JP2023535074A - 筋標的化複合体およびそれらの使用 - Google Patents

筋標的化複合体およびそれらの使用 Download PDF

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カタナニ，モハマド，ティー．
ウィーデン，ティモシー
ローデス，ジェイソン，ピー．
デジャルダン，コディ，エー．
クイン，ブレンダン
ナジム，ジョン
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Abstract

本開示の側面は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された筋標的化剤を含む複合体に関する。いくつかの態様において、筋標的化剤は、筋細胞上の内在化する細胞表面受容体へ特異的に結合する。いくつかの態様において、分子ペイロードは、筋疾患に関連する疾患アレルの活性を阻害する。いくつかの態様において、分子ペイロードは、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはRNAiオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドである。

Description

関連出願
本出願は、2021年4月29日に出願された「MUSCLE-TARGETING COMPLEXES AND USES THEREOF」と題する米国仮特許出願第63/181450号、2021年1月30日に出願された「MUSCLE-TARGETING COMPLEXES AND USES THEREOF」と題する米国仮特許出願第63/143831号、2020年8月23日に出願された「MUSCLE-TARGETING COMPLEXES AND USES THEREOF」と題する米国仮特許出願第63/069078号、2020年8月6日に出願された「MUSCLE-TARGETING COMPLEXES AND USES THEREOF」と題する米国仮特許出願第63/061842号、および2020年7月23日に出願された「MUSCLE-TARGETING COMPLEXES AND USES THEREOF」と題する米国仮特許出願第63/055785号の米国特許法第119(e)条に基づく優先権を主張し、それら各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の分野
本出願は、分子ペイロード(molecular payloads)(例として、オリゴヌクレオチド)を細胞へ送達するための標的化複合体、およびそれらの使用、特に疾患の処置に関する使用、に関する。
EFS-WEBを介しテキストファイルとして提出された配列表への言及
本出願は配列表を含有する。これはEFS-WebからASCIIフォーマットで提出されており、その全体が参照によってここに組み込まれる。2021年7月8日に作成された該ASCIIコピーはD082470041WO00-SEQ-DWYという名称であり、サイズは152,275バイトである。
筋疾患は、生死を脅かす合併症へ繋がる筋肉衰弱および/または(例として、および)筋肉機能障害に、しばしば関連する。かかる疾患の多くの例が特徴付けられてきており、筋ジストロフィー(例として、デュシェンヌ型、顔面肩甲上腕型、筋強直性、および眼咽頭の)、ポンペ病、中心核ミオパチー、家族性肥大型心筋症、レイン遠位型ミオパチー、進行性骨化性線維異形成症、フリートライヒ運動失調症、筋原線維ミオパチー、およびその他の様々な形態が含有される。これらの疾病は、一般に遺伝性であるが、自発的に生じ得る。これらの疾病は、しばしば先天性であるが、後発的に生じ得る。多くの希少な筋疾患は、優性または劣性表現型を有してもよい機能獲得型または機能喪失型突然変異に関連する、単一の遺伝子障害である。例えば、活性化突然変異(activating mutations)は、筋疾患に寄与するイオンチャネル、構造タンパク質、代謝タンパク質、およびシグナリングタンパク質をコードする遺伝子中に同定されてきた。筋疾患の遺伝的病因学の理解における進歩に拘わらず、有効な処置の選択肢は未だに限られている。
いくつかの側面に従うと、本開示は、筋細胞を、分子ペイロードをそれらの細胞へ送達することを目的として、標的にする複合体を提供する。いくつかの態様において、本開示の複合体は、筋疾患アレルを標的にする分子ペイロードの筋肉特異的送達を容易にさせる。例えば、いくつかの態様において、本明細書に提供される複合体は、遺伝子の発現または活性を、その遺伝子に関連する筋疾患(例として、表1の遺伝子/疾患)を有するかまたはこれを有すると疑われる対象においてモジュレートする分子ペイロードを送達するのに特に有用である。いくつかの態様において、本明細書に提供される複合体は、分子ペイロードを筋細胞へ送達することを目的として、筋細胞の表面上の受容体へ特異的に結合する筋標的化剤(例として、筋標的化抗体)を含む。いくつかの態様において、複合体は、受容体(例として、トランスフェリン受容体)に媒介される内在化を介して細胞中へ取り入れられ、これを受け分子ペイロードは細胞内部に放出されて機能を果たしてもよい。例えば、オリゴヌクレオチドを送達するように改変された複合体は、オリゴヌクレオチドが筋疾患アレルの発現または活性をモジュレートし得るように、オリゴヌクレオチドを放出してもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、複合体のオリゴヌクレオチドと筋標的化剤とを接続する共有結合性リンカーのエンドソーム切断によって放出される。
本開示の一態様は、筋疾患遺伝子の発現または活性をモジュレートするように構成された分子ペイロードに共有結合的に連結された抗トランスフェリン受容体(TfR)抗体を含む複合体に関し、抗体は、以下を含む:
(i)配列番号76と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号75と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(ii)配列番号69と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号70と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(iii)配列番号71と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号70と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(iv)配列番号72と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号70と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(v)配列番号73と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号74と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(vi)配列番号73と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号75と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(vii)配列番号76と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号74と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(viii)配列番号77と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号78と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(ix)配列番号79と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号80と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);または
(x)配列番号77と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);配列番号80と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL)。
いくつかの態様では、抗体は、以下を含む:
(i)配列番号76のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号75のアミノ酸配列を含むVL;
(ii)配列番号69のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号70のアミノ酸配列を含むVL;
(iii)配列番号71のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号70のアミノ酸配列を含むVL;
(iv)配列番号72のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号70のアミノ酸配列を含むVL;
(v)配列番号73のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号74のアミノ酸配列を含むVL;
(vi)配列番号73のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号75のアミノ酸配列を含むVL;
(vii)配列番号76のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号74のアミノ酸配列を含むVL;
(viii)配列番号77のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号78のアミノ酸配列を含むVL;
(ix)配列番号79のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号80のアミノ酸配列を含むVL;または
(x)配列番号77のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号80のアミノ酸配列を含むVL。
いくつかの態様において、抗体は、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント、scFv、Fv、完全長IgG、からなる群から選択される。いくつかの態様において、抗体は、Fabフラグメントである。
いくつかの態様では、抗体は、以下を含む:
(i)配列番号101と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号90と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(ii)配列番号97と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号85と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(iii)配列番号98と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号85と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(iv)配列番号99と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号85と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(v)配列番号100と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号89と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(vi)配列番号100と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号90と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(vii)配列番号101と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号89と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(viii)配列番号102と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号93と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(ix)配列番号103と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号95と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;または
(x)配列番号102と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号95と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖。
いくつかの態様では、抗体は、以下を含む:
(i)配列番号101のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(ii)配列番号97のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(iii)配列番号98のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(iv)配列番号99のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(v)配列番号100のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号89のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(vi)配列番号100のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(vii)配列番号101のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号89のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(viii)配列番号102のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号93のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(ix)配列番号103のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号95のアミノ酸配列を含む軽鎖;または
(x)配列番号102のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号95のアミノ酸配列を含む軽鎖。
いくつかの態様では、抗体は、トランスフェリン受容体のトランスフェリン結合部位に特異的に結合せず、および/または抗体は、トランスフェリン受容体へのトランスフェリンの結合を阻害しない。
いくつかの態様では、抗体は、ヒト、非ヒト霊長類および齧歯類のトランスフェリン受容体の2つ以上の細胞外エピトープと交差反応性である。
いくつかの態様では、複合体は、トランスフェリン受容体によって媒介される筋細胞内への分子ペイロードの内在化を促進するように構成される。
いくつかの態様において、分子ペイロードは、オリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、機能獲得型疾患アレルを有する筋疾患遺伝子に相補性の領域を含む。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも1個の修飾ヌクレオシド間連結を含む。いくつかの態様において、少なくとも1個の修飾ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオアート連結である。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、1つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの態様において、1つ以上の修飾ヌクレオシドは、2'-修飾ヌクレオシドである。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、細胞中の筋疾患遺伝子によってコードされるmRNA転写産物のRNAse H媒介切断を指向するgapmerオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、mixmerオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、筋疾患遺伝子によってコードされるmRNA転写産物のRNAi媒介切断を促進するRNAiオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、2'-修飾ヌクレオシドは、2'-O-メチル、2'-フルオロ(2'-F)、2'-O-メトキシエチル(2'-MOE)、および2',4'-架橋ヌクレオシドからなる群から選択される。
いくつかの態様において、1つ以上の修飾ヌクレオシドは、2',4'-架橋ヌクレオシドである。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマーである。
いくつかの態様において、抗体は、分子ペイロードへ、切断可能なリンカーを介して共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、切断可能なリンカーは、バリン-シトルリン配列を含む。
いくつかの態様において、抗体は、抗体のリジン残基またはシステイン残基への抱合を介して分子ペイロードへ共有結合的に連結される。
いくつかの態様において、筋疾患遺伝子の発現または活性をモジュレートすることは、RNAおよび/またはタンパク質の発現を減少させることを含む。
本開示の別の態様は、細胞における筋疾患遺伝子の発現または活性をモジュレートする方法に関し、方法は、細胞を、分子ペイロードの細胞への内在化を促進するのに有効な量の本明細書に開示される複合体と接触させることを含み、場合により、細胞は筋細胞である。
いくつかの態様において、筋疾患は、成人型ポンペ病、中心核ミオパチー(CNM)、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー(FSHD)、家族性肥大型心筋症、進行性骨化性線維異形成症(FOP)、フリートライヒ運動失調症(FRDA)、2型封入体ミオパチー、レイン遠位型ミオパチー、筋原線維ミオパチー、先天性筋強直症(常染色体優性型、トムゼン病)、筋強直性ジストロフィーI型、筋強直性ジストロフィーII型、筋細管ミオパチー、眼咽頭型筋ジストロフィー、および先天性異常筋強直症からなる群から選択される疾患である。
本開示の別の態様は、筋疾患を有する対象を治療する方法に関し、方法は、本明細書に開示される複合体の有効量を対象に投与することを含み、場合により筋疾患は、成人型ポンペ病、中心核ミオパチー(CNM)、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー(FSHD)、家族性肥大型心筋症、進行性骨化性線維異形成症(FOP)、フリートライヒ運動失調症(FRDA)、2型封入体ミオパチー、レイン遠位型ミオパチー、筋原線維ミオパチー、先天性筋強直症(常染色体優性型、トムゼン病)、筋強直性ジストロフィーI型、筋強直性ジストロフィーII型、筋細管ミオパチー、眼咽頭型筋ジストロフィー、および先天性異常筋強直症からなる群から選択される疾患である。
図1は、ビヒクルトランスフェクションと比べた、DMPK発現レベルに対する、DMPK(ASO300)を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドでHepa1-6細胞をトランスフェクトする効果を示す、非限定的な概略図を描く。
図2Aは、DMPKアンチセンスオリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結された抗トランスフェリン受容体抗体を含む筋肉標的化複合体の、精製最中に得られたHIL-HPLCトレースを示す非限定的な概略図を描く。
図2Bは、筋肉標的化複合体のSDS-PAGE分析の非限定的な画像を描く。
ASO300を含む筋標的化RI7 217 Fab抗体-オリゴヌクレオチド(DTX-C-008)の、DMPK発現レベルを低下させる能力を示す非限定的な概略図を描く。
図4A～4Eは、ビヒクル処置、ネイキッドASO300での処置、または対照の非標的化複合体(DTX-C-007)での処置と比べた、ASO300を含む筋標的化RI7 217 Fab抗体-オリゴヌクレオチド複合体(DTX-C-008)の、in vivoでのマウス筋組織中DMPK発現レベルを低下させる能力を示す非限定的な概略図を描く。(N＝3 C57Bl/6 WTマウス) 図4A～4Eは、ビヒクル処置、ネイキッドASO300での処置、または対照の非標的化複合体(DTX-C-007)での処置と比べた、ASO300を含む筋標的化RI7 217 Fab抗体-オリゴヌクレオチド複合体(DTX-C-008)の、in vivoでのマウス筋組織中DMPK発現レベルを低下させる能力を示す非限定的な概略図を描く。(N＝3 C57Bl/6 WTマウス) 図4A～4Eは、ビヒクル処置、ネイキッドASO300での処置、または対照の非標的化複合体(DTX-C-007)での処置と比べた、ASO300を含む筋標的化RI7 217 Fab抗体-オリゴヌクレオチド複合体(DTX-C-008)の、in vivoでのマウス筋組織中DMPK発現レベルを低下させる能力を示す非限定的な概略図を描く。(N＝3 C57Bl/6 WTマウス) 図4A～4Eは、ビヒクル処置、ネイキッドASO300での処置、または対照の非標的化複合体(DTX-C-007)での処置と比べた、ASO300を含む筋標的化RI7 217 Fab抗体-オリゴヌクレオチド複合体(DTX-C-008)の、in vivoでのマウス筋組織中DMPK発現レベルを低下させる能力を示す非限定的な概略図を描く。(N＝3 C57Bl/6 WTマウス) 図4A～4Eは、ビヒクル処置、ネイキッドASO300での処置、または対照の非標的化複合体(DTX-C-007)での処置と比べた、ASO300を含む筋標的化RI7 217 Fab抗体-オリゴヌクレオチド複合体(DTX-C-008)の、in vivoでのマウス筋組織中DMPK発現レベルを低下させる能力を示す非限定的な概略図を描く。(N＝3 C57Bl/6 WTマウス)
図5A～5Bは、ASO300を含む筋標的化RI7 217 Fab抗体-オリゴヌクレオチド(DTX-C-008)の組織選択性を示す非限定的な概略図を描く。ASO300を含む筋標的化複合体(DTX-C-008)は、ビヒクル処置、ネイキッドASO300での処置、または対照の非標的化複合体(DTX-C-007)での処置と比べて、in vivoでマウス脳または脾臓組織におけるDMPK発現レベルを低下させない。(N＝3 C57Bl/6 WTマウス) 図5A～5Bは、ASO300を含む筋標的化RI7 217 Fab抗体-オリゴヌクレオチド(DTX-C-008)の組織選択性を示す非限定的な概略図を描く。ASO300を含む筋標的化複合体(DTX-C-008)は、ビヒクル処置、ネイキッドASO300での処置、または対照の非標的化複合体(DTX-C-007)での処置と比べて、in vivoでマウス脳または脾臓組織におけるDMPK発現レベルを低下させない。(N＝3 C57Bl/6 WTマウス)
図6A～6Fは、ビヒクル処置、ネイキッドASO300での処置、または対照の非標的化複合体(DTX-C-007)での処置と比べた、ASO300を含む筋標的化RI7 217 Fab抗体-オリゴヌクレオチド複合体(DTX-C-008)の、in vivoでのマウス筋組織中DMPK発現レベルを低下させる能力を示す非限定的な概略図を描く。(N＝5 C57Bl/6 WTマウス) 図6A～6Fは、ビヒクル処置、ネイキッドASO300での処置、または対照の非標的化複合体(DTX-C-007)での処置と比べた、ASO300を含む筋標的化RI7 217 Fab抗体-オリゴヌクレオチド複合体(DTX-C-008)の、in vivoでのマウス筋組織中DMPK発現レベルを低下させる能力を示す非限定的な概略図を描く。(N＝5 C57Bl/6 WTマウス) 図6A～6Fは、ビヒクル処置、ネイキッドASO300での処置、または対照の非標的化複合体(DTX-C-007)での処置と比べた、ASO300を含む筋標的化RI7 217 Fab抗体-オリゴヌクレオチド複合体(DTX-C-008)の、in vivoでのマウス筋組織中DMPK発現レベルを低下させる能力を示す非限定的な概略図を描く。(N＝5 C57Bl/6 WTマウス) 図6A～6Fは、ビヒクル処置、ネイキッドASO300での処置、または対照の非標的化複合体(DTX-C-007)での処置と比べた、ASO300を含む筋標的化RI7 217 Fab抗体-オリゴヌクレオチド複合体(DTX-C-008)の、in vivoでのマウス筋組織中DMPK発現レベルを低下させる能力を示す非限定的な概略図を描く。(N＝5 C57Bl/6 WTマウス) 図6A～6Fは、ビヒクル処置、ネイキッドASO300での処置、または対照の非標的化複合体(DTX-C-007)での処置と比べた、ASO300を含む筋標的化RI7 217 Fab抗体-オリゴヌクレオチド複合体(DTX-C-008)の、in vivoでのマウス筋組織中DMPK発現レベルを低下させる能力を示す非限定的な概略図を描く。(N＝5 C57Bl/6 WTマウス) 図6A～6Fは、ビヒクル処置、ネイキッドASO300での処置、または対照の非標的化複体(DTX-C-007)での処置と比べた、ASO300を含む筋標的化RI7 217 Fab抗体-オリゴヌクレオチド複合体(DTX-C-008)の、in vivoでのマウス筋組織中DMPK発現レベルを低下させる能力を示す非限定的な概略図を描く。(N＝5 C57Bl/6 WTマウス)
図7A～7Lは、ビヒクル処置(生理食塩水)と比べ、ネイキッドDMPK ASO(ASO300)と比較した、抗hTfR抗体に共有結合的に連結されたASO300を含む筋標的化抗体-オリゴヌクレオチド複合体(DTX-C-012)の、in vivoでのカニクイザル筋組織におけるDMPK発現レベルを低下させる能力を示す非限定的な概略図を描く。(N＝3匹のオスのカニクイザル) 図7A～7Lは、ビヒクル処置(生理食塩水)と比べ、ネイキッドDMPK ASO(ASO300)と比較した、抗hTfR抗体に共有結合的に連結されたASO300を含む筋標的化抗体-オリゴヌクレオチド複合体(DTX-C-012)の、in vivoでのカニクイザル筋組織におけるDMPK発現レベルを低下させる能力を示す非限定的な概略図を描く。(N＝3匹のオスのカニクイザル) 図7A～7Lは、ビヒクル処置(生理食塩水)と比べ、ネイキッドDMPK ASO(ASO300)と比較した、抗hTfR抗体に共有結合的に連結されたASO300を含む筋標的化抗体-オリゴヌクレオチド複合体(DTX-C-012)の、in vivoでのカニクイザル筋組織におけるDMPK発現レベルを低下させる能力を示す非限定的な概略図を描く。(N＝3匹のオスのカニクイザル) 図7A～7Lは、ビヒクル処置(生理食塩水)と比べ、ネイキッドDMPK ASO(ASO300)と比較した、抗hTfR抗体に共有結合的に連結されたASO300を含む筋標的化抗体-オリゴヌクレオチド複合体(DTX-C-012)の、in vivoでのカニクイザル筋組織におけるDMPK発現レベルを低下させる能力を示す非限定的な概略図を描く。(N＝3匹のオスのカニクイザル) 図7A～7Lは、ビヒクル処置(生理食塩水)と比べ、ネイキッドDMPK ASO(ASO300)と比較した、抗hTfR抗体に共有結合的に連結されたASO300を含む筋標的化抗体-オリゴヌクレオチド複合体(DTX-C-012)の、in vivoでのカニクイザル筋組織におけるDMPK発現レベルを低下させる能力を示す非限定的な概略図を描く。(N＝3匹のオスのカニクイザル) 図7A～7Lは、ビヒクル処置(生理食塩水)と比べ、ネイキッドDMPK ASO(ASO300)と比較した、抗hTfR抗体に共有結合的に連結されたASO300を含む筋標的化抗体-オリゴヌクレオチド複合体(DTX-C-012)の、in vivoでのカニクイザル筋組織におけるDMPK発現レベルを低下させる能力を示す非限定的な概略図を描く。(N＝3匹のオスのカニクイザル) 図7A～7Lは、ビヒクル処置(生理食塩水)と比べ、ネイキッドDMPK ASO(ASO300)と比較した、抗hTfR抗体に共有結合的に連結されたASO300を含む筋標的化抗体-オリゴヌクレオチド複合体(DTX-C-012)の、in vivoでのカニクイザル筋組織におけるDMPK発現レベルを低下させる能力を示す非限定的な概略図を描く。(N＝3匹のオスのカニクイザル) 図7A～7Lは、ビヒクル処置(生理食塩水)と比べ、ネイキッドDMPK ASO(ASO300)と比較した、抗hTfR抗体に共有結合的に連結されたASO300を含む筋標的化抗体-オリゴヌクレオチド複合体(DTX-C-012)の、in vivoでのカニクイザル筋組織におけるDMPK発現レベルを低下させる能力を示す非限定的な概略図を描く。(N＝3匹のオスのカニクイザル) 図7A～7Lは、ビヒクル処置(生理食塩水)と比べ、ネイキッドDMPK ASO(ASO300)と比較した、抗hTfR抗体に共有結合的に連結されたASO300を含む筋標的化抗体-オリゴヌクレオチド複合体(DTX-C-012)の、in vivoでのカニクイザル筋組織におけるDMPK発現レベルを低下させる能力を示す非限定的な概略図を描く。(N＝3匹のオスのカニクイザル) 図7A～7Lは、ビヒクル処置(生理食塩水)と比べ、ネイキッドDMPK ASO(ASO300)と比較した、抗hTfR抗体に共有結合的に連結されたASO300を含む筋標的化抗体-オリゴヌクレオチド複合体(DTX-C-012)の、in vivoでのカニクイザル筋組織におけるDMPK発現レベルを低下させる能力を示す非限定的な概略図を描く。(N＝3匹のオスのカニクイザル) 図7A～7Lは、ビヒクル処置(生理食塩水)と比べ、ネイキッドDMPK ASO(ASO300)と比較した、抗hTfR抗体に共有結合的に連結されたASO300を含む筋標的化抗体-オリゴヌクレオチド複合体(DTX-C-012)の、in vivoでのカニクイザル筋組織におけるDMPK発現レベルを低下させる能力を示す非限定的な概略図を描く。(N＝3匹のオスのカニクイザル) 図7A～7Lは、ビヒクル処置(生理食塩水)と比べ、ネイキッドDMPK ASO(ASO300)と比較した、抗hTfR抗体に共有結合的に連結されたASO300を含む筋標的化抗体-オリゴヌクレオチド複合体(DTX-C-012)の、in vivoでのカニクイザル筋組織におけるDMPK発現レベルを低下させる能力を示す非限定的な概略図を描く。(N＝3匹のオスのカニクイザル)
図8A～8Bは、ビヒクル処置(生理食塩水)と比べ、ネイキッドDMPK ASO(ASO300)と比較した、抗hTfR抗体に共有結合的に連結されたASO300を含む筋標的化抗体-オリゴヌクレオチド複合体(DTX-C-012)の、in vivoでのカニクイザル平滑筋組織におけるDMPK発現レベルを低下させる能力を示す非限定的な概略図を描く。(N＝3匹のオスのカニクイザル) 図8A～8Bは、ビヒクル処置(生理食塩水)と比べ、ネイキッドDMPK ASO(ASO300)と比較した、抗hTfR抗体に共有結合的に連結されたASO300を含む筋標的化抗体-オリゴヌクレオチド複合体(DTX-C-012)の、in vivoでのカニクイザル平滑筋組織におけるDMPK発現レベルを低下させる能力を示す非限定的な概略図を描く。(N＝3匹のオスのカニクイザル)
図9A～9Dは、抗hTfR抗体に共有結合的に連結されたASO300を含む筋標的化抗体-オリゴヌクレオチド(DTX-C-012)の組織選択性を示す非限定的な概略図を描く。DMPK-ASOを含む筋標的化複合体は、ビヒクル処置と比較して、in vivoでカニクイザルの腎臓、脳、または脾臓組織におけるDMPKの発現レベルを低下させない。(N＝3匹のオスのカニクイザル) 図9A～9Dは、抗hTfR抗体に共有結合的に連結されたASO300を含む筋標的化抗体-オリゴヌクレオチド(DTX-C-012)の組織選択性を示す非限定的な概略図を描く。DMPK-ASOを含む筋標的化複合体は、ビヒクル処置と比較して、in vivoでカニクイザルの腎臓、脳、または脾臓組織におけるDMPKの発現レベルを低下させない。(N＝3匹のオスのカニクイザル) 図9A～9Dは、抗hTfR抗体に共有結合的に連結されたASO300を含む筋標的化抗体-オリゴヌクレオチド(DTX-C-012)の組織選択性を示す非限定的な概略図を描く。DMPK-ASOを含む筋標的化複合体は、ビヒクル処置と比較して、in vivoでカニクイザルの腎臓、脳、または脾臓組織におけるDMPKの発現レベルを低下させない。(N＝3匹のオスのカニクイザル) 図9A～9Dは、抗hTfR抗体に共有結合的に連結されたASO300を含む筋標的化抗体-オリゴヌクレオチド(DTX-C-012)の組織選択性を示す非限定的な概略図を描く。DMPK-ASOを含む筋標的化複合体は、ビヒクル処置と比較して、in vivoでカニクイザルの腎臓、脳、または脾臓組織におけるDMPKの発現レベルを低下させない。(N＝3匹のオスのカニクイザル)
図10は、カニクイザルにおける数種の組織型にわたって正規化されたDMPK mRNA組織発現レベルを示す。(N＝3匹のオスのカニクイザル)
図11A～11Bは、ビヒクル処置(生理食塩水)と比べ、ネイキッドDMPK ASO(ASO300)と比較した、ASO300を含む筋標的化RI7 217 Fab抗体-オリゴヌクレオチド複合体(DTX-C-008)の、DTX-C-008投薬後最大28日間、in vivoでマウス筋組織におけるDMPK発現レベルを低下させる能力を示す非限定的な概略図を描く。 図11A～11Bは、ビヒクル処置(生理食塩水)と比べ、ネイキッドDMPK ASO(ASO300)と比較した、ASO300を含む筋標的化RI7 217 Fab抗体-オリゴヌクレオチド複合体(DTX-C-008)の、DTX-C-008投薬後最大28日間、in vivoでマウス筋組織におけるDMPK発現レベルを低下させる能力を示す非限定的な概略図を描く。
図12は、抗hTfR抗体に共有結合的に連結されたASO300を含む筋標的化複合体(DTX-C-012)の単回用量がカニクイザルにおいて安全であり、忍容されることを示す。(N＝3匹のオスのカニクイザル)
図13A～13Bは、ビヒクル処置(PBS)と比べ、対照IgG2a Fab抗体-オリゴヌクレオチド複合体(DTX-C-007)およびネイキッドDMPK ASO(ASO300)と比較した、ASO300を含む筋標的化RI7 217 Fab抗体-オリゴヌクレオチド複合体(DTX-C-008)の、DTX-C-008投薬後最大12週間、in vivoでマウス筋組織におけるDMPK発現レベルを低下させる能力を示す非限定的な概略図を描く。(N＝5 C57Bl/6 WTマウス) 図13A～13Bは、ビヒクル処置(PBS)と比べ、対照IgG2a Fab抗体-オリゴヌクレオチド複合体(DTX-C-007)およびネイキッドDMPK ASO(ASO300)と比較した、ASO300を含む筋標的化RI7 217 Fab抗体-オリゴヌクレオチド複合体(DTX-C-008)の、DTX-C-008投薬後最大12週間、in vivoでマウス筋組織におけるDMPK発現レベルを低下させる能力を示す非限定的な概略図を描く。(N＝5 C57Bl/6 WTマウス)
図14A～14Bは、ASO300を含む筋標的化RI7 217 Fab抗体-オリゴヌクレオチド複合体(DTX-C-008)の、マウスモデルにおける核の突然変異体DMPK RNAを標的化する能力を示す非限定的な概略図を描く。(N＝6匹のマウス) 図14A～14Bは、ASO300を含む筋標的化RI7 217 Fab抗体-オリゴヌクレオチド複合体(DTX-C-008)の、マウスモデルにおける核の突然変異体DMPK RNAを標的化する能力を示す非限定的な概略図を描く。(N＝6匹のマウス)
図15A～15Bは、アクチンを標的にするオリゴヌクレオチドを含む筋標的化RI7 217 Fab抗体-ASO複合体(DTX-アクチン)の、筋組織中アクチンの発現レベルおよび筋強直症の機能グレードを用量依存的に低下させる能力を示す非限定的な概略図を描く。(N＝2匹のHSALRマウス) 図15A～15Bは、アクチンを標的にするオリゴヌクレオチドを含む筋標的化RI7 217 Fab抗体-ASO複合体(DTX-アクチン)の、筋組織中アクチンの発現レベルおよび筋強直症の機能グレードを用量依存的に低下させる能力を示す非限定的な概略図を描く。(N＝2匹のHSALRマウス)
図16A～16Cは、ASO300を含む筋標的化RI7 217 Fab抗体-オリゴヌクレオチド複合体(DTX-C-008)が、DM1心臓モデルにおける不整脈の機能的修正を検証するためのマウスモデルにおいて、長くなったQTc間隔を有意に短縮させることができることを示す非限定的な概略図を示す。(N＝10匹のマウス) 図16A～16Cは、ASO300を含む筋標的化RI7 217 Fab抗体-オリゴヌクレオチド複合体(DTX-C-008)が、DM1心臓モデルにおける不整脈の機能的修正を検証するためのマウスモデルにおいて、長くなったQTc間隔を有意に短縮させることができることを示す非限定的な概略図を示す。(N＝10匹のマウス) 図16A～16Cは、ASO300を含む筋標的化RI7 217 Fab抗体-オリゴヌクレオチド複合体(DTX-C-008)が、DM1心臓モデルにおける不整脈の機能的修正を検証するためのマウスモデルにおいて、長くなったQTc間隔を有意に短縮させることができることを示す非限定的な概略図を示す。(N＝10匹のマウス)
図17A～17Bは、抗hTfR抗体に共有結合的に連結されたASO300アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む筋標的化抗体-オリゴヌクレオチド複合体(DTX-C-012)が、DM1患者からのヒト細胞において、DMPKの発現レベルを低減すること、およびDMPK特異的標的遺伝子(Bin1)のスプライシングを修正することが可能であることを示す非限定的な概略図を描く。(N＝3) 図17A～17Bは、抗hTfR抗体に共有結合的に連結されたASO300アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む筋標的化抗体-オリゴヌクレオチド複合体(DTX-C-012)が、DM1患者からのヒト細胞において、DMPKの発現レベルを低減すること、およびDMPK特異的標的遺伝子(Bin1)のスプライシングを修正することが可能であることを示す非限定的な概略図を描く。(N＝3)
図18は、ネイキッドFM10アンチセンスオリゴヌクレオチドと比べた、FM10アンチセンスオリゴヌクレオチドへ抱合された抗TfR1 Fab(RI7 217)を含む筋標的化複合体(抗TfR抗体-FM10)の、ヒトU-2 OS細胞における下流のDUX4遺伝子(ZSCAN4、MBD3L2、TRIM43)の発現レベルの低下させる能力を示す非限定的な概略図を描く。
図19は、エキソン23スキッピングのホスホロジアミダートモルフォリノオリゴマー(PMO)を含む抗トランスフェリン受容体筋標的化複合体の、mdxマウスモデル筋組織中エキソンスキッピングの用量依存的増強能を示す非限定的な概略図を描く。
図20A～20Bは、エキソン23スキッピングのPMOを含む抗トランスフェリン受容体筋標的化複合体の、mdxマウスモデル骨格筋(四頭筋)中のジストロフィンを用量依存的に増加させる能力を示す非限定的な概略図を描く。 図20A～20Bは、エキソン23スキッピングのPMOを含む抗トランスフェリン受容体筋標的化複合体の、mdxマウスモデル骨格筋(四頭筋)中のジストロフィンを用量依存的に増加させる能力を示す非限定的な概略図を描く。
図21A～21Eは、エキソン23スキッピングのPMOを含む抗トランスフェリン受容体筋標的化複合体の、mdxマウスモデルにおける機能的性能を改善する能力(図21A、図21B、図21C、および図21D)、およびクレアチンキナーゼレベルの低下させる能力(図21E)を示す非限定的な概略図を描く。(**p＜0.01;***p＜0.001;****p＜0.0001) 図21A～21Eは、エキソン23スキッピングのPMOを含む抗トランスフェリン受容体筋標的化複合体の、mdxマウスモデルにおける機能的性能を改善する能力(図21A、図21B、図21C、および図21D)、およびクレアチンキナーゼレベルの低下させる能力(図21E)を示す非限定的な概略図を描く。(**p＜0.01;***p＜0.001;****p＜0.0001) 図21A～21Eは、エキソン23スキッピングのPMOを含む抗トランスフェリン受容体筋標的化複合体の、mdxマウスモデルにおける機能的性能を改善する能力(図21A、図21B、図21C、および図21D)、およびクレアチンキナーゼレベルの低下させる能力(図21E)を示す非限定的な概略図を描く。(**p＜0.01;***p＜0.001;****p＜0.0001) 図21A～21Eは、エキソン23スキッピングのPMOを含む抗トランスフェリン受容体筋標的化複合体の、mdxマウスモデルにおける機能的性能を改善する能力(図21A、図21B、図21C、および図21D)、およびクレアチンキナーゼレベルの低下させる能力(図21E)を示す非限定的な概略図を描く。(**p＜0.01;***p＜0.001;****p＜0.0001) 図21A～21Eは、エキソン23スキッピングのPMOを含む抗トランスフェリン受容体筋標的化複合体の、mdxマウスモデルにおける機能的性能を改善する能力(図21A、図21B、図21C、および図21D)、およびクレアチンキナーゼレベルの低下させる能力(図21E)を示す非限定的な概略図を描く。(**p＜0.01;***p＜0.001;****p＜0.0001)
図22A～22Cは、選択されたアンチセンスオリゴヌクレオチド(DMPK-ASO-1、DMPK-ASO-2、およびDMPK-ASO-3)の、ヒトDM1筋管におけるDMPKノックダウンでの用量応答を示す非限定的な概略図を描く。ASO300が対照として使用された。すべての試験されたオリゴヌクレオチドはDMPKノックダウンの活性を示した。統計学的分析:ネイキッドASO300処置に対するテューキーのHSD事後検定を用いた一元配置ANOVA;*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001、****p＜0.0001。 図22A～22Cは、選択されたアンチセンスオリゴヌクレオチド(DMPK-ASO-1、DMPK-ASO-2、およびDMPK-ASO-3)の、ヒトDM1筋管におけるDMPKノックダウンでの用量応答を示す非限定的な概略図を描く。ASO300が対照として使用された。すべての試験されたオリゴヌクレオチドはDMPKノックダウンの活性を示した。統計学的分析:ネイキッドASO300処置に対するテューキーのHSD事後検定を用いた一元配置ANOVA;*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001、****p＜0.0001。 図22A～22Cは、選択されたアンチセンスオリゴヌクレオチド(DMPK-ASO-1、DMPK-ASO-2、およびDMPK-ASO-3)の、ヒトDM1筋管におけるDMPKノックダウンでの用量応答を示す非限定的な概略図を描く。ASO300が対照として使用された。すべての試験されたオリゴヌクレオチドはDMPKノックダウンの活性を示した。統計学的分析:ネイキッドASO300処置に対するテューキーのHSD事後検定を用いた一元配置ANOVA;*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001、****p＜0.0001。
図23A～23Bは、選択されたアンチセンスオリゴヌクレオチド(DMPK-ASO-1、DMPK-ASO-2、およびDMPK-ASO-3)の、非ヒト霊長類(NHP)DM1筋管におけるDMPKノックダウンでの用量応答を示す非限定的な概略図を描く。ASO300が対照として使用された。すべての試験されたオリゴヌクレオチドはDMPKノックダウンの活性を示した。 図23A～23Bは、選択されたアンチセンスオリゴヌクレオチド(DMPK-ASO-1、DMPK-ASO-2、およびDMPK-ASO-3)の、非ヒト霊長類(NHP)DM1筋管におけるDMPKノックダウンでの用量応答を示す非限定的な概略図を描く。ASO300が対照として使用された。すべての試験されたオリゴヌクレオチドはDMPKノックダウンの活性を示した。
図24は、静脈内投与後の様々な生物種における、抗TfR抗体および分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド)を連結するのに使用されたリンカーの経時的な血清中安定性を示す。
図25A～25Fは、ELISAによって測定された、ヒトTfR1(hTfR1)またはカニクイザルTfR1(cTfR1)へのヒト化抗TfR Fabの結合を示す。図25Aは、ヒト化3M12バリアントのhTfR1への結合を示す。 図25A～25Fは、ELISAによって測定された、ヒトTfR1(hTfR1)またはカニクイザルTfR1(cTfR1)へのヒト化抗TfR Fabの結合を示す。図25Bは、ヒト化3M12バリアントのcTfR1への結合を示す。 図25A～25Fは、ELISAによって測定された、ヒトTfR1(hTfR1)またはカニクイザルTfR1(cTfR1)へのヒト化抗TfR Fabの結合を示す。図25Cは、ヒト化3A4バリアントのhTfR1への結合を示す。 図25A～25Fは、ELISAによって測定された、ヒトTfR1(hTfR1)またはカニクイザルTfR1(cTfR1)へのヒト化抗TfR Fabの結合を示す。図25Dは、ヒト化3A4バリアントのcTfR1への結合を示す。 図25A～25Fは、ELISAによって測定された、ヒトTfR1(hTfR1)またはカニクイザルTfR1(cTfR1)へのヒト化抗TfR Fabの結合を示す。図25Eは、ヒト化5H12バリアントのhTfR1への結合を示す。 図25A～25Fは、ELISAによって測定された、ヒトTfR1(hTfR1)またはカニクイザルTfR1(cTfR1)へのヒト化抗TfR Fabの結合を示す。図25Fは、ヒト化5H12バリアントのhTfR1への結合を示す。
図26は、横紋筋肉腫(RD)細胞内への抗TfR Fab抱合体の定量化された細胞取り込みを示す。試験した抱合体中の分子ペイロードは、DMPK標的化オリゴヌクレオチドであり、抱合体の取り込みは、示された抗TfR Fabによって促進された。陰性対照Fab(抗マウスTfR)または陽性対照Fab(抗ヒトTfR1)を有する抱合体もまた、このアッセイに包含される。細胞は、指し示された抱合体と共に100nMの濃度にて4時間インキュベートされた。細胞取り込みは、平均のCypher5e蛍光によって測定された。
図27A～27Fは、ELISAによって測定された、ヒトTfR1(hTfR1)およびカニクイザルTfR1(cTfR1)への、オリゴヌクレオチド抱合または非抱合ヒト化抗TfR Fabの結合を示す。図27Aは、ヒト化3M12バリアントの単独またはDMPK標的化オリゴとの抱合体でのhTfR1への結合を示す。それぞれのEC50値も示される。 図27A～27Fは、ELISAによって測定された、ヒトTfR1(hTfR1)およびカニクイザルTfR1(cTfR1)への、オリゴヌクレオチド抱合または非抱合ヒト化抗TfR Fabの結合を示す。図27Bは、ヒト化3M12バリアントの単独またはDMPK標的化オリゴとの抱合体でのcTfR1への結合を示す。それぞれのEC50値も示される。 図27A～27Fは、ELISAによって測定された、ヒトTfR1(hTfR1)およびカニクイザルTfR1(cTfR1)への、オリゴヌクレオチド抱合または非抱合ヒト化抗TfR Fabの結合を示す。図27Cは、ヒト化3A4バリアントの単独またはDMPK標的化オリゴとの抱合体でのhTfR1への結合を示す。それぞれのEC50値も示される。 図27A～27Fは、ELISAによって測定された、ヒトTfR1(hTfR1)およびカニクイザルTfR1(cTfR1)への、オリゴヌクレオチド抱合または非抱合ヒト化抗TfR Fabの結合を示す。図27Dは、ヒト化3A4バリアントの単独またはDMPK標的化オリゴとの抱合体でのcTfR1への結合を示す。それぞれのEC50値も示される。 図27A～27Fは、ELISAによって測定された、ヒトTfR1(hTfR1)およびカニクイザルTfR1(cTfR1)への、オリゴヌクレオチド抱合または非抱合ヒト化抗TfR Fabの結合を示す。図27Eは、ヒト化5H12バリアントの単独またはDMPK標的化オリゴとの抱合体でのhTfR1への結合を示す。それぞれのEC50値も示される。 図27A～27Fは、ELISAによって測定された、ヒトTfR1(hTfR1)およびカニクイザルTfR1(cTfR1)への、オリゴヌクレオチド抱合または非抱合ヒト化抗TfR Fabの結合を示す。図27Fは、ヒト化5H12バリアントの単独またはDMPK標的化オリゴとの抱合体でのcTfR1への結合を示す。それぞれのEC50値も示される。
図28は、PBSで処置された細胞と比べた、DMPK標的化オリゴヌクレオチドで処置されたRD細胞中のDMPK発現を示す。処置の継続期間は3日であった。DMPK標的化オリゴヌクレオチドは、遊離オリゴヌクレオチド(ジムノティック(gymnotic)取り込み、「free」)として、またはトランスフェクション試薬(「Trans」)を用いて細胞へ送達された。
図29は、DMPK標的化オリゴヌクレオチド(ASO300)へ抱合された、示されたヒト化抗TfR抗体を含有する様々な濃度の抱合体で処置されたRD細胞におけるDMPK発現を示す。処置の継続期間は3日であった。トランスフェクション剤を使用して送達されたASO300(「Trans」と標識)が、対照として使用された。
図30は、腓腹筋において測定された、DM1のHSA-LRマウスモデルにおける抗TfR1抗体-オリゴヌクレオチド抱合体(Ab-ASO)によるAtp2a1のスプライシング修正の結果を示す。使用された抗TfR抗体はRI7 217であり、オリゴヌクレオチドはヒト骨格筋系アクチンを標的にする。
図31は、抗TfR1抗体-オリゴヌクレオチド(Ab-ASO)抱合体または生理食塩水で処置されたHSA-LRマウスの腓腹筋において測定された、DM1に関して30を超える種々のRNAでのスプライシング修正を示す。使用された抗TfR抗体はRI7 217であり、オリゴヌクレオチドはヒト骨格筋系アクチンを標的にする。 図31は、抗TfR1抗体-オリゴヌクレオチド(Ab-ASO)抱合体または生理食塩水で処置されたHSA-LRマウスの腓腹筋において測定された、DM1に関して30を超える種々のRNAでのスプライシング修正を示す。使用された抗TfR抗体はRI7 217であり、オリゴヌクレオチドはヒト骨格筋系アクチンを標的にする。 図31は、抗TfR1抗体-オリゴヌクレオチド(Ab-ASO)抱合体または生理食塩水で処置されたHSA-LRマウスの腓腹筋において測定された、DM1に関して30を超える種々のRNAでのスプライシング修正を示す。使用された抗TfR抗体はRI7 217であり、オリゴヌクレオチドはヒト骨格筋系アクチンを標的にする。
図32は、抗TfR1抗体-オリゴヌクレオチド抱合体(Ab-ASO)もしくは生理食塩水で処置された、HSA-LRマウスの四頭筋、腓腹筋、または前脛骨筋におけるスプライシング異常を示す。データは、図31に示される30を超えるRNAにおいて測定された複合的なスプライシング異常を表す。
図33は、生理食塩水、非抱合オリゴヌクレオチド(ASO)、または抗TfR1抗体-オリゴヌクレオチド抱合体(Ab-ASO)で処置されたHSA-LRマウスの四頭筋、腓腹筋、および前脛骨筋において測定された筋強直症グレードを示す。筋強直症は、筋電図法(EMG)によって測定され、筋強直性放電(myotonic discharge)の頻度に基づき0、1、2、または3とグレード分けされた。
図34は、DMDエキソン51スキッピングオリゴヌクレオチド(PMO)によって促進された、ヒトDMD筋管におけるエキソン51のスキッピングを示す。細胞は、ネイキッドPMOで、または抗TfR1 Fabへ抱合されたPMO(Ab-PMO)で処置された。
図35は、エキソン23を標的にしたオリゴヌクレオチド(PMO)へ抱合された抗マウスTfR1(RI7 217)での処置後のmdxマウス四頭筋における、アルファ-アクチンをローディング対照として用いた、ジストロフィンのウエスタンブロッティングによって測定されたジストロフィン発現の用量依存的増加を示す。標準は、プールされた野生型タンパク質およびプールされたmdxタンパク質を使用して生成された。パーセントは、試料中へスパイクされたWTタンパク質の量を指し示す。
図36は、エキソン23を標的にするオリゴヌクレオチド(PMO)へ抱合された抗マウスTfR(RI7 217)の様々な用量での処置後の、mdxマウス四頭筋内のジストロフィンタンパク質レベルの定量化を示す。
図37は、生理食塩水で処置された野生型(WT)マウス、または生理食塩水、ネイキッドオリゴヌクレオチド、もしくは抗マウスTfR1(RI7 217)へ抱合されたオリゴヌクレオチドで処置されたmdxマウスからの四頭筋の免疫蛍光染色画像を示す。
図38A～38Bは、ネイキッドFM10(図38A)、または抗TfR1へ抱合されたFM10(図38B)で処置されたFSHD患者由来の筋管における、MBD3L2、TRIM43、およびZSCAN4の転写産物の広範な濃度にわたる発現を示す。 図38A～38Bは、ネイキッドFM10(図38A)、または抗TfR1へ抱合されたFM10(図38B)で処置されたFSHD患者由来の筋管における、MBD3L2、TRIM43、およびZSCAN4の転写産物の広範な濃度にわたる発現を示す。
図39は、DMDエキソンスキッピングオリゴヌクレオチドへ抱合された指定の抗TfR Fab'(3M12 VH3/VK2、3M12 VH4/VK3、および3A4 VH3 N54S/VK4)を含有する抱合体が、DMD患者筋管において、ネイキッドDMDエキソンスキッピングオリゴと比較して増強されたエキソンスキッピングをもたらしたことを例証するデータを示す。
図40A～40Eは、DMPK標的化オリゴヌクレオチドに抱合された指定の抗TfR Fab(対照、3M12 VH3/VK2、3M12 VH4/VK3、および3A4 VH3 N54S/VK4)を含有する抱合体の、ヒトTfR1を発現するマウス(hTfR1ノックインマウス)でのDMPK mRNA発現の低下におけるインビボ活性を示す。図40Aは、実験の設計(例として、IV投与量、投与頻度)を示す。DMPK mRNAレベルは、マウスの前脛骨筋(図40B)、腓腹筋(図40C)、心臓(図40D)および横隔膜(図40E)において最初の投与の14日後に測定された。 図40A～40Eは、DMPK標的化オリゴヌクレオチドに抱合された指定の抗TfR Fab(対照、3M12 VH3/VK2、3M12 VH4/VK3、および3A4 VH3 N54S/VK4)を含有する抱合体の、ヒトTfR1を発現するマウス(hTfR1ノックインマウス)でのDMPK mRNA発現の低下におけるインビボ活性を示す。図40Aは、実験の設計(例として、IV投与量、投与頻度)を示す。DMPK mRNAレベルは、マウスの前脛骨筋(図40B)、腓腹筋(図40C)、心臓(図40D)および横隔膜(図40E)において最初の投与の14日後に測定された。 図40A～40Eは、DMPK標的化オリゴヌクレオチドに抱合された指定の抗TfR Fab(対照、3M12 VH3/VK2、3M12 VH4/VK3、および3A4 VH3 N54S/VK4)を含有する抱合体の、ヒトTfR1を発現するマウス(hTfR1ノックインマウス)でのDMPK mRNA発現の低下におけるインビボ活性を示す。図40Aは、実験の設計(例として、IV投与量、投与頻度)を示す。DMPK mRNAレベルは、マウスの前脛骨筋(図40B)、腓腹筋(図40C)、心臓(図40D)および横隔膜(図40E)において最初の投与の14日後に測定された。 図40A～40Eは、DMPK標的化オリゴヌクレオチドに抱合された指定の抗TfR Fab(対照、3M12 VH3/VK2、3M12 VH4/VK3、および3A4 VH3 N54S/VK4)を含有する抱合体の、ヒトTfR1を発現するマウス(hTfR1ノックインマウス)でのDMPK mRNA発現の低下におけるインビボ活性を示す。図40Aは、実験の設計(例として、IV投与量、投与頻度)を示す。DMPK mRNAレベルは、マウスの前脛骨筋(図40B)、腓腹筋(図40C)、心臓(図40D)および横隔膜(図40E)において最初の投与の14日後に測定された。 図40A～40Eは、DMPK標的化オリゴヌクレオチドに抱合された指定の抗TfR Fab(対照、3M12 VH3/VK2、3M12 VH4/VK3、および3A4 VH3 N54S/VK4)を含有する抱合体の、ヒトTfR1を発現するマウス(hTfR1ノックインマウス)でのDMPK mRNA発現の低下におけるインビボ活性を示す。図40Aは、実験の設計(例として、IV投与量、投与頻度)を示す。DMPK mRNAレベルは、マウスの前脛骨筋(図40B)、腓腹筋(図40C)、心臓(図40D)および横隔膜(図40E)において最初の投与の14日後に測定された。
図41A～41Cは、DMPK標的化オリゴヌクレオチドに抱合された抗TfR抗体を含有する抱合体が、380のCUG反復を含有するDMPK突然変異体mRNAを発現するCM-DM1-32F初代細胞においてスプライシングを修正し、フォーカスを減少させたことを示す。図41Aは、抱合体が突然変異体DMPK mRNA発現を減少させたことを示す。 図41A～41Cは、DMPK標的化オリゴヌクレオチドに抱合された抗TfR抗体を含有する抱合体が、380のCUG反復を含有するDMPK突然変異体mRNAを発現するCM-DM1-32F初代細胞においてスプライシングを修正し、フォーカスを減少させたことを示す。図41Bは、抱合体がBIN1エキソン11スプライシングを修正したことを示す。 図41A～41Cは、DMPK標的化オリゴヌクレオチドに抱合された抗TfR抗体を含有する抱合体が、380のCUG反復を含有するDMPK突然変異体mRNAを発現するCM-DM1-32F初代細胞においてスプライシングを修正し、フォーカスを減少させたことを示す。図41Cは、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)分析の画像および画像の定量化を示し、抱合体が突然変異体DMPK mRNAによって形成された核フォーカスを減少させたことを実証する。図41Cの上部パネルに示される顕微鏡画像では、明るい丸い形状が細胞核を示し、DM1細胞の核内の明るい斑点(右の3つの顕微鏡パネル)がCUGフォーカスを示す。
図42は、抗TfR Fab 3M12 VH4/Vk3の組換えヒト(丸)、カニクイザル(四角)、マウス(上向き三角形)またはラット(下向き三角形)TfR1タンパク質への結合の、Fabの230pM～500nMの濃度範囲でのELISA測定値を示す。測定結果は、抗TfR FabがヒトおよびカニクイザルのTfR1と反応性であることを示す。マウスまたはラットの組換えTfR1へ結合は観察されなかった。データは、ベースラインに対して正規化された相対蛍光単位として示される。
図43は、組換えヒトTfR1またはTfR2に対する抗TfR Fab 3M12 VH4/Vk3の親和性を試験したELISAの、230pM～500nMのFabの濃度範囲にわたる結果を示す。データは、ベースラインに対して正規化された相対蛍光単位として提示される。結果は、Fabが組換えヒトTfR2に結合しないことを実証する。
図44は、抗TfR Fab 3M12 VH4/Vk3を対照アンチセンスオリゴヌクレオチドに連結するために使用されるリンカーの、PBS中、またはラット、マウス、カニクイザルもしくはヒト血清中での72時間のインキュベーションにわたる血清中安定性を示す。
図45は、DUX4標的化オリゴヌクレオチド(配列番号147)に抱合された抗TfR Fab 3M12 VH4/Vk3を含有する抱合体が、MDB3L2、TRIM43およびZSCAN4のmRNA発現の減少によって示されるように、C6(AB1080)不死化FSHD1細胞においてDUX4トランスクリプトームを阻害したことを示す。抱合体は、非抱合DUX4標的化オリゴヌクレオチドと比較して、DUX4トランスクリプトームの阻害において優れた活性を示した。
図46A～46Bは、遺伝子ノックダウンの用量応答曲線を示す。図46Aは、DUX4標的化オリゴヌクレオチド(配列番号147)に抱合された抗TfR Fab 3M12 VH4/Vk3を含有する抱合体で処置されたC6(AB1080)不死化FSHD1細胞におけるMBD3L2ノックダウンを示す。 図46A～46Bは、遺伝子ノックダウンの用量応答曲線を示す。図46Bは、DUX4標的化オリゴヌクレオチド(配列番号147)に抱合された抗TfR Fab 3M12 VH4/Vk3を含有する抱合体で処置されたFSHD患者筋管におけるMBD3L2、TRIM43およびZSCAN4ノックダウンを示す。図46Bは、図46Aに示すMBD3L2データを含む。
図47A～47Cは、ビヒクル、単回用量の非抱合ASO、または単回用量の抗TfR1抗体-ASO抱合体(Ab-ASO)で処置したHSA-LRマウスの四頭筋(図47A)、腓腹筋(図47B)、および前脛骨筋(図47C)におけるEMG筋強直症グレードを示す。使用された抗TfR1抗体はRI7 217 Fabであり、オリゴヌクレオチドはヒト骨格筋系アクチン(ACTA1)を標的にする。 図47A～47Cは、ビヒクル、単回用量の非抱合ASO、または単回用量の抗TfR1抗体-ASO抱合体(Ab-ASO)で処置したHSA-LRマウスの四頭筋(図47A)、腓腹筋(図47B)、および前脛骨筋(図47C)におけるEMG筋強直症グレードを示す。使用された抗TfR1抗体はRI7 217 Fabであり、オリゴヌクレオチドはヒト骨格筋系アクチン(ACTA1)を標的にする。 図47A～47Cは、ビヒクル、単回用量の非抱合ASO、または単回用量の抗TfR1抗体-ASO抱合体(Ab-ASO)で処置したHSA-LRマウスの四頭筋(図47A)、腓腹筋(図47B)、および前脛骨筋(図47C)におけるEMG筋強直症グレードを示す。使用された抗TfR1抗体はRI7 217 Fabであり、オリゴヌクレオチドはヒト骨格筋系アクチン(ACTA1)を標的にする。
図48は、単回用量のネイキッドASOのまたは用量当量の抗TFR1抗体-ASO抱合体(Ab-ASO)の後のHSALR DM1マウスにおける、ビヒクル処置マウスと比較した、qPCRによって測定されたヒトACTA1発現を示す。使用された抗TfR1抗体はRI7 217 Fabであり、オリゴヌクレオチドはヒト骨格筋系アクチン(ACTA1)を標的にする。
図49A～49Cは、10mg/kgネイキッドASO、20mg/kgネイキッドASOの単回用量、または抗TFR抗体-ASO抱合体(Ab-ASO)の用量当量の後のHSALR DM1マウスにおける四頭筋(図49A)、腓腹筋(図49B)、および前脛骨筋(図49C)におけるACTA1発現を、ビヒクル処置マウスと比較して示す。使用された抗TfR1抗体はRI7 217 Fabであり、オリゴヌクレオチドはヒト骨格筋系アクチン(ACTA1)を標的にする。(*p＜0.05;***p＜0.001) 図49A～49Cは、10mg/kgネイキッドASO、20mg/kgネイキッドASOの単回用量、または抗TFR抗体-ASO抱合体(Ab-ASO)の用量当量の後のHSALR DM1マウスにおける四頭筋(図49A)、腓腹筋(図49B)、および前脛骨筋(図49C)におけるACTA1発現を、ビヒクル処置マウスと比較して示す。使用された抗TfR1抗体はRI7 217 Fabであり、オリゴヌクレオチドはヒト骨格筋系アクチン(ACTA1)を標的にする。(*p＜0.05;***p＜0.001) 図49A～49Cは、10mg/kgネイキッドASO、20mg/kgネイキッドASOの単回用量、または抗TFR抗体-ASO抱合体(Ab-ASO)の用量当量の後のHSALR DM1マウスにおける四頭筋(図49A)、腓腹筋(図49B)、および前脛骨筋(図49C)におけるACTA1発現を、ビヒクル処置マウスと比較して示す。使用された抗TfR1抗体はRI7 217 Fabであり、オリゴヌクレオチドはヒト骨格筋系アクチン(ACTA1)を標的にする。(*p＜0.05;***p＜0.001)
図50A～50Cは、単回用量の生理食塩水、DMDにおいてエキソン23スキッピングを誘導する非抱合オリゴヌクレオチド(ASO)、またはASOに抱合された抗TfR1 RI7217 Fabを含有する抱合体(Ab-ASO)の投与の2週間後または4週間後の、野生型(WT)マウスおよびmdxマウスの四頭筋(図50A)、心臓(図50B)および横隔膜(図50C)におけるエキソン23スキッピングの定量化を示す。生理食塩水または非抱合ASOを投与したWTマウスまたはmdxマウスの組織では、エキソン23のスキッピングはほとんど、または全く観察されなかったが、Ab-ASOで処置したmdxマウスの組織では、有意なレベルのエキソン23のスキッピングが観察された。(*p＜0.05、**p＜0.01、****p＜0.0001) 図50A～50Cは、単回用量の生理食塩水、DMDにおいてエキソン23スキッピングを誘導する非抱合オリゴヌクレオチド(ASO)、またはASOに抱合された抗TfR1 RI7217 Fabを含有する抱合体(Ab-ASO)の投与の2週間後または4週間後の、野生型(WT)マウスおよびmdxマウスの四頭筋(図50A)、心臓(図50B)および横隔膜(図50C)におけるエキソン23スキッピングの定量化を示す。生理食塩水または非抱合ASOを投与したWTマウスまたはmdxマウスの組織では、エキソン23のスキッピングはほとんど、または全く観察されなかったが、Ab-ASOで処置したmdxマウスの組織では、有意なレベルのエキソン23のスキッピングが観察された。(*p＜0.05、**p＜0.01、****p＜0.0001) 図50A～50Cは、単回用量の生理食塩水、DMDにおいてエキソン23スキッピングを誘導する非抱合オリゴヌクレオチド(ASO)、またはASOに抱合された抗TfR1 RI7217 Fabを含有する抱合体(Ab-ASO)の投与の2週間後または4週間後の、野生型(WT)マウスおよびmdxマウスの四頭筋(図50A)、心臓(図50B)および横隔膜(図50C)におけるエキソン23スキッピングの定量化を示す。生理食塩水または非抱合ASOを投与したWTマウスまたはmdxマウスの組織では、エキソン23のスキッピングはほとんど、または全く観察されなかったが、Ab-ASOで処置したmdxマウスの組織では、有意なレベルのエキソン23のスキッピングが観察された。(*p＜0.05、**p＜0.01、****p＜0.0001)
図51A～51Dは、DMDにおいてエキソン23スキッピングを誘導する非抱合オリゴヌクレオチド(ASO)、またはASOに抱合された抗TfR1 RI7217 Fabを含有する抱合体(Ab-ASO)の単回用量後の、mdxマウスの四頭筋におけるジストロフィンタンパク質の測定を示す。図51Aは、ASOまたはAb-ASOの注射の2週間後の筋組織におけるジストロフィンおよびアルファ-アクチニンタンパク質のウエスタンブロットを示す。図51Aおよび図51Cにおける標準曲線は、野生型(WT)およびmdxマウスサンプルから組織をプールすることによって生成され、パーセントWTは、各サンプルにスパイクされたWTタンパク質の量を示す。(*p＜0.05;ns、有意でない) 図51A～51Dは、DMDにおいてエキソン23スキッピングを誘導する非抱合オリゴヌクレオチド(ASO)、またはASOに抱合された抗TfR1 RI7217 Fabを含有する抱合体(Ab-ASO)の単回用量後の、mdxマウスの四頭筋におけるジストロフィンタンパク質の測定を示す。図51Bは、野生型筋肉におけるジストロフィンタンパク質と比較した、図51Aのウエスタンブロットにおけるジストロフィンの定量化を示す。 図51A～51Dは、DMDにおいてエキソン23スキッピングを誘導する非抱合オリゴヌクレオチド(ASO)、またはASOに抱合された抗TfR1 RI7217 Fabを含有する抱合体(Ab-ASO)の単回用量後の、mdxマウスの四頭筋におけるジストロフィンタンパク質の測定を示す。図51Cは、ASOまたはAb-ASOの注射の4週間後の筋組織におけるジストロフィンおよびアルファ-アクチニンタンパク質のウエスタンブロットを示す。図51Aおよび図51Cにおける標準曲線は、野生型(WT)およびmdxマウスサンプルから組織をプールすることによって生成され、パーセントWTは、各サンプルにスパイクされたWTタンパク質の量を示す。(*p＜0.05;ns、有意でない) 図51A～51Dは、DMDにおいてエキソン23スキッピングを誘導する非抱合オリゴヌクレオチド(ASO)、またはASOに抱合された抗TfR1 RI7217 Fabを含有する抱合体(Ab-ASO)の単回用量後の、mdxマウスの四頭筋におけるジストロフィンタンパク質の測定を示す。図51Dは、野生型筋肉におけるジストロフィンタンパク質と比較した、図51Cのウエスタンブロットにおけるジストロフィンの定量化を示す。
図52A～52Dは、DMDにおいてエキソン23スキッピングを誘導する非抱合オリゴヌクレオチド(ASO)、またはASOに抱合された抗TfR1 RI7217 Fabを含有する抱合体(Ab-ASO)の単回用量後の、mdxマウスの心臓筋におけるジストロフィンタンパク質の測定を示す。図52Aは、ASOまたはAb-ASOの注射の2週間後の筋組織におけるジストロフィンおよびアルファ-アクチニンタンパク質のウエスタンブロットを示す。図52Aおよび図52Cにおける標準曲線は、野生型(WT)およびmdxマウスサンプルから組織をプールすることによって生成され、パーセントWTは、各サンプルにスパイクされたWTタンパク質の量を示す。(*p＜0.05;****p＜0.0001) 図52A～52Dは、DMDにおいてエキソン23スキッピングを誘導する非抱合オリゴヌクレオチド(ASO)、またはASOに抱合された抗TfR1 RI7217 Fabを含有する抱合体(Ab-ASO)の単回用量後の、mdxマウスの心臓筋におけるジストロフィンタンパク質の測定を示す。図52Bは、野生型筋肉におけるジストロフィンタンパク質と比較した、図52Aのウエスタンブロットにおけるジストロフィンの定量化を示す。 図52A～52Dは、DMDにおいてエキソン23スキッピングを誘導する非抱合オリゴヌクレオチド(ASO)、またはASOに抱合された抗TfR1 RI7217 Fabを含有する抱合体(Ab-ASO)の単回用量後の、mdxマウスの心臓筋におけるジストロフィンタンパク質の測定を示す。図52Cは、ASOまたはAb-ASOの注射の4週間後の筋組織におけるジストロフィンおよびアルファ-アクチニンタンパク質のウエスタンブロットを示す。図52Aおよび図52Cにおける標準曲線は、野生型(WT)およびmdxマウスサンプルから組織をプールすることによって生成され、パーセントWTは、各サンプルにスパイクされたWTタンパク質の量を示す。(*p＜0.05;****p＜0.0001) 図52A～52Dは、DMDにおいてエキソン23スキッピングを誘導する非抱合オリゴヌクレオチド(ASO)、またはASOに抱合された抗TfR1 RI7217 Fabを含有する抱合体(Ab-ASO)の単回用量後の、mdxマウスの心臓筋におけるジストロフィンタンパク質の測定を示す。図52Dは、野生型筋肉におけるジストロフィンタンパク質と比較した、図52Cのウエスタンブロットにおけるジストロフィンの定量化を示す。
図53A～53Dは、DMDにおいてエキソン23スキッピングを誘導する非抱合オリゴヌクレオチド(ASO)、またはASOに抱合された抗TfR1 RI7217 Fabを含有する抱合体(Ab-ASO)の単回用量後の、mdxマウスの横隔膜筋におけるジストロフィンタンパク質の測定を示す。図53Aは、ASOまたはAb-ASOの注射の2週間後の筋組織におけるジストロフィンおよびアルファ-アクチニンタンパク質のウエスタンブロットを示す。図53Aおよび図53Cにおける標準曲線は、野生型(WT)およびmdxマウスサンプルから組織をプールすることによって生成され、パーセントWTは、各サンプルにスパイクされたWTタンパク質の量を示す。(**p＜0.01;***p＜0.001) 図53A～53Dは、DMDにおいてエキソン23スキッピングを誘導する非抱合オリゴヌクレオチド(ASO)、またはASOに抱合された抗TfR1 RI7217 Fabを含有する抱合体(Ab-ASO)の単回用量後の、mdxマウスの横隔膜筋におけるジストロフィンタンパク質の測定を示す。図53Bは、野生型筋肉におけるジストロフィンタンパク質と比較した、図53Aのウエスタンブロットにおけるジストロフィンの定量化を示す。 図53A～53Dは、DMDにおいてエキソン23スキッピングを誘導する非抱合オリゴヌクレオチド(ASO)、またはASOに抱合された抗TfR1 RI7217 Fabを含有する抱合体(Ab-ASO)の単回用量後の、mdxマウスの横隔膜筋におけるジストロフィンタンパク質の測定を示す。図53Cは、ASOまたはAb-ASOの注射の4週間後の筋組織におけるジストロフィンおよびアルファ-アクチニンタンパク質のウエスタンブロットを示す。図53Aおよび図53Cにおける標準曲線は、野生型(WT)およびmdxマウスサンプルから組織をプールすることによって生成され、パーセントWTは、各サンプルにスパイクされたWTタンパク質の量を示す。(**p＜0.01;***p＜0.001) 図53A～53Dは、DMDにおいてエキソン23スキッピングを誘導する非抱合オリゴヌクレオチド(ASO)、またはASOに抱合された抗TfR1 RI7217 Fabを含有する抱合体(Ab-ASO)の単回用量後の、mdxマウスの横隔膜筋におけるジストロフィンタンパク質の測定を示す。図53Dは、野生型筋肉におけるジストロフィンタンパク質と比較した、図53Cのウエスタンブロットにおけるジストロフィンの定量化を示す。
図54A～54Cは、単回用量の生理食塩水、非抱合エキソン23スキッピングオリゴヌクレオチド(ASO)、またはASOに抱合された抗TfR1 RI7217 Fabを含有する抱合体(Ab-ASO)の投与の2週間後または4週間後、野生型(WT)マウスまたはmdxマウスの四頭筋(図54A)、横隔膜(図54B)および心臓(図54C)に投与されたオリゴヌクレオチド(ASO)の量の定量化を示す。 図54A～54Cは、単回用量の生理食塩水、非抱合エキソン23スキッピングオリゴヌクレオチド(ASO)、またはASOに抱合された抗TfR1 RI7217 Fabを含有する抱合体(Ab-ASO)の投与の2週間後または4週間後、野生型(WT)マウスまたはmdxマウスの四頭筋(図54A)、横隔膜(図54B)および心臓(図54C)に投与されたオリゴヌクレオチド(ASO)の量の定量化を示す。 図54A～54Cは、単回用量の生理食塩水、非抱合エキソン23スキッピングオリゴヌクレオチド(ASO)、またはASOに抱合された抗TfR1 RI7217 Fabを含有する抱合体(Ab-ASO)の投与の2週間後または4週間後、野生型(WT)マウスまたはmdxマウスの四頭筋(図54A)、横隔膜(図54B)および心臓(図54C)に投与されたオリゴヌクレオチド(ASO)の量の定量化を示す。
図55は、30mg/kgの非抱合(「ネイキッド」)オリゴヌクレオチド、またはDUX4標的化オリゴヌクレオチドに共有結合的に連結された抗TfR1 Fab 3M12 VH4/Vk3を含む抱合体(「Fab-オリゴヌクレオチド抱合体」)の3、10もしくは30mg/kgオリゴヌクレオチド当量の投与後の、経時的なDUX4標的化オリゴヌクレオチド(配列番号147)の非ヒト霊長類血漿中レベルを示す。
図56は、30mg/kgの非抱合(「ネイキッド」)オリゴヌクレオチド、またはDUX4標的化オリゴヌクレオチドに共有結合的に連結された抗TfR1 Fab 3M12 VH4/Vk3を含む抱合体(「Fab-オリゴヌクレオチド抱合体」)の3、10もしくは30mg/kgオリゴヌクレオチド当量の投与2週間後の、非ヒト霊長類筋組織サンプルにおいて測定されたDUX4標的化オリゴヌクレオチド(配列番号147)の組織レベルを示す。
図57は、30mg/kgの非抱合オリゴヌクレオチド(「オリゴ」)、またはDUX4標的化オリゴヌクレオチドに共有結合的に連結された抗TfR1 Fab 3M12 VH4/Vk3を含む抱合体(「抱合体」)の3、10もしくは30mg/kgオリゴヌクレオチド当量の投与1週間後の生検(左5本のバー)、または投与2週間後の検死(右5本のバー)によって収集された非ヒト霊長類筋組織サンプルにおいて測定されたDUX4標的化オリゴヌクレオチド(配列番号147)の組織レベルを示す。
図58A～58Bは、単回用量の抗TfR1抗体-オリゴヌクレオチド(Ab-ASO)抱合体または生理食塩水で処置したHSA-LRマウスの前脛骨筋(図58A)または四頭筋(図58B)において測定された、DM1患者においてミススプライシングされることが知られている、30超の種々のRNAにおけるスプライシング修正を示す。使用された抗TfR1抗体はRI7 217 Fabであり、オリゴヌクレオチドは骨格筋系アクチン(ACTA1)を標的にする。 図58A～58Bは、単回用量の抗TfR1抗体-オリゴヌクレオチド(Ab-ASO)抱合体または生理食塩水で処置したHSA-LRマウスの前脛骨筋(図58A)または四頭筋(図58B)において測定された、DM1患者においてミススプライシングされることが知られている、30超の種々のRNAにおけるスプライシング修正を示す。使用された抗TfR1抗体はRI7 217 Fabであり、オリゴヌクレオチドは骨格筋系アクチン(ACTA1)を標的にする。 図58A～58Bは、単回用量の抗TfR1抗体-オリゴヌクレオチド(Ab-ASO)抱合体または生理食塩水で処置したHSA-LRマウスの前脛骨筋(図58A)または四頭筋(図58B)において測定された、DM1患者においてミススプライシングされることが知られている、30超の種々のRNAにおけるスプライシング修正を示す。使用された抗TfR1抗体はRI7 217 Fabであり、オリゴヌクレオチドは骨格筋系アクチン(ACTA1)を標的にする。
図58A～58Bは、単回用量の抗TfR1抗体-オリゴヌクレオチド(Ab-ASO)抱合体または生理食塩水で処置したHSA-LRマウスの前脛骨筋(図58A)または四頭筋(図58B)において測定された、DM1患者においてミススプライシングされることが知られている、30超の種々のRNAにおけるスプライシング修正を示す。使用された抗TfR1抗体はRI7 217 Fabであり、オリゴヌクレオチドは骨格筋系アクチン(ACTA1)を標的にする。 図58A～58Bは、単回用量の抗TfR1抗体-オリゴヌクレオチド(Ab-ASO)抱合体または生理食塩水で処置したHSA-LRマウスの前脛骨筋(図58A)または四頭筋(図58B)において測定された、DM1患者においてミススプライシングされることが知られている、30超の種々のRNAにおけるスプライシング修正を示す。使用された抗TfR1抗体はRI7 217 Fabであり、オリゴヌクレオチドは骨格筋系アクチン(ACTA1)を標的にする。 図58A～58Bは、単回用量の抗TfR1抗体-オリゴヌクレオチド(Ab-ASO)抱合体または生理食塩水で処置したHSA-LRマウスの前脛骨筋(図58A)または四頭筋(図58B)において測定された、DM1患者においてミススプライシングされることが知られている、30超の種々のRNAにおけるスプライシング修正を示す。使用された抗TfR1抗体はRI7 217 Fabであり、オリゴヌクレオチドは骨格筋系アクチン(ACTA1)を標的にする。
図59は、ある濃度範囲を超えたエキソン53スキッピングオリゴヌクレオチドのジムノティック(gymnotic)取り込み後の、DMDエキソン52の欠失を有するDMD患者細胞におけるエキソン53スキッピング％を示す。
図60は、抗体に結合していない(「ネイキッドASO」)または抗TfR1 Fabに共有結合的に連結された(「抗TfR1 Fab-ASO複合体」)、いずれかのエキソン53スキッピングPMOの様々な濃度での処置後の、DMDエキソン52の欠失を有するDMD患者細胞におけるエキソン53スキッピング％を示す。
本開示の側面は、ある分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド、ペプチド、小分子)が筋細胞に有益な効果を有し得るものの、かかる細胞を効果的に標的にすることは難航を極めるという認識に関する。本明細書に記載のとおり、本開示は、かかる課題を克服するために、分子ペイロードへ共有結合的に連結された筋標的化剤を含む複合体を提供する。いくつかの態様において、複合体は、例として、筋疾患を有するかまたはこれを有すると疑われる対象において、筋細胞における標的遺伝子の発現または活性をモジュレートする分子ペイロードを送達するのに特に有用である。例えば、いくつかの態様において、複合体は、ポンペ病、中心核ミオパチー、進行性骨化性線維異形成症、フリートライヒ運動失調症、またはデュシェンヌ型筋ジストロフィーを含む希少な筋疾患を有する対象を処置するために有用である。いくつかの態様において、処置される疾病に応じて、かかる複合体において異なる分子ペイロードが使用されてもよい。例えば、原因となっている突然変異がスプライシング欠陥を与える場合、オリゴヌクレオチドまたは他のペイロードは、スプライシング欠陥を修正するために使用されてもよい(例として、エキソンスキッピングを阻害するまたは選択的スプライシングを促進するオリゴヌクレオチド)。原因となっている突然変異が機能獲得型アレルをもたらす場合、オリゴヌクレオチド(例として、RNAi、PMO、ASO-gapmer)は、アレルの発現または活性を阻害するために使用されてもよい。いくつかの態様において、例として、突然変異が機能喪失型アレルをもたらす場合、ペイロードは、例として、アレルの野生型バージョンを発現するために、発現コンストラクトを含んでもよい。いくつかの態様において、ペイロードは、例として遺伝子編集によって、原因となっている欠陥を修正するためのマシナリー(例として、ガイド核酸、遺伝子編集酵素をコードする発現コンストラクト)を含んでもよい。
定義された用語の記載を含む本開示のさらなる側面は、以下に提供される。
I.定義
投与すること:本明細書に使用される場合、用語「投与すること」または「投与」は、生理学的におよび/または薬理学的に有用なやり方で対象へ複合体を提供することを意味する(例として、対象における疾病を処置すること)。
およそ:本明細書に使用される場合、用語「およそ」または「約」は、目的の1つ以上の値へ適用されるとき、規定された参照値と類似の値を指す。ある態様において、用語「およそ」または「約」は、別様に述べられない限りまたは文脈から明らかでない限り(かかる数字が実行可能な値の100％を超える場合を除く)、規定された参照値のプラスマイナス(超または未満)の15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、またはこれ未満に収まる広範な値を指す。
抗体:本明細書に使用される場合、用語「抗体」は、少なくとも1つの免疫グロブリン可変ドメインまたは少なくとも1つの抗原決定基、例として、抗原へ特異的に結合するパラトープを包含するポリペプチドを指す。いくつかの態様において、抗体は、完全長の抗体である。いくつかの態様において、抗体は、キメラ抗体である。いくつかの態様において、抗体は、ヒト化抗体である。しかしながら、いくつかの態様において、抗体は、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント、Fvフラグメント、またはscFvフラグメントである。いくつかの態様において、抗体は、ラクダ科の動物の抗体に由来するナノボディー、またはサメ抗体に由来するナノボディーである。いくつかの態様において、抗体は、二重特異性抗体である。いくつかの態様において、抗体は、ヒト生殖細胞系配列を有するフレームワークを含む。別の態様において、抗体は、IgG、IgG1、IgG2、IgG2A、IgG2B、IgG2C、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgM、およびIgEの定常領域からなる群から選択される重鎖定常領域を含む。いくつかの態様において、抗体は、重(H)鎖可変領域(本明細書中VHと略される)、および/または(例として、および)、軽(L)鎖可変領域(本明細書中VLと略される)を含む。いくつかの態様において、抗体は、定常領域、例としてFc領域を含む。免疫グロブリン定常領域は、重鎖または軽鎖定常領域を指す。ヒトIgG重鎖および軽鎖定常領域アミノ酸配列およびそれらの機能的バリエーションは知られている。重鎖に関し、いくつかの態様において本明細書に記載の抗体の重鎖は、アルファ(α)、デルタ(Δ)、イプシロン(ε)、ガンマ(γ)、またはミュー(μ)重鎖であり得る。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体の重鎖は、ヒトのアルファ(α)、デルタ(Δ)、イプシロン(ε)、ガンマ(γ)、またはミュー(μ)重鎖を含み得る。具体的な態様において、本明細書に記載の抗体は、ヒトのガンマ1 CH1ドメイン、CH2ドメイン、および/または(例として、および)、CH3ドメインを含む。いくつかの態様において、VHドメインのアミノ酸配列は、ヒトガンマ(γ)重鎖定常領域のアミノ酸配列、例えば当該技術分野において知られているいずれの配列も含む。ヒト定常領域配列の非限定例は当該技術分野において記載されており、例として、米国特許第5,693,780号および上記のKabat E A et al.(1991)を見よ。いくつかの態様において、VHドメインは、本明細書に提供される可変鎖定常領域のいずれかと少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または少なくとも99％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、抗体は修飾されている(例として、グリコシル化、リン酸化、SUMO化、および/または(例として、および)、メチル化を介して修飾されている)。いくつかの態様において、抗体は、1個以上の糖または炭水化物分子へ抱合されたグリコシル化抗体である。いくつかの態様において、1個以上の糖または炭水化物分子は、N-グリコシル化、O-グリコシル化、C-グリコシル化、グリピエーション(GPIアンカー付着)、および/または(例として、および)、ホスホグリコシル化を介して、抗体へ抱合されている。いくつかの態様において、1個以上の糖または炭水化物分子は、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、またはグリカンである。いくつかの態様において、1個以上の糖または炭水化物分子は、分枝オリゴ糖類または分枝グリカンである。いくつかの態様において、1個以上の糖または炭水化物分子は、マンノース単位、グルコース単位、N-アセチルグルコサミン単位、N-アセチルガラクトサミン単位、ガラクトース単位、フコース単位、またはホスホ脂質単位を包含する。いくつかの態様において、抗体は、リンカーポリペプチドまたは免疫グロブリン定常領域へ連結された本開示の1個以上の抗原結合性フラグメントを含むポリペプチドを含む構築物である。リンカーポリペプチドは、ペプチド結合によって結び合わされた2個以上のアミノ酸残基を含み、1個以上の抗原結合部と連結させるために使用される。リンカーポリペプチドの例は報告されている(例として、Holliger,P.,et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448;Poljak,R.J.,et al.(1994)Structure 2:1121-1123を見よ)。またさらに、抗体は、1以上の他のタンパク質またはペプチドと、抗体もしくは抗体部分との共有結合または非共有結合の結び付きによって形成される、より大きな免疫接着分子の一部であってもよい。かかる免疫接着分子の例は、四量体scFv分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用(Kipriyanov,S.M.,et al.(1995)Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101)、ならびに二価のおよびビオチン化されたscFv分子を作製するためのシステイン残基、マーカーペプチド、およびC末ポリヒスチジンタグの使用(Kipriyanov,S.M.,et al.(1994)Mol.Immunol.31:1047-1058)を包含する。
