JP2023546112A - 長時間作用型眼送達用非共有結合タンパク質－ヒアルロナンコンジュゲート - Google Patents

長時間作用型眼送達用非共有結合タンパク質－ヒアルロナンコンジュゲート Download PDF

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ペーター ミヒャエル ヒュールスマン，
シュレニク チェタン メータ，
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Abstract

コンジュゲートは、眼内の治療標的に結合することができる第１の成分と、ヒアルロナンに結合することができる１つ以上の第２の成分（複数可）と、ヒアルロナンを含む１つ以上の第３の成分（複数可）とを含み得、各第２の成分は第１の成分に共有結合し、第３の成分に非共有結合しており、医薬として使用するための又は眼疾患の治療に使用するためのコンジュゲートを含む組成物、並びに対象における眼疾患を治療する方法。さらに、患者における組織を標的とする治療用分子は、ヒアルロン酸結合部分及び治療活性剤を含み得、ヒアルロン酸結合部分は、バーシカンの少なくとも２つのリンクドメインを含む。患者における組織を標的とする治療用分子は、ヒアルロン酸結合部分及び治療活性剤を含み得、ヒアルロン酸結合部分は、ヒアルロン酸に結合した（すなわち、予め複合体化した）バーシカンの少なくとも２つのリンクドメインを含む。患者における組織を標的とする治療用分子の送達方法は、本明細書に記載の任意の治療用分子を患者に投与することと、治療用分子に、標的組織への治療活性剤の長時間作用型送達を提供させることと、を含む。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は米国仮特許出願第６３／０９２，２５１号（２０２０年１０月１５日出願）米国仮特許出願第６３／２５０，７８２号（２０２１年９月２０日出願）に対する優先権を主張し、これらの両方は、本出願と共有されており、両方の内容全体は、本明細書に完全に記載されているかのように、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
分野
ヒアルロナン及び融合タンパク質－ヒアルロナンコンジュゲートに結合する融合タンパク質を使用する長時間作用型治療薬及び治療方法。
背景
硝子体内（ＩＶＴ）注射は、様々な眼症状を治療するための薬剤を投与するために一般的に使用される。ＩＶＴ注射は、後眼への薬物の直接適用を可能にし、したがって局所投与及び全身投与に一般的な障壁を排除する。このようにして薬物を直接適用することにより、後眼部組織における薬物のより高い眼内バイオアベイラビリティが可能になり、後眼部疾患のより有効な治療がもたらされる。Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｍ．Ｗ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ＆Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，１４（１）：５－７（２０１８）．ＩＶＴ注射を介して治療される一般的な症状の例には、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞、及び眼感染症（眼内炎及び網膜炎など）が含まれる。Ｔｈｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｒｅｔｉｎａ Ｓｐｅｃｉａｌｉｓｔｓ，ａｓｒｓ．ｏｒｇ／ｐａｔｉｅｎｔｓ／ｒｅｔｉｎａｌ－ｄｉｓｅａｓｅｓ／３３／ＩＶＴ－ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ（２０１７）．
疾患の停止及び視力の改善の有望な結果にもかかわらず、ＩＶＴ注射は不快で高価であり、網膜専門家がそれらを行うことを必要とする。ＩＶＴ注射は、感染、炎症、硝子体内への出血、眼内の浮遊物の存在の増加、光に対する感受性の増加、視力の低下、及び網膜剥離などの有害作用を一部の患者に引き起こすことが知られている。Ｔｈｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｒｅｔｉｎａ Ｓｐｅｃｉａｌｉｓｔｓ，ａｓｒｓ．ｏｒｇ／ｐａｔｉｅｎｔｓ／ｒｅｔｉｎａｌ－ｄｉｓｅａｓｅｓ／３３／ＩＶＴ－ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ（２０１７）．ＩＶＴ注射はまた、感染性眼内炎、無菌性眼内炎症、裂孔原性網膜剥離、眼内圧上昇及び眼出血に関連し得る。Ｉｄ．眼の長時間作用型送達技術は、薬物の反復注射の必要性を回避することができ、それは患者のコンプライアンス及び臨床転帰の改善に役立つ。硝子体液中の薬物半減期を延長する方法及び組成物（例えば、薬物リザーバを維持する能力、眼内の低い代謝回転速度、低い保持－標的媒介クリアランス、及び／又は高齢集団における見かけ上安定な特性）は、注射部位から標的部位への薬物の徐放を促進し、より高用量の使用を可能にし、必要な注射の回数を減少させる。
治療用分子の硝子体半減期は、ポリマーによるカプセル化又は化学修飾の代替として治療用分子をヒアルロナン（ＨＡ）に結合することによって延長することができる。Ｃｒｏｍｗｅｌｌ，Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．５９（９）：２３５（２０１８）；Ｇｈｏｓｈ，Ｊ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，８：１４８３７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１４８３７（２０１７）；Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｍ．Ｗ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ＆Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，１４（１）：５－７（２０１８）。特定の例では、長時間作用型抗ＶＥＧＦ抗体をヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）刺激遺伝子６タンパク質（ＴＳＧ－６）のＨＡ結合ドメイン（ＨＡＢＤ）に個別に融合した。Ｇｈｏｓｈ，Ｊ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，８：１４８３７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１４８３７（２０１７）。融合タンパク質は、未修飾抗ＶＥＧＦ抗体と比較して以下の改善を実証した：（１）半減期の３～４倍の増加；（２）血管新生網膜疾患の動物モデルにおけるＶＥＧＦ誘導性網膜変化を３～４倍長い期間にわたって減弱させる能力。Ｇｈｏｓｈ，Ｊ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，８：１４８３７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１４８３７（２０１７）。長時間作用型抗ＶＥＧＦ抗体とＴＳＧ－６、ＬＭＧ３２４との融合物を含む薬物候補を、新生血管加齢黄斑変性（ｎｖＡＭＤ）における最大耐量（ＭＴＤ）を決定するための単一漸増用量の安全性及び忍容性の評価のために臨床試験に進めた。ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０２３９８５００（２０１９）。残念なことに、飛蚊症、炎症及び後部硝子体剥離を含む重篤な有害事象のために試験を中止した。
抗体断片とヒアルロナン（ＨＡ）との化学的コンジュゲーションは、硝子体からの薬物の拡散速度を低下させ得る。しかしながら、このアプローチはＨＡの化学的活性化を必要とし、非天然リンカーの使用は、対照において活性化ＨＡの非天然代謝産物をもたらし得る。
本発明者らは、以下：（１）眼内の治療標的に結合することができる第１の成分と、（２）ＨＡに結合することができる１つ以上の第２の成分と、（３）ＨＡを含む１つ以上の第３の成分とを含み、各第２の成分は、（ａ）第１の成分に共有結合しており、（ｂ）第３の成分に非共有結合している、コンジュゲートを提供することによって、上述の欠点を回避することができることを見出した。上記の抗ＶＥＧＦ抗体及びＴＳＧ－６融合タンパク質ＬＭＧ３２４とは異なり、ＨＡに結合することができる第２の成分はＨＡと予め複合体化している。
本出願は、ヒアルロナン（ＨＡ）に結合することができる融合タンパク質を含む治療用分子の眼保持を増加させるための材料及び方法を開示する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、（１）眼内の治療標的に結合することができる第１の成分、及び（２）ＨＡに結合することができる１つ以上の第２の成分を含み、各第２の成分は、第１の成分に共有結合している。
本出願はまた、融合タンパク質がＨＡを含む１つ以上の第３の成分を更に含み、各第２の成分が第３の成分に更に非共有結合しているコンジュゲートを開示する。さらに、ＨＡに結合することができる第２の成分は、ＨＡと予め複合体化されていてもよい。コンジュゲートは硝子体と適合性であり、ＨＡに対する結合親和性を有する。材料及び方法は、改善された長時間作用型薬物設計のためのプラットフォーム技術を提供する。
概要
材料及び方法は、眼内の治療標的に結合することができ、ヒアルロナンに結合することができる治療用分子及びそのコンジュゲートに関する。以下の項目、実施形態、及び実施形態が提供される。
項１は、（ａ）眼内の治療標的に結合することができる第１の成分と、（ｂ）ヒアルロナンに結合することができる１つ以上の第２の成分であって、１つ以上の第２の成分が第１の成分に共有結合している、第２の成分と、（ｃ）任意に、ヒアルロナンを含む１つ以上の第３の成分と、を含み、存在する場合、１つ以上の第３の成分が１つ以上の第２の成分に非共有結合している、治療用分子である。
項２は、第１の成分が、タンパク質、ペプチド、受容体若しくはその断片、受容体に対するリガンド、ダルピン、核酸、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はアプタマーである、項１に記載の治療用分子である。
項３は、第１の成分が、抗体、抗原結合断片、特に抗体断片、より具体的には少なくともＦｃドメインを欠く抗体断片から選択され、特に断片が、（Ｆａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、又はＦａｂ断片、ＶｈＨ断片、ｓｃＦｖ断片、ｓｃＦｖ－Ｆｃ断片、及びミニボディ、より具体的にはＦａｂ断片であるか、又はそれらを含む、項１又は２に記載のコンジュゲートである。
項４は、第２の成分が、ヒアルロナン受容体ＣＤ４４（ＣＤ４４）ドメイン、脳特異的リンクタンパク質（ＢＲＡＬ１）ドメイン、腫瘍壊死因子刺激遺伝子６（ＴＳＧ－６）ドメイン、リンパ管内皮ヒアルロナン受容体１（ＬＹＶＥ－１）ドメイン、又はヒアルロン酸結合タンパク質（ＨＡＢＰ）ドメイン、アグリカンＧ１（ＡＧ１）ドメイン、又はバーシカンＧ１（ＶＧ１）ドメインを含む、項１～３のいずれかに記載の治療用分子である。
項５は、コンジュゲートが、１つの第２の成分、又は互いに同一である２つの第２の成分を含む、項１～４のいずれかに記載の治療用分子である。
項６は、第３の成分がヒアルロナンであり、ヒアルロナン（ａ）が、（ｉ）３ｋＤａ～６０ｋＤａ、４ｋＤａ～３０ｋＤａ、５ｋＤａ～２０ｋＤａ、若しくは４００Ｄａ～２００ｋＤａから選択される、（ｉｉ）少なくとも２、３、４、５、６、７、８、若しくは９ｋＤａの；又は（ｉｉｉ）最大で６０、５０、４０、３０、２５、２０若しくは１５ｋＤａの分子量を有し、（ｂ）１つ又は２つの第２の成分にモル過剰の結合当量を提供し、（ｃ）眼内のヒアルロナンの分解を減少させる修飾を有する、項１～４のいずれか１つに記載の治療用分子である。
項７は、第２の成分が、１０ｎＭ～１０μＭ、５ｎＭ～８μＭ、又は１００ｎＭ～５μＭのＫＤでヒアルロナンに結合することができる、項１～６のいずれかに記載の治療用分子である。
項８は、（ａ）第１及び第２の成分が融合タンパク質に含まれ、特に、１つ若しくは２つの第２の成分が第１の成分のＮ末端及び／又はＣ末端に共有結合しており、より具体的には、第１の成分が抗体若しくは抗原結合断片あり、１つ若しくは２つの第２の成分が第１の成分のＣ末端に共有結合しており；且つ／或いは（ｂ）１つ若しくは２つの第２の成分が、第１の成分に直接結合しているか、又はリンカー、特に少なくとも４アミノ酸及び／若しくは最大５０若しくは最大２５アミノ酸のリンカー、より具体的には（ＧｘＳ）ｎ若しくは（ＧｘＳ）ｎＧｍであって、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、（ｘ＝３、ｎ＝３、４、５若しくは６、且つｍ＝０、１、２若しくは３）若しくは（ｘ＝４、ｎ＝２、３、４若しくは５、且つｍ＝０、１、２若しくは３）であるリンカーを介して間接的に第１の成分に結合している、項１～７のいずれか１つに記載の治療用分子である。
項９は、治療標的がＶＥＧＦ、Ｃ２、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａ、Ｈｔｒ１、ＩＬ－３３、Ｐ因子、Ｄ因子、ＥＰＯ、ＥＰＯＲ、ＩＬ－１β、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１０、ＴＮＦα、ＦＧＦＲ２、ＰＤＧＦ又はＡＮＧ２、特にＶＥＧＦである、項１～８のいずれかに記載の治療用分子である。
項１０は、（ａ）第１の成分がＶＥＧＦに対する抗体若しくは抗原結合断片、特に抗ＶＥＧＦ Ｆａｂであり、且つ／又は（ｂ）１つ若しくは２つの第２の成分の各々が、ＣＤ４４ドメイン若しくはＴＳＧ－６ドメイン若しくはＶＧ１ドメインを含み、且つ／又は（ｃ）第３の成分が、５ｋＤａ～２０ｋＤａの分子量のヒアルロナンである、項１～９のいずれか１つに記載の治療用分子である。
項１１は、（ｉ）第１の成分が抗ＶＥＧＦ抗体若しくは抗原結合断片であり、１つ若しくは２つの第２の成分がＣＤ４４ドメインを含み、第３の成分が５ｋＤａ～２０ｋＤａの分子量のヒアルロナンである；（ｉｉ）第１の成分が抗ＶＥＧＦ抗体若しくは抗原結合断片であり、１つ若しくは２つの第２の成分がＴＳＧ－６ドメインを含み、第３の成分が５ｋＤａ～２０ｋＤａの分子量のヒアルロナンである；又は（ｉｉｉ）第１の成分が抗ＶＥＧＦ抗体若しくは抗原結合断片であり、１つ若しくは２つの第２の成分がＶＧ１ドメインを含み、第３の成分が５ｋＤａ～２０ｋＤａの分子量のヒアルロナンである、項１～１０のいずれか１つに記載の治療用分子である。
項１２は、（ａ）第１の成分が（ｉ）配列番号９７、９９、１０５、１０９又は１４４のＶＨドメインと、（ｉｉ）配列番号９８、１００、１０６、１１０又は１１５のＶＬドメインとを含み、（ｂ）第２の成分が、配列番号２を含む、項１～１１のいずれか１つに記載のコンジュゲートである。
項１３は、（ａ）第１の成分が（ｉ）配列番号９７、９９、１０５、１０９又は１４４のＶＨドメインと、（ｉｉ）配列番号９８、１００、１０６、１１０又は１１５のＶＬドメインとを含み、（ｂ）第２の成分が、配列番号４を含む、項１～１１のいずれか１つに記載のコンジュゲートである。
項１４は、（ａ）第１の成分が（ｉ）配列番号９７、９９、１０５、１０９又は１４４のＶＨドメインと、（ｉｉ）配列番号９８、１００、１０６、１１０又は１１５のＶＬドメインとを含み、（ｂ）第２の成分が、配列番号８６、６０、３２又は２９を含む、項１～１１のいずれか１つに記載のコンジュゲートである。
項１５は、第２の成分がバーシカンの少なくとも２つのリンクドメインを含む、請求項１～１１のいずれか１つに記載の治療用分子である。
項１６は、第２の成分がヒアルロナンに結合したバーシカンの少なくとも２つのリンクドメインを含む、項１５に記載の治療用分子である。
項１７は、ヒアルロナンが、１．５：１～１：１の範囲のヒアルロナン対治療用分子の比を可能にする、項１～２２のいずれか１つに記載の治療用分子である。
項１８は、第２の成分が、配列番号８６、６０、３２、又は２９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含む、項１４～１７のいずれか１つに記載の治療用分子である。
項１９は、第２の成分が配列番号８６、６０、３２、又は２９と少なくとも９５％の同一性を含む、項１４～１８のいずれか１つに記載の治療用分子である。
項２０は、第２の成分が少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、又は少なくとも５個の変異を含む、項１４～１９のいずれか１つに記載の治療用分子である。
項２１は、第２の成分が１～３個の変異を含み、１～３個の変異が単一アミノ酸置換、二重アミノ酸置換及び短縮を含む、項１４～２０のいずれか１つに記載の治療用分子である。
項２２は、第２の成分が１～５個の変異を含み、１～５個の変異が単一アミノ酸置換、二重アミノ酸置換及び短縮を含む、項１４～２１のいずれか１つに記載の治療用分子である。
項２３は、第２の成分が、配列番号２９と比較して短縮型変異を有する、項１４～２２のいずれか１つに記載の治療用分子である。
項２４は、短縮型変異が、Ｎ末端に１～１２９個のアミノ酸の短縮を含む、項２３に記載の治療用分子である。
項２５は、第２の成分が、野生型バーシカンのＩｇドメインが存在しない短縮型配列である、項１４～２４のいずれか１つに記載の治療用分子である。
項２６は、第２の成分が、配列番号２９と比較して、以下の変異：Ｒ１６０、Ｙ１６１、Ｅ１９４、Ｄ１９７、Ｙ２０８、Ｒ２１４、Ｙ２３０、Ｆ２６１、Ｄ２９５及びＲ２３３のうち少なくとも１つを含む、項１４～２５のいずれか１つに記載の治療用分子である。
項２７は、第２の成分が、配列番号２９と比較して、以下の変異：Ｒ１６０、Ｙ１６１、Ｅ１９４、Ｄ１９７、Ｙ２０８、Ｒ２１４、Ｙ２３０、Ｆ２６１、Ｄ２９５及びＲ２３３のうち２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個を含む、項１４～２６のいずれか１つに記載の治療用分子である。
項２８は、第２の成分が、配列番号２９に対して以下の位置：Ｒ１６０、Ｙ１６１、Ｅ１９４、Ｄ１９７、Ｙ２０８、Ｒ２１４、Ｍ２２２、Ｙ２３０、Ｒ２３３、Ｋ２６０、Ｆ２６１、Ｄ２９５、Ｙ２９６、Ｈ３０６、Ｒ３１２、Ｌ３２５、Ｙ３２６、及びＲ３２７の少なくとも１つに変異を含む、項１４～２７のいずれか１つに記載の治療用分子である。
項２９は、第２の成分が、配列番号２９に対して以下の位置：Ｒ１６０、Ｙ１６１、Ｅ１９４、Ｄ１９７、Ｙ２０８、Ｒ２１４、Ｍ２２２、Ｙ２３０、Ｒ２３３、Ｋ２６０、Ｆ２６１、Ｄ２９５、Ｙ２９６、Ｈ３０６、Ｒ３１２、Ｌ３２５、Ｙ３２６、及びＲ３２７のうち２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８個に変異を含む、項１４～２８のいずれか１つに記載の治療用分子である。
項３０は、第２の成分が、配列番号２９に対して以下の位置：Ｒ１６０、Ｙ１６１、Ｅ１９４、Ｄ１９７、Ｙ２０８、Ｒ２１４、Ｍ２２２、Ｙ２３０、Ｒ２３３、Ｋ２６０、Ｆ２６１、Ｄ２９５、Ｙ２９６、Ｈ３０６、Ｒ３１２、Ｌ３２５、Ｙ３２６、及びＲ３２７のうち２、３、４、５、又は６個に変異を含む、項１４～２９のいずれか１つに記載の治療用分子である。
項３１は、第２の成分が、配列番号２９に対して以下の変異：Ｒ１６０Ａ、Ｙ１６１Ａ、Ｄ１９７Ａ、Ｄ１９７Ｓ、Ｙ２０８Ａ、Ｙ２０８Ｆ、Ｒ２１４Ｋ、Ｍ２２２Ａ、Ｙ２３０Ａ、Ｙ２３０Ｆ、Ｒ２３３Ａ、Ｋ２６０Ａ、Ｋ２６０Ｒ、Ｆ２６１Ｙ、ＫＦ２６０ＲＹ、Ｄ２９５Ａ、Ｄ２９５Ｓ、Ｙ２９６Ａ、Ｙ２９６Ｆ、ＤＹ２９５ＳＦ、Ｈ３０６Ａ、Ｒ３１２Ａ、Ｌ３２５Ａ、Ｙ３２６Ａ、Ｒ３２７Ａ、及びＬＹＲ３２５ＬＦＫの少なくとも１つを含む、項１４～３０のいずれか１つに記載の治療用分子である。
項３２は、第２の成分が、Ｙ２０８Ａ及びＨ３０６Ａの少なくとも１つを含む、項１４～３１のいずれか１つに記載の治療用分子。
項３３は、第２の成分が、配列番号２９に対して、以下の変異：Ｒ１６０Ａ、Ｙ１６１Ａ、Ｄ１９７Ａ、Ｄ１９７Ｓ、Ｙ２０８Ａ、Ｙ２０８Ｆ、Ｒ２１４Ｋ、Ｍ２２２Ａ、Ｙ２３０Ａ、Ｙ２３０Ｆ、Ｒ２３３Ａ、Ｋ２６０Ａ、Ｋ２６０Ｒ、Ｆ２６１Ｙ、ＫＦ２６０ＲＹ、Ｄ２９５Ａ、Ｄ２９５Ｓ、Ｙ２９６Ａ、Ｙ２９６Ｆ、ＤＹ２９５ＳＦ、Ｈ３０６Ａ、Ｒ３１２Ａ、Ｌ３２５Ａ、Ｙ３２６Ａ、Ｒ３２７Ａ、及びＬＹＲ３２５ＬＦＫのうち少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個を含む、項１４～３２のいずれか１つに記載の治療用分子である。
項３４は、第２の成分が、配列番号２９に対して以下の変異：Ｒ１６０Ａ、Ｙ１６１Ａ、Ｄ１９７Ａ、Ｄ１９７Ｓ、Ｙ２０８Ａ、Ｙ２０８Ｆ、Ｒ２１４Ｋ、Ｍ２２２Ａ、Ｙ２３０Ａ、Ｙ２３０Ｆ、Ｒ２３３Ａ、Ｋ２６０Ａ、Ｋ２６０Ｒ、Ｆ２６１Ｙ、ＫＦ２６０ＲＹ、Ｄ２９５Ａ、Ｄ２９５Ｓ、Ｙ２９６Ａ、Ｙ２９６Ｆ、ＤＹ２９５ＳＦ、Ｈ３０６Ａ、Ｒ３１２Ａ、Ｌ３２５Ａ、Ｙ３２６Ａ、Ｒ３２７Ａ、及びＬＹＲ３２５ＬＦＫのうち少なくとも２、３、４、５、又は６個を含む、項１４～３３のいずれか１つに記載の治療用分子である。
項３５は、第２の成分が、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、又は配列番号５９である、項１４又は１８のいずれか１つに記載の治療用分子である。
項３６は、第１の成分がオリゴペプチド、タンパク質又は核酸を含む、項１～３５のいずれか１つに記載の治療用分子である。
項３７は、第１の成分が、治療薬、抗体、抗原結合断片、酵素、成長因子、オリゴペプチド、システインノットペプチド、成長因子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ロックド核酸、又はアプタマーを含む、項１～３６のいずれか１つに記載の治療用分子である。
項３８は、システインノットペプチドが、配列番号９２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である、項３７に記載の治療用分子である。
項３９は、成長因子が、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、神経成長因子（ＮＧＦ）、ＶＥＧＦ、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）及びインスリン様成長因子－Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ）を含む、項３７に記載の治療用分子である。
項４０は、第１の成分がＶＥＧＦに結合する、項１～３９のいずれか１つに記載の治療用分子である。
項４１は、ＶＥＧＦに結合する第１の成分がラニビズマブ、アフリベルセプト、ブロルシズマブ－ｄｂｌ及びベバシズマブを含む、項４０に記載の治療用分子である。
項４２は、アプタマーがペグ化されている、項３７に記載の治療用分子である。
項４３は、アプタマーがＭａｃｕｇｅｎ（登録商標）である、項３７又は４２のいずれか１つ記載の治療用分子である。
項４４は、リンカーがＧＧＧＧＳ（配列番号２７）又はその多量体、中でも（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号２８）を含む、項１～４３のいずれか１つに記載の治療用分子である。
項４５は、リンカーがＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号９５）を含む、項１～４２のいずれか１つに記載の治療用分子である。
項４６は、システインノットペプチド及び１つ又は２つの第２の成分が、配列ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号９５）を含むリンカーを介して連結されている、項４５に記載の治療用分子である。
項４７は、配列が（ａ）抗ＶＥＧＦ抗原結合断片を含み、（ｂ）配列番号９３又は配列番号９４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を含む、項４５又は４６に記載の治療用分子である。
項４８は、医薬として使用するための組成物であって、項１～４７のいずれか１つに記載の治療用分子と、任意に、薬学的に許容され得る添加物、希釈剤又は担体とを含む、組成物である。
項４９は、眼疾患又は脳疾患の治療に使用のための組成物であって、項１～４７のいずれか１つに記載のコンジュゲートと、任意に薬学的に許容され得る添加物、希釈剤又は担体とを含む、組成物である。
項５０は、眼内送達、特に硝子体内注射用に製剤化された、項４９に記載の使用のための組成物である。
項５１は、（ａ）組成物が、最大で３ヶ月ごと、特に最大で４ヶ月ごと、より具体的には最大で６ヶ月ごとに投与され、及び／又は（ｂ）コンジュゲート中の第１の成分の排出半減期が、コンジュゲートさていない第１の成分と比較して、少なくとも３倍、少なくとも４倍又は少なくとも５倍延長される、項４８～５０のいずれか１つに記載の使用のための組成物である。
項５２は、眼疾患が、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、特に滲出型ＡＭＤ又は新生血管型ＡＭＤ、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、特に増殖性ＤＲ又は非増殖性ＤＲ、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）又は地図状萎縮（ＧＡ）である、項４８～５１のいずれかに記載の使用のための組成物である。
項５３は、対象の眼疾患を治療する方法であって、項１～４７のいずれかに記載の治療用分子、又は項４８～５２のいずれかに定義される組成物を対象に投与することを含む、方法である。
項５４は、患者における組織を標的とする治療用分子の送達方法であって、項１～４７のいずれか１つに記載の治療用分子又は項４８～５２のいずれか１つに記載の組成物を患者に投与することと、治療用分子に、標的組織への第１の成分の長時間作用型送達の提供を可能にすることと、を含む方法である。
項５５は、投与工程の前に治療用分子をヒアルロナンに結合させることを更に含む、項５４に記載の方法である。
項５６は、治療用分子を含む第１の溶液とヒアルロナンを含む第２の溶液とを混合することを更に含む、項５５に記載の方法である。
項５７は、混合が容器を含む項５６に記載の方法である。
項５８は、容器が二区画シリンジである項５７に記載の方法である。
項５９は、項５６～５８のいずれか１つに記載の方法であって、混合により、対象に投与する準備ができているヒアルロナンに結合した治療用分子が生成される方法である。
項６０は、投与工程が単回注射である、項５４～５９のいずれか１つに記載の方法である。
項６１は、標的組織が眼又は脳を含む、項５４～６０のいずれか１つに記載の方法である。
項６２は、治療用分子が、未修飾の生物学的活性剤と比較して、改善された硝子体適合性、より長い硝子体滞留時間、より長い硝子体半減期、及び／又は改善された薬理学的効果の持続時間を提供する、項５４～６１のいずれか１つに記載の方法である。
態様６３は、（ａ）眼内の治療標的に結合することができる第１の成分と、（ｂ）ヒアルロナンに結合することができる１つ以上の第２の成分（複数可）と、（ｃ）ヒアルロナンを含む１つ以上の第３の成分（複数可）とを含み、各第２の成分は、第１の成分に共有結合しており、第３の成分に非共有結合している、コンジュゲートである。
態様６４は、第１の成分が、タンパク質、ペプチド、受容体若しくはその断片、受容体に対するリガンド、ダルピン、核酸、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はアプタマーである、態様６３に記載のコンジュゲートである。
態様６５は、第１の成分が抗体又は抗原結合抗体断片、特に抗体断片、より具体的には少なくともＦｃドメインを欠く抗体断片であり、特に断片が（Ｆａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、又はＦａｂ断片、より具体的にはＦａｂ断片であるか又はそれを含む、態様６３又は６４に記載のコンジュゲートである。
態様６６は、第２の成分が、ヒアルロナン受容体ＣＤ４４（ＣＤ４４）ドメイン、脳特異的リンクタンパク質（ＢＲＡＬ１）ドメイン、腫瘍壊死因子刺激遺伝子６（ＴＳＧ－６）ドメイン、リンパ管内皮ヒアルロナン受容体１（ＬＹＶＥ－１）ドメイン、又はヒアルロン酸結合タンパク質（ＨＡＢＰ）ドメイン、アグリカンＧ１（ＡＧ１）ドメイン、又はバーシカンＧ１（ＶＧ１）ドメインを含む、態様６３～６５のいずれかに記載のコンジュゲートである。
態様６７は、コンジュゲートが、１つ又は２つの第２の成分、特に２つの同一の第２の成分を含む、態様６３～６６のいずれかに記載のコンジュゲートである。
態様６８は、第３の成分がヒアルロナンであり、ヒアルロナンが、（ａ）３ｋＤａ～６０ｋＤａ、特に４ｋＤａ～３０ｋＤａ、より具体的には５ｋＤａ～２０ｋＤａの分子量、及び／又は（ｂ）少なくとも２、３、４、５、６、７、８若しくは９ｋＤａの分子量を有する、及び／又は（ｃ）最大で６０、５０、４０、３０、２５、２０若しくは１５ｋＤａの分子量を有し、；及び／又は（ｄ）、眼内のヒアルロナンの分解を減少させる修飾を有する、態様６３～６６のいずれかに記載のコンジュゲートである
態様６９は、（ａ）第１及び第２の成分が融合タンパク質に含まれ、特に、１つ若しくは２つの第２の成分が、第１の成分のＮ末端及び／又はＣ末端に共有結合しており、より具体的には、第１の成分は抗体若しくは抗原結合抗体断片であり、１つ若しくは２つの第２の成分が、第１の成分のＣ末端に共有結合しており；且つ／或いは（ｂ）第２の成分が、第１の成分に直接結合しているか、又はリンカー、特に少なくとも４アミノ酸及び／若しくは最大５０若しくは最大２５アミノ酸のリンカー、より具体的には（ＧｘＳ）ｎ若しくは（ＧｘＳ）ｎＧｍ（Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、（ｘ＝３、ｎ＝３、４、５若しくは６、且つｍ＝０、１、２若しくは３）若しくは（ｘ＝４、ｎ＝２、３、４若しくは５、且つｍ＝０、１、２若しくは３））であるリンカーを介して間接的に第１の成分に結合している、態様６３～６７のいずれかのコンジュゲートである。
態様７０は、治療標的がＶＥＧＦ、Ｃ５、Ｐ因子、Ｄ因子、ＥＰＯ、ＥＰＯＲ、ＩＬ－１β、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１０、ＴＮＦ、ＦＧＦＲ２、ＰＤＧＦ又はＡＮＧ２、特にＶＥＧＦである、態様６３～６９のいずれかに記載のコンジュゲートである。
態様７１は、（ａ）第１の成分がＶＥＧＦに対する抗体又は抗原結合抗体断片、特に抗ＶＥＧＦ Ｆａｂであり、且つ／又は（ｂ）１つ又は２つの第２の成分の各々が、ＣＤ４４ドメイン又はＴＳＧ－６ドメイン又はＶＧ１ドメインを含み、且つ／又は（ｃ）第３の成分が５ｋＤａ～２０ｋＤａの分子量のヒアルロナンであり、（ｄ）特に（ｅ）第１の成分が抗ＶＥＧＦ Ｆａｂであり、１つ又は２つの第２の成分のそれぞれがＣＤ４４ドメインを含み、第３の成分が５ｋＤａ～２０ｋＤａの分子量のヒアルロナンであるか、又は（ｆ）第１の成分が抗ＶＥＧＦ Ｆａｂであり、１つ又は２つの第２の成分の各々がＴＳＧ－６ドメインを含み、第３の成分が５ｋＤａ～２０ｋＤａの分子量のヒアルロナンであるか、又は（ｇ）第１の成分が抗ＶＥＧＦ Ｆａｂであり、１つ又は２つの第２の成分の各々がＶＧ１ドメインを含み、第３の成分が５ｋＤａ～２０ｋＤａの分子量のヒアルロナンである、態様６３～７０のいずれかに記載のコンジュゲートである。
態様７２は、第１の成分が、配列番号５に含まれるＶＨドメイン及び配列番号６に含まれるＶＬドメインを有する抗体であり、第２の成分が、配列番号４を含むか又はこれからなる、態様６３～７１のいずれかに記載のコンジュゲートである。
態様７３は、医薬として使用するための組成物であって、態様６３～７２のいずれかに記載のコンジュゲートと、任意に、薬学的に許容され得る添加物、希釈剤又は担体とを含む、組成物である。
態様７４は、眼疾患の治療に使用するための組成物であって、態様６３～７３のいずれかに記載のコンジュゲートと、任意に、薬学的に許容され得る添加物、希釈剤又は担体とを含む、組成物である。
態様７５は、眼内送達、特に硝子体内注射用に製剤化された、態様７３又は７４記載の使用のための組成物である。
項７６は、（ａ）組成物が、最大で３ヶ月ごと、特に最大で４ヶ月ごと、より具体的には最大で６ヶ月ごとに投与され、及び／又は（ｂ）コンジュゲート中の第１の成分の排出半減期が、コンジュゲートさていない第１の成分と比較して、少なくとも３倍、少なくとも４倍又は少なくとも５倍延長される、項７３～７５のいずれか１つに記載の使用のための組成物である。
態様７７は、眼疾患が、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、特に滲出型ＡＭＤ又は新生血管型ＡＭＤ、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、特に増殖性ＤＲ又は非増殖性ＤＲ、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）又は地図状萎縮（ＧＡ）である、態様７３～７６のいずれかに記載の使用のための組成物である。
態様７８は、対象の眼疾患を治療する方法であって、態様６３～７２のいずれかに記載のコンジュゲート、又は態様７３～７７のいずれかで定義される組成物を対象に投与することを含む方法である。
実施形態７９は、ヒアルロナン結合ドメインと治療活性剤とを含む患者の組織を標的とする治療用分子であって、ヒアルロナン結合ドメインは、バーシカンの少なくとも２つのリンクドメインを含む、治療用分子である。
実施形態８０は、ヒアルロナン結合ドメインと治療活性剤とを含む患者の組織を標的とする治療用分子であって、ヒアルロナン結合ドメインは、ＨＡ結合ドメインを介してヒアルロナンに結合するバーシカンの少なくとも２つのリンクドメインを含む、治療用分子である。
実施形態８１は、ヒアルロナンが４００Ｄａ～２００ｋＤａの範囲である、実施形態７９又は８０に記載の治療用分子である。
実施形態８２は、ヒアルロナンが少なくとも５ｋＤａである実施形態８１に記載の治療用分子である。
実施形態８３は、ヒアルロナンが１０ｋＤａである実施形態８１又は８２に記載の治療用分子である。
実施形態８４は、ヒアルロナンがモル過剰の結合当量をバーシカンのリンクドメインに提供する、実施形態７９～８３のいずれか１つに記載の治療用分子である。
実施形態８５は、ヒアルロナンが、１．５：１～１：１の範囲のヒアルロナン対治療用分子の比を可能にする、実施形態７９～８４のいずれか１つに記載の治療用分子。
実施形態８３は、ヒアルロナン結合ドメインが１０ｎＭ～１０μＭのＫＤを有する、実施形態７９～８５のいずれか１つに記載の治療用分子である。
実施形態８７は、ヒアルロナン結合ドメインが５ｎＭ～８μＭのＫＤを有する、実施形態７９～８６のいずれか１つに記載の治療用分子である。
実施形態８８は、ヒアルロナン結合ドメインが１００ｎＭ～５μＭのＫＤを有する、実施形態７９～８７のいずれか１つに記載の治療用分子である。
実施形態８９は、ヒアルロナン結合ドメインが、配列番号８６、６０、３２又は２９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である、実施形態７９～８８のいずれか１つに記載の治療用分子である。
実施形態９０は、ヒアルロナン結合ドメインが８６、６０、３２、又は２９と少なくとも９５％同一である、実施形態７９～８９のいずれか１つに記載の治療用分子である。
実施形態９１は、ヒアルロナン結合ドメインが少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、又は少なくとも５個の変異を含む、実施形態７９～９０のいずれか１つに記載の治療用分子である。
実施形態９２は、ヒアルロナン結合ドメインが１～３個の変異を含み、１～３個の変異が単一アミノ酸置換、二重アミノ酸置換及び短縮を含む、実施形態７９～９１のいずれか１つに記載の治療用分子である。
実施形態９３は、ヒアルロナン結合ドメインが１～５個の変異を含み、１～５個の変異が単一アミノ酸置換、二重アミノ酸置換及び短縮を含む、実施形態７９～９２のいずれか１つに記載の治療用分子である。
実施形態９４は、ヒアルロン酸結合ドメインが、配列番号２９と比較して短縮型変異を有する、実施形態７９～９３のいずれか１つに記載の治療用分子である。
実施形態９５は、短縮型変異がＮ末端上の１～１２９アミノ酸の短縮を含む、実施形態９４に記載の治療用分子である。
実施形態９６は、ヒアルロン酸結合ドメインが、野生型バーシカンのＩｇドメインが存在しない短縮型配列である、実施形態７９～９５のいずれか１つに記載の治療用分子である。
実施形態９７は、ヒアルロナン結合ドメインが、配列番号２９に対して以下のアミノ酸：Ｒ１６０、Ｙ１６１、Ｅ１９４、Ｄ１９７、Ｙ２０８、Ｒ２１４、Ｙ２３０、Ｆ２６１、Ｄ２９５及びＲ２３３の少なくとも１つを含む、実施形態７９～９６のいずれか１つに記載の治療用分子である。
実施形態９８は、ヒアルロナン結合ドメインが、配列番号２９に対して以下のアミノ酸：Ｒ１６０、Ｙ１６１、Ｅ１９４、Ｄ１９７、Ｙ２０８、Ｒ２１４、Ｙ２３０、Ｆ２６１、Ｄ２９５及びＲ２３３のうち少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個を含む、実施形態７９～９７のいずれか１つに記載の治療用分子である。
