CN116368150A - 肌肉靶向复合物及其用于治疗肌养蛋白病的用途 - Google Patents

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罗梅什·R·苏布拉马尼亚
穆罕默德·T·卡塔纳尼
蒂莫西·威登
科迪·A·德雅尔丹
布伦丹·奎因
约翰·纳吉姆
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Abstract

本公开内容的一些方面涉及包含与分子载荷共价连接的肌肉靶向剂的复合物。在一些实施方案中，所述肌肉靶向剂与肌细胞上的内化细胞表面受体特异性结合。在一些实施方案中，所述分子载荷促进功能性肌养蛋白的表达或活性。在一些实施方案中，所述分子载荷是寡核苷酸，例如反义寡核苷酸，例如引起由突变体DMD等位基因表达的mRNA中的外显子跳读的寡核苷酸。

Description

肌肉靶向复合物及其用于治疗肌养蛋白病的用途
相关申请
本申请根据35U.S.C§119(e)要求以下的优先权：2021年1月30日提交的标题为“MUSCLE TARGETING COMPLEXES AND USES THEREOF FOR TREATING DYSTROPHINOPATHIES”的美国临时申请序列No.63/143829；2020年8月23日提交的标题为“MUSCLE TARGETINGCOMPLEXES AND USES THEREOF FOR TREATING DYSTROPHINOPATHIES”的美国临时申请序列No.63/069077；以及2020年7月23日提交的标题为“MUSCLE TARGETING COMPLEXES ANDUSES THEREOF FOR TREATING DYSTROPHINOPATHIES”的美国临时申请序列No.63/055777；其各自的内容均通过引用整体并入本文。
技术领域
本申请涉及用于将分子载荷(例如，寡核苷酸)递送至细胞的靶向复合物及其用途，特别是与疾病治疗相关的用途。
参考作为文本文件通过EFS-Web提交的序列表
本申请包含已通过EFS-Web以ASCII格式提交并且在此通过引用整体并入的序列表。在2021年7月8日创建的所述ASCII拷贝被命名为D082470040WO00-SEQ-DWY并且大小为575,156字节。
背景技术
肌养蛋白病(dystrophinopathy)是由肌养蛋白(dystrophin)基因中的突变引起的一组独特的神经肌肉疾病。肌养蛋白病包括迪谢内肌营养不良(Duchenne musculardystrophy)、贝克肌营养不良(Becker muscular dystrophy)和X连锁的扩张型心肌病。肌养蛋白(DMD)是包含79个外显子和约260万总碱基对的大基因。DMD中的许多突变(包括外显子移码、缺失、替换和重复突变)能够降低功能性肌养蛋白的表达，导致肌养蛋白病。靶向人DMD的外显子51的一种药剂依特立生(eteplirsen)已被美国食品和药物管理局(Food andDrug Administration，FDA)初步批准，但其效力仍在评价中。
发明概述
根据一些方面，本公开内容提供了靶向肌细胞以用于将分子载荷递送至这些细胞的复合物。在一些实施方案中，本文中提供的复合物特别可用于递送提高或恢复功能性DMD之表达或活性的分子载荷。在一些实施方案中，复合物包含基于寡核苷酸的分子载荷，其通过框内外显子跳读机制或抑制终止密码子来促进功能性DMD的正常表达。在另一些实施方案中，复合物被配置成用于递送提高或恢复功能性肌养蛋白活性的小肌养蛋白(mini-dystrophin)基因或合成的mRNA。因此，在一些实施方案中，本文中提供的复合物包含与肌细胞表面上的受体特异性结合以用于将分子载荷递送至肌细胞的肌肉靶向剂(例如，肌肉靶向抗体)。在一些实施方案中，复合物通过受体介导的内化被摄取到细胞中，然后分子载荷可被释放以在细胞内部执行功能。例如，经工程化以递送寡核苷酸的复合物可以释放该寡核苷酸，使得该寡核苷酸可促进肌细胞中功能性DMD的表达(例如，通过外显子跳读机制)。在一些实施方案中，通过对连接复合物的寡核苷酸和肌肉靶向剂的共价接头进行内体切割而释放该寡核苷酸。
本公开内容的一个方面涉及这样的复合物，所述复合物包含与分子载荷共价连接的抗转铁蛋白受体(transferrin receptor，TfR)抗体，所述分子载荷被配置用于促进DMD基因的表达或活性，其中所述抗体包含：
(i)含有与SEQ ID NO:76具有至少95％同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)；和/或含有与SEQ ID NO:75具有至少95％同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(ii)含有与SEQ ID NO:69具有至少95％同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)；和/或含有与SEQ ID NO:70具有至少95％同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(iii)含有与SEQ ID NO:71具有至少95％同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)；和/或含有与SEQ ID NO:70具有至少95％同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(iv)含有与SEQ ID NO:72具有至少95％同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)；和/或含有与SEQ ID NO:70具有至少95％同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(v)含有与SEQ ID NO:73具有至少95％同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)；和/或含有与SEQ ID NO:74具有至少95％同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(vi)含有与SEQ ID NO:73具有至少95％同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)；和/或含有与SEQ ID NO:75具有至少95％同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(vii)含有与SEQ ID NO:76具有至少95％同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)；和/或含有与SEQ ID NO:74具有至少95％同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(viii)含有与SEQ ID NO:77具有至少95％同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)；和/或含有与SEQ ID NO:78具有至少95％同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(ix)含有与SEQ ID NO:79具有至少95％同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)；和/或含有与SEQ ID NO:80具有至少95％同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；或者
(x)含有与SEQ ID NO:77具有至少95％同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)；和/或含有与SEQ ID NO:80具有至少95％同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一些实施方案中，所述抗体包含：
(i)含有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的VL；
(ii)含有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VL；
(iii)含有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VL；
(iv)含有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VL；
(v)含有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的VL；
(vi)含有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的VL；
(vii)含有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的VL；
(viii)含有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的VL；
(ix)含有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的VL；或者
(x)含有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，所述抗体选自Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、scFv、Fv和全长IgG。在一些实施方案中，所述抗体为Fab片段。
在一些实施方案中，所述抗体包含：
(i)含有与SEQ ID NO:101具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链；和/或含有与SEQ ID NO:90具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链；
(ii)含有与SEQ ID NO:97具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链；和/或含有与SEQ ID NO:85具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链；
(iii)含有与SEQ ID NO:98具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链；和/或含有与SEQ ID NO:85具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链；
(iv)含有与SEQ ID NO:99具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链；和/或含有与SEQ ID NO:85具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链；
(v)含有与SEQ ID NO:100具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链；和/或含有与SEQ ID NO:89具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链；
(vi)含有与SEQ ID NO:100具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链；和/或含有与SEQ ID NO:90具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链；
(vii)含有与SEQ ID NO:101具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链；和/或含有与SEQ ID NO:89具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链；
(viii)含有与SEQ ID NO:102具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链；和/或含有与SEQ ID NO:93具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链；
(ix)含有与SEQ ID NO:103具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链；和/或含有与SEQ ID NO:95具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链；或者
(x)含有与SEQ ID NO:102具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链；和/或含有与SEQ ID NO:95具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，所述抗体包含：
(i)含有SEQ ID NO:101的氨基酸序列的重链；和含有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链；
(ii)含有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的重链；和含有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的轻链；
(iii)含有SEQ ID NO:98的氨基酸序列的重链；和含有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的轻链；
(iv)含有SEQ ID NO:99的氨基酸序列的重链；和含有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的轻链；
(v)含有SEQ ID NO:100的氨基酸序列的重链；和含有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的轻链；
(vi)含有SEQ ID NO:100的氨基酸序列的重链；和含有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链；
(vii)含有SEQ ID NO:101的氨基酸序列的重链；和含有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的轻链；
(viii)含有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的重链；和含有SEQ ID NO:93的氨基酸序列的轻链；
(ix)含有SEQ ID NO:103的氨基酸序列的重链；和含有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的轻链；或者
(x)含有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的重链；和含有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，抗体不与转铁蛋白受体的转铁蛋白结合位点特异性结合和/或肌肉靶向抗体不抑制转铁蛋白与转铁蛋白受体的结合。
在一些实施方案中，分子载荷是寡核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸促进DMDRNA中的外显子跳读。在一些实施方案中，寡核苷酸促进DMD的外显子在外显子8至外显子55的范围内的跳读。在一些实施方案中，寡核苷酸促进外显子8、外显子23、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53和/或外显子55的跳读。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含DMD转录物的一个或更多个完整或部分外显子剪接增强子(exonic splicing enhancer，ESE)之互补区。在一些实施方案中，寡核苷酸包含含有SEQ ID NO:402至436和2043至2238中所示的一个或更多个完整或部分ESE的靶序列之互补区。
在一些实施方案中，寡核苷酸促进外显子51的跳读。
在一些实施方案中，寡核苷酸的长度为20至30个核苷酸，并且包含含有SEQ IDNO:402至436中任一个所示的ESE的至少4个连续核苷酸的靶序列之互补区。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含SEQ ID NO:437至1241中任一个，或包含SEQ IDNO:1242至2046中任一个之互补区。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含表14中列出的寡核苷酸的靶序列之互补区。在一些实施方案中，寡核苷酸包含表14中列出的序列，其中所述寡核苷酸中的任意一个或更多个尿嘧啶碱基(U)可任选是胸腺嘧啶碱基(T)。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个经修饰核苷间键联。在一些实施方案中，至少一个经修饰核苷间键联为硫代磷酸酯键联。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含一个或更多个经修饰核苷。在一些实施方案中，所述一个或更多个经修饰核苷是2’-经修饰核苷。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含一个或更多个磷酸二酰胺吗啉代，任选地其中所述寡核苷酸是磷酸二酰胺吗啉代寡聚物(phosphorodiamidate morpholino oligomer，PMO)。
在一些实施方案中，抗体通过可切割接头与分子载荷共价连接。在一些实施方案中，可切割接头包含缬氨酸-瓜氨酸序列。
在一些实施方案中，抗体与分子载荷共价连接，所述共价连接通过与抗体的赖氨酸残基或半胱氨酸残基的缀合进行。
本公开内容的另一个方面涉及促进细胞中DMD蛋白的表达或活性的方法，所述方法包括使细胞与有效用于促进分子载荷内化到细胞中之量的本文中公开的复合物接触，任选地其中细胞是肌细胞。
本公开内容的另一个方面涉及治疗具有与肌养蛋白病相关的突变DMD等位基因的对象的方法，所述方法包括向对象施用有效量的本文中公开的复合物。
附图简述
图1描绘了非限制性示意图，其示出了用siRNA转染细胞的效果。
图2描绘了非限制性示意图，其示出了包含siRNA的肌肉靶向复合物的活性。
图3A至3B描绘了非限制性示意图，其示出了相对于包含相同siRNA的对照非靶向复合物，包含siRNA的肌肉靶向复合物在体内在小鼠肌肉组织(腓肠肌和心脏)中的活性。(N＝4只C57BL/6WT小鼠)
图4A至4E描绘了非限制性示意图，其示出了包含siRNA的肌肉靶向复合物的组织选择性。
图5描绘了非限制性示意图，其示出了包含外显子-23跳读磷酸二酰胺吗啉代寡聚物(PMO)的抗转铁蛋白受体肌肉靶向复合物剂量依赖性地增强mdx小鼠模型肌肉组织中的外显子跳读的能力。
图6A至6B描绘了非限制性示意图，其示出了包含外显子-23跳读PMO的抗转铁蛋白受体肌肉靶向复合物剂量依赖性地提高mdx小鼠模型骨骼肌(四头肌)中的肌养蛋白的能力。
图7A至7E描绘了非限制性示意图，其示出了包含外显子-23跳读PMO的抗转铁蛋白受体肌肉靶向复合物在mdx小鼠模型中改善功能性能(图7A、7B、7C和7D)和降低肌酸激酶水平(图7E)的能力。(**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001；NS不显著)。
图8示出了用于连接抗TfR抗体和分子载荷(例如，寡核苷酸)的接头在多种物种中在静脉内施用之后随时间的血清稳定性。
图9A至9F示出了通过ELISA测量的人源化抗TfR Fab与人TfR1(human TfR1，hTfR1)或食蟹猴TfR1(cTfR1)的结合。图9A示出了人源化3M12变体与hTfR1的结合。图9B示出了人源化3M12变体与cTfR1的结合。图9C示出了人源化3A4变体与hTfR1的结合。图9D示出了人源化3A4变体与cTfR1的结合。图9E示出了人源化5H12变体与hTfR1的结合。图9F示出了人源化5H12变体与hTfR1的结合。
图10示出了抗TfR Fab缀合物进入横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma，RD)细胞中的定量细胞摄取。受试缀合物中的分子载荷是DMPK靶向寡核苷酸，并且通过指定的抗TfR Fab促进缀合物的摄取。该测定还包括具有阴性对照Fab(抗小鼠TfR)或阳性对照Fab(抗人TfR1)的缀合物。将细胞与在100nM浓度下的指定缀合物一起孵育4小时。通过平均Cypher5e荧光测量细胞摄取。
图11A至11F示出了通过ELISA测量的寡核苷酸缀合或未缀合的人源化抗TfR Fab与人TfR1(hTfR1)和食蟹猴TfR1(cTfR1)的结合。图11A示出了单独或与DMPK靶向寡核苷酸缀合的人源化3M12变体与hTfR1的结合。图11B示出了单独或与DMPK靶向寡核苷酸缀合的人源化3M12变体与cTfR1的结合。图11C示出了单独或与DMPK靶向寡核苷酸缀合的人源化3A4变体与hTfR1的结合。图11D示出了单独或与DMPK靶向寡核苷酸缀合的人源化3A4变体与cTfR1的结合。图11E示出了单独或与DMPK靶向寡核苷酸缀合的人源化5H12变体与hTfR1的结合。图11F示出了单独或与DMPK靶向寡核苷酸缀合的人源化5H12变体与cTfR1的结合。还示出了各自的EC50值。
图12示出了在用多种浓度的缀合物处理的RD细胞中的DMPK表达，所述缀合物包含与DMPK靶向寡核苷酸ASO300缀合的指定人源化抗TfR抗体。治疗持续时间为3天。使用转染剂递送的ASO300用作对照。
图13示出了人DMD肌管中外显子51的跳读，其由DMD外显子51跳读寡核苷酸(PMO)促进。细胞是用裸PMO或用与抗TfR1 Fab缀合的PMO(Ab-PMO)处理的。
图14示出了在α-肌动蛋白作为上样对照的情况下，在用与靶向外显子23的寡核苷酸(PMO)缀合的抗小鼠TfR1(RI7 217)处理之后，mdx小鼠四头肌中肌养蛋白表达的剂量依赖性提高，如通过用于肌养蛋白的western印迹测量的。使用合并的野生型蛋白质和合并的mdx蛋白产生了标准品。百分比表示并入样品中的WT蛋白质的量。
图15示出了在用多种剂量的与靶向外显子23的寡核苷酸(PMO)缀合的抗小鼠TfR(RI7 217)处理之后，对mdx小鼠四头肌内肌养蛋白水平的定量。
图16示出了来自用盐水处理的野生型(WT)小鼠或者用盐水、裸寡核苷酸或与抗小鼠TfR1(RI7 217)缀合的寡核苷酸处理的mdx小鼠的四头肌的免疫荧光染色图像。
图17示出了这样的数据，其说明包含与DMD外显子跳读寡核苷酸缀合的指定抗TfRFab(3M12 VH3/VK2、3M12 VH4/VK3和3A4 VH3N54S/VK4)的缀合物导致与裸DMD外显子跳读寡核苷酸相比增强了DMD患者肌管中的外显子跳读。
图18示出了抗TfR Fab 3M12 VH4/Vk3与重组人(圆圈)、食蟹猴(正方形)、小鼠(向上三角形)或大鼠(向下三角形)TfR1蛋白在Fab浓度范围为230pM至500nM下之结合的ELISA测量结果。测量结果示出抗TfR Fab与人和食蟹猴的TfR1具有反应性。未观察到与小鼠或大鼠的重组TfR1的结合。数据作为相对于基线归一化的相对荧光单位示出。
图19示出了测试抗TfR Fab 3M12 VH4/Vk3在230pM至500nM Fab的浓度范围内对重组人TfR1或TfR2的亲和力的ELISA结果。数据作为相对于基线归一化的相对荧光单位给出。结果表明Fab不与重组人TfR2结合。
图20示出了用于连接抗TfR Fab 3M12 VH4/Vk3与对照反义寡核苷酸的接头在PBS中或者在大鼠、小鼠、食蟹猴或人的血清中孵育72小时期间的血清稳定性。
图21A至21C示出了在施用单剂量的盐水、诱导DMD中外显子23跳读的未缀合的寡核苷酸(ASO)、或包含与ASO缀合的抗TfR RI7217Fab的缀合物(Ab-ASO)之后2或4周，对野生型(WT)和mdx小鼠的四头肌(图21A)、心脏(图21B)和膈肌(图21C)中外显子23跳读的定量。在来自WT小鼠或者来自施用盐水或未缀合的ASO的mdx小鼠的组织中观察到很少或没有观察到外显子23跳读，而在用Ab-ASO处理的mdx小鼠的组织中观察到显著水平的外显子23跳读。(*p<0.05,**p<0.01,****p<0.0001)。
图22A至22D示出了在施用单剂量的诱导DMD中外显子23跳读的未缀合的寡核苷酸(ASO)或包含与ASO缀合的抗TfR1 RI7217 Fab的缀合物(Ab-ASO)之后，对mdx小鼠四头肌中肌养蛋白的测量结果。图22A示出了在注射ASO或Ab-ASO之后两周的肌肉组织中肌养蛋白和α-辅肌动蛋白的western印迹。图22B示出了相对于野生型肌肉中的肌养蛋白对图23A的western印迹中的肌养蛋白的定量。图22C示出了在注射ASO或Ab-ASO之后四周的肌肉组织中肌养蛋白和α-辅肌动蛋白的western印迹。图22D示出了相对于野生型肌肉中的肌养蛋白对图22C的western印迹中的肌养蛋白的定量。图22A和22C中的标准曲线通过合并来自野生型(WT)和mdx小鼠样品的组织而生成，并且WT百分比表示掺入每个样品中的WT蛋白的量。(*p<0.05；ns，不显著)
图23A至23D示出了在施用单剂量的诱导DMD中外显子23跳读的未缀合的寡核苷酸(ASO)或包含与ASO缀合的抗TfR1 RI7217 Fab的缀合物(Ab-ASO)之后，对mdx小鼠心肌中肌养蛋白的测量结果。图23A示出了在注射ASO或Ab-ASO之后两周的肌肉组织中肌养蛋白和α-辅肌动蛋白的western印迹。图23B示出了相对于野生型肌肉中的肌养蛋白，对图23A的western印迹中的肌养蛋白的定量。图23C示出了在注射ASO或Ab-ASO之后四周的肌肉组织中肌养蛋白和α-辅肌动蛋白的western印迹。图23D示出了相对于野生型肌肉中的肌养蛋白，对图23C的Western印迹中的肌养蛋白的定量。图23A和23C中的标准曲线通过合并来自野生型(WT)和mdx小鼠样品的组织而生成，并且WT百分比表示掺入每个样品中的WT蛋白的量。(*p<0.05,****p<0.0001)
图24A至24D示出了在施用单剂量的诱导DMD中外显子23跳读的未缀合的寡核苷酸(ASO)或包含与ASO缀合的抗TfR1 RI7217 Fab的缀合物(Ab-ASO)之后，对mdx小鼠膈肌中肌养蛋白的测量结果。图24A示出了在注射ASO或Ab-ASO之后两周的肌肉组织中肌养蛋白和α-辅肌动蛋白的western印迹。图24B示出了相对于野生型肌肉中的肌养蛋白，对图24A的western印迹中肌养蛋白的定量。图24C示出了在注射ASO或Ab-ASO之后四周的肌肉组织中肌养蛋白和α-辅肌动蛋白的western印迹。图24D示出了相对于野生型肌肉中的肌养蛋白，对图24C的western印迹中的肌养蛋白的定量。图24A和24C中的标准曲线是通过合并来自野生型(WT)和mdx小鼠样品的组织而生成的，并且WT百分比表示掺入每个样品中的WT蛋白的量。(**p<0.01,***p<0.001)
图25A至25C示出了在施用单剂量的盐水、未缀合的外显子23跳读寡核苷酸(ASO)、或包含与ASO缀合的抗TfR RI7217 Fab的缀合物(Ab-ASO)之后两周或四周，对野生型(WT)或mdx小鼠的四头肌(图25A)、膈肌(图25B)和心脏(图25C)中施用的寡核苷酸(ASO)量的定量。
图26示出了在gymnotic摄取一定浓度范围内的外显子53跳读寡核苷酸之后，携带DMD外显子52缺失的DMD患者细胞中的外显子53跳读％。
图27示出了在用多种浓度的外显子53跳读PMO处理之后，携带DMD外显子52缺失的DMD患者细胞中的外显子53跳读％，所述外显子53跳读PMO不与抗体连接(“裸ASO”)或与抗TfR1 Fab共价连接(“抗TfR1 Fab-ASO复合物”)。
发明详述
本公开内容的一些方面涉及这样的认识：尽管某些分子载荷(例如，寡核苷酸、肽、小分子)可在肌细胞中具有有益作用，但是已证明有效地靶向这样的细胞具有挑战。如本文中所述，本公开内容提供了包含与分子载荷共价连接的肌肉靶向剂的复合物，以克服这样的挑战。在一些实施方案中，所述复合物特别可用于递送调节(例如促进)肌细胞中靶基因之表达或活性的分子载荷，例如在患有或怀疑患有罕见肌肉疾病的对象中。例如，在一些实施方案中，提供了用于靶向DMD(例如，突变DMD等位基因)的复合物。在一些实施方案中，本文中提供的复合物可包含促进DMD的正常表达和活性的寡核苷酸。作为另一个实例，复合物可包含诱导DMD mRNA的外显子跳读的寡核苷酸。在一些实施方案中，可使用表达促进DMD的正常表达和活性的一种或更多种蛋白质的合成核酸载荷(例如，DNA或RNA载荷)。
在一些实施方案中，复合物可包含合成cDNA和/或(例如，和)合成mRNA(例如表达肌养蛋白或其片段(例如，肌养蛋白小基因))的分子载荷。在一些实施方案中，复合物可包含能够将核酸可编程核酸酶(例如，Cas9)靶向至DMD的疾病相关突变(例如突变DMD外显子)处或附近的序列的分子载荷，例如指导分子(例如指导RNA)。在一些实施方案中，这样的核酸可编程核酸酶可用于切割DMD的疾病相关突变(例如突变DMD外显子)的一部分或全部，以促进功能性DMD的表达。在一些实施方案中，复合物可包含分子载荷，其上调可替代肌养蛋白功能的基因的表达和/或(例如，和)活性，例如肌营养相关蛋白(utrophin)。
下面提供了本公开内容的另一些方面，包括对限定的术语的描述。
I.定义
施用：本文中使用的术语“施用”意指以生理和/或(例如，和)药理学上可用的方式向对象提供复合物(例如，以治疗对象中的病症)。
大约：本文中使用的术语“大约”或“约”，如应用于一个或更多个目的值时，是指类似于陈述的参考值的值。在某些实施方案中，术语“大约”或“约”是指落入陈述的参考值的任一方向上(大于或小于)15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、或更小以内的值的范围，除非另有说明或在其他情况下从上下文中可以明显看出(除非这样的数字超过可能值的100％)。
抗体：本文中使用的术语“抗体”是指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域或至少一个抗原决定簇(例如，与抗原特异性结合的互补位(paratope))的多肽。在一些实施方案中，抗体是全长抗体。在一些实施方案中，抗体是嵌合抗体。在一些实施方案中，抗体是人源化抗体。然而，在一些实施方案中，抗体是Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段或scFv片段。在一些实施方案中，抗体是来源于骆驼科抗体的纳米抗体或来源于鲨鱼抗体的纳米抗体。在一些实施方案中，抗体是双抗体。在一些实施方案中，抗体包含具有人种系序列的框架。在另一个实施方案中，抗体包含选自IgG、IgG1、IgG2、IgG2A、IgG2B、IgG2C、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgM和IgE恒定结构域的重链恒定结构域。在一些实施方案中，抗体包含重(H)链可变区(在本文中简称为VH)和/或(例如，和)轻(L)链可变区(在本文中简称为VL)。在一些实施方案中，抗体包含恒定结构域，例如Fc区。免疫球蛋白恒定结构域是指重链或轻链恒定结构域。人IgG重链和轻链恒定结构域氨基酸序列及其功能变异是已知的。关于重链，在一些实施方案中，本文中所述的抗体的重链可以是alpha(α)、delta(Δ)、epsilon(ε)、gamma(γ)或mu(μ)重链。在一些实施方案中，本文中所述的抗体的重链可包含人alpha(α)、delta(Δ)、epsilon(ε)、gamma(γ)或mu(μ)重链。在一个具体实施方案中，本文中所述的抗体包含人γ1CH1、CH2和/或(例如，和)CH3结构域。在一些实施方案中，VH结构域的氨基酸序列包含人gamma(γ)重链恒定区的氨基酸序列，例如本领域已知的任何。人恒定区序列的非限制性实例已在本领域中描述，例如，参见美国专利No.5,693,780和Kabat E A etal.,(1991)同上。在一些实施方案中，VH结构域包含与本文中提供的任何可变链恒定区具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，对抗体进行修饰，例如，通过糖基化、磷酸化、SUMO化(sumoylation)和/或(例如，和)甲基化进行修饰。在一些实施方案中，抗体是与一个或更多个糖或碳水化合物分子缀合的糖基化抗体。在一些实施方案中，一个或更多个糖或碳水化合物分子通过N-糖基化、O-糖基化、C-糖基化、糖基磷脂酰肌醇化(GPI锚定附着)和/或(例如，和)磷酸糖基化(phosphoglycosylation)与抗体缀合。在一些实施方案中，一个或更多个糖或碳水化合物分子是单糖、二糖、寡糖或聚糖。在一些实施方案中，一个或更多个糖或碳水化合物分子是支化的寡糖或支化的聚糖。在一些实施方案中，一个或更多个糖或碳水化合物分子包含甘露糖单元、葡萄糖单元、N-乙酰葡糖胺单元、N-乙酰半乳糖胺单元、半乳糖单元、岩藻糖单元或磷脂单元。在一些实施方案中，抗体是包含多肽的构建体，所述多肽包含与接头多肽或免疫球蛋白恒定结构域连接的一个或更多个本公开内容的抗原结合片段。接头多肽包含通过肽键连接的两个或更多个氨基酸残基，并且用于连接一个或更多个抗原结合部分。接头多肽的一些实例已有报道(参见，例如，Holliger,P.,et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448；Poljak,R.J.,et al.(1994)Structure 2:1121-1123)。另外，抗体可以是更大的免疫黏附分子的一部分，免疫黏附分子通过抗体或抗体部分与一个或更多个其他蛋白质或肽的共价或非共价缔合而形成。这样的免疫黏附分子的一些实例包括使用链霉亲和素核芯区域来制备四聚体scFv分子(Kipriyanov,S.M.,et al.(1995)Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101)，以及使用半胱氨酸残基、标记肽和C端多组氨酸标签来制备二价和生物素化的scFv分子(Kipriyanov,S.M.,et al.(1994)Mol.Immunol.31:1047-1058)。
CDR：本文中使用的术语“CDR”是指抗体可变序列内的互补决定区。典型的抗体分子包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其通常参与抗原结合。VH区和VL区可进一步细分为高变区，也称为“互补决定区”(“complementarity determining region，CDR”)，其中散布有更保守的称为“框架区”(“framework region，FR”)的区域。每个VH和VL通常由三个CDR和四个FR构成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。可使用本领域已知的方法，例如通过Kabat定义、IMGT定义、Chothia定义、AbM定义和/或(例如，和)接触定义(所有这些都是本领域公知的)来精确鉴定框架区和CDR的范围。参见，例如Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,Fifth Edition,U.S.Department ofHealth and Human Services,NIHPublication No.91-3242；
Figure GDA0004266820060000141
the international ImMunoGeneTics information
Figure GDA0004266820060000142
http://www.imgt.org,Lefranc,M.-P.et al.,Nucleic Acids Res.,27:209-212(1999)；Ruiz,M.et al.,Nucleic Acids Res.,28:219-221(2000)；Lefranc,M.-P.,Nucleic Acids Res.,29:207-209(2001)；Lefranc,M.-P.,Nucleic Acids Res.,31:307-310(2003)；Lefranc,M.-P.et al.,In Silico Biol.,5,0006(2004)[Epub],5:45-60(2005)；Lefranc,M.-P.et al.,Nucleic Acids Res.,33:D593-597(2005)；Lefranc,M.-P.et al.,Nucleic Acids Res.,37:D1006-1012(2009)；Lefranc,M.-P.et al.,NucleicAcids Res.,43:D413-422(2015)；Chothia et al.,(1989)Nature342:877；Chothia,C.etal.(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Al-lazikani et al(1997)J.Molec.Biol.273:927-948；以及Almagro,J.Mol.Recognit.17:132-143(2004)。还参见hgmp.mrc.ac.uk和bioinf.org.uk/abs。本文中使用的CDR可以是指由本领域已知的任何方法定义的CDR。具有相同CDR的两种抗体意指这两种抗体的该CDR的氨基酸序列相同，如通过相同的方法(例如IMGT定义)确定的。
重链和轻链的每个可变区中有三个CDR，对于每个可变区分别称为CDR1、CDR2和CDR3。本文中使用的术语“CDR组”是指出现在单个可变区内的能够结合抗原的三个CDR的组。这些CDR的确切边界已根据不同的系统进行了不同的定义。Kabat描述的系统(Kabat etal.,Sequences ofProteins of Immunological Interest(National Institutes ofHealth,Bethesda，Md.(1987)and(1991))不仅提供了适用于抗体的任何可变区的明确的残基编号系统，而且还提供了定义三个CDR的精确残基边界。这些CDR可被称为Kabat CDR。CDR的子部分可被指定为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别指定轻链和重链区域。这些区域可称为Chothia CDR，其具有与Kabat CDR重叠的边界。Padlan(FASEB J.9：133-139(1995))和MacCallum(J Mol Biol 262(5)：732-45(1996))已经描述了定义与Kabat CDR重叠的CDR的其他边界。另一些CDR边界定义可能并不严格遵循上述系统之一，但仍与KabatCDR重叠，尽管可根据预测或者根据特定残基或残基的组或甚至整个CDR不会显著影响抗原结合的实验发现来缩短或延长它们。本文中使用的方法可利用根据这些系统中的任何一个定义的CDR。表1中提供了CDR定义系统的一些实例。
表1.CDR定义
Figure GDA0004266820060000151
Lefranc，M.-P.et al.，Nucleic Acids Res.,27：209-212(1999)
2Kabat et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，N1H PublicationNo.91-3242
3Chothia et al.，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))
CDR接枝抗体(CDR-grafted antibody)：术语“CDR接枝抗体”是指包含来自一个物种的重链和轻链可变区序列但是其中VH和/或(例如，和)VL的一个或更多个CDR区的序列被来自另一物种的CDR序列替代的抗体，例如具有鼠重链和轻链可变区并且其中一个或更多个鼠CDR(例如，CDR3)已被人CDR序列替代的抗体。
嵌合抗体：术语“嵌合抗体”是指包含来自一个物种的重链和轻链可变区序列和来自另一物种的恒定区序列的抗体，例如具有与人恒定区连接的鼠重链和轻链可变区的抗体。
互补：本文中使用的术语“互补”是指在两个核苷酸或两组核苷酸之间精确配对的能力。特别地，互补是表征氢键配对引起两个核苷酸或两组核苷酸之间结合的程度的术语。例如，如果寡核苷酸的一个位置处的碱基能够与靶核酸(例如，mRNA)的相应位置处的碱基进行氢键合，则认为在该位置处碱基彼此互补。碱基配对可包括规范的沃森-克里克碱基配对和非沃森-克里克碱基配对(例如，Wobble碱基配对和Hoogsteen碱基配对)二者。例如，在一些实施方案中，对于互补碱基配对，腺苷型碱基(A)与胸苷型碱基(T)或尿嘧啶型碱基(U)互补，胞嘧啶型碱基(C)与鸟苷型碱基(G)互补，并且通用碱基如3-硝基吡咯或5-硝基吲哚可与任何A、C、U或T杂交并被认为是互补的。肌苷(I)在本领域中也被认为是通用碱基，并且被认为与任何A、C、U或T互补。
保守氨基酸替换：本文中使用的“保守氨基酸替换”是指不改变进行氨基酸替换的蛋白质的相对电荷或尺寸特征的氨基酸替换。可以根据本领域普通技术人员已知的用于改变多肽序列的方法来制备变体，所述方法例如可以在汇编这样的方法的参考文献中找到：例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,J.Sambrook,et al.,eds.,FourthEdition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,2012,或Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel,et al.,eds.,John Wiley&Sons,Inc.,New York。氨基酸的保守替换包括在以下组内的氨基酸之间进行的替换：(a)M、I、L、V；(b)F、Y、W；(c)K、R、H；(d)A、G；(e)S、T；(f)Q、N；和(g)E、D。
共价连接：本文中使用的术语“共价连接”是指两个或更多个分子通过至少一个共价键连接在一起的特征。在一些实施方案中，两个分子可以通过充当分子之间的接头的单键例如二硫键或二硫桥共价连接在一起。然而，在一些实施方案中，两个或更多个分子可以通过充当接头的分子共价连接在一起，该接头通过多个共价键将两个或更多个分子连接在一起。在一些实施方案中，接头可以是可切割接头。然而，在一些实施方案中，接头可以是不可切割接头。
交叉反应性：如本文中使用以及在靶向剂(例如，抗体)的情况下，术语“交叉反应性”是指物质能够以相似亲和力或亲合力与相似类型或类别的超过一种抗原(例如，多个同源物、旁系同源物或直系同源物的抗原)特异性结合的性质。例如，在一些实施方案中，对相似类型或类别的人和非人灵长类抗原(例如，人转铁蛋白受体和非人灵长类转铁蛋白受体)具有交叉反应性的抗体能够以相似亲和力或亲合力与人抗原和非人灵长类抗原结合。在一些实施方案中，抗体对相似类型或类别的人抗原和啮齿动物抗原具有交叉反应性。在一些实施方案中，抗体对相似类型或类别的啮齿动物抗原和非人灵长类抗原具有交叉反应性。在一些实施方案中，抗体对相似类型或类别的人抗原、非人灵长类抗原和啮齿动物抗原具有交叉反应性。
DMD：本文中使用的术语“DMD”是指编码肌养蛋白的基因，肌养蛋白是在肌细胞中，特别是在肌纤维中桥接内部细胞骨架和细胞外基质的肌养蛋白-糖蛋白复合物的关键组分。DMD中的缺失、重复和点突变可导致肌养蛋白病，例如迪谢内肌营养不良、贝克肌营养不良或心肌病(DMD相关扩张型心肌病)。替代启动子使用和选择性剪接导致该基因的许多独特的转录变体和蛋白质同种型。在一些实施方案中，肌养蛋白基因可以是人基因(基因ID:1756)、非人灵长类基因(例如，基因ID:465559)或啮齿动物基因(例如，基因ID:13405；基因ID:24907)。另外，已经表征了编码不同蛋白质同种型的多种人转录物变体(例如，如以以下GenBank RefSeq登录号进行注释：NM_000109.3、NM_004006.2(SEQ ID NO:2239)、NM_004009.3、NM_004010.3和NM_004011.3)。
DMD等位基因：本文中使用的术语“DMD等位基因”是指DMD基因的替代形式(例如，野生型或突变体形式)中的任一种。在一些实施方案中，DMD等位基因可编码保留其正常和典型功能的肌养蛋白。在一些实施方案中，DMD等位基因可包含一种或更多种导致肌营养不良的突变。导致迪谢内肌营养不良的常见突变涉及肌养蛋白等位基因中存在的79个外显子中的一个或更多个(例如外显子8、外显子23、外显子41、外显子44、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53或外显子55)的移码、缺失、替换和重复突变。DMD突变的另外的实例公开在例如Flanigan KM,et al.,Mutational spectrum of DMD mutations indystrophinopathy patients:application of modern diagnostic techniques toalarge cohort.Hum Mutat.2009Dec；30(12):1657-66中，其内容通过引用整体并入本文。
肌养蛋白病：本文中使用的术语“肌养蛋白病”是指由一种或更多种突变DMD等位基因引起的肌肉疾病。肌养蛋白病包括疾病(从轻到严重)的谱系，其包括迪谢内肌营养不良、贝克肌营养不良和DMD相关扩张型心肌病(DCM)。在一些实施方案中，在谱系的一端，肌养蛋白病在表型上与肌酸磷酸激酶(CK)的血清浓度的无症状增加和/或(例如，和)伴随有肌红蛋白尿的肌肉痉挛相关。在一些实施方案中，在谱系的另一端，肌养蛋白病在表型上与进行性肌肉疾病相关，该进行性肌肉疾病当骨骼肌最初受影响时通常归类为迪谢内或贝克肌营养不良，并且当心脏最初受影响时被归类为DMD相关扩张型心肌病。迪谢内肌营养不良的症状包括肌肉损失或变性、肌肉功能减弱、舌和小腿肌肉的假性肥大、神经系统异常的高风险和寿命缩短。迪谢内肌营养不良与在线人类孟德尔遗传(Online MendelianInheritance in Man)(OMIM)Entry#310200相关。贝克肌营养不良与OMIM Entry#300376相关。扩张型心肌病与OMIM Entry X#302045相关。
外显子剪接增强子(ESE)：本文中使用的术语“外显子剪接增强子”或“ESE”是指基因、前-mRNA或mRNA的外显子内指导或增强将前-mRNA剪接为mRNA的核酸序列基序，例如如Blencowe et al.,Trends Biochem Sci 25,106-10.(2000)中所述，所述文献通过引用并入本文。ESE可指导或增强剪接例如以从基因转录物中去除一个或更多个内含子和/或一个或更多个外显子。ESE基序的长度通常为6至8个核碱基。SR蛋白(例如，由基因SRSF1、SRSF2、SRSF3、SRSF4、SRSF5、SRSF6、SRSF7、SRSF8、SRSF9、SRSF10、SRSF11、SRSF12、TRA2A或TRA2B编码的蛋白质)通过其RNA识别基序区与ESE结合以促进剪接。ESE基序可通过多种方法鉴定，包括Cartegni et al.,Nucleic Acids Research,2003,Vol.31,No.13,3568–3571中所述的那些，所述文献通过引用并入本文。
框架：本文中使用的术语“框架”或“框架序列”是指可变区减去CDR的剩余序列。由于CDR序列的确切定义可通过不同的系统确定，因此框架序列的含义相应地具有不同解释。六个CDR(轻链的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3和重链的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)也将轻链和重链上的框架区分为每条链上的四个子区域(FR1、FR2、FR3和FR4)，其中CDR1位于FR1和FR2之间，CDR2位于FR2和FR3之间，并且CDR3位于FR3和FR4之间。在未将特定子区域指定为FR1、FR2、FR3或FR4的情况下，其他人提到的框架区代表单个天然存在的免疫球蛋白链的可变区内的组合的FR。本文中使用的FR代表四个子区域之一，并且FRs代表构成框架区的四个子区域中的两个或更多个。人重链和轻链接受体序列是本领域已知的。在一个实施方案中，本领域已知的接受体序列可用于本文中公开的抗体中。
人抗体：本文中使用的术语“人抗体”旨在包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本公开内容的人抗体可包含不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR中，特别是在CDR3中。然而，本文中使用的术语“人抗体”不旨在包括其中来源于另一哺乳动物物种(例如小鼠)种系的CDR序列已接枝到人框架序列上的抗体。
人源化抗体：术语“人源化抗体”是指包含来自非人物种(例如，小鼠)的重链和轻链可变区序列但是其中VH和/或(例如，和)VL序列的至少一部分已被改变为更加“人样”(即，更类似于人种系可变序列)的抗体。一种类型的人源化抗体是CDR接枝抗体，其中人CDR序列被引入非人VH和VL序列中以替代相应的非人CDR序列。在一个实施方案中，提供了人源化抗转铁蛋白受体抗体和抗原结合部分。这样的抗体可以通过使用传统的杂交瘤技术获得鼠抗转铁蛋白受体单克隆抗体随后使用体外基因工程化进行人源化来产生，例如在Kasaian et al的PCT公开No.WO 2005/123126 A2中公开的那些。
内化细胞表面受体：本文中使用的术语“内化细胞表面受体”是指在外部刺激(例如，配体与受体结合)下被细胞内化的细胞表面受体。在一些实施方案中，内化细胞表面受体通过内吞作用内化。在一些实施方案中，内化细胞表面受体通过网格蛋白介导的内吞作用内化。然而，在一些实施方案中，内化细胞表面受体通过不依赖于网格蛋白的途径内化，例如如吞噬作用、巨胞饮作用、小窝和筏介导的摄取或组成型网格蛋白非依赖性内吞作用。在一些实施方案中，内化细胞表面受体包含胞内结构域、跨膜结构域和/或(例如，和)胞外结构域，其可任选地还包含配体结合结构域。在一些实施方案中，细胞表面受体在配体结合后被细胞内化。在一些实施方案中，配体可以是肌肉靶向剂或肌肉靶向抗体。在一些实施方案中，内化细胞表面受体是转铁蛋白受体。
分离的抗体：本文中使用的“分离的抗体”旨在指代基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合转铁蛋白受体的分离的抗体基本上不含特异性结合转铁蛋白受体以外的抗原的抗体)。然而，特异性结合转铁蛋白受体复合物的分离的抗体可能与其他抗原(例如来自其他物种的转铁蛋白受体分子)具有交叉反应性。此外，分离的抗体可基本上不含其他细胞材料和/或(例如，和)化学物质。
[75]Kabat编号：术语“Kabat编号”、“Kabat定义和“Kabat标记”在本文可互换使用。在本领域中公认的这些术语是指对抗体或其抗原结合部分的重链和轻链可变区中的比其他氨基酸残基更加可变(即高变)的氨基酸残基进行编号的系统(Kabat et al.(1971)Ann.NY Acad,Sci.190:382-391以及,Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteinsof Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and HumanServices,NIH Publication No.91-3242)。对于重链可变区，CDR1的高变区为第31至35位氨基酸，CDR2的高变区为第50至65位氨基酸，并且CDR3的高变区为第95至102位氨基酸。对于轻链可变区，CDR1的高变区为第24至34位氨基酸，CDR2的高变区为第50至56位氨基酸，并且CDR3的高变区为第89至97位氨基酸。
分子载荷：本文中使用的术语“分子载荷”是指发挥调节生物学结局作用的分子或物质。在一些实施方案中，分子载荷与肌肉靶向剂连接或以其他方式缔合。在一些实施方案中，分子载荷是小分子、蛋白质、肽、核酸或寡核苷酸。在一些实施方案中，分子载荷发挥调节DNA序列的转录、调节蛋白质的表达或调节蛋白质的活性的作用。在一些实施方案中，分子载荷是寡核苷酸，其包含具有靶基因的互补区的链。
肌肉靶向剂：本文中使用的术语“肌肉靶向剂”是指与肌细胞上表达的抗原特异性结合的分子。肌细胞内或上的抗原可以是膜蛋白，例如整合膜蛋白或外周膜蛋白。通常来说，肌肉靶向剂与肌细胞上的抗原特异性结合，这有助于将肌肉靶向剂(和任何缔合的分子载荷)内化到肌细胞中。在一些实施方案中，肌肉靶向剂与肌肉上的内化细胞表面受体特异性结合，并且能够通过受体介导的内化而内化到肌细胞中。在一些实施方案中，肌肉靶向剂是小分子、蛋白质、肽、核酸(例如，适配体)、或抗体。在一些实施方案中，肌肉靶向剂与分子载荷连接。
肌肉靶向抗体：本文中使用的术语“肌肉靶向抗体”是指为与肌细胞内或上存在的抗原特异性结合的抗体的肌肉靶向剂。在一些实施方案中，肌肉靶向抗体与肌细胞上的抗原特异性结合，这有助于将肌肉靶向抗体(和任何缔合的分子载荷)内化到肌细胞中。在一些实施方案中，肌肉靶向抗体与存在于肌细胞上的内化细胞表面受体特异性结合。在一些实施方案中，肌肉靶向抗体是与转铁蛋白受体特异性结合的抗体。
寡核苷酸：本文中使用的术语“寡核苷酸”是指长度长至200个核苷酸的寡聚核酸化合物。寡核苷酸的一些实例包括但不限于RNAi寡核苷酸(例如，siRNA、shRNA)、微RNA、间隔聚体、混合聚体、磷酸二酰胺吗啉代、肽核酸、适配体、指导核酸(例如，Cas9指导RNA)等。寡核苷酸可以是单链或双链。在一些实施方案中，寡核苷酸可包含一个或更多个经修饰核苷酸(例如，2’-O-甲基糖修饰、嘌呤或嘧啶修饰)。在一些实施方案中，寡核苷酸可包含一个或更多个经修饰核苷酸间键联。在一些实施方案中，寡核苷酸可包含一个或更多个硫代磷酸酯键联，其可为Rp或Sp立体化学构象。
重组抗体：本文中使用的术语“重组人抗体”旨在包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体(在本公开内容中更详细地描述)，从重组、组合人抗体文库分离的抗体(Hoogenboom H.R.,(1997)TIB Tech.15:62-70；Azzazy H.,and Highsmith W.E.,(2002)Clin.Biochem.35:425-445；Gavilondo J.V.,and Larrick J.W.(2002)BioTechniques 29:128-145；Hoogenboom H.,and Chames P.(2000)Immunology Today 21:371-378)，从人免疫球蛋白基因转基因的动物(例如，小鼠)分离的抗体(参见例如Taylor,L.D.,et al.(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295；Kellermann S-A.,and Green L.L.(2002)Current Opinion inBiotechnology 13:593-597；Little M.et al(2000)Immunology Today 21:364-370)，或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他方式制备、表达、产生或分离的抗体。这样的重组人抗体具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，对这样的重组人抗体进行体外诱变(或当使用人Ig序列转基因的动物时，进行体内体细胞诱变)，并且因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，尽管其来源于人种系VH和VL序列并与之相关，但可能不是体内人抗体种系库中天然存在的。本公开内容的一个实施方案提供了能够结合人转铁蛋白受体的完全人抗体，其可使用本领域公知的技术产生，例如但不限于使用人Ig噬菌体文库，例如Jermutus et al.的PCT公开No.WO 2005/007699 A2中公开的那些。
互补区：本文中使用的术语“互补区”是指与例如靶核酸的同源核苷酸序列充分互补的例如寡核苷酸的核苷酸序列，使得两个核苷酸序列能够在生理条件下(例如，在细胞中)彼此退火。在一些实施方案中，互补区与靶核酸的同源核苷酸序列完全互补。然而，在一些实施方案中，互补区与靶核酸的同源核苷酸序列部分互补(例如，至少80％、90％、95％或99％互补)。在一些实施方案中，与靶核酸的同源核苷酸序列相比，互补区包含1、2、3或4个错配。
特异性结合：本文中使用的术语“特异性结合”是指分子以一定程度的亲和力或亲合力与结合伴侣结合的能力，该亲和力或亲合力使得分子能够用于在结合测定或其他结合环境中将结合伴侣与合适的对照区分开。关于抗体，术语“特异性结合”是指与合适的一种或更多种参考抗原相比，抗体以一定程度的亲和力或亲合力与特异性抗原结合的能力，该亲和力或亲合力使得抗体能够用于将特异性抗原与其他抗原区分开，例如至允许通过与如本文中所述的抗原结合而优先靶向某些细胞(例如，肌细胞)的程度。在一些实施方案中，如果抗体与靶标结合的KD为至少约10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10- 12M、10-13M或更小，则抗体与靶标特异性结合。在一些实施方案中，抗体与转铁蛋白受体(例如，转铁蛋白受体的顶端结构域(apical domain)的表位)特异性结合。
对象：本文中使用的术语“对象”是指哺乳动物。在一些实施方案中，对象是非人灵长类或啮齿动物。在一些实施方案中，对象是人。在一些实施方案中，对象是患者，例如患有或怀疑患有疾病的人患者。在一些实施方案中，对象是患有或怀疑患有由突变DMD基因序列(例如，DMD基因序列的外显子中的突变)引起的疾病的人患者。在一些实施方案中，对象患有肌养蛋白病，例如迪谢内肌营养不良。
转铁蛋白受体：本文中使用的术语“转铁蛋白受体”(也称为TFRC、CD71、p90、TFR或TFR1)是指结合转铁蛋白以促进通过内吞作用摄取铁的内化细胞表面受体。在一些实施方案中，转铁蛋白受体可以是人来源的(NCBI基因ID 7037)、非人灵长类来源的(例如，NCBI基因ID 711568或NCBI基因ID 102136007)或啮齿动物来源的(例如，NCBI基因ID 22042)。另外，已经表征了编码受体的不同同种型的多种人转录物变体(例如，如以以下GenBankRefSeq登录号注释的：NP_001121620.1、NP_003225.2、NP_001300894.1和NP_001300895.1)。
2’-经修饰核苷：本文中使用的术语“2’-经修饰核苷”和“2’-经修饰核糖核苷”可互换使用，并且是指在2’位置具有经修饰糖部分的核苷。在一些实施方案中，2’-经修饰核苷是2’-4’双环核苷，其中糖的2’和4’位置是桥联的(例如，通过亚甲基、亚乙基或(S)-约束性乙基桥联)。在一些实施方案中，2’-经修饰核苷是非双环的2’-经修饰核苷，例如，其中糖部分的2’位置被取代。2’-经修饰核苷的一些非限制性实例包括：2’-脱氧、2’-氟(2’-F)、2’-O-甲基(2’-O-Me)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、2’-O-二甲基氨基乙基氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)、锁核酸(locked nucleic acid，LNA，亚甲基桥联核酸)、亚乙基桥联核酸(ENA)和(S)-约束性乙基桥联核酸(cEt)。在一些实施方案中，本文中所述的2’-经修饰核苷是高亲和力的经修饰核苷酸和寡核苷酸，其包含相对于未经修饰的寡核苷酸而对靶序列具有提高的亲和力的2’-经修饰核苷酸。以下提供了2’-经修饰核苷之结构的一些实例：
Figure GDA0004266820060000231
II.复合物
本文中提供了包含与分子载荷共价连接的靶向剂(例如，抗体)的复合物。在一些实施方案中，复合物包含与寡核苷酸共价连接的肌肉靶向抗体。复合物可包含特异性结合单个抗原位点或结合可存在于相同或不同抗原上的至少两个抗原位点的抗体。
复合物可用于调节至少一种基因、蛋白质和/或(例如，和)核酸的活性或功能。在一些实施方案中，与复合物一起存在的分子载荷负责基因、蛋白质和/或(例如，和)核酸的调节。分子载荷可以是能够调节细胞中基因、蛋白质和/或(例如，和)核酸的活性或功能的小分子、蛋白质、核酸、寡核苷酸或任何分子实体。在一些实施方案中，分子载荷是靶向肌细胞中疾病相关重复的寡核苷酸。
在一些实施方案中，复合物包含与分子载荷(例如靶向突变DMD等位基因以促进外显子跳读的混合聚体反义寡核苷酸)共价连接的肌肉靶向剂，例如抗转铁蛋白受体抗体。
A.肌肉靶向剂
本公开内容的一些方面提供了肌肉靶向剂，例如用于将分子载荷递送至肌细胞。在一些实施方案中，这样的肌肉靶向剂能够例如通过与肌细胞上的抗原特异性结合而与肌细胞结合，并且将缔合的分子载荷递送至肌细胞。在一些实施方案中，分子载荷与肌肉靶向剂结合(例如，共价结合)，并且在肌肉靶向剂与肌细胞上的抗原结合后内化到肌细胞中，例如通过内吞作用。应当理解，根据本公开内容可以使用多种类型的肌肉靶向剂。例如，肌肉靶向剂可包含核酸(例如，DNA或RNA)、肽(例如，抗体)、脂质(例如，微泡(microvesicle))或糖部分(例如，多糖)，或者由其组成。示例性的肌肉靶向剂在本文中进一步详细描述，然而，应当理解，本文中提供的示例性肌肉靶向剂并不意味着是限制性的。
本公开内容的一些方面提供了与肌肉(例如骨骼肌、平滑肌或心肌)上的抗原特异性结合的肌肉靶向剂。在一些实施方案中，本文中提供的任何肌肉靶向剂均与骨骼肌细胞、平滑肌细胞和/或(例如，和)心肌细胞上的抗原结合(例如，特异性结合)。
通过与肌肉特异性细胞表面识别元件(例如，细胞膜蛋白)相互作用，可实现组织定位和选择性摄取到肌细胞中二者。在一些实施方案中，作为肌肉摄取转运体之底物的分子可用于将分子载荷递送到肌肉组织中。与肌肉表面识别元件结合之后是胞吞作用，其可允许甚至大分子(例如，抗体)进入肌细胞。作为另一个实例，与转铁蛋白或抗转铁蛋白受体抗体缀合的分子载荷可通过与转铁蛋白受体结合而被肌细胞摄取，然后可例如通过网格蛋白介导的内吞作用内吞。
肌肉靶向剂的使用可用于将分子载荷(例如，寡核苷酸)集中在肌肉中，同时降低与其他组织中的作用相关的毒性。在一些实施方案中，与对象内的另一种细胞类型相比，肌肉靶向剂将结合的分子载荷集中在肌细胞中。在一些实施方案中，肌肉靶向剂将结合的分子载荷以是非肌细胞(例如，肝、神经元、血液或脂肪细胞)中的量的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100倍高的量集中在肌细胞(例如，骨骼肌、平滑肌或心肌细胞)中。在一些实施方案中，当分子载荷在与肌肉靶向剂结合时递送至对象时，其在对象中的毒性降低至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％或95％。
在一些实施方案中，为了实现肌肉选择性，可能需要肌肉识别元件(例如，肌细胞抗原)。作为一个实例，肌肉靶向剂可以是为肌肉特异性摄取转运体之底物的小分子。作为另一个实例，肌肉靶向剂可以是通过转运体介导的内吞作用进入肌细胞的抗体。作为另一个实例，肌肉靶向剂可以是与肌细胞上的细胞表面受体结合的配体。应当理解，尽管基于转运体的方法为细胞进入提供了直接途径，但是基于受体的靶向可能涉及刺激的胞吞作用以达到期望的作用部位。
i.肌肉靶向抗体
在一些实施方案中，肌肉靶向剂是抗体。通常来说，抗体对其靶抗原的高特异性提供了用于选择性靶向肌细胞(例如，骨骼肌、平滑肌和/或(例如，和)心肌细胞)的潜力。这种特异性也可以限制脱靶毒性。能够靶向肌细胞表面抗原的抗体的一些实例已经报道并且在本公开内容的范围内。例如，靶向肌细胞表面的抗体在以下中有描述：Arahata K.,etal.“Immunostaining of skeletal and cardiac muscle surface membrane with antibodyagainst Duchenne muscular dystrophy peptide”Nature 1988；333:861-3；Song K.S.,et al.“Expression of caveolin-3in skeletal,cardiac,and smooth musclecells.Caveolin-3is a component of the sarcolemma and co-fractionates withdystrophin and dystrophin-associated glycoproteins”J Biol Chem 1996；271:15160-5；以及Weisbart R.H.et al.,“Cell type specific targeted intracellulardelivery into muscle of a monoclonal antibody that binds myosin IIb”MolImmunol.2003Mar,39(13):78309；其各自的全部内容均通过引用并入本文。