CDR:本明細書に使用される場合、用語「CDR」は、抗体可変配列内の相補性決定領域を指す。典型的な抗体分子は、重鎖可変領域(VH)および軽鎖可変領域(VL)を含み、これらは通常、抗原結合に関与する。VHおよびVL領域は、「フレームワーク領域」(「FR」)として知られるより保存された領域が散在する、「相補性決定領域」(「CDR」)としても知られる超可変領域にさらに細分することができる。各VHおよびVLは、典型的には、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4で配置された3つのCDRおよび4つのFRで構成される。フレームワーク領域およびCDRの範囲は、当技術分野で公知の方法論を使用して、例えば、Kabat定義、IMGT定義、Chothia定義、AbM定義、および/または(例として、および)接触定義によって正確に同定され得、これらはすべて当技術分野で周知である。例として、Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242;IMGT(登録商標),the international ImMunoGeneTics information system(登録商標)http://www.imgt.org,Lefranc,M.-P.et al.,Nucleic Acids Res.,27:209-212(1999);Ruiz,M.et al.,Nucleic Acids Res.,28:219-221(2000);Lefranc,M.-P.,Nucleic Acids Res.,29:207-209(2001);Lefranc,M.-P.,Nucleic Acids Res.,31:307-310(2003);Lefranc,M.-P.et al.,In Silico Biol.,5,0006(2004)［Epub］,5:45-60(2005);Lefranc,M.-P.et al.,Nucleic Acids Res.,33:D593-597(2005);Lefranc,M.-P.et al.,Nucleic Acids Res.,37:D1006-1012(2009);Lefranc,M.-P.et al.,Nucleic Acids Res.,43:D413-422(2015);Chothia et al.,(1989)Nature 342:877;Chothia,C.et al.(1987)J.Mol.Biol.196:901-917,Al-lazikani et al(1997)J.Molec.Biol.273:927-948;およびAlmagro,J.Mol.Recognit.17:132-143(2004)を見よ。hgmp.mrc.ac.ukおよびbioinf.org.uk/absも見よ。本明細書で使用される場合、CDRは、当技術分野で公知の任意の方法によって定義されるCDRを指し得る。同じCDRを有する2つの抗体は、同じ方法、例えばIMGT定義によって決定される場合、2つの抗体がそのCDRの同じアミノ酸配列を有することを意味する。
重鎖および軽鎖の可変領域の各々において3つのCDRがあり、これらは可変領域の各々につきCDR1、CDR2、およびCDR3と指定される。用語「CDRセット」は、本明細書に使用されるとき、抗原に結合することが可能な単一の可変領域に生じる3つのCDRの一群を指す。これらのCDRの厳密な境界は、種々の系に従い異なって定義されている。Kabat(Kabat et al.,Sequence of Proteins of Immunological Interest(国立衛生研究所,Bethesda,Md.(1987)および(1991))によって記載される系は、抗体のいずれの可変領域へも適用可能な一義的な残基ナンバリング系を提供するのみならず、3つのCDRを定義する正確な残基境界をも提供する。これらのCDRは、Kabat CDRと称されることもある。CDRの下位部(Sub-portions)は、L1、L2、およびL3、またはH1、H2、およびH3と指定されることがあり、ここで「L」および「H」は夫々、軽鎖および重鎖領域を指定する。これらの領域は、Kabat CDRと重複する境界を有するChothia CDRと称されることもある。Kabat CDRと重複するCDRを定義する他の境界は、Padlan(FASEB J.9:133-139(1995))およびMacCallum(J Mol Biol 262(5):732-45(1996))によって記載されている。さらに他のCDR境界定義は、上の系の1つに厳重に従わなくてもよいが、それでもなおKabat CDRと重複することがあり、具体的な残基もしくは残基の群またはCDR全体でさえも抗原結合に有意に影響を及ぼすものではないという予測あるいは実験的知見を踏まえ、それらは短縮または伸長されてもよい。本明細書で使用される方法は、これらの系のいずれかに従って定義されたCDRを利用してもよい。CDR定義系の例が表6に示される。
表6.CDR定義
Figure 2023535074000002
CDR接合(-grafted)抗体:用語「CDR接合抗体」は、マウス重鎖および軽鎖可変領域を有するがマウスCDRの1以上(例として、CDR3)がヒトCDR配列に置き換えられている抗体などの、ある種からの重鎖および軽鎖可変領域配列を含むが、そのVHおよび/またはVLのCDR領域の1以上の配列が別の種のCDR配列に置き換えられている抗体を指す。
キメラ抗体:用語「キメラ抗体」は、ヒト定常領域へ連結されたマウス重鎖および軽鎖可変領域を有する抗体などの、ある種からの重鎖および軽鎖可変領域配列と別の種からの定常領域配列を含む抗体を指す。
相補的:本明細書に使用されるとき、用語「相補的」は、2ヌクレオチド間または2組のヌクレオチド間の正確な対形成のための能力(capacity)を指す。とりわけ、相補的は、2ヌクレオチド間または2組のヌクレオチド間に結合をもたらす水素結合対形成の程度を特徴付ける用語である。例えば、ある位置のオリゴヌクレオチドの塩基が、対応する位置の標的核酸(例として、mRNA)の塩基と水素結合することが可能である場合、そのとき塩基は、その位置にて互いに相補的であると見なされる。塩基対合は、標準的なWatson-Crick塩基対合と非Watson-Crick塩基対合(例として、Wobble塩基対合およびHoogsteen塩基対合)との両方を包含してもよい。例えば、いくつかの態様において、相補的な塩基対合として、アデノシン型塩基(A)は、チミジン型塩基(T)またはウラシル型塩基(U)に相補的であり、シトシン型塩基(C)は、グアノシン型塩基(G)に相補的であり、3-ニトロピロールまたは5-ニトロインドールなどのユニバーサル塩基は、いずれのA、C、U、またはTとハイブリダイズし得る。イノシン(I)はまた、当該技術分野においてユニバーサル塩基であるとも見なされており、いずれのA、C、U、またはTに相補的であると見なされる。
保存アミノ酸置換:本明細書に使用されるとき、「保存アミノ酸置換」は、アミノ酸置換がなされたタンパク質の相対的な電荷またはサイズの特徴を変更しないアミノ酸置換を指す。バリアントは、当業者に知られているポリペプチド配列を変更するための方法に従って調製され得、例えば、かかる方法をまとめた参考文献、例として、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,J.Sambrook,et al.,eds.,Fourth Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,2012、またはCurrent Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel,et al.,eds.,John Wiley&Sons,Inc.,New Yorkから見出される。アミノ酸の保存的置換は、以下の群:(a)M、I、L、V;(b)F、Y、W;(c)K、R、H;(d)A、G;(e)S、T;(f)Q、N;および(g)E、D内のアミノ酸に対してなされる置換を包含する。
共有結合的に連結された(または、連結されている):本明細書に使用されるとき、用語「共有結合的に連結された(または、連結されている)」は、少なくとも1個の共有結合を介して一緒に連結されている2個以上の分子の特徴を指す。いくつかの態様において、2個の分子は一緒に、分子間リンカーとして働く単結合(例として、ジスルフィド結合またはジスルフィド架橋)によって共有結合的に連結され得る。しかしながら、いくつかの態様において、複数の共有結合を通して2個以上の分子を一緒に結び合わせるリンカーとして働く分子を介して、2個以上の分子は一緒に、共有結合的に連結され得る。いくつかの態様において、リンカーは、切断可能なリンカーであってもよい。しかしながら、いくつかの態様において、リンカーは、切断不能なリンカーであってもよい。
交差反応すること:本明細書に使用されるとき、および標的化剤(例として、抗体)の文脈において、用語「交差反応すること」は、同様のタイプまたはクラスの1種より多くの抗原(例として、複数のホモログ、パラログ、もしくはオルソログの抗原)へ、同様の親和性または結合活性で特異的に結合することが可能な剤の特性を指す。例えば、いくつかの態様において、同様のタイプまたはクラスのヒトおよび霊長目の非ヒト動物の抗原(例として、ヒトトランスフェリン受容体および霊長目の非ヒト動物のトランスフェリン受容体)に対して交差反応する抗体は、ヒト抗原および霊長目の非ヒト動物の抗原へ、同様の親和性または結合活性で結合することが可能である。いくつかの態様において、抗体は、同様のタイプまたはクラスのヒト抗原および齧歯類動物抗原に対して交差反応する。いくつかの態様において、抗体は、同様のタイプまたはクラスの齧歯類動物の抗原および霊長目の非ヒト動物の抗原に対して交差反応する。いくつかの態様において、抗体は、同様のタイプまたはクラスのヒト抗原、霊長目の非ヒト動物の抗原、および齧歯類動物の抗原に対して交差反応する。
疾患アレル:本明細書に使用されるとき、用語「疾患アレル」は、アレルが疾患と相関する、および/または(例として、および)、これに直接的にもしくは間接的に寄与する、またはこれを引き起こす、遺伝子の代替的な形態(例として、突然変異型)のいずれか1つを指す。疾患アレルは、野生型(非疾患)アレルと比べて、これらに限定されないが、挿入(例として、下に記載の疾患関連反復)、欠失、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異およびスプライス部位突然変異を含む遺伝子変更を含んでもよい。いくつかの態様において、疾患アレルは、機能喪失型突然変異を有する。いくつかの態様において、疾患アレルは、機能獲得型突然変異を有する。いくつかの態様において、疾患アレルは、活性化突然変異をコードする(例として、構成的に活性であるタンパク質をコードする)。いくつかの態様において、疾患アレルは、劣性表現型を有する劣性アレルである。いくつかの態様において、疾患アレルは、優性表現型を有する優性アレルである。
疾患関連反復:本明細書に使用されるとき、用語「疾患関連反復」は、反復ヌクレオチド配列の数ユニットが、遺伝的疾患と相関する、および/または(例として、および)、これに直接的にもしくは間接的に寄与する、またはこれを引き起こす、ゲノムの場所での反復ヌクレオチド配列を指す。疾患関連反復の各反復単位は、長さが、2、3、4、5またはそれ以上のヌクレオチドであってもよい。例えば、いくつかの態様において、疾患関連反復は、ジヌクレオチド反復である。いくつかの態様において、疾患関連反復は、トリヌクレオチド反復である。いくつかの態様において、疾患関連反復は、テトラヌクレオチド反復である。いくつかの態様において、疾患関連反復は、ペンタヌクレオチド反復である。いくつかの態様において、疾患関連反復は、CAG反復、CTG反復、CUG反復、CGG反復、CCTG反復、またはそれらのいずれかのヌクレオチド相補体を含む。いくつかの態様において、疾患関連反復は、遺伝子の非コード部分にある。しかしながら、いくつかの態様において、疾患関連反復は、遺伝子のコード領域にある。いくつかの態様において、疾患関連反復は、正常な状態から、遺伝的疾患に直接的にまたは間接的に寄与するまたはこれを引き起こす長さへ、拡張される。いくつかの態様において、疾患関連反復は、RNA(例として、RNA転写産物)にある。いくつかの態様において、疾患関連反復は、DNA(例として、染色体、プラスミド)にある。いくつかの態様において、疾患関連反復は、生殖細胞系列細胞の染色体において拡張される。いくつかの態様において、疾患関連反復は、体細胞の染色体において拡張される。いくつかの態様において、疾患関連反復は、先天性発症に関連する数多の反復単位へ拡張される。いくつかの態様において、疾患関連反復は、疾患の小児期発症に関連する数多の反復単位へ拡張される。いくつかの態様において、疾患関連反復は、疾患の成人発症に関連する数多の反復単位へ拡張される。
フレームワーク:本明細書に使用されるとき、用語「フレームワーク」または「フレームワーク配列」は、CDRを差し引いた可変領域の残りの配列を指す。CDR配列の厳密な定義が種々の系によって決定され得ることから、フレームワーク配列の意味は、相応に異なる解釈に依存する。6つのCDR(軽鎖のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3、ならびに重鎖のCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3)もまた、軽鎖および重鎖上のフレームワーク領域を各鎖上の4つの下位領域(FR1、FR2、FR3、およびFR4)に分け、ここでCDR1はFR1とFR2との間に、CDR2はFR2とFR3との間に、CDR3はFR3とFR4との間に位置付けられる。具体的な下位領域をFR1、FR2、FR3、またはFR4と特定しないフレームワーク領域は、他によって言及されるとき、天然に存在する単一の免疫グロブリン鎖の可変領域内の組み合わされたFR(複数)を表す。本明細書に使用されるとき、FRは4つの下位領域のうち1つを表し、FR(複数)はフレームワーク領域を含有する4つの下位領域のうち2つ以上を表す。ヒト重鎖および軽鎖アクセプター配列は、当該技術分野において知られている。一態様において、当該技術分野において知られているアクセプター配列は、本明細書に開示の抗体に使用されていてもよい。
ヒト抗体:用語「ヒト抗体」は、本明細書に使用されるとき、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を包含することが意図される。本開示のヒト抗体は、例えばCDR、とりわけCDR3において、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基(例として、in vitroでのランダム変異誘発もしくは部位特異的変異誘発によってか、またはin vivoでの体細胞変異によって導入された突然変異)を包含していてもよい。しかしながら、用語「ヒト抗体」は、本明細書に使用されるとき、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列上へ接合された抗体を包含することは意図されない。
ヒト化抗体:用語「ヒト化抗体」は、非ヒト種(例として、マウス)からの重鎖および軽鎖の可変領域配列を含むが、VH配列および/または(例として、および)VL配列の少なくとも一部がより「ヒト様」に、すなわち、ヒト生殖細胞系可変配列とより同様なものに変更された抗体を指す。ヒト化抗体のあるタイプは、ヒトCDR配列が非ヒトVHおよびVL配列上へ導入されて対応する非ヒトCDR配列と置き換えられたCDR接合抗体である。一態様において、ヒト化された抗トランスフェリン受容体抗体および抗原結合部分が提供される。かかる抗体は、既存のハイブリドーマ技術、これに続くin vitroの遺伝子工学を使用するヒト化(KasaianらのPCT刊行物第WO 2005/123126 A2号に開示されたものなど)を使用してマウス抗トランスフェリン受容体モノクローナル抗体を得ることによって生成されてもよい。
内在化する細胞表面受容体:本明細書に使用されるとき、用語「内在化する細胞表面受容体」は、例として、外部刺激(例として、受容体へ結合するリガンド)の際、細胞によって内在化される細胞表面受容体を指す。いくつかの態様において、内在化する細胞表面受容体は、エンドサイトーシスによって内在化される。いくつかの態様において、内在化する細胞表面受容体は、クラスリン媒介エンドサイトーシスによって内在化される。しかしながら、いくつかの態様において、内在化する細胞表面受容体は、クラスリンに依存しない経路、例えば、食作用、マクロピノサイトーシス、カベオラ-およびラフト-媒介取り込み、またはクラスリンに依存しない構成的エンドサイトーシスなどによって内在化される。いくつかの態様において、内在化する細胞表面受容体は、細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、および/または(例として、および)、細胞外ドメインを含み、これらは任意にさらにリガンド結合ドメインを含む。いくつかの態様において、細胞表面受容体は、リガンド結合後に細胞によって内在化されるようになる。いくつかの態様において、リガンドは、筋標的化剤または筋標的化抗体であってもよい。いくつかの態様において、内在化する細胞表面受容体は、トランスフェリン受容体である。
単離された抗体:「単離された抗体」は、本明細書に使用されるとき、異なる抗原特異性を有する他の抗体が実質的にない抗体を指すことが意図される(例として、トランスフェリン受容体に特異的に結合する単離された抗体は、トランスフェリン受容体以外の抗原に特異的に結合する抗体が実質的にない)。しかしながら、トランスフェリン受容体複合体に特異的に結合する単離された抗体は、他の種からのトランスフェリン受容体分子などの他の抗原への交差反応性を有していてもよい。その上、単離された抗体は、他の細胞の材料および/または(例として、および)化学物質が実質的になくてもよい。
Kabatナンバリング:用語「Kabatナンバリング」、「Kabat定義」、および「Kabat標識化」は本明細書中、互換的に使用される。これらの用語は、当該技術分野において認識されているが、抗体またはその抗原結合部分の重鎖および軽鎖可変領域中の他のアミノ酸残基より可変(すなわち、高可変)であるアミノ酸残基をナンバリングする系を指す(Kabat et al.(1971)Ann.NY Acad,Sci.190:382-391および、Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)。重鎖可変領域において、超可変領域は、CDR1につきアミノ酸位置31～35、CDR2につきアミノ酸位置50～65、およびCDR3につきアミノ酸位置95～102に及ぶ。軽鎖可変領域において、超可変領域は、CDR1につきアミノ酸位置24～34、CDR2につきアミノ酸位置50～56、およびCDR3につきアミノ酸位置89～97に及ぶ。
分子ペイロード:本明細書に使用されるとき、用語「分子ペイロード」は、生物学的結果(biological outcome)をモジュレートするよう機能する分子または種を指す。いくつかの態様において、分子ペイロードは、筋標的化剤へ連結されているか、または別様に結び付けられている。いくつかの態様において、分子ペイロードは、小分子、タンパク質、ペプチド、核酸、またはオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DNA配列の転写をモジュレートするよう、タンパク質の発現をモジュレートするよう、またはタンパク質の活性をモジュレートするよう機能する。いくつかの態様において、分子ペイロードは、標的遺伝子と相補性のある領域を有する鎖を含むオリゴヌクレオチドである。
筋疾患遺伝子:本明細書に使用されるとき、用語「筋疾患遺伝子」は、筋疾患と相関するおよび/またはこれに直接的にまたは間接的に寄与するまたはこれを引き起こす、少なくとも1つの疾患アレルを有する遺伝子を指す。いくつかの態様において、筋疾患は、希少疾患であり、例として、National Center for Advancing Translational Sciences(NCATS)のプログラムであるGenetic and Rare Diseases Information Center(GARD)によって定義されるものである。いくつかの態様において、筋疾患は、200,000人未満を冒すものとして特徴付けられる希少疾患である。いくつかの態様において、筋疾患は、単一遺伝子疾患である。いくつかの態様において、筋疾患遺伝子は、表1に列挙された遺伝子である。
筋標的化剤:本明細書に使用されるとき、用語「筋標的化剤」は、筋細胞上に発現されている抗原へ特異的に結合する分子を指す。筋細胞中または筋細胞上の抗原は、膜タンパク質、例えば、内在性膜タンパク質または表在性膜タンパク質であってもよい。典型的には、筋標的化剤は、筋細胞中への筋標的化剤(および結び付けられたいずれの分子ペイロード)の内在化を容易にさせる筋細胞上の抗原へ特異的に結合する。いくつかの態様において、筋標的化剤は、筋肉上の内在化する細胞表面受容体へ特異的に結合し、受容体媒介内在化を通して筋細胞中へ内在化されることが可能である。いくつかの態様において、筋標的化剤は、小分子、タンパク質、ペプチド、核酸(例として、アプタマー)、または抗体である。いくつかの態様において、筋標的化剤は、分子ペイロードへ連結されている。
筋標的化抗体:本明細書に使用されるとき、用語「筋標的化抗体」は、筋細胞中または筋細胞上に見出される抗原へ特異的に結合する抗体である筋標的化剤を指す。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、筋細胞中への筋標的化抗体(および結び付けられたいずれの分子ペイロード)の内在化を容易にする筋細胞上の抗原へ特異的に結合する。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、筋細胞上に存在する、内在化する細胞表面受容体へ特異的に結合する。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、トランスフェリン受容体へ特異的に結合する抗体である。
オリゴヌクレオチド:本明細書に使用されるとき、用語「オリゴヌクレオチド」は、長さが最大200ヌクレオチドまでのオリゴマーの核酸化合物を指す。オリゴヌクレオチドの例は、これらに限定されないが、RNAiオリゴヌクレオチド(例として、siRNA、shRNA)、マイクロRNA、gapmer、mixmer、ホスホロジアミダート、モルホリノ、ペプチド核酸、アプタマー、ガイド核酸(例として、Cas9ガイドRNA)等々を包含する。オリゴヌクレオチドは一本鎖または二本鎖であってもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、1個以上の修飾ヌクレオチド(例として、2'-O-メチル糖修飾、プリンまたはピリミジン修飾)を含んでいてもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、1個以上の修飾ヌクレオチド間連結を含んでいてもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、RpまたはSpの立体化学配置にあってもよい1個以上のホスホロチオアート連結を含んでいてもよい。
組換え抗体:用語「組換えヒト抗体」は、本明細書に使用されるとき、組換え手段によって調製、発現、創出、もしくは単離されたすべてのヒト抗体、例えば、宿主細胞中へトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体(本開示により詳細に記載される)、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗体(Hoogenboom H.R.,(1997)TIB Tech.15:62-70;Azzazy H.,and Highsmith W.E.,(2002)Clin.Biochem.35:425-445;Gavilondo J.V.,and Larrick J.W.(2002)BioTechniques 29:128-145;Hoogenboom H.,and Chames P.(2000)Immunology Today 21:371-378)、ヒト免疫グロブリン遺伝子トランスジェニック動物(例として、マウス)から単離された抗体(例として、Taylor,L.D.,et al.(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295;Kellermann S-A.,and Green L.L.(2002)Current Opinion in Biotechnology 13:593-597;Little M.et al(2000)Immunology Today 21:364-370を見よ)、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のDNA配列とのスプライシングを伴ういずれの他の手段によって調製、発現、創出、もしくは単離された抗体を包含することが意図される。かかる組換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。しかしながら、ある態様において、かかる組換えヒト抗体は、in vitroでの変異誘発(または、ヒトIg配列トランスジェニック動物が使用されるとき、in vivoでの体細胞変異誘発)へ供され、よって、組換え抗体のVHおよびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系のVH配列およびVL配列に由来しかつこれに関するとはいえ、in vivoでのヒト抗体の生殖細胞系列レパートリー内には天然に存在しないこともある配列である。本開示の一態様は、当該技術分野において周知である技法を使用して、例えば、これらに限定されないが、ヒトIgファージライブラリ(例えば、JermutusらのPCT刊行物第WO 2005/007699 A2号に開示されたもの)を使用する技法を使用して生成され得るヒトトランスフェリン受容体に結合することが可能な完全ヒト抗体を提供する。
相補性のある領域:本明細書に使用されるとき、用語「相補性のある領域」は、2つのヌクレオチド配列が生理学的な条件下(例として、細胞中)相互にアニーリングすることが可能であるような、同族の(cognate)ヌクレオチド配列(例として、標的核酸のヌクレオチド配列)に充分に相補的であるヌクレオチド配列(例として、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列)を指す。いくつかの態様において、相補性のある領域は、標的核酸の同族のヌクレオチド配列に完全に相補的である。しかしながら、いくつかの態様において、相補性のある領域は、標的核酸の同族のヌクレオチド配列に部分的に相補的(例として、少なくとも80％、90％、95％、または99％相補性)である。いくつかの態様において、相補性のある領域は、標的核酸の同族のヌクレオチド配列と比較して1個、2個、3個、または4個のミスマッチを含有する。
特異的に結合する:本明細書に使用されるとき、用語「特異的に結合する」は、結合アッセイまたは他の結合に関する文脈(binding context)において、分子が、適切な対照から結合パートナーを区別するために使用され得る親和性または結合活性の程度での、分子の、結合パートナーへの結合能を指す。抗体に関し、用語「特異的に結合する」は、親和性または結合活性の程度で(例として、本明細書に記載のとおり、抗原への結合を通してある細胞(例として、筋細胞)への優先的な標的化を許容する程度で)、適切な参照抗原、または抗体が他の抗原から特定の抗原を区別するために使用され得る抗原と比較して、抗体が特定の抗原へ結合する能力を指す。いくつかの態様において、抗体が標的へ結合する際少なくとも約10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、またはこれ未満のKDを有する場合、抗体は標的へ特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体が、トランスフェリン受容体、例として、トランスフェリン受容体の先端ドメインのエピトープへ特異的に結合する。
対象:本明細書に使用されるとき、用語「対象」は、哺乳動物を指す。いくつかの態様において、対象は、霊長目の非ヒト動物または齧歯類動物である。いくつかの態様において、対象は、ヒトである。いくつかの態様において、対象は、疾患を有するかまたは疾患を有すると疑われる患者/患畜(patient)、例として、ヒト患者である。いくつかの態様において、対象は、筋疾患(例として、表1に提供されたいずれかの疾患)を有するかまたはそれを有すると疑われるヒト患者である。
トランスフェリン受容体:本明細書に使用されるとき、用語「トランスフェリン受容体」(またTFRC、CD71、p90、TFR、またはTFR1としても知られている)は、エンドサイトーシスによる鉄取り込みを容易にするためのトランスフェリンへ結合する、内在化する細胞表面受容体を指す。いくつかの態様において、トランスフェリン受容体は、ヒト(NCBI Gene ID 7037)、霊長目の非ヒト動物(例として、NCBI Gene ID 711568もしくはNCBI Gene ID 102136007)、または齧歯類の動物(例として、NCBI Gene ID 22042)を起源としていてもよい。加えて、受容体の種々のアイソフォームをコードした複数のヒト転写産物バリアントが(例として、GenBank RefSeq受託番号:NP_001121620.1、NP_003225.2、NP_001300894.1、およびNP_001300895.1の注釈付きのものであるように)特徴付けられている。
2'修飾ヌクレオシド:本明細書に使用されるとき、用語「2'修飾ヌクレオシド」および「2'修飾リボヌクレオシド」は互換的に使用され、2'位にて修飾された糖部分を有するヌクレオシドを指す。いくつかの態様において、2'修飾ヌクレオシドは、2'-4'二環式ヌクレオシドであり、ここで糖の2'および4'位は架橋されている(例として、メチレン、エチレン、または(S)-拘束エチル架橋による)。いくつかの態様において、2'修飾ヌクレオシドは非二環式2'修飾ヌクレオシドであり、例えばここで糖部分の2'位は置換されている。2'修飾ヌクレオシドの非限定例は、以下:2'デオキシ、2'-フルオロ(2'-F)、2'-O-メチル(2'-O-Me)、2'-O-メトキシエチル(2'-MOE)、2'-O-アミノプロピル(2'-O-AP)、2'-O-ジメチルアミノエチル(2'-O-DMAOE)、2'-O-ジメチルアミノプロピル(2'-O-DMAP)、2'-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2'-O-DMAEOE)、2'-O-N-メチルアセトアミド(2'-O-NMA)、ロックド核酸(LNA、メチレン架橋核酸)、エチレン架橋核酸(ENA)、および(S)-拘束エチル架橋核酸(cEt)を包含する。いくつかの態様において、本明細書に記載の2'修飾ヌクレオシドは高親和性修飾ヌクレオチドであり、2'修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、未修飾のオリゴヌクレオチドと比べて標的配列に対する増大した親和性を有する。2'修飾ヌクレオシドの構造の例は、下に提供される:
Figure 2023535074000003
II.Complexes
本明細書に提供されるのは、標的化剤、例として、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗体を含む複合体である。いくつかの態様において、複合体は、オリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結された筋標的化抗体を含む。複合体は、単一の抗原部位に特異的に結合する抗体、または同じ抗原上もしくは異なる抗原上に存在していてもよい少なくとも2つの抗原部位へ結合する抗体を含んでいてもよい。複合体は、少なくとも1つの遺伝子、タンパク質、および/または(例として、および)、核酸の活性あるいは機能をモジュレートするために使用されてもよい。いくつかの態様において、複合体と共に存在する分子ペイロードは、遺伝子、タンパク質、および/または(例として、および)、核酸のモジュレーションを担う。分子ペイロードは、細胞中の遺伝子、タンパク質、および/または(例として、および)、核酸の活性あるいは機能をモジュレートすることが可能な、小分子、タンパク質、核酸、オリゴヌクレオチド、あるいはいずれの分子実体であってもよい。いくつかの態様において、分子ペイロードは、筋細胞における筋疾患アレルを標的にするオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、複合体は、分子ペイロード(例として、筋疾患アレルを標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチド)へ共有結合的に連結された、筋標的化剤(例として、抗トランスフェリン受容体抗体)を含む。
いくつかの態様において、複合体は、分子ペイロードが表1で提供された対応する遺伝子の活性に影響する筋疾患を、処置するために有用である。例えば、疾病に応じて、分子ペイロードは、遺伝子の転写または発現をモジュレート(例として、減少、増大)、遺伝子によってコードされるタンパク質の発現をモジュレート、またはコードされたタンパク質の活性をモジュレートしてもよい。いくつかの態様において、分子ペイロードは、表1に提供された標的遺伝子と相補性のある領域を有する鎖を含むオリゴヌクレオチドである。
表1-筋疾患および対応する遺伝子のリスト。
Figure 2023535074000004
Figure 2023535074000005
Figure 2023535074000006
A.筋標的化剤
本開示のいくつかの側面は、筋標的化剤、例として、分子ペイロードを筋細胞へ送達するための筋標的化剤を提供する。いくつかの態様において、かかる筋標的化剤は、例として、筋細胞上の抗原への特異的な結合を介して、筋細胞へ結合すること、および結び付けられた分子ペイロードを筋細胞へ送達することが可能である。いくつかの態様において、分子ペイロードは、筋標的化剤へ結合されて(例として、共有結合的に結合されて)おり、筋標的化剤が筋細胞上の抗原へ結合した際、例としてエンドサイトーシスを介して、筋細胞中へ内在化される。様々なタイプの筋標的化剤が本開示に従って使用されてもよいことは解されるはずである。例えば、筋標的化剤は、核酸(例として、DNAまたはRNA)、ペプチド(例として、抗体)、脂質(例として、マイクロベシクル)、または糖部(例として、多糖類)を含んでいてもよく、またはこれらからなっていてもよい。例示の筋標的化剤は本明細書中さらに詳細に記載されているが、しかしながら、本明細書に提供される例示の筋標的化剤が限定されることを意図していないことは解されるはずである。
本開示のいくつかの側面は、骨格筋、平滑筋、または心筋などの筋肉上の抗原へ特異的に結合する筋標的化剤を提供する。いくつかの態様において、本明細書に提供される筋標的化剤のいずれも、骨格筋細胞、平滑筋細胞、および/または(例として、および)、心筋細胞上の抗原へ結合する(例として、特異的に結合する)。
筋肉特異的細胞表面認識要素(例として、細胞膜タンパク質)との相互作用によって、組織局在化と筋細胞への選択的取り込みとの両方が達成され得る。いくつかの態様において、筋肉の取り込みトランスポーターの基質である分子は、分子ペイロードを筋組織中へ送達するのに有用である。筋肉表面認識要素への結合、これに続くエンドサイトーシスは、抗体などの巨大分子さえも筋細胞へ侵入できるようにし得る。別の例として、トランスフェリンまたは抗トランスフェリン受容体抗体へ抱合された分子ペイロードは、トランスフェリン受容体への結合を介し筋細胞によって取り入れられ得、次いで、例としてクラスリン媒介エンドサイトーシスを介し、形質膜陥入され(endocytosed)てもよい。
筋標的化剤の使用は、他の組織において効果に関連する毒性を低減しつつ、筋肉中の分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド)を濃縮するのに有用なこともある。いくつかの態様において、筋標的化剤は、対象内の別の細胞型と比較して、筋細胞中の結合された分子ペイロードを濃縮させる。いくつかの態様において、筋標的化剤は、筋細胞(例として、骨格筋細胞、平滑筋細胞、または心筋細胞)中の結合された分子ペイロードを、非筋細胞(例として、肝臓細胞、神経細胞、血液細胞、または脂肪細胞)中の量より少なくとも1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、または100倍多い量で濃縮する。いくつかの態様において、筋標的化剤へ結合された場合の分子ペイロードの対象における毒性は、これが対象へ送達されたとき、少なくとも1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％、または95％低減される。
いくつかの態様において、筋肉選択性を獲得するために、筋肉認識要素(例として、筋細胞抗原)が要されることもある。一例として、筋標的化剤は、筋肉特異的取り込みトランスポーターの基質である小分子であってもよい。別の例として、筋標的化剤は、トランスポーター媒介エンドサイトーシスを介して筋細胞へ侵入する抗体であってもよい。別の例として、筋標的化剤は、筋細胞上の細胞表面受容体へ結合するリガンドであってもよい。トランスポーターをベースとしたアプローチが細胞侵入への直通路を提供するのに対し、受容体をベースとした標的化が所望の作用部位に達するために刺激されたエンドサイトーシスを伴うこともあることは解されるはずである。
本開示に包含される筋細胞は、これらに限定されないが、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、筋芽細胞、およびミオサイトを含む。
i.筋標的抗体
いくつかの態様において、筋標的化剤は抗体である。一般に、それらの標的抗原に対する抗体の高い特異性は、筋細胞(例として、骨格筋細胞、平滑筋細胞、および/または(例として、および)、心筋細胞)を選択的に標的にする潜在力を提供する。この特異性はまた、オフターゲット毒性(off-target toxicity)を限定することもある。筋細胞の表面抗原を標的にすることが可能である抗体の例は報告されており、かつ本開示の範囲内にある。例えば、筋細胞の表面を標的とする抗体は、Arahata K.,et al.「Immunostaining of skeletal and cardiac muscle surface membrane with antibody against Duchenne muscular dystrophy peptide」Nature 1988;333:861-3;Song K.S.,et al.「Expression of caveolin-3 in skeletal,cardiac,and smooth muscle cells.Caveolin-3 is a component of the sarcolemma and co-fractionates with dystrophin and dystrophin-associated glycoproteins」J Biol Chem 1996;271:15160-5;およびWeisbart R.H.et al.,「Cell type specific targeted intracellular delivery into muscle of a monoclonal antibody that bind myosin IIb」Mol Immunol.2003 Mar,39(13):78309に記載され、その各々の全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
a.抗トランスフェリン受容体抗体
本開示のいくつかの側面は、トランスフェリン受容体、例として抗トランスフェリン受容体抗体へ結合する剤は筋細胞を標的にすることが可能であるという認識に基づく。トランスフェリン受容体は、細胞膜を越えてトランスフェリンを輸送し細胞内鉄レベルの調節およびホメオスタシスに加わる内在化する細胞表面受容体である。本開示のいくつかの側面は、トランスフェリン受容体へ結合することが可能なトランスフェリン受容体結合タンパク質を提供する。結果的に、本開示の側面は、トランスフェリン受容体へ結合する結合タンパク質(例として、抗体)を提供する。いくつかの態様において、トランスフェリン受容体へ結合する結合タンパク質は、結合されたいずれの分子ペイロードと共に、筋細胞中へ内在化される。本明細書に使用されるとき、トランスフェリン受容体へ結合する抗体は、トランスフェリン受容体抗体、抗トランスフェリン受容体抗体、または抗TfR抗体と互換的に称されることもある。トランスフェリン受容体へ結合する、例として特異的に結合する抗体は、トランスフェリン受容体へ結合した際、例として受容体媒介エンドサイトーシスを通して、細胞中へ内在化されてもよい。
抗トランスフェリン受容体抗体が、知られている数種の方法論、例としてファージディスプレーを使用するライブラリ設計を使用して、産生、合成、および/または(例として、および)、誘導体化されてもよいことは解されるはずである。例示の方法論は当該技術分野において特徴付けられており、参照により組み込まれる(Diez,P.et al.「High-throughput phage-display screening in array format」,Enzyme and microbial technology,2015,79,34-41.;Christoph M.H.and Stanley,J.R.「Antibody Phage Display:Technique and Applications」J Invest Dermatol.2014,134:2.;Engleman,Edgar(Ed.)「Human Hybridomas and Monoclonal Antibodies.」1985,Springer)。他の態様において、抗トランスフェリン抗体はこれまでに特徴付けられているかまたは開示されている。トランスフェリン受容体に特異的に結合する抗体は、当技術分野で公知である(例として、米国特許第4,364,934号、12/4/1979出願、「Monoclonal antibody to a human early thymocyte antigen and methods for preparing same」;米国特許第8,409,573号、6/14/2006出願、「Anti-CD71 monoclonal antibodies and uses thereof for treating malignant tumor cells」;米国特許第9,708,406号、5/20/2014出願、「Anti-transferrin receptor antibodies and methods of use」;米国特許第9,611,323号、12/19/2014出願、「Low affinity blood brain barrier receptor antibodies and uses therefor」;WO 2015/098989、12/24/2014出願、「Novel anti-Transferrin receptor antibody that passes through blood-brain barrier」;Schneider C.et al.「Structural features of the cell surface receptor for transferrin that is recognized by the monoclonal antibody OKT9.」J Biol Chem.1982,257:14,8516-8522.;Lee et al.「Targeting Rat Anti-Mouse Transferrin Receptor Monoclonal Antibodies through Blood-Brain Barrier in Mouse」2000,J Pharmacol.Exp.Ther.,292:1048-1052を見よ)。
本明細書に提供されるは、いくつかの側面において、筋標的化剤としての(例として、筋標的化複合体への)使用のための新しい抗TfR抗体である。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体は、高い特異性および親和性でトランスフェリン受容体に結合する。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体は、トランスフェリン受容体のいずれかの細胞外エピトープまたは抗体に対して暴露されるようになるエピトープに特異的に結合する。いくつかの態様において、本明細書に提供される抗TfR抗体はヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラットなどからのトランスフェリン受容体に特異的に結合する。いくつかの態様において、本明細書に提供される抗TfR抗体は、ヒトトランスフェリン受容体に結合する。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体は、配列番号105～108に提供されるような、ヒトまたは非ヒト霊長類トランスフェリン受容体のアミノ酸セグメントに結合する。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体は、トランスフェリン受容体の先端ドメインにはない、配列番号105に示されるヒトトランスフェリン受容体のアミノ酸90～96に対応するアミノ酸セグメントに結合する。
NCBI配列NP_003225.2(トランスフェリン受容体タンパク質1アイソフォーム1、homo sapiens)に対応する、ヒトトランスフェリン受容体アミノ酸配列の例は、以下のとおりである:
MMDQARSAFSNLFGGEPLSYTRFSLARQVDGDNSHVEMKLAVDEEENADNNTKANVTKPKRCSGSICYGTIAVIVFFLIGFMIGYLGYCKGVEPKTECERLAGTESPVREEPGEDFPAARRLYWDDLKRKLSEKLDSTDFTGTIKLLNENSYVPREAGSQKDENLALYVENQFREFKLSKVWRDQHFVKIQVKDSAQNSVIIVDKNGRLVYLVENPGGYVAYSKAATVTGKLVHANFGTKKDFEDLYTPVNGSIVIVRAGKITFAEKVANAESLNAIGVLIYMDQTKFPIVNAELSFFGHAHLGTGDPYTPGFPSFNHTQFPPSRSSGLPNIPVQTISRAAAEKLFGNMEGDCPSDWKTDSTCRMVTSESKNVKLTVSNVLKEIKILNIFGVIKGFVEPDHYVVVGAQRDAWGPGAAKSGVGTALLLKLAQMFSDMVLKDGFQPSRSIIFASWSAGDFGSVGATEWLEGYLSSLHLKAFTYINLDKAVLGTSNFKVSASPLLYTLIEKTMQNVKHPVTGQFLYQDSNWASKVEKLTLDNAAFPFLAYSGIPAVSFCFCEDTDYPYLGTTMDTYKELIERIPELNKVARAAAEVAGQFVIKLTHDVELNLDYERYNSQLLSFVRDLNQYRADIKEMGLSLQWLYSARGDFFRATSRLTTDFGNAEKTDRFVMKKLNDRVMRVEYHFLSPYVSPKESPFRHVFWGSGSHTLPALLENLKLRKQNNGAFNETLFRNQLALATWTIQGAANALSGDVWDIDNEF(配列番号105)
NCBI配列NP_001244232.1(トランスフェリン受容体タンパク質1、Macaca mulatta)に対応する、霊長目の非ヒト動物トランスフェリン受容体アミノ酸配列の例は、以下のとおりである:
MMDQARSAFSNLFGGEPLSYTRFSLARQVDGDNSHVEMKLGVDEEENTDNNTKPNGTKPKRCGGNICYGTIAVIIFFLIGFMIGYLGYCKGVEPKTECERLAGTESPAREEPEEDFPAAPRLYWDDLKRKLSEKLDTTDFTSTIKLLNENLYVPREAGSQKDENLALYIENQFREFKLSKVWRDQHFVKIQVKDSAQNSVIIVDKNGGLVYLVENPGGYVAYSKAATVTGKLVHANFGTKKDFEDLDSPVNGSIVIVRAGKITFAEKVANAESLNAIGVLIYMDQTKFPIVKADLSFFGHAHLGTGDPYTPGFPSFNHTQFPPSQSSGLPNIPVQTISRAAAEKLFGNMEGDCPSDWKTDSTCKMVTSENKSVKLTVSNVLKETKILNIFGVIKGFVEPDHYVVVGAQRDAWGPGAAKSSVGTALLLKLAQMFSDMVLKDGFQPSRSIIFASWSAGDFGSVGATEWLEGYLSSLHLKAFTYINLDKAVLGTSNFKVSASPLLYTLIEKTMQDVKHPVTGRSLYQDSNWASKVEKLTLDNAAFPFLAYSGIPAVSFCFCEDTDYPYLGTTMDTYKELVERIPELNKVARAAAEVAGQFVIKLTHDTELNLDYERYNSQLLLFLRDLNQYRADVKEMGLSLQWLYSARGDFFRATSRLTTDFRNAEKRDKFVMKKLNDRVMRVEYYFLSPYVSPKESPFRHVFWGSGSHTLSALLESLKLRRQNNSAFNETLFRNQLALATWTIQGAANALSGDVWDIDNEF
(配列番号106)
NCBI配列XP_005545315.1(トランスフェリン受容体タンパク質1、Macaca fascicularis)に対応する、霊長目の非ヒト動物トランスフェリン受容体アミノ酸配列の例は、以下のとおりである:
MMDQARSAFSNLFGGEPLSYTRFSLARQVDGDNSHVEMKLGVDEEENTDNNTKANGTKPKRCGGNICYGTIAVIIFFLIGFMIGYLGYCKGVEPKTECERLAGTESPAREEPEEDFPAAPRLYWDDLKRKLSEKLDTTDFTSTIKLLNENLYVPREAGSQKDENLALYIENQFREFKLSKVWRDQHFVKIQVKDSAQNSVIIVDKNGGLVYLVENPGGYVAYSKAATVTGKLVHANFGTKKDFEDLDSPVNGSIVIVRAGKITFAEKVANAESLNAIGVLIYMDQTKFPIVKADLSFFGHAHLGTGDPYTPGFPSFNHTQFPPSQSSGLPNIPVQTISRAAAEKLFGNMEGDCPSDWKTDSTCKMVTSENKSVKLTVSNVLKETKILNIFGVIKGFVEPDHYVVVGAQRDAWGPGAAKSSVGTALLLKLAQMFSDMVLKDGFQPSRSIIFASWSAGDFGSVGATEWLEGYLSSLHLKAFTYINLDKAVLGTSNFKVSASPLLYTLIEKTMQDVKHPVTGRSLYQDSNWASKVEKLTLDNAAFPFLAYSGIPAVSFCFCEDTDYPYLGTTMDTYKELVERIPELNKVARAAAEVAGQFVIKLTHDTELNLDYERYNSQLLLFLRDLNQYRADVKEMGLSLQWLYSARGDFFRATSRLTTDFRNAEKRDKFVMKKLNDRVMRVEYYFLSPYVSPKESPFRHVFWGSGSHTLSALLESLKLRRQNNSAFNETLFRNQLALATWTIQGAANALSGDVWDIDNEF(配列番号107)
NCBI配列NP_001344227.1(トランスフェリン受容体タンパク質1、mus musculus)に対応する、マウストランスフェリン受容体アミノ酸配列の例は、以下のとおりである:
MMDQARSAFSNLFGGEPLSYTRFSLARQVDGDNSHVEMKLAADEEENADNNMKASVRKPKRFNGRLCFAAIALVIFFLIGFMSGYLGYCKRVEQKEECVKLAETEETDKSETMETEDVPTSSRLYWADLKTLLSEKLNSIEFADTIKQLSQNTYTPREAGSQKDESLAYYIENQFHEFKFSKVWRDEHYVKIQVKSSIGQNMVTIVQSNGNLDPVESPEGYVAFSKPTEVSGKLVHANFGTKKDFEELSYSVNGSLVIVRAGEITFAEKVANAQSFNAIGVLIYMDKNKFPVVEADLALFGHAHLGTGDPYTPGFPSFNHTQFPPSQSSGLPNIPVQTISRAAAEKLFGKMEGSCPARWNIDSSCKLELSQNQNVKLIVKNVLKERRILNIFGVIKGYEEPDRYVVVGAQRDALGAGVAAKSSVGTGLLLKLAQVFSDMISKDGFRPSRSIIFASWTAGDFGAVGATEWLEGYLSSLHLKAFTYINLDKVVLGTSNFKVSASPLLYTLMGKIMQDVKHPVDGKSLYRDSNWISKVEKLSFDNAAYPFLAYSGIPAVSFCFCEDADYPYLGTRLDTYEALTQKVPQLNQMVRTAAEVAGQLIIKLTHDVELNLDYEMYNSKLLSFMKDLNQFKTDIRDMGLSLQWLYSARGDYFRATSRLTTDFHNAEKTNRFVMREINDRIMKVEYHFLSPYVSPRESPFRHIFWGSGSHTLSALVENLKLRQKNITAFNETLFRNQLALATWTIQGVANALSGDIWNIDNEF
(配列番号108)
いくつかの態様では、抗トランスフェリン受容体抗体は、以下のように受容体のアミノ酸セグメントに結合し:FVKIQVKDSAQNSVIIVDKNGRLVYLVENPGGYVAYSKAATVTGKLVHANFGTKKDFEDLYTPVNGSIVIVRAGKITFAEKVANAESLNAIGVLIYMDQTKFPIVNAELSFFGHAHLGTGDPYTPGFPSFNHTQFPPSRSSGLPNIPVQTISRAAAEKLFGNMEGDCPSDWKTDSTCRMVTSESKNVKLTVSNVLKE(配列番号109)トランスフェリン受容体とトランスフェリンおよび/または(例として、および)ヒト血色素症タンパク質(HFEとしても知られる)との間の結合相互作用を阻害しない。いくつかの態様において、抗本明細書に記載のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号109のエピトープには結合しない。
適切な方法論は、例として、組換えDNAプロトコルの使用を通じて、抗体、抗体フラグメント、もしくは抗原結合剤を得るか、および/または(例として、および)、産生するために使用されてもよい。いくつかの態様において、抗体はまた、ハイブリドーマの生成を通しても産生されてよい(例として、Kohler,G and Milstein,C.「Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity」Nature,1975,256:495-497を見よ)。関心のある抗原は、いずれの型または実体の、例として、組換え型もしくは天然に存在する型または実体の免疫原として使用されてもよい。ハイブリドーマは、標準的な方法、例としてELISAスクリーニングを使用してスクリーニングされることで、具体的な抗原を標的にする抗体を産生する少なくとも1個のハイブリドーマが見出される。抗体はまた、抗体を発現するタンパク質発現ライブラリ(例として、ファージディスプレーライブラリ)のスクリーニングを通しても産生されてよい。ファージディスプレーライブラリ設計はまた、いくつかの態様において使用されてもよい(例として、米国特許第5,223,409号、3/1/1991出願、「Directed evolution of novel binding proteins」;WO 1992/18619、4/10/1992出願、「Heterodimeric receptor libraries using phagemids」;WO 1991/17271、5/1/1991出願、「Recombinant library screening methods」;WO 1992/20791、5/15/1992出願、「Methods for producing members of specific binding pairs」;およびWO 1992/15679、2/28/1992出願、「Improved epitope displaying phage」を見よ)。いくつかの態様において、関心のある抗原は、非ヒト動物、例として、齧歯類の動物またはヤギを免疫するために使用されてもよい。いくつかの態様において、次いで抗体が非ヒト動物から得られたら、任意に数多の方法論を使用し、例として組換えDNA技法を使用し、修飾してもよい。抗体産生および方法論の追加の例も当該技術分野において知られている(例として、Harlow et al.「Antibodies:A Laboratory Manual」,Cold Spring Harbor Laboratory,1988を見よ)。
いくつかの態様において、抗体は修飾されている(例として、グリコシル化、リン酸化、SUMO化、および/または(例として、および)、メチル化を介して修飾されている)。いくつかの態様において、抗体は、1個以上の糖または炭水化物分子へ抱合されたグリコシル化抗体である。いくつかの態様において、1個以上の糖または炭水化物分子は、N-グリコシル化、O-グリコシル化、C-グリコシル化、グリピエーション(GPIアンカー付着)、および/または(例として、および)、ホスホグリコシル化を介して、抗体へ抱合されている。いくつかの態様において、1個以上の糖または炭水化物分子は、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、またはグリカンである。いくつかの態様において、1個以上の糖または炭水化物分子は、分枝オリゴ糖類または分枝グリカンである。いくつかの態様において、1個以上の糖または炭水化物分子は、マンノース単位、グルコース単位、N-アセチルグルコサミン単位、N-アセチルガラクトサミン単位、ガラクトース単位、フコース単位、またはホスホ脂質単位を包含する。いくつかの態様において、糖分子は、約1～10個、約1～5個、約5～10個、約1～4個、約1～3個、または約2個存在する。いくつかの態様において、グリコシル化抗体は、全体的にまたは部分的にグリコシル化されている。いくつかの態様において、抗体は、化学反応によって、または酵素的な手段によってグリコシル化されている。いくつかの態様において、抗体は、in vitroでまたは細胞(任意にN-またはO-グリコシル化経路中の酵素(例として、グリコシルトランスフェラーゼ)を欠乏していてもよい)内部でグリコシル化される。いくつかの態様において、抗体は、「Modified antibody,antibody-conjugate and process for the preparation thereof」と題する2014年5月1日に公開された国際特許出願公開WO2014065661に記載のとおりの糖または炭水化物分子で官能化されている。
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、表2から選択される抗TfR抗体のいずれか1つのVLドメインおよび/または(例として、および)VHドメインを含み、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、またはIgY免疫グロブリン分子、いずれかのクラス(例として、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2)、またはいずれかのサブクラス(例として、IgG2aおよびIgG2b)の免疫グロブリン分子の定常領域のアミノ酸配列を含む定常領域を含む。ヒト定常領域の非限定例は当該技術分野において記載されており、例として、上述のKabat E A et al.(1991)を見よ。
いくつかの態様において、トランスフェリン受容体に結合する薬剤、例として抗TfR抗体は、筋細胞を標的とすることができ、および/または(例として、および)血液脳関門を通過する薬剤の輸送を媒介する。トランスフェリン受容体は、細胞膜を越えてトランスフェリンを輸送し細胞内鉄レベルの調節およびホメオスタシスに加わる内在化する細胞表面受容体である。本開示のいくつかの側面は、トランスフェリン受容体へ結合することが可能なトランスフェリン受容体結合タンパク質を提供する。トランスフェリン受容体へ結合する、例として特異的に結合する抗体は、トランスフェリン受容体へ結合した際、例として受容体媒介エンドサイトーシスを通して、細胞中へ内在化されてもよい。
いくつかの態様では、トランスフェリン受容体に高い特異性および親和性で結合するヒト化抗体が本明細書で提供される。いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、トランスフェリン受容体のいずれかの細胞外エピトープ、または抗体に対して暴露されるようになるエピトープに特異的に結合する。いくつかの態様において、本明細書に提供されるヒト化抗TfR抗体はヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラットなどからのトランスフェリン受容体に特異的に結合する。いくつかの態様において、本明細書に提供されるヒト化抗TfR抗体は、ヒトトランスフェリン受容体に結合する。いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、配列番号105～108に提供されるような、ヒトまたは非ヒト霊長類トランスフェリン受容体のアミノ酸セグメントに結合する。いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、トランスフェリン受容体の先端ドメインにはない、配列番号105に示されるヒトトランスフェリン受容体のアミノ酸90～96に対応するアミノ酸セグメントに結合する。いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、TfR1に結合するが、TfR2には結合しない。
いくつかの態様において、抗TFR抗体は、少なくとも約10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、またはより小さい結合親和性(例として、Kdによって指し示される)によってTfR1(例として、ヒトまたは霊長目の非ヒト動物TfR1)に特異的に結合する。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体はサブナノモル範囲のKDによってTfR1に結合する。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体はトランスフェリン受容体1(TfR1)に選択的に結合するが、トランスフェリン受容体2(TfR2)には結合しない。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体はヒトTfR1およびカニクイTfR1に結合するが(例として、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、またはより小さいKdによる)、マウスTfR1には結合しない。抗TfR抗体の親和性および結合動態は、バイオセンサ技術(例として、OCTETまたはBIACORE)を包含するがこれらに限定されないいずれか好適な方法を使用して試験され得る。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体のいずれか1つの結合は、TfR1へのトランスフェリン結合と競合も阻害もしない。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体のいずれか1つの結合は、TfR1に対するHFE-ベータ2-ミクログロブリン結合と競合も阻害もしない。
本明細書中に記載される抗TfR抗体は、ヒト化抗体である。本明細書中に記載されるヒト化抗TfR抗体が由来するマウスモノクローナル抗TfR抗体のCDRおよび可変領域アミノ酸配列を表2に提供する。
表2.マウスモノクローナル抗TfR抗体
Figure 2023535074000007
Figure 2023535074000008
Figure 2023535074000009
いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、表2に提供される抗TfR抗体のいずれか1つのヒト化バリアントである。いくつかの態様において、本開示の抗TfR抗体は、表2に提供される示される抗TfR抗体のいずれか1つのCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3と同じCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含み、ヒト化重鎖可変領域および/または(例として、および)ヒト化軽鎖可変領域を含む。
ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域(CDR)からのその残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種(ドナー抗体)のCDRからの残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。いくつかの態様において、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。さらにまた、ヒト化抗体は、レシピエント抗体から見出されない残基も、移入された(imported)CDRまたはフレームワーク配列から見出されない残基も含んでいてもよいが、抗体の性能をさらに洗練および最適化するために包含される残基を含むこともある。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも1つの、典型的には2つの可変ドメインのすべてを実質的に含むであろうが、前記可変ドメインにおいて、CDR領域のすべてまたは実質的にすべてが、非ヒト免疫グロブリンのCDR領域に対応し、かつFR領域のすべてまたは実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のFR領域である。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン(典型的には、ヒト免疫グロブリンの)定常領域またはドメイン(Fc)の少なくとも一部も含むであろう。抗体は、WO 99/58572に記載のとおりに修飾されたFc領域を有していてもよい。ヒト化抗体の他の形態は、元の抗体に関して変更された1以上のCDR(1、2、3、4、5、6)を有しており、これらはまた、元の抗体からの1以上のCDRに由来する1以上のCDRとも呼ばれる。ヒト化抗体はまた、親和性成熟も伴うことがある。
ヒト化抗体およびこれらを作製する方法は知られており、例として、Almagro et al.,Front.Biosci.13:1619-1633(2008);Riechmann et al.,Nature 332:323-329(1988);Queen et al.,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989);米国特許第5,821,337号、第7,527,791号、第6,982,321号、および第7,087,409号;Kashmiri et al.,Methods 36:25-34(2005);Padlan et al.,Mol.Immunol.28:489-498(1991);Dall'Acqua et al.,Methods 36:43-60(2005);Osbourn et al.,Methods 36:61-68(2005);ならびにKlimka et al.,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)に記載されるとおりであり、これらのすべての内容は参照によって本明細書に組み込まれる。ヒト化に使用され得るヒトフレームワーク領域は、例として、Sims et al.J.Immunol.151:2296(1993);Carter et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:4285(1992);Presta et al.J.Immunol.151:2623(1993);Almagro et al.,Front.Biosci.13:1619-1633(2008));Baca et al.,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997);およびRosok et al.,J Biol.Chem.271:22611-22618(1996)に記載されており、これらすべての内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、表2に列挙されるVHのいずれか1つと比較して1つ以上のアミノ酸バリエーションを含む(例として、VHフレームワーク領域において)ヒト化VH、および/または(例として、および)表2に列挙されるVLのいずれか1つと比較して1つ以上のアミノ酸バリエーションを含む(例として、VLフレームワーク領域において)ヒト化VLを含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、表2に列挙される抗TfR抗体のいずれか(例として、配列番号17、22、26、43、61、65および68のいずれか1つ)のVHと比較して、25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有するヒト化VHを含む。代替え的または追加で(例として、追加で)、本開示のヒト化抗TfR抗体は、表2に列挙される抗TfR抗体のいずれか1つ(例として、配列番号18、44および62のいずれか1つ)のVLと比較して、25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有するヒト化VLを含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、表2に列挙された抗TfR抗体のいずれか(例として、配列番号17、22、26、43、61、65および68のいずれか1つ)のVHと少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)フレームワーク領域において同一であるアミノ酸配列を含むヒト化VHを含む。代替え的または追加で(例として、追加で)、いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、表2に列挙された抗TfR抗体のいずれか(例として、配列番号18、44および62のいずれか1つ)のVLと少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)フレームワーク領域において同一であるアミノ酸配列を含むヒト化VLを含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(IMGT定義系による)配列番号1のアミノ酸配列を有するCDR-H1、(IMGT定義系による)配列番号2、配列番号19、または配列番号23のアミノ酸配列を有するCDR-H2、(IMGT定義系による)配列番号3のアミノ酸配列を有するCDR-H3を含み、配列番号17、配列番号22、または配列番号26に示されるVHと比較して25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)をフレームワーク領域において含有するヒト化VHを含む。代替え的または追加で(例として、追加で)、本開示の抗TfR抗体は、(IMGT定義系による)配列番号4のアミノ酸配列を有するCDR-L1、(IMGT定義系による)配列番号5アミノ酸配列を有するCDR-L2、(IMGT定義系による)配列番号6のアミノ酸配列を有するCDR-L3を含み、配列番号18に示されるVLと比較して25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)をフレームワーク領域において含有するヒト化VLを含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(IMGT定義系による)配列番号1のアミノ酸配列を有するCDR-H1、(IMGT定義系による)配列番号2、配列番号19または配列番号23のアミノ酸配列を有するCDR-H2、(IMGT定義系による)配列番号3のアミノ酸配列を有するCDR-H3を含むヒト化VHを含み、フレームワーク領域において、配列番号17、配列番号22または配列番号26で示されるVHと少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一である。代替え的または追加で(例として、追加で)、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(IMGT定義系による)配列番号4のアミノ酸配列を有するCDR-L1、(IMGT定義系による)配列番号5アミノ酸配列を有するCDR-L2、および(IMGT定義系による)配列番号6のアミノ酸配列を有するCDR-L3を含むヒト化VLを含み、配列番号18のいずれか1つに示されるVLと、フレームワーク領域において少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一である。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(Kabat定義系による)配列番号7のアミノ酸配列を有するCDR-H1、(Kabat定義系による)配列番号8、配列番号20、または配列番号24のアミノ酸配列を有するCDR-H2、(Kabat定義系による)配列番号9のアミノ酸配列を有するCDR-H3を含み、配列番号17、配列番号22、または配列番号26に示されるVHと比較して25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)をフレームワーク領域において含有するヒト化VHを含む。代替的にまたは追加で(例として、追加で)、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(Kabat定義系による)配列番号10のアミノ酸配列を有するCDR-L1、(Kabat定義系に従う)配列番号11のアミノ酸配列を有するCDR-L2、および(Kabat定義系による)配列番号6のアミノ酸配列を有するCDR-L3を含み、配列番号18で示されるVLと比較して25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)をフレームワーク領域に含有するヒト化VLを含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(Kabat定義系による)配列番号7のアミノ酸配列を有するCDR-H1、(Kabat定義系による)配列番号8、配列番号20または配列番号24のアミノ酸配列を有するCDR-H2、(Kabat定義系による)配列番号9のアミノ酸配列を有するCDR-H3を含むヒト化VHを含み、フレームワーク領域において、配列番号17、配列番号22または配列番号26で示されるVHと少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一である。代替え的または追加で(例として、追加で)、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(Kabat定義系による)配列番号10のアミノ酸配列を有するCDR-L1、(Kabat定義系による)配列番号11のアミノ酸配列を有するCDR-L2、および(Kabat定義系による)配列番号6のアミノ酸配列を有するCDR-L3を含むヒト化VLを含み、配列番号18のいずれか1つに示されるVLと、フレームワーク領域において少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一である。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(Chothia定義系による)配列番号12のアミノ酸配列を有するCDR-H1、(Chothia定義系による)配列番号13、配列番号21、または配列番号25のアミノ酸配列を有するCDR-H2、(Chothia定義系による)配列番号14のアミノ酸配列を有するCDR-H3を含み、配列番号17、配列番号22、または配列番号26に示されるVHと比較して25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)をフレームワーク領域において含有するヒト化VHを含む。代替的にまたは追加で(例として、追加で)、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(Chothia定義系による)配列番号15のアミノ酸配列を有するCDR-L1、(Chothia定義系に従う)配列番号5のアミノ酸配列を有するCDR-L2、および(Chothia定義系による)配列番号16のアミノ酸配列を有するCDR-L3を含み、配列番号18で示されるVLと比較して25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)をフレームワーク領域に含有するヒト化VLを含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(Chothia定義系による)配列番号12のアミノ酸配列を有するCDR-H1、(Chothia定義系による)配列番号13、配列番号21または配列番号25のアミノ酸配列を有するCDR-H2、(Chothia定義系による)配列番号14のアミノ酸配列を有するCDR-H3を含むヒト化VHを含み、フレームワーク領域において、配列番号17、配列番号22または配列番号26で示されるVHと少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一である。代替え的または追加で(例として、追加で)、本開示の抗TfR抗体は、(Chothia定義系による)配列番号15のアミノ酸配列を有するCDR-L1、(Chothia定義系による)配列番号5のアミノ酸配列を有するCDR-L2、および(Chothia定義系による)配列番号16のアミノ酸配列を有するCDR-L3を含むヒト化VLを含み、配列番号18のいずれか1つに示されるVLと、フレームワーク領域において少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一である。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(IMGT定義系による)配列番号27のアミノ酸配列を有するCDR-H1、(IMGT定義系による)配列番号28のアミノ酸配列を有するCDR-H2、(IMGT定義系による)配列番号29のアミノ酸配列を有するCDR-H3を含み、配列番号43に示すVHと比較してフレームワーク領域に25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)含有するヒト化VHを含む。代替え的または追加で(例として、追加で)、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(IMGT定義系による)配列番号30のアミノ酸配列を有するCDR-L1、(IMGT定義系による)配列番号31アミノ酸配列を有するCDR-L2、(IMGT定義系による)配列番号32のアミノ酸配列を有するCDR-L3を含み、配列番号44に示されるVLと比較して25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)をフレームワーク領域において含有するヒト化VLを含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(IMGT定義系による)配列番号27のアミノ酸配列を有するCDR-H1、(IMGT定義系による)配列番号28のアミノ酸配列を有するCDR-H2、(IMGT定義系による)配列番号29のアミノ酸配列を有するCDR-H3を含むヒト化VHを含み、配列番号43に示されるVHとフレームワーク領域において少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一である。代替え的または追加で(例として、追加で)、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(IMGT定義系による)配列番号30のアミノ酸配列を有するCDR-L1、(IMGT定義系による)配列番号31のアミノ酸配列を有するCDR-L2、および(IMGT定義系による)配列番号32のアミノ酸配列を有するCDR-L3を含むヒト化VLを含み、配列番号44に示されるVLと、フレームワーク領域において少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一である。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(Kabat定義系による)配列番号33のアミノ酸配列を有するCDR-H1、(Kabat定義系による)配列番号34のアミノ酸配列を有するCDR-H2、(Kabat定義系による)配列番号35のアミノ酸配列を有するCDR-H3を含み、配列番号43に示すVHと比較してフレームワーク領域に25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)含有するヒト化VHを含む。代替的にまたは追加で(例として、追加で)、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(Kabat定義系による)配列番号36のアミノ酸配列を有するCDR-L1、(Kabat定義系による)配列番号37のアミノ酸配列を有するCDR-L2、および(Kabat定義系による)配列番号32のアミノ酸配列を有するCDR-L3を含み、配列番号44で示されるVLと比較して25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)をフレームワーク領域に含有するヒト化VLを含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(Kabat定義系による)配列番号33のアミノ酸配列を有するCDR-H1、(Kabat定義系による)配列番号34のアミノ酸配列を有するCDR-H2、(Kabat定義系による)配列番号35のアミノ酸配列を有するCDR-H3を含むヒト化VHを含み、配列番号43に示されるVHとフレームワーク領域において少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一である。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号36のアミノ酸配列を有するCDR-L1(Kabat定義系に従う)、配列番号37のアミノ酸配列を有するCDR-L2(Kabat定義系に従う)、および配列番号32のアミノ酸配列を有するCDR-L3(Kabat定義系に従う)を含むヒト化VLを含み、フレームワーク領域において、配列番号44で表されるとおりのVLと少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一である。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(Chothia定義系による)配列番号38のアミノ酸配列を有するCDR-H1、(Chothia定義系による)配列番号39のアミノ酸配列を有するCDR-H2、(Chothia定義系による)配列番号40のアミノ酸配列を有するCDR-H3を含み、配列番号43に示すVHと比較してフレームワーク領域に25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)含有するヒト化VHを含む。代替的にまたは追加で(例として、追加で)、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(Chothia定義系による)配列番号41のアミノ酸配列を有するCDR-L1、(Chothia定義系に従う)配列番号31のアミノ酸配列を有するCDR-L2、および(Chothia定義系による)配列番号42のアミノ酸配列を有するCDR-L3を含み、配列番号44で示されるVLと比較して25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)をフレームワーク領域に含有するヒト化VLを含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(Chothia定義系による)配列番号38のアミノ酸配列を有するCDR-H1、(Chothia定義系による)配列番号39のアミノ酸配列を有するCDR-H2、(Chothia定義系による)配列番号40のアミノ酸配列を有するCDR-H3を含むヒト化VHを含み、配列番号43に示されるVHとフレームワーク領域において少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一である。代替え的または追加で(例として、追加で)、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(Chothia定義系による)配列番号41のアミノ酸配列を有するCDR-L1、(Chothia定義系による)配列番号31アミノ酸配列を有するCDR-L2、および(Chothia定義系による)配列番号42のアミノ酸配列を有するCDR-L3を含むヒト化VLを含み、配列番号44に示されるVLと、フレームワーク領域において少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一である。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(IMGT定義系による)配列番号45、配列番号63または配列番号66のアミノ酸配列を有するCDR-H1、(IMGT定義系による)配列番号46のアミノ酸配列を有するCDR-H2、(IMGT定義系による)配列番号47のアミノ酸配列を有するCDR-H3を含み、配列番号61、配列番号65、または配列番号68に示されるVHと比較して25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)をフレームワーク領域において含有するヒト化VHを含む。代替え的または追加で(例として、追加で)、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(IMGT定義系による)配列番号48のアミノ酸配列を有するCDR-L1、(IMGT定義系による)配列番号49のアミノ酸配列を有するCDR-L2、および(IMGT定義系による)配列番号50のアミノ酸配列を有するCDR-L3を含み、配列番号62に示されるVLと比較して25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)をフレームワーク領域において含有するヒト化VLを含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(IMGT定義系による)配列番号45、配列番号63、または配列番号66のアミノ酸配列を有するCDR-H1、(IMGT定義系による)配列番号46のアミノ酸配列を有するCDR-H2、(IMGT定義系による)配列番号47のアミノ酸配列を有するCDR-H3を含むヒト化VHを含み、フレームワーク領域において、配列番号61、配列番号65または配列番号68で示されるVHと少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一である。代替え的または追加で(例として、追加で)、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(IMGT定義系による)配列番号48のアミノ酸配列を有するCDR-L1、(IMGT定義系による)配列番号49のアミノ酸配列を有するCDR-L2、および(IMGT定義系による)配列番号50のアミノ酸配列を有するCDR-L3を含むヒト化VLを含み、配列番号62に示されるVLと、フレームワーク領域において少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一である。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(Kabat定義系による)配列番号51、配列番号64または配列番号67のアミノ酸配列を有するCDR-H1、(Kabat定義系による)配列番号52のアミノ酸配列を有するCDR-H2、(Kabat定義系による)配列番号53のアミノ酸配列を有するCDR-H3を含み、配列番号61、配列番号65、配列番号68に示されるVHと比較して25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)をフレームワーク領域において含有するヒト化VHを含む。代替的にまたは追加で(例として、追加で)、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(Kabat定義系による)配列番号54のアミノ酸配列を有するCDR-L1、(Kabat定義系による)配列番号55のアミノ酸配列を有するCDR-L2、および(Kabat定義系による)配列番号50のアミノ酸配列を有するCDR-L3を含み、配列番号62で示されるVLと比較して25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)をフレームワーク領域に含有するヒト化VLを含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(Kabat定義系による)配列番号51、配列番号64、または配列番号67のアミノ酸配列を有するCDR-H1、(Kabat定義系による)配列番号52のアミノ酸配列を有するCDR-H2、(Kabat定義系による)配列番号53のアミノ酸配列を有するCDR-H3を含むヒト化VHを含み、フレームワーク領域において、配列番号61、配列番号65または配列番号68で示されるVHと少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一である。代替え的または追加で(例として、追加で)、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(Kabat定義系による)配列番号54のアミノ酸配列を有するCDR-L1、(Kabat定義系による)配列番号55のアミノ酸配列を有するCDR-L2、および(Kabat定義系による)配列番号50のアミノ酸配列を有するCDR-L3を含むヒト化VLを含み、配列番号62に示されるVLと、フレームワーク領域において少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一である。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(Chothia定義系による)配列番号56のアミノ酸配列を有するCDR-H1、(Chothia定義系による)配列番号57のアミノ酸配列を有するCDR-H2、(Chothia定義系による)配列番号58のアミノ酸配列を有するCDR-H3を含み、配列番号61、配列番号65、配列番号68に示すVHと比較してフレームワーク領域に25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)含有するヒト化VHを含む。代替的にまたは追加で(例として、追加で)、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(Chothia定義系による)配列番号59のアミノ酸配列を有するCDR-L1、(Chothia定義系に従う)配列番号49のアミノ酸配列を有するCDR-L2、および(Chothia定義系による)配列番号60のアミノ酸配列を有するCDR-L3を含み、配列番号62で示されるVLと比較して25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)をフレームワーク領域に含有するヒト化VLを含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(Chothia定義系による)配列番号56のアミノ酸配列を有するCDR-H1、(Chothia定義系による)配列番号57のアミノ酸配列を有するCDR-H2、(Chothia定義系による)配列番号58のアミノ酸配列を有するCDR-H3を含むヒト化VHを含み、配列番号61、配列番号65、配列番号68に示されるVHとフレームワーク領域において少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一である。代替え的または追加で(例として、追加で)、本開示のヒト化抗TfR抗体は、(Chothia定義系による)配列番号59のアミノ酸配列を有するCDR-L1、(Chothia定義系による)配列番号49のアミノ酸配列を有するCDR-L2、および(Chothia定義系による)配列番号60のアミノ酸配列を有するCDR-L3を含むヒト化VLを含み、配列番号62に示されるVLと、フレームワーク領域において少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一である。
