JP2022545682A - ＩｇＭグリコバリアント - Google Patents
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Abstract
本開示は、少なくとも１つのバリアントＩｇＭ由来重鎖を含む、単離されたＩｇＭ由来結合分子、例えばＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、または他のＩｇＭ由来結合分子を提供し、少なくとも１つのバリアントＩｇＭ由来重鎖は、標的に特異的に結合する結合ドメインと連結されているバリアントＩｇＭ重鎖定常領域を含み、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域の少なくとも１つのアスパラギン（Ｎ）結合型グリコシル化モチーフが当該モチーフにおけるグリコシル化を防止するように変異しており、且つ／または、少なくとも１つのＮ結合型グリコシル化モチーフがバリアントＩｇＭ重鎖に導入されている。TIFF2022545682000016.tif56128
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関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年８月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／８９１，２６３号の利益を主張し、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年８月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／８９１，２６３号の利益を主張し、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＡＳＣＩＩの写しは、２０２０年８月２１日に作成されたものであり、０２６ＷＯ１－Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｌｉｓｔｉｎｇと名付けられ、１６６，５７３バイトのサイズである。
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＡＳＣＩＩの写しは、２０２０年８月２１日に作成されたものであり、０２６ＷＯ１－Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｌｉｓｔｉｎｇと名付けられ、１６６，５７３バイトのサイズである。
多量体化することができる抗体及び抗体様分子（例えば、ＩｇＡ及びＩｇＭ抗体）は、例えば、免疫腫瘍学及び感染性疾患の分野で、特異性の改善、アビディティーの改善、及び複数の結合標的への結合能を可能にする有望な薬物候補として浮上している。例えば、米国特許第９，９５１，１３４号（特許文献1）、及び同第９，９３８，３４７号（特許文献2）、ならびに、ＰＣＴ公開第２０１６／１４１３０３号（特許文献3）、同第２０１６／１５４５９３号（特許文献4）、同第２０１６／１６８７５８号（特許文献5）、同第２０１７／０５９３８７号（特許文献6）、同第２０１７０５９３８０号（特許文献7）、同第２０１８／０１７８８８号（特許文献8）、同第２０１８／０１７７６３号（特許文献9）、同第２０１８／０１７８８９号（特許文献10）、及び、同第２０１８／０１７７６１号（特許文献11）を参照されたい。それらの内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
多価抗体の薬学動態（ＰＫ）及び薬力学（ＰＤ）は複雑であり、モノクローナル抗体の翻訳時の、及び翻訳後での構造、加えて、モノクローナル抗体が標的にする生理学的系に左右される。さらに、異なる抗体クラスは典型的には、異なる細胞及び生理学的系を介して、対象の中で処理される。例えば、ＩｇＧ抗体クラスは２０日の血清半減期を有する一方で、ＩｇＭ及びＩｇＡ抗体の半減期は、わずか約５～８日である。Ｂｒｅｋｋｅ，ＯＨ．，ａｎｄ Ｉ．Ｓａｎｄｌｉｅ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２： ５２－６２（２００３）（非特許文献1）。
抗体またはその生物学的治療薬のＰＫの、鍵となる決定因子の１つは、その濃度、及びグリコシル化の種類である（Ｈｉｇｅｌ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．１３９：１２３－１３１（２０１９）（非特許文献2））。抗体の特定の残基に共有結合した糖部分及びその誘導体は、アシアロ糖タンパク質（ＡＳＧＰ）受容体などの受容体により、その抗体がどのように認識されるかを決定し得、これにより転じて、抗体が体循環内からどれほど速く排出されるかを決定する。各ＩｇＭの重鎖定常領域は、アスパラギン（Ｎ）結合型グリコシル化の５つの部位を有し、Ｊ鎖は、１つのＮ結合型グリコシル化部位を有する。したがって、五量体のＪ鎖含有ＩｇＭは、最大で５１個のグリカン部分を含有し、これが複雑なグリコシル化プロファイルをもたらす（Ｈｅｎｎｉｃｋｅ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３９：１６２－１６６（２０１７）（非特許文献3））。グリカンの複雑性により、均質にグリコシル化した物質の製造が困難となる可能性がある。
多量体抗体の設計においてなされる進歩にもかかわらず、これらの分子の物理的、薬物動態的、及び薬力学的性質を操作できることが、依然として必要とされている。
Ｂｒｅｋｋｅ，ＯＨ．，ａｎｄ Ｉ．Ｓａｎｄｌｉｅ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２： ５２－６２（２００３）
Ｈｉｇｅｌ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．１３９：１２３－１３１（２０１９）
Ｈｅｎｎｉｃｋｅ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３９：１６２－１６６（２０１７）
本開示は、少なくとも１つのバリアントＩｇＭ由来重鎖、例えばＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、または、他のＩｇＭ由来結合分子を含む単離されたＩｇＭ由来結合分子を提供し、当該単離されたＩｇＭ由来結合分子は、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域を含み、少なくとも１つのバリアントＩｇＭ由来重鎖は、標的に特異的に結合する結合ドメインと連結されているバリアントＩｇＭ重鎖定常領域を含み、そこでは、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域の少なくとも１つのアスパラギン（Ｎ）結合型グリコシル化モチーフが、当該モチーフにおけるグリコシル化を防止するように変異しており、Ｎ結合型グリコシル化モチーフが、アミノ酸配列Ｎ－Ｘ１－Ｓ／Ｔ［配列中、Ｎはアスパラギンであり、Ｘ１はプロリン以外の任意のアミノ酸であり、Ｓ／Ｔはセリンまたはトレオニンである］を含む。ある特定の実施形態では、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域は、配列番号１（アレルＩＧＨＭ＊０３）または配列番号２（アレルＩＧＨＭ＊０４）のアミノ酸４６（モチーフＮ１）、アミノ酸２０９（モチーフＮ２）、アミノ酸２７２（モチーフＮ３）、アミノ酸２７９（モチーフＮ４）、及びアミノ酸４４０（モチーフＮ５）に対応するアミノ酸位置から始まる５つのＮ結合型グリコシル化モチーフＮ－Ｘ１－Ｓ／Ｔを含むヒトＩｇＭ重鎖定常領域に由来する。ある特定の実施形態では、Ｎ－Ｘ１－Ｓ／Ｔモチーフのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つが、当該モチーフのグリコシル化を防止する、アミノ酸挿入、欠失、または置換を含む。ある特定の実施形態では、ＩｇＭ由来結合分子は、モチーフＮ１、モチーフＮ２、モチーフＮ３、モチーフＮ５、またはモチーフＮ１、Ｎ２、Ｎ３、もしくはＮ５のうちの２つ以上、３つ以上、もしくは４つ全ての、任意の組合せにおけるアミノ酸挿入、欠失、または置換を含むことができ、当該アミノ酸挿入、欠失、または置換は、当該モチーフにおけるグリコシル化を防止する。
ある特定の実施形態では、ＩｇＭ由来結合分子は、配列番号１もしくは配列番号２のアミノ酸Ｎ４６、Ｎ２０９、Ｎ２７２、もしくはＮ４４０に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換［当該置換アミノ酸は任意のアミノ酸である］；配列番号１もしくは配列番号２のアミノ酸Ｓ４８、Ｓ２１１、Ｓ２７４、もしくはＳ４４２に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換［当該置換後のアミノ酸は、トレオニンを除く任意のアミノ酸である］；または当該アミノ酸置換のうちの２つ以上、３つ以上、もしくは４つ以上の任意の組合せを含むことができる。ある特定の実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１もしくは配列番号２のＮ４６Ｘ２、Ｎ４６Ａ、Ｎ４６Ｄ、Ｎ４６Ｑ、Ｎ４６Ｋ、Ｓ４８Ｘ３、Ｓ４８Ａ、Ｎ２２９Ｘ２、Ｎ２２９Ａ、Ｎ２２９Ｄ、Ｎ２２９Ｑ、Ｎ２２９Ｋ、Ｓ２３１Ｘ３、Ｓ２３１Ａ、Ｎ２７２Ｘ２、Ｎ２７２Ａ、Ｎ２７２Ｄ、Ｎ２７２Ｑ、Ｎ２７２Ｋ、Ｓ２７４Ｘ３、Ｓ２７４Ａ、Ｎ４４０Ｘ２、Ｎ４４０Ａ、Ｎ４４０Ｄ、Ｎ４４９Ｑ、Ｎ４４９Ｋ、Ｓ２４２Ｘ３、もしくはＳ４２４Ａ、または当該アミノ酸置換のうちの２つ以上、３つ以上、もしくは４つ以上の任意の組合せ［ここで、Ｘ２は任意のアミノ酸であり、Ｘ３はトレオニンを除く任意のアミノ酸である］に対応することができる。
ある特定の実施形態では、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、または配列番号１８のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＩｇＭ定常領域である。
ある特定の実施形態では、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域は、少なくとも１つの新しいアスパラギン（Ｎ）結合型グリコシル化モチーフをバリアントＩｇＭ重鎖定常領域に導入するように変異しており、少なくとも１つの新しいアスパラギン（Ｎ）結合型グリコシル化モチーフは、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域における、ＩｇＭ抗体において自然にはグリコシル化されない部位に導入されている。ある特定の実施形態では、新しいアスパラギン（Ｎ）結合型グリコシル化モチーフは、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域における、異なる免疫グロブリンアイソタイプ（例えば、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ４、ヒトＩｇＡ１、ヒトＩｇＡ２、ヒトＩｇＤ、及びヒトＩｇＥからなる群から選択されるヒト免疫グロブリンアイソタイプ）に存在するアスパラギン（Ｎ）結合型グリコシル化モチーフの位置に対応する位置に存在する。
ある特定の実施形態では、標的は、標的エピトープ、標的抗原、標的細胞、標的器官、または標的ウイルスである。
ある特定の実施形態では、ＩｇＭ由来結合分子は、それぞれ５つまたは６つの２価ＩｇＭ結合ユニットを含む五量体または六量体ＩｇＭ抗体であり、各結合ユニットは、バリアントＩｇＭ定常領域に対してアミノ末端側に位置するＶＨをそれぞれ含む２つのＩｇＭ重鎖と、免疫グロブリン軽鎖定常領域に対してアミノ末端側に位置する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）をそれぞれ含む２つの免疫グロブリン軽鎖とを含み、ＶＨ及びＶＬは、組み合わさって、標的に特異的に結合する抗原結合ドメインを形成する。ある特定の実施形態では、５つまたは６つのＩｇＭ結合ユニットは同一である。
ある特定の実施形態において、ＩｇＭ由来結合分子は、五量体であり、且つＪ鎖またはその機能性断片またはその機能性バリアントをさらに含む。ある特定の実施形態では、Ｊ鎖は、配列番号２０のアミノ酸配列を含む成熟ヒトＪ鎖、またはその機能性断片、またはその機能性バリアントである。ある特定の実施形態では、Ｊ鎖は、参照Ｊ鎖と比較して１つ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を含む機能性バリアントＪ鎖であり、参照Ｊ鎖は、当該１つ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を除いてバリアントＪ鎖と同一であり、バリアントＪ鎖を含むＩｇＭ由来結合分子は、対象動物に投与された際に、バリアントＪ鎖における１つ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を除いて同一であり且つ同一の動物種に同一の方法で投与される参照ＩｇＭ由来結合分子と比較して、増加した血清半減期を示す。ある特定の実施形態では、バリアントＪ鎖またはその機能性断片は、参照Ｊ鎖と比較して、１つ、２つ、３つ、または４つの単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を含む。ある特定の実施形態では、バリアントＪ鎖またはその機能性断片は、野生型成熟ヒトＪ鎖（配列番号２０）のアミノ酸Ｙ１０２に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含み、例えば配列番号２０のＹ１０２に対応するアミノ酸をアラニン（Ａ）で置換することができる。ある特定の実施形態では、Ｊ鎖はバリアントヒトＪ鎖Ｊ＊であり、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、バリアントＪ鎖またはその機能性断片は、成熟ヒトＪ鎖（配列番号２０）のアミノ酸４９（モチーフＮ６）に対応するアミノ酸位置から始まるアスパラギン（Ｎ）結合型グリコシル化モチーフＮ－Ｘ１－Ｓ／Ｔ［モチーフ中、Ｎはアスパラギンであり、Ｘ１はプロリン以外の任意のアミノ酸であり、Ｓ／Ｔはセリンまたはトレオニンである］内での変異を含み、当該変異は、当該モチーフにおけるグリコシル化を防止する。例えば、バリアントＪ鎖またはその機能性断片は、配列番号２０のアミノ酸Ｎ４９もしくはアミノ酸Ｓ５１に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含むことができ、Ｓ５１に対応するアミノ酸は、トレオニン（Ｔ）で置換されていないか、または、バリアントＪ鎖は、配列番号２０のアミノ酸Ｎ４９及びＳ５１の両方に対応するアミノ酸位置においてアミノ酸置換を含む。ある特定の実施形態では、配列番号２０のＮ４９に対応する位置は、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）で置換されている。ある特定の実施形態では、配列番号２０のＮ４９に対応する位置は、アラニン（Ａ）で置換されている。Ｊ鎖がバリアントヒトＪ鎖である場合、Ｊ鎖は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、配列番号２０のＮ４９に対応する位置は、アスパラギン酸（Ｄ）で置換されている。Ｊ鎖がバリアントヒトＪ鎖である場合、Ｊ鎖は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントは、異種部分をさらに含む改変Ｊ鎖であり、異種部分は、Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントに融合、またはコンジュゲートしている。ある特定の実施形態では、異種部分は、Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントに融合しているポリペプチドである。例えば、異種ポリペプチドは、例えば、少なくとも５個のアミノ酸、ただし２５個以下のアミノ酸を含む、ペプチドリンカーを介したＪ鎖またはその断片もしくはバリアントに融合することができ、例えば、ペプチドリンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２９）からなることができる。ある特定の実施形態では、異種ポリペプチドは、Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントのＮ末端、Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントのＣ末端、あるいはＪ鎖またはその断片もしくはバリアントのＮ末端及びＣ末端の両方に融合することができる。ある特定の実施形態では、異種ポリペプチドは、結合ドメイン、例えば、抗体またはその抗原結合断片を含む。ある特定の実施形態では、抗原結合断片は、ｓｃＦｖ断片である。ある特定の実施形態では、異種ｓｃＦｖ断片は、ＣＤ３εに特異的に結合する。ある特定の実施形態では、改変Ｊ鎖は、ペプチドリンカーを介して、それぞれ、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５３、及び配列番号５４；配列番号５７、配列番号５９、配列番号６２、配列番号６５、配列番号６７、及び配列番号６９；配列番号５７、配列番号５９、配列番号６２、配列番号６５、配列番号６７、及び配列番号７０；配列番号５８、配列番号６０、配列番号６３、配列番号６６、配列番号６８、及び配列番号７１；配列番号５８、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６６、配列番号６８、及び配列番号７２；配列番号５８、配列番号６１、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、及び配列番号７３を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、抗ＣＤ３ε ｓｃＦｖに融合している、配列番号２４（Ｖ１５Ｊ）、配列番号２５（Ｖ１５Ｊ＊）、配列番号２６（Ｖ１５Ｊ Ｎ４９Ｄ）、もしくは配列番号５５（ＳＪ＊）、または配列番号２０、２１、２２、もしくは２３のアミノ酸配列を含む。
本開示は、本明細書で提供する少なくとも１つのバリアントＩｇＭ由来重鎖をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド、またはそのようなポリヌクレオチドを含む組成物をさらに提供する。ある特定の実施形態では、当該組成物は、軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列をさらに含むことができる。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのバリアントＩｇＭ由来重鎖をコードする核酸配列、及び、軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列は、別のベクター上に存在する。ある特定の実施形態では、これらは単一のベクター上に存在する。ある特定の実施形態では、提供する組成物は、Ｊ鎖またはその機能性断片またはその機能性バリアントをコードする核酸配列をさらに含むことができる。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのバリアントＩｇＭ由来重鎖をコードする核酸配列、軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列、及び、Ｊ鎖をコードする核酸配列は、単一のベクター上に存在するか、または、２つ以上の別のベクター上に存在することができる。そのようなベクターは本開示によって提供される。本開示は、提供するポリヌクレオチドまたはベクターのいずれか１つ以上を含む宿主細胞もまた提供する。本開示は、提供するＩｇＭ由来結合分子の作製方法もまた提供し、当該方法は、提供する宿主細胞を培養することと、定常領域または抗体を回収することとを含む。
詳細な説明
定義
本明細書で使用する場合、「１個の」（「ａ」または「ａｎ」）実体という用語は、１個または複数個のその実体を指す。例えば、「１個の結合分子（ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」は、１個または複数個の結合分子を表すように理解される。したがって、「１個の」（「ａ」または「ａｎ」）、「１個または複数個」、及び「少なくとも１個」という用語は、本明細書では互換的に使用することができる。
定義
本明細書で使用する場合、「１個の」（「ａ」または「ａｎ」）実体という用語は、１個または複数個のその実体を指す。例えば、「１個の結合分子（ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」は、１個または複数個の結合分子を表すように理解される。したがって、「１個の」（「ａ」または「ａｎ」）、「１個または複数個」、及び「少なくとも１個」という用語は、本明細書では互換的に使用することができる。
さらに、本明細書で使用する場合の「及び／または」は、他方を伴うまたは伴わない２個の指定された特徴または構成要素の各々を具体的に開示するものとして解釈するものとする。したがって、「及び／または」という用語は、本明細書で「Ａ及び／またはＢ」のような表現で使用される場合、「Ａ及びＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、ならびに「Ｂ」（単独）を含むように意図されている。同様に、「及び／または」という用語は、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」のような表現で使用される場合、以下の実施形態の各々を包含するように意図されている：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）。
別途定義されない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語は、本開示が関連する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。例えば、ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ－Ｓｈｏｗ，２ｎｄ ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、及びｔｈｅ Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓは、本開示で使用されている用語の多くについての全般的辞書を当業者に提供する。
単位、接頭語、及び記号は、国際単位系（ＳＩ）で承認された形態で表される。数値範囲は、その範囲を画定する数字を含む。別途指示されない限り、アミノ酸配列はアミノからカルボキシの方向に左から右に記載される。本明細書に提供される見出しは、本明細書を全体的に参照することによって得ることができる、本開示の種々の実施形態（単数または複数）の制限ではない。したがって、すぐ後に定義される用語は、明細書全体を参照することによって、より十分に定義される。
本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」という用語は、単数形の「ポリペプチド」ならびに複数形の「ポリペプチド」を包含するように意図されており、アミド結合（ペプチド結合の別名でも知られている）によって直線的に結合した単量体（アミノ酸）から構成される分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２個以上のアミノ酸からなる任意の鎖（単数または複数）を指し、特定の長さの生成物を指すわけではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２個以上のアミノ酸からなる鎖（単数または複数）を指すために使用される他の用語が、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のうちのいずれかの代わりに、またはこれらの用語のうちのいずれかと互換的に使用することができる。また、「ポリペプチド」という用語は、ポリペプチドの発現後修飾の産物を指すようにも意図されており、発現後修飾としては、限定されるものではないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、及び既知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質切断、または非天然アミノ酸による修飾が挙げられる。ポリペプチドは、生体供給源から誘導するか、または組換え技術によって生成することができるが、指定された核酸配列から必ずしも翻訳されるわけではない。ポリペプチドは、化学合成を含む任意の様態で生成することができる。
本明細書に開示されるポリペプチドのサイズは、約３アミノ酸以上、５アミノ酸以上、１０アミノ酸以上、２０アミノ酸以上、２５アミノ酸以上、５０アミノ酸以上、７５アミノ酸以上、１００アミノ酸以上、２００アミノ酸以上、５００アミノ酸以上、１，０００アミノ酸以上、または２，０００アミノ酸以上であり得る。ポリペプチドは定義された３次元構造を有し得るが、必ずしもそのような構造を有するわけではない。定義された３次元構造を有するポリペプチドは折り畳まれていると言われ、定義された３次元構造を有するのではなく、多くの異なる立体構造をとり得るポリペプチドは、折り畳まれていないと言われる。本明細書で使用する場合、糖タンパク質という用語は、アミノ酸（例えば、セリンまたはアスパラギン）の酸素含有側鎖または窒素含有側鎖を介してタンパク質に付着されている少なくとも１個の炭水化物部分に結合したタンパク質を指す。
「単離された」ポリペプチドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体とは、その天然の環境にあるのではないポリペプチドが意図されている。特定の精製レベルは要求されない。例えば、単離されたポリペプチドは、その本来のまたは天然の環境から取り出されていることができる。宿主細胞内で発現した組換え産生ポリペプチド及びタンパク質は、本明細書で開示される場合、単離されているとみなされ、任意の好適な技法によって分離、分画、または部分的もしくは実質的に精製された天然または組換えポリペプチドも同様である。
本明細書で使用する場合、「非天然ポリペプチド」という用語またはその文法上の変化形は、「天然」であるもしくは「天然」であり得る、あるいは裁判官、または行政機関もしくは司法機関によって「天然」であると判定または解釈されるポリペプチドの形態を明示的に除外し、ただしこのような形態のみを除外する、条件付き定義である。
本明細書で開示される他のポリペプチドは、上記ポリペプチドの断片、誘導体、類似体、またはバリアント、及びこれらの任意の組合せである。本明細書で開示される場合、「断片」、「バリアント」、「誘導体」、及び「類似体」という用語は、対応する天然の抗体またはポリペプチドの少なくともいくつかの特性（例えば、ある抗原に対し特異的に結合する特性）を保持する任意のポリペプチドを含む。ポリペプチドの断片としては、例えば、本明細書の他の箇所で論じられている特定の抗体断片に加えて、タンパク質分解断片及び欠失断片が挙げられる。バリアント、例えばポリペプチドのバリアントには、上述の断片が含まれ、また、アミノ酸の置換、欠失、または挿入による改変アミノ酸配列を有するポリペプチドも含まれる。ある特定の実施形態では、バリアントは非天然であり得る。非天然バリアントは、当該技術分野で既知の変異誘発技法を用いて生成することができる。バリアントポリペプチドは、保存的または非保存的なアミノ酸の置換、欠失、または付加を含んでもよい。誘導体は、元のポリペプチドには見られない追加的な特徴を示すように改変されたポリペプチドである。例としては、融合タンパク質が挙げられる。バリアントポリペプチドは、本明細書では「ポリペプチド類似体」と呼ばれることもある。本明細書で使用する場合、ポリペプチドの「誘導体」は、官能性側鎖の反応によって化学的に誘導体化された１個または複数個のアミノ酸を有する主題ポリペプチドも指すことができる。また、２０種の標準的なアミノ酸の１つまたは複数の誘導体を含有するペプチドも「誘導体」として含まれる。例えば、４－ヒドロキシプロリンはプロリンの代用とすることができ、５－ヒドロキシリジンはリジンの代用とすることができ、３－メチルヒスチジンはヒスチジンの代用とすることができ、ホモセリンはセリンの代用とすることができ、オルニチンはリジンの代用とすることができる。
「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸が、類似の側鎖を有する別のアミノ酸で置換される置換である。塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、極性無電荷側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含めた、類似の側鎖を有するアミノ酸のファミリーが当該技術分野で定義されている。例えば、チロシンのフェニルアラニンへの置換は保存的置換である。ある特定の実施形態では、本開示のポリペプチド、結合分子、及び抗体の配列における保存的置換は、当該アミノ酸配列を含むポリペプチドまたは抗体が、結合分子が結合する抗原に結合するのを抑止しない。抗原結合を排除しないヌクレオチド及びアミノ酸保存的置換を特定する方法は、当技術分野で周知されている（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１１８０－１ １８７（１９９３）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１２（１０）：８７９－８８４（１９９９）；及びＢｕｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：．４１２－４１７（１９９７）を参照されたい）。
