KR20190138636A - 안구 장애의 치료를 위한 최적화된 항체 조성물 - Google Patents

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KR20190138636A
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패트릭 쾨닉
칭웨이 비비안 리
카티칸 라자고팔
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제넨테크, 인크.
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Abstract

본 발명은 폴리머 (예를 들어, 하이알루론산 (HA) 폴리머)에 공유결합된 항체 (예를 들어, 항-VEGF 항체)를 포함하는 항체 콘주게이트, 시스테인 조작된 항체, 그의 약제학적 조성물, 및, 예를 들어 병리적 혈관신생 (예를 들어, 안구 장애)와 연관된 장애의 치료를 위한 그의 용도를 제공한다.

Description

안구 장애의 치료를 위한 최적화된 항체 조성물
서열목록
본원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출되었고 전체적으로 본 명세서에 참고로 통합되어 있는 서열목록을 포함한다. 상기 ASCII 복사물 (2018년 3월 22일 창작)는, 50474-160WO3_Sequence_Listing_3.22.18_ST25로 명명되고, 그 크기는 57,671 바이트이다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 항체 콘주게이트, 시스테인 조작된 항체, 그의 조성물 (예를 들어, 약제학적 조성물), 및 그의 사용 방법에 관한 것이다.
혈관신생은 신규한 혈관이 기존의 혈관으로부터 형성되도록 하는 엄격하게-조절된 과정이다. 혈관신생은 적절한 혈액 순환을 보장하기 위해 발전 동안에 중요하지만, 많은 장애가 병리적 혈관신생, 예컨대 안구 장애 (예를 들어, 연령 관련 황반변성, AMD) 및 세포 증식성 장애 (예를 들어, 암)와 연관된다. 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)는 혈관신생의 임상적으로-입증된 드라이버이며, VEGF의 중화 (예를 들어, 항-VEGF 차단 항체를 사용함)는 병리적 신생혈관과 연관된 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
병리적 혈관신생 (예를 들어, AMD (예를 들어, 습성 AMD), 당뇨병성 황반 부종 (DME), 당뇨 망막병증 (DR), 및 망막 정맥 폐색 (RVO))과 연관된 안구 장애의 치료를 위한 현행 접근법은 전형적으로 VEGF 길항제 (예를 들어, 항-VEGF Fab 라니비주맙)의 유리체내 주사를 포함한다. 항-VEGF Fab의 작용 부위가 망막에서 안구 뒤쪽에 있고, Fab가 눈에서 상대적으로 짧은 체류 시간을 가질 수 있기 때문에, 항-VEGF Fab로부터 최대 환자 이익은 전형적으로 유리체내 주사에 의한 상대적으로 빈번한 투약 (예를 들어, 4주마다, Q4W)에 의해 수득된다. 안구 장애에 대한 항-VEGF 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, Fab)의 지속작용성 전달은, 적어도 부분적으로, 투여 빈도를 감소시키기 위해 바람직할 수 있으며, 이는 환자 편리 및 순응도를 개선시킬 수 있다.
안구 장애 (예를 들어, AMD (예를 들어, 습성 AMD), 당뇨병성 황반 부종 (DME), 당뇨 망막병증 (DR), 및 망막 정맥 폐색 (RVO))의 치료를 위해 지속작용성 전달을 위한 항체 조성물에 대한 요구가 남아 있다.
본 발명은 항체 (예를 들어, 항-VEGF 항체)에 공유결합된 단분산 폴리머 (예를 들어, 단분산 하이알루론산 (HA) 폴리머)를 포함하는 항체 콘주게이트, 예를 들어, 항체 콘주게이트를 제조하는데 사용될 수 있는 시스테인 조작된 항체, 항체 콘주게이트를 포함하는 조성물 (예를 들어, 약제학적 조성물), 뿐만 아니라 예를 들어, 치료 용도를 위해 항체 콘주게이트를 제조 및 사용하는 방법을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 (i) 항체 및 (ii) 상기 항체에 공유결합된 하이알루론산 (HA) 폴리머를 포함하는 항체 콘주게이트를 특징으로 하고, 상기 HA 폴리머는 1.1 이하의 다분산도 지수 (PDI)를 갖는다. 일부 구현예에서, HA 폴리머는 1.0 내지 1.1의 PDI를 갖는다. 일부 구현예에서, HA 폴리머는 1.0 내지 약 1.05의 PDI를 갖는다. 일부 구현예에서, HA 폴리머는 약 1.0001 내지 약 1.05의 PDI를 갖는다. 일부 구현예에서, HA 폴리머는 약 1.001의 PDI를 갖는다. 일부 구현예에서, HA 폴리머는 약 1 메가달톤 (MDa) 이하의 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, HA 폴리머는 약 25 kDa 내지 약 500 kDa의 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, HA 폴리머는 약 100 kDa 내지 약 250 kDa의 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, HA 폴리머는 약 150 kDa 내지 약 200 kDa의 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, HA 폴리머는 선형 HA 폴리머이다. 일부 구현예에서, 항체 콘주게이트는 약 10 nm 내지 약 60 nm의 유체역학적 반경을 갖는다. 일부 구현예에서, 항체 콘주게이트는 약 25 nm 내지 약 35 nm의 유체역학적 반경을 갖는다. 일부 구현예에서, 유체역학적 반경은 약 20 nM 내지 약 30 nm이다.
이전의 양태의 일부 구현예에서, 항체 콘주게이트는 HA 폴리머에 공유결합되지 않은 참조 항체에 비해 증가된 안구 반감기를 갖는다. 일부 구현예에서, 안구 반감기는 상기 참조 항체에 비해 적어도 약 2-배 증가된다. 일부 구현예에서, 안구 반감기는 상기 참조 항체에 비해 적어도 약 4-배 증가된다. 일부 구현예에서, 안구 반감기는 유리체 반감기이다. 일부 구현예에서, 참조 항체는 상기 항체 콘주게이트의 항체와 동일하다.
이전의 양태의 일부 구현예에서, 항체는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); IL-1β; IL-6; IL-6R; IL-13; IL-13R; PDGF; 안지오포이에틴; 안지오포이에틴 2; Tie2; S1P; 인테그린 αvβ3, αvβ5, 및 α5β1; 베타셀룰린; 아페린/APJ; 에리트로포이에틴; 보체 인자 D; TNFα; HtrA1; VEGF 수용체; ST-2 수용체; 및 AMD 위험에 유전적으로 연결된 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 생물학적 분자에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, VEGF 수용체는 VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, mbVEGFR, 또는 sVEGFR이다. 일부 구현예에서, AMD 위험에 유전적으로 연결된 단백질은 보체 경로 성분 C2, 인자 B, 인자 H, CFHR3, C3b, C5, C5a, 및 C3a; HtrA1; ARMS2; TIMP3; HLA; IL-8; CX3CR1; TLR3; TLR4; CETP; LIPC, COL10A1; 및 TNFRSF10A로 구성된 군으로부터 선택된다.
이전의 양태의 일부 구현예에서, 항체는 VEGF에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 하기 6개의 초가변성 영역 (HVR)을 포함한다: (a) DYWIH (서열번호: 1)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) GX1TPX2GGX3X4X5YX6DSVX7X8 (서열번호: 2)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2로서, 상기 X1는 Ile 또는 His, X2는 Ala 또는 Arg, X3는 Tyr 또는 Lys, X4는 Thr 또는 Glu, X5는 Arg, Tyr, Gln, 또는 Glu, X6는 Ala 또는 Glu, X7는 Lys 또는 Glu, 및 X8는 Gly 또는 Glu인, 상기 HVR-H2; (c) FVFFLPYAMDY (서열번호: 3)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) RASQX1VSTAVA (서열번호: 4)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1로서, 상기 X1는 Asp 또는 Arg인, 상기 HVR-L1; (e) X1ASFLYS (서열번호: 5)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2로서, 상기 X1는 Ser 또는 Met인, 상기 HVR-L2; 및 (f) X1QGYGX2PFT (서열번호: 6)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3로서, 상기 X1는 Gln, Asn, 또는 Thr 및 X2는 Ala, Asn, Gln, 또는 Arg인, 상기 HVR-L3. 일부 구현예에서, 항체는 하기 6개의 HVR을 포함한다: (a) DYWIH (서열번호: 1)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) GITPAGGYTRYADSVKG (서열번호: 7), GITPAGGYEYYADSVKG (서열번호: 21), 또는 GITPAGGYEYYADSVEG (서열번호: 22)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) FVFFLPYAMDY (서열번호: 3)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) RASQDVSTAVA (서열번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) SASFLYS (서열번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) QQGYGAPFT (서열번호: 10) 또는 QQGYGNPFT (서열번호: 23)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.
상기 양태의 일부 구현예에서, 항체는 하기 6개의 HVR을 포함한다: (a) DYWIH (서열번호: 1)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) GITPAGGYTRYADSVKG (서열번호: 7)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) FVFFLPYAMDY (서열번호: 3)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) RASQDVSTAVA (서열번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) SASFLYS (서열번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) QQGYGAPFT (서열번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구현예에서, 항체는 하기 중쇄 가변 (VH) 도메인 프레임워크 영역 (FR)을 추가로 포함한다: (a) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS (서열번호: 13)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1; (b) WVRQAPGKGLEWVA (서열번호: 14)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2; (c) RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR (서열번호: 15)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3; 및 (d) WGQGTLVTVSS (서열번호: 16)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4. 일부 구현예에서, 항체는 하기 경쇄 가변성 (VL) 도메인 FR을 추가로 포함한다: (a) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열번호: 17)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1; (b) WYQQKPGKAPKLLIY (서열번호: 18)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2; (c) GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (서열번호: 19)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3; 및 (d) FGQGTKVEIK (서열번호: 20)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4.
상기 양태의 일부 구현예에서, 항체는 하기 6개의 HVR을 포함한다: (a) DYWIH (서열번호: 1)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) GITPAGGYEYYADSVEG (서열번호: 22)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) FVFFLPYAMDY (서열번호: 3)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) RASQDVSTAVA (서열번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) SASFLYS (서열번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) QQGYGNPFT (서열번호: 23)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구현예에서, 항체는 하기 VL 도메인 FR을 추가로 포함한다: (a) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열번호: 17)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1; (b) WYQQKPGKAPKLLIY (서열번호: 18)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2; (c) GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열번호: 24)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3; 및 (d) FGQGTKVEIK (서열번호: 20)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4.
상기 양태의 일부 구현예에서, 항체는 하기 6개의 HVR을 포함한다: (a) DYWIH (서열번호: 1)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) GITPAGGYEYYADSVEG (서열번호: 22)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) FVFFLPYAMDY (서열번호: 3)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) RASQDVSTAVA (서열번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) SASFLYS (서열번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) QQGYGAPFT (서열번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구현예에서, 항체는 하기 VL 도메인 FR을 추가로 포함한다: (a) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열번호: 17), DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC (서열번호: 25), 또는 DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC (서열번호: 26)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1; (b) WYQQKPGKAPKLLIY (서열번호: 18) 또는 WYQQKPGEAPKLLIY (서열번호: 27)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2; (c) GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (서열번호: 19) 또는 GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC (서열번호: 28)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3; 및 (d) FGQGTKVEIK (서열번호: 20)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4. 일부 구현예에서, 항체는 하기 VH 도메인 FR을 추가로 포함한다: (a) EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (서열번호: 29) 또는 EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS (서열번호: 52)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1; (b) WVRQEPGEGLEWVA (서열번호: 30)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2; (c) RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (서열번호: 31)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3; 및 (d) WGQGELVTVSS (서열번호: 32)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4.
상기 양태의 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호: 11, 40, 또는 42의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; (b) 서열번호: 12, 41, 또는 46의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인. 일부 구현예에서, VH 도메인은 하기 FR을 추가로 포함한다: (a) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS (서열번호: 13)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1; (b) WVRQAPGKGLEWVA (서열번호: 14) 또는 WVRQEPGKGLEWVA (서열번호: 39)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2; (c) RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR (서열번호: 15)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3; 및 (d) WGQGTLVTVSS (서열번호: 16)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4. 일부 구현예에서, VH 도메인은 서열번호: 11의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 도메인은 하기 FR을 추가로 포함한다: (a) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열번호: 17) 또는 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTIDC (서열번호: 45)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1; (b) WYQQKPGKAPKLLIY (서열번호: 18)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2; (c) GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (서열번호: 19), GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDSATYYC (서열번호: 44), 또는 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYC (서열번호: 54)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3; 및 (d) FGQGTKVEIK (서열번호: 20) 또는 FGQGTKVEVK (서열번호: 55)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4. 일부 구현예에서, VL 도메인은 서열번호: 12의 아미노산 서열을 포함한다.
상기 양태의 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
상기 양태의 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
상기 양태의 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
상기 양태의 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
상기 양태의 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호: 33 또는 51의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; (b) 서열번호: 12, 34, 35, 36, 37, 또는 38의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인. 일부 구현예에서, 항체는 하기 FR을 추가로 포함한다: (a) EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (서열번호: 29) 또는 EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS (서열번호: 52)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1; (b) WVRQEPGEGLEWVA (서열번호: 30)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2; (c) RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (서열번호: 31)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3; 및 (d) WGQGELVTVSS (서열번호: 32)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4. 일부 구현예에서, VH 도메인은 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 하기 FR을 추가로 포함한다: (a) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열번호: 17), DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC (서열번호: 25), 또는 DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC (서열번호: 26)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1; (b) WYQQKPGKAPKLLIY (서열번호: 18) 또는 WYQQKPGEAPKLLIY (서열번호: 27)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2; (c) GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (서열번호: 19), GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열번호: 24), 또는 GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC (서열번호: 28)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3; 및 (d) FGQGTKVEIK (서열번호: 20)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4. 일부 구현예에서, VL 도메인은 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 도메인은 서열번호: 35의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 도메인은 서열번호: 36의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 도메인은 서열번호: 37의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 도메인은 서열번호: 12의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 도메인은 서열번호: 38의 아미노산 서열.
상기 양태의 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
상기 양태의 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
상기 양태의 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
상기 양태의 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
상기 양태의 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
상기 양태의 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
상기 양태의 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
상기 양태의 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
상기 양태의 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
상기 양태의 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
상기 양태의 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호: 48의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 (b) 서열번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
상기 양태의 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호: 49의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 (b) 서열번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
이전의 양태 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 항체는 VEGF의 VEGF 수용체에의 결합을 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, VEGF 수용체는 VEGF 수용체 1 (Flt-1)이다. 일부 구현예에서, VEGF 수용체는 VEGF 수용체 2 (KDR)이다.
이전의 양태 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 항체는 약 2 nM 이하의 Kd로 인간 VEGF (hVEGF)에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 약 75 pM 내지 약 2 nM의 Kd로 hVEGF에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 약 75 pM 내지 약 600 pM의 Kd로 hVEGF에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 약 75 pM 내지 약 500 pM의 Kd로 hVEGF에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 bind의 Kd로 hVEGF에 결합한다 약 80 pM. 일부 구현예에서, 항체는 약 60 pM의 Kd로 hVEGF에 결합한다.
이전의 양태 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 항체는 약 83.5 ℃ 초과의 용융 온도 (Tm)를 갖는다. 일부 구현예에서, 항체는 약 85 ℃ 내지 약 91 ℃의 Tm을 갖는다. 일부 구현예에서, 항체는 약 89 ℃의 Tm을 갖는다.
이전의 양태 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 항체는 8 미만의 등전점 (pI)을 갖는다. 일부 구현예에서, 항체는 약 5 내지 약 7의 pI을 갖는다. 일부 구현예에서, 항체는 약 5 내지 약 6의 pI을 갖는다.
이전의 양태 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 항체는 단클론성, 인간, 인간화, 또는 키메라이다.
이전의 양태 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 항체는 VEGF에 결합하는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 항체 단편은 Fab, Fab-C, Fab'-SH, Fv, scFv, 및 (Fab')2 단편으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 항체 단편은 Fab이다.
이전의 양태 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 항체는 단일특이적 항체이다. 이전의 양태 중 임의의 것의 다른 구현예에서, 항체는 다중특이적 항체이다. 일부 구현예에서, 다중특이적 항체는 이중특이적 항체이다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체는 VEGF 및 인터류킨　1β (IL-1β); 인터류킨-6 (IL-6); 인터류킨-6 수용체 (IL-6R); 인터류킨-13 (IL-13); IL-13 수용체 (IL-13R); PDGF; 안지오포이에틴; 안지오포이에틴 2; Tie2; S1P; 인테그린 αvβ3, αvβ5, 및 α5β1; 베타셀룰린; 아페린/APJ; 에리트로포이에틴; 보체 인자 D; TNFα; HtrA1; VEGF 수용체; ST-2 수용체; 및 연령 관련 황반 변성 (AMD) 위험에 유전자적으로 연결된 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 제2 생물학적 분자에 결합한다. 일부 구현예에서, VEGF 수용체는 VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, 막-결합 VEGF-수용체 (mbVEGFR), 또는 가용성 VEGF 수용체 (sVEGFR)이다. 일부 구현예에서, AMD 위험에 유전적으로 연결된 단백질은 보체 경로 성분 C2, 인자 B, 인자 H, CFHR3, C3b, C5, C5a, 및 C3a; HtrA1; ARMS2; TIMP3; HLA; 인터류킨-8 (IL-8); CX3CR1; TLR3; TLR4; CETP; LIPC, COL10A1; 및 TNFRSF10A로 구성된 군으로부터 선택된다.
이전의 양태 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 항체는 시스테인 조작된 항체이다. 일부 구현예에서, 시스테인 조작된 항체는 HC-A118C, HC-A140C, 및 HC-L174C (EU 넘버링)로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄에서의 시스테인 돌연변이, 또는 LC-K149C 및 LC-V205C (카밧 넘버링)로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄에서의 시스테인 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 중쇄에서의 시스테인 돌연변이는 HC-A118C (EU 넘버링)이다. 일부 구현예에서, 중쇄에서의 시스테인 돌연변이는 HC-A140C (EU 넘버링)이다. 일부 구현예에서, 중쇄에서의 시스테인 돌연변이는 HC-L174C (EU 넘버링)이다. 일부 구현예에서, 경쇄에서의 시스테인 돌연변이는 LC-K149C (카밧 넘버링)이다. 일부 구현예에서, 경쇄에서의 시스테인 돌연변이는 LC-V205C (카밧 넘버링)이다. 일부 구현예에서, HA 폴리머는 시스테인 돌연변이에서 항체에 공유결합된다.
또 다른 양태에서, 이전의 항체 콘주게이트 중 임의의 것은 약제로서 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 이전의 항체 콘주게이트 중 임의의 것은 대상체에서 안구 장애를 치료하기 위한 약제의 제조에서 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 이전의 항체 콘주게이트 중 임의의 것은 안구 장애를 가지고 있는 대상체에서 혈관신생을 감소 또는 억제하는데 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 이전의 항체 콘주게이트 중 임의의 것은 대상체에서 안구 장애를 치료하는데 사용될 수 있다.
이전의 양태 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 안구 장애는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 연령 관련 황반 변성 (AMD), 황반 변성, 황반 부종, 당뇨병성 황반 부종 (DME) (초점, 비-중심 DME 및 확산, 중심-관여된 DME 포함), 망막증, 당뇨 망막병증 (DR) (증식성 DR (PDR), 비-증식성 DR (NPDR), 및 고고도 DR 포함), 다른 허혈-관련된 망막증, 미숙아 망막증 (ROP), 망막 정맥 폐색 (RVO) (중심 (CRVO) 및 분지형 (BRVO) 형태 포함), CNV (근시 CNV 포함), 각막 신생혈관형성, 각막 신생혈관형성과 연관된 질환, 망막 신생혈관형성, 망막/맥락막 신생혈관형성과 연관된 질환, 병리적 근시, 폰 힙펠-린도우병, 눈의 히스토플라마증, 가족성 삼출성 유리체망막병증 (FEVR), 코우츠병, 노리병, 골다공증-거짓신경아교종 증후군 (OPPG), 결막하 출혈, 조홍, 안구 신생혈관 질환, 신생혈관 녹내장, 색소성 망막염 (RP), 고혈압 망막증, 망막 혈관종 증식, 황반 모세혈관확장증, 홍채 신생혈관형성, 안구내 신생혈관형성, 망막 퇴행, 포낭 황반 부종 (CME), 혈관염, 유두부종, 망막염, 결막염 (감염성 결막염 및 비-감염성 (예를 들어, 알러지성) 결막염 포함), 레버 선천성 흑내장, 포도막염 (감염성 및 비-감염성 포도막염 포함), 맥락막염, 안구 히스토플라마증, 눈꺼풀염, 안구 건조, 외상성 눈 손상, 및 쇼그렌병. 일부 구현예에서, 안구 장애는 AMD, DME, DR, 또는 RVO이다. 일부 구현예에서, 안구 장애는 AMD이다. 일부 구현예에서, AMD는 습성 AMD이다. 일부 구현예에서, 안구 장애는 DME이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 항체 콘주게이트 중 임의의 것, 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 추가로, 제2 제제를 포함하고, 상기 제2 제제는 항체, 항-혈관신생제, 사이토카인, 사이토카인 길항제, 코르티코스테로이드, 진통제, 및 제2 생물학적 분자에 결합하는 화합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 항-혈관신생제는 VEGF 길항제이다. 일부 구현예에서, VEGF 길항제는 항-VEGF 항체, 항-VEGF 수용체 항체, 가용성 VEGF 수용체 융합 단백질, 압타머, 항-VEGF DARPin® 또는 VEGFR 티로신 키나제 억제제이다. 일부 구현예에서, 항-VEGF 항체는 라니비주맙 (LUCENTIS®), RTH-258, 또는 이중특이적 항-VEGF 항체이다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항-VEGF 항체는 항-VEGF/항-Ang2 항체이다. 일부 구현예에서, 항-VEGF/항-Ang2 항체는 RG-7716이다. 일부 구현예에서, 가용성 VEGF 수용체 융합 단백질은 아플리베르셉트 (EYLEA®)이다. 일부 구현예에서, 압타머는 페갑타닙 (MACUGEN®)이다. 일부 구현예에서, 항-VEGF DARPin®는 아비시파르 페골이다. 일부 구현예에서, VEGFR 티로신 키나제 억제제는 4-(4-브로모-2-플루오로아닐리노)-6-메톡시-7-(1-메틸피페리딘-4-일메톡시)퀴나졸린 (ZD6474), 4-(4-플루오로-2-메틸인돌-5-일옥시)-6-메톡시-7-(3-피롤리딘-1-일프로폭시)퀴나졸린 (AZD2171), 바탈라닙 (PTK787), 세막사미닙 (SU5416), 및 SUTENT® (수니티닙)로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제2 생물학적 분자는 IL-1β; IL-6; IL-6R; IL-13; IL-13R; PDGF; 안지오포이에틴; 안지오포이에틴 2; Tie2; S1P; 인테그린 αvβ3, αvβ5, 및 α5β1; 베타셀룰린; 아페린/APJ; 에리트로포이에틴; 보체 인자 D; TNFα; HtrA1; VEGF 수용체; ST-2 수용체; 및 AMD 위험에 유전적으로 연결된 단백질로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, VEGF 수용체는 VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, mbVEGFR, 또는 sVEGFR이다. 일부 구현예에서, AMD 위험에 유전적으로 연결된 단백질은 보체 경로 성분 C2, 인자 B, 인자 H, CFHR3, C3b, C5, C5a, 및 C3a; HtrA1; ARMS2; TIMP3; HLA; IL-8; CX3CR1; TLR3; TLR4; CETP; LIPC, COL10A1; 및 TNFRSF10A로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제2 생물학적 분자에 결합된 화합물은 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 일부 구현예에서, 항원-결합 항체 단편은 Fab, Fab-C, Fab'-SH, Fv, scFv, 및 (Fab')2 단편으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 항원-결합 항체 단편은 Fab이다.
또 다른 양태에서, 이전의 약제학적 조성물 중 임의의 것은 약제로서 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 이전의 약제학적 조성물 중 임의의 것은 대상체에서 안구 장애를 치료하기 위한 약제의 제조에서 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 이전의 약제학적 조성물 중 임의의 것은 안구 장애를 가지고 있는 대상체에서 혈관신생을 감소 또는 억제하는데 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 이전의 약제학적 조성물 중 임의의 것은 대상체에서 안구 장애를 치료하는데 사용될 수 있다.
이전의 양태 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 안구 장애는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 연령 관련 황반 변성 (AMD), 황반 변성, 황반 부종, 당뇨병성 황반 부종 (DME) (초점, 비-중심 DME 및 확산, 중심-관여된 DME 포함), 망막증, 당뇨 망막병증 (DR) (증식성 DR (PDR), 비-증식성 DR (NPDR), 및 고고도 DR 포함), 다른 허혈-관련된 망막증, 미숙아 망막증 (ROP), 망막 정맥 폐색 (RVO) (중심 (CRVO) 및 분지형 (BRVO) 형태 포함), CNV (근시 CNV 포함), 각막 신생혈관형성, 각막 신생혈관형성과 연관된 질환, 망막 신생혈관형성, 망막/맥락막 신생혈관형성과 연관된 질환, 병리적 근시, 폰 힙펠-린도우병, 눈의 히스토플라마증, 가족성 삼출성 유리체망막병증 (FEVR), 코우츠병, 노리병, 골다공증-거짓신경아교종 증후군 (OPPG), 결막하 출혈, 조홍, 안구 신생혈관 질환, 신생혈관 녹내장, 색소성 망막염 (RP), 고혈압 망막증, 망막 혈관종 증식, 황반 모세혈관확장증, 홍채 신생혈관형성, 안구내 신생혈관형성, 망막 퇴행, 포낭 황반 부종 (CME), 혈관염, 유두부종, 망막염, 결막염 (감염성 결막염 및 비-감염성 (예를 들어, 알러지성) 결막염 포함), 레버 선천성 흑내장, 포도막염 (감염성 및 비-감염성 포도막염 포함), 맥락막염, 안구 히스토플라마증, 눈꺼풀염, 안구 건조, 외상성 눈 손상, 및 쇼그렌병. 일부 구현예에서, 안구 장애는 AMD, DME, DR, 또는 RVO이다. 일부 구현예에서, 안구 장애는 AMD이다. 일부 구현예에서, AMD는 습성 AMD이다. 일부 구현예에서, 안구 장애는 DME이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 안구 장애를 가지고 있는 대상체에서 혈관신생을 감소 또는 억제시키는 방법을 특징으로 하고, 상기 방법은 상기 대상체에게 본 명세서에 기재된 항체 콘주게이트 중 임의의 것 또는 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물 중 임의의 것의 유효량을 투여하여, 상기 대상체에서 혈관신생을 감소 또는 억제시키는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 안구 장애를 치료하는 방법을 특징으로 하고, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 항체 콘주게이트 중 임의의 것 또는 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물 중 임의의 것의 유효량을 그와 같은 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
이전의 양태 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 안구 장애는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 연령 관련 황반 변성 (AMD), 황반 변성, 황반 부종, 당뇨병성 황반 부종 (DME) (초점, 비-중심 DME 및 확산, 중심-관여된 DME 포함), 망막증, 당뇨 망막병증 (DR) (증식성 DR (PDR), 비-증식성 DR (NPDR), 및 고고도 DR 포함), 다른 허혈-관련된 망막증, 미숙아 망막증 (ROP), 망막 정맥 폐색 (RVO) (중심 (CRVO) 및 분지형 (BRVO) 형태 포함), CNV (근시 CNV 포함), 각막 신생혈관형성, 각막 신생혈관형성과 연관된 질환, 망막 신생혈관형성, 망막/맥락막 신생혈관형성과 연관된 질환, 병리적 근시, 폰 힙펠-린도우병, 눈의 히스토플라마증, 가족성 삼출성 유리체망막병증 (FEVR), 코우츠병, 노리병, 골다공증-거짓신경아교종 증후군 (OPPG), 결막하 출혈, 조홍, 안구 신생혈관 질환, 신생혈관 녹내장, 색소성 망막염 (RP), 고혈압 망막증, 망막 혈관종 증식, 황반 모세혈관확장증, 홍채 신생혈관형성, 안구내 신생혈관형성, 망막 퇴행, 포낭 황반 부종 (CME), 혈관염, 유두부종, 망막염, 결막염 (감염성 결막염 및 비-감염성 (예를 들어, 알러지성) 결막염 포함), 레버 선천성 흑내장, 포도막염 (감염성 및 비-감염성 포도막염 포함), 맥락막염, 안구 히스토플라마증, 눈꺼풀염, 안구 건조, 외상성 눈 손상, 및 쇼그렌병. 일부 구현예에서, 안구 장애는 AMD, DME, DR, 또는 RVO이다. 일부 구현예에서, 안구 장애는 AMD이다. 일부 구현예에서, AMD는 습성 AMD이다. 일부 구현예에서, 안구 장애는 DME이다.
이전의 양태 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, 상기 대상체에게 유효량의 제2 제제을 투여하는 것을 포함하고, 상기 제2 제제는 항체, 항-혈관신생제, 사이토카인, 사이토카인 길항제, 코르티코스테로이드, 진통제, 및 제2 생물학적 분자에 결합하는 화합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 항-혈관신생제는 VEGF 길항제이다. 일부 구현예에서, VEGF 길항제는 항-VEGF 항체, 항-VEGF 수용체 항체, 가용성 VEGF 수용체 융합 단백질, 압타머, 항-VEGF DARPin® 또는 VEGFR 티로신 키나제 억제제이다. 일부 구현예에서, 항-VEGF 항체는 라니비주맙 (LUCENTIS®), RTH-258, 또는 이중특이적 항-VEGF 항체이다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항-VEGF 항체는 항-VEGF/항-Ang2 항체이다. 일부 구현예에서, 항-VEGF/항-Ang2 항체는 RG-7716이다. 일부 구현예에서, 가용성 VEGF 수용체 융합 단백질은 아플리베르셉트 (EYLEA®)이다. 일부 구현예에서, 압타머는 페갑타닙 (MACUGEN®)이다. 일부 구현예에서, 항-VEGF DARPin®는 아비시파르 페골이다. 일부 구현예에서, VEGFR 티로신 키나제 억제제는 4-(4-브로모-2-플루오로아닐리노)-6-메톡시-7-(1-메틸피페리딘-4-일메톡시)퀴나졸린 (ZD6474), 4-(4-플루오로-2-메틸인돌-5-일옥시)-6-메톡시-7-(3-피롤리딘-1-일프로폭시)퀴나졸린 (AZD2171), 바탈라닙 (PTK787), 세막사미닙 (SU5416), 및 SUTENT® (수니티닙)로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제2 생물학적 분자는 IL-1β; IL-6; IL-6R; IL-13; IL-13R; PDGF; 안지오포이에틴; 안지오포이에틴 2; Tie2; S1P; 인테그린 αvβ3, αvβ5, 및 α5β1; 베타셀룰린; 아페린/APJ; 에리트로포이에틴; 보체 인자 D; TNFα; HtrA1; VEGF 수용체; ST-2 수용체; 및 AMD 위험에 유전적으로 연결된 단백질로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, VEGF 수용체는 VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, mbVEGFR, 또는 sVEGFR이다. 일부 구현예에서, AMD 위험에 유전적으로 연결된 단백질은 보체 경로 성분 C2, 인자 B, 인자 H, CFHR3, C3b, C5, C5a, 및 C3a; HtrA1; ARMS2; TIMP3; HLA; IL-8; CX3CR1; TLR3; TLR4; CETP; LIPC, COL10A1; 및 TNFRSF10A로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제2 생물학적 분자에 결합된 화합물은 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 일부 구현예에서, 항원-결합 항체 단편은 Fab, Fab-C, Fab'-SH, Fv, scFv, 및 (Fab')2 단편으로 구성된 군으로부터 선택된다.
이전의 양태 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 항체 콘주게이트 또는 약제학적 조성물은 투여된 유리체내로, 안구로, 안구내로, 공막주변으로, 테논낭하로, 상맥락막으로, 국소적으로, 정맥내로, 근육내로, 진피내로, 경피로, 동맥내로, 복강내로, 병소내로, 두개내로, 관절내로, 전립선내로, 늑막내로, 기관내로, 척추강내로, 비강내로, 질내로, 직장내로, 국소적으로, 종양내로, 복강내로, 복막으로, 심실내로, 피하로, 결막하로, 방광내로, 점막으로, 심막내로, 탯줄내로, 안와내로, 경구로, 경피로, 흡입에 의해, 주사로, 점안액에 의해, 이식에 의해, 주입에 의해, 연속적 주입에 의해, 국소화된 관류 수영 표적 세포에 의해 직접적으로, 카테터에 의해, 세척에 의해, 크림 내에서, 또는 지질 조성물 내에서 투여된다. 일부 구현예에서, 항체 콘주게이트 또는 약제학적 조성물은 투여된 유리체내로, 안구로, 안구내로, 공막주변으로, 테논낭하로, 상맥락막으로, 또는 국소적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 항체 콘주게이트 또는 약제학적 조성물은 투여된 유리체내로 주사로 투여된다. 일부 구현예에서, 항체 콘주게이트 또는 약제학적 조성물은 점안액 또는 연고에 의해 국소적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 항체 콘주게이트 또는 약제학적 조성물은 포트 전달 장치에 의해 투여된다.
이전의 양태 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 상기 대상체는 인간이다.
도 1A는 200 kDa HA의 대표적인 샘플에서 (몰 질량의 관점에서) 분자량의 모집단 분포를 도시하는 그래프이다.
도 1B는 5% 변형 가능성을 갖는 각각의 산성기로 확률론적 변형의 Monte Carlo 모의실험으로부터 유래하는 200 kDa HA 사슬 상의 말레이미드의 수의 모집단 분포를 도시하는 그래프이다.
도 1C는 40 kDa, 200 kDa, 및 600 kDa HA 폴리머의 다분산도를 도시하는 그래프이다. 그래프 아래의 표는 표시된 샘플에 대한 수평균분자량 (Mn), 중량평균분자량 (Mw),다분산도 지수 (PDI), 및 분자량 (MW) 범위 (Mw 관점에서)를 나타낸다.
도 2는 HA-G6.31.AARR 콘주게이트가 굴절률 (RI) 및 다중-각 광산란 (MALS) 검출기 (SEC-RI-MALS)와 인-라인으로 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 평가될 때 생리적으로 관련된 스트레스 상태 하에서 물리적 안정성에서 차이가 있는 것을 나타내는 일련의 그래프이다. 시리즈 라벨은 HA 백본 분자량 (40 kDa ("40K"); 200 kDa ("200K"); 및 600 kDa ("600K") 및 Fab 장입 수준을 지칭한다.
도 3은 SEC 체류 시간이 HA 백본 분자량에 의존하는 이 이동의 정도와 함께 이후 (더 작은 유체역학적 크기)로 이동하는 것을 입증하는, HA40K-G6.31.AARR-4.7% (좌측 패널), HA200K-G6.31.AARR-4.7% (중심 패널),및 HA600K-G6.31.AARR-2.1% (우측 패널)에 대해 경시적으로 SEC 체류 프로파일에서의 변화를 나타내는 일련의 그래프이다.
도 4는 HA40K-G6.31.AARR-4.7% (좌측 패널), HA200K-G6.31.AARR-4.7% (중심 패널), 및 HA600K-G6.31.AARR-2.1% (우측 패널)에 대한 누적 중량 분율로 플롯팅된 SEC-RI-MALS 데이터를 도시하는 일련의 그래프이다.
도 5는 2개 생산 기술 간에 질량 분포에서의 차이를 입증하는 상업적 다분산 HA (흑색) 및 단분산 HA (회색)의 SEC-RI-MALS 특성규명의 결과를 도시하는 그래프이다. 우측 패널에서의 표는 이 분석에 의해 결정된 Mn, Mw, 및 PDI 값을 나타낸다.
도 6은 질량 분포에서의 차이를 입증하는 다분산 HA200K-G6.31.AARR (흑색) 및 단분산 HA150K-G6.31.AARR (회색)의 SEC-RI-MALS 특성규명의 결과를 도시하는 그래프이다. 우측 패널에서의 표는 이 분석에 의해 결정된 Mn, Mw, 및 PDI 값을 나타낸다.
도 7은 표준 Fab-C 형식 분자가 표준 Fab 힌지 펩타이드 서열을 제1 및 제2 힌지 디설파이드 시스테인에 연장함에 의해 콘주게이션에 유용한 유리 시스테인 잔기를 함유하도록 설계된다는 것을 도시하는 개략도이다. 사슬간 디설파이드와 이 유리 시스테인 잔기 사이에 엉킴을 최소화하거나 방지하기 위해, 시스테인은 사슬간 디설파이드로부터 공간적으로 추가로 분리된 한 위치에서 Fab의 표면 상으로 대신 돌연변이될 수 있다 (본 명세서에서 일명 "ThioFab").
도 8A-8C는 힌지 서열의 가요성 및 공간적 근접성이 3개의 가능한 디설파이드 상태로 재배열되어 3개의 상이한 시스테인 잔기가 컨쥬게이션에 이용가능하게 될 수 있다는 것을 도시하는 일련의 개략도이다. 도 8A는 힌지 서열 시스테인이 감소되고 콘주게이션에 이용가능하게 되는 의도된 배치형태를 도시한다. 도 8B는 힌지 시스테인이 정상적으로 사슬간 디설파이드 결합의 일부인 HC 시스테인 잔기와 디설파이드 결합을 형성하여, 경쇄 (LC) 사슬간 디설파이드 시스테인이 콘주게이션에 이용가능하게 되는 고리화된 중쇄 (HC) 변이체를 도시한다. 도 8C는 힌지 시스테인이 정상적으로 사슬간 디설파이드 결합의 일부를 형성하는 LC 시스테인과 디설파이드 결합을 형성하여, HC 사슬간 디설파이드 시스테인이 콘주게이션에 이용가능하게 되는 LC 변이체를 도시한다.
도 9는 G6.31.AARR.Fab-C 상에서 수행되고 역상 초고성능 액체 크로마토그래피 비과시간 (RP-UPLC-TOF) 질량 분광분석법에 의해 분석된 일련의 말레이미드 캡핑 및 제한된 Lys-C 소화 실험의 결과를 나타내는 일련의 그래프를 도시한다. 피크 위의 숫자는 그 피크에 대한 총 이온 수이고 피크 면적의 측정치이다.
도 10A 및 10B는 사슬간 디설파이드에 의해 정상적으로 점유된 양 시스테인을 통해 콘주게이션과 연관된 콘주게이션 변이체의 존재를 확인하는, HA-G6.31.AARR 콘주게이트의 제한된 Lys-C (도 10A) 및 하이알로니다제 (HAase) (도 10B) 효소 소화의 결과를 나타내는 일련의 그래프이다.
도 11은 콘주게이트로 Fab의 전환이 ThioFab 샘플에 대해 더 낮았지만, HA200K-말레이미드에 G6.31.AARR ThioFab의 콘주게이션은 G6.31.AARR.Fab-C에 비교하여 정상적으로 진행되었다는 것을 나타내는 일련의 그래프이다.
도 12는 RP-UPLC-TOF에서 평가될 때 37℃에서 PBS + 2 mM 산화된 글루타티온 (GSSG) 내에서 상이한 포맷의 G6.31.AARR로부터 모델 폴리에틸렌글리콜 (PEG)-말레이미드폴리머의 디콘주게이션을 나타내는 그래프이다.
도 13A는 4D5 경쇄에 대한 카밧 넘버링 반응식을 도시한다.
도 13B는 4D5 항체에 대한 카밧 넘버링 체계 (중간 칼럼) 및 EU 넘버링 체계 (우측 칼럼)와 비교하여 N-말단에서 개시하는 순차적인 넘버링 체계 (좌측 칼럼)를 나타낸다.
도 14는 단분산 HA로부터 생산된 HA-G6.31.AARR 콘주게이트가 다분산 HA로부터 생산된 유사한 크기의 HA-G6.31.AARR 콘주게이트에 비교하여 4주에서 생리적 스트레스 하에서 개선된 물리적 안정성을 나타낸다는 것을 도시하는 그래프이다. 우측 패널에서의 표는 0, 2, 및 4주째에서 Mw (kDa)를 나타낸다.
I. 정의
본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "약"은 이 기술분야에서의 숙련가에게 쉽게 알려진 각각의 값에 대한 일반적인 오차범위를 지칭한다. 본 명세서에서 "약"의 값 또는 파라미터에 대한 언급은 그 값 또는 파라미터 자체에 대한 구현예를 포함한다 (그리고 설명한다).
본 명세서에서의 목적을 위해 "수용체 인간 프레임워크"는 아래에 정의된 바와 같은 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크로부터 유래된 경쇄 가변 도메인 (VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인 (VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크로부터 "유래된" 수용체 인간 프레임워크는 그것의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 아미노산 서열 변경을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 아미노산 변경의 수는 10 또는 그 미만, 9 또는 그 미만, 8 또는 그 미만, 7 또는 그 미만, 6 또는 그 미만, 5 또는 그 미만, 4 또는 그 미만, 3 또는 그 미만, 또는 2 또는 그 미만이다. 일부 구현예에서, VL 수용체 인간 프레임워크는 서열에서 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 공통 프레임워크 서열에 동일하다.
"친화도"는 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그것의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 지칭한다. 그것의 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 제시될 수 있다. 친화도는 본 명세서에서 기재된 것을 포함하여 당해 분야에서 알려진 일반적인 방법에 의해 측정될 수 있다. 결합 친화도를 측정하기 위한 특이적인 설명적이고 예시적인 구현예가 하기에 기재되어 있다.
"친화도 성숙된" 항체는 이러한 변경을 갖지 않는 모체 항체와 비교하여 하나 이상의 초가변 영역 (HVR) 및/또는 프레임워크 영역 (FR)에서 하나 이상의 변경을 갖는 항체를 지칭하고, 이러한 변경은 항원에 대한 항체의 친화도에서 개선을 초래한다.
용어 "혈관 내피 성장 인자" 또는 "VEGF"는 서열번호: 47 (또한 스위스 Prot 수탁번호 P15692, 유전자 ID (NCBI): 7422 참고)에 의해 예시된 바와 같은 혈관 내피 성장 인자 단백질 A를 지칭한다. 용어 "VEGF"는 서열번호: 47의 아미노산 서열뿐만 아니라 이들의 동족체 및 동형체를 갖는 단백질을 포괄한다. 용어 "VEGF"는 또한, 문헌 Ferrara Mol . Biol . Cell. 21:687 (2010), Leung 등, Science, 246:1306 (1989), 및 Houck 등, Mol . Endocrin ., 5:1806 (1991)에서 기재된 바와 같은 VEGF165의 플라스민 절단에 의해 생성된 110-아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자를 포함하여, 자연 발생 대립유전자 및 이들의 가공된 형태와 함께, VEGF의 알려진 동형체, 예를 들어, 스플라이스 동형체, 예를 들어, VEGF111,VEGF121,VEGF145, VEGF165,VEGF189,및 VEGF206을 포괄한다. 용어 "VEGF"는 또한 비-인간 종 예컨대 마우스, 랫트 또는 영장류로부터의 VEGF를 지칭한다. 때때로 특정 종으로부터의 VEGF는 인간 VEGF에 대해 hVEGF, 쥣과 VEGF에 대해 mVEGF, 및 기타 동종의 것과 같은 용어들로 표시된다. 용어 "VEGF"는 또한 165-아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자의 아미노산 8 내지 109 또는 1 내지 109를 포함하는 폴리펩타이드의 절단된 형태를 지칭하기 위해 사용된다. VEGF의 임의의 이러한 형태에 대한 언급은 , 예를 들어, "VEGF109", "VEGF (8-109)", "VEGF (1-109)" 또는 "VEGF165"에 의해 본원에서 확인될 수 있다. "절단된" 고유 VEGF에 대한 아미노산 위치는 고유 VEGF 서열에서 표시된 바와 같이 넘버링된다. 예를 들어, 절단된 고유 VEGF에서 아미노산 위치 17 (메티오닌)은 또한 고유 VEGF에서 위치 17 (메티오닌)이다. 절단된 고유 VEGF는 고유 VEGF에 비교할만한 KDR 및 Flt-1 수용체에 대한 결합 친화도를 갖는다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "VEGF 변이체"는 고유 VEGF 서열에서 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 VEGF 폴리펩타이드를 지칭한다. 선택적으로, 하나 이상의 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환(들)을 포함한다. 본 명세서에서 기재된 VEGF 변이체의 속기 지정의 목적을 위해, 숫자는 (Leung 등(상동) 및 Houck 등(상동)에서 제공된) 추정 고유 VEGF의 아미노산 서열에 따른 아미노산 잔기 위치를 지칭하는 것이 인지된다. 달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "VEGF"는 VEGF-A를 나타낸다.
용어들 "항-VEGF 항체", "VEGF에 결합하는 항체" 및 "VEGF에 특이적으로 결합하는 항체"는 항체가 VEGF를 표적화하는 진단 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 VEGF에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 일 구현예에서, 관련없는, 비-VEGF 단백질에 항-VEGF 항체의 결합의 정도는, 예를 들어, 방사선면역검정 (RIA)에 의해 측정될 때 VEGF에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 구현예에서, VEGF에 결합하는 항체는 ≤1μM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.1 nM, ≤0.01 nM, 또는 ≤0.001 nM (예를 들어 10-8 M 또는 그 미만, 예를 들어, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리상수 (Kd)를 갖는다. 특정 구현예에서, 항-VEGF 항체는 상이한 종으로부터 VEGF 중에 보존된 VEGF의 에피토프에 결합한다.
본 명세서에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 비제한적으로 단클론성 항체, 다클론성 항체, 다중 특이적 항체 (예를 들어, 이중 특이적 항체), 및 이들이 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함한 다양한 항체 구조를 포함한다.
"항체 단편"은 온전한 항체에 결합하는 항원을 결합하는 온전한 항체의 부분을 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 비제한적으로 Fv, Fab, Fab', Fab-C, Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일-사슬 항체 분자 (예를 들어, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이적 항체를 포함한다. 일부 사례에서, 항체 단편의 예는 비제한적으로 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일-사슬 항체 분자 (예를 들어, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이적 항체를 포함한다.
항체의 파파인 소화는, 쉽게 결정화하는 능력을 반영하는 지정인, "Fab" 단편, 및 잔존 "Fc" 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편을 생성한다. Fab 단편은 무거운 (H) 사슬 (VH)의 가변 영역 도메인과 함께 전체 가벼운 (L) 사슬, 및 일 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)으로 구성된다. 항체의 펩신 처리는 2가 항원-결합 활성을 갖는 2개 디설파이드 연결된 Fab 단편에 거의 상당하고 여전히 항원을 가교 결합할 수 있는 단일 큰 F(ab')2 단편을 생성한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함한 CH1 도메인의 카복시 말단에서 추가의 적은 잔기를 가짐으로써 Fab 단편과 다르다. Fab-C 분자는 서열이 제1 힌지 시스테인에서 절단되어, 발현에 의해 직접적으로 유리 시스테인을 갖는 Fab를 유도하도록 발현된 Fab 분자이다 (예를 들어, Shatz 등 Mol . Pharmaceutics 2016; PubMed identifier (PMID) 27244474 참고). 예를 들어, Fab-C 분자는 중쇄의 위치 Cys227에 유리 시스테인을 가질 수 있다. 다른 사례에서, Fab-C 분자는 중쇄의 위치 Cys229에 유리 시스테인을 가질 수 있다. Fab'-SH는 본 명세서에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 보유하는 Fab'에 대한 지정이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 알려져 있다.
본 명세서에서 용어 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부분를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 본 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다.　일 구현예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226으로부터, 또는 Pro230으로부터, 중쇄의 카복실-말단으로 신장한다.　그러나, Fc 영역의 C-말단 라이신 (Lys447)은 존재할 수도 또는 하지 않을 수도 있다. 본 명세서에서 달리 구체화되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌 Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)에서 기재된 바와 같은 EU 넘버링 체계, 또한 소위 EU 지수에 따른다.
"Fv"는 단단한 비-공유 결합에서 하나의 중쇄- 및 하나의 경쇄 가변 영역 도메인의 이량체로 구성된다. 이들 두 도메인의 폴딩으로부터 항원 결합에 대한 아미노산 잔기에 기여하고 항체에 항원 결합 특이성을 부여하는 6개 초가변성 루프 (H 및 L 사슬로부터 각각 3개 루프)가 나온다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 단지 3개의 HVR을 포함하는 절반의 Fv)도 종종 전체 결합 부위보다 낮은 친화도로 되지만, 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
"단일-사슬 Fv" 또한 약칭 "sFv" 또는 "scFv"는 단일 폴리펩타이드 사슬 안으로 연결된 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 바람직하게는, sFv 폴리펩타이드는 sFv가 항원 결합에 대해 원하는 구조를 형성하도록 할 수 있는 VH와 VL 도메인 사이에 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함한다. sFv의 검토에 대해서, 문헌 Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg 및 Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994) 참고.
용어 "디아바디"는 V 도메인의 사슬 간 짝짓기가 아닌 사슬 내 짝짓기를 달성하여, 2가 단편, 즉, 2개의 항원-결합 부위를 갖는 단편을 유도하도록 VH와 VL 도메인 사이에 짧은 링커 (약 5-10 잔기)를 갖는 sFv 단편(이전 단락 참고)을 구축함에 의해 제조된 작은 항체 단편을 지칭한다. 이중 특이적 디아바디는 2개 항체의 VH 및 VL 도메인이 상이한 폴리펩타이드 사슬 상에 존재하는 2개의 "교차" sFv 단편의 이종이량체이다. 디아바디는 예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161; 및 Hollinger 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 90:6444-6448 (1993)에 보다 완전하게 기재되어 있다.
"차단" 항체 또는 "길항제" 항체는 이것이 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 것이다. 특정 차단 항체 또는 길항제 항체는 실질적으로 또는 완전히 항원의 생물학적 활성을 억제한다.
기준 항체와 같이 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 50% 이상으로 경쟁 검정에서 그것의 항원에 대해 기준 항체의 결합을 차단하는 항체를 지칭하고, 반대로, 기준 항체는 50% 또는 그 초과로 경쟁 검정에서 그것의 항원에 대해 항체의 결합을 차단한다. 예시적인 경쟁 검정은 본 명세서에서 제공된다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정 원천 또는 종으로부터 유래되고, 반면에 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 상이한 원천 또는 종으로부터 유래되는 항체를 지칭한다.
항체의 "부류"는 그것의 중쇄에 의해 보유된 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체의 5개 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 있고, 이들 중 몇개는 서브클래스 (아이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 추가로 분할될 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다.