本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体のアミノ酸配列の例は、表3に提供される。
表3.ヒト化抗TfR抗体の可変領域
Figure 2023535074000010
Figure 2023535074000011
Figure 2023535074000012
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、表2に提供される抗TfR抗体のいずれか1つのCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含むヒト化VHを含み、表3に提供されるそれぞれのヒト化VHと比較して、1つ以上(例として、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10以外)のアミノ酸バリエーションを含む。代替え的または追加で(例として、追加で)、本開示のヒト化抗TfR抗体は、表2に提供される抗TfR抗体のいずれか1つのCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含むヒト化VLを含み、表3に提供されるそれぞれのヒト化VLと比較して、1つ以上(例として、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10以外)のアミノ酸バリエーションを含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号69と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含むヒト化VH、および/または配列番号70と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含むヒト化VLを含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号69のアミノ酸配列を含むヒト化VHおよび配列番号70のアミノ酸配列を含むヒト化VLを含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号71と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含むヒト化VH、および/または(例として、および)配列番号70と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含むヒト化VLを含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号71のアミノ酸配列を含むヒト化VHおよび配列番号70のアミノ酸配列を含むヒト化VLを含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号72と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含むヒト化VH、および/または配列番号70と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含むヒト化VLを含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号72のアミノ酸配列を含むヒト化VHおよび配列番号70のアミノ酸配列を含むヒト化VLを含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号73と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含むヒト化VH、および/または(例として、および)配列番号74と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含むヒト化VLを含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号73のアミノ酸配列を含むヒト化VHおよび配列番号74のアミノ酸配列を含むヒト化VLを含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号73と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含むヒト化VH、および/または配列番号75と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含むヒト化VLを含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号73のアミノ酸配列を含むヒト化VHおよび配列番号75のアミノ酸配列を含むヒト化VLを含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号76と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含むヒト化VH、および/または(例として、および)配列番号74と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含むヒト化VLを含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号76のアミノ酸配列を含むヒト化VHおよび配列番号74のアミノ酸配列を含むヒト化VLを含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号76と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含むヒト化VH、および/または配列番号75と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含むヒト化VLを含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号76のアミノ酸配列を含むヒト化VHおよび配列番号75のアミノ酸配列を含むヒト化VLを含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号77と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含むヒト化VH、および/または(例として、および)配列番号78と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含むヒト化VL含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号77のアミノ酸配列を含むヒト化VHおよび配列番号78のアミノ酸配列を含むヒト化VLを含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号79と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含むヒト化VH、および/または(例として、および)配列番号80と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含むヒト化VLを含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号79のアミノ酸配列を含むヒト化VHおよび配列番号80のアミノ酸配列を含むヒト化VLを含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号77と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含むヒト化VH、および/または(例として、および)配列番号80と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含むヒト化VL含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号77のアミノ酸配列を含むヒト化VHおよび配列番号80のアミノ酸配列を含むヒト化VLを含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、完全長IgGであり、これはヒト抗体からの重鎖定常領域および軽鎖定常領域を包含し得る。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体のいずれかの重鎖は、重鎖定常領域(CH)またはそのある部分(例として、CH1、CH2、CH3、またはそれらの組み合わせ)を含み得る。重鎖定常領域は、いずれの好適な起源、例として、ヒト、マウス、ラット、またはウサギに属し得る。特定の一例において、重鎖定常領域は、ヒトIgG(ガンマ重鎖)、例として、IgG1、IgG2、またはIgG4からのものである。ヒトIgG1定常領域の例は、下に与えられる:
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号81)
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体のいずれかの重鎖は、突然変異体ヒトIgG1定常領域を含む。例えば、ヒトIgG1のCH2ドメイン上のLALA突然変異の導入(ヒンジ下部残基Leu234 Leu235をAla234およびAla235によって置き換えるように突然変異させられたmAb b12に由来する突然変異体)は、Fcg受容体結合を低減することが公知である(Bruhns,P.,et al.(2009)およびXu,D.et al.(2000))。突然変異体ヒトIgG1定常領域は、下に与えられる（変異を太字にし、下線を付した）:
Figure 2023535074000013
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体のいずれかの軽鎖はさらに、軽鎖定常領域(CL)を含み得、これは当該技術分野において知られているいずれかのCLであり得る。いくつかの例において、CLは、カッパ軽鎖である。他の例において、CLは、ラムダ軽鎖である。いくつかの態様において、CLはカッパ軽鎖であって、その配列は下に与えられる:
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号83)
他の抗体の重鎖および軽鎖定常領域は当該技術分野において周知であり、例として、IMGTデータベース(www.imgt.org)において、またはwww.vbase2.org/vbstat.php.にて提供されるものであるが、これらの両方とも参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、表3に列挙されるVHまたはそれらのいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号81または配列番号82と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％同一である重鎖定常領域を含む重鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、表3に列挙されるVHまたはそれらのいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号81または配列番号82と比較して25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有する重鎖定常領域を含む重鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、表3に列挙されるVHまたはそれらのいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号81で示される重鎖定常領域を含む重鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、表3に列挙されるVHまたはそれらのいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号82で示される重鎖定常領域を含む重鎖を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、表3に列挙されるVLまたはそれらのいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号83と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％同一である軽鎖定常領域を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、表3に列挙されるVLまたはそれらのいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号83と比較して25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有する軽鎖定常領域を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、表3に列挙されるVLまたはそれらのいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号83示される軽鎖定常領域を含む軽鎖を含む。
記載される抗TfR抗体のIgG重鎖および軽鎖アミノ酸配列の例は、下の表4に提供される。
表4.ヒト化抗TfR IgGの例の重鎖および軽鎖配列
Figure 2023535074000014
Figure 2023535074000015
Figure 2023535074000016
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号84、86、87、88、91、92、および94のいずれか1つに示される重鎖と比較して、25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有する重鎖を含む。代替え的または追加で(例として、追加で)、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号85、89、90、93および95のいずれか1つに示される軽鎖と比較して、25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有する軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、配列番号84、86、87、88、91、92および94のいずれか1つと少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。代替的にまたは追加で(例として、追加で)、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、配列番号85、89、90、93および95のいずれか1つと少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体は、配列番号84、86、87、88、91、92および94のいずれか1つのアミノ酸配列を含む重鎖を含む。代替的にまたは追加で(例として、追加で)、本明細書に記載の抗TfR抗体は、配列番号85、89、90、93および95のいずれか1つのアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号84と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、および/または(例として、および)配列番号85と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号84のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号86と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、および/または(例として、および)配列番号85と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号86のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号87と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、および/または(例として、および)配列番号85と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号87のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号88と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、および/または(例として、および)配列番号89と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号88のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号89のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号88と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、および/または(例として、および)配列番号90と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号88のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号91と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、および/または(例として、および)配列番号89と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号91のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号89のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号91と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、および/または(例として、および)配列番号90と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号91のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号92と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、および/または(例として、および)配列番号93と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号92のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号93のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号94と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、および/または(例として、および)配列番号95と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号94のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号95のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号92と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、および/または(例として、および)配列番号95と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号92のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号95のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、抗TfR抗体は、無傷の抗体(完全長抗体)のFabフラグメント、Fab'フラグメント、またはF(ab')2フラグメントである。無傷の抗体(全長抗体)の抗原結合フラグメントは定型的な方法によって(例として、組み換え的に、または全長IgGの重鎖定常領域をパパインなどの酵素を使用して消化することによって)調製され得る。例えば、F(ab')2フラグメントは、抗体分子のペプシンまたはパパイン消化によって産生され得、Fab'フラグメントは、F(ab')2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成され得る。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体のFabフラグメントにおける重鎖領域は、ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT(配列番号96)のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、表3に列挙されるVHまたはそれらのいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号96と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％同一である重鎖定常領域を含む重鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、表3に列挙されるVHまたはそれらのいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号96と比較して25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有する重鎖定常領域を含む重鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、表3に列挙されるVHまたはそれらのいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号96で示される重鎖定常領域を含む重鎖を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、表3に列挙されるVLまたはそれらのいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号83と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％同一である軽鎖定常領域を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、表3に列挙されるVLまたはそれらのいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号83と比較して25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有する軽鎖定常領域を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、表3に列挙されるVLまたはそれらのいずれかのバリアントのいずれか1つ、および配列番号83示される軽鎖定常領域を含む軽鎖を含む。
記載される抗TfR抗体のFab重鎖および軽鎖アミノ酸配列の例は、下の表5に提供される。
表5.ヒト化抗TfR Fabの例の重鎖および軽鎖配列
Figure 2023535074000017
Figure 2023535074000018
Figure 2023535074000019
Figure 2023535074000020
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号97～103のいずれか1つに示される重鎖と比較して、25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有する重鎖を含む。代替え的または追加で(例として、追加で)、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号85、89、90、93および95のいずれか1つに示される軽鎖と比較して、25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有する軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、配列番号97～103のいずれか1つと少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。代替的にまたは追加で(例として、追加で)、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、配列番号85、89、90、93および95のいずれか1つと少なくとも75％(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体は、配列番号97～103のいずれか1つのアミノ酸配列を含む重鎖を含む。代替的にまたは追加で(例として、追加で)、本明細書に記載の抗TfR抗体は、配列番号85、89、90、93および95のいずれか1つのアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号97と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、および/または(例として、および)配列番号85と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号97のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号98と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、および/または(例として、および)配列番号85と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号98のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号99と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、および/または(例として、および)配列番号85と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号99のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号100と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、および/または(例として、および)配列番号89と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号100のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号89のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号100と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、および/または(例として、および)配列番号90と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号100のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号101と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、および/または(例として、および)配列番号89と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号101のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号89のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号101と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、および/または(例として、および)配列番号90と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号101のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号102と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、および/または(例として、および)配列番号93と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号102のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号93のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号103と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、および/または(例として、および)配列番号95と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号103のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号95のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号102と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、および/または(例として、および)配列番号95と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗TfR抗体は、配列番号102のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号95のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR受容体抗体は、いずれかの抗体形態であり得、無傷の(すなわち完全長)抗体、それらの抗原結合フラグメント(Fab、Fab'、F(ab')2、Fvなど)、一本鎖抗体、二重特異性抗体、またはナノボディーを包含するが、これらに限定されない。いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、scFvである。いくつかの態様において、本明細書に記載のヒト化抗TfR抗体は、scFv-Fab(例として、定常領域のある部分に融合されたscFv)である。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR受容体抗体は、C末端のN末端のいずれかにおいて、定常領域(例として、配列番号81もしくは配列番号82で示されるヒトIgG1定常領域、またはFc部分などのその部分)に融合されたscFvである。
いくつかの態様において、保存的突然変異は、例えば結晶構造に基づき決定されるとき、その残基が標的抗原(例として、トランスフェリン受容体)との相互作用に関与しそうにない位置にて、抗体配列(例として、CDRまたはフレームワーク配列)中へ導入され得る。いくつかの態様において、1、2つ以上の突然変異(例として、アミノ酸置換)は、血清半減期、補体結合、Fc受容体結合、および/または(例として、および)細胞への抗原依存的細胞傷害性などの、抗体の1以上の機能特性を変更させるために、本明細書に記載の抗TfR抗体のFc領域中(例として、Kabatナンバリング系(例として、KabatのEUインデックス)に従うナンバリングで、CH2ドメイン(ヒトIgG1の残基231～340)中、および/または(例として、および)CH3ドメイン(ヒトIgG1の残基341～447)中、および/または(例として、および)ヒンジ領域中)へ導入される。
いくつかの態様において、1、2つ以上の突然変異(例として、アミノ酸置換)は、ヒンジ領域中のシステイン残基の数が、例として米国特許第5,677,425号に記載のとおり変動(例として、増大または減少)され得るように、Fc領域(CH1ドメイン)のヒンジ領域中へ導入される。CH1ドメインのヒンジ領域中のシステイン残基の数は、例として、軽鎖および重鎖の会合(assembly)を容易にさせるため、または抗体の安定性を変更(例として、増大もしくは減少)するため、またはリンカー抱合を容易にさせるため、変更され得る。
いくつかの態様において、1、2個以上の突然変異(例として、アミノ酸置換)は、抗体の、エフェクター細胞表面上のFc受容体(例として、活性化されたFc受容体)への親和性を増加または減少させるため、本明細書に記載の筋標的化抗体のFc領域中(例として、Kabatナンバリング系(例として、KabatのEUインデックス)に従うナンバリングで、CH2ドメイン(ヒトIgG1の残基231～340)中、および/または(例として、および)CH3ドメイン(ヒトIgG1の残基341～447)中、および/または(例として、および)ヒンジ領域中)へ導入される。抗体のFc受容体への親和性を増大または減少させる抗体のFc領域中の突然変異、およびかかる突然変異をFc受容体中またはそのフラグメント中へ導入するための技法は、当業者に知られている。抗体のFc受容体への親和性を変更するためになされ得る、抗体のFc受容体中の突然変異の例は、例として、Smith P et al.,(2012)PNAS 109:6181-6186、米国特許第6,737,056号、ならびに国際公開第WO 02/060919号;第WO 98/23289号;および第WO 97/34631号(これらは参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。
いくつかの態様において、1、2個以上のアミノ酸突然変異(すなわち、置換、挿入、または欠失)は、in vivoでの抗体の半減期を変更(例として、増加または減少)させるため、IgG定常領域またはそのFcRn-結合フラグメント(好ましくは、Fcまたはヒンジ-Fcドメインフラグメント)中へ導入される。例えば、in vivoでの抗体の半減期を変更(例として、増加または減少)させるであろう突然変異について、例として、国際公開第WO 02/060919号;第WO 98/23289号;および第WO 97/34631号;ならびに米国特許第5,869,046号、第6,121,022号、第6,277,375号、および第6,165,745号を見よ。
いくつかの態様において、1、2以上のアミノ酸突然変異(すなわち、置換、挿入、または欠失)は、in vivoでの抗TfR抗体の半減期を減少させるため、IgG定常領域またはそのFcRn-結合フラグメント(好ましくは、Fcまたはヒンジ-Fcドメインフラグメント)中へ導入される。いくつかの態様において、1、2個以上のアミノ酸突然変異(すなわち、置換、挿入、または欠失)は、in vivoでの抗体の半減期を増加させるため、IgG定常領域またはそのFcRn-結合フラグメント(好ましくは、Fcまたはヒンジ-Fcドメインフラグメント)中へ導入される。いくつかの態様において、抗体は、KabatのEUインデックス(上記のKabat E Aら(1991))に従うナンバリングで第2定常(CH2)ドメイン(ヒトIgG1の残基231～340)中および/または(例として、および)第3定常(CH3)ドメイン(ヒトIgG1の残基341～447)中に、1個以上のアミノ酸突然変異(例として、置換)を有し得る。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体のIgG1定常領域は、KabatにあるようなEUインデックスに従ってナンバリングされた位置252におけるメチオニン(M)からチロシン(Y)への置換、位置254におけるセリン(S)からトレオニン(T)への置換、および位置256におけるトレオニン(T)からグルタミン酸(E)への置換を含む。米国特許第7,658,921号(これは、参照により本明細書に組み込まれる)を見よ。「YTE突然変異体」と称されるこのタイプの突然変異IgGは、同じ抗体の野生型バージョンと比較して4倍増大した半減期を発揮したことが示されている(Dall'Acqua W F et al.,(2006)J Biol Chem 281:23514-24を見よ)。いくつかの態様において、抗体は、KabatにあるようなEUインデックスに従ってナンバリングされた位置251～257、285～290、308～314、385～389、および428～436でのアミノ酸残基の、1、2、3以上のアミノ酸置換を含むIgG定常領域を含む。
いくつかの態様において、1、2またはそれ以上のアミノ酸置換は、抗トランスフェリン受容体抗体のエフェクター機能(単数または複数)を変更するため、IgG定常領域Fc領域中へ導入される。自身への親和性が変更されたエフェクターリガンドは、例えば、Fc受容体または補体のC1構成要素であり得る。このアプローチは、米国特許第5,624,821号および第5,648,260号においてさらに詳細に記載される。いくつかの態様において、定常領域ドメインの欠失または不活化(点突然変異または他の手段を通して)は、循環抗体のFc受容体への結合を低減し、それによって腫瘍局在化を増大し得る。定常領域を欠失または不活化し、それによって腫瘍局在化を増大させる突然変異の記載については、例として、米国特許第5,585,097号および第8,591,886号を見よ。いくつかの態様において、1以上のアミノ酸置換は、Fc領域上の潜在的なグリコシル化部位を除去するため(これによってFc受容体への結合が低減されることもある)、本明細書に記載の抗体のFc領域中へ導入されてもよい(例として、Shields R L et al.,(2001)J Biol Chem 276:6591-604を見よ)。
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体の定常領域中の1以上のアミノ酸残基は、抗体が変更されたClq結合および/または(例として、および)低減もしくは消失された補体依存性細胞傷害性(CDC)を有し得るように、異なるアミノ酸残基に置き換えられ得る。このアプローチは、米国特許第6,194,551号(Idusogie et al)においてさらに詳細に記載されている。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体のCH2ドメインのN末領域中の1以上のアミノ酸残基は変更されて、それによって抗体の補体結合能を変更する。このアプローチは、国際刊行物第WO 94/29351号においてさらに記載されている。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体のFc領域は、抗体の、細胞への抗体依存性細胞傷害性(ADCC)の媒介能を増大させるため、および/または(例として、および)、抗体のFcγ受容体への親和性を増大させるため、修飾されている。このアプローチは、国際刊行物第WO 00/42072号においてさらに記載されている。
いくつかの態様において、本明細書に提供される抗体の重鎖および/または(例として、および)軽鎖可変ドメイン(単数または複数)配列(単数または複数)は、本明細書の他の箇所に記載されるとおり、例えば、CDR接合抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、もしくは複合ヒト抗体、または抗原結合性フラグメントを生成するために使用され得る。当業者によって理解されるとおり、本明細書に提供される抗体のいずれかに由来するいずれのバリアント、CDR接合抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または複合抗体は、本明細書に記載の組成物および方法に有用であってもよく、バリアント、CDR接合抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または複合抗体が、これが由来する元の抗体と比べて、トランスフェリン受容体への少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％以上の結合を有し得るように、トランスフェリン受容体への特異的結合能を維持するであろう。
いくつかの態様において、本明細書に提供される抗体は、所望の特性を抗体へ付与する突然変異を含む。例えば、ネイティブなIgG4 mAbに生じることが知られているFabアーム交換(Fab-arm exchange)に起因する潜在的合併症を回避するため、本明細書に提供される抗体は、安定化「Adair」突然変異を含んでいてもよく(Angal S.,et al.,「A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human(IgG4)antibody」,Mol Immunol 30,105-108;1993)、ここでセリン228(EUナンバリング;残基241 Kabatナンバリング)は、IgG1様ヒンジ配列をもたらすプロリンへ変換されている。結果的に、抗体のいずれも、安定化「Adair」突然変異を包含していてもよい。
いくつかの態様において、抗体は修飾されている(例として、グリコシル化、リン酸化、SUMO化、および/または(例として、および)、メチル化を介して修飾されている)。いくつかの態様において、抗体は、1個以上の糖または炭水化物分子へ抱合されたグリコシル化抗体である。いくつかの態様において、1個以上の糖または炭水化物分子は、N-グリコシル化、O-グリコシル化、C-グリコシル化、グリピエーション(GPIアンカー付着)、および/または(例として、および)、ホスホグリコシル化を介して、抗体へ抱合されている。いくつかの態様において、1個以上の糖または炭水化物分子は、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、またはグリカンである。いくつかの態様において、1個以上の糖または炭水化物分子は、分枝オリゴ糖類または分枝グリカンである。いくつかの態様において、1個以上の糖または炭水化物分子は、マンノース単位、グルコース単位、N-アセチルグルコサミン単位、N-アセチルガラクトサミン単位、ガラクトース単位、フコース単位、またはホスホ脂質単位を包含する。いくつかの態様において、糖分子は、約1～10個、約1～5個、約5～10個、約1～4個、約1～3個、または約2個存在する。いくつかの態様において、グリコシル化抗体は、全体的にまたは部分的にグリコシル化されている。いくつかの態様において、抗体は、化学反応によって、または酵素的な手段によってグリコシル化されている。いくつかの態様において、抗体は、in vitroでまたは細胞(任意にN-またはO-グリコシル化経路中の酵素(例として、グリコシルトランスフェラーゼ)を欠乏していてもよい)内部でグリコシル化される。いくつかの態様において、抗体は、「Modified antibody,antibody-conjugate and process for the preparation thereof」と題する2014年5月1日に公開された国際特許出願公開WO2014065661に記載のとおりの糖または炭水化物分子で官能化されている。
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体のいずれか1つは、重鎖および/または(例として、および)軽鎖配列上にシグナルペプチド(例として、N末端シグナルペプチド)を含み得る。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR1抗体は、VHおよびVL配列のいずれか1つ、IgG重鎖および軽鎖配列のいずれか1つ、または本明細書に記載のFab重鎖および軽鎖配列のいずれか1つを含み、さらにシグナルペプチド(例として、N末端シグナルペプチド)を含む。いくつかの態様において、シグナルペプチドはMGWSCIILFLVATATGVHS(配列番号104)のアミノ酸配列を含む。
他の知られている抗トランスフェリン受容体抗体
当該技術分野において知られているいずれか他の適切な抗トランスフェリン受容体抗体は、本明細書に開示の複合体において筋標的化剤として使用され得る。知られている抗トランスフェリン受容体抗体(関連する参考文献および結合エピトープを包含する)の例は、表8に挙げられる。いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体は、本明細書に提供される抗トランスフェリン受容体抗体、例として、表8に挙げられる抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかの相補性決定領域(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3)を含む。
表8-関連する参考文献および結合エピトープ情報を包含する、抗トランスフェリン受容体抗体クローンのリスト
Figure 2023535074000021
Figure 2023535074000022
Figure 2023535074000023
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つからのCDR-H(例として、CDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3)アミノ酸配列の1つ以上を包含する。いくつかの態様において、トランスフェリン受容体抗体は、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つについて提供されるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を包含する。いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体は、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つについて提供されるCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を包含する。いくつかの態様において、抗トランスフェリン抗体は、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つについて提供されるCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を包含する。本開示は、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つについて提供されるCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、またはCDR-L3を含む分子をコードするいずれかの核酸配列をもまた包含する。いくつかの態様において、抗体の重鎖および軽鎖CDR3ドメインは、ある抗原についての抗体の結合特異性/親和性に特に重要な役割を演じ得る。したがって、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つの少なくとも重鎖および/または(例として、および)軽鎖CDR3を包含し得る。
いくつかの例において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかは、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体の1つからのCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、および/または(例として、および)CDR-L3配列のいずれかに実質的に類似の1以上のCDR(例として、CDR-HまたはCDR-L)配列を有する。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体のVH(例として、CDR-H1、CDR-H2、またはCDR-H3)および/または(例として、および)VL(例として、CDR-L1、CDR-L2、またはCDR-L3)領域上の1以上のCDRの位置は、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)に対する免疫特異的結合が維持される(例として、実質的に維持される。例えば、それが由来する元の抗体の結合の少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％)限り、1、2、3、4、5、または6アミノ酸位置だけ変動し得る。例えば、いくつかの態様において、本明細書に記載のいずれかの抗体のCDRを定義する位置は、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)に対する免疫特異的結合が維持される(例として、実質的に維持される。例えば、それが由来する元の抗体の結合の少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％)限り、CDRのN末端および/または(例として、および)C末端境界を、本明細書に記載の抗体のいずれか1つのCDR位置と比べて1、2、3、4、5、または6アミノ酸だけずらすことによって変動し得る。別の態様においては、本明細書に記載の抗体のVH(例として、CDR-H1、CDR-H2、またはCDR-H3)および/または(例として、および)VL(例として、CDR-L1、CDR-L2、またはCDR-L3)領域上の1以上のCDRの長さは、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)に対する免疫特異的結合が維持される(例として、実質的に維持される。例えば、それが由来する元の抗体の結合の少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％)限り、1、2、3、4、5アミノ酸、またはより多くだけ変動し得る(例として、より短いかまたはより長い)。
従って、いくつかの態様において、本明細書に記載のCDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、および/または(例として、および)CDR-H3は、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)に対する免疫特異的結合が維持される(例として、実質的に維持される。例えば、それが由来する元の抗体の結合と比べて少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％)限り、本明細書に記載のCDR(例として、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかからのCDR)の1つ以上よりも1、2、3、4、5アミノ酸、またはより多く短くあり得る。いくつかの態様において、本明細書に記載のCDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、および/または(例として、および)CDR-H3は、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)に対する免疫特異的結合が維持される(例として、実質的に維持される。例えば、それが由来する元の抗体の結合と比べて少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％)限り、本明細書に記載のCDR(例として、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかからのCDR)の1つ以上よりも1、2、3、4、5アミノ酸、またはより多く長くあり得る。いくつかの態様において、本明細書に記載のCDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、および/または(例として、および)CDR-H3のアミノ部分は、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)に対する免疫特異的結合が維持される(例として、実質的に維持される。例えば、それが由来する元の抗体の結合と比べて少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％)限り、本明細書に記載のCDR(例として、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかからのCDR)の1つ以上と比較して1、2、3、4、5アミノ酸、またはより多くだけ延伸され得る。いくつかの態様において、本明細書に記載のCDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、および/または(例として、および)CDR-H3のカルボキシ部分は、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)に対する免疫特異的結合が維持される(例として、実質的に維持される。例えば、それが由来する元の抗体の結合と比べて少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％)限り、本明細書に記載のCDR(例として、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかからのCDR)の1つ以上と比較して1、2、3、4、5アミノ酸、またはより多くだけ延伸され得る。いくつかの態様において、本明細書に記載のCDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、および/または(例として、および)CDR-H3のアミノ部分は、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)に対する免疫特異的結合が維持される(例として、実質的に維持される。例えば、それが由来する元の抗体の結合と比べて少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％)限り、本明細書に記載のCDR(例として、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかからのCDR)の1つ以上と比較して1、2、3、4、5アミノ酸、またはより多くだけ短縮され得る。いくつかの態様において、本明細書に記載のCDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、および/または(例として、および)CDR-H3のカルボキシ部分は、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)に対する免疫特異的結合が維持される(例として、実質的に維持される。例えば、それが由来する元の抗体の結合と比べて少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％)限り、本明細書に記載のCDR(例として、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかからのCDR)の1つ以上と比較して1、2、3、4、5アミノ酸、またはより多くだけ短縮され得る。例えば当該技術分野において記載された結合アッセイおよび条件を使用して、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)に対する免疫特異的結合が維持されるかどうかを確かめるためのいずれかの方法が使用され得る。
いくつかの例において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかは、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つに実質的に類似の1以上のCDR(例として、CDR-HまたはCDR-L)配列を有する。例えば、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)に対する免疫特異的結合が維持される(例として、実質的に維持される。例えば、それが由来する元の抗体の結合と比べて少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％)限り、抗体は、本明細書に提供されるCDR(例として、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかからのCDR)のいずれか1つの対応するCDR領域と比較して最大5、4、3、2、または1アミノ酸残基バリエーションまでを含有する表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかからの1以上のCDR配列(単数または複数)を包含し得る。いくつかの態様において、本明細書に提供されるCDRのいずれかにおけるアミノ酸バリエーションのいずれかは、保存的なバリエーションであり得る。保存的なバリエーションは、例えば結晶構造に基づいて決定されるとおり、残基がトランスフェリン受容体タンパク質(例として、ヒトトランスフェリン受容体タンパク質)との相互作用に関わることが蓋然的ではない位置においてCDRに導入され得る。本開示のいくつかの側面は、本明細書に提供される重鎖可変(VH)および/または(例として、および)軽鎖可変(VL)ドメインの1つ以上を含むトランスフェリン受容体抗体を提供する。いくつかの態様において、本明細書に提供されるVHドメインのいずれかは、本明細書に提供されるCDR-H配列(例として、CDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3)の1つ以上、例えば、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つで提供されるCDR-H配列のいずれかを包含する。いくつかの態様において、本明細書に提供されるVLドメインのいずれかは、本明細書に提供されるCDR-L配列(例として、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3)の1つ以上、例えば、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つで提供されるCDR-L配列のいずれかを包含する。
いくつかの態様において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどの、いずれかの抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖可変ドメインおよび/または(例として、および)軽鎖可変ドメインを包含するいずれかの抗体を包含する。いくつかの態様において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどのいずれかの抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖可変および軽鎖可変ペアを包含するいずれかの抗体を包含する。
本開示の側面は、本明細書に記載のもののいずれかと相同な重鎖可変(VH)および/または(例として、および)軽鎖可変(VL)ドメインアミノ酸配列を有する抗トランスフェリン受容体抗体を提供する。いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体は、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどのいずれかの抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖可変配列および/またはいずれかの軽鎖可変配列と少なくとも75％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一である重鎖可変配列または軽鎖可変配列を含む。いくつかの態様において、相同な重鎖可変および/または(例として、および)軽鎖可変アミノ酸配列は、本明細書に提供されるCDR配列のいずれかにおいては変動しない。例えば、いくつかの態様において、配列バリエーションの程度(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)は、本明細書に提供されるCDR配列のいずれかを排除する重鎖可変および/または(例として、および)軽鎖可変配列内において生起し得る。いくつかの態様において、本明細書に提供される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかは、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどのいずれかの抗トランスフェリン受容体抗体のフレームワーク配列と少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％同一であるフレームワーク配列を含む重鎖可変配列および軽鎖可変配列を含む。
いくつかの態様において、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)に特異的に結合する抗トランスフェリン受容体抗体は、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかの、本明細書に提供されるCDR-Lドメイン(CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3)またはCDR-Lドメインバリアントのいずれかを含む軽鎖可変VLドメインを含む。いくつかの態様において、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)に特異的に結合する抗トランスフェリン受容体抗体は、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどの、いずれかの抗トランスフェリン受容体抗体のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む軽鎖可変VLドメインを含む。いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体は、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどの、いずれかの抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖可変領域配列のフレームワーク領域の1、2、3、または4つを含む軽鎖可変(VL)領域配列を含む。いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体は、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどの、いずれかの抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖可変領域配列のフレームワーク領域の1、2、3、または4つと少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、または100％同一である軽鎖可変領域配列のフレームワーク領域の1、2、3、または4つを含む。いくつかの態様において、前記のアミノ酸配列に由来する軽鎖可変フレームワーク領域は、最大10アミノ酸までの置換、欠失、および/または(例として、および)挿入、好ましくは最大10アミノ酸までの置換の存在を除けば、前記のアミノ酸配列からなる。いくつかの態様において、該アミノ酸配列に由来する軽鎖可変フレームワーク領域は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10アミノ酸残基が、対応する霊長目の非ヒト動物またはヒトの軽鎖可変フレームワーク領域中の類似した位置に見出されるアミノ酸と置換された該アミノ酸配列からなる。
いくつかの態様において、トランスフェリン受容体へ特異的に結合する抗トランスフェリン受容体抗体は、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどのいずれの抗トランスフェリン受容体抗体のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む。いくつかの態様において、抗体はさらに、ヒトもしくは霊長目の動物の抗体のVLに由来する1つ、2つ、3つ、または4つすべてのVLフレームワーク領域を含む。本明細書に記載の軽鎖CDR配列との併用のための選択される抗体の霊長目の動物またはヒトの軽鎖フレームワーク領域は、例えば、非ヒト親抗体の軽鎖フレームワーク領域と、少なくとも70％(例として、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、または少なくとも99％)の同一性を有し得る。選択される霊長類またはヒトの抗体は、その軽鎖相補性決定領域において、本明細書に提供される抗体のいずれか(例として、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか)の軽鎖相補性決定領域のアミノ酸に対し、同じ数または実質的に同じ数のアミノ酸を有し得る。いくつかの態様において、霊長目の動物またはヒトの軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸残基は、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどのいずれの抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖フレームワーク領域と少なくとも75％同一性、少なくとも80％同一性、少なくとも85％同一性、少なくとも90％同一性、少なくとも95％同一性、少なくとも98％同一性、少なくとも99％(またはこれを超える)同一性を有する、天然の霊長目の動物またはヒトの抗体軽鎖フレームワーク領域からのものである。いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体はさらに、ヒト軽鎖可変カッパサブファミリーに由来する1つ、2つ、3つ、または4つすべてのVLフレームワーク領域を含む。いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体はさらに、ヒト軽鎖可変ラムダサブファミリーに由来する1つ、2つ、3つ、または4つすべてのVLフレームワーク領域を含む。
いくつかの態様において、本明細書に提供される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれも、軽鎖定常領域をさらに含む軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの態様において、軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ軽鎖定常領域である。いくつかの態様において、カッパまたはラムダ軽鎖定常領域は、哺乳動物から、例として、ヒト、サル、ラット、またはマウスからのものである。いくつかの態様において、軽鎖定常領域は、ヒトカッパ軽鎖定常領域である。いくつかの態様において、軽鎖定常領域は、ヒトラムダ軽鎖定常領域である。本明細書に提供される軽鎖定常領域のいずれも、本明細書に提供される軽鎖定常領域のいずれかのバリアントであってもよいことは解されるはずである。いくつかの態様において、軽鎖定常領域は、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどのいずれの抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖定常領域のいずれかと少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体は、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどの、いずれの抗トランスフェリン受容体抗体でもある。
いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体は、表8から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどのいずれの抗トランスフェリン受容体抗体のアミノ酸配列を含むVLドメインを含み、ここで定常領域は、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、もしくはIgY免疫グロブリン分子、またはヒトIgG、IgE、IgM、IgD、IgA、もしくはIgY免疫グロブリン分子の定常領域のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体は、VLドメイン、またはVLドメインのバリアントのいずれか、およびVHドメイン、またはVHドメインバリアントのいずれかを含み、ここでVLおよびVHドメイン、またはそれらのバリアントは、同じ抗体クローンからものであり、ここで定常領域は、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、もしくはIgY免疫グロブリン分子、いずれのクラス(例として、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2)またはいずれのサブクラス(例として、IgG2aおよびIgG2b)の免疫グロブリン分子の定常領域のアミノ酸配列を含む。ヒト定常領域の非限定例は当該技術分野において記載されており、例として、上述のKabat E A et al.(1991)を見よ。
いくつかの態様において、筋標的化剤は、抗トランスフェリン受容体抗体(例として、国際出願刊行物WO 2016/081643(参照により本明細書に組み込まれる)に記載のとおりの抗体およびそのバリアント)である。
種々の定義系に従う抗体の重鎖および軽鎖CDRは、表9中に提供される。種々の定義系、例として、Kabat定義、Chothia定義、および/またはContact定義は記載されている。例として、(例として、Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242,Chothia et al.,(1989)Nature 342:877;Chothia,C.et al.(1987)J.Mol.Biol.196:901-917,Al-lazikani et al(1997)J.Molec.Biol.273:927-948;およびAlmagro,J.Mol.Recognit.17:132-143(2004)を見よ。またhgmp.mrc.ac.ukおよびbioinf.org.uk/absも見よ)を見よ。
表9.マウストランスフェリン受容体抗体の重鎖および軽鎖CDR
Figure 2023535074000024
重鎖可変ドメイン(VH)および軽鎖可変ドメイン配列もまた提供される:
VH
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPTNGRTNYIEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGTRAYHYWGQGTSVTVSS(配列番号124)
VL
DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRASDNLYSNLAWYQQKQGKSPQLLVYDATNLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDFGTYYCQHFWGTPLTFGAGTKLELK(配列番号125)
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、表9に示されるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3と同じであるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、表9に示されるCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3と同じであるCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む。
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、CDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含み、これは、表9に示されるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3と比較して、合わせてわずか5アミノ酸バリエーション(例として、わずか5、4、3、2、または1アミノ酸バリエーション)を含有する。「合わせて」は、3つの重鎖CDRのすべてにおけるアミノ酸バリエーションの全数が、定義された範囲内であることを意味する。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含み得、これは、表9に示されるCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3と比較して、合わせてわずか5アミノ酸バリエーション(例として、わずか5、4、3、2、または1アミノ酸バリエーション)を含有する。
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、CDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含み、これらの少なくとも1つは、表9に示されるカウンターパート重鎖CDRと比較してわずか3アミノ酸バリエーション(例として、わずか3、2、または1アミノ酸バリエーション)を含有する。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含み得、これらの少なくとも1つは、表9に示されるカウンターパート軽鎖CDRと比較してわずか3アミノ酸バリエーション(例として、わずか3、2、または1アミノ酸バリエーション)を含有する。
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、CDR-L3を含み、これは表9に示されるCDR-L3と比較してわずか3アミノ酸バリエーション(例として、わずか3、2、または1アミノ酸バリエーション)を含有する。いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、表9に示されるCDR-L3と比較して1つのアミノ酸バリエーションを含有するCDR-L3を含む。いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、QHFAGTPLT(配列番号126)KabatおよびChothia定義系に従う)またはQHFAGTPL(配列番号127)Contact定義系に従う)のCDR-L3を含む。いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、表9に示されるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3と同じであるCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、およびCDR-L2を含み、QHFAGTPLT(配列番号126)KabatおよびChothia定義系に従う)またはQHFAGTPL(配列番号127)Contact定義系に従う)のCDR-L3を含む。
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、表9に示される重鎖CDRと、合わせて少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、または98％)同一である重鎖CDRを含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、表9に示される軽鎖CDRと、合わせて少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、または98％)同一である軽鎖CDRを含む。
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号124のアミノ酸配列を含むVHを含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号125のアミノ酸配列を含むVLを含む。
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号124で示されるVHと比較して、25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有するVHを含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号125で示されるVLと比較して、15以下のアミノ酸バリエーション(例として、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有するVLを含む。
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号124で示されるVHと少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、または98％)同一であるアミノ酸配列を含むVHを含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号125で示されるVLと少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、または98％)同一であるアミノ酸配列を含むVLを含む。
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、ヒト化抗体(例として、抗体のヒト化バリアント)である。いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、表9に示されるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3と同じであるCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含み、ヒト化重鎖可変領域および/または(例として、および)ヒト化軽鎖可変領域を含む。
ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域(CDR)からのその残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種(ドナー抗体)のCDRからの残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。いくつかの態様において、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。さらにまた、ヒト化抗体は、レシピエント抗体から見出されない残基も、移入された(imported)CDRまたはフレームワーク配列から見出されない残基も含んでいてもよいが、抗体の性能をさらに洗練および最適化するために包含される残基を含むこともある。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも1つの、典型的には2つの可変ドメインのすべてを実質的に含むであろうが、前記可変ドメインにおいて、CDR領域のすべてまたは実質的にすべてが、非ヒト免疫グロブリンのCDR領域に対応し、かつFR領域のすべてまたは実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のFR領域である。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン(典型的には、ヒト免疫グロブリンの)定常領域またはドメイン(Fc)の少なくとも一部も含むであろう。抗体は、WO 99/58572に記載のとおりに修飾されたFc領域を有していてもよい。ヒト化抗体の他の形態は、元の抗体に関して変更された1以上のCDR(1、2、3、4、5、6)を有しており、これらはまた、元の抗体からの1以上のCDRに由来する1以上のCDRとも呼ばれる。ヒト化抗体はまた、親和性成熟も伴うことがある。
いくつかの態様において、ヒト化は、CDR(例として、表9に示されるとおりの)をIGKV1-NL1*01およびIGHV1-3*01ヒト可変ドメイン中へ接合させることによって達成される。いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号125に示されるVLと比較して、9、13、17、18、40、45、および70位に1以上のアミノ酸置換、ならびに/または(例として、ならびに)配列番号124に示されるVHと比較して、1、5、7、11、12、20、38、40、44、66、75、81、83、87、および108位に1以上のアミノ酸置換を含むヒト化バリアントである。いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号125に示されるVLと比較して、9、13、17、18、40、45、および70位のすべてにアミノ酸置換、ならびに/または(例として、ならびに)配列番号124に示されるVHと比較して、1、5、7、11、12、20、38、40、44、66、75、81、83、87、および108位のすべてにアミノ酸置換を含むヒト化バリアントである。
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、ヒト化抗体であって、配列番号125で示されるVLの43および48位で残基を含有する。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、ヒト化抗体であって、配列番号124で示されるVHの48、67、69、71、および73位での残基を含有する。
本開示に従い使用されてもよいヒト化抗体の例の、VHおよびVLアミノ酸配列は、以下に提供される:
ヒト化されたVH
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQRLEWIGEINPTNGRTNYIEKFKSRATLTVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGTRAYHYWGQGTMVTVSS(配列番号128)
ヒト化されたVL
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASDNLYSNLAWYQQKPGKSPKLLVYDATNLADGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPLTFGQGTKVEIK
(配列番号129)
代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号128のアミノ酸配列を含むVHを含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号129のアミノ酸配列を含むVLを含む。
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号128で示されるVHと比較して、25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有するVHを含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号129で示されるVLと比較して、15以下のアミノ酸バリエーション(例として、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有するVLを含む。
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号128で表されるとおりのVHと少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、または98％)同一であるアミノ酸配列を含むVHを含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号129で表されるとおりのVLと少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、または98％)同一であるアミノ酸配列を含むVLを含む。
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号125に示されるVLと比較して、43および48位の1以上におけるアミノ酸置換、ならびに/または(例として、ならびに)配列番号124に示されるVHと比較して、48、67、69、71および73位の1以上におけるアミノ酸置換を含むヒト化バリアントである。いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号125に示されるVLと比較して、S43Aおよび/もしくは(例として、および)V48L突然変異、ならびに/または(例として、ならびに)配列番号124に示されるVHと比較して、A67V、L69I、V71R、およびK73Tの1以上の突然変異を含むヒト化バリアントである。
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号125に示されるVLと比較して、9、13、17、18、40、43、48、45、および70位の1以上におけるアミノ酸置換、ならびに/または(例として、ならびに)配列番号124に示されるVHと比較して、1、5、7、11、12、20、38、40、44、48、66、67、69、71、73、75、81、83、87、および108位の1以上におけるアミノ酸置換を含むヒト化バリアントである。
いくつかの態様において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、ヒト抗体からの重鎖定常領域および軽鎖定常領域を包含し得るキメラ抗体である。キメラ抗体は、第1の種からの可変領域または一部の可変領域、および第2の種からの定常領域を有する抗体を指す。典型的には、これらのキメラ抗体において、軽鎖と重鎖との両方の可変領域は、ある種の哺乳動物(例として、マウス、ウサギ、およびラットなどの非ヒト哺乳動物)に由来する抗体の可変領域を模倣する一方で、定常部は、ヒトなどの別の哺乳動物に由来する抗体中の配列と相同である。いくつかの態様において、アミノ酸修飾は、可変領域および/または(例として、および)定常領域においてなされ得る。
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗トランスフェリン受容体抗体は、ヒト抗体からの重鎖定常領域および軽鎖定常領域を包含し得るキメラ抗体である。キメラ抗体は、第1の種からの可変領域または一部の可変領域、および第2の種からの定常領域を有する抗体を指す。典型的には、これらのキメラ抗体において、軽鎖と重鎖との両方の可変領域は、ある種の哺乳動物(例として、マウス、ウサギ、およびラットなどの非ヒト哺乳動物)に由来する抗体の可変領域を模倣する一方で、定常部は、ヒトなどの別の哺乳動物に由来する抗体中の配列と相同である。いくつかの態様において、アミノ酸修飾は、可変領域および/または(例として、および)定常領域においてなされ得る。
