FR3049951A1 - Nouvelles constructions peptidiques et leur utilisation dans le traitement de la toxoplasmose - Google Patents
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Abstract
L'invention a pour objet une construction peptidique ne contenant pas de région CH1, reconnaissant l'antigène SAG1 de Toxoplasma gondii et capable de neutraliser l'invasion des cellules par Toxoplasma gondii, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose, notamment la toxoplasmose oculaire, la toxoplasmose congénitale et les troubles du comportement liés à la présence de Toxoplasma gondii.
Description
NOUVELLES CONSTRUCTIONS PEPTIDIQUES ET LEUR UTILISATION DANS LE
TRAITEMENT DE LA TOXOPLASMOSE L’invention a pour objet de nouvelles constructions peptidiques reconnaissant Tantigène SAGl de Toxoplasma gondii et leur utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
Depuis la Haute Antiquité, les Hommes connaissent les symptômes des maladies infectieuses et aujourd’hui encore celles-ci constituent un « défi » majeur pour les Sciences Biomédicales. Elles restent l’une des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde (33% des décès dans les pays en voie de développement). La toxoplasmose fait partie de ces grands défis sociétaux. Maladie parasitaire cosmopolite due à un protozoaire intracellulaire obligatoire {Toxoplasma gondii), elle demeure une de ces maladies ayant un fort impact économique et sanitaire, que l’on prenne en considération la Santé Humaine ou bien la Santé Vétérinaire.
Bien que généralement asymptomatique chez l’Homme, cette maladie peut toutefois revêtir un caractère de grande sévérité sous forme d’une neurotoxoplasmose, d’une choriorétinite toxoplasmique ou bien d’une toxoplasmose congénitale, à l’origine de l’apparition de troubles psychomoteurs et/ou oculaires chez l’enfant ou, dans le pire des cas, à l’origine de la perte de l’enfant à naître suite à un avortement. En France, on estime à 800 000 le nombre de patients atteints d’une toxoplasmose oculaire active ou cicatricielle, liée à la prolifération de Toxoplasma gondii au niveau des tissus rétiniens (Sauer et al, Ocular toxoplasmosis: from pathophysiology to microbiological diagnosis, J Fr Ophtalmol., 2013, vol 36, n°l, PP 76-81 ; Plever et al, Ocular toxoplasmosis: recent aspects of pathophysiology and clinical implications, Ophthalmic Res., 2014, vol 52, n°3, pp 116-123 ; Maenz et al, Ocular toxoplasmosis past, présent and new aspects of an old disease, Prog. Retin. Eye Res., 2014, vol 39, PP 77-106). La toxoplasmose congénitale (Hampton, Congénital Toxoplasmosis: A Review, Néonatal Network, 2015, vol 34, n°5, pp 274-278), quant à elle, représente environ 300 cas / an en France, suite à la transmission du parasite de la mère au fœtus (CNR Toxoplasmose, Rapport annuel d’activités du Centre National de Référence de la Toxoplasmose, 2013). Le parasite Toxoplasma gondii peut également être à l’origine de troubles du comportement (Flegr, Schizophrenia and Toxoplasma gondii: an undervalued association ?, Expert Rev. Anti Infect. Ther., 2015, vol 13, n°7, pp 817-820).
Sur le plan prophylactique, aucun vaccin à usage humain n’est actuellement disponible et cela malgré une forte demande. En médecine vétérinaire, un vaccin vivant atténué obtenu à partir de la souche S48 est commercialisé (Ovilis®, Toxovax®, Intervet). Sur le plan curatif, des traitements existent. Néanmoins, leur efficacité demeure discutable, d’autant plus que ceux-ci se révélent être extrêmement pénibles pour le patient, en terme de surveillance et d’effets indésirables. Bien que couramment utilisés, la spiramycine, la sulfadiazine, l’azithromycine et la pyriméthamine sont des traitements contraignants en terme de surveillance (Numération Formule Sanguine - Plaquettes) et d’effets secondaires (syndrome d'épidermolyse de Lyell, agranulocytose, colite pseudo-membraneuse). Par ailleurs, des résistances aux antiprotozoaires inhibiteurs de la dihydrofolate reductase (DHFR), telle que la pyriméthamine, peuvent être observées en cas de mutation au niveau du gène codant la DHFR. En outre, cette cible est également présente naturellement chez l’Homme, ceci pouvant conduire à des effets indésirables (anémie, thrombopénie, granulopénie) et à l’administration concomitante d’acide folique pour compenser ces effets délétères.
Il existe donc un réel besoin de développer une stratégie thérapeutique alternative à l’utilisation des traitements actuellement utilisés dans la prise en charge de la choriorétinite toxoplasmique et de la toxoplasmose congénitale. L’utilisation d’anticorps thérapeutiques, spécifiques de la forme infectieuse de Toxoplasma gondii, permettrait de répondre au mieux au cahier des charges suivant : activité anti-tachyzoïte neutralisante, diminution des effets secondaires et absence de résistance au traitement. Cette stratégie revêt un caractère innovant, puisque peu ou pas d’études similaires ont été publiées à ce jour. En effet, il est communément admis par la communauté scientifique que les réponses immunitaires protectrices anti-toxoplasmiques sont principalement d’ordre cellulaire, médiées par les lymphocytes T CD8+ et T CD4+ essentiellement via la sécrétion d’interféron γ (IFN-γ), cytokine majeure de résistance à l’infection. Le volet humoral de la réponse immunitaire demeure, à ce jour, très peu étudié. Toutefois, la recherche des anticorps sériques mù-Toxoplasma gondii représente l’outil diagnostique et de dépistage de la toxoplasmose et permet de définir le statut sérologique des individus non infectés, en phase de séroconversion ou infectés chroniquement.
Les anticorps, seuls ou en coopération avec l'immunité cellulaire, peuvent participer à la limitation de la dissémination du parasite. L’implication des anticorps dans la défense antitoxoplasmique a été démontrée par l’utilisation de souris de phénotype μΜΤ, déficientes en cellules B. Ces souris, après infection, développent une réponse IFN-γ normale mais succombent à l'infection dans les 4 semaines suivantes d’une surcharge parasitaire cérébrale (Kang et al., Decreased résistance of B cell-deficient mice to infection with Toxoplasma gondii despite unimpaired expression of IFN-gamma, TNF-alpha, and inducible nitric oxide synthase, J ImmunoL, 2000, vol 164, n°5, pp 2629-34). Le transfert passif d'anticorps anti-r. gondii pendant l’infection de ces mêmes souris rétablit la résistance vis-à-vis du parasite suggérant que les anticorps sont capables de limiter l’infection (Johnson et al.. Déficient humoral responses underlie susceptibility to Toxoplasma gondii in CD4-deficient mice. Infect. Immun., 2002, vol 70, n°l, pp 185-91).
La protéine SAGl est considérée comme la protéine de surface majoritairement présente sur la forme tachyzoïte du parasite Toxoplasma gondii. L’antigène SAGl est une protéine de 336 acides aminés, codée par le gène sagl. La protéine SAGl de Toxoplasma gondii est ancrée dans la membrane cellulaire par un ancrage glycosylphosphatidylinositol (GPI) (Wang et al., Research progress on surface antigen 1 (SAGl) of Toxoplasma gondii, Parasit Vectors, 2014, vol 7, p 180). La protéine SAGl de Toxoplasma gondii est également appelée P30. Elle se compose d’un domaine DI (domaine N-terminal) de 129 acides aminés et d’un domaine D2 (domaine C-terminal) de 126 acides aminés (Graille et al, Crystal Structure of the Complex between the Monomeric Form of Toxoplasma gondii Surface Antigen 1 (SAGI) and a Monoclonal Antibody that Mimics the Human Immune Response, J. mol. Biol., 2005, 354, pp 447-458). Elle est impliquée dans le pouvoir infectieux du parasite Toxoplasma gondii, en facilitant son rapprochement et sa fixation à la cellule hôte (Grimwood et Smith, Toxoplasma gondii: the rôle of parasite surface and secreted proteins in host cell invasion, Int. J. Parasitol. 1996, vol 26, n°2, pp 169-173 ; Robinson, Smith and Millner, Toxoplasma gondii major surface antigen (SAGl): in vitro analysis of host cell binding, Parasitology, 2004,vol 128, n°4, pp 391-396).
Dans la littérature, Graille et al. (Graille et al, Crystal Structure of the Complex between the Monomeric Form of Toxoplasma gondii Surface Antigen 1 (SAGI) and a Monoclonal Antibody that Mimics the Human Immune Response, J. mol. Biol., 2005, 354, pp 447-458) ont décrit un anticorps monoclonal (4F11E12) dirigé contre la protéine S AGI capable de se fixer à l’antigène au niveau du domaine DI avec une affinité de l’ordre du nanomolaire, au niveau d’un épitope conformationnel. Toutefois dans cette étude, les auteurs semblent indiquer que cet anticorps ne serait pas neutralisant dans la mesure où il ne peut empêcher rhomodimérisation de la protéine SAGl indispensable pour permettre l’entrée du parasite dans la cellule hôte. L’un des buts de l’invention est de fournir des constructions peptidiques, également désignées par « anticorps », inhibant l’invasion des cellules par le parasite Toxoplasma gondii.
Un autre aspect de l’invention est de fournir des constructions peptidiques efficaces dans le traitement de la toxoplasmose oculaire, la toxoplasmose congénitale et les troubles du comportement liés à la présence de Toxoplasma gondii. L’un des avantages de l’invention est de fournir des constructions peptidiques capables de diminuer, voire d’empêcher l’apparition de lésions oculaires dues à Toxoplasma gondii.
Un autre avantage de l’invention est de fournir des constructions peptidiques capables de réduire ou empêcher la transmission transplacentaire du parasite de la mère à la descendance. L’invention concerne une construction peptidique ne contenant pas de région CHl, reconnaissant l’antigène SAGl de Toxoplasma gondii et capable de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La neutralisation de l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii peut être mise en évidence par le test de neutralisation sur cellules HFF décrit dans le paragraphe 5 (Test de neutralisation in vitro) de l’Exemple 1 : Matériel et Méthodes. La densité optique (DO) mesurée à 565 nm obtenue avec une construction peptidique capable de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii ne sera pas significativement différente de la DO obtenue avec les cellules HFF seules.
De façon surprenante, les inventeurs ont trouvé qu’un fragment d’anticorps dirigé contre l’antigène SAGl du parasite Toxoplasma gondii permet d’inhiber l’invasion des cellules par les tachyzoïtes de Toxoplasma gondii et également que ce fragment a un effet thérapeutique sur des modèles murins de toxoplasmose oculaire et de toxoplasmose congénitale.
Par « construction peptidique », on entend n’importe quelle construction comprenant une partie peptidique constituée d’acides aminés reliés entre eux par des liaisons peptidiques, dans laquelle ladite partie peptidique comporte au moins un domaine de fixation à l’antigène SAGl de Toxoplasma gondii. Ce terme englobe en particulier les polypeptides seuls et toute association physique entre deux ou plusieurs polypeptides, liés entre eux par des liaisons covalentes telles que les liaisons peptidiques ou des liaisons disulfures de résidus cystéine, des liaisons chimiques ou non covalentes telles que les liaisons hydrogènes, les liaisons de van der Waals, les liaisons ioniques et hydrophobes. Ce terme inclut également l’association de un ou plusieurs polypeptides avec un ou plusieurs résidus ou chaines glucidiques.
Par construction peptidique, on entend également au sens de la présente invention et toutes les fois où ce terme est utilisé dans la présente description, un anticorps, et notamment un anticorps monovalent ou un anticorps bivalent.
Les constructions peptidiques selon la présente invention sont dites glycosylées lorsqu’elles comprennent au moins un résidu glucidique ou au moins une chaine glucidique.
Au sens de la présente invention, on entend par polypeptide tout polymère d’acides aminés reliés entre eux par des liaisons peptidiques, quelle que soit sa longueur. Ainsi, au sens de la présente invention, le terme polypeptide englobe également les peptides et les protéines.
Par « construction peptidique ou anticorps reconnaissant l’antigène S AGI de Toxoplama gondii », on entend que ladite construction peptidique ou ledit anticorps possède au moins un domaine de fixation à l’antigène S AGI de Toxoplama gondii.
Par « domaine de fixation », on entend tout site capable de se lier avec affinité et de façon spécifique à une autre molécule (antigène).
Par « tout site capable de se lier avec affinité à un antigène », on entend à titre d’illustration tout site pour lequel la constante de dissociation Kd caractérisant l’affinité dudit antigène pour ledit site est inférieure à 10'^ M.
Les valeurs des constantes d’association et de dissociation caractérisant l’affinité d’une construction peptidique pour un antigène peuvent être mesurées par résonnance plasmonique de surface (BIACORE), l’antigène étant immobilisé sur une Sensorchip. L’utilisation de la résonnance plasmonique de surface pour mesurer la liaison d’un ligand sur un récepteur est une technique bien connue de l’homme de métier.
Les termes S AGI et P30 sont employés indifféremment dans la présente description et désignent la même molécule.
La présente invention a pour objet une construction peptidique comprenant la région variable de la chaine lourde d’un premier anticorps reconnaissant l’antigène S AGI de Toxoplasma gondii et pouvant contenir tout ou partie de la région constante dépourvue de région CHl, de la chaine lourde d’un deuxième anticorps. ladite constniction peptidique reconnaissant l’antigène SAGl de Toxoplasma gondii et étant capable de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose. L’invention concerne aussi bien des anticorps constitués uniquement de deux chaines lourdes que des anticorps constituées de deux chaines lourdes et deux chaines légères.
Dans l’invention, le terme « anticorps » se réfère notamment à une immunoglobuline, protéine multimérique constituée de 4 chaînes participant à la réponse immunitaire acquise.
Les immunoglobulines sont bien connues de l’homme de métier et sont constituées d’un assemblage de deux dimères constitués chacun d’une chaîne lourde et d’une chaîne légère. Le complexe multimérique assemblé par la liaison d’une chaîne légère et d’une chaîne lourde par un pont disulfure entre deux cystéines, les deux chaînes lourdes étant elle-même également reliées entre elles par deux ponts disulfures.
Chacune des chaînes lourdes et des chaînes légères est constituée d’une région constante et d’une région variable. L’assemblage des chaînes qui composent un anticorps permet de définir une structure tridimensionnelle caractéristique en Y, où la base du Y correspond à la région constante Fc qui est reconnue par le complément et les récepteurs Fc, et les extrémités des bras du Y correspondent à l’assemblage respectif des régions variables de la chaîne légère et variables de la chaîne lourde.
Plus précisément, chaque chaîne légère est constituée d’une région variable (VL) et d’une région constante (CL). Chaque chaîne lourde est constituée d’une région variable (VH) et d’une région constante constituée de trois domaines constants CHl, CH2 et CHS. Les domaines CH2 et CHS composent le domaine Fc.
Les régions variables de la chaîne légère et de la chaîne lourde sont chacune constituées de trois régions déterminant la reconnaissance de l’antigène (CDR) entourées de quatre domaines charpentes. Le repliement tridimensionnel des régions variables de la chaîne lourde et de la chaîne légère est tel que les 6 CDR sont exposés du même côté de la protéine et permettent la formation d’une structure spécifique reconnaissant un antigène déterminé.