「ポリヌクレオチド」という用語は、単一の核酸及び複数の核酸を包含するように意図されており、単離された核酸分子またはコンストラクト、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、従来的なホスホジエステル結合または従来的でない結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含むことができる。「核酸」または「核酸配列」という用語は、ポリヌクレオチド中に存在する任意の１個以上の核酸セグメント、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ断片を指す。
「単離された」核酸またはポリヌクレオチドとは、その天然の環境から分離されている任意の形態の核酸またはポリヌクレオチドが意図される。例えば、ゲルから精製されたポリヌクレオチド、またはベクターに含有されるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、「単離された」ものとみなされよう。また、クローニングのための制限部位を有するように操作されたポリヌクレオチドセグメント（例えば、ＰＣＲ産物）は、「単離された」とみなされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例としては、異種宿主細胞中で維持された組換えポリヌクレオチド、または緩衝液もしくは食塩水などの非天然溶液中にある（部分的もしくは実質的に）精製されたポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたＲＮＡ分子としては、その転写物が自然界で見られるものではない、ポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロＲＮＡ転写物が挙げられる。単離されたポリヌクレオチドまたは核酸は、合成により生成されたそのような分子をさらに含む。加えて、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターなどの制御エレメントであり得るか、またはこれを含み得る。
本明細書で使用する場合、「非天然ポリヌクレオチド」という用語またはその文法上の変化形は、「天然」であるもしくは「天然」であり得る、あるいは裁判官、または行政機関もしくは司法機関によって「天然」であると判定または解釈される核酸またはポリヌクレオチドの形態を明示的に除外し、ただしこのような形態のみを除外する、条件付き定義である。
本明細書で使用する場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「ストップコドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないものの、コード領域の一部とみなすことができる。ただし、任意の隣接する配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなどは、コード領域の一部ではない。２個以上のコード領域が、（例えば、単一のベクター上の）単一のポリヌクレオチドコンストラクト内に、または（例えば、別々の（異なる）ベクター上の）別々のポリヌクレオチドコンストラクト内に存在してもよい。さらに、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでも２個以上のコード領域を含んでもよく、例えば、単一のベクターが、免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を別々にコードしてもよい。加えて、ベクター、ポリヌクレオチド、または核酸は、別のコード領域と融合したまたは融合していない異種コード領域を含んでもよい。異種コード領域としては、限定されるものではないが、分泌シグナルペプチドまたは異種機能的ドメインのような、特化したエレメントまたはモチーフをコードする領域が挙げられる。
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドまたは核酸はＤＮＡである。ＤＮＡの場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、通常、プロモーター及び／または、１個以上のコード領域と作動可能に連結された他の転写もしくは翻訳コントロールエレメントを含むことができる。作動可能な連結とは、遺伝子産物（例えば、ポリペプチド）のためのコード領域が、制御配列（複数可）の影響下またはコントロール下で遺伝子産物を発現させるような方法で１個以上の制御配列と連結されている場合にいう。２個のＤＮＡ断片（例えば、ポリペプチドコード領域及びそれと連結されたプロモーター）は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、且つ、当該２個のＤＮＡ断片間の結合の性質が、発現調節配列が遺伝子産物の発現を指示する能力を妨害しない、またはＤＮＡテンプレートが転写される能力を妨害しない場合、「作動可能に連結」されている。したがって、プロモーター領域が、ポリペプチドをコードする核酸と作動可能に連結されているとされるのは、当該プロモーターが当該核酸の転写をもたらすことができた場合である。プロモーターは、所定の細胞におけるＤＮＡの実質的な転写を指示する細胞特異的プロモーターであり得る。プロモーター以外の他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を指示するためにポリヌクレオチドと作動可能に連結され得る。
様々な転写制御領域が当業者に知られている。このような領域としては、限定されるものではないが、脊椎動物細胞内で機能する転写制御領域、例えば、限定されるものではないが、サイトメガロウイルス（最初期プロモーター、イントロンＡと連携）、シミアンウイルス４０（初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス）由来のプロモーター及びエンハンサーセグメントが挙げられる。他の転写制御領域としては、アクチン、ヒートショックタンパク質、ウシ成長ホルモン、及びウサギβ－グロビンなどの脊椎動物遺伝子に由来するもの、ならびに真核細胞内で遺伝子発現を制御可能な他の配列が挙げられる。追加の好適な転写制御領域としては、組織特異的プロモーター及びエンハンサー、ならびにリンホカイン誘導性プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘導可能なプロモーター）が挙げられる。
同様に、様々な翻訳制御エレメントが当業者に知られている。このようなエレメントとしては、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終止コドン、ならびにピコルナウイルスに由来するエレメント（特に、内部リボソーム進入部位またはＩＲＥＳ（ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる））が挙げられるが、これらに限定されない。
他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、またはリボソームＲＮＡの形態のＲＮＡであり得る。
ポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌またはシグナルペプチドをコードする追加のコード領域と連結され得る。シグナル仮説によれば、哺乳類細胞によって分泌されるタンパク質は、シグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有し、これは、粗面小胞体を通した伸長中のタンパク質鎖の搬出が開始されると成熟タンパク質から切断される。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが、ポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを有し得、このシグナルペプチドが完成したまたは「完全長」ポリペプチドから切断されて、ポリペプチドの分泌または「成熟」形態をもたらすことを認識している。ある特定の実施形態では、天然シグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖または軽鎖シグナルペプチド、または、配列に作動可能に連結されているポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。代替的に、異種哺乳類シグナルペプチドまたはその機能的誘導体を使用することができる。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）またはマウスβ－グルクロニダーゼのリーダー配列で置換することができる。
本明細書で使用する場合、「結合分子」という用語は、その最も広い意味において、受容体（例えば、エピトープまたは抗原決定基）に対し特異的に結合する分子を指す。本明細書でさらに記載されるように、結合分子は、本明細書に記載の１個以上の結合ドメイン、例えば、「抗原結合ドメイン」を含むことができる。結合分子の非限定例は、特異的結合を保持する、本明細書で詳細に説明される抗体または抗体様分子である。ある特定の実施形態では、「結合分子」は、本明細書で詳細に説明される、抗体、または抗体様分子もしくは抗体由来の分子を含む。
本明細書で使用する場合、「結合ドメイン」または「抗原結合ドメイン」という用語（同じ意味で用いることができる）とは、標的、例えばエピトープ、ポリペプチド、細胞、または器官に特異的に結合するのに必要であり、且つ十分である結合分子、例えば抗体、または抗体様分子もしくは抗体由来分子の領域を意味する。例えば、「Ｆｖ」、例えば、抗体の重鎖可変及び軽鎖可変領域は、２個の別々のポリペプチドサブユニットまたは単鎖のいずれかとして、「結合ドメイン」であるとみなされる。他の抗原結合ドメインとしては、限定されるものではないが、ラクダ種に由来する抗体の単一ドメイン重鎖可変領域（ＶＨＨ）、またはフィブロネクチン足場内で発現する６個の免疫グロブリン相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。本明細書に記載の「結合分子」は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個以上の「抗原結合ドメイン」を含むことができる。
「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語は、本明細書では互換的に使用することができる。抗体（または、本明細書で開示するその断片、バリアント、もしくは誘導体、例えばＩｇＭ様抗体）は、少なくとも、重鎖の可変ドメイン（例えば、ラクダ種由来のもの）、または少なくとも、重鎖及び軽鎖の可変ドメインを含む。脊椎動物系における基本的な免疫グロブリン構造は、比較的十分に理解されている。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．１９８８）を参照されたい。別段の明記がない限り、「抗体」という用語は、抗体の小さな抗原結合断片からフルサイズの抗体（例えば、２個の完全な重鎖及び２個の完全な軽鎖を含むＩｇＧ抗体、４つの完全な重鎖及び４つの完全な軽鎖を含み、Ｊ鎖及び／または分泌成分を含む２量体ＩｇＡ抗体、あるいは、ＩｇＭ由来結合分子、例えば、１０個または１２個の完全な重鎖及び１０個または１２個の完全な軽鎖を含み、任意選択でＪ鎖またはその機能性断片もしくはバリアントを含む、例えばＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体）に及ぶ任意のものを包含する。
「免疫グロブリン」という用語は、生化学的に区別することができるポリペプチドの様々な広範なクラスを含む。当業者であれば、重鎖が、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン（γ、μ、α、β、ε）に分類され、それらの間にいくつかのサブクラス（例えば、γ１～γ４またはα１～α２）が存在することを理解しよう。この鎖の性質が、抗体の「アイソタイプ」をそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥとして決定する。免疫グロブリンのサブクラス（サブタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２などは、十分に特徴づけられており、機能的な特殊化をもたらすことが知られている。これらの免疫グロブリンのそれぞれの改変バージョンは、本開示を考慮すれば当業者に容易に認識可能であり、したがって、これは本開示の範囲内である。
軽鎖は、カッパまたはラムダ（κ、λ）のいずれかに分類される。各重鎖クラスは、カッパ軽鎖またはラムダ軽鎖のいずれかと結合し得る。概して、軽鎖及び重鎖は互いに共有結合しており、免疫グロブリンが、例えば、ハイブリドーマ、Ｂ細胞、または遺伝子操作宿主細胞によって発現したとき、２個の重鎖の「テール」部分は、共有結合的なジスルフィド結合または非共有結合によって互いに結合する。重鎖では、アミノ酸配列は、Ｙ配置の分岐した端部のＮ末端から各鎖の底部のＣ末端まで続く。ある特定の抗体（例えば、ＩｇＧ抗体）の基本構造は、ジスルフィド結合により接続して「Ｙ」構造を形成する２個の重鎖サブユニット及び２個の軽鎖サブユニットを含み、本明細書においてこの構造は「Ｈ２Ｌ２構造」または「結合ユニット」とも呼ばれる。
「結合ユニット」という用語は、本明細書では結合分子の一部を指し、例えば、標準的な「Ｈ２Ｌ２」免疫グロブリン構造に対応する抗体、抗体様分子もしくは抗体由来分子、その抗原結合断片、またはその多量体化断片、すなわち、２個の重鎖またはその断片、及び２個の軽鎖またはその断片を指す。ある特定の実施形態では、例えば、結合分子が２価のＩｇＧ抗体またはその抗原結合断片である場合、「結合分子」及び「結合ユニット」という用語は等価である。他の実施形態では、例えば、結合分子が多量体、例えば二量体ＩｇＡ抗体もしくはＩｇＡ様抗体、五量体ＩｇＭ抗体もしくはＩｇＭ様抗体、もしくは、六量体ＩｇＭ抗体もしくはＩｇＭ様抗体、またはこれらの任意の誘導体である場合、結合分子は、２つ以上の「結合ユニット」を含む。それぞれ、ＩｇＡ二量体の場合は２つ、または、ＩｇＭ五量体もしくは六量体の場合は５つもしくは６つである。結合ユニットは、全長抗体の重鎖及び軽鎖を含む必要はないが、典型的には２価であり、すなわち、上で定義されるような、２個の「抗原結合ドメイン」を含む。本明細書で使用する場合、本開示で提供されるある特定の結合分子は「二量体」であり、ＩｇＡ定常領域またはその多量体化断片を含む、２価の結合ユニットを含む。本開示で提供されるある特定の結合分子は「五量体」または「六量体」であり、５個または６個の２価結合ユニットを含み、この結合ユニットは、ＩｇＭ定常領域またはその多量体化断片もしくはバリアントを含む。結合分子、例えば、２つ以上、例えば、２つ、５つ、または６つの結合ユニットを含む、抗体、または抗体様分子もしくは抗体由来結合分子は、本明細書では「多量体」と呼ばれる。
本明細書で使用する場合の「Ｊ鎖」という用語は、任意の動物種の天然配列ＩｇＭまたはＩｇＡ抗体のＪ鎖、その任意の機能性断片、その誘導体、及び／またはそのバリアントを指し、アミノ酸配列が配列番号２０として示される成熟ヒトＪ鎖を含む。種々のＪ鎖バリアント及び改変されたＪ鎖誘導体が本明細書に開示される。「機能性断片」または「機能性バリアント」は、ＩｇＭ重鎖定常領域と結合し、五量体ＩｇＭ抗体を形成できる（あるいは、ＩｇＡ重鎖定常領域と結合し、二量体ＩｇＡ抗体を形成できる）、それらの断片及びバリアントを含むことを、当業者は理解するであろう。
「改変Ｊ鎖」という用語は、本明細書では、天然Ｊ鎖配列に導入された、または取り付けられた、異種部分、例えば異種ポリペプチド、例えば外来の結合ドメインまたは機能性ドメインを含む、天然配列Ｊ鎖ポリペプチドの誘導体を指するように使用される。導入は、異種ポリペプチドもしくは他の部分の直接的もしくは間接的融合を含む手段、またはペプチドもしくは化学リンカーを介した付着による手段を含む、任意の手段によって達成することができる。「改変ヒトＪ鎖」という用語は、異種部分、例えば異種ポリペプチド、例えば外来の結合ドメインの導入により改変された、配列番号２０のアミノ酸配列の天然配列ヒトＪ鎖、またはその機能性断片、またはその機能性バリアントを包含するが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、異種部分は、ＩｇＭの五量体への、またはＩｇＡの二量体への効率的な重合、及びそのような重合体の標的への結合を妨害しない。例示的な改変Ｊ鎖は、例えば、米国特許第９，９５１，１３４号及び同第１０，６１８，９７８号、ならびに、米国特許出願公開第２０１９－０１８５５７０号に見出すことができ、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用する場合、「ＩｇＭ由来結合分子」という用語は、総称的に、天然ＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、ならびに、抗体抗原結合ドメインまたはそのサブユニットの代わりに非抗体結合ドメイン及び／または機能的ドメインを含む他のＩｇＭ由来結合分子、ならびにそれらの任意の断片、例えば、多量体化断片、バリアント、または誘導体を指す。
本明細書で使用する場合、「ＩｇＭ様抗体」という用語は、一般に、六量体を形成するかまたはＪ鎖と結合して五量体を形成する能力を依然として保持している、バリアント抗体または抗体由来結合分子を指す。ＩｇＭ様抗体または他のＩｇＭ由来結合分子は、典型的には、ＩｇＭ定常領域の少なくともＣμ４－ｔｐドメインを含むが、同じ種由来または異なる種由来の他の抗体アイソタイプ、例えば、ＩｇＧからの重鎖定常領域ドメインを含み得る。ＩｇＭ様抗体または他のＩｇＭ由来結合分子は、同様に、ＩｇＭ様抗体が六量体及び／または五量体を形成できる限り、１個または複数個の定常領域が欠失している抗体断片であることができる。したがって、ＩｇＭ様抗体または他のＩｇＭ由来結合分子は、例えば、ハイブリッドＩｇＭ／ＩｇＧ抗体であることができるか、または、ＩｇＭ抗体の「多量体化断片」であることができる。
「価数」、「２価」、「多価」という用語、及び文法的等価物は、結合ドメイン、例えば、所与の結合分子、例えば抗体、抗体由来分子、もしくは抗体様分子、または所与の結合ユニットにおける、抗原結合ドメインの数を指す。そのため、所与の結合分子、例えばＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、他のＩｇＭ由来結合分子、またはその多量体化断片を参照した「２価」、「４価」、及び「６価」という用語はそれぞれ、２つの抗原結合ドメイン、４つの抗原結合ドメイン、及び６つの抗原結合ドメインが存在することを表す。各結合ユニットが２価である場合の、典型的なＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、または他のＩｇＭ由来結合分子は、１０～１２個の価数を有することができる。２価または多価の結合分子、例えば抗体または抗体由来分子は、単一特異性、すなわち、抗原結合ドメインの全てが同一であることができるか、または、例えば、２つ以上の抗原結合ドメインが異なる、例えば、同一抗原の異なるエピトープに結合するか、もしくは、完全に異なる抗原に結合する場合、二重特異性もしくは多重特異性であることができる。
「エピトープ」という用語は、抗体、抗体様分子、または抗体由来分子の抗原結合ドメインに特異的に結合できる、任意の分子決定基を含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基などの分子の化学的に活性な表面グルーピングを含むことができ、ある特定の実施形態においては、３次元構造特性、及びまたは特定の電荷特性を有することができる。エピトープは、抗体の抗原結合ドメインによって結合される標的の領域である。
「標的」という用語は、最も広い意味で用いられ、結合分子、例えば抗体、抗体様分子、または抗体由来分子により結合され得る物質を含む。標的は、例えば、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、もしくは他の分子、または、このような分子上の最小エピトープであり得る。さらに、「標的」は例えば、結合分子、例えば抗体、抗体様分子、または抗体由来分子により結合可能なエピトープを含む、細胞、器官、または生命体、例えば動物、植物、微生物、もしくはウイルスであることができる。
抗体、抗体様分子、または抗体由来分子の軽鎖及び重鎖の両方は、構造的及び機能的に相同な領域に分割される。「定常」及び「可変」という用語は、機能的に使用される。この点において、可変軽鎖（ＶＬ）部分及び可変重鎖（ＶＨ）部分両方の可変ドメインが、抗原の認識及び特異性を決定することが理解されよう。逆に、軽鎖（ＣＬ）の定常領域ドメイン及び重鎖の定常領域（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはＣＨ４）は、分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合などの生物学的特性を付与する。慣例により、定常領域ドメインのナンバリングは、定常領域ドメインが抗体の抗原結合部位またはアミノ末端からより遠位になるにつれて増加する。Ｎ末端側部分は可変領域であり、Ｃ末端側部分は定常領域であり、ＣＨ３（または、例えばＩｇＭの場合はＣＨ４）ドメイン及びＣＬドメインは実際に、それぞれ重鎖及び軽鎖のカルボキシ末端を含む。
「完全長ＩｇＭ抗体重鎖」とは、Ｎ末端からＣ末端への方向に、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常重鎖定常ドメイン１（ＣＭ１またはＣμ１）、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＭ２またはＣμ２）、抗体重鎖ドメイン３（ＣＭ３またはＣμ３）、及びテールピースを含み得る抗体重鎖定常ドメイン４（ＣＭ４またはＣμ４）を含むポリペプチドである。
上述のとおり、可変領域（複数可）により、結合分子、例えば抗体、抗体様分子、または抗体由来分子が、抗原上のエピトープを選択的に認識し、これに特異的に結合することが可能になる。すなわち、結合分子、例えば抗体、抗体様分子、または抗体由来分子のＶＬドメイン及びＶＨドメイン、または相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットは、結合して抗原結合ドメインを形成する。より具体的には、抗原結合ドメインは、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖の各々の３個のＣＤＲによって定義することができる。ある特定の抗体は、より大きな構造を形成する。例えば、ＩｇＡは、２個のＨ２Ｌ２結合ユニット及びジスルフィド結合を介して共有結合したＪ鎖を含む分子を形成することができ、この分子はさらに分泌成分と連結されることができ、ＩｇＭは、５個または６個のＨ２Ｌ２結合ユニット及び、場合によっては、ジスルフィド結合を介して共有結合したＪ鎖を含む五量体または六量体の分子を形成することができる。
抗体の抗原結合ドメイン内に存在する６個の「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、短い非連続的なアミノ酸配列であり、抗体が水性環境内で３次元構成を呈するときに抗原結合ドメインを形成するように特異的に配置される。抗原結合ドメイン内の残りのアミノ酸は、「フレームワーク」領域と呼ばれ、より小さい分子間可変性を示す。フレームワーク領域は主としてβシート立体構造を採用し、ＣＤＲは、βシート構造を接続するループを形成し、このループは場合によってはβシート構造の一部を形成する。したがって、フレームワーク領域は、鎖間の非共有結合的相互作用によってＣＤＲを正しい方向に配置する足場を形成するように作用する。配置されたＣＤＲによって形成された抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原上のエピトープに対し相補的な表面を定義する。この相補的表面は、抗体がその同族エピトープに対し非共有結合的に結合するのを促進する。ＣＤＲ及びフレームワーク領域をそれぞれ構成するアミノ酸は、様々な異なる方法で定義されているため、任意の所与の重鎖または軽鎖可変領域が当業者によって容易に同定することができる（”Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｋａｂａｔ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９８３）、及びＣｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１－９１７（１９８７）を参照されたい（これらの全体が参照により本明細書に援用される））。
当技術分野内で使用及び／または許容されている用語の定義が２つ以上存在する場合、本明細書で使用する用語の定義は、反対のことが明示的に述べられていない限り、このような意味全てを含むように意図されている。具体的な例は、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内にある非連続的な抗原結合部位を説明するための「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）という用語の使用である。これらの特定の領域は、例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）及びＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）によって説明されており、これらの文献は参照による本明細書に援用される。Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの定義は、アミノ酸を互いに比較した場合のアミノ酸の重複またはサブセットを含む。それでも、抗体またはそのバリアントのＣＤＲに言及するためのいずれかの定義（または当業者に知られている他の定義）の適用は、別段の指示がない限り、本明細書で定義及び使用される用語の範囲内であるように意図されている。上記で引用した各参考文献によって定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸を、比較として以下の表１に示す。特定のＣＤＲを包含する正確な残基番号は、ＣＤＲの配列及びサイズに応じて異なる。当業者は、抗体の可変領域のアミノ酸配列を考慮して、どの残基が特定のＣＤＲを含むかを通例的に決定することができる。
（表１）ＣＤＲの定義*
*表１中の全てのＣＤＲ定義のナンバリングは、Ｋａｂａｔらによって示されるナンバリング慣例に従う（下記参照）。
また、抗体可変ドメインは、ＣＤＲを含めた可変領域セグメントを特定するために、例えば、ＩＭＧＴ情報システム（ｗｗｗ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／）（ＩＭＧＴ（登録商標）／Ｖ－Ｑｕｅｓｔ）を用いて分析することもできる。（例えば、Ｂｒｏｃｈｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３６：Ｗ５０３－５０８，２００８を参照されたい）。
Ｋａｂａｔらは、任意の抗体に適用可能な可変ドメイン配列のためのナンバリングシステムも定義した。当業者は、配列そのものを上回る実験データに依存せずに、この「Ｋａｂａｔナンバリング」のシステムを明瞭に任意の可変ドメイン配列に割り当てることができる。本明細書で使用する場合、「Ｋａｂａｔナンバリング」とは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，”Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）によって示されるナンバリングシステムを指す。ただし、Ｋａｂａｔナンバリングシステムの使用が明示的に述べられない限り、本開示における全てのアミノ酸配列について連続したナンバリングが使用される。
ヒトＩｇＭ定常ドメインに対するＫａｂａｔナンバリングシステムは、Ｋａｂａｔ，ｅｔ．ａｌ．“Ｔａｂｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ，Ｖ－Ｒｅｇｉｏｎｓ，Ｃ－Ｒｅｇｉｏｎｓ，Ｊ－Ｃｈａｉｎ，Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｇｅｎ，Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ，β－２ Ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ａｎｔｉｇｅｎｓ，Ｔｈｙ－１，Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ，Ｃ－Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｔｈｙｍｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ，Ｐｏｓｔ－ｇａｍｍａ Ｇｌｏｂｕｌｉｎ，α－２ Ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，” Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）に見出すことができる。ＩｇＭ定常領域は、連続的に（すなわち、アミノ酸番号１が定常領域の第１のアミノ酸から開始する）、またはＫａｂａｔナンバリングシステムを用いることによってナンバリングされ得る。ヒトＩｇＭ定常領域の２つのアレルの連続的なナンバリング（本明細書で配列番号１（アレルＩＧＨＭ＊０３）及び配列番号２（アレルＩＧＨＭ＊０４）として提示される）と、Ｋａｂａｔ体系によるナンバリングとの比較が下記に記載される。下線付きのアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ体系においては考慮されない（下記の二重下線付きの「Ｘ」は、セリン（Ｓ）（配列番号１）またはグリシン（Ｇ）（配列番号２）であり得る）。
ＩｇＭ重鎖についての連続的ナンバリング（配列番号１または配列番号２）／Ｋａｂａｔナンバリングキー
