JP2023535073A - ジストロフィン異常症を処置するための筋標的化複合体およびそれらの使用 - Google Patents

ジストロフィン異常症を処置するための筋標的化複合体およびそれらの使用 Download PDF

Info

Publication number
JP2023535073A
JP2023535073A JP2023504634A JP2023504634A JP2023535073A JP 2023535073 A JP2023535073 A JP 2023535073A JP 2023504634 A JP2023504634 A JP 2023504634A JP 2023504634 A JP2023504634 A JP 2023504634A JP 2023535073 A JP2023535073 A JP 2023535073A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
amino acid
acid sequence
antibody
light chain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023504634A
Other languages
English (en)
Inventor
サブラマニアン，ロメシュ，アール．
カタナニ，モハマド，ティー．
ウィーデン，ティモシー
デジャルダン，コディ，エー．
クイン，ブレンダン
ナジム，ジョン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dyne Therapeutics Inc
Original Assignee
Dyne Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dyne Therapeutics Inc filed Critical Dyne Therapeutics Inc
Publication of JP2023535073A publication Critical patent/JP2023535073A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2881—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD71
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/343—Spatial arrangement of the modifications having patterns, e.g. ==--==--==--
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3513—Protein; Peptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3521—Methyl
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
    • C12N2310/3533—Halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/33—Alteration of splicing

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本開示の側面は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された筋標的化剤を含む複合体に関する。いくつかの態様において、筋標的化剤は、筋細胞上の内在化する細胞表面受容体へ特異的に結合する。いくつかの態様において、分子ペイロードは、機能的なジストロフィンタンパク質の発現または活性を促進する。いくつかの態様において、分子ペイロードは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、例として、突然変異体DMDアレルから発現されたmRNAにおけるエキソンスキッピングを引き起こすオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドである。