Dans la présente description, les termes « domaine variable » et « région variable » sont utilisés indifféremment. De même, les termes « domaine constant » et « région constante » sont employés indifféremment.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique comprenant la région variable de la chaîne lourde d’un premier anticorps reconnaissant l’antigène S AGI de Toxoplasma gondii et pouvant contenir tout ou partie de la région constante dépourvue de région CHl, de la chaîne lourde d’un deuxième anticorps, ladite tout ou partie de la région constante dépourvue de région CHl de la chaîne lourde dudit deuxième anticorps permettant d’augmenter la demi-vie de ladite construction peptidique en conditions in vivo, ladite construction peptidique reconnaissant l’antigène SAGl de Toxoplasma gondii et étant capable de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La présente invention a pour objet une construction peptidique comprenant les régions variables de la chaîne lourde et de la chaîne légère d’un premier anticorps reconnaissant l’antigène SAGl de Toxoplasma gondii et pouvant contenir tout ou partie de la région constante dépourvue de région CHl, de la chaîne lourde d’un deuxième anticorps, ladite construction peptidique reconnaissant l’antigène SAGl de Toxoplasma gondii et étant capable de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique comprenant les régions variables de la chaîne lourde et de la chaîne légère d’un premier anticorps reconnaissant l’antigène SAGl de Toxoplasma gondii et pouvant contenir tout ou partie de la région constante dépourvue de région CHl, de la chaîne lourde d’un deuxième anticorps, ladite tout ou partie de la région constante dépourvue de région CHl de la chaîne lourde dudit deuxième anticorps permettant d’augmenter la demi-vie de ladite construction peptidique en conditions in vivo, ladite construction peptidique reconnaissant l’antigène SAGl de Toxoplasma gondii et étant capable de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique comprenant les régions variables de la chaîne lourde et de la chaîne légère d’un anticorps reconnaissant l’antigène SAGl de Toxoplasma gondii et pouvant contenir tout ou partie de la région constante dépourvue de région CHl, de la chaîne lourde du susdit anticorps reconnaissant Γ antigène S AGI de Toxoplasma gondii, ladite construction peptidique reconnaissant l’antigéne SAGl de Toxoplasma gondii et étant capable de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
Selon un mode de réalisation encore plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessous, dans laquelle ledit deuxième anticorps est une immunoglobuline IgG2a murine, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessous, dans laquelle ledit premier anticorps reconnaissant l’antigène SAGl de Toxoplasma gondii est l’anticorps monoclonal 4F11E12, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
Le domaine variable de la chaîne légère de l’anticorps monoclonal 4F11E12 a pour séquence la séquence d’acide aminés SEQ ID NO : 1 et le domaine variable de sa chaîne lourde a pour séquence la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 2.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose chez l’humain.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose appartenant au groupe : la toxoplasmose oculaire, la toxoplasmose congénitale et les troubles du comportement liés à la présence de Toxoplasma gondii.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, reconnaissant l’épitope conformationnel formé par les acides aminés aux positions 35 à 37, 39, 41, 42, 45, 48, 50, 59 à 65 et 112 à 114 de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 3, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose. L’épitope conformationnel formé par les acides aminés aux positions 35 à 37, 39, 41, 42, 45, 48, 50, 59 à 65 et 112 à 114 de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 3 est l’épitope reconnu par l’anticorps monoclonal 4F11E12.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant un CDR possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 4, sous réserve que ladite construction peptidique conserve sa capacité de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant un CDR possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 5, sous réserve que ladite construction peptidique conserve sa capacité de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant un CDR possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 6, sous réserve que ladite construction peptidique conserve sa capacité de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant un CDR possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 7, sous réserve que ladite construction peptidique conserve sa capacité de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant un CDR possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 8, sous réserve que ladite construction peptidique conserve sa capacité de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant un CDR possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 9, sous réserve que ladite construction peptidique conserve sa capacité de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant les six CDR suivants : un CDRl possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 4, un CDR2 possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 5, un CDR3 possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 6, un CDR4 possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 7, un CDR5 possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 8, et un CDR6 possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 9, sous réserve que ladite construction peptidique conserve sa capacité de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant un CDR consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 4, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant un CDR consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 5, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant un CDR consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 6, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant un CDR consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 7, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant un CDR consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 8, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant un CDR consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 9, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
Selon un mode de réalisation plus encore particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant les six CDR suivants : un CDRl consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 4, un CDR2 consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 5, un CDR3 consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 6, un CDR4 consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 7, un CDR5 consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 8 et un CDR6 consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 9, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, dépourvue des régions CH2 et CHS du susdit deuxième anticorps, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant une région CHS et dépourvue de région CH2 du susdit deuxième anticorps, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant une région CH2 et une région CHS du susdit deuxième anticorps, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant une région CH2 et dépourvue de région CHS du susdit deuxième anticorps, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
Selon un mode de réalisation avantageux, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, choisie parmi : les scFv, les diabodies, les diabodies simple chaîne, les minibodies tels que les scFv-CH3 et les diabody-CH3, les scFv-Fc, les diabody-Fc, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
Par « scFv », on entend une protéine fusion constituée par la région variable de la chaîne lourde d’une immunoglobuline et la région variable de la chaîne légère de ladite immunoglobuline liées entre elles de manière covalente via un court lien (linker) peptidique, comprenant généralement de 10 à 25 acides aminés.
Par « diabody », on entend un homodimère constitué de deux chaînes peptidiques, elles-mêmes constituées par la région variable de la chaîne lourde d’une immunoglobuline et la région variable de la chaîne légère de ladite immunoglobuline liées entre elles de manière covalente via un lien (linker) peptidique, comprenant généralement 5 acides aminés et trop court pour que les deux régions variables puissent se replier en scFv. Les deux sous-unités du diabody sont liées entre elles par des liaisons faibles, telles que les liaisons hydrophobes, les liaisons hydrogènes, les liaisons ioniques ou les liaisons de van der Waals.
Par « diabody simple chaîne », on entend une protéine fusion constituée de quatre domaines variables provenant d’une immunoglobuline liés entre eux de manière covalente via trois liens (linker) peptidiques, lesdits quatre domaines variables consistant en deux domaines variables de la chaîne lourde et deux domaines variables de la chaîne légère. Les deux domaines variables disposés au centre de la molécule sont un domaine variable de la chaîne lourde et un domaine variable de la chaîne légère.
Par « minibodies », on entend une protéine constituée d’un scFv fusionné avec le domaine CH3 de la chaîne lourde d’une immunoglobuline ou un homodimère constitué d’un diabody fusionné avec le domaine CH3 de la chaîne lourde d’une immunoglobuline. Dans la présente description, le terme « minibodies » désigne à la fois les scFv-CH3 et les diabody-CH3.
Par « scFv-CH3 », on entend une protéine constituée d’un scFv fusionné avec le domaine CH3 de la chaîne lourde d’une immunoglobuline.
Par « diabody-CH3 », on entend un homodimère constitué d’un diabody dans lequel chaque sous-unité est fusionnée avec le domaine CH3 de la chaîne lourde d’une immunoglobuline.
Par « scFv-Fc », on entend une protéine constituée par un scFv fusionné avec le fragment Fc d’une immunoglobuline, lui-même composé des domaines CH2 et CH3 de la chaîne lourde de ladite immunoglobuline. Dans la présente description, les scFv-Fc sont également désignés par le terme « scFv-CH2-CH3 ».
Par « diabody-Fc », on entend un homodimère constitué d’un diabody dans lequel chaque sous-unité est fusionnée avec le domaine Fc d’une immunoglobuline, lui-même composé des domaines CIC et CHS de la chaîne lourde de ladite immunoglobuline. Dans la présente description, les diabody-Fc sont également désignés par le terme « diabody-CH2-CH3 ».
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 10, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La construction peptidique de séquence SEQ ID NO : 10 est appelée SGO dans la présente description.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 10, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 10 peut être codée par la séquence d’acides nucléiques SEQ ED NO: 40.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés identiques possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ED NO: 11, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
Les deux sous-unités du diabody sont liées entre elles par des liaisons faibles, telles que les liaisons hydrophobes, les liaisons hydrogènes, les liaisons ioniques ou les liaisons de van der Waals.
La construction peptidique de séquence SEQ ED NO : 11 est appelée SG5 dans la présente description.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 11, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 11 peut être codée par la séquence d’acides nucléiques SEQ ID NO: 41.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ED NO: 12, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La construction peptidique de séquence SEQ ID NO : 12 est appelée SG2-HL dans la présente description.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 12, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 12 peut être codée par la séquence d’acides nucléiques SEQ ID NO: 42.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés identiques possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 13, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La construction peptidique de séquence SEQ ID NO : 13 est appelée DbSG2 dans la présente description.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 13, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 13 peut être codée par la séquence d’acides nucléiques SEQ ID NO: 43.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv-CH3 constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 14, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La construction peptidique de séquence SEQ ID NO : 14 est appelée SG2-CH3 dans la présente description.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv-CH3 constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 14, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 14 peut être codée par la séquence d’acides nucléiques SEQ ID NO: 44.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un diabody-CH3 constitué de deux séquences d’acides aminés identiques possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 15, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
Les deux sous-unités du diabody-CH3 sont liées entre elles par des liaisons faibles, telles que les liaisons hydrophobes, les liaisons hydrogènes, les liaisons ioniques ou les liaisons de van der Waals.
La construction peptidique de séquence SEQ ID NO : 15 est appelée DbSG2-CH3 dans la présente description.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un diabody-CH3 constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 15, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 15 peut être codée par la séquence d’acides nucléiques SEQ ID NO: 45.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv-Fc constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 16, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La construction peptidique de séquence SEQ ID NO : 16 est appelée SG2-Fc2a dans la présente description.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv-Fc constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 16, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 16 peut être codée par la séquence d’acides nucléiques SEQ ID NO: 46.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 17, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La construction peptidique de séquence SEQ ID NO : 17 est appelée scFvSGl dans la présente description.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 17, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 17 peut être codée par la séquence d’acides nucléiques SEQ ID NO: 47.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés identiques possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 18, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La construction peptidique de séquence SEQ ID NO : 18 est appelée DbF3S2 dans la présente description.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 18, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 18 peut être codée par la séquence d’acides nucléiques SEQ ID NO: 48.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés identiques possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 19, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La construction peptidique de séquence SEQ ID NO : 19 est appelée DbF4S2 dans la présente description.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ED NO: 19, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 19 peut être codée par la séquence d’acides nucléiques SEQ ID NO: 49.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 20, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La construction peptidique de séquence SEQ ID NO : 20 est appelée scFvF5S2 dans la présente description.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 20, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 20 peut être codée par la séquence d’acides nucléiques SEQ ID NO: 50.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 21, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La construction peptidique de séquence SEQ ID NO : 21 est appelée scFvF5S4 dans la présente description.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 21, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 21 peut être codée par la séquence d’acides nucléiques SEQ ID NO: 51.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 22, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La construction peptidique de séquence SEQ ID NO : 22 est appelée scFvF5S5 dans la présente description.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 22, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 22 peut être codée par la séquence d’acides nucléiques SEQ ID NO: 52.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 23, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La construction peptidique de séquence SEQ ID NO : 23 est appelée scFvF5S6 dans la présente description.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 23, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 23 peut être codée par la séquence d’acides nucléiques SEQ ID NO: 53.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 24, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La construction peptidique de séquence SEQ ID NO : 24 est appelée Hum-scFvH2S dans la présente description.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 24, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 24 peut être codée par la séquence d’acides nucléiques SEQ ID NO: 54.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 25, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La construction peptidique de séquence SEQ ID NO : 25 est appelée SGO-LH dans la présente description.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 25, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 25 peut être codée par la séquence d’acides nucléiques SEQ ED NO: 55.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés identiques possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ DD NO: 26, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La construction peptidique de séquence SEQ ID NO : 26 est appelée SG5-LH dans la présente description.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 26, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 26 peut être codée par la séquence d’acides nucléiques SEQ ID NO: 56.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 27, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La construction peptidique de séquence SEQ ID NO : 27 est appelée SG2-LH dans la présente description.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 27, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 27 peut être codée par la séquence d’acides nucléiques SEQ ID NO: 57.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés identiques possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 28, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La construction peptidique de séquence SEQ ID NO : 28 est appelée DbSG2-LH dans la présente description.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 28, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 28 peut être codée par la séquence d’acides nucléiques SEQ ID NO: 58.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv-CH3 constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 29, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La construction peptidique de séquence SEQ ID NO : 29 est appelée SG2-CH3-LH dans la présente description.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv-CH3 constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 29, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 29 peut être codée par la séquence d’acides nucléiques SEQ ID NO: 59.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un diabody-CH3 constitué de deux séquences d’acides aminés identiques possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 30, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La construction peptidique de séquence SEQ ID NO : 30 est appelée DbSG2-CH3-LH dans la présente description.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un diabody-CH3 constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 30, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 30 peut être codée par la séquence d’acides nucléiques SEQ ED NO: 60.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv-Fc constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ED NO: 31, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La construction peptidique de séquence SEQ ID NO : 31 est appelée SG2-Fc2a-LH dans la présente description.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv-Fc constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 31, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 31 peut être codée par la séquence d’acides nucléiques SEQ ED NO: 61.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 32 pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La construction peptidique de séquence SEQ ID NO : 32 est appelée scFvSGl-LH dans la présente description.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 32, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 32 peut être codée par la séquence d’acides nucléiques SEQ ID NO: 62.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés identiques possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 33, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La construction peptidique de séquence SEQ ID NO : 33 est appelée DbF3S2-LH dans la présente description.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 33, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 33 peut être codée par la séquence d’acides nucléiques SEQ ID NO: 63.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés identiques possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 34, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La construction peptidique de séquence SEQ ID NO : 34 est appelée DbF4S2-LH dans la présente description.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 34, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 34 peut être codée par la séquence d’acides nucléiques SEQ ID NO: 64.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 35, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La construction peptidique de séquence SEQ ID NO : 35 est appelée scFvF5S2-LH dans la présente description.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 35, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 35 peut être codée par la séquence d’acides nucléiques SEQ ID NO: 65.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 36, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La construction peptidique de séquence SEQ ID NO : 36 est appelée scFvF5S4-LH dans la présente description.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 36, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 36 peut être codée par la séquence d’acides nucléiques SEQ ID NO: 66.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 37, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La construction peptidique de séquence SEQ ID NO : 37 est appelée scFvF5S5-LH dans la présente description.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 37, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 37 peut être codée par la séquence d’acides nucléiques SEQ ID NO: 67.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 38 pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La construction peptidique de séquence SEQ ID NO : 38 est appelée scFvF5S6-LH dans la présente description.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 38, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 38 peut être codée par la séquence d’acides nucléiques SEQ ID NO: 68.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 39, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La construction peptidique de séquence SEQ ID NO : 39 est appelée Hum-scFvH2S-LH dans la présente description.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 39, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
La séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 39 peut être codée par la séquence d’acides nucléiques SEQ ID NO: 69. L’invention concerne également une construction peptidique comprenant la région variable de la chaîne lourde (VHH) d’un premier anticorps reconnaissant l’antigène SAGl de Toxoplasma gondii et pouvant contenir tout ou partie de la région constante dépourvue de région CHl, de la chaîne lourde d’un deuxième anticorps, ladite construction peptidique reconnaissant l’antigène SAGl de Toxoplasma gondii et étant capable de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
Ladite construction peptidique est alors dépourvue de région variable de chaîne légère. Dans ce mode de réalisation, ledit premier anticorps reconnaissant l’antigène SAGl de Toxoplasma gondii est un anticorps de camélidés, constitué de deux chaînes lourdes et dépourvus de chaîne légère. Les chaînes lourdes de ces anticorps comportent un domaine variable (VHH) et un domaine constant.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, pour son utilisation comme médicament.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ DD NO: 10, pour son utilisation comme médicament.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 10, pour son utilisation comme médicament.
Selon un autre aspect, l’invention concerne une composition pharmaceutique comprenant à titre de substance active une construction peptidique ne contenant pas de région CHl, reconnaissant l’antigène S AGI de Toxoplasma gondii et capable de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii, éventuellement en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique comprenant à titre de substance active une construction peptidique comprenant la région variable de la chaîne lourde d’un premier anticorps reconnaissant l’antigène S AGI de Toxoplasma gondii et pouvant contenir tout ou partie de la région constante dépourvue de région CHl, de la chaîne lourde d’un deuxième anticorps, ladite construction peptidique reconnaissant l’antigène SAGl de Toxoplasma gondii et étant capable de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii, éventuellement en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique comprenant à titre de substance active une construction peptidique comprenant la région variable de la chaîne lourde d’un premier anticorps reconnaissant l’antigène SAGl de Toxoplasma gondii et pouvant contenir tout ou partie de la région constante dépourvue de région CHl, de la chaîne lourde d’un deuxième anticorps, ladite tout ou partie de la région constante dépourvue de région CHl de la chaîne lourde dudit deuxième anticorps permettant d’augmenter la demi-vie de ladite construction peptidique en conditions in vivo, ladite construction peptidique reconnaissant l’antigène SAGl de Toxoplasma gondii et étant capable de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii. éventuellement en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique comprenant à titre de substance active une construction peptidique comprenant les régions variables de la chaîne lourde et de la chaîne légère d’un premier anticorps reconnaissant l’antigène S AGI de Toxoplasma gondii et pouvant contenir tout ou partie de la région constante dépourvue de région CHl, de la chaîne lourde d’un deuxième anticorps, ladite construction peptidique reconnaissant l’antigène S AGI de Toxoplasma gondii et étant capable de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii, éventuellement en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique comprenant à titre de substance active une construction peptidique comprenant les régions variables de la chaîne lourde et de la chaîne légère d’un premier anticorps reconnaissant l’antigène S AGI de Toxoplasma gondii et pouvant contenir tout ou partie de la région constante dépourvue de région CHl, de la chaîne lourde d’un deuxième anticorps, ladite tout ou partie de la région constante dépourvue de région CHl de la chaîne lourde dudit deuxième anticorps permettant d’augmenter la demi-vie de ladite construction peptidique en conditions in vivo, ladite construction peptidique reconnaissant l’antigène SAGl de Toxoplasma gondii et étant capable de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii, éventuellement en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit deuxième anticorps est une immunoglobuline IgG2a murine.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit premier anticorps reconnaissant l’antigène SAGl de Toxoplasma gondii est l’anticorps monoclonal 4F11E12.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique reconnaît l’épitope conformationnel formé par les acides aminés aux positions 35à37, 39, 41, 42, 45, 48, 50, 59 à 65 et 112 à 114 de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 3.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend un CDR possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97% , au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 4, sous réserve que ladite construction peptidique conserve sa capacité de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend un CDR possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 5, sous réserve que ladite construction peptidique conserve sa capacité de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend un CDR possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 6, sous réserve que ladite construction peptidique conserve sa capacité de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend un CDR possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 7, sous réserve que ladite construction peptidique conserve sa capacité de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend un CDR possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ED NO: 8 sous réserve que ladite construction peptidique conserve sa capacité de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend un CDR possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 9, sous réserve que ladite construction peptidique conserve sa capacité de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend les six CDR suivants : un CDRl possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ED NO: 4, un CDR2 possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 5, un CDR3 possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 6, un CDR4 possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 7, un CDR5 possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 8, et un CDR6 possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 9, sous réserve que ladite construction peptidique conserve sa capacité de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend un CDR consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 4.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend un CDR consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 5.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend un CDR consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 6.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend un CDR consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 7.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend un CDR consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 8.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend un CDR consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 9.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend les six CDR suivants : un CDRl consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 4, un CDR2 consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 5, un CDR3 consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 6, un CDR4 consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 7, un CDR5 consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 8 et un CDR6 consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 9.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique est dépourvue des régions CH2 et CHS du susdit deuxième anticorps.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend une région CHS et est dépourvue de région CIC du susdit deuxième anticorps.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend une région CIE et une région CHS du susdit deuxième anticorps.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend une région CIE et est dépourvue de région CHS du susdit deuxième anticorps.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique est choisie parmi : les scFv, les diabodies, les diabodies simple chaîne, les minibodies tels que les scFv-CHS et les diabodies-CHS, les scFv-Fc, les diabody-Fc.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQID NO: 10.