結合分子、例えば、抗体、抗体様分子、もしくは抗体由来分子、もしくはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体、及び／または多量体断片としては、限定されるものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体、１本鎖抗体、エピトープ結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖｓ、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、１本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＬまたはＶＬドメインのいずれかを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生された断片が挙げられる。ＳｃＦｖ分子は当技術分野で知られており、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号に記載されている。
「特異的に結合する」とは、概して、結合分子（例えば、抗体またはその断片、バリアント、もしくは誘導体）が、抗原結合ドメインを介しエピトープに結合し、その結合が抗原結合ドメインとエピトープとの間に何らかの相補性を伴うことを意味する。この定義によれば、結合分子、例えば、抗体、抗体様分子、または抗体由来分子が自らの抗原結合ドメインを介し、ランダムな無関係のエピトープに結合するよりも容易にあるエピトープに結合する場合、結合分子はそのエピトープに対し「特異的に結合する」と言われる。「特異性」という用語は、本明細書では、ある特定の結合分子がある特定のエピトープに結合する相対的親和性を称するために使用される。例えば、結合分子「Ａ」は、所与のエピトープにおいて結合分子「Ｂ」よりも高い特異性を有するとみなすことができ、または結合分子「Ａ」は、関連するエピトープ「Ｄ」に対するよりも高い特異性でエピトープ「Ｃ」に結合すると言うことができる。
結合分子、例えば、本明細書で開示される抗体またはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、標的抗原に対し、５×１０－２秒－１、１０－２秒－１、５×１０－３秒－１、１０－３秒－１、５×１０－４秒－１、１０－４秒－１、５×１０－５秒－１、または１０－５秒－１、５×１０－６秒－１、１０－６秒－１、５×１０－７秒－１、または１０－７秒－１以下のオフレート（ｋ（ｏｆｆ））で結合すると言うことができる。
結合分子、例えば、本明細書で開示される抗体またはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、標的抗原に対し、１０３Ｍ－１秒－１、５×１０３Ｍ－１秒－１、１０４Ｍ－１秒－１、５×１０４Ｍ－１秒－１、１０５Ｍ－１秒－１、５×１０５Ｍ－１秒－１、１０６Ｍ－１秒－１、または５×１０６Ｍ－１秒－１、または１０７Ｍ－１秒－１以上のオンレート（ｋ（ｏｎ））で結合すると言うことができる。
結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアント、もしくは誘導体が、参照抗体または抗原結合断片の所与のエピトープとの結合をある程度遮断する範囲において、そのエピトープに優先的に結合する場合、参照抗体または抗原結合断片のそのエピトープとの結合を競合的に阻害すると言われる。競合的阻害は、当技術分野で公知の任意の方法、例えば、競合ＥＬＩＳＡアッセイによって測定することができる。結合分子は、参照抗体または抗原結合断片の所与のエピトープとの結合を少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％競合的に阻害すると言うことができる。
本明細書で使用する場合、「親和性」という用語は、個々のエピトープにおける、１個以上の抗原結合ドメイン（例えば、免疫グロブリン分子の結合ドメイン）との結合の強さの尺度を指す。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．１９８８）の２７～２８ページを参照されたい。本明細書で使用する場合、「アビディティー」という用語は、抗原結合ドメイン集団と抗原との間における複合体の全体的安定性を指す。例えば、Ｈａｒｌｏｗの２９～３４ページを参照されたい。アビディティーは、集団内の個々の抗原結合ドメインにおける特定のエピトープとの親和性と、さらに免疫グロブリン及び抗原の結合価との両方に関連する。例えば、２価のモノクローナル抗体と、高度に反復するエピトープ構造（例えば、ポリマー）との間の相互作用は、高いアビディティーの１つと考えられる。２価のモノクローナル抗体と、細胞表面に高密度で存在する受容体との間の相互作用も、高いアビディティーを有すると考えられる。
本明細書で開示される結合分子、例えば、その抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体は、その交差反応性の観点からも説明または特定することができる。本明細書で使用する場合、「交差反応性」という用語は、ある抗原に特異的な結合分子（例えば、抗体またはその断片、バリアント、もしくは誘導体）が第２の抗原と反応する能力を指し、２つの異なる抗原物質間の関連性の尺度である。したがって、結合分子は、その形成を誘発したもの以外のエピトープに結合する場合、交差反応性である。交差反応性エピトープは、概して、誘発性エピトープと同じ相補的な構造的特徴の多くを含み、場合によっては、実際に元のエピトープよりも良好に適合する。
結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、抗原に対するその結合親和性の観点からも説明または特定することができる。例えば、結合分子は、解離定数すなわちＫＤが５×１０－２Ｍ、１０－２Ｍ、５×１０－３Ｍ、１０－３Ｍ、５×１０－４Ｍ、１０－４Ｍ、５×１０－５Ｍ、１０－５Ｍ、５×１０－６Ｍ、１０－６Ｍ、５×１０－７Ｍ、１０－７Ｍ、５×１０－８Ｍ、１０－８Ｍ、５×１０－９Ｍ、１０－９Ｍ、５×１０－１０Ｍ、１０－１０Ｍ、５×１０－１１Ｍ、１０－１１Ｍ、５×１０－１２Ｍ、１０－１２Ｍ、５×１０－１３Ｍ、１０－１３Ｍ、５×１０－１４Ｍ、１０－１４Ｍ、５×１０－１５Ｍ、または１０－１５Ｍ以下で抗原に結合することができる。
１本鎖抗体または他の抗原結合ドメインを含めた「抗原結合抗体断片」は、単独で存在する場合も、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、もしくはＣＨ４ドメイン、Ｊ鎖、または分泌成分のうちの１つ以上と組み合わせて存在する場合もある。また、可変領域（複数可）と、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、もしくはＣＨ４ドメイン、Ｊ鎖、または分泌成分のうちの１つ以上との任意の組合せを含むことができる抗原結合断片も含まれる。結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片は、鳥類及び哺乳類を含めた任意の動物起源からのものとすることができる。抗体は例えば、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、リャマ、ウマ、またはニワトリの抗体であり得る。別の実施形態では、可変領域は、（例えば、サメからの）コンドリコイド起源であり得る。本明細書で使用する場合、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、また、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、または１つ以上のヒト免疫グロブリンに対しトランスジェニックな動物から単離された抗体を含み、後述のように、及び例えばＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ ｅｔ ａｌ．による米国特許第５，９３９，５９８号で説明されているように、場合によっては内在的免疫グロブリンを発現することがあり、また発現しないこともある。本開示の実施形態によれば、本明細書で提供するＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、または他のＩｇＭ由来結合分子は、ＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、または他のＩｇＭ由来結合分子が多量体、例えば六量体またはペンタマーを形成できるあるのであれば、抗体の抗原結合断片、例えば、ｓｃＦｖ断片を含むことができる。本明細書で使用する場合、そのような断片は、「多量体化断片」を含む。
本明細書で使用する場合、「重鎖サブユニット」という用語は、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列を含み、結合分子（例えば、重鎖サブユニットを含む抗体、抗体様分子、または抗体由来分子）は、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば、上部、中部、及び／または下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、またはこれらのバリアントもしくは断片のうちの少なくとも１個を含むことができる。例えば、結合分子（例えば、抗体、抗体様分子、もしくは抗体由来分子、またはその断片、例えば多量体化断片、バリアント、もしくは誘導体）は、限定されるものではないが、ＶＨドメインに加えて、ＣＨ１ドメイン；ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、及びＣＨ２ドメイン；ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン；ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、及びＣＨ３ドメイン；またはＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含むことができる。ある特定の実施形態では、結合分子、例えば、抗体、抗体様分子、もしくは抗体由来分子、またはその断片、例えば、多量体化断片、バリアント、もしくは誘導体は、ＶＨドメインに加えて、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン；またはＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、及びＪ鎖を含み得る。さらに、本開示で使用するための結合分子、例えば、抗体、抗体様分子、または抗体由来分子は、ある特定の定常領域部分、例えば、ＣＨ２ドメインの全部または一部が欠如してもよい。当業者は、このようなドメイン（例えば、重鎖サブユニット）が、元の免疫グロブリン分子とはアミノ酸配列が異なるように改変されてもよいことを理解するであろう。本開示の実施形態によれば、本明細書で提供するＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、または他のＩｇＭ由来結合分子は、ＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、または他のＩｇＭ由来結合分子が多量体、例えば、六量体または五量体を形成することを可能にするのに十分なＩｇＭ重鎖定常領域の部分を含む。本明細書で使用する場合、そのような断片は、「多量体化断片」を含む。
本明細書で使用する場合、「軽鎖サブユニット」という用語は、免疫グロブリン軽鎖に由来するアミノ酸配列を含む。軽鎖サブユニットは少なくともＶＬを含み、さらに、ＣＬ（例えば、ＣκまたはＣλ）ドメインを含んでもよい。
結合分子（例えば、抗体、抗体様分子、抗体由来分子、抗原結合断片、バリアント、もしくはその誘導体、またはその多量体化断片）は、結合分子が認識または特異的に結合する標的、例えば標的抗原のエピトープ（複数可）または一部（複数可）の観点から説明または特定することができる。抗体の抗原結合ドメインと特異的に相互作用する標的抗原の一部は、「エピトープ」または「抗原決定基」である。標的抗原は、単一のエピトープまたは少なくとも２個のエピトープを含むことができ、抗原のサイズ、立体構造、及びタイプに応じて、任意の数のエピトープを含むことができる。
先に示したように、様々な免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造及び３次元構成は周知されている。本明細書で使用する場合、「ＶＨドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端側の可変ドメインを含み、「ＣＨ１ドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖の最初（最もアミノ末端側）の定常領域ドメインを含む。ＣＨ１ドメインは、ＶＨドメインに隣接し、典型的なＩｇＧ重鎖分子のヒンジ領域に対してアミノ末端側にある。
本明細書で使用する場合、「ジスルフィド結合」という用語は、例えば、ポリペプチドのシステイン残基における、２個の硫黄原子の間に形成された共有結合を含む。アミノ酸システインはチオール基を含み、このチオール基によって第２のチオール基とのジスルフィド結合または架橋が形成され得る。ジスルフィド結合は、「鎖内」（すなわち、単一のポリペプチドまたはポリペプチドサブユニットにおいてシステイン残基に結合する）であり得るか、または「鎖間」（すなわち、２個の別々のポリペプチドサブユニット、例えば、抗体重鎖及び抗体軽鎖、２本の抗体重鎖、またはＩｇＭもしくはＩｇＡ抗体重鎖定常領域及びＪ鎖を結合する）であり得る。
本明細書で使用される場合、「キメラ抗体」という用語は、免疫反応性領域または部位が第１の種から得られるかまたはそれに由来し、定常領域（インタクト、部分的、または改変されたものであり得る）が第２の種から得られる抗体を指す。いくつかの実施形態では、標的結合領域または部位は、非ヒト供給源（例えば、マウスまたは霊長類）に由来し、定常領域はヒトのものである。
「多重特異性抗体」または「二重特異性抗体」という用語は、単一の抗体分子内に２個以上の異なるエピトープに対する抗原結合ドメインを有する抗体、抗体様分子、または抗体由来分子を指す。カノニカルな抗体構造に追加される他の結合分子は、２つの結合特異性を用いて構築され得る。二重特異的または多重特異的抗体によるエピトープ結合は、同時であっても順次であってもよい。トリオーマ及びハイブリッドハイブリドーマは、二重特異的抗体を分泌することができる細胞株の２つの例である。二重特異的抗体は、組換え手段によって構築することもできる。（Ｓｔｒｏｈｌｅｉｎ ａｎｄ Ｈｅｉｓｓ，Ｆｕｔｕｒｅ Ｏｎｃｏｌ．６：１３８７－９４（２０１０）、Ｍａｂｒｙ ａｎｄ Ｓｎａｖｅｌｙ，ＩＤｒｕｇｓ．１３：５４３－９（２０１０））。二重特異的抗体はダイアボディでもあってもよい。
本明細書で使用する場合、「組換え抗体」という用語は、可変ドメイン、定常領域、及び／またはＪ鎖が、１個以上のアミノ酸の少なくとも部分的な置換により変化している抗体を指す。ある特定の実施形態では、既知の特異性を有する抗体からの全体のＣＤＲを異種抗体のフレームワーク領域に移植することができる。代替的ＣＤＲは、フレームワーク領域が由来する抗体と同じクラスに由来するか、またはサブクラスの抗体にさえも由来することができるが、ＣＤＲは、異なるクラスの抗体、例えば異なる種からの抗体に由来することもできる。既知の特異性を有する非ヒト抗体からの１つ以上の「ドナー」ＣＤＲがヒト重鎖または軽鎖フレームワーク領域に移植される組換え抗体は、本明細書では「ヒト化抗体」と呼ばれる。ある特定の実施形態では、全てのＣＤＲがドナー可変領域からの完全なＣＤＲで置き換えられるわけではないが、それでもドナーの抗原結合能力をレシピエントの可変ドメインに移行させることができる。例えば、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号、及び第６，１８０，３７０号に記載の説明を考慮すれば、これは十分に当業者の技能範囲内であり、通例の実験を行うことにより、または試行錯誤試験により、機能的組換え抗体またはヒト化抗体が得られる。
本明細書で使用する場合、「組み換えられた」という用語は、合成手段（例えば、組換え技術、ｉｎ ｖｉｔｒｏペプチド合成、ペプチドの酵素的もしくは化学的カップリング、またはこれらの技法の何らかの組合せ）による核酸またはポリペプチド分子の操作を含む。
本明細書で使用する場合、「結合した」、「融合した」、もしくは「融合」という用語、または他の文法上の同等語は、互換的に使用することができる。これらの用語は、化学的コンジュゲーションまたは組換え手段を含めた任意の手段により、２つ以上のエレメントまたは構成要素が一緒に連結することを指す。「インフレーム融合」とは、２つ以上のポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が連結して、元のＯＲＦの翻訳リーディングフレームを維持する様態で、連続的なより長いＯＲＦを形成することを指す。したがって、組換え融合タンパク質は、元のＯＲＦによってコードされたポリペプチドに対応する２つ以上のセグメントを含む単一のタンパク質である（これらのセグメントは、自然界では通常そのように連結されることはない）。リーディングフレームは、融合したセグメント全体にわたってこのように連続的に作製されるものの、セグメントは、例えば、インフレームリンカー配列によって、物理的または空間的に分離することができる。例えば、免疫グロブリン可変領域のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドは、インフレームで融合することができるが、「融合」ＣＤＲが連続的なポリペプチドの一部として同時翻訳される限り、少なくとも１個の免疫グロブリンフレームワーク領域または追加のＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドによって分離することができる。
ポリペプチドの文脈において、「線状配列」または「配列」とは、アミノ末端側からカルボキシル末端側への方向におけるポリペプチド内のアミノ酸の順序であり、配列内で隣り合ったアミノ酸は、ポリペプチドの一次構造内で連続している。ポリペプチドの別の部分に対して「アミノ末端側」または「Ｎ末端側」であるポリペプチドの部分は、連続したポリペプチド鎖内で先に現れる部分である。同様に、ポリペプチドの別の一部に対し「カルボキシ末端側」または「Ｃ末端側」であるポリペプチドの一部は、連続したポリペプチド鎖内で後に現れる一部分である。例えば、典型的な抗体において、可変ドメインは定常領域に対して「Ｎ末端側」であり、定常領域は可変ドメインに対して「Ｃ末端側」である。
本明細書で使用する場合、「発現」という用語は、遺伝子が生化学物質、例えばポリペプチドを生成するプロセスを指す。このプロセスは、細胞内における遺伝子の機能的存在の任意の顕在化を含み、これには、限定されるものではないが、遺伝子ノックダウンならびに一過性発現及び安定性発現の両方が含まれる。これには、限定されるものではないが、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））への遺伝子転写、及びポリペプチド（複数可）へのこのようなｍＲＮＡの翻訳が含まれる。最終的な所望の産物が生化学物質である場合、発現にはその生化学物質及び任意の前駆体の創出が含まれる。遺伝子の発現は「遺伝子産物」をもたらす。本明細書で使用する場合、遺伝子産物は、核酸（例えば、遺伝子の転写によってもたらされるメッセンジャーＲＮＡ）、または転写物から翻訳されるポリペプチドのいずれかであり得る。本明細書に記載される遺伝子産物には、転写後修飾（例えば、ポリアデニル化）を伴う核酸、または翻訳後修飾（例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、タンパク質分解切断など）を伴うポリペプチドがさらに含まれる。
「治療する」もしくは「治療」もしくは「治療すること」、または「緩和する」もしくは「緩和すること」などの用語は、既存の診断された病的状態または障害を治癒する、減速する、その症状を軽減する、及び／またはその進行を停止もしくは減速する治療的措置を指す。「防止する」、「防止」、「回避する」、「阻止」などといった用語は、診断されていない標的とされる病的状態または障害の発症を防止する予防的または防止的措置を指す。したがって、治療を必要とする者には、障害を既に有する者、障害を有する傾向にある者、及び障害が防止されるべきである者を含むことができる。
本明細書で使用する場合、「血清半減期」または「血漿半減期」という用語は、投与後に薬物、例えば、本明細書に記載するような抗体、抗体様分子、もしくは抗体由来分子、またはその断片、例えば多量体断片などの結合分子の、血清中または血漿中濃度が５０％減少するのにかかる時間（例えば、分、時間、または日単位）を指す。下記の２つの半減期が説明され得る：中央コンパートメント（例えば、静脈内送達の場合は血液）から末梢コンパートメント（例えば、組織または臓器）への薬物の再分布プロセスに起因する血漿中濃度の低下速度である、アルファ半減期、α半減期、またはｔ１／２α、及び排泄または代謝プロセスに起因する低下速度である、ベータ半減期、β半減期、またはｔ１／２β。
本明細書で使用する場合、「血漿中薬物濃度－時間曲線下面積」または「ＡＵＣ」という用語は、ある用量の薬物を投与した後の薬物への実際の身体曝露を反映し、ｍｇ＊ｈ／Ｌ単位で表される。この曲線下面積は、０時間（ｔ０）から無限大時間（∞）まで測定され、身体からの薬物の排出速度及び投与された用量に依存する。
本明細書で使用する場合、「平均滞留時間」または「ＭＲＴ」という用語は、薬物が体内に留まる平均的な時間の長さを指す。
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳類」とは、診断、予後、または治療が所望される任意の対象、特に哺乳類対象を意味する。哺乳類対象には、ヒト、飼育動物、家畜、及び動物園、スポーツ、または愛玩動物、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ブタ、ウシ、クマなどが含まれる。
本明細書で使用する場合、「療法から恩恵を受ける対象」及び「治療を必要とする動物」といった表現は、所与の治療薬、例えば、１つ以上の抗原結合ドメインを含む抗体などの結合分子の投与の恩恵を受ける、全ての候補対象のうちの、対象のサブセットを意味する。そのような結合分子（例えば、抗体）は、例えば、診断手順及び／または疾患の治療もしくは防止のために使用することができる。
ＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、または他のＩｇＭ由来結合分子
ＩｇＭは、抗原による刺激に応答してＢ細胞によって産生される第１の免疫グロブリンであり、血清中におよそ１．５ｍｇ／ｍｌで自然に存在し、半減期は約５日である。ＩｇＭは五量体または六量体分子であり、故に、５つまたは６つの結合ユニットを含む。ＩｇＭ結合ユニットは典型的には、２個の軽鎖及び２個の重鎖を含む。ＩｇＧ重鎖定常領域は３つの重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を含有するが、ＩｇＭの重鎖（μ）定常領域はさらに、４つの定常ドメイン（ＣＨ４）を含有し、Ｃ末端「テールピース」を含む。ヒトＩｇＭ定常領域は典型的には、配列番号１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ｐｉｒ｜｜Ｓ３７７６８、ＣＡＡ４７７０８．１、及びＣＡＡ４７７１４．１アレルＩＧＨＭ＊０３と同一）、または、配列番号２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ｓｐ｜Ｐ０１８７１．４、アレルＩＧＨＭ＊０４と同一である）のアミノ酸配列を含む。ヒトＣμ１領域は配列番号１または２の約アミノ酸５から約アミノ酸１０２の範囲であり、ヒトＣμ２領域は配列番号１または２の約アミノ酸１１４から約アミノ酸２０５の範囲であり、ヒトＣμ３領域は配列番号１または２の約アミノ酸２２４から約アミノ酸３１９の範囲であり、Ｃμ４領域は配列番号１または２の約アミノ酸３２９から約アミノ酸４３０であり、テールピースは配列番号１または２の約アミノ酸４３１から約アミノ酸４５３の範囲である。
ＩｇＭは、抗原による刺激に応答してＢ細胞によって産生される第１の免疫グロブリンであり、血清中におよそ１．５ｍｇ／ｍｌで自然に存在し、半減期は約５日である。ＩｇＭは五量体または六量体分子であり、故に、５つまたは６つの結合ユニットを含む。ＩｇＭ結合ユニットは典型的には、２個の軽鎖及び２個の重鎖を含む。ＩｇＧ重鎖定常領域は３つの重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を含有するが、ＩｇＭの重鎖（μ）定常領域はさらに、４つの定常ドメイン（ＣＨ４）を含有し、Ｃ末端「テールピース」を含む。ヒトＩｇＭ定常領域は典型的には、配列番号１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ｐｉｒ｜｜Ｓ３７７６８、ＣＡＡ４７７０８．１、及びＣＡＡ４７７１４．１アレルＩＧＨＭ＊０３と同一）、または、配列番号２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ｓｐ｜Ｐ０１８７１．４、アレルＩＧＨＭ＊０４と同一である）のアミノ酸配列を含む。ヒトＣμ１領域は配列番号１または２の約アミノ酸５から約アミノ酸１０２の範囲であり、ヒトＣμ２領域は配列番号１または２の約アミノ酸１１４から約アミノ酸２０５の範囲であり、ヒトＣμ３領域は配列番号１または２の約アミノ酸２２４から約アミノ酸３１９の範囲であり、Ｃμ４領域は配列番号１または２の約アミノ酸３２９から約アミノ酸４３０であり、テールピースは配列番号１または２の約アミノ酸４３１から約アミノ酸４５３の範囲である。
微小な配列バリエーションを伴うヒトＩｇＭ定常領域の他の形態及びアレルとしては、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＣＡＢ３７８３８．１、及びｐｉｒ｜｜ＭＨＨＵが存在するが、これらに限定されない。本開示の他の箇所で説明及び特許請求される、配列番号１または配列番号２に対応する位置におけるアミノ酸置換、挿入、及び／または欠失も同様に、代替のヒトＩｇＭ配列、加えて、他の種のＩｇＭ定常領域アミノ酸配列に組み込むことができる。
本明細書で提供するヒトＩｇＭ定常領域、及び同じくある特定の非ヒト霊長類ＩｇＭ定常領域は、典型的には、５個の天然アスパラギン（Ｎ）結合型グリコシル化モチーフまたは部位を含む。図１を参照されたい。本明細書で使用する場合、「Ｎ結合型グリコシル化モチーフ」は、アミノ酸配列Ｎ－Ｘ１－Ｓ／Ｔを含むか、またはそれからなる［配列中、Ｎはアスパラギンであり、Ｘ１は、プロリン（Ｐ）を除く任意のアミノ酸であり、Ｓ／Ｔはセリン（Ｓ）またはトレオニン（Ｔ）である］。グリカンは、アスパラギン残基の窒素原子に付着している。例えば、Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ Ｋ，Ｔａｙｌｏｒ ＭＥ（２００６），Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ ｅｄ．）．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ＵＳＡ．を参照されたい。Ｎ結合型グリコシル化モチーフは、配列番号１または配列番号２のヒトＩｇＭ重鎖定常領域において生じ、４６位（「Ｎ１」）、２０９位（「Ｎ２」）、２７２位（「Ｎ３」）、２７９位（「Ｎ４」）、及び４４０位（「Ｎ５」）から始まる。これらの５つのモチーフは、非ヒト霊長類ＩｇＭ重鎖定常領域において保存されており、５つのうちの４つは、マウスＩｇＭ重鎖定常領域において保存されている。図２を参照されたい。本明細書の他の箇所で示すように、ヒトＩｇＭ重鎖定常領域における、Ｎ４を除くこれらの部位の各々は、その部位でのグリコシル化を防止しながらも、依然としてＩｇＭ発現、及び六量体または五量体への集合を可能にするように変異させることができる。
各ＩｇＭ重鎖定常領域は、結合ドメイン、例えば抗原結合ドメイン、例えばｓｃＦｖもしくはＶＨＨ、または、抗原結合ドメインのサブユニット、例えばＶＨ領域と連結されることができる。ある特定の実施形態では、結合ドメインは、非抗体結合ドメイン、例えば受容体エクトドメイン、そのリガンドまたは受容体結合断片、サイトカインもしくはその受容体結合断片、成長因子もしくはその受容体結合断片、神経伝達物質もしくはその受容体結合断片、ペプチドもしくはタンパク質ホルモンもしくはその受容体結合断片、免疫チェックポイントモジュレーターリガンドもしくはその受容体結合断片、または細胞外マトリックスタンパク質の受容体結合断片であることができる。例えば、全体が参照により本明細書に援用されるＰＣＴ公開第２０２０００８６７号を参照されたい。
５つのＩｇＭ結合ユニットは、さらなる小型ポリペプチド鎖（Ｊ鎖）またはその機能性断片、バリアント、もしくは誘導体との複合体を形成し、五量体ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体を形成することができる。ヒトＪ鎖の前駆体形態は、配列番号１９として提示される。シグナルペプチドは、配列番号１９のアミノ酸１から、およそアミノ酸２２まで延び、成熟ヒトＪ鎖は、配列番号１９のおよそアミノ酸２３からアミノ酸１５９まで延びる。成熟ヒトＪ鎖は、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。