a.抗转铁蛋白受体抗体
本公开内容的一些方面是基于这样的认识：与转铁蛋白受体结合的物质(例如，抗转铁蛋白受体抗体)能够靶向肌细胞。转铁蛋白受体是内化细胞表面受体，其通过细胞膜转运转铁蛋白并参与胞内铁水平的调节和稳态。本公开内容的一些方面提供了能够与转铁蛋白受体结合的转铁蛋白受体结合蛋白。因此，本公开内容的一些方面提供了与转铁蛋白受体结合的结合蛋白(例如，抗体)。在一些实施方案中，与转铁蛋白受体结合的结合蛋白与任何结合的分子载荷一起被内化到肌细胞中。本文中使用的与转铁蛋白受体结合的抗体可以可互换地称为转铁蛋白受体抗体、抗转铁蛋白受体抗体或抗TfR抗体。与转铁蛋白受体结合(例如，特异性结合)的抗体可在与转铁蛋白受体结合后例如通过受体介导的内吞作用而被内化到细胞中。
应当理解，可使用数种已知的方法(例如使用噬菌体展示的文库设计)来产生、合成和/或(例如，和)衍生抗转铁蛋白受体抗体。示例性方法已经在本领域中表征并且通过引用并入(Díez,P.et al.“High-throughput phage-display screening in arrayformat”,Enzyme and microbial technology,2015,79,34-41.；Christoph M.H.andStanley,J.R.“Antibody Phage Display:Technique and Applications”J InvestDermatol.2014,134:2.；Engleman,Edgar(Ed.)“Human Hybridomas and MonoclonalAntibodies.”1985,Springer)。在另一些实施方案中，抗转铁蛋白抗体先前已被表征或公开。与转铁蛋白受体特异性结合的抗体是本领域中已知的(参见，例如1979年12月4日提交的美国专利No.4,364,934，“Monoclonal antibody to a human early thymocyteantigen and methods for preparing same”；2006年6月14日提交的美国专利No.8,409,573，“Anti-CD71monoclonal antibodies and uses thereof for treating malignanttumor cells”；2014年5月20日提交的美国专利No.9,708,406，“Anti-transferrinreceptor antibodies and methods of use”；2014年12月19日提交的US 9,611,323，“Lowaffinity blood brain barrier receptor antibodies and uses therefor”；2014年12月24日提交的WO 2015/098989，“Novel anti-Transferrin receptor antibody thatpasses through blood-brain barrier”；Schneider C.et al.“Structural features ofthe cell surface receptor for transferrin that is recognized by themonoclonal antibody OKT9.”J Biol Chem.1982,257:14,8516-8522.；Lee et al.“Targeting Rat Anti-Mouse Transferrin Receptor Monoclonal Antibodies throughBlood-Brain Barrier in Mouse”2000,J Pharmacol.Exp.Ther.,292:1048-1052)。
在一些方面中，本文中提供了用作肌肉靶向剂(例如，在肌肉靶向复合物中)的新抗TfR抗体。在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR抗体以高特异性和亲和力与转铁蛋白受体结合。在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR抗体与转铁蛋白受体的任何胞外表位或暴露于抗体的表位特异性结合。在一些实施方案中，本文中提供的抗TfR抗体与来自人、非人灵长类、小鼠、大鼠等的转铁蛋白受体特异性结合。在一些实施方案中，本文中提供的抗TfR抗体与人转铁蛋白受体结合。在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR抗体与人或非人灵长类转铁蛋白受体的氨基酸区段(如SEQ ID NO:105至108中提供的)结合。在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR抗体与这样的氨基酸区段结合：对应于人转铁蛋白受体(如SEQID NO:105中所示)的第90至96位氨基酸，其不在转铁蛋白受体的顶端结构域中。
对应于NCBI序列NP_003225.2(转铁蛋白受体蛋白1同种型1，智人(homosapiens))的示例性人转铁蛋白受体氨基酸序列如下：
Figure GDA0004266820060000271
对应于NCBI序列NP_001244232.1(转铁蛋白受体蛋白1，恒河猴(Macacamulatta))的示例性非人灵长类转铁蛋白受体氨基酸序列如下：
Figure GDA0004266820060000281
对应于NCBI序列XP_005545315.1(转铁蛋白受体蛋白1，食蟹猴(Macacafascicularis))的示例性非人灵长类转铁蛋白受体氨基酸序列如下：
Figure GDA0004266820060000282
对应于NCBI序列NP_001344227.1(转铁蛋白受体蛋白1，小家鼠(mus musculus))的示例性小鼠转铁蛋白受体氨基酸序列如下：
Figure GDA0004266820060000291
在一些实施方案中，抗转铁蛋白受体抗体与如下的受体氨基酸区段结合：
Figure GDA0004266820060000292
Figure GDA0004266820060000293
并且不抑制转铁蛋白受体与转铁蛋白和/或(例如，和)人血色素沉着蛋白(human hemochromatosis protein，也称为HFE)之间的结合相互作用。在一些实施方案中，本文中所述的抗转铁蛋白受体抗体不与SEQ IDNO:109中的表位结合。
可使用适当的方法来获得和/或(例如，和)产生抗体、抗体片段或抗原结合剂，例如，通过使用重组DNA方案。在一些实施方案中，也可通过杂交瘤的产生来产生抗体(参见，例如，Kohler,G and Milstein,C.“Continuous cultures of fused cells secretingantibody of predefined specificity”Nature,1975,256:495-497)。目的抗原可以以任何形式或实体(例如，重组或天然存在的形式或实体)用作免疫原。使用标准方法(例如ELISA筛选)筛选杂交瘤，以发现至少一种产生靶向特定抗原之抗体的杂交瘤。也可通过筛选表达抗体的蛋白质表达文库(例如，噬菌体展示文库)来产生抗体。在一些实施方案中，也可使用噬菌体展示文库设计(参见，例如，1991年3月1日提交的美国专利No 5,223,409，“Directed evolution of novel binding proteins”；1992年4月10日提交的WO 1992/18619，“Heterodimeric receptor libraries using phagemids”；1991年5月1日提交的WO1991/17271，“Recombinant library screening methods”；1992年5月15日提交的WO1992/20791，“Methods for producing members of specific binding pairs”；1992年2月28日提交的WO 1992/15679，“Improved epitope displaying phage”)。在一些实施方案中，目的抗原可用于对非人动物，例如啮齿动物或山羊进行免疫接种。在一些实施方案中，然后从非人动物获得抗体，并且可任选地使用多种方法(例如，使用重组DNA技术)对其进行修饰。抗体产生的其他实例和方法是本领域已知的(参见，例如Harlow et al.“Antibodies:ALaboratory Manual”,Cold Spring Harbor Laboratory,1988.)。
在一些实施方案中，对抗体进行修饰，例如，通过糖基化、磷酸化、SUMO化和/或(例如，和)甲基化进行修饰。在一些实施方案中，抗体是与一个或更多个糖或碳水化合物分子缀合的糖基化抗体。在一些实施方案中，一个或更多个糖或碳水化合物分子通过N-糖基化、O-糖基化、C-糖基化、糖基磷脂酰肌醇化(GPI锚定附着)和/或(例如，和)磷酸糖基化与抗体缀合。在一些实施方案中，一个或更多个糖或碳水化合物分子是单糖、二糖、寡糖或聚糖。在一些实施方案中，一个或更多个糖或碳水化合物分子是支化的寡糖或支化的聚糖。在一些实施方案中，一个或更多个糖或碳水化合物分子包含甘露糖单元、葡萄糖单元、N-乙酰葡糖胺单元、N-乙酰半乳糖胺单元、半乳糖单元、岩藻糖单元或磷脂单元。在一些实施方案中，存在约1至10、约1至5、约5至10、约1至4、约1至3或约2个糖分子。在一些实施方案中，糖基化抗体是完全或部分糖基化的。在一些实施方案中，通过化学反应或通过酶促手段使抗体糖基化。在一些实施方案中，抗体在体外或细胞内被糖基化，其可任选地缺少N-或O-糖基化途径中的酶，例如糖基转移酶。在一些实施方案中，用糖或碳水化合物分子对抗体进行官能化，如2014年5月1日公开的标题为“Modified antibody,antibody-conjugate and processfor the preparation thereof”的国际专利申请公开WO2014065661中所述。
在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR抗体包含选自表2的任一种抗TfR抗体的VL结构域和/或(例如，和)VH结构域，并且包含恒定区，所述恒定区包含IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的任何类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或任何亚类(例如，IgG2a和IgG2b)的恒定区的氨基酸序列。本领域中描述了人恒定区的一些非限制性实例，例如参见上文Kabat E A et al.,(1991)。
在一些实施方案中，与转铁蛋白受体结合的物质，例如抗TfR抗体，能够靶向肌细胞和/或(例如，和)介导物质穿过血脑屏障的转运。转铁蛋白受体是将转铁蛋白转运通过细胞膜并参与胞内铁水平的调节和稳态的内化细胞表面受体。本公开内容的一些方面提供了能够结合转铁蛋白受体的转铁蛋白受体结合蛋白。与转铁蛋白受体结合(例如，特异性结合)的抗体可在与转铁蛋白受体结合之后被内化至细胞中，例如通过受体介导的胞吞作用而被内化至细胞中。
在一些方面中，本文中提供了以高特异性和亲和力与转铁蛋白受体结合的人源化抗体。在一些实施方案中，本文中所述的人源化抗TfR抗体与转铁蛋白受体的任何胞外表位或暴露于抗体的表位特异性结合。在一些实施方案中，本文中提供的人源化抗TfR抗体与来自人、非人灵长类、小鼠、大鼠等的转铁蛋白受体特异性结合。在一些实施方案中，本文中提供的人源化抗TfR抗体与人转铁蛋白受体结合。在一些实施方案中，本文中所述的人源化抗TfR抗体与如SEQ ID NO:105至108中提供的人或非人灵长类转铁蛋白受体的氨基酸区段结合。在一些实施方案中，本文中所述的人源化抗TfR抗体与这样的氨基酸区段结合：对应于如SEQ ID NO:105中所示的人转铁蛋白受体的第90至96位氨基酸，其不在转铁蛋白受体的顶端结构域中。在一些实施方案中，本文中所述的人源化抗TfR抗体与TfR1结合但与不TfR2结合。
在一些实施方案中，抗TFR抗体以至少约10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M或更小的结合亲和力(例如，如Kd所示)特异性结合TfR1(例如，人或非人灵长类TfR1)。在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR抗体以亚纳摩范围的KD与TfR1结合。在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR抗体选择性地与转铁蛋白受体1(TfR1)结合但不与转铁蛋白受体2(TfR2)结合。在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR抗体与人TfR1和食蟹猴TfR1结合(例如，Kd为10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M或更小)，但不与小鼠TfR1结合。抗TfR抗体的亲和力和结合动力学可使用任何合适的方法测试，包括但不限于生物传感器技术(例如，OCTET或BIACORE)。在一些实施方案中，本文中所述的任一种抗TfR抗体的结合不竞争或抑制转铁蛋白与TfR1的结合。在一些实施方案中，本文中所述的任一种抗TfR抗体的结合不竞争或抑制HFE-β-2-微球蛋白与TfR1的结合。
本文中所述的抗TfR抗体是人源化抗体。表2中提供了本文中所述的人源化抗TfR抗体来源于其的小鼠单克隆抗TfR抗体的CDR和可变区氨基酸序列。
表2.小鼠单克隆抗TfR抗体
Figure GDA0004266820060000321
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Figure GDA0004266820060000331
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Figure GDA0004266820060000341
*突变位置根据包含突变的相应VH序列的Kabat编号
在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR抗体是表2中提供的任一种抗TfR抗体的人源化变体。在一些实施方案中，本公开内容的抗TfR抗体包含与表2中提供的任一种抗TfR抗体中的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3相同的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，并且包含人源化重链可变区和/或(例如，和)人源化轻链可变区。
人源化抗体是人免疫球蛋白(接受体抗体)，其中来自接受体的互补决定区(complementary determining region，CDR)的残基被来自具有期望特异性、亲和力和容量(capacity)的非人物种(供体抗体)例如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基替代。在一些实施方案中，人免疫球蛋白的Fv框架区(framework region，FR)残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可包含在接受体抗体或者导入的CDR或框架序列中均未发现但被包含在内以进一步完善和优化抗体性能的残基。一般而言，人源化抗体将包含至少一个并且通常是两个的可变结构域的基本上全部，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体最佳地还将包含免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)(通常是人免疫球蛋白的那些)的至少一部分。抗体可具有如WO 99/58572中所述修饰的Fc区。人源化抗体的另一些形式具有相对于原始抗体而改变的一个或更多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个、六个)，其也称为来源于来自原始抗体的一个或更多个CDR的一个或更多个CDR。人源化抗体还可能涉及亲和力成熟。
人源化抗体及其制备方法是已知的，例如，如在以下中描述的：Almagro et al.,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)；Riechmann et al.,Nature332:323-329(1988)；Queen et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利No.5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri et al.,Methods 36:25-34(2005)；Padlan et al.,Mol.Immunol.28:489-498(1991)；Dall’Acqua et al.,Methods 36:43-60(2005)；Osbourn et al.,Methods 36:61-68(2005)；以及Klimka et al.,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)，其全部内容均通过引用并入本文。可用于人源化的人框架区在例如以下中描述：Sims et al.J.Immunol.151:2296(1993)；Carter etal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；Presta et al.J.Immunol.,151:2623(1993)；Almagro et al.,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；Baca et al.,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)以及Rosok et al.,J Biol.Chem.271:22611-22618(1996)，其全部内容均通过引用并入本文。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含以下：人源化VH，其与表2中列出的任一种VH相比(例如，在VH框架区中)包含一个或更多个氨基酸变异，和/或(例如，和)人源化VL，其与表2中列出的任一种VL相比(例如，在VL框架区中)包含一个或更多个氨基酸变异。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含人源化VH，所述人源化VH与表2中列出的任何抗TfR抗体的VH(例如，SEQ ID NO:17、22、26、43、61、65和68中的任一种)相比，包含不超过25个氨基酸变异(例如，不超过25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)。作为替代或补充(例如，补充)，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含人源化VL，所述人源化VL与表2中列出的任一种抗TfR抗体的VL(例如，SEQ ID NO:18、44和62中的任一种)相比，包含不超过25个氨基酸变异(例如，不超过25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含人源化VH，所述人源化VH在框架区中包含与表2中列出的任何抗TfR抗体的VH(例如，SEQ ID NO:17、22、26、43、61、65和68中的任一种)具有至少75％(例如，75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列。作为替代或补充(例如，补充)，在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含人源化VL，所述人源化VL在框架区中包含与表2中列出的任何抗TfR抗体的VL(例如，SEQ ID NO:18、44和62中的任一种)具有至少75％(例如，75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含人源化VH，所述人源化VH包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR-H1(根据IMGT定义系统)、具有SEQ ID NO:2、SEQID NO:19或SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR-H2(根据IMGT定义系统)、具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H3(根据IMGT定义系统)，并且与SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:22或SEQID NO:26中所示的VH相比，在框架区中包含不超过25个氨基酸变异(例如，不超过25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)。作为替代或补充(例如，补充)，本公开内容的抗TfR抗体包含人源化VL，所述人源化VL包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-L1(根据IMGT定义系统)、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR-L2(根据IMGT定义系统)和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3(根据IMGT定义系统)，并且与SEQ ID NO:18中所示的VL相比，在框架区中包含不超过25个氨基酸变异(例如，不超过25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含人源化VH，所述人源化VH包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的CDR-H1(根据IMGT定义系统)、具有SEQ ID NO:2、SEQID NO:19或SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR-H2(根据IMGT定义系统)、具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H3(根据IMGT定义系统)，并且在框架区中与SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:22或SEQ ID NO:26中所示的VH具有至少75％(例如，75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性。作为替代或补充(例如，补充)，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含人源化VL，所述人源化VL包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-L1(根据IMGT定义系统)、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR-L2(根据IMGT定义系统)和具有,SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3(根据IMGT定义系统)，并且在框架区中与SEQ ID NO:18中任一种所示的VL具有至少75％(例如，75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含人源化VH，所述人源化VH包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-H1(根据Kabat定义系统)、具有SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR-H2(根据Kabat定义系统)、具有SEQ IDNO:9的氨基酸序列的CDR-H3(根据Kabat定义系统)，并且与SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:26中所示的VH相比，在框架区中包含不超过25个氨基酸变异(例如，不超过25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)。作为替代或补充(例如，补充)，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含人源化VL，所述人源化VL包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-L1(根据Kabat定义系统)、具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-L2(根据Kabat定义系统)和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3(根据Kabat定义系统)，并且与SEQ ID NO:18中所示的VL相比，在框架区中包含不超过25个氨基酸变异(例如，不超过25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含人源化VH，所述人源化VH包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-H1(根据Kabat定义系统)、具有SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR-H2(根据Kabat定义系统)、具有SEQ IDNO:9的氨基酸序列的CDR-H3(根据Kabat定义系统)，并且在框架区中与SEQ ID NO:17、SEQID NO:22或SEQ ID NO:26中所示的VH具有至少75％(例如，75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性。作为替代或补充(例如，补充)，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含人源化VL，所述人源化VL包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-L1(根据Kabat定义系统)、具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-L2(根据Kabat定义系统)和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3(根据Kabat定义系统)，并且在框架区中与SEQ ID NO:18中任一种所示的VL具有至少75％(例如，75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含人源化VH，所述人源化VH包含具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-H1(根据Chothia定义系统)、具有SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR-H2(根据Chothia定义系统)、具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3(根据Chothia定义系统)，并且与SEQ ID NO:17、SEQID NO:22或SEQ ID NO:26中所示的VH相比，在框架区中包含不超过25个氨基酸变异(例如，不超过25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)。作为替代或补充(例如，补充)，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含人源化VL，所述人源化VL包含具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1(根据Chothia定义系统)、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR-L2(根据Chothia定义系统)，和具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L3(根据Chothia定义系统)，并且与SEQ ID NO:18中所示的VL相比，在框架区中包含不超过25个氨基酸变异(例如，不超过25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含人源化VH，所述人源化VH包含具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-H1(根据Chothia定义系统)、具有SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR-H2(根据Chothia定义系统)、具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3(根据Chothia定义系统)，并且在框架区中与SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:26中所示的VH具有至少75％(例如，75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性。作为替代或补充(例如，补充)，本公开内容的抗TfR抗体包含人源化VL，所述人源化VL包含具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1(根据Chothia定义系统)、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR-L2(根据Chothia定义系统)和具有SEQ IDNO:16的氨基酸序列CDR-L3(根据Chothia定义系统)，并且在框架区中与SEQ ID NO:18中任一种所示的VL具有至少75％(例如，75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含人源化VH，所述人源化VH包含具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR-H1(根据IMGT定义系统)、具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR-H2(根据IMGT定义系统)、具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR-H3(根据IMGT定义系统)，并且与SEQ ID NO:43中所示的VH相比，在框架区中包含不超过25个氨基酸变异(例如，不超过25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)。作为替代或补充(例如，补充)，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含人源化VL，所述人源化VL包含具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR-L1(根据IMGT定义系统)、具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR-L2(根据IMGT定义系统)和具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR-L3(根据IMGT定义系统)，并且与SEQ ID NO:44中所示的VL相比，在框架区中包含不超过25个氨基酸变异(例如，不超过25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含人源化VH，所述人源化VH包含具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR-H1(根据IMGT定义系统)、具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR-H2(根据IMGT定义系统)、具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR-H3(根据IMGT定义系统)，并且在框架区中与SEQ ID NO:43中所示的VH具有至少75％(例如，75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性。作为替代或补充(例如，补充)，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含人源化VL，所述人源化VL包含具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR-L1(根据IMGT定义系统)、具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR-L2(根据IMGT定义系统)和具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR-L3(根据IMGT定义系统)，并且在框架区中与SEQ ID NO:44中所示的VL具有至少75％(例如，75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含人源化VH，所述人源化VH包含具SEQ ID NO:33有氨基酸序列的CDR-H1(根据Kabat定义系统)、具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR-H2(根据Kabat定义系统)、具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR-H3(根据Kabat定义系统)，并且与SEQ ID NO:43中所示的VH相比，在框架区中包含不超过25氨基酸变异(例如，不超过25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)。作为替代或补充(例如，补充)，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含人源化VL，所述人源化VL包含具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR-L1(根据Kabat定义系统)、具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR-L2(根据Kabat定义系统)和具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR-L3(根据Kabat定义系统)，并且与SEQ ID NO:44中所示的VL相比，在框架区中包含不超过25个氨基酸变异(例如，不超过25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含人源化VH，所述人源化VH包含具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR-H1(根据Kabat定义系统)、具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR-H2(根据Kabat定义系统)、具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR-H3(根据Kabat定义系统)，并且在框架区中与SEQ ID NO:43中所示的VH具有至少75％(例如，75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性。作为替代或补充(例如，补充)，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含人源化VL，所述人源化VL包含具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR-L1(根据Kabat定义系统)、具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR-L2(根据Kabat定义系统)和具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR-L3(根据Kabat定义系统)，并且在框架区与SEQ ID NO:44中所示的VL具有至少75％(例如，75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含人源化VH，所述人源化VH包含具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR-H1(根据Chothia定义系统)、具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR-H2(根据Chothia定义系统)、具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR-H3(根据Chothia定义系统)，并且与有SEQ ID NO:43中所示的VH相比，在框架区中包含不超过25个氨基酸变异(例如，不超过25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)。作为替代或补充(例如，补充)，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含人源化VL，所述人源化VL包含具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR-L1(根据Chothia定义系统)、具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR-L2(根据Chothia定义系统)和具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR-L3(根据Chothia定义系统)，并且与SEQ IDNO:44中所示的VL相比，在框架区中包含不超过25个氨基酸变异(例如，不超过25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含人源化VH，所述人源化VH包含具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR-H1(根据Chothia定义系统)、具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR-H2(根据Chothia定义系统)、具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR-H3(根据Chothia定义系统)，并且在框架区中与SEQ ID NO:43中所示的VH具有至少75％(例如，75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性。作为替代或补充(例如，补充)，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含人源化VL，所述人源化VL包含具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR-L1(根据Chothia定义系统)、具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR-L2(根据Chothia定义系统)和具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR-L3(根据Chothia定义系统)，并且在框架区中与SEQ ID NO:44中所示的VL具有至少75％(例如，75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含人源化VH，所述人源化VH包含具有SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:66的氨基酸序列的CDR-H1(根据IMGT定义系统)、具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR-H2(根据IMGT定义系统)、具有SEQ IDNO:47的氨基酸序列的CDR-H3(根据IMGT定义系统)，并且与SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:68中所示的VH相比，在框架区中包含不超过25个氨基酸变异(例如，不超过25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)。作为替代或补充(例如，补充)，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含人源化VL，所述人源化VL包含具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR-L1(根据IMGT定义系统)、具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的CDR-L2(根据IMGT定义系统)和具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CDR-L3(根据IMGT定义系统)，并且与SEQ ID NO:62中所示的VL相比，在框架区中包含不超过25个氨基酸变异(例如，不超过25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含人源化VH，所述人源化VH包含具有SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:66的氨基酸序列的CDR-H1(根据IMGT定义系统)、具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR-H2(根据IMGT定义系统)、具有SEQ IDNO:47的氨基酸序列的CDR-H3(根据IMGT定义系统)，并且在框架区中与SEQ ID NO:61、SEQID NO:65、SEQ ID NO:68中所示的VH具有至少75％(例如，75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性。作为替代或补充(例如，补充)，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含人源化VL，所述人源化VL包含具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR-L1(根据IMGT定义系统)、具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的CDR-L2(根据IMGT定义系统)和具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CDR-L3(根据IMGT定义系统)，并且在框架区与SEQ ID NO:62中所示的VL具有至少75％(例如，75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含人源化VH，所述人源化VH包含具有SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDR-H1(根据Kabat定义系统)、具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的CDR-H2(根据Kabat定义系统)、具有SEQ IDNO:53的氨基酸序列的CDR-H3(根据Kabat定义系统)，并且与SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:68中所示的VH相比，在框架区中包含不超过25个氨基酸变异(例如，不超过25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)。作为替代或补充(例如，补充)，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含人源化VL，所述人源化VL包含具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的CDR-L1(根据Kabat定义系统)、具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR-L2(根据Kabat定义系统)和具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CDR-L3(根据Kabat定义系统)，并且与SEQ ID NO:62中所示的VL相比，在框架区中包含不超过25个氨基酸变异(例如，不超过25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含人源化VH，所述人源化VH包含具有SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDR-H1(根据Kabat定义系统)、具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的CDR-H2(根据Kabat定义系统)、具有SEQ IDNO:53的氨基酸序列的CDR-H3(根据Kabat定义系统)，并且在框架区中与SEQ ID NO:61、SEQID NO:65、SEQ ID NO:68中所示的VH具有至少75％(例如，75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性。作为替代或补充(例如，补充)，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含人源化VL，所述人源化VL包含具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的CDR-L1(根据Kabat定义系统)、具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR-L2(根据Kabat定义系统)和具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CDR-L3(根据Kabat定义系统)，并且在框架区中与SEQ ID NO:62中所示的VL具有至少75％(例如，75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含人源化VH，所述人源化VH包含具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的CDR-H1(根据Chothia定义系统)、具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的CDR-H2(根据Chothia定义系统)、具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的CDR-H3(根据Chothia定义系统)，并且与SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:68中所示的VH相比，在框架区中包含不超过25个氨基酸变异(例如，不超过25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)。作为替代或补充(例如，补充)，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含人源化VL，所述人源化VL包含具有SEQID NO:59的氨基酸序列的CDR-L1(根据Chothia定义系统)、具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的CDR-L2(根据Chothia定义系统)和具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR-L3(根据Chothia定义系统)，并且与SEQ ID NO:62中所示的VL相比，在框架区中包含不超过25个氨基酸变异(例如，不超过25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含人源化VH，所述人源化VH包含具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的CDR-H1(根据Chothia定义系统)、具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的CDR-H2(根据Chothia定义系统)、具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的CDR-H3(根据Chothia定义系统)，并且在框架区中与SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:65、SEQ IDNO:68中所示的VH具有至少75％(例如，75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性。作为替代或补充(例如，补充)，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含人源化VL，所述人源化VL包含具有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的CDR-L1(根据Chothia定义系统)、具有SEQ IDNO:49的氨基酸序列的CDR-L2(根据Chothia定义系统)和具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR-L3(根据Chothia定义系统)，并且在框架区中与SEQ ID NO:62中所示的VL具有至少75％(例如，75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性。
表3中提供了本文中所述的人源化抗TfR抗体的氨基酸序列的一些实例。
表3.人源化抗TfR抗体的可变区
Figure GDA0004266820060000441
/>
Figure GDA0004266820060000451
/>
Figure GDA0004266820060000461
*突变位置根据包含突变的相应VH序列的Kabat编号
**根据Kabat编号系统的CDR被加粗
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含人源化VH，所述人源化VH包含表2中提供的任一种抗TfR抗体的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且与表3中提供的相应人源化VH相比，在框架区中包含的一个或更多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)氨基酸变异。作为替代或补充(例如，补充)，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含人源化VL，所述人源化VL包含表2中提供的任一种抗TfR抗体的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，并且与表3中提供的相应人源化VL相比，在框架区中包含一个或更多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)氨基酸变异。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含以下：含有与SEQ ID NO:69具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的人源化VH，和/或(例如，和)含有与SEQ ID NO:70具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的人源化VL。在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的人源化VH和含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的人源化VL。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含以下：含有与SEQ ID NO:71具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的人源化VH，和/或(例如，和)含有与SEQ ID NO:70具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的人源化VL。在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的人源化VH和含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的人源化VL。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含以下：含有与SEQ ID NO:72具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的人源化VH，和/或(例如，和)含有与SEQ ID NO:70具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的人源化VL。在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的人源化VH和含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的人源化VL。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含以下：含有与SEQ ID NO:73具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的人源化VH，和/或(例如，和)含有与SEQ ID NO:74具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的人源化VL。在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的人源化VH和含有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的人源化VL。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含以下：含有与SEQ ID NO:73具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的人源化VH，和/或(例如，和)含有与SEQ ID NO:75具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的人源化VL。在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的人源化VH和含有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的人源化VL。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含以下：含有与SEQ ID NO:76具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的人源化VH，和/或(例如，和)含有与SEQ ID NO:74具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的人源化VL。在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的人源化VH和含有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的人源化VL。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含以下：含有与SEQ ID NO:76具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的人源化VH，和/或(例如，和)含有与SEQ ID NO:75具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的人源化VL。在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的人源化VH和含有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的人源化VL。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含以下：含有与SEQ ID NO:77具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的人源化VH，和/或(例如，和)含有与SEQ ID NO:78具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的人源化VL。在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的人源化VH和含有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的人源化VL。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含以下：含有与SEQ ID NO:79具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的人源化VH，和/或(例如，和)含有与SEQ ID NO:80具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的人源化VL。在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的人源化VH和含有SEQ ID NO:80氨基酸序列的人源化VL。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含以下：含有与SEQ ID NO:77具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的人源化VH，和/或(例如，和)含有与SEQ ID NO:80具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的人源化VL。在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的人源化VH和含有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的人源化VL。
在一些实施方案中，本文中所述的人源化抗TfR抗体是全长IgG，其可包含来自人抗体的重恒定区和轻恒定区。在一些实施方案中，本文中所述的任何抗TfR抗体的重链可包含重链恒定区(CH)或其一部分(例如，CH1、CH2、CH3或其组合)。重链恒定区可具有任何合适的来源，例如人、小鼠、大鼠或兔。在一个具体实例中，重链恒定区来自人IgG例如IgG1、IgG2或IgG4(γ重链)。以下给出了人IgG1恒定区的一个实例：
Figure GDA0004266820060000491
在一些实施方案中，本文中所述的任何抗TfR抗体的重链包含突变体人IgG1恒定区。例如，已知在人IgG1的CH2结构域中引入LALA突变(来源于mAb b12的突变体，其已突变以用Ala234和Ala235替换较低的铰链残基Leu234 Leu235)降低了Fcg受体结合(Bruhns,P.,et al.(2009)和Xu,D.et al.(2000))。以下提供了突变体人IgG1恒定区(突变加粗并带有下划线)：
Figure GDA0004266820060000492
在一些实施方案中，本文中所述的任何抗TfR抗体的轻链可还包含轻链恒定区(CL)，其可以是本领域已知的任何CL。在一些实例中，CL是κ轻链。在另一些实例中，CL是λ轻链。在一些实施方案中，CL是κ轻链，以下提供了其序列：
Figure GDA0004266820060000493
其他抗体重链和轻链恒定区是本领域公知的，例如在IMGT数据库(www.imgt.org)或www.vbase2.org/vbstat.php.中提供的那些，二者均通过引用并入本文。
在一些实施方案中，本文中所述的人源化抗TfR抗体包含重链，所述重链包含表3中列出的任一种VH或其任意变体以及与SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:82具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的重链恒定区。在一些实施方案中，本文中所述的人源化抗TfR抗体包含重链，所述重链包含表3中列出的任一种VH或其任意变体以及与SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:82相比包含不超过25个氨基酸变异(例如，不超过25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)的重链恒定区。在一些实施方案中，本文中所述的人源化抗TfR抗体包含重链，所述重链包含表3中列出的任一种VH或其任意变体以及SEQ ID NO:81中所示的重链恒定区。在一些实施方案中，本文中所述的人源化抗TfR抗体包含重链，所述重链包含表3中列出的任一种VH或其任意变体以及SEQ ID NO:82中所示的重链恒定区。
在一些实施方案中，本文中所述的人源化抗TfR抗体包含轻链，所述轻链包含表3中列出的任一种VL或其任意变体以及与SEQ ID NO:83具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的轻链恒定区。在一些实施方案中，本文中所述的人源化抗TfR抗体包含轻链，所述轻链包含表3中列出的任一种VL或其任意变体以及与SEQ ID NO:83相比包含不超过25个氨基酸变异(例如，不超过25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)的轻链恒定区。在一些实施方案中，本文中所述的人源化抗TfR抗体包含轻链，所述轻链包含表3中列出的任一种VL或其任意变体以及SEQ ID NO:83中所示的轻链恒定区。
下表4中提供了所述抗TfR抗体的IgG重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列的一些实例。
表4.人源化抗TfR IgG实例的重链序列和轻链序列
Figure GDA0004266820060000511
/>
Figure GDA0004266820060000521
/>
Figure GDA0004266820060000531
*突变位置根据包含突变的相应VH序列的Kabat编号
**根据Kabat编号系统的CDR被加粗；VH/VL序列带有下划线
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含重链，所述重链与SEQ IDNO:84、86、87、88、91、92和94中任一个所示的重链相比，包含不超过25个氨基酸变异(例如，不超过25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)。作为替代或补充(例如，补充)，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含轻链，所述轻链与SEQ ID NO:85、89、90、93和95中任一个所示的轻链相比包含不超过25个氨基酸变异(例如，不超过25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)。