Description

関連出願
本出願は、2021年1月30日出願の「MUSCLE TARGETING COMPLEXES AND USES THEREOF FOR TREATING DYSTROPHINOPATHIES」と題する米国仮出願番号第63/143829号;2021年8月23日出願の「MUSCLE TARGETING COMPLEXES AND USES THEREOF FOR TREATING DYSTROPHINOPATHIES」と題する米国仮出願第63/069077号;および2020年7月23日出願の「MUSCLE TARGETING COMPLEXES AND USES THEREOF FOR TREATING DYSTROPHINOPATHIES」と題する米国仮出願第63/055777号)に基づく優先権を主張するものである；これら各々の内容はその全体が参照により、本明細書に組み込まれる。
本発明の分野
本出願は、分子ペイロード(molecular payloads)(例として、オリゴヌクレオチド)を細胞へ送達するための標的化複合体、およびそれらの使用、とくに疾患の処置に関する使用、に関する。
EFS-WEBを介しテキストファイルとして提出された配列表への言及
本出願は配列表を含有する。これはEFS WebからASCIIフォーマットで提出されており、その全体が参照によってここに組み込まれる2021年1月8日に作成された該ASCIIコピーは、D082470040WO00-SEQ-DWGDWYという名称であり、サイズは575,156バイトである。
発明の背景
ジストロフィン異常症は、ジストロフィン遺伝子における突然変異から結果として生じる別個の神経筋疾患のグループである。ジストロフィン異常症は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、および、Ｘ染色体拡張型心筋症を包含する。ジストロフィン(DMD)は、79個のエキソンおよび約2千6百万の総塩基対を含有する、巨大遺伝子である。エキソンフレームシフト、欠失、置換および重複突然変異を包含する、DMDにおける多数の突然変異は、機能的なジストロフィンの発現を低減することができ、ジストロフィン異常症に繋がる。ヒトDMDのエキソン51を標的とする1つの薬剤は、米国食品医薬品局(FDA)によって予備的に承認されているが、その効力は、依然として、評価中である。
発明の概要
いくつかの側面に従うと、本開示は、筋細胞を、分子ペイロードをそれらの細胞へ送達することを目的として、標的にする複合体を提供する。いくつかの態様において、本明細書に提供される複合体は、機能的なDMDの発現または活性を増大または回復する分子ペイロードを送達するのにとくに有用である。いくつかの態様において、複合体は、インフレームエキソンスキップ機構または停止コドンの抑制を介する、機能的なDMDの正常な発現を促進するオリゴヌクレオチドベースの分子ペイロードを含む。いくつかの態様において、複合体は、機能的なジストロフィン活性を増大または回復する、ミニジストロフィン遺伝子または合成mRNAを送達するように構成されている。従って、いくつかの態様において、本明細書に提供される複合体は、分子ペイロードを筋細胞へ送達することを目的として、筋細胞の表面上の受容体へ特異的に結合する筋標的化剤(例として、筋標的化抗体)を含む。いくつかの態様において、複合体は、受容体に媒介される内在化を介して細胞中へ取り入れられ、これを受け分子ペイロードは細胞内部に放出されて機能を果たしてもよい。例えば、オリゴヌクレオチドを送達するように改変された複合体は、オリゴヌクレオチドが筋細胞における機能的なDMDの発現を(例として、エキソンススキッピング機構を介して)促進し得るように、オリゴヌクレオチドを放出してもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、複合体のオリゴヌクレオチドと筋標的化剤とを接続する共有結合性リンカーのエンドソーム切断によって放出される。
本開示の一態様は、DMD遺伝子の発現または活性を促進するために構成された分子ペイロードに共有結合的に連結された抗トランスフェリン受容体(TfR)抗体を含む複合体に関し、抗体は、以下を含む:
(i)配列番号76と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号75と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(ii)配列番号69と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号70と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(iii)配列番号71と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号70と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(iv)配列番号72と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号70と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(v)配列番号73と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号74と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(vi)配列番号73と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号75と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(vii)配列番号76と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号74と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(viii)配列番号77と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号78と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(ix)配列番号79と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号80と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);または
(x)配列番号77と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH); および/または配列番号80と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL)。
いくつかの態様では、抗体は、以下を含む:
(i)配列番号76のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号75のアミノ酸配列を含むVL;
(ii)配列番号69のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号70のアミノ酸配列を含むVL;
(iii)配列番号71のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号70のアミノ酸配列を含むVL;
(iv)配列番号72のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号70のアミノ酸配列を含むVL;
(v)配列番号73のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号74のアミノ酸配列を含むVL;
(vi)配列番号73のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号75のアミノ酸配列を含むVL;
(vii)配列番号76のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号74のアミノ酸配列を含むVL;
(viii)配列番号77のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号78のアミノ酸配列を含むVL;
(ix)配列番号79のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号80のアミノ酸配列を含むVL;または
(x)配列番号77のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号80のアミノ酸配列を含むVL。
いくつかの態様において、抗体は、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント、scFv、Fv、完全長IgG、からなる群から選択される。いくつかの態様において、抗体は、Fabフラグメントである。
いくつかの態様では、抗体は、以下を含む:
(i)配列番号101と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号90と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(ii)配列番号97と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号85と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(iii)配列番号98と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号85と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(iv)配列番号99と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号85と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(v)配列番号100と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号89と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(vi)配列番号100と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号90と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(vii)配列番号101と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号89と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(viii)配列番号102と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号93と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(ix)配列番号103と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号95と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;または
(x)配列番号102と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号95と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖。
いくつかの態様では、抗体は、以下を含む:
(i)配列番号101のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(ii)配列番号97のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(iii)配列番号98のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(iv)配列番号99のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(v)配列番号100のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号89のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(vi)配列番号100のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(vii)配列番号101のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号89のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(viii)配列番号102のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号93のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(ix)配列番号103のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号95のアミノ酸配列を含む軽鎖;または
(x)配列番号102のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号95のアミノ酸配列を含む軽鎖。
いくつかの態様では、抗体は、トランスフェリン受容体のトランスフェリン結合部位に特異的に結合せず、および/または筋標的化抗体は、トランスフェリン受容体へのトランスフェリンの結合を阻害しない。
いくつかの態様において、分子ペイロードは、オリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMD RNAにおけるエキソンスキッピングを促進する。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、エキソン8～エキソン55の範囲におけるDMDのエキソンのスキッピングを促進する。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、エキソン8、エキソン23、エキソン43、エキソン44、エキソン45、エキソン46、エキソン50、エキソン51、エキソン52、エキソン53、および／またはエキソン55のスキッピングを促進する。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMD転写物の１つ以上の完全なまたは部分的なエキソニックスプライシングエンハンサー(ESE)と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号402～436および2043～2238に記載の１つ以上の完全なまたは部分的なESEを含む標的配列と相補性のある領域を含む。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、エキソン51のスキッピングを促進する。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、長さが20～30ヌクレオチドであり、および配列番号402～436のいずれか1つに記載のESEの少なくとも4つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号437～1241のいずれか1つを含むか、または配列番号1242～2046のいずれか1つと相補性のある領域を含む。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、表14に列挙されるオリゴヌクレオチドの標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、表14に列挙される配列を含み、オリゴヌクレオチド中のウラシル塩基(U)のいずれか1つ以上は、任意にチミン塩基(T)であってよい。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも1個の修飾ヌクレオシド間連結を含む。いくつかの態様において、少なくとも1個の修飾ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオアート連結である。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、1つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの態様において、1つ以上の修飾ヌクレオシドは、2'-修飾ヌクレオシドである。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドが1つ以上のホスホロジアミダートモルホリノを含み、ここで任意に、オリゴヌクレオチドはホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー(PMO)である。
いくつかの態様において、抗体は、分子ペイロードへ、切断可能なリンカーを介して共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、切断可能なリンカーは、バリン-シトルリン配列を含む。
いくつかの態様において、抗体は、抗体のリジン残基またはシステイン残基への抱合を介して分子ペイロードへ共有結合的に連結される。
本開示の別の態様は、細胞におけるDMD遺伝子の発現または活性を促進する方法に関し、方法は、細胞を、分子ペイロードの細胞への内在化を促進するのに有効な量の本明細書に開示される複合体と接触させることを含み、任意に、細胞は筋細胞である。
本開示の別の態様は、ジストロフィン異常症に関連する突然変異したDMDアレルを有する対象を治療する方法に関し、方法は、本明細書に開示される複合体の有効量を対象に投与することを含む。
図1は、siRNAで細胞をトランスフェクトした効果を示す、非限定的な概略図を描く。
図2は、siRNAを含む筋標的化複合体の活性を示す非限定的な概略図を描く。
図3A～3Bは、同じsiRNAを含む非標的化複合体対照と比べた、siRNAを含む筋標的化複合体の、in vivoでのマウス筋組織(腓腹筋および心臓)中の活性を示す非限定的な概略図を描く。(N=4匹のC57BL/6 WTマウス)
図4A～4Eは、siRNAを含む筋標的化複合体の組織選択性を示す非限定的な概略図を描く。 図4A～4Eは、siRNAを含む筋標的化複合体の組織選択性を示す非限定的な概略図を描く。 図4A～4Eは、siRNAを含む筋標的化複合体の組織選択性を示す非限定的な概略図を描く。
図5は、エキソン23スキッピングのホスホロジアミダートモルフォリノオリゴマー(PMO)を含む抗トランスフェリン受容体筋標的化複合体の、mdxマウスモデル筋組織中エキソンスキッピングの用量依存的増強能を示す非限定的な概略図を描く。
図6A～6Bは、エキソン23スキッピングのPMOを含む抗トランスフェリン受容体筋標的化複合体の、mdxマウスモデル骨格筋(大腿四頭筋)中ジストロフィンの用量依存的増大能を示す非限定的な概略図を描く。 図6A～6Bは、エキソン23スキッピングのPMOを含む抗トランスフェリン受容体筋標的化複合体の、mdxマウスモデル骨格筋(大腿四頭筋)中ジストロフィンの用量依存的増大能を示す非限定的な概略図を描く。
図7A～7Eは、エキソン23スキッピングのPMOを含む抗トランスフェリン受容体筋標的化複合体の、mdxマウスモデルにおける、機能的遂行(functional performance)の改善能(図7A、7B、７Cおよび７D)と、クレアチンキナーゼレベルの低減能(図7E)とを示す非限定的な概略図を描く(** ｐ＜0.01; *** ｐ＜0.001; ****; ｐ＜0.0001; NS有意ではない)。 図7A～7Cは、エキソン23スキッピングのPMOを含む抗トランスフェリン受容体筋標的化複合体の、mdxマウスモデルにおける、機能的遂行(functional performance)の改善能(図7A、7B、７Cおよび７D)と、クレアチンキナーゼレベルの低減能(図7E)とを示す非限定的な概略図を描く(** ｐ＜0.01; *** ｐ＜0.001; ****; ｐ＜0.0001; NS有意ではない)。 図7A～7Eは、エキソン23スキッピングのPMOを含む抗トランスフェリン受容体筋標的化複合体の、mdxマウスモデルにおける、機能的遂行(functional performance)の改善能(図7A、7B、７Cおよび７D)と、クレアチンキナーゼレベルの低減能(図7E)とを示す非限定的な概略図を描く(** ｐ＜0.01; *** ｐ＜0.001; ****; ｐ＜0.0001; NS有意ではない)。 図7A～7Eは、エキソン23スキッピングのPMOを含む抗トランスフェリン受容体筋標的化複合体の、mdxマウスモデルにおける、機能的遂行(functional performance)の改善能(図7A、7B、７Cおよび７D)と、クレアチンキナーゼレベルの低減能(図7E)とを示す非限定的な概略図を描く(** ｐ＜0.01; *** ｐ＜0.001; ****; ｐ＜0.0001; NS有意ではない)。 図7A～7Eは、エキソン23スキッピングのPMOを含む抗トランスフェリン受容体筋標的化複合体の、mdxマウスモデルにおける、機能的遂行(functional performance)の改善能(図7A、7B、７Cおよび７D)と、クレアチンキナーゼレベルの低減能(図7E)とを示す非限定的な概略図を描く(** ｐ＜0.01; *** ｐ＜0.001; ****; ｐ＜0.0001; NS有意ではない)。
図8は、静脈内投与後の様々な生物種における、抗TfR抗体および分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド)を連結するのに使用されたリンカーの経時的な血清中安定性を示す。
図9A～9Fは、ELISAによって測定された、ヒトTfR1(hTfR1)またはカニクイザルTfR1(cTfR1)へのヒト化抗TfR Fabの結合を示す。図9Aは、ヒト化3M12バリアントのhTfR1への結合を示す。 図9A～9Fは、ELISAによって測定された、ヒトTfR1(hTfR1)またはカニクイザルTfR1(cTfR1)へのヒト化抗TfR Fabの結合を示す。図9Bは、ヒト化3M12バリアントのcTfR1への結合を示す。 図9A～9Fは、ELISAによって測定された、ヒトTfR1(hTfR1)またはカニクイザルTfR1(cTfR1)へのヒト化抗TfR Fabの結合を示す。図9Cは、ヒト化3A4バリアントのhTfR1への結合を示す。 図9A～9Fは、ELISAによって測定された、ヒトTfR1(hTfR1)またはカニクイザルTfR1(cTfR1)へのヒト化抗TfR Fabの結合を示す。図9Dは、ヒト化3A4バリアントのcTfR1への結合を示す。 図9A～9Fは、ELISAによって測定された、ヒトTfR1(hTfR1)またはカニクイザルTfR1(cTfR1)へのヒト化抗TfR Fabの結合を示す。図9Eは、ヒト化5H12バリアントのhTfR1への結合を示す。 図9A～9Fは、ELISAによって測定された、ヒトTfR1(hTfR1)またはカニクイザルTfR1(cTfR1)へのヒト化抗TfR Fabの結合を示す。図9Fは、ヒト化5H12バリアントのhTfR1への結合を示す。
図10は、横紋筋肉腫(RD)細胞内への抗TfR Fab抱合体の定量化された細胞取り込みを示す。試験した抱合体中の分子ペイロードは、DMPK標的化オリゴヌクレオチドであり、抱合体の取り込みは、示された抗TfR Fabによって促進された。陰性対照Fab(抗マウスTfR)または陽性対照Fab(抗ヒトTfR1)を有する抱合体もまた、このアッセイに包含される。細胞は、指し示された抱合体と共に100nMの濃度にて4時間インキュベートされた。細胞取り込みは、平均のCypher5e蛍光によって測定された。
図11A～11Fは、ELISAによって測定された、ヒトTfR1(hTfR1)およびカニクイザルTfR1(cTfR1)への、オリゴヌクレオチド抱合または非抱合ヒト化抗TfR Fabの結合を示す。図11Aは、ヒト化3M12バリアントの単独またはDMPK標的化オリゴとの抱合体でのhTfR1への結合を示す。それぞれのEC50値も示される。 図11A～11Fは、ELISAによって測定された、ヒトTfR1(hTfR1)およびカニクイザルTfR1(cTfR1)への、オリゴヌクレオチド抱合または非抱合ヒト化抗TfR Fabの結合を示す。図11Bは、ヒト化3M12バリアントの単独またはDMPK標的化オリゴとの抱合体でのcTfR1への結合を示す。それぞれのEC50値も示される。 図11A～11Fは、ELISAによって測定された、ヒトTfR1(hTfR1)およびカニクイザルTfR1(cTfR1)への、オリゴヌクレオチド抱合または非抱合ヒト化抗TfR Fabの結合を示す。図11Cは、ヒト化3A4バリアントの単独またはDMPK標的化オリゴとの抱合体でのhTfR1への結合を示す。それぞれのEC50値も示される。 図11A～11Fは、ELISAによって測定された、ヒトTfR1(hTfR1)およびカニクイザルTfR1(cTfR1)への、オリゴヌクレオチド抱合または非抱合ヒト化抗TfR Fabの結合を示す。図11Dは、ヒト化3A4バリアントの単独またはDMPK標的化オリゴとの抱合体でのcTfR1への結合を示す。それぞれのEC50値も示される。 図11A～11Fは、ELISAによって測定された、ヒトTfR1(hTfR1)およびカニクイザルTfR1(cTfR1)への、オリゴヌクレオチド抱合または非抱合ヒト化抗TfR Fabの結合を示す。図11Eは、ヒト化5H12バリアントの単独またはDMPK標的化オリゴとの抱合体でのhTfR1への結合を示す。それぞれのEC50値も示される。 図11A～11Fは、ELISAによって測定された、ヒトTfR1(hTfR1)およびカニクイザルTfR1(cTfR1)への、オリゴヌクレオチド抱合または非抱合ヒト化抗TfR Fabの結合を示す。図11Fは、ヒト化5H12バリアントの単独またはDMPK標的化オリゴとの抱合体でのcTfR1への結合を示す。それぞれのEC50値も示される。
図12は、DMPK標的化オリゴヌクレオチドASO300へ抱合された、示されたヒト化抗TfR抗体を含有する様々な濃度の抱合体で処置されたRD細胞におけるDMPK発現を示す。処置の継続期間は3日であった。トランスフェクション剤を使用して送達されたASO300が、対照として使用された。
図13は、DMDエキソン51スキッピングオリゴヌクレオチド(PMO)によって促進された、ヒトDMD筋管におけるエキソン51のスキッピングを示す。細胞は、ネイキッドPMOで、または抗TfR1 Fabへ抱合されたPMO(Ab-PMO)で処置された。
図14は、エキソン23を標的にしたオリゴヌクレオチド(PMO)へ抱合された抗マウスTfR1(RI7 217)での処置後のmdxマウス四頭筋における、アルファ-アクチンをローディング対照として用いた、ジストロフィンのウエスタンブロッティングによって測定されたジストロフィン発現の用量依存的増加を示す。標準は、プールされた野生型タンパク質およびプールされたmdxタンパク質を使用して生成された。パーセントは、試料中へスパイクされたWTタンパク質の量を指し示す。
図15は、エキソン23を標的にするオリゴヌクレオチド(PMO)へ抱合された抗マウスTfR(RI7 217)の様々な用量での処置後の、mdxマウス四頭筋内のジストロフィンタンパク質レベルの定量化を示す。
図16は、生理食塩水で処置された野生型(WT)マウス、または生理食塩水、ネイキッドオリゴヌクレオチド、もしくは抗マウスTfR1(RI7 217)へ抱合されたオリゴヌクレオチドで処置されたmdxマウスからの四頭筋の免疫蛍光染色画像を示す。
図17は、DMDエキソンスキッピングオリゴヌクレオチドへ抱合された指定の抗TfR Fab'(3M12 VH3/VK2、3M12 VH4/VK3、および3A4 VH3 N54S/VK4)を含有する抱合体が、DMD患者筋管において、ネイキッドDMDエキソンスキッピングオリゴと比較して増強されたエキソンスキッピングをもたらしたことを例証するデータを示す。
図18は、抗TfR Fab 3M12 VH4/Vk3の組換えヒト(丸)、カニクイザル(四角)、マウス(上向き三角形)またはラット(下向き三角形)TfR1タンパク質への結合の、Fabの230pM～500nMの濃度範囲でのELISA測定値を示す。測定結果は、抗TfR FabがヒトおよびカニクイザルのTfR1と反応性であることを示す。マウスまたはラットの組換えTfR1へ結合は観察されなかった。データは、ベースラインに対して正規化された相対蛍光単位として示される。
図19は、組換えヒトTfR1またはTfR2に対する抗TfR Fab 3M12 VH4/Vk3の親和性を試験したELISAの、230pM～500nMのFabの濃度範囲にわたる結果を示す。データは、ベースラインに対して正規化された相対蛍光単位として提示される。結果は、Fabが組換えヒトTfR2に結合しないことを実証する。
図20は、抗TfR Fab 3M12 VH4/Vk3を対照アンチセンスオリゴヌクレオチドに連結するために使用されるリンカーの、PBS中、またはラット、マウス、カニクイザルもしくはヒト血清中での72時間のインキュベーションにわたる血清中安定性を示す。
図21A～21Cは、単回用量の生理食塩水、DMDにおいてエキソン23スキッピングを誘導する非抱合オリゴヌクレオチド(ASO)、またはASOに抱合された抗TfR1 RI7217 Fabを含有する抱合体(Ab-ASO)の投与の2週間後または4週間後の、野生型(WT)マウスおよびmdxマウスの四頭筋(図21A)、心臓(図21B)および横隔膜(図21C)におけるエキソン23スキッピングの定量化を示す。生理食塩水または非抱合ASOを投与したWTマウスまたはmdxマウスの組織では、エキソン23のスキッピングはほとんど、または全く観察されなかったが、Ab-ASOで処置したmdxマウスの組織では、有意なレベルのエキソン23のスキッピングが観察された。(*p＜0.05、**p＜0.01、****p＜0.0001) 図21A～21Cは、単回用量の生理食塩水、DMDにおいてエキソン23スキッピングを誘導する非抱合オリゴヌクレオチド(ASO)、またはASOに抱合された抗TfR1 RI7217 Fabを含有する抱合体(Ab-ASO)の投与の2週間後または4週間後の、野生型(WT)マウスおよびmdxマウスの四頭筋(図21A)、心臓(図21B)および横隔膜(図21C)におけるエキソン23スキッピングの定量化を示す。生理食塩水または非抱合ASOを投与したWTマウスまたはmdxマウスの組織では、エキソン23のスキッピングはほとんど、または全く観察されなかったが、Ab-ASOで処置したmdxマウスの組織では、有意なレベルのエキソン23のスキッピングが観察された。(*p＜0.05、**p＜0.01、****p＜0.0001) 図21A～21Cは、単回用量の生理食塩水、DMDにおいてエキソン23スキッピングを誘導する非抱合オリゴヌクレオチド(ASO)、またはASOに抱合された抗TfR1 RI7217 Fabを含有する抱合体(Ab-ASO)の投与の2週間後または4週間後の、野生型(WT)マウスおよびmdxマウスの四頭筋(図21A)、心臓(図21B)および横隔膜(図21C)におけるエキソン23スキッピングの定量化を示す。生理食塩水または非抱合ASOを投与したWTマウスまたはmdxマウスの組織では、エキソン23のスキッピングはほとんど、または全く観察されなかったが、Ab-ASOで処置したmdxマウスの組織では、有意なレベルのエキソン23のスキッピングが観察された。(*p＜0.05、**p＜0.01、****p＜0.0001)
図22A～22Dは、DMDにおいてエキソン23スキッピングを誘導する非抱合オリゴヌクレオチド(ASO)、またはASOに抱合された抗TfR1 RI7217 Fabを含有する抱合体(Ab-ASO)の単回用量後の、mdxマウスの四頭筋におけるジストロフィンタンパク質の測定を示す。図22Aは、ASOまたはAb-ASOの注射の2週間後の筋組織におけるジストロフィンおよびアルファ-アクチニンタンパク質のウエスタンブロットを示す。図22Aおよび図22Cにおける標準曲線は、野生型(WT)およびmdxマウスサンプルから組織をプールすることによって生成され、パーセントWTは、各サンプルにスパイクされたWTタンパク質の量を示す。(*p＜0.05;ns、有意でない) 図22A～22Dは、DMDにおいてエキソン23スキッピングを誘導する非抱合オリゴヌクレオチド(ASO)、またはASOに抱合された抗TfR1 RI7217 Fabを含有する抱合体(Ab-ASO)の単回用量後の、mdxマウスの四頭筋におけるジストロフィンタンパク質の測定を示す。図22Bは、野生型筋肉におけるジストロフィンタンパク質と比較した、図22Aのウエスタンブロットにおけるジストロフィンの定量化を示す。 図22A～22Dは、DMDにおいてエキソン23スキッピングを誘導する非抱合オリゴヌクレオチド(ASO)、またはASOに抱合された抗TfR1 RI7217 Fabを含有する抱合体(Ab-ASO)の単回用量後の、mdxマウスの四頭筋におけるジストロフィンタンパク質の測定を示す。図22Cは、ASOまたはAb-ASOの注射の4週間後の筋組織におけるジストロフィンおよびアルファ-アクチニンタンパク質のウエスタンブロットを示す。図22Aおよび図22Cにおける標準曲線は、野生型(WT)およびmdxマウスサンプルから組織をプールすることによって生成され、パーセントWTは、各サンプルにスパイクされたWTタンパク質の量を示す。(*p＜0.05;ns、有意でない) 図22A～22Dは、DMDにおいてエキソン23スキッピングを誘導する非抱合オリゴヌクレオチド(ASO)、またはASOに抱合された抗TfR1 RI7217 Fabを含有する抱合体(Ab-ASO)の単回用量後の、mdxマウスの四頭筋におけるジストロフィンタンパク質の測定を示す。図22Dは、野生型筋肉におけるジストロフィンタンパク質と比較した、図22Cのウエスタンブロットにおけるジストロフィンの定量化を示す。
図23A～23Dは、DMDにおいてエキソン23スキッピングを誘導する非抱合オリゴヌクレオチド(ASO)、またはASOに抱合された抗TfR1 RI7217 Fabを含有する抱合体(Ab-ASO)の単回用量後の、mdxマウスの心臓筋におけるジストロフィンタンパク質の測定を示す。図23Aは、ASOまたはAb-ASOの注射の2週間後の筋組織におけるジストロフィンおよびアルファ-アクチニンタンパク質のウエスタンブロットを示す。図23Aおよび図23Cにおける標準曲線は、野生型(WT)およびmdxマウスサンプルから組織をプールすることによって生成され、パーセントWTは、各サンプルにスパイクされたWTタンパク質の量を示す。(*p＜0.05;****p＜0.0001) 図23A～23Dは、DMDにおいてエキソン23スキッピングを誘導する非抱合オリゴヌクレオチド(ASO)、またはASOに抱合された抗TfR1 RI7217 Fabを含有する抱合体(Ab-ASO)の単回用量後の、mdxマウスの心臓筋におけるジストロフィンタンパク質の測定を示す。図23Bは、野生型筋肉におけるジストロフィンタンパク質と比較した、図23Aのウエスタンブロットにおけるジストロフィンの定量化を示す。 図23A～23Dは、DMDにおいてエキソン23スキッピングを誘導する非抱合オリゴヌクレオチド(ASO)、またはASOに抱合された抗TfR1 RI7217 Fabを含有する抱合体(Ab-ASO)の単回用量後の、mdxマウスの心臓筋におけるジストロフィンタンパク質の測定を示す。図23Cは、ASOまたはAb-ASOの注射の4週間後の筋組織におけるジストロフィンおよびアルファ-アクチニンタンパク質のウエスタンブロットを示す。図23Aおよび図23Cにおける標準曲線は、野生型(WT)およびmdxマウスサンプルから組織をプールすることによって生成され、パーセントWTは、各サンプルにスパイクされたWTタンパク質の量を示す。(*p＜0.05;****p＜0.0001) 図23A～23Dは、DMDにおいてエキソン23スキッピングを誘導する非抱合オリゴヌクレオチド(ASO)、またはASOに抱合された抗TfR1 RI7217 Fabを含有する抱合体(Ab-ASO)の単回用量後の、mdxマウスの心臓筋におけるジストロフィンタンパク質の測定を示す。図23Dは、野生型筋肉におけるジストロフィンタンパク質と比較した、図23Cのウエスタンブロットにおけるジストロフィンの定量化を示す。
図24A～24Dは、DMDにおいてエキソン23スキッピングを誘導する非抱合オリゴヌクレオチド(ASO)、またはASOに抱合された抗TfR1 RI7217 Fabを含有する抱合体(Ab-ASO)の単回用量後の、mdxマウスの横隔膜筋におけるジストロフィンタンパク質の測定を示す。図24Aは、ASOまたはAb-ASOの注射の2週間後の筋組織におけるジストロフィンおよびアルファ-アクチニンタンパク質のウエスタンブロットを示す。図24Aおよび図24Cにおける標準曲線は、野生型(WT)およびmdxマウスサンプルから組織をプールすることによって生成され、パーセントWTは、各サンプルにスパイクされたWTタンパク質の量を示す。(**p＜0.01;***p＜0.001) 図24A～24Dは、DMDにおいてエキソン23スキッピングを誘導する非抱合オリゴヌクレオチド(ASO)、またはASOに抱合された抗TfR1 RI7217 Fabを含有する抱合体(Ab-ASO)の単回用量後の、mdxマウスの横隔膜筋におけるジストロフィンタンパク質の測定を示す。図24Bは、野生型筋肉におけるジストロフィンタンパク質と比較した、図24Aのウエスタンブロットにおけるジストロフィンの定量化を示す。 図24A～24Dは、DMDにおいてエキソン23スキッピングを誘導する非抱合オリゴヌクレオチド(ASO)、またはASOに抱合された抗TfR1 RI7217 Fabを含有する抱合体(Ab-ASO)の単回用量後の、mdxマウスの横隔膜筋におけるジストロフィンタンパク質の測定を示す。図24Cは、ASOまたはAb-ASOの注射の4週間後の筋組織におけるジストロフィンおよびアルファ-アクチニンタンパク質のウエスタンブロットを示す。図24Aおよび図24Cにおける標準曲線は、野生型(WT)およびmdxマウスサンプルから組織をプールすることによって生成され、パーセントWTは、各サンプルにスパイクされたWTタンパク質の量を示す。(**p＜0.01;***p＜0.001) 図24A～24Dは、DMDにおいてエキソン23スキッピングを誘導する非抱合オリゴヌクレオチド(ASO)、またはASOに抱合された抗TfR1 RI7217 Fabを含有する抱合体(Ab-ASO)の単回用量後の、mdxマウスの横隔膜筋におけるジストロフィンタンパク質の測定を示す。図24Dは、野生型筋肉におけるジストロフィンタンパク質と比較した、図24Cのウエスタンブロットにおけるジストロフィンの定量化を示す。
図25A～25Cは、単回用量の生理食塩水、非抱合エキソン23スキッピングオリゴヌクレオチド(ASO)、またはASOに抱合された抗TfR1 RI7217 Fabを含有する抱合体(Ab-ASO)の投与の2週間後または4週間後、野生型(WT)マウスまたはmdxマウスの四頭筋(図25A)、横隔膜(図25B)および心臓(図25C)に投与されたオリゴヌクレオチド(ASO)の量の定量化を示す。 図25A～25Cは、単回用量の生理食塩水、非抱合エキソン23スキッピングオリゴヌクレオチド(ASO)、またはASOに抱合された抗TfR1 RI7217 Fabを含有する抱合体(Ab-ASO)の投与の2週間後または4週間後、野生型(WT)マウスまたはmdxマウスの四頭筋(図25A)、横隔膜(図25B)および心臓(図25C)に投与されたオリゴヌクレオチド(ASO)の量の定量化を示す。 図25A～25Cは、単回用量の生理食塩水、非抱合エキソン23スキッピングオリゴヌクレオチド(ASO)、またはASOに抱合された抗TfR1 RI7217 Fabを含有する抱合体(Ab-ASO)の投与の2週間後または4週間後、野生型(WT)マウスまたはmdxマウスの四頭筋(図25A)、横隔膜(図25B)および心臓(図25C)に投与されたオリゴヌクレオチド(ASO)の量の定量化を示す。
図26は、ある濃度範囲を超えたエキソン53スキッピングオリゴヌクレオチドのジムノティック(gymnotic)取り込み後の、DMDエキソン52の欠失を有するDMD患者細胞におけるエキソン53スキッピング％を示す。
図27は、抗体に結合していない(「ネイキッドASO」)または抗TfR1 Fabに共有結合的に連結された(「抗TfR1 Fab-ASO複合体」)、いずれかのエキソン53スキッピングPMOの様々な濃度での処置後の、DMDエキソン52の欠失を有するDMD患者細胞におけるエキソン53スキッピング％を示す。
発明の詳細な記載
本開示の側面は、ある分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド、ペプチド、小分子)が筋細胞に有益な効果を有し得るものの、かかる細胞を効果的に標的にすることは難航を極めるという認識に関する。本明細書に記載のとおり、本開示は、かかる課題を克服するために、分子ペイロードへ共有結合的に連結された筋標的化剤を含む複合体を提供する。いくつかの態様において、複合体は、例として、希少筋疾患を有するかまたはこれを有すると疑われる対象において、筋細胞における標的遺伝子の発現または活性をモジュレートする(例として、促進する)分子ペイロードを送達するのに特に有用である。例えば、いくつかの態様において、複合体は、DMD、例として、突然変異したDMDアレルを標的とするために提供される。いくつかの態様において、本明細書で提供される複合体は、DMDの正常な発現および活性を促進するオリゴヌクレオチドを含んでもよい。別の例として、複合体は、DMD mRNAのエキソンのスキッピングを誘導するオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの態様において、DMDの正常な発現および活性を促進する1つ以上のタンパク質を発現する合成核酸ペイロード(例として、DNAまたはRNAペイロード)が使用されてもよい。
いくつかの態様において、複合体は、例として、ジストロフィンまたはそのフラグメントを発現する、合成cDNAおよび／または(例として、および)合成mRNAの分子ペイロード(例として、ジストロフィンミニ遺伝子)を含んでもよい。いくつかの態様において、複合体は、疾患に関連するDMDの突然変異、例として、突然変異したDMDエキソンにおける、または、その近くの配列に、核酸プログラム可能なヌクレアーゼ(例として、Cas9)を標的とすることができるガイド分子(例として、ガイドRNA)などの分子ペイロードを含んでもよい。いくつかの態様において、かかる核酸プログラム可能なヌクレアーゼは、機能的なDMDの発現を促進するために、疾患に関連するDMDの変異、例として、突然変異したDMDエキソンの一部または全てを切断するために使用されてもよい。いくつかの態様において、複合体は、ユートロフィンなどのジストロフィンの機能を置き換えることができる遺伝子の発現および／または(例として、および)活性を上方制御する分子ペイロードを含んでもよい。
定義された用語の記載を含む本開示のさらなる側面は、以下に提供される。
I. 定義
投与する(施す)こと:本明細書に使用されるとき、用語「投与する(施す)こと」または「投与(施し)」は、生理学的におよび/または薬理学的に有用なやり方で対象へ複合体を提供すること(例として、対象における疾病を処置すること)を意味する。
およそ:本明細書に使用されるとき、用語「およそ」または「約」は、関心のある1つ以上の値へ適用されるとき、規定された参照値と同様の値を指す。ある態様において、用語「およそ」または「約」は、別様に述べられない限りまたは文脈から明らかでない限り(かかる数字が実行可能な値の100％を超える場合を除く)、規定された参照値のプラスマイナス(超または未満)の15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、またはこれ未満に収まる広範な値を指す。
抗体:本明細書に使用されるとき、用語「抗体」は、少なくとも1個の免疫グロブリン可変ドメインまたは少なくとも1個の抗原決定基、例として、抗原へ特異的に結合するパラトープを包含するポリペプチドを指す。いくつかの態様において、抗体は、完全長の抗体である。いくつかの態様において、抗体は、キメラ抗体である。いくつかの態様において、抗体は、ヒト化抗体である。しかしながら、いくつかの態様において、抗体は、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント、Fvフラグメント、またはscFvフラグメントである。いくつかの態様において、抗体は、ラクダ科の動物の抗体に由来するナノボディー、またはサメ抗体に由来するナノボディーである。いくつかの態様において、抗体は、二重特異性抗体である。いくつかの態様において、抗体は、ヒト生殖細胞系配列を有するフレームワークを含む。別の態様において、抗体は、IgG、IgG1、IgG2、IgG2A、IgG2B、IgG2C、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgM、およびIgEの定常領域からなる群から選択される重鎖定常領域を含む。いくつかの態様において、抗体は、重(H)鎖可変領域(本明細書中VHと略される)、および/または(例として、および)、軽(L)鎖可変領域(本明細書中VLと略される)を含む。いくつかの態様において、抗体は、定常領域、例としてFc領域を含む。免疫グロブリン定常領域は、重鎖または軽鎖定常領域を指す。ヒトIgG重鎖および軽鎖定常領域アミノ酸配列およびそれらの機能的バリエーションは知られている。重鎖に関し、いくつかの態様において本明細書に記載の抗体の重鎖は、アルファ(α)、デルタ(Δ)、イプシロン(ε)、ガンマ(γ)、またはミュー(μ)重鎖であり得る。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体の重鎖は、ヒトのアルファ(α)、デルタ(Δ)、イプシロン(ε)、ガンマ(γ)、またはミュー(μ)重鎖を含み得る。具体的な態様において、本明細書に記載の抗体は、ヒトのガンマ1 CH1ドメイン、CH2ドメイン、および/または(例として、および)、CH3ドメインを含む。いくつかの態様において、VHドメインのアミノ酸配列は、ヒトガンマ(γ)重鎖定常領域のアミノ酸配列、たとえば当該技術分野において知られているいずれの配列も含む。ヒト定常領域配列の非限定例は当該技術分野において記載されており、例として、米国特許第5,693,780号および上記のKabat E Aら(1991)を見よ。いくつかの態様において、VHドメインは、本明細書に提供される可変鎖定常領域のいずれかと少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または少なくとも99％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、抗体は修飾されており、例として、グリコシル化、リン酸化、SUMO化、および/または(例として、および)、メチル化を介して修飾されている。いくつかの態様において、抗体は、1個以上の糖または炭水化物分子へ抱合されたグリコシル化抗体である。いくつかの態様において、1個以上の糖または炭水化物分子は、N-グリコシル化、O-グリコシル化、C-グリコシル化、グリピエーション(glypiation)(GPIアンカー付着)、および/または(例として、および)、ホスホグリコシル化を介して抗体へ抱合されている。いくつかの態様において、1個以上の糖または炭水化物分子は、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、またはグリカンである。いくつかの態様において、1個以上の糖または炭水化物分子は、分枝オリゴ糖類または分枝グリカンである。いくつかの態様において、1個以上の糖または炭水化物分子は、マンノース単位、グルコース単位、N-アセチルグルコサミン単位、N-アセチルガラクトサミン単位、ガラクトース単位、フコース単位、またはホスホ脂質単位を包含する。いくつかの態様において、抗体は、リンカーポリペプチドまたは免疫グロブリン定常領域へ連結された本開示の1個以上の抗原結合性フラグメントを含むポリペプチドを含む構築物である。リンカーポリペプチドは、ペプチド結合によって結び合わされた2個以上のアミノ酸残基を含み、1個以上の抗原結合部と連結させるために使用される。リンカーポリペプチドの例は報告されている(例として、Holliger,P.,et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448;Poljak,R.J.,et al.(1994)Structure 2:1121-1123を見よ)。またさらに、抗体は、1つ以上の他のタンパク質またはペプチドと、抗体もしくは抗体部分との共有結合または非共有結合の結び付きによって形成される、より大きな免疫接着分子の一部であってもよい。かかる免疫接着分子の例は、四量体scFv分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用(Kipriyanov,S.M.,et al.(1995)Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101)、ならびに二価のおよびビオチン化されたscFv分子を作製するためのシステイン残基、マーカーペプチド、およびC末ポリヒスチジンタグの使用(Kipriyanov,S.M.,et al.(1994)Mol.Immunol.31:1047-1058)を包含する。
CDR:本明細書に使用される場合、用語「CDR」は、抗体可変配列内の相補性決定領域を指す。典型的な抗体分子は、重鎖可変領域(VH)および軽鎖可変領域(VL)を含み、これらは通常、抗原結合に関与する。VHおよびVL領域は、「フレームワーク領域」(「FR」)として知られるより保存された領域が散在する、「相補性決定領域」(「CDR」)としても知られる超可変領域にさらに細分することができる。各VHおよびVLは、典型的には、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4で配置された3つのCDRおよび4つのFRで構成される。フレームワーク領域およびCDRの範囲は、当技術分野で公知の方法論を使用して、例えば、Kabat定義、IMGT定義、Chothia定義、AbM定義、および/または(例として、および)接触定義によって正確に同定され得、これらはすべて当技術分野で周知である。例として、Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242;IMGT(登録商標),the international ImMunoGeneTics information system(登録商標)http://www.imgt.org,Lefranc,M.-P.et al.,Nucleic Acids Res.,27:209-212(1999);Ruiz,M.et al.,Nucleic Acids Res.,28:219-221(2000);Lefranc,M.-P.,Nucleic Acids Res.,29:207-209(2001);Lefranc,M.-P.,Nucleic Acids Res.,31:307-310(2003);Lefranc,M.-P.et al.,In Silico Biol.,5,0006(2004)［Epub］,5:45-60(2005);Lefranc,M.-P.et al.,Nucleic Acids Res.,33:D593-597(2005);Lefranc,M.-P.et al.,Nucleic Acids Res.,37:D1006-1012(2009);Lefranc,M.-P.et al.,Nucleic Acids Res.,43:D413-422(2015);Chothia et al.,(1989)Nature 342:877;Chothia,C.et al.(1987)J.Mol.Biol.196:901-917,Al-lazikani et al(1997)J.Molec.Biol.273:927-948;およびAlmagro,J.Mol.Recognit.17:132-143(2004)を見よ。hgmp.mrc.ac.ukおよびbioinf.org.uk/absも見よ。本明細書で使用される場合、CDRは、当技術分野で公知の任意の方法によって定義されるCDRを指し得る。同じCDRを有する2つの抗体は、同じ方法、例えばIMGT定義によって決定される場合、2つの抗体がそのCDRの同じアミノ酸配列を有することを意味する。
重鎖および軽鎖の可変領域の各々において3つのCDRがあり、これらは可変領域の各々につきCDR1、CDR2、およびCDR3と指定される。用語「CDRセット」は、本明細書に使用されるとき、抗原に結合することが可能な単一の可変領域に生じる3つのCDRの一群を指す。これらのCDRの厳密な境界は、種々の系に従い異なって定義されている。Kabat(Kabat et al.,Sequence of Proteins of Immunological Interest(国立衛生研究所,Bethesda,Md.(1987)および(1991))によって記載される系は、抗体のいずれの可変領域へも適用可能な一義的な残基ナンバリング系を提供するのみならず、3つのCDRを定義する正確な残基境界をも提供する。これらのCDRは、Kabat CDRと称されることもある。CDRの下位部(Sub-portions)は、L1、L2、およびL3、またはH1、H2、およびH3と指定されることがあり、ここで「L」および「H」は夫々、軽鎖および重鎖領域を指定する。これらの領域は、Kabat CDRと重複する境界を有するChothia CDRと称されることもある。Kabat CDRと重複するCDRを定義する他の境界は、Padlan(FASEB J.9:133-139(1995))およびMacCallum(J Mol Biol 262(5):732-45(1996))によって記載されている。さらに他のCDR境界定義は、上の系の1つに厳重に従わなくてもよいが、それでもなおKabat CDRと重複することがあり、具体的な残基もしくは残基の群またはCDR全体でさえも抗原結合に有意に影響を及ぼすものではないという予測あるいは実験的知見を踏まえ、それらは短縮または伸長されてもよい。本明細書で使用される方法は、これらの系のいずれかに従って定義されたCDRを利用してもよい。CDR定義系の例が表1に示される。
表1.CDR定義
CDR接合(-grafted)抗体:用語「CDR接合抗体」は、マウス重鎖および軽鎖可変領域を有するがマウスCDRの1以上(例として、CDR3)がヒトCDR配列に置き換えられている抗体などの、ある種からの重鎖および軽鎖可変領域配列を含むが、そのVHおよび/またはVLのCDR領域の1以上の配列が別の種のCDR配列に置き換えられている抗体を指す。
キメラ抗体:用語「キメラ抗体」は、ヒト定常領域へ連結されたマウス重鎖および軽鎖可変領域を有する抗体などの、ある種からの重鎖および軽鎖可変領域配列と別の種からの定常領域配列を含む抗体を指す。
相補的:本明細書に使用されるとき、用語「相補的」は、2ヌクレオチド間または2組のヌクレオチド間の正確な対形成のための能力(capacity)を指す。とりわけ、相補的は、2ヌクレオチド間または2組のヌクレオチド間に結合をもたらす水素結合対形成の程度を特徴付ける用語である。例えば、ある位置のオリゴヌクレオチドの塩基が、対応する位置の標的核酸(例として、mRNA)の塩基と水素結合することが可能である場合、そのとき塩基は、その位置にて互いに相補的であると見なされる。塩基対合は、標準的なWatson-Crick塩基対合と非Watson-Crick塩基対合(例として、Wobble塩基対合およびHoogsteen塩基対合)との両方を包含してもよい。例えば、いくつかの態様において、相補的な塩基対合として、アデノシン型塩基(A)は、チミジン型塩基(T)またはウラシル型塩基(U)に相補的であり、シトシン型塩基(C)は、グアノシン型塩基(G)に相補的であり、3-ニトロピロールまたは5-ニトロインドールなどのユニバーサル塩基は、いずれのA、C、U、またはTとハイブリダイズし得る。イノシン(I)はまた、当該技術分野においてユニバーサル塩基であるとも見なされており、いずれのA、C、U、またはTに相補的であると見なされる。
保存アミノ酸置換:本明細書に使用されるとき、「保存アミノ酸置換」は、アミノ酸置換がなされたタンパク質の相対的な電荷またはサイズの特徴を変更しないアミノ酸置換を指す。バリアントは、当業者に知られているポリペプチド配列を変更するための方法に従って調製され得、例えば、かかる方法をまとめた参考文献、例として、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,J.Sambrook,et al.,eds.,Fourth Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,2012、またはCurrent Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel,et al.,eds.,John Wiley&Sons,Inc.,New Yorkから見出される。アミノ酸の保存的置換は、以下の群:(a)M、I、L、V;(b)F、Y、W;(c)K、R、H;(d)A、G;(e)S、T;(f)Q、N;および(g)E、D内のアミノ酸に対してなされる置換を包含する。
共有結合的に連結された(または、連結されている):本明細書に使用されるとき、用語「共有結合的に連結された(または、連結されている)」は、少なくとも1個の共有結合を介して一緒に連結されている2個以上の分子の特徴を指す。いくつかの態様において、2個の分子は一緒に、分子間リンカーとして働く単結合(例として、ジスルフィド結合またはジスルフィド架橋)によって共有結合的に連結され得る。しかしながら、いくつかの態様において、複数の共有結合を通して2個以上の分子を一緒に結び合わせるリンカーとして働く分子を介して、2個以上の分子は一緒に、共有結合的に連結され得る。いくつかの態様において、リンカーは、切断可能なリンカーであってもよい。しかしながら、いくつかの態様において、リンカーは、切断不能なリンカーであってもよい。
交差反応すること:本明細書に使用されるとき、および標的化剤(例として、抗体)の文脈において、用語「交差反応すること」は、同様のタイプまたはクラスの1種より多くの抗原(例として、複数のホモログ、パラログ、もしくはオルソログの抗原)へ、同様の親和性または結合活性で特異的に結合することが可能な剤の特性を指す。例えば、いくつかの態様において、同様のタイプまたはクラスのヒトおよび霊長目の非ヒト動物の抗原(例として、ヒトトランスフェリン受容体および霊長目の非ヒト動物のトランスフェリン受容体)に対して交差反応する抗体は、ヒト抗原および霊長目の非ヒト動物の抗原へ、同様の親和性または結合活性で結合することが可能である。いくつかの態様において、抗体は、同様のタイプまたはクラスのヒト抗原および齧歯類動物抗原に対して交差反応する。いくつかの態様において、抗体は、同様のタイプまたはクラスの齧歯類動物の抗原および霊長目の非ヒト動物の抗原に対して交差反応する。いくつかの態様において、抗体は、同様のタイプまたはクラスのヒト抗原、霊長目の非ヒト動物の抗原、および齧歯類動物の抗原に対して交差反応する。
DMD:本明細書に使用されるとき、用語「DMD」は、筋細胞における内部細胞骨格および細胞外マトリックス、具体的には、筋肉繊維を架橋するジストロフィン－糖タンパク質複合体の重要な構成要素である、ジストロフィンタンパク質をコードする遺伝子を指す。DMDにおける欠失、重複および点突然変異は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィーまたは心筋症（例として、DMD関連拡張型心筋症)などの、ジストロフィン異常症を引き起こし得る。代替的なプロモーター使用および代替的なスプライシングは、この遺伝子について、多数の別個の転写産物バリアントおよびタンパク質アイソフォームを結果として生じる。いくつかの態様において、ジストロフィン遺伝子は、ヒト(遺伝子ID：1756)、非ヒト霊長類(例として、遺伝子ID：465559)、またはげっ歯類遺伝子(例として、遺伝子ID：13405；遺伝子ID：24907)であってもよい。さらに、異なるタンパク質アイソフォームをコードする、複数のヒト転写産物バリアント(例として、GenBank RefSeq Accession Number: NM_000109.3, NM_004006.2(配列番号2239), NM_004009.3, NM_004010.3および NM_004011.3で示される)が特徴付けられている。
DMDアレル:本明細書に使用されるとき、用語「DMDアレル」は、DMD遺伝子の代替的な形態(例として、野生型または突然変異型)のいずれか1つを指す。いくつかの態様において、DMDアレルは、その正常なおよび典型的な機能を保持するジストロフィンをコードしてもよい。いくつかの態様において、DMDアレルは、筋ジストロフィーを結果として生じる1つ以上の突然変異を含んでもよい。デュシェンヌ型筋ジストロフィーに繋がる一般的な突然変異は、ジストロフィンアレルにおいて存在する79のエキソン、例として、エキソン8、エキソン23、エキソン41、エキソン44、エキソン50、エキソン51、エキソン52、エキソン53またはエキソン55)の1つ以上のフレームシフト、欠失、置換、および重複突然変異を包含する。DMD突然変異のさらなる例は、例として、Flanigan KM, et al., Mutational spectrum of DMD mutations in dystrophinopathy patients: application of modern diagnostic techniques to a large cohort. Hum Mutat. 2009 Dec; 30 (12):1657-66において開示されており、その全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる。
ジストロフィン異常症：本明細書に使用されるとき、用語「ジストロフィン異常症」は、1つ以上の突然変異したDMDアレルから結果として生じる筋疾患を指す。ジストロフィン異常症は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、およびDMD関連拡張型心筋症(DCM)を包含する、１つの範囲(spectrum)の状態(軽度から重篤まで変化する)を包含する。いくつかの態様において、範囲の１つの末端において、ジストロフィン異常症は、クレアチンホスホキナーゼ(CK)の血漿濃度の無症状の増大、および／または(例として、および)ミオグロビン尿症を有する筋痙攣、に表現型的に関連している。いくつかの態様において、範囲の他の末端において、ジストロフィン異常症は、骨格筋が主に影響するときに、デュシェンヌ型筋ジストロフィーまたはベッカー型筋ジストロフィーとして一般的に分類され、および、心臓が主に影響するときに、DMD関連拡張型心筋症(DCM)として分類される、進行性の筋疾患に表現型的に関連している。デュシェンヌ型筋ジストロフィーの症状は、筋肉の喪失または変性、減少した筋機能、舌および子ウシの筋肉の偽性肥大(peseudophypertrophy)、高リスクの神経異常、および短縮された寿命を包含する。デュシェンヌ型筋ジストロフィーは、Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) Entry # 310200に関連している。ベッカー型筋ジストロフィーは、OMIM Entry # 300376に関連している。拡張型心筋症は、OMIM Entry X# 302045に関連している。
エキソニックスプライシングエンハンサー(ESE)：本明細書で使用されるように、用語「エキソニックスプライシングエンハンサー」または「ESE」は、例えば、Blencoweら、Trends Biochem Sci 25, 106-10 に記載のように、プレmRNAのmRNAへのスプライシングを指示または強化する遺伝子、プレmRNAまたはmRNAのエキソン内の核酸配列モチーフを指す。(2000)に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。ESEは、例えば、遺伝子転写物から1つ以上のイントロンおよび/または1つ以上のエキソンを除去するために、スプライシングを指示または促進してもよい。ESEモチーフは、典型的には6-8塩基長である。SRタンパク質(例えば、遺伝子SRSF1、SRSF2、SRSF3、SRSF4、SRSF5、SRSF6、SRSF7、SRSF8、SRSF9、SRSF10、SRSF11、SRSF12、TRA2AまたはTRA2Bによってコードされるタンパク質)はそのRNA認識モチーフ領域を通じてESEに結合してスプライシングを促進させる。ESEモチーフは、参照により本明細書に組み込まれるCartegni et al., Nucleic Acids Research, 2003, Vol. 31, No. 13, 3568-3571に記載されるものを含む多くの方法によって同定され得る。
フレームワーク:本明細書に使用されるとき、用語「フレームワーク」または「フレームワーク配列」は、CDRを差し引いた可変領域の残りの配列を指す。CDR配列の厳密な定義が種々の系によって決定され得ることから、フレームワーク配列の意味は、相応に異なる解釈に依存する。6つのCDR(軽鎖のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3、ならびに重鎖のCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3)もまた、軽鎖および重鎖上のフレームワーク領域を各鎖上の4つの下位領域(FR1、FR2、FR3、およびFR4)に分け、ここでCDR1はFR1とFR2との間に、CDR2はFR2とFR3との間に、CDR3はFR3とFR4との間に位置付けられる。具体的な下位領域をFR1、FR2、FR3、またはFR4と特定しないフレームワーク領域は、他によって言及されるとき、天然に存在する単一の免疫グロブリン鎖の可変領域内の組み合わされたFR(複数)を表す。本明細書に使用されるとき、FRは4つの下位領域のうち1つを表し、FR(複数)はフレームワーク領域を含有する4つの下位領域のうち2つ以上を表す。ヒト重鎖および軽鎖アクセプター配列は、当該技術分野において知られている。一態様において、当該技術分野において知られているアクセプター配列は、本明細書に開示の抗体に使用されていてもよい。
ヒト抗体:用語「ヒト抗体」は、本明細書に使用されるとき、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を包含することが意図される。本開示のヒト抗体は、例えばCDR、とりわけCDR3において、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基(例として、in vitroでのランダム変異誘発もしくは部位特異的変異誘発によってか、またはin vivoでの体細胞変異によって導入された突然変異)を包含していてもよい。しかしながら、用語「ヒト抗体」は、本明細書に使用されるとき、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列上へ接合された抗体を包含することは意図されない。
ヒト化抗体:用語「ヒト化抗体」は、非ヒト種(例として、マウス)からの重鎖および軽鎖の可変領域配列を含むが、VH配列および/または(例として、および)VL配列の少なくとも一部がより「ヒト様」に、すなわち、ヒト生殖細胞系可変配列とより同様なものに変更された抗体を指す。ヒト化抗体のあるタイプは、ヒトCDR配列が非ヒトVHおよびVL配列上へ導入されて対応する非ヒトCDR配列と置き換えられたCDR接合抗体である。一態様において、ヒト化された抗トランスフェリン受容体抗体および抗原結合部分が提供される。かかる抗体は、既存のハイブリドーマ技術、これに続くin vitroの遺伝子工学を使用するヒト化(KasaianらのPCT刊行物第WO 2005/123126 A2号に開示されたものなど)を使用してマウス抗トランスフェリン受容体モノクローナル抗体を得ることによって生成されてもよい。
内在化する細胞表面受容体:本明細書に使用されるとき、用語「内在化する細胞表面受容体」は、例として、外部刺激(例として、受容体へ結合するリガンド)の際、細胞によって内在化される細胞表面受容体を指す。いくつかの態様において、内在化する細胞表面受容体は、エンドサイトーシスによって内在化される。いくつかの態様において、内在化する細胞表面受容体は、クラスリン媒介エンドサイトーシスによって内在化される。しかしながら、いくつかの態様において、内在化する細胞表面受容体は、クラスリンに依存しない経路、例えば、食作用、マクロピノサイトーシス、カベオラ-およびラフト-媒介取り込み、またはクラスリンに依存しない構成的エンドサイトーシスなどによって内在化される。いくつかの態様において、内在化する細胞表面受容体は、細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、および/または(例として、および)、細胞外ドメインを含み、これらは任意にさらにリガンド結合ドメインを含む。いくつかの態様において、細胞表面受容体は、リガンド結合後に細胞によって内在化されるようになる。いくつかの態様において、リガンドは、筋標的化剤または筋標的化抗体であってもよい。いくつかの態様において、内在化する細胞表面受容体は、トランスフェリン受容体である。
単離された抗体:「単離された抗体」は、本明細書に使用されるとき、異なる抗原特異性を有する他の抗体が実質的にない抗体を指すことが意図される(例として、トランスフェリン受容体に特異的に結合する単離された抗体は、トランスフェリン受容体以外の抗原に特異的に結合する抗体が実質的にない)。しかしながら、トランスフェリン受容体複合体に特異的に結合する単離された抗体は、他の種からのトランスフェリン受容体分子などの他の抗原への交差反応性を有していてもよい。その上、単離された抗体は、他の細胞の材料および/または(例として、および)化学物質が実質的になくてもよい。
Kabatナンバリング:用語「Kabatナンバリング」、「Kabat定義」、および「Kabat標識化」は本明細書中、互換的に使用される。これらの用語は、当該技術分野において認識されているが、抗体またはその抗原結合部分の重鎖および軽鎖可変領域中の他のアミノ酸残基より可変(すなわち、高可変)であるアミノ酸残基をナンバリングする系を指す(Kabat et al.(1971)Ann.NY Acad,Sci.190:382-391および、Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)。重鎖可変領域において、超可変領域は、CDR1につきアミノ酸位置31～35、CDR2につきアミノ酸位置50～65、およびCDR3につきアミノ酸位置95～102に及ぶ。軽鎖可変領域において、超可変領域は、CDR1につきアミノ酸位置24～34、CDR2につきアミノ酸位置50～56、およびCDR3につきアミノ酸位置89～97に及ぶ。
分子ペイロード:本明細書に使用されるとき、用語「分子ペイロード」は、生物学的結果(biological outcome)をモジュレートするよう機能する分子または種を指す。いくつかの態様において、分子ペイロードは、筋標的化剤へ連結されているか、または筋標的化剤へ別様に結び付けられている。いくつかの態様において、分子ペイロードは、小分子、タンパク質、ペプチド、核酸、またはオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DNA配列の転写をモジュレートするよう、タンパク質の発現をモジュレートするよう、またはタンパク質の活性をモジュレートするよう機能する。いくつかの態様において、分子ペイロードは、標的遺伝子と相補性のある領域を有する鎖を含むオリゴヌクレオチドである。
筋標的化剤:本明細書に使用されるとき、用語「筋標的化剤」は、筋細胞上に発現されている抗原へ特異的に結合する分子を指す。筋細胞中または筋細胞上の抗原は、膜タンパク質、例えば、内在性膜タンパク質または表在性膜タンパク質であってもよい。典型的には、筋標的化剤は、筋細胞中への筋標的化剤(および結び付けられたいずれの分子ペイロード)の内在化を容易にさせる筋細胞上の抗原へ特異的に結合する。いくつかの態様において、筋標的化剤は、筋肉上の内在化する細胞表面受容体へ特異的に結合し、受容体媒介内在化を通して筋細胞中へ内在化されることが可能である。いくつかの態様において、筋標的化剤は、小分子、タンパク質、ペプチド、核酸(例として、アプタマー)、または抗体である。いくつかの態様において、筋標的化剤は、分子ペイロードへ連結されている。
筋標的化抗体:本明細書に使用されるとき、用語「筋標的化抗体」は、筋細胞中または筋細胞上に見出される抗原へ特異的に結合する抗体である筋標的化剤を指す。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、筋細胞中への筋標的化抗体(および結び付けられたいずれの分子ペイロード)の内在化を容易にする筋細胞上の抗原へ特異的に結合する。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、筋細胞上に存在する、内在化する細胞表面受容体へ特異的に結合する。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、トランスフェリン受容体へ特異的に結合する抗体である。
オリゴヌクレオチド:本明細書に使用されるとき、用語「オリゴヌクレオチド」は、長さが最大200ヌクレオチドまでのオリゴマーの核酸化合物を指す。オリゴヌクレオチドの例は、これらに限定されないが、RNAiオリゴヌクレオチド(例として、siRNA、shRNA)、マイクロRNA、gapmer、mixmer、ホスホロジアミダートモルホリノ、ペプチド核酸、アプタマー、ガイド核酸(例として、Cas9ガイドRNA)等々を包含する。オリゴヌクレオチドは一本鎖または二本鎖であってもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、1個以上の修飾ヌクレオチド(例として、2'-O-メチル糖修飾、プリンまたはピリミジン修飾)を含んでいてもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、1個以上の修飾ヌクレオチド間連結を含んでいてもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、RpまたはSpの立体化学配置にあってもよい1個以上のホスホロチオアート連結を含んでいてもよい。
組換え抗体:用語「組換えヒト抗体」は、本明細書に使用されるとき、組換え手段によって調製、発現、創出、もしくは単離されたすべてのヒト抗体、たとえば、宿主細胞中へトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体(本開示により詳細に記載される)、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗体(Hoogenboom H.R.,(1997)TIB Tech.15:62-70;Azzazy H.,and Highsmith W.E.,(2002)Clin.Biochem.35:425-445;Gavilondo J.V.,and Larrick J.W.(2002)BioTechniques 29:128-145;Hoogenboom H.,and Chames P.(2000)Immunology Today 21:371-378)、ヒト免疫グロブリン遺伝子トランスジェニック動物(例として、マウス)から単離された抗体(例として、Taylor,L.D.,et al.(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295;Kellermann S-A.,and Green L.L.(2002)Current Opinion in Biotechnology 13:593-597;Little M.et al(2000)Immunology Today 21:364-370を見よ)、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のDNA配列とのスプライシングを伴ういずれの他の手段によって調製、発現、創出、もしくは単離された抗体を包含することが意図される。かかる組換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。しかしながら、ある態様において、かかる組換えヒト抗体は、in vitroでの変異誘発(または、ヒトIg配列トランスジェニック動物が使用されるとき、in vivoでの体細胞変異誘発)へ供され、よって、組換え抗体のVHおよびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系のVH配列およびVL配列に由来しかつこれに関するとはいえ、in vivoでのヒト抗体の生殖細胞系列レパートリー内には天然に存在しないこともある配列である。本開示の一態様は、当該技術分野において周知である技法を使用して、たとえば、これらに限定されないが、ヒトIgファージライブラリ(たとえば、JermutusらのPCT刊行物第WO 2005/007699 A2号に開示されたもの)を使用する技法を使用して生成され得るヒトトランスフェリン受容体に結合することが可能な完全ヒト抗体を提供する。
相補性のある領域:本明細書に使用されるとき、用語「相補性のある領域」は、2つのヌクレオチド配列が生理学的な条件下(例として、細胞中)相互にアニーリングすることが可能であるような、同族の(cognate)ヌクレオチド配列(例として、標的核酸のヌクレオチド配列)に充分に相補的であるヌクレオチド配列(例として、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列)を指す。いくつかの態様において、相補性のある領域は、標的核酸の同族のヌクレオチド配列に完全に相補的である。しかしながら、いくつかの態様において、相補性のある領域は、標的核酸の同族のヌクレオチド配列に部分的に相補的(例として、少なくとも80％、90％、95％、または99％相補性)である。いくつかの態様において、相補性のある領域は、標的核酸の同族のヌクレオチド配列と比較して1個、2個、3個、または4個のミスマッチを含有する。
特異的に結合する:本明細書に使用されるとき、用語「特異的に結合する」は、結合アッセイまたは他の結合に関する文脈(binding context)において、分子が、適切な対照から結合パートナーを区別するために使用され得る親和性または結合活性の程度での、分子の、結合パートナーへの結合能を指す。抗体に関し、用語「特異的に結合する」は、親和性または結合活性の程度で(例として、本明細書に記載のとおり、抗原への結合を通してある細胞(例として、筋細胞)への優先的な標的化を許容する程度で)、適切な参照抗原、または抗体が他の抗原から特定の抗原を区別するために使用され得る抗原と比較して、抗体が特定の抗原へ結合する能力を指す。いくつかの態様において、抗体が標的へ結合する際少なくとも約10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、またはこれ未満のKDを有する場合、抗体は標的へ特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体が、トランスフェリン受容体、例として、トランスフェリン受容体の先端ドメインのエピトープへ特異的に結合する。
対象:本明細書に使用されるとき、用語「対象」は、哺乳動物を指す。いくつかの態様において、対象は、霊長目の非ヒト動物または齧歯類動物である。いくつかの態様において、対象は、ヒトである。いくつかの態様において、対象は、疾患を有するかまたは疾患を有すると疑われる患者/患畜(patient)、例として、ヒト患者である。いくつかの態様において、対象は、突然変異したDMD遺伝子配列、例として、DMD遺伝子配列のエキソンにおける突然変異から結果として生じる疾患を有するかまたは疾患を有すると疑われるヒト患者である。いくつかの態様において、対象は、ジストロフィン異常症、例として、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する。
トランスフェリン受容体:本明細書に使用されるとき、用語「トランスフェリン受容体」(またTFRC、CD71、p90、TFR、またはTFR1としても知られている)は、エンドサイトーシスによる鉄取り込みを容易にするためのトランスフェリンへ結合する、内在化する細胞表面受容体を指す。いくつかの態様において、トランスフェリン受容体は、ヒト(NCBI Gene ID 7037)、霊長目の非ヒト動物(例として、NCBI Gene ID 711568もしくはNCBI Gene ID 102136007)、または齧歯類の動物(例として、NCBI Gene ID 22042)を起源としていてもよい。加えて、受容体の種々のアイソフォームをコードした複数のヒト転写産物バリアントが(例として、GenBank RefSeq受託番号:NP_001121620.1、NP_003225.2、NP_001300894.1、およびNP_001300895.1の注釈付きのものであるように)特徴付けられている。
2'修飾ヌクレオシド:本明細書に使用されるとき、用語「2'修飾ヌクレオシド」および「2'修飾リボヌクレオシド」は互換的に使用され、2'位にて修飾された糖部分を有するヌクレオシドを指す。いくつかの態様において、2'修飾ヌクレオシドは、2'-4'二環式ヌクレオシドであり、ここで糖の2'および4'位は架橋されている(例として、メチレン、エチレン、または(S)-拘束エチル架橋による)。いくつかの態様において、2'修飾ヌクレオシドは非二環式2'修飾ヌクレオシドであり、例えばここで糖部分の2'位は置換されている。2'修飾ヌクレオシドの非限定例は、以下:2'デオキシ、2'-フルオロ(2'-F)、2'-O-メチル(2'-O-Me)、2'-O-メトキシエチル(2'-MOE)、2'-O-アミノプロピル(2'-O-AP)、2'-O-ジメチルアミノエチル(2'-O-DMAOE)、2'-O-ジメチルアミノプロピル(2'-O-DMAP)、2'-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2'-O-DMAEOE)、2'-O-N-メチルアセトアミド(2'-O-NMA)、ロックド核酸(LNA、メチレン架橋核酸)、エチレン架橋核酸(ENA)、および(S)-拘束エチル架橋核酸(cEt)を包含する。いくつかの態様において、本明細書に記載の2'修飾ヌクレオシドは高親和性修飾ヌクレオチドであり、2'修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、未修飾のオリゴヌクレオチドと比べて標的配列に対する増大した親和性を有する。2'修飾ヌクレオシドの構造の例は、下に提供される:
Figure 2023535073000003
II.複合体
本明細書に提供されるのは、標的化剤、例として、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗体を含む複合体である。いくつかの態様において、複合体は、オリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結された筋標的化抗体を含む。複合体は、単一の抗原部位に特異的に結合する抗体、または同じ抗原上もしくは異なる抗原上に存在していてもよい少なくとも2つの抗原部位へ結合する抗体を含んでいてもよい。
複合体は、少なくとも1個の遺伝子、タンパク質、および/または(例として、および)、核酸の活性あるいは機能をモジュレートするために使用されてもよい。いくつかの態様において、複合体とともに存在する分子ペイロードは、遺伝子、タンパク質、および/または(例として、および)、核酸のモジュレーションを担う。分子ペイロードは、細胞中の遺伝子、タンパク質、および/または(例として、および)、核酸の活性あるいは機能をモジュレートすることが可能な、小分子、タンパク質、核酸、オリゴヌクレオチド、あるいはいずれの分子実体であってもよい。いくつかの態様において、分子ペイロードは、筋細胞における疾患関連リピートを標的にするオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、複合体は、エキソンスキッピングを促進するために、分子ペイロード(例として、突然変異したDMDアレルを標的にするミックスマー(mixmer)アンチセンスオリゴヌクレオチド)へ共有結合的に連結された、筋標的化剤(例として、抗トランスフェリン受容体抗体)を含む。
Ａ．筋標的化剤
本開示のいくつかの側面は、筋標的化剤、例として、分子ペイロードを筋細胞へ送達するための筋標的化剤を提供する。いくつかの態様において、かかる筋標的化剤は、例として、筋細胞上の抗原への特異的な結合を介して、筋細胞へ結合すること、および結び付けられた分子ペイロードを筋細胞へ送達することが可能である。いくつかの態様において、分子ペイロードは、筋標的化剤へ結合されて(例として、共有結合的に結合されて)おり、筋標的化剤が筋細胞上の抗原へ結合した際、例としてエンドサイトーシスを介して、筋細胞中へ内在化される。様々なタイプの筋標的化剤が本開示に従い使用されてもよいことは解されるはずである。例えば、筋標的化剤は、核酸(例として、DNAまたはRNA)、ペプチド(例として、抗体)、脂質(例として、マイクロベシクル)、または糖部(例として、多糖類)を含んでいてもよく、またはこれらからなっていてもよい。例示の筋標的化剤は本明細書中さらに詳細に記載されているが、しかしながら、本明細書に提供される例示の筋標的化剤が限定されることを意図していないことは解されるはずである。
本開示のいくつかの側面は、骨格筋、平滑筋、または心筋などの筋肉上の抗原へ特異的に結合する筋標的化剤を提供する。いくつかの態様において、本明細書に提供される筋標的化剤のいずれも、骨格筋細胞、平滑筋細胞、および/または(例として、および)、心筋細胞上の抗原へ結合する(例として、特異的に結合する)。
筋肉特異的細胞表面認識要素(例として、細胞膜タンパク質)との相互作用によって、組織局在化と筋細胞への選択的取り込みとの両方が達成され得る。いくつかの態様において、筋肉の取り込みトランスポーターの基質である分子は、分子ペイロードを筋組織中へ送達するのに有用である。筋肉表面認識要素への結合、これに続くエンドサイトーシスは、抗体などの巨大分子さえも筋細胞へ侵入できるようにし得る。別の例として、トランスフェリンまたは抗トランスフェリン受容体抗体へ抱合された分子ペイロードは、トランスフェリン受容体への結合を介し筋細胞によって取り入れられ得、次いで、例としてクラスリン媒介エンドサイトーシスを介し、形質膜陥入され(endocytosed)てもよい。
筋標的化剤の使用は、他の組織において効果に関連する毒性を低減しつつ、筋肉中の分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド)を濃縮するのに有用なこともある。いくつかの態様において、筋標的化剤は、対象内の別の細胞型と比較して、筋細胞中の結合された分子ペイロードを濃縮させる。いくつかの態様において、筋標的化剤は、筋細胞(例として、骨格筋細胞、平滑筋細胞、または心筋細胞)中の結合された分子ペイロードを、非筋細胞(例として、肝臓細胞、神経細胞、血液細胞、または脂肪細胞)中の量より少なくとも1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、または100倍多い量で濃縮する。いくつかの態様において、筋標的化剤へ結合された場合の分子ペイロードの対象における毒性は、これが対象へ送達されたとき、少なくとも1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％、または95％低減される。
いくつかの態様において、筋肉選択性を獲得するために、筋肉認識要素(例として、筋細胞抗原)が要されることもある。一例として、筋標的化剤は、筋肉特異的取り込みトランスポーターの基質である小分子であってもよい。別の例として、筋標的化剤は、トランスポーター媒介エンドサイトーシスを介して筋細胞へ侵入する抗体であってもよい。別の例として、筋標的化剤は、筋細胞上の細胞表面受容体へ結合するリガンドであってもよい。トランスポーターをベースとしたアプローチが細胞侵入への直通路を提供するのに対し、受容体をベースとした標的化が所望の作用部位に達するために刺激されたエンドサイトーシスを伴うこともあることは解されるはずである。
i.筋標的抗体
いくつかの態様において、筋標的化剤は、抗体である。一般に、それらの標的抗原に対する抗体の高い特異性は、筋細胞(例として、骨格筋細胞、平滑筋細胞、および/または(例として、および)、心筋細胞)を選択的に標的にする潜在力を提供する。この特異性はまた、オフターゲット毒性(off-target toxicity)を限定することもある。筋細胞の表面抗原を標的にすることが可能である抗体の例は報告されており、かつ本開示の範囲内にある。例えば、筋細胞の表面を標的にする抗体は、Arahata K.,et al.“Immunostaining of skeletal and cardiac muscle surface membrane with antibody against Duchenne muscular dystrophy peptide”Nature 1988;333:861-3;Song K.S.,et al.“Expression of caveolin-3 in skeletal,cardiac,and smooth muscle cells.Caveolin-3 is a component of the sarcolemma and co-fractionates with dystrophin and dystrophin-associated glycoproteins”J Biol Chem 1996;271:15160-5;およびWeisbart R.H.et al.,“Cell type specific targeted intracellular delivery into muscle of a monoclonal antibody that binds myosin IIb”Mol Immunol.2003 Mar,39(13):78309に記載されている;これら各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
a.抗トランスフェリン受容体抗体
本開示のいくつかの側面は、トランスフェリン受容体、例として抗トランスフェリン受容体抗体へ結合する剤は筋細胞を標的にすることが可能であるという認識に基づく。トランスフェリン受容体は、細胞膜を越えてトランスフェリンを輸送し細胞内鉄レベルの調節およびホメオスタシスに加わる内在化する細胞表面受容体である。本開示のいくつかの側面は、トランスフェリン受容体へ結合することが可能なトランスフェリン受容体結合タンパク質を提供する。結果的に、本開示の側面は、トランスフェリン受容体へ結合する結合タンパク質(例として、抗体)を提供する。いくつかの態様において、トランスフェリン受容体へ結合する結合タンパク質は、結合されたいずれの分子ペイロードと共に、筋細胞中へ内在化される。本明細書に使用されるとき、トランスフェリン受容体へ結合する抗体は、トランスフェリン受容体抗体、抗トランスフェリン受容体抗体、または抗TfR抗体と互換的に称されることもある。トランスフェリン受容体へ結合する、例として特異的に結合する抗体は、トランスフェリン受容体へ結合した際、例として受容体媒介エンドサイトーシスを通して、細胞中へ内在化されてもよい。
抗トランスフェリン受容体抗体が、知られている数種の方法論、例としてファージディスプレーを使用するライブラリ設計を使用して、産生、合成、および/または(例として、および)、誘導体化されてもよいことは解されるはずである。例示の方法論は当該技術分野において特徴付けられており、参照により組み込まれる(Diez,P.et al.“High-throughput phage-display screening in array format”,Enzyme and microbial technology,2015,79,34-41.;Christoph M.H.and Stanley,J.R.“Antibody Phage Display:Technique and Applications”J Invest Dermatol.2014,134:2.;Engleman,Edgar(Ed.)“Human Hybridomas and Monoclonal Antibodies.”1985,Springer)。他の態様において、抗トランスフェリン抗体はこれまでに特徴付けられているかまたは開示されている。トランスフェリン受容体へ特異的に結合する抗体は当該技術分野において知られている(例として、米国特許第4,364,934号、12/4/1979出願、“Monoclonal antibody to a human early thymocyte antigen and methods for preparing same”;米国特許第8,409,573号、6/14/2006出願、“Anti-CD71 monoclonal antibodies and uses thereof for treating malignant tumor cells”;米国特許第9,708,406号、5/20/2014出願、“Anti-transferrin receptor antibodies and methods of use”;米国特許第9,611,323号、12/19/2014出願、“Low affinity blood brain barrier receptor antibodies and uses therefor”;WO 2015/098989、12/24/2014出願、“Novel anti-Transferrin receptor antibody that passes through blood-brain barrier”;Schneider C.et al.“Structural features of the cell surface receptor for transferrin that is recognized by the monoclonal antibody OKT9.”J Biol Chem.1982,257:14,8516-8522.;Lee et al.“Targeting Rat Anti-Mouse Transferrin Receptor Monoclonal Antibodies through Blood-Brain Barrier in Mouse”2000,J Pharmacol.Exp.Ther.,292:1048-1052を見よ)。
本明細書に提供されるは、いくつかの側面において、筋標的化剤としての(例として、筋標的化複合体への)使用のための新しい抗TfR抗体である。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体は、高い特異性および親和性でトランスフェリン受容体に結合する。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体は、トランスフェリン受容体のいずれかの細胞外エピトープまたは抗体に対して暴露されるようになるエピトープに特異的に結合する。いくつかの態様において、本明細書に提供される抗TfR抗体はヒト、霊長目の非ヒト動物、マウス、ラットなどからのトランスフェリン受容体に特異的に結合する。いくつかの態様において、本明細書に提供される抗TfR抗体はヒトトランスフェリン受容体に結合する。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体は、配列番号105～108で提供されるヒトまたは霊長目の非ヒト動物トランスフェリン受容体のアミノ酸セグメントに結合する。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体は、トランスフェリン受容体の頂点ドメインにはない、配列番号105で表されるとおりのヒトトランスフェリン受容体のアミノ酸90～96に対応するアミノ酸セグメントに結合する。
NCBI配列NP_003225.2(トランスフェリン受容体タンパク質1アイソフォーム1、homo sapiens)に対応する、ヒトトランスフェリン受容体アミノ酸配列の例は、以下のとおりである:
MMDQARSAFSNLFGGEPLSYTRFSLARQVDGDNSHVEMKLAVDEEENADNNTKANVTKPKRCSGSICYGTIAVIVFFLIGFMIGYLGYCKGVEPKTECERLAGTESPVREEPGEDFPAARRLYWDDLKRKLSEKLDSTDFTGTIKLLNENSYVPREAGSQKDENLALYVENQFREFKLSKVWRDQHFVKIQVKDSAQNSVIIVDKNGRLVYLVENPGGYVAYSKAATVTGKLVHANFGTKKDFEDLYTPVNGSIVIVRAGKITFAEKVANAESLNAIGVLIYMDQTKFPIVNAELSFFGHAHLGTGDPYTPGFPSFNHTQFPPSRSSGLPNIPVQTISRAAAEKLFGNMEGDCPSDWKTDSTCRMVTSESKNVKLTVSNVLKEIKILNIFGVIKGFVEPDHYVVVGAQRDAWGPGAAKSGVGTALLLKLAQMFSDMVLKDGFQPSRSIIFASWSAGDFGSVGATEWLEGYLSSLHLKAFTYINLDKAVLGTSNFKVSASPLLYTLIEKTMQNVKHPVTGQFLYQDSNWASKVEKLTLDNAAFPFLAYSGIPAVSFCFCEDTDYPYLGTTMDTYKELIERIPELNKVARAAAEVAGQFVIKLTHDVELNLDYERYNSQLLSFVRDLNQYRADIKEMGLSLQWLYSARGDFFRATSRLTTDFGNAEKTDRFVMKKLNDRVMRVEYHFLSPYVSPKESPFRHVFWGSGSHTLPALLENLKLRKQNNGAFNETLFRNQLALATWTIQGAANALSGDVWDIDNEF(配列番号105)
NCBI配列NP_001244232.1(トランスフェリン受容体タンパク質1、Macaca mulatta)に対応する、霊長目の非ヒト動物トランスフェリン受容体アミノ酸配列の例は、以下のとおりである:
MMDQARSAFSNLFGGEPLSYTRFSLARQVDGDNSHVEMKLGVDEEENTDNNTKPNGTKPKRCGGNICYGTIAVIIFFLIGFMIGYLGYCKGVEPKTECERLAGTESPAREEPEEDFPAAPRLYWDDLKRKLSEKLDTTDFTSTIKLLNENLYVPREAGSQKDENLALYIENQFREFKLSKVWRDQHFVKIQVKDSAQNSVIIVDKNGGLVYLVENPGGYVAYSKAATVTGKLVHANFGTKKDFEDLDSPVNGSIVIVRAGKITFAEKVANAESLNAIGVLIYMDQTKFPIVKADLSFFGHAHLGTGDPYTPGFPSFNHTQFPPSQSSGLPNIPVQTISRAAAEKLFGNMEGDCPSDWKTDSTCKMVTSENKSVKLTVSNVLKETKILNIFGVIKGFVEPDHYVVVGAQRDAWGPGAAKSSVGTALLLKLAQMFSDMVLKDGFQPSRSIIFASWSAGDFGSVGATEWLEGYLSSLHLKAFTYINLDKAVLGTSNFKVSASPLLYTLIEKTMQDVKHPVTGRSLYQDSNWASKVEKLTLDNAAFPFLAYSGIPAVSFCFCEDTDYPYLGTTMDTYKELVERIPELNKVARAAAEVAGQFVIKLTHDTELNLDYERYNSQLLLFLRDLNQYRADVKEMGLSLQWLYSARGDFFRATSRLTTDFRNAEKRDKFVMKKLNDRVMRVEYYFLSPYVSPKESPFRHVFWGSGSHTLSALLESLKLRRQNNSAFNETLFRNQLALATWTIQGAANALSGDVWDIDNEF
(配列番号106)
NCBI配列XP_005545315.1(トランスフェリン受容体タンパク質1、Macaca fascicularis)に対応する、霊長目の非ヒト動物トランスフェリン受容体アミノ酸配列の例は、以下のとおりである:
MMDQARSAFSNLFGGEPLSYTRFSLARQVDGDNSHVEMKLGVDEEENTDNNTKANGTKPKRCGGNICYGTIAVIIFFLIGFMIGYLGYCKGVEPKTECERLAGTESPAREEPEEDFPAAPRLYWDDLKRKLSEKLDTTDFTSTIKLLNENLYVPREAGSQKDENLALYIENQFREFKLSKVWRDQHFVKIQVKDSAQNSVIIVDKNGGLVYLVENPGGYVAYSKAATVTGKLVHANFGTKKDFEDLDSPVNGSIVIVRAGKITFAEKVANAESLNAIGVLIYMDQTKFPIVKADLSFFGHAHLGTGDPYTPGFPSFNHTQFPPSQSSGLPNIPVQTISRAAAEKLFGNMEGDCPSDWKTDSTCKMVTSENKSVKLTVSNVLKETKILNIFGVIKGFVEPDHYVVVGAQRDAWGPGAAKSSVGTALLLKLAQMFSDMVLKDGFQPSRSIIFASWSAGDFGSVGATEWLEGYLSSLHLKAFTYINLDKAVLGTSNFKVSASPLLYTLIEKTMQDVKHPVTGRSLYQDSNWASKVEKLTLDNAAFPFLAYSGIPAVSFCFCEDTDYPYLGTTMDTYKELVERIPELNKVARAAAEVAGQFVIKLTHDTELNLDYERYNSQLLLFLRDLNQYRADVKEMGLSLQWLYSARGDFFRATSRLTTDFRNAEKRDKFVMKKLNDRVMRVEYYFLSPYVSPKESPFRHVFWGSGSHTLSALLESLKLRRQNNSAFNETLFRNQLALATWTIQGAANALSGDVWDIDNEF(配列番号107)
NCBI配列NP_001344227.1(トランスフェリン受容体タンパク質1、mus musculus)に対応する、マウストランスフェリン受容体アミノ酸配列の例は、以下のとおりである:
MMDQARSAFSNLFGGEPLSYTRFSLARQVDGDNSHVEMKLAADEEENADNNMKASVRKPKRFNGRLCFAAIALVIFFLIGFMSGYLGYCKRVEQKEECVKLAETEETDKSETMETEDVPTSSRLYWADLKTLLSEKLNSIEFADTIKQLSQNTYTPREAGSQKDESLAYYIENQFHEFKFSKVWRDEHYVKIQVKSSIGQNMVTIVQSNGNLDPVESPEGYVAFSKPTEVSGKLVHANFGTKKDFEELSYSVNGSLVIVRAGEITFAEKVANAQSFNAIGVLIYMDKNKFPVVEADLALFGHAHLGTGDPYTPGFPSFNHTQFPPSQSSGLPNIPVQTISRAAAEKLFGKMEGSCPARWNIDSSCKLELSQNQNVKLIVKNVLKERRILNIFGVIKGYEEPDRYVVVGAQRDALGAGVAAKSSVGTGLLLKLAQVFSDMISKDGFRPSRSIIFASWTAGDFGAVGATEWLEGYLSSLHLKAFTYINLDKVVLGTSNFKVSASPLLYTLMGKIMQDVKHPVDGKSLYRDSNWISKVEKLSFDNAAYPFLAYSGIPAVSFCFCEDADYPYLGTRLDTYEALTQKVPQLNQMVRTAAEVAGQLIIKLTHDVELNLDYEMYNSKLLSFMKDLNQFKTDIRDMGLSLQWLYSARGDYFRATSRLTTDFHNAEKTNRFVMREINDRIMKVEYHFLSPYVSPRESPFRHIFWGSGSHTLSALVENLKLRQKNITAFNETLFRNQLALATWTIQGVANALSGDIWNIDNEF
(配列番号108)
いくつかの態様では、抗トランスフェリン受容体抗体は、以下のように受容体のアミノ酸セグメントに結合し:FVKIQVKDSAQNSVIIVDKNGRLVYLVENPGGYVAYSKAATVTGKLVHANFGTKKDFEDLYTPVNGSIVIVRAGKITFAEKVANAESLNAIGVLIYMDQTKFPIVNAELSFFGHAHLGTGDPYTPGFPSFNHTQFPPSRSSGLPNIPVQTISRAAAEKLFGNMEGDCPSDWKTDSTCRMVTSESKNVKLTVSNVLKE(配列番号109)トランスフェリン受容体とトランスフェリンおよび/または(例として、および)ヒト血色素症タンパク質(HFEとしても知られる)との間の結合相互作用を阻害しない。いくつかの態様において、抗本明細書に記載のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号109のエピトープには結合しない。
適切な方法論は、例として、組換えDNAプロトコルの使用を通じて、抗体、抗体フラグメント、もしくは抗原結合剤を得るか、および/または(例として、および)、産生するために使用されてもよい。いくつかの態様において、抗体はまた、ハイブリドーマの生成を通しても産生されてよい(例として、Kohler,G and Milstein,C.「Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity」Nature,1975,256:495-497を見よ)。関心のある抗原は、いずれの型または実体の、例として、組換え型もしくは天然に存在する型または実体の免疫原として使用されてもよい。ハイブリドーマは、標準的な方法、例としてELISAスクリーニングを使用してスクリーニングされることで、具体的な抗原を標的にする抗体を産生する少なくとも1個のハイブリドーマが見出される。抗体はまた、抗体を発現するタンパク質発現ライブラリ(例として、ファージディスプレーライブラリ)のスクリーニングを通しても産生されてよい。ファージディスプレーライブラリ設計はまた、いくつかの態様において使用されてもよい(例として、米国特許第5,223,409号、3/1/1991出願、「Directed evolution of novel binding proteins」;WO 1992/18619、4/10/1992出願、「Heterodimeric receptor libraries using phagemids」;WO 1991/17271、5/1/1991出願、「Recombinant library screening methods」;WO 1992/20791、5/15/1992出願、「Methods for producing members of specific binding pairs」;およびWO 1992/15679、2/28/1992出願、「Improved epitope displaying phage」を見よ)。いくつかの態様において、関心のある抗原は、非ヒト動物、例として、齧歯類の動物またはヤギを免疫するために使用されてもよい。いくつかの態様において、次いで抗体が非ヒト動物から得られたら、任意に数多の方法論を使用し、例として組換えDNA技法を使用し、修飾してもよい。抗体産生および方法論の追加の例も当該技術分野において知られている(例として、Harlow et al.「Antibodies:A Laboratory Manual」,Cold Spring Harbor Laboratory,1988を見よ)。
いくつかの態様において、抗体は修飾されている(例として、グリコシル化、リン酸化、SUMO化、および/または(例として、および)、メチル化を介して修飾されている)。いくつかの態様において、抗体は、1個以上の糖または炭水化物分子へ抱合されたグリコシル化抗体である。いくつかの態様において、1個以上の糖または炭水化物分子は、N-グリコシル化、O-グリコシル化、C-グリコシル化、グリピエーション(GPIアンカー付着)、および/または(例として、および)、ホスホグリコシル化を介して、抗体へ抱合されている。いくつかの態様において、1個以上の糖または炭水化物分子は、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、またはグリカンである。いくつかの態様において、1個以上の糖または炭水化物分子は、分枝オリゴ糖類または分枝グリカンである。いくつかの態様において、1個以上の糖または炭水化物分子は、マンノース単位、グルコース単位、N-アセチルグルコサミン単位、N-アセチルガラクトサミン単位、ガラクトース単位、フコース単位、またはホスホ脂質単位を包含する。いくつかの態様において、糖分子は、約1～10個、約1～5個、約5～10個、約1～4個、約1～3個、または約2個存在する。いくつかの態様において、グリコシル化抗体は、全体的にまたは部分的にグリコシル化されている。いくつかの態様において、抗体は、化学反応によって、または酵素的な手段によってグリコシル化されている。いくつかの態様において、抗体は、in vitroでまたは細胞(任意にN-またはO-グリコシル化経路中の酵素(例として、グリコシルトランスフェラーゼ)を欠乏していてもよい)内部でグリコシル化される。いくつかの態様において、抗体は、「Modified antibody,antibody-conjugate and process for the preparation thereof」と題する2014年5月1日に公開された国際特許出願公開WO2014065661に記載のとおりの糖または炭水化物分子で官能化されている。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、表2から選択される抗TfR抗体のいずれか1つのVLドメインおよび/または(例として、および)VHドメインを含み、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、またはIgY免疫グロブリン分子、いずれかのクラス(例として、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2)、またはいずれかのサブクラス(例として、IgG2aおよびIgG2b)の免疫グロブリン分子の定常領域のアミノ酸配列を含む定常領域を含む。ヒト定常領域の非限定例は当該技術分野において記載されており、例として、上述のKabat E A et al.(1991)を見よ。
いくつかの態様において、トランスフェリン受容体に結合する薬剤、例として抗TfR抗体は、筋細胞を標的とすることができ、および/または(例として、および)血液脳関門を通過する薬剤の輸送を媒介する。トランスフェリン受容体は、細胞膜を越えてトランスフェリンを輸送し細胞内鉄レベルの調節およびホメオスタシスに加わる内在化する細胞表面受容体である。本開示のいくつかの側面は、トランスフェリン受容体へ結合することが可能なトランスフェリン受容体結合タンパク質を提供する。トランスフェリン受容体へ結合する、例として特異的に結合する抗体は、トランスフェリン受容体へ結合した際、例として受容体媒介エンドサイトーシスを通して、細胞中へ内在化されてもよい。
いくつかの態様では、トランスフェリン受容体に高い特異性および親和性で結合するヒト化抗体が本明細書で提供される。いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、トランスフェリン受容体のいずれかの細胞外エピトープ、または抗体に対して暴露されるようになるエピトープに特異的に結合する。いくつかの態様において、本明細書に提供されるヒト化抗TfR抗体はヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラットなどからのトランスフェリン受容体に特異的に結合する。いくつかの態様において、本明細書に提供されるヒト化抗TfR抗体は、ヒトトランスフェリン受容体に結合する。いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、配列番号105～108に提供されるような、ヒトまたは非ヒト霊長類トランスフェリン受容体のアミノ酸セグメントに結合する。いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、トランスフェリン受容体の先端ドメインにはない、配列番号105に示されるヒトトランスフェリン受容体のアミノ酸90～96に対応するアミノ酸セグメントに結合する。いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、TfR1に結合するが、TfR2には結合しない。
いくつかの態様において、抗TfR抗体は、少なくとも約10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、またはより小さい結合親和性(例として、Kdによって指し示される)によってTfR1(例として、ヒトまたは霊長目の非ヒト動物TfR1)に特異的に結合する。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体はサブナノモル範囲のKDによってTfR1に結合する。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体はトランスフェリン受容体1(TfR1)に選択的に結合するが、トランスフェリン受容体2(TfR2)には結合しない。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体はヒトTfR1およびカニクイTfR1に結合するが(例として、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、またはより小さいKdによる)、マウスTfR1には結合しない。抗TfR抗体の親和性および結合動態は、バイオセンサ技術(例として、OCTETまたはBIACORE)を包含するがこれらに限定されないいずれか好適な方法を使用して試験され得る。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体のいずれか1つの結合は、TfR1へのトランスフェリン結合と競合も阻害もしない。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体のいずれか1つの結合は、TfR1に対するHFE-ベータ2-ミクログロブリン結合と競合も阻害もしない。
本明細書中に記載される抗TfR抗体は、ヒト化抗体である。本明細書中に記載されるヒト化抗TfR抗体が由来するマウスモノクローナル抗TfR抗体のCDRおよび可変領域アミノ酸配列を表2に提供する。
表2.マウスモノクローナル抗TfR抗体
Figure 2023535073000005
Figure 2023535073000006
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、表2に提供される抗TfR抗体のいずれか1つのヒト化バリアントである。いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、表2に提供される示される抗TfR抗体のいずれか1つのCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3と同じCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含み、ヒト化重鎖可変領域および/または(例として、および)ヒト化軽鎖可変領域を含む。
ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域(CDR)からのその残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種(ドナー抗体)のCDRからの残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。いくつかの態様において、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。さらにまた、ヒト化抗体は、レシピエント抗体から見出されない残基も、移入された(imported)CDRまたはフレームワーク配列から見出されない残基も含んでいてもよいが、抗体の性能をさらに洗練および最適化するために包含される残基を含むこともある。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも1つの、典型的には2つの可変ドメインのすべてを実質的に含むであろうが、前記可変ドメインにおいて、CDR領域のすべてまたは実質的にすべてが、非ヒト免疫グロブリンのCDR領域に対応し、かつFR領域のすべてまたは実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のFR領域である。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン(典型的には、ヒト免疫グロブリンの)定常領域またはドメイン(Fc)の少なくとも一部も含むであろう。抗体は、WO 99/58572に記載のとおりに修飾されたFc領域を有していてもよい。ヒト化抗体の他の形態は、元の抗体に関して変更された1以上のCDR(1、2、3、4、5、6)を有しており、これらはまた、元の抗体からの1以上のCDRに由来する1以上のCDRとも呼ばれる。ヒト化抗体はまた、親和性成熟も伴うことがある。
ヒト化抗体およびこれらを作製する方法は知られており、例として、Almagro et al.,Front.Biosci.13:1619-1633(2008);Riechmann et al.,Nature 332:323-329(1988);Queen et al.,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989);米国特許第5,821,337号、第7,527,791号、第6,982,321号、および第7,087,409号;Kashmiri et al., Methods 36:25-34(2005); Padlan et al., Mol. Immunol.28:489-498(1991); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60(2005); Osbourn et al., Methods 36:61-68(2005);ならびにKlimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260(2000)に記載されるとおりであり、これらのすべての内容は参照によって本明細書に組み込まれる。ヒト化に使用され得るヒトフレームワーク領域は、例として、Sims et al. J. Immunol. 151:2296(1993);Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:4285(1992); Presta et al. J. Immunol. 151:2623(1993); Almagro et al., Front. Biosci. 13:1619-1633(2008)); Baca et al., J. Biol. Chem.272:10678-10684(1997);およびRosok et al.,J Biol.Chem.271:22611-22618(1996)に記載されており、これらすべての内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、表2に列挙されるVHのいずれか1つと比較して1つ以上のアミノ酸バリエーションを含む(例として、VHフレームワーク領域において)ヒト化VH、および/または(例として、および)表2に列挙されるVLのいずれか1つと比較して1つ以上のアミノ酸バリエーションを含む(例として、VLフレームワーク領域において)ヒト化VLを含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、表2に列挙される抗TfR抗体のいずれか(例として、配列番号17、22、26、43、61、65および68のいずれか1つ)のVHと比較して、25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有するヒト化VHを含む。代替え的または追加で(例として、追加で)、本開示のヒト化抗TfR抗体は、表2に列挙される抗TfR抗体のいずれか1つ(例として、配列番号18、44および62のいずれか1つ)のVLと比較して、25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有するヒト化VLを含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、表2に列挙された抗TfR抗体のいずれか(例として、配列番号17、22、26、43、61、65および68のいずれか1つ)のVHと少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)フレームワーク領域において同一であるアミノ酸配列を含むヒト化VHを含む。代替え的または追加で(例として、追加で)、いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、表2に列挙された抗TfR抗体のいずれか(例として、配列番号18、44および62のいずれか1つ)のVLと少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)フレームワーク領域において同一であるアミノ酸配列を含むヒト化VLを含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(IMGT定義系による)配列番号1のアミノ酸配列を有するCDR-H1、(IMGT定義系による)配列番号2、配列番号19、または配列番号23のアミノ酸配列を有するCDR-H2、(IMGT定義系による)配列番号3のアミノ酸配列を有するCDR-H3を含み、配列番号17、配列番号22、または配列番号26に示されるVHと比較して25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)をフレームワーク領域において含有するヒト化VHを含む。代替え的または追加で(例として、追加で)、本開示の抗TfR抗体は、(IMGT定義系による)配列番号4のアミノ酸配列を有するCDR-L1、(IMGT定義系による)配列番号5アミノ酸配列を有するCDR-L2、(IMGT定義系による)配列番号6のアミノ酸配列を有するCDR-L3を含み、配列番号18に示されるVLと比較して25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)をフレームワーク領域において含有するヒト化VLを含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(IMGT定義系による)配列番号1のアミノ酸配列を有するCDR-H1、(IMGT定義系による)配列番号2、配列番号19または配列番号23のアミノ酸配列を有するCDR-H2、(IMGT定義系による)配列番号3のアミノ酸配列を有するCDR-H3を含むヒト化VHを含み、フレームワーク領域において、配列番号17、配列番号22または配列番号26で示されるVHと少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一である。代替え的または追加で(例として、追加で)、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(IMGT定義系による)配列番号4のアミノ酸配列を有するCDR-L1、(IMGT定義系による)配列番号5アミノ酸配列を有するCDR-L2、および(IMGT定義系による)配列番号6のアミノ酸配列を有するCDR-L3を含むヒト化VLを含み、配列番号18のいずれか1つに示されるVLと、フレームワーク領域において少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一である。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(Kabat定義系による)配列番号7のアミノ酸配列を有するCDR-H1、(Kabat定義系による)配列番号8、配列番号20、または配列番号24のアミノ酸配列を有するCDR-H2、(Kabat定義系による)配列番号9のアミノ酸配列を有するCDR-H3を含み、配列番号17、配列番号22、または配列番号26に示されるVHと比較して25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)をフレームワーク領域において含有するヒト化VHを含む。代替的にまたは追加で(例として、追加で)、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(Kabat定義系による)配列番号10のアミノ酸配列を有するCDR-L1、(Kabat定義系に従う)配列番号11のアミノ酸配列を有するCDR-L2、および(Kabat定義系による)配列番号6のアミノ酸配列を有するCDR-L3を含み、配列番号18で示されるVLと比較して25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)をフレームワーク領域に含有するヒト化VLを含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(Kabat定義系による)配列番号7のアミノ酸配列を有するCDR-H1、(Kabat定義系による)配列番号8、配列番号20または配列番号24のアミノ酸配列を有するCDR-H2、(Kabat定義系による)配列番号9のアミノ酸配列を有するCDR-H3を含むヒト化VHを含み、フレームワーク領域において、配列番号17、配列番号22または配列番号26で示されるVHと少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一である。代替え的または追加で(例として、追加で)、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(Kabat定義系による)配列番号10のアミノ酸配列を有するCDR-L1、(Kabat定義系による)配列番号11のアミノ酸配列を有するCDR-L2、および(Kabat定義系による)配列番号6のアミノ酸配列を有するCDR-L3を含むヒト化VLを含み、配列番号18のいずれか1つに示されるVLと、フレームワーク領域において少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一である。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(Chothia定義系による)配列番号12のアミノ酸配列を有するCDR-H1、(Chothia定義系による)配列番号13、配列番号21、または配列番号25のアミノ酸配列を有するCDR-H2、(Chothia定義系による)配列番号14のアミノ酸配列を有するCDR-H3を含み、配列番号17、配列番号22、または配列番号26に示されるVHと比較して25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)をフレームワーク領域において含有するヒト化VHを含む。代替的にまたは追加で(例として、追加で)、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(Chothia定義系による)配列番号15のアミノ酸配列を有するCDR-L1、(Chothia定義系に従う)配列番号5のアミノ酸配列を有するCDR-L2、および(Chothia定義系による)配列番号16のアミノ酸配列を有するCDR-L3を含み、配列番号18で示されるVLと比較して25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)をフレームワーク領域に含有するヒト化VLを含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(Chothia定義系による)配列番号12のアミノ酸配列を有するCDR-H1、(Chothia定義系による)配列番号13、配列番号21または配列番号25のアミノ酸配列を有するCDR-H2、(Chothia定義系による)配列番号14のアミノ酸配列を有するCDR-H3を含むヒト化VHを含み、フレームワーク領域において、配列番号17、配列番号22または配列番号26で示されるVHと少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一である。代替え的または追加で(例として、追加で)、本開示の抗TfR抗体は、(Chothia定義系による)配列番号15のアミノ酸配列を有するCDR-L1、(Chothia定義系による)配列番号5のアミノ酸配列を有するCDR-L2、および(Chothia定義系による)配列番号16のアミノ酸配列を有するCDR-L3を含むヒト化VLを含み、配列番号18のいずれか1つに示されるVLと、フレームワーク領域において少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一である。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(IMGT定義系による)配列番号27のアミノ酸配列を有するCDR-H1、(IMGT定義系による)配列番号28のアミノ酸配列を有するCDR-H2、(IMGT定義系による)配列番号29のアミノ酸配列を有するCDR-H3を含み、配列番号43に示すVHと比較してフレームワーク領域に25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)含有するヒト化VHを含む。代替え的または追加で(例として、追加で)、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(IMGT定義系による)配列番号30のアミノ酸配列を有するCDR-L1、(IMGT定義系による)配列番号31アミノ酸配列を有するCDR-L2、(IMGT定義系による)配列番号32のアミノ酸配列を有するCDR-L3を含み、配列番号44に示されるVLと比較して25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)をフレームワーク領域において含有するヒト化VLを含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(IMGT定義系による)配列番号27のアミノ酸配列を有するCDR-H1、(IMGT定義系による)配列番号28のアミノ酸配列を有するCDR-H2、(IMGT定義系による)配列番号29のアミノ酸配列を有するCDR-H3を含むヒト化VHを含み、配列番号43に示されるVHとフレームワーク領域において少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一である。代替え的または追加で(例として、追加で)、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(IMGT定義系による)配列番号30のアミノ酸配列を有するCDR-L1、(IMGT定義系による)配列番号31のアミノ酸配列を有するCDR-L2、および(IMGT定義系による)配列番号32のアミノ酸配列を有するCDR-L3を含むヒト化VLを含み、配列番号44に示されるVLと、フレームワーク領域において少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一である。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(Kabat定義系による)配列番号33のアミノ酸配列を有するCDR-H1、(Kabat定義系による)配列番号34のアミノ酸配列を有するCDR-H2、(Kabat定義系による)配列番号35のアミノ酸配列を有するCDR-H3を含み、配列番号43に示すVHと比較してフレームワーク領域に25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)含有するヒト化VHを含む。代替的にまたは追加で(例として、追加で)、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(Kabat定義系による)配列番号36のアミノ酸配列を有するCDR-L1、(Kabat定義系による)配列番号37のアミノ酸配列を有するCDR-L2、および(Kabat定義系による)配列番号32のアミノ酸配列を有するCDR-L3を含み、配列番号44で示されるVLと比較して25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)をフレームワーク領域に含有するヒト化VLを含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(Kabat定義系による)配列番号33のアミノ酸配列を有するCDR-H1、(Kabat定義系による)配列番号34のアミノ酸配列を有するCDR-H2、(Kabat定義系による)配列番号35のアミノ酸配列を有するCDR-H3を含むヒト化VHを含み、配列番号43に示されるVHとフレームワーク領域において少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一である。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号36のアミノ酸配列を有するCDR-L1(Kabat定義系に従う)、配列番号37のアミノ酸配列を有するCDR-L2(Kabat定義系に従う)、および配列番号32のアミノ酸配列を有するCDR-L3(Kabat定義系に従う)を含むヒト化VLを含み、フレームワーク領域において、配列番号44で表されるとおりのVLと少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一である。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(Chothia定義系による)配列番号38のアミノ酸配列を有するCDR-H1、(Chothia定義系による)配列番号39のアミノ酸配列を有するCDR-H2、(Chothia定義系による)配列番号40のアミノ酸配列を有するCDR-H3を含み、配列番号43に示すVHと比較してフレームワーク領域に25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)含有するヒト化VHを含む。代替的にまたは追加で(例として、追加で)、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(Chothia定義系による)配列番号41のアミノ酸配列を有するCDR-L1、(Chothia定義系に従う)配列番号31のアミノ酸配列を有するCDR-L2、および(Chothia定義系による)配列番号42のアミノ酸配列を有するCDR-L3を含み、配列番号44で示されるVLと比較して25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)をフレームワーク領域に含有するヒト化VLを含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(Chothia定義系による)配列番号38のアミノ酸配列を有するCDR-H1、(Chothia定義系による)配列番号39のアミノ酸配列を有するCDR-H2、(Chothia定義系による)配列番号40のアミノ酸配列を有するCDR-H3を含むヒト化VHを含み、配列番号43に示されるVHとフレームワーク領域において少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一である。代替え的または追加で(例として、追加で)、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(Chothia定義系による)配列番号41のアミノ酸配列を有するCDR-L1、(Chothia定義系による)配列番号31アミノ酸配列を有するCDR-L2、および(Chothia定義系による)配列番号42のアミノ酸配列を有するCDR-L3を含むヒト化VLを含み、配列番号44に示されるVLと、フレームワーク領域において少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一である。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(IMGT定義系による)配列番号45、配列番号63または配列番号66のアミノ酸配列を有するCDR-H1、(IMGT定義系による)配列番号46のアミノ酸配列を有するCDR-H2、(IMGT定義系による)配列番号47のアミノ酸配列を有するCDR-H3を含み、配列番号61、配列番号65、または配列番号68に示されるVHと比較して25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)をフレームワーク領域において含有するヒト化VHを含む。代替え的または追加で(例として、追加で)、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(IMGT定義系による)配列番号48のアミノ酸配列を有するCDR-L1、(IMGT定義系による)配列番号49のアミノ酸配列を有するCDR-L2、および(IMGT定義系による)配列番号50のアミノ酸配列を有するCDR-L3を含み、配列番号62に示されるVLと比較して25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)をフレームワーク領域において含有するヒト化VLを含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(IMGT定義系による)配列番号45、配列番号63、または配列番号66のアミノ酸配列を有するCDR-H1、(IMGT定義系による)配列番号46のアミノ酸配列を有するCDR-H2、(IMGT定義系による)配列番号47のアミノ酸配列を有するCDR-H3を含むヒト化VHを含み、フレームワーク領域において、配列番号61、配列番号65または配列番号68で示されるVHと少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一である。代替え的または追加で(例として、追加で)、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(IMGT定義系による)配列番号48のアミノ酸配列を有するCDR-L1、(IMGT定義系による)配列番号49のアミノ酸配列を有するCDR-L2、および(IMGT定義系による)配列番号50のアミノ酸配列を有するCDR-L3を含むヒト化VLを含み、配列番号62に示されるVLと、フレームワーク領域において少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一である。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(Kabat定義系による)配列番号51、配列番号64または配列番号67のアミノ酸配列を有するCDR-H1、(Kabat定義系による)配列番号52のアミノ酸配列を有するCDR-H2、(Kabat定義系による)配列番号53のアミノ酸配列を有するCDR-H3を含み、配列番号61、配列番号65、配列番号68に示されるVHと比較して25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)をフレームワーク領域において含有するヒト化VHを含む。代替的にまたは追加で(例として、追加で)、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(Kabat定義系による)配列番号54のアミノ酸配列を有するCDR-L1、(Kabat定義系による)配列番号55のアミノ酸配列を有するCDR-L2、および(Kabat定義系による)配列番号50のアミノ酸配列を有するCDR-L3を含み、配列番号62で示されるVLと比較して25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)をフレームワーク領域に含有するヒト化VLを含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(Kabat定義系による)配列番号51、配列番号64、または配列番号67のアミノ酸配列を有するCDR-H1、(Kabat定義系による)配列番号52のアミノ酸配列を有するCDR-H2、(Kabat定義系による)配列番号53のアミノ酸配列を有するCDR-H3を含むヒト化VHを含み、フレームワーク領域において、配列番号61、配列番号65または配列番号68で示されるVHと少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一である。代替え的または追加で(例として、追加で)、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(Kabat定義系による)配列番号54のアミノ酸配列を有するCDR-L1、(Kabat定義系による)配列番号55のアミノ酸配列を有するCDR-L2、および(Kabat定義系による)配列番号50のアミノ酸配列を有するCDR-L3を含むヒト化VLを含み、配列番号62に示されるVLと、フレームワーク領域において少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一である。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(Chothia定義系による)配列番号56のアミノ酸配列を有するCDR-H1、(Chothia定義系による)配列番号57のアミノ酸配列を有するCDR-H2、(Chothia定義系による)配列番号58のアミノ酸配列を有するCDR-H3を含み、配列番号61、配列番号65、配列番号68に示すVHと比較してフレームワーク領域に25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)含有するヒト化VHを含む。代替的にまたは追加で(例として、追加で)、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(Chothia定義系による)配列番号59のアミノ酸配列を有するCDR-L1、(Chothia定義系に従う)配列番号49のアミノ酸配列を有するCDR-L2、および(Chothia定義系による)配列番号60のアミノ酸配列を有するCDR-L3を含み、配列番号62で示されるVLと比較して25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)をフレームワーク領域に含有するヒト化VLを含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(Chothia定義系による)配列番号56のアミノ酸配列を有するCDR-H1、(Chothia定義系による)配列番号57のアミノ酸配列を有するCDR-H2、(Chothia定義系による)配列番号58のアミノ酸配列を有するCDR-H3を含むヒト化VHを含み、配列番号61、配列番号65、配列番号68に示されるVHとフレームワーク領域において少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一である。代替え的または追加で(例として、追加で)、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(Chothia定義系による)配列番号59のアミノ酸配列を有するCDR-L1、(Chothia定義系による)配列番号49のアミノ酸配列を有するCDR-L2、および(Chothia定義系による)配列番号60のアミノ酸配列を有するCDR-L3を含むヒト化VLを含み、配列番号62に示されるVLと、フレームワーク領域において少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一である。
本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体のアミノ酸配列の例は、表3に提供される。
表3.ヒト化抗TfR抗体の可変領域
Figure 2023535073000008
Figure 2023535073000009
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、表2に提供される抗TfR抗体のいずれか1つのCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含むヒト化VHを含み、表3に提供されるそれぞれのヒト化VHと比較して、1つ以上(例として、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10以外)のアミノ酸バリエーションを含む。代替え的または追加で(例として、追加で)、本開示のヒト化抗TfR抗体は、表2に提供される抗TfR抗体のいずれか1つのCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含むヒト化VLを含み、表3に提供されるそれぞれのヒト化VLと比較して、1つ以上(例として、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10以外)のアミノ酸バリエーションを含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号69と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含むヒト化VH、および/または配列番号70と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含むヒト化VLを含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号69のアミノ酸配列を含むヒト化VHおよび配列番号70のアミノ酸配列を含むヒト化VLを含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号71と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含むヒト化VH、および/または(例として、および)配列番号70と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含むヒト化VLを含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号71のアミノ酸配列を含むヒト化VHおよび配列番号70のアミノ酸配列を含むヒト化VLを含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号72と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含むヒト化VH、および/または配列番号70と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含むヒト化VLを含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号72のアミノ酸配列を含むヒト化VHおよび配列番号70のアミノ酸配列を含むヒト化VLを含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号73と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含むヒト化VH、および/または(例として、および)配列番号74と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含むヒト化VLを含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号73のアミノ酸配列を含むヒト化VHおよび配列番号74のアミノ酸配列を含むヒト化VLを含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号73と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含むヒト化VH、および/または配列番号75と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含むヒト化VLを含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号73のアミノ酸配列を含むヒト化VHおよび配列番号75のアミノ酸配列を含むヒト化VLを含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号76と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含むヒト化VH、および/または(例として、および)配列番号74と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含むヒト化VLを含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号76のアミノ酸配列を含むヒト化VHおよび配列番号74のアミノ酸配列を含むヒト化VLを含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号76と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含むヒト化VH、および/または配列番号75と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含むヒト化VLを含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号76のアミノ酸配列を含むヒト化VHおよび配列番号75のアミノ酸配列を含むヒト化VLを含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号77と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含むヒト化VH、および/または(例として、および)配列番号78と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含むヒト化VL含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号77のアミノ酸配列を含むヒト化VHおよび配列番号78のアミノ酸配列を含むヒト化VLを含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号79と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含むヒト化VH、および/または(例として、および)配列番号80と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含むヒト化VLを含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号79のアミノ酸配列を含むヒト化VHおよび配列番号80のアミノ酸配列を含むヒト化VLを含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号77と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含むヒト化VH、および/または(例として、および)配列番号80と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含むヒト化VL含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号77のアミノ酸配列を含むヒト化VHおよび配列番号80のアミノ酸配列を含むヒト化VLを含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、完全長IgGであり、これはヒト抗体からの重鎖定常領域および軽鎖定常領域を包含し得る。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体のいずれかの重鎖は、重鎖定常領域(CH)またはそのある部分(例として、CH1、CH2、CH3、またはそれらの組み合わせ)を含み得る。重鎖定常領域は、いずれの好適な起源、例として、ヒト、マウス、ラット、またはウサギに属し得る。特定の一例において、重鎖定常領域は、ヒトIgG(ガンマ重鎖)、例として、IgG1、IgG2、またはIgG4からのものである。ヒトIgG1定常領域の例は、下に与えられる:
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号81)
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体のいずれかの重鎖は、突然変異体ヒトIgG1定常領域を含む。例えば、ヒトIgG1のCH2ドメイン上のLALA突然変異の導入(ヒンジ下部残基Leu234 Leu235をAla234およびAla235によって置き換えるように突然変異させられたmAb b12に由来する突然変異体)は、Fcg受容体結合を低減することが公知である(Bruhns,P.,et al.(2009)およびXu,D.et al.(2000))。突然変異体ヒトIgG1定常領域は、下に与えられる(変異を太字にし、下線を付した):
Figure 2023535073000010
 (配列番号82)
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体のいずれかの軽鎖はさらに、軽鎖定常領域(CL)を含み得、これは当該技術分野において知られているいずれかのCLであり得る。いくつかの例において、CLは、カッパ軽鎖である。他の例において、CLは、ラムダ軽鎖である。いくつかの態様において、CLはカッパ軽鎖であって、その配列は下に与えられる:
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号83)
他の抗体の重鎖および軽鎖定常領域は当該技術分野において周知であり、例として、IMGTデータベース(www.imgt.org)において、またはwww.vbase2.org/vbstat.php.にて提供されるものであるが、これらの両方とも参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、表3に列挙されるVHまたはそれらのいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号81または配列番号82と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％同一である重鎖定常領域を含む重鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、表3に列挙されるVHまたはそれらのいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号81または配列番号82と比較して25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有する重鎖定常領域を含む重鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、表3に列挙されるVHまたはそれらのいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号81で示される重鎖定常領域を含む重鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、表3に列挙されるVHまたはそれらのいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号82で示される重鎖定常領域を含む重鎖を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、表3に列挙されるVLまたはそれらのいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号83と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％同一である軽鎖定常領域を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、表3に列挙されるVLまたはそれらのいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号83と比較して25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有する軽鎖定常領域を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、表3に列挙されるVLまたはそれらのいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号83示される軽鎖定常領域を含む軽鎖を含む。
記載される抗TfR抗体のIgG重鎖および軽鎖アミノ酸配列の例は、下の表4に提供される。
表4.ヒト化抗TfR IgGの例の重鎖および軽鎖配列
Figure 2023535073000012
Figure 2023535073000013
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号84、86、87、88、91、92、および94のいずれか1つに示される重鎖と比較して、25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有する重鎖を含む。代替え的または追加で(例として、追加で)、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号85、89、90、93および95のいずれか1つに示される軽鎖と比較して、25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有する軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、配列番号84、86、87、88、91、92および94のいずれか1つと少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。代替的にまたは追加で(例として、追加で)、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、配列番号85、89、90、93および95のいずれか1つと少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体は、配列番号84、86、87、88、91、92および94のいずれか1つのアミノ酸配列を含む重鎖を含む。代替的にまたは追加で(例として、追加で)、本明細書に記載の抗TfR抗体は、配列番号85、89、90、93および95のいずれか1つのアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号84と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、および/または(例として、および)配列番号85と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号84のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号86と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、および/または(例として、および)配列番号85と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号86のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号87と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、および/または(例として、および)配列番号85と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号87のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号88と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、および/または(例として、および)配列番号89と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号88のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号89のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号88と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、および/または(例として、および)配列番号90と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号88のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号91と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、および/または(例として、および)配列番号89と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号91のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号89のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号91と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、および/または(例として、および)配列番号90と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号91のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号92と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、および/または(例として、および)配列番号93と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号92のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号93のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号94と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、および/または(例として、および)配列番号95と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号94のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号95のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号92と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、および/または(例として、および)配列番号95と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号92のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号95のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、抗TfR抗体は、無傷の抗体(完全長抗体)のFabフラグメント、Fab'フラグメント、またはF(ab')2フラグメントである。無傷の抗体(全長抗体)の抗原結合フラグメントは定型的な方法によって(例として、組み換え的に、または全長IgGの重鎖定常領域をパパインなどの酵素を使用して消化することによって)調製され得る。例えば、F(ab')2フラグメントは、抗体分子のペプシンまたはパパイン消化によって産生され得、Fab'フラグメントは、F(ab')2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成され得る。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体のFabフラグメントにおける重鎖領域は、ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT(配列番号96)のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、表3に列挙されるVHまたはそれらのいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号96と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％同一である重鎖定常領域を含む重鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、表3に列挙されるVHまたはそれらのいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号96と比較して25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有する重鎖定常領域を含む重鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、表3に列挙されるVHまたはそれらのいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号96で示される重鎖定常領域を含む重鎖を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、表3に列挙されるVLまたはそれらのいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号83と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％同一である軽鎖定常領域を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、表3に列挙されるVLまたはそれらのいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号83と比較して25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有する軽鎖定常領域を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、表3に列挙されるVLまたはそれらのいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号83示される軽鎖定常領域を含む軽鎖を含む。
記載される抗TfR抗体のFab重鎖および軽鎖アミノ酸配列の例は、下の表5に提供される。
表5.ヒト化抗TfR Fabの例の重鎖および軽鎖配列
Figure 2023535073000015
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号97～103のいずれか1つに示される重鎖と比較して、25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有する重鎖を含む。代替え的または追加で(例として、追加で)、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号85、89、90、93および95のいずれか1つに示される軽鎖と比較して、25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有する軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、配列番号97～103のいずれか1つと少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。代替的にまたは追加で(例として、追加で)、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、配列番号85、89、90、93および95のいずれか1つと少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体は、配列番号97～103のいずれか1つのアミノ酸配列を含む重鎖を含む。代替的にまたは追加で(例として、追加で)、本明細書に記載の抗TfR抗体は、配列番号85、89、90、93および95のいずれか1つのアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号97と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、および/または(例として、および)配列番号85と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号97のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号98と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、および/または(例として、および)配列番号85と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号98のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号99と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、および/または(例として、および)配列番号85と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号99のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号100と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、および/または(例として、および)配列番号89と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号100のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号89のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号100と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、および/または(例として、および)配列番号90と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号100のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号101と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、および/または(例として、および)配列番号89と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号101のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号89のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号101と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、および/または(例として、および)配列番号90と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号101のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号102と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、および/または(例として、および)配列番号93と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号102のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号93のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号103と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、および/または(例として、および)配列番号95と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号103のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号95のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号102と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、および/または(例として、および)配列番号95と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号102のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号95のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR受容体抗体は、いずれかの抗体形態であり得、無傷の(すなわち完全長)抗体、それらの抗原結合フラグメント(Fab、Fab'、F(ab')2、Fvなど)、一本鎖抗体、二重特異性抗体、またはナノボディーを包含するが、これらに限定されない。いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、scFvである。いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、scFv-Fab(例として、定常領域のある部分に融合されたscFv)である。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR受容体抗体は、C末端のN末端のいずれかにおいて、定常領域(例として、配列番号81もしくは配列番号82で示されるヒトIgG1定常領域、またはFc部分などのその部分)に融合されたscFvである。
いくつかの態様において、保存的突然変異は、例えば結晶構造に基づき決定されるとき、その残基が標的抗原(例として、トランスフェリン受容体)との相互作用に関与しそうにない位置にて、抗体配列(例として、CDRまたはフレームワーク配列)中へ導入され得る。いくつかの態様において、1、2つ以上の突然変異(例として、アミノ酸置換)は、血清半減期、補体結合、Fc受容体結合、および/または(例として、および)細胞への抗原依存的細胞傷害性などの、抗体の1以上の機能特性を変更させるために、本明細書に記載の抗TfR抗体のFc領域中(例として、Kabatナンバリング系(例として、KabatのEUインデックス)に従うナンバリングで、CH2ドメイン(ヒトIgG1の残基231～340)中、および/または(例として、および)CH3ドメイン(ヒトIgG1の残基341～447)中、および/または(例として、および)ヒンジ領域中)へ導入される。
いくつかの態様において、1、2つ以上の突然変異(例として、アミノ酸置換)は、ヒンジ領域中のシステイン残基の数が、例として米国特許第5,677,425号に記載のとおり変動(例として、増大または減少)され得るように、Fc領域(CH1ドメイン)のヒンジ領域中へ導入される。CH1ドメインのヒンジ領域中のシステイン残基の数は、例として、軽鎖および重鎖の会合(assembly)を容易にさせるため、または抗体の安定性を変更(例として、増大もしくは減少)するため、またはリンカー抱合を容易にさせるため、変更され得る。
いくつかの態様において、1、2個以上の突然変異(例として、アミノ酸置換)は、抗体の、エフェクター細胞表面上のFc受容体(例として、活性化されたFc受容体)への親和性を増加または減少させるため、本明細書に記載の筋標的化抗体のFc領域中(例として、Kabatナンバリング系(例として、KabatのEUインデックス)に従うナンバリングで、CH2ドメイン(ヒトIgG1の残基231～340)中、および/または(例として、および)CH3ドメイン(ヒトIgG1の残基341～447)中、および/または(例として、および)ヒンジ領域中)へ導入される。抗体のFc受容体への親和性を増大または減少させる抗体のFc領域中の突然変異、およびかかる突然変異をFc受容体中またはそのフラグメント中へ導入するための技法は、当業者に知られている。抗体のFc受容体への親和性を変更するためになされ得る、抗体のFc受容体中の突然変異の例は、例として、Smith P et al.,(2012)PNAS 109:6181-6186、米国特許第6,737,056号、ならびに国際公開第WO 02/060919号;第WO 98/23289号;および第WO 97/34631号(これらは参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。
いくつかの態様において、1、2個以上のアミノ酸突然変異(すなわち、置換、挿入、または欠失)は、in vivoでの抗体の半減期を変更(例として、増加または減少)させるため、IgG定常領域またはそのFcRn-結合フラグメント(好ましくは、Fcまたはヒンジ-Fcドメインフラグメント)中へ導入される。例えば、in vivoでの抗体の半減期を変更(例として、増加または減少)させるであろう突然変異について、例として、国際公開第WO 02/060919号;第WO 98/23289号;および第WO 97/34631号;ならびに米国特許第5,869,046号、第6,121,022号、第6,277,375号、および第6,165,745号を見よ。
いくつかの態様において、1、2以上のアミノ酸突然変異(すなわち、置換、挿入、または欠失)は、in vivoでの抗TfR抗体の半減期を減少させるため、IgG定常領域またはそのFcRn-結合フラグメント(好ましくは、Fcまたはヒンジ-Fcドメインフラグメント)中へ導入される。いくつかの態様において、1、2個以上のアミノ酸突然変異(すなわち、置換、挿入、または欠失)は、in vivoでの抗体の半減期を増加させるため、IgG定常領域またはそのFcRn-結合フラグメント(好ましくは、Fcまたはヒンジ-Fcドメインフラグメント)中へ導入される。いくつかの態様において、抗体は、KabatのEUインデックス(上記のKabat E Aら(1991))に従うナンバリングで第2定常(CH2)ドメイン(ヒトIgG1の残基231～340)中および/または(例として、および)第3定常(CH3)ドメイン(ヒトIgG1の残基341～447)中に、1個以上のアミノ酸突然変異(例として、置換)を有し得る。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体のIgG1定常領域は、KabatにあるようなEUインデックスに従ってナンバリングされた位置252におけるメチオニン(M)からチロシン(Y)への置換、位置254におけるセリン(S)からトレオニン(T)への置換、および位置256におけるトレオニン(T)からグルタミン酸(E)への置換を含む。米国特許第7,658,921号(これは、参照により本明細書に組み込まれる)を見よ。「YTE突然変異体」と称されるこのタイプの突然変異IgGは、同じ抗体の野生型バージョンと比較して4倍増大した半減期を発揮したことが示されている(Dall'Acqua W F et al.,(2006)J Biol Chem 281:23514-24を見よ)。いくつかの態様において、抗体は、KabatにあるようなEUインデックスに従ってナンバリングされた位置251～257、285～290、308～314、385～389、および428～436でのアミノ酸残基の、1、2、3以上のアミノ酸置換を含むIgG定常領域を含む。
いくつかの態様において、1、2またはそれ以上のアミノ酸置換は、抗トランスフェリン受容体抗体のエフェクター機能(単数または複数)を変更するため、IgG定常領域Fc領域中へ導入される。自身への親和性が変更されたエフェクターリガンドは、例えば、Fc受容体または補体のC1構成要素であり得る。このアプローチは、米国特許第5,624,821号および第5,648,260号においてさらに詳細に記載される。いくつかの態様において、定常領域ドメインの欠失または不活化(点突然変異または他の手段を通して)は、循環抗体のFc受容体への結合を低減し、それによって腫瘍局在化を増大し得る。定常領域を欠失または不活化し、それによって腫瘍局在化を増大させる突然変異の記載については、例として、米国特許第5,585,097号および第8,591,886号を見よ。いくつかの態様において、1以上のアミノ酸置換は、Fc領域上の潜在的なグリコシル化部位を除去するため(これによってFc受容体への結合が低減されることもある)、本明細書に記載の抗体のFc領域中へ導入されてもよい(例として、Shields R L et al.,(2001)J Biol Chem 276:6591-604を見よ)。
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体の定常領域中の1以上のアミノ酸残基は、抗体が変更されたClq結合および/または(例として、および)低減もしくは消失された補体依存性細胞傷害性(CDC)を有し得るように、異なるアミノ酸残基に置き換えられ得る。このアプローチは、米国特許第6,194,551号(Idusogie et al)においてさらに詳細に記載されている。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体のCH2ドメインのN末領域中の1以上のアミノ酸残基は変更されて、それによって抗体の補体結合能を変更する。このアプローチは、国際刊行物第WO 94/29351号においてさらに記載されている。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体のFc領域は、抗体の、細胞への抗体依存性細胞傷害性(ADCC)の媒介能を増大させるため、および/または(例として、および)、抗体のFcγ受容体への親和性を増大させるため、修飾されている。このアプローチは、国際刊行物第WO 00/42072号においてさらに記載されている。
いくつかの態様において、本明細書に提供される抗体の重鎖および/または(例として、および)軽鎖可変ドメイン(単数または複数)配列(単数または複数)は、本明細書の他の箇所に記載されるとおり、例えば、CDR接合抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、もしくは複合ヒト抗体、または抗原結合性フラグメントを生成するために使用され得る。当業者によって理解されるとおり、本明細書に提供される抗体のいずれかに由来するいずれのバリアント、CDR接合抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または複合抗体は、本明細書に記載の組成物および方法に有用であってもよく、バリアント、CDR接合抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または複合抗体が、これが由来する元の抗体と比べて、トランスフェリン受容体への少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％以上の結合を有し得るように、トランスフェリン受容体への特異的結合能を維持するであろう。
いくつかの態様において、本明細書に提供される抗体は、所望の特性を抗体へ付与する突然変異を含む。例えば、ネイティブなIgG4 mAbに生じることが知られているFabアーム交換(Fab-arm exchange)に起因する潜在的合併症を回避するため、本明細書に提供される抗体は、安定化「Adair」突然変異を含んでいてもよく(Angal S.,et al.,「A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human(IgG4)antibody」,Mol Immunol 30,105-108;1993)、ここでセリン228(EUナンバリング;残基241 Kabatナンバリング)は、IgG1様ヒンジ配列をもたらすプロリンへ変換されている。結果的に、抗体のいずれも、安定化「Adair」突然変異を包含していてもよい。
いくつかの態様において、抗体は修飾されている(例として、グリコシル化、リン酸化、SUMO化、および/または(例として、および)、メチル化を介して修飾されている)。いくつかの態様において、抗体は、1個以上の糖または炭水化物分子へ抱合されたグリコシル化抗体である。いくつかの態様において、1個以上の糖または炭水化物分子は、N-グリコシル化、O-グリコシル化、C-グリコシル化、グリピエーション(GPIアンカー付着)、および/または(例として、および)、ホスホグリコシル化を介して、抗体へ抱合されている。いくつかの態様において、1個以上の糖または炭水化物分子は、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、またはグリカンである。いくつかの態様において、1個以上の糖または炭水化物分子は、分枝オリゴ糖類または分枝グリカンである。いくつかの態様において、1個以上の糖または炭水化物分子は、マンノース単位、グルコース単位、N-アセチルグルコサミン単位、N-アセチルガラクトサミン単位、ガラクトース単位、フコース単位、またはホスホ脂質単位を包含する。いくつかの態様において、糖分子は、約1～10個、約1～5個、約5～10個、約1～4個、約1～3個、または約2個存在する。いくつかの態様において、グリコシル化抗体は、全体的にまたは部分的にグリコシル化されている。いくつかの態様において、抗体は、化学反応によって、または酵素的な手段によってグリコシル化されている。いくつかの態様において、抗体は、in vitroでまたは細胞(任意にN-またはO-グリコシル化経路中の酵素(例として、グリコシルトランスフェラーゼ)を欠乏していてもよい)内部でグリコシル化される。いくつかの態様において、抗体は、「Modified antibody,antibody-conjugate and process for the preparation thereof」と題する2014年5月1日に公開された国際特許出願公開WO2014065661に記載のとおりの糖または炭水化物分子で官能化されている。
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体のいずれか1つは、重鎖および/または(例として、および)軽鎖配列上にシグナルペプチド(例として、N末端シグナルペプチド)を含み得る。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、VHおよびVL配列のいずれか1つ、IgG重鎖および軽鎖配列のいずれか1つ、または本明細書に記載のFab重鎖および軽鎖配列のいずれか1つを含み、さらにシグナルペプチド(例として、N末端シグナルペプチド)を含む。いくつかの態様において、シグナルペプチドはMGWSCIILFLVATATGVHS(配列番号104)のアミノ酸配列を含む。
他の知られている抗トランスフェリン受容体抗体
当該技術分野において知られているいずれか他の適切な抗トランスフェリン受容体抗体は、本明細書に開示の複合体において筋標的化剤として使用され得る。知られている抗トランスフェリン受容体抗体(関連する参考文献および結合エピトープを包含する)の例は、表8に挙げられる。いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体は、本明細書に提供される抗トランスフェリン受容体抗体、例として、表8に挙げられる抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかの相補性決定領域(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3)を含む。
表8-関連する参考文献および結合エピトープ情報を包含する、抗トランスフェリン受容体抗体クローンのリスト
Figure 2023535073000016
Figure 2023535073000017
Figure 2023535073000018
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つからのCDR-H(例として、CDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3)アミノ酸配列の1つ以上を包含する。いくつかの態様において、トランスフェリン受容体抗体は、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つについて提供されるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を包含する。いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体は、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つについて提供されるCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を包含する。いくつかの態様において、抗トランスフェリン抗体は、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つについて提供されるCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を包含する。本開示は、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つについて提供されるCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、またはCDR-L3を含む分子をコードするいずれかの核酸配列をもまた包含する。いくつかの態様において、抗体の重鎖および軽鎖CDR3ドメインは、ある抗原についての抗体の結合特異性/親和性に特に重要な役割を演じ得る。したがって、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つの少なくとも重鎖および/または(例として、および)軽鎖CDR3を包含し得る。
いくつかの例において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかは、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体の1つからのCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、および/または(例として、および)CDR-L3配列のいずれかに実質的に類似の1以上のCDR(例として、CDR-HまたはCDR-L)配列を有する。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体のVH(例として、CDR-H1、CDR-H2、またはCDR-H3)および/または(例として、および)VL(例として、CDR-L1、CDR-L2、またはCDR-L3)領域上の1以上のCDRの位置は、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)に対する免疫特異的結合が維持される(例として、実質的に維持される。例えば、それが由来する元の抗体の結合の少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％)限り、1、2、3、4、5、または6アミノ酸位置だけ変動し得る。例えば、いくつかの態様において、本明細書に記載のいずれかの抗体のCDRを定義する位置は、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)に対する免疫特異的結合が維持される(例として、実質的に維持される。例えば、それが由来する元の抗体の結合の少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％)限り、CDRのN末端および/または(例として、および)C末端境界を、本明細書に記載の抗体のいずれか1つのCDR位置と比べて1、2、3、4、5、または6アミノ酸だけずらすことによって変動し得る。別の態様においては、本明細書に記載の抗体のVH(例として、CDR-H1、CDR-H2、またはCDR-H3)および/または(例として、および)VL(例として、CDR-L1、CDR-L2、またはCDR-L3)領域上の1以上のCDRの長さは、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)に対する免疫特異的結合が維持される(例として、実質的に維持される。例えば、それが由来する元の抗体の結合の少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％)限り、1、2、3、4、5アミノ酸、またはより多くだけ変動し得る(例として、より短いかまたはより長い)。
従って、いくつかの態様において、本明細書に記載のCDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、および/または(例として、および)CDR-H3は、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)に対する免疫特異的結合が維持される(例として、実質的に維持される。例えば、それが由来する元の抗体の結合と比べて少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％)限り、本明細書に記載のCDR(例として、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかからのCDR)の1つ以上よりも1、2、3、4、5アミノ酸、またはより多く短くあり得る。いくつかの態様において、本明細書に記載のCDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、および/または(例として、および)CDR-H3は、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)に対する免疫特異的結合が維持される(例として、実質的に維持される。例えば、それが由来する元の抗体の結合と比べて少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％)限り、本明細書に記載のCDR(例として、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかからのCDR)の1つ以上よりも1、2、3、4、5アミノ酸、またはより多く長くあり得る。いくつかの態様において、本明細書に記載のCDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、および/または(例として、および)CDR-H3のアミノ部分は、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)に対する免疫特異的結合が維持される(例として、実質的に維持される。例えば、それが由来する元の抗体の結合と比べて少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％)限り、本明細書に記載のCDR(例として、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかからのCDR)の1つ以上と比較して1、2、3、4、5アミノ酸、またはより多くだけ延伸され得る。いくつかの態様において、本明細書に記載のCDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、および/または(例として、および)CDR-H3のカルボキシ部分は、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)に対する免疫特異的結合が維持される(例として、実質的に維持される。例えば、それが由来する元の抗体の結合と比べて少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％)限り、本明細書に記載のCDR(例として、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかからのCDR)の1つ以上と比較して1、2、3、4、5アミノ酸、またはより多くだけ延伸され得る。いくつかの態様において、本明細書に記載のCDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、および/または(例として、および)CDR-H3のアミノ部分は、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)に対する免疫特異的結合が維持される(例として、実質的に維持される。例えば、それが由来する元の抗体の結合と比べて少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％)限り、本明細書に記載のCDR(例として、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかからのCDR)の1つ以上と比較して1、2、3、4、5アミノ酸、またはより多くだけ短縮され得る。いくつかの態様において、本明細書に記載のCDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、および/または(例として、および)CDR-H3のカルボキシ部分は、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)に対する免疫特異的結合が維持される(例として、実質的に維持される。例えば、それが由来する元の抗体の結合と比べて少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％)限り、本明細書に記載のCDR(例として、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかからのCDR)の1つ以上と比較して1、2、3、4、5アミノ酸、またはより多くだけ短縮され得る。例えば当該技術分野において記載された結合アッセイおよび条件を使用して、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)に対する免疫特異的結合が維持されるかどうかを確かめるためのいずれかの方法が使用され得る。
いくつかの例において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかは、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つに実質的に類似の1以上のCDR(例として、CDR-HまたはCDR-L)配列を有する。例えば、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)に対する免疫特異的結合が維持される(例として、実質的に維持される。例えば、それが由来する元の抗体の結合と比べて少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％)限り、抗体は、本明細書に提供されるCDR(例として、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかからのCDR)のいずれか1つの対応するCDR領域と比較して最大5、4、3、2、または1アミノ酸残基バリエーションまでを含有する表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかからの1以上のCDR配列(単数または複数)を包含し得る。いくつかの態様において、本明細書に提供されるCDRのいずれかにおけるアミノ酸バリエーションのいずれかは、保存的なバリエーションであり得る。保存的なバリエーションは、例えば結晶構造に基づいて決定されるとおり、残基がトランスフェリン受容体タンパク質(例として、ヒトトランスフェリン受容体タンパク質)との相互作用に関わることが蓋然的ではない位置においてCDRに導入され得る。本開示のいくつかの側面は、本明細書に提供される重鎖可変(VH)および/または(例として、および)軽鎖可変(VL)ドメインの1つ以上を含むトランスフェリン受容体抗体を提供する。いくつかの態様において、本明細書に提供されるVHドメインのいずれかは、本明細書に提供されるCDR-H配列(例として、CDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3)の1つ以上、例えば、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つで提供されるCDR-H配列のいずれかを包含する。いくつかの態様において、本明細書に提供されるVLドメインのいずれかは、本明細書に提供されるCDR-L配列(例として、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3)の1つ以上、例えば、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つで提供されるCDR-L配列のいずれかを包含する。
いくつかの態様において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどの、いずれかの抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖可変ドメインおよび/または(例として、および)軽鎖可変ドメインを包含するいずれかの抗体を包含する。いくつかの態様において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどのいずれかの抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖可変および軽鎖可変ペアを包含するいずれかの抗体を包含する。
本開示の側面は、本明細書に記載のもののいずれかと相同な重鎖可変(VH)および/または(例として、および)軽鎖可変(VL)ドメインアミノ酸配列を有する抗トランスフェリン受容体抗体を提供する。いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体は、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどのいずれかの抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖可変配列および/またはいずれかの軽鎖可変配列と少なくとも75％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一である重鎖可変配列または軽鎖可変配列を含む。いくつかの態様において、相同な重鎖可変および/または(例として、および)軽鎖可変アミノ酸配列は、本明細書に提供されるCDR配列のいずれかにおいては変動しない。例えば、いくつかの態様において、配列バリエーションの程度(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)は、本明細書に提供されるCDR配列のいずれかを排除する重鎖可変および/または(例として、および)軽鎖可変配列内において生起し得る。いくつかの態様において、本明細書に提供される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかは、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどのいずれかの抗トランスフェリン受容体抗体のフレームワーク配列と少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％同一であるフレームワーク配列を含む重鎖可変配列および軽鎖可変配列を含む。
いくつかの態様において、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)に特異的に結合する抗トランスフェリン受容体抗体は、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかの、本明細書に提供されるCDR-Lドメイン(CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3)またはCDR-Lドメインバリアントのいずれかを含む軽鎖可変VLドメインを含む。いくつかの態様において、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)に特異的に結合する抗トランスフェリン受容体抗体は、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどの、いずれかの抗トランスフェリン受容体抗体のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む軽鎖可変VLドメインを含む。いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体は、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどの、いずれかの抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖可変領域配列のフレームワーク領域の1、2、3、または4つを含む軽鎖可変(VL)領域配列を含む。いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体は、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどの、いずれかの抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖可変領域配列のフレームワーク領域の1、2、3、または4つと少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、または100％同一である軽鎖可変領域配列のフレームワーク領域の1、2、3、または4つを含む。いくつかの態様において、前記のアミノ酸配列に由来する軽鎖可変フレームワーク領域は、最大10アミノ酸までの置換、欠失、および/または(例として、および)挿入、好ましくは最大10アミノ酸までの置換の存在を除けば、前記のアミノ酸配列からなる。いくつかの態様において、該アミノ酸配列に由来する軽鎖可変フレームワーク領域は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10アミノ酸残基が、対応する霊長目の非ヒト動物またはヒトの軽鎖可変フレームワーク領域中の類似した位置に見出されるアミノ酸と置換された該アミノ酸配列からなる。
いくつかの態様において、トランスフェリン受容体へ特異的に結合する抗トランスフェリン受容体抗体は、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどのいずれの抗トランスフェリン受容体抗体のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む。いくつかの態様において、抗体はさらに、ヒトもしくは霊長目の動物の抗体のVLに由来する1つ、2つ、3つ、または4つすべてのVLフレームワーク領域を含む。本明細書に記載の軽鎖CDR配列との併用のための選択される抗体の霊長目の動物またはヒトの軽鎖フレームワーク領域は、例えば、非ヒト親抗体の軽鎖フレームワーク領域と、少なくとも70％(例として、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、または少なくとも99％)の同一性を有し得る。選択される霊長類またはヒトの抗体は、その軽鎖相補性決定領域において、本明細書に提供される抗体のいずれか(例として、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか)の軽鎖相補性決定領域のアミノ酸に対し、同じ数または実質的に同じ数のアミノ酸を有し得る。いくつかの態様において、霊長目の動物またはヒトの軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸残基は、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどのいずれの抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖フレームワーク領域と少なくとも75％同一性、少なくとも80％同一性、少なくとも85％同一性、少なくとも90％同一性、少なくとも95％同一性、少なくとも98％同一性、少なくとも99％(またはこれを超える)同一性を有する、天然の霊長目の動物またはヒトの抗体軽鎖フレームワーク領域からのものである。いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体はさらに、ヒト軽鎖可変カッパサブファミリーに由来する1つ、2つ、3つ、または4つすべてのVLフレームワーク領域を含む。いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体はさらに、ヒト軽鎖可変ラムダサブファミリーに由来する1つ、2つ、3つ、または4つすべてのVLフレームワーク領域を含む。
いくつかの態様において、本明細書に提供される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれも、軽鎖定常領域をさらに含む軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの態様において、軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ軽鎖定常領域である。いくつかの態様において、カッパまたはラムダ軽鎖定常領域は、哺乳動物から、例として、ヒト、サル、ラット、またはマウスからのものである。いくつかの態様において、軽鎖定常領域は、ヒトカッパ軽鎖定常領域である。いくつかの態様において、軽鎖定常領域は、ヒトラムダ軽鎖定常領域である。本明細書に提供される軽鎖定常領域のいずれも、本明細書に提供される軽鎖定常領域のいずれかのバリアントであってもよいことは解されるはずである。いくつかの態様において、軽鎖定常領域は、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどのいずれの抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖定常領域のいずれかと少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体は、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどの、いずれの抗トランスフェリン受容体抗体でもある。
いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体は、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどのいずれの抗トランスフェリン受容体抗体のアミノ酸配列を含むVLドメインを含み、ここで定常領域は、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、もしくはIgY免疫グロブリン分子、またはヒトIgG、IgE、IgM、IgD、IgA、もしくはIgY免疫グロブリン分子の定常領域のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体は、VLドメイン、またはVLドメインのバリアントのいずれか、およびVHドメイン、またはVHドメインバリアントのいずれかを含み、ここでVLおよびVHドメイン、またはそれらのバリアントは、同じ抗体クローンからものであり、ここで定常領域は、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、もしくはIgY免疫グロブリン分子、いずれのクラス(例として、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2)またはいずれのサブクラス(例として、IgG2aおよびIgG2b)の免疫グロブリン分子の定常領域のアミノ酸配列を含む。ヒト定常領域の非限定例は当該技術分野において記載されており、例として、上述のKabat E A et al.(1991)を見よ。
いくつかの態様において、筋標的化剤は、抗トランスフェリン受容体抗体(例として、国際出願刊行物WO 2016/081643(参照により本明細書に組み込まれる)に記載のとおりの抗体およびそのバリアント)である。
種々の定義系に従う抗体の重鎖および軽鎖CDRは、表9中に提供される。種々の定義系、例として、Kabat定義、Chothia定義、および/またはContact定義は記載されている。例として、(例として、Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242,Chothia et al.,(1989)Nature 342:877;Chothia,C.et al.(1987)J.Mol.Biol.196:901-917,Al-lazikani et al(1997)J.Molec.Biol.273:927-948;およびAlmagro,J.Mol.Recognit.17:132-143(2004)を見よ。またhgmp.mrc.ac.ukおよびbioinf.org.uk/absも見よ)を見よ。

