TWI839327B - 用於治療眼部病症之最佳化之抗體組合物 - Google Patents

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Abstract

本發明提供包括共價連接至聚合物(例如，玻尿酸(HA)聚合物)之抗體(例如抗VEGF抗體)之抗體偶聯物、半胱胺酸改造之抗體、其醫藥組合物及其用途，例如用於治療與病理性血管生成相關之病症(例如，眼部病症)。

Description

用於治療眼部病症之最佳化之抗體組合物
本發明概言之係關於抗體偶聯物、半胱胺酸改造之抗體、其組合物(例如醫藥組合物)及其使用方法。
血管生成係嚴密調節之過程，藉助該過程自預先存在之血管形成新血管。儘管血管生成在發育期間對於確保足夠的血液循環至關重要，但許多病症與病理性血管生成相關，例如眼部病症(例如年齡相關性黃斑變性，AMD)及細胞增殖性病症(例如癌症)。血管內皮生長因子(VEGF)係經臨床驗證之血管生成之驅動因素，並且VEGF之中和(例如使用抗VEGF阻斷抗體)可用於治療與病理性血管生成相關之病症。
目前用於治療與病理性血管生成(例如AMD (例如，濕性AMD)、糖尿病性黃斑水腫(DME)、糖尿病性視網膜病變(DR)及視網膜靜脈阻塞(RVO))相關之眼部病症之方法通常涉及玻璃體內注射VEGF拮抗劑(例如，抗VEGF Fab雷珠單抗(ranibizumab))。由於抗VEGF Fab之作用位點在眼睛後部視網膜處，並且由於Fab在眼睛中可具有相對較短的停留時間，因此來自抗VEGF Fab之最大患者益處通常係藉由玻璃體內注射藉由相對頻繁的投藥(例如，每四週，Q4W)獲得。可能期望用於眼部病症之抗VEGF抗體或抗體片段(例如Fab)之長效遞送，以至少部分地降低投藥頻率，從而可改良患者之便利性及依從性。
業內需要用於治療眼部病症(例如，AMD (例如，濕性AMD)、糖尿病性黃斑水腫(DME)、糖尿病性視網膜病變(DR)及視網膜靜脈阻塞(RVO))之長效遞送之抗體組合物。
本發明提供抗體偶聯物，其包括共價附接至抗體(例如抗VEGF抗體)之單分散聚合物(例如單分散玻尿酸(HA)聚合物)；可用於(例如)製備抗體偶聯物之半胱胺酸改造之抗體；包括抗體偶聯物之組合物(例如醫藥組合物)；以及其製備及使用方法，例如其用於治療用途。
在一個態樣中，本發明係關於抗體偶聯物，其包含(i)抗體及(ii)共價附接至抗體之玻尿酸(HA)聚合物，其中HA聚合物具有1.1或更低之多分散性指數(PDI)。在一些實施例中，HA聚合物具有介於1.0至1.1之間之PDI。在一些實施例中，HA聚合物具有介於1.0至約1.05之間之PDI。在一些實施例中，HA聚合物具有在約1.0001至約1.05之間之PDI。在一些實施例中，HA聚合物具有約1.001之PDI。在一些實施例中，HA聚合物具有約1兆道爾頓(megadalton，MDa)或更低之分子量。在一些實施例中，HA聚合物具有在約25 kDa與約500 kDa之間之分子量。在一些實施例中，HA聚合物具有在約100 kDa與約250 kDa之間之分子量。在一些實施例中，HA聚合物具有在約150 kDa與約200 kDa之間之分子量。在一些實施例中，HA聚合物係線性HA聚合物。在一些實施例中，抗體偶聯物具有在約10 nm與約60 nm之間之流體動力學半徑。在一些實施例中，抗體偶聯物具有在約25 nm與約35 nm之間之流體動力學半徑。在一些實施例中，流體動力學半徑為約20 nm至約30 nm。
在前述態樣之一些實施例中，抗體偶聯物具有相對於未共價附接至HA聚合物之參考抗體增加之眼部半衰期。在一些實施例中，相對於參考抗體，眼部半衰期增加至少約2倍。在一些實施例中，相對於參考抗體，眼部半衰期增加至少約4倍。在一些實施例中，眼睛半衰期係玻璃體半衰期。在一些實施例中，參考抗體與抗體偶聯物之抗體相同。
在前述態樣之一些實施例中，抗體特異性結合至選自由以下各項組成之群之生物分子：血管內皮生長因子(VEGF)；IL-1β；IL-6；IL-6R；IL-13；IL-13R；PDGF；血管生成素；血管生成素2；Tie2；S1P；整聯蛋白αvβ3、αvβ5及α5β1；β細胞素；apelin/APJ；促紅血球生成素；補體因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受體；ST-2受體；及與AMD風險遺傳相關之蛋白質。在一些實施例中，VEGF受體係VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、mbVEGFR或sVEGFR。在一些實施例中，與AMD風險遺傳相關之蛋白質係選自由以下各項組成之群：補體途徑組分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a及C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；IL-8；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC，COL10A1；及TNFRSF10A。
在前述態樣之一些實施例中，抗體特異性結合至VEGF。在一些實施例中，抗體包含以下六個高變區(HVR)：(a)HVR-H1，其包含DYWIH (SEQ ID NO: 1)之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含GX1 TPX2 GGX3 X4 X5 YX6 DSVX7 X8 (SEQ ID NO: 2)之胺基酸序列，其中X1 係Ile或His，X2 係Ala或Arg，X3 係Tyr或Lys，X4 係Thr或Glu，X5 係Arg、Tyr、Gln或Glu，X6 係Ala或Glu，X7 係Lys或Glu，且X8 係Gly或Glu； (c) HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3)之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含RASQX1 VSTAVA (SEQ ID NO: 4)之胺基酸序列，其中X1 係Asp或Arg；(e) HVR-L2，其包含X1 ASFLYS (SEQ ID NO:5)之胺基酸序列，其中X1 係Ser或Met；及 (f) HVR-L3，其包含X1 QGYGX2 PFT (SEQ ID NO: 6)之胺基酸序列，其中X1 係Gln、Asn或Thr且X2 係Ala、Asn、Gln或Arg。在一些實施例中，抗體包含以下六種HVR：(a)HVR-H1，其包含DYWIH (SEQ ID NO: 1)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYTRYADSVKG (SEQ ID NO: 7)、GITPAGGYEYYADSVKG (SEQ ID NO: 21)或GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS (SEQ ID NO: 9)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10)或QQGYGNPFT (SEQ ID NO: 23)之胺基酸序列。
在上述態樣之一些實施例中，抗體包含以下六種HVR：(a)HVR-H1，其包含DYWIH (SEQ ID NO: 1)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYTRYADSVKG (SEQ ID NO: 7)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS (SEQ ID NO: 9)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10)之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體進一步包含以下重鏈可變(VH)結構域框架區(FR)：(a)FR-H1，其包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS (SEQ ID NO: 13)之胺基酸序列；(b)FR-H2，其包含WVRQAPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 14)之胺基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 15)之胺基酸序列；及(d)FR-H4，其包含WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 16)之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體進一步包含以下輕鏈可變(VL)結構域FR：(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17)之胺基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18)之胺基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19)之胺基酸序列；及(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20)之胺基酸序列。
在上述態樣之一些實施例中，抗體包含以下六種HVR：(a)HVR-H1，其包含DYWIH (SEQ ID NO: 1)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS (SEQ ID NO: 9)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含QQGYGNPFT (SEQ ID NO: 23)之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體進一步包含以下VL結構域FR：(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17)之胺基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18)之胺基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 24)之胺基酸序列；及(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20)之胺基酸序列。
在上述態樣之一些實施例中，抗體包含以下六種HVR：(a)HVR-H1，其包含DYWIH (SEQ ID NO: 1)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS (SEQ ID NO: 9)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10)之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體進一步包含以下VL結構域FR：(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17)、DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC (SEQ ID NO: 25)或DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC (SEQ ID NO: 26)之胺基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18)或WYQQKPGEAPKLLIY (SEQ ID NO: 27)之胺基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19)或GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 28)之胺基酸序列；及(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20)之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體進一步包含以下VH結構域FR：(a)FR-H1，其包含EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 29)或EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS (SEQ ID NO:52)之胺基酸序列；(b)FR-H2，其包含WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30)之胺基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31)之胺基酸序列；及(d)FR-H4，其包含WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32)之胺基酸序列。
在上述態樣之一些實施例中，抗體包含(a)VH結構域，其包含與SEQ ID NO: 11、40或42之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列；(b)VL結構域，其包含與SEQ ID NO: 12、41或46之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列；或(c)如(a)中之VH結構域及如(b)中之VL結構域。在一些實施例中，VH結構域進一步包含以下FR：(a)FR-H1，其包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS (SEQ ID NO: 13)之胺基酸序列；(b)FR-H2，其包含WVRQAPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 14)或WVRQEPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 39)之胺基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 15)之胺基酸序列；及(d)FR-H4，其包含WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 16)之胺基酸序列。在一些實施例中，VH結構域包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列。在一些實施例中，VL結構域進一步包含以下FR：(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17)或DIQMTQSPSSLSASVGDRVTIDC (SEQ ID NO: 45)之胺基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18)之胺基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19)、GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDSATYYC (SEQ ID NO: 44)或GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYC (SEQ ID NO:54)之胺基酸序列；及(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20)或FGQGTKVEVK (SEQ ID NO:55)之胺基酸序列。在一些實施例中，VL結構域包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列。
在上述態樣之一些實施例中，抗體包含(a)包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列之VH結構域及(b)包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列之VL結構域。
在上述態樣之一些實施例中，抗體包含(a)包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列之VH結構域及(b)包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列之VL結構域。
在上述態樣之一些實施例中，抗體包含(a)包含SEQ ID NO: 42之胺基酸序列之VH結構域及(b)包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列之VL結構域。
在上述態樣之一些實施例中，抗體包含(a)包含SEQ ID NO: 42之胺基酸序列之VH結構域及(b)包含SEQ ID NO: 41之胺基酸序列之VL結構域。
在上述態樣之一些實施例中，抗體包含(a)包含與SEQ ID NO: 33或51之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列之VH結構域；(b)包含與SEQ ID NO: 12、34、35、36、37或38之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列之VL結構域；或(c)如(a)中之VH結構域及如(b)中之VL結構域。在一些實施例中，抗體進一步包含以下FR：(a)FR-H1，其包含EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 29)或EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS (SEQ ID NO:52)之胺基酸序列；(b)FR-H2，其包含WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30)之胺基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31)之胺基酸序列；及(d)FR-H4，其包含WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32)之胺基酸序列。在一些實施例中，VH結構域包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列。在一些實施例中，VH結構域包含SEQ ID NO:51之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體進一步包含以下FR：(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17)、DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC (SEQ ID NO: 25)或DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC (SEQ ID NO: 26)之胺基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18)或WYQQKPGEAPKLLIY (SEQ ID NO: 27)之胺基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19)、GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 24)或GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 28)之胺基酸序列；及(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20)之胺基酸序列。在一些實施例中，VL結構域包含SEQ ID NO: 34之胺基酸序列。在一些實施例中，VL結構域包含SEQ ID NO: 35之胺基酸序列。在一些實施例中，VL結構域包含SEQ ID NO: 36之胺基酸序列。在一些實施例中，VL結構域包含SEQ ID NO: 37之胺基酸序列。在一些實施例中，VL結構域包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列。在一些實施例中，VL結構域包含SEQ ID NO: 38之胺基酸序列。
在上述態樣之一些實施例中，抗體包含(a)包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列之VH結構域及(b)包含SEQ ID NO: 38之胺基酸序列之VL結構域。
在上述態樣之一些實施例中，抗體包含(a)包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列之VH結構域及(b)包含SEQ ID NO: 34之胺基酸序列之VL結構域。
在上述態樣之一些實施例中，抗體包含(a)包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列之VH結構域及(b)包含SEQ ID NO: 35之胺基酸序列之VL結構域。
在上述態樣之一些實施例中，抗體包含(a)包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列之VH結構域及(b)包含SEQ ID NO: 36之胺基酸序列之VL結構域。
在上述態樣之一些實施例中，抗體包含(a)包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列之VH結構域及(b)包含SEQ ID NO: 37之胺基酸序列之VL結構域。
在上述態樣之一些實施例中，抗體包含(a)包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列之VH結構域及(b)包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列之VL結構域。
在上述態樣之一些實施例中，抗體包含(a)包含SEQ ID NO:51之胺基酸序列之VH結構域及(b)包含SEQ ID NO: 38之胺基酸序列之VL結構域。
在上述態樣之一些實施例中，抗體包含(a)包含SEQ ID NO:51之胺基酸序列之VH結構域及(b)包含SEQ ID NO: 35之胺基酸序列之VL結構域。
在上述態樣之一些實施例中，抗體包含(a)包含SEQ ID NO:51之胺基酸序列之VH結構域及(b)包含SEQ ID NO: 37之胺基酸序列之VL結構域。
在上述態樣之一些實施例中，抗體包含(a)包含SEQ ID NO:51之胺基酸序列之VH結構域及(b)包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列之VL結構域。
在上述態樣之一些實施例中，抗體包含(a)包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列之重鏈及(b)包含SEQ ID NO:50之胺基酸序列之輕鏈。
在上述態樣之一些實施例中，抗體包含(a)包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列之重鏈及(b)包含SEQ ID NO:50之胺基酸序列之輕鏈。
在任何前述態樣之一些實施例中，抗體能夠抑制VEGF至VEGF受體之結合。在一些實施例中，VEGF受體係VEGF受體1 (Flt-1)。在一些實施例中，VEGF受體係VEGF受體2 (KDR)。
在任何前述態樣之一些實施例中，抗體以約2 nM或更低之Kd結合人類VEGF (hVEGF)。在一些實施例中，抗體以在約75 pM與約2 nM之間之Kd結合hVEGF。在一些實施例中，抗體以約75 pM與約600 pM之間之Kd結合hVEGF。在一些實施例中，抗體以約75 pM與約500 pM之間之Kd結合hVEGF。在一些實施例中，抗體以約80 pM之Kd結合hVEGF。在一些實施例中，抗體以約60 pM之Kd結合hVEGF。
在任何前述態樣之一些實施例中，抗體具有大於約83.5℃之解鏈溫度(Tm)。在一些實施例中，抗體具有約85℃至約91℃之Tm。在一些實施例中，抗體具有約89℃之Tm。
在任何前述態樣之一些實施例中，抗體具有低於8之等電點(pI)。在一些實施例中，抗體具有約5至約7之pI。在一些實施例中，抗體具有約5至約6之pI。
在任何前述態樣之一些實施例中，抗體係單株、人類、人類化或嵌合的。
在任何前述態樣之一些實施例中，抗體係結合VEGF之抗體片段。在一些實施例中，抗體片段選自由Fab、Fab-C、Fab'-SH、Fv、scFv及(Fab')2 片段組成之群。在一些實施例中，抗體片段係Fab。
在任何前述態樣之一些實施例中，抗體係單特異性抗體。在任何前述態樣之其他實施例中，抗體係多特異性抗體。在一些實施例中，多特異性抗體係雙特異性抗體。在一些實施例中，雙特異性抗體結合VEGF及選自由以下各項組成之群之第二生物分子：介白素1β (IL-1β)；介白素-6 (IL-6)；介白素-6受體(IL-6R)；介白素-13 (IL-13)；IL-13受體(IL-13R)；PDGF；血管生成素；血管生成素2；Tie2；S1P；整聯蛋白αvβ3、αvβ5及α5β1；β細胞素；apelin/APJ；促紅血球生成素；補體因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受體；ST-2受體；及與年齡相關性黃斑變性(AMD)風險遺傳相關之蛋白質。在一些實施例中，VEGF受體係VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、膜結合VEGF受體(mbVEGFR)或可溶性VEGF受體(sVEGFR)。在一些實施例中，與AMD風險遺傳相關之蛋白質選自由以下各項組成之群：補體途徑組分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a及C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；介白素-8 (IL-8)；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC，COL10A1；及TNFRSF10A。
在任何前述態樣之一些實施例中，抗體係半胱胺酸改造之抗體。在一些實施例中，半胱胺酸改造之抗體在選自由HC-A118C、HC-A140C及HC-L174C (EU編號)組成之重鏈中包含半胱胺酸突變，或在選自由LC-K149C及LC-V205C (Kabat編號)組成之群之輕鏈中包含半胱胺酸突變。在一些實施例中，重鏈中之半胱胺酸突變係HC-A118C (EU編號)。在一些實施例中，重鏈中之半胱胺酸突變係HC-A140C (EU編號)。在一些實施例中，重鏈中之半胱胺酸突變係HC-L174C (EU編號)。在一些實施例中，輕鏈中之半胱胺酸突變係LC-K149C (Kabat編號)。在一些實施例中，輕鏈中之半胱胺酸突變係LC-V205C (Kabat編號)。在一些實施例中，HA聚合物在半胱胺酸突變處共價附接至抗體。
在另一態樣中，任何前述抗體偶聯物可用作藥物。
在另一態樣中，任何前述抗體偶聯物可用於製造用以治療個體之眼部病症之藥物。
在另一態樣中，任何前述抗體偶聯物可用於減少或抑制患有眼部病症之個體之血管生成。
在另一態樣中，任何前述抗體偶聯物可用於治療個體之眼部病症。
在任何前述態樣之一些實施例中，眼部病症選自由以下各項組成之群：年齡相關性黃斑變性(AMD)、黃斑變性、黃斑水腫、糖尿病性黃斑水腫(DME) (包括局灶性、非中心性DME及瀰漫性、中心參與性DME)、視網膜病變、糖尿病性視網膜病變(DR) (包括增殖性DR (PDR)、非增殖性DR (NPDR)及高海拔DR)、其他缺血相關性視網膜病變、早產兒視網膜病變(ROP)、視網膜靜脈阻塞(RVO) (包括中央型(CRVO)及分支型(BRVO))、CNV (包括近視CNV)、角膜新血管形成、與角膜新血管形成相關之疾病、視網膜新血管形成、與視網膜/脈絡膜新血管形成相關之疾病、病理性近視、馮希柏-林島氏病(von Hippel-Lindau disease)、眼睛組織胞漿菌病、家族性滲出性玻璃體視網膜病變(FEVR)、柯滋氏病(Coats' disease)、諾里氏病(Norrie Disease)、骨質疏鬆症-假性神經膠質瘤症候群(OPPG)、結膜下出血、皮膚發紅、眼部新生血管性疾病、新生血管性青光眼、色素性視網膜炎(RP)、高血壓性視網膜病變、視網膜血管瘤性增殖、黃斑毛細血管擴張症、虹膜新血管形成、眼內新血管形成、視網膜變性、囊樣黃斑水腫(CME)、血管炎、視神經乳頭水腫、視網膜炎、結膜炎(包括感染性結膜炎及非感染性(例如過敏性)結膜炎)、萊伯先天性黑朦(Leber congenital amaurosis)、眼色素層炎(包括感染性及非感染性眼色素層炎)、脈絡膜炎、眼部組織胞漿菌病、瞼炎、乾眼病、創傷性眼睛損傷及薛格連氏病(Sjögren's disease)。在一些實施例中，眼部病症係AMD、DME、DR或RVO。在一些實施例中，眼部病症係AMD。在一些實施例中，AMD係濕性AMD。在一些實施例中，眼部病症係DME。
在另一態樣中，本發明係關於醫藥組合物，其包含本文所述之任何抗體偶聯物、醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。在一些實施例中，醫藥組合物進一步包含第二藥劑，其中該第二藥劑選自由以下各項組成之群：抗體、抗血管生成劑、細胞介素、細胞介素拮抗劑、皮質類固醇、止痛劑及結合至第二生物分子之化合物。在一些實施例中，抗血管生成劑係VEGF拮抗劑。在一些實施例中，VEGF拮抗劑係抗VEGF抗體、抗VEGF受體抗體、可溶性VEGF受體融合蛋白、適體、抗VEGF DARPin®或VEGFR酪胺酸激酶抑制劑。在一些實施例中，抗VEGF抗體係雷珠單抗(LUCENTIS®)、RTH-258或雙特異性抗VEGF抗體。在一些實施例中，雙特異性抗VEGF抗體係抗VEGF/抗Ang2抗體。在一些實施例中，抗VEGF/抗Ang2抗體係RG-7716。在一些實施例中，可溶性VEGF受體融合蛋白係阿柏西普(aflibercept)(EYLEA®)。在一些實施例中，適體係培加他尼(pegaptanib) (MACUGEN®)。在一些實施例中，抗VEGF DARPin®係阿必昔帕單抗(abicipar pegol)。在一些實施例中，VEGFR酪胺酸激酶抑制劑選自由以下各項組成之群：4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基六氫吡啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474)、4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯啶-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171)、瓦他拉尼(vatalanib)(PTK787)、司馬沙尼(semaxaminib)(SU5416)及SUTENT® (舒尼替尼(sunitinib))。在一些實施例中，第二生物分子選自由由以下各項組成之群：IL-1β；IL-6；IL-6R；IL-13；IL-13R；PDGF；血管生成素；血管生成素2；Tie2；S1P；整聯蛋白αvβ3、αvβ5及α5β1；β細胞素；apelin/APJ；促紅血球生成素；補體因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受體；ST-2受體；及與AMD風險遺傳相關之蛋白質。在一些實施例中，VEGF受體係VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、mbVEGFR或sVEGFR。在一些實施例中，與AMD風險遺傳相關之蛋白質選自由以下各項組成之群：補體途徑組分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a及C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；IL-8；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC，COL10A1；及TNFRSF10A。在一些實施例中，結合第二生物分子之化合物係抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，抗原結合抗體片段選自由Fab、Fab-C、Fab'-SH、Fv、scFv及(Fab')2 片段組成之群。在一些實施例中，抗原結合抗體片段係Fab。
在另一態樣中，任何前述醫藥組合物可用作藥物。
在另一態樣中，任何前述醫藥組合物可用於製造用以治療個體之眼部病症之藥物。
在另一態樣中，任何前述醫藥組合物可用於減少或抑制患有眼部病症之個體之血管生成。
在另一態樣中，任何前述醫藥組合物可用於治療個體之眼部病症。
在任何前述態樣之一些實施例中，眼部病症係選自由以下各項組成之群：年齡相關性黃斑變性(AMD)、黃斑變性、黃斑水腫、糖尿病性黃斑水腫(DME) (包括局灶性、非中心性DME及瀰漫性、中心參與性DME)、視網膜病變、糖尿病性視網膜病變(DR) (包括增殖性DR (PDR)、非增殖性DR (NPDR)及高海拔DR)、其他缺血相關性視網膜病變、早產兒視網膜病變(ROP)、視網膜靜脈阻塞(RVO) (包括中央型(CRVO)及分支型(BRVO))、CNV (包括近視CNV)、角膜新血管形成、與角膜新血管形成相關之疾病、視網膜新血管形成、與視網膜/脈絡膜新血管形成相關之疾病、病理性近視、馮希柏-林島氏病、眼睛組織胞漿菌病、家族性滲出性玻璃體視網膜病變(FEVR)、柯滋氏病、諾里氏病、骨質疏鬆症-假性神經膠質瘤症候群(OPPG)、結膜下出血、皮膚發紅、眼部新生血管性疾病、新生血管性青光眼、色素性視網膜炎(RP)、高血壓性視網膜病變、視網膜血管瘤性增殖、黃斑毛細血管擴張症、虹膜新血管形成、眼內新血管形成、視網膜變性、囊樣黃斑水腫(CME)、血管炎、視神經乳頭水腫、視網膜炎、結膜炎(包括感染性結膜炎及非感染性(例如過敏性)結膜炎)、萊伯先天性黑朦、眼色素層炎(包括感染性及非感染性眼色素層炎)、脈絡膜炎、眼部組織胞漿菌病、瞼炎、乾眼病、創傷性眼睛損傷及薛格連氏病。在一些實施例中，眼部病症係AMD、DME、DR或RVO。在一些實施例中，眼部病症係AMD。在一些實施例中，AMD係濕性AMD。在一些實施例中，眼部病症係DME。
在另一態樣中，本發明係關於減少或抑制患有眼部病症之個體之血管生成之方法，該方法包括向個體投與有效量之本文所述之任何抗體偶聯物或本文所述之任何醫藥組合物，藉此減少或抑制個體之血管生成。
在另一態樣中，本發明係關於治療眼部病症之方法，其包括向需要該治療之個體投與有效量之本文所述之任何抗體偶聯物或本文所述之任何醫藥組合物。
在任何前述態樣之一些實施例中，眼部病症係選自由以下各項組成之群：年齡相關性黃斑變性(AMD)、黃斑變性、黃斑水腫、糖尿病性黃斑水腫(DME) (包括局灶性、非中心性DME及瀰漫性、中心參與性DME)、視網膜病變、糖尿病性視網膜病變(DR) (包括增殖性DR (PDR)、非增殖性DR (NPDR)及高海拔DR)、其他缺血相關性視網膜病變、早產兒視網膜病變(ROP)、視網膜靜脈阻塞(RVO) (包括中央型(CRVO)及分支型(BRVO))、CNV (包括近視CNV)、角膜新血管形成、與角膜新血管形成相關之疾病、視網膜新血管形成、與視網膜/脈絡膜新血管形成相關之疾病、病理性近視、馮希柏-林島氏病、眼睛組織胞漿菌病、家族性滲出性玻璃體視網膜病變(FEVR)、柯滋氏病、諾里氏病、骨質疏鬆症-假性神經膠質瘤症候群(OPPG)、結膜下出血、皮膚發紅、眼部新生血管性疾病、新生血管性青光眼、色素性視網膜炎(RP)、高血壓性視網膜病變、視網膜血管瘤性增殖、黃斑毛細血管擴張症、虹膜新血管形成、眼內新血管形成、視網膜變性、囊樣黃斑水腫(CME)、血管炎、視神經乳頭水腫、視網膜炎、結膜炎(包括感染性結膜炎及非感染性(例如過敏性)結膜炎)、萊伯先天性黑朦、眼色素層炎(包括感染性及非感染性眼色素層炎)、脈絡膜炎、眼部組織胞漿菌病、瞼炎、乾眼病、創傷性眼睛損傷及薛格連氏病。在一些實施例中，眼部病症係AMD、DME、DR或RVO。在一些實施例中，眼部病症係AMD。在一些實施例中，AMD係濕性AMD。在一些實施例中，眼部病症係DME。
在任何前述態樣之一些實施例中，該方法進一步包含向個體投與有效量之第二藥劑，其中該第二藥劑選自由以下各項組成之群：抗體、抗血管生成劑、細胞介素、細胞介素拮抗劑、皮質類固醇、止痛劑及結合至第二生物分子之化合物。在一些實施例中，抗血管生成劑係VEGF拮抗劑。在一些實施例中，VEGF拮抗劑係抗VEGF抗體、抗VEGF受體抗體、可溶性VEGF受體融合蛋白、適體、抗VEGF DARPin®或VEGFR酪胺酸激酶抑制劑。在一些實施例中，抗VEGF抗體係雷珠單抗(LUCENTIS®)、RTH-258或雙特異性抗VEGF抗體。在一些實施例中，雙特異性抗VEGF抗體係抗VEGF/抗Ang2抗體。在一些實施例中，抗VEGF/抗Ang2抗體係RG-7716。在一些實施例中，可溶性VEGF受體融合蛋白係阿柏西普(EYLEA®)。在一些實施例中，適體係培加他尼(MACUGEN®)。在一些實施例中，抗VEGF DARPin®係阿必昔帕單抗。在一些實施例中，VEGFR酪胺酸激酶抑制劑選自由以下各項組成之群：4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基六氫吡啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474)、4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯啶-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171)、瓦他拉尼(PTK787)、司馬沙尼(SU5416)及SUTENT® (舒尼替尼)。在一些實施例中，第二生物分子選自由以下各項組成之群：IL-1β；IL-6；IL-6R；IL-13；IL-13R；PDGF；血管生成素；血管生成素2；Tie2；S1P；整聯蛋白αvβ3、αvβ5及α5β1；β細胞素；apelin/APJ；促紅血球生成素；補體因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受體；ST-2受體；及與AMD風險遺傳相關之蛋白質。在一些實施例中，VEGF受體係VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、mbVEGFR或sVEGFR。在一些實施例中，與AMD風險遺傳相關之蛋白質選自由以下各項組成之群：補體途徑組分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a及C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；IL-8；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC，COL10A1；及TNFRSF10A。在一些實施例中，結合第二生物分子之化合物係抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，抗原結合抗體片段選自由Fab、Fab-C、Fab'-SH、Fv、scFv及(Fab')2 片段組成之群。
在任何前述態樣之一些實施例中，抗體偶聯物或醫藥組合物係以下列方式來投與：玻璃體內、經眼、眼內、近鞏膜、眼筋膜囊下、脈絡膜上腔、局部、靜脈內、肌內、皮內、經皮、動脈內、腹膜內、病灶內、顱內、關節內、前列腺內、胸膜內、氣管內、鞘內腔、鼻內、陰道內、直腸內、局部、腫瘤內、腹膜內、經腹膜、心包內、皮下、結膜下、囊泡內、經黏膜、心包內、臍帶內、眶內、經口、透皮、藉由吸入、藉由注射、藉由滴眼劑、藉由植入、藉由輸注、藉由連續輸注、藉由直接局部灌注浸浴靶細胞、藉由導管、藉由灌洗、以乳霜形式或以脂質組合物形式。在一些實施例中，抗體偶聯物或醫藥組合物係以下列方式來投與：玻璃體內、經眼、眼內、近鞏膜、眼筋膜囊下、脈絡膜上腔或局部。在一些實施例中，抗體偶聯物或醫藥組合物係藉由注射以玻璃體內方式來投與。在一些實施例中，抗體偶聯物或醫藥組合物係藉由滴眼劑或軟膏以局部方式來投與。在一些實施例中，抗體偶聯物或醫藥組合物係藉由埠遞送裝置投與。
在任何前述態樣之一些實施例中，個體係人類。
序列表
本申請案含有已經以ASCII格式電子提交且以全文引用方式併入本文中之序列表。在2018年2月14日創建之該ASCII拷貝係命名為50474-160AR2_Sequence_Listing_2.14.18_ST25並且大小為57,639字節。I 定義
如本文所用術語「約」係指本技術領域技術人員容易知曉之各別值之常見誤差範圍。在提及「約」時本文之值或參數包括(並闡述)針對該值或參數本身之實施例。
出於本文目的之「受體人類框架」係包含來源於人類免疫球蛋白框架或人類共有框架(如下文所定義)之輕鏈可變結構域(VL)框架或重鏈可變結構域(VH)框架之胺基酸序列之框架。「來源於」人類免疫球蛋白框架或人類共有框架之受體人類框架可包含其相同之胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列變化。在一些實施例中，胺基酸變化之數目係10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少或2或更少。在一些實施例中，VL受體人類框架之序列與VL人類免疫球蛋白框架序列或人類共有框架序列相同。
「親和力」係指分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如抗原)間之非共價相互作用之總和強度。除非另有指示，否則如本文所用，「結合親和力」係指反映結合對之成員(例如抗體與抗原)之間1:1相互作用之內在結合親和力。分子X對其搭配物Y之親和力通常可由解離常數(Kd)表示。親和力可藉由業內已知之常用方法(包括本文所述之彼等)來量測。下文闡述用於量測結合親和力之特定闡釋性及例示性實施例。
「親和力成熟之」抗體係指在一或多個高變區(HVR)及/或框架區(FR)中具有一或多種改變之抗體，與不具有該等改變之親本抗體相比，該等改變導致抗體對抗原之親和力提高。
術語「血管內皮生長因子」或「VEGF」係指血管內皮生長因子蛋白A，如SEQ ID NO: 47所示(亦參見Swiss Prot登錄號P15692、Gene ID(NCBI): 7422)。術語「VEGF」涵蓋具有SEQ ID NO: 47之胺基酸序列之蛋白質以及其同系物及同種型。術語「VEGF」亦涵蓋VEGF之已知同種型，例如剪接同種型，例如VEGF111 、VEGF121 、VEGF145 、VEGF165 、VEGF189 及VEGF206 ，以及天然存在之對偶基因及其處理形式，包括藉由VEGF165 之纖維蛋白溶酶裂解生成之110個胺基酸的人類血管內皮細胞生長因子，如FerraraMol. Biol. Cell. 21:687 (2010)、Leung等人，Science , 246:1306 (1989)及Houck等人，Mol. Endocrin. ,5:1806 (1991)中所闡述。術語「VEGF」亦係指來自非人類物種(例如小鼠、大鼠或靈長類動物)之VEGF。有時，來自特定物種之VEGF係藉由諸如人類VEGF之hVEGF、鼠類VEGF之mVEGF及諸如此類之術語來指示。術語「VEGF」亦用於指包含165個胺基酸之人類血管內皮細胞生長因子之胺基酸8至109或1至109之多肽的截短形式。所提及之任何該等形式之VEGF可在本申請中藉由(例如) 「VEGF109 」、「VEGF(8-109)」、「VEGF(1-109)」或「VEGF165 」來鑑別。「經截短」天然VEGF之胺基酸位置係如天然VEGF序列中所指示進行編號。例如，經截短天然VEGF中之胺基酸位置17 (甲硫胺酸)亦係天然VEGF中之位置17 (甲硫胺酸)。經截短天然VEGF具有與天然VEGF相當之對KDR及Flt-1受體之結合親和力。如本文所用術語「VEGF變體」係指在天然VEGF序列中包括一或多個胺基酸突變之VEGF多肽。視情況，該一或多個胺基酸突變包括胺基酸取代。出於簡化本文所述VEGF變體之指定之目的，應注意的是，數值係指沿假定的天然VEGF之胺基酸序列之胺基酸殘基位置(提供於Leung等人，上文文獻 及Houck等人，上文文獻 )。除非另有說明，否則本文所用術語「VEGF」指示VEGF-A。
術語「抗VEGF抗體」、「結合至VEGF之抗體」及「特異性結合VEGF之抗體」係指能夠以足夠的親和力結合VEGF之抗體，使得該抗體可用作靶向VEGF之診斷劑及/或治療劑。在一個實施例中，抗VEGF抗體至無關非VEGF蛋白之結合程度小於抗體至VEGF之結合之約10%，例如藉由放射免疫分析(RIA)所量測。在某些實施例中，結合至VEGF之抗體具有如下解離常數(Kd)：≤ 1μM、≤ 100 nm、≤ 10 nm、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM或≤ 0.001 nM (例如10-8 M或更小，例如，10-8 M至10-13 M，例如10-9 M至10-13 M)。在某些實施例中，抗VEGF抗體結合至在來自不同物種之VEGF中保守之VEGF表位。
本文中之術語「抗體」係以最廣泛之含義使用且涵蓋各種抗體結構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現期望之抗原結合活性即可。
「抗體片段」係指與完整抗體不同的包含完整抗體中與完整抗體所結合抗原結合之一部分之分子。抗體片段之實例包括(但不限於) Fv、Fab、Fab'、Fab-C、Fab'-SH、F(ab')2 ；雙體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；及由抗體片段形成之多特異性抗體。在一些情況下，抗體片段之實例包括(但不限於)Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2 ；雙體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；及由抗體片段形成之多特異性抗體。