Selon un autre mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 10.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés identiques possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 11.
Les deux sous-unités du diabody sont liées entre elles par des liaisons faibles, telles que les liaisons hydrophobes, les liaisons hydrogènes, les liaisons ioniques ou les liaisons de van der Waals.
Selon un autre mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 11.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 12.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 12.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés identiques possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO; 13.
Selon un autre mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 13.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un scFv-CH3 constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 14.
Selon un autre mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un scFv-CH3 constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 14.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un diabody-CH3 constitué de deux séquences d’acides aminés identiques possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 15.
Les deux sous-unités du diabody-CH3 sont liées entre elles par des liaisons faibles, telles que les liaisons hydrophobes, les liaisons hydrogènes, les liaisons ioniques ou les liaisons de van der Waals.
Selon un autre mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un diabody-CH3 constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 15.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un scFv-Fc constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 16.
Selon un autre mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un scFv-Fc constitué de la séquence d’acides aminés SEQIDNO: 16.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 17.
Selon un autre mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ IDNO: 17.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés identiques possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ DD NO: 18.
Selon un autre mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 18.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés identiques possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 19.
Selon un autre mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 19.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 20.
Selon un autre mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 20.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 21.
Selon un autre mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ IDNO: 21.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 22.
Selon un autre mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 22.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 23.
Selon un autre mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ IDNO: 23.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 24.
Selon un autre mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 24.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 25.
Selon un autre mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 25.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés identiques possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 26.
Selon un autre mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 26.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 27.
Selon un autre mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 27.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés identiques possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 28.
Selon un autre mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 28.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un scFv-CH3 constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 29.
Selon un autre mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un scFv-CH3 constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 29.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un diabody-CH3 constitué de deux séquences d’acides aminés identiques possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 30.
Selon un autre mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un diabody-CH3 constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 30.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un scFv-Fc constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 31.
Selon un autre mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un scFv-Fc constitué de la séquence d’acides aminés SEQ IDNO: 31.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 32.
Selon un autre mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 32.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés identiques possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 33.
Selon un autre mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 33.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés identiques possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 34.
Selon un autre mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 34.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 35.
Selon un autre mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ IDNO: 35.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 36.
Selon un autre mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 36.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 37.
Selon un autre mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 37.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 38.
Selon un autre mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ IDNO: 38.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 39.
Selon un autre mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique comprend ou consiste en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 39.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique est administrable à une dose comprise de 5 pg/kg à 50 mg/kg.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique est administrable à une dose comprise de 5 à 100 pg/kg, de 100 à 500 pg/kg, de 500 pg/kg à 1 mg/kg, de 1 à 15 mg/kg, de 15 à 30 mg/kg ou de 30 à 50 mg/kg.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique se présente sous une dose unitaire de 250 pg à 4g.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite construction peptidique se présente sous une dose unitaire de 250 pg à 7 mg, de 7 mg à 35 mg, de 35 à 70 mg, de 70 mg à 1,05 g, de 1,05 g à2,1 g, de2,1 g à4 g.
La composition pharmaceutique de l’invention peut être administrée par toute voie d’administration appropriée, par exemple par voie parentérale, orale, sublinguale, vaginale, rectale, transdermale, de préférence par injection intraveineuse, sous-cutanée ou intradermique. Une injection intramusculaire, intrapéritonéale, intrasynoviale, intrathécale ou intratumorale est aussi possible. Les injections peuvent être réalisées sous forme de bolus, ou par perfusion continue.
Les préparations pour une administration parentérale peuvent inclure des solutions aqueuses ou non-aqueuses stériles, des suspensions ou des émulsions. Des exemples de solvants non-aqueux sont le propyléne glycol, le polyéthylène glycol, des huiles végétales, telle que l'huile d'olive, ou des esters organiques injectables tels que l'éthyl oléate. Des véhicules aqueux comprennent l'eau, des solutions alcool/eau, des émulsions ou des suspensions.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, pour une administration par voie intraveineuse.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, pour une administration par voie sous-cutanée.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, pour une administration par voie orale.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, pour une administration par voie intravitréenne.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, pour une administration par voie intraveineuse, par voie sous-cutanée ou par voie orale, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose congénitale.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, pour une administration par voie intravitréenne, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose oculaire. L’invention concerne également une composition comprenant à titre de substance active une construction peptidique comprenant la région variable de la chaîne lourde (VHH) d’un premier anticorps reconnaissant l’antigène S AGI de Toxoplasma gondii et pouvant contenir tout ou partie de la région constante dépourvue de région CHl, de la chaîne lourde d’un deuxième anticorps, ladite construction peptidique reconnaissant l’antigène S AGI de Toxoplasma gondii et étant capable de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii, éventuellement en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Ladite construction peptidique est alors dépourvue de région variable de chaîne légère. Dans ce mode de réalisation, ledit premier anticorps reconnaissant l’antigène SAGl de Toxoplasma gondii est un anticorps de camélidés, constitué de deux chaînes lourdes et dépourvus de chaîne légère. Les chaînes lourdes de ces anticorps comportent un domaine variable (VHH) et un domaine constant.
Selon un autre aspect, l’invention concerne une construction peptidique ne contenant pas de région CHl, reconnaissant l’antigène SAGl de Toxoplasma gondii et capable de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10. L’invention a pour objet une construction peptidique comprenant la région variable de la chaîne lourde d’un premier anticorps reconnaissant l’antigène SAGl de Toxoplasma gondii et pouvant contenir tout ou partie de la région constante dépourvue de région CHl, de la chaîne lourde d’un deuxième anticorps, ladite construction peptidique reconnaissant l’antigène SAGl de Toxoplasma gondii et étant capable de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique comprenant la région variable de la chaîne lourde d’un premier anticorps reconnaissant l’antigène SAGl de Toxoplasma gondii et pouvant contenir tout ou partie de la région constante dépourvue de région CHl, de la chaîne lourde d’un deuxième anticorps. ladite tout ou partie de la région constante dépourvue de région CHl de la chaîne lourde dudit deuxième anticorps permettant d’augmenter la demi-vie de ladite construction peptidique en conditions in vivo, ladite construction peptidique reconnaissant l’antigène SAGl de Toxoplasma gondii et étant capable de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10. L’invention a pour objet une construction peptidique comprenant les régions variables de la chaîne lourde et de la chaîne légère d’un premier anticorps reconnaissant l’antigène SAGl de Toxoplasma gondii et pouvant contenir tout ou partie de la région constante dépourvue de région CHl, de la chaîne lourde d’un deuxième anticorps, ladite construction peptidique reconnaissant l’antigène SAGl de Toxoplasma gondii et étant capable de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique comprenant les régions variables de la chaîne lourde et de la chaîne légère d’un premier anticorps reconnaissant l’antigène SAGl de Toxoplasma gondii et pouvant contenir tout ou partie de la région constante dépourvue de région CHl, de la chaîne lourde d’un deuxième anticorps, ladite tout ou partie de la région constante dépourvue de région CHl de la chaîne lourde dudit deuxième anticorps permettant d’augmenter la demi-vie de ladite construction peptidique en conditions in vivo, ladite construction peptidique reconnaissant l’antigène SAGl de Toxoplasma gondii et étant capable de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit deuxième anticorps est une immunoglobuline IgG2a murine, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit premier anticorps reconnaissant l’antigène SAGl de Toxoplasmagondii est l’anticoq)s monoclonal 4F11E12, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQID NO: 10.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, reconnaissant l’épitope conformationnel formé par les acides aminés aux positions 35 à 37, 39, 41, 42, 45, 48, 50, 59 à 65 et 112 à 114 de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 3, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant un CDR possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 4, sous réserve que ladite construction peptidique conserve sa capacité de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii et que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant un CDR possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 5, sous réserve que ladite construction peptidique conserve sa capacité de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii et que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant un CDR possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 6, sous réserve que ladite construction peptidique conserve sa capacité de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii et que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant un CDR possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 7, sous réserve que ladite construction peptidique conserve sa capacité de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii et que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant un CDR possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 8, sous réserve que ladite construction peptidique conserve sa capacité de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii et que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant un CDR possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 9, sous réserve que ladite construction peptidique conserve sa capacité de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii et que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant les six CDR suivants : un CDRl possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 4, un CDR2 possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 5, un CDR3 possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 6, un CDR4 possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 7, un CDR5 possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 8, et un CDR6 possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 9, sous réserve que ladite construction peptidique conserve sa capacité de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii et que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant un CDR consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 4, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant un CDR consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 5, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant un CDR consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 6, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant un CDR consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 7, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant un CDR consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 8, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant un CDR consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 9, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un mode de réalisation encore plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant les six CDR suivants : un CDRl consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 4, un CDR2 consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 5, un CDR3 consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 6, un CDR4 consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 7, un CDR5 consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 8 et un CDR6 consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 9, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, dépourvue des régions CH2 et CHS du susdit deuxième anticorps, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant une région CHS et dépourvue de région CH2 du susdit deuxième anticorps, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant une région CH2 et une région CHS du susdit deuxième anticorps, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant une région CH2 et dépourvue de région CHS du susdit deuxième anticorps, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un mode de réalisation avantageux, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, choisie parmi : les scFv, les diabodies, les diabodies simple chaîne, les minibodies, tels que les scFv-CHS et les diabodies-CHS, les scFv-Fc, les diabody-Fc, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés identiques possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 11, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Les deux sous-unités du diabody sont liées entre elles par des liaisons faibles, telles que les liaisons hydrophobes, les liaisons hydrogènes, les liaisons ioniques ou les liaisons de van der Waals.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 11.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 12, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 12.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés identiques possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 13, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 13.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv-CH3 constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 14, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv-CH3 constitué de la séquence d’acides aminés SEQ Π) NO: 14.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un diabody-CH3 constitué de deux séquences d’acides aminés identiques possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 15, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Les deux sous-unités du diabody-CH3 sont liées entre elles par des liaisons faibles, telles que les liaisons hydrophobes, les liaisons hydrogènes, les liaisons ioniques ou les liaisons de van der Waals.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un diabody-CH3 constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 15.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv-Fc constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 16, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ Π) NO: 10.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv-Fc constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 16.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 17, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 17.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés identiques possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 18, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 18.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés identiques possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ DD NO: 19, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 19.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 20, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 20.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 21, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ Π) NO: 10.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 21.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 22, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 22.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 23, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 23.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 24, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 24.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 25, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 25.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés identiques possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 26, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 26.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 27, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 27.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés identiques possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 28, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 28.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv-CH3 constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 29, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv-CH3 constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 29.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un diabody-CH3 constitué de deux séquences d’acides aminés identiques possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 30, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un diabody-CH3 constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 30.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv-Fc constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 31, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv-Fc constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 31.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 32, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 32.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés identiques possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 33, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 33.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés identiques possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ DD NO: 34, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 34.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 35, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 35.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 36, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ Π) NO: 10.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 36.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 37, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 37.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 38, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 38.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué d’une séquence d’acides aminés possédant au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité ou au moins 99% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 39, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’invention concerne une construction peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou consistant en un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 39. L’invention concerne également une construction peptidique comprenant la région variable de la chaîne lourde (VHH) d’un premier anticorps reconnaissant l’antigène SAGl de Toxoplasma gondii et pouvant contenir tout ou partie de la région constante dépourvue de région CHl, de la chaîne lourde d’un deuxième anticorps, ladite construction peptidique reconnaissant l’antigène SAGl de Toxoplasma gondii et étant capable de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10. Ladite construction peptidique est alors dépourvue de région variable de chaîne légère. Dans ce mode de réalisation, ledit premier anticorps reconnaissant l’antigène SAGl de Toxoplasma gondii est un anticorps de camélidés, constitué de deux chaînes lourdes et dépourvus de chaîne légère. Les chaînes lourdes de ces anticorps comportent un domaine variable (VHH) et un domaine constant.
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1 : La figure 1 représente l’analyse de la liaison de la construction peptidique sur le parasite Toxoplasma gondii par immunofluorescence à l’aide d’un anticorps primaire de souris anti-histidine (dilué au 50®“® selon les recommandations du fournisseur) et d’un anticorps secondaire anti-IgG de souris couplé au fluorochrome Alexa488 (dilué au 500^“® selon les recommandations du fournisseur). La construction peptidique SGO a été ajoutée aux tachyzoïtes fixés sur les cupules à partir d’une solution de SGO à 160 pg/mL, la construction peptidique SG5 à partir d’une solution de SG5 à 147 pg/mL et la construction peptidique DbF3S2 à partir d’une solution de DbF3S2 à 155 pg/mL. L’observation a été réalisée au microscope à fluorescence (objectif x40). Les parties A, C, E, G et I correspondent aux observations des tachyzoïtes en contraste de phase (lumière blanche) et les parties B, D, F, H et J correspondent aux observations réalisées en immunofluorescence par l’intermédiaire d’un anticorps couplé à un fluorochrome. A et B : tachyzoïtes seuls. C et D : tachyzoïtes avec anticorps primaire anti-histidine et d’un anticorps secondaire anti-IgG de souris couplé au fluorochrome Alexa488. E et F : tachyzoïtes avec la construction peptidique SGO. G et H : tachyzoïtes avec la construction peptidique SG5. I et J : tachyzoïtes avec la construction peptidique DbF3S2.
Figure 2 A: La figure 2 A représente l’activité neutralisante de la construction peptidique SGO sur l’invasion cellulaire des tachyzoïtes de Toxoplasma gondii.
Des cellules HFF ont été infectées par des tachyzoïtes transfectés par un plasmide codant pour la β-galatosidase. Les constructions peptidiques (1,6 pg de SGO, dans un volume de 50 pL préparé à partir d’une solution à 109 pg/mL selon le paragraphe 5.Test de neutralisation in vitro de l’Exemple 1 (Matériel et Méthodes), ou 1,6 pg de B6P, (anticorps non pertinent), dans un volume de 50 pL préparé à partir d’une solution à 113 pg/mL selon le paragraphe 5.Test de neutralisation in vitro de l’Exemple 1 (Matériel et Méthodes)) ont été ajoutées simultanément aux parasites (100 tachyzoïtes). Le graphique représente l’activité β-galactosidase mesurée par spectrophotométrie à 565 nm pour chaque condition.
Des cellules HFF (HFF seules) constituent le témoin négatif de l’invasion cellulaire du parasite et des cellules HFF en présence de 100 tachyzoïtes de Toxoplasma gondii (100 Tachys) constituent le témoin positif
Figure 2 B : La figure 2 B représente l’activité neutralisante de la construction peptidique SGO sur l’invasion cellulaire des tachyzoïtes de Toxoplasma gondii.
Des cellules HFF ont été infectées par des tachyzoïtes transfectés par un plasmide codant pour la β-galatosidase. Les constructions peptidiques (3 pg de SGO, dans un volume de 50 pL préparé à partir d’une solution à 109 pg/mL selon le paragraphe 5.Test de neutralisation in vitro de l’Exemple 1 (Matériel et Méthodes), ou 3 pg de B6P (anticorps non pertinent), dans un volume de 50 pL préparé à partir d’une solution à 113 pg/mL selon le paragraphe 5.Test de neutralisation in vitro de l’Exemple 1 (Matériel et Méthodes)) ont été ajoutées simultanément aux parasites. Deux doses de parasites ont été utilisées : 1 000 tachyzoïte (lOOOT) et 10 000 tachyzoïtes (lOOOOT). Le graphique représente l’activité β-galactosidase mesurée par spectrophotométrie à 565 nm pour chaque condition.
Des cellules HFF (HFF seules) constituent le témoin négatif de l’invasion cellulaire du parasite et des cellules HFF en présence de 1000 ou 10 000 tachyzoïtes de Toxoplasma gondii (Tachys seuls) constituent le témoin positif
Figure 2 C : La figure 2 C représente l’activité neutralisante de la construction peptidique SGO sur l’invasion cellulaire des tachyzoïtes de Toxoplasma gondii, en fonction de la température d’incubation des cellules HFF avec les tachyzoïtes et la construction peptidique (incubation de 4 jours) : température ambiante (lOOOT (RT)) ou 37°C, la température physiologique (lOOOT (37°C)).
Des cellules HFF ont été infectées par des tachyzoïtes transfectés par un plasmide codant pour la β-galatosidase. 3 pg ou 10 pg de SGO, dans un volume de 50 pL préparé à partir d’une solution à 109 pg/mL selon le paragraphe 5.Test de neutralisation in vitro de l’Exemple 1 (Matériel et Méthodes), ont été ajoutés simultanément aux parasites (1000 tachyzoïtes). Le graphique représente l’activité β-galactosidase mesurée par spectrophotométrie à 565 nm pour chaque condition.