表9.マウストランスフェリン受容体抗体の重鎖および軽鎖CDR
重鎖可変ドメイン(VH)および軽鎖可変ドメイン配列もまた提供される:
VH
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPTNGRTNYIEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGTRAYHYWGQGTSVTVSS(配列番号124)
VL
DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRASDNLYSNLAWYQQKQGKSPQLLVYDATNLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDFGTYYCQHFWGTPLTFGAGTKLELK(配列番号125)
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、表9に示されるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3と同じであるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、表9に示されるCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3と同じであるCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む。
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、CDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含み、これは、表9に示されるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3と比較して、合わせてわずか5アミノ酸バリエーション(例として、わずか5、4、3、2、または1アミノ酸バリエーション)を含有する。「合わせて」は、3つの重鎖CDRのすべてにおけるアミノ酸バリエーションの全数が、定義された範囲内であることを意味する。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含み得、これは、表9に示されるCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3と比較して、合わせてわずか5アミノ酸バリエーション(例として、わずか5、4、3、2、または1アミノ酸バリエーション)を含有する。
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、CDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含み、これらの少なくとも1つは、表9に示されるカウンターパート重鎖CDRと比較してわずか3アミノ酸バリエーション(例として、わずか3、2、または1アミノ酸バリエーション)を含有する。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含み得、これらの少なくとも1つは、表9に示されるカウンターパート軽鎖CDRと比較してわずか3アミノ酸バリエーション(例として、わずか3、2、または1アミノ酸バリエーション)を含有する。
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、CDR-L3を含み、これは表9に示されるCDR-L3と比較してわずか3アミノ酸バリエーション(例として、わずか3、2、または1アミノ酸バリエーション)を含有する。いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、表9に示されるCDR-L3と比較して1つのアミノ酸バリエーションを含有するCDR-L3を含む。いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、QHFAGTPLT(配列番号126)KabatおよびChothia定義系に従う)またはQHFAGTPL(配列番号127)Contact定義系に従う)のCDR-L3を含む。いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、表9に示されるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3と同じであるCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、およびCDR-L2を含み、QHFAGTPLT(配列番号126)KabatおよびChothia定義系に従う)またはQHFAGTPL(配列番号127)Contact定義系に従う)のCDR-L3を含む。
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、表9に示される重鎖CDRと、合わせて少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、または98％)同一である重鎖CDRを含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、表9に示される軽鎖CDRと、合わせて少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、または98％)同一である軽鎖CDRを含む。
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号124のアミノ酸配列を含むVHを含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号125のアミノ酸配列を含むVLを含む。
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号124で示されるVHと比較して、25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有するVHを含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号125で示されるVLと比較して、15以下のアミノ酸バリエーション(例として、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有するVLを含む。
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号124で示されるVHと少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、または98％)同一であるアミノ酸配列を含むVHを含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号125で示されるVLと少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、または98％)同一であるアミノ酸配列を含むVLを含む。
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、ヒト化抗体(例として、抗体のヒト化バリアント)である。いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、表9に示されるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3と同じであるCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含み、ヒト化重鎖可変領域および/または(例として、および)ヒト化軽鎖可変領域を含む。
ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域(CDR)からのその残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種(ドナー抗体)のCDRからの残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。いくつかの態様において、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。さらにまた、ヒト化抗体は、レシピエント抗体から見出されない残基も、移入された(imported)CDRまたはフレームワーク配列から見出されない残基も含んでいてもよいが、抗体の性能をさらに洗練および最適化するために包含される残基を含むこともある。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも1つの、典型的には2つの可変ドメインのすべてを実質的に含むであろうが、前記可変ドメインにおいて、CDR領域のすべてまたは実質的にすべてが、非ヒト免疫グロブリンのCDR領域に対応し、かつFR領域のすべてまたは実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のFR領域である。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン(典型的には、ヒト免疫グロブリンの)定常領域またはドメイン(Fc)の少なくとも一部も含むであろう。抗体は、WO 99/58572に記載のとおりに修飾されたFc領域を有していてもよい。ヒト化抗体の他の形態は、元の抗体に関して変更された1以上のCDR(1、2、3、4、5、6)を有しており、これらはまた、元の抗体からの1以上のCDRに由来する1以上のCDRとも呼ばれる。ヒト化抗体はまた、親和性成熟も伴うことがある。
いくつかの態様において、ヒト化は、CDR(例として、表9に示されるとおりの)をIGKV1-NL1*01およびIGHV1-3*01ヒト可変ドメイン中へ接合させることによって達成される。いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号125に示されるVLと比較して、9、13、17、18、40、45、および70位に1以上のアミノ酸置換、ならびに/または(例として、ならびに)配列番号124に示されるVHと比較して、1、5、7、11、12、20、38、40、44、66、75、81、83、87、および108位に1以上のアミノ酸置換を含むヒト化バリアントである。いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号125に示されるVLと比較して、9、13、17、18、40、45、および70位のすべてにアミノ酸置換、ならびに/または(例として、ならびに)配列番号124に示されるVHと比較して、1、5、7、11、12、20、38、40、44、66、75、81、83、87、および108位のすべてにアミノ酸置換を含むヒト化バリアントである。
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、ヒト化抗体であって、配列番号125で示されるVLの43および48位で残基を含有する。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、ヒト化抗体であって、配列番号124で示されるVHの48、67、69、71、および73位での残基を含有する。
本開示に従い使用されてもよいヒト化抗体の例の、VHおよびVLアミノ酸配列は、以下に提供される:
ヒト化されたVH
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQRLEWIGEINPTNGRTNYIEKFKSRATLTVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGTRAYHYWGQGTMVTVSS(配列番号128)
ヒト化されたVL
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASDNLYSNLAWYQQKPGKSPKLLVYDATNLADGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPLTFGQGTKVEIK(配列番号129)
代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号128のアミノ酸配列を含むVHを含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号129のアミノ酸配列を含むVLを含む。
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号128で示されるVHと比較して、25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有するVHを含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号129で示されるVLと比較して、15以下のアミノ酸バリエーション(例として、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有するVLを含む。
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号128で表されるとおりのVHと少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、または98％)同一であるアミノ酸配列を含むVHを含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号129で表されるとおりのVLと少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、または98％)同一であるアミノ酸配列を含むVLを含む。
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号125に示されるVLと比較して、43および48位の1以上におけるアミノ酸置換、ならびに/または(例として、ならびに)配列番号124に示されるVHと比較して、48、67、69、71および73位の1以上におけるアミノ酸置換を含むヒト化バリアントである。いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号125に示されるVLと比較して、S43Aおよび/もしくは(例として、および)V48L突然変異、ならびに/または(例として、ならびに)配列番号124に示されるVHと比較して、A67V、L69I、V71R、およびK73Tの1以上の突然変異を含むヒト化バリアントである。
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号125に示されるVLと比較して、9、13、17、18、40、43、48、45、および70位の1以上におけるアミノ酸置換、ならびに/または(例として、ならびに)配列番号124に示されるVHと比較して、1、5、7、11、12、20、38、40、44、48、66、67、69、71、73、75、81、83、87、および108位の1以上におけるアミノ酸置換を含むヒト化バリアントである。
いくつかの態様において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、ヒト抗体からの重鎖定常領域および軽鎖定常領域を包含し得るキメラ抗体である。キメラ抗体は、第1の種からの可変領域または一部の可変領域、および第2の種からの定常領域を有する抗体を指す。典型的には、これらのキメラ抗体において、軽鎖と重鎖との両方の可変領域は、ある種の哺乳動物(例として、マウス、ウサギ、およびラットなどの非ヒト哺乳動物)に由来する抗体の可変領域を模倣する一方で、定常部は、ヒトなどの別の哺乳動物に由来する抗体中の配列と相同である。いくつかの態様において、アミノ酸修飾は、可変領域および/または(例として、および)定常領域においてなされ得る。
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗トランスフェリン受容体抗体は、ヒト抗体からの重鎖定常領域および軽鎖定常領域を包含し得るキメラ抗体である。キメラ抗体は、第1の種からの可変領域または一部の可変領域、および第2の種からの定常領域を有する抗体を指す。典型的には、これらのキメラ抗体において、軽鎖と重鎖との両方の可変領域は、ある種の哺乳動物(例として、マウス、ウサギ、およびラットなどの非ヒト哺乳動物)に由来する抗体の可変領域を模倣する一方で、定常部は、ヒトなどの別の哺乳動物に由来する抗体中の配列と相同である。いくつかの態様において、アミノ酸修飾は、可変領域および/または(例として、および)定常領域においてなされ得る。
いくつかの態様において、本明細書に記載のとおりの抗トランスフェリン受容体抗体のいずれの重鎖も、重鎖定常領域(CH)またはこの一部(例として、CH1、CH2、CH3、またはそれらの組み合わせ)を含んでいてもよい。重鎖定常領域は、いずれの好適な起源、例として、ヒト、マウス、ラット、またはウサギに属し得る。特定の一例において、重鎖定常領域は、ヒトIgG(ガンマ重鎖)、例として、IgG1、IgG2、またはIgG4からのものである。ヒトIgG1定常領域の例は、下に与えられる:
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号130)
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗トランスフェリン受容体抗体のいずれの軽鎖も、軽鎖定常領域(CL)をさらに含んでいてもよいが、これは当該技術分野において知られているいずれのCLでもあり得る。いくつかの例において、CLは、カッパ軽鎖である。他の例において、CLは、ラムダ軽鎖である。いくつかの態様において、CLはカッパ軽鎖であって、その配列は下に与えられる:
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号83)
他の抗体の重鎖および軽鎖定常領域は当該技術分野において周知であり、例として、IMGTデータベース(www.imgt.org)において、またはwww.vbase2.org/vbstat.php.にて提供されるものであるが、これらの両方とも参照により本明細書に組み込まれる。
記載される抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖および軽鎖アミノ酸配列の例は、下に提供される:
重鎖(VH＋ヒトIgG1定常領域)
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPTNGRTNYIEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGTRAYHYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号132)
軽鎖(VL＋カッパ軽鎖)
DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRASDNLYSNLAWYQQKQGKSPQLLVYDATNLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDFGTYYCQHFWGTPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号133)
重鎖(ヒト化VH＋ヒトIgG1定常領域)
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQRLEWIGEINPTNGRTNYIEKFKSRATLTVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGTRAYHYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号134)
軽鎖(ヒト化されたVL＋カッパ軽鎖)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASDNLYSNLAWYQQKPGKSPKLLVYDATNLADGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号135)
いくつかの態様において、本明細書に記載のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号132と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、または98％)同一のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本明細書に記載のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号133と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、または98％)同一のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号132のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本明細書に記載のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号133のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号132に示される重鎖と比較して、25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有する重鎖を含む。代替え的または追加で(例として、追加で)、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号133に示される軽鎖と比較して、15以下のアミノ酸バリエーション(例として、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有する軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号134と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、または98％)同一のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本明細書に記載のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号135と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、または98％)同一のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号134のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本明細書に記載のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号135のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、配列番号134に示されるヒト化抗体の重鎖と比較して、25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有する重鎖を含む。代替え的または追加で(例として、追加で)、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号135に示されるヒト化抗体の軽鎖と比較して、15以下のアミノ酸バリエーション(例として、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有する軽鎖を含む。
いくつかの態様において、トランスフェリン受容体抗体は、無傷の抗体(完全長抗体)の抗原結合性フラグメント(Fab)である。無傷の抗体(完全長抗体)の抗原結合性フラグメントは、定型的な方法を介して調製され得る。例えば、F(ab')2フラグメントは、抗体分子のペプシン消化によって産生され得、Fab'フラグメントは、F(ab')2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成され得る。本明細書に記載のトランスフェリン受容体抗体のFabアミノ酸配列の例は、下に提供される:
重鎖Fab(VH＋ヒトIgG1定常領域の一部)
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPTNGRTNYIEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGTRAYHYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP(配列番号136)
重鎖Fab(ヒト化VH＋ヒトIgG1定常領域の一部)
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQRLEWIGEINPTNGRTNYIEKFKSRATLTVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGTRAYHYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP(配列番号137)
いくつかの態様において、本明細書に記載のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号136のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本明細書に記載のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号133のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号137のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本明細書に記載のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号135のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
本明細書に記載の抗トランスフェリン受容体抗体は、これらに限定されないが、無傷の(すなわち、完全長)抗体、それらの抗原結合性フラグメント(Fab、Fab'、F(ab')2、Fvなどの)、単一鎖抗体、二重特異性抗体、またはナノボディーを包含する、いずれの抗体の形態でもあり得る。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗トランスフェリン受容体抗体は、scFvである。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗トランスフェリン受容体抗体は、scFv-Fab(例として、一部の定常領域と縮合されたscFv)である。いくつかの態様において、本明細書に記載のトランスフェリン受容体抗体は、定常領域(例として、配列番号130で示されるヒトIgG1定常領域)と縮合されたscFvである。
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体のいずれか1つは、組換えDNAテクノロジーによって、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞浮遊培養から、任意にCHO-K1細胞(例として、European Collection of Animal Cell Cultureに由来するCHO-K1細胞、Cat.No.85051005)浮遊培養から生ずる。
いくつかの態様において、本明細書に提供される抗体は、1以上の翻訳後修飾を有し得る。いくつかの態様においては、ピログルタミン酸形成(ピロGlu)ともまた呼ばれるN末端環化が、産生の間にN末端グルタミン酸(Glu)および/またはグルタミン(Gln)残基において抗体に生起し得る。したがって、N末端グルタメートまたはグルタミン残基を含む配列を有すると特定される抗体は、翻訳後修飾に起因するピログルタメート形成を受けた抗体を包含することを理解されたい。いくつかの態様において、ピログルタミン酸形成は、重鎖配列に生起する。いくつかの態様において、ピログルタミン酸形成は軽鎖配列に生起する。
b.他の筋標的抗体
いくつかの態様において、筋標的化抗体は、ヘモジュベリン(hemojuvelin)、カベオリン-3、デュシェンヌ型筋ジストロフィーペプチド、ミオシンIib、またはCD63に特異的に結合する抗体である。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、筋原性前駆体タンパク質に特異的に結合する抗体である。例示の筋原性前駆体タンパク質は、限定せずに、ABCG2、M-カドヘリン/カドヘリン-15、カベオリン-1、CD34、FoxK1、インテグリンアルファ7、インテグリンアルファ7ベータ1、MYF-5、MyoD、ミオゲニン、NCAM-1/CD56、Pax3、Pax7、およびPax9を包含する。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、骨格筋タンパク質に特異的に結合する抗体である。例示の骨格筋タンパク質は、限定せずに、アルファ-サルコグリカン、ベータ-サルコグリカン、カルパインインヒビター、クレアチンキナーゼMM/CKMM、eIF5A、エノラーゼ2/ニューロン特異的エノラーゼ、イプシロン-サルコグリカン、FABP3/H-FABP、GDF-8/ミオスタチン、GDF-11/GDF-8、インテグリンアルファ7、インテグリンアルファ7ベータ1、インテグリンベータ1/CD29、MCAM/CD146、MyoD、ミオゲニン、ミオシン軽鎖キナーゼインヒビター、NCAM-1/CD56、およびトロポニンIを包含する。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、平滑筋タンパク質に特異的に結合する抗体である。例示の平滑筋タンパク質は、限定せずに、アルファ-平滑筋アクチン、VE-カドヘリン、カルデスモン/CALD1、カルポニン1、デスミン、ヒスタミンH2 R、モチリンR/GPR38、トランスジェリン(Transgelin)/TAGLN、およびビメンチンを包含する。しかしながら、追加の標的への抗体が本開示の範囲内であること、および本明細書に提供される標的の例示のリストが限定することを意図していないことは解されるはずである。
c.抗体特色/変更
いくつかの態様において、保存的突然変異は、例えば結晶構造に基づき決定されるとき、その残基が標的抗原(例として、トランスフェリン受容体)との相互作用に関与しそうにない位置にて、抗体配列(例として、CDRまたはフレームワーク配列)中へ導入され得る。いくつかの態様において、1、2個以上の突然変異(例として、アミノ酸置換)は、血清半減期、補体結合、Fc受容体結合、および/または(例として、および)細胞への抗原依存的細胞傷害性などの、抗体の1以上の機能特性を変更させるために、本明細書に記載の筋標的化抗体のFc領域中(例として、Kabatナンバリング系(例として、KabatのEUインデックス)に従うナンバリングで、CH2ドメイン(ヒトIgG1の残基231～340)中、および/または(例として、および)CH3ドメイン(ヒトIgG1の残基341～447)中、および/または(例として、および)ヒンジ領域中)へ導入される。
いくつかの態様において、1、2つ以上の突然変異(例として、アミノ酸置換)は、ヒンジ領域中のシステイン残基の数が、例として米国特許第5,677,425号に記載のとおり変動(例として、増大または減少)され得るように、Fc領域(CH1ドメイン)のヒンジ領域中へ導入される。CH1ドメインのヒンジ領域中のシステイン残基の数は、例として、軽鎖および重鎖の会合(assembly)を容易にさせるため、または抗体の安定性を変更(例として、増大もしくは減少)するため、またはリンカー抱合を容易にさせるため、変更され得る。
いくつかの態様において、1、2個以上の突然変異(例として、アミノ酸置換)は、抗体の、エフェクター細胞表面上のFc受容体(例として、活性化されたFc受容体)への親和性を増加または減少させるため、本明細書に記載の筋標的化抗体のFc領域中(例として、Kabatナンバリング系(例として、KabatのEUインデックス)に従うナンバリングで、CH2ドメイン(ヒトIgG1の残基231～340)中、および/または(例として、および)CH3ドメイン(ヒトIgG1の残基341～447)中、および/または(例として、および)ヒンジ領域中)へ導入される。抗体のFc受容体への親和性を増大または減少させる抗体のFc領域中の突然変異、およびかかる突然変異をFc受容体中またはそのフラグメント中へ導入するための技法は、当業者に知られている。抗体のFc受容体への親和性を変更するためになされ得る、抗体のFc受容体中の突然変異の例は、例として、Smith P et al.,(2012)PNAS 109:6181-6186、米国特許第6,737,056号、ならびに国際公開第WO 02/060919号;第WO 98/23289号;および第WO 97/34631号(これらは参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。
いくつかの態様において、1、2個以上のアミノ酸突然変異(すなわち、置換、挿入、または欠失)は、in vivoでの抗体の半減期を変更(例として、増加または減少)させるため、IgG定常領域またはそのFcRn-結合フラグメント(好ましくは、Fcまたはヒンジ-Fcドメインフラグメント)中へ導入される。例えば、in vivoでの抗体の半減期を変更(例として、増加または減少)させるであろう突然変異について、例として、国際公開第WO 02/060919号;第WO 98/23289号;および第WO 97/34631号;ならびに米国特許第5,869,046号、第6,121,022号、第6,277,375号、および第6,165,745号を見よ。
いくつかの態様において、1、2個以上のアミノ酸突然変異(すなわち、置換、挿入、または欠失)は、in vivoでの抗トランスフェリン受容体抗体の半減期を減少させるため、IgG定常領域またはそのFcRn-結合フラグメント(好ましくは、Fcまたはヒンジ-Fcドメインフラグメント)中へ導入される。いくつかの態様において、1、2個以上のアミノ酸突然変異(すなわち、置換、挿入、または欠失)は、in vivoでの抗体の半減期を増加させるため、IgG定常領域またはそのFcRn-結合フラグメント(好ましくは、Fcまたはヒンジ-Fcドメインフラグメント)中へ導入される。いくつかの態様において、抗体は、KabatのEUインデックス(上記のKabat E Aら(1991))に従うナンバリングで第2定常(CH2)ドメイン(ヒトIgG1の残基231～340)中および/または(例として、および)第3定常(CH3)ドメイン(ヒトIgG1の残基341～447)中に、1個以上のアミノ酸突然変異(例として、置換)を有し得る。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体のIgG1定常領域は、KabatにあるようなEUインデックスに従ってナンバリングされた位置252におけるメチオニン(M)からチロシン(Y)への置換、位置254におけるセリン(S)からトレオニン(T)への置換、および位置256におけるトレオニン(T)からグルタミン酸(E)への置換を含む。米国特許第7,658,921号(これは、参照により本明細書に組み込まれる)を見よ。「YTE突然変異体」と称されるこのタイプの突然変異IgGは、同じ抗体の野生型バージョンと比較して4倍増大した半減期を発揮したことが示されている(Dall'Acqua W F et al.,(2006)J Biol Chem 281:23514-24を見よ)。いくつかの態様において、抗体は、KabatにあるようなEUインデックスに従ってナンバリングされた位置251～257、285～290、308～314、385～389、および428～436でのアミノ酸残基の、1、2、3以上のアミノ酸置換を含むIgG定常領域を含む。
いくつかの態様において、1、2以上のアミノ酸置換は、抗トランスフェリン受容体抗体のエフェクター機能(単数または複数)を変更するため、IgG定常領域Fc領域中へ導入される。自身への親和性が変更されたエフェクターリガンドは、例えば、Fc受容体または補体のC1構成要素であり得る。このアプローチは、米国特許第5,624,821号および第5,648,260号においてさらに詳細に記載される。いくつかの態様において、定常領域ドメインの欠失または不活化(点突然変異または他の手段を通して)は、循環抗体のFc受容体への結合を低減し、それによって腫瘍局在化を増大し得る。定常領域を欠失または不活化し、それによって腫瘍局在化を増大させる突然変異の記載については、例として、米国特許第5,585,097号および第8,591,886号を見よ。いくつかの態様において、1以上のアミノ酸置換は、Fc領域上の潜在的なグリコシル化部位を除去するため(これによってFc受容体への結合が低減されることもある)、本明細書に記載の抗体のFc領域中へ導入されてもよい(例として、Shields R L et al.,(2001)J Biol Chem 276:6591-604を見よ)。
いくつかの態様において、本明細書に記載の筋標的化抗体の定常領域中の1以上のアミノ酸残基は、抗体が変更されたClq結合および/または(例として、および)低減もしくは消失された補体依存性細胞傷害性(CDC)を有し得るように、異なるアミノ酸残基に置き換えられ得る。このアプローチは、米国特許第6,194,551号(Idusogie et al)においてさらに詳細に記載されている。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体のCH2ドメインのN末領域中の1以上のアミノ酸残基は変更されて、それによって抗体の補体結合能を変更する。このアプローチは、国際刊行物第WO 94/29351号においてさらに記載されている。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体のFc領域は、抗体の、細胞への抗体依存性細胞傷害性(ADCC)の媒介能を増大させるため、および/または(例として、および)、抗体のFcγ受容体への親和性を増大させるため、修飾されている。このアプローチは、国際刊行物第WO 00/42072号においてさらに記載されている。
いくつかの態様において、本明細書に提供される抗体の重鎖および/または(例として、および)軽鎖可変ドメイン(単数または複数)配列(単数または複数)は、本明細書の他の箇所に記載されるとおり、例えば、CDR接合抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、もしくは複合ヒト抗体、または抗原結合性フラグメントを生成するために使用され得る。当業者によって理解されるとおり、本明細書に提供される抗体のいずれかに由来するいずれのバリアント、CDR接合抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または複合抗体は、本明細書に記載の組成物および方法に有用であってもよく、バリアント、CDR接合抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または複合抗体が、これが由来する元の抗体と比べて、トランスフェリン受容体への少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％以上の結合を有し得るように、トランスフェリン受容体への特異的結合能を維持するであろう。
いくつかの態様において、本明細書に提供される抗体は、所望の特性を抗体へ付与する突然変異を含む。例えば、ネイティブなIgG4 mAbに生じることが知られているFabアーム交換(Fab-arm exchange)に起因する潜在的合併症を回避するため、本明細書に提供される抗体は、安定化「Adair」突然変異を含んでいてもよく(Angal S.,et al.,「A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human(IgG4)antibody」,Mol Immunol 30,105-108;1993)、ここでセリン228(EUナンバリング;残基241 Kabatナンバリング)は、IgG1様ヒンジ配列をもたらすプロリンへ変換されている。結果的に、抗体のいずれも、安定化「Adair」突然変異を包含していてもよい。
本明細書に提供されるとおり、本開示の抗体は、任意に、定常領域またはその一部を含んでいてもよい。例えば、VLドメインは、そのC末端にて、軽鎖定常領域様CκまたはCλへ付着されていてもよい。同様に、VHドメインまたはその一部は、すべてのまたは一部の重鎖様IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgM、およびいずれのアイソタイプのサブクラスへ付着されていてもよい。抗体は、好適な定常領域を包含していてもよい(例えば、Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,No.91-3242,National Institutes of Health Publications,Bethesda,Md.(1991)を見よ)。したがって、本開示の範囲内の抗体は、いずれの好適な定常領域と組み合わされて、VHおよびVLドメイン、またはその抗原結合部を包含していてもよい。
ii.筋標的化ペプチド
本開示のいくつかの側面は、筋標的化ペプチドを筋標的化剤として提供する。特定の細胞型へ結合する短いペプチド配列(例として、長さが5～20アミノ酸のペプチド配列)は記載されている。例えば、細胞標的化ペプチドは、Vines e.,et al.,A.、「Cell-penetrating and cell-targeting peptides in drug delivery」Biochim Biophys Acta 2008,1786:126-38;Jarver P.,et al.,「In vivo biodistribution and efficacy of peptide mediated delivery」Trends Pharmacol Sci 2010;31:528-35;Samoylova T.I.,et al.,「Elucidation of muscle-binding peptides by phage display screening」Muscle Nerve 1999;22:460-6;米国特許第6,329,501号、2001年12月11日発行、題名「METHODS AND COMPOSITIONS FOR TARGETING COMPOUNDS TO MUSCLE」;およびSamoylov A.M.,et al.,「Recognition of cell-specific binding of phage display derived peptides using an acoustic wave sensor」Biomol Eng 2002;18:269-72に記載されており、これらのそれぞれの内容全体は、参照によって本明細書に組み込まれる。特定の細胞表面抗原(例として、受容体)と相互作用するようにペプチドを設計することによって、所望される組織、例として、筋肉への選択性が獲得され得る。骨格筋標的化が調査されており、広範な分子ペイロードが送達されることができる。巨大な抗体またはウイルス粒子についての実際上の不利な点の多くが存在しないこれらのアプローチは、筋組織への高選択性を有していてもよい。結果的に、いくつかの態様において、筋標的化剤は、長さが4アミノ酸から50アミノ酸までの筋標的化ペプチドである。いくつかの態様において、筋標的化ペプチドは、長さが4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50アミノ酸である。筋標的化ペプチドは、ファージディスプレーなどの数種の方法のいずれかを使用して生成され得る。
いくつかの態様において、筋標的化ペプチドは、他のある細胞と比較して、筋細胞において過剰発現されているかまたは相対的に高度に発現されている、内在化する細胞表面受容体(例として、トランスフェリン受容体)へ結合してもよい。いくつかの態様において、筋標的化ペプチドは、トランスフェリン受容体を標的にしてもよい(例として、トランスフェリン受容体へ結合してもよい)。いくつかの態様において、トランスフェリン受容体を標的にするペプチドは、天然に存在するリガンド、例として、トランスフェリンのセグメントを含んでいてもよい。いくつかの態様において、トランスフェリン受容体を標的にするペプチドは、米国特許第6,743,893号、11/30/2000出願、「RECEPTOR-MEDIATED UPTAKE OF PEPTIDES THAT BIND THE HUMAN TRANSFERRIN RECEPTOR」に記載のとおりである。いくつかの態様において、トランスフェリン受容体を標的にするペプチドは、Kawamoto,M.et al,「A novel transferrin receptor-targeted hybrid peptide disintegrates cancer cell membrane to induce rapid killing of cancer cells」BMC Cancer.2011 Aug 18;11:359に記載のとおりである。いくつかの態様において、トランスフェリン受容体を標的にするペプチドは、米国特許第8,399,653号、5/20/2011出願、「TRANSFERRIN/TRANSFERRIN RECEPTOR-MEDIATED SIRNA DELIVERY」に記載のとおりである。
上述のとおり、筋標的化ペプチドの例は報告されている。例えば、筋肉特異的ペプチドは、表面へプタペプチドを提示するファージディスプレーライブラリを使用して同定された。一例として、アミノ酸配列ASSLNIA(配列番号138)を有するペプチドは、in vitroでC2C12マウス筋管へ結合し、かつin vivoでマウス筋組織へ結合した。結果的に、いくつかの態様において、筋標的化剤は、アミノ酸配列ASSLNIA(配列番号138)を含む。このペプチドは、肝臓、腎臓、および脳への結合が低減された、マウスへの静脈内注射後の心筋組織および骨格筋組織への結合について改善された特異性を発揮した。追加の筋肉特異的ペプチドがファージディスプレーを使用して同定されている。例えば、DMDへの処置という文脈において、12アミノ酸ペプチドが、筋標的化のためのファージディスプレーライブラリによって同定された。Yoshida D.,et al.,「Targeting of salicylate to skin and muscle following topical injections in rats」Int J Pharm 2002;231:177-84を見よ;その内容全体は、参照によって本明細書に組み込まれる。ここで、配列SKTFNTHPQSTP(配列番号139)を有する12アミノ酸ペプチドが同定され、この筋標的化ペプチドは、ASSLNIA(配列番号138)ペプチドと比べてC2C12細胞への改善された結合を示した。
他の細胞型より筋肉(例として、骨格筋)に対して選択的なペプチドを同定するためのいずれの追加の方法はin vitroでの選択を包含し、これはGhosh D.,et al.,「Selection of muscle-binding peptides from context-specific peptide-presenting phage libraries for adenoviral vector targeting」J Virol 2005;79:13667-72に記載されている;この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。ランダム12-merペプチドファージディスプレーライブラリを非筋細胞型の混合物とプレインキュベートすることによって、非特異的細胞バインダーが選出された。選択を繰り返した後、12アミノ酸ペプチドTARGEHKEEELI(配列番号140)が最も頻繁に出現した。結果的に、いくつかの態様において、筋標的化剤は、アミノ酸配列TARGEHKEEELI(配列番号140)を含む。
筋標的化剤は、アミノ酸含有分子またはペプチドであってもよい。筋標的化ペプチドは、筋細胞から見出されたタンパク質受容体へ優先的に結合するタンパク質の配列に対応していてもよい。いくつかの態様において、筋標的化ペプチドは、ペプチドが筋細胞を優先的に標的にし得るように、疎水性アミノ酸(例として、バリン)の性質(propensity)を高く含有する。いくつかの態様において、筋標的化ペプチドは、これまでに特徴付けも開示もされていない。これらのペプチドは、数種の方法論のいずれか、例として、ファージディスプレードペプチドライブラリ、1ビーズ・1化合物(one-bead one-compound)ペプチドライブラリ、または位置走査性(positional scanning)合成ペプチドコンビナトリアルライブラリを使用して、想起、産生、合成、および/または(例として、および)、誘導体化されてもよい。例示の方法論は、当該技術分野において特徴付けられてきており、参照により組み込まれる(Gray,B.P.and Brown,K.C.「Combinatorial Peptide Libraries:Mining for Cell-Binding Peptides」Chem Rev.2014,114:2,1020-1081.;Samoylova,T.I.and Smith,B.F.「Elucidation of muscle-binding peptides by phage display screening」Muscle Nerve,1999,22:4.460-6.)。いくつかの態様において、筋標的化ペプチドは過去に開示されている(例として、Writer M.J.et al.「Targeted gene delivery to human airway epithelial cells with synthetic vectors incorporating novel targeting peptides selected by phage display」J.Drug Targeting.2004;12:185;Cai,D.「BDNF-mediated enhancement of inflammation and injury in the aging heart」Physiol Genomics.2006,24:3,191-7.;Zhang,L.「Molecular profiling of heart endothelial cells」Circulation,2005,112:11,1601-11.;McGuire,M.J.et al.「In vitro selection of a peptide with high selectivity for cardiomyocytes in vivo」J Mol Biol.2004,342:1,171-82を見よ)。例示の筋標的化ペプチドは、以下の群のアミノ酸配列を含む:CQAQGQLVC(配列番号141)、CSERSMNFC(配列番号142)、CPKTRRVPC(配列番号143)、WLSEAGPVVTVRALRGTGSW(配列番号144)、ASSLNIA(配列番号138)、CMQHSMRVC(配列番号145)、およびDDTRHWG(配列番号146)。いくつかの態様において、筋標的化ペプチドは、約2～25アミノ酸、約2～20アミノ酸、約2～15アミノ酸、約2～10アミノ酸、または約2～5アミノ酸を含んでいてもよい。筋標的化ペプチドは、天然に存在するアミノ酸、例として、システイン、アラニン、または天然に存在しないか、もしくは修飾アミノ酸を含んでいてもよい。天然に存在しないアミノ酸は、β-アミノ酸、ホモ-アミノ酸、プロリン誘導体、3-置換アラニン誘導体、線形コアアミノ酸、N-メチルアミノ酸、および当該技術分野において知られているその他のアミノ酸を包含する。いくつかの態様において、筋標的化ペプチドは線状であってもよい;他の態様において、筋標的化ペプチドは環状(例として、二環式)であってもよい(例として、Silvana,M.G.et al.Mol.Therapy,2018,26:1,132-147を見よ)。
iii.筋標的化受容体リガンド
筋標的化剤は、リガンド、例として、受容体タンパク質へ結合するリガンドであってもよい。筋標的化リガンドは、タンパク質、例としてトランスフェリンであってもよく、それは筋細胞によって発現される内在化する細胞表面受容体へ結合する。結果的に、いくつかの態様において、筋標的化剤は、トランスフェリン、またはトランスフェリン受容体へ結合するその誘導体である。筋標的化リガンドは、代替的に、小分子、例として、他の細胞型と比べて優先的に筋細胞を標的にする親油性小分子であってもよい。筋細胞を標的にしてもよい例示の親油性小分子は、コレステロール、コレステリル、ステアリン酸、パルミチン酸、オレイン酸、オレイル、リノレン酸、リノール酸、ミリスチン酸、ステロール、ジヒドロテストステロン、テストステロン誘導体、グリセリン、アルキル鎖、トリチル基、およびアルコキシ酸を含む化合物を包含する。
iv.筋標的化アプタマー
筋標的化剤は、他の細胞型と比べて優先的に筋細胞を標的にするアプタマー、例としてRNAアプタマーであってもよい。いくつかの態様において、筋標的化アプタマーはこれまでに特徴付けも開示もされていない。これらのアプタマーは、数種の方法論のいずれか、例として、指数関数的濃縮によるリガンドの体系的進化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)を使用して、想起、産生、合成、および/または(例として、および)、誘導体化されてもよい。例示の方法論は当該技術分野において特徴付けされており、参照により組み込まれる(Yan,A.C.and Levy,M.「Aptamers and aptamer targeted delivery」RNA biology,2009,6:3,316-20.;Germer,K.et al.「RNA aptamers and their therapeutic and diagnostic applications」Int.J.Biochem.Mol.Biol.2013;4:27-40)。いくつかの態様において、筋標的化アプタマーは以前に開示されている(例として、Phillippou,S.et al.「Selection and Identification of Skeletal-muscle-Targeted RNA Aptamers」Mol Ther Nucleic Acids.2018,10:199-214.;Thiel,W.H.et al.「Smooth Muscle Cell-targeted RNA Aptamer Inhibits Neointimal Formation」Mol Ther.2016,24:4,779-87を見よ)。例示の筋標的化アプタマーは、A01B RNAアプタマーおよびRNA Apt 14を包含する。いくつかの態様において、アプタマーは、核酸をベースとしたアプタマー、オリゴヌクレオチドアプタマー、またはペプチドアプタマーである。いくつかの態様において、アプタマーは、約5～15kDa、約5～10kDa、約10～15kDa、約1～5Da、約1～3kDa、またはこれより小さいものであってもよい。
v.他の筋標的化剤
筋細胞(例として、骨格筋細胞)を標的にするための1つのストラテジーは、筋線維鞘上に発現されたトランスポータータンパク質などの筋肉トランスポータータンパク質の基質を使用することである。いくつかの態様において、筋標的化剤は、筋組織に特異的な流入トランスポーターの基質である。いくつかの態様において、流入トランスポーターは、骨格筋組織に特異的である。骨格筋の筋線維鞘上に発現されるトランスポーターの二大クラスは、(1)骨格筋組織からの流出に容易にさせる、アデノシン三リン酸(ATP)結合カセット(ABC)スーパーファミリー、および(2)基質の骨格筋中への流入を容易にし得る、溶質輸送体(solute carrier)(SLC)スーパーファミリーである。いくつかの態様において、筋標的化剤は、トランスポーターのABCスーパーファミリーまたはSLCスーパーファミリーへ結合する基質である。いくつかの態様において、トランスポーターのABCまたはSLCスーパーファミリーへ結合する基質は、天然に存在する基質である。いくつかの態様において、トランスポーターのABCまたはSLCスーパーファミリーへ結合する基質は、天然に存在しない基質、例えば、トランスポーターのABCまたはSLCスーパーファミリーへ結合するその合成誘導体である。
いくつかの態様において、筋標的化剤は、トランスポーターのSLCスーパーファミリーの基質である。SLCトランスポーターは、平衡型であるか、または基質の輸送を推進させる膜にわたって創出されたプロトンもしくはナトリウムのイオン勾配を使用するかのいずれかである。骨格筋への高発現を有する例示のSLCトランスポーターは、限定せずに、SATTトランスポーター(ASCT1;SLC1A4)、GLUT4トランスポーター(SLC2A4)、GLUT7トランスポーター(GLUT7;SLC2A7)、ATRC2トランスポーター(CAT-2;SLC7A2)、LAT3トランスポーター(KIAA0245;SLC7A6)、PHT1トランスポーター(PTR4;SLC15A4)、OATP-Jトランスポーター(OATP5A1;SLC21A15)、OCT3トランスポーター(EMT;SLC22A3)、OCTN2トランスポーター(FLJ46769;SLC22A5)、ENTトランスポーター(ENT1;SLC29A1およびENT2;SLC29A2)、PAT2トランスポーター(SLC36A2)、およびSAT2トランスポーター(KIAA1382;SLC38A2)を包含する。これらのトランスポーターは、基質の骨格筋中への流入を容易にさせることで、筋標的化のための好機を提供し得る。
いくつかの態様において、筋標的化剤は、平衡型ヌクレオシドトランスポーター2(ENT2)トランスポーターの基質である。他のトランスポーターと比べて、ENT2は、骨格筋において最高発現するmRNAの1つを有する。ヒトENT2(hENT2)は、脳、心臓、胎盤、胸腺、膵臓、前立腺、および腎臓などのほとんどの体器官に発現されるものの、特に骨格筋に豊富である。ヒトENT2は、その基質の取り込みを、それらの濃度勾配に応じて容易にさせる。ENT2は、広範なプリンおよびピリミジン核酸塩基を輸送することによってヌクレオシドホメオスタシスを維持する役割を果たす。hENT2トランスポーターは、イノシンを除くすべてのヌクレオシド(アデノシン、グアノシン、ウリジン、チミジン、およびシチジン)に対して低親和性を有する。結果的に、いくつかの態様において、筋標的化剤は、ENT2基質である。例示のENT2基質は、限定せずに、イノシン、2',3'-ジデオキシイノシン、およびクロファラビンを包含する。いくつかの態様において、本明細書に提供される筋標的化剤のいずれも、分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチドペイロード)に関連する。いくつかの態様において、筋標的化剤は、分子ペイロードへ共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、筋標的化剤は、分子ペイロードへ非共有結合的に連結されている。
いくつかの態様において、筋標的化剤は、ナトリウムイオン依存性の高親和性カルニチントランスポーターである有機カチオン/カルニチントランスポーター(OCTN2)の基質である。いくつかの態様において、筋標的化剤は、カルニチン、ミルドロネート、アセチルカルニチン、またはOCTN2へ結合するそのいずれかの誘導体である。いくつかの態様において、カルニチン、ミルドロネート、アセチルカルニチン、またはそれらの誘導体は、分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチドペイロード)へ共有結合的に連結されている。
筋標的化剤は、筋細胞を標的にする少なくとも1つの可溶性形態で存在するタンパク質であるタンパク質であってもよい。いくつかの態様において、筋標的化タンパク質は、鉄過剰およびホメオスタシスに関与するタンパク質ヘモジュベリン(またrepulsive guidance molecule Cまたはヘモクロマトーシスタイプ2タンパク質としても知られている)であってもよい。いくつかの態様において、ヘモジュベリンは、完全長もしくはフラグメントであっても、または機能的ヘモジュベリンタンパク質と少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％配列同一性をもつ突然変異体であってもよい。いくつかの態様において、ヘモジュベリン突然変異体は、可溶性フラグメントであってもよく、N末シグナリングを欠いていてもよく、および/または(例として、および)、C末アンカードメイン(anchoring domain)を欠いていてもよい。いくつかの態様において、ヘモジュベリンは、GenBank RefSeq受託番号NM_001316767.1、NM_145277.4、NM_202004.3、NM_213652.3、またはNM_213653.3の注釈付きのものであってもよい。ヘモジュベリンがヒト、霊長目の非ヒト動物、または齧歯類の動物を起源とするものであってもよいことは解されるはずである。
Ｂ．分子ペイロード
本開示のいくつかの側面は、分子ペイロード、例として、生物学的結果(例として、DNA配列の転写、RNA配列のスプライシングおよびプロセシング、タンパク質の発現、またはタンパク質の活性)をモジュレートするための分子ペイロードを提供する。いくつかの態様において、分子ペイロードは、筋標的化剤へ連結されているか、または別様に結び付けられている。いくつかの態様において、かかる分子ペイロードは、例として、結び付けられた筋標的化剤による筋細胞への送達を受けた筋細胞中の核酸またはタンパク質への特異的結合を介して、筋細胞を標的にすることが可能である。様々なタイプの筋標的化剤が本開示に従って使用されてもよいことは解されるはずである。例えば、分子ペイロードは、オリゴヌクレオチド(例として、アンチセンスオリゴヌクレオチド)、ペプチド(例として、疾患に関連する筋細胞中の核酸もしくはタンパク質に結合するペプチド)、タンパク質(例として、疾患に関連する筋細胞中の核酸もしくはタンパク質に結合するタンパク質)、または小分子(例として、疾患に関連する筋細胞中の核酸もしくはタンパク質の機能をモジュレートする小分子)を含んでいてもよく、またはこれらからなっていてもよい。いくつかの態様において、分子ペイロードは、突然変異したDMDアレルと相補性のある領域を有する鎖を含むオリゴヌクレオチドである。例示の分子ペイロードは本明細書にさらに詳細に記載されているが、しかしながら、本明細書に提供される例示の分子ペイロードが限定されることを意図していないことは解されるはずである。
ｉ．オリゴヌクレオチド
いずれの好適なオリゴヌクレオチドも、分子ペイロードとして、本明細書に記載のとおり使用されてよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、エキソンスキッピングを誘導するために設計されてもよく(例として、EXONDYS 51 オリゴヌクレオチド(Sarepta Therapeutics, Inc.)、これは、配列番号３４３(CUCCAACAUCAAGGAAGAUGGCAUUUCUAG)を含み;WVE-210201(Wave Life Sciences)、これは、配列番号334 (UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU)を含み;Casimersen (Sarepta Therapeutics, Inc.)、これは配列番号302を含み、または(CAAUGCCAUCCUGGAGUUCCUG);またはGolodirsen(Sarepta Therapeutics, Inc.)、これは配列番号380(GUUGCCUCCGGUUCUGAAGGUGUUC)を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、エキソンスキッピングを誘導するために設計されてもよく(例として、viltolarsen(NS Pharma, Inc.)、配列番号2257(CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC)を含み、または renadirsen (Daiichi Sankyo Company)、これは、配列番号2252(CGCUGCCCAAUGCCAUCC)を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、表10で提供される配列の配列またはその一部(例えば、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20またはそれ以上の連続したヌクレオシド)を含み、および／またはオリゴヌクレオチドは、表10で提供される標的配列と相補性のある領域を含む。本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドのいずれか1つ(例えば、表10に列挙されるオリゴヌクレオチド)におけるチミン塩基(T’s)のいずれか1つ以上は、任意にウラシル塩基(U’s)であってもよく、および／または本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドにおけるU’sのいずれか1つは、任意にT’sであってもよい。
表10.オリゴヌクレオチド分子ペイロードの例
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、mRNAの分解を引き起こすよう設計されていてもよい(例として、オリゴヌクレオチドは、分解を引き起こすgapmer、siRNA、リボザイム、またはアプタマーであってもよい)。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、mRNAの翻訳を遮断するよう設計されていてもよい(例として、オリゴヌクレオチドは、翻訳を遮断するmixmer、siRNA、またはアプタマーであってもよい)。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、mRNAの分解を引き起こしてその翻訳を遮断するよう設計されていてもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、mRNAの安定を促進するよう設計されてもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、mRNAの翻訳を促進するよう設計されてもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、mRNAの安定を促進してその翻訳を促進するよう設計されていてもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、酵素(例として、遺伝子編集酵素)の活性に向かわせるためのガイド核酸(例として、ガイドRNA)であってもよい。いくつかの態様において、ガイド核酸は、突然変異したDMDアレルの全部または一部を欠失するように(例として、インフレームエキソンスキッピングを容易にするように)酵素を向かわせてもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMD発現の抑圧的制御因子(例として、miR-31)を標的とするよう設計されてもよい。オリゴヌクレオチドの他の例は本明細書に提供されている。いくつかの態様において、一方のフォーマット(format)からの機能的配列(例として、アンチセンス鎖配列)を他方のフォーマットへ組み込むことによって、あるフォーマットのオリゴヌクレオチド(例として、アンチセンスオリゴヌクレオチド)が、別のフォーマット(例として、siRNAオリゴヌクレオチド)へ好適に適応されてもよいことは解されるはずである。
DMDを標的にするための有用なオリゴヌクレオチドの例は、「MULTIPLE EXON SKIPPING COMPOSITIONS FOR DMD」と題する2010年5月27日に公開された米国特許出願刊行物US20100130591A1;「MEANS AND METHOD FOR INDUCING EXON-SKIPPING」と題する2013年1月29日に登録された米国特許第8,361,979号;「METHOD FOR EFFICIENT EXON (44) SKIPPING IN DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY AND ASSOCIATED MEANS」と題する2012年3月8日に公開された米国特許出願刊行物20120059042;「EXON SKIPPING COMPOSITIONS FOR TREATING MUSCULAR DYSTROPHY」と題する2014年11月6日に公開された米国特許出願刊行物20140329881;「ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES FOR INDUCING EXON SKIPPING AND METHODS OF USE THEREOF」と題する2012年7月31日に登録された米国特許第8,232,384号;「METHODS AND MEANS FOR EFFICIENT SKIPPING OF EXON 45 IN DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY PRE-MRNA」と題する2012年1月26日に公開された米国特許出願刊行物20120022134A1;「ADENO-ASSOCIATED VIRAL VECTOR FOR EXON SKIPPING IN A GENE ENCODING A DISPENSABLE DOMAN PROTEIN」と題する2012年3月29日に公開された米国特許出願刊行物20120077860;「OLIGOMERS」と題する2012年12月4日に登録された米国特許第8,324,371号;「ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES」と題する2015年7月14日に登録された米国特許第9,078,911号;「ANTISENSE NUCLEIC ACIDS」と題する2015年7月14日に登録された米国特許第9,079,934号;「MIR-31 IN DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY THERAPY」と題する2015年5月19日に登録された米国特許第9,034,838号;および「OLIGONUCLEOTIDE COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF」と題する2017年4月13日に公開された国際特許刊行物WO2017062862A3に提供され、これら各々の内容全体は本明細書に組み込まれる。
表1４は、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用であるオリゴヌクレオチドの配列の非制限的な例を提供する。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、表14に提供される任意の配列を含み得る。