実施形態９９は、ヒアルロナン結合ドメインが、配列番号２９に対して以下の位置：Ｒ１６０、Ｙ１６１、Ｅ１９４、Ｄ１９７、Ｙ２０８、Ｒ２１４、Ｍ２２２、Ｙ２３０、Ｒ２３３、Ｋ２６０、Ｆ２６１、Ｄ２９５、Ｙ２９６、Ｈ３０６、Ｒ３１２、Ｌ３２５、Ｙ３２６、及びＲ３２７の少なくとも１つに変異を含む、実施形態７９～９８のいずれか１つに記載の治療用分子である。
実施形態１００は、ヒアルロナン結合ドメインが、配列番号２９に対して以下の位置：Ｒ１６０、Ｙ１６１、Ｅ１９４、Ｄ１９７、Ｙ２０８、Ｒ２１４、Ｍ２２２、Ｙ２３０、Ｒ２３３、Ｋ２６０、Ｆ２６１、Ｄ２９５、Ｙ２９６、Ｈ３０６、Ｒ３１２、Ｌ３２５、Ｙ３２６、及びＲ３２７の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８個に変異を含む、実施形態７９～９９のいずれか１つに記載の治療用分子である。
実施形態１０１は、ヒアルロナン結合ドメインが、配列番号２９に対して以下の位置：Ｒ１６０、Ｙ１６１、Ｅ１９４、Ｄ１９７、Ｙ２０８、Ｒ２１４、Ｍ２２２、Ｙ２３０、Ｒ２３３、Ｋ２６０、Ｆ２６１、Ｄ２９５、Ｙ２９６、Ｈ３０６、Ｒ３１２、Ｌ３２５、Ｙ３２６、及びＲ３２７の２、３、４、５、又は６個に変異を含む、実施形態７９～１００のいずれか１つに記載の治療用分子である。
実施形態１０２は、ヒアルロナン結合ドメインが、配列番号２９に対して、以下の変異：Ｒ１６０Ａ、Ｙ１６１Ａ、Ｄ１９７Ａ、Ｄ１９７Ｓ、Ｙ２０８Ａ、Ｙ２０８Ｆ、Ｒ２１４Ｋ、Ｍ２２２Ａ、Ｙ２３０Ａ、Ｙ２３０Ｆ、Ｒ２３３Ａ、Ｋ２６０Ａ、Ｋ２６０Ｒ、Ｆ２６１Ｙ、ＫＦ２６０ＲＹ、Ｄ２９５Ａ、Ｄ２９５Ｓ、Ｙ２９６Ａ、Ｙ２９６Ｆ、ＤＹ２９５ＳＦ、Ｈ３０６Ａ、Ｒ３１２Ａ、Ｌ３２５Ａ、Ｙ３２６Ａ、Ｒ３２７Ａ、及びＬＹＲ３２５ＬＦＫの少なくとも１つを含む、実施形態７９～１０１のいずれか１つに記載の治療用分子である。
実施形態１０３は、ヒアルロナン結合ドメインがＹ２０８Ａ及びＨ３０６Ａの少なくとも１つを含む、実施形態７９～１０２のいずれか１つに記載の治療用分子である。
実施形態１０４は、ヒアルロナン結合ドメインが、配列番号２９に対して以下の変異：Ｒ１６０Ａ、Ｙ１６１Ａ、Ｄ１９７Ａ、Ｄ１９７Ｓ、Ｙ２０８Ａ、Ｙ２０８Ｆ、Ｒ２１４Ｋ、Ｍ２２２Ａ、Ｙ２３０Ａ、Ｙ２３０Ｆ、Ｒ２３３Ａ、Ｋ２６０Ａ、Ｋ２６０Ｒ、Ｆ２６１Ｙ、ＫＦ２６０ＲＹ、Ｄ２９５Ａ、Ｄ２９５Ｓ、Ｙ２９６Ａ、Ｙ２９６Ｆ、ＤＹ２９５ＳＦ、Ｈ３０６Ａ、Ｒ３１２Ａ、Ｌ３２５Ａ、Ｙ３２６Ａ、Ｒ３２７Ａ、及びＬＹＲ３２５ＬＦＫのうち少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６又は１７個を含む、実施形態７９～１０３のいずれかに１つに記載の治療用分子である。
実施形態１０５は、ここで、ヒアルロナン結合ドメインは、配列番号２９に対して、以下の変異：Ｒ１６０Ａ、Ｙ１６１Ａ、Ｄ１９７Ａ、Ｄ１９７Ｓ、Ｙ２０８Ａ、Ｙ２０８Ｆ、Ｒ２１４Ｋ、Ｍ２２２Ａ、Ｙ２３０Ａ、Ｙ２３０Ｆ、Ｒ２３３Ａ、Ｋ２６０Ａ、Ｋ２６０Ｒ、Ｆ２６１Ｙ、ＫＦ２６０ＲＹ、Ｄ２９５Ａ、Ｄ２９５Ｓ、Ｙ２９６Ａ、Ｙ２９６Ｆ、ＤＹ２９５ＳＦ、Ｈ３０６Ａ、Ｒ３１２Ａ、Ｌ３２５Ａ、Ｙ３２６Ａ、Ｒ３２７Ａ、及びＬＹＲ３２５ＬＦＫのうち少なくとも２、３、４、５、又は６個を含む、実施形態７９～１０４のいずれか１つに記載の治療用分子である。
実施形態１０６は、ヒアルロナン結合ドメインが、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、又は配列番号５９である、実施形態７９～１０５のいずれか１つに記載の治療用分子である。
実施形態１０７は、治療活性剤がオリゴペプチド、タンパク質、又は核酸を含む、実施形態７９～１０６のいずれか１つに記載の治療用分子である。
実施形態１０８は、治療活性剤が、抗体、抗原結合断片、システインノットペプチド、成長因子、又はアプタマーを含む、実施形態７９～１０７のいずれか１つに記載の治療用分子である。
実施形態１０９は、治療活性剤が抗原に結合することができる実施形態１０８に記載の治療用分子である。
実施形態１１０は、治療活性剤が、ＶＥＧＦ、ＨｔｒＡ１、ＩＬ－３３、Ｃ５、Ｐ因子、Ｄ因子、ＥＰＯ、ＥＰＯＲ、ＩＬ－１β、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１０、ＴＮＦα、ＦＧＦＲ２、ＰＤＧＦ、又はＡＮＧ２に結合することができる、実施形態１０９に記載の治療用分子である。
実施形態１１１は、治療活性剤が抗体又はその抗原結合断片（限定されないが、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、ＶｈＨ断片、ｓｃＦｖ断片、ｓｃＦｖ－Ｆｃ断片、又はミニボディを含む）である、実施形態１０９又は１１０のいずれか１つに記載の治療用分子である。
実施形態１１２は、治療活性剤がオリゴペプチド又はタンパク質である、実施形態１０９又は１１０のいずれか１つに記載の治療用分子である。
実施形態１１３は、オリゴペプチド又はタンパク質がシステインノットペプチド又は酵素である、実施形態１０２に記載の治療用分子である。
実施形態１１４は、システインノットペプチドが、配列番号９２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である、実施形態１０３に記載の治療用分子である。
実施形態１１５は、治療活性剤が、線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、神経増殖因子（ＮＧＦ）、ＶＥＧＦ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、及びインスリン様増殖因子－Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ）を含む増殖因子である、実施形態７９～１０８のいずれか１つに記載の治療用分子である。
実施形態１１６は、ＶＥＧＦに結合する治療活性剤がラニビズマブ、アフリベルセプト、ブロルシズマブ－ｄｂｌ及びベバシズマブを含む実施形態１１０に記載の治療用分子である。
実施形態１１７は、治療活性剤が核酸である、実施形態７９～１１０のいずれか１つに記載の治療用分子である。
実施形態１１８は、核酸がアプタマー、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及び／又はロックド核酸である、実施形態１１７に記載の治療用分子である。
実施形態１１９は、アプタマーがＶＥＧＦに結合する実施形態１１８に記載の治療用分子である。
実施形態１２０は、アプタマーがペグ化されている、実施形態１０８、１１８又は１１９のいずれか１つに記載の治療用分子である。
実施形態１２１は、アプタマーがＭａｃｕｇｅｎ（登録商標）である、実施形態１０８又は１１８～１２０のいずれか１つに記載の治療用分子である。
実施形態１２２は、治療活性剤とヒアルロナン結合ドメインがリンカーを介して共有結合している、実施形態７９～１２１のいずれか１つに記載の治療用分子である。
実施形態１２３は、リンカーが少なくとも４アミノ酸である実施形態１２２の治療用分子である。
実施形態１２４は、リンカーが５０アミノ酸以下である、実施形態１２２又は１２３に記載の治療用分子である。
実施形態１２５は、リンカーが４～２５アミノ酸である、実施形態１２２～１２４のいずれか１つに記載の治療用分子である。
実施形態１２６は、リンカーが、（ＧｘＳ）ｎ又は（ＧｘＳ）ｎＧｍ（Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、及び（ｘ＝３、ｎ＝３、４、５又は６、且つｍ＝０、１、２又は３）又は（ｘ＝４、ｎ＝２、３、４又は５、且つｍ＝０、１、２又は３））を含む、実施形態１２２～１２５のいずれか１つに記載の治療用分子である。
実施形態１２７は、リンカーがＧＧＧＳ（配列番号８４）又はその多量体、中でも（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号８５）を含む、実施形態１２２～１２６のいずれか１つに記載の治療用分子である。
実施形態１２８は、リンカーが、（ＧｘＳ）ｎ（Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、及び（ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０））を含む、実施形態１２２～１２５のいずれか１つに記載の治療用分子である。
実施形態１２９は、リンカーがＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ配列番号９５）を含む、実施形態１２２～１２５又は１２８のいずれか１つに記載の治療用分子である。
実施形態１３０は、治療活性剤が抗ＶＥＧＦ抗原結合部分及びシステインノットペプチドを含む、実施形態７９～１０７のいずれか１つに記載の治療用分子である。
実施形態１３１は、システインノットペプチドとヒアルロナン結合ドメインが、配列ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号９５）を含むリンカーを介して連結されている、実施形態１３０に記載の治療用分子である。
実施形態１３２は、配列が（ａ）抗ＶＥＧＦ抗原結合部分を含み、（ｂ）配列番号９３又は配列番号９４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を含む、実施形態１３０又は１３１に記載の治療用分子である。
実施形態１３３は、ヒアルロナン結合ドメインがヒアルロナンに非共有結合的に結合することができる、実施形態７９～１３２のいずれか１つに記載の治療用分子である。
実施形態１３４は、患者における組織を標的とする治療用分子の送達方法であって、実施形態７９～１３３のいずれか１つに記載の治療用分子を患者に投与することと、治療用分子に、標的組織への治療活性剤の長時間作用型送達の提供を可能にすることと、を含む方法である。
実施形態１３５は、投与工程の前に治療用分子をヒアルロナンに結合させることを更に含む、実施形態１３４に記載の方法である。
実施形態１３６は、治療用分子を含む第１の溶液とヒアルロナンを含む第２の溶液とを混合することを更に含む、実施形態１３５に記載の方法である。
実施形態１３７は、混合が容器を含む実施形態１３６に記載の方法である。
実施形態１３８は、容器が二区画シリンジである実施形態１３７に記載の方法である。
実施形態１３９は、実施形態１３６～１３８のいずれか１つに記載の方法であって、混合により、対象に投与する準備ができているヒアルロナンに結合した治療用分子が生成される方法である。
実施形態１４０は、投与工程が単回注射である、実施形態１３４～１３９のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１４１は、標的組織が眼又は脳を含む、実施形態１３４～１４０のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１４２は、治療用分子が、未修飾の治療活性剤と比較して、改善された硝子体適合性、より長い硝子体滞留時間、より長い硝子体半減期、及び／又は改善された薬理学的効果の持続時間を提供する、実施形態１３４～１４１のいずれか１つに記載の方法である。
追加の目的及び利点は、以下の説明に部分的に記載され、説明から部分的に明らかになるか、又は実践によって習得され得る。目的及び利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘される要素及び組み合わせによって実現及び達成されるであろう。
前述の一般的な説明及び以下の詳細な説明は、いずれも例示的かつ説明的なものにすぎず、特許請求の範囲を限定するものではないことを理解されたい。
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付の図面は、１つ（複数）の実施形態を示し、説明と共に、本明細書に記載の原理を説明するのに役立つ。
図１は、１０ｋＤａヒアルロナン（ＨＡ）とのプレ複合体化の有無にかかわらず、Ｆａｂ－ヒアルロナン結合ドメイン（Ｆａｂ－ＨＡＢＤ）融合タンパク質ＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ；ＴＳＫｇｅｌ ＵＰ－ＳＷ３０００、２μｍ、４．６×１５０ｍｍ；ランニング緩衝液０．２Ｍ ＫＰｈ、０．２５Ｍ ＫＣｌ ｐＨ６．２）を示す。Ｆａｂ－ＨＡＢＤを実施例１に記載されるように調製し、実施例２に記載されるように試験した。
図２Ａ～図２Ｂは、ニュージーランドホワイトウサギにおける用量正規化硝子体内（ＩＶＴ）注射後のウサギ抗ｃ－Ｍｅｔ Ｆａｂ（ＲａｂＦａｂ）及びウサギ抗ｃ－Ｍｅｔ Ｆａｂ－ＶＧ１ Ｆａｂ－ＨＡＢＤ（ＲａｂＦａｂ－Ｆａｂ－ＨＡＢＤ）の硝子体薬物動態（ＰＫ）を示す。図２Ａは、ＩＶＴ後の経時的な硝子体内に存在するＲａｂＦａｂ又はＲａｂＦａｂ－Ｆａｂ－ＨＡＢＤの量を示す。ＲａｂＦａｂ融合物、すなわち１２５Ｉ－ＲａｂＦａｂ－２ｘＴＳＧ６（配列番号１５及び１６；０．５ｍｇ／眼）、及びＲａｂＦａｂ－１ｘＴＳＧ６（配列番号１３及び１４；０．３ｍｇ／眼）、ＲａｂＦａｂ（配列番号６１及び６２；０．３ｍｇ／眼）、並びに１２５Ｉ－ラニビズマブ（１２５Ｉ－Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標））対照（０．５ｍｇ／眼）についてデータを示す。データ点は用量正規化されている。図２Ｂは、ＲａｂＦａｂ（０．１５ｍｇ／眼）、又は０．０２６ｍｇ／眼、０．１５ｍｇ／眼若しくは２．５ｍｇ／眼のＲａｂＦａｂ－２ｘＴＳＧ６について蛍光光度法によってモニターした硝子体薬物動態を示す。
図３は、ＴＳＧ６（配列番号３２）のＩＶＴ投与の４日後に網膜変性を示すＯＳウサギ眼の組織病理画像を示す。
図４Ａ～図４Ｂは、眼房水及び硝子体液中のＶＰＤＦ（未修飾；図４Ａ）、並びにＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４＋１０ｋＤａ ＨＡ（図４Ｂ）のＩＶＴ薬物動態（ＰＫ）プロファイル（経時的な薬物の平均濃度）を示す。
図５Ａ～図５Ｃは、ブタ硝子体との異なる混合物を示す。図５Ａは、未修飾抗ＶＥＧＦ／抗ＰＤＧＦ Ｆａｂ断片（ＶＰＤＦ）と混合されたブタ硝子体（均一、（透明））を示す。図５Ｂは、ＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４と混合されたブタ硝子体を示す（不均一（沈殿））。図５Ｃは、１％（ｗ／ｖ）ＨＡ １０ｋＤａ、ＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４プレ複合体と混合したブタ硝子体を示す（均一（透明））。
図６Ａ～図６Ｆは、異なる濃度のＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４と混合したブタ硝子体を示す。図６Ａ：３７．５ｍｇ／ｍＬ ＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４．図６Ｂ：９．４ｍｇ／ｍＬ ＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４．図６Ｃ：２．４ｍｇ／ｍＬ ＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４．図６Ｄ：０．６ｍｇ／ｍＬ ＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４．図６Ｅ：０．１５ｍｇ／ｍＬ ＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４．図６Ｆ：０．０４ｍｇ／ｍＬ ＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４．＋＋＋強い沈殿；＋＋中程度の沈殿；＋光析出；透明な硝子体。
図７Ａ～図７Ｃは、指定のＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４試料の注射時のブタ眼全体の硝子体の不均一性を示す。図７Ａ：緩衝液対照。図７Ｂ：複合体化されていないＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４。図７Ｃ：ＨＡ－複合体化ＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４．
図８Ａ～図８Ｂは、バーシカンのドメインアーキテクチャ及びリンクドメインのアミノ酸配列を示す。バーシカンは硝子体液に対して内因性である。図８Ａは、バーシカンドメイン：ＶＧ１、ＧＡＧ結合ドメイン及びＧ３ドメインを示す。ＶＧ１ドメイン（ＷＴ ＶＧ１；配列番号２９）は、Ｉｇ様ドメインと、それに続く２つのリンクドメイン、すなわち、Ｌｉｎｋ１及びＬｉｎｋ２とを含み、これらはＨＡ結合に関与する。図８Ｂは、ＴＳＧ６ ＬＤ（配列番号４）、ＶＧ１ Ｌｉｎｋ１（配列番号３０）及びＶＧ１ Ｌｉｎｋ２（配列番号３１）を含むリンクドメインの配列アラインメントを示す。
図９Ａ～図９Ｂは、ブタ硝子体液中のＷＴ ＶＧ１ではなくＴＳＧ６の沈殿を示す。ＴＳＧ６（ＷＴ ＶＧ１ではない）と１：４希釈（ＰＢＳ）ブタ硝子体との混合について濁りが観察された。硝子体内のＴＳＧ６及びＷＴ ＶＧ１の最終濃度は約１ｍｇ／ｍＬであった。図９Ａは、ＴＳＧ６対対照を示す－遠心分離時にペレットが観察された。図９Ｂは、ＷＴ ＶＧ１対対照を示す－遠心分離時にペレットは観察されなかった。
図１０Ａ～図１０Ｂは、ＲａｂＦａｂ－ＴＳＧ６がブタ硝子体内で沈殿するが、ＲａｂＦａｂ－ＶＧ１は沈殿しないことを示す。ＴＳＧ６又はＶＧ１はそれぞれ、ＲａｂＦａｂに組換え的に結合され、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）一次アミン標識化学を介してＡｌｅｘａ ４８８にコンジュゲートされる。図１０ＡはＲａｂＦａｂ－ＴＳＧ６を示す。図１０ＢはＲａｂＦａｂ－ＶＧ１を示す。
図１１Ａ～図１１Ｃは、ＶＧ１及びＲａｂＦａｂ－ＶＧ１がウサギ硝子体液中で沈殿しないことを示す。図１１Ａは、約４０ｇ／ＬでのＶＧ１を示す。図１１Ｂは、約４０ｇ／ＬのＲａｂＦａｂ－ＶＧ１を示す。図１１Ｃは、約１７ｇ／ＬのＲａｂＦａｂ－ＶＧ１＋１０ｋＤａ ＨＡを示す。いかなる条件でも沈殿は観察されなかった。
図１２は、ｅｘ ｖｉｖｏでの硝子体液とのＶＧ１相互作用の蛍光相関分光法（ＦＣＳ）測定を示す。遅い拡散を示す測定値は、タンパク質が硝子体液と相互作用することを示し、速い拡散はそうでないことを示す。硝子体液の希釈係数はヒートマップの上部に示されており、左端の列は希釈されていない対照／試料を示している。右端の列はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４を示す。間の列は、左から右への希釈係数の増加を示す。非結合対照の測定値を２つの上段に示す。以下の試料の測定値を３～８行目に示す：遊離ＶＧ１、ＰｉｇＦａｂ－ＶＧ１、ＰｉｇＦａｂ－ＶＧ１＋１０ｋＤａ ＨＡ（１：１）、遊離ＶＧ１、ＲａｂＦａｂ－ＶＧ１、及びＲａｂＦａｂ－ＶＧ１＋１０ｋＤａ ＨＡ（１：１）。非結合対照は、最も速い拡散を示した（図１２、１及び２行目）。全ての試料が対照と比較して有意な遅延拡散を示したが、遊離ＶＧ１、ＰｉｇＦａｂ－ＶＧ１及びＲａｂＦａｂ－ＶＧ１は、硝子体が６，０００倍を超えて希釈されるまで遅延拡散を示した（図１２、３、４、６、及び７行目；希釈されていない状態から希釈係数６，５６１まで）。１０ｋＤａ ＨＡと共製剤化された試料では遅い拡散が観察されたが、希釈係数が７２９倍を超えると効果は消失した（図１２、５行目：ＰｉｇＦａｂ－ＶＧ１＋１０ｋＤａ ＨＡ（１：１）、８行目：ＲａｂＦａｂ－ＶＧ１＋１０ｋＤａ ＨＡ（１：１）；ＰＢＳに対する希釈係数７２９）。これらの結果は、ＶＧ１が内因性ＨＡと相互作用し得ることを示している。
図１３は、３７°Ｃでの抗ＨｔｒＡ１－ＶＧ１の熱ストレス（すなわち、タンパク質安定性）分析を示す。Ｔ０＝インキュベーション対照なし。Ｔ４ｗｋ＝４週間のインキュベーション後。
図１４は、ブタ眼房水におけるｐｉｇＦａｂ－ＶＧ１の平均濃度を示す。１．８ｍｇのｐｉｇＦａｂ－ＶＧ１単独又は等しい質量濃度の１０ｋＤａ ＨＡと予め複合体化したｐｉｇＦａｂ－ＶＧ１のＩＶＴ注射後に質量分析によって濃度を測定した。いくつかの動物の平均値を、標準偏差を示すエラーバーと共に示す。
図１５は、ラットレーザー誘発脈絡膜新生血管（ラットレーザーＣＮＶ）におけるＶＰＤＦ ＶＧ１による新生血管形成の阻害パーセントを示す。
図１６Ａ～図１６Ｃは、治療の３０日後に試験物質質で治療したウサギの眼の組織病理学を示す。図１６ＡはＷＴ ＶＧ１を示し、図１６ＢはＲａｂＦａｂ－ＶＧ１を示し、図１６ＣはＨＡを有するＲａｂＦａｂ－ＶＧ１を示す。
図１７Ａ～図１７Ｂは、マウスにおける脳室内注射後の脳レベルを示す。図１７Ａは、経時的に脳内に保持されたタンパク質の量を示す。図１７Ｂは、曲線下面積（ＡＵＣ）によって測定される脳内の曝露レベルを示す。＊群間の比較のため、＊はｐ＜０．０１を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。抗ｇＤ＝抗単純ヘルペスウイルス－１糖タンパク質Ｄ。ＢＲＤ＝抗ｇＤ Ｆａｂ－ＶＧ１。
図１８は、ＷＴ ＶＧ１及びＨＡコンジュゲートの結晶構造を示す。ＶＧ１のＩｇドメインは図の上部に現れ、Ｌｉｎｋ１ドメインは図の下部の右側に、Ｌｉｎｋ２ドメインは図の下部の左側にある。ＨＡの結合は、より小さいＨＡ分子がＶＧ１分子の右下側にある状態で示されている。
図１９は、配列番号２９、３３～５９のＶＧ１バリアントのアラインメントを示す。Ｎ末端上の最初の２０アミノ酸は、バーシカンシグナル配列（＊で示す）である。ボックスで囲まれたアミノ酸は保存された残基である。これらのタンパク質は全て、精製のためにＣ末端Ｈｉｓタグを用いて作製した。
配列の説明
表１は、本明細書で参照される特定の配列のリストを提供する。提供されるアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端である。
Ｉ．Ａ．定義
他に定義されていない限り、本明細書で使用されている全ての技術的及び科学的用語及び任意の頭字語は、本開示の分野の当業者により共通して理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似の、又は同等の任意の方法及び材料を本明細書で提示された実施において使用することができるが、特定の方法、及び材料が本明細書に記載されている。
特に明記しない限り、本明細書で使用される以下の用語及び句は、以下の意味を有することを意図している：
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、完全な（完全な又はインタクトな）抗体を意味する。抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖及び２本の軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）及び重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３の３つのドメインから構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）及び軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬからなる。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に更に細分することができる。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序で配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４．重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（ＣＩｑ）を含む宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合断片」又は「抗体断片」という用語は、所与の抗原（例えば、ＶＥＧＦなどの眼における治療標的）に特異的に結合する能力を保持し、したがって所望の抗原結合活性を示す抗体の１つ以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、インタクトな抗体の断片によって行うことができる。抗体の抗原結合断片という用語に包含される結合断片の例としては、限定されないが、抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ及びｓｃＦａｂ）；単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体；ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の単一アームのＶＬドメイン及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；ＶＨドメイン又はＶＬドメインからなる単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）断片；並びに単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。特定の抗体断片の総説については、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１１２６－１１３６（２００５）を参照されたい。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え法を使用して、ＶＬ及びＶＨ領域が対になって一価分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる）を形成する単一タンパク質鎖として作製することを可能にする人工ペプチドリンカーによって連結することができる。そのような一本鎖抗体は、抗体の１つ以上の抗原結合断片を含み得る。これらの抗原結合断片は、当業者に公知の従来の技術を使用して得られ、断片は、インタクトな抗体と同じ様式で有用性についてスクリーニングされる。抗原結合断片はまた、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ－ＮＡＲ及びビス－ｓｃＦｖ）に組み込まれ得る。抗原結合断片は、相補的軽鎖ポリペプチドと一緒になって抗原結合領域の対を形成するタンデムＦｖセグメントの対（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）を含む一本鎖分子に組み込むことができる。「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む。
アプタマーは、特定の標的分子に結合するオリゴヌクレオチド又はペプチド分子である。アプタマーは通常、大きなランダム配列プールから選択することによって作製されるが、天然アプタマーもリボスイッチに存在する。アプタマーは、高分子薬物として基礎研究及び臨床目的の両方に使用することができる。アプタマーをリボザイムと組み合わせて、それらの標的分子の存在下で自己切断することができる。これらの化合物分子は、更なる研究、産業及び臨床用途を有する。より具体的には、アプタマーは、オリゴヌクレオチドの（通常は短い）鎖からなるＤＮＡ又はＲＮＡ又はＸＮＡアプタマー、及び両端でタンパク質骨格に結合した１つ（又は複数）の短い可変ペプチドドメインからなるペプチドアプタマーとして分類することができる。ＤＮＡアプタマー及びＲＮＡアプタマーの両方が、様々な標的に対して堅牢な結合親和性を示す。ＤＮＡアプタマー及びＲＮＡアプタマーは、同じ標的に対して選択されている。これらの標的には、リゾチーム、トロンビン、インターフェロンγ、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ドーパミンが含まれる。例えばＶＥＧＦの場合、ＤＮＡアプタマーはＲＮＡアプタマーの類縁体であり、チミンがウラシルに置き換わっている。
「共有結合」は、分子結合とも呼ばれ、原子間の電子対の共有を伴う化学結合である。これらの電子対は共有対又は結合対として知られており、それらが電子を共有するときの原子間の引力と反発力の安定なバランスは共有結合として知られている。
本明細書で使用される場合、「ＤＡＲＰｉｎ」（設計されたアンキリンリピートタンパク質の頭字語）という用語は、典型的には高度に特異的で高親和性の標的タンパク質結合を示す抗体模倣タンパク質を指す。それらは、典型的には、遺伝子操作され、天然のアンキリンタンパク質に由来し、これらのタンパク質の少なくとも３つ、通常は４つ又は５つの反復モチーフからなる。それらの分子量は、四反復又は五反復ＤＡＲＰｉｎについてそれぞれ約１４又は１８ｋＤａである。ＤＡＲＰｉｎの例は、例えば、米国特許第７，４１７，１３０号に見出すことができる。
薬剤、例えば、医薬組成物の「有効量」は、所望の治療又は予防結果を達成するために必要な用量及び期間で有効な量を指す。
本明細書で使用される場合、「眼疾患」という用語は、病理学的血管新生及び／又は萎縮に関連する任意の眼疾患を含む。「眼疾患（ｅｙｅ ｄｉｓｅａｓｅ）」という用語は、「眼症状（ｅｙｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」、「眼障害（ｅｙｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）」、「眼の症状（ｏｃｕｌａｒ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」、「眼の疾患（ｏｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ）」、及び「眼の障害（ｏｃｕｌａｒ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）」という用語と同義である。
本明細書で使用される場合、「Ｆａｂ－ヒアルロナン結合ドメイン」、「Ｆａｂ－ヒアルロン酸結合ドメイン」及び「Ｆａｂ－ＨＡＢＤ」は、Ｆａｂ及びヒアルロナン結合ドメインを含む融合タンパク質を指す。これらの用語は同義であり、本開示を通して互換的に使用され得る。
本明細書で使用される場合、「ヒアルロナン」、「ヒアルロン酸」、「ヒアルロネート」及び「ＨＡ」は、化学式（Ｃ１４Ｈ２１ＮＯ１１）ｎ及びその塩を有する非硫酸化グルコサミノグリカンを指す。
本明細書で使用される場合、「ヒアルロン酸結合ドメイン」、「ヒアルロン酸結合部分」、「ＨＡ結合ドメイン」又は「ＨＡＢＤ」は、ヒアルロン酸に結合することができる任意の部分を指す。いくつかの例では、ＨＡＢＤは、ＨＡ結合タンパク質のドメインであり得る。
リガンドは、生体分子と複合体又はコンジュゲートを形成して生物学的目的を果たす物質である。タンパク質－リガンド結合において、リガンドは、通常、標的タンパク質上の部位に結合することによってシグナルを生成する分子である。結合は、典型的には、標的タンパク質の立体配座異性（立体配座）の変化をもたらす。ＤＮＡ－リガンド結合研究では、リガンドは、ＤＮＡ二重らせんに結合する小分子、イオン、又はタンパク質であり得る。リガンドと結合パートナーとの関係は、電荷、疎水性及び分子構造の関数である。結合の例は、時間及び空間の極小範囲にわたって起こるため、速度定数は通常非常に小さい数である。リガンドは、天然に存在するリガンド又は天然に存在しないリガンドであり得る。さらに、それはアゴニスト、パーシャルアゴニスト、アンタゴニスト又はインバースアゴニストであり得る。
「非共有結合相互作用」は、電子の共有を伴わず、むしろ分子間又は分子内の電磁相互作用のより分散した変化を伴うという点で共有結合とは異なる。非共有結合相互作用は、静電、π効果、ファンデルワールス力、及び疎水性効果などの異なるカテゴリーに分類することができる。好ましくは、コンジュゲートは、単離された形態で提供される。第１及び第２の成分は、リンカーを介して互いに共有結合していてもよく、又は直接結合していてもよい。
核酸は、ヌクレオチドから構成されるバイオポリマーであり、３つの成分：５炭素糖、リン酸基及び窒素塩基から構成されるモノマーである。核酸という用語は、ＤＮＡ及びＲＮＡの全体的な名称である。糖が化合物リボースである場合、ポリマーはＲＮＡ（リボ核酸）である。糖がデオキシリボースとしてのリボースに由来する場合、ポリマーはＤＮＡ（デオキシリボ核酸）である。
本明細書で使用される場合、「ペプチドリンカー」という用語は、好ましくは合成起源のアミノ酸配列を有するペプチドを意味する。
タンパク質は、アミノ酸残基の１つ以上の長鎖からなる大きなバイオポリマー（ポリペプチド）である。タンパク質は、代謝反応の触媒、ＤＮＡ複製、刺激への応答、細胞及び生物への構造の提供、及びある場所から別の場所への分子の輸送を含む、生物内の膨大な機能を果たす。タンパク質は、主に、それらの遺伝子のヌクレオチド配列によって決定され、通常、その活性を決定する特定の三次元構造へのタンパク質フォールディングをもたらすアミノ酸の配列が互いに異なる。２０～３０残基未満を含有する短いポリペプチドは、一般にペプチドと呼ばれる。
本明細書で使用される場合、「タンパク質コンジュゲート」又は「コンジュゲート」は、ヒアルロナンに非共有結合したタンパク質を指す。
受容体は、通常タンパク質から構成される化学構造であり、生体系に組み込まれ得るシグナルを受容及び伝達する。これらのシグナルは、典型的には化学的メッセンジャー（リガンド）であり、受容体に結合し、何らかの形態の細胞／組織応答、例えば細胞の活性の変化を引き起こす。受容体の作用を分類することができる３つの主な方法がある：シグナルの中継、増幅、又は統合。中継はシグナルを前方に送り、増幅は単一リガンドの効果を高め、統合はシグナルを別の生化学経路に組み込むことを可能にする。この意味で、受容体は、内因性化学シグナルを認識し、それに応答するタンパク質分子である。したがって、リガンド結合部位及びそれらのリガンドを含む受容体又は断片は、本発明の文脈において適切な結合対応物（第１の成分及び治療標的）である。
本明細書で使用される場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（及びその文法的な変化形、例えば、「治療（ｔｒｅａｔ）する」又は「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」）は、治療される個体において疾患の本来の経過を変える試行における臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の経過の間に行うことができる。治療の所望の効果としては、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症候の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減弱、転移を予防すること、疾患進行速度を低下させること、病状の寛解又は緩和、及び回復又は予後の改善が挙げられる。いくつかの態様では、本発明の抗体は、疾患の発症を遅らせるため、あるいは疾患の進行を遅らせるために使用される。
数値範囲は、範囲を定義する数を含む。測定値及び測定可能な値は、有効数字及び測定に関連する誤差を考慮して、近似値であると理解される。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む、含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含む、含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含む、含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む／挙げられる（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む／挙げられる（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含む／挙げられる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、限定することを意図するものではない。前述の一般的な説明及び詳細な説明の両方は、例示的かつ説明的なものにすぎず、教示を限定するものではないことを理解されたい。
明細書及び特許請求の範囲の全ての数字は、「約」という用語によって修飾されている。これは、各数字が、質問における数値又は範囲の１０％として定義されるような小さな変動を含むことを意味する。
本明細書に具体的に記載されていない限り、様々な構成要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と記載する本明細書の実施形態は、記載された構成要素「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」又は「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」とも考えられる。様々な構成要素「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」を列挙する本明細書の実施形態は、列挙された構成要素「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」又は「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」とも考えられ、様々な構成要素「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」を列挙する本明細書の実施形態は、列挙された構成要素「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とも企図される（この互換性は、特許請求の範囲におけるこれらの用語の使用には適用されない）。「又は」という用語は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、包括的な意味で、すなわち「及び／又は」と同等に使用される。