"시스테인 조작된 항체" 또는 "시스테인 조작된 항체 변이체"는 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 항체이다. 특정 사례에서, 시스테인 조작된 항체는 THIOMAB™ 항체 또는 ThioFab 항체로 지칭될 수 있다. 시스테인 조작된 항체의 티올기(들)는 다른 모이어티, 예를 들어, 폴리머 (예를 들어, 단분산 HA 폴리머를 포함한 HA 폴리머)에 접합될 수 있다. 특정 구현예에서, 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 일어난다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함에 의해, 반응성 티올기는 그것에 의해 항체의 접근가능한 부위에 배치되고 그리고 항체를 다른 모이어티, 예컨대 폴리머 (예를 들어, HA 폴리머)에 접합하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 시스테인 조작된 항체는 경쇄 (예를 들어, 카밧 넘버링에 따른 LC-G64C, LC-I106C, LC-R108C, LC-R142C, 또는 LC-K149C) 또는 중쇄 (예를 들어, 카밧 넘버링에 따른 HC-D101C, HC-V184C, 또는 HC-T205C, 또는 EU 넘버링에 따른 HC-T114C, HC-A140C, HC-L174C, HC-L179C, HC-T187C, HC-T209C, HC-V262C, HC-G371C, HC-Y373C, HC-E382C, HC-S424C, HC-N434C, 및 HC-Q438C (즉, 카밧 넘버링에 따른 HC-A136C는 EU 넘버링에 따른 HC-A140C임))에서 시스테인에 대해 비-시스테인 고유 잔기의 단일 돌연변이를 갖는 항체일 수 있다 (도 13A 및 13B 참고). 특정 사례에서, 시스테인 조작된 항체는 HC-A118C, HC-A140C, 및 HC-L174C (EU 넘버링)로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄에서의 시스테인 돌연변이, 또는 LC-V205C 및 LC-K149C (카밧넘버링)로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄에서의 시스테인 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 사례에서, 시스테인 조작된 항체는 각각의 전장 항체 (즉, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 갖는 항체)가 2개의 조작된 시스테인 잔기를 가지고, 각각의 Fab 단편은 하나의 조작된 시스테인 잔기를 가지도록 중쇄 또는 경쇄 중 어느 하나에서 단일 시스테인 돌연변이를 갖는다. 다른 사례에서, 시스테인 조작된 항체는 1 초과 시스테인 돌연변이 (예를 들어, 2, 3, 4, 또는 5 시스테인 돌연변이)를 갖는다.
"유리 시스테인 아미노산"은 모체 항체 안으로 조작되고, 티올 작용기 (-SH)를 가지며, 분자내 또는 분자간 디설파이드 브릿지로서 쌍으로 되지 않는 시스테인 아미노산 잔기를 지칭한다.
용어 "티올 반응성 값"은 유리 시스테인 아미노산의 반응성의 정량적 특성규명이다. 티올 반응성 값은 티올-반응 시약과 반응하고 최대 값 1로 전환되는 시스테인 조작된 항체에서 유리 시스테인 아미노산의 백분율이다. 예를 들어, 티올-반응 시약, 예컨대 바이오틴-말레이미드 시약과 100% 수율로 반응하여 바이오틴-라벨링된 항체를 형성하는 시스테인 조작된 항체상의 유리 시스테인 아미노산은 1.0의 티올 반응성 값을 갖는다. 티올-반응 시약과 90% 수율로 반응하는 동일 또는 상이한 모체 항체 안으로 조작된 또 다른 시스테인 아미노산은 약 0.9의 티올 반응성 값을 갖는다. 티올-반응 시약과 80% 수율로 반응하는 동일 또는 상이한 모체 항체 안으로 조작된 또 다른 시스테인 아미노산은 약 0.8의 티올 반응성 값을 갖는다. 티올-반응 시약과 70% 수율로 반응하는 동일 또는 상이한 모체 항체 안으로 조작된 또 다른 시스테인 아미노산은 약 0.7의 티올 반응성 값을 갖는다. 티올-반응 시약과 60% 수율로 반응하는 동일 또는 상이한 모체 항체 안으로 조작된 또 다른 시스테인 아미노산은 약 0.6의 티올 반응성 값을 갖는다. 티올-반응 시약과 50% 수율로 반응하는 동일 또는 상이한 모체 항체 안으로 조작된 또 다른 시스테인 아미노산은 약 0.5의 티올 반응성 값을 갖는다. 티올-반응 시약과 40% 수율로 반응하는 동일 또는 상이한 모체 항체 안으로 조작된 또 다른 시스테인 아미노산은 약 0.4의 티올 반응성 값을 갖는다. 티올-반응 시약과 30% 수율로 반응하는 동일 또는 상이한 모체 항체 안으로 조작된 또 다른 시스테인 아미노산은 약 0.3의 티올 반응성 값을 갖는다. 티올-반응 시약과 20% 수율로 반응하는 동일 또는 상이한 모체 항체 안으로 조작된 또 다른 시스테인 아미노산은 약 0.2의 티올 반응성 값을 갖는다. 티올-반응 시약과 10% 수율로 반응하는 동일 또는 상이한 모체 항체 안으로 조작된 또 다른 시스테인 아미노산은 약 0.1의 티올 반응성 값을 갖는다. 티올-반응 시약과 반응하는데 전적으로 실패한 동일 또는 상이한 모체 항체 안으로 조작된 또 다른 시스테인 아미노산은 0의 티올 반응성 값을 갖는다. 특정 시스테인의 티올 반응성 값의 결정은 ELISA 검정 (예를 들어, 본 명세서에서 기재된 바와 같은 PHESELECTOR 검정), 질량분광법, 액체크로마토그래피, 자동방사선촬영, 또는 다른 정량적 분석적 시험에 의해 수행될 수 있다.
"모체 항체"는 하나 이상의 아미노산 잔기가 하나 이상의 시스테인 잔기에 의해 대체된 아미노산 서열을 포함하는 항체이다. 모체 항체는 고유 또는 야생형 서열을 포함할 수 있다. 모체 항체는 항체의 다른 고유, 야생형, 또는 변형된 형태에 비하여 기존의 아미노산 서열 변형 (예컨대 첨가, 결실 및/또는 치환)을 가질 수 있다. 모체 항체는 관심 있는 표적 항원, 예를 들어, 생물학적으로 중요한 폴리펩타이드, 예컨대 VEGF에 대한 것일 수 있다. 본 명세서에서 기재된 임의의 항체 (예를 들어, 항-VEGF 항체)는 모체 항체일 수 있다.
"효과기 기능"은 항체 아이소타입에 따라 변하는 항체의 Fc 영역에 기인한 이들 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 효과기 기능의 예는 하기를 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존적 세포-매개된 세포독성 (ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어 B 세포 수용체)의 다운-조절; 및 B 세포 활성화.
"프레임워크" 또는 "프레임워크 영역" 또는 "FR"은 초가변성 영역 (HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3, 및 FR4로 구성된다.
용어들 "전장 항체", "온전한 항체" 및 "전체의 항체"는 고유 항체 구조에 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 또는 본 명세서에서 정의된 바와 같이 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭하기 위해 본 명세서에서 교환가능하게 사용된다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산된 항체의 것에 상응하거나 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-인코딩 서열을 이용하는 비-인간 원천으로부터 유래된 아미노산 서열을 보유하는 것이다. 이 인간 항체의 정의는 구체적으로 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 배제한다.
"인간 공통 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에서 가장 통상적으로 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위그룹으로부터 된다. 일반적으로, 서열의 하위그룹은 문헌 Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3에서와 같은 하위그룹이다. 일 구현예에서, VL의 경우, 하위그룹은 Kabat 등(상동)에서와 같은 하위그룹 카파 I이다. 일 구현예에서, VH의 경우, 하위그룹은 Kabat 등(상동)에서와 같은 하위그룹 III이다.
비-인간 (예를 들어, 설치류) 항체의 "인간화된" 형태는 비-인간 항체로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대개, 인간화된 항체는 수령체의 초가변성 영역으로부터의 잔기가 원하는 항체 특이성, 친화도, 및 능력을 갖는 비-인간종 (공여체 항체) 예컨대 마우스, 랫트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 초가변성 영역으로부터의 잔기에 의해 대체된 인간 면역글로불린 (수령체 항체)이다. 일부사례에서, 인간 면역글로불린의 FR 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 게다가, 인간화된 항체는 수령체 항체 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 개선하기 위해 수행된다. 일반적으로, 인간화된 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 초가변성 루프가 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR이 인간 면역글로불린 서열의 것인, 적어도 하나, 그리고 전형적으로 2개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함할 것이다. 인간화된 항체는 선택적으로 또한 면역글로불린 불변영역 (Fc), 전형적으로 인간 면역글로불린의 것의 적어도 일부분을 포함할 것이다. 추가의 세부사항에 대해서, 문헌 Jones 등, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann 등, Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr . Op. Struct . Biol . 2:593-596 (1992) 참고.
용어 "가변성"은 가변 도메인의 특정 분절이 항체들 중에서 서열이 광범위하게 다르다는 사실을 지칭한다. 가변성 또는 "V" 도메인은 항원 결합을 매개하고 그것의 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 정의한다. 그러나, 가변성은 가변 도메인의 범위에 걸쳐 고르게 분포되어 있지 않다. 대신에, V 영역은 각각 9-12개 아미노산 길이인 "초가변성 영역"이라 불리는 극단적인 가변성의 더 짧은 영역에 의해 분리된 15-30개 아미노산의 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 상대적으로 불변의 스트레치로 구성된다. 본 명세서에서 사용될 때 용어 "초가변성 영역" 또는 "HVR"은 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변성 영역은 일반적으로, 예를 들어, VL에 대략 약 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3), 및 VH에 대략 약 잔기 26-35 (H1), 49-65 (H2) 및 95-102 (H3) (일 구현예에서, H1은 대략 약 잔기 31-35임); 문헌 Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))로부터의 아미노산 잔기 및/또는 "초가변성 루프" (예를 들어, VL에서 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 및 91-96 (L3), 및 VH에서 26-32 (H1), 53-55 (H2), 및 96-101 (H3); 문헌 Chothia and Lesk, J. Mol . Biol . 196:901-917 (1987)로부터의 이들 잔기를 포함한다. 고유 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 각각은 3개의 초가변성 영역에 의해 연결된 베타-시트 배치형태를 주로 채택하는 4개의 FR을 포함하고, 이것은 베타-시트 구조를 연결하고 일부 경우에는 그 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각각의 사슬에서 초가변성 영역은 FR에 의해 근접하여 함께 유지되고, 다른 사슬로부터의 초가변성 영역과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (문헌 Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) 참고). 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL)에서 하기 서열에 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4. 불변 도메인은 항체를 항원에 결합시키는 데 직접적으로 관여하지는 않지만, 항체 의존적 세포 세포독성 (ADCC)에서의 항체의 참여와 같은 다양한 효과기 기능을 나타낸다.
용어 "카밧에서와 같은 가변 도메인 잔기 넘버링" 또는 "카밧에서와 같은 아미노산 위치 넘버링" 및 그것의 변동은 Kabat 등(상동)에서 항체의 편집의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 사용되는 넘버링 시스템을 지칭한다. 이 넘버링 시스템을 사용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR의 단축, 또는 그 안으로 삽입에 상응하는 더 적거나 추가적인 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 후에 단일 아미노산 삽입물 (카밧에 따른 잔기 52a) 및 중쇄 FR 잔기 82 후 삽입된 잔기 (예를 들어 카밧에 따른 잔기 82a, 82b 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 카밧 넘버링은 "표준" 카밧 넘버링된 서열로 항체의 서열의 상동성의 영역에서의 정렬에 의해 주어진 항체에 대해 결정될 수 있다.
카밧 넘버링 시스템은 일반적으로 가변 도메인에서의 잔기 (경쇄의 대략 1-107 잔기 및 중쇄의 1-113 잔기)를 언급할 때 사용된다 (예를 들어, 본 명세서에 전체적으로 참고로 편입된, 문헌 Kabat 등, Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) 참고). "EU 넘버링 시스템" 또는 "EU 지수"는 일반적으로 면역글로불린 중쇄 불변 영역에서 잔기를 언급할 때 사용된다 (예를 들어, Kabat 등(상동)에서 보고된 EU 지수). "카밧에서와 같은 EU 지수"는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 지칭한다. 본 명세서에서 달리 언급되지 않는 한, 항체이다 가변 도메인에서 잔기 번호에 대한 언급은 카밧 넘버링 시스템에 의한 잔기 넘버링을 의미한다. 본 명세서에서 달리 언급되지 않는 한, 항체이다 불변 도메인에서 잔기 번호에 대한 언급은 문헌 Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991에서 기재된 바와 같은 EU 넘버링시스템, 또한 소위 EU 지수에 의한 잔기 넘버링을 의미한다.
달리 나타내지 않는 한, 가변 도메인에서 HVR 잔기 및 다른 잔기 (예를 들어, FR 잔기)는 Kabat 등(상동)에 따라 본 명세서에서 넘버링된다.
본 명세서에서 개시된 다양한 항체를 기술하기 위해 사용될 때 용어 "단리된 항체"는 이것이 발현된 세포 또는 세포 배양물로부터 확인 및 분리되고 및/또는 회수된 항체를 의미한다. 그것의 천연 환경의 오염 물질 성분은 전형적으로 폴리펩타이드의 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이며, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 예를 들어 전기 영동 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전점 전기영동 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온교환 또는 역상 HPLC)에 의해 측정될 때 95% 또는 99% 초과의 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가 방법에 대한 검토는, 예를 들어 Flatman 등, J. Chromatogr . B 848:79-87 (2007) 참고. 바람직한 구현예에서, 항체는 (1) 회전컵 서열분석기의 사용에 의하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 수득하기에 충분한 정도로 정제되거나, (2) 쿠마씨 청색 또는, 바람직하게는, 염색을 사용한 비환원 또는 환원조건 하에서 SDS-PAGE에 의한 균질성으로 정제될 것이다. 단리된 항체는 폴리펩타이드 천연 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 내의 원위치 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로 단리된 폴리펩타이드는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "단클론성 항체"는 실질적으로 균질한항체의 모집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉, 모집단을 포함하는 개별 항체는 자연발생 돌연변이를 함유하거나 또는 단클론성 항체 제제의 생산 도중 발생하는 가능한 변이체 항체를 제외하고는 동일하고 및/또는 동일한 에피토프에 결합하며, 이러한 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다. 전형적으로 상이한 결정인자 (에피토프)에 대해 지향된 상이한 항체를 포함하는 다클론성 항체 제제와는 대조적으로, 단클론성 항체 제제의 각각의 단클론성 항체는 항원상의 단일 결정인자에 대해 지향된다. 따라서, 개질제 "단클론성"은 실질적으로 균질한 항체의 모집단으로부터 수득된 항체의 특성을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 요구하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단클론성 항체는 비제한적으로 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파아지-디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자좌의 모두 또는 일부를 함유하는 형질전환 동물을 이용하는 방법을 포함하는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있고, 단클론성 항체를 제조하기 위한 이러한 방법 및 다른 예시적인 방법이 본 명세서에 기재되어있다.
용어 "다중특이적 항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고 구체적으로 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항체를 포괄하고, 여기서 VH-VL 단위는 폴리에피토프 특이성을 갖는다 (즉, 하나의 생물학적 분자 상의 2개의 상이한 에피토프 또는 상이한 생물학적 분자 상의 각각의 에피토프에 결합할 수 있다). 이러한 다중특이적 항체는, 비제한적으로, 전장 항체, 2 또는 그 초과 VL 및 VH 도메인을 갖는 항체, 항체 단편 예컨대 Fab, Fab', Fab-C. Fv, dsFv, scFv, 디아바디, 이중특이적 디아바디 및 트리아바디, 공유적으로 또는 비-공유적으로 연결된 항체 단편을 포함한다. "폴리에피토프 특이성"은 동일 또는 상이한 표적(들) 상의 2 또는 그 초과의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 지칭한다. "이중의 특이성" 또는 "이중특이성"은 동일 또는 상이한 표적(들) 상의 2개의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 지칭한다. 그러나, 이중특이적 항체에 대조적으로, 이중의-특이적 항체는 아미노산 서열이 동일한 2개의 항원-결합 아암을 가지고 각각의 Fab 아암은 2개의 항원을 인식할 수 있다. 이중의-특이성은 항체가 단일 Fab 또는 IgG 분자로 2개의 상이한 항원과 고친화도로 상호작용할 수 있게 한다. 일 구현예에 따르면, IgG1 형태에서 다중특이적 항체는 5μM 내지 0.001pM, 3μM 내지 0.001pM, 1μM 내지 0.001pM, 0.5μM 내지 0.001pM 또는 0.1μM 내지 0.001pM의 친화도로 각각의 에피토프에 결합한다. "단일특이적"은 단 하나의 에피토프에 결합하는 능력을 지칭한다.
"고유 항체"는 가변 구조를 갖는 자연발생 면역글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들어, 고유 IgG 항체는 디설파이드-결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 구성된, 약 150,000 달톤의 헤테로사량체 당단백질이다. N-말단으로부터 C-말단까지, 각각의 중쇄는 가변 영역 (VH), 또한 소위 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인과, 이어서 3개의 불변 도메인 (CH1, CH2, 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단으로부터 C-말단까지, 각각의 경쇄는 가변 영역 (VL), 또한 소위 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인과, 이어서 불변 가벼운 (CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는 그것의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기반하여, 소위 카파 (κ) 및 람다 (λ)인 2 유형 중 하나에 배정될 수 있다.
표적 분자에 대한 항체의 결합과 관련하여, 특정 폴리펩타이드 또는 특정 폴리펩타이드 표적상의 에피토프에 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합한다" 또는 "그에 대해 특이적"이라는 용어는 비-특이적 상호작용과는 측정가능하게 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은, 예를 들어, 대조군 분자의 결합과 비교하여 분자의 결합을 결정함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합은 표적과 유사한 대조군 분자, 예를 들어 과잉의 비-표지된 표적과의 경쟁에 의해 결정될 수 있다. 이 경우에, 프로브로에 대한 표지된 표적의 결합이 과잉의 비표지된 표적에 의해 경쟁적으로 억제되는 경우 특이적 결합이 지시된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 특정 폴리펩타이드 또는 특정 폴리펩타이드 표적상의 에피토프에 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합한다" 또는 "그에 대해 특이적"이라는 용어는, 예를 들어, 상기 표적에 대해 10-4 M 또는 미만, 대안적으로 10-5 M 또는 미만, 대안적으로 10-6 M 또는 미만, 대안적으로 10-7　M 또는 미만, 대안적으로 10-8 M 또는 미만, 대안적으로 10-9 M 또는 미만, 대안적으로 10-10 M 또는 미만, 대안적으로 10-11 M 또는 미만, 대안적으로 10-12M 또는 미만의 Kd 또는 10-4 M 내지 10-6 M 또는 10-6　M 내지 10-10　M 또는 10-7 M 내지 10-9　M의 범위 내인 Kd를 갖는 분자에 의해 나타날 수 있다. 숙련가에 의해 인정되는 바와 같이, 친화도 및 Kd 값은 역으로 관련된다. 항원에 대한 높은 친화도는 낮은 Kd 값에 의해 측정된다. 일 구현예에서, 용어 "특이적 결합"은 분자가 임의의 다른 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 에피토프에 실질적으로 결합하지 않고 특정 폴리펩타이드 또는 특정 폴리펩타이드 상의 에피토프에 결합하는 결합을 지칭한다.
"항-VEGF 항체를 인코딩하는 핵산"은 단일 벡터 또는 별개의 벡터에서의 이러한 핵산 분자(들)를 포함하여 항체 중쇄 및 경쇄 (또는 이의 단편)를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 지칭하고, 이러한 핵산 분자(들)는 숙주 세포에서 하나 이상의 위치에 존재한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "벡터"는 그것이 연결된 또 다른 핵산을 전파할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 본 용어는 자가-복제 핵산 구조로서의 벡터뿐만 아니라 이것이 도입된 숙주 세포의 게놈 안에 편입된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 이들이 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본 명세서에서 "발현 벡터"로 언급된다.
용어들 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되고 이러한 세포의 자손을 포함하여 외인성 핵산이 도입된 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 일차 형질전환된 세포 및 계대 수에 관계없이 이들로부터 유래된 자손을 포함한, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함한다. 자손은 핵산 함량에서 모체 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있지만, 돌연변이를 함유할 수 있다. 본래 형질전환된 세포에서 선별되거나 선택된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 본 명세서에 포함된다.
참조 폴리펩타이드 서열에 대한 "퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성"은 서열을 정렬하고, 필요한 경우, 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해, 갭을 도입하고 그리고 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않은 후, 참조 폴리펩타이드 서열에서 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열에서 아미노산 잔기의 백분율로 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은, 예를 들어, 공공연하게 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 당 업계의 기술 내에게 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본 명세서에서의 목적을 위해, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc.에 의해 작성되었으며, 소스 코드는 워싱톤 D.C., 20559에 있는 미국 저작권 청에 사용자 문서화로 출원되어, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재의 Genentech, Inc.로부터 공공연하게 이용가능하거나, 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함한 UNIX 운영 체제에서 사용하기 위해 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며 변하지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 이용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대해, 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 % (대안적으로 주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대해, 특정 아미노산 서열 동일성 %를 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 표현될 수 있음)는 아래와 같이 계산된다: 분획 X/Y의 100 배, 여기서 X는 프로그램이 A 및 B의 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일하게 일치할 때 채점된 아미노산 잔기의 수이고, 여기서 Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이에 동등하지 않은 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 %는 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 %와 동등하지 않을 것이다는 것이 인정될 것이다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 아미노산 서열 동일성 % 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞 단락에서 기재된 바와 같이 수득된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "투여하는"는 화합물 (예를 들어, 본 발명의 항체 (예를 들어, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체) 또는 항체 콘주게이트 (예를 들어, 단분산 HA 콘주게이트)) 또는 조성물 (예를 들어, 약제학적 조성물, 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 항체 콘주게이트를 포함하는 약제학적 조성물)의 투약량을 대상체에게 제공하는 방법을 의미한다. 본 명세서에서 기재된 방법에서 이용된 조성물은, 예를 들어, 유리체내로 (예를 들어, 유리체내 주사에 의해), 점안액에 의해, 근육내로, 정맥내로, 진피내로, 경피로, 동맥내로, 복강내로, 병소내로, 두개내로, 관절내로, 전립선내로, 늑막내로, 기관내로, 척추강내로, 비강내로, 질내로, 직장내로, 국소적으로, 종양내로, 복막으로, 피하로, 결막하로, 방광내로, 점막으로, 심막내로, 탯줄내로, 안구내로, 안와내로, 경구로, 국소적으로, 경피로, 흡입에 의해, 주사로, 이식에 의해, 주입에 의해, 연속적 주입에 의해, 국소화된 관류 수영 표적 세포에 의해 직접적으로, 카테터에 의해, 세척에 의해, 크림 내에서, 또는 지질 조성물 내에서 투여될 수 있다. 본 명세서에서 기재된 방법에서 이용된 조성물은 또한 전신으로 또는 국소적으로 투여될 수 있다. 투여 방법은 다양한 인자 (예를 들어, 투여되고 있는 화합물 또는 조성물 및 치료되고 있는 병태, 질환, 또는 장애의 중증도)에 따라 변할 수 있다.
"혈관신생"은, 신규한 혈관이 기존의 혈관으로부터 형성되는 과정을 지칭한다. 혈관신생는 중배엽 세포 전구체로부터 내피 세포의 드 노보 형성인 맥관형성으로부터 뚜렷하다. 병리적 혈관신생과 연관된 장애는 본 발명의 조성물 및 방법에 의해 치료될 수 있다. 예시적인 병리적 혈관신생과 연관된 장애는 안구 병태를 비제한적으로 포함한다 (비제한적인 안구 병태는, 예를 들어, 증식성 당뇨 망막병증을 포함하는 망막증, 맥락막 신생혈관형성 (CNV), 연령 관련 황반 변성 (AMD), 당뇨병성 및 다른 허혈-관련된 망막증, 당뇨병성 황반 부종 (DME), 병리적 근시, 폰 힙펠-린도우병, 눈의 히스토플라마증, 망막 정맥 폐색 (중심 (CRVO) 및 분지형 (BRVO) 형태 포함), 각막 신생혈관형성, 망막 신생혈관형성, 미숙아 망막증 (ROP), 가족성 삼출성 유리체망막병증 (FEVR), 코우츠병, 노리병, 골다공증-거짓신경아교종 증후군 (OPPG), 결막하 출혈, 조홍, 안구 신생혈관 질환, 신생혈관 녹내장, 및 고혈압 망막증을 포함한다). 추가의 안구 장애는 아래에 기재되어 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "안구 장애"는, 병리학적 혈관신생과 연관된 임의의 안구 장애 (또한 본 명세서에서 "안구 병태"와 교환가능하게 언급됨)을 포함한다. 안구 장애는 변경되거나 조절되지 않은 증식 및/또는 신규한 혈관의 안구 조직의 구조 예컨대 망막 또는 각막으로의 침습을 특징으로 할 수 있다. 비제한적인 안구 장애는, 예를 들어, AMD (예를 들어, 습성 AMD, 건조 AMD, 중기 AMD, 진행성 AMD, 및 지리학적 위축증 (GA)), 황반 변성, 황반 부종, DME (예를 들어, 초점, 비-중심 DME 및 확산, 중심-관여된 DME), 망막증, 당뇨 망막병증 (DR) (예를 들어, 증식성 DR (PDR), 비-증식성 DR (NPDR), 및 고고도 DR), 다른 허혈-관련된 망막증, ROP, 망막 정맥 폐색 (RVO) (예를 들어, 중심 (CRVO) 및 분지형 (BRVO) 형태), CNV (예를 들어, 근시 CNV), 각막 신생혈관형성, 각막 신생혈관형성과 연관된 질환, 망막 신생혈관형성, 망막/맥락막 신생혈관형성과 연관된 질환, 병리적 근시, 폰 힙펠-린도우병, 눈의 히스토플라마증, FEVR, 코우츠병, 노리병, OPPG, 결막하 출혈, 조홍, 안구 신생혈관 질환, 신생혈관 녹내장, 색소성 망막염 (RP), 고혈압 망막증, 망막 혈관종 증식, 황반 모세혈관확장증, 홍채 신생혈관형성, 안구내 신생혈관형성, 망막 퇴행, 포낭 황반 부종 (CME), 혈관염, 유두부종, 망막염, 결막염 (예를 들어, 감염성 결막염 및 비-감염성 (예를 들어, 알러지성) 결막염), 레버 선천성 흑내장 (로도 알려지다 레버 선천성 흑내장 또는 LCA), 포도막염 (감염성 및 비-감염성 포도막염 포함), 맥락막염 (예를 들어, 다초점 맥락막염), 안구 히스토플라마증, 눈꺼풀염, 안구 건조, 외상성 눈 손상, 쇼그렌병, 및 다른 안과 질환을 포함하고, 상기 질환 또는 장애는 안구 신생혈관형성, 혈관 누출, 및/또는 망막 부종과 연관된다. 추가의 예시적인 안구 장애는 조홍 (각도의 신생혈관형성)과 연관된 질환 및 모든 형태의 증식성 유리체망막병증을 포함하는 섬유맥관 또는 섬유질 조직의 비정상 증식에 의해 야기된 질환을 포함한다.
예시적인 각막 신생혈관형성과 연관된 질환은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 유행성 각결막염, 비타민 A 결핍, 콘택트 렌즈 과도착용, 아토피성 각막염, 상윤부 각막염, 건성 익상편 각막염, 쇼그렌 증후군, 장미 여드름, 소수포증, 매독, 마이코박테리아 감염, 지질 퇴행, 화학적 화상, 박테리아 궤양, 진균 궤양, 단순 포진 감염, 대상포진 감염, 원생동물 감염, 카포시 육종, 무렌 궤양, 테리엔 변연 변성, 가장자리 각질용해, 류마티스성 관절염, 전신 낭창, 다발동맥염, 트라우마, 베게너 유육종증, 공막염, 스티븐-존슨 증후군, 유사천포창 방사상 각막절개, 및 각막 이식 거부.
예시적인 망막/맥락막 신생혈관형성과 연관된 질환은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 당뇨 망막병증, 황반 변성, 겸상 적혈구 빈혈, 유육종증, 매독, 탄력섬유 가황색종, 파제트병, 정맥 폐색, 동맥 폐색, 경동맥 폐쇄성 질환, 만성 포도막염/유리체염, 마이코박테리아 감염, 라임병, 전신 홍반성 낭창, 미숙아 망막증, 색소성 망막염, 망막 부종 (황반 부종 포함), 이글스 질환, 베체트병, 망막염 또는 맥락막염 (예를 들어, 다초점 맥락막염)을 야기하는 감염, 추정된 안구 히스토플라마증, 베스츠 질환 (난황상 황반 변성), 근시, 시신경 유도소와, 스타가르트병, 평면 부염, 망막 탈착 (예를 들어, 만성 망막 탈착), 과다점성 증후군, 톡소플라스마증, 트라우마, 및 후-레이저 합병증.
"혈관신생 인자 또는 제제"는 혈관의 발달을 자극하고, 예를 들어, 혈관신생, 내피 세포 성장, 혈관의 안정성, 및/또는 맥관형성, 등을 촉진하는 성장 인자이다. 예를 들어, 혈관신생 인자는,, 비제한적으로, 예를 들어, 하기를 포함한다: VEGF 및 VEGF 계열의 구성원, PlGF, PDGF 계열, 섬유모세포 성장 인자 계열 (FGFs), TIE 리간드 (안지오포이에틴), 에프린, Del-1, 섬유모세포 성장 인자: 산성 (aFGF) 및 베이직 (bFGF), 폴리스타틴, 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF), 간세포 성장 인자 (HGF) /산란검출기 인자 (SF), 인터류킨-8 (IL-8), 렙틴, 미드카인, 태반 성장 인자, 혈소판-유래된 내피 세포 성장 인자 (PD-ECGF), 혈소판-유래된 성장 인자, 특히 PDGF-BB 또는 PDGFR-베타, 플레이오트로핀 (PTN), 프로그라눌린, 프롤리페린, 형질전환 성장 인자-알파 (TGF-알파), 형질전환 성장 인자-베타 (TGF-베타), 종양 괴사 인자-알파 (TNF-알파), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)/혈관 투과도 인자 (VPF), 등. 또한 상처 치유를 촉진하는 인자, 예컨대 성장 호르몬, 인슐린-유사 성장 인자-I (IGF-I), VIGF, 표피 성장 인자 (EGF), CTGF 및 그것의 계열의 구성원, 및 TGF-알파 및 TGF-베타를 포함한다. 참고, 예를 들어, Klagsbrun 및 D'Amore, Annu . Rev. Physiol ., 53:217-39 (1991); Streit 및 Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003); Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12):1359-1364 (1999); Tonini 등, Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (예를 들어, 알려진 혈관신생 인자를 열거하는 표 1); 및 Sato, Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003).
"항-혈관신생 제제" 또는 "혈관신생 억제제"는 작은 분자량 서브스턴스, 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 단리된 단백질, 재조합 단백질, 항체, 또는 콘주게이트 또는 이의 융합 단백질을 지칭하되, 이들은 혈관신생, 맥관형성, 또는 바람직하지 않은 혈관 투과도를, 직접적으로 또는 간접적으로 억제한다. 항-혈관신생 제제는 혈관신생 인자 또는 그것의 수용체에 결합하고 그것의 혈관신생 활성을 차단하는 제제들을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 항-혈관신생 제제는 항체 또는 상기에서 정의된 바와 같은 혈관신생제에 대한 다른 길항체, 예를 들어, VEGF 길항제 (예를 들어, VEGF-A 또는 VEGF-A 수용체 (예를 들어, KDR 수용체 또는 Flt-1 수용체)에 대한 항체), PDGF 길항제 (예를 들어, 항-PDGFR 억제제 예컨대 GLEEVECTM (이마티닙 메실레이트))이다. 항-혈관신생 제제는 또한 천연 혈관신생 억제제, 예를 들어, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 등을 포함한다. 참고, 예를 들어, Klagsbrun 및 D'Amore, Annu . Rev. Physiol ., 53:217-39 (1991); Streit 및 Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003) (예를 들어, 악성 흑색종에서 항-혈관신생 요법을 열거하는 표 3); Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12):1359-1364 (1999); Tonini 등, Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (예를 들어, 알려진 항혈관신생 인자를 열거하는 표 2); 및, Sato Int . J. Clin . Oncol ., 8:200-206 (2003) (예를 들어, 표 1은 임상시험에서 사용된 항-혈관신생제를 열거한다).
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "VEGF 길항제"는, VEGF에 결합하고, VEGF 발현 수준을 감소시키거나, 또는 하나 이상의 VEGF 수용체에 결합하는 VEGF를 비제한적으로 포함하는 VEGF 생물학적 활성, VEGF 신호전달, 및 VEGF-매개된 혈관신생 및 내피 세포 생존 또는 증식을 중화, 차단, 억제, 폐기, 감소 또는 방해할 수 있는 분자를 지칭한다. 예를 들어, VEGF 생물학적 활성을 중화, 차단, 억제, 폐기, 감소 또는 방해할 수 있는 분자는 하나 이상의 VEGF 수용체 (VEGFR) (예를 들어, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, 막-결합 VEGF 수용체 (mbVEGFR), 또는 가용성 VEGF 수용체 (sVEGFR))에 결합함으로서 그것의 효과를 발휘할 수 있다. 본 발명의 방법에서 유용한 VEGF 길항제로서 포함되는 것은 VEGF, 항-VEGF 항체 및 이의 항원-결합 단편에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드, 수용체 분자 및 VEGF에 특이적으로 결합함으로써 격리 하나 이상의 수용체, 융합 단백질 (예를 들어, VEGF-Trap (Regeneron)), 및 VEGF121-젤로닌 (Peregrine)에 대한 그것의 결합을 격리하는 유도체이다. VEGF 길항제는 또한 VEGF 폴리펩타이드의 길항제 변이체, VEGF 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자의 단편에 대해 적어도 상보적인 안티센스 핵염기 올리고머; VEGF 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자의 단편에 대해 적어도 상보적인 작은 RNA; VEGF를 표적으로 하는 리보자임; VEGF에 대한 펩티바디; 및 VEGF 압타머를 포함한다. VEGF 길항제는 또한, VEGFR, 항-VEGFR 항체, 및 이의 항원-결합 단편에 결합하는 폴리펩타이드, 및 VEGF 생물학적 활성 (예를 들어, VEGF 신호전달)을 차단, 억제, 폐기, 감소 또는 방해함으로써 VEGFR에 결합하는 유도체, 또는 융합 단백질을 포함한다. VEGF 길항제는 또한, VEGF 또는 VEGFR에 결합하고 VEGF 생물학적 활성을 차단, 억제, 폐기, 감소 또는 방해할 수 있는 비펩타이드 소분자을 포함한다. 따라서, 용어 "VEGF 활성"은 구체적으로 VEGF의 VEGF-매개된 생물학적 활성을 포함한다. 특정 구현예에서, VEGF 길항제는, 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 초과까지, VEGF의 발현 수준 또는 생물학적 활성을 감소 또는 억제한다. 일부 구현예에서, VEGF-특이적 길항제에 의해 억제된 VEGF는 VEGF (8-109), VEGF (1-109), 또는 VEGF165이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 VEGF 길항제는, 비제한적으로, 하기를 포함할 수 있다: 항-VEGFR2 항체 및 관련된 분자 (예를 들어, 라무시루맙, 타니비루맙, 아플리베르셉트), 항-VEGFR1 항체 및 관련된 분자 (예를 들어, 이크루쿠맙, 아플리베르셉트 (VEGF 트랩-아이; EYLEA®), 및 ziv-아플리베르셉트 (VEGF Trap; ZALTRAP®)), 이중특이적 VEGF 항체 (예를 들어, MP-0250, 바누시주맙 (VEGF-ANG2), 및 US 2001/0236388에 개시된 이중특이적 항), 항-VEGF, 항-VEGFR1, 및 항-VEGFR2 아암 중 2개의 조합을 포함하는 이중특이적 항체, 항-VEGF 항체 (예를 들어, 베바시주맙, 세바시주맙, 및 라니비주맙), 및 비펩타이드 소분자 VEGF 길항제 (예를 들어, 파조파닙, 악시티닙, 반데타닙, 스티바가, 카보잔티닙, 렌바티닙, 닌테다닙, 오란티닙, 텔라티닙, 도비티닙, 세디라닙, 모테사닙, 설파티닙, 아파티닙, 포레티닙, 파미티닙, 및 티보자닙). 추가의 VEGF 길항제는 아래에 기재되어 있다.
제제, 예를 들어, 약제학적 제형의 "유효량"은 원하는 치료적 또는 예방적 결과를 달성하기 위해 필요한 투약량 및 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은, 비제한적으로, 사육된 동물 (예를 들어, 소, 양, 고양이, 개, 및 말), 영장류 (예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류 예컨대 원숭이), 토끼, 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 랫트)를 포함한다. 특정 구현예에서, 개체 또는 대상체는 인간이다. "대상체"는 "환자"일 수 있다.
"장애"는 항체로의 치료로부터 유익할 수 있는 임의의 병태이다. 예를 들어, 비정상 혈관신생 (과도하거나, 부적절하거나 조절되지 않는 혈관신생)에 대해 예방을 필요로 하거나 예방해야 하는 포유동물. 이것은 포유동물이 해당 장애에 걸리기 쉬운 이들 병리 상태를 포함한 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함한다. 본 명세서에서 치료되는 장애의 비-제한적인 예는 병리적 혈관신생과 관련된 장애 (예를 들어, 안구 장애)를 포함한다.
용어 "포장 삽입물"은 치료 제품의 상업적 패키지에 관례상 포함된 지침을 지칭하는데 사용되며, 그것은 이러한 치료 제품의 사용에 관한 징후, 용법, 투약량, 투여, 병용요법, 사용금지사유 및/또는 경고에 대한 정보를 포함한다.
"약제학적으로 허용가능한 담체"는 대상체에게 비독성인 활성 성분 이외의 약제학적 제형에서의 성분을 지칭한다. 약제학적으로 허용가능한 담체는, 비제한적으로, 완충액, 부형제, 안정화제, 또는 보존제를 포함한다.
용어 "약제학적 제형"은 그 안에 함유된 활성 성분 (예를 들어, 항체 콘주게이트)의 생물학적 활성이 효과적이 되도록 허용되는 이러한 형태이고 제형이 투여될 수 있는 대상체에게 허용되지 않는 독성을 갖는 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "치료" (및 이들의 문법적 변형 예컨대 "치료한다" 또는 "치료하는")는 치료되는 개체의 자연스러운 과정을 변경하려는 시도에서 임상 개입을 지칭하며, 예방을 위해 또는 임상 병리학의 과정 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료의 효과는, 비제한적으로, 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접 또는 간접적 병리적 결과의 약화, 질병 진행률 감소, 질환 상태의 개선 또는 일시적 처방 및 차도 또는 개선된 예후를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체 콘주게이트 또는 본 발명의 항체 콘주게이트를 포함하는 다른 조성물 (예를 들어, 약제학적 제형)은 질환의 발달을 지연시키거나 질환의 진행을 늦추기 위해 사용된다.
"단리된" 핵산 분자는 통상적으로 핵산의 천연 공급원과 관련되는 적어도 하나의 오염물질 핵산 분자로부터 확인되고 분리된 핵산 분자이다. 단리된 핵산 분자는 그것이 자연에서 발견되는 형태 또는 환경 이외의 것이다. 따라서 단리된 핵산 분자는 그것이 천연 세포에 존재할 때의 핵산 분자와는 구별된다. 그러나, 단리된 핵산 분자는, 예를 들어, 핵산 분자가 천연 세포의 것과 상이한 염색체 위치에 있는 항체를 통상적으로 발현하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함한다.
표현 "조절 서열"은 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 원핵생물에 적합한 조절 서열은, 예를 들어, 프로모터, 선택적으로 오퍼레이터 서열, 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 향상제를 이용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 예비서열 또는 분비성 리더를 위한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 프레단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드를 위한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 향상제는 그것이 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되고; 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 용이하게 하기 위해 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 인접하고, 분비성 리더의 경우 인접하고 판독 단계이 있음을 의미한다. 그러나 향상제는 인접할 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서 결찰에 의해 달성된다. 그러한 부위가 존재하지 않으면, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커는 통상적인 관례에 따라 사용된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되며, 이러한 모든 지정은 자손을 포함한다. 따라서, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"라는 단어는 일차 대상체 세포 및 계대의 횟수에 관계없이 이로부터 유래된 배양물을 포함한다. 고의적이거나 우연한 돌연변이로 인해 모든 자손이 DNA 함량에서 정확하게 동일하지 않을 수도 있다는 것이 또한 이해된다. 본래 형질전환된 세포에서 선별된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 포함된다. 별개의 지정이 의도된 경우, 문맥으로부터 명확해질 것이다.
개시 또는 참조 폴리펩타이드 (예를 들어, 기준항체 또는 그것의 가변 도메인(들)/HVR(들))의 "변이체" 또는 "돌연변이체"는 (1) 개시 또는 참조 폴리펩타이드의 것과 상이한 아미노산 서열을 가지고 (2) 천연 또는 인공 (인조) 돌연변이 유발을 통해 개시 또는 참조 폴리펩타이드로부터 유래된 폴리펩타이드이다. 이러한 변이체는, 예를 들어,본 명세서에서 일명 "아미노산 잔기 변경"인, 관심 폴리펩타이드의 아미노산 서열 내 잔기로부터의 결실 및/또는 그 안으로 삽입 및/또는 이들의 치환을 포함한다. 따라서, 변이체 HVR은 개시 또는 참조 폴리펩타이드 서열 (예컨대, 원천 항체 또는 항원 결합 단편의 서열)과 관련하여 변이체 서열을 포함하는 HVR을 지칭한다. 이 문맥에서, 아미노산 잔기 변경은 개시 또는 참조 폴리펩타이드 서열 (예컨대 기준 항체 또는 이의 단편의 서열)에서 상응하는 위치에서 아미노산과 상이한 아미노산을 지칭한다. 최종 작제물이 원하는 기능적 특성을 보유하는 경우, 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합이 최종 변이체 또는 돌연변이체 작제물에 도달하도록 이루어질 수 있다. 아미노산 변화는 또한 당화 부위의 수 또는 위치를 변화시키는 것과 같이 폴리펩타이드의 번역 후 과정을 변경시킬 수 있다.
"야생형 (WT)" 또는 "참조" 서열 또는 "야생형" 또는 "참조" 단백질/폴리펩타이드, 예컨대 HVR 또는 참조 항체의 가변 도메인의 서열은 변이체 폴리펩타이드가 돌연변이의 도입을 통해 유래된 참조 서열일 수있다. 일반적으로, 주어진 단백질에 대한 "야생형" 서열은 사실상 가장 흔한 서열이다. 유사하게, "야생형" 유전자 서열은 자연에서 가장 통상적으로 발견되는 그 유전자에 대한 서열이다. 돌연변이는 자연적 과정 또는 사람에 유도된 수단을 통해 "야생형" 유전자 (따라서 그것을 인코딩하는 단백질) 안으로 도입될 수 있다. 이러한 과정의 생성물은 최초 "야생형" 단백질 또는 유전자의 "변이체" 또는 "돌연변이체" 형태이다.
"등전점 (pI)"은 분자 (예를 들어, 항체와 같은 단백질)가 순 전하를 보유하지 않는 pH를 의미하며, 또한 당 업계에서 "pH(I)" 또는 "IEP"로 지칭된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "항체 콘주게이트"는 하나 이상의 폴리머에 공유결합된 항체이다. 임의의 적합한 폴리머는 항체, 예를 들어 친수성 폴리머(예를 들어, 하이알루론산 (HA) 또는 폴리에틸렌글리콜 (PEG)) 또는 소수성 폴리머 (예를 들어, 폴리(락트산-코-글라이콜산) (PLGA))에 접합될 수 있다. 특정 구현예에서, 폴리머는 HA (또한 본 명세서에서 일명 "HA 콘주게이트")이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리머"는 선형, 원형, 분지형, 가교결합된, 또는 덴드리머 방식으로 화학 결합에 의해 연결된 반복 구조 단위 (즉, 단량체) 또는 이들의 조합을 포함하는 분자를 의미한다. 폴리머는 합성 또는 자연 발생, 또는 이들의 조합일 수 있다. 용어 "폴리머"는 2 또는 그 초과의 상이한 단량체를 포함하는 폴리머인 공중합체를 포괄하는 것으로 이해해야 한다. 폴리머는 또한 단지 단일 유형의 단량체만을 포함하는 폴리머인 단일 중합체일 수 있다.
용어 "다분산도 지수 (PDI)"는 폴리머의 분자량 분포의 광범위성의 척도를 지칭한다. PDI는 또한 당 업계에서 "분산도 지수", "불균질성 지수", 또는 "분산도 (Ð)"로 지칭된다. 폴리머 샘플의 PDI는 방정식 (I): Ð M = M w /M n 을 사용하여 계산될 수 있고, 여기서 M w 는 중량평균 몰 질량이고 M n 은 수평균 몰 질량이다. 달리 나타내지 않는 한, PDI는 방정식 (I)에 따라 계산된다.
폴리머 샘플은 "단분산" (당 업계에 균일한 것으로도 알려져 있음) 또는 "다분산" (당 업계에 불-균일한 것으로도 알려져 있음)으로 간주될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 HA 폴리머 또는 HA 콘주게이트 샘플에 관하여 "단분산"은 HA 폴리머 또는 HA 콘주게이트 샘플이 약 1.1이거나 또는 그 미만, 예를 들어, 약 1.001, 약 1.02, 약 1.03, 약 1.04, 약 1.05, 약 1.06, 약 1.07, 약 1.08, 약 1.09, 또는 약 1.1의 PDI를 갖는 것을 의미한다. 예를 들어, 단분산 HA 폴리머 또는 HA 콘주게이트 샘플은 1.0 내지 약 1.1 (예를 들어, 1 내지 약 1.1, 1 내지 약 1.09, 1 내지 약 1.08, 1 내지 약 1.07, 1 내지 약 1.06, 1 내지 약 1.05, 1 내지 약 1.04, 1 내지 약 1.03, 1 내지 약 1.02, 1 내지 약 1.01, 1 내지 약 1.005, 약 1.001 내지 약 1.1, 약 1.001 내지 약 1.1, 약 1.001 내지 약 1.09, 약 1.001 내지 약 1.08, 약 1.001 내지 약 1.07, 약 1.001 내지 약 1.06, 약 1.001 내지 약 1.05, 약 1.001 내지 약 1.04, 약 1.001 내지 약 1.03, 약 1.001 내지 약 1.02, 약 1.001 내지 약 1.01, 약 1.001 내지 약 1.005, 약 1.001 내지 약 1.004, 약 1.001 내지 약 1.003, 약 1.001 내지 약 1.002, 약 1.0001 내지 약 1.1, 약 1.0001 내지 약 1.09, 약 1.0001 내지 약 1.08, 약 1.0001 내지 약 1.07, 약 1.0001 내지 약 1.06, 약 1.0001 내지 약 1.05, 약 1.0001 내지 약 1.04, 약 1.0001 내지 약 1.03, 약 1.0001 내지 약 1.02, 약 1.0001 내지 약 1.01, 약 1.0001 내지 약 1.005, 약 1.0001 내지 약 1.004, 약 1.0001 내지 약 1.003, 약 1.0001 내지 약 1.002, 또는 약 1.0001 내지 약 1.005) 사이의 PDI를 가질 수 있다.
그에 반해서, 용어 "다분산"은 HA 폴리머 또는 HA 콘주게이트 샘플이 1.1 초과, 예를 들어, 약 1.3, 약 1.4, 약 1.5, 약 1.6, 약 1.7, 약 1.8, 또는 더 높은 PDI를 갖는 것을 의미한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 다분산 HA 폴리머 또는 HA 콘주게이트 샘플은 약 1.3 내지 약 2, 약 1.4 내지 약 2, 약 1.5 내지 약 2, 약 1.6 내지 약 2, 약 1.7 내지 약 2, 약 1.8 내지 약 2, 또는 약 1.9 내지 약 2 사이의 PDI를 갖는다.
본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 용어들 "하이알루론산", "히알루라논" 및 "HA"는 N-아세틸 글루코사민 및 글루쿠론산의 반복하는 이당류 단위를 함유하는 중합체 글리코사미노글리칸 (GAG)을 지칭한다. HA는, 예를 들어, 세포외 기질 (예를 들어, 눈의 유리체), 결합 조직, 상피성, 및 신경 조직에서 발견될 수 있는 음이온성, 비황산화된 GAG이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "폴리에틸렌 글리콜" 또는 "PEG"는 그것의 분자량에 의존하여, 폴리에틸렌 옥사이드 (PEO) 또는 폴리옥시에틸렌(POE)으로도 알려져 있는 폴리에테르 화합물을 지칭한다. PEG는 H-(O-CH2-CH2)n-OH의 구조를 가질 수 있고, 여기서 n은 임의의 적합한 정수이다. PEG는 분지형 PEG, 스타 PEG 또는 콤 PEG일 수있다. PEG는, 예를 들어, PEG 사량체, PEG 헥사머 또는 PEG 옥타머일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "청소능"은 단위 시간당 구획 (예를 들어, 눈 (예를 들어, 유리체))로부터 제거되는 서브스턴스 (예를 들어, 항-VEGF 항체, 항체 콘주게이트, 융합 단백질 (예를 들어, Fab 융합 단백질), 또는 중합체 제형)의 용적을 지칭한다.
용어 "반감기"는 생체내 (예를 들어, 눈 (예를 들어, 유리체)에서) 또는 시험관내에서 서브스턴스 (예를 들어, 항-VEGF 항체, 항체 콘주게이트, 융합 단백질 (예를 들어, Fab 융합 단백질), 또는 중합체 제형)의 농도를 2분의 1로 감소하는데 필요한 시간을 지칭한다.
II. 조성물 및 방법
본 발명은 항체 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 항-VEGF 항체를 포함하는 항-VEGF 항체)에 연결된 폴리머 (예를 들어, 단분산 HA 폴리머를 포함하는 단분산 폴리머)를 포함하는 항체 콘주게이트, 예를 들어, 항체 콘주게이트를 제조하는데 사용될 수 있는 시스테인 조작된 항체, 항체 콘주게이트를 포함하는 조성물 (예를 들어, 약제학적 조성물), 뿐만 아니라 예를 들어, 치료 용도 (예를 들어, 안구 장애의 치료)를 위한 상기 콘주게이트를 제조 및 사용하는 방법을 제공한다.
