

oG*oCoGoUoA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oUoGoCoC*oC(SEQ ID NO：185)，

oC*oCoCoAoG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oUoCoAoC*oA(SEQ ID NO：174)，

oC*oCoAoUoC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oUoCoCoG*oC(SEQ ID NO：186)，

oGoC*oGoU*oAdG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oUoG*oCoC(SEQ ID NO：191)和

oGoC*oGoU*oAdG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oU*oG(SEQ ID NO：192)，

13.实施方案2至12中任一项所述的复合物，其中所述抗TfR1抗体包含表2中列出的任何抗TfR1抗体的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)、重链互补决定区3(CDR-H3)、轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)、轻链互补决定区3(CDR-L3)。

14.实施方案2至13中任一项所述的复合物，其中所述抗TfR1抗体包含表3中列出的任何抗TfR1抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。

15.实施方案2至13中任一项所述的复合物，其中所述抗TfR1抗体是Fab，任选地其中所述Fab包含表5中列出的任何抗TfR1 Fab的重链和轻链。

16.实施方案1至15中任一项所述的复合物，其中所述肌肉靶向剂和所述反义寡核苷酸通过接头共价连接，任选地其中所述接头包含缬氨酸-瓜氨酸二肽。

17.降低肌细胞中DMPK表达的方法，所述方法包括使肌细胞与用于促进其反义寡核苷酸内化到肌细胞中的有效量的实施方案1至16中任一项所述的复合物接触。

18.治疗1型强直性肌营养不良(DM1)的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用有效量的实施方案1至16中任一项所述的复合物。

19.实施方案18所述的方法，其中施用所述复合物导致DMPK mRNA降低至少30％。

20.实施方案18所述的方法，其中施用所述复合物导致在所述对象中的肌细胞核中的突变体DMPK mRNA降低。

21.反义寡核苷酸，其选自以下：

+C*+A*oG*oC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*oG*oU*+C*+A(SEQ ID NO：179)，

+C*+A*+G*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*+U*+C*+A(SEQ ID NO：179)，

oC*oA*oG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oU*oC*oA(SEQ ID NO：179)，

oG*oC*oG*oU*oA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oU*oG*oC*oC*oC(SEQ IDNO：185)，

oC*oC*oC*oA*oG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oU*oC*oA*oC*oA(SEQ IDNO：174)，

+G*+U*+A*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*+U*+G*+C(SEQ ID NO：187)，

+G*+U*oA*oG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*oC*oU*+G*+C(SEQ ID NO：187)，

+C*+G*oU*oA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*oU*oC*+U*+G(SEQ ID NO：177)，

+U*+A*oG*oA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oU*oG*+C*+C(SEQ ID NO：188)，

+C*+C*oA*oG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*oA*oG*+U*+C(SEQ ID NO：180)，

+A*+G*oC*oG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oU*oC*+A*+C(SEQ ID NO：181)，

+A*+U*+C*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*+U*+C*+C(SEQ ID NO：189)，

+C*+A*oU*oC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*oA*oA*+U*+C(SEQ ID NO：190)，

+A*+U*oC*oU*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*oA*oU*+C*+C(SEQ ID NO：182)，

+U*+C*oU*oC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oU*oC*+C*+G(SEQ ID NO：184)，

oG*oU*oA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oU*oG*oC(SEQ ID NO：187)，

oA*oU*oC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oU*oC*oC(SEQ ID NO：189)，

+G*+C*oG*oU*oA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oU*oG*oC*+C*+C(SEQ IDNO：185)，

+C*+C*oC*oA*oG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oU*oC*oA*+C*+A(SEQ IDNO：174)，

oG*oCoG*oUoA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oUoG*oCoC*oC(SEQ ID NO：185)，

oC*oCoC*oAoG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oUoC*oAoC*oA(SEQ ID NO：174)，

oC*oCoA*oUoC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oUoC*oCoG*oC(SEQ ID NO：186)，

oG*oCoGoUoA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oUoGoCoC*oC(SEQ ID NO：185)，

oC*oCoCoAoG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oUoCoAoC*oA(SEQ ID NO：174)，

oC*oCoAoUoC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oUoCoCoG*oC(SEQ ID NO：186)，

oGoC*oGoU*oAdG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oUoG*oCoC(SEQ ID NO：191)和

oGoC*oGoU*oAdG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oU*oG(SEQ ID NO：192)，