いくつかの態様において、本明細書に記載のとおりの抗トランスフェリン受容体抗体のいずれの重鎖も、重鎖定常領域(CH)またはこの一部(例として、CH1、CH2、CH3、またはそれらの組み合わせ)を含んでいてもよい。重鎖定常領域は、いずれの好適な起源、例として、ヒト、マウス、ラット、またはウサギに属し得る。特定の一例において、重鎖定常領域は、ヒトIgG(ガンマ重鎖)、例として、IgG1、IgG2、またはIgG4からのものである。ヒトIgG1定常領域の例は、下に与えられる:
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号130)
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗トランスフェリン受容体抗体のいずれの軽鎖も、軽鎖定常領域(CL)をさらに含んでいてもよいが、これは当該技術分野において知られているいずれのCLでもあり得る。いくつかの例において、CLは、カッパ軽鎖である。他の例において、CLは、ラムダ軽鎖である。いくつかの態様において、CLはカッパ軽鎖であって、その配列は下に与えられる:
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号83)
他の抗体の重鎖および軽鎖定常領域は当該技術分野において周知であり、例として、IMGTデータベース(www.imgt.org)において、またはwww.vbase2.org/vbstat.php.にて提供されるものであるが、これらの両方とも参照により本明細書に組み込まれる。
記載される抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖および軽鎖アミノ酸配列の例は、下に提供される:
重鎖(VH＋ヒトIgG1定常領域)
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPTNGRTNYIEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGTRAYHYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号132)
軽鎖(VL＋カッパ軽鎖)
DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRASDNLYSNLAWYQQKQGKSPQLLVYDATNLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDFGTYYCQHFWGTPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号133)
重鎖(ヒト化VH＋ヒトIgG1定常領域)
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQRLEWIGEINPTNGRTNYIEKFKSRATLTVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGTRAYHYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号134)
軽鎖(ヒト化されたVL＋カッパ軽鎖)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASDNLYSNLAWYQQKPGKSPKLLVYDATNLADGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号135)
いくつかの態様において、本明細書に記載のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号132と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、または98％)同一のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本明細書に記載のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号133と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、または98％)同一のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号132のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本明細書に記載のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号133のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号132に示される重鎖と比較して、25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有する重鎖を含む。代替え的または追加で(例として、追加で)、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号133に示される軽鎖と比較して、15以下のアミノ酸バリエーション(例として、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有する軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号134と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、または98％)同一のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本明細書に記載のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号135と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、または98％)同一のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号134のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本明細書に記載のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号135のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、配列番号134に示されるヒト化抗体の重鎖と比較して、25以下のアミノ酸バリエーション(例として、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有する重鎖を含む。代替え的または追加で(例として、追加で)、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号135に示されるヒト化抗体の軽鎖と比較して、15以下のアミノ酸バリエーション(例として、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸バリエーション)を含有する軽鎖を含む。
いくつかの態様において、トランスフェリン受容体抗体は、無傷の抗体(完全長抗体)の抗原結合性フラグメント(Fab)である。無傷の抗体(完全長抗体)の抗原結合性フラグメントは、定型的な方法を介して調製され得る。例えば、F(ab')2フラグメントは、抗体分子のペプシン消化によって産生され得、Fab'フラグメントは、F(ab')2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成され得る。本明細書に記載のトランスフェリン受容体抗体のFabアミノ酸配列の例は、下に提供される:
重鎖Fab(VH＋ヒトIgG1定常領域の一部)
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPTNGRTNYIEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGTRAYHYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP(配列番号136)
重鎖Fab(ヒト化VH＋ヒトIgG1定常領域の一部)
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQRLEWIGEINPTNGRTNYIEKFKSRATLTVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGTRAYHYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP(配列番号137)
いくつかの態様において、本明細書に記載のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号136のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本明細書に記載のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号133のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号137のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。代替的にまたは加えて(例として、加えて)、本明細書に記載のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号135のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
本明細書に記載の抗トランスフェリン受容体抗体は、これらに限定されないが、無傷の(すなわち、完全長)抗体、それらの抗原結合性フラグメント(Fab、Fab'、F(ab')2、Fvなどの)、単一鎖抗体、二重特異性抗体、またはナノボディーを包含する、いずれの抗体の形態でもあり得る。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗トランスフェリン受容体抗体は、scFvである。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗トランスフェリン受容体抗体は、scFv-Fab(例として、一部の定常領域と縮合されたscFv)である。いくつかの態様において、本明細書に記載のトランスフェリン受容体抗体は、定常領域(例として、配列番号130で示されるヒトIgG1定常領域)と縮合されたscFvである。
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗TfR抗体のいずれか1つは、組換えDNAテクノロジーによって、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞浮遊培養から、任意にCHO-K1細胞(例として、European Collection of Animal Cell Cultureに由来するCHO-K1細胞、Cat.No.85051005)浮遊培養から生ずる。
いくつかの態様において、本明細書に提供される抗体は、1以上の翻訳後修飾を有し得る。いくつかの態様においては、ピログルタミン酸形成(ピロGlu)ともまた呼ばれるN末端環化が、産生の間にN末端グルタミン酸(Glu)および/またはグルタミン(Gln)残基において抗体に生起し得る。したがって、N末端グルタメートまたはグルタミン残基を含む配列を有すると特定される抗体は、翻訳後修飾に起因するピログルタメート形成を受けた抗体を包含することを理解されたい。いくつかの態様において、ピログルタミン酸形成は、重鎖配列に生起する。いくつかの態様において、ピログルタミン酸形成は軽鎖配列に生起する。
b.他の筋標的抗体
いくつかの態様において、筋標的化抗体は、ヘモジュベリン(hemojuvelin)、カベオリン-3、デュシェンヌ型筋ジストロフィーペプチド、ミオシンIib、またはCD63に特異的に結合する抗体である。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、筋原性前駆体タンパク質に特異的に結合する抗体である。例示の筋原性前駆体タンパク質は、限定せずに、ABCG2、M-カドヘリン/カドヘリン-15、カベオリン-1、CD34、FoxK1、インテグリンアルファ7、インテグリンアルファ7ベータ1、MYF-5、MyoD、ミオゲニン、NCAM-1/CD56、Pax3、Pax7、およびPax9を包含する。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、骨格筋タンパク質に特異的に結合する抗体である。例示の骨格筋タンパク質は、限定せずに、アルファ-サルコグリカン、ベータ-サルコグリカン、カルパインインヒビター、クレアチンキナーゼMM/CKMM、eIF5A、エノラーゼ2/ニューロン特異的エノラーゼ、イプシロン-サルコグリカン、FABP3/H-FABP、GDF-8/ミオスタチン、GDF-11/GDF-8、インテグリンアルファ7、インテグリンアルファ7ベータ1、インテグリンベータ1/CD29、MCAM/CD146、MyoD、ミオゲニン、ミオシン軽鎖キナーゼインヒビター、NCAM-1/CD56、およびトロポニンIを包含する。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、平滑筋タンパク質に特異的に結合する抗体である。例示の平滑筋タンパク質は、限定せずに、アルファ-平滑筋アクチン、VE-カドヘリン、カルデスモン/CALD1、カルポニン1、デスミン、ヒスタミンH2 R、モチリンR/GPR38、トランスジェリン(Transgelin)/TAGLN、およびビメンチンを包含する。しかしながら、追加の標的への抗体が本開示の範囲内であること、および本明細書に提供される標的の例示のリストが限定することを意図していないことは解されるはずである。
c.抗体特色/変更
いくつかの態様において、保存的突然変異は、例えば結晶構造に基づき決定されるとき、その残基が標的抗原(例として、トランスフェリン受容体)との相互作用に関与しそうにない位置にて、抗体配列(例として、CDRまたはフレームワーク配列)中へ導入され得る。いくつかの態様において、1、2個以上の突然変異(例として、アミノ酸置換)は、血清半減期、補体結合、Fc受容体結合、および/または(例として、および)細胞への抗原依存的細胞傷害性などの、抗体の1以上の機能特性を変更させるために、本明細書に記載の筋標的化抗体のFc領域中(例として、Kabatナンバリング系(例として、KabatのEUインデックス)に従うナンバリングで、CH2ドメイン(ヒトIgG1の残基231～340)中、および/または(例として、および)CH3ドメイン(ヒトIgG1の残基341～447)中、および/または(例として、および)ヒンジ領域中)へ導入される。
いくつかの態様において、1、2つ以上の突然変異(例として、アミノ酸置換)は、ヒンジ領域中のシステイン残基の数が、例として米国特許第5,677,425号に記載のとおり変動(例として、増大または減少)され得るように、Fc領域(CH1ドメイン)のヒンジ領域中へ導入される。CH1ドメインのヒンジ領域中のシステイン残基の数は、例として、軽鎖および重鎖の会合(assembly)を容易にさせるため、または抗体の安定性を変更(例として、増大もしくは減少)するため、またはリンカー抱合を容易にさせるため、変更され得る。
いくつかの態様において、1、2個以上の突然変異(例として、アミノ酸置換)は、抗体の、エフェクター細胞表面上のFc受容体(例として、活性化されたFc受容体)への親和性を増加または減少させるため、本明細書に記載の筋標的化抗体のFc領域中(例として、Kabatナンバリング系(例として、KabatのEUインデックス)に従うナンバリングで、CH2ドメイン(ヒトIgG1の残基231～340)中、および/または(例として、および)CH3ドメイン(ヒトIgG1の残基341～447)中、および/または(例として、および)ヒンジ領域中)へ導入される。抗体のFc受容体への親和性を増大または減少させる抗体のFc領域中の突然変異、およびかかる突然変異をFc受容体中またはそのフラグメント中へ導入するための技法は、当業者に知られている。抗体のFc受容体への親和性を変更するためになされ得る、抗体のFc受容体中の突然変異の例は、例として、Smith P et al.,(2012)PNAS 109:6181-6186、米国特許第6,737,056号、ならびに国際公開第WO 02/060919号;第WO 98/23289号;および第WO 97/34631号(これらは参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。
いくつかの態様において、1、2個以上のアミノ酸突然変異(すなわち、置換、挿入、または欠失)は、in vivoでの抗体の半減期を変更(例として、増加または減少)させるため、IgG定常領域またはそのFcRn-結合フラグメント(好ましくは、Fcまたはヒンジ-Fcドメインフラグメント)中へ導入される。例えば、in vivoでの抗体の半減期を変更(例として、増加または減少)させるであろう突然変異について、例として、国際公開第WO 02/060919号;第WO 98/23289号;および第WO 97/34631号;ならびに米国特許第5,869,046号、第6,121,022号、第6,277,375号、および第6,165,745号を見よ。
いくつかの態様において、1、2個以上のアミノ酸突然変異(すなわち、置換、挿入、または欠失)は、in vivoでの抗トランスフェリン受容体抗体の半減期を減少させるため、IgG定常領域またはそのFcRn-結合フラグメント(好ましくは、Fcまたはヒンジ-Fcドメインフラグメント)中へ導入される。いくつかの態様において、1、2個以上のアミノ酸突然変異(すなわち、置換、挿入、または欠失)は、in vivoでの抗体の半減期を増加させるため、IgG定常領域またはそのFcRn-結合フラグメント(好ましくは、Fcまたはヒンジ-Fcドメインフラグメント)中へ導入される。いくつかの態様において、抗体は、KabatのEUインデックス(上記のKabat E Aら(1991))に従うナンバリングで第2定常(CH2)ドメイン(ヒトIgG1の残基231～340)中および/または(例として、および)第3定常(CH3)ドメイン(ヒトIgG1の残基341～447)中に、1個以上のアミノ酸突然変異(例として、置換)を有し得る。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体のIgG1定常領域は、KabatにあるようなEUインデックスに従ってナンバリングされた位置252におけるメチオニン(M)からチロシン(Y)への置換、位置254におけるセリン(S)からトレオニン(T)への置換、および位置256におけるトレオニン(T)からグルタミン酸(E)への置換を含む。米国特許第7,658,921号(これは、参照により本明細書に組み込まれる)を見よ。「YTE突然変異体」と称されるこのタイプの突然変異IgGは、同じ抗体の野生型バージョンと比較して4倍増大した半減期を発揮したことが示されている(Dall'Acqua W F et al.,(2006)J Biol Chem 281:23514-24を見よ)。いくつかの態様において、抗体は、KabatにあるようなEUインデックスに従ってナンバリングされた位置251～257、285～290、308～314、385～389、および428～436でのアミノ酸残基の、1、2、3以上のアミノ酸置換を含むIgG定常領域を含む。
いくつかの態様において、1、2以上のアミノ酸置換は、抗トランスフェリン受容体抗体のエフェクター機能(単数または複数)を変更するため、IgG定常領域Fc領域中へ導入される。自身への親和性が変更されたエフェクターリガンドは、例えば、Fc受容体または補体のC1構成要素であり得る。このアプローチは、米国特許第5,624,821号および第5,648,260号においてさらに詳細に記載される。いくつかの態様において、定常領域ドメインの欠失または不活化(点突然変異または他の手段を通して)は、循環抗体のFc受容体への結合を低減し、それによって腫瘍局在化を増大し得る。定常領域を欠失または不活化し、それによって腫瘍局在化を増大させる突然変異の記載については、例として、米国特許第5,585,097号および第8,591,886号を見よ。いくつかの態様において、1以上のアミノ酸置換は、Fc領域上の潜在的なグリコシル化部位を除去するため(これによってFc受容体への結合が低減されることもある)、本明細書に記載の抗体のFc領域中へ導入されてもよい(例として、Shields R L et al.,(2001)J Biol Chem 276:6591-604を見よ)。
いくつかの態様において、本明細書に記載の筋標的化抗体の定常領域中の1以上のアミノ酸残基は、抗体が変更されたClq結合および/または(例として、および)低減もしくは消失された補体依存性細胞傷害性(CDC)を有し得るように、異なるアミノ酸残基に置き換えられ得る。このアプローチは、米国特許第6,194,551号(Idusogie et al)においてさらに詳細に記載されている。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体のCH2ドメインのN末領域中の1以上のアミノ酸残基は変更されて、それによって抗体の補体結合能を変更する。このアプローチは、国際刊行物第WO 94/29351号においてさらに記載されている。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体のFc領域は、抗体の、細胞への抗体依存性細胞傷害性(ADCC)の媒介能を増大させるため、および/または(例として、および)、抗体のFcγ受容体への親和性を増大させるため、修飾されている。このアプローチは、国際刊行物第WO 00/42072号においてさらに記載されている。
いくつかの態様において、本明細書に提供される抗体の重鎖および/または(例として、および)軽鎖可変ドメイン(単数または複数)配列(単数または複数)は、本明細書の他の箇所に記載されるとおり、例えば、CDR接合抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、もしくは複合ヒト抗体、または抗原結合性フラグメントを生成するために使用され得る。当業者によって理解されるとおり、本明細書に提供される抗体のいずれかに由来するいずれのバリアント、CDR接合抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または複合抗体は、本明細書に記載の組成物および方法に有用であってもよく、バリアント、CDR接合抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または複合抗体が、これが由来する元の抗体と比べて、トランスフェリン受容体への少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％以上の結合を有し得るように、トランスフェリン受容体への特異的結合能を維持するであろう。
いくつかの態様において、本明細書に提供される抗体は、所望の特性を抗体へ付与する突然変異を含む。例えば、ネイティブなIgG4 mAbに生じることが知られているFabアーム交換(Fab-arm exchange)に起因する潜在的合併症を回避するため、本明細書に提供される抗体は、安定化「Adair」突然変異を含んでいてもよく(Angal S.,et al.,「A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human(IgG4)antibody」,Mol Immunol 30,105-108;1993)、ここでセリン228(EUナンバリング;残基241 Kabatナンバリング)は、IgG1様ヒンジ配列をもたらすプロリンへ変換されている。結果的に、抗体のいずれも、安定化「Adair」突然変異を包含していてもよい。
本明細書に提供されるとおり、本開示の抗体は、任意に、定常領域またはその一部を含んでいてもよい。例えば、VLドメインは、そのC末端にて、軽鎖定常領域様CκまたはCλへ付着されていてもよい。同様に、VHドメインまたはその一部は、すべてのまたは一部の重鎖様IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgM、およびいずれのアイソタイプのサブクラスへ付着されていてもよい。抗体は、好適な定常領域を包含していてもよい(例えば、Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,No.91-3242,National Institutes of Health Publications,Bethesda,Md.(1991)を見よ)。したがって、本開示の範囲内の抗体は、いずれの好適な定常領域と組み合わされて、VHおよびVLドメイン、またはその抗原結合部を包含していてもよい。
ii.筋標的化ペプチド
本開示のいくつかの側面は、筋標的化ペプチドを筋標的化剤として提供する。特定の細胞型へ結合する短いペプチド配列(例として、長さが5～20アミノ酸のペプチド配列)は記載されている。例えば、細胞標的化ペプチドは、Vines e.,et al.,A.、「Cell-penetrating and cell-targeting peptides in drug delivery」Biochim Biophys Acta 2008,1786:126-38;Jarver P.,et al.,「In vivo biodistribution and efficacy of peptide mediated delivery」Trends Pharmacol Sci 2010;31:528-35;Samoylova T.I.,et al.,「Elucidation of muscle-binding peptides by phage display screening」Muscle Nerve 1999;22:460-6;米国特許第6,329,501号、2001年12月11日発行、題名「METHODS AND COMPOSITIONS FOR TARGETING COMPOUNDS TO MUSCLE」;およびSamoylov A.M.,et al.,「Recognition of cell-specific binding of phage display derived peptides using an acoustic wave sensor」Biomol Eng 2002;18:269-72に記載されており、これらのそれぞれの内容全体は、参照によって本明細書に組み込まれる。特定の細胞表面抗原(例として、受容体)と相互作用するようにペプチドを設計することによって、所望される組織、例として、筋肉への選択性が獲得され得る。骨格筋標的化が調査されており、広範な分子ペイロードが送達されることができる。巨大な抗体またはウイルス粒子についての実際上の不利な点の多くが存在しないこれらのアプローチは、筋組織への高選択性を有していてもよい。結果的に、いくつかの態様において、筋標的化剤は、長さが4アミノ酸から50アミノ酸までの筋標的化ペプチドである。いくつかの態様において、筋標的化ペプチドは、長さが4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50アミノ酸である。筋標的化ペプチドは、ファージディスプレーなどの数種の方法のいずれかを使用して生成され得る。
いくつかの態様において、筋標的化ペプチドは、他のある細胞と比較して、筋細胞において過剰発現されているかまたは相対的に高度に発現されている、内在化する細胞表面受容体(例として、トランスフェリン受容体)へ結合してもよい。いくつかの態様において、筋標的化ペプチドは、トランスフェリン受容体を標的にしてもよい(例として、トランスフェリン受容体へ結合してもよい)。いくつかの態様において、トランスフェリン受容体を標的にするペプチドは、天然に存在するリガンド、例として、トランスフェリンのセグメントを含んでいてもよい。いくつかの態様において、トランスフェリン受容体を標的にするペプチドは、米国特許第6,743,893号、11/30/2000出願、「RECEPTOR-MEDIATED UPTAKE OF PEPTIDES THAT BIND THE HUMAN TRANSFERRIN RECEPTOR」に記載のとおりである。いくつかの態様において、トランスフェリン受容体を標的にするペプチドは、Kawamoto,M.et al,「A novel transferrin receptor-targeted hybrid peptide disintegrates cancer cell membrane to induce rapid killing of cancer cells」BMC Cancer.2011 Aug 18;11:359に記載のとおりである。いくつかの態様において、トランスフェリン受容体を標的にするペプチドは、米国特許第8,399,653号、5/20/2011出願、「TRANSFERRIN/TRANSFERRIN RECEPTOR-MEDIATED SIRNA DELIVERY」に記載のとおりである。
上述のとおり、筋標的化ペプチドの例は報告されている。例えば、筋肉特異的ペプチドは、表面へプタペプチドを提示するファージディスプレーライブラリを使用して同定された。一例として、アミノ酸配列ASSLNIA(配列番号138)を有するペプチドは、in vitroでC2C12マウス筋管へ結合し、かつin vivoでマウス筋組織へ結合した。結果的に、いくつかの態様において、筋標的化剤は、アミノ酸配列ASSLNIA(配列番号138)を含む。このペプチドは、肝臓、腎臓、および脳への結合が低減された、マウスへの静脈内注射後の心筋組織および骨格筋組織への結合について改善された特異性を発揮した。追加の筋肉特異的ペプチドがファージディスプレーを使用して同定されている。例えば、DMDへの処置という文脈において、12アミノ酸ペプチドが、筋標的化のためのファージディスプレーライブラリによって同定された。Yoshida D.,et al.,「Targeting of salicylate to skin and muscle following topical injections in rats」Int J Pharm 2002;231:177-84を見よ;その内容全体は、参照によって本明細書に組み込まれる。ここで、配列SKTFNTHPQSTP(配列番号139)を有する12アミノ酸ペプチドが同定され、この筋標的化ペプチドは、ASSLNIA(配列番号138)ペプチドと比べてC2C12細胞への改善された結合を示した。
他の細胞型より筋肉(例として、骨格筋)に対して選択的なペプチドを同定するためのいずれの追加の方法はin vitroでの選択を包含し、これはGhosh D.,et al.,「Selection of muscle-binding peptides from context-specific peptide-presenting phage libraries for adenoviral vector targeting」J Virol 2005;79:13667-72に記載されている;この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。ランダム12-merペプチドファージディスプレーライブラリを非筋細胞型の混合物とプレインキュベートすることによって、非特異的細胞バインダーが選出された。選択を繰り返した後、12アミノ酸ペプチドTARGEHKEEELI(配列番号140)が最も頻繁に出現した。結果的に、いくつかの態様において、筋標的化剤は、アミノ酸配列TARGEHKEEELI(配列番号140)を含む。
筋標的化剤は、アミノ酸含有分子またはペプチドであってもよい。筋標的化ペプチドは、筋細胞から見出されたタンパク質受容体へ優先的に結合するタンパク質の配列に対応していてもよい。いくつかの態様において、筋標的化ペプチドは、ペプチドが筋細胞を優先的に標的にし得るように、疎水性アミノ酸(例として、バリン)の性質(propensity)を高く含有する。いくつかの態様において、筋標的化ペプチドは、これまでに特徴付けも開示もされていない。これらのペプチドは、数種の方法論のいずれか、例として、ファージディスプレードペプチドライブラリ、1ビーズ・1化合物(one-bead one-compound)ペプチドライブラリ、または位置走査性(positional scanning)合成ペプチドコンビナトリアルライブラリを使用して、想起、産生、合成、および/または(例として、および)、誘導体化されてもよい。例示の方法論は、当該技術分野において特徴付けられてきており、参照により組み込まれる(Gray,B.P.and Brown,K.C.「Combinatorial Peptide Libraries:Mining for Cell-Binding Peptides」Chem Rev.2014,114:2,1020-1081.;Samoylova,T.I.and Smith,B.F.「Elucidation of muscle-binding peptides by phage display screening」Muscle Nerve,1999,22:4.460-6.)。いくつかの態様において、筋標的化ペプチドは過去に開示されている(例として、Writer M.J.et al.「Targeted gene delivery to human airway epithelial cells with synthetic vectors incorporating novel targeting peptides selected by phage display」J.Drug Targeting.2004;12:185;Cai,D.「BDNF-mediated enhancement of inflammation and injury in the aging heart」Physiol Genomics.2006,24:3,191-7.;Zhang,L.「Molecular profiling of heart endothelial cells」Circulation,2005,112:11,1601-11.;McGuire,M.J.et al.「In vitro selection of a peptide with high selectivity for cardiomyocytes in vivo」J Mol Biol.2004,342:1,171-82を見よ)。例示の筋標的化ペプチドは、以下の群のアミノ酸配列を含む:CQAQGQLVC(配列番号141)、CSERSMNFC(配列番号142)、CPKTRRVPC(配列番号143)、WLSEAGPVVTVRALRGTGSW(配列番号144)、ASSLNIA(配列番号138)、CMQHSMRVC(配列番号145)、およびDDTRHWG(配列番号146)。いくつかの態様において、筋標的化ペプチドは、約2～25アミノ酸、約2～20アミノ酸、約2～15アミノ酸、約2～10アミノ酸、または約2～5アミノ酸を含んでいてもよい。筋標的化ペプチドは、天然に存在するアミノ酸、例として、システイン、アラニン、または天然に存在しないか、もしくは修飾アミノ酸を含んでいてもよい。天然に存在しないアミノ酸は、β-アミノ酸、ホモ-アミノ酸、プロリン誘導体、3-置換アラニン誘導体、線形コアアミノ酸、N-メチルアミノ酸、および当該技術分野において知られているその他のアミノ酸を包含する。いくつかの態様において、筋標的化ペプチドは線状であってもよい;他の態様において、筋標的化ペプチドは環状(例として、二環式)であってもよい(例として、Silvana,M.G.et al.Mol.Therapy,2018,26:1,132-147を見よ)。
iii.筋標的化受容体リガンド
筋標的化剤は、リガンド、例として、受容体タンパク質へ結合するリガンドであってもよい。筋標的化リガンドは、タンパク質、例としてトランスフェリンであってもよく、それは筋細胞によって発現される内在化する細胞表面受容体へ結合する。結果的に、いくつかの態様において、筋標的化剤は、トランスフェリン、またはトランスフェリン受容体へ結合するその誘導体である。筋標的化リガンドは、代替的に、小分子、例として、他の細胞型と比べて優先的に筋細胞を標的にする親油性小分子であってもよい。筋細胞を標的にしてもよい例示の親油性小分子は、コレステロール、コレステリル、ステアリン酸、パルミチン酸、オレイン酸、オレイル、リノレン酸、リノール酸、ミリスチン酸、ステロール、ジヒドロテストステロン、テストステロン誘導体、グリセリン、アルキル鎖、トリチル基、およびアルコキシ酸を含む化合物を包含する。
iv.筋標的化アプタマー
筋標的化剤は、他の細胞型と比べて優先的に筋細胞を標的にするアプタマー、例としてRNAアプタマーであってもよい。いくつかの態様において、筋標的化アプタマーはこれまでに特徴付けも開示もされていない。これらのアプタマーは、数種の方法論のいずれか、例として、指数関数的濃縮によるリガンドの体系的進化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)を使用して、想起、産生、合成、および/または(例として、および)、誘導体化されてもよい。例示の方法論は当該技術分野において特徴付けされており、参照により組み込まれる(Yan,A.C.and Levy,M.「Aptamers and aptamer targeted delivery」RNA biology,2009,6:3,316-20.;Germer,K.et al.「RNA aptamers and their therapeutic and diagnostic applications」Int.J.Biochem.Mol.Biol.2013;4:27-40)。いくつかの態様において、筋標的化アプタマーは以前に開示されている(例として、Phillippou,S.et al.「Selection and Identification of Skeletal-muscle-Targeted RNA Aptamers」Mol Ther Nucleic Acids.2018,10:199-214.;Thiel,W.H.et al.「Smooth Muscle Cell-targeted RNA Aptamer Inhibits Neointimal Formation」Mol Ther.2016,24:4,779-87を見よ)。例示の筋標的化アプタマーは、A01B RNAアプタマーおよびRNA Apt 14を包含する。いくつかの態様において、アプタマーは、核酸をベースとしたアプタマー、オリゴヌクレオチドアプタマー、またはペプチドアプタマーである。いくつかの態様において、アプタマーは、約5～15kDa、約5～10kDa、約10～15kDa、約1～5Da、約1～3kDa、またはこれより小さいものであってもよい。
v.他の筋標的化剤
筋細胞(例として、骨格筋細胞)を標的にするための1つのストラテジーは、筋線維鞘上に発現されたトランスポータータンパク質などの筋肉トランスポータータンパク質の基質を使用することである。いくつかの態様において、筋標的化剤は、筋組織に特異的な流入トランスポーターの基質である。いくつかの態様において、流入トランスポーターは、骨格筋組織に特異的である。骨格筋の筋線維鞘上に発現されるトランスポーターの二大クラスは、(1)骨格筋組織からの流出に容易にさせる、アデノシン三リン酸(ATP)結合カセット(ABC)スーパーファミリー、および(2)基質の骨格筋中への流入を容易にし得る、溶質輸送体(solute carrier)(SLC)スーパーファミリーである。いくつかの態様において、筋標的化剤は、トランスポーターのABCスーパーファミリーまたはSLCスーパーファミリーへ結合する基質である。いくつかの態様において、トランスポーターのABCまたはSLCスーパーファミリーへ結合する基質は、天然に存在する基質である。いくつかの態様において、トランスポーターのABCまたはSLCスーパーファミリーへ結合する基質は、天然に存在しない基質、例えば、トランスポーターのABCまたはSLCスーパーファミリーへ結合するその合成誘導体である。
いくつかの態様において、筋標的化剤は、トランスポーターのSLCスーパーファミリーの基質である。SLCトランスポーターは、平衡型であるか、または基質の輸送を推進させる膜にわたって創出されたプロトンもしくはナトリウムのイオン勾配を使用するかのいずれかである。骨格筋への高発現を有する例示のSLCトランスポーターは、限定せずに、SATTトランスポーター(ASCT1;SLC1A4)、GLUT4トランスポーター(SLC2A4)、GLUT7トランスポーター(GLUT7;SLC2A7)、ATRC2トランスポーター(CAT-2;SLC7A2)、LAT3トランスポーター(KIAA0245;SLC7A6)、PHT1トランスポーター(PTR4;SLC15A4)、OATP-Jトランスポーター(OATP5A1;SLC21A15)、OCT3トランスポーター(EMT;SLC22A3)、OCTN2トランスポーター(FLJ46769;SLC22A5)、ENTトランスポーター(ENT1;SLC29A1およびENT2;SLC29A2)、PAT2トランスポーター(SLC36A2)、およびSAT2トランスポーター(KIAA1382;SLC38A2)を包含する。これらのトランスポーターは、基質の骨格筋中への流入を容易にさせることで、筋標的化のための好機を提供し得る。
いくつかの態様において、筋標的化剤は、平衡型ヌクレオシドトランスポーター2(ENT2)トランスポーターの基質である。他のトランスポーターと比べて、ENT2は、骨格筋において最高発現するmRNAの1つを有する。ヒトENT2(hENT2)は、脳、心臓、胎盤、胸腺、膵臓、前立腺、および腎臓などのほとんどの体器官に発現されるものの、特に骨格筋に豊富である。ヒトENT2は、その基質の取り込みを、それらの濃度勾配に応じて容易にさせる。ENT2は、広範なプリンおよびピリミジン核酸塩基を輸送することによってヌクレオシドホメオスタシスを維持する役割を果たす。hENT2トランスポーターは、イノシンを除くすべてのヌクレオシド(アデノシン、グアノシン、ウリジン、チミジン、およびシチジン)に対して低親和性を有する。結果的に、いくつかの態様において、筋標的化剤は、ENT2基質である。例示のENT2基質は、限定せずに、イノシン、2',3'-ジデオキシイノシン、およびクロファラビンを包含する。いくつかの態様において、本明細書に提供される筋標的化剤のいずれも、分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチドペイロード)に関連する。いくつかの態様において、筋標的化剤は、分子ペイロードへ共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、筋標的化剤は、分子ペイロードへ非共有結合的に連結されている。
いくつかの態様において、筋標的化剤は、ナトリウムイオン依存性の高親和性カルニチントランスポーターである有機カチオン/カルニチントランスポーター(OCTN2)の基質である。いくつかの態様において、筋標的化剤は、カルニチン、ミルドロネート、アセチルカルニチン、またはOCTN2へ結合するそのいずれかの誘導体である。いくつかの態様において、カルニチン、ミルドロネート、アセチルカルニチン、またはそれらの誘導体は、分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチドペイロード)へ共有結合的に連結されている。
筋標的化剤は、筋細胞を標的にする少なくとも1つの可溶性形態で存在するタンパク質であるタンパク質であってもよい。いくつかの態様において、筋標的化タンパク質は、鉄過剰およびホメオスタシスに関与するタンパク質ヘモジュベリン(またrepulsive guidance molecule Cまたはヘモクロマトーシスタイプ2タンパク質としても知られている)であってもよい。いくつかの態様において、ヘモジュベリンは、完全長もしくはフラグメントであっても、または機能的ヘモジュベリンタンパク質と少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％配列同一性をもつ突然変異体であってもよい。いくつかの態様において、ヘモジュベリン突然変異体は、可溶性フラグメントであってもよく、N末シグナリングを欠いていてもよく、および/または(例として、および)、C末アンカードメイン(anchoring domain)を欠いていてもよい。いくつかの態様において、ヘモジュベリンは、GenBank RefSeq受託番号NM_001316767.1、NM_145277.4、NM_202004.3、NM_213652.3、またはNM_213653.3の注釈付きのものであってもよい。ヘモジュベリンがヒト、霊長目の非ヒト動物、または齧歯類の動物を起源とするものであってもよいことは解されるはずである。
B.分子ペイロード
本開示のいくつかの側面は、分子ペイロード、例として、生物学的結果(例として、DNA配列の転写、タンパク質の発現、またはタンパク質の活性)をモジュレートするための分子ペイロードを提供する。いくつかの態様において、分子ペイロードは、筋標的化剤へ連結されているか、または別様に結び付けられている。いくつかの態様において、かかる分子ペイロードは、例として、結び付けられた筋標的化剤による筋細胞への送達を受けた筋細胞中の核酸またはタンパク質への特異的結合を介して、筋細胞を標的にすることが可能である。様々なタイプの筋標的化剤が本開示に従って使用されてもよいことは解されるはずである。例えば、分子ペイロードは、オリゴヌクレオチド(例として、アンチセンスオリゴヌクレオチド)、ペプチド(例として、疾患に関連する筋細胞中の核酸もしくはタンパク質に結合するペプチド)、タンパク質(例として、疾患に関連する筋細胞中の核酸もしくはタンパク質に結合するタンパク質)、または小分子(例として、疾患に関連する筋細胞中の核酸もしくはタンパク質の機能をモジュレートする小分子)を含んでいてもよく、またはこれらからなっていてもよい。いくつかの態様において、分子ペイロードは、表1で提供された遺伝子に相補性のある領域を有する鎖を含むオリゴヌクレオチドである。例示の分子ペイロードは本明細書にさらに詳細に記載されているが、しかしながら、本明細書に提供される例示の分子ペイロードが限定されることを意図していないことは解されるはずである。
いくつかの態様において、少なくとも1(例として、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも10)の分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド)は、筋標的化剤へ連結されている。いくつかの態様において、筋標的化剤へ連結されたすべての分子ペイロードは、同じであり、例として同じ遺伝子を標的にする。いくつかの態様において、筋標的化剤へ連結されたすべての分子ペイロードは、異なっており、例えば分子ペイロードは、同じ標的遺伝子の異なる部分を標的にしてもよく、または分子ペイロードは、少なくとも2つの異なる標的遺伝子を標的にしてもよい。いくつかの態様において、筋標的化剤は、同じであるいくつかの分子ペイロードおよび異なるいくつかの分子ペイロードへ連結されてもよい。
本開示はまた、複合体の少なくとも80％(例として、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％)が同数の分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド)へ連結された筋標的化剤を含む、複数の複合体を含む組成物を提供する。
i.オリゴヌクレオチド
いずれの好適なオリゴヌクレオチドも、分子ペイロードとして、本明細書に記載のとおり使用されてよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、mRNAの分解を引き起こすよう設計されていてもよい(例として、オリゴヌクレオチドは、分解を引き起こすgapmer、siRNA、リボザイム、またはアプタマーであってもよい)。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、mRNAの翻訳を遮断するよう設計されていてもよい(例として、オリゴヌクレオチドは、翻訳を遮断するmixmer、siRNA、またはアプタマーであってもよい)。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、mRNAの分解を引き起こしてその翻訳を遮断するよう設計されていてもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、酵素(例として、遺伝子編集酵素)の活性に向かわせるためのガイド核酸(例として、ガイドRNA)であってもよい。オリゴヌクレオチドの他の例は本明細書に提供されている。いくつかの態様において、一方のフォーマット(format)からの機能的配列(例として、アンチセンス鎖配列)を他方のフォーマットへ組み込むことによって、あるフォーマットのオリゴヌクレオチド(例として、アンチセンスオリゴヌクレオチド)が、別のフォーマット(例として、siRNAオリゴヌクレオチド)へ好適に適応されてもよいことは解されるはずである。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、表1で提供された標的遺伝子と相補性のある領域を含んでもよい。さらなる非限定例は、表1の選択された遺伝子について、以下提供される。
DMPK/DM1
いくつかの態様において、DMPKを標的にするために、例としてDM1の処置のために、有用なオリゴヌクレオチドの例は、Compound And Method For Treating Myotonic Dystrophyと題する2010年1月1日に公開された米国特許出願公開第20100016215A1号;Modulation Of Dystrophia Myotonica-Protein Kinase(DMPK)Expressionと題する2010年7月19日に公開された米国特許出願公開第20130237585A1号;「Antisense Conjugates For Decreasing Expression Of Dmpk」と題する2015年3月5日に公開された米国特許出願公開第20150064181A1号;「Peptide-Linked Morpholino Antisense Oligonucleotides For Treatment Of Myotonic Dystrophy」と題する2015年8月27日に公開された米国特許出願公開第20150238627A1号;Pandey,S.K.et al.「Identification and Characterization of Modified Antisense Oligonucleotides Targeting DMPK in Mice and Nonhuman Primates for the Treatment of Myotonic Dystrophy Type 1」J.of Pharmacol Exp Ther,2015,355:329-340.;Langlois,M.et al.「Cytoplasmic and Nuclear Retained DMPK mRNAs Are Targets for RNA Interference in Myotonic Dystrophy Cells」J.Biological Chemistry,2005,280:17,16949-16954.;Jauvin,D.et al.「Targeting DMPK with Antisense Oligonucleotide Improves Muscle Strength in Myotonic Dystrophy Type 1 Mice」,Mol.Ther:Nucleic Acids,2017,7:465-474.;Mulders,S.A.et al.「Triplet-repeat oligonucleotide-mediated reversal of RNA toxicity in myotonic dystrophy」PNAS,2009,106:33,13915-13920.;Wheeler,T.M.et al.,「Targeting nuclear RNA for in vivo correction of myotonic dystrophy」Nature,2012,488(7409):111-115.;および「Compounds And Methods For Modulation Of Dystrophia Myotonica-Protein Kinase(Dmpk)Expression」と題する2016年10月20日に公開された米国特許出願公開第20160304877A1に提供され、これら各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
DMPK遺伝子編集を促進するためのオリゴヌクレオチドの例は、「Genetic Correction Of Myotonic Dystrophy Type 1」と題する2017年3月3日に公開された米国特許出願公開第20170088819A1号;および、「Materials And Methods For Treatment Of Myotonic Dystrophy Type 1(DM1)And Other Related Disorders」と題する2018年4月1日に公開された国際特許出願公開WO18002812A1号を包含し、これら各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMPKの突然変異型、例として、Botta A.et al.「The CTG repeat expansion size correlates with splicing defect in muscle from myotonic dystrophy type 1 patients」J Med Genet.2008 Oct;45(10):639-46.;およびMachuca-Tzili L.et al.「Clinical and molecular aspects of the myotonic dystrophies:a review」Muscle Nerve.2005 Jul;32(1):1-18に報告されている突然変異型に対する相補性領域を有してもよく、これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドは、DMPKを標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチド標的化は、参照により本明細書に組み込まれる「Compounds And Methods For Modulation Of Dystrophia Myotonica-Protein Kinase(DMPK)Expression」と題する2016年10月20日に公開された米国特許出願公開US20160304877A1号に記載された、DMPKを標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチド(例として、Gapmer)のいずれか1つである。いくつかの態様において、DMPK標的化オリゴヌクレオチドは、Genbank受託番号NM_001081560.2で表されるまたはGenbank受託番号NG_009784.1で表されるDMPK遺伝子配列の領域を標的にする。
いくつかの態様において、DMPK標的化オリゴヌクレオチドは、Genbank受託番号NM_001081560.2中の少なくとも10個の連続的なヌクレオチド(例として、少なくとも10個、少なくとも12個、少なくとも14個、少なくとも16個、またはそれ以上の連続的なヌクレオチド)である標的領域に相補的な領域を含むヌクレオチド配列を含む。
いくつかの態様において、DMPK標的化オリゴヌクレオチドは、gapmerモチーフを含む。「Gapmer」は、RNase H切断を支持する複数のヌクレオチドを有する内部領域が、1個以上のヌクレオチドを有する外部領域の間に位置されるキメラのアンチセンス化合物を意味し、ここで内部領域を含むヌクレオチドは、ヌクレオチドまたは外部領域を含むヌクレオチドとは化学的に別個である。内部領域は「ギャップセグメント」と称され得、外部領域は「ウイングセグメント」と称され得る。いくつかの態様において、DMPK標的化オリゴヌクレオチドは、1個以上の修飾ヌクレオチド、および/または(例として、および)1個以上の修飾ヌクレオチド間連結を含む。いくつかの態様において、ヌクレオチド間連結は、ホスホロチオアート連結である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、完全なホスホロチオアート主鎖を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、cET末端を伴うDNA gapmer(例として、3-10-3;cET-DNA-cET)である。いくつかの態様において、DMPK標的化オリゴヌクレオチドは、1以上の6'-(S)-CH3二環式ヌクレオチド、1以上のβ-D-2'-デオキシリボヌクレオチド、および/または(例として、および)1以上の5-メチル-シトシンヌクレオチドを含む。
DUX4/FSHD
いくつかの態様において、DUX4を標的にするために、例として、FSHDの処置のために、有用なオリゴヌクレオチドの例は、「AGENTS USEFUL IN TREATING FACIOSCAPULOHUMERAL MUSCULAR DYSTROPHY」と題する2017年2月2日に公開された米国特許第9,988,628号;「RECOMBINANT VIRUS PRODUCTS AND METHODS FOR INHIBITING EXPRESSION OF DUX4」と題する2014年10月30日に公開された米国特許第9,469,851号;「AGENTS USEFUL IN TREATING FACIOSCAPULOHUMERAL MUSCULAR DYSTROPHY」と題する2012年9月6日に公開された米国特許出願公開第20120225034号;「MORPHOLINO TARGETING DUX4 FOR TREATING FSHD」と題する2013年8月15日に公開されたPCT特許出願公開番号WO 2013/120038号;Chen et al.,「Morpholino-mediated Knockdown of DUX4 Toward Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy Therapeutics」、Molecular Therapy,2016,24:8,1405-1411.;およびAnsseau et al.,「Antisense Oligonucleotides Used to Target the DUX4 mRNA as Therapeutic Approaches in Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy(FSHD)」,Genes,2017,8,93.に提供され、これら各々の内容全体は本明細書に組み込まれる。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、標的DUX4遺伝子またはmRNAとハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチド、モルホリノ、siRNA、shRNA、または別のヌクレオチドである。
いくつかの態様において、例として、FSHDの処置のために、オリゴヌクレオチドは、2015年にCurr Opin Genet Devで公開されたDaxinger,et al.,「Genetic and Epigenetic Contributors to FSHD」、Lim J-W,et al.,DICER/AGO-dependent epigenetic silencing of D4Z4 repeats enhanced by exogenous siRNA suggests mechanisms and therapies for FSHD Hum Mol Genet.2015 Sep 1;24(17):4817-4828(これら各々の内容全体は本明細書に組み込まれる)におけるとおり、低メチル化され縮小されたD4Z4反復と相補性のある領域を有してもよい。
DNM2/CNM
いくつかの態様において、DNM2を標的にするために、例として、CNMの処置のために、有用なオリゴヌクレオチドの例は、「DYNAMIN 2 INHIBITOR FOR THE TREATMENT OF DUCHENNE'S MUSCULAR DYSTROPHY」と題する2018年5月24日に公開された米国特許出願公開第20180142008号、および「ALLELE-SPECIFIC SILENCING THERAPY FOR DYNAMIN 2-RELATED DISEASES」と題する2018年6月7日に公開されたPCT出願公開番号WO 2018/100010A1号に提供されている。例えば、いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DNM2発現と特異的に干渉するRNAi、アンチセンス核酸、siRNA、またはリボザイムである。DNM2を標的にするための有用なオリゴヌクレオチドの他の例は、2018年4月4日にMol.Ther.で公開されたTasfaout,et al.,「Single Intramuscular Injection of AAV-shRNA Reduces DNM2 and Prevents Myotubular Myopathy in Mice」およびTasfaout,et al.,「Antisense oligonucleotide-mediated Dnm2 knockdown prevents and reverts myotubular myopathy in mice」,Nature Communications volume 8,Article number:15661(2017)に提供されている。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DNM2 mRNAを効率的に標的にするshRNAまたはモルホリノである。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、2015年7月にMol.Cell Biol.で発表されたTodaka,et al.「Overexpression of NF90-NF45 Represses Myogenic MicroRNA Biogenesis,Resulting in Development of Skeletal Muscle Atrophy and Centronuclear Muscle Fibers」にあるような、miR-133活性に対して抵抗性である野生型DNM2をコードする。DNM2を標的とするのに有用なオリゴヌクレオチドのさらなる例は、2013年にPLoS Oneに発表されたGibbs,et al.,「Two Dynamin-2 Genes are Required for Normal Zebrafish Development」に提供されており、その各々の内容はその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、例として、CNMの処置のために、オリゴヌクレオチドは、2012年にHum.Mutat.で公開されたBoehm et al,「Mutation Spectrum in the Large GTPase Dynamin 2,and Genotype-Phenotype Correlation in Autosomal Dominant Centronuclear Myopathy」(この内容全体は本明細書に組み込まれる)におけるとおり、CNMに関連するDNM2における突然変異体と相補性のある領域を有してもよい。
ポンペ病
いくつかの態様において、例として、ポンペ病の処置のために、オリゴヌクレオチドは、van der Wal,et al.,「GAA Deficiency in Pompe Disease is Alleviated by Exon Inclusion in iPSC-Derived Skeletal Muscle Cells」、Mol Ther Nucleic Acids.2017 Jun 16;7:101-115(この内容全体は本明細書に組み込まれる)におけるとおり、GAA疾患アレル中にエキソン2封入を媒介する。結果的に、いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、GAA疾患アレルと相補性のある領域を有してもよい。
いくつかの態様において、例として、ポンペ病の処置のために、RNAiまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、例えば、2017年にMol Ther Nucleic Acidsで公開されたClayton,et al.,「Antisense Oligonucleotide-mediated Suppression of Muscle Glycogen Synthase 1 Synthesis as an Approach for Substrate Reduction Therapy of Pompe Disease」、または「INHIBITING OR DOWNREGULATING GLYCOGEN SYNTHASE BY CREATING PREMATURE STOP CODONS USING ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES」と題する2017年6月29日に公開された米国特許出願公開第2017182189号(これらの内容は参照により本明細書に組み込まれる)において報告されたように、筋細胞中の野生型GYS1の発現を抑制するために利用される。結果的に、いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、RefSeq番号NM_002103.4に対応するヒトGYS1配列および/または(例として、および)RefSeq番号NM_030678.3に対応するマウスGYS1配列である配列と、相補性のある領域を有するアンチセンス鎖を有してもよい。
ACVR1/FOP
例えば、FOPの処置のために、ACVR1を標的にするのに有用なオリゴヌクレオチドの例は、米国特許出願2009/0253132、10/8/2009公開、「Mutated ACVR1 for diagnosis and treatment of fibrodyplasia ossificans progressiva(FOP)」;WO 2015/152183、10/8/2015公開、「Prophylactic agent and therapeutic agent for fibrodysplasia ossificans progressive」;Lowery,J.W.et al,「Allele-specific RNA Interference in FOP-Silencing the FOP gene」,GENE THERAPY,vol.19,2012,pages 701-702;Takahashi,M.et al.「Disease-causing allele-specific silencing against the ALK2 mutants,R206H and G356D,in fibrodysplasia ossificans progressiva」Gene Therapy(2012)19,781-785;Shi,S.et al.「Antisense-Oligonucleotide Mediated Exon Skipping in Activin-Receptor-Like Kinase 2:Inhibiting the Receptor That Is Overactive in Fibrodysplasia Ossificans Progressiva」Plos One,July 2013,Vol 8:7,e69096.;米国特許出願2017/0159056、6/8/2017公開、「Antisense oligonucleotides and methods of use thereof」;米国特許第8,859,752号、10/4/2014発行、「SIRNA-based therapy of Fibrodyplasia Ossificans Progressiva(FOP)」;WO2004/094636、11/4/2004公開、「Effective sirna knock-down constructs」に提供されているが、これら各々の内容はそれら全体が本明細書に組み込まれる。
FXN/フリートライヒ運動失調症
いくつかの態様において、FXNを標的にするためにおよび/またはそうでなければフラタキシン欠乏症を補償するために、例として、フリートライヒ運動失調症の処置のために、有用なオリゴヌクレオチドの例は、Li,L.et al「Activating frataxin expression by repeat-targeted nucleic acids」Nat.Comm.2016,7:10606.;WO 2016/094374、6/16/2016公開、「Compositions and methods for treatment of Friedreich's ataxia.」;WO 2015/020993、2/12/2015公開、「RNAi COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATMENT OF FRIEDREICH'S ATAXIA」;WO 2017/186815、11/2/2017公開、「Antisense oligonucleotides for enhanced expression of frataxin」;WO 2008/018795、2/14/2008公開、「Methods and means for treating dna repeat instability associated genetic disorders」;米国特許出願2018/0028557、2/1/2018公開、「Hybrid oligonucleotides and uses thereof」;WO 2015/023975、2/19/2015公開、「Compositions and methods for modulating RNA」;WO 2015/023939、2/19/2015公開、「Compositions and methods for modulating expression of frataxin」;米国特許出願2017/0281643、10/5/2017公開、「Compounds and methods for modulating frataxin expression」;Li L.et al.,「Activating frataxin expression by repeat-targeted nucleic acids」Nature Communications,2016年2月4日公開;およびLi L.et al.「Activation of Frataxin Protein Expression by Antisense Oligonucleotides Targeting the Mutant Expanded Repeat」Nucleic Acid Ther.2018 Feb;28(1):23-33.に提供され、これら各々の内容全体は本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドペイロードは、例として、米国特許第9,593,330号、6/9/2011出願、「Treatment of frataxin(FXN)related diseases by inhibition of natural antisense transcript to FXN」(この内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる)において開示されたように、FXN発現を阻害する天然アンチセンス転写産物の発現を阻害するために構成される(例として、gapmerまたはRNAiオリゴヌクレオチドとして)。
FXN遺伝子編集を促進するためのオリゴヌクレオチドの例は、WO 2016/094845、6/16/2016公開、「Compositions and methods for editing nucleic acids in cells utilizing oligonucleotides」;WO 2015/089354、6/18/2015公開、「Compositions and methods of use of CRISPR-Cas systems in nucleotide repeat disorders」;WO 2015/139139、9/24/2015公開、「CRISPR-based methods and products for increasing frataxin levels and uses thereof」;およびWO 2018/002783、1/4/2018公開、「Materials and methods for treatment of Friedreich ataxia and other related disorders」を包含し、これら各々の内容全体は本明細書に組み込まれる。
非FXN遺伝子、例としてFXNの後成的調節因子、の標的化を通じてFXN遺伝子発現を促進するためのオリゴヌクレオチドの例は、WO 2015/023938、2/19/2015公開、「Epigenetic regulators of frataxin」を包含し、この内容全体は本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ヒト由来のFXN遺伝子(Gene ID 2395;NC_000009.12)および/または(例として、および)マウス由来のFXN遺伝子(Gene ID 14297;NC_000085.6)として規定される配列と、相補性のある領域を有してもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、例として、Montermini,L.et al.「The Friedreich ataxia GAA triplet repeat:premutation and normal alleles」Hum.Molec.Genet.,1997,6:1261-1266.;Filla,A.et al.「The relationship between trinucleotide(GAA)repeat length and clinical features in Friedreich ataxia」Am.J.Hum.Genet.1996,59:554-560.;Pandolfo,M.Friedreich ataxia:the clinical picture.J.Neurol.2009,256,3-8に報告されているような、FXNの突然変異型に対する相補性領域を有してもよい。これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
DMD/ジストロフィン異常症
DMDを標的にするための有用なオリゴヌクレオチドの例は、「MULTIPLE EXON SKIPPING COMPOSITIONS FOR DMD」と題する2010年5月27日に公開された米国特許出願公開US20100130591A1;「MEANS AND METHOD FOR INDUCING EXON-SKIPPING」と題する2013年1月29日に登録された米国特許第8,361,979号;「METHOD FOR EFFICIENT EXON(44)SKIPPING IN DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY AND ASSOCIATED MEANS」と題する2012年3月8日に公開された米国特許出願公開20120059042;「EXON SKIPPING COMPOSITIONS FOR TREATING MUSCULAR DYSTROPHY」と題する2014年11月6日に公開された米国特許出願公開20140329881;「ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES FOR INDUCING EXON SKIPPING AND METHODS OF USE THEREOF」と題する2012年7月31日に登録された米国特許第8,232,384号;「METHODS AND MEANS FOR EFFICIENT SKIPPING OF EXON 45 IN DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY PRE-MRNA」と題する2012年1月26日に公開された米国特許出願公開20120022134A1;「ADENO-ASSOCIATED VIRAL VECTOR FOR EXON SKIPPING IN A GENE ENCODING A DISPENSABLE DOMAN PROTEIN」と題する2012年3月29日に公開された米国特許出願公開20120077860;「OLIGOMERS」と題する2012年12月4日に登録された米国特許第8,324,371号;「ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES」と題する2015年7月14日に登録された米国特許第9,078,911号;「ANTISENSE NUCLEIC ACIDS」と題する2015年7月14日に登録された米国特許第9,079,934号;「MIR-31 IN DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY THERAPY」と題する2015年5月19日に登録された米国特許第9,034,838号;および「OLIGONUCLEOTIDE COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF」と題する2017年4月13日に公開された国際特許公開WO2017062862A3に提供され、これら各々の内容全体は本明細書に組み込まれる。
DMD遺伝子編集を促進するためのオリゴヌクレオチドの例は、「METHODS OF MODIFYING THE DYSTROPHIN GENE AND RESTORING DYSTROPHIN EXPRESSION AND USES THEREOF」と題する2018年3月29日に公開された国際特許公開WO2018053632A1;「MODIFICATION OF THE DYSTROPHIN GENE AND USES THEREOF」と題する2017年3月30日に公開された国際特許公開WO2017049407A1;「CRISPR/CAS-RELATED METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY AND BECKER MUSCULAR DYSTROPHY」と題する2016年10月6日に公開された国際特許公開WO2016161380A1;「THERAPEUTIC TARGETS FOR THE CORRECTION OF THE HUMAN DYSTROPHIN GENE BY GENE EDITING AND METHODS OF USE」と題する2017年6月8日に公開された国際特許公開WO2017095967;「MATERIALS AND METHODS FOR TREATMENT OF DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY」と題する2017年5月4日に公開された国際特許公開WO2017072590A1;「PREVENTION OF MUSCULAR DYSTROPHY BY CRISPR/CPF1-MEDIATED GENE EDITING」と題する2018年5月31日に公開された国際特許公開WO2018098480A1;、「RNA-Guided Systems for In Vivo Gene Editing」と題する2017年9月21日に公開された米国特許出願公開US20170266320A1;「PREVENTION OF MUSCULAR DYSTROPHY BY CRISPR/CAS9-MEDIATED GENE EDITING」と題する2016年2月18日に公開された国際特許公開WO2016025469A1;「RNA-GUIDED GENE EDITING AND GENE REGULATION」と題する2016年7月14日に公開された米国特許出願公開2016/0201089;および「MEGANUCLEASE VARIANTS CLEAVING A DNA TARGET SEQUENCE FROM THE DYSTROPHN GENE AND USES THEREOF」と題する2013年6月6日に公開された米国特許出願刊公開2013/0145487を包含し、これら各々の内容全体は本明細書に組み込まれる。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、例として、ヒト、マウスおよび非ヒト種から選択される、複数の種のDMD遺伝子配列と相補性のある領域を有してもよい。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、突然変異体DMDアレル、例えば、フレームシフトおよび不適当なRNAスプライシング/プロセシングに繋がるヒト中DMDのエキソン1～79のいずれかにおける少なくとも1個の突然変異を伴うDMDアレル、と相補性のある領域を有してもよい。
MYH7/肥大性心筋症
ペイロードとして、例として、MYH7を標的にするための、有用なオリゴヌクレオチドの例は、Inhibitors of MYH7B and Uses Thereofと題する2018年4月5日に公開された米国特許出願公開20180094262;Oligonucleotides and Methods for Treatment of Cardiomyopathy Using RNA Interferenceと題する2016年12月1日に公開された米国特許出願公開20160348103;「Allele-specific RNA Silencing for the Treatment of Hypertrophic Cardiomyopathy」と題する2016年8月18日に公開された米国特許出願公開20160237430;「Inhibitors of MYH7B and Uses Thereof」と題する2016年2月4日に公開された米国特許出願公開20160032286;「MicroRNA Inhibitors Comprising Locked Nucleotides」と題する2014年7月3日に公開された米国特許出願公開20140187603;「Dual Targeting of miR-208 and miR-499 in the Treatment of Cardiac Disorders」と題する2014年6月26日に公開された米国特許出願公開20140179764;「Compositions and Methods to Treat Muscular and Cardiovascular Disorders」と題する2012年5月10日に公開された米国特許出願公開20120114744に提供され、これら各々の内容全体は本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、lncRNAまたはmRNAを、例として分解のために、標的にしてもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、例として分解のために、ミスマッチ修復経路に関与するタンパク質をコードする核酸、例として、MSH2、MutLアルファ、MutSベータ、MutLアルファを標的にしてもよい。ミスマッチ修復経路に関与するタンパク質(かかるタンパク質をコードするmRNAは、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドによって標的にされてもよい)の非限定例は、Iyer,R.R.et al.,「DNA triplet repeat expansion and mismatch repair」Annu Rev Biochem.2015;84:199-226;およびSchmidt M.H.and Pearson C.E.,「Disease-associated repeat instability and mismatch repair」DNA Repair(Amst).2016 Feb;38:117-26に記載されている。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドのいずれか1つは、例として、ナトリウム、カリウム、またはマグネシウム塩としての塩形態であり得る。
いくつかの態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのいずれか1つの5'または3'ヌクレオシド(例として、末端ヌクレオシド)は、任意にスペーサーを介してアミン基に抱合される。いくつかの態様において、スペーサーは脂肪族部分を含む。いくつかの態様において、スペーサーはポリエチレングリコール部分を含む。いくつかの態様においては、ホスホジエステル連結がスペーサーとオリゴヌクレオチドの5'または3'ヌクレオシドとの間に存在する。いくつかの態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのいずれかの5'または3'ヌクレオシド(例として、末端ヌクレオシド)はスペーサーに抱合され、これが置換もしくは非置換の脂肪族、置換もしくは非置換のヘテロ脂肪族、置換もしくは非置換のカルボシクリレン、置換もしくは非置換のヘテロシクリレン、置換もしくは非置換のアリーレン、置換もしくは非置換のヘテロアリーレン、-O-、-N(RA)-、-S-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-C(＝O)NRA-、-NRAC(＝O)-、-NRAC(＝O)RA-、-C(＝O)RA-、-NRAC(＝O)O-、-NRAC(＝O)N(RA)-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-OC(＝O)N(RA)-、-S(O)2NRA-、-NRAS(O)2-、またはそれらの組み合わせであり;各RAは独立して水素または置換もしくは非置換のアルキルである。ある種の態様において、スペーサーは置換もしくは非置換のアルキレン、置換もしくは非置換のヘテロシクリレン、置換もしくは非置換のヘテロアリーレン、-O-、-N(RA)-、または-C(＝O)N(RA)2、あるいはそれらの組み合わせである。
いくつかの態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのいずれか1つの5'または3'ヌクレオシドは、式-NH2-(CH2)n-の化合物に抱合され、nは1～12の整数である。いくつかの態様において、nは6、7、8、9、10、11、または12である。いくつかの態様においては、ホスホジエステル連結が式NH2-(CH2)n-の化合物とオリゴヌクレオチドの5'または3'ヌクレオシドとの間に存在する。いくつかの態様において、式NH2-(CH2)6-の化合物は6-アミノ-1-ヘキサノール(NH2-(CH2)6-OH)とオリゴヌクレオチドの5'リン酸との間の反応によってオリゴヌクレオチドに抱合される。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、標的化薬剤、例えば抗TfR抗体などの筋標的化剤に例えばアミン基を介して抱合される。
a.オリゴヌクレオチドサイズ/配列
オリゴヌクレオチドは、例としてフォーマットに応じて、様々な異なる長さのものであってもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、長さが7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75ヌクレオチドであるか、またはこれより長い。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、長さが8～50ヌクレオチド、長さが8～40ヌクレオチド、長さが8～30ヌクレオチド、長さが10～15ヌクレオチド、長さが10～20ヌクレオチド、長さが15～25ヌクレオチド、長さが21～23ヌクレオチド等々である。
いくつかの態様において、本開示の目的上オリゴヌクレオチドの相補的な核酸配列は、前記配列の標的分子(例として、mRNA)への結合が標的(例として、mRNA)の正常な機能に干渉して活性の喪失(例として、翻訳の阻害)または発現の喪失(例として、標的mRNAの分解)を引き起こしたとき、かつ非特異的結合の回避が所望される条件下、例として、in vivoアッセイまたは治療処置のケースおよびin vitroアッセイのケースにおける生理学的な条件下、アッセイがストリンジェンシー(stringency)の好適な条件下で実施される条件下で、前記配列の非標的配列への非特異的結合を回避するのに充分な程度の相補性があるとき、標的核酸に特異的にハイブリダイズ可能であるか、または標的核酸に特異的である。よって、いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、標的核酸の連続したヌクレオチドに少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または100％相補的であってもよい。いくつかの態様において、相補的なヌクレオチド配列は、標的核酸に特異的にハイブリダイズ可能であるか、または標的核酸に特異的であるその標的の配列に100％相補的である必要はない。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、長さが8～15、8～30、8～40、または10～50、または5～50、または5～40ヌクレオチドの範囲にある標的核酸と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドの、標的核酸と相補性のある領域は、長さが5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50ヌクレオチドである。いくつかの態様において、相補性のある領域は、標的核酸の少なくとも連続した8ヌクレオチドと相補的である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、標的核酸の一部の連続したヌクレオチドと比較して1、2または3塩基ミスマッチを含有していてもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、15塩基にわたり最大3ミスマッチまで、または10塩基にわたり最大2ミスマッチまで有していてもよい。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドのいずれか1つの標的配列に対して相補的である(例として、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または100％)。いくつかの態様において、かかる標的配列は本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドに対して100％相補的である。
