JP2012528112A - 抗原結合タンパク質 - Google Patents

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Abstract

本発明は、眼の疾患を治療するのに用いるためのＴＮＦαアンタゴニストとＶＥＧＦアンタゴニストの組合せに関し、ＴＮＦαまたはＴＮＦα受容体および／またはＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体と結合する抗原結合タンパク質を提供する。
【選択図】なし

Description

視力喪失は、先進経済に関する大きな健康問題になってきた。失明または弱視は、４０歳過ぎの３００万人を上回る米国民が罹患しており、これは年齢に伴って有意に増大する。例えば８０歳以上は、米国民の約８％を構成するが、しかし失明のほぼ７０％を占めている。典型的に年齢に関連する眼疾患としては、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）白内障、糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）および緑内障が挙げられる。
加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）は、先進国における失明の主因である。ＡＭＤには２つの主要な臨床症状がある。萎縮性（非滲出性）ＡＭＤは、網膜色素上皮（ＲＰＥ）および神経網膜の変性を特徴とする。早期段階の萎縮性ＡＭＤは、ＲＰＥ細胞層下のドルーゼン形成を伴う。早期萎縮性ＡＭＤは末期疾患に進行し得るが、末期萎縮性ＡＭＤでは、ＲＰＥは完全に変性し、黄斑の領域にＲＰＥ萎縮の明確に区別された領域、すなわち「地図状萎縮」を形成する。この型の疾患では、ＲＰＥの変性は黄斑性桿体および錐体の二次的な死を生じ、これらの場合、これが重度の加齢性視力喪失をもたらす。ＡＭＤ患者の一部は、当該疾患の異なる型とみなされるかまたはさらなる合併症とみなされ得るものを発症する。ＡＭＤ患者の約１０〜２０％は、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）を発症する。これが生じる場合、疾患の型は「滲出性ＡＭＤ」として既知であり、これは、最も重症な視力喪失のうちのいくつかに関連し得る。滲出性ＡＭＤでは、新規の脈絡膜血管はブルック膜の裂け目を通って成長し、ＲＰＥおよび神経網膜の中および下で増殖する。現在は、非常に一般的な萎縮型のＡＭＤのための治療の決定的な手段も、早期非滲出性ＡＭＤが地図状萎縮かまたは滲出性ＡＭＤに進行するのを防止するための決定的手段もない（Ｐｅｔｒｕｋｈｉｎ Ｋ, Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｔａｒｇｅｔｓ （２００７） １１： ６２５−６３９）。
糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）は、糖尿病患者における読書視力の喪失の最も頻度の高い原因である。２９年以上糖尿病を有している個体におけるＤＭＥの有病率は、約３０％である（Ｋｌｅｉｎ Ｒ ｅｔ ａｌ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ １９８４： ９１； １４６４−１４７４）。ＤＭＥは、ＩＬ−６、ＶＥＧＦおよびその他のサイトカインのレベル増大に関連し、異常網膜毛細管からの漏出を有する血液網膜関門の汎化性破綻ならびに網膜下間隙に発現する微小動脈瘤を伴う。最新ＤＭＥ治療の目標は、浮腫および漏出を低減して、視力改善をもたらすことである。良好な血糖症制御およびレーザー光凝固または抗血管新生処置は、糖尿病性眼の中心黄斑領域のさらなる増悪を防止するかまたは遅延することを目指す。コルチコステロイドの硝子体内注射も用いられてきた。
網膜静脈閉塞は、網膜静脈を通る血流の閉塞の後に起こる。これは、糖尿病、緑内障または高血圧のために密接に関連する腎動脈における血餅形成または圧力増大によるものであり得る。網膜からの血流低減は、眼血管における血圧の汎化性増大ならびに眼における酸素レベル低減を引き起こす。これは、順次、異常血管増殖、出血および浮腫、組織損傷および視力喪失をもたらす。ＲＶＯには２つの主な型があり、すなわち、網膜静脈分枝閉塞症（ＢＲＶＯ）と網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）である。視力の突然のかすみまたは喪失は、ＲＶＯの共通の特徴である。白内障発症および眼内圧上昇を伴う危険性はあるけれども、ＲＶＯを治療するために眼内コルチコステロイドが用いられてきた（Ｋｉｅｒｎａｎ ＤＦ ｅｔ ａｌ Ｅｘｐ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ ２００９ １０（１５） ２５１１−２５２５）。ＲＶＯの有病率は、〜０．２％（ＣＲＶＯ）から〜０．７％（ＢＲＶＯ）の範囲である。
ブドウ膜炎は、主に働き盛りの人々が罹患し、ブドウ膜（虹彩、毛様体および脈絡膜）の炎症を含む。前部ブドウ膜炎は、ブドウ膜炎症例の約７５％を構成する最も一般的な型のブドウ膜炎であり、それは主に、虹彩および毛様体を冒す。ブドウ膜炎は自己免疫疾患とみなされ、病因は依然として不明であるが、一方で、症例の約５０％においてＨＬＡ−Ｂ２７との関連性が認められている。後部ブドウ膜（すなわち脈絡膜）に関与する炎症は、後部ブドウ膜炎として既知であり、網膜の二次性関与が一般的である。ブドウ膜炎は、主に、眼区画中へのＣＤ４ Ｔ細胞の浸潤を伴う炎症性疾患である（Ｐａｒｏｌｉ ＭＰ ｅｔ ａｌ ２００７ １７（６） ９３８−９４２ Ｅｕｒ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ）。この場合も、コルチコステロイドが、局所的、眼周囲または全身的に投与される処置のための主力である。
ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子−α）は、多数の眼性炎症症状と関連づけられてきた前炎症性サイトカインである（Ｔｈｅｏｄｏｓｓｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ., Ａｍ． Ｊ. Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ. （２００９） １４７： ８２５−８３０）。
ＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）およびＶＥＧＦ受容体は、脈絡膜および網膜血管新生の両方を刺激し、このような血管の血管透過性を調節することが既知である（Ｇｒａｇｏｕｄａｓ ｅｔ ａｌ., Ｎ. Ｅｎｇｌ. Ｊ. Ｍｅｄ （２００４） ３５１： ２８０５）。新血管新生および漏出は、滲出型の加齢性黄斑変性の顕著な特徴である。アプタマーであるペガプタニブ（マクゲン（商標））（これは、ＶＥＧＦ−Ａアイソフォーム１６５を中和する）およびラニビズマブ（ルセンティス（商標））（これは、ＶＥＧＦ−Ａの全てのアイソフォームを遮断する）が、目下、使用を承認されている。
炎症性応答も、新血管新生において有意の病態生理学的役割を果たす（Ｓａｋｕｒｉ ｅｔ ａｌ., Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ （２００３） ４４： ５３４９−５３５４；Ｏｈ ｅｔ ａｌ. Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ （１９９９） ４０： １８９１−１８９８；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ., Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ （２００６） ８３： １３２５−１３３４）。
ＴＮＦαアンタゴニストに関する参考文献としては、Ｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ., Ａｒｃｈ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ （２００７） １２５： １２２１−１２２４；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ.， Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ （２００６） ８３： １３２５−１３３４；Ｋｏｃｉｏｋ ｅｔ ａｌ., Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ （２００６） １１： ５０５７−５０６５；Ｍａｒｋｏｍｉｃｈｅｌａｋｉｓ ｅｔ ａｌ. Ａｍ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ （２００５） １３９： ５３７−５４０が挙げられる。
インフリキシマブの硝子体内注射は、用量関連性であると思われる重篤な眼内炎症反応を引き出し得る、ということを複数の試験が示している。このような悪性事象は、アダリムマブに関しては認められなかった（Ｐｒｏｇｒａｍ ４２４７, Ｐｏｓｔｅｒ Ｄ９１３, Ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ ＴＮＦ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｍａｃｕｌａｒ Ｅｄｅｍａ： Ａ Ｐｉｌｏｔ Ｓｔｕｄｙ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｐａｎ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｔｉｎａ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ ａｎｄ Ｐｒｏｇｒａｍ ４７４９， Ｐｏｓｔｅｒ Ｄ１０８７, Ｏｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ Ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ ＴＮＦ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ： Ａ Ｐｉｌｏｔ Ｓｔｕｄｙ Ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｐａｎ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｔｉｎａ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ, Ｔｈｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｖｉｓｉｏｎ ａｎｄ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ （ＡＲＶＯ） Ｍａｙ ２−６ ２０１０. Ｆｔ. Ｌａｕｄｅｒｄａｌｅ ＵＳＡ）。
眼性疾患進行を防止するのに有効であり、より広範な患者群に視力改善を提供する治療レジメンが必要とされている。
本発明は、具体的には、眼の疾患を治療するのに用いるための、ＴＮＦαアンタゴニストとＶＥＧＦアンタゴニストの組合せに関する。
抗ＶＥＧＦおよび抗ＴＮＦアプローチはともに、ＡＭＤを治療するに際しての基準を有し、機械論的には、これらの様式は重複せず、したがって、抗ＶＥＧＦアプローチ療法に首尾よく応答しない患者は抗ＴＮＦ処置に応答し得るし、この逆も言える。
抗ＶＥＧＦ分枝の抗血管新生活性と組合される抗ＴＮＦの抗炎症利益は、このような眼疾患を治療するに際して効力改善を提供する。
個々のＴＮＦαアンタゴニストおよび個々のＶＥＧＦアンタゴニスト（すなわち別個のＴＮＦαおよびＶＥＧＦアンタゴニスト分子）の組合せの投与は、本発明により取り扱われる。さらに、ＴＮＦαアンタゴニストおよびＶＥＧＦアンタゴニストの両方として作用する（すなわち、ＴＮＦαまたはＴＮＦα受容体と結合し、その機能を抑制し、好ましくは遮断し、ならびにＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体と結合し、その機能を抑制し、好ましくは遮断し得る）二重標的化機能を有する単一構築物の投与は、本発明に包含される。単一構築物は、抗体足場または他のこのような適切な足場を基礎にし得る。受容体−Ｆｃ融合物も、本発明の一部とみなされる。
本発明は、特に抗原結合タンパク質に関する。
特に、本発明は、ＴＮＦα／ＶＥＧＦ二重標的化単一構築物であって、ＴＮＦαアンタゴニスト部分がヒト抗ＴＮＦα抗体であるかまたはそれに由来する構築物に関する。ＴＮＦα抗体は、アダリムマブまたはゴリムマブであり得る。
本発明は、特に、眼の疾患を治療するに際して用いるための、1つまたは複数のエピトープ結合ドメインと連結されるタンパク質足場を含む抗原結合タンパク質であって、少なくとも２つの抗原結合部位を有し、そのうちの少なくとも１つがエピトープ結合ドメインからであり、そのうちの少なくとも１つが対合化ＶＨ／ＶＬドメインからであり、そして抗原結合部位のうちの少なくとも１つがＴＮＦαまたはＴＮＦα受容体、例えばＴＮＦＲ１と結合し得るし、抗原結合部位の少なくとも１つがＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体、例えばＶＥＧＦＲ２と結合し得る抗原結合タンパク質に関する。
1つまたは複数のエピトープ結合ドメインと連結される受容体−Ｆｃ融合物、例えばＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体−結合ドメインと連結されるＴＮＦα受容体−Ｆｃ融合物、あるいはＴＮＦαまたはＴＮＦα受容体結合ドメインと連結されるＶＥＧＦ受容体−Ｆｃ融合物も、本発明の一部である。
本発明は、ＴＮＦαアンタゴニスト部分、ＶＥＧＦアンタゴニスト部分、ならびに上記ＴＮＦαアンタゴニスト部分を上記ＶＥＧＦアンタゴニスト部分に連結するリンカーを含む二重標的化抗原結合分子であって、ＴＮＦαアンタゴニスト部分が表１に列挙されるＴＮＦαアンタゴニストのうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み；ＶＥＧＦアンタゴニスト部分が表２に列挙されるＶＥＧＦアンタゴニストのうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み；リンカーが１〜１５０アミノ酸長のアミノ酸配列であり；そして二重標的化分子がＤＭＳ４０００またはＤＭＳ４０３１でない二重標的化抗原結合分子を提供する。リンカーは、非ペプチドベースのリンカー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびＰＥＧベースのリンカーでもあり得る。
本発明は、また、本発明の抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、例えば、本明細書記載の抗原結合タンパク質のいずれかのうちの重鎖をコードするポリヌクレオチド配列、および本明細書記載の抗原結合タンパク質のいずれかのうちの軽鎖をコードするポリヌクレオチドを提供する。このようなポリヌクレオチドは、等価のポリペプチド配列に対応するコード配列を示す。しかしながら、このようなポリヌクレオチド配列は、開始コドン、適切なシグナル配列および停止コドンと共に発現ベクター中にクローン化され得る、と理解されるであろう。
本発明はさらに組み換え型の形質転換または形質移入した宿主細胞を提供し、この宿主細胞は、本発明の抗原結合タンパク質をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド、例えば、本明細書記載の抗原結合タンパク質の重鎖および軽鎖を含む。
さらに、本発明は本明細書記載のいずれかの抗原結合タンパク質の産生方法を提供し、この方法は、本発明の抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのベクター、例えば、第１および第２のベクターを含む宿主細胞を適切な培地、例えば無血清培地中で培養するステップを含み、前記第１のベクターが本明細書記載の抗原結合タンパク質の重鎖をコードするポリヌクレオチドを含み、前記第２のベクターが本明細書記載の抗原結合タンパク質の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。
本発明はさらに本明細書記載の抗原結合タンパク質および製薬上許容可能な担体を含む、全身送達のために、または眼に局所的に送達するために適した医薬品組成物を提供する。本発明の医薬品組成物は、さらなる活性作用物質をさらに含み得る。
本発明は、眼疾患を予防するかまたは治療するのに用いるための、アダリムマブ、インフリキシマブ、エタネルセプト、ＥＳＢＡ１０５、ＰＥＰ−１−５−１９、ＰＥＰ１−５−４９０、ＰＥＰ１−５−４９３、配列番号２のアドネクチン、ゴリムマブ、セルトリズマブ、ＡＬＫ−６９３１、ならびに配列番号３０の重鎖および配列番号３１の軽鎖を含む抗体からなる群から選択されるＴＮＦαアンタゴニストであって、ベバシズマブ、ラニビズマブ、ｒ８４、アフリベルセプト、ＣＴ０１、ＤＯＭ１５−１０−１１、ＤＯＭ１５−２６−５９３、ＰＲＳ−０５０、ＰＲＳ−０５１、ＭＰ００１２、ＣＴ−３２２、ＥＳＢＡ９０３、ＥＰＩ−００３０、ＥＰＩ−００１０およびＤＭＳ１５７１からなる群から選択されるＶＥＧＦアンタゴニストと組合せて投与されるべきものであるＴＮＦαアンタゴニストを提供する。
本発明は、眼疾患を防止するかまたは治療するのに用いるための、ベバシズマブ、ラニビズマブ、ｒ８４、アフリベルセプト、ＣＴ０１、ＤＯＭ１５−１０−１１、ＤＯＭ１５−２６−５９３、ＰＲＳ−０５０、ＰＲＳ−０５１、ＭＰ００１２、ＣＴ−３２２、ＥＳＢＡ９０３、ＥＰＩ−００３０、ＥＰＩ−００１０およびＤＭＳ１５７１からなる群から選択されるＶＥＧＦアンタゴニストであって、アダリムマブ、インフリキシマブ、エタネルセプト、ＥＳＢＡ１０５、ＰＥＰ１−５−１９、ＰＥＰ１−５−４９０、ＰＥＰ１−５−４９３、配列番号２のアドネクチン、ゴリムマブ、セルトリズマブ、ＡＬＫ−６９３１、ならびに配列番号３０の重鎖および配列番号３１の軽鎖を含む抗体からなる群から選択されるＴＮＦαアンタゴニストと組合せて投与されるべきものであるＶＥＧＦアンタゴニストも提供する。
本発明は、ＴＮＦαアンタゴニスト部分、ＶＥＧＦアンタゴニスト部分、ならびに上記ＴＮＦαアンタゴニスト部分を上記ＶＥＧＦアンタゴニスト部分に連結するリンカーを含む二重標的化抗原結合分子であって、
ＴＮＦαアンタゴニスト部分が表１に列挙されるＴＮＦαアンタゴニストのうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み；
ＶＥＧＦアンタゴニスト部分が表２に列挙されるＶＥＧＦアンタゴニストのうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み；
リンカーが１〜１５０アミノ酸長のアミノ酸配列であり；そして
二重標的化分子がＤＭＳ４０００またはＤＭＳ４０３１でない
二重標的化抗原結合分子も提供する。
本発明は、ＴＮＦαアンタゴニスト部分、ＶＥＧＦアンタゴニスト部分、ならびに上記ＴＮＦαアンタゴニスト部分を上記ＶＥＧＦアンタゴニスト部分に連結するリンカーを含む二重標的化抗原結合分子であって、
ＴＮＦαアンタゴニスト部分が表１に列挙されるＴＮＦαアンタゴニストのうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み；
ＶＥＧＦアンタゴニスト部分が表２に列挙されるＶＥＧＦアンタゴニストのうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み；
リンカーが１〜１５０アミノ酸長のアミノ酸配列である
二重標的化抗原結合分子であって、眼の疾患を予防するかまたは治療するのに用いるためであり、そして４〜６週間毎に硝子体内投与されるべきものである二重標的化抗原結合分子も提供する。
本発明は、配列番号６９、７０、７１または７２の重鎖配列、および配列番号１２の軽鎖配列を含む抗原結合タンパク質も提供する。
眼疾患に悩まされる患者を防止するかまたは治療する方法であって、予防的または治療的有効量の本明細書中に開示されるような組成物または二重標的化タンパク質を全身的または局所的に患者の眼に投与することも提供される。
抗ＴＮＦα／抗ＶＥＧＦ ｍＡｂ−ｄＡｂ、ＤＭＳ４０００のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。 抗ＴＮＦα／抗ＶＥＧＦ ｍＡｂ−ｄＡｂ、ＤＭＳ４０００のＳＥＣプロフィールを示す。 ＤＭＳ４０００の抗ＶＥＧＦ活性を示す。 ＤＭＳ４０００の抗ＴＮＦα活性を示す。 ＤＭＳ４０００の（ＰＫ）特性を示す。 ＥＬＩＳＡの結果を示し、二重特異性ＢＰＣ１８２１がＶＥＧＦＲ２およびＢ７−１の両方と結合することを確証する。 ＥＬＩＳＡの結果を示し、二重特異性ＢＰＣ１８２１がＶＥＧＦＲ２およびＢ７−１の両方との結合を示すことを確証する。 本発明の二重標的化抗原結合分子を構築するためのマトリックスを示す。 本発明の二重標的化抗原結合分子を構築するためのマトリックスを示す。 ＰＥＰ−ＤＯＭ構築物に関するＢＩＡｃｏｒｅ分析を示す。 ＰＥＰ−ＤＯＭ構築物に関するＢＩＡｃｏｒｅ分析を示す（図９結合曲線のＴＮＦ／ＶＥＧＦ結合領域のクローズアップ）。 表１０に示したデータのグラフである。化合物は全て、２μｌの容積で硝子体内注射により投与した。黒色バーは７日目結果を示す．白色バーは１４日目結果を示す。 表１１に示したデータのグラフである。化合物は全て、２μｌの容積で硝子体内注射により投与した。黒色バーは７日目結果を示す．白色バーは１４日目結果を示す。 レーザーＰＣ後７日目（初回ＦＳ）および１４日目（２回目ＦＳ）の赤外線（ＩＲ、上左パネル）、自家蛍光（ＡＦ、下左パネル）およびフルオレセイン血管造影（ＦＳ、大パネル）を示す（例示画像を示す：１． ビヒクル処置眼、２． ２μｇ ＤＭＳ１５７１で処置した眼、および８． ３０μｇ エンブレル（商標）で処置した眼）。ＣＮＶ病変は、ＤＭＳ１５７１による処置に応答する病変より断続的で、低散在性であると思われる、ということは注目に値する。 表１２に示したデータのグラフである。化合物は全て、２μｌの容積で硝子体内注射により投与した。 ＥＤ１ ｍａｂで染色したフラットマウント網膜の顕微鏡写真例を示す。パネル１Ａ〜１Ｂおよびパネル エンブレル８．４は、抗ＶＥＧＦ（ＤＭＳ１５７１）（１Ａ）、ビヒクルのみ（１Ｂ）またはエンブレル（エンブレル８．４）で処置した眼からの網膜のフラットマウントを示す。ＥＤ１で可視化されたレーザー熱傷部位に伴うマクロファージ（ＣＤ６８、黒色）×２０。パネル１Ｄは、網膜の内部核層（ＩＮＬ）に浸透したレーザー熱傷部位に伴うマクロファージを示す網膜のクリオスタット切片（２０μｍ）を示す（ＥＤ１＋、黒色）。ＲＧＣ、網膜神経節細胞層；ＢＶ、血管。×２０。
定義
本明細書で使われる用語「タンパク質足場」は、限定されるものではないが、免疫グロブリン（Ｉｇ）足場、例えば、ＩｇＧ足場を含み、これは４鎖または２鎖抗体であってもよく、または抗体のＦｃ領域のみを含んでもよく、あるいは１つまたは複数の抗体由来の定常領域を含んでもよい。また、この定常領域は、ヒトまたは霊長類起源であっても、ヒトおよび霊長類定常領域の人工キメラであってもよい。このようなタンパク質足場は、１つまたは複数の定常領域の他に抗原結合性部位を含んでもよい。例えば、タンパク質足場がＩｇＧ全体を含む場合もある。このようなタンパク質足場は、他のタンパク質ドメイン、例えばエピトープ結合ドメインまたはＳｃＦｖドメイン等の抗原結合性部位を有するタンパク質ドメインに結合可能である。
本明細書で使われる用語「受容体−Ｆｃ融合物」は、抗体のＦｃ領域に連結された受容体または細胞表面タンパク質の可溶性リガンドまたは細胞外ドメインを指す。受容体または細胞表面タンパク質のこのような可溶性リガンドまたは細胞外ドメインの断片は、この定義内に含まれるが、但し、それらは全長タンパク質の生物学的機能を保持し、すなわち、それらは抗原結合能力を保持する。「ドメイン」は、残りのタンパク質とは無関係な三次構造を有する折り畳まれたタンパク質構造である。一般的に、ドメインはタンパク質の別個の機能的特性に関与し、そして多くの場合、残りのタンパク質および／またはドメインの機能の損失を伴わずに、他のタンパク質に付加されるか、除去されるかまたは移され得る。「抗体単一可変ドメイン」は、抗体可変ドメインに特徴的な配列を含む折り畳まれたポリペプチドドメインである。したがって、それは、完全抗体可変ドメインおよび修飾可変ドメイン（例えばこの場合、1つまたは複数のループは、抗体可変ドメインに特徴的でない配列に置き換えられている）、あるいは切頭化されているかもしくはＮ−またはＣ末端伸長ならびに全長ドメインの少なくとも結合活性および特異性を保持する可変ドメインの断片を含む抗体可変ドメインを包含する。
本明細書で使われる用語「ヒト化抗体」は、非ヒトドナー免疫グロブリンに由来するそのＣＤＲを有する工学処理抗体の一型を指し、その分子の残りの免疫グロブリン由来部分は1つまたは複数のヒト免疫グロブリン（単数または複数）に由来する。さらに、フレームワーク支持残基は、結合親和性を保存するよう変更され得る（例えば、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ. Ｐｒｏ. Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ, ８６： １００２９−１００３２ （１９８９）、Ｈｏｄｇｓｏｎ ｅｔ ａｌ. Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ, ９： ４２１ （１９９１）参照）。適切なヒトアクセプター抗体は、ドナー抗体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列との相同性により、慣用的データベース、例えばＫＡＢＡＴ（登録商標）データベース、ロス・アラモス・データベースおよびスイスプロテイン・データベースから選択されるものであり得る。（アミノ酸に基づいて）ドナー抗体のフレームワーク領域との相同性により特性化されるヒト抗体は、ドナーＣＤＲの挿入のための重鎖定常領域および／または重鎖可変フレームワーク領域を提供するのに適切であり得る。軽鎖定常または可変フレームワーク領域を供与し得る適切なアクセプター抗体は、同様にして選択され得る。アクセプター抗体重鎖および軽鎖は同一アクセプター抗体に起源を有する必要はない、ということに留意すべきである。従来技術は、このようなヒト化抗体のいくつかの産生方法を記載する（例えば、ＥＰ−Ａ−０２３９４００およびＥＰ−Ａ−０５４９５１参照）。一実施形態では、本発明の抗体はヒト化抗体である。