例示的なバリアント、及び改変Ｊ鎖を、本明細書の他の箇所で示す。Ｊ鎖がないと、ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体は、典型的には、１２個の抗原結合ドメインからなる六量体に集合する。Ｊ鎖があると、ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体は典型的には集合して、１０個の抗原結合ドメインを含む五量体になり、Ｊ鎖が、さらなる抗原結合ドメイン（複数可）を含む１つ以上の異種ポリペプチドを含む改変Ｊ鎖である場合、１０個以上の抗原結合ドメインを含む五量体になる。５個または６個のＩｇＭ結合ユニットが、五量体または六量体のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体に集合することは、Ｃμ４及びテールピースドメインを伴うと考えられている。例えば、Ｂｒａａｔｈｅｎ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：４２７５５－４２７６２（２００２）を参照されたい。したがって、本開示で提供される五量体または六量体のＩｇＭ抗体は、典型的には、少なくともＣμ４及び／またはテールピースドメイン（本明細書では、まとめてＣμ４－ｔｐとも呼ばれる。）を含む。ＩｇＭ重鎖定常領域の「多量体化断片」はそれ故、少なくともＣμ４－ｔｐドメインを含む。ＩｇＭ重鎖定常領域は、Ｃμ３ドメインもしくはその断片、Ｃμ２ドメインもしくはその断片、Ｃμ１ドメインもしくはその断片、及び／または他のＩｇＭ重鎖ドメインを追加的に含み得る。ある特定の実施形態では、ＩｇＭ由来結合分子、例えば、本明細書で提供するＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、または他のＩｇＭ由来結合分子は、完全ＩｇＭ重（μ）鎖定常ドメイン、例えば、本明細書で提供するものといった、例えば配列番号１もしくは配列番号２、またはそのバリアント、誘導体、もしくは類似体を含むことができる。
特定の実施形態では、本開示は、５つの２価結合ユニットを含む、五量体ＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、または他のＩｇＭ由来結合分子を提供し、各結合ユニットは、それぞれが抗原結合ドメインまたはそのサブユニットと連結された、２つのＩｇＭ重鎖定常領域またはその多量体化断片もしくはバリアントを含む。ある特定の実施形態では、２個のＩｇＭ重鎖定常領域は、ヒト重鎖定常領域である。
いくつかの実施形態では、多量体結合分子は六量体であり、６個の２価結合ユニットまたはそのバリアントもしくは断片を含む。いくつかの実施形態では、多量体結合分子は六量体であり、６個の２価結合ユニットまたはそのバリアントもしくは断片を含み、各結合ユニットは、２つのＩｇＭ重鎖定常領域、またはその多量体化断片もしくはバリアントを含む。
ＩｇＭ重鎖定常領域は、定常領域が、ＩｇＭもしくはＩｇＭ様抗体で所望の機能を果たす、例えば、第２のＩｇＭ定常領域と会合して１、２、もしくは３個の抗原結合ドメイン（複数可）を含む結合ユニットを形成する、且つ／または、他の結合ユニットと会合し（及び、五量体、Ｊ鎖の場合に）六量体または五量体を形成することができることを条件として、Ｃμ１ドメインまたはその断片もしくはバリアント、Ｃμ２ドメインまたはその断片もしくはバリアント、Ｃμ３ドメインまたはその断片もしくはバリアント、Ｃμ４ドメインまたはその断片もしくはバリアント、及び／あるいはテールピース（ｔｐ）またはその断片もしくはバリアントのうちの１つ以上を含むことができる。ある特定の実施形態では、個別の結合ユニット内にある２つのＩｇＭ重鎖定常領域またはその断片もしくはバリアントはそれぞれ、Ｃμ４ドメインまたはその断片もしくはバリアント、テールピース（ｔｐ）またはその断片もしくはバリアント、あるいはＣμ４ドメイン及びｔｐまたはそれらの断片もしくはバリアントの組合せを含む。ある特定の実施形態では、個別の結合ユニット内にある２つのＩｇＭ重鎖定常領域またはその断片もしくはバリアントはそれぞれ、Ｃμ３ドメインまたはその断片もしくはバリアント、Ｃμ２ドメインまたはその断片もしくはバリアント、Ｃμ１ドメインまたはその断片もしくはバリアント、あるいはこれらのいずれかの組合せをさらに含む。
いくつかの実施形態では、ＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体の結合ユニットは、２つの軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体の結合ユニットは、軽鎖の２つの断片を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖はカッパ軽鎖である。いくつかの実施形態では、軽鎖はラムダ軽鎖である。いくつかの実施形態では、各結合ユニットは、免疫グロブリン軽鎖定常領域に対してアミノ末端側に位置するＶＬをそれぞれ含む２つの免疫グロブリン軽鎖を含む。
本明細書で提供するＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、または他のＩｇＭ由来結合分子が五量体である場合、ＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、または他のＩｇＭ由来結合分子は、典型的には、Ｊ鎖、またはその機能性断片もしくはバリアントをさらに含む。ある特定の実施形態では、Ｊ鎖は、本明細書の他の箇所に記載されているような、Ｊ鎖に結合した１つ以上の異種部分をさらに含む、改変Ｊ鎖またはそのバリアントである。ある特定の実施形態では、Ｊ鎖は、本明細書の他の箇所で論じるように、本明細書で提供するＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、または他のＩｇＭ由来結合分子の血清半減期に影響を及ぼす、例えば、これを向上させるように、変異することができる。ある特定の実施形態では、Ｊ鎖は、本明細書の他の箇所で論じるように、グリコシル化に影響を及ぼすように変異することができる。
ＩｇＭ重鎖定常領域は、定常領域が、ＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、または他のＩｇＭ由来結合分子において所望の機能を果たすことができる、例えば、第２のＩｇＭ定常領域と会合して１、２、もしくは３個の抗原結合ドメインを含む結合ユニットを形成することができ、且つ／または他の結合ユニットと会合して（五量体、Ｊ鎖の場合に）六量体または五量体を形成することができることを条件として、Ｃμ１ドメインまたはその断片もしくはバリアント、Ｃμ２ドメインまたはその断片もしくはバリアント、Ｃμ３ドメインまたはその断片もしくはバリアント、及び／あるいはＣμ４ドメインまたはその断片もしくはバリアントのうちの１つ以上を含むことができる。ある特定の実施形態では、個別の結合ユニット内にある２つのＩｇＭ重鎖定常領域またはその断片もしくはバリアントはそれぞれ、Ｃμ４ドメインまたはその断片もしくはバリアント、テールピース（ｔｐ）またはその断片もしくはバリアント、あるいはＣμ４ドメイン及びＴＰまたはそれらの断片もしくはバリアントの組合せを含む。ある特定の実施形態では、個別の結合ユニット内にある２つのＩｇＭ重鎖定常領域またはその断片もしくはバリアントはそれぞれ、Ｃμ３ドメインまたはその断片もしくはバリアント、Ｃμ２ドメインまたはその断片もしくはバリアント、Ｃμ１ドメインまたはその断片もしくはバリアント、あるいはこれらのいずれかの組合せをさらに含む。
改変Ｊ鎖
ある特定の実施形態では、五量体ＩｇＭ由来結合分子、例えば、本明細書で提供するＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体のＪ鎖は、例えば、ＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、または他のＩｇＭ由来結合分子が、その結合標的（複数可）に集合及び結合する能力に干渉することなく、異種部分、または２つ以上の異種部分、例えばポリペプチドを導入することにより、改変することができる。全体が本明細書に参照により組み込まれる、米国特許第９，９５１，１３４号及び同第１０，６１８，９７８号、ならびに、米国特許出願公開第ＵＳ－２０１９－０１８５５７０号を参照されたい。したがって、本明細書の他の箇所に記載する多重特異性ＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体を含む、本明細書で提供するＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体は、Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントに導入、例えば融合または化学的にコンジュゲートした、異種部分、例えば異種ポリペプチドを含む、改変Ｊ鎖またはその機能性断片もしくはバリアントを含むことができる。ある特定の実施形態では、異種部分は、Ｊ鎖にインフレームで融合しているか、あるいはＪ鎖またはその断片もしくはバリアントに化学的にコンジュゲートしている、ペプチドまたはポリペプチド配列であることができる。ある特定の実施形態では、異種ポリペプチドは、典型的には、少なくとも５個のアミノ酸、ただし２５個以下のアミノ酸からなる、ペプチドリンカー、例えばペプチドリンカーを介して、Ｊ鎖またはその機能性断片に融合する。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号２７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２８）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３０）、または、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３１）からなる。ある特定の実施形態では、異種部分は、Ｊ鎖にコンジュゲートした化学的部分であることができる。Ｊ鎖に結合させるべき異種部分としては、結合部分、例えば、抗体もしくはその抗原結合断片、例えば、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、サイトカイン、例えばＩＬ－２もしくはＩＬ－１５（例えば、その全体が本明細書に参照により組み込まれている、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０４６３７９号を参照されたい。）、ＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、もしくは他のＩｇＭ由来結合分子の半減期を増加させることができる安定化ペプチド、または、ポリマーもしくは細胞毒素などの化学的部分が挙げることができるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、異種部分は、結合分子、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはＨＳＡ結合分子の半減期を増加させることができる、安定化ペプチドを含む。
ある特定の実施形態では、五量体ＩｇＭ由来結合分子、例えば、本明細書で提供するＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体のＪ鎖は、例えば、ＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、または他のＩｇＭ由来結合分子が、その結合標的（複数可）に集合及び結合する能力に干渉することなく、異種部分、または２つ以上の異種部分、例えばポリペプチドを導入することにより、改変することができる。全体が本明細書に参照により組み込まれる、米国特許第９，９５１，１３４号及び同第１０，６１８，９７８号、ならびに、米国特許出願公開第ＵＳ－２０１９－０１８５５７０号を参照されたい。したがって、本明細書の他の箇所に記載する多重特異性ＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体を含む、本明細書で提供するＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体は、Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントに導入、例えば融合または化学的にコンジュゲートした、異種部分、例えば異種ポリペプチドを含む、改変Ｊ鎖またはその機能性断片もしくはバリアントを含むことができる。ある特定の実施形態では、異種部分は、Ｊ鎖にインフレームで融合しているか、あるいはＪ鎖またはその断片もしくはバリアントに化学的にコンジュゲートしている、ペプチドまたはポリペプチド配列であることができる。ある特定の実施形態では、異種ポリペプチドは、典型的には、少なくとも５個のアミノ酸、ただし２５個以下のアミノ酸からなる、ペプチドリンカー、例えばペプチドリンカーを介して、Ｊ鎖またはその機能性断片に融合する。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号２７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２８）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３０）、または、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３１）からなる。ある特定の実施形態では、異種部分は、Ｊ鎖にコンジュゲートした化学的部分であることができる。Ｊ鎖に結合させるべき異種部分としては、結合部分、例えば、抗体もしくはその抗原結合断片、例えば、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、サイトカイン、例えばＩＬ－２もしくはＩＬ－１５（例えば、その全体が本明細書に参照により組み込まれている、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０４６３７９号を参照されたい。）、ＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、もしくは他のＩｇＭ由来結合分子の半減期を増加させることができる安定化ペプチド、または、ポリマーもしくは細胞毒素などの化学的部分が挙げることができるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、異種部分は、結合分子、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはＨＳＡ結合分子の半減期を増加させることができる、安定化ペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、改変Ｊ鎖は抗原結合ドメインを含むことができ、抗原結合ドメインとしては、限定されるものではないが、標的抗原に対し特異的に結合することができるポリペプチド（小ペプチドを含む）が挙げられる。ある特定の実施形態では、改変Ｊ鎖と連結された抗原結合ドメインは、本明細書の他の箇所に記載される抗体またはその抗原結合断片であり得る。ある特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、例えば、ラクダ科抗体またはコンドリクトイド（ｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ）抗体からの、ｓｃＦｖ抗原結合ドメインまたは一本鎖抗原結合ドメインであり得る。抗原結合ドメインは、Ｊ鎖の機能または結合したＩｇＭまたはＩｇＡ抗体の機能を妨害することなく、抗原結合ドメインのその結合標的への結合を可能にする任意の位置でＪ鎖に導入することができる。挿入箇所としては、限定されるものではないが、Ｃ末端もしくはその付近、Ｎ末端もしくはその付近、またはＪ鎖の３次元構造に基づいてアクセス可能な内部の箇所が挙げられる。ある特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号２０のシステイン残基９２と１０１との間で配列番号２０の成熟ヒトＪ鎖に導入することができる。さらなる実施形態では、抗原結合ドメインは、グリコシル化部位またはその付近で配列番号２０のヒトＪ鎖に導入することができる。さらなる実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｃ末端から約１０アミノ酸残基以内、または、Ｎ末端から約１０アミノ酸以内の、配列番号２０のヒトＪ鎖に導入することができる。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供するＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、または他のＩｇＭ由来結合分子のＪ鎖は、例えば、本明細書で提供する、ＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＡ様抗体、またはＩｇＭもしくはＩｇＡ由来結合分子の血清半減期を変化させることができる１つ以上のアミノ酸置換を含む、バリアントＪ鎖である。例えば、ある特定のアミノ酸置換、欠失、または挿入は、バリアントＪ鎖内の１つ以上の単独のアミノ酸置換、欠失、または挿入を除いて同一であり、且つ同一の動物種に対して同一の方法を用いて投与される、ＩｇＭ由来参照結合分子と比較して、対象動物への投与された際に、増加した血清半減期を示す、ＩｇＭ由来結合分子をもたらすことができる。ある特定の実施形態では、バリアントＪ鎖は、参照Ｊ鎖と比較して、１つ、２つ、３つ、または４つの単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を含むことができる。
いくつかの実施形態では、多量体結合分子は、１つ以上のポリマーＩｇ受容体（例えば、ｐＩｇＲ、Ｆｃα－ｍｕ受容体（ＦｃαμＲ）、またはＦｃ ｍｕ受容体（ＦｃμＲ））に対するグリコシル化の低下、または結合の低下を伴う、本明細書に記載するバリアント配列などの、バリアントＪ鎖配列を含むことができる。例えば、全体が参照により本明細書に援用されるＰＣＴ公開番号第２０１９／１６９３１４号を参照されたい。ある特定の実施形態では、本明細書で提供するＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、または他のＩｇＭ由来結合分子のＪ鎖は、成熟野生型ヒトＪ鎖（配列番号２０）のアミノ酸Ｙ１０２に対応するアミノ酸位置にアミノ酸置換を含む。「成熟野生型ヒトＪ鎖のアミノ酸Ｙ１０２に対応するアミノ酸」とは、ヒトＪ鎖におけるＹ１０２に相同である任意の種のＪ鎖の配列におけるアミノ酸を意味する。全体が参照により本明細書に援用されるＰＣＴ公開番号第２０１９／１６９３１４号を参照されたい。配列番号２０におけるＹ１０２に対応する位置は、少なくとも４３の他の種のＪ鎖アミノ酸配列において保存されている。参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，９５１，１３４号の図４を参照されたい。配列番号２０のＹ１０２に対応する位置におけるある特定の変異は、ある特定の免疫グロブリン受容体、例えば、ヒトもしくはマウスＦｃαμ受容体、マウスＦｃμ受容体、及び／または、ヒトもしくはマウスポリマーＩｇ受容体（ｐＩｇ受容体）の、変異Ｊ鎖を含むＩｇＭ五量体への結合を示すことができる。配列番号２０のＹ１０２に対応するアミノ酸において変異を含む、ＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、及び他のＩｇＭ由来結合分子は、置換を除いて同一であり、且つ同一の方法で同一種に投与される、対応する抗体、抗体様分子、または結合分子よりも、動物に投与されるときに、改善された血清半減期を有する。ある特定の実施形態では、配列番号２０のＹ１０２に対応するアミノ酸を、任意のアミノ酸で置換することができる。ある特定の実施形態では、配列番号２０のＹ１０２に対応するアミノ酸は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、またはアルギニン（Ｒ）で置換することができる。特定の実施形態では、配列番号２０のＹ１０２に対応するアミノ酸を、アラニンで置換することができる。特定の実施形態では、Ｊ鎖、またはその機能性断片もしくはバリアントは、「Ｊ＊」と本明細書では呼ばれる、バリアントヒトＪ鎖であり、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。
グリコバリアントＩｇＭ由来結合分子
本開示は、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、または少なくとも１２個のバリアントＩｇＭ由来重鎖を含む、単離されたＩｇＭ由来結合分子、例えば、ＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、または他のＩｇＭ由来結合分子を提供する。本開示により提供されるように、バリアントＩｇＭ由来重鎖（複数可）は、結合ドメイン（例えば、対象となる標的に特異的に結合する抗体の抗原結合ドメイン）と連結されている、完全長ＩｇＭ重鎖定常領域のバリアント、ＩｇＭ重鎖定常領域の多量体化断片、または、多量体化に必要なＩｇＭ重鎖定常領域の少なくとも最小部分を含むハイブリッド定常領域であることができる、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域を含む。標的に結合する結合ドメインは、例えば、抗原結合ドメイン、または抗原結合ドメインのサブユニット、例えば、抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）であることができる。本開示は、対象となる任意の標的に結合する結合分子に関する。
本開示は、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、または少なくとも１２個のバリアントＩｇＭ由来重鎖を含む、単離されたＩｇＭ由来結合分子、例えば、ＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、または他のＩｇＭ由来結合分子を提供する。本開示により提供されるように、バリアントＩｇＭ由来重鎖（複数可）は、結合ドメイン（例えば、対象となる標的に特異的に結合する抗体の抗原結合ドメイン）と連結されている、完全長ＩｇＭ重鎖定常領域のバリアント、ＩｇＭ重鎖定常領域の多量体化断片、または、多量体化に必要なＩｇＭ重鎖定常領域の少なくとも最小部分を含むハイブリッド定常領域であることができる、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域を含む。標的に結合する結合ドメインは、例えば、抗原結合ドメイン、または抗原結合ドメインのサブユニット、例えば、抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）であることができる。本開示は、対象となる任意の標的に結合する結合分子に関する。
本明細書で提供する１つまたは複数のバリアントＩｇＭ重鎖定常領域としては、結合分子のグリコシル化、例えば、アスパラギン（Ｎ）結合型グリコシル化に影響を及ぼす変化を含む。例えば、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域（複数可）は、例えば、５つの自然に存在するアスパラギン（Ｎ）結合型グリコシル化モチーフ（ヒトＩｇＭ重鎖定常領域の場合）におけるグリコシル化を防止するために変異した、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域の当該モチーフのうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、または４つにおいて、グリコシル化を破壊する、例えば防止する、１つ以上の単独のアミノ酸挿入、欠失、または置換を含むことができ、Ｎ結合型グリコシル化モチーフはアミノ酸配列Ｎ－Ｘ１－Ｓ／Ｔを含む［配列中、Ｎはアスパラギンであり、Ｘ１は、プロリンを除く任意のアミノ酸であり、Ｓ／Ｔはセリンまたはトレオニンである］。ヒト及び非ヒト霊長類ＩｇＭ重鎖定常領域は典型的には、５つのＮ結合型グリコシル化モチーフを有し、マウスＩｇＭ重鎖定常領域は典型的には、４つのＮ結合型グリコシル化モチーフを有する。図２を参照されたい。
結合分子のグリコシル化に影響を及ぼす変化を有するＩｇＭ由来結合分子は、当該結合分子のある特定の生理的、薬物動態学的、または薬力学的特性を変化させる、例えば、改善することができる。例えば、そのような結合分子は、発現及び製造の間に、改善された血清半減期を示すことができ、且つ／または、より均質な抗体の調製を可能にすることができる。したがって、そのような結合分子を組み込んで、より安全に、より効果的に、且つより容易に、バイオ製剤を製造することができる。
本明細書で提供するように、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域は、配列番号１（アレルＩＧＨＭ＊０３）または配列番号２（アレルＩＧＨＭ＊０４）のアミノ酸４６（モチーフＮ１）、アミノ酸２０９（モチーフＮ２）、アミノ酸２７２（モチーフＮ３）、アミノ酸２７９（モチーフＮ４）、及びアミノ酸４４０（モチーフＮ５）に対応するアミノ酸位置から始まる５つのＮ結合型グリコシル化モチーフＮ－Ｘ１－Ｓ／Ｔを含むヒトＩｇＭ重鎖定常領域（例えば、配列番号１または配列番号２）に由来することができる。バリアントＩｇＭ重鎖定常領域は同様に、例えば、他のヒトＩｇＭアレルに、非ヒト霊長類ＩｇＭ重鎖定常領域に、または、他の種、例えば、げっ歯類ＩｇＭ重鎖定常領域、例えばマウスＩｇＭ重鎖定常領域のＩｇＭ重鎖定常領域に由来することができる。ヒトＩｇＭ重鎖定常領域中の５つのＮ結合型グリコシル化モチーフ、すなわちＮ１～Ｎ５は、他の霊長類種で保存されているが、マウスＩｇＭ重鎖定常領域では、位置Ｎ３におけるＮ結合型グリコシル化モチーフが保存されていない。図２を参照されたい。
ある特定の実施形態では、モチーフＮ１、モチーフＮ２、モチーフＮ３、及び／またはモチーフＮ５に対応するＮ－Ｘ１－Ｓ／Ｔモチーフのうちの、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つは、当該モチーフにおけるグリコシル化を防止するアミノ酸挿入、欠失、または置換を含む。グリコシル化の防止は、アスパラギン残基を置換する、もしくは、アスパラギン残基を非アスパラギン残基で置換することにより、または、モチーフの３番目の位置におけるセリンもしくはトレオニン残基を取り除く、もしくは、セリンもしくはトレオニン残基を、非セリンもしくは非トレオニン残基で置換することにより、達成することができる。モチーフにおけるグリコシル化の防止は、モチーフの位置Ｘ１において、プロリン残基を挿入することによってもまた実現することができる。
したがって、ＩｇＭ由来結合分子、例えば、本明細書で提供するＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、または他のＩｇＭ由来結合分子は、モチーフＮ１、モチーフＮ２、モチーフＮ３、モチーフＮ５、またはモチーフＮ１、Ｎ２、Ｎ３、もしくはＮ５の２つ以上、３つ以上、もしくは４つ全てのいずれかの組合せの、Ｎ、Ｘ１、またはＳ／Ｔ位置のいずれかにおける、アミノ酸挿入、欠失、または置換を含むことができ、アミノ酸挿入、欠失、または置換は、当該モチーフにおけるグリコシル化を防止する。
ある特定の実施形態では、ＩｇＭ由来結合分子、例えば、本明細書で提供するＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、または他のＩｇＭ由来結合分子は、配列番号１もしくは配列番号２のアミノ酸Ｎ４６、Ｎ２０９、Ｎ２７２、もしくはＮ４４０に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換、または、配列番号１もしくは配列番号２のＮ４６、Ｎ２０９、Ｎ２７２、もしくはＮ４４０におけるアミノ酸置換を含むことができ、置換アミノ酸は、任意のアミノ酸である。本明細書で使用する場合、配列中の特定のアミノ酸に対応する「アミノ酸位置」は、相同配列、例えば非ヒト霊長類重鎖定常領域中の保存モチーフ、または、ヒトＩｇＭ定常領域の別のアレル中の、アミノ酸であることができる。ある特定の実施形態では、ＩｇＭ由来結合分子、例えば、本明細書で提供するＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、または他のＩｇＭ由来結合分子は、配列番号１もしくは配列番号２のアミノ酸Ｓ４８、Ｓ２１１、Ｓ２７４、もしくはＳ４４２に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換；または、配列番号１もしくは配列番号２のＳ４８、Ｓ２１１、Ｓ２７４、もしくはＳ４４２におけるアミノ酸置換［置換後のアミノ酸は、トレオニンを除く任意のアミノ酸である］；または当該アミノ酸置換のうちの２つ以上、３つ以上、もしくは４つ以上の任意の組合せを含むことができる。
例えば、ＩｇＭ由来結合分子、例えば、本明細書で提供するＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、または他のＩｇＭ由来結合分子は、配列番号１もしくは配列番号２のＮ４６Ｘ２、Ｎ４６Ａ、Ｎ４６Ｄ、Ｎ４６Ｑ、Ｎ４６Ｋ、Ｓ４８Ｘ３、Ｓ４８Ａ、Ｎ２２９Ｘ２、Ｎ２２９Ａ、Ｎ２２９Ｄ、Ｎ２２９Ｑ、Ｎ２２９Ｋ、Ｓ２３１Ｘ３、Ｓ２３１Ａ、Ｎ２７２Ｘ２、Ｎ２７２Ａ、Ｎ２７２Ｄ、Ｎ２７２Ｑ、Ｎ２７２Ｋ、Ｓ２７４Ｘ３、Ｓ２７４Ａ、Ｎ４４０Ｘ２、Ｎ４４０Ａ、Ｎ４４０Ｄ、Ｎ４４９Ｑ、Ｎ４４９Ｋ、Ｓ２４２Ｘ３、もしくはＳ４２４Ａに対応するアミノ酸置換、または当該アミノ酸置換のうちの２つ以上、３つ以上、もしくは４つ以上の任意の組合せを含むことができ、ここで、Ｘ２は任意のアミノ酸であり、Ｘ３はトレオニンを除く任意のアミノ酸である。当業者は、さらなるアミノ酸置換、欠失、及び／または挿入が同様に所与のモチーフにおいてＮ結合型グリコシル化を防止することができることを容易に理解するであろう。
ある特定の実施形態では、ＩｇＭ由来結合分子、例えば、ＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、または他のＩｇＭ由来結合分子のバリアントＩｇＭ重鎖定常領域は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、または配列番号１８のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＩｇＭ定常領域である。これらの配列のそれぞれにおいて、Ｘ１９１は、ＧまたはＳであることができる。