A. 본 발명의 콘주게이트에서 사용하기 위한 예시적인 항체
본 발명은 폴리머 (예를 들어, 단분산 폴리머)에 공유결합된 항체 (예를 들어, 항-VEGF 항체)을 포함하는 항체 콘주게이트를 제공한다. 임의의 적합한 항체 (예를 들어, 항-VEGF 항체)는 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 항원에 특이적으로 결합할 수 있다: VEGF; 인터류킨-1 베타 (IL-1β); 인터류킨-6 (IL-6); 인터류킨-6 수용체 (IL-6R); 인터류킨-13 (IL-13); IL-13 수용체 (IL-13R); PDGF (예를 들어, PDGF-BB); 안지오포이에틴; 안지오포이에틴 2 (Ang2); Tie2; S1P; 인테그린 αvβ3, αvβ5, 및 α5β1; 베타셀룰린; 아페린/APJ; 에리트로포이에틴; 보체 인자 D; TNFα; HtrA1; VEGF 수용체 (예를 들어, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, 막-결합 VEGF-수용체 (mbVEGFR), 또는 가용성 VEGF 수용체 (sVEGFR)); ST-2 수용체; 및 연령 관련 황반 변성 (AMD) 위험에 유전자적으로 연결된 단백질 (예를 들어, 보체 경로 성분 C2, 인자 B, 인자 H, CFHR3, C3b, C5, C5a, 및 C3a; HtrA1; ARMS2; TIMP3; HLA; 인터류킨-8 (IL-8); CX3CR1; TLR3; TLR4; CETP; LIPC; COL10A1; 및 TNFRSF10A). 그와 같은 항체는, 예를 들어, 혈관신생을 감소시키고/거나 병리적 혈관신생과 연관된 장애 (예를 들어, 안구 장애)를 치료하거나 그 진행을 지연시키는데 유용할 수 있다. 본 발명의 항체 콘주게이트에서 사용될 수 있는 예시적인, 비제한적인 항-VEGF 항체는 아래에 추가로 기재되어 있다.
일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 HVR을 포함할 수 있다: (a) DYWIH (서열번호: 1)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) GX1TPX2GGX3X4X5YX6DSVX7X8 (서열번호: 2)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2로서, 상기 X1는 Ile 또는 His, X2는 Ala 또는 Arg, X3는 Tyr 또는 Lys, X4는 Thr 또는 Glu, X5는 Arg, Tyr, Gln, 또는 Glu, X6는 Ala 또는 Glu, X7는 Lys 또는 Glu, 및 X8는 Gly 또는 Glu인, 상기 HVR-H2; (c) FVFFLPYAMDY (서열번호: 3)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) RASQX1VSTAVA (서열번호: 4)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1로서, 상기 X1는 Asp 또는 Arg인, 상기 HVR-L1; (e) X1ASFLYS (서열번호: 5)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2로서, 상기 X1는 Ser 또는 Met인, 상기 HVR-L2; 및 (f) X1QGYGX2PFT (서열번호: 6)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3로서, 상기 X1는 Gln, Asn, 또는 Thr 및 X2는 Ala, Asn, Gln, 또는 Arg인, 상기 HVR-L3, 또는 상기 HVR 중 하나 이상의 조합 및 서열번호: 1-6 중 임의의 하나 에 대해 적어도 약 80% 서열 동일성 (예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성)을 갖는 그의 하나 이상의 변이체.
예를 들어, 항-VEGF 항체는 하기로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 HVR을 포함할 수 있다: (a) DYWIH (서열번호: 1)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) GITPAGGYTRYADSVKG (서열번호: 7), GITPAGGYEYYADSVKG (서열번호: 21), 또는 GITPAGGYEYYADSVEG (서열번호: 22)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) FVFFLPYAMDY (서열번호: 3)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) RASQDVSTAVA (서열번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) SASFLYS (서열번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) QQGYGAPFT (서열번호: 10) 또는 QQGYGNPFT (서열번호: 23)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 또는 상기 HVR 중 하나 이상의 조합 및 서열번호: 1, 3, 7-10, 또는 21-23 중 임의의 하나 에 대해 적어도 약 80% 서열 동일성 (예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성)을 갖는 그의 하나 이상의 변이체.
예를 들어, 일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 HVR을 포함할 수 있다: (a) DYWIH (서열번호: 1)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) GITPAGGYTRYADSVKG (서열번호: 7)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) FVFFLPYAMDY (서열번호: 3)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) RASQDVSTAVA (서열번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) SASFLYS (서열번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) QQGYGAPFT (서열번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 또는 상기 HVR 중 하나 이상의 조합 및 서열번호: 1, 3, 또는 7-10 중 임의의 하나 에 대해 적어도 약 80% 서열 동일성 (예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성)을 갖는 그의 하나 이상의 변이체. 특정 예에서, 일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기 6개의 HVR을 포함한다: (a) DYWIH (서열번호: 1)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) GITPAGGYTRYADSVKG (서열번호: 7)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) FVFFLPYAMDY (서열번호: 3)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) RASQDVSTAVA (서열번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) SASFLYS (서열번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) QQGYGAPFT (서열번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.
일부 사례에서, 이전의 항-VEGF 항체 중 임의의 것은 하기 중쇄 가변 도메인 프레임워크 영역 (FR) 중 1, 2, 3, 또는 4개를 포함할 수 있다: (a) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS (서열번호: 13)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1; (b) WVRQAPGKGLEWVA (서열번호: 14)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2; (c) RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR (서열번호: 15)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3; 및 (d) WGQGTLVTVSS (서열번호: 16)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4.
일부 사례에서, 이전의 항-VEGF 항체 중 임의의 것은 하기 경쇄 가변 도메인 FR 중 1, 2, 3, 또는 4개를 포함할 수 있다: (a) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열번호: 17)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1; (b) WYQQKPGKAPKLLIY (서열번호: 18)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2; (c) GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (서열번호: 19)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3; 및 (d) FGQGTKVEIK (서열번호: 20)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4.
예를 들어, 일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기 6개의 HVR을 포함한다: (a) DYWIH (서열번호: 1)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) GITPAGGYTRYADSVKG (서열번호: 7)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) FVFFLPYAMDY (서열번호: 3)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) RASQDVSTAVA (서열번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) SASFLYS (서열번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) QQGYGAPFT (서열번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기 4개의 중쇄 가변 도메인 FR을 포함한다: (a) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS (서열번호: 13)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1; (b) WVRQAPGKGLEWVA (서열번호: 14)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2; (c) RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR (서열번호: 15)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3; 및 (d) WGQGTLVTVSS (서열번호: 16)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4. 추가 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기 4개의 경쇄 가변 도메인 FR을 포함한다: (a) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열번호: 17)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1; (b) WYQQKPGKAPKLLIY (서열번호: 18)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2; (c) GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (서열번호: 19)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3; 및 (d) FGQGTKVEIK (서열번호: 20)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4. 일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
예를 들어, 일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 HVR을 포함할 수 있다: (a) DYWIH (서열번호: 1)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) GITPAGGYEYYADSVEG (서열번호: 22)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) FVFFLPYAMDY (서열번호: 3)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) RASQDVSTAVA (서열번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) SASFLYS (서열번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) QQGYGNPFT (서열번호: 23)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 또는 상기 HVR 중 하나 이상의 조합 및 서열번호: 1, 3, 8, 9, 22, 또는 23 중 임의의 하나 에 대해 적어도 약 80% 서열 동일성 (예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성)을 갖는 그의 하나 이상의 변이체. 특정 예에서, 일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기 6개의 HVR을 포함한다: (a) DYWIH (서열번호: 1)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) GITPAGGYEYYADSVEG (서열번호: 22)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) FVFFLPYAMDY (서열번호: 3)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) RASQDVSTAVA (서열번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) SASFLYS (서열번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) QQGYGNPFT (서열번호: 23)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.
일부 사례에서, 이전의 항-VEGF 항체 중 임의의 것은 하기 중쇄 가변 도메인 프레임워크 영역 (FR) 중 1, 2, 3, 또는 4개를 포함할 수 있다: (a) EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (서열번호: 29) 또는 EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS (서열번호: 52)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1; (b) WVRQEPGEGLEWVA (서열번호: 30)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2; (c) RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (서열번호: 31)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3; 및 (d) WGQGELVTVSS (서열번호: 32)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4.
일부 사례에서, 이전의 항-VEGF 항체 중 임의의 것은 하기 경쇄 가변 도메인 FR 중 1, 2, 3, 또는 4개를 포함할 수 있다: (a) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열번호: 17)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1; (b) WYQQKPGKAPKLLIY (서열번호: 18)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2; (c) GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열번호: 24)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3; 및 (d) FGQGTKVEIK (서열번호: 20)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4.
예를 들어, 일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기 6개의 HVR을 포함한다: (a) DYWIH (서열번호: 1)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) GITPAGGYEYYADSVEG (서열번호: 22)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) FVFFLPYAMDY (서열번호: 3)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) RASQDVSTAVA (서열번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) SASFLYS (서열번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) QQGYGNPFT (서열번호: 23)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기 4개의 중쇄 가변 도메인 FR을 포함한다: (a) EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (서열번호: 29)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1; (b) WVRQEPGEGLEWVA (서열번호: 30)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2; (c) RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (서열번호: 31)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3; 및 (d) WGQGELVTVSS (서열번호: 32)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4. 추가 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기 4개의 경쇄 가변 도메인 FR을 포함한다: (a) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열번호: 17)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1; (b) WYQQKPGKAPKLLIY (서열번호: 18)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2; (c) GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열번호: 24)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3; 및 (d) FGQGTKVEIK (서열번호: 20)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4. 일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기 6개의 HVR을 포함한다: (a) DYWIH (서열번호: 1)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) GITPAGGYEYYADSVEG (서열번호: 22)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) FVFFLPYAMDY (서열번호: 3)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) RASQDVSTAVA (서열번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) SASFLYS (서열번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) QQGYGNPFT (서열번호: 23)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기 4개의 중쇄 가변 도메인 FR을 포함한다: (a) EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS (서열번호: 52)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1; (b) WVRQEPGEGLEWVA (서열번호: 30)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2; (c) RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (서열번호: 31)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3; 및 (d) WGQGELVTVSS (서열번호: 32)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4. 추가 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기 4개의 경쇄 가변 도메인 FR을 포함한다: (a) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열번호: 17)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1; (b) WYQQKPGKAPKLLIY (서열번호: 18)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2; (c) GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열번호: 24)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3; 및 (d) FGQGTKVEIK (서열번호: 20)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4. 일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
예를 들어, 일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 HVR을 포함할 수 있다: (a) DYWIH (서열번호: 1)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) GITPAGGYEYYADSVEG (서열번호: 22)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) FVFFLPYAMDY (서열번호: 3)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) RASQDVSTAVA (서열번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) SASFLYS (서열번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) QQGYGAPFT (서열번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 또는 상기 HVR 중 하나 이상의 조합 및 서열번호: 1, 3, 8-10, 또는 22 중 임의의 하나 에 대해 적어도 약 80% 서열 동일성 (예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성)을 갖는 그의 하나 이상의 변이체. 특정 예에서, 일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기 6개의 HVR을 포함한다: (a) DYWIH (서열번호: 1)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) GITPAGGYEYYADSVEG (서열번호: 22)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) FVFFLPYAMDY (서열번호: 3)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) RASQDVSTAVA (서열번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) SASFLYS (서열번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) QQGYGAPFT (서열번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.
일부 사례에서, 이전의 항-VEGF 항체 중 임의의 것은 하기 중쇄 가변 도메인 프레임워크 영역 (FR) 중 1, 2, 3, 또는 4개를 포함할 수 있다: (a) EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (서열번호: 29) 또는 EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS (서열번호: 52)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1; (b) WVRQEPGEGLEWVA (서열번호: 30)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2; (c) RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (서열번호: 31)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3; 및 (d) WGQGELVTVSS (서열번호: 32)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4.
일부 사례에서, 이전의 항-VEGF 항체 중 임의의 것은 하기 경쇄 가변 도메인 FR 중 1, 2, 3, 또는 4개를 포함할 수 있다: (a) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열번호: 17), DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC (서열번호: 25), 또는 DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC (서열번호: 26)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1; (b) WYQQKPGKAPKLLIY (서열번호: 18) 또는 WYQQKPGEAPKLLIY (서열번호: 27)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2; (c) GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (서열번호: 19) 또는 GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC (서열번호: 28)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3; 및 (d) FGQGTKVEIK (서열번호: 20)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4.
예를 들어, 일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기 6개의 HVR을 포함한다: (a) DYWIH (서열번호: 1)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) GITPAGGYEYYADSVEG (서열번호: 22)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) FVFFLPYAMDY (서열번호: 3)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) RASQDVSTAVA (서열번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) SASFLYS (서열번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) QQGYGAPFT (서열번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기 4개의 중쇄 가변 도메인 FR을 포함한다: (a) EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (서열번호: 29)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1; (b) WVRQEPGEGLEWVA (서열번호: 30)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2; (c) RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (서열번호: 31)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3; 및 (d) WGQGELVTVSS (서열번호: 32)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4. 추가 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기 4개의 경쇄 가변 도메인 FR을 포함한다: (a) DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC (서열번호: 25)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1; (b) WYQQKPGKAPKLLIY (서열번호: 18)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2; (c) GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (서열번호: 19)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3; 및 (d) FGQGTKVEIK (서열번호: 20)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4. 일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
예를 들어, 다른 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기 6개의 HVR을 포함한다: (a) DYWIH (서열번호: 1)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) GITPAGGYEYYADSVEG (서열번호: 22)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) FVFFLPYAMDY (서열번호: 3)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) RASQDVSTAVA (서열번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) SASFLYS (서열번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) QQGYGAPFT (서열번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기 4개의 중쇄 가변 도메인 FR을 포함한다: (a) EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (서열번호: 29)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1; (b) WVRQEPGEGLEWVA (서열번호: 30)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2; (c) RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (서열번호: 31)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3; 및 (d) WGQGELVTVSS (서열번호: 32)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4. 추가 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기 4개의 경쇄 가변 도메인 FR을 포함한다: (a) DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC (서열번호: 26)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1; (b) WYQQKPGEAPKLLIY (서열번호: 27)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2; (c) GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC (서열번호: 28)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3; 및 (d) FGQGTKVEIK (서열번호: 20)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4. 일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
예를 들어, 다른 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기 6개의 HVR을 포함한다: (a) DYWIH (서열번호: 1)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) GITPAGGYEYYADSVEG (서열번호: 22)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) FVFFLPYAMDY (서열번호: 3)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) RASQDVSTAVA (서열번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) SASFLYS (서열번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) QQGYGAPFT (서열번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기 4개의 중쇄 가변 도메인 FR을 포함한다: (a) EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS (서열번호: 52)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1; (b) WVRQEPGEGLEWVA (서열번호: 30)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2; (c) RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (서열번호: 31)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3; 및 (d) WGQGELVTVSS (서열번호: 32)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4. 추가 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기 4개의 경쇄 가변 도메인 FR을 포함한다: (a) DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC (서열번호: 26)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1; (b) WYQQKPGEAPKLLIY (서열번호: 27)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2; (c) GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC (서열번호: 28)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3; 및 (d) FGQGTKVEIK (서열번호: 20)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4. 일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
예를 들어, 또 다른 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기 6개의 HVR을 포함한다: (a) DYWIH (서열번호: 1)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) GITPAGGYEYYADSVEG (서열번호: 22)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) FVFFLPYAMDY (서열번호: 3)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) RASQDVSTAVA (서열번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) SASFLYS (서열번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) QQGYGAPFT (서열번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기 4개의 중쇄 가변 도메인 FR을 포함한다: (a) EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (서열번호: 29)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1; (b) WVRQEPGEGLEWVA (서열번호: 30)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2; (c) RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (서열번호: 31)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3; 및 (d) WGQGELVTVSS (서열번호: 32)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4. 추가 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기 4개의 경쇄 가변 도메인 FR을 포함한다: (a) DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC (서열번호: 25)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1; (b) WYQQKPGEAPKLLIY (서열번호: 27)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2; (c) GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (서열번호: 19)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3; 및 (d) FGQGTKVEIK (서열번호: 20)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4. 일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
예를 들어, 또 추가의 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기 6개의 HVR을 포함한다: (a) DYWIH (서열번호: 1)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) GITPAGGYEYYADSVEG (서열번호: 22)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) FVFFLPYAMDY (서열번호: 3)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) RASQDVSTAVA (서열번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) SASFLYS (서열번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) QQGYGAPFT (서열번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기 4개의 중쇄 가변 도메인 FR을 포함한다: (a) EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (서열번호: 29)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1; (b) WVRQEPGEGLEWVA (서열번호: 30)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2; (c) RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (서열번호: 31)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3; 및 (d) WGQGELVTVSS (서열번호: 32)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4. 추가 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기 4개의 경쇄 가변 도메인 FR을 포함한다: (a) DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC (서열번호: 26)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1; (b) WYQQKPGKAPKLLIY (서열번호: 18)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2; (c) GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (서열번호: 19)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3; 및 (d) FGQGTKVEIK (서열번호: 20)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4. 일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
다른 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기 6개의 HVR을 포함한다: (a) DYWIH (서열번호: 1)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) GITPAGGYEYYADSVEG (서열번호: 22)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) FVFFLPYAMDY (서열번호: 3)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) RASQDVSTAVA (서열번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) SASFLYS (서열번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) QQGYGAPFT (서열번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기 4개의 중쇄 가변 도메인 FR을 포함한다: (a) EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS (서열번호: 52)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1; (b) WVRQEPGEGLEWVA (서열번호: 30)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2; (c) RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (서열번호: 31)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3; 및 (d) WGQGELVTVSS (서열번호: 32)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4. 추가 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기 4개의 경쇄 가변 도메인 FR을 포함한다: (a) DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC (서열번호: 26)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1; (b) WYQQKPGKAPKLLIY (서열번호: 18)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2; (c) GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (서열번호: 19)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3; 및 (d) FGQGTKVEIK (서열번호: 20)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4. 일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
예를 들어, 다른 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기 6개의 HVR을 포함한다: (a) DYWIH (서열번호: 1)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) GITPAGGYEYYADSVEG (서열번호: 22)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) FVFFLPYAMDY (서열번호: 3)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) RASQDVSTAVA (서열번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) SASFLYS (서열번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) QQGYGAPFT (서열번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기 4개의 중쇄 가변 도메인 FR을 포함한다: (a) EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (서열번호: 29)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1; (b) WVRQEPGEGLEWVA (서열번호: 30)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2; (c) RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (서열번호: 31)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3; 및 (d) WGQGELVTVSS (서열번호: 32)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4. 추가 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기 4개의 경쇄 가변 도메인 FR을 포함한다: (a) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열번호: 17)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1; (b) WYQQKPGKAPKLLIY (서열번호: 18)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2; (c) GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (서열번호: 19)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3; 및 (d) FGQGTKVEIK (서열번호: 20)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4. 일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
다른 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기 6개의 HVR을 포함한다: (a) DYWIH (서열번호: 1)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) GITPAGGYEYYADSVEG (서열번호: 22)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) FVFFLPYAMDY (서열번호: 3)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) RASQDVSTAVA (서열번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) SASFLYS (서열번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) QQGYGAPFT (서열번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기 4개의 중쇄 가변 도메인 FR을 포함한다: (a) EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS (서열번호: 52)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1; (b) WVRQEPGEGLEWVA (서열번호: 30)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2; (c) RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (서열번호: 31)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3; 및 (d) WGQGELVTVSS (서열번호: 32)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4. 추가 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기 4개의 경쇄 가변 도메인 FR을 포함한다: (a) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열번호: 17)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1; (b) WYQQKPGKAPKLLIY (서열번호: 18)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2; (c) GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (서열번호: 19)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3; 및 (d) FGQGTKVEIK (서열번호: 20)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4. 일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호: 11, 40, 또는 42 중 임의의 하나 또는 그 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 도메인; (b) 서열번호: 12, 41, 또는 46 중 임의의 하나 또는 그 서열에 대해 적어도 90% 서열 (예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 도메인; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인. 예를 들어, 일부 사례에서, 항체는 서열번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 사례에서, 항체는 서열번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 사례에서, 항체는 서열번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 사례에서, 항체는 서열번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 사례에서, 항체는 서열번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
일부 사례에서, 이전의 항-VEGF 항체 중 임의의 것은 하기 중쇄 가변 도메인 프레임워크 영역 (FR) 중 1, 2, 3, 또는 4개를 포함할 수 있다: (a) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS (서열번호: 13)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1; (b) WVRQAPGKGLEWVA (서열번호: 14) 또는 WVRQEPGKGLEWVA (서열번호: 39)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2; (c) RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR (서열번호: 15)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3; 및 (d) WGQGTLVTVSS (서열번호: 16)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4.
일부 사례에서, 이전의 항-VEGF 항체 중 임의의 것은 하기 경쇄 가변 도메인 FR 중 1, 2, 3, 또는 4개를 포함할 수 있다: (a) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열번호: 17) 또는 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTIDC (서열번호: 45)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1; (b) WYQQKPGKAPKLLIY (서열번호: 18)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2; (c) GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (서열번호: 19), GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDSATYYC (서열번호: 44), 또는 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYC (서열번호: 54)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3; 및 (d) FGQGTKVEIK (서열번호: 20) 또는 FGQGTKVEVK (서열번호: 55)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4.
일부 사례에서, 항체는 서열번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGNPFTFGQGTKVEIK (서열번호: 59).
일부 사례에서, 항체는 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGNPFTFGQGTKVEIK (서열번호: 59).
일부 사례에서, 항체는 서열번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGNPFTFGQGTKVEIK (서열번호: 59).
일부 사례에서, 항체는 서열번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGNPFTFGQGTKVEIK (서열번호: 59).
일부 사례에서, 항체는 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGNPFTFGQGTKVEIK (서열번호: 59).
일부 사례에서, 항체는 서열번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGAPFTFGQGTKVEIK (서열번호: 60).
일부 사례에서, 항체는 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGAPFTFGQGTKVEIK (서열번호: 60).
일부 사례에서, 항체는 서열번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGAPFTFGQGTKVEIK (서열번호: 60).
일부 사례에서, 항체는 서열번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGAPFTFGQGTKVEIK (서열번호: 60).
일부 사례에서, 항체는 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGAPFTFGQGTKVEIK (서열번호: 60). 예를 들어, 일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호: 11또는 그 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; (b) 서열번호: 11또는 그 서열에 대해 적어도 90% 서열 (예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인. 일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기를 포함할 수 있다: (a) DYWIH (서열번호: 1)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) GITPAGGYTRYADSVKG (서열번호: 7)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) FVFFLPYAMDY (서열번호: 3)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) RASQDVSTAVA (서열번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) SASFLYS (서열번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) QQGYGAPFT (서열번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기 중쇄 프레임워크 영역을 포함한다: (a) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS (서열번호: 13)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1; (b) WVRQAPGKGLEWVA (서열번호: 14)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2; (c) RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR (서열번호: 15)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3; 및 (d) WGQGTLVTVSS (서열번호: 16)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4. 일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기 경쇄 프레임워크 영역을 포함한다: (a) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열번호: 17)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1; (b) WYQQKPGKAPKLLIY (서열번호: 18)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2; (c) GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (서열번호: 19)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3; 및 (d) FGQGTKVEIK (서열번호: 20)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4. 일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기를 포함하는 결합 도메인을 포함한다: (a) 서열번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 사례에서, 예시적인 항-VEGF는 N94A.F83A.N82aR.Y58R (또한 일명 G6.31 AARR 또는 G6.31.AARR)이다.
일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호: 33 또는 51또는 그 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; (b) 서열번호: 12, 34, 35, 36, 37, 또는 38 중 임의의 하나 또는 그 서열에 대해 적어도 90% 서열 (예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인. 예를 들어, 일부 사례에서, 항체는 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 사례에서, 항체는 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 사례에서, 항체는 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 사례에서, 항체는 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 사례에서, 항체는 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 사례에서, 항체는 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 사례에서, 항체는 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 사례에서, 항체는 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 사례에서, 항체는 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 사례에서, 항체는 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
일부 사례에서, 이전의 항-VEGF 항체 중 임의의 것은 하기 중쇄 가변 도메인 프레임워크 영역 (FR) 중 1, 2, 3, 또는 4개를 포함할 수 있다: EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (서열번호: 29) 또는 EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS (서열번호: 52)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1; (b) WVRQEPGEGLEWVA (서열번호: 30)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2 또는 WVRQEPGKGLEWVA (서열번호: 39); (c) RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (서열번호: 31)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3; 및 (d) WGQGELVTVSS (서열번호: 32)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4.
일부 사례에서, 이전의 항-VEGF 항체 중 임의의 것은 하기 경쇄 가변 도메인 FR 중 1, 2, 3, 또는 4개를 포함할 수 있다: (a) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열번호: 17), DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC (서열번호: 25), 또는 DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC (서열번호: 26)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1; (b) WYQQKPGKAPKLLIY (서열번호: 18) 또는 WYQQKPGEAPKLLIY (서열번호: 27)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2; (c) GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (서열번호: 19), GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열번호: 24), 또는 GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC (서열번호: 28)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3; 및 (d) FGQGTKVEIK (서열번호: 20)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4.
일부 사례에서, 본 발명은 하기를 포함하는 항체를 제공한다: (a) 서열번호: 48의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 (b) 서열번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄. 특정 구현예에서, 항체는 Fab 형식으로 발현된 G6.31 AARR이다.
일부 사례에서, 본 발명은 하기를 포함하는 항체를 제공한다: (a) 서열번호: 49의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 (b) 서열번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄. 특정 구현예에서, 항체는 항-인간 IgG에 대한 반응성이 결여된 G6.31 AARR의 변이체 버전이다.
추가 양태에서, 상기 구현예 중 임의의 것에 따른 항체 (예를 들어, 항-VEGF 항체)는 아래의 섹션 1-8에 기재된 바와 같이 단독으로 또는 조합하여 특징 중 임의의 것을 편입시킬 수 있다:
1. 항체 친화성
특정 구현예에서, 본 명세서에 제공된 항체는 ≤1 μM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.1 nM, ≤0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어, 10-8 M 또는 그 미만, 예를 들어, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다. 예를 들어, 일부 사례에서, 본 명세서에 제공된 항체는 약 10 nM 이하의 Kd로 항원 (예를 들어, 인간 VEGF (hVEGF))에 결합한다. 일부 사례에서, 본 명세서에 제공된 항체는 약 5 nM 이하의 Kd로 항원 (예를 들어, hVEGF)에 결합한다. 일부 사례에서, 본 명세서에 제공된 항체는 약 2 nM 이하의 Kd로 hVEGF에 결합한다. 예를 들어, 일부 사례에서, 항체는 하기의 Kd로 항원 (예를 들어, hVEGF)에 결합한다: 약 25 pM 내지 약 2 nM (예를 들어, 약 25 pM, 약 50 pM, 약 75 pM, 약 100 pM, 약 125 pM, 약 150 pM, 약 175 pM, 약 200 pM, 약 225 pM, 약 250 pM, 약 275 pM, 약 300 pM, 약 325 pM, 약 350 pM, 약 375 pM, 약 400 pM, 약 425 pM, 약 450 pM, 약 475 pM, 약 500 pM, 약 525 pM, 약 550 pM, 약 575 pM, 약 600 pM, 약 625 pM, 약 650 pM, 약 675 pM, 약 700 pM, 약 725 pM, 약 750 pM, 약 775 pM, 약 800 pM, 약 825 pM, 약 850 pM, 약 875 pM, 약 900 pM, 약 925 pM, 약 950 pM, 약 975 pM, 약 1 nM, 약 1.1 nM, 약 1.2 nM, 약 1.3 nM, 약 1.4 nM, 약 1.5 nM, 약 1.6 nM, 약 1.7 nM, 약 1.8 nM, 약 1.9 nM, 또는 약 2 nM). 일부 사례에서, 항체는 하기의 Kd로 항원 (예를 들어, hVEGF)에 결합한다: 약 75 pM 내지 약 600 pM (예를 들어, 약 75 pM, 약 100 pM, 약 125 pM, 약 150 pM, 약 175 pM, 약 200 pM, 약 225 pM, 약 250 pM, 약 275 pM, 약 300 pM, 약 325 pM, 약 350 pM, 약 375 pM, 약 400 pM, 약 425 pM, 약 450 pM, 약 475 pM, 약 500 pM, 약 525 pM, 약 550 pM, 약 575 pM, 약 600 pM). 일부 사례에서, 항체는 약 75 pM 내지 약 500 pM의 Kd로 항원 (예를 들어, hVEGF)에 결합한다. 일부 사례에서, 항체는 약 75 pM 내지 약 400 pM의 Kd로 항원 (예를 들어, hVEGF)에 결합한다. 일부 사례에서, 항체는 약 75 pM 내지 약 300 pM의 Kd로 항원 (예를 들어, hVEGF)에 결합한다. 일부 사례에서, 항체는 약 75 pM 내지 약 200 pM의 Kd로 항원 (예를 들어, hVEGF)에 결합한다. 일부 사례에서, 항체는 약 75 pM 내지 약 150 pM의 Kd로 항원 (예를 들어, hVEGF)에 결합한다. 일부 사례에서, 항체는 약 75 pM 내지 약 125 pM의 Kd로 항원 (예를 들어, hVEGF)에 결합한다. 일부 사례에서, 항체는 약 75 pM 내지 약 100 pM의 Kd로 항원 (예를 들어, hVEGF)에 결합한다. 일부 사례에서, 항체는 약 80 pM의 Kd로 항원 (예를 들어, hVEGF)에 결합한다. 일부 사례에서, 항체는 약 60 pM의 Kd로 항원 (예를 들어, hVEGF)에 결합한다. 일부 사례에서, 항체는 약 40 pM의 Kd로 항원 (예를 들어, hVEGF)에 결합한다.
일 구현예에서, Kd는 방사선표지된 항원 결합 검정 (RIA)에 의해 측정된다. 일 구현예에서, RIA는 관심 항체의 Fab 버전 및 그것의 항원으로 수행된다. 예를 들어, 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화도는 비표지된 항원의 적정 시리즈의 존재하에 최소 농도의 (125I)-표지된 항원으로 Fab를 평형화하고, 그 다음 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 결합된 항원을 포획함에 의해 측정된다 (예를 들어, Chen 등,J. Mol . Biol . 293:865-881(1999) 참고). 검정에 대한 조건을 확립하기 위해, MICROTITER® 다중-웰 플레이트 (Thermo Scientific)를 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6)에서 5 μg/ml의 포획 항-Fab 항체 (Cappel Labs)로 밤새 코팅하고, 후속으로 2 내지 5 시간 동안 실온에서 (대략 23℃) 포스페이트 완충 식염수(PBS) 중 2% (w/v) 소과 혈청 알부민 (BSA)으로 차단하였다. 비-흡착성 플레이트 (Nunc #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원을 관심있는 Fab의 연속 희석물과 혼합한다 (예를 들어, Presta 등, Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)에서 항-VEGF 항체인 Fab-12의 평가와 일치함). 관심 있는 Fab는 그런 다음 밤새 인큐베이션되었다; 그러나, 인큐베이션은 평형이 도달되는 것을 보장하기 위해 더 긴 기간 (예를 들어, 약 65 시간) 동안 지속될 수 있다. 그 후에, 혼합물은 실온에서 인큐베이션을 위해 (예를 들어, 1시간 동안) 포획 플레이트로 이전된다. 용액은 그런 다음 제거되고 플레이트는 PBS 내 0.1% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20®)으로 8회 세정된다. 플레이트가 건조되면, 150 μl/웰의 섬광기 (MICROSCINT-20™; Packard)를 첨가하고, 플레이트를 TOPCOUNT™ 감마 계수기 (Packard) 상에서 10분 동안 계수한다. 20% 이하의 최대 결합을 제공하는 각각의 Fab의 농도가 경쟁적 결합 검정에 사용하기 위해 선택된다.
또 다른 구현예에 따르면, Kd는 BIACORE® 표면 플라즈몬 공명 검정을 사용하여 측정된다. 예를 들어, BIACORE®-2000 또는 BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)을 사용한 검정은 ~10 반응 단위 (RU)에서 고정된 항원 CM5 칩으로 25℃에서 수행된다. 일 구현예에서, 카복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIAcore, Inc.)은 공급자의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 및 N-하이드록시석신이미드 (NHS)로 활성화된다. 항원은 대략 10 반응 단위 (RU)의 커플링된 단백질을 달성하기 위해 5 μl/분의 유량으로 주사 전에, pH 4.8, 10 mM 아세트산 나트륨으로 5 μg/ml (~0.2 μM)로 희석된다. 항원의 주사에 이어, 1 M 에탄올아민을 주입하여 미반응기를 차단한다. 동역학 측정을 위해, Fab (0.78 nM 내지 500 nM)의 2-배 연속 희석물을 대략 25 μl/분의 유량으로 25℃에서 0.05% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20™) 계면활성제 (PBST)를 갖는 PBS에 주입한다. 결합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)는 결합 및 해리 센서그램을 동시에 적합화함에 의해 간단한 일대일 랑뮤어 결합 모델 (BIACORE® 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용하여 계산된다. 평형 해리 상수 (Kd)는 koff/kon 비로 계산된다. 예를 들어, Chen 등,J . Mol . Biol . 293:865-881 (1999) 참고. 상기 표면 플라즈몬 공명 검정에 의해 온-속도가 106 M- 1 s-1을 초과하는 경우, 온-속도는 분광기, 예컨대 정지-유동 장착된 분광측정기 (Aviv Instruments) 또는 교반된 큐벳을 갖는 8000-시리즈 SLM-AMINCO™ 분광측정기 (ThermoSpectronic)에서 측정될 때 항원의 증가 농도의 존재에서 25℃에서 pH 7.2인 PBS 내 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 대역통과)에서의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 사용함에 의해 결정될 수 있다.
2. 항체 안정성
일부 사례에서, 본 발명의 항체 콘주게이트 또는 이들의 조성물에 사용된 항체는, 예를 들어, 항-VEGF 항체, 예를 들어, G6.31 (예를 들어, 전체적으로 참고로 본 명세서에 편입되는, 미국 특허 번호 7,758,859 및 국제 출원 공개 번호 WO 2005/012359 참고)에 비교하여 향상된 안정성을 갖는다. 항체의 안정성은 당해 분야에 알려진 임의의 방법, 예를 들어, 시차주사형광측정법 (DSF), 원형2색성 (CD), 고유단백질형광, 시차주사열량측정, 분광법, 광산란 (예를 들어,동적광산란 (DLS) 및 정적광산란 (SLS), 자기-상호작용 크로마토그래피 (SIC)를 사용하여 결정될 수 있다. 항-VEGF 항체는, 예를 들어, 항-VEGF 항체, 예를 들어, G6.31에 비교하여 향상된 용융 온도 (Tm), 응집 온도 (Tagg), 또는 안정성의 다른 메트릭스를 가질 수 있다.
특정 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 항체는 약 80℃ 이상 (예를 들어, 약 81℃, 약 82℃, 약 83℃, 약 84℃, 약 85℃, 약 86℃, 약 87℃, 약 88℃, 약 89℃, 약 90℃, 약 91℃, 약 92℃, 또는 약 93℃)인 Tm을 갖는다. 예를 들어, 일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 약 83.5℃ 이상 (예를 들어, 약 83.5℃, 약 84℃, 약 85℃, 약 86℃, 약 87℃, 약 88℃, 약 89℃, 약 90℃, 약 91℃, 약 92℃, 또는 약 93℃)인 Tm을 갖는다. 일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 약 82℃ 내지 약 92℃ (예를 들어, 약 82℃, 약 83℃, 약 84℃, 약 85℃, 약 86℃, 약 87℃, 약 88℃, 약 89℃, 약 90℃, 약 91℃, 또는 약 92℃)의 Tm을 갖는다. 일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 약 82℃의 Tm을 갖는다. 일부 사례에서, 항-VEGF 항체의 임의의 이전의 Tm 값은 DSF를 사용하여 결정된다. 일부 구현예에서, 항-VEGF 항체의 Tm 값은, 예를 들어, 전체적으로 참고로 본 명세서에 편입되는, 국제 특허 출원 번호 PCT/US2016/053454의 실시예 1에 기재된 바와 같이 결정된다.
3. 항체 단편
특정 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은, 비제한적으로, Fab, Fab', Fab-C, Fab'-SH, F(ab')2, Fv, 및 scFv 단편, 및 하기에 기재된 다른 단편을 포함한다. 특정 항체 단편의 검토를 위하여, Hudson 등,Nat. Med . 9:129-134 (2003)을 참고한다. scFv 단편의 검토를 위하여, 예를 들어,
Figure pct00001
in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)을 참조한다; 또한 하기를 참조한다: WO 93/16185; 및 미국 특허 번호 5,571,894 및 5,587,458. 회수 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편의 논의를 위하여, 미국 특허 번호 5,869,046을 참조한다.
디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson 등, Nat. Med . 9:129-134 (2003); 및 Hollinger 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90: 6444-6448 (1993)을 참조한다. 트리아바디 및 테트라바디가 또한 Hudson 등,Nat. Med . 9:129-134 (2003)에 기재되어 있다.
단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 모두 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 모두 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 구현예에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (Domantis, Inc., Waltham, MA; 예를 들어, 미국 특허 번호 6,248,516 B1 참고).
항체 단편은 비제한적으로, 본 명세서에서 기재된 바와 같은 온전한 항체의 단백질 분해 소화뿐만 아니라 재조합 숙주 세포 (예를 들어, E. 콜리 또는 파아지)에 의한 생산을 포함한 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
4. 키메라 및 인간화된 항체
특정 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체는, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567; 및 Morrison 등, Proc . Natl. Acad . Sci . USA, 81:6851-6855 (1984)에 기재되어 있다. 일 예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역 (예를 들어, 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼, 또는 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이로부터 유래된 가변 도메인) 및 인간 불변 도메인을 포함한다. 추가 예에서, 키메라 항체는 부류 또는 서브클래스가 모항체의 것으로부터 변화된 "부류 스위칭된" 항체이다. 키메라 항체는 이들의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 구현예에서, 키메라 항체는 인간화된 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 친계 비-인간 항체의 특이성 및 친화도를 유지하면서 인간에 대한 면역원성을 감소하도록 인간화된다. 일반적으로, 인간화된 항체는 HVR, 예를 들어, CDR (또는 이들의 일부분)이 비-인간 항체로부터 유래되고 FR (또는 이들의 일부분)이 인간 항체 서열로부터 유래되는 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화된 항체는 선택적으로 또한 인간 불변 영역의 적어도 일부분을 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 인간화된 항체에서 일부 FR 잔기는, 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화도를 복원하거나 또는 개선하기 위해, 비-인간 항체 (예를 들어, HVR 잔기가 유래되어 진 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화된 항체 및 이를 제조하는 방법은, 예를 들어, Almagro and Fransson, Front. Biosci . 13:1619-1633 (2008)에서 검토되고, 예를 들어, Riechmann 등, Nature 332:323-329 (1988); Queen 등, Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 86:10029-10033 (1989); 미국 특허 번호 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409; Kashmiri 등, Methods 36:25-34 (2005) (특이성 결정 영역 (SDR) 그라프팅을 기술함); Padlan, Mol . Immunol . 28:489-498 (1991) ("재표면화"를 기술함); Dall'Acqua 등, Methods 36:43-60 (2005) ("FR 셔플링"을 기술한); 및 Osbourn 등, Methods 36:61-68 (2005) 그리고 Klimka 등,Br . J. Cancer, 83:252-260 (2000) (FR 셔플링에 대한 "유도된 선택" 접근법을 기술함)에 추가로 기재되어 있다.
인간화를 위해 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 비제한적으로 하기를 포함한다: "최적화" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역 (예를 들어, Sims 등,J. Immunol . 151:2296 (1993) 참고); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 하위그룹의 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, Carter 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89:4285 (1992); 및 Presta 등, J. Immunol., 151:2623 (1993) 참고); 인간 성숙한 (체세포로 돌연변이된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식계열 프레임워크 영역(예를 들어, Almagro and Fransson, Front. Biosci . 13:1619-1633 (2008) 참고); 및 FR 라이브러리를 스크리닝함으로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, Baca 등, J. Biol . Chem . 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok 등, J. Biol . Chem . 271:22611-22618 (1996) 참고).
5. 인간 항체
특정 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당 업계에서 알려진 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 van Dijk and van de Winkel, Curr . Opin . Pharmacol . 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr . Opin . Immunol . 20:450-459 (2008)에 기재되어 있다.
인간 항체는 항원성 도전에 반응하여 온전한 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 온전한 항체를 생성하도록 변형된 형질전환 동물에 면역원을 투여함에 의해 제조될 수 있다. 이러한 동물은 전형적으로, 내인성 면역글로불린 유전자좌를 대체하거나, 염색체외로 존재하거나 동물의 염색체에 무작위로 통합된, 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유한다. 이러한 형질전환 마우스에서, 내인성 면역글로불린 유전자좌는 일반적으로 불활성화되었다. 형질전환 동물로부터 인간 항체를 수득하는 방법의 검토에 대해서는, Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)을 참조한다. 또한 하기를 참조한다: 예를 들어, XENOMOUSE™ 기술을 기재한 미국 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584; HUMAB® 기술을 기재한 미국 특허 번호 5,770,429; K-M MOUSE® 기술을 기재한 미국 특허 번호 7,041,870, 및 VELOCIMOUSE® 기술을 기재한 미국 특허 출원 공개 번호 US 2007/0061900). 이러한 동물에 의해 생성된 온전한 항체로부터의 인간 가변 영역은, 예를 들어, 상이한 인간 불변 영역과 배합시킴에 의해 추가로 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마-기반 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 단클론성 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주가 기재되었다. (예를 들어, Kozbor J. Immunol ., 133: 3001 (1984); Brodeur 등, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner 등, J. Immunol., 147: 86 (1991) 참고.) 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체가 또한 Li 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 103:3557-3562 (2006)에 기재되어 있다. 추가의 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터 단클론성 인간 IgM 항체의 생산을 기술함) 및 Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (인간-인간 하이브리도마를 기술함)에 기재된 것들을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술 (트리오마 기술)이 또한 Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)에 기재되어 있다.
인간 항체는 또한 인간-유래된 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함에 의해 생성될 수 있다. 이러한 가변 도메인 서열은 그런 다음 원하는 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선정하기 위한 기술이 아래에 기재되어 있다.
6. 라이브러리- 유래된 항체
본 발명의 항체는 원하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 스크리닝함에 의해 단리될 수 있다. 예를 들어, 파아지 디스플레이 라이브러리를 생성하고 원하는 결합 특성을 보유하는 항체에 대해 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 다양한 방법이 당해 기술에 공지되어 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, Hoogenboom 등, in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien 등, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)에서 검토되고 그리고, 예를 들어, McCafferty 등, Nature 348:552-554; Clackson 등, Nature 352: 624-628 (1991); Marks 등, J. Mol . Biol . 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu 등, J. Mol . Biol . 338(2): 299-310 (2004); Lee 등, J. Mol. Biol . 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee 등, J. Immunol . Methods 284(1-2): 119-132(2004)에 추가로 기재되어 있다.
특정 파아지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 Winter 등,Ann. Rev. Immunol ., 12: 433-455 (1994)에 기재된 바와 같이, 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 별도로 클로닝되고 그런 다음 항원-결합 파아지에 대해 선별될 수 있는 파아지 라이브러리에 무작위로 재조합된다. 파아지는 전형적으로 단일-사슬 Fv (scFv) 단편 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 나타낸다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 구축할 필요없이 면역원에 고-친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, 순수 레퍼토리는 (예를 들어, 인간으로부터) 클로닝되어 Griffiths 등, EMBO J, 12: 725-734 (1993)에 의해 기재된 바와 같이 임의의 면역화 없이 광범위한 비-자체 및 또한 자체 항원에 항체의 단일 원천을 제공할 수 있다. 마지막으로, 순수 라이브러리는 또한, Hoogenboom and Winter, J. Mol . Biol., 227: 381-388 (1992)에서 기재된 바와 같이, 줄기 세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 분절을 클로닝하고, 랜덤 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용하여 고도로 가변성 CDR3 영역을 인코딩하고 시험관내 재배열을 달성함에 의해 합성으로 만들어 질 수 있다. 인간 항체 파아지 라이브러리를 기술하는 특허 공보는, 예를 들어: 미국 특허 번호 5,750,373, 및 미국 특허 공보 번호 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, 및 2009/0002360을 포함한다.
항체 또는 항체 단편은 국제 특허 출원 번호 PCT/US2016/053454에 기재된 바와 같이 파아지 라이브러리로부터 유래될 수 있다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본 명세서에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 간주된다.
7. 다중특이적 항체
특정 구현예에서, 본 명세서에 제공된 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어, 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 부위에 대한 결합 특이성을 갖는 단클론성 항체이다. 특정 구현예에서, 결합 특이성 중 하나는 VEGF에 대한 것이고 다른 것은 하기에 대한 것이다: 임의의 다른 항원 (예를 들어, 제2 생물학적 분자, 예를 들어, 인터류킨-1 베타 (IL-1β); 인터류킨-6 (IL-6); 인터류킨-6 수용체 (IL-6R); 인터류킨-13 (IL-13); IL-13 수용체 (IL-13R); PDGF (예를 들어, PDGF-BB); 안지오포이에틴; 안지오포이에틴 2 (Ang2); Tie2; S1P; 인테그린 αvβ3, αvβ5, 및 α5β1; 베타셀룰린; 아페린/APJ; 에리트로포이에틴; 보체 인자 D; TNFα; HtrA1; VEGF 수용체 (예를 들어, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, 막-결합 VEGF-수용체 (mbVEGFR), 또는 가용성 VEGF 수용체 (sVEGFR)); ST-2 수용체; 및 연령 관련 황반 변성 (AMD) 위험에 유전자적으로 연결된 단백질, 예컨대 보체 경로 성분 C2, 인자 B, 인자 H, CFHR3, C3b, C5, C5a, 및 C3a; HtrA1; ARMS2; TIMP3; HLA; 인터류킨-8 (IL-8); CX3CR1; TLR3; TLR4; CETP; LIPC; COL10A1; 및 TNFRSF10A. 따라서, 이중특이적 항체는 하기에 대한 결합 특이성을 가질 수 있다: VEGF 및 IL-1β; VEGF 및 IL-6; VEGF 및 IL-6R; VEGF 및 IL-13; VEGF 및 IL-13R; VEGF 및 PDGF (예를 들어, PDGF-BB); VEGF 및 안지오포이에틴; VEGF 및 Ang2; VEGF 및 Tie2; VEGF 및 S1P; VEGF 및 인테그린 αvβ3; VEGF 및 인테그린 αvβ5; VEGF 및 인테그린 α5β1; VEGF 및 베타셀룰린; VEGF 및 아페린/APJ; VEGF 및 에리트로포이에틴; VEGF 및 보체 인자 D; VEGF 및 TNFα; VEGF 및 HtrA1; VEGF 및 VEGF 수용체 (예를 들어, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, mbVEGFR, 또는 sVEGFR); VEGF 및 ST-2 수용체; VEGF 및 C2; VEGF 및 인자 B; VEGF 및 인자 H; VEGF 및 CFHR3; VEGF 및 C3b; VEGF 및 C5; VEGF 및 C5a; VEGF 및 C3a; VEGF 및 ARMS2; VEGF 및 TIMP3; VEGF 및 HLA; VEGF 및 IL-8; VEGF 및 CX3CR1; VEGF 및 TLR3; VEGF 및 TLR4; VEGF 및 CETP; VEGF 및 LIPC; VEGF 및 COL10A1; 또는 VEGF 및 TNFRSF10A. 특정 구현예에서, 이중특이적 항체는 2개의 상이한 VEGF의 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 또한, 세포독성 약물을, VEGF를 발현시키는 세포로 국소화하기 위해 사용될 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, Fab, Fab', 또는 Fab-C 단편)으로서 제조될 수 있다.
일부 사례에서, 이중특이적 항체는 하기에 개시된 이중특이적 항-VEGF/항-안지오포이에틴 2 (Ang2) 항체이다: U.S. 특허 출원 번호 US 2014/0017244 (이는 본 명세서에 참고로 전체적으로 편입됨). 예를 들어, 항-VEGF/항-Ang2 이중특이적 항체는 VEGF (예컨대 본 명세서에 기재된 항-VEGF 항체 중 임의의 것)에 결합하는 제1 결합 도메인 및 하기를 포함하는 Ang2에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함할 수 있다: (a) GYYMH (서열번호: 62)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) WINPNSGGTNYAQKFQG (서열번호: 63)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) SPNPYYYDSSGYYYPGAFDI (서열번호: 64)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) GGNNIGSKSVH (서열번호: 65)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) DDSDRPS (서열번호: 66)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) QVWDSSSDHWV (서열번호: 67)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 또는 상기 HVR 중 하나 이상의 조합 및 서열번호: 62-67 중 임의의 하나 에 대해 적어도 약 80% 서열 동일성 (예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성)을 갖는 그의 하나 이상의 변이체.
일부 사례에서, 항-VEGF/항-Ang2 이중특이적 항체는 VEGF (예컨대 본 명세서에 기재된 항-VEGF 항체 중 임의의 것)에 결합하는 제1 결합 도메인 및 Ang2에 결합하고 하기를 포함하는 제2 결합 도메인을 포함한다: (a) 서열번호: 68또는 이의 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성 (예를 들어, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; (b) 서열번호: 69 또는 이의 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성 (예를 들어, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인. 일부 사례에서, 항-VEGF/항-Ang2 이중특이적 항체는 VEGF (예컨대 본 명세서에 기재된 항-VEGF 항체 중 임의의 것)에 결합하는 제1 결합 도메인 및 Ang2에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인을 포함할 수 있고, 상기 제2 결합 도메인은 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2010/069532 (이는 본 명세서에 참고로 전체적으로 편입됨)에 기재된 임의의 항체 결합 도메인, 또는 그것의 변이체이다.
다른 사례에서, 항-VEGF/항-Ang2 이중특이적 항체는 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2016/073157에 기재된 임의의 항-VEGF/항-Ang2 이중특이적 항체이다.
일부 사례에서, 이중특이적 항체는 이중특이적 항-VEGF/항-IL-6 항체이다. 일부 사례에서, 항-VEGF/항-IL-6 이중특이적 항체는 VEGF (예컨대 본 명세서에 기재된 항-VEGF 항체 중 임의의 것)에 결합하는 제1 결합 도메인 및 IL-6에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함할 수 있다. 제2 결합 도메인은 당업계에서 알려진 임의의 항-IL-6 항체, 예를 들어, EBI-031 (Eleven Biotherapeutics; 참고, 예를 들어, WO 2016/073890 (이는 본 명세서에 참고로 전체적으로 편입됨)), 실툭시맙 (SYLVANT®), 올로키주맙, 클라자키주맙, 시루쿠맙, 엘실리모맙, 게릴림주맙, OPR-003, MEDI-5117, PF-04236921, 또는 그것의 변이체의 결합 도메인일 수 있다.