表14－DMDを標的とするためのオリゴヌクレオチド配列。
Figure 2023535073000022
Figure 2023535073000023
Figure 2023535073000024
Figure 2023535073000025
Figure 2023535073000026
Figure 2023535073000027
いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、DMD RNA(例えば、配列番号2239のDp427m転写物)の領域を標的とする。いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、DMDのRNA(例えば、配列番号2239のDp427m転写物)と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、DMD RNA(例えば、配列番号2240～2250のいずれか1つ)のエキソンに相補性のある領域を含む。DMD RNAの配列およびエキソン配列の例は下に提供される。
Homo sapiensジストロフィン(DMD)、転写バリアントDp427m、mRNA(NCBI参照配列:NM_004006.2)
TCCTGGCATCAGTTACTGTGTTGACTCACTCAGTGTTGGGATCACTCACTTTCCCCCTACAGGACTCAGATCTGGGAGGCAATTACCTTCGGAGAAAAACGAATAGGAAAAACTGAAGTGTTACTTTTTTTAAAGCTGCTGAAGTTTGTTGGTTTCTCATTGTTTTTAAGCCTACTGGAGCAATAAAGTTTGAAGAACTTTTACCAGGTTTTTTTTATCGCTGCCTTGATATACACTTTTCAAAATGCTTTGGTGGGAAGAAGTAGAGGACTGTTATGAAAGAGAAGATGTTCAAAAGAAAACATTCACAAAATGGGTAAATGCACAATTTTCTAAGTTTGGGAAGCAGCATATTGAGAACCTCTTCAGTGACCTACAGGATGGGAGGCGCCTCCTAGACCTCCTCGAAGGCCTGACAGGGCAAAAACTGCCAAAAGAAAAAGGATCCACAAGAGTTCATGCCCTGAACAATGTCAACAAGGCACTGCGGGTTTTGCAGAACAATAATGTTGATTTAGTGAATATTGGAAGTACTGACATCGTAGATGGAAATCATAAACTGACTCTTGGTTTGATTTGGAATATAATCCTCCACTGGCAGGTCAAAAATGTAATGAAAAATATCATGGCTGGATTGCAACAAACCAACAGTGAAAAGATTCTCCTGAGCTGGGTCCGACAATCAACTCGTAATTATCCACAGGTTAATGTAATCAACTTCACCACCAGCTGGTCTGATGGCCTGGCTTTGAATGCTCTCATCCATAGTCATAGGCCAGACCTATTTGACTGGAATAGTGTGGTTTGCCAGCAGTCAGCCACACAACGACTGGAACATGCATTCAACATCGCCAGATATCAATTAGGCATAGAGAAACTACTCGATCCTGAAGATGTTGATACCACCTATCCAGATAAGAAGTCCATCTTAATGTACATCACATCACTCTTCCAAGTTTTGCCTCAACAAGTGAGCATTGAAGCCATCCAGGAAGTGGAAATGTTGCCAAGGCCACCTAAAGTGACTAAAGAAGAACATTTTCAGTTACATCATCAAATGCACTATTCTCAACAGATCACGGTCAGTCTAGCACAGGGATATGAGAGAACTTCTTCCCCTAAGCCTCGATTCAAGAGCTATGCCTACACACAGGCTGCTTATGTCACCACCTCTGACCCTACACGGAGCCCATTTCCTTCACAGCATTTGGAAGCTCCTGAAGACAAGTCATTTGGCAGTTCATTGATGGAGAGTGAAGTAAACCTGGACCGTTATCAAACAGCTTTAGAAGAAGTATTATCGTGGCTTCTTTCTGCTGAGGACACATTGCAAGCACAAGGAGAGATTTCTAATGATGTGGAAGTGGTGAAAGACCAGTTTCATACTCATGAGGGGTACATGATGGATTTGACAGCCCATCAGGGCCGGGTTGGTAATATTCTACAATTGGGAAGTAAGCTGATTGGAACAGGAAAATTATCAGAAGATGAAGAAACTGAAGTACAAGAGCAGATGAATCTCCTAAATTCAAGATGGGAATGCCTCAGGGTAGCTAGCATGGAAAAACAAAGCAATTTACATAGAGTTTTAATGGATCTCCAGAATCAGAAACTGAAAGAGTTGAATGACTGGCTAACAAAAACAGAAGAAAGAACAAGGAAAATGGAGGAAGAGCCTCTTGGACCTGATCTTGAAGACCTAAAACGCCAAGTACAACAACATAAGGTGCTTCAAGAAGATCTAGAACAAGAACAAGTCAGGGTCAATTCTCTCACTCACATGGTGGTGGTAGTTGATGAATCTAGTGGAGATCACGCAACTGCTGCTTTGGAAGAACAACTTAAGGTATTGGGAGATCGATGGGCAAACATCTGTAGATGGACAGAAGACCGCTGGGTTCTTTTACAAGACATCCTTCTCAAATGGCAACGTCTTACTGAAGAACAGTGCCTTTTTAGTGCATGGCTTTCAGAAAAAGAAGATGCAGTGAACAAGATTCACACAACTGGCTTTAAAGATCAAAATGAAATGTTATCAAGTCTTCAAAAACTGGCCGTTTTAAAAGCGGATCTAGAAAAGAAAAAGCAATCCATGGGCAAACTGTATTCACTCAAACAAGATCTTCTTTCAACACTGAAGAATAAGTCAGTGACCCAGAAGACGGAAGCATGGCTGGATAACTTTGCCCGGTGTTGGGATAATTTAGTCCAAAAACTTGAAAAGAGTACAGCACAGATTTCACAGGCTGTCACCACCACTCAGCCATCACTAACACAGACAACTGTAATGGAAACAGTAACTACGGTGACCACAAGGGAACAGATCCTGGTAAAGCATGCTCAAGAGGAACTTCCACCACCACCTCCCCAAAAGAAGAGGCAGATTACTGTGGATTCTGAAATTAGGAAAAGGTTGGATGTTGATATAACTGAACTTCACAGCTGGATTACTCGCTCAGAAGCTGTGTTGCAGAGTCCTGAATTTGCAATCTTTCGGAAGGAAGGCAACTTCTCAGACTTAAAAGAAAAAGTCAATGCCATAGAGCGAGAAAAAGCTGAGAAGTTCAGAAAACTGCAAGATGCCAGCAGATCAGCTCAGGCCCTGGTGGAACAGATGGTGAATGAGGGTGTTAATGCAGATAGCATCAAACAAGCCTCAGAACAACTGAACAGCCGGTGGATCGAATTCTGCCAGTTGCTAAGTGAGAGACTTAACTGGCTGGAGTATCAGAACAACATCATCGCTTTCTATAATCAGCTACAACAATTGGAGCAGATGACAACTACTGCTGAAAACTGGTTGAAAATCCAACCCACCACCCCATCAGAGCCAACAGCAATTAAAAGTCAGTTAAAAATTTGTAAGGATGAAGTCAACCGGCTATCAGGTCTTCAACCTCAAATTGAACGATTAAAAATTCAAAGCATAGCCCTGAAAGAGAAAGGACAAGGACCCATGTTCCTGGATGCAGACTTTGTGGCCTTTACAAATCATTTTAAGCAAGTCTTTTCTGATGTGCAGGCCAGAGAGAAAGAGCTACAGACAATTTTTGACACTTTGCCACCAATGCGCTATCAGGAGACCATGAGTGCCATCAGGACATGGGTCCAGCAGTCAGAAACCAAACTCTCCATACCTCAACTTAGTGTCACCGACTATGAAATCATGGAGCAGAGACTCGGGGAATTGCAGGCTTTACAAAGTTCTCTGCAAGAGCAACAAAGTGGCCTATACTATCTCAGCACCACTGTGAAAGAGATGTCGAAGAAAGCGCCCTCTGAAATTAGCCGGAAATATCAATCAGAATTTGAAGAAATTGAGGGACGCTGGAAGAAGCTCTCCTCCCAGCTGGTTGAGCATTGTCAAAAGCTAGAGGAGCAAATGAATAAACTCCGAAAAATTCAGAATCACATACAAACCCTGAAGAAATGGATGGCTGAAGTTGATGTTTTTCTGAAGGAGGAATGGCCTGCCCTTGGGGATTCAGAAATTCTAAAAAAGCAGCTGAAACAGTGCAGACTTTTAGTCAGTGATATTCAGACAATTCAGCCCAGTCTAAACAGTGTCAATGAAGGTGGGCAGAAGATAAAGAATGAAGCAGAGCCAGAGTTTGCTTCGAGACTTGAGACAGAACTCAAAGAACTTAACACTCAGTGGGATCACATGTGCCAACAGGTCTATGCCAGAAAGGAGGCCTTGAAGGGAGGTTTGGAGAAAACTGTAAGCCTCCAGAAAGATCTATCAGAGATGCACGAATGGATGACACAAGCTGAAGAAGAGTATCTTGAGAGAGATTTTGAATATAAAACTCCAGATGAATTACAGAAAGCAGTTGAAGAGATGAAGAGAGCTAAAGAAGAGGCCCAACAAAAAGAAGCGAAAGTGAAACTCCTTACTGAGTCTGTAAATAGTGTCATAGCTCAAGCTCCACCTGTAGCACAAGAGGCCTTAAAAAAGGAACTTGAAACTCTAACCACCAACTACCAGTGGCTCTGCACTAGGCTGAATGGGAAATGCAAGACTTTGGAAGAAGTTTGGGCATGTTGGCATGAGTTATTGTCATACTTGGAGAAAGCAAACAAGTGGCTAAATGAAGTAGAATTTAAACTTAAAACCACTGAAAACATTCCTGGCGGAGCTGAGGAAATCTCTGAGGTGCTAGATTCACTTGAAAATTTGATGCGACATTCAGAGGATAACCCAAATCAGATTCGCATATTGGCACAGACCCTAACAGATGGCGGAGTCATGGATGAGCTAATCAATGAGGAACTTGAGACATTTAATTCTCGTTGGAGGGAACTACATGAAGAGGCTGTAAGGAGGCAAAAGTTGCTTGAACAGAGCATCCAGTCTGCCCAGGAGACTGAAAAATCCTTACACTTAATCCAGGAGTCCCTCACATTCATTGACAAGCAGTTGGCAGCTTATATTGCAGACAAGGTGGACGCAGCTCAAATGCCTCAGGAAGCCCAGAAAATCCAATCTGATTTGACAAGTCATGAGATCAGTTTAGAAGAAATGAAGAAACATAATCAGGGGAAGGAGGCTGCCCAAAGAGTCCTGTCTCAGATTGATGTTGCACAGAAAAAATTACAAGATGTCTCCATGAAGTTTCGATTATTCCAGAAACCAGCCAATTTTGAGCAGCGTCTACAAGAAAGTAAGATGATTTTAGATGAAGTGAAGATGCACTTGCCTGCATTGGAAACAAAGAGTGTGGAACAGGAAGTAGTACAGTCACAGCTAAATCATTGTGTGAACTTGTATAAAAGTCTGAGTGAAGTGAAGTCTGAAGTGGAAATGGTGATAAAGACTGGACGTCAGATTGTACAGAAAAAGCAGACGGAAAATCCCAAAGAACTTGATGAAAGAGTAACAGCTTTGAAATTGCATTATAATGAGCTGGGAGCAAAGGTAACAGAAAGAAAGCAACAGTTGGAGAAATGCTTGAAATTGTCCCGTAAGATGCGAAAGGAAATGAATGTCTTGACAGAATGGCTGGCAGCTACAGATATGGAATTGACAAAGAGATCAGCAGTTGAAGGAATGCCTAGTAATTTGGATTCTGAAGTTGCCTGGGGAAAGGCTACTCAAAAAGAGATTGAGAAACAGAAGGTGCACCTGAAGAGTATCACAGAGGTAGGAGAGGCCTTGAAAACAGTTTTGGGCAAGAAGGAGACGTTGGTGGAAGATAAACTCAGTCTTCTGAATAGTAACTGGATAGCTGTCACCTCCCGAGCAGAAGAGTGGTTAAATCTTTTGTTGGAATACCAGAAACACATGGAAACTTTTGACCAGAATGTGGACCACATCACAAAGTGGATCATTCAGGCTGACACACTTTTGGATGAATCAGAGAAAAAGAAACCCCAGCAAAAAGAAGACGTGCTTAAGCGTTTAAAGGCAGAACTGAATGACATACGCCCAAAGGTGGACTCTACACGTGACCAAGCAGCAAACTTGATGGCAAACCGCGGTGACCACTGCAGGAAATTAGTAGAGCCCCAAATCTCAGAGCTCAACCATCGATTTGCAGCCATTTCACACAGAATTAAGACTGGAAAGGCCTCCATTCCTTTGAAGGAATTGGAGCAGTTTAACTCAGATATACAAAAATTGCTTGAACCACTGGAGGCTGAAATTCAGCAGGGGGTGAATCTGAAAGAGGAAGACTTCAATAAAGATATGAATGAAGACAATGAGGGTACTGTAAAAGAATTGTTGCAAAGAGGAGACAACTTACAACAAAGAATCACAGATGAGAGAAAGCGAGAGGAAATAAAGATAAAACAGCAGCTGTTACAGACAAAACATAATGCTCTCAAGGATTTGAGGTCTCAAAGAAGAAAAAAGGCTCTAGAAATTTCTCATCAGTGGTATCAGTACAAGAGGCAGGCTGATGATCTCCTGAAATGCTTGGATGACATTGAAAAAAAATTAGCCAGCCTACCTGAGCCCAGAGATGAAAGGAAAATAAAGGAAATTGATCGGGAATTGCAGAAGAAGAAAGAGGAGCTGAATGCAGTGCGTAGGCAAGCTGAGGGCTTGTCTGAGGATGGGGCCGCAATGGCAGTGGAGCCAACTCAGATCCAGCTCAGCAAGCGCTGGCGGGAAATTGAGAGCAAATTTGCTCAGTTTCGAAGACTCAACTTTGCACAAATTCACACTGTCCGTGAAGAAACGATGATGGTGATGACTGAAGACATGCCTTTGGAAATTTCTTATGTGCCTTCTACTTATTTGACTGAAATCACTCATGTCTCACAAGCCCTATTAGAAGTGGAACAACTTCTCAATGCTCCTGACCTCTGTGCTAAGGACTTTGAAGATCTCTTTAAGCAAGAGGAGTCTCTGAAGAATATAAAAGATAGTCTACAACAAAGCTCAGGTCGGATTGACATTATTCATAGCAAGAAGACAGCAGCATTGCAAAGTGCAACGCCTGTGGAAAGGGTGAAGCTACAGGAAGCTCTCTCCCAGCTTGATTTCCAATGGGAAAAAGTTAACAAAATGTACAAGGACCGACAAGGGCGATTTGACAGATCTGTTGAGAAATGGCGGCGTTTTCATTATGATATAAAGATATTTAATCAGTGGCTAACAGAAGCTGAACAGTTTCTCAGAAAGACACAAATTCCTGAGAATTGGGAACATGCTAAATACAAATGGTATCTTAAGGAACTCCAGGATGGCATTGGGCAGCGGCAAACTGTTGTCAGAACATTGAATGCAACTGGGGAAGAAATAATTCAGCAATCCTCAAAAACAGATGCCAGTATTCTACAGGAAAAATTGGGAAGCCTGAATCTGCGGTGGCAGGAGGTCTGCAAACAGCTGTCAGACAGAAAAAAGAGGCTAGAAGAACAAAAGAATATCTTGTCAGAATTTCAAAGAGATTTAAATGAATTTGTTTTATGGTTGGAGGAAGCAGATAACATTGCTAGTATCCCACTTGAACCTGGAAAAGAGCAGCAACTAAAAGAAAAGCTTGAGCAAGTCAAGTTACTGGTGGAAGAGTTGCCCCTGCGCCAGGGAATTCTCAAACAATTAAATGAAACTGGAGGACCCGTGCTTGTAAGTGCTCCCATAAGCCCAGAAGAGCAAGATAAACTTGAAAATAAGCTCAAGCAGACAAATCTCCAGTGGATAAAGGTTTCCAGAGCTTTACCTGAGAAACAAGGAGAAATTGAAGCTCAAATAAAAGACCTTGGGCAGCTTGAAAAAAAGCTTGAAGACCTTGAAGAGCAGTTAAATCATCTGCTGCTGTGGTTATCTCCTATTAGGAATCAGTTGGAAATTTATAACCAACCAAACCAAGAAGGACCATTTGACGTTCAGGAAACTGAAATAGCAGTTCAAGCTAAACAACCGGATGTGGAAGAGATTTTGTCTAAAGGGCAGCATTTGTACAAGGAAAAACCAGCCACTCAGCCAGTGAAGAGGAAGTTAGAAGATCTGAGCTCTGAGTGGAAGGCGGTAAACCGTTTACTTCAAGAGCTGAGGGCAAAGCAGCCTGACCTAGCTCCTGGACTGACCACTATTGGAGCCTCTCCTACTCAGACTGTTACTCTGGTGACACAACCTGTGGTTACTAAGGAAACTGCCATCTCCAAACTAGAAATGCCATCTTCCTTGATGTTGGAGGTACCTGCTCTGGCAGATTTCAACCGGGCTTGGACAGAACTTACCGACTGGCTTTCTCTGCTTGATCAAGTTATAAAATCACAGAGGGTGATGGTGGGTGACCTTGAGGATATCAACGAGATGATCATCAAGCAGAAGGCAACAATGCAGGATTTGGAACAGAGGCGTCCCCAGTTGGAAGAACTCATTACCGCTGCCCAAAATTTGAAAAACAAGACCAGCAATCAAGAGGCTAGAACAATCATTACGGATCGAATTGAAAGAATTCAGAATCAGTGGGATGAAGTACAAGAACACCTTCAGAACCGGAGGCAACAGTTGAATGAAATGTTAAAGGATTCAACACAATGGCTGGAAGCTAAGGAAGAAGCTGAGCAGGTCTTAGGACAGGCCAGAGCCAAGCTTGAGTCATGGAAGGAGGGTCCCTATACAGTAGATGCAATCCAAAAGAAAATCACAGAAACCAAGCAGTTGGCCAAAGACCTCCGCCAGTGGCAGACAAATGTAGATGTGGCAAATGACTTGGCCCTGAAACTTCTCCGGGATTATTCTGCAGATGATACCAGAAAAGTCCACATGATAACAGAGAATATCAATGCCTCTTGGAGAAGCATTCATAAAAGGGTGAGTGAGCGAGAGGCTGCTTTGGAAGAAACTCATAGATTACTGCAACAGTTCCCCCTGGACCTGGAAAAGTTTCTTGCCTGGCTTACAGAAGCTGAAACAACTGCCAATGTCCTACAGGATGCTACCCGTAAGGAAAGGCTCCTAGAAGACTCCAAGGGAGTAAAAGAGCTGATGAAACAATGGCAAGACCTCCAAGGTGAAATTGAAGCTCACACAGATGTTTATCACAACCTGGATGAAAACAGCCAAAAAATCCTGAGATCCCTGGAAGGTTCCGATGATGCAGTCCTGTTACAAAGACGTTTGGATAACATGAACTTCAAGTGGAGTGAACTTCGGAAAAAGTCTCTCAACATTAGGTCCCATTTGGAAGCCAGTTCTGACCAGTGGAAGCGTCTGCACCTTTCTCTGCAGGAACTTCTGGTGTGGCTACAGCTGAAAGATGATGAATTAAGCCGGCAGGCACCTATTGGAGGCGACTTTCCAGCAGTTCAGAAGCAGAACGATGTACATAGGGCCTTCAAGAGGGAATTGAAAACTAAAGAACCTGTAATCATGAGTACTCTTGAGACTGTACGAATATTTCTGACAGAGCAGCCTTTGGAAGGACTAGAGAAACTCTACCAGGAGCCCAGAGAGCTGCCTCCTGAGGAGAGAGCCCAGAATGTCACTCGGCTTCTACGAAAGCAGGCTGAGGAGGTCAATACTGAGTGGGAAAAATTGAACCTGCACTCCGCTGACTGGCAGAGAAAAATAGATGAGACCCTTGAAAGACTCCAGGAACTTCAAGAGGCCACGGATGAGCTGGACCTCAAGCTGCGCCAAGCTGAGGTGATCAAGGGATCCTGGCAGCCCGTGGGCGATCTCCTCATTGACTCTCTCCAAGATCACCTCGAGAAAGTCAAGGCACTTCGAGGAGAAATTGCGCCTCTGAAAGAGAACGTGAGCCACGTCAATGACCTTGCTCGCCAGCTTACCACTTTGGGCATTCAGCTCTCACCGTATAACCTCAGCACTCTGGAAGACCTGAACACCAGATGGAAGCTTCTGCAGGTGGCCGTCGAGGACCGAGTCAGGCAGCTGCATGAAGCCCACAGGGACTTTGGTCCAGCATCTCAGCACTTTCTTTCCACGTCTGTCCAGGGTCCCTGGGAGAGAGCCATCTCGCCAAACAAAGTGCCCTACTATATCAACCACGAGACTCAAACAACTTGCTGGGACCATCCCAAAATGACAGAGCTCTACCAGTCTTTAGCTGACCTGAATAATGTCAGATTCTCAGCTTATAGGACTGCCATGAAACTCCGAAGACTGCAGAAGGCCCTTTGCTTGGATCTCTTGAGCCTGTCAGCTGCATGTGATGCCTTGGACCAGCACAACCTCAAGCAAAATGACCAGCCCATGGATATCCTGCAGATTATTAATTGTTTGACCACTATTTATGACCGCCTGGAGCAAGAGCACAACAATTTGGTCAACGTCCCTCTCTGCGTGGATATGTGTCTGAACTGGCTGCTGAATGTTTATGATACGGGACGAACAGGGAGGATCCGTGTCCTGTCTTTTAAAACTGGCATCATTTCCCTGTGTAAAGCACATTTGGAAGACAAGTACAGATACCTTTTCAAGCAAGTGGCAAGTTCAACAGGATTTTGTGACCAGCGCAGGCTGGGCCTCCTTCTGCATGATTCTATCCAAATTCCAAGACAGTTGGGTGAAGTTGCATCCTTTGGGGGCAGTAACATTGAGCCAAGTGTCCGGAGCTGCTTCCAATTTGCTAATAATAAGCCAGAGATCGAAGCGGCCCTCTTCCTAGACTGGATGAGACTGGAACCCCAGTCCATGGTGTGGCTGCCCGTCCTGCACAGAGTGGCTGCTGCAGAAACTGCCAAGCATCAGGCCAAATGTAACATCTGCAAAGAGTGTCCAATCATTGGATTCAGGTACAGGAGTCTAAAGCACTTTA
ATTATGACATCTGCCAAAGCTGCTTTTTTTCTGGTCGAGTTGCAAAAGGCCATAAAATGCACTATCCCATGGTGGAATATTGCACTCCGACTACATCAGGAGAAGATGTTCGAGACTTTGCCAAGGTACTAAAAAACAAATTTCGAACCAAAAGGTATTTTGCGAAGCATCCCCGAATGGGCTACCTGCCAGTGCAGACTGTCTTAGAGGGGGACAACATGGAAACTCCCGTTACTCTGATCAACTTCTGGCCAGTAGATTCTGCGCCTGCCTCGTCCCCTCAGCTTTCACACGATGATACTCATTCACGCATTGAACATTATGCTAGCAGGCTAGCAGAAATGGAAAACAGCAATGGATCTTATCTAAATGATAGCATCTCTCCTAATGAGAGCATAGATGATGAACATTTGTTAATCCAGCATTACTGCCAAAGTTTGAACCAGGACTCCCCCCTGAGCCAGCCTCGTAGTCCTGCCCAGATCTTGATTTCCTTAGAGAGTGAGGAAAGAGGGGAGCTAGAGAGAATCCTAGCAGATCTTGAGGAAGAAAACAGGAATCTGCAAGCAGAATATGACCGTCTAAAGCAGCAGCACGAACATAAAGGCCTGTCCCCACTGCCGTCCCCTCCTGAAATGATGCCCACCTCTCCCCAGAGTCCCCGGGATGCTGAGCTCATTGCTGAGGCCAAGCTACTGCGTCAACACAAAGGCCGCCTGGAAGCCAGGATGCAAATCCTGGAAGACCACAATAAACAGCTGGAGTCACAGTTACACAGGCTAAGGCAGCTGCTGGAGCAACCCCAGGCAGAGGCCAAAGTGAATGGCACAACGGTGTCCTCTCCTTCTACCTCTCTACAGAGGTCCGACAGCAGTCAGCCTATGCTGCTCCGAGTGGTTGGCAGTCAAACTTCGGACTCCATGGGTGAGGAAGATCTTCTCAGTCCTCCCCAGGACACAAGCACAGGGTTAGAGGAGGTGATGGAGCAACTCAACAACTCCTTCCCTAGTTCAAGAGGAAGAAATACCCCTGGAAAGCCAATGAGAGAGGACACAATGTAGGAAGTCTTTTCCACATGGCAGATGATTTGGGCAGAGCGATGGAGTCCTTAGTATCAGTCATGACAGATGAAGAAGGAGCAGAATAAATGTTTTACAACTCCTGATTCCCGCATGGTTTTTATAATATTCATACAACAAAGAGGATTAGACAGTAAGAGTTTACAAGAAATAAATCTATATTTTTGTGAAGGGTAGTGGTATTATACTGTAGATTTCAGTAGTTTCTAAGTCTGTTATTGTTTTGTTAACAATGGCAGGTTTTACACGTCTATGCAATTGTACAAAAAAGTTATAAGAAAACTACATGTAAAATCTTGATAGCTAAATAACTTGCCATTTCTTTATATGGAACGCATTTTGGGTTGTTTAAAAATTTATAACAGTTATAAAGAAAGATTGTAAACTAAAGTGTGCTTTATAAAAAAAAGTTGTTTATAAAAACCCCTAAAAACAAAACAAACACACACACACACACATACACACACACACACAAAACTTTGAGGCAGCGCATTGTTTTGCATCCTTTTGGCGTGATATCCATATGAAATTCATGGCTTTTTCTTTTTTTGCATATTAAAGATAAGACTTCCTCTACCACCACACCAAATGACTACTACACACTGCTCATTTGAGAACTGTCAGCTGAGTGGGGCAGGCTTGAGTTTTCATTTCATATATCTATATGTCTATAAGTATATAAATACTATAGTTATATAGATAAAGAGATACGAATTTCTATAGACTGACTTTTTCCATTTTTTAAATGTTCATGTCACATCCTAATAGAAAGAAATTACTTCTAGTCAGTCATCCAGGCTTACCTGCTTGGTCTAGAATGGATTTTTCCCGGAGCCGGAAGCCAGGAGGAAACTACACCACACTAAAACATTGTCTACAGCTCCAGATGTTTCTCATTTTAAACAACTTTCCACTGACAACGAAAGTAAAGTAAAGTATTGGATTTTTTTAAAGGGAACATGTGAATGAATACACAGGACTTATTATATCAGAGTGAGTAATCGGTTGGTTGGTTGATTGATTGATTGATTGATACATTCAGCTTCCTGCTGCTAGCAATGCCACGATTTAGATTTAATGATGCTTCAGTGGAAATCAATCAGAAGGTATTCTGACCTTGTGAACATCAGAAGGTATTTTTTAACTCCCAAGCAGTAGCAGGACGATGATAGGGCTGGAGGGCTATGGATTCCCAGCCCATCCCTGTGAAGGAGTAGGCCACTCTTTAAGTGAAGGATTGGATGATTGTTCATAATACATAAAGTTCTCTGTAATTACAACTAAATTATTATGCCCTCTTCTCACAGTCAAAAGGAACTGGGTGGTTTGGTTTTTGTTGCTTTTTTAGATTTATTGTCCCATGTGGGATGAGTTTTTAAATGCCACAAGACATAATTTAAAATAAATAAACTTTGGGAAAAGGTGTAAAACAGTAGCCCCATCACATTTGTGATACTGACAGGTATCAACCCAGAAGCCCATGAACTGTGTTTCCATCCTTTGCATTTCTCTGCGAGTAGTTCCACACAGGTTTGTAAGTAAGTAAGAAAGAAGGCAAATTGATTCAAATGTTACAAAAAAACCCTTCTTGGTGGATTAGACAGGTTAAATATATAAACAAACAAACAAAAATTGCTCAAAAAAGAGGAGAAAAGCTCAAGAGGAAAAGCTAAGGACTGGTAGGAAAAAGCTTTACTCTTTCATGCCATTTTATTTCTTTTTGATTTTTAAATCATTCATTCAATAGATACCACCGTGTGACCTATAATTTTGCAAATCTGTTACCTCTGACATCAAGTGTAATTAGCTTTTGGAGAGTGGGCTGACATCAAGTGTAATTAGCTTTTGGAGAGTGGGTTTTGTCCATTATTAATAATTAATTAATTAACATCAAACACGGCTTCTCATGCTATTTCTACCTCACTTTGGTTTTGGGGTGTTCCTGATAATTGTGCACACCTGAGTTCACAGCTTCACCACTTGTCCATTGCGTTATTTTCTTTTTCCTTTATAATTCTTTCTTTTTCCTTCATAATTTTCAAAAGAAAACCCAAAGCTCTAAGGTAACAAATTACCAAATTACATGAAGATTTGGTTTTTGTCTTGCATTTTTTTCCTTTATGTGACGCTGGACCTTTTCTTTACCCAAGGATTTTTAAAACTCAGATTTAAAACAAGGGGTTACTTTACATCCTACTAAGAAGTTTAAGTAAGTAAGTTTCATTCTAAAATCAGAGGTAAATAGAGTGCATAAATAATTTTGTTTTAATCTTTTTGTTTTTCTTTTAGACACATTAGCTCTGGAGTGAGTCTGTCATAATATTTGAACAAAAATTGAGAGCTTTATTGCTGCATTTTAAGCATAATTAATTTGGACATTATTTCGTGTTGTGTTCTTTATAACCACCAAGTATTAAACTGTAAATCATAATGTAACTGAAGCATAAACATCACATGGCATGTTTTGTCATTGTTTTCAGGTACTGAGTTCTTACTTGAGTATCATAATATATTGTGTTTTAACACCAACACTGTAACATTTACGAATTATTTTTTTAAACTTCAGTTTTACTGCATTTTCACAACATATCAGACTTCACCAAATATATGCCTTACTATTGTATTATAGTACTGCTTTACTGTGTATCTCAATAAAGCACGCAGTTATGTTAC (配列番号2239)
Homo sapiensジストロフィン(DMD)、転写バリアントDp427m、エキソン8(NCBI参照配列：NM_004006.2の894～1075位ヌクレオチド
ATGTTGATACCACCTATCCAGATAAGAAGTCCATCTTAATGTACATCACATCACTCTTCCAAGTTTTGCCTCAACAAGTGAGCATTGAAGCCATCCAGGAAGTGGAAATGTTGCCAAGGCCACCTAAAGTGACTAAAGAAGAACATTTTCAGTTACATCATCAAATGCACTATTCTCAACAG (配列番号2240)
Homo sapiensジストロフィン(DMD)、 転写バリアントDp427m、エキソン23(NCBI参照配列:NM_004006.2の3194～3406位ヌクレオチド)
GCTTTACAAAGTTCTCTGCAAGAGCAACAAAGTGGCCTATACTATCTCAGCACCACTGTGAAAGAGATGTCGAAGAAAGCGCCCTCTGAAATTAGCCGGAAATATCAATCAGAATTTGAAGAAATTGAGGGACGCTGGAAGAAGCTCTCCTCCCAGCTGGTTGAGCATTGTCAAAAGCTAGAGGAGCAAATGAATAAACTCCGAAAAATTCAG (配列番号2241)
Homo sapiensジストロフィン(DMD)、転写バリアントDp427m、エキソン43(NCBI参照配列:NM_004006.2の6362～6534位ヌクレオチド)
AATATAAAAGATAGTCTACAACAAAGCTCAGGTCGGATTGACATTATTCATAGCAAGAAGACAGCAGCATTGCAAAGTGCAACGCCTGTGGAAAGGGTGAAGCTACAGGAAGCTCTCTCCCAGCTTGATTTCCAATGGGAAAAAGTTAACAAAATGTACAAGGACCGACAAGG(配列番号2242)
Homo sapiensジストロフィン(DMD)、転写バリアントDp427m、エキソン44(NCBI参照配列:NM_004006.2の6535～6682位ヌクレオチド)
GCGATTTGACAGATCTGTTGAGAAATGGCGGCGTTTTCATTATGATATAAAGATATTTAATCAGTGGCTAACAGAAGCTGAACAGTTTCTCAGAAAGACACAAATTCCTGAGAATTGGGAACATGCTAAATACAAATGGTATCTTAAG (配列番号2243)
Homo sapiensジストロフィン(DMD)、転写バリアントDp427m、エキソン45(NCBI参照配列:NM_004006.2の6683～6858位ヌクレオチド)
GAACTCCAGGATGGCATTGGGCAGCGGCAAACTGTTGTCAGAACATTGAATGCAACTGGGGAAGAAATAATTCAGCAATCCTCAAAAACAGATGCCAGTATTCTACAGGAAAAATTGGGAAGCCTGAATCTGCGGTGGCAGGAGGTCTGCAAACAGCTGTCAGACAGAAAAAAGAG (配列番号2244)
Homo sapiensジストロフィン(DMD)、転写バリアントDp427m、エキソン46(NCBI参照配列:NM_004006.2の6859～7006位ヌクレオチド)
GCTAGAAGAACAAAAGAATATCTTGTCAGAATTTCAAAGAGATTTAAATGAATTTGTTTTATGGTTGGAGGAAGCAGATAACATTGCTAGTATCCCACTTGAACCTGGAAAAGAGCAGCAACTAAAAGAAAAGCTTGAGCAAGTCAAG (配列番号2245)
Homo sapiensジストロフィン(DMD)、転写バリアントDp427m、エキソン50(NCBI参照配列:NM_004006.2の7445～7553位ヌクレオチド)
AGGAAGTTAGAAGATCTGAGCTCTGAGTGGAAGGCGGTAAACCGTTTACTTCAAGAGCTGAGGGCAAAGCAGCCTGACCTAGCTCCTGGACTGACCACTATTGGAGCCT(配列番号2246)
Homo sapiensジストロフィン(DMD)、転写バリアント Dp427m、エキソン 51(NCBI参照配列:NM_004006.2の7554～7786位ヌクレオチド)
CTCCTACTCAGACTGTTACTCTGGTGACACAACCTGTGGTTACTAAGGAAACTGCCATCTCCAAACTAGAAATGCCATCTTCCTTGATGTTGGAGGTACCTGCTCTGGCAGATTTCAACCGGGCTTGGACAGAACTTACCGACTGGCTTTCTCTGCTTGATCAAGTTATAAAATCACAGAGGGTGATGGTGGGTGACCTTGAGGATATCAACGAGATGATCATCAAGCAGAAG (配列番号2247)
Homo sapiensジストロフィン(DMD)、転写バリアントDp427m、エキソン52(NCBI参照配列:NM_004006.2の7787～7904位ヌクレオチド)
GCAACAATGCAGGATTTGGAACAGAGGCGTCCCCAGTTGGAAGAACTCATTACCGCTGCCCAAAATTTGAAAAACAAGACCAGCAATCAAGAGGCTAGAACAATCATTACGGATCGAA (配列番号2248)
Homo sapiensジストロフィン(DMD)、転写バリアントDp427m、エキソン53(NCBI参照配列:NM_004006.2の7905～8116位ヌクレオチド)
TTGAAAGAATTCAGAATCAGTGGGATGAAGTACAAGAACACCTTCAGAACCGGAGGCAACAGTTGAATGAAATGTTAAAGGATTCAACACAATGGCTGGAAGCTAAGGAAGAAGCTGAGCAGGTCTTAGGACAGGCCAGAGCCAAGCTTGAGTCATGGAAGGAGGGTCCCTATACAGTAGATGCAATCCAAAAGAAAATCACAGAAACCAAG (配列番号2249)
Homo sapiensジストロフィン(DMD)、転写バリアントDp427m、エキソン55(NCBI参照配列:NM_004006.2の8272～8461位ヌクレオチド)
GGTGAGTGAGCGAGAGGCTGCTTTGGAAGAAACTCATAGATTACTGCAACAGTTCCCCCTGGACCTGGAAAAGTTTCTTGCCTGGCTTACAGAAGCTGAAACAACTGCCAATGTCCTACAGGATGCTACCCGTAAGGAAAGGCTCCTAGAAGACTCCAAGGGAGTAAAAGAGCTGATGAAACAATGGCAA (配列番号2250)
いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、DMDにおけるエキソニックスプライシングエンハンサー(ESE)配列(例として、エキソン23、44、45、46、50、51、52、53、または55のESE配列)を標的とする。いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、DMDにおけるエキソニックスプライシングエンハンサー(ESE)配列(例として、エキソン8、23、43、44、45、46、50、51、52、53、または55のESE配列)を標的とする。いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例えば、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、DMDエキソン51のESE配列(例として、表15に列挙されるESE)を標的とする。いくつかの態様において、DMDを標的とするために有用なオリゴヌクレオチドは、DMDエキソン8、23、42、44、45、46、50、52、53、または55のESE配列(例として、表11に列挙されるESE)を標的とする。
いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソン8、23、42、44、45、46、50、52、53、および55の1つ以上をスキッピングするために)有用なオリゴヌクレオチドは、DMD転写物の1つ以上の完全なまたは部分的なESE(例として、表15または表11に列挙される１つ以上の完全なまたは部分的なESE)を含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号402～436および2043～2238において記載される１つ以上の完全なまたは部分的なESEを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号402～436および2043～2238のいずれか1つに記載のESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7、または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。
表15. DMDのエキソン内のエキソニックスプライシングエンハンサー
表11. DMDのエキソン8、23、43、44、45、46、50、52、53、および55内のエキソニックスプライシングエンハンサー
Figure 2023535073000030
Figure 2023535073000031
Figure 2023535073000032
Figure 2023535073000033
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMDエキソン8の１つ以上の完全なまたは部分的なESEを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMDエキソン8のESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7、または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号2047～2062で表されるとおりの１つ以上の完全なまたは部分的なESEを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号2047～2062のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7、または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMDエキソン8の1つ以上のESE(例として、2、3、4、またはそれ以上の隣接ESE)の少なくとも6(例として、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、またはそれ以上)つのヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号2047～2062で表されるとおりの１つ以上のESEの少なくとも6(例として、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、またはそれ以上)つのヌクレオチド(例として、2、3、4、またはそれ以上隣接するESE)を含む標的配列と相補性のある領域を含む。
いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、長さが18～35ヌクレオチドであり、配列番号2047～2062のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、長さが20～30(例として、20、25、30)ヌクレオチドであり、配列番号2047～2062のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7、または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、長さが20ヌクレオチドであり、配列番号2047～2062のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7、または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、長さが30ヌクレオチドであり、配列番号2047～2062のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7、または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ＤＭＤエキソン２３の１つ以上の完全なまたは部分的なＥＳＥを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ＤＭＤエキソン２３のＥＳＥの少なくとも４つ(例として、４、５、６、７、または８)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号４２９および２０６３～２０８６で表されるとおりの１つ以上の完全なまたは部分的なＥＳＥを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号４２９および２０６３～２０８６のいずれか１つで表されるとおりのＥＳＥの少なくとも４(例として、４、５、６、７、または８)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMDエキソン23の１つ以上のESE(例として、2、3、4、またはそれ以上の隣接ESE)の少なくとも6(例として、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、またはそれ以上)つのヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号429および2063～2086で表されるとおりの１つ以上のESEの少なくとも6(例として、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、またはそれ以上)つのヌクレオチド(例として、2、3、4、またはそれ以上の隣接するESE)を含む標的配列と相補性のある領域を含む。
いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、長さが18～35ヌクレオチドであり、配列番号429および2063～2086のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、長さが20～30(例として、20、25、30)つのヌクレオチドであり、配列番号429および2063～2086のいずれか1つに記載されているESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7、または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。
いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、長さが20ヌクレオチドであり、配列番号429および2063～2086のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、長さが30ヌクレオチドであり、配列番号429および2063～2086のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7、または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMDエキソン43の１つ以上の完全なまたは部分的なESEを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMDエキソン43のESEの少なくとも4つ(例として、4、5、6、7、または8)の連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号412、2078～2080、および2087～2111で表されるとおりの１つ以上の完全なまたは部分的なESEを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号412、2078～2080、および2087～2111のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7、または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMDエキソン43の1つ以上のESE(例として、2、3、4、またはそれ以上の隣接するESE)の少なくとも6(例として、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、またはそれ以上)つのヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号412、2078～2080、および2087～2111で表されるとおりの1つ以上のESE(例として、2、3、4、またはそれ以上の隣接するESE)の少なくとも6つ(例として、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、またはそれ以上)つのヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。
いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、長さが18～35ヌクレオチドであり、配列番号412、2078～2080、および2087～2111のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、長さが20～30(例として、20、25、30)ヌクレオチドであり、配列番号412、2078～2080、および2087～2111のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7、または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、長さが20ヌクレオチドであり、配列番号412、2078～2080、および2087～2111のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7、または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、長さが30ヌクレオチドであり、配列番号412、2078～2080、および2087～2111のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7、または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMDエキソン44の１つ以上の完全なまたは部分的なESEを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMDエキソン44のESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7、または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号409および2112～2121で表されるとおりの１つ以上の完全なまたは部分的なESEを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号409および2112～2121のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7、または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMDエキソン44の１つ以上のESE(例として、2、3、4、またはそれ以上の隣接ESE)の少なくとも6(例として、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、またはそれ以上)つのヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号409および2112～2121で表されるとおりの１つ以上のESE(例として、2、3、4、またはそれ以上の隣接するESE)の少なくとも6(例として、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、またはそれ以上)つのヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。
いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、長さが18～35ヌクレオチドであり、配列番号409および2112～2121のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、長さが20～30(例として、20、25、30)ヌクレオチドであり、配列番号409および2112～2121のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7、または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、長さが20ヌクレオチドであり、少なくとも4(例として。4、5、6、7、または8)つの連続したヌクレオチドを含む、配列番号409および2112～2121のいずれか1つに記載されるようなESEを含む。いくつかの態様において、DMDの標的化に有用なオリゴヌクレオチド(例として。エキソンスキッピングのために)30ヌクレオチドの長さであり、配列番号409および2112～2121のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMDエキソン45の１つ以上の完全なまたは部分的なESEを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMDエキソン45のESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7、または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号2097、2102、2103、および2122～2146で表されるとおりの１つ以上の完全なまたは部分的なESEを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号2097、2102、2103、および2122～2146のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7、または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMDエキソン45の１つ以上のESE(例として、2、3、4、またはそれ以上の隣接ESE)の少なくとも6(例として、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、またはそれ以上)つのヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号2097、2102、2103、および2122～2146に記載される１つ以上のESE(例として、2、3、4、またはそれ以上の隣接するESE)の少なくとも6(例として、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、またはそれ以上)つのヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。
いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、長さが18～35ヌクレオチドであり、配列番号2097、2102、2103、および2122～2146のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、長さが20～30(例として、20、25、30)ヌクレオチドであり、配列番号2097、2102、2103、および2122～2146のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7、または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、長さが20ヌクレオチドであり、配列番号2097、2102、2103、および2122～2146のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7、または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、長さが30ヌクレオチドであり、配列番号2097、2102、2103、および2122～2146のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7、または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMDエキソン46の１つ以上の完全なまたは部分的なESEを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMDエキソン46のESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7、または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号2096および2147～2158で表されるとおりの１つ以上の完全なまたは部分的なESEを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号2096および2147～2158のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7、または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMDエキソン46の1つ以上のESE(例として、2、3、4、またはそれ以上の隣接ESE)の少なくとも6(例として、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、またはそれ以上)つのヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号2096および2147～2158で表されるとおりの１つ以上のESE(例として、2、3、4、またはそれ以上の隣接するESE)の少なくとも6(例として、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、またはそれ以上)つのヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。
いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、長さが18～35ヌクレオチドであり、配列番号2096および2147～2158のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、長さが20～30(例として、20、25、30)ヌクレオチドであり、配列番号2096および2147～2158のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7、または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、長さが20ヌクレオチドであり、配列番号2096および2147～2158のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、長さが30ヌクレオチドであり、配列番号2096および2147～2158のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMDエキソン50の１つ以上の完全なまたは部分的なESEを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMDエキソン50のESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7、または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号2096および2160～2177で表されるとおりの１つ以上の完全なまたは部分的なESEを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号2096および2160～2177のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7、または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMDエキソン50の1つ以上のESE(例として、2、3、4、またはそれ以上の隣接ESE)の少なくとも6(例として、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、またはそれ以上)つのヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号2096および2160～2177で表されるとおりの１つ以上のESE(例として、2、3、4、またはそれ以上の隣接するESE)の少なくとも6(例として、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、またはそれ以上)つのヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。
いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、長さが18～35ヌクレオチドであり、配列番号2096および2160～2177のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、長さが20～30(例として、20、25、30)ヌクレオチドであり、配列番号2096および2160～2177のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、長さが20ヌクレオチドであり、配列番号2096および2160～2177のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、長さが30ヌクレオチドであり、配列番号2096および2160～2177のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMDエキソン51の１つ以上の完全なまたは部分的なESEを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMDエキソン51のESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7、または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号402～436に規定される１つ以上の完全なまたは部分的なESEを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号402～436のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7、または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号419で表されるとおりのESEの少なくとも4つ(例として、4、5、6、7、8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMDエキソン51の1つ以上のESE(例として、2、3、4、またはそれ以上の隣接ESE)の少なくとも6(例として、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、またはそれ以上)つのヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号402～436で表されるとおりの1つ以上のESE(例として、2、3、4、またはそれ以上の隣接するESE)の少なくとも6(例として、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、またはそれ以上)つのヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号418および配列番号419で表されるとおりのESEの少なくとも6(例として、6、7、8、9、10、11、12、13、または14)つのヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。
いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、長さが18～35ヌクレオチドであり、配列番号402-436のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、長さが20～30(例として、20、25、30)ヌクレオチドであり、配列番号402～436のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7、または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、長さが20ヌクレオチドであり、配列番号402～436のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、長さが30ヌクレオチドであり、配列番号402～436のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7、または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。
いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、20～30(例として、20、25、30)ヌクレオチドの長さで、配列番号419で表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、長さが30ヌクレオチドであり、配列番号419で表されるとおりのESEの少なくとも4つ(例として、4、5、6、7、または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、長さが20～30(例として、20、25、30)ヌクレオチドであり、配列番号418および配列番号419で表されるとおりのESEの少なくとも6(例として、6、7、8、9、10、11、12、13、または14)つのヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域からを含む。 いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、長さが30ヌクレオチドであり、配列番号418および配列番号419で表されるとおりのESEの少なくとも6(例として、6、7、8、9、10、11、12、13、または14)つのヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。
DMDエキソン51スキップに有用なオリゴヌクレオチドの非限定的な例及びその標的配列は、配列番号437～1241および配列番号1242～2046に、夫々提供される。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、長さ20～30ヌクレオチドであり、配列番号1242～2046のいずれか1つの少なくとも20つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、長さが20～30ヌクレオチドであり、配列番号437～1241のいずれか1つの少なくとも20つの連続したヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号437～1241のいずれか1つのヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも30ヌクレオチド(例として、30、31、32、33、34、または35)長であり、配列番号437～1241のいずれか1つのヌクレオチド配列を含む。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、長さが20～30ヌクレオチドであり、配列番号1548、1550、1551、1552、1555、1558、1559、1562、1565、1569、1577、1583、1589、1595、1600、1606、1610、1614、1621、1626、1629、1632、1637、1640、1643、1646、1650、1655、1658、および1662のうちのいずれか1つの連続した少なくとも20つのヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは20～30長さがヌクレオチドであり、配列番号743、745、746、747、750、753、754、757、760、764、772、778、784、790、795、801、805、809、816、821、824、827、832、835、838、841、845、850、853、および857のうちいずれか１つの20つの連続したヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号743、745、746、747、750、753、754、757、760、764、772、778、784、790、795、801、805、809、816、821、824、827、832、835、838、841、845、850、853、および857のいずれか１つの核酸塩基配列を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、長さが30ヌクレオチドであり、配列番号743、745、746、747、750、753、754、757、760、764、772、778、784、790、795、801、805、809、816、821、824、827、832、835、838、841、845、850、853および857のいずれか１つの核酸配列を含む。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMDエキソン52の１つ以上の完全なまたは部分的なESEを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMDエキソン52のESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7、または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号432および2178～2192で表されるとおりの１つ以上の完全なまたは部分的なESEを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号432および2178～2192のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7、または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMDエキソン52の1つ以上のESE(例として、2、3、4、またはそれ以上の隣接ESE)の少なくとも6(例として、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、またはそれ以上)つのヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号432および2178～2192で表されるとおりの1つ以上のESE(例として、2、3、4、またはそれ以上の隣接するESE)の少なくとも6(例として、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、またはそれ以上)つのヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。
いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、長さが18～35ヌクレオチドであり、配列番号432および2178～2192のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、長さが20～30(例として、20、25、30)ヌクレオチドであり、配列番号432および2178～2192のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、長さが20ヌクレオチドであり、配列番号432および2178～2192のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、長さが30ヌクレオチドであり、配列番号432および2178～2192のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMDエキソン53の１つ以上の完全なまたは部分的なESEを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMDエキソン53のESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7、または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号416、430、431、2108、2114、2127、および2193～2213で表されるとおりの1つ以上の完全なまたは部分的なESEを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号416、430、431、2108、2114、2127、および2193～2213のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4つ(例として、4、5、6、7、または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMDエキソン53の1つ以上のESE(例として、2、3、4、またはそれ以上の隣接ESE)の少なくとも6(例として、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、またはそれ以上)つのヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号416、430、431、2108、2114、2127、および2193～2213に記載される１つ以上のESE(例として、2、3、4、または複数の隣接するESE)の少なくとも6(例として、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、またはより多くの)つのヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。
いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、長さが18～35ヌクレオチドであり、配列番号416、430、431、2108、2114、2127および2193～2213のいずれか１つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、長さが20～30(例として、20、25、30)ヌクレオチドであり、配列番号416、430、431、2108、2114、2127、および2193～2213のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7、または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、長さが20ヌクレオチドであり、配列番号416、430、431、2108、2114、2127、および2193～2213のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、長さが30ヌクレオチドであり、配列番号416、430、431、2108、2114、2127、および2193-2213のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMDエキソン55の１つ以上の完全なまたは部分的なESEを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMDエキソン55のESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7、または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号2097、2102、2103、2116、2147、2199、および2214～2238で表されるとおりの１つ以上の完全なまたは部分的なESEを含む標的配列と相補性のある領域を含む。 いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号2097、2102、2103、2116、2147、2199、および2214～2238のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMDエキソン55の１つ以上のESE(例として、2、3、4、またはそれ以上の隣接ESE)の少なくとも6(例として、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、またはそれ以上)つのヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも6個(例として、配列番号2097、2102、2103、2116、2147、2199、および2214～2238で表されるとおりの１つ以上のESE(例として、2、3、4、または複数の隣接するESE)の6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、またはそれ以上)つのヌクレオチドを含む、標的配列と相補性のある領域を含む。
いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、長さが18～35ヌクレオチドであり、少なくとも4(例として、配列番号2097、2102、2103、2116、2147、2199、および2214～2238のいずれか1つで表されるとおりのESEの4、5、6、7、または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、長さが20～30(例として、20、25、30)ヌクレオチドであり、少なくとも4(例として、配列番号2097、2102、2103、2116、2147、2199、および2214～2238のいずれか1つで表されるとおりのESEの4、5、6、7、または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、長さが、20ヌクレオチドであり、配列番号2097、2102、2103、2116、2147、2199、および2214～2238のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドは、長さが、30ヌクレオチドであり、配列番号2097、2102、2103、2116、2147、2199、および2214～2238のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4(例として、4、5、6、7または8)つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む。
いくつかの態様において、DMDを標的とするために(例として、エキソンスキッピングのために)有用なオリゴヌクレオチドのいずれか1つは、ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー(PMO)である。)
DMDを標的とするオリゴヌクレオチド(例として、エキソンスキッピングのための)の追加の例は、「ADENO-ASSOCIATED VIRAL VECTOR FOR EXON SKIPPING IN A GENE ENCODING A DISPENSIBLE-DOMAIN PROTEIN」と題する2013年3月21日に公開された米国特許出願刊行物2013-072541；「OLIGONUCLEOTIDE FOR THE TREATMENT OF MUSCULAR DYSTROPHY PATIENTS」と題する2015年7月9日に公開された米国特許出願刊行物2015-191725；2「COMPOSITIONS AND METHODS FOR DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY GENE THERAPY」と題する2015年7月16日に公開された米国特許出願刊行物2015-196670；「GENOME EDITING WITH SPLIT CAS9 EXPRESSED FROM TWO VECTORS」と題する2017年12月7日に公開された米国特許出願刊行物2017-349905；「OLIGOMERS HAVING BICYCLIC SCAFFOLD MOEITIES」と題する2018年2月1日に公開された米国特許出願刊行物2018-028554；「ANTISENSE MOLECULES AND METHODS FOR TREATING PATHOLOGIES」と題する2018年6月21日に公開された米国特許出願刊行物2018-171333；「ANTISENSE NUCLEIC ACIDS」と題する2018年6月28日に公開された米国特許出願刊行物2018-179538；「MODIFICATION OF THE DYSTROPHIN GENE AND USES THEREOF」と題する2018年9月20日に公開された米国特許出願刊行物2018-265859；「NUCLEIC ACID-POLYPEPTIDE COMPOSITIONS AND METHODS OF INDUCING EXON SKIPPING」と題する2018年12月27日に公開された米国特許出願刊行物2018-369400；「NUCLEIC ACID-POLYPEPTIDE COMPOSITIONS AND METHODS OF INDUCING EXON SKIPPING」と題する2019年1月3日に公開された米国特許出願刊行物2019-000986；「OLIGONUCLEOTIDE COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF」と題する2019年1月10日に公開された米国特許出願刊行物2019-00898；「METHODS AND MEANS FOR EFFICIENT SKIPPING OF EXON 45 IN DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY PRE-MRNA」と題する2019年4月18日に公開された米国特許出願刊行物2019-112604；「METHODS AND MEANS FOR EFFICIENT SKIPPING OF EXON 45 IN DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY PRE-MRNA」と題する2019年4月25日に公開された米国特許出願刊行物2019-119679；「OLIGONUCLEOTIDE COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF」と題する2019年5月2日に公開された米国特許出願刊行物2019-127733；「THERAPEUTIC APPLICATIONS OF CPF1-BASED GENOME EDITING」と題する2019年5月23日に公開された米国特許出願刊行物2019-151476；「COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY AND RELATED DISORDERS」と題する2019年6月13日に公開された米国特許出願刊行物2019-177723；「METHODS AND MEANS FOR EFFICIENT SKIPPING OF EXON 45 IN DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY PRE-MRNA」と題する2019年6月13日に公開された米国特許出願刊行物2019-177725；「OLIGONUCLEOTIDES, COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF」と題する2019年7月11日に公開された米国特許出願刊行物2019-209604；「METHODS AND COMPOSITIONS OF BIOLOGICALLY ACTIVE AGENTS」と題する2019年８月15日に公開された米国特許出願刊行物2019-249173；「ANTISENSE MOLECULES AND METHODS FOR TREATING PATHOLOGIES」と題する2019年9月5日に公開された米国特許出願刊行物2019-270994；「MULTIPLE EXON SKIPPING COMPOSITIONS FOR DMD」と題する2019年9月19日に公開された米国特許出願刊行物2019-284556；「ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES FOR INDUCING EXON SKIPPING AND METHODS OF USE THEREOF」と題する2019年10月24日に公開された米国特許出願刊行物2019-323010；「COMPOUNDS AND METHODS FOR USE IN DYSTROPHIN TRANSCRIPT」と題する2019年1月31日に公開された米国特許出願刊行物2019-330626；「OPTIMIZED STRATEGY FOR EXON SKIPPING MODIFICATIONS USING CRISPR/CAS9 WITH TRIPLE GUIDE SEQUENCES」と題する2019年11月7日に公開された米国特許出願刊行物2019-338311；「COMPOSITIONS FOR TREATING MUSCULAR DYSTROPHY」と題する2019年11月28日に公開された米国特許出願刊行物2019-359982；「DMD REPORTER MODELS CONTAINING HUMANIZED DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY MUTATIONS」と題する2019年12月5日に公開された米国特許出願刊行物2019-364862；「OLIGONUCLEOTIDE COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF」と題する2019年12月26日に公開された米国特許出願刊行物2019-390197；「COMPOSITIONS FOR TREATING MUSCULAR DYSTROPHY」と題する2020年2月6日に公開された米国特許出願刊行物2020-040337；「ANTISENSE MOLECULES AND METHODS FOR TREATING PATHOLOGIES」と題する2019年5月14日に登録された米国特許第10,287,586号；「COMPOSITIONS FOR TREATING MUSCULAR DYSTROPHY」と題する2019年7月2日に登録された米国特許第10,337,003号；「COMPOSITIONS FOR TREATING MUSCULAR DYSTROPHY」と題する2019年7月30日に登録された米国特許第10,364,431号；「OLIGONUCLEOTIDE COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF」と題する2019年10月22日に登録された 米国特許第10,450,568号；「ANTISENSE NUCLEIC ACIDS」と題する2019年11月26日に登録された米国特許第10,487,106号；「OLIGONUCLEOTIDE COMPRISING AN INOSINE FOR TREATING DMD」と題する2020年1月14日に登録された米国特許第10,533,171号；「RNA-GUIDED GENE EDITING AND GENE REGULATION」と題する2020年7月7日に登録された米国特許第10,704,060号；「EFFECTIVE GENE THERAPY TOOLS FOR DYSTROPHIN EXON 53 SKIPPING」と題する2020年8月25日に登録された米国特許第10,752,898号；「METHODS AND MEANS FOR EFFICIENT SKIPPING OF AT LEAST ONE OF THE FOLLOWING EXONS OF THE HUMAN DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY GENE: 43, 46, 50-53」と題する2020年12月29日に登録された米国特許第10,876,114号；「TEST STRIP HAVING A DIAGONAL ARRAY OF CAPTURE SPOTS」と題する2000年8月8日に登録された米国特許第6,100,099号；「METHOD OF PERFORMING IMMUNOCHROMATOGRAPHY」と題する2001年4月3日に登録された米国特許第6,210,898号；「INDUCTION OF EXON SKIPPING IN EUKARYOTIC CELLS」と題する2011年7月5日に登録された米国特許第7,973,015号；「BIOINFORMATICALLY DETECTABLE GROUP OF NOVEL REGULATORY GENES AND USES THEREOF」と題する2011年10月18日に登録された米国特許第8,039,608号；「MEANS AND METHOD FOR INDUCING EXON-SKIPPING」と題する2013年1月29日に登録された米国特許第8,361,979号；「MEGANUCLEASE REAGENTS OF USES THEREOF FOR TREATING GENETIC DISEASES CAUSED BY FRAME SHIFT/NON SENSE MUTATIONS」と題する2014年8月12日に登録された米国特許第8,802,437号；「MULTIPLE EXON SKIPPING COMPOSITIONS FOR DMD」と題する2014年10月21日に登録された米国特許第8,865,883号；「ENA NUCLEIC ACID PHARMACEUTICALS CAPABLE OF MODIFYING SPLICING OF MRNA PRECURSORS」と題する2017年5月23日に登録された米国特許第9,657,049号；「ENA NUCLEIC ACID PHARMACEUTICALS CAPABLE OF MODIFYING SPLICING OF MRNA PRECURSORS」と題する2017年5月23日に登録された米国特許第9,657,050号；「ANTISENSE NUCLEIC ACIDS」と題する2018年6月5日に登録された米国特許第9,988,629号；「ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES AND USES THREREOF」と題する2011年6月30日に公開された国際特許公開WO2011/078797 A2；「MODIFIED SNRNAS FOR USE IN THERAPY」と題する2011年12月15日に公開された国際特許公開WO2011/154427 A1；「PRE-MRNA SPLICE SWITCHING OR MODULATING OLIGONUCLEOTIDES COMPRISING BICYCLIC SCAFFOLD MOIETIES, WITH IMPROVED CHARACTERISTICS FOR THE TREATMENT OF GENETIC DISORDERS」と題する2018年1月11日に公開された国際特許公開WO2018/007475 A1；「COMPOUNDS AND METHODS FOR MODULATION OF DYSTROPHIN TRANSCRIPT」と題する2018年1月18日に公開された国際特許公開WO2018/014042 A1；「THERAPEUTIC APPLICATIONS OF CPF1-BASED GENOME EDITING」と題する2018年1月25日に公開された国際特許公開WO2018/017754 A1；「DMD REPORTER MODELS CONTAINING HUMANIZED DUSCHENE MUSCULAR DYSTROPHY MUTATIONS」と題する2018年6月14日に公開された国際特許公開WO2018/107003 A1；「OPTIMIZED STRATEGY FOR EXON SKIPPING MODIFICATIONS USING CRISPR/CAS9 WITH TRIPLE GUIDE SEQUENCES」と題する2018年7月12日に公開された国際特許公開WO2018/129296 A1；「ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES THAT BIND TO EXON 51 OF HUMAN DYSTROPHIN PRE-MRNA」と題する2019年1月24日に公開された国際特許公開WO2019/014772 A1；「EXON SKIPPING OLIGOMER CONJUGATES FOR MUSCULAR DYSTROPHY」と題する2019年3月28日に公開された国際特許公開WO2019/059973 A1；「NUCLEIC ACID-POLYPEPTIDE COMPOSITIONS AND METHODS OF INDUCING EXON SKIPPING」と題する2019年3月28日に公開された国際特許公開WO2019/060775 A1；「COMBINATION THERAPIES FOR TREATING MUSCULAR DYSTROPHY」と題する2019年4月4日に公開された国際特許公開WO2019/067975 A1；「CRISPR/CAS SYSTEMS FOR TREATMENT OF DMD」と題する2019年5月16日に公開された国際特許公開WO2019/092507 A2；「THERAPEUTIC CRISPR/CAS9 COMPOSITIONS AND METHODS OF USE」と題する2019年7月11日に公開された国際特許公開WO2019/136216 A1；「COMPOSITIONS AND METHODS FOR CORRECTING DYSTROPHIN MUTATIONS IN HUMAN CARDIOMYOCYTES」と題する2019年8月8日に公開された国際特許公開WO2019/152609 A1；「OLIGONUCLEOTIDE COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF」と題する2019年10月17日に公開された国際特許公開WO2019/200185 A1；「OLIGONUCLEOTIDES CONJUGATES COMPRISING 7'-5'-ALPHA-ANOMERIC-BICYCLIC SUGAR NUCLEOSIDES」と題する2019年11月14日に公開された国際特許公開WO2019/215333 A1；「EXON SKIPPING OLIGOMERS FOR MUSCULAR DYSTROPY」と題する2019年12月19日に公開された国際特許公開WO 2019/241385 A2；「CORRECTION OF DYSTROPHIN EXON 43, EXON 45, OR EXON 52 DELETIONS IN DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY」と題する2019年12月26日に公開された国際特許公開WO2019/246480 A1；2020年2月6日に公開された「MUSCLE TARGETING COMPLEXES AND USES THEREOF FOR TREATING DYSTROPHINOPATHIES」と題する国際特許公開WO2020/028832 A1；「SUBSTANCES FOR TARGETING VARIOUS SELECTED ORGANS OR TISSUES」と題する2018年5月24日に公開された国際特許公開WO2018/091544 A1；「PREVENTION OF MUSCULAR DYSTROPHY BY CRISPR/CPF1-MEDIATED GENE EDITING」と題する2018年5月31日に公開された国際特許公開WO2018/098480 A1；「METHOD OF MULTIPLEX LIGASE CHAIN REACTION」と題する1993年10月１４日に公開された国際特許公開WO1993/020227 A1；「ANTISENSE NUCLEIC ACID」と題する2013年7月4日に公開された国際特許公開WO2013/100190 A1；「GENETIC CORRECTION OF MUTATED GENES」と題する2013年10月31日に公開された国際特許公開WO2013/163628 A2；「MEANS AND METHOD FOR INDUCING EXON-SKIPPING」と題する2007年11月29日に公開された国際特許公開WO2007/135105 A1；「OLIGONUCLEOTIDE ANALOGUES HAVING MODIFIED INTERSUBUNIT LINKAGES AND/OR TERMINAL GROUPS」と題する2011年12月1日に公開された国際特許公開WO2011/150408 A2；「ANTISENSE NUCLEIC ACID」と題する2012年3月8日に公開された国際特許公開WO2012/029986 A1において提供され；各々の内容は本明細書において、その全体において組み込まれる。
DMD遺伝子編集を促進するためのオリゴヌクレオチドの例は、「METHODS OF MODIFYING THE DYSTROPHIN GENE AND RESTORING DYSTROPHIN EXPRESSION AND USES THEREOF」と題する2018年3月29日に公開された国際特許公開WO2018053632A1;「MODIFICATION OF THE DYSTROPHIN GENE AND USES THEREOF」と題する2017年3月30日に公開された国際特許公開WO2017049407A1;「CRISPR/CAS-RELATED METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY AND BECKER MUSCULAR DYSTROPHY」と題する2016年10月6日に公開された国際特許公開WO2016161380A1;「THERAPEUTIC TARGETS FOR THE CORRECTION OF THE HUMAN DYSTROPHIN GENE BY GENE EDITING AND METHODS OF USE」と題する2017年6月8日に公開された国際特許公開WO2017095967;「MATERIALS AND METHODS FOR TREATMENT OF DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY」と題する2017年5月4日に公開された国際特許公開WO2017072590A1;「PREVENTION OF MUSCULAR DYSTROPHY BY CRISPR/CPF1-MEDIATED GENE EDITING」と題する2018年5月31日に公開された国際特許公開WO2018098480A1;、「RNA-Guided Systems for In Vivo Gene Editing」と題する2017年9月21日に公開された米国特許出願公開US20170266320A1;「PREVENTION OF MUSCULAR DYSTROPHY BY CRISPR/CAS9-MEDIATED GENE EDITING」と題する2016年2月18日に公開された国際特許公開WO2016025469A1;「RNA-GUIDED GENE EDITING AND GENE REGULATION」と題する2016年7月14日に公開された米国特許出願公開2016/0201089;および「MEGANUCLEASE VARIANTS CLEAVING A DNA TARGET SEQUENCE FROM THE DYSTROPHN GENE AND USES THEREOF」と題する2013年6月6日に公開された米国特許出願刊公開2013/0145487を包含し、これら各々の内容全体は本明細書に組み込まれる。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、例として、ヒト、マウスおよび非ヒト種から選択される、複数の種のDMD遺伝子配列と相補性のある領域を有してもよい。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、突然変異体DMDアレル、例えば、フレームシフトおよび不適当なRNAスプライシング/プロセシングに繋がるヒト中DMDのエキソン1～79のいずれかにおける少なくとも1個の突然変異を伴うDMDアレル、と相補性のある領域を有してもよい。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、lncRNAまたはmRNAを、例として分解のために、標的にしてもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、例として分解のために、ミスマッチ修復経路に関与するタンパク質をコードする核酸、例として、MSH2、MutLアルファ、MutSベータ、MutLアルファを標的にしてもよい。ミスマッチ修復経路に関与するタンパク質(かかるタンパク質をコードするmRNAは、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドによって標的にされてもよい)の非限定例は、Iyer,R.R.et al.,「DNA triplet repeat expansion and mismatch repair」Annu Rev Biochem.2015;84:199-226;およびSchmidt M.H.and Pearson C.E.,「Disease-associated repeat instability and mismatch repair」DNA Repair(Amst).2016 Feb;38:117-26に記載されている。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドのいずれか1つは、例として、ナトリウム、カリウム、またはマグネシウム塩としての塩形態であり得る。
いくつかの態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのいずれか1つの5'または3'ヌクレオシド(例として、末端ヌクレオシド)は、任意にスペーサーを介してアミン基に抱合される。いくつかの態様において、スペーサーは脂肪族部分を含む。いくつかの態様において、スペーサーはポリエチレングリコール部分を含む。いくつかの態様においては、ホスホジエステル連結がスペーサーとオリゴヌクレオチドの5'または3'ヌクレオシドとの間に存在する。いくつかの態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのいずれかの5'または3'ヌクレオシド(例として、末端ヌクレオシド)はスペーサーに抱合され、これが置換もしくは非置換の脂肪族、置換もしくは非置換のヘテロ脂肪族、置換もしくは非置換のカルボシクリレン、置換もしくは非置換のヘテロシクリレン、置換もしくは非置換のアリーレン、置換もしくは非置換のヘテロアリーレン、-O-、-N(RA)-、-S-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-C(＝O)NRA-、-NRAC(＝O)-、-NRAC(＝O)RA-、-C(＝O)RA-、-NRAC(＝O)O-、-NRAC(＝O)N(RA)-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-OC(＝O)N(RA)-、-S(O)2NRA-、-NRAS(O)2-、またはそれらの組み合わせであり;各RAは独立して水素または置換もしくは非置換のアルキルである。ある種の態様において、スペーサーは置換もしくは非置換のアルキレン、置換もしくは非置換のヘテロシクリレン、置換もしくは非置換のヘテロアリーレン、-O-、-N(RA)-、または-C(＝O)N(RA)2、あるいはそれらの組み合わせである。
いくつかの態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのいずれか1つの5'または3'ヌクレオシドは、式-NH2-(CH2)n-の化合物に抱合され、nは1～12の整数である。いくつかの態様において、nは6、7、8、9、10、11、または12である。いくつかの態様においては、ホスホジエステル連結が式NH2-(CH2)n-の化合物とオリゴヌクレオチドの5'または3'ヌクレオシドとの間に存在する。いくつかの態様において、式NH2-(CH2)6-の化合物は6-アミノ-1-ヘキサノール(NH2-(CH2)6-OH)とオリゴヌクレオチドの5'リン酸との間の反応によってオリゴヌクレオチドに抱合される。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、標的化薬剤、例えば抗TfR抗体などの筋標的化剤に例えばアミン基を介して抱合される。
a.オリゴヌクレオチドサイズ/配列
オリゴヌクレオチドは、例としてフォーマットに応じて、様々な異なる長さのものであってもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、長さが7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75ヌクレオチドであるか、またはこれより長い。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、長さが8～50ヌクレオチド、長さが8～40ヌクレオチド、長さが8～30ヌクレオチド、長さが10～15ヌクレオチド、長さが10～20ヌクレオチド、長さが15～25ヌクレオチド、長さが21～23ヌクレオチド等々である。
いくつかの態様において、本開示の目的上オリゴヌクレオチドの相補的な核酸配列は、前記配列の標的分子(例として、mRNA)への結合が標的(例として、mRNA)の機能に干渉して活性の変化(例として、翻訳、選択的スプライシング、エキソンスキッピングの阻害)または発現の喪失(例として、標的mRNAの分解)を引き起こしたとき、かつ非特異的結合の回避が所望される条件下、例として、in vivoアッセイまたは治療処置のケースおよびin vitroアッセイのケースにおける生理学的な条件下、アッセイがストリンジェンシー(stringency)の好適な条件下で実施される条件下で、前記配列の非標的配列への非特異的結合を回避するのに充分な程度の相補性があるとき、標的核酸に特異的にハイブリダイズ可能であるか、または標的核酸に特異的である。よって、いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、標的核酸の連続したヌクレオチドに少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または100％相補的であってもよい。いくつかの態様において、相補的なヌクレオチド配列は、標的核酸に特異的にハイブリダイズ可能であるか、または標的核酸に特異的であるその標的の配列に100％相補的である必要はない。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、長さが8～15、8～30、8～40、または10～50、または5～50、または5～40ヌクレオチドの範囲にある標的核酸と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドの、標的核酸と相補性のある領域は、長さが5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50ヌクレオチドである。いくつかの態様において、相補性のある領域は、標的核酸の少なくとも連続した8ヌクレオチドと相補的である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、標的核酸の一部の連続したヌクレオチドと比較して1、2または3塩基ミスマッチを含有していてもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、15塩基にわたり最大3ミスマッチまで、または10塩基にわたり最大2ミスマッチまで有していてもよい。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、本明細書において記載されるオリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されるオリゴヌクレオチド)のいずれか１つの標的配列に(例として、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または100％)相補的である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号437～1241によって提供されるオリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されるオリゴヌクレオチド)のいずれか１つの標的配列に(例として、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または100％)相補的である。いくつかの態様において、かかる標的配列は、表14に列挙されるオリゴヌクレオチドに100％相補的である。いくつかの態様において、かかる標的配列は、配列番号437～1241によって提供されるオリゴヌクレオチドに100％相補的である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、本明細書において提供される標的配列(例として、表14に列挙されるオリゴヌクレオチドのいずれか１つの標的配列)に(例として、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または100％)相補的である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号1242～2046によって提供される標的配列に(例として、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または100％)相補的である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドのいずれか1つ(例えば、表1４に列挙されるオリゴヌクレオチド)におけるチミン塩基(T’s)のいずれか1つ以上は、任意にウラシル塩基(U’s)であってもよく、および／または本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドにおけるU’sのいずれか1つ以上は、任意にT’sであってもよい。いくつかの態様において、配列番号437～1241で提供されるオリゴヌクレオチドのいずれか1つにおける、もしくは配列番号1242～2046のいずれか１つに相補的であるオリゴヌクレオチドにおけるチミン塩基(T’s)のいずれか1つ以上は、任意にウラシル塩基(U’s)であってもよく、および／または本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドにおけるU’sのいずれか1つ以上は、任意にT’sであってもよい。
b.オリゴヌクレオチド修飾:
本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、修飾されていてもよく、例として、修飾された糖部、修飾されたヌクレオシド間連結、修飾ヌクレオチド、および/またはそれらの組み合わせを含む。加えて、いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、以下の特性の1以上を呈してもよい:選択的スプライシングを媒介しない;免疫刺激性ではない;ヌクレアーゼ抵抗性である;非修飾オリゴヌクレオチドと比較して改善された細胞取り込みを有する;細胞または哺乳動物への毒性がない;改善されたエンドソームの内部への出口(exit)を細胞中に有する;TLR刺激を最小限に抑える;または、パターン認識受容体を回避する。本明細書に記載のオリゴヌクレオチドの修飾された化学的性質またはフォーマットのいずれも、互いに組み合わせられ得る。例えば、1、2、3、4、5、またはこれより多くの異なるタイプの修飾が、同じオリゴヌクレオチド内に包含され得る。
いくつかの態様において、修飾が組み込まれるオリゴヌクレオチドを、ネイティブなオリゴデオキシヌクレオチド分子またはオリゴリボヌクレオチド分子よりヌクレアーゼ消化に耐性があるようにさせる、特定のヌクレオチド修飾が使用されてもよい;これらの修飾されたオリゴヌクレオチドは、非修飾オリゴヌクレオチドより長時間無傷で存続する。修飾されたオリゴヌクレオチドの特定例は、修飾された主鎖、例えば、ホスホロチオアート、ホスホトリエステル、メチルホスホナート、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間連結、または短鎖ヘテロ原子のもしくは複素環式の糖間連結などの修飾されたヌクレオシド間連結を含むものを包含する。結果的に、本開示のオリゴヌクレオチドは、修飾、例として、ヌクレオチド修飾の組み込みなどによる核酸分解に対して安定化され得る。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの2～10、2～15、2～16、2～17、2～18、2～19、2～20、2～25、2～30、2～40、2～45ヌクレオチド、またはこれより多いヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである、長さが最大50ヌクレオチドまでまたは最大100ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドであってもよい。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの2～10、2～15、2～16、2～17、2～18、2～19、2～20、2～25、2～30ヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである、長さが8～30ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであってもよい。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの2～4、2～5、2～6、2～7、2～8、2～9、2～10、2～11、2～12、2～13、2～14ヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである、長さが8～15ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであってもよい。任意に、オリゴヌクレオチドは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10ヌクレオチドを除き、どのヌクレオチドも修飾されていてもよい。オリゴヌクレオチド修飾は本明細書にさらに記載されている。
c.修飾ヌクレオシド
いくつかの態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、糖の2'位において修飾された少なくとも1つのヌクレオシドを含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは少なくとも1つの2'修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチド上のヌクレオシドのすべては2'修飾ヌクレオシドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、1以上の非二環式2'-修飾ヌクレオチド、例として、2'-デオキシ、2'-フルオロ(2'-F)、2'-O-メチル(2'-O-Me)、2'-O-メトキシエチル(2'-O-MOE)、2'-O-アミノプロピル(2'-O-AP)、2'-O-ジメチルアミノエチル(2'-O-DMAOE)、2'-O-ジメチルアミノプロピル(2'-O-DMAP)、2'-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2'-O-DMAEOE)、または2'-O--N-メチルアセトアミド(2'-O-NMA)の修飾ヌクレオシドを包含する。
いくつかの態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、1以上の2'-4'二環式ヌクレオシドを含むが、前記ヌクレオシド中リボース環は、その環中2個の原子を接続する(例として、メチレン(LNA)架橋、エチレン(ENA)架橋、または(S)-拘束エチル(cEt)架橋を介して、2'-O原子を4'-C原子へ接続する)架橋部分を含む。LNAの例は、2008年4月17日に公開され「RNA Antagonist Compounds For The Modulation Of PCSK9」と題する国際特許出願公開WO/2008/043753(この内容は、その全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる)に記載されている。ENAの例は、2005年5月12日に公開され「APP/ENA Antisense」と題する国際特許公開番号WO 2005/042777;Morita et al.,Nucleic Acid Res.,Suppl 1:241-242,2001;Surono et al.,Hum.Gene Ther.,15:749-757,2004;Koizumi,Curr.Opin.Mol.Ther.,8:144-149,2006;およびHorie et al.,Nucleic Acids Symp.Ser(Oxf),49:171-172,2005に提供されており、これらの開示はそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。cEtの例は、米国特許7,101,993;7,399,845および7,569,686に提供されており、これら各々はそれら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、以下の米国特許または特許出願公開うち1つに開示された修飾ヌクレオシドを含む:米国特許7,399,845、2008年7月15日発行、表題「6-Modified Bicyclic Nucleic Acid Analogs」;米国特許7,741,457、2010年6月22日発行、表題「6-Modified Bicyclic Nucleic Acid Analogs」;米国特許8,022,193、2011年9月20日発行、表題「6-Modified Bicyclic Nucleic Acid Analogs」;米国特許7,569,686、2009年8月4日発行、表題「Compounds And Methods For Synthesis Of Bicyclic Nucleic Acid Analogs」;米国特許7,335,765、2008年2月26日発行、表題「Novel Nucleoside And Oligonucleotide Analogues」;米国特許7,314,923、2008年1月1日発行、表題「Novel Nucleoside And Oligonucleotide Analogues」;米国特許7,816,333、2010年10月19日発行、表題「Oligonucleotide Analogues And Methods Utilizing The Same」および米国公開第2011/0009471号、現在米国特許8,957,201、2015年2月17日発行、表題「Oligonucleotide Analogues And Methods Utilizing The Same」、すべての用途において(for all purposes)、これら各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも1個の修飾ヌクレオシドも有さないオリゴヌクレオチドと比較して、1℃、2℃、3℃、4℃、または5℃の範囲にあるオリゴヌクレオチドのTmの増大をもたらす少なくとも1個の修飾ヌクレオシドを含む。オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシドを有さないオリゴヌクレオチドと比較して、合計で2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、またはこれを超える温度の範囲にあるオリゴヌクレオチドのTmの増大をもたらす複数の修飾ヌクレオシドを有していてもよい。
オリゴヌクレオチドは、異なる種類のヌクレオシドのミックスを含み得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、2'-デオキシリボヌクレオシドまたはリボヌクレオシドおよび2'-フルオロ修飾ヌクレオシドのミックスを含み得る。オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオシドまたはリボヌクレオシドおよび2'-O-Me修飾ヌクレオシドのミックスを含み得る。オリゴヌクレオチドは、2'-フルオロ修飾ヌクレオシドおよび2'-O-Me修飾ヌクレオシドのミックスを含み得る。オリゴヌクレオチドは、2'-4'二環式ヌクレオシドおよび2'MOE、2'-フルオロ、または2'-O-Me修飾ヌクレオシドのミックスを含み得る。オリゴヌクレオチドは、非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOE、2'-フルオロ、または2'-O-Me)および2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNA、ENA、cEt)のミックスを含み得る。
オリゴヌクレオチドは、異なる種類の交互のヌクレオシドを含み得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、交互の2'-デオキシリボヌクレオシドまたはリボヌクレオシドおよび2'-フルオロ修飾ヌクレオシドを含み得る。オリゴヌクレオチドは、交互のデオキシリボヌクレオシドまたはリボヌクレオシドおよび2'-O-Me修飾ヌクレオシドを含み得る。オリゴヌクレオチドは、交互の2'-フルオロ修飾ヌクレオシドおよび2'-O-Me修飾ヌクレオシドを含み得る。オリゴヌクレオチドは、交互の2'-4'二環式ヌクレオシドおよび2'-MOE、2'-フルオロ、または2'-O-Me修飾ヌクレオシドを含み得る。オリゴヌクレオチドは、交互の非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOE、2'-フルオロ、または2'-O-Me)および2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNA、ENA、cEt)を含み得る。
いくつかの態様においては、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、5'-ビニルホスホン酸修飾、1以上の無塩基残基、および/または1以上の逆向きの無塩基残基を含む。
d.ヌクレオシド間連結/主鎖
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオアートまたは他の修飾ヌクレオシド間連結を含有していてもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結を、少なくとも2個のヌクレオチド間に含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結を、すべてのヌクレオチド間に含む。例えば、いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド間連結を、ヌクレオチド配列の5'または3'末端の、第1の、第2の、および/または(例として、および)、第3のヌクレオシド間連結にて含む。
使用されてもよい、リンを含有する連結は、これらに限定されないが、正常な3'-5'連結、これらの2'-5'連結類似体を有する、ホスホロチオアート、キラルのホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホナート(3'アルキレンホスホナートおよびキラルのホスホナートを含む)、ホスフィナート、ホスホロアミダート(3'-アミノホスホロアミダートおよびアミノアルキルホスホロアミダートを含む)、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびにボラノホスファートと、逆方向の極性を有するこれら(ここでヌクレオシド単位の隣接する対は3'-5'から5'-3'へまたは2'-5'から5'-2'へ連結されている)とを包含する;米国特許第3,687,808号;第4,469,863号;第4,476,301号;第5,023,243号;第5,177,196号;第5,188,897号;第5,264,423号;第5,276,019号;第5,278,302号;第5,286,717号;第5,321,131号;第5,399,676号;第5,405,939号;第5,453,496号;第5,455,233号;第5,466,677号;第5,476,925号;第5,519,126号;第5,536,821号;第5,541,306号;第5,550,111号;第5,563,253号;第5,571,799号;第5,587,361号;および第5,625,050号を見よ。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、メチレン(メチルイミノ)またはMMI主鎖;アミド主鎖(De Mesmaeker et al.Ace.Chem.Res.1995,28:366-374を見よ);モルホリノ主鎖(SummertonおよびWeller、米国特許第5,034,506号を見よ);またはペプチド核酸(PNA)主鎖(ここでオリゴヌクレオチドのホスホジエステル主鎖がポリアミド主鎖に置き換えられており、ヌクレオチドがポリアミド主鎖のアザ窒素原子へ直接的または間接的に結合されている、Nielsen et al.,Science 1991,254,1497を見よ)などのヘテロ原子主鎖を有していてもよい。
e.立体特異的オリゴヌクレオチド
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間のリン原子はキラルであり、およびオリゴヌクレオチドの特性はキラルのリン原子の立体配置に基づき調整される。いくつかの態様において、適切な方法は、立体制御されたやり方(例として、Oka N,Wada T,Stereocontrolled synthesis of oligonucleotide analogs containing chiral internucleotidic phosphorus atoms.Chem Soc Rev.2011 Dec;40(12):5829-43に記載のとおりの)でP-キラルオリゴヌクレオチド類似体を合成するために使用されてもよい。いくつかの態様において、実質的にすべてのSpホスホロチオアート糖間連結または実質的にすべてのRpホスホロチオアート糖間連結のいずれかによって一緒に結び合わされたヌクレオシド単位を含む、ホスホロチオアート含有オリゴヌクレオチドが提供される。いくつかの態様において、実質的にキラル純粋な糖間連結を有するかかるホスホロチオアートオリゴヌクレオチドは、例えば、1996年12月12日に発行された米国特許5,587,261(この内容は全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる)に記載されるとおり、酵素合成または化学合成によって調製される。いくつかの態様において、キラル制御されたオリゴヌクレオチドは、標的核酸の選択的切断パターンを提供する。例えば、いくつかの態様において、キラル制御されたオリゴヌクレオチドは、例えば、2017年2月2日に公開された表題「CHIRAL DESIGN」の米国特許出願公開20170037399 A1(この内容は全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる)に記載のとおり、核酸の相補的な配列内に単一の切断部位を提供する。
f.モルホリノ
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、モルホリノをベースとした化合物であってもよい。モルホリノをベースとしたオリゴマー化合物は、Dwaine A.Braasch and David R.Corey,Biochemistry,2002,41(14),4503-4510);Genesis,volume 30,issue 3,2001;Heasman,J.,Dev.Biol.,2002,243,209-214;Nasevicius et al.,Nat.Genet.,2000,26,216-220;Lacerra et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,2000,97,9591-9596;および1991年7月23日発行の米国特許第5,034,506号に記載されている。いくつかの態様において、モルホリノをベースとしたオリゴマー化合物は、ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー(PMO)である(例として、Iverson,Curr.Opin.Mol.Ther.,3:235-238,2001;およびWang et al.,J.Gene Med.,12:354-364,2010に記載のとおり;これらの開示はこれら全体が参照により本明細書に組み込まれる)。
g.ペプチド核酸(PNA)
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位の糖とヌクレオシド間連結(主鎖)との両方とも、新規な基に置き換えられている。いくつかの態様において、塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持されている。かかるオリゴマー化合物の1つである、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸(PNA)と称される。PNA化合物中のオリゴヌクレオチドの糖-主鎖は、アミド含有主鎖、例えば、アミノエチルグリシン主鎖に置き換えられている。核酸塩基は保持されており、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子へ直接的または間接的に結合されている。PNA化合物の調製を報告する代表的な刊行物は、これらに限定されないが、米国特許第5,539,082号;第5,714,331号;および第5,719,262号(これら各々は参照により本明細書に組み込まれる)を包含する。PNA化合物のさらなる教示は、Nielsen et al.,Science,1991,254,1497-1500から見出され得る。
h.Gapmers
いくつかの態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、gapmerである。gapmerオリゴヌクレオチドは、一般に、ギャップ領域Yの周りのフランキング領域としてXおよびZを有する式5'-X-Y-Z-3'を有する。いくつかの態様において、式5'-X-Y-Z-3'のフランキング領域Xは、X領域、フランキング配列X、5'ウイング領域X、または5'ウイングセグメントとも呼ばれる。いくつかの態様において、式5'-X-Y-Z-3'のフランキング領域ZはZ領域、フランキング配列Z、3'ウイング領域Z、または3'ウイングセグメントとも呼ばれる。いくつかの態様において、式5'-X-Y-Z-3'のギャップ領域Yは、Y領域、Yセグメント、またはギャップセグメントYとも呼ばれる。いくつかの態様において、ギャップ領域Yの各ヌクレオシドは2'-デオキシリボヌクレオシドであり、5'ウイング領域Xまたは3'ウイング領域Zのいずれも2'-デオキシリボヌクレオシドを含有しない。
いくつかの態様において、Y領域は、ヌクレオチドの連続した伸び、例として、6以上のDNAヌクレオチドであり、それらはRNAse HなどのRNAseを動員することができる。いくつかの態様において、gapmerは標的核酸に結合し、この点において、RNAseが動員され、それから標的核酸を切断し得る。いくつかの態様において、Y領域は、高親和性修飾ヌクレオシド、例えば1から6つの高親和性修飾ヌクレオシドを含む領域XおよびZによって5'および3'両方をフランキングされる。高親和性修飾ヌクレオシドの例は、2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOE、2'O-Me、2'-F)または2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNA、cEt、ENA)を包含するが、これらに限定されない。いくつかの態様において、フランキング配列XおよびZは長さが1～20ヌクレオチド、1～8ヌクレオチド、または1～5ヌクレオチドであり得る。フランキング配列XおよびZは類似の長さまたは非類似の長さであり得る。いくつかの態様において、ギャップセグメントYは、長さが5～20ヌクレオチド、5～15、12ヌクレオチド、または6～10ヌクレオチドのヌクレオチド配列であり得る。
いくつかの態様において、gapmerオリゴヌクレオチドのギャップ領域は、DNAヌクレオチドに加えて、効率的なRNase H作用にとって許容されることが知られている修飾ヌクレオチド、例えばC4'置換ヌクレオチド、非環状ヌクレオチド、およびアラビノ型ヌクレオチドを含有し得る。いくつかの態様において、ギャップ領域は1以上の未修飾のヌクレオシド間を含む。いくつかの態様において、一方または両方のフランキング領域は、各々独立して、1以上のホスホロチオアートヌクレオシド間連結(例として、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結または他の連結)を少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、またはより多くのヌクレオチド間に含む。いくつかの態様において、ギャップ領域および2つのフランキング領域は、各々が独立して、修飾されたヌクレオシド間連結(例として、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結または他の連結)を少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、またはより多くのヌクレオチド間に含む。
gapmerは適切な方法を使用して生じ得る。gapmerの調製を教示する代表的な米国特許、米国特許公開、およびPCT公開は、米国特許第5,013,830号;第5,149,797号;第5,220,007号;第5,256,775号;第5,366,878号;第5,403,711号;第5,491,133号;第5,565,350号;第5,623,065号;第5,652,355号;第5,652,356号;第5,700,922号;第5,898,031号;第7,015,315号;第7,101,993号;第7,399,845号;第7,432,250号;第7,569,686号;第7,683,036号;第7,750,131号;第8,580,756号;第9,045,754号;第9,428,534号;第9,695,418号;第10,017,764号;第10,260,069号;第9,428,534号;第8,580,756号;米国特許公開第US20050074801号、第US20090221685号;第US20090286969号、第US20100197762号、および第US20110112170号;PCT公開第WO2004069991号;第WO2005023825号;第WO2008049085号および第WO2009090182号;ならびに欧州特許第EP2,149,605号を包含するが、これらに限定されない。これら各々はその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、gapmerは長さが10～40ヌクレオシドである。例えば、gapmerは長さが10～40、10～35、10～30、10～25、10～20、10～15、15～40、15～35、15～30、15～25、15～20、20～40、20～35、20～30、20～25、25～40、25～35、25～30、30～40、30～35、または35～40ヌクレオシドであり得る。いくつかの態様において、gapmerは長さが10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、または40ヌクレオシドである。
いくつかの態様において、gapmer上のギャップ領域Yは長さが5～20ヌクレオシドである。例えば、ギャップ領域Yは長さが5～20、5～15、5～10、10～20、10～15、または15～20ヌクレオシドであり得る。いくつかの態様において、ギャップ領域Yは長さが5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオシドである。いくつかの態様において、ギャップ領域Yの各ヌクレオシドは2'-デオキシリボヌクレオシドである。いくつかの態様において、ギャップ領域Yのすべてのヌクレオシドが2'デオキシリボヌクレオシドである。いくつかの態様において、ギャップ領域Yのヌクレオシドの1つ以上は修飾ヌクレオシドである(例として、本明細書に記載のものなどの2'修飾ヌクレオシド)。いくつかの態様において、ギャップ領域Yの1以上のシトシンは任意に5-メチルシトシンである。いくつかの態様において、ギャップ領域Yの各シトシンは5-メチルシトシンである。
いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)およびgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)は、独立して1～20ヌクレオシドの長さである。例えば、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)およびgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)は、独立して1～20、1～15、1～10、1～7、1～5、1～3、1～2、2～5、2～7、3～5、3～7、5～20、5～15、5～10、10～20、10～15、または15～20ヌクレオシドの長さであり得る。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)およびgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)は、独立して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオシドの長さである。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)およびgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)は同じ長さである。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)およびgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)は異なる長さである。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)はgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)よりも長い。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)はgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)よりも短い。
いくつかの態様において、gapmerは、5-10-5、4-12-4、3-14-3、2-16-2、1-18-1、3-10-3、2-10-2、1-10-1、2-8-2、4-6-4、3-6-3、2-6-2、4-7-4、3-7-3、2-7-2、4-8-4、3-8-3、2-8-2、1-8-1、2-9-2、1-9-1、2-10-2、1-10-1、1-12-1、1-16-1、2-15-1、1-15-2、1-14-3、3-14-1、2-14-2、1-13-4、4-13-1、2-13-3、3-13-2、1-12-5、5-12-1、2-12-4、4-12-2、3-12-3、1-11-6、6-11-1、2-11-5、5-11-2、3-11-4、4-11-3、1-17-1、2-16-1、1-16-2、1-15-3、3-15-1、2-15-2、1-14-4、4-14-1、2-14-3、3-14-2、1-13-5、5-13-1、2-13-4、4-13-2、3-13-3、1-12-6、6-12-1、2-12-5、5-12-2、3-12-4、4-12-3、1-11-7、7-11-1、2-11-6、6-11-2、3-11-5、5-11-3、4-11-4、1-18-1、1-17-2、2-17-1、1-16-3、1-16-3、2-16-2、1-15-4、4-15-1、2-15-3、3-15-2、1-14-5、5-14-1、2-14-4、4-14-2、3-14-3、1-13-6、6-13-1、2-13-5、5-13-2、3-13-4、4-13-3、1-12-7、7-12-1、2-12-6、6-12-2、3-12-5、5-12-3、1-11-8、8-11-1、2-11-7、7-11-2、3-11-6、6-11-3、4-11-5、5-11-4、1-18-1、1-17-2、2-17-1、1-16-3、3-16-1、2-16-2、1-15-4、4-15-1、2-15-3、3-15-2、1-14-5、2-14-4、4-14-2、3-14-3、1-13-6、6-13-1、2-13-5、5-13-2、3-13-4、4-13-3、1-12-7、7-12-1、2-12-6、6-12-2、3-12-5、5-12-3、1-11-8、8-11-1、2-11-7、7-11-2、3-11-6、6-11-3、4-11-5、5-11-4、1-19-1、1-18-2、2-18-1、1-17-3、3-17-1、2-17-2、1-16-4、4-16-1、2-16-3、3-16-2、1-15-5、2-15-4、4-15-2、3-15-3、1-14-6、6-14-1、2-14-5、5-14-2、3-14-4、4-14-3、1-13-7、7-13-1、2-13-6、6-13-2、3-13-5、5-13-3、4-13-4、1-12-8、8-12-1、2-12-7、7-12-2、3-12-6、6-12-3、4-12-5、5-12-4、2-11-8、8-11-2、3-11-7、7-11-3、4-11-6、6-11-4、5-11-5、1-20-1、1-19-2、2-19-1、1-18-3、3-18-1、2-18-2、1-17-4、4-17-1、2-17-3、3-17-2、1-16-5、2-16-4、4-16-2、3-16-3、1-15-6、6-15-1、2-15-5、5-15-2、3-15-4、4-15-3、1-14-7、7-14-1、2-14-6、6-14-2、3-14-5、5-14-3、4-14-4、1-13-8、8-13-1、2-13-7、7-13-2、3-13-6、6-13-3、4-13-5、5-13-4、2-12-8、8-12-2、3-12-7、7-12-3、4-12-6、6-12-4、5-12-5、3-11-8、8-11-3、4-11-7、7-11-4、5-11-6、6-11-5、1-21-1、1-20-2、2-20-1、1-20-3、3-19-1、2-19-2、1-18-4、4-18-1、2-18-3、3-18-2、1-17-5、2-17-4、4-17-2、3-17-3、1-16-6、6-16-1、2-16-5、5-16-2、3-16-4、4-16-3、1-15-7、7-15-1、2-15-6、6-15-2、3-15-5、5-15-3、4-15-4、1-14-8、8-14-1、2-14-7、7-14-2、3-14-6、6-14-3、4-14-5、5-14-4、2-13-8、8-13-2、3-13-7、7-13-3、4-13-6、6-13-4、5-13-5、1-12-10、10-12-1、2-12-9、9-12-2、3-12-8、8-12-3、4-12-7、7-12-4、5-12-6、6-12-5、4-11-8、8-11-4、5-11-7、7-11-5、6-11-6、1-22-1、1-21-2、2-21-1、1-21-3、3-20-1、2-20-2、1-19-4、4-19-1、2-19-3、3-19-2、1-18-5、2-18-4、4-18-2、3-18-3、1-17-6、6-17-1、2-17-5、5-17-2、3-17-4、4-17-3、1-16-7、7-16-1、2-16-6、6-16-2、3-16-5、5-16-3、4-16-4、1-15-8、8-15-1、2-15-7、7-15-2、3-15-6、6-15-3、4-15-5、5-15-4、2-14-8、8-14-2、3-14-7、7-14-3、4-14-6、6-14-4、5-14-5、3-13-8、8-13-3、4-13-7、7-13-4、5-13-6、6-13-5、4-12-8、8-12-4、5-12-7、7-12-5、6-12-6、5-11-8、8-11-5、6-11-7、または7-11-6の5'-X-Y-Z-3'を含む。数は、5'-X-Y-Z-3'gapmerのX、Y、およびZ領域のヌクレオシド数を指し示す。
いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)またはgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)の1以上のヌクレオシドは、修飾ヌクレオチドである(例として、高親和性修飾ヌクレオシド)。いくつかの態様において、修飾ヌクレオシド(例として、高親和性修飾ヌクレオシド)は2'修飾ヌクレオシドである。いくつかの態様において、2'修飾ヌクレオシドは2'-4'二環式ヌクレオシドまたは非二環式2'修飾ヌクレオシドである。いくつかの態様において、高親和性修飾ヌクレオシドは、2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNA、cEt、またはENA)または非二環式2'-修飾ヌクレオシド(例として、2'-フルオロ(2'-F)、2'-O-メチル(2'-O-Me)、2'-O-メトキシエチル(2'-MOE)、2'-O-アミノプロピル(2'-O-AP)、2'-O-ジメチルアミノエチル(2'-O-DMAOE)、2'-O-ジメチルアミノプロピル(2'-O-DMAP)、2'-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2'-O-DMAEOE)、または2'-O-N-メチルアセトアミド(2'-O-NMA))である。
いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)の1以上のヌクレオシドは高親和性修飾ヌクレオシドである。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)の各ヌクレオシドは高親和性修飾ヌクレオシドである。いくつかの態様において、gapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)の1以上のヌクレオシドは高親和性修飾ヌクレオシドである。いくつかの態様において、gapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)の各ヌクレオシドは高親和性修飾ヌクレオシドである。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)の1以上のヌクレオシドは高親和性修飾ヌクレオシドであり、gapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)の1以上のヌクレオシドは高親和性修飾ヌクレオシドである。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)の各ヌクレオシドは高親和性修飾ヌクレオシドであり、gapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)の各ヌクレオシドは高親和性修飾ヌクレオシドである。
いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)は、gapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)と同じ高親和性ヌクレオシドを含む。例えば、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)およびgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)は、1以上の非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)を含み得る。別の例では、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)およびgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)は、1以上の2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)を含み得る。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)およびgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)の各ヌクレオシドは、非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)である。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)およびgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)の各ヌクレオシドは、2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)である。
いくつかの態様において、gapmerは5'-X-Y-Z-3'構成を含み、XおよびZは独立して長さが1～7(例として、1、2、3、4、5、6、または7)ヌクレオシドであり、Yは長さが6～10(例として、6、7、8、9、または10)ヌクレオシドであり、XおよびZの各ヌクレオシドは非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)であり、Yの各ヌクレオシドは2'デオキシリボヌクレオシドである。いくつかの態様において、gapmerは5'-X-Y-Z-3'構成を含み、XおよびZは独立して長さが1～7(例として、1、2、3、4、5、6、または7)ヌクレオシドであり、Yは長さが6～10(例として、6、7、8、9、または10)ヌクレオシドであり、XおよびZの各ヌクレオシドは2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)であり、Yの各ヌクレオシドは2'デオキシリボヌクレオシドである。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)は、gapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)とは異なる高親和性ヌクレオシドを含む。例えば、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)は、1以上の非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)を含み得、gapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)は、1以上の2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)を含み得る。別の例では、gapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)は、1以上の非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)を含み得、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)は、1以上の2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)を含み得る。
いくつかの態様において、gapmerは5'-X-Y-Z-3'構成を含み、XおよびZは独立して長さが1～7(例として、1、2、3、4、5、6、または7)ヌクレオシドであり、Yは長さが6～10(例として、6、7、8、9、または10)ヌクレオシドであり、Xの各ヌクレオシドは非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)であり、Zの各ヌクレオシドは2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)であり、Yの各ヌクレオシドは2'-デオキシリボヌクレオシドである。いくつかの態様において、gapmerは5'-X-Y-Z-3'構成を含み、XおよびZは独立して長さが1～7(例として、1、2、3、4、5、6、または7)ヌクレオシドであり、Yは長さが6～10(例として、6、7、8、9、または10)ヌクレオシドであり、Xの各ヌクレオシドは2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)であり、Zの各ヌクレオシドは非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'MOEまたは2'-O-Me)であり、Yの各ヌクレオシドは2'-デオキシリボヌクレオシドである。
いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)は、1以上の非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)および1以上の2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)を含む。いくつかの態様において、gapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)は、1以上の非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)および1以上の2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)を含む。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)およびgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)両方は、1以上の非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)および1以上の2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)を含む。
いくつかの態様において、gapmerは5'-X-Y-Z-3'構成を含み、XおよびZは独立して長さが2～7(例として、2、3、4、5、6、または7)ヌクレオシドであり、Yは長さが6～10(例として、6、7、8、9、または10)ヌクレオシドであり、X(最も5'の位置は位置1である)の位置1、2、3、4、5、6、または7のすべてではないが少なくとも1つ(例として、1、2、3、4、5、または6)は非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)であり、XおよびZ両方のヌクレオシドの残りは2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)であり、Yの各ヌクレオシドは2'デオキシリボヌクレオシドである。いくつかの態様において、gapmerは5'-X-Y-Z-3'構成を含み、XおよびZは独立して長さが2～7(例として、2、3、4、5、6、または7)ヌクレオシドであり、Yは長さが6～10(例として、6、7、8、9、または10)ヌクレオシドであり、Z(最も5'の位置は位置1である)の位置1、2、3、4、5、6、または7のすべてではないが少なくとも1つ(例として、1、2、3、4、5、または6)は、非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)であり、XおよびZ両方のヌクレオシドの残りは2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)であり、Yの各ヌクレオシドは2'デオキシリボヌクレオシドである。いくつかの態様において、gapmerは5'-X-Y-Z-3'構成を含み、XおよびZは独立して長さが2～7(例として、2、3、4、5、6、または7)ヌクレオシドであり、Yは長さが6～10(例として、6、7、8、9、または10)ヌクレオシドであり、Xの位置1、2、3、4、5、6、または7のすべてではないが少なくとも1つ(例として、1、2、3、4、5、または6)およびZ(最も5'の位置は位置1である)のすべてではないが位置(例として、1、2、3、4、5、または6)1、2、3、4、5、6、または7の少なくとも1つが、非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)であり、XおよびZ両方のヌクレオシドの残りは2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)であり、Yの各ヌクレオシドは2'デオキシリボヌクレオシドである。