木瓜蛋白酶消化抗體產生兩個稱為「Fab」片段及殘留「Fc」片段之相同的抗原結合片段，其名稱反映容易結晶之能力。Fab片段由整條輕鏈(L)連同重鏈(H)之可變區結構域(VH)以及一條重鏈之第一恆定結構域(CH1)組成。胃蛋白酶處理抗體產生單一大F(ab')2 片段，其大致對應於兩個具有二價抗原結合活性之二硫鍵連接之Fab片段且仍能夠交聯抗原。Fab'片段與Fab片段之不同之處在於在CH1結構域之羧基末端具有額外幾個殘基，包括來自抗體鉸鏈區之一或多個半胱胺酸。Fab-C分子係經表現使得序列在第一個鉸鏈半胱胺酸處被截短從而在表現時直接產生具有游離半胱胺酸之Fab的Fab分子(參見例如Shatz等人，Mol. Pharmaceutics 2016 ；PubMed識別符(PMID) 27244474)。例如，Fab-C分子可在重鏈之位置Cys227具有游離半胱胺酸。在其他情況下，Fab-C分子可在重鏈之位置Cys229具有游離半胱胺酸。Fab'-SH係本文對Fab'之命名，其中恆定結構域之半胱胺酸殘基帶有游離巰基。F(ab')2 抗體片段最初係作為在其間具有鉸鏈半胱胺酸之Fab'片段對產生的。抗體片段之其他化學偶合亦係已知的。
術語「Fc區」在本文用於定義含有恆定區之至少一部分之免疫球蛋白重鏈之C末端區。該術語包括天然序列Fc區及變體Fc區。在一個實施例中，人類IgG重鏈Fc區自Cys226或自Pro230延伸至重鏈之羧基末端。然而，Fc區之C末端離胺酸(Lys447)可或可不存在。除非本文另外指定，否則Fc區或恆定區中之胺基酸殘基之編號係根據EU編號系統(亦稱為EU索引)進行，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest ，第5版Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991)中所闡述。
「Fv」由緊密非共價締合之一個重鏈及一個輕鏈可變區結構域之二聚體組成。從這兩個結構域之摺疊發出六個高度變異環(3個環各自來自H鏈及L鏈)，其貢獻胺基酸殘基用於抗原結合並賦予抗體抗原結合特異性。然而，即使單一可變結構域(或僅包含特異於抗原之三個HVR之Fv之一半)具有識別及結合抗原之能力，但其親和力通常低於整個結合位點。
「單鏈Fv」亦縮寫為「sFv」或「scFv」，其係包含連接成單一多肽鏈之VH及VL抗體結構域之抗體片段。較佳地，sFv多肽進一步包含在VH與VL結構域之間之多肽接頭，該接頭使得sFv能夠形成抗原結合所期望之結構。關於sFv之綜述，參見Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies ，第113卷，Rosenburg及Moore編輯，Springer-Verlag, New York，第269-315頁(1994)。
術語「雙體」係指藉由以下方式製備之小抗體片段：用在VH結構域與VL結構域之間之短接頭(約5-10個殘基)構築sFv片段(參見前述段落)，使得達成V結構域之鏈間而非鏈內配對，從而產生二價片段，亦即具有兩個抗原結合位點之片段。雙特異性雙體係兩種「交叉」 sFv片段之異二聚體，其中該兩種抗體之VH及VL結構域存在於不同的多肽鏈上。雙體在以下各項中有更全面的闡述：例如EP 404,097；WO 93/11161；及Hollinger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 90:6444-6448 (1993)。
「阻斷」抗體或「拮抗劑」抗體係抑制或降低其所結合抗原之生物活性之抗體。某些阻斷抗體或拮抗劑抗體基本上或完全抑制抗原之生物活性。
作為參考抗體之「結合至同一表位之抗體」係指在競爭分析中將參考抗體至其抗原之結合阻斷50%或更多之抗體，且相反地，在競爭分析中參考抗體將該抗體至其抗原之結合阻斷50%或更多。本文提供例示性競爭分析。
術語「嵌合」抗體係指如下抗體：其中重鏈及/或輕鏈之一部分源自具體來源或物種，而重鏈及/或輕鏈之其餘部分源自不同的來源或物種。
抗體之「類別」係指其重鏈所具有的恆定結構域或恆定區之類型。存在五大類抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，並且該等中之若干種可進一步分為亞類(同種型)，例如IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgA1 及IgA2 。對應於不同類別免疫球蛋白之重鏈恆定結構域分別稱α、δ、ε、γ及µ。
「半胱胺酸改造之抗體」或「半胱胺酸改造之抗體變體」係其中抗體之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代之抗體。在某些情況下，半胱胺酸改造之抗體可稱作THIOMABTM 抗體或ThioFab抗體。半胱胺酸改造之抗體之巰基可偶聯至其他部分，例如聚合物(例如HA聚合物，包括單分散HA聚合物)。在具體實施例中，所取代之殘基出現在抗體之可及位點處。藉由用半胱胺酸取代彼等殘基，反應性巰基藉此位於抗體之可及位點處且可用於將抗體偶聯至其他部分，例如聚合物(例如HA聚合物)。例如，半胱胺酸改造之抗體可為在輕鏈中(例如，根據Kabat編號之LC-G64C、LC-I106C、LC-R108C、LC-R142C或LC-K149C)或在重鏈中(例如，根據Kabat編號之HC-D101C、HC-V184C或HC-T205C，或根據EU編號之HC-T114C、HC-A140C、HC-L174C、HC-L179C、HC-T187C、HC-T209C、HC-V262C、HC-G371C、HC-Y373C、HC-E382C、HC-S424C、HC-N434C及HC-Q438C (亦即，根據Kabat編號之HC-A136C係根據EU編號之HC-A140C))具有非半胱胺酸天然殘基至半胱胺酸之單一突變之抗體(參見圖13A及圖13B)。在具體情況下，半胱胺酸改造之抗體可在重鏈中包括選自由HC-A118C、HC-A140C及HC-L174C (EU編號)組成之群之半胱胺酸突變，或者在輕鏈中包括選自由LC-V205C及LC-K149C (Kabat編號)組成之群之半胱胺酸突變。在一些情況下，半胱胺酸改造之抗體在重鏈或輕鏈中具有單一半胱胺酸突變，使得每一全長抗體(亦即具有兩條重鏈及兩條輕鏈之抗體)具有兩個改造之半胱胺酸殘基，且每一Fab片段具有一個改造之半胱胺酸殘基。在其他情況下，半胱胺酸改造之抗體具有一個以上半胱胺酸突變(例如，2、3、4或5個半胱胺酸突變)。
「游離半胱胺酸胺基酸」係指已改造成親本抗體之半胱胺酸胺基酸殘基具有巰基官能基(—SH)且不作為分子內或分子間二硫橋來配對。
術語「巰基反應性值」係游離半胱胺酸胺基酸之反應性之定量表徵。巰基反應性值係半胱胺酸改造之抗體中與巰基反應性試劑反應之游離半胱胺酸胺基酸之百分比，並且轉化為1之最大值。例如，半胱胺酸改造之抗體上以100%產率與巰基反應試劑(例如生物素-馬來醯亞胺試劑)反應以形成生物素標記之抗體的游離半胱胺酸胺基酸具有1.0之巰基反應性值。以90%產率與巰基反應性試劑反應之被改造成相同或不同親本抗體之另一半胱胺酸胺基酸具有約0.9之巰基反應性值。以80%產率與巰基反應性試劑反應之被改造成相同或不同親本抗體之另一半胱胺酸胺基酸具有約0.8之巰基反應性值。以70%產率與巰基反應性試劑反應之被改造成相同或不同親本抗體之另一半胱胺酸胺基酸具有約0.7之巰基反應性值。以60%產率與巰基反應性試劑反應之被改造成相同或不同親本抗體之另一半胱胺酸胺基酸具有約0.6之巰基反應性值。以50%產率與巰基反應性試劑反應之被改造成相同或不同親本抗體之另一半胱胺酸胺基酸具有約0.5之巰基反應性值。以40%產率與巰基反應性試劑反應之被改造成相同或不同親本抗體之另一半胱胺酸胺基酸具有約0.4之巰基反應性值。以30%收率與巰基反應性試劑反應之被改造成相同或不同親本抗體中之另一半胱胺酸胺基酸具有約0.3之巰基反應性值。以20%產率與巰基反應性試劑反應之被改造成相同或不同親本抗體中之另一半胱胺酸胺基酸具有約0.2之巰基反應性值。以10%產率與巰基反應試劑反應之被改造成相同或不同親本抗體之另一半胱胺酸胺基酸具有約0.1之巰基反應性值。完全不能與巰基反應性試劑反應之被改造成相同或不同親本抗體之另一半胱胺酸胺基酸具有0之巰基反應性值。具體半胱胺酸之巰基反應性值之測定可藉由ELISA分析(例如，如本文所述之PHESELECTOR分析)、質譜法、液相層析法、自動放射攝影術或其他定量分析測試進行。
「親本抗體」係包含一或多個胺基酸殘基被一或多個半胱胺酸殘基置換之胺基酸序列之抗體。親本抗體可包含天然或野生型序列。相對於抗體之其他天然、野生型或經修飾形式，親本抗體可具有預先存在之胺基酸序列修飾(例如添加、缺失及/或取代)。親本抗體可針對目标的靶抗原，例如生物學重要的多肽，例如VEGF。本文所述之任何抗體(例如抗VEGF抗體)可為親本抗體。
「效應物功能」係指可歸因於抗體之Fc區之彼等生物活性，其隨抗體同種型而變化。抗體效應物功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調；及B細胞活化。
「框架」或「框架區」或「FR」係指除高變區(HVR)殘基以外之可變結構域殘基。可變結構域之FR通常由四個FR結構域組成：FR1、FR2、FR3及FR4。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「整個抗體」在本文中可互換使用，係指具有與天然抗體結構基本相似之結構或具有含有如本文所定義之Fc區之重鏈的抗體。
「人類抗體」係具有對應於由人類或人類細胞產生之抗體或來源於利用人類抗體庫或其他人類抗體編碼序列之非人類來源之抗體的胺基酸序列的抗體。人類抗體之此定義特別排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。
「人類共有框架」係代表所選擇之人類免疫球蛋白VL或VH框架序列中最常出現之胺基酸殘基之框架。通常，人類免疫球蛋白VL或VH序列之選擇來自可變結構域序列之子組。通常，序列之子組係如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest , 第五版, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), 第1-3卷中之子組。在一個實施例中，對於VL，該子組係如Kabat等人，上文文獻 中之子組κI。在一個實施例中，對於VH，子組係如Kabat等人，上文文獻 中之子組III。
非人類(例如囓齒動物)抗體之「人類化」形式係含有源自非人類抗體之最小序列之嵌合抗體。大部分情況下，人類化抗體係人類免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體之高變區之殘基被來自具有期望抗體特異性、親和力及能力之非人類物種(供體抗體)(例如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物)之高變區的殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之FR殘基被相應的非人類殘基置換。此外，人類化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中未發現之殘基。作出該等修飾以進一步改進抗體性能。通常，人類化抗體將包含基本上所有的至少一個、通常兩個可變結構域，其中所有或基本上所有的高度變異環對應於非人類類免疫球蛋白之彼等，並且所有或基本上所有的FR係人類免疫球蛋白序列之彼等。人類化抗體視情況亦將包含免疫球蛋白恆定區(Fc) (通常人類免疫球蛋白之恆定區)之至少一部分。對於其他細節，參見Jones等人，Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332:323-329 (1988)；及Presta,Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)。
術語「可變」係指可變結構域之某些區段之序列在抗體間廣泛不同之事實。可變或「V」結構域介導抗原結合並定義具體抗體對其具體抗原之特異性。然而，可變性並非均勻分佈在可變結構域之範圍內。反而，V區由15-30個胺基酸之相對不變的區段(稱為框架區(FR))組成，該等相對不變的區段係由變異性極強之較短區(稱為「高變區」)分開，該等較短區各自長9-12個胺基酸。當在本文中使用時，術語「高變區」或「HVR」係指抗體中負責抗原結合之胺基酸殘基。高變區通常包含(例如)來自VL中之約殘基24-34 (L1)、50-56 (L2)及89-97 (L3)附近以及VH中之約殘基26-35 (H1)、49-65 (H2)及95-102 (H3) (在一個實施例中，H1在約殘基31-35附近)附近之胺基酸殘基；Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest ，第5版Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))及/或來自「高度變異環」之彼等殘基(例如，VL中之殘基26-32 (L1)、50-52 (L2)及91-96 (L3)，及VH中之26-32 (H1)、53-55 (H2)及96-101 (H3)；Chothia及Lesk,J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)。天然重鏈及輕鏈之可變結構域各自包含四個FR，其大部分採用β摺疊構形，其藉由三個高變區連接，從而形成連接β摺疊結構且在一些情形下形成β摺疊結構之一部分之環。每條鏈中之高變區藉由FR緊密靠近在一起，且與來自另一條鏈之高變區一起有助於形成抗體之抗原結合位點(參見Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest ，第5版Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda，MD. (1991))。因此，HVR及FR序列通常以下列順序出現在VH (或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。恆定結構域不直接參與抗體至抗原之結合，但展現各種效應物功能，例如抗體參與抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。
術語「如Kabat中之可變結構域殘基編號」或「如Kabat中之胺基酸位置編號」及其變化形式係指用於Kabat等人，上文文獻 中之抗體編譯之重鏈可變結構域或輕鏈可變結構域之編號系統。使用此編號系統，實際線性胺基酸序列可含有更少或額外的胺基酸，此對應於可變結構域之FR或HVR之縮短或插入。例如，重鏈可變結構域可包括在H2之殘基52後之單一胺基酸插入物(根據Kabat之殘基52a)及在重鏈FR殘基82後插入之殘基(例如根據Kabat之殘基82a、82b及82c等)。給定抗體之殘基之Kabat編號可藉由在抗體序列與「標準」Kabat編號序列之同源區進行比對來確定。
當提及可變結構域中之殘基(大約輕鏈之殘基1-107及重鏈之殘基1-113)時，通常使用Kabat編號系統(參見例如Kabat等人，Sequences of Immunological Interest 第5版Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)，其係以全文引用方式併入本文)。當提及免疫球蛋白重鏈恆定區中之殘基時，通常使用「EU編號系統」或「EU索引」(例如，Kabat等人，上文文獻 中之EU索引)。「如Kabat中之EU索引」係指人類IgG1 EU抗體之殘基編號。除非本文另有說明，否則所提及之抗體可變結構域中之殘基號意指藉由Kabat編號系統之殘基編號。除非本文另有說明，否則所提及之抗體恆定結構域中之殘基號意指藉由EU編號系統(亦稱為EU索引)之殘基編號，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest , 第5版Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991中所述。
除非另有指示，否則可變結構域中之HVR殘基及其他殘基(例如FR殘基)在本文中係根據Kabat等人，上文文獻 來編號。
當用於闡述本文所揭示之各種抗體時，術語「經分離抗體」意指已自表現其之細胞或細胞培養物鑑別並分離及/或回收之抗體。其天然環境之污染物組分係通常會干擾多肽之診斷或治療用途之材料，並且可包括酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質溶質。在一些實施例中，將抗體純化至大於95%或99%，如藉由(例如)電泳(例如，SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如離子交換或反相HPLC)所測定。對於評估抗體純度之方法之綜述，參見例如Flatman等人，J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)。在較佳實施例中，藉由使用旋杯式測序儀將抗體純化(1)至足以獲得N末端或內部胺基酸序列之至少15個殘基之程度，或(2)藉由非還原或還原條件下使用考馬斯藍(Coomassie blue)或較佳銀染之SDS-PAGE純化至均質性。經分離抗體包括重組細胞內之原位抗體，乃因多肽天然環境之至少一種組分將不存在。然而，通常，經分離多肽將藉由至少一個純化步驟來製備。
如本文所用術語「單株抗體」係指自基本上均質之抗體群體獲得之抗體，亦即除包含該群體之個別抗體係相同的及/或結合相同表位，唯(例如)含有天然存在之突變或在單株抗體製備物之產生期間出現之突變之可能的變體抗體除外，該等變體通常以少量存在。與通常包括針對不同決定簇(表位)之不同抗體之多株抗體製備物相反，單株抗體製備物之每一單株抗體係針對抗原上之單一決定簇。因此，修飾語「單株」指示自基本上均質之抗體群體獲得之抗體之特徵，並且不應解釋為需要藉由任何特定方法產生抗體。例如，根據本發明使用之單株抗體可藉由多種技術來製備，該等技術包括(但不限於)雜交瘤方法、重組DNA方法、噬菌體顯示方法及利用含有所有或一部分人類免疫球蛋白基因座之轉基因動物之方法，該等方法及用於製備單株抗體之其他例示性方法闡述於本文中。
術語「多特異性抗體」係以最廣泛含義使用並且特別涵蓋包含重鏈可變結構域(VH)及輕鏈可變結構域(VL)之抗體，其中VH-VL單元具有多表位特異性(亦即能夠結合至一個生物分子上之兩個不同表位或不同生物分子上之每一表位)。該等多特異性抗體包括(但不限於)全長抗體、具有兩個或更多個VL及VH結構域之抗體、諸如Fab、Fab'、Fab-C、Fv、dsFv、scFv等抗體片段、雙體、雙特異性雙體及三體，已共價或非共價附接之抗體片段。「多表位特異性」係指特異性結合至相同或不同靶標上之兩個或更多個不同表位之能力。「雙重特異性」或「雙特異性」係指特異性結合至相同或不同靶標上之兩個不同表位之能力。然而，與雙特異性抗體相比，雙重特異性抗體具有兩個在胺基酸序列方面相同之抗原結合臂，且每一Fab臂能夠識別兩種抗原。雙重特異性容許抗體以單一Fab或IgG分子形式與兩種不同抗原以高親和力相互作用。根據一個實施例，呈IgG1形式之多特異性抗體以5 μM至0.001 pM、3 μM至0.001 pM、1 μM至0.001 pM、0.5 μM至0.001 pM或0.1 μM至0.001 pM之親和力結合至每一表位。「單特異性」係指僅結合一個表位之能力。
「天然抗體」係指具有不同結構之天然存在之免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗體係約150,000道爾頓之異四聚體醣蛋白，其由兩個相同的輕鏈及二硫鍵鍵結之兩個相同的重鏈組成。自N末端至C末端，每條重鏈具有可變區(VH)(亦稱為可變重鏈結構域或重鏈可變結構域)，隨後係三個恆定結構域(CH1、CH2及CH3)。類似地，自N末端至C末端，每條輕鏈具有可變區(VL)(亦稱為可變輕鏈結構域或輕鏈可變結構域)，隨後係恆定輕鏈(CL)結構域。基於其恆定結構域之胺基酸序列，可將抗體之輕鏈分為兩種類型中之一種，稱為卡帕(κ)及拉姆達(λ)。
就抗體至靶分子之結合而言，術語「特異性結合」或「特異性結合至」或「特異於」具體多肽或具體多肽靶上之表位意味著結合與非特異性相互作用顯著不同。例如，可藉由與對照分子之結合相比測定分子之結合來量測特異性結合。例如，可藉由與靶標類似之對照分子(例如過量之非標記靶標)競爭來測定特異性結合。在此情形下，若標記靶標至探針之結合受到過量未標記靶標之競爭性抑制，則指示特異性結合。如本文所用術語「特異性結合」或「特異性結合至」或「特異於」具體多肽或具體多肽靶上之表位可例如藉由對靶標具有如下Kd之分子來展現：10-4 M或更低，另一選擇為10-5 M或更低，另一選擇為10-6 M或更低，另一選擇為10-7 M或更低，另一選擇為10-8 M或更低，另一選擇為10-9 M或更低，另一選擇為10-10 M或更低，另一選擇為10-11 M或更低，另一選擇為10-12 M或更低，或在10-4 M至10-6 M或10-6 M至10-10 M或10-7 M至10-9 M範圍內之Kd。如熟習此項技術者將瞭解，親和力及Kd值係反相關的。藉由低Kd值量測對抗原之高親和力。在一個實施例中，術語「特異性結合」係指其中分子結合至具體多肽或具體多肽上之表位而基本上不結合至任何其他多肽或多肽表位之結合。
「編碼抗VEGF抗體之核酸」係指一或多種編碼抗體重鏈及輕鏈(或其片段)之核酸分子，包括在單一載體或單獨載體中之該(該等)核酸分子，並且該等核酸酸分子存在於宿主細胞之一或多個位置。
如本文所用術語「載體」係指能夠使與其連接之另一核酸增殖之核酸分子。該術語包括作為自複製核酸結構之載體以及併入已引入其中之宿主細胞之基因體中之載體。某些載體能夠指導其可操作連接之核酸之表現。該等載體在本文中稱作「表現載體」。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞系」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指已引入外源核酸之細胞，包括該等細胞之子代。宿主細胞包括「轉變體」及「轉變細胞」，其包括原代轉變細胞及自其衍生之子代，而不考慮傳代次數。子代之核酸含量可能與親本細胞不完全相同，但可含有突變。本文包括具有與在最初轉變之細胞中篩選或選擇的相同的功能或生物活性之突變子代。
相對於參考多肽序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」係定義為在比對序列並引入空位(若需要)以達成最大序列一致性百分比並且不將任何保守性取代視為序列一致性之一部分之後，候選序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致之胺基酸殘基之百分比。出於測定胺基酸序列一致性百分比之比對可藉由業內熟知之各種方式來達成，例如使用公開可用之計算機軟體，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟體來達成。熟習此項技術者可確定用於比對序列之適當參數，包括在所比較序列之全長上達成最大比對所需要之任何算法。然而，出於本文之目的，胺基酸序列一致性%值係使用序列比較計算機程式ALIGN-2生成。ALIGN-2序列比較計算機程式係由Genentech, Inc.編寫，且源代碼已在美國版權局，華盛頓特區，20559在美國版權註冊號TXU510087註冊之用戶文件中提交。ALIGN-2程式可自加利福尼亞州南舊金山的Genentech, Inc.公開獲得，或者可自源代碼編譯。ALIGN-2程式應當被編譯以在UNIX操作系統(包括數位UNIX V4.0D)上使用。所有序列比較參數皆由ALIGN-2程式設定並且不發生變化。
在其中使用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情況下，給定胺基酸序列A相對於、與或針對給定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性% (其可替代地表述為給定胺基酸序列A相對於、與或針對給定胺基酸序列B所具有或包含之某一胺基酸序列一致性%)係如下來計算：100× 分數X/Y，其中X係藉由A及B之程式比對中之序列比對程式ALIGN-2被列為一致匹配物之胺基酸殘基之數量，並且其中Y係B中之胺基酸殘基之總數。應瞭解，倘若胺基酸序列A之長度不等於胺基酸序列B之長度，則A相對於B之胺基酸序列一致性%將不等於B相對於A之胺基酸序列一致性%。除非另有特別說明，否則本文所使用之所有胺基酸序列一致性%值皆如緊接在使用ALIGN-2計算機程式前之段落中所述獲得。
如本文所用，「投與」意指向個體給予一定劑量之本發明化合物(例如抗體(例如，半胱胺酸改造之抗VEGF抗體)或抗體偶聯物(例如單分散HA偶聯物))或組合物(例如醫藥組合物，例如包括本發明之抗體或抗體偶聯物之醫藥組合物)之方法。用於本文所述方法中之組合物可藉由下列方式來投與，例如玻璃體內(例如藉由玻璃體內注射)、藉由滴眼劑、肌內、靜脈內、皮內、經皮、動脈內、腹膜內、病變內、顱內、關節內、前列腺內、胸膜內、氣管內、鞘內腔、鼻內、陰道內、直腸內、局部、腫瘤內、經腹膜、皮下、結膜下、囊泡內、經黏膜、心包內、臍帶內、眼內、眶內、經口、局部、透皮、藉由吸入、藉由注射、藉由植入、藉由輸注、藉由連續輸注、藉由直接局部灌注浸浴靶細胞、藉由導管、藉由灌洗、以乳霜形式或以脂質組合物形式。用於本文所述方法中之組合物亦可全身或局部投與。投與方法可端視各種因素(例如，所投與之化合物或組合物及所治療之病況、疾病或病症之嚴重程度)而變化。
「血管生成」係指自預先存在血管形成新血管之過程。血管生成與血管發生不同，血管發生係自中胚層細胞前體重新形成內皮細胞。與病理性血管生成相關之病症可藉由本發明之組合物及方法來治療。與病理性血管生成相關之例示性病症包括(但不限於)眼部病症(非限制性眼部病症包括(例如)視網膜病變(包括增殖性糖尿病性視網膜病變、脈絡膜新血管形成(CNV)、年齡相關性黃斑變性(AMD)、糖尿病及其他局部缺血相關性視網膜病變)、糖尿病性黃斑水腫(DME)、病理性近視、馮希柏-林島氏病、眼睛組織胞漿菌病、視網膜靜脈阻塞(包括中央型(CRVO)及分支型(BRVO))、角膜新血管形成、視網膜新血管形成、早產兒視網膜病變(ROP)、家族性滲出性玻璃體視網膜病變(FEVR)、柯滋氏病、諾里氏病、骨質疏鬆症-假性神經膠質瘤症候群(OPPG)、結膜下出血、皮膚發紅、眼部新生血管疾病、新生血管性青光眼及高血壓視網膜病變)。下文闡述其他眼部病症。
如本文所用術語「眼部病症」包括與病理性血管生成相關之任何眼部病症(在本文中亦可互換地稱作「眼部病況」)。眼部病症可以改變或失調之新血管增殖及/或侵入至眼部組織結構(例如視網膜或角膜)中為特徵。非限制性眼部病症包括(例如)AMD (例如，濕性AMD、乾性AMD、中度AMD、晚期AMD及地圖狀萎縮(GA))、黃斑變性、黃斑水腫、DME (例如局灶性、非中心性DME及彌漫性、中心參與性DME)、視網膜病變、糖尿病性視網膜病變(DR) (例如增殖性DR (PDR)、非增殖性DR (NPDR)及高海拔DR)、其他缺血相關性視網膜病變、ROP、視網膜靜脈阻塞(RVO) (例如，中央型(CRVO)及分支型(BRVO))、CNV (例如近視性CNV)、角膜新血管形成、與角膜新血管形成相關之疾病、視網膜新血管形成、與視網膜/脈絡膜新血管形成相關之疾病、病理性近視、馮希柏-林島氏病、眼睛組織胞漿菌病、FEVR、柯滋氏病、諾里氏病、OPPG、結膜下出血、皮膚發紅、眼部新生血管性疾病、新生血管性青光眼、色素性視網膜炎(RP)、高血壓性視網膜病變、視網膜血管瘤性增殖、黃斑毛細血管擴張症、虹膜新血管形成、眼內新血管形成、視網膜變性、囊樣黃斑水腫(CME)、血管炎、視神經乳頭水腫、視網膜炎、結膜炎(例如感染性結膜炎及非感染性(例如過敏性)結膜炎)、萊伯先天性黑朦(亦稱為萊伯氏先天性黑朦或LCA)、眼色素層炎(包括感染性及非感染性眼色素層炎)、脈絡膜炎(例如多灶性脈絡膜炎)、眼部組織胞漿菌病、瞼炎、乾眼病、創傷性眼睛損傷、薛格蓮氏病，及其中疾病或病症與眼部新血管形成、血管滲漏及/或視網膜水腫相關之其他眼科疾病。其他例示性眼部病症包括與皮膚發紅(前房角新血管形成)相關之疾病及由纖維血管或纖維組織之異常增殖造成的疾病，包括增殖性玻璃體視網膜病變之所有形式。
與角膜新血管形成相關之例示性疾病包括(但不限於)流行性角膜結膜炎、維生素A缺乏症、隱形眼鏡過度佩戴、異位性角膜炎、上邊緣角膜炎、翼狀胬肉乾燥性角膜炎、薛格蓮氏症候群、紅斑痤瘡、小水皰病、梅毒、分枝桿菌感染、脂質變性、化學灼傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、單純疱疹感染、帶狀疱疹感染、原生動物感染、卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma)、蠶食性角膜潰瘍(Mooren ulcer)、特芮安氏角膜邊緣變性(Terrien's marginal degeneration)、邊緣性角質層分解、類風濕性關節炎、全身性狼瘡、多動脈炎、創傷、韋格納氏類肉瘤病(Wegener's sarcoidosis)、史蒂文斯-約翰遜症候群(Stevens-Johnson syndrome)、放射狀角膜切開術及角膜移植片排斥。
與視網膜/脈絡膜新血管形成相關之例示性疾病包括(但不限於)糖尿病性視網膜病變、黃斑變性、鐮狀細胞貧血症、類肉瘤、梅毒、彈性纖維假黃瘤、佩吉特氏病(Paget's disease)、靜脈阻塞、動脈阻塞、頸動脈阻塞性疾病、慢性眼色素層炎/玻璃體炎、分枝桿菌感染、萊姆病(Lyme's disease)、全身性紅斑狼瘡、早產兒視網膜病變、色素性視網膜炎、視網膜水腫(包括黃斑水腫)、伊爾斯病(Eales disease)、白塞氏病(Behcet's disease)、造成視網膜炎或脈絡膜炎之感染(例如多灶性脈絡膜炎)、眼部假組織胞漿菌病、貝斯特氏病(Best's disease)(卵黃狀黃斑變性)、近視、視盤凹陷、斯達加特氏病(Stargart's disease)、睫狀體扁平部炎、視網膜脫落(例如慢性視網膜脫落)、高黏度症候群、弓蟲病、創傷及雷射後併發症。
「血管生成因子或藥劑」係刺激血管發生之生長因子，例如促進血管生成、內皮細胞生長、血管穩定性及/或血管發生等。例如，血管生成因子包括(但不限於)不限於(例如) VEGF及VEGF家族成員、PlGF、PDGF家族、纖維母細胞生長因子家族(FGF)、TIE配體(血管生成素)、肝配蛋白、Del-1、纖維母細胞生長因子：酸性(aFGF)及鹼性(bFGF)，抑濾泡素、顆粒性白血球群落刺激因子(G-CSF)、肝細胞生長因子(HGF)/分散因子(SF)、介白素-8 (IL-8)、瘦素、中期因子、胎盤生長因子、血小板源性內皮細胞生長因子(PD-ECGF)、血小板源性生長因子(尤其PDGF-BB或PDGFR-β)、多效生長因子(PTN)、顆粒素蛋白前體、增殖蛋白、轉變生長因子-α (TGF-α)、轉變生長因子-β (TGF-β)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、血管內皮生長因子(VEGF)/血管滲透因子(VPF)等。其亦包括促進傷口癒合之因子，例如生長激素、胰島素樣生長因子-I (IGF-I)、VIGF、表皮生長因子(EGF)、CTGF及其家族成員及TGF-α及TGF-β。參見例如Klagsbrun及D'Amore,Annu. Rev. Physiol. ,53:217-39 (1991)；Streit及Detmar,Oncogene , 22:3172-3179 (2003)；Ferrara及Alitalo,Nature Medicine 5(12):1359-1364 (1999)；Tonini等人，Oncogene , 22:6549-6556 (2003) (例如，表1列示已知血管生成因子)；及Sato,Int. J. Clin. Oncol. , 8:200-206 (2003)。
「抗血管生成劑」或「血管生成抑制劑」係指直接或間接抑制血管生成、血管發生或不合意之血管滲透性之小分子量物質、多肽、經分離蛋白、重組蛋白、抗體或其偶聯物或融合蛋白。應瞭解，抗血管生成劑包括彼等結合及阻斷血管生成因子或其受體之血管生成活性之藥劑。例如，抗血管生成劑係如上定義之抗血管生成劑之抗體或其他拮抗劑，例如VEGF拮抗劑(例如針對VEGF-A或針對VEGF-A受體之抗體(例如KDR受體或Flt-1受體))、PDGF拮抗劑(例如抗PDGFR抑制劑，例如GLEEVECTM (甲磺酸伊馬替尼(Imatinib Mesylate)))。抗血管生成劑亦包括天然血管生成抑制劑，例如血管抑素、內皮抑素等。參見例如Klagsbrun及D'Amore，Annu. Rev. Physiol. ，53:217-39 (1991)；Streit及Detmar，Oncogene , 22:3172-3179 (2003)(例如，表3列示惡性黑素瘤中之抗血管生成療法)；Ferrara及Alitalo，Nature Medicine5(12):1359-1364 (1999)；Tonini等人，Oncogene , 22:6549-6556 (2003)(例如表2列示已知之抗血管生成因子)；及SatoInt. J. Clin. O ncol . ，8:200-206 (2003)(例如，表1列示臨床試驗中使用之抗血管生成劑)。
如本文所用，術語「VEGF拮抗劑」係指能夠結合至VEGF、降低VEGF表現程度或中和、阻斷、抑制、消除、減少或干擾VEGF生物活性(包括(但不限於)VEGF結合至一或多種VEGF受體、VEGF信號傳導以及VEGF介導之血管生成及內皮細胞存活或增殖)之分子。例如，能夠中和、阻斷、抑制、消除、減少或干擾VEGF生物活性之分子可藉由結合至一或多種VEGF受體(VEGFR)(例如VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、膜結合VEGF受體(mbVEGFR)或可溶性VEGF受體(sVEGFR))發揮其效應。作為可用於本發明方法中之VEGF拮抗劑包括在內的係特異性結合至VEGF之多肽、抗VEGF抗體及其抗原結合片段、特異性結合至VEGF藉此隔絕其與一或多種受體結合之受體分子及衍生物、融合蛋白(例如，VEGF-Trap (Regeneron))及VEGF121 -白樹毒素(Peregrine)。VEGF拮抗劑亦包括VEGF多肽之拮抗劑變體、與編碼VEGF多肽之核酸分子之至少一個片段互補的反義核鹼基寡聚物；與編碼VEGF多肽之核酸分子之至少一個片段互補的小RNA；靶向VEGF之核酶；VEGF之肽體；及VEGF適體。VEGF拮抗劑亦包括結合至VEGFR之多肽、抗VEGFR抗體及其抗原結合片段，以及結合至VEGFR藉此阻斷、抑制、消除、減少或干擾VEGF生物活性(例如VEGF信號傳導)之衍生物，或融合蛋白。VEGF拮抗劑亦包括結合至VEGF或VEGFR並能夠阻斷、抑制、消除、減少或干擾VEGF生物活性之非肽小分子。因此，術語「VEGF活性」特定地包括VEGF介導之VEGF之生物活性。在某些實施例中，VEGF拮抗劑減少或抑制VEGF之表現程度或生物活性之至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。在一些實施例中，受VEGF特異性拮抗劑抑制之VEGF係VEGF(8-109)、VEGF(1-109)或VEGF165 。
如本文所用，VEGF拮抗劑可包括(但不限於)抗VEGFR2抗體及相關分子(例如雷莫盧單抗(ramucirumab)、他尼盧單抗(tanibirumab)、阿柏西普)，抗VEGFR1抗體及相關分子(例如依庫克單抗(icrucumab)、阿柏西普(VEGF Trap-Eye；EYLEAÒ)及ziv-阿柏西普(VEGF Trap；ZALTRAPÒ))，雙特異性VEGF抗體(例如，MP-0250，萬西珠單抗(vanucizumab) (VEGF-ANG2)及揭示於US 2001/0236388中之雙特異性抗體)、包括抗VEGF、抗VEGFR1及抗VEGFR2臂中之兩者之雙特異性抗體、抗VEGF抗體(例如貝伐珠單抗(bevacizumab)、塞瓦單抗(sevacizumab)及雷珠單抗)及非肽小分子VEGF拮抗劑(例如，帕唑帕尼(pazopanib)、阿西替尼(axitinib)、凡德他尼(vandetanib)、瑞格菲尼(stivarga)、卡博替尼(cabozantinib)、樂伐替尼(lenvatinib)、尼達尼布(nintedanib)、奧蘭替尼(orantinib)、替拉替尼(telatinib)、多維替尼(dovitinig)、西地尼布(cediranib)、莫特塞尼(motesanib)、索凡替尼(sulfatinib)、阿帕替尼(apatinib)、福替尼布(foretinib)、法米替尼(famitinib)及替伏贊尼(tivozanib))。下文闡述其他VEGF拮抗劑。
藥劑(例如醫藥調配物)之「有效量」係指在必需的劑量及時間段內有效大成期望之治療或預防結果之量。
「個體(individual)」或「個體(subject)」係哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)馴養動物(例如牛、羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類類靈長類動物(例如猴))、兔及囓齒類動物(例如小鼠及大鼠)。在某些實施例中，個體(individual)或個體(subject)係人類。「個體(subject)」可能係「患者」。
「病症」係可自抗體治療受益之任何病況。例如，罹患或需要預防異常血管生成(過度、不適當或不受控制之血管生成)之哺乳動物。此包括慢性及急性病症或疾病，包括使哺乳動物易患所述病症之彼等病理病況。本文中欲治療之病症之非限制性實例包括與病理性血管生成(例如眼部病症)相關之病症。
術語「包裝插頁」用於指通常包含在治療產品之商業包裝中之說明書，其含有關於適應症、用法、劑量、投與、組合療法、禁忌症及/或關於使用該等治療產品之警告的資訊。
「醫藥學上可接受之載劑」係指醫藥調配物中除活性成分以外之對個體無毒之成分。醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
術語「醫藥調配物」係指如下製劑：以允許其中所含的活性成分(例如，抗體偶聯物)之生物活性有效，並且不含有對可能投與該調配物之個體不可接受地有毒的其他組分。
如本文所用，「治療(treatment)」(及其語法變化形式，例如「治療(treat或treating))係指嘗試改變所治療個體之自然病程並且可用於預防或在臨床病理學過程期間實施之臨床干預。治療之合意效應包括(但不限於)預防疾病之發生或復發、症狀之緩解、疾病之任何直接或間接病理學後果之減少、疾病進展之速率降低、疾病狀態之改善或減輕以及預後之緩和或改良。在一些實施例中，本發明之抗體偶聯物或包括本發明之抗體偶聯物的其他組合物(例如醫藥調配物)用於延遲疾病之發展或減緩疾病之進展。
「經分離」核酸分子係自核酸之天然來源中通常與其締合之至少一種污染性核酸分子鑑別及分離的核酸分子。經分離核酸分子不呈在自然界中發現之形式或設置。因此，經分離核酸分子與存在於天然細胞中之核酸分子不同。然而，經分離核酸分子包括通常表現抗體之細胞中所含有的核酸分子，其中例如該核酸分子處於與天然細胞之核酸分子不同之染色體位置中。
表述「控制序列」係指在具體宿主生物體中表現可操作連接之編碼序列所必需的DNA序列。例如，適用於原核生物之控制序列包括啟動子、視情況操縱子序列及核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、聚腺苷酸化信號及增強子。
當核酸置於與另一核酸序列之功能關係中時，其係「可操作連接的」。例如，若前序列或分泌前導序列之DNA係表現為參與多肽之分泌之前蛋白，則其可操作連接至該多肽之DNA；若啟動子或增強子影響編碼序列之轉錄，則其可操作連接至該序列；或者若核糖體結合位點經定位以便於轉譯，則其可操作連接至編碼序列。通常，「可操作連接」意指所連接之DNA序列係連續的，並且在分泌性前導序列之情形下係連續的且處於閱讀相。然而，增強子不必係連續的。連接係藉由在方便的限制性位點進行接合來完成。若不存在該等位點，則根據習用實踐使用合成之寡核苷酸適配體或接頭。
如本文所用，表述「細胞」、「細胞系」及「細胞培養物」可互換使用，且所有該等名稱皆包括子代。因此，詞語「轉變體」及「轉變細胞」包括原代個體細胞及源自其之培養物，而不考慮轉移次數。亦應瞭解，由於有意或無意的突變，所有子代之DNA含量皆可能不完全相同。本發明包括在初始轉變細胞中篩選之具有相同功能或生物活性之變體子代。倘若預期不同的名稱，則自上下文可明瞭。
起始或參考多肽(例如，參考抗體或其可變結構域/HVR)之「變體」或「突變體」係如下多肽：(1)具有與起始或參考多肽之胺基酸序列不同之胺基酸序列且(2)藉助天然或人工(人造)誘變自起始或參考多肽衍生而來。該等變體包括(例如)在目标之多肽之胺基酸序列內之殘基的缺失及/或插入及/或取代，在本文中稱作「胺基酸殘基改變」。因此，變體HVR係指相對於起始或參考多肽序列(例如源抗體或抗原結合片段之序列)包含變體序列之HVR。在此上下文中，胺基酸殘基改變係指胺基酸與起始或參考多肽序列中之相應位置處之胺基酸(例如參考抗體或其片段之胺基酸)不同。只要最終構築體具有期望之功能特徵，則可進行缺失、插入及取代之任何組合以達成最終變體或突變體構築體。胺基酸變化亦可改變多肽之轉譯後過程，例如改變醣基化位點之數目或位置。
「野生型(WT)」或「參考」序列或「野生型」或「參考」蛋白質/多肽之序列(例如參考抗體之HVR或可變結構域)可為藉助引入突變而自其衍生出變體多肽之參考序列。通常，給定蛋白質之「野生型」序列係自然界中最常見之序列。類似地，「野生型」基因序列係該基因在自然界中最常見之序列。可藉助自然過程或藉助人為誘導之手段將突變引入「野生型」基因(及由此其所編碼之蛋白質)。該等過程之產物係原始「野生型」蛋白質或基因之「變體」或「突變體」形式。
「等電點(pI)」係指分子(例如蛋白質，例如抗體)不攜帶淨電荷時之pH，在業內亦稱為「pH(I)」或「IEP」。」
如本文所用，「抗體偶聯物」係共價附接至一或多種聚合物之抗體。可將任何適宜的聚合物偶聯至抗體，例如親水性聚合物(例如玻尿酸(HA)或聚乙二醇(PEG))或疏水性聚合物(例如聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA))。在具體實施例中，聚合物係HA (在本文中亦稱作「HA偶聯物」)。
如本文所用，術語「聚合物」意指包括藉由化學鍵以線性、環狀、具支鏈、交聯或樹狀方式或其組合連接之重複結構單元(亦即單體)之分子。聚合物可為合成的或天然存在的，或其組合。應瞭解，術語「聚合物」涵蓋共聚物，該等共聚物係包括兩種或更多種不同單體之聚合物。聚合物亦可為均聚物，該均聚物係僅包括單一類型單體之聚合物。
術語「多分散性指數(PDI)」係指聚合物之分子量分佈之寬度之量度。PDI在業內亦稱作「分散性指數」、「異質性指數」或「分散度(Đ)」。聚合物試樣之PDI可使用等式(I)來計算：ĐM = MW /Mn ，其中MW 係重量平均莫耳質量且Mn 係數量平均莫耳質量。除非另有指示，否則PDI係根據等式(I)來計算。
聚合物試樣可視為「單分散的」(在業內亦稱為均勻的)或「多分散的」(在業內亦稱為非均勻的)。如本文所用，關於HA聚合物或HA偶聯物試樣之術語「單分散」意味著HA聚合物或HA偶聯物試樣具有小於或等於約1.1之PDI，例如約1.001、約1.02、約1.03、約1.04、約1.05、約1.06、約1.07、約1.08、約1.09或約1.1。例如，單分散HA聚合物或HA偶聯物試樣之PDI可在1.0至約1.1之間(例如，在1至約1.1之間、在1至約1.09之間、在1至約1.08之間、在1至約1.07之間、在1至約1.06之間、在1至約1.05之間、在1至約1.04之間、在1至約1.03之間、在1至約1.02之間、在1至約1.01之間、在1至約1.005之間、在約1.001至約1.1之間、在約1.001至約1.1之間、在約1.001至約1.09之間、在約1.001至約1.08之間、在約1.001至約1.07之間、在約1.001至約1.06之間、在約1.001至約1.05之間、在約1.001至約1.04之間、在約1.001至約1.03之間、在約1.001至約1.02之間、在約1.001至約1.01之間、在約1.001至約1.005之間、在約1.001至約1.004之間、在約1.001至約1.003之間、在約1.001至約1.002之間、在約1.0001至約1.1之間、在約1.0001至約1.09之間、在約1.0001至約1.08之間、在約1.0001至約1.07之間、在約1.0001至約1.06之間、在約1.0001至約1.05之間、在約1.0001至約1.04之間、在約1.0001至約1.03之間、在約1.0001至約1.02之間、在約1.0001至約1.01之間、在約1.0001至約1.005之間、在約1.0001至約1.004之間、在約1.0001至約1.003之間、在約1.0001至約1.002之間或在約1.0001至約1.005之間)。
相反，術語「多分散」意指HA聚合物或HA偶聯物試樣之PDI為大於1.1(例如約1.3、約1.4、約1.5、約1.6、約1.7、約1.8或更高)。例如，在一些實施例中，多分散HA聚合物或HA偶聯物試樣之PDI在約1.3至約2、約1.4至約2、約1.5至約2、約1.6至約2、約1.7至約2、約1.8至約2或約1.9至約2之間。
術語「玻尿酸(hyaluronic acid)」、「玻尿酸(hyaluranon)」及「HA」在本文可互換使用，其係指含有N- 乙醯葡萄糖胺及葡萄糖醛酸之重複二糖單元之聚合醣胺聚糖(GAG)。HA係陰離子非硫酸化GAG，其可見於(例如)細胞外基質(例如在眼睛之玻璃體中)、結締組織、上皮及神經組織中。
如本文所用，術語「聚乙二醇」或「PEG」係指聚醚化合物，其亦稱為聚氧化乙烯(PEO)或聚氧乙烯(POE)，此端視其分子量而定。PEG可具有H-(O-CH2 -CH2 )n -OH之結構，其中n係任何適宜整數。PEG可為具支鏈PEG、星形PEG或梳形PEG。PEG可為(例如) PEG四聚體、PEG六聚體或PEG八聚體。
如本文所用術語「清除率」係指每單位時間自隔室(例如，眼睛(例如玻璃體))清除之物質(例如，抗VEGF抗體、抗體偶聯物、融合蛋白(例如，Fab融合蛋白)或聚合物調配物)之體積。
術語「半衰期」係指在活體內(例如在眼睛(例如玻璃體)中)或在活體外濃縮物質(例如抗VEGF抗體、抗體偶聯物、融合蛋白(例如Fab融合蛋白)或聚合物調配物)以減少一半所需的時間。II. 組合物及方法
本發明提供抗體偶聯物，其包括連接至抗體(例如抗VEGF抗體，包括本文所述之任何抗VEGF抗體)之聚合物(例如單分散聚合物，包括單分散HA聚合物)；在(例如)製備抗體偶聯物時可使用之半胱胺酸改造之抗體；包括抗體偶聯物之組合物(例如醫藥組合物)；以及其製備及使用方法，例如其用於治療用途(例如治療眼部病症)。A. 用於本發明偶聯物中之例示性抗體