いくつかの態様において、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドのいずれか1つの上のチミン塩基(T)のいずれか1つ以上は任意にウラシル塩基(U)であり得、および/またはUのいずれか1つ以上は任意にTであり得る。
b.オリゴヌクレオチド修飾:
本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、修飾されていてもよく、例として、修飾された糖部、修飾されたヌクレオシド間連結、修飾ヌクレオチド、および/またはそれらの組み合わせを含む。加えて、いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、以下の特性の1以上を呈してもよい:選択的スプライシングを媒介しない;免疫刺激性ではない;ヌクレアーゼ抵抗性である;非修飾オリゴヌクレオチドと比較して改善された細胞取り込みを有する;細胞または哺乳動物への毒性がない;改善されたエンドソームの内部への出口(exit)を細胞中に有する;TLR刺激を最小限に抑える;または、パターン認識受容体を回避する。本明細書に記載のオリゴヌクレオチドの修飾された化学的性質またはフォーマットのいずれも、互いに組み合わせられ得る。例えば、1、2、3、4、5、またはこれより多くの異なるタイプの修飾が、同じオリゴヌクレオチド内に包含され得る。
いくつかの態様において、修飾が組み込まれるオリゴヌクレオチドを、ネイティブなオリゴデオキシヌクレオチド分子またはオリゴリボヌクレオチド分子よりヌクレアーゼ消化に耐性があるようにさせる、特定のヌクレオチド修飾が使用されてもよい;これらの修飾されたオリゴヌクレオチドは、非修飾オリゴヌクレオチドより長時間無傷で存続する。修飾されたオリゴヌクレオチドの特定例は、修飾された主鎖、例えば、ホスホロチオアート、ホスホトリエステル、メチルホスホナート、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間連結、または短鎖ヘテロ原子のもしくは複素環式の糖間連結などの修飾されたヌクレオシド間連結を含むものを包含する。結果的に、本開示のオリゴヌクレオチドは、修飾、例として、ヌクレオチド修飾の組み込みなどによる核酸分解に対して安定化され得る。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの2～10、2～15、2～16、2～17、2～18、2～19、2～20、2～25、2～30、2～40、2～45ヌクレオチド、またはこれより多いヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである、長さが最大50ヌクレオチドまでまたは最大100ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドであってもよい。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの2～10、2～15、2～16、2～17、2～18、2～19、2～20、2～25、2～30ヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである、長さが8～30ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであってもよい。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの2～4、2～5、2～6、2～7、2～8、2～9、2～10、2～11、2～12、2～13、2～14ヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである、長さが8～15ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであってもよい。任意に、オリゴヌクレオチドは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10ヌクレオチドを除き、どのヌクレオチドも修飾されていてもよい。オリゴヌクレオチド修飾は本明細書にさらに記載されている。
c.修飾ヌクレオシド
いくつかの態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、糖の2'位において修飾された少なくとも1つのヌクレオシドを含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは少なくとも1つの2'修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチド上のヌクレオシドのすべては2'修飾ヌクレオシドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、1以上の非二環式2'-修飾ヌクレオチド、例として、2'-デオキシ、2'-フルオロ(2'-F)、2'-O-メチル(2'-O-Me)、2'-O-メトキシエチル(2'-O-MOE)、2'-O-アミノプロピル(2'-O-AP)、2'-O-ジメチルアミノエチル(2'-O-DMAOE)、2'-O-ジメチルアミノプロピル(2'-O-DMAP)、2'-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2'-O-DMAEOE)、または2'-O--N-メチルアセトアミド(2'-O-NMA)の修飾ヌクレオシドを包含する。
いくつかの態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、1以上の2'-4'二環式ヌクレオシドを含むが、前記ヌクレオシド中リボース環は、その環中2個の原子を接続する(例として、メチレン(LNA)架橋、エチレン(ENA)架橋、または(S)-拘束エチル(cEt)架橋を介して、2'-O原子を4'-C原子へ接続する)架橋部分を含む。LNAの例は、2008年4月17日に公開され「RNA Antagonist Compounds For The Modulation Of PCSK9」と題する国際特許出願公開WO/2008/043753(この内容は、その全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる)に記載されている。ENAの例は、2005年5月12日に公開され「APP/ENA Antisense」と題する国際特許公開番号WO 2005/042777;Morita et al.,Nucleic Acid Res.,Suppl 1:241-242,2001;Surono et al.,Hum.Gene Ther.,15:749-757,2004;Koizumi,Curr.Opin.Mol.Ther.,8:144-149,2006;およびHorie et al.,Nucleic Acids Symp.Ser(Oxf),49:171-172,2005に提供されており、これらの開示はそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。cEtの例は、米国特許7,101,993;7,399,845および7,569,686に提供されており、これら各々はそれら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、以下の米国特許または特許出願公開うち1つに開示された修飾ヌクレオシドを含む:米国特許7,399,845、2008年7月15日発行、表題「6-Modified Bicyclic Nucleic Acid Analogs」;米国特許7,741,457、2010年6月22日発行、表題「6-Modified Bicyclic Nucleic Acid Analogs」;米国特許8,022,193、2011年9月20日発行、表題「6-Modified Bicyclic Nucleic Acid Analogs」;米国特許7,569,686、2009年8月4日発行、表題「Compounds And Methods For Synthesis Of Bicyclic Nucleic Acid Analogs」;米国特許7,335,765、2008年2月26日発行、表題「Novel Nucleoside And Oligonucleotide Analogues」;米国特許7,314,923、2008年1月1日発行、表題「Novel Nucleoside And Oligonucleotide Analogues」;米国特許7,816,333、2010年10月19日発行、表題「Oligonucleotide Analogues And Methods Utilizing The Same」および米国公開第2011/0009471号、現在米国特許8,957,201、2015年2月17日発行、表題「Oligonucleotide Analogues And Methods Utilizing The Same」、すべての用途において(for all purposes)、これら各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも1個の修飾ヌクレオシドも有さないオリゴヌクレオチドと比較して、1℃、2℃、3℃、4℃、または5℃の範囲にあるオリゴヌクレオチドのTmの増大をもたらす少なくとも1個の修飾ヌクレオシドを含む。オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシドを有さないオリゴヌクレオチドと比較して、合計で2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、またはこれを超える温度の範囲にあるオリゴヌクレオチドのTmの増大をもたらす複数の修飾ヌクレオシドを有していてもよい。
オリゴヌクレオチドは、異なる種類のヌクレオシドのミックスを含み得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、2'-デオキシリボヌクレオシドまたはリボヌクレオシドおよび2'-フルオロ修飾ヌクレオシドのミックスを含み得る。オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオシドまたはリボヌクレオシドおよび2'-O-Me修飾ヌクレオシドのミックスを含み得る。オリゴヌクレオチドは、2'-フルオロ修飾ヌクレオシドおよび2'-O-Me修飾ヌクレオシドのミックスを含み得る。オリゴヌクレオチドは、2'-4'二環式ヌクレオシドおよび2'MOE、2'-フルオロ、または2'-O-Me修飾ヌクレオシドのミックスを含み得る。オリゴヌクレオチドは、非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOE、2'-フルオロ、または2'-O-Me)および2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNA、ENA、cEt)のミックスを含み得る。
オリゴヌクレオチドは、異なる種類の交互のヌクレオシドを含み得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、交互の2'-デオキシリボヌクレオシドまたはリボヌクレオシドおよび2'-フルオロ修飾ヌクレオシドを含み得る。オリゴヌクレオチドは、交互のデオキシリボヌクレオシドまたはリボヌクレオシドおよび2'-O-Me修飾ヌクレオシドを含み得る。オリゴヌクレオチドは、交互の2'-フルオロ修飾ヌクレオシドおよび2'-O-Me修飾ヌクレオシドを含み得る。オリゴヌクレオチドは、交互の2'-4'二環式ヌクレオシドおよび2'-MOE、2'-フルオロ、または2'-O-Me修飾ヌクレオシドを含み得る。オリゴヌクレオチドは、交互の非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOE、2'-フルオロ、または2'-O-Me)および2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNA、ENA、cEt)を含み得る。
いくつかの態様においては、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、5'-ビニルホスホン酸修飾、1以上の無塩基残基、および/または1以上の逆向きの無塩基残基を含む。
d.ヌクレオシド間連結/主鎖
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオアートまたは他の修飾ヌクレオシド間連結を含有していてもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結を、少なくとも2個のヌクレオチド間に含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結を、すべてのヌクレオチド間に含む。例えば、いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド間連結を、ヌクレオチド配列の5'または3'末端の、第1の、第2の、および/または(例として、および)、第3のヌクレオシド間連結にて含む。
使用されてもよい、リンを含有する連結は、これらに限定されないが、正常な3'-5'連結、これらの2'-5'連結類似体を有する、ホスホロチオアート、キラルのホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホナート(3'アルキレンホスホナートおよびキラルのホスホナートを含む)、ホスフィナート、ホスホロアミダート(3'-アミノホスホロアミダートおよびアミノアルキルホスホロアミダートを含む)、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびにボラノホスファートと、逆方向の極性を有するこれら(ここでヌクレオシド単位の隣接する対は3'-5'から5'-3'へまたは2'-5'から5'-2'へ連結されている)とを包含する;米国特許第3,687,808号;第4,469,863号;第4,476,301号;第5,023,243号;第5,177,196号;第5,188,897号;第5,264,423号;第5,276,019号;第5,278,302号;第5,286,717号;第5,321,131号;第5,399,676号;第5,405,939号;第5,453,496号;第5,455,233号;第5,466,677号;第5,476,925号;第5,519,126号;第5,536,821号;第5,541,306号;第5,550,111号;第5,563,253号;第5,571,799号;第5,587,361号;および第5,625,050号を見よ。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、メチレン(メチルイミノ)またはMMI主鎖;アミド主鎖(De Mesmaeker et al.Ace.Chem.Res.1995,28:366-374を見よ);モルホリノ主鎖(SummertonおよびWeller、米国特許第5,034,506号を見よ);またはペプチド核酸(PNA)主鎖(ここでオリゴヌクレオチドのホスホジエステル主鎖がポリアミド主鎖に置き換えられており、ヌクレオチドがポリアミド主鎖のアザ窒素原子へ直接的または間接的に結合されている、Nielsen et al.,Science 1991,254,1497を見よ)などのヘテロ原子主鎖を有していてもよい。
e.立体特異的オリゴヌクレオチド
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間のリン原子はキラルであり、およびオリゴヌクレオチドの特性はキラルのリン原子の立体配置に基づき調整される。いくつかの態様において、適切な方法は、立体制御されたやり方(例として、Oka N,Wada T,Stereocontrolled synthesis of oligonucleotide analogs containing chiral internucleotidic phosphorus atoms.Chem Soc Rev.2011 Dec;40(12):5829-43に記載のとおりの)でP-キラルオリゴヌクレオチド類似体を合成するために使用されてもよい。いくつかの態様において、実質的にすべてのSpホスホロチオアート糖間連結または実質的にすべてのRpホスホロチオアート糖間連結のいずれかによって一緒に結び合わされたヌクレオシド単位を含む、ホスホロチオアート含有オリゴヌクレオチドが提供される。いくつかの態様において、実質的にキラル純粋な糖間連結を有するかかるホスホロチオアートオリゴヌクレオチドは、例えば、1996年12月12日に発行された米国特許5,587,261(この内容は全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる)に記載されるとおり、酵素合成または化学合成によって調製される。いくつかの態様において、キラル制御されたオリゴヌクレオチドは、標的核酸の選択的切断パターンを提供する。例えば、いくつかの態様において、キラル制御されたオリゴヌクレオチドは、例えば、2017年2月2日に公開された表題「CHIRAL DESIGN」の米国特許出願公開20170037399 A1(この内容は全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる)に記載のとおり、核酸の相補的な配列内に単一の切断部位を提供する。
f.モルホリノ
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、モルホリノをベースとした化合物であってもよい。モルホリノをベースとしたオリゴマー化合物は、Dwaine A.Braasch and David R.Corey,Biochemistry,2002,41(14),4503-4510);Genesis,volume 30,issue 3,2001;Heasman,J.,Dev.Biol.,2002,243,209-214;Nasevicius et al.,Nat.Genet.,2000,26,216-220;Lacerra et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,2000,97,9591-9596;および1991年7月23日発行の米国特許第5,034,506号に記載されている。いくつかの態様において、モルホリノをベースとしたオリゴマー化合物は、ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー(PMO)である(例として、Iverson,Curr.Opin.Mol.Ther.,3:235-238,2001;およびWang et al.,J.Gene Med.,12:354-364,2010に記載のとおり;これらの開示はこれら全体が参照により本明細書に組み込まれる)。
g.ペプチド核酸(PNA)
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位の糖とヌクレオシド間連結(主鎖)との両方とも、新規な基に置き換えられている。いくつかの態様において、塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持されている。かかるオリゴマー化合物の1つである、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸(PNA)と称される。PNA化合物中のオリゴヌクレオチドの糖-主鎖は、アミド含有主鎖、例えば、アミノエチルグリシン主鎖に置き換えられている。核酸塩基は保持されており、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子へ直接的または間接的に結合されている。PNA化合物の調製を報告する代表的な刊行物は、これらに限定されないが、米国特許第5,539,082号;第5,714,331号;および第5,719,262号(これら各々は参照により本明細書に組み込まれる)を包含する。PNA化合物のさらなる教示は、Nielsen et al.,Science,1991,254,1497-1500から見出され得る。
h.Gapmers
いくつかの態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、gapmerである。gapmerオリゴヌクレオチドは、一般に、ギャップ領域Yの周りのフランキング領域としてXおよびZを有する式5'-X-Y-Z-3'を有する。いくつかの態様において、式5'-X-Y-Z-3'のフランキング領域Xは、X領域、フランキング配列X、5'ウイング領域X、または5'ウイングセグメントとも呼ばれる。いくつかの態様において、式5'-X-Y-Z-3'のフランキング領域ZはZ領域、フランキング配列Z、3'ウイング領域Z、または3'ウイングセグメントとも呼ばれる。いくつかの態様において、式5'-X-Y-Z-3'のギャップ領域Yは、Y領域、Yセグメント、またはギャップセグメントYとも呼ばれる。いくつかの態様において、ギャップ領域Yの各ヌクレオシドは2'-デオキシリボヌクレオシドであり、5'ウイング領域Xまたは3'ウイング領域Zのいずれも2'-デオキシリボヌクレオシドを含有しない。
いくつかの態様において、Y領域は、ヌクレオチドの連続した伸び、例として、6以上のDNAヌクレオチドであり、それらはRNAse HなどのRNAseを動員することができる。いくつかの態様において、gapmerは標的核酸に結合し、この点において、RNAseが動員され、それから標的核酸を切断し得る。いくつかの態様において、Y領域は、高親和性修飾ヌクレオシド、例えば1から6つの高親和性修飾ヌクレオシドを含む領域XおよびZによって5'および3'両方をフランキングされる。高親和性修飾ヌクレオシドの例は、2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOE、2'O-Me、2'-F)または2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNA、cEt、ENA)を包含するが、これらに限定されない。いくつかの態様において、フランキング配列XおよびZは長さが1～20ヌクレオチド、1～8ヌクレオチド、または1～5ヌクレオチドであり得る。フランキング配列XおよびZは類似の長さまたは非類似の長さであり得る。いくつかの態様において、ギャップセグメントYは、長さが5～20ヌクレオチド、5～15、12ヌクレオチド、または6～10ヌクレオチドのヌクレオチド配列であり得る。
いくつかの態様において、gapmerオリゴヌクレオチドのギャップ領域は、DNAヌクレオチドに加えて、効率的なRNase H作用にとって許容されることが知られている修飾ヌクレオチド、例えばC4'置換ヌクレオチド、非環状ヌクレオチド、およびアラビノ型ヌクレオチドを含有し得る。いくつかの態様において、ギャップ領域は1以上の未修飾のヌクレオシド間を含む。いくつかの態様において、一方または両方のフランキング領域は、各々独立して、1以上のホスホロチオアートヌクレオシド間連結(例として、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結または他の連結)を少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、またはより多くのヌクレオチド間に含む。いくつかの態様において、ギャップ領域および2つのフランキング領域は、各々が独立して、修飾されたヌクレオシド間連結(例として、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結または他の連結)を少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、またはより多くのヌクレオチド間に含む。
gapmerは適切な方法を使用して生じ得る。gapmerの調製を教示する代表的な米国特許、米国特許公開、およびPCT公開は、米国特許第5,013,830号;第5,149,797号;第5,220,007号;第5,256,775号;第5,366,878号;第5,403,711号;第5,491,133号;第5,565,350号;第5,623,065号;第5,652,355号;第5,652,356号;第5,700,922号;第5,898,031号;第7,015,315号;第7,101,993号;第7,399,845号;第7,432,250号;第7,569,686号;第7,683,036号;第7,750,131号;第8,580,756号;第9,045,754号;第9,428,534号;第9,695,418号;第10,017,764号;第10,260,069号;第9,428,534号;第8,580,756号;米国特許公開第US20050074801号、第US20090221685号;第US20090286969号、第US20100197762号、および第US20110112170号;PCT公開第WO2004069991号;第WO2005023825号;第WO2008049085号および第WO2009090182号;ならびに欧州特許第EP2,149,605号を包含するが、これらに限定されない。これら各々はその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、gapmerは長さが10～40ヌクレオシドである。例えば、gapmerは長さが10～40、10～35、10～30、10～25、10～20、10～15、15～40、15～35、15～30、15～25、15～20、20～40、20～35、20～30、20～25、25～40、25～35、25～30、30～40、30～35、または35～40ヌクレオシドであり得る。いくつかの態様において、gapmerは長さが10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、または40ヌクレオシドである。
いくつかの態様において、gapmer上のギャップ領域Yは長さが5～20ヌクレオシドである。例えば、ギャップ領域Yは長さが5～20、5～15、5～10、10～20、10～15、または15～20ヌクレオシドであり得る。いくつかの態様において、ギャップ領域Yは長さが5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオシドである。いくつかの態様において、ギャップ領域Yの各ヌクレオシドは2'-デオキシリボヌクレオシドである。いくつかの態様において、ギャップ領域Yのすべてのヌクレオシドが2'デオキシリボヌクレオシドである。いくつかの態様において、ギャップ領域Yのヌクレオシドの1つ以上は修飾ヌクレオシドである(例として、本明細書に記載のものなどの2'修飾ヌクレオシド)。いくつかの態様において、ギャップ領域Yの1以上のシトシンは任意に5-メチルシトシンである。いくつかの態様において、ギャップ領域Yの各シトシンは5-メチルシトシンである。
いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)およびgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)は、独立して1～20ヌクレオシドの長さである。例えば、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)およびgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)は、独立して1～20、1～15、1～10、1～7、1～5、1～3、1～2、2～5、2～7、3～5、3～7、5～20、5～15、5～10、10～20、10～15、または15～20ヌクレオシドの長さであり得る。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)およびgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)は、独立して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオシドの長さである。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)およびgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)は同じ長さである。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)およびgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)は異なる長さである。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)はgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)よりも長い。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)はgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)よりも短い。
いくつかの態様において、gapmerは、5-10-5、4-12-4、3-14-3、2-16-2、1-18-1、3-10-3、2-10-2、1-10-1、2-8-2、4-6-4、3-6-3、2-6-2、4-7-4、3-7-3、2-7-2、4-8-4、3-8-3、2-8-2、1-8-1、2-9-2、1-9-1、2-10-2、1-10-1、1-12-1、1-16-1、2-15-1、1-15-2、1-14-3、3-14-1、2-14-2、1-13-4、4-13-1、2-13-3、3-13-2、1-12-5、5-12-1、2-12-4、4-12-2、3-12-3、1-11-6、6-11-1、2-11-5、5-11-2、3-11-4、4-11-3、1-17-1、2-16-1、1-16-2、1-15-3、3-15-1、2-15-2、1-14-4、4-14-1、2-14-3、3-14-2、1-13-5、5-13-1、2-13-4、4-13-2、3-13-3、1-12-6、6-12-1、2-12-5、5-12-2、3-12-4、4-12-3、1-11-7、7-11-1、2-11-6、6-11-2、3-11-5、5-11-3、4-11-4、1-18-1、1-17-2、2-17-1、1-16-3、1-16-3、2-16-2、1-15-4、4-15-1、2-15-3、3-15-2、1-14-5、5-14-1、2-14-4、4-14-2、3-14-3、1-13-6、6-13-1、2-13-5、5-13-2、3-13-4、4-13-3、1-12-7、7-12-1、2-12-6、6-12-2、3-12-5、5-12-3、1-11-8、8-11-1、2-11-7、7-11-2、3-11-6、6-11-3、4-11-5、5-11-4、1-18-1、1-17-2、2-17-1、1-16-3、3-16-1、2-16-2、1-15-4、4-15-1、2-15-3、3-15-2、1-14-5、2-14-4、4-14-2、3-14-3、1-13-6、6-13-1、2-13-5、5-13-2、3-13-4、4-13-3、1-12-7、7-12-1、2-12-6、6-12-2、3-12-5、5-12-3、1-11-8、8-11-1、2-11-7、7-11-2、3-11-6、6-11-3、4-11-5、5-11-4、1-19-1、1-18-2、2-18-1、1-17-3、3-17-1、2-17-2、1-16-4、4-16-1、2-16-3、3-16-2、1-15-5、2-15-4、4-15-2、3-15-3、1-14-6、6-14-1、2-14-5、5-14-2、3-14-4、4-14-3、1-13-7、7-13-1、2-13-6、6-13-2、3-13-5、5-13-3、4-13-4、1-12-8、8-12-1、2-12-7、7-12-2、3-12-6、6-12-3、4-12-5、5-12-4、2-11-8、8-11-2、3-11-7、7-11-3、4-11-6、6-11-4、5-11-5、1-20-1、1-19-2、2-19-1、1-18-3、3-18-1、2-18-2、1-17-4、4-17-1、2-17-3、3-17-2、1-16-5、2-16-4、4-16-2、3-16-3、1-15-6、6-15-1、2-15-5、5-15-2、3-15-4、4-15-3、1-14-7、7-14-1、2-14-6、6-14-2、3-14-5、5-14-3、4-14-4、1-13-8、8-13-1、2-13-7、7-13-2、3-13-6、6-13-3、4-13-5、5-13-4、2-12-8、8-12-2、3-12-7、7-12-3、4-12-6、6-12-4、5-12-5、3-11-8、8-11-3、4-11-7、7-11-4、5-11-6、6-11-5、1-21-1、1-20-2、2-20-1、1-20-3、3-19-1、2-19-2、1-18-4、4-18-1、2-18-3、3-18-2、1-17-5、2-17-4、4-17-2、3-17-3、1-16-6、6-16-1、2-16-5、5-16-2、3-16-4、4-16-3、1-15-7、7-15-1、2-15-6、6-15-2、3-15-5、5-15-3、4-15-4、1-14-8、8-14-1、2-14-7、7-14-2、3-14-6、6-14-3、4-14-5、5-14-4、2-13-8、8-13-2、3-13-7、7-13-3、4-13-6、6-13-4、5-13-5、1-12-10、10-12-1、2-12-9、9-12-2、3-12-8、8-12-3、4-12-7、7-12-4、5-12-6、6-12-5、4-11-8、8-11-4、5-11-7、7-11-5、6-11-6、1-22-1、1-21-2、2-21-1、1-21-3、3-20-1、2-20-2、1-19-4、4-19-1、2-19-3、3-19-2、1-18-5、2-18-4、4-18-2、3-18-3、1-17-6、6-17-1、2-17-5、5-17-2、3-17-4、4-17-3、1-16-7、7-16-1、2-16-6、6-16-2、3-16-5、5-16-3、4-16-4、1-15-8、8-15-1、2-15-7、7-15-2、3-15-6、6-15-3、4-15-5、5-15-4、2-14-8、8-14-2、3-14-7、7-14-3、4-14-6、6-14-4、5-14-5、3-13-8、8-13-3、4-13-7、7-13-4、5-13-6、6-13-5、4-12-8、8-12-4、5-12-7、7-12-5、6-12-6、5-11-8、8-11-5、6-11-7、または7-11-6の5'-X-Y-Z-3'を含む。数は、5'-X-Y-Z-3'gapmerのX、Y、およびZ領域のヌクレオシド数を指し示す。
いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)またはgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)の1以上のヌクレオシドは、修飾ヌクレオチドである(例として、高親和性修飾ヌクレオシド)。いくつかの態様において、修飾ヌクレオシド(例として、高親和性修飾ヌクレオシド)は2'修飾ヌクレオシドである。いくつかの態様において、2'修飾ヌクレオシドは2'-4'二環式ヌクレオシドまたは非二環式2'修飾ヌクレオシドである。いくつかの態様において、高親和性修飾ヌクレオシドは、2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNA、cEt、またはENA)または非二環式2'-修飾ヌクレオシド(例として、2'-フルオロ(2'-F)、2'-O-メチル(2'-O-Me)、2'-O-メトキシエチル(2'-MOE)、2'-O-アミノプロピル(2'-O-AP)、2'-O-ジメチルアミノエチル(2'-O-DMAOE)、2'-O-ジメチルアミノプロピル(2'-O-DMAP)、2'-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2'-O-DMAEOE)、または2'-O-N-メチルアセトアミド(2'-O-NMA))である。
いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)の1以上のヌクレオシドは高親和性修飾ヌクレオシドである。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)の各ヌクレオシドは高親和性修飾ヌクレオシドである。いくつかの態様において、gapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)の1以上のヌクレオシドは高親和性修飾ヌクレオシドである。いくつかの態様において、gapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)の各ヌクレオシドは高親和性修飾ヌクレオシドである。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)の1以上のヌクレオシドは高親和性修飾ヌクレオシドであり、gapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)の1以上のヌクレオシドは高親和性修飾ヌクレオシドである。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)の各ヌクレオシドは高親和性修飾ヌクレオシドであり、gapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)の各ヌクレオシドは高親和性修飾ヌクレオシドである。
いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)は、gapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)と同じ高親和性ヌクレオシドを含む。例えば、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)およびgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)は、1以上の非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)を含み得る。別の例では、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)およびgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)は、1以上の2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)を含み得る。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)およびgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)の各ヌクレオシドは、非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)である。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)およびgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)の各ヌクレオシドは、2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)である。
いくつかの態様において、gapmerは5'-X-Y-Z-3'構成を含み、XおよびZは独立して長さが1～7(例として、1、2、3、4、5、6、または7)ヌクレオシドであり、Yは長さが6～10(例として、6、7、8、9、または10)ヌクレオシドであり、XおよびZの各ヌクレオシドは非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)であり、Yの各ヌクレオシドは2'デオキシリボヌクレオシドである。いくつかの態様において、gapmerは5'-X-Y-Z-3'構成を含み、XおよびZは独立して長さが1～7(例として、1、2、3、4、5、6、または7)ヌクレオシドであり、Yは長さが6～10(例として、6、7、8、9、または10)ヌクレオシドであり、XおよびZの各ヌクレオシドは2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)であり、Yの各ヌクレオシドは2'デオキシリボヌクレオシドである。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)は、gapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)とは異なる高親和性ヌクレオシドを含む。例えば、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)は、1以上の非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)を含み得、gapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)は、1以上の2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)を含み得る。別の例では、gapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)は、1以上の非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)を含み得、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)は、1以上の2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)を含み得る。
いくつかの態様において、gapmerは5'-X-Y-Z-3'構成を含み、XおよびZは独立して長さが1～7(例として、1、2、3、4、5、6、または7)ヌクレオシドであり、Yは長さが6～10(例として、6、7、8、9、または10)ヌクレオシドであり、Xの各ヌクレオシドは非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)であり、Zの各ヌクレオシドは2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)であり、Yの各ヌクレオシドは2'-デオキシリボヌクレオシドである。いくつかの態様において、gapmerは5'-X-Y-Z-3'構成を含み、XおよびZは独立して長さが1～7(例として、1、2、3、4、5、6、または7)ヌクレオシドであり、Yは長さが6～10(例として、6、7、8、9、または10)ヌクレオシドであり、Xの各ヌクレオシドは2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)であり、Zの各ヌクレオシドは非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'MOEまたは2'-O-Me)であり、Yの各ヌクレオシドは2'-デオキシリボヌクレオシドである。
いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)は、1以上の非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)および1以上の2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)を含む。いくつかの態様において、gapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)は、1以上の非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)および1以上の2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)を含む。いくつかの態様において、gapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)およびgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)両方は、1以上の非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)および1以上の2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)を含む。
いくつかの態様において、gapmerは5'-X-Y-Z-3'構成を含み、XおよびZは独立して長さが2～7(例として、2、3、4、5、6、または7)ヌクレオシドであり、Yは長さが6～10(例として、6、7、8、9、または10)ヌクレオシドであり、X(最も5'の位置は位置1である)の位置1、2、3、4、5、6、または7のすべてではないが少なくとも1つ(例として、1、2、3、4、5、または6)は非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)であり、XおよびZ両方のヌクレオシドの残りは2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)であり、Yの各ヌクレオシドは2'デオキシリボヌクレオシドである。いくつかの態様において、gapmerは5'-X-Y-Z-3'構成を含み、XおよびZは独立して長さが2～7(例として、2、3、4、5、6、または7)ヌクレオシドであり、Yは長さが6～10(例として、6、7、8、9、または10)ヌクレオシドであり、Z(最も5'の位置は位置1である)の位置1、2、3、4、5、6、または7のすべてではないが少なくとも1つ(例として、1、2、3、4、5、または6)は、非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)であり、XおよびZ両方のヌクレオシドの残りは2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)であり、Yの各ヌクレオシドは2'デオキシリボヌクレオシドである。いくつかの態様において、gapmerは5'-X-Y-Z-3'構成を含み、XおよびZは独立して長さが2～7(例として、2、3、4、5、6、または7)ヌクレオシドであり、Yは長さが6～10(例として、6、7、8、9、または10)ヌクレオシドであり、Xの位置1、2、3、4、5、6、または7のすべてではないが少なくとも1つ(例として、1、2、3、4、5、または6)およびZ(最も5'の位置は位置1である)のすべてではないが位置(例として、1、2、3、4、5、または6)1、2、3、4、5、6、または7の少なくとも1つが、非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)であり、XおよびZ両方のヌクレオシドの残りは2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)であり、Yの各ヌクレオシドは2'デオキシリボヌクレオシドである。
非二環式2'修飾ヌクレオシド(例として、2'-MOEまたは2'-O-Me)および2'-4'二環式ヌクレオシド(例として、LNAまたはcEt)のミックスをgapmerの5'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のX)および/またはgapmerの3'ウイング領域(5'-X-Y-Z-3'式のZ)に有するgapmer構成の非限定例は、以下:BBB-(D)n-BBBAA;KKK-(D)n-KKKAA;LLL-(D)n-LLLAA;BBB-(D)n-BBBEE;KKK-(D)n-KKKEE;LLL-(D)n-LLLEE;BBB-(D)n-BBBAA;KKK-(D)n-KKKAA;LLL-(D)n-LLLAA;BBB-(D)n-BBBEE;KKK-(D)n-KKKEE;LLL-(D)n-LLLEE;BBB-(D)n-BBBAAA;KKK-(D)n-KKKAAA;LLL-(D)n-LLLAAA;BBB-(D)n-BBBEEE;KKK-(D)n-KKKEEE;LLL-(D)n-LLLEEE;BBB-(D)n-BBBAAA;KKK-(D)n-KKKAAA;LLL-(D)n-LLLAAA;BBB-(D)n-BBBEEE;KKK-(D)n-KKKEEE;LLL-(D)n-LLLEEE;BABA-(D)n-ABAB;KAKA-(D)n-AKAK;LALA-(D)n-ALAL;BEBE-(D)n-EBEB;KEKE-(D)n-EKEK;LELE-(D)n-ELEL;BABA-(D)n-ABAB;KAKA-(D)n-AKAK;LALA-(D)n-ALAL;BEBE-(D)n-EBEB;KEKE-(D)n-EKEK;LELE-(D)n-ELEL;ABAB-(D)n-ABAB;AKAK-(D)n-AKAK;ALAL-(D)n-ALAL;EBEB-(D)n-EBEB;EKEK-(D)n-EKEK;ELEL-(D)n-ELEL;ABAB-(D)n-ABAB;AKAK-(D)n-AKAK;ALAL-(D)n-ALAL;EBEB-(D)n-EBEB;EKEK-(D)n-EKEK;ELEL-(D)n-ELEL;AABB-(D)n-BBAA;BBAA-(D)n-AABB;AAKK-(D)n-KKAA;AALL-(D)n-LLAA;EEBB-(D)n-BBEE;EEKK-(D)n-KKEE;EELL-(D)n-LLEE;AABB-(D)n-BBAA;AAKK-(D)n-KKAA;AALL-(D)n-LLAA;EEBB-(D)n-BBEE;EEKK-(D)n-KKEE;EELL-(D)n-LLEE;BBB-(D)n-BBA;KKK-(D)n-KKA;LLL-(D)n-LLA;BBB-(D)n-BBE;KKK-(D)n-KKE;LLL-(D)n-LLE;BBB-(D)n-BBA;KKK-(D)n-KKA;LLL-(D)n-LLA;BBB-(D)n-BBE;KKK-(D)n-KKE;LLL-(D)n-LLE;BBB-(D)n-BBA;KKK-(D)n-KKA;LLL-(D)n-LLA;BBB-(D)n-BBE;KKK-(D)n-KKE;LLL-(D)n-LLE;ABBB-(D)n-BBBA;AKKK-(D)n-KKKA;ALLL-(D)n-LLLA;EBBB-(D)n-BBBE;EKKK-(D)n-KKKE;ELLL-(D)n-LLLE;ABBB-(D)n-BBBA;AKKK-(D)n-KKKA;ALLL-(D)n-LLLA;EBBB-(D)n-BBBE;EKKK-(D)n-KKKE;ELLL-(D)n-LLLE;ABBB-(D)n-BBBAA;AKKK-(D)n-KKKAA;ALLL-(D)n-LLLAA;EBBB-(D)n-BBBEE;EKKK-(D)n-KKKEE;ELLL-(D)n-LLLEE;ABBB-(D)n-BBBAA;AKKK-(D)n-KKKAA;ALLL-(D)n-LLLAA;EBBB-(D)n-BBBEE;EKKK-(D)n-KKKEE;ELLL-(D)n-LLLEE;AABBB-(D)n-BBB;AAKKK-(D)n-KKK;AALLL-(D)n-LLL;EEBBB-(D)n-BBB;EEKKK-(D)n-KKK;EELLL-(D)n-LLL;AABBB-(D)n-BBB;AAKKK-(D)n-KKK;AALLL-(D)n-LLL;EEBBB-(D)n-BBB;EEKKK-(D)n-KKK;EELLL-(D)n-LLL;AABBB-(D)n-BBBA;AAKKK-(D)n-KKKA;AALLL-(D)n-LLLA;EEBBB-(D)n-BBBE;EEKKK-(D)n-KKKE;EELLL-(D)n-LLLE;AABBB-(D)n-BBBA;AAKKK-(D)n-KKKA;AALLL-(D)n-LLLA;EEBBB-(D)n-BBBE;EEKKK-(D)n-KKKE;EELLL-(D)n-LLLE;ABBAABB-(D)n-BB;AKKAAKK-(D)n-KK;ALLAALLL-(D)n-LL;EBBEEBB-(D)n-BB;EKKEEKK-(D)n-KK;ELLEELL-(D)n-LL;ABBAABB-(D)n-BB;AKKAAKK-(D)n-KK;ALLAALL-(D)n-LL;EBBEEBB-(D)n-BB;EKKEEKK-(D)n-KK;ELLEELL-(D)n-LL;ABBABB-(D)n-BBB;AKKAKK-(D)n-KKK;ALLALLL-(D)n-LLL;EBBEBB-(D)n-BBB;EKKEKK-(D)n-KKK;ELLELL-(D)n-LLL;ABBABB-(D)n-BBB;AKKAKK-(D)n-KKK;ALLALL-(D)n-LLL;EBBEBB-(D)n-BBB;EKKEKK-(D)n-KKK;ELLELL-(D)n-LLL;EEEK-(D)n-EEEEEEEE;EEK-(D)n-EEEEEEEEE;EK-(D)n-EEEEEEEEEE;EK-(D)n-EEEKK;K-(D)n-EEEKEKE;K-(D)n-EEEKEKEE;K-(D)n-EEKEK;EK-(D)n-EEEEKEKE;EK-(D)n-EEEKEK;EEK-(D)n-KEEKE;EK-(D)n-EEKEK;EK-(D)n-KEEK;EEK-(D)n-EEEKEK;EK-(D)n-KEEEKEE;EK-(D)n-EEKEKE;EK-(D)n-EEEKEKE;およびEK-(D)n-EEEEKEKを包含する;「A」ヌクレオシドは2'修飾ヌクレオシドを含み;「B」は2'-4'二環式ヌクレオシドを表し;「K」は拘束エチルヌクレオシド(cEt)を表し;「L」はLNAヌクレオシドを表し;「E」は2'-MOE修飾リボヌクレオシドを表し;「D」は2'デオキシリボヌクレオシドを表し;「n」はギャップセグメント(5'-X-Y-Z-3'構成のY)の長さを表し、1～20の間の整数である。
いくつかの態様において、本明細書に記載のgapmerのいずれか1つは、1以上の修飾されたヌクレオシド連結(例として、ホスホロチオアート連結)をX、Y、およびZ領域の各々に含む。いくつかの態様において、本明細書に記載のgapmerのいずれか1つにおける各ヌクレオシド間連結はホスホロチオアート連結である。いくつかの態様において、X、Y、およびZ領域の各々は、独立して、ホスホロチオアート連結およびホスホジエステル連結のミックスを含む。いくつかの態様において、ギャップ領域Yの各ヌクレオシド間連結はホスホロチオアート連結であり、5'ウイング領域Xはホスホロチオアート連結およびホスホジエステル連結のミックスを含み、3'ウイング領域Zはホスホロチオアート連結およびホスホジエステル連結のミックスを含む。
i.Mixmers
いくつかの態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、mixmerであってもよく、またはmixmer配列パターンを含んでいてもよい。一般に、mixmerは、天然に存在するヌクレオシドと天然に存在しないヌクレオシドとの両方を含むオリゴヌクレオチドであるか、または2つの異なるタイプの天然に存在しないヌクレオシドを、典型的には互い違いなパターンで含むオリゴヌクレオチドである。Mixmerは一般に、非修飾オリゴヌクレオチドより高い結合親和性を有し、標的分子に特異的に結合する、例として、標的分子上の結合部位を遮断するために使用されてもよい。一般に、mixmerは、RNaseを標的分子へ動員させず、よって標的分子の切断を促進しない。RNase Hを動員することが可能ではない、かかるオリゴヌクレオチドは記載されており、例えば、WO2007/112754またはWO2007/112753を見よ。
いくつかの態様において、mixmerは、ヌクレオシド類似体と天然に存在するヌクレオシドとの反復パターン、もしくは1タイプのヌクレオシド類似体ともう1タイプのヌクレオシド類似体との反復パターンを含むか、またはこれらからなる。しかしながら、mixmerは、反復パターンを含む必要がなく、その代わりに、修飾ヌクレオシドと天然に存在するヌクレオシドとのいずれの配置も、または1タイプの修飾ヌクレオシドともう1タイプの修飾ヌクレオシドとのいずれの配置も含むことができる。反復パターンは、実例として、2ヌクレオシド毎または3ヌクレオシド毎に、LNAなどの修飾ヌクレオシドであってもよく、残りのヌクレオシドは、DNAなどの天然に存在するヌクレオシドであるか、あるいは2'MOEもしくは2'フルオロ類似体などの2'置換ヌクレオシド類似体、または本明細書に記載のいずれの他の修飾ヌクレオシドである。LNA単位などの修飾ヌクレオシドの反復パターンが、固定された位置にて-例として5'末端または3'末端にて、修飾ヌクレオシドと組み合わされてもよいことは認識されている。
いくつかの態様において、mixmerは、5個より多く、4個より多く、3個より多く、または2個より多く連続した、DNAヌクレオシドなどの天然に存在するヌクレオシドの領域を含まない。いくつかの態様において、mixmerは、少なくとも2個連続したLNAなどの、少なくとも2個連続した修飾ヌクレオシドからなる領域を少なくとも含む。いくつかの態様において、mixmerは、少なくとも3個連続したLNAなどの、少なくとも3個連続した修飾ヌクレオシドからなる領域を少なくとも含む。
いくつかの態様において、mixmerは、7個より多く、6個より多く、5個より多く、4個より多く、3個より多く、または2個より多く連続した、LNAなどのヌクレオシド類似体の領域を含まない。いくつかの態様において、LNA単位は、本明細書に言及されたヌクレオシド類似体などの他のヌクレオシド類似体に置き換えられていてもよい。
Mixmerは、非限定例におけるLNAヌクレオシドおよび2'-O-Me ヌクレオシドなどの親和性増強修飾ヌクレオシドの混合物を含むよう設計されていてもよい。いくつかの態様において、mixmerは、修飾ヌクレオシド間連結(例として、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結または他の連結)を、少なくとも2個の、少なくとも3個の、少なくとも4個の、少なくとも5個の、またはこれより多くのヌクレオシド間に含む。
mixmerは、いずれの好適な方法を使用しても産生されてよい。mixmerの調製を教示する代表的な米国特許、米国特許公開、およびPCT公開は、米国特許公開第US20060128646号、US20090209748号、US20090298916号、US20110077288号、およびUS20120322851号、および米国特許第7687617号を包含する。
いくつかの態様において、mixmerは、1以上のモルホリノヌクレオシドを含む。例えば、いくつかの態様において、mixmerは、1以上の他のヌクレオシド(例として、DNA、RNAヌクレオシド)または修飾ヌクレオシド(例として、LNA、2'-O-Me ヌクレオシド)と(例として、互い違いなやり方で)混合されたモルホリノヌクレオシドを含んでいてもよい。
いくつかの態様において、mixmerは、例えば、Touznik A.,et al.,LNA/DNA mixmer-based antisense oligonucleotides correct alternative splicing of the SMN2 gene and restore SMN protein expression in type 1 SMA fibroblasts Scientific Reports,volume 7,Article number:3672(2017),Chen S.et al.,Synthesis of a Morpholino Nucleic Acid(MNA)-Uridine Phosphoramidite,and Exon Skipping Using MNA/2'-O-Methyl Mixmer Antisense Oligonucleotide,Molecules 2016,21,1582(これら各々の内容は参照により本明細書に組み込まれる)に報告されるとおり、スプライス修正(splice correcting)またはエキソンスキッピングに有用である。
j.RNA干渉(RNAi)
いくつかの態様において、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドは、低分子干渉RNAまたはサイレンシングRNAとしても知られている、低分子干渉RNA(siRNA)の形態であってもよい。siRNAは、二本鎖RNA分子の類であって、細胞中のRNA干渉(RNAi)経路を介した分解のために核酸(例として、mRNA)を標的にする、典型的には長さが約20～25塩基対である。siRNA分子の特異性は、アンチセンス鎖分子のその標的RNAへの結合によって決定されてもよい。有効なsiRNA分子は一般に、より長いsiRNAもまた有効であり得るが、細胞中の非特異的なRNA干渉経路の引き金を、インターフェロン応答を介して引くことを防止するため、長さが30～35個未満の塩基対である。いくつかの態様において、siRNA分子は長さが7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50塩基対、またはより多くである。いくつかの態様において、siRNA分子は長さが8～30塩基対、長さが10～15塩基対、長さが10～20塩基対、長さが15～25塩基対、長さが19～21塩基対、長さが21～23塩基対である。
適切な標的RNA配列の選択を受けて、すべてのまたは一部の標的配列に相補的なヌクレオチド配列、すなわちアンチセンス配列を含むsiRNA分子は、適切な方法(例として、PCT公開番号WO2004/016735;および米国特許公開第2004/0077574号および第2008/0081791号を見よ)を使用して設計および調製され得る。siRNA分子は、二本鎖(すなわち、アンチセンス鎖と、ハイブリダイズしてdsRNAを形成する相補的センス鎖とを含むdsRNA分子)または一本鎖(すなわち、アンチセンス鎖だけを含むssRNA分子)であり得る。siRNA分子は、自己相補的センスおよびアンチセンス鎖を有する、二重鎖、非対称二重鎖、ヘアピン、または非対称ヘアピン2次構造を含み得る。
いくつかの態様において、siRNA分子のアンチセンス鎖は長さが7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50ヌクレオチド、またはより多くである。いくつかの態様において、アンチセンス鎖は長さが8～50ヌクレオチド、長さが8～40ヌクレオチド、長さが8～30ヌクレオチド、長さが10～15ヌクレオチド、長さが10～20ヌクレオチド、長さが15～25ヌクレオチド、長さが19～21ヌクレオチド、長さが21～23ヌクレオチドである。
いくつかの態様において、siRNA分子のセンス鎖は長さが7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50ヌクレオチド、またはより多くである。いくつかの態様において、センス鎖は長さが8～50ヌクレオチド、長さが8～40ヌクレオチド、長さが8～30ヌクレオチド、長さが10～15ヌクレオチド、長さが10～20ヌクレオチド、長さが15～25ヌクレオチド、長さが19～21ヌクレオチド、長さが21～23ヌクレオチドである。
いくつかの態様において、siRNA分子は、標的mRNA上の標的領域に対する相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの態様において、相補性の領域は、標的mRNA上の標的領域に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または100％相補的である。いくつかの態様において、標的領域は、標的mRNA上の一続きのヌクレオチドの領域である。いくつかの態様において、標的RNA配列について特異的にハイブリダイゼーション可能または特異的であるためには、相補的なヌクレオチド配列は、その標的のものに対して100％相補的である必要はない。
いくつかの態様において、siRNA分子は標的RNA配列に対する相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含み、相補性の領域は長さが8～15、8～30、8～40、または10～50、または5～50、または5～40ヌクレオチドの範囲である。いくつかの態様において、相補性の領域は長さが5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50ヌクレオチドである。いくつかの態様において、相補性の領域は、標的RNA配列の少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、またはより多くの一続きのヌクレオチドと相補的である。いくつかの態様において、siRNA分子は、標的RNA配列の一続きのヌクレオチドの部分と比較して1、2、3、4、またはわずか5塩基ミスマッチを含有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、siRNA分子は、15塩基につき最大3つまでのミスマッチ、または10塩基につき最大2つまでのミスマッチを有するヌクレオチド配列を含む。
いくつかの態様において、siRNA分子は、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドの標的RNA配列に対して相補的である(例として、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または100％)ヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの態様において、siRNA分子は、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドと少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または100％同一であるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの態様において、siRNA分子は、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドの少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、またはより多くの一続きのヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含む。
二本鎖siRNAは、同じ長さまたは異なる長さのセンスRNA鎖およびアンチセンスRNA鎖を含んでいてもよい。二本鎖siRNA分子はまた、ステムループ構造の単一オリゴヌクレオチド(ここでsiRNA分子の自己相補的センスおよびアンチセンス領域は、核酸ベースのまたは非核酸ベースのリンカー(単数または複数)を用いて連結されている)、ならびに2以上のループ構造と自己相補的センスおよびアンチセンス鎖を含むステムとを有する環状一本鎖RNA(ここで環状RNAは、in vivoまたはin vitroのいずれかで処理されてRNAiを媒介することが可能な活性siRNA分子を生成し得る)からも会合され得る。よって小さいヘアピンRNA(shRNA)分子もまた、本明細書に企図される。これらの分子は、逆相補的(センス)配列に加えて、特定のアンチセンス配列を含み、典型的にはスペーサーまたはループ配列によって分離されている。スペーサーまたはループの切断は、(任意に、片鎖または両鎖の3'末端および/または(例として、および)5'末端から1、2、3個以上のヌクレオチドの付加または除去をもたらすこともある追加のプロセシングステップにより)一本鎖RNA分子およびその逆相補体を、それらがアニールしてdsRNA分子を形成し得るように提供する。スペーサーは、スペーサーの切断(および任意に、これに続く、片鎖または両鎖の3'末端および/または(例として、および)5'末端から1、2、3、4、もしくはこれより多いヌクレオチドの付加または除去をもたらすこともあるプロセシングステップ)に先立ちアンチセンス配列とセンス配列とをアニールさせて二本鎖構造体(またはステム)を形成させるのに充分な長さであり得る。スペーサー配列は、2つの相補的ヌクレオチド配列領域間に置かれた無関係なヌクレオチド配列であってもよく、前記領域はアニールして二本鎖核酸になったらshRNAを含むことになる。
siRNA分子の全体的な長さは、設計されたsiRNA分子のタイプに応じて、約14ヌクレオチドから約100ヌクレオチドまで変動し得る。一般に、これらのヌクレオチドの約14個と約50個との間は、RNA標的配列に相補的である、すなわちsiRNA分子の特定のアンチセンス配列を構成する。例えば、siRNAが二本鎖siRNAまたは一本鎖siRNAであるとき、長さは約14ヌクレオチドから約50ヌクレオチドまで変動し得るが一方、siRNAがshRNAまたは環状分子であるとき、長さは約40ヌクレオチドから約100ヌクレオチドまで変動し得る。
siRNA分子は、分子の一方の末端にて3'突出を含んでいてもよく、他方の末端は平滑末端であっても、または突出(5'または3')も有していてよい。siRNA分子が分子の両末端にて突出を含むとき、突出の長さは、同じであっても、または異なっていてもよい。一態様において、本開示のsiRNA分子は、分子の両末端上に約1～約3ヌクレオチドの3'突出を含む。いくつかの態様において、siRNA分子は約1～約3ヌクレオチドの3'突出をセンス鎖に含む。いくつかの態様において、siRNA分子は約1～約3ヌクレオチドの3'突出をアンチセンス鎖に含む。いくつかの態様において、siRNA分子は約1～約3ヌクレオチドの3'突出をセンス鎖およびアンチセンス鎖両方に含む。
いくつかの態様において、siRNA分子は1以上の修飾ヌクレオチド(例として、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはより多く)を含む。いくつかの態様において、siRNA分子は1以上の修飾ヌクレオチドおよび/または(例として、および)1以上の修飾されたヌクレオチド間連結を含む。いくつかの態様において、修飾ヌクレオチドは、修飾された糖部分(例として、2'修飾ヌクレオチド)である。いくつかの態様において、siRNA分子は、1以上の2'修飾ヌクレオチド、例えば2'-デオキシ、2'-フルオロ(2'-F)、2'-O-メチル(2'-O-Me)、2'-O-メトキシエチル(2'-MOE)、2'-O-アミノプロピル(2'-O-AP)、2'-O-ジメチルアミノエチル(2'-O-DMAOE)、2'-O-ジメチルアミノプロピル(2'-O-DMAP)、2'-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2'-O-DMAEOE)、または2'-O-N-メチルアセトアミド(2'-O--NMA)を含む。いくつかの態様において、siRNA分子の各ヌクレオチドは修飾ヌクレオチド(例として、2'修飾ヌクレオチド)である。いくつかの態様において、siRNA分子は1以上のホスホロジアミダートモルフォリノを含む。いくつかの態様において、siRNA分子の各ヌクレオチドはホスホロジアミダートモルフォリノである。
いくつかの態様において、siRNA分子はホスホロチオアートまたは他の修飾されたヌクレオチド間連結を含有する。いくつかの態様において、siRNA分子はホスホロチオアートヌクレオシド間連結を含む。いくつかの態様において、siRNA分子はホスホロチオアートヌクレオシド間連結を少なくとも2つのヌクレオチド間に含む。いくつかの態様において、siRNA分子はホスホロチオアートヌクレオシド間連結をすべてのヌクレオチド間に含む。例えば、いくつかの態様において、siRNA分子は、修飾されたヌクレオチド間連結をsiRNA分子の5'または3'端の第1の、第2の、および/または(例として、および)第3のヌクレオシド間連結に含む。
いくつかの態様において、修飾されたヌクレオチド間連結はリン含有連結である。いくつかの態様において、使用され得るリン含有連結は、正常な3'-5'連結を有するホスホロチオアート、キラルホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、3'アルキレンホスホナートおよびキラルホスホナートを含むメチルおよび他のアルキルホスホナート、ホスフィナート、3'-アミノホスホロアミダートおよびアミノアルキルホスホロアミダートを含むホスホロアミダート、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびボラノホスファート、これらの2'-5'連結アナログ、ならびにヌクレオシド単位の隣接するペアが3'-5'対5'-3'または2'-5'対5'-2'で連結される逆向きの極性を有するものを包含するが、これらに限定されない;米国特許第3.687.808号;第4.469.863号;第4,476,301号;第5,023.243号;第5,177,196号;第5,188,897号;第5,264,423号;第5,276,019号;第5,278,302号;第5,286,717号;第5,321,131号;第5,399,676号;第5,405,939号;第5,453,496号;第5,455,233号;第5,466,677号;第5,476,925号;第5,519,126号;第5,536,821号;第5,541,306号;第5,550,111号;第5,563,253号;第5,571,799号;第5,587,361号;および第5,625,050号を見よ。
本明細書に記載のsiRNA分子の修飾されたケミストリーまたはフォーマットのいずれかは、互いと組み合わせられ得る。例えば、1、2、3、4、5、またはより多くの異なる型の修飾が同じsiRNA分子上に包含され得る。
いくつかの態様において、アンチセンス鎖は1以上の修飾ヌクレオチド(例として、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはより多く)を含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖は1以上の修飾ヌクレオチドおよび/または(例として、および)1以上の修飾されたヌクレオチド間連結を含む。いくつかの態様において、修飾ヌクレオチドは修飾された糖部分(例として、2'修飾ヌクレオチド)を含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、1以上の2'修飾ヌクレオチド、例えば2'-デオキシ、2'-フルオロ(2'-F)、2'-O-メチル(2'-O-Me)、2'-O-メトキシエチル(2'-MOE)、2'-O-アミノプロピル(2'-O-AP)、2'-O-ジメチルアミノエチル(2'-O-DMAOE)、2'-O-ジメチルアミノプロピル(2'-O-DMAP)、2'-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2'-O-DMAEOE)、または2'-O-N-メチルアセトアミド(2'-O--NMA)を含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖の各ヌクレオチドは修飾ヌクレオチド(例として、2'修飾ヌクレオチド)である。いくつかの態様において、アンチセンス鎖は1以上のホスホロジアミダートモルフォリノを含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖はホスホロジアミダートモルフォリノオリゴマー(PMO)である。
いくつかの態様において、アンチセンス鎖はホスホロチオアートまたは他の修飾されたヌクレオチド間連結を含有する。いくつかの態様において、アンチセンス鎖はホスホロチオアートヌクレオシド間連結を含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖はホスホロチオアートヌクレオシド間連結を少なくとも2つのヌクレオチド間に含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖はホスホロチオアートヌクレオシド間連結をすべてのヌクレオチド間に含む。例えば、いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、修飾されたヌクレオチド間連結をsiRNA分子の5'または3'端の第1の、第2の、および/または(例として、および)第3のヌクレオシド間連結に含む。いくつかの態様において、修飾されたヌクレオチド間連結はリン含有連結である。いくつかの態様において、使用され得るリン含有連結は、正常な3'-5'連結を有するホスホロチオアート、キラルホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、3'アルキレンホスホナートおよびキラルホスホナートを含むメチルおよび他のアルキルホスホナート、ホスフィナート、3'-アミノホスホロアミダートおよびアミノアルキルホスホロアミダートを含むホスホロアミダート、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびボラノホスファート、これらの2'-5'連結アナログ、ならびにヌクレオシド単位の隣接するペアが3'-5'対5'-3'または2'-5'対5'-2'で連結される逆向きの極性を有するものを包含するが、これらに限定されない;米国特許第3.687.808号;第4.469.863号;第4,476,301号;第5,023.243号;第5,177,196号;第5,188,897号;第5,264,423号;第5,276,019号;第5,278,302号;第5,286,717号;第5,321,131号;第5,399,676号;第5,405,939号;第5,453,496号;第5,455,233号;第5,466,677号;第5,476,925号;第5,519,126号;第5,536,821号;第5,541,306号;第5,550,111号;第5,563,253号;第5,571,799号;第5,587,361号;および第5,625,050号を見よ。
本明細書に記載のアンチセンス鎖の修飾されたケミストリーまたはフォーマットのいずれかは、互いと組み合わせられ得る。例えば、1、2、3、4、5、またはより多くの異なる型の修飾が同じアンチセンス鎖上に包含され得る。
いくつかの態様において、センス鎖は1以上の修飾ヌクレオチド(例として、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはより多く)を含む。いくつかの態様において、センス鎖は1以上の修飾ヌクレオチドおよび/または(例として、および)1以上の修飾されたヌクレオチド間連結を含む。いくつかの態様において、修飾ヌクレオチドは、修飾された糖部分(例として、2'修飾ヌクレオチド)である。いくつかの態様において、センス鎖は、1以上の2'修飾ヌクレオチド、例えば2'-デオキシ、2'-フルオロ(2'-F)、2'-O-メチル(2'-O-Me)、2'O-メトキシエチル(2'-MOE)、2'-O-アミノプロピル(2'-O-AP)、2'-O-ジメチルアミノエチル(2'-O-DMAOE)、2'-O-ジメチルアミノプロピル(2'-O-DMAP)、2'-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2'-O-DMAEOE)、または2'-O-N-メチルアセトアミド(2'-O--NMA)を含む。いくつかの態様において、センス鎖の各ヌクレオチドは修飾ヌクレオチド(例として、2'修飾ヌクレオチド)である。いくつかの態様において、センス鎖は1以上のホスホロジアミダートモルフォリノを含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖はホスホロジアミダートモルフォリノオリゴマー(PMO)である。いくつかの態様において、センス鎖はホスホロチオアートまたは他の修飾されたヌクレオチド間連結を含有する。いくつかの態様において、センス鎖はホスホロチオアートヌクレオシド間連結を含む。いくつかの態様において、センス鎖はホスホロチオアートヌクレオシド間連結を少なくとも2つのヌクレオチド間に含む。いくつかの態様において、センス鎖はホスホロチオアートヌクレオシド間連結をすべてのヌクレオチド間に含む。例えば、いくつかの態様において、センス鎖は、修飾されたヌクレオチド間連結をセンス鎖の5'または3'端の第1の、第2の、および/または(例として、および)第3のヌクレオシド間連結に含む。
いくつかの態様において、修飾されたヌクレオチド間連結はリン含有連結である。いくつかの態様において、使用され得るリン含有連結は、正常な3'-5'連結を有するホスホロチオアート、キラルホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、3'アルキレンホスホナートおよびキラルホスホナートを含むメチルおよび他のアルキルホスホナート、ホスフィナート、3'-アミノホスホロアミダートおよびアミノアルキルホスホロアミダートを含むホスホロアミダート、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびボラノホスファート、これらの2'-5'連結アナログ、ならびにヌクレオシド単位の隣接するペアが3'-5'対5'-3'または2'-5'対5'-2'で連結される逆向きの極性を有するものを包含するが、これらに限定されない;米国特許第3.687.808号;第4.469.863号;第4,476,301号;第5,023.243号;第5,177,196号;第5,188,897号;第5,264,423号;第5,276,019号;第5,278,302号;第5,286,717号;第5,321,131号;第5,399,676号;第5,405,939号;第5,453,496号;第5,455,233号;第5,466,677号;第5,476,925号;第5,519,126号;第5,536,821号;第5,541,306号;第5,550,111号;第5,563,253号;第5,571,799号;第5,587,361号;および第5,625,050号を見よ。
本明細書に記載のセンス鎖の修飾されたケミストリーまたはフォーマットのいずれかは、互いと組み合わせられ得る。例えば、1、2、3、4、5、またはより多くの異なる型の修飾が同じセンス鎖上に包含され得る。
いくつかの態様において、siRNA分子のアンチセンスまたはセンス鎖は、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)ローディングを増強または低減する修飾を含む。いくつかの態様において、siRNA分子のアンチセンス鎖はRISCローディングを増強する修飾を含む。いくつかの態様において、siRNA分子のセンス鎖は、RISCローディングを低減およびオフターゲット効果を低減する修飾を含む。いくつかの態様において、siRNA分子のアンチセンス鎖は2'-O-メトキシエチル(2'-MOE)修飾を含む。その全体が参照によって本明細書に組み込まれるSong et al.,(2017)Mol Ther Nucleic Acids 9:242-250に記載されているとおり、切断部位における2'-O-メトキシエチル(2'-MOE)基の追加は、修飾鎖の指向的なRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)ローディングを容易化することによって、siRNAの特異性およびサイレンシング活性両方を改善する。いくつかの態様において、siRNA分子のアンチセンス鎖は2'-OMe-ホスホロジチオアート修飾を含み、これは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるWu et al.(2014)Nat Commun 5:3459に記載されているとおり、RISCローディングを増大させる。
いくつかの態様において、siRNA分子のセンス鎖は5'モルホリノを含み、これは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるKumar et al.,(2019)Chem Commun(Camb)55(35):5139-5142に記載されているとおり、センス鎖のRISCローディングを低減ならびにアンチセンス鎖選択およびRNAi活性を改善する。いくつかの態様において、siRNA分子のセンス鎖は、合成RNA様高親和性ヌクレオチドアナログのロックド核酸(LNA)によって修飾される。これは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるElman et al.,(2005)Nucleic Acids Res.33(1):439-447に記載されているとおり、センス鎖のRISCローディングを低減し、RISCへのアンチセンス鎖組み込みをさらに増強する。いくつかの態様において、siRNA分子のセンス鎖は5'アンロックド核酸(UNA)修飾を含み、これは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるSnead et al.,(2013)Mol Ther Nucleic Acids 2(7):e103に記載されているとおり、センス鎖のRISCローディングを低減し、アンチセンス鎖のサイレンシング力価(potentcy)を改善する。いくつかの態様において、siRNA分子のセンス鎖は5-ニトロインドール修飾を含み、これは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるZhang et al.,(2012)Chembiochem 13(13):1940-1945に記載されているとおり、センス鎖のRNAi力価を減少させ(descresed)、オフターゲット効果を低減する。いくつかの態様において、センス鎖は2'-O'メチル(2'-O-Me)修飾を含み、これは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるZheng et al.,FASEB(2013)27(10):4017-4026に記載されているとおり、センス鎖のRISCローディングおよびオフターゲット効果を低減する。いくつかの態様において、siRNA分子のセンス鎖はモルホリノ、2'-MOE、または2'-O-Me残基によって完全に置換され、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるKole et al.,(2012)Nature reviews.Drug Discovery 11(2):125-140に記載されているとおり、RISCによって認識されない。いくつかの態様において、siRNA分子のアンチセンス鎖は2'-MOE修飾を含み、センス鎖は2'-O-Me修飾を含む(例として、Song et al.,(2017)Mol Ther Nucleic Acids 9:242-250を見よ)。いくつかの態様において、少なくとも1つの(例として、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも10)siRNA分子が、筋標的化剤に(例として、共有結合的に)連結される。いくつかの態様において、筋標的化剤は、核酸(例として、DNAまたはRNA)、ペプチド(例として、抗体)、脂質(例として、マイクロベシクル)、または糖部分(例として、多糖)を含み得るか、またはそれからなり得る。いくつかの態様において、筋標的化剤は抗体である。いくつかの態様において、筋標的化剤は抗トランスフェリン受容体抗体である(例として、本明細書に提供される抗TfR抗体のいずれか1つ)。いくつかの態様において、筋標的化剤はsiRNA分子のセンス鎖の5'末端に連結され得る。いくつかの態様において、筋標的化剤はsiRNA分子のセンス鎖の3'末端に連結され得る。いくつかの態様において、筋標的化剤はsiRNA分子のセンス鎖に内部で連結され得る。いくつかの態様において、筋標的化剤はsiRNA分子のアンチセンス鎖の5'末端に連結され得る。いくつかの態様において、筋標的化剤はsiRNA分子のアンチセンス鎖の3'末端に連結され得る。いくつかの態様において、筋標的化剤はsiRNA分子のアンチセンス鎖に内部で連結され得る。
k. マイクロRNA(miRNAs)
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、マイクロRNA(miRNA)であってもよい。マイクロRNA(「miRNA」と称される)は、標的RNA転写産物上の相補的な部位へ結合することによって遺伝子発現を制御する調節性分子の類に属する、小さい非コーディングRNAである。典型的には、miRNAは、巨大なRNA前駆体(pri-miRNAと呼ばれる)から生成されるが、前記前駆体は核中で処理されておよそ70ヌクレオチドpre-miRNAになり、これが折り畳まれて不完全なステムループ構造体になる。これらのpre-miRNAは、典型的には、細胞質内で追加のプロセシングステップを経るが、前記細胞質内の長さが18～25ヌクレオチドの成熟miRNAは、RNase III酵素であるDicerによってpre-miRNAヘアピンの片側から切除される。
本明細書に使用されるとき、miRNAは、pri-miRNA、pre-miRNA、成熟miRNA、または成熟miRNAの生物活性を保持するそのバリアントのフラグメントを包含する。一態様において、miRNAのサイズ範囲は、21ヌクレオチドから170ヌクレオチドまでであり得る。一態様において、miRNAのサイズ範囲は、長さが70ヌクレオチドから170ヌクレオチドまでである。別の態様において、長さが21ヌクレオチドから25ヌクレオチドまでの成熟miRNAが使用され得る。