Des cellules HFF (HFF seules) constituent le témoin négatif de l’invasion cellulaire du parasite et des cellules HFF en présence de 1000 tachyzoïtes de Toxoplasma gondii (Tachys seuls) constituent le témoin positif
Figure 2 D : La figure 2 D représente l’activité neutralisante de la construction peptidique SGO, à des doses croissantes, sur l’invasion cellulaire des tachyzoïtes de Toxoplasma gondii. Des cellules HFF ont été infectées par des tachyzoïtes transfectés par un plasmide codant pour la β-galatosidase. Le SGO (3 pg ou 10 pg dans un volume de 50 pL préparé à partir d’une solution à 109 pg/mL selon le paragraphe 5.Test de neutralisation in vitro de l’Exemple 1 (Matériel et Méthodes)) a été ajouté aux cellules HFF soit simultanément aux parasites (100 tachyzoïtes), après une pré-incubation de Ih avec les tachyzoïtes (lOOT), soit sans préincubation avec les tachyzoïtes, avec un délai de 5 min après l’ajout des tachyzoïtes (lOOT aucune pré-incubation). Le graphique représente l’activité β-galactosidase mesurée par spectrophotométrie à 565 nm pour chaque condition.
Des cellules HFF (HFF seules) constituent le témoin négatif de l’invasion cellulaire du parasite et des cellules HFF en présence de 100 tachyzoïtes de Toxoplasma gondii (Tachys seuls) constituent le témoin positif
Figure 3 : La figure 3 représente l’effet dose-dépendant des constructions peptidiques sur leur activité neutralisante sur l’invasion cellulaire des tachyzoïtes de Toxoplasma gondii.
Des cellules HFF ont été infectées par des tachyzoïtes transfectés par un plasmide codant pour la β-galatosidase.. Les constructions peptidiques (1,5 pg, 3 pg et 6 pg de SGO (dans un volume de 50 pL préparé à partir d’une solution à 160 pg/mL selon le paragraphe 5.Test de neutralisation in vitro de l’Exemple 1 (Matériel et Méthodes) ; 1,5 pg, 3 pg et 6 pg de SG5 (dans un volume de 50 pL préparé à partir d’une solution à 147 pg/mL selon le paragraphe 5.Test de neutralisation in vitro de l’Exemple 1 (Matériel et Méthodes) ; 1,5 pg et 3 pg de DbF3S2 (dans un volume de 50 pL préparé à partir d’une solution à 155 pg/mL selon le paragraphe 5.Test de neutralisation in vitro de l’Exemple 1 (Matériel et Méthodes)) ont été ajoutés simultanément aux parasites. Le graphique représente l’activité β-galactosidase mesurée par spectrophotométrie à 565 nm pour chaque condition.
Des cellules HFF (cellules) constituent le témoin négatif de l’invasion cellulaire du parasite et des cellules HFF en présence de 100 tachyzoïtes de Toxoplasma gondii (cellules + tachyzoïtes) constituent le témoin positif
Figure 4 : La figure 4 représente le poids moyen des souriceaux en gramme 3 semaines après leur naissance en fonction du traitement reçu par la mère.
Lot infecté : les souris gestantes ont été infectées par gavage avec 10 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii à H1.
Lot infecté et traité : les souris gestantes ont été infectées par gavage avec 10 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii à Jll puis traitées par une injection intrapéritonéale quotidienne de 15 pg de SGO (à partir d’une solution de SGO à 120 pg/mL) jusqu’à la mise bas.
Figure 5 : La figure 5 représente l’immunomarquage des tackyzoïtes, réalisé sur des coupes rétiniennes d’yeux de souris dans lesquels ont été injectés du SGO seul (à la concentration de 120 pg/mL) (ligne SGO) ou des tachyzoïtes de la souche ME49 seuls (ligne ME49) ou des tachyzoïtes + SGO (ligne SGO + ME49). L’observation a été réalisée au microscope à fluorescence (grossissement x250). En ligne 2 (ME49), les tachyzoïtes sont visibles par immuno-marquage en colonne 3. En présence de SGO (ligne SG0+1VIE49) les tachyzoïtes ne sont plus détectables en immuno-marquage, ce qui souligne l’effet neutralisant de l’anticorps sur l’invasion cellulaire du parasite.
EXEMPLES
Exemple 1 : Matériel et Méthodes 1. Construction des vecteurs d’expression 1.1. Bactéries et plasmides utilisés
1.1.1. Bactéries et plasmides utilisés pour l’expression des constructions peptidiques SG5 et SGO
Les bactéries Escherichia coli BL21 de génotype F-, ompT, hsdSB(rB-, nte-), dcm, gai, X(DE3), pLysS, Cni ont été utilisées pour l’expression des constructions peptidiques à partir du vecteur plasmidique pET22b (NOVAGEN) (système procaryote), sous le contrôle du promoteur T7. Le vecteur d’expression pET22b contient une séquence pelB permettant l’exportation des constructions peptidiques dans le périplasme des bactéries, domaine oxydant permettant d’obtenir des constructions peptidiques correctement conformées. Cette séquence a été fusionnée avec les séquences codant les domaines VH et VL des constructions peptidiques, ainsi que la séquence d’un lien peptidique. Les plasmides possèdent également une séquence codante pour une étiquette histidine, facilitant la purification de la protéine par chromatographie d’affinité ainsi que sa détection.
Pour la construction peptidique SG5, le vecteur de clonage pGEMT (PROMEGA) a d’abord été utilisé. Ce dernier a permis le clonage direct des produits de la PCR. En effet, le plasmide pGEMT est linéarisé par l’enzyme de restriction EcoRV et possède une thymidine à chacune de ses extrémités permettant de lier l’adénine ajoutée aux amplicons par les Taq polymérases sans activité exonucléase. Ce plasmide de 3015 pb code notamment pour la β-lactamase (conférant aux bactéries hôtes une résistance à l’ampicilline) et comporte le gène de la sous-unité a de la β-galactosidase (cassette lacZ). Dans ce dernier est localisé le site de clonage multiple encadré par les promoteurs T7 et SP6. Le gène de la β-galactosidase permet ainsi un criblage « blanc-bleu » des colonies possédant le plasmide recombinant sur milieu Lysogeny Broth (LB) agar additionnés d’IPTG, de X-gal et d’ampicilline : les bactéries ayant intégré le plasmide recombinant restent blanches tandis que les bactéries ne possédant pas le plasmide recombinant se colorent en bleu.
Les bactéries Escherichia coli TGI de génotype supE thi-1 A(lac-proAB) A(mcrB-hsdSM5 (rK -mK -) [F’ traD36proAB lacP Z A MIS J ont été utilisées pour le clonage des plasmides.
1.1.2. Bactéries et plasmides utilisés pour l’expression des constructions peptidiques scFvSGl. SG2-HL. DbF3S2. DbF4S2. scFvF5S2. scFvF5S4 . scFvF5S5. scFvF5S6 et Hum-scFvH2S
Les bactéries Escherichia coli HB2151 de génotype K12, ara, E{lac-pro), thi(¥' proAB, lacP lacZAMlS) ont été utilisées pour l’expression des constructions peptidiques scFvSGl, SG2-HL, DbF3S2, DbF4S2, scFvF5S2, scFvF5S4, scFvF5S5, scFvF5S6 et Hum-scFvH2S à partir du vecteur plasmidique pSWl (PMID : 23680984) (système procaryote). Ces plasmides possèdent par ailleurs : i) des modifications au niveau du VL permettant la purification par protéine-L (PpL), et ii) une séquence codante pour une étiquette histidine pouvant être utilisée pour la purification de la protéine par chromatographie d’affinité ainsi que pour sa détection. 1.1.3. Bactéries et plasmides utilisés pour l’expression des constructions peptidiques SG2-LH. DbSG2. SG2-CH3. SG2-Fc2a. SG2-HL etPbSG2-CH3
Les bactéries Escherichia coli DH5a de génotype F’/ endAl, hsdR17, (rk ' mk supE44, thi-1, recAl, gyrA, (Nallr), relAl, A (lacZYA-argF) U169, deoR, (Φ 80dlacA (lacZ)M15j ont été utilisées pour l’expression des constructions peptidiques à partir du vecteur plasmidique pMT-Bip (ThermoFischer) (système eucaryote) sous le contrôle du promoteur métallothionéine. Cette étape a pour but de produire une quantité suffisante de plasmides (contenant un insert) avant la réalisation de la transfection des cellules eucaryotes avec lesdits plasmides.
Le vecteur d’expression pMT-Bip contient une séquence BiP permettant la sécrétion des constructions peptidiques dans le surnageant de culture cellulaire. Cette séquence a été fusionnée avec les séquences codant les domaines VH et VL des constructions peptidiques, ainsi que la séquence d’un lien peptidique. De plus, ces plasmides possèdent : i) des modifications au niveau du domaine VL permettant la purification par PpL, et ii) une séquence codante pour une étiquette histidine pouvant être utilisée pour la purification de la protéine par chromatographie d’affinité ainsi que pour sa détection. 1.2. Purification des plasmides bactériens
1.2.1 Plasmides pET22b et pSWl et pGEMT
Les bactéries (BL21 et HB21) ont été cultivées pendant 16h à 37°C dans 5 mL de milieu LB contenant de l’ampicilline (50 pg/mL). Les plasmides ont ensuite été extraits et purifiés à l’aide du kit Plasmid Minikit I (Oméga Biotek) selon les conditions mentionnées par le fournisseur. La méthode utilisée est celle de la lyse alcaline.
1.2.2. Plasmides pMT-BIP
Les bactéries (DH5a) ont été cultivées pendant 16h à 37°C dans 100 mL de milieu LB (Luria Broth) contenant de l’ampicilline (50 pg/mL). Les plasmides ont ensuite été extraits et purifiés à l’aide du kit Plasmid Maxi Kit (QIAGEN) selon les conditions mentionnées par le fournisseur. La méthode utilisée est celle de la lyse alcaline. 1.3. Techniques employées pour la construction des plasmides recombinants 1.31. Amplification génique par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour le SG5 L’amplification de la séquence nucléotidique codant le domaine variable de la chaîne légère VL de la construction peptidique SGO a été réalisée au moyen d’une PCR. La réaction a consisté en une succession de 27 cycles consistant en une phase de dénaturation de l’ADN (95°C), une phase d'hybridation avec les deux amorces de séquence SEQ ID NO : 70 et de séquence SEQ ID NO : 71 présentées dans le Tableau I (50°C) et une phase d'extension par TADN polymérase à partir des amorces (72°C). Les réactions d’amplification ont été effectuées dans un volume final de 50 pL contenant 0,25 unités de GoTaq polymerase (Promega), 0,1 pM de chaque amorce, 0,1 mM de chaque dNTP, 10 pL de tampon 5X GoTaq Flexi Buffer (Promega) et 1 pg d’ADN matrice. L’amorce « sens» (SG5For) de séquence SEQ ID NO : 70 a permis d’introduire un site BamHl à l’extrémité N-terminale du domaine VL amplifié, et l’amorce «anti-sens » (SG5rev) de séquence SEQ ID NO : 71 a permis d’introduire un site Xhol à l’extrémité C-terminale.
1.3.2. Clonage des produits PCR
Les produits de la PCR ont été purifiés (à l’aide d’un Kit d’extraction Macherey Nagel) et clonés en utilisant le vecteur pGEM-T (Promega). Leur ligation a été réalisée dans un volume final de 10 pL contenant 2 pg de produits PCR, 100 ng de vecteur pGEM-T et 1 unité de T4 DNA ligase. La ligation a été effectuée à température ambiante pendant Ih, puis le mélange réactionnel a été utilisé pour la transformation de bactéries TGI. Les bactéries transformées ont été sélectionnées sur un milieu LB (peptone 10 g/L, extrait de levure 5 g/L et NaCl 10 g/L) supplémenté de 50 pg/mL d’ampicilline, 10 pM de X-gal et 100 pg d’IPTG.
1.3.3. Digestion enzymatique d’ADN
Les digestions des inserts (séquences codant les protéines des constructions peptidiques SGO, SG2-LH, DbSG2, SG2-CH3 SG2-Fc2a, SG2-HL, DbSG2-CH3, scFvSGl, DbF3S2, DbF4S2, scFvF5S2, scFvF5S4 et Hum-scfvH2S et séquence codant le domaine VL de la construction peptidique SGO) ainsi que des plasmides (pET22b, PMT-Bip, pSWl, pGEMT) ont été réalisées à l’aide de différents couples d’endonucléases, en utilisant 10 unités d'enzymes par pg d'ADN en présence du tampon recommandé. Les réactions ont été incubées 15 min à 37°C. Les couples d’endonucléases utilisés pour chaque construction peptidique et les vecteurs d’expression dans lesquels les inserts sont ensuite clonés sont présentés dans le Tableau I.
Tableau I
1.3.4. Electrophorèse d’ADN
Les fragments d'ADN ont été séparés par électrophorèse en gel d'agarose (1,5-2%) en tampon TAE (Tris-Acétate 40 mM, EDTA 1 mM pH 8). Les gels ont été additionnés de 0,1 pg/mL de bromure d'éthidium (BET) ce qui a permis après migration sous un courant de 100 V de visualiser l'ADN sous rayonnement ultra-violet. Les marqueurs de taille BenchTop et IkD (Promega) ont été utilisés pour déterminer la taille des fragments analysés. 1.3.5. Purifications des fragments d’ADN à partir d’agarose
Après migration électrophorétique, les bandes d’agarose contenant les fragments d'ADN issus des digestions enzymatiques ont été excisées et purifiées grâce au kit Nucleospin® Extract II (Macherey-Nagel®) selon les conditions mentionnées par le fournisseur. Le principe de la purification est basé sur l'affinité que possède l'ADN pour la silice en présence d'une forte concentration en sodium. Un volume d'ADN, à purifier, additionné de deux volumes d'une solution « d'accrochage » (Binding Buffer NT) a été déposé sur une membrane de silice. Alors que les fragments d'ADN de plus de 50 pb sont fixés sur la membrane, les dNTP, les oligonucléotides et les protéines présents dans le produit de PCR ont été éliminés par centrifugation (11 000g, 1 min). La membrane a ensuite été nettoyée des sels et des protéines restants par un lavage avec 700 pL de tampon NT3 de plus faible salinité contenant de l'éthanol (centrifugation à 11 000g, 1 min). Elle a ensuite été séchée par une centrifugation (2 min à 11 000g). L'ADN purifié retenu par la colonne a enfin été élué dans 20 pL d'eau milliQ par centrifugation (11 000g, 1 min). 1.3.6. Ligation vecteur-insert
La ligation a été réalisée dans un volume final de lOpL de milieu de ligation (constitué de tampon de ligase et d’eau) contenant 1 unité de T4 DNA ligase (Promega®) et 200 ng de vecteur pGEMT, pET22b, pSWl ou pMT-Bip (préalablement digéré). La quantité d'insert a été ajustée pour que le rapport molaire vecteur:insert soit de 1:3. Les réactions ont ensuite été incubées toute la nuit à 4°C. 1.4. Transformation de bactéries compétentes 1.4.1. Préparation des bactéries compétentes
Les bactéries ont été rendues compétentes par un traitement au CaCli. Les bactéries ont tout d’abord été cultivées jusqu’en phase exponentielle de croissance (Aeoo mn = 0,4) dans du milieu LB. Ensuite, la culture a été placée à 4°C pendant 10 min puis centrifugée (20 min, 3 000g, 4°C). Le culot bactérien a été resuspendu avec 10 mL d’une solution de CaCb à 0,1 M et mis dans la glace (4°C) pendant environ lh30. Une centrifugation (20 min, 3 000 g, 4°C) a permis de récupérer le culot bactérien qui a été resuspendu dans 2 mL de solution de CaCli à 0,1M, puis gardé à 4°C dans la glace jusqu’à utilisation. 1.4.2. Transformation bactérienne 5 pL du produit de ligation ont été ajoutés à 200 pL de bactéries compétentes. Le mélange a été incubé 30 min à 4°C. Un choc thermique a été réalisé en plaçant l’échantillon 90 secondes à 42°C puis 2 min à 4°C. Les bactéries ont été remises en culture en ajoutant 800 pL de milieu LB pendant 45 min à 37°C sous agitation (200 rpm).
Seule la transformation bactérienne avec le plasmide pGEMT a nécessité l’ajout préalable de 20 pL de X-Gal et d’IPTG (0,84 mM) sur les géloses LB agar/ampicilline (1 pg/pL) permettant ainsi un criblage « blanc-bleu ». Par la suite, le protocole a été similaire pour toutes les transformations: 200 pL de la transformation ont été étalés sur gélose LB/agar/ampicilline. Les boîtes ont ensuite été incubées toute la nuit à 37°C. 2, Production des protéines 2.1. Expression des protéines en système bactérien 2.1.1. Souche bactérienne : Escherichia coli
Le système d’expression qui a été choisi pour produire les protéines recombinantes a nécessité les souches bactériennes Escherichia coli BL21pLysS et/ou HB2151, selon les vecteurs utilisés. 2.1.2. Production bactérienne
Les constructions peptidiques ont été produites dans le périplasme des bactéries transformées Escherichia coli BL21pLysS ou HB2151 par les différents plasmides. Une préculture des bactéries a été réalisée dans 5 mL de milieu LB et incubée toute la nuit à 37°C sous agitation (200 rpm). Un volume de 500 pL de cette pré-culture a été utilisé pour ensemencer 500 mL de milieu 2xYT contenant 50 pg/mL d’ampicilline. Ensuite, la culture a été incubée 8 h à 37°C sous agitation (150 rpm). L’induction de la production des constructions peptidiques a été réalisée grâce à l’ajout de 0,84 mM d’IPTG, et la culture bactérienne a été incubée toute la nuit (16°C, agitation de 75 rpm). 2.1.3. Extraction périplasmique
Les protéines produites ont été extraites du périplasme par un choc osmotique. La culture induite par IPTG a été centrifugée (5 000 g, 10 min, 4°C). Le culot a été repris dans 10 mL de tampon TES (Tris 0,2 M pH8, EDTA 0,5 mM, Sucrose 0,5 M) et incubé 30 min dans la glace. Puis 15 mL de TES dilué au quart ont été ajoutés et la solution a été incubée 30 min dans la glace. Une nouvelle centrifugation (10 000g, 10 min, 4°C) a permis d’éliminer les débris cellulaires et de récupérer le périplasme contenant la protéine d’intérêt.