일부 사례에서, 이중특이적 항체는 이중특이적 항-VEGF/항-IL-6R 항체이다. 일부 사례에서, 항-VEGF/항-IL-6R 이중특이적 항체는 VEGF (예컨대 본 명세서에서 기재된 임의의 항-VEGF 항체)를 결합하는 제1 결합 도메인 및 IL-6R을 결합하는 제2 결합 도메인을 포함할 수 있다. 제2 결합 도메인은 당 업계에서 알려진 임의의 항-IL-6R 항체, 예를 들어, 토실리주맙 (ACTEMRA®) (예를 들어, 본 명세서에 전체적으로 참고로 편입된, WO 1992/019579 참고), 사릴루맙, 보발릴리주맙 (ALX-0061), SA-237, 또는 그것의 변이체 결합 도메인일 수 있다.
다중특이적 항체를 제조하는 기술은, 비제한적으로, 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공-발현 (Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, 및 Traunecker 등, EMBO J. 10: 3655 (1991) 참고), 및 "놉-인-홀" 엔지니어링 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,731,168 참고)을 포함한다. 다중-특이적 항체는 또한 항체 Fc-헤테로이량체성 분자를 제조하기 위해 정전기 조향 효과를 엔지니어링하는 것 (WO　2009/089004A1); 2 또는 그 초과의 항체 또는 단편을 가교결합시키는 것 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,676,980, 및 Brennan 등, Science, 229: 81 (1985) 참고); 이중특이적 항체를 생산하기 위해 류신 지퍼를 사용하는 것 (예를 들어, Kostelny 등, J. Immunol ., 148(5):1547-1553 (1992) 참고); 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위해 "디아바디" 기술을 사용하는 것 (예를 들어, Hollinger 등, Proc . Natl . Acad . Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) 참고); 및 단일-사슬 Fv (sFv) 이량체를 사용하는 것 (예를 들어, Gruber 등, J. Immunol.,152:5368 (1994) 참고); 및 예를 들어, Tutt 등, J. Immunol .147:60 (1991)에 기재된 바와 같이 삼중특이적 항체를 제조함에 의해 만들어 질 수 있다.
"옥토퍼스 항체"를 포함한 3개 또는 그 초과의 기능적 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체가 또한 본 명세서에서 포함된다 (예를 들어 US　2006/0025576A1 참고).
본 명세서에서 항체 또는 단편은 또한 VEGF뿐만 아니라 또 다른 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 FAb" 또는 "DAF"를 포함한다 (예를 들어, US　2008/0069820 참고).
8. 항체 변이체
특정 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체 (예를 들어, 하나 이상의 아미노산 잔기 변경을 포함하는 항체 변이체)가 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 안으로 적절한 변형을 도입하거나 또는 펩타이드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 내의 잔기로부터 결실, 및/또는 그 안으로 삽입 및/또는 그의 치환을 포함한다. 최종 작제물에 도달하도록 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합이 이루어 질 수 있고, 단, 본 최종 작제물은 원하는 특성, 예를 들어, 항원 결합을 보유한다.
a) 치환, 삽입, 및 결실 변이체
특정 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환형 돌연변이유발에 대한 관심 있는 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환은 "바람직한 치환"의 제목 하에 표 1에 나타나 있다. 보다 실질적인 변화는 "예시적인 치환"의 제목 하에 표 1에 그리고 아미노산 측쇄 부류와 관련하여 아래에서 추가로 기재된 바와 같이 제공되어 있다. 아미노산 치환은 관심 있는 항체 및, 원하는 활성, 예를 들어, 유지된/개선된 항원 결합, 줄어든 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 선별된 생성물 안으로 도입될 수 있다.
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아미노산은 공통 측쇄 특성에 따라 그룹화될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다.
치환형 변이체의 일 유형은 하나 이상의 초가변성 영역 잔기 및/또는 모체 항체 (예를 들어, 인간화된 또는 인간 항체)의 FR 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가 연구를 위해 선택된 생성된 변이체(들)는 모항체에 비해 특정 생물학적 특성 (예를 들어, 증가된 친화도, 증가된 안정성, 증가된 발현, 변경된 pI, 및/또는 감소된 면역원성)에서 변형 (예를 들어, 개선)을 가질 것이고 및/또는 모항체의 실질적으로 유지된 특정 생물학적 특성을 가질 것이다. 예시적인 치환형 변이체는, 예를 들어, 파아지 디스플레이-기반 친화도 성숙 기술 예컨대 본 명세서에서 기재된 것을 사용하여 편리하게 생성될 수 있는 친화도 성숙된 항체이다. 간단히, 하나 이상의 HVR 잔기가 돌연변이되고 변이체 항체가 파아지 상에 표시되고 특정 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 선별된다.
변경 (예를 들어, 치환)은, 예를 들어, 항체 친화성을 개선하기 위해 HVR에서 이루어 질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟", 즉, 체세포 성숙 과정 동안 고주파수에서 돌연변이 당하는 코돈에 의해 인코딩된 잔기 (예를 들어, Chowdhury, Methods Mol . Biol . 207:179-196 (2008) 참고), 및/또는 결합 친화도에 대해 시험되는 얻어진 변이체 VH 또는 VL과 항원을 접촉하는 잔기에서 이루어 질 수 있다. 이차 라이브러리를 구축하고 이로부터 재선정함에 의한 친화도 성숙은, 예를 들어, Hoogenboom 등, in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien 등, ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001))에 기재되어 있다. 친화도 성숙의 일부 구현예에서, 임의의 다양한 방법 (예를 들어, 오류 유발 PCR, 사슬 셔플링, 또는 올리고뉴클레오타이드-지향된 돌연변이 유발)에 의한 성숙을 위해 선택된 가변성 유전자 안으로 다양성이 도입된다. 이차 라이브러리가 그런 다음 창작된다. 상기 라이브러리는 그런 다음 원하는 친화도를 갖는 임의의 항체 변이체를 식별하기 위해 선별된다. 다양성을 도입하기 위한 또 다른 방법은 몇개의 HVR 잔기 (예를 들어, 한번에 4-6 잔기)가 무작위화되는 HVR-지향된 접근법을 포함한다. 항원 결합에 관여된 HVR 잔기는, 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 사용하여 구체적으로 확인될 수 있다. CDR-H3 및 CDR-L3이 특히 종종 표적화된다.
특정 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은, 그러한 변경이 항체가 항원에 결합하는 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 하나 이상의 HVR 내에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 보존적 치환)이 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 예를 들어 HVR에서 항원 접촉 잔기의 외부에 있을 수 있다. 상기 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 구현예에서, 각각의 HVR은 변경되지 않거나 1개, 2개 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
특정 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은, 이러한 변경이 항체가 항원에 결합하는 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 하나 이상의 FR 내에서 일어날 수 있다. 이러한 변경은, 예를 들어, 항체 친화성 및/또는 안정성을 개선시킬 수 있다 (예를 들어, 증가된 용융 온도에 의해 평가되는 경우).
돌연변이유발에 대해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인을 위한 유용한 방법은 Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085에 기재된 바와 같은 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불린다. 이 방법에서, 표적 잔기의 잔기 또는 군 (예를 들어, 하전된 잔기 예컨대 Arg, Asp, His, Lys, 및 Glu)이 확인되고 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체되어 항원과 항체의 상호작용이 영향을 받는지 여부를 결정한다. 초기 치환에 대한 기능적 민감성을 입증하는 아미노산 위치에 추가의 치환이 도입될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 항체와 항원 사이의 접점을 식별하기 위한 항원-항체 복합체의 결정 구조. 이러한 접촉 잔기 및 인접하는 잔기는 치환을 위한 후보로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 변이체가 원하는 속성을 함유하고 있는지 여부를 결정하기 위해 변이체가 선별될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입뿐만 아니라 하나의 잔기에서 수백 또는 그 초과의 잔기를 함유하는 폴리펩타이드까지의 길이 범위인 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 N- 또는 C-말단에 대한 효소 (예를 들어, ADEPT의 경우) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩타이드에의 융합을 포함한다.
b) 당화 변이체
특정 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 항체는 항체가 당화되는 정도를 증가시키거나 감소시키도록 변경된다. 항체에 당화 부위의 첨가 또는 결실은 하나 이상의 당화 부위가 생성 또는 제거되도록 아미노산 서열을 변경함에 의해 편리하게 달성될 수 있다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 이에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생성된 고유 항체는 일반적으로 N-결합에 의해 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 부착된 분지형, 바이안테너리 올리고당을 전형적으로 포함한다. 예를 들어, Wright 등, TIBTECH 15:26-32 (1997) 참고. 올리고당은 다양한 탄수화물, 예를 들어, 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스 및 시알산뿐만 아니라 바이안테너리 올리고당 구조의 "줄기"에서 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체에서 올리고당의 변형은 특정한 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 생성하기 위해 이루어질 수 있다.
일 구현예에서, Fc 영역에 (직접적으로 또는 간접적으로) 부착된 푸코스가 결여된 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 이러한 항체에서 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코스의 양은 예를 들어 WO　2008/077546에서 기재된 바와 같이 MALDI-TOF 질량 분광분석법에 의해 측정될 때 Asn 297에 부착된 모든 당 구조 (예를 들어, 복합, 하이브리드 및 높음 만노스 구조)의 합계에 대해, Asn297에서 당 사슬 내의 푸코스의 평균 양을 계산함으로써 결정된다. Asn297은 Fc 영역에서 약 297 위치에 위치한 아스파라긴 잔기 (Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링)를 지칭한다; 그러나, Asn297은 또한 항체의 작은 서열 변동으로 인해, 위치 297의 약 ± 3 아미노산 업스트림 또는 다운스트림, 즉 위치 294와 300 사이에 위치할 수 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공보 번호 US 2003/0157108; US 2004/0093621 참고. "탈푸코실화된" 또는 "푸코스-결핍된" 항체 변이체에 관련된 공보의 예는 하기를 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki 등, J. Mol . Biol . 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki 등, Biotech. Bioeng . 87: 614 (2004). 탈푸코실화된 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화에서 결핍된 Lec13 CHO 세포 (Ripka 등, Arch. Biochem . Biophys . 249:533-545 (1986); 미국 특허 출원 번호 US 2003/0157108 A1, Presta, L; 및 WO　2004/056312 A1, Adams 등, 특히 실시예 11에), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실전달효소 유전자, FUT8 , 녹아웃 CHO 세포 (예를 들어, Yamane-Ohnuki 등, Biotech. Bioeng . 87: 614 (2004); Kanda 등, Biotechnol . Bioeng., 94(4):680-688 (2006); 및 WO2003/085107 참고)를 포함한다.
항체 변이체, 예를 들어, 항체의 Fc 영역에 부착된 바이안테너리 올리고당이 GlcNAc에 의해 이등분된, 이등분한 올리고당으로 추가로 제공된다. 이러한 항체 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예는, 예를 들어, WO 2003/011878; 미국 특허 번호 6,602,684; 및 US 2005/0123546 (Umana 등)에 기재되어 있다. Fc 영역에 부착된 올리고당에 적어도 하나의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체는, 예를 들어, WO 1997/30087; WO 1998/58964; 및 WO 1999/22764 (Raju, S.)에 기재되어 있다.
c) Fc 영역 변이체
특정 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본 명세서에서 제공된 항체의 Fc 영역 안으로 도입될 수 있고, 그것에 의해 Fc 영역 변이체를 생성한다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에 아미노산 잔기 변경 (예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은, 생체내 항체의 반감기가 불필요하거나 또는 유해한 특정 효과기 기능 (예컨대 보체 및 ADCC)에 여전히 중요한 적용에 대해 바람직한 후보로 하는, 효과기 기능 전부는 아니지만 일부를 보유하는 항체 변이체를 고려한다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정이 수행될 수 있다. 예를 들어, 항체가 FcγR 결합을 결여하고 (따라서 ADCC 활성이 결여될 수 있음) FcRn 결합 능력을 보유하는 것을 보장하기 위해 Fc 수용체 (FcR) 결합 검정이 수행될 수 있다. ADCC를 매개하는 일차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면에 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서 FcR 발현은 Ravetch and Kinet, Annu . Rev. Immunol . 9:457-492 (1991)의 464 페이지의 표 3에 요약되어 있다.
관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비-제한적인 예는 하기에서 기재되어 있다: 미국 특허 번호 5,500,362 (예를 들어 Hellstrom 등, Proc. Nat'l Acad . Sci . USA 83:7059-7063 (1986) 및 Hellstrom, I 등, Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 82:1499-1502 (1985); 미국 특허 번호 5,821,337; 및Bruggemann 등, J. Exp . Med . 166:1351-1361 (1987) 참고). 대안적으로, 비-방사성 검정 방법이 이용될 수 있다 (예를 들어, 유세포측정을 위한 ACTI™ 비-방사성 세포독성 검정 (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; 및 CYTOTOX 96® 비-방사성 세포독성 검정 (Promega, Madison, WI) 참고. 이러한 검정에 유용한 효과기 세포는 말초혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 살해 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로, 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내, 예를 들어, 동물 모델에서 예컨대 Clynes 등, Proc . Nat'l Acad . Sci . USA95:652-656 (1998)에 개시된 것에서 평가될 수 있다. 항체는 C1q에 결합할 수 없고 따라서 CDC 활성을 결여한다는 것을 확인하기 위한 C1q 결합 검정이 또한 수행될 수 있다. 예를 들어, WO　2006/029879 및 WO　2005/100402에서의 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 검정이 수행될 수 있다 (예를 들어, Gazzano-Santoro 등, J. Immunol . Methods 202:163 (1996); Cragg 등, Blood 101:1045-1052 (2003); 및 Cragg 등, Blood 103:2738-2743 (2004) 참고). FcRn 결합 및 생체내 청소능/반감기 결정이 또한 당해 분야에서 알려진 방법 (예를 들어, Petkova 등, Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006) 참고)을 사용하여 수행될 수 있다.
감소된 효과기 기능을 갖는 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것들을 포함한다 (미국 특허 번호 6,737,056). 이러한 Fc 돌연변이체는 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 포함하는, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2종 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다 (미국 특허 번호 7,332,581).
FcR에 대한 개선된 또는 줄어든 결합을 갖는 특정 항체 변이체가 기재되어 있다. (예를 들어, 미국 특허 번호 6,737,056; WO 2004/056312, 및 Shields 등, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001) 참고).
특정 구현예에서, 항체 변이체는 ADCC를 개선하는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어, Fc 영역의 위치 298, 333, 및/또는 334 (잔기의 EU 넘버링)에서 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 변경은, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,194,551, WO　99/51642, 및 Idusogie 등, J. Immunol . 164: 4178-4184 (2000)에서 기재된 바와 같이, 변경된 (즉, 개선된 또는 줄어든) C1q 결합 및/또는 보체 의존적 세포독성 (CDC)을 초래하는 Fc 영역에서 이루어 진다.
태아로 모계 IgG의 전이를 담당하는 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 대한 증가된 반감기 및 개선된 결합을 갖는 항체 (Guyer 등, J. Immunol . 117:587 (1976) 및 Kim 등, J. Immunol . 24:249 (1994))가 US2005/0014934A1 (Hinton 등)에 기재되어 있다.　이들 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선하는 하나 이상의 치환을 그 안에 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이러한 Fc 변이체는 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 하나 이상에서 치환, 예를 들어, Fc 영역 잔기 434의 치환을 갖는 것들을 포함한다 (미국 특허 번호 7,371,826). 또한 Fc 영역 변이체의 다른 예에 관하여 하기를 참조한다: Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); 미국 특허 번호 5,648,260; 미국 특허 번호 5,624,821; 및 WO 94/29351.
d) 시스테인 조작된 항체 변이체
본 발명은 야생형 또는 모체항체의 하나 이상의 아미노산 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 항-VEGF 항체를 포함하는 항-VEGF 항체)이 시스테인 아미노산으로 대체된 (즉, "치환된" 또는 "돌연변이된") 시스테인 조작된 항체 (즉, "조작된 시스테인")를 제공한다. 임의의 형태의 항체가 그렇게 조작, 즉 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, 모체 단클론성 항체는 "THIOMAB™ 항체"를 형성하도록 조작될 수 있다. THIOMAB™ 항체의 일 예는 조작된 시스테인을 갖는 항체 단편 (즉, Fab)이다. 이 Fab THIOMAB™ 항체는 "ThioFab"로 지칭될 수 있다. IgG 항체의 이량체성 특성에 기인하여, 단일 부위 돌연변이는 ThioFab에서 단일 조작된 시스테인 잔기를 생성하는 반면, 단일 부위 돌연변이는 THIOMAB™ 항체에서 2개의 조작된 시스테인 잔기를 생성한다는 것에 유의해야 한다.
조작된 시스테인 (Cys) 잔기를 갖는 돌연변이체는 새로 도입된 조작된 시스테인 티올기의 반응성에 대해 평가될 수 있다. 티올 반응성 값은 0 내지 1.0 범위에서 상대적인 수치 용어이고 임의의 시스테인 조작된 항체에 대해 측정될 수 있다. 본 발명의 시스테인 조작된 항체의 티올 반응성 값은 0.0 내지 1.0의 범위이다. 구체적으로, 본 발명의 시스테인 조작된 항체의 티올 반응성 값은 0.1 내지 1.0의 범위이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 시스테인 조작된 항체의 티올 반응성 값은 0.0 내지 0.1, 0.1 내지 0.5, 0.1 내지 0.6, 0.1 내지 0.7, 0.1 내지 0.8, 0.1 내지 0.9, 또는 0.1 내지 1.0의 범위이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 시스테인 조작된 항체의 티올 반응성 값은 0.2 내지 1.0, 0.3 내지 1.0, 0.4 내지 1.0, 0.5 내지 1.0, 0.6 내지 1.0, 0.7 내지 1.0, 또는 0.8 내지 1.0의 범위이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 시스테인 조작된 항체의 티올 반응성 값은 0.6 내지 1.0의 범위이다. 특정구현예에서, 본 발명의 시스테인 조작된 항체의 티올 반응성 값은 0.7 내지 1.0의 범위이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 시스테인 조작된 항체의 티올 반응성 값은 0.8 내지 10의 범위이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 시스테인 조작된 항체의 티올 반응성 값은 0.5 내지 0.8의 범위이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 시스테인 조작된 항체의 티올 반응성 값은 0.5 내지 0.9의 범위이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 시스테인 조작된 항체의 티올 반응성 값은 0.5 내지 0.7의 범위이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 시스테인 조작된 항체의 티올 반응성 값은 0.5 내지 1.0의 범위이다.
본 발명은 친전자성 기능성과 반응성인 시스테인 조작된 항체를 생성하기 위한 디자인, 선택 및 제조 방법을 제공한다. 이들 방법은 추가로 지정된, 설계된, 선택적 부위에 접합된 폴리머 모이어티를 갖는 항체 콘주게이트 화합물 예컨대, 예를 들어, 항체-폴리머 콘주게이트를 가능하게 한다. 항체 표면상의 반응성 시스테인 잔기는 티올 반응기 예컨대 말레이미드 또는 할로아세틸을 통해 폴리머를 구체적으로 접합시킬 수 있다. 말레이미드 기에 대한 Cys 잔기의 티올 기능성의 친핵성 반응성은 단백질에서의 임의의 다른 아미노산 작용기, 예컨대 라이신 잔기의 아미노기 또는 N-말단 아미노기에 비해 약 1000배 더 높다. 아이오도 아세틸 및 말레이미드 시약에서 티올 특이적 기능성은 아민 기와 반응할 수 있지만, 더 높은 pH (> 9.0) 및 더 긴 반응 시간이 요구된다 (Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London).
본 발명의 시스테인 조작된 항체는 바람직하게는 그것의 야생형, 모체 항체 대응물의 항원 결합 능력을 보유한다. 따라서, 시스테인 조작된 항체는, 바람직하게는 구체적으로, 항원에 결합할 수 있다. 예시적인, 비제한적인 항원은 VEGF; IL-1β; IL-6; IL-6R; IL-13; IL-13R; PDGF (예를 들어, PDGF-BB); 안지오포이에틴; 안지오포이에틴 2 (Ang2); Tie2; S1P; 인테그린 αvβ3, αvβ5, 및 α5β1; 베타셀룰린; 아페린/APJ; 에리트로포이에틴; 보체인자 D; TNFα; HtrA1; VEGF 수용체 (예를 들어, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, mbVEGFR, 또는 sVEGFR); ST-2 수용체; 및 AMD 위험에 유전자적으로 연결된 단백질 (예를 들어, 보체 경로 성분 C2, 인자 B, 인자 H, CFHR3, C3b, C5, C5a, 및 C3a; HtrA1; ARMS2; TIMP3; HLA; IL-8; CX3CR1; TLR3; TLR4; CETP; LIPC; COL10A1; 및 TNFRSF10A)을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 항체 (예를 들어, 상기에 기재된 임의의 항-VEGF 항체)는 시스테인 조작된 항체를 생성하기 위해 사용된 모체 항체일 수 있다. 본원에 기재된 예시적인 방법은 본 명세서에 기재된 디자인 및 스크리닝 단계의 적용을 통해 항체의 확인 및 생산에 일반적으로 적용될 수 있다.
본 발명의 시스테인 조작된 항체는 부위-특이적이고 효율적으로 티올-반응 시약과 커플링될 수 있다. 본 티올-반응 시약은, 예를 들어, 청소능-개질제 예컨대 폴리머 (예를 들어, HA 폴리머 또는 폴리에틸렌 글리콜의 다양한 이성질체), 제3 성분에 결합하는 펩타이드, 또는 또 다른 탄수화물 또는 친유성 제제, 다작용성 링커 시약, 캡쳐, 즉, 친화도, 표지 시약 (예를 들어, 바이오틴-링커 시약), 검출 표지 (예를 들어, 형광단 시약), 고상 고정화 시약 (예를 들어, SEPHAROSE™, 폴리스티렌, 또는 유리), 또는 약물-링커 중간체일 수 있다. 티올-반응 시약의 일 예는 N-에틸말레이미드 (NEM)이다. 예시적인 구현예에서, 바이오틴-링커 시약과 THIOMAB™ 항체의 반응은 조작된 시스테인 잔기의 존재 및 반응성이 검출되고 측정될 수 있는 바이오티닐화된 THIOMAB™ 항체를 제공한다. 다작용성 링커 시약과 THIOMAB™ 항체의 반응은 폴리머, 약물 모이어티 시약 또는 다른 표지와 추가로 반응될 수 있는 작용화된 링커를 갖는 THIOMAB™ 항체를 제공한다. 약물-링커 중간체와 THIOMAB™ 항체의 반응은 THIOMAB™ 항체 약물 콘주게이트를 제공한다. 특정 구현예에서, THIOMAB™ 항체는 ThioFab이다.
시스테인 조작된 항체는 반응 기, 예를 들어, 말레이미드, 아이오도아세트아미드, 피리딜 디설파이드, 또는 다른 티올-반응 콘주게이션 파트너인 티올-반응성 제제에 접합될 수 있다 (예를 들어, Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Hermanson, G. in Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, San Diego, pp. 40-55, 643-671 참고). 파트너는 세포독성 약물 (예를 들어, 독소 예컨대 독소루비신 또는 백일해 독소), 형광단 예컨대 플루오레세인 또는 로다민 같은 형광 염료, 이미지형성을 위한 킬레이트제 또는 방사선요법 금속, 펩티딜 또는 비-펩티딜 표지 또는 검출 태그, 또는 청소능-개질제 예컨대 폴리머 (예를 들어, HA 폴리머 또는 폴리에틸렌 글리콜의 다양한 이성질체), 제3 성분에 결합하는 펩타이드, 또는 또 다른 탄수화물 또는 친유성 제제일 수 있다.
PHESELECTOR (반응 티올의 선택을 위한 파아지 ELISA) 검정은 ELISA 파아지 형식에서의 항체에서 반응성 시스테인 기의 검출을 허용한다. 본 명세서에 전체적으로 참고로 편입되는, 미국 특허 번호 7,521,541 및 미국 특허 공개 번호 20110301334를 참조한다. 구체적으로, PHESESLECTOR 검정은 웰 표면 상에 관심 단백질 (예를 들어,항체)을 도포하는 과정, 이어서 파아지 입자로 인큐베이션 및 그 다음 홀스래디쉬 페록시다아제 (HRP) 라벨링된 이차 항체를 흡광도 검출하는 과정을 포함한다. 파아지 상에 표시된 돌연변이체 단백질은 신속하고 강력하며 높은-처리량 방식으로 선별될 수 있다. 시스테인 조작된 항체의 라이브러리는 항체 또는 다른 단백질의 랜덤 단백질-파아지 라이브러리로부터 유리 Cys 편입의 적절하게 반응성인 부위를 확인하기 위해 동일한 접근법을 사용하여 결합 선택에 생산 및 적용될 수 있다. 이 기술은 파아지 상에 표시된 시스테인 돌연변이체 단백질을 또한 티올-반응성인 친화도 시약 또는 리포터 그룹과 반응시키는 것을 포함한다.
특정 구현예에서, PHESELECTOR 검정은 하기 단계를 포함한다: (1) 소과 혈청 알부민 (BSA), 표적 단백질 (예를 들어, VEGF)의 일부분 또는 전체, 및 스트렙타비딘 (2 μg/ml의 100 μl)을 MAXISORB® 96 웰 플레이트 상에 별도로 코팅하는 단계; (2) 0.5% TWEEN®-20 (PBS에서)으로 차단한 후, 바이오티닐화된 및 비-바이오티닐화된 THIOMAB™ 항체-파아지 (2Х1010 파아지 입자)를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하는 단계; (3) 파아지와의 인큐베이션에 이어서 HRP 라벨링된 이차 항체 (항-M13 파아지 도포 단백질, pVIII 단백질 항체)로 인큐베이션하는 단계; (4) 표준 HRP 반응을 수행하고 흡광도는 450 nm에서 측정하는 단계; (5) 티올 반응성은 1의 티올 반응성 값이 시스테인 티올의 완전한 바이오티닐화를 나타내도록 스트렙타비딘에 대한 OD450/표적 단백질 (예를 들어, VEGF)에 대한 OD450 사이의 비를 계산함으로써 측정하는 단계.
시스테인 조작된 항체를 인코딩하는 DNA는 통상적인 절차 (예를 들어, 쥣과 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 구체적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함에 의함)를 사용하여 쉽게 단리 및 서열분석된다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 공급원으로서 작용한다. 일단 단리되면, DNA는 발현 벡터 안으로 배치될 수 있고, 이것은 그런 다음, 달리는 항체 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포 예컨대 E. 콜리 세포, 유인원 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, HEK293T 세포, 또는 다른 포유동물 숙주 세포, 예컨대 골수종 세포 (미국 특허 번호 5,807,715; US 2005/0048572; US 2004/0229310) 안으로 형질감염되어 재조합 숙주 세포에서 단클론성 항체의 합성을 수득한다. 대개의 경우, 시스테인 조작된 항체의 수율은 야생형 항체와 유사하다.
디자인 및 선택 후, 시스테인 조작된 항체, 예를 들어 반응성이 높은 비결합 Cys 잔기를 갖는 THIOMAB™ 항체는: (i) 박테리아, 예를 들어, E. 콜리, 시스템 또는 포유동물 세포 배양 시스템 (WO 01/00245), 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO) 또는 HEK293 세포 (예를 들어, HEK293T 세포)에서의 발현; 및 (ii) 일반적인 단백질 정제 기술 (예를 들어, Lowman et al (1991) J. Biol. Chem. 266(17):10982-10988)을 사용한 정제에 의해 생산될 수 있다. 특정 구현예에서, THIOMAB™ 항체는 포유동물 세포 발현 시스템에서 발현된다. 특정 구현예에서, 포유동물 세포 발현 시스템은 HEK293T 세포이다.
중쇄 및 경쇄의 조작된 Cys 잔기의 구조 위치는 순차적인 넘버링 시스템에 따라 넘버링될 수 있다. 이 순차적인 넘버링 시스템은 도 13A 및 13B에서의 4D5 항체에 대한 카밧 넘버링 시스템 (Kabat 등, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.)에 상관된다. 카밧 넘버링 시스템을 사용하여, 그의 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR의 단축, 또는 그 안으로의 삽입에 상응하여 더 적거나 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 시스테인 조작된 중쇄 변이체 부위 및 경쇄 변이체 부위는 도 13A 및 13B에서 순차적인 넘버링 및 카밧 넘버링에 의해 확인된다.
티올 반응성은 또한 항체의 특정 도메인, 예컨대 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 중쇄 불변 도메인, CH1, CH2 및 CH3에 대해 일반화될 수 있다. 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 및 0.95 이상의 티올 반응성 값을 초래하는 시스테인 대체는 각각 IgG 서브클래스: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, 및 IgA2를 포함하는, 온전한 항체: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM의 중쇄 불변 도메인 α, δ, ε, γ, 및 μ에서 이루어질 수 있다.
시스테인 조작된 항체는, 예를 들어, 하기에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다: 미국 특허 번호 7,521,541 또는 국제 특허 공개 번호 WO 2006/034488 (이는 전체적으로 참고로 본 명세서에 편입되어 있음). 일부 구현예에서, 시스테인 조작된 항체 변이체는 미국 특허 번호 7,521,541 또는 국제 특허 공개 번호 WO 2006/034488에 기재된 시스테인 조작된 항체 변이체이다. 일부 사례에서, 시스테인 조작된 항체 변이체는 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2011/156328 또는 미국 특허 번호 9,000,130 (이는 전체적으로 참고로 본 명세서에 편입되어 있음)에 기재된 시스테인 조작된 항체 변이체이다. 일부 구현예에서, 시스테인 조작된 항체 변이체는 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2016/040856 (이는 본 명세서에 참고로 전체적으로 편입됨), 예를 들어, WO 2016/040856의 표 1 내지 4에 기재된 시스테인 조작된 항체 변이체이다.
예를 들어, 특정 구현예에서, 시스테인 돌연변이는 HC-I195C, HC-S420C, HC-Y432C, 및 LC-G64C (카밧 넘버링에 따라)로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 시스테인 돌연변이는 HC-Y432C 및 LC-G64C (카밧 넘버링에 따라)로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 시스테인 돌연변이는 중쇄 돌연변이 및는 Y33C, G162C, V184C, I195C, S420C, Y432C, 및 Q434C (카밧 넘버링에 따라)로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 시스테인 돌연변이는 중쇄 돌연변이 및는 R19C, E46C, T57C, Y59C, A60C, M100cC, W103C, G162C, I195C, V258C, S420C, H425C, 및 N430C (카밧 넘버링에 따라)로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 시스테인 돌연변이는 중쇄 돌연변이 및는 Y33C, G162C, V184C, 및 I195C (카밧 넘버링에 따라)로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 시스테인 돌연변이는 중쇄 돌연변이 및는 R19C, E46C, Y59C, A60C, M100cC, W103C, V258C, H425C, 및 N430C (카밧 넘버링에 따라)로 구성된 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 시스테인 돌연변이는 경쇄 돌연변이이고, Y55C, G64C, T85C, T180C, 및 N430C (카밧 넘버링에 따라)로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 시스테인 돌연변이는 경쇄 돌연변이이고, T31C, S52C, G64C, R66C, A193C, 및 N430C (카밧 넘버링에 따라)로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 시스테인 돌연변이는 경쇄 돌연변이이고, G64C, T85C, T180C, 및 N430C (카밧 넘버링에 따라)로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 시스테인 돌연변이는 경쇄 돌연변이이고, S52C, G64C, R66C, A193C, 및 N430C (카밧 넘버링에 따라)로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 경쇄에서의 시스테인 돌연변이는 LC-I106C, LC-R108C, LC-R142C, 및 LC-K149C (카밧 넘버링에 따라)를 포함하는 시스테인 돌연변이의 군으로부터 선택된다 (참고 도 13A; 표 2). 특정 구현예에서, 경쇄에서의 시스테인 돌연변이는 LC-K149C (카밧 넘버링에 따라)이다 (참고 도 13A). 특정 구현예에서, 경쇄에서의 시스테인 돌연변이는 LC-V205C (카밧 넘버링에 따라)이다.
Figure pct00003
특정 구현예에서, 중쇄에서의 시스테인 돌연변이는 하기로 구성된 시스테인 돌연변이의 군으로부터 선택된다: HC-T114C, HC-A140C, HC-L174C, HC-L179C, HC-T187C, HC-T209C, HC-V262C, HC-G371C, HC-Y373C, HC-E382C, HC-S424C, HC-N434C, 및 HC-Q438C (EU 넘버링에 따라) (참고 도 13B; 표 3). 특정 구현예에서, 중쇄에서의 시스테인 돌연변이는 카밧 넘버링에 따른 HC-A143C 이다 (즉, EU 넘버링에 따른 HC-A140C) (참고 도 13B; 표 3). 특정 구현예에서, 중쇄에서의 시스테인 돌연변이는 EU 넘버링에 따른 HC-A174C이다 (참고 도 13B; 표 3). 특정 구현예에서, 중쇄에서의 시스테인 돌연변이는 EU 넘버링에 따른 HC-A118C (즉, 카밧 넘버링에 따른 HC-A114C)이다.
특정 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 바와 같은 임의의 시스테인 조작된 항체는 하기 시스테인 돌연변이: 카밧 넘버링에 따른 LC-K149C 및 EU 넘버링에 따른 HC-A140C 중 하나를 갖는다 (참고 표 2 및 3 및 도 13A 및 13B).
Figure pct00004
특정 구현예에서, 하기 잔기 중 임의의 하나 이상은 하기의 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (카밧 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링).
특정 구현예에서, 시스테인 조작된 항체는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 시스테인 돌연변이를 포함할 수 있다: V2C, L4C, V5C, L11C, R19C, F27C, I29C, T32C, Y33C, Q39C, A40C, K43C, L45C, E46C, T53C, G55C, T57C, R58C, Y59C, A60C, T68C, N76C, Y79C, Q81C, W95C, G96C, D101C, W103C, T116C, K117C, T135C, N155C, A158C, G162C, G174C, L175C, T183C, V184C, I195C, N199C, S203C, F239C, M248C, E254C, V258C, N272C, V278C, L305C, T331C, S333C, R340C, Q343C, K356C, E384C, S399C, K410C, Q414C, G416C, N417C, Y432C, T433C, K435C, S438C, L439C, M100cC, 및 N82aC (카밧 넘버링에 따라). 또한 하기를 참조한다: 국제 특허 출원 번호 WO 2016/040856의 표 3.
특정 구현예에서, 시스테인 조작된 항체는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 시스테인 돌연변이를 포함할 수 있다: S12C, S14C, G16C, R18C, T22C, R24C, Q27C, T31C, A32C, Q38C, K39C, G41C, K42C, P44C, Y49C, S50C, S52C, F53C, L54C, Y55C, S63C, G64C, R66C, D70C, T72C, T74C, S76C, Q79C, T85C, H91C, Y92C, P95C, T97C, F98C, K103C, E105C, K107C, P119C, K126C, T129C, S131C, Q147C, W148C, A153C, Q155C, S156C, S159C, Q160C, S162C, Q166C, T172C, T180C, V191C, A193C, E195C, V205C, T206C, 및 N210C (카밧 넘버링에 따라). 또한 하기를 참조한다: 국제 특허 출원 번호 WO 2016/040856의 표 4.
특정 구현예에서, 시스테인 조작된 항체는 HC-I195C, HC-S420C, HC-Y432C, 및 LC-G64C (카밧 넘버링에 따라)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 시스테인 돌연변이를 포함할 수 있다. 또한 하기를 참조한다: 국제 특허 출원 번호 WO 2016/040856의 표 5.
특정 구현예에서, 시스테인 조작된 항체는 LC-T22C, LC-K39C, LC-Y49C, LC-Y55C, LC-T85C, LC-T97C, LC-I106C, LC-R108C, LC-R142C, LC-K149C, 및 LC-V205C (카밧 넘버링에 따라)로 구성된 부위의 군으로부터 선택된 경쇄 시스테인 돌연변이를 포함한다.
시스테인 조작된 항체는 임의의 적합한 수의 조작된 시스테인 잔기, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 그 초과 개의 조작된 시스테인 잔기를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 시스테인 조작된 항체는 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 또는 1-10개의 조작된 시스테인 잔기를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 시스테인 조작된 항체는 1개의 조작된 시스테인 잔기를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 시스테인 조작된 항체는 2개의 조작된 시스테인 잔기를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 시스테인 조작된 항체는 3개의 조작된 시스테인 잔기를 포함할 수 있다.
이전의 구현예 중 임의의 것에서, 시스테인 조작된 항체는 상기에 기재된 시스테인 돌연변이 중 임의의 것과 동등한 위치에서 조작된 시스테인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체가 위치 118 (EU 넘버링)에서 천연 세린을 포함하면, 세린은 시스테인으로 돌연변이되어 S118C 돌연변이를 형성할 수 있다.
예를 들어, 본 발명은 HC-A118C, HC-A140C, 및 HC-L174C (EU 넘버링)로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄에서의 시스테인 돌연변이, 또는 LC-V205C 및 LC-K149C (카밧 넘버링)로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄에서의 시스테인 돌연변이를 포함하는 시스테인 조작된 항-VEGF 항체를 제공하고, 상기 항-VEGF 항체는 본 명세서에 기재된 임의의 항-VEGF 항체, 예를 들어, 표 8-10에 기재된 임의의 항-VEGF 항체이다. 일부 구현예에서, 항-VEGF 항체는 N94A.F83A.N82aR.Y58R (G6.31 AARR)이다. 일부 구현예에서, 항-VEGF 항체는 G6.31 WT이다. 일부 구현예에서, 항-VEGF 항체는 LC-N94A이다. 일부 구현예에서, 항-VEGF 항체는 LC-N94A.LC-F83A이다. 일부 구현예에서, 항-VEGF 항체는 LC-N94A.LC-F83A이다. 일부 구현예에서, 항-VEGF 항체는 HC-A40E.HC-T57E (G6.31 AAEE)이다. 일부 구현예에서, 항-VEGF 항체는 HCcombo이다. 일부 구현예에서, 항-VEGF 항체는 HCLC2이다. 일부 구현예에서, 항-VEGF 항체는 HCLC4이다. 일부 구현예에서, 항-VEGF 항체는 HCLC5이다. 일부 구현예에서, 항-VEGF 항체는 HCLC3이다. 일부 구현예에서, 항-VEGF 항체는 HCLC1이다. 일부 구현예에서, 항-VEGF 항체는 R19HCcombo이다. 일부 구현예에서, 항-VEGF 항체는 R19HCLC2이다. 일부 구현예에서, 항-VEGF 항체는 R19HCLC4. 일부 구현예에서, 항-VEGF 항체는 R19HCLC5이다.
특정 예에서, 본 발명은 HC-A118C, HC-A140C, 및 HC-L174C (EU 넘버링)로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄에서의 시스테인 돌연변이, 또는 LC-V205C 및 LC-K149C (카밧 넘버링)로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄에서의 시스테인 돌연변이를 포함하는 시스테인 조작된 항-VEGF 항체를 제공하되, 상기 항체는 하기 6개의 HVR을 포함한다: (a) DYWIH (서열번호: 1)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) GITPAGGYTRYADSVKG (서열번호: 7)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) FVFFLPYAMDY (서열번호: 3)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) RASQDVSTAVA (서열번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) SASFLYS (서열번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) QQGYGAPFT (서열번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 사례에서, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체는 하기 4개의 중쇄 가변 도메인 FR을 포함한다: (a) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS (서열번호: 13)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1; (b) WVRQAPGKGLEWVA (서열번호: 14)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2; (c) RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR (서열번호: 15)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3; 및 (d) WGQGTLVTVSS (서열번호: 16)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4. 추가 사례에서, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체는 하기 4개의 경쇄 가변 도메인 FR을 포함한다: (a) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열번호: 17)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1; (b) WYQQKPGKAPKLLIY (서열번호: 18)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2; (c) GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (서열번호: 19)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3; 및 (d) FGQGTKVEIK (서열번호: 20)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4. 일부 사례에서, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 사례에서, 모 항체는 G6.31 AARR. 일부 구현예에서, 시스테인 돌연변이는 HC-A118C이다. 다른 구현예에서, 시스테인 돌연변이는 HC-A140C이다. 또 다른 구현예에서, 시스테인 돌연변이는 HC-L174C (EU 넘버링)이다. 다른 구현예에서, 시스테인 돌연변이는 LC-V205C (카밧 넘버링)이다. 다른 구현예에서, 시스테인 돌연변이는 LC-K149C (카밧 넘버링)이다.
일부 사례에서, 본 발명은 하기를 포함하는 항체를 제공한다: (a) 서열번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 (b) 서열번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
일부 사례에서, 본 발명은 하기를 포함하는 항체를 제공한다: (a) 서열번호: 92의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 (b) 서열번호: 91의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
일부 사례에서, 본 발명은 하기를 포함하는 항체를 제공한다: (a) 서열번호: 94의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 (b) 서열번호: 93의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
e) 항체 유도체
특정 구현예에서, 본 명세서에 제공된 항체는 당해 기술에 공지되어 있고 쉽게 이용가능한 추가의 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 비제한적으로 수용성 폴리머를 포함한다. 수용성 폴리머의 비-제한적인 예는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1, 3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단일중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 단일중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 및 이들의 혼합물. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 물에서의 그것의 안정성으로 인해 제조시에 이점을 가질 수 있다. 폴리머는 임의의 분자량을 가질 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착된 폴리머의 수는 변할 수 있고, 1 초과개의 폴리머가 부착되면, 동일 또는 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용된 폴리머의 수 및/또는 유형은 개선될 항체의 특정한 특성 또는 기능, 항체 유도체가 정의된 조건 하에서 요법에 사용될 지의 여부, 및 기타 동종의 것을 비제한적으로 포함하는 고려사항들을 기반으로 결정될 수 있다. 추가의 항체 콘주게이트는 본 명세서, 예를 들어, 아래의 부문 G 및 in 실시예 1 및 2에 기재되어 있다.
또 다른 구현예에서, 방선에의 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 항체 및 비단백질성 모이어티의 콘주게이트가 제공된다. 일 구현예에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (Kam 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 102: 11600-11605 (2005)). 상기 방사선은 임의의 파장을 가질 수 있고, 통상적인 세포에 유해하지 않지만, 항체-비단백질성 모이어티에 가까운 세포가 사멸되는 온도로 상기 비단백질성 모이어티를 가열하는 파장을 비제한적으로 포함한다.
f) 등전점 변이체
본 발명은 변경된 등전점을 갖는 항체 변이체를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은, 예를 들어, 항-VEGF 항체, 예를 들어, G6.31와 비교시, 감소된 등전점 (pI)을 갖는 항체 변이체를 제공한다. 일부 사례에서, 표면 전하는 생리적 pH에서 감소된다. 일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 약 8 이하 (예를 들어, 약 8, 약 7, 약 6, 약 5, 또는 약 4)의 pI를 갖는다. 일부 사례에서, 항체는 약 4 내지 약 8 (예를 들어, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 또는 약 8)의 pI을 갖는다. 일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 약 5 내지 약 7 (예를 들어, 약 5, 약 6, 또는 약 7)의 pI을 갖는다. 일부 사례에서, 항-VEGF 항체는 약 5 내지 약 6 (예를 들어, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 약 5.4, 약 5.5, 약 5.6, 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9, 또는 약 6)의 pI을 갖는다.
본 발명의 항체는, 예를 들어, 주어진 위치에서의 야생형 아미노산 잔기를 더 낮은 pI를 갖는 아미노산으로 치환함으로써 감소된 pI를 갖도록 조작될 수 있다. 아미노산의 pI은 아민 (-NH2), 카복실산 (-COOH), 및 아미노산의 측쇄의 pKa 값을 기반으로 결정될 수 있는데, 이는 당해 기술에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 표면-노출된 아미노산 잔기는 항체의 pI를 감소시키기 위해 치환될 수 있다. 일 구현예에서, 표면-노출된 아미노산 잔기는 글루타메이트 (E) 로 치환될 수 있다. 일 구현예에서, 표면-노출된 아미노산 잔기는 아스파르테이트 (D) 로 치환될 수 있다.
B. 재조합 방법 및 조성물
본 명세서에 기재된 임의의 항체 (예를 들어, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체를 포함하는 항-VEGF 항체)는, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567에 기재된 바와 같은 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생산될 수 있다. 일 구현예에서, 본 명세서에 기재된 항-VEGF 항체를 인코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열 (예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 인코딩할 수 있다. 추가의 구현예에서, 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 추가의 구현예에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 하나의 그와 같은 구현예에서, 숙주 세포는: (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다 (예를 들어, 이들로 형질전환된다). 일 구현예에서, 숙주 세포는 진핵, 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프양 세포 (예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 일 구현예에서, 항-VEGF 항체를 제조하는 방법이 제공되고, 여기서 상기 방법은 항체의 발현에 적합한 조건 하에서 상기 제공된 바와 같이 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계 및 선택적으로 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
항체 (예를 들어, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체를 포함하는 항-VEGF 항체)의 재조합 생산을 위해, 예를 들어 상기 기재된 바와 같이 항체를 코딩하는 핵산을 단리하고 숙주 세포에서 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입한다. 이러한 핵산은 통상적인 절차 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 구체적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함에 의해)를 사용하여 쉽게 단리 및 서열분석될 수 있다.
항체-인코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본 명세서에 기재된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 특히 당화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않은 경우, 항체는 박테리아에서 생산될 수 있다. 박테리아에서 항체 단편 및 폴리펩타이드의 발현에 대해서는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,648,237, 5,789,199, 및 5,840,523을 참조한다. 또한 하기를 참조한다: E. 콜리에서 항체 단편의 발현을 기술하는, Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254. 발현 후, 항체는 박테리아 세포 페이스트로부터 가용성 분획으로 단리될 수 있고 추가로 정제될 수 있다.
원핵생물에 더하여, 진핵 미생물 예컨대 사상균 또는 효모는 당화 경로가 "인간화"된 진균 및 효모 균주를 포함하는 항체-인코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주로, 부분적으로 또는 완전하게 인간 당화 패턴을 갖는 항체의 생산을 초래한다. Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), 및 Li 등,Nat . Biotech. 24:210-215 (2006)를 참조한다.
당화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다중 세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 특히 스포도프테라 프루지페르다 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 공조하여 사용될 수 있는 수 많은 바큘로바이러스 균주가 확인되었다
식물 세포 배양물이 또한 숙주로서 이용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, 및 6,417,429 (형질전환 식물에서 항체를 생산하는 PLANTIBODIES™ 기술을 설명함)를 참조한다.
척추동물 세포가 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액에서 성장하도록 적응된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40 (COS-7)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 라인; 인간 배아 신장 라인 (예를 들어, Graham 등, J. Gen Virol . 36:59 (1977)에 기재된 293 또는 293 세포); 어린 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들어, Mather, Biol . Reprod . 23:243-251 (1980)에 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁 경부암종 세포 (HELA); 갯과 신장 세포 (MDCK; 버팔로 랫트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유선 종양 (MMT 060562); 예를 들어 Mather 등, Annals NY Acad . Sci . 383:44-68 (1982)에 기재된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 DHFR- CHO 세포를 포함하는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 (Urlaub 등, Proc . Natl. Acad . Sci . USA 77:4216 (1980)); 및 골수종 세포주 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토에 대해, 예를 들어, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (BKC Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)를 참조한다.
C. 검정
항체 (예를 들어, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체를 포함하여, 본 명세서에서 기재된 항-VEGF 항체)뿐만 아니라 항체 콘주게이트 (예를 들어, 항-VEGF 항체를 포함하는 항체 콘주게이트 (예를 들어, 본 명세서에서 제공된 임의의 항-VEGF 항체))는 당 업계에서 알려진 다양한 검정에 의해 그것의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 확인, 선별되거나, 또는 특성규명될 수 있다.
1. 결합 검정 및 다른 검정
일 양태에서, 항체 (예를 들어, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체를 포함한 항-VEGF 항체), 또는 이들의 항체 콘주게이트가, 예를 들어, 알려진 방법 예컨대 ELISA, 웨스턴 블랏, 등에 의해 그것의 항원 결합 활성에 대해 시험된다.
또 다른 양태에서, 항원 (예를 들어, VEGF)에 대한 결합에 대해 본 명세서에서 기재된 바와 같은 항체, 또는 이들의 항체 콘주게이트와 경쟁하는 항체를 식별하기 위해 경쟁 검정이 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 이러한 경쟁 항체는 본 명세서에서 기재된 바와 같은 항체에 의해 결합된 동일한 에피토프 (예를 들어, 선형 또는 형태적 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 맵핑하기 위한 상세한 예시적인 방법은 Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)에서의 Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols"에 제공되어 있다.
예시적인 경쟁 검정에서, 고정된 VEGF는 VEGF에 결합하는 제1 표지된 항체 및 VEGF에 결합에 대해 제1 항체와 경쟁하는 그것의 능력에 대해 시험되는 제2 비표지된 항체를 포함하는 용액에서 인큐베이션된다. 제2 항체는 하이브리도마 상청액에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 고정된 VEGF는 제1 표지된 항체를 포함하지만 제2 비표지된 항체를 포함하지 않는 용액에서 인큐베이션된다. 제1 항체의 VEGF에 대한 결합에 허용되는 조건 하에서 인큐베이션한 후, 과잉의 미결합된 항체를 제거하고 고정된 VEGF와 연관된 표지의 양을 측정한다. 고정된 VEGF와 연관된 표지의 양이 대조군 샘플에 비해 시험 샘플에서 실질적으로 감소되면, 그것은 제2 항체가 VEGF에 결합하기 위해 제1 항체와 경쟁하고 있음을 나타낸다. 다른 항원에 대해 유사한 검정이 수행될 수 있다. Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)를 참조한다.
2. 활성 검정
일 양태에서, 생물학적 활성을 갖는 항체 (예를 들어, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체를 포함하는 항-VEGF 항체) 또는 그것의 항체 콘주게이트를 확인하기 위한 검정이 제공된다. 생물학적 활성은 예를 들어, 생체내, 시험관내, 또는 생체외 중 어느 하나에서 항원 (예를 들어, VEGF (예를 들어, 혈류에서의 VEGF)) 또는 이의 펩타이드 단편에 결합하는 것을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 생물학적 활성은 항원을 차단 또는 중화시키는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 생물학적 활성은 VEGF를 차단 또는 중화시키거나, 또는 VEGF가 리간드, 예를 들어 KDR 또는 Flt-1과 같은 수용체에 결합하는 것을 방지하는 것을 포함할 수 있다. 생체내 및/또는 시험관내에서 이러한 생물학적 활성을 갖는 항체 또는 그것의 항체 콘주게이트가 또한 제공된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그것의 항체 콘주게이트는 이러한 생물학적 활성에 대해 시험된다.