在一些实施方案中，本文中所述的人源化抗TfR抗体包含重链，所述重链包含与SEQ ID NO:84、86、87、88、91、92和94中的任一个具有至少75％(例如，75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列。作为替代或补充(例如，补充)，本文中所述的人源化抗TfR抗体包含轻链，所述轻链包含与SEQ ID NO:85、89、90、93和95中的任一个具有至少75％(例如，75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:84、86、87、88、91、92和94中任一个的氨基酸序列的重链。作为替代或补充(例如，补充)，本文中所述的抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:85、89、90、93和95中任一个的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含以下：含有与SEQ ID NO:84具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的重链，和/或(例如，和)含有与SEQ ID NO:85具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:84的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含以下：含有与SEQ ID NO:86具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的重链，和/或(例如，和)含有与SEQ ID NO:85具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含以下：含有与SEQ ID NO:87具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的重链，和/或(例如，和)含有与SEQ ID NO:85具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含以下：含有与SEQ ID NO:88具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的重链，和/或(例如，和)含有与SEQ ID NO:89具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含以下：含有与SEQ ID NO:88具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的重链，和/或(例如，和)含有与SEQ ID NO:90具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含以下：含有与SEQ ID NO:91具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的重链，和/或(例如，和)含有与SEQ ID NO:89具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含以下：含有与SEQ ID NO:91具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的重链，和/或(例如，和)含有与SEQ ID NO:90具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含以下：含有与SEQ ID NO:92具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的重链，和/或(例如，和)含有与SEQ ID NO:93具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:93的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含以下：含有与SEQ ID NO:94具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的重链，和/或(例如，和)含有SEQ ID NO:95具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:94的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含以下：含有与SEQ ID NO:92具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的重链，和/或(例如，和)含有与SEQ ID NO:95具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，抗TfR抗体是完整抗体(全长抗体)的Fab片段、Fab’片段或F(ab’)2片段。完整抗体(全长抗体)的抗原结合片段可以通过常规方法制备(例如，重组地制备或通过使用酶如木瓜蛋白酶消化全长IgG的重链恒定区来制备)。例如，F(ab’)2片段可通过胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化抗体分子产生，并且Fab’片段可通过还原F(ab’)2片段的二硫桥产生。在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1抗体的Fab片段中的重链恒定区包含以下氨基酸序列：
Figure GDA0004266820060000561
在一些实施方案中，本文中所述的人源化抗TfR抗体包含重链，所述重链包含表3中列出的任一种VH或其任意变体以及与SEQ ID NO:96具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的重链恒定区。在一些实施方案中，本文中所述的人源化抗TfR抗体包含重链，所述重链包含表3中列出的任一种VH或其任意变体以及与SEQ ID NO:96相比包含不超过25个氨基酸变异(例如，不超过25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)的重链恒定区。在一些实施方案中，本文中所述的人源化抗TfR抗体包含重链，所述重链包含表3中列出的任一种VH或其任意变体以及SEQ ID NO:96中所示的重链恒定区。
在一些实施方案中，本文中所述的人源化抗TfR抗体包含轻链，所述轻链包含表3中列出的任一种VL或其任意变体以及与SEQ ID NO:83具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的轻链恒定区。在一些实施方案中，本文中所述的人源化抗TfR抗体包含轻链，所述轻链包含表3中列出的任一种VL或其任意变体以及与SEQ ID NO:83相比包含不超过25个氨基酸变异(例如，不超过25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)的轻链恒定区。在一些实施方案中，本文中所述的人源化抗TfR抗体包含轻链，所述轻链包含表3中列出的任一种VL或其任意变体以及SEQ ID NO:83中所示的轻链恒定区。
下表5中提供了所述抗TfR抗体的Fab重链和轻链氨基酸序列的一些实例。
表5.人源化抗TfR Fab实例的重链和轻链序列
Figure GDA0004266820060000571
/>
Figure GDA0004266820060000581
/>
Figure GDA0004266820060000591
*突变位置根据包含突变的相应VH序列的Kabat编号
**根据Kabat编号系统的CDR被加粗；VH/VL序列带有下划线
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含重链，所述重链与SEQ IDNO:97至103中的任一个中所示的重链相比包含不超过25个氨基酸变异(例如，不超过25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)。作为替代或补充(例如，补充)，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含轻链，所述轻链与SEQID NO:85、89、90、93和95中的任一个中所示的轻链相比不超过25个氨基酸变异(例如，不超过25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)。
在一些实施方案中，本文中所述的人源化抗TfR抗体包含重链，所述重链包含与SEQ ID NO:97至103中的任一个具有至少75％(例如，75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列。作为替代或补充(例如，补充)，本文中所述的人源化抗TfR抗体包含轻链，所述轻链包含与SEQ ID NO:85、89、90、93和95中的任一个具有至少75％(例如，75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:97至103中任一个的氨基酸序列。作为替代或补充(例如，补充)，本文中所述的抗TfR抗体包含轻链，所述轻链包含SEQ IDNO:85、89、90、93和95中任一个的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含以下：含有与SEQ ID NO:97具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的重链，和/或(例如，和)含有与SEQ ID NO:85具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含以下：含有与SEQ ID NO:98具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的重链，和/或(例如，和)含有与SEQ ID NO:85具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:98的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含以下：含有与SEQ ID NO:99具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的重链，和/或(例如，和)含有与SEQ ID NO:85具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:99的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含以下：含有与SEQ ID NO:100具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的重链，和/或(例如，和)含有与SEQ ID NO:89具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:100的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含以下：含有与SEQ ID NO:100具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的重链，和/或(例如，和)含有与SEQ ID NO:90具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:100的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含以下：含有与SEQ ID NO:101具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的重链，和/或(例如，和)含有与SEQ ID NO:89具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:101的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含以下：含有与SEQ ID NO:101具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的重链，和/或(例如，和)含有与SEQ ID NO:90具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:101的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含以下：含有与SEQ ID NO:102具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的重链，和/或(例如，和)含有与SEQ ID NO:93具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:93的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含以下：含有与SEQ ID NO:103具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的重链，和/或(例如，和)含有与SEQ ID NO:95具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:103的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含以下：含有与SEQ ID NO:102具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的重链，和/或(例如，和)含有与SEQ ID NO:95具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，本公开内容的人源化抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本文中所述的人源化抗TfR受体抗体可以是任何抗体形式，包括但不限于完整(即全长)抗体、其抗原结合片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、单链抗体、双特异性抗体或纳米抗体。在一些实施方案中，本文中所述的人源化抗TfR抗体是scFv。在一些实施方案中，本文中所述的人源化抗TfR抗体是scFv-Fab(例如，与恒定区的一部分融合的scFv)。在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR受体抗体是与恒定区(例如，SEQ IDNO:81或SEQ ID NO:82中所示的人IgG1恒定区或其一部分，例如Fc部分)在C端或N端融合的scFv。
在一些实施方案中，可在残基不太可能参与与靶抗原(例如，转铁蛋白受体)相互作用的位置(例如，如基于晶体结构确定的)处将保守突变引入抗体序列(例如，CDR或框架序列)中。在一些实施方案中，将一个、两个或更多个突变(例如，氨基酸替换)引入本文中所述的抗TfR抗体的Fc区(例如，在CH2结构域(人IgG1的第231至340位残基)和/或(例如，和)CH3结构域(人IgG1的第341至447位残基)和/或(例如，和)铰链区中，根据Kabat编号系统(例如，Kabat中的EU索引)编号)，以改变抗体的一种或更多种功能特性，例如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或(例如，和)抗原依赖性细胞毒性。
在一些实施方案中，将一个、两个或更多个突变(例如，氨基酸替换)引入Fc区(CH1结构域)的铰链区中，使得铰链区中的半胱氨酸残基的数目改变(例如，增加或减少)，如例如美国专利No.5,677,425中所述。可改变CH1结构域的铰链区中半胱氨酸残基的数目，例如以促进轻链和重链的组装，或改变(例如，提高或降低)抗体的稳定性或促进接头缀合。
在一些实施方案中，将一个、两个或更多个突变(例如，氨基酸替换)引入本文中所述的肌肉靶向抗体的Fc区(例如，在CH2结构域(人IgG1的第231至340位残基)和/或(例如，和)CH3结构域(人IgG1的第341至447位残基)和/或(例如，和)铰链区中，根据Kabat编号系统(例如，Kabat中的EU索引)编号)，以提高或降低抗体对效应细胞表面上Fc受体(例如，激活的Fc受体)的亲和力。降低或提高抗体对Fc受体的亲和力的抗体Fc区中突变以及将这样的突变引入Fc受体或其片段的技术是本领域技术人员已知的。可被进行以改变抗体对Fc受体的亲和力的抗体Fc受体中突变的一些实例描述于以下中：例如Smith P et al.,(2012)PNAS 109:6181-6186,美国专利No.6,737,056，以及国际公开No.WO 02/060919、WO 98/23289、和WO 97/34631，其通过引用并入本文。
在一些实施方案中，将一个、两个或更多个氨基酸突变(即，替换、插入或缺失)引入IgG恒定结构域或其FcRn结合片段(优选地，Fc或铰链-Fc结构域片段)中以改变(例如，降低或提高)抗体在体内的半衰期。参见例如国际公开No.WO 02/060919、WO 98/23289和WO97/34631，以及美国专利No.5,869,046、6,121,022、6,277,375和6,165,745，例如将改变(例如，降低或提高)抗体在体内的半衰期的突变。
在一些实施方案中，将一个、两个或更多个氨基酸突变(即，替换、插入或缺失)引入IgG恒定结构域或其FcRn结合片段(优选地，Fc或铰链-Fc结构域片段)中以降低体内抗TfR抗体的半衰期。在一些实施方案中，将一个、两个或更多个氨基酸突变(即，替换、插入或缺失)引入IgG恒定结构域或其FcRn结合片段(优选地，Fc或铰链-Fc结构域片段)中以提高抗体在体内的半衰期。在一些实施方案中，抗体可在第二恒定(CH2)结构域(人IgG1的第231至340位残基)和/或(例如，和)第三恒定(CH3)结构域(人IgG1的第341至447位残基)(根据Kabat中的EU索引(Kabat E A et al.,(1991)同上)编号)中具有一个或更多个氨基酸突变(例如，替换)。在一些实施方案中，本文中所述的抗体的IgG1的恒定区包含在第252位处的甲硫氨酸(M)至酪氨酸(Y)替换，在第254位处的丝氨酸(S)至苏氨酸(T)替换，以及在第256位处的苏氨酸(T)至谷氨酸(E)替换，所述位置根据Kabat中的EU索引编号。参见美国专利No.7,658,921，其通过引用并入本文。这种类型的突变体IgG(称为“YTE突变体”)已显示出与同一抗体的野生型形式相比半衰期提高4倍(参见Dall’Acqua W F et al.,(2006)JBiol Chem281:23514-24)。在一些实施方案中，抗体包含IgG恒定结构域，该结构域包含在第251至257、285至290、308至314、385至389和428至436位处的氨基酸残基的一个、两个、三个或更多个氨基酸替换，所述位置根据Kabat中的EU索引编号。
在一些实施方案中，将一个、两个或更多个氨基酸替换引入IgG恒定结构域Fc区中，以改变抗抗TfR抗体的效应子功能。对其的亲和力被改变的效应配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。该方法在美国专利No.5,624,821和5,648,260中有更详细的描述。在一些实施方案中，恒定区结构域的缺失或失活(通过点突变或其他方式)可降低循环抗体的Fc受体结合，从而提高肿瘤定位。对于使恒定结构域缺失或失活从而提高肿瘤定位的突变的描述，参见例如美国专利No.5,585,097和8,591,886。在一些实施方案中，可将一个或更多个氨基酸替换引入本文中所述的抗体的Fc区中，以去除Fc区上潜在的糖基化位点，这可降低Fc受体结合(参见，例如Shields R L et al.,(2001)J Biol Chem 276:6591-604)。
在一些实施方案中，可将本文中所述的抗TfR抗体的恒定区中的一个或更多个氨基替换为不同的氨基酸残基，使得抗体具有改变的C1q结合和/或(例如，和)降低或消除的补体依赖性细胞毒性(complement dependent cytotoxicity，CDC)。这种方法在美国专利No.6,194,551(Idusogie et al)中有更详细的描述。在一些实施方案中，改变本文中所述的抗体的CH2结构域的N端区域中的一个或更多个氨基酸残基，从而改变抗体的固定补体的能力。这种方法在国际公开No.WO 94/29351中有进一步描述。在一些实施方案中，对本文中所述的抗体的Fc区进行修饰以提高抗体的介导抗体依赖性细胞毒性(antibody dependentcellular cytotoxicity，ADCC)的能力和/或(例如，和)提高抗体对Fcγ受体的亲和力。这种方法在国际公开No.WO 00/42072中有进一步描述。
在一些实施方案中，本文中提供的抗体的重链和/或(例如，和)轻链可变结构域序列可用于产生例如CDR接枝、嵌合、人源化或复合的人抗体或抗原结合片段，如本文中其他地方所述。如本领域普通技术人员所理解的，来源于本文中提供的任何抗体的任何变体(CDR接枝、嵌合、人源化或复合的抗体)可用于本文中所述的组合物和方法中，并将保持特异性结合转铁蛋白受体的能力，从而使得相对于其所来源原始抗体，变体(CDR接枝、嵌合、人源化或复合的抗体)具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或更多的与转铁蛋白受体的结合。
在一些实施方案中，本文中提供的抗体包含赋予抗体以期望性质的突变。例如，为了避免归因于已知与天然IgG4 mAb发生的Fab臂交换而引起的潜在并发症，本文中提供的抗体可包含稳定性‘Adair’突变(Angal S.,et al.,“A single amino acid substitutionabolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human(IgG4)antibody,”MolImmunol 30,105-108；1993)，其中第228位(EU编号，根据Kabat编号为第241位残基)丝氨酸转化为脯氨酸，从而产生了IgG1样铰链序列。因此，任何抗体都可包含稳定性‘Adair’突变。
在一些实施方案中，对抗体进行修饰，例如，通过糖基化、磷酸化、SUMO化和/或(例如，和)甲基化进行修饰。在一些实施方案中，抗体是与一个或更多个糖或碳水化合物分子缀合的糖基化抗体。在一些实施方案中，一个或更多个糖或碳水化合物分子通过N-糖基化、O-糖基化、C-糖基化、糖基磷脂酰肌醇化(GPI锚定附着)和/或(例如，和)磷酸糖基化与抗体缀合。在一些实施方案中，一个或更多个糖或碳水化合物分子是单糖、二糖、寡糖或聚糖。在一些实施方案中，一个或更多个糖或碳水化合物分子是支化的寡糖或支化的聚糖。在一些实施方案中，一个或更多个糖或碳水化合物分子包含甘露糖单元、葡萄糖单元、N-乙酰葡糖胺单元、N-乙酰半乳糖胺单元、半乳糖单元、岩藻糖单元或磷脂单元。在一些实施方案中，存在约1至10、约1至5、约5至10、约1至4、约1至3或约2个糖分子。在一些实施方案中，糖基化抗体是完全或部分糖基化的。在一些实施方案中，通过化学反应或通过酶促手段使抗体糖基化。在一些实施方案中，抗体在体外或细胞内被糖基化，其可任选地缺少N-或O-糖基化途径中的酶，例如糖基转移酶。在一些实施方案中，用糖或碳水化合物分子对抗体进行官能化，如2014年5月1日公开的标题为“Modified antibody,antibody-conjugate and processfor the preparation thereof”的国际专利申请公开WO2014065661中所述。
在一些实施方案中，本文中所述的任一种抗TfR1抗体可在重链序列和/或(例如，和)轻链序列中包含信号肽(例如，N端信号肽)。在一些实施方案中，本文中所述的抗TfR1抗体包含VH和VL序列中的任一种、IgG重链序列和轻链序列中的任一种、或者本文中所述的Fab’重链序列和轻链序列中的任一种，并且还包含信号肽(例如，N端信号肽)。在一些实施方案中，信号肽包含氨基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ ID NO:104)。
其他已知的抗转铁蛋白受体抗体
本领域已知的任何其他合适的抗转铁蛋白受体抗体均可用作本文中公开的复合物中的肌肉靶向剂。表8中列出了已知的抗转铁蛋白受体抗体的一些实例，包括相关参考文献和结合表位。在一些实施方案中，抗转铁蛋白受体抗体包含本文中提供的任何抗转铁蛋白受体抗体(例如表8中列出的抗转铁蛋白受体抗体)的互补决定区(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)。
表8.抗转铁蛋白受体抗体克隆的列表，包括相关参考文献和结合表位信息。
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在一些实施方案中，本公开内容的转铁蛋白受体抗体包含来自选自表8的任一种抗转铁蛋白受体抗体的一个或更多个CDR-H(例如，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)氨基酸序列。在一些实施方案中，转铁蛋白受体抗体包含如针对选自表8的任一种抗转铁蛋白受体抗体提供的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在一些实施方案中，抗转铁蛋白受体抗体包含如针对选自表8的任一种抗转铁蛋白受体抗体提供的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，抗转铁蛋白抗体包含如针对选自表8的任一种抗转铁蛋白受体抗体提供的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。本公开内容还包含编码包含如针对选自表8的任一种抗转铁蛋白受体抗体提供的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3的分子的任何核酸序列。在一些实施方案中，抗体重链和轻链CDR3结构域可在抗体对抗原的结合特异性/亲和力中发挥特别重要的作用。因此，本公开内容的抗转铁蛋白受体抗体可至少包含选自表8的任一种抗转铁蛋白受体抗体的重链和/或(例如，和)轻链CDR3。
在一些实例中，本公开内容的任何抗转铁蛋白受体抗体均具有与来自选自表8的一种抗转铁蛋白受体抗体的任何CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和/或(例如，和)CDR-L3序列基本上类似的一个或更多个CDR(例如，CDR-H或CDR-L)序列。在一些实施方案中，本文中所述的抗体的一个或更多个CDR沿着VH(例如，CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3)和/或(例如，和)VL(例如，CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3)区的位置可改变一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸位置，只要维持了与转铁蛋白受体(例如，人转铁蛋白受体)的免疫特异性结合(例如，基本上维持了其所来源原始抗体之结合的例如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)即可。例如，在一些实施方案中，限定本文中所述的任何抗体的CDR的位置可通过将CDR的N端和/或(例如，和)C端边界相对于本文中所述的任一种抗体的CDR位置移动一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸来改变，只要维持了与转铁蛋白受体(例如，人转铁蛋白受体)的免疫特异性结合(例如，基本上维持了其所来源原始抗体之结合的例如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)即可。在另一个实施方案中，本文中所述的抗体的一个或更多个CDR沿着VH(例如，CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3)和/或(例如，和)VL(例如，CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3)区的长度可改变(例如，变得更短或更长)一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸，只要维持了与转铁蛋白受体(例如，人转铁蛋白受体)的免疫特异性结合(例如，基本上维持了其所来源原始抗体之结合的例如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)即可。
因此，在一些实施方案中，本文中所述的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和/或(例如，和)CDR-H3可比本文中所述的一个或更多个CDR(例如来自选自表8的任何抗转铁蛋白受体抗体的CDR)短一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸，只要维持了与转铁蛋白受体(例如，人转铁蛋白受体)的免疫特异性结合(例如，相对于其所来源原始抗体的结合，基本上维持了例如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)即可。在一些实施方案中，本文中所述的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和/或(例如，和)CDR-H3可比本文中所述的一个或更多个CDR(例如来自选自表8的任何抗转铁蛋白受体抗体的CDR)长一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸，只要维持了与转铁蛋白受体(例如，人转铁蛋白受体)的免疫特异性结合(例如，相对于其所来源原始抗体的结合，基本上维持了例如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)即可。在一些实施方案中，与本文中所述的一个或更多个CDR(例如来自选自表8的任何抗转铁蛋白受体抗体的CDR)相比，本文中所述的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和/或(例如，和)CDR-H3的氨基部分可延长一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸，只要维持了与转铁蛋白受体(例如，人转铁蛋白受体)的免疫特异性结合(例如，相对于其所来源原始抗体的结合，基本上维持了例如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)即可。在一些实施方案中，与本文中所述的一个或更多个CDR(例如来自选自表8的任何抗转铁蛋白受体抗体的CDR)相比，本文中所述的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和/或(例如，和)CDR-H3的羧基部分可延长一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸，只要维持了与转铁蛋白受体(例如，人转铁蛋白受体)的免疫特异性结合(例如，相对于其所来源原始抗体的结合，基本上维持了例如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)即可。在一些实施方案中，与本文中所述的一个或更多个CDR(例如来自选自表8的任何抗转铁蛋白受体抗体的CDR)相比，本文中所述的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和/或(例如，和)CDR-H3的氨基部分可缩短一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸，只要维持了与转铁蛋白受体(例如，人转铁蛋白受体)的免疫特异性结合(例如，相对于其所来源原始抗体的结合，基本上维持了例如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)即可。在一些实施方案中，与本文中所述的一个或更多个CDR(例如来自选自表8的任何抗转铁蛋白受体抗体的CDR)相比，本文中所述的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和/或(例如，和)CDR-H3的羧基部分可缩短一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸，只要维持了与转铁蛋白受体(例如，人转铁蛋白受体)的免疫特异性结合(例如，相对于其所来源原始抗体的结合，基本上维持了例如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)即可。可使用任何方法来确定是否维持了与转铁蛋白受体(例如，人转铁蛋白受体)的免疫特异性结合，例如使用本领域描述的结合测定和条件来确定。
在一些实例中，本公开内容的任何抗转铁蛋白受体抗体均具有与选自表8的任一种抗转铁蛋白受体抗体基本上类似的一个或更多个CDR(例如，CDR-H或CDR-L)序列。例如，抗体可包含来自选自表8的任何抗转铁蛋白受体抗体的一个或更多个CDR序列，其与本文中提供的任一个CDR(例如来自选自表8的任何抗转铁蛋白受体抗体的CDR)的相应CDR区相比包含多至5、4、3、2或1个氨基酸残基变异，只要维持了与转铁蛋白受体(例如，人转铁蛋白受体)的免疫特异性结合(例如，相对于其所来源原始抗体的结合，基本上维持了例如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)即可。在一些实施方案中，本文中提供的任何CDR中的任何氨基酸变异均可以是保守变异。保守变异可在残基不太可能参与与转铁蛋白受体蛋白(例如，人转铁蛋白受体蛋白)相互作用的位置(例如如基于晶体结构确定的)处引入CDR中。本公开内容的一些方面提供了转铁蛋白受体抗体，其包含本文中提供的一个或更多个重链可变(VH)和/或(例如，和)轻链可变(VL)结构域。在一些实施方案中，本文中提供的任何VH结构域均包含本文中提供的一个或更多个CDR-H序列(例如，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)，例如选自表8的任一种抗转铁蛋白受体抗体中提供的任何CDR-H序列。在一些实施方案中，本文中提供的任何VL结构域均包含本文中提供的一个或更多个CDR-L序列(例如，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)，例如选自表8的任一种抗转铁蛋白受体抗体中提供的任何CDR-L序列。
在一些实施方案中，本公开内容的抗转铁蛋白受体抗体包括包含任何抗转铁蛋白受体抗体(例如选自表8的任一种抗转铁蛋白受体抗体)的重链可变结构域和/或(例如，和)轻链可变结构域的任何抗体。在一些实施方案中，本公开内容的抗转铁蛋白受体抗体包括包含任何抗转铁蛋白受体抗体(例如选自表8的任一种抗转铁蛋白受体抗体)的重链可变和轻链可变对的任何抗体。
本公开内容的一些方面提供了抗转铁蛋白受体抗体，其具有与本文中所述的那些中的任何同源的重链可变(VH)和/或(例如，和)轻链可变(VL)结构域氨基酸序列。在一些实施方案中，抗转铁蛋白受体抗体包含与任何抗转铁蛋白受体抗体(例如选自表8的任一种抗转铁蛋白受体抗体)的重链可变序列和/或任何轻链可变序列具有至少75％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)同一性的重链可变序列或轻链可变序列。在一些实施方案中，同源重链可变和/或(例如，和)轻链可变氨基酸序列在本文中提供的任何CDR序列内均不变化。例如，在一些实施方案中，序列变异的程度(例如，75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)可发生在不包括本文中提供的任何CDR序列的重链可变和/或(例如，和)轻链可变序列中。在一些实施方案中，本文中提供的任何抗转铁蛋白受体抗体均包含重链可变序列和轻链可变序列，其包含与任何抗转铁蛋白受体抗体(例如选自表8的任一种抗转铁蛋白受体抗体)的框架序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的框架序列。
在一些实施方案中，与转铁蛋白受体(例如，人转铁蛋白受体)特异性结合的抗转铁蛋白受体抗体包含轻链可变VL结构域，所述轻链可变VL结构域包含选自表8的任何抗转铁蛋白受体抗体的任何CDR-L结构域(CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)，或本文中提供的CDR-L结构域变体。在一些实施方案中，与转铁蛋白受体(例如，人转铁蛋白受体)特异性结合的抗转铁蛋白受体抗体包含轻链可变VL结构域，所述轻链可变VL结构域包含任何抗转铁蛋白受体抗体(例如选自表8的任一种抗转铁蛋白受体抗体)的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，抗转铁蛋白受体抗体包含轻链可变(VL)区序列，所述轻链可变(VL)区序列包含任何抗转铁蛋白受体抗体(例如选自表8的任一种抗转铁蛋白受体抗体)的轻链可变区序列的一个、两个、三个或四个框架区。在一些实施方案中，抗转铁蛋白受体抗体包含轻链可变区序列的一个、两个、三个或四个框架区，其与任何抗转铁蛋白受体抗体(例如选自表8的任一种抗转铁蛋白受体抗体)的轻链可变区序列的一个、两个、三个或四个框架区具有至少75％、80％、85％、90％、95％或100％同一性。在一些实施方案中，来源于所述氨基酸序列的轻链可变框架区由所述氨基酸序列组成，但是存在至多10个氨基酸替换、缺失和/或(例如，和)插入，优选至多10个氨基酸替换。在一些实施方案中，来源于所述氨基酸序列的轻链可变框架区由所述氨基酸序列组成，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基替换存在于相应的非人灵长类或人轻链可变框架区的类似位置的氨基酸。
在一些实施方案中，与转铁蛋白受体特异性结合的抗转铁蛋白受体抗体包含任何抗转铁蛋白受体抗体(例如选自表8的任一种抗转铁蛋白受体抗体)的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，抗体还包含来源于人抗体或灵长类抗体的VL的一个、两个、三个或全部四个VL框架区。被选择与本文中所述的轻链CDR序列一起使用的灵长类或人抗体轻链框架区可与非人亲本抗体的轻链框架区具有例如至少70％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或至少99％)同一性。所选择的灵长类或人抗体在其轻链互补决定区中的氨基酸编号可与本文中提供的任何抗体(例如选自表8的任何抗转铁蛋白受体抗体)的轻链互补决定区中的氨基酸编号相同或基本上相同。在一些实施方案中，灵长类或人轻链框架区氨基酸残基来自天然灵长类或人抗体轻链框架区，其与任何抗转铁蛋白受体抗体(例如选自表8的任一种抗转铁蛋白受体抗体)的轻链框架区具有至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少98％同一性、至少99％(或更多)同一性。在一些实施方案中，抗转铁蛋白受体抗体还包含来源于人轻链可变κ亚家族的一个、两个、三个或全部四个VL框架区。在一些实施方案中，抗转铁蛋白受体抗体还包含来源于人轻链可变λ亚家族的一个、两个、三个或全部四个VL框架区。
在一些实施方案中，本文中提供的任何抗转铁蛋白受体抗体均包含轻链可变结构域，其还包含轻链恒定区。在一些实施方案中，轻链恒定区是κ或λ轻链恒定区。在一些实施方案中，κ或λ轻链恒定区来自哺乳动物，例如来自人、猴、大鼠或小鼠。在一些实施方案中，轻链恒定区是人κ轻链恒定区。在一些实施方案中，轻链恒定区是人λ轻链恒定区。应当理解，本文中提供的任何轻链恒定区均可以是本文中提供的任何轻链恒定区的变体。在一些实施方案中，轻链恒定区包含与任何抗转铁蛋白受体抗体(例如选自表8的任一种抗转铁蛋白受体抗体)的任何轻链恒定区具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗转铁蛋白受体抗体是任何抗转铁蛋白受体抗体，例如选自表8的任一种抗转铁蛋白受体抗体。
在一些实施方案中，抗转铁蛋白受体抗体包含VL结构域，所述VL结构域包含任何抗转铁蛋白受体抗体(例如选自表8的任一种抗转铁蛋白受体抗体)的氨基酸序列，并且其中恒定区包含IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子或人IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子的恒定区的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗转铁蛋白受体抗体包含任何VL结构域或VL结构域变体，以及任何VH结构域或VH结构域变体，其中VL和VH结构域或其变体来自同一抗体克隆，并且其中恒定区包含IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子或者免疫球蛋白分子的任何类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或任何亚类(例如，IgG2a和IgG2b)的恒定区的氨基酸序列。本领域中描述了人恒定区的一些非限制性实例，例如参见上文Kabat E A et al.,(1991)。
在一些实施方案中，肌肉靶向剂是转铁蛋白受体抗体(例如，如国际申请公开WO2016/081643中所述的抗体及其变体，所述国际申请公开通过引用并入本文)。
表9中提供了根据不同定义系统的抗体的重链和轻链CDR。已经描述了不同的定义系统，例如Kabat定义、Chothia定义和/或(例如，和)contact定义。参见例如(例如，Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242,Chothia et al.,(1989)Nature342:877；Chothia,C.et al.(1987)J.Mol.Biol.196:901-917,Al-lazikani et al(1997)J.Molec.Biol.273:927-948；以及Almagro,J.Mol.Recognit.17:132-143(2004)。还参见hgmp.mrc.ac.uk和bioinf.org.uk/abs)。
表9小鼠转铁蛋白受体抗体的重链和轻链CDR
Figure GDA0004266820060000751
还提供了重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域序列：
VH
Figure GDA0004266820060000752
VL
Figure GDA0004266820060000761
在一些实施方案中，本公开内容的转铁蛋白受体抗体包含与表9中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3相同的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。作为替代或补充(例如，补充)，本公开内容的转铁蛋白受体抗体包含与表9中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3相同的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
在一些实施方案中，本公开内容的转铁蛋白受体抗体包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，与表9中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3相比，其共同包含不超过5个氨基酸变异(例如，不超过5、4、3、2或1个氨基酸变异)。“共同”意指所有三个重链CDR中的氨基酸变异的总数在限定的范围内。作为替代或补充(例如，补充)，本公开内容的转铁蛋白受体抗体可包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，与表9中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3相比，其共同包含不超过5个氨基酸变异(例如，不超过5、4、3、2或1个氨基酸变异)。
在一些实施方案中，本公开内容的转铁蛋白受体抗体包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中至少一个与表9中所示的对应重链CDR相比包含不超过3个氨基酸变异(例如，不超过3、2或1个氨基酸变异)。作为替代或补充(例如，补充)，本公开内容的转铁蛋白受体抗体可包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中至少一个与表9中所示的对应轻链CDR相比包含不超过3个氨基酸变异(例如，不超过3、2或1个氨基酸变异)。
在一些实施方案中，本公开内容的转铁蛋白受体抗体包含CDR-L3，其与表9中所示的CDR-L3相比包含不超过3个氨基酸变异(例如，不超过3、2或1个氨基酸变异)。在一些实施方案中，本公开内容的转铁蛋白受体抗体包含CDR-L3，其与表9中所示的CDR-L3相比包含1个氨基酸变异。在一些实施方案中，本公开内容的转铁蛋白受体抗体包含QHFAGTPLT(SEQID NO:126)的CDR-L3(根据Kabat和Chothia定义系统)或QHFAGTPL(SEQ ID NO:127)的CDR-L3(根据Contact定义系统)。在一些实施方案中，本公开内容的转铁蛋白受体抗体包含与表9中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3相同的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1和CDR-L2，并且包含QHFAGTPLT(SEQ ID NO:126)的CDR-L3(根据Kabat和Chothia定义系统)或QHFAGTPL(SEQ ID NO:127)的CDR-L3(根据Contact定义系统)。
在一些实施方案中，本公开内容的转铁蛋白受体抗体包含重链CDR，其共同与表9中所示的重链CDR具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％或98％)同一性。作为替代或补充(例如，补充)，本公开内容的转铁蛋白受体抗体包含轻链CDR，其共同与表9中所示的轻链CDR具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％或98％)同一性。
在一些实施方案中，本公开内容的转铁蛋白受体抗体包含含有SEQ ID NO:124的氨基酸序列的VH。作为替代或补充(例如，补充)，本公开内容的转铁蛋白受体抗体包含含有SEQ ID NO:125的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，本公开内容的转铁蛋白受体抗体包含VH，所述VH与SEQ IDNO:124中所示的VH相比包含不超过25个氨基酸变异(例如，不超过25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)。作为替代或补充(例如，补充)，本公开内容的转铁蛋白受体抗体包含VL，所述VL与SEQ ID NO:125中所示的VL相比包含不超过15个氨基酸变异(例如，不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)。
在一些实施方案中，本公开内容的转铁蛋白受体抗体包含VH，所述VH包含与SEQID NO:124中所示的VH具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列。作为替代或补充(例如，补充)，本公开内容的转铁蛋白受体抗体包含VL，所述VL包含与SEQ ID NO:125中所示的VL具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开内容的转铁蛋白受体抗体是人源化抗体(例如，抗体的人源化变体)。在一些实施方案中，本公开内容的转铁蛋白受体抗体包含与表9中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3相同的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，并且包含人源化重链可变区和/或(例如，和)人源化轻链可变区。
人源化抗体是人免疫球蛋白(接受体抗体)，其中来自接受体的互补决定区(CDR)的残基被来自具有期望特异性、亲和力和容量的非人物种(供体抗体)例如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基替代。在一些实施方案中，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可包含在接受体抗体或者导入的CDR或框架序列中均未发现但被包含在内以进一步完善和优化抗体性能的残基。一般而言，人源化抗体将包含至少一个并且通常是两个的可变结构域的基本上全部，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体最佳地还将包含免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)(通常是人免疫球蛋白的那些)的至少一部分。抗体可具有如WO 99/58572中所述修饰的Fc区。人源化抗体的另一些形式具有相对于原始抗体而改变的一个或更多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个、六个)，其也称为来源于来自原始抗体的一个或更多个CDR的一个或更多个CDR。人源化抗体还可能涉及亲和力成熟。
在一些实施方案中，通过将CDR(例如，如表9中所示的)接枝到IGKV1-NL1*01和IGHV1-3*01人可变结构域中来实现人源化。在一些实施方案中，本公开内容的转铁蛋白受体抗体是人源化变体，其与SEQ ID NO:125中所示的VL相比在第9、13、17、18、40、45和70位处包含一个或更多个氨基酸替换，和/或(例如，和)与SEQ ID NO:124中所示的VH相比在第1、5、7、11、12、20、38、40、44、66、75、81、83、87和108位包含一个或更多个氨基酸替换。在一些实施方案中，本公开内容的转铁蛋白受体抗体是人源化变体，其与SEQ ID NO:125中所示的VL相比在全部的第9、13、17、18、40、45和70位处包含氨基酸替换，和/或(例如，和)与SEQID NO:124中所示的VH相比在全部的第1、5、7、11、12、20、38、40、44、66、75、81、83、87和108位处包含氨基酸替换。
在一些实施方案中，本公开内容的转铁蛋白受体抗体是人源化抗体并且包含SEQID NO:125中所示的VL的第43和48位处的残基。作为替代或补充(例如，补充)，本公开内容的转铁蛋白受体抗体是人源化抗体并且包含SEQ ID NO:124中所示的VH的第48、67、69、71和73位处的残基。
提供了可根据本公开内容使用的示例性人源化抗体的VH和VL氨基酸序列：
人源化VH
Figure GDA0004266820060000791
人源化VL
Figure GDA0004266820060000792
在一些实施方案中，本公开内容的转铁蛋白受体抗体包含含有SEQ ID NO:128的氨基酸序列的VH。作为替代或补充(例如，补充)，本公开内容的转铁蛋白受体抗体包含含有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，本公开内容的转铁蛋白受体抗体包含VH，所述VH与SEQ IDNO:128中所示的VH相比包含不超过25个氨基酸变异(例如，不超过25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)。作为替代或补充(例如，补充)，本公开内容的转铁蛋白受体抗体包含VL，所述VL与SEQ ID NO:129中所示的VL相比包含不超过15个氨基酸变异(例如，不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)。
在一些实施方案中，本公开内容的转铁蛋白受体抗体包含VH，所述VH包含与SEQID NO:128中所示的VH具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列。作为替代或补充(例如，补充)，本公开内容的转铁蛋白受体抗体包含VL，所述VL包含与SEQ ID NO:129中所示的VL具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开内容的转铁蛋白受体抗体是人源化变体，其与SEQ IDNO:125中所示的VL相比在第43和48位中的一个或更多个处包含氨基酸替换，和/或(例如，和)与SEQ ID NO:124中所示的VH相比在第48、67、69、71和73位中的一个或更多个处包含氨基酸替换。在一些实施方案中，本公开内容的转铁蛋白受体抗体是人源化变体，其与SEQ IDNO:125中所示的VL相比包含S43A和/或(例如，和)V48L突变，和/或(例如，和)与SEQ ID NO:124中所示的VH相比包含A67V、L69I、V71R和K73T突变中的一个或更多个。
在一些实施方案中，本公开内容的转铁蛋白受体抗体是人源化变体，其与SEQ IDNO:125中所示的VL相比在第9、13、17、18、40、43、48、45和70位中的一个或更多个处包含氨基酸替换，和/或(例如，和)与SEQ ID NO:124中所示的VH相比在第1、5、7、11、12、20、38、40、44、48、66、67、69、71、73、75、81、83、87和108位中的一个或更多个处包含氨基酸替换。
在一些实施方案中，本公开内容的转铁蛋白受体抗体是嵌合抗体，其可包含来自人抗体的重恒定区和轻恒定区。嵌合抗体是指具有来自第一物种的可变区或可变区的一部分以及来自第二物种的恒定区的抗体。通常来说，在这些嵌合抗体中，轻链和重链二者的可变区模拟来源于一种哺乳动物(例如，非人哺乳动物，例如小鼠、兔和大鼠)的抗体的可变区，而恒定部分与来源于另一种哺乳动物(例如人)的抗体中的序列同源。在一些实施方案中，可在可变区和/或(例如，和)恒定区中进行氨基酸修饰。
在一些实施方案中，本文中所述的转铁蛋白受体抗体是嵌合抗体，其可包含来自人抗体的重恒定区和轻恒定区。嵌合抗体是指具有来自第一物种的可变区或可变区的一部分以及来自第二物种的恒定区的抗体。通常来说，在这些嵌合抗体中，轻链和重链二者的可变区模拟来源于一种哺乳动物(例如，非人哺乳动物，例如小鼠、兔和大鼠)的抗体的可变区，而恒定部分与来源于另一种哺乳动物(例如人)的抗体中的序列同源。在一些实施方案中，可在可变区和/或(例如，和)恒定区中进行氨基酸修饰。
在一些实施方案中，如本文中所述的任何转铁蛋白受体抗体的重链可包含重链恒定区(CH)或其一部分(例如，CH1、CH2、CH3或其组合)。重链恒定区可具有任何合适的来源，例如人、小鼠、大鼠或兔。在一个具体实例中，重链恒定区是来自人IgG例如IgG1、IgG2或IgG4(γ重链)。下面给出了人IgG1恒定区的一个实例：
Figure GDA0004266820060000811
在一些实施方案中，本文中所述的任何转铁蛋白受体抗体的轻链还可包含轻链恒定区(CL)，其可以是本领域已知的任何CL。在一些实例中，CL是κ轻链。在另一些实例中，CL是λ轻链。在一些实施方案中，CL是κ轻链，以下提供了其序列：
Figure GDA0004266820060000812
其他抗体重链和轻链恒定区是本领域公知的，例如在IMGT数据库(www.imgt.org)或www.vbase2.org/vbstat.php.中提供的那些，二者均通过引用并入本文。
以下提供了所述转铁蛋白受体抗体的重链和轻链氨基酸序列的一些实例：
重链(VH+人IgG1恒定区)
Figure GDA0004266820060000813
轻链(VL+κ轻链)
Figure GDA0004266820060000821
重链(人源化VH+人IgG1恒定区)
Figure GDA0004266820060000822
轻链(人源化VL+κ轻链)
Figure GDA0004266820060000823
在一些实施方案中，本文中所述的转铁蛋白受体抗体包含重链，所述重链包含与SEQ ID NO:132具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列。作为替代或补充(例如，补充)，本文中所述的转铁蛋白受体抗体包含轻链，所述轻链包含与SEQ ID NO:133具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文中所述的转铁蛋白受体抗体包含含有SEQ ID NO:132的氨基酸序列的重链。作为替代或补充(例如，补充)，本文中所述的转铁蛋白受体抗体包含含有SEQ IDNO:133的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开内容的转铁蛋白受体抗体包含重链，所述重链与SEQID NO:132中所示的重链相比包含不超过25个氨基酸变异(例如，不超过25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)。作为替代或补充(例如，补充)，本公开内容的转铁蛋白受体抗体包含轻链，所述轻链与SEQ ID NO:133中所示的轻链相比包含不超过15个氨基酸变异(例如，不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)。
在一些实施方案中，本文中所述的转铁蛋白受体抗体包含重链，所述重链包含与SEQ ID NO:134具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列。作为替代或补充(例如，补充)，本文中所述的转铁蛋白受体抗体包含轻链，所述轻链包含与SEQ ID NO:135具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％或98％)同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文中所述的转铁蛋白受体抗体包含含有SEQ ID NO:134的氨基酸序列的重链。作为替代或补充(例如，补充)，本文中所述的转铁蛋白受体抗体包含含有SEQ IDNO:135的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开内容的转铁蛋白受体抗体包含重链，所述重链与SEQID NO:134中所示的人源化抗体的重链相比包含不超过25个氨基酸变异(例如，不超过25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)。作为替代或补充(例如，补充)，本公开内容的转铁蛋白受体抗体包含轻链，所述轻链与SEQID NO:135中所示的人源化抗体的轻链相比包含不超过15个氨基酸变异(例如，不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)。
在一些实施方案中，转铁蛋白受体抗体是完整抗体(全长抗体)的抗原结合片段(Fab)。完整抗体(全长抗体)的抗原结合片段可通过常规方法制备。例如，F(ab’)2片段可通过抗体分子的胃蛋白酶消化产生，并且Fab’片段可通过还原F(ab’)2片段的二硫桥而产生。以下提供了本文中所述的转铁蛋白受体抗体的Fab氨基酸序列的一些实例：
重链Fab(VH+人IgG1恒定区的一部分)
Figure GDA0004266820060000831
重链Fab(人源化VH+人IgG1恒定区的一部分)
Figure GDA0004266820060000841
在一些实施方案中，本文中所述的转铁蛋白受体抗体包含含有SEQ ID NO:136的氨基酸序列的重链。作为替代或补充(例如，补充)，本文中所述的转铁蛋白受体抗体包含含有SEQ ID NO:133的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本文中所述的转铁蛋白受体抗体包含含有SEQ ID NO:137的氨基酸序列的重链。作为替代或补充(例如，补充)，本文中所述的转铁蛋白受体抗体包含含有SEQ ID NO:135的氨基酸序列的轻链。
本文中所述的转铁蛋白受体抗体可以是任何抗体形式，包括但不限于完整(即全长)抗体、其抗原结合片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、单链抗体、双特异性抗体或纳米抗体。在一些实施方案中，本文中所述的转铁蛋白受体抗体是scFv。在一些实施方案中，本文中所述的转铁蛋白受体抗体是scFv-Fab(例如，与恒定区的一部分融合的scFv)。在一些实施方案中，本文中所述的转铁蛋白受体抗体是与恒定区(例如，SEQ ID NO:130中所示的人IgG1恒定区)融合的scFv。
在一些实施方案中，本文中所述的任一种抗TfR抗体是通过重组DNA技术在中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)细胞悬浮培养物中，任选地在CHO-K1细胞(例如，来源于欧洲动物细胞培养物保藏中心(European Collection of Animal Cell Culture)的CHO-K1细胞，目录号85051005)悬浮培养物中产生的。
在一些实施方案中，本文中提供的抗体可具有一种或更多种翻译后修饰。在一些实施方案中，也称为焦谷氨酸形成(pyro-Glu)的N端环化可在产生期间在抗体的N端谷氨酸(Glu)和/或谷氨酰胺(Gln)残基处发生。因此，应理解指定为具有包含N端谷氨酸或谷氨酰胺残基的序列的抗体涵盖已经历由翻译后修饰引起的焦谷氨酸形成的抗体。在一些实施方案中，焦谷氨酸形成发生在重链序列中。在一些实施方案中，焦谷氨酸形成发生在轻链序列中。
b.其他肌肉靶向抗体
在一些实施方案中，肌肉靶向抗体是特异性结合血幼素(hemojuvelin)、小窝蛋白-3、迪谢内肌营养不良肽(Duchenne muscular dystrophy peptide)、肌球蛋白Iib或CD63的抗体。在一些实施方案中，肌肉靶向抗体是特异性结合肌原性前体蛋白的抗体。一些示例性的肌原性前体蛋白包括但不限于ABCG2、M-钙黏着蛋白/钙黏着蛋白-15、小窝蛋白-1、CD34、FoxK1、整联蛋白α7、整联蛋白α7β1、MYF-5、MyoD、肌细胞生成蛋白、NCAM-1/CD56、Pax3、Pax7和Pax9。在一些实施方案中，肌肉靶向抗体是特异性结合骨骼肌蛋白的抗体。一些示例性的骨骼肌蛋白包括但不限于α-肌聚糖蛋白(alpha-Sarcoglycan)、β-肌聚糖蛋白、钙蛋白酶抑制剂、肌酸激酶MM/CKMM、eIF5A、烯醇化酶2/神经元特异性烯醇化酶、ε-肌聚糖蛋白、FABP3/H-FABP、GDF-8/肌生成抑制蛋白、GDF-11/GDF-8、整联蛋白α7、整联蛋白α7β1、整联蛋白β1/CD29、MCAM/CD146、MyoD、肌细胞生成蛋白、肌球蛋白轻链激酶抑制剂、NCAM-1/CD56和肌钙蛋白I。在一些实施方案中，肌肉靶向抗体是特异性结合平滑肌蛋白的抗体。一些示例性的平滑肌蛋白包括但不限于α-平滑肌肌动蛋白、VE-钙黏着蛋白、钙调蛋白结合蛋白/CALD1、钙调理蛋白1、结蛋白(Desmin)、组胺H2 R、胃动素R/GPR38、转凝蛋白/TAGLN、和波形蛋白。然而，应当理解，针对其他靶标的抗体在本公开内容的范围内，并且本文中提供的靶标的示例性列表并不意味着是限制性的。
c.抗体特征/改变
在一些实施方案中，可在残基不太可能参与与靶抗原(例如，转铁蛋白受体)相互作用的位置(例如，如基于晶体结构确定的)处将保守突变引入抗体序列(例如，CDR或框架序列)中。在一些实施方案中，将一个、两个或更多个突变(例如，氨基酸替换)引入本文中所述的肌肉靶向抗体的Fc区(例如，在CH2结构域(人IgG1的第231至340位残基)和/或(例如，和)CH3结构域(人IgG1的第341至447位残基)和/或(例如，和)铰链区中，根据Kabat编号系统(例如，Kabat中的EU索引)编号)，以改变抗体的一种或更多种功能特性，例如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或(例如，和)抗原依赖性细胞毒性。
在一些实施方案中，将一个、两个或更多个突变(例如，氨基酸替换)引入Fc区(CH1结构域)的铰链区中，使得铰链区中的半胱氨酸残基的数目改变(例如，增加或减少)，如例如美国专利No.5,677,425中所述。可改变CH1结构域的铰链区中半胱氨酸残基的数目，例如以促进轻链和重链的组装，或改变(例如，提高或降低)抗体的稳定性或促进接头缀合。
在一些实施方案中，将一个、两个或更多个突变(例如，氨基酸替换)引入本文中所述的肌肉靶向抗体的Fc区(例如，在CH2结构域(人IgG1的第231至340位残基)和/或(例如，和)CH3结构域(人IgG1的第341至447位残基)和/或(例如，和)铰链区中，根据Kabat编号系统(例如，Kabat中的EU索引)编号)，以提高或降低抗体对效应细胞表面上Fc受体(例如，激活的Fc受体)的亲和力。降低或提高抗体对Fc受体的亲和力的抗体Fc区中突变以及将这样的突变引入Fc受体或其片段的技术是本领域技术人员已知的。可被进行以改变抗体对Fc受体的亲和力的抗体Fc受体中突变的一些实例描述于以下中：例如Smith P et al.,(2012)PNAS 109:6181-6186,美国专利No.6,737,056，以及国际公开No.WO 02/060919、WO 98/23289、和WO 97/34631，其通过引用并入本文。