非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)および2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)のミックスをgapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)および/またはgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)に有するgapmer構成の非限定例は、以下:BBB-(D)n-BBBAA;KKK-(D)n-KKKAA;LLL-(D)n-LLLAA;BBB-(D)n-BBBEE;KKK-(D)n-KKKEE;LLL-(D)n-LLLEE;BBB-(D)n-BBBAA;KKK-(D)n-KKKAA;LLL-(D)n-LLLAA;BBB-(D)n-BBBEE;KKK-(D)n-KKKEE;LLL-(D)n-LLLEE;BBB-(D)n-BBBAAA;KKK-(D)n-KKKAAA;LLL-(D)n-LLLAAA;BBB-(D)n-BBBEEE;KKK-(D)n-KKKEEE;LLL-(D)n-LLLEEE;BBB-(D)n-BBBAAA;KKK-(D)n-KKKAAA;LLL-(D)n-LLLAAA;BBB-(D)n-BBBEEE;KKK-(D)n-KKKEEE;LLL-(D)n-LLLEEE;BABA-(D)n-ABAB;KAKA-(D)n-AKAK;LALA-(D)n-ALAL;BEBE-(D)n-EBEB;KEKE-(D)n-EKEK;LELE-(D)n-ELEL;BABA-(D)n-ABAB;KAKA-(D)n-AKAK;LALA-(D)n-ALAL;BEBE-(D)n-EBEB;KEKE-(D)n-EKEK;LELE-(D)n-ELEL;ABAB-(D)n-ABAB;AKAK-(D)n-AKAK;ALAL-(D)n-ALAL;EBEB-(D)n-EBEB;EKEK-(D)n-EKEK;ELEL-(D)n-ELEL;ABAB-(D)n-ABAB;AKAK-(D)n-AKAK;ALAL-(D)n-ALAL;EBEB-(D)n-EBEB;EKEK-(D)n-EKEK;ELEL-(D)n-ELEL;AABB-(D)n-BBAA;BBAA-(D)n-AABB;AAKK-(D)n-KKAA;AALL-(D)n-LLAA;EEBB-(D)n-BBEE;EEKK-(D)n-KKEE;EELL-(D)n-LLEE;AABB-(D)n-BBAA;AAKK-(D)n-KKAA;AALL-(D)n-LLAA;EEBB-(D)n-BBEE;EEKK-(D)n-KKEE;EELL-(D)n-LLEE;BBB-(D)n-BBA;KKK-(D)n-KKA;LLL-(D)n-LLA;BBB-(D)n-BBE;KKK-(D)n-KKE;LLL-(D)n-LLE;BBB-(D)n-BBA;KKK-(D)n-KKA;LLL-(D)n-LLA;BBB-(D)n-BBE;KKK-(D)n-KKE;LLL-(D)n-LLE;BBB-(D)n-BBA;KKK-(D)n-KKA;LLL-(D)n-LLA;BBB-(D)n-BBE;KKK-(D)n-KKE;LLL-(D)n-LLE;ABBB-(D)n-BBBA;AKKK-(D)n-KKKA;ALLL-(D)n-LLLA;EBBB-(D)n-BBBE;EKKK-(D)n-KKKE;ELLL-(D)n-LLLE;ABBB-(D)n-BBBA;AKKK-(D)n-KKKA;ALLL-(D)n-LLLA;EBBB-(D)n-BBBE;EKKK-(D)n-KKKE;ELLL-(D)n-LLLE;ABBB-(D)n-BBBAA;AKKK-(D)n-KKKAA;ALLL-(D)n-LLLAA;EBBB-(D)n-BBBEE;EKKK-(D)n-KKKEE;ELLL-(D)n-LLLEE;ABBB-(D)n-BBBAA;AKKK-(D)n-KKKAA;ALLL-(D)n-LLLAA;EBBB-(D)n-BBBEE;EKKK-(D)n-KKKEE;ELLL-(D)n-LLLEE;AABBB-(D)n-BBB;AAKKK-(D)n-KKK;AALLL-(D)n-LLL;EEBBB-(D)n-BBB;EEKKK-(D)n-KKK;EELLL-(D)n-LLL;AABBB-(D)n-BBB;AAKKK-(D)n-KKK;AALLL-(D)n-LLL;EEBBB-(D)n-BBB;EEKKK-(D)n-KKK;EELLL-(D)n-LLL;AABBB-(D)n-BBBA;AAKKK-(D)n-KKKA;AALLL-(D)n-LLLA;EEBBB-(D)n-BBBE;EEKKK-(D)n-KKKE;EELLL-(D)n-LLLE;AABBB-(D)n-BBBA;AAKKK-(D)n-KKKA;AALLL-(D)n-LLLA;EEBBB-(D)n-BBBE;EEKKK-(D)n-KKKE;EELLL-(D)n-LLLE;ABBAABB-(D)n-BB;AKKAAKK-(D)n-KK;ALLAALLL-(D)n-LL;EBBEEBB-(D)n-BB;EKKEEKK-(D)n-KK;ELLEELL-(D)n-LL;ABBAABB-(D)n-BB;AKKAAKK-(D)n-KK;ALLAALL-(D)n-LL;EBBEEBB-(D)n-BB;EKKEEKK-(D)n-KK;ELLEELL-(D)n-LL;ABBABB-(D)n-BBB;AKKAKK-(D)n-KKK;ALLALLL-(D)n-LLL;EBBEBB-(D)n-BBB;EKKEKK-(D)n-KKK;ELLELL-(D)n-LLL;ABBABB-(D)n-BBB;AKKAKK-(D)n-KKK;ALLALL-(D)n-LLL;EBBEBB-(D)n-BBB;EKKEKK-(D)n-KKK;ELLELL-(D)n-LLL;EEEK-(D)n-EEEEEEEE;EEK-(D)n-EEEEEEEEE;EK-(D)n-EEEEEEEEEE;EK-(D)n-EEEKK;K-(D)n-EEEKEKE;K-(D)n-EEEKEKEE;K-(D)n-EEKEK;EK-(D)n-EEEEKEKE;EK-(D)n-EEEKEK;EEK-(D)n-KEEKE;EK-(D)n-EEKEK;EK-(D)n-KEEK;EEK-(D)n-EEEKEK;EK-(D)n-KEEEKEE;EK-(D)n-EEKEKE;EK-(D)n-EEEKEKE;およびEK-(D)n-EEEEKEKを包含する;「A」ヌクレオシドは2'修飾ヌクレオシドを含み;「B」は2'-4'二環式ヌクレオシドを表し;「K」は拘束エチルヌクレオシド(cEt)を表し;「L」はLNAヌクレオシドを表し;「E」は2'-MOE修飾リボヌクレオシドを表し;「D」は2'デオキシリボヌクレオシドを表し;「n」はギャップセグメント(5'-X-Y-Z-3'構成のY)の長さを表し、1～20の間の整数である。
いくつかの態様において、本明細書に記載のgapmerのいずれか1つは、1以上の修飾されたヌクレオシド連結(例として、ホスホロチオアート連結)をX、Y、およびZ領域の各々に含む。いくつかの態様において、本明細書に記載のgapmerのいずれか1つにおける各ヌクレオシド間連結はホスホロチオアート連結である。いくつかの態様において、X、Y、およびZ領域の各々は、独立して、ホスホロチオアート連結およびホスホジエステル連結のミックスを含む。いくつかの態様において、ギャップ領域Yの各ヌクレオシド間連結はホスホロチオアート連結であり、5'ウイング領域Xはホスホロチオアート連結およびホスホジエステル連結のミックスを含み、3'ウイング領域Zはホスホロチオアート連結およびホスホジエステル連結のミックスを含む。
i.Mixmers
いくつかの態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、mixmerであってもよく、またはmixmer配列パターンを含んでいてもよい。一般に、mixmerは、天然に存在するヌクレオシドと天然に存在しないヌクレオシドとの両方を含むオリゴヌクレオチドであるか、または2つの異なるタイプの天然に存在しないヌクレオシドを、典型的には互い違いなパターンで含むオリゴヌクレオチドである。Mixmerは一般に、非修飾オリゴヌクレオチドより高い結合親和性を有し、標的分子に特異的に結合する、例として、標的分子上の結合部位を遮断するために使用されてもよい。一般に、mixmerは、RNaseを標的分子へ動員させず、よって標的分子の切断を促進しない。RNase Hを動員することが可能ではない、かかるオリゴヌクレオチドは記載されており、例えば、WO2007/112754またはWO2007/112753を見よ。
いくつかの態様において、mixmerは、ヌクレオシド類似体と天然に存在するヌクレオシドとの反復パターン、もしくは1タイプのヌクレオシド類似体ともう1タイプのヌクレオシド類似体との反復パターンを含むか、またはこれらからなる。しかしながら、mixmerは、反復パターンを含む必要がなく、その代わりに、修飾ヌクレオシドと天然に存在するヌクレオシドとのいずれの配置も、または1タイプの修飾ヌクレオシドともう1タイプの修飾ヌクレオシドとのいずれの配置も含むことができる。反復パターンは、実例として、2ヌクレオシド毎または3ヌクレオシド毎に、LNAなどの修飾ヌクレオシドであってもよく、残りのヌクレオシドは、DNAなどの天然に存在するヌクレオシドであるか、あるいは2'MOEもしくは2'フルオロ類似体などの2'置換ヌクレオシド類似体、または本明細書に記載のいずれの他の修飾ヌクレオシドである。LNA単位などの修飾ヌクレオシドの反復パターンが、固定された位置にて-例として5'末端または3'末端にて、修飾ヌクレオシドと組み合わされてもよいことは認識されている。
いくつかの態様において、mixmerは、5個より多く、4個より多く、3個より多く、または2個より多く連続した、DNAヌクレオシドなどの天然に存在するヌクレオシドの領域を含まない。いくつかの態様において、mixmerは、少なくとも2個連続したLNAなどの、少なくとも2個連続した修飾ヌクレオシドからなる領域を少なくとも含む。いくつかの態様において、mixmerは、少なくとも3個連続したLNAなどの、少なくとも3個連続した修飾ヌクレオシドからなる領域を少なくとも含む。
いくつかの態様において、mixmerは、7個より多く、6個より多く、5個より多く、4個より多く、3個より多く、または2個より多く連続した、LNAなどのヌクレオシド類似体の領域を含まない。いくつかの態様において、LNA単位は、本明細書に言及されたヌクレオシド類似体などの他のヌクレオシド類似体に置き換えられていてもよい。
Mixmerは、非限定例におけるLNAヌクレオシドおよび2'-O-Me ヌクレオシドなどの親和性増強修飾ヌクレオシドの混合物を含むよう設計されていてもよい。いくつかの態様において、mixmerは、修飾ヌクレオシド間連結(例として、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結または他の連結)を、少なくとも2個の、少なくとも3個の、少なくとも4個の、少なくとも5個の、またはこれより多くのヌクレオシド間に含む。
mixmerは、いずれの好適な方法を使用しても産生されてよい。mixmerの調製を教示する代表的な米国特許、米国特許公開、およびPCT公開は、米国特許公開第US20060128646号、US20090209748号、US20090298916号、US20110077288号、およびUS20120322851号、および米国特許第7687617号を包含する。
いくつかの態様において、mixmerは、1以上のモルホリノヌクレオシドを含む。例えば、いくつかの態様において、mixmerは、1以上の他のヌクレオシド(例として、DNA、RNAヌクレオシド)または修飾ヌクレオシド(例として、LNA、2'-O-Me ヌクレオシド)と(例として、互い違いなやり方で)混合されたモルホリノヌクレオシドを含んでいてもよい。
いくつかの態様において、mixmerは、例えば、Touznik A.,et al.,LNA/DNA mixmer-based antisense oligonucleotides correct alternative splicing of the SMN2 gene and restore SMN protein expression in type 1 SMA fibroblasts Scientific Reports,volume 7,Article number:3672(2017),Chen S.et al.,Synthesis of a Morpholino Nucleic Acid(MNA)-Uridine Phosphoramidite,and Exon Skipping Using MNA/2'-O-Methyl Mixmer Antisense Oligonucleotide,Molecules 2016,21,1582(これら各々の内容は参照により本明細書に組み込まれる)に報告されるとおり、スプライス修正(splice correcting)またはエキソンスキッピングに有用である。
j.RNA干渉(RNAi)
いくつかの態様において、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドは、低分子干渉RNAまたはサイレンシングRNAとしても知られている、低分子干渉RNA(siRNA)の形態であってもよい。siRNAは、二本鎖RNA分子の類であって、細胞中のRNA干渉(RNAi)経路を介した分解のために核酸(例として、mRNA)を標的にする、典型的には長さが約20～25塩基対である。siRNA分子の特異性は、アンチセンス鎖分子のその標的RNAへの結合によって決定されてもよい。有効なsiRNA分子は一般に、より長いsiRNAもまた有効であり得るが、細胞中の非特異的なRNA干渉経路の引き金を、インターフェロン応答を介して引くことを防止するため、長さが30～35個未満の塩基対である。いくつかの態様において、siRNA分子は長さが7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50塩基対、またはより多くである。いくつかの態様において、siRNA分子は長さが8～30塩基対、長さが10～15塩基対、長さが10～20塩基対、長さが15～25塩基対、長さが19～21塩基対、長さが21～23塩基対である。
適切な標的RNA配列の選択を受けて、すべてのまたは一部の標的配列に相補的なヌクレオチド配列、すなわちアンチセンス配列を含むsiRNA分子は、適切な方法(例として、PCT公開番号WO2004/016735;および米国特許公開第2004/0077574号および第2008/0081791号を見よ)を使用して設計および調製され得る。siRNA分子は、二本鎖(すなわち、アンチセンス鎖と、ハイブリダイズしてdsRNAを形成する相補的センス鎖とを含むdsRNA分子)または一本鎖(すなわち、アンチセンス鎖だけを含むssRNA分子)であり得る。siRNA分子は、自己相補的センスおよびアンチセンス鎖を有する、二重鎖、非対称二重鎖、ヘアピン、または非対称ヘアピン2次構造を含み得る。
いくつかの態様において、siRNA分子のアンチセンス鎖は長さが7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50ヌクレオチド、またはより多くである。いくつかの態様において、アンチセンス鎖は長さが8～50ヌクレオチド、長さが8～40ヌクレオチド、長さが8～30ヌクレオチド、長さが10～15ヌクレオチド、長さが10～20ヌクレオチド、長さが15～25ヌクレオチド、長さが19～21ヌクレオチド、長さが21～23ヌクレオチドである。
いくつかの態様において、siRNA分子のセンス鎖は長さが7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50ヌクレオチド、またはより多くである。いくつかの態様において、センス鎖は長さが8～50ヌクレオチド、長さが8～40ヌクレオチド、長さが8～30ヌクレオチド、長さが10～15ヌクレオチド、長さが10～20ヌクレオチド、長さが15～25ヌクレオチド、長さが19～21ヌクレオチド、長さが21～23ヌクレオチドである。
いくつかの態様において、siRNA分子は、標的mRNA上の標的領域に対する相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの態様において、相補性の領域は、標的mRNA上の標的領域に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または100％相補的である。いくつかの態様において、標的領域は、標的mRNA上の一続きのヌクレオチドの領域である。いくつかの態様において、標的RNA配列について特異的にハイブリダイゼーション可能または特異的であるためには、相補的なヌクレオチド配列は、その標的のものに対して100％相補的である必要はない。
いくつかの態様において、siRNA分子は標的RNA配列に対する相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含み、相補性の領域は長さが8～15、8～30、8～40、または10～50、または5～50、または5～40ヌクレオチドの範囲である。いくつかの態様において、相補性の領域は長さが5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50ヌクレオチドである。いくつかの態様において、相補性の領域は、標的RNA配列の少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、またはより多くの一続きのヌクレオチドと相補的である。いくつかの態様において、siRNA分子は、標的RNA配列の一続きのヌクレオチドの部分と比較して1、2、3、4、またはわずか5塩基ミスマッチを含有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、siRNA分子は、15塩基につき最大3つまでのミスマッチ、または10塩基につき最大2つまでのミスマッチを有するヌクレオチド配列を含む。
いくつかの態様において、siRNA分子は、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドの標的RNA配列に対して相補的である(例として、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または100％)ヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの態様において、siRNA分子は、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドと少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または100％同一であるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの態様において、siRNA分子は、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドの少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、またはより多くの一続きのヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含む。
二本鎖siRNAは、同じ長さまたは異なる長さのセンスRNA鎖およびアンチセンスRNA鎖を含んでいてもよい。二本鎖siRNA分子はまた、ステムループ構造の単一オリゴヌクレオチド(ここでsiRNA分子の自己相補的センスおよびアンチセンス領域は、核酸ベースのまたは非核酸ベースのリンカー(単数または複数)を用いて連結されている)、ならびに2以上のループ構造と自己相補的センスおよびアンチセンス鎖を含むステムとを有する環状一本鎖RNA(ここで環状RNAは、in vivoまたはin vitroのいずれかで処理されてRNAiを媒介することが可能な活性siRNA分子を生成し得る)からも会合され得る。よって小さいヘアピンRNA(shRNA)分子もまた、本明細書に企図される。これらの分子は、逆相補的(センス)配列に加えて、特定のアンチセンス配列を含み、典型的にはスペーサーまたはループ配列によって分離されている。スペーサーまたはループの切断は、(任意に、片鎖または両鎖の3'末端および/または(例として、および)5'末端から1、2、3個以上のヌクレオチドの付加または除去をもたらすこともある追加のプロセシングステップにより)一本鎖RNA分子およびその逆相補体を、それらがアニールしてdsRNA分子を形成し得るように提供する。スペーサーは、スペーサーの切断(および任意に、これに続く、片鎖または両鎖の3'末端および/または(例として、および)5'末端から1、2、3、4、もしくはこれより多いヌクレオチドの付加または除去をもたらすこともあるプロセシングステップ)に先立ちアンチセンス配列とセンス配列とをアニールさせて二本鎖構造体(またはステム)を形成させるのに充分な長さであり得る。スペーサー配列は、2つの相補的ヌクレオチド配列領域間に置かれた無関係なヌクレオチド配列であってもよく、前記領域はアニールして二本鎖核酸になったらshRNAを含むことになる。
siRNA分子の全体的な長さは、設計されたsiRNA分子のタイプに応じて、約14ヌクレオチドから約100ヌクレオチドまで変動し得る。一般に、これらのヌクレオチドの約14個と約50個との間は、RNA標的配列に相補的である、すなわちsiRNA分子の特定のアンチセンス配列を構成する。例えば、siRNAが二本鎖siRNAまたは一本鎖siRNAであるとき、長さは約14ヌクレオチドから約50ヌクレオチドまで変動し得るが一方、siRNAがshRNAまたは環状分子であるとき、長さは約40ヌクレオチドから約100ヌクレオチドまで変動し得る。
siRNA分子は、分子の一方の末端にて3'突出を含んでいてもよく、他方の末端は平滑末端であっても、または突出(5'または3')も有していてよい。siRNA分子が分子の両末端にて突出を含むとき、突出の長さは、同じであっても、または異なっていてもよい。一態様において、本開示のsiRNA分子は、分子の両末端上に約1～約3ヌクレオチドの3'突出を含む。いくつかの態様において、siRNA分子は約1～約3ヌクレオチドの3'突出をセンス鎖に含む。いくつかの態様において、siRNA分子は約1～約3ヌクレオチドの3'突出をアンチセンス鎖に含む。いくつかの態様において、siRNA分子は約1～約3ヌクレオチドの3'突出をセンス鎖およびアンチセンス鎖両方に含む。
いくつかの態様において、siRNA分子は1以上の修飾ヌクレオチド(例として、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはより多く)を含む。いくつかの態様において、siRNA分子は1以上の修飾ヌクレオチドおよび/または(例として、および)1以上の修飾されたヌクレオチド間連結を含む。いくつかの態様において、修飾ヌクレオチドは、修飾された糖部分(例として、2'修飾ヌクレオチド)である。いくつかの態様において、siRNA分子は、1以上の2'修飾ヌクレオチド、例えば2'-デオキシ、2'-フルオロ(2'-F)、2'-O-メチル(2'-O-Me)、2'-O-メトキシエチル(2'-MOE)、2'-O-アミノプロピル(2'-O-AP)、2'-O-ジメチルアミノエチル(2'-O-DMAOE)、2'-O-ジメチルアミノプロピル(2'-O-DMAP)、2'-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2'-O-DMAEOE)、または2'-O-N-メチルアセトアミド(2'-O--NMA)を含む。いくつかの態様において、siRNA分子の各ヌクレオチドは修飾ヌクレオチド(例として、2'修飾ヌクレオチド)である。いくつかの態様において、siRNA分子は1以上のホスホロジアミダートモルフォリノを含む。いくつかの態様において、siRNA分子の各ヌクレオチドはホスホロジアミダートモルフォリノである。
いくつかの態様において、siRNA分子はホスホロチオアートまたは他の修飾されたヌクレオチド間連結を含有する。いくつかの態様において、siRNA分子はホスホロチオアートヌクレオシド間連結を含む。いくつかの態様において、siRNA分子はホスホロチオアートヌクレオシド間連結を少なくとも2つのヌクレオチド間に含む。いくつかの態様において、siRNA分子はホスホロチオアートヌクレオシド間連結をすべてのヌクレオチド間に含む。例えば、いくつかの態様において、siRNA分子は、修飾されたヌクレオチド間連結をsiRNA分子の5'または3'端の第1の、第2の、および/または(例として、および)第3のヌクレオシド間連結に含む。
いくつかの態様において、修飾されたヌクレオチド間連結はリン含有連結である。いくつかの態様において、使用され得るリン含有連結は、正常な3'-5'連結を有するホスホロチオアート、キラルホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、3'アルキレンホスホナートおよびキラルホスホナートを含むメチルおよび他のアルキルホスホナート、ホスフィナート、3'-アミノホスホロアミダートおよびアミノアルキルホスホロアミダートを含むホスホロアミダート、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびボラノホスファート、これらの2'-5'連結アナログ、ならびにヌクレオシド単位の隣接するペアが3'-5'対5'-3'または2'-5'対5'-2'で連結される逆向きの極性を有するものを包含するが、これらに限定されない;米国特許第3.687.808号;第4.469.863号;第4,476,301号;第5,023.243号;第5,177,196号;第5,188,897号;第5,264,423号;第5,276,019号;第5,278,302号;第5,286,717号;第5,321,131号;第5,399,676号;第5,405,939号;第5,453,496号;第5,455,233号;第5,466,677号;第5,476,925号;第5,519,126号;第5,536,821号;第5,541,306号;第5,550,111号;第5,563,253号;第5,571,799号;第5,587,361号;および第5,625,050号を見よ。
本明細書に記載のsiRNA分子の修飾されたケミストリーまたはフォーマットのいずれかは、互いと組み合わせられ得る。例えば、1、2、3、4、5、またはより多くの異なる型の修飾が同じsiRNA分子上に包含され得る。
いくつかの態様において、アンチセンス鎖は1以上の修飾ヌクレオチド(例として、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはより多く)を含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖は1以上の修飾ヌクレオチドおよび/または(例として、および)1以上の修飾されたヌクレオチド間連結を含む。いくつかの態様において、修飾ヌクレオチドは修飾された糖部分(例として、2'修飾ヌクレオチド)を含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、1以上の2'修飾ヌクレオチド、例えば2'-デオキシ、2'-フルオロ(2'-F)、2'-O-メチル(2'-O-Me)、2'-O-メトキシエチル(2'-MOE)、2'-O-アミノプロピル(2'-O-AP)、2'-O-ジメチルアミノエチル(2'-O-DMAOE)、2'-O-ジメチルアミノプロピル(2'-O-DMAP)、2'-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2'-O-DMAEOE)、または2'-O-N-メチルアセトアミド(2'-O--NMA)を含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖の各ヌクレオチドは修飾ヌクレオチド(例として、2'修飾ヌクレオチド)である。いくつかの態様において、アンチセンス鎖は1以上のホスホロジアミダートモルフォリノを含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖はホスホロジアミダートモルフォリノオリゴマー(PMO)である。
いくつかの態様において、アンチセンス鎖はホスホロチオアートまたは他の修飾されたヌクレオチド間連結を含有する。いくつかの態様において、アンチセンス鎖はホスホロチオアートヌクレオシド間連結を含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖はホスホロチオアートヌクレオシド間連結を少なくとも2つのヌクレオチド間に含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖はホスホロチオアートヌクレオシド間連結をすべてのヌクレオチド間に含む。例えば、いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、修飾されたヌクレオチド間連結をsiRNA分子の5'または3'端の第1の、第2の、および/または(例として、および)第3のヌクレオシド間連結に含む。いくつかの態様において、修飾されたヌクレオチド間連結はリン含有連結である。いくつかの態様において、使用され得るリン含有連結は、正常な3'-5'連結を有するホスホロチオアート、キラルホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、3'アルキレンホスホナートおよびキラルホスホナートを含むメチルおよび他のアルキルホスホナート、ホスフィナート、3'-アミノホスホロアミダートおよびアミノアルキルホスホロアミダートを含むホスホロアミダート、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびボラノホスファート、これらの2'-5'連結アナログ、ならびにヌクレオシド単位の隣接するペアが3'-5'対5'-3'または2'-5'対5'-2'で連結される逆向きの極性を有するものを包含するが、これらに限定されない;米国特許第3.687.808号;第4.469.863号;第4,476,301号;第5,023.243号;第5,177,196号;第5,188,897号;第5,264,423号;第5,276,019号;第5,278,302号;第5,286,717号;第5,321,131号;第5,399,676号;第5,405,939号;第5,453,496号;第5,455,233号;第5,466,677号;第5,476,925号;第5,519,126号;第5,536,821号;第5,541,306号;第5,550,111号;第5,563,253号;第5,571,799号;第5,587,361号;および第5,625,050号を見よ。
本明細書に記載のアンチセンス鎖の修飾されたケミストリーまたはフォーマットのいずれかは、互いと組み合わせられ得る。例えば、1、2、3、4、5、またはより多くの異なる型の修飾が同じアンチセンス鎖上に包含され得る。
いくつかの態様において、センス鎖は1以上の修飾ヌクレオチド(例として、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはより多く)を含む。いくつかの態様において、センス鎖は1以上の修飾ヌクレオチドおよび/または(例として、および)1以上の修飾されたヌクレオチド間連結を含む。いくつかの態様において、修飾ヌクレオチドは、修飾された糖部分(例として、2'修飾ヌクレオチド)である。いくつかの態様において、センス鎖は、1以上の2'修飾ヌクレオチド、例えば2'-デオキシ、2'-フルオロ(2'-F)、2'-O-メチル(2'-O-Me)、2'O-メトキシエチル(2'-MOE)、2'-O-アミノプロピル(2'-O-AP)、2'-O-ジメチルアミノエチル(2'-O-DMAOE)、2'-O-ジメチルアミノプロピル(2'-O-DMAP)、2'-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2'-O-DMAEOE)、または2'-O-N-メチルアセトアミド(2'-O--NMA)を含む。いくつかの態様において、センス鎖の各ヌクレオチドは修飾ヌクレオチド(例として、2'修飾ヌクレオチド)である。いくつかの態様において、センス鎖は1以上のホスホロジアミダートモルフォリノを含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖はホスホロジアミダートモルフォリノオリゴマー(PMO)である。いくつかの態様において、センス鎖はホスホロチオアートまたは他の修飾されたヌクレオチド間連結を含有する。いくつかの態様において、センス鎖はホスホロチオアートヌクレオシド間連結を含む。いくつかの態様において、センス鎖はホスホロチオアートヌクレオシド間連結を少なくとも2つのヌクレオチド間に含む。いくつかの態様において、センス鎖はホスホロチオアートヌクレオシド間連結をすべてのヌクレオチド間に含む。例えば、いくつかの態様において、センス鎖は、修飾されたヌクレオチド間連結をセンス鎖の5'または3'端の第1の、第2の、および/または(例として、および)第3のヌクレオシド間連結に含む。
いくつかの態様において、修飾されたヌクレオチド間連結はリン含有連結である。いくつかの態様において、使用され得るリン含有連結は、正常な3'-5'連結を有するホスホロチオアート、キラルホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、3'アルキレンホスホナートおよびキラルホスホナートを含むメチルおよび他のアルキルホスホナート、ホスフィナート、3'-アミノホスホロアミダートおよびアミノアルキルホスホロアミダートを含むホスホロアミダート、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびボラノホスファート、これらの2'-5'連結アナログ、ならびにヌクレオシド単位の隣接するペアが3'-5'対5'-3'または2'-5'対5'-2'で連結される逆向きの極性を有するものを包含するが、これらに限定されない;米国特許第3.687.808号;第4.469.863号;第4,476,301号;第5,023.243号;第5,177,196号;第5,188,897号;第5,264,423号;第5,276,019号;第5,278,302号;第5,286,717号;第5,321,131号;第5,399,676号;第5,405,939号;第5,453,496号;第5,455,233号;第5,466,677号;第5,476,925号;第5,519,126号;第5,536,821号;第5,541,306号;第5,550,111号;第5,563,253号;第5,571,799号;第5,587,361号;および第5,625,050号を見よ。
本明細書に記載のセンス鎖の修飾されたケミストリーまたはフォーマットのいずれかは、互いと組み合わせられ得る。例えば、1、2、3、4、5、またはより多くの異なる型の修飾が同じセンス鎖上に包含され得る。
いくつかの態様において、siRNA分子のアンチセンスまたはセンス鎖は、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)ローディングを増強または低減する修飾を含む。いくつかの態様において、siRNA分子のアンチセンス鎖はRISCローディングを増強する修飾を含む。いくつかの態様において、siRNA分子のセンス鎖は、RISCローディングを低減およびオフターゲット効果を低減する修飾を含む。いくつかの態様において、siRNA分子のアンチセンス鎖は2'-O-メトキシエチル(2'-MOE)修飾を含む。その全体が参照によって本明細書に組み込まれるSong et al.,(2017)Mol Ther Nucleic Acids 9:242-250に記載されているとおり、切断部位における2'-O-メトキシエチル(2'-MOE)基の追加は、修飾鎖の指向的なRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)ローディングを容易化することによって、siRNAの特異性およびサイレンシング活性両方を改善する。いくつかの態様において、siRNA分子のアンチセンス鎖は2'-OMe-ホスホロジチオアート修飾を含み、これは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるWu et al.(2014)Nat Commun 5:3459に記載されているとおり、RISCローディングを増大させる。
いくつかの態様において、siRNA分子のセンス鎖は5'モルホリノを含み、これは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるKumar et al.,(2019)Chem Commun(Camb)55(35):5139-5142に記載されているとおり、センス鎖のRISCローディングを低減ならびにアンチセンス鎖選択およびRNAi活性を改善する。いくつかの態様において、siRNA分子のセンス鎖は、合成RNA様高親和性ヌクレオチドアナログのロックド核酸(LNA)によって修飾される。これは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるElman et al.,(2005)Nucleic Acids Res.33(1):439-447に記載されているとおり、センス鎖のRISCローディングを低減し、RISCへのアンチセンス鎖組み込みをさらに増強する。いくつかの態様において、siRNA分子のセンス鎖は5'アンロックド核酸(UNA)修飾を含み、これは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるSnead et al.,(2013)Mol Ther Nucleic Acids 2(7):e103に記載されているとおり、センス鎖のRISCローディングを低減し、アンチセンス鎖のサイレンシング力価(potentcy)を改善する。いくつかの態様において、siRNA分子のセンス鎖は5-ニトロインドール修飾を含み、これは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるZhang et al.,(2012)Chembiochem 13(13):1940-1945に記載されているとおり、センス鎖のRNAi力価を減少させ(descresed)、オフターゲット効果を低減する。いくつかの態様において、センス鎖は2'-O'メチル(2'-O-Me)修飾を含み、これは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるZheng et al.,FASEB(2013)27(10):4017-4026に記載されているとおり、センス鎖のRISCローディングおよびオフターゲット効果を低減する。いくつかの態様において、siRNA分子のセンス鎖はモルホリノ、2'-MOE、または2'-O-Me残基によって完全に置換され、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるKole et al.,(2012)Nature reviews.Drug Discovery 11(2):125-140に記載されているとおり、RISCによって認識されない。いくつかの態様において、siRNA分子のアンチセンス鎖は2'-MOE修飾を含み、センス鎖は2'-O-Me修飾を含む(例として、Song et al.,(2017)Mol Ther Nucleic Acids 9:242-250を見よ)。いくつかの態様において、少なくとも1つの(例として、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも10)siRNA分子が、筋標的化剤に(例として、共有結合的に)連結される。いくつかの態様において、筋標的化剤は、核酸(例として、DNAまたはRNA)、ペプチド(例として、抗体)、脂質(例として、マイクロベシクル)、または糖部分(例として、多糖)を含み得るか、またはそれからなり得る。いくつかの態様において、筋標的化剤は抗体である。いくつかの態様において、筋標的化剤は抗トランスフェリン受容体抗体である(例として、本明細書に提供される抗TfR抗体のいずれか1つ)。いくつかの態様において、筋標的化剤はsiRNA分子のセンス鎖の5'末端に連結され得る。いくつかの態様において、筋標的化剤はsiRNA分子のセンス鎖の3'末端に連結され得る。いくつかの態様において、筋標的化剤はsiRNA分子のセンス鎖に内部で連結され得る。いくつかの態様において、筋標的化剤はsiRNA分子のアンチセンス鎖の5'末端に連結され得る。いくつかの態様において、筋標的化剤はsiRNA分子のアンチセンス鎖の3'末端に連結され得る。いくつかの態様において、筋標的化剤はsiRNA分子のアンチセンス鎖に内部で連結され得る。
k.マイクロRNA(miRNAs)
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、マイクロRNA(miRNA)であってもよい。マイクロRNA(「miRNA」と称される)は、標的RNA転写産物上の相補的な部位へ結合することによって遺伝子発現を制御する調節性分子の類に属する、小さい非コーディングRNAである。典型的には、miRNAは、巨大なRNA前駆体(pri-miRNAと呼ばれる)から生成されるが、前記前駆体は核中で処理されておよそ70ヌクレオチドpre-miRNAになり、これが折り畳まれて不完全なステムループ構造体になる。これらのpre-miRNAは、典型的には、細胞質内で追加のプロセシングステップを経るが、前記細胞質内の長さが18～25ヌクレオチドの成熟miRNAは、RNase III酵素であるDicerによってpre-miRNAヘアピンの片側から切除される。
本明細書に使用されるとき、miRNAは、pri-miRNA、pre-miRNA、成熟miRNA、または成熟miRNAの生物活性を保持するそのバリアントのフラグメントを包含する。一態様において、miRNAのサイズ範囲は、21ヌクレオチドから170ヌクレオチドまでであり得る。一態様において、miRNAのサイズ範囲は、長さが70ヌクレオチドから170ヌクレオチドまでである。別の態様において、長さが21ヌクレオチドから25ヌクレオチドまでの成熟miRNAが使用され得る。
l.アプタマー
いくつかの態様において、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドは、アプタマーの形態であってもよい。一般に、分子ペイロードの文脈において、アプタマーは、細胞中の小分子、タンパク質、核酸などの標的へ特異的に結合するいずれの核酸でもある。いくつかの態様において、アプタマーは、DNAアプタマーまたはRNAアプタマーである。いくつかの態様において、核酸アプタマーは、一本鎖のDNAまたはRNA(ssDNAまたはssRNA)である。一本鎖核酸アプタマーが、ヘリックスおよび/または(例として、および)ループ構造を形成してもよいことは理解されるべきである。核酸アプタマーを形成する核酸は、天然に存在するヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、炭化水素リンカー(例として、アルキレン)もしくはポリエーテルリンカー(例として、PEGリンカー)が1以上のヌクレオチド間に挿入された天然に存在するヌクレオチド、炭化水素もしくはPEGリンカーが1以上のヌクレオチド間に挿入された修飾ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含んでいてもよい。アプタマーおよびアプタマーを産生する方法を記載する例示の刊行物および特許は、例として、Lorsch and Szostak,1996;Jayasena,1999;米国特許第5,270,163号;第5,567,588号;第5,650,275号;第5,670,637号;第5,683,867号;第5,696,249号;第5,789,157号;第5,843,653号;第5,864,026号;第5,989,823号;第6,569,630号;第8,318,438号およびPCT出願WO 99/31275を包含するが、これら各々は参照により本明細書に組み込まれる。
m.リボザイム
いくつかの態様において、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドは、リボザイムの形態であってもよい。リボザイム(リボ核酸酵素)は、タンパク質酵素の作用と同様の特定の生化学的反応を実施することが可能な分子、典型的にはRNA分子である。リボザイムは、これらがハイブリダイズしているRNA分子(mRNA、RNA含有基質、lncRNA、およびリボザイム自体など)中の特定のホスホジエステル連結での切断能を包含する酵素活性をもつ分子である。
リボザイムは、数種の物理的構造の1つを取り得、これらの1つが「ハンマーヘッド」と呼ばれる。ハンマーヘッド型リボザイムは、保存された9塩基を含有する触媒コア、二本鎖ステムおよびループ構造(ステムループII)、ならびに触媒コアを囲む標的RNAフランキング領域に相補的な2つの領域から構成される。フランキング領域によって、リボザイムは、二本鎖ステムIおよびIIIを形成することによって標的RNAへ特異的に結合することができる。切断は、3',5'-リン酸ジエステルから2',3'-環状リン酸ジエステルへのエステル交換反応による特定のリボヌクレオチド三塩基(triplet)の次に、cis(すなわち、ハンマーヘッドモチーフを含有する同じRNA分子の切断)で、またはtrans(リボザイムを含有するもの以外のRNA基質の切断)で生じる。理論によって拘束されることは望まないが、この触媒活性は、リボザイムの触媒領域中に高度に保存された特定の配列が存在することを要すると考えられている。
リボザイム構造中の修飾はまた、様々な分子の非コア部分の、非ヌクレオチド分子との置換または置き換えも包含する。例えば、Benseler et al.(J.Am.Chem.Soc.(1993)115:8483-8484)は、ハンマーヘッド様分子を開示しており、ここでステムIIの2塩基対およびループIIの4ヌクレオチドすべてが、ヘキサエチレングリコール、プロパンジオール、ビス(トリエチレングリコール)ホスファート、トリス(プロパンジオール)ビスホスファート、またはビス(プロパンジオール)ホスファートを基にする非ヌクレオシドリンカーに置き換えられていた。Ma et al.(Biochem.(1993)32:1751-1758;Nucleic Acids Res.(1993)21:2585-2589)は、TARリボザイムヘアピンの6ヌクレオチドループを、エチレングリコールに関する非ヌクレオチドリンカーに置き換えた。Thomson et al.(Nucleic Acids Res.(1993)21:5600-5603)は、ループIIを、長さが13、17、および19原子の線状の非ヌクレオチドリンカーに置き換えた。
リボザイムオリゴヌクレオチドは、周知の方法(例として、PCT公開WO9118624;WO9413688;WO9201806;およびWO92/07065;ならびに米国特許5436143および5650502を見よ)を使用して調製され得るか、または商業的供給源(例として、US Biochemicals)から購入され得、所望の場合、細胞中ヌクレアーゼによる分解に対するオリゴヌクレオチドの耐性を増大させるためにヌクレオチド類似体を組み込み得る。リボザイムは、例として、市販の合成機(例として、Applied Biosystems,Inc.またはMilligenによって製造された)の使用による、任意の知られているやり方で合成されてもよい。リボザイムはまた、従来の手段によって、組換えベクターにおいても産生されてよい。Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(Current edition)を見よ。リボザイムRNA配列は、例えば、T7またはSP6などのRNAポリメラーゼを使用することによる従来法で、合成されてもよい。
n.ガイド核酸
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ガイド核酸、例として、ガイドRNA(gRNA)分子である。一般に、ガイドRNAは、(1)Cas9などの、核酸をプログラムできるDNA結合タンパク質(napDNAbp)へ結合する骨格(scaffold)配列、および(2)gRNAが、核酸をプログラムできるDNA結合タンパク質をDNA標的配列に近づけるために結合するDNA標的配列(例として、ゲノムDNA標的)を定義するヌクレオチドスペーサー部分から構成される低分子合成RNAである。いくつかの態様において、napDNAbpは、核酸をプログラムできるタンパク質に、標的DNA配列(例として、標的ゲノムDNA配列)を標的にさせる1以上のRNA(単数または複数)と(例として、これと結合して、またはこれと結び付いて)複合体を形成する、核酸をプログラムできるタンパク質である。いくつかの態様において、核酸プログラム可能なヌクレアーゼは、RNAとの複合体にあるとき、ヌクレアーゼ:RNA複合体と称されることもある。ガイドRNAは、2以上のRNAの複合体として、または単一のRNA分子として存在し得る。
単一のRNA分子として存在するガイドRNA(gRNA)は、単一のガイドRNA(sgRNA)と称されることもあるが、gRNAはまた、単一分子または2以上の分子の複合体のいずれかとして存在するガイドRNAを指すためにも使用される。典型的には、単一のRNA種として存在するgRNAは、2つのドメインを含む:(1)標的核酸(すなわち、Cas9複合体の標的への結合に向かわせる)との相同性を共有するドメイン;および(2)Cas9タンパク質に結合するドメイン。いくつかの態様において、ドメイン(2)は、tracrRNAとして知られている配列に対応し、ステムループ構造を含む。いくつかの態様において、ドメイン(2)は、Jinek et al.,Science 337:816-821(2012)(この内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる)に提供されるとおり、tracrRNAと同一または相同である。
いくつかの態様において、gRNAは、ドメイン(1)および(2)の2以上を含み、伸長(extended)gRNAと称されることもある。例えば、伸長gRNAは、本明細書に記載のとおり、2以上のCas9タンパク質に結合し、および2以上の別個の領域での標的核酸に結合するであろう。gRNAは、ヌクレアーゼ/RNA複合体の該標的部位への結合を媒介する標的部位に相補的なヌクレオチド配列を含み、ヌクレアーゼ:RNA複合体の配列特異性を提供する。いくつかの態様において、RNAプログラム可能ヌクレアーゼは、(CRISPR関連系)Cas9エンドヌクレアーゼ、例えば、化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)由来のCas9(Csn1)である(例として、「Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes」Ferretti,J.J.,McShan W.M.,Ajdic D.J.,Savic D.J.,Savic G.,Lyon K.,Primeaux C.,Sezate S.,Suvorov A.N.,Kenton S.,Lai H.S.,Lin S.P.,Qian Y.,Jia H.G.,Najar F.Z.,Ren Q.,Zhu H.,Song L.,White J.,Yuan X.,Clifton S.W.,Roe B.A.,McLaughlin R.E.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:4658-4663(2001);「CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III」Deltcheva E.,Chylinski K.,Sharma C.M.,Gonzales K.,Chao Y.,Pirzada Z.A.,Eckert M.R.,Vogel J.,Charpentier E.,Nature 471:602-607(2011);および「A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity」Jinek M.,Chylinski K.,Fonfara I.,Hauer M.,Doudna J.A.,Charpentier E.Science 337:816-821(2012)を見よ。これらの各々の内容全体は、参照によって本明細書に組み込まれる。
o.マルチマー
いくつかの態様において、分子ペイロードは、リンカーによって接続された2以上のオリゴヌクレオチドのマルチマー(例として、コンカテマー)を含んでいてもよい。このように、いくつかの態様において、複合体/抱合体のオリゴヌクレオチドの負荷(loading)は、標的化剤上の利用可能な連結部位(例として、抗体上の利用可能なチオール部位)を超えて増大され得るか、または具体的なペイロード負荷量に達するよう別様に整え得る。マルチマー中のオリゴヌクレオチドは、同じかまたは異なり得る(例として、異なる遺伝子、もしくは同じ遺伝子上の異なる部位、またはそれらの産物を標的にする)。
いくつかの態様において、マルチマーは、切断可能なリンカーによって一緒に連結された2以上のオリゴヌクレオチドを含む。しかしながら、いくつかの態様において、マルチマーは、切断不能なリンカーによって一緒に連結された2以上のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、マルチマーは、一緒に連結された2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはこれより多くのオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、マルチマーは、一緒に連結された2～5、2～10、または4～20オリゴヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、マルチマーは、(線状配置において)末端間(end-to-end)で連結された2以上のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、マルチマーは、オリゴヌクレオチドベースのリンカー(例として、ポリ-dTリンカー、塩基性リンカー)を介して、末端間で連結された2以上のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、マルチマーは、別のオリゴヌクレオチドの3'末端に連結された1つのオリゴヌクレオチドの5'末端を含む。いくつかの態様において、マルチマーは、別のオリゴヌクレオチドの3'末端に連結された1つのオリゴヌクレオチドの3'末端を含む。いくつかの態様において、マルチマーは、別のオリゴヌクレオチドの5'末端に連結された1つのオリゴヌクレオチドの5'末端を含む。またさらに、いくつかの態様において、マルチマーは、分枝リンカーによって一緒に連結された複数のオリゴヌクレオチドを含む分枝構造を含み得る。
本明細書に提供される複合体に使用されてもよいマルチマーのさらなる例は、例えば、2015年11月5日に公開され、Methods of delivering multiple targeting oligonucleotides to a cell using cleavable linkersと題する米国特許出願第2015/0315588 A1号;2015年9月3日に公開され、Multimeric Oligonucleotide Compoundsと題する米国特許出願第2015/0247141 A1号;2011年6月30日に公開され、Immunostimulatory Oligonucleotide Multimersと題する米国特許出願第US 2011/0158937 A1号;および1997年12月2日に発行され、Triplex-Forming Antisense Oligonucleotides Having Abasic Linkers Targeting Nucleic Acids Comprising Mixed Sequences Of Purines And Pyrimidinesと題する米国特許第5,693,773号に開示されており、これら各々の内容はそれら全体が参照されることにより本明細書に組み込まれる。
ii.小分子:
いずれの好適な小分子も、本明細書に記載のとおり、分子ペイロードとして使用されてもよい。いくつかの態様において、小分子は、DMD突然変異体配列のエキソンスキッピングを増強する。いくつかの態様において、小分子は、「IDENTIFICATION OF SMALL MOLECULES THAT FACILITATE THERAPEUTIC EXON SKIPPING」と題する2014年3月20日に公開された米国特許出願公開US20140080896A1に記載されたとおりである。小分子ペイロードのさらなる例は、「Identification of structurally similar small molecules that enhance therapeutic exon skipping」と題する2018年5月29日に登録された米国特許第9,982,260号に提供されている。例えば、いくつかの態様において、小分子は、ペルフェナジン、フルペンチキソール、ズクロペンチキソールまたはコリナンテイン(corynanthine)などのエキソンスキッピングのエンハンサーである。いくつかの態様において、エキソンスキッピングの小分子エンハンサーは、リアノジン受容体またはカルモジュリンを阻害する。いくつかの態様において、小分子は、マニュマイシンAなどのH-Ras経路インヒビターである。いくつかの態様において、小分子は、終止コドンのサプレッサーであり、リボソームを未熟終止コドンに脱感作させる。いくつかの態様において、小分子は、2013年6月25日に公開されたMcElroy S.P.et al.「A Lack of Premature Termination Codon Read Through Efficacy of PTC124(Ataluren)in a Diverse Array of Reporter Assays.」PLOS Biologyに記載されたとおり、アタルレンである。いくつかの態様において、小分子は、例として、Manzur,A.Y.et al.「Glucocorticoid corticosteroids for Duchenne muscular dystrophy」Cochrane Database Syst Rev.2004;(2):CD003725に記載されたとおり、コルチコステロイドである。いくつかの態様において、小分子は、ユートロフィンなどのジストロフィンの機能を置き換え得る遺伝子の発現および/または(例として、および)活性を上方調節する。いくつかの態様において、ユートロフィンモジュレーターは、「TREATMENT OF DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY」と題する2007年8月16日に公開された国際公開番号WO2007091106、および/または(例として、および)、「COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY」と題する2017年10月5日に公開された国際公開番号WO/2017/168151に記載されたとおりである。
iii.ペプチド/タンパク質
いずれの好適なペプチドまたはタンパク質も、本明細書に記載のとおりの分子ペイロードとして使用されてもよい。いくつかの態様において、タンパク質は、酵素である。いくつかの態様において、ペプチドまたはタンパク質は、数種の方法論、例として、ファージディスプレードペプチドライブラリ、1ビーズ・1化合物ペプチドライブラリ、または位置走査性合成ペプチドコンビナトリアルライブラリを使用して産生、合成、および/または(例として、および)、誘導体化されてもよい。例示の方法論は、当該技術分野において特徴付けられてきており、参照により組み込まれる(Gray,B.P.and Brown,K.C.「Combinatorial Peptide Libraries:Mining for Cell-Binding Peptides」Chem Rev.2014,114:2,1020-1081.;Samoylova,T.I.and Smith,B.F.「Elucidation of muscle-binding peptides by phage display screening」Muscle Nerve,1999,22:4.460-6.)。
いくつかの態様において、ペプチドは、突然変異体DMDアレルから発現されるmRNAにおけるエキソンスキッピングを容易にさせてもよい。いくつかの態様において、ペプチドは、機能的ジストロフィンの発現、および/または(例として、および)、ジストロフィンの代わりに機能することができるタンパク質の発現を促進してもよい。いくつかの態様において、ペイロードは、ジストロフィンの機能的フラグメント、例として、機能的ジストロフィンタンパク質のアミノ酸セグメントであるタンパク質である。
いくつかの態様において、ペプチドまたはタンパク質は、少なくとも1つのジンクフィンガーを含む。
いくつかの態様において、ペプチドまたはタンパク質は、約2～25アミノ酸、約2～20アミノ酸、約2～15アミノ酸、約2～10アミノ酸、または約2～5アミノ酸を含んでいてもよい。ペプチドまたはタンパク質は、天然に存在するアミノ酸、例として、システイン、アラニン、または非天然に存在しないか、もしくは修飾されたアミノ酸を含んでいてもよい。天然に存在しないアミノ酸は、β-アミノ酸、ホモ-アミノ酸、プロリン誘導体、3-置換アラニン誘導体、線形コアアミノ酸、N-メチルアミノ酸、および当該技術分野において知られているその他のアミノ酸を包含する。いくつかの態様において、ペプチドは、線状であってもよい;他の態様において、ペプチドは、環状、例として二環式であってもよい。
iv.核酸コントラクト
いずれの好適な遺伝子発現コンストラクトも、本明細書に記載のとおりの分子ペイロードとして使用されてもよい。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、ベクターまたはcDNAフラグメントであってもよい。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、メッセンジャーRNA(mRNA)であってもよい。いくつかの態様において、本明細書に使用されるmRNAは、修飾されたmRNA、例として、2014年4月24日に発行の米国特許8,710,200、表題「Engineered nucleic acids encoding a modified erythropoietin and their expression」に記載されるとおりのものであってもよい。いくつかの態様において、mRNAは、5'メチルcapを含んでいてもよい。いくつかの態様において、mRNAは、ポリAテール、任意に長さが最大160ヌクレオチドまでのものを含んでいてもよい。遺伝子発現コンストラクトは、ジストロフィンタンパク質、ジストロフィンフラグメント、ミニ-ジストロフィン、ユートロフィンタンパク質、またはジストロフィンと共通の機能を共有するいずれのタンパク質の配列をコードしてもよい。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、筋細胞の核内で発現、例として、過剰発現、されてもよい。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、少なくとも1のジンクフィンガーを含むタンパク質をコードする。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、ジストロフィン、またはジストロフィンと機能を共有するタンパク質、例として、ユートロフィン、の発現を促進するタンパク質をコードする。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、遺伝子編集酵素をコードする。いくつかの態様において、遺伝子発現コントラクトは、米国特許出願公開US20170368198A1、2017年12月28日出願、題名「Optimized mini-dystrophin genes and expression cassettes and their use」;Duan D.「Myodys,a full-length dystrophin plasmid vector for Duchenne and Becker muscular dystrophy gene therapy.」Curr Opin Mol Ther 2008;10:86-94;およびTang,Y.et al.,「AAV-directed muscular dystrophy gene therapy」Expert Opin Biol Ther.2010 Mar;10(3):395-408に開示された発現カセットに記載されたとおりであり、それら各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
C.リンカー
本明細書に記載の複合体は一般に、本明細書に記載の抗TfR抗体のいずれか1つを分子ペイロードへ接続するリンカーを含む。リンカーは、少なくとも1つの共有結合を含む。いくつかの態様において、リンカーは、抗TfR抗体を分子ペイロードへ接続する単結合、例として、ジスルフィド結合またはジスルフィド架橋であってもよい。しかしながら、いくつかの態様において、リンカーは、複数の共有結合を通して、本明細書に記載の抗TfR抗体のいずれか1つを分子ペイロードへ接続してもよい。いくつかの態様において、リンカーは、切断可能なリンカーであってもよい。しかしながら、いくつかの態様において、リンカーは、切断不能なリンカーであってもよい。リンカーは一般に、in vitroおよびin vivoで安定しており、ある細胞環境において安定していてもよい。加えて、一般にリンカーは、抗TfR抗体または分子ペイロードのいずれかの機能特性に負の影響を及ぼさない。リンカーの合成の例および方法は、当技術分野で公知である(例として、Kline,T.et al.「Methods to Make Homogenous Antibody Drug Conjugates」Pharmaceutical Research,2015,32:11,3480-3493.;Jain,N.et al.「Current ADC Linker Chemistry」Pharm Res.2015,32:11,3526-3540.;McCombs,J.R.and Owen,S.C.「Antibody Drug Conjugates:Design and Selection of Linker,Payload and Conjugation Chemistry」AAPS J.2015,17:2,339-351を見よ)。
リンカーの前駆体は、典型的には、抗TfR抗体と分子ペイロードとの両方へ付着できる2つの異なる反応性の高い種を含有しているであろう。いくつかの態様において、2つの異なる反応性の高い種は、求核試薬および/または(例として、および)求電子試薬であってもよい。いくつかの態様において、リンカーは、抗TfR抗体のリジン残基またはシステイン残基への抱合を介して、抗TfR抗体へ接続されている。いくつかの態様において、リンカーは、マレイミド含有リンカーを介して抗TfR抗体のシステイン残基へ接続されており、ここで任意に、マレイミド含有リンカーは、マレイミドカプロイルまたはマレイミドメチルシクロヘキサン-1-カルボキシラート基を含む。いくつかの態様において、リンカーは、3-アリールプロピオニトリル官能基を介して、抗TfR抗体のシステイン残基またはチオール官能化分子ペイロードへ接続されている。いくつかの態様において、リンカーは、抗TfR抗体のリシン残基へ接続されている。いくつかの態様において、リンカーは、アミド結合、カルバマート結合、ヒドラジド、トリアゾール、チオエーテル、またはジスルフィド結合を介して、抗TfR抗体および/または(例として、および)分子ペイロードへ接続されている。
i.切断可能なリンカー
切断可能なリンカーは、プロテアーゼ感受性リンカー、pH感受性リンカー、またはグルタチオン感受性リンカーであってもよい。これらのリンカーは一般に、細胞内のみで切断可能であって、好ましくは、細胞外環境において、例として、筋細胞の細胞外において安定している。
プロテアーゼ感受性リンカーは、プロテアーゼ酵素活性によって切断可能である。これらのリンカーは、典型的にはペプチド配列を含んでおり、長さが2～10アミノ酸、約2～5アミノ酸、約5～10アミノ酸、約10アミノ酸、約5アミノ酸、約3アミノ酸、または約2アミノ酸であってもよい。いくつかの態様において、ペプチド配列は、天然に存在するアミノ酸、例として、システイン、アラニン、または天然に存在しないかもしくは修飾されたアミノ酸を含んでいてもよい。天然に存在しないアミノ酸は、β-アミノ酸、ホモ-アミノ酸、プロリン誘導体、3-置換アラニン誘導体、線形コアアミノ酸、N-メチルアミノ酸、および当該技術分野において知られているその他のアミノ酸を包含する。いくつかの態様において、プロテアーゼ感受性リンカーは、バリン-シトルリンまたはアラニン-シトルリンのジペプチド配列を含む。いくつかの態様において、プロテアーゼ感受性リンカーは、リソソームのプロテアーゼ、例として、カテプシンB、および/またはエンドソームのプロテアーゼによって切断され得る。
pH感受性リンカーは、高または低pH環境において容易に分解される共有結合の連結である。いくつかの態様において、pH感受性リンカーは、4～6の範囲にあるpHにて切断されてもよい。いくつかの態様において、pH感受性リンカーは、ヒドラゾンまたは環状アセタールを含む。いくつかの態様において、pH感受性リンカーは、エンドソームまたはリソソーム内で切断される。
いくつかの態様において、グルタチオン感受性リンカーは、ジスルフィド部を含む。いくつかの態様において、グルタチオン感受性リンカーは、細胞内部でのグルタチオン種とのジスルフィド交換反応によって切断される。いくつかの態様において、ジスルフィド部はさらに、少なくとも1アミノ酸、例としてシステイン残基を含む。
いくつかの態様において、リンカーは、Val-citリンカー(例として、米国特許6,214,345(参照により本明細書に組み込まれる)に記載されるとおり)である。いくつかの態様において、抱合前に、val-citリンカーは以下の構造を有する。
Figure 2023535073000035
いくつかの態様において、抱合後、val-citリンカーは以下の構造を有する。
Figure 2023535073000036
いくつかの態様において、Val-citリンカーは、反応性の高い化学的部分(例として、クリックケミストリー抱合のためのSPAAC)へ付着される。いくつかの実施形態では、クリックケミストリー抱合の前に、反応性の高い化学的部分(例として、クリックケミストリー抱合のためのSPAAC)に付着されたval-citリンカーは、以下の構造を有し、
Figure 2023535073000037
 式中、nは0～10の任意の数である。いくつかの態様において、nは3である。
いくつかの態様において、反応性の高い化学的部分(例として、クリックケミストリー抱合のためのSPAAC)へ付着されるval-citリンカーは、(例として、異なる化学的部分を介して)分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド)へ抱合される。いくつかの態様において、反応性の高い化学的部分(例として、クリックケミストリー抱合のためのSPAAC)に付着され、分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド)に抱合されたval-citリンカーは、(クリックケミストリー抱合前)以下の構造を有し、
Figure 2023535073000038
 式中、nは0～10の任意の数である。いくつかの態様において、nは3である。
いくつかの態様において、分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド)への抱合後、val-citリンカーは以下の構造を有し、
Figure 2023535073000039
 式中、nは0～10の任意の数であり、mは0～10の任意の数である。いくつかの態様において、nは3であり、およびmは4である。
ii.切断不能リンカー
いくつかの態様において、切断不能なリンカーが使用されてもよい。一般に、切断不能なリンカーは、細胞環境または生理環境において容易に分解され得ない。いくつかの態様において、切断不能なリンカーは、任意に置換されていてもよいアルキル基を含むが、ここで置換は、ハロゲン、ヒドロキシル基、酸素種、および他の一般的な置換を包含していてもよい。いくつかの態様において、リンカーは、任意に置換されていてもよいアルキル、任意に置換されていてもよいアルキレン、任意に置換されていてもよいアリーレン、ヘテロアリーレン、少なくとも1個の非天然アミノ酸を含むペプチド配列、トランケートされたグリカン、酵素的に分解され得ない糖(単数もしくは複数)、アジド、アルキン-アジド、LPXT配列を含むペプチド配列、チオエーテル、ビオチン、ビフェニル、反復単位のポリエチレングリコールもしくは等価な化合物、酸エステル、酸アミド、スルファミド、および/または(例として、および)、アルコキシ-アミンリンカーを含んでいてもよい。いくつかの態様において、ソルターゼ媒介ライゲーションは、LPXT配列を含む抗TfR抗体を、(G)n配列を含む分子ペイロードへ共有結合的に連結するために利用されるであろう(例として、Proft T.Sortase-mediated protein ligation:an emerging biotechnology tool for protein modification and immobilization.Biotechnol Lett.2010,32(1):1-10を見よ)。
いくつかの態様において、リンカーは、置換されたアルキレン、任意に置換されていてもよいアルケニレン、任意に置換されていてもよいアルキニレン、任意に置換されていてもよいシクロアルキレン、任意に置換されていてもよいシクロアルケニレン、任意に置換されていてもよいアリーレン、N、O、およびSから選択される少なくとも1個のヘテロ原子をさらに含む任意に置換されていてもよいヘテロアリーレン;N、O、およびSから選択される少なくとも1個のヘテロ原子をさらに含む任意に置換されていてもよいヘテロシクリレン;イミノ、任意に置換されていてもよい窒素種、任意に置換されていてもよい酸素種O、任意に置換されていてもよい硫黄種、またはポリ(アルキレンオキシド)、例として、ポリエチレンオキシドまたはポリプロピレンオキシドを含んでいてもよい。
iii.リンカー抱合
いくつかの態様において、リンカーは、ホスファート、チオエーテル、エーテル、炭素-炭素、カルバマート、またはアミド結合を介して抗TfR抗体および/または(例として、および)分子ペイロードへ接続されている。いくつかの態様において、リンカーは、ホスファートまたはホスホロチオアート基、例として、オリゴヌクレオチド主鎖の末端のホスファートを介してオリゴヌクレオチドへ接続されている。いくつかの態様において、リンカーは、抗TfR抗体上に存在するリシン残基またはシステイン残基を介して、抗TfR抗体へ接続されている。
いくつかの態様において、リンカーは、トリアゾールを形成するアジドとアルキンとの間のシクロ付加反応によって、抗TfR抗体および/または(例として、および)分子ペイロードへ接続されており、ここでアジドおよびアルキンは、抗TfR抗体、分子ペイロード、またはリンカー上に位置付けられていてもよい。いくつかの態様において、アルキンは、環状アルキン、例としてシクロオクチンであってもよい。いくつかの態様において、アルキンは、ビシクロノニン(またビシクロ［6.1.0］ノニンまたはBCNとしても知られている)または置換ビシクロノニンであってもよい。いくつかの態様において、シクロオクタンは、2011年11月3日に公開の国際特許出願公開WO2011136645号、表題「Fused Cyclooctyne Compounds And Their Use In Metal-free Click Reactions」に記載のとおりである。いくつかの態様において、アジドは、アジドを含む糖または炭水化物分子であってもよい。いくつかの態様において、アジドは、6-アジド-6-デオキシガラクトースまたは6-アジド-N-アセチルガラクトサミンであってもよい。いくつかの態様において、アジドを含む糖または炭水化物分子は、2016年10月27日に公開の国際特許出願公開WO2016170186号、表題「Process For The Modification Of A Glycoprotein Using A Glycosyltransferase That Is Or Is Derived From A β(1,4)-N-Acetylgalactosaminyltransferase」に記載のとおりである。いくつかの態様において、トリアゾールを形成するアジドとアルキンとの間のシクロ付加反応(ここでアジドおよびアルキンは、抗TfR抗体、分子ペイロード、またはリンカー上に位置付けられていてもよい)は、2014年5月1日に公開の国際特許出願公開WO2014065661号、表題「Modified antibody,antibody-conjugate and process for the preparation thereof」;または2016年10月27日に公開の国際特許出願公開WO2016170186、表題「Process For The Modification Of A Glycoprotein Using A Glycosyltransferase That Is Or Is Derived From A β(1,4)-N-Acetylgalactosaminyltransferase」に記載のとおりである。
いくつかの態様において、リンカーはさらに、スペーサー、例として、ポリエチレングリコールスペーサーまたはアシル/カルバモイルスルファミドスペーサー、例として、HydraSpace(商標)スペーサーを含む。いくつかの態様において、スペーサーは、Verkade,J.M.M.et al.,「A Polar Sulfamide Spacer Significantly Enhances the Manufacturability,Stability,and Therapeutic Index of Antibody-Drug Conjugates」、Antibodies,2018,7,12に記載のとおりである。
いくつかの態様において、リンカーは、求ジエン体とジエン/ヘテロ-ジエンとの間のディールス・アルダー反応によって、抗TfR抗体および/または(例として、および)分子ペイロードへ接続されるが、ここで求ジエン体およびジエン/ヘテロ-ジエンは、抗TfR抗体、分子ペイロード、またはリンカー上に位置付けられていてもよい。いくつかの態様において、リンカーは、他のペリ環状反応、例として、エン反応によって、抗TfR抗体および/または(例として、および)分子ペイロードへ接続される。いくつかの態様において、リンカーは、アミド、チオアミド、またはスルホンアミド結合反応によって、抗TfR抗体および/または(例として、および)分子ペイロードへ接続される。いくつかの態様において、リンカーは、リンカーと抗TfR抗体および/または(例として、および)分子ペイロードとの間に存在するオキシム基、ヒドラゾン基、またはセミカルバジド基を形成する縮合反応によって、抗TfR抗体および/または(例として、および)分子ペイロードへ接続される。
いくつかの態様において、リンカーは、求核試薬(例として、アミン基またはヒドロキシル基)と求電子試薬(例として、カルボン酸、カーボナート、またはアルデヒド)との間の抱合体付加反応によって、抗TfR抗体および/または(例として、および)分子ペイロードへ接続される。いくつかの態様において、リンカーと抗TfR抗体または分子ペイロードとの間の反応に先立ち、求核試薬はリンカー上に存在していてもよく、求電子試薬は抗TfR抗体または分子ペイロード上に存在していてもよい。いくつかの態様において、リンカーと抗TfR抗体または分子ペイロードとの間の反応に先立ち、求電子試薬はリンカー上に存在していてもよく、求核試薬は抗TfR抗体または分子ペイロード上に存在していてもよい。いくつかの態様において、求電子試薬は、アジド、ペンタフルオロフェニル、ケイ素中心、カルボニル、カルボン酸、無水物、イソシアナート、チオイソシアナート、スクシニミジルエステル、スルホスクシニミジルエステル、マレイミド、アルキルハロゲン化物、アルキル擬ハロゲン化物、エポキシド、エピスルフィド、アジリジン、アリール、活性化リン中心、および/または(例として、および)、活性化硫黄中心であってもよい。いくつかの態様において、求核試薬は、任意に置換されていてもよいアルケン、任意に置換されていてもよいアルキン、任意に置換されていてもよいアリール、任意に置換されていてもよいヘテロシクリル、ヒドロキシル基、アミノ基、アルキルアミノ基、アニリド基、またはチオール基であってもよい。
いくつかの態様において、反応性の高い化学的部分(例として、クリックケミストリー抱合のためのSPAAC)に付着されたval-citリンカーは、以下の構造によって抗TfR抗体に抱合され、
Figure 2023535073000040
 式中、mは0～10の任意の数である。いくつかの態様において、mは4である。
いくつかの実施形態では、反応性の高い化学的部分(例として、クリックケミストリー抱合のためのSPAAC)に付着されたval-citリンカーは、以下の構造を有する抗TfR抗体に抱合され、
Figure 2023535073000041
 式中、mは0～10の任意の数である。いくつかの態様において、mは4である。
いくつかの態様において、反応性の高い化学的部分(例として、クリックケミストリー抱合のためのSPAAC)に付着され、抗TfR抗体に抱合されたval-citリンカーは、以下の構造を有し:
Figure 2023535073000042
 式中、nは0～10の任意の数であり、mは0～10の任意の数である。いくつかの態様において、nは3であり、および/または(例として、および)mは4である。
いくつかの態様において、抗TfR抗体と分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド)とを共有的に結合するために使用されたval-citリンカーは、以下の構造を有し:
Figure 2023535073000043
 式中、nは３であり、およびｍは４である。
いくつかの態様において、抗体と分子ペイロードとを連結するval-citリンカーは、以下の構造を有し:
Figure 2023535073000044
 式中、nは0～10の任意の数であり、mは0～10の任意の数である。いくつかの態様において、nは3であり、および/または(例として、および)mは4である。いくつかの態様において、nは3であり、および/または(例として、および)mは4である。いくつかの態様において、Xは、NH(例として、リジンのアミン基からのNH)、S(例として、システインのチオール基からのS)または抗体のO(例として、セリン、トレオニンまたはチロシンのヒドロキシル基からのO)である。
いくつかの態様において、本明細書中に記載される複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535073000045
 式中、nは0～10の任意の数であり、mは0～10の任意の数である。いくつかの態様において、nは3であり、および/または(例として、および)mは4である。
構造式(A)、(B)、(C)、および(D)中、L1は、いくつかの態様において、置換もしくは非置換の脂肪族、置換もしくは非置換のヘテロ脂肪族、置換もしくは非置換のカルボシクリレン、置換もしくは非置換のヘテロシクリレン、置換もしくは非置換のアリーレン、置換もしくは非置換のヘテロアリーレン、-O-、-N(RA)-、-S-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-C(＝O)NRA-、-NRAC(＝O)-、-NRAC(＝O)RA-、-C(＝O)RA-、-NRAC(＝O)O-、-NRAC(＝O)N(RA)-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-OC(＝O)N(RA)-、-S(O)2NRA-、-NRAS(O)2-、またはそれらの組み合わせであるスペーサーである。いくつかの態様において、L1は、
Figure 2023535073000046
 であり、式中、ピペラジン部分はオリゴヌクレオチドに連結しており、L2は
Figure 2023535073000047
 である。
いくつかの態様において、L1は
Figure 2023535073000048
 であり、式中、ピペラジン部分はオリゴヌクレオチドに連結している。
いくつかの態様において、L1は
Figure 2023535073000049
 である。
いくつかの態様において、L1は、オリゴヌクレオチドの5'ホスファートへ連結される。
いくつかの態様において、L1は、任意である(例として、存在する必要はない)。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体のいずれか1つは、以下の構造を有し、
Figure 2023535073000050
 式中、nは0～15(例として、3)であり、mは0～15(例として、4)である。
C.抗体-分子ペイロード複合体の例
本明細書に記載の分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド)のいずれかへ共有結合的に連結された、本明細書に記載のいずれか1つの抗TfR抗体を含む複合体の非限定的な例が、本明細書でさらに提供される。いくつかの態様において、抗TfR抗体(例として、表2に提供される抗TfR抗体のいずれか1つ)は、リンカーを介して分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド)へ共有結合的に連結される。本明細書に記載のリンカーのいずれも、使用されてもよい。いくつかの態様において、分子ペイロードがオリゴヌクレオチドである場合、リンカーは、オリゴヌクレオチドの5'末端、3'末端、または内部へ連結されている。いくつかの態様において、リンカーは、チオール反応性の連結を介して(例として、抗TfR抗体中のシステインを介して)抗TfR抗体へ連結されている。いくつかの態様において、リンカー(例として、Val-citリンカー)は、抗体(例として、本明細書に記載の抗TfR抗体)へアミン基を介して(例として、抗体中のリシンを介して)連結されている。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチド)である。
Val-citリンカーを介して分子ペイロードに共有結合的に連結された抗TfR抗体を含む複合体の構造の例が、以下に提供され、
Figure 2023535073000051
 式中、リンカーは、チオール反応性連結を介して(例として、抗体中のシステインを介して)抗体に連結されている。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチド)である。
Val-citリンカーを介して分子ペイロードに共有結合的に連結された抗TfR抗体を含む複合体の構造の別の例が、以下に提供され、
Figure 2023535073000052
 式中、nは0～10の間の数であり、mは0～10の間の数であり、リンカーはアミン基(例として、リジン残基上の)を介して抗体へ連結され、および/または(例として、および)リンカーはオリゴヌクレオチドへ(例として、5'末端、3'末端、または内部に)連結される。いくつかの態様において、リンカーはリジンを介して抗体へ連結され、リンカーはオリゴヌクレオチドに5'末端にて連結され、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、分子ペイロードは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むオリゴヌクレオチドであり、リンカーは、5'末端または3'末端でセンス鎖またはアンチセンス鎖に連結される。
抗体は、種々の化学量論で分子ペイロードへ連結され得ることが解されるはずであって、その特性は薬物抗体比(DAR)と称されてもよく、「薬物」は分子ペイロードである。いくつかの態様において、1つの分子ペイロードが抗体へ連結されている(DAR＝1)。いくつかの態様において、2つの分子ペイロードが抗体へ連結されている(DAR＝2)。いくつかの態様において、3つの分子ペイロードが抗体へ連結されている(DAR＝3)。いくつかの態様において、4つの分子ペイロードが抗体へ連結されている(DAR＝4)。いくつかの態様において、各々が異なるDARを有する異なる複合体の混合物が提供される。いくつかの態様において、かかる混合物中の複合体の平均DARは、1～3、1～4、1～5以上の範囲にあってもよい。DARは、分子ペイロードを抗体上の種々の部位へ抱合させることによって、および/または(例として、および)、マルチマーを抗体上の1以上の部位へ抱合させることによって、増大されてもよい。例えば、2のDARは、単一分子ペイロードを抗体上の2つの異なる部位へ抱合させることによって、または二量体分子ペイロードを抗体の単一部位へ抱合させることによって、達成されてもよい。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードに共有結合的に連結された本明細書に記載の抗TfR抗体(例として、IgGまたはFab形態の表2に提供される3-A4、3-M12および5-H12抗体)を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、リンカー(例として、Val-citリンカー)を介して分子ペイロードに共有結合的に連結された、本明細書に記載の抗TfR抗体(例として、IgGまたはFab形態の表2に提供される3-A4、3-M12および5-H12抗体)を含む。いくつかの態様において、リンカー(例として、Val-citリンカー)は、チオール反応性の連結を介して(例として、抗体中のシステインを介して)、抗体(例として、本明細書に記載される抗TfR抗体)へ連結されている。いくつかの態様において、リンカー(例として、Val-citリンカー)は、抗体(例として、本明細書に記載の抗TfR抗体)へアミン基を介して(例として、抗体中のリシンを介して)連結されている。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチド)である。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体の例のいずれか1つにおいて、分子ペイロードは、DMD標的化オリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体の例のいずれか1つにおいて、分子ペイロードは、配列番号1242～2046のいずれか１つによって提供される標的配列に対して少なくとも15の連続するヌクレオチドの相補性のある領域を含むオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体の例のいずれか1つにおいて、分子ペイロードは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供される標的配列に対して少なくとも15の連続するヌクレオチドの領域を含むオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体の例のいずれか1つにおいて、分子ペイロードは、表15において列挙されるESEの少なくとも5の連続するヌクレオチドの相補性のある領域を含む、DMD標的化オリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体の例のいずれか1つにおいて、分子ペイロードは、表14に列挙されるオリゴヌクレオチドから選択される、DMD標的化オリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体の例のいずれか1つにおいて、分子ペイロードは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドから選択される、DMD標的化オリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、表2に示されるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3と同じであるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3と;表2に示されるCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3と同じCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3とを含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、分子ペイロードは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号69、配列番号71または配列番号72のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号70のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、分子ペイロードは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号73または配列番号76のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号74のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、分子ペイロードは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号73または配列番号76のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号75のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、分子ペイロードは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号77を含むVHおよび配列番号78のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、分子ペイロードは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号77または配列番号79のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号80のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、分子ペイロードは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号84、配列番号86または配列番号87のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、分子ペイロードは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号88または配列番号91のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号89のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、分子ペイロードは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号88または配列番号91のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、分子ペイロードは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号92または配列番号94のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号95のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、分子ペイロードは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号92のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号93のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、分子ペイロードは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号97、配列番号98または配列番号99のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号85のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、分子ペイロードは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号100、または配列番号101のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号89のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、分子ペイロードは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号100または配列番号101のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、分子ペイロードは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号102のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号93のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、オリゴヌクレオチド(例として、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、分子ペイロードは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号102または配列番号103のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号95のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、オリゴヌクレオチド(例として、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、分子ペイロードは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号84のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535073000053
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号86のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535073000054
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号87のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535073000055
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号88のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号89のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535073000056
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号88のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535073000057
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号91のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号89のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535073000058
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号91のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535073000059
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号92のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号93のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535073000060
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号94のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号95のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535073000061
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号92のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号95のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535073000062
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR Fabを含み、抗TfR Fabは、配列番号69のアミノ酸配列を含むVHと、配列番号70のアミノ酸配列を含むVLとを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535073000063
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR Fabを含み、抗TfR Fabは、配列番号71のアミノ酸配列を含むVHと、配列番号70のアミノ酸配列を含むVLとを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535073000064
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR Fabを含み、抗TfR Fabは、配列番号72のアミノ酸配列を含むVHと、配列番号70のアミノ酸配列を含むVLとを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535073000065
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR Fabを含み、抗TfR Fabは、配列番号73のアミノ酸配列を含むVHと、配列番号74のアミノ酸配列を含むVLとを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535073000066
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR Fabを含み、抗TfR Fabは、配列番号73のアミノ酸配列を含むVHと、配列番号75のアミノ酸配列を含むVLとを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535073000067
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR Fabを含み、抗TfR Fabは、配列番号76のアミノ酸配列を含むVHと、配列番号74のアミノ酸配列を含むVLとを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535073000068
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR Fabを含み、抗TfR Fabは、配列番号76のアミノ酸配列を含むVHと、配列番号75のアミノ酸配列を含むVLとを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535073000069
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR Fabを含み、抗TfR Fabは、配列番号77のアミノ酸配列を含むVHと、配列番号78のアミノ酸配列を含むVLとを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535073000070
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR Fabを含み、抗TfR Fabは、配列番号79のアミノ酸配列を含むVHと、配列番号80のアミノ酸配列を含むVLとを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535073000071
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR Fabを含み、抗TfR Fabは、配列番号77のアミノ酸配列を含むVHと、配列番号80のアミノ酸配列を含むVLとを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535073000072
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR Fabを含み、抗TfR Fabは、配列番号97のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535073000073
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR Fabを含み、抗TfR Fabは、配列番号98のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535073000074
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR Fabを含み、抗TfR Fabは、配列番号99のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535073000075
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR Fabを含み、抗TfR Fabは、配列番号100のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号89のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535073000076
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR Fabを含み、抗TfR Fabは、配列番号100のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535073000077
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR Fabを含み、抗TfR Fabは、配列番号101のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号89のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535073000078
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR Fabを含み、抗TfR Fabは、配列番号101のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535073000079
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR Fabを含み、抗TfR Fabは、配列番号102のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号93のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535073000080
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR Fabを含み、抗TfR Fabは、配列番号103のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号95のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535073000081
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR Fabを含み、抗TfR Fabは、配列番号102のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号95のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535073000082
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMD標的化オリゴヌクレオチド(例として、表14に列挙されたオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号437～1241のいずれか１つによって提供されるか、または配列番号1242～2046のいずれか１つに相補性のあるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書中に記載される複合体の例のいずれか1つにおいて、L1は、本明細書中に記載されるスペーサーのいずれか1つである。
いくつかの態様において、L1は
Figure 2023535073000083
 であり、式中、ピペラジン部分はオリゴヌクレオチドに連結しており、L2は
Figure 2023535073000084
 である。
いくつかの態様において、L1は
Figure 2023535073000085
 であり、式中、ピペラジン部分はオリゴヌクレオチドに連結している。
いくつかの態様において、L1は
Figure 2023535073000086
 である。
いくつかの態様において、L1は、オリゴヌクレオチドの5'ホスファートへ連結される。
いくつかの態様において、L1は、任意である(例として、存在する必要はない)。
III.製剤
本明細書に提供される複合体は、いずれの好適なやり方でも製剤化されていてよい。一般に、本明細書に提供される複合体は、医薬への使用に好適なやり方で製剤化されている。例えば、複合体は、分解を最小限に抑え、送達および/または(例として、および)取り込みを容易にする製剤を使用して、対象へ送達され得るか、あるいは、製剤中の複合体へ別の有益な特性を提供する。いくつかの態様において、本明細書に提供されるのは、複合体および薬学的に許容し得る担体を含む組成物である。かかる組成物は、対象の標的細胞周囲の環境中または対象の全身のいずれかへ投与されたとき充分量の複合体が標的筋細胞に侵入できるように、好適に製剤化され得る。いくつかの態様において、複合体は、リン酸緩衝生理食塩溶液などの緩衝溶液中、リポソーム中、ミセル構造体中、およびカプシド中に製剤化される。
いくつかの態様において、組成物が、本明細書に提供される複合体の1以上の構成要素(例として、筋標的化剤、リンカー、分子ペイロード、またはこれらのいずれか1つの前駆体分子)を個別に包含していてもよいことは解されるはずである。
いくつかの態様において、複合体は、水中または水性溶液(例として、pH調整された水)中に製剤化される。いくつかの態様において、複合体は、塩基性緩衝水性溶液(例として、PBS)中に製剤化される。いくつかの態様において、本明細書に開示のとおりの製剤は、賦形剤を含む。いくつかの態様において、賦形剤は、組成物へ、改善された安定性、改善された吸収、改善された可溶性、および/または(例として、および)、活性成分の治療増強を付与する。いくつかの態様において、賦形剤は、緩衝剤(例として、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、トリス塩基、もしくは水酸化ナトリウム)、またはビヒクル(例として、緩衝溶液、ワセリン、ジメチルスルホキシド、または鉱油)である。
いくつかの態様において、複合体またはその構成要素(例として、オリゴヌクレオチドまたは抗体)は、その貯蔵寿命を延長するため凍結乾燥され、次いで使用(例として、対象への投与)前に溶液にさせられる。結果的に、本明細書に記載の複合体またはその構成要素を含む組成物中の賦形剤は、凍結保護剤(lyoprotectant)(例として、マンニトール、ラクトース、ポリエチレングリコール、もしくはポリビニルピロリドン)、または崩壊温度修飾因子(例として、デキストラン、フィコール、もしくはゼラチン)であってもよい。
いくつかの態様において、医薬組成物は、その意図された投与ルートに適合するよう製剤化されている。投与ルートの例は、非経口投与、例として、静脈内投与、皮内投与、皮下投与を包含する。典型的には、投与ルートは、静脈内投与または皮下投与である。
注射剤への使用に好適な医薬組成物は、滅菌水性溶液(ここで水に可溶性である)または分散溶液、および滅菌注射剤溶液または分散溶液の即時調製のための滅菌粉末を包含する。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)、および好適なそれらの混合物を含有する溶媒または分散媒体であり得る。いくつかの態様において、製剤は、組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、および塩化ナトリウムを包含する。滅菌注射剤溶液は、要求量の複合体を、上に列挙された成分の1つまたはそれらの組み合わせと共に、選択された溶媒に組み込むこと、要求に応じ、これに続き濾過滅菌することによって調製され得る。
いくつかの態様において、組成物は、活性成分(単数または複数)のパーセンテージが組成物全体の重量または体積の約1％と約80％以上との間であってもよいが、少なくとも約0.1％の複合体もしくはその構成要素を含有していてもよい。可溶性、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与ルート、産物の貯蔵寿命などの因子、ならびに他の薬理学的留意事項は、かかる医薬製剤を調製する当業者によって企図されるであろう。そのため様々な投薬量および処置計画が所望されることもある。
IV.使用/処置の方法
本明細書に記載のとおりの分子ペイロードへ共有結合的に連結された筋標的化剤を含む複合体は、ジストロフィン異常症、例として、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、を有する対象を処置するのに有効である。いくつかの態様において、複合体は、オリゴヌクレオチドである分子ペイロード、例として、突然変異型DMDアレルから発現されるｍRNAのエキソンスキッピングを増強する、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、対象は、ヒト対象、霊長目の非ヒト動物対象、齧歯類動物対象、またはいずれの好適な哺乳類の動物対象であってもよい。いくつかの態様において、対象は、表1に提供された筋疾患を有してもよい。いくつかの態様において、対象は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーか、またはほかのジストロフィン異常症を有していてもよい。いくつかの態様において、対象は、フレームシフト変異を引き起こし、および不適切なRNAスプライシング／処理をもたらすDMDエキソンにおける、少なくとも1つの変異を任意で含んでいてもよい、変異したDMD対立遺伝子を有する。いくつかの態様において、対象は、重度のジストロフィノパシーの症状、例として、筋萎縮または筋喪失に苦しんでいる。いくつかの態様において、対象は、クレアチンホスホキナーゼ(CK)の血清濃度、および／または(例として、および)ミオグロビン尿を伴う筋肉けいれんの無症状の増加を有する。いくつかの態様において、対象は、デュシェンヌ型もしくはベッカー型筋ジストロフィーまたはDMD関連拡張型心筋症(DCM)などの進行性筋疾患を有する。いくつかの態様において、対象は、ジストロフィノパシーの症状に苦しんでいない。
本開示の側面は、本明細書に記載のとおりの有効量の複合体を対象へ投与することを伴う方法を包含する。いくつかの態様において、分子ペイロードへ共有結合的に連結された筋標的化剤を含む複合体を含む有効量の医薬組成物は、処置を必要とする対象へ投与され得る。いくつかの態様において、本明細書に記載のとおりの複合体を含む医薬組成物は、静脈内投与を包含してもよい好適なルートによって、例として、ボーラスとして、またはある期間にわたる連続注入によって、投与されてもよい。いくつかの態様において、静脈内投与は、筋肉内の、腹腔内の、脳脊髄内の(intracerebrospinal)、皮下の、関節内の、滑液嚢内の、または髄腔内のルートによって実施されてもよい。いくつかの態様において、医薬組成物は、固体形態、水性形態、または液体形態であってもよい。いくつかの態様において、水性または液体形態は、噴霧されてもよく、または凍結乾燥されてもよい。いくつかの態様において、噴霧形態または凍結乾燥形態は、水性または液体溶液で再構成されてもよい。
静脈内投与のための組成物は、植物油、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、乳酸エチル、炭酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、エタノール、およびポリオール(グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど)などの様々な担体を含有していてもよい。静脈内注射のための水可溶性抗体は点滴法によって投与され得、これによって抗体および薬学的に許容し得る賦形剤を含有する医薬製剤が注入される。生理学的に許容し得る賦形剤は、例えば、5％デキストロース、0.9％生理食塩水、リンガー溶液、または他の好適な賦形剤を包含していてもよい。筋肉内用調製物、例として、抗体の好適な可溶性の塩形態の滅菌製剤は、注射用水、0.9％生理食塩水、または5％グルコース溶液などの医薬賦形剤に溶解されて投与され得る。
いくつかの態様において、分子ペイロードへ共有結合的に連結されたた筋標的化剤を含む複合体を含む医薬組成物は、部位特異的または局部的な送達技法を介して投与される。これらの技法の例は、複合体の埋め込み型デポー供給源、局部送達カテーテル、部位特異的担体、直接注射、または直塗り(direct application)を包含する。
いくつかの態様において、分子ペイロードへ共有結合的に連結された筋標的化剤を含む複合体を含む医薬組成物は、治療効果を対象に付与する有効濃度にて投与される。有効量は、当業者によって認識されるとおり、疾患の重症度、処置される対象の特有な特徴、例として、年齢、体調、健康状態、または体重、処置時間、いずれの併用治療の性質、投与ルート、および関連因子に応じて変動する。これらの関連因子は当業者に知られており、わずかな定型的実験法で対処され得る。いくつかの態様において、有効濃度は、患者に安全であると見なされる最大用量である。いくつかの態様において、有効濃度は、最大限の効き目を提供する、実行可能な最低濃度であろう。
経験的考察、例として、対象における複合体の半減期は一般に、処置のために使用される医薬組成物の濃度の決定に寄与するであろう。投与頻度は、処置の効き目を最大化するために経験的に決定かつ調整されてもよい。
一般に、本明細書に記載の複合体のいずれかの投与について、当初の候補投薬量は、上に記載の因子、例として、安全性または有効性に応じて、約1～100mg/kgであってもよく、またはこれより多くてもよい。いくつかの態様において、処置は、一度施されるであろう。いくつかの態様において、処置は、毎日、隔週、毎週、隔月、毎月、または対象へ最大の効き目を提供しつつ安全性へのリスクを最小に抑えるいずれの時間間隔にて、施されるであろう。一般に、有効性ならびに処置および安全性へのリスクは、処置過程を通してずっと監視されることもある。
処置の効き目は、いずれか好適な方法を使用して査定されてもよい。いくつかの態様において、処置の効き目は、ジストロフィン異常症、例として、筋萎縮や筋力低下、被験者の自己報告によるアウトカム、例として、移動、セルフケア、通常の活動、痛み/不快感、不安/抑うつ、またはQOL指標、例として、寿命、に関連する症状の所見の評価することよって分析されてもよい。
いくつかの態様において、本明細書に記載の分子ペイロードへ共有結合的に連結された筋標的化剤を含む複合体を含む医薬組成物は、対照(例として、処置に先立つ遺伝子発現のベースラインレベル)と比べて、標的遺伝子の活性または発現を少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、または少なくとも95％阻害するのに充分な有効濃度にて、対象へ投与される。
いくつかの態様において、本明細書に記載の分子ペイロードへ共有結合的に連結された筋標的化剤を含む複合体を含む医薬組成物の対象への単回投薬または投与は、少なくとも1～5日間、1～10日間、5～15日間、10～20日間、15～30日間、20～40日間、25～50日間、またはこれより長い期間、標的遺伝子の活性または発現を阻害するのに充分である。いくつかの態様において、本明細書に記載の分子ペイロードへ共有結合的に連結された筋標的化剤を含む複合体を含む医薬組成物の対象への単回投薬または投与は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12週間、標的遺伝子の活性または発現を阻害するのに充分である。いくつかの態様において、本明細書に記載の分子ペイロードへ共有結合的に連結された筋標的化剤を含む複合体を含む医薬組成物の対象への単回投薬または投与は、少なくとも1、2、3、4、5、または6カ月間、標的遺伝子の活性または発現を阻害するのに充分である。
いくつかの態様において、医薬組成物は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された筋標的化剤を含む、1種より多くの複合体を含んでいてもよい。いくつかの態様において、医薬組成物は、対象、例として、ジストロフィン異常症を有するヒト対象の処置のためのいずれか他の好適な治療剤をさらに含んでいてもよい。いくつかの態様において、他の治療剤は、本明細書に記載の複合体の有効性を増強または補完するものであってもよい。いくつかの態様において、他の治療剤は、本明細書に記載の複合体とは異なる症状または疾患を処置するよう機能してもよい。
例1:トランスフェクトされたアンチセンスオリゴヌクレオチドでのHPRTの標的化
ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)を標的にするsiRNAは、不死化細胞株中HPRTの発現レベルを低減する能力についてin vitroで試験された。手短に言えば、Hepa1-6細胞が、リポフェクタミン2000で製剤化された対照siRNA(SiCTRL, 100nM)、またはリポフェクタミン2000で製剤化されたHPRTを標的にするsiRNA(siHPRT, 100nM)をトランスフェクトされた。HPRT発現レベルを、トランスフェクションを受けてから72時間評価した。ビヒクル(リン酸緩衝生理食塩水)を培養中Hepa1-6細胞へ送達して細胞を48時間維持した、対照実験もまた実施した。図1に示されるとおり、ASO300はHPRT発現レベルを対照と比較して約90％低減させたことがわかった。使用されたsiRNAの配列は、表６において提供される。
表6.siHPRTおよびsiCTRLの配列
例2:筋標的化複合体でのHPRTの標的化
非切断可能なN-ガンマ-マレイミドブチリル-オキシスクシンイミドエステル(GMBS)リンカーを介して、抗トランスフェリン受容体抗体であるRI7 217 抗-TfR1 Fab (DTX-A-002)へ共有結合的に連結された、例1に使用されたHPRT siRNA(siHPRT)を含む筋標的化複合体が生成された。
手短に言えば、GMBSリンカーは、乾燥DMSOに溶解されアミドカップリング反応を使用して水溶液条件のもと、アミド結合形成を通して、siHPRTのセンス鎖の３末端へカップリングされた。反応の完了は、カイザーテストによって証された。過剰なリンカーおよび有機溶媒はゲル浸透クロマトグラフィーによって除去した。次いで、精製されたsiRNAのマレイミド官能化センス鎖は、マイケル付加反応を使用して、DTX-A-002抗体へカップリングされた。
抗体カップリング反応の産物は、次いでサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)精製へ供された。DTX-A-002抗体へ共有的に付着された1つまたは2つのsiHPRT分子を含む、抗TｆR-siHRT複合体は、精製された。デンシトメトリーは、精製されたサンプル複合体が、1.46の平均siHPRT対抗体比を有することを確認した。SDS-PAGE分析は、精製されたサンプルの複合体の＞90％が、1つまたは2つのsiHPRT分子のいずれかに連結されたDTX-A-002を含むことを実証した。
上記と同じ方法を使用して、GMBSリンカーを介してIgG2a(Fab)抗体(DTX-A-00３)へ共有結合的に連結された、例1で使用されたHPRT siRNA(siHPRT)を含むIgG2a-siHPRT対照複合体を生成した。デンシトメトリーは、DTX-C-001(IgG2a-siHPRT複合体)が、1.46の平均siHPRT対抗体比を有することを確認し、およびSDS-PAGE分析は、対照複合体の複合体の精製されたサンプル＞90％が、1つまたは2つのsiHPRT分子のいずれかに連結されたDTX-A-003を含むことを実証した。
次いで、抗TfR-siHPRT複合体は、細胞内在化およびin celluloにおけるHPRTの阻害について試験された。トランスフェリン受容体の相対的に高い発現レベルを有するHepa1-6細胞を、ビヒクル(リン酸緩衝食塩水)、IgG2a-siHPRT(100nM)、抗TfR-siCTRL(100nM)または抗TfR-siHPRT(100nM)の存在下で72時間インキュベートした。72時間インキュベーションの後、細胞を単離してHPRTの発現レベルについてアッセイした(図2)。抗TfR-siHPRTで処置された細胞は、ビヒクル対照で処置された細胞およびIgG2a-siHPRT複合体で処置されたものと比べて、HPRTの発現の約50％の低減を実証した。その一方で、IgG2a-siHPRTまたは抗TfR-siCTRLで処置された細胞のいずれかは、ビヒクル対照(HPRT発現における低減なし)に匹敵するHPRT発現レベルを有した。これらのデータは、抗TfR-siHPRTの抗トランスフェリン受容体抗体が複合体の細胞内在化を可能にし、それによって抗TfR-siHPRTがHPRTの発現を阻害できることを示唆する。
例3:筋標的化複合体でのマウス筋組織中HPRTの標的化
例2に記載の筋標的化複合体である抗TfR-siHPRTは、マウス組織中のHPRTの阻害について試験された。C57BL/6野生型マウスは、ビヒクル対照(リン酸緩衝食塩水);siHPRT(2mg/kｇのsiRNA);IgG2a-siHPRT(2mg/kgのsiRNA,抗体複合体9mg/kgに相当する)；または抗TfR-siHPRT(2mg/kgのsiRNA、抗体複合体9mg/kgに相当する)の単回用量を静脈内注射された。各実験条件を4匹の個々のC57BL/6野生型マウスにおいて再現した。注射から3日の期間後に、マウスを安楽死させ、細分して単離された組織型とした。続いて個々の組織試料をHPRTの発現レベルについてアッセイした(図3A～3Bおよび4A～4E)。
抗TfR-siHPRT複合体で処置されたマウスは、siHPRT対照で処置されたマウスと比べて、腓腹筋(31％低減;p＜0.05)および心臓(30％低減;p＜0.05)におけるHPRT発現の低減を実証した(図3A～3B)。その一方で、IgG2a-siHPRT複合体で処置されたマウスは、アッセイされたすべての筋組織型について、siHPRT対照マウスで処置されたマウス(HPRT発現における低減がほとんどまたは全くなし)に匹敵するHPRT発現レベルを有した。
抗TfR-siHPRT複合体で処置されたマウスは、脳、肝臓、肺、腎臓、および脾臓組織などの非筋組織においてHPRT発現の無変化を実証した(図4A～4E)。これらのデータは、抗TfR-siHPRT複合体の抗トランスフェリン受容体抗体がin vivoマウスモデルで複合体の筋肉特異的組織中への細胞内在化を可能にし、それによってsiHPRTがHPRTの発現を阻害できることを示唆している。これらのデータは、本開示の抗TfR-オリゴヌクレオチド複合体が、筋組織を特異的に標的にすることが可能であることをさらに実証する。
例4:筋標的化複合体でのDMDの標的化
DMDの突然変異型対立遺伝子(DMD ASO)を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド、エクソンスキップのための、例えば、表14で開示されているとおりの配列を有するオリゴヌクレオチドがカテプシン切断可能リンカーを介して、抗トランスフェリン受容体抗体DTX-A-002(RI7 217（Fab))に共有結合されている筋肉標的複合体を生成する。
手短には、精製されたVal-Cit-リンカーDMD ASOは、抗体のリシンにおけるε－アミンを修飾することを通して産生される官能化された抗体フラグメント（例として、RI7 217(Fab)または15G11(Fab))にカップリングされる。
抗体カップリング反応の生成物を、次に疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC-HPLC）に供して、筋標的複合体を精製する。精製された複合体のデンシトメトリーおよびSDS-PAGE分析により、ASO対抗体の平均比および全純度を、夫々決定することができる。
上記と同じ方法を用いて、IgG2a（Fab）抗体にVal-Citリンカーを介して共有的に結合されたDMD ASOを含む対照複合体を生成する。DMD ASOに共有的に結合されたDTX-A-002を含む精製された標的複合体を、次に、細胞内在化およびDMDエキソンスキッピングの調節について試験する。トランスフェリンレセプターの比較的高い発現レベルを有する疾患関連筋肉細胞を、ビヒクル対照（生理食塩水）、筋標的化複合体（100nM）、または対照複合体（100nM）の存在下で、72時間インキュベートする。72時間のインキュベーション後、細胞を単離し、DMDの発現レベルについてアッセイする。
例5:筋標的化複合体によるDMDの標的化
抗トランスフェリン受容体抗体DTX-A-002(RI7 217(Fab))へ共有結合的に連結されたDMDのエキソン23を標的とするPMO ASOを含む筋標的化複合体(DTX-C-042が生成された。
手短には、ビシクロ［6.1.0］ノニン-PEG3-L-バリン-L-シトルリン-ペンタフルオロフェニルエステル(BCN-PEG3-Val-Cit-PFP)リンカー分子を、アミドカップリング反応を使用してNH2-C6-(エキソン23 PMO)にカップリングした。過剰なリンカーおよび有機溶媒はゲル浸透クロマトグラフィーによって除去した。次いで、精製されたVal-Citリンカー-(エキソン23 PMO)を、リジン上のε-アミンをアジド-PEG4-PFPによって修飾することによって生成されたアジド官能化抗トランスフェリン受容体抗体(DTX-A-002)にカップリングした。
次いで、抗体カップリング反応の生成物は精製され、デンシメトリーは、DTX-C-042複合体のこのサンプルが1.9という平均ASO対抗体比を有することを確認した。
この例に使用されたDMDのエキソン23を標的とするPMO ASOは、GGCCAAACCUCGGCUUACCUGAAAU(配列番号171)からなる配列を含む。
DTX-C-042は、ジストロフィン遺伝子のエキソン23のエキソンスキッピングを誘導し、その後、in vivoでDMDに関連する標的筋肉におけるジストロフィンタンパク質の発現を増加させる能力について試験された。DMDマウスモデルであるmdxマウスは、単回用量のビヒクル対照(生理食塩水);10mg/kg ASOの用量でのDTX-C-042複合体;20mg/kg ASOの用量でのDTX-C-042複合体;または30mg/kg ASOの用量でのDTX-C-042複合体を静脈内注射された。各実験条件は4匹のmdxマウスで反復した。4匹の野生型マウスにもまた対照実験としてビヒクル対照(生理食塩水)を投薬した。
処置の14日後にマウスを安楽死させ、標的化された筋組織を収集した。続いて、個々の筋組織試料をジストロフィン遺伝子のエキソン23のパーセントスキップについてアッセイした(図5)。さらに、標的筋肉中のジストロフィンタンパク質レベルも定量された(四頭筋におけるジストロフィンの定量化を図6A～図6Bに示す)。
抗体-ASO複合体で処置されたマウスは、四頭筋、横隔膜、および心臓の筋肉におけるエキソン23のパーセントエキソンスキッピングの用量依存的な増大を実証した。抗体-ASO複合体で処置されたマウスは、四頭筋におけるジストロフィンタンパク質の発現の用量依存的な増大をもまた実証し、DTX-C-042の30mg/kg ASO当量で処置されたマウスでは平均で＞4％のジストロフィンタンパク質であった。
これらのデータは、DTX-C-042複合体の抗トランスフェリン受容体抗体がin vivoのmdxマウスモデルにおいて筋肉特異的な組織への複合体の細胞内在化を可能化し、それによって、エキソン23 PMO ASOがDMDのエキソン23のエキソンスキッピングを誘導することを許すことを実証している。これらのデータは、DTX-C-042複合体が筋組織を特異的に標的化できることをさらに実証している。
例14:筋標的化複合体によってDMDを標的化してmdxマウスモデルにおいて機能的な利益を実証する
Mdxマウス(DMDマウスモデル;有疾患マウス)は、単回用量のビヒクル対照(生理食塩水);MDX-ASO(ネイキッドエキソン23スキッピングのPMO ASO、30mg/kg);または例5に記載されているDTX-C-042複合体(エキソン23スキッピングのPMOに連結された抗トランスフェリン受容体抗体RI7 217 Fab、30mg/kg ASO当量)を静脈注射された。各実験条件は5匹のmdxマウスで反復した。5匹の野生型マウス(健康なマウス)にもまたビヒクル対照(生理食塩水)を投薬した。
注射の2週間および4週間後に、すべての処置されたマウスの機能的な活動は、オープンフィールドチャンバー実験を使用して決定された。実験には3つの一続きのステージが関わった:(1)各マウスがオープンフィールドチャンバー内に置かれる10分の期間;(2)各マウスが後肢疲労負荷に付される10分の期間;および(3)各マウスがオープンフィールドチャンバー内に置かれる10分の期間である。ステージ(1)および(3)の間に移動した全の水平距離を収集した。第1のおよび第2の試験の間に移動した全距離のパーセント変化。図7Aに示されるとおり、2週の時点で、生理食塩水で処置された野生型マウスは、ステージ(1)と比べてステージ(3)の間に平均で約20％少なく移動した;生理食塩水で処置されたmdxマウスは、ステージ(1)と比べてステージ(3)の間に平均で約70％少なく移動した;MDX-ASOで処置されたmdxマウスは、ステージ(1)と比べてステージ(3)の間に平均で約85％少なく移動した;DTX-C-042で処置されたmdxマウスは、ステージ(1)と比べてステージ(3)の間に平均で約40％少なく移動した。生理食塩水で処置された野生型マウスと比較されるときに、生理食塩水で処置されたmdxマウスは有意に悪い成績であった(ステージ(1)と比べてステージ(3)において移動した距離の有意な減少によって指し示される)。この観察は、DMD患者によって経験される損なわれた運動機能と整合する。ネイキッドMDX-ASOで処置されたmdxマウスは、ビヒクルで処置されたものと同じ機能的性能の悪化を示した。対照的に、DTX-C-042で処置されたmdxマウスの性能は、ビヒクル処置された野生型マウスと統計的に異ならなかった。図7Bに示されるとおり、4週の時点で、生理食塩水で処置された野生型マウスは、ステージ(1)と比べてステージ(3)の間に平均で約35％少なく移動した;生理食塩水で処置されたmdxマウスは、ステージ(1)と比べてステージ(3)の間に平均で約80％少なく移動した;MDX-ASOで処置されたmdxマウスは、ステージ(1)と比べてステージ(3)の間に平均で約55％少なく移動した;DTX-C-042で処置されたmdxマウスは、ステージ(1)と比べてステージ(3)の間に平均で約50％少なく移動した。
注射の2週間および4週間後に、すべての処置されたマウスの活動は、ケージの回し車試験を使用して決定された。各マウスを、回し車を有するケージ内に24時間の期間にわたって個々に置いた。24時間の期間には、5時間の照明オン、次に13時間の暗が関わり、6時間の照明で終わった。回し車上で各マウスが移動した全距離(メートルmによる)を、24時間の期間にわたって継続的に収集し、続いて別々の1時間のインクリメントにビニングした。図7Cに示すように、2週の時点で、DTX-C-042で処置されたmdxマウスが移動した距離は、MDX-ASOまたは生理食塩水で処置されたmdxマウスが移動した距離よりも多く、ある時点で野生型マウスが移動した距離に近づいた。図7Dに示されるとおり、4週の時点で、暗期の間に(すなわち、マウスが活発であるときに)、DTX-C-042複合体で処置されたmdxマウスが移動した距離は、生理食塩水で処置された野生型マウスが移動した全距離を密接に反映した。これは、生理食塩水またはMDX ASOどちらかで処置されたmdxマウスとは対照的である。これらは暗期の間にかなり短い距離を移動した。
この例のすべてのマウスを、注射の2週および4週後にクレアチンキナーゼ活性レベルについてさらに試験した。野生型マウスは筋組織から大量のクレアチンキナーゼは分泌しない。反対に、mdxマウス(有疾患筋組織を有する)はまさに高いレベルのクレアチンキナーゼを分泌する。これはクレアチンキナーゼ酵素活性の決定によって観察され得る。図7Eに示されるとおり、生理食塩水で処置されたmdxマウスは、生理食塩水で処置された野生型マウスと比べて、2週後および4週後にそれぞれおよそ9倍および10倍多くのクレアチンキナーゼ酵素活性を有した。ネイキッドASOによる投薬は、mdxマウスに有意な利益を提供しなかった。しかしながら、mdxマウスにDTX-C-042複合体を投薬することは、2および4週後に両方とも、クレアチンキナーゼ活性のレベルの統計的に有意な低減をまさに提供した。
これらの驚くべき結果は、抗体-ASO複合体が、これらのマウスが健康な(野生型)マウスに似た表現型指標を有するようにして、DMD表現型を患うマウス(mdxマウス)に機能的な利益を提供することができることを示している。抗体-ASO複合体の性能は、ネイキッドPMO(MDX-ASO)と比べて、抗体-ASO複合体の抗トランスフェリン受容体抗体がこの例で示された機能的な利益を提供することを担っていることを実証している。
例7:選択された抗TfR1抗体のヒトTfR1に対する結合親和性
Ka(会合速度定数)、Kd(解離速度定数)、およびKD(親和性)の測定のために、選択された抗TfR1抗体を、ヒトTfR1に対するそれらの結合親和性について試験した。2つの知られている抗TfR1抗体15G11およびOKT9を対照として使用した。結合実験は、Carterra LSA上25℃にて実施された。抗マウスIgGおよび抗ヒトIgG抗体の「芝生」がアミンカップリングによってHC30Mチップ上に調製された。IgGはチップ上に捕捉された。hTfR1、cyTfR1、およびhTfR2の希釈系列を結合のためにチップに注入した(1000nMから出発、1:3希釈、8つの濃度)。
結合データは、緩衝液分析物注入からの応答を差し引くことと、Ka(会合速度定数)、Kd(解離速度定数)、およびKD(親和性)の概算のための1:1ラングミュア結合モデルに対してグローバルフィッティングすることとによって参照した。Carterra(商標)Kineticsソフトウェアを使用した。5～6つの濃度を曲線フィッティングに使用した。
結果は、マウスmAbが13pM～50nMの範囲のKD値でhTfR1への結合を実証することを示した。マウスmAbの大多数は、一桁ナノモル～サブナノモル範囲のKD値を有した。試験されたマウスmAbはcyTfR1に対する交差反応性の結合を示し、16pM～22nMの範囲であるKD値を有した。
抗TfR1抗体のKa値、Kd値、およびKD値は、表７に提供される。
表７.抗TfR1抗体のKa値、Kd値、およびKD値
例8:オリゴヌクレオチドとの抗TfR1抗体の抱合
ツールオリゴ(ASO)へ共有結合的に抱合された抗TfR1抗体を含有する複合体が生成された。第1に、抗TfR抗体クローン3-A4、3-M12、および5-H12のFabフラグメントは、マウスモノクローナル抗体を酵素によって全長IgGのヒンジ領域においてまたはその下で切ること、続いて部分的な還元によって調製された。Fab'は、結合力または親和性がmAbと同等であることが確認された。
抗TfR mAbをカテプシン切断可能なリンカーを介してASO300に共有結合的に連結することによって、筋標的化複合体が生成された。手短には、ビシクロ［6.1.0］ノニン-PEG3-L-バリン-L-シトルリン-ペンタフルオロフェニルエステル(BCN-PEG3-Val-Cit-PFP)リンカー分子が、カルバメート結合によってASO300にカップリングされた。過剰なリンカーおよび有機溶媒をタンジェント流ろ過(TFF)によって除去した。次いで、精製されたVal-Citリンカー-ASOを、リジン上のε-アミンをアジド-PEG4-PFPによって修飾することによって生成されたアジド官能化抗トランスフェリン受容体抗体にカップリングした。陽性対照の筋標的化複合体をもまた15G11を使用して生成した。
次いで、抗体カップリング反応の生成物を2つの精製方法に供して、遊離抗体および遊離ペイロードを除去した。抱合体の濃度をNanodrop A280またはBCAタンパク質アッセイどちらか(抗体)およびQuant-It Ribogreenアッセイ(ペイロード)によって決定した。対応する薬物-抗体比(DAR)を計算した。DARは0.8と2.0との間の範囲にあり、すべての試料が等量のペイロードを受けるようにして標準化された。
次いで、精製された複合体を細胞内在化および標的遺伝子DMPKの阻害について試験した。霊長目の非ヒト動物(NHP)またはDM1(DM1患者から提供)細胞を96ウェルプレート上で成長させ、7日にわたって筋管に分化させた。次いで、細胞を、漸増していく濃度(0.5nM、5nM、50nM)の各複合体によって72時間にわたって処置した。細胞を収穫し、RNAを単離し、逆転写を行ってcDNAを生成した。qPCRをPpib(対照)およびDMPKに特異的なTaqManキットを使用してQuantStudio 7によって行った。処置された細胞対無処置の細胞の残りのDMPK転写産物の相対量を計算し、結果は表12に示されている。
結果は、抗TfR1抗体が筋細胞を標的化し、筋細胞によって分子ペイロード(ツールオリゴのASO300)と共に内在化される能力があることと、分子ペイロードは標的遺伝子(DMPK)を標的化およびノックダウンする能力があることとを実証した。DMDを標的にする分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド)へ抱合された抗TfR1抗体を含む複合体のノックダウン活性は、本明細書に記載の同じアッセイを使用して、例として、配列番号437～1241のいずれか1つによって提供される表14に記載されるか、または配列番号1242～2046のいずれか1つに相補的であるオリゴヌクレオチドのいずれか1つを使用することによって、試験されてもよい。
表12.抗TfR1抗体の結合親和性および抱合体の有効性
興味深いことに、DMPKノックダウン結果は、トランスフェリン受容体に対する抗TfRの結合親和性とDMPKノックダウンのために細胞にDMPK ASOを送達することにおける有効性との間の相関の欠如を示した。驚くべきことに、本明細書に提供される抗TfR抗体(例として、少なくとも3-A4、3-M12、および5-H12)は、これらの抗体および対照抗体15G11の間のヒトまたはカニクイトランスフェリン受容体に対する同等の結合親和性(または、5-H12などのある種の事例では、より低い結合親和性)にもかかわらず、対照抗体15G11と比較して、カニクイ細胞またはヒトDM1患者細胞どちらかにおいて、標的細胞にペイロード(例として、DMPK ASO)を送達することおよび分子ペイロードの生物学的効果(例として、DMPKノックダウン)を達成することにおいて優れた活性を実証した。
上位の属性、例えば高いhuTfR1親和性、NHPおよびDM1患者細胞株におけるDMPKの＞50％ノックダウン、3つの固有配列による同定されたエピトープ結合、低い/ない予測されるPTM部位、ならびに良好な発現および抱合効率が、ヒト化のための上位3つのクローン、3-A4、3-M12、および5-H12の選択につながった。
例9:ヒト化抗TfR1抗体
表2に示す抗TfR抗体はヒト化および突然変異誘発に供され、製造可能性の負担を軽減した。ヒト化バリアントはスクリーニングされ、それらの結合特性および生物学的活性について試験された。抗TfR1重鎖可変領域および軽鎖可変領域のヒト化バリアント(それぞれ5つのバリアント)が、Composite Human Technologyを用いて設計された。これらの重鎖および軽鎖可変領域を有するFabをコードする遺伝子が合成され、各ヒト化重鎖および軽鎖バリアントを発現するようにベクターが構築された。続いて、各ベクターを小規模で発現させ、得られたヒト化抗TfR1 Fabが分析された。ヒト化Fabは、標的抗原に対する抗体親和性、相対発現、ヒト生殖系列配列に対する相同性パーセント、およびMHCクラスII予測T細胞エピトープの数(iTope(商標)MCHクラスII in silico分析を使用して決定される)のBiocoreアッセイを含むいくつかの基準に基づいて、さらなる試験のために選択された。
重鎖可変領域および軽鎖可変領域にアミノ酸置換を導入することによって、いくつかの抗体の親配列内の潜在的な傾向(liability)が特定された。これらの置換は、相対発現レベル、iTope(商標)スコアおよびBiacore単回サイクル動態分析からの相対KDに基づいて選択された。ヒト化バリアントが試験され、最初に標的抗原に対する親和性に基づいてバリアントが選択された。続いて、選択したヒト化Fabは、表16および表17に示す、分析した各バリアントの凝集および分解に対する安定性および感受性の一連の生物物理学的評価に基づいてさらにスクリーニングされた。選択されたFabは、TfR1に結合するそれらの特性について速度論的分析によって分析された。これらの分析の結果は表13に示される。表16および表17に示す抱合体の場合、選択したヒト化Fabは、DMPK標的化オリゴヌクレオチドASO300に抱合された。高温(40℃)に9日間曝露された後のヒトおよびcyno TfR1への同等の結合親和性によって示されるように、選択されたFabは、曝露前と比較して熱的に安定である(表13を見よ)。
表16.ヒト化抗TfR Fabの生物物理学的評価データ
表17.ヒト化抗TfR Fabおよび抱合体の熱安定性
Figure 2023535073000091
 表13.TfR1に結合するヒト化抗TfR Fabの速度論的分析
ヒト化抗TfR1 FabのTfR1への結合(ELISA)
ヒト化抗TfR抗体のTfR1への結合を測定するために、ELISAが行われた。高結合性黒色平底96ウェルプレート(Corning＃3925)は、最初にPBS中1μg/mLの組換えhuTfR1 100μL/ウェルでコーティングされ、4℃で一晩インキュベートされた。ウェルは空にされ、残留液体は除去された。PBS中1％のBSA(w/w)200μLを各ウェルに添加してブロッキングを行った。ブロッキングは、300rpmのシェーカーで室温で2時間進行させた。ブロッキング後、液体は除去され、ウェルは300μLのTBSTで3回洗浄された。次いで、抗TfR1抗体が8点連続希釈(希釈範囲5μg/mL～5ng/mL)で三通の0.5％ BSA/TBSTに添加された。陽性対照およびアイソタイプ対照も、ELISAプレートに包含された。プレートはオービタルシェーカー上で300rpmで60分間室温でインキュベートされ、プレートは300μLのTBSTで3回洗浄された。抗(H＋L)IgG-A488(1:500)(Invitrogen ＃A11013)は、TBST中0.5％ BSAに希釈され、100μLを各ウェルに添加された。次いでプレートは、オービタルシェーカー上、300rpmで60分間室温でインキュベートされた。液体は除去され、プレートは300μLのTBSTで4回洗浄された。次いで、495nm励起および50nm発光(15nm帯域幅)での吸光度がプレートリーダー上で測定された。データは記録され、EC50について分析された。ヒト化3M12、3A4および5H12 FabのヒトTfR1(hTfR1)への結合についてのデータが、それぞれ図9A、図9Cおよび図9Eに示される。カニクイザル(Macaca fascicularis)TfR1(cTfR1)を用いて、hTfR1について上述したのと同じプロトコルに従ってELISA測定が行われ、結果は図9B、図9Dおよび図9Fに示される。
hTfR1およびcTfR1へのヒト化抗TfR Fabの結合に関するこれら2セットのELISA分析の結果は、ヒト化3M12 FabがhTfR1およびcTfR1の両方への一貫した結合を示すこと、およびヒト化3A4 FabがhTfR1と比較してcTfR1への結合の減少を示すことを実証する。
抗体-オリゴヌクレオチド抱合体は、それぞれがASO300に抱合された6つのヒト化抗TfR Fabを使用して調製された。抱合効率および下流精製が特徴付けられ、生成物抱合体の様々な特性が測定された。結果は、抱合効率が試験した10のバリアントすべてにわたって堅牢であったこと、および精製プロセス(疎水性相互作用クロマトグラフィー、引き続いてヒドロキシアパタイト樹脂クロマトグラフィー)が有効であったことを実証している。精製抱合体は、サイズ排除クロマトグラフィーによって分析した場合、＞97％の純度を示した。
いくつかのヒト化Fabは、TfR1によって媒介される内在化を評価するための細胞取り込み実験において試験された。抗体によって媒介されるそのような細胞取り込みを測定するために、ヒト化抗TfR Fab抱合体は、pH感受性色素であるCypher5eで標識された。横紋筋肉腫(RD)細胞を4時間にわたって100nMの抱合体によって処置し、トリプシン処理し、2回洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。平均のCypher5e蛍光(取り込みを表す)をAttune NxTソフトウェアを使用して計算した。図10に示されるように、ヒト化抗TfR1 Fabは、陽性対照抗TfR Fabと比較して、類似するか、または増加したエンドソーム取り込みを示す。類似の内在化効率が、異なるオリゴヌクレオチドペイロードで観察された。抗マウスTfR抗体を陰性対照として使用した。コールドな(非内在化)条件は陽性対照抗体抱合体の蛍光シグナルを廃し(データは示さない)、陽性対照およびヒト化抗TfR Fab抱合体における陽性シグナルがFab抱合体の内在化を原因とすることを指し示した。同様に、DMDエキソンスキッピングを誘導するオリゴヌクレオチドもまた、筋細胞による細胞内取り込みのためにヒト化抗TfR Fabsと結合させることができる。
6つのヒト化抗TfR Fabの抱合体も、ELISAによってhTfR1およびcTfR1への結合について試験され、ヒト化Fabの非抱合形態と比較された。結果は、ヒト化3M12および5H12 Fabが、それらの非抱合形態と比較して、抱合後に同様のレベルのhTfR1およびcTfR1結合を維持することを実証する(3M12、図11Aおよび図11B;5H12、図11Eおよび図11F)。興味深いことに、3A4クローンは、それらの非抱合形態と比較して、抱合後にcTfR1への結合の改善を示す(図11Cおよび図11D)。
この例で使用される場合、「非抱合」という用語は、抗体がオリゴヌクレオチドに抱合されなかったことを示す。
例10.in vitroの抗体-オリゴヌクレオチド抱合体によって促進されるDMPK mRNAレベルのノックダウン
ヒト化抗TfR Fabの3M12(VH3/Vk2)、3M-12(VH4/Vk3)および3A4(VH3-N54S/Vk4)を含有する抱合体は、DMPK標的化オリゴヌクレオチドASO300に抱合され、横紋筋肉腫(RD)細胞において、DMPK転写産物発現のノックダウンについて試験された。抗体は、式(C)に示されるリンカーを介してASO300に包含された。
RD細胞を、10％FBSおよびペニシリン/ストレプトマイシンを補ったグルタミンありのDMEMの成長培地によってほとんどコンフルエントまで培養した。次いで、細胞を96ウェルプレートにウェル当たり20K細胞で播種し、24時間にわたって回復することを許した。次いで細胞は、抱合体で3日間処置された。全RNAを細胞から収集し、cDNAを合成し、DMPK発現をqPCRによって測定した。
図12の結果は、DMPK発現レベルが、PBS処理細胞における発現と比較して、各示された抱合体で処置された細胞において低下したことを示しており、ヒト化抗TfR FabがRD細胞によるDMPK標的化オリゴヌクレオチドの取り込みを媒介することができること、および内在化DMPK標的化オリゴヌクレオチドがDMPK mRNAレベルをノックダウンするのに有効であることを示している。
同様に、DMDエキソンスキッピングを誘導するオリゴヌクレオチドも、筋細胞への送達のためにヒト化抗TfR Fabsへ抱合させ、および筋細胞におけるDMDエキソンスキッピングを誘導することができる。
例11.抗TfR-オリゴヌクレオチド抱合体処置は、DMDのmdxマウスモデルにおけるジストロフィン発現を増加させた
in vivoのDMDエキソンスキッピングを誘導する別のオリゴヌクレオチドの効果を試験するために、エキソン23スキッピングを誘導するオリゴヌクレオチド(PMO)を、ネイキッドオリゴヌクレオチドとして、または抗マウスTfR抗体との抱合体としてDMDのmdxマウスモデルに投与した。ジストロフィン発現が測定された。抱合体によって促進されるエキソンスキッピングは、ウエスタンブロットによって例証(図14)および図15で定量されるとおり、ジストロフィンタンパク質の用量依存的な産生をもたらした。アルファ-アクチンをローディング対照として使用した。
mdxマウスに投与されたエキソン23抱合体の単回用量は、図16に示されるとおり、総体的なジストロフィンレベルを増大させることに加えて、ジストロフィン発現を筋細胞膜にもまた復元した。四頭筋のジストロフィンの免疫蛍光染色は、抱合されたもので処置されたmdxマウスが、それらの四頭筋において、ネイキッドオリゴヌクレオチドまたは生理食塩水で処置されたマウスよりも高いレベルのジストロフィンを有することを実証した。
例12.DMD筋管におけるオリゴヌクレオチドによって媒介されるエキソンスキッピング
核における特異的なDMDエキソンのスキップを促進することは、筋細胞がより完全な機能的なジストロフィンタンパク質を作り出すことを許し得る。DMDエキソン51のスキップを誘導するオリゴヌクレオチド(PMO)は抗TfR1 Fabに抱合され、抱合されたものは、エキソン51スキッピングによって左右される突然変異を有するヒトDMD筋管において試験された。図13に示されるとおり、抱合体による処置は、等モルの用量のネイキッドオリゴヌクレオチドによる処置後のエキソンスキッピングの25％増大と比較して、エキソンスキッピングの50％増大をもたらした(p値＝0.001)。図5に示すものなど、DMDのmdxマウスモデルでも同様の結果が観察された。
例13.抗TfR抗体および分子ペイロードを連結するリンカーの血清中安定性
例において抗体に連結されたオリゴヌクレオチドは、式(C)に示される切断可能なリンカーを介して抱合された。リンカーは血清中において安定性を維持し、標的化された筋細胞における充分なペイロード蓄積を利する放出動態を提供することが重要である。この血清中安定性は、静脈内全身投与、血流中における抱合されたオリゴヌクレオチドの安定性、筋組織への送達、および筋細胞における治療薬ペイロードの内在化にとって重要である。リンカーは、Fabへの複数の型のペイロード(ASO、siRNA、およびPMOを包含する)の正確な抱合を容易化することが確認されている。このフレキシビリティは、各筋疾患の遺伝学的な基礎に対処するための適当な型のペイロードの合理的選択を可能化した。加えて、リンカーおよび抱合ケミストリーは、各型のペイロードについて、各Fabに取り付けられるペイロード分子の比の最適化を許し、種々の筋疾患適用への使用を可能化するための分子の迅速な設計、産生、およびスクリーニングを可能化した。
図8は、in vivoのリンカーの血清中安定性を示す。これは静脈内投薬後の72時間の過程において複数の生物種間で同等であった。少なくとも75％の安定性が各ケースにおいて投薬後の72時間に測定された。
例14.DMD患者筋管における抗TfR抱合体のエキソンスキッピング活性
本研究では、DMDエキソン51スキッピングオリゴヌクレオチドに抱合された抗TfR Fab(3M12 VH3/Vκ2, 3M12 VH4/Vκ3、および3A4 VH3 N54S/Vκ4)を含有する抗TfR抱合体のエキソンスキッピング活性が評価された。エキソン52欠失をもつ不死化ヒト筋芽細胞は融解され、1e6細胞/フラスコの密度でPromocell骨格筋細胞成長培地(5％FBSおよび1×Pen-Strepあり)に播種され、コンフルエントまで成長させた。ひとたびコンフルエントになると、細胞をトリプシン処理し、遠心によってペレット化し、新鮮なPromocell骨格筋細胞成長培地に再懸濁した。細胞数がカウントされ、細胞をマトリゲルコーティング96ウェルプレートに50k細胞/ウェルの密度で播種された。細胞が24時間にわたって回復することを許した。成長培地を吸い取ることと血清なしの分化培地による置き換えとによって、細胞を誘導して分化させた。次いで、細胞は10μMの抱合または非抱合DMDエキソンスキッピングオリゴヌクレオチドによって処置された。細胞は試験物と10日間インキュベートされ、次いで、全RNAが96ウェルプレートから収穫された。全RNAの75ngに対してcDNA合成が行われ、各細胞型におけるエキソン51スキッピングの程度を評価するために変異特異的PCRが行われた。突然変異特異的PCR産物を4％アガロースゲルに流し、SYBR goldを使用して視覚化した。デンシメトリーが使用されて、スキップされたおよびスキップされなかったアンプリコンの相対量を計算し、エキソンスキッピングは、存在するアンプリコンの全量によって除算された、エキソン51がスキッピングされたアンプリコンの比として決定された:
Figure 2023535073000093
結果は、DMDエキソン51スキッピングオリゴヌクレオチドに共有的に結合された3M12 VH3/Vκ2または3M12 VH4/Vκ3 Fabのいずれかとの抱合体が、非抱合DMDエキソンスキッピングオリゴヌクレオチドと比較して、患者の筋管においてエキソンスキッピングの増強をもたらしたことを実証している(図17)。
実施例で使用されるとおり、用語「非抱合」は、オリゴヌクレオチドが抗体に抱合されていないことを示唆する。
例15.抗TfR Fab 3M12 VH4の結合活性の特徴付け
抗TfR Fab 3M12 VH4/Vκ3の、ヒトおよびカニクイザルTfR1結合についての特異性を試験し、ヒトTfR1対TfR2についてのその選択性を確認するためにin vitro試験が行われた。様々な種由来のTfR1への抗TfR Fab 3M12 VH4/Vκ3の結合親和性は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を使用して決定された。Fabの一連の希釈物が、組換えヒト、カニクイザル、マウス、またはラットTfR1で事前にコーティングされたプレートに添加された。短いインキュベーションの後、Fabの結合は、蛍光タグ付き抗(H＋L)IgG二次抗体の添加および495nm励起および520nm発光での蛍光強度の測定によって定量された。Fabは、ヒトおよびカニクイザルTfR1に対して強い結合親和性を示し、マウスまたはラットTfR1の検出可能な結合は観察されなかった(図18)。表面プラズモン共鳴(SPR)測定が行われ、結果は表18に示される。FabのKdは、ヒトTfR1受容体に対しては7.68×10-10Mであると計算され、カニクイザルTfR1受容体に対しては5.18×10-9Mであると計算された。
表18.表面プラズモン共鳴を使用して測定した、ヒトおよびカニクイザルTfR1またはヒトTfR2への抗TfR Fab 3M12 VH4/Vk3結合の速度論的分析
ヒトTfR2に対する抗TfR Fab 3M12 VH4/Vk3の交差反応性を試験するために、ELISAが実施された。組換えヒトTfR2タンパク質は、2μg/mLで一晩プレーティングされ、PBS中1％ウシ血清アルブミン(BSA)で1時間ブロッキングされた。Fabまたは陽性対照抗TfR2抗体の一連の希釈物が0.5％ BSA/TBSTに1時間添加された。洗浄後、抗(H＋L)IgG-A488(Invitrogen＃MA5-25932)蛍光二次抗体が0.5％ BSA/TBST中1:500希釈で添加され、プレートは1時間インキュベートされた。Biotek Synergyプレートリーダーを使用して、495nm励起および520nm発光で相対蛍光が測定された。hTfR2への抗TfR Fab 3M12 VH4/Vk3の結合は観察されなかった(図19)。
例16.抗TfR Fab-ASO抱合体の血清中安定性
抗TfR Fab VH4/Vk3は、式(C)に示されるリンカーを介して対照アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)に抱合され、得られた抱合体は、FabをASOに抱合するリンカーの安定性について試験された。蛍光標識された抱合体をPBS、またはラット、マウス、カニクイザルもしくはヒト血清中でインキュベートし、相対蛍光強度を経時的に測定することによって血清中安定性が測定され、蛍光が高いほど、より多くの抱合体が無傷で残っていることを示す。図20は、血清中安定性が複数の種にわたって類似しており、72時間後も高いままであったことを示す。
例17.カニクイザルにおける、in vivoでの抗TfR Fab-ASO抱合体のエキソンスキッピング活性
抗TfR Fab 3M12 VH4/Vk3は、配列番号419に表されるとおりのエキソンスプライシングエンハンサー(ESE)配列を標的とするジストロフィン(DMD)エキソン51スキッピングアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)に抱合された。エキソン51スキッピングオリゴヌクレオチドは、30ヌクレオチド長のホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー(PMO)である。抱合体のエキソンスキッピング活性は、健康な非ヒト霊長類においてin vivoで試験された。ナイーブ雄カニクイザル(n＝4～5/群)は、1日目および8日目に、静脈内注入を介してビヒクルの2回用量、30mg/kgのASO単独、または122mg/kgの抱合体(30mg/kgのASO当量)を投与された。最初の用量が投与された2週間後または4週間後に動物は屠殺され、組織が採取された。Promega Maxwell(登録商標)RSC装置を使用して組織サンプルから全RNAを収集し、qScript cDNA SuperMixを使用してcDNA合成が行われた。エキソン51スキッピングの評価は、エンドポイントPCRを使用して行われた。
PCR産物のキャピラリー電気泳動を使用してエキソンスキッピングを評価し、以下の式を使用してエキソン51スキッピング％が計算された:
Figure 2023535073000095
 計算されたエキソン51スキッピング結果は表19に示される。