ＩｇＭ由来結合分子、例えば、本明細書で提供するＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、または他のＩｇＭ由来結合分子のバリアントＩｇＭ重鎖定常領域をさらに変異させ、少なくとも１つの新しいアスパラギン（Ｎ）結合型グリコシル化モチーフをバリアントＩｇＭ重鎖定常領域に導入することができ、少なくとも１つの新しいＮ結合型グリコシル化モチーフは、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域における、ＩｇＭ抗体において自然にはグリコシル化されない部位に導入される。このような新しいＮ結合型グリコシル化モチーフは、例えば、血清半減期を改善する、製造収率を改善する、または、結合分子により担持されるグリカンに一層の一貫性を付与することにより、ＩｇＭ由来結合分子の物理的、薬物動態学的、または薬力学的性質を改善することができる。ある特定の実施形態では、新しいＮ結合型グリコシル化モチーフは、異なる免疫グロブリンアイソタイプ中に存在するＮ結合型グリコシル化モチーフの位置に対応する、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域中の位置において導入することができる。例えば、図１のアラインメントを参照されたい。ある特定の実施形態では、異なる免疫グロブリンアイソタイプは、ヒトＩｇＧ１（例えば配列番号３４）、ヒトＩｇＧ２（例えば配列番号３５）、ヒトＩｇＧ３（例えば配列番号３６）、ヒトＩｇＧ４（例えば配列番号３７）、ヒトＩｇＡ１（例えば配列番号３８）、ヒトＩｇＡ２（例えば配列番号３９）、ヒトＩｇＤ（例えば配列番号４０）、及び、ヒトＩｇＥ（例えば配列番号４１）からなる群から選択されるヒト免疫グロブリンアイソタイプである。これらの配列を以下に提示する。当業者は容易に、これらの配列のアレル多様体が存在し、本開示に含められることを理解するであろう。
本明細書で提供するＩｇＭ由来結合分子は、結合ドメインまたはそのサブユニット、例えば、抗体抗原結合ドメイン、例えば、対象となる標的に特異的に結合する、抗体抗原結合ドメインのｓｃＦｖ、ＶＨＨ、またはＶＨサブユニットと連結されている、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、または少なくとも１２個のグリコバリアントＩｇＭ重鎖定常領域を含む。ある特定の実施形態では、標的は、標的エピトープ、標的抗原、標的細胞、標的器官、または標的ウイルスである。標的としては、腫瘍抗原、他の腫瘍学的標的、免疫腫瘍学的標的（免疫チェックポイント阻害剤など）、感染症標的（例えば、感染細胞の表面で発現するウイルス性抗原）、血液脳関門輸送に関与する標的抗原、神経変性疾患及び神経炎症性疾患に関与する標的抗原、ならびにこれらのいずれかの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。このような標的に結合する例示的な標的及び結合ドメインは、本明細書の他の箇所で示され、例えば、米国特許公開公報第ＵＳ－２０１９－０１００５９７号、ＰＣＴ公開番号第ＷＯ ２０１７／０５９３８７号（及び、関連する米国公開番号第ＵＳ－２０１９－０１８５５７０号）、ＷＯ／２０１７／１９６８６７、ＷＯ ２０１８／０１７８８８、ＷＯ ２０１８／０１７８８９、ＷＯ ２０１８／０１７７６１、ＷＯ ２０１８／０１７７６３、ＷＯ ２０１８／１８７７０２、ＷＯ２０１９１６５３４０、ＷＯ ２０１９／１６９３１４、もしくはＷＯ ２０２００８６７４５、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０４６３７９号、もしくはＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０４６３３５、または、米国特許第９，９５１，１３４号、同第９，９３８，３４７号、同第８，３７７，４３５号、同第９，４５８，２４１号、同第９，４０９，９７６号、同第１０，３５１，６３１号、同第１０，５７０，１９１号、同第１０，６０４，５５９号、もしくは同第１０，６１８，９７８号に見出すことができる。これらの出願及び／または特許のそれぞれは、それら全体が本明細書に参照により組み込まれる。
ある特定の実施形態では、標的は、腫瘍特異的抗原、すなわち、主として腫瘍もしくはがん細胞のみで発現する、または、成人の通常の健常細胞にてのみ、検出不可能な濃度で発現し得る、標的抗原である。ある特定の実施形態では、標的は、腫瘍関連抗原、すなわち、健常細胞及びがん性細胞の両方で発現するが、通常の健常細胞よりも、がん性細胞にてはるかに高い密度で発現する、標的抗原である。例示的な腫瘍特異的及び腫瘍関連抗原としては、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ２とも呼ばれる）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）、受容体チロシン－プロテインキナーゼＥｒｂＢ４、細胞毒性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ受容体－１（ＶＥＧＦＲ１）、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ５２、ＣＤ３０、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＤ３８、ガングリオシドＧＤ２、シグナル伝達リンパ球性活性化分子ファミリーメンバー７（ＳＬＡＭＦ７）の自己リガンド受容体、血小板由来成長因子Ａ（ＰＤＧＦＲＡ）、ＣＤ２２、ＦＬＴ３（ＣＤ１３５）、ＣＤ１２３、ＭＵＣ－１６、がん胎児性抗原関連細胞接着分子１（ＣＥＡＣＡＭ－１）、メソセリン、腫瘍関連カルシウムシグナル伝達物質２（Ｔｒｏｐ－２）、グリピカン－３（ＧＰＣ－３）、ヒト血液群Ｈ型１三糖（Ｇｌｏｂｏ－Ｈ）、シアリルＴｎ抗原（ＳＴｎ抗原）、またはＣＤ３３が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、これらの標的抗原は、いくつかの異なる名前で文献に現れるが、これらの周知の治療標的は、オンラインで入手可能なデータベース、例えばＥＸＰＡＳＹ．ｏｒｇを用いて、容易に識別可能であることを理解するであろう。
他の腫瘍関連及び／または腫瘍特異的抗原としては、ＤＬＬ４、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、Ｎｏｔｃｈ４、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、ｃ－Ｍｅｔ、ＩＧＦ－１Ｒ、パッチド、ヘッジホッグファミリーポリペプチド、ＷＮＴファミリーポリペプチド、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＩＬ－６、ＴＮＦα、ＩＬ－２３、ＩＬ－１７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ３、ＣＥＡ、Ｍｕｃ１６、ＰＳＣＡ、ＣＤ４４、ｃ－Ｋｉｔ、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４、ＢＭＰファミリーポリペプチド、ＢＭＰＲ１ａ、ＢＭＰＲ１ｂ、または、ＴＮＦ受容体スーパーファミリータンパク質（例えば、ＴＮＦＲ１（ＤＲ１）、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦＲ１／２、ＣＤ４０（ｐ５０）、Ｆａｓ（ＣＤ９５、Ａｐｏ１、ＤＲ２）、ＣＤ３０、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７、ＩＬＡ）、ＴＲＡＩＬＲ１（ＤＲ４、Ａｐｏ２）、ＤＲ５（ＴＲＡＩＬＲ２）、ＴＲＡＩＬＲ３（ＤｃＲ１）、ＴＲＡＩＬＲ４（ＤｃＲ２）、ＯＰＧ（ＯＣＩＦ）、ＴＷＥＡＫＲ（ＦＮ１４）、ＬＩＧＨＴＲ（ＨＶＥＭ）、ＤｃＲ３、ＤＲ３、ＥＤＡＲ、もしくはＸＥＤＡＲなど）が挙げられるが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態では、ＩｇＭ由来結合分子、例えば、ＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、または他のＩｇＭ由来結合分子は、それぞれ５個または６個の２価ＩｇＭ結合ユニットを含む五量体または六量体のＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、または他のＩｇＭ由来結合分子である。ある特定の実施形態に従うと、各結合ユニットは、バリアントＩｇＭ定常領域に対してアミノ末端側に位置するＶＨをそれぞれ有する、本明細書に記載する２つのグリコバリアントＩｇＭ重鎖と、免疫グロブリン軽鎖定常領域（例えば、カッパまたはラムダ定常領域）に対してアミノ末端側に位置する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）をそれぞれ有する２つの免疫グロブリン軽鎖とを含む。提供されるＶＨ及びＶＬは、組み合わさって、対象となる標的に特異的に結合する抗原結合ドメインを形成する。ある特定の実施形態では、５つまたは６つのＩｇＭ結合ユニットは同一である。
ＩｇＭ由来結合分子が五量体であるこれらの実施形態では、本明細書の他の箇所に記載されている、Ｊ鎖、またはその機能性断片、またはその機能性バリアントをさらに含むことができる。例えば、Ｊ鎖は、配列番号２０のアミノ酸配列を含む成熟ヒトＪ鎖、またはその機能性断片、またはその機能性バリアントであることができる。当業者が理解するように、本文脈における「機能性断片」または「機能性バリアント」は、ＩｇＭ結合ユニット（例えば、ＩｇＭ重鎖定常領域）と結合して五量体ＩｇＭ抗体を形成することが可能な断片及びバリアントを含む。
ある特定の実施形態では、五量体ＩｇＭ由来結合分子、例えば、本明細書で提供するＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、または他のＩｇＭ由来結合分子のＪ鎖は、１つ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を除いてバリアントＪ鎖と同一である参照Ｊ鎖と比較して、１つ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を含む、機能性バリアントＪ鎖である。例えば、ある特定のアミノ酸置換、欠失、または挿入は、バリアントＪ鎖内の１つ以上の単独のアミノ酸置換、欠失、または挿入を除いて同一であり且つ同一の動物種に対して同一の方法で投与されるＩｇＭ由来参照結合分子と比較して、対象動物に投与された際に増加した血清半減期を示す、ＩｇＭ由来結合分子をもたらすことができる。ある特定の実施形態では、バリアントＪ鎖は、参照Ｊ鎖と比較して、１つ、２つ、３つ、または４つの単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を含むことができる。
本明細書の他の箇所に詳細に記載するように、ある特定の実施形態では、本明細書で提供する五量体ＩｇＭ由来結合分子のバリアントＪ鎖またはその機能性断片は、野生型成熟ヒトＪ鎖（配列番号２０）のアミノ酸Ｙ１０２に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む。Ｙ１０２は、アミノ酸、例えばアラニンで置換することができる。特定の実施形態では、バリアントヒトＪ鎖は、「Ｊ＊」と本明細書で呼ばれる、配列番号２１のアミノ酸配列を含むことができる。
バリアントまたは野生型アミノ酸配列のいずれかを有する、五量体ＩｇＭ由来結合分子、例えば、本明細書で提供するＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、または他のＩｇＭ由来結合分子のＪ鎖または断片は、異種部分をさらに含む「改変Ｊ鎖」であることができ、異種部分は、Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントに融合またはコンジュゲートしている。例えば、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第９，９５１，１３４号、及び同第１０，６１８，９７８号、ならびに、米国特許公開公報第２０１９／０１８５５７０号において、例示的ではあるが非限定的な異種部分が提供される。ある特定の実施形態では、異種部分は、Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントに融合しているポリペプチドであるか、あるいはＪ鎖またはその断片もしくはバリアントの中に存在する。異種ポリペプチドは、場合によっては、ペプチドリンカーを介して、Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントに融合していてもよいし、Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントの中に存在してもよい。任意の好適なリンカーを用いることができ、例えば、ペプチドリンカーは、少なくとも５個のアミノ酸、少なくとも１０個のアミノ酸、及び、少なくとも２０個のアミノ酸、少なくとも３０個のアミノ酸、またはそれ以上などを含むことができる。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、２５個以下のアミノ酸を含む。特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、５個のアミノ酸、１０個のアミノ酸、１５個のアミノ酸、２０個のアミノ酸、または２５個のアミノ酸からなることができる。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、グリシン及びセリン、例えば、（ＧＧＧＧＳ）ｎ［ｎは１、２、３、４、５、またはそれ以上であることができる］（配列番号８４）を含む。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号２７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２８）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３０）、または、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３１）からなる。ある特定の実施形態では、異種ポリペプチドは、Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントのＮ末端、Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントのＣ末端、あるいはＪ鎖またはその断片もしくはバリアントのＮ末端及びＣ末端の両方に融合することができる。ある特定の実施形態では、異種ポリペプチドは、Ｊ鎖の中で内的に融合するすることができる。ある特定の実施形態では、異種ポリペプチドは結合ドメイン、例えば抗原結合ドメインであることができる。例えば、異種ポリペプチドは、抗体、抗体のサブユニット、または抗体の抗原結合断片、例えばｓｃＦｖ断片であることができる。ある特定の実施形態では、結合ドメイン、例えばｓｃＦｖ断片は、エフェクター細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞に結合することができる。ある特定の実施形態では、結合ドメイン、例えばｓｃＦｖ断片は、細胞傷害性Ｔ細胞上でＣＤ３、例えばＣＤ３εに特異的に結合することができる。ある特定の実施形態では、本明細書で提供する五量体ＩｇＭ由来結合分子の改変Ｊ鎖は、配列番号２４（Ｖ１５Ｊ）、配列番号２５（Ｖ１５Ｊ＊）、配列番号２６（Ｖ１５Ｊ Ｎ４９Ｄ）のアミノ酸配列、または、ネズミ抗体ＳＰ３４の、６つの相補性決定領域、すなわち、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、及びＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列、すなわち、それぞれ配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５３、及び配列番号５４を含む、抗ＣＤ３ε ｓｃＦｖ抗原結合ドメインを含むＪ鎖、例えば、配列番号５５のアミノ酸配列を含む改変Ｊ鎖 ＳＪ＊、または、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、及びＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列、すなわち、それぞれ、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６２、配列番号６５、配列番号６７、及び配列番号６９；配列番号５７、配列番号５９、配列番号６２、配列番号６５、配列番号６７、及び配列番号７０；配列番号５８、配列番号６０、配列番号６３、配列番号６６、配列番号６８、及び配列番号７１；配列番号５８、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６６、配列番号６８、及び配列番号７２；配列番号５８、配列番号６１、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、及び配列番号７３、例えば、それぞれ、配列番号７４及び配列番号７５、配列番号７６及び配列番号７７、配列番号７８及び配列番号７９、配列番号８０及び配列番号８１、または配列番号８２及び配列番号８３の、ＶＨ及びＶＬを含む、抗ＣＤ３ε ｓｃＦｖ抗原結合ドメインを含む。
血清半減期が増加したＩｇＭ由来結合分子
ある特定のＩｇＭ由来結合分子、例えば、本明細書で提供するＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、または他のＩｇＭ由来結合分子は、本明細書に記載するグリコシル化変異に加えて、さらに組み換えをして、血清半減期を増加させることができる。ＩｇＭ由来結合分子の血清半減期を増加させることができる例示的なＩｇＭ重鎖定常領域変異は、ＷＯ ２０１９／１６９３１４に開示されており、本明細書中に、その全体が参照により組み込まれる。例えば、本明細書の他の箇所に記載されるグリコシル化変異のうちの１つまたは複数に加えて、本明細書で提供するＩｇＭ由来結合分子のバリアントＩｇＭ重鎖定常領域は、野生型ヒトＩｇＭ定常領域（例えば、配列番号１または配列番号２）のアミノ酸Ｓ４０１、Ｅ４０２、Ｅ４０３、Ｒ３４４、及び／またはＥ３４５に対応するアミノ酸位置にアミノ酸置換を含み得る。「野生型ヒトＩｇＭ定常領域のアミノ酸Ｓ４０１、Ｅ４０２、Ｅ４０３、Ｒ３４４、及び／またはＥ３４５に対応するアミノ酸」とは、ヒトＩｇＭ定常領域におけるＳ４０１、Ｅ４０２、Ｅ４０３、Ｒ３４４、及び／またはＥ３４５に相同である、任意の種のＩｇＭ定常領域の配列におけるアミノ酸を意味する。ある特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２のＳ４０１、Ｅ４０２、Ｅ４０３、Ｒ３４４、及び／またはＥ３４５に対応するアミノ酸は、任意のアミノ酸、例えば、アラニンで置換され得る。
ある特定のＩｇＭ由来結合分子、例えば、本明細書で提供するＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、または他のＩｇＭ由来結合分子は、本明細書に記載するグリコシル化変異に加えて、さらに組み換えをして、血清半減期を増加させることができる。ＩｇＭ由来結合分子の血清半減期を増加させることができる例示的なＩｇＭ重鎖定常領域変異は、ＷＯ ２０１９／１６９３１４に開示されており、本明細書中に、その全体が参照により組み込まれる。例えば、本明細書の他の箇所に記載されるグリコシル化変異のうちの１つまたは複数に加えて、本明細書で提供するＩｇＭ由来結合分子のバリアントＩｇＭ重鎖定常領域は、野生型ヒトＩｇＭ定常領域（例えば、配列番号１または配列番号２）のアミノ酸Ｓ４０１、Ｅ４０２、Ｅ４０３、Ｒ３４４、及び／またはＥ３４５に対応するアミノ酸位置にアミノ酸置換を含み得る。「野生型ヒトＩｇＭ定常領域のアミノ酸Ｓ４０１、Ｅ４０２、Ｅ４０３、Ｒ３４４、及び／またはＥ３４５に対応するアミノ酸」とは、ヒトＩｇＭ定常領域におけるＳ４０１、Ｅ４０２、Ｅ４０３、Ｒ３４４、及び／またはＥ３４５に相同である、任意の種のＩｇＭ定常領域の配列におけるアミノ酸を意味する。ある特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２のＳ４０１、Ｅ４０２、Ｅ４０３、Ｒ３４４、及び／またはＥ３４５に対応するアミノ酸は、任意のアミノ酸、例えば、アラニンで置換され得る。
野生型Ｊ鎖は典型的には、１つのＮ結合型グリコシル化部位を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供する五量体ＩｇＭ由来結合分子のバリアントＪ鎖またはその機能性断片は、例えば、成熟ヒトＪ鎖（配列番号２０）またはＪ＊（配列番号２１）のアミノ酸４９（モチーフＮ６）に対応するアミノ酸位置から始まるアスパラギン（Ｎ）結合型グリコシル化モチーフＮ－Ｘ１－Ｓ／Ｔ内の変異［モチーフ中、Ｎはアスパラギンであり、Ｘ１はプロリン以外のアミノ酸であり、Ｓ／Ｔはセリンまたはトレオニンである］を含み、当該変異は、当該モチーフにおけるグリコシル化を防止する。ＰＣＴ国際公開特許第ＷＯ２０１９／１６９３１４号で示されるように、この部位におけるグリコシル化を防止する変異は、バリアントＪ鎖におけるグリコシル化を防止する１つまたは複数の変異を除いて同一であり且つ同一の動物種に同一の方法で投与される参照ＩｇＭ由来結合分子と比較して、対象動物に投与されると増加した血清半減期を示す、ＩｇＭ由来結合分子、例えば、本明細書で提供するＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、または他のＩｇＭ由来結合分子をもたらすことができる。
例えば、ある特定の実施形態では、本明細書で提供する五量体ＩｇＭ由来結合分子のバリアントＪ鎖またはその機能性断片は、配列番号２０のアミノ酸Ｎ４９またはアミノ酸Ｓ５１に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含むことができる。ただし、Ｓ５１に対応するアミノ酸がトレオニン（Ｔ）で置換されていないか、または、バリアントＪ鎖が、配列番号２０のアミノ酸Ｎ４９及びＳ５１の両方に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む。ある特定の実施形態では、配列番号２０のＮ４９に対応する位置は、任意のアミノ酸、例えば、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）で置換されている。特定の実施形態では、配列番号２０のＮ４９に対応する位置は、アラニン（Ａ）で置換することができる。特定の実施形態では、本明細書で提供する五量体ＩｇＭ由来結合分子のＪ鎖は、バリアントヒトＪ鎖であり、配列番号２２のアミノ酸配列を有する。別の特定の実施形態では、配列番号２０のＮ４９に対応する位置は、アスパラギン酸（Ｄ）で置換することができる。特定の実施形態では、本明細書で提供する五量体ＩｇＭ由来結合分子のＪ鎖は、バリアントヒトＪ鎖であり、配列番号２３のアミノ酸配列を有する。
ＣＤＣ活性が低下したバリアントヒトＩｇＭ定常領域
ある特定のＩｇＭ由来結合分子、例えば、本明細書で提供するＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、または他のＩｇＭ由来結合分子は、本明細書に記載するグリコシル化変異に加えて、さらに組み換えをして、ＣＤＣ活性の低下を付与する変異を除いて同一であり、対応する参照ヒトＩｇＭ定常領域を含む参照ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体と比較して、補体の存在下において、細胞に対して補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低下を示すことができる。これらのＣＤＣ変異を、本明細書で提供するような、Ｎ結合型グリコシル化を遮断する、及び／または、血清半減期の増加を付与する変異のいずれかと組み合わせることができる。「対応する参照ヒトＩｇＭ定常領域」とは、ＣＤＣ活性に影響を及ぼす定常領域における１つまたは複数の変異を除いてバリアントＩｇＭ定常領域と同一である、ヒトＩｇＭ定常領域またはその部分、例えば、Ｃμ３ドメインを意味する。ある特定の実施形態では、バリアントヒトＩｇＭ定常領域は、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１８／１８７７０２号（これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、野生型ヒトＩｇＭ定常領域と比べて、例えばＣμ３ドメインにおいて、１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。ＣＤＣを測定するためのアッセイが当業者に周知されており、例示的なアッセイが、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１８／１８７７０２号に記載されている。
ある特定のＩｇＭ由来結合分子、例えば、本明細書で提供するＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、または他のＩｇＭ由来結合分子は、本明細書に記載するグリコシル化変異に加えて、さらに組み換えをして、ＣＤＣ活性の低下を付与する変異を除いて同一であり、対応する参照ヒトＩｇＭ定常領域を含む参照ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体と比較して、補体の存在下において、細胞に対して補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低下を示すことができる。これらのＣＤＣ変異を、本明細書で提供するような、Ｎ結合型グリコシル化を遮断する、及び／または、血清半減期の増加を付与する変異のいずれかと組み合わせることができる。「対応する参照ヒトＩｇＭ定常領域」とは、ＣＤＣ活性に影響を及ぼす定常領域における１つまたは複数の変異を除いてバリアントＩｇＭ定常領域と同一である、ヒトＩｇＭ定常領域またはその部分、例えば、Ｃμ３ドメインを意味する。ある特定の実施形態では、バリアントヒトＩｇＭ定常領域は、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１８／１８７７０２号（これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、野生型ヒトＩｇＭ定常領域と比べて、例えばＣμ３ドメインにおいて、１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。ＣＤＣを測定するためのアッセイが当業者に周知されており、例示的なアッセイが、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１８／１８７７０２号に記載されている。
ある特定の実施形態では、ＣＤＣ活性の低下を付与するバリアントヒトＩｇＭ定常領域は、配列番号１（ヒトＩｇＭ定常領域アレルＩＧＨＭ＊０３）または配列番号２（ヒトＩｇＭ定常領域アレルＩＧＨＭ＊０４）の、位置Ｌ３１０、Ｐ３１１、Ｐ３１３、及び／またはＫ３１５における野生型ヒトＩｇＭ定常領域に対応する、アミノ酸置換を含む。ある特定の実施形態では、ＣＤＣ活性の低下を付与するバリアントヒトＩｇＭ定常領域は、配列番号１または配列番号２の位置Ｐ３１１における野生型ヒトＩｇＭ定常領域に対応する、アミノ酸置換を含む。他の実施形態では、本明細書で提供するバリアントＩｇＭ定常領域は、配列番号１または配列番号２の位置Ｐ３１３における野生型ヒトＩｇＭ定常領域に対応する、アミノ酸置換を含有する。他の実施形態では、本明細書で提供するバリアントＩｇＭ定常領域は、配列番号１もしくは配列番号２の位置Ｐ３１１、及び／または、配列番号１もしくは配列番号２の位置Ｐ３１３における野生型ヒトＩｇＭ定常領域に対応する、置換の組合せを含有する。これらのプロリン残基は独立して、任意のアミノ酸、例えば、アラニン、セリン、またはグリシンで置換することができる。ある特定の実施形態では、ＣＤＣ活性の低下を付与するバリアントヒトＩｇＭ定常領域は、配列番号１または配列番号２の位置Ｋ３１５における野生型ヒトＩｇＭ定常領域に対応する、アミノ酸置換を含む。リジン残基は独立して、任意のアミノ酸、例えばアラニン、セリン、グリシン、またはアスパラギン酸で置換することができる。ある特定の実施形態では、ＣＤＣ活性の低下を付与するバリアントヒトＩｇＭ定常領域は、配列番号１または配列番号２の位置Ｋ３１５における野生型ヒトＩｇＭ定常領域に対応する、アスパラギン酸でのアミノ酸置換を含む。ある特定の実施形態では、ＣＤＣ活性の低下を付与するバリアントヒトＩｇＭ定常領域は、配列番号１または配列番号２の位置Ｌ３１０における野生型ヒトＩｇＭ定常領域に対応する、アミノ酸置換を含む。リジン残基は独立して、任意のアミノ酸、例えばアラニン、セリン、グリシン、またはアスパラギン酸で置換することができる。ある特定の実施形態では、ＣＤＣ活性の低下を付与するバリアントヒトＩｇＭ定常領域は、配列番号１または配列番号２の位置Ｌ３１０における野生型ヒトＩｇＭ定常領域に対応する、アスパラギン酸でのアミノ酸置換を含む。
ポリヌクレオチド、ベクター、及び宿主細胞
本開示は、ＩｇＭ由来結合分子、例えば、本明細書で提供するＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、または他のＩｇＭ由来結合分子のポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド、例えば、単離された、組換え、及び／または自然に存在しないポリヌクレオチドをさらに提供する。「ポリペプチドサブユニット」とは、独立して翻訳できる結合分子、結合ユニット、ＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、または抗原結合ドメインの一部を意味する。例としては抗体可変ドメイン、例えばＶＨもしくはＶＬ、Ｊ鎖、分泌性成分、一本鎖Ｆｖ、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖定常領域、抗体軽鎖定常領域、及び／または、これらの断片、バリアント、もしくは誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