3. 안정성 검정
일 양태에서, 항체 (예를 들어, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체를 포함하는 항-VEGF 항체) 또는 그것의 항체 콘주게이트의 안정성 (예를 들어, 열안정성)을 결정하기 위한 검정이 제공된다. 예를 들어, 항체 또는 그것의 항체 콘주게이트의 안정성은 당해 분야에 알려진 임의의 방법, 예를 들어, 시차주사 형광 측정법 (DSF), 원형 2색성 (CD), 고유 단백질 형광, 시차주사 열량측정, 분광법, 광산란 (예를 들어, 동적광산란 (DLS) 및 정적 광산란 (SLS), 자기-상호작용 크로마토그래피 (SIC)를 사용하여 결정될 수 있다. 항체 또는 그것의 항체 콘주게이트의 안정성은, 예를 들어 국제 특허 출원 번호 PCT/US2016/053454의 실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이 DSF를 사용하여, 예를 들어, 본 명세서에서 기재된 바와 같이 결정될 수 있다. 일부 사례에서, 항체 콘주게이트의 안정성은, 예를 들어, 실시예 1에 기재된 바와 같이 굴절률 및 다중-각 광산란 검출기 (SEC-RI-MALS)와 인-라인으로 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정될 수 있다.
D. 약제학적 제형
본 명세서에서 제공된 항체 (예를 들어, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체를 포함하는 항-VEGF 항체) 또는 그것의 항체 콘주게이트의 약제학적 제형은 원하는 정도의 순도를 갖는 이러한 항체 또는 항체 콘주게이트를 하나 이상의 선택적인 약제학적으로 허용가능한 캐리어 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 혼합함에 의해 제조된다. 약제학적으로 허용가능한 캐리어는 일반적으로 이용된 투약량 및 농도에서 수령체에게 비독성이며, 비제한적으로: 완충액 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 산화방지제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄; 헥사메토늄 염화물; 벤즈알코늄 염화물; 벤즈에토늄 염화물; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10 잔기 미만) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함한 단당류, 이당류, 및 기타 탄수화물; 킬레이트제 예컨대 EDTA; 당류 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염형성 반대이온 예컨대 나트륨; 금속착물 (예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다. 본 명세서에서 예시적인 약제학적으로 허용가능한 캐리어는 침입형 약물 분산제 예컨대 가용성 중성-활성 하이알로니다제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어, 인간 가용성 PH-20 하이알로니다제 당단백질, 예컨대 rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.)을 추가로 포함한다.　rHuPH20을 포함한 특정 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법은 미국 특허 공보 번호 2005/0260186 및 2006/0104968에 기재되어 있다. 일 양태에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가의 글리코사미노글리카나제 예컨대 콘드로이티나제와 조합된다.
예시적인 동결건조된 항체 제형이 미국 특허 번호 6,267,958에 기재되어 있다. 수성 항체 제형은 미국 특허 번호 6,171,586 및 WO2006/044908에 기재된 것들을 포함하고, 후자 제형은 히스티딘-아세테이트 완충액을 포함한다.
본 명세서에서의 제형은 또한 치료될 특정한 조짐에 대해 필요에 따라 1 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 부정적으로 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, 면역 억제제를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합하여 적합하게 존재한다.
활성 성분은, 예를 들어, 콜로이드성 약물 전달시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 마이크로구형체, 마이크로에멀션, 나노-입자 및 나노캡슐)에서 또는 매크로에멀션에서 각각 코아세르베이션 기술에 의하거나 또는 계면 중합, 예를 들어, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타실레이트) 마이크로캡슐에 의해 제조된 마이크로캡슐에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 아래에서 개시되어 있다: Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).
생체내 투여를 위해 사용되는 제형은 일반적으로 멸균성이다. 멸균은, 예를 들어, 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성될 수 있다.
특정 구현예에서, 약제학적 제형은 하나 이상의 추가의 화합물을 포함한다. 특정 구현예에서, 추가의 화합물은 하기로 구성된 군으로부터 선택된 제2 생물학적 분자에 결합한다: IL-1β; IL-6; IL-6R; IL-13; IL-13R; PDGF; 안지오포이에틴; 안지오포이에틴 2; Tie2; S1P; 인테그린 αvβ3, αvβ5, 및 α5β1; 베타셀룰린; 아페린/APJ; 에리트로포이에틴; 보체 인자 D; TNFα; HtrA1; VEGF 수용체; ST-2 수용체; 및 연령 관련 황반 변성 (AMD) 위험에 유전자적으로 연결된 단백질, 예컨대 보체 경로 성분 C2, 인자 B, 인자 H, CFHR3, C3b, C5, C5a, 및 C3a; HtrA1; ARMS2; TIMP3; HLA; IL-8; CX3CR1; TLR3; TLR4; CETP; LIPC; COL10A1; 및 TNFRSF10A. 특정 구현예에서, 추가의 화합물은 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
예를 들어, 일부 사례에서, 추가의 화합물은 이중특이적 항체 (예를 들어, 항-VEGF/항-Ang2 이중특이적 항체, 예컨대 RG-7716 또는 임의의 이중특이적 항-VEGF/항-Ang2 이중특이적 항체 (WO 2010/069532 또는 WO 2016/073157에서 개시됨)이다.
또 다른 예에서, 일부 사례에서, 추가의 화합물은 항-IL-6 항체, 예를 들어, EBI-031 (Eleven Biotherapeutics; 참고, 예를 들어, WO 2016/073890), 실툭시맙 (SYLVANT®), 올로키주맙, 클라자키주맙, 시루쿠맙, 엘실리모맙, 게릴림주맙, OPR-003, MEDI-5117, PF-04236921, 또는 그것의 변이체이다.
또 추가의 예에서, 일부 사례에서, 추가의 화합물은 항-IL-6R 항체, 예를 들어, 토실리주맙 (ACTEMRA®) (참고, 예를 들어, WO 1992/019579), 사릴루맙, 보발릴리주맙 (ALX-0061), SA-237, 또는 그것의 변이체이다.
E. 치료 방법 및 조성물
본 명세서에 제공된 항체 (예를 들어, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체를 포함하는 항-VEGF 항체) 또는 그의 항체 콘주게이트 (예를 들어, 단분산 HA 콘주게이트) 중 임의의 것이 치료 방법에서 사용될 수 있다.
일 양태에서, 약제로서 사용하기 위한 항-VEGF 항체 (예를 들어, 조작된 시스테인 항-VEGF 항체)가 제공된다. 또 다른 양태에서, 약제로서 사용하기 위한 항체 콘주게이트 (예를 들어, 단분산 HA 콘주게이트)가 제공된다. 추가 양태에서, 본 발명은 병리적 혈관신생과 연관된 장애를 치료하는데 사용하기 위한 항-VEGF 항체 (예를 들어, 조작된 시스테인 항-VEGF 항체)를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 병리적 혈관신생과 연관된 장애를 치료하는데 사용하기 위한 항체 콘주게이트 (예를 들어, 단분산 HA 콘주게이트)를 제공한다. 일부 구현예에서, 병리적 혈관신생과 연관된 장애는 안구 장애이다. 일부 사례에서, 안구 장애는 AMD (예를 들어, 습성 AMD, 건조 AMD, 중기 AMD, 진행성 AMD, 또는 지리학적 위축증 (GA)), 황반 변성, 황반 부종, DME (예를 들어, 초점, 비-중심 DME 또는 확산, 중심-관여된 DME), 망막증, 당뇨 망막병증 (DR) (예를 들어, 증식성 DR (PDR), 비-증식성 DR (NPDR), 또는 고고도 DR), 다른 허혈-관련된 망막증, ROP, 망막 정맥 폐색 (RVO) (예를 들어, 중심 (CRVO) 및 분지형 (BRVO) 형태), CNV (예를 들어, 근시 CNV), 각막 신생혈관형성, 각막 신생혈관형성과 연관된 질환, 망막 신생혈관형성, 망막/맥락막 신생혈관형성과 연관된 질환, 병리적 근시, 폰 힙펠-린도우병, 눈의 히스토플라마증, FEVR, 코우츠병, 노리병, OPPG, 결막하 출혈, 조홍, 안구 신생혈관 질환, 신생혈관 녹내장, 색소성 망막염 (RP), 고혈압 망막증, 망막 혈관종 증식, 황반 모세혈관확장증, 홍채 신생혈관형성, 안구내 신생혈관형성, 망막 퇴행, 포낭 황반 부종 (CME), 혈관염, 유두부종, 망막염, 결막염 (예를 들어, 감염성 결막염 및 비-감염성 (예를 들어, 알러지성) 결막염), 레버 선천성 흑내장, 포도막염 (감염성 및 비-감염성 포도막염 포함), 맥락막염 (예를 들어, 다초점 맥락막염), 안구 히스토플라마증, 눈꺼풀염, 안구 건조, 외상성 눈 손상, 또는 쇼그렌병이다.
또 다른 양태에서, 치료 방법에서 사용하기 위한 항-VEGF 항체 (예를 들어, 조작된 시스테인 항-VEGF 항체)가 제공된다. 또 다른 양태에서, 치료 방법에서 사용하기 위한 항체 콘주게이트 (예를 들어, 단분산 HA 콘주게이트)이 제공된다. 특정 사례에서, 본 발명은 병리적 혈관신생과 연관된 장애를 가지고 있는 대상체를 치료하는 방법에서 사용하기 위한 항-VEGF 항체 (예를 들어, 조작된 시스테인 항-VEGF 항체)를 제공하고, 상기 방법은 상기 개체에게 항-VEGF 항체의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 병리적 혈관신생과 연관된 장애를 가지고 있는 대상체를 치료하는 방법에서 사용하기 위한 항체 콘주게이트 (예를 들어, 단분산 HA 콘주게이트)를 제공하고, 상기 방법은 상기 개체에게 항체 콘주게이트의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 일부 사례에서, 병리적 혈관신생과 연관된 장애는 안구 장애이다. 일부 사례에서, 안구 장애는 AMD (예를 들어, 습성 AMD, 건조 AMD, 중기 AMD, 진행성 AMD, 또는 지리학적 위축증 (GA)), 황반 변성, 황반 부종, DME (예를 들어, 초점, 비-중심 DME 또는 확산, 중심-관여된 DME), 망막증, 당뇨 망막병증 (DR) (예를 들어, 증식성 DR (PDR), 비-증식성 DR (NPDR), 또는 고고도 DR), 다른 허혈-관련된 망막증, ROP, 망막 정맥 폐색 (RVO) (예를 들어, 중심 (CRVO) 및 분지형 (BRVO) 형태), CNV (예를 들어, 근시 CNV), 각막 신생혈관형성, 각막 신생혈관형성과 연관된 질환, 망막 신생혈관형성, 망막/맥락막 신생혈관형성과 연관된 질환, 병리적 근시, 폰 힙펠-린도우병, 눈의 히스토플라마증, FEVR, 코우츠병, 노리병, OPPG, 결막하 출혈, 조홍, 안구 신생혈관 질환, 신생혈관 녹내장, 색소성 망막염 (RP), 고혈압 망막증, 망막 혈관종 증식, 황반 모세혈관확장증, 홍채 신생혈관형성, 안구내 신생혈관형성, 망막 퇴행, 포낭 황반 부종 (CME), 혈관염, 유두부종, 망막염, 결막염 (예를 들어, 감염성 결막염 및 비-감염성 (예를 들어, 알러지성) 결막염), 레버 선천성 흑내장, 포도막염 (감염성 및 비-감염성 포도막염 포함), 맥락막염 (예를 들어, 다초점 맥락막염), 안구 히스토플라마증, 눈꺼풀염, 안구 건조, 외상성 눈 손상, 또는 쇼그렌병이다.
일부 사례에서, 본 발명은 대상체에서 혈관신생을 감소 또는 억제하는데 사용하기 위한 항-VEGF 항체 (예를 들어, 조작된 시스테인 항-VEGF 항체)를 제공한다. 또 다른 양태에서, 대상체에서 혈관신생을 감소 또는 억제시키는데 사용하기 위한 항체 콘주게이트 (예를 들어, 단분산 HA 콘주게이트)가 제공된다. 특정 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 혈관신생을 감소 또는 억제하는 방법에서 사용하기 위한 항-VEGF 항체 (예를 들어, 조작된 시스테인 항-VEGF 항체)을 제공하고, 상기 방법은 상기 개체에게 효과적인의 항-VEGF 항체를 투여하여 혈관신생을 감소 또는 억제하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 대상체에서 혈관신생을 감소 또는 억제하는 방법에서 사용하기 위한 항체 콘주게이트 (예를 들어, 단분산 HA 콘주게이트)를 제공하고, 상기 방법은 상기 개체에게 항체 콘주게이트의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 상기 사용 중 임의의 것에 따른 "대상체"는 인간일 수 있다.
본 발명은 약제의 제조 및 준비에서 항-VEGF 항체 (예를 들어, 조작된 시스테인 항-VEGF 항체)의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 약제의 제조 및 준비에서 항체 콘주게이트 (예를 들어, 단분산 HA 콘주게이트)의 용도를 제공한다. 예를 들어, 일 사례에서, 약제는 병리적 혈관신생과 연관된 장애의 치료를 위한 것이다. 추가 사례에서, 약제는 병리적 혈관신생과 연관된 장애를 치료하는 방법에서 사용하기 위한 것이고, 상기 방법은 병리적 혈관신생과 연관된 장애를 가지고 있는 대상체에게 유효량의 약제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 사례에서, 병리적 혈관신생과 연관된 장애는 안구 장애이다. 일부 사례에서, 안구 장애는 AMD (예를 들어, 습성 AMD, 건조 AMD, 중기 AMD, 진행성 AMD, 또는 지리학적 위축증 (GA)), 황반 변성, 황반 부종, DME (예를 들어, 초점, 비-중심 DME 또는 확산, 중심-관여된 DME), 망막증, 당뇨 망막병증 (DR) (예를 들어, 증식성 DR (PDR), 비-증식성 DR (NPDR), 또는 고고도 DR), 다른 허혈-관련된 망막증, ROP, 망막 정맥 폐색 (RVO) (예를 들어, 중심 (CRVO) 및 분지형 (BRVO) 형태), CNV (예를 들어, 근시 CNV), 각막 신생혈관형성, 각막 신생혈관형성과 연관된 질환, 망막 신생혈관형성, 망막/맥락막 신생혈관형성과 연관된 질환, 병리적 근시, 폰 힙펠-린도우병, 눈의 히스토플라마증, FEVR, 코우츠병, 노리병, OPPG, 결막하 출혈, 조홍, 안구 신생혈관 질환, 신생혈관 녹내장, 색소성 망막염 (RP), 고혈압 망막증, 망막 혈관종 증식, 황반 모세혈관확장증, 홍채 신생혈관형성, 안구내 신생혈관형성, 망막 퇴행, 포낭 황반 부종 (CME), 혈관염, 유두부종, 망막염, 결막염 (예를 들어, 감염성 결막염 및 비-감염성 (예를 들어, 알러지성) 결막염), 레버 선천성 흑내장, 포도막염 (감염성 및 비-감염성 포도막염 포함), 맥락막염 (예를 들어, 다초점 맥락막염), 안구 히스토플라마증, 눈꺼풀염, 안구 건조, 외상성 눈 손상, 또는 쇼그렌병이다. 추가 사례에서, 약제는 대상체에서 혈관신생을 감소 또는 억제시키기 위한 것이다. 추가 사례에서, 약제는 대상체에서 혈관신생을 감소 또는 억제하는 방법에서 사용하기 위한 것이고, 상기 방법은 상기 대상체에게 약제의 효과적인 양을 투여하여 혈관신생을 감소 또는 억제하는 것을 포함한다. 약제의 이전의 용도 중 임의의 것에서, 상기 방법은 상기 개체에게, 예를 들어, 아래에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 추가의 치료제의 유효량을 투여하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명은 병리적 혈관신생과 연관된 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 병리적 혈관신생과 연관된 장애를 가지고 있는 개체에게 항-VEGF 항체 (예를 들어, 조작된 시스테인 항-VEGF 항체)의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 예에서, 상기 방법은 병리적 혈관신생과 연관된 장애를 가지고 있는 개체에게 항체 콘주게이트 (예를 들어, 단분산 HA 콘주게이트)의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 일부 사례에서, 병리적 혈관신생과 연관된 장애는 안구 장애이다. 일부 사례에서, 안구 장애는 AMD (예를 들어, 습성 AMD, 건조 AMD, 중기 AMD, 진행성 AMD, 또는 지리학적 위축증 (GA)), 황반 변성, 황반 부종, DME (예를 들어, 초점, 비-중심 DME 또는 확산, 중심-관여된 DME), 망막증, 당뇨 망막병증 (DR) (예를 들어, 증식성 DR (PDR), 비-증식성 DR (NPDR), 또는 고고도 DR), 다른 허혈-관련된 망막증, ROP, 망막 정맥 폐색 (RVO) (예를 들어, 중심 (CRVO) 및 분지형 (BRVO) 형태), CNV (예를 들어, 근시 CNV), 각막 신생혈관형성, 각막 신생혈관형성과 연관된 질환, 망막 신생혈관형성, 망막/맥락막 신생혈관형성과 연관된 질환, 병리적 근시, 폰 힙펠-린도우병, 눈의 히스토플라마증, FEVR, 코우츠병, 노리병, OPPG, 결막하 출혈, 조홍, 안구 신생혈관 질환, 신생혈관 녹내장, 색소성 망막염 (RP), 고혈압 망막증, 망막 혈관종 증식, 황반 모세혈관확장증, 홍채 신생혈관형성, 안구내 신생혈관형성, 망막 퇴행, 포낭 황반 부종 (CME), 혈관염, 유두부종, 망막염, 결막염 (예를 들어, 감염성 결막염 및 비-감염성 (예를 들어, 알러지성) 결막염), 레버 선천성 흑내장, 포도막염 (감염성 및 비-감염성 포도막염 포함), 맥락막염 (예를 들어, 다초점 맥락막염), 안구 히스토플라마증, 눈꺼풀염, 안구 건조, 외상성 눈 손상, 또는 쇼그렌병이다. 추가 사례에서, 본 방법은 추가로, 상기 개체에게 아래에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 추가의 치료제의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 상기 방법 중 임의의 것에 따른 "대상체"는 인간일 수 있다.
본 발명의 항체 (예를 들어, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체) 또는 항체 콘주게이트 (예를 들어, 단분산 HA 콘주게이트)가 포유동물을 치료하기 위해 사용될 수 있음이 고려된다. 일 구현예에서, 항체 (예를 들어, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체) 또는 항체 콘주게이트 (예를 들어, 단분산 HA 콘주게이트)는, 예를 들어 전임상 데이터를 얻기 위해 비인간 포유동물에게 투여된다. 치료될 예시적인 비인간 포유동물은, 전임상 연구가 수행되는 비인간 영장류, 개, 고양이, 설치류 (예를 들어, 마우스 및 랫트) 및 다른 포유동물을 포함한다. 그와 같은 포유동물은 항체로 치료될 질환에 대한 확립된 동물 모델 일 수 있거나 또는 관심 항체의 독성 또는 약동학을 연구하기 위해 사용될 수 있다. 각각의 이들 구현예에서, 용량 단계적 확대 연구는 포유동물에서 수행될 수 있다. 항체 (예를 들어, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체) 또는 항체 콘주게이트 (예를 들어, 단분산 HA 콘주게이트)는 예를 들어 고형 종양 모델에서 호스트 설치류에 투여될 수 있다. 항체 또는 항체 콘주게이트는 예를 들어, 유리체내 투여에 의해 (예를 들어, 유리체내 주사) 또는 포트 전달 장치를 사용하여 안구 약동학적 연구를 위해 호스트 (예를 들어, 설치류, 예를 들어, 토끼)에 투여될 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은, 예를 들어, 상기 치료 방법 중 임의의 것에서 사용하기 위해 본 명세서에서 제공된 항체 (예를 들어, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체) 또는 항체 콘주게이트 (예를 들어, 단분산 HA 콘주게이트) 중 임의의 것을 포함하는 약제학적 제형을 제공한다. 일 구현예에서, 약제학적 제형은 본 명세서에서 제공된 항체 (예를 들어, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체) 또는 항체 콘주게이트 (예를 들어, 단분산 HA 콘주게이트) 중 임의의 것 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 제형은, 예를 들어, 아래에 기재된 바와 같이 본 명세서에서 제공된 항체 (예를 들어, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체) 또는 항체 콘주게이트 (예를 들어, 단분산 HA 콘주게이트) 중 임의의 것 및 적어도 하나의 추가의 치료제를 포함한다. 특정 구현예에서, 약제학적 제형은 하나 이상의 추가의 화합물을 포함한다. 특정 구현예에서, 추가의 화합물은 하기로 구성된 군으로부터 선택된 제2 생물학적 분자에 결합한다: IL-1β; IL-6; IL-6R; IL-13; IL-13R; PDGF; 안지오포이에틴; Ang2; Tie2; S1P; 인테그린 αvβ3, αvβ5, 및 α5β1; 베타셀룰린; 아페린/APJ; 에리트로포이에틴; 보체 인자 D; TNFα; HtrA1; VEGF 수용체; ST-2 수용체; 및 연령 관련 황반 변성 (AMD) 위험에 유전자적으로 연결된 단백질, 예컨대 보체 경로 성분 C2, 인자 B, 인자 H, CFHR3, C3b, C5, C5a, 및 C3a; HtrA1; ARMS2; TIMP3; HLA; 인터류킨-8 (IL-8); CX3CR1; TLR3; TLR4; CETP; LIPC, COL10A1; 및 TNFRSF10A. 특정 구현예에서, 추가의 화합물은 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 예를 들어, 일부 사례에서, 추가의 화합물은 이중특이적 항체 (예를 들어, 항-VEGF/항-Ang2 이중특이적 항체, 예컨대 RG-7716 또는 임의의 이중특이적 항-VEGF/항-Ang2 이중특이적 항체 (WO 2010/069532 또는 WO 2016/073157에서 개시됨) 또는 그것의 변이체이다. 또 다른 예에서, 일부 사례에서, 추가의 화합물은 항-IL-6 항체, 예를 들어, EBI-031 (Eleven Biotherapeutics; 참고, 예를 들어, WO 2016/073890), 실툭시맙 (SYLVANT®), 올로키주맙, 클라자키주맙, 시루쿠맙, 엘실리모맙, 게릴림주맙, OPR-003, MEDI-5117, PF-04236921, 또는 그것의 변이체이다. 또 추가의 예에서, 일부 사례에서, 추가의 화합물은 항-IL-6R 항체, 예를 들어, 토실리주맙 (ACTEMRA®) (참고, 예를 들어, WO 1992/019579), 사릴루맙, 보발릴리주맙 (ALX-0061), SA-237, 또는 그것의 변이체이다.
항체 (예를 들어, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체) 또는 항체 콘주게이트 (예를 들어, 단분산 HA 콘주게이트)는 요법에서 단독으로 또는 다른 제제와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체 (예를 들어, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체) 또는 항체 콘주게이트 (예를 들어, 단분산 HA 콘주게이트)는 적어도 하나의 추가의 치료제와 공투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 추가의 치료제는 또 다른 항체, 항-혈관신생제, 면역억제제, 사이토카인, 사이토카인 길항제, 코르티코스테로이드, 항-구토제, 암 백신, 진통제, 또는 이들의 조합이다.
예를 들어, 특정 구현예에서, 이전의 방법 중 임의의 것은 추가로, 하나 이상의 추가의 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체 (예를 들어, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체) 또는 항체 콘주게이트 (예를 들어, 단분산 HA 콘주게이트)는 추가의 화합물(들)와 동시에 투여된다. 특정 구현예에서, 항체 또는 항체 콘주게이트는 추가의 화합물(들)보다 전에 또는 후에 투여된다. 특정 구현예에서, 추가의 화합물은 하기로 구성된 군으로부터 선택된 제2 생물학적 분자에 결합한다: IL-1β; IL-6; IL-6R; IL-13; IL-13R; PDGF; 안지오포이에틴; Ang2; Tie2; S1P; 인테그린 αvβ3, αvβ5, 및 α5β1; 베타셀룰린; 아페린/APJ; 에리트로포이에틴; 보체 인자 D; TNFα; HtrA1; VEGF 수용체; ST-2 수용체; 및 AMD 위험에 유전적으로 연결된 단백질, 예컨대 보체 경로 성분 C2, 인자 B, 인자 H, CFHR3, C3b, C5, C5a, 및 C3a; HtrA1; ARMS2; TIMP3; HLA; 인터류킨-8 (IL-8); CX3CR1; TLR3; TLR4; CETP; LIPC; COL10A1; 및 TNFRSF10A. 특정 구현예에서, 추가의 화합물은 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
상기의 구현예 중 임의의 것에 따른 (또는 그것에 적용된) 특정 구현예에서, 안구 장애는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 안구내 신생혈관 질환이다: 증식성 망막증, 맥락막 신생혈관형성 (CNV), 연령 관련 황반 변성 (AMD), 당뇨병성 및 다른 허혈-관련된 망막증, 당뇨병성 황반 부종, 병리적 근시, 폰 힙펠-린도우병, 눈의 히스토플라마증, CRVO 및 BRVO를 포함하는 망막 정맥 폐색 (RVO), 각막 신생혈관형성, 망막 신생혈관형성, 및 미숙아 망막증 (ROP). 예를 들어, 일부 사례에서, 추가의 화합물은 이중특이적 항체 (예를 들어, 항-VEGF/항-Ang2 이중특이적 항체, 예컨대 RG-7716 또는 임의의 이중특이적 항-VEGF/항-Ang2 이중특이적 항체 (WO 2010/069532 또는 WO 2016/073157에서 개시됨) 또는 그것의 변이체이다. 또 다른 예에서, 일부 사례에서, 추가의 화합물은 항-IL-6 항체, 예를 들어, EBI-031 (Eleven Biotherapeutics; 참고, 예를 들어, WO 2016/073890), 실툭시맙 (SYLVANT®), 올로키주맙, 클라자키주맙, 시루쿠맙, 엘실리모맙, 게릴림주맙, OPR-003, MEDI-5117, PF-04236921, 또는 그것의 변이체이다. 또 추가의 예에서, 일부 사례에서, 추가의 화합물은 항-IL-6R 항체, 예를 들어, 토실리주맙 (ACTEMRA®) (참고, 예를 들어, WO 1992/019579), 사릴루맙, 보발릴리주맙 (ALX-0061), SA-237, 또는 그것의 변이체이다.
일부 사례에서, 본 발명의 항체 (예를 들어, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체) 또는 항체 콘주게이트 (예를 들어, 단분산 HA 콘주게이트)는 안구 장애, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 안구 장애 (예를 들어, AMD (예를 들어, 습성 AMD), DME, DR, 또는 RVO)의 치료를 위해 적어도 하나의 추가의 치료제와 함께 투여될 수 있다. 안구 장애의 치료용 병용 요법을 위한 예시적인 추가의 치료제는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 항-혈관신생제, 예컨대 예를 들어, 항-VEGF 항체 (예를 들어, 항-VEGF Fab LUCENTIS® (라니비주맙))을 포함하는 VEGF 길항제, 가용성 수용체 융합 단백질 (예를 들어, 재조합 가용성 수용체 융합 단백질 EYLEA® (아플리베르셉트, VEGF Trap Eye으로도 알려짐; Regeneron/Aventis)), 압타머 (예를 들어, 항-VEGF 페길화된 압타머 MACUGEN® (페갑타닙 나트륨; NeXstar Pharmaceuticals/OSI Pharmaceuticals)), 및 VEGFR 티로신 키나제 억제제 (예를 들어, 4-(4-브로모-2-플루오로아닐리노)-6-메톡시-7-(1-메틸피페리딘-4-일메톡시)퀴나졸린 (ZD6474), 4-(4-플루오로-2-메틸인돌-5-일옥시)-6-메톡시-7-(3-피롤리딘-1-일프로폭시)퀴나졸린 (AZD2171), 바탈라닙 (PTK787), 세막사미닙 (SU5416; SUGEN), 및 SUTENT® (수니티닙)); 트립토파닐-tRNA 합성효소 (TrpRS); 스쿠알라민; RETAANE® (데포 현탁액용 아네코르타브 아세테이트; Alcon, Inc.); 콤브레타스타틴 A4 전구약물 (CA4P); MIFEPREX® (미페프리스톤-ru486); 테논낭하 트리암시놀론 아세토나이드; 유리체내 결정성 트리암시놀론 아세토나이드; 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제 (예를 들어, 프리노마스타트 (AG3340; Pfizer)); 플루오시놀론 아세토나이드 (플루오시놀론 안구내 임플란트 포함; Bausch & Lomb/Control Delivery Systems); 리노마이드; 인테그린 β3 기능의 억제제; 안지오스타틴, 및 이들의 조합. 본 발명의 항체 콘주게이트와 함께 투여될 수 있는 이들 및 다른 치료제는, 예를 들어, 하기에 기재되어 있다: U.S. 특허 출원 번호 US 2014/0017244 (이는 본 명세서에 참고로 전체적으로 편입됨).
안구 장애 (예를 들어, AMD, DME, DR, 또는 RVO)의 치료를 위해 본 발명의 항체 (예를 들어, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체) 또는 항체 콘주게이트 (예를 들어, 단분산 HA 콘주게이트) 와 함께 사용될 수 있는 추가의 치료제의 추가 예는,, 비제한적으로, 하기를 포함한다: VISUDYNE® (베르테포르핀; 비-열 레이저를 갖는 광역학적 요법과 공조하여 전형적으로 사용된 광 -활성화된 약물), PKC412, 엔도비온 (NS 3728; NeuroSearch A/S), 신경친화성 인자 (예를 들어, 신경교 유래된 신경친화성 인자 (GDNF) 및 섬모 신경친화성 인자 (CNTF)), 딜티아젬, 도르졸라마이드, PHOTOTROP®, 9-시스-망막, 안약 (예를 들어, 포스폴린 아이오다이드, 에코티오페이트, 또는 탄산탈수소효소 억제제), 베오바스타트 (AE-941; AEterna Laboratories, Inc.), Sirna-027 (AGF-745; Sima Therapeutics, Inc.), 뉴로트로핀 (단지 예로써, NT-4/5 포함, Genentech), Cand5 (Acuity Pharmaceuticals), INS-37217 (Inspire Pharmaceuticals), 인테그린 길항제 (Jerini AG 및 Abbott Laboratories로부터의 것들 포함), EG-3306 (Ark Therapeutics Ltd Ltd.), BDM-E (BioDiem Ltd.), 탈리도마이드 (예를 들어, EntreMed, Inc.에 의해 사용됨), 카디오트로핀-1 (Genentech), 2-메톡시에스트라디올 (Allergan/Oculex), DL-8234 (Toray Industries), NTC-200 (Neurotech), 테트라티오몰리브데이트 (University of Michigan), LYN-002 (Lynkeus Biotech), 미세조류 화합물 (Aquasearch/Albany, Mera Pharmaceuticals), D-9120 (Celltech Group plc), ATX-S10 (Hamamatsu Photonics), TGF-베타 2 (G효소/Celtrix), 티로신 키나제 억제제 (예를 들어, Allergan, SUGEN, 또는 Pfizer으로부터의 것들), NX-278-L (NeXstar Pharmaceuticals/Gilead Sciences), Opt-24 (OPTIS France SA), 망막 세포 신경절 신경보호제 (Cogent Neurosciences), N-니트로피라졸 유도체 (포르피머 나트륨), KP-102 (Krenitsky Pharmaceuticals), 사이클로스포린 A, 광역학적 요법에 사용된 치료제 (예를 들어, VISUDYNE®; 수용체-표적화된 PDT, Bristol-Myers Squibb, Co.; PDT를 가지고 있는 주사용 포르피머 나트륨; 베르테포르핀, QLT Inc.; PDT를 가지고 있는 로스타프르핀, Miravent Medical Technologies; PDT를 가지고 있는 , Nippon Petroleum; 및 모텍사핀 루테튬, Pharmacyclics, Inc.), 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (예로써, Novagali Pharma SA and ISIS-13650, Isis Pharmaceuticals에 의해 시험된 제품을 포함함), 및 이들의 조합.
본 발명의 항체 (예를 들어, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체) 또는 항체 콘주게이트 (예를 들어, 단분산 HA 콘주게이트)는 안구 장애 (예를 들어, AMD, DME, DR, 또는 RVO)의 치료를 위해 예를 들어 하기를 포함하는 요법 또는 수술 과정 함께 투여될 수 있다: 레이저 광응고 (예를 들어, 범망막성 광응고 (PRP)), 결정강 레이저링, 황반 구멍 수술, 황반 전좌 수술, 이식가능 미니어쳐 망원경, PHI-모션 혈관조영술 (로도 알려지다 마이크로-레이저 요법 및 피더 용기 치료), 양성자 빔 요법, 미세자극 요법, 망막 탈착 및 유리체 수술, 공막 돌륭술, 황반하 수술, 동공통과 온열요법, 광시스템 I 요법, RNA 간섭 (RNAi)의 사용, 체외 유동술 (로도 알려지다 막 차등 여과 및 유동요법), 마이크로칩 이식, 줄기 세포 요법, 유전자 대체 요법, 리보자임 유전자 요법 (저산소증 반응 인자에 대한 유전자 요법 포함, Oxford Biomedica; Lentipak, Genetix; 및 PDEF 유전자 요법, GenVec), 광수용체/망막 세포 이식 (이식가능 망막 상피 세포 포함, Diacrin, Inc.; 망막 세포 이식, Cell Genesys, Inc.), 침술, 및 이들의 조합.
일부 사례에서, 본 발명의 항체 (예를 들어, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체) 또는 항체 콘주게이트 (예를 들어, 단분산 HA 콘주게이트)는 안구 장애 (예를 들어, AMD, DME, DR, 또는 RVO)의 치료를 위해 항-혈관신생제와 함께 투여될 수 있다. 임의의 적합한 항-혈관신생제는 하기에서 열거된 것을 비제한적으로 포함하는 본 발명의 항체 (예를 들어, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체) 또는 항체 콘주게이트 와 함께 사용될 수 있다: Carmeliet 등 Nature 407:249-257, 2000. 일부 구현예에서, 항-혈관신생제는 하기를 비제한적으로 포함하는 VEGF 길항제이다: 항-VEGF 항체 (예를 들어, 항-VEGF Fab LUCENTIS® (라니비주맙), RTH-258 (예전에 ESBA-1008, 항-VEGF 단일-사슬 항체 단편; Novartis), 또는 이중특이적 항-VEGF 항체 (예를 들어, 항-VEGF/항-안지오포이에틴 2 이중특이적 항체 예컨대 RG-7716; Roche)), 가용성 재조합 수용체 융합 단백질 (예를 들어, EYLEA® (아플리베르셉트)), VEGF 변이체, 가용성 VEGFR 단편, VEGF (예를 들어, 페갑타닙) 또는 VEGFR를 차단할 수 있는 압타머, 중화하는 항-VEGFR 항체, VEGFR 티로신 키나제의 소분자 억제제, 항-VEGF DARPin® (예를 들어, 아비시파르 페골), VEGF 또는 VEGFR의 발현을 억제하는 작은 간섭 RNA, VEGFR 티로신 키나제 억제제 (예를 들어, 4-(4-브로모-2-플루오로아닐리노)-6-메톡시-7-(1-메틸피페리딘-4-일메톡시)퀴나졸린 (ZD6474), 4-(4-플루오로-2-메틸인돌-5-일옥시)-6-메톡시-7-(3-피롤리딘-1-일프로폭시)퀴나졸린 (AZD2171), 바탈라닙 (PTK787), 세막사미닙 (SU5416; SUGEN), 및 SUTENT® (수니티닙)), 및 이들의 조합. 일부 사례에서, 이중특이적 항-VEGF 항체는 제2 생물학적 분자에 결합하되, 이는 비제한적으로 하기를 포함한다: IL-1β; IL-6; IL-6R; PDGF (예를 들어, PDGF-BB); 안지오포이에틴; 안지오포이에틴 2; Tie2; S1P; 인테그린 αvβ3, αvβ5, 및 α5β1; 베타셀룰린; 아페린/APJ; 에리트로포이에틴; 보체 인자 D; TNFα; HtrA1; VEGF 수용체 (예를 들어, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, mbVEGFR, 또는 sVEGFR); ST-2 수용체; 및 연령 관련 황반 변성 (AMD) 위험에 유전자적으로 연결된 단백질, 예컨대 보체 경로 성분 C2, 인자 B, 인자 H, CFHR3, C3b, C5, C5a, 및 C3a; HtrA1; ARMS2; TIMP3; HLA; IL-8; CX3CR1; TLR3; TLR4; CETP; LIPC; COL10A1; 및 TNFRSF10A. 예를 들어, 일부 사례에서, 추가의 화합물은 이중특이적 항체 (예를 들어, 항-VEGF/항-Ang2 이중특이적 항체, 예컨대 RG-7716 또는 임의의 이중특이적 항-VEGF/항-Ang2 이중특이적 항체 (WO 2010/069532 또는 WO 2016/073157에서 개시됨) 또는 그것의 변이체이다.
안구 장애 (예를 들어, AMD, DME, DR, 또는 RVO)의 치료를 위해 본 발명의 항체 (예를 들어, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체) 또는 항체 콘주게이트 (예를 들어, 단분산 HA 콘주게이트)와 함께 투여될 수 있는 다른 적합한 항-혈관신생제는 하기를 포함한다: 코르티코스테로이드, 안지오스타틱 스테로이드, 아네코르타브 아세테이트, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 티로신 키나제 억제제, 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP) 억제제, 인슐린-유사 성장 인자-결합 단백질 3 (IGFBP3), 기질 유래 인자 (SDF-1) 길항제 (예를 들어, 항-SDF-1 항체), 안료 상피-유래 인자 (PEDF), 감마-세크레타제, 델타-유사 리간드 4, 인테그린 길항제, 저산소증-유도성 인자 (HIF)-1α 길항제, 단백질 키나제 CK2 길항제, 신생혈관형성의 부위로 귀소하는 줄기 세포 (예를 들어, 내피 선조 세포)를 억제하는 제제 (예를 들어, 항-혈관 내피 카드헤린 (CD-144) 항체 및/또는 항-SDF-1 항체), 및 이들의 조합.
추가 예에서, 일부 사례에서, 본 발명의 항체 (예를 들어, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체) 또는 항체 콘주게이트 (예를 들어, 단분산 HA 콘주게이트)는 하기와 함께 투여될 수 있다: 안구 장애 (예를 들어, AMD, DME, DR, 또는 RVO)의 치료를 위해 신생혈관형성에 대항하여 활성을 가지고 있는 제제, 예컨대 항-염증성 약물, 라파마이신 (mTOR) 억제제 (예를 들어, 라파마이신, AFINITOR® (에버롤리무스), 및 TORISEL® (템시롤리무스))의 포유동물 표적, 사이클로스포린, 종양 괴사 인자 (TNF) 길항제 (예를 들어, 항-TNFα 항체 또는 이의 항원-결합 단편 (예를 들어, 인플릭시맙, 아달리무맙, 세르톨리주맙 페골, 및 골리무맙) 또는 가용성 수용체 융합 단백질 (예를 들어, 에타네르셉트)), 항-보완제, 비스테로이드 항염증 제제 (NSAID), 또는 이들의 조합.
또 추가의 예에서, 일부 사례에서, 본 발명의 항체 (예를 들어, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체) 또는 항체 콘주게이트 (예를 들어, 단분산 HA 콘주게이트)는 신경보호성이고 건조 AMD에서 습성 AMD로의 진행을 잠재적으로 감소시킬 수 있는 제제 와 함께 투여될 수 있고, 그 예는 약물 예컨대 데하이드로에피안드로스테론 (DHEA) (브랜드명: PRASTERATM 및 FIDELIN®), 데하이드로에피안드로스테론 설페이트, 및 프레그네놀론 설페이트를 포함하는 "신경스테로이드"로 불리는 약물의 부류이다.
임의의 적합한 AMD 치료제는 안구 장애 (예를 들어, AMD, DME, DR, 또는 RVO)의 치료를 위해 본 발명의 항체 (예를 들어, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체) 또는 항체 콘주게이트 (예를 들어, 단분산 HA 콘주게이트) 와 함께 추가의 치료제로서 투여될 수 있고, 상기의 추가의 치료제는 비제한적으로, 하기를 포함한다: VEGF 길항제, 예를 들어, 항-VEGF 항체 (예를 들어, LUCENTIS® (라니비주맙), RTH-258 (예전에 ESBA-1008, 항-VEGF 단일-사슬 항체 단편; Novartis), 또는 이중특이적 항-VEGF 항체 (예를 들어, 항-VEGF/항-안지오포이에틴 2 이중특이적 항체 예컨대 RG-7716; Roche)), 가용성 VEGF 수용체 융합 단백질 (예를 들어, EYLEA® (아플리베르셉트)), 항-VEGF DARPin® (예를 들어, 아비시파르 페골; 분자 파트너 AG/알레르간), 또는 항-VEGF 압타머 (예를 들어, MACUGEN® (페갑타닙 나트륨)); 혈소판-유래된 성장 인자 (PDGF) 길항제, 예를 들어, 항-PDGF 항체, 항-PDGFR 항체 (예를 들어, REGN2176-3), 항-PDGF-BB 페길화된 압타머 (예를 들어, FOVISTA®; Ophthotech/Novartis), 가용성 PDGFR 수용체 융합 단백질, 또는 이중 PDGF/VEGF 길항제 (예를 들어, 소분자 억제제 (예를 들어, DE-120 (Santen) 또는 X-82 (TyrogeneX)) 또는 이중특이적 항-PDGF/항-VEGF 항체)); 광역학적 요법과 조합한 VISUDYNE® (베르테포르핀); 산화방지제; 보체 시스템 길항제, 예를 들어, 보체 인자 C5 길항제 (예를 들어, 소분자 억제제 (예를 들어, ARC-1905; Opthotech) 또는 항-C5 항체 (예를 들어, LFG-316; Novartis), 프로페르딘 길항제 (예를 들어, 항-프로페르딘 항체, 예를 들어, CLG-561; Alcon), 또는 보체 인자 D 길항제 (예를 들어, 항-보체 인자 D 항체, 예를 들어, 람팔리주맙; Roche)); 시각적 사이클 개질제 (예를 들어, 에믹수스타트 하이드로클로라이드); 스쿠알라민 (예를 들어, OHR-102; Ohr Pharmaceutical); 비타민 및 미네랄 보충물 (예를 들어, 연령 관련 안구 질환 연구 1에 기재된 것들 (AREDS1; 아연 및/또는 산화방지제) 및 연구 2 (AREDS2; 아연, 산화방지제, 루테인, 제아잔틴, 및/또는 오메가-3 지방산)); 세포 기반 요법, 예를 들어, NT-501 (Renexus); PH-05206388 (Pfizer), huCNS-SC 세포 이식 (StemCells), CNTO-2476 (Janssen), OpRegen (Cell Cure Neurosciences), 또는 MA09-hRPE 세포 이식 (Ocata Therapeutics); 조직 인자 길항제 (예를 들어, hI-con1; Iconic Therapeutics); 알파-아드레날린 수용체 효능제 (예를 들어, 브리모니딘 타르트레이트); 펩타이드 백신 (예를 들어, S-646240; Shionogi); 아밀로이드 베타 길항제 (예를 들어, 항-베타 아밀로이드 단클론성 항체, 예를 들어, GSK-933776); S1P 길항제 (예를 들어, 항-S1P 항체, 예를 들어, iSONEPTM; Lpath Inc); ROBO4 길항제 (예를 들어, 항-ROBO4 항체, 예를 들어, DS-7080a; Daiichi Sankyo); 엔도스타틴 및 안지오스타틴을 발현시키는 렌티바이러스 벡터 (예를 들어, RetinoStat); 및 이들의 임의의 조합. 일부 사례에서, AMD 치료제 (이전의 AMD 치료제 중 임의의 것 포함)는 공-제형화될 수 있다. 예를 들어, 항-PDGFR 항체 REGN2176-3는 아플리베르셉트 (EYLEA®)와 공-제형화될 수 있다. 일부 사례에서, 그와 같은 공-제형은 본 발명의 항체와 함께 투여될 수 있다. 일부 사례에서, 안구 장애는 AMD (예를 들어, 습성 AMD)이다.
본 발명의 항체 (예를 들어, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체) 또는 항체 콘주게이트 (예를 들어, 단분산 HA 콘주게이트)는 안구 장애 (예를 들어, AMD, DME, DR, 또는 RVO)의 치료를 위해 LUCENTIS® (라니비주맙) 와 함께 투여될 수 있다. LUCENTIS® (라니비주맙)는, 예를 들어, 0.3 mg/눈 또는 0.5 mg/눈으로, 예를 들어, 매달 유리체내 주사에 의해 투여될 수 있다. 일부 사례에서, 안구 장애는 AMD (예를 들어, 습성 AMD)이다.
본 발명의 항체 (예를 들어, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체) 또는 항체 콘주게이트 (예를 들어, 단분산 HA 콘주게이트)는 안구 장애 (예를 들어, AMD, DME, DR, 또는 RVO)의 치료를 위해 EYLEA® (아플리베르셉트) 와 함께 투여될 수 있다. EYLEA® (아플리베르셉트)는, 예를 들어, 2 mg/눈으로 유리체내 주사에 의해, 예를 들어, 처음 3개월 동안 매 4주 (Q4W), 또는 Q4W 투여되고, 이어서 유지를 위채 2개월마다 1회 주사될 수 있다. 일부 사례에서, 안구 장애는 AMD (예를 들어, 습성 AMD)이다.
본 발명의 항체 (예를 들어, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체) 또는 항체 콘주게이트 (예를 들어, 단분산 HA 콘주게이트)는 안구 장애 (예를 들어, AMD, DME, DR, 또는 RVO)의 치료를 위해 MACUGEN® (페갑타닙 나트륨) 와 함께 투여될 수 있다. MACUGEN® (페갑타닙 나트륨)는, 예를 들어, 0.3 mg/눈으로 유리체내 주사에 의해 6주 마다 투여될 수 잇다. 일부 사례에서, 안구 장애는 AMD (예를 들어, 습성 AMD)이다.
본 발명의 항체 (예를 들어, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체) 또는 항체 콘주게이트 (예를 들어, 단분산 HA 콘주게이트)는 안구 장애 (예를 들어, AMD, DME, DR, 또는 RVO)의 치료를 위한 광역학적 요법과 함께 VISUDYNE® (베르테포르핀) 와 함께 투여될 수 있다. VISUDYNE®는, 예를 들어, 정맥내 주입에 의해 임의의 적합한 용량 (예를 들어, 6 mg/m2의 체표면적에서) 투여될 수 있고, 3개월마다 1회 (예를 들어, 주입의 10 분에 걸쳐) 전달될 수 있다. 일부 사례에서, 안구 장애는 AMD (예를 들어, 습성 AMD)이다.
본 발명의 항체 (예를 들어, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체) 또는 항체 콘주게이트 (예를 들어, 단분산 HA 콘주게이트)는 안구 장애 (예를 들어, AMD, DME, DR, 또는 RVO)의 치료를 위해 PDGF 길항제와 조합하여 투여될 수 있다. 본 발명의 항체와 함께 사용될 수 있는 예시적인 PDGF 길항제는 항-PDGF 항체, 항-PDGFR 항체, 소분자 억제제 (예를 들어, 스쿠알라민), 항-PDGF-B 페길화된 압타머 예컨대 FOVISTA® (E10030; Ophthotech/Novartis), 또는 이중 PDGF/VEGF 길항제 (예를 들어, 소분자 억제제 (예를 들어,DE-120 (Santen) 또는 X-82 (TyrogeneX)) 또는 이중특이적 항-PDGF/항-VEGF 항체)를 포함한다. 예를 들어, FOVISTA®는 본 발명의 항체에 대한 부속 요법으로 투여될 수 있다. FOVISTA®는, 예를 들어, 유리체내 주사에 의해, 예를 들어 매 4주 마다 (Q4W), 임의의 적합한 용량, 예를 들어, 0.1 mg/눈 내지 2.5 mg/눈, 예를 들어, 0.3 mg/눈 또는 1.5 mg/눈으로 투여될 수 있다. OHR-102 (스쿠알라민 락테이트 안과 용액, 0.2%)는, 예를 들어, 매일 2회 점안액에 의해 투여될 수 있다. OHR-102는 VEGF 길항제 예컨대 LUCENTIS® 또는 EYLEA®와 조합하여 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체 콘주게이트는 OHR-102, LUCENTIS®, 및/또는 EYLEA®와 조합하여 투여될 수 있다. 일부 사례에서, 안구 장애는 AMD (예를 들어, 습성 AMD)이다.
본 발명의 항체 (예를 들어, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체) 또는 항체 콘주게이트 (예를 들어, 단분산 HA 콘주게이트)는 안구 장애 (예를 들어, AMD, DME, DR, 또는 RVO)의 치료를 위하여 RTH-258과 조합하여 투여될 수 있다. RTH-258은, 예를 들어, 유리체내 주사 또는 눈 주입에 의하여 투여될 수 있다. 유리체내 주사의 경우, RTH-258은, 예를 들어, 장입으로 처음 3개월 동안 매 4주마다 한번 (Q4W), 이어서 유지를 위해 매 12주 마다 (Q12W) 또는 매 8주 마다 (Q8W) 주사로 임의의 적합한 용량 (예를 들어, 3 mg/눈 또는 6 mg/눈)으로 투여될 수 있다. 일부 사례에서, 안구 장애는 AMD (예를 들어, 습성 AMD)이다.
본 발명의 항체 (예를 들어, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체) 또는 항체 콘주게이트 (예를 들어, 단분산 HA 콘주게이트)는 안구 장애 (예를 들어, AMD, DME, DR, 또는 RVO)의 치료를 위하여 아비시파르 페골과 조합하여 투여될 수 있다. 아비시파르 페골은, 예를 들어, 유리체내 주사에 의하여 투여될 수 있다. 아비시파르 페골은, 예를 들어, 장입으로 처음 3개월 동안 매 4주마다 한번 (Q4W), 이어서 유지를 위해 매 12주 마다 (Q12W) 또는 매 8주 마다 (Q8W) 주사로 임의의 적합한 용량 (예를 들어, 1 mg/눈, 2 mg/눈, 3 mg/눈, 4 mg/눈, 또는 4.2 mg/눈)으로 투여될 수 있다. 일부 사례에서, 안구 장애는 AMD (예를 들어, 습성 AMD)이다.