在一些实施方案中，将一个、两个或更多个氨基酸突变(即，替换、插入或缺失)引入IgG恒定结构域或其FcRn结合片段(优选地，Fc或铰链-Fc结构域片段)中以改变(例如，降低或提高)抗体在体内的半衰期。参见例如国际公开No.WO 02/060919、WO 98/23289和WO97/34631，以及美国专利No.5,869,046、6,121,022、6,277,375和6,165,745，例如将改变(例如，降低或提高)抗体在体内的半衰期的突变。
在一些实施方案中，将一个、两个或更多个氨基酸突变(即，替换、插入或缺失)引入IgG恒定结构域或其FcRn结合片段(优选地，Fc或铰链-Fc结构域片段)中以降低抗转铁蛋白受体抗体在体内的半衰期。在一些实施方案中，将一个、两个或更多个氨基酸突变(即，替换、插入或缺失)引入IgG恒定结构域或其FcRn结合片段(优选地，Fc或铰链-Fc结构域片段)中以提高抗体在体内的半衰期。在一些实施方案中，抗体可在第二恒定(CH2)结构域(人IgG1的第231至340位残基)和/或(例如，和)第三恒定(CH3)结构域(人IgG1的第341至447位残基)(根据Kabat中的EU索引(Kabat E A et al.,(1991)同上)编号)中具有一个或更多个氨基酸突变(例如，替换)。在一些实施方案中，本文中所述的抗体的IgG1的恒定区包含在第252位处的甲硫氨酸(M)至酪氨酸(Y)替换、在第254位处的丝氨酸(S)至苏氨酸(T)替换，以及在第256位处的苏氨酸(T)至谷氨酸(E)替换，所述位置根据Kabat中的EU索引编号。参见美国专利No.7,658,921，其通过引用并入本文。这种类型的突变体IgG(称为“YTE突变体”)已显示出与同一抗体的野生型形式相比半衰期提高4倍(参见Dall’Acqua W F et al.,(2006)J Biol Chem 281:23514-24)。在一些实施方案中，抗体包含IgG恒定结构域，该结构域包含在第251至257、285至290、308至314、385至389和428至436位处的氨基酸残基的一个、两个、三个或更多个氨基酸替换，所述位置根据Kabat中的EU索引编号。
在一些实施方案中，将一个、两个或更多个氨基酸替换引入IgG恒定结构域Fc区中，以改变抗转铁蛋白受体抗体的效应子功能。对其的亲和力被改变的效应配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。该方法在美国专利No.5,624,821和5,648,260中有更详细的描述。在一些实施方案中，恒定区结构域的缺失或失活(通过点突变或其他方式)可降低循环抗体的Fc受体结合，从而提高肿瘤定位。对于使恒定结构域缺失或失活从而提高肿瘤定位的突变的描述，参见例如美国专利No.5,585,097和8,591,886。在一些实施方案中，可将一个或更多个氨基酸替换引入本文中所述的抗体的Fc区中，以去除Fc区上潜在的糖基化位点，这可降低Fc受体结合(参见，例如Shields R L et al.,(2001)J Biol Chem 276:6591-604)。
在一些实施方案中，可将本文中所述的肌肉靶向抗体的恒定区中的一个或更多个氨基替换为不同的氨基酸残基，使得抗体具有改变的Clq结合和/或者(例如，和)降低或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。这种方法在美国专利No.6,194,551(Idusogie et al)中有更详细的描述。在一些实施方案中，改变本文中所述的抗体的CH2结构域的N端区域中的一个或更多个氨基酸残基，从而改变抗体的固定补体的能力。这种方法在国际公开No.WO94/29351中有进一步描述。在一些实施方案中，对本文中所述的抗体的Fc区进行修饰以提高抗体的介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或(例如，和)以提高抗体对Fcγ受体的亲和力。这种方法在国际公开No.WO 00/42072中有进一步描述。
在一些实施方案中，本文中提供的抗体的重链和/或(例如，和)轻链可变结构域序列可用于产生例如CDR接枝、嵌合、人源化或复合的人抗体或抗原结合片段，如本文中其他地方所述。如本领域普通技术人员所理解的，来源于本文中提供的任何抗体的任何变体(CDR接枝、嵌合、人源化或复合的抗体)可用于本文中所述的组合物和方法中，并将保持特异性结合转铁蛋白受体的能力，从而使得相对于其所来源原始抗体，变体(CDR接枝、嵌合、人源化或复合的抗体)具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或更多的与转铁蛋白受体的结合。
在一些实施方案中，本文中提供的抗体包含赋予抗体以期望性质的突变。例如，为了避免归因于已知与天然IgG4 mAb发生的Fab臂交换而引起的潜在并发症，本文中提供的抗体可包含稳定性‘Adair’突变(Angal S.,et al.,“Asingle amino acid substitutionabolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human(IgG4)antibody,”MolImmunol 30,105-108；1993)，其中第228位(EU编号，根据Kabat编号为第241位残基)丝氨酸转化为脯氨酸，从而产生了IgG1样铰链序列。因此，任何抗体都可包含稳定性‘Adair’突变。
如本文中所提供，本公开内容的抗体可任选地包含恒定区或其一部分。例如，VL结构域可在其C端连接至轻链恒定结构域，如Cκ或Cλ。类似地，VH结构域或其一部分可连接至如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM(以及任何同种型亚类)的重链的全部或一部分。抗体可包括合适的恒定区(参见，例如，Kabat et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,No.91-3242,National Institutes of Health Publications,Bethesda,Md.(1991))。因此，在本公开内容范围内的抗体可包含与任何合适的恒定区组合的VH和VL结构域或其抗原结合部分。
ii.肌肉靶向肽
本公开内容的一些方面提供了肌肉靶向肽作为肌肉靶向剂。已描述了与特定细胞类型结合的短肽序列(例如，长度为5至20个氨基酸的肽序列)。例如，细胞靶向肽已在以下中进行了描述：Vines e.,et al.,A.“Cell-penetrating and cell-targeting peptidesin drug delivery”Biochim Biophys Acta 2008,1786:126-38；Jarver P.,et al.,“Invivo biodistribution and efficacy of peptide mediated delivery”TrendsPharmacol Sci 2010；31:528-35；Samoylova T.I.,et al.,“Elucidation of muscle-binding peptides by phage display screening”Muscle Nerve 1999；22:460-6；美国专利No.6,329,501，其于2001年12月11日授权，标题为“METHODS AND COMPOSITIONS FORTARGETING COMPOUNDS TO MUSCLE”；以及Samoylov A.M.,et al.,“Recognition of cell-specific binding of phage display derived peptides using an acoustic wavesensor.”Biomol Eng 2002；18:269-72；其各自的全部内容均通过引用并入本文。通过设计肽与特定的细胞表面抗原(例如，受体)相互作用，可实现对所期望组织例如肌肉的选择性。已研究了骨骼肌靶向并且能够递送一系列分子载荷。这些方法可对肌肉组织具有高度选择性，而没有大的抗体或病毒颗粒的许多实际缺点。因此，在一些实施方案中，肌肉靶向剂是长度为4至50个氨基酸的肌肉靶向肽。在一些实施方案中，肌肉靶向肽的长度为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。可使用数种方法中的任一种(例如噬菌体展示)来产生肌肉靶向肽。
在一些实施方案中，肌肉靶向肽可与和某些其他细胞相比在肌细胞中过表达或相对高地表达的内化细胞表面受体，例如转铁蛋白受体结合。在一些实施方案中，肌肉靶向肽可靶向转铁蛋白受体(例如，与之结合)。在一些实施方案中，靶向转铁蛋白受体的肽可包含天然存在配体(例如转铁蛋白)的区段。在一些实施方案中，靶向转铁蛋白受体的肽如2000年11月30日提交的美国专利No.6,743,893，“RECEPTOR-MEDIATED UPTAKE OF PEPTIDESTHAT BIND THE HUMAN TRANSFERRIN RECEPTOR”中所述。在一些实施方案中，靶向转铁蛋白受体的肽如Kawamoto,M.et al,“Anovel transferrin receptor-targeted hybridpeptide disintegrates cancer cell membrane to induce rapid killing of cancercells.”BMC Cancer.2011Aug 18；11:359中所述。在一些实施方案中，靶向转铁蛋白受体的肽如2011年5月20日提交的美国专利No.8,399,653，“TRANSFERRIN/TRANSFERRINRECEPTOR-MEDIATED SIRNA DELIVERY”中所述。
如上所讨论，已报道了肌肉靶向肽的一些实例。例如，使用呈递表面七肽的噬菌体展示文库鉴定了肌肉特异性肽。作为一个实例，具有氨基酸序列ASSLNIA(SEQ ID NO:138)的肽在体外与C2C12鼠肌管结合，并且在体内与小鼠肌肉组织结合。因此，在一些实施方案中，肌肉靶向剂包含氨基酸序列ASSLNIA(SEQ ID NO:138)。该肽在小鼠中进行静脉内注射之后展示出提高的与心脏和骨骼肌组织结合的特异性，以及降低的与肝、肾和脑的结合。使用噬菌体展示已鉴定了另外的肌肉特异性肽。例如，通过噬菌体展示文库鉴定了12个氨基酸的肽用于在DMD治疗的情况下进行肌肉靶向。参见Yoshida D.,et al.,“Targeting ofsalicylate to skin and muscle following topical injections in rats.”Int JPharm2002；231:177-84；其全部内容在此通过引用并入。在此，鉴定了具有序列SKTFNTHPQSTP(SEQ ID NO:139)的12个氨基酸的肽，并且该肌肉靶向肽相对于ASSLNIA(SEQID NO:138)肽显示出提高的与C2C12细胞的结合。
用于鉴定相对于其他细胞类型而对肌肉(例如，骨骼肌)具有选择性的肽的另一方法包括体外选择，这已在Ghosh D.,et al.,“Selection of muscle-binding peptidesfrom context-specific peptide-presenting phage libraries for adenoviralvector targeting”J Virol 2005；79:13667-72中进了描述；其全部内容通过引用并入本文。通过将随机的12聚体(12-mer)肽噬菌体展示文库与非肌细胞类型的混合物预孵育选择出了非特异性细胞结合物。在数轮选择之后，12个氨基酸的肽TARGEHKEEELI(SEQ ID NO:140)最频繁地出现。因此，在一些实施方案中，肌肉靶向剂包含氨基酸序列TARGEHKEEELI(SEQ ID NO:140)。
肌肉靶向剂可以是含氨基酸的分子或肽。肌肉靶向肽可对应于优先与肌细胞中发现的蛋白质受体结合的蛋白质序列。在一些实施方案中，肌肉靶向肽包含高倾向性的疏水性氨基酸，例如缬氨酸，使得该肽优先靶向肌细胞。在一些实施方案中，肌肉靶向肽是先前未表征或公开过的。可使用数种方法中的任一种(例如噬菌体展示肽文库、单珠单化合物肽文库或位置扫描合成肽组合文库)来构思、产生、合成和/或(例如，和)衍生这些肽。示例性方法已在本领域中表征并通过引用并入(Gray,B.P.and Brown,K.C.“CombinatorialPeptide Libraries:Mining for Cell-Binding Peptides”Chem Rev.2014,114:2,1020–1081.；Samoylova,T.I.and Smith,B.F.“Elucidation of muscle-binding peptides byphage display screening.”Muscle Nerve,1999,22:4.460-6.)。在一些实施方案中，先前已公开了肌肉靶向肽(参见，例如Writer M.J.et al.“Targeted gene delivery to humanairway epithelial cells with synthetic vectors incorporating novel targetingpeptides selected by phage display.”J.Drug Targeting.2004；12:185；Cai,D.“BDNF-mediated enhancement of inflammation and injury in the aging heart.”PhysiolGenomics.2006,24:3,191-7.；Zhang,L.“Molecular profiling of heart endothelialcells.”Circulation,2005,112:11,1601-11.；McGuire,M.J.et al.“In vitro selectionof a peptide with high selectivity for cardiomyocytes in vivo.”J MolBiol.2004,342:1,171-82.)。示例性的肌肉靶向肽包含以下组的氨基酸序列：CQAQGQLVC(SEQ ID NO：141)，CSERSMNFC(SEQ ID NO：142)，CPKTRRVPC(SEQ ID NO：143)，WLSEAGPVVTVRALRGTGSW(SEQ ID NO：144)，ASSLNIA(SEQ ID NO：138)，CMQHSMRVC(SEQ IDNO：145)和DDTRHWG(SEQ ID NO：146)。
在一些实施方案中，肌肉靶向肽可包含约2至25个氨基酸、约2至20个氨基酸、约2至15个氨基酸、约2至10个氨基酸或约2至5个氨基酸。肌肉靶向肽可包含天然存在的氨基酸例如半胱氨酸、丙氨酸或者非天然存在或经修饰氨基酸。非天然存在的氨基酸包括β-氨基酸、高氨基酸(homo-amino acid)、脯氨酸衍生物、3-经取代的丙氨酸衍生物、线性核心氨基酸、N-甲基氨基酸和本领域中已知的其他氨基酸。在一些实施方案中，肌肉靶向肽可以是线性的；在另一些实施方案中，肌肉靶向肽可以是环状的，例如双环的(参见，例如Silvana，M.G.et al.Mol.Therapy,2018，26：1，132-147.)。
iii.肌肉靶向受体配体
肌肉靶向剂可以是配体，例如与受体蛋白结合的配体。肌肉靶向配体可以是蛋白质，例如转铁蛋白，其与由肌细胞表达的内化细胞表面受体结合。因此，在一些实施方案中，肌肉靶向剂是转铁蛋白或与转铁蛋白受体结合的转铁蛋白衍生物。肌肉靶向配体可替代地是小分子，例如相对于其他细胞类型而优先靶向肌细胞的亲脂性小分子。可靶向肌细胞的一些示例性亲脂性小分子包括包含以下的化合物：胆固醇、胆固醇基、硬脂酸、棕榈酸、油酸、油烯基、亚麻烯(linolene)、亚油酸、肉豆蔻酸、甾醇类、二氢睾酮、睾酮衍生物、甘油、烷基链、三苯甲基类和烷氧基酸。
iv.肌肉靶向适配体
肌肉靶向剂可以是适配体，例如RNA适配体，其相对于其他细胞类型而优先靶向肌细胞。在一些实施方案中，肌肉靶向适配体是先前未表征或公开过的。可使用数种方法中的任一种(例如通过指数富集的配体的系统进化)来构思、产生、合成和/或(例如，和)衍生这些适配体。示例性方法已在本领域中表征并通过引用并入(Yan，A.C.and Levy,M.“Aptamers and aptamer targeted delivery”RNA biology,2009，6：3，316-20.；Germer,K.et al.“RNA aptamers and their therapeutic and diagnostic applications.”Int.J.Biochem.Mol.Biol.2013；4：27-40.)。在一些实施方案中，先前已公开了肌肉靶向适配体(参见，例如Phillippou,S.et al.“Selection and Identification of Skeletal-Muscle-Targeted RNA Aptamers.”Mol Ther Nucleic Acids.2018,10:199-214.；Thiel,W.H.et al.“Smooth Muscle Cell-targeted RNA Aptamer Inhibits NeointimalFormation.”Mol Ther.2016,24:4,779-87.)。示例性的肌肉靶向适配体包括A01B RNA适配体和RNA Apt 14。在一些实施方案中，适配体是基于核酸的适配体、寡核苷酸适配体或肽适配体。在一些实施方案中，适配体可以是约5至15kDa、约5至10kDa、约10至15kDa、约1至5Da、约1至3kDa或更小。
v.其他肌肉靶向剂
用于靶向肌细胞(例如，骨骼肌细胞)的一种策略是使用肌转运体蛋白(例如在肌膜上表达的转运体蛋白)的底物。在一些实施方案中，肌肉靶向剂是对肌肉组织具有特异性的流入转运体的底物。在一些实施方案中，流入转运体对骨骼肌组织具有特异性。两类主要的转运体在骨骼肌肌膜上表达：(1)三磷酸腺苷(ATP)结合盒(ABC)超家族，其促进从骨骼肌组织流出和(2)溶质运载体(SLC)超家族，其可促进底物流入骨骼肌中。在一些实施方案中，肌肉靶向剂是与转运体的ABC超家族或SLC超家族结合的底物。在一些实施方案中，与转运体的ABC或SLC超家族结合的底物是天然存在的底物。在一些实施方案中，与转运体的ABC或SLC超家族结合的底物是非天然存在的底物，例如，与转运体的ABC或SLC超家族结合的其合成衍生物。
在一些实施方案中，肌肉靶向剂是转运体的SLC超家族的底物。SLC转运体是平衡型的，或者使用跨膜而产生的质子或钠离子梯度来驱动底物的转运。具有高骨骼肌表达的示例性SLC转运体包括但不限于SATT转运体(ASCT1；SLC1A4)、GLUT4转运体(SLC2A4)、GLUT7转运体(GLUT7；SLC2A7)、ATRC2转运体(CAT-2；SLC7A2)、LAT3转运体(KIAA0245；SLC7A6)、PHT1转运体(PTR4；SLC15A4)、OATP-J转运体(OATP5A1；SLC21A15)、OCT3转运体(EMT；SLC22A3)、OCTN2转运体(FLJ46769；SLC22A5)、ENT转运体(ENT1；SLC29A1和ENT2；SLC29A2)、PAT2转运体(SLC36A2)和SAT2转运体(KIAA1382；SLC38A2)。这些转运体可促进底物流入骨骼肌中，为肌肉靶向提供机会。
在一些实施方案中，肌肉靶向剂是平衡型核苷转运体2(equilibrativenucleoside transporter 2，ENT2)转运体的底物。相对于其他转运体，ENT2在骨骼肌中具有最高的mRNA表达之一。虽然人ENT2(hENT2)在大多数身体器官例如脑、心脏、胎盘、胸腺、胰腺、前列腺和肾中表达，但其在骨骼肌中特别丰富。人ENT2促进其底物的吸收，这取决于该底物的浓度梯度。ENT2通过转运广泛范围的嘌呤和嘧啶核苷碱基在维持核苷稳态中发挥作用。hENT2转运体对除肌苷之外的所有核苷(腺苷、鸟苷、尿苷、胸苷和胞苷)均具有低的亲和力。因此，在一些实施方案中，肌肉靶向剂是ENT2底物。示例性的ENT2底物包括但不限于肌苷、2’,3’-二脱氧肌苷和氯法拉滨(calofarabine)。在一些实施方案中，本文中提供的任何肌肉靶向剂均与分子载荷(例如，寡核苷酸载荷)缔合。在一些实施方案中，肌肉靶向剂与分子载荷共价连接。在一些实施方案中，肌肉靶向剂与分子载荷非共价连接。
在一些实施方案中，肌肉靶向剂是有机阳离子/肉碱转运体(OCTN2)的底物，所述有机阳离子/肉碱转运体是钠离子依赖性的高亲和力肉碱转运体。在一些实施方案中，肌肉靶向剂是肉碱、米屈肼(mildronate)、乙酰肉碱、或与OCTN2结合的其任意衍生物。在一些实施方案中，肉碱、米屈肼、乙酰肉碱或其衍生物与分子载荷(例如，寡核苷酸载荷)共价连接。
肌肉靶向剂可以是蛋白质，该蛋白质是以靶向肌细胞的至少一种可溶性形式存在的蛋白质。在一些实施方案中，肌肉靶向蛋白可以是血幼素(也称为排斥性导向分子C或血色素沉着症2型蛋白)，所述血幼素是参与铁超负荷和稳态的蛋白。在一些实施方案中，血幼素可以是全长或片段，或者与功能性血幼素蛋白具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的突变体。在一些实施方案中，血幼素突变体可以是可溶性片段、可缺乏N端信号传导、和/或(例如，和)缺乏C端锚定结构域。在一些实施方案中，血幼素可以以GenBank RefSeq登录号NM_001316767.1、NM_145277.4、NM_202004.3、NM_213652.3或NM_213653.3进行注释。应当理解，血幼素可以是人、非人灵长类或啮齿动物来源的。
B.分子载荷
本公开内容的一些方面提供了分子载荷，例如，用于调节生物学结局，例如，DNA序列的转录、RNA序列的剪接和加工、蛋白质的表达或蛋白质的活性。在一些实施方案中，分子载荷与肌肉靶向剂连接或以其他方式缔合。在一些实施方案中，这样的分子载荷能够靶向肌细胞，例如在通过缔合的肌肉靶向剂递送至肌细胞之后通过与肌细胞中的核酸或蛋白质特异性结合。应理解，根据本公开内容可使用多种类型的肌肉靶向剂。例如，分子载荷可包含以下或由以下组成：寡核苷酸(例如，反义寡核苷酸)、肽(例如，结合肌细胞中与疾病相关的核酸或蛋白质的肽)、蛋白质(例如，结合肌细胞中与疾病相关的核酸或蛋白质的蛋白质)或小分子(例如，调节肌细胞中与疾病相关的核酸或蛋白质之功能的小分子)。在一些实施方案中，分子载荷是包含具有突变DMD等位基因之互补区的链的寡核苷酸。本文中进一步详细描述了示例性分子载荷，然而，应理解，本文中提供的示例性分子载荷并不意味着是限制性的。
i.寡核苷酸
如本文中所述，任何合适的寡核苷酸均可用作分子载荷。在一些实施方案中，寡核苷酸可被设计为诱导外显子跳读，例如，EXONDYS 51寡核苷酸(Sarepta Therapeutics，Inc.)，其包含SEQ ID NO：343(CUCCAACAUCAAGGAAGAUGGCAUUUCUAG)；WVE-210201(WaveLifeSciences)，其包含SEQ ID NO：334(UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU)；Casimersen(SareptaTherapeutics，Inc.)，其包含SEQ ID NO：302(CAAUGCCAUCCUGGAGUUCCUG)；或Golodirsen(Sarepta Therapeutics，Inc.)，其包含SEQ ID NO：380(GUUGCCUCCGGUUCUGAAGGUGUUC)。在一些实施方案中，寡核苷酸可被设计为诱导外显子跳读，例如，viltolarsene(NS Pharma，Inc.)，其包含SEQ ID NO：2257(CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC)或renadirsene(Daiichi SankyoCompany)，其包含SEQ ID NO：2252(CGCUGCCCAAUGCCAUCC)。在一些实施方案中，寡核苷酸包含表10中提供的序列的序列或其一部分(例如，其10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个连续核苷)，和/或寡核苷酸包含表10中提供的靶序列之互补区。本文中提供的任一个寡核苷酸(例如，表10中列出的寡核苷酸)中的任意一个或更多个胸腺嘧啶碱基(T)可任选地是尿嘧啶碱基(U)，和/或本文中提供的寡核苷酸中的任意一个或更多个U可任选地是T。
表10.寡核苷酸分子载荷的实例
Figure GDA0004266820060000951
Figure GDA0004266820060000952
表10中提供的任一个寡核苷酸和/或靶序列中的每个胸腺嘧啶碱基(T)可独立且任选地用尿嘧啶碱基(U)替换，和/或每个U可独立且任选地用T替换。表10中列出的靶序列包含T，但考虑DMD靶向寡核苷酸与RNA和/或DNA的结合。
在一些实施方案中，寡核苷酸可被设计为引起mRNA的降解(例如，寡核苷酸可以是引起降解的间隔聚体、siRNA、核酶或适配体)。在一些实施方案中，寡核苷酸可被设计为阻断mRNA的翻译(例如，寡核苷酸可以是阻断翻译的混合聚体、siRNA或适配体)。在一些实施方案中，寡核苷酸可被设计为引起mRNA的降解和阻断mRNA的翻译。在一些实施方案中，寡核苷酸可被设计为促进mRNA的稳定性。在一些实施方案中，寡核苷酸可被设计为促进mRNA的翻译。在一些实施方案中，寡核苷酸可被设计为促进mRNA的稳定性和促进mRNA的翻译。在一些实施方案中，寡核苷酸可以是用于指导酶(例如，基因编辑酶)的活性的指导核酸(例如，指导RNA)。在一些实施方案中，指导核酸可指导酶以使突变DMD等位基因的全部或一部分缺失(例如，以促进框内外显子跳读)。在一些实施方案中，寡核苷酸可被设计为靶向DMD表达的阻抑调节物(例如miR-31)。本文中提供了寡核苷酸的另一些实例。应理解，在一些实施方案中，可通过将功能序列(例如，反义链序列)从一种格式并入另一种格式来使一种格式的寡核苷酸(例如，反义寡核苷酸)适当地适应成另一种格式(例如，siRNA寡核苷酸)。
可用于靶向DMD的寡核苷酸的实例在以下中提供：美国专利申请公开US20100130591A1，其于2010年5月27日公开，标题为“MULTIPLE EXON SKIPPINGCOMPOSITIONS FOR DMD”；美国专利No.8,361,979，其于2013年1月29日授权，标题为“MEANSAND METHOD FOR INDUCING EXON-SKIPPING”；美国专利申请公开20120059042，其于2012年3月8日公开，标题为“METHOD FOR EFFICIENT EXON(44)SKIPPING IN DUCHENNE MUSCULARDYSTROPHY AND ASSOCIATED MEANS；美国专利申请公开20140329881，其于2014年11月6日公开，标题为“EXON SKIPPING COMPOSITIONS FOR TREATING MUSCULAR DYSTROPHY”；美国专利No.8,232,384，其于2012年7月31日授权，标题为“ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES FORINDUCING EXON SKIPPING AND METHODS OF USE THEREOF”；美国专利申请公开20120022134A1，其于2012年1月26日公开，标题为“METHODS AND MEANS FOR EFFICIENTSKIPPING OF EXON 45IN DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY PRE-MRNA；美国专利申请公开20120077860，其于2012年3月29日公开，标题为“ADENO-ASSOCIATED VIRAL VECTOR FOREXON SKIPPING IN A GENE ENCODING A DISPENSABLE DOMAN PROTEIN”；美国专利No.8,324,371，其于2012年12月4日授权，标题为“OLIGOMERS”；美国专利No.9,078,911，其于2015年7月14日授权，标题为“ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES”；美国专利No.9,079,934，其于2015年7月14日授权，标题为“ANTISENSE NUCLEIC ACIDS”；美国专利No.9,034,838，其于2015年5月19日授权，标题为“MIR-31IN DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY THERAPY”；以及国际专利公开WO2017062862A3，其于2017年4月13日公开，标题为“OLIGONUCLEOTIDECOMPOSITIONS AND METHODS THEREOF”；其各自的内容均以其整体并入本文。
表14提供了可用于靶向DMD(例如用于外显子跳读)的寡核苷酸序列的非限制性实例。在一些实施方案中，寡核苷酸可包含表14中提供的任何序列。
表14-用于靶向DMD的寡核苷酸序列。
Figure GDA0004266820060000971
/>
Figure GDA0004266820060000981
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Figure GDA0004266820060000991
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Figure GDA0004266820060001001
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Figure GDA0004266820060001011
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Figure GDA0004266820060001021
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Figure GDA0004266820060001031
在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸靶向DMDRNA(例如，SEQ ID NO:2239的Dp427m转录物)的一个区域。在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸包含DMD RNA(例如，SEQ ID NO:2239的Dp427m转录物)之互补区。在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸包含与DMD RNA(例如，SEQ ID NO:2240至2250中任一个)的外显子之互补区。以下提供了DMDRNA序列和外显子序列的一些实例。
智人(Homo sapiens)肌养蛋白(DMD)，转录物变体Dp427m，mRNA(NCBI参考序列：NM_004006.2)
Figure GDA0004266820060001041
/>
Figure GDA0004266820060001051
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Figure GDA0004266820060001061
/>
Figure GDA0004266820060001071
智人肌养蛋白(DMD)，转录物变体Dp427m，外显子8(NCBI参考序列：NM_004006.2的第894至1075位核苷酸)
Figure GDA0004266820060001072
智人肌养蛋白(DMD)，转录物变体Dp427m，外显子23(NCBI参考序列：NM_004006.2的第3194至3406位核苷酸)
Figure GDA0004266820060001081
智人肌养蛋白(DMD)，转录物变体Dp427m，外显子43(NCBI参考序列：NM_004006.2的第6362至6534位核苷酸)
Figure GDA0004266820060001082
智人肌养蛋白(DMD)，转录物变体Dp427m，外显子44(NCBI参考序列：NM_004006.2的第6535至6682位核苷酸)
Figure GDA0004266820060001083
智人肌养蛋白(DMD)，转录物变体Dp427m，外显子45(NCBI参考序列：NM_004006.2的第6683至6858位核苷酸)
Figure GDA0004266820060001084
智人肌养蛋白(DMD)，转录物变体Dp427m，外显子46(NCBI参考序列：NM_004006.2的第6859至7006位核苷酸)
Figure GDA0004266820060001085
智人肌养蛋白(DMD)，转录物变体Dp427m，外显子50(NCBI参考序列：NM_004006.2的第7445至7553位核苷酸)
Figure GDA0004266820060001086
智人肌养蛋白(DMD)，转录物变体Dp427m，外显子51(NCBI参考序列：NM_004006.2的第7554至7786位核苷酸)
Figure GDA0004266820060001091
智人肌养蛋白(DMD)，转录物变体Dp427m，外显子52(NCBI参考序列：NM_004006.2的第7787至7904位核苷酸)
Figure GDA0004266820060001092
智人肌养蛋白(DMD)，转录物变体Dp427m，外显子53(NCBI参考序列：NM_004006.2的第7905至8116位核苷酸)
Figure GDA0004266820060001093
/>
智人肌养蛋白(DMD)，转录物变体Dp427m，外显子55(NCBI参考序列：NM_004006.2的第8272至8461位核苷酸)
Figure GDA0004266820060001094
在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸靶向DMD中的外显子剪接增强子(ESE)序列(例如，外显子23、44、45、46、50、51、52、53或55的ESE序列)。在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸靶向DMD中的外显子剪接增强子(ESE)序列(例如，外显子8、23、43、44、45、46、50、44、45、46、50、51、52、53或55的ESE序列)。在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸靶向DMD外显子51的ESE序列(例如，表15中列出的ESE)。在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸靶向DMD外显子8、23、42、44、45、46、50、52、53或55的ESE序列(例如，表11中列出的ESE)。
在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读，例如用于跳读外显子8、23、42、44、45、46、50、52、53和55中的一个或更多个)的寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含DMD转录物的一个或更多个完整或部分ESE(例如，表15或表11中列出的一个或更多个完整或部分ESE)。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:402至436和2043至2238中所示的一个或更多个完整或部分ESE。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:402至436和2043至2238中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。
表15.DMD的外显子51内的外显子剪接增强子
Figure GDA0004266820060001111
*参考起始位置是指ESE基序的第一个核苷酸在NCBI参考序列NG_012232.1(NG_012232，第1版)的核苷酸5,001至2,225,382中的位置。NCBI参考序列NG_012232.1(NG_012232，第1版)的核苷酸5,001至2,225,382对应于X染色体上的智人肌养蛋白(DMD)基因。
表11.DMD的外显子8、23、43、44、45、46、50、52、53和55内的外显子剪接增强子
Figure GDA0004266820060001121
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Figure GDA0004266820060001131
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Figure GDA0004266820060001141
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Figure GDA0004266820060001151
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Figure GDA0004266820060001161
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Figure GDA0004266820060001171
*参考起始位置是指ESE基序的第一个核苷酸在NCBI参考序列NG_012232.1(NG_012232，第1版)的核苷酸5,001至2,225,382中的位置。NCBI参考序列NG_012232.1(NG_012232，第1版)的核苷酸5,001至2,225,382对应于X染色体上的智人肌养蛋白(DMD)基因。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含DMD外显子8的一个或更多个完整或部分ESE。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含DMD外显子8的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:2047至2062中所示的一个或更多个完整或部分ESE。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:2047至2062中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含DMD外显子8的一个或更多个ESE(例如，2、3、4或更多个相邻ESE)的至少6个(例如，6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:2047至2062中所示的一个或更多个ESE(例如，2、3、4或更多个相邻ESE)的至少6个(例如，6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)核苷酸。
在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为18至35个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:2047至2062中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为20至30(例如，20、25、30)个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:2047至2062中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为20个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:2047至2062中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为30个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:2047至2062中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含DMD外显子23的一个或更多个完整或部分ESE。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含DMD外显子23的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:429和2063至2086中所示的一个或更多个完整或部分ESE。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:429和2063至2086中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含DMD外显子23的一个或更多个ESE(例如，2、3、4或更多个相邻ESE)的至少6个(例如，6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:429和2063至2086中所示的一个或更多个ESE(例如2、3、4或更多个相邻ESE)的至少6个(例如，6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)核苷酸。
在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为18至35个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:429和2063至2086中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为20至30(例如，20、25、30)个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:429和2063至2086中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为20个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:429和2063至2086中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为30个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:429和2063至2086中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含DMD外显子43的一个或更多个完整或部分ESE。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含DMD外显子43的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:412、2078至2080和2087至2111中所示的一个或更多个完整或部分ESE。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:412、2078至2080和2087至2111中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含DMD外显子43的一个或更多个ESE(例如，2、3、4或更多个相邻ESE)的至少6个(例如，6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:412、2078至2080和2087至2111中所示的一个或更多个ESE(例如2、3、4或更多个相邻ESE)的至少6个(例如，6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)核苷酸。
在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为18至35个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:412、2078至2080和2087至2111中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为20至30(例如，20、25、30)个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:412、2078至2080和2087至2111中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为20个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:412、2078至2080和2087至2111中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为30个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:412、2078至2080和2087至2111中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含DMD外显子44的一个或更多个完整或部分ESE。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含DMD外显子44的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:409和2112至2121中所示的一个或更多个完整或部分ESE。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:409和2112至2121中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含DMD外显子44的一个或更多个ESE(例如，2、3、4或更多个相邻ESE)的至少6个(例如，6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:409和2112至2121中所示的一个或更多个ESE(例如2、3、4或更多个相邻ESE)的至少6个(例如，6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)核苷酸。
在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为18至35个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:409和2112至2121中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为20至30(例如，20、25、30)个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:409和2112至2121中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8)个连续核苷酸。在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为20个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:409和2112至2121中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为30个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:409和2112至2121中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含DMD外显子45的一个或更多个完整或部分ESE。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含DMD外显子45的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:2097、2102、2103和2122至2146中所示的一个或更多个完整或部分ESE。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:2097、2102、2103和2122至2146中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含DMD外显子45的一个或更多个ESE(例如，2、3、4或更多个相邻ESE)的至少6个(例如，6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:2097、2102、2103和2122至2146中所示的一个或更多个ESE(例如，2、3、4或更多个相邻ESE)的至少6个(例如，6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)核苷酸。
在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为18至35个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:2097、2102、2103和2122至2146中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为20至30(例如，20、25、30)个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:2097、2102、2103和2122至2146中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为20个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:2097、2102、2103和2122至2146中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为30个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:2097、2102、2103和2122至2146中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含DMD外显子46的一个或更多个完整或部分ESE。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含DMD外显子46的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:2096和2147至2158中所示的一个或更多个完整或部分ESE。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:2096和2147至2158中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含DMD外显子46的一个或更多个ESE(例如，2、3、4或更多个相邻ESE)的至少6个(例如，6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:2096和2147至2158中所示的一个或更多个ESE(例如2、3、4或更多个相邻ESE)的至少6个(例如，6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)核苷酸。
在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为18至35个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:2096和2147至2158中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为20至30(例如，20、25、30)个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:2096和2147至2158中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8)个连续核苷酸。在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为20个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:2096和2147至2158中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为30个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:2096和2147至2158中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含DMD外显子50的一个或更多个完整或部分ESE。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含DMD外显子50的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:2096和2160至2177中所示的一个或更多个完整或部分ESE。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:2096和2160至2177中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含DMD外显子50的一个或更多个ESE(例如，2、3、4或更多个相邻ESE)的至少6个(例如，6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:2096和2160至2177中所示的一个或更多个ESE(例如2、3、4或更多个相邻ESE)的至少6个(例如，6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)核苷酸。
在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为18至35个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:2096和2160至2177中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为20至30(例如，20、25、30)个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:2096和2160至2177中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8)个连续核苷酸。在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为20个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:2096和2160至2177中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为30个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:2096和2160至2177中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含DMD外显子51的一个或更多个完整或部分ESE。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含DMD外显子51的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:402至436中所示的一个或更多个完整或部分ESE。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:402至436中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:419中所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7、8个)连续核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含DMD外显子51的一个或更多个ESE(例如，2、3、4或更多个相邻ESE)的至少6个(例如，6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:402至436中所示的一个或更多个ESE(例如，2、3、4或更多个相邻ESE)的至少6个(例如，6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:418和SEQ ID NO:419中所示的ESE的至少6个(例如，6、7、8、9、10、11、12、13或14个)核苷酸。
在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为18至35个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:402至436中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为20至30(例如，20、25、30)个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:402至436中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为20个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ IDNO:402至436中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为30个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:402至436中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。
在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为20至30(例如，20、25、30)个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:419中所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为30个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:419中所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸的长度为20至30(例如，20、25、30)个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:418和SEQ ID NO:419中所示的ESE的至少6(例如，6、7、8、9、10、11、12、13或14个)核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度为30个核苷酸并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:418和SEQ ID NO:419中所示的ESE的至少6个(例如，6、7、8、9、10、11、12、13或14个)核苷酸。
SEQ ID NO:437至1241和SEQ ID NO:1242至2046中分别提供了可用于DMD外显子51跳读的寡核苷酸及其靶序列的一些非限制性实例。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度为20至30个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述互补区包含SEQ ID NO:1242至2046中任一个的至少20个连续核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度为20至30个核苷酸，并且包含SEQ ID NO:437至1241中任一个的至少20个连续核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含SEQ ID NO:437至1241中任一个的核苷酸序列。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度为至少30(例如，30、31、32、33、34或35)个核苷酸，并且包含SEQ ID NO:437至1241中任一个的核苷酸序列。
在一些实施方案中，寡核苷酸的长度为20至30个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:1548、1550、1551、1552、1555、1558、1559、1562、1565、1569、1577、1583、1589、1595、1600、1606、1610、1614、1621、1626、1629、1632、1637、1640、1643、1646、1650、1655、1658和1662中任一个的至少20个连续核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度为20至30个核苷酸，并且包含SEQ ID NO:743、745、746、747、750、753、754、757、760、764、772、778、784、790、795、801、805、809、816、821、824、827、832、835、838、841、845、850、853和857中任一个的至少20个连续核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含SEQ IDNO:743、745、746、747、750、753、754、757、760、764、772、778、784、790、795、801、805、809、816、821、824、827、832、835、838、841、845、850、853和857中任一个的核苷酸序列。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度为30个核苷酸，并且包含SEQ ID NO:743、745、746、747、750、753、754、757、760、764、772、778、784、790、795、801、805、809、816、821、824、827、832、835、838、841、845、850、853和857中任一个的核苷酸序列。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含DMD外显子52的一个或更多个完整或部分ESE。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含DMD外显子52的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:432和2178至2192中所示的一个或更多个完整或部分ESE。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:432和2178至2192中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含DMD外显子52的一个或更多个ESE(例如，2、3、4或更多个相邻ESE)的至少6个(例如，6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:432和2178至2192中所示的一个或更多个ESE(例如2、3、4或更多个相邻ESE)的至少6个(例如，6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)核苷酸。