表19．カニクイザルジストロフィンにおけるジストロフィンのエキソン51スキッピング
組織ASO蓄積も、ASO配列に相補的なプローブを用いたハイブリダイゼーションELISAを用いて定量された。標準曲線が作成され、標準曲線の線形回帰からASOレベル(ng/g)が導出された。ASOは、抗TfR Fab VH4/Vk3-ASO抱合体の投与後に、非抱合ASOの投与と比較して、評価されたすべての組織により高いレベルで分布された。非抱合ASOの静脈内投与は、最初の投与の2週間および4週間後に評価されたすべての組織においてバックグラウンドレベルに近いASOレベルをもたらした。抗TfR Fab VH4/Vk3-ASO抱合体の投与は、最初の投与の2週間後に、評価した組織を通したASOの分布を心臓＞横隔膜＞二頭筋＞四頭筋＞腓腹筋＞前脛骨筋の順位でもたらした。組織濃度の持続時間も評価された。四頭筋、二頭筋および横隔膜のASOの濃度は、評価した期間(2～4週間)にわたって50％未満減少したが、心臓、前脛骨筋および腓腹筋のASOのレベルは、実質的に変化しないままであった(表20)。
この例で使用される場合、「非抱合」という用語は、オリゴヌクレオチドが抗体に抱合されなかったことを示す。
表20.カニクイザルにおけるDMDエキソン51スキッピングASOの組織分布
例18.mdxマウスにおけるバイオマーカー発現および筋機能に対する、DMDエキソン23スキッピングを誘導するオリゴヌクレオチドに抱合された抗TfR Fabを含有する抱合体の効果
この研究の目的は、mdxマウスにおけるジストロフィン発現および筋機能に対する、アンチセンスオリゴヌクレオチドに抱合された抗マウスTfR1 Fab(Ab-ASO)の単回用量、またはそのネイキッドASOの単回用量の効果を決定することであった。この例で使用した複合体は、例5に記載のDTX-C-042であった。
7週齢の雄mdxホモ接合型マウスは、8つの処置群のそれぞれに無作為に割て当てられた。マウスは、尾静脈を介して、30mg/kgの単回用量のASO、30mg/kgのASOに相当する用量のAb-ASO、または生理食塩水を投与された。組織が採取され、投与の2週間後または4週間後に分析された。
筋肉におけるエキソン23スキッピングの測定:エキソン23スキッピングの定量化は、75ngの全RNA投入量を用いて、SuperScript(登録商標)III(Thermo Fisher)を使用する単一段階RT-PCR反応を使用して行われた。使用したPCRプライマーは、5'-CACATCTTTGATGGTGTGAGG(フォワード)(配列番号2264)および5'-CAACTTCAGCCATCCATTTCTG(リバース)(配列番号2253)であった。毛細管電気泳動を使用して、以下の式:
Figure 2023535073000098
 を使用して、目的の骨格筋においてスキッピングされた、およびスキッピングされていないバンドを定量した。結果は、抗TfR Fab-オリゴヌクレオチド抱合体(Ab-ASO)の単回投与が、mdxマウスの四頭筋(図21A)、心臓(図21B)、および横隔膜(図21C)におけるエキソン23のスキッピングスキップの有意な増加を促進したことを実証する。対照的に、野生型(WT)マウスまたは生理食塩水もしくはネイキッドASOで処置したmdxマウスの同じ筋組織では、エキソン23スキッピングはほとんど、または全く観察されなかった。
筋肉中のジストロフィンタンパク質の測定:四頭筋から採取した筋組織サンプルは均質化され、BCAアッセイによってタンパク質濃度が測定された。全タンパク質(25μg)は、3％～8％ Tris-アセテートタンパク質ゲルに充填され、150Vで1時間泳動された。次いで、ゲルはポリフッ化ビニリデン膜に転写され、膜は切断され、ジストロフィン含有部分は抗ジストロフィン抗体(Abcamカタログ＃15277)中で4℃にて一晩インキュベートされ、続いてヤギ抗ウサギIgG(H＋L)西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合体(Bio-Rad)中で室温にて30分間インキュベートされた。対照として、ブロットの残りの部分が、抗アルファ-アクチニン抗体(Abcamカタログ番号9465)と共に4℃で一晩、続いてヤギ抗マウスIgG(H＋L)西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合体(Bio-Rad)と共に室温で15分間インキュベートされた。ブロットを、ECL Western Detection Kit(Cytiva)を使用して発色させ、iBright分析ソフトウェア(Thermo Fisher Scientific)を使用して定量した。ウエスタンブロットの画像は、注射の2週間後に収集された筋肉組織について図22A(四頭筋)、図23A(心臓)、および図24A(横隔膜)に示され、ウエスタンブロット結果の定量化は、図22B(四頭筋)、図23B(心臓)、および図24B(横隔膜)に示される。ウエスタンブロットの画像は、注射の4週間後に収集された筋肉組織について図22C(四頭筋)、図23C(心臓)、および図24C(横隔膜)に示され、ウエスタンブロット結果の定量化は、図22D(四頭筋)、図23D(心臓)、および図24D(横隔膜)に示される。各ウエスタンブロットでは、野生型およびmdx組織由来のプールしたタンパク質を用いて標準曲線が作成され、各標準におけるパーセンテージ野生型(％WT)タンパク質は、サンプル中の野生型タンパク質の量を示す。図22A～図22Dは、投与後2週間および4週間で、四頭筋のジストロフィンタンパク質の増加を、Ab-ASOがネイキッドASOよりも大幅に促進したことを実証している。図23A～図23Dは、投与後2週間および4週間で、Ab-ASOが心臓筋のジストロフィンタンパク質の増加を促進したが、非抱合ASOで処置したマウスの心臓筋では野生型ジストロフィンがほとんど、または全く測定されなかったことを実証している。図24A～図24Dは、投与後2週間および4週間で、Ab-ASOが横隔膜筋のジストロフィンタンパク質の増加を促進したが、ネイキッドASOで処置したマウスの横隔膜筋では野生型ジストロフィンがほとんど、または全く測定されなかったことを実証している。
組織内のASO含有量の測定:酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)は、NeutrAvidin被覆プレートを目的のASOに特異的な捕捉プローブでコーティングすることによって行われた。プロテイナーゼK消化組織溶解物が被覆プレート上でインキュベートされ、目的のASOを捕捉プローブに結合させた。次いで、プレートは洗浄され、未結合捕捉プローブがミクロコッカスヌクレアーゼで消化された後、さらに洗浄し、ブロッキングした。ジゴキシゲニンHRP抱合抗体が添加され、無傷の捕捉プローブに結合させ、次いで、TMB基質(R&D Systems,Inc.)を使用して画像化された。定量化は、骨格筋マトリックス中に希釈した既知濃度の標準曲線を用いて行われた。結果は、Fab抱合体の投与が、四頭筋(図25A)、横隔膜(図25B)および心臓(図25C)内のASOの実質的な蓄積を達成することができるのに対して、ネイキッドASOの投与は、各筋組織中のASO含有量をほとんど、または全く示さなかったことを実証している。これらの結果は、生理食塩水またはネイキッドASOを投与したマウスの筋組織ではASOがほとんどまたは全く検出されなかったが、Ab-ASOの投与は、投与後2週間および4週間で試験した各組織で測定可能な量のASOをもたらしたことを実証している。
例19.DMDエキソン53スキッピングオリゴヌクレオチドの抗TfR1抗体への抱合は、その力価を改善する
エキソン53スキッピングオリゴヌクレオチドに対する抗TfR1標的化の効果を試験するために、式(C)の構造を有するリンカーを介してエキソン53スキッピングPMOに共有結合的に連結された抗TfR1 Fab抗体(3M12 VH4/Vk3)を含む複合体が形成された。この例では、2つのエキソン53スキッピングPMO:配列GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC(配列番号2256)を含むエキソン53 PMO-A、および配列CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC(配列番号2257)を含むエキソン53 PMO-Bが使用された。
最初に、ジムノティック(gymnotic)取り込み後にエキソン53のスキッピングを促進にする(すなわち、トランスフェクション剤または修飾なしで筋標的化をもたらす)能力について、エキソン53スキップPMO単独が試験された。DMDエキソン52の欠失を有するKM1328 DMD患者細胞が、ある範囲の濃度のエキソン53 PMO-Aまたはエキソン53 PMO-Bで処置され、エキソン53のスキッピングが測定された。図26に示すように、エキソン53 PMO-Aは、エキソン53 PMO-Bよりも約2倍強力であった。用量応答曲線に基づいて、エキソン53の50％スキッピングを達成するためには、2.5μMのエキソン53 PMO-Aまたは4.7μMのエキソン53 PMO-Bの濃度が必要であると計算された。
次に、エキソン53 PMO-Aまたはエキソン53 PMO-Bのいずれかに共有結合的に連結された抗TfR1 Fabを含む複合体(「抗TfR1 Fab-ASO複合体」)は、抗体に連結していない同じPMO(「ネイキッドASO」)と比較して、KM1328 DMD患者細胞におけるエキソン53のスキッピングを促進するそれらの能力について試験された。細胞は、0.16μM、0.32μM、0.63μMもしくは1.25μMの濃度のネイキッドASO、または0.16μM、0.32μM、0.63μMもしくは1.25μMのASO当量濃度の抗TfR1 Fab-ASO複合体で処置された。図27に示すように、Fab-ASO複合体は、試験した各濃度でネイキッドASOよりも多いエキソン53スキッピングを達成し、試験したより低い用量(0.16μM、0.32μMおよび0.63μM)でのエキソン53 PMO-Aによるエキソン53スキッピングの著しい改善の達成を包含する。これらの結果は、エキソンスキッピングオリゴヌクレオチドを抗TfR1抗体に共有結合的に連結することにより、より低用量でのエキソンスキッピング活性を促進することができ、それにより、より低用量でのオリゴヌクレオチドの有効性を可能にすることを実証する。
追加の態様
1.DMD遺伝子の発現または活性を促進するように構成された分子ペイロードに共有結合的に連結された筋標的化剤を含む複合体であって、筋標的化剤は、筋細胞上の内在化細胞表面受容体に特異的に結合し、
筋標的化剤は、ヒト化抗体であり、
抗体は、以下を含む: (i)配列番号69と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号70と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(ii)配列番号71と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号70と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(iii)配列番号72と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号70と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(iv)配列番号73と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号74と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(v)配列番号73と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号75と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(vi)配列番号76と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号74と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(vii)配列番号76と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号75と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(viii)配列番号77と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号78と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(ix)配列番号79と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号80と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);または
(x)配列番号77と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH); および/または配列番号80と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL)。
2.抗体が以下を含む、態様1に記載の複合体:
(i)配列番号69のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号70のアミノ酸配列を含むVL;
(ii)配列番号71のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号70のアミノ酸配列を含むVL;
(iii)配列番号72のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号70のアミノ酸配列を含むVL;
(iv)配列番号73のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号74のアミノ酸配列を含むVL;
(v)配列番号73のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号75のアミノ酸配列を含むVL;
(vi)配列番号76のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号74のアミノ酸配列を含むVL;
(vii)配列番号76のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号75のアミノ酸配列を含むVL;
(viii)配列番号77のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号78のアミノ酸配列を含むVL;
(ix)配列番号79のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号80のアミノ酸配列を含むVL;または
(x)配列番号77のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号80のアミノ酸配列を含むVL。
3.抗体が、完全長IgG、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント、scFv、およびFvからなる群から選択される、態様1または態様2に記載の複合体。
4.抗体が完全長IgGであり、場合により完全長IgGがアイソタイプIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4の重鎖定常領域を含む、態様3に記載の複合体。
5.抗体が以下を含む、態様4に記載の複合体:
(i)配列番号84と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号85と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(ii)配列番号86と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号85と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(iii)配列番号87と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号85と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(iv)配列番号88と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号89と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(v)配列番号88と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号90と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(vi)配列番号91と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号89と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(vii)配列番号91と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号90と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(viii)配列番号92と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号93と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(ix)配列番号94と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号95と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;または
(x)配列番号92と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号95と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖。
6.抗体がFabフラグメントである、態様3に記載の複合体。
7.抗体が以下を含む、態様6に記載の複合体:
(i)配列番号97と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号85と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(ii)配列番号98と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号85と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(iii)配列番号99と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号85と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(iv)配列番号100と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号89と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(v)配列番号100と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号90と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(vi)配列番号101と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号89と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(vii)配列番号101と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号90と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(viii)配列番号102と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号93と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(ix)配列番号103と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号95と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;または
(x)配列番号102と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号95と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖。
8.抗体が以下を含む、態様6または態様7に記載の複合体:
(i)配列番号97のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(ii)配列番号98のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(iii)配列番号99のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(iv)配列番号100のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号89のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(v)配列番号100のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(vi)配列番号101のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号89のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(vii)配列番号101のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(viii)配列番号102のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号93のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(ix)配列番号103のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号95のアミノ酸配列を含む軽鎖;または
(x)配列番号102のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号95のアミノ酸配列を含む軽鎖。
9.トランスフェリン受容体に対する抗体の結合の平衡解離定数(KD)が、10-11Mから10-6Mまでの範囲にある、態様1～8のいずれか1つに記載の複合体。
10.抗体が、トランスフェリン受容体のトランスフェリン結合部位に特異的に結合せず、および/または筋標的化抗体がトランスフェリン受容体に対するトランスフェリンの結合を阻害しない、態様1～9のいずれか1つに記載の複合体。
11.抗体が、ヒト、非ヒト霊長類および齧歯類のトランスフェリン受容体の2以上の細胞外エピトープと交差反応性である、態様1～10のいずれか1つに記載の複合体。
12.トランスフェリン受容体によって媒介される、分子ペイロードの筋細胞内への内在化を促進するように複合体が構成される、態様1～11のいずれか1つに記載の複合体。
13.抗体がキメラ抗体であり、任意にキメラ抗体がヒト化モノクローナル抗体である、態様1～12のいずれか1つに記載の複合体。
14.抗体が、ScFv、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント、またはFvフラグメントの形態である、態様1～13のいずれか1つに記載の複合体。
15.分子ペイロードがオリゴヌクレオチドである、態様1～14のいずれか1つに記載の複合体。
16.オリゴヌクレオチドが、表14に列挙される遺伝子またはそれからコードされるmRNAと相補性の領域を含む、態様15に記載の複合体。
16.1 オリゴヌクレオチドが、配列番号437～1241のいずれか1つを含む、または配列番号1242～2046のいずれか1つと相補性のある領域を含む、態様15に記載の複合体。
17 オリゴヌクレオチドが、突然変異型DMDアレルに相補性のある領域を含む、態様16または16.1に記載の複合体。
18. 分子ペイロードが、ポリペプチドである、態様1～14のいずれか1つに記載の複合体。
19. ポリペプチドが、ジストロフィンタンパク質の機能的フラグメントである、態様18に記載の複合体。
20. オリゴヌクレオチドが、モノまたはマルチエキソンスキッピングによってDMD対立遺伝子における切断変異を抑制するように構成される、態様15～17のいずれか１つに記載の複合体。
21. オリゴヌクレオチドが、アンチセンスを媒介したエキソンスキッピングを促進し、インフレームのジストロフィンmRNAを生成する、態様15～17のいずれか1つに記載の複合体。
22. オリゴヌクレオチドが、エキソン8～エキソン55、任意に、エキソン23～エキソン53の範囲内のDMDのエキソンのスキップを促進する、態様21に記載の複合体。
23. オリゴヌクレオチドが、エキソン8、エキソン23、エキソン44、エキソン45、エキソン50、エキソン51、エキソン52、エキソン53、および／またはエキソン55のスキップを促進する、態様22に記載の複合体。
24. オリゴヌクレオチドが、エキソン51のスキッピングを促進する、態様21に記載の複合体。
25. オリゴヌクレオチドが、エキソン44～エキソン53の範囲内の複数のエキソンのスキップを促進する、態様24に記載の複合体。
26. オリゴヌクレオチドが、少なくとも1つの修飾ヌクレオチド間連結を含む、態様15～25のいずれか1つに記載の複合体。
27. 少なくとも1つの修飾されたヌクレオチド間連結が、ホスホロチオアート連結である、態様26記載の複合体。
28. オリゴヌクレオチドが、Rp立体化学的配座および/またはSp立体化学的配座でのホスホロチオアート連結を含む、態様27に記載の複合体。
29. オリゴヌクレオチドが、すべてがRp立体化学的配座であるか、またはすべてがSp立体化学的配座であるホスホロチオアート連結を含む、態様28に記載の複合体。
30.オリゴヌクレオチドが1つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、態様15～17または20～29のいずれか1つに記載の複合体。
31. 1つ以上の修飾ヌクレオチドが2'修飾ヌクレオチドである、態様30に記載の複合体。
32. オリゴヌクレオチドが、細胞においてDMDの発現を負に調節するmiRNAのRNAse H媒介切断を導くgapmerオリゴヌクレオチドであり、任意に、ここでmiRNAが、miR-31である態様15～17または20～31のいずれか1つに記載の複合体。
33. gapmerオリゴヌクレオチドが、2～8修飾ヌクレオチドのウイングによってフランキングされた5～15デオキシリボヌクレオチドの中央部分を含む、態様32に記載の複合体。
34. ウイングの修飾ヌクレオチドが2'修飾ヌクレオチドである、態様33に記載の複合体。
35. オリゴヌクレオチドがmixmerオリゴヌクレオチドである、態様15～17または20～31のいずれか1つに記載の複合体。
36. mixmerオリゴヌクレオチドがエキソンスキッピングを促進する、態様35に記載の複合体。
37. mixmerオリゴヌクレオチドが2以上の異なる2'修飾ヌクレオチドを含む、態様35または36に記載の複合体。
38. オリゴヌクレオチドが、細胞においてDMDの発現を負に調節するmiRNAのRNAi媒介切断を促進するRNAiオリゴヌクレオチドであり、任意に、ここでmiRNAが、miR-31である態様15～17または20～31のいずれか1つに記載の複合体。
39. RNAiオリゴヌクレオチドが、長さが19～25ヌクレオチドの二本鎖オリゴヌクレオチドである、態様38に記載の複合体。
40. RNAiオリゴヌクレオチドが、少なくとも1つの2'修飾ヌクレオチドを含む、態様38または39に記載の複合体。
41. 各2'修飾ヌクレオチドが、2'-O-メチル、2'-フルオロ(2'-F)、2'-O-メトキシエチル(2'-MOE)、および2',4'架橋ヌクレオチドからなる群から選択される、態様31、34、37、または40のいずれか1つに記載の複合体。
42. 1つ以上の修飾ヌクレオチドが架橋ヌクレオチドである、態様30に記載の複合体。
43. 少なくとも1つの2'修飾ヌクレオチドが、2',4'-拘束2'-O-エチル(cEt)およびロックド核酸(LNA)ヌクレオチドから選択される2',4'架橋ヌクレオチドである、態様31、34、37、または40のいずれか1つに記載の複合体。
44. オリゴヌクレオチドがゲノム編集ヌクレアーゼのためのガイド配列を含む、態様15～17または20～31のいずれか1つに記載の複合体。
45. オリゴヌクレオチドがホスホロジアミダイトモルフォリノオリゴマーである、態様15～17または20～31のいずれか1つに記載の複合体。
46. 筋標的化剤が、切断可能なリンカーを介して分子ペイロードへ共有結合的に連結される、態様1～45のいずれか1つに記載の複合体。
47. 切断可能なリンカーが、プロテアーゼ感受性リンカー、pH感受性リンカー、およびグルタチオン感受性リンカーから選択される、態様46に記載の複合体。
48. 切断可能なリンカーがプロテアーゼ感受性リンカーである、態様47に記載の複合体。
49. プロテアーゼ感受性リンカーが、リソソームプロテアーゼおよび/またはエンドソームプロテアーゼによって切断可能な配列を含む、態様48に記載の複合体。
50. プロテアーゼ感受性リンカーがバリン-シトルリンジペプチド配列を含む、態様48に記載の複合体。
51. リンカーが、4～6の範囲のpHにおいて切断されるpH感受性リンカーである、態様47に記載の複合体。
52. 抗体が、非切断可能なリンカーを介して分子ペイロードへ共有結合的に連結される、態様1～45のいずれか1つに記載の複合体。
53. 非切断可能なリンカーがアルカンリンカーである、態様52に記載の複合体。
54. 抗体が非天然アミノ酸を含み、これにオリゴヌクレオチドが共有結合的に連結される、態様1～53のいずれか1つに記載の複合体。
55. 抗体が、抗体のリジン残基またはシステイン残基への抱合を介してオリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結される、態様1～53のいずれか1つに記載の複合体。
56. オリゴヌクレオチドが、マレイミド含有リンカーを介して抗体のシステインに抱合され、任意にマレイミド含有リンカーが、マレイミドカプロイルまたはマレイミドメチルシクロヘキサン-1-カルボキシレート基を含む、態様55に記載の複合体。
57. 抗体が、グリコシル化抗体であり、これが、オリゴヌクレオチドが共有結合的に連結される少なくとも1つの糖部分を含む、態様1～56のいずれか1つに記載の複合体。
58. 糖部分が分岐型マンノースである、態様57に記載の複合体。
59. 抗体が、グリコシル化抗体であり、これが1～4つの糖部分を含み、これら各々が別個のオリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結される、態様57または58に記載の複合体。
60. 抗体が完全グリコシル化抗体である、態様57に記載の複合体。
61. 抗体が部分グリコシル化抗体である、態様57に記載の複合体。
62. 部分グリコシル化抗体が、化学的または酵素的手段によって産生される、態様61に記載の複合体。
63. 部分グリコシル化抗体が、細胞、N-またはO-グリコシル化経路の酵素を欠乏している細胞において産生される、態様61に記載の複合体。
64. 細胞を態様1～63のいずれか1つに記載の複合体と接触させることを含む、トランスフェリン受容体を発現する細胞に分子ペイロードを送達する方法。
65. 態様1～63のいずれか1つに記載の複合体を、細胞への分子ペイロードの内在化を促進するのに有効な量で細胞と接触させることを含む、DMDタンパク質の発現または活性を促進する方法。
66. 細胞がin vitroである、態様65に記載の方法。
67. 細胞が対象に存在する、態様65に記載の方法。
68. 対象がヒトである、態様67に記載の方法。
69. 態様1～63のいずれか1つに記載の複合体の有効量を対象へ投与することを含む、ジストロフィン異常症に関連する突然変異型DMDアレルを有する対象を処置する方法。
70. 細胞においてDMD mRNA転写物のエキソンスキッピングを促進する方法であって、方法が、態様1～63のいずれか１つに記載の複合体の有効量を細胞に投与することを含む方法。
71. 方法が、DMD mRNA転写物のエキソン8、エキソン23、エキソン44、エキソン45、エキソン50、エキソン51、エキソン52、エキソン53、および／またはキクソン55のスキッピングを促進する、態様70に記載の方法。
72. 方法が、DMD mRNA転写物のエキソン51のスキッピングを促進する、態様70または72に記載の方法。
73. DMD遺伝子の発現または活性を促進するために構成された分子ペイロードに共有結合的に連結された抗トランスフェリン受容体(TfR)抗体を含む複合体であって、抗体が、以下を含む:
(i)配列番号76と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号75と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(ii)配列番号69と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号70と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(iii)配列番号71と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号70と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(iv)配列番号72と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号70と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(v)配列番号73と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号74と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(vi)配列番号73と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号75と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(vii)配列番号76と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号74と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(viii)配列番号77と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号78と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(ix)配列番号79と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号80と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);または
(x)配列番号77と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH); および/または配列番号80と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL)。
73. DMD遺伝子の発現または活性を促進するために構成された分子ペイロードに共有結合的に連結された抗トランスフェリン受容体(TfR)抗体を含む複合体であって、抗TfR抗体が、翻訳後修飾に起因するピログルタメート形成を受けている、複合体。
等価物および用語
例証的に本明細書に記載された開示は、好適には、本明細書に具体的には開示されないいずれかの要素(単数または複数)、限定(単数または複数)の非存在下において実施され得る。それゆえに、例えば、本出願の各事例において、用語「含む」、「から本質的になる」、および「からなる」のいずれかは、他の2つの用語のどちらかによって置き換えられ得る。採用された用語および表現は、限定ではなく記載の用語として使用され、かかる用語および表現の使用には、示されるおよび記載される特徴のいずれかの等価物またはそれらの部分を排除する意図はなく、種々の改変が本開示の範囲内で可能であることが認識される。それゆえに、本開示は好ましい態様によって具体的に開示されたが、本明細書に開示される概念の任意の特徴、改変、および変形が当業者によって頼られ得ることと、かかる改変および変形は本開示の範囲内であると考慮されることとは理解されるべきである。
加えて、本開示の特徴または側面がマーカッシュ群または代替物の他の群分けとして記載されるところでは、当業者は、本開示がそれによってマーカッシュ群または他の群のいずれかの個々の構成員または構成員のサブグループとしてもまた記載されることを認識するであろう。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドまたは他の核酸の構造を記載する際には、配列表で提示される配列が参照され得ることは了解されるべきである。かかる態様において、実際のオリゴヌクレオチドまたは他の核酸は、指定された配列と本質的に同じかまたは類似の相補的な特性を保持しながら、指定された配列と比較して、1以上の代替的なヌクレオチド(例として、DNAヌクレオチドのRNAカウンターパート、またはRNAヌクレオチドのDNAカウンターパート)および/または(例として、および)1以上の修飾ヌクレオチドおよび/または(例として、および)1以上の修飾されたヌクレオチド間連結および/または(例として、および)1以上の他の改変を有し得る。
本発明を記載する文脈における(特に次の請求項の文脈における)用語「a」および「an」および「the」ならびに類似のレファレントの使用は、本明細書に別様に指し示されないかまたは文脈によって明瞭に否定されない限り、単数および複数両方をカバーすると解釈されるべきである。用語「含む」、「有する」、「包含する」、および「含有する」は、別様に指摘されない限り、開放型の用語として解釈されるべきである(すなわち、「包含するが、これらに限定されない」を意味する)。本明細書における値の範囲の記載は、本明細書に別様に指し示されない限り、単に、範囲内に収まる各別個の値を個々に参照する簡略な方法として働くことを意図され、各別個の値は、それが本明細書に個々に記載される場合のように本明細書に組み込まれる。本明細書に別様に指し示されないかまたは別様には文脈によって明瞭に否定されない限り、本明細書に記載のすべての方法はいずれかの好適な順序で行われ得る。別様に請求されない限り、本明細書に提供されるいずれかのおよびすべての例または例示的な文言(例として、「などの」)の使用は、単に本発明をより良く解き明かすことを意図され、本発明の範囲に限定を課さない。本明細書のいかなる文言も、いずれかの請求されない要素を本発明の実施にとって必須であると指し示すものと解釈されるべきではない。
本発明の態様が本明細書に記載されている。それらの態様の変形は、先述の記載を読むことによって当業者には明らかになり得る。
本発明者は当業者がかかる変形を適当に採用することを予期し、本発明者は本発明が本明細書に具体的に記載されるとおりとは別様に実施されることを意図する。したがって、本発明は、然るべき法律によって許可される本明細書に添付される請求項に記載される主題のすべての改変および等価物を包含する。その上、それらのすべての可能な変形における上に記載された要素のいずれかの組み合わせは、本明細書に別様に指し示されないかまたは別様に文脈によって明瞭に否定されない限り、本発明によって包摂される。当業者は、本明細書に記載される本発明の特定の態様の多くの均等物を認識するか、またはせいぜい慣例的な実験作業を用いて確かめることができるであろう。かかる等価物は次の請求項によって包摂されることを意図される。