임의의 적합한 DME 및/또는 DR 치료제는, 비제한적으로, VEGF 길항제 (예를 들어, LUCENTIS® 또는 EYLEA®), 코르티코스테로이드 (예를 들어, 코르티코스테로이드 임플란트 (예를 들어, OZURDEX® (덱사메타손 유리체내 임플란트) 또는 ILUVIEN® (플루오시놀론 아세토나이드 유리체내 임플란트)) 또는 유리체내 주사에 의한 투여를 위해 제형화된 코르티코스테로이드 (예를 들어, 트리암시놀론 아세토나이드)), 또는 이들의 조합을 포함하여, 안구 장애 (예를 들어, AMD, DME, DR, 또는 RVO)의 치료를 위해 본 발명의 항체 (예를 들어, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체) 항체 콘주게이트 (예를 들어, 단분산 HA 콘주게이트)와 조합하여 투여될 수 있다. 일부 사례에서, 안구 장애는 DME 및/또는 DR이다.
본 발명의 항체 (예를 들어, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체) 또는 항체 콘주게이트 (예를 들어, 단분산 HA 콘주게이트)는 DME 및/또는 DR (예를 들어, NPDR 또는 PDR)의 치료를 위해 LUCENTIS® (라니비주맙)과 조합하여 투여될 수 있다. LUCENTIS® (라니비주맙)은, 예를 들어, 매 4주 마다 (Q4W) 유리체내 주사에 의해, 예를 들어, 0.3 mg/눈 또는 0.5 mg/눈으로 투여될 수 있다.
본 발명의 항체 (예를 들어, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체) 또는 항체 콘주게이트 (예를 들어, 단분산 HA 콘주게이트)는 DME 및/또는 DR (예를 들어, NPDR 또는 PDR)의 치료를 위해 EYLEA® (아플리베르셉트)과 조합하여 투여될 수 있다. EYLEA® (아플리베르셉트)은, 예를 들어, 매 4주 마다 (Q4W), 또는 처음 5개월 동안 Q4W 유리체내 주사에 의해, 이어서 유지를 위해 매 8주 마다 한번 (Q8W) 주사로, 예를 들어, 2 mg/눈으로 투여될 수 있다.
본 발명의 항체 (예를 들어, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체) 또는 항체 콘주게이트 (예를 들어, 단분산 HA 콘주게이트)는 DME 및/또는 DR의 치료를 위해 OZURDEX® (덱사메타손 유리체내 임플란트)과 조합하여 투여될 수 있다. OZURDEX®는, 최대 6개월 마다 투여될 수 있는 0.7 mg 덱사메타손 유리체내 임플란트로 투여될 수 있다.
본 발명의 항체 (예를 들어, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체) 또는 항체 콘주게이트 (예를 들어, 단분산 HA 콘주게이트)는 DME 및/또는 DR의 치료를 위해 ILUVIEN® (덱사메타손 유리체내 임플란트)과 조합하여 투여될 수 있다. OZURDEX®는, 0.25 μg/일의 비율로 용출될 수 있고 최대 약 36개월 동안 지속하는 0.19 mg 플루오시놀론 아세토나이드 유리체내 임플란트로 투여될 수 있다.
일부 경우에, 본 발명의 항체 (예를 들어, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체) 또는 항체 콘주게이트 (예를 들어, 단분산 HA 콘주게이트)와 조합하여 AMD 치료제 (예를 들어, 라니비주맙 또는 아플리베르셉트)를 투여하기 위해 TAO/PRN 치료 레지멘 또는 TAE 치료 레지멘이 사용될 수 있다. TAO/PRN 레지멘의 경우, 매 4주 마다 (Q4W) (전형적으로 약 3개월 동안) 초기 유리체내 주사 후, 대상체는 매월 또는 격월 (또는 더욱 더 긴 간격)로, 투여된 주사로 질환 활성의 증거 (예를 들어, 광학 일관성 단층 촬영 (OCT)에서 시력 또는 유체의 감소)의 발생이 모니터링된다. TAE 레지멘의 경우, 대상체는 매 4주 마다 (Q4W) 치료될 수 있고, 이어서 각각의 후속적인 방문마다 최대 간격 (예를 들어, 6주 마다, 8주 마다, 10주 마다, 또는 12주 마다)까지 고정된 수의 주 (예를 들어, +2주) 만큼 치료의 간격을 연장할 수 있다. 질환 활성의 증거가 없는 경우에도 눈(들)이 각각의 방문시에 관찰되고 치료될 수 있다. 황반이 (예를 들어, OCT에 의해) 습식으로 나타나는 경우, 황반이 다시 건조해 보일 때까지 주사에 대한 간격은 단축될 수 있다 (예를 들어, -2주). 일부 사례에서, 안구 장애는 AMD (예를 들어, 습성 AMD)이다.
상기 언급된 이러한 병용 요법은 병용 투여 (2 또는 그 초과의 치료제가 동일하거나 별도의 제형에 포함되는 경우) 및 개별 투여를 포함하며, 이 경우에 본 발명의 항체 또는 항체 콘주게이트의 투여는 추가의 치료제 또는 제제의 투여 이전에, 동시에, 및/또는 후속하여 일어날 수 있다. 일 구현예에서, 항체 또는 항체 콘주게이트의 투여 및 추가의 치료제의 투여는 서로 약 1, 2, 3, 4 또는 5 개월 내에, 또는 약 1, 2 또는 3 주 내에, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 일 내에 일어난다.
안구 질환 또는 병태의 예방 또는 치료를 위한 본 발명의 항체 (예를 들어, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체) 또는 항체 콘주게이트 (예를 들어, 단분산 HA 콘주게이트) (및 임의의 추가의 치료제)는 비제한적으로, 예를 들어, 안구, 안구내, 및/또는 유리체내 주사, 및/또는 공막주변 주사, 및/또는 테논낭하 주사, 및/또는 상맥락막 주사, 및/또는 안약 및/또는 연고의 형태로 국소 투여를 포함한, 임의의 적당한 수단에 의해 투여될 수 있다. 이러한 항체 또는 항체 콘주게이트는 참조문헌 예컨대 Intraocular Drug Delivery, Jaffe, Jaffe, Ashton, and Pearson, editors, Taylor & Francis (March 2006)에 기재된 것들을 포함한 다양한 방법에 의해, 예를 들어, 유리체 안으로 화합물의 느린 방출을 가능하게 하는 디바이스 및/또는 데포로서 유리체내로 전달될 수 있다. 일 예에서, 디바이스는 장기적인 기간 동안 화합물을 방출하는 미니 펌프 및/또는 매트릭스 및/또는 수동 확산 시스템 및/또는 캡슐화된 세포의 형태로 될 수 있다 (Intraocular Drug Delivery, Jaffe, Jaffe, Ashton, and Pearson, editors, Taylor & Francis (March 2006). 사용될 수 있는 추가의 접근법은 하기 부문 G에 기재되어 있다.
안구, 안구내 또는 유리체내 투여를 위한 제형은 당 업계에 공지된 방법과 부형제를 사용함에 의해 제조될 수 있다. 효율적인 치료를 위한 중요한 특징은 눈을 통한 적절한 침투이다. 약물이 국소적으로 전달될 수 있는 눈의 전면의 질환과는 달리, 망막 질환은 전형적으로 보다 부위-특이적인 접근법으로부터 이점이 있다. 안약 및 연고는 눈의 뒤쪽을 거의 관통하지 않으며, 혈액-안구 장벽은 전신으로 투여된 약물이 안구 조직 안으로 침투하는 것을 방해한다. 따라서, 망막 질환, 예컨대 AMD 및 CNV를 치료하기 위한 약물 전달을 위한 선택의 방법은 전형적으로 직접적인 유리체내 주사이다. 유리체내 주사는 일반적으로 환자의 상태 및 전달되는 약물의 특성 및 반감기에 따라 간격을 두고 반복된다. 사용될 수 있는 추가의 접근법은 아래 부문 G에 기재되어 있다.
특정 안구 장애 또는 병태의 치료에 효과적인 항체 또는 항체 콘주게이트의 양은 장애 또는 병태의 특성에 의존할 것이고, 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 가능하다면, 본 발명의 용량-반응 곡선 및 약제학적 조성물을 먼저 시험관내에서 결정하고, 그 다음 인간에서 시험하기 전에 유용한 동물 모델 시스템에서 결정하는 것이 바람직하다.
추가의 적합한 투여 수단은 비경구, 폐내, 및 비강내, 그리고, 국소 치료에 대해 요망하는 경우, 병소내 투여를 포함한다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여를 포함한다. 투약은 투여가 짧은 지 또는 만성적인지에 부분적으로 의존하여, 임의의 적합한 경로, 예를 들어 정맥내 또는 피하 주사와 같은 주사에 의한 것일 수 있다. 비제한적으로 다양한 시점에 걸친 단일 또는 다중 투여, 볼러스 투여, 및 펄스 주입을 포함한 다양한 투약 계획이 본 명세서에서 고려된다. 일부 사례에서, 본 발명의 항체 콘주게이트는 정맥내로, 근육내로, 진피내로, 경피로, 동맥내로, 복강내로, 병소내로, 두개내로, 관절내로, 전립선내로, 늑막내로, 기관내로, 척추강내로, 비강내로, 질내로, 직장내로, 국소적으로, 종양내로, 복강내로, 복막으로, 심실내로, 피하로, 결막하로, 방광내로, 점막으로, 심막내로, 탯줄내로, 안와내로, 경구로, 국소적으로, 경피로, 흡입에 의해, 주사로, 이식에 의해, 주입에 의해, 연속적 주입에 의해, 직접적으로 국소화된 관류 수영 표적 세포에 의해, 카테터에 의해, 세척에 의해, 크림에, 또는 지질 조성물에 투여될 수 있다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, (단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가의 치료제와 조합하여 사용될 때) 본 발명의 항체 (예를 들어, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체) 또는 항체 콘주게이트 (예를 들어, 단분산 HA 콘주게이트)의 적절한 투약량은 치료될 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 과정, 항체가 예방적 또는 치료적 목적으로 투여되는지 여부, 이전의 요법, 항체에 대한 환자의 임상 병력과 반응 및 주치의의 재량에 따라 달라질 것이다. 항체 (예를 들어, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체) 또는 항체 콘주게이트 (예를 들어, 단분산 HA 콘주게이트)는 한꺼번에 또는 일련의 치료를 통해 환자에게 적합하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어, 0.1 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.6 mg/kg, 0.8 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, 또는 10 mg/kg)의 항체 또는 항체콘주게이트가, 예를 들어, 하나 이상의 별개의 투여에 의하거나, 또는 연속적 주입에 의해 환자에 투여를 위한 초기 후보 투약량일 수 있다. 일부 구현예에서, 사용된 항체 또는 항체 콘주게이트는 약 0.01 mg/kg 내지 약 45 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 40 mg/kg, 약 0.01mg/kg 내지 약 35 mg/kg, 약 0.01mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 25 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 15 mg/kg, 약 0.01mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.01mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 또는 약 0.01 mg/kg 내지 약 1 mg/kg이다. 항체 콘주게이트의 경우, 투약은 콘주게이트의 항체 성분의 중량을 기준으로 할 수 있다. 하나의 전형적인 1일 투약량은 상기 언급된 인자에 의존하여 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위일 것이다. 병태에 의존하여 며칠 또는 더 긴 기간에 걸친 반복된 투여의 경우, 치료는 일반적으로 질환 증상의 원하는 억제가 나타날 때까지 지속될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 방법은 추가의 요법을 더 포함할 수 있다. 본 추가의 요법은 방사선 요법, 수술, 화학 요법, 유전자 요법, DNA 요법, 바이러스 요법, RNA 요법, 면역 요법, 골수이식, 나노 요법, 단클론성 항체 요법, 또는 전술한 것의 조합일 수 있다. 추가의 요법은 아쥬반트 또는 네오아쥬반트 요법의 형태로 될 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 요법은 소분자 효소적 억제제 또는 항-전이성 제제의 투여이다. 일부 구현예에서, 추가의 요법은 부작용 제한 제제 (예를 들어, 치료의 부작용의 발생 및/또는 중증도를 줄이기 위한 제제, 예컨대 항-메스꺼움 제제, 등)의 투여이다. 일부 구현예에서, 추가의 요법은 방사선 요법이다. 일부 구현예에서, 추가의 요법은 수술이다. 일부 구현예에서, 추가의 요법은 방사선 요법과 수술의 조합이다. 일부 구현예에서, 추가의 요법은 감마 조사이다. 일부 구현예에서, 추가의 요법은 상기에 기재된 치료제 중 하나 이상의 별도의 투여일 수 있다.
임의의 상기 제형 또는 치료 방법은 항-VEGF 항체 대신에 또는 이에 부가하여 본 발명의 면역접합체를 사용하여 수행될 수 있다는 것이 이해해야 한다.
임의의 상기 제형 또는 치료 방법은 본 발명의 항체 콘주게이트 (예를 들어, 하기 부문 G에서, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 것)를 사용하여 수행될 수 있다는 것이 이해해야 한다.
F. 제조 물품
본 발명의 또 다른 양태에서, 상기에 기재된 장애의 치료 및/또는 예방에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 용기 및 용기 상에 또는 용기와 관련된 표지 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로 형성될 수 있다. 용기는 그것만으로 또는 병태를 치료, 예방 및/또는 진단하기에 효과적인 또 다른 조성물과 조합된 조성물을 보유하며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 스토퍼를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물 중 적어도 하나의 활성제는 본 발명의 항체 조성물 (예를 들어, 항체 (예를 들어, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체) 또는 그것의 항체 콘주게이트)이다. 표지 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택의 병태를 치료하는데 사용됨을 나타낸다. 나아가, 제조 물품은 (a) 조성물이 그 안에 함유된 제1 용기로, 여기서 본 조성물은 본 발명의 항체 또는 이의 항체 조성물을 포함하는, 제1 용기; 및 선택적으로 (b) 조성물이 그 안에 함유된 제2 용기로, 여기서 본 조성물은 추가의 치료제를 포함하는, 제2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 이 구현예에서 제조 물품은 조성물(들)이 특정 병태를 치료하는데 사용될 수 있음을 나타내는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 제조 물품은 약제학적으로-허용가능한 완충액, 예컨대 정균 주사용 물 (BWFI), 포스페이트-완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 그것은 다른 완충액, 희석제, 필터, 니들, 및 주사기를 포함하여 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
임의의 상기 제조 물품은 본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 이의 항체 콘주게이트 및/또는 임의의 추가의 치료제를 포함할 수 있는 것을 이해해야 한다.
G. 안구 지속작용성 전달 접근법
본 발명은 눈으로 항체 (예를 들어, 항-VEGF 항체 (본 명세서에 기재된 임의의 항-VEGF 항체, 예컨대 G6.31 AARR을 포함함))의 지속작용성 전달을 위해 사용될 수 있는 안구 장애 치료용 조성물을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 본 명세서에 기재된 항-VEGF 항체 (예를 들어, Fab, Fab-C 또는 시스테인 조작된 항체 (예를 들어, ThioFab) 콘주게이트)를 포함하는 항체 콘주게이트 (예를 들어, 단분산 HA 콘주게이트)를 제공한다. 본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 항체 또는 항체 콘주게이트의 안구 투여에 사용될 수 있는 디바이스를 제공한다. 본 발명은 본 명세서에 기재된 항체 또는 항체 콘주게이트를 포함하는 약제학적 조성물을 추가로 제공한다. 이들 조성물은 본 명세서에 기재된 임의의 치료 방법, 예를 들어 안구 장애 (예를 들어, AMD (예를 들어, 습성 AMD), DME, DR (예를 들어, NPDR 또는 PDR), 또는 RVO (예를 들어, CRVO 또는 BRVO))를 치료하는 방법에 사용될 수 있다.
1. 항체 콘주게이트
본 발명은 항체 (예를 들어, 항-VEGF 항체) 및 이 항체에 공유결합된 단분산 폴리머를 포함하는 항체 콘주게이트를 제공한다. 항체 (예를 들어, 항-VEGF 항체)는 비가역적 방식 또는 가역적 방식으로 단분산 폴리머에 공유결합될 수 있다. 본 명세서에서 기재된 것 또는 당업계에서 알려진 기타를 포함하는 임의의 적합한 단분산 폴리머가 사용될 수 있다.
본 발명은 항체 및 이 항체에 공유결합된 단분산 폴리머 (예를 들어, 단분산 HA 폴리머)를 포함하는 항체 콘주게이트를 제공한다. 폴리머는 약 1.1 이하의 다분산도 지수 (PDI)를 가질 수 있다. PDI 값이 항체 콘주게이트를 제조하기 위해 사용된 폴리머의 PDI 값을 지칭할 수 있는 것으로 이해해야 한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 폴리머는 1.0 내지 약 1.1 (예를 들어, 1 내지 약 1.1, 1 내지 약 1.09, 1 내지 약 1.08, 1 내지 약 1.07, 1 내지 약 1.06, 1 내지 약 1.05, 1 내지 약 1.04, 1 내지 약 1.03, 1 내지 약 1.02, 1 내지 약 1.01, 1 내지 약 1.005, 약 1.001 내지 약 1.1, 약 1.001 내지 약 1.1, 약 1.001 내지 약 1.09, 약 1.001 내지 약 1.08, 약 1.001 내지 약 1.07, 약 1.001 내지 약 1.06, 약 1.001 내지 약 1.05, 약 1.001 내지 약 1.04, 약 1.001 내지 약 1.03, 약 1.001 내지 약 1.02, 약 1.001 내지 약 1.01, 약 1.001 내지 약 1.005, 약 1.001 내지 약 1.004, 약 1.001 내지 약 1.003, 약 1.001 내지 약 1.002, 약 1.0001 내지 약 1.1, 약 1.0001 내지 약 1.09, 약 1.0001 내지 약 1.08, 약 1.0001 내지 약 1.07, 약 1.0001 내지 약 1.06, 약 1.0001 내지 약 1.05, 약 1.0001 내지 약 1.04, 약 1.0001 내지 약 1.03, 약 1.0001 내지 약 1.02, 약 1.0001 내지 약 1.01, 약 1.0001 내지 약 1.005, 약 1.0001 내지 약 1.004, 약 1.0001 내지 약 1.003, 약 1.0001 내지 약 1.002, 또는 약 1.0001 내지 약 1.005)의 PDI를 갖는다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 단분산 폴리머 (예를 들어, 단분산 HA 폴리머)는 1.001, 약 1.0001, 약 1.00001, 약 1.000001, 약 1.0000001, 또는 그 미만의 PDI를 갖는다. 일부 구현예에서, 단분산 폴리머 (예를 들어, 단분산 HA 폴리머)는 1.0, 약 1.001, 약 1.002, 약 1.003, 약 1.004, 약 1.005, 약 1.006, 약 1.007, 약 1.008, 약 1.009, 약 1.01, 약 1.011, 약 1.012, 약 1.013, 약 1.014, 약 1.015, 약 1.016, 약 1.017, 약 1.018, 약 1.019, 약 1.02, 약 1.021, 약 1.022, 약 1.023, 약 1.024, 약 1.025, 약 1.026, 약 1.027, 약 1.028, 약 1.029, 약 1.03, 약 1.031, 약 1.032, 약 1.033, 약 1.034, 약 1.035, 약 1.036, 약 1.037, 약 1.038, 약 1.039, 약 1.04, 약 1.041, 약 1.042, 약 1.043, 약 1.044, 약 1.045, 약 1.046, 약 1.047, 약 1.048, 약 1.049, 약 1.05, 약 1.051, 약 1.052, 약 1.053, 약 1.054, 약 1.055, 약 1.056, 약 1.057, 약 1.058, 약 1.059, 약 1.06, 약 1.061, 약 1.062, 약 1.063, 약 1.064, 약 1.065, 약 1.066, 약 1.067, 약 1.068, 약 1.069, 약 1.07, 약 1.071, 약 1.072, 약 1.073, 약 1.074, 약 1.075, 약 1.076, 약 1.077, 약 1.078, 약 1.079, 약 1.08, 약 1.081, 약 1.082, 약 1.083, 약 1.084, 약 1.085, 약 1.086, 약 1.087, 약 1.088, 약 1.089, 약 1.09, 약 1.091, 약 1.092, 약 1.093, 약 1.094, 약 1.095, 약 1.096, 약 1.097, 약 1.098, 약 1.099, 또는 약 1.1의 PDI를 갖는다. 일부 구현예에서, 폴리머 (예를 들어, HA 폴리머)는 약 1.001의 PDI를 갖는다.
단분산 폴리머는 친수성 폴리머 또는 소수성 폴리머일 수 있다. 친수성 폴리머가 수용성 폴리머일 수 있음을 이해해야 한다. 임의의 적합한 친수성 폴리머가 사용될 수 있고, 그 예는 하기에 기재된 친수성 폴리머이다: 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2011/066417 및/또는 Pelegri-O'Day 등. J. Am. Chem . Soc . 136:14323-14332, 2014 (이는 본 명세서에 참고로 전체적으로 편입됨). 예시적인, 사용될 수 있는 비제한적인 친수성 폴리머는 하기를 포함한다: 하이알루론산 (HA), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG; 폴리(에틸렌 글리콜) 로도 알려짐) (예를 들어, 직쇄 PEG, 분지형 PEG, 빗살모양 PEG, 및 수지상 PEG), 폴리[에틸렌 옥사이드)-코-(메틸렌 에틸렌 옥사이드)], 폴리(폴리(에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 메타크릴레이트) (pPEGMA), 아가로스, 알기네이트, 카라기난, 카복시메틸셀룰로스, 셀룰로스, 셀룰로스 유도체, 키토산, 콘드로이틴 설페이트, 콜라겐, 더마탄 설페이트, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 피브린, 피브리노겐, 파이브로넥틴, 푸코이단, 젤라틴, 글리코사미노글리칸 (GAGs), gly공중합체, 헤파린, 헤파린 설페이트, 고-분지형 다당류 (예를 들어, 갈락토스 덴드리머), 케라탄 설페이트, 메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스 (HPMC), 폴리(N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드) (pHPMA), 펙틴, 펙틴 유도체, 펜토산 폴리설페이트, 전분, 하이드록실에틸 전분 (HES), 스티렌, 빈트로넥틴, 폴리(아크릴산), 폴리(메타크릴산), 폴리(아크릴아미드), 폴리(아크릴산), 폴리(아민), 폴리(아미노산), 폴리(카복시베타인) (PCB), 고분자전해질, 폴리(글루탐산) (PGA), 폴리(글리세롤) (PG) (예를 들어, 선형, 중간작용성, 하이퍼분지형, 또는 선형 하이퍼분지형 PG), 폴리(말레산), 폴리(2-옥사졸린) (POZ), 폴리(2-에틸-2-옥사졸린, 폴리시알산 (PSA), 폴리스티렌, 폴리스티렌 유도체 (예를 들어, 충전된 폴리스티렌 유도체), 폴리(스티렌설포네이트-코-PEGMA), 폴리비닐피롤리돈 (PVP), 폴리(N-아크릴로일모폴린) (pNAcM), 및 그것의 공중합체. 일부 사례에서, 폴리머는 소수성 폴리머, 예를 들어, 폴리(락트산-코- 글라이콜산) (PLGA), 폴리락타이드 (PLA), 및 폴리글라이콜라이드 (PGA). 폴리머는 생분해성 및/또는 생체적합성일 수 있다. 특정 구현예에서, 폴리머는 HA이다.
예로써, 단분산 폴리머 (예를 들어, HA 폴리머)는, 예를 들어, 2 내지 약 1x104 단량체 (예를 들어, 약 10, 약 50, 약 100, 약 200, 약 300, 약 400, 약 500, 약 600, 약 700, 약 800, 약 900, 약 1000, 약 2000, 약 3000, 약 4000, 약 5000, 약 6000, 약 7000, 약 8000, 약 9000, 또는 약 1x104 단량체), 또는 그 초과 개의 단량체의 임의의 적합한 수를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리머 (예를 들어, HA 폴리머)는 약 50 내지 약 250개의 단량체, 약 50 및 약 500개의 단량체, 약 50 내지 약 1000개의 단량체, 약 50 내지 약 2000개의 단량체, 약 50 내지 약 3000개의 단량체, 약 50 내지 약 4000개의 단량체, 약 50 내지 약 5000개의 단량체, 약 50 내지 약 6000개의 단량체, 약 50 내지 약 7000개의 단량체, 약 50 내지 약 8000개의 단량체, 약 50 내지 약 9000개의 단량체, 약 50 내지 약 10000개의 단량체, 약 100 내지 약 250개의 단량체, 약 100 및 약 500개의 단량체, 약 100 내지 약 1000개의 단량체, 약 100 내지 약 2000개의 단량체, 약 100 내지 약 3000개의 단량체, 약 100 내지 약 4000개의 단량체, 약 100 내지 약 5000개의 단량체, 약 100 내지 약 6000개의 단량체, 약 100 내지 약 7000개의 단량체, 약 100 내지 약 8000개의 단량체, 약 100 내지 약 9000개의 단량체, 약 100 내지 약 10000개의 단량체, 약 250 내지 약 500개의 단량체, 약 250 내지 약 1000개의 단량체, 약 250 내지 약 2000개의 단량체, 약 250 내지 약 3000개의 단량체, 약 250 내지 약 4000개의 단량체, 약 250 내지 약 5000개의 단량체, 약 250 내지 약 6000개의 단량체, 약 250 내지 약 7000개의 단량체, 약 250 내지 약 8000개의 단량체, 약 250 내지 약 9000개의 단량체, 약 250 내지 약 10000개의 단량체. 약 500 내지 약 1000개의 단량체, 약 500 내지 약 2000개의 단량체, 약 500 내지 약 3000개의 단량체, 약 500 내지 약 4000개의 단량체, 약 500 내지 약 5000개의 단량체, 약 500 내지 약 6000개의 단량체, 약 500 내지 약 7000개의 단량체, 약 500 내지 약 8000개의 단량체, 약 500 내지 약 9000개의 단량체, 또는 약 500 내지 약 10000개의 단량체를 포함할 수 있다. 일부 사례에서, 폴리머 (예를 들어, HA 폴리머)는 약 500개의 단량체를 포함할 수 있다.
본 발명은 단분산 HA 폴리머에 공유결합된 항체 (예를 들어, 항-VEGF 항체 예컨대 G6.31 AARR)을 포함하는 항체 콘주게이트를 제공한다. 그와 같은 항체 콘주게이트는 때때로 본 명세서에서 일명 "단분산 HA 콘주게이트"이다. 단분산 HA 폴리머는 약 1.1 이하의 다분산도 지수 (PDI)를 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 단분산 HA 폴리머는 1.0 내지 약 1.1 (예를 들어, 1 내지 약 1.1, 1 내지 약 1.09, 1 내지 약 1.08, 1 내지 약 1.07, 1 내지 약 1.06, 1 내지 약 1.05, 1 내지 약 1.04, 1 내지 약 1.03, 1 내지 약 1.02, 1 내지 약 1.01, 1 내지 약 1.005, 약 1.001 내지 약 1.1, 약 1.001 내지 약 1.1, 약 1.001 내지 약 1.09, 약 1.001 내지 약 1.08, 약 1.001 내지 약 1.07, 약 1.001 내지 약 1.06, 약 1.001 내지 약 1.05, 약 1.001 내지 약 1.04, 약 1.001 내지 약 1.03, 약 1.001 내지 약 1.02, 약 1.001 내지 약 1.01, 약 1.001 내지 약 1.005, 약 1.001 내지 약 1.004, 약 1.001 내지 약 1.003, 약 1.001 내지 약 1.002, 약 1.0001 내지 약 1.1, 약 1.0001 내지 약 1.09, 약 1.0001 내지 약 1.08, 약 1.0001 내지 약 1.07, 약 1.0001 내지 약 1.06, 약 1.0001 내지 약 1.05, 약 1.0001 내지 약 1.04, 약 1.0001 내지 약 1.03, 약 1.0001 내지 약 1.02, 약 1.0001 내지 약 1.01, 약 1.0001 내지 약 1.005, 약 1.0001 내지 약 1.004, 약 1.0001 내지 약 1.003, 약 1.0001 내지 약 1.002, 또는 약 1.0001 내지 약 1.005)의 PDI를 갖는다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 단분산 HA 폴리머는 1.001, 약 1.0001, 약 1.00001, 약 1.000001, 약 1.0000001, 또는 그 미만의 PDI를 갖는다. 일부 구현예에서, 단분산 HA 폴리머는 1.0, 약 1.001, 약 1.002, 약 1.003, 약 1.004, 약 1.005, 약 1.006, 약 1.007, 약 1.008, 약 1.009, 약 1.01, 약 1.011, 약 1.012, 약 1.013, 약 1.014, 약 1.015, 약 1.016, 약 1.017, 약 1.018, 약 1.019, 약 1.02, 약 1.021, 약 1.022, 약 1.023, 약 1.024, 약 1.025, 약 1.026, 약 1.027, 약 1.028, 약 1.029, 약 1.03, 약 1.031, 약 1.032, 약 1.033, 약 1.034, 약 1.035, 약 1.036, 약 1.037, 약 1.038, 약 1.039, 약 1.04, 약 1.041, 약 1.042, 약 1.043, 약 1.044, 약 1.045, 약 1.046, 약 1.047, 약 1.048, 약 1.049, 약 1.05, 약 1.051, 약 1.052, 약 1.053, 약 1.054, 약 1.055, 약 1.056, 약 1.057, 약 1.058, 약 1.059, 약 1.06, 약 1.061, 약 1.062, 약 1.063, 약 1.064, 약 1.065, 약 1.066, 약 1.067, 약 1.068, 약 1.069, 약 1.07, 약 1.071, 약 1.072, 약 1.073, 약 1.074, 약 1.075, 약 1.076, 약 1.077, 약 1.078, 약 1.079, 약 1.08, 약 1.081, 약 1.082, 약 1.083, 약 1.084, 약 1.085, 약 1.086, 약 1.087, 약 1.088, 약 1.089, 약 1.09, 약 1.091, 약 1.092, 약 1.093, 약 1.094, 약 1.095, 약 1.096, 약 1.097, 약 1.098, 약 1.099, 또는 약 1.1의 PDI를 갖는다. 일부 구현예에서, 단분산 HA 폴리머는 약 1.001의 PDI를 갖는다.
일부 사례에서, 단분산 HA 폴리머는 약 2.5 메가달톤 (MDa) 이하 (예를 들어, 약 2.5 MDa 이하, 약 2.4 MDa 이하, 약 2.3 MDa 이하, 약 2.2. MDa 이하, 약 2.1 MDa 이하, 약 2.0 MDa 이하, 약 1.9 MDa 이하, 약 1.8 MDa 이하, 약 1.7 MDa 이하, 약 1.6 MDa 이하, 약 1.5 MDa 이하, 약 1.4 MDa 이하, 약 1.3 MDa 이하, 약 1.2 MDa 이하, 약 1.1 MDa 이하, 약 1.0 MDa 이하, 약 900 kDa 이하, 약 800 kDa 이하, 약 700 kDa 이하, 약 600 kDa 이하, 약 500 kDa 이하, 약 400 kDa 이하, 약 300 kDa 이하, 약 200 kDa 이하, 또는 약 100 kDa 이하)의 분자량을 갖는다. 일부 사례에서, HA 폴리머는 약 1 MDa 이하 (예를 들어, 약 1.0 MDa 이하, 약 900 kDa 이하, 약 800 kDa 이하, 약 700 kDa 이하, 약 600 kDa 이하, 약 500 kDa 이하, 약 400 kDa 이하, 약 300 kDa 이하, 약 200 kDa 이하, 또는 약 100 kDa 이하)의 분자량을 갖는다. 일부 사례에서, HA 폴리머는 약 25 kDa 내지 약 2.5 MDa (예를 들어, 약 25 kDa 내지 약 2.5 mDa, 약 25 kDa 내지 약 2 MDa, 약 25 kDa 내지 약 1.5 MDa, 약 25 kDa 내지 약 1 MDa, 약 25 kDa 내지 약 900 kDa, 약 25 kDa 내지 약 800 kDa, 약 25 kDa 내지 약 700 kDa, 약 25 kDa 내지 약 600 kDa, 약 25 kDa 내지 약 500 kDa, 약 100 kDa 내지 약 2.5 mDa, 약 100 kDa 내지 약 2 MDa, 약 100 kDa 내지 약 1.5 MDa, 약 100 kDa 내지 약 1 MDa, 약 100 kDa 내지 약 900 kDa, 약 100 kDa 내지 약 800 kDa, 약 100 kDa 내지 약 700 kDa, 약 100 kDa 내지 약 600 kDa, 약 100 kDa 내지 약 500 kDa, 약 250 kDa 내지 약 2.5 MDa, 약 250 kDa 내지 약 2 MDa, 약 250 kDa 내지 약 1.5 MDa, 약 250 kDa 내지 약 1 MDa, 약 250 kDa 내지 약 900 kDa, 약 250 kDa 내지 약 800 kDa, 약 250 kDa 내지 약 700 kDa, 약 250 kDa 내지 약 600 kDa, 약 250 kDa 내지 약 500 kDa, 약 500 kDa 내지 약 2.5 MDa, 약 500 kDa 내지 약 2 MDa, 약 500 kDa 내지 약 1.5 MDa, 약 500 kDa 내지 약 1 MDa, 약 500 kDa 내지 약 900 kDa, 약 500 kDa 내지 약 800 kDa, 약 500 kDa 내지 약 700 kDa, 약 500 kDa 내지 약 600 kDa, 약 1 MDa 내지 약 2.5 MDa, 약 1 MDa 내지 약 2 MDa, 약 1 MDa 내지 약 1.5 MDa, 약 1 MDa 내지 약 1.25 MDa, 약 1.25 MDa 내지 약 2.5 MDa, 약 1.25 MDa 내지 약 2 MDa, 약 1.25 MDa 내지 약 1.5 MDa, 약 1.5 MDa 내지 약 2.5 MDa, 약 1.5 MDa 내지 약 2 MDa, 약 1.5 MDa 내지 약 1.75 MDa, 또는 약 1.75 MDa 내지 약 2.5 MDa)의 분자량을 갖는다.
일부 사례에서, 단분산 HA 폴리머는 약 25 kDa 내지 약 500 kDa (예를 들어, 약 25 kDa 내지 약 500 kDa, 약 25 kDa 내지 약 450 kDa, 약 25 kDa 내지 약 400 kDa, 약 25 kDa 내지 약 350 kDa, 약 25 kDa 내지 약 300 kDa, 약 25 kDa 내지 약 300 kDa, 약 25 kDa 내지 약 250 kDa, 약 25 kDa 내지 약 200 kDa, 약 25 kDa 내지 약 150 kDa, 약 25 kDa 내지 약 100 kDa, 약 25 kDa 내지 약 50 kDa, 약 40 kDa 내지 약 500 kDa, 약 40 kDa 내지 약 450 kDa, 약 40 kDa 내지 약 400 kDa, 약 40 kDa 내지 약 350 kDa, 약 40 kDa 내지 약 300 kDa, 약 40 kDa 내지 약 300 kDa, 약 40 kDa 내지 약 250 kDa, 약 40 kDa 내지 약 200 kDa, 약 40 kDa 내지 약 150 kDa, 약 40 kDa 내지 약 100 kDa, 약 40 kDa 내지 약 50 kDa, 약 50 kDa 내지 약 500 kDa, 약 50 kDa 내지 약 450 kDa, 약 50 kDa 내지 약 400 kDa, 약 50 kDa 내지 약 350 kDa, 약 50 kDa 내지 약 300 kDa, 약 50 kDa 내지 약 300 kDa, 약 50 kDa 내지 약 250 kDa, 약 50 kDa 내지 약 200 kDa, 약 50 kDa 내지 약 150 kDa, 약 50 kDa 내지 약 100 kDa, 약 50 kDa 내지 약 75 kDa, 약 100 kDa 내지 약 500 kDa, 약 100 kDa 내지 약 450 kDa, 약 100 kDa 내지 약 400 kDa, 약 100 kDa 내지 약 350 kDa, 약 100 kDa 내지 약 300 kDa, 약 100 kDa 내지 약 300 kDa, 약 100 kDa 내지 약 250 kDa, 약 100 kDa 내지 약 200 kDa, 약 100 kDa 내지 약 150 kDa, 약 150 kDa 내지 약 500 kDa, 약 150 kDa 내지 약 450 kDa, 약 150 kDa 내지 약 400 kDa, 약 150 kDa 내지 약 350 kDa, 약 150 kDa 내지 약 300 kDa, 약 150 kDa 내지 약 300 kDa, 약 150 kDa 내지 약 250 kDa, 약 150 kDa 내지 약 200 kDa, 약 175 kDa 내지 약 500 kDa, 약 175 kDa 내지 약 450 kDa, 약 175 kDa 내지 약 400 kDa, 약 175 kDa 내지 약 350 kDa, 약 175 kDa 내지 약 300 kDa, 약 175 kDa 내지 약 300 kDa, 175 200 kDa 내지 약 250 kDa, 약 175 kDa 내지 약 225 kDa, 약 200 kDa 내지 약 500 kDa, 약 200 kDa 내지 약 450 kDa, 약 200 kDa 내지 약 400 kDa, 약 200 kDa 내지 약 350 kDa, 약 200 kDa 내지 약 300 kDa, 약 200 kDa 내지 약 300 kDa, 약 200 kDa 내지 약 250 kDa, 또는 약 200 kDa 내지 약 225 kDa)의 분자량을 갖는다.
일부 사례에서, 단분산 HA 폴리머는 약 100 kDa 내지 약 250 kDa (예를 들어, 약 100 kDa, 약 110 kDa, 약 120 kDa, 약 130 kDa, 약 140 kDa, 약 150 kDa, 약 160 kDa, 약 170 kDa, 약 180 kDa, 약 190 kDa, 약 200 kDa, 약 210 kDa, 약 220 kDa, 약 230 kDa, 약 240 kDa, 또는 약 250 kDa)의 분자량을 갖는다. 특정 사례에서, HA 폴리머는 약 200 kDa의 분자량을 갖는다.
이전의 분자량 중 임의의 것은 중량평균 분자량 (중량평균 몰 질량으로도 알려지다)일 수 있다.
일부 사례에서, 이전의 단분산 HA 폴리머 중 임의의 것은 선형이고, 즉, 가교결합되지 않는다.
다른 사례에서, 본 발명은 단분산 PEG 폴리머에 공유결합된 항체 (예를 들어, 항-VEGF 항체 예컨대 G6.31 AARR)를 포함하는 항체 콘주게이트를 제공한다. 그와 같은 항체 콘주게이트는 때때로 본 명세서에서 "PEG 콘주게이트"로 칭한다. 임의의 적합한 단분산 PEG 폴리머가 사용될 수 있다. 단분산 PEG 폴리머가 단분산 HA 폴리머와 비교하여 상이한 PDI 값를 가질 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 상업적으로 입수가능한 PEG 폴리머는 1.1 미만의 PDI를 가질 수 있고; 따라서, 단분산 PEG 폴리머는 단분산 HA 폴리머와 비교하여 상이한 범위의 PDI 값 에 의해 정의된다. 예를 들어, 단분산 PEG 폴리머는 약 1 내지 약 1.02의 PDI (예를 들어, 1, 약 1.001, 약 1.002, 약 1.003, 약 1.004, 약 1.005, 약 1.006, 약 1.007, 약 1.008, 약 1.009, 약 1.01, 약 1.011, 약 1.012, 약 1.013, 약 1.014, 약 1.015, 약 1.016, 약 1.017, 약 1.018, 약 1.019, 또는 약 1.02의 PDI)를 가질 수 있다. PEG는 분지형 PEG, 성상 PEG, 또는 빗살모양 PEG.일 수 있다 PEG 폴리머는, 예를 들어, PEG 사량체, PEG 육량체, 또는 PEG 팔량체일 수 있다. 일부 사례에서, 항체 콘주게이트는 PEG 덴드리머에 공유결합된 항-VEGF 항체 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 항-VEGF 항체, 예컨대 G6.31 AARR)을 포함한다. PEG 폴리머는 상업적으로 입수가능하고, 그 예는 JenKem Technology, Quanta BioDesign, NOF America Corporation, 및 다른 판매인으로부터이다.
일부 사례에서, 단분산 PEG 폴리머는 약 1 kDa 내지 약 500 kDa (예를 들어, 약 1 kDa 내지 약 500 kDa, 약 1 kDa 내지 약 450 kDa, 약 1 kDa 내지 약 400 kDa, 약 1 kDa 내지 약 350 kDa, 약 1 kDa 내지 약 300 kDa, 약 1 kDa 내지 약 300 kDa, 약 1 kDa 내지 약 250 kDa, 약 1 kDa 내지 약 200 kDa, 약 1 kDa 내지 약 150 kDa, 약 1 kDa 내지 약 100 kDa, 약 1 kDa 내지 약 50 kDa, 약 10 kDa 내지 약 500 kDa, 약 10 kDa 내지 약 450 kDa, 약 10 kDa 내지 약 400 kDa, 약 10 kDa 내지 약 350 kDa, 약 10 kDa 내지 약 300 kDa, 약 10 kDa 내지 약 300 kDa, 약 10 kDa 내지 약 250 kDa, 약 10 kDa 내지 약 200 kDa, 약 10 kDa 내지 약 150 kDa, 약 10 kDa 내지 약 100 kDa, 약 10 kDa 내지 약 50 kDa, 약 20 kDa 내지 약 500 kDa, 약 20 kDa 내지 약 450 kDa, 약 20 kDa 내지 약 400 kDa, 약 20 kDa 내지 약 350 kDa, 약 20 kDa 내지 약 300 kDa, 약 20 kDa 내지 약 300 kDa, 약 20 kDa 내지 약 250 kDa, 약 20 kDa 내지 약 200 kDa, 약 20 kDa 내지 약 150 kDa, 약 20 kDa 내지 약 100 kDa, 약 20 kDa 내지 약 75 kDa, 약 30 kDa 내지 약 500 kDa, 약 30 kDa 내지 약 450 kDa, 약 30 kDa 내지 약 400 kDa, 약 30 kDa 내지 약 350 kDa, 약 30 kDa 내지 약 300 kDa, 약 30 kDa 내지 약 300 kDa, 약 30 kDa 내지 약 250 kDa, 약 30 kDa 내지 약 200 kDa, 약 30 kDa 내지 약 150 kDa, 약 40 kDa 내지 약 500 kDa, 약 40 kDa 내지 약 450 kDa, 약 40 kDa 내지 약 400 kDa, 약 40 kDa 내지 약 350 kDa, 약 40 kDa 내지 약 300 kDa, 약 40 kDa 내지 약 300 kDa, 약 40 kDa 내지 약 250 kDa, 약 40 kDa 내지 약 200 kDa, 약 50 kDa 내지 약 500 kDa, 약 50 kDa 내지 약 450 kDa, 약 50 kDa 내지 약 400 kDa, 약 50 kDa 내지 약 350 kDa, 약 50 kDa 내지 약 300 kDa, 약 50 kDa 내지 약 300 kDa, 50 200 kDa 내지 약 250 kDa, 또는 약 50 kDa 내지 약 225 kDa)의 분자량을 갖는다.
일부 사례에서, 단분산 PEG 폴리머는 약 5 kDa 내지 약 250 kDa (예를 들어, 약 1 kDa, 약 5 kDa, 약 10 kDa, 약 15 kDa, 약 20 kDa, 약 25 kDa, 약 30 kDa, 약 35 kDa, 약 40 kDa, 약 50 kDa, 약 60 kDa, 약 70 kDa, 약 80 kDa, 약 90 kDa, 100 kDa, 약 110 kDa, 약 120 kDa, 약 130 kDa, 약 140 kDa, 약 150 kDa, 약 160 kDa, 약 170 kDa, 약 180 kDa, 약 190 kDa, 약 200 kDa, 약 210 kDa, 약 220 kDa, 약 230 kDa, 약 240 kDa, 또는 약 250 kDa)의 분자량을 갖는다. 특정 사례에서, PEG 폴리머는 약 20 kDa의 분자량을 갖는다. 다른 사례에서, PEG 폴리머는 약 40 kDa의 분자량을 갖는다.
이전의 분자량 중 임의의 것은 중량평균 분자량 (중량평균 몰 질량으로도 알려짐)일 수 있다.
일부 사례에서, 단분산 PEG 폴리머는 PEG 사량체이다. PEG 사량체는 상업적으로 입수가능하고, 그 예는 NOF America SUNBRIGHT® PTE-400MA, PTE-200MA, PTE-100MA, 및 JenKem Technology USA 4 아암 PEG 말레이미드 (Cat. No. 4ARM-MAL)이다. 일부 사례에서, PEG 사량체는 펜타에리트리톨 코어를 갖는다. 예를 들어, 일부 사례에서, PEG 사량체는 식 (I)의 구조를 포함하되, n은 독립적으로 임의의 적합한 정수이다:
식 I:
Figure pct00005
또 다른 예에서, 일부 사례에서, 단분산 PEG 폴리머는 PEG 육량체이다. PEG 육량체는 상업적으로 입수가능하고, 그 예는 JenKem Technology USA 6 아암 PEG 아민 (Cat. No. 6ARM(DP)-NH2HCl), 또는 PEG 육량체 (Quanta BioDesign)이다. 일부 사례에서, PEG 육량체는 디펜틸에리트리톨 코어를 포함한다.
일부 사례에서, 단분산 PEG 폴리머는 PEG 팔량체. PEG 팔량체는 상업적으로 입수가능가능하며, 그 예는 NOF America SUNBRIGHT® HGEO 시리즈 또는 JenKem Technology USA 8 아암 PEG 말레이미드 (Cat. No. 8ARM(TP)-MAL)이다. 일부 사례에서, PEG 팔량체는 트리펜타에리트리톨 코어를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 사례에서, PEG 팔량체는 식 (II)의 구조를 포함하되, n은 독립적으로 임의의 적합한 정수이다:
식 II:
Figure pct00006
또 다른 예에서, 일부 사례에서, PEG 팔량체는 트리펜타에리트리톨 코어를 포함한다.
본 명세서에서 기재된 것 및 당업계에서 알려진 기타를 포함하는 임의의 적합한 콘주게이션 접근법이 본 발명의 항-VEGF 항체를 단분산 폴리머에 접합시키기 위해 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 예를 들어, 단분산 폴리머는 일차 아민 기, 카복실기, 설프하이드릴 기, 또는 카보닐 기를 포함하는 임의의 적합한 단백질 작용기 에 접합될 수 있다. 임의의 적합한 화학적 반응 기는 하기를 표적으로 하기 위해 사용될 수 있다: 단백질 작용기, 예를 들어, 카보디이미드 (예를 들어, EDC), NHS 에스테르, 이미도에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, 하이드록시메틸 포스핀, 말레이미드, 할로아세틸 (예를 들어, 브로모아세틸 또는 아이오도아세틸), 피리딜디설파이드, 티오설포네이트, 비닐설폰, 하이드라진, 알콕시아민, 디아지린, 아릴 아자이드, 이소시아네이트, 또는 당업계에서 알려진 기타. 참고, 예를 들어, Hermanson, Bioconjugate Techniques, 3rd Edition, 2013. 특정 구현예에서, HA (예를 들어, 단분산 HA)는 말레이미드 기 (HA-말레이미드)로 변형되고, 두 번째로, 시스테인 상의 유리 티올 (예를 들어, Fab-C 또는 시스테인 변이체 (예를 들어, THIOMABTM 또는 ThioFab))을 포함하는 항체는 예를 들어, 실시예 1에 기재된 바와 같이 HA-말레이미드와 반응하여 공유 HA-Fab 콘주게이트를 형성한다.
이전의 항체 콘주게이트 중 임의의 것은 약 5 nm 내지 약 200 nm (예를 들어, 약 5 nm, 약 10 nm, 약 20 nm, 약 30 nm, 약 40 nm, 약 50 nm, 약 60 nm, 약 70 nm, 약 80 nm, 약 90 nm, 약 100 nm, 약 110 nm, 약 120 nm, 약 130 nm, 약 140 nm, 약 150 nm, 약 160 nm, 약 170 nm, 약 180 nm, 약 190 nm, 또는 약 200 nm)의 유체역학적 반경을 가질 수 있다. 일부 사례에서, 항체 콘주게이트는 약 5 nm 내지 약 150 nm (예를 들어, 약 5 nm, 약 10 nm, 약 20 nm, 약 30 nm, 약 40 nm, 약 50 nm, 약 60 nm, 약 70 nm, 약 80 nm, 약 90 nm, 약 100 nm, 약 110 nm, 약 120 nm, 약 130 nm, 약 140 nm, 또는 약 150 nm)의 유체역학적 반경을 갖는다. 일부 사례에서, 항체 콘주게이트는 약 5 nm 내지 약 100 nm (예를 들어, 약 5 nm, 약 10 nm, 약 20 nm, 약 30 nm, 약 40 nm, 약 50 nm, 약 60 nm, 약 70 nm, 약 80 nm, 약 90 nm, 또는 약 100 nm)의 유체역학적 반경을 갖는다. 일부 사례에서, 항체 콘주게이트는 약 5 nm 내지 약 60 nm (예를 들어, 약 5 nm, 약 10 nm, 약 20 nm, 약 30 nm, 약 40 nm, 약 50 nm, 또는 약 60 nm)의 유체역학적 반경을 갖는다. 일부 사례에서, 항체 콘주게이트는 약 25 nm 내지 약 35 nm (예를 들어, 약 25 nm, 약 26 nm, 약 27 nm, 약 28 nm, 약 29 nm, 약 30 nm, 약 31 nm, 약 32 nm, 약 33 nm, 약 34 nm, 또는 약 35 nm)의 유체역학적 반경을 갖는다. 일부 사례에서, 유체역학적 반경은 약 28 nm이다.