在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为18至35个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:432和2178至2192中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为20至30(例如，20、25、30)个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:432和2178至2192中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为20个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:432和2178至2192中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为30个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:432和2178至2192中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含DMD外显子53的一个或更多个完整或部分ESE。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含DMD外显子53的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:416、430、431、2108、2114、2127和2193至2213中所示的一个或更多个完整或部分ESE。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:416、430、431、2108、2114、2127和2193至2213中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含DMD外显子53的一个或更多个ESE(例如，2、3、4或更多个相邻ESE)的至少6个(例如，6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:416、430、431、2108、2114、2127和2193至2213中所示的一个或更多个ESE(例如2、3、4或更多个相邻ESE)的至少6个(例如，6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)核苷酸。
在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为18至35个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:416、430、431、2108、2114、2127和2193至2213中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为20至30(例如，20、25、30)个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:416、430、431、2108、2114、2127和2193至2213中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为20个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:416、430、431、2108、2114、2127和2193至2213中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为30个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:416、430、431、2108、2114、2127和2193至2213中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含DMD外显子55的一个或更多个完整或部分ESE。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含DMD外显子55的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:2097、2102、2103、2116、2147、2199和2214至2238中所示的一个或更多个完整或部分ESE。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:2097、2102、2103、2116、2147、2199和2214至2238中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含DMD外显子55的一个或更多个ESE(例如，2、3、4或更多个相邻ESE)的至少6个(例如，6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:2097、2102、2103、2116、2147、2199和2214至2238中所示的一个或更多个ESE(例如2、3、4或更多个相邻ESE)的至少6个(例如，6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)核苷酸。
在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为18至35个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:2097、2102、2103、2116、2147、2199和2214至2238中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为20至30(例如，20、25、30)个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:2097、2102、2103、2116、2147、2199和2214至2238中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为20个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:2097、2102、2103、2116、2147、2199和2214至2238中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的长度为30个核苷酸，并且包含靶序列之互补区，所述靶序列包含SEQ ID NO:2097、2102、2103、2116、2147、2199和2214至2238中任一个所示的ESE的至少4个(例如，4、5、6、7或8个)连续核苷酸。
在一些实施方案中，可用于靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的任一种寡核苷酸是磷酸二酰胺吗啉代寡聚物(PMO)。
以下提供了靶向DMD(例如，用于外显子跳读)的寡核苷酸的另一些实例：美国专利申请公开2013-072541，其于2013年3月21日公开，标题为“ADENO-ASSOCIATED VIRALVECTOR FOR EXON SKIPPING IN A GENE ENCODING A DISPENSIBLE-DOMAIN PROTEIN”；美国专利申请公开2015-191725，其于2015年7月9日公开，标题为“OLIGONUCLEOTIDE FOR THETREATMENT OF MUSCULAR DYSTROPHY PATIENTS”；美国专利申请公开2015-196670，其于2015年7月16日公开，标题为“COMPOSITIONS AND METHODS FOR DUCHENNE MUSCULARDYSTROPHY GENE THERAPY”；美国专利申请公开2017-349905，其于2017年12月7日公开，标题为“GENOME EDITING WITH SPLIT CAS9 EXPRESSED FROM TWO VECTORS”；美国专利申请公开2018-028554，其于2018年2月1日公开，标题为“OLIGOMERS HAVING BICYCLICSCAFFOLD MOEITIES”；美国专利申请公开2018-171333，其于2018年6月21日公开，标题为“ANTISENSE MOLECULES AND METHODS FOR TREATING PATHOLOGIES”；美国专利申请公开2018-179538，其于2018年6月28日公开，标题为“ANTISENSE NUCLEIC ACIDS”；美国专利申请公开2018-265859，其于2018年9月20日公开，标题为“MODIFICATION OF THE DYSTROPHINGENE AND USES THEREOF”；美国专利申请公开2018-369400，其于2018年12月27日公开，标题为“NUCLEIC ACID-POLYPEPTIDE COMSITIONS AND METHODS OF INDUCING EXONSKIPPING”；美国专利申请公开2019-000986，其于2019年1月3日公开，标题为“NUCLEICACID-POLYPEPTIDE COMPOSITIONS AND METHODS OF INDUCING EXON SKIPPING”；美国专利申请公开2019-008986，其于2019年1月10日公开，标题为“OLIGONUCLEOTIDE COMPOSITIONSAND METHODS THEREOF”；美国专利申请公开2019-112604，其于2019年4月18日公开，标题为“METHODS AND MEANS FOR EFFICIENT SKIPPING OF EXON 45IN DUCHENNE MUSCULARDYSTROPHY PRE-MRNA”；美国专利申请公开2019-119679，其于2019年4月25日公开，标题为“METHODS AND MEANS FOR EFFICIENT SKIPPING OF EXON 45IN DUCHENNE MUSCULARDYSTROPHY PRE-MRNA”；美国专利申请公开2019-127733，其于2019年5月2日公开，标题为“OLIGONUCLEOTIDE COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF”；美国专利申请公开2019-151476，其于2019年5月23日公开，标题为“THERAPEUTIC APPLICATIONS OF CPF1-BASEDGENOME EDITING”；美国专利申请公开2019-177723，其于2019年6月13日公开，标题为“COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY ANDRELATED DISORDERS”；美国专利申请公开2019-177725，其于2019年6月13日公开，标题为“METHODS AND MEANS FOR EFFICIENT SKIPPING OF EXON 45IN DUCHENNE MUSCULARDYSTROPHY PRE-MRNA”；美国专利申请公开2019-209604，其于2019年7月11日公开，标题为“OLIGONUCLEOTIDES,COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF”；美国专利申请公开2019-249173，其于2019年8月15日公开，标题为“METHODS AND COMPOSITIONS OF BIOLOGICALLYACTIVE AGENTS”；美国专利申请公开2019-270994，其于2019年9月5日公开，标题为“ANTISENSE MOLECULES AND METHODS FOR TREATING PATHOLOGIES”；美国专利申请公开2019-284556，其于2019年9月19日公开，标题为“MULTIPLE EXON SKIPPING COMPOSITIONSFOR DMD”；美国专利申请公开2019-323010，其于2019年10月24日公开，标题为“ANTISENSEOLIGONUCLEOTIDES FOR INDUCING EXON SKIPPING AND METHODS OF USE THEREOF”；美国专利申请公开2019-330626，其于2019年10月31日公开，标题为“COMPOUNDS AND METHODSFOR USE IN DYSTROPHIN TRANSCRIPT”；美国专利申请公开2019-338311，其于2019年11月7日公开，标题为“OPTIMIZED STRATEGY FOR EXON SKIPPING MODIFICATIONS USINGCRISPR/CAS9 WITH TRIPLE GUIDE SEQUENCES”；美国专利申请公开2019-359982，其于2019年11月28日公开，标题为“COMPOSITIONS FOR TREATING MUSCULAR DYSTROPHY”；美国专利申请公开2019-364862，其于2019年12月5日公开，标题为“DMD REPORTER MODELSCONTAINING HUMANIZED DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY MUTATIONS”；美国专利申请公开2019-390197，其于2019年12月26日公开，标题为“OLIGONUCLEOTIDE COMPOSITIONS ANDMETHODS THEREOF”；美国专利申请公开2020-040337，其于2020年2月6日公开，标题为“COMPOSITIONS FOR TREATING MUSCULAR DYSTROPHY”；美国专利No.10,287,586，其于2019年5月14日授权，标题为“ANTISENSE MOLECULES AND METHODS FOR TREATINGPATHOLOGIES”；美国专利No.10,337,003，其于2019年7月2日授权，标题为“COMPOSITIONSFOR TREATING MUSCULAR DYSTROPHY”；美国专利No.10,364,431，其于2019年7月30日授权，标题为“COMPOSITIONS FOR TREATING MUSCULAR DYSTROPHY”；美国专利No.10,450,568，其于2019年10月22日授权，标题为“OLIGONUCLEOTIDE COMPOSITIONS AND METHODSTHEREOF”；美国专利No.10,487,106，其于2019年11月26日授权，标题为“ANTISENSENUCLEIC ACIDS”；美国专利No.10,533,171，其于2020年1月14日授权，标题为“OLIGONUCLEOTIDE COMPRISING AN INOSINE FOR TREATING DMD”；美国专利No.10,704,060，其于2020年7月7日授权，标题为“RNA-GUIDED GENE EDITING AND GENE REGULATION”；美国专利No.10,752,898，其于2020年8月25日授权，标题为“EFFECTIVE GENE THERAPYTOOLS FOR DYSTROPHIN EXON 53SKIPPING”；美国专利No.10,876,114，其于2020年12月29日授权，标题为“METHODS AND MEANS FOR EFFICIENT SKIPPING OF AT LEAST ONE OF THEFOLLOWING EXONS OF THE HUMAN DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY GENE:43,46,50-53”；美国专利No.6,100,099，其于2000年8月8日授权，标题为“TEST STRIP HAVING A DIAGONALARRAY OF CAPTURE SPOTS”；美国专利No.6,210,898，其于2001年4月3日授权，标题为“METHOD OF PERFORMING IMMUNOCHROMATOGRAPHY”；美国专利No.7,973,015，其于2011年7月5日授权，标题为“INDUCTION OF EXON SKIPPING IN EUKARYOTIC CELLS”；美国专利No.8,039,608，其于2011年10月18日授权，标题为“BIOINFORMATICALLY DETECTABLE GROUPOF NOVEL REGULATORY GENES AND USES THEREOF”；美国专利No.8,361,979，其于2013年1月29日授权，标题为“MEANS AND METHOD FOR INDUCING EXON-SKIPPING”；美国专利No.8,802,437，其于2014年8月12日授权，标题为“MEGANCLEASE REAGENTS OF USES THEREOF FORTREATING GENETIC DISEASES CAUSED BY FRAME SHIFT/NON SENSE MUTATIONS”；美国专利No.8,865,883，其于2014年10月21日授权，标题为“MULTIPLE EXON SKIPPINGCOMPOSITIONS FOR DMD”；美国专利No.9,657,049，其于2017年5月23日授权，标题为“ENANUCLEIC ACID PHARMACEUTICALS CAPABLE OF MODIFYING SPLICING OF MRNAPRECURSORS”；美国专利No.9,657,050，其于2017年5月23日授权，标题为“ENA NUCLEICACID PHARMACEUTICALS CAPABLE OF MODIFYING SPLICING OF MRNA PRECURSORS”；美国专利No.9,988,629，其于2018年6月5日授权，标题为“ANTISENSE NUCLEIC ACIDS”；国际专利公开WO 2011/078797 A2，其于2011年6月30日公开，标题为“ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDESAND USES THREREOF”；国际专利公开WO 2011/154427 A1，其于2011年12月15日公开，标题为“MODIFIED SNRNAS FOR USE IN THERAPY”；国际专利公开WO 2018/007475 A1，其于2018年1月11日公开，标题为“PRE-mRNA SPLICE SWITCHING OR MODULATING OLIGONUCLEOTIDESCOMPRISING BICYCLIC SCAFFOLD MOIETIES、WITH IMPROVED CHARACTERISTICS FORTREATMENT OF GENETIC DISORDERS”；国际专利公开WO 2018/014042 A1，其于2018年1月18日公开，标题为“COMPOUNDS AND METHODS FOR MODULATION OF DYSTROPHIN TRANSCRIPT”；国际专利公开WO 2018/017754 A1，其于2018年1月25日公开，标题为“THERAPEUTICAPPLICATIONS OF CPF1-BASED GENOME EDITING”；国际专利公开WO 2018/107003 A1，其于2018年6月14日公开，标题为“DMD REPORTER MODELS CONTAINING HUMANIZED DUSCHENEMUSCULAR DYSTROPHY MUTATIONS”；国际专利公开WO 2018/129296 A1，其于2018年7月12日公开，标题为“OPTIMIZED STRATEGY FOR EXON SKIPPING MODIFICATIONS USING CRISPR/CAS9 WITH TRIPLE GUIDE SEQUENCES”；国际专利公开WO 2019/014772 A1，其于2019年1月24日公开，标题为“ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES THAT BIND TO EXON 51OF HUMANDYSTROPHIN PRE-MRNA”；国际专利公开WO 2019/059973A1，其于2019年3月28日公开，标题为“EXON SKIPPING OLIGOMER CONJUGATES FOR MUSCULAR DYSTROPHY”；国际专利公开WO2019/060775A1，其于2019年3月28日公开，标题为“NUCLEIC ACID-POLYPEPTIDECOMPOSITIONS AND METHODS OF INDUCING EXON SKIPPING”；国际专利公开WO 2019/067975 A1，其于2019年4月4日公开，标题为“COMBINATION THERAPIES FOR TREATINGMUSCULAR DYSTROPHY”；国际专利公开WO 2019/092507 A2，其于2019年5月16日公开，标题为“CRISPR/CAS SYSTEMS FOR TREATMENT OF DMD”；国际专利公开WO 2019/136216 A1，其于2019年7月11日公开，标题为“THERAPEUTIC CRISPR/CAS9COMPOSITIONS AND METHODS OFUSE”；国际专利公开WO 2019/152609A1，其于2019年8月8日公开，标题为“COMPOSITIONSAND METHODS FOR CORRECTING DYSTROPHIN MUTATIONS IN HUMAN CARDIOMYOCYTES”；国际专利公开WO 2019/200185 A1，其于2019年10月17日公开，标题为“OLIGONUCLEOTIDECOMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF”；国际专利公开WO 2019/215333A1，其于2019年11月14日公开，标题为“OLIGONUCLEOTIDES CONJUGATES COMPRISING 7'-5'-ALPHA-ANOMERIC-BICYCLIC SUGAR NUCLEOSIDES”；国际专利公开WO 2019/241385A2，其于2019年12月19日公开，标题为“EXON SKIPPING OLIGOMERS FOR MUSCULAR DYSTROPY”；国际专利公开WO 2019/246480A1，其于2019年12月26日公开，标题为“CORRECTION OF DYSTROPHINEXON 43、EXON 45、OR EXON 52DELETIONS IN DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY”；国际专利公开WO 2020/028832 A1，其于2020年2月6日公开，标题为“MUSCLE TARGETING COMPLEXESAND USES THEREOF FOR TREATING DYSTROPHINOPATHIES”；国际专利公开WO 2018/091544A1，其于2018年5月24日公开，标题为“SUBSTANCES FOR TARGETING VARIOUS SELECTEDORGANS OR TISSUES”；国际专利公开WO 2018/098480A1，其于2018年5月31日公开，标题为“PREVENTION OF MUSCULAR DYSTROPHY BY CRISPR/CPF1-MEDIATED GENE EDITING”；国际专利公开WO 1993/020227 A1，其于1993年10月14日公开，标题为“METHOD OF MULTIPLEXLIGASE CHAIN REACTION”；国际专利公开WO 2013/100190 A1，其于2013年7月4日公开，标题为“ANTISENSE NUCLEIC ACID”；国际专利公开WO 2013/163628A2，其于2013年10月31日公开，标题为“GENETIC CORRECTION OF MUTATED GENES”；国际专利公开WO 2007/135105A1，其于2007年11月29日公开，标题为“MEANS AND METHOD FOR INDUCING EXON-SKIPPING”；国际专利公开WO 2011/150408 A2，其于2011年12月1日公开，标题为“OLIGONUCLEOTIDE ANALOGUES HAVING MODIFIED INTERSUBUNIT LINKAGES AND/ORTERMINAL GROUPS”；国际专利公开WO 2012/029986 A1，其于2012年3月8日公开，标题为“ANTISENSE NUCLEIC ACID”；其中各自的内容整体并入本文。
用于促进DMD基因编辑的寡核苷酸的实例包括国际专利公开WO2018053632A1，其于2018年3月29日公开，标题为“METHODS OF MODIFYING THE DYSTROPHIN GENE ANDRESTORING DYSTROPHIN EXPRESSION AND USES THEREOF”；国际专利公开WO2017049407A1，其于2017年3月30日公开，标题为“MODIFICATION OF THE DYSTROPHIN GENE AND USESTHEREOF”；国际专利公开WO2016161380A1，其于2016年10月6日公开，标题为“CRISPR/CAS-RELATED METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY ANDBECKER MUSCULAR DYSTROPHY”；国际专利公开WO2017095967，其于2017年6月8日公开，标题为“THERAPEUTIC TARGETS FOR THE CORRECTION OF THE HUMAN DYSTROPHIN GENE BYGENE EDITING AND METHODS OF USE”；国际专利公开WO2017072590A1，其于2017年5月4日公开，标题为“MATERIALS AND METHODS FOR TREATMENT OF DUCHENNE MUSCULARDYSTROPHY”；国际专利公开WO2018098480A1，其于2018年5月31日公开，标题为“PREVENTIONOF MUSCULAR DYSTROPHY BY CRISPR/CPF1-MEDIATED GENE EDITING”；美国专利申请公开US20170266320A1，其于2017年9月21日公开，标题为“RNA-Guided Systems for In VivoGene Editing”；国际专利公开WO2016025469A1，其于2016年2月18日公开，标题为“PREVENTION OF MUSCULAR DYSTROPHY BY CRISPR/CAS9-MEDIATED GENE EDITING”；美国专利申请公开2016/0201089，其于2016年7月14日公开，标题为“RNA-GUIDED GENE EDITINGAND GENE REGULATION”；以及美国专利申请公开2013/0145487，其于2013年6月6日公开，标题为“MEGANUCLEASE VARIANTS CLEAVING A DNA TARGET SEQUENCE FROM THE DYSTROPHNGENE AND USES THEREOF”；其各自的内容均以其整体并入本文。在一些实施方案中，寡核苷酸可具有与多种物种(例如，选自人、小鼠和非人物种)的DMD基因序列互补的区域。
在一些实施方案中，寡核苷酸可具有突变体DMD等位基因(例如在人DMD的外显子1至79中的任一个中具有至少一个突变的DMD等位基因，所述突变导致移码和不正确的RNA剪接/加工)的互补区。
在一些实施方案中，寡核苷酸可靶向lncRNA或mRNA，例如用于降解。在一些实施方案中，寡核苷酸可靶向(例如用于降解)编码参与错配修复途径的蛋白质(例如MSH2、MutLα、MutSβ、MutLα)的核酸。参与错配修复途径的蛋白质(其中编码这样的蛋白质的mRNA可被本文中所述的寡核苷酸靶向)的非限制性实例描述在Iyer,R.R.et al.，“DNA tripletrepeat expansion and mismatch repair”Annu Rev Biochem.2015；84：199-226.；以及Schmidt M.H.and Pearson C.E.，“Disease-associated repeat instability andmismatch repair”’DNA Repair(Amst).2016Feb；38：117-26中。
在一些实施方案中，寡核苷酸中的任一种可以是盐形式，例如，作为钠盐、钾盐或镁盐。
在一些实施方案中，本文中所述的任一种寡核苷酸的5’或3’核苷(例如，末端核苷)任选地通过间隔基(spacer)与胺基缀合。在一些实施方案中，间隔基包含脂族部分。在一些实施方案中，间隔基包含聚乙二醇部分。在一些实施方案中，磷酸二酯键联存在于间隔基与寡核苷酸的5’或3’核苷之间。在一些实施方案中，本文中所述的任何寡核苷酸的5’或3’核苷(例如，末端核苷)与间隔基缀合，所述间隔基是经取代或未经取代的脂族、经取代或未经取代的杂脂族、经取代或未经取代的亚碳环基、经取代或未经取代的亚杂环基、经取代或未经取代的亚芳基、经取代或未经取代的亚杂芳基、-O-，-N(RA)-，-S-，-C(＝O)-，-C(＝O)O-，-C(＝O)NRA，-NRAC(＝O)-，-NRAC(＝O)RA，-C(＝O)RA，-NRAC(＝O)O-，-NRAC(＝O)N(RA)-，-OC(＝O)-，-OC(＝O)O-，-OC(＝O)N(RA)-，-S(O)2NRA，-NRAS(O)2-，或其组合；每个RA独立地是氢或经取代或未经取代的烷基。在某些实施方案中，间隔基是经取代或未经取代的亚烷基、经取代或未经取代的亚杂环基、经取代或未经取代的亚杂芳基、-O-、-N(RA)-或-C(＝O)N(RA)2，或其组合。
在一些实施方案中，本文中所述的任一种寡核苷酸的5’或3’核苷与式-NH2-(CH2)n-的化合物缀合，其中n是1至12的整数。在一些实施方案中，n是6、7、8、9、10、11或12。在一些实施方案中，磷酸二酯键联存在于式NH2-(CH2)n-的化合物与寡核苷酸的5’或3’核苷之间。在一些实施方案中，式NH2-(CH2)6-的化合物通过6-氨基-1-己醇(NH2-(CH2)6-OH)与寡核苷酸的5’磷酸之间的反应与寡核苷酸缀合。
在一些实施方案中，寡核苷酸例如通过胺基与靶向剂，例如肌肉靶向剂例如抗TfR抗体缀合。
a.寡核苷酸大小/序列
寡核苷酸可具有多种不同的长度，例如，取决于格式。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度为7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75或更多个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度为8至50个核苷酸、长度为8至40个核苷酸、长度为8至30个核苷酸、长度为10至15个核苷酸、长度为10至20个核苷酸、长度为15至25个核苷酸、长度为21至23个核苷酸，等。
在一些实施方案中，当寡核苷酸的互补核酸序列与靶分子(例如，mRNA)的结合干扰靶标(例如，mRNA)的功能导致改变活性(例如，抑制翻译、改变剪接、外显子跳读)或表达(例如，降解靶mRNA)，并且具有足够程度的互补性以避免在以下情况下的该序列与非靶标序列的非特异性结合时，出于本公开内容的目的，寡核苷酸的互补核酸序列与靶核酸可特异性地杂交或对靶核酸具有特异性：在其中期望避免非特异性结合的条件下，例如在生理条件下在体内测定或治疗性处理的情况下，以及在体外测定的情况下，在其中在合适的严格条件下进行测定的条件下。因此，在一些实施方案中，寡核苷酸可与靶核酸的连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补。在一些实施方案中，互补核苷酸序列不需要与其所靶向的100％互补来与靶核酸可特异性地杂交或对靶核酸具有特异性。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含靶核酸之互补区，所述互补区的长度为8至15、8至30、8至40或10至50、或5至50或5至40个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸与靶核酸的互补区的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。在一些实施方案中，互补区与靶核酸的至少8个连续核苷酸互补。在一些实施方案中，与靶核酸的连续核苷酸部分相比，寡核苷酸可包含1、2或3个碱基错配。在一些实施方案中，寡核苷酸在15个碱基上可具有至多3个错配，或在10个碱基上具有至多2个错配。
在一些实施方案中，寡核苷酸与本文中所述的任一种寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)的靶序列互补(例如，至少85％、至少90％、至少95％或100％互补)。在一些实施方案中，寡核苷酸与由SEQ ID NO:437至1241提供的任一种寡核苷酸的靶序列互补(例如，至少85％、至少90％、至少95％或100％互补)。在一些实施方案中，这样的靶序列与表14中列出的寡核苷酸100％互补。在一些实施方案中，这样的靶序列与由SEQ ID NO:437至1241提供的寡核苷酸100％互补。在一些实施方案中，寡核苷酸与本文中提供的靶序列(例如，表14中列出的任一种寡核苷酸的靶序列)互补(例如，至少85％、至少90％、至少95％或100％互补)。在一些实施方案中，寡核苷酸与由SEQ ID NO:1242至2046提供的任一种寡核苷酸的靶序列互补(例如，至少85％、至少90％、至少95％或100％互补)。
在一些实施方案中，本文中提供的任一种寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)中的任意一个或更多个胸腺嘧啶碱基(T)可任选地是尿嘧啶碱基(U)，和/或本文中提供的寡核苷酸中的任意一个或更多个U可任选地是T。在一些实施方案中，由SEQ ID NO:437至1241提供的任一种寡核苷酸中或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸中的任意一个或更多个胸腺嘧啶碱基(T)可任选地是尿嘧啶碱基(U)，和/或寡核苷酸中的任意一个或更多个U可任选地是T。
b.寡核苷酸修饰：
本文中所述的寡核苷酸可被修饰，例如，包含经修饰糖部分、经修饰核苷间键联、经修饰核苷酸和/或(例如，和)其组合。另外，在一些实施方案中，寡核苷酸可表现出以下特性中的一种或更多种：不介导选择性剪接；不是免疫刺激性的；具有核酸酶抗性；与未经修饰寡核苷酸相比具有提高的细胞摄取；对细胞或哺乳动物无毒；提高了在细胞中内部排出内体；使TLR刺激最小化；或避免模式识别受体。本文中所述的寡核苷酸的任何经修饰的化学组成(chemistry)或形式可彼此组合。例如，同一寡核苷酸内可包含一种、两种、三种、四种、五种或更多种不同类型的修饰。
在一些实施方案中，可使用某些核苷酸修饰，所述核苷酸修饰使并入它们的寡核苷酸比天然寡脱氧核苷酸或寡核糖核苷酸分子对核酸酶消化更具抗性；这些经修饰寡核苷酸比未经修饰寡核苷酸完整存活更长的时间。经修饰寡核苷酸的一些具体实例包括含有经修饰的主链(backbone)的那些，例如经修饰核苷间键联，例如硫代磷酸酯键联、磷酸三酯键联、甲基膦酸酯键联、短链烷基键联或环烷基糖间键联或短链杂原子键联或杂环糖间键联。因此，本公开内容的寡核苷酸可例如通过并入修饰例如核苷酸修饰而稳定化以抵抗溶核降解。
在一些实施方案中，寡核苷酸的长度可以是多至50个或多至100个核苷酸，其中寡核苷酸的2至10、2至15、2至16、2至17、2至18、2至19、2至20、2至25、2至30、2至40、2至45或更多个核苷酸是经修饰核苷酸。寡核苷酸的长度可以是8至30个核苷酸，其中寡核苷酸的2至10、2至15、2至16、2至17、2至18、2至19、2至20、2至25、2至30个核苷酸是经修饰核苷酸。寡核苷酸的长度可以是8至15个核苷酸，其中寡核苷酸的2至4、2至5、2至6、2至7、2至8、2至9、2至10、2至11、2至12、2至13、2至14个核苷酸是经修饰核苷酸。任选地，寡核苷酸可具有除1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个经修饰核苷酸之外的每个核苷酸。寡核苷酸修饰在本文中进一步描述。
c.经修饰核苷
在一些实施方案中，本文中所述的寡核苷酸包含在糖的2’位置处经修饰的至少一个核苷。在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个2’-经修饰核苷。在一些实施方案中，寡核苷酸中的所有核苷均是2’-经修饰核苷。
在一些实施方案中，本文中所述的寡核苷酸包含一个或更多个非双环2’-经修饰核苷，例如2’-脱氧、2’-氟(2’-F)、2’-O-甲基(2’-O-Me)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、2’-O-二甲基氨基乙基氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)修饰的核苷。
在一些实施方案中，本文中所述的寡核苷酸包含一个或更多个2’-4’双环核苷，其中核糖环包含连接环中的两个原子的桥联部分，例如，通过亚甲基(LNA)桥联、亚乙基(ENA)桥联或(S)-约束性乙基(cEt)桥联将2’-O原子与4’-C原子连接。LNA的一些实例描述于国际专利申请公开WO/2008/043753中，其于2008年4月17日公开，并且标题为“RNA AntagonistCompounds For The Modulation OfPCSK9”，其内容通过引用整体并入本文。ENA的一些实例在以下中提供：国际专利公开No.WO 2005/042777，其于2005年5月12日公开，并且标题为“APP/ENA Antisense”；Morita et al.,Nucleic Acid Res.,增刊1:241-242,2001；Suronoet al.,Hum.Gene Ther.,15:749-757,2004；Koizumi,Curr.Opin.Mol.Ther.,8:144-149,2006以及Horie et al.,Nucleic Acids Symp.Ser(Oxf),49:171-172,2005；其公开内容通过引用整体并入本文。cEt的一些实例在以下中提供：美国专利7,101,993、7,399,845和7,569,686，其各自通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含在以下美国专利或专利申请公开之一中公开的经修饰核苷：美国专利7,399,845，其于2008年7月15日授权，并且标题为“6-ModifiedBicyclic Nucleic Acid Analogs”；美国专利7,741,457，其于2010年6月22日授权，并且标题为“6-Modified Bicyclic Nucleic Acid Analogs”；美国专利8,022,193，其于2011年9月20日授权，并且标题为“6-Modified Bicyclic Nucleic Acid Analogs”；美国专利7,569,686，其于2009年8月4日授权，并且标题为“Compounds And Methods For SynthesisOfBicyclic Nucleic Acid Analogs”；美国专利7,335,765，其于2008年2月26日授权，并且标题为“Novel Nucleoside And Oligonucleotide Analogues”；美国专利7,314,923，其于2008年1月1日授权，并且标题为“Novel Nucleoside And Oligonucleotide Analogues”；美国专利7,816,333，其于2010年10月19日授权，并且标题为“Oligonucleotide AnaloguesAnd Methods Utilizing The Same”和美国公开号2011/0009471，现在为美国专利8,957,201，其于2015年2月17日授权，并且标题为“Oligonucleotide Analogues And MethodsUtilizing The Same”，其各自的全部内容出于所有目的通过引用并入本文。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个经修饰核苷，其导致所述寡核苷酸与不具有至少一个经修饰核苷的寡核苷酸相比，Tm提高1℃、2℃、3℃、4℃或5℃。寡核苷酸可具有多个经修饰核苷，其导致所述寡核苷酸与不具有经修饰核苷的寡核苷酸相比，Tm总体提高2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃或更高。
寡核苷酸可包含不同种类的核苷的混合物。例如，寡核苷酸可包含2’-脱氧核糖核苷或核糖核苷和2’-氟修饰核苷的混合物。寡核苷酸可包含脱氧核糖核苷或核糖核苷和2’-O-Me修饰核苷的混合物。寡核苷酸可包含2’-氟修饰核苷和2’-O-Me修饰核苷的混合物。寡核苷酸可包含2’-4’双环核苷和2’-MOE、2’-氟或2’-O-Me修饰核苷的混合物。寡核苷酸可包含非双环2’-经修饰核苷(例如，2’-MOE、2’-氟或2’-O-Me)和2’-4’双环核苷(例如，LNA、ENA、cEt)的混合物。
寡核苷酸可包含不同种类的替代核苷。例如，寡核苷酸可包含替代的2’-脱氧核糖核苷或核糖核苷和2’-氟修饰核苷。寡核苷酸可包含替代的脱氧核糖核苷或核糖核苷和2’-O-Me修饰核苷。寡核苷酸可包含替代的2’-氟修饰核苷和2’-O-Me修饰核苷。寡核苷酸可包含替代的2’-4’双环核苷和2’-MOE、2’-氟或2’-O-Me修饰核苷。寡核苷酸可包含替代的非双环2’-经修饰核苷(例如，2’-MOE、2’-氟或2’-O-Me)和2’-4’双环核苷(例如，LNA、ENA、cEt)。
在一些实施方案中，本文中所述的寡核苷酸包含5’-乙烯基膦酸酯修饰、一个或更多个无碱基残基和/或一个或更多个倒置无碱基残基。
d.核苷间键联/主链
在一些实施方案中，寡核苷酸可包含硫代磷酸酯键联或其他经修饰核苷间键联。在一些实施方案中，寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷间键联。在一些实施方案中，寡核苷酸在至少两个核苷酸之间包含硫代磷酸酯核苷间键联。在一些实施方案中，寡核苷酸在所有核苷酸之间均包含硫代磷酸酯核苷间键联。例如，在一些实施方案中，寡核苷酸在核苷酸序列的5’或3’末端的第一、第二和/或(例如，和)第三核苷间键联处包含经修饰核苷间键联。
可使用的含磷的键联包括但不限于：硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基膦酸酯和包含3’亚烷基膦酸酯的其他烷基膦酸酯、以及手性膦酸酯、次膦酸酯、包含3’-氨基磷酰胺酯和氨基烷基磷酰胺酯的磷酰胺酯、硫羰基磷酰胺酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯和具有正常3’-5’键联的硼烷磷酸酯、这些的2’-5’连接类似物、以及其中相邻的核苷单元对连接在3’-5’到5’-3’或2’-5’到5’-2’的具有相反极性的那些；参见美国专利no.3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；和5,625,050。
在一些实施方案中，寡核苷酸可具有杂原子主链，例如亚甲基(甲基亚氨基)或MMI主链；酰胺主链(参见De Mesmaeker et al.Ace.Chem.Res.1995,28:366-374)；吗啉代主链(参见Summerton and Weller，美国专利No.5,034,506)；或肽核酸(peptide nucleicacid，PNA)主链(其中寡核苷酸的磷酸二酯主链被聚酰胺主链替换，核苷酸与聚酰胺主链的氮杂氮原子直接或间接结合，参见Nielsen et al.,Science1991,254,1497)。
e.立体特异性寡核苷酸
在一些实施方案中，寡核苷酸的核苷酸间磷原子是手性的，并且基于手性磷原子的构型调节寡核苷酸的特性。在一些实施方案中，可使用适当方法来以立体控制的方式合成P-手性寡核苷酸类似物(例如，如Oka N,Wada T,Stereocontrolled synthesis ofoligonucleotide analogs containing chiral internucleotidic phosphorusatoms.Chem Soc Rev.2011Dec；40(12):5829-43中所述)。在一些实施方案中，提供了含硫代磷酸酯的寡核苷酸，其包含通过基本上所有的Sp或基本上所有的Rp硫代磷酸酯糖间键联连接在一起的核苷单元。在一些实施方案中，具有基本上手性纯糖间键联的这样的硫代磷酸酯寡核苷酸通过酶或化学合成制备，如例如于1996年12月12日授权的美国专利5,587,261中所述，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸提供了靶核酸的选择性切割模式。例如，在一些实施方案中，手性控制的寡核苷酸在核酸的互补序列内提供了单个位点切割，如例如美国专利申请公开20170037399A1中所述，其于2017年2月2日公开，标题为“CHIRALDESIGN”，其内容通过引用整体并入本文。
f.吗啉代
在一些实施方案中，寡核苷酸可以是基于吗啉代的化合物。基于吗啉代的寡聚化合物描述于Dwaine A.Braasch and David R.Corey,Biochemistry,2002,41(14),4503-4510)；Genesis,volume 30,issue 3,2001；Heasman,J.,Dev.Biol.,2002,243,209-214；Nasevicius et al.,Nat.Genet.,2000,26,216-220；Lacerra et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,2000,97,9591-9596；和1991年7月23日授权的美国专利No.5,034,506。在一些实施方案中，基于吗啉代的寡聚化合物是磷酸二酰胺吗啉代寡聚物(phosphorodiamidate morpholino oligomer，PMO)(例如，如Iverson,Curr.Opin.Mol.Ther.,3:235-238,2001；和Wang et al.,J.Gene Med.,12:354-364,2010中所述；其公开内容通过引用整体并入本文)。
g.肽核酸(PNA)
在一些实施方案中，寡核苷酸的核苷酸单元的糖和核苷间键联(主链)二者均被新的基团替换。在一些实施方案中，碱基单元被维持以用于与适当的核酸靶化合物杂交。一种这样的寡聚化合物(已显示具有优异的杂交特性的寡核苷酸模拟物)被称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖-主链被含酰胺的主链(例如，氨基乙基甘氨酸主链)替换。核碱基被保留并且与主链酰胺部分的氮杂氮原子直接或间接结合。报道制备PNA化合物的代表性出版物包括但不限于美国专利no.5,539,082；5,714,331；和5,719,262，其各自通过引用并入本文。PNA化合物的进一步教导可在Nielsen et al.,Science,1991,254,1497-1500中发现。
h.间隔聚体
在一些实施方案中，本文中所述的寡核苷酸是间隔聚体。间隔聚体寡核苷酸通常具有式5’-X-Y-Z-3’，其中X和Z作为围绕间隔区Y的侧翼区。在一些实施方案中，式5’-X-Y-Z-3’的侧翼区X也称为X区、侧翼序列X、5’翼区X或5’翼区段。在一些实施方案中，式5’-X-Y-Z-3’的侧翼区Z也称为Z区、侧翼序列Z、3’翼区Z或3’翼区段。在一些实施方案中，式5’-X-Y-Z-3’的间隔区Y也称为Y区、Y区段或间隔区段Y。在一些实施方案中，间隔区Y中的每个核苷是2’-脱氧核糖核苷，并且5’翼区X或3’翼区Z均不包含任何2’-脱氧核糖核苷。
在一些实施方案中，Y区是核苷酸的连续延伸，例如，6个或更多个DNA核苷酸的区域，其能够募集RNA酶(例如RNA酶H)。在一些实施方案中，间隔聚体与靶核酸结合，在该点处RNA酶被募集并随后可切割靶核酸。在一些实施方案中，Y区5’和3’二者的侧翼是包含高亲和力经修饰核苷，例如1至6个高亲和力经修饰核苷的X和Z区。高亲和力经修饰核苷的一些实例包括但不限于2’-经修饰核苷(例如，2’-MOE、2’O-Me、2’-F)或2’-4’双环核苷(例如，LNA、cEt、ENA)。在一些实施方案中，侧翼序列X和Z的长度可以是1至20个核苷酸、1至8个核苷酸或1至5个核苷酸。侧翼序列X和Z可具有相似长度或不同长度。在一些实施方案中，间隔区段Y可以是长度为5至20个核苷酸、5至15个十二个核苷酸或6至10个核苷酸的核苷酸序列。
在一些实施方案中，除DNA核苷酸之外，间隔聚体寡核苷酸的间隔区可包含已知可被接受用于高效的RNA酶H作用的经修饰核苷酸，例如C4’-取代的核苷酸、无环核苷酸和阿拉伯糖(arabino)构型的核苷酸。在一些实施方案中，间隔区包含一个或更多个未经修饰的核苷间。在一些实施方案中，一个或两个侧翼区在至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或更多个核苷酸之间各自独立地包含一个或更多个硫代磷酸酯核苷间键联(例如，硫代磷酸酯核苷间键联或其他键联)。在一些实施方案中，间隔区和两个侧翼区在至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或更多个核苷酸之间各自独立地包含经修饰核苷间键联(例如，硫代磷酸酯核苷间键联或其他键联)。
可使用适当的方法产生间隔聚体。教导制备间隔聚体的代表性美国专利、美国专利出版物和PCT出版物包括但不限于：美国专利No.5,013,830；5,149,797；5,220,007；5,256,775；5,366,878；5,403,711；5,491,133；5,565,350；5,623,065；5,652,355；5,652,356；5,700,922；5,898,031；7,015,315；7,101,993；7,399,845；7,432,250；7,569,686；7,683,036；7,750,131；8,580,756；9,045,754；9,428,534；9,695,418；10,017,764；10,260,069；9,428,534；8,580,756；
美国专利公开No.US20050074801、US20090221685、US20090286969、US20100197762和US20110112170；PCT公开No.WO2004069991、WO2005023825、WO2008049085和WO2009090182；以及EP专利No.EP2,149,605，其各自通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，间隔聚体的长度为10至40个核苷。例如，间隔聚体的长度可以是10至40、10至35、10至30、10至25、10至20、10至15、15至40、15至35、15至30、15至25、15至20、20至40、20至35、20至30、20至25、25至40、25至35、25至30、30至40、30至35或35至40个核苷。在一些实施方案中，间隔聚体的长度是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷。
在一些实施方案中，间隔聚体中的间隔区Y的长度为5至20个核苷。例如，间隔区Y的长度可以是5至20、5至15、5至10、10至20、10至15或15至20个核苷。在一些实施方案中，间隔区Y的长度是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷。在一些实施方案中，间隔区Y中的每个核苷是2’-脱氧核糖核苷。在一些实施方案中，间隔区Y中的所有核苷均是2’-脱氧核糖核苷。在一些实施方案中，间隔区Y中的一个或更多个核苷是经修饰核苷(例如，2’经修饰核苷，例如本文中所述的那些)。在一些实施方案中，间隔区Y中的一个或更多个胞嘧啶任选地是5-甲基-胞嘧啶。在一些实施方案中，间隔区Y中的每个胞嘧啶是5-甲基-胞嘧啶。
在一些实施方案中，间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)和间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)独立地为1至20个核苷长。例如，间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)和间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)可独立地为1至20、1至15、1至10、1至7、1至5、1至3、1至2、2至5、2至7、3至5、3至7、5至20、5至15、5至10、10至20、10至15或15至20个核苷长。在一些实施方案中，间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)和间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷长。在一些实施方案中，间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)和间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)的长度相同。在一些实施方案中，间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)和间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)的长度不同。在一些实施方案中，间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)比间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)长。在一些实施方案中，间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)比间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)短。
在一些实施方案中，间隔聚体包含以下的5’-X-Y-Z-3’：5-10-5，4-12-4，3-14-3，2-16-2，1-18-1，3-10-3，2-10-2，1-10-1，2-8-2，4-6-4，3-6-3，2-6-2，4-7-4,3-7-3，2-7-2，4-8-4，3-8-3，2-8-2，1-8-1，2-9-2，1-9-1，2-10-2，1-10-1，1-12-1，1-16-1，2-15-1，1-15-2，1-14-3，3-14-1，2-14-2，1-13-4,4-13-1，2-13-3，3-13-2，1-12-5，5-12-1，2-12-4，4-12-2，3-12-3，1-11-6,6-11-1，2-11-5，5-11-2，3-11-4，4-11-3，1-17-1，2-16-1，1-16-2，1-15-3，3-15-1，2-15-2，1-14-4，4-14-1，2-14-3，3-14-2，1-13-5，5-13-1，2-13-4，4-13-2，3-13-3，1-12-6,6-12-1，2-12-5，5-12-2，3-12-4，4-12-3，1-11-7,7-11-1，2-11-6，6-11-2,3-11-5，5-11-3，4-11-4，1-18-1，1-17-2，2-17-1，1-16-3，1-16-3，2-16-2，1-15-4，4-15-1，2-15-3，3-15-2，1-14-5，5-14-1，2-14-4，4-14-2，3-14-3，1-13-6，6-13-1，2-13-5，5-13-2，3-13-4,4-13-3，1-12-7,7-12-1，2-12-6,6-12-2，3-12-5，5-12-3，1-11-8，8-11-1，2-11-7,7-11-2，3-11-6,6-11-3，4-11-5，5-11-4，1-18-1，1-17-2，2-17-1，1-16-3，3-16-1，2-16-2，1-15-4，4-15-1，2-15-3，3-15-2，1-14-5，2-14-4,4-14-2,3-14-3，1-13-6，6-13-1，2-13-5，5-13-2，3-13-4，4-13-3，1-12-7，7-12-1，2-12-6，6-12-2,3-12-5，5-12-3，1-11-8，8-11-1，2-11-7，7-11-2，3-11-6,6-11-3，4-11-5，5-11-4，1-19-1，1-18-2,2-18-1，1-17-3，3-17-1，2-17-2，1-16-4，4-16-1，2-16-3，3-16-2，1-15-5，2-15-4,4-15-2,3-15-3，1-14-6，6-14-1，2-14-5，5-14-2，3-14-4，4-14-3，1-13-7，7-13-1，2-13-6,6-13-2,3-13-5，5-13-3,4-13-4，1-12-8，8-12-1，2-12-7，7-12-2，3-12-6,6-12-3，4-12-5，5-12-4，2-11-8，8-11-2，3-11-7，7-11-3，4-11-6，6-11-4，5-11-5，1-20-1，1-19-2，2-19-1，1-18-3，3-18-1，2-18-2，1-17-4，4-17-1，2-17-3，3-17-2，1-16-5，2-16-4,4-16-2，3-16-3，1-15-6，6-15-1，2-15-5，5-15-2，3-15-4，4-15-3，1-14-7,7-14-1，2-14-6,6-14-2，3-14-5，5-14-3，4-14-4，1-13-8，8-13-1，2-13-7,7-13-2,3-13-6,6-13-3,4-13-5，5-13-4，2-12-8，8-12-2,3-12-7,7-12-3，4-12-6，6-12-4，5-12-5，3-11-8，8-11-3,4-11-7,7-11-4，5-11-6，6-11-5，1-21-1，1-20-2，2-20-1，1-20-3，3-19-1，2-19-2，1-18-4，4-18-1，2-18-3，3-18-2，1-17-5，2-17-4，4-17-2，3-17-3，1-16-6，6-16-1，2-16-5，5-16-2，3-16-4,4-16-3，1-15-7，7-15-1，2-15-6，6-15-2，3-15-5，5-15-3,4-15-4，1-14-8，8-14-1，2-14-7,7-14-2，3-14-6，6-14-3，4-14-5，5-14-4，2-13-8，8-13-2，3-13-7，7-13-3，4-13-6,6-13-4,5-13-5，1-12-10，10-12-1，2-12-9,9-12-2，3-12-8，8-12-3，4-12-7,7-12-4，5-12-6.6-12-5，4-11-8，8-11-4，5-11-7,7-11-5，6-11-6，1-22-1，1-21-2，2-21-1，1-21-3，3-20-1，2-20-2，1-19-4，4-19-1，2-19-3，3-19-2，1-18-5，2-18-4,4-18-2，3-18-3，1-17-6，6-17-1，2-17-5，5-17-2，3-17-4，4-17-3，1-16-7,7-16-1，2-16-6,6-16-2,3-16-5，5-16-3，4-16-4，1-15-8，8-15-1，2-15-7，7-15-2，3-15-6,6-15-3，4-15-5，5-15-4,2-14-8，8-14-2，3-14-7，7-14-3，4-14-6,6-14-4，5-14-5，3-13-8，8-13-3，4-13-7,7-13-4，5-13-6，6-13-5，4-12-8，8-12-4，5-12-7，7-12-5，6-12-6，5-11-8，8-11-5，6-11-7或7-11-6。
数字表示5’-X-Y-Z-3’间隔聚体中X、Y和Z区中的核苷的数目。
在一些实施方案中，间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)或间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)中的一个或更多个核苷是经修饰核苷酸(例如，高亲和力经修饰核苷)。在一些实施方案中，经修饰核苷(例如，高亲和力经修饰核苷)是2’-经修饰核苷。在一些实施方案中，2’-经修饰核苷是2’-4’双环核苷或非双环2’-经修饰核苷。在一些实施方案中，高亲和力经修饰核苷是2’-4’双环核苷(例如，LNA、cEt或ENA)或非双环2’-经修饰核苷(例如2’-氟(2’-F)、2’-O-甲基(2’-O-Me)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、2’-O-二甲基氨基乙基氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA))。
在一些实施方案中，间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)中的一个或更多个核苷是高亲和力经修饰核苷。在一些实施方案中，间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)中的每个核苷是高亲和力经修饰核苷。在一些实施方案中，间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)中的一个或更多个核苷是高亲和力经修饰核苷。在一些实施方案中，间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)中的每个核苷是高亲和力经修饰核苷。在一些实施方案中，间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)中的一个或更多个核苷是高亲和力经修饰核苷，并且间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)中的一个或更多个核苷是高亲和力经修饰核苷。在一些实施方案中，间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)中的每个核苷是高亲和力经修饰核苷，并且间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)中的每个核苷是高亲和力经修饰核苷。
在一些实施方案中，间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)包含与间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)相同的高亲和力核苷。例如，间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)和间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)可包含一个或更多个非双环2’-经修饰核苷(例如，2’-MOE或2’-O-Me)。在另一个实例中，间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)和间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)可包含一个或更多个2’-4’双环核苷(例如，LNA或cEt)。在一些实施方案中，间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)和间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)中的每个核苷是非双环2’-经修饰核苷(例如，2’-MOE或2’-O-Me)。在一些实施方案中，间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)和间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)中的每个核苷是2’-4’双环核苷(例如，LNA或cEt)。
在一些实施方案中，间隔聚体包含5’-X-Y-Z-3’构型，其中X和Z的长度独立地为1至7个(例如，1、2、3、4、5、6或7个)核苷，并且Y的长度为6至10个(例如，6、7、8、9或10个)核苷，其中X和Z中的每个核苷是非双环2’-经修饰核苷(例如，2’-MOE或2’-O-Me)，并且Y中的每个核苷是2’-脱氧核糖核苷。在一些实施方案中，间隔聚体包含5’-X-Y-Z-3’构型，其中X和Z的长度独立地为1至7个(例如，1、2、3、4、5、6或7个)核苷，并且Y的长度为6至10个(例如，6、7、8、9或10个)核苷，其中X和Z中的每个核苷是2’-4’双环核苷(例如，LNA或cEt)，并且Y中的每个核苷是2’-脱氧核糖核苷。在一些实施方案中，间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)包含与间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)不同的高亲和力核苷。例如，间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)可包含一个或更多个非双环2’-经修饰核苷(例如，2’-MOE或2’-O-Me)，并且间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)可包含一个或更多个2’-4’双环核苷(例如，LNA或cEt)。在另一个实例中，间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)可包含一个或更多个非双环2’-经修饰核苷(例如，2’-MOE或2’-O-Me)，并且间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)可包含一个或更多个2’-4’双环核苷(例如，LNA或cEt)。