l. アプタマー
いくつかの態様において、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドは、アプタマーの形態であってもよい。一般に、分子ペイロードの文脈において、アプタマーは、細胞中の小分子、タンパク質、核酸などの標的へ特異的に結合するいずれの核酸でもある。いくつかの態様において、アプタマーは、DNAアプタマーまたはRNAアプタマーである。いくつかの態様において、核酸アプタマーは、一本鎖のDNAまたはRNA(ssDNAまたはssRNA)である。一本鎖核酸アプタマーが、ヘリックスおよび/または(例として、および)ループ構造を形成してもよいことは理解されるべきである。核酸アプタマーを形成する核酸は、天然に存在するヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、炭化水素リンカー(例として、アルキレン)もしくはポリエーテルリンカー(例として、PEGリンカー)が1以上のヌクレオチド間に挿入された天然に存在するヌクレオチド、炭化水素もしくはPEGリンカーが1以上のヌクレオチド間に挿入された修飾ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含んでいてもよい。アプタマーおよびアプタマーを産生する方法を記載する例示の刊行物および特許は、例として、Lorsch and Szostak,1996;Jayasena,1999;米国特許第5,270,163号;第5,567,588号;第5,650,275号;第5,670,637号;第5,683,867号;第5,696,249号;第5,789,157号;第5,843,653号;第5,864,026号;第5,989,823号;第6,569,630号;第8,318,438号およびPCT出願WO 99/31275を包含するが、これら各々は参照により本明細書に組み込まれる。
m.リボザイム
いくつかの態様において、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドは、リボザイムの形態であってもよい。リボザイム(リボ核酸酵素)は、タンパク質酵素の作用と同様の特定の生化学的反応を実施することが可能な分子、典型的にはRNA分子である。リボザイムは、これらがハイブリダイズしているRNA分子(mRNA、RNA含有基質、lncRNA、およびリボザイム自体など)中の特定のホスホジエステル連結での切断能を包含する酵素活性をもつ分子である。
リボザイムは、数種の物理的構造の1つを取り得、これらの1つが「ハンマーヘッド」と呼ばれる。ハンマーヘッド型リボザイムは、保存された9塩基を含有する触媒コア、二本鎖ステムおよびループ構造(ステムループII)、ならびに触媒コアを囲む標的RNAフランキング領域に相補的な2つの領域から構成される。フランキング領域によって、リボザイムは、二本鎖ステムIおよびIIIを形成することによって標的RNAへ特異的に結合することができる。切断は、3',5'-リン酸ジエステルから2',3'-環状リン酸ジエステルへのエステル交換反応による特定のリボヌクレオチド三塩基(triplet)の次に、cis(すなわち、ハンマーヘッドモチーフを含有する同じRNA分子の切断)で、またはtrans(リボザイムを含有するもの以外のRNA基質の切断)で生じる。理論によって拘束されることは望まないが、この触媒活性は、リボザイムの触媒領域中に高度に保存された特定の配列が存在することを要すると考えられている。
リボザイム構造中の修飾はまた、様々な分子の非コア部分の、非ヌクレオチド分子との置換または置き換えも包含する。例えば、Benseler et al.(J.Am.Chem.Soc.(1993)115:8483-8484)は、ハンマーヘッド様分子を開示しており、ここでステムIIの2塩基対およびループIIの4ヌクレオチドすべてが、ヘキサエチレングリコール、プロパンジオール、ビス(トリエチレングリコール)ホスファート、トリス(プロパンジオール)ビスホスファート、またはビス(プロパンジオール)ホスファートを基にする非ヌクレオシドリンカーに置き換えられていた。Ma et al.(Biochem.(1993)32:1751-1758;Nucleic Acids Res.(1993)21:2585-2589)は、TARリボザイムヘアピンの6ヌクレオチドループを、エチレングリコールに関する非ヌクレオチドリンカーに置き換えた。Thomson et al.(Nucleic Acids Res.(1993)21:5600-5603)は、ループIIを、長さが13、17、および19原子の線状の非ヌクレオチドリンカーに置き換えた。
リボザイムオリゴヌクレオチドは、周知の方法(例として、PCT公開WO9118624;WO9413688;WO9201806;およびWO92/07065;ならびに米国特許5436143および5650502を見よ)を使用して調製され得るか、または商業的供給源(例として、US Biochemicals)から購入され得、所望の場合、細胞中ヌクレアーゼによる分解に対するオリゴヌクレオチドの耐性を増大させるためにヌクレオチド類似体を組み込み得る。リボザイムは、例として、市販の合成機(例として、Applied Biosystems,Inc.またはMilligenによって製造された)の使用による、任意の知られているやり方で合成されてもよい。リボザイムはまた、従来の手段によって、組換えベクターにおいても産生されてよい。Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(Current edition)を見よ。リボザイムRNA配列は、例えば、T7またはSP6などのRNAポリメラーゼを使用することによる従来法で、合成されてもよい。
n.ガイド核酸
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ガイド核酸、例として、ガイドRNA(gRNA)分子である。一般に、ガイドRNAは、(1)Cas9などの、核酸をプログラムできるDNA結合タンパク質(napDNAbp)へ結合する骨格(scaffold)配列、および(2)gRNAが、核酸をプログラムできるDNA結合タンパク質をDNA標的配列に近づけるために結合するDNA標的配列(例として、ゲノムDNA標的)を定義するヌクレオチドスペーサー部分から構成される低分子合成RNAである。いくつかの態様において、napDNAbpは、核酸をプログラムできるタンパク質に、標的DNA配列(例として、標的ゲノムDNA配列)を標的にさせる1以上のRNA(単数または複数)と(例として、これと結合して、またはこれと結び付いて)複合体を形成する、核酸をプログラムできるタンパク質である。いくつかの態様において、核酸プログラム可能なヌクレアーゼは、RNAとの複合体にあるとき、ヌクレアーゼ:RNA複合体と称されることもある。ガイドRNAは、2以上のRNAの複合体として、または単一のRNA分子として存在し得る。
単一のRNA分子として存在するガイドRNA(gRNA)は、単一のガイドRNA(sgRNA)と称されることもあるが、gRNAはまた、単一分子または2以上の分子の複合体のいずれかとして存在するガイドRNAを指すためにも使用される。典型的には、単一のRNA種として存在するgRNAは、2つのドメインを含む:(1)標的核酸(すなわち、Cas9複合体の標的への結合に向かわせる)との相同性を共有するドメイン;および(2)Cas9タンパク質に結合するドメイン。いくつかの態様において、ドメイン(2)は、tracrRNAとして知られている配列に対応し、ステムループ構造を含む。いくつかの態様において、ドメイン(2)は、Jinek et al.,Science 337:816-821(2012)(この内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる)に提供されるとおり、tracrRNAと同一または相同である。
いくつかの態様において、gRNAは、ドメイン(1)および(2)の2以上を含み、伸長(extended)gRNAと称されることもある。例えば、伸長gRNAは、本明細書に記載のとおり、2以上のCas9タンパク質に結合し、および2以上の別個の領域での標的核酸に結合するであろう。gRNAは、ヌクレアーゼ/RNA複合体の該標的部位への結合を媒介する標的部位に相補的なヌクレオチド配列を含み、ヌクレアーゼ:RNA複合体の配列特異性を提供する。いくつかの態様において、RNAプログラム可能ヌクレアーゼは、(CRISPR関連系)Cas9エンドヌクレアーゼ、例えば、化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)由来のCas9(Csn1)である(例として、「Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes」Ferretti,J.J.,McShan W.M.,Ajdic D.J.,Savic D.J.,Savic G.,Lyon K.,Primeaux C.,Sezate S.,Suvorov A.N.,Kenton S.,Lai H.S.,Lin S.P.,Qian Y.,Jia H.G.,Najar F.Z.,Ren Q.,Zhu H.,Song L.,White J.,Yuan X.,Clifton S.W.,Roe B.A.,McLaughlin R.E.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:4658-4663(2001);「CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III」Deltcheva E.,Chylinski K.,Sharma C.M.,Gonzales K.,Chao Y.,Pirzada Z.A.,Eckert M.R.,Vogel J.,Charpentier E.,Nature 471:602-607(2011);および「A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity」Jinek M.,Chylinski K.,Fonfara I.,Hauer M.,Doudna J.A.,Charpentier E.Science 337:816-821(2012)を見よ。これらの各々の内容全体は、参照によって本明細書に組み込まれる。
o.スプライス変更オリゴヌクレオチド
いくつかの態様において、本開示のオリゴヌクレオチド(例として、モルホリノを包含するアンチセンスオリゴヌクレオチド)は、スプライシングを標的にする。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、エキソンスキッピングを誘導することおよび遺伝子内の読み取りフレームを修復することによって、スプライシングを標的にする。非限定例として、オリゴヌクレオチドは、フレームシフト突然変異をコードするエキソンおよび/または(例として、および)未熟終止コドンをコードするエキソンのスキッピングを誘導してもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、スプライス部位のスプライソソーム認識をブロッキングすることにより、エキソンスキッピングを誘導してもよい。いくつかの態様において、エキソンスキッピングは、参照タンパク質と比べて、トランケートされたが機能的なタンパク質(例として、以下に記載された、トランケートされたが機能的なDMDタンパク質)をもたらす。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、特定のエキソン(例として、以下に記載された、SMN2遺伝子のエキソン7)の封入を促進する。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、スプライス部位阻害配列を標的にすることによって、エキソンの封入を誘導してもよい。RNAスプライシングは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)および脊髄性筋萎縮症(SMA)を包含する筋疾患に関与してきた。
ジストロフィン(DMD)をコードする遺伝子における変更(例として、欠失、点突然変異、および複製)は、DMDを引き起こす。これらの変更は、フレームシフト突然変異および/または(例として、および)ナンセンス突然変異へ繋がり得る。いくつかの態様において、本開示のオリゴヌクレオチドは、1以上のDMDエキソン(例として、エキソン8、エキソン43、エキソン44、エキソン45、エキソン50、エキソン51、エキソン52、エキソン53、および/または(例として、および)、エキソン55)のスキッピングを促進し、機能的なトランケートされたタンパク質をもたらす。例として、2013年7月16日に公開された米国特許第8,486,907号および2014年9月18日に公開されたU.S.20140275212を見よ。
SMAにおいて、機能的SMN1の喪失がある。SMN2遺伝子はSMN1に対するパラログであるが、SMN2遺伝子の選択的スプライシングは、主としてエキソン7のスキッピング、およびこれに続くSMN1喪失について補償し得ないトランケートされたSMNタンパク質の産生へ繋がる。いくつかの態様において、本開示のオリゴヌクレオチドは、SMN2エキソン7の封入を促進する。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、SMN2スプライス部位阻害配列を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドである(例として、2010年11月23日に公開された米国特許第7,838,657号を見よ)。
p. マルチマー
いくつかの態様において、分子ペイロードは、リンカーによって接続された2以上のオリゴヌクレオチドのマルチマー(例として、コンカテマー)を含んでいてもよい。このように、いくつかの態様において、複合体/抱合体のオリゴヌクレオチドの負荷(loading)は、標的化剤上の利用可能な連結部位(例として、抗体上の利用可能なチオール部位)を超えて増大され得るか、または具体的なペイロード負荷量に達するよう別様に整え得る。マルチマー中のオリゴヌクレオチドは、同じかまたは異なり得る(例として、異なる遺伝子、もしくは同じ遺伝子上の異なる部位、またはそれらの産物を標的にする)。
いくつかの態様において、マルチマーは、切断可能なリンカーによって一緒に連結された2以上のオリゴヌクレオチドを含む。しかしながら、いくつかの態様において、マルチマーは、切断不能なリンカーによって一緒に連結された2以上のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、マルチマーは、一緒に連結された2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはこれより多くのオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、マルチマーは、一緒に連結された2～5、2～10、または4～20オリゴヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、マルチマーは、(線状配置において)末端間(end-to-end)で連結された2以上のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、マルチマーは、オリゴヌクレオチドベースのリンカー(例として、ポリ-dTリンカー、塩基性リンカー)を介して、末端間で連結された2以上のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、マルチマーは、別のオリゴヌクレオチドの3'末端に連結された1つのオリゴヌクレオチドの5'末端を含む。いくつかの態様において、マルチマーは、別のオリゴヌクレオチドの3'末端に連結された1つのオリゴヌクレオチドの3'末端を含む。いくつかの態様において、マルチマーは、別のオリゴヌクレオチドの5'末端に連結された1つのオリゴヌクレオチドの5'末端を含む。またさらに、いくつかの態様において、マルチマーは、分枝リンカーによって一緒に連結された複数のオリゴヌクレオチドを含む分枝構造を含み得る。
本明細書に提供される複合体に使用されてもよいマルチマーのさらなる例は、例えば、2015年11月5日に公開され、Methods of delivering multiple targeting oligonucleotides to a cell using cleavable linkersと題する米国特許出願第2015/0315588 A1号;2015年9月3日に公開され、Multimeric Oligonucleotide Compoundsと題する米国特許出願第2015/0247141 A1号;2011年6月30日に公開され、Immunostimulatory Oligonucleotide Multimersと題する米国特許出願第US 2011/0158937 A1号;および1997年12月2日に発行され、Triplex-Forming Antisense Oligonucleotides Having Abasic Linkers Targeting Nucleic Acids Comprising Mixed Sequences Of Purines And Pyrimidinesと題する米国特許第5,693,773号に開示されており、これら各々の内容はそれら全体が参照されることにより本明細書に組み込まれる。
ii.小分子:
いずれの好適な小分子も、本明細書に記載のとおり、分子ペイロードとして使用されてもよい。非限定例は、表1の選択された遺伝子について、以下提供される。
DMPK/DM1
いくつかの態様において、例として、DMの処置のために、小分子は、「Compounds And Methods For Myotonic Dystrophy Therapy」と題する2016年2月25日に公開された米国特許公開2016052914A1に記載されたとおりである。小分子ペイロードのさらなる例は、Lopez-Morato M,et al.,Small Molecules Which Improve Pathogenesis of Myotonic Dystrophy Type 1,(Review)Front.Neurol.,18 May 2018に提供される。例えば、いくつかの態様において、小分子は、フェニルブタゾン、ケトプロフェン、ISOX、またはボリノスタットなどのMBNL1上方調節因子である。いくつかの態様において、小分子は、マニュマイシンAなどのH-Ras経路インヒビターである。いくつかの態様において、小分子は、Ro-318220、C16、C51、メトホルミン、AICAR、塩化リチウム、TDZD-8またはBioなどのタンパク質キナーゼモジュレーターである。いくつかの態様において、小分子は、ハルミンなどの植物性アルカロイドである。いくつかの態様において、小分子は、ペンタミジン、プロパミジン、ヘプタミジンまたはアクチノマイシンDなどの転写インヒビターである。いくつかの態様では、小分子は、例えばJones K,et al.,GSK3β mediates muscle pathology in myotonic dystrophy.J Clin Invest.2012 Dec;122(12):4461-72;およびWei C,et al.,GSK3β is a new therapeutic target for myotonic dystrophy type 1.Rare Dis.2013;1:e26555;およびPalomo V,et al.,Subtly Modulating Glycogen Synthase Kinase 3 β:Allosteric Inhibitor Development and Their Potential for the Treatment of Chronic Diseases.J Med Chem.2017 Jun 22;60(12):4983-5001に開示されるような、グリコーゲン合成酵素キナーゼ3ベータ(GSK3B)のインヒビターであり、これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの態様において、小分子は、Gonzalez AL,et al.,In silico discovery of substituted pyrido［2,3-d］pyrimidines and pentamidine-like compounds with biological activity in myotonic dystrophy models.PLoS One.2017 Jun 5;12(6):e0178931(この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる)に開示されたとおり、置換ピリド［2,3-d］ピリミジンおよびペンタミジン様化合物である。いくつかの態様において、小分子は、例えば、Zhange F,et al.,A flow cytometry-based screen identifies MBNL1 modulators that rescue splicing defects in myotonic dystrophy type I.Hum Mol Genet.2017 Aug 15;26(16):3056-3068(この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる)に開示されたとおり、MBNL1モジュレーターである。
DUX4/FSHD
いくつかの態様において、例として、FSHDの処置のために、小分子ペイロードは、「METHODS OF TREATING MUSCULAR DYSTROPHY」と題する2017年11月30日に公開された米国特許出願公開20170340606に記載されたとおり、または「INHIBITION OF DUX4 EXPRESSION USING BROMODOMAIN AND EXTRA-TERMINAL DOMAIN PROTEIN INHIBITORS(BETi)」と題する2018年2月22日に公開された米国特許出願公開20180050043に記載されたとおりである。小分子ペイロードのさらなる例は、Bosnakovski,D.,et al.,High-throughput screening identifies inhibitors of DUX4-induced myoblast toxicity,Skelet Muscle,Feb 2014、およびChoi.S.et al.,「Transcriptional Inhibitors Identified in a 160,000-Compound Small-Molecule DUX4 Viability Screen」、Journal of Biomolecular Screening,2016に提供される。例えば、いくつかの態様において、小分子は、SHC351、SHC540、SHC572などの転写インヒビターである。いくつかの態様において、小分子は、インテグリンなどの別のタンパク質の産生または活性を増大させるSTR00316である。いくつかの態様において、小分子は、JQ1、PF1-1、I-BET-762、I-BET-151、RVX-208、またはCPI-0610などのブロモドメインインヒビター(BETi)である。
DNM/CNM
いくつかの態様において、例として、CNMの処置のために、小分子は、CNMの処置のために、「DYNAMIN 2 INHIBITOR FOR TREATMENT OF CENTRONUCLEAR MYOPATHIES」と題する2016年9月15日に公開された米国特許出願公開番号20160264976に記載されたとおりである。例えば、いくつかの態様において、小分子は、3-ヒドロキシナフタレン-2-カルボン酸(3,4-ジヒドロキシベンジリデン)ヒドラジド、3-ヒドロキシ-N'-［(2,4,5-トリヒドロキシフェニル)メチリデン］ナフタレン-2-カルボヒドロ-アジドからなる群から選択される。いくつかの態様において、小分子は、「COMPOSITION AND METHOD FOR MUSCLE REPAIR AND REGENERATION」と題する2018年1月4日に公開された米国特許出願公開番号20180000762に記載されたとおりである。いくつかの態様において、小分子は、4-［(E)-2-［5,6,7,8-テトラヒドロ-5,5,8,8-テトラメチル-3-(1H-ピラゾール-1-イルメチル-)-2-ナフタレニル］-エテニル］-安息香酸などのレチノイド受容体アゴニストである。いくつかの態様において、小分子は、「METHODS,COMPOUNDS,AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF MUSCULOSKELETAL DISEASES」と題する2017年5月4日に公開された米国特許出願公開番号20170119748に記載されたとおりである。上記これらの刊行物の各々の内容全体は、本明細書に組み込まれる。
ポンペ病
いくつかの態様において、例として、ポンペ病の処置のために、小分子は、「METHOD FOR TREATMENT OF POMPE DISEASE USING 1-DEOXYNOJIRIMYCIN DERIVATIVES」と題する2016年2月25日に公開された米国特許出願公開番号20160051528に記載されたとおり、N-ブチル-DNJ、N-メチル-DNJ、またはN-シクロプロピルメチル-DNJなどの1-デオキシノジリマイシン(DNJ)誘導体である。いくつかの態様において、小分子DNJ誘導体は、GAAの活性を増大するための分子シャペロンとして使用される。いくつかの態様において、非阻害性酸性アルファグルコシダーゼシャペロンML247小分子は、2011年12月にProbe Reports from NIH Molecular Librariesで公開されたMarugan,et al.,「Discovery,SAR,and Biological Evaluation of a Non-Inhibitory Chaperone for Acid Alpha Glucosidase」におけるとおり、利用される。例えば、小分子シャペロンML247は、PD関連GAAアレルまたは野生型GAAアレルの活性を増大するために利用される。上記これらの刊行物の各々の内容全体は、本明細書に組み込まれる。
FXN/フリートライヒ運動失調症
いくつかの態様において、例として、フリートライヒ運動失調症の処置のために、小分子は、Herman D.et al.「Histone deacetylase inhibitors reverse gene silencing in Friedreich's ataxia.」Nat Chem Biol.2006;2:551-558に記載のとおりである。いくつかの態様において、小分子は、Rai,M.et al.「HDAC inhibitors correct frataxin deficiency in a Friedreich ataxia mouse model.」PLoS One.2008 Apr 9;3(4):e1958に記載のとおりである。小分子ペイロードのさらなる例は、Richardson,T.E.et al,「Therapeutic strategies in Friedreich's Ataxia」,Brain Res.2013 Jun 13;1514:91-97;Zeier Z et al.「Bromodomain inhibitors regulate the C9ORF72 locus in ALS」Exp Neurol.2015 Sep;271:241-50.;およびGottesfeld J.M.「Small molecules affecting transcription in Friedreich ataxia.」Pharmacol Ther.2007 Nov;116(2):236-48に提供される。例えば、いくつかの態様において、小分子は、ヒストンデアセチラーゼのインヒビターであり、例として、BML-210および化合物106である。いくつかの態様において、小分子は、17β-エストラジオールまたはメチレンブルーである。いくつかの態様において、小分子は、疾患関連反復および/または(例として、および)R-ループを標的に(例として、これに結合)する。いくつかの態様において、小分子は、WO 2004/003565、1/8/2004公開、「A screening method and compounds for treating friedreich ataxia」に記載されたとおりである。いくつかの態様において、小分子は、グルタチオンペルオキシダーゼ模倣物である。
DMD/ジストロフィン異常症
いくつかの態様において、小分子は、突然変異体DMDアレルからのmRNA発現のエキソンスキッピングを増強する。いくつかの態様において、小分子は、「IDENTIFICATION OF SMALL MOLECULES THAT FACILITATE THERAPEUTIC EXON SKIPPING」と題する2014年3月20日に公開された米国特許出願公開US20140080896A1に記載されたとおりである。小分子ペイロードのさらなる例は、「Identification of structurally similar small molecules that enhance therapeutic exon skipping」と題する2018年5月29日に登録された米国特許第9,982,260号に提供されている。例えば、いくつかの態様において、小分子は、ペルフェナジン、フルペンチキソール、ズクロペンチキソールまたはコリナンテイン(corynanthine)などのエキソンスキッピングのエンハンサーである。いくつかの態様において、エキソンスキッピングの小分子エンハンサーは、リアノジン受容体またはカルモジュリンを阻害する。いくつかの態様において、小分子は、マニュマイシンAなどのH-Ras経路インヒビターである。いくつかの態様において、小分子は、終止コドンのサプレッサーであり、リボソームを未熟終止コドンに脱感作させる。いくつかの態様において、小分子は、2013年6月25日に公開されたMcElroy S.P.et al.「A Lack of Premature Termination Codon Read Through Efficacy of PTC124(Ataluren)in a Diverse Array of Reporter Assays.」PLOS Biologyに記載されたとおり、アタルレンである。いくつかの態様において、小分子は、例として、Manzur,A.Y.et al.「Glucocorticoid corticosteroids for Duchenne muscular dystrophy」Cochrane Database Syst Rev.2004;(2):CD003725に記載されたとおり、コルチコステロイドである。いくつかの態様において、小分子は、ユートロフィンなどのジストロフィンの機能を置き換え得る遺伝子の発現および/または(例として、および)活性を上方調節する。いくつかの態様において、ユートロフィンモジュレーターは、「TREATMENT OF DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY」と題する2007年8月16日に公開された国際公開番号WO2007091106、および/または(例として、および)、「COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY」と題する2017年10月5日に公開された国際公開番号WO/2017/168151に記載されたとおりである。
MYH7/肥大性心筋症
いくつかの態様において、小分子は、Therapies for Cardiomyopathyと題する2016年4月21日に公開された米国特許出願公開20160106771などにおける、MYH7遺伝子の発現をモジュレートする5-アザシチジンまたは5-アザ-2'-デオキシシチジンなどの低メチル化剤であり;いくつかの態様において、小分子は、Treatment for Myopathyと題する2018年7月5日に公開された米国特許出願公開20180185478などにおける、ニフロキサジド、ケトプロフェン、スルファサラジン、5,15-ジフェニルポルフィリン、またはAG490などのJAK-STATインヒビターであり;いくつかの態様において、小分子は、Tang,W.,et al."Modulating Beta-Cardiac Myosin Function at the Molecular and Tissue Levels,"Front.Physiol.2016(7):659(これらのいずれの内容全体は参照により本明細書に組み込まれる)におけるとおり、ADPの解離を変えない一方でミオシン収縮の力を低減させるパラ-ニトロブレッビスタチン(para-Nitroblebbistatin)である。
iii.Peptides/Proteins
いずれの好適なペプチドまたはタンパク質も、本明細書に記載のとおりの分子ペイロードとして使用されてもよい。いくつかの態様において、タンパク質は、酵素である(例として、酸性アルファ-グルコシダーゼ、例として、GAA遺伝子によってコードされるもの)。これらのペプチドまたはタンパク質は、数種の方法論、例として、ファージディスプレードペプチドライブラリ、1ビーズ・1化合物ペプチドライブラリ、または位置走査性合成ペプチドコンビナトリアルライブラリを使用して産生、合成、および/または(例として、および)、誘導体化されてもよい。例示の方法論は、当該技術分野において特徴付けられてきており、参照により組み込まれる(Gray,B.P.and Brown,K.C.「Combinatorial Peptide Libraries:Mining for Cell-Binding Peptides」Chem Rev.2014,114:2,1020-1081.;Samoylova,T.I.and Smith,B.F.「Elucidation of muscle-binding peptides by phage display screening」Muscle Nerve,1999,22:4.460-6.)。
非限定例は、表1の選択された遺伝子について、以下提供される。
DMPK/DM1
ペプチドまたはタンパク質ペイロードは、例として、DM1の処置のために、核酸(例として疾患関連反復)またはタンパク質(例として筋細胞中に見られるMBNL1)へ優先的に結合するタンパク質の配列に相当してもよい。いくつかの態様において、ペプチドは、米国特許出願2018/0021449、1/25/2018公開、「Antisense conjugates for decreasing expression of DMPK」に記載されたとおりである。いくつかの態様において、ペプチドは、Garcia-Lopez et al.,「In vivo discovery of a peptide that prevents CUG-RNA hairpin formation and reverses RNA toxicity in myotonic dystrophy models」,PNAS July 19,2011.108(29)11866-11871に記載されたとおりである。いくつかの態様において、ペプチドまたはタンパク質は、疾患関連反復、例としてRNA CUG反復拡張を標的に(例として、結合)してもよい。
いくつかの態様において、例として、DM1の処置のために、ペプチドまたはタンパク質は、MBNLタンパク質、例として、MBNL1のフラグメントを含む。いくつかの態様において、ペプチドまたはタンパク質は、少なくとも1つのジンクフィンガーを含む。いくつかの態様において、ペプチドまたはタンパク質は、約2～25アミノ酸、約2～20アミノ酸、約2～15アミノ酸、約2～10アミノ酸、または約2～5アミノ酸を含んでいてもよい。ペプチドまたはタンパク質は、天然に存在するアミノ酸、例として、システイン、アラニン、または非天然に存在しないか、もしくは修飾されたアミノ酸を含んでいてもよい。天然に存在しないアミノ酸は、β-アミノ酸、ホモ-アミノ酸、プロリン誘導体、3-置換アラニン誘導体、線形コアアミノ酸、N-メチルアミノ酸、および当該技術分野において知られているその他のアミノ酸を包含する。いくつかの態様において、ペプチドは、線状であってもよい;他の態様において、ペプチドは、環状、例として二環式であってもよい。
DUX4/FSHD
いくつかの態様において、例として、FSHDの処置のために、ペプチドまたはタンパク質は、DUX4発現を阻害するDME1またはDME2エンハンサーへ、例として、アクチベーターの結合をブロッキングすることによって、結合してもよい。
DNM2/CNM
いくつかの態様において、例として、CNMの処置のために、ペプチドは、「DYNAMIN 2 INHIBITOR FOR TREATMENT OF CENTRONUCLEAR MYOPATHIES」と題する2016年9月15日に公開された米国特許出願公開番号20160264976に記載されたとおり、アミノ酸配列QVPSRPNRAP(配列番号152)を伴うダイナミンインヒビターペプチドである。
ポンペ病
いくつかの態様において、例として、ポンペ病の処置のために、分子ペイロードは、「METHODS AND ORAL FORMULATIONS FOR ENZYME REPLACEMENT THERAPY OF HUMAN LYSOSOMAL AND METABOLIC DISEASES」と題する2016年12月1日に公開された米国特許出願公開番号20160346363、「METHODS AND MATERIALS FOR TREATMENT OF POMPE'S DISEASE」と題する2016年9月29日に公開された米国特許出願公開番号 20160279254、または、「METHODS AND MATERIALS FOR TREATMENT OF POMPE'S DISEASE」と題する2013年9月19日に公開された米国特許出願公開番号 20130243746におけるとおり、酸性アルファ-グルコシダーゼまたは野生型GAAタンパク質またはその活性フラグメントなどのタンパク質または酵素である。いくつかの態様において、酸性アルファ-グルコシダーゼまたは野生型GAAタンパク質は、対象のGAA活性を増大させる。いくつかの態様において、酸性アルファ-グルコシダーゼまたは野生型GAAタンパク質は、GAA遺伝子によってコードされる。
ACVR1/FOP
いくつかの態様において、例として、FOPの処置のために、ペプチドまたはタンパク質は、調節性SMAD6および7またはそれらのフラグメントなどのBMPインヒビターである。ペプチドまたはタンパク質の追加の例は、Cappato,S.et al.「The Horizon of a Therapy for Rare Genetic Diseases:A「Druggable」Future for Fibrodysplasia Ossificans Progressiva」Int.J.Mol.Sci.2018,19(4),989に包含される。上記の各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
FXN/フリートライヒ運動失調症
いくつかの態様において、例として、フリートライヒ運動失調症の処置のために、ペプチドは、米国特許第8,815,230号、8/30/2010出願、「Methods for treating Friedreich's ataxia with interferon gamma」に記載されたとおりである。いくつかの態様において、ペプチドは、Britti,E.et al.「Frataxin-deficient neurons and mice models of Friedreich ataxia are improved by TAT-MTScs-FXN treatment.」J Cell Mol Med.2018 Feb;22(2):834-848に記載されたとおりである。いくつかの態様において、ペプチドは、Zhao,H.et al.,「Peptide SS-31 upregulates frataxin expression and improves the quality of mitochondria:implications in the treatment of Friedreich ataxia」,Sci Rep.2017 Aug 29;7(1):9840に記載されたとおりである。いくつかの態様において、ペプチドは、Vyas,P.M.et al.「A TAT-frataxin fusion protein increases lifespan and cardiac function in a conditional Friedreich's ataxia mouse model」,Hum Mol Genet.2012 Mar 15;21(6):1230-47に記載されたとおりである。いくつかの態様において、ペプチドまたはタンパク質は、疾患関連反復、例としてGAA反復拡張を標的に(例として、結合)してもよい。
DMD/ジストロフィン異常症
いくつかの態様において、例として、デュシェンヌ型筋ジストロフィーなどのジストロフィン異常症の処置のために、ペプチドは、突然変異体DMDアレルから発現されるmRNAにおけるエキソンスキッピングを容易にさせてもよい。いくつかの態様において、ペプチドは、機能的ジストロフィンの発現、および/または(例として、および)、ジストロフィンの代わりに機能することができるタンパク質の発現を促進してもよい。いくつかの態様において、ペイロードは、ジストロフィンの機能的フラグメント、例として、機能的ジストロフィンタンパク質のアミノ酸セグメントであるタンパク質である。
iv.核酸コントラクト
いずれの好適な遺伝子発現コンストラクトも、本明細書に記載のとおりの分子ペイロードとして使用されてもよい。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、ベクターまたはcDNAフラグメントであってもよい。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、メッセンジャーRNA(mRNA)であってもよい。いくつかの態様において、本明細書に使用されるmRNAは、修飾されたmRNA、例として、2014年4月24日に発行の米国特許8,710,200、表題「Engineered nucleic acids encoding a modified erythropoietin and their expression」に記載されるとおりのものであってもよい。いくつかの態様において、mRNAは、5'メチルcapを含んでいてもよい。いくつかの態様において、mRNAは、ポリAテール、任意に長さが最大160ヌクレオチドまでのものを含んでいてもよい。遺伝子発現コンストラクトは、筋疾患において欠乏するタンパク質の配列をコードしていてもよい。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、筋細胞の核内で発現、例として、過剰発現、されてもよい。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、筋疾患において欠乏する遺伝子をコードしていてもよい。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、少なくとも1のジンクフィンガーを含むタンパク質をコードする。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、表1の遺伝子に結合するタンパク質をコードする。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、表1の遺伝子によってコードされるタンパク質(例として、突然変異タンパク質)の発現の低減へ繋がるタンパク質をコードする。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、遺伝子編集酵素をコードする。分子ペイロードとして使用されてもよい核酸コントラクトの追加例は、2017年9月19日に公開の国際特許出願公開WO2017152149A1、表題「CLOSED-ENDED LINEAR DUPLEX DNA FOR NON-VIRAL GENE TRANSFER」;2014年10月7日に発行の米国特許8,853,377B2、表題「MRNA FOR USE IN TREATMENT OF HUMAN GENETIC DISEASES」;および2014年9月2日に発行の米国特許US8822663B2、「ENGINEERED NUCLEIC ACIDS AND METHODS OF USE THEREOF」に提供されており、これら各々の内容はこれらの全体を参照により本明細書に組み込まれる。
さらなる非限定例は、表1の選択された遺伝子/疾患について、以下提供される。
DMPK/DM1
いくつかの態様において、例として、DMの処置のために、遺伝子発現コンストラクトは、MBNLタンパク質、例としてMBNL1、をコードする。
DUX4/FSHD
いくつかの態様において、例として、FSHDの処置のために、遺伝子発現コンストラクトは、オリゴヌクレオチド(例として、DUX4を標的にするshRNA)またはDUX4の発現を下方調節するタンパク質(例として、DUX4発現を阻害するために、例として、アクチベーターの結合をブロッキングすることによって、DME1またはDME2エンハンサーへ結合するペプチドまたはタンパク質)をコードする。
DNM2/CNM
いくつかの態様において、例として、CNM1の処置のために、遺伝子発現コンストラクトは、突然変異体DNM2タンパク質の発現を下方調節するかまたは野生型DNM2を発現するタンパク質の、配列をコードしてもよい。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、DNM2の発現を阻害するオリゴヌクレオチド(例として、shRNA)をコードする。しかしながら、いくつかの態様において、発現コンストラクトは、Trochet D.,et al.,Reprogramming the Dynamin 2 mRNA by Spliceosome-mediated RNA Trans-splicing Mol Ther Nucleic Acids.2016 Sep;5(9):e362(この内容は参照により本明細書に組み込まれる)に記載されたとおり、突然変異DNM2-mRNAを初期化するために使用されてもよいスプライソソーム媒介性RNAトランススプライシング構成要素をコードする。
ポンペ病
いくつかの態様において、例として、ポンペ病の処置のために、遺伝子発現コンストラクトは、野生型GAAタンパク質をコードする。遺伝子発現コンストラクトは、GYS1タンパク質の減少した活性に繋がるタンパク質の配列をコードしてもよい。いくつかの態様において、例として、ポンペ病の処置のために、遺伝子発現コンストラクトは、GYS1の発現を阻害するオリゴヌクレオチド(例として、shRNA)をコードする。
ACVR1/FOP
遺伝子発現コンストラクトは、ACVR1遺伝子の減少した発現またはACVR1タンパク質の減少した活性に繋がるタンパク質の配列をコードしてもよい。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、ACVR1の発現をネガティブに調節する後成的調節因子の発現における低減に繋がるタンパク質、例として、ヒストン脱アセチル化酵素をコードする。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、ACVR1の発現を阻害するオリゴヌクレオチド(例として、shRNA)をコードする。
FXN/フリートライヒ運動失調症
遺伝子発現コンストラクトは、フラタキシンの増大した発現に繋がるタンパク質の配列をコードしてもよい。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、筋細胞の核内で発現、例として、過剰発現、されてもよい。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、フラタキシンをコードする。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、FXNの発現をネガティブに調節する後成的調節因子の機能を阻害するタンパク質、例として、ヒストン脱アセチル化酵素をコードする。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、GAAトリヌクレオチドの疾患関連反復拡張へ結合するタンパク質をコードする。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、FXNの発現をネガティブに調節する後成的調節因子の発現における低減に繋がるタンパク質、例として、ヒストン脱アセチル化酵素をコードする。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、遺伝子編集酵素をコードする。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、エリスロポエチンをコードする(例として、Miller,J.L.et al,「Erythropoietin and small molecule agonists of the tissue-protective erythropoietin receptor increase FXN expression in neuronal cells in vitro and in FXN-deficient KIKO mice in vivo」,Neuropharmacology.2017 Sep 1;123:34-45を見よ)。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、インターフェロンガンマをコードする(例として米国特許第8,815,230、8/30/2010出願、「Methods for treating Friedreich's ataxia with interferon gamma」を見よ)。
DMD/ジストロフィン異常症
遺伝子発現コンストラクトは、ジストロフィンタンパク質、ジストロフィンフラグメント、ミニ-ジストロフィン、ユートロフィンタンパク質、またはジストロフィンと共通の機能を共有するいずれのタンパク質の配列をコードしてもよい。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、筋細胞の核内で発現、例として、過剰発現、されてもよい。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、少なくとも1のジンクフィンガーを含むタンパク質をコードする。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、ジストロフィン、またはジストロフィンと機能を共有するタンパク質、例として、ユートロフィン、の発現を促進するタンパク質をコードする。いくつかの態様において、遺伝子発現コンストラクトは、遺伝子編集酵素をコードする。いくつかの態様において、遺伝子発現コントラクトは、米国特許出願公開US20170368198A1、2017年12月28日出願、題名「Optimized mini-dystrophin genes and expression cassettes and their use」;Duan D.「Myodys,a full-length dystrophin plasmid vector for Duchenne and Becker muscular dystrophy gene therapy.」Curr Opin Mol Ther 2008;10:86-94;およびTang,Y.et al.,「AAV-directed muscular dystrophy gene therapy」Expert Opin Biol Ther.2010 Mar;10(3):395-408に開示された発現カセットに記載されたとおりであり、それら各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
C.リンカー
本明細書に記載の複合体は一般に、本明細書に記載の抗TfR抗体のいずれか1つを分子ペイロードへ接続するリンカーを含む。リンカーは、少なくとも1つの共有結合を含む。いくつかの態様において、リンカーは、抗TfR抗体を分子ペイロードへ接続する単結合、例として、ジスルフィド結合またはジスルフィド架橋であってもよい。しかしながら、いくつかの態様において、リンカーは、複数の共有結合を通して、本明細書に記載の抗TfR抗体のいずれか1つを分子ペイロードへ接続してもよい。いくつかの態様において、リンカーは、切断可能なリンカーであってもよい。しかしながら、いくつかの態様において、リンカーは、切断不能なリンカーであってもよい。リンカーは一般に、in vitroおよびin vivoで安定しており、ある細胞環境において安定していてもよい。加えて、一般にリンカーは、抗TfR抗体または分子ペイロードのいずれかの機能特性に負の影響を及ぼさない。リンカーの合成の例および方法は、当技術分野で公知である(例として、Kline,T.et al.「Methods to Make Homogenous Antibody Drug Conjugates」Pharmaceutical Research,2015,32:11,3480-3493.;Jain,N.et al.「Current ADC Linker Chemistry」Pharm Res.2015,32:11,3526-3540.;McCombs,J.R.and Owen,S.C.「Antibody Drug Conjugates:Design and Selection of Linker,Payload and Conjugation Chemistry」AAPS J.2015,17:2,339-351を見よ)。
リンカーの前駆体は、典型的には、抗TfR抗体と分子ペイロードとの両方へ付着できる2つの異なる反応性の高い種を含有しているであろう。いくつかの態様において、2つの異なる反応性の高い種は、求核試薬および/または(例として、および)求電子試薬であってもよい。いくつかの態様において、リンカーは、抗TfR抗体のリジン残基またはシステイン残基への抱合を介して、抗TfR抗体へ接続されている。いくつかの態様において、リンカーは、マレイミド含有リンカーを介して抗TfR抗体のシステイン残基へ接続されており、ここで任意に、マレイミド含有リンカーは、マレイミドカプロイルまたはマレイミドメチルシクロヘキサン-1-カルボキシラート基を含む。いくつかの態様において、リンカーは、3-アリールプロピオニトリル官能基を介して、抗TfR抗体のシステイン残基またはチオール官能化分子ペイロードへ接続されている。いくつかの態様において、リンカーは、抗TfR抗体のリシン残基へ接続されている。いくつかの態様において、リンカーは、アミド結合、カルバマート結合、ヒドラジド、トリアゾール、チオエーテル、またはジスルフィド結合を介して、抗TfR抗体および/または(例として、および)分子ペイロードへ接続されている。
i.切断可能なリンカー
切断可能なリンカーは、プロテアーゼ感受性リンカー、pH感受性リンカー、またはグルタチオン感受性リンカーであってもよい。これらのリンカーは一般に、細胞内のみで切断可能であって、好ましくは、細胞外環境において、例として、筋細胞の細胞外において安定している。
プロテアーゼ感受性リンカーは、プロテアーゼ酵素活性によって切断可能である。これらのリンカーは、典型的にはペプチド配列を含んでおり、長さが2～10アミノ酸、約2～5アミノ酸、約5～10アミノ酸、約10アミノ酸、約5アミノ酸、約3アミノ酸、または約2アミノ酸であってもよい。いくつかの態様において、ペプチド配列は、天然に存在するアミノ酸、例として、システイン、アラニン、または天然に存在しないかもしくは修飾されたアミノ酸を含んでいてもよい。天然に存在しないアミノ酸は、β-アミノ酸、ホモ-アミノ酸、プロリン誘導体、3-置換アラニン誘導体、線形コアアミノ酸、N-メチルアミノ酸、および当該技術分野において知られているその他のアミノ酸を包含する。いくつかの態様において、プロテアーゼ感受性リンカーは、バリン-シトルリンまたはアラニン-シトルリンのジペプチド配列を含む。いくつかの態様において、プロテアーゼ感受性リンカーは、リソソームのプロテアーゼ、例として、カテプシンB、および/またはエンドソームのプロテアーゼによって切断され得る。
pH感受性リンカーは、高または低pH環境において容易に分解される共有結合の連結である。いくつかの態様において、pH感受性リンカーは、4～6の範囲にあるpHにて切断されてもよい。いくつかの態様において、pH感受性リンカーは、ヒドラゾンまたは環状アセタールを含む。いくつかの態様において、pH感受性リンカーは、エンドソームまたはリソソーム内で切断される。
いくつかの態様において、グルタチオン感受性リンカーは、ジスルフィド部を含む。いくつかの態様において、グルタチオン感受性リンカーは、細胞内部でのグルタチオン種とのジスルフィド交換反応によって切断される。いくつかの態様において、ジスルフィド部はさらに、少なくとも1アミノ酸、例としてシステイン残基を含む。
いくつかの態様において、リンカーは、Val-citリンカー(例として、米国特許6,214,345(参照により本明細書に組み込まれる)に記載されるとおり)である。いくつかの態様において、抱合前に、val-citリンカーは以下の構造を有する。
Figure 2023535074000025
いくつかの態様において、抱合後、val-citリンカーは以下の構造を有する。
Figure 2023535074000026
いくつかの態様において、Val-citリンカーは、反応性の高い化学的部分(例として、クリックケミストリー抱合のためのSPAAC)へ付着される。いくつかの実施形態では、クリックケミストリー抱合の前に、反応性の高い化学的部分(例として、クリックケミストリー抱合のためのSPAAC)に付着されたval-citリンカーは、以下の構造を有し、
Figure 2023535074000027
 式中、nは0～10の任意の数である。いくつかの態様において、nは3である。
いくつかの態様において、反応性の高い化学的部分(例として、クリックケミストリー抱合のためのSPAAC)へ付着されるval-citリンカーは、(例として、異なる化学的部分を介して)分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド)へ抱合される。いくつかの態様において、反応性の高い化学的部分(例として、クリックケミストリー抱合のためのSPAAC)に付着され、分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド)に抱合されたval-citリンカーは、(クリックケミストリー抱合前)以下の構造を有し、
Figure 2023535074000028
 式中、nは0～10の任意の数である。いくつかの態様において、nは3である。
いくつかの態様において、分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド)への抱合後、val-citリンカーは以下の構造を有し、
Figure 2023535074000029
 式中、nは0～10の任意の数であり、mは0～10の任意の数である。いくつかの態様において、nは3であり、およびmは4である。
ii.切断不能リンカー
いくつかの態様において、切断不能なリンカーが使用されてもよい。一般に、切断不能なリンカーは、細胞環境または生理環境において容易に分解され得ない。いくつかの態様において、切断不能なリンカーは、任意に置換されていてもよいアルキル基を含むが、ここで置換は、ハロゲン、ヒドロキシル基、酸素種、および他の一般的な置換を包含していてもよい。いくつかの態様において、リンカーは、任意に置換されていてもよいアルキル、任意に置換されていてもよいアルキレン、任意に置換されていてもよいアリーレン、ヘテロアリーレン、少なくとも1個の非天然アミノ酸を含むペプチド配列、トランケートされたグリカン、酵素的に分解され得ない糖(単数もしくは複数)、アジド、アルキン-アジド、LPXT配列を含むペプチド配列、チオエーテル、ビオチン、ビフェニル、反復単位のポリエチレングリコールもしくは等価な化合物、酸エステル、酸アミド、スルファミド、および/または(例として、および)、アルコキシ-アミンリンカーを含んでいてもよい。いくつかの態様において、ソルターゼ媒介ライゲーションは、LPXT配列を含む抗TfR抗体を、(G)n配列を含む分子ペイロードへ共有結合的に連結するために利用されるであろう(例として、Proft T.Sortase-mediated protein ligation:an emerging biotechnology tool for protein modification and immobilization.Biotechnol Lett.2010,32(1):1-10を見よ)。
いくつかの態様において、リンカーは、置換されたアルキレン、任意に置換されていてもよいアルケニレン、任意に置換されていてもよいアルキニレン、任意に置換されていてもよいシクロアルキレン、任意に置換されていてもよいシクロアルケニレン、任意に置換されていてもよいアリーレン、N、O、およびSから選択される少なくとも1個のヘテロ原子をさらに含む任意に置換されていてもよいヘテロアリーレン;N、O、およびSから選択される少なくとも1個のヘテロ原子をさらに含む任意に置換されていてもよいヘテロシクリレン;イミノ、任意に置換されていてもよい窒素種、任意に置換されていてもよい酸素種O、任意に置換されていてもよい硫黄種、またはポリ(アルキレンオキシド)、例として、ポリエチレンオキシドまたはポリプロピレンオキシドを含んでいてもよい。
iii.リンカー抱合
いくつかの態様において、リンカーは、ホスファート、チオエーテル、エーテル、炭素-炭素、カルバマート、またはアミド結合を介して抗TfR抗体および/または(例として、および)分子ペイロードへ接続されている。いくつかの態様において、リンカーは、ホスファートまたはホスホロチオアート基、例として、オリゴヌクレオチド主鎖の末端のホスファートを介してオリゴヌクレオチドへ接続されている。いくつかの態様において、リンカーは、抗TfR抗体上に存在するリシン残基またはシステイン残基を介して、抗TfR抗体へ接続されている。
いくつかの態様において、リンカーは、トリアゾールを形成するアジドとアルキンとの間のシクロ付加反応によって、抗TfR抗体および/または(例として、および)分子ペイロードへ接続されており、ここでアジドおよびアルキンは、抗TfR抗体、分子ペイロード、またはリンカー上に位置付けられていてもよい。いくつかの態様において、アルキンは、環状アルキン、例としてシクロオクチンであってもよい。いくつかの態様において、アルキンは、ビシクロノニン(またビシクロ［6.1.0］ノニンまたはBCNとしても知られている)または置換ビシクロノニンであってもよい。いくつかの態様において、シクロオクタンは、2011年11月3日に公開の国際特許出願公開WO2011136645号、表題「Fused Cyclooctyne Compounds And Their Use In Metal-free Click Reactions」に記載のとおりである。いくつかの態様において、アジドは、アジドを含む糖または炭水化物分子であってもよい。いくつかの態様において、アジドは、6-アジド-6-デオキシガラクトースまたは6-アジド-N-アセチルガラクトサミンであってもよい。いくつかの態様において、アジドを含む糖または炭水化物分子は、2016年10月27日に公開の国際特許出願公開WO2016170186号、表題「Process For The Modification Of A Glycoprotein Using A Glycosyltransferase That Is Or Is Derived From A β(1,4)-N-Acetylgalactosaminyltransferase」に記載のとおりである。いくつかの態様において、トリアゾールを形成するアジドとアルキンとの間のシクロ付加反応(ここでアジドおよびアルキンは、抗TfR抗体、分子ペイロード、またはリンカー上に位置付けられていてもよい)は、2014年5月1日に公開の国際特許出願公開WO2014065661号、表題「Modified antibody,antibody-conjugate and process for the preparation thereof」;または2016年10月27日に公開の国際特許出願公開WO2016170186、表題「Process For The Modification Of A Glycoprotein Using A Glycosyltransferase That Is Or Is Derived From A β(1,4)-N-Acetylgalactosaminyltransferase」に記載のとおりである。
いくつかの態様において、リンカーはさらに、スペーサー、例として、ポリエチレングリコールスペーサーまたはアシル/カルバモイルスルファミドスペーサー、例として、HydraSpace(商標)スペーサーを含む。いくつかの態様において、スペーサーは、Verkade,J.M.M.et al.,「A Polar Sulfamide Spacer Significantly Enhances the Manufacturability,Stability,and Therapeutic Index of Antibody-Drug Conjugates」、Antibodies,2018,7,12に記載のとおりである。
いくつかの態様において、リンカーは、求ジエン体とジエン/ヘテロ-ジエンとの間のディールス・アルダー反応によって、抗TfR抗体および/または(例として、および)分子ペイロードへ接続されるが、ここで求ジエン体およびジエン/ヘテロ-ジエンは、抗TfR抗体、分子ペイロード、またはリンカー上に位置付けられていてもよい。いくつかの態様において、リンカーは、他のペリ環状反応、例として、エン反応によって、抗TfR抗体および/または(例として、および)分子ペイロードへ接続される。いくつかの態様において、リンカーは、アミド、チオアミド、またはスルホンアミド結合反応によって、抗TfR抗体および/または(例として、および)分子ペイロードへ接続される。いくつかの態様において、リンカーは、リンカーと抗TfR抗体および/または(例として、および)分子ペイロードとの間に存在するオキシム基、ヒドラゾン基、またはセミカルバジド基を形成する縮合反応によって、抗TfR抗体および/または(例として、および)分子ペイロードへ接続される。
いくつかの態様において、リンカーは、求核試薬(例として、アミン基またはヒドロキシル基)と求電子試薬(例として、カルボン酸、カーボナート、またはアルデヒド)との間の抱合体付加反応によって、抗TfR抗体および/または(例として、および)分子ペイロードへ接続される。いくつかの態様において、リンカーと抗TfR抗体または分子ペイロードとの間の反応に先立ち、求核試薬はリンカー上に存在していてもよく、求電子試薬は抗TfR抗体または分子ペイロード上に存在していてもよい。いくつかの態様において、リンカーと抗TfR抗体または分子ペイロードとの間の反応に先立ち、求電子試薬はリンカー上に存在していてもよく、求核試薬は抗TfR抗体または分子ペイロード上に存在していてもよい。いくつかの態様において、求電子試薬は、アジド、ペンタフルオロフェニル、ケイ素中心、カルボニル、カルボン酸、無水物、イソシアナート、チオイソシアナート、スクシニミジルエステル、スルホスクシニミジルエステル、マレイミド、アルキルハロゲン化物、アルキル擬ハロゲン化物、エポキシド、エピスルフィド、アジリジン、アリール、活性化リン中心、および/または(例として、および)、活性化硫黄中心であってもよい。いくつかの態様において、求核試薬は、任意に置換されていてもよいアルケン、任意に置換されていてもよいアルキン、任意に置換されていてもよいアリール、任意に置換されていてもよいヘテロシクリル、ヒドロキシル基、アミノ基、アルキルアミノ基、アニリド基、またはチオール基であってもよい。
いくつかの態様において、反応性の高い化学的部分(例として、クリックケミストリー抱合のためのSPAAC)に付着されたval-citリンカーは、以下の構造によって抗TfR抗体に抱合され、
Figure 2023535074000030
 式中、mは0～10の任意の数である。いくつかの態様において、mは4である。
いくつかの実施形態では、反応性の高い化学的部分(例として、クリックケミストリー抱合のためのSPAAC)に付着されたval-citリンカーは、以下の構造を有する抗TfR抗体に抱合され、
Figure 2023535074000031
 式中、mは0～10の任意の数である。いくつかの態様において、mは4である。
いくつかの態様において、反応性の高い化学的部分(例として、クリックケミストリー抱合のためのSPAAC)に付着され、抗TfR抗体に抱合されたval-citリンカーは、以下の構造を有し:
Figure 2023535074000032
 式中、nは0～10の任意の数であり、mは0～10の任意の数である。いくつかの態様において、nは3であり、および/または(例として、および)mは4である。
いくつかの態様において、抗体と分子ペイロードとを連結するval-citリンカーは、以下の構造を有し:
Figure 2023535074000033
 式中、nは0～10の任意の数であり、mは0～10の任意の数である。いくつかの態様において、nは3であり、および/または(例として、および)mは4である。いくつかの態様において、nは3であり、および/または(例として、および)mは4である。いくつかの態様において、Xは、NH(例として、リジンのアミン基からのNH)、S(例として、システインのチオール基からのS)または抗体のO(例として、セリン、トレオニンまたはチロシンのヒドロキシル基からのO)である。
いくつかの態様において、本明細書中に記載される複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535074000034
 式中、nは0～10の任意の数であり、mは0～10の任意の数である。いくつかの態様において、nは3であり、および/または(例として、および)mは4である。
構造式(A)、(B)、(C)、および(D)中、L1は、いくつかの態様において、置換もしくは非置換の脂肪族、置換もしくは非置換のヘテロ脂肪族、置換もしくは非置換のカルボシクリレン、置換もしくは非置換のヘテロシクリレン、置換もしくは非置換のアリーレン、置換もしくは非置換のヘテロアリーレン、-O-、-N(RA)-、-S-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-C(＝O)NRA-、-NRAC(＝O)-、-NRAC(＝O)RA-、-C(＝O)RA-、-NRAC(＝O)O-、-NRAC(＝O)N(RA)-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-OC(＝O)N(RA)-、-S(O)2NRA-、-NRAS(O)2-、またはそれらの組み合わせであるスペーサーである。いくつかの態様において、L1は、
Figure 2023535074000035
 であり、式中、ピペラジン部分はオリゴヌクレオチドに連結しており、L2は
Figure 2023535074000036
 である。
いくつかの態様において、L1は
Figure 2023535074000037
 であり、式中、ピペラジン部分はオリゴヌクレオチドに連結している。
いくつかの態様において、L1は
Figure 2023535074000038
 である。
いくつかの態様において、L1は、オリゴヌクレオチドの5'ホスファートへ連結される。
いくつかの態様において、L1は、任意である(例として、存在する必要はない)。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体のいずれか1つは、以下の構造を有し、
Figure 2023535074000039
 式中、nは0～15(例として、3)であり、mは0～15(例として、4)である。
C.抗体-分子ペイロード複合体の例
本明細書に記載の分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド)のいずれかへ共有結合的に連結された、本明細書に記載のいずれか1つの抗TfR抗体を含む複合体の非限定的な例が、本明細書でさらに提供される。いくつかの態様において、抗TfR抗体(例として、表2に提供される抗TfR抗体のいずれか1つ)は、リンカーを介して分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド)へ共有結合的に連結される。本明細書に記載のリンカーのいずれも、使用されてもよい。いくつかの態様において、分子ペイロードがオリゴヌクレオチドである場合、リンカーは、オリゴヌクレオチドの5'末端、3'末端、または内部へ連結されている。いくつかの態様において、リンカーは、チオール反応性の連結を介して(例として、抗TfR抗体中のシステインを介して)抗TfR抗体へ連結されている。いくつかの態様において、リンカー(例として、Val-citリンカー)は、抗体(例として、本明細書に記載の抗TfR抗体)へアミン基を介して(例として、抗体中のリシンを介して)連結されている。いくつかの態様において、分子ペイロードは、オリゴヌクレオチド(例として、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチド)である。
Val-citリンカーを介して分子ペイロードに共有結合的に連結された抗TfR抗体を含む複合体の構造の例が、以下に提供され、
Figure 2023535074000040
 式中、リンカーは、チオール反応性連結を介して(例として、抗体中のシステインを介して)抗体に連結されている。いくつかの態様において、分子ペイロードは、オリゴヌクレオチド(例として、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチド)である。
Val-citリンカーを介して分子ペイロードに共有結合的に連結された抗TfR抗体を含む複合体の構造の別の例が、以下に提供され、
Figure 2023535074000041
 式中、nは0～10の間の数であり、mは0～10の間の数であり、リンカーはアミン基(例として、リジン残基上の)を介して抗体へ連結され、および/または(例として、および)リンカーはオリゴヌクレオチドへ(例として、5'末端、3'末端、または内部に)連結される。いくつかの態様において、リンカーはリジンを介して抗体へ連結され、リンカーはオリゴヌクレオチドに5'末端にて連結され、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、分子ペイロードは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むオリゴヌクレオチドであり、リンカーは、5'末端または3'末端でセンス鎖またはアンチセンス鎖に連結される。いくつかの態様において、分子ペイロードは、オリゴヌクレオチド(例として、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチド)である。
抗体は、種々の化学量論で分子ペイロードへ連結され得ることが解されるはずであって、その特性は薬物抗体比(DAR)と称されてもよく、「薬物」は分子ペイロードである。いくつかの態様において、1つの分子ペイロードが抗体へ連結されている(DAR＝1)。いくつかの態様において、2つの分子ペイロードが抗体へ連結されている(DAR＝2)。いくつかの態様において、3つの分子ペイロードが抗体へ連結されている(DAR＝3)。いくつかの態様において、4つの分子ペイロードが抗体へ連結されている(DAR＝4)。いくつかの態様において、各々が異なるDARを有する異なる複合体の混合物が提供される。いくつかの態様において、かかる混合物中の複合体の平均DARは、1～3、1～4、1～5以上の範囲にあってもよい。DARは、分子ペイロードを抗体上の種々の部位へ抱合させることによって、および/または(例として、および)、マルチマーを抗体上の1以上の部位へ抱合させることによって、増大されてもよい。例えば、2のDARは、単一分子ペイロードを抗体上の2つの異なる部位へ抱合させることによって、または二量体分子ペイロードを抗体の単一部位へ抱合させることによって、達成されてもよい。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードに共有結合的に連結された本明細書に記載の抗TfR抗体(例として、IgGまたはFab形態の表2に提供される3-A4、3-M12および5-H12抗体)を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、リンカー(例として、Val-citリンカー)を介して分子ペイロードに共有結合的に連結された、本明細書に記載の抗TfR抗体(例として、IgGまたはFab形態の表2に提供される3-A4、3-M12および5-H12抗体)を含む。いくつかの態様において、リンカー(例として、Val-citリンカー)は、チオール反応性の連結を介して(例として、抗体中のシステインを介して)、抗体(例として、本明細書に記載される抗TfR抗体)へ連結されている。いくつかの態様において、リンカー(例として、Val-citリンカー)は、抗体(例として、本明細書に記載の抗TfR抗体)へアミン基を介して(例として、抗体中のリシンを介して)連結されている。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体の例のいずれか1つにおいて、分子ペイロードは、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体の例のいずれか1つにおいて、分子ペイロードは、表1に記載される遺伝子標的配列のいずれか1つに対して少なくとも15ヌクレオチドの相補性領域を含むオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、表2に示されるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3と同じであるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3と;表2に示されるCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3と同じCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3とを含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号69、配列番号71または配列番号72のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号70のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、オリゴヌクレオチド(例として、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチド)である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号73または配列番号76のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号74のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、オリゴヌクレオチド(例として、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチド)である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号73または配列番号76のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号75のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、オリゴヌクレオチド(例として、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチド)である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号77を含むVHおよび配列番号78のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、オリゴヌクレオチド(例として、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチド)である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号77または配列番号79のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号80のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、オリゴヌクレオチド(例として、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチド)である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号84、配列番号86または配列番号87のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、オリゴヌクレオチド(例として、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチド)である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号88または配列番号91のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号89のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、オリゴヌクレオチド(例として、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチド)である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号88または配列番号91のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、オリゴヌクレオチド(例として、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチド)である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号92または配列番号94のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号95のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、オリゴヌクレオチド(例として、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチド)である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号92のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号93のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、オリゴヌクレオチド(例として、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチド)である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号97、配列番号98または配列番号99のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号85のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、オリゴヌクレオチド(例として、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチド)である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号100または配列番号101のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号89のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、オリゴヌクレオチド(例として、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチド)である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号100または配列番号101のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、オリゴヌクレオチド(例として、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチド)である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号102のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号93のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、オリゴヌクレオチド(例として、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチド)である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の複合体は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号102または配列番号103のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号95のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、分子ペイロードは、オリゴヌクレオチド(例として、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチド)である。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号84のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535074000042
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号86のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535074000043
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号87のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535074000044
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号88のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号89のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535074000045
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号88のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535074000046
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号91のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号89のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535074000047
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号91のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535074000048
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号92のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号93のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535074000049
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号94のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号95のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535074000050
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR抗体を含み、抗TfR抗体は、配列番号92のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号95のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535074000051