本發明提供抗體偶聯物，其包括共價附接至聚合物(例如單分散聚合物)之抗體(例如抗VEGF抗體)。可使用任何適宜的抗體(例如抗VEGF抗體)。例如，抗體可特異性結合至選自由以下各項組成之群之抗原：VEGF；介白素-1β (IL-1β)；介白素-6 (IL-6)；介白素-6受體(IL-6R)；介白素-13 (IL-13)；IL-13受體(IL-13R)；PDGF (例如，PDGF-BB)；血管生成素；血管生成素2 (Ang2)；Tie2；S1P；整聯蛋白αvβ3、αvβ5及α5β1；β細胞素；apelin/APJ；促紅血球生成素；補體因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受體(例如，VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、膜結合VEGF受體(mbVEGFR)或可溶性VEGF受體(sVEGFR))；ST-2受體；及與年齡相關性黃斑變性(AMD)風險遺傳相關之蛋白質(例如補體途徑組分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a及C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；白介素-8 (IL-8)；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC；COL10A1；及TNFRSF10A)。該等抗體可用於(例如)減少血管生成及/或治療或延遲與病理性血管生成相關之病症(例如眼部病症)之進展。下文進一步闡述可用於本發明之抗體偶聯物中之例示性、非限制性的抗VEGF抗體。
在一些情形下，抗VEGF抗體可包括至少一種、兩種、三種、四種、五種或六種選自以下之HVR：(a)HVR-H1，其包含DYWIH (SEQ ID NO: 1)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GX1 TPX2 GGX3 X4 X5 YX6 DSVX7 X8 (SEQ ID NO: 2)之胺基酸序列，其中X1 係Ile或His，X2 係Ala或Arg，X3 係Tyr或Lys，X4 係Thr或Glu，X5 係Arg、Tyr、Gln或Glu，X6 係Ala或Glu，X7 係Lys或Glu，且X8 係Gly或Glu；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQX1 VSTAVA (SEQ ID NO: 4)之胺基酸序列，其中X1 係Asp或Arg；(e)HVR-L2，其包含X1 ASFLYS (SEQ ID NO:5)之胺基酸序列，其中X1 係Ser或Met；及(f)HVR-L3，其包含X1 QGYGX2 PFT (SEQ ID NO: 6)之胺基酸序列，其中X1 係Gln、Asn或Thr且X2 係Ala、Asn、Gln或Arg，或一或多種上述HVR與其一或多種變體之組合，該等變體與SEQ ID NO: 1至6中之任一者具有至少約80%之序列一致性(例如81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性)。
例如，抗VEGF抗體可包括至少一種、兩種、三種、四種、五種或六種選自以下各項之HVR：(a)HVR-H1，其包含DYWIH (SEQ ID NO: 1)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYTRYADSVKG (SEQ ID NO: 7)、GITPAGGYEYYADSVKG (SEQ ID NO: 21)或GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS (SEQ ID NO: 9)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10)或QQGYGNPFT (SEQ ID NO: 23)之胺基酸序列，或一或多種上述HVR與其一或多種變體之組合，該等變體與SEQ ID NO: 1、3、7至10或21至23中之任一者具有至少約80%序列一致性(例如，81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性)。
例如，在一些情形下，抗VEGF抗體可包括至少一種、兩種、三種、四種、五種或六種選自以下各項之HVR：(a) HVR-H1，其包含DYWIH (SEQ ID NO: 1)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYTRYADSVKG (SEQ ID NO: 7)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS (SEQ ID NO: 9)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10)之胺基酸序列，或一或多種上述HVR與其一或多種變體之組合，該等變體與SEQ ID NO: 1、3或7至10中之任一者具有至少約80%序列一致性(例如，81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性)。在具體實例中，在一些情況下，抗VEGF抗體包括以下六種HVR：(a)HVR-H1，其包含DYWIH (SEQ ID NO: 1)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYTRYADSVKG (SEQ ID NO: 7)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS (SEQ ID NO: 9)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10)之胺基酸序列。
在一些情況下，任何前述抗VEGF抗體可包括以下重鏈可變結構域框架區(FR)中之一者、二者、三者或四者：(a)FR-H1，其包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS (SEQ ID NO: 13)之胺基酸序列；(b)FR-H2，其包含WVRQAPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 14)之胺基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 15)之胺基酸序列；及(d)FR-H4，其包含WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 16)之胺基酸序列。
在一些情況下，任何前述抗VEGF抗體可包括以下輕鏈可變結構域FR中之一者、二者、三者或四者：(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17)之胺基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18)之胺基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19)之胺基酸序列；及(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20)之胺基酸序列。
例如，在一些情況下，抗VEGF抗體包括以下六種HVR：(a)HVR-H1，其包含DYWIH (SEQ ID NO: 1)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYTRYADSVKG (SEQ ID NO: 7)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS (SEQ ID NO: 9)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10)之胺基酸序列。在一些情況下，抗VEGF抗體包括以下四種重鏈可變結構域FR：(a)FR-H1，其包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS (SEQ ID NO: 13)之胺基酸序列；(b)FR-H2，其包含WVRQAPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 14)之胺基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 15)之胺基酸序列；及(d)FR-H4，其包含WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 16)之胺基酸序列。在其他情況下，抗VEGF抗體包括以下四種輕鏈可變結構域FR：(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17)之胺基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18)之胺基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19)之胺基酸序列；及(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20)之胺基酸序列。在一些情況下，抗VEGF抗體包括(a)包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列之VH結構域及(b)包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列之VL結構域。
例如，在一些情況下，抗VEGF抗體可包括至少一種、兩種、三種、四種、五種或六種選自以下各項之HVR：(a)HVR-H1，其包含DYWIH (SEQ ID NO: 1)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS (SEQ ID NO: 9)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含QQGYGNPFT (SEQ ID NO: 23)之胺基酸序列，或一或多種上述HVR與其一或多種變體之組合，該等變體與SEQ ID NO: 1、3、8、9、22或23中之任一者具有至少約80%序列一致性(例如，81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性)。在具體實例中，在一些情況下，抗VEGF抗體包括以下六種HVR：(a)HVR-H1，其包含DYWIH (SEQ ID NO: 1)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS (SEQ ID NO: 9)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含QQGYGNPFT (SEQ ID NO: 23)之胺基酸序列。
在一些情況下，任何前述抗VEGF抗體可包括以下重鏈可變結構域框架區(FR)中之一者、二者、三者或四者：(a)FR-H1，其包含EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 29)或EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS (SEQ ID NO:52)之胺基酸序列；(b)FR-H2，其包含WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30)之胺基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31)之胺基酸序列；及(d)FR-H4，其包含WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32)之胺基酸序列。
在一些情況下，任何前述抗VEGF抗體可包括以下輕鏈可變結構域FR中之一者、二者、三者或四者：(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17)之胺基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18)之胺基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 24)之胺基酸序列；及(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20)之胺基酸序列。
例如，在一些情況下，抗VEGF抗體包括以下六種HVR：(a)HVR-H1，其包含DYWIH (SEQ ID NO: 1)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS (SEQ ID NO: 9)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含QQGYGNPFT (SEQ ID NO: 23)之胺基酸序列。在一些情況下，抗VEGF抗體包括以下四種重鏈可變結構域FR：(a)FR-H1，其包含EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 29)之胺基酸序列；(b)FR-H2，其包含WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30)之胺基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31)之胺基酸序列；及(d)FR-H4，其包含WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32)之胺基酸序列。在其他情況下，抗VEGF抗體包括以下四種輕鏈可變結構域FR：(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17)之胺基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18)之胺基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 24)之胺基酸序列；及(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20)之胺基酸序列。在一些情況下，抗VEGF抗體包括(a)包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列之VH結構域及(b)包含SEQ ID NO: 38之胺基酸序列之VL結構域。
在一些情況下，抗VEGF抗體包含以下六種HVR：(a)HVR-H1，其包含DYWIH (SEQ ID NO: 1)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS (SEQ ID NO: 9)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含QQGYGNPFT (SEQ ID NO: 23)之胺基酸序列。在一些情況下，抗VEGF抗體包括以下四種重鏈可變結構域FR：(a)FR-H1，其包含EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS (SEQ ID NO:52)之胺基酸序列；(b)FR-H2，其包含WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30)之胺基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31)之胺基酸序列；及(d)FR-H4，其包含WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32)之胺基酸序列。在其他情況下，抗VEGF抗體包括以下四種輕鏈可變結構域FR：(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17)之胺基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18)之胺基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 24)之胺基酸序列；及(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20)之胺基酸序列。在一些情況下，抗VEGF抗體包括(a)包含SEQ ID NO:51之胺基酸序列之VH結構域及(b)包含SEQ ID NO: 38之胺基酸序列之VL結構域。
例如，在一些情況下，抗VEGF抗體可包括至少一種、兩種、三種、四種、五種或六種選自以下各項之HVR：(a)HVR-H1，其包含DYWIH (SEQ ID NO: 1)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS (SEQ ID NO: 9)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10)之胺基酸序列，或一或多種上述HVR及其一或多種變體的組合，該等變體與SEQ ID NO: 1、3、8至10或22中之任一者具有至少約80%序列一致性(例如，81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性)。在具體實例中，在一些情況下，抗VEGF抗體包括以下六種HVR：(a)HVR-H1，其包含DYWIH (SEQ ID NO: 1)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS (SEQ ID NO: 9)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10)之胺基酸序列。
在一些情況下，任何前述抗VEGF抗體可包括以下重鏈可變結構域框架區(FR)中之一者、二者、三者或四者：(a)FR-H1，其包含EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 29)或EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS (SEQ ID NO:52)之胺基酸序列；(b)FR-H2，其包含WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30)之胺基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31)之胺基酸序列；及(d)FR-H4，其包含WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32)之胺基酸序列。
在一些情況下，任何前述抗VEGF抗體可包括以下輕鏈可變結構域FR中之一者、二者、三者或四者：(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17)、DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC (SEQ ID NO: 25)或DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC (SEQ ID NO: 26)之胺基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18)或WYQQKPGEAPKLLIY (SEQ ID NO: 27)之胺基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19)或GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 28)之胺基酸序列；及(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20)之胺基酸序列。
例如，在一些情況下，抗VEGF抗體包括以下六種HVR：(a)HVR-H1，其包含DYWIH (SEQ ID NO: 1)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS (SEQ ID NO: 9)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10)之胺基酸序列。在一些情況下，抗VEGF抗體包括以下四種重鏈可變結構域FR：(a)FR-H1，其包含EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 29)之胺基酸序列；(b)FR-H2，其包含WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30)之胺基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31)之胺基酸序列；及(d)FR-H4，其包含WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32)之胺基酸序列。在其他情況下，抗VEGF抗體包括以下四種輕鏈可變結構域FR：(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC (SEQ ID NO: 25)之胺基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18)之胺基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19)之胺基酸序列；及(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20)之胺基酸序列。在一些情況下，抗VEGF抗體包括(a)包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列之VH結構域及(b)包含SEQ ID NO: 34之胺基酸序列之VL結構域。
例如，在其他情況下，抗VEGF抗體包括以下六種HVR：(a)HVR-H1，其包含DYWIH (SEQ ID NO: 1)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS (SEQ ID NO: 9)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10)之胺基酸序列。在一些情況下，抗VEGF抗體包括以下四種重鏈可變結構域FR：(a)FR-H1，其包含EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 29)之胺基酸序列；(b)FR-H2，其包含WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30)之胺基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31)之胺基酸序列；及(d)FR-H4，其包含WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32)之胺基酸序列。在其他情況下，抗VEGF抗體包括以下四種輕鏈可變結構域FR：(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC (SEQ ID NO: 26)之胺基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGEAPKLLIY (SEQ ID NO: 27)之胺基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 28)之胺基酸序列；及(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20)之胺基酸序列。在一些情況下，抗VEGF抗體包括(a)包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列之VH結構域及(b)包含SEQ ID NO: 35之胺基酸序列之VL結構域。
例如，在其他情況下，抗VEGF抗體包括以下六種HVR：(a)HVR-H1，其包含DYWIH (SEQ ID NO: 1)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS (SEQ ID NO: 9)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10)之胺基酸序列。在一些情況下，抗VEGF抗體包括以下四種重鏈可變結構域FR：(a)FR-H1，其包含EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS (SEQ ID NO:52)之胺基酸序列；(b)FR-H2，其包含WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30)之胺基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31)之胺基酸序列；及(d)FR-H4，其包含WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32)之胺基酸序列。在其他情況下，抗VEGF抗體包括以下四種輕鏈可變結構域FR：(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC (SEQ ID NO: 26)之胺基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGEAPKLLIY (SEQ ID NO: 27)之胺基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 28)之胺基酸序列；及(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20)之胺基酸序列。在一些情況下，抗VEGF抗體包括(a)包含SEQ ID NO:51之胺基酸序列之VH結構域及(b)包含SEQ ID NO: 35之胺基酸序列之VL結構域。
例如，在其他情況下，抗VEGF抗體包括以下六種HVR：(a)HVR-H1，其包含DYWIH (SEQ ID NO: 1)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS (SEQ ID NO: 9)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10)之胺基酸序列。在一些情況下，抗VEGF抗體包括以下四種重鏈可變結構域FR：(a)FR-H1，其包含EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 29)之胺基酸序列；(b)FR-H2，其包含WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30)之胺基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31)之胺基酸序列；及(d)FR-H4，其包含WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32)之胺基酸序列。在其他情況下，抗VEGF抗體包括以下四種輕鏈可變結構域FR：(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC (SEQ ID NO: 25)之胺基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGEAPKLLIY (SEQ ID NO: 27)之胺基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19)之胺基酸序列；及(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20)之胺基酸序列。在一些情況下，抗VEGF抗體包括(a)包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列之VH結構域及(b)包含SEQ ID NO: 36之胺基酸序列之VL結構域。
例如，在其他情況下，抗VEGF抗體包括以下六種HVR：(a)HVR-H1，其包含DYWIH (SEQ ID NO: 1)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS (SEQ ID NO: 9)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10)之胺基酸序列。在一些情況下，抗VEGF抗體包括以下四種重鏈可變結構域FR：(a)FR-H1，其包含EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 29)之胺基酸序列；(b)FR-H2，其包含WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30)之胺基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31)之胺基酸序列；及(d)FR-H4，其包含WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32)之胺基酸序列。在其他情況下，抗VEGF抗體包括以下四種輕鏈可變結構域FR：(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC (SEQ ID NO: 26)之胺基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18)之胺基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19)之胺基酸序列；及(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20)之胺基酸序列。在一些情況下，抗VEGF抗體包括(a)包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列之VH結構域及(b)包含SEQ ID NO: 37之胺基酸序列之VL結構域。
在其他情況下，抗VEGF抗體包括以下六種HVR：(a)HVR-H1，其包含DYWIH (SEQ ID NO: 1)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS (SEQ ID NO: 9)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10)之胺基酸序列。在一些情況下，抗VEGF抗體包括以下四種重鏈可變結構域FR：(a)FR-H1，其包含EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS (SEQ ID NO:52)之胺基酸序列；(b)FR-H2，其包含WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30)之胺基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31)之胺基酸序列；及(d)FR-H4，其包含WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32)之胺基酸序列。在其他情況下，抗VEGF抗體包括以下四種輕鏈可變結構域FR：(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC (SEQ ID NO: 26)之胺基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18)之胺基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19)之胺基酸序列；及(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20)之胺基酸序列。在一些情況下，抗VEGF抗體包括(a)包含SEQ ID NO:51之胺基酸序列之VH結構域及(b)包含SEQ ID NO: 37之胺基酸序列之VL結構域。
例如，在其他情況下，抗VEGF抗體包括以下六種HVR：(a)HVR-H1，其包含DYWIH (SEQ ID NO: 1)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS (SEQ ID NO: 9)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10)之胺基酸序列。在一些情況下，抗VEGF抗體包括以下四種重鏈可變結構域FR：(a)FR-H1，其包含EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 29)之胺基酸序列；(b)FR-H2，其包含WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30)之胺基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31)之胺基酸序列；及(d)FR-H4，其包含WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32)之胺基酸序列。在其他情況下，抗VEGF抗體包括以下四種輕鏈可變結構域FR：(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17)之胺基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18)之胺基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19)之胺基酸序列；及(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20)之胺基酸序列。在一些情況下，抗VEGF抗體包括(a)包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列之VH結構域及(b)包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列之VL結構域。
在其他情況下，抗VEGF抗體包括以下六種HVR：(a)HVR-H1，其包含DYWIH (SEQ ID NO: 1)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS (SEQ ID NO: 9)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10)之胺基酸序列。在一些情況下，抗VEGF抗體包括以下四種重鏈可變結構域FR：(a)FR-H1，其包含EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS (SEQ ID NO:52)之胺基酸序列；(b)FR-H2，其包含WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30)之胺基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31)之胺基酸序列；及(d)FR-H4，其包含WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32)之胺基酸序列。在其他情況下，抗VEGF抗體包括以下四種輕鏈可變結構域FR：(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17)之胺基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18)之胺基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19)之胺基酸序列；及(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20)之胺基酸序列。在一些情況下，抗VEGF抗體包括(a)包含SEQ ID NO:51之胺基酸序列之VH結構域及(b)包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列之VL結構域。
在一些情況下，抗VEGF抗體包含(a)重鏈可變(VH)結構域，其包含與SEQ ID NO: 11、40或42中任一者或其序列具有至少90%序列一致性(例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)之胺基酸序列；(b)輕鏈可變(VL)結構域，其包含與SEQ ID NO: 12、41或46中任一者或其序列具有至少90%序列(例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)之胺基酸序列；或(c)如(a)中之VH結構域及如(b)中之VL結構域。例如，在一些情況下，抗體包含含有SEQ ID NO: 11之胺基酸序列之VH結構域及含有SEQ ID NO: 12之胺基酸序列之VL結構域。在一些情況下，抗體包含含有SEQ ID NO: 40之胺基酸序列之VH結構域及含有SEQ ID NO: 12之胺基酸序列之VL結構域。在一些情況下，抗體包含含有SEQ ID NO: 42之胺基酸序列之VH結構域及含有SEQ ID NO: 12之胺基酸序列之VL結構域。在一些情況下，抗體包含含有SEQ ID NO: 42之胺基酸序列之VH結構域及含有SEQ ID NO: 41之胺基酸序列之VL結構域。在一些情況下，抗體包含含有SEQ ID NO: 11之胺基酸序列之VH結構域及含有SEQ ID NO: 46之胺基酸序列之VL結構域。
在一些情況下，任何前述抗VEGF抗體可包括以下重鏈可變結構域框架區(FR)中之一者、二者、三者或四者：(a)FR-H1，其包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS (SEQ ID NO: 13)之胺基酸序列；(b)FR-H2，其包含WVRQAPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 14)或WVRQEPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 39)之胺基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 15)之胺基酸序列；及(d)FR-H4，其包含WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 16)之胺基酸序列。
在一些情況下，任何前述抗VEGF抗體可包括以下輕鏈可變結構域FR中之一者、二者、三者或四者：(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17)或DIQMTQSPSSLSASVGDRVTIDC (SEQ ID NO: 45)之胺基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18)之胺基酸序列；(c) FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19)、GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDSATYYC (SEQ ID NO: 44)或GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYC (SEQ ID NO: 54)之胺基酸序列；及(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20)或FGQGTKVEVK (SEQ ID NO:55)之胺基酸序列。
在一些情況下，抗體包含含有SEQ ID NO: 11之胺基酸序列之VH結構域及含有DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGNPFTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:59)之胺基酸序列之VL結構域。
在一些情況下，抗體包含含有SEQ ID NO: 33之胺基酸序列之VH結構域及含有DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGNPFTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:59)之胺基酸序列之VL結構域。
在一些情況下，抗體包含含有SEQ ID NO: 40之胺基酸序列之VH結構域及含有DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGNPFTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:59)之胺基酸序列之VL結構域。
在一些情況下，抗體包含含有SEQ ID NO: 42之胺基酸序列之VH結構域及含有DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGNPFTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:59)之胺基酸序列之VL結構域。
在一些情況下，抗體包含含有SEQ ID NO:51之胺基酸序列之VH結構域及含有DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGNPFTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:59)之胺基酸序列之VL結構域。
在一些情況下，抗體包含含有SEQ ID NO: 11之胺基酸序列之VH結構域及含有DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGAPFTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 60)之胺基酸序列之VL結構域。
在一些情況下，抗體包含含有SEQ ID NO: 33之胺基酸序列之VH結構域及含有DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGAPFTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 60)之胺基酸序列之VL結構域。
在一些情況下，抗體包含含有SEQ ID NO: 40之胺基酸序列之VH結構域及含有DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGAPFTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 60)之胺基酸序列之VL結構域。
在一些情況下，抗體包含含有SEQ ID NO: 42之胺基酸序列之VH結構域及含有DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGAPFTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 60)之胺基酸序列之VL結構域。
在一些情況下，抗體包含含有SEQ ID NO:51之胺基酸序列之VH結構域及含有DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGAPFTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 60)之胺基酸序列之VL結構域。例如，在一些情況下，抗VEGF抗體包含(a) VH結構域，其包含與SEQ ID NO: 11或其序列具有至少90%序列一致性(例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)之胺基酸序列；(b) VL結構域，其包含與SEQ ID NO: 11或其序列具有至少90%序列一致性(例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)之胺基酸序列；或(c)如(a)中之VH結構域及如(b)中之VL結構域。在一些情況下，抗VEGF抗體可包括(a)HVR-H1，其包含DYWIH (SEQ ID NO: 1)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYTRYADSVKG (SEQ ID NO: 7)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS (SEQ ID NO: 9)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10)之胺基酸序列。在一些情況下，抗VEGF抗體包括以下重鏈框架區：(a)FR-H1，其包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS (SEQ ID NO: 13)之胺基酸序列；(b)FR-H2，其包含WVRQAPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 14)之胺基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 15)之胺基酸序列；及(d)FR-H4，其包含WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 16)之胺基酸序列。在一些情況下，抗VEGF抗體包括以下輕鏈框架區：(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17)之胺基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18)之胺基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19)之胺基酸序列；及(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20)之胺基酸序列。在一些情況下，抗VEGF抗體包括結合結構域，該結合結構域包含(a)包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列之VH結構域及(b)包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列之VL結構域。在一些情況下，例示性抗VEGF係N94A.F83A.N82aR.Y58R (亦稱作G6.31 AARR或G6.31.AARR)。