「ＣＤＲ」は、抗原結合タンパク質の相補性決定領域アミノ酸配列と定義される。これらは、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の超可変領域である。免疫グロブリンの可変部には、３つの重鎖および３つの軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ領域）が存在する。したがって、本明細書で使われる用語「ＣＤＲ」は、３つの重鎖ＣＤＲ全て、３つの軽鎖ＣＤＲ全て、全ての重鎖および軽鎖ＣＤＲ、または少なくとも２つのＣＤＲを指す。
「ＣＤＲ変異体」は、少なくとも１つのアミノ酸により修飾されたアミノ酸配列を包含し、この場合、上記修飾は、アミノ酸配列の化学的または部分的（例えば１０個以下のアミノ酸の）変更であり得るが、この修飾が、変異体に非修飾配列の生物学的特性を保持させる。例えば、変異体は、ＩＬ−１８と結合し、それを中和する機能的変異体である。ＣＤＲアミノ酸配列の部分的変更は、１〜数個のアミノ酸の欠失または置換によるか、あるいは１〜数個のアミノ酸の付加または挿入によるか、あるいはその組合せによる（例えば１０個以下のアミノ酸による）ものであり得る。ＣＤＲ変異体は、アミノ酸配列中に、任意の組合せで、１、２、３、４、５または６個のアミノ酸の置換、付加または欠失を含有し得る。ＣＤＲ変異体または結合単位変異体は、アミノ酸配列中に、任意の組合せで、１、２または３個のアミノ酸の置換、挿入または欠失を含有し得る。アミノ酸残基における置換は、保存的置換、例えば、１個の疎水性アミノ酸を代替的疎水性アミノ酸に置き換えることであり得る。例えばロイシンは、バリンまたはイソロイシンで置換され得る。
用語「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリン遺伝子配列由来の抗体を指す。これらの完全ヒト抗体は、再工学処理化または脱免疫化齧歯類モノクローナル抗体に対する代替物を提供する（例えば、ヒト化抗体）を低免疫原性治療用抗体の供給源として提供し、それらは、普通は、ファージ表示またはトランスジェニックマウス・プラットフォームを用いて生成される。一実施形態では、本発明の抗体はヒト抗体である。
語句「免疫グロブリン単一可変ドメイン」は、別の可変領域またはドメインとは独立に、抗原またはエピトープに特異的に結合する抗体可変ドメイン（ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）を指す。免疫グロブリン単一可変ドメインは、他の異なる可変領域または可変ドメインと共に、ある種のフォーマット（例えば、ホモまたはヘテロ多量体）で存在できる。この場合、他の領域またはドメインは、単一免疫グロブリン可変ドメインによる抗原結合には要求されていない（すなわち、免疫グロブリン単一可変ドメインは新たな可変ドメインとは独立に抗原に結合する）。本明細書で使われる場合、「ドメイン抗体」または「ｄＡｂ」は、抗原に結合が可能な「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同じである。免疫グロブリン単一可変ドメインは、ヒト抗体可変ドメインであってもよいが、例えばげっ歯類（例はＷＯ００／２９００４で開示）、テンジクザメおよびラクダのＶＨＨｄＡｂ、等他の種由来の単一抗体可変ドメインを含んでもよい。ラクダＶＨＨはラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、およびグアナコ等の種由来の免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドであり、これは元々軽鎖の欠けた重鎖抗体を産生する。このＶＨＨ領域は、当業者に利用可能な標準的な方法によりヒト化されてもよく、この領域も本発明による「ドメイン抗体」と考えられる。本明細書で使われる「ＶＨ」はラクダＶＨＨドメインを含む。ＮＡＲＶは、テンジクザメを含む軟骨魚類で特定された別のタイプの免疫グロブリン単一可変ドメインである。また、これらの領域は、新規抗原受容体可変領域（通常、Ｖ（ＮＡＲ）またはＮＡＲＶと省略）としても知られる。詳細は、Ｍｏｌ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. ４４, ６５６−６６５ （２００６）及びＵＳ２００５００４３５１９Ａ参照。
用語「エピトープ結合ドメイン」は、別の可変領域またはドメインとは独立に、抗原またはエピトープに特異的に結合するドメインを指す。これは、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、例えばヒト、ラクダまたはサメの免疫グロブリン単一可変ドメインであってもよく、または下記を含む群から選択された足場の誘導体であってもよい：ＣＴＬＡ−４（Ｅｖｉｂｏｄｙ）；リポカリン；プロテインＡ由来分子、例えばプロテインＡのＺ−領域（アフィボディ、ＳｐＡ）、Ａ−領域（アビマー／マキシボディ（Ｍａｘｉｂｏｄｙ））；熱ショックタンパク質、例えばＧｒｏＥＬとＧｒｏＥＳ；トランスフェリン（トランスボディ（Ｔｒａｎｓ−ｂｏｄｙ））；アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）；ペプチドアプタマー；Ｃ−タイプレクチン領域（テトラネクチン）；ヒトγクリスタリンおよびヒトユビキチン（ａｆｆｉｌｉｎ）；ＰＤＺドメイン；ヒトプロテアーゼ阻害剤のスコーピオントキシンクニッツタイプドメイン；およびフィブロネクチン（アドネクチン（ａｄｎｅｃｔｉｎ））；これらは天然のリガンド以外のリガンドに結合させるためにタンパク質工学による操作が行われたものである。
ＣＴＬＡ−４（細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原４）は主にＣＤ４＋Ｔ細胞上に発現するＣＤ２８ファミリー受容体である。その細胞外ドメインは可変ドメイン様Ｉｇ折畳を有する。抗体のＣＤＲに対応するループは、異種の配列と置換することにより異なる結合特性を付与することができる。異なる結合特異性を有するように操作されたＣＴＬＡ−４分子は、Ｅｖｉｂｏｄｙとして知られている。詳細は、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８ （１−２）, ３１−４５ （２００１）を参照のこと。
リポカリンは細胞外タンパク質ファミリー で、ステロイド, ビリン, レチノイドおよび脂質、等の小さな疎水性の分子を輸送する。これらは、円錐形構造の開口端に多くのループがある強固なβ−シート二次構造を有し、これは別の標的抗原に結合するように操作できる。アンチカリンはサイズが１６０−１８０アミノ酸で、リポカリン由来である。詳細は、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １４８２： ３３７−３５０ （２０００）, ＵＳ７２５０２９７Ｂ１およびＵＳ２００７０２２４６３３を参照のこと。
アフィボディは、黄色ブドウ球菌のプロテインＡ由来の足場で、抗原結合するように操作できる。このドメインは約５８のアミノ酸からなる３つのらせん状束で構成される。ライブラリは表面残基の無作為化により生成されている。詳細は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ.Ｄｅｓ.Ｓｅｌ.１７, ４５５−４６２ （２００４）および ＥＰ１６４１８１８Ａ１を参照のこと。
アビマーは、Ａ−ドメイン足場ファミリー由来の多ドメインタンパク質である。約３５アミノ酸の未変性ドメインは、明確なジスルフィド結合構造をとっている。多様性は、Ａ−ドメインファミリー中の天然突然変異の混ぜ合わせにより生成されている。詳細は、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３（１２）, １５５６ − １５６１ （２００５） ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇｓ １６（６）, ９０９−９１７ （Ｊｕｎｅ ２００７）を参照のこと。
トランスフェリンは、単量体血清輸送糖タンパク質である。トランスフェリンは許容表面ループに挿入する操作により別の標的抗原に結合させることができる。操作したトランスフェリン足場の例には、トランスボディがある。詳細は、Ｊ. Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ ２７４, ２４０６６−２４０７３ （１９９９）参照。
設計アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）は、膜内在性タンパク質の細胞骨格への連結を媒介するタンパク質ファミリーであるアンキリン由来である。アンキリンの一つの繰り返し単位は３３残基のモチーフで、２つのα−螺旋とβ−回転とで構成される。これらは、各繰り返し中の一つ目のα−らせんとβ−回転の残基を無作為化することにより標的抗原に結合するよう操作できる。これらの結合面は、分子の数を増やすことにより増加させることができる（親和性成熟の方法）。詳細は、Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ. ３３２, ４８９−５０３ （２００３）, ＰＮＡＳ １００（４）, １７００−１７０５ （２００３）とＪ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ. ３６９, １０１５−１０２８ （２００７）およびＵＳ２００４０１３２０２８Ａ１参照。
フィブロネクチンは、抗原に結合させるように操作可能な足場である。アドネクチンは、ヒトＩＩＩ型フィブロネクチン（ＦＮ３）における１５繰り返し単位の内の１０番目のドメインの天然アミノ酸配列骨格からなる。β−サンドイッチの一端の３つのループは操作によりアドネクチンに特異的に治療標的を認識させることができる。詳細は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ. Ｄｅｓ. Ｓｅｌ. １８, ４３５−４４４ （２００５）, ＵＳ２００８０１３９７９１, ＷＯ２００５０５６７６４ およびＵＳ６８１８４１８Ｂ１参照。
ペプチドアプタマーはコンビナトリアル認識分子で、定常性足場タンパク質で構成され、このタンパク質の典型的例には、活性部位に挿入された制限付き可変ペプチドループを含むチオレドキシン（ＴｒｘＡ）がある。詳細は、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ.Ｂｉｏｌ. Ｔｈｅｒ. ５, ７８３−７９７ （２００５）参照。
ミクロボディは、長さ２５−５０アミノ酸の自然発生のマイクロタンパク質由来で、３−４システインブリッジを含む。マイクロタンパク質の例には、ＫａｌａｔａＢ１、コノトキシンおよびノッティンがある。マイクロタンパク質は、ループを有し、これは、マイクロタンパク質全体の折り畳みに影響を与えないで２５アミノ酸まで含有するように操作できる。操作されたノッティンドメインの詳細については、ＷＯ２００８０９８７９６参照。
他のエピトープ結合ドメインには、別の標的抗原の結合特性を操作するための足場として使われてきたタンパク質、例えばヒトγ−クリスタリンおよびヒトユビキチン（ａｆｆｉｌｉｎ）、ヒトプロテアーゼ阻害剤のｋｕｎｉｔｚタイプドメイン、Ｒａｓ−結合タンパク質ＡＦ−６のＰＤＺドメイン、サソリ毒（カリブドトキシン）、Ｃ−タイプレクチンドメイン（テトラネクチン）がある（これらは、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ （２００７, ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｓｔｅｆａｎ Ｄｕｂｅｌ） の７章Ｎｏｎ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＳｃａｆｆｏｌｄｓおよびＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ １５：１４−２７ （２００６）でレビューされている）。本発明のエピトープ結合ドメインは、これらの代替タンパク質ドメインに由来してもよい。
「二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ）」は、二重特異性四価免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）様分子である（Ｗｕ ｅｔ ａｌ. Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （２００７） ２５： １２９０−１２９７）。ＤＶＤ−Ｉｇは、ポリペプチド鎖を含む結合タンパク質と定義され得るが、このポリペプチド鎖は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎ（ここで、ＶＤ１は第一可変ドメインであり、ＶＤ２は第二可変ドメインであり、Ｃは定常ドメインであり、Ｘ１はアミノ酸またはポリペプチド（リンカー）を表し、Ｘ２はＦｃ領域を表し、そしてｎは０または１を表す）を含む（ＷＯ ２００７０２４７１５）。本発明の状況では、ＶＤ１はＴＮＦαまたはＴＮＦα受容体と結合し、ＶＤ２はＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体と結合死、あるいはその逆もある。
本明細書で使われる用語「ペアードＶＨドメイン」、「ペアードＶＬドメイン」、および「ペアードＶＨ／ＶＬドメイン」は、それらのパートナー可変ドメインペアとペアの場合のみ抗原に特異的に結合する抗体可変ドメインを指す。いずれの対形成でも常に１つのＶＨと１つのＶＬがあり、用語「ペアードＶＨドメイン」はＶＨパートナーを指し、用語「ペアードＶＬドメイン」はＶＬパートナーを指し、用語「ペアードＶＨ／ＶＬドメイン」は２つのドメインを一緒に表す。
本明細書で使われる用語「抗原結合タンパク質」は、抗体、抗体断片、例えばドメイン抗体（ｄＡｂ）、ＳｃＦｃ、ＦＡｂ、ＦＡｂ２、ならびに他のタンパク質構築物、例えば受容体−Ｆｃ融合物（これはＴＮＦαおよび／またはＶＥＧＦと結合し得る）を指す。抗原結合分子、例えば抗体、ドメイン抗体、ドメイン抗体の複合物、例えばダンベル型の、ｄＡｂ−ｄＡｂ直列融合物、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、ディアボディ、ｍＡｂｄＡｂ、ＤＶＤ−Ｉｇ、アフィボディ、ヘテロ接合抗体または二重特異性物、例えばＴＮＦαまたはＴＮＦα受容体に対する第一特異性およびＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体に対する第二特異性を有する二重特異性抗体は、少なくとも１つのＩｇ可変ドメインを含み得る。一実施形態では、抗原結合分子は抗体である。別の実施形態では、抗原結合分子は、ｄＡｂ、すなわち、免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えば、異なるＶ領域またはドメインとは独立して、抗原またはエピトープを特異的に結合するＶＨ、ＶＨＨまたはＶＬである。抗原結合分子は、２つの標的と結合し得る。すなわちそれらは、二重標的化タンパク質であり得る。抗原結合分子は、抗体と抗原結合断片の組合せ、例えばモノクローナル抗体と連結された1つまたは複数のドメイン抗体および／または1つまたは複数のＳｃＦｖであり得る。抗原結合分子は、非Ｉｇドメイン、例えば、ＣＴＬＡ−４（Ｅｖｉｂｏｄｙ）；リポカリン；プロテインＡ由来分子、例えばプロテインＡのＺ−領域（アフィボディ、ＳｐＡ）、Ａ−領域（アビマー／マキシボディ（Ｍａｘｉｂｏｄｙ））；熱ショックタンパク質、例えばＧｒｏＥＬとＧｒｏＥＳ；トランスフェリン（トランスボディ（ｔｒａｎｓ−ｂｏｄｙ））；アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）；ペプチドアプタマー；Ｃ−タイプレクチン領域（テトラネクチン）；ヒトγクリスタリンおよびヒトユビキチン（ａｆｆｉｌｉｎ）；ＰＤＺドメイン；ヒトプロテアーゼ阻害剤のスコーピオントキシンクニッツタイプドメイン；およびフィブロネクチン（アドネクチン（ａｄｎｅｃｔｉｎ））からなる群から選択される足場の誘導体であるドメインも含み得る；これらはＴＮＦαおよび／またはＶＥＧＦに結合させるためにタンパク質工学による操作が行われたものである。本明細書で使用する用語「抗原結合タンパク質」は、ヒトＴＮＦαおよび／またはＶＥＧＦと拮抗しおよび／または中和し得るであろう。さらに、抗原結合タンパク質は、ＴＮＦαおよび／またはＶＥＧＦと結合することによりＴＮＦαおよび／またはＶＥＧＦ活性を遮断し、そして天然リガンドが受容体を結合しおよび／または活性化しないようにし得る。
本明細書で使用する用語「ＶＥＧＦアンタゴニスト」は、ＶＥＧＦの少なくとも１つの活性を低減しおよび／または排除し得る任意の化合物を包含する。例として、ＶＥＧＦアンタゴニストはＶＥＧＦと結合し得るし、その結合はＶＥＧＦ活性を直接的に低減するかまたは排除し得る、あるいはそれは少なくとも１つのリガンドが受容体を結合するのを遮断することにより間接的に働き得る。
本明細書で使用する用語「ＴＮＦαアンタゴニスト」は、ＴＮＦαの少なくとも１つの活性を低減しおよび／または排除し得る任意の化合物を包含する。例として、ＴＮＦαアンタゴニストはＴＮＦαと結合し得るし、その結合はＴＮＦα活性を直接的に低減するかまたは排除し得る、あるいはそれは少なくとも１つのリガンドが受容体を結合するのを遮断することにより間接的に働き得る。
抗原結合タンパク質に関連して使用する用語「特異的に結合する」は、抗原結合タンパク質がその標的タンパク質（単数または複数）（例えば、ＴＮＦα、ＴＮＦＲ、ＢＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ）と結合し、他の（例えば無関係な）タンパク質と結合しないか有意に結合しない。しかしながらこの用語は、所定の種（例えばヒト）における標的タンパク質に対する抗体は、他の種（例えば非ヒト霊長類）における他の型の標的タンパク質とも交差反応し得る、という事実を除外しない。
用語「ＫＤ」は、平衡解離定数を指す。本発明の一実施形態では、抗原結合性部位は、多くてもＫｄ値１ｍＭで抗原と結合し、例えばＢｉａｃｏｒｅ（商標）で測定してＫｄ値１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ、で各抗原と結合する。本発明の一実施形態では、抗原結合部位は、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）で測定して１０ｎＭまたはそれ未満、１ｎＭまたはそれ未満、５００ｐＭまたはそれ未満、２００ｐＭまたはそれ未満、１００ｐＭまたはそれ未満で各抗原と結合する。
本明細書で使われる用語「抗原結合性部位」は、抗原に特異的に結合可能な構築物上の部位を指し、これは、単一ドメイン、例えばエピトープ結合ドメインであっても、標準的抗体上に認められるペアードＶＨ／ＶＬドメインであってもよい。本発明の一部の態様では、単一鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）ドメインは抗原結合性部位を提供できる。
用語「ｍＡｂ／ｄＡｂ」および「ｄＡｂ／ｍＡｂ」は、本明細書では本発明の抗原結合タンパク質を指す。この２つの用語は、本明細書では相互に置き換え可能な使い方が可能で、同じ意味が意図されている。
用語「定常重鎖１」は本明細書では、免疫グロブリン重鎖の定常ドメインＣＨ１を指す。
用語「定常軽鎖」は本明細書では、免疫グロブリン軽鎖の定常ドメインＣＬを指す。
用語「ライブラリー」は、異種ポリペプチドまたは核酸の混合物を指す。ライブラリーは、その各々が単一ポリペプチドまたは核酸配列を有する膜からなる。この結果、「ライブラリー」は「レパートリー」と同義である。
「普遍的フレームワーク」は、Ｋａｂａｔ（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”, ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）により定義されるような配列中に保存される抗体の領域に対応する、またはＣｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ, Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ. （１９８７） １９６： ９１０−９１７により定義されるようなヒト生殖系列免疫グロブリンレパートリーまたは構造に対応する単一抗体フレームワーク配列である。
本発明は、眼に用いるのに適したＴＮＦαアンタゴニストおよび／またはＶＥＧＦアンタゴニストを含む組成物を提供する。本発明は、眼の疾患を予防するかまたは治療するのに用いるためのＴＮＦαアンタゴニストとＶＥＧＦアンタゴニストの組み合わせも提供する。本発明は、ＴＮＦαアンタゴニストをＶＥＧＦアンタゴニストと併用して投与することにより眼の疾患を予防するかまたは治療する方法も提供する。ＴＮＦαアンタゴニストとＶＥＧＦアンタゴニストを別々に投与しても、順次投与しても、同時に投与してもよい。
個々のＴＮＦαアンタゴニストおよび個々のＶＥＧＦアンタゴニスト（すなわち、別個のＴＮＦαおよびＶＥＧＦアンタゴニスト分子）の組合せの投与は、本発明に包含される。さらに、２つまたはそれ以上の抗原と結合し得る単一分子または構築物は本発明に包含され、例えば、ＴＮＦαアンタゴニストおよびＶＥＧＦアンタゴニストとして作用する二重標的化機能を有する（すなわち、ＴＮＦαまたはＴＮＦαのための受容体と結合し、その機能を抑制し、好ましくは遮断し、且つＶＥＧＦまたはＶＥＧＦのための受容体と結合し、その機能を抑制し、好ましくは遮断し得る）分子の投与は、本発明に包含される。例えば、本発明は、ＴＮＦαおよびＶＥＧＦＲ２等と結合し得る二重標的化分子を提供する。一実施形態では、二重標的化分子は、ＴＮＦ受容体およびＶＥＧＦ受容体と結合し得る。
本発明のＴＮＦαアンタゴニストは、ＴＮＦ受容体を介したシグナル伝達を、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％抑制し得る。本発明のＶＥＧＦアンタゴニストは、ＶＥＧＦ受容体を介したシグナル伝達を、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％抑制し得る。
一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストは、ヒト抗原結合タンパク質、特にヒト抗ＴＮＦα抗体またはその断片、あるいはヒト抗ＴＮＦＲ抗体またはその断片である。一実施形態では、ＶＥＧＦアンタゴニストは、ヒト抗原結合タンパク質、特にヒト抗ＶＥＧＦ抗体またはその断片、あるいはヒト抗ＶＥＧＦＲ抗体またはその断片である。一実施形態では、、抗原結合タンパク質はＴＮＦα／ＶＥＧＦ二重標的化単一構築物であって、この場合、ＴＮＦαアンタゴニスト部分はヒトである。特定の一実施形態では、ＴＮＦアンタゴニストはアダリムマブまたはゴリムマブであるかまたはそれに由来する。
アンタゴニストは、本明細書中に記載されるような抗体足場または他のこのような適切な足場を基礎にし得る。このようなアンタゴニストは、抗体またはエピトープ結合ドメイン、例えばｄＡｂであり得る。受容体−Ｆｃ融合物は、本発明の一部とみなされる。
本発明のアンタゴニストは、別々の分子の混合物として、一緒に投与（すなわち同時投与）してもよいし、あるいは互いを１ヶ月以内、１週間以内、あるいは２４時間以内、例えば２０時間以内、または１５時間以内、または１２時間以内、または１０時間以内、または８時間以内、または６時間以内、または４時間以内、または２時間以内、または１時間以内、または３０分以内に投与してもよい。本発明のアンアゴニストは、別々の処方物として、または単一処方物として、例えば両アンタゴニストを含有するリポソームとして、同時投与してもよい。
本発明のＶＥＧＦアンタゴニストと組合せて投与され得るか、あるいは本発明の二重標的化分子を生成するのに用いられ得る本発明の範囲内のＴＮＦαアンタゴニストとしては、表１で以下に列挙されるものが挙げられる。
Figure 2012528112
表１の名称で同定されるＴＮＦαアンタゴニストのほかに、本発明によるＴＮＦαアンタゴニストとしては、配列番号３０の重鎖および配列番号３１の軽鎖を含む抗体が挙げられる。
本発明のＴＮＦαアンタゴニストと組合せて投与され得る、あるいは本発明の二重標的化分子を生成するのに用いられ得る本発明の範囲内のＶＥＧＦアンタゴニストとしては、表２で以下に列挙されるものが挙げられる。
Figure 2012528112
本発明は、タンパク質足場を含む眼の疾患を治療するのに用いるための抗原結合タンパク質を提供する。この足場は１つまたは複数のエピトープ結合ドメインに結合する。当該抗原結合タンパク質は少なくとも２つの抗原結合性部位を有し、少なくともその内の１つがエピトープ結合ドメインに由来し、少なくとも１つがペアードＶＨ／ＶＬドメインに由来し、またこの抗原結合性部位の少なくとも１つはＴＮＦαまたはＴＮＦαのための受容体と結合し、抗原結合部位のうちの少なくとも１つはＶＥＧＦまたはＶＥＧＦのための受容体と結合する。