Claims (28)

  1. DMD遺伝子の発現または活性を促進するために構成された分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗トランスフェリン受容体（TfR）抗体を含む複合体であって、抗体が、
    (i)配列番号76と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号75と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
    (ii)配列番号69と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号70と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
    (iii)配列番号71と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号70と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
    (iv)配列番号72と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号70と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
    (v)配列番号73と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号74と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
    (vi)配列番号73と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号75と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
    (vii)配列番号76と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号74と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
    (viii)配列番号77と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号78と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
    (ix)配列番号79と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号80と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);または
    (x)配列番号77と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH); および/または配列番号80と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL)
    を含む、前記複合体。
  2. 抗体が、
    (i)配列番号76のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号75のアミノ酸配列を含むVL;
    (ii)配列番号69のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号70のアミノ酸配列を含むVL;
    (iii)配列番号71のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号70のアミノ酸配列を含むVL;
    (iv)配列番号72のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号70のアミノ酸配列を含むVL;
    (v)配列番号73のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号74のアミノ酸配列を含むVL;
    (vi)配列番号73のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号75のアミノ酸配列を含むVL;
    (vii)配列番号76のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号74のアミノ酸配列を含むVL;
    (viii)配列番号77のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号78のアミノ酸配列を含むVL;
    (ix)配列番号79のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号80のアミノ酸配列を含むVL;または
    (x)配列番号77のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号80のアミノ酸配列を含むVL
    を含む、請求項1に記載の複合体。
  3. 抗体が、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント、scFv、Fv、および完全長IgGからなる群から選択される、請求項1または2に記載の複合体。
  4. 抗体が、Fabフラグメントである、請求項3に記載の複合体。
  5. 抗体が、
    (i)配列番号101と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号90と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
    (ii)配列番号97と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号85と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
    (iii)配列番号98と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号85と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
    (iv)配列番号99と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号85と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
    (v)配列番号100と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号89と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
    (vi)配列番号100と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号90と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
    (vii)配列番号101と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号89と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
    (viii)配列番号102と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号93と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
    (ix)配列番号103と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号95と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;または
    (x)配列番号102と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号95と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖
    を含む、請求項4に記載の複合体。
  6. 抗体が、
    (i)配列番号101のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖;
    (ii)配列番号97のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖;
    (iii)配列番号98のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖;
    (iv)配列番号99のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖;
    (v)配列番号100のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号89のアミノ酸配列を含む軽鎖;
    (vi)配列番号100のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖;
    (vii)配列番号101のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号89のアミノ酸配列を含む軽鎖;
    (viii)配列番号102のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号93のアミノ酸配列を含む軽鎖;
    (ix)配列番号103のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号95のアミノ酸配列を含む軽鎖;または
    (x)配列番号102のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号95のアミノ酸配列を含む軽鎖
    を含む、請求項4または5に記載の複合体。
  7. 抗体が、トランスフェリン受容体のトランスフェリン結合部位へ特異的に結合せず、および/または筋標的化抗体が、トランスフェリン受容体へのトランスフェリンの結合を阻害しない、請求項1～6のいずれか一項に記載の複合体。
  8. 分子ペイロードが、オリゴヌクレオチドである、請求項1～7のいずれか一項に記載の複合体。
  9. オリゴヌクレオチドがDMD RNAにおけるエキソンスキッピングを促進する、請求項8に記載の複合体。
  10. オリゴヌクレオチドが、エキソン8からエキソン55の範囲におけるDMDのエキソンのスキッピングを促進する、請求項9に記載の複合体。
  11. オリゴヌクレオチドが、エキソン8、エキソン23、エキソン43、エキソン44、エキソン45、エキソン46、エキソン50、エキソン51、エキソン52、エキソン53、および／またはエキソン55のスキッピングを促進する、請求項9または10に記載の複合体。
  12. オリゴヌクレオチドが、DMD転写物の1つ以上の完全なまたは部分的なエキソニックスプライシングエンハンサー（ESE）と相補性のある領域を含む、請求項8～11のいずれか一項に記載の複合体。
  13. オリゴヌクレオチドが、配列番号402～436および2043～2238で表されるとおりの1つ以上の完全なまたは部分的なESEを含む標的配列と相補性のある領域を含む、請求項8～12のいずれか一項に記載の複合体。
  14. オリゴヌクレオチドが、エキソン51のスキッピングを促進する、請求項8～13のいずれか一項に記載の複合体。
  15. オリゴヌクレオチドが、長さが20～30ヌクレオチドであり、および配列番号402～436のいずれか1つで表されるとおりのESEの少なくとも4つの連続したヌクレオチドを含む標的配列と相補性のある領域を含む、請求項8～14のいずれか一項に記載の複合体。
  16. オリゴヌクレオチドが、配列番号437～1241のいずれか1つを含む、または配列番号1242～2046のいずれか1つと相補性のある領域を含む、請求項8～14のいずれか一項に記載の複合体。
  17. オリゴヌクレオチドが、表14に列挙されるオリゴヌクレオチドの標的配列と相補性のある領域を含む、請求項8～10のいずれか一項に記載の複合体。
  18. オリゴヌクレオチドが、表14に列挙される配列を含み、オリゴヌクレオチド中のウラシル塩基（U）のいずれか1つ以上が、任意にチミン塩基（T）であってもよい、請求項8～10および17のいずれか一項に記載の複合体。
  19. オリゴヌクレオチドが、少なくとも1つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、請求項8～18のいずれか一項に記載の複合体。
  20. 少なくとも1つの修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項19に記載の複合体。
  21. オリゴヌクレオチドが1つ以上の修飾ヌクレオシドを含む、請求項8～20のいずれか一項に記載の複合体。
  22. 1つ以上の修飾ヌクレオシドが、2'-修飾ヌクレオシドである、請求項21に記載の複合体。
  23. オリゴヌクレオチドが、1つ以上のホスホロジアミダートモルホリノを含み、任意にオリゴヌクレオチドが、ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー（PMO）である、請求項8～18のいずれか一項に記載の複合体。
  24. 抗体が、切断可能なリンカーを介して分子ペイロードに共有結合されている、請求項1～23のいずれか一項に記載の複合体。
  25. 切断可能なリンカーが、バリン－シトルリン配列を含む、請求項24に記載の複合体。
  26. 抗体が、抗体のリジン残基またはシステイン残基への抱合を介して分子ペイロードに共有結合的に連結されている、請求項1～25のいずれか一項に記載の複合体。
  27. 細胞中のDMDタンパク質の発現または活性を促進する方法であって、方法が、細胞を請求項1～26のいずれか一項に記載の複合体と、細胞への分子ペイロードの内在化を促進するのに有効な量で接触させることを含み、任意に、細胞が筋細胞である、前記方法。
  28. ジストロフィン異常症に関連する突然変異したDMDアレルを有する対象を処置する方法であって、方法が、有効量の請求項1～26のいずれか一項に記載の複合体を対象へ投与することを含む、前記方法。
JP2023504634A 2020-07-23 2021-07-09 ジストロフィン異常症を処置するための筋標的化複合体およびそれらの使用 Pending JP2023535073A (ja)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063055777P 2020-07-23 2020-07-23
US63/055,777 2020-07-23
US202063069077P 2020-08-23 2020-08-23
US63/069,077 2020-08-23
US202163143829P 2021-01-30 2021-01-30
US63/143,829 2021-01-30
PCT/US2021/040998 WO2022020107A1 (en) 2020-07-23 2021-07-09 Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2023535073A true JP2023535073A (ja) 2023-08-15