ここで、本発明の特定の実施形態を詳細に参照し、その例を添付の図面、実施例、及び実施形態に示す。図面、実施例、及び実施形態（特に明記しない限り）は、本発明の範囲を本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル、及び試薬に限定することを意図するものではなく、それらは変化し得ることが理解されよう。本発明は、添付の特許請求の範囲及び含まれる実施形態によって定義される本発明内に含まれ得る全ての代替形態、修正形態、及び均等物を網羅することを意図している。さらに、本明細書で使用されている用語は、特定の実施形態のみについて記載する目的のためのものであり、本開示の範囲を限定することを意図しない。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」、及び「ｔｈｅ（その）」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。同様に、「含む、備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む、含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「包含する（ｅｎｃｏｍｐａｓｓ）」という言葉は、排他的ではなく包括的に解釈される。
本明細書で使用されるセクションの見出しは、構成上の目的のためだけであり、決して所望の主題を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書で引用される全ての刊行物（科学刊行物及び特許刊行物）は、参照により組み込まれる。参照により組み込まれるいずれかの材料が、本明細書で定義されるいずれかの用語又は本明細書の他の明示的な内容と矛盾する場合、本明細書が優先する。本教示は、様々な実施形態に関連して説明されているが、本教示がそのような実施形態に限定されることは意図されていない。逆に、本教示は、当業者によって理解されるように、様々な代替物、改変物、及び均等物を包含する。
ＩＩ．治療活性剤（すなわち、第１の成分）と、ヒアルロナン結合ドメイン（ＨＡＢＤ；すなわち、第２の成分）とを含む治療用分子
本出願は、治療活性剤及びＨＡ結合ドメイン（ＨＡＢＤ）を含む患者の組織を標的とする治療用分子を提供する。各治療用分子は、第１の成分と、１つ以上の第２の成分とを含む。第１の成分は、眼内の治療標的に結合することができる。第２の成分はＨＡに結合することができ、したがってＨＡ結合ドメイン（ＨＡＢＤ）を含む。
いくつかの実施形態では、治療用分子は、第１の成分と、１つ以上の第２の成分とを有する融合タンパク質である。第１及び第２の成分は、互いに共有結合し、それによって融合タンパク質を形成する。いくつかの実施形態では、治療用分子は、ペプチドリンカーを更に含む。
いくつかの実施形態では、治療用分子は１つの第２の成分を含む。いくつかの実施形態では、治療用分子は、２つ以上の第２の成分を含む。特に、２つのタンパク質（すなわち、１つの重鎖又はその断片、及び１つの軽鎖又はその断片）から構成される抗体又はその抗原結合断片が使用される場合、治療用分子は、２つの第２の成分を含み得る。これらの実施形態では、１つ目の第２の成分が抗体又は抗原結合断片の重鎖に連結され、２つ目第２の成分が抗体又は抗原結合断片の軽鎖に連結される。いくつかの実施形態では、１つ目の第２の成分はＦａｂ断片の重鎖のＣ末端に連結されており、２つ目の第２の成分はＦａｂ断片の軽鎖のＣ末端に連結されている。
いくつかの実施形態では、治療用分子は、（第１及び第２の成分に加えて）１つ以上の第３の成分を更に含む。第２の成分は、第１の成分に共有結合し、第２の成分は、第３の成分に非共有結合する。いくつかの実施形態では、第３の成分はヒアルロナン（ＨＡ）である。これらの実施形態のいくつかでは、第２の成分はＨＡに結合することができ、治療用分子タンパク質（すなわち、第２の成分に共有結合した第１の成分）はＨＡ（すなわち、第３の成分）と予め複合体化され得る。これらの実施形態のいくつかでは、第１、第２、及び第３の成分はコンジュゲートを形成する。
本明細書では、第１、第２、及び第３の成分の非限定的な例が提供される。
Ａ．第１の成分－治療活性剤
多くの実施形態では、第１の成分は、治療標的に結合することができ、これにより、治療標的を生物活性剤又は治療活性剤にする。いくつかの実施形態では、第１の成分は、眼内の治療標的に結合することができる。本明細書で使用される場合、「結合することができる」という用語は、物質又は薬剤又は成分が標的に特異的に結合し、任意に、標的の活性を調節することができることを意味する。言い換えれば、第１の成分は、眼内の治療標的へのその結合の結果として、眼内で治療活性である。いくつかの実施形態では、第１の成分は、治療標的に結合した後、治療標的の活性を活性化、不活性化、増加又は減少させることができる。いくつかの実施形態では、治療標的は眼内の適切な構造体であり、その活性は治療される眼疾患に関連する。いくつかの実施形態では、第１の成分は、シグナル伝達カスケードにおいて治療標的のすぐ上流又は下流の成分に結合する。いくつかの実施形態では、第１の成分は、眼疾患を治療するための公知の治療薬を含む。
特異的結合成分又は結合ドメインは、好ましくは、その対応する標的分子に対して少なくとも１０６ｌ／ｍｏｌの親和性を有する。特異的結合ドメインは、その標的分子に対して、好ましくは１０７ｌ／ｍｏｌ、又は更により好ましくは１０８ｌ／ｍｏｌ、又は最も好ましくは１０９ｌ／ｍｏｌの親和性を有する。「親和性」は、分子（例えば、抗体）とその結合パートナー（例えば、抗原）との単一の結合部位の間の非共有性相互作用の合計の強度を指す。別途示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体及び抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は一般に、解離定数（ＫＤ）によって表し得る。親和性は、本明細書に記載するものを含め、当技術分野で公知である一般的な方法によって測定し得る。当業者が理解するように、「特異的」という用語は、存在する他の生体分子が結合ドメインに特異的な結合剤に有意に結合しないことを示すために使用される。好ましくは、標的分子以外の生体分子への結合レベルは、それぞれ標的分子に対する親和性のわずか１０％以下、より好ましくはわずか５％以下の結合親和性をもたらす。好ましい特異的結合剤は、親和性及び特異性について上記の最小基準の両方を満たす。
いくつかの実施形態では、第１の成分は、治療標的に結合する受容体又はその断片、抗体又はその断片、成長因子、システインノットペプチド、酵素、又はＤＡＲｐｉｎなどのタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、小さいサイズから大きいサイズの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、タンパク質は、２～２０個のアミノ酸を含むペプチドである。いくつかの実施形態では、タンパク質は、２１～５０個のアミノ酸を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、タンパク質は、５０個を超えるアミノ酸を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、タンパク質は、２つ以上の直鎖又はアミノ酸を含むタンパク質複合体であり、各アミノ酸鎖は任意の数のアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、第１の成分は８０ｋＤａ以下である。いくつかの実施形態では、第１の成分は８０ｋＤａより大きい。
いくつかの実施形態では、第１の成分は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る核酸を含む。核酸は、標的に関連する核酸に相補的であり得る（例えば、標的のｍＲＮＡ又はその関連部分に相補的な核酸）。いくつかの実施形態では、核酸はアプタマーである。いくつかの実施形態では、核酸はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、ロックド核酸を含む。
１．眼内の治療標的
いくつかの実施形態では、第１の成分は、眼内の治療標的に結合する。眼には多くの治療標的がある。これらの分子及び経路を効果的に標的とする治療法が開発されるにつれて、頻繁なＩＶＴ注射に関連する治療負荷及びリスクを低減しながら、視覚転帰の改善を提供する必要がある。
ａ）血管新生促進因子、炎症性因子及び成長因子メディエーター
いくつかの実施形態では、第１の成分は、血管新生促進因子、炎症性因子及び／又は成長因子メディエーターである治療標的に結合する。血管新生、炎症、及び成長因子メディエーターは、網膜疾患、例えば血管新生加齢黄斑変性（ＡＭＤ；滲出型ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、及び網膜静脈閉塞症に関与している。
これらの血管新生促進性、炎症性又は成長因子メディエーター分子の例としては、限定されないが、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、アンジオポエチン、Ｓ１Ｐ、インテグリンανβ３、インテグリンανβ５、インテグリンα５β１、ベタセルリン、アペリン／ＡＰＪ、エリスロポエチン、補体因子Ｄ及びＴＮＦαが挙げられる。
ｂ）加齢黄斑変性（ＡＭＤ）におけるタンパク質
いくつかの実施形態では、第１の成分は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）リスクの増加に遺伝的に関連するタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、第１の成分は、Ｃ２、Ｂ因子、Ｈ因子、ＣＦＨＲ３、Ｃ３ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａ及びＣ３ａなどの補体経路成分に結合する。いくつかの実施形態では、第１の成分は、ＨｔｒＡ１、ＡＲＭＳ２、ＴＩＭＰ３、ＨＬＡ、ＩＬ－８、ＣＸ３ＣＲ１、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＣＥＴＰ、ＬＩＰＣ又はＣＯＬ１０Ａ１に結合する。
ｃ）血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）
いくつかの実施形態では、第１の成分は血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に結合する。ＶＥＧＦは、様々な眼疾患、例えば糖尿病性網膜症又は黄斑浮腫に関連する状態又は障害に関連することが知られている。（下記のセクションＩＩＩを参照されたい。）
「ＶＥＧＦ」という用語は、１６５アミノ酸の血管内皮細胞成長因子、並びに関連する１２１アミノ酸、１８９アミノ酸及び２０６アミノ酸の血管内皮細胞成長因子、並びにそれらの成長因子の天然に存在する対立遺伝子及びプロセシングされた形態を指す。ＶＥＧＦは、任意の種由来のＶＥＧＦタンパク質を指し得る。
ＶＥＧＦは、正常な発達血管形成及び病理学的血管形成の両方において必須である。星状膠細胞によるＶＥＧＦの低酸素誘導性分泌は、網膜血管系の形成を導く重要な要素である。高レベルのＶＥＧＦはまた、網膜及び脈絡膜における新しい血管の病理学的増殖を誘導する。ＶＥＧＦなどの血管新生因子の阻害は、加齢黄斑変性、増殖性網膜症及び未熟児網膜症を含む病理学的眼血管形成の治療アプローチを設計する際の主要な戦略となっている。
「ＶＥＧＦ媒介障害」という用語は、ＶＥＧＦの関与を必要とする症候又は疾患状態の発症、進行又は持続性の任意の障害を指す。例示的なＶＥＧＦ媒介障害としては、限定されないが、加齢性黄斑変性、血管新生緑内障、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、網膜静脈閉塞、未熟児網膜症、母斑症に関連する異常な血管増殖、浮腫（脳腫瘍に関連するものなど）、Ｍｅｉｇｓ症候群、関節リウマチ、乾癬及びアテローム性動脈硬化症が挙げられる。
いくつかの実施形態では、第１の成分は、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ｍｂＶＥＧＦＲ又はｓＶＥＧＦＲなどのＶＥＧＦ受容体である。
いくつかの実施形態では、第１の成分はＶＥＧＦに対する抗体又は抗原結合断片であり、より具体的には抗ＶＥＧＦ Ｆａｂである。ＶＥＧＦ抗体及び抗原結合断片は、本明細書の開示によって提供される。使用することができる他の抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦアンタゴニスト及びＶＥＧＦ受容体アンタゴニストとしては、例えば、ラニビズマブ、ベバシズマブ、アフリベルセプト、ペガプタニブ、ＣＴ－３２２並びに米国特許出願公開第２０１２／００１４９５８号、国際公開第１９９８／０４５３３１号及び国際公開第２０１５／１９８２４３号（これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）で論じられているような抗ＶＥＧＦ抗体及び断片が挙げられる。いくつかの実施形態では、第１の成分は、以下のセクションＩＩ．Ａ．２．ａ）に開示されているものなどのＶＥＧＦを標的とする薬物を含む。
ｄ）エリスロポエチン（ＥＰＯ）
いくつかの実施形態では、第１の成分はエリスロポエチン（ＥＰＯ）に結合する。いくつかの実施形態では、第１の成分はエリスロポエチン受容体（ＥＰＯＲ）に結合する。ＥＰＯは、異なる種のエリスロポエチンタンパク質を指す。ヒト、カニクイザル、マウス、ラット及びウサギＥＰＯのタンパク質配列は、公的に入手可能である。ヒトＥＰＯはまた、高グリコシル化され得る。「ＥＰＯ受容体」又は「ＥＰＯＲ」という用語は互換的に使用され、異なる種のエリスロポエチン受容体タンパク質を指す。
ｅ）アンジオポエチン
いくつかの実施形態では、第１の成分は、アンジオポエチン２（ＡＮＧ２）などのアンジオポエチンに結合する。ＡＮＧ２は、眼の病理学的血管新生に関与する２つのプロセスである血管新生及び免疫活性化の両方において機能するので、滲出型ＡＭＤの治療候補として知られている。ヒトの眼では、高レベルのＡＮＧ２は、滲出型ＡＭＤの疾患重症度と相関する。糖尿病性網膜症及び網膜静脈閉塞症の患者においても眼内ＡＮＧ２レベルの上昇が検出され、眼ＡＮＧ２を標的とすることの医学的意義の可能性が示唆された。ＡＮＧ２は、異なる種のタンパク質を指す。ＶＥＧＦ－Ａ／ＡＮＧ２の併用阻害を使用して、血管漏出、免疫反応性、及びアポトーシスを強く減少させることも示唆されている。
ｆ）インターロイキン
いくつかの実施形態では、第１の成分は、インターロイキン（ＩＬ－）１β（ＩＬ－１β）、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７Ａ及びＩＬ－１９などのインターロイキンに結合する。インターロイキンは、潜在的に盲目となる炎症性疾患であるブドウ膜炎などの眼疾患に関連している。インターロイキンは、任意の種のものであり得る。
ｇ）血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）
いくつかの実施形態では、第１の成分は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）又は血小板由来成長因子サブユニットＢ（ＰＤＧＦ－ＢＢ）である治療標的に結合する。ＰＤＧＦ及びＰＤＧＦ－ＢＢは、任意の種に由来し得る。いくつかの実施形態では、第１の成分は、以下のセクションＩＩ．Ａ．２．ｅ）に開示されるものなどのＰＤＧＦアンタゴニストを含む。
ｈ）ＶＰＤＦ
いくつかの実施形態では、第１の成分はＶＥＧＦ及びＰＤＧＦに結合する。様々なタンパク質、抗体、抗体断片、結合ドメイン、アゴニスト及びアンタゴニストがＶＥＧＦ及びＰＤＧＦに結合し得る。本明細書で使用される場合、「抗ＶＰ」という用語は、ＶＥＧＦ及びＰＤＧＦに結合する二重特異性抗体又はその断片を指す。
いくつかの態実施形態では、第１の成分はデュアルターゲティングＦａｂ、すなわちｄｕｔａＦａｂである。本明細書で使用される場合、「抗ＶＰＤＦ」は、ＶＥＧＦ及びＰＤＧＦに結合するｄｕｔａＦａｂを指す。
ｉ）ＨｔｒＡタンパク質
いくつかの実施形態では、第１の成分は、セリンプロテアーゼのＨｔｒＡファミリーのメンバーに結合する。ＨｔｒＡタンパク質は、少なくとも１つのＣ末端ＰＤＺドメインを有する触媒ドメインと、タンパク質代謝及び細胞運命に関連するＡＴＰ非依存性プロテイナーゼシャペロンとを有する。Ｃｌａｕｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ １０（３）：４４３－４４５（２００２）．ヒトには、ＨｔｒＡ１、ＨｔｒＡ２、ＨｔｒＡ３、及びＨｔｒＡ４の４つのＨｔｒＡタンパク質がある。ヒトでは、ＨｔｒＡ１、ＨｔｒＡ３、及びＨｔｒＡ４は、同じドメインアーキテクチャ：Ｎ末端ＩＧＦＢＰ様モジュール及びＫａｚａｌ様モジュール、トリプシン様フォールドを有するプロテアーゼドメイン、並びにＣ末端ＰＤＺドメインを共有する。ヒトの遺伝子研究により、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の進行と、ＨｔｒＡ１転写レベルの上昇をもたらすＨｔｒＡ１プロモーター領域の一塩基多型（ＳＮＰ）との間の強い相関が特定された。Ｄｅｗａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１４：９８９－９９２（２００６）；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１４：９９２－９３３（２００６）．
いくつかの実施形態では、第１の成分は、ＨｔｒＡ１に結合する。いくつかの実施形態では、第１の成分は、ＨｔｒＡ２に結合する。いくつかの実施形態では、第１の成分は、ＨｔｒＡ３に結合する。いくつかの実施形態では、第１の成分は、ＨｔｒＡ４に結合する。
ｊ）他の治療標的
いくつかの実施形態では、第１の成分は、以下の治療標的の１つに結合する：Ｐ因子、Ｄ因子、ＴＮＦα、ＦＧＦＲ、ＩＬ－６Ｒ、Ｔｉｅ２、Ｓ１Ｐ、インテグリンαｖβ３、インテグリンαｖβ５、インテグリンα５β１、ベタセルリン、アペリン／ＡＰＪ、補体因子Ｄ、ＴＮＦα、ＨｔｒＡ１、ＳＴ－２受容体、インスリン、ヒト成長因子、補体因子Ｈ、ＣＤ３５、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、補体受容体１関連（ＣＲＲＹ）、神経成長因子、色素上皮由来因子、エンドスタチン、毛様体神経栄養因子、補体因子１阻害剤、補体因子様－１、補体因子Ｉ等。
「Ｄ因子」という用語は、任意の種に由来するＤ因子タンパク質を指す。
「Ｐ因子」という用語は、任意の種に由来するＰ因子タンパク質を指す。ヒト因子Ｐは、テキサス州タイラーのＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈから得ることができる。カニクイザル因子Ｐは、カニクイザル血清から精製することができる（プロトコルはＮａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ９０：７７－８３．から適合された）。Ｐ因子は、当技術分野では「プロペルジン」としても知られている。
「ＦＧＦＲ２」という用語は、任意の種に由来する線維芽細胞増殖因子受容体２を指す。
２．治療薬
眼疾患を治療するための任意の好適な治療剤を第１の成分として使用することができる（これらは下記のセクションＩＩＩで論じられる）。いくつかの実施形態では、第１の成分は、眼内の標的に結合する承認された治療薬を含む。いくつかの実施形態では、第１の成分はヒト起源の標的に結合する。いくつかの実施形態では、第１の成分は、眼疾患の治療のための認められている治療薬を含む。
ａ）ＶＥＧＦを標的とする薬物
いくつかの実施形態では、第１の成分は、例えば、以下を含むがこれらに限定されないＶＥＧＦアンタゴニストを含む：（１）抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）（ラニビズマブ）、ＲＴＨ－２５８（以前はＥＳＢ－１００８、抗ＶＥＧＦ一本鎖抗体断片；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、又は二重特異性抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ＲＧ－７７１６などの抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエチン２二重特異性抗体；Ｒｏｃｈｅ））、（２）可溶性ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質（例えば、ＥＹＬＥＡ（登録商標）；アフリベルセプト））、（３）抗ＶＥＧＦ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）（例えば、アビシパル ペゴル；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ ＡＧ／Ａｌｌｅｒｇａｎ）又は（４）抗ＶＥＧＦアプタマー（例えば、ＭＡＣＵＧＥＮ（登録商標）；ペガプタニブナトリウム））。
いくつかの実施形態では、第１の成分は、特に眼疾患の治療のためのＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）（ラニビズマブ）を含む。いくつかの例では、眼疾患は加齢黄斑変性（ＡＭＤ；例えば、滲出型ＡＭＤ）である。いくつかの例では、眼疾患は地図状萎縮（ＧＡ）である。いくつかの例では、眼疾患は、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）及び／又は糖尿病性網膜症（ＤＲ；例えば、非増殖性ＤＲ（ＮＰＤＲ）又は増殖性ＤＲ（ＰＤＲ））である。
いくつかの実施形態では、第１の成分は、特に眼疾患の治療のためのＲＴＨ－２５８を含む。いくつかの例では、眼疾患は、ＡＭＤ（例えば、滲出型ＡＭＤ）である。いくつかの例では、眼疾患はＧＡである。
いくつかの実施形態では、第１の成分は、特に眼疾患の治療のために、ＥＹＬＥＡ（登録商標）（アフリベルセプト）を含む。いくつかの例では、眼疾患は、ＡＭＤ（例えば、滲出型ＡＭＤ）である。いくつかの例では、眼疾患はＧＡである。いくつかの例では、眼疾患はＤＭＥ及び／又はＤＲ（例えば、ＮＰＤＲ又はＰＤＲ）である。
いくつかの実施形態では、第１の成分は、特に眼疾患の治療のためのアビシパル ペゴルを含む。いくつかの例では、眼疾患は、ＡＭＤ（例えば、滲出型ＡＭＤ）である。いくつかの例では、眼疾患はＧＡである。
いくつかの実施形態では、第１の成分は、特に眼疾患の治療のためのＭＡＣＵＧＥＮ（登録商標）（ペガプタニブナトリウム）を含む。いくつかの例では、眼疾患は、ＡＭＤ（例えば、滲出型ＡＭＤ）である。いくつかの例では、眼疾患はＧＡである。
ｂ）抗血管形成剤
いくつかの実施形態では、第１の成分は、抗血管形成剤を含む。抗血管形成剤の非限定的な例としては、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）（ラニビズマブ）、ＲＴＨ－２５８（以前はＥＳＢ－１００８、抗ＶＥＧＦ一本鎖抗体断片；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、二重特異性抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ＲＧ－７７１６などの抗ＶＥＧＦ／抗アンギオポエチン２二重特異性抗体；Ｒｏｃｈｅ）、可溶性組換え受容体融合タンパク質（例えば、ＥＹＬＥＡ（登録商標）（アフリベルセプト）；ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ Ｅｙｅとしても知られている；Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ／Ａｖｅｎｔｉｓ）、ＶＥＧＦバリアント、可溶性ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）断片、ＶＥＧＦを遮断することができるアプタマー（例えば、抗ＶＥＧＦペグ化アプタマーＭＡＣＵＧＥＮ（登録商標）（ペガプタニブナトリウム；ＮｅＸｓｔａｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／ＯＳＩ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ））、ＶＥＧＦＲを遮断することができるアプタマー、抗ＶＥＧＦＲ抗体を中和するアプタマー、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼの小分子阻害剤、抗ＶＥＧＦ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）（例えば、アビシパル ペゴル；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ ＡＧ／Ａｌｌｅｒｇａｎ）、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦＲの発現を阻害する低分子干渉ＲＮＡ、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（例えば、４－（４－ブロモ－２－フルオロアニリノ）－６－メトキシ－７－（１－メチルピペリジン－４－イルメトキシ）キナゾリン（ＺＤ６４７４）、４－（４－フルオロ－２－メチルインドール－５－イルオキシ）－６－メトキシ－７－（３－ピロリジン－１－イルプロポキシ）キナゾリン（ＡＺＤ２１７１）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７）、セマキサミニブ（ＳＵ５４１６；ＳＵＧＥＮ）及びＳＵＴＥＮＴ（登録商標）（スニチニブ））、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
ｃ）抗血管新生剤
いくつかの実施形態では、第１の成分は、眼疾患の治療のための新生血管形成に対して活性を有する薬剤、例えば、抗炎症薬、哺乳動物のラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）阻害剤（例えば、ラパマイシン、ＡＦＩＮＩＴＯＲ（登録商標）（エベロリムス）、ＴＯＲＩＳＥＬ（登録商標）（テムシロリムス））、シクロスポリン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アンタゴニスト（例えば、抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合断片（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、及びゴリムマブ）又は可溶性受容体融合タンパク質（例えば、エタネルセプト））、抗補体剤、非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、又はそれらの組み合わせを含む。
ｄ）神経保護剤
いくつかの実施形態では、第１の成分は、神経保護的であり、疾患の進行を潜在的に減少させることができる薬剤を含む。例えば、薬剤は、萎縮型ＡＭＤから滲出型ＡＭＤへの進行を減少させ得る。神経保護剤の例には、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）（ＰＲＡＳＴＥＲＡ（商標）及びＦＩＤＥＬＩＮ（登録商標））、デヒドロエピアンドロステロン硫酸塩、及びプレグネノロン硫酸塩などの薬物を含む「神経ステロイド」と呼ばれる薬物のクラスが含まれる。
ｅ）ＰＤＧＦアンタゴニスト
いくつかの実施形態では、第１の成分は、ＰＤＧＦアンタゴニストを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦアンタゴニストは、（１）抗ＰＤＧＦ抗体（例えば、ＲＥＧＮ２１７６－３）、２）抗ＰＤＧＦ－ＢＢペグ化アプタマー（例えば、ＦＯＶＩＳＴＡ（登録商標）；Ｅ１００３０；Ｏｐｈｔｈｏｔｅｃｈ／Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、（３）可溶性ＰＤＧＦＲ受容体融合タンパク質、（４）二重ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアンタゴニスト／阻害剤（例えば、ＤＥ－１２０（Ｓａｎｔｅｎ）又はＸ－８２（ＴｙｒｏｇｅｎｅＸ））、（５）二重特異性抗ＰＤＧＦ／抗ＶＥＧＦ抗体）、（６）抗ＰＤＧＦＲ抗体、又は（７）小分子阻害剤（例えば、スクアラミン）である。
ｆ）補体系アンタゴニスト
いくつかの実施形態では、第１の成分は、補体系アンタゴニストを含む。補体系アンタゴニストの例としては、補体因子Ｃ５アンタゴニスト（例えば、小分子阻害剤（例えば、ＡＲＣ－１９０５；Ｏｐｔｈｏｔｅｃｈ））、抗Ｃ５抗体（例えば、ＬＦＧ－３１６；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、プロペルジンアンタゴニスト（例えば、抗プロペルジン抗体；ＣＬＧ－５６１；Ａｌｃｏｎ）、補体因子Ｄアンタゴニスト（例えば、抗補体因子Ｄ抗体；ランパリズマブ；Ｒｏｃｈｅ）及びＣ３ブロッキングペプチド（例えば、ＡＰＬ－２；Ａｐｐｅｌｌｉｓ）が挙げられる。
ｇ）眼疾患の治療のための承認された薬物
いくつかの実施形態では、第１の成分は、眼疾患の治療について承認されている治療薬を含む。眼疾患の治療は、下記のセクションＩＩＩで論じられる。認知されている薬物の例としては、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ステロイド（例えば、炎症及び／又は線維症の軽減のため）、抗生物質、局所眼麻酔薬、眼接着剤（例えば、術後創傷閉鎖のため）、酵素剤（硝子体手術のため）、例えば遺伝子治療技術のためのＤＮＡ又はＲＮＡ、神経保護効果を媒介する薬剤、例えばニューロトロフィンの供給、過剰なグルタミン酸刺激の遮断、Ｃａ２＋恒常性の安定化、アポトーシスの予防、ワクチン接種を介した免疫状態の調節、内因性神経保護機構の誘導、抗酸化剤、ビタミン、及びミネラルサプリメントが挙げられる。
いくつかの実施形態では、第１の成分は、特に、限定されないが、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）又はＥＹＬＥＡ（登録商標））、コルチコステロイド（例えば、コルチコステロイドインプラント、ＯＺＵＲＤＥＸ（登録商標）；デキサメタゾンＩＶＴインプラント；又はＩＬＵＶＩＥＮ（登録商標）、フルオシノロンアセトニドＩＶＴインプラント）若しくはＩＶＴ注射による投与のために製剤化されたコルチコステロイド（例えば、トリアムシノロンアセトニド）、又はそれらの組み合わせを含む眼疾患の治療のための任意の適切なＤＭＥ及び／又はＤＲ治療剤を含む。いくつかの例では、眼疾患はＤＭＥ及び／又はＤＲである。
第１の成分の状態として使用に適した眼疾患の治療のための承認された薬物の更なる例としては、限定されないが、ＶＩＳＵＤＹＮＥ（登録商標）（ベルテポルフィン；通常、非熱レーザーによる光線力学的療法と組み合わせて使用される光活性化薬）、ＰＫＣ４１２、Ｅｎｄｏｖｉｏｎ（ＮＳ３７２８；ＮｅｕｒｏＳｅａｒｃｈ Ａ／Ｓ）、神経栄養因子（例えば、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）及び毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ））、ジルチアゼム、ドルゾラミド、ＰＨＯＴＯＴＲＯＰ（登録商標）、９－ｃｉｓ－レチナール、点眼薬（例えば、ヨウ化ホスホリン、エコチオフェート、又は炭酸脱水酵素阻害剤）、ｖｅｏｖａｓｔａｔ（ＡＥ－９４１；ＡＥｔｅｒｎａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、Ｓｉｒｎａ－０２７（ＡＧＦ－７４５；Ｓｉｍａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、ニューロトロフィン（ほんの一例として、ＮＴ－４／５、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈを含む）、Ｃａｎｄ５（Ａｃｕｉｔｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＩＮＳ－３７２１７（Ｉｎｓｐｉｒｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、インテグリンアンタゴニスト（Ｊｅｒｉｎｉ ＡＧ及びＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからのものを含む）、ＥＧ－３３０６（Ａｒｋ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｌｔｄ．）、ＢＤＭ－Ｅ（ＢｉｏＤｉｅｍ Ｌｔｄ．）、サリドマイド（例えば、ＥｎｔｒｅＭｅｄ，Ｉｎｃ．によって使用される）、カルジオトロフィン－１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、２－メトキシエストラジオール（Ａｌｌｅｒｇａｎ／Ｏｃｕｌｅｘ）、ＤＬ－８２３４（Ｔｏｒａｙ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、ＮＴＣ－２００（Ｎｅｕｒｏｔｅｃｈ）、テトラチオモリブデート（ミシガン大学）、ＬＹＮ－００２（Ｌｙｎｋｅｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、微細藻類化合物（Ａｑｕａｓｅａｒｃｈ／Ａｌｂａｎｙ、Ｍｅｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、Ｄ－９１２０（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ Ｇｒｏｕｐ ｐｌｃ）、ＡＴＸ－Ｓ１０（浜松ホトニクス）、ＴＧＦ－ベータ２（Ｇｅｎｚｙｍｅ／Ｃｅｌｔｒｉｘ）、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、米国特許第７，７７１，７４２号で論じられているもの、並びにＶＥＧＦＲ阻害剤ＳＵＧＥＮ（ＳＵ５４１６）及びＰｆｉｚｅｒのＩｎｌｙｔａ、ダコミチニブ、ＬＯＲＢＲＥＮＡ（登録商標）（ロラチニブ）、ＮＸ－２７８－Ｌ（ＮｅＸｓｔａｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／Ｇｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｏｐｔ－２４（ＯＰＴＩＳ Ｆｒａｎｃｅ ＳＡ）、網膜細胞神経節神経保護剤（Ｃｏｇｅｎｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｎ－ニトロピラゾール誘導体（Ｔｅｘａｓ Ａ＆Ｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍ）、ＫＰ－１０２（Ｋｒｅｎｉｔｓｋｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、シクロスポリンＡ、光線力学的療法で使用される治療剤（例えば、ＶＩＳＵＤＹＮＥ（登録商標）；受容体標的ＰＤＴ、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ，Ｃｏ．；ＰＤＴを伴う注射用ポルフィマーナトリウム；ベルテポルフィン、ＱＬＴ Ｉｎｃ．；ＰＤＴを伴うロスタポルフィン、Ｍｉｒａｖｅｎｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ＰＤＴを伴うタラポルフィンナトリウム、Ｎｉｐｐｏｎ Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ；及びモテキサフィンルテチウム、Ｐｈａｒｍａｃｙｃｌｏｓ，Ｉｎｃ．）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（例として、Ｎｏｖａｇａｌｉ Ｐｈａｒｍａ ＳＡ及びＩＳＩＳ－１３６５０、Ｉｏｎｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって試験された製品を含む）、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
いくつかの実施形態では、第１の成分は、組織因子アンタゴニスト（例えば、ｈＩ－ｃｏｎ１；Ｉｃｏｎｉｃ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、アルファ－アドレナリン作動性受容体アゴニスト（例えば、ブリモニジン酒石酸塩；Ａｌｌｅｒｇａｎ）、ペプチドワクチン（例えば、Ｓ－６４６２４０；Ｓｈｉｏｎｏｇｉ）、アミロイドベータアンタゴニスト（例えば、抗βアミロイドモノクローナル抗体；ＧＳＫ－９３３７７６）、Ｓ１Ｐアンタゴニスト（例えば、抗Ｓ１Ｐ抗体；ｉＳＯＮＥＰ（商標）；Ｌｐａｔｈ Ｉｎｃ）、ＲＯＢＯ４アンタゴニスト、抗ＲＯＢＯ４抗体（例えば、ＤＳ－７０８０ａ；Ｄａｉｉｃｈｉ Ｓａｎｋｙｏ）を含む。