このような抗原結合性タンパク質は、タンパク質足場を含み、この足場は、例えばＩｇＧ等のＩｇ足場、例えば１つまたは複数のエピトープ結合ドメインに結合するモノクローナル抗体、例えばドメイン抗体を含み、結合タンパク質は少なくとも２つの抗原結合性部位を有し、その内の少なくとも１つがエピトープ結合ドメインに由来し、また抗原結合性部位の少なくとも１つはＴＮＦαまたはＴＮＦαのための受容体に結合し、抗原結合部位の少なくとも１つはＶＥＧＦまたはＶＥＧＦのための受容体と結合している。また、本発明はこれを産生する方法およびその使用、特に眼の治療での使用に関する。
本発明のこのような抗原結合タンパク質は、ｍＡｂｄＡｂとも呼ばれる。
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質のタンパク質足場は、Ｉｇ足場、例えばＩｇＧ足場またはＩｇＡ足場である。ＩｇＧ足場は、抗体の全てのドメイン（すなわち、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＶＨ、ＶＬ、ＣＬ）を含んでもよい。本発明の抗原結合タンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはＩｇＧ４ＰＥから選択されたＩｇＧ足場を含んでもよい。
本発明の抗原結合タンパク質は少なくとも２つの抗原結合性部位を有し、例えば２つの結合部位の内、一つ目の結合部位は抗原上の第１のエピトープに特異性を有し、二つ目の結合部位は同じ抗原上の第２のエピトープに特異性を有する。さらなる実施形態では、４つの抗原結合性部位、または６つの抗原結合性部位、または８つの抗原結合性部位、または１０以上の抗原結合性部位が存在する。一実施形態では、抗原結合タンパク質は、１つ以上の抗原、例えば２つの抗原、または３つの抗原、または４つの抗原に対して特異性を有する。
別の態様では、本発明は、２つ以上の式Ｉの構造を含む少なくとも１つのホモ二量体を含むＴＮＦαまたはＴＮＦα受容体およびＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体pと結合可能な抗原結合タンパク質に関する：
Figure 2012528112
式中、Ｘは、定常重鎖ドメイン２（ＣＨ２）および定常重鎖ドメイン３（ＣＨ３）を含む定常抗体領域を表し；
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ７およびＲ８は、各々、エピトープ結合ドメインを表し；
Ｒ２は、定常重鎖１（ＣＨ１）、およびエピトープ結合ドメインからなる群から選択されたドメインを表し；
Ｒ３は、ペアードＶＨおよびエピトープ結合ドメインからなる群から選択されたドメインを表し；
Ｒ５は、定常軽鎖（ＣＬ）、およびエピトープ結合ドメインからなる群より選択されたドメインを表し；
Ｒ６は、ペアードＶＬおよびエピトープ結合ドメインからなる群から選択されたドメインを表し；
ｎは、０、１、２、３および４から独立に選択された整数を表し；
ｍは、０および１から独立に選択された整数を表し、
この場合、定常重鎖１（ＣＨ１）および定常軽鎖（ＣＬ）ドメインが会合しており、
少なくとも１つのエピトープ結合ドメインが存在し、
さらに、Ｒ３がペアードＶＨドメインを表す場合は、Ｒ６はペアードＶＬドメインを表して、２つのドメインが一緒になって抗原に結合できるようにする。
一実施形態では、Ｒ６はペアードＶＬを表し、Ｒ３はペアードＶＨを表す。
さらなる実施形態では、Ｒ７とＲ８のどちらか、または両方がエピトープ結合ドメインを表す。
またさらなる実施形態では、Ｒ１とＲ４のどちらか、または両方がエピトープ結合ドメインを表す。
一実施形態では、Ｒ４が存在する。
一実施形態では、Ｒ１、Ｒ７およびＲ８はエピトープ結合ドメインを表す。
一実施形態では、Ｒ１、Ｒ７、Ｒ８およびＲ４はエピトープ結合ドメインを表す。
一実施形態では、（Ｒ１）ｎ、（Ｒ２）ｍ、（Ｒ４）ｍおよび（Ｒ５）ｍ＝０、すなわち存在せず、Ｒ３はペアードＶＨドメインであり、Ｒ６はペアードＶＬドメインであり、Ｒ８はＶＨｄＡｂであり、およびＲ７はＶＬｄＡｂである。
別の実施形態では、（Ｒ１）ｎ、（Ｒ２）ｍ、（Ｒ４）ｍおよび（Ｒ５）ｍは０、すなわち存在せず、Ｒ３はペアードＶＨドメインであり、Ｒ６はペアードＶＬドメインであり、Ｒ８はＶＨｄＡｂであり、および（Ｒ７）ｍ＝０すなわち存在しない。
別の実施形態では、（Ｒ２）ｍおよび（Ｒ５）ｍは０、すなわち存在せず、Ｒ１はｄＡｂであり、Ｒ４はｄＡｂであり、Ｒ３はペアードＶＨドメインであり、Ｒ６はペアードＶＬドメインであり、（Ｒ８）ｍと（Ｒ７）ｍ＝０、すなわち存在しない。
本発明の一実施形態では、エピトープ結合ドメインはｄＡｂである。
本発明の別の態様では、抗原結合タンパク質は、ＴＮＦαまたはＴＮＦα受容体に対する第一の特異性およびＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体に対する第二の特異性を有する二重特異性抗体である。
本発明のさらなる態様では、抗原結合タンパク質は二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ）である。
本発明の別の態様では、抗原結合タンパク質はｄＡｂ−ｄＡｂ直列融合物である。
本発明の別の態様では、抗原結合タンパク質は受容体−Ｆｃ融合物であって、これは、1つまたは複数のエピトープ結合ドメインと連結され得る。受容体−Ｆｃ融合物は免疫グロブリン足場を含み、すなわち、それらは、受容体または細胞表面タンパク質の可溶性リガンドまたは細胞外ドメインならびに1つまたは複数のエピトープ結合ドメインと連結される抗体のＦｃ部分を含む。このような受容体−Ｆｃ−エピトープ結合ドメイン融合物は、受容体−Ｉｇ−エピトープ結合ドメイン融合物としても言及され得る。Ｆｃ部分は、任意のアイソタイプの抗体、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはＩｇＧ４ＰＥから選択され得る。
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質はＶＥＧＦに対する特異性を有し、例えばそれらは、ＶＥＧＦと結合するエピトープ結合ドメイン、例えばVＥＧＦと結合するｄＡｂ、アンチカリンまたはアドネクチンと連結される受容体−Ｆｃ融合物を含む。
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、ＶＥＧＦＲ２に対する特異性を有し、例えばそれらは、ＶＥＧＦＲ２と結合するエピトープ結合ドメイン、例えばVＥＧＦＲ２と結合するｄＡｂまたはアドネクチンと連結される受容体−Ｆｃ融合物を含む。
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質はＴＮＦαに対する特異性を有し、例えばそれらは、ＴＮＦαと結合するエピトープ結合ドメイン、例えばＴＮＦαと結合するｄＡｂまたはアドネクチンと連結される受容体−Ｆｃ融合物を含む。
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、ＴＮＦαまたはＴＮＦα受容体およびＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体の両方に対する特異性を有し、例えばそれらは、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体と結合するエピトープ結合ドメインと連結されるＴＮＦα受容体−Ｆｃ融合物を含む。別の例は、ＴＮＦαまたはＴＮＦα受容体と結合するエピトープ結合ドメインと連結されるＶＥＧＦ受容体−Ｆｃ融合物を含む抗原結合タンパク質である。
本明細書記載の抗原結合タンパク質はいずれも１つまたは複数の抗原を中和することができ、例えばそれらはＴＮＦαを中和し得るし、および／またはそれらはＶＥＧＦも中和し得る、と理解されるであろう。
本発明の抗原結合タンパク質に関連して本明細書全体を通して使われる用語「中和する」およびその文法的変形体は、本発明の抗原結合タンパク質の存在下、このような抗原結合タンパク質の無い場合の標的の活性に比較して、全体的または部分的に標的の生物活性が低下することを意味する。限定されないが、中和は、リガンドのブロッキング、受容体を活性化するリガンドの阻害、受容体の発現低下、またはエフェクター機能への作用のうちの１つまたは複数であってもよい。
中和のレベルはいくつかの方法、例えば、下記の実施例１．３に記載されるように実行され得るＭＲＣ−５細胞におけるＩＬ−分泌検定で測定することができる。このアッセイにおけるＴＮＦαの中和は、中和作用のある抗原結合タンパク質の存在下でＩＬ−分泌の抑制を評価することにより測定される。中和のレベルは、例えば実施例１．３に記載されるように実行され得る受容体に対するリガンドの結合の阻害を測定するアッセイでも測定可能である。このアッセイでは、ＶＥＧＦの中和は、中和作用のある抗原結合タンパク質の存在下でリガンドとその受容体の間の結合性の低下を評価することにより測定される。
中和を評価する他の方法、例えば中和する抗原結合タンパク質の存在下、リガンドとその受容体間の結合低下を評価することにより測定する方法が、当業者には既知であり、例えばＢｉａｃｏｒｅ（商標）アッセイがある。
本発明の別の態様では、少なくとも実質的に本明細書で例示されているものと等価な中和活性を有する抗原結合タンパク質が提供される。
本発明の抗原結合タンパク質はＴＮＦαまたはＴＮＦα受容体に対して特異性を有し、例えばＴＮＦαに結合可能なエピトープ結合ドメイン、および／またはＴＮＦαに結合するペアードＶＨ／ＶＬを含む。抗原結合タンパク質はＴＮＦαに結合可能な抗体を含んでもよい。抗原結合タンパク質はＴＮＦαに結合可能なｄＡｂを含んでもよい。
本発明の抗原結合タンパク質は、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦのための受容体に対する特異性も有する。一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質はＴＮＦαおよびＶＥＧＦに同時に結合可能である。
本明細書記載の抗原結合タンパク質はいずれも、例えば実施例３に記載されたような適切なアッセイを使った化学量論的解析により測定することにより、同時に２つ以上の抗原に結合可能であってもよいことは理解されよう。
このような抗原結合タンパク質の例には、ＴＮＦαアンタゴニストであるエピトープ結合ドメインを有するＶＥＧＦ抗体、例えば、重鎖のＣ末端やＮ末端または軽鎖のＣ末端やＮ末端に結合した抗ＴＮＦαアドネクチンがある。実施例には、配列番号２０または２２の重鎖配列および配列番号２１の軽鎖配列を含み、重鎖と軽鎖の片方または両方がＴＮＦαに結合する１つまたは複数のエピトープ結合ドメイン、例えば配列番号２および配列番号１７で記述されるものから選択されるエピトープ結合ドメインをさらに含む抗原結合タンパク質が含まれる。
一実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＴＮＦαアンタゴニストであるエピトープ結合ドメインに結合した抗ＶＥＧＦ抗体を含み、この抗ＶＥＧＦ抗体は配列番号２０または２２の重鎖配列および配列番号２１の軽鎖配列を有する抗体と同じＣＤＲを有する。
このような抗原結合タンパク質の例には、重鎖のＣ末端またはＮ末端またはＣ末端と結合されるＶＥＧＦアンタゴニストであるエピトープ結合ドメインを有するＴＮＦα抗体が含まれる。例としては、配列番号１０の重鎖配列および配列番号１２の軽鎖配列を含む抗原結合タンパク質が挙げられる。この重鎖および軽鎖の一方または両方はさらに、1つまたは複数のエピトープ結合ドメインを含み、これは、例えばＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体、例えばＶＥＧＦＲ２と結合することにより、ＶＥＧＦを拮抗し得る。このようなエピトープ結合ドメインは、配列番号１、１８、１９、２３または４４で記述されるものから選択され得る。
一実施形態では、本発明の抗原結合構築物は、配列番号の重鎖配列および配列番号１２の軽鎖配列、または配列番号１５の重鎖配列および配列番号１２の軽鎖配列、または配列番号２４の重鎖配列および配列番号１２の軽鎖配列を含む。
一実施形態では、本発明の抗原結合構築物は、ＷＯ０２１２５０２、ＵＳ２００７／０００３５４８、ＵＳ７２５０１６５、ＥP１３０９６９１またはＷＯ０２１２５００（これらの記載内容は各々、参照により本明細書中に組み込まれる）に開示されたような抗ＴＮＦα結合タンパク質を含む。
一実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＶＥＧＦアンタゴニストであるエピトープ結合ドメインと連結される抗ＴＮＦα抗体を含み、この抗ＴＮＦα抗体は、配列番号１０の重鎖および配列番号１２の軽鎖を有する抗体と同じＣＤＲを有する。
このような抗原結合タンパク質の他の例には、抗ＶＥＧＦエピトープ結合ドメイを有し、重鎖のＣ末端またはＮ末端、または軽鎖のＣ末端またはＮ末端に結合した抗ＴＮＦα抗体が含まれ、このＶＥＧＦエピトープ結合ドメインは、ＷＯ２００７０８０３９２（参照により本明細書に組み込まれる）に記述されたいずれかの、特に配列番号１１７、１１９、１２３、１２７〜１９８、５３９および５４０で示されたＶＥＧＦ ｄＡｂ配列から選択されたＶＥＧＦ ｄＡｂ、またはＷＯ２００８１４９１４６（参照により本明細書に組み込まれる）に記述されたいずれかの、特にＤＯＭ１５−２６−５０１、ＤＯＭ１５−２６−５５５、ＤＯＭ１５−２６−５５８、ＤＯＭ１５−２６−５８９、ＤＯＭ１５−２６−５９１、ＤＯＭ１５−２６−５９４およびＤＯＭ１５−２６−５９５と記載されたＶＥＧＦ ｄＡｂ配列から選択されたＶＥＧＦ ｄＡｂ、またはＷＯ２００７０６６１０６（参照により本明細書に組み込まれる）に記述されたいずれかのＶＥＧＦ ｄＡｂから選択されたＶＥＧＦ ｄＡｂ、またはＷＯ２００８１４９１４７（参照により本明細書に組み込まれる）に記述されたいずれかのＶＥＧＦ ｄＡｂから選択されたＶＥＧＦ ｄＡｂ、またはＷＯ２００８１４９１５０（参照により本明細書に組み込まれる）に記述されたいずれかのＶＥＧＦ ｄＡｂから選択されたＶＥＧＦ ｄＡｂである。
これらの具体的配列およびＷＯ２００７０８０３９２、ＷＯ２００８１４９１４６、ＷＯ２００７０６６１０６、ＷＯ２００８１４９１４７およびＷＯ２００８１４９１５０の関連開示は、本明細書の請求項に組み込むために開示するという明白な意図を有し、しかも本発明を応用するための可変ドメインとアンタゴニストの実施例として、あたかも本明細書に明示的に記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
このような抗原結合構築物の他の例としては、重鎖のＣ末端またはＮ末端または軽鎖のＣ末端またはＮ末端に結合される、1つまたは複数の抗ＴＮＦαエピトープ結合ドメインを有する抗ＶＥＧＦ抗体が挙げられるが、この場合、ＴＮＦαエピトープ結合ドメインはＷＯ０４００３０１９（参照により本明細書中に組み込まれる）に開示されたＴＮＦα ｄＡｂのいずれかから選択されるＴＮＦα ｄＡｂ、特に、ＴＡＲ１−５−１９、ＴＡＲ１−５およびＴＡＲ１−２７として記載されるｄＡｂである。これらの具体的配列およびＷＯ０４００３０１９の関連開示は、本明細書の請求項に組み込むために開示するという明白な意図を有し、しかも本発明を応用するための可変ドメインとアンタゴニストの実施例として、あたかも本明細書に明示的に記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
このような抗原結合構築物の他の例には、1つまたは複数の抗ＴＮＦＲ１エピトープ結合ドメイを有し、重鎖のＣ末端またはＮ末端、または軽鎖のＣ末端またはＮ末端に結合した抗ＶＥＧＦ抗体が含まれるが、このＴＮＦＲ１エピトープ結合ドメインは、ＷＯ０４００３０１９（参照により本明細書に組み込まれる）に記述されたいずれかの、特にＴＡＲ２−１０およびＴＡＲ２−５として記載されるＴＮＦＲ１ ｄＡｂ配列から選択されたＴＮＦＲ１ ｄＡｂ；またはＷＯ２００６０３８０２７（参照により本明細書に組み込まれる）に記述されたいずれかの、特に配列番号３２〜９８、１６７〜１７９、３７３〜４０１、４３１、４３３〜５１７および６２７で記述されたＴＮＦＲ１ ｄＡｂ配列から選択されたＴＮＦＲ１ ｄＡｂ；またはＷＯ２００８１４９１４４（参照により本明細書に組み込まれる）に記述されたいずれかの、特にＤＯＭ１ｈ−１３１−５１１、ＤＯＭ１ｈ−１３１−２０１、ＤＯＭ１ｈ−１３１−２０２、ＤＯＭ１ｈ−１３１−２０３、ＤＯＭ１ｈ−１３１−２０４、ＤＯＭ１ｈ−１３１−２０５として記載されるＴＮＦＲ１ ｄＡｂ配列から選択されたＴＮＦＲ１ ｄＡｂ；またはＷＯ２００８１４９１４８（参照により本明細書に組み込まれる）に記述されたいずれかの、特にＤＯＭ１ｈ−１３１−２０６として記載されるＴＮＦＲ１ ｄＡｂから選択されたＴＮＦＲ１ ｄＡｂである。
これらの具体的配列およびＷＯ２００６０３８０２７およびＷＯ２００８１４９１４４の関連開示は、本明細書の請求項に組み込むために開示するという明白な意図を有し、しかも本発明を応用するための可変ドメインとアンタゴニストの実施例として、あたかも本明細書に明示的に記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
抗原結合タンパク質のさらなる例としては、ＶＥＧＦＲ２に対する特異性を有するエピトープ結合ドメインと連結されるＴＮＦＲ２−Ｉｇ融合物が挙げられ、例えば、このＴＮＦＲ２−Ｉｇ融合物のＣ末端またはＮ末端に、抗ＶＥＧＦＲ２アドネクチンが連結される。例えば抗原結合タンパク質は、配列番号３４で記述されるＴＮＦＲ２−Ｉｇ配列を含み、これはＶＥＧＦＲ２と結合する1つまたは複数のエピトープ結合ドメイン、例えば配列番号１８で記述されるアドネクチンをさらに含む。
抗原結合タンパク質の他の例としては、ＶＥＧＦに対する特異性を有するエピトープ結合ドメインと連結されるＴＮＦＲ２−Ｉｇ融合物が挙げられ、例えば、このＴＮＦＲ２−Ｉｇ融合物のＣ末端またはＮ末端に、抗ＶＥＧＦ ｄＡｂまたは抗ＶＥＧＦアンチカリンが連結される。例えば受容体−Ｆｃ−エピトープ結合ドメイン融合物は、配列番号３４で記述されるＴＮＦＲ２−Ｉｇ配列を含み、これはＶＥＧＦと結合する1つまたは複数のエピトープ結合ドメイン、例えば配列番号１で記述されるｄＡｂまたは配列番号１９で記述されるアンチカリンをさらに含む。
この明細書全体を通して、可変ドメイン配列および全長抗体配列中のアミノ酸残基は、カバト番号付け規約に従って番号付けされる。同様に、実施例で用いられる用語「ＣＤＲ」、「ＣＤＲＬ１」、「ＣＤＲＬ２」、「ＣＤＲＬ３」、「ＣＤＲＨ１」、「ＣＤＲＨ２」、「ＣＤＲＨ３」は、カバト番号付け規約に従う。さらなる情報に関しては、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ., Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ４ｔｈ Ｅｄ., Ｕ.Ｓ. Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ （１９８７）を参照。
しかしながら、本明細書全体を通しての可変ドメイン配列および全長抗体配列中のアミノ酸残基に関するカバト番号付け規約をわれわれは用いるが、しかし、可変ドメイン配列および全長抗体配列中のアミノ酸残基に関しては代替的番号付け規約が存在することは、当業者には明らかであろう。ＣＤＲ配列に関する代替的番号付け規約も存在し、例えばＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ. （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３４２： ８７７−８８３に記述されたものがある。抗体の構造およびタンパク質フォールディングは、他の残基がＣＤＲ配列の一部とみなされる、ということを意味し、当業者にはそのように理解されるべきである。
当業者に利用可能なＣＤＲ配列に関する他の番号付け規約としては、「ＡｂＭ」（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂａｔｈ）および「コンタクト」（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｌｏｎｄｏｎ）法が挙げられる。カバト、コチア、ＡｂＭおよびコンタクト法のうちの少なくとも２つを用いる最小重複領域を決定して、「最小結合単位」を提供し得る。最小結合単位は、ＣＤＲの亜部分であり得る。
ＣＤＲ変異体を有する抗原結合タンパク質も、本発明の一部とみなされる。このような抗原結合タンパク質は、重鎖のＣ末端および／またはＮ末端および／または軽鎖のＣ末端および／またはＮ末端、および／または受容体−Ｆｃまたは受容体−Ｆｃ−ｄＡｂ融合物のＮ末端またはＣ末端と結合された、同一のまたは異なる抗原特異性を有する1つまたは複数のさらなるエピトープ結合ドメインも有する。
本発明の一実施形態では、ＡＤＣＣおよび／または補体活性化またはエフェクター機能を低減させるような抗体または受容体−Ｆｃ融合物となるよう、定常領域を含み本明細書記載の発明に従った抗原結合タンパク質が提供される。このような一実施形態では、重鎖定常領域は、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４アイソタイプの本来の無効化定常領域または変異ＩｇＧ１定常領域を含んでもよい。適切な修飾の例は、EP0307434に記載されている。一例では、位置２３５および２３７（ＥＵインデックスナンバリング、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ., （１９８３） “Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”, ＵＳ Ｄｅｐｔ. Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）のアラニン残基の置換が含まれる。
一実施形態では、抗原結合タンパク質のＦｃ部分は、機能的に無力にされる。このようなＦｃ無力化は、安全性プロフィール改善を示す抗原結合タンパク質を提供し得る。
また、本発明は、エピトープ結合ドメインを抗体の重鎖上、特に、エピトー結合ドメインを重鎖のＣ末端上に配置することにより、抗原結合タンパク質のＣＤＣ機能を低減する方法を提供する。
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、Ｆｃ機能を保持し、例えば、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性の一方または両方を有し得る。
本発明の抗原結合タンパク質は、いくつかのエフェクター機能を有し得る。例えば、免疫グロブリン足場がエフェクター機能を有する抗体由来のＦｃ領域を含有する場合、例えば、免疫グロブリン足場はＩｇＧ１からのＣＨ２およびＣＨ３を含む。エフェクター機能のレベルは、既知の技法により、例えばＣＨ２ドメインにおける突然変異により変えられ得る。例えばこの場合、ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインは、２３９および３３２および３３０から選択される位置に1つまたは複数の突然変異を有し、例えば、抗体がエフェクター機能を増強するよう、その突然変異はＳ２３９ＤおよびＩ３３２ＥおよびＡ３３０Ｌから選択され、例えば、Ｆｃ領域のフコシル化を低減するよう、本発明の抗原結合タンパク質のグリコシル化プロフィールを変更する。
一実施形態では、抗原結合性タンパク質は、ドメイン抗体（ｄＡｂ）であるエピトープ結合ドメインを含む。例えば、エピトープ結合ドメインは、ヒトＶＨまたはヒトＶＬであっても、ラクダＶＨＨまたはサメｄＡｂ（ＮＡＲＶ）であってもよい。一実施形態では、抗原結合タンパク質は、下記の群から選択された足場誘導体であるエピトープ結合ドメインを含む：ＣＴＬＡ−４（Ｅｖｉｂｏｄｙ）；リポカリン；プロテインＡ由来分子例えばプロテインＡのＺドメイン（アフィボディ、ＳｐＡ）、Ａドメイン（アビマー／マキシボディ）；ＧｒｏＥＬやＧｒｏＥＳ等の熱ショックタンパク質；トランスフェリン（トランスボディ）；アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）；ペプチドアプタマー；Ｃ−タイプレクチンドメイン（テトラネクチン）；ヒトγクリスタリンおよびヒトユビキチン（ａｆｆｉｌｉｎ）；ＰＤＺドメイン；ヒトプロテアーゼ阻害剤のスコーピオントキシンクニッツタイプドメイン；およびフィブロネクチン（アドネクチン）；これは天然のリガンド以外のリガンドに結合させるためにタンパク質工学による操作が行われたものである。
本発明の抗原結合タンパク質は、アドネクチンであるエピトープ結合ドメインに結合したタンパク質足場、例えば、重鎖のＣ末端に結合したアドネクチンを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、またはアドネクチンに結合したタンパク質足場、例えば、重鎖のＮ末端に結合したアドネクチンを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、アドネクチンに結合したタンパク質足場、例えば、軽鎖のＣ末端に結合したアドネクチンを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、アドネクチンに結合したタンパク質足場、例えば、軽鎖のＮ末端に結合したアドネクチンを有するＩｇＧ足場を含んでもよい。