Le surnageant a ensuite été dialysé contre du tampon PB S (Phosphate Buffered Saline : KCl 27 mM, NaCl 1,4 mM, KH2PO4 anhydre 15 mM, Na2HP04 80 mM, pH 7,4). 2,2. Expression des protéines en système eucaryote
Les protéines ont été produites en cellules d'insecte Schneider Drosophila S2 (SD-S2). Après décongélation, les cellules ont été mises en culture dans le milieu S2 (milieu Schneider Drosophila 2, Sérum de veau fœtal 10 %, Penicilline-Streptomycine 1 %). La transfection des cellules a été réalisée avec le kit Lipofectamine® 2000 (LifeTechnology®) selon les recommandations du fabricant. Ainsi, ces cellules ont été transfectées dans un premier temps de façon transitoire par le plasmide pMT-Bip contenant les séquences d’intérêt. Les surnageants ont été analysés 4 jours plus tard sur gel d’acrylamide 12% par Western blot après transfert sur membrane de nitro-cellulose afin de s’assurer que les protéines étaient bien produites. En parallèle, des cellules SD-S2 ont été transfectées de manière stable par le plasmide pMT-Bip contenant les séquences d’intérêts et le plasmide pMT-Bip contenant un gène de résistance à l’hygromycine. Les cellules transfectées ont été sélectionnées par résistance à l’hygromycine (300 pg/ml) ajoutée dans le milieu de culture S2. L’induction de la production des protéines a été réalisable dès que les cellules ont atteint une cinétique de multiplication suffisante, au bout de trois semaines de sélection environ.
Un cycle de production est organisé ainsi : les cellules ont été mises en culture dans le milieu S2-hygromycine pendant 5 jours à l'issue desquels les cellules ont été récupérées par centrifugation (700 g, 10 min, 30°C), reprises dans 10 mL de milieu Schneider Drosophila, puis comptées avec du Bleu Trypan sur cellule de Malassez. Les cellules ont ensuite été réintroduites dans des flacons de culture de 225 cm^ dans du milieu d'induction (Milieu Schneider Drosophila 2, Penicilline-Streptomycine 1 %, CUSO4 ImM) de façon à obtenir 400 mL de cellules à une densité de 5.10^ cellules/mL. Le sulfate de cuivre permet d'activer l'expression du transgène grâce au promoteur de la métallothionéine. Les surnageants de culture ont été prélevés 96 h après l'induction puis centrifugés (700 g, 10 min, 30°C) afin d'éliminer les cellules. Une partie des cellules transfectées n'a pas été induite et a été remise en culture pour commencer un nouveau cycle de production de protéines recombinantes. 3. Purification des protéines 3.1, Purification des protéines recombinantes par chromatographie d’affinité sur colonne nickel-aearose
La purification des protéines recombinantes repose sur l’affinité des atomes de nickel avec les résidus histidines de l’étiquette en C-terminal de la protéine. Tout d’abord, afin d’enlever le maximum de débris, le périplasme a été centrifugé 10 min à 5 000 g à température ambiante. 300 pL de gel nickel-agarose (Miltenyi Biotec) pour 50 mL de périplasme ont été ajoutés au surnageant puis la solution a été mise sous agitation lente pendantlh30.
Une centrifugation de 3 min à 500 g a permis de récolter tout le gel, qui a été chargé sur une colonne de chromatographie. Ensuite, un lavage a été réalisé avec 25 mL de PB S puis 5 mL d’une solution de glycine (0,1 M, pH 6). L’élution de la protéine a été effectuée avec 5 mL d’une solution de glycine à 0,1 M à pH 3. Des fractions de 1 mL ont été récupérées et immédiatement neutralisées par ajout de Tris IM. Elles ont ensuite été dialysées contre un tampon PB S à 4°C toute la nuit.
Après dialyse, l’absorbance à 280 nm a été mesurée afin d’estimer la concentration en protéine selon la loi de Beer-Lambert A=elC (A : absorbance ; ε ; coefficient d’extinction molaire ; 1 : longueur de la cuve ; C : concentration). 3.2. Purification des protéines recombinantes par chromatographie d’affinité sur colonne PpL-agarose
Tout d’abord, afin d’enlever le maximum de débris, le périplasme bactérien ou le surnageant de culture cellulaire a été centrifugé 10 min à 5 000 g à température ambiante. 300 pL de Ppl-agarose pour 50 mL de périplasme ou de surnageant de culture ont été ajoutés au surnageant de centrifugation, puis la solution a été mise sous agitation lente pendant lh30.
Une centrifugation de 3 min à 500g a permis de récolter tout le gel, qui a été chargé sur une colonne de chromatographie. Ensuite, un lavage a été réalisé avec 25 mL de PBS puis 5 mL d’une solution de glycine (0,1 M, pH 6). L’élution de la protéine a été réalisée avec 5 mL d’une solution de glycine à 0,1 M à pH 3, puis avec 5 mL d’une solution de glycine à 0,1 M à pH 2. Des fractions de 1 mL ont été récupérées et immédiatement neutralisées par ajout de Tris IM. Elles ont ensuite été dialysées contre un tampon PBS à 4°C toute la nuit.
Après dialyse, l’absorbance à 280 nm a été mesurée afin d’estimer la concentration en protéine selon la loi de Beer-Lambert A=elC (A : absorbance ; ε : coefficient d’extinction molaire ; 1 : longueur de la cuve ; C : concentration). 4» Analyse des protéines 41. Analyse structurale : FPLC (FastProtein Liquid Chromatography^
Les purifications des constructions peptidiques ont été analysées par chromatographie d’exclusion-diffusion sur une colonne Superdex (Biosciences). 200 pL de constructions peptidiques (fractions recueillies après purification par chromatographie sur colonne nickel-agarose ou sur colonne PpL-agarose) ont été chargés sur la colonne. L’élution des protéines a été réalisée par du PBS avec un débit de 0,5 mL/min avant de réaliser une mesure d’absorbance à 280 nm. 4.2. Electrophorèse en gel de polvacrylamide (SDS-PAGE) en conditions dénaturantes
Les échantillons protéiques (fractions recueillies après purification par chromatographie sur colonne nickel-agarose ou sur colonne PpL-agarose) ont été dilués dans du tampon de charge (Tris-HCl pH 6,8 100 mM, SDS (Sodium Dodécyl Sulfate) 4%, β-mercapto-éthanol 1%, bleu de bromophénol 0,2%, glycérol 20%) puis dénaturés par chauffage à 95°C pendant 5 min. Ils ont ensuite été déposés sur un gel de polyacrylamide à 12% puis ont été mis à migrer sous un courant de 60 mA. Les protéines présentes dans le gel ont été visualisées après coloration de 30 min au bleu de Coomassie (bleu de Coomassie 0,25%, méthanol 45% et acide acétique 10%) et une décoloration à l’aide du tampon de décoloration. 4.3. Caractérisation des protéines par immuno-détection 4.3.1. Anticorps utilisés pour la détection des protéines
Un anticorps monoclonal anti-histidine (Sigma) a été utilisé afin de détecter la présence des protéines possédant l’étiquette histidine. Un anticorps anti-IgG murin couplé à la phosphatase alcaline (Sigma) a été utilisé comme anticorps secondaire pour révéler la présence de l’anticorps monoclonal anti-histidine. Un anticorps anti-histidine couplé à la HRP (Horse Radish Peroxydase) (Miltenyi Biotec) a été utilisé pour révéler directement la présence des protéines possédant l’étiquette histidine. La protéine L (PpL) couplée à la HRP (Horse Radish Peroxydase) est utilisée pour révéler directement la présence des protéines reconnues par la protéine L. 4.3.2· Western blot
Un transfert passif des protéines sur membrane de nitrocellulose a été réalisé sur la nuit. Le lendemain, la membrane a tout d’abord été saturée avec une solution de TNT (Tris-HCl 15 mM, NaCl 140 mM pH 8, Tween 20 0,05%) additionné de 5% de lait écrémé en poudre, pendant Ih.
Constructions peptidiques présentant le tag histidine : L’anticorps monoclonal anti-histidine a été ajouté sur la membrane à la dilution 1/2000® pendant Ih sous agitation. La membrane a été lavée trois fois par du TNT puis incubée avec l’anticorps secondaire anti-IgG murin couplé à la phosphatase alcaline (dilué au 1/5000 dans du TNT) pendant Ih sous agitation. Le lavage de la membrane a été réalisé deux fois avec du TNT puis par du tampon R (Tris-HCl 100 mM, NaCl 100 mM MgCli 6H2O 5 mM, pH 9,5). La présence des anticorps a été révélée par la réaction de la phosphatase alcaline avec son substrat (BCIP : Bromo Chloro Indolyl Phosphate) en présence de NBT (Nitro Blue Tétrazolium) et la réaction colorée a été arrêtée par rinçage à l’eau distillée.
4 3 3. ELISA
Une plaque 96 puits (NUNC Maximax) a été coatée avec 10 pg/mL d’extrait total (ET) de toxoplasme dilué dans un tampon carbonate (Na2C03 0,1 M, NaHC03, pH 9,6) à raison de 100 pL/puits. La plaque a été laissée toute la nuit à 4°C.
Le lendemain, la saturation des sites non spécifiques a été réalisée par 200 pL/puits de PBS-Tween additionné de 3% de BSA (Bovine Sérum Albumine) pendant lh30-2h à 37°C. La plaque a ensuite été lavée 3 fois avec du PBS-Tween 0,05%. Les échantillons (fractions contenant les protéines des constructions peptidiques recueillies après purification par chromatographie sur colonne nickel-agarose ou sur colonne PpL-agarose) ont été déposés en duplicat dans un volume final de 100 pL/puits. Après lh30 d’incubation à 37°C, 3 lavages au PBS-Tween 0,05% ont été effectués.
Constmctions peptidiques présentant le tag histidine : L’anticorps anti-histidine couplé à la peroxydase, dilué au 1/1000 dans du PBS, a été ajouté à raison de 100 pL/puits. Après Ih d’incubation à 37°C, la révélation a été réalisée par ajout de 100 pL/puits de TMB (3,3’,5,5’-tétraméthylbenzidine) pendant 5 à 10 min à température ambiante et dans l’obscurité. La réaction a été arrêtée par ajout de 50 pL d’une solution d’H2S04 2 N. La lecture de la plaque a été faite à 450 nm grâce à un lecteur de plaque. 4.3.4. Immuno-fluorescence indirecte
La technique d’immuno-fluorescence a consisté à fixer des tachyzoïtes de Toxoplasma gondii sur des cupules et à mettre en présence les constructions peptidiques à tester. La liaison de la construction peptidique sur le parasite a été révélée par un anticorps couplé à un fluorochrome.
Tout d’abord le surnageant d’une culture de tachyzoïtes a été récupéré et centrifugé (3500 rpm, 15 min) puis le culot a été resuspendu avec 5 mL de PBS. Cette étape a été exécutée trois fois. La troisième fois, le culot a été resuspendu de sorte à obtenir 5.10^ tachyzoïtes/mL. 20 pL (soit 1.10^ tachyzoïtes) ont été déposés sur chaque cupule, puis laissés sécher sous hotte toute la nuit. Les cupules ont ensuite été stockées à -20°C jusqu’à utilisation.
Sans attendre la décongélation des cupules, les tachyzoïtes ont été fixés dans un bain d’acétone froid pendant 2 min. Chaque cupule a ensuite été rincée trois fois au PBS. Puis 30 pL d’échantillon (fractions contenant les protéines des constructions peptidiques recueillies après purification par chromatographie sur colonne nickel-agarose ou sur colonne PpL-agarose) ont été déposés et incubés en chambre humide à 4°C pendant 16 heures. A l’issue de l’incubation, trois lavages au PBS ont été réalisés avant de déposer 40 pL de l’anticorps primaire anti-histidine (dilué au 1/50) par cupule. Les cupules ont été incubées lh30 à 37°C en chambre humide. Après 3 rinçages au PBS, l’anticorps secondaire anti-IgG de souris couplé au fluorochrome Alexa488 (dilution 1/500) a été ajouté puis les cupules ont été incubées en chambre humide à 37°C pendant lh30. Afin d’éliminer les anticorps non fixés, 3 lavages au PBS ont été effectués. Enfin, une lame a ensuite été fixée sur les cupules. L’observation a été réalisée au microscope à fluorescence (objectif x40). 5. Test de neutralisation in vitro
Des cellules de lignée HFF (Human Foreskin Fibroblast) ont été déposées dans une plaque 96 puits (P96), à raison de 2.10^^ cellules/puits, dans 100 pL de milieu DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) additionné de 1% glutamine, 1% S VF (Sérum de Veau Fœtal), 1% pénicilline-streptomycine, sans rouge de phénol, puis ont été incubées pendant 24h (37°C, 5% CO2).
Des tachyzoïtes, d’une souche RH de Toxoplasma gondii, transfectés par un plasmide codant pour la β-galactosidase ont été utilisés. Le gène de la β-galactosidase est sous le control du promoteur du gène codant la protéine SAGl.
Pour chaque puits, un volume de 50 pL de milieu DMEM contenant 100 tachyzoïtes a été ajouté à 50 pL d’une solution contenant de 1,5 à 10 pg de construction peptidique à tester pour une pré-incubation d’une heure. Puis les 100 pL de la solution pré-incubée ont été mis en présence des cellules: les constructions peptidiques et les parasites ont donc été ajoutés simultanément.
Alternativement, lorsque cela est explicitement mentionné, un volume de 50 pL de milieu DMEM contenant 100 tachyzoïtes a été ajouté dans chaque puits puis 50 pL d’une solution contenant de 1,5 à 10 pg de construction peptidique à tester ont été mis en présence des cellules et des parasites sans pré-incubation (avec un délai de 5 min après l’ajout des tachyzoïtes).
Dans les deux cas, le volume de 50 pL de la solution contenant de 1,5 à 10 pg de construction peptidique a été préparé de la façon suivante : à partir d’une solution contenant la construction peptidique à différentes concentrations selon la construction peptique, un volume a été déterminé de façon à ce que ce volume contienne la masse de construction peptidique voulue. Ce volume a été prélevé puis complété avec une solution tampon jusqu’à l’obtention d’un volume de 50 pL.
La plaque a été incubée pendant 4 jours à 37°C sauf mention contraire, sous 5% CO2.
Afin d’analyser l’action de chaque construction peptidique, 150 pL de surnageant ont été retirés de chaque puits et 50 pL de tampon de lyse (0,1% Triton lOOX) ont été ajoutés dans chaque puits. Les puits ont ensuite été grattés afin de lyser toutes les cellules. Sur une nouvelle P96, 50 pL de lysat ont été déposés dans chaque puits, auxquels ont été ajoutés 50 pL d’une solution de CPRG (Chlorophenol Red-β-D-galactopyranoside, 1 pM) dans de l’HEPES (100 pM, pH 8). Clivé par la β-galactosidase présente dans les tachyzoïtes, le CPRG produit un composé soluble de couleur rouge, mesurable par spectophotométrie. La plaque a ensuite été incubée à 37°C pendant 20 min afin que l’enzyme puisse agir. La coloration a été mesurée à 565 nm. 6. Test de neutralisation in vivo 6.1. Modèle de toxoplasmose congénitale
Des souris mâles et femelles swiss OFl (Janvier), souris albinos non consanguines, ont été utilisées.
Pour chaque expérience, le protocole a été le suivant : A Jl, la mise au mâle a été réalisée en plaçant 2 femelles en présence d’un mâle pendant 48h. Les souris femelles ont ensuite fait l’objet d’une surveillance quotidienne afin de déterminer les souris gestantes de celles non gestantes. A Jll, correspondant à la mi-gestation, les souris femelles gestantes ont toutes été infectées par gavage avec des kystes de la souche 76k de Toxoplasma gondii. Les souris ont ensuite été séparées en 2 lots. Le premier lot, dit « témoin infecté », était constitué de souris uniquement infectées par T. gondii. Le second lot, dit « infecté et traité », était constitué de souris infectées mais aussi traitées par la construction peptidique. Dans ce dernier lot, les souris infectées par T. gondii ont reçu quotidiennement, à partir du jour de l’infection (à mi-gestation) et jusqu’à la mise bas, la construction peptidique par injection intrapéritonéale (15 ou 27 pg/souris/jour à partir d’une préparation à 120 pg/mL).
Après la naissance des souriceaux, un suivi de la protection ainsi que de la réponse immunitaire induite ont été réalisés. Pour cela, les souriceaux ont régulièrement été surveillés (taille/poids) avant d’être sacrifiés à l’âge de 4-5 semaines de vie. Leurs cerveaux ont ensuite été prélevés puis broyés afin d’évaluer la charge parasitaire, paramètre reflétant la protection.