本開示は、ＩｇＭ由来結合分子、例えば、本明細書で提供するＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、または他のＩｇＭ由来結合分子のポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド、例えば、単離された、組換え、及び／または自然に存在しないポリヌクレオチドをさらに提供する。「ポリペプチドサブユニット」とは、独立して翻訳できる結合分子、結合ユニット、ＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、または抗原結合ドメインの一部を意味する。例としては抗体可変ドメイン、例えばＶＨもしくはＶＬ、Ｊ鎖、分泌性成分、一本鎖Ｆｖ、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖定常領域、抗体軽鎖定常領域、及び／または、これらの断片、バリアント、もしくは誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態では、ポリペプチドサブユニットは、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域を含む、本明細書で提供するバリアントＩｇＭ由来重鎖を含むことができ、そこでは、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域の少なくとも１つのアスパラギン（Ｎ）結合型グリコシル化モチーフが、当該モチーフにおけるグリコシル化を防止するように変異している。バリアントＩｇＭ重鎖定常領域は、全てが本明細書で提供される、結合ドメイン、例えば抗原結合ドメインまたはそのサブユニット、例えば、抗原結合ドメインのＶＨ部分に融合することができる。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、バリアントヒトＩｇＭ由来重鎖定常領域を含むポリペプチドサブユニットをコードすることができる。例えば、ＩｇＭ由来重鎖ポリペプチドサブユニットは、配列番号３～１８のいずれかのアミノ酸配列を含むことができる。
ある特定の実施形態では、ポリペプチドサブユニットは、本明細書の他の箇所に記載されている抗原結合ドメインの抗体ＶＬ部分を含むことができる。ある特定の実施形態では、ポリペプチドサブユニットは、ＶＬのＣ末端に融合できる抗体軽鎖定常領域、例えば、ヒト抗体軽鎖定常領域、またはその断片を含むことができる。
ある特定の実施形態では、ポリペプチドサブユニットは、本明細書で提供するＪ鎖、改変Ｊ鎖、またはその任意の機能性断片もしくはバリアントを含むことができる。ある特定の実施形態では、ポリペプチドサブユニットは、改変Ｊ鎖を含む、ヒトＪ鎖、またはその機能性断片もしくはバリアントを含むことができる。ある特定の実施形態では、Ｊ鎖ポリペプチドサブユニットは、配列番号１９～２６または５５のいずれかのアミノ酸配列を含むことができる。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供するポリヌクレオチド、例えば、プラスミドなどの発現ベクターは、１つのポリペプチドサブユニット（例えば、バリアントＩｇＭ由来重鎖、軽鎖、もしくはＪ鎖）をコードする核酸配列を含むことができるか、または、本明細書で提供するＩｇＭ由来結合分子のポリペプチドサブユニットのうちの２つ以上もしくは３つ全てをコードする、２つ以上の核酸配列を含むことができる。あるいは、それらの３つのポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列は、個別のポリヌクレオチド、例えば、個別の発現ベクター上に存在することができる。本開示は、そのような１つまたは複数の発現ベクターを提供する。本開示は、提供するポリヌクレオチド（複数可）または発現ベクター（複数可）をコードする、１つ以上の宿主細胞もまた提供する。
したがって、ある特定の実施形態では、抗原結合ドメインを形成させるために、抗体の可変領域をコードする核酸配列を、ＩｇＭ由来の構造のための発現ベクター、特に本明細書で提供するバリアントＩｇＭ重鎖定常領域（例えば、配列番号３～１８のいずれか）をコードするものに挿入することができ、さらに、本明細書で提供するＪ鎖またはその機能性断片もしくはバリアントをコードする（例えば、配列番号１９～２６または５５のいずれかをコードする）ポリヌクレオチド、及び軽鎖と組み合わせることができ、これにより、本明細書の他の箇所に記載されている１つ以上のＮ結合型グリコシル化モチーフにおけるグリコシル化が損なわれている５つまたは６つの結合ユニットを有するＩｇＭ由来結合分子を作製する。簡潔に述べると、重鎖及び軽鎖可変ドメイン配列をコードする核酸配列を、発現の際に、ベクターが所望の完全長重鎖または軽鎖を得るように、既存の分子から合成または増幅して、適切な向き及びフレームで、１つ以上のベクターに挿入することができる。これらの目的に有用なベクターが当該技術分野で知られている。そのようなベクターはまた、エンハンサー、及び所望の鎖の発現を達成するのに必要とされる他の配列を含み得る。複数のベクターまたは１つのベクターを使用することができる。このベクター、またはこれらのベクターを宿主細胞にトランスフェクションすることができ、次いで、バリアントＩｇＭ由来重鎖、及び／もしくは軽鎖、及び／もしくはＪ鎖、またはこれらの機能性断片もしくはバリアントが発現し、ＩｇＭ由来結合分子が組み立てられ、その後、単離及び／または精製することができる。発現の際に、鎖は、完全に機能性の多量体ＩｇＭ由来結合分子、例えば、血清半減期が向上した、本明細書で提供するＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、または他のＩｇＭ由来結合分子を形成する。発現及び精製プロセスは、必要であれば商業規模で行うことができる。
本開示は、２つ以上のポリヌクレオチドを含む組成物をさらに提供し、２つ以上のポリヌクレオチドはまとめて、上述した改変グリコシル化を有するＩｇＭ由来結合分子をコードすることができる。ある特定の実施形態では、組成物は、本明細書の他の箇所で提供する、バリアントＩｇＭ由来重鎖またはその多量体化断片（例えば、配列番号３～１８のいずれか）をコードするポリヌクレオチドを含むことができ、ＩｇＭ様重鎖は、結合ドメイン、例えば抗原結合ドメイン、またはそのサブユニット、例えばＶＨドメインをさらに含む。組成物は、軽鎖またはその断片（例えば、少なくとも抗原結合ドメインのＶＬを含む、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖）をコードするポリヌクレオチドをさらに含むことができる。提供するポリヌクレオチド組成物は、本明細書で提供するＪ鎖またはその機能性断片もしくはバリアント（例えば、配列番号１９～２６または５５のいずれか）をコードするポリヌクレオチドをさらに含むことができる。ある特定の実施形態では、本明細書で提供する組成物を構成するポリヌクレオチドは、２つ、３つ、またはそれ以上の個別のベクター、例えば発現ベクター上に位置することができる。そのようなベクターは本開示によって提供される。ある特定の実施形態では、本明細書で提供する組成物を構成するポリヌクレオチドのうちの２個以上が、単一のベクター、例えば、発現ベクター上に位置することができる。そのようなベクターは本開示によって提供される。
本開示はさらに、本明細書で提供するＩｇＭ由来結合分子もしくはその任意のサブユニットをコードする１個のポリヌクレオチドもしくは２個以上のポリヌクレオチド、本明細書で提供するポリヌクレオチド組成物、または１個のベクター、もしくは本明細書で提供するＩｇＭ由来結合分子もしくはその任意のサブユニットを合わせてコードする２個、３個、もしくはそれよりも多くのベクターを含む、宿主細胞、例えば、原核または真核宿主細胞を提供する。
関連する実施形態では、本開示は、本開示により提供される、グリコシル化が低下したＩｇＭ由来結合分子を作製する方法を提供し、当該方法は、本明細書で提供する宿主細胞を培養することと、ＩｇＭ由来結合分子を回収することと、を含む。
使用方法
本開示は、治療を必要とする対象において疾患または障害を治療する方法であって、当該対象に、治療上有効な量のＩｇＭ由来結合分子、例えば、本明細書で提供するＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、または他のＩｇＭ由来結合分子を投与することを含む、上記方法をさらに提供する。本開示により提供される、グリコシル化が低下したＩｇＭ由来結合分子は、結合分子上でのグリコ形態の数を簡略化し、より均一に結合分子に結合する糖の特性をより均一にすること、例えば、シアル酸基のグリカンへの、より完全な付加により、より均質な治療用組成物をもたらすことができる。均質性に対してこのような改善を行うことにより、グリコシル化の低下を除いて同一である参照ＩｇＭ由来結合分子と比較して、製造の一層の容易さ、及びまた、結合分子上でのより大きな安全性を付与することができる。さらに、グリコシル化が低下したＩｇＭ由来結合分子は、グリコシル化の低下を除いて同一である参照ＩｇＭ由来結合分子と比較して、増加した血清半減期を示すことができる。「治療上有効な用量または量」または「有効量」とは、投与されたときに、対象の治療に関して正の治療応答をもたらすＩｇＭ由来結合分子の量が意図されている。
本開示は、治療を必要とする対象において疾患または障害を治療する方法であって、当該対象に、治療上有効な量のＩｇＭ由来結合分子、例えば、本明細書で提供するＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、または他のＩｇＭ由来結合分子を投与することを含む、上記方法をさらに提供する。本開示により提供される、グリコシル化が低下したＩｇＭ由来結合分子は、結合分子上でのグリコ形態の数を簡略化し、より均一に結合分子に結合する糖の特性をより均一にすること、例えば、シアル酸基のグリカンへの、より完全な付加により、より均質な治療用組成物をもたらすことができる。均質性に対してこのような改善を行うことにより、グリコシル化の低下を除いて同一である参照ＩｇＭ由来結合分子と比較して、製造の一層の容易さ、及びまた、結合分子上でのより大きな安全性を付与することができる。さらに、グリコシル化が低下したＩｇＭ由来結合分子は、グリコシル化の低下を除いて同一である参照ＩｇＭ由来結合分子と比較して、増加した血清半減期を示すことができる。「治療上有効な用量または量」または「有効量」とは、投与されたときに、対象の治療に関して正の治療応答をもたらすＩｇＭ由来結合分子の量が意図されている。
例えばがん治療に対する組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、対象の生理的状態、対象がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬剤、及び治療が予防的なものであるか治療的なものであるかを含む、多くの異なる要因に応じて変化する。通常、対象はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含めた非ヒト哺乳動物もまた治療することができる。当業者に知られている通例の方法を用いて治療用量を滴定して、安全性及び有効性を最適化することができる。
治療が行われる対象は、治療を必要とする任意の動物、例えば哺乳動物であり得、ある特定の実施形態では、対象はヒト対象である。
対象に投与される調製物は、その最も単純な形態において、従来的な剤形で投与される本明細書で提供するＩｇＭ由来結合分子、またはその多量体抗原結合断片であり、このＩｇＭ由来結合分子は、本明細書の他の箇所に記載されるような医薬賦形剤、担体、または希釈剤と組み合わせることができる。
本開示の組成物は、任意の好適な方法により、例えば、非経口、脳室内、経口、吸入スプレーにより、局所的、経直腸、経鼻、頬側、経膣で、または移植リザーバーを介して、投与することができる。本明細書で使用する場合、「非経口的」という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液内、胸骨内、髄腔内、肝臓内、病巣内、及び頭蓋内の注射または輸注技法を含む。
医薬組成物及び投与方法
ＩｇＭ由来結合分子、例えば、本明細書で提供するＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、または他のＩｇＭ由来結合分子の調製方法、及び、当該分子の投与を必要とする対象への当該分子の投与方法は、当業者に周知されているか、または本開示を考慮して当業者によって容易に決定される。ある特定の実施形態では、投与形態は、注射用溶液、特に、腫瘍内、静脈内、もしくは動脈内注射、または点滴用溶液である。好適な医薬組成物は、緩衝液（例えば、酢酸、リン酸、またはクエン酸緩衝液）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、任意選択で安定化剤（例えば、ヒトアルブミン）などを含むことができる。
ＩｇＭ由来結合分子、例えば、本明細書で提供するＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、または他のＩｇＭ由来結合分子の調製方法、及び、当該分子の投与を必要とする対象への当該分子の投与方法は、当業者に周知されているか、または本開示を考慮して当業者によって容易に決定される。ある特定の実施形態では、投与形態は、注射用溶液、特に、腫瘍内、静脈内、もしくは動脈内注射、または点滴用溶液である。好適な医薬組成物は、緩衝液（例えば、酢酸、リン酸、またはクエン酸緩衝液）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、任意選択で安定化剤（例えば、ヒトアルブミン）などを含むことができる。
開示するＩｇＭ由来結合分子は、活性剤の投与を容易にし、活性剤の安定性を促進するために製剤化することができる。したがって、医薬組成物は、医薬的に許容される無毒性の無菌担体、例えば、生理食塩水、無毒性緩衝液、保存料などを含むことができる。本明細書で提供するＩｇＭ由来結合分子の医薬有効量は、標的に対する有効な結合を達成し、且つ治療上の有益性を達成するのに十分な量を意味する。好適な製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、例えば、２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）（２００５）に記載されている。
本明細書で提供するある特定の医薬組成物は、許容される剤形で経口投与することができ、このような剤形には、例えば、カプセル、錠剤、水性懸濁液または水溶液が含まれる。ある特定の医薬組成物は、経鼻エアロゾルまたは吸入によって投与することもできる。そのような組成物は、食塩水溶液として、ベンジルアルコールもしくは他の好適な防腐剤、生物学的利用能を強化するための吸収促進剤、及び／または他の従来的な可溶化剤もしくは分散剤を用いて調製され得る。
単一の剤形をもたらすために担体材料と組み合わされ得るＩｇＭ由来結合分子の量は、例えば、治療される対象及び特定の投与様式に応じて変動する。組成物は、単回用量、複数回用量として、または輸注において確立された期間にわたり、投与することができる。薬用量レジメンも、最適な所望の応答（例えば、治療または予防応答）を提供するように調整され得る。
本開示はまた、がんなどの疾患を治療するか、予防するか、または管理するための医薬品の製造における、本明細書で提供するＩｇＭ由来結合分子の使用を可能にする。本開示は、がんなどの疾患の治療、予防、または管理に使用するための、本明細書で提供するＩｇＭ由来結合分子もまた提供する。
本開示は、別段の指示がない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の従来的技法を採用し、このような技法は当業者の技能の範囲内である。そのような技法は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｄ．（２０１２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ ｅｄ．；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．（１９９２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ）、Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ，ｅｄｓ．，（１９９５）ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ），Ｖｏｌｕｍｅｓ １－４；Ｇａｉｔ，ｅｄ．（１９９０）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）、Ｍｕｌｌｉｓらの米国特許第４，６８３，１９５号、Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）、Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（２０１６）Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，７ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ－Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ）、Ｗｏｏｄｗａｒｄ，Ｊ．，Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）（１９８５）、Ｐｅｒｂａｌ（１９８８）Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；２ｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）；Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．（１９８７）Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｓ．Ｃ．Ｍａｋｒｉｄｅｓ（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５１－１５５（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）、Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）、Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）を参照されたい。
抗体工学の一般原理は、例えば、Ｓｔｒｏｈｌ，Ｗ．Ｒ．，ａｎｄ Ｌ．Ｍ．Ｓｔｒｏｈｌ（２０１２），Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｗｏｏｄｈｅａｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）に記載されている。タンパク質工学の一般原理は、例えば、Ｐａｒｋ ａｎｄ Ｃｏｃｈｒａｎ，ｅｄｓ．（２００９），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｓｉｇｎ（ＣＤＣ Ｐｒｅｓｓ）に記載されている。免疫学の一般原理は、例えば、Ａｂｂａｓ ａｎｄ Ｌｉｃｈｔｍａｎ（２０１７）Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）に記載されている。追加として、当該技術分野で既知の免疫学の標準的方法は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ Ｏｎｌｉｎｅ Ｌｉｂｒａｒｙ）、Ｗｉｌｄ，Ｄ．（２０１３），Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，ｅｄ．（２０１３），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）、及びＯｓｓｉｐｏｗ ａｎｄ Ｆｉｓｃｈｅｒ，ｅｄｓ．，（２０１４），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）に従って得ることができる。
上記で引用される参考文献の全て、ならびに本明細書で引用された全ての参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
以下の実施例は、限定としてではなく例示説明として提供されるものである。
実施例１：ＩｇＭグリコバリアントの構造及び特性決定
全てのヒト免疫グロブリンの、Ｎ結合型グリコシル化部位を、図１Ａ及び図１Ｂで比較する。様々な異なる種のＩｇＭ抗体の、Ｎ結合型グリコシル化部位を、図２Ａ及び図２Ｂに示す。ヒトＩｇＭ重鎖の空間充填モデルを、図３に示す。５つのＮ結合型グリコシル化モチーフを、Ｃμ１ドメイン内のＮ１（配列番号１または配列番号２のＮ４６）、Ｃμ２ドメイン内のＮ２（配列番号１または配列番号２のＮ２０９）、Ｃμ３ドメイン内のＮ３（配列番号１または配列番号２のＮ２７２）、Ｃμ３ドメイン内のＮ４（配列番号１または配列番号２のＮ２７９）、及び、テールピースドメイン内のＮ５（配列番号１または配列番号２のＮ４４０）として示す。
全てのヒト免疫グロブリンの、Ｎ結合型グリコシル化部位を、図１Ａ及び図１Ｂで比較する。様々な異なる種のＩｇＭ抗体の、Ｎ結合型グリコシル化部位を、図２Ａ及び図２Ｂに示す。ヒトＩｇＭ重鎖の空間充填モデルを、図３に示す。５つのＮ結合型グリコシル化モチーフを、Ｃμ１ドメイン内のＮ１（配列番号１または配列番号２のＮ４６）、Ｃμ２ドメイン内のＮ２（配列番号１または配列番号２のＮ２０９）、Ｃμ３ドメイン内のＮ３（配列番号１または配列番号２のＮ２７２）、Ｃμ３ドメイン内のＮ４（配列番号１または配列番号２のＮ２７９）、及び、テールピースドメイン内のＮ５（配列番号１または配列番号２のＮ４４０）として示す。
配列番号２のヒトＩｇＭ定常領域内に存在する５つのＮ結合型グリコシル化モチーフ内の、アスパラギン（Ｎ）残基の１つのアラニンまたはアスパラギン酸変異を有する、改変ヒトＩｇＭ定常領域をコードするＤＮＡバリアントを設計し、合成のために商業ベンダーに提出した。野生型または改変ＩｇＭ定常領域を含む、野生型または改変ヒト五量体または六量体ＩｇＭ抗体を発現でき、ＣＤ２０に特異的に結合可能な、例示的なプラスミド構築物を、以下の方法により作製した。
１．５．３のＶＨ及びＶＬ領域（それぞれ、配列番号３２及び３３、米国特許出願第２０１９－０１００５９７号を参照されたい）、ならびに、Ｎ１～Ｎ５における、様々な単一の、アスパラギンのアラニンへの変異、または、アスパラギンのアスパラギン酸への変異をコードするＤＮＡ断片を、商業ベンダーにより、標準的な分子生物学的技術によって、重鎖及び軽鎖発現ベクターにサブクローニングするために合成した。
ＩｇＭ重鎖、軽鎖、及び改変Ｊ鎖（Ｖ１５Ｊ、配列番号２４）をコードするプラスミド構築物を、ＣＨＯ細胞に同時トランスフェクションし、グリコバリアント抗ＣＤ２０ＩｇＭ抗体を発現する細胞を選択した。これらは全て、標準的な方法に従った。Ｎ４９（Ｎ６）においてＶ１５Ｊ Ｊ鎖内のＮ結合型グリコシル化モチーフ内で６番目の単一のアラニン変異を作製し、野生型ＩｇＭと結合させた。
細胞上清に存在する抗体を、メーカーの手順に従い、Ｃａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ ＩｇＭ（Ｃａｔａｌｏｇ ２８９０．０５， ＢＡＣ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて回収した。非還元条件下にて、ＳＤＳ ＰＡＧＥ上で抗体を評価すると、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／１４１３０３号において以前に記載したような集合を示した。抗Ｊ鎖抗体と反応したウェスタンブロットと共に、アラニン変異を図４に示し、アスパラギン酸変異を図５に示す。図４に示すように、発現し組み立てられた、Ｎ１、Ｎ２、及びＮ３における、単一のアラニン変異を含むバリアントＩｇＭ、ならびに、バリアントＩｇＭが、Ｎ４にて単一のアラニン変異を有する、対応する野生型ＩｇＭ（１．５．３ＩｇＭ Ｖ１５Ｊ）は、発現の低下を示し、Ｎ５にて単一のアラニン変異を有するバリアントＩｇＭは、六量体として組み立てられた。Ｎ６にて単一のアラニン変異を有するＩｇＭもまた、適切に発現して組み立てられた。図５に示すように、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ５、及びＮ６にて単一のアスパラギン酸変異を有するバリアントＩｇＭは、五量体として適切に発現及び組み立てられ、Ｎ４における変異は発現しなかった、または組み立てられなかった。
次に、選択した二重アスパラギン酸変異体を上述のとおりに構築し、非還元条件下にて、ＳＤＳ ＰＡＧＥ上で評価すると、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／１４１３０３号において以前に記載したような組み立てを示した。Ｊ鎖を伴うＩｇＭ結合ユニットの適切な組み立てを示すために、これらの変異体を、抗Ｊ鎖抗体を用いるウェスタンブロットにより評価した。結果を図６に示す。Ｎ１Ｄ及びＮ２Ｄ、Ｎ２Ｄ及びＮ３Ｄ、及びＮ１Ｄ及びＮ３Ｄにおける二重変異体は全て、五量体として適切に発現及び組み立てられたが、Ｎ１Ｄ及びＮ５Ｄにおける二重変異体は、構築物が抗Ｊ鎖抗体と反応しなかったため、Ｊ鎖なしでは六量体として発現、または組み立てられなかった。
実施例２：補体依存性細胞傷害
実施例１で生成した、１．５．３ＩｇＭ Ｖ１５Ｊ、１．５．３ＩｇＭ Ｖ１５Ｊ Ｎ１Ａ、１．５．３ＩｇＭ Ｖ１５Ｊ Ｎ２Ａ、及び１．５．３ＩｇＭ Ｖ１５Ｊ Ｎ３Ａ抗体を、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイを用いて比較した。
実施例１で生成した、１．５．３ＩｇＭ Ｖ１５Ｊ、１．５．３ＩｇＭ Ｖ１５Ｊ Ｎ１Ａ、１．５．３ＩｇＭ Ｖ１５Ｊ Ｎ２Ａ、及び１．５．３ＩｇＭ Ｖ１５Ｊ Ｎ３Ａ抗体を、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイを用いて比較した。
ＣＤ２０を発現するＲａｊｉ細胞株（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＣＬ－８６）を使用して、各抗体のＣＤＣ有効性を測定した。５万個の細胞を、９６ウェルプレートに播種した。細胞を、連続希釈した抗体で処理した。ヒト血清補体（Ｑｕｉｄｅｌカタログ番号Ａ１１３）を、１０％の最終濃度で各ウェルに添加した。反応混合物を３７℃で４時間、インキュベートした。Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｇ７５７２）を、各ウェルに存在する培地の体積と等しい体積で添加した。プレートを２分間振盪し、室温で１０分間インキュベートして、ルミネセンスを照度計で測定した。試験した抗体の間で、ＣＤＣ活性の有意差はなかった（データは図示せず）。
実施例３：Ｔ細胞活性化アッセイ
実施例１で生成した、１．５．３ＩｇＭ Ｖ１５Ｊ、１．５．３ＩｇＭ Ｖ１５Ｊ Ｎ１Ａ、１．５．３ＩｇＭ Ｖ１５Ｊ Ｎ２Ａ、及び１．５．３ＩｇＭ Ｖ１５Ｊ Ｎ３Ａ抗体を、Ｔ細胞活性化アッセイを用いて比較した。
実施例１で生成した、１．５．３ＩｇＭ Ｖ１５Ｊ、１．５．３ＩｇＭ Ｖ１５Ｊ Ｎ１Ａ、１．５．３ＩｇＭ Ｖ１５Ｊ Ｎ２Ａ、及び１．５．３ＩｇＭ Ｖ１５Ｊ Ｎ３Ａ抗体を、Ｔ細胞活性化アッセイを用いて比較した。
組み換えたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ ＣＳ１７６４０３）及びＲＰＭＩ８２２６細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１５５）を、１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。５％のＣＯ２を伴い、白色３８４ウェルアッセイプレート内で、２時間３７℃で、２０μＬの７５００個のＲＰＭＩ８２２６細胞と共に、抗体の連続希釈液をインキュベートした。組換えＪｕｒｋａｔ細胞（２５０００）を混合物に添加し、最終体積を４０μＬにした。混合物を、５％のＣＯ２と共に、５時間３７℃でインキュベートした。次に、細胞混合物を２０μＬの、ルシフェリンを含有する細胞溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ）と混合し、ルシフェラーゼレポーター活性を測定した。光の出力を、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーにより測定した。ＥＣ５０を、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、４つのパラメーター曲線適合により測定した。試験した抗体の間で、Ｔ細胞活性化の有意差はなかった（データは図示せず）。
実施例４：ＥＬＩＳＡ結合
例示的な結合ドメインに融合しているＷＴヒトＩｇＭ定常領域（配列番号１）、Ｎ３Ｄ ＩｇＭ定常領域（配列番号８）、または、Ｎ３Ｋ ＩｇＭ定常領域（配列番号５６）を使用して、抗ＣＤ３Ｊ＊を含む、抗体を生成した。抗体が例示的な結合ドメインの標的に結合する能力を、実施例１で生成した１．５．３ ＷＴ ＩｇＭ ＶＪ＊と比較した。
例示的な結合ドメインに融合しているＷＴヒトＩｇＭ定常領域（配列番号１）、Ｎ３Ｄ ＩｇＭ定常領域（配列番号８）、または、Ｎ３Ｋ ＩｇＭ定常領域（配列番号５６）を使用して、抗ＣＤ３Ｊ＊を含む、抗体を生成した。抗体が例示的な結合ドメインの標的に結合する能力を、実施例１で生成した１．５．３ ＷＴ ＩｇＭ ＶＪ＊と比較した。