他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、タンパク質足場、例えばＣＴＬＡ−４であるエピトープ結合ドメインに結合したＩｇＧ足場、例えば、重鎖のＮ末端に結合したＣＴＬＡ−４を有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、例えば、重鎖のＣ末端に結合したＣＴＬＡ−４を有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、例えば、軽鎖のＮ末端に結合したＣＴＬＡ−４を有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、軽鎖のＣ末端に結合したＣＴＬＡ−４を有するＩｇＧ足場を含んでもよい。
他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、タンパク質足場、例えばリポカリンであるエピトープ結合ドメインに結合したＩｇＧ足場、例えば、重鎖のＮ末端に結合したリポカリンを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、例えば、重鎖のＣ末端に結合したリポカリンを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、例えば、軽鎖のＮ末端に結合したリポカリンを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、軽鎖のＣ末端に結合したリポカリンを有するＩｇＧ足場を含んでもよい。
他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、タンパク質足場、例えばＳｐＡであるエピトープ結合ドメインに結合したＩｇＧ足場、例えば、重鎖のＮ末端に結合したＳｐＡを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、例えば、重鎖のＣ末端に結合したＳｐＡを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、例えば、軽鎖のＮ末端に結合したＳｐＡを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、軽鎖のＣ末端に結合したＳｐＡを有するＩｇＧ足場を含んでもよい。
他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、タンパク質足場、例えばアフィボディであるエピトープ結合ドメインに結合したＩｇＧ足場、例えば、重鎖のＮ末端に結合したアフィボディを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、例えば、重鎖のＣ末端に結合したアフィボディを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、例えば、軽鎖のＮ末端に結合したアフィボディを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、軽鎖のＣ末端に結合したアフィボディを有するＩｇＧ足場を含んでもよい。
他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、タンパク質足場、例えばａｆｆｉｍｅｒであるエピトープ結合ドメインに結合したＩｇＧ足場、例えば、重鎖のＮ末端に結合したａｆｆｉｍｅｒを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、例えば、重鎖のＣ末端に結合したａｆｆｉｍｅｒを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、例えば、軽鎖のＮ末端に結合したａｆｆｉｍｅｒを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、軽鎖のＣ末端に結合したａｆｆｉｍｅｒを有するＩｇＧ足場を含んでもよい。
他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、タンパク質足場、例えばＧｒｏＥｌであるエピトープ結合ドメインに結合したＩｇＧ足場、例えば、重鎖のＮ末端に結合したＧｒｏＥｌを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、例えば、重鎖のＣ末端に結合したＧｒｏＥｌを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、例えば、軽鎖のＮ末端に結合したＧｒｏＥｌを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、軽鎖のＣ末端に結合したＧｒｏＥｌを有するＩｇＧ足場を含んでもよい。
他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、タンパク質足場、例えばトランスフェリンであるエピトープ結合ドメインに結合したＩｇＧ足場、例えば、重鎖のＮ末端に結合したトランスフェリンを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、例えば、重鎖のＣ末端に結合したトランスフェリンを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、例えば、軽鎖のＮ末端に結合したトランスフェリンを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、軽鎖のＣ末端に結合したトランスフェリンを有するＩｇＧ足場を含んでもよい。
他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、タンパク質足場、例えばＧｒｏＥＳであるエピトープ結合ドメインに結合したＩｇＧ足場、例えば、重鎖のＮ末端に結合したＧｒｏＥＳを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、例えば、重鎖のＣ末端に結合したＧｒｏＥＳを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、例えば、軽鎖のＮ末端に結合したＧｒｏＥＳを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、軽鎖のＣ末端に結合したＧｒｏＥＳを有するＩｇＧ足場を含んでもよい。
他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、タンパク質足場、例えばＤＡＲＰｉｎであるエピトープ結合ドメインに結合したＩｇＧ足場、例えば、重鎖のＮ末端に結合したＤＡＲＰｉｎを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、例えば、重鎖のＣ末端に結合したＤＡＲＰｉｎを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、例えば、軽鎖のＮ末端に結合したＤＡＲＰｉｎを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、軽鎖のＣ末端に結合したＤＡＲＰｉｎを有するＩｇＧ足場を含んでもよい。
他の実施形態では、抗原結合性構築物は、タンパク質足場、例えばペプチドアプタマーであるエピトープ結合ドメインに結合したＩｇＧ足場、例えば、重鎖のＮ末端に結合したペプチドアプタマーを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、例えば、重鎖のＣ末端に結合したペプチドアプタマーを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、例えば、軽鎖のＮ末端に結合したペプチドアプタマーを有するＩｇＧ足場を含んでもよく、または、軽鎖のＣ末端に結合したペプチドアプタマーを有するＩｇＧ足場を含んでもよい。
本発明の一実施形態では、４つのエピトープ結合ドメイン、例えば４つのドメイン抗体があり、２つのエピトープ結合ドメインが同じ抗原に対し特異性を有してもよく、あるいは抗原結合タンパク質中に存在する全てのエピトープ結合ドメインが同じ抗原に対し特異性を有してもよい。
本発明のタンパク質足場は、リンカーを使ってエピトープ結合ドメインに連結してもよい。同様に、本発明の受容体−Ｆｃ融合物は、リンカーを使ってエピトープ結合ドメインに連結しても良い。ＤＶＤ−ＩｇのＶＤ１およびＶＤ２ドメインも、リンカーにより一緒に連結され得る。適切なリンカーの例は、１アミノ酸〜１５０アミノ酸の長さ、または１アミノ酸〜１４０アミノ酸、例えば、１アミノ酸〜１３０アミノ酸、または１〜１２０アミノ酸、または１〜８０アミノ酸、または１〜５０アミノ酸、または１〜２０アミノ酸、または１〜１０アミノ酸、または５〜１８アミノ酸のアミノ酸配列であってもよい。このような配列は、それ自身の三次構造を有してもよく、例えば、本発明のリンカーが単一可変ドメインを含んでもよい。一実施形態では、リンカーのサイズは、単一可変ドメインと同等である。適切なリンカーは、サイズが１〜２０オングストロームであってもよく、例えば、１５オングストローム未満、または１０オングストローム未満、または５オングストローム未満であってもよい。
本発明の一実施形態では、少なくとも１つのエピトープ結合ドメインは、１〜１５０アミノ酸、例えば、１〜２０アミノ酸、例えば１〜１０アミノ酸からなるリンカーで、Ｉｇ足場に直接結合している。
このようなリンカーは、配列番号３〜８、配列番号２５または配列番号６６〜６８で示されるもののいずれか１つ、あるいはこのようなリンカーの複合から選択することができる。例えば、リンカーは「ＴＶＡＡＰＳ」であってもよく、またはリンカーは「ＧＧＧＧＳ」であってもよく、または、これらリンカーの複合であってもよい。
本発明の一実施形態では、リンカーは「ＳＴＧ」（配列番号２５）である。
リンカーは、１または２つのアミノ酸変化を伴う本明細書中に記載される任意のリンカーであり得る。本発明の抗原結合タンパク質で使用するリンカーは、単体でも他のリンカーとの組み合わせでも、１つまたは複数組のＧＳ残基、例えば、「ＧＳＴＶＡＡＰＳ」または「ＴＶＡＡＰＳＧＳ」または「ＧＳＴＶＡＡＰＳＧＳ」またはこれらのリンカーの複合であってもよい。一実施形態では、リンカーは「ＧＳＴＶＡＡＰＳＧＳ」を含むかまたはそれから成る。
一実施形態では、リンカーは、ＧＳ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）×２（例えば、「ＧＳＴＶＡＡＰＳＧＳＴＶＡＡＰＳＧＳ」 配列番号６６）を含むかまたはそれから成る。一実施形態では、リンカーは、ＧＳ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）×３（例えば、「ＧＳＴＶＡＡＰＳＧＳＴＶＡＡＰＳＧＳＧＳＴＶＡＡＰＳＧＳ」 配列番号６７）を含むかまたはそれから成る。一実施形態では、リンカーは、ＧＳ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）×４（例えば、「ＧＳＴＶＡＡＰＳＧＳＴＶＡＡＰＳＧＳＧＳＴＶＡＡＰＳＧＳＧＳＴＶＡＡＰＳＧＳ」 配列番号６８）を含むかまたはそれから成る。
一実施形態では、エピトープ結合ドメインは、リンカー「（ＰＡＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ」によりＩｇ足場に結合している。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインは、リンカー「（ＧＧＧＧＳ）ｎまたはｐ（ＧＳ）ｍ」によりＩｇ足場に結合している。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインは、リンカー「（ＴＶＡＡＰＳ）ｎまたはｐ（ＧＳ）ｍ」によりＩｇ足場に結合している。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインは、リンカー「（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎまたはｐ」によりＩｇ足場に結合している。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインは、リンカー「（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳ）ｐ（ＧＳ）ｍ」によりＩｇ足場に結合している。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインは、リンカー「（ＰＡＶＰＰＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ」によりＩｇ足場に結合している。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインは、リンカー「（ＴＶＳＤＶＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ」によりＩｇ足場に結合している。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインは、リンカー「（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ」によりＩｇ足場に結合している。この全ての実施形態で、ｎ＝１〜１０、およびｍ＝０〜４、およびｐ＝２〜１０である。
このようなリンカーの例には、（ＰＡＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝１およびｍ＝１（配列番号１４５））、（ＰＡＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝２およびｍ＝１（配列番号１４６））、（ＰＡＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝３およびｍ＝１（配列番号１４７））、（ＰＡＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝４およびｍ＝１）、（ＰＡＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝２およびｍ＝０）、（ＰＡＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝３およびｍ＝０）、（ＰＡＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝４およびｍ＝０）がある。
このようなリンカーの例には、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝１およびｍ＝１）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝２およびｍ＝１）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝３およびｍ＝１）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝４およびｍ＝１）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝２およびｍ＝０（配列番号１４８））、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝３およびｍ＝０（配列番号１４９））、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝４およびｍ＝０）がある。
このようなリンカーの例には、（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳ）ｐ（ここでｐ＝１およびｍ＝１）、（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳ）ｐ（ここでｐ＝２およびｍ＝１）、（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳ）ｐ（ここでｐ＝３およびｍ＝１）、（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳ）ｐ（ここでｐ＝４およびｍ＝１）、（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳ）ｐ（ここでｐ＝５およびｍ＝１）、または（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳ）ｐ（ここでｐ＝６およびｍ＝１）がある。
このようなリンカーの例には、（ＴＶＡＡＰＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝１およびｍ＝１）、（ＴＶＡＡＰＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝２およびｍ＝１（配列番号１５０））、（ＴＶＡＡＰＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝３およびｍ＝１（配列番号１５１））、（ＴＶＡＡＰＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝４およびｍ＝１）、（ＴＶＡＡＰＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝２およびｍ＝０）、（ＴＶＡＡＰＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝３およびｍ＝０）、（ＴＶＡＡＰＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝４およびｍ＝０）がある。
このようなリンカーの例には、（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎ（ここでｎ＝１およびｍ＝１）、（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎ（ここでｎ＝２およびｍ＝１（配列番号６６））、（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎ（ここでｎ＝３およびｍ＝１（配列番号６７））、または（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎ（ここでｎ＝４およびｍ＝１（配列番号６８））、（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎ（ここでｎ＝５およびｍ＝１（配列番号１５２））、（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎ（ここでｎ＝６およびｍ＝１（配列番号１５３））、（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎ（ここでｎ＝１およびｍ＝０（配列番号８））、（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎ（ここでｎ＝２およびｍ＝１０）、（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎ（ここでｎ＝３およびｍ＝０）、または（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎ（ここでｎ＝０）がある。
このようなリンカーの例には、（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｐ（ＧＳ）ｍ（ここでｐ＝２およびｍ＝１）、（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｐ（ＧＳ）ｍ（ここでｐ＝３およびｍ＝１）、（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｐ（ＧＳ）ｍ（ここでｐ＝４およびｍ＝１）、（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｐ（ＧＳ）ｍ（ここでｐ＝２およびｍ＝０）、（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｐ（ＧＳ）ｍ（ここでｐ＝３およびｍ＝０）、（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｐ（ＧＳ）ｍ（ここでｐ＝４およびｍ＝０）がある。
このようなリンカーの例には、（ＰＡＶＰＰＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝１およびｍ＝１（配列番号１５４））、（ＰＡＶＰＰＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝２およびｍ＝１（配列番号１５５））、（ＰＡＶＰＰＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝３およびｍ＝１（配列番号１５６））、（ＰＡＶＰＰＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝４およびｍ＝１）、（ＰＡＶＰＰＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝２およびｍ＝０）、（ＰＡＶＰＰＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝３およびｍ＝０）、（ＰＡＶＰＰＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝４およびｍ＝０）がある。
このようなリンカーの例には、（ＴＶＳＤＶＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝１およびｍ＝１（配列番号１５７））、（ＴＶＳＤＶＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝２およびｍ＝１（配列番号１５８））、（ＴＶＳＤＶＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝３およびｍ＝１（配列番号１５９））、（ＴＶＳＤＶＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝４およびｍ＝１）、（ＴＶＳＤＶＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝２およびｍ＝０）、（ＴＶＳＤＶＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝３およびｍ＝０）、（ＴＶＳＤＶＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝４およびｍ＝０）がある。
このようなリンカーの例には、（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝１およびｍ＝１（配列番号１６０））、（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝２およびｍ＝１（配列番号１６１））、（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝３およびｍ＝１（配列番号１６２））、（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝４およびｍ＝１）、（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝２およびｍ＝０）、（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝３およびｍ＝０）、（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ（ここでｎ＝４およびｍ＝０）がある。
別の実施形態では、エピトープ結合ドメインおよびＩｇ足場の間にはリンカーが存在しない。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインはリンカー「ＴＶＡＡＰＳ」によりＩｇ足場に結合する。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインはリンカー「ＴＶＡＡＰＳＧＳ」によりＩｇ足場に結合する。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインはリンカー「ＧＳ」によりＩｇ足場に結合する。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインはリンカー「ＡＳＴＫＧＰＴ」によりＩｇ足場に結合する。
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、少なくとも１つの抗原結合性部位、例えばヒト血清アルブミンに結合可能な少なくとも１つのエピトープ結合ドメインを含む。
一実施形態では、少なくとも３つの抗原結合性部位があり、例えば４または５または６または８または１０抗原結合性部位があり、この抗原結合タンパク質は少なくとも３または４または５または６または８または１０抗原に結合可能であり、例えば、３または４または５または６または８または１０抗原に同時に結合可能である。
本発明はさらにまた、医療に用いるために、例えば眼の疾患（代替的には、「眼疾患」として本明細書中で言及される）、例えば糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、類嚢胞黄斑浮腫、ブドウ膜炎、ＡＭＤ（加齢性黄斑変性）、脈絡膜血管新生性ＡＭＤ、地図状萎縮、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症（ＢＲＶＯおよび／またはＣＲＶＯ）ならびにその他の黄斑症および眼性血管障害を治療するための医薬剤の製造に用いるために、本明細書中に開示される抗原結合タンパク質を提供する。一実施形態では、治療されるべき疾患はＡＭＤである。別の実施形態では、治療されるべき疾患はＤＭＥである。