いくつかの実施形態では、第１の成分は、トリプトファン－ｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｒｐＲＳ）、スクアラミン、ＲＥＴＡＡＮＥ（登録商標）（デポー懸濁液用の酢酸アカンノルタベ；Ａｌｃｏｎ，Ｉｎｃ．）、コンブレタスタチンＡ４プロドラッグ（ＣＡ４Ｐ）、ＭＩＦＥＰＲＥＸ（登録商標）（ミフェプリストン－ｒｕ４８６）、サブテノントリアムシノロンアセトニド、ＩＶＴ結晶性トリアムシノロンアセトニド、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤（例えば、プリノマスタット；ＡＧ ３３４０；Ｐｆｉｚｅｒ）、フルオシノロンアセトニド（フルオシノロン眼内インプラントを含む；Ｂａｕｓｃｈ＆Ｌｏｍｂ／制御送達システム）、リノミド、インテグリンβ３機能の阻害剤、アンギオスタチン、及びそれらの組み合わせを含む。これら及び他の治療薬は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第２０１４／００１７２４４号に記載されている。
３．抗体及び抗原結合断片
いくつかの実施形態では、第１の成分は、抗原に結合することができる抗体又はその抗原結合断片を含むか、又はそれに由来する。無関係な非標的タンパク質への抗体又は抗原結合断片の結合の程度は、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した場合に、標的への抗体の結合の約１０％未満である。特定の態様では、標的に結合する抗体又は抗原結合断片は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例え１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。抗体又はその抗原結合断片は、抗体が１μＭ以下のＫＤを有する場合に標的に「特異的に結合する」と言われる。
いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、二重特異性抗体、少なくともＦｃドメインを欠く抗体、Ｆａｂ断片、（Ｆａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、ＶｈＨ断片、ｓｃＦｖ断片、ｓｃＦｖ－Ｆｃ断片、又はミニボディを含む。
いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、眼内に存在する抗原に結合する。いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ＶＥＧＦ、ＨｔｒＡ１、ＩＬ－３３、Ｃ５、Ｐ因子、Ｄ因子、ＥＰＯ、ＥＰＯＲ、ＩＬ－１β、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１０、ＴＮＦα、ＦＧＦＲ２、ＰＤＧＦ、又はＡＮＧ２に結合し得る。
いくつかの実施形態では、第１の成分は、抗ＶＥＧＦ抗体若しくは抗体結合断片、抗ＰＤＧＦ抗体若しくは抗体結合断片、抗ＡＮＧ２抗体若しくは抗体結合断片、又は抗ＩＬ－１β抗体若しくは抗体結合断片である。ＶＥＧＦに結合する抗体の例としては、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）（ラニビズマブ）、Ｅｙｌｅａ（登録商標）（アフリベルセプト）、Ｂｅｏｖｕ（登録商標）（ブロルシズマブ－ｄｂｌ）及びＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）（ベバシズマブ）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、抗体は二重特異性抗体を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２二重特異性抗体、例えばＲＧ－７７１６、又は国際公開第２０１０／０６９５３２号若しくは国際公開第２０１６／０７３１５７号に開示されている任意の二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２二重特異性抗体、又はそのバリアントである。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は抗ＶＰＤＦ抗体、すなわち抗ＶＥＧＦ及び抗ＰＤＧＦ ｄｕｔａＦａｂ抗体である。
いくつかの実施形態では、第１の成分は抗ＩＬ－６抗体、例えばＥＢＩ－０３１（Ｅｌｅｖｅｎ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ；例えば、国際公開第２０１６／０７３８９０号を参照）、シルツキシマブ（ＳＹＬＶＡＮＴ（登録商標））、オロキズマブ、クラザキズマブ、シルクマブ、エルシリモマブ、ＯＰＲ－００３、ＭＥＤＩ５１１７、ＰＦ－０４２３６９２１、又はそれらのバリアントである。
いくつかの実施形態では、第１の成分は、抗ＩＬ－６Ｒ抗体、例えば、トシリズマブ（ＡＣＴＥＭＲＡ（登録商標））（例えば、国際公開第１９９２／０１９５７９号を参照）、サリルマブ、ＡＬＸ－００６１、ＳＡ２３７又はそれらのバリアントである。
いくつかの実施形態では、第１の成分はＲａｂＦａｂであり、これは、ヒトｃＭＥＴ受容体の細胞内ドメインに由来するリン酸化ペプチドに対してウサギにおいて惹起された親モノクローナル抗体（Ｇ１０）に由来する抗原結合性Ｆａｂ断片であり、したがって、眼における細胞外標的には結合しない。Ｓｈａｔｚ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．，１３（９）：２９９６－３００３（２０１６）．
いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、抗体又はその抗原結合断片ではないペプチド又はポリペプチドを含む。
４．成長因子
いくつかの実施形態では、第１の成分は成長因子を含む。いくつかの実施形態では、成長因子は、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、神経成長因子（ＮＧＦ）、ＶＥＧＦ、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、及びインスリン様成長因子－Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ）を含む。
５．システインノットペプチド
いくつかの実施形態では、第１の成分はシステインノットペプチドを含む。いくつかの実施形態では、システインノットペプチドは、配列番号９２（システインノットペプチド配列）と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を含む。
システインノットペプチドは、上記のセクションＩＩ．Ａ．２～上記のセクションＩＩ．Ａ．４で論じられた例示的な第１の成分のいずれかを含む、第１の成分を形成するために別の分子に共有結合され得る。いくつかの実施形態では、第１の成分は、抗ＶＥＧＦ抗原結合断片に共有結合したシステインノットペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、ＨＡＢＤ（すなわち、第２の成分）は、システインノットペプチドで第１の成分に共有結合している。いくつかの実施形態では、共有結合性リンカーは、配列番号９５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、共有結合性リンカーは、配列ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号９５）を含む。いくつかの実施形態では、システインノットペプチドは、Ｃ末端ｈｉｓタグ（配列番号２９）でＶＧ１に共有結合している。いくつかの実施形態では、システインノットペプチドは、Ｉｇドメイン欠失及びＣ末端ｈｉｓタグ（配列番号３２）でＶＧ１に共有結合している。いくつかの実施形態では、システインノットペプチドは、Ｎ末端ｈｉｓタグでＶＧ１に共有結合している。いくつかの実施形態では、システインノットペプチドは、Ｉｇドメイン欠失及びＮ末端ｈｉｓタグを有するＶＧ１に共有結合している。
Ｂ．第２の成分－ヒアルロナン結合ドメイン（ＨＡＢＤ）
多くの実施形態では、第２の成分は、ＨＡ結合タンパク質（ＨＡ結合ドメインを含む；ＨＡＢＤ）を含むか、又はそれに由来する。いくつかの実施形態では、第２の成分はＨＡＢＤを含む。ＨＡＢＤを含むタンパク質の例としては、ＣＤ４４、腫瘍壊死因子刺激遺伝子６（ＴＳＧ６）、バーシカン、脳特異的リンクタンパク質（ＢＲＡＬ１）、リンパ管内皮ヒアルロナン受容体－１（ＬＹＶＥ－１）及びアグリカンが挙げられる。
いくつかの実施形態では、２つの第２の成分は異なっていても同一であってもよい。例えば、治療用分子は、２つの異なるドメインの対を形成するために、第２の成分として、２つのＣＤ４４ドメイン、２つのＴＳＧ－６ドメイン、２つのＶＧ１ドメイン、又は前述のドメインの任意の組み合わせを含み得る。
眼は、角膜、眼房水、水晶体、硝子体液、網膜、網膜色素上皮、及び脈絡膜を含むいくつかの別個の区画を有する複雑な組織である。区画は、ＨＡなどの細胞外高分子を含む。
「ヒアルロナン結合タンパク質」又は「ＨＡ結合タンパク質」という用語は、ＨＡに結合するタンパク質又はタンパク質のファミリーを指す。典型的には、これらのＨＡ結合タンパク質はＨＡＢＤを含む。様々なＨＡ結合分子が当技術分野で周知であり、これらは第２の成分として使用され得る（例えば、Ｄａｙ，ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ ２７７：４５８５及びＹａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＥＭＢＯ Ｊ １３：２８６－２９６を参照）。例示的なＨＡ結合タンパク質としては、ＣＤ４４、ＬＹＶＥ－１、アグリカン、バーシカン、ブレビカン、ニューロカン、ヒアルロナン結合タンパク質１（ＨＡＢＰ１；Ｃ１ｑＢＰ／Ｃ１ｑＲ及びｐ３２としても知られる）、ＨＡＰＬＮ１（リンクタンパク質及びＣＲＴＬ１としても公知である）、ヒアルロナン及びプロテオグリカンリンクタンパク質４（ＨＡＰＬＮ４；脳リンクタンパク質２としても知られている）、レイリン、スタビリン－１、スタビリン－２、脳特異的連結タンパク質（ＢＲＡＬ１）、又は腫瘍壊死因子刺激遺伝子－６（ＴＳＧ－６）、ＲＨＡ Ｍ、細菌ＨＡ合成酵素、及びコラーゲンＶＩが挙げられる。
多くのＨＡ結合タンパク質及びペプチド断片は、ＨＡ結合に関与する約１００アミノ酸長の共通構造ドメインを含有し、構造ドメインは、「リンクドメイン」と呼ばれる（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ １３：２，２８６－２９６（１９９４）、及びＭａｈｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ ２７６：２５，２２７６４－２２７７１（２００１））。任意のそのようなタンパク質が本発明において使用され得る。上記の例示的なタンパク質などの任意のＨＡ結合タンパク質のＨＡＢＤは、ＨＡに結合する能力を付与するために第２の成分に含まれ得る。好ましくは、第２の成分は、ＣＤ４４（ＣＤ４４）ドメイン、脳特異的リンクタンパク質（ＢＲＡＬ１）ドメイン、腫瘍壊死因子刺激遺伝子６（ＴＳＧ－６）ドメイン、リンパ管内皮ヒアルロナン受容体１（ＬＹＶＥ－１）ドメイン、ヒアルロナン結合タンパク質（ＨＡＢＰ）ドメイン、アグリカンＧ１（ＡＧ１）ドメイン、又はバーシカンＧ１（ＶＧ１）ドメインを含む。眼に使用するためのペプチドタグを含む例示的かつ適切なＨＡ結合分子は、国際公開第２０１４／９９９９７号及び国際公開第２０１５／１９８２４号に記載されており、それらの全体が参照により組み込まれる。本明細書に記載されている配列のいずれも本発明で使用することができる。
いくつかの実施形態では、第２の成分は、眼からの第１の成分のクリアランスを減少させ、それによってその眼半減期を増加させるために、第１の成分に共有結合している。第１の成分は、眼疾患においてより長い眼保持及び／又はより長い作用持続時間を有することから利益を得ることができる。
さらに、第２の成分は、ＨＡを含む第３の成分に非共有結合してコンジュゲートを形成し得る。いくつかの実施形態では、コンジュゲート中の各第２の成分は、別々のＨＡ分子に結合し得る。いくつかの実施形態では、２つ以上の第２の成分が同じＨＡ分子に結合し得る。
多くの実施形態では、ＨＡに対するＨＡＢＤの結合親和性は、いくつかの範囲内にあり得、結合親和性は、治療活性剤の作用機序に応じて調節され得る。例えば、作用部位が硝子体液中にある場合、高い結合親和性は、生物学的薬剤を硝子体液内に保持するのに役立ち得る。作用部位が代わりに網膜にある場合、より低い結合親和性は、生物学的薬剤が硝子体液を横切って網膜に到達するのを助けることができる。
多くの実施形態では、ＨＡＢＤは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を含む方法を使用して測定することができるＨＡに対する結合親和性を有する。理論に拘束されるものではないが、いくつかの実施形態では、ＨＡに対するＨＡＢＤの結合親和性（ＫＤ）の範囲は、１０ｎＭ～１０μＭ、５ｎＭ～１０ｎＭ、及び１００ｎＭ～５μＭを含む。
多くの実施形態では、ＨＡとのＨＡＢＤの相互作用を観察することができる。いくつかの実施形態では、相互作用が、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）を含む方法を使用して観察される。ＦＣＳでは、溶液の小体積部分の蛍光強度を監視することによって分子の拡散を決定することができる。蛍光強度は分子の動きによって変動し、これらの変動の定量的分析は分子の拡散時間をもたらすことができる。適切な分光特性を有する蛍光色素を使用することにより、生体マトリックス中の拡散を決定することができる。いくつかの実施形態では、ＦＣＳによる観察は、ＳＰＲによる測定と相関する。
いくつかの実施形態では、ＨＡＢＤは、その起源タンパク質と比較した場合に野生型である配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＡＢＤは、その起源のタンパク質と比較した場合、そのタンパク質配列に１つ以上の変異を含み得る。多くの実施形態では、これらの変異は、単一アミノ酸置換、二重アミノ酸置換、付加、欠失及び短縮を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＡＢＤは、単一又は二重のアミノ酸置換を含む。多くの例では、置換は、アミノ酸置換が元のアミノ酸を類似の生化学的特性を有する異なるアミノ酸に変化させる保存的突然変異を含み得る。他の例では、置換は、アミノ酸置換が元のアミノ酸を異なる生化学的特性を有する異なるアミノ酸に変化させる非保存的突然変異を含み得る。
いくつかの実施形態では、ＨＡＢＤは、ＨＡ結合に寄与するアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、これらのアミノ酸は、ＨＡ結合親和性を維持するために保存され得る。いくつかの実施形態では、これらのアミノ酸は、所望の親和性及び長時間作用型治療薬に所望の持続時間に応じて、ＨＡ結合親和性を変化させるために置換され得る。
いくつかの実施形態では、ＨＡＢＤは、ＨＡＢＤ及び／又は治療用分子の熱安定性に寄与するアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、これらのアミノ酸は主な熱安定性まで保存され得る。いくつかの実施形態では、これらのアミノ酸は、熱安定性を変化させるために置換され得る。
いくつかの実施形態では、ＨＡＢＤは、本明細書に開示される参照配列の１つと比較して、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、又は少なくとも５つの変異を含む。いくつかの実施形態では、ＨＡＢＤは１～３個の変異を含み、１～３個の変異は独立して、単一アミノ酸置換、二重アミノ酸置換、付加、欠失、及び短縮を含む。いくつかの実施形態では、ＨＡＢＤは１～５個の突然変異を含み、１～５個の突然変異は独立して、単一アミノ酸置換、二重アミノ酸置換、付加、欠失、及び短縮を含む。
いくつかの実施形態では、第２の成分は、ＣＤ４４、ＴＳＧ６、又はバーシカンを含むか、又はそれらに由来する。いくつかの実施形態では、第２の成分は、ＣＤ４４ドメイン、ＴＳＧ６ドメイン又はバーシカンドメインを含む。
１．ＣＤ４４
いくつかの実施形態では、第２の成分は、ＣＤ４４（配列番号１）に由来する。ＣＤ４４受容体は、リンクドメイン、ＧＡＧ結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含む。選択的スプライシングによって処理される異なるモジュール組成物を有するいくつかのアイソフォームが記載されている。いくつかの実施形態では、第２の成分はＣＤ４４ ＨＡ受容体ドメインに由来するか、又はＣＤ４４ ＨＡ受容体ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第２の成分は、配列番号２に由来するか、又はそれを含む。
２．腫瘍壊死因子刺激遺伝子－６（ＴＳＧ６）
いくつかの実施形態では、第２の成分はＴＳＧ６に由来する。ＴＮＦＡＩＰ６としても公知のＴＳＧ－６は、ＨＡ結合リンクドメインとそれに続くＣＵＢドメインから構成される。いくつかの実施形態では、第２の成分は、ＴＳＧ６ ＨＡ結合リンクドメインに由来するか、又はＴＳＧ６ ＨＡ結合リンクドメインを含む。いくつかの実施形態では、第２の成分は、配列番号４に由来するか、又はそれを含む。
３．バーシカン
いくつかの実施形態では、第２の成分はバーシカンに由来する。バーシカンは、以下のドメインを含む：ＶＧ１、ＧＡＧ結合ドメイン及びＧ３ドメイン（図８Ａ）。ＶＧ１ドメイン（配列番号２９）は、Ｉｇドメイン、Ｌｉｎｋ１及びＬｉｎｋ２を含む（図８Ａ）。いくつかの実施形態では、第２の成分は、Ｌｉｎｋ１（配列番号３０）及び／又はＬｉｎｋ２（配列番号３１）を含み、Ｌｉｎｋ１及び／又はＬｉｎｋ２はＨＡに結合することができる。
ａ）野生型ＶＧ１
いくつかの実施形態では、ＨＡＢＤは、配列番号２９に示されるアミノ酸配列を有する野生型（ＷＴ）ＶＧ１を含む。いくつかの実施形態では、ＨＡＢＤは、Ｌｉｎｋ１（配列番号３０）及び／又はＬｉｎｋ２（配列番号３１）に記載のアミノ酸配列を含む。
ｂ）変異体ＶＧ１
いくつかの実施形態では、ＨＡＢＤは変異体ＶＧ１を含む。多くの実施形態では、ＶＧ１変異は、配列番号２９（ＷＴ ＶＧ１）、３２（ＶＧ１ΔＩｇ）、６０（ＷＴ ＶＧ１コンセンサス配列）又は８６（ＶＧ１ΔＩｇコンセンサス配列）に示すアミノ酸配列に対するものである。いくつかの実施形態では、ＨＡＢＤは、配列番号２９（ＷＴ ＶＧ１）、３２（ＶＧ１ΔＩｇ）、６０（ＷＴ ＶＧ１コンセンサス配列）、又は８６（ＶＧ１ΔＩｇコンセンサス配列）と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＡＢＤは、配列番号２９（ＷＴ ＶＧ１）、３２（ＶＧ１ΔＩｇ）、６０（ＷＴ ＶＧ１コンセンサス配列）、又は８６（ＶＧ１ΔＩｇコンセンサス配列）と少なくとも９５％同一の配列を含む。
ｃ）短縮型ＶＧ１
いくつかの実施形態では、ＨＡＢＤは、配列番号２９（ＷＴ ＶＧ１）又は６０（ＷＴ ＶＧ１コンセンサス配列）と比較して短縮型変異を含む。いくつかの実施形態では、ＨＡＢＤは、バーシカンのＮ末端から１～１２９アミノ酸の短縮を含む。いくつかの実施形態では、ＨＡＢＤは、野生型バーシカンのＩｇドメインが存在しない短縮型配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＡＢＤは、配列番号３２（ＶＧ１ΔＩｇ）又は８６（ＶＧ１ΔＩｇコンセンサス配列）と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＡＢＤは、配列番号３２（ＶＧ１ΔＩｇ）又は８６（ＶＧ１ΔＩｇコンセンサス配列）と少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＡＢＤは、配列番号３２（ＶＧ１ΔＩｇ）を含む。
ｄ）アミノ酸置換
いくつかの実施形態では、ＨＡＢＤは、配列番号２９と比較して以下のアミノ酸：Ｒ１６０、Ｙ１６１、Ｅ１９４、Ｄ１９７、Ｙ２０８、Ｒ２１４、Ｙ２３０、Ｆ２６１、Ｄ２９５及びＲ２３３の少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、ＨＡＢＤは、配列番号２９と比較して、以下のアミノ酸：Ｒ１６０、Ｙ１６１、Ｅ１９４、Ｄ１９７、Ｙ２０８、Ｒ２１４、Ｙ２３０、Ｆ２６１、Ｄ２９５及びＲ２３３のうち２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＡＢＤは、ＨＡ結合親和性を増加又は減少させるために野生型と比較して変異され得るアミノ酸を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＡＢＤは、配列番号２９に対して以下の位置：Ｒ１６０、Ｙ１６１、Ｅ１９４、Ｄ１９７、Ｙ２０８、Ｒ２１４、Ｍ２２２、Ｙ２３０、Ｒ２３３、Ｋ２６０、Ｆ２６１、Ｄ２９５、Ｙ２９６、Ｈ３０６、Ｒ３１２、Ｌ３２５、Ｙ３２６、及びＲ３２７の少なくとも１つに変異を含む。いくつかの実施形態では、ＨＡＢＤは、配列番号２９に対する以下の位置：Ｒ１６０、Ｙ１６１、Ｅ１９４、Ｄ１９７、Ｙ２０８、Ｒ２１４、Ｍ２２２、Ｙ２３０、Ｒ２３３、Ｋ２６０、Ｆ２６１、Ｄ２９５、Ｙ２９６、Ｈ３０６、Ｒ３１２、Ｌ３２５、Ｙ３２６、及びＲ３２７のうち２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８個に変異を含む。いくつかの実施形態では、ＨＡＢＤは、配列番号２９に対して以下の位置：Ｒ１６０、Ｙ１６１、Ｅ１９４、Ｄ１９７、Ｙ２０８、Ｒ２１４、Ｍ２２２、Ｙ２３０、Ｒ２３３、Ｋ２６０、Ｆ２６１、Ｄ２９５、Ｙ２９６、Ｈ３０６、Ｒ３１２、Ｌ３２５、Ｙ３２６、及びＲ３２７のうち２、３、４、５、又は６個に変異を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＡＢＤは、配列番号２９と比較して、以下の変異：Ｒ１６０Ａ、Ｙ１６１Ａ、Ｄ１９７Ａ、Ｄ１９７Ｓ、Ｙ２０８Ａ、Ｙ２０８Ｆ、Ｒ２１４Ｋ、Ｍ２２２Ａ、Ｙ２３０Ａ、Ｙ２３０Ｆ、Ｒ２３３Ａ、Ｋ２６０Ａ、Ｋ２６０Ｒ、Ｆ２６１Ｙ、ＫＦ２６０ＲＹ、Ｄ２９５Ａ、Ｄ２９５Ｓ、Ｙ２９６Ａ、Ｙ２９６Ｆ、ＤＹ２９５ＳＦ、Ｈ３０６Ａ、Ｒ３１２Ａ、Ｌ３２５Ａ、Ｙ３２６Ａ、Ｒ３２７Ａ、及びＬＹＲ３２５ＬＦＫの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、ＨＡＢＤは、Ｙ２０８Ａ及びＨ３０６Ａの少なくとも１つを含む。
いくつかの実施形態では、ＨＡＢＤは、配列番号２９と比較して、以下の変異：Ｒ１６０Ａ、Ｙ１６１Ａ、Ｄ１９７Ａ、Ｄ１９７Ｓ、Ｙ２０８Ａ、Ｙ２０８Ｆ、Ｒ２１４Ｋ、Ｍ２２２Ａ、Ｙ２３０Ａ、Ｙ２３０Ｆ、Ｒ２３３Ａ、Ｋ２６０Ａ、Ｋ２６０Ｒ、Ｆ２６１Ｙ、ＫＦ２６０ＲＹ、Ｄ２９５Ａ、Ｄ２９５Ｓ、Ｙ２９６Ａ、Ｙ２９６Ｆ、ＤＹ２９５ＳＦ、Ｈ３０６Ａ、Ｒ３１２Ａ、Ｌ３２５Ａ、Ｙ３２６Ａ、Ｒ３２７Ａ、及びＬＹＲ３２５ＬＦＫのうち少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個を含む。いくつかの実施形態では、ＨＡＢＤは、配列番号２９と比較して、以下の変異：Ｒ１６０Ａ、Ｙ１６１Ａ、Ｄ１９７Ａ、Ｄ１９７Ｓ、Ｙ２０８Ａ、Ｙ２０８Ｆ、Ｒ２１４Ｋ、Ｍ２２２Ａ、Ｙ２３０Ａ、Ｙ２３０Ｆ、Ｒ２３３Ａ、Ｋ２６０Ａ、Ｋ２６０Ｒ、Ｆ２６１Ｙ、ＫＦ２６０ＲＹ、Ｄ２９５Ａ、Ｄ２９５Ｓ、Ｙ２９６Ａ、Ｙ２９６Ｆ、ＤＹ２９５ＳＦ、Ｈ３０６Ａ、Ｒ３１２Ａ、Ｌ３２５Ａ、Ｙ３２６Ａ、Ｒ３２７Ａ、及びＬＹＲ３２５ＬＦＫのうち少なくとも２、３、４、５、又は６個を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＡＢＤは、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、又は配列番号５９である。
４．脳特異的リンクタンパク質（ＢＲＡＬ１）
いくつかの実施形態では、第２の成分は、ＢＲＡＬ１に由来する。ＢＲＡＬ１は、免疫グロブリンドメイン、リンクドメインモジュール１、及びリンクドメインモジュール２を含む。リンクドメインモジュール１及び２はＨＡに結合することができる。いくつかの実施形態では、第２の成分は、ＢＲＡＬ１からのリンクドメインリンクドメインモジュール１及び／又はリンクドメインモジュール２を含む。
５．リンパ管内皮ヒアルロナン受容体－１（ＬＹＶＥ－１）
いくつかの実施形態では、第２の成分は、ＬＹＶＥ－１に由来する。ＬＹＶＥ－１は、ＨＡに結合するリンクドメインを含むＣＤ４４のホモログである。いくつかの実施形態では、第２の成分は、ＬＹＶＥ－１由来のリンクドメインを含む。
６．アグリカン
いくつかの実施形態では、第２の成分はアグリカンに由来する。アグリカンは３つの球状ドメインを含み、Ｇ１ドメインは連結タンパク質の構造モチーフを有してＨＡと相互作用し、Ｇ２ドメインはＧ１ドメインと相同であって産生プロセシングに関与し、Ｇ３ドメインはコアタンパク質のカルボキシル末端を構成する。いくつかの実施形態では、第２の成分は、アグリカン由来のＧ１ドメインを含む。
Ｃ．第３の成分－ヒアルロナン（ＨＡ）
いくつかの実施形態では、治療用分子は、１つ以上の第３の成分を更に含む。いくつかの実施形態では、第３の成分はＨＡを含む。いくつかの実施形態では、治療用分子（第１及び第２の成分を含む）をＨＡと予め複合体化してコンジュゲートを形成する。いくつかの実施形態では、第３の成分は、５ｋＤａ～２０ｋＤａの分子量のＨＡである。
いくつかの実施形態では、治療用分子の第２の成分は、第３の成分に非共有結合してコンジュゲートを形成する。いくつかの実施形態では、治療用分子の第２の成分は、第３の成分に共有結合してコンジュゲートを形成する。
好ましくは、第１の成分に共有結合した第２の成分は、１０．０μＭ以下のＫＤで第３の成分（すなわち、ヒアルロナン）に結合する。例えば、第２の成分は、９．０μＭ、８．０μＭ、７．０μＭ、６．０μＭ、５．０μＭ、４．０μＭ、３．０μＭ、２．０μＭ、１．５μＭ、１．０μＭ又は０．５μＭ以下のＫＤでＨＡに結合することができる。
１．ヒアルロナン（ＨＡ）
ヒアルロナン（ＨＡ）は、細胞外マトリックス及び細胞表面に存在する直鎖状グリコサミノグリカンである。ＨＡは、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮａｃ）及びグルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）の反復二糖単位を含有し、これらは、交互のβ１→３グルクロニド結合及びβ１→４グルコサミニド結合によって連結され、直鎖状ポリマーを形成する。ＨＡは、Ｎｅｃａｓ ｅｔ ａｌ，２００８，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｎｉ Ｍｅｄｉｃｉｎａ，５３：３９７－４１１に更に記載されている。グリコサミノグリカンは、全ての脊椎動物の細胞外マトリックス中に遍在的に存在し、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）のいくつかの株の莢膜中にも存在する。機能的には、ＨＡ分子は、細胞接着に関与し、細胞遊走を支援する組織中の高度に水和した細胞外マトリックスの維持に重要である。硝子体液は、眼の中心部分における水分及び構造の保持に優れているため、水の他に主にＨＡから構成される。それは、眼を潤滑状態に保ち、失われた水分を補充するのに役立つ。ＨＡはまた、ＣＤ４４及びリンパ管内皮ヒアルロナン受容体－１（ＬＹＶＥ－１）などの多数のＨＡ結合タンパク質及び細胞表面受容体と相互作用することによって多様な生物学的機能を示す。ＨＡ結合タンパク質及びＨＡＢＤの例は、上記のセクションＩＩ．Ｂで論じられる。
ＨＡは、１，０００～１０，０００，０００Ｄａの広い分子量範囲を有する。組織中の天然高分子量ＨＡは、リンパ系、リンパ節、肝臓及び腎臓を通る代謝経路中に小分子に分解する。一方、ＨＡの半減期は血漿中で約２．５～５．５分であることが知られているが、眼の硝子体内では約７０日と報告されている。ＨＡの独特の物理化学的特性及び様々な生物学的機能は、薬物送達、関節炎治療、眼科手術及び組織工学などのその広範な生物医学的用途をもたらした。特に、ＨＡは、様々な送達経路を介した生物／医薬品の標的特異的及び長期送達のために広く研究されてきた。その粘弾性及び粘膜付着特性を利用して、ＨＡは局所眼科薬の有効な送達担体として利用されてきた。
規定のサイズのＨＡが本発明において特に好適であることが示されている。これによれば、ＨＡは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８若しくは９ｋＤａの分子量及び／又は最大６０、５０、４０、３０、２５、２０若しくは１５ｋＤａの分子量を有し得る。分子量の特に適切な範囲は、３ｋＤａ～６０ｋＤａ、特に４ｋＤａ～３０ｋＤａ、より具体的には５ｋＤａ～２０ｋＤａである。
いくつかの実施形態では、未修飾の天然に存在するＨＡの使用が好ましい。これらの実施形態では、未修飾の天然に存在するＨＡの使用は副作用を減少させる。例えば、ＨＡＢＤと１０ｋＤａのＨＡとのプレ複合体化は、硝子体液中のｉｎ ｖｉｔｒｏでの沈殿を減少させ、ブタ及びウサギで観察される眼毒性を軽減するＨＡＢＤがＴＳＧ－６又はＣＤ４４である他の例では、ＴＳＧ－６又はＣＤ４４がＨＡとプレ複合体でない場合、炎症及び網膜などの眼毒性が観察された。
いくつかの実施形態では、ＨＡは、限定されないが、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸マグネシウム及びヒアルロン酸カルシウムを含むヒアルロン酸塩である。
いくつかの実施形態では、ＨＡは小さな化学修飾を有し得る。化学修飾は、ＨＡ分解の低減、水溶性の増加又は減少、ＨＡ拡散速度の変更、及び／又はＨＡ粘度の変更に有用であり得る。ＨＡを化学的に修飾するための２つの一般的なアプローチ、すなわち、（１）機能性化学試薬を使用した架橋ＨＡ、及び（２）単官能試薬を使用したＨＡのカップリングが当技術分野で公知である。ジビニルスルホン、ビスエポキシド、ホルムアルデヒド及びビシャリドは、ＨＡを架橋するために使用されている二官能性試薬である。化学修飾ＨＡ調製物としては、限定されないが、アミノエチルメタクリレート化ＨＡ、アジピン酸ジヒドラジドグラフト化ＨＡ、ジメチルエーテル錯体化ＨＡ、ＨＡ－システインエチルエステル、尿素架橋ＨＡ及びＮ－アセチルシステインＨＡが挙げられる。特に興味深いのは、眼におけるＨＡのＨＡ分解を減少させる修飾である。
２．コンジュゲートを形成するための治療用分子とヒアルロナン（ＨＡ）とのプレ複合体化
いくつかの実施形態では、治療用分子をＨＡと予め複合体化してコンジュゲートを形成する。以下の実施例５で論じるように、治療用分子に含まれる遊離ＨＡＢＤの初期濃度は注射部位で高く、有害作用を引き起こす可能性がある。いくつかの例では、これらの効果は、遊離ＨＡＢＤが注射部位でＩＶＴ ＨＡと接触することによって引き起こされ得る。ＨＡＢＤとＨＡのプレ複合体化は、ＨＡＢＤが注射部位から硝子体の残りの部分に拡散する時間を与えることによって、これらの有害な影響を減少させる。ＨＡＢＤが予め複合体化したＨＡとの相互作用からＩＶＴ ＨＡに切り替わると、拡散時間の遅延及び硝子体半減期の増加が起こる。したがって、いくつかの実施形態では、治療用分子は、当該治療用分子を含み、ＨＡを含む１つ以上の第３の成分を更に含むコンジュゲートである。
いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、治療用分子とＨＡとの間の非共有結合性相互作用を含む。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、治療用分子とＨＡとの間の共有結合相互作用を含む。
いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、単離されたコンジュゲートであってもよく、すなわち、コンジュゲートは、治療される個体内にはない。いくつかの態様では、コンジュゲートは、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、及びキャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）によって決定される、９５％超又は９９％超の純度まで精製される。抗体精製を評価するための方法の総説については、例えばＦｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ ８４８：７９－８７（２００７）を参照されたい。
Ｄ．融合タンパク質
いくつかの実施形態では、第１及び第２の成分はタンパク質であり、より好ましくは融合タンパク質に含まれており、第１の成分と第２の成分とは、共有結合性リンカーを介して連結されている。
融合タンパク質は、２つ以上の元々別個のタンパク質又はペプチドの結合によって作製されるタンパク質である。この手順は、元の別個のタンパク質のそれぞれに由来する機能的特性を有する単一のポリペプチドをもたらす。タンパク質は、互いに直接融合され得る。タンパク質はまた、リンカーを介して融合されてもよく、これにより、タンパク質が互いに独立して折り畳まれ、それらの天然の状態のそれぞれにおいて予想通りに挙動する可能性を高め得る。二量体又は多量体融合タンパク質は、タンパク質複合体形成を誘導するペプチドドメインの元のタンパク質への（例えば、抗体ドメインとの）融合によって遺伝子工学によって製造することができる。
いくつかの実施形態では、第２の成分は、第１の成分に直接結合している。これは、２つの成分の間に更なる化学元素（原子又は基）が存在することなく、第２の成分が第１の成分に直接続く（又はその逆）ことを意味する。いくつかの実施形態では、第１の成分の最後のアミノ酸は、第２の成分の第１のアミノ酸に直接隣接している。いくつかの実施形態では、第２の成分の最後のアミノ酸は、第１の成分の第１のアミノ酸に直接隣接している。
いくつかの実施形態では、第２の成分は、リンカー、特にペプチドリンカーを介して第１の成分に間接的に結合される。いくつかの実施形態では、これは、ペプチドリンカーが第１の成分と第２の成分との間にあることを意味する。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、第１の成分の最後のアミノ酸と第２の成分の最初のアミノ酸との間にある。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、第２の成分の最後のアミノ酸と第１の成分の最初のアミノ酸との間にある。
いくつかの実施形態では、１つ又は２つの第２の成分は、第１の成分のＮ末端及び／又はＣ末端に共有結合している。いくつかの実施形態では、第１の成分は抗体又は抗原結合断片であり、１つ又は２つの第２の成分は、第１の成分のＣ末端に（直接又はペプチドリンカーを介して）共有結合している。融合タンパク質がＦａｂ－ＨＡＢＤである実施形態では、ＨＡＢＤはＦａｂのＣ末端に共有結合している。
１．ペプチドリンカー
多くの実施形態では、ペプチドリンカーは、治療活性剤（すなわち、第１の成分）とＨＡＢＤ（すなわち、第２の成分）とを接続する。いくつかの実施形態では、リンカーは少なくとも４個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは４～２５個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは５～１００個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、１０個～５０個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは２５アミノ酸以下である。いくつかの実施形態では、リンカーは５０アミノ酸以下である。
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、隣接するタンパク質ドメインが互いに対して自由に動くことができるように、グリシン及びセリンなどの柔軟な残基を含む。したがって、いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーはグリシン－セリンリンカー、すなわちグリシン及びセリン残基のパターンからなるペプチドリンカーである。一実施形態では、当該ペプチドリンカーは、（ＧｘＳ）ｎ又は（ＧｘＳ）ｎＧｍであり、式中、Ｇ＝グリシン及びＳ＝セリンである。これらの実施形態では、ｘ＝３、ｎ＝３、４、５又は６、且つｍ＝０、１、２又は３である。他の実施形態では、ｘ＝４、ｎ＝２、３、４又は５、且つｍ＝０、１、２又は３である。いくつかの実施形態では、ｘ＝４、且つｎ＝２又は３である。いくつかの実施形態では、ｘ＝４、且つｎ＝２である。
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号２７）又はその多量体、中でも（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号２８）から構成される。
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは（ＧＳ）ｎを含み、式中、Ｇはグリシンであり、Ｓはセリンである。これらの実施形態では、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である。いくつかの実施形態では、ｎ＝１０である。いくつかの実施形態では、リンカーは配列番号９５である。