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR Fabを含み、抗TfR Fabは、配列番号69のアミノ酸配列を含むVHと、配列番号70のアミノ酸配列を含むVLとを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535074000052
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR Fabを含み、抗TfR Fabは、配列番号71のアミノ酸配列を含むVHと、配列番号70のアミノ酸配列を含むVLとを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535074000053
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR Fabを含み、抗TfR Fabは、配列番号72のアミノ酸配列を含むVHと、配列番号70のアミノ酸配列を含むVLとを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535074000054
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR Fabを含み、抗TfR Fabは、配列番号73のアミノ酸配列を含むVHと、配列番号74のアミノ酸配列を含むVLとを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535074000055
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR Fabを含み、抗TfR Fabは、配列番号73のアミノ酸配列を含むVHと、配列番号75のアミノ酸配列を含むVLとを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535074000056
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR Fabを含み、抗TfR Fabは、配列番号76のアミノ酸配列を含むVHと、配列番号74のアミノ酸配列を含むVLとを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535074000057
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR Fabを含み、抗TfR Fabは、配列番号76のアミノ酸配列を含むVHと、配列番号75のアミノ酸配列を含むVLとを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535074000058
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR Fabを含み、抗TfR Fabは、配列番号77のアミノ酸配列を含むVHと、配列番号78のアミノ酸配列を含むVLとを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535074000059
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR Fabを含み、抗TfR Fabは、配列番号79のアミノ酸配列を含むVHと、配列番号80のアミノ酸配列を含むVLとを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535074000060
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR Fabを含み、抗TfR Fabは、配列番号77のアミノ酸配列を含むVHと、配列番号80のアミノ酸配列を含むVLとを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535074000061
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR Fabを含み、抗TfR Fabは、配列番号97のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535074000062
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR Fabを含み、抗TfR Fabは、配列番号98のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535074000063
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR Fabを含み、抗TfR Fabは、配列番号99のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535074000064
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR Fabを含み、抗TfR Fabは、配列番号100のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号89のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535074000065
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR Fabを含み、抗TfR Fabは、配列番号100のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535074000066
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR Fabを含み、抗TfR Fabは、配列番号101のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号89のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535074000067
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR Fabを含み、抗TfR Fabは、配列番号101のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535074000068
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR Fabを含み、抗TfR Fabは、配列番号102のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号93のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535074000069
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR Fabを含み、抗TfR Fabは、配列番号103のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号95のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535074000070
 式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結された抗TfR Fabを含み、抗TfR Fabは、配列番号102のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号95のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含み、複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023535074000071
式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、表1に列挙された遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、本明細書中に記載される複合体の例のいずれか1つにおいて、L1は、本明細書中に記載されるスペーサーのいずれか1つである。
いくつかの態様において、L1は、
Figure 2023535074000072
 であり、式中、ピペラジン部分はオリゴヌクレオチドに連結しており、L2は
Figure 2023535074000073
 である。
いくつかの態様において、L1は
Figure 2023535074000074
 であり、式中、ピペラジン部分はオリゴヌクレオチドに連結している。
いくつかの態様において、L1は
Figure 2023535074000075
 である。
いくつかの態様において、L1は、オリゴヌクレオチドの5'ホスファートへ連結される。
いくつかの態様において、L1は、任意である(例として、存在する必要はない)。
III.製剤
本明細書に提供される複合体は、いずれの好適なやり方でも製剤化されていてよい。一般に、本明細書に提供される複合体は、医薬への使用に好適なやり方で製剤化されている。例えば、複合体は、分解を最小限に抑え、送達および/または(例として、および)取り込みを容易にする製剤を使用して、対象へ送達され得るか、あるいは、製剤中の複合体へ別の有益な特性を提供する。いくつかの態様において、本明細書に提供されるのは、複合体および薬学的に許容し得る担体を含む組成物である。かかる組成物は、対象の標的細胞周囲の環境中または対象の全身のいずれかへ投与されたとき充分量の複合体が標的筋細胞に侵入できるように、好適に製剤化され得る。いくつかの態様において、複合体は、リン酸緩衝生理食塩溶液などの緩衝溶液中、リポソーム中、ミセル構造体中、およびカプシド中に製剤化される。
いくつかの態様において、組成物が、本明細書に提供される複合体の1以上の構成要素(例として、筋標的化剤、リンカー、分子ペイロード、またはこれらのいずれか1つの前駆体分子)を個別に包含していてもよいことは解されるはずである。
いくつかの態様において、複合体は、水中または水性溶液(例として、pH調整された水)中に製剤化される。いくつかの態様において、複合体は、塩基性緩衝水性溶液(例として、PBS)中に製剤化される。いくつかの態様において、本明細書に開示のとおりの製剤は、賦形剤を含む。いくつかの態様において、賦形剤は、組成物へ、改善された安定性、改善された吸収、改善された可溶性、および/または(例として、および)、活性成分の治療増強を付与する。いくつかの態様において、賦形剤は、緩衝剤(例として、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、トリス塩基、もしくは水酸化ナトリウム)、またはビヒクル(例として、緩衝溶液、ワセリン、ジメチルスルホキシド、または鉱油)である。
いくつかの態様において、複合体またはその構成要素(例として、オリゴヌクレオチドまたは抗体)は、その貯蔵寿命を延長するため凍結乾燥され、次いで使用(例として、対象への投与)前に溶液にさせられる。結果的に、本明細書に記載の複合体またはその構成要素を含む組成物中の賦形剤は、凍結保護剤(lyoprotectant)(例として、マンニトール、ラクトース、ポリエチレングリコール、もしくはポリビニルピロリドン)、または崩壊温度修飾因子(例として、デキストラン、フィコール、もしくはゼラチン)であってもよい。
いくつかの態様において、医薬組成物は、その意図された投与ルートに適合するよう製剤化されている。投与ルートの例は、非経口投与、例として、静脈内投与、皮内投与、皮下投与を包含する。典型的には、投与ルートは、静脈内投与または皮下投与である。いくつかの態様において、投与ルートは、筋肉外非経口投与である。
注射剤への使用に好適な医薬組成物は、滅菌水性溶液(ここで水に可溶性である)または分散溶液、および滅菌注射剤溶液または分散溶液の即時調製のための滅菌粉末を包含する。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)、および好適なそれらの混合物を含有する溶媒または分散媒体であり得る。いくつかの態様において、製剤は、組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、および塩化ナトリウムを包含する。滅菌注射剤溶液は、要求量の複合体を、上に列挙された成分の1つまたはそれらの組み合わせと共に、選択された溶媒に組み込むこと、要求に応じ、これに続き濾過滅菌することによって調製され得る。
いくつかの態様において、組成物は、活性成分(単数または複数)のパーセンテージが組成物全体の重量または体積の約1％と約80％以上との間であってもよいが、少なくとも約0.1％の複合体もしくはその構成要素を含有していてもよい。可溶性、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与ルート、産物の貯蔵寿命などの因子、ならびに他の薬理学的留意事項は、かかる医薬製剤を調製する当業者によって企図されるであろう。そのため様々な投薬量および処置計画が所望されることもある。
IV.使用/処置の方法
本明細書に記載のとおりの分子ペイロードへ共有結合的に連結された筋標的化剤を含む複合体は、筋疾患(例として、希少な筋疾患)を処置するのに有効である。いくつかの態様において、複合体は、表1に提供される筋疾患を処置するのに有効である。いくつかの態様において、筋疾患は、疾患アレルに関連しており、例えば、具体的な筋疾患の疾患アレルは、表1に挙げられた対応する遺伝子において遺伝子変化を含んでいてもよい。
いくつかの態様において、対象は、ヒト対象、霊長目の非ヒト動物対象、齧歯類動物対象、またはいずれの好適な哺乳類の動物対象であってもよい。いくつかの態様において、対象は、表1に提供された筋疾患を有してもよい。
本開示の側面は、本明細書に記載のとおりの有効量の複合体を対象へ投与することを伴う方法を包含する。いくつかの態様において、分子ペイロードへ共有結合的に連結された筋標的化剤を含む複合体を含む有効量の医薬組成物は、処置を必要とする対象へ投与され得る。いくつかの態様において、本明細書に記載のとおりの複合体を含む医薬組成物は、静脈内投与を包含してもよい好適なルートによって、例として、ボーラスとして、またはある期間にわたる連続注入によって、投与されてもよい。いくつかの態様において、静脈内投与は、筋肉内の、腹腔内の、脳脊髄内の(intracerebrospinal)、皮下の、関節内の、滑液嚢内の、または髄腔内のルートによって実施されてもよい。いくつかの態様において、医薬組成物は、固体形態、水性形態、または液体形態であってもよい。いくつかの態様において、水性または液体形態は、噴霧されてもよく、または凍結乾燥されてもよい。いくつかの態様において、噴霧形態または凍結乾燥形態は、水性または液体溶液で再構成されてもよい。
静脈内投与のための組成物は、植物油、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、乳酸エチル、炭酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、エタノール、およびポリオール(グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど)などの様々な担体を含有していてもよい。静脈内注射のための水可溶性抗体は点滴法によって投与され得、これによって抗体および薬学的に許容し得る賦形剤を含有する医薬製剤が注入される。生理学的に許容し得る賦形剤は、例えば、5％デキストロース、0.9％生理食塩水、リンガー溶液、または他の好適な賦形剤を包含していてもよい。筋肉内用調製物、例として、抗体の好適な可溶性の塩形態の滅菌製剤は、注射用水、0.9％生理食塩水、または5％グルコース溶液などの医薬賦形剤に溶解されて投与され得る。
いくつかの態様において、分子ペイロードへ共有結合的に連結されたた筋標的化剤を含む複合体を含む医薬組成物は、部位特異的または局部的な送達技法を介して投与される。これらの技法の例は、複合体の埋め込み型デポー供給源、局部送達カテーテル、部位特異的担体、直接注射、または直塗り(direct application)を包含する。
いくつかの態様において、分子ペイロードへ共有結合的に連結された筋標的化剤を含む複合体を含む医薬組成物は、治療効果を対象に付与する有効濃度にて投与される。有効量は、当業者によって認識されるとおり、疾患の重症度、処置される対象の特有な特徴、例として、年齢、体調、健康状態、または体重、処置時間、いずれの併用治療の性質、投与ルート、および関連因子に応じて変動する。これらの関連因子は当業者に知られており、わずかな定型的実験法で対処され得る。いくつかの態様において、有効濃度は、患者に安全であると見なされる最大用量である。いくつかの態様において、有効濃度は、最大限の効き目を提供する、実行可能な最低濃度であろう。
経験的考察、例として、対象における複合体の半減期は一般に、処置のために使用される医薬組成物の濃度の決定に寄与するであろう。投与頻度は、処置の効き目を最大化するために経験的に決定かつ調整されてもよい。
一般に、本明細書に記載の複合体のいずれかの投与について、当初の候補投薬量は、上に記載の因子、例として、安全性または有効性に応じて、約1～100mg/kgであってもよく、またはこれより多くてもよい。いくつかの態様において、処置は、一度施されるであろう。いくつかの態様において、処置は、毎日、隔週、毎週、隔月、毎月、または対象へ最大の効き目を提供しつつ安全性へのリスクを最小に抑えるいずれの時間間隔にて、施されるであろう。一般に、有効性ならびに処置および安全性へのリスクは、処置過程を通してずっと監視されることもある。
処置の効き目は、いずれか好適な方法を使用して査定されてもよい。いくつかの態様において、処置の効き目は、筋疾患に関連する症状の所見の評価よって査定されてもよい。
いくつかの態様において、本明細書に記載の分子ペイロードへ共有結合的に連結された筋標的化剤を含む複合体を含む医薬組成物は、対照(例として、処置に先立つ遺伝子発現のベースラインレベル)と比べて、標的遺伝子の活性または発現を少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、または少なくとも95％阻害するのに充分な有効濃度にて、対象へ投与される。
いくつかの態様において、本明細書に記載の分子ペイロードへ共有結合的に連結された筋標的化剤を含む複合体を含む医薬組成物の対象への単回投薬または投与は、少なくとも1～5日間、1～10日間、5～15日間、10～20日間、15～30日間、20～40日間、25～50日間、またはこれより長い期間、標的遺伝子の活性または発現を阻害するのに充分である。いくつかの態様において、本明細書に記載の分子ペイロードへ共有結合的に連結された筋標的化剤を含む複合体を含む医薬組成物の対象への単回投薬または投与は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12週間、標的遺伝子の活性または発現を阻害するのに充分である。いくつかの態様において、本明細書に記載の分子ペイロードへ共有結合的に連結された筋標的化剤を含む複合体を含む医薬組成物の対象への単回投薬または投与は、少なくとも1、2、3、4、5、または6カ月間、標的遺伝子の活性または発現を阻害するのに充分である。
いくつかの態様において、医薬組成物は、分子ペイロードへ共有結合的に連結された筋標的化剤を含む、1種より多くの複合体を含んでいてもよい。いくつかの態様において、医薬組成物は、対象、例として、筋疾患(例として、表1で提供された筋疾患)を有するヒト対象の処置のためのいずれか他の好適な治療剤をさらに含んでいてもよい。いくつかの態様において、他の治療剤は、本明細書に記載の複合体の有効性を増強または補完するものであってもよい。いくつかの態様において、他の治療剤は、本明細書に記載の複合体とは異なる症状または疾患を処置するよう機能してもよい。
例1:トランスフェクトされたアンチセンスオリゴヌクレオチドでのDMPKの標的化
DMPK(ASO300)の野生型および変異アレルの両方を標的にするgapmerアンチセンスオリゴヌクレオチドは、不死化細胞株中DMPKの発現レベルを低減する能力についてin vitroで試験された。手短に言えば、Hepa1-6細胞が、リポフェクタミン2000で製剤化されたASO300(100nM)をトランスフェクトされた。DMPK発現レベルを、トランスフェクションを受けてから72時間評価した。ビヒクル(リン酸緩衝生理食塩水)を培養中Hepa1-6細胞へ送達して細胞を72時間維持した、対照実験もまた実施した。図1に示されるとおり、ASO300はDMPK発現レベルを対照と比較して約90％低減させたことがわかった。
例2:筋標的化複合体でのDMPKの標的化
カテプシン切断可能なリンカーを介して、抗トランスフェリン受容体抗体であるDTX-A-002(RI7 217(Fab))へ共有結合的に連結された、例1に使用されたDMPK ASO(ASO300)を含む筋標的化複合体が生成された。
手短に言えば、マレイミドカプロイル-L-バリン-L-シトルリン-p-アミノベンジルアルコールp-ニトロフェニルカーボナート(MC-Val-Cit-PABC-PNP)リンカー分子は、アミドカップリング反応を使用して、NH2-C6-ASO300へカップリングされた。過剰なリンカーおよび有機溶媒はゲル浸透クロマトグラフィーによって除去した。次いで、精製されたVal-Cit-リンカー-ASO300は、チオール-反応性の抗トランスフェリン受容体抗体(DTX-A-002)へカップリングされた。
抗体カップリング反応の産物は、次いで疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC-HPLC)へ供された。図2Aは、得られたHIC-HPLCトレースを示し、そのトレースの画分B7～C2(縦線によって示される)は、SDS-PAGEによって決定されるように、DTX-A-002に共有結合的に付着された1つまたは2つのDMPK ASO分子を含む抗体-オリゴヌクレオチド複合体(DTX-C-008と呼ばれる)を含んでいた。これらのHIC-HPLC画分を合わせ、さらなる精製後のデンシトメトリーにより、DTX-C-008複合体のこのサンプルが1.48の平均ASO対抗体比(DAR)を有することを確認した。SDS-PAGE分析は、DTX-C-008複合体のこのサンプルの86.4％が、1つまたは2つのDMPK ASO分子のいずれかに連結されたDTX-A-002を含むことを実証した(図2B)。
上記と同じ方法を使用して、Val-Citリンカーを介してIgG2a(Fab)抗体(DTX-C-007)へ共有結合的に連結された、例1で使用されたDMPK ASO(ASO300)を含む対照複合体を生成した。
次いで、精製されたRI7 217 Fab抗体-ASO複合体(DTX-C-008)は、細胞内在化およびDMPKの阻害について試験された。トランスフェリン受容体の相対的に高い発現レベルを有するHepa1-6細胞を、ビヒクル対照、DTX-C-008(100nM)、またはDTX-C-007(100nM)の存在下で72時間インキュベートした。72時間インキュベーションの後、細胞を単離してDMPKの発現レベルについてアッセイした(図3)。DTX-C-008で処置された細胞は、ビヒクル対照で処置された細胞と比べて、DMPK発現の約65％の低減を実証した。その一方で、DTX-C-007で処置された細胞は、ビヒクル対照(DMPK発現における低減なし)に匹敵するDMPK発現レベルを有した。これらのデータは、DTX-C-008の抗トランスフェリン受容体抗体が複合体の細胞内在化を可能にし、それによってDMPK ASOがDMPKの発現を阻害できることを示唆する。
例3:筋標的化複合体でのマウス筋組織中DMPKの標的化
例2に記載の筋標的化複合体であるRI7 217 Fab抗体-ASO複合体DTX-C-008は、マウス組織中DMPKの阻害について試験された。C57BL/6野生型マウスは、ビヒクル対照、ネイキッドASO300(3mg/kgのASO)、DTX-C-008(3mg/kgのASO、抗体抱合体20mg/kgに相当する)、またはDTX-C-007 IgG2a Fab抗体-ASO複合体(3mg/kgのASO、抗体抱合体20mg/kgに相当する)の単回用量を静脈内注射された。ネイキッドASO300、例1に記載のDMPK ASOが対照として使用された。各実験条件を3匹の個々のC57BL/6野生型マウスにおいて再現した。注射から7日の期間後に、マウスを安楽死させ、細分して単離された組織型とした。続いて個々の組織試料をDMPKの発現レベルについてアッセイした(図4A～4Eおよび5A～5B)。
DTX-C-008複合体で処置されたマウスは、様々な骨格、心、および平滑筋組織におけるDMPK発現の低減を実証した。例えば、図4A～4Eに示されるとおり、DMPK発現レベルは、ビヒクル対照で処置されたマウスと比べて、腓腹筋(50％低減)、心臓(30％低減)、食道(45％低減)、前脛骨筋(47％低減)、およびヒラメ筋(31％低減)組織において有意に低減された。その一方で、DTX-C-007複合体で処置されたマウスは、アッセイされたすべての筋組織型について、ビヒクル対照マウスおよびネイキッドASO300で処置されたマウス(DMPK発現における低減なし)に匹敵するDMPK発現レベルを有した。
DTX-C-008複合体で処置されたマウスは、脾臓および脳組織などの非筋組織においてDMPK発現の無変化を実証した(図5Aおよび5B)。
これらのデータは、DTX-C-008の抗トランスフェリン受容体抗体がin vivoマウスモデルで複合体の筋肉特異的組織中への細胞内在化を可能にし、それによってDMPK ASOがDMPKの発現を阻害できることを示唆している。これらのデータは、DTX-C-008複合体が、筋組織を特異的に標的にすることが可能であることをさらに実証する。
例4:筋標的化複合体でのマウス筋組織中DMPKの標的化
例2に記載の筋標的化複合体であるRI7 217 Fab抗体-ASO複合体DTX-C-008は、マウス組織中DMPKの用量依存的阻害について試験された。C57BL/6野生型マウスは、ビヒクル対照(リン酸緩衝生理食塩水、PBS)、ネイキッドASO300(10mg/kgのASO)、DTX-C-008(3mg/kgまたは10mg/kgのASO、ここで3mg/kgは、抗体抱合体20mg/kgに相当する)、またはDTX-C-007 IgG2a Fab抗体-ASO複合体(3mg/kgまたは10mg/kgのASO、ここで3mg/kgは、抗体抱合体20mg/kgに相当する)の単回用量を静脈内注射された。ネイキッドASO300、例1に記載のDMPK ASOが対照として使用された。各実験条件を5匹の個々のC57BL/6野生型マウスにおいて再現した。注射から7日の期間後に、マウスを安楽死させ、細分して単離された組織型とした。続いて個々の組織試料をDMPKの発現レベルについてアッセイした(図6A～6F)。
DTX-C-008複合体で処置されたマウスは、様々な骨格筋組織におけるDMPK発現の低減を実証した。図6A～6Fに示されるとおり、DMPK発現レベルは、ビヒクル対照で処置されたマウス、前脛骨筋(3mg/kgおよび10mg/kgのDTX-C-008について夫々、58％および75％低減)、ヒラメ筋(3mg/kgおよび10mg/kgのDTX-C-008について夫々、55％および66％低減)、長指伸筋(EDL)(3mg/kgおよび10mg/kgのDTX-C-008について夫々、52％および72％低減)、腓腹筋(3mg/kgおよび10mg/kgのDTX-C-008について夫々、55％および77％低減)、心臓(3mg/kgおよび10mg/kgのDTX-C-008について夫々、19％および35％低減)、および横隔膜(3mg/kgおよび10mg/kgのDTX-C-008について夫々、53％および70％低減)組織において、優位に低減された。注目すべきことに、アッセイされたすべての筋組織型は、3mg/kg抗体抱合体と比べて、10mg/kg抗体抱合体でDMPKレベルのより大きな低減を伴う、DMPKの用量依存性阻害を経験した。
その一方で、対照DTX-C-007複合体で処置されたマウスは、アッセイされたすべての筋組織型について、ビヒクル対照(DMPK発現における低減なし)に匹敵するDMPK発現レベルを有した。
これらのデータは、DTX-C-008の抗トランスフェリン受容体抗体がin vivoマウスモデルで複合体の筋肉特異的組織中への細胞内在化を可能にし、それによってDMPK ASOがDMPKの発現を阻害できることを示唆している。これらのデータは、DTX-C-008複合体が、DMPKの用量依存的阻害のために、筋組織を特異的に標的にすることが可能であることをさらに実証する。
例5:筋標的化複合体でのカニクイザル筋組織中DMPKの標的化
ASO300(DTX-C-012)を含む筋標的化複合体は、例2に記載の方法を使用して生成および精製された。DTX-C-012は、DMPKを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドであるASO300に、カテプシン切断可能Val-Citリンカーを介して共有結合的に連結されたヒト抗トランスフェリン受容体抗体を含む複合体である。DTX-C-012で使用される抗TfR抗体は、カニクイザルおよびヒトTfR1と交差反応性である。HIC-HPLC精製およびさらなる精製に続き、デンシトメトリーは、DTX-C-012が平均1.32というASOの対抗体比を有したことを確認し、SDS-PAGEは92.3％という純度を明らかにした。
DTX-C-012は、オスのカニクイザル組織中DMPKの阻害について試験された。オスのカニクイザル(19-31月齢;2～3kg)は、0日目に単回用量の生理食塩水対照、ネイキッドASO300(10mg/kgのASO)、またはDTX-C-012(10mg/kgのASO)を静脈内注射された。各実験条件を3匹の個々のオスのカニクイザルにおいて再現した。注射から7日目に、組織生検材料(筋組織を含有する)を採取した。DMPK mRNA発現レベル、ASO検出アッセイ、血清臨床化学、組織組織学、臨床所見、および体重を分析した。サルを14日目に安楽死させた。
生理食塩水対照と比べて、DTX-C-012を使用するDMPK mRNA発現の有意なノックダウン(KD)がヒラメ筋、深指屈筋、および咬筋において夫々、39％KD、62％KD、および41％KDで観察された(図7A～7C)。DTX-C-012によるDMPK mRNA発現の堅固なノックダウンが、腓腹筋(62％KD;図7D)、EDL(29％KD;図7E)、前脛骨筋筋肉(23％KD;図7F)、横隔膜(54％KD;図7G)、舌(43％KD;図7H)、心臓筋肉(36％KD;図7I)、四頭筋(58％KD;図7J)、二頭筋(51％KD;図7K)、および三角筋(47％KD;図7L)においてさらに観察された。平滑筋におけるDTX-C-012によるDMPK mRNA発現のノックダウンが、腸においてもまた、空腸-十二指腸末端で63％KD(図8A)および回腸で70％KDを伴って、観察された(図8B)。注目すべきことに、ネイキッドDMPK ASO300(すなわち、筋標的化剤へ連結されていない)は、アッセイされたほとんどの筋組織型について、ビヒクル対照(すなわち、DMPK発現がほとんどまたは全く低減されない)と比べて、DMPK発現レベルにおいて最小限の効果を有した。DTX-C-012複合体で処置されたサルは、腎臓、脳、および脾臓組織などのほとんどの非筋組織においてDMPK発現の無変化を実証した(図9A～図9D)。追加の組織を、カニクイザルにおける数個の組織型にわたって正規化されたDMPK mRNA組織発現レベルを示す図10において描かれたとおり、調べた。(N＝3匹のオスのカニクイザル)
安楽死に先立ち、すべてのサルを、網状赤血球レベル、血小板レベル、ヘモグロビン発現、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)発現、アスパルタートアミノトランスフェラーゼ(AST)発現、および血液尿素窒素(BUN)レベルについて、投薬後2、7、および14日目に試験した。図12に示されるように、抗体-オリゴヌクレオチド複合体を投与されたサルは、実験の期間全体を通して、正常な網状赤血球レベル、血小板レベルおよびヘモグロビン発現を有していた。DTX-C-012を投与されたサルもまた、実験の全期間を通して、正常なアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)発現、アスパルタートアミノトランスフェラーゼ(AST)発現、および血液尿素窒素(BUN)レベルを有した。これらのデータは、ASO300を含む複合体の単回用量が、カニクイザルにおいて安全で許容されることを示す。
これらのデータは、DTX-C-012複合体の抗トランスフェリン受容体抗体がin vivoカニクイザルモデルで複合体の筋肉特異的組織中への細胞内在化を可能にし、それによってDMPK ASO(ASO300)がDMPKの発現を阻害できることを実証している。これらのデータは、DTX-C-012複合体が、DMPKの用量依存的阻害のために、非筋組織に実質的な影響を与えることなく、筋組織を特異的に標的にすることが可能であることをさらに実証する。これは、(筋標的化剤へ連結されていない)ネイキッドDMPK ASO300の、in vivoカニクイザルモデルの筋組織でのDMPKの発現を阻害する限定的な能力との直接的な対比である。
例6:筋標的化複合体でのマウス筋組織中DMPKの標的化
例2に記載のRI7 217 Fab抗体-ASO筋標的化複合体、DTX-C-008は、マウス組織におけるDMPKの時間依存的な阻害について試験された。C57BL/6野生型マウスは、表10に記載されたとおり、単回用量のビヒクル対照(生理食塩水)、ネイキッドASO300(10mg/kgのASO)、またはDTX-C-008(10mg/kgのASO)を静脈内注射され、所定期間後に安楽死された。安楽死に続き、マウスを細分し単離された組織型とし、続いて組織試料をDMPKの発現レベルについてアッセイした(図11A～11B)。
表10.実験条件
Figure 2023535074000076
 DTX-C-008複合体で処置されたマウスは、群9～12(注射および安楽死の間3～28日)のすべてについて、ビヒクルと比べて、腓腹筋(図11A)および前脛骨筋(図11B)において、DMPK発現のおよそ50％低減を実証した。ネイキッドASO300オリゴヌクレオチドで処置されたマウスは、DMPK発現における有意な低減を実証しなかった。
例7:筋標的化複合体でのマウス筋組織中DMPKの標的化
例2に記載のRI7 217 Fab抗体-ASO筋標的化複合体、DTX-C-008は、in vivoでのマウス組織におけるDMPKの時間依存的な阻害について試験された。C57BL/6野生型マウスは、表11に記載されるとおり、単回用量のビヒクル対照(リン酸緩衝生理食塩水(PBS))、ネイキッドアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO300)(10mg/kgのASO)、DTX-C-007 IgG2a Fab抗体-ASO対照複合体(10mg/kgのASO)、またはDTX-C-008(10mg/kgのASO)を第0日に静脈注射され、所定の時間の期間後に安楽死された。各実験条件のマウスの1つの群は4週(第28日)に第2の用量(複数回用量群)に付した。安楽死後マウスを単離された組織型にセグメンテーションし、続いて前脛骨筋および腓腹筋組織の試料をDMPKの発現レベルについてアッセイした(図13A～13B)。
表11.実験条件
Figure 2023535074000077
ビヒクルと比べて、RI7 217 Fab抗体-ASO DTX-C-008複合体で処置されたマウスは、前脛骨筋のDMPK発現の約50～60％低減(図13A)および腓腹筋のDMPK発現の約30～50％低減(図13B)を群16～20のすべて(注射および安楽死の間は2～12週)について実証した。これらのデータは、筋標的化複合体DTX-C-008の単回用量が、複合体の投与後少なくとも12週間DMPKの発現を低減することを示す。
対照的に、ネイキッドアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは対照複合体で処置されたマウスは、すべての実験群および組織においてDMPK発現の有意な阻害を実証しなかった。
これらのデータは、本明細書に記載のとおりの筋標的化複合体が、該筋標的化複合体の単回の投薬または投与後、最大12週間までin vivoでのDMPK発現の持続的阻害を提供することが可能であることを実証する。
例8:筋標的化複合体は、核内の遺伝子発現を標的にし得る
例2に記載のRI7 217 Fab抗体-ASO筋標的化複合体、DTX-C-008は、マウス筋組織において核保持されたDMPK RNAの阻害について試験された。この例に使用されるマウスは、ヒト突然変異体DMPK遺伝子(図14Aに示す概略図)-350 CTG反復領域および下流のCに代えてGの一塩基多型を有するDMPKを発現するように操作されている。図14Aに示されるとおり、ヒト突然変異体DMPK RNAは核に保持され、マウス野生型DMPK RNAは細胞質および核内に所在する。
マウスは、単回用量のビヒクル対照(生理食塩水)、IgG2a Fab-ASO対照複合体DTX-C-007(10mg/kgのASO)、ネイキッドASO300(10mg/kgのASO)、またはDTX-C-008(10mg/kgのASO)を静脈注射され、14日後に安楽死された。6匹のマウスを各実験条件において処置した。安楽死後マウスを、単離された組織型にセグメント化し、続いて組織試料を突然変異体および野生型DMPKの発現レベルについてアッセイした(図14B)。
筋標的化複合体DTX-C-008で処置されたマウスは、核保持された突然変異体DMPKと野生型DMPKとの両方の統計的に有意な低減を実証した(p値＜0.05)。これらのデータは、本明細書に記載のとおりの筋標的化複合体が核内DMPKを標的にすることが可能であることを実証している。
例9:筋標的化複合体は、HSALRマウスモデルにおいて筋強直症を退行させる
カテプシン切断可能なリンカーを介して抗トランスフェリン受容体抗体DTX-A-002(RI7 217 Fab)へ共有結合的に連結された、アクチンを標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)を含む筋標的化複合体(DTX-アクチン)が生成された。
アクチン-標的化ASOはMOE 5-10-5 gapmerであり、これは、以下:5'-NH2-(CH2)6dA*oC*oC*oA*oT*oT*dT*dT*dC*dT*dT*dC*dC*dA*dC*dA*oG*oG*oG*oC*oT-3(配列番号131)を含み;ここで「*」はPS連結を表し;「d」はデオキシ核酸を表し;「o」は2'-MOEを表す。
次いで、ヒトDM1患者で観察されるものに類似の機能的な筋強直症表現型を有するマウスモデルのHSALRマウスにおいて、DTX-アクチンを、標的遺伝子発現(hACTA1)を低減および筋強直症を低減するその能力について試験した。HSALRマウスモデルの詳細は、Mankodi,A.et al.Science.289:1769,2000に記載されているとおりである。HSALRマウスは、単回用量のPBSまたはDTX-アクチン(10mg/kgまたは20mg/kg ASO当量のどちらか)を静脈注射された。これらの3つの実験条件の各々は2匹の個々のマウスにおいて反復した。注射後の第14日に、マウスを安楽死させ、特異的な筋肉の四頭筋(quad)、腓腹筋(gastroc)、および前脛骨筋(TA)を収集した。筋組織をhACTA1の発現について分析した。ビヒクル対照と比べて、DTX-アクチンはhACTA1発現の低減をすべての3つの筋組織において実証した(図15A)。
注射後の第14日に、上に記載の安楽死および組織収集に先立って、筋電図法(EMG)を特定の筋肉について行った。EMG筋強直性放電は盲検化された評価者によって4点スケールでグレード分類された:0、筋強直症なし;1、針刺入の50％未満において時たまの筋強直性放電;2、針刺入の50％超において筋強直性放電;および3:ほとんど刺入毎に筋強直性放電である。ビヒクル対照と比べて、DTX-アクチンはすべての3つの筋組織においてグレード分類された筋強直症の低減を実証した(図15B)。20mg/kg ASO当量の用量のDTX-アクチンで処置されたマウスは、四頭筋および腓腹筋において筋強直症なしからほとんどなしを実証した。
これらのデータは、筋標的化複合体の単回用量が、ヒトDM1患者で観察されるものに類似の機能的な筋強直症表現型を有するマウスモデルのHSALRマウスにおいて、遺伝子特異的な標的化および機能的な筋強直症の低減が可能であることを実証している。
例10:筋標的化複合体は、DM1マウスモデルの不整脈を機能的に修正し得る
例2に記載のRI7 217 Fab抗体-ASO筋標的化複合体DTX-C-008は、DM1マウスモデルの不整脈を機能的に修正するその能力について試験された。この例に使用されたマウスは、ミオシン重鎖リバースtetトランス活性化因子(MHC rtTA)を発現するマウスおよびヒトDMPKの突然変異体形態(CUG960)を発現するマウスの産仔である。図16Aは、変異導入遺伝子のゲノムコントラクトを示す。
生後第1日に始まるドキシサイクリン含有の固形飼料(chow)(2gドキシサイクリン/kg固形飼料、Bio-Serv)を、当初は授乳する母獣(dam)から、続いて離乳後には固形飼料からマウスに提供して、心臓における突然変異体DMPKの選択的発現を誘導した。「Doxオフ対照」群を例外として、すべてのマウスは、研究の過程全体においてドキシサイクリンを含有する固形飼料によって維持された。12週齢で、すべてのマウスはベースラインの投薬前ECG評価を経過した。次いでマウスは、ビヒクル(生理食塩水)、ネイキッドASO300(10mg/kg)、DTX-C-008(10mg/kgのASO当量)、またはDTX-C-008(20mg/kgのASO当量)のいずれかの単回用量によって静脈内処置された。ベースラインの投薬前ECG評価後に、「Doxオフ対照」群のマウスはドキシサイクリンなしの固形飼料に切り替えた。投薬後ECG評価を、すべてのマウスにおいて、処置の7日後および14日後に、または「Doxオフ対照」群のケースではドキシサイクリンなしの固形飼料への復帰の7日後および14日後に行った。ECGスペクトルの各々について、QRSおよびQTc間隔が測定された。
このモデルでは、ドキシサイクリンで処置されたマウスは、DM1患者で報告されたものに類似であり、心臓不整脈の増大した傾向と整合する心臓における突然変異体DMPKの発現によって推進されるQRSおよびQTC間隔の延長を見せる。「Doxオフ対照」群の食餌でのドキシサイクリンの除去は、突然変異体DMPKの発現をオフにし、QRS(図16B)およびQTC(図16C)間隔の正常化をもたらす。ドキシサイクリンによって維持および20mg/kgの筋標的化複合体DTX-C-008で処置されたマウスは、心臓における突然変異体DMPKの継続した発現にもかかわらず、14日後にはそれらのQTc間隔の統計的に有意な低減を実証した(図16C)。QTc間隔のこの低減はDM1マウスモデルにおける心臓不整脈の修正を表している。これらのデータは、本明細書に記載の筋標的化複合体がDM1モデルにおいて表現型上のおよび治療上の利益を提供できることを実証している。
例11:筋標的化複合体は、DMPKを標的化およびDM1関係遺伝子スプライシングを修正し得る
ヒトDM1患者に由来する単離された筋細胞において、例5に記載の筋標的化複合体DTX-C-012が、DMPK発現の低減と、DMPKの下流遺伝子Bin1のスプライシング欠陥のその後の修正とについて試験された。
手短には、一晩回復することを許される前に、患者細胞が10k細胞/ウェルの密度で播種された。次いで、細胞は、PBS(ビヒクル対照)、ネイキッドASO300、またはDTX-C-012(500nM;55.5nM ASOに相当)によって処置された。細胞が14日にわたって分化することを許した。DMPKの発現レベルおよび％Bin1エキソン11包含を分化後の第10、11、12、13、および14日に決定した。
DTX-C-012複合体によるDM1患者細胞の処置は、分化後の第10日ほども早くDMPKレベルの低減に至る(図17A)。DTX-C-012複合体によるDM1患者細胞の処置は、Bin1スプライシングの統計的に有意な時間依存的変化にもまた至る(図17B)(**p＜0.01、***p＜0.001)。これらのデータは、本明細書に記載の筋標的化複合体が、表現型上のおよび治療上の利益(DM1遺伝子特異的なスプライシングの増大した修正)をDM1モデルにおいて提供できることを実証している。
例12:筋標的化複合体は、細胞内在化およびDUX4の標的化を可能にさせる
抗トランスフェリン受容体抗体へ共有結合的に連結されたFM10 PMOを含む筋標的化複合体(抗TfR抗体-FM10)が生成された。
手短には、精製されたVal-Citリンカー-FM10を、抗体のリジン上のε-アミンを修飾することによって生成された官能化15G11抗体にカップリングした。
次いで、抗体カップリング反応の産物を疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)およびサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)に付して、純粋な抱合体を単離した。次いで、限外ろ過を使用して抱合体を濃縮し、デンシトメトリーは、抗TfR抗体-FM10複合体のこのサンプルが1.9という平均ASO対抗体比を有することを確認した。
FM10 PMOは、配列GGGCATTTTAATATATCTCTGAACT(配列番号147)を含む。
ヒトU-2 OS細胞に複合体を投薬した。手短には、一晩回復することを許される前に、U-2 OS細胞が10k細胞/ウェルの密度で播種された。次いで細胞は、次の処置の1つによって処置された-ビヒクル対照(PBS)、DUX4を標的にするsiRNA、ネイキッドFM10 PMO(1μM)、ネイキッドFM10 PMO(10μM)、または抗TfR抗体-FM10(1μM;800nMのネイキッドPMOに相当)。全RNAのために収穫される前に、細胞は72時間にわたってインキュベートされた。cDNAを全RNA抽出物から合成し、qPCRを行って、下流のDUX4遺伝子(ZSCAN4、MBD3L2、TRIM43)の発現を技術的4反復で決定した。すべてのqPCRデータは標準的なΔΔCT法を使用して分析され、無処置の細胞(すなわち、いずれかのオリゴヌクレオチドなし)からなるプレートに基づく陰性対照に対して正規化された。次いで、結果を倍率変化に変換して、有効性を評価した。
図18に示されるとおり、FSHDにおけるDUX4の上方調節はZSCAN4、MBD3L2、およびTRIM43を包含する疾患特徴的な遺伝子の上方調節に至る。FSHD患者細胞における病理学的に関係性がある事象を反映する、DUX4を発現しZSCAN4、MDB3L2、およびTRIM43の上昇したレベルを有するU-2 OS細胞において、1μMのネイキッドFM10による処置はZSCAN4、MBD3L2、およびTRIM43発現を低減することを叶えない。(10μMへの)ネイキッドFM10の増大した濃度は、ZSCAN4およびTRIM43発現の控えめな低減に至るが、MDB3L2発現に対する効果を有さない。対照的に、抗TfR抗体-FM10(1μM濃度;800nMのネイキッドFM10に相当)による処置は、MBD3L2、ZSCAN4、およびTRIM43の発現を有意に低減した。
これらのデータは、抗TfR抗体-FM10複合体の抗トランスフェリン受容体抗体がU-2 OS細胞への複合体の細胞内在化を可能化し、それによって、FM10 PMOがDUX4の発現を阻害することを許したことを示している。
例13:筋標的化複合体によるDMDの標的化
抗トランスフェリン受容体抗体DTX-A-002(RI7 217(Fab))へ共有結合的に連結されたエキソン23 PMO ASOを含む筋標的化複合体(DTX-C-042が生成された。
手短には、ビシクロ［6.1.0］ノニン-PEG3-L-バリン-L-シトルリン-ペンタフルオロフェニルエステル(BCN-PEG3-Val-Cit-PFP)リンカー分子を、アミドカップリング反応を使用してNH2-C6-(エキソン23 PMO)にカップリングした。過剰なリンカーおよび有機溶媒はゲル浸透クロマトグラフィーによって除去した。次いで、精製されたVal-Citリンカー-(エキソン23 PMO)を、リジン上のε-アミンをアジド-PEG4-PFPによって修飾することによって生成されたアジド官能化抗トランスフェリン受容体抗体(DTX-A-002)にカップリングした。
次いで、抗体カップリング反応の生成物は精製され、デンシメトリーは、DTX-C-042複合体のこのサンプルが1.9という平均ASO対抗体比を有することを確認した。
この例に使用されたDMDのエキソン23を標的とするPMO ASOは、GGCCAAACCUCGGCUUACCUGAAAU(配列番号148)からなる配列を含む。
DTX-C-042は、ジストロフィン遺伝子のエキソン23のエキソンスキッピングを誘導し、その後、in vivoでDMDに関連する標的筋肉におけるジストロフィンタンパク質の発現を増加させる能力について試験された。DMDマウスモデルであるmdxマウスは、単回用量のビヒクル対照(生理食塩水);10mg/kg ASOの用量でのDTX-C-042複合体;20mg/kg ASOの用量でのDTX-C-042複合体;または30mg/kg ASOの用量でのDTX-C-042複合体を静脈内注射された。各実験条件は4匹のmdxマウスで反復した。4匹の野生型マウスにもまた対照実験としてビヒクル対照(生理食塩水)を投薬した。
処置の14日後にマウスを安楽死させ、標的化された筋組織を収集した。続いて、個々の筋組織試料をジストロフィン遺伝子のエキソン23のパーセントスキップについてアッセイした(図19)。さらに、標的筋肉中のジストロフィンタンパク質レベルも定量された(四頭筋におけるジストロフィンの定量化を図20A～図20Bに示す)。
抗体-ASO複合体で処置されたマウスは、四頭筋、横隔膜、および心臓の筋肉におけるエキソン23のパーセントエキソンスキッピングの用量依存的な増大を実証した。抗体-ASO複合体で処置されたマウスは、四頭筋におけるジストロフィンタンパク質の発現の用量依存的な増大をもまた実証し、DTX-C-042の30mg/kg ASO当量で処置されたマウスでは平均で＞4％のジストロフィンタンパク質であった。
これらのデータは、抗体-ASO複合体の抗トランスフェリン受容体抗体がin vivoのmdxマウスモデルにおいて筋肉特異的な組織への複合体の細胞内在化を可能化し、それによって、エキソン23 PMO ASOがDMDのエキソン23のエキソンスキッピングを誘導することを許すことを実証している。これらのデータは、抗体-ASO複合体が筋組織を特異的に標的化できることをさらに実証している。
例14:筋標的化複合体によってDMDを標的化してmdxマウスモデルにおいて機能的な利益を実証する
Mdxマウス(DMDマウスモデル;有疾患マウス)は、単回用量のビヒクル対照(生理食塩水);MDX-ASO(ネイキッドエキソン23スキッピングのPMO ASO、30mg/kg);または例13に記載されているDTX-C-042複合体(エキソン23スキッピングのPMOに連結された抗トランスフェリン受容体抗体RI7 217 Fab、30mg/kg ASO当量)を静脈注射された。各実験条件は5匹のmdxマウスで反復した。5匹の野生型マウス(健康なマウス)にもまたビヒクル対照(生理食塩水)を投薬した。
注射の2週間および4週間後に、すべての処置されたマウスの機能的な活動は、オープンフィールドチャンバー実験を使用して決定された。実験には3つの一続きのステージが関わった:(1)各マウスがオープンフィールドチャンバー内に置かれる10分の期間;(2)各マウスが後肢疲労負荷に付される10分の期間;および(3)各マウスがオープンフィールドチャンバー内に置かれる10分の期間である。ステージ(1)および(3)の間に移動した全の水平距離を収集した。第1のおよび第2の試験の間に移動した全距離のパーセント変化。図21Aに示されるとおり、2週の時点で、生理食塩水で処置された野生型マウスは、ステージ(1)と比べてステージ(3)の間に平均で約20％少なく移動した;生理食塩水で処置されたmdxマウスは、ステージ(1)と比べてステージ(3)の間に平均で約70％少なく移動した;MDX-ASOで処置されたmdxマウスは、ステージ(1)と比べてステージ(3)の間に平均で約85％少なく移動した;DTX-C-042で処置されたmdxマウスは、ステージ(1)と比べてステージ(3)の間に平均で約40％少なく移動した。生理食塩水で処置された野生型マウスと比較されるときに、生理食塩水で処置されたmdxマウスは有意に悪い成績であった(ステージ(1)と比べてステージ(3)において移動した距離の有意な減少によって指し示される)。この観察は、DMD患者によって経験される損なわれた運動機能と整合する。ネイキッドMDX-ASOで処置されたmdxマウスは、ビヒクルで処置されたものと同じ機能的性能の悪化を示した。対照的に、DTX-C-042で処置されたmdxマウスの性能は、ビヒクル処置された野生型マウスと統計的に異ならなかった。図21Bに示されるとおり、4週の時点で、生理食塩水で処置された野生型マウスは、ステージ(1)と比べてステージ(3)の間に平均で約35％少なく移動した;生理食塩水で処置されたmdxマウスは、ステージ(1)と比べてステージ(3)の間に平均で約80％少なく移動した;MDX-ASOで処置されたmdxマウスは、ステージ(1)と比べてステージ(3)の間に平均で約55％少なく移動した;DTX-C-042で処置されたmdxマウスは、ステージ(1)と比べてステージ(3)の間に平均で約50％少なく移動した。
注射の2週間および4週間後に、すべての処置されたマウスの活動は、ケージの回し車試験を使用して決定された。各マウスを、回し車を有するケージ内に24時間の期間にわたって個々に置いた。24時間の期間には、5時間の照明オン、次に13時間の暗が関わり、6時間の照明で終わった。回し車上で各マウスが移動した全距離(メートルmによる)を、24時間の期間にわたって継続的に収集し、続いて別々の1時間のインクリメントにビニングした。図21Cに示すように、2週の時点で、DTX-C-042で処置されたmdxマウスが移動した距離は、MDX-ASOまたは生理食塩水で処置されたmdxマウスが移動した距離よりも多く、ある時点で野生型マウスが移動した距離に近づいた。図21Dに示されるとおり、4週の時点で、暗期の間に(すなわち、マウスが活発であるときに)、DTX-C-042複合体で処置されたmdxマウスが移動した距離は、生理食塩水で処置された野生型マウスが移動した全距離を密接に反映した。これは、生理食塩水またはMDX ASOどちらかで処置されたmdxマウスとは対照的である。これらは暗期の間にかなり短い距離を移動した。
この例のすべてのマウスを、注射の2週および4週後にクレアチンキナーゼ活性レベルについてさらに試験した。野生型マウスは筋組織から大量のクレアチンキナーゼは分泌しない。反対に、mdxマウス(有疾患筋組織を有する)はまさに高いレベルのクレアチンキナーゼを分泌する。これはクレアチンキナーゼ酵素活性の決定によって観察され得る。図21Eに示されるとおり、生理食塩水で処置されたmdxマウスは、生理食塩水で処置された野生型マウスと比べて、2週後および4週後にそれぞれおよそ9倍および10倍多くのクレアチンキナーゼ酵素活性を有した。ネイキッドASOによる投薬は、mdxマウスに有意な利益を提供しなかった。しかしながら、mdxマウスにDTX-C-042複合体を投薬することは、2および4週後に両方とも、クレアチンキナーゼ活性のレベルの統計的に有意な低減をまさに提供した。
これらの驚くべき結果は、抗体-ASO複合体が、これらのマウスが健康な(野生型)マウスに似た表現型指標を有するようにして、DMD表現型を患うマウス(mdxマウス)に機能的な利益を提供することができることを示している。抗体-ASO複合体の性能は、ネイキッドPMO(MDX-ASO)と比べて、抗体-ASO複合体の抗トランスフェリン受容体抗体がこの例で示された機能的な利益を提供することを担っていることを実証している。
例15:選択されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、DM1およびNHP筋管におけるDMPK発現の用量依存的な低減を提供した
in vivoで安全である(例として、サイトカイン誘導によって測定される低い免疫原性によって指し示される)オリゴを同定するために、さらに、製造性および二次構造の考慮に基づいて、DMPKに対するオリゴヌクレオチドがさらに査定された。3つのアンチセンスオリゴヌクレオチド、DMPK-ASO-1(配列番号149)、DMPK-ASO-2(配列番号150)、およびDMPK-ASO-3(配列番号151)が選択された。次いで、これらのオリゴヌクレオチドは、用量応答性の様式でDM1筋管およびNHP筋管におけるDMPK発現を低減するそれらの能力について評価された。ツール化合物のASO300が対照として使用された。アンチセンスオリゴヌクレオチドの各々はDM1およびNHP筋管のDMPKを用量依存的に低減することができた(夫々、図22A～22Cおよび図23A～23Bを見よ)。
これらのデータは、これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドがin vivoで安全であり、インセルロでDMPKの用量依存的な低減ができることを実証し、これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む筋標的化複合体がin vivoの筋組織においてDMPKを標的にできるであろうことを示唆する。
例16:選択された抗TfR1抗体のヒトTfR1に対する結合親和性
Ka(会合速度定数)、Kd(解離速度定数)、およびKD(親和性)の測定のために、選択された抗TfR1抗体を、ヒトTfR1に対するそれらの結合親和性について試験した。2つの知られている抗TfR1抗体15G11およびOKT9を対照として使用した。結合実験は、Carterra LSA上で25℃で実施された。抗マウスIgGおよび抗ヒトIgG抗体の「芝生」がアミンカップリングによってHC30Mチップ上に調製された。IgGはチップ上に捕捉された。hTfR1、cyTfR1、およびhTfR2の希釈系列を結合のためにチップに注入した(1000nMから出発、1:3希釈、8つの濃度)。
結合データは、緩衝液分析物注入からの応答を差し引くことと、Ka(会合速度定数)、Kd(解離速度定数)、およびKD(親和性)の概算のための1:1ラングミュア結合モデルに対してグローバルフィッティングすることとによって参照した。Carterra(商標)Kineticsソフトウェアを使用した。5～6つの濃度を曲線フィッティングに使用した。
結果は、マウスmAbが13pM～50nMの範囲のKD値でhTfR1への結合を実証することを示した。マウスmAbの大多数は、一桁ナノモル～サブナノモル範囲のKD値を有した。試験されたマウスmAbはcyTfR1に対する交差反応性の結合を示し、16pM～22nMの範囲であるKD値を有した。
抗TfR1抗体のKa値、Kd値、およびKD値は、表12に提供される。
表12.抗TfR1抗体のKa値、Kd値、およびKD値
Figure 2023535074000078
例17:オリゴヌクレオチドとの抗TfR1抗体の抱合
DMPK(ASO300)を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)へ共有結合的に抱合された抗TfR1抗体を含有する複合体が生成された。第1に、抗TfR抗体クローン3-A4、3-M12、および5-H12のFabフラグメントは、マウスモノクローナル抗体を酵素によって全長IgGのヒンジ領域においてまたはその下で切ること、続いて部分的な還元によって調製された。Fab'は、結合力または親和性がmAbと同等であることが確認された。
抗TfR mAbをカテプシン切断可能なリンカーを介してASO300に共有結合的に連結することによって、筋標的化複合体が生成された。手短には、ビシクロ［6.1.0］ノニン-PEG3-L-バリン-L-シトルリン-ペンタフルオロフェニルエステル(BCN-PEG3-Val-Cit-PFP)リンカー分子が、カルバメート結合によってASO300にカップリングされた。過剰なリンカーおよび有機溶媒をタンジェント流ろ過(TFF)によって除去した。次いで、精製されたVal-Citリンカー-ASOを、リジン上のε-アミンをアジド-PEG4-PFPによって修飾することによって生成されたアジド官能化抗トランスフェリン受容体抗体にカップリングした。陽性対照の筋標的化複合体をもまた15G11を使用して生成した。
次いで、抗体カップリング反応の生成物を2つの精製方法に供して、遊離抗体および遊離ペイロードを除去した。抱合体の濃度をNanodrop A280またはBCAタンパク質アッセイどちらか(抗体)およびQuant-It Ribogreenアッセイ(ペイロード)によって決定した。対応する薬物-抗体比(DAR)を計算した。DARは0.8と2.0との間の範囲にあり、すべての試料が等量のペイロードを受けるようにして標準化された。
次いで、精製された複合体を細胞内在化およびDMPKの阻害について試験した。霊長目の非ヒト動物(NHP)またはDM1(DM1患者から提供)細胞を96ウェルプレート上で成長させ、7日にわたって筋管に分化させた。次いで、細胞を、漸増していく濃度(0.5nM、5nM、50nM)の各複合体によって72時間にわたって処置した。細胞を収穫し、RNAを単離し、逆転写を行ってcDNAを生成した。qPCRをPpib(対照)およびDMPKに特異的なTaqManキットを使用してQuantStudio 7によって行った。処置された細胞対無処置の細胞の残りのDMPK転写産物の相対量を計算し、結果は表13に示されている。
結果は、抗TfR1抗体が筋細胞を標的化し、筋細胞によって分子ペイロード(ASO300)と共に内在化される能力があることと、分子ペイロードは標的遺伝子(DMPK)を標的化およびノックダウンする能力があることとを実証した。表1に挙げられる他の希少筋疾患遺伝子のいずれかを標的にする分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド)へ抱合された抗TfR1抗体を含む複合体のノックダウン活性は、本明細書に記載の同じアッセイを使用して試験され得る。
表13.抗TfR1抗体の結合親和性および抱合体の有効性
Figure 2023535074000079
興味深いことに、DMPKノックダウン結果は、トランスフェリン受容体に対する抗TfRの結合親和性とDMPKノックダウンのために細胞にDMPK ASOを送達することにおける有効性との間の相関の欠如を示した。驚くべきことに、本明細書に提供される抗TfR抗体(例として、少なくとも3-A4、3-M12、および5-H12)は、これらの抗体および対照抗体15G11の間のヒトまたはカニクイトランスフェリン受容体に対する同等の結合親和性(または、5-H12などのある種の事例では、より低い結合親和性)にもかかわらず、対照抗体15G11と比較して、カニクイ細胞またはヒトDM1患者細胞どちらかにおいて、標的細胞にペイロード(例として、DMPK ASO)を送達することおよび分子ペイロードの生物学的効果(例として、DMPKノックダウン)を達成することにおいて優れた活性を実証した。
上位の属性、例えば高いhuTfR1親和性、NHPおよびDM1患者細胞株におけるDMPKの＞50％ノックダウン、3つの固有配列による同定されたエピトープ結合、低い/ない予測されるPTM部位、ならびに良好な発現および抱合効率が、ヒト化のための上位3つのクローン、3-A4、3-M12、および5-H12の選択につながった。
例18:ヒト化抗TfR1抗体
表2に示す抗TfR抗体はヒト化および突然変異誘発に供され、製造可能性の負担を軽減した。ヒト化バリアントはスクリーニングされ、それらの結合特性および生物学的活性について試験された。抗TfR1重鎖可変領域および軽鎖可変領域のヒト化バリアント(それぞれ5つのバリアント)が、Composite Human Technologyを用いて設計された。これらの重鎖および軽鎖可変領域を有するFabをコードする遺伝子が合成され、各ヒト化重鎖および軽鎖バリアントを発現するようにベクターが構築された。続いて、各ベクターを小規模で発現させ、得られたヒト化抗TfR1 Fabが分析された。ヒト化Fabは、標的抗原に対する抗体親和性、相対発現、ヒト生殖系列配列に対する相同性パーセント、およびMHCクラスII予測T細胞エピトープの数(iTope(商標)MCHクラスII in silico分析を使用して決定される)のBiocoreアッセイを含むいくつかの基準に基づいて、さらなる試験のために選択された。
重鎖可変領域および軽鎖可変領域にアミノ酸置換を導入することによって、いくつかの抗体の親配列内の潜在的な傾向(liability)が特定された。これらの置換は、相対発現レベル、iTope(商標)スコアおよびBiacore単回サイクル動態分析からの相対KDに基づいて選択された。ヒト化バリアントが試験され、最初に標的抗原に対する親和性に基づいてバリアントが選択された。続いて、選択したヒト化Fabは、表14および表15に示す、分析した各バリアントの凝集および分解に対する安定性および感受性の一連の生物物理学的評価に基づいてさらにスクリーニングされた。選択されたFabは、TfR1に結合するそれらの特性について速度論的分析によって分析された。これらの分析の結果は表16に示される。表14および表15に示す抱合体の場合、選択したヒト化Fabは、DMPK標的化オリゴヌクレオチドASO300に抱合された。高温(40℃)に9日間曝露された後のヒトおよびcyno TfR1への同等の結合親和性によって示されるように、選択されたFabは、曝露前と比較して熱的に安定である(表16を見よ)。
表14.ヒト化抗TfR Fabの生物物理学的評価データ
Figure 2023535074000080
 表15.ヒト化抗TfR Fabおよび抱合体の熱安定性
Figure 2023535074000081
Figure 2023535074000082
 表16.TfR1に結合するヒト化抗TfR Fabの速度論的分析
Figure 2023535074000083
ヒト化抗TfR1 FabのTfR1への結合(ELISA)
ヒト化抗TfR抗体のTfR1への結合を測定するために、ELISAが行われた。高結合性黒色平底96ウェルプレート(Corning＃3925)は、最初にPBS中1μg/mLの組換えhuTfR1 100μL/ウェルでコーティングされ、4℃で一晩インキュベートされた。ウェルは空にされ、残留液体は除去された。PBS中1％のBSA(w/w)200μLを各ウェルに添加してブロッキングを行った。ブロッキングは、300rpmのシェーカーで室温で2時間進行させた。ブロッキング後、液体は除去され、ウェルは300μLのTBSTで3回洗浄された。次いで、抗TfR1抗体が8点連続希釈(希釈範囲5μg/mL～5ng/mL)で三通の0.5％ BSA/TBSTに添加された。陽性対照およびアイソタイプ対照も、ELISAプレートに包含された。プレートはオービタルシェーカー上で300rpmで60分間室温でインキュベートされ、プレートは300μLのTBSTで3回洗浄された。抗(H＋L)IgG-A488(1:500)(Invitrogen ＃A11013)は、TBST中0.5％ BSAに希釈され、100μLを各ウェルに添加された。次いでプレートは、オービタルシェーカー上、300rpmで60分間室温でインキュベートされた。液体は除去され、プレートは300μLのTBSTで4回洗浄された。次いで、495nm励起および50nm発光(15nm帯域幅)での吸光度がプレートリーダー上で測定された。データは記録され、EC50について分析された。ヒト化3M12、3A4および5H12 FabのヒトTfR1(hTfR1)への結合についてのデータが、それぞれ図25A、図25Cおよび図25Eに示される。カニクイザル(Macaca fascicularis)TfR1(cTfR1)を用いて、hTfR1について上述したのと同じプロトコルに従ってELISA測定が行われ、結果は図25B、図25Dおよび図25Fに示される。
hTfR1およびcTfR1へのヒト化抗TfR Fabの結合に関するこれら2セットのELISA分析の結果は、ヒト化3M12 FabがhTfR1およびcTfR1の両方への一貫した結合を示すこと、およびヒト化3A4 FabがhTfR1と比較してcTfR1への結合の減少を示すことを実証する。
抗体-オリゴヌクレオチド抱合体は、それぞれがASO300に抱合された6つのヒト化抗TfR Fabを使用して調製された。抱合効率および下流精製が特徴付けられ、生成物抱合体の様々な特性が測定された。結果は、抱合効率が試験した10のバリアントすべてにわたって堅牢であったこと、および精製プロセス(疎水性相互作用クロマトグラフィー、引き続いてヒドロキシアパタイト樹脂クロマトグラフィー)が有効であったことを実証している。精製抱合体は、サイズ排除クロマトグラフィーによって分析した場合、＞97％の純度を示した。
いくつかのヒト化Fabは、TfR1によって媒介される内在化を評価するための細胞取り込み実験において試験された。抗体によって媒介されるそのような細胞取り込みを測定するために、ヒト化抗TfR Fab抱合体は、pH感受性色素であるCypher5eで標識された。横紋筋肉腫(RD)細胞を4時間にわたって100nMの抱合体によって処置し、トリプシン処理し、2回洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。平均のCypher5e蛍光(取り込みを表す)をAttune NxTソフトウェアを使用して計算した。図26に示されるように、ヒト化抗TfR1 Fabは、陽性対照抗TfR Fab(15G11)と比較して、類似するか、または増加したエンドソーム取り込みを示す。類似の内在化効率が、異なるオリゴヌクレオチドペイロードで観察された。抗マウスTfR抗体を陰性対照として使用した。コールドな(非内在化)条件は陽性対照抗体抱合体の蛍光シグナルを廃し(データは示さない)、陽性対照およびヒト化抗TfR Fab抱合体における陽性シグナルがFab抱合体の内在化を原因とすることを指し示した。
6つのヒト化抗TfR Fabの抱合体も、ELISAによってhTfR1およびcTfR1への結合について試験され、ヒト化Fabの非抱合形態と比較された。結果は、ヒト化3M12および5H12 Fabが、それらの非抱合形態と比較して、抱合後に同様のレベルのhTfR1およびcTfR1結合を維持することを実証する(3M12、図27Aおよび図27B;5H12、図27Eおよび図27F)。興味深いことに、3A4クローンは、それらの非抱合形態と比較して、抱合後にcTfR1への結合の改善を示す(図27Cおよび図27D)。
この例で使用される場合、「非抱合」という用語は、抗体がオリゴヌクレオチドに抱合されなかったことを示す。
例19.in vitroのオリゴヌクレオチド抱合体によって促進されるDMPK mRNAレベルのノックダウン
DMPK標的化オリゴヌクレオチド(例として、ASO)を、DMPK転写産物発現のノックダウンについて横紋筋肉腫(RD)細胞で試験した。RD細胞を、10％FBSおよびペニシリン/ストレプトマイシンを補ったグルタミンありのDMEMの成長培地によってほとんどコンフルエントまで培養した。次いで、細胞を96ウェルプレートにウェル当たり20K細胞で播種し、24時間にわたって回復することを許した。次いで、細胞を遊離のDMPK標的化オリゴヌクレオチドによってまたはウェル当たり0.3μLのLipofectamine Messenger MAXトランスフェクション試薬を使用するオリゴヌクレオチドのトランスフェクションによって処置した。3日後に、全RNAを細胞から収集し、cDNAを合成し、DMPK発現をqPCRによって測定した。
図28の結果は、PBS処置された細胞における発現と比べて、DMPK発現レベルが、各所与のDMPK標的化オリゴヌクレオチドで処置された細胞では低減されたことを示す。いくつかのDMPKオリゴヌクレオチドはDMPK発現レベルの用量依存的な低減を示した。図28において、DMPK-ASO-1は、配列GCGUAGAAGGGCGUCUGCCC(配列番号149)を有する。DMPK-ASO-2は、配列CCCAGCGCCCACCAGUCACA(配列番号150)を有する。DMPK-ASO-3は、配列CCAUCUCGGCCGGAAUCCGC(配列番号151)を有する。ASO300もまた、この実験に使用された。
例20.in vitroの抗体-オリゴヌクレオチド抱合体によって促進されるDMPK mRNAレベルのノックダウン
ヒト化抗TfR Fabの3M12(VH3/Vk2)、3M-12(VH4/Vk3)および3A4(VH3-N54S/Vk4)を含有する抱合体は、DMPK標的化オリゴヌクレオチドASO300に抱合され、横紋筋肉腫(RD)細胞において、DMPK転写産物発現のノックダウンについて試験された。抗体は、式(C)に示されるリンカーを介してASO300に包含された。
RD細胞を、10％FBSおよびペニシリン/ストレプトマイシンを補ったグルタミンありのDMEMの成長培地によってほとんどコンフルエントまで培養した。次いで、細胞を96ウェルプレートにウェル当たり20K細胞で播種し、24時間にわたって回復することを許した。次いで細胞は、抱合体で3日間処置された。全RNAを細胞から収集し、cDNAを合成し、DMPK発現をqPCRによって測定した。
図29の結果は、DMPK発現レベルが、PBS処理細胞における発現と比較して、各示された抱合体で処置された細胞において低下したことを示しており、ヒト化抗TfR FabがRD細胞によるDMPK標的化オリゴヌクレオチドの取り込みを媒介することができること、および内在化DMPK標的化オリゴヌクレオチドがDMPK mRNAレベルをノックダウンするのに有効であることを示している。
例21.DM1のHSA-LRマウスモデルにおけるスプライシング修正および機能的有効性
ヒト骨格筋系アクチン(ACTA1)を標的にする(target)オリゴヌクレオチドへ抱合された抗TfR抗体を含有する抱合体によって、DM1のHSA-LRマウスモデルにおけるスプライシングの修正が実証された。この研究に使用された抗TfR1抗体はRI7 217であった。ACTA1を標的にするオリゴヌクレオチドは-MOE 5-10-5 gapmerであり、これは、以下:5'-NH2-(CH2)6-dA*oC*oC*oA*oT*oT*dT*dT*dC*dT*dT*dC*dC*dA*dC*dA*oG*oG*oG*oC*oT-3(配列番号131)を含み;「*」はPS連結を表し;「d」はデオキシ核酸を表し;「o」は2'-MOEを表す。
HSA-LR DM1マウスモデルはDM1の良く検証されたモデルであり、これはヒトDM1患者に非常に類似である病理を見せる。HSA-LRモデルはヒト骨格筋系アクチン(ACTA1)プロモーターを使用してCUGの長い反復(LR)の発現を推進する。このモデルでは、有毒なDMPK RNAが核内に蓄積し、Muscleblind様タンパク質(MBNL)などのスプライシングを担うタンパク質を隔離し、CLCN1(塩素チャネル)、ATP2a1(カルシウムチャネル)、および他を包含する複数のRNAのミススプライシングをもたらす。このミススプライシングは、マウスがヒトのDM1臨床像のホールマークである筋強直症をもまた見せることを引き起こす。
静脈内送達された抗TfR-オリゴヌクレオチド抱合体は、複数のRNAおよび複数の筋肉におけるスプライシングの用量依存的な修正の活性を有することが示されており、HSA-LRマウスによって良く忍容された。この研究では、抱合体が30よりも多くの異なるRNAのスプライシングを修正する能力を評価した。DM1では、これらのRNAの有意なRNAミススプライシングは、複数の筋肉の機能する能力を低減する。モニタリングされたRNAはHSA-LRマウスにおける筋肉の収縮および弛緩にとって重大である。スプライシングの用量依存的な修正が観察された。
図30は、カルシウムチャネルをコードし、筋肉収縮および弛緩に寄与するAtp2a1についての結果を示す。X軸はスプライス異常を表し、1.00は重症のミススプライシングを表し、0.00は野生型(WT)スプライスパターンを表す。図における右から左への進行は、スプライシングの修正を表す。Y軸は、～のスプライシングされた遺伝子のパーセント(PSI)を表す。ATP2a1の重症のミススプライシングは、ATP2a1 RNAのエキソン22の排除によって引き起こされる。WTスプライシングは、エキソン22のほぼ完全な包含を反映する。結果は、抱合体が腓腹筋において用量依存的な様式でATP2a1のスプライシングを修正したことを実証している。
この研究で試験された30を超える異なるRNAのデータが図31、図58Aおよび図58Bに示される。腓腹筋(図31)、前脛骨筋(図58A)および四頭筋(図58B)において、試験したRNAのすべてについて同様の用量依存的なスプライシングの修正が達成された。これらのRNAのいくつかでは、スプライシングの修正は図30のようにPSIの減少によって反映され、他のRNAでは、修正はPSIの増加によって反映される。
RNAのセットにおけるスプライシングの類似の用量依存的な改善は、抱合体による処置後に四頭筋および前脛骨筋で観察された。図32は、各筋肉型において試験された30よりも多くのRNA間で生理食塩水および異なる用量のAb-ASOについて観察された複合的なレベルのスプライシング異常を示す。10mg/kgおよび20mg/kgの用量がこの研究で投与された。
HSA-LRモデルのいくつかの筋肉における複数の遺伝子のスプライシング異常の低減に加えて、疾患修飾がHSA-LRモデルで観察された。図33の結果は、筋強直症のほぼ完全な退行が抱合体の単回用量後に達成されたことを示す。4点スケールによる筋強直症の重症度を生理食塩水(PBS)、ネイキッドオリゴヌクレオチド、または抱合体の投薬の14日後に評価した。グレード0は筋強直症が観察されなかったことを指し示し、グレード1は筋強直性放電が筋電図法(EMG)によって針刺入の50％未満で測定されたことを指し示し、グレード2は筋強直性放電が針刺入の50％超で測定されたことを指し示し、グレード3は筋強直性放電がほとんど針刺入毎に測定されたことを指し示する。
例22.抗TfR-オリゴヌクレオチド抱合体処置は、DMDのmdxマウスモデルにおけるジストロフィン発現を増加させた
in vivoのDMDエキソンスキッピングを誘導する別のオリゴヌクレオチドの効果を試験するために、エキソン23スキッピングを誘導するオリゴヌクレオチド(PMO)を、ネイキッドオリゴヌクレオチドとして、または抗マウスTfR抗体との抱合体としてDMDのmdxマウスモデルに投与した。ジストロフィン発現が測定された。抱合体によって促進されるエキソンスキッピングは、ウエスタンブロットによって例証(図35)および図36で定量されるとおり、ジストロフィンタンパク質の用量依存的な産生をもたらした。アルファ-アクチンをローディング対照として使用した。
mdxマウスに投与されたエキソン23抱合体の単回用量は、図37に示されるとおり、総体的なジストロフィンレベルを増大させることに加えて、ジストロフィン発現を筋細胞膜にもまた復元した。四頭筋のジストロフィンの免疫蛍光染色は、抱合されたもので処置されたmdxマウスが、それらの四頭筋において、ネイキッドオリゴヌクレオチドまたは生理食塩水で処置されたマウスよりも高いレベルのジストロフィンを有することを実証した。
例23.DMD筋管におけるオリゴヌクレオチドによって媒介されるエキソンスキッピング
核における特異的なDMDエキソンのスキップを促進することは、筋細胞がより完全な機能的なジストロフィンタンパク質を作り出すことを許し得る。DMDエキソン51のスキップを誘導するオリゴヌクレオチド(PMO)は抗TfR1 Fabに抱合され、抱合されたものは、エキソン51スキッピングによって左右される突然変異を有するヒトDMD筋管において試験された。図34に示されるとおり、抱合体による処置は、等モルの用量のネイキッドオリゴヌクレオチドによる処置後のエキソンスキッピングの25％増大と比較して、エキソンスキッピングの50％増大をもたらした(p値＝0.001)。図19に示すものなど、DMDのmdxマウスモデルでも同様の結果が観察された。
例24.FSHDを処置するためのDUX4を標的にする抗体抱合オリゴヌクレオチドの機能的な活性
FSHD患者由来の筋管は、抗TfR1 Fabへ抱合されたFM10またはネイキッドFM10によって処置された。FM10は、配列5'-GGGCATTTTAATATATCTCTGAACT-3'(配列番号147)を有する。DUX4活性化後にのみ発現されることが知られている3つの遺伝子から転写されるmRNAの発現を、続いて筋管で測定した。これらの3つのDUX4関連遺伝子の発現は、図38A(ネイキッドオリゴヌクレオチド)および38B(Ab-オリゴヌクレオチド)に示されるとおり低減された。加えて、抱合体の半数阻害要求濃度(IC50)値は、下の表7に示されるとおり、ネイキッドFM10で観察されるものよりも最大9.6倍低く、抱合体がDUX4関連遺伝子発現の抑制においてネイキッドFM10よりも最大9.6倍強力であることを実証した。
また、DUX4関連遺伝子を抑制するために使用されてもよい追加の抗DUX4オリゴヌクレオチドはACUGCGCGCAGGUCUAGCCAGGAAG(配列番号153)およびUGCGCACUGCGCGCAGGUCUAGCCAGGAAG(配列番号154)である。
表7.DUX4関連遺伝子の阻害のIC50値
Figure 2023535074000084
例25.抗TfR抗体および分子ペイロードを連結するリンカーの血清中安定性
例において抗体に連結されたオリゴヌクレオチドは、式(C)に示される切断可能なリンカーを介して抱合された。リンカーは血清中において安定性を維持し、標的化された筋細胞における充分なペイロード蓄積を利する放出動態を提供することが重要である。この血清中安定性は、静脈内全身投与、血流中における抱合されたオリゴヌクレオチドの安定性、筋組織への送達、および筋細胞における治療薬ペイロードの内在化にとって重要である。リンカーは、Fabへの複数の型のペイロード(ASO、siRNA、およびPMOを包含する)の正確な抱合を容易化することが確認されている。このフレキシビリティは、各筋疾患の遺伝学的な基礎に対処するための適当な型のペイロードの合理的選択を可能化した。加えて、リンカーおよび抱合ケミストリーは、各型のペイロードについて、各Fabに取り付けられるペイロード分子の比の最適化を許し、種々の筋疾患適用への使用を可能化するための分子の迅速な設計、産生、およびスクリーニングを可能化した。
図24は、in vivoのリンカーの血清中安定性を示す。これは静脈内投薬後の72時間の過程において複数の生物種間で同等であった。少なくとも75％の安定性が各ケースにおいて投薬後の72時間に測定された。
例26.DMD患者筋管における抗TfR抱合体のエキソンスキッピング活性
本研究では、DMDエキソン51スキッピングオリゴヌクレオチドに抱合された抗TfR Fab(3M12 VH3/VK2、3M12 VH4/VK3、および3A4 VH3 N54S/VK4)を含有する抗TfR抱合体のエキソンスキッピング活性が評価された。エキソン52欠失をもつ不死化ヒト筋芽細胞は融解され、1e6細胞/フラスコの密度でPromocell骨格筋細胞成長培地(5％FBSおよび1×Pen-Strepあり)に播種され、コンフルエントまで成長させた。ひとたびコンフルエントになると、細胞をトリプシン処理し、遠心によってペレット化し、新鮮なPromocell骨格筋細胞成長培地に再懸濁した。細胞数がカウントされ、細胞をマトリゲルコーティング96ウェルプレートに50k細胞/ウェルの密度で播種された。細胞が24時間にわたって回復することを許した。成長培地を吸い取ることと血清なしの分化培地による置き換えとによって、細胞を誘導して分化させた。次いで、細胞は10μMの抱合または非抱合DMDエキソンスキッピングオリゴヌクレオチドによって処置された。細胞は試験物と10日間インキュベートされ、次いで、全RNAが96ウェルプレートから収穫された。全RNAの75ngに対してcDNA合成が行われ、各細胞型におけるエキソン51スキッピングの程度を評価するために変異特異的PCRが行われた。突然変異特異的PCR産物を4％アガロースゲルに流し、SYBR goldを使用して視覚化した。デンシメトリーが使用されて、スキップされたおよびスキップされなかったアンプリコンの相対量を計算し、エキソンスキッピングは、存在するアンプリコンの全量によって除算された、エキソン51がスキッピングされたアンプリコンの比として決定された:
Figure 2023535074000085
データは、DMDエキソン51スキッピングオリゴヌクレオチドに抱合された3M12 VH3/Vκ2または3M12 VH4/Vκ3 Fabのいずれかとの抱合体が、非抱合DMDエキソンスキッピングオリゴヌクレオチドと比較して、患者の筋管においてエキソンスキッピングの増強をもたらしたことを実証している(図39)。
この例で使用される場合、「非抱合」という用語は、オリゴヌクレオチドが抗体に抱合されなかったことを示す。
例27.hTfR1マウスにおける抗TfR抱合体のin vivo活性
DM1では、正常よりも高い数のCUG反復が大きいヘアピンループを形成し、これらが核にトラップされたままに残り、核のフォーカスを形成する。これらはスプライシングタンパク質に結合し、スプライシングタンパク質がそれらの正常な機能を果たす能力を阻害する。有毒な核DMPKレベルが低減されるときには、核のフォーカスは逓減し、スプライシングタンパク質を放出し、正常なmRNAプロセシングの復元を許し、可能性としては疾患進行を停止または退行させる。
DMPK標的化オリゴヌクレオチドASO300へ抱合された抗TfR Fab(対照、3M12 VH3/VK2、3M12 VH4/VK3、3A4 VH3 N54S/VK4)を含有する抱合体の、マウスにおける静脈内全身投与後に複数の筋組織のDMPK mRNAレベルを低減するin vivo活性が評価された。
1つのTfR1アレルがヒトTFR1アレルによって置き換えられた雄および雌C57BL/6マウスは、5および15週齢の間で表17および図40Aに概説されている投薬スケジュールに従って投与された。マウスは、第1の注射の14日後に屠殺され、選択された筋肉を表18に示されているとおり収集した。
Figure 2023535074000086
Figure 2023535074000087
全RNAを製造者(Promega)によって提供されるキットを使用してMaxwell Rapid Sample Concentrator(RSC)装置によって抽出した。精製されたRNAを逆転写し、DmpkおよびPpib転写産物のレベルを特異的なTaqManアッセイ(ThermoFisher)によるqRT-PCRによって決定した。Dmpk発現のLogの倍率変化を2-ΔΔCT法に従って計算した。Ppibを参照遺伝子として、ビヒクルを注射されたマウスを対照群として使用した。対照マウスおよび抱合体を投与されたマウスの間のDmpk発現の違いの統計的有意性は、多重比較のためのダネットの補正による一元配置ANOVAによって決定された。図40B～図40Eに示されるとおり、試験された抱合体は、種々の筋組織においてin vivoのDMPK mRNAレベルを低減する堅実な活性を示した。
例28.患者由来細胞における抗TfR抱合体のin vitro活性
380個のCUG反復を含有する変異DMPK mRNAを発現するCM-DM1-32F初代細胞において、DMPK mRNA発現を低減、BIN1スプライシングを修正、および核のフォーカスを低減する抗TfR抱合体の活性を決定するためのin vitro実験が行われた。CM-DM1-32F初代細胞は、DM1患者から単離された不死化筋芽細胞株である(CL5細胞;Arandel et al.,Dis Model Mech.2017 Apr 1;10(4):487-497に記載)。抱合体1は、DMPK標的化オリゴヌクレオチド(ASO300)へ抱合された抗TfR mAbを含有する。抱合体2はDMPK ASO-1(GCGUAGAAGGGCGUCUGCCC;配列番号149)へ抱合された抗TfR Fab'を含有する。
CL5細胞は156,000細胞/cm2の密度で播種され、24時間回復させ、記載されたとおり(Arandel et al.Dis Model Mech.(2017)10(4):487-497)分化培地に移されて筋管形成を誘導し、続いて500nMのペイロード濃度で抱合体1および抱合体2に暴露された。ビヒクルPBSに暴露された並行培養が対照として働いた。細胞を10日の培養後に収穫した。
遺伝子発現の分析には、細胞をQiagen miRNAeasyキットによる全RNA抽出のためにQiazolによって収集した。精製されたRNAを逆転写し、DMPK、PPIB、BIN1転写産物、およびエキソン11を含有するBIN1 mRNAアイソフォームのレベルを、特異的なTaqManアッセイ(ThermoFisher)によるqRT-PCRによって決定した。DMPK発現のLogの倍率変化を2-ΔΔCT法に従って計算した。PPIBを参照遺伝子として、ビヒクルへ暴露された細胞を対照群として使用した。エキソン11を含有するBIN1アイソフォームレベルのLogの倍率変化を2-ΔΔCT法に従って計算した。BIN1を参照遺伝子として、ビヒクルへ暴露された細胞を対照群として使用した。
突然変異体DMPKの核のフォーカスの面積を測定するために、細胞を4％ホルマリンによって固定し、0.1％Triton X-100によって透過処理し、Cy5フルオロフォアへ抱合されたCAGペプチド核酸プローブと70°Cでハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーション緩衝液および2×SSC溶液による複数の洗浄後に、核をDAPIによって対比染色した。画像を400×の拡大率で共焦点顕微鏡法によって収集し、フォーカス面積を、DAPIシグナルの面積内に含有されるCy5シグナルの面積として測定した。データは核面積によって補正されたフォーカス面積として表現された。
結果は、DMPK標的化オリゴヌクレオチド(ASO300またはDMPK ASO-1(配列番号149))へ抱合された抗TfR(IgGまたはFab')を含有する抱合体の単回用量が、突然変異体DMPK発現の低減(図41A)、BIN1スプライシングの修正(図41B)、および核フォーカスのおよそ40％の低減(図41C)をもたらしたことを示している。