Family

ID=79728346

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023504634A Pending JP2023535073A (ja) 2020-07-23 2021-07-09 ジストロフィン異常症を処置するための筋標的化複合体およびそれらの使用

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20230285586A1 (ja)
EP (1) EP4185330A1 (ja)
JP (1) JP2023535073A (ja)
KR (1) KR20230044242A (ja)
CN (1) CN116368150A (ja)
AU (1) AU2021312709A1 (ja)
BR (1) BR112023001125A2 (ja)
CA (1) CA3186752A1 (ja)
IL (1) IL299662A (ja)
MX (1) MX2023000984A (ja)
WO (1) WO2022020107A1 (ja)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3108282A1 (en) 2018-08-02 2020-02-06 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
KR20210081324A (ko) 2018-08-02 2021-07-01 다인 세라퓨틱스, 인크. 근육 표적화 복합체 및 안면견갑상완 근육 이영양증을 치료하기 위한 그의 용도
US11911484B2 (en) 2018-08-02 2024-02-27 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating myotonic dystrophy
US12018087B2 (en) 2018-08-02 2024-06-25 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle-targeting complexes comprising an anti-transferrin receptor antibody linked to an oligonucleotide and methods of delivering oligonucleotide to a subject
WO2022270585A1 (ja) 2021-06-23 2022-12-29 日本新薬株式会社 アンチセンスオリゴマーの組み合わせ
US11638761B2 (en) 2021-07-09 2023-05-02 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating Facioscapulohumeral muscular dystrophy
US11969475B2 (en) 2021-07-09 2024-04-30 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating facioscapulohumeral muscular dystrophy
US11633498B2 (en) 2021-07-09 2023-04-25 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating myotonic dystrophy
US11648318B2 (en) 2021-07-09 2023-05-16 Dyne Therapeutics, Inc. Anti-transferrin receptor (TFR) antibody and uses thereof
US11771776B2 (en) 2021-07-09 2023-10-03 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
US11931421B2 (en) 2022-04-15 2024-03-19 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and formulations for treating myotonic dystrophy

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR3049951A1 (fr) * 2016-04-12 2017-10-13 Univ Rabelais Francois Nouvelles constructions peptidiques et leur utilisation dans le traitement de la toxoplasmose
TW202015726A (zh) * 2018-05-30 2020-05-01 瑞士商諾華公司 Ｅｎｔｐｄ２抗體、組合療法、及使用該等抗體和組合療法之方法
CA3108282A1 (en) * 2018-08-02 2020-02-06 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies

Also Published As

Publication number Publication date
EP4185330A1 (en) 2023-05-31
WO2022020107A1 (en) 2022-01-27
CA3186752A1 (en) 2022-01-27
CN116368150A (zh) 2023-06-30
BR112023001125A2 (pt) 2023-02-14
MX2023000984A (es) 2023-05-03
AU2021312709A1 (en) 2023-03-16
IL299662A (en) 2023-03-01
KR20230044242A (ko) 2023-04-03
US20230285586A1 (en) 2023-09-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230111212A1 (en) Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
JP2023535073A (ja) ジストロフィン異常症を処置するための筋標的化複合体およびそれらの使用
JP2023512442A (ja) 顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーを処置するための筋標的化複合体およびそれらの使用
JP2023535444A (ja) 顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーを処置するための筋標的化複合体およびそれらの使用
JP2023509793A (ja) 筋緊張性ジストロフィーを処置するための筋標的化複合体およびその使用
US11771776B2 (en) Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
JP2023535074A (ja) 筋標的化複合体およびそれらの使用
JP2023510351A (ja) 筋標的化複合体およびそれらの使用
JP2023535078A (ja) 筋緊張性ジストロフィーを処置するための筋標的化複合体およびその使用
JP2023512441A (ja) 筋肉標的複合体および筋肉の健康に関連する遺伝子のモジュレーションのためのその使用
EP4093773A1 (en) Muscle-targeting complexes and uses thereof in treating muscle atrophy
WO2022020109A1 (en) Muscle-targeting complexes and uses thereof in treating muscle atrophy
WO2021142269A1 (en) Muscle targeting complexes and uses thereof for modulation of genes associated with muscle atrophy
WO2021142217A1 (en) Muscle targeting complexes and uses thereof for modulation of milck1
WO2021142260A1 (en) Muscle targeting complexes and uses thereof for modulation of acvr1
JP2024524222A (ja) 筋標的化複合体およびフリードライヒ運動失調症を処置するためのその使用