Ｅ．治療用分子及びコンジュゲートの特定の実施形態
１．ＶＥＧＦ
いくつかの実施形態では、治療用分子は、（１）抗ＶＥＧＦ抗体、抗体断片、抗原結合断片又はＦａｂを含む第１の成分と、（２）１つ又は２つの第２の成分であって、ＣＤ４４ ＨＡ受容体ドメイン、ＴＳＧ６ドメイン及び／又はＶＧ１ドメインを含む第２の成分とを含む。
いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、（１）抗ＶＥＧＦ抗体、抗原結合断片、抗体断片、又はＦａｂを含む第１の成分と、（２）１つ又は２つの第２の成分と、（３）５ｋＤａ～２０ｋＤａの範囲の分子量のＨＡとを含む。
ａ）Ｇ６．３１
いくつかの実施形態では、第１の成分は、Ｇ６．３１抗ＶＥＧＦ Ｆａｂを含む抗体である。いくつかの実施形態では、第１の成分は、配列番号１７に含まれるＶＨドメインを有する抗体である。いくつかの実施形態にでは、第１の成分は、配列番号１８に含まれるＶＬドメインを有する抗体である。いくつかの実施形態では、第１の成分は、配列番号１０５に示されるＶＨドメインを含む抗体である。いくつかの実施形態では、第１の成分は、配列番号１０６に示されるＶＬドメインを含む抗体である。
ｂ）ＰｉｇＦａｂ
いくつかの実施形態では、第１の成分は、ＰｉｇＦａｂ抗ＶＥＧＦ Ｆａｂを含む抗体である。いくつかの実施形態では、第１の成分は、配列番号６６に含まれるＶＨドメインを有する抗体である。いくつかの実施形態にでは、第１の成分は、配列番号６５に含まれるＶＬドメインを有する抗体である。いくつかの実施形態では、第１の成分は、配列番号９７に示されるＶＨドメインを含む抗体である。いくつかの実施形態では、第１の成分は、配列番号９８に示されるＶＬドメインを含む抗体である。
ｃ）ラニビズマブ
いくつかの実施形態では、第１の成分はラニビズマブを含む抗体である。いくつかの実施形態では、第１の成分は、配列番号７７に含まれるＶＨドメインを有する抗体である。いくつかの実施形態にでは、第１の成分は、配列番号７６に含まれるＶＬドメインを有する抗体である。いくつかの実施形態では、第１の成分は、配列番号１１４に示されるＶＨドメインを含む抗体である。いくつかの実施形態では、第１の成分は、配列番号１１５に示されるＶＬドメインを含む抗体である。
ｄ）ＣＤ４４
いくつかの実施形態では、１つ又は２つの第２の成分は、ＣＤ４４ ＨＡ受容体ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第２の成分は配列番号２を含む。
ｅ）ＴＳＧ６
いくつかの実施形態では、１つ又は２つの第２の成分は、ＴＳＧ６ドメインを含む。いくつかの実施形態では、１つ又は２つの第２の成分は、配列番号４を含む。
いくつかの実施形態では、治療用分子は、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、及び／又は配列番号２０を含む。
ｆ）ＶＧ１
いくつかの実施形態では、１つ又は２つの第２の成分は、ＶＧ１ドメインを含む。いくつかの実施形態では、上記１つ又は２つの第２の成分は、以下の配列番号２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０又は８７のうち１つ又は２つを含む。
いくつかの実施形態では、治療用分子は、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７６及び／又は配列番号７７を含む。
ｇ）システインノットペプチド（ＣＫＰ）
いくつかの実施形態では、第１の成分は、抗ＶＥＧＦ抗原結合断片を含むことに加えて、任意に、システインノットペプチド（ＣＫＰ）を更に含む。いくつかの実施形態では、ＣＫＰは、配列番号９２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、治療用分子は、配列番号９３と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗原結合断片は、配列番号９４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗原結合断片及びシステインノットペプチドを含む第１の成分を含む当該治療用分子は、上記セクションＩＩ．Ｂで論じるように、ＨＡＢＤを含む第２の成分を更に含み得る。
いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、（１）抗ＶＥＧＦ抗原結合断片を含む第１の成分と、（２）ＨＡＢＤを含む１つ又は２つの第２の成分と、（３）５ｋＤａ～２０ｋＤａの範囲の分子量のＨＡとを含む。
２．ＮＶＳ２４
いくつかの実施形態では、治療用分子は、（１）抗ＶＥＧＦ抗体、ＮＶＳ２４を含む第１の成分と、（２）ＴＳＧ ６（Ｌａｖａ１２）ドメインを含む１つの第２の成分とを含む。
いくつかの実施形態では、第１の成分はＮＶＳ２４抗体を含む。いくつかの実施形態では、第１の成分は、配列番号２１に含まれるＶＨドメインを有する抗体である。いくつかの実施形態にでは、第１の成分は、配列番号２２に含まれるＶＬドメインを有する抗体である。いくつかの実施形態では、第１の成分は、配列番号１０９に示されるＶＨドメインを含む抗体である。いくつかの実施形態では、第１の成分は、配列番号１１０に示されるＶＬドメインを含む抗体である。
ａ）ＴＳＧ６（Ｌａｖａ１２）
いくつかの実施形態では、第２の成分は、ＴＳＧ６（Ｌａｖａ１２）ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第２の成分は配列番号１１３を含む。
いくつかの実施形態では、治療用分子は、配列番号２１及び／又は配列番号２２を含む。
３．抗ＶＥＧＦ及び抗ＰＤＧＦ二重標的化抗体（抗ＶＰ－ｄｕｔａＦａｂ；抗ＶＰＤＦ）
いくつかの実施形態では、治療用分子は、（１）上記のセクションＩＩ．Ａ．１．ｈ）で論じられる、ＶＥＧＦ及びＰＤＧＦ（例えば二重特異性抗体又は二重標的化抗体、ｄｕｔａＦａｂ）に結合することができる第１の成分と、（２）ＣＤ４４ ＨＡ受容体ドメイン、ＴＳＧ６ドメイン及び／又はＶＧ１ドメインを含む１つ又は２つの第２の成分とを含む。
いくつかの実施形態では、第１の成分は、配列番号５に含まれるＶＨドメインを有する抗体である。いくつかの実施形態にでは、第１の成分は、配列番号６に含まれるＶＬドメインを有する抗体である。いくつかの実施形態では、第１の成分は、配列番号９９に示されるＶＨドメインを含む抗体である。いくつかの実施形態では、第１の成分は、配列番号１００に示されるＶＬドメインを含む抗体である。
ａ）ＣＤ４４
いくつかの実施形態では、１つ又は２つの第２の成分は、ＣＤ４４ ＨＡ受容体ドメインを含む。いくつかの実施形態では、１つ又は２つの第２の成分は、配列番号２を含む。
いくつかの実施形態では、治療用分子は、配列番号５、配列番号６、配列番号７、及び／又は配列番号８を含む。
いくつかの実施形態では、１つ又は２つの第２の成分は、ＣＤ４４－ｋｏドメインを含む。いくつかの実施形態では、上記１つ又は２つの第２の成分は、配列番号２５及び／又は２６に示されるＣＤ４４－ｋｏドメインを含む。
いくつかの実施形態では、治療用分子は、配列番号２５及び／又は２６を含む。
ｂ）ＴＳＧ６（Ｌａｖａ１２）
いくつかの実施形態では、第２の成分は、ＴＳＧ６（Ｌａｖａ１２）ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第２の成分は配列番号１１３を含む。
いくつかの実施形態では、治療用分子は、配列番号２３及び／又は配列番号２４を含む。
ｃ）ＶＧ１
いくつかの実施形態では、１つ又は２つの第２の成分は、ＶＧ１ドメインを含む。いくつかの実施形態では、上記１つ又は２つの第２の成分は、以下の配列番号２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０又は８７のうち１つ又は２つを含む。
いくつかの実施形態では、治療用分子は、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７２、及び／又は配列番号７３を含む。
４．ＲａｂＦａｂ
いくつかの実施形態では、治療用分子は、（１）ＲａｂＦａｂ抗体を含む第１の成分（上記のセクションＩＩ．Ａ．３で論じられる）と、（２）ＴＳＧ６ドメイン及び／又はＶＧ１ドメインを含む１つ又は２つの第２の成分とを含む。
いくつかの実施形態では、ＲａｂＦａｂ抗体は、ＲａｂＦａｂ ＶＨ及びＶＬドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＲａｂＦａｂ抗体は、配列番号１３に含まれるＶＨドメイン及び配列番号１４に含まれるＶＬドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＲａｂＦａｂ抗体は、配列番号１０７に示されるＶＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＲａｂＦａｂ抗体は、配列番号１０８に示されるＶＬドメインを含む。
ａ）ＴＳＧ６
いくつかの実施形態では、１つ又は２つの第２の成分は、ＴＳＧ６ドメインを含む。いくつかの実施形態では、１つ又は２つの第２の成分は、配列番号４を含む。
いくつかの実施形態では、治療用分子は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、及び／又は配列番号１６を含む。
ｂ）ＶＧ１
いくつかの実施形態では、１つ又は２つの第２の成分は、ＶＧ１ドメインを含む。いくつかの実施形態では、上記１つ又は２つの第２の成分は、以下の配列番号２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０又は８７のうち１つ又は２つを含む。
いくつかの実施形態では、治療用分子は、配列番号６３及び／又は配列番号６４を含む。
５．２０Ｄ１２ｖ２．３
いくつかの実施形態では、第１の成分は、抗補体因子Ｄ抗体Ｆａｂ、２０Ｄ１２ｖ２．３を含む抗体である。いくつかの実施形態では、第１の成分は、配列番号７５に含まれるＶＨドメインを有する抗体である。いくつかの実施形態にでは、第１の成分は、配列番号７４に含まれるＶＬドメインを有する抗体である。いくつかの実施形態では、第１の成分は、配列番号１１１に示されるＶＨドメインを含む抗体である。いくつかの実施形態では、第１の成分は、配列番号１１２に示されるＶＬドメインを含む抗体である。
ａ）ＶＧ１
いくつかの実施形態では、１つ又は２つの第２の成分は、ＶＧ１ドメインを含む。いくつかの実施形態では、上記１つ又は２つの第２の成分は、以下の配列番号２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０又は８７のうち１つ又は２つを含む。
いくつかの実施形態では、治療用分子は、配列番号７４及び／又は配列番号７５を含む。
６．ＨｔｒＡ１
いくつかの実施形態では、第１の成分は、ヒトＨｔｒＡ１に結合することができる抗体又は抗体断片を含む抗体である。いくつかの実施形態では、第１の成分は、配列番号１１８に含まれるＶＨドメインを有する抗体である。いくつかの実施形態にでは、第１の成分は、配列番号１１９に含まれるＶＬドメインを有する抗体である。いくつかの実施形態では、第１の成分は、配列番号１１６に示されるＶＨドメインを含む抗体である。いくつかの実施形態では、第１の成分は、配列番号１１７に示されるＶＬドメインを含む抗体である。
ａ）ＶＧ１
いくつかの実施形態では、１つ又は２つの第２の成分は、ＶＧ１ドメインを含む。いくつかの実施形態では、上記１つ又は２つの第２の成分は、以下の配列番号２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０又は８７のうち１つ又は２つを含む。
いくつかの実施形態では、治療用分子は、配列番号１１８及び／又は配列番号１１９を含む。
ＩＩＩ．眼疾患の治療
材料及び方法は、眼疾患の治療に有用である。眼疾患は、網膜又は角膜などの眼組織の構造内への新生血管の増殖及び／又は浸潤の変化又は非調節によって特徴付けることができる。眼疾患は、網膜組織（光受容体並びにその下の網膜色素上皮（ＲＰＥ）及び脈絡毛細管板）の萎縮によって特徴付けることができる。非限定的な眼疾患としては、例えば、加齢黄斑変性（ＡＭＤ；例えば、滲出型ＡＭＤ、乾燥型ＡＭＤ、中間型ＡＭＤ、進行型ＡＭＤ、及び地図状萎縮（ＧＡ））、黄斑変性、黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）（例えば、焦点、非中心ＤＭＥ、及び、びまん性、中心関与ＤＭＥ）、網膜症、糖尿病性網膜症（ＤＲ）（例えば、増殖性ＤＲ（ＰＤＲ）、非増殖性ＤＲ（ＮＰＤＲ）、及び高所ＤＲ）、他の虚血関連網膜症、ＲＯＰ、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）（例えば、中心（ＣＲＶＯ）及び分岐（ＢＲＶＯ）形態）、ＣＮＶ（例えば、近視性ＣＮＶ）、角膜血管新生、角膜血管新生に関連する疾患、網膜血管新生、網膜／脈絡膜血管新生に関連する疾患、中心性漿液性網膜症（ＣＳＲ）、病的近視、フォンヒッペル・リンダウ病、眼のヒストプラズマ症、ＦＥＶＲ、コーツ病、ノーリー病、骨粗鬆症性偽神経膠腫症候群（ＯＰＰＧ）に関連する網膜異常、結膜下出血、ルベオーシス、眼血管新生疾患、血管新生緑内障、網膜色素変性症（ＲＰ）、高血圧性網膜症、網膜血管腫状増殖、黄斑血管拡張症、虹彩血管新生、眼内血管新生、網膜変性、類嚢胞黄斑浮腫（ＣＭＥ）、血管炎、乳頭浮腫、ＣＭＶ網膜炎を含むがこれに限定されない網膜炎、眼黒色腫、網膜芽細胞腫、結膜炎（例えば、感染性結膜炎及び非感染性（例えば、アレルギー性）結膜炎）、レーバー先天性黒内障（レーバー先天性黒内障又はＬＣＡとしても知られる）、ブドウ膜炎（感染性及び非感染性ブドウ膜炎を含む）、脈絡膜炎（例えば、多巣性脈絡膜炎）、眼ヒストプラズマ症、眼瞼炎、ドライアイ、外傷性眼損傷、シェーグレン病、並びに、疾患又は障害が眼血管新生、血管漏出、及び／又は網膜浮腫若しくは網膜萎縮に関連する他の眼疾患が挙げられる。更なる例示的な眼疾患には、あらゆる形態の増殖性硝子体網膜症を含む、線維血管組織又は線維組織の異常増殖によって引き起こされる疾患が含まれる。
角膜血管新生（虹彩の血管新生、隅角の血管新生、又はルベオーシス（ｒｕｂｅｏｓｉｓ））に関連する例示的な疾患には、限定されないが、流行性角結膜炎、ビタミンＡ欠乏症、コンタクトレンズオーバーウェア、アトピー性角膜炎、上輪部角膜炎、翼状片、乾性角膜炎、シェーグレン症候群、酒さ性ざ瘡（ａｃｎｅ ｒｏｓａｃｅａ）、フリクテン症（ｐｈｙｌｅｃｔｅｎｕｌｏｓｉｓ）、梅毒、マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）感染症、脂肪変性症、化学的火傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、単純ヘルペス感染症、帯状疱疹感染症、原虫感染症、カポシ肉腫、モーレン潰瘍、テリエン周辺角膜変性、周辺角質溶解、関節リウマチ、全身性紅斑、多発性動脈炎、外傷、ウェゲナーサルコイドーシス、強膜炎、スティーブンジョンソン症候群、類天疱瘡、角膜放射状切開、及び角膜移植後拒絶反応が含まれる。
血管漏出の増加、動脈瘤及び毛細血管脱落を含む、脈絡膜血管新生及び網膜血管系の欠陥に関連する例示的な眼疾患としては、限定されないが、糖尿病性網膜症、黄斑変性、鎌状赤血球貧血、サルコイド、梅毒、弾性線維性仮性黄色腫、パジェット病、静脈閉塞、動脈閉塞、頸動脈閉塞性疾患、慢性ブドウ膜炎／硝子体炎、マイコバクテリア感染症、ライム病、全身性エリテマトーデス、未熟児網膜症、網膜浮腫（黄斑浮腫を含む）、イールズ病、ベーチェット病、網膜炎又は脈絡膜炎を引き起こす感染症（例えば、多焦点脈絡膜）、推定眼ヒストプラズマ症、ベスト病（硝子体黄斑変性）、近視、視神経乳頭、扁平部炎、網膜剥離（例えば、慢性網膜剥離）、過粘度症候群、トキソプラスマ症、外傷及びレーザー後合併症が挙げられる。
網膜組織（光受容体及びその下にあるＲＰＥ）の萎縮に関連する例示的な眼疾患としては、限定されないが、萎縮型又は非滲出型ＡＭＤ（例えば、地図状萎縮又は進行性萎縮型ＡＭＤ）、黄斑萎縮（例えば、新生血管形成及び／又は地図状萎縮に関連する萎縮）、糖尿病性網膜症、シュタルガルト病、Ｓｏｒｓｂｙ眼底ジストロフィ、網膜分離症（網膜神経感覚層の異常な分裂）、及び網膜色素変性症が和えられる。
上の実施形態のいずれかに従った（又は適用される）特定の実施形態では、眼疾患は、増殖性網膜症、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性及び他の虚血関連網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、病理学的近視、フォンヒッペル・リンダウ病、眼のヒストプラズマ症、ＣＲＶＯ及びＢＲＶＯを含む網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、角膜血管新生、網膜血管新生、及び未熟児網膜症（ＲＯＰ）からなる群から選択される眼内血管新生疾患である。本発明の好ましい実施形態では、眼疾患は、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、特に滲出型ＡＭＤ又は新生血管型ＡＭＤ、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、特に増殖性ＤＲ又は非増殖性ＤＲ、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）又は地図状萎縮（ＧＡ）である。
本明細書中に開示される治療用分子、コンジュゲート及び組成物は、哺乳動物対象における眼疾患を治療するための医薬として使用され得る。哺乳動物の例としては、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及び非ヒト霊長類、例えば、サル）、ウサギ及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、治療用分子、コンジュゲート及び組成物の治療標的は、ヒトの眼における標的である。
ＩＶ．治療方法
治療用分子、コンジュゲート、又は組成物を患者の組織に送達することを含む、眼疾患を治療する方法が本明細書で提供される。多くの実施形態では、本方法は、治療用分子が標的組織への治療活性剤の長時間作用型送達を提供し得るように治療用分子を投与することを含む。多くの実施形態では、標的組織は眼内にある。
Ａ．投与方法
治療用分子、コンジュゲート又は組成物は、例えば、とりわけ、局所、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、気管内又は皮内経路による投与を含む、任意の有効で便利な様式で投与され得る。組成物は眼への投与に適していることが好ましく、より具体的には、組成物はＩＶＴ投与に適していてもよい。したがって、好ましい実施形態では、組成物は、眼内送達、特にＩＶＴ注射のために製剤化される。治療において、又は予防として、治療用分子、コンジュゲート、又は組成物は、注射可能な組成物として、例えば滅菌水性分散液として個体に投与され得る。
この理論に拘束されるものではないが、コンジュゲートの注入は、ＩＶＴ ＨＡとの相互作用の前に、予め複合体化されたＨＡＢＤからのＨＡの拡散を促進することができると想定される。解離が遅いため、硝子体内の遊離ＨＡＢＤの濃度は低い。硝子体内に存在する遊離ＨＡＢＤの濃度が低いと、ＨＡと予め複合体を形成していない治療用分子よりも眼に対する有害性が低くなり得る。
いくつかの実施形態では、投与工程は単回注射である。いくつかの実施形態では、投与工程は、２回以上の注射を含む。
Ｂ．組成物
医薬として、特に眼疾患の治療において使用するための組成物が本明細書で提供される。組成物は、医薬分野での使用又は医薬として意図されているため医薬組成物と呼ばれることがあり、その中に含有される活性成分の生物学的活性が有効であることを可能にするような形態であり、医薬組成物が投与される対象に対して許容できないほどに毒性である追加の成分を含有しない調製物を指す。
いくつかの実施形態では、組成物は治療用分子を含む。いくつかの実施形態では、組成物はコンジュゲートを含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、任意に、薬学的に許容され得る添加物、希釈剤、又は担体、例えば緩衝物質、安定剤、保存剤、又は更なる成分、特に薬学的組成物に関連して一般的に知られている成分を含む。
一般に、任意成分又は追加成分の性質は、組成物の特定の形態及び使用される投与様式に依存する。薬学的に許容され得る担体は、組成物を増強又は安定化することができ、又は組成物の調製を容易にするために使用することができる。そのような担体としては、生理的に適合性の生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等、並びにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。組成物は、１つ以上の他の治療剤、特に、例えば、網膜血管疾患などの眼疾患に関連する状態又は障害を治療又は予防するのに適した治療剤を更に含有することができる。製剤は投与様式に適していなければならない。例えば、非経口製剤は、通常、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロール等の薬学的及び生理学的に許容され得る流体をビヒクルとして含む注射用流体を含む。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、湿潤剤又は乳化剤、保存剤及びｐＨ緩衝剤等の少量の非毒性補助物質を含有することができる。
組成物は、安定剤を含み得る。「安定剤」という用語は、加熱又は凍結中に生じる有害な条件等から組成物を保護し、及び／又はある条件若しくは状態での本発明のコンジュゲートの安定性又は貯蔵寿命を延長する物質を指す。安定剤の例としては、スクロース、ラクトース及びマンノース等の糖；マンニトール等の糖アルコール；グリシン又はグルタミン酸等のアミノ酸；及びヒト血清アルブミン又はゼラチン等のタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
Ｃ．有効用量
典型的には、治療用分子又はコンジュゲートの治療有効用量又は有効用量が、本開示の医薬組成物に用いられる。治療用分子及びコンジュゲートは、当業者に公知の従来の方法によって薬学的に許容され得る剤形に製剤化される。投与レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調整される。例えば、単回ボーラスを投与してもよく、いくつかの分割用量を経時的に投与してもよく、又は治療状況の緊急性によって示されるように用量を比例的に減少又は増加させてもよい。投与の容易さ及び投薬量の均一性のために、非経口組成物を投薬単位形態で製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される投薬単位形態は、治療される対照に対する単位投薬量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要とされる医薬担体と会合して所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性化合物を含有する。
医薬組成物中の活性成分（すなわち、治療用分子及びコンジュゲート）の実際の投与量レベルは、患者に有毒ではなく、特定の患者、組成物、及び投与様式に対して所望の治療応答を達成するのに有効な活性成分の量を得るように変化させることができる。選択される投与量レベルは、使用される本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排出速度、治療の期間、使用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物及び／又は材料、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康状態及び以前の病歴、並びに同様の因子を含む種々の薬物動態学的因子に依存する。投薬量レベルは、本明細書中に記載される１つ以上の眼／視覚評価を使用して決定されるような治療応答を達成するように選択及び／又は調整される場合がある。医師又は獣医師は、所望の治療効果を達成するのに必要なレベルよりも低いレベルで医薬組成物に使用されるコンジュゲートの治療用分子の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加させることができる。一般に、本明細書に記載の眼疾患の治療のための組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬物、及び治療が予防的であるか治療的であるかを含む多くの異なる因子に応じて変化する。
治療投与量は、安全性及び有効性を最適化するために漸増する必要がある。本発明のコンジュゲートを用いたＩＶＴ投与のための投薬量は、注射あたり０．１ｍｇ／眼～１０ｍｇ／眼の範囲であり得る。１眼あたりの単回投与は、１眼あたり１回以上の注射で実施され得る。例えば、２０ｍｇ／眼の単回用量は、それぞれ１０ｍｇの２回の注射で送達され得、総用量は２０ｍｇとなる。注入当たりの体積は、１０マイクロリットル～５０マイクロリットルであってもよく、一方、用量当たりの体積は、１０マイクロリットル～１００マイクロリットルであってもよい。Ｌｕｃｅｎｔｉｓとの使用に適した米国食品医薬品局（ＦＤＡ）承認の用量及びレジメンが考慮される。抗ＶＥＧＦ抗体又は抗原結合断片と共に使用するのに適した他の用量及びレジメンは、米国特許出願公開第２０１２／００１４９５８号に記載されており、その全体が参照により組み込まれる。
組成物は、複数回投与され得る。単回投与間の間隔は、毎週、毎月又は毎年であり得る。間隔はまた、例えば、視力又は黄斑浮腫に基づいて、患者における再治療の必要性によって示されるように不規則であり得る。さらに、代替の投与間隔は、医師によって決定され、有効であるために毎月又は必要に応じて投与され得る。有効性は、眼の状態並びに眼疾患の種類及び重症度に基づき、例えば、病変成長、抗ＶＥＧＦ救済の速度、光干渉断層撮影法（ＯＣＴ）によって決定される網膜の厚さ、及び視力によって特徴付けられる。投与量及び頻度は、患者における本発明のコンジュゲートの半減期及び治療標的（例えば、ＶＥＧＦ、Ｃ５、ＥＰＯ、第Ｐ因子など）のレベルに応じて変化し得る。しかしながら、本発明の好ましい実施形態では、組成物は、最大で３ヶ月ごとに、最大で４ヶ月ごとに、より具体的には６ヶ月ごとに投与されるべきである。これは、それぞれの結合していない（遊離）第１の成分と比較して、コンジュゲート中の第１の成分の半減期の増加（したがって、有効期間の延長）を反映する。これによれば、コンジュゲート中の第１の成分の排出半減期は、非コンジュゲートの第１の成分と比較して、少なくとも３倍、少なくとも４倍又は少なくとも５倍延長される。遊離の第１の成分と比較した、コンジュゲート中の第１の成分の排出半減期の相対的な増加は、ＩＶＴ注射によって分子を投与し、当技術分野で公知の分析方法、例えばＥＬＩＳＡ、質量分析、ウェスタンブロット、放射免疫アッセイ又は蛍光標識を使用して様々な時点で残存する濃度を測定することによって決定することができる。血中濃度を測定し、使用して、一般に記載されるように（Ｘｕ Ｌ ｅｔ ａｌ．，ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ ＳｃＬ，５４（３）：１８１６－２４（２０１３））、眼からのクリアランス速度を計算することもでき、コンジュゲートの一部としての分子（例えば、抗体又は断片）は、遊離分子のものよりも長い眼半減期を示す。例えば、眼中のコンジュゲートは、遊離の第１の成分と比較して半減期の２５％の増加（例えば、５～６．２５日間）、遊離の第１の成分と比較して半減期の５０％の増加（例えば、５～７．５日間）、遊離の第１の成分と比較して半減期の７５％の増加（例えば、５～８．７５日間）、又は遊離の第１の成分と比較して半減期の１００％の増加（例えば、５～１０日間）を有することができ、特定の態様では、コンジュゲートの半減期は、遊離の第１の成分と比較して半減期の１００％を超えて増加し得ることが企図される（例えば、５～１５日間、２０又は３０日間；１週間～３週間、４週間以上等）。
Ｄ．併用療法
併用療法は、併用投与（２つ以上の治療薬が同じ又は別個の製剤に含まれる場合）、及び別個の投与を包含し、その場合、治療用分子及びコンジュゲートの投与は、追加の治療薬（複数可）の投与の前、同時及び／又は後に行うことができる。特定の実施形態では、治療用分子、コンジュゲート又は組成物は、更なる化合物と同時に投与される。特定の実施形態では、治療用分子、コンジュゲート又は組成物は、更なる化合物の前又は後に投与される。いくつかの実施形態では、治療用分子、コンジュゲート又は組成物の投与及び更なる治療薬の投与は、互いに約１、２、３、４若しくは５ヶ月以内、又は約１、２若しくは３週間以内、又は約１、２、３、４、５若しくは６日以内に行われる。
眼疾患を治療するための任意の適切な治療剤、特に眼疾患を治療するための剤を、当該追加の化合物として使用することができる。眼疾患は上記のセクションＩＩＩで論じられる。さらに、治療用分子の成分として上記のセクションＩＩ．Ａで論じられる任意の分子もまた、併用療法で使用される追加の化合物として使用され得る。
いくつかの実施形態では、追加の化合物は、上記のセクションＩＩ．Ａ．１．ｈ）及びＣａｒｍｅｌｉｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４０７：２４９－２５７（２０００）で論じられている抗血管形成剤である。他の適切な抗血管形成剤としては、コルチコステロイド、血管新生抑制ステロイド、酢酸アカンコルターブ、アンギオスタチン、エンドスタチン、チロシンキナーゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）阻害剤、インスリン様成長因子結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ３）、間質由来因子（ＳＤＦ－１）アンタゴニスト（例えば、抗ＳＤＦ－１抗体）、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、ガンマ－セクレターゼ、Ｄｅｌｔａ様リガンド４、インテグリンアンタゴニスト、低酸素誘導性因子（ＨＩＦ）－１αアンタゴニスト、プロテインキナーゼＣＫ２アンタゴニスト、新生血管形成部位にホーミングする幹細胞（例えば、内皮前駆細胞）を阻害する薬剤（例えば、抗血管内皮カドヘリン（ＣＤ－１４４）抗体及び／又は抗ＳＤＦ－１抗体）、及びこれらの組合せが挙げられる。
治療用分子、コンジュゲート又は組成物はまた、例えば、レーザー光凝固（例えば、汎網膜光凝固（ＰＲＰ））、ドルーゼンレーザー発振、黄斑円孔手術、黄斑転座手術、埋め込み型小型望遠鏡、ＰＨＩ運動血管造影法（マイクロレーザー治療及びフィーダー血管治療としても知られる）、陽子線療法、微小刺激療法、網膜剥離及び硝子体手術、強膜バックル、黄斑下手術、経乳頭温熱療法、光化学系Ｉ療法、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の使用、体外レオフェレーシス（膜分画濾過及びレオセラピーとしても知られる）、マイクロチップ移植、幹細胞療法、遺伝子置換療法、リボザイム遺伝子療法（低酸素応答エレメントの遺伝子療法を含む、Ｏｘｆｏｒｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ；Ｌｅｎｔｉｐａｋ、Ｇｅｎｅｔｉｘ；及びＰＤＥＦ遺伝子療法、ＧｅｎＶｅｃ）、光受容体／網膜細胞移植（移植可能な網膜上皮細胞を含む、Ｄｉａｃｒｉｎ，Ｉｎｃ．；網膜細胞移植、例えば、Ａｓｔｅｌｌａｓ Ｐｈａｒｍａ ＵＳ，Ｉｎｃ．、ＲｅＮｅｕｒｏｎ、ＣＨＡ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、穿刺、及びそれらの組み合わせを含む、眼疾患（例えば、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、ＲＶＯ、又はＧＡ）の治療のための治療又は外科的手順と組み合わせて投与され得る。
治療用分子、コンジュゲート又は組成物はまた、視覚サイクル調節剤（例えば、エミクススタト（ｅｍｉｘｕｓｔａｔ）塩酸）：スクアラミン（例えば、ＯＨＲ－１０２；Ｏｈｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）；ビタミン及びミネラル補助剤（例えば、加齢性眼疾患研究１（ＡＲＥＤＳ１；亜鉛及び／又は酸化防止剤）及び研究２（ＡＲＥＤＳ２；亜鉛、酸化防止剤、ルテイン、ゼアキサンチン、及び／又はオメガ－３脂肪酸）に記載されているもの）；細胞ベースの治療、例えば、ＮＴ－５０１（Ｒｅｎｅｘｕｓ）；ＰＨ－０５２０６３８８（Ｐｆｉｚｅｒ）、ｈｕＣＮＳ－ＳＣ細胞移植（ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ）、ＣＮＴＯ－２４７６（臍帯幹細胞株；Ｊａｎｓｓｅｎ）、ＯｐＲｅｇｅｎ（ＲＰＥ細胞の懸濁液；Ｃｅｌｌ Ｃｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、又はＭＡ０９－ｈＲＰＥ細胞移植（Ｏｃａｔａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）と組み合わせて投与され得る。
いくつかの実施形態では、追加の治療剤はＡＭＤ治療剤である。例えば、抗ＰＤＧＦＲ抗体ＲＥＧＮ ２１７６－３は、アフリベルセプト（ＥＹＬＥＡ（登録商標））と共製剤化することができる。いくつかの例では、そのような共製剤は、治療用分子、コンジュゲート又は組成物と組み合わせて投与することができる。
いくつかの実施形態では、更なる化合物は、エンドスタチン及びアンギオスタチンを発現するレンチウイルスベクター（例えば、ＲｅｔｉｎｏＳｔａｔ）を含む。
特定の実施形態では、追加の化合物は、ＩＬ－１β；ＩＬ－６；ＩＬ－６Ｒ；ＩＬ－１３；ＩＬ－１３Ｒ；ＰＤＧＦ；アンジオポエチン；Ａｎｇ２；Ｔｉｅ２；Ｓ１Ｐ；インテグリンαｖβ３、αｖβ５、及びα５β１；ベタセルリン；アペリン／ＡＰＪ；エリスロポエチン；補体因子Ｄ；ＴＮＦα；ＨｔｒＡ１；ＶＥＧＦ受容体；ＳＴ－２受容体；及び補体経路成分Ｃ２、Ｂ因子、Ｈ因子、ＣＦＨＲ３、Ｃ３ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａ、及びＣ３ａなど、ＡＭＤリスクに遺伝的に関連するタンパク質；ＨｔｒＡ１；ＡＲＭＳ２；ＴＩＭＰ３；ＨＬＡ；インターロイキン－８（ＩＬ－８）；ＣＸ３ＣＲ１；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＣＥＴＰ；ＬＩＰＣ；ＣＯＬ１０Ａ１；及びＴＮＦＲＳＦ１０Ａからなる群から選択される第２の生体分子に結合する。特定の実施形態では、追加の化合物は、上記のセクションＩＩ．Ａ．３で論じられた抗体及び抗原結合断片の例を含む、抗体又はその抗原結合断片である。
Ｅ．標的組織
いくつかの実施形態では、標的組織は、眼、脳、骨及び／又は腫瘍を含む。いくつかの実施形態では、組織は網膜を含む。いくつかの実施形態では、治療用分子、コンジュゲート又は組成物は、眼、脳、骨又は腫瘍に注射される。いくつかの実施形態では、治療用分子、コンジュゲート又は組成物は、硝子体液、脳脊髄液又は滑液に注入される。いくつかの実施形態では、治療用分子、コンジュゲート又は組成物は皮下注射される。
いくつかの実施形態では、治療用分子、コンジュゲート、又は組成物は、未修飾の治療活性剤と比較して、改善された適合性、より長い滞留時間、及び／又は注射部位に対するより長い半減期を提供する。いくつかの実施形態では、治療用分子、コンジュゲート又は組成物は、未修飾の治療活性剤と比較して、標的組織での薬理学的効果の持続時間を更に改善し得る。
いくつかの実施形態では、治療用分子、コンジュゲート、又は組成物は、未修飾の治療活性剤と比較して、改善された硝子体適合性、より長い硝子体滞留時間、より長い硝子体半減期、及び／又は改善された薬理学的効果の持続時間を提供する。いくつかの実施形態では、治療用分子、コンジュゲート、又は組成物は、未修飾の治療活性剤と比較して、脳、滑膜関節、又は腫瘍における改善された適合性、より長い滞留時間、より長い半減期、及び／又は改善された薬理学的効果の持続時間を提供する。
Ｆ．治療用分子のＨＡへの結合
いくつかの実施形態では、本方法は、投与工程の前に治療用分子をＨＡに結合すること（すなわち、治療用分子をＨＡとプレ複合体化してコンジュゲートを形成すること）を含む。これらの実施形態では、プレ複合体化は、治療用分子がＨＡに結合することを可能にする。これらの実施形態のいくつかでは、ＨＡは治療用分子のＨＡＢＤに結合している。ＨＡＢＤの例は、上記のセクションＩＩ．Ｂで検討されている。
いくつかの実施形態では、本方法は、治療用分子を含む第１の溶液とＨＡを含む第２の溶液とを混合することを含む。いくつかの実施形態では、混合は容器を含む。容器の例には、バイアル、単一区画シリンジ、及び２区画シリンジが含まれる。いくつかの実施形態では、混合は、対象に投与する準備ができているＨＡに結合した治療用分子を生成する。
いくつかの実施形態では、ＨＡは、４００Ｄａ～２００ｋＤａのサイズの範囲である。いくつかの実施形態では、ＨＡは少なくとも５ｋＤａである。いくつかの実施形態では、ＨＡは１０ｋＤａである。いくつかの実施形態では、ＨＡのサイズ／量は、結合又はプレ複合体化混合物中に存在するＨＡ結合部位の数に対してモル過剰のＨＡを可能にする。いくつかの実施形態では、ＨＡのサイズ／量は、ＨＡＢＤに対する結合当量のモル過剰を提供する。いくつかの実施形態では、ＨＡのサイズ／量は、１．５：１～１：１の範囲のＨＡ対治療用分子の比を可能にする。