일부 사례에서, 항체 콘주게이트는 약 10 nm 내지 약 200 nm, 약 10 nm 내지 약 180 nm, 약 10 nm 내지 약 160 nm, 약 10 nm 내지 약 140 nm, 약 10 nm 내지 약 120 nm, 약 10 nm 내지 약 100 nm, 약 10 nm 내지 약 80 nm, 약 10 nm 내지 약 60 nm, 약 10 nm 내지 약 50 nm, 약 10 nm 내지 약 40 nm, 약 10 nm 내지 약 30 nm, 약 20 nm 내지 약 200 nm, 약 20 nm 내지 약 180 nm, 약 20 nm 내지 약 160 nm, 약 20 nm 내지 약 140 nm, 약 20 nm 내지 약 120 nm, 약 20 nm 내지 약 100 nm, 약 20 nm 내지 약 80 nm, 약 20 nm 내지 약 60 nm, 약 20 nm 내지 약 50 nm, 약 20 nm 내지 약 40 nm, 약 20 nm 내지 약 30 nm, 약 30 nm 내지 약 200 nm, 약 30 nm 내지 약 180 nm, 약 30 nm 내지 약 160 nm, 약 30 nm 내지 약 140 nm, 약 30 nm 내지 약 120 nm, 약 30 nm 내지 약 100 nm, 약 30 nm 내지 약 80 nm, 약 30 nm 내지 약 60 nm, 약 30 nm 내지 약 50 nm, 약 30 nm 내지 약 40 nm, 약 40 nm 내지 약 200 nm, 약 40 nm 내지 약 180 nm, 약 40 nm 내지 약 160 nm, 약 40 nm 내지 약 140 nm, 약 40 nm 내지 약 120 nm, 약 40 nm 내지 약 100 nm, 약 40 nm 내지 약 80 nm, 약 40 nm 내지 약 60 nm, 약 40 nm 내지 약 50 nm, 약 50 nm 내지 약 200 nm, 약 50 nm 내지 약 180 nm, 약 50 nm 내지 약 160 nm, 약 50 nm 내지 약 140 nm, 약 50 nm 내지 약 120 nm, 약 50 nm 내지 약 100 nm, 약 50 nm 내지 약 80 nm, 약 50 nm 내지 약 60 nm, 약 60 nm 내지 약 200 nm, 약 60 nm 내지 약 180 nm, 약 60 nm 내지 약 160 nm, 약 60 nm 내지 약 140 nm, 약 60 nm 내지 약 120 nm, 약 60 nm 내지 약 100 nm, 또는 약 60 nm 내지 약 80 nm의 유체역학적 반경을 갖는다.
이전의 항체 콘주게이트 중 임의의 것에서, 항체는 VEGF에 결합하는 항체 단편, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 항-VEGF 항체의 VEGF에 결합하는 항체 단편일 수 있다. 일부 사례에서, 항-VEGF 항체는본 명세서에서 기재된 바와 같은 시스테인 조작된 항-VEGF 항체이다 (참고, 예를 들어, 상기의 부문 1(8)(d)). 일부 사례에서, 항체 단편은 Fab, Fab', Fab-C, Fab'-SH, Fv, scFv, 및 (Fab')2 단편으로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 사례에서, 항체 단편은 Fab, Fab', 또는 Fab-C이다. 일부 사례에서, 항체 단편은 Fab-C이다.
이전의 항체 콘주게이트 중 임의의 것은 폴리머 (예를 들어, 친수성 폴리머)에 공유결합하지 않는 참조 항체에 비해 증가된 안구 반감기를 가질 수 있다. 일부 사례에서, 안구 반감기는 참조 항체에 비해 적어도 약 2-배 (예를 들어, 약 2-배, 약 3-배, 약 4-배, 약 5-배, 약 6-배, 약 7-배, 약 8-배, 약 9-배, 약 10-배, 약 12-배, 약 14-배, 약 16-배, 약 18-배, 약 20-배, 또는 그 초과) 증가된다. 일부 사례에서, 안구 반감기는 상기 참조 항체에 비해 적어도 약 4-배 증가된다. 일부 사례에서, 안구 반감기는 유리체 반감기이다. 일부 사례에서, 참조 항체는 상기 항체 콘주게이트의 항체와 동일하다. 다른 사례에서, 참조 항체는 항체 콘주게이트의 항체와 동일하지 않다.
이전의 항체 콘주게이트 중 임의의 것은 폴리머 (예를 들어, 친수성 폴리머)에 공유결합하지 않는 참조 항체에 비해 줄어든 인구 청소능을 가질 수 있다. 일부 사례에서, 청소능은 참조 항체에 비해 적어도 약 2-배 (예를 들어, 약 2-배, 약 3-배, 약 4-배, 약 5-배, 약 6-배, 약 7-배, 약 8-배, 약 9-배, 약 10-배, 약 12-배, 약 14-배, 약 16-배, 약 18-배, 약 20-배, 또는 그 초과) 줄어든다. 일부 사례에서, 청소능은 참조 항체에 비해 적어도 약 4-배 줄어든다. 일부 사례에서, 청소능은 유리체로부터의 청소능이다. 일부 사례에서, 참조 항체는 상기 항체 콘주게이트의 항체와 동일하다. 다른 사례에서, 참조 항체는 항체 콘주게이트의 항체와 동일하지 않다.
일부 사례에서, 이전의 항체 콘주게이트 (예를 들어, HA 콘주게이트) 중 임의의 것 (예를 들어, 유리체내 주사에 의한) 2개의 안구내 투여 사이의 기간은 적어도 1 개월, 예를 들어, 적어도 1 개월, 적어도 5 주, 적어도 6 주, 적어도 7 주, 적어도 8 주, 적어도 9 주, 적어도 10 주, 적어도 11 주, 적어도 12 주, 적어도 13 주, 적어도 14 주, 적어도 15 주, 적어도 16 주, 적어도 20 주, 적어도 24 주, 적어도 28 주, 적어도 32 주, 적어도 36 주, 적어도 40 주, 적어도 44 주, 적어도 48 주, 적어도 52 주 또는 그 초과이다. 일부 경우에, 2개의 안구내 투여 사이의 최대 기간은 4년 이하, 예를 들어, 3년 이하, 2년 이하, 또는 1년 이하이다. 항체 콘주게이트는, 예를 들어, 2 내지 12 개월 마다, 예를 들어, 4 내지 10 개월 마다 투여될 수 있다. 일부 사례에서, 항체 콘주게이트는 6 개월마다 투여된다.
본 발명은 또한 상기에 기재된 항체 콘주게이트 중 임의의 것을 포함하는 조성물 (예를 들어, 약제학적 조성물)을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 조성물은 하나 이상의 추가의 화합물을 포함한다. 특정 구현예에서, 추가의 화합물은 하기로 구성된 군으로부터 선택된 제2 생물학적 분자에 결합한다: IL-1β; IL-6; IL-6R; PDGF; 안지오포이에틴; 안지오포이에틴 2; Tie2; S1P; 인테그린 αvβ3, αvβ5, 및 α5β1; 베타셀룰린; 아페린/APJ; 에리트로포이에틴; 보체 인자 D; TNFα; HtrA1; VEGF 수용체; ST-2 수용체; 및 연령 관련 황반 변성 (AMD) 위험에 유전자적으로 연결된 단백질, 예컨대 보체 경로 성분 C2, 인자 B, 인자 H, CFHR3, C3b, C5, C5a, 및 C3a; HtrA1; ARMS2; TIMP3; HLA; 인터류킨-8 (IL-8); CX3CR1; TLR3; TLR4; CETP; LIPC; COL10A1; 및 TNFRSF10A. 특정 구현예에서, 추가의 화합물은 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 예를 들어, 일부 사례에서, 추가의 화합물은 이중특이적 항체 (예를 들어, 항-VEGF/항-Ang2 이중특이적 항체, 예컨대 RG-7716 또는 임의의 이중특이적 항-VEGF/항-Ang2 이중특이적 항체 (WO 2010/069532 또는 WO 2016/073157에서 개시됨) 또는 그것의 변이체이다. 또 다른 예에서, 일부 사례에서, 추가의 화합물은 항-IL-6 항체, 예를 들어, EBI-031 (Eleven Biotherapeutics; 참고, 예를 들어, WO 2016/073890), 실툭시맙 (SYLVANT®), 올로키주맙, 클라자키주맙, 시루쿠맙, 엘실리모맙, 게릴림주맙, OPR-003, MEDI-5117, PF-04236921, 또는 그것의 변이체이다. 또 추가의 예에서, 일부 사례에서, 추가의 화합물은 항-IL-6R 항체, 예를 들어, 토실리주맙 (ACTEMRA®) (참고, 예를 들어, WO 1992/019579), 사릴루맙, 보발릴리주맙 (ALX-0061), SA-237, 또는 그것의 변이체이다.
본 발명은 추가로, 상기에 기재된 항체 콘주게이트 중 임의의 것 및 추가의 VEGF 길항제를 포함하는 조성물 (예를 들어, 약제학적 조성물)을 제공한다. .
2. 디바이스
본 명세서에 기재된 항체 (예를 들어, 시스테인 조작된 항-VEGF 항체) 또는 항체 콘주게이트 (예를 들어, 단분산 HA 콘주게이트) 중 임의의 것은 포트 전달 장치를 사용하여 눈에 투여될 수 있다. 포트 전달 장치는 개월 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 그 초과 개월)의 기간에 걸쳐 치료제 (예를 들어, 항-VEGF 항체 콘주게이트)를 방출할 수 있는 이식가능, 보충가능한 디바이스이다. 사용될 수 있는 예시적인 포트 전달 장치는 ForSight Labs, LLC 및/또는 ForSight VISION4 (예를 들어, 국제 특허 출원 공개 번호 WO　2010/088548, WO2015/085234, WO 2013/116061, WO 2012/019176, WO 2013/040247, 및 WO　2012/019047에 기재됨, 이는 본 명세서에 참고로 전체적으로 편입됨)로부터의 것을 포함한다.
예를 들어, 본 발명은 본 명세서에 기재된 항체 또는 항체 콘주게이트 중 임의의 것를 수용하고 있는 저장소를 포함하는 포트 전달 장치를 제공한다. 포트 전달 장치는 추가로, 근위 영역, 저장소와 유체 연통된 근위 영역에 커플링된 관형 바디, 및 저장소와 유체 연통되고 조성물을 눈에 방출하도록 구성된 하나 이상의 배출구를 포함할 수 있다. 관형 바디는 약 0.5 mm 이하의 눈에서 절개 또는 개방을 통해 삽입되도록 구성된 외부 직경을 가질 수 있다. 디바이스는 약 1 mM 내지 약 15 mm의 길이 (예를 들어, 약 1 mm, 약 2 mm, 약 4 mm, 약 5 mm, 약 6 mm, 약 7 mm, 약 9 mm, 약 11 mm, 약 13 mm, 또는 약 15 mm의 길이)일 수 있다. 저장소는 임의의 적합한 용적을 가질 수 있다. 일부 사례에서, 저장소는 약 1 μl 내지 약 100 μl (예를 들어, 약 1 μl, 약 5 μl, 약 10 μl, 약 20 μl, 약 50 μl, 약 75 μl, 또는 약 100 μl)의 용적을 갖는다. 디바이스 또는 그것의 구성 부품은 임의의 적합한 물질, 예를 들어, 폴리이미드로 만들어질 수 있다.
일부 사례에서, 포트 전달 장치는 본 명세서에 기재된 항체 또는 항체 콘주게이트 중 임의의 것 및 하나 이상의 추가의 화합물을 수용하고 있는 저장소를 포함한다. 특정 구현예에서, 추가의 화합물은 하기로 구성된 군으로부터 선택된 제2 생물학적 분자에 결합한다: IL-1β; IL-6; IL-6R; PDGF; 안지오포이에틴; 안지오포이에틴 2; Tie2; S1P; 인테그린 αvβ3, αvβ5, 및 α5β1; 베타셀룰린; 아페린/APJ; 에리트로포이에틴; 보체 인자 D; TNFα; HtrA1; VEGF 수용체; ST-2 수용체; 및 AMD 위험에 유전적으로 연결된 단백질, 예컨대 보체 경로 성분 C2, 인자 B, 인자 H, CFHR3, C3b, C5, C5a, 및 C3a; HtrA1; ARMS2; TIMP3; HLA; IL-8; CX3CR1; TLR3; TLR4; CETP; LIPC; COL10A1; 및 TNFRSF10A. 특정 구현예에서, 추가의 화합물은 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 예를 들어, 일부 사례에서, 추가의 화합물은 이중특이적 항체 (예를 들어, 항-VEGF/항-Ang2 이중특이적 항체, 예컨대 RG-7716 또는 임의의 이중특이적 항-VEGF/항-Ang2 이중특이적 항체 (WO 2010/069532 또는 WO 2016/073157에서 개시됨) 또는 그것의 변이체이다. 또 다른 예에서, 일부 사례에서, 추가의 화합물은 항-IL-6 항체, 예를 들어, EBI-031 (Eleven Biotherapeutics; 참고, 예를 들어, WO 2016/073890), 실툭시맙 (SYLVANT®), 올로키주맙, 클라자키주맙, 시루쿠맙, 엘실리모맙, 게릴림주맙, OPR-003, MEDI-5117, PF-04236921, 또는 그것의 변이체이다. 또 추가의 예에서, 일부 사례에서, 추가의 화합물은 항-IL-6R 항체, 예를 들어, 토실리주맙 (ACTEMRA®) (참고, 예를 들어, WO 1992/019579), 사릴루맙, 보발릴리주맙 (ALX-0061), SA-237, 또는 그것의 변이체이다.
일부 사례에서, 포트 전달 장치는 본 명세서에 기재된 항체 또는 항체 콘주게이트 중 임의의 것 및 추가의 VEGF 길항제를 포함한다.
III. 실시예
하기는 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 상기에 제공된 일반적인 설명이 주어지면, 다양한 다른 구현예들이 실시될 수 있다는 것을 이해해야 한다.
실시예 1: 개선된 안정성을 위해 단분산 HA로부터 제조된 선형 하이알루론산 (HA) 항체 콘주게이트
생고분자 하이알루론산 (HA)에 Fab의 콘주게이션은, 예를 들어, Fab의 확산을 늦춤에 의해 눈에서 Fab의 체류 시간과, 이에 의해, 유리액으로부터 청소능을 상당히 개선시킬 수 있다. HA-Fab 콘주게이트 생산을 위해 2단계 공정이 이용되었다: 첫째, 상업적 HA는 말레이미드 기 (HA-말레이미드)로 변형되고, 두 번째로 Fab-C (시스테인 상의 유리 티올을 갖는 Fab)는 HA-말레이미드와 반응하여 공유 HA-Fab 콘주게이트를 형성한다.
전형적인 수단을 통해 생산될 때, HA-단백질 콘주게이트는 가변성의 2개의 직교 성분을 가질 수 있다. 가변성의 제1 원천은 다분산도이며, 이는 HA 백본의 다분산도에 의해 기여된다 (도 1A). 제2 원천은 불균질성이며, 이는 주어진 HA 사슬에 부착된 Fab 분자의 수에서의 차이에 의해 기여된다. 이 제2 가변성의 원천은 HA 콘주게이션 공정의 제1 단계에서 HA 사슬의 말레이미드 변형의 확률론적 특성에 의해 지시된다. 도 1B는 200 kDa HA 사슬의 각각의 산성기가 1000개 독립적인 HA 사슬에 대해 반복된, 말레이미드-함유 링커와 반응할 5% 확률이 주어진 Monte Carlo 모의실험의 결과를 도시한다. 본 결과는 모의실험 전반에 걸쳐 HA 사슬당 말레이미드의 평균 수가 24.7의 기대된 값이지만 절대 범위는 11 내지 42이었음을 시사한다.
수성상 및 유리액에서 항체 콘주게이트 (예를 들어, 선형 HA 및 항-VEGF 항체 G6.31 AARR을 포함하는 항체 콘주게이트; 본 명세서에서 일명 HA-G6.31.AARR 항체 콘주게이트)의 물리적 및 콜로이드성 안정성을 유지하는 것이 바람직할 수 있다. 위에 기재된 모의실험에 부분적으로 기반하여, HA 백본 분자량 및 Fab 장입 수준은 물리적 안정성에 중요한 파라미터일 수 있는 것으로 간주된다. Fab 장입 수준은 각각의 HA 사슬에 부착된 항체 (예를 들어, G6.31.AARR) 분자의 평균 수를 지칭하고 Fab 모이어티와 공유결합으로 변형된 HA 백본상의 산성기의 퍼센트 관점에서 표시된다 (각각의 HA 반복 단위는 글루쿠론산 당류 상에 하나의 변형가능한 산성기를 함유한다). 다른 파라미터는 콘주게이트 안정성 (예를 들어, 순전하, 표면 전하 분포, 소수성을 포함하는 Fab의 특정한 특성)에 기여할 수 있지만, 이들은 일반적으로 이 특정한 분자의 범위 내로 통제할 수 없다.
HA-G6.31.AARR 물리적 안정성에 대한 HA MW 및 Fab 장입 수준의 영향을 평가하기 위해, 콘주게이트는 3개의 상이한 HA 개시 MW (대략 40 kDa, 200 kDa 및 600 kDa) 및 다양한 Fab 장입 수준으로 준비되었고, 생물학적 노출을 모방하기 위해 생리적 조건하에서 스트레스 받고 몇개월에 걸쳐 물리적 안정성에 대해 모니터링하였다.
(A) 물질 및 방법
(i) 물질
3가지 상이한 분자량의 나트륨 하이알루로네이트 (HA, Lifecore Biomedical, Chaska, MN)가 이 연구에 사용되었다. 굴절률 및 다중-각 광산란 검출기 (SEC-RI-MALS)와 인-라인으로 크기 배제 크로마토그래피에 의해 평가된 그것의 특성이 표 4에 요약되어 있다. Mn은 수평균 분자량을 나타내고; Mw는 중량평균 분자량을 나타내고; PDI는 다분산도 지수를 나타내고; RH는 유체역학적 반경을 나타낸다. 표 5는 SEC-RI-MALS에 의해 결정된 단분산 샘플과 비교한 다양한 다분산 HA 샘플의 Mn, Mw 및 PDI에 대한 데이터를 나타낸다. 표 4 및 5로부터의 데이터는 상이한 다분산도를 갖는 2개의 상이한 HA-200K의 로트로부터의 것이다.
Figure pct00007
(ii) 말레이미드 - 작용화된 HA (HA- mal )의 합성
HA는 커플링 시약 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모폴리늄 염화물 (DMTMM) 및 링커 N-(2-아미노에틸)말레이미드 트리플루오로아세테이트 염 (AEM)과의 수성 반응을 사용하여 말레이미드 기로 변형되었다. HA는 2.5 mg/mL로 100 mM 2-(N-모폴리노)에탄설폰산 (MES) (pH 5.5)에 용해시키고 이 용액에 DMTMM 및 AEM을 교반하에서 첨가하였다. 첨가된 DMTMM 및 AEM의 양은 다양하였고, 2 내지 10% 범위인 상이한 수준의 말레이미드 작용화를 표적으로하도록 선택되었다. 반응물은 2시간 동안 70℃로 가열하였다.
과잉 AEM 및 DMTMM은 탈염 절차를 통해 반응물로부터 제거하였다. HIPREPTM 26/10 탈염 컬럼을
Figure pct00008
KTA™ 정제 시스템 (GE Life Sciences)에 장착하고 10 mM 아세트산 나트륨 (pH 4.0) 150 mM NaCl로 평형화시켰다. 반응물을 컬럼 상에 순수하게 주입하고, HA-mal 피크를 302 nm에서의 흡광도에 따라 수집하고 원심 한외여과 디바이스를 사용하여 5 mg/mL 초과로 농축시켰다. HA-mal 모액에서 말레이미드 농도는 UV-가시광 분광측정기를 사용하여 302 nm에서의 흡광도에 의해 측정되었고, HA 사슬당 말레이미드 기의 몰비는 다중-각 광산란 (SEC-MALS)을 갖는 크기 배제 크로마토그래피를 통해 평가되었다.
(iii) HA-mal에 Fab-C의 콘주게이션
Fab-C의 용액은 1M 포스페이트 (pH 6.5)를 사용하여 50 mM의 최종 포스페이트 농도로 pH가 6.5로 조정되고 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)은 2.5 mM의 최종 농도로 스파이킹되었다. Fab-C 용액을 교반하고 여기에 10 mM 포스페이트 (pH 6.5), 150 mM NaCl 및 2.5 mM EDTA로 구성된 반응 완충액에 희석된 HA-mal을 첨가하였다. 화학양론은 최종 반응에서 말레이미드의 몰당 1.2 몰의 Fab-C로 설정하고, 용적은 최종 단백질 농도가 1㎎/mL가 되도록 설정하였다. 콘주게이션 반응은 교반하에 실온에서 수행되었다. 3 시간에서, 머캅토에탄올을 말레이미드의 몰당 2 몰로 첨가하여 미반응 말레이미드 기를 캡핑하였다. 30분 후, 반응물을 10 mM 포스페이트 (pH 6.5)로 50 mM NaCl 미만으로 희석하였다.
정제는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 사용하여 수행되어 콘주게이트로부터 유리 Fab-C 및 Fab 이량체를 분리하였다. HILOAD® 26/600 SUPERDEX® 200 pg 칼럼 (GE Healthcare)을 10 mM HisHCl (pH 5.5) 150 mM NaCl로 평형화하고 반응물을 깔끔하게 주입하였다. 콘주게이트, Fab 이량체, 및 Fab 단량체와 연관된 피크는 별도로 용출되었고 콘주게이트 피크가 수집되었다.
(iv) SEC-RI-MALS에 의한 HA-Fab 콘주게이트의 분석
잔존 유리 Fab 함량, 총 콘주게이트 몰 질량, 및 단백질 질량 분율이 인-라인으로 Wyatt OPTILAB® T-rEX™ 굴절률 (RI) 검출기 및 Wyatt HELEOS™-II 다중-각 광산란 (MALS) 검출기를 갖는 Agilent 1200 HPLC 상에서 SEC-RI-MALS-QELS (크기 배제 크로마토그래피 (SEC), 굴절률 (RI) 다중-각 광산란 (MALS), 및 준-탄성 광산란 (QELS)의 조합)에 의해 평가되었다. SEC의 경우, 2개 칼럼이 직렬식으로 실행되었다: 작동 완충제로 포스페이트 완충 식염수 (PBS) (pH 7.4)를 갖는 ACCLAIM™ 7.8x150 mm 1000 Å 기공 크기 이어서 ACCLAIM™ 7.8x150 mm 300 Å 기공 크기. 소과 혈청 알부민 (BSA) 대조군을 사용하여 MALS 검출기를 정규화하고 검출기 사이의 밴드 확대를 교정하였다. 유리 Fab 함량은 Fab 및 HA-Fab 콘주게이트에 상응하는 UV A280 피크를 통합함으로써 측정되었다. 콘주게이트 몰 질량은 콘주게이트 피크의 중량평균 분자량 (Mw)으로 취해졌다. 단백질 질량 분획은 시차 굴절률 (dRI) 및 UV A280 신호를 사용하여 단백질 콘주게이트 분석을 사용하여 계산되었다.
(v) HA-G6.31.AARR 콘주게이트 생리적 스트레스 및 분석
정제된 콘주게이트는 PBS로 완충액 교환되고 2 mM 아지드화 나트륨 및 0.01% 폴리소르베이트 20 (PBSTN)으로 스파이킹되었다. 최종 농도는 Fab 기준으로 대략 5 mg/mL였다. 샘플을 밀봉하고 37℃에서 인큐베이션하였다. 이 상태는 유리액의 대리로 역할을 한다 (유리체의 pH, 온도 및 이온 강도를 모방함). 5 mg/mL 농도는 유리체에서의 침전 경향을 평가하기 위한 "스트레스성" 농도를 나타낸다 (4 mL 인간 유리체에서 2 mg 용량은 0.5 mg/mL Fab와 동등함). 명시된 시점에서, 샘플을 회수하고, 0.01% 폴리소르베이트 20 및 10% (w/v) 트레할로스로 10 mM HisHCl (pH 5.5)에서 1 mg/mL로 희석하고, 가용성 단백질 농도 (A280), 탁도 (A450), SEC 체류 시간, 및 분자량 (상기와 같이 SEC-RI-MALS에 의한 Mn 및 Mw)에 대해 분석하였다.
(B) 결과
(i) 물질의 특성 규명
표 6은 이 연구에 사용된 9개 콘주게이트의 SEC-RI-MALS 특성규명 결과를 열거한다. 콘주게이트는 HA 백본 MW (40 kDa, 200 kDa 또는 600 kDa) 및 Fab 장입 수준 둘 모두에서 상이하다. 샘플 명칭은 HA 백본 MW (kDA)와 이어서 Fab 장입 수준 (%)으로 주어진다.
Figure pct00009
HA-G6.31.AARR 콘주게이트의 다분산도는 SEC-RI-MALS를 사용하여 실험적으로 평가되었다 (도 1C). 다분산도 지수는 HA40K, HA200K, 및 HA600K 콘주게이트에 대해 각각 1.58, 1.78, 및 1.41이었다.
(ii) 생리적 스트레스하에서 콘주게이트 안정성
생리적 스트레스 상태하에서, 일부 HA-G6.31.AARR 콘주게이트는 PBSTN에서 연장된 인큐베이션에 걸쳐 상당한 물리적 변화를 보였다. 이 변화는 도 2에서 나타낸 바와 같이 시간에 따른 평균 분자량 (Mw, 중량평균 분자량)에서의 전이에 의해 가장 분명하게 입증된다. 일부 샘플은 12-주간의 연구에 걸쳐 Mw에서 변하지 않았지만, 모든 실행된 것들은 경시적으로 Mw에서의 감소를 나타냈다. Mw 감소의 정도는 HA 백본 분자량 및 Fab 장입 수준 둘 모두에 의존적이었다. 일반적으로, HA 분자량 및 Fab 장입이 더 높은 샘플에서 침전이 발생하는 것으로 관측되었다.
이 Mw 전이를 이해하기 위해, 인큐베이션된 HA-G6.31.AARR 콘주게이트의 SEC 체류 프로파일의 분석을 수행하였다. 인큐베이션이 연장되면 SEC 체류 시간이 이후로 이동하여, 콘주게이트의 평균 모집단이 시간이 지남에 따라 점진적으로 더 작아지고 있음을 나타낸다 (도 3). SEC 체류 시간은 전적으로 백본 HA 분자량 (Fab 장입에 의해서가 아님)에 의해 정의되기 때문에, 이 관찰은: (a) 콘주게이트 분자의 전체 모집단이 경시적으로 더 작아지거나, 또는 (b) 더 높은 분자량 부분 모집단이 용액으로부터 침전되어, 더 작은 콘주게이트로 명백한 전이를 초래하였다는 것 중 어느 하나를 나타냈다. 이들 데이터는 또한 표 7에 요약되어 있으며, 여기서 연구 시작 (T0) 및 12주째에서 체류 시간 간의 차이가 도시되어 있다.
Figure pct00010
SEC 및 MALS에 의해 측정된 이들 변화는 더 높은 HA 백본 분자량 및 더 높은 Fab 장입 샘플이 이후 시점에서 가시적 침전물을 함유한다는 시각적 관찰에 의해 평행화되었다. 이 관찰은 SEC 체류 프로파일에서 관찰된 전이, 즉 HA의 더 높은 분자량 부분 모집단이 침전되어 용액에 남아있는 평균 모집단에서의 전이를 초래한다는 후자의 설명을 뒷받침한다
추가로 이 가설을 뒷받침하는 것은 도 4에서 나타낸 바와 같이 분자량에 대한 HA-G6.31.AARR 콘주게이트의 분포를 검사하는 SEC-RI-MALS 데이터의 재분석이다. 40K HA 백본 샘플 (좌측 패널)의 경우, 분자량에 대한 콘주게이트 분자의 전체적인 분포는 생리적 병태에 장기간 노출되었을 때 현저히 변화하지 않았다. 600K HA 백본 샘플 (우측 패널)의 경우, 모든 모집단 분획이 더 작은 분자량으로 연속적 전이하여, 콘주게이트 분자의 넓은 모집단이 용액에서 침전되었음을 나타낸다. 200K HA 백본 샘플 (중심 패널)의 경우, 모집단 분획에서의 전이는 주로 더 높은 분자량 콘주게이트 분자에서 발생했다. 이는 200K HA 백본 샘플에서 상대적으로 안정한 및 불안정한 콘주게이트 분자의 혼합된 모집단이 있었음을 나타낸다. 시간이 지남에 따라, 더 높은 분자량 콘주게이트 분자 (상대적으로 불안정한 부분 모집단)가 용액으로부터 침전되어, 상대적으로 안정한 부분 모집단 만이 용액에 남게 된다.
(iii) 단분산 HA 콘주게이트
다분산 HA200K-G6.31.AARR 모집단 내에서 단지 더 높은 MW 모집단만이 물리적 불안정성과 침전를 이끌고 있다는 이해에 기초하여, 본 발명자들은 다분산 HA 백본에서 단분산 HA 백본으로의 스위칭은 보다 안정한 항체 콘주게이트를 초래할 수 있다는 것을 가정하였다.
표준 상업적으로 이용가능한 HA는 다음과 같은 다단계 공정으로 생산된다: (a) HA는 극도로 높은 MW HA (Mw 1-4 MDa)를 초래하는 박테리아 발효에 의해 합성되고, (b) HA는 세포 배양물로부터 정제되고. 그리고 (c) HA는 HA 분자의 무작위 절단을 초래하는 제어된 방식으로 화학적으로 분해된다. 이 공정의 최종 단계는 발효 단독으로는 달리 실행가능하지 않은 저 분자량 HA의 생성에 중요하다. 그러나, 무작위 절단 열화 공정은 또한 HA 분자량의 넓은 (즉, 다분산) 분포를 초래한다.
HA는 또한 동조화된 화학-효소 과정을 통해 상업적 규모로 합성될 수 있다 (본 명세서에 전체적으로 참고로 편입되는, Jing 등 J. Biol . Chem . 279:42345-42349, 2004; Jing 등 Anal. Biochem . 355:183-188, 2006; 및 미국 특허 번호 8,088,604 참고). 이 공정에서, 정제된 하이알루로난 합성효소 효소는 작은 HA 올리고당 (전형적으로 HA 사량체, HA4) 및 우리딘 디포스페이트 (UDP) 당류 UDP-글루쿠론산 및 UDP-N-아세틸글루코사민의 혼합물에 첨가된다. 하이알루로난 합성효소 효소는 HA의 동조화된 중합을 초래하는 교대 방식에 이용가능한 당류를 사용하여 올리고당 단편을 신장시킨다. 얻어진 HA 폴리머의 분자량은 개시 반응에서 HA 기질 (예를 들어 HA4) 대 당류의 비에 의해 제어될 수 있다. 이 공정의 결과는 고도로 단분산 HA 폴리머이다.
비교하기 위해, 유사한 크기의 다분산 및 단분산 상업적 HA의 SEC-RI-MALS 특성규명이 도 5에 비교되어 있다. 가장 주목할만한 것은 다분산도 지수에서의 차이로, 다분산 HA200K의 경우 1.779이고 단분산 HA150K의 경우 1.001이었다. 단분산 HA에 대한 다분산도의 이 낮은 수준은 HA-단백질 콘주게이트의 관점에서 몇 가지 주요 이점을 제공하는 것으로 간주된다: (a) HA 다분산도의 제거는 샘플에서 불균질성의 유일한 원천으로 단백질 장입 수준의 차이를 남기기 때문에 보다 용이한 분석적 특성규명; (b) 전체적인 모집단에서 저 분자량 및 고 분자량 HA 백본의 제거, 이는 HA-G6.31.AARR 콘주게이트 내의 고 분자량 HA 백본 부분모집단에서 관찰되는 불안정성 및 침전을 제거할 수 있음; 및 (c) 제형화된 HA-항체 콘주게이트의 점도의 잠재적 감소.
G6.31.AARR 콘주게이트를 제조하기 위하여 다분산 및 단분산 HA 개시 물질을 사용하는 맥락에서, 다분산도에서 동일한 차이가 관측되었다: 다분산 HA200K-G6.31.AARR은 1.228의 다분산도 지수를 가졌고 반면에 단분산 HA150K-G6.31.AARR은 1.003의 다분산도 지수를 가졌다 (도 6). 이 단분산도는 다분산 HA-G6.31.AARR 콘주게이트의 생리적 스트레스 하에서 관측된 불안정성 및 침전을 담당하는 것으로 추정되는, 더 높은 HA 백본 분자량 부분모집단의 부재에 기인하여 HA-G6.31.AARR 콘주게이트 안정성을 개선시킬 것으로 기대된다.
실시예 2: 선형 HA 항체 콘주게이트에 대한 최적화된 Fab 장입 및 시스테인-조작된 부위
폴리머 스캐폴드에 대한 단클론성 항체 (mAb) 또는 항체 단편 (Fab)의 공유 콘주게이션은 아민 화학 (용매-접근가능한 라이신 잔기를 통한 직접적인 아미드화)으로부터 기질-인식 효소 예컨대 트랜스루타미나제를 사용한 화학-효소적 콘주게이션에 이르는 다양한 화학을 통하여 수행될 수 있다. 최근에, 티올-말레이미드 콘주게이션 화학이 상당한 관심을 얻었는데, 이는 이것이 다른 접근법에 비해 하기와 같은 몇개의 주요 이점을 제공하기 때문이다: (a) 이것은 부위-선택적으로, 감소된 용매-접근가능한 시스테인 잔기에만 반응하고, (b) 이것은 극도로 신속한 반응이고, (c) 말레이미드-함유 링커는 쉽게 이용가능하고 전형적으로 합성으로 쉽게 접근될 수 있으며, (d) 시스테인 잔기는 전형적으로 단백질 구조에 쉽게 편입될 수 있고, 그리고 (e) 티올-말레이미드 콘주게이션은 수성 조건에서 중성 pH 근처에서 수행될 수 있다.
말레이미드 콘주게이션에 잘받아들이는 Fab를 생성하기 위해, 하나의 전략은 중쇄 서열이 힌지 펩타이드를 통해 제1 및 제2 힌지 디설파이드 시스테인 위치 중 어느 하나로 연장되고 그 시스테인 잔기에서 절단되는 Fab-C를 생성하는 것이다 (도 7). 실제로, 이 접근법은 폴리머 스캐폴드에 대한 콘주게이션에 영향을 미치는 다수의 합병증을 잠재적으로 도입할 수 있다. 사슬간 디설파이드 결합에 이 유리 시스테인 잔기의 공간적 근접의 주요 결과는 티올 스크램블링이며, 여기서 이들 3개의 근처 시스테인 잔기는 3개의 가능한 디설파이드 배치형태를 형성할 수 있다. 3개의 가능한 디설파이드 배치형태는 도 8A-8C에 도식적으로 예시되어 있다. 각각의 배치형태에서, 상이한 시스테인 잔기가 감소되어, 말레이미드-함유 폴리머 백본에 대한 콘주게이션의 잠재적 부위를 만든다. 이것의 결과는 Fab와 HA 백본 사이의 부착 부위에서의 불균질성이며, 이는 접합된 물질의 생성물 품질, Fab 안정성 또는 안전성의 관점에서 결과를 초래할 수 있다.
본 발명자들은 유연한 공간적으로 근위 힌지 서열로부터 Fab 상의 추가의 표면 위치로 유리 시스테인 잔기를 재배치하는 것은 이들 콘주게이션 변이체를 줄이거나 제거할 수 있다고 가정했다. 이 접근법은 본질적으로 THIOMAB™ 시스테인 조작된 단클론성 항체에 의해 이용된 것과 유사하며, 여기서 표면 잔기는 나중의 콘주게이션을 위해 시스테인으로 돌연변이된다. Fab 형식에서, 본 발명자들은 표면-돌연변이된 시스테인-함유 Fab를 "ThioFab"로 지칭한다.
티올-말레이미드 화학을 사용하여 생산된 단백질-폴리머 콘주게이트는 또한 역-마이클 첨가 반응을 통해 폴리머 백본으로부터 단백질의 디콘주게이션을 겪을 수 있다. 이것은 pH- 및 온도-의존 방식으로 폴리머 백본으로부터 유리 단백질의 느린 방출을 초래할 수있다. 이 거동은 또한 시스테인 잔기 주변의 국소 화학적 환경 및 말레이미드-함유 링커의 구조 (예를 들어, 전자를 끄는 기 또는 아민의 존재)에 의해 영향을 받는다. THIOMAB™ 개발에서 상이한 시스테인 위치의 역-마이클 감수성에 대한 발견 (Shen 등 Nat. Biotechnol. 30:184-189, 2012 참조)에 기반하여, 본 발명자들은 유리 시스테인을 힌지 펩타이드에서 표면 위치로 이동시키는 것은 폴리머 백본으로부터 역-마이클 유리 Fab 방출 속도를 감소시킬 것이다는 것을 또한 예상했다. 본 발명자들은 또한 생리적 조건하에서 Fab-C 및 ThioFab 형식 분자에 모델 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-말레이미드 폴리머의 역-마이클 디콘주게이션의 속도를 조사했다.
(A) 물질 및 방법
(i) 물질
Lys-C 효소는 Promega (카탈로그 # V1671, Madison, WI)로부터 구매하였고, 하이알로니다제 (재조합 인간 PH20, 또한 일명 HAase) 효소는 Halozyme (San Diego, CA)으로부터 구매하였고, N-에틸말레이미드 (NEM)는 Sigma Aldrich (St. Louis, MO)로부터 구매했다. 정의된 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 말레이미드 (d-mPEG4-Mal, 파트 # 10745)는 Quanta Biodesign(Plain City, OH)으로부터 구매했다.
(ii) G6.31.AARR.Fab-C의 제한된 Lys-C 소화
제한된 Lys-C 소화는 G6.31.AARR.Fab-C 샘플 상에서 수행되었다. 단백질의 보다 전통적 Lys-C 소화에 비교하여, "제한된" Lys-C 소화는 감소된 양의 Lys-C 효소로 비-변성 조건하에서 수행된다. 이것은 G6.31.AARR.Fab-C 분자 (KTHTC (서열번호: 61))의 힌지 펩타이드 부분의 선택적 소화를 초래하여, 라이신 잔기 후에 절단된다. 상이한 조건: (a) +NEM, -소화, (b) +NEM +소화, (c) -NEM, +소화, 및 (d) -NEM, -소화로 시험된 G6.31.AARR.Fab-C의 4가지 샘플이 있다.
각각의 샘플에 대해, 500μL의 10 mM 히스티딘-아세테이트 + 150 mM 염화나트륨 (pH 5.5) 내 500μg Fab-C에 50μl의 1M Tris + 10 mM NEM (pH 7.5)을 첨가하였다; NEM은 -NEM 샘플에 대해 생략되었다. 샘플은 임의의 유리 티올을 캡핑하기 위해 37℃에서 30분 동안 인큐베이션되었다. Lys-C 효소는 그런 다음 +Lys-C 샘플에 1:500 Lys-C:Fab-C의 질량비로 첨가되었다. 샘플은 37℃에서 30분 동안 인큐베이션되었다. 소화 후, 샘플을 냉동시켜 반응을 중단시키고 RP-UPLC-TOF에 의해 분석하였다.
(iii) HA200K-G6.31.AARR의 제한된 Lys-C 소화
500μL의 10 mM 히스티딘-아세테이트 + 150 mM 염화나트륨 완충액 (pH 5.5) 내 500μg (단백질 기준)의 HA200K-G6.31.AARR에 50μL의 1M Tris (pH 7.5)를 첨가하였다. Lys-C 효소는 1:500 Lys-C:Fab-C의 질량 비로 첨가하였다. 샘플은 37℃에서 밤새 인큐베이션되었다. 소화 후, 샘플을 냉동시켜 반응을 중단시키고 RP-UPLC-TOF에 의해 분석하였다.
(iv) HA200K-G6.31.AARR의 하이알로니다제 소화
500μg (단백질 기준)의 HA200K-G6.31.AARR을 500μL의 10 mM 히스티딘-아세테이트 + 150 mM 염화나트륨 (pH 5.5)에서 희석하였다. HAase를 콘주게이트 내 1μg HA당 10 단위 (U)로 첨가하였다. 반응 혼합물은 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션되었다. 소화 후, 샘플을 냉동시켜 반응을 중단시키고 RP-UPLC-TOF에 의해 분석하였다.
(v) 모델 G6.31.AARR-PEG 콘주게이트의 역-마이클-매개된 디콘주게이션
G6.31.AARR.Fab-C, G6.31.AARR.A140C, G6.31.AARR.L174C, 및 G6.31.AARR.K149C가 0.2 내지 0.5 mg/mL 사이에서 10 mM 포스페이트(pH 6.5) 150 mM NaCl 2.5 mM EDTA로 완충액 교환되고 d-mPEG4-Mal이 20-배 몰 과잉으로 첨가되었다. 반응은 실온에서 2시간 동안 인큐베이션되고 이어서 PD-10 칼럼 (GE Healthcare, Pittsburgh, PA) 상에서 PBS (pH 7.4) 안으로 탈염에 의해 정제되었다. 콘주게이트는 그런 다음 원심 한외여과에 의해 1 mg/mL로 농축되고 2 mM의 최종 농도로 산화된 글루타티온 (GSSG)으로 스파이킹되었다. 작제물은 37℃에서 인큐베이션되고 샘플은 RP-UPLC-TOF에 의한 분석을 위해 주기적으로 뽑아졌다.
(vi) 역상 초고성능 액체 크로마토그래피 비과 시간 (RP- UPLC - TOF ) 질량 분광분석법 (MS) 분석
샘플의 온전한 질량은 Agilent 1290 초고성능 액체 크로마토그래피 (UPLC) 시스템과 인라인으로 Agilent 6230 전기분무 이온화 (ESI)-비과 시간 (TOF) 질량 분광분석기를 사용하여 액체 크로마토그래피-질량 분광분석법 (LC/MS) 분석에 의하여 수득되었다. 대략 2.5μg의 단백질이 샘플당 주입되었고 직접적인 온라인 MS 분석을 위해 역상 초고성능 액체 크로마토그래피 (RP-UPLC)에 의해 탈염되었다. 수득한 스펙트럼은 MassHunter 워크스테이션 소프트웨어/정성적 분석 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA)을 사용하여 제로-전하 상태로 디콘볼류션되었다.
(B) 결과
(i) G6.31.AARR.Fab-C에서 디설파이드 상태
도 8A-8C에 도시된 3개의 디설파이드 상태가 G6.31.AARR.Fab-C에 존재하고 동적 열역학적 평형으로 유지되는지 여부를 확인하기 위해, 본 발명자들은 NEM과 제한된 Lys-C 소화를 사용한 말레이미드 캡핑을 사용하여 일련의 실험을 수행하여 3개의 시스테인 잔기의 즉각적인 상태 및 동적으로 재배열하는 그것의 능력 둘 모두를 입증했다.
제1 실험에서, G6.31.AARR.Fab-C는 (임의의 유리 티올의 제거에 기인하여 디설파이드 상태를 동결하는) NEM으로 캡핑되고 그 다음 제한된 Lys-C 소화를 거쳐, 의도된 유리 시스테인 잔기 전에 중쇄 힌지 펩타이드 서열을 단리한다 (도 9, 제2 크로마토그램). RP-UPLC-TOF 상에서 변성 분석시, 도 8A-8C에 제시된 3개의 디설파이드 상태와 연관된 종이 관측되었다: (a) 온전한 Fab 마이너스 힌지 펩타이드 (도 8A와 연관됨); (b) 경쇄 플러스 NEM 및 고리화된 중쇄 (도 8B와 연관됨); 및 (c) 경쇄 플러스 힌지 펩타이드 및 중쇄 마이너스 힌지 펩타이드 플러스 NEM (도 8C와 연관됨). 이 실험은 G6.31.AARR.Fab-C가 균질한 상태로 존재하지 않지만 상이한 디설파이드 배치형태 및 결과적으로 반응성 시스테인 잔기를 갖는 3개의 별개의 종을 함유함을 구체적으로 실증하였다.
제2 실험에서, G6.31.AARR.Fab-C는 NEM 캡핑 없이 제한된 Lys-C 소화를 거쳐, 시스테인이 동적으로 재배열할 가능성을 남겼다 (도 9, 제3 크로마토그램). 이 실험에서, 거의 모든 RP-UPLC-TOF 분석된 단백질은 동일한 상태로 되었다: Fab 마이너스 힌지 펩타이드. 제1 실험의 결과를 감안할 때, 이 제2 데이터 세트는 3개의 유리 시스테인이 동적으로 그리고 상대적으로 빠른 시간-척도 (30분 실험 기간)로 재배열되었음을 나타낸다. Lys-C에 의한 힌지 펩타이드의 절단 후, 3개의 가능한 디설파이드 상태는 3개의 시스테인 잔기 사이에서 동적으로 "스크램블"된다. 일부 시점에서 정확한 사슬간 디설파이드이 형성되면, 힌지 펩타이드 서열은 Lys-C에 의해 이전에 절단되기 때문에 용액으로 방출되도록 남겨진다. 결과는 이 재배열 과정을 통해 샘플이 완전한 정확하게-형성된 사슬간 디설파이드를 향하여 유도된다는 것이다.
이들 두 실험은 G6.31.AARR.Fab-C가 3개의 근위 시스테인 잔기에 관하여 3개의 별개의 상태로 존재할 수 있고 그것의 상대 존재비는 동적 열역학적 평형에 의해 정의된다는 것을 확인했다. 이 후자의 발견은 재처리 단계가 2개의 부정확한 디설파이드 배치형태를 완전히 제거할 수 없다는 것을 나타내기 때문에 중요한데, 이는 임의의 짧은 기간이 주어지면 3개의 시스테인이 제1 실험에서 관찰된 3개의 변이체를 형성하도록 재-스크램블링할 것이기 때문이다.
(ii) HA-G6.31.AARR.Fab-C 콘주게이트에서 콘주게이션 변이체
이들 3개의 디설파이드 변이체는 G6.31.AARR.Fab-C에 존재하지만, 이들은 HA-G6.31.AARR 콘주게이트에 변이체로서 또한 존재한다는 것을 보여주었다. HA-말레이미드에 대한 개별 G6.31.AARR.Fab-C 분자의 콘주게이션의 정확한 위치를 밝히기 위해, 본 발명자들은 2가지 효소소화 절차를 사용했다. 첫번째, 제한된 Lys-C 소화는 의도된 유리 중쇄 시스테인 잔기에 선행하는 힌지 펩타이드에서 G6.31.AARR을 절단하였다. 정확하게 접합된 G6.31.AARR 분자에서, 이 처리는 유리 온전한 G6.31.AARR을 용액안으로 방출해야 한다. 그러나, RP-UPLC-TOF를 변성함에 의한 소화된 샘플의 분석은 용액에서 추가의 종: 유리 경쇄 플러스 절단된 힌지 펩타이드를 확인하였다 (도 10A). 이 종의 존재는 G6.31.AARR.Fab-C의 모집단이 사슬간 디설파이드에 의해 정상적으로 점유된 중쇄 시스테인을 통해 HA에 접합되었음을 확인하였으며, 짐작컨대 이는 도 8C에 도시된 디설파이드 변이체로부터 유래된 것이다.
제2 효소 소화 절차는 모든 콘주게이션을 그대로 유지했지만, 하이알로니다제 (HAase)를 사용하여 HA 백본을 소모적으로 소화시켰다. 이는 용액 중의 유리 분자의 분석뿐만 아니라 공유결합된 작은 HA 올리고당을 갖는 접합된 단백질을 허용 하였다. 이 방법은 개별 수준에서 접합된 종의 직접적인 관찰을 허용하였다. 이 실험에서, 의도된 중쇄 말단 시스테인을 통해 HA에 정확하게 접합된 G6.31.AARR 분자가 관측되었다; 그러나, 도 8B에 묘사된 디설파이드 변이체를 통한 콘주게이션의 직접적인 증거가 또한 발견되었다. 이것은 2가지 관찰에 의해 지지되었다: (a) 용액에 유리 고리화된 중쇄 분자의 존재; 및 (b) 공유결합된 말레이미드 링커 플러스 경쇄를 갖는 HA 올리고당의 존재 (도 10B). 이들 종의 존재는 G6.31.AARR.Fab-C의 모집단이 사슬간 디설파이드에 의해 정상적으로 점유된 경쇄 시스테인을 통해 HA에 접합되었음을 확인하였으며, 짐작컨대 이는 도 8B에 묘사된 디설파이드 변이체로부터 유래된 것이다.
이들 두 소화 실험은 디설파이드 재배열이 G6.31.AARR.Fab-C 및 HA-말레이미드 사이의 부착 부위에 변동으로 이어진다는 것을 확인했다. 이 관찰은 콘주게이션에 사용된 임의의 말레이미드-함유 폴리머 백본 및 3개의 시스테인 잔기의 이 배치형태를 근접하게 함유하는 임의의 Fab-C에 적용될 것으로 기대된다.
(iii) 보다 균질한 콘주게이션을 위한 유리 시스테인-함유 Fab 설계
위에 기재된 데이터는 Fab-C 분자를 말레이미드-함유 폴리머 백본에 부착할 때 3개의 콘주게이션 변이체가 존재함을 나타낸다. 이 콘주게이션 불균일성은 열역학적 평형에서 3개의 별개의 디설파이드 배치형태의 존재에 의해 야기되며, 각각의 배치형태는 콘주게이션에 영향을 미치는 상이한 시스테인 잔기를 남긴다. 이들 3개의 디설파이드 배치형태가 가능하다는 것은 의도된 유리 힌지 시스테인 잔기의 사슬간 디설파이드에의 근접성 및 유리 시스테인이 부착된 힌지 펩타이드 서열의 가요성을 포함하는 몇개의 인자에 의해 영향을 받을 수 있다.
사슬간 디설파이드와 유리 시스테인이 스크램블하는 것을 피하기 위해, 본 발명자들은 사슬간 디설파이드로부터 자유 시스테인을 더 멀리 이동시키는 것을 구상했다. 따라서, 본 발명자들은 표준 Fab 형식 분자에 대해 전형적인 힌지 서열 및 시스테인 잔기에 대해 Fab의 돌연변이된 표면 잔기를 절단하였다. 상기 부위는 이들이 항원 결합에 부정적인 영향을 미치지 않도록 HVR로부터 충분히 떨어져 있고 스크램블링을 방지하기 위해 사슬간 디설파이드로부터 충분히 떨어지도록 선택되었다.
초기 스크리닝 연구의 경우, 이들 기준을 충족하기 위해 THIOMAB™ 개발로부터 이전의 보고서를 기반으로 3개 위치가 선택되었다: LC-K149 (EU 넘버링), HC-A140 (EU 넘버링), 및 HC-L174 (EU 넘버링). 각각의 부위는 시스테인 잔기에 대해 돌연변이되고 힌지 펩타이드는 제1 힌지 디설파이드 시스테인 직전에 종결되었다 (즉, KTHT; 서열번호: 87).