９６ウェルの白色ポリスチレンＥＬＩＳＡプレート（Ｐｉｅｒｃｅ １５０４２）を、ウェル当たり１００μＬの、１０μｇ／ｍＬまたは０．３μｇ／ｍＬの標的タンパク質で、一晩４℃でコーティングした。次に、プレートを０．０５％のＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで洗浄し、２％のＢＳＡ－ＰＢＳでブロックした。ブロックした後、１００μＬの、抗体の連続希釈液をウェルに添加し、室温で２時間インキュベートした。次に、プレートを洗浄し、ＨＲＰがコンジュゲートしたマウス抗ヒトカッパ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，９２３０－０５、２％のＢＳＡ－ＰＢＳに、１：６０００で希釈）と共にインキュベートした。０．０５％のＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎを用いた１０回の最終洗浄の後、プレートを、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ化学発光基質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，３７０７０）を用いて読み取った。発光データを、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ）上で収集し、４つのパラメーターのロジスティックモデルを用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにより分析した。
結果を図８に示す。結合は、例示的抗体の間で拮抗した。抗ＣＤ２０ ＩｇＭ抗体は、標的に結合しなかった。
本開示の広がり及び範囲は、上述の例示的な実施形態のいずれによっても限定されるべきではなく、以下の特許請求の範囲及びそれらの均等物に従ってのみ定義されるべきである。
（表２）本開示における配列
（表３）追加の抗ＣＤ３ ＶＨ及びＶＬ配列
結果を図７に示す。結合は、例示的抗体の間で拮抗した。抗ＣＤ２０ ＩｇＭ抗体は、標的に結合しなかった。
本開示は、本明細書で提供する少なくとも１つのバリアントＩｇＭ由来重鎖をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド、またはそのようなポリヌクレオチドを含む組成物をさらに提供する。ある特定の実施形態では、当該組成物は、軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列をさらに含むことができる。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのバリアントＩｇＭ由来重鎖をコードする核酸配列、及び、軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列は、別のベクター上に存在する。ある特定の実施形態では、これらは単一のベクター上に存在する。ある特定の実施形態では、提供する組成物は、Ｊ鎖またはその機能性断片またはその機能性バリアントをコードする核酸配列をさらに含むことができる。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのバリアントＩｇＭ由来重鎖をコードする核酸配列、軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列、及び、Ｊ鎖をコードする核酸配列は、単一のベクター上に存在するか、または、２つ以上の別のベクター上に存在することができる。そのようなベクターは本開示によって提供される。本開示は、提供するポリヌクレオチドまたはベクターのいずれか１つ以上を含む宿主細胞もまた提供する。本開示は、提供するＩｇＭ由来結合分子の作製方法もまた提供し、当該方法は、提供する宿主細胞を培養することと、定常領域または抗体を回収することとを含む。
[本発明1001]
少なくとも1つのバリアントＩｇＭ由来重鎖を含む、単離されたＩｇＭ由来結合分子であって、前記少なくとも1つのバリアントＩｇＭ由来重鎖が、標的に特異的に結合する結合ドメインと連結されているバリアントＩｇＭ重鎖定常領域を含み、前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域の少なくとも1つのアスパラギン（Ｎ）結合型グリコシル化モチーフが、前記モチーフにおけるグリコシル化を防止するように変異しており、Ｎ結合型グリコシル化モチーフがアミノ酸配列Ｎ－Ｘ 1 －Ｓ／Ｔを含み、配列中、Ｎはアスパラギンであり、Ｘ 1 は、プロリンを除く任意のアミノ酸であり、Ｓ／Ｔはセリンまたはトレオニンである、前記結合分子。
[本発明1002]
前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域が、配列番号1（アレルＩＧＨＭ ＊ 03）または配列番号2（アレルＩＧＨＭ ＊ 04）のアミノ酸46（モチーフＮ1）、アミノ酸209（モチーフＮ2）、アミノ酸272（モチーフＮ3）、アミノ酸279（モチーフＮ4）、及びアミノ酸440（モチーフＮ5）に対応するアミノ酸位置から始まる5つのＮ結合型グリコシル化モチーフＮ－Ｘ 1 －Ｓ／Ｔを含むヒトＩｇＭ重鎖定常領域に由来する、本発明1001のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1003]
前記Ｎ－Ｘ 1 －Ｓ／Ｔモチーフのうちの少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、または少なくとも4つが、前記モチーフにおけるグリコシル化を防止するアミノ酸挿入、欠失、または置換を含む、本発明1002のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1004]
前記ＩｇＭ由来結合分子が、モチーフＮ1、モチーフＮ2、モチーフＮ3、モチーフＮ5、またはモチーフＮ1、Ｎ2、Ｎ3、もしくはＮ5のうちの2つ以上、3つ以上、もしくは4つ全ての任意の組合せにおいて、アミノ酸挿入、欠失、または置換を含み、前記アミノ酸挿入、欠失、または置換が、前記モチーフにおけるグリコシル化を防止する、本発明1003のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1005]
置換後のアミノ酸が任意のアミノ酸である、配列番号1もしくは配列番号2のアミノ酸Ｎ46、Ｎ209、Ｎ272、もしくはＮ440に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換；置換後のアミノ酸がトレオニンを除く任意のアミノ酸である、配列番号1もしくは配列番号2のアミノ酸Ｓ48、Ｓ211、Ｓ274、もしくはＳ442に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換；または前記アミノ酸置換のうちの2つ以上、3つ以上、もしくは4つ以上の任意の組合せを含む、本発明1004のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1006]
前記ＩｇＭ由来結合分子が、配列番号1もしくは配列番号2のＮ46Ｘ 2 、Ｎ46Ａ、Ｎ46Ｄ、Ｎ46Ｑ、Ｎ46Ｋ、Ｓ48Ｘ 3 、Ｓ48Ａ、Ｎ229Ｘ 2 、Ｎ229Ａ、Ｎ229Ｄ、Ｎ229Ｑ、Ｎ229Ｋ、Ｓ231Ｘ 3 、Ｓ231Ａ、Ｎ272Ｘ 2 、Ｎ272Ａ、Ｎ272Ｄ、Ｎ272Ｑ、Ｎ272Ｋ、Ｓ274Ｘ 3 、Ｓ274Ａ、Ｎ440Ｘ 2 、Ｎ440Ａ、Ｎ440Ｄ、Ｎ449Ｑ、Ｎ449Ｋ、Ｓ242Ｘ 3 、もしくはＳ424Ａに対応するアミノ酸置換、または前記アミノ酸置換のうちの2つ以上、3つ以上、もしくは4つ以上の任意の組合せを含み、Ｘ 2 は任意のアミノ酸であり、Ｘ 3 はトレオニンを除く任意のアミノ酸である、本発明1005のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1007]
前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域が、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、または配列番号18のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＩｇＭ定常領域である、本発明1001～1006のいずれかのＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1008]
前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域が、前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域に少なくとも1つの新しいアスパラギン（Ｎ）結合型グリコシル化モチーフを導入するように変異しており、前記少なくとも1つの新しいアスパラギン（Ｎ）結合型グリコシル化モチーフが、前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域における、ＩｇＭ抗体において自然にはグリコシル化されない部位に導入されている、本発明1001～1007のいずれかのＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1009]
前記新しいアスパラギン（Ｎ）結合型グリコシル化モチーフが、前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域における、異なる免疫グロブリンアイソタイプに存在するアスパラギン（Ｎ）結合型グリコシル化モチーフの位置に対応する位置に存在する、本発明1008のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1010]
前記異なる免疫グロブリンアイソタイプが、ヒトＩｇＧ1、ヒトＩｇＧ2、ヒトＩｇＧ3、ヒトＩｇＧ4、ヒトＩｇＡ1、ヒトＩｇＡ2、ヒトＩｇＤ、及びヒトＩｇＥからなる群から選択されるヒト免疫グロブリンアイソタイプである、本発明1009のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1011]
前記標的が、標的エピトープ、標的抗原、標的細胞、標的器官、または標的ウイルスである、本発明1001～1010のいずれかのＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1012]
前記ＩｇＭ由来結合分子が、それぞれ5つまたは6つの2価ＩｇＭ結合ユニットを含む五量体または六量体ＩｇＭ抗体であり、各結合ユニットが、前記バリアントＩｇＭ定常領域に対してアミノ末端側に位置するＶＨをそれぞれ含む2つのＩｇＭ重鎖と、免疫グロブリン軽鎖定常領域に対してアミノ末端側に位置する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）をそれぞれ含む2つの免疫グロブリン軽鎖とを含み、前記ＶＨ及びＶＬが、組み合わさって、前記標的に特異的に結合する抗原結合ドメインを形成する、本発明1001～1011のいずれかのＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1013]
前記5つまたは6つのＩｇＭ結合ユニットが同一である、本発明1012のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1014]
五量体であり、且つＪ鎖またはその機能性断片またはその機能性バリアントをさらに含む、本発明1012または本発明1013のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1015]
前記Ｊ鎖が、配列番号20のアミノ酸配列を含む成熟ヒトＪ鎖、またはその機能性断片、またはその機能性バリアントである、本発明1014のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1016]
前記Ｊ鎖が、参照Ｊ鎖と比較して1つ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を含む、機能性バリアントＪ鎖であり、前記参照Ｊ鎖が、前記1つ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を除いて前記バリアントＪ鎖と同一であり、前記ＩｇＭ由来結合分子が、対象動物に投与された際に、前記バリアントＪ鎖における前記1つ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を除いて同一であり且つ同一の動物種に同一の方法で投与される参照ＩｇＭ由来結合分子と比較して、増加した血清半減期を示す、本発明1014または本発明1015のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1017]
前記バリアントＪ鎖またはその機能性断片が、前記参照Ｊ鎖と比較して1つ、2つ、3つ、または4つの単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を含む、本発明1016のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1018]
前記バリアントＪ鎖またはその機能性断片が、野生型成熟ヒトＪ鎖（配列番号20）のアミノ酸Ｙ102に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む、本発明1016または本発明1017のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1019]
配列番号20のＹ102に対応するアミノ酸がアラニン（Ａ）で置換されている、本発明1018のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1020]
前記Ｊ鎖が、配列番号21のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＪ鎖Ｊ ＊ である、本発明1019のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1021]
前記バリアントＪ鎖またはその機能性断片が、成熟ヒトＪ鎖（配列番号20）のアミノ酸49（モチーフＮ6）に対応するアミノ酸位置から始まるアスパラギン（Ｎ）結合型グリコシル化モチーフＮ－Ｘ 1 －Ｓ／Ｔ内での変異を含み、モチーフ中、Ｎはアスパラギンであり、Ｘ 1 はプロリン以外の任意のアミノ酸であり、Ｓ／Ｔはセリンまたはトレオニンであり、前記変異が、前記モチーフにおけるグリコシル化を防止する、本発明1016～1019のいずれかのＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1022]
前記バリアントＪ鎖またはその機能性断片が、配列番号20のアミノ酸Ｎ49もしくはアミノ酸Ｓ51に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含み、Ｓ51に対応するアミノ酸がトレオニン（Ｔ）で置換されていないか、または、前記バリアントＪ鎖が、配列番号20のアミノ酸Ｎ49及びＳ51の両方に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む、本発明1021のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1023]
配列番号20のＮ49に対応する前記位置が、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）で置換されている、本発明1022のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1024]
配列番号20のＮ49に対応する前記位置がアラニン（Ａ）で置換されている、本発明1023のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1025]
前記Ｊ鎖がバリアントヒトＪ鎖であり、且つ配列番号22のアミノ酸配列を含む、本発明1024のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1026]
配列番号20のＮ49に対応する前記位置がアスパラギン酸（Ｄ）で置換されている、本発明1023のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1027]
前記Ｊ鎖がバリアントヒトＪ鎖であり、且つ配列番号23のアミノ酸配列を含む、本発明1026のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1028]
前記Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントが、異種部分をさらに含む改変Ｊ鎖であり、前記異種部分が、前記Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントに融合またはコンジュゲートしている、本発明1014～1027のいずれかのＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1029]
前記異種部分が、前記Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントに融合しているポリペプチドである、本発明1028のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1030]
前記異種ポリペプチドが、ペプチドリンカーを介して前記Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントに融合している、本発明1029のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1031]
前記ペプチドリンカーが、少なくとも5個のアミノ酸、ただし25個以下のアミノ酸を含む、本発明1030のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1032]
前記ペプチドリンカーが、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号29）からなる、本発明1030または本発明1031のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1033]
前記異種ポリペプチドが、前記Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントのＮ末端、前記Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントのＣ末端、あるいは前記Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントのＮ末端及びＣ末端の両方に融合している、本発明1029～1032のいずれかのＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1034]
前記異種ポリペプチドが結合ドメインを含む、本発明1029～1033のいずれかのＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1035]
前記異種ポリペプチドの前記結合ドメインが、抗体またはその抗原結合断片である、本発明1034のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1036]
前記抗原結合断片がｓｃＦｖ断片である、本発明1035のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1037]
前記異種ｓｃＦｖ断片がＣＤ3εに特異的に結合する、本発明1036のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1038]
前記改変Ｊ鎖が、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号52、配列番号53、及び配列番号54；配列番号57、配列番号59、配列番号62、配列番号65、配列番号67、及び配列番号69；配列番号57、配列番号59、配列番号62、配列番号65、配列番号67、及び配列番号70；配列番号58、配列番号60、配列番号63、配列番号66、配列番号68、及び配列番号71；配列番号58、配列番号61、配列番号63、配列番号66、配列番号68、及び配列番号72；配列番号58、配列番号61、配列番号64、配列番号66、配列番号68、及び配列番号73をそれぞれ含むＨＣＤＲ1、ＨＣＤＲ2、ＨＣＤＲ3、ＬＣＤＲ1、ＬＣＤＲ2、及びＬＣＤＲ3アミノ酸配列を含む抗ＣＤ3ε ｓｃＦｖにペプチドリンカーを介して融合している、配列番号24（Ｖ15Ｊ）、配列番号25（Ｖ15Ｊ ＊ ）、配列番号26（Ｖ15Ｊ Ｎ49Ｄ）、もしくは配列番号55（ＳＪ ＊ ）、または配列番号20、21、22、もしくは23のアミノ酸配列を含む、本発明1037のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1039]
本発明1001～1037のいずれかの少なくとも1つのバリアントＩｇＭ由来重鎖をコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
[本発明1040]
本発明1039のポリヌクレオチドを含む、組成物。
[本発明1041]
軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列をさらに含む、本発明1040の組成物。
[本発明1042]
前記少なくとも1つのバリアントＩｇＭ由来重鎖をコードする前記核酸配列と、前記軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする前記核酸配列とが、別のベクター上にある、本発明1041の組成物。
[本発明1043]
前記少なくとも1つのバリアントＩｇＭ由来重鎖をコードする前記核酸配列と、前記軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする前記核酸配列とが、単一のベクター上にある、本発明1041の組成物。
[本発明1044]
Ｊ鎖またはその機能性断片またはその機能性バリアントをコードする核酸配列をさらに含む、本発明1041～1043のいずれかの組成物。
[本発明1045]
前記少なくとも1つのバリアントＩｇＭ由来重鎖をコードする前記核酸配列と、前記軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする前記核酸配列と、前記Ｊ鎖をコードする前記核酸配列とが、単一のベクター上にある、本発明1044の組成物。
[本発明1046]
前記少なくとも1つのバリアントＩｇＭ由来重鎖をコードする前記核酸配列と、前記軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする前記核酸配列と、前記Ｊ鎖をコードする前記核酸配列とが、それぞれ別のベクター上にある、本発明1044の組成物。
[本発明1047]
本発明1042、1043、1045、または1046のいずれかの1つまたは複数のベクター。
[本発明1048]
宿主細胞であって、本発明1039のポリヌクレオチド、本発明1040～1046のいずれかの組成物、または、本発明1047の1つもしくは複数のベクターを含み、前記宿主細胞が、本発明1001～1037のいずれかのＩｇＭ由来結合分子を発現することができる、前記宿主細胞。
[本発明1049]
本発明1001～1037のいずれかのＩｇＭ由来結合分子を作製する方法であって、本発明1048の宿主細胞を培養することと、前記定常領域または抗体を回収することとを含む、前記方法。
[本発明1001]
少なくとも1つのバリアントＩｇＭ由来重鎖を含む、単離されたＩｇＭ由来結合分子であって、前記少なくとも1つのバリアントＩｇＭ由来重鎖が、標的に特異的に結合する結合ドメインと連結されているバリアントＩｇＭ重鎖定常領域を含み、前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域の少なくとも1つのアスパラギン（Ｎ）結合型グリコシル化モチーフが、前記モチーフにおけるグリコシル化を防止するように変異しており、Ｎ結合型グリコシル化モチーフがアミノ酸配列Ｎ－Ｘ 1 －Ｓ／Ｔを含み、配列中、Ｎはアスパラギンであり、Ｘ 1 は、プロリンを除く任意のアミノ酸であり、Ｓ／Ｔはセリンまたはトレオニンである、前記結合分子。
[本発明1002]
前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域が、配列番号1（アレルＩＧＨＭ ＊ 03）または配列番号2（アレルＩＧＨＭ ＊ 04）のアミノ酸46（モチーフＮ1）、アミノ酸209（モチーフＮ2）、アミノ酸272（モチーフＮ3）、アミノ酸279（モチーフＮ4）、及びアミノ酸440（モチーフＮ5）に対応するアミノ酸位置から始まる5つのＮ結合型グリコシル化モチーフＮ－Ｘ 1 －Ｓ／Ｔを含むヒトＩｇＭ重鎖定常領域に由来する、本発明1001のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1003]
前記Ｎ－Ｘ 1 －Ｓ／Ｔモチーフのうちの少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、または少なくとも4つが、前記モチーフにおけるグリコシル化を防止するアミノ酸挿入、欠失、または置換を含む、本発明1002のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1004]
前記ＩｇＭ由来結合分子が、モチーフＮ1、モチーフＮ2、モチーフＮ3、モチーフＮ5、またはモチーフＮ1、Ｎ2、Ｎ3、もしくはＮ5のうちの2つ以上、3つ以上、もしくは4つ全ての任意の組合せにおいて、アミノ酸挿入、欠失、または置換を含み、前記アミノ酸挿入、欠失、または置換が、前記モチーフにおけるグリコシル化を防止する、本発明1003のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1005]
置換後のアミノ酸が任意のアミノ酸である、配列番号1もしくは配列番号2のアミノ酸Ｎ46、Ｎ209、Ｎ272、もしくはＮ440に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換；置換後のアミノ酸がトレオニンを除く任意のアミノ酸である、配列番号1もしくは配列番号2のアミノ酸Ｓ48、Ｓ211、Ｓ274、もしくはＳ442に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換；または前記アミノ酸置換のうちの2つ以上、3つ以上、もしくは4つ以上の任意の組合せを含む、本発明1004のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1006]
前記ＩｇＭ由来結合分子が、配列番号1もしくは配列番号2のＮ46Ｘ 2 、Ｎ46Ａ、Ｎ46Ｄ、Ｎ46Ｑ、Ｎ46Ｋ、Ｓ48Ｘ 3 、Ｓ48Ａ、Ｎ229Ｘ 2 、Ｎ229Ａ、Ｎ229Ｄ、Ｎ229Ｑ、Ｎ229Ｋ、Ｓ231Ｘ 3 、Ｓ231Ａ、Ｎ272Ｘ 2 、Ｎ272Ａ、Ｎ272Ｄ、Ｎ272Ｑ、Ｎ272Ｋ、Ｓ274Ｘ 3 、Ｓ274Ａ、Ｎ440Ｘ 2 、Ｎ440Ａ、Ｎ440Ｄ、Ｎ449Ｑ、Ｎ449Ｋ、Ｓ242Ｘ 3 、もしくはＳ424Ａに対応するアミノ酸置換、または前記アミノ酸置換のうちの2つ以上、3つ以上、もしくは4つ以上の任意の組合せを含み、Ｘ 2 は任意のアミノ酸であり、Ｘ 3 はトレオニンを除く任意のアミノ酸である、本発明1005のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1007]
前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域が、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、または配列番号18のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＩｇＭ定常領域である、本発明1001～1006のいずれかのＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1008]
前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域が、前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域に少なくとも1つの新しいアスパラギン（Ｎ）結合型グリコシル化モチーフを導入するように変異しており、前記少なくとも1つの新しいアスパラギン（Ｎ）結合型グリコシル化モチーフが、前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域における、ＩｇＭ抗体において自然にはグリコシル化されない部位に導入されている、本発明1001～1007のいずれかのＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1009]
前記新しいアスパラギン（Ｎ）結合型グリコシル化モチーフが、前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域における、異なる免疫グロブリンアイソタイプに存在するアスパラギン（Ｎ）結合型グリコシル化モチーフの位置に対応する位置に存在する、本発明1008のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1010]
前記異なる免疫グロブリンアイソタイプが、ヒトＩｇＧ1、ヒトＩｇＧ2、ヒトＩｇＧ3、ヒトＩｇＧ4、ヒトＩｇＡ1、ヒトＩｇＡ2、ヒトＩｇＤ、及びヒトＩｇＥからなる群から選択されるヒト免疫グロブリンアイソタイプである、本発明1009のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1011]
前記標的が、標的エピトープ、標的抗原、標的細胞、標的器官、または標的ウイルスである、本発明1001～1010のいずれかのＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1012]