在一些情況下，抗VEGF抗體包含(a)VH結構域，其包含與SEQ ID NO: 33或51或其序列具有至少90%序列一致性(例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)之胺基酸序列；(b) VL結構域，其包含與SEQ ID NO: 12、34、35、36、37或38中任一者或其序列具有至少90%序列一致性(例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)之胺基酸序列；或(c)如(a)中之VH結構域及如(b)中之VL結構域。例如，在一些情況下，抗體包含含有SEQ ID NO: 33之胺基酸序列之VH結構域及含有SEQ ID NO: 12之胺基酸序列之VL結構域。在一些情況下，抗體包含含有SEQ ID NO: 33之胺基酸序列之VH結構域及含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列之VL結構域。在一些情況下，抗體包含含有SEQ ID NO: 33之胺基酸序列之VH結構域及含有SEQ ID NO: 35之胺基酸序列之VL結構域。在一些情況下，抗體包含含有SEQ ID NO: 33之胺基酸序列之VH結構域及含有SEQ ID NO: 36之胺基酸序列之VL結構域。在一些情況下，抗體包含含有SEQ ID NO: 33之胺基酸序列之VH結構域及含有SEQ ID NO: 37之胺基酸序列之VL結構域。在一些情況下，抗體包含含有SEQ ID NO: 33之胺基酸序列之VH結構域及含有SEQ ID NO: 38之胺基酸序列之VL結構域。在一些情況下，抗體包含含有SEQ ID NO:51之胺基酸序列之VH結構域及含有SEQ ID NO: 38之胺基酸序列之VL結構域。在一些情況下，抗體包含含有SEQ ID NO:51之胺基酸序列之VH結構域及含有SEQ ID NO: 35之胺基酸序列之VL結構域。在一些情況下，抗體包含含有SEQ ID NO:51之胺基酸序列之VH結構域及含有SEQ ID NO: 37之胺基酸序列之VL結構域。在一些情況下，抗體包含含有SEQ ID NO:51之胺基酸序列之VH結構域及含有SEQ ID NO: 12之胺基酸序列之VL結構域。
在一些情況下，任何前述抗VEGF抗體可包括以下重鏈可變結構域框架區(FR)中之一者、二者、三者或四者：FR-H1，其包含EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 29)或EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 52)之胺基酸序列；(b) FR-H2，其包含WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30)或WVRQEPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 39)之胺基酸序列；(c) FR-H3，其包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31)之胺基酸序列；及(d) FR-H4，其包含WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32)之胺基酸序列。
在一些情況下，任何前述抗VEGF抗體可包括以下輕鏈可變結構域FR中之一者、二者、三者或四者：(a) FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17)、DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC (SEQ ID NO: 25)或DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC (SEQ ID NO: 26)之胺基酸序列；(b) FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18)或WYQQKPGEAPKLLIY (SEQ ID NO: 27)之胺基酸序列；(c) FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19)、GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 24)或GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 28)之胺基酸序列；及(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20)之胺基酸序列。
在一些情形下，本發明提供包含(a)包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列之重鏈及/或(b)包含SEQ ID NO:50之胺基酸序列之輕鏈的抗體。在某些實施例中，抗體係以Fab格式表現之G6.31 AARR。
在一些情況下，本發明提供包含(a)包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列之重鏈及/或(b)包含SEQ ID NO:50之胺基酸序列之輕鏈的抗體。在某些實施例中，抗體係缺乏對抗人類IgG之反應性之G6.31 AARR之變體型式。
在另一態樣中，根據上述實施例中之任一者之抗體(例如抗VEGF抗體)可單獨地或以組合形式納入如下文第1-8部分中所述之任何特徵：1. 抗體親和力
在某些實施例中，本文所提供之抗體具有≤ 1μM、≤ 100 nm、≤ 10 nm、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM或≤ 0.001 nM (例如，10-8 M或更小，例如10-8 M至10-13 M，例如10-9 M至10-13 M)之解離常數(Kd)。例如，在一些情況下，本文所提供之抗體以約10 nm或更低之Kd結合抗原(例如人類VEGF (hVEGF))。在一些情況下，本文所提供之抗體以約5 nM或更低之Kd結合抗原(例如hVEGF)。在一些情況下，本文所提供之抗體以約2 nM或更低之Kd結合hVEGF。例如，在一些情況下，抗體以在約25 pM與約2 nM之間(例如，約25 pM、約50 pM、約75 pM、約100 pM、約125 pM、約150 pM、約175 pM、約200 pM、約225 pM、約250 pM、約275 pM、約300 pM、約325 pM、約350 pM、約375 pM、約400 pM、約425 pM、約約450 pM、約475 pM、約500 pM、約525 pM、約550 pM、約575 pM、約600 pM、約625 pM、約650 pM、約675 pM、約700 pM、約725 pM、約750 pM、約775 pM、約800 pM、約825 pM、約850 pM、約875 pM、約900 pM、約925 pM、約950 pM、約975 pM、約1 nM、約1.1 nM、約1.2 nM、約1.3 nM、約1.4 nM、約1.5 nM、約1.6 nM、約1.7 nM、約1.8 nM、約1.9 nM或約2 nM)之Kd結合抗原(例如hVEGF)。在一些情況下，抗體以在約75 pM與約600 pM之間(例如約75 pM、約100 pM、約125 pM、約150 pM、約175 pM、約200 pM、約225 pM、約250 pM、約275 pM、約300 pM、約325 pM、約350 pM、約375 pM、約400 pM、約425 pM、約450 pM、約475 pM、約500 pM、約525 pM、約550 pM、約575 pM、約600 pM)之Kd結合抗原(例如hVEGF)。在一些情況下，抗體以在約75 pM與約500 pM之間之Kd結合抗原(例如hVEGF)。在一些情況下，抗體以在約75 pM與約400 pM之間之Kd結合抗原(例如hVEGF)。在一些情況下，抗體以在約75 pM與約300 pM之間之Kd結合抗原(例如hVEGF)。在一些情況下，抗體以在約75 pM與約200 pM之間之Kd結合抗原(例如hVEGF)。在一些情況下，抗體以在約75 pM與約150 pM之間之Kd結合抗原(例如hVEGF)。在一些情況下，抗體以在約75 pM與約125 pM之間之Kd結合抗原(例如hVEGF)。在一些情況下，抗體以在約75 pM與約100 pM之間之Kd結合抗原(例如hVEGF)。在一些情況下，抗體以約80 pM之Kd結合抗原(例如hVEGF)。在一些情況下，抗體以約60 pM之Kd結合抗原(例如hVEGF)。在一些情況下，抗體以約40 pM之Kd結合抗原(例如hVEGF)。
在一個實施例中，Kd係藉由放射性標記之抗原結合分析(RIA)來量測。在一個實施例中，RIA係用目标抗體之Fab型式及其抗原實施。例如，Fab對抗原之溶液結合親和力係藉由以下方式來量測：在滴定系列之未標記抗原存在下用最小濃度之(125 I)標記之抗原平衡Fab，接下來用抗Fab抗體塗佈之板捕獲所結合抗原(參見例如Chen等人，J.Mol. Biol. 293:865-881(1999))。為建立分析條件，用於50 mM碳酸鈉(pH 9.6)中之5 μg/ml捕獲抗Fab抗體(Cappel Labs)將MICROTITER®多孔板(Thermo Scientific)塗佈過夜，且隨後在室溫(約23℃)用於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中之2% (w/v)牛血清白蛋白(BSA)阻斷2至5小時。在非吸附板(Nunc＃269620)中，將100 pM或26 pM [125 I] -抗原與目标Fab之連續稀釋液混合(例如，與抗VEGF抗體Fab-12之評估一致，Presta等人，Cancer Res. 57:4593-4599 (1997))。接下來將目标之Fab培育過夜；然而，培育可能會持續較長時間(例如約65小時)以確保達到平衡。之後，將混合物轉移至捕獲板以在室溫下培育(例如1小時)。接下來去除溶液，並用於PBS中之0.1%聚山梨醇酯20 (TWEEN-20®)將板洗滌八次。當板乾燥後，添加150 μl/孔之閃爍劑(MICROSCINT-20TM ；Packard)，並在TOPCOUNTTM γ計數器(Packard)上對板進行計數且持續10分鐘。選擇給出小於或等於最大結合之20%之每一Fab之濃度用於競爭性結合分析。
根據另一實施例，使用BIACORE®表面電漿共振分析來量測Kd。例如，使用BIACORE®-2000或BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)之分析係在25℃下用約10個反應單位(RU)之固定抗原CM5晶片實施。在一個實施例中，根據供應商之說明書，用N- 乙基-N' -(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N- 羥基琥珀醯亞胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物感測器晶片(CM5, BIAcore, Inc.)。用10 mM乙酸鈉(pH 4.8)將抗原稀釋至5 μg/ml (約0.2μM)，之後以5 μl/分鐘之流速注射以達成約10個反應單位(RU)之偶合蛋白。注射抗原後，注射1 M乙醇胺以阻斷未反應之基團。對於動力學量測，在25℃下在含有0.05%聚山梨醇酯20 (TWEEN-20TM )表面活性劑(PBST)之PBS中以約25 μl/分鐘之流速注射Fab之兩倍系列稀釋液(0.78 nM至500 nm)。藉由同時擬合締合及解離感測圖，使用簡單的一對一Langmuir結合模型(BIACORE®Evaluation Software 3.2版本)計算締合速率(kon )及解離速率(koff )。平衡解離常數(Kd)係計算為比率koff /kon 。參見例如Chen等人，J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)。若締合速率超過106 M-1 s-1 (藉由上述表面電漿共振分析)，則該締合速率可藉由使用螢光淬滅技術來測定，該螢光淬滅技術在25℃下在增加濃度之抗原存在下量測於PBS (pH 7.2)中之20 nM抗抗原抗體(Fab形式)之螢光發射強度之增加或減少(激發= 295 nm；發射= 340 nm，16 nm帶通)，如在光譜儀(例如配備有停止流動之分光光度計(Aviv Instruments)或具有攪拌比色皿之8000系列SLM-AMINCOTM 分光光度計(ThermoSpectronic))中所量測。2. 抗體穩定性
在一些情況下，例如與抗VEGF抗體(例如G6.31)相比，用於本發明之抗體偶聯物或其組合物中之抗體具有增強之穩定性(參見例如美國專利第7,758,859號及國際申請公開案第WO 2005/012359號，其全部內容以引用方式併入本文)。可使用業內已知之任何方法(例如差示掃描螢光測定法(DSF)、圓二色性(CD)、蛋白質內源螢光、差示掃描量熱法、光譜術、光散射(例如動態光散射(DLS)及靜態光散射(SLS))、自相互作用層析(SIC))來測定抗體之穩定性。例如，與抗VEGF抗體(例如G6.31)相比，抗VEGF抗體可具有(例如)增強之解鏈溫度(Tm )、聚集溫度(Tagg )或其他穩定性指標。
在某些實施例中，本文所提供之抗體之Tm 大於或等於約80℃ (例如，約81℃、約82℃、約83℃、約84℃、約85℃、約86℃、約87℃、約88℃、約89℃、約90℃、約91℃、約92℃或約93℃)。例如，在一些情況下，抗VEGF抗體之Tm 大於或等於約83.5℃(例如，約83.5℃、約84℃、約85℃、約86℃、約87℃、約88℃、約89℃、約90℃、約91℃、約92℃或約93℃)。在一些情況下，抗VEGF抗體之Tm 為約82℃至約92℃ (例如，約82℃、約83℃、約84℃、約85℃、約86℃、約87℃、約88℃、約89℃、約90℃、約91℃或約92℃)。在一些情況下，抗VEGF抗體之Tm 為約82℃。在一些情況下，使用DSF來測定抗VEGF抗體之任何前述Tm 值。在一些實施例中，抗VEGF抗體之Tm 值係如在(例如)國際專利申請案第PCT/US2016/053454號之實施例1中所闡述來測定，該案之全部內容以引用方式併入本文。3. 抗體片段
在某些實施例中，本文所提供之抗體係抗體片段。抗體片段包括(但不限於) Fab、Fab'、Fab-C、Fab'-SH、F(ab')2 、Fv及scFv片段及下文所述之其他片段。關於某些抗體片段之綜述，參見Hudson等人，Nat. Med. 9:129-134 (2003)。關於scFv片段之綜述，參見例如Pluckthün,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies , 第113卷, Rosenburg及Moore編輯，(Springer-Verlag, New York), 第269-315頁(1994)；亦參見WO 93/16185；及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。為論述包含補救受體結合表位殘基且具有增加之活體內半衰期之Fab及F(ab')2 片段，參見美國專利第5,869,046號。
雙體係可為二價或雙特異性之具有兩個抗原結合位點之抗體片段。參見例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat. Med. 9:129-134(2003)；及Hollinger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)。三體及四體亦闡述於Hudson等人，Nat. Med. 9:129-134 (2003)中。
單結構域抗體係包含抗體之全部或一部分重鏈可變結構域或全部或一部分輕鏈可變結構域之抗體片段。在某些實施例中，單結構域抗體係人類單結構域抗體(Domantis, Inc., Waltham, MA；參見例如美國專利第6,248,516 B1號)。
抗體片段可藉由各種技術(包括(但不限於)完整抗體之蛋白水解消化以及重組宿主細胞(例如大腸桿菌(E. coli )或噬菌體)之產生)來製備，如本文所闡述。4. 嵌合抗體及人類化抗體
在某些實施例中，本文所提供之抗體係嵌合抗體。某些嵌合抗體闡述於例如以下文獻中：美國專利第4,816,567號；及Morrison等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 81:6851-6855 (1984)。在一個實例中，嵌合抗體包含非人類可變區(例如源自小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人類靈長類動物(例如猴)之可變結構域)及人類恆定結構域。在另一實例中，嵌合抗體係「類別切換」抗體，其中類別或亞類已自親本抗體之類別或亞類變化。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
在某些實施例中，嵌合抗體係人類化抗體。通常，將非人類抗體人類化以減少對人類之免疫原性，同時保留親本非人類抗體之特異性及親和力。通常，人類化抗體包含一或多個可變結構域，其中HVR (例如CDR) (或其部分)係源自非人類抗體，並且FR (或其部分)係源自人類抗體序列。人類化抗體視情況亦將包含人類恆定區之至少一部分。在一些實施例中，人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如，HVR殘基衍生之抗體)之相應殘基取代，例如以恢復或改良抗體特異性或親和力。
例如，人類化抗體及其製備方法綜述於(例如)Almagro及Fransson,Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)中，並且進一步闡述於以下文獻中：例如Riechmann等人，Nature 332:323-329 (1988)；Queen等人，Proc. Nat 'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)；美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Kashmiri等人，Methods 36:25-34 (2005) (闡述特異性決定區(SDR)移植)；Padlan,Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (闡述「表面重修」)；Dall'Acqua等人，Methods 36:43-60(2005) (闡述「FR改組」)；及Osbourn等人，Methods 36:61-68 (2005)及Klimka等人，Br. J. Cancer , 83:252-260(2000) (闡述FR改組之「導向選擇」方法)。
可用於人類化之人類框架區包括(但不限於)：使用「最適合」方法選擇之框架區(參見例如，Sims等人，J. Immunol. 151 :2296 (1993))；來源於輕鏈或重鏈可變區之特定子組之人類抗體之共有序列的框架區(參見例如Carter等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 89:4285 (1992)；及Presta等人，J. Immunol. , 151:2623 (1993))；人類成熟(體細胞突變之)框架區或人類種系框架區(參見例如，Almagro及Fransson,Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008))；及來源於篩選FR庫之框架區(參見例如Baca等人，J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)及Rosok等人，J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996))。5. 人類抗體
在某些實施例中，本文所提供之抗體係人類抗體。人類抗體可使用業內已知之各種技術來產生。人類抗體通常闡述於van Dijk及van de Winkel，Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001)及Lonberg,Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)中。
人類抗體可藉由將免疫原投與已經修飾以響應抗原攻擊而產生完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體之轉基因動物來製備。該等動物通常含有全部或一部分人類免疫球蛋白基因座，其置換內源性免疫球蛋白基因座，或者其存在於染色體外或隨機整合至動物染色體中。在該等轉基因小鼠中，內源性免疫球蛋白基因座通常已經失活。關於自轉基因動物獲得人類抗體之方法之綜述，參見Lonberg,Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)。例如亦參見闡述XENOMOUSE™技術之美國專利第6,075,181號及第6,150,584號；闡述HUMAB®技術之美國專利第5,770,429號；闡述K-M MOUSE®技術之美國專利第7,041,870號及闡述VELOCIMOUSE®技術之美國專利申請公開案第US 2007/0061900號。例如，可藉由與不同的人類恆定區組合來進一步修飾來自由該等動物生成之完整抗體之人類可變區。
人類抗體亦可藉由基於雜交瘤之方法來製備。已經闡述了用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類異骨髓瘤細胞系。(參見例如KozborJ. Immunol. , 133: 3001 (1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications , 第51-63頁(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；及Boerner等人，J. Immunol ., 147: 86 (1991))。藉由人類B細胞雜交瘤技術生成之人類抗體亦闡述於Li等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 103:3557-3562 (2006)中。其他方法包括闡述於(例如)美國專利第7,189,826號(闡述自雜交瘤細胞系產生單株人類IgM抗體)及Ni,Xiandai Mianyixue , 26(4):265-268 (2006) (闡述人-人雜交瘤)中之彼等。人類雜交瘤技術(Trioma技術)亦闡述於Vollmers及Brandlein,Histology and Histopathology , 20(3):927-937 (2005)及Vollmers及Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology , 27(3):185-91 (2005)中。
人類抗體亦可藉由分離選自人源噬菌體顯示庫之Fv純系可變結構域序列來生成。然後可將該等可變結構域序列與期望之人類恆定結構域組合。下文闡述自抗體庫中選擇人類抗體之技術。6. 庫源抗體
可藉由篩選組合庫中具有一或多種期望活性之抗體來分離本發明之抗體。例如，業內已知多種方法用於生成噬菌體顯示庫並篩選該等庫中具有期望結合特徵之抗體。該等方法綜述於(例如) Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien等人編輯，Human Press, Totowa, NJ, 2001)中，並且進一步闡述於以下文獻中：例如McCafferty等人，Nature 348:552-554；Clackson等人，Nature 352: 624-628 (1991)；Marks等人，J. Mol. Biol. 222:581-597 (1992)；Marks及Bradbury，Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo編輯，Human Press, Totowa, NJ, 2003)；Sidhu等人，J. Mol. Biol. 338(2): 299-310(2004)；Lee等人，J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)；Fellouse,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)；及Lee等人，J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)。
在某些噬菌體顯示方法中，藉由聚合酶鏈式反應(PCR)分開選殖VH及VL基因之儲庫，並在噬菌體庫中隨機重組，接下來可如Winter等人，Ann. Rev. Immunol. , 12: 433-455 (1994)中所闡述篩選抗原結合噬菌體。噬菌體通常顯示抗體片段，其呈單鏈Fv (scFv)片段或呈Fab片段。來自免疫源之儲庫提供對免疫原之高親和力抗體，而不需要構築雜交瘤。或者，可選殖(例如自人類)幼稚庫以提供針對眾多非自身亦及自身抗原之單一抗體來源而無需任何免疫，如Griffiths等人，EMBO J, 12: 725-734 (1993)所述。最後，亦可藉由自幹細胞選殖未重排之V基因片段並使用含有隨機序列之PCR引子來編碼高度可變的CDR3區並在活體外完成重排來合成製備幼稚庫，如Hoogenboom及Winter,J. Mol. Biol. , 227: 381-388 (1992)所闡述。闡述人類抗體噬菌體庫之專利公開案包括(例如)美國專利第5,750,373號及美國專利公開案第2005/0079574號、第2005/0119455號、第2005/0266000號、第2007/0117126號、第2007/0160598號、第2007/0237764號、第2007/0292936號及第2009/0002360號。
如國際專利申請案第PCT/US2016/053454號中所述，抗體或抗體片段可源自噬菌體庫。
自人類抗體庫分離之抗體或抗體片段被視為本文之人類抗體或人類抗體片段。7. 多特異性抗體
在某些實施例中，本文所提供之抗體係多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體係對至少兩個不同位點具有結合特異性之單株抗體。在某些實施例中，結合特異性中之一者係針對VEGF且另一者係針對任何其他抗原，例如，第二生物分子，例如介白素-1β (IL-1β)；介白素-6 (IL-6)；白介素-6受體(IL-6R)；白介素-13 (IL-13)；IL-13受體(IL-13R)；PDGF (例如PDGF-BB)；血管生成素；血管生成素2 (Ang2)；Tie2；S1P；整聯蛋白αvβ3、αvβ5及α5β1；β細胞素；apelin/APJ；促紅血球生成素；補體因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受體(例如VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、膜結合VEGF受體(mbVEGFR)或可溶性VEGF受體(sVEGFR))；ST-2受體；以及與年齡相關性黃斑變性(AMD)風險遺傳相關之蛋白質，例如補體途徑組分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a及C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；介白素-8 (IL-8)；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC；COL10A1；及TNFRSF10A。因此，雙特異性抗體可對以下各項具有結合特異性：VEGF及IL-1β；VEGF及IL-6；VEGF及IL-6R；VEGF及IL-13；VEGF及IL-13R；VEGF及PDGF (例如PDGF-BB)；VEGF及血管生成素；VEGF及Ang2；VEGF及Tie2；VEGF及S1P；VEGF及整聯蛋白αvβ3；VEGF及整聯蛋白αvβ5；VEGF及整聯蛋白α5β1；VEGF及β細胞素；VEGF及apelin/APJ；VEGF及促紅血球生成素；VEGF及補體因子D；VEGF及TNFα；VEGF及HtrA1；VEGF及VEGF受體(例如，VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、mbVEGFR或sVEGFR)；VEGF及ST-2受體；VEGF及C2；VEGF及因子B；VEGF及H因子；VEGF及CFHR3；VEGF及C3b；VEGF及C5；VEGF及C5a；VEGF及C3a；VEGF及ARMS2；VEGF及TIMP3；VEGF及HLA；VEGF及IL-8；VEGF及CX3CR1；VEGF及TLR3；VEGF及TLR4；VEGF及CETP；VEGF及LIPC；VEGF及COL10A1；或VEGF及TNFRSF10A。在某些實施例中，雙特異性抗體可結合至VEGF之兩個不同表位。雙特異性抗體亦可用於將細胞毒性劑定位至表現VEGF之細胞。雙特異性抗體可製備為全長抗體或抗體片段(例如Fab、Fab'或Fab-C片段)。
在一些情況下，雙特異性抗體係美國專利申請案第US 2014/0017244號中揭示之雙特異性抗VEGF/抗血管發生素2 (Ang2)抗體，該案係以全文引用方式併入本文。例如，抗VEGF/抗Ang2雙特異性抗體可包括結合VEGF之第一結合結構域(例如本文所述之任何抗VEGF抗體)及結合Ang2之第二結合結構域，該雙特異性抗體包括(a)HVR-H1，其包含GYYMH (SEQ ID NO: 62)之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含WINPNSGGTNYAQKFQG (SEQ ID NO: 63)之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SPNPYYYDSSGYYYPGAFDI (SEQ ID NO: 64)之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含GGNNIGSKSVH (SEQ ID NO: 65)之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含DDSDRPS (SEQ ID NO: 66)之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含QVWDSSSDHWV (SEQ ID NO: 67)之胺基酸序列，或一或多種上述HVR及其一或多種變體之組合，該等變體與SEQ ID NO: 62-67中之任一者具有至少約80%序列一致性(例如，81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性)。
在一些情況下，抗VEGF/抗Ang2雙特異性抗體可包括結合VEGF之第一結合結構域(例如本文所述之任何抗VEGF抗體)及結合Ang2之第二結合結構域且包括(a) VH結構域，其包含與SEQ ID NO: 68或其序列具有至少80%序列一致性(例如，80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)之胺基酸序列；(b) VL結構域，其包含與SEQ ID NO: 69或其序列具有至少80%序列一致性(例如，80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)之胺基酸序列；或(c)如(a)中之VH結構域及如(b)中之VL結構域。在一些情況下，抗VEGF/抗Ang2雙特異性抗體可包括結合VEGF之第一結合結構域(例如本文所述之任何抗VEGF抗體)及特異性結合至Ang2之第二結合結構域，其中該第二結合結構域係國際專利申請公開案第WO 2010/069532號中所闡述之任何抗體結合結構域(該案係以全文引用方式併入本文)，或其變體。
在其他情況下，抗VEGF/抗Ang2雙特異性抗體係國際專利申請公開案第WO 2016/073157號中所闡述之任何抗VEGF/抗Ang2雙特異性抗體。
在一些情況下，雙特異性抗體係雙特異性抗VEGF/抗IL-6抗體。在一些情況下，抗VEGF/抗IL-6雙特異性抗體可包括結合VEGF之第一結合結構域(例如本文所述之任何抗VEGF抗體)及結合IL-6之第二結合結構域。該第二結合結構域可為業內已知之任何抗IL-6抗體之結合結構域，該抗IL-6抗體係例如EBI-031 (Eleven Biotherapeutics；參見例如WO2016/073890，其係以全文引用方式併入本文))、司妥昔單抗(siltuximab) (SYLVANT®)、奧洛珠單抗(olokizumab)、克拉珠單抗(clazakizumab)、西盧卡單抗(sirukumab)、艾西莫單抗(elsilimomab)、格利珠單抗(gerilimzumab)、OPR-003、MEDI-5117、PF-04236921或其變體。
在一些情況下，雙特異性抗體係雙特異性抗VEGF/抗IL-6R抗體。在一些情況下，抗VEGF/抗IL-6R雙特異性抗體可包括結合VEGF之第一結合結構域(例如任何本文所述之抗VEGF抗體)及結合IL-6R之第二結合結構域。該第二結合結構域可為業內已知之任何抗IL-6R抗體之結合結構域，該抗IL-6R抗體係例如托珠單抗(tocilizumab)(ACTEMRA®) (參見例如WO 1992/019579，其係以全文引用方式併入本文)、沙魯單抗(sarilumab)、沃巴利珠單抗(vobarilizumab) (ALX-0061)、SA-237或其變體。
用於製備多特異性抗體之技術包括(但不限於)具有不同特異性之兩種免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之重組共表現(參見Milstein及Cuello，Nature 305:537 (1983))、WO 93/08829及Traunecker等人，EMBO J. 10: 3655 (1991))及「孔中球(knob-in-hole)」改造(參見例如美國專利第5,731,168號)。多特異性抗體亦可藉由以下方式來製備：改造靜電轉向效應用於製備抗體Fc-異二聚體分子(WO 2009/089004A1)；使兩種或更多種抗體或片段交聯(參見例如美國專利第4,676,980號及Brennan等人，Science , 229: 81 (1985))；使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體(參見例如Kostelny等人，J. Immunol. , 148(5):1547-1553 (1992))；使用「雙體」技術來製備雙特異性抗體片段(參見例如Hollinger等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 90:6444-6448 (1993))；及使用單鏈Fv (sFv)二聚體(參見例如Gruber等人， J. Immunol. , 152:5368 (1994))；及如(例如) Tutt等人，J. Immunol. 147:60(1991)中所闡述製備三特異性抗體。
本文亦包括具有三個或更多個功能性抗原結合位點之經改造抗體，包括「Octopus抗體」(參見例如US 2006/0025576A1)。
本文中之抗體或片段亦包括包含結合至VEGF以及另一不同抗原之抗原結合位點之「雙重作用FAb」或「DAF」(參見例如US 2008/0069820)。8. 抗體變體
在某些實施例中，涵蓋本文所提供之抗體之胺基酸序列變體(例如，包括一或多個胺基酸殘基改變之抗體變體)。例如，可能期望改良抗體之結合親和力及/或其他生物學性質。抗體之胺基酸序列變體可藉由將適當的修飾引入編碼抗體之核苷酸序列中或藉由肽合成來製備。該等修飾包括(例如)抗體之胺基酸序列內之殘基之缺失及/或插入及/或取代。可作出缺失、插入及取代之任何組合以達成最終構築體，前提係最終構築體具有期望之特徵，例如抗原結合。a) 取代、插入及缺失變體
在某些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代之抗體變體。取代誘變目标的位點包括HVR及FR。在表1中「較佳取代」之標題下顯示保守取代。在表1中「例示性取代」標題下提供更實質性的變化，並且如下文參考胺基酸側鏈類別進一步闡述。可將胺基酸取代引入目标抗體中並篩選產物以獲得期望之活性，例如保留/改良之抗原結合、降低之免疫原性或改良之ADCC或CDC。表 1
胺基酸可根據常見側鏈性質來分組： (1) 疏水性：正白胺酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile； (2) 中性親水性：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln； (3) 酸性：Asp，Glu； (4) 鹼性：His，Lys，Arg； (5) 影響鏈定向之殘基：Gly，Pro； (6) 芳香族：Trp，Tyr，Phe。
非保守取代將需要將該等類別中之一個類別之成員換成另一類別。
一種類型之取代變體涉及取代親本抗體(例如，人類化或人類抗體)之一或多個高變區殘基及/或FR殘基。通常，選擇用於進一步研究之所得變體相對於親本抗體將具有某些生物學性質之改變(例如改良) (例如親和力增加、穩定性增加、表現增加、pI改變及/或免疫原性降低)及/或將實質上保留親本抗體之某些生物學性質。例示性取代變體係親和力成熟之抗體，其可使用(例如)基於噬菌體顯示之親和力成熟技術(例如本文所述之彼等)方便地生成。簡而言之，將一或多個HVR殘基突變，並在噬菌體上顯示變體抗體並針對具體生物活性(例如結合親和力)進行篩選。
例如，可在HVR中進行改變(例如，取代)以改良抗體親和力。該等改變可在HVR 「熱點」中進行，亦即由在體細胞成熟過程期間以高頻率經歷突變之密碼子編碼之殘基(參見例如Chowdhury，Methods Mol. Biol. 207 :179-196 (2008))，及/或與抗原接觸之殘基，且測試所得變體VH或VL之結合親和力。藉由構築二級庫並自其重新選擇之親和力成熟已闡述於(例如) Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien等人編輯，Human Press, Totowa, NJ, (2001))中。在親和力成熟之一些實施例中，藉由多種方法中之任一種(例如，易錯PCR、鏈改組或寡核苷酸定向誘變)將多樣性引入選擇用於成熟之可變基因。接下來創建二級庫。接下來篩選庫以鑑別具有期望親和力之任何抗體變體。另一種引入多樣性之方法涉及HVR指導之方法，其中幾個HVR殘基(例如，一次4-6個殘基)被隨機化。參與抗原結合之HVR殘基可使用(例如)丙胺酸掃描誘變或建模來特定地鑑別。特別係CDR-H3及CDR-L3通常被靶向。
在某些實施例中，取代、插入或缺失可發生在一或多個HVR內，只要該等改變不會顯著降低抗體結合抗原之能力即可。例如，可在HVR中進行基本上不會降低結合親和力之保守改變(例如，如本文提供之保守取代)。例如，該等改變可在HVR中之抗原接觸殘基之外。在上文提供之變體VH及VL序列之某些實施例中，每一HVR未改變，或含有不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。
在某些實施例中，取代、插入或缺失可發生在一或多個FR內，只要該等改變不會顯著降低抗體結合抗原之能力即可。例如，該等改變可改良抗體親和力及/或穩定性(例如，如藉由增加之解鏈溫度所評估)。
用於鑑別可被靶向用於誘變之抗體之殘基或區之有用方法稱為「丙胺酸掃描誘變」，如Cunningham及Wells (1989)Science , 244:1081-1085所闡述。在此方法中，鑑別殘基或靶殘基組(例如帶電殘基，例如Arg、Asp、His、Lys及Glu)並用中性或帶負電的胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)置換以確定抗體與抗原之相互作用是否受到影響。其他取代可在證明對最初取代具有功能敏感性之胺基酸位置引入。另一選擇為或另外，抗原-抗體複合物之晶體結構來鑑別抗體與抗原之間之接觸點。該等接觸殘基及相鄰殘基可作為取代之候選物被靶向或消除。可篩選變體以確定其是否含有期望之性質。
胺基酸序列插入包括長度範圍自一個殘基至含有一百個或更多個殘基之多肽之胺基末端及/或羧基末端融合，以及單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N末端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他插入變體包括抗體之N末端或C末端與酶(例如用於ADEPT)或增加抗體血清半衰期之多肽之融合。b) 醣基化變體
在某些實施例中，改變本文所提供之抗體以增加或降低抗體醣基化之程度。抗體中醣基化位點之添加或缺失可藉由改變胺基酸序列來方便地完成，從而產生或去除一或多個醣基化位點。
倘若抗體包含Fc區時，則可改變與其附接之碳水化合物。由哺乳動物細胞產生之天然抗體通常包含具支鏈的雙觸角寡醣，其通常藉由N鍵聯附接至Fc區之CH2結構域之Asn297。參見例如Wright等人，TIBTECH 15:26-32 (1997)。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯葡萄糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及附接至雙觸角寡醣結構之「主幹」中之GlcNAc之岩藻醣。在一些實施例中，可對本發明抗體中之寡醣進行修飾以便產生具有某些改良性質之抗體變體。
在一個實施例中，提供具有缺乏附接(直接或間接)至Fc區之岩藻醣之碳水化合物結構的抗體變體。例如，該抗體中岩藻醣之量可為1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。藉由相對於附接至Asn 297之所有糖結構(例如複合物、雜合物及高甘露糖結構)之總和(藉由MALDI-TOF質譜法所量測)計算Asn297處糖鏈內岩藻醣之平均量來測定岩藻醣的量，如(例如) WO 2008/077546中所闡述。Asn297係指位於Fc區約297位之天冬醯胺殘基(Fc區殘基之Eu編號)；然而，Asn297亦可位於297位之上游或下游約± 3個胺基酸處，亦即位於294位與300位之間，此歸因於抗體中之微小序列變異。該等岩藻醣基化變體可能具有改良之ADCC功能。參見例如美國專利公開案第US 2003/0157108號；第US 2004/0093621號。與「去岩藻醣基化」或「岩藻醣缺陷型」抗體變體相關之公開案之實例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人，J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)；Yamane-Ohnuki等人，Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)。能夠產生去岩藻醣基化抗體之細胞系之實例包括蛋白質岩藻醣化有缺陷的Lec13 CHO細胞(Ripka等人，Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；美國專利申請案第US 2003/0157108 A1號，Presta, L；及WO 2004/056312 A1，Adams等人，尤其在實例11處)，及基因剔除細胞系，例如α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因，FUT8 ，基因剔除CHO細胞(參見例如Yamane-Ohnuki等人，Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)；Kanda等人，Biotechnol. Bioeng ., 94(4):680-688 (2006)；及WO2003/085107)。
進一步提供具有二分寡醣之抗體變體，例如其中附接至抗體之Fc區之雙觸角寡醣被GlcNAc二分。該等抗體變體可具有降低之岩藻醣基化及/或改良之ADCC功能。該等抗體變體之實例闡述於(例如) WO 2003/011878、美國專利第6,602,684號及US 2005/0123546 (Umana等人)中。亦提供在附接至Fc區之寡醣中具有至少一個半乳糖殘基之抗體變體。該等抗體變體可能具有改良之CDC功能。該等抗體變體闡述於(例如) WO 1997/30087、WO 1998/58964及WO 1999/22764 (Raju, S.)中。c) Fc 區變體
在某些實施例中，可將一或多個胺基酸修飾引入本文所提供之抗體之Fc區，藉此生成Fc區變體。Fc區變體可包含在一或多個胺基酸位置包含胺基酸殘基改變(例如，取代)之人類Fc區序列(例如，人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。
在某些實施例中，本發明涵蓋如下抗體變體：具有一些但並非所有效應物功能，從而使其成為用於其中抗體活體內半衰期至關重要但某些效應物功能(例如補體及ADCC)係不必要或有害之應用之合意候選者。可進行活體外及/或活體內細胞毒性分析以證實CDC及/或ADCC活性之減少/消耗。例如，可進行Fc受體(FcR)結合分析以確保抗體缺乏FcγR結合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留了FcRn結合能力。介導ADCC之原代細胞NK細胞僅表現FcγRIII，而單核球表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。造血細胞上之FcR表現總結於Ravetch及Kinet，Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)之第464頁之表3中。