本発明は、眼の疾患、例えば糖尿病性黄斑浮腫、類嚢胞黄斑浮腫、ブドウ膜炎、ＡＭＤ（加齢性黄斑変性）、脈絡膜血管新生性ＡＭＤ、地図状萎縮、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症（ＢＲＶＯおよび／またはＣＲＶＯ）ならびにその他の黄斑症および眼性血管障害に罹患している患者の治療方法であって、治療的有効量の本発明の抗原結合タンパク質を投与することを包含する方法を提供する。
本発明の抗原結合タンパク質は、眼の疾患、例えば糖尿病性黄斑浮腫、類嚢胞黄斑浮腫、ブドウ膜炎、ＡＭＤ（加齢性黄斑変性）、脈絡膜血管新生性ＡＭＤ、地図状萎縮、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症（ＢＲＶＯおよび／またはＣＲＶＯ）ならびにその他の黄斑症および眼性血管障害、あるいはＴＮＦαおよび／またはＶＥＧＦの過剰産生に関連した任意の他の疾患の治療のために用いられ得る。
特定の一実施形態では、疾患はＡＭＤ、具体的には脈絡膜血管新生ＡＭＤである。
本発明に使われるタンパク質足場は、抗体の全てのドメイン、従来型の抗体のＦｃ部分を含む全モノクローナル抗体足場を含み、または、本発明のタンパク質足場は、一価抗体のような従来にない抗体構造または従来にない抗体構造のＦｃ部分を含んでもよい。このような一価抗体は、重鎖のヒンジ部がホモ二量体化しないように修飾されたペアード重鎖と軽鎖を含んでもよい（このような一価抗体は、ＷＯ２００７０５９７８２に記述されている）。他の一価抗体は、機能的可変領域とＣＨ１領域が欠けた第２の重鎖と二量体化するペアード重鎖／軽鎖を含んでもよい。この場合、ホモ二量体よりもヘテロ二量体を形成するように第１と第２の重鎖を修飾して、２つの重鎖と１つの軽鎖を有する一価抗体ができる（このような一価抗体は、ＷＯ２００６０１５３７１に記載されている）。このような一価抗体は、本発明のエピトープ結合ドメインが結合できるタンパク質足場を提供可能である。このような一価抗体のＦｃ領域は、可溶性リガンド、受容体または細胞表面タンパク質の細胞外ドメイン、およびエピトープ結合ドメインが連結され得る本発明の免疫グロブリン足場を提供し得る。このような一価構造では、可溶性リガンドあるいは受容体または細胞表面タンパク質の細胞外ドメイン（第一重鎖と連結される）および1つまたは複数のエピトープ結合ドメイン（第二重鎖と連結される）を有することが可能である。
本発明に使われるエピトープ結合ドメインは、異なるＶ領域またはドメインと独立して、抗原またはエピトープに特異的に結合するドメインであり、これは、ドメイン抗体であっても、または下記の群から選択された足場の誘導体であるドメインであってもよい：ＣＴＬＡ−４（Ｅｖｉｂｏｄｙ）；リポカイン；プロテインＡ誘導分子、例えばプロテインＡのＺドメイン（アフィボディ、ＳｐＡ）、Ａドメイン（アビマー／マキシボディ）；熱ショックタンパク質、例えばＧｒｏＥｌおよびＧｒｏＥＳ；トランスフェリン（トランスボディ）；アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）；ペプチドアプタマー；Ｃタイプレクチンドメイン（テトラネクチン）；ヒトγクリスタリンおよびヒトユビキチン（ａｆｆｉｌｉｎ）；ＰＤＺドメイン；ヒトプロテアーゼ阻害剤のスコーピオントキシンクニッツタイプドメイン；およびフィブロネクチン（アドネクチン）：これらは天然のリガンド以外のリガンドに結合させるためにタンパク質工学による操作が行われたものである。一実施形態では、これはドメイン抗体であってもよく、また他の適切なドメイン、例えば、ＣＴＬＡ−４、リポカリン、ＳｐＡ、アフィボディ、アビマー、ＧｒｏＥｌ、トランスフェリン、ＧｒｏＥＳおよびフィブロネクチンからなる群から選択されたドメインであってもよい。一実施形態では、これはｄＡｂ、アフィボディ、アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）およびアドネクチンから選択されてもよい。別の実施形態では、これは、アフィボディ、アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）およびアドネクチンから選択されてもよい。別の実施形態では、これは、ドメイン抗体、例えば、ヒト、ラクダまたはサメ（ＮＡＲＶ）のドメイン抗体から選択されたドメイン抗体であってもよい。
エピトープ結合ドメインは、１つまたは複数の位置でタンパク質足場に結合可能である。これらの位置には、タンパク質足場のＣ末端およびＮ末端、例えば、ＩｇＧの重鎖のＣ末端および／または軽鎖のＣ末端、または例えばＩｇＧの重鎖のＮ末端および／または軽鎖のＮ末端が挙げられる。
一実施形態では、第１のエピトープ結合ドメインがタンパク質足場に結合し、第２のエピトープ結合ドメインが第１のエピトープ結合ドメインに結合する。例えばタンパク質足場がＩｇＧ足場の場合は、第１のエピトープ結合ドメインはＩｇＧ足場の重鎖のＣ末端に結合してもよく、そのエピトープ結合ドメインがそのＣ末端の位置で第２のエピトープ結合ドメインに結合してもよい。または例えば、第１のエピトープ結合ドメインは、ＩｇＧ足場の軽鎖のＣ末端に結合してもよく、その第１のエピトープ結合ドメインは、そのＣ末端の位置で第２のエピトープ結合ドメインにさらに結合してもよい。または例えば、第１のエピトープ結合ドメインは、ＩｇＧ足場の軽鎖のＮ末端に結合してもよく、その第１のエピトープ結合ドメインはそのＮ末端の位置で第２のエピトープ結合ドメインにさらに結合してもよい。または例えば、第１のエピトープ結合ドメインは、ＩｇＧ足場の重鎖のＮ末端に結合してもよく、その第１のエピトープ結合ドメインは、そのＮ末端の位置で第２のエピトープ結合ドメインにさらに結合してもよい。
エピトープ結合ドメインがドメイン抗体である場合は、一部のドメイン抗体が足場内の特定の位置に適合することがある。
本発明で使用するドメイン抗体は、通常のＩｇＧの重鎖および／または軽鎖のＣ末端で結合可能である。さらに、一部のｄＡｂは、通常の抗体の重鎖および軽鎖の両方のＣ末端に結合できる。
エピトープ結合ドメインは、1つまたは複数の位置で受容体−Ｆｃ融合物と連結され得る。これらの位置としては、受容体−Ｆｃ融合物のＣ末端およびＮ末端が挙げられる。例えば、それらは受容体−Ｆｃ融合物のＦｃ部分と直接的に連結され得るし、あるいはそれらは、受容体−Ｆｃ融合物の受容体または細胞表面タンパク質部分の可溶性リガンドまたは細胞外ドメインと連結され得る。受容体または細胞表面タンパク質の可溶性リガンドまたは細胞外ドメインがＦｃ部分のＣ末端と直接的に連結される場合、エピトープ結合ドメインはＦｃ部分のＣ末端と、あるいは受容体または細胞表面タンパク質の可溶性リガンドまたは細胞外ドメインのＮ末端と直接的に連結され得る。
一実施形態では、第一エピトープ結合ドメインは受容体−Ｆｃ融合物と連結され、第二エピトープ結合ドメインは第一エピトープ結合ドメインと連結される。例えば、第一エピトープ結合ドメインは受容体−Ｆｃ融合物のＣ末端に連結され得るし、そのエピトープ結合ドメインは第二エピトープ結合ドメインとそのＣ末端で連結され得る。あるいは例えば第一エピトープ結合ドメインは受容体−Ｆｃ融合物のＮ末端に連結され得るし、そしてその第一エピトープ結合ドメインはさらに、第二エピトープ結合ドメインとそのＮ末端で連結され得る。エピトープ結合ドメインがドメイン抗体である場合、一部のドメイン抗体は足場内の特定の位置に適合され得る。
ｄＡｂのＮ末端が抗体定常ドメイン（ＣＨ３またはＣＬのいずれか）に融合している構築物の場合は、ペプチドリンカーは、ｄＡｂが抗原に結合するのを支援することができる。事実、ｄＡｂのＮ末端は、抗原結合活性に関わる相補性決定領域（ＣＤＲＳ）の近傍に配置される。従って、短いペプチドリンカーは、エピトープ結合ドメインおよびタンパク質足場に対する定常ドメインの間のスペーサーとして作用し、これによりｄＡｂ ＣＤＲをより容易に抗原に近づけることができ、従って高い親和性での結合が可能となる。
ｄＡｂがＩｇＧに結合する環境は、融合しようとする抗体鎖によって異なる。ＩｇＧ足場の抗体軽鎖のＣ末端で融合する場合は、各ｄＡｂが抗体ヒンジとＦｃ部の近くに配置されることが期待される。このようなｄＡｂは相互に大きく離れていると思われる。通常の抗体では、Ｆａｂ断片間の角度、および各Ｆａｂ断片とＦｃ部間の角度は非常に大きく変動する。ｍＡｂｄＡｂの場合はＦａｂ断片間の角度は大きくは異ならないが、一方、各ＦａｂとＦｃ部間の角度には、ある程度の角度制約が観察されることがある。
ＩｇＧ足場の抗体重鎖のＣ末端で融合した場合、各ｄＡｂはＦｃ部のＣＨ３ドメインの近くに配置されることが期待される。これはＦｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＦｃＲｎ）へのＦｃ結合特性に影響することは期待できない。理由は、これらの受容体が、ＣＨ２ドメイン（ＦｃγＲＩ、ＩＩおよびＩＩＩクラスの受容体の場合）またはＣＨ２およびＣＨ３ドメイン間のヒンジ（例えば、ＦｃＲｎ受容体の場合）と結合しているからである。このような抗原結合性タンパク質の別の特徴は、両ｄＡｂが相互に空間的に接近していることが期待され、適切なリンカーにより与えられた柔軟性があるという条件下、これらのｄＡｂはホモ二量体さえ形成でき、従って、Ｆｃ部の「ジップド（ｚｉｐｐｅｄ）」四次構造化を促進し、この構築物の安定性を高めることができる。
このような構造の考察は、エピトープ結合ドメインに結合する最も適切な位置、例えば、ｄＡｂのタンパク質足場（例えば、抗体）上の、または受容体−Ｆｃ融合物上の位置の選択の助けとなり得る。
抗原のサイズ、その局在化（血液中または細胞表面上）、その四次構造（単量体または多量体）は変動可能である。通常の抗体は、ヒンジ部が存在することによりアダプター構築物として機能するように元々設計されているが、Ｆａｂ断片の先端での２つの抗原結合性部位の方向は大きく変動でき、従って抗原の分子特性とその環境への適応が可能である。対照的に、抗体または他のタンパク質足場に結合したｄＡｂ、例えばヒンジ部を有しない抗体を含むタンパク質足場は、直接的あるいは間接的に構造的柔軟性に乏しい場合がある。
ｄＡｂの溶液中結合状態と方法の理解も有益である。インビトロでｄＡｂは単量体での存在が多く、溶液中ではホモ二量体か多量体が多いという根拠が蓄積されてきた（Ｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ. （１９９９） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９０ ｐ６８５−６９８； Ｅｗｅｒｔ ｅｔ ａｌ （２００３） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３２５, ｐ５３１−５５３, Ｊｅｓｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ （２００４） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３３７ ｐ８９３−９０３； Ｊｅｓｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ （２００４） Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２２ ｐ１１６１−１１６５； Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ （１９９７） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ. １０ ｐ６０７−６１４； Ｓｅｐｕｌｖａｄａ ｅｔ ａｌ （２００３） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３３３ ｐ３５５−３６５）。これはＩｇドメインに関してインビボで観察された多量体発生、例えば、ベンスジョーンズタンパク質（免疫グロブリン軽鎖の二量体（Ｅｐｐ ｅｔ ａｌ （１９７５） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １４ ｐ４９４３−４９５２； Ｈｕａｎ ｅｔ ａｌ （１９９４） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３ ｐ１４８４８−１４８５７； Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ （１９９７） Ｍｏｌ ｉｍｍｕｎｏｌ ３４ ｐ１２９１−１３０１）およびアミロイド線維 （Ｊａｍｅｓ ｅｔ ａｌ. （２００７） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ. ３６７：６０３−８）を強く想起させる。
例えば、溶液中では二量体化する傾向のドメイン抗体を軽鎖のＣ末端または受容体−Ｆｃ融合物のＮ末端よりもＦｃ部のＣ末端に結合させることが望ましいという可能性もある。Ｆｃ部のＣ末端への結合により本発明の抗原結合タンパク質との関連で、これらのｄＡｂが二量体化するからである。
本発明の抗原結合タンパク質は、単一抗原に特異的な抗原結合性部位を含んでもよく、２つ以上の抗原または単一抗原上の２つ以上のエピトープに対し特異的な抗原結合性部位を有してもよく、また、抗原結合性部位のそれぞれが同じまたは異なる抗原上の別々のエピトープに対し特異的であってもよい。
特に、本発明の抗原結合タンパク質は、ＴＮＦαおよびＶＥＧＦに関連した疾患、例えば眼の疾患、例えば糖尿病性黄斑浮腫、類嚢胞黄斑浮腫、ブドウ膜炎、ＡＭＤ（加齢性黄斑変性）、脈絡膜血管新生性ＡＭＤ、地図状萎縮、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症（ＢＲＶＯおよび／またはＣＲＶＯ）ならびにその他の黄斑症および眼性血管障害を治療するのに有用であり得る。
前記の眼の疾患のいずれか、特にＡＭＤの治療のために組合せて投与され得る特定のＴＮＦαアンタゴニストおよびＶＥＧＦアンタゴニストを、以下に示す。
一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはアダリムマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはベバシズマブである。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはアダリムマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはラニビズマブである。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはアダリムマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはｒ８４である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはアダリムマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはアフリベルセプトである。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはアダリムマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＣＴ０１である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはアダリムマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＤＯＭ１５−１０−１１である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはアダリムマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＤＯＭ１５−２６−５９３である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはアダリムマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＰＲＳ−０５０である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはアダリムマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＰＲＳ−０５１である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはアダリムマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＭＰ０１１２である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはアダリムマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＣＴ−３２２である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはアダリムマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＥＳＢＡ９０３である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはアダリムマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＥＰＩ−００３０である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはアダリムマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＥＰＩ−００１０である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはアダリムマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＤＭＳ１５７１である。
一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはインフリキシマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはベバシズマブである。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはインフリキシマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはラニビズマブである。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはインフリキシマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはｒ８４である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはインフリキシマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはアフリベルセプトである。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはインフリキシマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＣＴ０１である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはインフリキシマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＤＯＭ１５−１０−１１である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはインフリキシマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＤＯＭ１５−２６−５９３である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはインフリキシマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＰＲＳ−０５０である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはインフリキシマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＰＲＳ−０５１である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはインフリキシマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＭＰ０１１２である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはインフリキシマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＣＴ−３２２である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはインフリキシマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＥＳＢＡ９０３である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはインフリキシマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＥＰＩ−００３０である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはインフリキシマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＥＰＩ−００１０である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはインフリキシマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＤＭＳ１５７１である。
一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはエタネルセプトであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはベバシズマブである。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはエタネルセプトであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはラニビズマブである。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはエタネルセプトであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはｒ８４である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはエタネルセプトであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはアフリベルセプトである。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはエタネルセプトであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＣＴ０１である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはエタネルセプトであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＤＯＭ１５−１０−１１である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはエタネルセプトであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＤＯＭ１５−２６−５９３である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはエタネルセプトであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＰＲＳ−０５０である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはエタネルセプトであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＰＲＳ−０５１である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはエタネルセプトであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＭＰ０１１２である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはエタネルセプトであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＣＴ−３２２である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはエタネルセプトであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＥＳＢＡ９０３である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはエタネルセプトであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＥＰＩ−００３０である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはエタネルセプトであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＥＰＩ−００１０である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはエタネルセプトであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＤＭＳ１５７１である。