前記ＩｇＭ由来結合分子が、それぞれ5つまたは6つの2価ＩｇＭ結合ユニットを含む五量体または六量体ＩｇＭ抗体であり、各結合ユニットが、前記バリアントＩｇＭ定常領域に対してアミノ末端側に位置するＶＨをそれぞれ含む2つのＩｇＭ重鎖と、免疫グロブリン軽鎖定常領域に対してアミノ末端側に位置する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）をそれぞれ含む2つの免疫グロブリン軽鎖とを含み、前記ＶＨ及びＶＬが、組み合わさって、前記標的に特異的に結合する抗原結合ドメインを形成する、本発明1001～1011のいずれかのＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1013]
前記5つまたは6つのＩｇＭ結合ユニットが同一である、本発明1012のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1014]
五量体であり、且つＪ鎖またはその機能性断片またはその機能性バリアントをさらに含む、本発明1012または本発明1013のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1015]
前記Ｊ鎖が、配列番号20のアミノ酸配列を含む成熟ヒトＪ鎖、またはその機能性断片、またはその機能性バリアントである、本発明1014のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1016]
前記Ｊ鎖が、参照Ｊ鎖と比較して1つ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を含む、機能性バリアントＪ鎖であり、前記参照Ｊ鎖が、前記1つ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を除いて前記バリアントＪ鎖と同一であり、前記ＩｇＭ由来結合分子が、対象動物に投与された際に、前記バリアントＪ鎖における前記1つ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を除いて同一であり且つ同一の動物種に同一の方法で投与される参照ＩｇＭ由来結合分子と比較して、増加した血清半減期を示す、本発明1014または本発明1015のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1017]
前記バリアントＪ鎖またはその機能性断片が、前記参照Ｊ鎖と比較して1つ、2つ、3つ、または4つの単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を含む、本発明1016のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1018]
前記バリアントＪ鎖またはその機能性断片が、野生型成熟ヒトＪ鎖（配列番号20）のアミノ酸Ｙ102に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む、本発明1016または本発明1017のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1019]
配列番号20のＹ102に対応するアミノ酸がアラニン（Ａ）で置換されている、本発明1018のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1020]
前記Ｊ鎖が、配列番号21のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＪ鎖Ｊ ＊ である、本発明1019のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1021]
前記バリアントＪ鎖またはその機能性断片が、成熟ヒトＪ鎖（配列番号20）のアミノ酸49（モチーフＮ6）に対応するアミノ酸位置から始まるアスパラギン（Ｎ）結合型グリコシル化モチーフＮ－Ｘ 1 －Ｓ／Ｔ内での変異を含み、モチーフ中、Ｎはアスパラギンであり、Ｘ 1 はプロリン以外の任意のアミノ酸であり、Ｓ／Ｔはセリンまたはトレオニンであり、前記変異が、前記モチーフにおけるグリコシル化を防止する、本発明1016～1019のいずれかのＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1022]
前記バリアントＪ鎖またはその機能性断片が、配列番号20のアミノ酸Ｎ49もしくはアミノ酸Ｓ51に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含み、Ｓ51に対応するアミノ酸がトレオニン（Ｔ）で置換されていないか、または、前記バリアントＪ鎖が、配列番号20のアミノ酸Ｎ49及びＳ51の両方に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む、本発明1021のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1023]
配列番号20のＮ49に対応する前記位置が、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）で置換されている、本発明1022のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1024]
配列番号20のＮ49に対応する前記位置がアラニン（Ａ）で置換されている、本発明1023のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1025]
前記Ｊ鎖がバリアントヒトＪ鎖であり、且つ配列番号22のアミノ酸配列を含む、本発明1024のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1026]
配列番号20のＮ49に対応する前記位置がアスパラギン酸（Ｄ）で置換されている、本発明1023のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1027]
前記Ｊ鎖がバリアントヒトＪ鎖であり、且つ配列番号23のアミノ酸配列を含む、本発明1026のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1028]
前記Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントが、異種部分をさらに含む改変Ｊ鎖であり、前記異種部分が、前記Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントに融合またはコンジュゲートしている、本発明1014～1027のいずれかのＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1029]
前記異種部分が、前記Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントに融合しているポリペプチドである、本発明1028のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1030]
前記異種ポリペプチドが、ペプチドリンカーを介して前記Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントに融合している、本発明1029のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1031]
前記ペプチドリンカーが、少なくとも5個のアミノ酸、ただし25個以下のアミノ酸を含む、本発明1030のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1032]
前記ペプチドリンカーが、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号29）からなる、本発明1030または本発明1031のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1033]
前記異種ポリペプチドが、前記Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントのＮ末端、前記Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントのＣ末端、あるいは前記Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントのＮ末端及びＣ末端の両方に融合している、本発明1029～1032のいずれかのＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1034]
前記異種ポリペプチドが結合ドメインを含む、本発明1029～1033のいずれかのＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1035]
前記異種ポリペプチドの前記結合ドメインが、抗体またはその抗原結合断片である、本発明1034のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1036]
前記抗原結合断片がｓｃＦｖ断片である、本発明1035のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1037]
前記異種ｓｃＦｖ断片がＣＤ3εに特異的に結合する、本発明1036のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1038]
前記改変Ｊ鎖が、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号52、配列番号53、及び配列番号54；配列番号57、配列番号59、配列番号62、配列番号65、配列番号67、及び配列番号69；配列番号57、配列番号59、配列番号62、配列番号65、配列番号67、及び配列番号70；配列番号58、配列番号60、配列番号63、配列番号66、配列番号68、及び配列番号71；配列番号58、配列番号61、配列番号63、配列番号66、配列番号68、及び配列番号72；配列番号58、配列番号61、配列番号64、配列番号66、配列番号68、及び配列番号73をそれぞれ含むＨＣＤＲ1、ＨＣＤＲ2、ＨＣＤＲ3、ＬＣＤＲ1、ＬＣＤＲ2、及びＬＣＤＲ3アミノ酸配列を含む抗ＣＤ3ε ｓｃＦｖにペプチドリンカーを介して融合している、配列番号24（Ｖ15Ｊ）、配列番号25（Ｖ15Ｊ ＊ ）、配列番号26（Ｖ15Ｊ Ｎ49Ｄ）、もしくは配列番号55（ＳＪ ＊ ）、または配列番号20、21、22、もしくは23のアミノ酸配列を含む、本発明1037のＩｇＭ由来結合分子。
[本発明1039]
本発明1001～1037のいずれかの少なくとも1つのバリアントＩｇＭ由来重鎖をコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
[本発明1040]
本発明1039のポリヌクレオチドを含む、組成物。
[本発明1041]
軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列をさらに含む、本発明1040の組成物。
[本発明1042]
前記少なくとも1つのバリアントＩｇＭ由来重鎖をコードする前記核酸配列と、前記軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする前記核酸配列とが、別のベクター上にある、本発明1041の組成物。
[本発明1043]
前記少なくとも1つのバリアントＩｇＭ由来重鎖をコードする前記核酸配列と、前記軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする前記核酸配列とが、単一のベクター上にある、本発明1041の組成物。
[本発明1044]
Ｊ鎖またはその機能性断片またはその機能性バリアントをコードする核酸配列をさらに含む、本発明1041～1043のいずれかの組成物。
[本発明1045]
前記少なくとも1つのバリアントＩｇＭ由来重鎖をコードする前記核酸配列と、前記軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする前記核酸配列と、前記Ｊ鎖をコードする前記核酸配列とが、単一のベクター上にある、本発明1044の組成物。
[本発明1046]
前記少なくとも1つのバリアントＩｇＭ由来重鎖をコードする前記核酸配列と、前記軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする前記核酸配列と、前記Ｊ鎖をコードする前記核酸配列とが、それぞれ別のベクター上にある、本発明1044の組成物。
[本発明1047]
本発明1042、1043、1045、または1046のいずれかの1つまたは複数のベクター。
[本発明1048]
宿主細胞であって、本発明1039のポリヌクレオチド、本発明1040～1046のいずれかの組成物、または、本発明1047の1つもしくは複数のベクターを含み、前記宿主細胞が、本発明1001～1037のいずれかのＩｇＭ由来結合分子を発現することができる、前記宿主細胞。
[本発明1049]
本発明1001～1037のいずれかのＩｇＭ由来結合分子を作製する方法であって、本発明1048の宿主細胞を培養することと、前記定常領域または抗体を回収することとを含む、前記方法。
Claims (49)
- 少なくとも１つのバリアントＩｇＭ由来重鎖を含む、単離されたＩｇＭ由来結合分子であって、前記少なくとも１つのバリアントＩｇＭ由来重鎖が、標的に特異的に結合する結合ドメインと連結されているバリアントＩｇＭ重鎖定常領域を含み、前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域の少なくとも１つのアスパラギン（Ｎ）結合型グリコシル化モチーフが、前記モチーフにおけるグリコシル化を防止するように変異しており、Ｎ結合型グリコシル化モチーフがアミノ酸配列Ｎ－Ｘ１－Ｓ／Ｔを含み、配列中、Ｎはアスパラギンであり、Ｘ１は、プロリンを除く任意のアミノ酸であり、Ｓ／Ｔはセリンまたはトレオニンである、前記結合分子。
- 前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域が、配列番号１（アレルＩＧＨＭ＊０３）または配列番号２（アレルＩＧＨＭ＊０４）のアミノ酸４６（モチーフＮ１）、アミノ酸２０９（モチーフＮ２）、アミノ酸２７２（モチーフＮ３）、アミノ酸２７９（モチーフＮ４）、及びアミノ酸４４０（モチーフＮ５）に対応するアミノ酸位置から始まる５つのＮ結合型グリコシル化モチーフＮ－Ｘ１－Ｓ／Ｔを含むヒトＩｇＭ重鎖定常領域に由来する、請求項１に記載のＩｇＭ由来結合分子。
- 前記Ｎ－Ｘ１－Ｓ／Ｔモチーフのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つが、前記モチーフにおけるグリコシル化を防止するアミノ酸挿入、欠失、または置換を含む、請求項２に記載のＩｇＭ由来結合分子。
- 前記ＩｇＭ由来結合分子が、モチーフＮ１、モチーフＮ２、モチーフＮ３、モチーフＮ５、またはモチーフＮ１、Ｎ２、Ｎ３、もしくはＮ５のうちの２つ以上、３つ以上、もしくは４つ全ての任意の組合せにおいて、アミノ酸挿入、欠失、または置換を含み、前記アミノ酸挿入、欠失、または置換が、前記モチーフにおけるグリコシル化を防止する、請求項３に記載のＩｇＭ由来結合分子。
- 置換後のアミノ酸が任意のアミノ酸である、配列番号１もしくは配列番号２のアミノ酸Ｎ４６、Ｎ２０９、Ｎ２７２、もしくはＮ４４０に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換；置換後のアミノ酸がトレオニンを除く任意のアミノ酸である、配列番号１もしくは配列番号２のアミノ酸Ｓ４８、Ｓ２１１、Ｓ２７４、もしくはＳ４４２に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換；または前記アミノ酸置換のうちの２つ以上、３つ以上、もしくは４つ以上の任意の組合せを含む、請求項４に記載のＩｇＭ由来結合分子。
- 前記ＩｇＭ由来結合分子が、配列番号１もしくは配列番号２のＮ４６Ｘ２、Ｎ４６Ａ、Ｎ４６Ｄ、Ｎ４６Ｑ、Ｎ４６Ｋ、Ｓ４８Ｘ３、Ｓ４８Ａ、Ｎ２２９Ｘ２、Ｎ２２９Ａ、Ｎ２２９Ｄ、Ｎ２２９Ｑ、Ｎ２２９Ｋ、Ｓ２３１Ｘ３、Ｓ２３１Ａ、Ｎ２７２Ｘ２、Ｎ２７２Ａ、Ｎ２７２Ｄ、Ｎ２７２Ｑ、Ｎ２７２Ｋ、Ｓ２７４Ｘ３、Ｓ２７４Ａ、Ｎ４４０Ｘ２、Ｎ４４０Ａ、Ｎ４４０Ｄ、Ｎ４４９Ｑ、Ｎ４４９Ｋ、Ｓ２４２Ｘ３、もしくはＳ４２４Ａに対応するアミノ酸置換、または前記アミノ酸置換のうちの２つ以上、３つ以上、もしくは４つ以上の任意の組合せを含み、Ｘ２は任意のアミノ酸であり、Ｘ３はトレオニンを除く任意のアミノ酸である、請求項５に記載のＩｇＭ由来結合分子。
- 前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域が、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、または配列番号１８のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＩｇＭ定常領域である、請求項１～６のいずれか一項に記載のＩｇＭ由来結合分子。
- 前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域が、前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域に少なくとも１つの新しいアスパラギン（Ｎ）結合型グリコシル化モチーフを導入するように変異しており、前記少なくとも１つの新しいアスパラギン（Ｎ）結合型グリコシル化モチーフが、前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域における、ＩｇＭ抗体において自然にはグリコシル化されない部位に導入されている、請求項１～７のいずれか一項に記載のＩｇＭ由来結合分子。
- 前記新しいアスパラギン（Ｎ）結合型グリコシル化モチーフが、前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域における、異なる免疫グロブリンアイソタイプに存在するアスパラギン（Ｎ）結合型グリコシル化モチーフの位置に対応する位置に存在する、請求項８に記載のＩｇＭ由来結合分子。
- 前記異なる免疫グロブリンアイソタイプが、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ４、ヒトＩｇＡ１、ヒトＩｇＡ２、ヒトＩｇＤ、及びヒトＩｇＥからなる群から選択されるヒト免疫グロブリンアイソタイプである、請求項９に記載のＩｇＭ由来結合分子。
- 前記標的が、標的エピトープ、標的抗原、標的細胞、標的器官、または標的ウイルスである、請求項１～１０のいずれか一項に記載のＩｇＭ由来結合分子。
- 前記ＩｇＭ由来結合分子が、それぞれ５つまたは６つの２価ＩｇＭ結合ユニットを含む五量体または六量体ＩｇＭ抗体であり、各結合ユニットが、前記バリアントＩｇＭ定常領域に対してアミノ末端側に位置するＶＨをそれぞれ含む２つのＩｇＭ重鎖と、免疫グロブリン軽鎖定常領域に対してアミノ末端側に位置する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）をそれぞれ含む２つの免疫グロブリン軽鎖とを含み、前記ＶＨ及びＶＬが、組み合わさって、前記標的に特異的に結合する抗原結合ドメインを形成する、請求項１～１１のいずれか一項に記載のＩｇＭ由来結合分子。
- 前記５つまたは６つのＩｇＭ結合ユニットが同一である、請求項１２に記載のＩｇＭ由来結合分子。
- 五量体であり、且つＪ鎖またはその機能性断片またはその機能性バリアントをさらに含む、請求項１２または請求項１３に記載のＩｇＭ由来結合分子。
- 前記Ｊ鎖が、配列番号２０のアミノ酸配列を含む成熟ヒトＪ鎖、またはその機能性断片、またはその機能性バリアントである、請求項１４に記載のＩｇＭ由来結合分子。
- 前記Ｊ鎖が、参照Ｊ鎖と比較して１つ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を含む、機能性バリアントＪ鎖であり、前記参照Ｊ鎖が、前記１つ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を除いて前記バリアントＪ鎖と同一であり、前記ＩｇＭ由来結合分子が、対象動物に投与された際に、前記バリアントＪ鎖における前記１つ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を除いて同一であり且つ同一の動物種に同一の方法で投与される参照ＩｇＭ由来結合分子と比較して、増加した血清半減期を示す、請求項１４または請求項１５に記載のＩｇＭ由来結合分子。
- 前記バリアントＪ鎖またはその機能性断片が、前記参照Ｊ鎖と比較して１つ、２つ、３つ、または４つの単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を含む、請求項１６に記載のＩｇＭ由来結合分子。
- 前記バリアントＪ鎖またはその機能性断片が、野生型成熟ヒトＪ鎖（配列番号２０）のアミノ酸Ｙ１０２に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む、請求項１６または請求項１７に記載のＩｇＭ由来結合分子。
- 配列番号２０のＹ１０２に対応するアミノ酸がアラニン（Ａ）で置換されている、請求項１８に記載のＩｇＭ由来結合分子。
- 前記Ｊ鎖が、配列番号２１のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＪ鎖Ｊ＊である、請求項１９に記載のＩｇＭ由来結合分子。
- 前記バリアントＪ鎖またはその機能性断片が、成熟ヒトＪ鎖（配列番号２０）のアミノ酸４９（モチーフＮ６）に対応するアミノ酸位置から始まるアスパラギン（Ｎ）結合型グリコシル化モチーフＮ－Ｘ１－Ｓ／Ｔ内での変異を含み、モチーフ中、Ｎはアスパラギンであり、Ｘ１はプロリン以外の任意のアミノ酸であり、Ｓ／Ｔはセリンまたはトレオニンであり、前記変異が、前記モチーフにおけるグリコシル化を防止する、請求項１６～１９のいずれか一項に記載のＩｇＭ由来結合分子。
- 前記バリアントＪ鎖またはその機能性断片が、配列番号２０のアミノ酸Ｎ４９もしくはアミノ酸Ｓ５１に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含み、Ｓ５１に対応するアミノ酸がトレオニン（Ｔ）で置換されていないか、または、前記バリアントＪ鎖が、配列番号２０のアミノ酸Ｎ４９及びＳ５１の両方に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む、請求項２１に記載のＩｇＭ由来結合分子。
- 配列番号２０のＮ４９に対応する前記位置が、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）で置換されている、請求項２２に記載のＩｇＭ由来結合分子。
- 配列番号２０のＮ４９に対応する前記位置がアラニン（Ａ）で置換されている、請求項２３に記載のＩｇＭ由来結合分子。
- 前記Ｊ鎖がバリアントヒトＪ鎖であり、且つ配列番号２２のアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載のＩｇＭ由来結合分子。
- 配列番号２０のＮ４９に対応する前記位置がアスパラギン酸（Ｄ）で置換されている、請求項２３に記載のＩｇＭ由来結合分子。
- 前記Ｊ鎖がバリアントヒトＪ鎖であり、且つ配列番号２３のアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載のＩｇＭ由来結合分子。
- 前記Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントが、異種部分をさらに含む改変Ｊ鎖であり、前記異種部分が、前記Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントに融合またはコンジュゲートしている、請求項１４～２７のいずれか一項に記載のＩｇＭ由来結合分子。
- 前記異種部分が、前記Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントに融合しているポリペプチドである、請求項２８に記載のＩｇＭ由来結合分子。
- 前記異種ポリペプチドが、ペプチドリンカーを介して前記Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントに融合している、請求項２９に記載のＩｇＭ由来結合分子。
- 前記ペプチドリンカーが、少なくとも５個のアミノ酸、ただし２５個以下のアミノ酸を含む、請求項３０に記載のＩｇＭ由来結合分子。
- 前記ペプチドリンカーが、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２９）からなる、請求項３０または請求項３１に記載のＩｇＭ由来結合分子。
- 前記異種ポリペプチドが、前記Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントのＮ末端、前記Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントのＣ末端、あるいは前記Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントのＮ末端及びＣ末端の両方に融合している、請求項２９～３２のいずれか一項に記載のＩｇＭ由来結合分子。
- 前記異種ポリペプチドが結合ドメインを含む、請求項２９～３３のいずれか一項に記載のＩｇＭ由来結合分子。
- 前記異種ポリペプチドの前記結合ドメインが、抗体またはその抗原結合断片である、請求項３４に記載のＩｇＭ由来結合分子。
- 前記抗原結合断片がｓｃＦｖ断片である、請求項３５に記載のＩｇＭ由来結合分子。
- 前記異種ｓｃＦｖ断片がＣＤ３εに特異的に結合する、請求項３６に記載のＩｇＭ由来結合分子。
- 前記改変Ｊ鎖が、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５３、及び配列番号５４；配列番号５７、配列番号５９、配列番号６２、配列番号６５、配列番号６７、及び配列番号６９；配列番号５７、配列番号５９、配列番号６２、配列番号６５、配列番号６７、及び配列番号７０；配列番号５８、配列番号６０、配列番号６３、配列番号６６、配列番号６８、及び配列番号７１；配列番号５８、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６６、配列番号６８、及び配列番号７２；配列番号５８、配列番号６１、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、及び配列番号７３をそれぞれ含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む抗ＣＤ３ε ｓｃＦｖにペプチドリンカーを介して融合している、配列番号２４（Ｖ１５Ｊ）、配列番号２５（Ｖ１５Ｊ＊）、配列番号２６（Ｖ１５Ｊ Ｎ４９Ｄ）、もしくは配列番号５５（ＳＪ＊）、または配列番号２０、２１、２２、もしくは２３のアミノ酸配列を含む、請求項３７に記載のＩｇＭ由来結合分子。
- 請求項１～３７のいずれか一項に記載の少なくとも１つのバリアントＩｇＭ由来重鎖をコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
- 請求項３９に記載のポリヌクレオチドを含む、組成物。
- 軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列をさらに含む、請求項４０に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つのバリアントＩｇＭ由来重鎖をコードする前記核酸配列と、前記軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする前記核酸配列とが、別のベクター上にある、請求項４１に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つのバリアントＩｇＭ由来重鎖をコードする前記核酸配列と、前記軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする前記核酸配列とが、単一のベクター上にある、請求項４１に記載の組成物。
- Ｊ鎖またはその機能性断片またはその機能性バリアントをコードする核酸配列をさらに含む、請求項４１～４３のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つのバリアントＩｇＭ由来重鎖をコードする前記核酸配列と、前記軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする前記核酸配列と、前記Ｊ鎖をコードする前記核酸配列とが、単一のベクター上にある、請求項４４に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つのバリアントＩｇＭ由来重鎖をコードする前記核酸配列と、前記軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする前記核酸配列と、前記Ｊ鎖をコードする前記核酸配列とが、それぞれ別のベクター上にある、請求項４４に記載の組成物。
- 請求項４２、４３、４５、または４６のいずれか一項に記載の１つまたは複数のベクター。
- 宿主細胞であって、請求項３９に記載のポリヌクレオチド、請求項４０～４６のいずれか一項に記載の組成物、または、請求項４７に記載の１つもしくは複数のベクターを含み、前記宿主細胞が、請求項１～３７のいずれか一項に記載のＩｇＭ由来結合分子を発現することができる、前記宿主細胞。
- 請求項１～３７のいずれか一項に記載のＩｇＭ由来結合分子を作製する方法であって、請求項４８に記載の宿主細胞を培養することと、前記定常領域または抗体を回収することとを含む、前記方法。
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