22.实施方案21所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸选自：

NH₂-(CH₂)₆-+C*+A*oG*oC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*oG*oU*+C*+A(SEQ ID NO：179)，

NH₂-(CH₂)₆-+C*+A*+G*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*+U*+C*+A(SEQ ID NO：179)，

NH₂-(CH₂)₆-oC*oA*oG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oU*oC*oA(SEQ ID NO：179)，

NH₂-(CH₂)₆-oG*oC*oG*oU*oA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oU*oG*oC*oC*oC(SEQ ID NO：185)，

NH₂-(CH₂)₆-oC*oC*oC*oA*oG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oU*oC*oA*oC*oA(SEQ ID NO：174)，

NH₂-(CH₂)₆-oC*oC*oA*oU*oC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oU*oC*oC*oG*oC(SEQ ID NO：186)，

NH₂-(CH₂)₆-+G*+U*+A*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*+U*+G*+C(SEQ ID NO：187)，

NH₂-(CH₂)₆-+G*+U*oA*oG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*oC*oU*+G*+C(SEQ ID NO：187)，

NH₂-(CH₂)₆-+C*+G*oU*oA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*oU*oC*+U*+G(SEQ ID NO：177)，

NH₂-(CH₂)₆-+U*+A*oG*oA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oU*oG*+C*+C(SEQ ID NO：188)，

NH₂-(CH₂)₆-+C*+C*oA*oG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*oA*oG*+U*+C(SEQ ID NO：180)，

NH₂-(CH₂)₆-+A*+G*oC*oG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oU*oC*+A*+C(SEQ ID NO：181)，

NH₂-(CH₂)₆-+A*+U*+C*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*+U*+C*+C(SEQ IDNO：189)，

NH₂-(CH₂)₆-+C*+A*oU*oC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*oA*oA*+U*+C(SEQ IDNO：190)，

NH₂-(CH₂)₆-+A*+U*oC*oU*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*oA*oU*+C*+C(SEQ IDNO：182)，

NH₂-(CH₂)₆-+U*+C*oU*oC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oU*oC*+C*+G(SEQ ID NO：184)，

NH₂-(CH₂)₆-oG*oU*oA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oU*oG*oC(SEQ ID NO：187)，

NH₂-(CH₂)₆-oA*oU*oC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oU*oC*oC(SEQ IDNO：189)，

NH₂-(CH₂)₆-+G*+C*oG*oU*oA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oU*oG*oC*+C*+C(SEQ ID NO：185)，

NH₂-(CH₂)₆-+C*+C*oC*oA*oG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oU*oC*oA*+C*+A(SEQ ID NO：174)，

NH₂-(CH₂)₆-+C*+C*oA*oU*oC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oU*oC*oC*+G*+C(SEQ ID NO：186)，

NH₂-(CH₂)₆-oG*oCoG*oUoA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oUoG*oCoC*oC(SEQ ID NO：185)，

NH₂-(CH₂)₆-oC*oCoC*oAoG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oUoC*oAoC*oA(SEQ ID NO：174)，

NH₂-(CH₂)₆-oC*oCoA*oUoC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oUoC*oCoG*oC(SEQ ID NO：186)，

NH₂-(CH₂)₆-oG*oCoGoUoA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oUoGoCoC*oC(SEQID NO：185)，

NH₂-(CH₂)₆-oC*oCoCoAoG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oUoCoAoC*oA(SEQID NO：174)，

NH₂-(CH₂)₆-oC*oCoAoUoC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oUoCoCoG*oC(SEQID NO：186)，

NH₂-(CH₂)₆-oGoC*oGoU*oAdG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oUoG*oCoC(SEQ IDNO：191)和

NH₂-(CH₂)₆-oGoC*oGoU*oAdG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oU*oG(SEQ ID NO：192)，