Par ailleurs, une étude de la réponse cellulaire a également été réalisée sur les splénocytes par dosage cytokinique (interleukine 10 (IL-10), interféron-γ (IFNy)). 6.2. Modèle de toxoplasmose oculaire
Des souris femelles, swiss OFl, albinos non-consanguines, (Janvier), ont été utilisées et réparties dans différents lots : - Lot 1 : les souris ont reçu par injection intravitréenne 200 tachyzoïtes de la souche de Toxoplasma gondii ME49 à JO. - Lot 2 : les souris ont reçu par injection intravitréenne 600 ng de construction peptidique (à partir d’une préparation à 120 pg/mL) à JO. - Lot 3 : les souris ont reçu par injection intravitréenne simultanément 200 tachyzoïtes de la souche ME49 et 600 ng de construction peptidique (à partir d’une préparation à 120 pg/mL) à JO.
Les injections, sous un volume de 5pL, dans la limbe (jonction entre la cornée et la sclérotique) ont été réalisées sous anesthésie générale par isoflurane à l’aide d’une seringue Hamilton de 250 pL (Dutscher) sur laquelle était montée une aiguille de 32 Gauges (Dutscher).
Les yeux des souris ont ensuite été examinés à la loupe binoculaire, sous anesthésie générale par isoflurane, à Jl, J2, J6 et J7 afin de réaliser l’examen clinique. Celui-ci a été réalisé sur le segment antérieur (cornée, sclère, conjonctive, cristallin, humeur aqueuse) et le segment postérieur (vitré, rétine). Ces examens cliniques ont été réalisés à la loupe binoculaire. L’hydratation cornéenne a été respectée afin d’éviter l’apparition d’une kératite d’exposition ou d’un oedème cornéen qui auraient perturbé l’examen.
Les yeux examinés ont été répartis en cinq stades cliniques: - 0 : aucun signe inflammatoire, - 1 : Tyndall en chambre antérieure ou vitréen modéré, - 2 : Tyndall en chambre antérieure ou vitréen sévère et/ou dilatation des vaisseaux iriens et/ou conjonctivo-scléraux (cataracte sous capsulaire postérieure), - 3 : troubles cornéens et précipités rétrocoméens et/ou hyalite très sévère, - 4 : cataracte secondaire.
Immunohi stochimi e A J8, les souris ont été sacrifiées. Les yeux entiers ont été prélevés après canthotomie interne et externe, désinsérés des muscles oculomoteurs et de la conjonctive aux ciseaux de Vannas et énucléés par traction sur le nerf optique. Les yeux ont été congelés à -80°C, directement ou après avoir été fixés dans du paraformaldéhyde 4% (un oeil par souris), après inclusion dans le milieu d’enrobage : oct embadding matrix cellpath. Les blocs congelés ont été coupés au cryostat (Leica CM3050) à 10 microns, déposés sur lame (4 coupes par lame) et laissés à sécher une nuit. Les lames peuvent être utilisées directement ou congelées à -80°C puis décongelées pendant Ih. Les lames ont été fixées dans quatre bains d’acétone successifs de 3 min, à 60, 70, 80 et 90%, puis dans un bain de paraformaldéhyde 4% de 3 min et lavées deux fois dans du PB S pendant 5 min.
Le marquage des tachyzoïtes au niveau des coupes rétiniennes a ensuite été réalisé via l’utilisation d’un sérum d’infection et d’un anticorps secondaire (extravidine FITC). 50 pL de sérum d’infection ont été déposés par coupe. Les lames ont reposées pendant 2h en chambre humide à 37°C, puis ont été réalisés 3 lavages de 3 min avec du PBS (bains). L’anticorps secondaire a été déposé pendant 30 min : l’extravidine FITC (sigma E2761) (dilué au 1/1000^“®) (marquage des tachyzoites en vert). ). Les trois lavages de 3 min au PBS à température ambiante ont été renouvelés et la contre-coloration a été faite avec du Hoescht (Molecular Probes 1333342 H3573) dilué dans l’eau au 1/2000^“® (coloration des noyaux en bleu) pendant une minute. 50 pL par coupe ont été déposés. Les lames ont ensuite été lavées 3 fois pendant 3 min à température ambiante (bains) et montées avec du Vectashield HlOOO sans laisser de bulles. Après séchage, les lames ont été observées au microscope à fluorescence.
Exemple 2 ; Production et analyse des protéines de la construction peptidique SGO 1. Construction du vecteur d’expression
Le gène codant la construction peptidique SGO, représentée par la séquence SEQ ID NO : 10, a été obtenu par synthèse auprès de la société Thermo Fisher Scientific GENEART, cloné dans un vecteur. Les séquences nucléotidiques codant les domaines variables des chaînes lourdes (VH) et légères (VL) ont été optimisées en vue d’une production de la protéine en système procaryote.
Le vecteur contenant le gène codant la construction peptidique SGO a ensuite été digéré à l’aide d’un couple d’endonucléases (Tableau I). Le fragment d’ADN issus de la double digestion a ensuite été isolé par électrophorèse en gel d’agarose puis purifié. Ce fragment d’ADN, codant la construction peptidique (insert), a alors été inséré dans le vecteur d’expression pET22b, préalablement digéré par le même couple d’endonucléases, (tableau I) via une ligation. Les produits de ligation ont été utilisés pour transformer des bactéries Escherichia coli BL21. 2. Production, purification et analyses des protéines
Les protéines de la construction peptidique SGI ont été produites en système bactérien {Escherichia coli BL21). Les protéines produites ont été extraites du périplasme par un choc osmotique.
Les protéines ont ensuite été purifiées par chromatographie d’affinité sur colonne nickel-agarose.
Les protéines purifiées ont ensuite été analysées par FPLC (analyse structurale) puis par électrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) en conditions dénaturantes. Les protéines ont ensuite été caractérisées par immuno-détection à l’aide d’un Western blot.
Exemple 3 ; Production et analyse des protéines de la construction peptidique SG5 1. Construction du vecteur d’expression
La séquence nucléotidique du SG5 représentée par la séquence SEQ ID NO : 11, a été obtenue à l’aide d’une technique de PCR.
Tout d’abord, la séquence nucléotidique du domaine variable de la chaîne légère (domaine VL) de la construction peptidique SGO a été amplifiée par PCR. Le produit de la PCR a ensuite été purifié puis cloné dans le vecteur pGEMT.
Des bactéries TGI ont été transformées avec le vecteur pGEMT. Après culture des bactéries, le plasmide a été purifié à l’aide du kit Plasmid Minikit I. Le plasmide a ensuite été digéré par BamHl et Xhol. Le fragment d’ADN issus de la double digestion a ensuite été isolé par électrophorèse en gel d’agarose puis purifié. Ce fragment d’ADN, codant le domaine variable de la chaîne légère de la construction peptidique SGO (insert), a alors été inséré dans le vecteur d’expression pET22b, préalablement digéré par le même couple d’endonucléases, via une ligation.
Des bactéries BL21 rendues compétentes ont ensuite été transformées avec le produit de ligation. 2» Production, purification et analyses des protéines
Les protéines de la construction peptidique SG5 ont été produites en système bactérien {Escherichia coli BL21). Les protéines produites ont été extraites du périplasme par un choc osmotique.
Les protéines ont ensuite été purifiées par chromatographie d’affinité sur colonne nickel-agarose.
Les protéines purifiées ont ensuite été analysées par FPLC (analyse structurale) puis par électrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) en conditions dénaturantes. Les protéines ont ensuite été caractérisées par immuno-détection à l’aide d’un Western blot.
Exemple 4 ; Production et analyse des protéines de la construction peptidique SGl-T.TT 1. Construction du vecteur d’expression
Le gène codant la construction peptidique SG2-LH représentée par la séquence SEQ ID NO : 27, a été obtenu par synthèse auprès de la société Thermo Fisher Scientific GENEART, cloné dans un vecteur. Les séquences nucléotidiques codant les domaines variables des chaînes lourdes (VH) et légères (VL) ont été optimisées en vue d’une production de la protéine en système eucaryote.
Le vecteur contenant le gène codant la construction peptidique SG2-LH a ensuite été digéré à l’aide d’un couple d’endonucléases (Tableau I). Le fragment d’ADN issus de la double digestion a ensuite été isolé par électrophorèse en gel d’agarose puis purifié. Ce fragment d’ADN, codant la construction peptidique (insert) a alors été inséré dans le vecteur d’expression pMT-Bip, préalablement digéré par le même couple d’endonucléases, (tableau I) via une ligation. Les produits de ligation ont été utilisés pour transformer des bactéries Escherichia coli DH5a, dans le but d’obtenir après culture et purification (maxi prep) une quantité suffisamment importante de plasmide pour réaliser la transfection des cellules S2. 2. Production, purification et analyses des protéines
Les protéines de la construction peptidique SG2-LH ont été produites en système eucaryote. Les protéines produites ont été sécrétées dans le milieu de culture des cellules S2 après induction au sulfate de cuivre.
Les protéines ont ensuite ètè purifiées par chromatographie d’affinité sur colonne PpL agarose.
Les protéines purifiées ont ensuite été analysées par FPLC (analyse structurale) puis par électrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) en conditions dénaturantes. Les protéines ont ensuite été caractérisées par immuno-détection à l’aide d’un Western blot.
Exemple 5 ; Production et analyse des protéines de la construction peptidique DbSG2 1» Construction du vecteur d’expression
Le gène codant la construction peptidique DbSG2 représentée par la séquence SEQ ID NO : 13, a été obtenu par synthèse auprès de la société Thermo Fisher Scientific GENEART, cloné dans un vecteur. Les séquences nucléotidiques codant les domaines variables des chaînes lourdes (VH) et légères (VL) ont été optimisées en vue d’une production de la protéine en système eucaryote.
Le vecteur contenant le gène codant la construction peptidique DbSG2 a ensuite été digéré à l’aide d’un couple d’endonucléases (Tableau I). Le fragment d’ADN issus de la double digestion a ensuite été isolé par électrophorèse en gel d’agarose puis purifié. Ce fragment d’ADN, codant la construction peptidique (insert) a alors été inséré dans le vecteur d’expression pMT-Bip, préalablement digéré par le même couple d’endonucléases, (tableau I) via une ligation. Les produits de ligation ont été utilisés pour transformer des bactéries Escherichia coli DH5a, dans le but d’obtenir après culture et purification (maxi prep) une quantité suffisamment importante de plasmide pour réaliser la transfection des cellules S2. 2. Production, purification et analyses des protéines
Les protéines de la construction peptidique DbSG2ont été produites en système eucaryote. Les protéines produites ont été sécrétées dans le milieu de culture des cellules S2 après induction au sulfate de cuivre.
Les protéines ont ensuite été purifiées par chromatographie d’affinité sur colonne PpL agarose.
Les protéines purifiées ont ensuite été analysées par FPLC (analyse structurale) puis par électrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) en conditions dénaturantes. Les protéines ont ensuite été caractérisées par immuno-détection à l’aide d’un Western blot.
Exemple 6 : Production et analyse des protéines de la construction peptidique SG2-CH3 1. Construction du vecteur d’expression
Le gène codant la construction peptidique SG2-CH3 représentée par la séquence SEQ ID NO : 14, a été obtenu par synthèse auprès de la société Thermo Fisher Scientific GENEART, cloné dans un vecteur. Les séquences nucléotidiques codant les domaines variables des chaînes lourdes (VH) et légères (VL) ont été optimisées en vue d’une production de la protéine en système eucaryote.
Le vecteur contenant le gène codant la construction peptidique SG2-CH3 a ensuite été digéré à l’aide d’un couple d’endonucléases (Tableau I). Le fragment d’ADN issus de la double digestion a ensuite été isolé par électrophorèse en gel d’agarose puis purifié. Ce fragment d’ADN, codant la construction peptidique (insert) a alors été inséré dans le vecteur d’expression pMT-Bip, préalablement digéré par le même couple d’endonucléases, (tableau I) via une ligation. Les produits de ligation ont été utilisés pour transformer des bactéries Escherichia coli DH5a, dans le but d’obtenir après culture et purification (maxi prep) une quantité suffisamment importante de plasmide pour réaliser la transfection des cellules S2. 2» Production, purification et analyses des protéines
Les protéines de la construction peptidique SG2-CH3 ont été produites en système eucaryote. Les protéines produites ont été sécrétées dans le milieu de culture des cellules S2 après induction au sulfate de cuivre.
Les protéines ont ensuite été purifiées par chromatographie d’affinité sur colonne PpL agarose.
Les protéines purifiées ont ensuite été analysées par FPLC (analyse structurale) puis par électrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) en conditions dénaturantes. Les protéines ont ensuite été caractérisées par immuno-détection à l’aide d’un Western blot.
Exemple 7 : Production et analyse des protéines de la construction peptidique SG2-Fc2a 1. Construction du vecteur d’expression
Le gène codant la construction peptidique SG2-Fc2a représentée par la séquence SEQ ID NO : 16, a été obtenu par synthèse auprès de la société Thermo Fisher Scientific GENEART, cloné dans un vecteur. Les séquences nucléotidiques codant les domaines variables des chaînes lourdes (VH) et légères (VL) ont été optimisées en vue d’une production de la protéine en système eucaryote.
Le vecteur contenant le gène codant la construction peptidique SG2-Fc2a a ensuite été digéré à l’aide d’un couple d’endonucléases (Tableau I). Le fragment d’ADN issus de la double digestion a ensuite été isolé par électrophorèse en gel d’agarose puis purifié. Ce fragment d’ADN, codant la construction peptidique (insert) a alors été inséré dans le vecteur d’expression pMT-Bip, préalablement digéré par le même couple d’endonucléases, (tableau I) via une ligation. Les produits de ligation ont été utilisés pour transformer des bactéries Escherichia coli DH5a, dans le but d’obtenir après culture et purification (maxi prep) une quantité suffisamment importante de plasmide pour réaliser la transfection des cellules S2. 2» Production, purification et analyses des protéines
Les protéines de la construction peptidique SG2-Fc2a ont été produites en système eucaryote. Les protéines produites ont été sécrétées dans le milieu de culture des cellules S2 après induction au sulfate de cuivre.
Les protéines ont ensuite été purifiées par chromatographie d’affinité sur colonne PpL agarose.
Les protéines purifiées ont ensuite été analysées par FPLC (analyse structurale) puis par électrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) en conditions dénaturantes. Les protéines ont ensuite été caractérisées par immuno-détection à l’aide d’un Western blot.
Exemple 8 ; Production et analyse des protéines de la construction peptidique SG2-TTT. 1» Production en système eucaryote 1.1. Construction du vecteur d’expression
Le gène codant la construction peptidique SG2-HL représentée par la séquence SEQ ID NO : 12, a été obtenu par synthèse auprès de la société Thermo Fisher Scientific GENEART, cloné dans un vecteur. Les séquences nucléotidiques codant les domaines variables des chaînes lourdes (VH) et légères (VL) ont été optimisées en vue d’une production de la protéine en système eucaryote.
Le vecteur contenant le gène codant la construction peptidique SG2-HL a ensuite été digéré à l’aide d’un couple d’endonucléases (Tableau I). Le fragment d’ADN issus de la double digestion a ensuite été isolé par électrophorèse en gel d’agarose puis purifié. Ce fragment d’ADN, codant la construction peptidique (insert) a alors été inséré dans le vecteur d’expression pMT-Bip, préalablement digéré par le même couple d’endonucléases, (tableau I) via une ligation. Les produits de ligation ont été utilisés pour transformer des bactéries Escherichia coli DH5a, dans le but d’obtenir après culture et purification (maxi prep) une quantité suffisamment importante de plasmide pour réaliser la transfection des cellules S2. 1.2. Production, purification et analyses des protéines
Les protéines de la construction peptidique SG2-HL ont été produites en système eucaryote. Les protéines produites ont été sécrétées dans le milieu de culture des cellules S2 après induction au sulfate de cuivre.
Les protéines ont ensuite été purifiées par chromatographie d’affinité sur colonne PpL agarose.
Les protéines purifiées ont ensuite été analysées par FPLC (analyse structurale) puis par électrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) en conditions dénaturantes. Les protéines ont ensuite été caractérisées par immuno-détection à l’aide d’un Western blot. 2. Production en système procarvote 2,1 Construction du vecteur d’expression
Le gène codant la construction peptidique SG2-HL représentée par la séquence SEQ ID NO : 12, a été obtenu par synthèse auprès de la société Thermo Fisher Scientific GENEART, cloné dans un vecteur. Les séquences nucléotidiques codant les domaines variables des chaînes lourdes (VH) et légères (VL) ont été optimisées en vue d’une production de la protéine en système procaryote.
Le vecteur contenant le gène codant la construction peptidique SG2-HL a ensuite été digéré à l’aide d’un couple d’endonucléases (Tableau I). Le fragment d’ADN issus de la double digestion a ensuite été isolé par électrophorèse en gel d’agarose puis purifié. Ce fragment d’ADN, codant la construction peptidique (insert) a alors été inséré dans le vecteur d’expression pSWl, préalablement digéré par le même couple d’endonucléases, (tableau I) via une ligation. Les produits de ligation ont été utilisés pour transformer des bactéries Escherichia coli HB2151. 2.2. Production, purification et analyses des protéines
Les protéines de la construction peptidique SG2-HL ont été produites en système procaryote (Escherichia coli HB2151). Les protéines produites ont été extraites du périplasme par un choc osmotique.
Les protéines ont ensuite été purifiées par chromatographie d’affinité sur colonne PpL-agarose.
Les protéines purifiées ont ensuite été analysées par FPLC (analyse structurale) puis par électrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) en conditions dénaturantes. Les protéines ont ensuite été caractérisées par immuno-détection à l’aide d’un Western blot.