一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＥＳＢＡ１０５であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはベバシズマブである。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＥＳＢＡ１０５であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはラニビズマブである。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＥＳＢＡ１０５であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはｒ８４である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＥＳＢＡ１０５であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはアフリベルセプトである。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＥＳＢＡ１０５であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＣＴ０１である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＥＳＢＡ１０５であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＤＯＭ１５−１０−１１である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＥＳＢＡ１０５であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＤＯＭ１５−２６−５９３である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＥＳＢＡ１０５であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＰＲＳ−０５０である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＥＳＢＡ１０５であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＰＲＳ−０５１である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＥＳＢＡ１０５であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＭＰ０１１２である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＥＳＢＡ１０５であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＣＴ−３２２である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＥＳＢＡ１０５であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＥＳＢＡ９０３である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＥＳＢＡ１０５であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＥＰＩ−００３０である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＥＳＢＡ１０５であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＥＰＩ−００１０である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＥＳＢＡ１０５であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＤＭＳ１５７１である。
一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＰＥＰ１−５−１９であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはベバシズマブである。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＰＥＰ１−５−１９であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはラニビズマブである。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＰＥＰ１−５−１９であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはｒ８４である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＰＥＰ１−５−１９であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはアフリベルセプトである。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＰＥＰ１−５−１９であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＣＴ０１である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＰＥＰ１−５−１９であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＤＯＭ１５−１０−１１である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＰＥＰ１−５−１９であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＤＯＭ１５−２６−５９３である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＰＥＰ１−５−１９であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＰＲＳ−０５０である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＰＥＰ１−５−１９であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＰＲＳ−０５１である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＰＥＰ１−５−１９であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＭＰ０１１２である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＰＥＰ１−５−１９であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＣＴ−３２２である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＰＥＰ１−５−１９であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＥＳＢＡ９０３である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＰＥＰ１−５−１９であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＥＰＩ−００３０である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＰＥＰ１−５−１９であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＥＰＩ−００１０である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＰＥＰ１−５−１９であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＤＭＳ１５７１である。
一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＰＥＰ１−５−４９０であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはベバシズマブである。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＰＥＰ１−５−４９０であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはラニビズマブである。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＰＥＰ１−５−４９０であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはｒ８４である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＰＥＰ１−５−４９０であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはアフリベルセプトである。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＰＥＰ１−５−４９０であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＣＴ０１である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＰＥＰ１−５−４９０であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＤＯＭ１５−１０−１１である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＰＥＰ１−５−４９０であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＤＯＭ１５−２６−５９３である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＰＥＰ１−５−４９０であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＰＲＳ−０５０である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＰＥＰ１−５−４９０であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＰＲＳ−０５１である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＰＥＰ１−５−４９０であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＭＰ０１１２である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＰＥＰ１−５−４９０であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＣＴ−３２２である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＰＥＰ１−５−４９０であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＥＳＢＡ９０３である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＰＥＰ１−５−４９０であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＥＰＩ−００３０である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＰＥＰ１−５−４９０であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＥＰＩ−００１０である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＰＥＰ１−５−４９０であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＤＭＳ１５７１である。
一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＰＥＰ１−５−４９３であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはベバシズマブである。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＰＥＰ１−５−４９３であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはラニビズマブである。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＰＥＰ１−５−４９３であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはｒ８４である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＰＥＰ１−５−４９３であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはアフリベルセプトである。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＰＥＰ１−５−４９３であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＣＴ０１である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＰＥＰ１−５−４９３であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＤＯＭ１５−１０−１１である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＰＥＰ１−５−４９３であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＤＯＭ１５−２６−５９３である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＰＥＰ１−５−４９３であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＰＲＳ−０５０である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＰＥＰ１−５−４９３であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＰＲＳ−０５１である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＰＥＰ１−５−４９３であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＭＰ０１１２である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＰＥＰ１−５−４９３であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＣＴ−３２２である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＰＥＰ１−５−４９３であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＥＳＢＡ９０３である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＰＥＰ１−５−４９３であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＥＰＩ−００３０である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＰＥＰ１−５−４９３であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＥＰＩ−００１０である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＰＥＰ１−５−４９３であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＤＭＳ１５７１である。
一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストは配列番号２のアドネクチンであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはベバシズマブである。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストは配列番号２のアドネクチンであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはラニビズマブである。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストは配列番号２のアドネクチンであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはｒ８４である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストは配列番号２のアドネクチンであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはアフリベルセプトである。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストは配列番号２のアドネクチンであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＣＴ０１である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストは配列番号２のアドネクチンであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＤＯＭ１５−１０−１１である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストは配列番号２のアドネクチンであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＤＯＭ１５−２６−５９３である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストは配列番号２のアドネクチンであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＰＲＳ−０５０である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストは配列番号２のアドネクチンであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＰＲＳ−０５１である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストは配列番号２のアドネクチンであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＭＰ０１１２である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストは配列番号２のアドネクチンであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＣＴ−３２２である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストは配列番号２のアドネクチンであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＥＳＢＡ９０３である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストは配列番号２のアドネクチンであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＥＰＩ−００３０である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストは配列番号２のアドネクチンであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＥＰＩ−００１０である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストは配列番号２のアドネクチンであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＤＭＳ１５７１である。
一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはゴリムマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはベバシズマブである。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはゴリムマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはラニビズマブである。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはゴリムマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはｒ８４である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはゴリムマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはアフリベルセプトである。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはゴリムマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＣＴ０１である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはゴリムマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＤＯＭ１５−１０−１１である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはゴリムマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＤＯＭ１５−２６−５９３である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはゴリムマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＰＲＳ−０５０である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはゴリムマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＰＲＳ−０５１である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはゴリムマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＭＰ０１１２である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはゴリムマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＣＴ−３２２である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはゴリムマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＥＳＢＡ９０３である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはゴリムマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＥＰＩ−００３０である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはゴリムマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＥＰＩ−００１０である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはゴリムマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＤＭＳ１５７１である。