其中“xdC”是5-甲基-脱氧胞苷；“dN”是2’-脱氧核糖核苷；“+N”是LNA核苷；“oN”是2’-MOE修饰的核糖核苷；“oC”是5-甲基-2’-MOE-胞苷；“+C”是5-甲基-2’-4’-双环-胞苷(2’-4’亚甲基桥)；“oU”是5-甲基-2’-MOE-尿苷；“+U’是5-甲基-2’-4’-双环-尿苷(2’-4’亚甲基桥)；“*”表示硫代磷酸酯核苷间键联；以及在核苷之间不存在“*”表示磷酸二酯核苷间键联，并且其中在5’-NH₂-(CH₂)₆-与反义寡核苷酸之间存在磷酸二酯键联。

23.组合物，其包含钠盐形式的实施方案21或实施方案22所述的反义寡核苷酸。

等同方案和术语

本文中举例说明性地描述的公开内容可在不存在本文中未具体公开的任何一个或更多个要素、一个或更多个限制的情况下适当地实践。因此，例如，在本文中的每种情况下，术语“包含/包括”、“基本上由......组成”和“由......组成”中的任一个可用其他两个术语中的任一个替换。已采用的术语和表达作为描述而非限制的术语使用，并且使用这样的术语和表达不旨在排除所示出和所描述的特征的任何等同形式或其一部分，而是应认识到，在所公开内容的范围内可进行多种修改。因此，应理解，尽管已通过一些优选的实施方案、任选的特征具体公开了本公开内容，但是本领域技术人员可获取本文中所公开概念的修改和变化，并且这样的修改和变化被认为是在本公开内容的范围内。

另外，在根据马库什组(Markush group)或其他替代组描述本公开内容的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开内容也因此以马库什组或其他组的任何个体成员或成员亚组的方式描述。

应理解，在一些实施方案中，在描述寡核苷酸或其他核酸的结构时可参考序列表中所示的序列。在这样的实施方案中，实际的寡核苷酸或其他核酸与指定序列相比可具有一个或更多个替代核苷酸(例如，DNA核苷酸的RNA对应物或RNA核苷酸的DNA对应物)和/或者(例如，和)一个或更多个经修饰核苷酸和/或者(例如，和)一个或更多个经修饰核苷酸间键联和/或者(例如，和)一个或更多个其他修饰，同时保留与指定序列基本相同或相似的互补特性。

除非在本文中另外指明或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(尤其是在所附权利要求的上下文中)使用没有数量词修饰的名词将被解释为一个/种或更多个/种。除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”将被解释为开放式术语(即，意指“包括但不限于”)。除非本文中另外指明，否则本文中值范围的记载仅旨在用作分别指代落入该范围内的每个单独值的速记方法，并且每个单独值均被并入说明书中，如同其在本文中被单独记载一样。除非在本文中另外指明或在其他情况下与上下文明显矛盾，否则本文中所述的所有方法均可以以任何合适的顺序进行。除非另有说明，否则本文中提供的任何和所有实例或示例性语言(如“例如”)的使用仅仅旨在更好地说明本发明，并且不对本发明的范围构成限制。说明书中的语言均不应被解释为表示对本发明的实践必要的任何未要求保护的要素。

本文中描述了本发明的一些实施方案。在阅读前述说明之后，那些实施实施方案的变化方案对于本领域普通技术人员可变得明显。

本发明人预期技术人员在适当时采用这样的变化方案，并且本发明人希望以除本文中具体描述的之外的方式实践本发明。因此，如适用法律所允许的，本发明包括在此所附权利要求中记载的主题的所有修改方案和等同方案。此外，除非在本文中另外指明或在其他情况下与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖其所有可能变化方案中的上述要素的任何组合。本领域技术人员将认识到或仅使用常规实验就能够确定本文中所述的本发明的具体实施方案的许多等同方案。这样的等同方案旨在由所附权利要求书涵盖。