Exemple 9 ; Production et analyse des protéines de la construction peptidique DbSG2-CH3 1» Construction du vecteur d’expression
Le gène codant la construction peptidique DbSG2-CH3 représentée par la séquence SEQ ID NO : 15, a été obtenu par synthèse auprès de la société Thermo Fisher Scientific GENEART, cloné dans un vecteur. Les séquences nucléotidiques codant les domaines variables des chaînes lourdes (VH) et légères (VL) ont été optimisées en vue d’une production de la protéine en système eucaryote.
Le vecteur contenant le gène codant la construction peptidique DbSG2-CH3 a ensuite été digéré à l’aide d’un couple d’endonucléases (Tableau I). Le fragment d’ADN issus de la double digestion a ensuite été isolé par électrophorèse en gel d’agarose puis purifié. Ce fragment d’ADN, codant la construction peptidique (insert) a alors été inséré dans le vecteur d’expression pMT-Bip, préalablement digéré par le même couple d’endonucléases, (tableau I) via une ligation. Les produits de ligation ont été utilisés pour transformer des bactéries Escherichia coli DH5a, dans le but d’obtenir après culture et purification (maxi prep) une quantité suffisamment importante de plasmide pour réaliser la transfection des cellules S2. 2. Production., purification et analyses des protéines
Les protéines de la construction peptidique DbSG2-CH3 ont été produites en système eucaryote. Les protéines produites ont été sécrétées dans le milieu de culture des cellules S2 après induction au sulfate de cuivre.
Les protéines ont ensuite été purifiées par chromatographie d’affinité sur colonne PpL agarose.
Les protéines purifiées ont ensuite été analysées par FPLC (analyse structurale) puis par électrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) en conditions dénaturantes. Les protéines ont ensuite été caractérisées par immuno-détection à l’aide d’un Western blot.
Exemple 10 : Production et analyse des protéines de la construction peptidique scFvSGl 1. Construction du vecteur d’expression
Le gène codant la construction peptidique scFvSGl représentée par la séquence SEQ ID NO : 17, a été obtenu par synthèse auprès de la société Thermo Fisher Scientific GENEART, cloné dans un vecteur. Les séquences nucléotidiques codant les domaines variables des chaînes lourdes (VH) et légères (VL) ont été optimisées en vue d’une production de la protéine en système procaryote.
Le vecteur contenant le gène codant la construction peptidique scFvSGl a ensuite été digéré à l’aide d’un couple d’endonucléases (Tableau I). Le fragment d’ADN issus de la double digestion a ensuite été isolé par électrophorèse en gel d’agarose puis purifié. Ce fragment d’ADN, codant la construction peptidique (insert) a alors été inséré dans le vecteur d’expression pSWl, préalablement digéré par le même couple d’endonucléases, (tableau I) via une ligation. Les produits de ligation ont été utilisés pour transformer des bactéries Escherichia coli HB2151. 2» Production, purification et analyses des protéines
Les protéines de la construction peptidique scFvSGl ont été produites en système procaryote (Escherichia coli HB2151). Les protéines produites ont été extraites du périplasme par un choc osmotique.
Les protéines ont ensuite été purifiées par chromatographie d’affinité sur colonne PpL-agarose.
Les protéines purifiées ont ensuite été analysées par FPLC (analyse structurale) puis par électrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) en conditions dénaturantes. Les protéines ont ensuite été caractérisées par immuno-détection à l’aide d’un Western blot.
Exemple 11 : Production et analyse des protéines de la construction peptidique DbF3S2 1. Construction du vecteur d’expression
Le gène codant la construction peptidique DbF3S2 représentée par la séquence SEQ ID NO : 18, a été obtenu par synthèse auprès de la société Thermo Fisher Scientific GENEART, cloné dans un vecteur. Les séquences nucléotidiques codant les domaines variables des chaînes lourdes (VH) et légères (VL) ont été optimisées en vue d’une production de la protéine en système procaryote.
Le vecteur contenant le gène codant la construction peptidique DbF3S2 a ensuite été digéré à l’aide d’un couple d’endonucléases (Tableau I). Le fragment d’ADN issus de la double digestion a ensuite été isolé par électrophorèse en gel d’agarose puis purifié. Ce fragment d’ADN, codant la construction peptidique (insert) a alors été inséré dans le vecteur d’expression pSWl, préalablement digéré par le même couple d’endonucléases, (tableau I) via une ligation. Les produits de ligation ont été utilisés pour transformer des bactéries Escherichia coli HB2151. 2. Production, purification et analyses des protéines
Les protéines de la construction peptidique DbF3S2 ont été produites en système procaryote {Escherichia coli HB2151). Les protéines produites ont été extraites du périplasme par un choc osmotique.
Les protéines ont ensuite été purifiées par chromatographie d’affinité sur colonne PpL-agarose.
Les protéines purifiées ont ensuite été analysées par FPLC (analyse structurale) puis par électrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) en conditions dénaturantes. Les protéines ont ensuite été caractérisées par immuno-détection à l’aide d’un Western blot.
Exemple 12 : Production et analyse des protéines de la construction peptidique DbF4S2 1. Construction du vecteur d’expression
Le gène codant la construction peptidique DbF4S2 représentée par la séquence SEQ ID NO : 19, a été obtenu par synthèse auprès de la société Thermo Fisher Scientific GENEART, cloné dans un vecteur. Les séquences nucléotidiques codant les domaines variables des chaînes lourdes (VH) et légères (VL) ont été optimisées en vue d’une production de la protéine en système procaryote.
Le vecteur contenant le gène codant la construction peptidique DbF4S2 a ensuite été digéré à l’aide d’un couple d’endonucléases (Tableau I). Le fragment d’ADN issus de la double digestion a ensuite été isolé par électrophorèse en gel d’agarose puis purifié. Ce fragment d’ADN, codant la construction peptidique (insert) a alors été inséré dans le vecteur d’expression pSWl, préalablement digéré par le même couple d’endonucléases, (tableau I) via une ligation. Les produits de ligation ont été utilisés pour transformer des bactéries Escherichia coli HB2151. 2. Production, purification et analyses des protéines
Les protéines de la construction peptidique DbF4S2 ont été produites en système procaryote {Escherichia coli HB2151). Les protéines produites ont été extraites du périplasme par un choc osmotique.
Les protéines ont ensuite été purifiées par chromatographie d’affinité sur colonne PpL-agarose.
Les protéines purifiées ont ensuite été analysées par FPLC (analyse structurale) puis par électrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) en conditions dénaturantes. Les protéines ont ensuite été caractérisées par immuno-détection à l’aide d’un Western blot.
Exemple 13 : Production et analyse des protéines de la construction peptidique scFvF5S2 1. Construction du vecteur d’expression
Le gène codant la construction peptidique scFvF5S2 représentée par la séquence SEQ ID NO : 20, a été obtenu par synthèse auprès de la société Thermo Fisher Scientific GENEART, cloné dans un vecteur. Les séquences nucléotidiques codant les domaines variables des chaînes lourdes (VH) et légères (VL) ont été optimisées en vue d’une production de la protéine en système procaryote.
Le vecteur contenant le gène codant la construction peptidique scFvF5S2 a ensuite été digéré à l’aide d’un couple d’endonucléases (Tableau I). Le fragment d’ADN issus de la double digestion a ensuite été isolé par électrophorèse en gel d’agarose puis purifié. Ce fragment d’ADN, codant la construction peptidique (insert) a alors été inséré dans le vecteur d’expression pSWl, préalablement digéré par le même couple d’endonucléases, (tableau I) via une ligation. Les produits de ligation ont été utilisés pour transformer des bactéries Escherichia coli HB2151. 2. Production, purification et analyses des protéines
Les protéines de la construction peptidique scFvF5S2 ont été produites en système procaryote {Escherichia coli HB2151). Les protéines produites ont été extraites du périplasme par un choc osmotique.
Les protéines ont ensuite été purifiées par chromatographie d’affinité sur colonne Ppl-agarose.
Les protéines purifiées ont ensuite été analysées par FPLC (analyse structurale) puis par électrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) en conditions dénaturantes. Les protéines ont ensuite été caractérisées par immuno-détection à l’aide d’un Western blot.
Exemple 14 ; Production et analyse des protéines de la construction peptidique scFvF5S4 1. Construction du vecteur d’expression
Le gène codant la constmction peptidique scFvF5S4 représentée par la séquence SEQ ID NO : 21, a été obtenu par synthèse auprès de la société Thermo Fisher Scientific GENEART, cloné dans un vecteur. Les séquences nucléotidiques codant les domaines variables des chaînes lourdes (VH) et légères (VL) ont été optimisées en vue d’une production de la protéine en système procaryote.
Le vecteur contenant le gène codant la construction peptidique scFvF5S4 a ensuite été digéré à l’aide d’un couple d’endonucléases (Tableau I). Le fragment d’ADN issus de la double digestion a ensuite été isolé par électrophorèse en gel d’agarose puis purifié. Ce fragment d’ADN, codant la construction peptidique (insert) a alors été inséré dans le vecteur d’expression pSWl, préalablement digéré par le même couple d’endonucléases, (tableau I) via une ligation. Les produits de ligation ont été utilisés pour transformer des bactéries Escherichia coli HB2151. 2. Production, purification et analyses des protéines
Les protéines de la construction peptidique scFvF5S4 ont été produites en système procaryote {Escherichia coli HB2151). Les protéines produites ont été extraites du périplasme par un choc osmotique.
Les protéines ont ensuite été purifiées par chromatographie d’affinité sur colonne PpL-agarose.
Les protéines purifiées ont ensuite été analysées par FPLC (analyse structurale) puis par électrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) en conditions dénaturantes. Les protéines ont ensuite été caractérisées par immuno-détection à l’aide d’un Western blot.
Exemple 15 ; Production et analyse des protéines de la construction peptidique scFvF5S5 1» Construction du vecteur d’expression
Le gène codant la construction peptidique scFvF5S5 représentée par la séquence SEQ ID NO : 22, a été obtenu par synthèse auprès de la société Thermo Fisher Scientific GENEART, cloné dans un vecteur. Les séquences nucléotidiques codant les domaines variables des chaînes lourdes (VH) et légères (VL) ont été optimisées en vue d’une production de la protéine en système procaryote.
Le vecteur contenant le gène codant la construction peptidique scFvF5S5 a ensuite été digéré à l’aide d’un couple d’endonucléases (Tableau I). Le fragment d’ADN issus de la double digestion a ensuite été isolé par électrophorèse en gel d’agarose puis purifié. Ce fragment d’ADN, codant la construction peptidique (insert) a alors été inséré dans le vecteur d’expression pSWl, préalablement digéré par le même couple d’endonucléases, (tableau I) via une ligation. Les produits de ligation ont été utilisés pour transformer des bactéries Escherichia coli HB2151. 2. Production, purification et analyses des protéines
Les protéines de la construction peptidique scFvF5S5 ont été produites en système procaryote {Escherichia coli HB2151). Les protéines produites ont été extraites du périplasme par un choc osmotique.
Les protéines ont ensuite été purifiées par chromatographie d’affinité sur colonne Ppl-agarose.
Les protéines purifiées ont ensuite été analysées par FPLC (analyse structurale) puis par électrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) en conditions dénaturantes. Les protéines ont ensuite été caractérisées par immuno-détection à l’aide d’un Western blot.
Exemple 16 ; Production et analyse des protéines de la construction peptidique scFvF5S6 1. Construction du vecteur d’expression
Le gène codant la construction peptidique scFvF5S6 représentée par la séquence SEQ ID NO : 23, a été obtenu par synthèse auprès de la société Thermo Fisher Scientific GENEART, cloné dans un vecteur. Les séquences nucléotidiques codant les domaines variables des chaînes lourdes (VH) et légères (VL) ont été optimisées en vue d’une production de la protéine en système procaryote.
Le vecteur contenant le gène codant la construction peptidique scFvF5S6 a ensuite été digéré à l’aide d’un couple d’endonucléases (Tableau I). Le fragment d’ADN issus de la double digestion a ensuite été isolé par électrophorèse en gel d’agarose puis purifié. Ce fragment d’ADN, codant la construction peptidique (insert) a alors été inséré dans le vecteur d’expression pSWl, préalablement digéré par le même couple d’endonucléases, (tableau I) via une ligation. Les produits de ligation ont été utilisés pour transformer des bactéries Escherichia coli HB2151. 2» Production, purification et analyses des protéines
Les protéines de la construction peptidique scFvF5S6 ont été produites en système procaryote {Escherichia coli HB2151). Les protéines produites ont été extraites du périplasme par un choc osmotique.
Les protéines ont ensuite été purifiées par chromatographie d’affinité sur colonne PpL-agarose.
Les protéines purifiées ont ensuite été analysées par FPLC (analyse structurale) puis par électrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) en conditions dénaturantes. Les protéines ont ensuite été caractérisées par immuno-détection à l’aide d’un Western blot.
Exemple 17 : Production et analyse des protéines de la construction peptidique Hum-
scFvHlS 1. Construction du vecteur d’expression
Le gène codant la construction peptidique Hum-scFvH2S représentée par la séquence SEQ ID NO : 24, a été obtenu par synthèse auprès de la société Thermo Fisher Scientific GENEART, cloné dans un vecteur. Les séquences nucléotidiques codant les domaines variables des chaînes lourdes (VH) et légères (VL) ont été optimisées en vue d’une production de la protéine en système procaryote.
Le vecteur contenant le gène codant la construction peptidique Hum-scFvH2S a ensuite été digéré à l’aide d’un couple d’endonucléases (Tableau I). Le fragment d’ADN issus de la double digestion a ensuite été isolé par électrophorèse en gel d’agarose puis purifié. Ce fragment d’ADN, codant la construction peptidique (insert) a alors été inséré dans le vecteur d’expression pSWl, préalablement digéré par le même couple d’endonucléases, (tableau I) via une ligation. Les produits de ligation ont été utilisés pour transformer des bactéries Escherichia coli HB2151. 2» Production, purification et analyses des protéines
Les protéines de la construction peptidique Hum-scFvH2S ont été produites en système procaryote {Escherichia coli HB2151). Les protéines produites ont été extraites du périplasme par un choc osmotique.
Les protéines ont ensuite été purifiées par chromatographie d’affinité sur colonne PpL-agarose.
Les protéines purifiées ont ensuite été analysées par FPLC (analyse structurale) puis par électrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) en conditions dénaturantes. Les protéines ont ensuite été caractérisées par immuno-détection à l’aide d’un Western blot.
Exemple 18 ; Analyse de la fixation de la construction peptidique SGO sur Toxovlasma eondii
La fixation de la construction peptidique SGO sur Toxoplasma gondii est observée par immunofluorescence, selon le protocole décrit au paragraphe 4.3.4 de l’Exemple 1 (Matériel et Méthodes).
Des tachyzoïtes de Toxoplasma gondii ont été fixés sur des cupules à raison de 1.10^ tachyzoïtes par cupule. L’échantillon contenant la construction peptidique SGO a été déposé sur les cupules qui ont été incubées en chambre humide à 4°C pendant la nuit.
Les résultats sont présentés en Figure 1.
La présence de fluorescence dans la partie F de la Figure 1 montre que le SGO se fixe sur les tachyzoïtes de Toxoplasma gondii. La fixation du SGO est également visible en lumière blanche dans la partie E de la Figure 1.
Exemple 19 ; Analyse de la fixation de la construction peptidique SG5 sur Toxoplasma eondii
La fixation de la construction peptidique SG5 sur Toxoplasma gondii est observée par immunofluorescence, selon le protocole décrit au paragraphe 4.3.4 de l’Exemple 1 (Matériel et Méthodes). Des tachyzoïtes de Toxoplasma gondii ont été fixés sur des cupules à raison de 1.10^ tachyzoïtes par cupule. L’échantillon contenant la construction peptidique SG5 a été déposé sur les cupules qui ont été incubées en chambre humide à 4°C pendant la nuit.
Les résultats sont présentés en Figure 1.
La présence de fluorescence dans la partie H de la Figure 1 montre que le SG5 se fixe sur les tachyzoïtes de Toxoplasma gondii. La fixation du SG5 est également visible en lumière blanche dans la partie G de la Figure 1.
Exemple 20 : Analyse de la fixation de la construction peptidique DbF3S2 sur
Toxoplasma sondii
La fixation de la construction peptidique DbF3S2 sur Toxoplasma gondii est observée par immunofluorescence, selon le protocole décrit au paragraphe 4.3.4 de l’Exemple 1 (Matériel et Méthodes).
Des tachyzoïtes de Toxoplasma gondii ont été fixés sur des cupules à raison de 1.10^ tachyzoïtes par cupule. L’échantillon contenant la construction peptidique DbF3S2 a été déposé sur les cupules qui ont été incubées en chambre humide à 4°C pendant la nuit.
Les résultats sont présentés en Figure 1.
La présence de fluorescence dans la partie J de la Figure 1 montre que le DbF3S2 se fixe sur les tachyzoïtes de Toxoplasma gondii. La fixation du SG5 est également visible en lumière blanche dans la partie I de la Figure 1.
Exemple 21 : Analyse de la fixation de la construction peptidique scFvF5S2 sur
Toxoplasma 2ondii
La fixation de la construction peptidique scFvF5S2 sur Toxoplasma gondii est observée par immunofluorescence, selon le protocole décrit au paragraphe 4.3.4 de l’Exemple 1 (Matériel et Méthodes).