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。先に与えた一般的な説明を考慮すると、種々の他の実施形態が実施されてもよいことは理解される。
以下の実施例では、Ｆａｂ断片又はペプチド、及びヒアルロナン結合ドメイン、すなわちＦａｂ－ＨＡＢＤを含む融合タンパク質について考察する。実施例１～７は、ＣＤ４４及び／又はＴＳＧ６ ＨＡＢＤに関する。実施例８～１８は、ＶＧ１ ＨＡＢＤに関する。
実施例１．Ｆａｂ－ヒアルロナン結合ドメイン融合タンパク質（Ｆａｂ－ＨＡＢＤ）の生成及びＨＡとの複合体化
Ｆａｂ断片とヒアルロナン結合ドメインとの１０個の融合タンパク質（以下、Ｆａｂ－ＨＡＢＤと呼ぶ）を作製した（表２）。Ｆａｂ－ＨＡＢＤは、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ含有リンカー配列（本明細書では「１ｘバージョン」と呼ぶ）を介したＦａｂ断片の重鎖のＣ末端への１つのＨＡＢＤの組換え融合によって作製した。場合により、追加のＨＡＢＤをＦａｂ断片トの軽鎖のＣ末端に融合した（本明細書では「２×バージョン」と呼ぶ）。
ＶＥＧＦ及びＰＤＧＦ（「ＶＰＤＦ」と呼ばれる）、ジゴキシゲニン（「Ｄｉｇ」と呼ばれる）、及びＶＥＧＦ（クローン「Ｇ６．３１」）に特異的に結合するＦａｂ断片を使用して、Ｆａｂ－ＨＡＢＤを作製した。
ＨＡＢＤは、ＣＤ４４（配列番号２）又はＴＳＧ６（配列番号４）に由来した。
Ｄｉｇ抗体を１つ又は２つのＣＤ４４ ＨＡ受容体ドメインに共有結合させ、非結合対照分子として使用した（配列番号９～１２）。
Ａ．材料及び方法
１．タンパク質発現
様々なＦａｂ－ＨＡＢＤ発現プラスミドを、標準的な分子生物学技術を使用して制限クローニング又は遺伝子合成によって作製した。各ポリペプチド鎖に対して別々の発現ベクターを作製した。発現をＨＥＫ２９３細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）において行い、発現プラスミドを１：１の比で混合した。
いくつかの例では、ＴＳＧ６を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ．）で発現させた。
いくつかの例では、ＲａｂＦａｂ－１ｘＴＳＧ６及びＲａｂＦａｂ－２ｘＴＳＧ６は、安定にトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞からの分泌によって産生された。
２．タンパク質精製
４，０００ｒｐｍ、４°Ｃで２０分間の遠心分離によって上清を回収した。その後、無細胞上清を０．２２μｍボトルトップフィルタで濾過し、冷凍庫（－２０°Ｃ）で保存した。
Ｆａｂ－ＨＡＢＤを、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）と共に抗Ｃカッパ及び抗ＣＨ１樹脂を使用するアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製した。
簡潔には、滅菌濾過細胞培養上清を、１×ＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ及び２．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化したＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ樹脂 ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に捕捉し、平衡化緩衝液で洗浄し、ｐＨ２．８の１００ｍＭクエン酸ナトリウムで溶出した。溶出した抗体画分をプールし、ｐＨを７．５に調整した。次いで、タンパク質を、１×ＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ及び２．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化したＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＩｇＧ－ＣＨ１樹脂（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に捕捉し、平衡化緩衝液で洗浄し、ｐＨ２．８の１００ｍＭクエン酸ナトリウムで溶出した。タンパク質試料の濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ８００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて２８０ｎｍで測定した。
分析ＳＥＣは、ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を介して、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０ランニングバッファーを流速１．５ｍＬ／分で用いて行った。
サイズ排除クロマトグラフィーからの抗体含有プール画分を－８０°Ｃで凍結し、更なる使用のために保存した。
いくつかの例では、ＴＳＧ６を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ．）から精製した。簡潔には、７Ｍグアニジン－ＨＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１００ｍＭテトラチオン酸ナトリウム及び２０ｍＭ亜硫酸ナトリウムからなる緩衝液を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を抽出した。Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（登録商標）ホモジナイザーを用いたホモジナイゼーション、遠心分離及び上清の濾過後、ｈｉｓタグ付きタンパク質を、６Ｍグアニジン－ＨＣｌ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．６で平衡化したＮｉ－ＮＴＡカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に捕捉した。カラムを２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．６、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４で洗浄し、２５０ｍＭイミダゾールを含有する緩衝液で溶出した。カラムから溶出したＴＳＧ６を希釈によって１．５ｍｇ／ｍＬにリフォールディングし、続いて０．５Ｍグアニジン－ＨＣｌ、０．５Ｍ ｌ－アルギニン、１ｍＭ還元型グルタチオン（ＧＳＨ）及び１ｍＭ酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）の溶液に対して４°Ｃの温度で一晩透析した。２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）への緩衝液交換後、リフォールディングされた物質をＳＰ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。
いくつかの例では、ＲａｂＦａｂ－１ｘＴＳＧ６及びＲａｂＦａｂ－２ｘＴＳＧ６を、安定にトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞によって分泌させ、細胞培養培地から精製した。これらのタンパク質はリフォールディングを必要としなかった。ＲａｂＦａｂ－１ｘＴＳＧ６は、ｇｌｙ－ｇｌｙ－ｇｌｙ－ｇｌｙ－ｓｅｒリンカーを介してＴＳＧ－に融合したこのＦａｂを有し、ＨＡＢＤはＨＣのＣ末端にある。ＲａｂＦａｂ－２ｘＴＳＧ６は、ｇｌｙ－ｇｌｙ－ｇｌｙ－ｇｌｙ－ｓｅｒリンカーを介してＴＳＧ６に融合したこのＦａｂを有し、一方のＨＡＢＤはＨＣのＣ末端にあり、他方はＬＣのＣ末端にある。両方のタンパク質は、精製に使用するために重鎖のＣ末端にＨｉｓタグを有する。これらのＦａｂ－ＨＡＢＤは、（１）Ｓｈａｔｚ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．，１３（９）：２９９６－３００３（２０１６）に記載される抗原親和性カラムでの捕捉、（２）Ｎｉｃｋｅｌ－ＮＴＡカラムでのＨｉｓタグ化材料の単離、続いて（３）ＳＰ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅでの陽イオン交換クロマトグラフィーからなる３カラムクロマトグラフィーを使用して、ＣＨＯ上清から精製された。
３．ヒアルロナン（ＨＡ）との複合体化
Ｆａｂ－ＨＡＢＤ－ＨＡコンジュゲート（以下、Ｆａｂ－ＨＡＢＤ－ＨＡと呼ぶ）の形成のため、Ｆａｂ－ＨＡＢＤを１０ｋＤａヒアルロン酸ナトリウム（Ｌｉｆｅｃｏｒｅ，Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）と１：１（ｗ／ｗ）で混合した。混合後、コンジュゲートを濃縮し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １０ｋＤａカットオフ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で再緩衝した。最終製剤は、２０ｍＭヒスチジンｐＨ６．０、２６０ｍＭスクロース、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ ２０であった。最後に、コンジュゲートを０．２２μｍフィルタ（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ－ＭＣ、遠心部０．２２μｍ、ＧＶ Ｄｕｒａｐｏｒｅ）を通してフィルタにかけた。タンパク質－ＨＡコンジュゲートの形成を、それぞれのＦａｂ－ＨＡＢＤと比較してより短い保持時間へのＳＥＣのシフトによって監視した（図１を参照）。
実施例２．Ｆａｂ－ＨＡＢＤの分子特性
実施例２．１．ＨＡとの相互作用
Ａ．材料及び方法
Ｆａｂ－ＨＡＢＤのＨＡＢＤがＨＡに結合する能力を調べた。ＨＡへのＦａｂ－ＣＤ ４４及びＦａｂ－ＴＳＧ ６ Ｆａｂ－ＨＡＢＤの結合を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＳＰＲによって試験した（表３）。簡潔には、Ｆａｂ－ＣＤ４４ Ｆａｂ－ＨＡＢＤを、それぞれ３．７～３００ｎＭの範囲の濃度でＨＡコーティングチップ（ＳＣＢＳ ＨＹ、Ｘａｎｔｅｃｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、ドイツ）上に８０秒間又は１２０秒間注入した。いくつかの実験のため、ストレプトアビジン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でコーティングされたＳｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ ＳＡ Ｃｈｉｐにビオチン－ＨＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス）を間接的にカップリングさせることによってＨＡコーティングチップを調製した。解離相を６００秒間監視した。その後、１０ｍＭグリシンｐＨ１．５を６０秒間又は３Ｍ ＭｇＣｌ２ を３０秒間注入することによって表面を再生した。バルク屈折率差は、緩衝液注入から得られた応答を差し引くことによって補正した。全ての実験を、ＰＢＳ－Ｔ（１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ ｐＨ７、４、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０）を使用して２５°Ｃで行った。導出された曲線は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌに適合させた。全ての実験を、ＰＢＳ－Ｔ（１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ ｐＨ７、４、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０）を使用して２５℃で行った。
さらに、ＶＤＰＦ－２ｘＣＤ４４とＨＡとの相互作用を等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）によって試験した。簡潔には、Ｆａｂ－ＣＤ ４４融合物をＰＢＳ（１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ ｐＨ７、４）に対して透析した。透析後、全ての分子が、緩衝液に関連するミスマッチを避けるために全く同じ緩衝液条件にあるように、残りの緩衝液を使用してＨＡを溶解した。ＨＡ分子を、それぞれ１０μＭ（１０ｋＤａ ＨＡ）又は２μＭ（５０ｋＤａ ＨＡ）の濃度で試料細胞にロードした。参照セルに脱イオン水を充填した。Ｆａｂ－ＣＤ４４融合物を１５０μＭの濃度でシリンジに充填した。滴定実験を２５℃で行った。親和定数Ｋ並びに化学量論Ｎは、Ｏｒｉｇｉｎ ７．０（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の一組の部位モデルを使用して計算した。
同様に、ＩＴＣを使用して、ＴＳＧ６と１０ｋＤａのＨＡとの相互作用を測定した（表４）（ただし、これらの実験では、ＴＳＧ６（２０μＭ）を熱量計セルに入れ、シリンジ内のＨＡ（５０μＭ）で滴定した）。ＰＢＳを含有する溶液を上記のように調製し、測定温度は２５°Ｃ又は３７°Ｃであった。これらの測定を、Ａｕｔｏ ＰＥＡＱ ＩＴＣ機器（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で行った。データ分析は、Ｎを１．０に固定したままにし、ＨＡ濃度及び親和性定数Ｋを可変パラメータとしたことを除いて、前の段落に記載した通りであった。
Ｂ．結果
Ｆａｂ－ＣＤ４４及びＦａｂ－ＴＳＧ６によるＨＡ結合についてのＳＰＲによるＫＤを表３に示す。
相互作用の強さは、ＨＡＢＤ配列並びに相互作用の結合活性（すなわち、２ｘバージョンは、ＨＡへの親和性結合を介してより高い機能的親和性を示す）によって決定される。
ＩＴＣ分析（表４）により、以下に示すＨＡ親和性が得られ、結合部位濃度は４００～７４５μＭと計算され、１０ｋＤａ ＨＡ鎖あたり８～１５個のＴＳＧ６分子の推定化学量論を示す。細胞中の５０μＭ ＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４及びシリンジ中の１５０μＭ １０ｋＤａ ＨＡを使用した同様の実験により、２５μＭのＫＤ及び１０ｋＤａ ＨＡ鎖あたり４．５ ＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４の見かけの化学量論を得た。ＣＤ４４のより弱いＨＡ結合親和性は、より高い濃度がＩＴＣ実験に使用されることを必要とした。２×ＣＤ４４融合物の二価ＨＡ結合性、及びＴＳＧ６と比較してより高分子量のＣＤ４４から予想され得るように、１０ｋＤａの結合化学量論は、２×ＣＤ４４と比較して１×ＴＳＧ６について２～３倍大きい。相互作用の強さは、ＨＡＢＤ配列並びに相互作用の結合活性（すなわち、２ｘバージョンは、ＨＡへの親和性結合を介してより高い機能的親和性を示す）によって決定される。
相互作用の化学量論に関して、本発明者らは、平均して、１０ｋＤａ ＨＡ分子あたり１．５個のＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４が結合し得るのに対して、５０ｋＤａ ＨＡ分子あたり５個のＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４が結合し得ることを見出した。
ＳＰＲ測定によれば、ＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４はＶＥＧＦリガンドとＰＤＧＦリガンドの両方に同時に結合することができた。ＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４へのＶＥＧＦ及びＰＤＧＦの結合を、未修飾ＶＰＤＦへのそれらの結合と比較した。簡潔には、ＰＤＧＦを、標準的なカップリング化学を用いてＳｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にカップリングさせて、およそ４０００レゾナンスユニット（ＲＵ）の表面を得た。ＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４融合物並びに未修飾ＶＰＤＦ対照をそれぞれ３μｇ／ｍＬの濃度で注射した後、ＶＥＧＦを５μｇ／ｍＬの濃度で注入して、リガンドＰＤＧＦ及びＶＥＧＦの両方へのＦａｂの同時結合を実証した。その後、１０ｍＭグリシンｐＨ２．０を６０秒間注入することによって表面を再生した。ＳＰＲ測定により、ＶＰＤＦ Ｆａｂ断片重鎖のＣ末端へのＨＡＢＤの融合が、リガンドと標的タンパク質との相互作用を妨害しないことが確認された。
実施例２．２．Ｆａｂ－ＨＡＢＤの安定性
眼における長時間作用型送達のためのＦａｂ－ＨＡＢＤの使用は、１カ月規模での体温でのタンパク質安定性を必要とする。これのための前提条件は、３７℃より高いＦａｂ－ＨＡＢＤの熱安定性である。
Ａ．材料及び方法
ＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４及びＴＳＧ６の熱安定性を静的光散乱及びタンパク質自己蛍光によって試験した。試料をおよそ１ｍｇ／ｍＬに希釈し、Ｏｐｔｉｍ機器（Ａｖａｃｔａ Ｉｎｃ．）を使用して、０．１°Ｃ／分の発熱速度で２５°Ｃから８０°Ｃまでの温度勾配に供した。光散乱及び蛍光データを、このプロセス中に２６６ｎｍレーザーを照射して記録した。散乱強度が増加する温度として定義されるおよそ７５°Ｃの凝集開始を決定した。同時に、蛍光発光スペクトルを記録した。
ＶＰＤＦ－ＣＤ４４については、蛍光スペクトルの重心平均を温度に対してプロットしたときに、およそ５６°Ｃ及び７９°Ｃで２つの遷移を測定した。これらの遷移は、おそらくＦａｂドメイン及びＣＤ４４ドメインのタンパク質の変性を示す。したがって、熱アンフォールディングに関連する散乱又はスペクトル変化は＞＞３７°Ｃであり、これはこのＦａｂ－ＨＡＢＤの良好な安定性を示す。
Ｂ．結果
ＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４について、５６°Ｃ及び７９°Ｃで２つの遷移を測定した。これらの２つのＴｍは、ＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４の変性における遷移を示し、ＣＤ４４ドメインは５６°Ｃで変性し、Ｆａｂは７９°Ｃで変性する。
ＴＳＧ６については、観察されたＴｍ開始は３５°Ｃであると測定され、測定されたＴｍは４３°Ｃであった。
実施例３．ラットレーザー脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）におけるＩｎ Ｖｉｖｏ有効性
Ａ．材料及び方法
以下の仮定を試験するために、レーザー誘発性脈絡膜新生血管（ラットレーザーＣＮＶ）のｉｎ ｖｉｖｏラットモデルでＦａｂ－ＨＡＢＤを試験した：（１）Ｆａｂ－ＨＡＢＤはＩＶＴ ＨＡに結合するにもかかわらずｉｎ ｖｉｖｏで有効である（すなわち、Ｆａｂ－ＨＡＢＤは血管新生を阻害することができる）；及び（２）Ｆａｂ－ＨＡＢＤは、それぞれの未修飾Ｆａｂ断片と比較して、より長期のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を有する。
このため、ラットは、レーザー損傷を受ける１週間前又は３週間前のいずれかにタンパク質製剤のＩＶＴ注射を受けた（１眼あたり６回のレーザー熱傷）。レーザー損傷の設定の１週間後、蛍光血管造影（ＦＡ）イメージングを用いて血管成長について病変を分析した。
Ｆａｂ－ＨＡＢＤを、それぞれの未修飾Ｆａｂ断片と比較した。Ｆａｂ－ＨＡＢＤの長期持続有効性を検出するために、未修飾Ｆａｂの用量を「最小効果用量」（すなわち、ラットモデルの持続期間内のビヒクルと比較して、血管新生の検出可能な阻害が低いだけである）に滴定して、モデルの同じ用量及び期間でＦａｂ－ＨＡＢＤの長期持続有効性を示した。
Ｂ．結果
試験した全てのＦａｂ－ＨＡＢＤは、ｉｎ ｖｉｖｏで新生血管形成の阻害を示した（表５）。これは、Ｆａｂ－ＨＡＢＤが硝子体内でＨＡに結合したにもかかわらず、関連する組織に到達して薬理学的効果を発揮することを示す。
試験した全てのＦａｂ－ＨＡＢＤは、同じモデル設定内の同じ用量でのそれぞれの未修飾Ｆａｂ断片と比較して、薬理学的効果のより長い持続時間を示した（表５）。これは、ＩＶＴ ＨＡに結合する能力がｉｎ ｖｉｖｏで薬理学的効果を延長し得ることを示す。
ｉｎ ｖｉｖｏモデルの分割は、ＨＡに対する親和性の有意差にもかかわらず、異なる分子に対する有効性の永続性の区別を可能にしなかった。モデルに適用された低非治療用量では、忍容性の問題は検出されなかった。Ｆａｂ－ＨＡＢＤの用量を投与されたラットの全ての眼は完全に正常であり、障害の徴候はなく、生存期間中にのみ緩衝液を投与された眼と同等であった。
実施例４．ＲａｂＦａｂ、ＲａｂＦａｂ－１ｘＴＳＧ６及びＲａｂＦａｂ－２ｘＴＳＧ６を用いたウサギ薬物動態（ＰＫ）研究
Ａ．材料及び方法
動物研究のためのタンパク質を、透析によって２０ｍＭヒスチジン酢酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５、又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４のいずれかに製剤化した。製剤は、３００～３４０ｍＯｓｍ／ｋｇの間の凝固点法によって測定された浸透圧と等張であった。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による分析は、全てのタンパク質がこれらの製剤において≧９５％モノマーであることを示した。エンドトキシンレベルを、最終投与濃度で０．１ＥＵ／眼未満であると評価した。
硝子体半減期研究のため、雌ウサギに、対照物品（ＰＢＳ、ｎ＝１）、０．１５ｍｇ／眼のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－４８８標識ＲａｂＦａｂ（ｎ＝２）、又はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－４８８（ＡＦ－４８８）標識ＲａｂＦａｂ－２ｘＴＳＧ６を、両眼にＩＴＶ注射によって総体積５０μＬで０．０５（ｎ＝２）、０．１５（ｎ＝２）、及び２．５（ｎ＝４）ｍｇ／眼の用量で投与する追加の薬物動態研究を行った。硝子体液及び眼房水中の試験物質質濃度を、以前に記載されたように蛍光光度法を使用して特定の時点で測定した。Ｄｉｃｋｍａｎｎ，Ｌ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，５６（１１）：６９９１－６９９９（２０１５）．濃度－時間プロファイルを使用して、Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（Ｃｅｒｔａｒａ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州マウンテンビュー）を使用した非コンパートメント分析を使用して薬物動態パラメータを推定した。蛍光光度法アプローチを使用して作成された濃度－時間プロファイルについては、投与部位の個体間変動及びその後の硝子体を通る試験物質の拡散に起因する可能性が高いため、投与後最初の４８時間のサンプリングはＰＫ分析から除外された。Ｄｉｃｋｍａｎｎ，Ｌ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，５６（１１）：６９９１－６９９９（２０１５）．ＰＫ分析は、ＣＬ＝用量／ＡＵＣ（用量は既知であり、ＡＵＣは線形台形法を使用して測定される）として計算されるクリアランス（ＣＬ）を用いた非コンパートメント分析を使用して行った。定常状態における分布容積は、クリアランス値と、終相の傾きから求めた消失速度定数を用いて、Ｖ＝ＣＬ／ｋｅｌとして算出した。消失半減期を、ｔ１／２＝ｌｎ（２）／ｋｅｌとして計算した。
Ｂ．結果
眼滞留時間に影響を及ぼすＨＡ結合の能力を、最初に、ニュージーランドホワイトウサギにおける薬物動態（ＰＫ）実験を用いて調べた。ウサギ硝子体（約６５μｇ／ｍＬ）のＨＡ濃度は、ヒト硝子体（１００～４００μｇ／ｍＬ）、又はブタ（硝子体ＨＡ約１８０μｇ／ｍＬ）若しくはカニクイザル（硝子体ＨＡ約１５０μｇ／ｍＬ）などの他の前臨床種よりもかなり低いが、試験物質のＩＶＴ投与後の初期ＰＫ研究にはウサギがしばしば用いられる。研究は、０．３ｍｇ／眼のＲａｂＦａｂ、０．３ｍｇ／眼のＲａｂＦａｂ－１ｘＴＳＧ６、又は０．５ｍｇ／眼のＲａｂＦａｂ－２ｘＴＳＧ６のＩＶＴ注射を使用するように設計された。ｅｘ ｖｉｖｏで硝子体液に添加されたタンパク質を使用した回復実験は、以前に記載されたように抗イディオタイプ検出抗体を用いたＥＬＩＳＡを使用してＲａｂＦａｂ及びＲａｂＦａｂ－１ｘＴＳＧ ６を定量できることを示した（Ｓｈａｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０１６ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ）。しかし、ＲａｂＦａｂ－２ｘＴＳＧ６を用いたＥＬＩＳＡでは、硝子体濃度の放射化学的測定をこの材料に使用するように、不十分な回収率が得られた。ＰＫ研究のため、ＲａｂＦａｂ－２ｘＴＳＧ６をヨウ素１２５で放射性標識した。
図２Ａに示すように、ＰＫパラメータを表６に要約すると、ＲａｂＦａｂ－１ｘＴＳＧ６及びＲａｂＦａｂ－２ｘＴＳＧ６の両方が、遊離ＲａｂＦａｂと比較してより長い硝子体滞留時間を示した。ＲａｂＦａｂ－１ｘＴＳＧ６は、ＲａｂＦａｂよりも１．４倍長い半減期を示したが、半減期の増加は、ＲａｂＦａｂ－２ｘＴＳＧ６については２．２倍であった。これらの結果は、ＨＡＢＤへのＦａｂの融合が眼区画におけるこれらの分子の保持時間を増加させ得ることを示す。他の種の硝子体ＨＡ濃度がより高いことを考えると、Ｆａｂ－ＨＡＢＤを有する動物では更に大きな半減期延長が得られると予想される。
さらに、硝子体半減期研究は、蛍光光度法によって観察されるように、ＲａｂＦａｂと比較してＲａｂＦａｂ－２ｘＴＳＧ６の硝子体半減期におよそ３～４倍の増加があり、評価された範囲にわたって用量に明らかに依存しないことを示した（図２Ｂ）。しかし、２１日間の研究期間は、薬物動態学的パラメータの信頼できる決定には十分な長さではなく、投与されたＲａｂＦａｂ－２ｘＴＳＧ６のおよそ４０％が研究終了時に硝子体内に残存していると推定された。
実施例５．ＲａｂＦａｂ－１ｘＴＳＧ６及び遊離ＴＳＧ６のウサギ眼忍容性
Ａ．材料及び方法
遊離ＴＳＧ ６及びＲａｂＦａｂ－１ｘＴＳＧ６の単回ＩＴＶ用量の毒性を、ニュージーランドホワイトウサギで評価した。４週間の単回ＩＶＴ用量研究を設計し（表７）、実施した。血清中のＲａｂＦａｂ－１ｘＴＳＧ６又は遊離ＴＳＧ ６に対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）をＥＬＩＳＡによって測定した。プレートをＲａｂＦａｂ－１ｘＴＳＧ－６又は遊離ＴＳＧ６でコーティングし、研究動物から採取した血清とインキュベートし、次いで、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ウサギＦｃ抗体で抗薬物抗体を検出した。
Ｂ．結果
一般に、ＲａｂＦａｂ－１ｘＴＳＧ－６を投与された動物は、遊離ＴＳＧ６を投与された動物よりも重篤な所見が少なかった。遊離ＴＳＧ６を投与した動物は、有意な臨床所見を有していた。４匹の動物が４日目に予定通り剖検されたが、他の４匹の動物は、有意な臨床所見及び動物福祉に対する懸念のために、３０日目ではなく１２日目又は１７日目のいずれかで早期に終了させた。これらの臨床所見には、腫脹して赤くなった眼瞼及び結膜、スタッフが近づいたときに目を閉じたままにした動物、並びに眼の炎症及び刺激が含まれた。投与後３日までに、遊離ＴＳＧ６を投与した動物は、水晶体及び外側から完全な網膜変性の顕微鏡所見と相関する、著しい後初期白内障及び可変網膜血管減衰を示した。ＲａｂＦａｂ－１ｘＴＳＧ６を投与した動物では、類似しているがそれほど重篤ではない所見が存在した。顕著な、主に単核細胞の炎症が、投与後７日目から全ての動物において認められた。炎症及び網膜変性は、網膜剥離、並びにビメンチン、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、及びグルタミンシンテターゼ陽性ミュラー（Ｍｕｌｌｅｒ）細胞の肥大及び末梢移動の証拠と多巣性に関連していた。ＴＳＧ６のＩＶＴ投与の４日後の網膜変性を示す組織病理画像を図３に示す。
ＲａｂＦａｂ－１ｘＴＳＧ６を投与し、４日目に剖検に供した両動物は、４日目に血清中に存在する抗薬物抗体（ＡＤＡ）の証拠を有していた。しかしながら、これらの動物のうちの１匹はＡＤＡプレ用量を有していたが、この治療群の残りの３匹の動物はＡＤＡプレ用量を有していなかった。後の剖検を受けたこの群の動物は、４日目及び８日目に血清ＡＤＡについて陰性であったが、１５日目にＡＤＡ陽性になった。遊離ＴＳＧ６で治療した動物の血清ＡＤＡ応答の分析は、アッセイの感度が低いために決定的ではなかった。
一般に、ＲａｂＦａｂ－１ｘＴＳＧ－６を投与された動物は、遊離ＴＳＧ６を投与された動物よりも重篤な所見が少なかった（表８）。白内障は各動物に存在したが、白内障は自然に点状であり、顕微鏡切片では相関は同定されなかった。網膜変性の臨床的証拠はなかったが、最小から軽度の網膜外変性の顕微鏡的証拠が個々の眼に存在していた。８日目以降、中程度から重度に類似した硝子体細胞及び水性細胞が存在した。動物を４日目及び１７日目に安楽死させた。
抗ＲａｂＦａｂ応答の評価は、投与前の３／８匹の動物（２匹の動物に遊離ＴＳＧ６を投与し、１匹の動物にＲａｂＦａｂ－１ｘＴＳＧ６を投与した）についてカットオフを超える値の存在により複雑であった。しかしながら、試験項目の投与後、ＲａｂＦａｂ－１ｘＴＳＧ６を投与した３／４匹の動物は、ＡＤＡ力価が出現したか又は増加しており、１匹の動物を４日目に安楽死させ、両方の動物を１７日目に安楽死させた。対照的に、遊離ＴＳＧ６を投与した動物１（剖検４日目）のみが、投与前と比較して高いＡＤＡ力価を有していた。
臨床徴候及び顕微鏡的病変の早期発症は、網膜及び水晶体変性におけるＴＳＧ６の直接的な役割を示唆しているが、後の時点での所見は、予想外に激しいＡＤＡ応答によって混乱した。ミュラー細胞の末梢移動は、網膜への傷害又は網膜の剥離後のウサギ網膜の非特異的応答であると結論付けられた。
実施例６．ミニブタにおける治療用量の薬物動態（ＰＫ）
本研究の目的は、ミニブタへのＩＶＴ注射（ＩＶＴ）によって１回投与されたＦａｂ－ＨＡＢＤ及びＦａｂ－ＨＡＢＤ－ＨＡｓの眼及び全身ＰＫパラメータ、並びに結果として生じる眼半減期（ｔ１／２）の延長を決定することであった。さらに、抗薬物抗体（ＡＤＡ）、眼の忍容性及び眼の病態（いくつかの研究対象において）の調査を行った。
Ａ．材料及び方法
１４匹のＧｏｔｔｉｎｇｅｎ ＳＰＦミニブタに、治療用量の以下の試験項目を両眼に投与した（５０μＬ／眼）（表９）。
ＩＶＴ投与後、試験項目を投与した動物の血液及び眼房水試料を研究期間中（最大９週間）定期的に収集し、硝子体液を予定された安楽死の直後に採取して試験項目の全身及び眼のＰＫを追跡した。血漿、眼房水及び硝子体液を試験項目濃度について分析し、血漿及び硝子体液試料をＡＤＡの存在について更に分析した。
Ｂ．結果：研究の寿命期の間、ＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４を投与された主に５匹中２匹の動物の眼に関する肉眼的所見は、この試験項目のＩＶＴ注射がブタの眼によって忍容されず、動物の早期屠殺をもたらしたことを示した。組織病理学的評価のために、動物あたり１つの眼を用意した。簡潔には、このような肉眼的所見は、混濁硝子体、正常粘度未満の硝子体、及び最終的には視力喪失の挙動徴候であった。眼の組織病理学的所見は、虹彩、毛様体、小柱網及び網膜における血管周囲／血管、主に単核細胞浸潤を伴う中等度の混合細胞炎症からなっていた。網膜変性は、変性した神経節細胞、ＩＮＬにおける細胞の喪失、集塊した光受容体及びＰＲ層における置換された核からなっていた。さらに、混合細胞浸潤及び線維束を有する好酸球性タンパク質性物質が硝子体内に観察された。視神経に所見は認められなかった。
ＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４＋１０ｋＤａ ＨＡを受けた５匹の動物のうち少なくとも１匹の眼に関する肉眼的所見は、ＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４と比較して有意に重症度が低かった。簡潔には、両眼の前房にフレア／白ベールがあり、これが角膜の後ろに蓄積物を作ったが、早期終了のために考慮されなかった。
結論として、ＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４とＨＡ（すなわち、ＩＶＴ注射前のＨＡによるＣＤ４４ ＨＡ結合部位の占有）との複合体化は、ＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４の眼忍容性を改善した。
未修飾ＶＰＤＦを受けた動物群では、肉眼的所見又は忍容性の問題は見られなかった。
試験項目ＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４及びＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４＋１０ｋＤａ ＨＡのＰＫ結果は、眼房水及び硝子体に由来し、非区画分析による個々の濃度時間データから計算され、図４Ａ～Ｂにグラフで示されている。
５．８日間の未修飾ＶＰＤＦのＩＶＴ ｔ１／２はそのような分子について予想される範囲内にあるが、４８日間のＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４＋１０ｋＤａ ＨＡのＩＶＴ ｔ１／２は、未修飾ＶＰＤＦと比較して眼内滞留時間の約８倍の増加に対応する。結論として、ＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４＋１０ｋＤａは、ＨＡに複合体化していないＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４と比較して有意に改善された忍容性及び未修飾ＶＰＤＦと比較して有意に改善された眼内半減期を示す。
実施例７．硝子体適合性のためのＨＡとのプレ複合体化
ｉｎ ｖｉｖｏミニブタ研究からの肉眼的所見、すなわち硝子体の濁りは、純粋なＨＡとのＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４のプレ複合体化によって減少し得る、ＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４とブタ硝子体との不適合性（すなわち、沈殿物の形成）を示唆している。これらの効果を更に調査し、これらの観察結果がＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４分子に限定されるか、又は他のＦａｂ－ＨＡＢＤについても検出できるかどうかを試験するために、本発明者らは、硝子体変性を検出するためのｅｘ ｖｉｖｏ試験システムを開発した。
ＨＡと予め複合体化した場合のいくつかのＦａｂ－ＨＡＢＤの硝子体適合性を評価するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ 「液滴」試験を開発した。この実施例は、ＨＡ（すなわち、コンジュゲート）と予め複合体化したＦａｂ－ＨＡＢＤがｉｎ ｖｉｔｒｏ実験で硝子体と適合性であったことを示す。以前に観察された硝子体の不適合性は、遊離ＨＡＢＤによって引き起こされた可能性があり、これはＨＡプレ複合体化によって軽減された。Ｆａｂ－ＨＡＢＤと遊離ＨＡＢＤとの不適合性は、濃度依存性であることが示された。さらに、ＨＡ結合を無効にする点変異を含むＦａｂ－ＨＡＢＤ変異体であるＣＤ４４ｋｏは、予め複合体化された形態及び単離された形態の両方で硝子体と適合性であった。
実施例７．１．ＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４と１０ｋＤａ ＨＡとのプレ複合体化は硝子体内（ＩＶＴ）忍容性を改善する
Ａ．材料及び方法
第１の試験では、ブタ硝子体をＤｏｕｎｃｅホモジナイザーで１０回ホモジナイズし、１０，０００ｇで２分間の遠心分離によって破片を除去した。次いで、２μｌの均質化された硝子体の液滴をガラス顕微鏡スライドに適用した。さらに、２μｌの試験試料（すなわち、定義された濃度のＦａｂ－ＨＡＢＤ又はＦａｂ－ＨＡＢＤ－ＨＡ）を、更に混合することなく硝子滴の上に添加した。液滴の併合のおよそ１分後、不均一性及び沈殿について明視野モードで４０倍の倍率で光学顕微鏡によって試料を検査した。
Ｂ．結果
２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中２００ｍｇ／ｍＬの濃度の未修飾ＶＰＤＦと混合されたブタ硝子体は均一で透明である（図５Ａ）が、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中２０ｍｇ／ｍＬの濃度のＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４と混合されたブタ硝子体は不均一であり、沈殿の明確な徴候を示す（図５Ｂ）。