例29.抗TfR Fab 3M12 VH4/Vk3の結合活性の特徴付け
抗TfR Fab 3M12 VH4/Vk3の、ヒトおよびカニクイザルTfR1結合についての特異性を試験し、ヒトTfR1対TfR2についてのその選択性を確認するためにin vitro試験が行われた。様々な種由来のTfR1への抗TfR Fab 3M12 VH4/Vk3の結合親和性は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を使用して決定された。Fabの一連の希釈物が、組換えヒト、カニクイザル、マウス、またはラットTfR1で事前にコーティングされたプレートに添加された。短いインキュベーションの後、Fabの結合は、蛍光タグ付き抗(H＋L)IgG二次抗体の添加および495nm励起および520nm発光での蛍光強度の測定によって定量された。Fabは、ヒトおよびカニクイザルTfR1に対して強い結合親和性を示し、マウスまたはラットTfR1の検出可能な結合は観察されなかった(図42)。表面プラズモン共鳴(SPR)測定が行われ、結果は表19に示される。FabのKdは、ヒトTfR1受容体に対しては7.68×10-10Mであると計算され、カニクイザルTfR1受容体に対しては5.18×10-9Mであると計算された。
表19.表面プラズモン共鳴を使用して測定した、ヒトおよびカニクイザルTfR1またはヒトTfR2への抗TfR Fab 3M12 VH4/Vk3結合の速度論的分析
Figure 2023535074000088
ヒトTfR2に対する抗TfR Fab 3M12 VH4/Vk3の交差反応性を試験するために、ELISAが実施された。組換えヒトTfR2タンパク質は、2μg/mLで一晩プレーティングされ、PBS中1％ウシ血清アルブミン(BSA)で1時間ブロッキングされた。Fabまたは陽性対照抗TfR2抗体の一連の希釈物が0.5％ BSA/TBSTに1時間添加された。洗浄後、抗(H＋L)IgG-A488(Invitrogen＃MA5-25932)蛍光二次抗体が0.5％ BSA/TBST中1:500希釈で添加され、プレートは1時間インキュベートされた。Biotek Synergyプレートリーダーを使用して、495nm励起および520nm発光で相対蛍光が測定された。hTfR2への抗TfR Fab 3M12 VH4/Vk3の結合は観察されなかった(図43)。
例30.抗TfR Fab-ASO抱合体の血清中安定性
抗TfR Fab VH4/Vk3は、式(C)に示されるリンカーを介して対照アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)に抱合され、得られた抱合体は、FabをASOに抱合するリンカーの安定性について試験された。蛍光標識された抱合体をPBS、またはラット、マウス、カニクイザルもしくはヒト血清中でインキュベートし、相対蛍光強度を経時的に測定することによって血清中安定性が測定され、蛍光が高いほど、より多くの抱合体が無傷で残っていることを示す。図44は、血清中安定性が複数の種にわたって類似しており、72時間後も高いままであったことを示す。
例31.カニクイザルにおける、in vivoでの抗TfR Fab-ASO抱合体のエキソンスキッピング活性
抗TfR Fab 3M12 VH4/Vk3は、DMDエキソン51中のエキソンスプライシングエンハンサー(ESE)配列を標的とするジストロフィン(DMD)エキソン51スキッピングアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)に抱合された。エキソン51スキッピングオリゴヌクレオチドは、30ヌクレオチド長のホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー(PMO)である。抱合体のエキソンスキッピング活性は、健康な非ヒト霊長類においてin vivoで試験された。ナイーブ雄カニクイザル(n＝4～5/群)は、1日目および8日目に、静脈内注入を介してビヒクルの2回用量、30mg/kgのASO単独、または122mg/kgの抱合体(30mg/kgのASO当量)を投与された。最初の用量が投与された2週間後または4週間後に動物は屠殺され、組織が採取された。Promega Maxwell(登録商標)RSC装置を使用して組織サンプルから全RNAを収集し、qScript cDNA SuperMixを使用してcDNA合成が行われた。エキソン51スキッピングの評価は、エンドポイントPCRを使用して行われた。
PCR産物のキャピラリー電気泳動を使用してエキソンスキッピングを評価し、以下の式を使用してエキソン51スキッピング％が計算された:
Figure 2023535074000089
 計算されたエキソン51スキッピング結果は表20に示される。
表20カニクイザルジストロフィンにおけるジストロフィンのエキソン51スキッピング
Figure 2023535074000090
組織ASO蓄積も、ASO配列に相補的なプローブを用いたハイブリダイゼーションELISAを用いて定量された。標準曲線が作成され、標準曲線の線形回帰からASOレベル(ng/g)が導出された。ASOは、抗TfR Fab VH4/Vk3-ASO抱合体の投与後に、非抱合ASOの投与と比較して、評価されたすべての組織により高いレベルで分布された。非抱合ASOの静脈内投与は、最初の投与の2週間および4週間後に評価されたすべての組織においてバックグラウンドレベルに近いASOレベルをもたらした。抗TfR Fab VH4/Vk3-ASO抱合体の投与は、最初の投与の2週間後に、評価した組織を通したASOの分布を心臓＞横隔膜＞二頭筋＞四頭筋＞腓腹筋＞前脛骨筋の順位でもたらした。組織濃度の持続時間も評価された。四頭筋、二頭筋および横隔膜のASOの濃度は、評価した期間(2～4週間)にわたって50％未満減少したが、心臓、前脛骨筋および腓腹筋のASOのレベルは、実質的に変化しないままであった(表21)。
この例で使用される場合、「非抱合」という用語は、オリゴヌクレオチドが抗体に抱合されなかったことを示す。
表21.カニクイザルにおけるDMDエキソン51スキッピングASOの組織分布
Figure 2023535074000091
例32.FSHD患者由来不死化筋芽細胞における、DUX4標的化オリゴヌクレオチドに抱合された抗TfR Fabを含有する抱合体の効果
抗TfR Fab 3M12 VH4/VK3は、切断可能なVal-Citリンカーを介してDUX4標的化オリゴヌクレオチド(配列番号147)に抱合されて、オリゴヌクレオチドの筋肉送達の増強を達成した。オリゴヌクレオチドはPMOであり、DUX4転写産物のポリアデニル化シグナルを標的とする。抱合体の活性は、有意なレベルの表面TfR1発現およびDUX4トランスクリプトームマーカー(MBD3L2、TRIM43、ZSCAN4)の活性化を有するC6(AB1080)不死化FSHD1細胞株において評価された。筋細胞への抗TfR FabによるPMO(配列番号147)の受容体媒介送達は、8nM PMO濃度でDUX4トランスクリプトームバイオマーカーの約75％の減少をもたらしたが、当量の非抱合PMOは、ビヒクル処置細胞と比較して有意なバイオマーカー減少を示さないことが実証されている(図45)。結果は、抗TfR Fabとの抱合が、FSHDの処置のための治療用オリゴヌクレオチドの筋細胞への送達を増強することを示す。
この例で使用される場合、「非抱合」という用語は、オリゴヌクレオチドが抗体に抱合されなかったことを示す。
さらに、MBD3L2 mRNAの減少についての用量反応曲線が図46Aに示される。抱合体について半数阻害要求濃度(IC50)値は、189pMであった。MBD3L2、TRIM43、およびZSCAN4 mRNAの減少についての用量反応曲線が図46Bに示される。MBD3L2、TRIM43、およびZSCAN4を阻害する抱合体のIC50値は、それぞれ200pM、50pM、および200pMであった。
例32の実験手順
細胞培養および試験物処置
C6(AB1080)不死化FSHD筋芽細胞は、Supplementary mix(C-39365、Promocell)および1％ Penstrep(15140-122、Gibco)を含む骨格増殖培地(CAT＃C-23060、Promocell)中、96ウェルプレート(ThermoFisher Scientific)上に45,000細胞/ウェルの密度に播種された。24時間後、増殖培地は、分化培地、NbActiv4(Brainbits)および1％ Pen/Strep(Gibco)と交換された。細胞は、非抱合DUX4標的化オリゴヌクレオチド、8nMのPMO濃度の抱合体、ビヒクルで技術的反復で4時間処置した後、1XPBS(10010023、Gibco)で1回洗い流した。馴化分化培地は直ちにウェルに戻され、細胞は下流分析のために5日後に採取された。
MBD3L2、TRIM43およびZSCAN4ノックダウンの用量応答曲線では、C6(AB1080)不死化FSHD筋芽細胞は、上記のとおりであるが抱合体の濃度を変えて処置された。
RNA抽出およびqPCR
全RNAは、RNeasy 96 Kit(Qiagen)を用いて製造者の説明書に従って細胞単層から抽出された。RNAはBiotekプレートリーダーで定量され、ヌクレアーゼフリー水(Qiagen)でサンプル毎に50ngに希釈され、qScript cDNA SuperMix(QuantaBio)で逆転写された。TRIM43(Hs00299174_m1)、MBD3L2(Hs00544743_m1)、ZSCAN4(Hs00537549_m1)およびRPL13A(Hs04194366_g1)転写物のレベルを測定することによって、特異的TaqManアッセイ(ThermoFisher)を用いてqPCRによって遺伝子発現が分析された。Ct決定のための2段階増幅反応および蛍光測定が、QuantStudio 7装置(Thermo Scientific)で行われた。目的の転写産物の発現のLogの倍率変化が、参照遺伝子としてRPL13Aおよび対照群としてビヒクルに曝露された細胞使用して、2-ΔΔCT法に従って計算された。データは平均±S.D.として表される。
例33.DM1のモデルであるHSALRマウスにおける、オリゴヌクレオチド(ASO)に抱合された抗マウスTfR1 Fabの単回投与のヒトACTA1 mRNAに対する効果
6週齢～8週齢のホモ接合型HSALRマウスは、5つの処置群のうちの1つに無作為に割り当てられ、ビヒクル、ヒトACTA1 mRNAを標的とするネイキッドオリゴヌクレオチド(ASO)の10mg/kgもしくは20mg/kg用量、またはASOに抱合された抗TfR1 RI7217 Fabを含有する抱合体(Ab-ASO)の10mg/kgもしくは20mg/kgのASOに相当する用量で処置された。
ビヒクル、ASOまたはAb-ASOの静脈内注射の28日後、四頭筋(図47A)、腓腹筋(図47B)、および前脛骨筋(図47C)でのEMG筋強直性放電が盲検化された試験者によって4点スケールでグレード分けされ、そこで0は筋強直症が無いことを示し;1は針刺入の50％未満での時折の筋強直性放電を示し;2は針刺入の50％超での筋強直性放電を示し;3はほぼ刺入毎の筋強直性放電を示した。HSALRDM1モデルにおいて、ネイキッドASOではなく抱合体の単回投与が、筋強直症を用量依存的に退行させた。
ビヒクル処置群と各実験アームとの間の差の統計的有意性は、ダンの多重比較検定を用いたクラスカル・ウォリス検定によって決定された。データは、平均±S.E.M.として報告される;*p＜0.05、**p＜0.01。
さらに、処置の14日後および28日後にマウスは屠殺され、四頭筋(quad)、腓腹筋(gastroc)および前脛骨筋(TA)が収集され、ACTA1の発現について分析された。Ab-ASO抱合体を使用したACTA1発現のノックダウン(KD)は、単回投与後14日でPBS対照と比較して四頭筋(quad)、腓腹筋(gastroc)および前脛骨筋(TA)で観察されたが、ネイキッドASOは同じ時間枠でACTA1抑制を促進しなかった(図48)。処置の28日後の筋肉におけるACTA1の測定は、Ab-ASO抱合体が両試験用量(10mg/kg ASO当量および20mg/kg ASO当量)でビヒクル対照と比較してACTA1発現を減少させたのに対して、同じ用量のネイキッドASOはACTA1抑制を促進しなかったことを示した(図49A～図49C;*p＜0.05、**p＜0.01)。
例34.mdxマウスにおけるバイオマーカー発現および筋機能に対する、DMDエキソン23スキッピングを誘導するオリゴヌクレオチドに抱合された抗TfR1 Fabを含有する抱合体の効果
この研究の目的は、mdxマウスにおけるジストロフィン発現および筋機能に対する、アンチセンスオリゴヌクレオチドに抱合された抗マウスTfR1 Fab(Ab-ASO)の単回用量、またはそのネイキッドASOの単回用量の効果を決定することであった。この例で使用した複合体は、例13に記載のDTX-C-042であった。
7週齢の雄mdxホモ接合型マウスは、8つの処置群のそれぞれに無作為に割て当てられた。マウスは、尾静脈を介して、30mg/kgの単回用量のASO、30mg/kgのASOに相当する用量のAb-ASO、または生理食塩水を投与された。組織が採取され、投与の2週間後または4週間後に分析された。
筋肉におけるエキソン23スキッピングの測定:エキソン23スキッピングの定量化は、75ngの全RNA投入量を用いて、SuperScript(登録商標)III(Thermo Fisher)を使用する単一段階RT-PCR反応を使用して行われた。使用したPCRプライマーは、5'-CACATCTTTGATGGTGTGAGG(フォワード)(配列番号155)および5'-CAACTTCAGCCATCCATTTCTG(リバース)(配列番号156)であった。毛細管電気泳動を使用して、以下の式:
Figure 2023535074000092
 を使用して、目的の骨格筋においてスキッピングされた、およびスキッピングされていないバンドを定量した。結果は、抗TfR1 Fab-オリゴヌクレオチド抱合体(Ab-ASO)の単回投与が、mdxマウスの四頭筋(図50A)、心臓(図50B)、および横隔膜(図50C)におけるエキソン23のスキッピングスキップの有意な増加を促進したことを実証する。対照的に、野生型(WT)マウスまたは生理食塩水もしくはネイキッドASOで処置したmdxマウスの同じ筋組織では、エキソン23スキッピングはほとんど、または全く観察されなかった。
筋肉中のジストロフィンタンパク質の測定:四頭筋から採取した筋組織サンプルは均質化され、BCAアッセイによってタンパク質濃度が測定された。全タンパク質(25μg)は、3％～8％ Tris-アセテートタンパク質ゲルに充填され、150Vで1時間泳動された。次いで、ゲルはポリフッ化ビニリデン膜に転写され、膜は切断され、ジストロフィン含有部分は抗ジストロフィン抗体(Abcamカタログ＃15277)中で4℃にて一晩インキュベートされ、続いてヤギ抗ウサギIgG(H＋L)西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合体(Bio-Rad)中で室温にて30分間インキュベートされた。対照として、ブロットの残りの部分が、抗アルファ-アクチニン抗体(Abcamカタログ番号9465)と共に4℃で一晩、続いてヤギ抗マウスIgG(H＋L)西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合体(Bio-Rad)と共に室温で15分間インキュベートされた。ブロットを、ECL Western Detection Kit(Cytiva)を使用して発色させ、iBright分析ソフトウェア(Thermo Fisher Scientific)を使用して定量した。ウエスタンブロットの画像は、注射の2週間後に収集された筋肉組織について図51A(四頭筋)、図52A(心臓)、および図53A(横隔膜)に示され、ウエスタンブロット結果の定量化は、図51B(四頭筋)、図52B(心臓)、および図53B(横隔膜)に示される。ウエスタンブロットの画像は、注射の4週間後に収集された筋肉組織について図51C(四頭筋)、図52C(心臓)、および図53C(横隔膜)に示され、ウエスタンブロット結果の定量化は、図51D(四頭筋)、図52D(心臓)、および図53D(横隔膜)に示される。各ウエスタンブロットでは、野生型およびmdx組織由来のプールしたタンパク質を用いて標準曲線が作成され、各標準におけるパーセンテージ野生型(％WT)タンパク質は、サンプル中の野生型タンパク質の量を示す。図51A～図51Dは、投与後2週間および4週間で、四頭筋のジストロフィンタンパク質の増加を、Ab-ASOがネイキッドASOよりも大幅に促進したことを実証している。図52A～52Dは、投与後2週間および4週間で、Ab-ASOが心臓筋のジストロフィンタンパク質の増加を促進したが、ネイキッドASOで処置したマウスの心臓筋では野生型ジストロフィンがほとんど、または全く測定されなかったことを実証している。図53A～53Dは、投与後2週間および4週間で、Ab-ASOが横隔膜筋のジストロフィンタンパク質の増加を促進したが、ネイキッドASOで処置したマウスの横隔膜筋では野生型ジストロフィンがほとんど、または全く測定されなかったことを実証している。
組織内のASO含有量の測定:酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)は、NeutrAvidin被覆プレートを目的のASOに特異的な捕捉プローブでコーティングすることによって行われた。プロテイナーゼK消化組織溶解物が被覆プレート上でインキュベートされ、目的のASOを捕捉プローブに結合させた。次いで、プレートは洗浄され、未結合捕捉プローブがミクロコッカスヌクレアーゼで消化された後、さらに洗浄し、ブロッキングした。ジゴキシゲニンHRP抱合抗体が添加され、無傷の捕捉プローブに結合させ、次いで、TMB基質(R&D Systems,Inc.)を使用して画像化された。定量化は、骨格筋マトリックス中に希釈した既知濃度の標準曲線を用いて行われた。結果は、Fab抱合体の投与が、四頭筋(図54A)、横隔膜(図54B)および心臓(図54C)内のASOの実質的な蓄積を達成することができるのに対して、ネイキッドASOの投与は、各筋組織中のASO含有量をほとんど、または全く示さなかったことを実証している。図54A～図54Cは、生理食塩水またはネイキッドASOを投与したマウスの筋組織ではASOがほとんどまたは全く検出されなかったが、Ab-ASOの投与は、投与後2週間および4週間で試験した各組織で測定可能な量のASOをもたらしたことを実証している。
例35.非ヒト霊長類における抗体-オリゴヌクレオチド抱合体の薬物動態特性
DUX4標的化オリゴヌクレオチド(配列番号147)は、ネイキッドで、または抗TfR1抗体(3M12 VH4/Vk3 Fab)への抱合のいずれかで非ヒト霊長類に静脈内投与された。ネイキッドオリゴヌクレオチドは30mg/kgの用量で投与され、抱合体は3mg/kg、10mg/kg、または30mg/kgオリゴヌクレオチド当量の用量で投与された。経時的に測定したオリゴヌクレオチドの血漿レベルが図55に示される。結果は、抗体-オリゴヌクレオチド抱合体の全身曝露が線形薬物動態特性を示し、ネイキッドオリゴヌクレオチドと比較してより高い曝露を達成することを実証している。血漿測定はまた、抗体-オリゴヌクレオチド抱合体が約60時間の長い血清半減期を有することを実証する。さらに、抗体-オリゴヌクレオチド抱合体は、ネイキッドオリゴヌクレオチドと比較した曲線下面積の58倍の増加を示す。これらの結果は、表22に要約される。
表22.血漿濃度測定から計算した薬物動態値
Figure 2023535074000093
オリゴヌクレオチドまたは抗体-オリゴヌクレオチド抱合体の投与の2週間後、検死が行われ、非ヒト霊長類からの筋組織が収集され、オリゴヌクレオチドレベルが測定された。試験した各筋組織(心臓、口輪筋、大頬骨筋、横隔膜、僧帽筋、三角筋、腓腹筋、二頭筋、四頭筋、および前脛骨筋)において、組織オリゴヌクレオチドレベルは、抗体-オリゴヌクレオチド抱合体(3、10または30mg/kgオリゴヌクレオチド当量)の各用量で、ネイキッドオリゴヌクレオチド(30mg/kg)と比較して上昇した(図56)。対照として、ビヒクル処置動物から収集された組織中の組織オリゴヌクレオチドレベルも測定され、試験した筋組織のいずれにおいてもオリゴヌクレオチドは検出されなかった。これらの結果は、抗体-オリゴヌクレオチド抱合体が、筋組織へのDUX4標的化オリゴヌクレオチドの高暴露を達成し、ネイキッドで投与されたオリゴヌクレオチドよりも著しく高いことを実証している。
DUX4標的化オリゴヌクレオチドの組織蓄積を経時的に評価するために、組織オリゴヌクレオチドレベルは、投与の1週間後に収集された腓腹筋生検サンプルにおいて測定され、投与の2週間後に収集された検死サンプルにおいて測定された値と比較された。オリゴヌクレオチドレベルは、3、10、または30mg/kgのオリゴヌクレオチド当量の抗体-オリゴヌクレオチド抱合体を投与した動物から収集された腓腹筋生検サンプルにおいて、30mg/kgのネイキッドオリゴヌクレオチドを投与した動物から収集された生検サンプルよりも著しく高く、そのレベルは、投与の2週間後に収集された組織ではさらに高かった(図57)。オリゴヌクレオチドは、ビヒクル処置動物由来の組織サンプルでは検出されなかった。これらの結果は、抗体-オリゴヌクレオチド抱合体が、ネイキッドオリゴヌクレオチドと比較した場合、筋組織へのDUX4標的化オリゴヌクレオチドの高暴露を達成し、抱合体が経時的に蓄積し続けることを実証している。
例35.DMDエキソン53スキッピングオリゴヌクレオチドの抗TfR1抗体への抱合は、その力価を改善する
エキソン53スキッピングオリゴヌクレオチドに対する抗TfR1標的化の効果を試験するために、式(C)の構造を有するリンカーを介してエキソン53スキッピングPMOに共有結合的に連結された抗TfR1 Fab抗体(3M12 VH4/Vk3)を含む複合体が形成された。この例では、2つのエキソン53スキッピングPMO:配列GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC(配列番号156)を含むエキソン53 PMO-A、および配列CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC(配列番号157)を含むエキソン53 PMO-Bが使用された。
最初に、ジムノティック(gymnotic)取り込み後にエキソン53のスキッピングを促進にする(すなわち、トランスフェクション剤または修飾なしで筋標的化をもたらす)能力について、エキソン53スキップPMO単独が試験された。DMDエキソン52の欠失を有するKM1328 DMD患者細胞が、ある範囲の濃度のエキソン53 PMO-Aまたはエキソン53 PMO-Bで処置され、エキソン53のスキッピングが測定された。図59に示すように、エキソン53 PMO-Aは、エキソン53 PMO-Bよりも約2倍強力であった。用量応答曲線に基づいて、エキソン53の50％スキッピングを達成するためには、2.5μMのエキソン53 PMO-Aまたは4.7μMのエキソン53 PMO-Bの濃度が必要であると計算された。
次に、エキソン53 PMO-Aまたはエキソン53 PMO-Bのいずれかに共有結合的に連結された抗TfR1 Fabを含む複合体(「抗TfR1 Fab-ASO複合体」)は、抗体に連結していない同じPMO(「ネイキッドASO」)と比較して、KM1328 DMD患者細胞におけるエキソン53のスキッピングを促進するそれらの能力について試験された。細胞は、0.16μM、0.32μM、0.63μMもしくは1.25μMの濃度のネイキッドASO、または0.16μM、0.32μM、0.63μMもしくは1.25μMのASO当量濃度の抗TfR1 Fab-ASO複合体で処置された。図60に示すように、Fab-ASO複合体は、試験した各濃度でネイキッドASOよりも多いエキソン53スキッピングを達成し、試験したより低い用量(0.16μM、0.32μMおよび0.63μM)でのエキソン53 PMO-Aによるエキソン53スキッピングの著しい改善の達成を包含する。これらの結果は、エキソンスキッピングオリゴヌクレオチドを抗TfR1抗体に共有結合的に連結することにより、より低用量でのエキソンスキッピング活性を促進することができ、それにより、より低用量でのオリゴヌクレオチドの有効性を可能にすることを実証する。
追加の態様
1.機能獲得型疾患アレルに関連する筋疾患を有すると診断された対象を処置する方法であって、方法は、疾患アレルの発現または活性を阻害するように構成された分子ペイロードに共有結合的に連結された筋標的化剤を含む複合体を対象に投与することを含み、筋標的化剤は、対象の筋細胞上の内在化細胞表面受容体に特異的に結合し、
筋標的化剤は、トランスフェリン受容体に結合するヒト化抗体であり、
抗体は、以下を含む:
(i)配列番号69と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号70と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(ii)配列番号71と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号70と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(iii)配列番号72と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号70と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(iv)配列番号73と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号74と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(v)配列番号73と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号75と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(vi)配列番号76と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号74と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(vii)配列番号76と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号75と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(viii)配列番号77と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号78と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(ix)配列番号79と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号80と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);または
(x)配列番号77と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);配列番号80と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL)。
2.抗体が以下を含む、態様1に記載の方法:
(i)配列番号69のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号70のアミノ酸配列を含むVL;
(ii)配列番号71のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号70のアミノ酸配列を含むVL;
(iii)配列番号72のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号70のアミノ酸配列を含むVL;
(iv)配列番号73のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号74のアミノ酸配列を含むVL;
(v)配列番号73のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号75のアミノ酸配列を含むVL;
(vi)配列番号76のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号74のアミノ酸配列を含むVL;
(vii)配列番号76のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号75のアミノ酸配列を含むVL;
(viii)配列番号77のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号78のアミノ酸配列を含むVL;
(ix)配列番号79のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号80のアミノ酸配列を含むVL;または
(x)配列番号77のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号80のアミノ酸配列を含むVL。
3.抗体が、完全長IgG、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント、scFv、およびFvからなる群から選択される、態様1または態様2に記載の方法。
4.抗体が完全長IgGであり、場合により完全長IgGがアイソタイプIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4の重鎖定常領域を含む、態様3に記載の方法。
5.抗体が以下を含む、態様4に記載の方法:
(i)配列番号84と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号85と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(ii)配列番号86と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号85と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(iii)配列番号87と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号85と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(iv)配列番号88と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号89と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(v)配列番号88と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号90と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(vi)配列番号91と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号89と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(vii)配列番号91と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号90と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(viii)配列番号92と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号93と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(ix)配列番号94と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号95と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;または
(x)配列番号92と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号95と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖。
6.抗体がFabフラグメントである、態様3に記載の方法。
7.抗体が以下を含む、態様6に記載の方法:
(i)配列番号97と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号85と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(ii)配列番号98と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号85と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(iii)配列番号99と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号85と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(iv)配列番号100と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号89と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(v)配列番号100と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号90と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(vi)配列番号101と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号89と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(vii)配列番号101と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号90と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(viii)配列番号102と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号93と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(ix)配列番号103と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号95と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;または
(x)配列番号102と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号95と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖。
8.抗体が以下を含む、態様6または態様7に記載の方法:
(i)配列番号97のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(ii)配列番号98のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(iii)配列番号99のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(iv)配列番号100のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号89のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(v)配列番号100のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(vi)配列番号101のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号89のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(vii)配列番号101のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(viii)配列番号102のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号93のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(ix)配列番号103のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号95のアミノ酸配列を含む軽鎖;または
(x)配列番号102のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号95のアミノ酸配列を含む軽鎖。
9.筋疾患が遺伝性である。態様1～8のいずれか1つに記載の方法。
10.筋疾患が対象の一連の家族の世代において増大した重症度を呈する、態様1～9のいずれか1つに記載の方法。
11.対象が疾患アレルの遺伝学的分析に基づいて筋疾患を有すると診断された、態様1～10のいずれか1つに記載の方法。
12.対象が、投与に先立ち、進行性筋肉衰弱および/または筋肉減少症を呈する、態様1～11のいずれか1つに記載の方法。
13.対象が、投与に先立ち、例として筋電図法で測定可能な筋強直症を呈する、態様1～12のいずれか1つに記載の方法。
14.トランスフェリン受容体に対する抗体の結合の平衡解離定数(KD)が、10-11Mから10-6Mまでの範囲にある、態様1～13のいずれか1つに記載の方法。
15.抗体が、トランスフェリン受容体のトランスフェリン結合部位に特異的に結合せず、および/または抗体がトランスフェリン受容体に対するトランスフェリンの結合を阻害しない、態様1～14のいずれか1つに記載の方法。
16.抗体が、ヒト、非ヒト霊長類および齧歯類のトランスフェリン受容体の2以上の細胞外エピトープと交差反応性である、態様1～15のいずれか1つに記載の方法。
17.トランスフェリン受容体によって媒介される、分子ペイロードの筋細胞内への内在化を促進するように方法が構成される、態様1～16のいずれか1つに記載の方法。
18.抗体がキメラ抗体であり、任意にキメラ抗体がヒト化モノクローナル抗体である、態様1～17のいずれか1つに記載の方法。
19.抗体が、ScFv、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント、またはFvフラグメントの形態である、態様1～18のいずれか1つに記載の方法。
20.分子ペイロードがオリゴヌクレオチドである、態様1～19のいずれか1つに記載の方法。
21.オリゴヌクレオチドが、表1に列挙される遺伝子またはそれからコードされるmRNAと相補性の領域を含む、態様20に記載の方法。
22.オリゴヌクレオチドが、gapmerオリゴヌクレオチド、mixmerオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、RNAiオリゴヌクレオチド、メッセンジャーRNA(mRNA)、またはガイド配列である、態様20または21に記載の方法。
23.複合体が筋肉外の非経口投与によって対象へ投与される、態様1～22のいずれか1つに記載の方法。
24.複合体が静脈内投与によって対象へ投与される、態様23に記載の方法。
25.複合体が、複合体の皮下投与によって対象へ投与される、態様23に記載の方法。
26.一本鎖オリゴヌクレオチドに連結された筋標的化剤を含む複合体であって、筋標的化剤が筋細胞上の内在化細胞表面受容体に特異的に結合し、オリゴヌクレオチドが筋疾患遺伝子に対する相補性領域を含み、任意で筋標的化剤が、トランスフェリン受容体に結合するヒト化抗体であり、以下を含む:
(i)配列番号69と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号70と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(ii)配列番号71と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号70と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(iii)配列番号72と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号70と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(iv)配列番号73と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号74と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(v)配列番号73と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号75と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(vi)配列番号76と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号74と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(vii)配列番号76と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号75と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(viii)配列番号77と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号78と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(ix)配列番号79と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号80と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);または
(x)配列番号77と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);配列番号80と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL)。
27.複数の複合体を含む組成物であって、各複合体が、少なくとも3つのオリゴヌクレオチドに共有結合的に連結された筋標的化剤を含み、筋標的化剤が対象の筋細胞上の内在化細胞表面受容体に特異的に結合し、各オリゴヌクレオチドが筋疾患遺伝子に対する相補性領域を含み、任意で筋標的化剤が、トランスフェリン受容体に結合するヒト化抗体であり、以下を含む:
(i)配列番号69と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号70と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(ii)配列番号71と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号70と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(iii)配列番号72と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号70と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(iv)配列番号73と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号74と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(v)配列番号73と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号75と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(vi)配列番号76と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号74と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(vii)配列番号76と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号75と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(viii)配列番号77と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号78と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(ix)配列番号79と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号80と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);または
(x)配列番号77と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);配列番号80と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL)。
28.筋細胞中で機能する非分泌生成物をコードする筋疾患遺伝子の発現または活性をモジュレートするように構成された分子ペイロードに共有結合的に連結された筋標的化剤を含む複合体であって、筋標的化剤が筋細胞上の内在化細胞表面受容体に特異的に結合し、任意で筋標的化剤が、トランスフェリン受容体に結合するヒト化抗体であり、以下を含む:
(i)配列番号69と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号70と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(ii)配列番号71と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号70と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(iii)配列番号72と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号70と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(iv)配列番号73と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号74と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(v)配列番号73と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号75と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(vi)配列番号76と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号74と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(vii)配列番号76と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号75と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(viii)配列番号77と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号78と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(ix)配列番号79と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号80と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);または
(x)配列番号77と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);配列番号80と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL)。
29.抗体が以下を含む、態様28に記載の複合体:
(i)配列番号69のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号70のアミノ酸配列を含むVL;
(ii)配列番号71のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号70のアミノ酸配列を含むVL;
(iii)配列番号72のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号70のアミノ酸配列を含むVL;
(iv)配列番号73のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号74のアミノ酸配列を含むVL;
(v)配列番号73のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号75のアミノ酸配列を含むVL;
(vi)配列番号76のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号74のアミノ酸配列を含むVL;
(vii)配列番号76のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号75のアミノ酸配列を含むVL;
(viii)配列番号77のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号78のアミノ酸配列を含むVL;
(ix)配列番号79のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号80のアミノ酸配列を含むVL;または
(x)配列番号77のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号80のアミノ酸配列を含むVL。
30.抗体が、完全長IgG、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント、scFv、およびFvからなる群から選択される、態様29または態様29に記載の複合体。
31.抗体が完全長IgGであり、場合により完全長IgGがアイソタイプIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4の重鎖定常領域を含む、態様30に記載の複合体。
32.抗体が以下を含む、態様31に記載の複合体:
(i)配列番号84と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号85と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(ii)配列番号86と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号85と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(iii)配列番号87と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号85と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(iv)配列番号88と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号89と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(v)配列番号88と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号90と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(vi)配列番号91と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号89と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(vii)配列番号91と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号90と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(viii)配列番号92と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号93と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(ix)配列番号94と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号95と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;または
(x)配列番号92と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号95と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖。
33.抗体がFabフラグメントである、態様30に記載の複合体。
34.抗体が以下を含む、態様33に記載の複合体:
(i)配列番号97と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号85と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(ii)配列番号98と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号85と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(iii)配列番号99と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号85と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(iv)配列番号100と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号89と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(v)配列番号100と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号90と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(vi)配列番号101と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号89と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(vii)配列番号101と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号90と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(viii)配列番号102と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号93と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(ix)配列番号103と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号95と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;または
(x)配列番号102と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号95と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖。
35.抗体が以下を含む、態様33または態様34に記載の複合体:
(i)配列番号97のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(ii)配列番号98のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(iii)配列番号99のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(iv)配列番号100のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号89のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(v)配列番号100のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(vi)配列番号101のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号89のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(vii)配列番号101のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(viii)配列番号102のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号93のアミノ酸配列を含む軽鎖;
(ix)配列番号103のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号95のアミノ酸配列を含む軽鎖;または
(x)配列番号102のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号95のアミノ酸配列を含む軽鎖。
36.トランスフェリン受容体に対する筋標的化抗体の結合の平衡解離定数(KD)が、10-11Mから10-6Mまでの範囲にある、態様28～35のいずれか1つに記載の複合体。
37.抗体がトランスフェリン受容体のトランスフェリン結合部位に特異的に結合せず、および/または抗体がトランスフェリン受容体に対するトランスフェリンの結合を阻害しない、態様28～36のいずれか1つに記載の複合体。
38.抗体が、ヒト、非ヒト霊長類および齧歯類のトランスフェリン受容体の2以上の細胞外エピトープと交差反応性である、態様28～37のいずれか1つに記載の複合体。
39.複合体が、筋細胞内への分子ペイロードのトランスフェリン受容体によって媒介される内在化を促進するように構成される、態様28～38のいずれか1つに記載の複合体。
40.抗体がキメラ抗体である、態様28～39のいずれか1つに記載の複合体。
41.キメラ抗体がヒト化モノクローナル抗体である、態様40に記載の複合体。
42.抗体が、ScFv、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント、またはFvフラグメントの形態である、態様28～41のいずれか1つに記載の複合体。
43.分子ペイロードがオリゴヌクレオチドである、態様28～42のいずれか1つに記載の複合体。
44.オリゴヌクレオチドが、機能獲得型の疾患アレルを有する筋疾患遺伝子に対する相補性の領域を含む、態様43記載の複合体。
45.分子ペイロードがポリペプチドである、態様28～42のいずれか1つに記載の複合体。
46.ポリペプチドがE3ユビキチンリガーゼインヒビターペプチドである、態様45に記載の複合体。
47.オリゴヌクレオチドが、少なくとも1つの修飾ヌクレオチド間連結を含む、態様43または44記載の複合体。
48.少なくとも1つの修飾されたヌクレオチド間連結が、ホスホロチオアート連結である、態様47記載の複合体。
49.オリゴヌクレオチドが、Rp立体化学的配座および/またはSp立体化学的配座でのホスホロチオアート連結を含む、態様48に記載の複合体。
50.オリゴヌクレオチドが、すべてがRp立体化学的配座であるか、またはすべてがSp立体化学的配座であるホスホロチオアート連結を含む、態様49に記載の複合体。
51.オリゴヌクレオチドが1つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、態様43、44または47～50のいずれか1つに記載の複合体。
52.1つ以上の修飾ヌクレオチドが2'修飾ヌクレオチドである、態様51に記載の複合体。
53.オリゴヌクレオチドが、細胞中、筋疾患遺伝子によってコードされるmRNA転写産物のRNAse H媒介切断を導くgapmerオリゴヌクレオチドである、態様43、44または47～52のいずれか1つに記載の複合体。
54.gapmerオリゴヌクレオチドが、2～8修飾ヌクレオチドのウイングによってフランキングされた5～15デオキシリボヌクレオチドの中央部分を含む、態様53に記載の複合体。
55.ウイングの修飾ヌクレオチドが2'修飾ヌクレオチドである、態様54に記載の複合体。
56.オリゴヌクレオチドがmixmerオリゴヌクレオチドである、態様43、44または47～52のいずれか1つに記載の複合体。
57.mixmerオリゴヌクレオチドが2以上の異なる2'修飾ヌクレオチドを含む、態様56に記載の複合体。
58.オリゴヌクレオチドが、筋疾患遺伝子によってコードされるmRNA転写産物のRNAi媒介切断を促進するRNAiオリゴヌクレオチドである、態様43、44または47～52のいずれか1つに記載の複合体。
59.RNAiオリゴヌクレオチドが、長さが19～25ヌクレオチドの二本鎖オリゴヌクレオチドである、態様58に記載の複合体。
60.RNAiオリゴヌクレオチドが、少なくとも1つの2'修飾ヌクレオチドを含む、態様58または59に記載の複合体。
61.各2'修飾ヌクレオチドが、2'-O-メチル、2'-フルオロ(2'-F)、2'-O-メトキシエチル(2'-MOE)、および2',4'架橋ヌクレオチドからなる群から選択される、態様52、55、57または60のいずれか1つに記載の複合体。
62.1つ以上の修飾ヌクレオチドが架橋ヌクレオチドである、態様51に記載の複合体。
63.少なくとも1つの2'修飾ヌクレオチドが、2',4'-拘束2'-O-エチル(cEt)およびロックド核酸(LNA)ヌクレオチドから選択される2',4'架橋ヌクレオチドである、態様52、55、57または60のいずれか1つに記載の複合体。
64.オリゴヌクレオチドがゲノム編集ヌクレアーゼのためのガイド配列を含む、態様43、44または47～52のいずれか1つに記載の複合体。
65.オリゴヌクレオチドがホスホロジアミダイトモルフォリノオリゴマーである、態様43、44または47～52のいずれか1つに記載の複合体。
66.抗体が、切断可能なリンカーを介して分子ペイロードへ共有結合的に連結される、態様28～65のいずれか1つに記載の複合体。
67.切断可能なリンカーが、プロテアーゼ感受性リンカー、pH感受性リンカー、およびグルタチオン感受性リンカーから選択される、態様66に記載の複合体。
68.切断可能なリンカーがプロテアーゼ感受性リンカーである、態様67に記載の複合体。
69.プロテアーゼ感受性リンカーが、リソソームプロテアーゼおよび/またはエンドソームプロテアーゼによって切断可能な配列を含む、態様68に記載の複合体。
70.プロテアーゼ感受性リンカーがバリン-シトルリンジペプチド配列を含む、態様68に記載の複合体。
71.リンカーが、4～6の範囲のpHにおいて切断されるpH感受性リンカーである、態様67に記載の複合体。
72.抗体が、非切断可能なリンカーを介して分子ペイロードへ共有結合的に連結される、態様28～65のいずれか1つに記載の複合体。
73.非切断可能なリンカーがアルカンリンカーである、態様72に記載の複合体。
74.抗体が非天然アミノ酸を含み、これにオリゴヌクレオチドが共有結合的に連結される、態様28～73のいずれか1つに記載の複合体。
75.抗体が、抗体のリジン残基またはシステイン残基への抱合を介してオリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結される、態様28～74のいずれか1つに記載の複合体。
76.抗体が、マレイミド含有リンカーを介してシステインに抱合され、任意にマレイミド含有リンカーが、マレイミドカプロイルまたはマレイミドメチルシクロヘキサン-1-カルボキシレート基を含む、態様75に記載の複合体。
77.抗体が、グリコシル化抗体であり、これが、オリゴヌクレオチドが共有結合的に連結される少なくとも1つの糖部分を含む、態様28～76のいずれか1つに記載の複合体。
78.糖部分が分岐型マンノースである、態様77に記載の複合体。
79.抗体が、グリコシル化抗体であり、これが1～4つの糖部分を含み、これら各々が別個のオリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結される、態様77または78に記載の複合体。
80.抗体が完全グリコシル化抗体である、態様77に記載の複合体。
81.抗体が部分グリコシル化抗体である、態様77に記載の複合体。
82.部分グリコシル化抗体が、化学的または酵素的手段によって産生される、態様81に記載の複合体。
83.部分グリコシル化抗体が、細胞、N-またはO-グリコシル化経路の酵素を欠乏している細胞において産生される、態様81に記載の複合体。
84.細胞を態様29～83のいずれか1つに記載の複合体と接触させることを含む、トランスフェリン受容体を発現する細胞に分子ペイロードを送達する方法。
85.態様29～83のいずれか1つに記載の複合体を、細胞への分子ペイロードの内在化を促進するのに有効な量で細胞と接触させることを含む、細胞の筋疾患遺伝子の発現または活性を阻害する方法。
86.細胞がin vitroである、態様85に記載の方法。
87.細胞が対象に存在する、態様85に記載の方法。
88.対象がヒトである、態様87に記載の方法。
89.態様29～83のいずれか1つに記載の複合体の有効量を対象へ投与することを含む、筋疾患を有する対象を処置する方法。
90.筋疾患が表1に挙げられる疾患である、態様89に記載の方法。
91.筋疾患が、以下:成人型ポンペ病、中心核ミオパチー(CNM)、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー(FSHD)、家族性肥大型心筋症、進行性骨化性線維異形成症(FOP)、フリートライヒ運動失調症(FRDA)、2型封入体ミオパチー、レイン遠位型ミオパチー、筋原線維ミオパチー、先天性筋強直症(常染色体優性型、トムゼン病)、筋強直性ジストロフィーI型、筋強直性ジストロフィーII型、筋細管ミオパチー、眼咽頭型筋ジストロフィー、および先天性異常筋強直症からなる群から選択される疾患である、態様89に記載の方法。
92.筋疾患遺伝子の発現または活性をモジュレートするように構成された分子ペイロードに共有結合的に連結された抗トランスフェリン受容体(TfR)抗体を含む複合体であって、抗体が、以下を含む:
(i)配列番号76と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号75と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(ii)配列番号69と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号70と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(iii)配列番号71と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号70と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(iv)配列番号72と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号70と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(v)配列番号73と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号74と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(vi)配列番号73と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号75と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(vii)配列番号76と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号74と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(viii)配列番号77と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号78と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
(ix)配列番号79と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号80と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);または
(x)配列番号77と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);配列番号80と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL)。
93.筋疾患遺伝子の発現または活性をモジュレートするように構成された分子ペイロードに共有結合的に連結された抗トランスフェリン受容体(TfR)抗体を含む複合体であって、抗TfR抗体が、翻訳後修飾に起因するピログルタメート形成を受けている、複合体。
等価物および用語
例証的に本明細書に記載された開示は、好適には、本明細書に具体的には開示されないいずれかの要素(単数または複数)、限定(単数または複数)の非存在下において実施され得る。それゆえに、例えば、本出願の各事例において、用語「含む」、「から本質的になる」、および「からなる」のいずれかは、他の2つの用語のどちらかによって置き換えられ得る。採用された用語および表現は、限定ではなく記載の用語として使用され、かかる用語および表現の使用には、示されるおよび記載される特徴のいずれかの等価物またはそれらの部分を排除する意図はなく、種々の改変が本開示の範囲内で可能であることが認識される。それゆえに、本開示は好ましい態様によって具体的に開示されたが、本明細書に開示される概念の任意の特徴、改変、および変形が当業者によって頼られ得ることと、かかる改変および変形は本開示の範囲内であると考慮されることとは理解されるべきである。
加えて、本開示の特徴または側面がマーカッシュ群または代替物の他の群分けとして記載されるところでは、当業者は、本開示がそれによってマーカッシュ群または他の群のいずれかの個々の構成員または構成員のサブグループとしてもまた記載されることを認識するであろう。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドまたは他の核酸の構造を記載する際には、配列表で提示される配列が参照され得ることは了解されるべきである。かかる態様において、実際のオリゴヌクレオチドまたは他の核酸は、指定された配列と本質的に同じかまたは類似の相補的な特性を保持しながら、指定された配列と比較して、1以上の代替的なヌクレオチド(例として、DNAヌクレオチドのRNAカウンターパート、またはRNAヌクレオチドのDNAカウンターパート)および/または(例として、および)1以上の修飾ヌクレオチドおよび/または(例として、および)1以上の修飾されたヌクレオチド間連結および/または(例として、および)1以上の他の改変を有し得る。
本発明を記載する文脈における(特に次の請求項の文脈における)用語「a」および「an」および「the」ならびに類似のレファレントの使用は、本明細書に別様に指し示されないかまたは文脈によって明瞭に否定されない限り、単数および複数両方をカバーすると解釈されるべきである。用語「含む」、「有する」、「包含する」、および「含有する」は、別様に指摘されない限り、開放型の用語として解釈されるべきである(すなわち、「包含するが、これらに限定されない」を意味する)。本明細書における値の範囲の記載は、本明細書に別様に指し示されない限り、単に、範囲内に収まる各別個の値を個々に参照する簡略な方法として働くことを意図され、各別個の値は、それが本明細書に個々に記載される場合のように本明細書に組み込まれる。本明細書に別様に指し示されないかまたは別様には文脈によって明瞭に否定されない限り、本明細書に記載のすべての方法はいずれかの好適な順序で行われ得る。別様に請求されない限り、本明細書に提供されるいずれかのおよびすべての例または例示的な文言(例として、「などの」)の使用は、単に本発明をより良く解き明かすことを意図され、本発明の範囲に限定を課さない。本明細書のいかなる文言も、いずれかの請求されない要素を本発明の実施にとって必須であると指し示すものと解釈されるべきではない。
本発明の態様が本明細書に記載されている。それらの態様の変形は、先述の記載を読むことによって当業者には明らかになり得る。
本発明者は当業者がかかる変形を適当に採用することを予期し、本発明者は本発明が本明細書に具体的に記載されるとおりとは別様に実施されることを意図する。したがって、本発明は、然るべき法律によって許可される本明細書に添付される請求項に記載される主題のすべての改変および等価物を包含する。その上、それらのすべての可能な変形における上に記載された要素のいずれかの組み合わせは、本明細書に別様に指し示されないかまたは別様に文脈によって明瞭に否定されない限り、本発明によって包摂される。当業者は、本明細書に記載される本発明の特定の態様の多くの均等物を認識するか、またはせいぜい慣例的な実験作業を用いて確かめることができるであろう。かかる等価物は次の請求項によって包摂されることを意図される。

Claims (28)

  1. 筋疾患遺伝子の発現または活性をモジュレートするように構成された分子ペイロードに共有結合的に連結された抗トランスフェリン受容体(TfR)抗体を含む複合体であって、抗体が、
    (i)配列番号76と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号75と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
    (ii)配列番号69と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号70と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
    (iii)配列番号71と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号70と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
    (iv)配列番号72と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号70と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
    (v)配列番号73と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号74と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
    (vi)配列番号73と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号75と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
    (vii)配列番号76と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号74と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
    (viii)配列番号77と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号78と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
    (ix)配列番号79と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);および/または配列番号80と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);または
    (x)配列番号77と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);配列番号80と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL)
    を含む複合体。
  2. 抗体が、
    (i)配列番号76のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号75のアミノ酸配列を含むVL;
    (ii)配列番号69のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号70のアミノ酸配列を含むVL;
    (iii)配列番号71のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号70のアミノ酸配列を含むVL;
    (iv)配列番号72のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号70のアミノ酸配列を含むVL;
    (v)配列番号73のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号74のアミノ酸配列を含むVL;
    (vi)配列番号73のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号75のアミノ酸配列を含むVL;
    (vii)配列番号76のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号74のアミノ酸配列を含むVL;
    (viii)配列番号77のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号78のアミノ酸配列を含むVL;
    (ix)配列番号79のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号80のアミノ酸配列を含むVL;または
    (x)配列番号77のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号80のアミノ酸配列を含むVL
    を含む、請求項1記載の複合体。
  3. 抗体が、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント、scFv、Fv、および完全長IgGからなる群から選択される、請求項1または2に記載の複合体。
  4. 抗体が、Fabフラグメントである、請求項3に記載の複合体。
  5. 抗体が、
    (i)配列番号101と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号90と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
    (ii)配列番号97と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号85と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
    (iii)配列番号98と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号85と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
    (iv)配列番号99と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号85と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
    (v)配列番号100と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号89と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
    (vi)配列番号100と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号90と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
    (vii)配列番号101と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号89と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
    (viii)配列番号102と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号93と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;
    (ix)配列番号103と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号95と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖;または
    (x)配列番号102と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または配列番号95と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖
    を含む、請求項4に記載の複合体。
  6. 抗体が、
    (i)配列番号101のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖;
    (ii)配列番号97のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖;
    (iii)配列番号98のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖;
    (iv)配列番号99のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖;
    (v)配列番号100のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号89のアミノ酸配列を含む軽鎖;
    (vi)配列番号100のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖;
    (vii)配列番号101のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号89のアミノ酸配列を含む軽鎖;
    (viii)配列番号102のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号93のアミノ酸配列を含む軽鎖;
    (ix)配列番号103のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号95のアミノ酸配列を含む軽鎖;または
    (x)配列番号102のアミノ酸配列を含む重鎖;および配列番号95のアミノ酸配列を含む軽鎖
    を含む、請求項4または5に記載の複合体。
  7. 抗体が、トランスフェリン受容体のトランスフェリン結合部位へ特異的に結合せず、および/または抗体が、トランスフェリン受容体に対するトランスフェリンの結合を阻害しない、請求項1～6のいずれか一項に記載の複合体。
  8. 抗体が、ヒト、非ヒト霊長類および齧歯類のトランスフェリン受容体の2つ以上の細胞外エピトープと交差反応性である、請求項1～7のいずれか一項に記載の複合体。
  9. 筋細胞内への分子ペイロードのトランスフェリン受容体によって媒介される内在化を促進するように構成される、請求項1～8のいずれか一項に記載の複合体。
  10. 分子ペイロードが、オリゴヌクレオチドである、請求項1～9のいずれか一項に記載の複合体。
  11. オリゴヌクレオチドが、機能獲得型の疾患アレルを有する筋疾患遺伝子に対する相補性の領域を含む、請求項10に記載の複合体。
  12. オリゴヌクレオチドが、少なくとも1つの修飾されたヌクレオシド間連結を含む、請求項10または11に記載の複合体。
  13. 少なくとも1つの修飾されたヌクレオシド間連結が、ホスホロチオアート連結である、請求項12に記載の複合体。
  14. オリゴヌクレオチドが1つ以上の修飾ヌクレオシドを含む、請求項10～13のいずれか一項に記載の複合体。
  15. 1つ以上の修飾ヌクレオシドが、2'修飾ヌクレオシドである、請求項14に記載の複合体。
  16. オリゴヌクレオチドが、細胞中、筋疾患遺伝子によってコードされるmRNA転写産物のRNAse H媒介切断を導くgapmerオリゴヌクレオチドである、請求項10～15のいずれか一項に記載の複合体。
  17. オリゴヌクレオチドが、mixmerオリゴヌクレオチドである、請求項10～15のいずれか一項に記載の複合体。
  18. オリゴヌクレオチドが、筋疾患遺伝子によってコードされるmRNA転写産物のRNAi媒介切断を促進するRNAiオリゴヌクレオチドである、請求項10～15のいずれか一項に記載の複合体。
  19. 各2'-修飾ヌクレオシドが、2'-O-メチル、2'-フルオロ(2'-F)、2'-O-メトキシエチル(2'-MOE)、および2',4'-架橋ヌクレオシドからなる群から選択される、請求項15に記載の複合体。
  20. 1つ以上の修飾ヌクレオシドが、2',4'-架橋ヌクレオシドである、請求項14に記載の複合体。
  21. オリゴヌクレオチドが、ホスホロジアミダートモルフォリノオリゴマーである、請求項10～15のいずれか一項に記載の複合体。
  22. 抗体が、切断可能なリンカーを介して分子ペイロードへ共有結合的に連結される、請求項1～21のいずれか一項に記載の複合体。
  23. 切断可能なリンカーが、バリン-シトルリン配列を含む、請求項22に記載の複合体。
  24. 抗体が、抗体のリジン残基またはシステイン残基への抱合を介して分子ペイロードへ共有結合的に連結される、請求項1～23のいずれか一項に記載の複合体。
  25. 筋疾患遺伝子の発現または活性をモジュレートすることが、RNAおよび/またはタンパク質の発現を減少させることを含む、請求項1～24のいずれか一項に記載の複合体。
  26. 細胞中の筋疾患遺伝子の発現または活性をモジュレートする方法であって、細胞を請求項1～25のいずれか一項に記載の複合体と、細胞への分子ペイロードの内在化を促進するのに有効な量で接触させることを含み、任意で細胞が筋細胞である、前記方法。
  27. 筋疾患が、成人型ポンペ病、中心核ミオパチー(CNM)、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー(FSHD)、家族性肥大型心筋症、進行性骨化性線維異形成症(FOP)、フリートライヒ運動失調症(FRDA)、2型封入体ミオパチー、レイン遠位型ミオパチー、筋原線維ミオパチー、先天性筋強直症(常染色体優性型、トムゼン病)、筋強直性ジストロフィーI型、筋強直性ジストロフィーII型、筋細管ミオパチー、眼咽頭型筋ジストロフィー、および先天性異常筋強直症からなる群から選択される疾患である、請求項26に記載の方法。
  28. 筋疾患を有する対象を処置する方法であって、有効量の請求項1～25のいずれか一項に記載の複合体を対象に投与することを含み、任意で筋疾患が、成人型ポンペ病、中心核ミオパチー(CNM)、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー(FSHD)、家族性肥大型心筋症、進行性骨化性線維異形成症(FOP)、フリートライヒ運動失調症(FRDA)、2型封入体ミオパチー、レイン遠位型ミオパチー、筋原線維ミオパチー、先天性筋強直症(常染色体優性型、トムゼン病)、筋強直性ジストロフィーI型、筋強直性ジストロフィーII型、筋細管ミオパチー、眼咽頭型筋ジストロフィー、および先天性異常筋強直症からなる群から選択される疾患である、前記方法。
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