Claims

1.复合物，其包含与反义寡核苷酸共价连接的肌肉靶向剂，其中所述反义寡核苷酸的长度为15至20个核苷酸，所述反义寡核苷酸包含SEQ ID NO：166、163、167、160、169、171、202、161、162、170、165、164、172和168的任一个中的至少15个连续核苷的互补区，并且所述反义寡核苷酸包含5’-X-Y-Z-3’构型，其中

2.权利要求1所述的复合物，其中所述肌肉靶向剂包含抗转铁蛋白受体1(TfR1)抗体。

3.权利要求1或权利要求2所述的复合物，其中所述反义寡核苷酸包含SEQ ID NO：179、187、180、185、189、182、191、184、174、186、190、188、177、192和181中的任一个的核苷酸序列。

4.权利要求1至3中任一项所述的复合物，其中X中的每个核苷是2’-经修饰核苷和/或Z中的每个核苷是2’-经修饰核苷，任选地其中每个2’-经修饰核苷独立地是2’-4’双环核苷或非双环2’-经修饰核苷。

5.权利要求1至4中任一项所述的复合物，其中X中的每个核苷是非双环2’-经修饰核苷和/或Z中的每个核苷是非双环2’-经修饰核苷，任选地其中所述非双环2’-经修饰核苷是2’-MOE修饰的核苷。

6.权利要求1至4中任一项所述的复合物，其中X中的每个核苷是2’-4’双环核苷和/或Z中的每个核苷是2’-4’双环核苷，任选地其中所述2’-4’双环核苷选自LNA、cEt和ENA。

7.权利要求1至4中任一项所述的复合物，其中X包含至少一个2’-4’双环核苷和至少一个非双环2’-经修饰核苷，和/或Z包含至少一个2’-4’双环核苷和至少一个非双环2’-经修饰核苷，任选地其中至少一个非双环2’-经修饰核苷是2’-MOE修饰的核苷，并且至少一个2’-4’双环核苷选自LNA、cEt和ENA。

8.权利要求1至7中任一项所述的复合物，其中所述反义寡核苷酸包含以下的5’-X-Y-Z-3’构型：

9.权利要求1至8中任一项所述的复合物，其中所述反义寡核苷酸包含一个或更多个硫代磷酸酯核苷间键联。

10.权利要求1至9中任一项所述的复合物，其中所述反义寡核苷酸中的每个核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联。

11.权利要求1至9中任一项所述的复合物，其中所述反义寡核苷酸包含一个或更多个磷酸二酯核苷间键联，任选地其中所述磷酸二酯核苷间键联在X和或Z中。

12.权利要求1至3中任一项所述的复合物，其中所述反义寡核苷酸包含选自以下的寡核苷酸：

+C*+A*oG*oC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*oG*oU*+C*+A(SEQ ID NO：179)，

+C*+A*+G*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*+U*+C*+A(SEQ ID NO：179)，

oC*oA*oG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oU*oC*oA(SEQ ID NO：179)，

oG*oC*oG*oU*oA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oU*oG*oC*oC*oC(SEQ ID NO：185)，

oC*oC*oC*oA*oG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oU*oC*oA*oC*oA(SEQ ID NO：174)，

oC*oC*oA*oU*oC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oU*oC*oC*oG*oC(SEQ ID NO：186)，

+G*+U*+A*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*+U*+G*+C(SEQ ID NO：187)，

+G*+U*oA*oG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*oC*oU*+G*+C(SEQ ID NO：187)，

+C*+G*oU*oA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*oU*oC*+U*+G(SEQ ID NO：177)，

+U*+A*oG*oA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oU*oG*+C*+C(SEQ ID NO：188)，

+C*+C*oA*oG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*oA*oG*+U*+C(SEQ ID NO：180)，

+A*+G*oC*oG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oU*oC*+A*+C(SEQ ID NO：181)，

+A*+U*+C*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*+U*+C*+C(SEQ ID NO：189)，

+C*+A*oU*oC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*oA*oA*+U*+C(SEQ ID NO：190)，

+A*+U*oC*oU*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*oA*oU*+C*+C(SEQ ID NO：182)，