この結果は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＩＶＴ注射時にも、ＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４とブタ硝子体との不適合性を示唆している。したがって、硝子体の不適合性は、ＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４について見られるｉｎ ｖｉｖｏ 忍容性問題の潜在的な根本原因の１つである。
２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中の１％（ｗ／ｖ）ＨＡ（１０ｋＤａ、Ｌｉｆｅｃｏｒｅ，Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）と２０ｍｇ／ｍＬの濃度のＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４のプレ複合体化は、硝子体適合性をもたらす（図５Ｃ）。この結果は、ＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４と１０ｋＤａ ＨＡとのプレ複合体化がＩＶＴ忍容性を改善することが示された上記のミニブタｉｎ ｖｉｖｏ研究からの所見を反映している。
実施例７．２．ＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４の硝子体不適合性は濃度に依存する
Ａ．材料及び方法
ＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４の硝子体不適合性の濃度依存性を試験するため、２μｌのブタ硝子体を、３７．５ｍｇ／ｍＬの開始濃度で２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中のＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４の１：４希釈物と混合した。硝子体とタンパク質の混合物を、硝子体の不均質性について光学顕微鏡法によって調べた。
Ｂ．結果
検出された不均一性は、タンパク質濃度に依存していた（表１０；図６Ａ～Ｆ）。ＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４の硝子体適合性は、０．６～０．１５ｍｇ／ｍＬの間に達した。これらの結果を上記のｉｎ ｖｉｖｏミニブタ研究における所見（ＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４の濃度＝１７．４ｍｇ／ｍＬ）と関連付けると、１７．４ｍｇ／ｍＬの濃度のＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４溶液のＩＶＴ注射が、観察された忍容性の問題の根本原因であり得る同様の不均一性をもたらし得ることが示唆される。
実施例７．３．ＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４の硝子体の不適合性は硝子体内（ＩＶＴ）ＨＡとのその相互作用に関連する
Ａ．材料及び方法
ＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４の硝子体不適合性がＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４とＩＶＴ ＨＡとの相互作用によって誘導されるかどうかを試験するため、本発明者らは、タンパク質の残りをインタクトのままにして、ＨＡへの結合を消失させるＣＤ４４のＨＡ結合部位内の点変異を含むこの分子のバリアント（ＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４－ｋｏ）を設計した（本明細書では「ｋｏバリアント」と呼ぶ）。
Ｂ．結果
ＣＤ４４ｋｏバリアントは、一過性発現、精製及び生物物理学的特性（分析サイズ排除、変性ＳＤＳキャピラリー電気泳動）において同一の挙動を示し、その同一性を質量分析によって確認した。ＨＡ結合部位変異の導入は、ＳＰＲによって示されるように親和性の完全な喪失をもたらした（実施例２と同じ方法で試験した）。
このＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４－ｋｏバリアントを２ｘＶＰＤＦと同じ濃度で上記の実施例７．２に記載されるように硝子体適合性について試験した場合、硝子体の不均一性は検出されず、硝子体適合性を示唆した（表１１）。
実施例７．４．ＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４は、ヒアルロニダーゼによる前治療後の硝子体と適合性である
Ａ．材料及び方法
さらに、本発明者らは、ヒアルロニダーゼで前治療してＨＡを分解したブタ硝子体におけるＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４の硝子体適合性を試験した。このために、ブタ精巣由来のヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）をＰＢＳ中に２ｍｇ／ｍＬ（＞１．５Ｕ／μＬ）で溶解した。このヒアルロニダーゼ溶液１μＬを５０μＬのブタ硝子体に添加し、３７°Ｃで２時間インキュベートした。対照試料をＰＢＳ緩衝液のみで治療した。
Ｂ．結果
結果として、ＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４は、おそらく高分子量ＨＡの分解に起因して、ヒアルロニダーゼで前処理した硝子体と混合した場合、２０ｍｇ／ｍＬの濃度で不均一性を示さなかった。
要約すると、これらの結果は、ＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４のｉｎ ｖｉｖｏ忍容性問題の根本原因となり得る硝子体不適合性が、ＣＤ４４－ＨＡＢＤと高分子量ＩＶＴ ＨＡとの相互作用に関連することを示唆している。
実施例７．５．Ｆａｂ－ＨＡＢＤの硝子体不適合性は、特定の濃度でのＨＡＢＤと硝子体ＨＡとの相互作用に関連する
Ａ．材料及び方法
硝子体の不適合性がＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４のみの特徴であるかどうかを試験するために、本発明者らは、上記の実施例７．２及び７．３で上述したように、硝子体の不均一性について他のＦａｂ－ＨＡＢＤ又はＨＡＢＤ単独を試験した。試験したタンパク質を実施例１に記載する。
Ｂ．結果
ＶＰＤＦ－１ｘＣＤ４４は、ＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４と比較して同等の硝子体不均一性を示した。結果は、２×バージョンによるＨＡポリマーの結合活性及び潜在的架橋の増加が硝子体不適合性に関連しないことを示唆している。結果は、硝子体不適合性に関連するＣＤ４４ ＨＡＢＤとＩＶＴ ＨＡとの間の相互作用を示唆している（表１２）。
ＴＳＧ６ドメインを有するＦａｂ－ＨＡＢＤは、ＣＤ４４を有するＦａｂ－ＨＡＢＤと同等の硝子体不均一性を示す。Ｆａｂ成分Ｇ６．３１は、同じ濃度で硝子体の不均一性を示さなかったが、単離されたＴＳＧ６ドメインは示した。これも、硝子体の不適合性が特定の濃度でのＨＡＢＤと硝子体ＨＡとの間の相互作用に関連するという示唆を裏付けている。
実施例７．６．硝子体の不適合性はＨＡとのプレ複合体化によって救済され得る
Ａ．材料及び方法
ＶＰＤＦ－１ｘＣＤ４４及びＴＳＧ６バリアントについて検出された硝子体不適合性がＨＡとのプレ複合体化によって救済され得るかどうかを試験するために、本発明者らは、１％（ｗ／ｖ）ＨＡ（１０ｋＤａ、Ｌｉｆｅｃｏｒｅ，Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を含む表１３に示すコンジュゲートを作製した。
Ｂ．結果
硝子体の不均一性は、１０ｋＤａ ＨＡとのプレ複合体化によって試験した全てのＦａｂ－ＨＡＢＤについて救済された（表１３）。これらの結果は、純粋なＨＡとのＨＡ結合タンパク質のプレ複合体化が、硝子体適合性、ひいてはこれらの分子の潜在的な忍容性問題を改善する方法であり得ることを示唆する。
実施例７．７．Ｆａｂ－ＨＡＢＤの硝子体不適合性はブタ硝子体に特異的ではない
Ａ．材料及び方法
ＣＤ４４及びＴＳＧ６含有Ｆａｂ－ＨＡＢＤについて検出された硝子体の不適合性がブタ硝子体においてのみ生じる効果であるかどうかを試験するために、本発明者らは、ブタ硝子体の代わりにウサギ硝子体を使用して、上記の実施例７．１～７．６に記載の適合性試験を行った。
Ｂ．結果
試験した全てのＦａｂ－ＨＡＢＤについて、ブタ硝子体と同様の硝子体の不適合性が検出された。さらに、ウサギ硝子体で検出された全ての硝子体不適合性は、Ｆａｂ－ＨＡＢＤと１０ｋＤａ ＨＡとのプレ複合体化によって救済することができた。
これらの結果は、硝子体の不適合性がブタ硝子体に特異的ではないことを示唆している。
実施例７．８．Ｉｎ Ｉｉｖｏで注射すると硝子体の不均一性が誘発される
Ａ．材料及び方法
ｅｘ ｖｉｖｏ硝子体適合性試験結果とｉｎ ｖｉｖｏ ミニブタ研究からの忍容性所見との間の関連を生成するために、本発明者らは、硝子体の不均一性及びＨＡプレ複合体化による救済がブタ眼全体で検出され得るかどうかを試験した。
このために、屠殺直後に全ブタ眼を受け取り、１７．４ｍｇ／ｍＬ＋／－１％（ｗ／ｖ）ＨＡ １０ｋＤａの濃度の２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中ＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４溶液５０μｌを注射した。眼（上記のｉｎ ｖｉｖｏ ミニブタ研究と同一）。次いで、眼をＨＢＳＳ（Ｌｏｎｚａ，Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）に移し、３７℃で４時間保持した。インキュベーション後、眼を開け、硝子体を取り出して不均一性を調べた。
Ｂ．結果
図７Ａ～図７Ｃに示すように、注射時の硝子体不適合性は、Ｆａｂ－ＨＡＢＤとＨＡとのプレ複合体化によって解決することができる。緩衝液の注入はＩＶＴ不均一性をもたらさず、透明な硝子体をもたらした（図７Ａ）。ＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４の注射は、注射側の周囲の硝子体に濃い白色の不均一性（沈殿物様）をもたらした（図７Ｂ）。純粋なＨＡと予め複合体化したＶＰＤＦを注射した眼からの硝子体は、有意差を示し（図７Ｃ）、すなわち、不均一性が検出されたが、これは硝子体全体を通して著しく低密度であり、より薄かった。
これらの結果は、ＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４誘導性の不均一性が注射部位付近のブタ眼全体にも生じることを示唆している。この理論に拘束されるものではないが、本発明者らは、同じ不均一性がｉｎ ｖｉｖｏ注射時に誘導され、観察された忍容性の問題の根本原因であり得ることを示唆する。
さらに、ＨＡとのＶＰＤＦ－２ｘＣＤ４４のプレ複合体化は、注射部位の周りの観察された不均一性を減少させる。本発明者らは、同じ効果が、ＶＰＤＦ－２ｘＣＤ ４４－ＨＡについてｉｎ ｖｉｖｏで観察された忍容性の改善をもたらすことを示唆する。硝子体不適合性が別のＴＳＧ６ ＨＡＢＤとも起こり、純粋なＨＡを用いた予備製剤化によって等しく救済することができるという実施例７．５及び７．６の観察結果と合わせて、本発明者らは、このアプローチが硝子体適合性、したがってＨＡＢＤ含有タンパク質のＩＶＴ忍容性を改善するための一般原理であり得ることを示唆する。
実施例８．バーシカンＶＧ１及びＶＧ１ΔＩｇ ＨＡＢＤはＨＡを結合することができる
バーシカンのＨＡＢＤを研究して、ＴＳＧ６及びＣＤ４４ ＨＡＢＤよりも優れた眼忍容性及び眼滞留時間を提供するＨＡＢＤとして使用できるかどうかを判定した。
バーシカンは、リンクモジュールのタンデムリピートを有すると同定された。図８Ａに示されるように、バーシカンのアミノ酸配列は、本明細書においてＷＴ ＶＧ１と呼ばれるバーシカンのＮ末端断片がＮ末端Ｉｇ様ドメイン及び２つのリンクドメインを含むように、Ｉｇ様ドメインとそれに続く２つのリンクモジュールをコードする。この実施例では、本発明者らは、ＷＴ ＶＧ１及びＩｇドメインを含まない短縮バリアントＶＧ１ΔＩｇを作製し、ＨＡへの結合についてそれらを試験した。さらに、以下の実施例では、Ｆａｂ及びＷＴ ＶＧ１からなるＷＴ ＶＧ１及びＦａｂ－ＨＡＢＤを、ウサギ及びミニブタにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏ硝子体適合性及びＩＶＴ注射時の忍容性について試験した。
Ａ．材料及び方法
タンパク質の発現プラスミドを、標準的な分子生物学技術を使用して制限クローニング及び／又は遺伝子合成によって作製した。ＣＨＯ又はＨＥＫ２９３細胞のいずれかで発現を行った。
４，０００ｒｐｍ、４°Ｃで２０分間の遠心分離によって上清を回収した。その後、無細胞上清を０．２２μｍボトルトップフィルターを通してフィルタにかけ、冷凍庫（－２０°Ｃ）で保存した。
ＷＴ ＶＧ１及びＶＧ１ΔＩｇのＨｉｓタグ付き変異体を、ＳＥＣと共にＮｉ－ＮＴＡ樹脂を使用するアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製した。簡潔には、滅菌濾過した細胞培養上清をＨｉｓＴｒａｐ樹脂上に捕捉し、洗浄し、高イミダゾール濃度を含有する緩衝液を用いて溶出した。溶出したタンパク質画分をプールし、濃縮した後、ランニング緩衝液として２０ｍＭ酢酸ヒスチジン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５を使用してＳＥＣに供した。
ＷＴ ＶＧ１及びＶＧ１ΔＩｇのＨＡへの結合を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＳＰＲによって試験した。簡潔には、ＷＴ ＶＧ１及びＶＧ１ΔＩｇを、固定化ストレプトアビジンを介してビオチン－ＨＡ（Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＰＥＧＷｏｒｋｓ、ノースカロライナ州）で間接的にコーティングしたＳｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５チップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）に、８０秒間又は１２０秒間注入した。注入濃度はそれぞれ０．５ｎＭ～１μＭの範囲であった。解離相を３００秒間～６００秒間モニターした。続いて、１Ｍ ＭｇＣｌ２を１５秒間注入することによって表面を再生した。全ての実験は、ＰＢＳ（１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ ｐＨ７．４）を使用して２５°Ｃで行った。ＨＡ結合について得られた曲線を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して１：１ラングミュア結合モデルに当てはめた。
Ｂ．結果
バーシカンＨＡＢＤはＨＡに結合することができる。各タンパク質のＨＡ結合のＫＤを表１４に示す。
実施例９．ＷＴ ＶＧ１及びＴＳＧ ６タンパク質のグリコサミノグリカン結合プロファイル
Ａ．材料及び方法
ＷＴ ＶＧ１及びＴＳＧ６のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合プロファイルを、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＳＰＲによってヘパリン硫酸及びコンドロイチン硫酸への結合を測定することによって決定した。簡潔には、タンパク質を、ストレプトアビジンを介してビオチン－ヘパリン硫酸又はビオチン－コンドロイチン硫酸のいずれかで間接的にコーティングしたＳｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５チップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）に１８０秒間注入した。注入濃度はそれぞれ約５ｎＭ～１０００ｎＭの範囲であった。解離相を１２０秒間監視した。続いて、１Ｍ ＭｇＣｌ２を３０秒間注入することによって表面を再生した。
Ｂ．結果
結果は、ＷＴ ＶＧ１がＴＳＧ６よりも結合において選択的であることを示している（表１５）。ＷＴ ＶＧ１は、ヘパリン硫酸又はコンドロイチン硫酸に対する観察可能な結合を有していなかったが、ＴＳＧ６は、ヘパリン及びコンドロイチン硫酸の両方に対して緊密な結合を有していた。
実施例１０．ＶＧ１ ＨＡＢＤを含むＦａｂ－ＨＡＢＤは抗原及びＨＡの結合が可能である
Ａ．材料及び方法
Ａ．１．コンストラクト設計
Ｆａｂ－ＨＡＢＤは、ＷＴ ＶＧ１配列のＦａｂ断片重鎖のＣ末端又はＩｇＧ１重鎖のＮ末端への組換え融合によって作製されたか、又は作製され得る。ペプチド－ＶＧ１融合物については、ＷＴ ＶＧ１のＮ末端（ＥＥＴＩ－ＶＧ１）及びＷＴ ＶＧ１のＣ末端（ＶＧ１－ＥＥＴＩ）の両方に結合したペプチド（ＥＥＴＩ）を有するコンストラクトが作製されたか、又は作製され得る。ＥＥＴＩとＷＴ ＶＧ１との間に組み込まれたＴＥＶ切断部位を有する２つの更なるコンストラクト（ＥＥＴＩ－ＴＥＶ－ＶＧ１及びＶＧ１－ＴＥＶ－ＥＥＴＩ）も作製した。使用されるリンカー又は使用され得るリンカーを表１６に示す。
Ａ．２．種一致代用ブタ抗ＶＥＧＦ Ｆａｂの作製
ａｂＹｓｉｓデータベースの検索では、ブタ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ）ＩｇＧの対になった重鎖及び軽鎖の既知の例が得られなかったため、本発明者らは、抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ（Ｇ６．３１．ＡＡＲＲ）からのＣＤＲ移植によって既知の抗原に対する能動的結合抗体を作製しようとした。ＮＣＢＩ発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースで、Ｇ６．３１フレームワーク（ＶＨ４／ＶＬＫ２）と高い配列同一性を有するブタｍＲＮＡ ＥＳＴを検索した。いくつかの配列を選択し、Ｇ６．３１．ＡＡＲＲからのＣＤＲを適切なフレームワーク領域内に移植して、「ブタ化」Ｇ６．３１．ＡＡＲＲを作製した。重鎖及び軽鎖配列をランダムに対にし、３０ｍＬ培養物中の２９３Ｅｘｐｉ細胞又はＣＨＯ細胞で発現させた。精製をＣａｐｔｏ Ｌ樹脂上で行い、続いてサイズ排除クロマトグラフィーを行い、精製したタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ、マススペックによって調べ、ヒト及びブタＶＥＧＦへの結合について評価した。ＶＥＧＦに対する良好な親和性を有する１つの配列をスケールアップ及びその後のｔｏｘ／ＰＫ分析のために選択し、この配列をＶＧ１に組換え融合してＰｉｇＦａｂ－ＶＧ１を作製した。
Ａ．３．安定な発現及び精製
タンパク質発現を、ＣＨＯ細胞又は２９３Ｅｘｐｉ細胞へのＤＮＡコンストラクトのカチオン性脂質トランスフェクションによって行った。培養体積は３０ｍＬ～３５Ｌの範囲であった。いくつかのコンストラクトについては、培養体積当たりのタンパク質収量を増加させるために、迅速に安定な細胞株を作製した。
精製は、６ｘ－ヒスチジン標識分子に対してＮｉ－ＮＴＡ樹脂、又はＦａｂ融合に対してＧａｍｍａ ｂｉｎｄ Ｐｌｕｓ樹脂のいずれかを使用するアフィニティークロマトグラフィーによって行った。場合によっては、Ｓｅｐｈａｄｅｘ樹脂の最終サイズ排除工程の前に二次イオン交換工程を実施した。
Ａ．４．ＨＡ結合
ＶＧ１がＦａｂ－ＨＡＢＤとしてそのＨＡ結合特性を保持していることを確認するために、実施例２．１で前述したようにＳＰＲを使用した。単一サイクル速度論を使用して実験を行い、解離を最大６００秒間監視した。試験したタンパク質濃度はタンパク質間で変動したが、５００ｎＭ～６．２５ｎＭの範囲であった。
Ａ．５．抗原結合
抗原結合を、それぞれの抗原をＳｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５チップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に直接固定し、実施例２．１に記載のようにＳＰＲによって結合を測定することによって試験した。相互作用の既知の親和性に基づいて、異なるタンパク質濃度を使用した。
Ｂ．結果
Ｂ．１．ヒアルロナン（ＨＡ）結合
ＨＡ結合についての全てのデータを、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して１：１ラングミュア結合モデルに当てはめた。各タンパク質のＫＤを表１７に示す。
Ｂ．２．抗原結合
表１８は、測定されたＫＤと共に抗原結合について分析されたタンパク質を示す。ＶＧ１と様々なＦａｂ重鎖とのＣ末端融合は、抗原結合に影響を及ぼさなかった。ＥＥＴＩ－ＶＧ１融合の場合、リンカー及び結合部位の柔軟性が抗原結合に影響を及ぼした。より柔軟なリンカー及びＣ末端融合が好ましい。
実施例１１．ＨＡＢＤのＩｎ Ｖｉｔｒｏ硝子体適合性
Ａ．材料及び方法
この実施例は、硝子体液中のＶＧ１ドメイン溶解度の試験を記載する。Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーを使用して調製し、続いて１０，０００×ｇで２分間遠心分離して破片を除去した硝子体液をこれらの研究に使用した。
更なる実験は、明視野及び蛍光顕微鏡の両方を使用してｅｘ ｖｉｖｏで硝子体液中の沈殿を監視することができるように、Ａｌｅｘａ４８８標識タンパク質を利用した。等量の試験物質及び硝子体液を、３－ｉｎ－１三チャネルスライド（ｉｂｉｄｉ，ＵＳＡ，Ｉｎｃ．、カタログ番号８０３１６）の２つのチャネルの各々に連続的に注入することによって混合し、混合界面を顕微鏡によって視覚的に監視した。
Ｂ．結果
ＴＳＧ６を予めＰＢＳ ｐＨ７．４で１：４に希釈したブタ硝子体液と混合すると、溶液は濁り（図９Ａ）、混合物の遠心分離時にペレットが観察された。対照的に、ＶＧ１をブタ硝子体と１：４及び１：１の比の両方で混合した際に溶液は透明のままであり（図９Ｂ、遠心分離の際にペレットは観察されなかった。
さらに、ブタ硝子体中のＲａｂＦａｂ－ＴＳＧ６についてｅｘ ｖｉｖｏで沈殿が観察されたが（図１０Ａ）、ＲａｂＦａｂ－ＶＧ１については沈殿は観察されなかった（図１０Ｂ）。同様に、ＶＧ１（図１１Ａ）、ＲａｂＦａｂ－ＶＧ１（図１１Ｂ）、又は等濃度（質量基準）のＲａｂＦａｂ－ＶＧ１及び１０ｋＤａ ＨＡを含有する製剤（図１１Ｃ）を比較した場合、ウサギ硝子体においてｅｘ ｖｉｖｏで沈殿は観察されなかった。
ＴＳＧ６とは対照的に、ｅｘ ｖｉｖｏでの硝子体液中の沈殿を防ぐために、１０ｋＤａ ＨＡを含むＶＧ１の予備製剤化は必ずしも必要ではない。
実施例１２．Ｅｘ ＶｉｖｏでのＶＧ１と硝子体液との相互作用
Ａ．材料及び方法
蛍光相関分光法（ＦＣＳ）を使用して、単離されたＶＧ１及びＦａｂ－ＶＧ１ Ｆａｂ－ＨＡＢＤと硝子体液とのｅｘ ｖｉｖｏでの相互作用を調べた。ＶＧ１及びＦａｂ－ＶＧ１を、ＰＥＧ４－ＤＹ６４７－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを使用してリジン残基上に共有結合的に標識した。ＤＹ６４７の蛍光発光は、５９４又は６３３ｎｍのレーザによって励起され、より長い波長で検出され得る。反応化学は、標識レベルが１分子当たり１蛍光色素以下になるように制御した。ブタ硝子体液を新たに屠殺した動物の眼から収集し、ｄｏｕｎｃｅホモジナイザを用いてホモジナイズした。この物質をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４で１：３に段階希釈した。標識された試験物質を、２０ｎＭの最終濃度まで各希釈アリコートに添加した。試験物質質は、（１）遊離ＶＧ１、（２）ｐｉｇＦａｂ－ＶＧ１、（３）１：１の等しい重量比の１０ｋＤａ ＨＡと混合したｐｉｇＦａｂ－ＶＧ１、（４）ＲａｂＦａｂ－ＶＧ１、及び（５）１：１の等しい重量比の１０ｋＤａ ＨＡと混合したＲａｂＦａｂ－ＶＧ１であった。周囲温度での２時間のインキュベーションの後、ＦＣＳを行った。
Ｂ．結果
ＦＣＳ測定の結果を図１２に示す。希釈されていない又はわずかに希釈された硝子体と共にインキュベートした場合、試料の全てが、緩衝液（ＰＢＳ）単独でのインキュベーションと比較して有意に遅延した拡散を示した。遊離ＶＧ １、ＰｉｇＦａｂ－ＶＧ１及びＲａｂＦａｂ－ＶＧ１の場合、この遅延拡散は、硝子体が６，０００倍超に希釈されるまで持続した（図１２の３、４、６、及び７行目；希釈されていない状態から希釈係数６，５６１まで）。１０ｋＤａ ＨＡと共製剤化された試料についても遅い拡散が観察されたが、硝子体液の希釈倍率が７２９倍以上であると効果が消失した（図１２、５行目：ＰｉｇＦａｂ－ＶＧ １＋１０ ｋＤａ ＨＡ（１：１）、８行目：ＲａｂＦａｂ－ＶＧ １＋１０ ｋＤａ ＨＡ（１：１）；ＰＢＳに対する希釈係数７２９）。これらの結果は、硝子体液に内在するおそらく高分子量ＨＡである硝子体成分と、ＶＧ１含有試験物質質との間に強い相互作用があることを示している。低分子量ＨＡの存在下であっても、硝子体液のより小さな希釈（図１２、５行目：ＰｉｇＦａｂ－ＶＧ１＋１０ｋＤａ ＨＡ（１：１）、８行目：ＲａｂＦａｂ－ＶＧ１＋１０ｋＤａ ＨＡ（１：１））では、ＶＧ１は内因性ＨＡと相互作用することができる。これは、ＶＧ１及びＦａｂ－ＶＧ１が１０ｋＤａのＨＡから解離し、硝子体液中に存在するＨＡに結合することができることを示している。しかしながら、硝子体液が著しく希釈されると、低ＭＷ ＨＡへのＶＧ１結合について競合するのに十分な高濃度の高ＭＷ ＨＡは存在しない（図１２、５行目：ＰｉｇＦａｂ－ＶＧ１＋１０ｋＤａ ＨＡ（１：１）、８行目：ＲａｂＦａｂ－ＶＧ１＋１０ｋＤａ ＨＡ（１：１）；ＰＢＳに対する希釈係数７２９）。低ＭＷ ＨＡに結合したＶＧ１は、結合していない材料と比較して、拡散がわずかに又は無視できる程度に遅くなる（図１２、５行目：ＰｉｇＦａｂ－ＶＧ１＋１０ｋＤａ ＨＡ（１：１）及び８行目：ＲａｂＦａｂ－ＶＧ１＋１０ｋＤａ ＨＡ（１：１）に対するＰＢＳ対照；これらの試料は、硝子体を添加していない１０ｋＤａのＨＡを有する）。
実施例１３．Ｆａｂ－ＶＧ１の熱ストレス安定性に対する１０ｋＤａ ＨＡとのプレ複合体化の効果
Ａ．材料及び方法
抗ＨｔｒＡ１－ＶＧ１タンパク質を使用して、熱ストレスに対する安定性に対するＦａｂ－ＶＧ１と１０ｋＤａ ＨＡとのプレ複合体化の効果を試験した。これらの実験のため、抗ＨｔｒＡ１－ＶＧ１を、１．８ｍｇ／ｍＬの１０ｋＤａ ＨＡの添加の有無にかかわらず、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４中に３ｍｇ／ｍＬで製剤化した。１．８ｍｇ／ｍＬ（１８０μＭ）濃度の１０ｋＤａ ＨＡは、抗ＨｔｒＡ １－ＶＧ１濃度（３５μＭ）の５倍モル過剰である。これらの製剤を３７°Ｃの温度で４週間インキュベートし、次いで、Ｍｉｃｈｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，２００７（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７９，５９６３）によって記載されているように、非還元キャピラリー電気泳動－ドデシル硫酸ナトリウム（ＮＲ ＣＥ－ＳＤＳ）によって分析した。モノマー種及び断片に加えて、ＳＤＳによる変性に耐性の凝集体がＮＲ ＣＥ－ＳＤＳによって検出される。
Ｂ．結果
図１３に示され、表１９に要約されるように、１０ｋＤａ ＨＡとのプレ複合体化は、抗ＨｔｒＡ１－ＶＧ１におけるＳＤＳ安定凝集体の形成を阻害する。高分子量形態（ＨＭＷＦ）の形成速度は、１週間当たり１．２％から１週間当たり０．１％に低下する。１０ｋＤａ ＨＡの存在はまた、凝集に対する効果よりも小さいが、断片化に対する効果を有するようであり、低分子量形態（ＬＷＭＦ）の形成速度は、ＨＡに複合体化した場合に約２倍低下する。これらの結果は、製剤中に１０ｋＤａ ＨＡを含めることは、中性ｐＨでの熱ストレス条件に対して抗ＨｔｒＡ１－ＶＧ１を安定化したことを示している。
実施例１４．Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ Ｍｉｎｉｐｉｇ（登録商標）におけるＶＧ１及びＶＧ１ Ｆａｂ－ＨＡＢＤの眼忍容性
Ａ．材料及び方法
Ａ．１．硝子体内（ＩＶＴ）注射及びエンドポイントの評価
ＶＧ１及びＦａｂ－ＶＧ１ Ｆａｂ－ＨＡＢＤのＩＶＴ注射の忍容性を、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ Ｍｉｎｉｐｉｇ（登録商標）を用いて評価した。研究の計画を表２０に示す。
各ミニブタは、両眼にＩＶＴを介して投与された５０μＬの単回注射を受けた。過去のデータに基づいて、この量はミニブタにおいて十分に許容された。ＩＶＴ注射手順は、公認の獣医眼科医によって実施された。群１のミニブタをビヒクル対照の注射で治療した。群２のミニブタを、単離されたＷＴ ＶＧ１（実施例８で上記のように作製した）で治療した。群３のミニブタをｐｉｇＦａｂ－ＶＧ１（実施例１０に記載のように製造した）で治療した。群４のミニブタを、等しい重量の１０ｋＤａ ＨＡを予め配合したｐｉｇＦａｂ－ＶＧ１で治療した。全ての試験物質質を、指定のタンパク質濃度で、２０ｍＭヒスチジン酢酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５に製剤化した。群３及び群４のｐｉｇＦａｂ－ＶＧ１の用量は、総エンドトキシン量を１眼あたり０．０５エンドトキシン単位（ＥＵ）未満に維持する実現可能な最大用量を表す。このレベルのエンドトキシンは、ミニブタ眼研究において許容されることが以前に見出されている。ＷＴ ＶＧ１（約３０ｋＤａ）とｐｉｇＦａｂ－ＶＧ１（約８０ｋＤａ）との間の分子量の差を考えると、群２の用量レベルは、群３及び群４と比較して、用量あたり１．６のＨＡ結合モル当量を表す。
以下のパラメータ及びエンドポイントをこの研究で評価した：死亡率、臨床徴候、体重、眼科（検査、眼圧測定、広視野カラー眼底イメージング、ＯＣＴイメージング及び網膜電図検査［ＥＲＧ］）、生物分析的分析、トキシコキネティックパラメータ、抗薬物抗体評価、肉眼的剖検所見、及び組織病理学的検査。
全生存動物の両眼について、間接検眼鏡検査及び細隙灯生体顕微鏡検査を介して、委員会認定の獣医眼科医によって検眼鏡検査を実施した。眼検査を、治療前、並びに１日目（投与後）、３、５、８、１５、１７、２２及び２９日目に全ての動物に対して行った。
眼圧（ＩＯＰ）は、眼科検査と同時に、認定眼科医によって、生存している全ての動物の両眼の圧平眼圧測定によって測定した。眼内圧を、治療前並びに１日目（投与後）、３日目、５日目、８日目、１５日目、１７日目、２２日目及び２９日目に全ての動物について測定した。
Ｃｌａｒｉｔｙ ＲｅｔＣａｍ Ｓｈｕｔｔｌｅを使用した広視野カラー眼底画像化を、２９日目に全ての生存動物で行った。投与された試験物質が見える場合、写真撮影を試みた。
２９日目、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ ＨＲＡ／ＯＣＴシステムを使用した光干渉断層撮影イメージング；視神経を通る単一の垂直高解像度ラインスキャンを実施した。
ＥＲＧ評価を、２９日目に全ての生存動物に対して行った。ＥＲＧの前に動物を最低１時間暗順応させた。ＩＳＣＥＶ標準パラメータによるフラッシュ強度及び５分の光適応時間（Ｒｅｔｉｐｏｒｔガンマ、Ｒｏｌａｎｄ Ｃｏｎｓｕｌｔ）を用いた、Ｇａｎｚｆｅｌｄドーム刺激による全視野フラッシュＥＲＧ；振幅値及び潜時値をトレースから測定した。
試験物質の血清濃度を決定するために、胸部入口を通して前大静脈を介して全ての生存動物から血液試料（およそ０．５ｍＬ）を採取した。他の手順のための絶食と一致する間隔を除いて、採血前に動物を絶食させなかった。採血は、前治療、１日目（投与後６及び１２時間）並びに２、３、５、８、１２、１５、２２及び２９日目に１回行った。
血液試料を血清分離チューブに収集し、収集の６０分以内に１３００ｇで１０分間、制御された室温で遠心分離するまで、制御された室温で凝固させた。得られた血清を、予め標識した０．５０ｍＬ ２Ｄバーコード付マトリックスチューブ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｃａｔ ３７４４中での遠心分離の開始から３０分以内に１アリコートに入れた。全てのアリコートをドライアイス上で急速凍結し、－６０°Ｃ～－９０°Ｃで凍結保存した。
血清試料をＥＬＩＳＡアッセイで抗薬物抗体（ＡＤＡ）の存在について試験した。試験物質をアッセイプレートに固定し、血清とインキュベートして洗浄した後、酵素検出のために西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートしたＦｃ部分を有する抗Ｐｉｇ ＩｇＧ試薬で免疫複合体を検出した。
眼房水の収集は、全ての動物について１５日目に、委員会認定の獣医眼科医によって実施された。眼房水の収集は、結膜鉗子を使用して眼球の位置を固定しながら、３１ゲージ針の先端を縁のすぐ後ろの強膜におよそ９０度の角度で斜めに挿入した。次いで、虹彩と角膜との間の前房に前進させる前に、針の角度を浅くした。シリンジプランジャをゆっくりと引き抜いて、最大５０μＬの眼房水を得ることができる最大容量を吸引した。針を取り除き、上強膜組織を挿入部位に接近させ、結膜鉗子で把持した。反対側の眼に対して同一の試料採取手順を実施した。収集した試料を１．０ｍＬのガラスマトリックスｔｒａｋｍａｔｅｓ ２Ｄバーコード付保存管に保存し、次いでＴＰＥキャップで覆った。試料を液体窒素中で凍結させ、６０°Ｃ～－９０°Ｃで凍結保存した。眼房水中の試験物質質レベルを、マススペックベースのアッセイを使用して決定した。
Ａ．２．試料調製
ＰｉｇＦａｂ標準検量線は、２５ｍＭ重炭酸アンモニウムで希釈したブタ水性マトリックス中に異なる量のＰｉｇＦａｂを添加することによって実施した。次いで、標準／試料を以下のように処理した：システイニル残基からのジスルフィド結合を１０ｍＭ ＤＴＴを用いて６０°Ｃで１時間還元し、次いでチオール基を５５ｍＭヨードアセトアミドを用いて暗所室温で４５分間アルキル化した。次いで、標準／試料を３６μｇ／ｍＬトリプシン（配列決定グレードのトリプシン、Ｖ５１１１、Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化し、３７°Ｃで一晩インキュベートした。消化後、重ペプチド（Ｈｅａｖｙ ｐｅｐｔｉｄｅ）を標準溶液及び試料溶液の両方に添加した。０．５～１２μｇ／ｍＬの濃度範囲について直線検量線を得た。
Ａ．３．標識ペプチド
Ｒ（ＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲ ｍ／ｚ：８９１．９８＋２）アミノ酸に重同位体標識を含むペプチド標準を購入した（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ、米国マサチューセッツ州ガードナー）。特性評価及び濃度データは、製造業者によって提供された。標識ペプチドを水１ｍＬにおいて－８０°Ｃで保存した。
Ａ．４．質量分析（ＭＳ）による分析
ＰｉｇＦａｂからの消化物を、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＣＳＨ Ｃ１８カラム（１３０Å、１．７μｍ、１ｍｍ×１００ ｍｍ）を用いて勾配溶出下でＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチューセッツ州ミルフォード）で分離した。カラムを５０°Ｃに維持し、オートサンプラートレイを８°Ｃに維持した。移動相は、流速０．０４ｍＬ／分で、０．１％ＦＡ（Ａ）を含む水及び０．１％ＦＡ（Ｂ）を含むアセトニトリルであった。試料を２分間にわたって２％～９０％Ｂの勾配で溶出し、続いて２分間２％Ｂに減少させてカラムを再平衡化した。注入量は１０μＬであった。
Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ ６５００質量分析計（Ａｂ Ｓｃｉｅｘ、マサチューセッツ州フラミントン）を、ＯｐｔｉＦｌｏｗ（登録商標）Ｔｕｒｂｏ Ｖイオン源を取り付けた陽イオン多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードで操作した。監視したＰｉｇＦａｂ前駆体（Ｑ１）イオンは、９０Ｖでのデクラスタリング電位を有するＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲ（ｍ／ｚ：８８６．９８＋２）であり、監視した生成物（Ｑ３）イオンは、２９ｅＶでの衝突エネルギーを有する３５９．２０ｍ／ｚであった。それぞれ３７ｅＶ及び３０ｅＶの衝突エネルギーを有する７６５．３９ｍ／ｚ及び６０２．３３ｍ／ｚの２つの他の生成物イオンもまた、確認イオン（ｑｕａｌｉｆｉｅｒｓ）としてモニターした。ＭＳ／ＭＳ設定パラメータは以下の通りであった：イオンスプレー電圧、４５００Ｖ；カーテンガス、３０ｐｓｉ；ネブライザーガス（ＧＳ １）、２５ｐｓｉ；温度、３００°Ｃ；及び滞留時間、５０ｍｓ。ＰｉｇＦａｂのための重ペプチドも作製し（８９１．９７ｍ／ｚ）、衝突エネルギー２９ｅＶで遷移３６９．２０４ｍ／ｚを使用して定量した。
データ取得には、Ｓｃｉｅｘ Ａｎａｌｙｓｔソフトウェアバージョン１．７．１（ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ）を使用した。生データをＰｅａｋＶｉｅｗ ２．２で可視化した。