在一些实施方案中，间隔聚体包含5’-X-Y-Z-3’构型，其中X和Z的长度独立地为1至7个(例如，1、2、3、4、5、6或7个)核苷，并且Y的长度为6至10个(例如，6、7、8、9或10个)核苷，其中X中的每个核苷是非双环2’-经修饰核苷(例如，2’-MOE或2’-O-Me)，Z中的每个核苷是2’-4’双环核苷(例如，LNA或cEt)，并且Y中的每个核苷是2’-脱氧核糖核苷。在一些实施方案中，间隔聚体包含5’-X-Y-Z-3’构型，其中X和Z的长度独立地为1至7个(例如，1、2、3、4、5、6或7个)核苷，并且Y的长度为6至10个(例如，6、7、8、9或10个)核苷，其中X中的每个核苷是2’-4’双环核苷(例如，LNA或cEt)，Z中的每个核苷是非双环2’-经修饰核苷(例如，2’-MOE或2’-O-Me)，并且Y中的每个核苷是2’-脱氧核糖核苷。
在一些实施方案中，间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)包含一个或更多个非双环2’-经修饰核苷(例如，2’-MOE或2’-O-Me)和一个或更多个2’-4’双环核苷(例如，LNA或cEt)。在一些实施方案中，间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)包含一个或更多个非双环2’-经修饰核苷(例如，2’-MOE或2’-O-Me)和一个或更多个2’-4’双环核苷(例如，LNA或cEt)。在一些实施方案中，间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)和间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)二者均包含一个或更多个非双环2’-经修饰核苷(例如，2’-MOE或2’-O-Me)和一个或更多个2’-4’双环核苷(例如，LNA或cEt)。
在一些实施方案中，间隔聚体包含5’-X-Y-Z-3’构型，其中X和Z的长度独立地为2至7个(例如，2、3、4、5、6或7个)核苷，并且Y的长度为6至10个(例如，6、7、8、9或10个)核苷，其中X中第1、2、3、4、5、6或7位(最5’的位置是第1位)中的至少一个但不是全部(例如，1、2、3、4、5或6个)是非双环2’-经修饰核苷(例如，2’-MOE或2’-O-Me)，其中X和Z二者中的剩余核苷是2’-4’双环核苷(例如，LNA或cEt)，并且其中Y中的每个核苷是2’脱氧核糖核苷。在一些实施方案中，间隔聚体包含5’-X-Y-Z-3’构型，其中X和Z的长度独立地为2至7个(例如，2、3、4、5、6或7个)核苷，并且Y的长度为6至10个(例如，6、7、8、9或10个)核苷，其中Z中第1、2、3、4、5、6或7位(最5’的位置是第1位)中的至少一个但不是全部(例如，1、2、3、4、5或6个)是非双环2’-经修饰核苷(例如，2’-MOE或2’-O-Me)，其中X和Z二者中的剩余核苷是2’-4’双环核苷(例如，LNA或cEt)，并且其中Y中的每个核苷是2’脱氧核糖核苷。在一些实施方案中，间隔聚体包含5’-X-Y-Z-3’构型，其中X和Z的长度独立地为2至7个(例如，2、3、4、5、6或7个)核苷，并且Y的长度为6至10个(例如，6、7、8、9或10个)核苷，其中X中第1、2、3、4、5、6或7位中的至少一个但不是全部(例如，1、2、3、4、5或6个)和Z中第1、2、3、4、5、6或7位(最5’的位置是第1位)中的至少一个位置但不是全部(例如，1、2、3、4、5或6个)是非双环2’-经修饰核苷(例如，2’-MOE或2’-O-Me)，其中X和Z二者中的剩余核苷是2’-4’双环核苷(例如，LNA或cEt)，并且其中Y中的每个核苷是2’脱氧核糖核苷。
在间隔聚体的5’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的X)和/或间隔聚体的3’翼区(5’-X-Y-Z-3’式中的Z)中具有非双环2’-经修饰核苷(例如，2’-MOE或2’-O-Me)和2’-4’双环核苷(例如，LNA或cEt)的混合物的间隔聚体构型的一些非限制性实例包括：BBB-(D)n-BBBAA；KKK-(D)n-KKKAA；LLL-(D)n-LLLAA；BBB-(D)n-BBBEE；KKK-(D)n-KKKEE；LLL-(D)n-LLLEE；BBB-(D)n-BBBAA；KKK-(D)n-KKKAA；LLL-(D)n-LLLAA；BBB-(D)n-BBBEE；KKK-(D)n-KKKEE；LLL-(D)n-LLLEE；BBB-(D)n-BBBAAA；KKK-(D)n-KKKAAA；LLL-(D)n-LLLAAA；BBB-(D)n-BBBEEE；KKK-(D)n-KKKEEE；LLL-(D)n-LLLEEE；BBB-(D)n-BBBAAA；KKK-(D)n-KKKAAA；LLL-(D)n-LLLAAA；BBB-(D)n-BBBEEE；KKK-(D)n-KKKEEE；LLL-(D)n-LLLEEE；BABA-(D)n-ABAB；KAKA-(D)n-AKAK；LALA-(D)n-ALAL；BEBE-(D)n-EBEB；KEKE-(D)n-EKEK；LELE-(D)n-ELEL；BABA-(D)n-ABAB；KAKA-(D)n-AKAK；LALA-(D)n-ALAL；BEBE-(D)n-EBEB；KEKE-(D)n-EKEK；LELE-(D)n-ELEL；ABAB-(D)n-ABAB；AKAK-(D)n-AKAK；ALAL-(D)n-ALAL；EBEB-(D)n-EBEB；EKEK-(D)n-EKEK；ELEL-(D)n-ELEL；ABAB-(D)n-ABAB；AKAK-(D)n-AKAK；ALAL-(D)n-ALAL；EBEB-(D)n-EBEB；EKEK-(D)n-EKEK；ELEL-(D)n-ELEL；AABB-(D)n-BBAA；BBAA-(D)n-AABB；AAKK-(D)n-KKAA；AALL-(D)n-LLAA；EEBB-(D)n-BBEE；EEKK-(D)n-KKEE；EELL-(D)n-LLEE；AABB-(D)n-BBAA；AAKK-(D)n-KKAA；AALL-(D)n-LLAA；EEBB-(D)n-BBEE；EEKK-(D)n-KKEE；EELL-(D)n-LLEE；BBB-(D)n-BBA；KKK-(D)n-KKA；LLL-(D)n-LLA；BBB-(D)n-BBE；KKK-(D)n-KKE；LLL-(D)n-LLE；BBB-(D)n-BBA；KKK-(D)n-KKA；LLL-(D)n-LLA；BBB-(D)n-BBE；KKK-(D)n-KKE；LLL-(D)n-LLE；BBB-(D)n-BBA；KKK-(D)n-KKA；LLL-(D)n-LLA；BBB-(D)n-BBE；KKK-(D)n-KKE；LLL-(D)n-LLE；ABBB-(D)n-BBBA；AKKK-(D)n-KKKA；ALLL-(D)n-LLLA；EBBB-(D)n-BBBE；EKKK-(D)n-KKKE；ELLL-(D)n-LLLE；ABBB-(D)n-BBBA；AKKK-(D)n-KKKA；ALLL-(D)n-LLLA；EBBB-(D)n-BBBE；EKKK-(D)n-KKKE；ELLL-(D)n-LLLE；ABBB-(D)n-BBBAA；AKKK-(D)n-KKKAA；ALLL-(D)n-LLLAA；EBBB-(D)n-BBBEE；EKKK-(D)n-KKKEE；ELLL-(D)n-LLLEE；ABBB-(D)n-BBBAA；AKKK-(D)n-KKKAA；ALLL-(D)n-LLLAA；EBBB-(D)n-BBBEE；EKKK-(D)n-KKKEE；ELLL-(D)n-LLLEE；AABBB-(D)n-BBB；AAKKK-(D)n-KKK；AALLL-(D)n-LLL；EEBBB-(D)n-B BB；EEKKK-(D)n-KKK；EELLL-(D)n-LLL；AABBB-(D)n-BBB；AAKKK-(D)n-KKK；AALLL-(D)n-LLL；EEBBB-(D)n-BBB；EEKKK-(D)n-KKK；EELLL-(D)n-LLL；AABBB-(D)n-BBBA；AAKKK-(D)n-KKKA；AALLL-(D)n-LLLA；EEBBB-(D)n-BBBE；EEKKK-(D)n-KKKE；EELLL-(D)n-LLLE；AABBB-(D)n-BBBA；AAKKK-(D)n-KKKA；AALLL-(D)n-LLLA；EEBBB-(D)n-BBBE；EEKKK-(D)n-KKKE；EELLL-(D)n-LLLE；ABBAABB-(D)n-BB；AKKAAKK-(D)n-KK；ALLAALLL-(D)n-LL；EBBEEBB-（D)n-BB；EKKEEKK-(D)n-KK；ELLEELL-(D)n-LL；ABBAABB-(D)n-BB；AKKAAKK-(D)n-KK；ALLAALL-(D)n-LL；EBBEEBB-(D)n-BB；EKKEEKK-(D)n-KK；ELLEELL-(D)n-LL；ABBABB-(D)n-BBB；AKKAKK-(D)n-KKK；ALLALLL-(D)n-LLL；EBBEBB-(D)n-BBB；EKKEKK-(D)n-KKK；ELLELL-(D)n-LLL；ABBABB-(D)n-BBB；AKKAKK-(D)n-KKK；ALLALL-(D)n-LLL；EBBEBB-(D)n-BBB；EKKEKK-(D)n-KKK；ELLELL-(D)n-LLL；EEEK-(D)n-EEEEEEEE；EEK-(D)n-EEEEEEEEE；EK-(D)n-EEEEEEEEEE；EK-(D)n-EEEKK；K-(D)n-EEEKEKE；K-(D)n-EEEKEKEE；K-(D)n-EEKEK；EK-(D)n-EEEEKEKE；EK-(D)n-EEEKEK；EEK-(D)n-KEEKE；EK-(D)n-EEKEKvEK-(D)n-KEEK；EEK-(D)n-EEEKEK；EK-(D)n-KEEEKEE；EK-(D)n-EEKEKE；EK-(D)n-EEEKEKE；和EK-(D)n-EEEEKEK,
“A”核苷包含2’-经修饰核苷；“B”表示2’-4’双环核苷；“K”表示约束性乙基核苷(cEt)；“L”表示LNA核苷；以及“E”表示2’-MOE修饰的核糖核苷；“D”表示2’-脱氧核糖核苷；“n”表示间隔区段(5’-X-Y-Z-3’构型中的Y)的长度并且是1至20的整数。
在一些实施方案中，本文中所述的任一种间隔聚体在X、Y和Z区的每一个中包含一个或更多个经修饰核苷键联(例如，硫代磷酸酯键联)。在一些实施方案中，本文中所述的任一种间隔聚体中的每个核苷间键联是硫代磷酸酯键联。在一些实施方案中，X、Y和Z区各自独立地包含硫代磷酸酯键联和磷酸二酯键联的混合物。在一些实施方案中，间隔区Y中的每个核苷间键联是硫代磷酸酯键联，5’翼区X包含硫代磷酸酯键联和磷酸二酯键联的混合物，并且3’翼区Z包含硫代磷酸酯键联和磷酸二酯键联的混合物。
i.混合聚体
在一些实施方案中，本文中所述的寡核苷酸可以是混合聚体或者包含混合聚体序列模式。通常来说，混合聚体是包含天然和非天然存在的核苷二者的寡核苷酸或者通常以替代模式包含两种不同类型的非天然存在的核苷的寡核苷酸。混合聚体通常比未经修饰寡核苷酸具有更高的结合亲和力，并且可用于特异性结合靶分子，例如，来阻断靶分子上的结合位点。通常来说，混合聚体不向靶分子募集RNA酶并且因此不促进靶分子的切割。已描述了不能募集RNA酶H的这样的寡核苷酸，例如，参见WO2007/112754或WO2007/112753。
在一些实施方案中，混合聚体包含以下或者由以下组成：重复模式的核苷类似物和天然存在的核苷、或者一种类型的核苷类似物和第二种类型的核苷类似物。然而，混合聚体不需要包含重复模式，并且可替代地包含经修饰核苷和天然存在的核苷的任何排列，或者一种类型的经修饰核苷和第二种类型的经修饰核苷的任何排列。重复模式可以是例如每第二个或每第三个核苷是经修饰核苷(例如LNA)，并且剩余核苷是天然存在的核苷，例如DNA，或是2’经取代的核苷类似物，例如2’MOE或2’氟类似物，或者本文中所述的任何其他经修饰核苷。公认的是，经修饰核苷的重复模式，例如LNA单元，可在固定位置例如在5’或3’末端与经修饰核苷组合。
在一些实施方案中，混合聚体不包含多于5个、多于4个、多于3个或多于2个连续的天然存在的核苷(例如DNA核苷)的区域。在一些实施方案中，混合聚体包含至少一个由至少两个连续的经修饰核苷，例如至少两个连续的LNA组成的区域。在一些实施方案中，混合聚体包含至少一个由至少三个连续的经修饰核苷单元，例如至少三个连续的LNA组成的区域。
在一些实施方案中，混合聚体不包含多于7个、多于6个、多于5个、多于4个、多于3个或多于2个连续的核苷类似物例如LNA的区域。在一些实施方案中，LNA单元可被其他核苷类似物例如本文中提及的那些替换。
混合聚体可被设计为包含亲和力增强的经修饰核苷(例如在非限制性实例中LNA核苷和2’-O-Me核苷)的混合物。在一些实施方案中，混合聚体在至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或更多个核苷之间包含经修饰核苷间键联(例如，硫代磷酸酯核苷间键联或其他键联)。
可使用任何合适的方法产生混合聚体。教导制备混合聚体的代表性美国专利、美国专利出版物和PCT出版物包括美国专利公开No.US20060128646、US20090209748、US20090298916、US20110077288和US20120322851以及美国专利No.7687617。
在一些实施方案中，混合聚体包含一个或更多个吗啉代核苷。例如，在一些实施方案中，混合聚体可包含与一个或更多个其他核苷(例如，DNA、RNA核苷)或经修饰核苷(例如，LNA、2’-O-Me核苷)混合(例如，以交替方式混合)的吗啉代核苷。
在一些实施方案中，混合聚体可用于剪接校正或外显子跳读，例如，如以下中报道的：Touznik A.，et al.，LNA/DNA mixmer-based antisense oligonucleotides correctalternative splicing of the SMN2 gene and restore SMN protein expression intype 1 SMA fibroblasts Scientific Reports，第7卷，Article number：3672(2017)，Chen S.et al.，Synthesis of a Morpholino Nucleic Acid(MNA)-UridinePhosphoramidite，and Exon Skipping Using MNA/2′-O-Methyl Mixmer AntisenseOligonucleotide，Molecules 2016，21，1582，其各自的内容通过引用并入本文。
j.RNA干扰(RNAi)
在一些实施方案中，本文中提供的寡核苷酸可以是小干扰RNA(smallinterfering RNA，siRNA，也称为短干扰RNA或沉默RNA)的形式。siRNA是一类双链RNA分子，通常长度为约20至25个碱基对，其通过细胞中的RNA干扰(RNAi)途径靶向核酸(例如，mRNA)用于降解。siRNA分子的特异性可通过分子反义链与其靶RNA的结合来确定。有效的siRNA分子的长度通常少于30至35个碱基对，以防止通过干扰素应答触发细胞中的非特异性RNA干扰途径(尽管更长的siRNA也可能是有效的)。在一些实施方案中，siRNA分子的长度为7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，35，40，45，50，或更多个碱基对。在一些实施方案中，siRNA分子的长度为8至30个碱基对、长度为10至15个碱基对、长度为10至20个碱基对、长度为15至25个碱基对、长度为19至21个碱基对、长度为21至23个碱基对。
在选择适当的靶RNA序列之后，可使用适当的方法设计和制备包含与全部或部分靶序列互补的核苷酸序列(即反义序列)的siRNA分子(参见，例如PCT公开号WO 2004/016735；以及美国专利公开No.2004/0077574和2008/0081791)。siRNA分子可以是双链的(即，包含反义链和杂交以形成dsRNA的互补有义链链的dsRNA分子)或单链的(即，仅包含反义链的ssRNA分子)。siRNA分子可包含具有自身互补的有义链和反义链的双链体(duplex)、不对称双链体、发夹或不对称发夹二级结构。
在一些实施方案中，siRNA分子的反义链的长度为7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，35，40，45，50，或更多个核苷酸。在一些实施方案中，反义链的长度为8至50个核苷酸、长度为8至40个核苷酸、长度为8至30个核苷酸、长度为10至15个核苷酸、长度为10至20个核苷酸、长度为15至25个核苷酸、长度为19至21个核苷酸、长度为21至23个核苷酸。
在一些实施方案中，siRNA分子的有义链的长度为7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，35，40，45，50，或更多个核苷酸。在一些实施方案中，有义链的长度为8至50个核苷酸、长度为8至40个核苷酸、长度为8至30个核苷酸、长度为10至15个核苷酸、长度为10至20个核苷酸、长度为15至25个核苷酸、长度为19至21个核苷酸、长度为21至23个核苷酸。
在一些实施方案中，siRNA分子包含反义链，所述反义链包含靶mRNA中的靶区域之互补区。在一些实施方案中，互补区为与靶mRNA中的靶区域至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补。在一些实施方案中，靶区域是靶mRNA中的连续核苷酸的区域。在一些实施方案中，互补核苷酸序列不需要与其靶标的核苷酸序列100％互补来与靶RNA序列可特异性地杂交或对靶RNA序列具有特异性。
在一些实施方案中，siRNA分子包含反义链，所述反义链包含靶RNA序列之互补区，并且该互补区的长度在8至15、8至30、8至40、或10至50、或5至50、或5至40个核苷酸的范围内。在一些实施方案中，互补区的长度为5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，或50个核苷酸。在一些实施方案中，互补区与靶RNA序列的至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个或更多个连续核苷酸互补。在一些实施方案中，siRNA分子包含与靶RNA序列的连续核苷酸的一部分相比包含不超过1、2、3、4或5个碱基错配的核苷酸序列。在一些实施方案中，siRNA分子包含在15个碱基上具有至多3个错配或在10个碱基上具有至多2个错配的核苷酸序列。
在一些实施方案中，siRNA分子包含反义链，所述反义链包含与本文中提供的寡核苷酸的靶RNA序列互补(例如，至少85％、至少90％、至少95％或100％)的核苷酸序列。在一些实施方案中，siRNA分子包含反义链，所述反义链包含与本文中提供的寡核苷酸具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，siRNA分子包含反义链，所述反义链包含本文中提供的寡核苷酸的至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个或更多个连续核苷酸。
双链siRNA可包含相同长度或不同长度的有义和反义RNA链。双链siRNA分子也可由单个寡核苷酸组装成茎-环结构，其中siRNA分子的自身互补有义和反义区通过以下连接：基于核酸或基于非核酸的接头，以及环状单链RNA，其具有两个或更多个环结构和包含自身互补有义链和反义链的茎，其中环状RNA可在体内或体外加工以产生能够介导RNAi的活性siRNA分子。因此，本文中也考虑了小发夹RNA(small hairpin RNA，shRNA)分子。除通常由间隔区或环序列隔开的反向互补(有义)序列之外，这些分子还包含特定的反义序列。间隔区或环的切割提供了单链RNA分子及其反向互补物，使得它们可进行退火以形成dsRNA分子(任选地，具有可导致从任一或两条链的3’末端和/或(例如，和)5’末端添加或去除一个、两个、三个或更多个核苷酸的另外的加工步骤)。间隔区可具有足够的长度以允许反义和有义序列在切割间隔区(和任选地，可导致从任一或两条链的3’末端和/或(例如，和)5’末端添加或去除一个、两个、三个、四个或更多个核苷酸的后续加工步骤)之前进行退火并形成双链结构(或茎)。间隔区序列可以是位于两个互补核苷酸序列区域之间的不相关核苷酸序列，当退火成双链核酸时其包含shRNA。
siRNA分子的总长度可根据所设计siRNA分子的类型在约14至约100个核苷酸内变化。通常来说，这些核苷酸中的约14至约50个与RNA靶序列互补，即构成siRNA分子的特异性反义序列。例如，当siRNA是双链siRNA或单链siRNA时，长度可在约14至约50个核苷酸内变化，而当siRNA是shRNA或环状分子时，长度可在约40个核苷酸至约100个核苷酸内变化。
siRNA分子可在分子的一个末端包含3’突出端，另一末端可以是平末端或也具有突出端(5’或3’)。当siRNA分子在分子的两个末端均包含突出端时，突出端的长度可相同或不同。在一个实施方案中，本公开内容的siRNA分子在分子的两个末端均包含约1至约3个核苷酸的3’突出端。在一些实施方案中，siRNA分子在有义链上包含约1至约3个核苷酸的3’突出端。在一些实施方案中，siRNA分子在反义链上包含约1至约3个核苷酸的3’突出端。在一些实施方案中，siRNA分子在有义链和反义链二者上均包含约1至约3个核苷酸的3’突出端。
在一些实施方案中，siRNA分子包含一个或更多个经修饰核苷酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)。在一些实施方案中，siRNA分子包含一个或更多个经修饰核苷酸和/或(例如，和)一个或更多个经修饰核苷酸间键联。在一些实施方案中，经修饰核苷酸是经修饰糖部分(例如，2’经修饰核苷酸)。在一些实施方案中，siRNA分子包含一个或更多个2’经修饰核苷酸，例如2’-脱氧、2’-氟(2’-F)、2’-O-甲基(2’-O-Me)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、2’-O-二甲基氨基乙基氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O--N-甲基乙酰胺基(2’-O--NMA)。在一些实施方案中，siRNA分子的每个核苷酸均是经修饰核苷酸(例如，2’-经修饰核苷酸)。在一些实施方案中，siRNA分子包含一个或更多个磷酸二酰胺吗啉代。在一些实施方案中，siRNA分子的每个核苷酸均是磷酸二酰胺吗啉代。
在一些实施方案中，siRNA分子包含硫代磷酸酯键联或其他经修饰核苷酸间键联。在一些实施方案中，siRNA分子包含硫代磷酸酯核苷间键联。在一些实施方案中，siRNA分子在至少两个核苷酸之间包含硫代磷酸酯核苷间键联。在一些实施方案中，siRNA分子在所有核苷酸之间均包含硫代磷酸酯核苷间键联。例如，在一些实施方案中，siRNA分子在siRNA分子的5’或3’末端的第一、第二和/或(例如，和)第三核苷间键联处包含经修饰核苷酸间键联。
在一些实施方案中，经修饰核苷酸间键联是含磷的键联。在一些实施方案中，可使用的含磷的键联包括但不限于：硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基膦酸酯和包含3’亚烷基膦酸酯的其他烷基膦酸酯、以及手性膦酸酯、次膦酸酯、包含3’-氨基磷酰胺酯和氨基烷基磷酰胺酯的磷酰胺酯、硫羰基磷酰胺酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯和具有正常3’-5’键联的硼烷磷酸酯、这些的2’-5’连接类似物、以及其中相邻的核苷单元对连接在3’-5’到5’-3’或2’-5’到5’-2’的具有相反极性的那些；参见美国专利no.3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；和5,625,050。
本文中所述的siRNA分子的任何经修饰化学组成或形式可彼此组合。例如，同一siRNA分子内可包含一种、两种、三种、四种、五种或更多种不同类型的修饰。
在一些实施方案中，反义链包含一个或更多个经修饰核苷酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)。在一些实施方案中，反义链包含一个或更多个经修饰核苷酸和/或(例如，和)一个或更多个经修饰核苷酸间键联。在一些实施方案中，经修饰核苷酸包含经修饰糖部分(例如，2’经修饰核苷酸)。在一些实施方案中，反义链包含一个或更多个2’经修饰核苷酸，例如2’-脱氧、2’-氟(2’-F)、2’-O-甲基(2’-O-Me)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、2’-O-二甲基氨基乙基氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O--N-甲基乙酰胺基(2’-O--NMA)。在一些实施方案中，反义链的每个核苷酸均是经修饰核苷酸(例如，2’-经修饰核苷酸)。在一些实施方案中，反义链包含一个或更多个磷酸二酰胺吗啉代。在一些实施方案中，反义链是磷酸二酰胺吗啉代寡聚物(PMO)。
在一些实施方案中，反义链包含硫代磷酸酯键联或其他经修饰核苷酸间键联。在一些实施方案中，反义链包含硫代磷酸酯核苷间键联。在一些实施方案中，反义链在至少两个核苷酸之间包含硫代磷酸酯核苷间键联。在一些实施方案中，反义链在所有核苷酸之间均包含硫代磷酸酯核苷间键联。例如，在一些实施方案中，反义链在siRNA分子的5’或3’末端的第一、第二和/或(例如，和)第三核苷间键联处包含经修饰核苷酸间键联。在一些实施方案中，经修饰核苷酸间键联是含磷的键联。在一些实施方案中，可使用的含磷的键联包括但不限于：硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基膦酸酯和包含3’亚烷基膦酸酯的其他烷基膦酸酯、以及手性膦酸酯、次膦酸酯、包含3’-氨基磷酰胺酯和氨基烷基磷酰胺酯的磷酰胺酯、硫羰基磷酰胺酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯和具有正常3’-5’键联的硼烷磷酸酯、这些的2’-5’连接类似物、以及其中相邻的核苷单元对连接在3’-5’到5’-3’或2’-5’到5’-2’的具有相反极性的那些；参见美国专利no.3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；和5,625,050。
本文中所述的反义链的任何经修饰化学组成或形式可彼此组合。例如，同一反义链内可包含一种、两种、三种、四种、五种或更多种不同类型的修饰。
在一些实施方案中，有义链包含一个或更多个经修饰核苷酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)。在一些实施方案中，有义链包含一个或更多个经修饰核苷酸和/或(例如，和)一个或更多个经修饰核苷酸间键联。在一些实施方案中，经修饰核苷酸是经修饰糖部分(例如，2’经修饰核苷酸)。在一些实施方案中，有义链包含一个或更多个2’经修饰核苷酸，例如2’-脱氧、2’-氟(2’-F)、2’-O-甲基(2’-O-Me)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、2’-O-二甲基氨基乙基氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O--N-甲基乙酰胺基(2’-O--NMA)。在一些实施方案中，有义链的每个核苷酸均是经修饰核苷酸(例如，2’-经修饰核苷酸)。在一些实施方案中，有义链包含一个或更多个磷酸二酰胺吗啉代。在一些实施方案中，反义链是磷酸二酰胺吗啉代寡聚物(PMO)。在一些实施方案中，有义链包含硫代磷酸酯键联或其他经修饰核苷酸间键联。在一些实施方案中，有义链包含硫代磷酸酯核苷间键联。在一些实施方案中，有义链在至少两个核苷酸之间包含硫代磷酸酯核苷间键联。在一些实施方案中，有义链在所有核苷酸之间均包含硫代磷酸酯核苷间键联。例如，在一些实施方案中，有义链在有义链的5’或3’末端的第一、第二和/或(例如，和)第三核苷间键联处包含经修饰核苷酸间键联。
在一些实施方案中，经修饰核苷酸间键联是含磷的键联。在一些实施方案中，可使用的含磷的键联包括但不限于：硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基膦酸酯和包含3’亚烷基膦酸酯的其他烷基膦酸酯、以及手性膦酸酯、次膦酸酯、包含3’-氨基磷酰胺酯和氨基烷基磷酰胺酯的磷酰胺酯、硫羰基磷酰胺酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯和具有正常3’-5’键联的硼烷磷酸酯、这些的2’-5’连接类似物、以及其中相邻的核苷单元对连接在3’-5’到5’-3’或2’-5’到5’-2’的具有相反极性的那些；参见美国专利no.3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；和5,625,050。
本文中所述的有义链的任何经修饰化学组成或形式可彼此组合。例如，同一有义链内可包含一种、两种、三种、四种、五种或更多种不同类型的修饰。
在一些实施方案中，siRNA分子的反义链或有义链包含增强或降低RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)负载的修饰。在一些实施方案中，siRNA分子的反义链包含增强RISC负载的修饰。在一些实施方案中，siRNA分子的有义链包含降低RISC负载并降低脱靶效应的修饰。在一些实施方案中，siRNA分子的反义链包含2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)修饰。在切割位点添加2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)基团通过促进经修饰链的定向RNA诱导沉默复合物(RISC)负载改善了siRNA的特异性和沉默活性二者，如Song et al.，(2017)Mol Ther Nucleic Acids 9：242-250中所述，其通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，siRNA分子的反义链包含提高RISC负载的2’-OMe-二硫代磷酸酯修饰，如Wu etal.，(2014)Nat Commun 5：3459中所述，其通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，siRNA分子的有义链包含5’-吗啉代，其降低有义链的RISC负载并改善反义链选择和RNAi活性，如Kumar et al.，(2019)Chem Commun(Camb)55(35)：5139-5142中所述，该文献通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，siRNA分子的有义链是用合成的RNA样高亲和力核苷酸类似物锁核酸(LNA)来修饰的，其降低有义链的RISC负载并进一步增强反义链并入到RISC中，如Elman et al.，(2005)Nucleic Acids Res.33(1)：439-447中所述，该文献通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，siRNA分子的有义链包含5’解锁核酸(UNA)修饰，其降低有义链的RISC负载并改善反义链的沉默效力，如Snead etal.,(2013)Mol Ther Nucleic Acids 2(7):e103中所述，该文献通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，siRNA分子的有义链包含5-硝基吲哚修饰，其降低有义链的RNAi效力并降低脱靶效应，如Zhang et al.,(2012)Chembiochem 13(13):1940-1945中所述，该文献通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，有义链包含2’-O’甲基(2’-O-Me)修饰，其降低有义链的RISC负载和脱靶效应，如Zheng et al.,FASEB(2013)27(10):4017-4026中所述，该文献通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，siRNA分子的有义链被吗啉代、2’-MOE或2’-O-Me残基完全替换并且不被RISC识别，如Kole et al.,(2012)Nature reviews.DrugDiscovery11(2):125-140中所述，该文献通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，siRNA分子的反义链包含2’-MOE修饰并且有义链包含2’-O-Me修饰(参见例如Song et al.,(2017)Mol Ther Nucleic Acids 9:242-250)。在一些实施方案中，至少一个(例如，至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个)siRNA分子与肌肉靶向剂(例如，共价)连接。在一些实施方案中，肌肉靶向剂可包含以下或者由以下组成：核酸(例如，DNA或RNA)、肽(例如，抗体)、脂质(例如，微囊泡)或糖部分(例如，多糖)。在一些实施方案中，肌肉靶向剂是抗体。在一些实施方案中，肌肉靶向剂是抗转铁蛋白受体抗体(例如，本文中提供的任一种抗TfR抗体)。在一些实施方案中，肌肉靶向剂可与siRNA分子有义链的5’末端连接。在一些实施方案中，肌肉靶向剂可与siRNA分子有义链的3’末端连接。在一些实施方案中，肌肉靶向剂可与siRNA分子的有义链内部连接。在一些实施方案中，肌肉靶向剂可与siRNA分子反义链的5’末端连接。在一些实施方案中，肌肉靶向剂可与siRNA分子反义链的3’末端连接。在一些实施方案中，肌肉靶向剂可与siRNA分子的反义链内部连接。
k.微RNA(miRNA)
在一些实施方案中，寡核苷酸可以是微RNA(miRNA)。微RNA(称为“miRNA”)是小的非编码RNA，属于通过与靶RNA转录物上的互补位点结合来控制基因表达的一类调节分子。通常来说，miRNA由大的RNA前体(称为初级miRNA(pri-miRNA))产生，所述RNA前体在细胞核中加工成约70个核苷酸的前体miRNA，前体miRNA折叠成不完美的茎-环结构。这些前体miRNA通常在胞质内经历另外的加工步骤，在此长度为18至25个核苷酸的成熟miRNA被RNA酶III酶Dicer从前体miRNA发夹的一侧切离。
本文中使用的miRNA包括初级miRNA、前体miRNA、成熟miRNA或保留成熟miRNA的生物学活性的其变体的片段。在一个实施方案中，miRNA的尺寸范围可以是21个核苷酸至170个核苷酸。在一个实施方案中，miRNA的尺寸范围是长度为70至170个核苷酸。在另一个实施方案中，可使用长度为21至25个核苷酸的成熟miRNA。
l.适配体
在一些实施方案中，本文中提供的寡核苷酸可以是适配体的形式。通常来说，在分子载荷的情况下，适配体是与靶标(例如细胞中的小分子、蛋白质、核酸)特异性结合的任何核酸。在一些实施方案中，适配体是DNA适配体或RNA适配体。在一些实施方案中，核酸适配体是单链DNA或RNA(ssDNA或ssRNA)。应理解，单链核酸适配体可形成螺旋和/或(例如，和)环结构。形成核酸适配体的核酸可包含天然存在的核苷酸、经修饰核苷酸、具有插入在一个或更多个核苷酸之间的烃接头(例如，亚烷基)或聚醚接头(例如，PEG接头)的天然存在的核苷酸、具有插入在一个或更多个核苷酸之间的烃或PEG接头的经修饰核苷酸，或其组合。描述适配体和制备适配体的方法的示例性出版物和专利包括，例如，Lorsch and Szostak，1996；Jayasena，1999；美国专利No.5,270,163；5,567,588；5,650,275；5,670,637；5,683,867；5,696,249；5,789,157；5,843,653；5,864,026；5,989,823；6,569,630；8,318,438和PCT申请WO 99/31275，其各自通过引用并入本文。
m.核酶
在一些实施方案中，本文中提供的寡核苷酸可以是核酶的形式。核酶(核糖核酸酶)是能够进行特定的生化反应，类似于蛋白质酶作用的分子，通常是RNA分子。核酶是具有催化活性的分子，所述催化活性包括在与该核酶杂交的RNA分子(例如，mRNA、含RNA的底物、lncRNA)和核酶本身中的特定磷酸二酯键联处进行切割的能力。
核酶可采用数种物理结构之一，其中之一被称为“锤头状的”。锤头状核酶由包含9个保守碱基的催化核心、双链茎和环结构(茎-环II)以及与靶RNA侧翼区催化核心互补的两个区域构成。通过形成双链茎I和III，侧翼区能够使核酶与靶RNA特异性结合。通过3’，5’-磷酸二酯至2’,3’-环状磷酸二酯的酯交换反应，在特定核糖核苷酸三联体旁以顺式(即，切割包含锤头状基序的同一RNA分子)或以反式(切割除包含核酶的RNA底物之外的RNA底物)发生切割。不希望受理论束缚，认为这种催化活性需要在核酶的催化区域中存在特定的、高度保守的序列。
核酶结构中的修饰还包括用非核苷酸分子替换或替代分子的多个非核心部分。例如，Benseler et al.(J.Am.Chem.Soc.(1993)115:8483-8484)公开了锤头状样分子，其中茎II的两个碱基对和环II的所有四个核苷酸被基于六乙二醇、丙二醇、双(三乙二醇)磷酸酯、三(丙二醇)二磷酸酯或双(丙二醇)磷酸酯的非核苷接头替代。Ma et al.(Biochem.(1993)32:1751-1758；Nucleic Acids Res.(1993)21:2585-2589)用非核苷酸的乙二醇相关的接头替代了TAR核酶发夹的六个核苷酸的环。Thomson et al.(Nucleic Acids Res.(1993)21:5600-5603)用长度为13、17和19个原子的线性非核苷酸接头替代了环II。
核酶寡核苷酸可使用公知的方法(参见，例如，PCT公开WO9118624；WO9413688；WO9201806；和WO 92/07065；以及美国专利5436143和5650502)制备，或者可从商业来源(例如，US Biochemicals)购买，而且如果需要的话，可并入核苷酸类似物来提高寡核苷酸对细胞中通过核酸酶进行的降解的抗性。可以以任何已知的方式，例如通过使用例如由AppliedBiosystems,Inc.或Milligen生产的市售合成仪来合成核酶。也可通过常规手段在重组载体中产生核酶。参见Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory(现行版)。核酶RNA序列可常规地合成，例如通过使用RNA聚合酶例如T7或SP6。
n.指导核酸
在一些实施方案中，寡核苷酸是指导核酸，例如，指导RNA(gRNA)分子。通常来说，指导RNA是由以下构成的短的合成RNA：(1)与核酸可编程DNA结合蛋白(napDNAbp)(例如，Cas9)结合的支架序列，和(2)核苷酸间隔区部分，其定义了与gRNA结合的DNA靶序列(例如，基因组DNA靶标)，以将核酸可编程DNA结合蛋白引至接近DNA靶序列。在一些实施方案中，napDNAbp是与一种或更多种RNA形成复合物(例如，与之结合或缔合)的核酸可编程蛋白，所述RNA将核酸可编程蛋白靶向靶DNA序列(例如，靶基因组DNA序列)。在一些实施方案中，当与RNA复合时，核酸可编程核酸酶可被称为核酸酶:RNA复合物。指导RNA可作为两种或更多种RNA的复合物，或者作为单个RNA分子存在。
作为单个RNA分子存在的指导RNA(gRNA)可被称为单指导RNA(single-guide RNA，sgRNA)，尽管gRNA也被用于指代作为单个分子或者作为两种或更多种分子的复合物存在的指导RNA。通常来说，作为单个RNA种类存在的gRNA包含两个结构域：(1)与靶核酸享有同源性的结构域(即，指导Cas9复合物与靶标的结合)；以及(2)结合Cas9蛋白的结构域。在一些实施方案中，结构域(2)对应于被称为tracrRNA的序列，并且包含茎-环结构。在一些实施方案中，结构域(2)与如Jinek et al.,Science 337:816-821(2012)(其全部内容通过引用并入本文)中提供的tracrRNA相同或同源。
在一些实施方案中，gRNA包含结构域(1)和(2)中的两个或更多个，并且可被称为扩增gRNA(extended gRNA)。例如，如本文中所述，扩增gRNA将结合两个或更多个Cas9蛋白并且在两个或更多个不同的区域结合靶核酸。gRNA包含与靶位点互补的核苷酸序列，其介导核酸酶/RNA复合物与所述靶位点的结合，提供核酸酶:RNA复合物的序列特异性。在一些实施方案中，RNA可编程核酸酶是(CRISPR相关系统)Cas9核酸内切酶，例如来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9(Csn1)(参见，例如，“Complete genome sequence ofan M1strain of Streptococcus pyogenes.”Ferretti J.J.,McShan W.M.,Ajdic D.J.,Savic D.J.,Savic G.,Lyon K.,Primeaux C.,Sezate S.,Suvorov A.N.,Kenton S.,LaiH.S.,Lin S.P.,Qian Y.,Jia H.G.,Najar F.Z.,Ren Q.,Zhu H.,Song L.,White J.,YuanX.,Clifton S.W.,Roe B.A.,McLaughlin R.E.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:4658-4663(2001)；“CRISPR RNAmaturation by trans-encoded small RNAand host factorRNase III.”Deltcheva E.,Chylinski K.,Sharma C.M.,Gonzales K.,Chao Y.,PirzadaZ.A.,Eckert M.R.,Vogel J.,Charpentier E.,Nature 471:602-607(2011)；和“Aprogrammable dual-RNA-guided DNAendonuclease in adaptive bacterialimmunity.”Jinek M.,Chylinski K.,Fonfara I.,Hauer M.,Doudna J.A.,CharpentierE.Science337:816-821(2012)，其各自的全部内容通过引用并入本文。
o.多聚体
在一些实施方案中，分子载荷可包含通过接头连接的2个或更多个寡核苷酸的多聚体(例如，串联体)。在一些实施方案中，以这种方式，复合物的寡核苷酸负载可提高到超过靶向剂上的可用连接位点(例如，抗体上的可用硫醇位点)，或者以其他方式调节以实现特定的载荷负载量。多聚体中的寡核苷酸可相同或不同(例如，靶向不同基因或者同一基因或其产物上的不同位点)。
在一些实施方案中，多聚体包含通过可切割接头连接在一起的2个或更多个寡核苷酸。然而，在一些实施方案中，多聚体包含通过不可切割接头连接在一起的2个或更多个寡核苷酸。在一些实施方案中，多聚体包含2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个连接在一起的寡核苷酸。在一些实施方案中，多聚体包含2至5、2至10或4至20个连接在一起的寡核苷酸。
在一些实施方案中，多聚体包含2个或更多个首尾相连(以线性排列)的寡核苷酸。在一些实施方案中，多聚体包含2个或更多个通过基于寡核苷酸的接头(例如，聚-dT接头，一种无碱基接头)首尾相连的寡核苷酸。在一些实施方案中，多聚体包含一个寡核苷酸的5’末端，其与另一个寡核苷酸的3’末端连接。在一些实施方案中，多聚体包含一个寡核苷酸的3’末端，其与另一个寡核苷酸的3’末端连接。在一些实施方案中，多聚体包含一个寡核苷酸的5’末端，其与另一个寡核苷酸的5’末端连接。尽管如此，在一些实施方案中，多聚体可包含分支结构，所述分支结构包含通过分支接头连接在一起的多个寡核苷酸。
可用于本文中提供的复合物中的多聚体的另一些实例在以下中公开：例如，美国专利申请号2015/0315588A1，标题为Methods of delivering multiple targetingoligonucleotides to a cell using cleavable linkers，其于2015年11月5日公开；美国专利申请号2015/0247141A1，标题为Multimeric Oligonucleotide Compounds，其于2015年9月3日公开；美国专利申请号US 2011/0158937 A1，标题为ImmunostimulatoryOligonucleotide Multimers，其于2011年6月30日公开；和美国专利号5,693,773，标题为Triplex-Forming Antisense Oligonucleotides Having Abasic Linkers TargetingNucleic Acids Comprising Mixed Sequences Of Purines And Pyrimidines，其于1997年12月2日授权，其各自的内容通过引用整体并入本文。
ii.小分子：
如本文中所述，任何合适的小分子均可用作分子载荷。在一些实施方案中，小分子增强了DMD突变体序列的外显子跳读。在一些实施方案中，小分子如美国专利申请公开US20140080896A1中所述，其于2014年3月20日公开，标题为“IDENTIFICATION OFSMALLMOLECULES THAT FACILITATE THERAPEUTIC EXON SKIPPING”。小分子载荷的另一些实例在美国专利No.9,982,260中提供，其于2018年5月29日授权，标题为“Identificationof structurally similar small molecules that enhance therapeutic exonskipping”。例如，在一些实施方案中，小分子是外显子跳读的增强剂，例如奋乃静(perphenazine)、氟哌噻吨(flupentixol)、珠氯噻醇(zuclopenthixol)或柯喃因(corynanthine)。在一些实施方案中，外显子跳读的小分子增强剂抑制利阿诺定(ryanodine)受体或钙调蛋白。在一些实施方案中，小分子是H-Ras途径抑制剂，例如手霉素A(manumycin A)。在一些实施方案中，小分子是终止密码子的抑制剂并且使核糖体对提前终止密码子不敏感。在一些实施方案中，小分子是阿塔鲁伦(ataluren)，如McElroy S.P.etal.“ALack ofPremature Termination Codon Read Through Efficacy of PTC124(Ataluren)in a Diverse Array of Reporter Assays.”PLOS Biology中所述,其于2013年6月25日公开。在一些实施方案中，小分子是皮质类固醇，例如如Manzur,A.Y.et al.“Glucocorticoid corticosteroids for Duchenne muscular dystrophy”.CochraneDatabase Syst Rev.2004；(2):CD003725中所述。在一些实施方案中，小分子上调可替代肌养蛋白功能的基因(例如肌营养相关蛋白)的表达和/或(例如，和)活性。在一些实施方案中，肌营养相关蛋白调节物描述于国际公开No.WO2007091106中，其于2007年8月16日公开，标题为“TREATMENT OF DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY”，和/或(例如，和)国际公开No.WO/2017/168151中，其于2017年10月5日公开，标题为“COMPOSITION FOR THE TREATMENT OFDUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY”。
iii.肽/蛋白质
如本文中所述，任何合适的肽或蛋白质均可用作分子载荷。在一些实施方案中，蛋白质是酶。在一些实施方案中，可使用数种方法例如噬菌体展示肽文库、单珠单化合物肽文库或位置扫描合成肽组合文库来产生、合成和/或(例如，和)衍生肽或蛋白质。示例性的方法已在本领域中表征并通过引用并入(Gray,B.P.and Brown,K.C.“CombinatorialPeptide Libraries:Mining for Cell-Binding Peptides”Chem Rev.2014,114:2,1020–1081.；Samoylova,T.I.and Smith,B.F.“Elucidation of muscle-binding peptides byphage display screening.”Muscle Nerve,1999,22:4.460-6.)。
在一些实施方案中，肽可促进由突变DMD等位基因表达的mRNA中的外显子跳读。在一些实施方案中，肽可促进功能性肌养蛋白的表达和/或(例如，和)促进能够替代肌养蛋白发挥作用的蛋白质的表达。在一些实施方案中，载荷是作为肌养蛋白的功能性片段(例如功能性肌养蛋白的氨基酸区段)的蛋白质。
在一些实施方案中，肽或蛋白质包含至少一个锌指。
在一些实施方案中，肽或蛋白质可包含约2至25个氨基酸，约2至20个氨基酸，约2至15个氨基酸，约2至10个氨基酸或约2至5个氨基酸。肽或蛋白质可包含天然存在的氨基酸(例如半胱氨酸、丙氨酸)或非天然存在的氨基酸或经修饰氨基酸。非天然存在的氨基酸包括β-氨基酸、高氨基酸、脯氨酸衍生物、3-经取代的丙氨酸衍生物、线性核心氨基酸、N-甲基氨基酸和本领域已知的其他氨基酸。在一些实施方案中，肽可以是线性的；在另一些实施方案中，该肽可以是环状的，例如双环的。
iv.核酸构建体
如本文中所述，任何合适的基因表达构建体均可用作分子载荷。在一些实施方案中，基因表达构建体可以是载体或cDNA片段。在一些实施方案中，基因表达构建体可以是信使RNA(mRNA)。在一些实施方案中，本文中使用的mRNA可以是经修饰mRNA，例如，如美国专利8,710,200中所述，其于2014年4月24日授权，标题为“Engineered nucleic acidsencoding a modified erythropoietin and their expression”。在一些实施方案中，mRNA可包含5’甲基帽。在一些实施方案中，mRNA可包含聚A尾，任选长度多至160个核苷酸。基因表达构建体可编码肌养蛋白、肌养蛋白片段、小肌养蛋白(mini-dystrophin)、肌营养相关蛋白或与肌养蛋白共有共同功能的任何蛋白质的序列。在一些实施方案中，基因表达构建体可在肌细胞的细胞核内表达，例如过表达。在一些实施方案中，基因表达构建体编码包含至少一个锌指的蛋白质。在一些实施方案中，基因表达构建体编码促进肌养蛋白或与肌养蛋白共有功能的蛋白质(例如肌营养相关蛋白)的表达的蛋白质。在一些实施方案中，基因表达构建体编码基因编辑酶。在一些实施方案中，基因表达构建体如以下中所述：美国专利申请公开US20170368198A1，其于2017年12月28日公开，标题为“Optimized mini-dystrophin genes and expression cassettes and their use”；Duan D.“Myodys,afull-length dystrophin plasmid vector for Duchenne and Becker musculardystrophy gene therapy.”Curr Opin Mol Ther 2008；10:86–94；并且表达盒在Tang,Y.et al.,“AAV-directed muscular dystrophy gene therapy”Expert Opin BiolTher.2010Mar；10(3):395-408中公开；其各自的内容均通过引用整体并入本文。
C.接头
本文中所述的复合物通常包含连接本文中所述的任一种抗TfR抗体与分子载荷的接头。接头包含至少一个共价键。在一些实施方案中，接头可以是连接抗TfR抗体与分子载荷的单键，例如二硫键或二硫桥。然而，在一些实施方案中，接头可通过多个共价键连接本文中所述的任一种抗TfR抗体与分子载荷。在一些实施方案中，接头可以是可切割接头。然而，在一些实施方案中，接头可以是不可切割接头。接头通常在体外和体内是稳定的，并且在某些细胞环境中可以是稳定的。另外，通常来说接头不负面影响抗TfR抗体或分子载荷的功能特性。接头合成的实例和方法是本领域中已知的(参见，例如Kline,T.et al.“Methodsto Make Homogenous Antibody Drug Conjugates.”Pharmaceutical Research,2015,32:11,3480–3493.；Jain,N.et al.“Current ADC Linker Chemistry”Pharm Res.2015,32:11,3526–3540.；McCombs,J.R.and Owen,S.C.“Antibody Drug Conjugates:Design andSelection of Linker,Payload and Conjugation Chemistry”AAPS J.2015,17:2,339–351.)。
接头的前体通常将包含允许与抗TfR抗体和分子载荷二者连接的两种不同的反应性物质。在一些实施方案中，两种不同的反应性物质可以是亲核体和/或(例如，和)亲电体。在一些实施方案中，接头通过与抗TfR抗体的赖氨酸残基或半胱氨酸残基缀合而与抗TfR抗体连接。在一些实施方案中，接头通过含马来酰亚胺的接头与抗TfR抗体的半胱氨酸残基连接，其中任选地，含马来酰亚胺的接头包含马来酰亚胺基己酰基或马来酰亚胺基甲基环己烷-1-羧酸根基团。在一些实施方案中，接头通过3-芳基丙腈官能团与抗TfR抗体的半胱氨酸残基或巯基官能化的分子载荷连接。在一些实施方案中，接头与抗TfR抗体的赖氨酸残基连接。在一些实施方案中，接头通过酰胺键、氨基甲酸酯键、酰肼、三唑、硫醚或二硫键与抗TfR抗体和/或(例如，和)分子载荷连接。
i.可切割接头
可切割接头可以是蛋白酶敏感性接头、pH敏感性接头或谷胱甘肽敏感性接头。这些接头通常仅在胞内可切割，并且优选在胞外环境，例如肌细胞胞外中稳定。
蛋白酶敏感性接头可通过蛋白酶酶活性切割。这些接头通常包含肽序列，并且长度可为2至10个氨基酸、约2至5个氨基酸、约5至10个氨基酸、约10个氨基酸、约5个氨基酸、约3个氨基酸或约2个氨基酸。在一些实施方案中，肽序列可包含天然存在的氨基酸(例如半胱氨酸、丙氨酸)或者非天然存在的或经修饰的氨基酸。非天然存在的氨基酸包括β-氨基酸、高氨基酸、脯氨酸衍生物、3-经取代的丙氨酸衍生物、线性核心氨基酸、N-甲基氨基酸和本领域已知的其他氨基酸。在一些实施方案中，蛋白酶敏感性接头包含缬氨酸-瓜氨酸或丙氨酸-瓜氨酸二肽序列。在一些实施方案中，蛋白酶敏感性接头可被溶酶体蛋白酶(例如组织蛋白酶B(cathepsin B))和/或(例如，和)内体蛋白酶切割。
pH敏感性接头是在高或低pH环境中容易降解的共价键联。在一些实施方案中，pH敏感性接头可在4至6的pH下被切割。在一些实施方案中，pH敏感性接头包含腙或环缩醛。在一些实施方案中，pH敏感性接头在内体或溶酶体内被切割。
在一些实施方案中，谷胱甘肽敏感性接头包含二硫化物部分。在一些实施方案中，谷胱甘肽敏感性接头通过与细胞内的谷胱甘肽物质进行二硫化物交换反应来切割。在一些实施方案中，二硫化物部分还包含至少一种氨基酸，例如半胱氨酸残基。
在一些实施方案中，接头是Val-cit接头(例如，如美国专利6,214,345中所述，其通过引用并入本文)。在一些实施方案中，在缀合之前，val-cit接头具有以下结构：
Figure GDA0004266820060001681
在一些实施方案中，在缀合之后，val-cit接头具有以下结构：
Figure GDA0004266820060001691
在一些实施方案中，Val-cit接头与反应性化学部分(例如，用于点击化学缀合的SPAAC)连接。在一些实施方案中，在点击化学缀合之前，与反应性化学部分(例如，用于点击化学缀合的SPAAC)连接的val-cit接头具有以下结构：
Figure GDA0004266820060001692
其中n是0至10的任意数字。在一些实施方案中，n是3。
在一些实施方案中，与反应性化学部分(例如，用于点击化学缀合的SPAAC)连接的val-cit接头与分子载荷(例如，寡核苷酸)缀合(例如，通过不同的化学部分缀合)。在一些实施方案中，与反应性化学部分(例如，用于点击化学缀合的SPAAC)连接并与分子载荷(例如，寡核苷酸)缀合的val-cit接头具有以下结构(在点击化学缀合之前)：
Figure GDA0004266820060001701
其中n是0至10的任意数字。在一些实施方案中，n是3。
在一些实施方案中，在与分子载荷(例如，寡核苷酸)缀合之后，val-cit接头具有以下结构：
Figure GDA0004266820060001702
其中n是0至10的任意数字，并且其中m是0至10的任意数字。在一些实施方案中，n是3并且m是4。
ii.不可切割接头
在一些实施方案中，可使用不可切割接头。通常来说，不可切割接头在细胞或生理环境中不容易被降解。在一些实施方案中，不可切割接头包含任选经取代的烷基，其中所述取代可包括卤素、羟基、氧物质和其他常见的取代。在一些实施方案中，接头可包含任选经取代的烷基、任选经取代的亚烷基、任选经取代的亚芳基、杂亚芳基、包含至少一种非天然氨基酸的肽序列、截短的聚糖、不能被酶降解的一种或更多种糖、叠氮化物、炔-叠氮化物、包含LPXT序列的肽序列、硫醚、生物素、联苯、聚乙二醇或等同化合物的重复单元、酸性酯、酰胺、磺酰胺和/或(例如，和)烷氧基-胺接头。在一些实施方案中，分选酶介导的连接将用于共价连接包含LPXT序列的抗TfR抗体与包含(G)n序列的分子载荷(参见，例如ProftT.Sortase-mediated protein ligation:an emerging biotechnology tool forprotein modification and immobilization.Biotechnol Lett.2010,32(1):1-10.)。
在一些实施方案中，接头可包含经取代的亚烷基、任选经取代的亚烯基、任选经取代的亚炔基、任选经取代的亚环烷基、任选经取代的亚环烯基、任选经取代的亚芳基、还包含至少一个选自N、O和S的杂原子的任选经取代的杂亚芳基；还包含至少一个选自N、O和S的杂原子的任选经取代的亚杂环基；亚氨基、任选经取代的氮物质、任选经取代的氧物质O、任选经取代的硫物质或聚(环氧烷烃)，例如聚环氧乙烷或聚环氧丙烷。
iii.接头缀合
在一些实施方案中，接头通过磷酸酯、硫醚、醚、碳-碳、氨基甲酸酯、或酰胺键与抗TfR抗体和/或(例如，和)分子载荷连接。在一些实施方案中，接头通过磷酸酯或硫代磷酸酯基团例如寡核苷酸主链的末端磷酸酯与寡核苷酸连接。在一些实施方案中，接头通过抗TfR抗体上存在的赖氨酸或半胱氨酸残基与该抗TfR抗体连接。
在一些实施方案中，接头通过叠氮化物和炔烃之间的环加成反应与抗TfR抗体和/或(例如，和)分子载荷连接以形成三唑，其中叠氮化物和炔烃可位于抗TfR抗体、分子载荷或接头上。在一些实施方案中，炔烃可以是环炔烃，例如环辛炔。在一些实施方案中，炔烃可以是双环壬炔(也称为双环[6.1.0]壬炔或BCN)或经取代的双环壬炔。在一些实施方案中，环辛烷如国际专利申请公开WO2011136645中所述，其于2011年11月3日公开，标题为“FusedCyclooctyne Compounds And Their Use In Metal-free Click Reactions”。在一些实施方案中，叠氮化物可以是包含叠氮化物的糖或碳水化合物分子。在一些实施方案中，叠氮化物可以是6-叠氮基-6-脱氧半乳糖或6-叠氮基-N-乙酰半乳糖胺。在一些实施方案中，包含叠氮化物的糖或碳水化合物分子如国际专利申请公开WO2016170186中所述，其于2016年10月27日公开，标题为“Process For The Modification Of A Glycoprotein Using AGlycosyltransferase That Is Or Is Derived From Aβ(1,4)-N-Acetylgalactosaminyltransferase”。在一些实施方案中，在叠氮化物和炔烃之间进行环加成反应以形成三唑，其中叠氮化物和炔烃可位于抗TfR抗体、分子载荷或接头上，如以下中所述：国际专利申请公开WO2014065661，其于2014年5月1日公开，标题为“Modifiedantibody,antibody-conjugate and process for the preparation thereof”；或国际专利申请公开WO2016170186，其于2016年10月27日公开，标题为“Process For TheModification Of A Glycoprotein Using AGlycosyltransferase That Is Or IsDerived From Aβ(1,4)-N-Acetylgalactosaminyltransferase”。
在一些实施方案中，接头还包含间隔基，例如聚乙二醇间隔基或酰基/胺甲酰基磺酰胺间隔基，例如HydraSpaceTM间隔基。在一些实施方案中，间隔基如Verkade,J.M.M.etal.,“A Polar Sulfamide Spacer Significantly Enhances the Manufacturability,Stability,and Therapeutic Index of Antibody-Drug Conjugates”,Antibodies,2018,7,12中所述。
在一些实施方案中，接头通过亲二烯体和二烯/杂二烯之间的第尔斯-阿尔德反应(Diels-Alder reaction)与抗TfR抗体和/或(例如，和)分子载荷连接，其中亲二烯体和二烯/杂二烯可位于抗TfR抗体、分子载荷或接头上。在一些实施方案中，接头通过其他周环反应(pericyclic reaction)，例如烯反应与抗TfR抗体和/或(例如，和)分子载荷连接。在一些实施方案中，接头通过酰胺、硫代酰胺或磺酰胺键合反应与抗TfR抗体和/或(例如，和)分子载荷连接。在一些实施方案中，接头通过缩合反应与抗TfR抗体和/或(例如，和)分子载荷连接，以形成存在于接头和抗TfR抗体和/或(例如，和)分子载荷之间的肟、腙或氨基脲基团。
在一些实施方案中，接头通过亲核体(例如胺、或羟基、碳酸)和亲电体(例如羧酸或醛)之间的共轭加成反应与抗TfR抗体和/或(例如，和)分子载荷连接。在一些实施方案中，在进行接头和抗TfR抗体或分子载荷之间的反应之前，亲核体可存在于接头上并且亲电体可存在于抗TfR抗体或分子载荷上。在一些实施方案中，在进行接头和抗TfR抗体或分子载荷之间的反应之前，亲电体可存在于接头上并且亲核体可存在于抗TfR抗体或分子载荷上。在一些实施方案中，亲电体可以是叠氮化物、五氟苯基、硅中心、羰基、羧酸、酸酐、异氰酸酯、硫代异氰酸酯、琥珀酰亚胺酯、磺基琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺、烷基卤化物、烷基假卤化物、环氧化物、环硫化物、氮丙啶、芳基、活化的磷中心和/或(例如，和)活化的硫中心。在一些实施方案中，亲核体可以是任选经取代的烯烃、任选经取代的炔烃、任选经取代的芳基、任选经取代的杂环基、羟基、氨基、烷基氨基、苯胺基或硫醇基。
在一些实施方案中，与反应性化学部分(例如，用于点击化学缀合的SPAAC)连接的val-cit接头通过以下结构与抗TfR抗体缀合：
Figure GDA0004266820060001731
其中m是0至10的任意数字。在一些实施方案中，m是4。
在一些实施方案中，与反应性化学部分(例如，用于点击化学缀合的SPAAC)连接的val-cit接头与抗TfR抗体缀合，其具有以下结构：
Figure GDA0004266820060001732
其中m是0至10的任意数字。在一些实施方案中，m是4。
在一些实施方案中，与反应性化学部分(例如，用于点击化学缀合的SPAAC)连接并与抗TfR抗体缀合的val-cit接头具有以下结构：
Figure GDA0004266820060001733