+U*+C*oU*oC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oU*oC*+C*+G(SEQ ID NO：184)，

oG*oU*oA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oU*oG*oC(SEQ ID NO：187)，

oA*oU*oC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oU*oC*oC(SEQ ID NO：189)，

+G*+C*oG*oU*oA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oU*oG*oC*+C*+C(SEQ ID NO：185)，

+C*+C*oC*oA*oG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oU*oC*oA*+C*+A(SEQ ID NO：174)，

+C*+C*oA*oU*oC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oU*oC*oC*+G*+C(SEQ ID NO：186)，

oG*oCoG*oUoA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oUoG*oCoC*oC(SEQ ID NO：185)，

oC*oCoC*oAoG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oUoC*oAoC*oA(SEQ ID NO：174)，

oC*oCoA*oUoC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oUoC*oCoG*oC(SEQ ID NO：186)，

oG*oCoGoUoA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oUoGoCoC*oC(SEQ ID NO：185)，

oC*oCoCoAoG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oUoCoAoC*oA(SEQ ID NO：174)，

oC*oCoAoUoC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oUoCoCoG*oC(SEQ ID NO：186)，

oGoC*oGoU*oAdG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oUoG*oCoC(SEQ ID NO：191)和

oGoC*oGoU*oAdG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oU*oG(SEQ ID NO：192)，

13.权利要求2至12中任一项所述的复合物，其中所述抗TfR1抗体包含表2中列出的任何抗TfR1抗体的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)、重链互补决定区3(CDR-H3)、轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)、轻链互补决定区3(CDR-L3)。

14.权利要求2至13中任一项所述的复合物，其中所述抗TfR1抗体包含表3中列出的任何抗TfR1抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。

15.权利要求2至13中任一项所述的复合物，其中所述抗TfR1抗体是Fab，任选地其中所述Fab包含表5中列出的任何抗TfR1 Fab的重链和轻链。

16.权利要求2至13中任一项所述的复合物，其中所述抗TfR1抗体包含：

17.权利要求16所述的复合物，其中所述抗TfR1抗体包含含有SEQ ID NO：76的氨基酸序列的VH和包含含有SEQ ID NO：75的氨基酸序列的VL。

18.权利要求17所述的复合物，其中所述抗TfR1抗体是Fab并且包含含有SEQ ID NO：101的氨基酸序列的重链和包含含有SEQ ID NO：90的氨基酸序列的轻链。

19.权利要求1至18中任一项所述的复合物，其中所述肌肉靶向剂和所述反义寡核苷酸通过接头共价连接，任选地其中所述接头包含缬氨酸-瓜氨酸二肽。

20.降低肌细胞中DMPK表达的方法，所述方法包括使所述肌细胞与用于促进其反义寡核苷酸内化到所述肌细胞中的有效量的权利要求1至19中任一项所述的复合物接触。

21.权利要求20所述的方法，其中降低DMPK表达包括降低所述肌细胞中DMPK mRNA的水平，任选地其中所述DMPK mRNA是突变体DMPK mRNA。

22.治疗1型强直性肌营养不良(DM1)的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用有效量的权利要求1至19中任一项所述的复合物。

23.权利要求22所述的方法，其中所述对象具有包含疾病相关CUG重复的突变体DMPK等位基因。

24.权利要求22或权利要求23所述的方法，其中施用所述复合物导致DMPK mRNA降低至少30％。

25.权利要求23或权利要求24所述的方法，其中施用所述复合物导致所述对象中的肌细胞核中的突变体DMPK mRNA降低。

26.反义寡核苷酸，其包含选自以下的寡核苷酸：

+C*+A*oG*oC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*oG*oU*+C*+A(SEQ ID NO：179)，

+C*+A*+G*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*+U*+C*+A(SEQ ID NO：179)，

oC*oA*oG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oU*oC*oA(SEQ ID NO：179)，

+G*+U*+A*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*+U*+G*+C(SEQ ID NO：187)，

+G*+U*oA*oG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*oC*oU*+G*+C(SEQ ID NO：187)，

+C*+G*oU*oA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*oU*oC*+U*+G(SEQ ID NO：177)，

+U*+A*oG*oA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oU*oG*+C*+C(SEQ ID NO：188)，