用於評估目标分子的ADCC活性之活體外分析之非限制性實例闡述於美國專利第5,500,362號中(參見例如Hellstrom等人，Proc. Nat 'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)及Hellstrom, I等人，Proc. Nat 'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)；美國專利第5,821,337號；幾Bruggemann等人，J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987))。另一選擇為，可使用非放射性分析方法(參見例如用於流式細胞術之ACTI™非放射性細胞毒性分析(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA；及CYTOTOX 96®非放射性細胞毒性分析(Promega, Madison, WI))。用於該等分析之有用效應細胞包括外周血單核細胞(PBMC)及自然殺傷(NK)細胞。另一選擇為或另外，可在活體內評估目标分子之ADCC活性，例如在諸如揭示於Clynes等人，Proc. Nat 'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)中者之動物模型中進行。亦可實施C1q結合分析以證實抗體不能結合C1q且因此缺乏CDC活性。參見例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為評估補體活化，可實施CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro等人，J. Immunol. Methods 202:163 (1996)；Cragg等人，Blood 101:1045-1052 (2003)；及Cragg等人，Blood 103:2738-2743 (2004))。FcRn結合及活體內清除率/半衰期測定亦可使用業內已知之方法來進行(參見例如，Petkova等人，Int 'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006))。
具有降低之效應物功能之抗體包括取代Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者之彼等(美國專利第6,737,056號)。該等Fc突變體包括在胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或更多者處具有取代之Fc突變體，包括殘基265及297取代為丙胺酸之所謂的「DANA」 Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。
闡述具有改善的或減少的與FcR的結合的某些抗體變體。(參見例如美國專利第號6,737,056；WO 2004/056312及Shields等人，J. Biol. Chem. 9 (2):6591-6604 (2001))。
在某些實施例中，抗體變體包含具有一或多個改良ADCC之胺基酸取代(例如在Fc區之位置298、333及/或334處之取代(殘基之EU編號))之Fc區。
在一些實施例中，在Fc區中進行改變從而導致C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)發生改變(亦即改良或減弱)，例如，如美國專利第6,194,551號、WO 99/51642及Idusogie等人，J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)中所闡述。
具有延長之半衰期及改良之結合至新生兒Fc受體(FcRn)的抗體係負責將母體IgG轉移至胎兒(Guyer等人，J. Immunol. 117:587 (1976)及Kim等人，J. Immunol. 24:249 (1994))闡述於US2005/0014934A1 (Hinton等人)中。彼等抗體包含其中具有一或多個改良Fc區與FcRn之結合之取代之Fc區。該等Fc變體包括在下列Fc區殘基中之一或多者處具有取代(例如Fc區殘基434之取代(美國專利第7,371,826號))之彼等：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434。亦參見Duncan及Winter，Nature 322:738-40(1988)；美國專利第5,648,260號；美國專利第5,624,821號；及關於Fc區變體之其他實例之WO 94/29351。d) 半胱胺酸改造之抗體變體
本發明提供半胱胺酸改造之抗體，其中野生型或親本抗體(例如抗VEGF抗體，包括本文所述之任何抗VEGF抗體)之一或多個胺基酸經半胱胺酸胺基酸(亦即「改造之半胱胺酸」)置換(即「取代」或「突變」)。任何形式之抗體均可如此改造(亦即突變)。例如，親本單株抗體可經改造以形成「THIOMAB™抗體」。THIOMAB™抗體之一個實例係具有經改造半胱胺酸之抗體片段(亦即Fab)。此Fab THIOMAB™抗體可稱作「ThioFab」。應當注意的是，單一位點突變在ThioFab中產生單一經改造半胱胺酸殘基，而單一位點突變在THIOMAB™抗體中產生兩個經改造半胱胺酸殘基，此歸因於IgG抗體之二聚體性質。
可評估具有經改造半胱胺酸(Cys)殘基之突變體之新引入的經改造半胱胺酸巰基之反應性。巰基反應性值係在0至1.0範圍內之相對數值項，並且可針對任何半胱胺酸改造之抗體來量測。本發明之半胱胺酸改造之抗體之巰基反應性值在0.0至1.0之範圍內。特定而言，本發明之半胱胺酸改造之抗體之巰基反應性值在0.1之1.0之範圍內。在某些實施例中，本發明之半胱胺酸改造之抗體之巰基反應性值在0.0至0.1、0.1至0.5、0.1至0.6、0.1至0.7、0.1至0.8、0.1至0.9或0.1至1.0之範圍內。在某些實施例中，本發明之半胱胺酸改造之抗體之巰基反應性值在0.2至1.0、0.3至1.0、0.4至1.0、0.5至1.0、0.6至1.0、0.7至1.0或0.8至1.0之範圍內。在某些實施例中，本發明之半胱胺酸改造之抗體之巰基反應性值在0.6至1.0之範圍內。在某些實施例中，本發明之半胱胺酸改造之抗體之巰基反應性值在0.7至1.0之範圍內。在某些實施例中，本發明之半胱胺酸改造之抗體之巰基反應性值在0.8至10之範圍內。在某些實施例中，本發明之半胱胺酸改造之抗體之巰基反應性值在0.5至0.8之範圍內。在某些實施例中，本發明之半胱胺酸改造抗體之巰基反應性值在0.5至0.9之範圍內。在某些實施例中，本發明之半胱胺酸改造抗體之巰基反應性值在0.5至0.7之範圍內。在某些實施例中，本發明之半胱胺酸改造之抗體之巰基反應性值在0.5至1.0之範圍內。
本發明提供用於產生與親電子官能基反應之半胱胺酸改造之抗體之設計、選擇及製備方法。該等方法進一步使得抗體偶聯物化合物(例如具有聚合物部分之抗體-聚合物偶聯物)在經指定、經設計之選擇性位點處偶聯。抗體表面上之反應性半胱胺酸殘基容許藉助巰基反應性基團(例如馬來醯亞胺或鹵乙醯基)特異性地偶聯聚合物。Cys殘基之巰基官能基與馬來醯亞胺基團之親核反應性較蛋白質中之任何其他胺基酸官能基(例如離胺酸殘基之胺基或N末端胺基)高約1000倍。碘乙醯基及馬來醯亞胺試劑中之巰基特異性官能基可與胺基反應，但需要更高之pH (＞ 9.0)及更長之反應時間(Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London)。
本發明之半胱胺酸改造之抗體較佳保留其野生型親本抗體對應物之抗原結合能力。因此，半胱胺酸改造之抗體能夠較佳特異性結合至抗原。例示性的非限制性抗原包括VEGF；IL-1β；IL-6；IL-6R；IL-13；IL-13R；PDGF (例如，PDGF-BB)；血管生成素；血管生成素2 (Ang2)；Tie2；S1P；整聯蛋白αvβ3、αvβ5及α5β1；β細胞素；apelin/APJ；促紅血球生成素；補體因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受體(例如，VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、mbVEGFR或sVEGFR)；ST-2受體；及與AMD風險遺傳相關之蛋白(例如補體途徑組分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a及C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；IL-8；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC；COL10A1；及TNFRSF10A)。
本文所述之任何抗體(例如上述任何抗VEGF抗體)可為用於生成半胱胺酸改造之抗體之親本抗體。本文所闡述之例示性方法通常可藉助應用本文所述之設計及篩選步驟應用至抗體的鑑別及產生。
本發明之半胱胺酸改造之抗體可與巰基反應性試劑位點特異性地且有效地偶合。巰基反應性試劑可為(例如)清除率改良劑，例如聚合物(例如，HA聚合物或聚乙二醇之各種異構物)、結合至第三組分之肽或另一碳水化合物或親脂性試劑；多功能接頭試劑；捕獲劑，亦即親和力標記試劑(例如，生物素-接頭試劑)；檢測標記(例如螢光團試劑)；固相固定劑(例如SEPHAROSE™、聚苯乙烯或玻璃)；或藥物-接頭中間體。巰基反應性試劑之一個實例係N-乙基馬來醯亞胺(NEM)。在一個例示性實施例中，THIOMAB™抗體與生物素-接頭試劑之反應提供生物素化的THIOMAB™抗體，藉由該抗體可檢測並量測經改造半胱胺酸殘基之存在及反應性。THIOMAB™抗體與多功能接頭試劑之反應提供具有功能化接頭之THIOMAB™抗體，其可進一步與聚合物、藥物部分試劑或其他標記反應。THIOMAB™抗體與藥物-接頭中間體之反應提供THIOMAB™抗體藥物偶聯物。在某些實施例中，THIOMAB™抗體係ThioFab。
半胱胺酸改造之抗體可偶聯至巰基反應性劑，其中反應性基團係(例如)馬來醯亞胺、碘乙醯胺、吡啶基二硫鍵或其他巰基反應性偶聯搭配物(參見例如Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.；Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2；Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London；Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2；Hermanson, G. in Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, San Diego, 第40-55頁，第643-671頁)。搭配物可為細胞毒性劑(例如毒素，例如阿黴素(doxorubicin)或百日咳毒素)、螢光團(例如螢光染料(如螢光素或羅丹明(rhodamine)))、用於成像或放射治療性金屬之螯合劑、肽基或非肽基標記或檢測標籤或清除率改良劑例(例如聚合物(例如HA聚合物或聚乙二醇之各種異構物)、結合至第三組分之肽或另一碳水化合物或親脂性劑)。
PHESELECTOR (用於選擇反應性巰基之噬菌體ELISA)分析容許以ELISA噬菌體格式檢測抗體中之反應性半胱胺酸基團。參見美國專利第7,521,541號及美國專利公開案第20110301334號，其係以全文引用方式併入本文。特定而言，PHESESLECTOR分析包括以下過程：將目标的蛋白質(例如抗體)塗佈於孔表面上，隨後與噬菌體粒子一起培育，且接下來用辣根過氧化物酶(HRP)標記之二級抗體進行吸光度檢測。顯示於噬菌體上之突變蛋白可以快速、穩健且高通量之方式進行篩選。可產生半胱胺酸改造之抗體庫，並使用相同方法進行結合選擇以自抗體或其他蛋白質之隨機蛋白質-噬菌體庫鑑別游離半胱胺酸納入之適當反應性位點。此技術包括使顯示於噬菌體上之半胱胺酸突變蛋白與亦具有巰基反應性之親和試劑或報告基團反應。
在某些實施例中，PHESELECTOR分析包括以下步驟：(1)將牛血清白蛋白(BSA)、靶蛋白(例如VEGF)之一部分或全部及鏈黴親和素(streptavidin)(100 μl 2 μg/ml)分開塗佈於MAXISORB® 96孔板上；(2)在用0.5% TWEEN®-20(於PBS中)阻斷後，將生物素化及非生物素化的THIOMAB™抗體-噬菌體(2×1010 個噬菌體粒子)在室溫下培育1小時；(3)與噬菌體一起培育，隨後與HRP標記之二級抗體(抗M13噬菌活體外殼蛋白、pVIII蛋白抗體)一起培育；(4)實施標準HRP反應並在450 nm下量測吸光度；(5)藉由計算鏈黴親和素之OD450 /靶蛋白(例如，VEGF)之OD450 之間之比率量測巰基反應性，使得巰基反應性值1指示半胱胺酸巰基之完整生物素化。
編碼半胱胺酸改造之抗體之DNA易於使用習用程序(例如，藉由使用能夠特異性結合至編碼鼠類抗體之重鏈及輕鏈之基因之寡核苷酸探針)來分離及測序。雜交瘤細胞用作該DNA之來源。一旦分離，可將DNA置於表現載體中，接下來將其轉染至不另外產生抗體蛋白之宿主細胞(例如大腸桿菌細胞、猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、HEK293T細胞或其他哺乳動物宿主細胞(例如骨髓瘤細胞)(美國專利第5,807,715號；US 2005/0048572；US 2004/0229310))，以在重組宿主細胞中獲得單株抗體之合成。在大多數情況下，半胱胺酸改造之抗體之產量與野生型抗體類似。
在設計及選擇之後，可藉由以下方式產生半胱胺酸改造之抗體，例如具有高度反應性之未配對Cys殘基之THIOMAB™抗體：(i)在細菌(例如大腸桿菌)系統或哺乳動物細胞培養系統(WO 01/00245)(例如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或HEK293細胞(例如HEK293T細胞))中表現；及(ii)使用常用蛋白質純化技術(例如Lowman等人(1991) J. Biol. Chem. 266(17):10982-10988)進行純化。在特定實施例中，THIOMAB™抗體在哺乳動物細胞表現系統中表現。在特定實施例中，哺乳動物細胞表現系統係HEK293T細胞。
重鏈及輕鏈之經改造Cys殘基之結構位置可根據序列編號系統進行編號。此序列編號系統與圖13A及圖13B中之4D5抗體之Kabat編號系統(Kabat等人，(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.)相關。使用Kabat編號系統，實際線性胺基酸序列可能含有較少或其他胺基酸序列，此對應於可變結構域之FR或CDR之縮短或插入。半胱胺酸改造之重鏈變體位點及輕鏈變體位點係藉由圖13A及圖13B中之序列編號及Kabat編號來鑑別。
巰基反應性亦可推廣至抗體之某些結構域，例如輕鏈恆定結構域(CL)及重鏈恆定結構域CH1、CH2及CH3。可在完整抗體(分別IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，包括IgG亞類：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA及IgA2)之重鏈恆定結構域α、δ、ε、γ及μ中作出導致約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9及0.95及更高巰基反應性值之半胱胺酸置換。
半胱胺酸改造之抗體可如(例如)美國專利第7,521,541號或國際專利公開案第WO 2006/034488號中所闡述來生成，該等案件係以全文引用方式併入本文。在一些實施例中，半胱胺酸改造之抗體變體係闡述於美國專利第7,521,541號或國際專利公開案第WO 2006/034488號中之半胱胺酸改造之抗體變體。在一些情況下，半胱胺酸改造之抗體變體係闡述於國際專利申請公開案第WO 2011/156328號或美國專利第9,000,130號中之半胱胺酸改造之抗體變體，該等案件係以全文引用方式併入本文。在一些實施例中，半胱胺酸改造之抗體變體係闡述於國際專利申請公開案第WO 2016/040856號(例如WO 2016/040856之表1-4)中之半胱胺酸改造之抗體變體，該案係以全文引用方式併入本文。
例如，在某些實施例中，半胱胺酸突變選自由HC-I195C、HC-S420C、HC-Y432C及LC-G64C (根據Kabat編號)組成之群。在某些實施例中，半胱胺酸突變選自由HC-Y432C及LC-G64C (根據Kabat編號)組成之群。在某些實施例中，半胱胺酸突變係重鏈突變並且選自由Y33C、G162C、V184C、I195C、S420C、Y432C及Q434C (根據Kabat編號)組成之群。在某些實施例中，半胱胺酸突變係重鏈突變並且選自由R19C、E46C、T57C、Y59C、A60C、M100cC、W103C、G162C、I195C、V258C、S420C、H425C及N430C (根據Kabat編號)組成之群。在某些實施例中，半胱胺酸突變係重鏈突變並且選自由Y33C、G162C、V184C及I195C (根據Kabat編號)組成之群。在某些實施例中，半胱胺酸突變係重鏈突變並且選自由R19C、E46C、Y59C、A60C、M100cC、W103C、V258C、H425C及N430C (根據Kabat編號)組成之群。
在某些實施例中，半胱胺酸突變係輕鏈突變並且選自由Y55C、G64C、T85C、T180C及N430C (根據Kabat編號)組成之群。在某些實施例中，半胱胺酸突變係輕鏈突變並且選自由T31C、S52C、G64C、R66C、A193C及N430C (根據Kabat編號)組成之群。在某些實施例中，半胱胺酸突變係輕鏈突變並且選自由G64C、T85C、T180C及N430C (根據Kabat編號)組成之群。在某些實施例中，半胱胺酸突變係輕鏈突變並且選自由S52C、G64C、R66C、A193C及N430C (根據Kabat編號)組成之群。在特定實施例中，輕鏈中之半胱胺酸突變選自包含LC-I106C、LC-R108C、LC-R142C及LC-K149C (根據Kabat編號)之半胱胺酸突變之群(參見圖13A；表2)。在具體實施例中，輕鏈中之半胱胺酸突變係LC-K149C (根據Kabat編號) (參見圖13A)。在具體實施例中，輕鏈中之半胱胺酸突變係LC-V205C (根據Kabat編號)。表 2 ： 例示性輕鏈半胱胺酸突變
在具體實施例中，重鏈中之半胱胺酸突變選自由以下各項組成之群：HC-T114C、HC-A140C、HC-L174C、HC-L179C、HC-T187C、HC-T209C、HC-V262C、HC-G371C、HC-Y373C、HC-E382C、HC-S424C、HC-N434C及HC-Q438C (根據EU編號) (參見圖13B；表3)。在具體實施例中，重鏈中之半胱胺酸突變係根據Kabat編號之HC-A143C (亦即，根據EU編號之HC-A140C) (參見圖13B；表3)。在具體實施例中，重鏈中之半胱胺酸突變係根據EU編號之HC-A174C (參見圖13B；表3)。在具體實施例中，重鏈中之半胱胺酸突變係根據EU編號之HC-A118C (亦即根據Kabat編號之HC-A114C)。
在具體實施例中，如本文所述之任何半胱胺酸改造之抗體具有以下半胱胺酸突變中之一者：根據Kabat編號之LC-K149C及根據EU編號之HC-A140C (參見表2及表3及圖13A及圖13B)。表 3 ： 例示性重鏈半胱胺酸突變
在某些實施例中，以下殘基中之任一或多者可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205 (Kabat編號)；重鏈之A118 (EU編號)；及重鏈Fc區之S400(EU編號)。
在某些實施例中，半胱胺酸改造之抗體可包括一或多種選自由以下各項組成之群之重鏈半胱胺酸突變：V2C、L4C、V5C、L11C、R19C、F27C、I29C、T32C、Y33C、Q39C、A40C、K43C、L45C、E46C、T53C、G55C、T57C、R58C、Y59C、A60C、T68C、N76C、Y79C、Q81C、W95C、G96C、D101C、W103C、T116C、K117C、T135C、N155C、A158C、G162C、G174C、L175C、T183C、V184C、I195C、N199C、S203C、F239C、M248C、E254C、V258C、N272C、V278C、L305C、T331C、S333C、R340C、Q343C、K356C、E384C、S399C、K410C、Q414C、G416C、N417C、Y432C、T433C、K435C、S438C、L439C、M100cC及N82aC (根據Kabat編號)。亦參見國際專利申請案第WO 2016/040856號之表3。
在某些實施例中，半胱胺酸改造之抗體可包括一或多種選自由以下各項組成之群之輕鏈半胱胺酸突變：S12C、S14C、G16C、R18C、T22C、R24C、Q27C、T31C、A32C、Q38C、K39C、G41C、K42C、P44C、Y49C、S50C、S52C、F53C、L54C、Y55C、S63C、G64C、R66C、D70C、T72C、T74C、S76C、Q79C、T85C、H91C、Y92C、P95C、T97C、F98C、K103C、E105C、K107C、P119C、K126C、T129C、S131C、Q147C、W148C、A153C、Q155C、S156C、S159C、Q160C、S162C、Q166C、T172C、T180C、V191C、A193C、E195C、V205C、T206C及N210C (根據Kabat編號)。亦參見國際專利申請案第WO 2016/040856號之表4。
在某些實施例中，半胱胺酸改造之抗體可包括一或多種選自由以下各項組成之群之半胱胺酸突變：HC-I195C、HC-S420C、HC-Y432C及LC-G64C (根據Kabat編號)。亦參見國際專利申請案第WO 2016/040856號之表5。
在某些實施例中，半胱胺酸改造之抗體包括選自由以下各項組成之群之輕鏈半胱胺酸突變：LC-T22C、LC-K39C、LC-Y49C、LC-Y55C、LC-T85C、LC-T97C、LC-I106C、LC-R108C、LC-R142C、LC-K149C及LC-V205C (根據Kabat編號)。
半胱胺酸改造之抗體可包括任何適宜數量之改造之半胱胺酸殘基，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個或更多個改造之半胱胺酸殘基。在一些實施例中，半胱胺酸改造之抗體可包括1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9或1-10個改造之半胱胺酸殘基。在一些實施例中，半胱胺酸改造之抗體可包括1個改造之半胱胺酸殘基。在一些實施例中，半胱胺酸改造之抗體可包括2個改造之半胱胺酸殘基。在一些實施例中，半胱胺酸改造之抗體可包括3個改造之半胱胺酸殘基。
在任何前述實施例中，半胱胺酸改造之抗體可在與上述任何半胱胺酸突變等效之位置包括改造之半胱胺酸。例如，若抗體在位置118處包括天然絲胺酸(EU編號)，則絲胺酸可突變為半胱胺酸以形成S118C突變。
例如，本發明提供半胱胺酸改造之抗VEGF抗體，其在選自由HC-A118C、HC-A140C及HC-L174C (EU編號)組成之群之重鏈中包含半胱胺酸突變，或者在選自由LC-V205C及LC-K149C (Kabat編號)組成之群之輕鏈中包含半胱胺酸突變，其中抗VEGF抗體係本文所述之任一抗VEGF抗體，例如闡述於表8-10中之任一抗VEGF抗體。在一些實施例中，抗VEGF抗體係N94A.F83A.N82aR.Y58R (G6.31 AARR)。在一些實施例中，抗VEGF抗體係G6.31 WT。在一些實施例中，抗VEGF抗體係LC-N94A。在一些實施例中，抗VEGF抗體係LC-N94A.LC-F83A。在一些實施例中，抗VEGF抗體係LC-N94A.LC-F83A。在一些實施例中，抗VEGF抗體係HC-A40E.HC-T57E (G6.31 AAEE)。在一些實施例中，抗VEGF抗體係HCcombo。在一些實施例中，抗VEGF抗體係HCLC2。在一些實施例中，抗VEGF抗體係HCLC4。在一些實施例中，抗VEGF抗體係HCLC5。在一些實施例中，抗VEGF抗體係HCLC3。在一些實施例中，抗VEGF抗體係HCLC1。在一些實施例中，抗VEGF抗體係R19HCcombo。在一些實施例中，抗VEGF抗體係R19HCLC2。在一些實施例中，抗VEGF抗體係R19HCLC4。在一些實施例中，抗VEGF抗體係R19HCLC5。
在具體實例中，本發明提供半胱胺酸改造之抗VEGF抗體，其在選自由HC-A118C、HC-A140C及HC-L174C (EU編號)組成之群之重鏈中包含半胱胺酸突變或在選自由LC-V205C及LC-K149C (Kabat編號)組成之群之輕鏈中包含半胱胺酸突變，其中該抗體包含以下六種HVR：(a)HVR-H1，其包含DYWIH (SEQ ID NO: 1)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYTRYADSVKG (SEQ ID NO: 7)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS (SEQ ID NO: 9)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10)之胺基酸序列。在一些情況下，半胱胺酸改造之抗VEGF抗體包括以下四種重鏈可變結構域FR：(a)FR-H1，其包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS (SEQ ID NO: 13)之胺基酸序列；(b)FR-H2，其包含WVRQAPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 14)之胺基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 15)之胺基酸序列；及(d)FR-H4，其包含WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 16)之胺基酸序列。在其他情況下，半胱胺酸改造之抗VEGF抗體包括以下四種輕鏈可變結構域FR：(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17)之胺基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18)之胺基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19)之胺基酸序列；及(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20)之胺基酸序列。在一些情況下，半胱胺酸改造之抗VEGF抗體包括(a)包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列之VH結構域及(b)包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列之VL結構域。在一些情況下，親本抗體係G6.31 AARR。在一些實施例中，半胱胺酸突變係HC-A118C。在其他實施例中，半胱胺酸突變係HC-A140C。在其他實施例中，半胱胺酸突變係HC-L174C (EU編號)。在其他實施例中，半胱胺酸突變係LC-V205C (Kabat編號)。在其他實施例中，半胱胺酸突變係LC-K149C (Kabat編號)。
在一些情況下，本發明提供包含(a)包含SEQ ID NO: 90之胺基酸序列之重鏈及/或(b)包含SEQ ID NO: 89之胺基酸序列之輕鏈的抗體。
在一些情況下，本發明提供包含(a)包含SEQ ID NO: 92之胺基酸序列之重鏈及/或(b)包含SEQ ID NO: 91之胺基酸序列之輕鏈的抗體。
在一些情況下，本發明提供包含(a)包含SEQ ID NO: 94之胺基酸序列之重鏈及/或(b)包含SEQ ID NO: 93之胺基酸序列之輕鏈的抗體。e) 抗體衍生物
在某些實施例中，可對本文所提供之抗體進行進一步修飾以含有業內已知且容易獲得之其他非蛋白質部分。適於衍生抗體之部分包括(但不限於)水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇之共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由於其在水中之穩定性可能具有製造優勢。聚合物可具有任何分子量，並且可具支鏈或無支鏈。附接至抗體之聚合物之數量可變化，並且若附接一種以上聚合物，則其可為相同或不同的分子。通常，用於衍生之聚合物之數量及/或類型可基於以下考慮來確定，所述考慮包括(但不限於)欲改良抗體之具體性質或功能、抗體衍生物在所定義條件下是否將用於療法中及諸如此類。本文在(例如)下文部分G及實例1及2中闡述其他抗體偶聯物。
在另一實施例中，提供可藉由暴露於輻射而選擇性加熱之抗體與非蛋白質部分之偶聯物。在一個實施例中，非蛋白質部分係碳奈米管(Kam等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005))。輻射可具有任何波長，並且包括(但不限於)不傷害普通細胞但能將非蛋白質部分加熱至鄰近抗體-非蛋白質部分之細胞被殺死之溫度之波長。f) 等電點變體
本發明提供等電點改變之抗體變體。例如，與抗VEGF抗體(例如G6.31)相比，本發明提供(例如)等電點(pI)降低之抗體變體。在某些情況下，表面電荷在生理pH下減少。在一些情況下，抗VEGF抗體具有等於或低於約8 (例如，約8、約7、約6、約5或約4)之pI。在一些情況下，抗體具有約4至約8 (例如，約4、約5、約6、約7或約8)之pI。在一些情況下，抗VEGF抗體具有約5至約7 (例如，約5、約6或約7)之pI。在一些情況下，抗VEGF抗體具有約5至約6 (例如，約5.1、約5.2、約5.3、約5.4、約5.5、約5.6、約5.7、約5.8、約5.9或約6)之pI。
例如，可藉由用具有較低pI之胺基酸取代給定位置處之野生型胺基酸殘基將本發明之抗體改造為具有降低之pI。可基於業內已知之胺(-NH2 )、羧酸(-COOH)及胺基酸側鏈之pKa值來確定胺基酸之pI。在一些實施例中，表面暴露之胺基酸殘基可經取代以降低抗體之pI。在一個實施例中，表面暴露之胺基酸殘基可經麩胺酸(E)取代。在一個實施例中，表面暴露之胺基酸殘基可經天冬胺酸(D)取代。B. 重組方法及組合物
本文所述之任何抗體(例如，抗VEGF抗體，包括半胱胺酸改造之抗VEGF抗體)可使用(例如)如美國專利第4,816,567號中所述之重組方法及組合物來產生。在一個實施例中，提供編碼本文所述之抗VEGF抗體之經分離核酸。此一核酸可編碼包含VL之胺基酸序列及/或包含抗體之VH之胺基酸序列(例如抗體之輕鏈及/或重鏈)。在另一實施例中，提供一或多種包含此一核酸之載體(例如表現載體)。在另一實施例中，提供包含此一核酸之宿主細胞。在一個該實施例中，宿主細胞包含以下各項(例如已經其轉變)：(1)包含編碼包含抗體VL之胺基酸序列及包含抗體VH之胺基酸序列之核酸的載體，或(2)包含編碼包含抗的VL之胺基酸序列之核酸的第一載體及包含編碼包含抗體VH之胺基酸序列之核酸的第二載體。在一個實施例中，宿主細胞係真核生物，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴樣細胞(例如Y0、NS0、Sp20細胞)。在一個實施例中，提供製備抗VEGF抗體之方法，其中該方法包括在適於表現抗體之條件下培養包含編碼抗體之核酸之宿主細胞，且視情況自宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收抗體。
為重組產生抗體(例如抗VEGF抗體，包括半胱胺酸改造之抗VEGF抗體)，分離編碼例如如上所述之抗體之核酸並將其插入一或多個載體中用於在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。該核酸可使用習用程序(例如，藉由使用能夠特異性結合至編碼抗體重鏈及輕鏈之基因之寡核苷酸探針)容易地分離並測序。
用於選殖或表現編碼抗體之載體之適宜宿主細胞包括本文所述之原核或真核細胞。例如，可在細菌中產生抗體，特別是當不需要醣基化及Fc效應功能時。為在細菌中表現抗體片段及多肽，參見例如美國專利第5,648,237號、第5,789,199號及第5,840,523號。亦參見Charlton，Methods in Molecular Biology ，第 248 卷 (B.K.C. Lo編輯，Humana Press, Totowa, NJ, 2003)，第245-254頁，其闡述抗體片段在大腸桿菌中之表現。在表現後，可自細菌細胞糊在可溶性部分中分離抗體且可進行進一步純化。
除原核生物外，真核微生物(例如絲狀真菌或酵母)係用於編碼抗體之載體之適宜選殖或表現宿主，包括其醣基化途徑已「人類化」從而導致產生具有部分或完全人類醣基化型式之真菌及酵母菌株。參見Gerngross，Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)及Li等人，Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)。
用於表現醣基化抗體之適宜宿主細胞亦源自多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已經鑑別出許多可與昆蟲細胞結合使用之桿狀病毒株，特別是用於轉染草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda )細胞之桿狀病毒株。
植物細胞培養物亦可用作宿主。參見例如美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429號(闡述用於在轉基因植物中產生抗體之PLANTIBODIES™技術)。
脊椎動物細胞亦可用作宿主。例如，適於懸浮生長之哺乳動物細胞系可能係有用的。有用哺乳動物宿主細胞系之其他實例係由SV40(COS-7)轉變之猴腎CV1系；人類胚胎腎系(如例如Graham等人，J. Gen Virol. 36:59 (1977)中所述之293或293細胞；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠塞爾托利細胞(TM4細胞，例如如Mather，Biol. Reprod. 23 :243-251 (1980)中所述)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK；布法羅大鼠(buffalo rat)肝細胞(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562)；TRI細胞，如例如Mather等人， Annals N.Y. Acad. Sci . 383:44-68 (1982)所闡述；MRC5細胞；及FS4細胞。其他有用的哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR- CHO細胞(Urlaub等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))；及骨髓瘤細胞系，例如Y0、NS0及Sp2/0。關於適於抗體產生之某些哺乳動物宿主細胞系之綜述，參見例如Yazaki及Wu，Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo編輯，Humana Press, Totowa, NJ), 第255-268頁(2003)。C. 分析
抗體(例如本文所述之抗VEGF抗體，包括半胱胺酸改造之抗VEGF抗體)以及抗體偶聯物(例如，包括抗VEGF抗體之抗體偶聯物(例如本文所提供之任何抗VEGF抗體))可藉由業內已知之各種分析針對其物理/化學性質及/或生物活性來鑑別、篩選或表徵。1. 結合分析及其他分析
在一個態樣中，例如藉由諸如ELISA、西方墨點(Western blot)等已知方法來測試抗體(例如抗VEGF抗體，包括半胱胺酸改造之抗VEGF抗體)或其抗體偶聯物之抗原結合活性。
在另一態樣中，可使用競爭分析來鑑別與如本文所述之抗體或其抗體偶聯物競爭結合至抗原(例如VEGF)之抗體。在某些實施例中，此一競爭性抗體結合至由如本文所述抗體結合之相同表位(例如，線性或構象表位)。用於映射抗體所結合表位之詳細例示性方法係提供於Morris (1996) 「Epitope Mapping Protocols」,Methods in Molecular Biology 第66卷(Humana Press, Totowa, NJ)中。
在例示性競爭分析中，在包含結合至VEGF之第一標記抗體及測試其與第一抗體競爭結合至VEGF之能力之第二未標記抗體的溶液中培育經固定VEGF。第二抗體可存在於雜交瘤上清液中。作為對照，在包含第一標記抗體但不包含第二未標記抗體之溶液中培育經固定VEGF。在允許第一抗體結合至VEGF之條件下培育之後，去除過量未結合之抗體，且量測與經固定VEGF締合之標記之量。若測試試樣中與經固定VEGF締合之標記之量相對於對照試樣顯著降低，則此指示第二抗體與第一抗體競爭結合至VEGF。可對其他抗原實施類似的分析。參見Harlow及Lane(1988)Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)。2. 活性分析
在一個態樣中，提供用於鑑別具有生物活性之抗體(例如，抗VEGF抗體，包括半胱胺酸改造之抗VEGF抗體)或其抗體偶聯物之分析。生物活性可包括(例如)活體內、活體外或離體結合至抗原(例如VEGF (例如血流中之VEGF))或其肽片段。在某些實施例中，生物活性可包括阻斷或中和抗原。例如，在某些實施例中，生物活性可包括阻斷或中和VEGF，或阻止VEGF結合至配體，例如諸如KDR或Flt-1等受體。亦提供在活體內及/或活體外具有該生物活性之抗體或其抗體偶聯物。在某些實施例中，測試本發明之抗體或其抗體偶聯物之該生物活性。3. 穩定性分析
在一個態樣中，提供用於測定抗體(例如抗VEGF抗體，包括半胱胺酸改造之抗VEGF抗體)或其抗體偶聯物之穩定性(例如，熱穩定性)之分析。例如，可使用業內已知之任何方法(例如差示掃描螢光測定法(DSF)、圓二色性(CD)、蛋白質內源螢光、差示掃描量熱法、光譜術、光散射(例如，動態光散射(DLS)及靜態光散射(SLS))、自相互作用層析(SIC))來測定抗體或其抗體偶聯物之穩定性。抗體或其抗體偶聯物之穩定性可如本文所述使用(例如) DSF來測定，如在(例如)國際專利申請案第PCT/US2016/053454號之實例1及2中所述。在一些情況下，抗體偶聯物之穩定性可藉由粒徑篩析層析結合折射指數及多角度光散射檢測器(SEC-RI-MALS)來測定，例如如實施例1中所述。D. 醫藥調配物
本文所提供之抗體(例如，抗VEGF抗體，包括半胱胺酸改造之抗VEGF抗體)或其抗體偶聯物之醫藥調配物係藉由將具有期望純度之該抗體或抗體偶聯物與一或多種可選的醫藥學上可接受之載劑混合(Remington's Pharmaceutical Sciences 第16版，Osol，A.編輯(1980))以凍乾調配物或水溶液之形式來製備。醫藥學上可接受之載劑在所採用之劑量及濃度下通常對接受者無毒，並且包括(但不限於)：緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六甲雙銨；苯紮氯銨；苄索氯銨；苯酚、丁基或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，例如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質複合物)；及/或非離子表面活性劑，例如聚乙二醇(PEG)。本文之例示性的醫藥學上可接受之載劑進一步包括間質藥物分散劑，例如可溶性中性活性玻尿酸酶醣蛋白(sHASEGP)，例如人類可溶性PH-20玻尿酸酶醣蛋白，例如rHuPH20(HYLENEX®，Baxter International, Inc.)。某些例示性sHASEGP (包括rHuPH20)及使用方法闡述於美國專利公開案第2005/0260186號及第2006/0104968號中。在一個態樣中，sHASEGP與一或多種其他醣胺聚糖酶(例如軟骨素酶)組合。
例示性的凍乾抗體調配物闡述於美國專利第6,267,958號中。水性抗體調配物包括闡述於美國專利第6,171,586號及第WO2006/044908號中之彼等，後者調配物包括組胺酸乙酸鹽緩衝液。
根據所治療之具體適應症之需要，本文之調配物亦可含有一種以上活性化合物，較佳不會相互不利地影響之具有互補活性之彼等。例如，可能期望進一步提供免疫抑制劑。該等分子適合以對於預期目的有效之量組合存在。
活性成分可包埋在(例如)藉由凝聚技術或藉由界面聚合製備之微膠囊中，該等微膠囊分別例如羥甲基纖維素或明膠-微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊；在膠體藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中；或在巨乳液中。該等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences 第16版，Osol, A.編輯(1980)中。
欲用於活體內投與之調配物通常係無菌的。例如，可藉由無菌濾膜過濾容易地完成無菌操作。
在某些實施例中，醫藥調配物包括一或多種其他化合物。在某些實施例中，該其他化合物結合至選自由以下各項組成之群之第二生物分子：IL-1β；IL-6；IL-6R；IL-13；IL-13R；PDGF；血管生成素；血管生成素2；Tie2；S1P；整聯蛋白αvβ3、αvβ5及α5β1；β細胞素；apelin/APJ；促紅血球生成素；補體因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受體；ST-2受體；及與年齡相關性黃斑變性(AMD)風險遺傳相關之蛋白質，例如補體途徑組分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a及C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；IL-8；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC；COL10A1；及TNFRSF10A。在某些實施例中，該其他化合物係抗體或其抗原結合片段。
例如，在一些情況下，該其他化合物係雙特異性抗體(例如，抗VEGF/抗Ang2雙特異性抗體，例如RG-7716或揭示於WO 2010/069532或WO 2016/073157中之任何雙特異性抗VEGF/抗Ang2雙特異性抗體)。
在另一實例中，在一些情況下，該其他化合物係抗IL-6抗體，例如EBI-031 (Eleven Biotherapeutics；參見例如WO 2016/073890)、司妥昔單抗(SYLVANT®)、奧洛珠單抗、克拉珠單抗、西盧卡單抗、艾西莫單抗、格利珠單抗、OPR-003、MEDI-5117、PF-04236921或其變體。
在又一實例中，在一些情況下，該其他化合物係抗IL-6R抗體，例如托珠單抗(ACTEMRA®) (參見例如WO 1992/019579)、沙魯單抗、沃巴利珠單抗(ALX-0061)、SA-237或其變體。E. 治療方法及組合物
本文所提供之任何抗體(例如抗VEGF抗體，包括半胱胺酸改造之抗VEGF抗體)或其抗體偶聯物(例如單分散HA偶聯物)可用於治療方法中。
在一個態樣中，提供用作藥物之抗VEGF抗體(例如，改造之半胱胺酸抗VEGF抗體)。在另一態樣中，提供用作藥物之抗體偶聯物(例如，單分散HA偶聯物)。在其他態樣，本發明提供用於治療與病理性血管生成相關之病症之抗VEGF抗體(例如，改造之半胱胺酸抗VEGF抗體)。在另一態樣中，本發明提供用於治療與病理性血管生成相關之病症之抗體偶聯物(例如單分散HA偶聯物)。在一些實施例中，與病理性血管生成相關之病症係眼部病症。在一些情況下，眼部病症係AMD (例如，濕性AMD、乾性AMD、中度AMD、晚期AMD或地圖狀萎縮(GA))、黃斑變性、黃斑水腫、DME (例如局灶性、非中心性DME或瀰漫性、中心參與性DME)、視網膜病變、糖尿病性視網膜病變(DR) (例如增殖性DR (PDR)、非增殖性DR (NPDR)或高海拔DR)、其他缺血相關性視網膜病變、ROP、視網膜靜脈阻塞(RVO) (例如中央型(CRVO)及分支型(BRVO))、CNV (例如近視CNV)、角膜新血管形成、與角膜新血管形成相關之疾病、視網膜新血管形成、與視網膜/脈絡膜新血管形成相關之疾病、病理性近視、馮希柏-林島氏病、眼睛組織胞漿菌病、FEVR、柯滋氏病、諾里氏病、OPPG、結膜下出血、皮膚發紅、眼部新生血管性疾病、新生血管性青光眼、 色素性視網膜炎(RP)、高血壓性視網膜病變、視網膜血管瘤性增殖、黃斑毛細血管擴張症、虹膜新血管形成、眼內新血管形成、視網膜變性、囊樣黃斑水腫(CME)、血管炎、視神經乳頭水腫、視網膜炎、結膜炎(例如感染性結膜炎及非感染性(例如過敏性)結膜炎)、萊伯先天性黑朦、眼色素層炎(包括感染性及非感染性眼色素層炎)、脈絡膜炎(例如多灶性脈絡膜炎)、眼部組織胞漿菌病、瞼炎、乾眼病、創傷性眼睛損傷或薛格連氏病。
在另一態樣中，提供用於治療方法中之抗VEGF抗體(例如，改造之半胱胺酸抗VEGF抗體)。在另一態樣中，提供用於治療方法中之抗體偶聯物(例如單分散HA偶聯物)。在某些情況下，本發明提供用於治療患有與病理性血管生成相關之病症之個體之方法中的抗VEGF抗體(例如，改造之半胱胺酸抗VEGF抗體)，該方法包括向個體投與有效量之抗VEGF抗體。本發明亦提供用於治療患有與病理性血管生成相關之病症之個體之方法中的抗體偶聯物(例如單分散HA偶聯物)，該方法包括向個體投與有效量之抗體偶聯物。在一些情況下，與病理性血管生成相關之病症係眼部病症。在一些情況下，眼部病症係AMD (例如，濕性AMD、乾性AMD、中度AMD、晚期AMD或地圖狀萎縮(GA))、黃斑變性、黃斑水腫、DME (例如局灶性、非中心性DME或瀰漫性、中心參與性DME)、視網膜病變、糖尿病性視網膜病變(DR) (例如增殖性DR (PDR)、非增殖性DR (NPDR)或高海拔DR)、其他缺血相關性視網膜病變、ROP、視網膜靜脈阻塞(RVO) (例如中央型(CRVO)及分支型(BRVO))、CNV (例如近視CNV)、角膜新血管形成、與角膜新血管形成相關之疾病、視網膜新血管形成、與視網膜/脈絡膜新血管形成相關之疾病、病理性近視、馮希柏-林島氏病、眼睛組織胞漿菌病、FEVR、柯滋氏病、諾里氏病、OPPG、結膜下出血、皮膚發紅、眼部新生血管性疾病、新生血管性青光眼、 色素性視網膜炎(RP)、高血壓性視網膜病變、視網膜血管瘤性增殖、黃斑毛細血管擴張症、虹膜新血管形成、眼內新血管形成、視網膜變性、囊樣黃斑水腫(CME)、血管炎、視神經乳頭水腫、視網膜炎、結膜炎(例如，感染性結膜炎及非感染性(例如，過敏性)結膜炎、萊伯先天性黑朦、眼色素層炎(包括感染性及非感染性眼色素層炎)、脈絡膜炎(例如多灶性脈絡膜炎)、眼部組織胞漿菌病、瞼炎、乾眼病、創傷性眼睛損傷或薛格連氏病。