其中n是0至10的任意数字，其中m是0至10的任意数字。在一些实施方案中，n是3和/或(例如，和)m是4。
在一些实施方案中，用于共价连接抗TfR抗体和分子载荷(例如，寡核苷酸)的val-cit接头具有以下结构：
Figure GDA0004266820060001741
其中n是3并且m是4。
在一些实施方案中，连接抗体和分子载荷的val-cit接头具有以下结构：
Figure GDA0004266820060001742
其中n是0至10的任意数字，其中m是0至10的任意数字。在一些实施方案中，n是3和/或(例如，和)m是4。在一些实施方案中，n是3和/或(例如，和)m是4。在一些实施方案中，X是抗体的NH(例如，来自赖氨酸的胺基的NH)、S(例如，来自半胱氨酸的硫醇基的S)或O(例如，来自丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸的羟基的O)。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物具有以下结构：
Figure GDA0004266820060001751
其中n是0至10的任意数字，其中m是0至10的任意数字。在一些实施方案中，n是3和/或(例如，和)m是4。
在结构式(A)、(B)、(C)和(D)中，L1在一些实施方案中是间隔基，所述间隔基是经取代或未经取代的脂族、经取代或未经取代的杂脂族、经取代或未经取代的亚碳环基、经取代或未经取代的亚杂环基、经取代或未经取代的亚芳基、经取代或未经取代的亚杂芳基、-O-，-N(RA)-，-S-，-C(＝O)-，-C(＝O)O-，-C(＝O)NRA，-NRAC(＝O)-，-NRAC(＝O)RA-，-C(＝O)RA-，-NRAC(＝O)O-，-NRAC(＝O)N(RA)-，-OC(＝O)-，-OC(＝O)O-，-OC(＝O)N(RA)-，-S(O)2NRA，-NRAS(O)2-，或其组合。在一些实施方案中，L1是
Figure GDA0004266820060001752
/>
其中哌嗪部分与寡核苷酸连接，其中L2是
Figure GDA0004266820060001761
在一些实施方案中，L1是：
Figure GDA0004266820060001762
其中哌嗪部分与寡核苷酸连接。
在一些实施方案中，L1是
Figure GDA0004266820060001763
在一些实施方案中，L1与寡核苷酸的5’磷酸连接。
在一些实施方案中，L1是任选的(例如，不是必要存在的)。
在一些实施方案中，本文中所述的任一种复合物具有以下结构：
Figure GDA0004266820060001764
其中n是0至15(例如3)并且m是0至15(例如4)。
C.抗体-分子载荷复合物的一些实例
本文中还提供了包含与本文中所述的任何分子载荷(例如，寡核苷酸)共价连接的任一种本文中所述的抗TfR抗体的复合物的一些非限制性实例。在一些实施方案中，抗TfR抗体(例如，表2中提供的任一种抗TfR抗体)通过接头与分子载荷(例如，寡核苷酸)共价连接。可使用本文中所述的任何接头。在一些实施方案中，如果分子载荷是寡核苷酸，则接头与寡核苷酸的5’末端、3’末端或内部连接。在一些实施方案中，接头通过硫醇反应性键联(例如，通过抗TfR抗体中的半胱氨酸)与抗TfR抗体连接。在一些实施方案中，接头(例如，Val-cit接头)通过胺基(例如，通过抗体中的赖氨酸)与抗体(例如，本文中所述的抗TfR抗体)连接。在一些实施方案中，分子载荷是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，分子载荷是DMD靶向寡核苷酸(例如，由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸)。
以下提供了复合物的结构的一个实例，其包含通过Val-cit接头与分子载荷共价连接的抗TfR抗体：
Figure GDA0004266820060001771
其中接头通过硫醇反应性键联(例如，通过抗体中的半胱氨酸)与抗体连接。在一些实施方案中，分子载荷是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，分子载荷是DMD靶向寡核苷酸(例如，由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸)。
以下提供了复合物的结构的另一个实例，其包含通过Val-cit接头与分子载荷共价连接的抗TfR抗体：
Figure GDA0004266820060001781
其中n是0至10的数字，其中m是0至10的数字，其中接头通过胺基(例如，赖氨酸残基上的)与抗体连接，和/或(例如，和)其中接头与寡核苷酸(例如，在5’末端、3’末端或内部)连接。在一些实施方案中，接头通过赖氨酸与抗体连接，接头在5’末端与寡核苷酸连接，n是3并且m是4。在一些实施方案中，分子载荷是包含有义链和反义链的寡核苷酸，并且接头在5’末端或3’末端与有义链或反义链连接。
应理解，抗体可与具有不同化学计量的分子载荷连接，该特性可被称为药物抗体比(drug to antibody ratio，DAR)，其中“药物”是分子载荷。在一些实施方案中，一个分子载荷与一个抗体连接(DAR＝1)。在一些实施方案中，两个分子载荷与一个抗体连接(DAR＝2)。在一些实施方案中，三个分子载荷与一个抗体连接(DAR＝3)。在一些实施方案中，四个分子载荷与一个抗体连接(DAR＝4)。在一些实施方案中，提供了不同复合物的混合物，每种复合物具有不同的DAR。在一些实施方案中，这样的混合物中的复合物的平均DAR可在1至3、1至4、1至5或更大的范围内。可通过将分子载荷缀合至抗体上的不同位点和/或(例如，和)通过将多聚体缀合至抗体上的一个或更多个位点来提高DAR。例如，可通过将单个分子载荷缀合至抗体上的两个不同位点或通过将二聚体分子载荷缀合至抗体的单个位点来实现DAR为2。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含与分子载荷共价连接的本文中所述的抗TfR抗体(例如，表2中提供的IgG或Fab形式的3-A4、3-M12和5-H12抗体)。在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含通过接头(例如，Val-cit接头)与分子载荷共价连接的本文中所述的抗TfR抗体(例如，表2中提供的IgG或Fab形式的3-A4、3-M12和5-H12抗体)。在一些实施方案中，接头(例如，Val-cit接头)通过硫醇反应性键联(例如，通过抗体中的半胱氨酸)与抗体(例如，本文中所述的抗TfR抗体)连接。在一些实施方案中，接头(例如，Val-cit接头)通过胺基(例如，通过抗体中的赖氨酸)与抗体(例如，本文中所述的抗TfR抗体)连接。在一些实施方案中，分子载荷是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，分子载荷是DMD靶向寡核苷酸(例如，由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸)。
在一些实施方案中，在本文中所述复合物的任一个实例中，分子载荷是DMD靶向寡核苷酸，其包含由SEQ ID NO:1242至2046中任一个提供的靶序列的至少15个连续核苷酸的互补区。在一些实施方案中，在本文中所述复合物的任一个实例中，分子载荷是DMD靶向寡核苷酸，其包含SEQ ID NO:437至1241中任一个的至少15个连续核苷酸的互补区。在一些实施方案中，在本文中所述复合物的任一个实例中，分子载荷是DMD靶向寡核苷酸，其包含表15中列出ESE的至少5个连续核苷酸的互补区。在一些实施方案中，在本文中所述复合物的任一个实例中，分子载荷是选自表14中列出寡核苷酸的DMD靶向寡核苷酸。在一些实施方案中，在本文中所述复合物的任一个实例中，分子载荷是选自由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供，或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸的DMD靶向寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含与分子载荷共价连接的抗TfR抗体，其中所述抗TfR抗体包含与表2中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3相同的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；以及与表2中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3相同的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，分子载荷是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，分子载荷是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含与分子载荷共价连接的抗TfR抗体，其中所述抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，分子载荷是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，分子载荷是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含与分子载荷共价连接的抗TfR抗体，其中所述抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VH和含有SEQID NO:74的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，分子载荷是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，分子载荷是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含与分子载荷共价连接的抗TfR抗体，其中所述抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VH和含有SEQID NO:75的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，分子载荷是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，分子载荷是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含与分子载荷共价连接的抗TfR抗体，其中所述抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，分子载荷是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，分子载荷是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ IDNO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含与分子载荷共价连接的抗TfR抗体，其中所述抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:77或SEQ ID NO:79的氨基酸序列的VH和含有SEQID NO:80的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，分子载荷是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，分子载荷是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含与分子载荷共价连接的抗TfR抗体，其中所述抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86或SEQ ID NO:87的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，分子载荷是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，分子载荷是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含与分子载荷共价连接的抗TfR抗体，其中所述抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:88或SEQ ID NO:91的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，分子载荷是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，分子载荷是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含与分子载荷共价连接的抗TfR抗体，其中所述抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:88或SEQ ID NO:91的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，分子载荷是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，分子载荷是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含与分子载荷共价连接的抗TfR抗体，其中所述抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:92或SEQ ID NO:94的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，分子载荷是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，分子载荷是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含与分子载荷共价连接的抗TfR抗体，其中所述抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:93的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，分子载荷是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，分子载荷是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含与分子载荷共价连接的抗TfR抗体，其中所述抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98或SEQ ID NO:99的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，分子载荷是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，分子载荷是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含与分子载荷共价连接的抗TfR抗体，其中所述抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:100或SEQ ID NO:101的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，分子载荷是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，分子载荷是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含与分子载荷共价连接的抗TfR抗体，其中所述抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:100或SEQ ID NO:101的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，分子载荷是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，分子载荷是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含与分子载荷共价连接的抗TfR抗体，其中所述抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:93的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，分子载荷是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，分子载荷是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含与分子载荷共价连接的抗TfR抗体，其中所述抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:102或SEQ ID NO:103的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，分子载荷是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，分子载荷是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含通过赖氨酸与寡核苷酸的5’末端共价连接的抗TfR抗体，其中所述抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:84的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的轻链；其中所述复合物具有以下结构：
Figure GDA0004266820060001831
/>
其中n是3并且m是4。在一些实施方案中，寡核苷酸是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含通过赖氨酸与寡核苷酸的5’末端共价连接的抗TfR抗体，其中所述抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的轻链；其中所述复合物具有以下结构：
Figure GDA0004266820060001832
其中n是3并且m是4。在一些实施方案中，寡核苷酸是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含通过赖氨酸与寡核苷酸的5’末端共价连接的抗TfR抗体，其中所述抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的轻链；其中所述复合物具有以下结构：
Figure GDA0004266820060001841
其中n是3并且m是4。在一些实施方案中，寡核苷酸是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含通过赖氨酸与寡核苷酸的5’末端共价连接的抗TfR抗体，其中所述抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的轻链；其中所述复合物具有以下结构：
Figure GDA0004266820060001842
其中n是3并且m是4。在一些实施方案中，寡核苷酸是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含通过赖氨酸与寡核苷酸的5’末端共价连接的抗TfR抗体，其中所述抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链；其中所述复合物具有以下结构：
Figure GDA0004266820060001851
其中n是3并且m是4。在一些实施方案中，寡核苷酸是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含通过赖氨酸与寡核苷酸的5’末端共价连接的抗TfR抗体，其中所述抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的轻链；其中所述复合物具有以下结构：
Figure GDA0004266820060001852
其中n是3并且m是4。在一些实施方案中，寡核苷酸是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含通过赖氨酸与寡核苷酸的5’末端共价连接的抗TfR抗体，其中所述抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链；其中所述复合物具有以下结构：
Figure GDA0004266820060001861
其中n是3并且m是4。在一些实施方案中，寡核苷酸是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含通过赖氨酸与寡核苷酸的5’末端共价连接的抗TfR抗体，其中所述抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:93的氨基酸序列的轻链；其中所述复合物具有以下结构：
Figure GDA0004266820060001862
其中n是3并且m是4。在一些实施方案中，寡核苷酸是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含通过赖氨酸与寡核苷酸的5’末端共价连接的抗TfR抗体，其中所述抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:94的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的轻链；其中所述复合物具有以下结构：
Figure GDA0004266820060001871
其中n是3并且m是4。在一些实施方案中，寡核苷酸是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含通过赖氨酸与寡核苷酸的5’末端共价连接的抗TfR抗体，其中所述抗TfR抗体包含含有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的轻链；其中所述复合物具有以下结构：
Figure GDA0004266820060001872
其中n是3并且m是4。在一些实施方案中，寡核苷酸是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含通过赖氨酸与寡核苷酸的5’末端共价连接的抗TfR Fab，其中所述抗TfR Fab包含含有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VL；其中所述复合物具有以下结构：
Figure GDA0004266820060001881
其中n是3并且m是4。在一些实施方案中，寡核苷酸是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含通过赖氨酸与寡核苷酸的5’末端共价连接的抗TfR Fab，其中所述抗TfR Fab包含含有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VL；其中所述复合物具有以下结构：
Figure GDA0004266820060001891
其中n是3并且m是4。在一些实施方案中，寡核苷酸是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含通过赖氨酸与寡核苷酸的5’末端共价连接的抗TfR Fab，其中所述抗TfR Fab包含含有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VL；其中所述复合物具有以下结构：
Figure GDA0004266820060001892
其中n是3并且m是4。在一些实施方案中，寡核苷酸是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含通过赖氨酸与寡核苷酸的5’末端共价连接的抗TfR Fab，其中所述抗TfR Fab包含含有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的VL；其中所述复合物具有以下结构：
Figure GDA0004266820060001901
其中n是3并且m是4。在一些实施方案中，寡核苷酸是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含通过赖氨酸与寡核苷酸的5’末端共价连接的抗TfR Fab，其中所述抗TfR Fab包含含有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的VL；其中所述复合物具有以下结构：
Figure GDA0004266820060001902
其中n是3并且m是4。在一些实施方案中，寡核苷酸是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含通过赖氨酸与寡核苷酸的5’末端共价连接的抗TfR Fab，其中所述抗TfR Fab包含含有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的VL；其中所述复合物具有以下结构：
Figure GDA0004266820060001911
其中n是3并且m是4。在一些实施方案中，寡核苷酸是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含通过赖氨酸与寡核苷酸的5’末端共价连接的抗TfR Fab，其中所述抗TfR Fab包含含有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的VL；其中所述复合物具有以下结构：
Figure GDA0004266820060001912
其中n是3并且m是4。在一些实施方案中，寡核苷酸是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含通过赖氨酸与寡核苷酸的5’末端共价连接的抗TfR Fab，其中所述抗TfR Fab包含含有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的VL；其中所述复合物具有以下结构：
Figure GDA0004266820060001921
其中n是3并且m是4。在一些实施方案中，寡核苷酸是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含通过赖氨酸与寡核苷酸的5’末端共价连接的抗TfR Fab，其中所述抗TfR Fab包含含有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的VL；其中所述复合物具有以下结构：
Figure GDA0004266820060001922
其中n是3并且m是4。在一些实施方案中，寡核苷酸是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含通过赖氨酸与寡核苷酸的5’末端共价连接的抗TfR Fab，其中所述抗TfR Fab包含含有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的VL；其中所述复合物具有以下结构：
Figure GDA0004266820060001931
其中n是3并且m是4。在一些实施方案中，寡核苷酸是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含通过赖氨酸与寡核苷酸的5’末端共价连接的抗TfR Fab，其中所述抗TfR Fab包含含有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的轻链；其中所述复合物具有以下结构：
Figure GDA0004266820060001941
其中n是3并且m是4。在一些实施方案中，寡核苷酸是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含通过赖氨酸与寡核苷酸的5’末端共价连接的抗TfR Fab，其中所述抗TfR Fab包含含有SEQ ID NO:98的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的轻链；其中所述复合物具有以下结构：
Figure GDA0004266820060001942
其中n是3并且m是4。在一些实施方案中，寡核苷酸是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含通过赖氨酸与寡核苷酸的5’末端共价连接的抗TfR Fab，其中所述抗TfR Fab包含含有SEQ ID NO:99的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的轻链；其中所述复合物具有以下结构：
Figure GDA0004266820060001951
其中n是3并且m是4。在一些实施方案中，寡核苷酸是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含通过赖氨酸与寡核苷酸的5’末端共价连接的抗TfR Fab，其中所述抗TfR Fab包含含有SEQ ID NO:100的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的轻链；其中所述复合物具有以下结构：
Figure GDA0004266820060001952
其中n是3并且m是4。在一些实施方案中，寡核苷酸是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含通过赖氨酸与寡核苷酸的5’末端共价连接的抗TfR Fab，其中所述抗TfR Fab包含含有SEQ ID NO:100的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链；其中所述复合物具有以下结构：
Figure GDA0004266820060001961
其中n是3并且m是4。在一些实施方案中，寡核苷酸是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含通过赖氨酸与寡核苷酸的5’末端共价连接的抗TfR Fab，其中所述抗TfR Fab包含含有SEQ ID NO:101的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的轻链；其中所述复合物具有以下结构：
Figure GDA0004266820060001962
其中n是3并且m是4。在一些实施方案中，寡核苷酸是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含通过赖氨酸与寡核苷酸的5’末端共价连接的抗TfR Fab，其中所述抗TfR Fab包含含有SEQ ID NO:101的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链；其中所述复合物具有以下结构：
Figure GDA0004266820060001971
其中n是3并且m是4。在一些实施方案中，寡核苷酸是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含通过赖氨酸与寡核苷酸的5’末端共价连接的抗TfR Fab，其中所述抗TfR Fab包含含有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:93的氨基酸序列的轻链；其中所述复合物具有以下结构：
Figure GDA0004266820060001972
其中n是3并且m是4。在一些实施方案中，寡核苷酸是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含通过赖氨酸与寡核苷酸的5’末端共价连接的抗TfR Fab，其中所述抗TfR Fab包含含有SEQ ID NO:103的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的轻链；其中所述复合物具有以下结构：
Figure GDA0004266820060001981
其中n是3并且m是4。在一些实施方案中，寡核苷酸是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的复合物包含通过赖氨酸与寡核苷酸的5’末端共价连接的抗TfR Fab，其中所述抗TfR Fab包含含有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的轻链；其中所述复合物具有以下结构：
Figure GDA0004266820060001991
其中n是3并且m是4。在一些实施方案中，寡核苷酸是DMD靶向寡核苷酸(例如，表14中列出的寡核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸是由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，在本文中所述的复合物的任一实例中，L1是本文中所述的任一种间隔基。
在一些实施方案中，L1是：
Figure GDA0004266820060001992
其中哌嗪部分与寡核苷酸连接，其中L2是
Figure GDA0004266820060001993
在一些实施方案中，L1是：
Figure GDA0004266820060002001
/>
其中哌嗪部分与寡核苷酸连接。
在一些实施方案中，L1是
Figure GDA0004266820060002002
在一些实施方案中，L1与寡核苷酸的5’磷酸连接。
在一些实施方案中，L1是任选的(例如，不是必要存在的)。
III.制剂
本文中提供的复合物可以以任何合适的方式配制。通常来说，本文中提供的复合物以适用于药物用途的方式配制。例如，可使用使降解最小化、促进递送和/或(例如，和)摄取或者为制剂中的复合物提供另外的有益特性的制剂将复合物递送至对象。在一些实施方案中，本文中提供了包含复合物和可药用载体的组合物。可适当地配制这样的组合物使得当施用于对象时，无论是施用至靶细胞的直接环境中或全身性施用，足够量的复合物都能进入靶肌细胞。在一些实施方案中，复合物被配制在缓冲溶液例如磷酸盐缓冲盐水溶液、脂质体、胶束结构和衣壳中。
应理解，在一些实施方案中，组合物可分别包含本文中提供的复合物的一种或更多种组分(例如，肌肉靶向剂、接头、分子载荷或它们中任一者的前体分子)。
在一些实施方案中，复合物被配制在水或水溶液(例如，用pH调节的水)中。在一些实施方案中，复合物被配制在碱性缓冲水溶液(例如，PBS)中。在一些实施方案中，本文中公开的制剂包含赋形剂。在一些实施方案中，赋形剂赋予组合物以改善的稳定性、改善的吸收、改善的溶解性和/或(例如，和)活性成分的治疗性增强。在一些实施方案中，赋形剂是缓冲剂(例如，柠檬酸钠、磷酸钠、tris碱或氢氧化钠)或载剂(例如，缓冲溶液、矿脂(petrolatum)、二甲基亚砜或矿物油)。
在一些实施方案中，将复合物或其组分(例如，寡核苷酸或抗体)冻干用于延长其保质期，并随后在使用(例如，施用于对象)之前制成溶液。因此，包含本文中所述的复合物或其组分的组合物中的赋形剂可以是冻干保护剂(例如，甘露醇、乳糖、聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮)或崩解温度调节剂(例如，右旋糖酐、ficoll或明胶)。
在一些实施方案中，药物组合物被配制成与其预期施用途径相容。施用途径的一些实例包括肠胃外施用，例如静脉内、皮内、皮下施用。通常来说，施用途径是静脉内或皮下的。
适用于可注射使用的药物组合物包含无菌水溶液(在具有水溶性时)或分散体，以及用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，及其合适的混合物。在一些实施方案中，组合物中的制剂包含等张剂，例如糖、多元醇例如甘露醇、山梨醇以及氯化钠。无菌可注射溶液可通过将所需量的复合物与以上列举的成分之一或组合(根据需要)一起并入选定的溶剂中，然后过滤灭菌来制备。
在一些实施方案中，组合物可包含至少约0.1％的复合物或其组分，或者更多，尽管活性成分的百分比可为总组合物的重量或体积的约1％至约80％或更多。本领域技术人员将预期制备这样的药物制剂的因素例如溶解性、生物利用度、生物学半衰期、施用途径、产品保质期以及其他药理学预期因素，并且因此多种剂量和治疗方案可以是期望的。
IV.使用/治疗方法
如本文中所述的包含与分子载荷共价连接的肌肉靶向剂的复合物在治疗患有肌养蛋白病(例如，迪谢内肌营养不良)的对象中是有效的。在一些实施方案中，复合物包含分子载荷，所述分子载荷是寡核苷酸，例如促进由突变DMD等位基因表达的mRNA的外显子跳读的反义寡核苷酸。
在一些实施方案中，对象可以是人对象、非人灵长类对象、啮齿动物对象或任何合适的哺乳动物对象。在一些实施方案中，对象可患有迪谢内肌营养不良或其他肌养蛋白病。在一些实施方案中，对象具有突变DMD等位基因，其可任选地在DMD外显子中包含至少一个突变，该突变导致移码突变并导致不正确的RNA剪接/加工。在一些实施方案中，对象患有严重肌养蛋白病的症状，例如肌肉萎缩或肌肉损失。在一些实施方案中，对象具有肌酸磷酸激酶(CK)的血清浓度的无症状提高和/或(例如，和)伴随有肌红蛋白尿的肌肉痉挛。在一些实施方案中，对象患有进行性肌肉疾病，例如迪谢内肌营养不良或贝克肌营养不良或DMD相关扩张型心肌病(DCM)。在一些实施方案中，对象不患有肌养蛋白病的症状。
本公开内容的一个方面包括涉及向对象施用有效量的本文中所述的复合物的方法。在一些实施方案中，可向有治疗需要的对象施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含含有与分子载荷共价连接的肌肉靶向剂的复合物。在一些实施方案中，可通过合适的途径施用包含如本文中所述的复合物的药物组合物，所述途径可包括静脉内施用，例如作为推注(bolus)或通过在一段时间内的连续输注。在一些实施方案中，可通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内或鞘内途径进行静脉内施用。在一些实施方案中，药物组合物可以是固体形式、水性形式或液体形式。在一些实施方案中，可将水性或液体形式雾化或冻干。在一些实施方案中，雾化或冻干形式可用水溶液或液体溶液重构。
用于静脉内施用的组合物可包含多种载体，例如植物油、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、豆蔻酸异丙酯、乙醇以及多元醇(甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)。对于静脉内注射，水溶性抗体可通过滴注方法施用，通过该方法输注包含抗体和生理学上可接受的赋形剂的药物制剂。生理上可接受的赋形剂可包括，例如5％右旋糖、0.9％盐水、林格液(Ringer’s solution)或其他合适的赋形剂。可将肌内制剂，例如抗体的合适可溶性盐形式的无菌制剂溶解在药用赋形剂例如注射用水、0.9％盐水或5％葡萄糖溶液中并施用。
在一些实施方案中，包含含有与分子载荷共价连接的肌肉靶向剂的复合物的药物组合物通过位点特异性或局部递送技术施用。这些技术的一些实例包括复合物的可植入储库源、局部递送导管、位点特异性载体、直接注射或直接应用。
在一些实施方案中，包含含有与分子载荷共价连接的肌肉靶向剂的复合物的药物组合物以赋予对象治疗作用的有效浓度施用。如本领域技术人员所公认的，有效量根据疾病的严重程度、所治疗对象的独特特征(例如年龄、身体状况、健康或体重)、治疗的持续时间、任何同时治疗的性质、施用途径和相关因素而变化。这些相关因素是本领域技术人员已知的，并且仅通过常规实验即可解决。在一些实施方案中，有效浓度是被认为对患者安全的最大剂量。在一些实施方案中，有效浓度将是提供最大效力的最低的可能浓度。
经验预期因素(例如复合物在对象中的半衰期)通常将有助于确定用于治疗的药物组合物的浓度。施用频率可凭经验确定和调整以使治疗效力最大化。
通常来说，对于本文中所述的任何复合物的施用，根据上述因素，例如安全性或效力，初始候选剂量可为约1至100mg/kg或更高。在一些实施方案中，将施用一次治疗。在一些实施方案中，将每天、每两周、每周、每两个月、每月或以提供最大效力的同时使对对象的安全风险最小化的任何时间间隔施用治疗。通常来说，可在整个治疗过程中监测效力和治疗以及安全风险。
可使用任何合适的方法评估治疗的效力。在一些实施方案中，治疗的效力可如下进行评估：通过对与肌养蛋白病相关的症状(例如肌肉萎缩或肌无力)的观察结果进行的评价，通过对对象的自我报告结局(例如移动性、自我护理、日常活动、疼痛/不适和焦虑/抑郁)的测量，或通过生活质量指标(例如寿命)。
在一些实施方案中，将包含含有与分子载荷共价连接的肌肉靶向剂的本文中所述的复合物的药物组合物以相对于对照(例如治疗之前基因表达的基线水平)足以调节至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的靶基因活性或表达的有效浓度施用于对象。
在一些实施方案中，向对象单次给药或施用包含含有与分子载荷共价连接的肌肉靶向剂的本文中所述的复合物的药物组合物足以抑制靶基因的活性或表达持续至少1至5天、1至10天、5至15天、10至20天、15至30天、20至40天、25至50天或更多天。在一些实施方案中，向对象单次给药或施用包含含有与分子载荷共价连接的肌肉靶向剂的本文中所述的复合物的药物组合物足以抑制靶基因的活性或表达持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周。在一些实施方案中，向对象单次给药或施用包含含有与分子载荷共价连接的肌肉靶向剂的本文中所述的复合物的药物组合物足以抑制靶基因的活性或表达持续至少1、2、3、4、5或6个月。
在一些实施方案中，药物组合物可包含多于一种包含与分子载荷共价连接的肌肉靶向剂的复合物。在一些实施方案中，药物组合物还可包含用于治疗对象(例如，患有肌养蛋白病的人对象)的任何其他合适的治疗剂。在一些实施方案中，其他治疗剂可增强或补充本文中所述复合物的效力。在一些实施方案中，其他治疗剂可发挥功能来治疗不同于本文中所述复合物的症状或疾病。
实施例
实施例1：用经转染的反义寡核苷酸靶向HPRT
在体外测试了靶向次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(hypoxanthinephosphoribosyltransferase，HPRT)的siRNA降低永生化细胞系中HPRT表达水平的能力。简言之，用使用lipofectamine 2000配制的对照siRNA(siCTRL；100nM)或靶向HPRT的siRNA(siHPRT；100nM)转染Hepa 1-6细胞。转染之后48小时评价HPRT表达水平。还进行了对照实验，其中将载剂(磷酸盐缓冲盐水)递送至培养中的Hepa 1-6细胞并将细胞维持48小时。如图1中所示，发现与对照相比，HPRT siRNA使HPRT表达水平降低约90％。表6中提供了所使用的siRNA的序列。
表6.siHPRT和siCTRL的序列
序列* SEQ ID NO：
siHPRT有义链 5′-UcCuAuGaCuGuAgAuUuUaU-(CH2)6NH2-3′ 147
siHPRT反义链 5′-paUaAaAuCuAcAgUcAuAgGasAsu-3′ 148
siCTRL有义链 5′-UgUaAuAaCcAuAuCuAcCuU-(CH2)6NH2-3′ 149
siCTRL反义链 5′-aAgGuAgAuAuGgUuAuUaCasAsa-3′ 150
*小写字母-2’Ome核糖；大写字母-2’氟核糖；p-磷酸键联；s-硫代磷酸酯键联
实施例2：用肌肉靶向复合物靶向HPRT
产生了肌肉靶向复合物，其包含通过不可切割的N-γ-马来酰亚胺基丁酰基-氧基琥珀酰亚胺酯(GMBS)接头与抗转铁蛋白受体抗体RI7217抗TfR1 Fab(DTX-A-002)共价连接的在实施例1中使用的HPRT siRNA(siHPRT)。
简言之，将GMBS接头溶解在无水DMSO中，并通过在水性条件下形成酰胺键来与siHPRT有义链的3’末端偶联。通过Kaiser测试验证反应的完成。通过凝胶渗透色谱除去过量的接头和有机溶剂。然后使用迈克尔加成反应将经纯化的siHPRT的马来酰亚胺官能化有义链与DTX-A-002抗体偶联。
然后对抗体偶联反应的产物进行尺寸排阻色谱(size exclusionchromatograpy，SEC)纯化。对包含与DTX-A-002抗体共价连接的一个或两个siHPRT分子的抗TfR-siHPRT复合物进行纯化。密度测定法证实，经纯化的复合物样品的平均siHPRT与抗体之比为1.46。SDS-PAGE分析表明，>90％的经纯化的复合物样品包含与一个或两个siHPRT分子连接的DTX-A-002。
使用与上述相同的方法，产生了对照IgG2a-siHPRT复合物，其包含通过GMBS接头与IgG2a(Fab)抗体(DTX-A-003)共价连接的在实施例1中使用的HPRT siRNA(siHPRT)。密度测定法证实，DTX-C-001(IgG2a-siHPRT复合物)的平均siHPRT与抗体之比为1.46，并且SDS-PAGE表明，>90％的经纯化的对照复合物样品包含与一个或两个siHPRT分子连接的DTX-A-003。
然后测试抗TfR-siHPRT复合物的细胞内化和对细胞内HPRT的抑制。在载剂(磷酸盐缓冲盐水)、IgG2a-siHPRT(100nM)、抗TfR-siCTRL(100nM)或抗TfR-siHPRT(100nM)的存在下将具有相对高的转铁蛋白受体表达水平的Hepa 1-6细胞孵育72小时。孵育72小时之后，分离细胞并测定HPRT的表达水平(图2)。相对于用载剂对照处理的细胞和用IgG2a-siHPRT复合物处理的那些细胞，用抗TfR-siHPRT处理的细胞表现出HPRT表达降低了约50％。同时，用IgG2a-siHPRT或抗TfR-siCTRL处理之细胞的HPRT表达水平与载剂对照相当(HPRT表达未降低)。这些数据表明抗TfR-siHPRT的抗转铁蛋白受体抗体能够使复合物进行细胞内化，从而使siHPRT抑制HPRT的表达。
实施例3：用肌肉靶向复合物靶向小鼠肌肉组织中的HPRT
测试了实施例2中所述的肌肉靶向复合物抗TfR-siHPRT对小鼠组织中HPRT的抑制。用单剂量的载剂对照(磷酸盐缓冲盐水)、siHPRT(2mg/kg siRNA)、IgG2a-siHPRT(2mg/kg siRNA，相当于9mg/kg抗体复合物)或抗TfR-siHPRT(2mg/kg siRNA，相当于9mg/kg抗体复合物)静脉内注射C57BL/6野生型小鼠。每个实验条件在四只单独的C57BL/6野生型小鼠中重复。在注射之后3天时期之后，使小鼠安乐死并分割为分离的组织类型。随后测定单独的组织样品的HPRT表达水平(图3A至3B和4A至4E)。
相对于用siHPRT对照处理的小鼠，用抗TfR-siHPRT复合物处理的小鼠表现出腓肠肌(31％降低；p<0.05)和心脏(30％降低；p<0.05)中的HPRT表达降低(图3A至3B)。同时，对于所有测定的肌肉组织类型，用IgG2a-siHPRT复合物处理的小鼠的HPRT表达水平与siHPRT对照相当(HPRT表达几乎没有或没有降低)。
用抗TfR-siHPRT复合物处理的小鼠显示出在非肌肉组织例如脑、肝、肺、肾和脾组织中HPRT表达没有变化(图4A至4E)。这些数据表明，在体内小鼠模型中抗TfR-siHPRT复合物的抗转铁蛋白受体抗体能够使复合物细胞内化至肌肉特异性组织中，从而允许siHPRT抑制HPRT的表达。这些数据还表明本公开内容的抗TfR-寡核苷酸复合物能够特异性地靶向肌肉组织。
实施例4：用肌肉靶向复合物靶向DMD
产生了肌肉靶向复合物，其包含通过组织蛋白酶可切割接头与抗转铁蛋白受体抗体DTX-A-002(RI7 217(Fab))共价连接的靶向DMD的突变体等位基因用于外显子跳读的反义寡核苷酸(DMD ASO)，例如具有表14中公开的序列的寡核苷酸。
简言之，将经纯化的Val-Cit-接头-DMD ASO与通过修饰抗体的赖氨酸上的ε-胺而产生的功能化抗体片段(例如，RI7 217(Fab)或15G11(Fab))偶联。
然后对抗体偶联反应的产物进行疏水相互作用色谱(HIC-HPLC)以纯化肌肉靶向复合物。经纯化的复合物的密度测定法和SDS-PAGE分析分别允许确定ASO与抗体的平均比和总纯度。
使用与上述相同的方法，产生了对照复合物，其包含通过Val-Cit接头与IgG2a(Fab)抗体共价连接的DMD ASO。然后测试包含与DMD ASO共价连接的DTX-A-002的经纯化的肌肉靶向复合物的细胞内化和对DMD外显子跳读的调节。在载剂对照(盐水)、肌肉靶向复合物(100nM)或对照复合物(100nM)的存在下，将具有相对高的转铁蛋白受体表达水平的疾病相关肌细胞孵育72小时。孵育72小时之后，分离细胞并测定DMD的表达水平。
实施例5：用肌肉靶向复合物靶向DMD
产生了肌肉靶向复合物(DTX-C-042)，其包含与抗转铁蛋白受体抗体DTX-A-002(RI7217(Fab))共价连接的靶向DMD的外显子23的PMO ASO。
简言之，使用酰胺偶联反应将双环[6.1.0]壬炔-PEG3-L-缬氨酸-L-瓜氨酸-五氟苯基酯(BCN-PEG3-Val-Cit-PFP)接头分子与NH2-C6-(外显子23PMO)偶联。通过凝胶渗透色谱除去过量的接头和有机溶剂。然后将经纯化的Val-Cit-接头-(外显子-23PMO)与叠氮化物功能化的抗转铁蛋白受体抗体(DTX-A-002)偶联，所述叠氮化物功能化的抗转铁蛋白受体抗体(DTX-A-002)通过用叠氮化物-PEG4-PFP修饰赖氨酸上的ε-胺而产生。
然后对抗体偶联反应的产物进行纯化并且密度测定法证实了该DTX-C-042复合物样品的平均ASO与抗体之比为1.9。
在本实施例中使用的靶向DMD的外显子23的PMO ASO包含由GGCCAAACCUCGGCUUACCUGAAAU(SEQ ID NO：171)组成的序列。
测试了DTX-C-042在体内诱导肌养蛋白基因的外显子23的外显子跳读以及随后提高肌养蛋白在与DMD相关的靶肌肉中的表达的能力。用单剂量的载剂对照(盐水)、10mg/kgASO剂量的DTX-C-042复合物、20mg/kg ASO剂量的DTX-C-042复合物或30mg/kg ASO剂量的DTX-C-042复合物静脉内注射DMD小鼠模型mdx小鼠。每个实验条件在四只mdx小鼠中重复。还用载剂对照(盐水)对四只野生型小鼠进行给药作为对照实验。
在处理之后十四天，使小鼠安乐死并收集靶肌肉组织。随后测定各肌肉组织样品的肌养蛋白基因的外显子23的跳读百分比(图5)。另外，还量化了靶肌肉中的肌养蛋白水平(图6A至6B中示出了对四头肌中肌养蛋白的定量)。
用DTX-C-042复合物处理的小鼠表现出四头肌、膈肌和心肌中外显子23的外显子跳读百分比的剂量依赖性提高。用DTX-C-042复合物处理的小鼠还表现出四头肌中肌养蛋白表达的剂量依赖性提高，其中在用30mg/kg ASO当量DTX-C-042处理的小鼠中，肌养蛋白平均值>4％。
这些数据表明，抗体-ASO复合物的抗转铁蛋白受体抗体能够在体内mdx小鼠模型中将复合物细胞内化至肌肉特异性组织中，从而允许外显子23PMO ASO诱导DMD的外显子23的外显子跳读。这些数据还表明抗体-ASO复合物能够特异性地靶向肌肉组织。
实施例6：用肌肉靶向复合物靶向DMD以表明在mdx小鼠模型中的功能性益处
用单剂量的载剂对照(盐水)、MDX-ASO(裸外显子23跳读PMO ASO，30mg/kg)或如实施例5中所述的DTX-C-042复合物(与外显子23跳读PMO连接的抗转铁蛋白受体抗体RI7217Fab，30mg/kg ASO当量)静脉内注射mdx小鼠(DMD小鼠模型；患病小鼠)。每个实验条件在五只mdx小鼠中重复。还用载剂对照(盐水)对五只野生型小鼠(健康小鼠)进行给药。
在注射之后两周和四周，使用开阔场室实验(open field chamber experiment)确定所有经处理小鼠的功能活性。实验包括三个连续的阶段：(1)10分钟时段，在此期间将每只小鼠置于开阔场室中；(2)10分钟时段，在此期间对每只小鼠进行后肢疲劳挑战；以及(3)10分钟时段，在此期间将每只小鼠置于开阔场室中。收集阶段(1)和(3)期间行进的总水平距离。在第一次与第二次测试之间行进的总距离的百分比变化。如图7A中所示，在两周时间点时，用盐水处理的野生型小鼠相对于阶段(1)在阶段(3)期间行进的平均值为约20％更少；用盐水处理的mdx小鼠相对于阶段(1)在阶段(3)期间行进情况的平均值为约70％更少；用MDX-ASO处理的mdx小鼠相对于阶段(1)在阶段(3)期间行进情况的平均值为约85％更少；以及用DTX-C-042处理的mdx小鼠相对于阶段(1)在阶段(3)期间行进情况的平均值为约40％更少。当与用盐水处理的野生型小鼠相比时，用盐水处理的mdx小鼠表现显著更差(如通过相对于阶段(1)在阶段(3)中行进的距离显著减少所示)。该观察结果与DMD患者所经历的运动功能受损一致。用裸MDX-ASO处理的mdx小鼠显示出与用载剂处理的小鼠相同的受损功能性能。相比之下，用DTX-C-042处理的mdx小鼠的性能与经载剂处理的野生型小鼠无统计学差异。如图7B中所示，在4周时间点时，用盐水处理的野生型小鼠相对于阶段(1)在阶段(3)期间行进的平均值为约35％更少；用盐水处理的mdx小鼠相对于阶段(1)在阶段(3)期间行进情况的平均值为约80％更少；用MDX-ASO处理的mdx小鼠相对于阶段(1)在阶段(3)期间行进情况的平均值为约55％更少；以及用DTX-C-042处理的mdx小鼠相对于阶段(1)在阶段(3)期间行进情况的平均值为约50％更少。
在注射之后两周和四周，使用笼式跑轮测试(cage running wheel test)确定所有经处理小鼠的活性。将每只小鼠单独置于带有跑轮的笼中持续24小时时期。该24小时时期包含光照的五小时，随后是黑暗的十三小时，以及以光照的六小时结束。在整个24小时时期连续收集每只老鼠在跑轮上行进的总距离(以米(m)计)，并随后将其分成离散的一小时增量。如图7C中所示，在两周时间点时，用DTX-C-042处理的mdx小鼠行进的距离长于用MDX-ASO或盐水处理的mdx小鼠行进的距离，并且接近在某个时间下野生型小鼠所行进的距离。如图7D中所示，在四周时间点时，在黑暗时期(即，当小鼠活动时)期间，用DTX-C-042复合物处理的mdx小鼠行进的距离与用盐水处理的野生型小鼠行进的总距离密切相似(mirror)。这与用盐水或MDX-ASO处理的mdx小鼠形成对比，所述用盐水或MDX-ASO处理的mdx小鼠在黑暗期期间行进的距离显著更短。
还在注射之后两周和四周测试了本实施例中所有小鼠的肌酸激酶活性水平。野生型小鼠未从肌肉组织中分泌大量肌酸激酶。相反，mdx小鼠(具有患病的肌肉组织)分泌高水平的肌酸激酶，这可通过肌酸激酶酶活性的测定来观察到。如图7E中所示，相对于用盐水处理的野生型小鼠，用盐水处理的mdx小鼠在两周和四周之后分别具有约9倍和10倍高的肌酸激酶酶活性。用裸ASO给药对mdx小鼠未提供显著益处。然而，用DTX-C-042复合物复合物对mdx小鼠进行给药在两周和四周二者之后均提供了统计学上显著降低的肌酸激酶活性水平。
这些出人意料的结果显示，抗体-ASO复合物能够为患有DMD表型的小鼠(mdx小鼠)提供功能性益处，使得这些小鼠具有类似于健康(野生型)小鼠的表型指标。相对于裸PMO(MDX-ASO)，抗体-ASO复合物的性能表明抗体-ASO复合物的抗转铁蛋白受体抗体负责提供本实施例中所示的功能性益处。
实施例7：所选择的抗TfR1抗体对人TfR1的结合亲和力
针对Ka(结合速率常数)、Kd(解离速率常数)和KD(亲和力)的测量结果，测得所选择的抗TfR1抗体与人TfR1的结合亲和力。使用两种已知的抗TfR1抗体15G11和OKT9作为对照。结合实验在Carterra LSA上在25℃下进行。通过胺偶联在HC30M芯片上制备抗小鼠IgG和抗人IgG抗体“苔状物(lawn)”。IgG被捕获在芯片上。将hTfR1、cyTfR1和hTfR2的稀释系列注射至芯片用于结合(从1000nM开始，1：3稀释，8个浓度)。
结合数据通过以下进行参考：减去来自缓冲分析物注射剂的响应，并整体拟合到1：1朗缪尔结合模型(Langmuir binding model)，以用于使用CarterraTM动力学软件来评估Ka(结合速率常数)、Kd(解离速率常数)和KD(亲和力)。使用5至6个浓度以进行曲线拟合。
结果显示，小鼠mAb显示出与hTfR1的结合并且KD值为13pM至50nM。大多数小鼠mAb的KD值在个位数纳摩至亚纳摩范围内。受试小鼠mAb显示出与cyTfR1的交叉反应性结合并且KD值为16pM至22nM。
在表7中提供了抗TfR1抗体的Ka、Kd和KD值。
表7.抗TfR1抗体的Ka、Kd和KD值
名称 KD(M) Ka(M) Kd(M)
对照-15G11 2.83E-10 3.70E+05 1.04E-04
对照-OKT9 mIgG 5.36E-10 7.74E+05 4.15E-04
3-A04 4.36E-10 4.47E+05 1.95E-04
3-M12 7.68E-10 1.66E+05 1.27E-04
5-H12 2.08E-07 6.67E+04 1.39E-02
实施例8：抗TfR1抗体与寡核苷酸的缀合
产生了包含与工具寡核苷酸(ASO300)共价缀合的抗TfR1抗体的复合物。首先，抗TfR抗体克隆3-A4、3-M12和5-H12的Fab片段是通过在完整IgG的铰链区中或下方用酶切割小鼠单克隆抗体，然后进行部分还原来制备的。Fab被证实在亲合力或亲和力方面与mAb相当。
通过将抗TfR mAb与ASO300经组织蛋白酶可切割接头共价连接来产生肌肉靶向复合物。简言之，将双环[6.1.0]壬炔-PEG3-L-缬氨酸-L-瓜氨酸-五氟苯基酯(BCN-PEG3-Val-Cit-PFP)接头分子通过氨基甲酸酯键与ASO300偶联。通过切向流过滤(TFF)除去过量的接头和有机溶剂。然后将经纯化的Val-Cit-接头-ASO与叠氮化物功能化抗转铁蛋白受体抗体偶联，所述叠氮化物功能化抗转铁蛋白受体抗体通过用叠氮化物-PEG4-PFP修饰赖氨酸上的ε-胺而产生。还使用15G11产生了阳性对照肌肉靶向复合物。
然后对抗体偶联反应的产物进行两种纯化方法以除去游离抗体和游离载荷。通过Nanodrop A280或BCA蛋白测定(针对抗体)和Quant-It Ribogreen测定(针对载荷)确定缀合物的浓度。计算对应的药物抗体比(DAR)。DAR为0.8至2.0，并进行了标准化以使得所有样品均接受等量的载荷。
然后测试经纯化的复合物的细胞内化和对靶基因DMPK的抑制。使非人灵长类(NHP)或DM1(由DM1患者捐赠)细胞在96孔板中生长，并分化成肌管，持续7天。然后用递增浓度(0.5nM、5nM、50nM)的各复合物处理细胞72小时。收获细胞，分离RNA，并进行逆转录以产生cDNA。在QuantStudio 7上使用对Ppib(对照)和DMPK具有特异性的TaqMan试剂盒进行qPCR。计算经处理与未经处理细胞中剩余DMPK转录物的相对量，并在表12中示出结果。
结果表明，抗TfR1抗体能够靶向肌细胞，被具有分子载荷(工具寡核苷酸ASO300)的肌细胞内化，并且分子载荷能够靶向并敲低靶基因(DMPK)。可使用与本文中所述相同的测定(例如，通过使用表14中所述、由SEQ ID NO:437至1241中任一个提供，或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补的任一种寡核苷酸)来测试复合物的敲低活性，所述复合物包含与靶向DMD的分子载荷(例如，寡核苷酸)缀合的抗TfR1抗体。
表12.抗TfR1抗体的结合亲和力和缀合物的效力
Figure GDA0004266820060002121
令人感兴趣的是，DMPK敲低结果显示抗TfR与转铁蛋白受体的结合亲和力与将DMPK ASO递送至细胞以进行DMPK敲低的效力之间缺乏相关性。出乎意料的是，与对照抗体15G11相比，本文中提供的抗TfR抗体(例如，至少3-A4、3-M12和5-H12)在将载荷(例如，DMPKASO)递送至靶细胞以及在食蟹猴细胞或人DM1患者细胞中实现分子载荷的生物学作用(例如，DMPK敲低)方面表现出优异的活性，尽管这些抗体与对照抗体15G11对人或食蟹猴转铁蛋白受体的结合亲和力相当(或者，在某些情况下，例如5-H12，结合亲和力更低)。
顶级属性(top attribute)例如高huTfR1亲和力、NHP和DM1患者细胞系中DMPK的敲低>50％、鉴定的与3种独特序列结合的表位、低/无预测的PTM位点以及良好的表达和缀合效率导致选择前3个克隆3-A4、3-M12和5-H12用于人源化。
实施例9：人源化抗TfR1抗体
对表2中示出的抗TfR抗体进行人源化和诱变以降低可制造性可能性。筛选人源化变体并测试其结合特性和生物活性。使用Composite Human Technology设计抗TfR1重链和轻链可变区的人源化变体(各5个变体)。合成编码具有这些重链和轻链可变区的Fab的基因，并构建载体以表达每个人源化的重链和轻链变体。随后，小规模表达每个载体，并分析所得的人源化抗TfR1 Fab。基于数项标准选择人源化的Fab用于进一步测试，所述标准包括针对靶抗原的抗体亲和力的Biocore测定、相对表达、与人种系序列的同源性百分比以及预测的MHC II类T细胞表位的数目(使用iTopeTMMCH II类进行计算机分析确定)。
通过在重链和轻链可变区中引入氨基酸替换，在一些抗体的亲本序列中确定了潜在可能性。这些替换是基于相对表达水平、iTopeTM评分和来自Biacore单循环动力学分析的相对KD选择的。测试人源化变体并最初基于对靶抗原的亲和力选择变体。随后，基于对每个分析变体(在表16和表17中示出)的聚集和降解的稳定性和易感性的一系列生物物理学评估进一步筛选选择的人源化Fab。通过动力学分析分析选择的Fab与TfR1的结合特性。这些分析的结果在表13中示出。对于表16和表17中示出的缀合物，将选择的人源化Fab与DMPK靶向寡核苷酸ASO300缀合。如由在暴露于高温(40℃)持续9天之后与暴露之前相比对人和食蟹猴TfR1具有相当的结合亲和力所示，选择的Fab具有热稳定性(参见表13)。
表16.人源化的抗TfR Fab的生物物理评估数据
Figure GDA0004266820060002131
/>
Figure GDA0004266820060002141
*在缀合之后恢复食蟹猴结合；
表17.人源化的抗TfR Fab和缀合物的热稳定性
Figure GDA0004266820060002142
/>
Figure GDA0004266820060002151
/>
Figure GDA0004266820060002161
表13.与TfR1结合的人源化抗TfR Fab的动力学分析
人源化抗TfR Fab ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M) RMAX Chi2(RU2)
3A4(VH3/Vk4) 7.65E+10 1.15E+02 1.50E-09 48.0 0.776
3A4(VH3-N54S/Vk4) 4.90E+10 6.56E+01 1.34E-09 49.4 0.622
3A4(VH3-N54T/Vk4) 2.28E+05 7.05E-04 3.09E-09 61.1 1.650
3M12(VH3/Vk2) 2.64E+05 1.04E-04 3.95E-10 78.4 0.037
3M12(VH3/Vk3) 2.42E+05 8.34E-05 3.45E-10 91.1 0.025
3M12(VH4/Vk2) 2.52E+05 9.98E-05 3.96E-10 74.8 0.024
3M12(VH4/Vk3) 2.52E+05 8.61E-05 3.41E-10 82.4 0.030
5H12(VH5-C33D/Vk4) 6.78E+05 6.72E-04 9.91E-10 49.3 0.093
5H12(VH5-C33Y/Vk3) 1.95E+05 1.22E-04 6.27E-10 68.5 0.021
5H12(VH5-C33Y/Vk4) 1.86E+05 1.17E-04 6.26E-10 75.2 0.026
人源化抗TfR1 Fab与TfR1的结合(ELISA)