一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはセルトリズマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはベバシズマブである。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはセルトリズマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはラニビズマブである。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはセルトリズマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはｒ８４である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはセルトリズマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはアフリベルセプトである。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはセルトリズマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＣＴ０１である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはセルトリズマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＤＯＭ１５−１０−１１である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはセルトリズマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＤＯＭ１５−２６−５９３である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはセルトリズマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＰＲＳ−０５０である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはセルトリズマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＰＲＳ−０５１である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはセルトリズマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＭＰ０１１２である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはセルトリズマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＣＴ−３２２である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはセルトリズマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＥＳＢＡ９０３である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはセルトリズマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＥＰＩ−００３０である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはセルトリズマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＥＰＩ−００１０である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはセルトリズマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＤＭＳ１５７１である。
一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＡＬＫ−６９３１であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはベバシズマブである。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＡＬＫ−６９３１であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはラニビズマブである。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＡＬＫ−６９３１であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはｒ８４である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＡＬＫ−６９３１であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはアフリベルセプトである。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＡＬＫ−６９３１であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＣＴ０１である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＡＬＫ−６９３１であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＤＯＭ１５−１０−１１である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＡＬＫ−６９３１であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＤＯＭ１５−２６−５９３である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＡＬＫ−６９３１であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＰＲＳ−０５０である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＡＬＫ−６９３１であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＰＲＳ−０５１である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＡＬＫ−６９３１であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＭＰ０１１２である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＡＬＫ−６９３１であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＣＴ−３２２である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＡＬＫ−６９３１であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＥＳＢＡ９０３である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＡＬＫ−６９３１であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＥＰＩ−００３０である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＡＬＫ−６９３１であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＥＰＩ−００１０である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストはＡＬＫ−６９３１であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＤＭＳ１５７１である。
一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストは配列番号３０の重鎖および配列番号３１の軽鎖を含む抗体であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはベバシズマブである。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストは配列番号３０の重鎖および配列番号３１の軽鎖を含む抗体であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはラニビズマブである。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストは配列番号３０の重鎖および配列番号３１の軽鎖を含む抗体であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはｒ８４である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストは配列番号３０の重鎖および配列番号３１の軽鎖を含む抗体であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはアフリベルセプトである。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストは配列番号３０の重鎖および配列番号３１の軽鎖を含む抗体であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＣＴ０１である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストは配列番号３０の重鎖および配列番号３１の軽鎖を含む抗体であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＤＯＭ１５−１０−１１である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストは配列番号３０の重鎖および配列番号３１の軽鎖を含む抗体であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＤＯＭ１５−２６−５９３である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストは配列番号３０の重鎖および配列番号３１の軽鎖を含む抗体であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＰＲＳ−０５０である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストは配列番号３０の重鎖および配列番号３１の軽鎖を含む抗体であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＰＲＳ−０５１である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストは配列番号３０の重鎖および配列番号３１の軽鎖を含む抗体であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＭＰ０１１２である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストは配列番号３０の重鎖および配列番号３１の軽鎖を含む抗体であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＣＴ−３２２である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストは配列番号３０の重鎖および配列番号３１の軽鎖を含む抗体であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＥＳＢＡ９０３である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストは配列番号３０の重鎖および配列番号３１の軽鎖を含む抗体であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＥＰＩ−００３０である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストは配列番号３０の重鎖および配列番号３１の軽鎖を含む抗体であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＥＰＩ−００１０である。一実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストは配列番号３０の重鎖および配列番号３１の軽鎖を含む抗体であり、ＶＥＧＦアンタゴニストはＤＭＳ１５７１である。
上記の組合せの各々は、本発明の二重標的化分子を生成するためにも用いることができる。本発明の二重標的化分子の特定の且つ非限定的例を以下に示す：Ｆｃ利用可能ＤＭＳ４０００（配列番号１４および配列番号１２）、Ｆｃ無効化ＤＭＳ４０００（配列番号４７および配列番号１２）、ＤＭＳ４０３１（配列番号１６および配列番号１２）、ＤＯＭ−ＰＥＰ直列融合物（配列番号６２）、ＰＥＰ−ＤＯＭ直列融合物（配列番号６４）、配列番号６９〜７２から選択される重鎖および配列番号１２の軽鎖を有する二重標的化分子、ならびに配列番号７２〜１４０で列挙されるもの。
本発明の抗原結合タンパク質は、本発明の抗原結合タンパク質のためのコード配列を含む発現ベクターを有する宿主細胞の形質移入により産生可能である。発現ベクターまたは組換えプラスミドは、宿主細胞での複製および発現、および／または宿主細胞からの分泌を制御できる通常の制御配列の操作環境に抗原結合タンパク質のためのこれらのコード配列を置くことにより産生可能である。調節配列には、プロモータ配列、例えば、ＣＭＶプロモータ、および他の既知抗体から得られるシグナル配列が含まれる。同様にして、相補的抗原結合タンパク質の軽鎖または重鎖をコードしたＤＮＡ塩基配列を有する第２の発現ベクターを産生できる。特定の実施形態では、この第２の発現ベクターは、コード配列と選択可能なマーカーに関することを除いて第１の発現ベクターに同じであり、従って各ポリペプチド鎖が機能的に発現していることを可能な限り確実にする。あるいは、抗原結合性構築物のための重鎖と軽鎖コード配列を単一のベクター上、例えば、同じベクター中の２つの発現カセットに置いてもよい。
選択された宿主細胞は、第１と第２のベクターの両方を使って通常の技術により同時形質移入され（または、単純に単一のベクターで形質移入され）、組換えまたは合成された軽鎖と重鎖の両方を含む本発明の形質移入した宿主細胞が作られる。この形質移入した細胞は、次に通常の技術により培養され本発明の操作された抗原結合タンパク質が産生される。組換え重鎖および／または軽鎖の会合を含む抗原結合タンパク質は、適切なアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡやＲＩＡ、により培養物からスクリーニングされる。同様の通常の技術を採用して、他の抗原結合タンパク質を構築することが可能である。
本方法で採用されたクローニングおよびサブクローニングステップのための適切なベクター、および、本発明の組成物の作成は、当業者により選択され得る。例えば、通常のクローニングベクターのｐＵＣシリーズを使用可能である。１つのベクター、ｐＵＣ１９、は市販品で、Ａｍｅｒｓｈａｍ（バッキンガムシャー州、英国）またはＰｈａｒｍａｃｉａ（ウプサラ、スウェーデン）、等の卸売業者から入手可能である。さらに、容易に複製可能で、多くのクローニング部位および選択可能な遺伝子（例えば、抗生物質耐性）を有し、容易に操作可能である任意のベクターが、クローニングの目的に使用可能である。したがって、クローニングベクターの選択は本発明における制約因子ではない。
また、発現ベクターを、異種のＤＮＡ塩基配列、例えば哺乳動物のジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ＤＨＦＲ）の発現を増幅するのに適した遺伝子により特徴づけることができる。他のベクター配列には、ポリＡシグナル配列、例えば、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）由来の配列、およびβ‐グロビンプロモータ配列（ｂｅｔａｇｌｏｐｒｏ）が含まれる。本明細書で使える発現ベクターは、当業者にはよく知られた技術により合成してもよい。
このようなベクターの構成要素、例えば、レプリコン、選択遺伝子、エンハンサー、プロモータ、シグナル配列等は市販または天然の入手源から入手してもよく、また、選択宿主中の組換えＤＮＡの生成物の発現および／または分泌の誘導に使用される既知手順により合成してもよい。哺乳動物、細菌、昆虫、酵母および真菌の発現に関して当業界で既知の多くのタイプの他の適切な発現ベクターもこの目的に選択してもよい。
また本発明は、本発明の抗原結合タンパク質のコード配列を含む組換えプラスミドを形質移入された細胞株を包含する。これらクローニングベクターのクローニングと他の操作に有用な宿主細胞もまた、従来からあるものである。しかし、種々の大腸菌株由来の細胞は、本発明の抗原結合タンパク質の構築におけるクローニングベクターや他のステップの複製に使うことができる。
本発明の抗原結合タンパク質の発現のための適切な宿主細胞または細胞株には、哺乳動物細胞、例えば、ＮＳ０、Ｓｐ２／０、ＣＨＯ（例えば、ＤＧ４４）、ＣＯＳ、ＨＥＫ、繊維芽細胞（例えば、３Ｔ３）、および骨髄腫細胞が含まれる。例えば、これはＣＨＯまたは骨髄腫細胞中で発現させてもよい。ヒト細胞を使って、分子をヒトグリコシル化パターンで修飾させてもよい。あるいは、他の真核細胞株を採用してもよい。適切な哺乳動物宿主細胞の選択、ならびに形質転換、培養、増幅、スクリーニングと生成物産生および精製の方法は、当業者には既知である。例えば、前述のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌを参照。
細菌細胞は、組換えＦａｂの発現のため、または本発明の他の実施形態のために適切な宿主細胞として有用であり得る（例えば、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ， Ａ., Ｉｍｍｕｎｏｌ. Ｒｅｖ., １３０：１５１−１８８ （１９９２）参照）。しかし、細菌細胞で発現したタンパク質は、折り畳まれていないまたは不適切に折り畳まれた形式または非グリコシル化形式になる傾向があるため、細菌細胞中で産生されたいずれの組換えＦａｂも抗原結合能力の保持の観点でスクリーニングしなければならなくなる。細菌細胞で発現された分子が正しく折り畳まれた形式で産生された場合は、その細菌細胞は望ましい宿主となるだろう。あるいは、別の実施形態で、分子が細菌宿主中で発現され、その後再折畳みが可能である。例えば、発現に使われる種々の大腸菌株は、バイオテクノロジーの分野で宿主細胞としてよく知られている。種々の枯草菌、ストレプトマイセス属、他の桿菌等の株もまたこの方法に採用できる。
所望の場合は、当業者に既知の酵母細胞株もまた、昆虫細胞、例えば、ショウジョウバエと鱗翅類、およびウイルス発現システムと同様に、宿主細胞として入手可能である。例えば、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ., Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ, ８：２７７−２９８, Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ （１９８６）、および本明細書に引用の文献を参照のこと。
ベクターが作成される一般的な方法、本発明の宿主細胞を産生するために必要な形質移入方法、およびこのような宿主細胞から本発明の抗原結合タンパク質を産生するために必要な培養方法は全て従来からの技術であってもよい。典型的には、本発明の培養方法は無血清培養方法で、通常、細胞を無血清懸濁液中で培養する。同様に、本発明の抗原結合タンパク質を一度産生した後、細胞培養内容物から本発明の抗原結合タンパク質を、当分野の標準的手法、例えば、硫安塩析法、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフイー、ゲル電気泳動法等により精製してもよい。このような技術は、当該分野の技術の範囲内にあり本発明を制限するものではない。例えば、改変抗体の調製に関しては、ＷＯ ９９／５８６７９ および ＷＯ ９６／１６９９０に記載されている。
抗原結合タンパク質のさらに別の発現法では、遺伝子組み換え動物中での発現を使用してもよい。この例は、Ｕ.Ｓ. Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ.４，８７３，３１６に記載されている。これは、動物カゼインプロモータを使った発現システムであり、このプロモータは、遺伝子導入で哺乳動物に取り込んだ場合、雌のミルク中に所望の組換えタンパク質を産生させる。
本発明のさらなる態様では、本発明の抗体を産生する方法を提供し、この方法は本発明の抗体の軽鎖および／または重鎖をコードしたベクターで形質転換または形質移入した宿主細胞を培養し、これにより産生された抗体を回収するステップを含む。
本発明に従って、本発明の抗原結合タンパク質を産生する方法が提供され、この方法は、
（ａ）抗原結合タンパク質をコードしたポリヌクレオチドを含むベクターを提供するステップ；
（ｂ）哺乳動物宿主細胞（例えば、ＣＨＯ）を前記ベクターで形質転換するステップ；
（ｃ）抗原結合タンパク質を前記宿主細胞から前記培地へ分泌を促す条件下で、ステップ（ｂ）の宿主細胞を培養するステップ；
（ｄ）分泌されたステップ（ｃ）の抗原結合タンパク質を回収するステップ、
を含む。
本発明に従って、本発明の抗原結合タンパク質を産生する方法が提供され、この方法は、
（ａ）抗原結合タンパク質の重鎖をコードした第１のベクターを提供するステップ；
（ｂ）抗原結合タンパク質の軽鎖をコードした第２のベクターを提供するステップ；
（ｃ）哺乳動物宿主細胞（例えば、ＣＨＯ）を前記第１と第２のベクターで形質転換するステップ；
（ｄ）抗原結合タンパク質を前記宿主細胞から前記培地へ分泌を促す条件下で、ステップ（ｃ）の宿主細胞を培養するステップ；
（ｅ）分泌されたステップ（ｄ）の抗原結合性構築物を回収するステップ、
を含む。
所望の方法で発現された後、抗原結合タンパク質のインビトロ活性を適切なアッセイにより調査する。現在よく使われるＥＬＩＳＡアッセイ方式を採用し、標的に対する抗原結合タンパク質の定性および定量評価を行う。さらに、他のインビトロアッセイを使って、通常のクリアランス機序にも拘らず体の中に残留している抗原結合タンパク質を評価するために実施されるヒトの臨床試験の前に中和性能を確認してもよい。
治療の用量と持続時間は、ヒトの循環系における本発明の分子の相対的持続時間に関係しており、治療条件と患者の全体的健康状態に基づいて当業者により調節可能である。最大の治療効果を得るためには、長期間にわたる（例えば、４〜６ヶ月間）反復投薬（例えば、週一回または２週間に一回）が必要となる場合があることが想定される。
本発明の治療薬の投与方法は、宿主の眼に薬剤を送達する任意の適切な経路であってよい。有効量の抗原結合タンパク質および本発明の医薬品組成物を、受動的投与、例えば静脈内または皮下投与により送達するには、全身投与は十分であり得る。本発明の抗原結合タンパク質および医薬品組成物は、局所的適用、例えば点眼薬または点眼用ゲル、硝子体内注射、眼房内または眼周囲投与を介して、すなわち眼球後、眼球周囲、腱下または結膜下注射により、あるいは下、上または外側直筋への送達により強膜下に、より局所的に眼に送達され得る。局所投与の他の経路は、低用量でより容易に、本発明の抗原結合タンパク質および医薬品組成物を眼の後部セグメントに到達させ得る。局所適用は、ウサギモデルの眼の後部への抗体断片の浸透を可能にするために記載されている（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＫＡ ｅｔ ａｌ.， （２００５））。抗体断片または完全モノクローナル抗体の硝子体内注射が記載されており、製品ラニビズマブおよびベバシズマブに対してＡＭＤ患者に良好に耐容される。
一実施形態では、ＴＮＦアンタゴニストおよびＶＥＧＦアンタゴニストはともに、硝子体内に投与される。一実施形態では、ＶＥＧＦアンタゴニストは硝子体内に投与され、そしてＴＮＦアンタゴニスト、特にＥＳＢＡ１０５は、局所的以外により、例えばこれもまた硝子体内に、または結膜下に、投与される。一実施形態では、ＴＮＦアンタゴニストは硝子体内に投与され、ＶＥＧＦアンタゴニストは局所的に投与される。
眼の特定領域に、例えば眼の表面に、もしくは涙管または涙腺に、抗原結合タンパク質の送達を標的化することは有用であり得るし、あるいは眼内送達、例えば前または後眼房への、例えば硝子体液への、ならびに眼構造、例えば虹彩、毛様体、涙腺への送達も存在する。それゆえ、本発明はさらに、眼に組成物を直接送達する方法であって、以下の：眼内注射、局所送達（例えば点眼薬）、眼周囲投与、緩徐送達処方物の使用から選択される方法により、眼に上記組成物を投与することを包含する方法を提供する。