在一些情況下，本發明提供用於減少或抑制個體血管生成之抗VEGF抗體(例如，改造之半胱胺酸抗VEGF抗體)。在另一態樣中，提供用於減少或抑制個體之血管生成之抗體偶聯物(例如單分散HA偶聯物)。在某些實施例中，本發明提供用於減少或抑制個體之血管生成之方法中的抗VEGF抗體(例如，改造之半胱胺酸抗VEGF抗體)，該方法包括向個體投與有效之抗VEGF抗體以減少或抑制血管生成。本發明亦提供用於減少或抑制個體之血管生成之方法中的抗體偶聯物(例如，單分散HA偶聯物)，該方法包括向個體投與有效量之抗體偶聯物。根據任何上述用途之「個體」可為人類。
本發明提供抗VEGF抗體(例如，改造之半胱胺酸抗VEGF抗體)在製造或製備藥物中之用途。本發明亦提供抗體偶聯物(例如單分散HA偶聯物)在製造或製備藥物中之用途。例如，在一種情況下，該藥物係用於治療與病理性血管生成相關之病症。在另一情況下，該藥物係用於治療與病理性血管生成相關之病症之方法，該方法包括向患有與病理性血管生成相關之病症之個體投與有效量之藥物。在一些情況下，與病理性血管生成相關之病症係眼部病症。在一些情況下，眼部病症係AMD (例如，濕性AMD、乾性AMD、中度AMD、晚期AMD或地圖狀萎縮(GA))、黃斑變性、黃斑水腫、DME (例如局灶性、非中心性DME或瀰漫性、中心參與性DME)、視網膜病變、糖尿病性視網膜病變(DR)(例如增殖性DR (PDR)、非增殖性DR (NPDR)或高海拔DR)、其他缺血相關性視網膜病變、ROP、視網膜靜脈阻塞(RVO)(例如中央型(CRVO)及分支型(BRVO))、CNV (例如近視CNV)、角膜新血管形成、與角膜新血管形成相關之疾病、視網膜新血管形成、與視網膜/脈絡膜新血管形成相關之疾病、病理性近視、馮希柏-林島氏病、眼睛組織胞漿菌病、FEVR、柯滋氏病、諾里氏病、OPPG、結膜下出血、皮膚發紅、眼部新生血管性疾病、新生血管性青光眼、 色素性視網膜炎(RP)、高血壓性視網膜病變、視網膜血管瘤性增殖、黃斑毛細血管擴張症、虹膜新血管形成、眼內新血管形成、視網膜變性、囊樣黃斑水腫(CME)、血管炎、視神經乳頭水腫、視網膜炎、結膜炎(例如，感染性結膜炎及非感染性(例如，過敏性)結膜炎、萊伯先天性黑朦、眼色素層炎(包括感染性及非感染性眼色素層炎)、脈絡膜炎(例如多灶性脈絡膜炎)、眼部組織胞漿菌病、瞼炎、乾眼病、創傷性眼睛損傷或薛格連氏病。在另一情況下，該藥物用於減少或抑制個體之血管生成。在另一情況下，該藥物係用於減少或抑制個體之血管生成之方法，該方法包括向個體投與有效量之藥物以減少或抑制血管生成。在藥物之任何前述用途中，該方法可包括向個體投與有效量之至少一種其他治療劑，例如如下文所述。
本發明提供治療與病理性血管生成相關之病症之方法。在一個實施例中，該方法包括向患有與病理性血管生成相關之病症之個體投與有效量之抗VEGF抗體(例如，改造之半胱胺酸抗VEGF抗體)。在另一實例中，該方法包括向患有與病理性血管生成相關之病症之個體投與有效量之抗體偶聯物(例如，單分散HA偶聯物)。在一些情況下，與病理性血管生成相關之病症係眼部病症。在一些情況下，眼部病症係AMD (例如，濕性AMD、乾性AMD、中度AMD、晚期AMD或地圖狀萎縮(GA))、黃斑變性、黃斑水腫、DME (例如局灶性、非中心性DME或瀰漫性、中心參與性DME)、視網膜病變、糖尿病性視網膜病變(DR) (例如增殖性DR (PDR)、非增殖性DR (NPDR)或高海拔DR)、其他缺血相關性視網膜病變、ROP、視網膜靜脈阻塞(RVO)(例如中央型(CRVO)及分支型(BRVO))、CNV (例如近視CNV)、角膜新血管形成、與角膜新血管形成相關之疾病、視網膜新血管形成、與視網膜/脈絡膜新血管形成相關之疾病、病理性近視、馮希柏-林島氏病、眼睛組織胞漿菌病、FEVR、柯滋氏病、諾里氏病、OPPG、結膜下出血、皮膚發紅、眼部新生血管性疾病、新生血管性青光眼、 色素性視網膜炎(RP)、高血壓性視網膜病變、視網膜血管瘤性增殖、黃斑毛細血管擴張症、虹膜新血管形成、眼內新血管形成、視網膜變性、囊樣黃斑水腫(CME)、血管炎、視神經乳頭水腫、視網膜炎、結膜炎(例如，感染性結膜炎及非感染性(例如，過敏性)結膜炎、萊伯先天性黑朦、眼色素層炎(包括感染性及非感染性眼色素層炎)、脈絡膜炎(例如多灶性脈絡膜炎)、眼部組織胞漿菌病、瞼炎、乾眼病、創傷性眼睛損傷或薛格連氏病。在其他情況下，該方法進一步包含向個體投與有效量之至少一種其他治療劑，如下文所述。根據任何上述方法之「個體」可為人類。
預計本發明之抗體(例如半胱胺酸改造之抗VEGF抗體)或抗體偶聯物(例如單分散HA偶聯物)可用於治療哺乳動物。在一個實施例中，例如，出於獲得臨床前數據之目的，將抗體(例如，半胱胺酸改造之抗VEGF抗體)或抗體偶聯物(例如單分散HA偶聯物)投與給非人類類哺乳動物。欲治療之例示性非人類類哺乳動物包括非人類靈長類動物、狗、貓、囓齒動物(例如小鼠及大鼠)以及其中實施臨床前研究之其他哺乳動物。該等哺乳動物可為針對欲用抗體治療之疾病建立之動物模型，或者可用於研究目标抗體之毒性或藥物動力學。在該等實施例中之每一者中，可在哺乳動物中實施劑量遞增研究。例如，抗體(例如，半胱胺酸改造之抗VEGF抗體)或抗體偶聯物(例如單分散HA偶聯物)可在實體腫瘤模型中投與宿主囓齒動物。例如，可藉由玻璃體內投與(例如玻璃體內注射)或使用埠遞送裝置，將抗體或抗體偶聯物投與於宿主(例如囓齒動物，例如兔)以進行眼部藥物動力學研究。
在另一態樣中，本發明提供醫藥調配物，其包含本文所提供之任何抗體(例如，半胱胺酸改造之抗VEGF抗體)或抗體偶聯物(例如單分散HA偶聯物)，例如其用於任何上述治療方法中。在一個實施例中，醫藥調配物包含本文所提供之任何抗體(例如，半胱胺酸改造之抗VEGF抗體)或抗體偶聯物(例如單分散HA偶聯物)及醫藥學上可接受之載劑。在另一實施例中，醫藥調配物包含本文所提供之任何抗體(例如，半胱胺酸改造之抗VEGF抗體)或抗體偶聯物(例如單分散HA偶聯物)及至少一種其他治療劑，例如如下文所述。在某些實施例中，醫藥調配物包含一或多種其他化合物。在某些實施例中，該其他化合物結合至選自由以下各項組成之群之第二生物分子：IL-1β；IL-6；IL-6R；IL-13；IL-13R；PDGF；血管生成素；Ang2；Tie2；S1P；整聯蛋白αvβ3、αvβ5及α5β1；β細胞素；apelin/APJ；促紅血球生成素；補體因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受體；ST-2受體；及與年齡相關性黃斑變性(AMD)風險遺傳相關之蛋白質，例如補體途徑組分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a及C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；介白素-8 (IL-8)；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC，COL10A1；及TNFRSF10A。在某些實施例中，該其他化合物係抗體或其抗原結合片段。例如，在一些情況下，該其他化合物係雙特異性抗體，例如，抗VEGF/抗Ang2雙特異性抗體，例如RG-7716或揭示於WO 2010/069532或WO 2016/073157中之任何雙特異性抗VEGF/抗Ang2雙特異性抗體或其變體。在另一實例中，在一些情況下，該其他化合物係抗IL-6抗體，例如EBI-031 (Eleven Biotherapeutics；參見例如WO2016/073890)、司妥昔單抗(SYLVANT®)、奧洛珠單抗、克拉珠單抗、西盧卡單抗、艾西莫單抗、格利珠單抗、OPR-003、MEDI-5117、PF-04236921或其變體。在又一實例中，在一些情況下，該其他化合物係抗IL-6R抗體，例如托珠單抗(ACTEMRA®) (參見例如WO 1992/019579)、沙魯單抗、沃巴利珠單抗(ALX-0061)、SA-237或其變體。
抗體(例如半胱胺酸改造之抗VEGF抗體)或抗體偶聯物(例如單分散HA偶聯物)可單獨或與其他藥劑組合用於療法中。例如，抗體(例如半胱胺酸改造之抗VEGF抗體)或抗體偶聯物(例如單分散HA偶聯物)可與至少一種其他治療劑共投與。在某些實施例中，其他治療劑係另一抗體、抗血管生成劑、免疫抑制劑、細胞介素、細胞介素拮抗劑、皮質類固醇、抗嘔吐劑、癌症疫苗、止痛劑或其組合。
例如，在某些實施例中，任何前述方法進一步包含投與一或多種其他化合物。在某些實施例中，抗體(例如半胱胺酸改造之抗VEGF抗體)或抗體偶聯物(例如單分散HA偶聯物)係與其他化合物同時投與。在某些實施例中，抗體或抗體偶聯物係在其他化合物之前或之後投與。在某些實施例中，其他化合物結合至選自由以下各項組成之群之第二生物分子：IL-1β；IL-6；IL-6R；IL-13；IL-13R；PDGF；血管生成素；Ang2；Tie2；S1P；整聯蛋白αvβ3、αvβ5及α5β1；β細胞素；apelin/APJ；促紅血球生成素；補體因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受體；ST-2受體；及與AMD風險遺傳相關之蛋白質，例如補體途徑組分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a及C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；介白素-8 (IL-8)；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC；COL10A1；及TNFRSF10A。在某些實施例中，其他化合物係抗體或其抗原結合片段。
在根據(或應用於)上述任何實施例之某些實施例中，眼部病症係選自由以下各項組成之群之眼內新生血管疾病：增殖性視網膜病變、脈絡膜新血管形成(CNV)、年齡相關性黃斑變性(AMD)、糖尿病及其他缺血相關性視網膜病變、糖尿病性黃斑水腫、病理性近視、馮希柏-林島氏病、眼睛組織胞漿菌病、視網膜靜脈阻塞(RVO) (包括CRVO及BRVO)、角膜新血管形成、視網膜新血管形成及早產兒視網膜病變(ROP)。例如，在一些情況下，該其他化合物係雙特異性抗體，例如，抗VEGF/抗Ang2雙特異性抗體，例如RG-7716或揭示於WO 2010/069532或WO 2016/073157中之任何雙特異性抗VEGF/抗Ang2雙特異性抗體或其變體。在另一實例中，在一些情況下，該其他化合物係抗IL-6抗體，例如EBI-031 (Eleven Biotherapeutics；參見例如WO2016/073890)、司妥昔單抗(SYLVANT®)、奧洛珠單抗、克拉珠單抗、西盧卡單抗、艾西莫單抗、格利珠單抗、OPR-003、MEDI-5117、PF-04236921或其變體。在又一實例中，在一些情況下，該其他化合物係抗IL-6R抗體，例如托珠單抗(ACTEMRA®)(參見例如WO 1992/019579)、沙魯單抗、沃巴利珠單抗(ALX-0061)、SA-237或其變體。
在一些情況下，本發明之抗體(例如半胱胺酸改造之抗VEGF抗體)或抗體偶聯物(例如單分散HA偶聯物)可與至少一種其他治療劑組合投與用於治療眼部病症，例如，本文所闡述之眼部病症(例如，AMD (例如，濕性AMD)、DME、DR或RVO)。用於治療眼部病症之組合療法之例示性的其他治療劑包括(但不限於)抗血管生成劑，例如VEGF拮抗劑，包括(例如)抗VEGF抗體(例如抗VEGF Fab LUCENTIS® (雷珠單抗)))、可溶性受體融合蛋白(例如重組可溶性受體融合蛋白EYLEA® (阿柏西普，亦稱為VEGF Trap Eye；Regeneron/Aventis))、適體(例如抗VEGF聚乙二醇化適體MACUGEN® (培加他尼鈉；NeXstar Pharmaceuticals/OSI Pharmaceuticals))及VEGFR酪胺酸激酶抑制劑(例如，4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基六氫吡啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474))、4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯啶-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171)、瓦他拉尼(PTK787)、司馬沙尼(SU5416；SUGEN)及SUTENT® (舒尼替尼))；色胺醯基-tRNA合成酶(TrpRS)；角鯊胺；RETAANE® (用於貯庫懸浮液之乙酸阿奈可他(anecortave acetate)；Alcon, Inc.)；考布他汀(Combretastatin) A4前藥(CA4P)；MIFEPREX® (米非司酮-ru486(mifepristone-ru486))；眼筋膜囊下曲安奈德(triamcinolone acetonide)；玻璃體內結晶曲安奈德；基質金屬蛋白酶抑制劑(例如普啉司他(Prinomastat) (AG3340；Pfizer))；乙酸氟輕鬆(fluocinolone acetonide)(包括氟輕鬆眼內植入物；Bausch & Lomb/Control Delivery Systems)；利諾胺(linomide)；整聯蛋白β3功能之抑制劑；血管抑素，及其組合。可與本發明之抗體偶聯物組合投與之該等及其他治療劑闡述於(例如)美國專利申請案第US 2014/0017244號中，該案係以全文引用方式併入本文。
可與用於治療眼部病症(例如，AMD、DME、DR或RVO)之本發明之抗體(例如，半胱胺酸改造之抗VEGF抗體)或抗體偶聯物(例如單分散HA偶聯物)組合使用之其他治療劑的其他實例包括(但不限於)VISUDYNE® (維替泊芬(verteporfin)；通常與非熱雷射光動力療法結合使用之光活化藥物)、PKC412、蒽多韋(Endovion) (NS 3728；NeuroSearch A/S)、神經營養因子(例如神經膠細胞源性神經營養因子(GDNF)及睫狀神經營養因子(CNTF))、地爾硫卓(diltiazem)、多佐胺(dorzolamide)、PHOTOTROP®、9-順式-視黃醛、眼用藥物(例如碘化磷酸、乙膦硫膽鹼(echothiophate)或碳酸酐酶抑制劑)、新伐司他(veovastat) (AE-941；AEterna Laboratories, Inc.)、Sirna-027 (AGF-745；Sima Therapeutics, Inc.)、神經營養蛋白(包括例如NT-4/5，Genentech)、Cand5 (Acuity Pharmaceuticals)、INS-37217 (Inspire Pharmaceuticals)、整聯蛋白拮抗劑(包括來自Jerini AG及Abbott Laboratories之彼等)、EG-3306 (Ark Therapeutics Ltd.)、BDM-E (BioDiem Ltd.)、沙利度胺(thalidomide)(在使用時，例如由EntreMed, Inc.提供)、心肌營養素-1 Genentech)、2-甲氧基雌二醇(Allergan/Oculex)、DL-8234 (Toray Industries)、NTC-200(Neurotech)、四硫鉬酸鹽(University of Michigan)、LYN-002 (Lynkeus Biotech)、微藻化合物(Aquasearch/Albany, Mera Pharmaceuticals)、D-9120(Celltech Group plc)、ATX-S10(Hamamatsu Photonics)、TGF-β2 (Genzyme/Celtrix)、酪胺酸激酶抑制劑(例如來自Allergan、SUGEN或Pfizer之彼等)、NX-278-L (NeXstar Pharmaceuticals/Gilead Sciences)、Opt-24 (OPTIS France SA)、視網膜細胞神經節神經保護劑(Cogent Neurosciences)、N-硝基吡唑衍生物(Texas A&M University System)、KP-102 (Krenitsky Pharmaceuticals)、環孢菌素A(cyclosporin A)、用於光動力療法中之治療劑(例如VISUDYNE®；靶受體之PDT，Bristol-Myers Squibb, Co.；用於與PDT一起注射之卟吩普鈉(porfimer sodium)；維替泊芬，QLT Inc.；具有PDT之羅他泊芬(rostaporfin), Miravent Medical Technologies；具有PDT之他拉泊芬鈉(talaporfin sodium)，Nippon Petroleum；及莫特沙芬鑥(motexafin lutetium)，Pharmacyclics, Inc.)、反義寡核苷酸(舉例而言，包括由Novagali Pharma SA及ISIS-13650測試之產品，Isis Pharmaceuticals)及其組合。
本發明之抗體(例如半胱胺酸改造之抗VEGF抗體)或抗體偶聯物(例如單分散HA偶聯物)可與用於治療眼部病症(例如AMD、DME、DR或RVO)之療法或手術程序組合投與，包括例如雷射光凝(例如全視網膜光凝(PRP))、隱結雷射、黃斑裂孔手術、黃斑轉位手術、可植入小型望遠鏡、PHI運動血管造影術(亦稱為微型雷射療法及供養血管治療)、質子束療法、微刺激療法、視網膜脫落及玻璃體手術、鞏膜扣帶、黃斑下手術、經瞳孔熱療法、光系統I療法、使用RNA干擾(RNAi)、體外流變法(亦稱為膜差分過濾及流變療法)、微晶片植入、幹細胞療法、基因置換療法、核酶基因療法(包括缺氧反應元件之基因療法，Oxford Biomedica；Lentipak, Genetix；及PDEF基因療法，GenVec)、光受體/視網膜細胞移植(包括可移植的視網膜上皮細胞，Diacrin, Inc.；視網膜細胞移植，Cell Genesys, Inc.)、針灸及其組合。
在一些情況下，本發明之抗體(例如，半胱胺酸改造之抗VEGF抗體)或抗體偶聯物(例如單分散HA偶聯物)可與抗血管生成劑組合投與來治療眼部病症(例如，AMD、DME、DR或RVO)。任何適宜的抗血管生成劑均可與本發明之抗體(例如，半胱胺酸改造之抗VEGF抗體)或抗體偶聯物組合使用，包括(但不限於) Carmeliet等人Nature 407:249-257, 2000。在一些實施例中，抗血管生成劑係VEGF拮抗劑，包括(但不限於)抗VEGF抗體(例如，抗VEGF Fab LUCENTIS® (雷珠單抗)、RTH-258 (先前為ESBA-1008、抗VEGF單鏈抗體片段；Novartis)或雙特異性抗VEGF抗體(例如抗VEGF/抗血管生成素2雙特異性抗體，例如RG-7716；Roche))、可溶性重組受體融合蛋白(例如EYLEA® (阿柏西普))、VEGF變體、可溶性VEGFR片段、能夠阻斷VEGF (例如培加他尼)或VEGFR之適體、中和性抗VEGFR抗體、VEGFR酪胺酸激酶之小分子抑制劑、抗VEGF DARPin® (例如，阿必昔帕單抗)、抑制VEGF或VEGFR表現之小干擾RNA、VEGFR酪胺酸激酶抑制劑(例如4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基六氫吡啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474)、4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯啶-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171)、瓦他拉尼(PTK787)、司馬沙尼(SU5416；SUGEN)及SUTENT® (舒尼替尼))及其組合。在一些情況下，雙特異性抗VEGF抗體結合至第二生物分子，包括(但不限於) IL-1β；IL-6；IL-6R；PDGF(例如，PDGF-BB)；血管生成素；血管生成素2；Tie2；S1P；整聯蛋白αvβ3、αvβ5及α5β1；β細胞素；apelin/APJ；促紅血球生成素；補體因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受體(例如，VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、mbVEGFR或sVEGFR)；ST-2受體；以及與年齡相關性黃斑變性(AMD)風險遺傳相關之蛋白質，例如補體途徑組分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a及C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；IL-8；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC；COL10A1；及TNFRSF10A。例如，在一些情況下，該其他化合物係雙特異性抗體，例如，抗VEGF/抗Ang2雙特異性抗體，例如RG-7716或揭示於WO 2010/069532或WO 2016/073157中之任何雙特異性抗VEGF/抗Ang2雙特異性抗體或其變體。
可與本發明之抗體(例如，半胱胺酸改造之抗VEGF抗體)或抗體偶聯物(例如單分散HA偶聯物)組合投與用於治療眼部病症(例如，AMD、DME、DR或RVO)之其他適宜的抗血管生成劑包括皮質類固醇、抗血管生成類固醇、乙酸阿奈可他、血管抑素、內皮抑素、酪胺酸激酶抑制劑、基質金屬蛋白酶(MMP)抑制劑、胰島素樣生長因子結合蛋白3 (IGFBP3)、基質衍生因子(SDF-1)拮抗劑(例如抗SDF-1抗體)、色素上皮衍生因子(PEDF)、γ分泌酶、δ樣配體4、整聯蛋白拮抗劑、缺氧誘導因子因子(HIF)-1α拮抗劑、蛋白激酶CK2拮抗劑、抑制幹細胞(例如內皮祖細胞)歸巢至新血管形成位點之藥劑(例如抗血管內皮鈣黏蛋白(CD-144)抗體及/或抗SDF-1抗體)及其組合。
在另一實例中，在一些情況下，本發明之抗體(例如，半胱胺酸改造之抗VEGF抗體)或抗體偶聯物(例如單分散HA偶聯物)可與具有抗血管形成活性之藥劑組合用於治療眼部病症(例如AMD、DME、DR或RVO)，該藥劑係例如抗發炎藥、雷帕黴素(rapamycin)之哺乳動物靶(mTOR)抑制劑(例如雷帕黴素、AFINITOR® (依維莫司(everolimus))及TORISEL® (替西羅莫斯(temsirolimus)))、環孢菌素(cyclosporine)、腫瘤壞死因子(TNF)拮抗劑(例如，抗TNFα抗體或其抗原結合片段(例如，英夫利昔單抗(infliximab)、阿達木單抗(adalimumab)、塞妥利珠單抗(certolizumab pegol)及戈利木單抗(golimumab))或可溶性受體融合蛋白(例如依那西普(etanercept)))、非類固醇抗發炎劑(NSAID)或其組合。
在又一實例中，在一些情況下，本發明之抗體(例如半胱胺酸改造之抗VEGF抗體)或抗體偶聯物(例如單分散HA偶聯物)可與作為神經保護劑之藥劑組合投與且可潛在地減少乾性AMD至濕性AMD之進展，該藥劑係例如稱為「神經類固醇」之藥物類別，其包括諸如脫氫表雄固酮(DHEA) (商品名：PRASTERA™及FIDELIN®)、硫酸脫氫表雄固酮及硫酸孕烯醇酮等藥物。
可將任何適宜的AMD治療劑作為另一治療劑與本發明之抗體(例如半胱胺酸改造之抗VEGF抗體)或抗體偶聯物(例如單分散HA偶聯物)組合投與來治療眼部病症(例如AMD、DME、DR或RVO)，包括(但不限於)VEGF拮抗劑，例如抗VEGF抗體(例如，LUCENTIS® (雷珠單抗)、RTH-258 (以前為ESBA-1008、抗VEGF單鏈抗體片段；Novartis)或雙特異性抗VEGF抗體(例如抗VEGF/抗血管生成素2雙特異性抗體，例如RG-7716；Roche))、可溶性VEGF受體融合蛋白(例如EYLEA® (阿柏西普))、抗VEGF DARPin® (例如，阿必昔帕單抗；Molecular Partners AG/Allergan)或抗VEGF適體(例如，MACUGEN® (培加他尼鈉))；血小板源性生長因子(PDGF)拮抗劑，例如抗PDGF抗體、抗PDGFR抗體(例如REGN2176-3)、抗PDGF-BB聚乙二醇化適體(例如FOVISTA®; Ophthotech/Novartis)、可溶性PDGFR受體融合蛋白或雙重PDGF/VEGF拮抗劑(例如，小分子抑制劑(例如DE-120(Santen)或X-82 (TyrogeneX))或雙特異性抗PDGF/抗VEGF抗體))；VISUDYNE® (維替泊芬)與光動力療法組合；抗氧化劑；補體系統拮抗劑，例如補體因子C5拮抗劑(例如，小分子抑制劑(例如ARC-1905；Opthotech)或抗C5抗體(例如LFG-316；Novartis)，備解素拮抗劑(例如，抗備解素抗體，例如CLG-561；Alcon)或補體因子D拮抗劑(例如抗補體因子D抗體，例如蘭帕珠單抗(lampalizumab)；Roche))；視覺週期調節劑(例如鹽酸愛米司他(emixustat hydrochloride))；角鯊胺(例如，OHR-102；Ohr Pharmaceutical)；維生素及礦物補充劑(例如，闡述於年齡相關性眼病研究1中之彼等(AREDS1；鋅及/或抗氧化劑)及研究2中之彼等(AREDS2；鋅、抗氧化劑、葉黃素、玉米黃質及/或ω-3脂肪酸))；基於細胞之療法，例如NT-501 (Renexus)；PH-05206388 (Pfizer)、huCNS-SC細胞移植(StemCells)、CNTO-2476 (Janssen)、OpRegen (Cell Cure Neurosciences)或MA09-hRPE細胞移植(Ocata Therapeutics)；組織因子拮抗劑(例如，hI-con1；Iconic Therapeutics)；α腎上腺素受體激動劑(例如酒石酸溴莫尼定(brimonidine tartrate))；肽疫苗(例如S-646240；Shionogi)；澱粉樣蛋白β拮抗劑(例如，抗β澱粉樣蛋白單株抗體，例如GSK-933776)；S1P拮抗劑(例如，抗S1P抗體，例如iSONEPTM ；Lpath Inc)；ROBO4拮抗劑(例如，抗ROBO4抗體，例如DS-7080a；Daiichi Sankyo)；表現內皮抑素及血管抑制素之慢病毒載體(例如RetinoStat)；及其任何組合。在一些情況下，AMD治療劑(包括任何前述AMD治療劑)可共配製。例如，抗PDGFR抗體REGN2176-3可與阿柏西普(EYLEA®)共調配。在一些情況下，此一共調配可與本發明之抗體組合投與。在一些情況下，眼部病症係AMD (例如，濕性AMD)。
本發明之抗體(例如，半胱胺酸改造之抗VEGF抗體)或抗體偶聯物(例如單分散HA偶聯物)可與LUCENTIS® (雷珠單抗)組合投與用於治療眼部病症(例如AMD、DME、DR或RVO)。例如，每月可藉由玻璃體內注射以(例如)0.3 mg/眼或0.5 mg/眼投與LUCENTIS® (雷珠單抗)。在一些情況下，眼部病症係AMD (例如，濕性AMD)。
本發明之抗體(例如，半胱胺酸改造之抗VEGF抗體)或抗體偶聯物(例如單分散HA偶聯物)可與EYLEA® (阿柏西普)組合投與用於治療眼部病症(例如AMD、DME、DR或RVO)。例如，EYLEA® (阿柏西普)可(例如)每4週(Q4W)或前3個月Q4W藉由玻璃體內注射以2 mg/眼投與，隨後每兩個月一次注射進行維持。在一些情況下，眼部病症係AMD (例如，濕性AMD)。
本發明之抗體(例如半胱胺酸改造之抗VEGF抗體)或抗體偶聯物(例如單分散HA偶聯物)可與MACUGEN® (培加他尼鈉)組合投與用於治療眼部病症(例如AMD、DME、DR或RVO)。MACUGEN® (培加他尼鈉)可(例如)每6週藉由玻璃體內注射以0.3 mg/眼投與。在一些情況下，眼部病症係AMD (例如，濕性AMD)。
本發明之抗體(例如半胱胺酸改造之抗VEGF抗體)或抗體偶聯物(例如單分散HA偶聯物)可與VISUDYNE® (維替泊芬)組合與光動力療法組合投與用於治療眼部病症(例如，AMD、DME、DR或RVO)。例如，VISUDYNE®可以任何適宜劑量(例如，6 mg/m2 體表面積)藉由靜脈內輸注投與並且每三個月遞送一次(例如，輸注10分鐘以上)。在一些情況下，眼部病症係AMD (例如，濕性AMD)。
本發明之抗體(例如，半胱胺酸改造之抗VEGF抗體)或抗體偶聯物(例如單分散HA偶聯物)可與PDGF拮抗劑組合投與用於治療眼部病症(例如AMD、DME、DR或RVO)。可與本發明之抗體組合使用之例示性PDGF拮抗劑包括抗PDGF抗體、抗PDGFR抗體、小分子抑制劑(例如角鯊胺)、抗PDGF-B聚乙二醇化適體例如FOVISTA® (E10030；Ophthotech/Novartis)或雙重PDGF/VEGF拮抗劑(例如，小分子抑制劑(例如DE-120(Santen)或X-82 (TyrogeneX))或雙特異性抗PDGF/抗VEGF抗體)。例如，可將FOVISTA®作為本發明抗體之輔助療法投與。FOVISTA®可(例如)每四週(Q4W)藉由(例如)玻璃體內注射以任何適宜的劑量(例如0.1 mg/眼至2.5 mg/眼，例如0.3 mg/眼或1.5 mg/眼)投與。OHR-102 (乳酸角鯊胺眼科溶液，0.2%)可(例如)每日兩次藉由滴眼劑投與。OHR-102可與VEGF拮抗劑(例如LUCENTIS®或EYLEA®)組合投與。在一些實施例中，本發明之抗體偶聯物可與OHR-102、LUCENTIS®及/或EYLEA®組合投與。在一些情況下，眼部病症係AMD (例如，濕性AMD)。
本發明之抗體(例如，半胱胺酸改造之抗VEGF抗體)或抗體偶聯物(例如單分散HA偶聯物)可與RTH-258組合投與用於治療眼部病症(例如AMD、DME、DR或RVO)。例如，RTH-258可藉由玻璃體內注射或眼部輸注來投與。對於玻璃體內注射，RTH-258可以任何適宜劑的量(例如，3 mg/眼或6 mg/眼)投與，例如，前三個月每四週一次(Q4W)作為加載，隨後每12週(Q12W)或每8週(Q8W)注射進行維持。在一些情況下，眼部病症係AMD (例如，濕性AMD)。
本發明之抗體(例如，半胱胺酸改造之抗VEGF抗體)或抗體偶聯物(例如單分散HA偶聯物)可與阿必昔帕單抗組合用於治療眼部病症(例如AMD、DME、DR或RVO)。例如，可藉由玻璃體內注射來投與阿必昔帕單抗。可以任何適宜的劑量(例如，1 mg/眼、2 mg/眼、3 mg/眼、4 mg/眼或4.2 mg/眼)投與阿必昔帕單抗，例如前三個月每四週一次(Q4W)作為加載，隨後每12週(Q12W)或每8週(Q8W)注射進行維持。在一些情況下，眼部病症係AMD (例如，濕性AMD)。
任何適宜的DME及/或DR治療劑均可與本發明之抗體(例如，半胱胺酸改造之抗VEGF抗體)、抗體偶聯物(例如，單分散HA偶聯物)組合投與用於治療眼部病症(例如，AMD、DME、DR或RVO)，包括(但不限於) VEGF拮抗劑(例如LUCENTIS®或EYLEA®)、皮質類固醇(例如，皮質類固醇植入物(例如OZURDEX® (地塞米松(dexamethasone)玻璃體內植入物)或ILUVIEN® (乙酸氟輕鬆玻璃體內植入物))或經調配用於藉由玻璃體內注射投與之皮質類固醇(例如曲安奈德))或其組合。在一些情況下，眼部病症係DME及/或DR。
本發明之抗體(例如半胱胺酸改造之抗VEGF抗體)或抗體偶聯物(例如單分散HA偶聯物)可與LUCENTIS® (雷珠單抗)組合投與用於治療DME及/或DR (例如，NPDR或PDR)。例如，LUCENTIS® (雷珠單抗)可(例如)每4週(Q4W)藉由玻璃體內注射以0.3 mg/眼或0.5 mg/眼投與。
本發明之抗體(例如半胱胺酸改造之抗VEGF抗體)或抗體偶聯物(例如單分散HA偶聯物)可與EYLEA® (阿柏西普)組合投與用於治療DME及/或DR (例如，NPDR或PDR)。EYLEA® (阿柏西普)可(例如)每4週(Q4W)或在前5個月Q4W藉由玻璃體內注射以2 mg/眼投與，隨後每8週注射一次(Q8W)注射進行維持。
本發明之抗體(例如，半胱胺酸改造之抗VEGF抗體)或抗體偶聯物(例如單分散HA偶聯物)可與OZURDEX® (地塞米松玻璃體內植入物)組合投與用於治療DME及/或DR。OZURDEX®可以0.7 mg地塞米松玻璃體內植入物之形式投與，其可長達每6個月進行投與。
本發明之抗體(例如，半胱胺酸改造之抗VEGF抗體)或抗體偶聯物(例如單分散HA偶聯物)可與ILUVIEN® (地塞米松玻璃體內植入物)組合投與用於治療DME及/或DR。OZURDEX®可以0.19 mg乙酸氟輕鬆玻璃體內植入物之形式投與，其可以0.25 μg/天之速率溶析，且可持續長達約36個月。
在一些情況下，TAO/PRN治療方案或TAE治療方案可用於與抗體(例如，半胱胺酸改造之抗VEGF抗體)或抗體偶聯物(例如，單分散HA偶聯物)組合投與AMD治療劑(例如，雷珠單抗或阿柏西普)。對於TAO/PRN方案，在每四週(Q4W)(通常持續約3個月)進行初始玻璃體內注射之後，每月或每隔一個月(或以甚至更長之間隔)監測個體，且在出現疾病活動之證據(例如，視敏度下降或光同調斷層掃描(OCT)上之流體下降)時投與注射。對於TAE方案，可每四週(Q4W)治療個體，隨後在每次後續訪視中將治療間隔延長固定週數(例如，+2週)直至最大間隔(例如，每6週、每8週、每10週或每12週)。即使不存在疾病活動證據，亦可在每次訪視時觀察及治療眼睛。若黃斑出現潮濕(例如藉由OCT)，則可縮短注射間隔(例如-2週)，直至黃斑再次出現乾燥。在一些情況下，眼部病症係AMD (例如，濕性AMD)。
上文所述之該等組合療法涵蓋組合投與(其中兩種或更多種治療劑包括在相同或分開的調配物中)及分開投與，在該情形下，本發明之抗體或抗體偶聯物之投與可在其他一或多種治療劑之前、與其同時及/或在其之後投與。在一個實施例中，抗體或抗體偶聯物之投與及另一治療劑之投與彼此可在約1、2、3、4或5個月內或在約1週、2週或3週內或在約1天、2天、3天、4天、5天或6天內進行。
用於預防或治療眼部疾病或病症之本發明之抗體(例如，半胱胺酸改造之抗VEGF抗體)或抗體偶聯物(例如單分散HA偶聯物) (及任何其他治療劑)可藉由任何適宜手段來投與，包括(但不限於)(例如)眼部、眼內及/或玻璃體內注射，及/或近鞏膜注射，及/或眼筋膜囊下注射，及/或脈絡膜上腔注射，及/或以滴眼劑及/或軟膏形式之局部投與。該等抗體或抗體偶聯物可藉由各種方法來遞送，例如玻璃體內作為容許化合物緩慢釋放至玻璃體之裝置及/或儲庫，包括諸如Intraocular Drug Delivery，Jaffe、Jaffe、Ashton及Pearson，編者，Taylor & Francis (2006年3月)等參考文獻中所闡述之彼等。在一個實例中，裝置可呈微型幫浦及/或基質及/或被動擴散系統及/或長時間釋放化合物之經囊封細胞之形式(Intraocular Drug Delivery，Jaffe、Jaffe、Ashton及Pearson，編者，Taylor & Francis (2006年3月)。可使用之其他方法在下文部分G中有闡述。
用於眼部、眼內或玻璃體內投與之調配物可藉由業內已知之方法及使用賦形劑來製備。有效治療之重要特性係適當的穿透眼睛。與可局部遞送藥物之眼前部疾病不同，視網膜疾病通常受益於位點特異性更強之方法。滴眼劑及軟膏很少滲透至眼睛後部，並且血眼障壁阻礙全身投與之藥物滲透至眼部組織中。因此，用於治療視網膜疾病(例如AMD及CNV)之藥物遞送所選擇之方法通常係直接玻璃體內注射。玻璃體內注射通常以取決於患者病況及所遞送藥物之性質及半衰期之間隔重複進行。可使用之其他方法在下文部分G中有闡述。
將有效治療特定眼部疾病或病症之抗體或抗體偶聯物之量將取決於該疾病或病症之性質，並且可藉由標準臨床技術來確定。倘若可能，期望首先在活體外測定本發明之劑量-反應曲線及醫藥組合物，且接下來在有用的動物模型系統中測定，之後在人類中測試之前。
其他適宜的投與方式包括非經腸、肺內及鼻內，並且若期望則可局部治療、病灶內投與。非經腸輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投與。投藥可藉由任何適宜途徑進行，例如藉由注射(例如靜脈內或皮下注射)，此部分地端視投與係短暫的抑或係長期的而定。本文涵蓋各種投藥時間表，包括(但不限於)在各個時間點之單次或多次投與、濃注投與及脈衝輸注。在一些情況下，本發明之抗體偶聯物可以下列方式來投與：靜脈內、肌內、皮內、經皮、動脈內、腹膜內、病灶內、顱內、關節內、前列腺內、胸膜內、氣管內、鞘內、鼻內、陰道內、直腸內、局部、腫瘤內、腹膜內、經腹膜、心室內、皮下、結膜下、囊泡內、經黏膜、心包內、臍帶內、眶內、經口、局部、透皮、藉由吸入、藉由注射、藉由植入、藉由輸注、藉由連續輸注、藉由直接局部灌注浸浴靶細胞、藉由導管、藉由灌洗、以乳霜形式或以脂質組合物形式
為預防或治療疾病，本發明之抗體(例如半胱胺酸改造之抗VEGF抗體)或抗體偶聯物(例如單分散HA偶聯物)之適當劑量(當單獨使用或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)將取決於欲治療疾病之類型、抗體之類型、疾病之嚴重程度及進程、抗體是否經投與用於預防或治療目的、先前療法、患者之臨床病史及對抗體之反應及主治醫師之判斷。抗體(例如半胱胺酸改造之抗VEGF抗體)或抗體偶聯物(例如單分散HA偶聯物)可一次性或經過一系列處理適宜地投與患者。端視疾病之類型及嚴重程度，約1 μg/kg至15 mg/kg (例如0.1 mg/kg、0.2 mg/kg、0.4 mg/kg、0.6 mg/kg、0.8 mg/kg、1 mg/kg、2 mg/kg、3 mg/kg、4 mg/kg、5 mg/kg、6 mg/kg、7 mg/kg、8 mg/kg、9 mg/kg或10 mg/kg)抗體或抗體偶聯物可為投與患者之初始候選劑量，無論係(例如)藉由一或多次分開投與抑或藉由連續輸注。在一些實施例中，所用抗體或抗體偶聯物為約0.01 mg/kg至約45 mg/kg、約0.01 mg/kg至約4 0 mg/kg、約0.01 mg/kg至約35 mg/kg、約0.01 mg/kg至約3 0 mg/kg、約0.01 mg/kg至約25 mg/kg、約0.01 mg/kg至約2 0 mg/kg、約0.01 mg/kg至約15 mg/kg、約0.01 mg/kg至約1 0 mg/kg、約0.01 mg/kg至約5 mg/kg或約0.01 mg/kg至約1 mg/kg。對於抗體偶聯物，投藥可基於偶聯物之抗體組分之重量。一個典型日劑量可在約1 μg/kg至100 mg/kg或更多之範圍內，此端視上述因素而定。對於持續幾天或更長時間之重複投與，端視病況，治療通常持續至出現期望之疾病症狀抑制。
在一些實施例中，該等方法可進一步包含另一療法。該另一療法可為放射療法、手術、化學療法、基因療法、DNA療法、病毒療法、RNA療法、免疫療法、骨髓移植、奈米療法、單株抗體療法或前述之組合。該另一療法可呈輔助療法或新輔助療法之形式。在一些實施例中，該另一療法係投與小分子酶抑制劑或抗轉移劑。在一些實施例中，該另一療法係投與副作用限制劑(例如意欲減輕治療副作用之發生及/或嚴重程度之藥劑，例如抗噁心劑等)。在一些實施例中，該另一療法係放射療法。在一些實施例中，該另一療法係手術。在一些實施例中，該另一療法係放射療法及手術之組合。在一些實施例中，該另一療法係γ輻照。在一些實施例中，該另一療法可為分開投與一或多種上述治療劑。
應瞭解，任何上述調配物或治療方法均可使用本發明之免疫偶聯物代替抗VEGF抗體或者與抗VEGF抗體組合來實施。
應瞭解，任何上述調配物或治療方法均可使用本發明之抗體偶聯物(例如本文(例如下文部分G)中所闡述之任何一種)來實施。F. 製品
在本發明之在另一態樣中，提供含有可用於治療及/或預防上述病症之材料之製品。該製品包含容器及在容器上或與容器相關之標記或包裝插頁。適合的容器包括(例如)瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可由各種材料(例如玻璃或塑膠)形成。容器容納組合物，該組合物本身或與另一可有效治療、預防及/或診斷病況之組合物組合，並且可具有無菌入口(例如容器可為靜脈內溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿之塞子之小瓶)。組合物中之至少一種活性劑係本發明之抗體組合物(例如抗體(例如，半胱胺酸改造之抗VEGF抗體)或其抗體偶聯物)。標記或包裝插頁指示該組合物用於治療所選擇之病況。此外，製品可包含(a)其中含有組合物之第一容器，其中該組合物包含本發明之抗體或其抗體組合物；及視情況(b)其中含有組合物之第二容器，其中該組合物包含另一治療劑。本發明之此實施例中之製品可進一步包含指示組合物可用於治療特定病況之包裝插頁。另一選擇為或另外，製品亦可包含第二(或第三)容器，該容器包含醫藥學上可接受之緩衝液，例如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。其可進一步包括自商業及使用者觀點來看所期望之其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
應瞭解，任何上述製品均可包括本文所述之任何抗體或其抗體偶聯物及/或任何其他治療劑。G. 眼部長效遞送方法
本發明提供用於治療眼部病症之組合物，其可用於將抗體(例如抗VEGF抗體(包括本文所述之任何抗VEGF抗體，例如G6.31 AARR))長效遞送至眼睛。例如，本發明提供抗體偶聯物(例如單分散HA偶聯物)，其包括本文所述之抗VEGF抗體(例如Fab、Fab-C或半胱胺酸改造之抗體(例如ThioFab)偶聯物)。本發明亦提供可用於眼部投與本文所述之抗體或抗體偶聯物之裝置。本發明進一步提供醫藥組合物，其包括本文所述之抗體或抗體偶聯物。該等組合物可用於本文所述之任何治療方法中，例如，治療眼部病症(例如，AMD (例如，濕性AMD)、DME、DR (例如NPDR或PDR)或RVO(例如，CRVO或BRVO))之方法。1. 抗體偶聯物
本發明提供抗體偶聯物，其包括抗體(例如抗VEGF抗體)及共價附接至抗體之單分散聚合物。抗體(例如抗VEGF抗體)可以不可逆方式或可逆方式共價附接至單分散聚合物。可使用任何適合的單分散聚合物，包括本文所闡述之彼等或其他業內已知者。
本發明提供抗體偶聯物，其包括抗體及共價附接至該抗體之單分散聚合物(例如單分散HA聚合物)。聚合物可具有約1.1或更低之多分散性指數(PDI)。應瞭解，PDI值可指用於製備抗體偶聯物之聚合物之PDI值。例如，在一些實施例中，聚合物之PDI在1.0至約1.1 (例如，在1至約1.1之間、在1至約1.09之間、在1至約1.08之間、在1至約1.07之間、在1至約1.06之間、在1至約1.05之間、在1至約1.04之間、在1至約1.03之間、在1至約1.02之間、在1至約1.01之間、在1至約1.005之間、在約1.001至約1.1之間、在約1.001至約1.1之間、在約1.001至約1.09之間、在約1.001至約1.08之間、在約1.001至約1.07之間、在約1.001至約1.06之間、在約1.001至約1.05之間、在約1.001至約1.04之間、在約1.001至約1.03之間、在約1.001至約1.02之間、在約1.001至約1.01之間、在約1.001至約1.005之間、在約1.001至約1.004之間、在約1.001至約1.003之間、在約1.001至約1.002之間、在約1.0001至約1.1之間、在約1.0001至約1.09之間、在約1.0001至約1.08之間、在約1.0001至約1.07之間、在約1.0001至約1.06之間、在約1.0001至約1.05之間、在約1.0001至約1.04之間、在約1.0001至約1.03之間、在約1.0001至約1.02之間、在約1.0001至約1.01之間、在約1.0001至約1.005之間、在約1.0001至約1.004之間、在約1.0001至約1.003之間、在約1.0001至約1.002之間或在約1.0001至約1.005之間)。
例如，在一些實施例中，單分散聚合物(例如單分散HA聚合物)之PDI為1.001、約1.0001、約1.00001、約1.000001、約1.0000001或更低。在一些實施例中，單分散聚合物(例如單分散HA聚合物)之PDI為1.0、約1.001、約1.002、約1.003、約1.004、約1.005、約1.006、約1.007、約1.008、約1.009、約1.01、約1.011、約1.012、約1.013、約1.014、約1.015、約1.016、約1.017、約1.018、約1.019、約1.02、約1.021、約1.022、約1.023、約1.024、約1.025、約1.026、約1.027、約1.028、約1.029、約1.03、約1.031、約1.032、約1.033、約1.034、約1.035、約1.036、約1.037、約1.038、約1.039、約1.04、約1.041、約1.042、約1.043、約1.044、約1.045、約1.046、約1.047、約1.048、約1.049、約1.05、約1.051、約1.052、約1.053、約1.054、約1.055、約1.056、約1.057、約1.058、約1.059、約1.06、約1.061、約1.062、約1.063、約1.064、約1.065、約1.066、約1.067、約1.068、約1.069、約1.07、約1.071、約1.072、約1.073、約1.074、約1.075、約1.076、約1.077、約1.078、約1.079、約1.08、約1.081、約1.082、約1.083、約1.084、約1.085、約1.086、約1.087、約1.088、約1.089、約1.09、約1.091、約1.092、約1.093、約1.094、約1.095、約1.096、約1.097、約1.098、約1.099或約1.1。在一些實施例中，聚合物(例如HA聚合物)具有約1.001之PDI。