+C*+C*oA*oG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*oA*oG*+U*+C(SEQ ID NO：180)，

+A*+G*oC*oG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oU*oC*+A*+C(SEQ ID NO：181)，

+A*+U*+C*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*+U*+C*+C(SEQ ID NO：189)，

+C*+A*oU*oC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*oA*oA*+U*+C(SEQ ID NO：190)，

+A*+U*oC*oU*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*oA*oU*+C*+C(SEQ ID NO：182)，

+U*+C*oU*oC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oU*oC*+C*+G(SEQ ID NO：184)，

oG*oU*oA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oU*oG*oC(SEQ ID NO：187)，

oA*oU*oC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oU*oC*oC(SEQ ID NO：189)，

oG*oCoG*oUoA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oUoG*oCoC*oC(SEQ ID NO：185)，

oC*oCoC*oAoG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oUoC*oAoC*oA(SEQ ID NO：174)，

oC*oCoA*oUoC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oUoC*oCoG*oC(SEQ ID NO：186)，

oG*oCoGoUoA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oUoGoCoC*oC(SEQ ID NO：185)，

oC*oCoCoAoG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oUoCoAoC*oA(SEQ ID NO：174)，

oC*oCoAoUoC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oUoCoCoG*oC(SEQ ID NO：186)，

oGoC*oGoU*oAdG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oUoG*oCoC(SEQ ID NO：191)和

oGoC*oGoU*oAdG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oU*oG(SEQ ID NO：192)，

27.权利要求26所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含选自以下的寡核苷酸：

NH₂-(CH₂)₆-+A*+U*+C*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*+U*+C*+C(SEQ ID NO：189)，

NH₂-(CH₂)₆-+C*+A*oU*oC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*oA*oA*+U*+C(SEQ ID NO：190)，

NH₂-(CH₂)₆-+A*+U*oC*oU*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*oA*oU*+C*+C(SEQ ID NO：182)，

NH₂-(CH₂)₆-oA*oU*oC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oU*oC*oC(SEQ ID NO：189)，

NH₂-(CH₂)₆-oG*oCoG*oUoA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oUoG*oCoC*oC(SEQ IDNO：185)，

NH₂-(CH₂)₆-oC*oCoC*oAoG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oUoC*oAoC*oA(SEQ IDNO：174)，

NH₂-(CH₂)₆-oC*oCoA*oUoC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oUoC*oCoG*oC(SEQID NO：186)，

NH₂-(CH₂)₆-oG*oCoGoUoA*dG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oUoGoCoC*oC(SEQ IDNO：185)，

NH₂-(CH₂)₆-oC*oCoCoAoG*xdC*dG*dC*dC*dC*dA*dC*dC*dA*dG*oUoCoAoC*oA(SEQ IDNO：174)，

NH₂-(CH₂)₆-oC*oCoAoUoC*dT*xdC*dG*dG*dC*xdC*dG*dG*dA*dA*oUoCoCoG*oC(SEQ IDNO：186)，

NH₂-(CH₂)₆-oGoC*oGoU*oAdG*dA*dA*dG*dG*dG*xdC*dG*dT*dC*oUoG*oCoC(SEQ ID NO：191)和

其中“xdC”是5-甲基-脱氧胞苷；“dN”是2’-脱氧核糖核苷；“+N”是LNA核苷；“oN”是2’-MOE修饰的核糖核苷；“oC”是5-甲基-2’-MOE-胞苷；“+C”是5-甲基-2’-4’-双环-胞苷(2’-4’亚甲基桥)；“oU”是5-甲基-2’-MOE-尿苷；“+U”是5-甲基-2’-4’-双环-尿苷(2’-4’亚甲基桥)；“*”表示硫代磷酸酯核苷间键联；以及在核苷之间不存在“*”表示磷酸二酯核苷间键联，

并且其中在5’-NH₂-(CH₂)₆-与所述反义寡核苷酸之间存在磷酸二酯键联。

28.组合物，其包含钠盐形式的权利要求26或权利要求27所述的反义寡核苷酸。