이들 시스테인 부위가 여전히 HA-말레이미드에 반응성임을 확인하기 위해, 본 발명자들은 전형적인 조건 (10 mM 포스페이트 (pH 6.5), 150 mM NaCl 및 2.5 mM EDTA)에서 파일럿 콘주게이션을 수행하고, 밤새 인큐베이션 후 SEC-RI-MALS에 의해 생성물을 평가하였다. 콘주게이션은 G6.31.AARR.Fab-C 콘주게이션 반응 대조군와 비교하여 정확한 체류 시간에서 HA-G6.31.AARR 콘주게이트의 생성으로 정상적으로 진행되었다 (도 11). ThioFab 샘플에서 언급된 유일한 주요 차이는 콘주게이트로 Fab의 낮은 전환율이었다. 이것은 콘주게이션 반응의 상대적으로 낮은 pH (pH 6.5)에 의해 야기될 수 있으며, 이는 ThioFab 조작된 시스테인 잔기의 것에 비교해 힌지 시스테인의 pKa에 더 적합할 수 있다. 콘주게이션 반응의 pH를 증가시키면 ThioFab 콘주게이션에 대한 수율이 개선될 것으로 기대된다.
(iv) Fab-C 및 ThioFab 포맷의 역-마이클 첨가 감수성
Fab-C 및 ThioFab 포맷에서의 G6.31.AARR을 PEG-말레이미드 작제물을 모델화하기 위해 접합시키고, 유리 티올 트랩으로서 작용하기 위해 GSSG와 함께 37℃에서 PBS에서 인큐베이션하고 (즉, PEG-말레이미드로 방출된 유리 티올의 역-마이클 첨가를 예방) 이어서 RP-UPLC-TOF에 의한 주기적인 분석을 하였다. Fab-C-PEG 구축물에서, 최초 7일에 걸쳐 상당한 역-마이클 디콘주게이션이 관측되어, 온전한 콘주게이트의 9.8% 손실이 발생하였다 (도 12). ThioFab 콘주게이트는 14일 동안 거의 디콘주게이션을 나타내지 않는 A140C 변이체, 동일한 기간에 걸쳐 5.9% 디콘주게이션을 나타내는 L174C 및 7.1% 디콘주게이션을 나타내는 K149C 변이체로 Fab-C에 비해 다양한 수준의 개선을 나타냈다. 이들 데이터는 시스테인 돌연변이 변이체가 역-마이클-매개된 단백질 디콘주게이션에 대해 보호성일 수 있고 온전한 단백질-폴리머 콘주게이트를 유지하는데 있어 Fab-C 형식에 비해 상당한 이점을 제공할 수 있음을 시사한다.
실시예 3: 본 발명의 항체 콘주게이트에 사용하기 위한 예시적인 항- VEGF 항체
본 명세서에서 기재된 임의의 항-VEGF 항체가 실시예 1 및 2에 기재된 바와 같은 항체 콘주게이트를 제조하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 국제 특허 출원 번호 PCT/US2016/053454에 기재된 임의의 항-VEGF 항체가 사용될 수 있다. 표 8은 사용될 수있는 예시적인 항-VEGF 항체뿐만 아니라 각각의 항체에 대한 VH 및 VL 도메인의 아미노산 서열을 기술한다. 표 9는 표 8에 기재된 항-VEGF 항체에 대한 VL HVR 아미노산 서열을 기술한다. 표 10은 표 8에 기재된 항-VEGF 항체에 대한 VH HVR 아미노산 서열을 기술한다. 특정 구현예에서, 항-VEGF 항체 G6.31 AARR (또한 본 명세서에서 일명 "G6.31.AARR")이 사용된다.
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
상기에 열거된 임의의 항체, 예를 들어 G6.31 AARR의 Fab 중쇄의 상부 힌지 영역은 돌연변이되어 문헌에 보고된 항-IgG1 힌지 자가항체에 대한 반응성을 제거할 수 있다. 예를 들어, Brezski 등 ,J. Immunol . 181:3183-3192, 2008 및 Brezski 등, mAbs 2:3, 212-220, 2010 참고. 따라서, G6.31 AARR 중쇄의 C-말단 아미노산은 T (야생형 (WT) 버전) 또는 L (항-인간 IgG Fab에 대한 반응성이 결여된 변이체 버전) 중 어느 하나일 수 있다. 야생형 G6.31 AARR의 전장 중쇄 아미노산 서열은 서열번호:48이다. 항-인간 IgG Fab에 대한 반응성이 결여된 변이체 버전의 전장 중쇄 아미노산 서열은 서열번호:49이다. G6.31 AARR 및 항-인간 IgG Fab에 대한 반응성이 결여된 변이체 버전 둘 모두에 대한 전장 경쇄 아미노산 서열은 서열번호:50이다.
G6.31.AARR.LC-K149C 시스테인 조작된 항체 변이체 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열은 하기에 나타나 있다 (LC-C149는 굵고 밑줄친 글자체로 되어있다).
경쇄 (LC):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQQGYGAPFTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW C VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 89).
중쇄 (HC):
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISDYWIHWVRQAPGKGLEWVAGITPAGGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCARFVFFLPYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT (서열번호: 90).
G6.31AARR.HC-A140C 시스테인 조작된 항체 변이체 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열은 하기에 나타나 있다 (HC-C140은 굵은 밑줄친 글자체로 되어있다).
LC:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQQGYGAPFTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 91).
HC:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISDYWIHWVRQAPGKGLEWVAGITPAGGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCARFVFFLPYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT C ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT (서열번호: 92).
G6.31AARR.HC-L174C 시스테인 조작된 항체 변이체 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열은 하기에 나타나 있다 (HC-C174는 굵은 밑줄친 글자체로 되어있다).
LC:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQQGYGAPFTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 93).
HC:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISDYWIHWVRQAPGKGLEWVAGITPAGGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCARFVFFLPYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV C QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT (서열번호: 94).
실시예 4: 단분산 HA로부터 생산된 HA-G6. 31.AARR 콘주게이트는 다분산 HA로부터 생산된 HA-G6. 31.AARR 콘주게이트에 비하여 생리적 스트레스 하에서 개선된 물리적 안정성을 나타낸다
(A) 물질 및 방법
파스튜렐라 멀토시다 하이알루로난 합성효소 (PmHAS)를 사용한 화학효소적 수단에 의해 합성된 단분산 HA는 Hyalose (Oklahoma City, OK)로부터 구입했다. 다른 모든 화학물질 및 시약은 Sigma Aldrich (St. Louis, MO)로부터 구입했다.
단분산 HA (monoHA, Mw 137 kDa, RH 21.2 nm)를 4.0% 말레이미드기를 함유하는 것으로 이전에 기재된 바와 같이 N-(2-아미노에틸말레이미드)로 변형시켰다. G6.31.AARR.Fab-C를 그런 다음 이전에 기재된 바와 같이 monoHA-말레이미드 백본에 접합시키고 PBS pH 7.4 작동 완충액을 갖는 HILOAD® SUPERDEX® 200 pg 칼럼상에서 SEC에 의해 정제하였다. 콘주게이트 분획을 모으고 SEC-RI-MALS에 의해 확인하였다
정제된 monoHA-G6.31.AARR을 PBS에서 5 mg/mL (Fab 기준)로 한외여과에 의해 농축하고, 아지드화 나트륨 및 폴리소르베이트 20 (PS20)으로 각각 2 mM 및 0.01%의 최종 농도로 스파이킹하고 37℃에서 인큐베이션하였다. 샘플링 시점에서, 샘플을 회수하고 10 mM His-HCl (pH 5.5), 150 mM NaCl, 10% (w/v) 트레할로스 및 0.01% 폴리소르베이트 20을 함유하는 완충액에서 1 mg/mL로 희석하고, 그 다음 가용성 단백질 농도 (A280), 탁도 (A450), SEC 체류 시간, 및 분자량 (SEC-RI-MALS에 의한 Mn 및 Mw)에 대해 분석하였다.
(B) 결과
단분산 HA를 사용하여 생산된 HA-G6.31.AARR 콘주게이트는 동일한 Fab 장입 수준에서 유사한 크기의 다분산 HA로 생산된 HA-G6.31.AARR 콘주게이트와 비교하여 4주 이상 크게 개선된 물리적 안정성을 나타냈다 (도 14). monoHA-G6.31.AARR의 분자량 (Mw)은 0주째에서부터 2주 및 4주째까지 약간 감소했지만, 이 손실은 통상적으로 티올-말레이미드 접합된 단백질에 대해 관측되는 바와 같이 역-마이클 디콘주게이션으로 인한 유리 Fab의 손실에 의해 전적으로 설명될 수 있다. monoHA-G6.31.AARR에 대한 SEC 체류 시간에서 또한 구별할 수 있는 전이는 없었으며, 이는 콘주게이트의 물리적 크기가 경시적으로 변하지 않았음을 나타낸다.
이들 결과는 다분산 HA 개시 물질로부터 생성된 HA-G6.31.AARR 콘주게이트의 모집단 내에서 고분자량 HA-기반 부분모집단이 생리적 스트레스 후 관측된 물리적 불안정성에 원인이 된다는 가설을 분명히 지지한다. HA 개시 물질 (즉, 단분산 HA로부터 개시)을 균질화함으로써 이 부분모집단을 제거하는 것은 생리적 스트레스 상태 하에서 침전이 덜 발생하는 보다 안정한 콘주게이트 분자를 초래한다. 이들 데이터는 생체내 사용을 위한 치료제로서 단분산 HA 물질로부터 생성된 HA-G6.31.AARR 콘주게이트를 사용하는 것을 추가로 지지한다.
전술한 발명은 이해의 명괘함을 위해 예시 및 실시예로서 일부 상세하게 기재하였지만, 설명 및 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 명세서에 인용된 모든 특허 및 과학적 문헌의 개시내용은 명시적으로 전체적으로 참고로 편입된다.
<110> Genentech, Inc. F. Hoffmann-La Roche AG <120> OPTIMIZED ANTIBODY COMPOSITIONS FOR TREATMENT OF OCULAR DISORDERS <130> 50474-160WO3 <150> US 62/475,163 <151> 2017-03-22 <160> 94 <170> KoPatentIn version 3.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 Asp Tyr Trp Ile His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> Xaa is Ile or His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) <223> Xaa is Ala or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> Xaa is Tyr or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9) <223> Xaa is Thr or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10) <223> Xaa is Arg, Tyr, Gln, or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12) <223> Xaa is Ala or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16) <223> Xaa is Lys or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17) <223> Xaa is Gly or Glu <400> 2 Gly Xaa Thr Pro Xaa Gly Gly Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Asp Ser Val Xaa 1 5 10 15 Xaa <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> 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Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Gly Asn Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 60 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 60 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Gly Ala Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 61 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 61 Lys Thr His Thr Cys 1 5 <210> 62 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 62 Gly Tyr Tyr Met His 1 5 <210> 63 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 63 Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 64 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 64 Ser Pro Asn Pro Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr Pro Gly 1 5 10 15 Ala Phe Asp Ile 20 <210> 65 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 65 Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val His 1 5 10 <210> 66 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 66 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser 1 5 <210> 67 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 67 Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Trp Val 1 5 10 <210> 68 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 68 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Pro Asn Pro Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr 100 105 110 Pro Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 69 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 69 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His 85 90 95 Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 <210> 70 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 70 Gly Thr Lys Val Glu Cys Lys Arg Thr Val Ala 1 5 10 <210> 71 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 71 Lys Val Glu Ile Lys Cys Thr Val Ala Ala Pro 1 5 10 <210> 72 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 72 Asn Asn Phe Tyr Pro Cys Glu Ala Lys Val Gln 1 5 10 <210> 73 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 73 Ala Lys Val Gln Trp Cys Val Asp Asn Ala Leu 1 5 10 <210> 74 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 74 Gln Gly Thr Leu Val Cys Val Ser Ser Ala Ser 1 5 10 <210> 75 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 75 Thr Ser Gly Gly Thr Cys Ala Leu Gly Cys Leu 1 5 10 <210> 76 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 76 Thr Phe Pro Ala Val Cys Gln Ser Ser Gly Leu 1 5 10 <210> 77 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 77 Leu Gln Ser Ser Gly Cys Tyr Ser Leu Ser Ser 1 5 10 <210> 78 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 78 Leu Ser Ser Val Val Cys Val Pro Ser Ser Ser 1 5 10 <210> 79 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 79 His Lys Pro Ser Asn Cys Lys Val Asp Lys Lys 1 5 10 <210> 80 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 80 Pro Glu Val Thr Cys Cys Val Val Asp Val Ser 1 5 10 <210> 81 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 81 Thr Cys Leu Val Lys Cys Phe Tyr Pro Ser Asp 1 5 10 <210> 82 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 82 Leu Val Lys Gly Phe Cys Pro Ser Asp Ile Ala 1 5 10 <210> 83 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 83 Ile Ala Val Glu Trp Cys Ser Asn Gly Gln Pro 1 5 10 <210> 84 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 84 Gln Gly Asn Val Phe Cys Cys Ser Val Met His 1 5 10 <210> 85 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 85 His Glu Ala Leu His Cys His Tyr Thr Gln Lys 1 5 10 <210> 86 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 86 His Asn His Tyr Thr Cys Lys Ser Leu Ser Leu 1 5 10 <210> 87 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 87 Lys Thr His Thr 1 <210> 88 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 88 Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys 1 5 <210> 89 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 89 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Gly Ala Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Cys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 90 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 90 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Asp Tyr 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Thr Pro Ala Gly Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Arg Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Val Phe Phe Leu Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr 225 <210> 91 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 91 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Gly Ala Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 92 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 92 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Asp Tyr 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Thr Pro Ala Gly Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Arg Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Val Phe Phe Leu Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Cys Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr 225 <210> 93 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 93 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Gly Ala Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 94 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 94 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Asp Tyr 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Thr Pro Ala Gly Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Arg Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Val Phe Phe Leu Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Cys Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr 225

Claims (158)

  1. (i) 항체 및 (ii) 상기 항체에 공유결합된 하이알루론산 (HA) 폴리머를 포함하는 항체 콘주게이트로서, 상기 HA 폴리머는 1.1 이하의 다분산도 지수 (PDI)를 갖는, 항체 콘주게이트.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 HA 폴리머는 1.0 내지 1.1의 PDI를 갖는, 항체 콘주게이트.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 HA 폴리머는 1.0 내지 약 1.05의 PDI를 갖는, 항체 콘주게이트.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HA 폴리머는 약 1.0001 내지 약 1.05의 PDI를 갖는, 항체 콘주게이트.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 HA 폴리머는 약 1.001의 PDI를 갖는, 항체 콘주게이트.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HA 폴리머는 약 1 메가달톤 (MDa) 이하의 분자량을 갖는, 항체 콘주게이트.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 HA 폴리머는 약 25 kDa 내지 약 500 kDa의 분자량을 갖는, 항체 콘주게이트.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 HA 폴리머는 약 100 kDa 내지 약 250 kDa의 분자량을 갖는, 항체 콘주게이트.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 HA 폴리머는 약 150 kDa 내지 약 200 kDa의 분자량을 갖는, 항체 콘주게이트.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HA 폴리머는 선형 HA 폴리머인, 항체 콘주게이트.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 콘주게이트는 약 10 nm 내지 약 60 nm의 유체역학적 반경을 갖는, 항체 콘주게이트.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 항체 콘주게이트는 약 25 nm 내지 약 35 nm의 유체역학적 반경을 갖는, 항체 콘주게이트.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 유체역학적 반경은 약 20 nM 내지 약 30 nm인, 항체 콘주게이트.
  14. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 콘주게이트는 HA 폴리머에 공유결합되지 않은 참조 항체에 비해 증가된 안구 반감기를 갖는, 항체 콘주게이트.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 안구 반감기는 상기 참조 항체에 비해 적어도 약 2-배 증가되는, 항체 콘주게이트.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 안구 반감기는 상기 참조 항체에 비해 적어도 약 4-배 증가되는, 항체 콘주게이트.
  17. 청구항 14 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안구 반감기는 유리체 반감기인, 항체 콘주게이트.
  18. 청구항 14 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, 상기 참조 항체는 상기 항체 콘주게이트의 항체와 동일한, 항체 콘주게이트.
  19. 청구항 1 내지 18 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); IL-1β; IL-6; IL-6R; IL-13; IL-13R; PDGF; 안지오포이에틴; 안지오포이에틴 2; Tie2; S1P; 인테그린 αvβ3, αvβ5, 및 α5β1; 베타셀룰린; 아페린/APJ; 에리트로포이에틴; 보체 인자 D; TNFα; HtrA1; VEGF 수용체; ST-2 수용체; 및 AMD 위험에 유전적으로 연결된 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 생물학적 분자에 특이적으로 결합하는, 항체 콘주게이트.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 VEGF 수용체는 VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, mbVEGFR, 또는 sVEGFR인, 항체 콘주게이트.
  21. 청구항 19에 있어서, 상기 AMD 위험에 유전적으로 연결된 단백질은 보체 경로 성분 C2, 인자 B, 인자 H, CFHR3, C3b, C5, C5a, 및 C3a; HtrA1; ARMS2; TIMP3; HLA; IL-8; CX3CR1; TLR3; TLR4; CETP; LIPC, COL10A1; 및 TNFRSF10A로 구성된 군으로부터 선택되는, 항체 콘주게이트.
  22. 청구항 19에 있어서, 상기 항체는 VEGF에 특이적으로 결합하는, 항체 콘주게이트.
  23. 청구항 22에 있어서, 상기 항체는 하기 6개의 초가변성 영역 (HVR)을 포함하는, 항체 콘주게이트:
    (a) DYWIH (서열번호: 1)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
    (b) GX1TPX2GGX3X4X5YX6DSVX7X8 (서열번호: 2)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2로서, 상기 X1는 Ile 또는 His, X2는 Ala 또는 Arg, X3는 Tyr 또는 Lys, X4는 Thr 또는 Glu, X5는 Arg, Tyr, Gln, 또는 Glu, X6는 Ala 또는 Glu, X7는 Lys 또는 Glu, 및 X8는 Gly 또는 Glu인, 상기 HVR-H2;
    (c) FVFFLPYAMDY (서열번호: 3)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
    (d) RASQX1VSTAVA (서열번호: 4)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1로서, 상기 X1는 Asp 또는 Arg인, 상기 HVR-L1;
    (e) X1ASFLYS (서열번호: 5)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2로서, 상기 X1는 Ser 또는 Met인, 상기 HVR-L2; 및
    (f) X1QGYGX2PFT (서열번호: 6)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3로서, 상기 X1는 Gln, Asn, 또는 Thr 및 X2는 Ala, Asn, Gln, 또는 Arg인, 상기 HVR-L3.
  24. 청구항 23에 있어서, 상기 항체는 하기 6개의 HVR을 포함하는, 항체 콘주게이트:
    (a) DYWIH (서열번호: 1)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
    (b) GITPAGGYTRYADSVKG (서열번호: 7), GITPAGGYEYYADSVKG (서열번호: 21), 또는 GITPAGGYEYYADSVEG (서열번호: 22)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2;
    (c) FVFFLPYAMDY (서열번호: 3)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
    (d) RASQDVSTAVA (서열번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
    (e) SASFLYS (서열번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
    (f) QQGYGAPFT (서열번호: 10) 또는 QQGYGNPFT (서열번호: 23)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.
  25. 청구항 23 또는 24에 있어서, 상기 항체는 하기 6개의 HVR을 포함하는, 항체 콘주게이트:
    (a) DYWIH (서열번호: 1)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
    (b) GITPAGGYTRYADSVKG (서열번호: 7)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2;
    (c) FVFFLPYAMDY (서열번호: 3)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
    (d) RASQDVSTAVA (서열번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
    (e) SASFLYS (서열번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
    (f) QQGYGAPFT (서열번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.
  26. 청구항 23 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 하기 중쇄 가변성 (VH) 도메인 프레임워크 영역 (FR)을 추가로 포함하는, 항체 콘주게이트:
    (a) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS (서열번호: 13)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1;
    (b) WVRQAPGKGLEWVA (서열번호: 14)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2;
    (c) RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR (서열번호: 15)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3; 및
    (d) WGQGTLVTVSS (서열번호: 16)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4.
  27. 청구항 23 내지 26 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 하기 경쇄 가변성 (VL) 도메인 FR을 추가로 포함하는, 항체 콘주게이트:
    (a) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열번호: 17)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1;
    (b) WYQQKPGKAPKLLIY (서열번호: 18)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2;
    (c) GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (서열번호: 19)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3; 및
    (d) FGQGTKVEIK (서열번호: 20)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4.
  28. 청구항 23 또는 24에 있어서, 상기 항체는 하기 6개의 HVR을 포함하는, 항체 콘주게이트:
    (a) DYWIH (서열번호: 1)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
    (b) GITPAGGYEYYADSVEG (서열번호: 22)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2;
    (c) FVFFLPYAMDY (서열번호: 3)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
    (d) RASQDVSTAVA (서열번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
    (e) SASFLYS (서열번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
    (f) QQGYGNPFT (서열번호: 23)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.
  29. 청구항 28에 있어서, 상기 항체는 하기 VL 도메인 FR을 추가로 포함하는, 항체 콘주게이트:
    (a) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열번호: 17)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1;
    (b) WYQQKPGKAPKLLIY (서열번호: 18)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2;
    (c) GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열번호: 24)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3; 및
    (d) FGQGTKVEIK (서열번호: 20)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4.
  30. 청구항 23 또는 24에 있어서, 상기 항체는 하기 6개의 HVR을 포함하는, 항체 콘주게이트:
    (a) DYWIH (서열번호: 1)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
    (b) GITPAGGYEYYADSVEG (서열번호: 22)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2;
    (c) FVFFLPYAMDY (서열번호: 3)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
    (d) RASQDVSTAVA (서열번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
    (e) SASFLYS (서열번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
    (f) QQGYGAPFT (서열번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.
  31. 청구항 30에 있어서, 상기 항체는 하기 VL 도메인 FR을 추가로 포함하는, 항체:
    (a) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열번호: 17), DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC (서열번호: 25), 또는 DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC (서열번호: 26)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1;
    (b) WYQQKPGKAPKLLIY (서열번호: 18) 또는 WYQQKPGEAPKLLIY (서열번호: 27)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2;
    (c) GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (서열번호: 19) 또는 GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC (서열번호: 28)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3; 및
    (d) FGQGTKVEIK (서열번호: 20)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4.
  32. 청구항 28 내지 31 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 하기 VH 도메인 FR을 추가로 포함하는, 항체:
    (a) EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (서열번호: 29) 또는 EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS (서열번호: 52)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1;
    (b) WVRQEPGEGLEWVA (서열번호: 30)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2;
    (c) RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (서열번호: 31)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3; 및
    (d) WGQGELVTVSS (서열번호: 32)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4.
  33. 청구항 22에 있어서, 상기 항체는 하기를 포함하는, 항체 콘주게이트: (a) 서열번호: 11, 40, 또는 42의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; (b) 서열번호: 12, 41, 또는 46의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인.
  34. 청구항 33에 있어서, 상기 VH 도메인은 하기 FR을 추가로 포함하는, 항체 콘주게이트:
    (a) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS (서열번호: 13)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1;
    (b) WVRQAPGKGLEWVA (서열번호: 14) 또는 WVRQEPGKGLEWVA (서열번호: 39)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2;
    (c) RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR (서열번호: 15)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3; 및
    (d) WGQGTLVTVSS (서열번호: 16)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4.
  35. 청구항 34에 있어서, 상기 VH 도메인은 서열번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 콘주게이트.
  36. 청구항 33 내지 35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VL 도메인은 하기 FR을 추가로 포함하는, 항체 콘주게이트:
    (a) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열번호: 17) 또는 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTIDC (서열번호: 45)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1;
    (b) WYQQKPGKAPKLLIY (서열번호: 18)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2;
    (c) GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (서열번호: 19) GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDSATYYC (서열번호: 44), 또는 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYC (서열번호: 54)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3; 및
    (d) FGQGTKVEIK (서열번호: 20)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4 또는 FGQGTKVEVK (서열번호: 55).
  37. 청구항 36에 있어서, 상기 VL 도메인은 서열번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 콘주게이트.
  38. 청구항 33에 있어서, 상기 항체는 하기를 포함하는, 항체 콘주게이트: (a) 서열번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
  39. 청구항 33에 있어서, 상기 항체는 하기를 포함하는, 항체 콘주게이트: (a) 서열번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
  40. 청구항 33에 있어서, 상기 항체는 하기를 포함하는, 항체 콘주게이트: (a) 서열번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
  41. 청구항 33에 있어서, 상기 항체는 하기를 포함하는, 항체 콘주게이트: (a) 서열번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
  42. 청구항 22에 있어서, 상기 항체는 하기를 포함하는, 항체 콘주게이트: (a) 서열번호: 33 또는 51의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; (b) 서열번호: 12, 34, 35, 36, 37, 또는 38의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인.
  43. 청구항 42에 있어서, 상기 항체는 하기 FR을 추가로 포함하는, 항체 콘주게이트:
    (a) EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (서열번호: 29) 또는 EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS (서열번호: 52)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1;
    (b) WVRQEPGEGLEWVA (서열번호: 30)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2;
    (c) RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (서열번호: 31)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3; 및
    (d) WGQGELVTVSS (서열번호: 32)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4.
  44. 청구항 43에 있어서, 상기 VH 도메인은 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 콘주게이트.
  45. 청구항 43에 있어서, 상기 VH 도메인은 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 콘주게이트.
  46. 청구항 42 내지 45 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 하기 FR을 추가로 포함하는, 항체 콘주게이트:
    (a) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열번호: 17), DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC (서열번호: 25), 또는 DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC (서열번호: 26)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1;
    (b) WYQQKPGKAPKLLIY (서열번호: 18) 또는 WYQQKPGEAPKLLIY (서열번호: 27)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2;
    (c) GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (서열번호: 19), GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열번호: 24), 또는 GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC (서열번호: 28)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3; 및
    (d) FGQGTKVEIK (서열번호: 20)의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4.
  47. 청구항 46에 있어서, 상기 VL 도메인은 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 콘주게이트.
  48. 청구항 46에 있어서, 상기 VL 도메인은 서열번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 콘주게이트.
  49. 청구항 46에 있어서, 상기 VL 도메인은 서열번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 콘주게이트.
  50. 청구항 46에 있어서, 상기 VL 도메인은 서열번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 콘주게이트.
  51. 청구항 46에 있어서, 상기 VL 도메인은 서열번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 콘주게이트.
  52. 청구항 46에 있어서, 상기 VL 도메인은 서열번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 콘주게이트.
  53. 청구항 42에 있어서, 상기 항체는 하기를 포함하는, 항체 콘주게이트: (a) 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
  54. 청구항 42에 있어서, 상기 항체는 하기를 포함하는, 항체 콘주게이트: (a) 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
  55. 청구항 42에 있어서, 상기 항체는 하기를 포함하는, 항체 콘주게이트: (a) 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
  56. 청구항 42에 있어서, 상기 항체는 하기를 포함하는, 항체 콘주게이트: (a) 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
  57. 청구항 42에 있어서, 상기 항체는 하기를 포함하는, 항체 콘주게이트: (a) 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
  58. 청구항 42에 있어서, 상기 항체는 하기를 포함하는, 항체 콘주게이트: (a) 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
  59. 청구항 42에 있어서, 상기 항체는 하기를 포함하는, 항체 콘주게이트: (a) 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
  60. 청구항 42에 있어서, 상기 항체는 하기를 포함하는, 항체 콘주게이트: (a) 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
  61. 청구항 42에 있어서, 상기 항체는 하기를 포함하는, 항체 콘주게이트: (a) 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
  62. 청구항 42에 있어서, 상기 항체는 하기를 포함하는, 항체 콘주게이트: (a) 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
  63. 청구항 42에 있어서, 상기 항체는 하기를 포함하는, 항체 콘주게이트: (a) 서열번호: 48의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 (b) 서열번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
  64. 청구항 42에 있어서, 상기 항체는 하기를 포함하는, 항체 콘주게이트: (a) 서열번호: 49의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 (b) 서열번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
  65. 청구항 22 내지 64 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 VEGF의 VEGF 수용체에의 결합을 억제할 수 있는, 항체 콘주게이트.
  66. 청구항 65에 있어서, 상기 VEGF 수용체는 VEGF 수용체 1 (Flt-1)인, 항체 콘주게이트.
  67. 청구항 65에 있어서, 상기 VEGF 수용체는 VEGF 수용체 2 (KDR)인, 항체 콘주게이트.
  68. 청구항 22 내지 67 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 약 2 nM 이하의 Kd로 인간 VEGF (hVEGF)에 결합하는, 항체 콘주게이트.
  69. 청구항 68에 있어서, 상기 항체는 약 75 pM 내지 약 2 nM의 Kd로 hVEGF에 결합하는, 항체 콘주게이트.
  70. 청구항 69에 있어서, 상기 항체는 약 75 pM 내지 약 600 pM의 Kd로 hVEGF에 결합하는, 항체 콘주게이트.
  71. 청구항 70에 있어서, 상기 항체는 약 75 pM 내지 약 500 pM의 Kd로 hVEGF에 결합하는, 항체 콘주게이트.
  72. 청구항 71에 있어서, 상기 항체는 약 60 pM의 Kd로 hVEGF에 결합하는, 항체 콘주게이트.
  73. 청구항 23 내지 27, 33 내지 41, 및 63 내지 72 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 약 83.5 ℃ 초과의 용융 온도 (Tm)를 갖는, 항체 콘주게이트.
  74. 청구항 73에 있어서, 상기 항체는 약 85 ℃ 내지 약 91 ℃의 Tm을 갖는, 항체 콘주게이트.
  75. 청구항 74에 있어서, 상기 항체는 약 89 ℃의 Tm을 갖는, 항체 콘주게이트.
  76. 청구항 23, 24, 28 내지 32, 42 내지 62 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 8 미만의 등전점 (pI)을 갖는, 항체 콘주게이트.
  77. 청구항 76에 있어서, 상기 항체는 약 5 내지 약 7의 pI을 갖는, 항체 콘주게이트.
  78. 청구항 77에 있어서, 상기 항체는 약 5 내지 약 6의 pI을 갖는, 항체 콘주게이트.
  79. 청구항 1 내지 78 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 단클론성, 인간, 인간화된, 또는 키메라인, 항체 콘주게이트.
  80. 청구항 1 내지 79 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 항원-결합 항체 단편인, 항체 콘주게이트.
  81. 청구항 80에 있어서, 상기 항체 단편은 Fab, Fab-C, Fab'-SH, Fv, scFv, 및 (Fab')2 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는, 항체 콘주게이트.
  82. 청구항 81에 있어서, 상기 항체 단편는 Fab인, 항체 콘주게이트.
  83. 청구항 1 내지 82 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 단일특이적 항체인, 항체 콘주게이트.
  84. 청구항 1 내지 82 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 다중특이적 항체인, 항체 콘주게이트.
  85. 청구항 84에 있어서, 상기 다중특이적 항체는 이중특이적 항체인, 항체 콘주게이트.
  86. 청구항 85에 있어서, 상기 이중특이적 항체는 VEGF 및 하기로 구성된 군으로부터 선택된 제2 생물학적 분자에 결합하는, 항체 콘주게이트: IL-1β; 인터류킨-6 (IL-6); 인터류킨-6 수용체 (IL-6R); 인터류킨-13 (IL-13); IL-13 수용체 (IL-13R); PDGF; 안지오포이에틴; 안지오포이에틴 2; Tie2; S1P; 인테그린 αvβ3, αvβ5, 및 α5β1; 베타셀룰린; 아페린/APJ; 에리트로포이에틴; 보체 인자 D; TNFα; HtrA1; VEGF 수용체; ST-2 수용체; 및 연령 관련 황반 변성 (AMD) 위험에 유전자적으로 연결된 단백질.
  87. 청구항 86에 있어서, 상기 VEGF 수용체는 VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, 막-결합 VEGF-수용체 (mbVEGFR), 또는 가용성 VEGF 수용체 (sVEGFR)인, 항체 콘주게이트.
  88. 청구항 86에 있어서, 상기 AMD 위험에 유전적으로 연결된 단백질은 보체 경로 성분 C2, 인자 B, 인자 H, CFHR3, C3b, C5, C5a, 및 C3a; HtrA1; ARMS2; TIMP3; HLA; 인터류킨-8 (IL-8); CX3CR1; TLR3; TLR4; CETP; LIPC, COL10A1; 및 TNFRSF10A로 구성된 군으로부터 선택되는, 항체 콘주게이트.
  89. 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 시스테인 조작된 항체인, 항체 콘주게이트.
  90. 청구항 89에 있어서, 상기 시스테인 조작된 항체는 HC-A118C, HC-A140C, 및 HC-L174C (EU 넘버링)로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄에서의 시스테인 돌연변이, 또는 LC-K149C 및 LC-V205C (카밧 넘버링)로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄에서의 시스테인 돌연변이를 포함하는, 항체 콘주게이트.
  91. 청구항 90에 있어서, 상기 중쇄에서의 시스테인 돌연변이는 HC-A118C (EU 넘버링)인, 항체 콘주게이트.
  92. 청구항 90에 있어서, 상기 중쇄에서의 시스테인 돌연변이는 HC-A140C (EU 넘버링)인, 항체 콘주게이트.
  93. 청구항 90에 있어서, 상기 중쇄에서의 시스테인 돌연변이는 HC-L174C (EU 넘버링)인, 항체 콘주게이트.
  94. 청구항 90에 있어서, 상기 경쇄에서의 시스테인 돌연변이는 LC-K149C (카밧 넘버링)인, 항체 콘주게이트.
  95. 청구항 90에 있어서, 상기 경쇄에서의 시스테인 돌연변이는 LC-V205C (카밧 넘버링)인, 항체 콘주게이트.
  96. 청구항 90 내지 95 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HA 폴리머는 시스테인 돌연변이에서 항체에 공유결합되는, 항체 콘주게이트.
  97. 청구항 1 내지 96 중 어느 한 항에 있어서, 약제로서 사용하기 위한, 항체 콘주게이트.
  98. 청구항 1 내지 96 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 안구 장애를 치료하기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한, 항체 콘주게이트.
  99. 청구항 1 내지 96 중 어느 한 항에 있어서, 안구 장애를 가지고 있는 대상체에서 혈관신생을 감소 또는 억제시키는데 사용하기 위한, 항체 콘주게이트.
  100. 청구항 1 내지 96 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 안구 장애를 치료하는데 사용하기 위한, 항체 콘주게이트.
  101. 청구항 98 내지 100 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안구 장애는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는, 항체 콘주게이트: 연령 관련 황반 변성 (AMD), 황반 변성, 황반 부종, 당뇨병성 황반 부종 (DME) (초점, 비-중심 DME 및 확산, 중심-관여된 DME 포함), 망막증, 당뇨 망막병증 (DR) (증식성 DR (PDR), 비-증식성 DR (NPDR), 및 고고도 DR 포함), 다른 허혈-관련된 망막증, 미숙아 망막증 (ROP), 망막 정맥 폐색 (RVO) (중심 (CRVO) 및 분지형 (BRVO) 형태 포함), CNV (근시 CNV 포함), 각막 신생혈관형성, 각막 신생혈관형성과 연관된 질환, 망막 신생혈관형성, 망막/맥락막 신생혈관형성과 연관된 질환, 병리적 근시, 폰 힙펠-린도우병, 눈의 히스토플라마증, 가족성 삼출성 유리체망막병증 (FEVR), 코우츠병, 노리병, 골다공증-거짓신경아교종 증후군 (OPPG), 결막하 출혈, 조홍, 안구 신생혈관 질환, 신생혈관 녹내장, 색소성 망막염 (RP), 고혈압 망막증, 망막 혈관종 증식, 황반 모세혈관확장증, 홍채 신생혈관형성, 안구내 신생혈관형성, 망막 퇴행, 포낭 황반 부종 (CME), 혈관염, 유두부종, 망막염, 결막염 (감염성 결막염 및 비-감염성 (예를 들어, 알러지성) 결막염 포함), 레버 선천성 흑내장, 포도막염 (감염성 및 비-감염성 포도막염 포함), 맥락막염, 안구 히스토플라마증, 눈꺼풀염, 안구 건조, 외상성 눈 손상, 및 쇼그렌병.
  102. 청구항 101에 있어서, 상기 안구 장애는 AMD, DME, DR, 또는 RVO인, 항체 콘주게이트.
  103. 청구항 101 또는 102에 있어서, 상기 안구 장애는 AMD인, 항체 콘주게이트.
  104. 청구항 101 내지 103 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AMD는 습윤 AMD인, 항체 콘주게이트.
  105. 청구항 101 또는 102에 있어서, 상기 안구 장애는 DME인, 항체 콘주게이트.
  106. 청구항 1 내지 96 중 어느 한 항의 항체 콘주게이트 및 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물.
  107. 청구항 106에 있어서, 제2 제제를 추가로 포함하되, 상기 제2 제제는 항체, 항-혈관신생제, 사이토카인, 사이토카인 길항제, 코르티코스테로이드, 진통제, 및 제2 생물학적 분자에 결합하는 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  108. 청구항 107에 있어서, 상기 항-혈관신생제는 VEGF 길항제인, 약제학적 조성물.
  109. 청구항 108에 있어서, 상기 VEGF 길항제는 항-VEGF 항체, 항-VEGF 수용체 항체, 가용성 VEGF 수용체 융합 단백질, 압타머, 항-VEGF DARPin® 또는 VEGFR 티로신 키나제 억제제인, 약제학적 조성물.
  110. 청구항 109에 있어서, 상기 항-VEGF 항체는 라니비주맙 (LUCENTIS®), RTH-258, 또는 이중특이적 항-VEGF 항체인, 약제학적 조성물.
  111. 청구항 110에 있어서, 상기 이중특이적 항-VEGF 항체는 항-VEGF/항-Ang2 항체인, 약제학적 조성물.
  112. 청구항 111에 있어서, 상기 항-VEGF/항-Ang2 항체는 RG-7716인, 약제학적 조성물.
  113. 청구항 109에 있어서, 상기 가용성 VEGF 수용체 융합 단백질은 아플리베르셉트 (EYLEA®)인, 약제학적 조성물.
  114. 청구항 109에 있어서, 상기 압타머는 페갑타닙 (MACUGEN®)인, 약제학적 조성물.
  115. 청구항 109에 있어서, 상기 항-VEGF DARPin®는 아비시파르 페골인, 약제학적 조성물.
  116. 청구항 109에 있어서, 상기 VEGFR 티로신 키나제 억제제는 4-(4-브로모-2-플루오로아닐리노)-6-메톡시-7-(1-메틸피페리딘-4-일메톡시)퀴나졸린 (ZD6474), 4-(4-플루오로-2-메틸인돌-5-일옥시)-6-메톡시-7-(3-피롤리딘-1-일프로폭시)퀴나졸린 (AZD2171), 바탈라닙 (PTK787), 세막사미닙 (SU5416), 및 SUTENT® (수니티닙)로 구성된 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  117. 청구항 107에 있어서, 상기 제2 생물학적 분자는 IL-1β; IL-6; IL-6R; IL-13; IL-13R; PDGF; 안지오포이에틴; 안지오포이에틴 2; Tie2; S1P; 인테그린 αvβ3, αvβ5, 및 α5β1; 베타셀룰린; 아페린/APJ; 에리트로포이에틴; 보체 인자 D; TNFα; HtrA1; VEGF 수용체; ST-2 수용체; 및 AMD 위험에 유전적으로 연결된 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  118. 청구항 117에 있어서, 상기 VEGF 수용체는 VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, mbVEGFR, 또는 sVEGFR인, 약제학적 조성물.
  119. 청구항 117에 있어서, 상기 AMD 위험에 유전적으로 연결된 단백질은 보체 경로 성분 C2, 인자 B, 인자 H, CFHR3, C3b, C5, C5a, 및 C3a; HtrA1; ARMS2; TIMP3; HLA; IL-8; CX3CR1; TLR3; TLR4; CETP; LIPC, COL10A1; 및 TNFRSF10A로 구성된 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  120. 청구항 107 및 117 내지 119 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 생물학적 분자에 결합된 화합물은 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 약제학적 조성물.
  121. 청구항 120에 있어서, 상기 항원-결합 항체 단편은 Fab, Fab-C, Fab'-SH, Fv, scFv, 및 (Fab')2 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  122. 청구항 106 내지 121 중 어느 한 항에 있어서, 약제로서 사용되는, 약제학적 조성물.
  123. 청구항 106 내지 121 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 안구 장애를 치료하기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
  124. 청구항 106 내지 121 중 어느 한 항에 있어서, 안구 장애를 가지고 있는 대상체에서 혈관신생을 감소 또는 억제시키는데 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
  125. 청구항 106 내지 121 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 안구 장애를 치료하는데 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
  126. 청구항 123 내지 125 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안구 장애는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물: 연령 관련 황반 변성 (AMD), 황반 변성, 황반 부종, 당뇨병성 황반 부종 (DME) (초점, 비-중심 DME 및 확산, 중심-관여된 DME 포함), 망막증, 당뇨 망막병증 (DR) (증식성 DR (PDR), 비-증식성 DR (NPDR), 및 고고도 DR 포함), 다른 허혈-관련된 망막증, 미숙아 망막증 (ROP), 망막 정맥 폐색 (RVO) (중심 (CRVO) 및 분지형 (BRVO) 형태 포함), CNV (근시 CNV 포함), 각막 신생혈관형성, 각막 신생혈관형성과 연관된 질환, 망막 신생혈관형성, 망막/맥락막 신생혈관형성과 연관된 질환, 병리적 근시, 폰 힙펠-린도우병, 눈의 히스토플라마증, 가족성 삼출성 유리체망막병증 (FEVR), 코우츠병, 노리병, 골다공증-거짓신경아교종 증후군 (OPPG), 결막하 출혈, 조홍, 안구 신생혈관 질환, 신생혈관 녹내장, 색소성 망막염 (RP), 고혈압 망막증, 망막 혈관종 증식, 황반 모세혈관확장증, 홍채 신생혈관형성, 안구내 신생혈관형성, 망막 퇴행, 포낭 황반 부종 (CME), 혈관염, 유두부종, 망막염, 결막염 (감염성 결막염 및 비-감염성 (예를 들어, 알러지성) 결막염 포함), 레버 선천성 흑내장, 포도막염 (감염성 및 비-감염성 포도막염 포함), 맥락막염, 안구 히스토플라마증, 눈꺼풀염, 안구 건조, 외상성 눈 손상, 및 쇼그렌병.
  127. 청구항 126에 있어서, 상기 안구 장애는 AMD, DME, DR, 또는 RVO인, 약제학적 조성물.
  128. 청구항 126 또는 127에 있어서, 상기 안구 장애는 AMD인, 약제학적 조성물.
  129. 청구항 126 내지 128 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AMD는 습윤 AMD인, 약제학적 조성물.
  130. 청구항 126 또는 127에 있어서, 상기 안구 장애는 DME인, 약제학적 조성물.
  131. 안구 장애를 가지고 있는 대상체에서 혈관신생을 감소 또는 억제시키는 방법으로서, 상기 대상체에게 청구항 1 내지 96 중 어느 한 항의 항체 콘주게이트 또는 청구항 106 내지 121 중 어느 한 항의 약제학적 조성물의 유효량을 투여함으로써, 상기 대상체에서 혈관신생을 감소 또는 억제시키는 것을 포함한는, 방법.
  132. 안구 장애를 치료하는 방법으로서, 청구항 1 내지 96 중 어느 한 항의 항체 콘주게이트 또는 청구항 106 내지 121 중 어느 한 항의 약제학적 조성물의 유효량을 그와 같은 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  133. 청구항 131 또는 132에 있어서, 상기 안구 장애는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법: 연령 관련 황반 변성 (AMD), 황반 변성, 황반 부종, 당뇨병성 황반 부종 (DME) (초점, 비-중심 DME 및 확산, 중심-관여된 DME 포함), 망막증, 당뇨 망막병증 (DR) (증식성 DR (PDR), 비-증식성 DR (NPDR), 및 고고도 DR 포함), 다른 허혈-관련된 망막증, 미숙아 망막증 (ROP), 망막 정맥 폐색 (RVO) (중심 (CRVO) 및 분지형 (BRVO) 형태 포함), CNV (근시 CNV 포함), 각막 신생혈관형성, 각막 신생혈관형성과 연관된 질환, 망막 신생혈관형성, 망막/맥락막 신생혈관형성과 연관된 질환, 병리적 근시, 폰 힙펠-린도우병, 눈의 히스토플라마증, 가족성 삼출성 유리체망막병증 (FEVR), 코우츠병, 노리병, 골다공증-거짓신경아교종 증후군 (OPPG), 결막하 출혈, 조홍, 안구 신생혈관 질환, 신생혈관 녹내장, 색소성 망막염 (RP), 고혈압 망막증, 망막 혈관종 증식, 황반 모세혈관확장증, 홍채 신생혈관형성, 안구내 신생혈관형성, 망막 퇴행, 포낭 황반 부종 (CME), 혈관염, 유두부종, 망막염, 결막염 (감염성 결막염 및 비-감염성 (예를 들어, 알러지성) 결막염 포함), 레버 선천성 흑내장, 포도막염 (감염성 및 비-감염성 포도막염 포함), 맥락막염, 안구 히스토플라마증, 눈꺼풀염, 안구 건조, 외상성 눈 손상, 및 쇼그렌병.
  134. 청구항 133에 있어서, 상기 안구 장애는 AMD, DME, DR, 또는 RVO인, 방법.
  135. 청구항 133 또는 134에 있어서, 상기 안구 장애는 AMD인, 방법.
  136. 청구항 133 내지 135 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AMD는 습윤 AMD인, 방법.
  137. 청구항 133 또는 134에 있어서, 상기 안구 장애는 DME인, 방법.
  138. 청구항 131 내지 137 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 유효량의 제2 제제를 투여하는 것을 추가로 포함하되, 상기 제2 제제는 항체, 항-혈관신생제, 사이토카인, 사이토카인 길항제, 코르티코스테로이드, 진통제, 및 제2 생물학적 분자에 결합하는 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  139. 청구항 138에 있어서, 상기 항-혈관신생제는 VEGF 길항제인, 방법.
  140. 청구항 139에 있어서, 상기 VEGF 길항제는 항-VEGF 항체, 항-VEGF 수용체 항체, 가용성 VEGF 수용체 융합 단백질, 압타머, 항-VEGF DARPin® 또는 VEGFR 티로신 키나제 억제제인, 방법.
  141. 청구항 140에 있어서, 상기 항-VEGF 항체는 라니비주맙 (LUCENTIS®), RTH-258, 또는 이중특이적 항-VEGF 항체인, 방법.
  142. 청구항 141에 있어서, 상기 이중특이적 항-VEGF 항체는 항-VEGF/항-Ang2 항체인, 방법.
  143. 청구항 142에 있어서, 상기 항-VEGF/항-Ang2 항체는 RG-7716인, 방법.
  144. 청구항 140에 있어서, 상기 가용성 VEGF 수용체 융합 단백질은 아플리베르셉트 (EYLEA®)인, 방법.
  145. 청구항 140에 있어서, 상기 압타머는 페갑타닙 (MACUGEN®)인, 방법.
  146. 청구항 140에 있어서, 상기 항-VEGF DARPin®는 아비시파르 페골인, 방법.
  147. 청구항 140에 있어서, 상기 VEGFR 티로신 키나제 억제제는 4-(4-브로모-2-플루오로아닐리노)-6-메톡시-7-(1-메틸피페리딘-4-일메톡시)퀴나졸린 (ZD6474), 4-(4-플루오로-2-메틸인돌-5-일옥시)-6-메톡시-7-(3-피롤리딘-1-일프로폭시)퀴나졸린 (AZD2171), 바탈라닙 (PTK787), 세막사미닙 (SU5416), 및 SUTENT® (수니티닙)로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  148. 청구항 138에 있어서, 상기 제2 생물학적 분자는 IL-1β; IL-6; IL-6R; IL-13; IL-13R; PDGF; 안지오포이에틴; 안지오포이에틴 2; Tie2; S1P; 인테그린 αvβ3, αvβ5, 및 α5β1; 베타셀룰린; 아페린/APJ; 에리트로포이에틴; 보체 인자 D; TNFα; HtrA1; VEGF 수용체; ST-2 수용체; 및 AMD 위험에 유전적으로 연결된 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  149. 청구항 148에 있어서, 상기 VEGF 수용체는 VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, mbVEGFR, 또는 sVEGFR인, 방법.
  150. 청구항 149에 있어서, 상기 AMD 위험에 유전적으로 연결된 단백질은 보체 경로 성분 C2, 인자 B, 인자 H, CFHR3, C3b, C5, C5a, 및 C3a; HtrA1; ARMS2; TIMP3; HLA; IL-8; CX3CR1; TLR3; TLR4; CETP; LIPC, COL10A1; 및 TNFRSF10A로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  151. 청구항 138 및 148 내지 150 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 생물학적 분자에 결합된 화합물은 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 방법.
  152. 청구항 151에 있어서, 상기 항원-결합 항체 단편은 Fab, Fab-C, Fab'-SH, Fv, scFv, 및 (Fab')2 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  153. 청구항 131 내지 152 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 콘주게이트 또는 상기 약제학적 조성물은 유리체내로, 안구로, 안구내로, 공막주변으로, 테논낭하로, 상맥락막으로, 국소적으로, 정맥내로, 근육내로, 진피내로, 경피로, 동맥내로, 복강내로, 병소내로, 두개내로, 관절내로, 전립선내로, 늑막내로, 기관내로, 척추강내로, 비강내로, 질내로, 직장내로, 국소적으로, 종양내로, 복강내로, 복막으로, 심실내로, 피하로, 결막하로, 방광내로, 점막으로, 심막내로, 탯줄내로, 안와내로, 경구로, 경피로, 흡입에 의해, 주사로, 점안액에 의해, 이식에 의해, 주입에 의해, 연속적 주입에 의해, 국소화된 관류 수영 표적 세포에 의해 직접적으로, 카테터에 의해, 세척에 의해, 크림 내에서, 또는 지질 조성물 내에서 투여되는, 방법.
  154. 청구항 153에 있어서, 상기 항체 콘주게이트 또는 상기 약제학적 조성물은 유리체내로, 안구로, 안구내로, 공막주변으로, 테논낭하로, 상맥락막으로, 또는 국소적으로 투여되는, 방법.
  155. 청구항 153 또는 154에 있어서, 상기 항체 콘주게이트 또는 상기 약제학적 조성물은 투여된 유리체내로 주사로 투여되는, 방법.
  156. 청구항 153 또는 154에 있어서, 상기 항체 콘주게이트 또는 상기 약제학적 조성물은 점안액 또는 연고에 의해 국소적으로 투여되는, 방법.
  157. 청구항 153 또는 154에 있어서, 상기 항체 콘주게이트 또는 상기 약제학적 조성물은 포트 전달 장치에 의해 투여되는, 방법.
  158. 청구항 131 내지 157 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 인간인, 방법.

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