單分散聚合物可為親水性聚合物或疏水性聚合物。應瞭解，親水性聚合物可為水溶性聚合物。可使用任何適合的親水性聚合物，例如闡述於國際專利申請公開案第WO 2011/066417號及/或Pelegri-O'Day等人J. Am. Chem. Soc. 136:14323-14332, 2014中之親水性聚合物，該等文獻係以全文引用方式併入本文。可使用之例示性的非限制性親水性聚合物包括玻尿酸(HA)、聚乙二醇(PEG；亦稱為聚(乙二醇)) (例如直鏈PEG、具支鏈PEG、梳狀PEG及樹枝狀PEG)、聚[環氧乙烷)-共 -(亞甲基環氧乙烷)]、聚(聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯) (pPEGMA)、瓊脂糖、藻酸鹽、角叉菜膠、羧甲基纖維素、纖維素、纖維素衍生物、幾丁聚醣、硫酸軟骨素、膠原、硫酸皮膚素、葡聚糖、硫酸葡聚糖、纖維蛋白、纖維蛋白原、纖維接合素、褐藻糖膠、明膠、醣胺聚糖(GAG)、糖聚合物、肝素、硫酸肝素、高度具支鏈多醣(例如半乳糖樹枝狀聚合物)、硫酸角質素、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、聚(N- (2-羥丙基)甲基丙烯醯胺) (pHPMA)、果膠、果膠衍生物、戊聚糖多硫酸酯、澱粉、羥乙基澱粉(HES)、苯乙烯、玻連蛋白、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚(丙烯醯胺)、聚(丙烯酸)、聚(胺)、聚(胺基酸)、聚(羧基甜菜鹼)(PCB)、聚電解質、聚(麩胺酸)(PGA)、聚(甘油) (PG)(例如線性、中等官能度、超具支鏈或線性超具支鏈PG)、聚(馬來酸)、聚(2-噁唑啉) (POZ)、聚(2-乙基-2-噁唑啉、聚唾液酸(PSA)、聚苯乙烯、聚苯乙烯衍生物(例如，帶電聚苯乙烯衍生物)、聚(苯乙烯磺酸酯-共-PEGMA)、聚乙烯吡咯啶酮(PVP)、聚(N- 丙烯醯基嗎啉) (pNAcM)及其共聚物。在一些情況下，聚合物係疏水性聚合物，例如，聚(乳酸-共 -乙醇酸) (PLGA)、聚乳酸(PLA)及聚乙交酯(PGA)。聚合物可為可生物降解的及/或生物相容的。在具體實施例中，聚合物係HA。
舉例而言，單分散聚合物(例如HA聚合物)可包括任何適合數量之單體，例如介於2×104 個單體與約1×104 個單體之間(例如約10、約50、約100、約200、約300、約400、約500、約600、約700、約800、約900、約1000、約2000、約3000、約4000、約5000、約6000、約7000、約8000、約9000或約1×104 個單體)或更多。例如，聚合物(例如HA聚合物)可包括在約50與約250個單體之間、在約50與約500個單體之間、在約50與約1000個單體之間、在約50與約2000個單體之間、在約50與約3000個單體之間、在約50與約4000個單體之間、在約50與約5000個單體之間、在約50與約6000個單體之間、在約50與約7000個單體之間、在約50與約8000個單體之間、在約50與約9000個單體之間、在約50與約10000個單體之間、在約100與約250個單體、約100與約500個單體之間、在約100與約1000個單體之間、在約100與約2000個單體之間、在約100與約3000個單體之間、在約100與約4000個單體之間、在約100與約5000個單體之間、在約100與約6000個單體之間、在約100與約7000個單體之間、在約100與約8000個單體之間、在約100與約9000個單體之間、在約100與約10000個單體之間、在約250與約500個單體之間、在約250與約1000個單體之間、在約250與約2000個單體之間、在約250與約3000個單體之間、在約250與約4000個單體之間、在約250與約5000個單體之間、在約250與約6000個單體之間、在約250與約7000個單體之間、在約250與約8000個單體之間、在約250與約9000個單體之間、在約250與約10000個單體之間、在約500與約1000個單體之間、在約500與約2000個單體之間、在約500與約3000個單體之間、在約500與約4000個單體之間、在約500與約5000個單體之間、在約500與約6000個單體之間、在約500與約7000個單體之間、在約500與約8000個單體之間、在約500與約9000個單體之間或在約500與約10000個單體之間。在一些情況下，聚合物(例如HA聚合物)可包括約500個單體。
本發明提供抗體偶聯物，其包括共價附接至單分散HA聚合物之抗體(例如，抗VEGF抗體，例如G6.31 AARR)。該等抗體偶聯物在本文中有時稱作「單分散HA偶聯物」。單分散HA聚合物可具有約1.1或更低之多分散性指數(PDI)。例如，在一些實施例中，單分散HA聚合物之PDI介於1.0至約1.1之間(例如介於1至約1.1之間、介於1至約1.09之間、介於1至約1.08之間、介於1至約1.07之間、介於1至約1.06之間、介於1至約1.05之間、介於1至約1.04之間、介於1至約1.03之間、介於1至約1.02之間、介於1至約1.01之間、介於1至約1.005之間、在約1.001至約1.1之間、在約1.001至約1.1之間、在約1.001至約1.09之間、在約1.001至約1.08之間、在約1.001至約1.07之間、在約1.001至約1.06之間、在約1.001至約1.05之間、在約1.001至約1.04之間、在約1.001至約1.03之間、在約1.001至約1.02之間、在約1.001至約1.01之間、在約1.001至約1.005之間、在約1.001至約1.004之間、在約1.001至約1.003之間、在約1.001至約1.002之間、在約1.0001至約1.1之間、在約1.0001至約1.09之間、在約1.0001至約1.08之間、在約1.0001至約1.07之間、在約1.0001至約1.06之間、在約1.0001至約1.05之間、在約1.0001至約1.04之間、在約1.0001至約1.03之間、在約1.0001至約1.02之間、在約1.0001至約1.01之間、在約1.0001至約1.005之間、在約1.0001至約1.004之間、在約1.0001至約1.003之間、在約1.0001至約1.002之間或在約1.0001至約1.005之間)。
例如，在一些實施例中，單分散HA聚合物之PDI為1.001、約1.0001、約1.00001、約1.000001、約1.0000001或更低。在一些實施例中，單分散HA聚合物之PDI為1.0、約1.001、約1.002、約1.003、約1.004、約1.005、約1.006、約1.007、約1.008、約1.009、約1.01、約1.011、約1.012、約1.013、約1.014、約1.015、約1.016、約1.017、約1.018、約1.019、約1.02、約1.021、約1.022、約1.023、約1.024、約1.025、約1.026、約1.027、約1.028、約1.029、約1.03、約1.031、約1.032、約1.033、約1.034、約1.035、約1.036、約1.037、約1.038、約1.039、約1.04、約1.041、約1.042、約1.043、約1.044、約1.045、約1.046、約1.047、約1.048、約1.049、約1.05、約1.051、約1.052、約1.053、約1.054、約1.055、約1.056、約1.057、約1.058、約1.059、約1.06、約1.061、約1.062、約1.063、約1.064、約1.065、約1.066、約1.067、約1.068、約1.069、約1.07、約1.071、約1.072、約1.073、約1.074、約1.075、約1.076、約1.077、約1.078、約1.079、約1.08、約1.081、約1.082、約1.083、約1.084、約1.085、約1.086、約1.087、約1.088、約1.089、約1.09、約1.091、約1.092、約1.093、約1.094、約1.095、約1.096、約1.097、約1.098、約1.099或約1.1。在一些實施例中，單分散HA聚合物之PDI為約1.001。
在一些情況下，單分散HA聚合物之分子量為約2.5兆道爾頓( MDa)或更低(例如，約2.5 MDa或更低、約2.4 MDa或更低、約2.3 MDa或更低、約2.2 MDa或更低、約2.1 MDa或更低、約2.0 MDa或更低、約1.9 MDa或更低、約1.8 MDa或更低、約1.7 MDa或更低、約1.6 MDa或更低、約1.5 MDa或更低、約1.4 MDa或約1.3 MDa或更低、約1.2 MDa或更低、約1.1 MDa或更低、約1.0 MDa或更低、約900 kDa或更低、約800 kDa或更低、約700 kDa或更低、約600 kDa或更低、約500 kDa或更低、約400 kDa或更低、約300 kDa或更低、約200 kDa或更低或約100 kDa或更低)。在一些情況下，HA聚合物之分子量為約1 MDa或更低(例如，約1.0 MDa或更低、約900 kDa或更低、約800 kDa或更低、約700 kDa或更低、約600 kDa或更低、約500 kDa或更低、約400 kDa或更低、約300 kDa或更低、約200 kDa或更低或約100 kDa或更低)。在一些情況下，HA聚合物之分子量在約25 kDa與約2.5 MDa之間(例如，在約25 kDa與約2.5 mDa之間、在約25 kDa與約2 MDa之間、在約25 kDa與約1.5 MDa之間、在約25 kDa與約1 MDa之間、在約25 kDa與約900 kDa之間、在約25 kDa與約800 kDa之間、在約25 kDa與約700 kDa之間、在約25 kDa與約600 kDa之間、在約25 kDa與約500 kDa之間、在約100 kDa與約2.5 mDa之間、在約100 kDa與約2 MDa之間、在約100 kDa與約1.5 MDa之間、在約100 kDa與約1 MDa之間、在約100 kDa與約900 kDa之間、在約100 kDa與約800 kDa之間、在約100 kDa與約700 kDa之間、在約100 kDa與約600 kDa之間、在約100 kDa與約500 kDa之間、在約250 kDa與約2.5 MDa之間、在約250 kDa與約2 MDa之間、在約250 kDa與約1.5 MDa之間、在約250 kDa與約1 MDa之間、在約250 kDa與約900 kDa之間、在約250 kDa與約800 kDa之間、在約250 kDa與約700 kDa之間、在約250 kDa與約600 kDa之間、在約250 kDa與約500 kDa之間、在約500 kDa與約2.5 MDa之間、在約500 kDa與約2 MDa之間、在約500 kDa與約1.5 MDa之間、在約500 kDa與約1 MDa之間、在約500 kDa與約900 kDa之間、在約500 kDa與約800 kDa之間、在約500 kDa與約700 kDa之間、在約500 kDa與約600 kDa之間、在約1 MDa與約2.5 MDa之間、在約1 MDa與約2 MDa之間、在約1 MDa與約1.5 MDa之間、在約1 MDa與約1.25 MDa之間、在約1.25 MDa與約2.5 MDa之間、在約1.25 MDa與約2 MDa之間、在約1.25 MDa與約1.5 MDa之間、在約1.5 MDa與約2.5 MDa之間、在約1.5 MDa與約2 MDa之間、在約1.5 MDa與約1.75 MDa或在1.75 MDa與約2.5 MDa之間)。
在一些情況下，單分散HA聚合物之分子量在約25 kDa與約500 kDa之間(例如，在約25 kDa與約500 kDa之間、在約25 kDa與約450 kDa之間、在約25 kDa與約400 kDa之間、在約25 kDa與約350 kDa之間、在約25 kDa與約300 kDa之間、在約25 kDa與約300 kDa之間、在約25 kDa與約250 kDa之間、在約25 kDa與約200 kDa之間、在約25 kDa與約150 kDa之間、在約25 kDa與約100 kDa之間、在約25 kDa與約50 kDa之間、在約40 kDa與約500 kDa之間、在約40 kDa與約450 kDa之間、在約40 kDa與約400 kDa之間、在約40 kDa與約350 kDa之間、在約40 kDa與約300 kDa之間、在約40 kDa與約300 kDa之間、在約40 kDa與約250 kDa之間、在約40 kDa與約200 kDa之間、在約40 kDa與約150 kDa之間、在約40 kDa與約100 kDa之間、在約40 kDa與約50 kDa之間、在約50 kDa與約500 kDa之間、在約50 kDa與約450 kDa之間、在約50 kDa與約400 kDa之間、在約50 kDa與約350 kDa之間、在約50 kDa與約300 kDa之間、在約50 kDa與約300 kDa之間、在約50 kDa與約250 kDa之間、在約50 kDa與約200 kDa之間、在約50 kDa與約150 kDa之間、在約50 kDa與約100 kDa之間、在約50 kDa與約75 kDa之間、在約100 kDa與約500 kDa之間、在約100 kDa與約450 kDa之間、在約100 kDa與約400 kDa之間、在約100 kDa與約350 kDa之間、在約100 kDa與約300 kDa之間、在約100 kDa與約300 kDa之間、在約100 kDa與約250 kDa之間、在約100 kDa與約200 kDa之間、在約100 kDa與約150 kDa之間、在約150 kDa與約500 kDa之間、在約150 kDa與約450 kDa之間、在約150 kDa與約400 kDa之間、在約150 kDa與約350 kDa之間、在約150 kDa與約300 kDa之間、在約150 kDa與約300 kDa之間、在約150 kDa與約250 kDa之間、在約150 kDa與約200 kDa之間、在約175 kDa與約500 kDa之間、在約175 kDa與約450 kDa之間、在約175 kDa與約400 kDa之間、在約175 kDa與約350 kDa之間、在約175 kDa與約300 kDa之間、在約175 kDa與約300 kDa之間、在175 200 kDa與約250 kDa之間、在約175 kDa與約225 kDa之間、在約200 kDa與約500 kDa之間、在約200 kDa與約450 kDa之間、在約200 kDa與約400 kDa之間、在約200 kDa與約350 kDa之間、在約200 kDa與約300 kDa之間、在約200 kDa與約300 kDa之間、在約200 kDa與約250 kDa之間或在約200 kDa與約225 kDa之間)。
在一些情況下，單分散HA聚合物之分子量在約100 kDa與約250 kDa之間(例如約100 kDa、約110 kDa、約120 kDa、約130 kDa、約140 kDa、約150 kDa、約160 kDa、約170 kDa、約180 kDa、約190 kDa、約200 kDa、約210 kDa、約220 kDa、約230 kDa、約240 kDa或約250 kDa)。在具體情況下，HA聚合物之分子量為約200 kDa。
任何前述分子量可為重量平均分子量(亦稱為重量平均莫耳質量)。
在一些情況下，任何前述單分散HA聚合物係線性的，亦即不交聯。
在其他情況下，本發明提供抗體偶聯物，其包括共價附接至單分散PEG聚合物之抗體(例如，抗VEGF抗體，例如G6.31 AARR)。該等抗體偶聯物在本文中有時稱作「PEG偶聯物」。可使用任何適合的單分散PEG聚合物。應瞭解，與單分散HA聚合物相比，單分散PEG聚合物可具有不同的PDI值。例如，市售PEG聚合物可具有低於1.1之PDI；因此，與單分散HA聚合物相比，單分散PEG聚合物將由不同範圍之PDI值限定。例如，單分散PEG聚合物之PDI可為約1至約1.02 (例如，PDI為1、約1.001、約1.002、約1.003、約1.004、約1.005、約1.006、約1.007、約1.008、約1.009、約1.01、約1.011、約1.012、約1.013、約1.014、約1.015、約1.016、約1.017、約1.018、約1.019或約1.02)。PEG可為具支鏈PEG、星形PEG或梳形PEG。PEG聚合物可為(例如) PEG四聚體、PEG六聚體或PEG八聚體。在一些情況下，抗體偶聯物包括共價附接至PEG樹枝狀聚合物之抗VEGF抗體(例如，本文所述之抗VEGF抗體，例如G6.31 AARR)。PEG聚合物可自(例如) JenKem Technology, Quanta BioDesign, NOF America Corporation及其他供應商購得。
在一些情況下，單分散PEG聚合物之分子量在約1 kDa與約500 kDa之間(例如，在約1 kDa與約500 kDa之間、在約1 kDa與約450 kDa之間、在約1 kDa與約400 kDa之間、在約1 kDa與約350 kDa之間、在約1 kDa與約300 kDa之間、在約1 kDa與約300 kDa之間、在約1 kDa與約250 kDa之間、在約1 kDa與約200 kDa之間、在約1 kDa與約150 kDa之間、在約1 kDa與約100 kDa之間、在約1 kDa與約50 kDa之間、在約10 kDa與約500 kDa之間、在約10 kDa與約450 kDa之間、在約10 kDa與約400 kDa之間、在約10 kDa與約350 kDa之間、在約10 kDa與約300 kDa之間、在約10 kDa與約300 kDa之間、在約10 kDa與約250 kDa之間、在約10 kDa與約200 kDa之間、在約10 kDa與約150 kDa之間、在約10 kDa與約100 kDa之間、在約10 kDa與約50 kDa之間、在約20 kDa與約500 kDa之間、在約20 kDa與約450 kDa之間、在約20 kDa與約400 kDa之間、在約20 kDa與約350 kDa之間、在約20 kDa與約300 kDa之間、在約20 kDa與約300 kDa之間、在約20 kDa與約250 kDa之間、在約20 kDa與約200 kDa之間、在約20 kDa與約150 kDa之間、在約20 kDa與約100 kDa之間、在約20 kDa與約75 kDa之間、在約30 kDa與約500 kDa之間、在約30 kDa與約450 kDa之間、在約30 kDa與約400 kDa之間、在約30 kDa與約350 kDa之間、在約30 kDa與約300 kDa之間、在約30 kDa與約300 kDa之間、在約30 kDa與約250 kDa之間、在約30 kDa與約200 kDa之間、在約30 kDa與約150 kDa之間、在約40 kDa與約500 kDa之間、在約40 kDa與約450 kDa之間、在約40 kDa與約400 kDa之間、在約40 kDa與約350 kDa之間、在約40 kDa與約300 kDa之間、在約40 kDa與約300 kDa之間、在約40 kDa與約250 kDa之間、在約40 kDa與約200 kDa之間、在約50 kDa與約500 kDa之間、在約50 kDa與約450 kDa之間、在約50 kDa與約400 kDa之間、在約50 kDa與約350 kDa之間、在約50 kDa與約300 kDa之間、在約50 kDa與約300 kDa之間、在50 200 kDa與約250 kDa之間或在約50 kDa與約225 kDa之間)。
在一些情況下，單分散PEG聚合物之分子量在約5 kDa與約250 kDa之間(例如約1 kDa、約5 kDa、約10 kDa、約15 kDa、約20 kDa、約25 kDa、約30 kDa、約35 kDa、約40 kDa、約50 kDa、約60 kDa、約70 kDa、約80 kDa、約90 kDa，100 kDa、約110 kDa、約120 kDa、約130 kDa、約140 kDa、約150 kDa、約160 kDa、約170 kDa、約180 kDa、約190 kDa、約200 kDa、約210 kDa、約220 kDa、約230 kDa、約240 kDa或約250 kDa)。在具體情況下，PEG聚合物之分子量為約20 kDa。在其他情況下，PEG聚合物之分子量為約40 kDa。
任何前述分子量均可為重量平均分子量(亦稱為重量平均莫耳質量)。
在一些情況下，單分散PEG聚合物係PEG四聚體。PEG四聚體係可自市面購得，例如NOF America SUNBRIGHT® PTE-400MA、PTE-200MA、PTE-100MA及JenKem Technology USA 4臂PEG馬來醯亞胺(目錄號4ARM-MAL)。在一些情況下，PEG四聚體具有新戊四醇核心。例如，在一些情況下，PEG四聚體包括式(I)之結構，其中n獨立地係任何適合的整數： 式I：
在另一實例中，在一些情況下，單分散PEG聚合物係PEG六聚體。PEG六聚物可自市面購得，例如JenKem Technology USA 6臂PEG胺(目錄號6ARM(DP)-NH2HCl)或來自Quanta BioDesign之PEG六聚體。在一些情況下，PEG六聚體包括二戊基赤藻糖醇核心。
在一些情況下，單分散PEG聚合物係PEG八聚體。PEG八聚體係可自市面購得，例如，NOF America SUNBRIGHT®HGEO系列或JenKem Technology USA 8臂PEG馬來醯亞胺(目錄號8ARM(TP)-MAL)。在一些情況下，PEG八聚體可包括三新戊四醇核心。例如，在一些情況下，PEG八聚體包括式(II)之結構，其中n獨立地為任何適合的整數： 式II：
在又一實例中，在一些情況下，PEG八聚體包括三新戊四醇核心。
應瞭解，可使用任何適合的偶聯方法(包括本文所闡述之彼等及其他業內已知者)將本發明之抗VEGF抗體偶聯至單分散聚合物。例如，單分散聚合物可偶聯至任何適合的蛋白質官能基，包括一級胺基團、羧基、巰基或羰基。可使用任何適宜化學反應性基團來靶向蛋白質官能基，例如，碳化二亞胺(例如EDC)、NHS酯、亞胺酸酯、五氟苯基酯、羥甲基膦、馬來醯亞胺、鹵乙醯基(例如溴乙醯基或碘乙醯基)、吡啶基二硫鍵、硫代磺酸酯、乙烯基碸、肼、烷氧基胺、二氮環丙烯、芳基疊氮化物、異氰酸酯或其他業內已知者。參見例如Hermanson，Bioconjugate Techniques ，第3版，2013。在具體實施例中，用馬來醯亞胺基團(HA-馬來醯亞胺)改質HA (例如，單分散HA)，且其次，使在半胱胺酸上包括游離巰基之抗體(例如Fab-C或半胱胺酸變體(例如THIOMABTM 或ThioFab))與HA-馬來醯亞胺反應形成共價HA-Fab偶聯物，例如，如實施例1中所述。
任何前述抗體偶聯物之流體動力學半徑均可在約5 nm與約200 nm之間(例如，約5 nm、約10 nm、約20 nm、約30 nm、約40 nm、約50 nm、約60 nm、約70 nm、約80 nm、約90 nm、約100 nm、約110 nm、約120 nm、約130 nm、約140 nm、約150 nm、約160 nm、約170 nm、約180 nm、約190 nm或約200 nm)。在一些情況下，抗體偶聯物之流體動力學半徑在約5 nm與約150 nm之間(例如，約5 nm、約10 nm、約20 nm、約30 nm、約40 nm、約50 nm、約60 nm、約70 nm、約80 nm、約90 nm、約100 nm、約110 nm、約120 nm、約130 nm、約140 nm或約150 nm)。在一些情況下，抗體偶聯物之流體動力學半徑在約5 nm與約100 nm之間(例如，約5 nm、約10 nm、約20 nm、約30 nm、約40 nm、約50 nm、約60 nm、約70 nm、約80 nm、約90 nm或約100 nm)。在一些情況下，抗體偶聯物之流體動力學半徑在約5 nm與約60 nm之間(例如約5 nm、約10 nm、約20 nm、約30 nm、約40 nm、約50 nm或約60 nm)。在一些情況下，抗體偶聯物之流體動力學半徑在約25 nm與約35 nm之間(例如，約25 nm、約26 nm、約27 nm、約28 nm、約29 nm、約30 nm、約31 nm、約32 nm、約33 nm、約34 nm或約35 nm)。在一些情況下，流體動力學半徑為約28 nm。
在一些情況下，抗體偶聯物之流體動力學半徑在約10 nm與約200 nm之間、在約10 nm與約180 nm之間、在約10 nm與約160 nm之間、在約10 nm與約140 nm之間、在約10 nm與約120 nm之間、在約10 nm與約100 nm之間、在約10 nm與約80 nm之間、在約10 nm與約60 nm之間、在約10 nm與約50 nm之間、在約10 nm與約40 nm之間、在約10 nm與約30 nm之間、在約20 nm與約200 nm之間、在約20 nm與約180 nm之間、在約20 nm與約160 nm之間、在約20 nm與約140 nm之間、在約20 nm與約120 nm之間、在約20 nm與約100 nm之間、在約20 nm與約80 nm之間、在約20 nm與約60 nm之間、在約20 nm與約50 nm之間、在約20 nm與約40 nm之間、在約20 nm與約30 nm之間、在約30 nm與約200 nm之間、在約30 nm與約180 nm之間、在約30 nm與約160 nm之間、在約30 nm與約140 nm之間、在約30 nm與約120 nm之間、在約30 nm與約100 nm之間、在約30 nm與約80 nm之間、在約30 nm與約60 nm之間、在約30 nm與約50 nm之間、在約30 nm與約40 nm之間、在約40 nm與約200 nm之間、在約40 nm與約180 nm之間、在約40 nm與約160 nm之間、在約40 nm與約140 nm之間、在約40 nm與約120 nm之間、在約40 nm與約100 nm之間、在約40 nm與約80 nm之間、在約40 nm與約60 nm之間、在約40 nm與約50 nm之間、在約50 nm與約200 nm之間、在約50 nm與約180 nm之間、在約50 nm與約160 nm之間、在約50 nm與約140 nm之間、在約50 nm與約120 nm之間、在約50 nm與約100 nm之間、在約50 nm與約80 nm之間、在約50 nm與約60 nm之間、在約60 nm與約200 nm之間、在約60 nm與約180 nm之間、在約60 nm與約160 nm之間、在約60 nm與約140 nm之間、在約60 nm與約120 nm之間、在約60 nm與約100 nm之間或在約60 nm與約80 nm之間。
在任何前述抗體偶聯物中，抗體可為結合VEGF之抗體片段，例如本文所述之結合VEGF之抗VEGF抗體之抗體片段。在一些情況下，抗VEGF抗體係半胱胺酸改造之抗VEGF抗體，如本文所述(參見例如上文部分第1(8)(d))。在一些情況下，抗體片段選自由Fab、Fab'、Fab-C、Fab'-SH、Fv、scFv及(Fab')2 片段組成之群。在具體情況下，抗體片段係Fab、Fab'或Fab-C。在一些情況下，抗體片段係Fab-C。
任何前述抗體偶聯物可具有相對於未共價附接至聚合物(例如親水性聚合物)之參考抗體增加之眼部半衰期。在一些情況下，相對於參考抗體，眼部半衰期增加至少約2倍(例如，約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約12倍、約14倍、約16倍、約18倍、約20倍或更多)。在一些情況下，相對於參考抗體，眼部半衰期增加至少約4倍。在某些情況下，眼部半衰期係玻璃體半衰期。在一些情況下，參考抗體與抗體偶聯物之抗體相同。在其他情況下，參考抗體與抗體偶聯物之抗體不同。
任何前述抗體偶聯物可具有相對於未共價附接至聚合物(例如，親水性聚合物)之參考抗體降低之眼部清除率。在一些情況下，相對於參考抗體，清除率降低至少約2倍(例如，約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約12倍、約14倍、約16倍、約18倍、約20倍或更多)。在一些情況下，相對於參考抗體，清除率降低至少約4倍。在某些情況下，清除率係自玻璃體之清除率。在一些情況下，參考抗體與抗體偶聯物之抗體相同。在其他情形下，參考抗體與抗體偶聯物之抗體不同。
在一些情況下，任何前述抗體偶聯物(例如HA偶聯物)之兩次眼內投與(例如藉由玻璃體內注射)之間之時間段為至少1個月，例如至少1個月、至少5週、至少6週、至少7週、至少8週、至少9週、至少10週、至少11週、至少12週、至少13週、至少14週、至少15週、至少16週、至少20週、至少24週、至少28週、至少32週、至少36週、至少40週、至少44週、至少48週、至少52週或更多個週。在某些情形下，兩次眼內投與之間之最長時段不超過四年，例如不超過三年，不超過兩年或不超過一年。抗體偶聯物可(例如)每2至12個月(例如每4至10個月)進行投與。在一些情況下，抗體偶聯物係每六個月進行投與。
本發明亦提供包括任何上述抗體偶聯物之組合物(例如醫藥組合物)。在某些實施例中，該組合物包含一或多種其他化合物。在某些實施例中，該其他化合物結合至選自由以下各項組成之群之第二生物分子：IL-1β；IL-6；IL-6R；PDGF；血管生成素；血管生成素2；Tie2；S1P；整聯蛋白αvβ3、αvβ5及α5β1；β細胞素；apelin/APJ；促紅血球生成素；補體因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受體；ST-2受體；以及與年齡相關性黃斑變性(AMD)風險遺傳相關之蛋白質，例如補體途徑組分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a及C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；介白素-8 (IL-8)；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC；COL10A1；及TNFRSF10A。在某些實施例中，該其他化合物係抗體或其抗原結合片段。例如，在一些情況下，該其他化合物係雙特異性抗體，例如，抗VEGF/抗Ang2雙特異性抗體，例如RG-7716或揭示於WO 2010/069532或WO 2016/073157中之任何雙特異性抗VEGF/抗Ang2雙特異性抗體或其變體。在另一實例中，在一些情況下，該其他化合物係抗IL-6抗體，例如EBI-031 (Eleven Biotherapeutics；參見例如WO2016/073890)、司妥昔單抗(SYLVANT®)、奧洛珠單抗、克拉珠單抗、西盧卡單抗、艾西莫單抗、格利珠單抗、OPR-003、MEDI-5117、PF-04236921或其變體。在又一實例中，在一些情況下，該其他化合物係抗IL-6R抗體，例如托珠單抗(ACTEMRA®) (參見例如WO 1992/019579)、沙魯單抗、沃巴利珠單抗(ALX-0061)、SA-237或其變體。
本發明亦提供包括任何上述抗體偶聯物及另一VEGF拮抗劑之組合物(例如醫藥組合物)。2. 裝置
本文所述之任何抗體(例如，半胱胺酸改造之抗VEGF抗體)或抗體偶聯物(例如單分散HA偶聯物)可使用埠遞送裝置投與於眼睛。埠遞送裝置係可植入的可再填充裝置，其可在數月(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個或更多個月)之時段內釋放治療劑(例如，抗VEGF抗體偶聯物)。可使用之例示性埠遞送裝置包括來自ForSight Labs、LLC及/或ForSight VISION4之彼等，例如如國際專利申請公開案第WO 2010/088548號、第WO 2015/085234號、第WO 2013/116061號、第WO 2012/019176號、第WO 2013/040247及第WO 2012/019047號中所闡述，該等案件係以全文引用方式併入本文。
例如，本發明提供埠遞送裝置，其包括含有任何本文所述抗體或抗體偶聯物之貯存器。埠遞送裝置可進一步包括近端區、耦合至與貯存器流體連通之近端區之管狀主體，以及與貯存器流體連通且經組態以將組合物釋放至眼中之一或多個出口。管狀主體可具有外徑，該外徑經組態以藉助眼中約0.5 mm或更小之切口或開口插入。裝置之長度可為約1 mm至約15 mm (例如約1 mm、約2 mm、約4 mm、約5 mm、約6 mm、約7 mm、約9 mm、約11 mm、約13 mm或約15 mm之長度)。貯存器可具有任何適宜的體積。在一些情況下，貯存器之體積為約1 μl至約100 μl (例如約1 μl、約5 μl、約10 μl、約20 μl、約50 μl、約75 μl或約100 μl)。裝置或其組成部件可由任何適合的材料(例如聚醯亞胺)製成。
在一些情況下，埠遞送裝置包括含有本文所述之任何抗體或抗體偶聯物及一或多種其他化合物之貯存器。在某些實施例中，該其他化合物結合至選自由以下各項組成之群之第二生物分子：IL-1β；IL-6；IL-6R；PDGF；血管生成素；血管生成素2；Tie2；S1P；整聯蛋白αvβ3、αvβ5及α5β1；β細胞素；apelin/APJ；促紅血球生成素；補體因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受體；ST-2受體；及與AMD風險遺傳相關之蛋白質，例如補體途徑組分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a及C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；IL-8；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC；COL10A1；及TNFRSF10A。在某些實施例中，該其他化合物係抗體或其抗原結合片段。例如，在一些情況下，該其他化合物係雙特異性抗體，例如，抗VEGF/抗Ang2雙特異性抗體，例如RG-7716或公開於WO 2010/069532或WO 2016/073157中之任何雙特異性抗VEGF/抗Ang2雙特異性抗體或其變體。在另一實例中，在一些情況下，該另一化合物係抗IL-6抗體，例如EBI-031 (Eleven Biotherapeutics；參見例如WO2016/073890)、司妥昔單抗(SYLVANT®)、奧洛珠單抗、克拉珠單抗、西盧卡單抗、艾西莫單抗、格利珠單抗、OPR-003、MEDI-5117、PF-04236921或其變體。在又一實例中，在一些情況下，該另一化合物係抗IL-6R抗體，例如托珠單抗(ACTEMRA®) (參見例如WO 1992/019579)、沙魯單抗、沃巴利珠單抗(ALX-0061)、SA-237或其變體。
在一些情況下，埠遞送裝置包括本文所述之任何抗體或抗體偶聯物及另一VEGF拮抗劑。III. 實例
以下係本發明之方法及組合物之實例。應瞭解，給定上文所提供之一般闡述，可實踐各種其他實施例。實例 1 ： 自單分散 HA 製備之線性玻尿酸 (HA) 抗體偶聯物用於改良穩定性
Fab與生物聚合物玻尿酸(HA)之偶聯可顯著改良Fab在眼中之停留時間，例如，藉由減緩Fab之擴散且由此減緩自玻璃體液之清除來進行。HA-Fab偶聯物之產生採用兩步式製程：首先用馬來醯亞胺基團(HA-馬來醯亞胺)修飾商購HA，且其次使Fab-C(在半胱胺酸上帶有游離巰基之Fab)與HA-馬來醯亞胺以形成共價HA-Fab偶聯物。
當經由典型方式產生時，HA-蛋白質偶聯物可具有兩個正交變異組分。變異性之第一個來源係多分散性，此係由HA主鏈之多分散性造成的(圖1A)。第二個來源係異質性，此係由附接至給定HA鏈之Fab分子數量之差異造成的。變異性之此第二來源係藉由HA偶聯過程第一步中馬來醯亞胺修飾HA鏈之隨機性質來指示。圖1B顯示蒙特卡洛模擬之結果，其中200 kDa HA鏈之每一酸基團係給予5%與含馬來醯亞胺之接頭反應的機率，重複1000個獨立HA鏈。結果表明，雖然整個模擬期間每個HA鏈中馬來醯亞胺之平均數係預計值24.7，但絕對範圍係11至42。
可能期望維持抗體偶聯物(例如包括線性HA及抗VEGF抗體G6.31 AARR之抗體偶聯物；在本文中稱作HA-G6.31.AARR抗體偶聯物)在水相中及在玻璃體液中之物理及膠體穩定性。部分地基於上述模擬，認為HA主鏈分子量及Fab加載量可能係物理穩定性之重要參數。Fab加載量係指附接至每一HA鏈之抗體(例如G6.31.AARR)分子之平均數，並且係以HA主鏈上經Fab部分共價修飾之酸基團之百分比來表示(每一HA重複單元在葡萄糖醛酸醣上含有一個可修飾酸基團)。儘管其他參數可能有助於偶聯物穩定性(例如Fab之特定性質，包括淨電荷、表面電荷分佈、疏水性)，但其在此特定分子之範圍內通常係不可控的。
為評估HA MW及Fab加載量對HA-G6.31.AARR物理穩定性之影響，用三種不同的HA起始MW (大約40 kDa、200 kDa及600 kDa)及不同的Fab加載量製備偶聯物，在生理條件下施加應激，並持續幾個月監測物理穩定性以模仿生物暴露。(A) 材料及方法 (i) 材料
此研究中使用三個不同分子量之玻尿酸鈉(HA，Lifecore Biomedical，Chaska，MN)。其性質總結於表4中，該等性質係如藉由粒徑篩析層析結合折射指數及多角度光散射檢測器(SEC-RI-MALS)所評估。Mn指示數量平均分子量；Mw指示重量平均分子量；PDI指示多分散性指數；且RH 指示流體動力學半徑。表5顯示與如藉由SEC-RI-MALS測定之單分散試樣相比，各種多分散HA試樣之Mn、Mw及PDI之數據。表4及5中之數據係來自兩個不同批次的HA-200K，其具有不同的多分散性。表 4 ： 此本研究中使用之 HA 之性質 表 5 ： 與單分散試樣相比 ， 多分散 HA 試樣之性質 (ii) 馬來醯亞胺官能化 HA (HA-mal) 之合成
使用偶聯試劑4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鎓氯化物(DMTMM)及接頭N-(2)-胺基乙基)馬來醯亞胺三氟乙酸鹽(AEM)之水性反應用馬來醯亞胺基團修飾HA。HA係以2.5 mg/mL溶解於100 mM 2-(N-嗎啉基)乙磺酸(MES) (pH5.5)中，且在攪拌下向此溶液中添加DMTMM及AEM。所添加DMTMM及AEM之量係變化的並且經選擇以靶向在2%至10%範圍內之不同含量之馬來醯亞胺官能化。將反應物加熱至70℃並保持2小時。
經由脫鹽程序自反應去除過量的AEM及DMTMM。將HIPREP™ 26/10脫鹽管柱安裝於ÄKTA™純化系統(GE Life Sciences)上並用10 mM乙酸鈉(pH 4.0)150 mM NaCl平衡。將純淨的反應物注射至管柱上，且根據302 nm處之吸光度收集HA-mal峰，並使用離心超濾裝置濃縮至大於5 mg/mL。使用紫外可見光分光光度計藉由在302 nm處之吸光度量測HA-mal存儲溶液中之馬來醯亞胺濃度，且經由具有多角度光散射之粒徑篩析層析(SEC-MALS)來評價每個HA鏈之馬來醯亞胺基團之莫耳比。(iii) Fab-C 至 HA-mal 之偶聯
使用1 M磷酸鹽(pH 6.5)將Fab-C溶液之pH調節至6.5至50 mM之最終磷酸鹽濃度，並將乙二胺四乙酸(EDTA)摻加至2.5 mM之最終濃度。攪拌Fab-C溶液並向其中添加HA-mal，將其稀釋至由10 mM磷酸鹽(pH 6.5)、150 mM NaCl及2.5 mM EDTA構成之反應緩衝液中。在最終反應中以1.2莫耳Fab-C/莫耳馬來醯亞胺設定化學計量學，並且設定體積以得到1 mg/mL之最終蛋白質濃度。在室溫下在攪拌下實施偶聯反應。在3小時時，以2莫耳/莫耳馬來醯亞胺添加巰基乙醇以對未反應之馬來醯亞胺基團進行封端。30分鐘後，用10 mM磷酸鹽(pH 6.5)將反應物稀釋至小於50 mM NaCl。
使用粒徑篩析層析法(SEC)實施純化以使游離Fab-C及Fab二聚體與偶聯物分離。用10 mM HisHCl (pH5.5) 150 mM NaCl平衡HILOAD® 26/600 SUPERDEX® 200pg管柱(GE Healthcare)，並將反應物以純淨形式注射。分開溶析與偶聯物、Fab二聚體及Fab單體相關之峰並收集偶聯物峰。(iv) 藉由 SEC-RI-MALS 分析 HA-Fab 偶聯物
藉由SEC-RI-MALS-QELS (粒徑篩析層析(SEC)、折射指數(RI)多角度光散射(MALS)及準彈性光散射(QELS)之組合)在帶有Wyatt OPTILAB® T-rEX™折射指數(RI)檢測器及Wyatt HELEOS™-II多度光散射(MALS)檢測器之Agilent 1200 HPLC上評價殘餘游離Fab含量、總偶聯物莫耳質量及蛋白質質量分數。對於SEC，串聯運行兩個管柱：ACCLAIM™ 7.8×150 mm 1000Å孔徑，隨後ACCLAIM™ 7.8×150 mm 300 Å孔徑，其中磷酸鹽緩衝鹽水(PBS) (pH 7.4)作為運行緩衝液。使用牛血清白蛋白(BSA)對照來正規化MALS檢測器並校正檢測器之間之帶增寬。藉由對對應於Fab及HA-Fab偶聯物之UV A280 峰進行積分來量測游離Fab含量。將偶聯物莫耳質量視為偶聯物峰之重量平均分子量(Mw)。使用差示折射指數(dRI)及UV A280 信號使用蛋白偶聯物分析來計算蛋白質質量分數。(v) HA-G6.31.AARR 偶聯物生理應激及分析
將經純化偶聯物以緩衝液交換至PBS中並摻加2 mM疊氮化鈉及0.01%聚山梨醇酯20 (PBSTN)。以Fab為基礎，最終濃度為約5 mg/mL。密封試樣並在37℃下培育。此條件用作玻璃體液之代替(模仿玻璃體之pH、溫度及離子強度)。5 mg/mL濃度代表用於評估玻璃體中沈澱傾向之「有壓力」濃度(4 mL人類玻璃體中之2 mg劑量等效於0.5 mg/mL Fab)。在指定時間點取出試樣，在具有0.01%聚山梨醇酯20及10% (w/v)海藻糖之10 mM HisHCl (pH5.5)中稀釋至1 mg/mL，並評估可溶性蛋白濃度(A280 )、濁度(A450 )、SEC保留時間及分子量(藉由上述SEC-RI-MALS得到之Mn及Mw)。(B) 結果 (i) 材料之表徵
表6列示此研究中所使用之九種偶聯物之SEC-RI-MALS表徵結果。偶聯物在HA主鏈MW (40 kDa、200 kDa或600 kDa)及Fab加載量方面不同。試樣名稱以HA主鏈MW (kDA)隨後Fab加載量(%)給出。表 6 ： HA-G6.31.AARR 起始材料之 SEC-RI-MALS 表徵結果
使用SEC-RI-MALS藉由實驗評估HA-G6.31.AARR偶聯物之多分散性(圖1C)。HA40K、HA200K及HA600K偶聯物之多分散性指數分別為1.58、1.78及1.41。(ii) 生理應激下之偶聯物穩定性
在生理應激條件下，一些HA-G6.31.AARR偶聯物在PBSTN中長時間培育時顯示顯著物理變化。平均分子量(Mw，重量平均分子量)隨時間之移位可最明顯地證明此變化，如圖2中所顯示。儘管一些試樣在12週研究中沒有改變Mw，但改變之彼等皆顯示隨時間推移Mw降低。Mw降低之程度取決於HA主鏈分子量及Fab加載量。通常，觀察到在HA分子量及Fab加載較高之試樣中出現沈澱。
為理解此Mw移位，對所培育HA-G6.31.AARR偶聯物之SEC保留曲線實施分析。在長時間培育後，SEC保留時間移位至較晚的時間，從而指示偶聯物之平均群體隨時間逐漸變小(圖3)。由於SEC保留時間完全由主鏈HA分子量(而不是由Fab加載)來定義，故此觀察指示：(a)整個偶聯物分子群體隨時間變小，或(b)較高分子量亞群體自溶液沈澱出來，導致明顯移位至較小偶聯物。該等數據亦總結於表7中，其中顯示研究開始(T0)及第12週之保留時間之間之差異。表 7 ： 研究開始時及暴露於生理條件後 12 週時 HA-G6.31.AARR 穩定性試樣之 SEC 保留時間
藉由SEC及MALS量測之該等變化係與較高HA主鏈分子量及較高Fab加載試樣在較晚時間點含有可見沈澱物之視覺觀察結果平行。此觀察結果支持後面對SEC保留曲線觀察到之移位之解釋，亦即較高分子量之HA亞群發生沈澱且導致溶液中剩餘之平均群體發生移位。
進一步支持此假設的係對SEC-RI-MALS數據的再分析，其檢查HA-G6.31.AARR偶聯物關於分子量之分佈，如圖4中所顯示。對於40K HA主鏈試樣(左圖)，在長時間暴露於生理條件時，偶聯物分子關於分子量之總體分佈未發生明顯變化。對於600K HA主鏈試樣(右圖)，所有群體分數皆連續移位至較小分子量，指示廣泛的偶聯物分子群體自溶液沈澱出來。對於200K HA主鏈試樣(中圖)，群體分數之移位主要發生在較高分子量的偶聯物分子中。此指示在200K HA主鏈試樣中存在相對穩定及不穩定之偶聯物分子之混合群體。隨著時間的推移，較高分子量之偶聯物分子(相對不穩定的亞群)自溶液沈澱出來，只剩下相對穩定的亞群留在溶液中。(iii) 單分散 HA 偶聯物
基於對多分散HA200K-G6.31.AARR群體內之瞭解，僅較高MW之亞群體驅動物理不穩定性及沈澱，吾人假設自多分散HA主鏈切換為單分散HA主鏈可產生更穩定的抗體偶聯物。
標準市售HA係藉由多步驟製程產生，其中：(a)藉由細菌醱酵合成HA，從而產生極高MW之HA (Mw 1-4 MDa)，(b)自細胞培養物純化HA，及(c)以受控方式化學降解HA，導致HA分子之隨機斷裂。該製程之此最後一步對於產生較低分子量之HA係至關重要的，否則單獨醱酵將不可行。然而，隨機斷裂降解製程亦導致HA分子量之廣泛(即多分散)分佈。
HA亦可經由同步的化學-酶促製程以商業規模來合成(參見Jing等人J. Biol. Chem. 279:42345-42349, 2004; Jing等人Anal. Biochem. 355:183-188, 2006；及美國專利第8,088,604號，該等文獻係以全文引用方式併入本文)。在此製程中，將經純化玻尿酸合酶添加至小HA寡醣(通常係HA四聚體，HA4 )及尿苷二磷酸(UDP)醣UDP葡萄糖醛酸及UDP-N- 乙醯葡萄糖胺之混合物中。玻尿酸合酶使用可用糖以交替方式延伸寡醣片段，導致HA之同步聚合。所得HA聚合物之分子量可藉由起始反應中HA受質(例如HA4 )對糖之比例來控制。此製程之結果係高度單分散之HA聚合物。
為進行比較，在圖5中比較了多分散性及單分散性商購HA之SEC-RI-MALS表徵。最值得注意的是多分散性指數之差異，其對於多分散性HA200K為1.779，且對於單分散性HA150K為1.001。此對於單分散HA之較低水準之多分散性被視為自HA-蛋白質偶聯物之角度提供若干關鍵優點：(a)較容易的分析表徵，此乃因消除HA多分散性使得蛋白質加載量之差異成為試樣異質性之唯一來源；(b)消除總體群體中之較低及較高分子量之HA主鏈，此可消除在HA-G6.31.AARR偶聯物內較高分子量HA主鏈亞群中觀察到之不穩定性及沈澱；及(c)所調配HA-抗體偶聯物之黏度之潛在降低。
在使用多分散及單分散HA起始材料來製備G6.31.AARR偶聯物之情況下，觀察至多分散性之相同差異：多分散HA200K-G6.31.AARR具有1.228之多分散性指數，而單分散HA150K-G6.31.AARR具有1.003之多分散性指數(圖6)。預計此單分散性將由於不存在較高HA主鏈分子量亞群而改良HA-G6.31.AARR偶聯物之穩定性，假定此係造成在多分散HA-G6.31.AARR偶聯物之生理應激下觀察到之不穩定性及沈澱之原因。實例 2 ： 線性 HA 抗體偶聯物之最佳化之 Fab 加載及半胱胺酸改造之位點
單株抗體(mAb)或抗體片段(Fab)至聚合物支架之共價偶聯可藉由多種化學方法來實施，該等化學方法之範圍為胺化學(藉助溶劑可及之離胺酸殘基進行直接醯胺化)至使用受質-識別酶(例如轉麩醯胺酸酶)之化學-酶促偶聯。最近，巰基-馬來醯亞胺偶聯化學獲得了顯著的興趣，乃因其提供優於其他方法之若干關鍵優點：(a)其係位點選擇性的，僅對經還原之溶劑可及之半胱胺酸殘基反應，(b)其係極其快速的反應，(c)含馬來醯亞胺之接頭容易獲得且通常易於合成獲取，(d)半胱胺酸殘基通常可易於併入蛋白質結構中，及(e)巰基-馬來醯亞胺偶聯可在水性條件中在接近中性之pH值下實施。