为了测量人源化抗TfR抗体与TfR1的结合，进行ELISA。首先用100μL/孔的在PBS中的1μg/mL重组huTfR1包被高结合、黑色、平底的96孔板(Coming#3925)，并在4℃下孵育过夜。将孔清空并去除残余液体。通过向每个孔添加200μL在PBS中的1％BSA(w/w)进行封闭。允许在室温下在300rpm的振荡器上进行封闭2小时。在封闭之后，去除液体并将孔用300μLTBST洗涤3次。然后在0.5％BSA/TBST中以8点连续稀释(稀释范围5μg/mL至5ng/mL)一式三份添加抗TfR1抗体。ELISA板上还包括阳性对照和同种型对照。将板在室温下在轨道振荡器上以300rpm孵育60分钟，并将板用300μL TBST洗涤3次。将抗(H+L)IgG-A488(1：500)(Invitrogen#A11013)在TBST中的0.5％BSA中稀释，并向每个孔添加100μL。然后允许板在轨道振荡器上以300rpm在室温下孵育60分钟。去除液体并将板用300μL TBST洗涤四次。然后在板读取器上在495nm激发和50nm发射(具有15nm带宽)下测量吸光度。记录数据并分析EC50。人源化3M12、3A4和5H12 Fab与人TfR1(hTfR1)结合的数据分别在图9A、9C和9E中示出。根据上述针对hTfR1的相同方案，使用食蟹猴(Macaca fascicularis)TfR1(cTfR1)进行ELISA测量，并在图9B、9D和9F中示出结果。
有关人源化抗TfR Fab与hTfR1和cTfR1结合的这两组ELISA分析的结果表明，人源化3M12 Fab显示出与hTfR1和cTfR1二者的一致结合，并且人源化3A4 Fab显示出相对于hTfR1的与cTfR1的结合降低。
使用六种人源化抗TfR Fab制备抗体-寡核苷酸缀合物，其中每一种均与DMPK靶向寡核苷酸ASO300缀合。对缀合效率和下游纯化进行表征并测量产物缀合物的多种特性。结果表明，所有10个受试变体的结合效率均是稳健的，并且纯化过程(疏水相互作用色谱，随后是羟基磷灰石树脂色谱)是高效的。如通过尺寸排阻色谱分析的，纯化的缀合物显示出>97％的纯度。
在细胞摄取实验中测试了数种人源化Fab来评价TfR1介导的内化。为了测量这种由抗体介导的细胞摄取，将人源化抗TfR Fab缀合物用Cypher5e(pH敏感性染料)标记。将横纹肌肉瘤(RD)细胞用100nM缀合物处理4小时，胰蛋白酶化，洗涤两次，并通过流式细胞术分析。使用Attune NxT软件计算平均Cypher5e荧光(代表摄取)。如图10中所示，人源化抗TfRFab与阳性对照抗TfR1 Fab相比显示出相似或更高的内体摄取。对于不同的寡核苷酸载荷观察到了类似的内化效率。抗小鼠TfR抗体用作阴性对照。冷(非内化)条件消除了阳性对照抗体缀合物的荧光信号(数据未显示)，表明阳性对照和人源化抗TfR Fab缀合物中的阳性信号是由于Fab缀合物的内化引起的。类似地，诱导DMD外显子跳读的寡核苷酸也可缀合人源化抗TfR Fab以用于被肌细胞摄取。
还通过ELISA测试了六种人源化抗TfR Fab的缀合物与hTfR1和cTfR1的结合，并与人源化Fab的未缀合形式进行了比较。结果表明，人源化3M12和5H12 Fab在缀合之后相对于其未缀合形式保持相似的hTfR1和cTfR1结合水平(3M12，图11A和11B；5H12，图11E和11F)。令人感兴趣的是，3A4克隆在缀合之后相对于其未缀合形式显示出与cTfR1的结合提高(图11C和11D)。
本实施例中使用的术语“未缀合的”表示抗体未与寡核苷酸缀合。
实施例10.抗体-寡核苷酸缀合物体外促进DMPK mRNA水平的敲低
将含有人源化抗TfR Fab 3M12(VH3/Vk2)、3M-12(VH4/Vk3)和3A4(VH3-N54S/Vk4)的缀合物与DMPK靶向寡核苷酸ASO300缀合，并在横纹肌肉瘤(RD)细胞中测试对DMPK转录物表达的敲低。抗体通过式(C)中示出的接头与ASO300缀合。
在具有谷氨酰胺、补充有10％ FBS和青霉素/链霉素的DMEM生长培养基中培养RD细胞直至接近汇合。然后将细胞以每孔20K个细胞接种到96孔板中，并使其恢复24小时。然后将细胞用缀合物处理3天。从细胞收集总RNA，合成cDNA并通过qPCR测量DMPK表达。
图12中的结果示出相对于在经PBS处理的细胞中的表达，在用每种指定缀合物处理的细胞中的DMPK表达水平降低，表明人源化抗TfR Fab能够介导RD细胞摄取DMPK靶向寡核苷酸并且内化的DMPK靶向寡核苷酸在敲低DMPK mRNA水平方面是有效的。
类似地，诱导DMD外显子跳读的寡核苷酸也可缀合人源化抗TfR Fab以用于递送至肌细胞并在肌细胞中诱导DMD外显子跳读。
实施例11.抗TfR-寡核苷酸缀合物处理提高了DMD的mdx小鼠模型中的肌养蛋白表达
为了测试在体内诱导DMD外显子跳读的另一种寡核苷酸的作用，将诱导外显子23跳读的寡核苷酸(PMO)作为裸寡核苷酸或与抗小鼠TfR抗体缀合以施用于DMD的mdx小鼠模型。测量肌养蛋白表达。如western印迹所示(图14)和在图15中所定量的，由缀合物促进的外显子跳读导致肌养蛋白的剂量依赖性产生。α-肌动蛋白用作上样对照。
在mdx小鼠中，所施用的单剂量的外显子23-缀合物除了提高总体肌养蛋白水平之外，还恢复了肌养蛋白向肌细胞膜的表达，如图16中所示。对四头肌中肌养蛋白的免疫荧光染色表明，用缀合物处理的mdx小鼠比用裸寡核苷酸或盐水处理的小鼠在其四头肌中具有更高的肌养蛋白水平。
实施例12.DMD肌管中寡核苷酸介导的外显子跳读
促进细胞核中特定DMD外显子的跳读可使得肌细胞产生更完整的功能性肌养蛋白。将诱导DMD外显子51跳读的寡核苷酸(PMO)与抗TfR1 Fab缀合，并在具有适合于外显子51跳读的突变的人DMD肌管中测试缀合物。如图13中所示，与用等摩剂量的裸寡核苷酸处理后外显子跳读提高25％相比，用缀合物处理导致外显子跳读提高50％(p值＝0.001)。在DMD的mdx小鼠模型中观察到类似的结果，例如图5中所示的那些。
实施例13.连接抗TfR抗体与分子载荷的接头的血清稳定性
在一些实例中与抗体连接的寡核苷酸通过式(C)中示出的可切割接头缀合。重要的是，接头在血清中维持稳定性并提供释放动力学，这有利于在靶肌细胞中积累足够的载荷。这种血清稳定性对于全身静脉内施用、经缀合寡核苷酸在血流中的稳定性、向肌肉组织的递送和治疗性载荷在肌细胞中的内化是重要的。已证实该接头有助于将多种类型的载荷(包括ASO、siRNA和PMO)精确地与Fab缀合。这种灵活性使得能够合理选择适当类型的载荷来解决各肌肉疾病的遗传基础。另外，接头和缀合化学允许针对每种类型的载荷优化所连接载荷分子与各Fab之比，并能够实现分子的快速设计、产生和筛选，以能够用于多种肌肉疾病应用。
图8示出了体内接头的血清稳定性，其在静脉内给药之后72小时的过程中在多种物种之间是可比的。在每种情况下在给药之后72小时测量到至少75％的稳定性。
实施例14.DMD患者肌管中抗TfR缀合物的外显子跳读活性
在该研究中，评价了包含与DMD外显子51跳读寡核苷酸缀合的抗TfR Fab(3M12VH3/Vκ2、3M12 VH4/Vκ3和3A4 VH3 N54S/Vκ4)的抗TfR缀合物的外显子跳读活性。将携带外显子51缺失的永生化人成肌细胞解冻并以1e6个细胞/瓶的密度接种在Promocell骨骼细胞生长培养基(含5％ FBS和1×Pen-Strep)中，并使其生长至汇合。一旦汇合，就将细胞进行胰蛋白酶化并通过离心进行沉淀并重悬在新鲜Promocell骨骼细胞生长培养基中。对细胞数进行计数并将细胞以50k个细胞/孔的密度接种到经基质胶包被的96孔板中。使细胞恢复24小时。通过抽吸生长培养基并用不含血清的分化培养基替代来诱导细胞分化。然后将细胞用10μM的经缀合或未经缀合的DMD外显子跳读寡核苷酸处理。将细胞与测试品一起孵育十天，然后从96孔板收获总RNA。对75ng总RNA进行cDNA合成，并进行突变特异性PCR以评价每种细胞类型中外显子51跳读的程度。将突变特异性PCR产物在4％琼脂糖凝胶上运行，并使用SYBR gold使其显现。使用密度测定法来计算跳读和未跳读的扩增子的相对量，并将外显子跳读确定为外显子51跳读的扩增子除以存在的扩增子总量的比：
Figure GDA0004266820060002201
结果表明，在患者肌管中，与未缀合的DMD外显子跳读寡核苷酸相比，具有与DMD外显子51-跳读寡核苷酸共价连接的3M12 VH3/Vκ2或3M12 VH4/Vκ3Fab的缀合物引起外显子跳读增强(图17)。
本实施例中使用的术语“未缀合的”表示寡核苷酸未与抗体缀合。
实施例15.抗TfR Fab 3M12 VH4/Vk3的结合活性的表征
进行体外研究以测试抗TfR Fab 3M12 VH4/Vκ3对人和食蟹猴TfR1结合的特异性，并确定其对人TfR1 vs TfR2的选择性。使用酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)确定抗TfR Fab3M12 VH4/Vκ3与来自不同物种的TfR1的结合亲和力。将Fab的连续稀释物添加至用重组人、食蟹猴、小鼠或大鼠的TfR1预包被的板。在短暂孵育之后，通过添加荧光标记的抗(H+L)IgG二抗并测量495nm激发和520nm发射处的荧光强度来量化Fab的结合。Fab显示出对人和食蟹猴的TfR1的强结合亲和力，并且未观察到小鼠或大鼠的TfR1的可检测结合(图18)。还进行了表面等离子共振(surface plasmonresonance，SPR)测量，并将结果在表18中示出。Fab针对人TfR1受体的Kd计算为7.68×10- 10M，以及针对食蟹猴TfR1受体的Kd计算为5.18×10-9M。
表18.使用表面等离子共振测量的与人和食蟹猴TfR1或人TfR2结合的抗TfR Fab3M12 VH4/Vk3的动力学分析
Figure GDA0004266820060002211
ND＝通过SPR未检测到结合(10pM至100uM)
为了测试抗TfR Fab 3M12 VH4/Vk3与人TfR2的交叉反应性，进行了ELISA。将重组人TfR2蛋白以2μg/mL接种过夜，并用PBS中的1％牛血清白蛋白(BSA)封闭1小时。在0.5％BSA/TBST中添加Fab或阳性对照抗TfR2抗体的连续稀释物，持续1小时。在洗涤之后，以1:500稀释度在0.5％ BSA/TBST中添加抗(H+L)IgG-A488(Invitrogen#MA5-25932)荧光二抗，并将板孵育1小时。使用Biotek Synergy板读取器在495nm激发和520nm发射下测量相对荧光。未观察到抗TfR Fab3M12 VH4/Vk3与hTfR2的结合(图19)。
实施例16.抗TfR Fab-ASO缀合物的血清稳定性
抗TfR FabVH4/Vk3通过式(C)中示出的接头与对照反义寡核苷酸(ASO)缀合，并针对将Fab与ASO缀合的接头测试所得缀合物的稳定性。通过在PBS中或者在大鼠、小鼠、食蟹猴或人血清中孵育荧光标记的缀合物并测量随时间的相对荧光强度来测量血清稳定性，其中较高的荧光指示更多的缀合物保持完整。图20示出多个物种中的血清稳定性相似，并且在72小时之后仍然很高。
实施例17.食蟹猴中抗TfR Fab-ASO缀合物的体内外显子跳读活性
将抗TfR Fab 3M12 VH4/Vk3与肌养蛋白(DMD)外显子51-跳读反义寡核苷酸(ASO)缀合，所述肌养蛋白(DMD)外显子51-跳读反义寡核苷酸(ASO)靶向SEQ ID NO:419所示的ESE。外显子51跳读寡核苷酸是长度为30个核苷酸的磷酸二酰胺吗啉代寡聚物(PMO)。在健康的非人灵长类中体内测试缀合物的外显子跳读活性。在第1天和第8天，通过静脉输注向原初雄性食蟹猴(每组n＝4至5只)施用两剂量的载剂、单独的30mg/kg ASO、或122mg/kg缀合物(相当于30mg/kg ASO)。在施用第一剂量之后2周或4周处死动物并收获组织。使用Promega
Figure GDA0004266820060002221
RSC仪器从组织样品收集总RNA，并使用qScript cDNA SuperMix进行cDNA合成。使用终点PCR进行外显子51跳读的评估。
PCR产物的毛细管电泳用于评估外显子跳读，并且使用下式计算外显子51跳读百分比：
Figure GDA0004266820060002222
表19中示出了计算的外显子51跳读结果。
表19.食蟹猴肌养蛋白中肌养蛋白的外显子51跳读
Figure GDA0004266820060002231
a ASO＝反义寡核苷酸。
b缀合物剂量作为抗TfR Fab 3M12 VH4/Vk3-ASO缀合物的mg/kg列出。
c ASO剂量作为mg/kg的抗TfR Fab 3M12 VH4/Vk3-ASO剂量的ASO等同物列出。
d外显子跳读值是外显子51跳读的平均％，其中括号中为标准偏差(n＝5)。
还使用杂交ELISA和与ASO序列互补的探针对组织ASO累积进行定量。生成标准曲线并从标准曲线的线性回归导出ASO水平(以ng/g计)。与施用未缀合的ASO相比，在施用抗TfR Fab VH4/Vk3-ASO缀合物之后，ASO以更高水平分布到所有评价的组织。在施用第一剂量之后2周和4周在所有评价的组织中，静脉内施用未缀合的ASO导致ASO水平接近背景水平。抗TfR Fab VH4/Vk3-ASO缀合物的施用导致在第一次给药之后2周ASO以以下排列顺序分布在评价的组织中：心脏>膈肌>二头肌>四头肌>腓肠肌>胫骨前肌。还评估了组织浓度的持续时间。四头肌、二头肌和膈肌中的ASO浓度在评价的时间段(2至4周)内下降小于50％，而心脏、胫骨前肌和腓肠肌中的ASO水平几乎保持不变(表20)。
本实施例中使用的术语“未缀合的”表示寡核苷酸未与抗体缀合。
表20.食蟹猴中DMD外显子51跳读ASO的组织分布
Figure GDA0004266820060002241
a ASO＝反义寡核苷酸。
b缀合物剂量作为mg/kg的抗TfR Fab 3M12 VH4/Vk3 ASO缀合物列出。
c ASO剂量作为mg/kg的ASO或抗TfR Fab 3M12 VH4/Vk3-ASO缀合物剂量的ASO等同物列出。
d ASO值是组织中ASO的平均浓度(以ng/g计)，其中括号中为标准偏差(n＝5)。
实施例18.包含与诱导DMD外显子23跳读的寡核苷酸缀合的抗TfR1Fab的缀合物对mdx小鼠中生物标志物表达和肌肉功能的影响
本研究的目的是确定单剂量的与反义寡核苷酸缀合的抗小鼠TfR Fab(Ab-ASO)或单剂量的相同裸ASO对mdx小鼠中肌养蛋白表达和肌肉功能的影响。本实施例中使用的复合物为如实施例5中所述的DTX-C-042。
将七周龄的雄性mdx纯合小鼠随机分配到八个处理组的每一个组。通过尾静脉向小鼠施用单剂量的30mg/kg ASO、剂量相当于30mg/kg ASO的Ab-ASO或盐水。在施用之后2周或4周收获组织并进行分析。
肌肉中外显子23跳读的测量：以75ng总RNA输入，使用
Figure GDA0004266820060002251
III(ThermoFisher)，使用单步RT-PCR反应进行外显子23跳读的定量。使用的PCR引物为5’-CACATCTTTGATGGTGTGAGG(正向)(SEQ ID NO：2264)和5’-CAACTTCAGCCATCCATTTCTG(反向)(SEQ ID NO：2253)。毛细管电泳用于使用以下等式对目的骨骼肌中的跳读带和未跳读带进行定量：
Figure GDA0004266820060002252
结果表明，抗TfR Fab-寡核苷酸缀合物(Ab-ASO)的单次施用促进了mdx小鼠的四头肌(图21A)、心脏(图21B)和膈肌(图21C)中外显子23跳读的显著提高。相比之下，在野生型(WT)小鼠或用盐水或裸ASO处理的mdx小鼠的相同肌肉组织中观察到很少或没有观察到外显子23跳读。
肌肉中肌养蛋白的测量：将从四头肌获取的肌肉组织样品均质化，并通过BCA测定测量蛋白质浓度。将总蛋白(25μg)上样到3％至8％Tris-乙酸蛋白凝胶上，并在150V下运行1小时。然后将凝胶转移到聚偏二氟乙烯膜上，并将膜切下，然后将含有肌养蛋白的部分在抗肌养蛋白抗体(Abcam目录号#15277)中在4℃下孵育过夜，然后是在山羊抗兔IgG(H+L)辣根过氧化物酶缀合物(Bio-Rad)中在室温下孵育30分钟。作为对照，将剩余的印迹部分与抗α-辅肌动蛋白抗体(Abcam目录号#9465)在4℃下孵育过夜，然后是与山羊抗小鼠IgG(H+L)辣根过氧化物酶缀合物(Bio-Rad)在室温下孵育15分钟。使用ECL Western检测试剂盒(Cytiva)使印迹显影，并使用iBright分析软件(Thermo Fisher Scientific)进行量化。图22A(四头肌)、23A(心脏)和24A(膈肌)中示出了在注射之后两周收集的肌肉组织的Western印迹的图像以及图22B(四头肌)、23B(心脏)和24B(膈肌)中示出了对Western印迹结果的量化。图22C(四头肌)、23C(心脏)和25C(膈肌)示出了在注射之后四周收集的肌肉组织的Western印迹的图像以及图22D(四头肌)、23D(心脏)和24D(膈肌)示出了对Western印迹结果的量化。在每个western印迹中，标准曲线是使用来自野生型和mdx组织的合并蛋白质生成的，并且每个标准品中的野生型蛋白质百分比(％WT)表示样品中野生型蛋白质的量。图22A至22D表明，在施用之后两周和四周，Ab-ASO比未缀合的ASO在更大程度上促进四头肌中肌养蛋白的提高。图23A至23D表明，在施用之后两周和四周，Ab-ASO促进了心肌中肌养蛋白的提高，而在来自用裸ASO处理的小鼠的心肌中很少测量到至没有测量到野生型肌养蛋白。图24A至24D表明，在施用之后两周和四周，Ab-ASO促进了膈肌中肌养蛋白的提高，而在来自用裸ASO处理的小鼠的膈肌中很少测量到至没有测量到野生型肌养蛋白。
组织内ASO含量的测量：通过用对目的ASO具有特异性的捕获探针包被经NeutrAvidin包被的板来进行酶联免疫吸附测定(ELISA)。在经包被的板上孵育蛋白酶K消化的组织裂解物以使目的ASO与捕获探针结合。然后洗涤板并用微球菌核酸酶消化未结合的捕获探针，然后进一步洗涤和封闭。添加地高辛HRP缀合抗体以与完整的捕获探针结合，然后使用TMB底物(R&D Systems,Inc.)成像。使用稀释到骨骼肌基质中的已知浓度的标准曲线进行定量。结果表明，施用Fab缀合物能够实现四头肌(图25A)、膈肌(图25B)和心脏(图25C)内ASO的大量积累，而施用裸ASO显示为在每个肌肉组织中具有很少含量或没有ASO含量。这些结果表明，在施用盐水或裸ASO的小鼠的肌肉组织中检测到很少或检测不到ASO，而施用Ab-ASO导致在施用之后两周和四周测试的每个组织中的可测量量的ASO。
实施例19.DMD外显子53跳读寡核苷酸与抗TfR1抗体的缀合提高了它们的效力
为了测试抗TfR1靶向对外显子53跳读寡核苷酸的作用，形成了这样的复合物，其包含通过具有式(C)结构的接头与外显子53跳读PMO共价连接的抗TfR1 Fab抗体(3M12VH4/Vk3)。本实施例中使用了两种外显子53跳读PMO：外显子53PMO-A，其包含序列GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC(SEQ ID NO：2256)，和外显子53PMO-B，其包含序列CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC(SEQ ID NO：2257)。
首先，测试单独的外显子53跳读PMO在gymnotic摄取(即，没有转染剂或修饰以赋予肌肉靶向)之后促进外显子53跳读的能力。用一系列浓度的外显子53PMO-A或外显子53PMO-B处理携带DMD外显子52缺失的KM1328DMD患者细胞，并测量外显子53跳读。如图26中所示，外显子53PMO-A的效力是外显子53PMO-B的约2倍强。基于剂量响应曲线，计算出外显子53PMO-A的浓度为2.5μM或外显子53PMO-B的浓度为4.7μM是实现外显子53的50％跳读所需的。
接下来，测试了包含与外显子53PMO-A或外显子53PMO-B共价连接的抗TfR1 Fab的复合物(“抗TfR1 Fab-ASO复合物”)与未与抗体连接的相同PMO(“裸ASO”)相比促进KM1328DMD患者细胞中外显子53的跳读的能力。将细胞用浓度为0.16μM、0.32μM、0.63μM或1.25μM的裸ASO处理，或者用ASO等效浓度为0.16μM、0.32μM、0.63μM或1.25μM的抗TfR1 Fab-ASO复合物处理。如图27中所示，在每个测试浓度下，Fab-ASO复合物比裸ASO实现了更大的外显子53跳读，包括在较低测试剂量(0.16μM、0.32μM和0.63μM)下通过外显子53PMO-A实现了显著改善的外显子53跳读。这些结果表明，将外显子跳读寡核苷酸与抗TfR1抗体共价连接可在较低剂量下促进外显子跳读活性，从而使寡核苷酸能够在较低剂量下发挥效力。
另一些实施方案
1.复合物，其包含与分子载荷共价连接的肌肉靶向剂，所述分子载荷被配置成用于促进DMD基因的表达或活性，其中所述肌肉靶向剂与肌细胞上的内化细胞表面受体特异性结合，其中所述肌肉靶向剂是人源化抗体，其中所述抗体包含：
(i)含有与SEQ ID NO：69具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)；和/或含有与SEQ ID NO：70具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(ii)含有与SEQ ID NO:71具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)；和/或含有与SEQ ID NO:70具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(iii)含有与SEQ ID NO:72具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)；和/或含有与SEQ ID NO:70具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(iv)含有与SEQ ID NO:73具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)；和/或含有与SEQ ID NO:74具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(v)含有与SEQ ID NO:73具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)；和/或含有与SEQ ID NO:75具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(vi)含有与SEQ ID NO:76具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)；和/或含有与SEQ ID NO:74具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(vii)含有与SEQ ID NO:76具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)；和/或含有与SEQ ID NO:75具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(viii)含有与SEQ ID NO:77具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)；和/或含有与SEQ ID NO:78具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(ix)含有与SEQ ID NO:79具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)；和/或含有与SEQ ID NO:80具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；或者
(x)含有与SEQ ID NO:77具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)；和/或含有与SEQ ID NO:80具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
2.实施方案1所述的复合物，其中所述抗体包含：
(i)含有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VL；
(ii)含有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VL；
(iii)含有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:70的氨基酸的VL；
(iv)含有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的VL；
(v)含有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的VL；
(vi)含有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的VL；
(vii)含有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的VL；
(viii)含有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的VL；
(ix)含有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的VL；或者
(x)含有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的VL。
3.实施方案1或实施方案2所述的复合物，其中所述抗体选自全长IgG、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、scFv和Fv。
4.实施方案3所述的复合物，其中所述抗体是全长IgG，任选地其中所述全长IgG包含同种型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区。
5.实施方案4所述的复合物，其中所述抗体包含：
(i)含有与SEQ ID NO:84具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链；和/或含有与SEQ ID NO:85具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链；
(ii)含有与SEQ ID NO:86具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链；和/或含有与SEQ ID NO:85具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链；
(iii)含有与SEQ ID NO:87具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链；和/或含有与SEQ ID NO:85具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链；
(iv)含有与SEQ ID NO:88具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链；和/或含有与SEQ ID NO:89具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链；
(v)含有与SEQ ID NO:88具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链；和/或含有与SEQ ID NO:90具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链；
(vi)含有与SEQ ID NO:91具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链；和/或含有与SEQ ID NO:89具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链；
(vii)含有与SEQ ID NO:91具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链；和/或含有与SEQ ID NO:90具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链；
(viii)含有与SEQ ID NO:92具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链；和/或含有与SEQ ID NO:93具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链；
(ix)含有与SEQ ID NO:94具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链；和/或含有与SEQ ID NO:95具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链；或者
(x)含有与SEQ ID NO:92具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链；和/或含有与SEQ ID NO:95具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链。
6.实施方案3所述的复合物，其中所述抗体是Fab片段。
7.实施方案6所述的复合物，其中所述抗体包含：
(i)含有与SEQ ID NO:97具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链；和/或含有与SEQ ID NO:85具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链；
(ii)含有与SEQ ID NO:98具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链；和/或含有与SEQ ID NO:85具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链；
(iii)含有与SEQ ID NO:99具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链；和/或含有与SEQ ID NO:85具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链；
(iv)含有与SEQ ID NO:100具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链；和/或含有与SEQ ID NO:89具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链；
(v)含有与SEQ ID NO:100具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链；和/或含有与SEQ ID NO:90具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链；
(vi)含有与SEQ ID NO:101具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链；和/或含有与SEQ ID NO:89具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链；
(vii)含有与SEQ ID NO:101具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链；和/或含有与SEQ ID NO:90具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链；
(viii)含有与SEQ ID NO:102具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链；和/或含有与SEQ ID NO:93具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链；
(ix)含有与SEQ ID NO:103具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链；和/或含有与SEQ ID NO:95具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链；或者
(x)含有与SEQ ID NO:102具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链；和/或含有与SEQ ID NO:95具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链。
8.实施方案6或实施方案7所述的复合物，其中所述抗体包含：
(i)含有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的重链；和含有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的轻链；
(ii)含有SEQ ID NO:98的氨基酸序列的重链；和含有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的轻链；
(iii)含有SEQ ID NO:99的氨基酸序列的重链；和含有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的轻链；
(iv)含有SEQ ID NO:100的氨基酸序列的重链；和含有SEQ IDNO:89的氨基酸序列的轻链；
(v)含有SEQ ID NO:100的氨基酸序列的重链；和含有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链；
(vi)含有SEQ ID NO:101的氨基酸序列的重链；和含有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的轻链；
(vii)含有SEQ ID NO:101的氨基酸序列的重链；和含有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链；
(viii)含有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的重链；和含有SEQ ID NO:93的氨基酸序列的轻链；
(ix)含有SEQ ID NO:103的氨基酸序列的重链；和含有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的轻链；或者
(x)含有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的重链；和含有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的轻链。
9.实施方案1至8中任一项所述的复合物，其中所述抗体与所述转铁蛋白受体之结合的平衡解离常数(KD)为10-11M至10-6M。
10.实施方案1至9中任一项所述的复合物，其中所述抗体不与所述转铁蛋白受体的转铁蛋白结合位点特异性结合和/或其中肌肉靶向抗体不抑制转铁蛋白与所述转铁蛋白受体的结合。
11.实施方案1至10中任一项所述的复合物，其中所述抗体与人、非人灵长类和啮齿动物的转铁蛋白受体中的两种或更多种的胞外表位具有交叉反应性。
12.实施方案1至11中任一项所述的复合物，其中所述复合物被配置成促进转铁蛋白受体介导的所述分子载荷内化到肌细胞中。
13.实施方案1至12中任一项所述的复合物，其中所述抗体是嵌合抗体，任选地其中所述嵌合抗体是人源化单克隆抗体。
14.实施方案1至13中任一项所述的复合物，其中所述抗体是ScFv、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段或Fv片段的形式。
15.实施方案1至14中任一项所述的复合物，其中所述分子载荷是寡核苷酸。
16.实施方案15所述的复合物，其中所述寡核苷酸包含表14中列出的序列。
16.1.实施方案15所述的复合物，其中所述寡核苷酸包含SEQ ID NO:437至1241中任一个，或与SEQ ID NO:1242至2046中任一个互补。
17.实施方案16或实施方案16.1所述的复合物，其中所述寡核苷酸包含突变DMD等位基因之互补区。
18.实施方案1至14中任一项所述的复合物，其中所述分子载荷是多肽。
19.实施方案18所述的复合物，其中所述多肽是肌养蛋白的功能性片段。
20.实施方案15至17中任一项所述的复合物，其中所述寡核苷酸被配置成通过单外显子跳读或多外显子跳读来抑制DMD等位基因中的截短突变。
21.实施方案15至17中任一项所述的复合物，其中所述寡核苷酸促进反义介导的外显子跳读以产生框内肌养蛋白mRNA。
22.实施方案21所述的复合物，其中所述寡核苷酸促进DMD的外显子在外显子8至外显子55，任选地外显子23至外显子53的范围内的跳读。
23.实施方案22所述的复合物，其中所述寡核苷酸促进外显子8、外显子23、外显子44、外显子45、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53和/或外显子55的跳读。
24.实施方案21所述的复合物，其中所述寡核苷酸促进外显子51的跳读。
25.实施方案24所述的复合物，其中所述寡核苷酸促进外显子44至外显子53的范围内的多个外显子的跳读。
26.实施方案15至17或20至25中任一项所述的复合物，其中所述寡核苷酸包含至少一个经修饰核苷酸间键联。
27.实施方案26所述的复合物，其中所述至少一个经修饰核苷酸间键联是硫代磷酸酯键联。
28.实施方案27所述的复合物，其中所述寡核苷酸包含处于Rp立体化学构象和/或Sp立体化学构象的硫代磷酸酯键联。
29.实施方案28所述的复合物，其中所述寡核苷酸包含全部处于Rp立体化学构象或全部处于Sp立体化学构象的硫代磷酸酯键联。
30.实施方案15至17或20至29中任一项所述的复合物，其中所述寡核苷酸包含一个或更多个经修饰核苷酸。
31.实施方案30所述的复合物，其中所述一个或更多个经修饰核苷酸是2’-经修饰核苷酸。
32.实施方案15至17或20至31中任一项所述的复合物，其中所述寡核苷酸是在细胞中指导RNA酶H介导的对miRNA之切割的间隔聚体寡核苷酸，所述miRNA负调节DMD表达，任选地其中所述miRNA是miR-31。
33.实施方案32所述的复合物，其中所述间隔聚体寡核苷酸包含5至15个脱氧核糖核苷酸的中央部分，所述中央部分的侧翼是2至8个经修饰核苷酸的翼。
34.实施方案33所述的复合物，其中所述翼的经修饰核苷酸是2’-经修饰核苷酸。
35.实施方案15至17或20至31中任一项所述的复合物，其中所述寡核苷酸是混合聚体寡核苷酸。
36.实施方案35所述的复合物，其中所述混合聚体寡核苷酸促进外显子跳读。
37.实施方案35或36所述的复合物，其中所述混合聚体寡核苷酸包含两个或更多个不同的2’经修饰核苷酸。
38.实施方案15至22或20至31中任一项所述的复合物，其中所述寡核苷酸是在细胞中促进RNAi介导的对miRNA之切割的RNAi寡核苷酸，所述miRNA负调节DMD表达，任选地其中所述miRNA是miR-31。
39.实施方案38所述的复合物，其中所述RNAi寡核苷酸是长度为19至25个核苷酸的双链寡核苷酸。
40.实施方案38或39所述的复合物，其中所述RNAi寡核苷酸包含至少一个2’经修饰核苷酸。
41.实施方案31、34、37或40中任一项所述的复合物，其中每个2’经修饰核苷酸选自：2’-O-甲基、2’-氟(2’-F)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)和2’,4’-桥联核苷酸。
42.实施方案30所述的复合物，其中所述一个或更多个经修饰核苷酸是桥联核苷酸。
43.实施方案31、34、37或40中任一项所述的复合物，其中至少一个2’经修饰核苷酸是2’,4’-桥联核苷酸，其选自：2’,4’-约束性2’-O-乙基(cEt)和锁核酸(LNA)核苷酸。
44.实施方案15至17或20至31中任一项所述的复合物，其中所述寡核苷酸包含基因组编辑核酸酶的指导序列。
45.实施方案15至17或20至31中任一项所述的复合物，其中所述寡核苷酸是磷酸二酰胺吗啉代寡聚物。
46.实施方案1至45中任一项所述的复合物，其中所述肌肉靶向剂通过可切割接头与所述分子载荷共价连接。
47.实施方案46所述的复合物，其中所述可切割接头选自：蛋白酶敏感性接头、pH敏感性接头和谷胱甘肽敏感性接头。
48.实施方案47所述的复合物，其中所述可切割接头是蛋白酶敏感性接头。
49.实施方案48所述的复合物，其中所述蛋白酶敏感性接头包含可被溶酶体蛋白酶和/或内体蛋白酶切割的序列。
50.实施方案48所述的复合物，其中所述蛋白酶敏感性接头包含缬氨酸-瓜氨酸二肽序列。
51.实施方案47所述的复合物，其中所述接头是在4至6的pH下被切割的pH敏感性接头。
52.实施方案1至45中任一项所述的复合物，其中所述肌肉靶向剂通过不可切割接头与所述分子载荷共价连接。
53.实施方案52所述的复合物，其中所述不可切割接头是烷烃接头。
54.实施方案1至53中任一项所述的复合物，其中所述抗体包含与所述寡核苷酸共价连接的非天然氨基酸。
55.实施方案1至53中任一项所述的复合物，其中所述抗体与所述寡核苷酸共价连接，所述共价连接通过与所述抗体的赖氨酸残基或半胱氨酸残基的缀合进行。
56.实施方案55所述的复合物，其中所述寡核苷酸通过含马来酰亚胺的接头与所述抗体的半胱氨酸缀合，任选地其中所述含马来酰亚胺的接头包含马来酰亚胺基己酰基或马来酰亚胺基甲基环己烷-1-羧酸根基团。
57.实施方案1至56中任一项所述的复合物，其中所述抗体是包含至少一个糖部分的糖基化抗体，所述寡核苷酸与所述糖部分共价连接。
58.实施方案57所述的复合物，其中所述糖部分是支化的甘露糖。
59.实施方案57或58所述的复合物，其中所述抗体是包含一至四个糖部分的糖基化抗体，每个所述糖部分均与单独的寡核苷酸共价连接。
60.实施方案57所述的复合物，其中所述抗体是完全糖基化抗体。
61.实施方案57所述的复合物，其中所述抗体是部分糖基化抗体。
62.实施方案61所述的复合物，其中所述部分糖基化抗体是通过化学或酶促方式产生的。
63.实施方案61所述的复合物，其中所述部分糖基化抗体是在细胞中产生的，所述细胞缺乏N-或O-糖基化途径中的酶。
64.将分子载荷递送至表达转铁蛋白受体之细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与实施方案1至63中任一项所述的复合物接触。
65.促进细胞中DMD蛋白的表达或活性的方法，所述方法包括使所述细胞与有效促进分子载荷内化至所述细胞之量的实施方案1至63中任一项所述的复合物接触。
66.实施方案65所述的方法，其中所述细胞是体外的。
67.实施方案65所述的方法，其中所述细胞在对象中。
68.实施方案67所述的方法，其中所述对象是人。
69.治疗具有与肌养蛋白病相关的突变DMD等位基因的对象的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的实施方案1至63中任一项所述的复合物。
70.促进细胞中DMD mRNA转录物的外显子跳读的方法，所述方法包括向所述细胞施用有效量的实施方案1至63中任一项所述的复合物。
71.实施方案70所述的方法，其中所述方法促进所述DMD mRNA转录物的外显子8、外显子23、外显子44、外显子45、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53和/或外显子55的跳读。
72.实施方案70或71所述的方法，其中所述方法促进所述DMD mRNA转录物的外显子51的跳读。
73.复合物，其包含与分子载荷共价连接的抗转铁蛋白受体(TfR)抗体，所述分子载荷被配置用于促进DMD基因的表达或活性，其中所述抗体包含：
(i)含有与SEQ ID NO:76具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)；和/或含有与SEQ ID NO:75具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(ii)含有与SEQ ID NO:69具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)；和/或含有与SEQ ID NO:70具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(iii)含有与SEQ ID NO:71具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)；和/或含有与SEQ ID NO:70具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(iv)含有与SEQ ID NO:72具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)；和/或含有与SEQ ID NO:70具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(v)含有与SEQ ID NO:73具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)；和/或含有与SEQ ID NO:74具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(vi)含有与SEQ ID NO:73具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)；和/或含有与SEQ ID NO:75具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(vii)含有与SEQ ID NO:76具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)；和/或含有与SEQ ID NO:74具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(viii)含有与SEQ ID NO:77具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)；和/或含有与SEQ ID NO:78具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(ix)含有与SEQ ID NO:79具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)；和/或含有与SEQ ID NO:80具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；或者
(x)包含与SEQ ID NO:77具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)；和/或含有与SEQ ID NO:80具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
73.复合物，其包含与分子载荷共价连接的抗转铁蛋白受体(TfR)抗体，所述分子载荷被配置成用于促进DMD基因的表达或活性，其中所述抗TfR抗体已经历由翻译后修饰引起的焦谷氨酸形成。
等同方案和术语
本文中举例说明性地描述的公开内容可在不存在本文中未具体公开的任何一个或更多个要素、一个或更多个限制的情况下适当地实践。因此，例如，在本文中的每种情况下，术语“包含/包括”、“基本上由......组成”和“由......组成”中的任一个可用其他两个术语中的任一个替换。已采用的术语和表达作为描述而非限制的术语使用，并且使用这样的术语和表达不旨在排除所示出和所描述的特征的任何等同形式或其一部分，而是应认识到，在所公开内容的范围内可进行多种修改。因此，应理解，尽管已通过一些优选的实施方案、任选的特征具体公开了本公开内容，但是本领域技术人员可获取本文中所公开概念的修改和变化，并且这样的修改和变化被认为是在本公开内容的范围内。
另外，在根据马库什组(Markush group)或其他替代组描述本公开内容的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开内容也因此以马库什组或其他组的任何个体成员或成员亚组的方式描述。
应理解，在一些实施方案中，在描述寡核苷酸或其他核酸的结构时可参考序列表中所示的序列。在这样的实施方案中，实际的寡核苷酸或其他核酸与指定序列相比可具有一个或更多个替代核苷酸(例如，DNA核苷酸的RNA对应物或RNA核苷酸的DNA对应物)和/或者(例如，和)一个或更多个经修饰核苷酸和/或者(例如，和)一个或更多个经修饰核苷酸间键联和/或者(例如，和)一个或更多个其他修饰，同时保留与指定序列基本相同或相似的互补特性。
除非在本文中另外指明或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(尤其是在所附权利要求的上下文中)使用没有数量词修饰的名词将被解释为一个/种或更多个/种。除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”将被解释为开放式术语(即，意指“包括但不限于”)。除非本文中另外指明，否则本文中值范围的记载仅旨在用作分别指代落入该范围内的每个单独值的速记方法，并且每个单独值均被并入说明书中，如同其在本文中被单独记载一样。除非在本文中另外指明或在其他情况下与上下文明显矛盾，否则本文中所述的所有方法均可以以任何合适的顺序进行。除非另有说明，否则本文中提供的任何和所有实例或示例性语言(如“例如”)的使用仅仅旨在更好地说明本发明，并且不对本发明的范围构成限制。说明书中的语言均不应被解释为表示对本发明的实践必要的任何未要求保护的要素。
本文中描述了本发明的一些实施方案。在阅读前述说明之后，那些实施实施方案的变化方案对于本领域普通技术人员可变得明显。
本发明人预期技术人员在适当时采用这样的变化方案，并且本发明人希望以除本文中具体描述的之外的方式实践本发明。因此，如适用法律所允许的，本发明包括在此所附权利要求中记载的主题的所有修改方案和等同方案。此外，除非在本文中另外指明或在其他情况下与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖其所有可能变化方案中的上述要素的任何组合。本领域技术人员将认识到或仅使用常规实验就能够确定本文中所述的本发明的具体实施方案的许多等同方案。这样的等同方案旨在由所附权利要求书涵盖。

Claims (28)

1.复合物，其包含与分子载荷共价连接的抗转铁蛋白受体(TfR)抗体，所述分子载荷被配置成用于促进DMD基因的表达或活性，其中所述抗体包含：
(i)含有与SEQ ID NO:76具有至少95％同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)；和/或含有与SEQ ID NO:75具有至少95％同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(ii)含有与SEQ ID NO:69具有至少95％同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)；和/或含有与SEQ ID NO:70具有至少95％同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(iii)含有与SEQ ID NO:71具有至少95％同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)；和/或含有与SEQ ID NO:70具有至少95％同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(iv)含有与SEQ ID NO:72具有至少95％同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)；和/或含有与SEQ ID NO:70具有至少95％同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(v)含有与SEQ ID NO:73具有至少95％同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)；和/或含有与SEQ ID NO:74具有至少95％同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(vi)含有与SEQ ID NO:73具有至少95％同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)；和/或含有与SEQ ID NO:75具有至少95％同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(vii)含有与SEQ ID NO:76具有至少95％同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)；和/或含有与SEQ ID NO:74具有至少95％同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(viii)含有与SEQ ID NO:77具有至少95％同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)；和/或含有与SEQ ID NO:78具有至少95％同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(ix)含有与SEQ ID NO:79具有至少95％同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)；和/或含有与SEQ ID NO:80具有至少95％同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；或者
(x)含有与SEQ ID NO:77具有至少95％同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)；和/或含有与SEQ ID NO:80具有至少95％同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
2.权利要求1所述的复合物，其中所述抗体包含：
(i)含有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的VL；
(ii)含有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VL；
(iii)含有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VL；
(iv)含有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VL；
(v)含有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的VL；
(vi)含有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的VL；
(vii)含有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的VL；
(viii)含有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的VL；
(ix)含有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的VL；或者
(x)含有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的VL。
3.权利要求1或权利要求2所述的复合物，其中所述抗体选自Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、scFv、Fv和全长IgG。
4.权利要求3所述的复合物，其中所述抗体为Fab片段。
5.权利要求4所述的复合物，其中所述抗体包含：
(i)含有与SEQ ID NO:101具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链；和/或含有与SEQID NO:90具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链；
(ii)含有与SEQ ID NO:97具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链；和/或含有与SEQID NO:85具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链；
(iii)含有与SEQ ID NO:98具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链；和/或含有与SEQ ID NO:85具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链；
(iv)含有与SEQ ID NO:99具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链；和/或含有与SEQID NO:85具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链；
(v)含有与SEQ ID NO:100具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链；和/或含有与SEQID NO:89具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链；
(vi)含有与SEQ ID NO:100具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链；和/或含有与SEQ ID NO:90具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链；
(vii)含有与SEQ ID NO:101具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链；和/或含有与SEQ ID NO:89具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链；
(viii)含有与SEQ ID NO:102具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链；和/或含有与SEQ ID NO:93具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链；
(ix)含有与SEQ ID NO:103具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链；和/或含有与SEQ ID NO:95具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链；或者
(x)含有与SEQ ID NO:102具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链；和/或含有与SEQID NO:95具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链。
6.权利要求4或权利要求5所述的复合物，其中所述抗体包含：
(i)含有SEQ ID NO:101的氨基酸序列的重链；和含有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链；
(ii)含有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的重链；和含有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的轻链；
(iii)含有SEQ ID NO:98的氨基酸序列的重链；和含有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的轻链；
(iv)含有SEQ ID NO:99的氨基酸序列的重链；和含有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的轻链；
(v)含有SEQ ID NO:100的氨基酸序列的重链；和含有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的轻链；
(vi)含有SEQ ID NO:100的氨基酸序列的重链；和含有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链；
(vii)含有SEQ ID NO:101的氨基酸序列的重链；和含有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的轻链；
(viii)含有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的重链；和含有SEQ ID NO:93的氨基酸序列的轻链；
(ix)含有SEQ ID NO:103的氨基酸序列的重链；和含有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的轻链；或者
(x)含有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的重链；和含有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的轻链。
7.权利要求1至6中任一项所述的复合物，其中所述抗体不与所述转铁蛋白受体的转铁蛋白结合位点特异性结合和/或其中肌肉靶向抗体不抑制转铁蛋白与所述转铁蛋白受体的结合。
8.权利要求1至7中任一项所述的复合物，其中所述分子载荷是寡核苷酸。
9.权利要求8所述的复合物，其中所述寡核苷酸促进DMD RNA中的外显子跳读。
10.权利要求9所述的复合物，其中所述寡核苷酸促进DMD的外显子在外显子8至外显子55的范围内的跳读。
11.权利要求9或权利要求10所述的复合物，其中所述寡核苷酸促进外显子8、外显子23、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53和/或外显子55的跳读。
12.权利要求8至11中任一项所述的复合物，其中所述寡核苷酸包含DMD转录物的一个或更多个完整或部分外显子剪接增强子(ESE)之互补区。
13.权利要求8至12中任一项所述的复合物，其中所述寡核苷酸包含含有SEQ ID NO:402至436和2043至2238中所示的一个或更多个完整或部分ESE的靶序列之互补区。
14.权利要求8至13中任一项所述的复合物，其中所述寡核苷酸促进外显子51的跳读。
15.权利要求8至14中任一项所述的复合物，其中所述寡核苷酸的长度为20至30个核苷酸，并且包含含有SEQ ID NO:402至436中的任一个所示的ESE的至少4个连续核苷酸的靶序列之互补区。
16.权利要求8至14中任一项所述的复合物，其中所述寡核苷酸包含SEQ ID NO:437至1241中的任一个，或包含SEQ ID NO:1242至2046中的任一个之互补区。
17.权利要求8至10中任一项所述的复合物，其中所述寡核苷酸包含表14中列出的寡核苷酸的靶序列之互补区。
18.权利要求8至10和17中任一项所述的复合物，其中所述寡核苷酸包含表14中列出的序列，其中所述寡核苷酸中的任意一个或更多个尿嘧啶碱基(U)可任选是胸腺嘧啶碱基(T)。
19.权利要求8至18中任一项所述的复合物，其中所述寡核苷酸包含至少一个经修饰核苷间键联。
20.权利要求19所述的复合物，其中所述至少一个经修饰核苷间键联为硫代磷酸酯键联。
21.权利要求8至20中任一项所述的复合物，其中所述寡核苷酸包含一个或更多个经修饰核苷。
22.权利要求21所述的复合物，其中所述一个或更多个经修饰核苷是2’-经修饰核苷。
23.权利要求8至18中任一项所述的复合物，其中所述寡核苷酸包含一个或更多个磷酸二酰胺吗啉代，任选地其中所述寡核苷酸是磷酸二酰胺吗啉代寡聚物(PMO)。
24.权利要求1至23中任一项所述的复合物，其中所述抗体通过可切割接头与所述分子载荷共价连接。
25.权利要求24所述的复合物，其中所述可切割接头包含缬氨酸-瓜氨酸序列。
26.权利要求1至25中任一项所述的复合物，其中所述抗体与所述分子载荷共价连接，所述共价连接通过与所述抗体的赖氨酸残基或半胱氨酸残基的缀合进行。
27.促进细胞中DMD蛋白的表达或活性的方法，所述方法包括使所述细胞与有效用于促进分子载荷内化至所述细胞之量的权利要求1至26中任一项所述的复合物接触，任选地其中所述细胞是肌细胞。
28.治疗具有与肌养蛋白病相关的突变DMD等位基因的对象的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的权利要求1至26中任一项所述的复合物。
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