Des tachyzoïtes de Toxoplasma gondii ont été fixés sur des cupules à raison de 1.10^ tachyzoïtes par cupule. L’échantillon contenant la construction peptidique scFvF5S2 a été déposé sur les cupules qui ont été incubées en chambre humide à 4°C pendant la nuit.
Exemple 22 ; Analyse de la fixation de la construction peptidique scFvF5S4 sur Toxoplasma gondii
La fixation de la construction peptidique scFvF5S4 sur Toxoplasma gondii est observée par immunofluorescence, selon le protocole décrit au paragraphe 4.3.4 de l’Exemple 1 (Matériel et Méthodes).
Des tachyzoïtes de Toxoplasma gondii ont été fixés sur des cupules à raison de 1.10^ tachyzoïtes par cupule. L’échantillon contenant la construction peptidique scFvF5S4 a été déposé sur les cupules qui ont été incubées en chambre humide à 4°C pendant la nuit.
Exemple 23 : Analyse de la fixation de la construction peptidique scFvFSSS sur Toxovlasma eondii
La fixation de la construction peptidique scFvF5S5 sur Toxoplasma gondii est observée par immunofluorescence, selon le protocole décrit au paragraphe 4.3.4 de l’Exemple 1 (Matériel et Méthodes).
Des tachyzoïtes de Toxoplasma gondii ont été fixés sur des cupules à raison de 1.10^ tachyzoïtes par cupule. L’échantillon contenant la construction peptidique scFvF5S5 a été déposé sur les cupules qui ont été incubées en chambre humide à 4°C pendant la nuit.
Exemple 24 : Analyse de la fixation de la construction peptidique scFvF5S6 sur Toxovlasma 2ondii
La fixation de la construction peptidique scFvF5S6 sur Toxoplasma gondii est observée par immunofluorescence, selon le protocole décrit au paragraphe 4.3.4 de l’Exemple 1 (Matériel et Méthodes).
Des tachyzoïtes de Toxoplasma gondii ont été fixés sur des cupules à raison de 1.10^ tachyzoïtes par cupule. L’échantillon contenant la construction peptidique scFvF5S6 a été déposé sur les cupules qui ont été incubées en chambre humide à 4°C pendant la nuit.
Exemple 25 : Efficacité de la construction SGO sur la neutralisation in vitro de l’invasion des cellules TTFF par les tachyzoïtes de Toxovlasma sondii
Des cellules de lignée HFF ont été déposées dans une plaque 96 puits (P96), à raison de 2.10"^ cellules/puits.
Pour chaque puit, un certain volume d’une solution de SGO à 109 pg/mL a été prélevé de manière à ce qu’il contienne 1,5 pg, 1,6 pg, 3 pg, 6 pg ou 10 pg de SGO puis ce dernier a été complété avec une solution tampon jusqu’à l’obtention d’un volume de 50 pL.
Après 24h d’incubation des cellules HFF dans les puits, les 50 pL de la solution contenant la construction peptidique SGO à différentes concentrations, de manière à ce que les quantités de SGO soient de 1,5 pg, 1,6 pg, 3 pg, 6 pg ou 10 pg, ont été ajoutés dans chaque puit, soit simultanément à l’ajout de 100, 1 000 ou 10 000 tachyzoïtes, d’une souche RH de Toxoplasma gondii, transfectés par un plasmide codant pour la β-galactosidase, après une préincubation d’une heure, soit avec un délai de 5 min après l’ajout des tachyzoïtes (sans préincubation). La plaque a été incubée pendant 4 jours à 37°C, ou à température ambiante, sous 5% CO2.
La neutralisation in vitro de l’invasion des cellules HFF par les tachyzoïtes de Toxoplasma gondii est évaluée par mesure de la densité optique (DO) à la longueur d’onde 565 nm.
Les résultats sont présentés en Figures 2 A, 2 B, 2 C, 2 D et en Figure 3.
La construction peptidique SGO inhibe l’invasion cellulaire des cellules HFF par les tachyzoïtes de Toxoplasma gondii en comparaison avec l’anticorps non pertinent B6P quelle que soit la quantité de tachyzoïtes (100, 1 000 ou 10 000) (Figure 2A et 2 B). L’effet d’inhibition persiste que l’on soit en condition physiologique (37°C) ou à température ambiante (Figure 2 C).
La pré-incubation n’est pas un prérequis au pouvoir inhibiteur du SGO, puisque sans pré-incubation, le SGO est en mesure d’inhiber aussi efficacement l’invasion cellulaire qu’avec pré-incubation (Figure 2 D).
Exemple 26 : Efficacité de la construction SG5 sur la neutralisation in vitro de l’invasion des cellules HFF par les tachyzoïtes de Toxoplasma gondii
Des cellules de lignée HFF ont été déposées dans une plaque 96 puits (P96), à raison de 2. lO"^ cellules/puits.
Pour chaque puits, un certain volume d’une solution de SG5 à 147 pg/mL a été prélevé de manière à ce qu’il contienne 1,5 pg, 3 pg ou 6 pg de SG5 puis ce dernier a été complété avec une solution tampon jusqu’à l’obtention d’un volume de 50 pL.
Après 24h d’incubation des cellules HFF dans les puits, les 50 pL de la solution contenant la construction peptidique SG5 à différentes concentrations, de manière à ce que les quantités de SG5 soient de 1,5 pg, 3 pg ou 6 pg, ont été ajoutés dans chaque puits, simultanément à 100 tachyzoïtes, d’une souche RH de Toxoplasma gondii, transfectés par un plasmide codant pour la β-galactosidase. La plaque a été incubée pendant 4 jours à 37°C sous 5% CO2.
La neutralisation in vitro de l’invasion des cellules HFF par les tachyzoïtes de Toxoplasma gondii est évaluée par mesure de la densité optique (DO) à la longueur d’onde 565 nm.
Les résultats sont présentés en Figure 3.
Le SG5 est en mesure d’inhiber l’invasion cellulaire par le parasite. Par ailleurs, un effet dose-dépendant est observé.
Exemple 27 ; Efficacité de la construction DbF3S2 sur la neutralisation in vitro de l’invasion des cellules HFF par les tachyzoïtes de Toxoplasma sondii
Des cellules de lignée HFF ont été déposées dans une plaque 96 puits (P96), à raison de 2.10^^ cellules/puits.
Pour chaque puits, un certain volume d’une solution de DbF3S2 à 155 pg/mL a été prélevé de manière à ce qu’il contienne 1,5 pg ou 3 pg de DbF3S2 puis ce dernier a été complété avec une solution tampon jusqu’à l’obtention d’un volume de 50 pL.
Après 24h d’incubation des cellules HFF dans les puits, les 50 pL de la solution contenant la construction peptidique DbF3S2 à différentes concentrations, de manière à ce que les quantités de DbF3S2 soient de 1,5 pg ou 3 pg, ont été ajoutés dans chaque puit, simultanément à 100 tachyzoïtes, d’une souche RH de Toxoplasma gondii, transfectés par un plasmide codant pour la β-galactosidase. La plaque a été incubée pendant 4 jours à 37°C sous 5% CO2.
La neutralisation in vitro de l’invasion des cellules HFF par les tachyzoïtes de Toxoplasma gondii est évaluée par mesure de la densité optique (DO) à la longueur d’onde 565 nm.
Les résultats sont présentés en Figure 3.
Le DbF3S2 est en mesure d’inhiber l’invasion cellulaire par le parasite, mais il semble moins efficace que le SGO et le SG5. Aucun effet dose-dépendant n’est observé pour cette construction peptidique.
Exemple 28 ; Efficacité de la construction peptidiaue SGO dans le traitement de la toxoplasmose dans un modèle murin de toxoplasmose congénitale
Des souris mâles et femelles swiss OFl (Janvier), souris albinos non consanguines, ont été utilisées.
Trois expériences ont été réalisées, dont les paramètres (nombre de souris par lot (Nbre souris/lot), nombre de kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii administrés (Nbre de kystes (76K)) et quantité de SGO administré quotidiennement aux souris traitées (Quantité de SGO en pg)) sont résumés dans le Tableau II.
Tableau II
Les résultats de l’expérience 1 sont présentés en Figure 4.
Les souriceaux des souris du lot « infecté et traité » ont un poids supérieur aux souriceaux des souris du lot « témoin infecté ».
Exemple 29; Efficacité de la construction peptidique SGO dans le traitement de la toxoplasmose dans un modèle murin de toxoplasmose oculaire
Des souris femelles swiss OFl (Janvier), albinos non-consanguines, ont été utilisées.
Les yeux des souris ont été examinés à la loupe binoculaire, sous anesthésie générale par isoflurane, à Jl, J2, J6 et J7 afin de réaliser l’examen clinique sur le segment antérieur (cornée, sclère, conjonctive, cristallin, humeur aqueuse) et le segment postérieur (vitré, rétine). A J8, les souris ont été sacrifiées, les yeux prélevés puis congelés. Des coupes des yeux ont été réalisées et déposées sur lame (4 coupes par lame) et laissées à sécher une nuit. Les lames ont été observées au microscope à fluorescence.
Les résultats sont présentés en Figure 5.
Le marquage réalisé avec le sérum d’infection semble mettre en évidence la présence de tachyzoïtes dans la rétine de la souris ayant reçu une injection intra-vitréenne de parasites seuls (ligne ME49, case de la Figure 5) alors qu’aucun tachyzoïtes n’a été mis en évidence dans la rétine de la souris ayant reçu les tachyzoïtes et le SGO ou le SGO seul (respectivement ligne SGO + ME49 case 3 et ligne SGO case 3 de la Figure 5). Ces résultats indiquent que la construction peptidique SGO limite la prolifération parasitaire.
Claims (15)
- REVENDICATIONS1. Construction peptidique ne contenant pas de région CHl, reconnaissant l’antigène SAGl de Toxoplasma gondii et capable de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose, notamment la toxoplasmose oculaire, la toxoplasmose congénitale et les troubles du comportement liés à la présence de Toxoplasma gondii.
- 2. Construction peptidique selon la revendication 1, comprenant les régions variables de la chaîne lourde et de la chaîne légère d’un premier anticorps reconnaissant l’antigène SAGl de Toxoplasma gondii, notamment l’anticorps monoclonal 4F11E12, et pouvant contenir tout ou partie de la région constante dépourvue de région CHl, de la chaîne lourde d’un deuxième anticorps, notamment une immunoglobuline IgG2a murine, ladite construction peptidique reconnaissant l’antigène SAGl de Toxoplasma gondii et étant capable de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
- 3. Construction peptidique selon la revendication 1 ou 2, reconnaissant l’épitope conformationnel formé par les acides aminés aux positions 35 à 37, 39, 41, 42, 45, 48, 50, 59 à 65 et 112 à 114 de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 3, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
- 4. Construction peptidique selon l’une des revendications 1 à 3, comprenant les six CDR suivants : un CDRl possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 4, et notamment consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 4, un CDR2 possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 5, et notamment consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 5, un CDR3 possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 6, et notamment consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 6, un CDR4 possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 7, et notamment consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 7, un CDR5 possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 8, et notamment consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 8, et un CDR6 possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 9, et notamment consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 9, sous réserve que ladite construction peptidique conserve sa capacité de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasmagondii, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
- 5. Construction peptidique selon l’une des revendications 1 à 4, dépourvue des régions CH2 et CHS du susdit deuxième anticorps, ou comprenant une région CHS et dépourvue de région CH2 du susdit deuxième anticorps, ou comprenant une région CH2 et une région CHS du susdit deuxième anticorps, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
- 6. Construction peptidique selon l’une des revendications 1 à 5, choisie parmi : - les scFv, notamment un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 10, un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 12, un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 17, un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 20, un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 21, un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 22, un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 23, un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 24, un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 25, un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 27, un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 32, un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 35, un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 36, un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 37, un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 38 ou un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 39, - les diabodies, notamment un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 11, un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 13, un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 18, un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 19, un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 26, un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 28, un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 33 ou un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 34, - les diabodies simple chaîne, - les minibodies tels que les scFv-CH3, notamment un scFv-CH3 constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 14 ou un scFv-CH3 constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 29, et les diabody-CH3, notamment un diabody-CH3 constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 15 ou un diabody-CH3 constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 30, - les scFv-Fc, notamment un scFv-Fc constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 16 ou un scFv-Fc constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 31, - les diabody-Fc, pour son utilisation dans le traitement de la toxoplasmose.
- 7. Composition pharmaceutique comprenant à titre de substance active une construction peptidique ne contenant pas de région CHl, reconnaissant l’antigène SAGl de Toxoplasma gondii et capable de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii, éventuellement en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
- 8. Composition pharmaceutique selon la revendication 7, comprenant à titre de substance active une construction peptidique comprenant les régions variables de la chaîne lourde et de la chaîne légère d’un premier anticorps reconnaissant l’antigène SAGl de Toxoplasma gondii, notamment l’anticorps monoclonal 4F11E12, et pouvant contenir tout ou partie de la région constante dépourvue de région CHl, de la chaîne lourde d’un deuxième anticorps, notamment une immunoglobuline IgG2a murine, ladite construction peptidique reconnaissant l’antigène SAGl de Toxoplasma gondii et étant capable de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii.
- 9. Composition pharmaceutique selon la revendication 7 ou 8, dans laquelle ladite construction peptidique reconnait l’épitope conformationnel formé par les acides aminés aux positions 35 à 37, 39, 41, 42, 45, 48, 50, 59 à 65 et 112 à 114 de la séquence d’acides aminés SEQ ED NO: 3.
- 10. Composition pharmaceutique selon l’une des revendications 7 à 9, dans laquelle ladite construction peptidique comprend les six CDR suivants : un CDRl possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ED NO: 4, notamment consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ED NO: 4, un CDR2 possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ED NO: 5, notamment consistant en la séquence d’acides aminés SEQ HD NO: 5, un CDR3 possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ED NO: 6, notamment consistant en la séquence d’acides aminés SEQ HD NO: 6, un CDR4 possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ED NO: 7, notamment consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 7, un CDR5 possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ED NO: 8, notamment consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 8, et un CDR6 possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ED NO: 9, notamment consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 9, sous réserve que ladite construction peptidique conserve sa capacité de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasmagondii.
- 11. Composition pharmaceutique selon l’une des revendications 7 à 10, dans laquelle ladite construction peptidique est dépourvue des régions CH2 et CH3 du susdit deuxième anticorps, ou comprend une région CH3 et est dépourvue de région CH2 du susdit deuxième anticorps, ou comprend une région CH2 et une région CH3 du susdit deuxième anticorps.
- 12. Composition pharmaceutique selon l’une des revendications 7 à 11, dans laquelle ladite construction peptidique est choisie parmi : - les scFv, notamment un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 10, un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO; 12, un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 17, un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 20, un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 21, un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 22, un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 23, un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 24, un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 25, un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 27, un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 32, un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 35, un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 36, un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 37, un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 38 ou un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 39, - les diabodies, notamment un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 11, un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 13, un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 18, un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 19, un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 26, un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 28, un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 33 ou un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 34, - les diabodies simple chaîne, - les minibodies tels que les scFv-CH3, notamment un scFv-CH3 constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 14 ou un scFv-CH3 constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 29, et les diabody-CH3, notamment un diabody-CH3 constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 15 ou un diabody-CH3 constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 30, - les scFv-Fc, notamment un scFv-Fc constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 16 ou un scFv-Fc constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 31, - les diabody-Fc.
- 13. Construction peptidique ne contenant pas de région CHl, reconnaissant l’antigène SAGl de Toxoplasma gondii et capable de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii, notamment comprenant les régions variables de la chaîne lourde et de la chaîne légère d’un premier anticorps reconnaissant l’antigène SAGl de Toxoplasma gondii, notamment l’anticorps monoclonal 4F11E12, et pouvant contenir tout ou partie de la région constante dépourvue de région CHl, de la chaîne lourde d’un deuxième anticorps, notamment une immunoglobuline IgG2a murine, sous réserve que ladite construction peptidique soit différente de la séquence SEQ ID NO: 10.
- 14. Construction peptidique selon la revendication 13, comprenant les six CDR suivants : un CDRl possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ED NO: 4, notamment consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 4, un CDR2 possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ED NO: 5, notamment consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ED NO: 5, un CDR3 possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ED NO: 6, notamment consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 6, un CDR4 possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ED NO: 7, notamment consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 7, un CDR5 possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ED NO: 8, notamment consistant en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 8, et un CDR6 possédant au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ED NO: 9, notamment consistant en la séquence d’acides aminés SEQ HD NO: 9, sous réserve que ladite construction peptidique conserve sa capacité de neutraliser l’invasion des cellules par Toxoplasma gondii.
- 15. Construction peptidique selon la revendication 13 ou 14, choisie parmi : - les scFv, notamment un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 12, un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 17, un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 20, un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 21, un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 22, un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 23, un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 24, un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 25, un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 27, un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 32, un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 35, un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 36, un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 37, un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 38 ou un scFv constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 39, - les diabodies, notamment un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 11, un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 13, un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 18, un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 19, un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 26, un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 28, un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 33 ou un diabody constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 34, - les diabodies simple chaîne, - les minibodies tels que les scFv-CH3, notamment un scFv-CH3 constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 14 ou un scFv-CH3 constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 29, et les diabody-CH3, notamment un diabody-CH3 constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 15 ou un diabody-CH3 constitué de deux séquences d’acides aminés de séquence SEQ ID NO: 30, - les scFv-Fc, notamment un scFv-Fc constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 16 ou un scFv-Fc constitué de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 31, - les diabody-Fc.
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