為產生適合於馬來醯亞胺偶聯之Fab，一種策略係產生Fab-C，其中重鏈序列係藉助鉸鏈肽延伸至第一或第二鉸鏈二硫鍵半胱胺酸位置並在該半胱胺酸殘基處經截短(圖7)。實際上，此方法可潛在地引入多種影響偶聯至聚合物支架之障礙。此游離半胱胺酸殘基與鏈間二硫鍵之空間鄰近性之主要結果係巰基置亂，其中該三個鄰近的半胱胺酸殘基可形成三種可能的二硫鍵構形。該三種可能的二硫鍵構形繪示性地圖解說明於圖8A-8C中。在每一構形中，不同的半胱胺酸殘基被還原，使得其成為與含馬來醯亞胺之聚合物主鏈偶聯之潛在位點。此之結果係Fab與HA主鏈之間之附接位點的異質性，自產品質量、Fab穩定性或偶聯材料之安全性之角度此可能具有影響。
吾人假設將游離半胱胺酸殘基自撓性空間鄰近鉸鏈序列重新定位至Fab上之另一表面位置可減少或消除該等偶聯變體。此方法在性質上類似於THIOMAB™半胱胺酸改造之單株抗體所採用者，其中表面殘基突變為半胱胺酸用於稍後偶聯。在Fab格式中，將表面突變之含半胱胺酸之Fab稱為「ThioFab」。
使用巰基-馬來醯亞胺化學產生之蛋白質-聚合物偶聯物亦可能遭受藉助反向邁克爾加成(reverse-Michael addition)反應之蛋白質自聚合物主鏈之去偶聯。此可導致以pH及溫度依賴性方式自聚合物主鏈緩慢釋放游離蛋白質。此性質亦受半胱胺酸殘基周圍局部化學環境及含馬來醯亞胺之接頭之結構(例如吸電子基團或胺之存在)的影響。基於在THIOMAB™研發中不同半胱胺酸位置之反向邁克爾易發性之發現(參見Shen等人，Nat. Biotechnol. 30:184-189, 2012)，吾人亦預測將游離半胱胺酸自鉸鏈肽移動至表面位置會降低自聚合物主鏈反向邁克爾自由Fab釋放的速率。吾人亦研究了在生理條件下在Fab-C及ThioFab格式分子上模型聚乙二醇(PEG)-馬來醯亞胺聚合物之反向邁克爾去偶聯之速率。(A) 材料及方法 (i) 材料
Lys-C酶係購自Promega (目錄號V1671，Madison，WI)，玻尿酸酶(重組人類PH20，亦稱作HAase)係購自Halozyme (San Diego，CA)，N- 乙基馬來醯亞胺(NEM)係購自Sigma Aldrich (St.Louis，MO)。所定義之甲氧基聚乙二醇馬來醯亞胺(d-mPEG4-Mal，件號10745)係購自Quanta Biodesign (Plain City，OH)。(ii) G6.31.AARR.Fab-C 之有限 Lys-C 消化
對G6.31.AARR.Fab-C試樣實施有限的Lys-C消化。與更傳統的蛋白質之Lys-C消化物相比，「有限」之Lys-C消化物係利用減少量之Lys-C酶且在非變性條件下實施。此導致選擇性的消化G6.31.AARR.Fab-C分子(KTHTC (SEQ ID NO: 61))之鉸鏈肽部分，該部分係在離胺酸殘基之後被裂解。G6.31.AARR.Fab-C存在利用不同條件來測試之四種試樣，(a) +NEM，-消化，(b)+ NEM +消化，(c) -NEM，+消化及(d) -NEM，-消化。
對於每一試樣，向於500 μL 10 mM組胺酸乙酸鹽+ 150 mM氯化鈉(pH 5.5)中之500 μg Fab-C中添加50 μl 1 M Tris + 10 mM NEM(pH 7.5)；對於-NEM試樣，省略NEM。將試樣在37℃培育30分鐘以對任何游離巰基進行封端。接下來將Lys-C酶以1:500 Lys-C:Fab-C之質量比添加至+Lys-C試樣中。將試樣在37℃培育30分鐘。在消化後，將試樣冷凍以淬滅反應並藉由RP-UPLC-TOF進行分析。(iii) HA200K-G6.31.AARR 之有限 Lys-C 消化
向於500 μL 10 mM組胺酸乙酸鹽+ 150 mM氯化鈉緩衝液(pH 5.5)中之500 μg (以蛋白質為基礎) HA200K-G6.31.AARR中添加50 μL 1 M Tris (pH 7.5)。以1:500 Lys-C:Fab-C之質量比添加Lys-C酶。將試樣在37℃培育過夜。消化後，將試樣冷凍以淬滅反應並藉由RP-UPLC-TOF進行分析。(iv) HA200K-G6.31.AARR 之玻尿酸酶消化物
在500 μL之10 mM組胺酸乙酸鹽+ 150 mM氯化鈉(pH5.5)中稀釋500μg (以蛋白質為基礎)之HA200K-G6.31.AARR。在偶聯物中每1 μg HA添加10單位(U) HAase。將反應混合物在37℃培育4小時。消化後，將試樣冷凍以淬滅反應並藉由RP-UPLC-TOF進行分析。(v) 模型 G6.31.AARR-PEG 偶聯物之反向邁克爾介導之去偶聯
將G6.31.AARR.Fab-C、G6.31.AARR.A140C、G6.31.AARR.L174C及G6.31.AARR.K149C之緩衝液交換為10 mM磷酸鹽(pH 6.5)、150 mM NaCl、在0.2 mg/mL與0.5 mg/mL之間之2.5 mM EDTA，並添加20倍莫耳過量之d-mPEG4-Mal。將反應物在室溫下培育2小時，隨後藉由在PD-10管柱(GE Healthcare，Pittsburgh，PA)上脫鹽至PBS (pH 7.4)中來純化。接下來藉由離心超濾將偶聯物濃縮至1 mg/mL，並摻加氧化麩胱甘肽(GSSG)至2 mM之最終濃度。在37℃下培育構築體並定期抽取試樣以藉由RP-UPLC-TOF進行分析。(vi) 反相超高效液相層析飛行時間 (RP-UPLC-TOF) 質譜 (MS) 分析
使用Agilent 6230電噴霧離子化(ESI)-飛行時間(TOF)質譜儀結合Agilent 1290超高效液相層析(UPLC)系統，藉由液相層析-質譜法(LC/MS)分析獲得試樣之完整質量。每個試樣注射大約2.5 μg蛋白質，並藉由反相超高效液相層析(RP-UPLC)進行脫鹽用於直接在線MS分析。使用MassHunter工作站軟體/定性分析(Agilent Technologies Inc.，Santa Clara，CA)將所得光譜去捲積為零電荷狀態。(B) 結果 (i) G6.31.AARR.Fab-C 中之二硫鍵狀態
為證實圖8A-8C中所顯示之三種二硫鍵狀態是否存在於G6.31.AARR.Fab-C中且維持在動態熱力學平衡中，吾人使用NEM及有限的Lys-C消化物使用馬來醯亞胺封端進行一系列實驗來探測三種半胱胺酸殘基之瞬時狀態及其動態重排之能力。
在第一實驗中，用NEM (由於消除任何游離巰基而冷凍二硫鍵狀態)對G6.31.AARR.Fab-C進行封端，且接下來經受有限的Lys-C消化，在預期之游離半胱胺酸殘基之前裂解重鏈鉸鏈肽序列(圖9，第二層析圖)。在RP-UPLC-TOF上進行變性分析時，觀察到與圖8A-8C中呈現之三種二硫鍵狀態相關之物質：(a)完整Fab減去鉸鏈肽(與圖8A相關)；(b)輕鏈加NEM及環化重鏈(與圖8B相關)；及(c)輕鏈加鉸鏈肽及重鏈減鉸鏈肽加NEM (與圖8C相關)。此實驗具體證明G6.31.AARR.Fab-C不以均質狀態存在，但含有三種具有不同二硫鍵構形之不同物種及因此反應性半胱胺酸殘基。
在第二實驗中，使G6.31.AARR.Fab-C經受有限的Lys-C消化，而沒有NEM封端，使半胱胺酸可能發生動態重排(圖9，第三層析圖)。在此實驗中，幾乎所有的RP-UPLC-TOF分析之蛋白質皆處於相同的狀態：Fab減去鉸鏈肽。鑒於第一個實驗之結果，此第二組數據指示，三個游離半胱胺酸動態地且在相對較快的時間標度(30分鐘之實驗持續時間)發生重排。在藉由Lys-C裂解鉸鏈肽之後，三個可能的二硫鍵狀態在三個半胱胺酸殘基之間動態地「置亂」。若在某一時間點形成正確的鏈間二硫鍵，則使得鉸鏈肽序列釋放至溶液中，乃因其先前已由Lys-C裂解。結果係藉助此重排過程將試樣驅向完全正確形成之鏈間二硫鍵。
該兩個實驗證實，G6.31.AARR.Fab-C關於三個近端半胱胺酸殘基可以三個不同的狀態存在且其相對豐度係由動態熱力學平衡來定義。此後一發現至關重要，乃因其指示再處理步驟皆不能完全消除兩個不正確的二硫鍵構形，乃因在任何較短時間段之情況下，該三個半胱胺酸將重新置亂以形成在第一實驗中觀察到之三種變體。(ii) HA-G6.31.AARR.Fab-C 偶聯物中之偶聯變體
儘管該三種二硫鍵變體存在於G6.31.AARR.Fab-C中，但仍然顯示其亦以HA-G6.31.AARR偶聯物中之變體形式存在。為闡明個別G6.31.AARR.Fab-C分子至HA-馬來醯亞胺之偶聯之確切位置，吾人使用兩種酶消化程序。第一種，有限的Lys-C消化，在預期的游離重鏈半胱胺酸殘基之前之鉸鏈肽處裂解G6.31.AARR。在正確偶聯之G6.31.AARR分子中，此處理應將游離的完整G6.31.AARR釋放至溶液中。然而，藉由變性RP-UPLC-TOF分析經消化試樣可鑑別溶液中之另一物質：游離輕鏈加經裂解鉸鏈肽(圖10A)。此物質之存在證實G6.31.AARR.Fab-C之群體係藉助通常由可能源於圖8C中所繪示之二硫鍵變體之鏈間二硫鍵佔據的重鏈半胱胺酸偶聯至HA。
第二酶消化程序保持所有偶聯物完整，但使用玻尿酸酶(HAase)可徹底消化HA主鏈。此不僅允許分析溶液中之游離分子，且亦可分析與小HA寡醣共價附接之偶聯蛋白質。此方法允許在個體層面上直接觀察偶聯物質。在此實驗中，觀察到藉助預期的重鏈末端半胱胺酸正確地偶聯至HA之G6.31.AARR分子；然而，亦發現了藉助圖8B中所繪示之二硫鍵變體之偶聯之直接證據。此係藉由兩個觀察結果來支持：(a)溶液中存在游離環化之重鏈分子；及(b)存在具有共價附接之馬來醯亞胺接頭之HA寡醣加輕鏈(圖10B)。該等物質之存在證實G6.31.AARR.Fab-C之群體係藉由通常由可能源於圖8B中所繪示之二硫鍵變體之鏈間二硫鍵佔據的輕鏈半胱胺酸偶聯至HA。
該兩個消化實驗證實二硫鍵重排確實導致G6.31.AARR.Fab-C與HA-馬來醯亞胺之間之附接位點之變化。預計此觀察結果適用於任何用於偶聯之含馬來醯亞胺之聚合物主鏈及任何含有三個半胱胺酸殘基緊密靠近之此構形的Fab-C。(iii) 設計用於更均質偶聯之含游離半胱胺酸之 Fab
上述數據顯示當將Fab-C分子附接至含馬來醯亞胺之聚合物主鏈時存在三種偶聯變體。此偶聯異質性係由熱力學平衡中存在三種不同的二硫鍵構形造成的，其中每一構形使不同的半胱胺酸殘基可用於影響偶聯。該三種二硫鍵構形係可能的，可能受若干因素(包括預期游離鉸鏈半胱胺酸殘基與鏈間二硫鍵之接近度及游離半胱胺酸所附接之鉸鏈肽序列之撓性)之影響。
為避免游離半胱胺酸與鏈間二硫鍵置亂，吾人設想將游離半胱胺酸自鏈間二硫鍵進一步移動。因此，吾人將標準Fab格式分子之典型鉸鏈序列截短，並將Fab之表面殘基突變為半胱胺酸殘基。選擇該等位點使得其距離HVR足夠遠以免負面地影響抗原結合且距離鏈間二硫鍵足夠遠以防止置亂。
對於最初的篩選研究，基於THIOMAB™研發之先前報導選擇三個地點以滿足該等準則：LC-K149 (EU編號)、HC-A140 (EU編號)及HC-L174 (EU編號)。每一位點突變為半胱胺酸殘基，且鉸鏈肽係緊接在第一鉸鏈二硫鍵半胱胺酸(即KTHT；SEQ ID NO: 87)之前終止。
為證實該等半胱胺酸位點對HA-馬來醯亞胺仍具有反應性，吾人在典型條件(10 mM磷酸鹽(pH 6.5)、150 mM NaCl及2.5 mM EDTA)下實施引導偶聯，並在過夜培育之後藉由SEC-RI-MALS評估產物。與G6.31.AARR.Fab-C偶聯反應對照(圖11)相比，在適當的保留時間下，偶聯通常伴隨HA-G6.31.AARR偶聯物之生成進行。在ThioFab試樣中注意到之唯一的主要差異係Fab向偶聯物之轉化率較低。此可能係由偶聯反應之相對低的pH (pH 6.5)造成的，與ThioFab改造之半胱胺酸殘基相比，此可能更適合於鉸鏈半胱胺酸之pKa。預計增加偶聯反應之pH將改良ThioFab偶聯物之產量。(iv) Fab-C 及 ThioFab 格式之反向邁克爾加成易發性
將呈Fab-C及ThioFab格式之G6.31.AARR偶聯至模型PEG-馬來醯亞胺構築體，並在37℃下在PBS中與GSSG一起培育以充當游離巰基陷阱(亦即，防止所釋放游離巰基與PEG-馬來醯亞胺發生反向邁克爾加成)，隨後藉由RP-UPLC-TOF定期分析。在Fab-C-PEG構築體中，在前七天觀察到顯著的反向邁克爾去偶聯，導致完整偶聯物損失9.8% (圖12)。ThioFab偶聯物顯示優於Fab-C之可變程度之改良，其中A140C變體顯示在14天內幾乎沒有去偶聯，L174C變體顯示5.9%去偶聯，且K149C變體顯示在同一時間內具有7.1%去偶聯。該等數據表明半胱胺酸突變變體可保護免受反向邁克爾介導之蛋白質去偶聯，且可在保持完整蛋白質-聚合物偶聯物方面提供優於Fab-C格式之顯著優點。實施例 3 ： 用於本發明之抗體偶聯物中之例示性抗 VEGF 抗體
本文所述之任何抗VEGF抗體可用於製備如實例1及2中所述之抗體偶聯物。例如，可使用國際專利申請案第PCT/US2016/053454號中所述之任何抗VEGF抗體。表8闡述可使用之例示性抗VEGF抗體以及每一抗體之VH及VL結構域之胺基酸序列。表9闡述表8中所闡述之抗VEGF抗體之VL HVR胺基酸序列。表10闡述表8中所闡述之抗VEGF抗體之VH HVR胺基酸序列。在具體實施例中，使用抗VEGF抗體G6.31 AARR(在本文中亦稱作「G6.31.AARR」)。表 8 ： 例示性抗 VEGF 抗體之 VH 及 VL 胺基酸序列 表 9 ： 來自表 8 之抗體之 VL HVR 序列 表 10 ： 來自表 8 之抗體之 VH HVR 序列
上文所列示之任何抗體(例如G6.31 AARR)之Fab重鏈之上鉸鏈區可經突變以去除對文獻中已報導之抗IgG1鉸鏈自體抗體之反應性。參見例如Brezski等人，J. Immunol. 181:3183-3192, 2008及Brezski等人，mAbs 2:3, 212-220, 2010。因此，G6.31 AARR重鏈之C末端胺基酸可為T (野生型(WT)型式)或L (缺乏對抗人類IgG Fab之反應性之變體型式)。野生型G6.31 AARR之全長重鏈胺基酸序列係SEQ ID NO: 48。缺乏對抗人類IgG Fab之反應性之變體型式之全長重鏈胺基酸序列係SEQ ID NO: 49。G6.31 AARR及缺乏對抗人類IgG Fab之反應性之變體型式的全長輕鏈胺基酸序列係SEQ ID NO: 50。
下文顯示G6.31.AARR.LC-K149C半胱胺酸改造之抗體變體輕鏈及重鏈之胺基酸序列(LC-C149係用粗體及帶下劃線字體表示)。
輕鏈(LC)： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQQGYGAPFTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW C VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 89)。
重鏈(HC)： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISDYWIHWVRQAPGKGLEWVAGITPAGGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCARFVFFLPYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT (SEQ ID NO: 90)。
下文顯示G6.31AARR.HC-A140C半胱胺酸改造之抗體變體輕鏈及重鏈之胺基酸序列(HC-C140係以粗體下劃線字體表示)。
LC： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQQGYGAPFTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 91)。
HC： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISDYWIHWVRQAPGKGLEWVAGITPAGGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCARFVFFLPYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT C ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT (SEQ ID NO: 92)。
下文顯示G6.31AARR.HC-L174C半胱胺酸改造之抗體變體輕鏈及重鏈之胺基酸序列(HC-C174係以粗體下劃線字體表示)。
LC： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQQGYGAPFTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 93)。
HC： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISDYWIHWVRQAPGKGLEWVAGITPAGGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCARFVFFLPYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV C QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT (SEQ ID NO: 94)。實例 4 ： 相對於自多分散 HA 產生之 HA-G6.31.AARR 偶聯物 ， 自單分散 HA 產生之 HA-G6.31.AARR 偶聯物在生理應激下顯示改良之物理穩定性 (A) 材料及方法
藉由使用多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida )玻尿酸合酶(PmHAS)之化學酶法合成之單分散HA係來自Hyalose (Oklahoma City，OK)。所有其他化學品及試劑皆來自Sigma Aldrich (St. Louis，MO)。
如先前所述用N- (2-胺基乙基馬來醯亞胺)修飾單分散HA (monoHA，Mw 137 kDa，RH 21.2 nm)以含有4.0%馬來醯亞胺基團。接下來如先前所述將G6.31.AARR.Fab-C偶聯至monoHA-馬來醯亞胺主鏈，並藉由SEC在HILOAD® SUPERDEX® 200 pg管柱上用PBS (pH 7.4)運行緩衝液進行純化。彙集偶聯物流份並藉由SEC-RI-MALS來證實。
藉由超濾將經純化monoHA-G6.31.AARR濃縮至於PBS中之5 mg/mL (基於Fab)，摻加疊氮化鈉及聚山梨醇酯20 (PS20)至分別2 mM及0.01%之最終濃度，並在37℃下培育。在取樣時間點，取出試樣並在含有10 mM His-HCl (pH5.5)、150 mM NaCl、10% (w/v)海藻糖及0.01%聚山梨醇酯20之緩衝液中稀釋至1 mg/mL，且接下來分析可溶性蛋白質濃度(A280 )、濁度(A450 )、SEC保留時間及分子量(藉由SEC-RI-MALS測定之Mn及Mw)。(B) 結果
與在相同Fab加載量下用類似大小之多分散HA產生之HA-G6.31.AARR偶聯物相比，使用單分散HA產生之HA-G6.31.AARR偶聯物在四週內顯示極大改良之物理穩定性(圖14)。monoHA-G6.31.AARR之分子量(Mw)自第0週至第2週及第4週略微下降，但此損失可藉由歸因於反向邁克爾去偶聯之游離Fab之損失來徹底解釋，如針對巰基-馬來醯亞胺偶聯之蛋白質通常觀察到者。monoHA-G6.31.AARR之SEC保留時間亦沒有可察覺之移位，指示偶聯物之物理大小不隨時間變化。
該等結果明確支持如下假設：在自多分散HA起始材料產生之HA-G6.31.AARR偶聯物群體內，基於高分子量HA之亞群負責在生理應激之後觀察到之物理不穩定性。藉由均質化HA起始材料(亦即，自單分散HA開始)去除此亞群產生更穩定之偶聯物分子，其在生理應激條件下更不易沈澱。該等數據進一步支持可使用自單分散HA材料產生之HA-G6.31.AARR偶聯物作為治療劑在活體內使用。
儘管出於清楚理解之目的已藉助闡釋及實例詳細闡述了前述發明，但該等闡述及實例不應視為限制本發明之範圍。本文引用之所有專利及科學文獻之公開內容皆明確地以全文引用方式併入。
圖 1A 係顯示200 kDa HA之代表性試樣中分子量(以莫耳質量計)之群體分佈之圖形。
圖 1B 係顯示由具有5%修飾機率之每一酸基團之隨機修飾之蒙特卡洛模擬(Monte Carlo simulation)產生的200 kDa HA鏈上馬來醯亞胺數量之群體分佈的圖形。
圖 1C 係顯示40 kDa、200 kDa及600 kDa HA聚合物之多分散性之圖形。該圖形下面的表顯示所指示試樣之數量平均分子量(Mn)、重量平均分子量(Mw)、多分散性指數(PDI)及分子量(MW)範圍(以Mw表示)。
圖 2 係一系列顯示HA-G6.31.AARR偶聯物在生理相關應激條件下具有物理穩定性差異之圖形，如藉由粒徑篩析層析(SEC)結合折射指數(RI)及多角度光散射(MALS)檢測器(SEC-RI-MALS)所評估。系列標記係指HA主鏈分子量(40 kDa (「40K」)；200 kDa (「200K」)；及600 kDa (「600K」))及Fab加載量。
圖 3 係一系列圖形，其顯示HA40K-G6.31.AARR-4.7%(左圖)、HA200K-G6.31.AARR-4.7%(中圖)及HA600K-G6.31.AARR-2.1%(右圖)隨時間之SEC保留曲線之變化，證明SEC保留時間移位至較晚時間(較小流體動力學大小)，其中此移位程度取決於HA主鏈分子量。
圖 4 係一系列圖形，其顯示HA40K-G6.31.AARR-4.7% (左圖)、HA200K-G6.31.AARR-4.7% (中圖)及HA600K-G6.31.AARR-2.1% (右圖)之作為累積重量分數繪製之SEC-RI-MALS數據。
圖 5 係顯示商業多分散HA (黑色)及單分散HA (灰色)之SEC-RI-MALS表徵結果之圖形，證明兩種產生技術之間之質量分佈差異。右圖中之表顯示藉由此分析測定之Mn、Mw及PDI值。
圖 6 係顯示多分散HA200K-G6.31.AARR(黑色)及單分散HA150K-G6.31.AARR(灰色)之SEC-RI-MALS表徵結果之圖形，證明質量分佈之差異。右圖中之表顯示藉由此分析測定之Mn、Mw及PDI值。
圖 7 係顯示標準Fab-C格式分子經設計以藉由將標準Fab鉸鏈肽序列延伸至第一或第二鉸鏈二硫鍵半胱胺酸而含有可用於偶聯之游離半胱胺酸殘基的示意圖。為最小化或防止鏈間二硫鍵與此游離半胱胺酸殘基之間之置亂，半胱胺酸可替代地在空間上進一步與鏈間二硫鍵分開之位置突變至Fab表面上(在本文中稱為「ThioFab」)。
圖 8A-8C 係一系列示意圖，其顯示鉸鏈序列之撓性及空間鄰近性可導致重排成三種可能的二硫鍵狀態，使得三種不同的半胱胺酸殘基可用於偶聯。圖8A顯示其中鉸鏈序列半胱胺酸減少且可用於偶聯之預期構形。圖8B顯示其中鉸鏈半胱胺酸與通常係鏈間二硫鍵之一部分之HC半胱胺酸殘基形成二硫鍵之環化重鏈(HC)變體，使得輕鏈(LC)鏈間二硫鍵半胱胺酸可用於偶聯。圖8C顯示LC變體，其中鉸鏈半胱胺酸與通常構成鏈間二硫鍵之一部分之LC半胱胺酸形成二硫鍵，使得HC鏈間二硫鍵半胱胺酸可用於偶聯。
圖 9 顯示一系列圖，其顯示一系列馬來醯亞胺封端及有限的Lys-C消化實驗之結果，該等實驗係在G6.31.AARR.Fab-C上實施且藉由反相超高效液相層析飛行時間(RP-UPLC-TOF)質譜分析的。峰上之數值係該峰之總離子計數且係峰面積之量度。
圖 10A 及圖 10B 係一系列圖形，其顯示HA-G6.31.AARR偶聯物之有限Lys-C (圖10A)及玻尿酸酶(HAase) (圖10B)酶促消化之結果，證實偶聯變體之存在與藉助通常由鏈間二硫鍵佔據之兩個半胱胺酸之偶聯相關。
圖 11 係一系列圖形，其顯示與G6.31.AARR.Fab-C相比，G6.31.AARR ThioFab與HA200K-馬來醯亞胺之偶聯正常進行，但ThioFab試樣中Fab向偶聯物之轉化較低。
圖 12 係顯示在37℃下在PBS + 2 mM氧化麩胱甘肽(GSSG)中模型聚乙二醇(PEG)-馬來醯亞胺聚合物自不同格式之G6.31.AARR之去偶聯(如藉由RP-UPLC-TOF所評估)的圖形。
圖 13A 顯示4D5輕鏈之Kabat編號方案。
圖 13B 顯示與4D5抗體之Kabat編號方案(中間列)及EU編號方案(右列)相比，在N末端開始之序列編號方案(左列)。
圖 14 係顯示與自多分散HA產生之類似大小之HA-G6.31.AARR偶聯物相比，自單分散HA產生之HA-G6.31.AARR偶聯物在四週生理應激下顯示改良之物理穩定性之圖形。右圖中之表顯示0週、2週及4週之Mw (kDa)。
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<213> 人工序列
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<223> 合成構築體
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Figure 107109759-A0305-02-0188-60
<210> 47
<211> 232
<212> PRT
<213> 智人
<400> 47
Figure 107109759-A0305-02-0188-61
Figure 107109759-A0305-02-0189-62
<210> 48
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 48
Figure 107109759-A0305-02-0189-63
Figure 107109759-A0305-02-0190-64
Figure 107109759-A0305-02-0191-65
<210> 49
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 49
Figure 107109759-A0305-02-0191-66
Figure 107109759-A0305-02-0192-67
<210> 50
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 50
Figure 107109759-A0305-02-0193-68
Figure 107109759-A0305-02-0194-69
<210> 51
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 51
Figure 107109759-A0305-02-0194-70
Figure 107109759-A0305-02-0195-71
<210> 52
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 52
Figure 107109759-A0305-02-0195-72
<210> 53
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 53
Figure 107109759-A0305-02-0195-73
<210> 54
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 54
Figure 107109759-A0305-02-0196-74
<210> 55
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 55
Figure 107109759-A0305-02-0196-75
<210> 56
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 56
Figure 107109759-A0305-02-0197-76
<210> 57
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 57
Figure 107109759-A0305-02-0197-77
<210> 58
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 58
Figure 107109759-A0305-02-0197-78
<210> 59
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 59
Figure 107109759-A0305-02-0197-79
Figure 107109759-A0305-02-0198-80
<210> 60
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 60
Figure 107109759-A0305-02-0198-81
Figure 107109759-A0305-02-0199-83
<210> 61
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 61
Figure 107109759-A0305-02-0199-84
<210> 62
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 62
Figure 107109759-A0305-02-0199-85
<210> 63
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 63
Figure 107109759-A0305-02-0200-86
<210> 64
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 64
Figure 107109759-A0305-02-0200-87
<210> 65
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 65
Figure 107109759-A0305-02-0201-88
<210> 66
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 66
Figure 107109759-A0305-02-0201-89
<210> 67
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 67
Figure 107109759-A0305-02-0201-90
<210> 68
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 68
Figure 107109759-A0305-02-0201-91
Figure 107109759-A0305-02-0202-92
<210> 69
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 69
Figure 107109759-A0305-02-0203-93
<210> 70
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 70
Figure 107109759-A0305-02-0203-94
<210> 71
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 71
Figure 107109759-A0305-02-0204-95
<210> 72
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 72
Figure 107109759-A0305-02-0204-96
<210> 73
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 73
Figure 107109759-A0305-02-0204-97
<210> 74
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 74
Figure 107109759-A0305-02-0205-98
<210> 75
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 75
Figure 107109759-A0305-02-0205-99
<210> 76
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 76
Figure 107109759-A0305-02-0205-100
<210> 77
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 77
Figure 107109759-A0305-02-0206-101
<210> 78
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 78
Figure 107109759-A0305-02-0206-102
<210> 79
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 79
Figure 107109759-A0305-02-0206-103
<210> 80
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 80
Figure 107109759-A0305-02-0207-104
<210> 81
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 81
Figure 107109759-A0305-02-0207-105
<210> 82
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 82
Figure 107109759-A0305-02-0207-106
<210> 83
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 83
Figure 107109759-A0305-02-0208-107
<210> 84
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 84
Figure 107109759-A0305-02-0208-108
<210> 85
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 85
Figure 107109759-A0305-02-0208-109
<210> 86
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 86
Figure 107109759-A0305-02-0208-110
Figure 107109759-A0305-02-0209-2
<210> 87
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 87
Figure 107109759-A0305-02-0209-111
<210> 88
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 88
Figure 107109759-A0305-02-0209-112
<210> 89
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 89
Figure 107109759-A0305-02-0209-113
Figure 107109759-A0305-02-0210-114
Figure 107109759-A0305-02-0211-115
<210> 90
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 90
Figure 107109759-A0305-02-0211-116
Figure 107109759-A0305-02-0212-117
<210> 91
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 91
Figure 107109759-A0305-02-0213-118
Figure 107109759-A0305-02-0214-119
<210> 92
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 92
Figure 107109759-A0305-02-0214-120
Figure 107109759-A0305-02-0215-121
<210> 93
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 93
Figure 107109759-A0305-02-0216-122
Figure 107109759-A0305-02-0217-123
<210> 94
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 94
Figure 107109759-A0305-02-0217-125
Figure 107109759-A0305-02-0218-126

Claims (32)

  1. 一種抗體偶聯物，其包含(i)特異性結合至血管內皮生長因子(VEGF)之抗體，以及(ii)共價附接至該抗體之玻尿酸(HA)聚合物，其中該HA聚合物具有1.1或更低之多分散性指數(PDI)，其中該抗體包含以下六個高變區(HVR)：(a)HVR-H1，其包含DYWIH(SEQ ID NO：1)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYTRYADSVKG(SEQ ID NO：7)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO：3)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO：8)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS(SEQ ID NO：9)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT(SEQ ID NO：10)之胺基酸序列。
  2. 如請求項1之抗體偶聯物，其中該HA聚合物具有介於1.0與1.07之間之PDI。
  3. 如請求項2之抗體偶聯物，其中該HA聚合物具有介於1.0001與1.06之間之PDI。
  4. 如請求項3之抗體偶聯物，其中該HA聚合物具有1.05之PDI。
  5. 如請求項1至4中任一項之抗體偶聯物，其中：(i)該HA聚合物具有約1兆道爾頓(MDa)或更低之分子量；(ii)該HA聚合物係線性HA聚合物；(iii)該抗體偶聯物具有介於10nm與60nm之間之流體動力學半徑；及/或(iv)該抗體偶聯物具有相對於未共價附接至該HA聚合物之參考抗體增加之眼部半衰期。
  6. 如請求項1至4中任一項之抗體偶聯物，其中該抗體進一步包含以下重鏈可變(VH)結構域框架區(FR)：(a)FR-H1，其包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS(SEQ ID NO：13)之胺基酸序列；(b)FR-H2，其包含WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO：14)之胺基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO：15)之胺基酸序列；及(d)FR-H4，其包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：16)之胺基酸序列。
  7. 如請求項6之抗體偶聯物，其中該抗體進一步包含以下輕鏈可變(VL)結構域框架區(FR)：(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO：17)之胺基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：18)之胺基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO：19)之胺基酸序列；及(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：20)之胺基酸序列。
  8. 如請求項7之抗體偶聯物，其中該VH結構域包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列。
  9. 如請求項7之抗體偶聯物，其中該VL結構域包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列。
  10. 如請求項7之抗體偶聯物，其中：(i)該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列之VH結構域，以及(b)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之VL結構域。
  11. 如請求項1至4中任一項之抗體偶聯物，其中該抗體能夠抑制 VEGF與VEGF受體之結合。
  12. 如請求項11之抗體偶聯物，其中該VEGF受體係VEGF受體1(Flt-1)或VEGF受體2(KDR)。
  13. 如請求項1至4中任一項之抗體偶聯物，其中該抗體以介於75pM與2nM之間之Kd結合hVEGF；具有大於約83.5℃之解鏈溫度(Tm)；及/或具有低於8之等電點(pI)。
  14. 如請求項1至4中任一項之抗體偶聯物，其中該抗體係單株抗體、人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體。
  15. 如請求項14之抗體偶聯物，其中該抗體係抗原結合抗體片段。
  16. 如請求項15之抗體偶聯物，其中該抗體片段係選自由Fab、Fab-C、Fab'-SH、Fv、scFv及(Fab')2片段組成之群。
  17. 如請求項16之抗體偶聯物，其中該抗體片段係Fab或Fab-C。
  18. 如請求項1至4中任一項之抗體偶聯物，其中該抗體係單特異性抗體。
  19. 如請求項1至4中任一項之抗體偶聯物，其中該抗體係多特異性抗體。
  20. 如請求項19之抗體偶聯物，其中該多特異性抗體係雙特異性抗體。
  21. 如請求項1至4中任一項之抗體偶聯物，其中該抗體係半胱胺酸改造之抗體。
  22. 如請求項21之抗體偶聯物，其中該半胱胺酸改造之抗體包含選自由HC-A118C、HC-A140C及HC-L174C(EU編號)組成之群之重鏈半胱胺酸突變，或選自由LC-K149C及LC-V205C(Kabat編號)組成之群之輕鏈半胱胺酸突變。
  23. 如請求項22之抗體偶聯物，其中該HA聚合物在該半胱胺酸突變處共價附接至該抗體。
  24. 如請求項1之抗體偶聯物，其中：(i)該HA聚合物具有介於1.0與1.07之間之PDI；(ii)該HA聚合物具有介於100kDa與250kDa之間之分子量；及/或(iii)該抗體係半胱胺酸改造之抗體。
  25. 如請求項4之抗體偶聯物，其中：(i)該HA聚合物具有介於1.0001與1.06之間之PDI；(ii)該HA聚合物具有介於150kDa與200kDa之間之分子量；及/或(iii)該半胱胺酸改造之抗體包含選自由HC-A118C、HC-A140C及HC-L174C(EU編號)組成之群之重鏈半胱胺酸突變，或選自由LC-K149C及LC-V205C(Kabat編號)組成之群之輕鏈半胱胺酸突變。
  26. 一種抗體偶聯物，其包含(i)特異性結合至VEGF之抗體及(ii)共價附接至該抗體之HA聚合物，其中該HA聚合物具有1.05之PDI，且其中該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列之VH結構域及(b)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之VL結構域。
  27. 一種抗體偶聯物，其包含(i)特異性結合至VEGF之抗體及(ii)共價附接至該抗體之HA聚合物，其中該HA聚合物具有1.05之PDI，及其中該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：49之胺基酸序列之重鏈及(b)包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列之輕鏈。
  28. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至27中任一項之抗體偶聯物及醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。
  29. 一種如請求項1至27中任一項之抗體偶聯物或如請求項28之醫藥組合物之用途，其係用於製備用以(i)治療個體之眼部病症或(ii)減少或抑 制患有眼部病症之個體之血管生成之藥劑。
  30. 如請求項29之用途，其中該眼部病症係選自由以下各項組成之群：黃斑變性、黃斑水腫、、視網膜病變、、其他缺血相關性視網膜病變、脈絡膜新血管形成(CNV)、角膜新血管形成、與角膜新血管形成相關之疾病、視網膜新血管形成、與視網膜/脈絡膜新血管形成相關之疾病、病理性近視、馮希柏-林島氏病、眼睛組織胞漿菌病、家族性滲出性玻璃體視網膜病變(FEVR)、柯滋氏病、諾里氏病、骨質疏鬆症-假性神經膠質瘤症候群(OPPG)、結膜下出血、皮膚發紅、眼部新生血管性疾病、新生血管性青光眼、色素性視網膜炎(RP)、高血壓性視網膜病變、視網膜血管瘤性增殖、黃斑毛細血管擴張症、虹膜新血管形成、眼內新血管形成、視網膜變性、囊樣黃斑水腫(CME)、血管炎、視神經乳頭水腫、視網膜炎、結膜炎、萊伯先天性黑朦、眼色素層炎、脈絡膜炎、眼部組織胞漿菌病、瞼炎、乾眼病、創傷性眼睛損傷及薛格連氏病。
  31. 如請求項29之用途，其中該眼部病症係年齡相關性黃斑變性(AMD)、糖尿病性黃斑水腫(DME)、糖尿病性視網膜病變(DR)、早產兒視網膜病變(ROP)或視網膜靜脈阻塞(RVO)。
  32. 如請求項31之用途，其中該眼部病症係AMD、DME、DR或RVO。
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