Ｂ．結果
全ての動物は終了予定日まで生存した。したがって、予定外の安楽死は必要とされなかった。試験品関連の眼検査所見には、試験物質注入領域内の硝子体の濁り及び最小後部ブドウ膜炎が含まれた。
眼科検査時の所見は以下の通りであった：
（１）群２（ＷＴ ＶＧ１）－硝子体側頭部内で観察された最小の濁りが、６匹の動物のうち２匹において１日目に存在した。これは３日目までに消散し、研究終了まで存在しなかった。４匹中１匹が１５日目に最小の後部ブドウ膜炎を有し、これは１７日目までに消散した。最小後部ブドウ膜炎は臨床的に有意であるとは考えられなかった。
（２）群３（ｐｉｇＦａｂ－ＶＧ１）－１日目に、６匹全ての動物が、試験物質注射の領域で、硝子体内側頭部に硝子体の濁りを示した。これは３日目に６匹全ての動物で持続し、５日目に動物は４／４匹の動物において中心硝子体を含む拡散の徴候を示した。８日目から２２日目まで、本発明者らは罹患した硝子体領域の減少を観察し、２９日目に、４匹の動物のうち２匹のみが硝子体内側頭部にわずかな濁りを有していた。局所的な硝子体の濁りは、本質的に炎症性であるようには見えなかったが、硝子体の硬さに局所的な影響を及ぼすように見えた。
（３）群４（ｐｉｇＦａｂ－ＶＧ１＋１０ｋＤａ ＨＡ）－研究期間中、試験物質質関連の眼検査所見はなかった。
眼内圧値は、研究全体を通して全ての時点で全ての動物において正常範囲内であった。
いずれの動物も、いかなる時点においても試験物質質に対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）を示さなかった。
２９日目に撮影されたカラー眼底写真及び光干渉断層撮影画像は、全ての群２及び４の動物における正常な硝子体及び網膜の形態を示した。群３の全ての動物は、眼底写真上の局所的な硝子体の濁りが最小限であり、ＯＣＴ上の後部硝子体の反射性が最小限であり、視力検査所見と一致していた。
網膜電図分析を２９日目に全ての動物で行った。動物番号３００６は、Ｓｃｏｔｏｐｉｃ ０．０１光強度で両眼のｂ波振幅が中程度に減少した。他の全ての光強度は正常範囲内であり、この動物が薄暗い網膜機能に影響を及ぼすバックグラウンド異常を有することを示唆した。動物番号２００５及び４００３は、両眼でいくらかの非対称性を示し、ＯＳと比較して振幅ＯＤがわずかに減少した。これは、非中心眼位置ＯＤを含む記録条件に関連すると疑われた。試験物質質の効果を示唆する所見はいずれの動物にもなかった。
眼又は視神経における試験物質関連の肉眼的所見はなかった。
試験物質質で治療された動物における全ての肉眼的観察は、種におけるバックグラウンド所見であったか、又は偶発的であり、試験物質に関連しないと考えられた。これらの所見は、発生率が低く、発生率又は重症度の明確な用量関係がなく、及び／又は相関性のある試験物質関連の顕微鏡所見がなかった。
眼又は視神経における試験物質関連の顕微鏡所見はなかった。
全ての顕微鏡観察は偶発的であり、試験物質質に関連しないと考えられた。これらの所見は、種についての既知のバックグラウンド所見であり、及び／又は対照及び試験物質で治療した動物について同様の発生率及び重症度であった。
眼房水試料中のＰｉｇＦａｂ－ＶＧ １のレベルを質量分析によって決定した。ミニブタの眼において、等しい質量量の１０ｋＤａ ＨＡと予め複合体化した１．８ｍｇ／眼のＰｉｇＦａｂ－ＶＧ１又はＰｉｇＦａｂ－ＶＧ１のＩＶＴ注射後、高い眼房水レベルが得られ、３０日間維持された（図１４）。これらの結果は、４週間の研究期間中、ミニブタの眼に測定可能なレベルの試験物質質が存在したことを示している。３０日目の濃度は、未修飾Ｆａｂについて測定されたものより少なくとも一桁高かった（図４Ａ）。
結論として、単回ＩＶＴ注射によるＷＴ ＶＧ１（１．１３ｍｇ／眼）、ｐｉｇＦａｂ－ＶＧ１（１．８ｍｇ／眼）又はｐｉｇＦａｂ－ＶＧ１＋１０ｋＤａ ＨＡ（１．８ｍｇ／眼）の投与は、それぞれの用量レベルのそれぞれでＧｏｔｔｉｎｇｅｎミニブタにおいて十分な忍容性があった。全ての動物は予定された終了まで生存し、異常な臨床所見はなく、体重は影響を受けなかった。研究時間中及び単回注射での試験物質質に対する検出可能な免疫応答の欠如は、試験物質質の直接効果を評価することを可能にした。検眼鏡所見は、試験物質注入部位での一過性の最小限の硝子体の濁りに限定され、これは３日目までに消散し（ＷＴ ＶＧ－１）、試験物質注入付近での硝子体の濁りは改善したが、研究終了によって完全には消散しなかった（ｐｉｇＦａｂ－ＶＧ １）。ｐｉｇＦａｂ－ＶＧ１＋１０ｋＤａ ＨＡについて検眼鏡所見はなく、ＩＯＰ、ＯＣＴ及びＥＲＧの結果は全ての動物について正常であった。眼又は視神経に試験物質関連の肉眼的又は顕微鏡的影響はなかった。
実施例１５．ラットレーザー誘発脈絡膜血管新生（ラットレーザーＣＮＶ）におけるＶＰＤＦ－ＶＧ１の有効性
以下の仮定を試験するために、レーザー誘発性脈絡膜新生血管（ラットレーザーＣＮＶ）のｉｎ ｖｉｖｏラットモデルでＦａｂ－ＨＡＢＤを試験した：（１）Ｆａｂ－ＨＡＢＤはｉｎ ｖｉｖｏ で有効であり（すなわち、Ｆａｂ－ＨＡＢＤは血管新生を阻害することができる）、（２）Ｆａｂ－ＨＡＢＤは未修飾Ｆａｂ断片と同等又はそれより優れたｉｎ ｖｉｖｏ 有効性の耐久性を有する。
Ａ．材料及び方法
ラットは、レーザー損傷を受ける１週間前又は３週間前のいずれかにタンパク質製剤のＩＶＴ注射を受けた（１眼あたり６回のレーザー熱傷）。レーザー損傷の設定の１週間後、蛍光血管造影（ＦＡ）イメージングを用いて血管成長について病変を分析した。
Ｆａｂ－ＨＡＢＤを、それぞれの未修飾Ｆａｂ断片と比較した。Ｆａｂ－ＨＡＢＤの長期持続有効性を検出するために、未修飾Ｆａｂの用量を「最小効果用量」（すなわち、ラットモデルの持続期間内のビヒクルと比較して、血管新生の検出可能な阻害が低いだけである）に滴定して、モデルの同じ用量及び期間でＦａｂ－ＨＡＢＤの長期持続有効性を示した。
Ｂ．結果
図１５に示すように、ＶＰＤＦ－ＶＧ１はＣＮＶ病変の阻害に対して活性であり、レーザー治療の７又は２１日前に投与された。この研究では、ＶＰＤＦ－ＶＧ１に対する効果の持続性は、未修飾Ｆａｂに匹敵した。
実施例１６．ニュージーランド白ウサギにおけるＶＧ１及びＶＧ１ Ｆａｂ－ＨＡＢＤの眼忍容性
Ａ．材料及び方法
この研究の目的は、雄ニュージーランドホワイトウサギへの単回両側ＩＶＴ注射後の３０日間の観察期間にわたって、１：１（ｗ／ｗ）の１０ｋＤａ ＨＡを予め製剤化した試験物質質ＷＴ ＶＧ１、ＲａｂＦａｂ－ＶＧ１及びＲａｂＦａｂ－ＶＧ１の眼忍容性を決定することであった。研究計画は表２１に示す通りであった。
この研究では、以下のパラメータ及びエンドポイントを評価した：死亡率、臨床徴候、体重、食物消費量、眼科（すなわち、検査、眼圧測定、広視野カラー眼底イメージング、ＯＣＴ及びＥＲＧ）、生物分析的分析、毒物動態学的パラメータ、抗薬物抗体評価、肉眼的剖検所見、及び組織病理学的検査。
Ｂ．結果
体重及び食物消費の評価に基づく全身性の試験物質に関連する影響はなかった。全ての組織が正常範囲内にあると考えられる肉眼的な死後所見もなかった。
ウサギの血清を、投与前並びに研究の８、１５、２２及び２９日目に抗薬物抗体（ＡＤＡ）の存在についてアッセイした。投与前に、ＷＴ ＶＧ１の投与に指定された６匹の動物のうち３匹が、測定可能な血清ＡＤＡを有していた。同様に、ＲａｂＦａｂ－ＶＧ１又はＲａｂＦａｂ－ＶＧ１＋１０ｋＤａ ＨＡによる治療にそれぞれ指定された１／６匹及び０／６匹の動物が、試験物質に対する既存の血清ＡＤＡを有していた。８日目に、ＷＴ ＶＧ１群及びＲａｂＦａｂ－ＶＧ１群の両方の動物の全てが血清中の試験物質品に対してＡＤＡを示し、研究期間中陽性のままであったが、ＲａｂＦａｂ－ＶＧ１＋１０ｋＤａ ＨＡ群の動物の２／３が血清ＡＤＡを有していた。１５日目に、全ての動物は、研究終了まで持続した血清ＡＤＡについて陽性であった。
臨床検眼鏡所見は、ＷＴ ＶＧ１、ＲａｂＦａｂ－ＶＧ１及びＲａｂＦａｂ－ＶＧ１＋１０ｋＤａ ＨＡで治療した動物における前部及び後部ブドウ膜炎の発症と一致していたが、重症度は治療群間で異なっていた。例えば、ＷＴ ＶＧ１は、２２日目までに、いくつかの眼において後嚢下白内障を含む中等度の前部及び後部ブドウ膜炎をもたらした。比較すると、ＲａｂＦａｂ－ＶＧ１で治療したほとんどの動物は、この同じ時点で軽度のブドウ膜炎を示した。さらに、ＲａｂＦａｂ－ＶＧ１＋１０ｋＤａ ＨＡで治療した動物は、最小から軽度の前部及び後部ブドウ膜炎のみを示した。各治療群において、ブドウ膜炎の徴候は、ＷＴ ＶＧ１を投与した動物に対する局所眼治療も含めた１８日目の全身性抗炎症治療の開始後２９日目に改善された。眼圧の低下は活動性ブドウ膜炎と一致していたが、硝子体の濁りの変化の程度は群ごとにブドウ膜炎の重症度が異なることにも対応していた。これらの場合、硝子体の濁りは、ＲａｂＦａｂ－ＶＧ１＋１０ｋＤａ ＨＡ治療動物ではほんのわずかな硝子体の混濁に限定されたが、ＷＴ ＶＧ１動物は中程度の濁り及び後部白内障を示した。治療依存性効果の程度も、ＯＣＴ及びＥＲＧによって観察され、暗順応及び明所視の振幅の減少は、ＷＴ ＶＧ１治療眼における網膜機能及び変性の重度の変化を示唆した。
眼顕微鏡効果もまた、ＲａｂＦａｂ－ＶＧ１効果（図１６Ｂ）がそれほど重症ではなく、ＲａｂＦａｂ－ＶＧ１＋１０ｋＤａ ＨＡ効果（図１６Ｃ）が硝子体に限定され、重症度が最小から軽度にすぎなかった他の試験材料と比較して、ＷＴ ＶＧ１で治療した眼において最も実質的であった（図１６Ａ）。ＷＴ ＶＧ１関連硝子体炎症は、視神経乳頭の近くの領域、剥離した様々に壊死した網膜、及び水晶体後嚢に隣接する炎症性細胞シートを含んでいた。さらに、前房は、血清タンパク質と一致して、均一な好酸球性物質を含んでいた。網膜では、ＷＴ ＶＧ１関連炎症は、血管及び血管周囲の炎症を伴う最小から顕著な壊死を伴う網膜実質内に延びる混合細胞型によって特徴付けられた。反応性ミュラー細胞が網膜中央に観察された。
ＷＴ ＶＧ１と同様に、ＲａｂＦａｂ－ＶＧ１治療眼は、反応性ミュラー細胞に関連することが多い最小から中程度のびまん性光受容体変性を示した。しかしながら、ＲａｂＦａｂ－ＶＧ１光受容体層変性は、変性が光受容体層のみに対して選択的であったのに対して、網膜壊死は複数の網膜層を含んでいたことから、ＷＴ ＶＧ１に関連する網膜壊死とは異なっていた。さらに、硝子体内の線維血管膜は、ＷＴ ＶＧ１治療眼及びＲａｂＦａｂ－ＶＧ１治療眼の両方を特徴づけた。これらの場合、膜は、線維芽細胞、多数の新しい血管、及び早期コラーゲン沈着からなっていた。牽引バンドも膜とは別に観察された。ＷＴ ＶＧ１及びＲａｂＦａｂ－ＶＧ１とは対照的に、ＲａｂＦａｂ－ＶＧ１＋１０ｋＤａのＨＡ関連効果は、硝子体及び内境界膜に限定された最小から軽度の単核炎症に限定された。
結論として、ニュージーランドホワイトウサギへのＷＴ ＶＧ１、ＲａｂＦａｂ－ＶＧ１又はＲａｂＦａｂ－ＶＧ１＋１０ｋＤａ ＨＡの単回ＩＶＴ投与は、前部及び後部ブドウ膜炎の発症をもたらし、これはＷＴ ＶＧ１を投与した動物において最も重度であり、ＲａｂＦａｂ－ＶＧ１で中等度であり、ＲａｂＦａｂ－ＶＧ１＋１０ｋＤａ ＨＡで軽度から中等度であった。顕微鏡検査では、炎症に加えて、有意な網膜壊死及び網膜変性がそれぞれＷＴ ＶＧ１及びＲａｂＦａｂ－ＶＧ１と共に認められ、これらはＥＲＧ振幅減少と相関していた。研究終了時に、ＲａｂＦａｂ－ＶＧ１＋１０ｋＤａ ＨＡ眼には活動性前部ブドウ膜炎の徴候はなく、最小限の慢性後部ブドウ膜炎しか観察されなかった。これらの結果の解釈は、１５日目までの全ての試験物質に対するＡＤＡの観察によって混乱するが、１０ｋＤａ ＨＡとのＲａｂＦａｂ－ＶＧ１のプレ複合体化又は結合は、ウサギの眼におけるこのＦａｂ－ＨＡＢＤの忍容性を改善するようである。
実施例１７．Ｆａｂ－ＶＧ１の脳保持
ＶＧ１を介したＨＡ結合が脳内での保持を達成する能力を、マウスにおける脳室内注射によって試験した。これらの目的のために、非標的結合抗体抗単純ヘルペスウイルス－１糖タンパク質Ｄ（抗ｇＤ）を、Ｆａｂ断片（抗ｇＤ Ｆａｂ）、インタクトＩｇＧ（抗ｇＤ ＩｇＧ）、又はＶＧ１との融合タンパク質（抗ｇＤ Ｆａｂ－ＶＧ１；ＢＲＤ）のいずれかとして使用した。
Ａ．材料及び方法
Ａ．１．動物：
これらの研究で使用した野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、カンザス大学育種コロニーから入手した。生きた動物を使用するためのプロトコル（ＡＵＳ ７５－１５；承認日：１／２５／２１）は、カンザス大学の動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。全ての動物は、１２時間の暗／明サイクル及び食物及び水への無制限のアクセスを有する温度制御環境下で、動物管理ユニット（ＡＣＵ）の職員及び獣医師によって飼育された。
Ａ．２．抗体とＩＲＤｙｅ８００ＣＷ ＮＨＳエステルとのコンジュゲーション
製造業者の指示に従って、抗体をＩＲＤｙｅ８００とコンジュゲートさせた。簡潔には、１０％リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ９（ｖ／ｖ）を含むＰＢＳ中の抗体を、ＩＲＤｙｅ８００と２５℃で２時間反応させた。過剰な色素を、７ｋＤａの分画分子量を有するＺｅｂａスピン脱塩カラム（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して除去した。コンジュゲート抗体の純度を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して評価した。Ｏｄｙｓｓｅｙ ＣＬｘ ＮＩＲスキャナーを使用してＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを８００ｎｍでスキャンし、全ての過剰な色素が除去されたことを確認した。
Ａ．３．脳室内注射
１．５～２％イソフルランを使用して５～１０週齢の健康なＣ５７ＢＬ／６マウスを麻酔し、定位装置（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ Ｃｏ．）に入れた。正中矢状切開を行ってマウスの頭蓋骨を露出させ、ブレグマを同定した。右の側方に１．０ｍｍ、ブレグマの前方に０．３ｍｍの頭蓋骨に小さな穿頭孔を作った。３３ゲージの取り外し可能な針を備えた１０μＬハミルトンシリンジ（番号７７６２－０６）をステレオタックス（ｓｔｅｒｅｏｔａｘ）に装備し、マウスの側脳室に２．２５ｍｍの深さで１ｍｇ／ｍＬの濃度で５μＬの抗体溶液に対して使用した。抗体を１μＬ／分の速度で注入した。安楽死の直前に、顎下静脈からの血液試料（約１００μＬ）を、抗凝固剤としてリチウムヘパリンを含む冷却した血漿収集管に収集した。試料を１０，０００×ｇで３分間遠心分離するまで氷上で保持し、血漿を分析まで－８０°Ｃで保存した。マウスを４～５％イソフルランで深く麻酔している間に、０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＨＢＳＳの氷冷溶液の経心臓灌流を介して様々な時点の後にマウスを屠殺した。脳、心臓、肺、肝臓、脾臓、及び腎臓を収集し、分析まで氷上に保った。
Ａ．４．抗体器官定量
単離した臓器を秤量し、１ｍＬのＰＢＳ中で機械的にホモジナイズした。ストック溶液を様々な量のＰＢＳで希釈することによって、標準的な近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）抗体溶液を作製した。次いで、１０μＬの標準溶液を１００μＬの均質化ブランク臓器に添加して９６ウェルプレートに入れ、Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｃｌｘスキャナーを使用してウェルをスキャンすることによって、各臓器について検量線を作成した。各ウェルの蛍光強度を、器官１グラム当たりの抗体の濃度にわたってプロットして、線形曲線を得た。脳室内注射マウスの器官を検量線と比較して、抗体沈着を決定した。血漿分析は、最初に５倍希釈したブランク血漿を用いて同様に行った。次いで、希釈血漿の１００μＬアリコートに１０μＬの抗体標準をスパイクして、脳室内注射マウス血漿試料を比較した標準曲線を作成した。
Ｂ．結果
図１７に示すように、抗ｇＤ Ｆａｂ－ＶＧ１（ＢＲＤ；配列番号１２１及び１２４）は、同等用量の抗ｇＤ Ｆａｂ（配列番号１２０及び１２１）又は抗ｇＤ ＩｇＧ（配列番号１２１及び１２２）よりも長く脳内に持続し、曲線下面積（ＡＵＣ）として表されるより大きな曝露レベルを与えた。曝露レベルのこれらの差は、抗ｇＤ Ｆａｂ－ＶＧ１と抗ｇＤ Ｆａｂとの比較についてはｐ値が０．０１未満であり、抗ｇＤ Ｆａｂ－ＶＧ１と抗ｇＤ ＩｇＧとの比較についてはｐ値が０．００１未満であり、統計学的に有意である。
実施例１８．ＶＧ１親和性バリアントの作製
Ａ．材料及び方法
Ａ．１．ＷＴ ＶＧ１の結晶化及びＨＡ結合残基の同定
市販の結晶化スクリーニング（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ及びＱｉａｇｅｎ）を使用して、ＨＡとコンジュゲートしたＷＴ ＶＧ１の結晶化条件を同定した。ＨＡ結合ＶＣＡＮの構造は、結晶をＨＡ ６－ｍｅｒに浸漬することによって得た。結晶を採取し、凍結防止剤なしで液体窒素中で急速凍結した。回折データは、それぞれＰｉｌａｔｕｓ ６Ｍ又はＥｉｇｅｒ １６Ｍ検出器（Ｄｅｃｔｒｉｓ）でＳｔａｎｆｏｒｄ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｌｉｇｈｔｓｏｕｒｃｅ（ＳＳＲＬ）ｂｅａｍＬｉｎｅ １２－２又は１４－１で収集した。ＣＯＯＴでモデル構築し、続いてＲＥＦＭＡＣ ５、ＢＵＳＴＥＲ又はＰｈｅｎｉｘ－Ｒｅｆｉｎｅで精密化することによって、構造を反復的に精密化した。Ａｄａｍｓ，Ｐ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，６６（Ｐｔ ２）：２１３－２２１（２０１０）；Ｂｌａｎｃ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，６０：２２１０－２２２１（２００４）；Ｅｍｓｌｅｙ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，６６：４８６－５０１（２０１０）；Ｅｍｓｌｅｙ ａｎｄ Ｃｏｗｔａｎ，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，６６：２１２６－２１３２（２００４）；Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ，Ｇ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，６７：３５５－３６７，（２０１１）．
ＰｙＭｏｌ及び／又はキメラのいずれかを用いてＷＴ ＶＧ１－ＨＡコンジュゲート構造（図１８）を分析し、水素結合、静電及び疎水性相互作用電位に基づいてＨＡと相互作用する残基を同定した。
Ａ．２．示差走査蛍光（ＤＳＦ）
ＷＴ ＶＧ１及び単一アミノ酸バリアントの熱安定性を、示差走査蛍光（ＤＳＦ）を用いて測定した。簡潔には、０．１ｍｇ／ｍＬの精製タンパク質をＰＢＳ中でＳｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ色素と混合した。各試料を２５°Ｃから９５°Ｃまで０．０５°／秒の増分で温度勾配に供し、蛍光の増加を５８５ｎｍで監視した。生の蛍光単位を、カスタムエクセルマクロを使用して負の導関数としてプロットし、Ｔｍを計算した。
Ａ．３．ＷＴ ＶＧ１－ＨＡコンジュゲート結晶構造に基づいて設計されたＶＧ１バリアント
ＷＴ ＶＧ１－ＨＡコンジュゲート結晶構造（図１８）によれば、ＨＡはリンク１ドメインにのみ結合することが見出された。したがって、モデリングを使用して、ＨＡ結合に関与し得るリンク２残基を予測した。結晶構造を検証し、ＷＴ ＶＧ１のＨＡ結合親和性を減弱させる変異体を同定するために、結晶接触を形成する残基をアラニン、又は場合によっては代替アミノ酸に変異させた。さらに、ＨＡと結晶接触しないが、ＴＳＧ６におけるＨＡ結合に重要ないくつかのＷＴ ＶＧ１残基（ＶＧ１リンクドメインとＴＳＧ－６リンクドメインとの間の配列アラインメントに基づく；図８Ｂ）もアラニンに変異した。変異の組み合わせ効果をプローブするために、少数の二重部位変異体、例えば、それぞれＡｒｇ及びＴｙｒに変化したＬｙｓ２６０及びＰｈｅ２６１（ＫＦ２６０ＲＹ）を作製し、ＨＡ結合について試験した。表２２は、実施例１０に記載されているように製造されたＶＧ１バリアントを列挙している。作製及び試験したＶＧ１バリアントのアミノ酸配列アラインメントを図１９に示す。
Ａ．４．分子特性
ＨＡ結合を、実施例１０に記載されるようにＳＰＲによって測定した。変異体を１２０秒間注射し、解離を１８０秒間監視した。
Ｂ．結果
Ｂ．１．ＶＧ１バリアントはＨＡ結合が低下している
変異体Ｒ１６０Ａ、Ｙ１６１Ａ及びＤ１９７Ａは、２～７μＭの範囲でＨＡ結合の減衰を示した。表２３は、ＳＰＲによって測定された各ＶＧ １バリアントについて測定されたｋａ（Ｍ－１ｓ－１）、ｋｄ（ｓ－１）、及びＫＤ（Ｍ）を示す。
Ｂ．２．ＶＧ１バリアントの安定性
表２４は、産生されたＶＧ１変異体及び各変異体について測定されたＴｍ（融解温度；℃）を示す。ほとんどの変異は、ＷＴ ＶＧ１と比較して熱安定性にわずかな減少を有するか、又は影響を及ぼさなかったが、Ｙ２０８Ａ及びＨ３０６Ａは、それぞれＴｍの２．１６°Ｃ及び２．８１°Ｃの改善を示した。
等価物
前述の明細書は、当業者が実施形態を実施することを可能にするのに十分であると考えられる。前述の説明及び実施例は、特定の実施形態を詳述し、本発明者らが企図する最良の実施形態を説明する。しかしながら、前述の内容がいかに詳細に記載されていても、本実施形態は多くの方法で実施することができ、添付の特許請求の範囲及びその均等物に従って解釈されるべきであることが理解されよう。
本明細書で使用される場合、約という用語は、明示的に示されているかどうかにかかわらず、例えば、整数、分数、及びパーセンテージを含む数値を指す。約という用語は、一般に、当業者が列挙された値（例えば、同じ機能又は結果を有する）と等価であると考えるであろう数値の範囲（例えば、列挙された範囲の＋／－５～１０％）を指す。少なくとも及び約などの用語が数値又は範囲のリストの前にある場合、それらの用語は、リストに提供された値又は範囲の全てを修飾する。場合によっては、約という用語は、最も近い有効数字に四捨五入された数値を含むことができる。

Claims (31)

  1. 治療用分子であって、
    ａ． 眼内の治療標的に結合することができる第１の成分と、
    ｂ． ヒアルロナンに結合することができる１つ以上の第２の成分であって、前記１つ以上の第２の成分が前記第１の成分に共有結合している、第２の成分と、
    ｃ． 任意に、ヒアルロナンを含む１つ以上の第３の成分と
    を含み、
    存在する場合、前記１つ以上の第３の成分が、前記１つ以上の第２の成分に非共有結合している、治療用分子。
  2. 前記第１の成分が、タンパク質、ペプチド、受容体若しくはその断片、受容体に対するリガンド、ダルピン、核酸、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又はアプタマーである、請求項１に記載の治療用分子。
  3. 前記第１の成分が、抗体、抗原結合断片、特に抗体断片、より具体的には少なくともＦｃドメインを欠く抗体断片から選択され、特に前記断片が、（Ｆａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ断片、ＶｈＨ断片、ｓｃＦｖ断片、ｓｃＦｖ－Ｆｃ断片、及びミニボディ、より具体的にはＦａｂ断片であるか、又はそれらを含む、請求項１又は２に記載の治療用分子。
  4. 前記第２の成分が、ヒアルロナン受容体ＣＤ４４（ＣＤ４４）ドメイン、脳特異的リンクタンパク質（ＢＲＡＬ１）ドメイン、腫瘍壊死因子刺激遺伝子６（ＴＳＧ－６）ドメイン、リンパ管内皮ヒアルロナン受容体１（ＬＹＶＥ－１）ドメイン、又はヒアルロン酸結合タンパク質（ＨＡＢＰ）ドメイン、アグリカンＧ１（ＡＧ１）ドメイン、又はバーシカンＧ１（ＶＧ１）ドメインを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の治療用分子。
  5. コンジュゲートが、１つの第２の成分、又は互いに同一である２つの第２の成分を含む、請求項１～４のいずれかに記載の治療用分子。
  6. 前記第３の成分がヒアルロナンであり、前記ヒアルロナンが、
    ａ．
    ｉ． ３ｋＤａ～６０ｋＤａ、４ｋＤａ～３０ｋＤａ、５ｋＤａ～２０ｋＤａ、若しくは４００Ｄａ～２００ｋＤａから選択される分子量、
    ｉｉ． 少なくとも２、３、４、５、６、７、８、若しくは９ｋＤａの分子量、又は
    ｉｉｉ． 最大６０、５０、４０、３０、２５、２０、若しくは１５ｋＤａの分子量
    を有し、
    ｂ． 前記１つ又は２つの第２の成分に対してモル過剰の結合当量を提供し、
    ｃ． 前記眼内の前記ヒアルロナンの分解を減少させる修飾を有する、請求項１～４のいずれかに記載の治療用分子。
  7. 前記第２の成分が、１０ｎＭ～１０μＭ、５ｎＭ～８μＭ、又は１００ｎＭ～５μＭのＫＤでヒアルロナンに結合することができる、請求項１～６のいずれか一項に記載の治療用分子。
  8. ａ． 前記第１の成分及び前記第２の成分が融合タンパク質に含まれ、特に、前記１つ又は２つの第２の成分が、前記第１の成分のＮ末端及び／又はＣ末端に共有結合しており、より具体的には、前記第１の成分が抗体又は抗原結合断片であり、前記１つ又は２つの第２の成分が、前記第１の成分のＣ末端に共有結合しており；且つ／或いは
    ｂ． 前記１つ若しくは２つの第２の成分が、前記第１の成分に直接結合しているか、又はリンカー、特に少なくとも４アミノ酸及び／若しくは最大５０若しくは最大２５アミノ酸のリンカー、より具体的には（ＧｘＳ）ｎ若しくは（ＧｘＳ）ｎＧｍであって、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、（ｘ＝３、ｎ＝３、４、５若しくは６、且つｍ＝０、１、２若しくは３）若しくは（ｘ＝４、ｎ＝２、３、４若しくは５、且つｍ＝０、１、２若しくは３）であるリンカーを介して間接的に前記第１の成分に結合している、
    請求項１～７のいずれかに記載の治療用分子。
  9. 前記治療標的が、ＶＥＧＦ、Ｃ２、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａ、ＨｔｒＡ１、ＩＬ－３３、Ｐ因子、Ｄ因子、ＥＰＯ、ＥＰＯＲ、ＩＬ－１β、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１０、ＴＮＦα、ＦＧＦＲ２、ＰＤＧＦ又はＡＮＧ２である、請求項１～８のいずれかに記載の治療用分子。
  10. ａ． 前記第１の成分がＶＥＧＦに対する抗体若しくは抗原結合断片であり、且つ／又は
    ｂ． 前記１つ若しくは２つの第２の成分の各々が、ＣＤ４４ドメイン若しくはＴＳＧ－６ドメイン若しくはＶＧ１ドメインを含み、且つ／又は
    ｃ． 前記第３の成分が、５ｋＤａ～２０ｋＤａの分子量のヒアルロナンである、
    請求項１～９のいずれかに記載の治療用分子。
  11. ａ． 前記第１の成分が抗ＶＥＧＦ抗体若しくは抗原結合断片であり、前記１つ若しくは２つの第２の成分がＣＤ４４ドメインを含み、前記第３の成分が５ｋＤａ～２０ｋＤａの分子量のヒアルロナンであるか、
    ｂ． 前記第１の成分が抗ＶＥＧＦ抗体若しくは抗原結合断片であり、前記１つ若しくは２つの第２の成分がＴＳＧ－６ドメインを含み、前記第３の成分が５ｋＤａ～２０ｋＤａの分子量のヒアルロナンであるか、又は
    ｃ． 前記第１の成分が抗ＶＥＧＦ抗体若しくは抗原結合断片であり、前記１つ若しくは２つの第２の成分がＶＧ１ドメインを含み、前記第３の成分が５ｋＤａ～２０ｋＤａの分子量のヒアルロナンである、
    請求項１～１０のいずれか一項に記載の治療用分子。
  12. ａ． 前記第１の成分が、
    ｉ． 配列番号９７、９９、１０５、１０９又は１１４のＶＨドメインと、
    ｉｉ． 配列番号９８、１００、１０６、１１０又は１１５のＶＬドメインと、を含み、
    ｂ． 前記第２の成分が、配列番号２を含む、
    請求項１～１１のいずれか一項に記載の治療用分子。
  13. ａ． 前記第１の成分が、
    ｉ． 配列番号９７、９９、１０５、１０９又は１１４のＶＨドメインと、
    ｉｉ． 配列番号９８、１００、１０６、１１０又は１１５のＶＬドメインと、を含み、
    ｂ． 前記第２の成分が、配列番号４を含む、
    請求項１～１１のいずれか一項に記載の治療用分子。
  14. ａ． 前記第１の成分が、
    ｉ． 配列番号９７、９９、１０５、１０９又は１１４のＶＨドメインと、
    ｉｉ． 配列番号９８、１００、１０６、１１０又は１１５のＶＬドメインと、を含み、
    ｂ． 前記第２の成分が、配列番号８６、６０、３２又は２９を含む、
    請求項１～１１のいずれか一項に記載の治療用分子。
  15. 前記第２の成分が、配列番号８６、６０、３２又は２９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である、請求項１４に記載の治療用分子。
  16. 前記第２の成分が１～５個の変異を含み、前記１～５個の変異が単一アミノ酸置換、二重アミノ酸置換、及び／又は短縮を含む、請求項１４又は１５に記載の治療用分子。
  17. 前記第２の成分が、配列番号２９と比較して短縮型変異を有する、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の治療用分子。
  18. 前記短縮型変異が、Ｎ末端に１～１２９個のアミノ酸の短縮を含む、請求項１７に記載の治療用分子。
  19. 前記第２の成分が、野生型バーシカンのＩｇドメインが存在しない短縮型配列である、請求項１４～１８のいずれか一項に記載の治療用分子。
  20. 前記第２の成分が、配列番号２９に対して以下の位置：Ｒ１６０、Ｙ１６１、Ｅ１９４、Ｄ１９７、Ｙ２０８、Ｒ２１４、Ｍ２２２、Ｙ２３０、Ｒ２３３、Ｋ２６０、Ｆ２６１、Ｄ２９５、Ｙ２９６、Ｈ３０６、Ｒ３１２、Ｌ３２５、Ｙ３２６、及びＲ３２７
    のうち１、２、３、４、５、又は６個に変異を含む、請求項１４～１９のいずれか一項に記載の治療用分子。
  21. 前記第２の成分が、配列番号２９と比較して、以下の変異：Ｒ１６０Ａ、Ｙ１６１Ａ、Ｄ１９７Ａ、Ｄ１９７Ｓ、Ｙ２０８Ａ、Ｙ２０８Ｆ、Ｒ２１４Ｋ、Ｍ２２２Ａ、Ｙ２３０Ａ、Ｙ２３０Ｆ、Ｒ２３３Ａ、Ｋ２６０Ａ、Ｋ２６０Ｒ、Ｆ２６１Ｙ、ＫＦ２６０ＲＹ、Ｄ２９５Ａ、Ｄ２９５Ｓ、Ｙ２９６Ａ、Ｙ２９６Ｆ、ＤＹ２９５ＳＦ、Ｈ３０６Ａ、Ｒ３１２Ａ、Ｌ３２５Ａ、Ｙ３２６Ａ、Ｒ３２７Ａ、及びＬＹＲ３２５ＬＦＫ
    のうち少なくとも１、２、３、４、５、又は６個を含む、請求項１４～２０のいずれか一項に記載の治療用分子。
  22. 前記第２の成分が、Ｙ２０８Ａ及びＨ３０６Ａの少なくとも１つを含む、請求項１４～２１のいずれか一項に記載の治療用分子。
  23. 前記第２の成分が、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、又は配列番号５９である、請求項１４又は１５に記載の治療用分子。
  24. 前記第１の成分がシステインノットペプチドを更に含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の治療用分子。
  25. 前記システインノットペプチドが、配列番号９２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性である、請求項２４に記載の治療用分子。
  26. アミノ酸配列が、配列番号９３又は配列番号９４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を含む、請求項２４又は２５に記載の治療用分子。
  27. 医薬として使用するための組成物であって、請求項１～２６のいずれか一項に記載の治療用分子と、任意に、薬学的に許容され得る添加物、希釈剤又は担体とを含む、組成物。
  28. 眼疾患又は脳疾患の治療に使用するための組成物であって、請求項１～２６のいずれか一項に記載の治療用分子と、任意に、薬学的に許容され得る添加物、希釈剤又は担体とを含む、組成物。
  29. 眼内送達、特に硝子体内注射用に製剤化された、請求項２８に記載の使用のための組成物。
  30. 前記眼疾患が、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、特に滲出型ＡＭＤ若しくは新生血管型ＡＭＤ、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、特に増殖性ＤＲ若しくは非増殖性ＤＲ、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）又は地図状萎縮（ＧＡ）である、請求項２８又は２９に記載の使用のための組成物。
  31. 患者における組織を標的とする治療用分子の送達方法であって、請求項１～２６のいずれか一項に記載の治療用分子又は請求項２７～３０のいずれか一項に記載の組成物を前記患者に投与することと、前記治療用分子に、前記標的組織への前記第１の成分の長時間作用型送達を提供させることと、を含む、送達方法。
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Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5144088A (en) 1991-04-26 1992-09-01 Aristech Chemical Corporation Manufacture of neopentyl glycol (I)
CA2286330C (en) 1997-04-07 2008-06-10 Genentech, Inc. Anti-vegf antibodies
US7417130B2 (en) 2000-09-08 2008-08-26 University Of Zurich Collection of repeat proteins comprising repeat modules
US7771742B2 (en) 2004-04-30 2010-08-10 Allergan, Inc. Sustained release intraocular implants containing tyrosine kinase inhibitors and related methods
EP3722310A1 (en) 2008-06-25 2020-10-14 Novartis AG Stable and soluble antibodies inhibiting vegf
US20140248296A1 (en) * 2008-10-16 2014-09-04 Kathleen Cogan Farinas Sustained drug delivery system
US8133979B2 (en) 2008-12-16 2012-03-13 Hoffmann-La Roche Inc. Antibodies against human angiopoietin 2
LT3495387T (lt) 2012-07-13 2021-11-25 Roche Glycart Ag Bispecifiniai anti-vegf / anti-ang-2 antikūnai ir jų panaudojimas akių kraujagyslių ligoms gydyti
CA2891686A1 (en) 2012-12-18 2014-06-26 Novartis Ag Compositions and methods that utilize a peptide tag that binds to hyaluronan
US10434188B1 (en) * 2013-06-04 2019-10-08 The Trustees Of Indiana University Hyaluronic acid binding domain-growth factor fusion protein cDNAs and fusion proteins for cartilage matrix preservation and repair
CN105008791B (zh) 2013-08-06 2017-08-29 奥林巴斯株式会社 光源光学系统、光纤光源、显微镜和汽车用前照灯
US20170290876A1 (en) 2014-06-25 2017-10-12 Novartis Ag Compositions and methods for long acting proteins
WO2016073157A1 (en) 2014-11-06 2016-05-12 Genentech, Inc. Anti-ang2 antibodies and methods of use thereof
MX2017005992A (es) 2014-11-07 2017-09-15 Eleven Biotherapeutics Inc Anticuerpos mejorados contra il-6.
AU2017217677A1 (en) * 2016-02-08 2018-07-26 Vitrisa Therapeutics, Inc. Compositions with improved intravitreal half-life and uses thereof

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