例えば、局所送達により（例えば点眼薬として）、抗原結合タンパク質が、眼浸透増強剤、例えばカプリン酸ナトリウムとともに眼に送達されるか、あるいは粘性増強剤、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）とともに送達される場合も有用であり得る。したがって、本発明はさらに、例えば眼への局所送達のために、（ａ）本発明の抗原結合タンパク質を、そして（ｂ）眼浸透増強剤および／または（ｃ）粘性増強剤も含む組成物を提供する。
本発明の抗原結合タンパク質および医薬品組成物の送達は、硝子体内インプラントによっても投与され得る。眼球後および眼球周囲注射は、特殊な２３〜２６ゲージ針で達成され得るし、硝子体内注射より低侵襲性である。腱下注射は、組成物をより長い期間、強膜と接触させて、これにより眼後部に浸透し易くなる。結膜の真下へのタンパク質の注射はウサギモデルで記載されており、これにより分子は強膜全体により直接的に拡散して、眼の後部セグメントに達する。
徐放性薬剤送達系も用いられ、これは、眼の中または周囲に、より長い時間に亘って物質を放出させ、したがって、投与頻度を少なくし得る。このような系としては、治療用組成物を充填されるかまたはそれで被覆され得るミセル、ゲル、ヒドロゲル、ナノ粒子、マイクロ粒子またはインプラントが挙げられる。これらは、注射により、またはその他の前に記載された低侵襲性経路のいずれかにより、すなわち、眼周囲または強膜下経路により、眼の硝子体に送達され得る。このような徐放性系および局所送達経路の例としては、後も旨くおよびＲＰＥ層に標的化されるナノ粒子ベースの処方物の強膜した投与または硝子体内投与のための感熱性緩徐放出ヒドロゲルが挙げられる（Ｊａｎｏｉｒａ ＫＧ, ｅｔ ａｌ., （２００７）；Ｂｉｒｃｈ ＤＧ （２００７））。送達系および局所投与経路の多数の他の組合せが可能であり、本発明の抗原結合タンパク質の組成物、および医薬品組成物に関して考察され得る。
特定の一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、硝子体内注射により硝子体に投与される。特定の一実施形態では、本発明の抗原タンパク質、特に二重標的化構築物は、４〜８週間毎に、好ましくは６〜８週間毎に、硝子体内投与される。特定の一実施形態では、抗原結合タンパク質は、結膜下注射により投与される。特定の一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、局所的に投与される。別の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、徐放性薬剤送達系により投与される。特定の一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、静脈内注射により投与される。特定の一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、皮下注射により投与される。
本発明の特定の一実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＤＭＳ４０００、あるいは配列番号６９、７０、７１または７２の重鎖配列および配列番号１２の軽鎖配列からなる抗原結合タンパク質であり、これは４〜８週間後との硝子体内注射により投与されるべきである。
本発明の治療薬は、本発明の有効量の本発明の抗原結合タンパク質を製薬上許容可能な担体中の有効成分として含む医薬品組成物として調製されてもよい。本発明の予防薬としでは、抗原結合タンパク質を含む水性懸濁液または水溶液が、注射の準備ができた形で、生理的ｐＨに緩衝され得る。非経口投与用組成物は、通常、本発明の抗原結合タンパク質の溶液、または製薬上許容可能な担体、好ましくは水性担体、に溶解したその混合溶液を含む。種々の水性担体、例えば、０．９％食塩水、０．３％グリシン等を用いてもよい。これらの溶液は、無菌状態で、通常、粒子状物質の無い状態にされる。これらの溶液は、通常のよく知られた滅菌技術（例えば、濾過）により無菌にされる。組成物は、適切な生理学的条件に必要とされるｐＨ調節剤および緩衝剤等のような製薬上許容可能な補助物質を含んでもよい。このような製剤処方物中の本発明の抗原結合タンパク質の濃度は様々であってよく、すなわち、重量％で約０．５％未満、通常、約１％または少なくとも約１％から１５〜２０％までになり、また選択された具体的な投与方法に従って主に流体容量、粘性、等に基づいて選択される。
従って、本発明の筋肉内注射用医薬品組成物は、１ｍＬの無菌緩衝水、および約１ｎｇ〜約２００ｍｇ、例えば、約５０ｎｇ〜約３０ｍｇまたはそれ以上、または約５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明の抗原結合タンパク質を含むように調製され得る。同様に、本発明の点滴静注用医薬品組成物は、約２５０ｍｌの無菌リンゲル液、および約１〜約３０ｍｇ、または約５ｍｇ〜約２５ｍｇのリンゲル液１ｍｌ当たりの本発明の抗原結合タンパク質を含むように調製され得る。非経口投与組成物を調製する実際の方法は既知で、当業者には明らかであり、詳細は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ, １５ｔｈ ｅｄ., Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ, イーストン、ペンシルベニア州、に記載されている。本発明の静脈内投与可能な抗原結合タンパク質製剤の調製については、Ｌａｓｍａｒ Ｕ ａｎｄ Ｐａｒｋｉｎｓ Ｄ “Ｔｈｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ”, Ｐｈａｒｍａ． Ｓｃｉ. Ｔｅｃｈ. ｔｏｄａｙ, ｐａｇｅ １２９−１３７, Ｖｏｌ.３ （３ｒｄ Ａｐｒｉｌ ２０００）；Ｗａｎｇ, Ｗ “Ｉｎｓｔａｂility, ｓｔａｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｑｕｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ”, Ｉｎｔ. Ｊ. Ｐｈａｒｍ １８５ （１９９９） １２９−１８８； Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｐａｒｔ Ａ ａｎｄ Ｂ ｅｄ Ａｈｅｒｎ Ｔ.Ｊ., Ｍａｎｎｉｎｇ Ｍ. Ｃ., Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ, ＮＹ： Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ （１９９２）；Ａｋｅｒｓ, Ｍ. Ｊ.“Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ−Ｄｒｕｇ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”, Ｊ. Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９１ （２００２） ２２８３−２３００；Ｉｍａｍｕｒａ, Ｋ ｅｔ ａｌ “Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｓｕｇａｒ ｏｎ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｄｒｉｅｄ ｓｔａｔｅ”, Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９２ （２００３） ２６６−２７４；Ｉｚｕｔｓｕ, Ｋｋｏｊｉｍａ, Ｓ.“Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ ｄｕｒｉｎｇ ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ”, Ｊ Ｐｈａｒｍ. Ｐｈａｒｍａｃｏｌ, ５４ （２００２） １０３３−１０３９；Ｊｏｈｎｓｏｎ, Ｒ, “Ｍａｎｎｉｔｏｌ−ｓｕｃｒｏｓｅ ｍｉｘｔｕｒｅｓ−ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ”, Ｊ. Ｐｈａｒｍ. Ｓｃｉ， ９１ （２００２） ９１４−９２２；Ｈａ, Ｅ Ｗａｎｇ Ｗ, Ｗａｎｇ Ｙ. ｊ. “Ｐｅｒｏｘｉｄｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ”, Ｊ. Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ, ９１, ２２５２−２２６４,（２００２）、を参照のこと。この全内容は参照により本明細書に組み込まれ、具体的に参照される。
一実施形態では、医薬品として用いる場合、本発明の治療薬はユニット剤形として存在する。適切な治療有効量は当業者には容易に決定可能である。適切な用量は患者の体重により計算され、例えば、０．００００１〜２０ｍｇ／ｋｇ、例えば０．０００１〜２０ｍｇ／ｋｇ、例えば０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、例えば１〜２０ｍｇ／ｋｇまたは例えば１〜１５ｍｇ／ｋｇ、例えば１０〜１５ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。本発明を使用してヒトを有効に治療する条件は、適切な用量が０．０００１〜１０００ｍｇ、例えば０．００１〜１０００ｍｇ、例えば０．０１〜５００ｍｇ、例えば５００ｍｇ、例えば０．１〜１００ｍｇ、または０．１〜８０ｍｇ、または０．１〜６０ｍｇ、または０．１〜４０ｍｇ、または例えば１〜１００ｍｇ、または１〜５０ｍｇの範囲内の本発明の抗原結合タンパク質であってもよく、これらは非経口、例えば、皮下、静脈内、または筋肉内に、あるいは局所的に投与できる。このような用量は必要なら、医師により選択された適切な時間間隔で反復してもよい。
治療薬が、例えば硝子体内注射により、眼に直接的に投与されるべきものである場合、投与量は、各ヒトの眼に投与されるタンパク質の総量が２ｍを超えないようであるべきであるのが好ましい。一実施形態では、単一のヒト眼に投与されるタンパク質の総量は、約２ｍｇである。一実施形態では、単一のヒト眼に投与されるタンパク質の総量は、約１．８ｍｇである。一実施形態では、単一のヒト眼に投与されるタンパク質の総量は、約１．６ｍｇである。一実施形態では、単一のヒト眼に投与されるタンパク質の総量は、約１．４ｍｇである。一実施形態では、単一のヒト眼に投与されるタンパク質の総量は、約１．２ｍｇである。一実施形態では、単一のヒト眼に投与されるタンパク質の総量は、約１．０ｍｇである。一実施形態では、単一のヒト眼に投与されるタンパク質の総量は、約２．０ｍｇ未満、１．８ｍｇ未満、１．６ｍｇ未満、１．４ｍｇ未満、１．２ｍｇ未満または１．０ｍｇ未満である。
本明細書記載の抗原結合タンパク質は、貯蔵用に冷凍乾燥が可能で、使用に先立ち適切な担体中で再構成できる。この技術は、通常の免疫グロブリンで有効であることが示されており、既知技術の凍結乾燥と再構成技術を用いることができる。
当技術分野で既知のいくつかの方法を使って本発明に使われるエピトープ結合ドメインを見つけることが可能である。
用語「ライブラリ」は、異種のポリペプチドまたは核酸の混合物を指す。ライブラリは、それぞれ単一ポリペプチドまたは核酸配列を有するメンバーからなる。この点で、「ライブラリ」は「レパートリー」と同義である。ライブラリメンバー間の配列の差異は、ライブラリ中に存在する多様性の原因である。ライブラリはポリペプチドまたは核酸の単純な混合物の形を取ってもよく、また、核酸のライブラリで形質転換された生命体または細胞の形、例えば、細菌、ウイルス、動物、または植物等の形であってもよい。一実施例では、各々個々の生命体または細胞は１つのみまたは限られた数のライブラリメンバーを含む。核酸によってコードされたポリペプチドを発現させるためには、核酸が発現ベクターの中に組み込まれるのが好ましい。従って一態様では、ライブラリは宿主生物の集合体の形を取ることができ、各生命体は、対応するポリペプチドメンバーを産生するように発現可能な核酸形式で単一ライブラリメンバーを含む発現ベクターのコピーを１つまたは複数を含んでもよい。従って、この宿主生物の集合体は多様なポリペプチドの大きなレパートリーをコードする可能性を有している。
「ユニバーサルフレームワーク」は、Ｋａｂａｔの定義（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”, 米国保健社会福祉省）の配列中に保存された抗体領域に対応する単一抗体フレームワーク配列、またはＣｈｏｔｈｉａとＬｅｓｋの定義（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ, （１９８７） Ｊ. Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ. １９６：９１０−９１７）によるヒト生殖細胞系列免疫グロブリンレパートリーまたは構造に対応する単一抗体フレームワーク配列である。これは、単一フレームワークでも、これらのフレームワークの一組であってもよく、たとえ高頻度可変領域のみの変異であっても、実質的にあらゆる結合特異性の誘導も許容することが認められてきた。
本明細書で定義された、アミノ酸およびヌクレオチド配列の整合性と相同性、類似性または同一性は、一実施形態では、デフォルトのパラメーターを使ってＢＬＡＳＴ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅアルゴリズムにより調製および測定される(Ｔａｔｕｓｏｖａ, Ｔ. Ａ. ｅｔ ａｌ., ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ, １７４：１８７−１８８ （１９９９）)。
ディスプレイシステム（例えば、核酸のコード化機能、および、核酸によりコードされたペプチドまたはポリペプチドの機能特性とリンクしたディスプレイシステム）が、本明細書記載の方法で、例えば、ｄＡｂまたは他のエピトープ結合ドメインの選択において使われた場合、選択されたペプチドまたはポリペプチドをコードした核酸のコピー数を増幅または増大することは、好都合なことが多い。これは、本明細書記載の方法や他の適切な方法を使って追加のラウンドのため、あるいは、追加のレパートリー（例えば、親和性成熟レパートリー）を調製するために、十分な量の核酸および／またはペプチドまたはポリペプチドを得る効率的な手段を提供する。従って、一部の実施形態では、エピトープ結合ドメイン選択方法は、ディスプレイシステム（例えば、ファージディスプレイのような、核酸のコーディング機能および核酸によりコードされたペプチドまたはポリペプチドの機能特性とリンクしたディスプレイ）の使用を含み、選択されたペプチドまたはポリペプチドをコードした核酸のコピー数を増幅または増大するステップをさらに含む。核酸は、任意の適切な方法、例えば、ファージ増幅、細胞増殖またはポリメラーゼ連鎖反応、を使って増幅可能である。
一実施例では、この方法は核酸のコーディング機能、および核酸によりコードされたポリペプチドの物理的、化学的および／または機能的特性にリンクしたディスプレイシステムを用いる。このようなディスプレイシステムは、複数の複写可能な遺伝子パッケージ（ｇｅｎｅｔｉｃ ｐａｃｋａｇｅ）、例えば、バクテリオファージまたは細胞（細菌）を含むことができる。ディスプレイシステムは、ライブラリ、例えば、バクテリオファージディスプレイライブラリを含んでもよい。バクテリオファージディスプレイはディスプレイシステムの一例である。
多くの適切なバクテリオファージディスプレイシステム（例えば、一価のディスプレイおよび多価のディスプレイシステム）が記載されている（例えばＧｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ., Ｕ.Ｓ. Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ. ６，５５５，３１３ Ｂ１（参照により本明細書に組み込まれる）；Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ., Ｕ.Ｓ. Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ. ５，７３３，７４３ （参照により本明細書に組み込まれる）； ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ., Ｕ.Ｓ. Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ. ５，９６９，１０８（参照により本明細書に組み込まれる）； Ｍｕｌｌｉｇａｎ−Ｋｅｈｏｅ, Ｕ.Ｓ. Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ. ５，７０２，８９２ （参照により本明細書に組み込まれる）； Ｗｉｎｔｅｒ, Ｇ. ｅｔ ａｌ., Ａｎｎｕ. Ｒｅｖ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. １２：４３３−４５５ （１９９４）； Ｓｏｕｍｉｌｌｉｏｎ, Ｐ. ｅｔ ａｌ., Ａｐｐｌ. Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. ４７（２−３）：１７５−１８９ （１９９４）； Ｃａｓｔａｇｎｏｌｉ, Ｌ. ｅｔ ａｌ., Ｃｏｍｂ. Ｃｈｅｍ. Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ, ４（２）：１２１−１３３ （２００１）参照)。バクテリオファージディスプレイシステムで表示されるペプチドまたはポリペプチドは、あらゆる適切なバクテリオファージ、例えば、線状ファージ（例えば、ｆｄ、Ｍ１３、Ｆ１）、溶菌ファージ（例えば、Ｔ４、Ｔ７、ラムダ）、またはＲＮＡファージ（例えば、ＭＳ２）、上でも表示可能である。
通常、適切なファージコートタンパク質（例えば、ｆｄ ｐＩＩＩタンパク質）との融合タンパク質としてペプチドまたはファージポリポリペプチドのレパートリーを表示するファージライブラリが作成または提供される。融合タンパク質は、ペプチドまたはポリペプチドファージコートタンパク質の先端、または所望なら内部位置にペプチドまたはポリペプチドを表示できる。例えば、表示されたペプチドまたはポリペプチドは、ｐＩＩＩのドメイン１に対してアミノ末端である位置に存在可能である（ｐＩＩＩのドメイン１はＮ１とも呼ばれる）。表示されたポリペプチドは、直接ｐＩＩＩに（例えば、ｐＩＩＩのドメイン１のＮ末端）またはリンカーを使ってｐＩＩＩに融合可能である。所望なら、融合体はタグ（例えば、ｍｙｃエピトープ、Ｈｉｓタグ）をさらに含むこともできる。ファージコートタンパク質との融合タンパク質として表示されたペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを含むライブラリは、任意の適切な方法を用いて制作可能である。例えば、表示されたペプチドまたはポリペプチドをコードしたファージベクターライブラリやファージミドベクターを、適切な宿主細菌中に導入し、その結果得られた細菌を培養して（例えば、適切なヘルパーファージを使って、または必要ならプラスミドを補完して）ファージを産生する。ファージライブラリは、任意の適切な方法、例えば、沈降法および遠心分離法、により培養物から回収可能である。
ディスプレイシステムは任意の多様な所望量を含むペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを含むこともできる。例えば、このレパートリーは生命体、生命体のグループ、所望組織または所望細胞型により発現された自然発生のポリペプチドに対応するアミノ酸配列のペプチドまたはポリペプチドを含むことも、または、ランダムなアミノ酸配列またはランダム化されたアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドを含むこともできる。希望するなら、このポリペプチドは、共通のコアまたは足場を共有することができる。例えば、レパートリーまたはライブラリ中の全ポリペプチドが、プロテインＡ、プロテインＬ、プロテインＧ、フィブロネクチンドメイン、アンチカリン、ＣＴＬＡ４、所望の酵素（例えば、ポリメラーゼ、セルラーゼ）、または免疫グロブリンスーパーファミリー由来のポリペプチド、例えば、抗体または抗体断片（例えば、抗体可変ドメイン）から選択された足場をベースにすることも可能である。このようなレパートリーやライブラリ中のポリペプチドは、ランダムなアミノ酸配列またはランダム化されたアミノ酸配列の規定領域および共通アミノ酸配列の領域を含むことができる。特定の実施形態では、レパートリー中の全てまたは実質的に全てのポリペプチドが所望のタイプ、例えば、所望の酵素（例えば、ポリメラーゼ）または所望の抗体の抗原結合性断片（例えば、ヒトＶＨまたはヒトＶＬ）、である。一部の実施形態では、ポリペプチドディスプレイシステムはポリペプチドのレパートリーを含み、その中の各ポリペプチドは抗体可変ドメインを含む。例えば、レパートリー中の各ポリペプチドはＶＨ、ＶＬまたはＦｖ（例えば、単鎖Ｆｖ）を含んでもよい。
アミノ酸配列の多様性を、任意の適切な方法を使って、ペプチドまたはポリペプチドまたは足場の任意の所望の領域に導入可能である。例えば、アミノ酸配列の多様性は、任意の適切な変異誘発性（例えば、低忠実性ＰＣＲ、オリゴヌクレオチド媒介または部位特異的変異、ＮＮＫコドンを使った多様化）または任意の他の適切な方法を使って、多様化ポリペプチドをコードした核酸ライブラリを調製することにより、標的部位、例えば抗体可変ドメインの相補性決定領域または疎水性ドメインに導入可能である。所望なら、多様化すべきポリペプチドの領域をランダム化できる。レパートリーを構成するポリペプチドのサイズは、概して選択可能であり、均一なポリペプチドサイズは必要ではない。レパートリー中のポリペプチドは、少なくとも三次構造を有する（少なくとも１つのドメインを形成する）ことができる。
選択／単離／回収
エピトープ結合ドメインまたはドメインの集合体は、適切な方法を使って、レパートリーまたはライブラリ（例えば、ディスプレイシステム中の）から選択、単離、および／または回収可能である。例えば、ドメインは選択可能な特性（例えば、物理的特性、化学的特性、機能特性）に基づいて選択または単離される。適切な選択可能な特性には、レパートリー中のペプチドまたはポリペプチドの生物活性、例えば、一般的リガンド（例えば、スーパー抗原）に対する結合性、標的リガンド（例えば、抗原、エピトープ、基質）に対する結合性、抗体に対する結合性（例えば、ペプチドまたはポリペプチド上に発現したエピトープ経由）、および触媒能力が含まれる（例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ., ＷＯ ９９／２０７４９； ＷＯ ０１／５７０６５； ＷＯ ９９／５８６５５参照）。
一部の実施形態では、実質的に全てのドメインが共通の選択可能特性を共有するペプチドまたはポリペプチドのライブラリまたはレパートリーから、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドが選択および／または単離される。例えば、ドメインは、実質的に全てのドメインに共通の一般的リガンドに結合するライブラリまたはレパートリー、共通の標的リガンドに結合するライブラリまたはレパートリー、共通の抗体に結合する（またはそれによって結合される）ライブラリまたはレパートリー、または共通の触媒能力を有するライブラリまたはレパートリーから選択することができる。このタイプの選択は、所望の生物活性を有する親ペプチドまたはポリペプチドに基づいたドメインのレパートリーを調製する際、例えば免疫グロブリン単一可変ドメインの親和性成熟を行う場合、特に有用である。共通の一般的リガンドへの結合性に基づいた選択では、元のライブラリまたはレパートリーの要素である全てまたは実質的に全てのドメイを含むドメインのコレクションまたは集合体が得られる。例えば、標的リガンドまたは一般的リガンドに結合しているドメイン、例えばプロテインＡ、プロテインＬまたは抗体は、パニングまたは適切な親和性マトリックスを使って選択、単離、および／または回収できる。パニングは、リガンド（例えば、一般的リガンド、標的リガンド）の溶液を適切な容器（例えば、チューブ、ペトリ皿）に加え、リガンドを容器の壁表面上に沈着または被覆させることにより達成できる。過剰リガンドを洗い流し、ドメインを容器に加え、この容器をペプチドまたはポリペプチドが固定化されたリガンドと結合するのに適した条件下で維持する。非結合ドメインは、洗い流され、結合ドメインは、任意の適切な方法、例えば、削り取りやｐＨを下げることによって回収できる。適切なリガンド親和性マトリックスは、通常、固体支持体またはビーズ（例えば、アガロース）を含み、これにリガンドを共有結合的または非共有結合的に連結させる。親和性マトリックスは、ドメインがマトリックス上のリガンドに結合するための適切な条件下、バッチプロセス、カラムプロセスまたは任意の他の適切なプロセスを使って、ペプチドまたはポリペプチド（例えば、プロテアーゼとインキュベートされたレパートリー）と結合させることができる。親和性マトリックスと結合しないドメインは洗い流し、結合したドメインは、低ｐＨバッファー、マイルドな変性剤（例えば、尿素）、またはリガンドとの結合で競合するペプチドまたはドメインで溶出等の任意の適切な方法で溶出し、回収できる。一実施例では、ビオチン化した標的リガンドは、レパートリー中のドメインが標的リガンドに結合するための適切な条件下、レパートリーと結合する。結合ドメインは、固定化されたアビジンストレプトアビジン（例えば、ビーズ上の）を使って回収される。
一部の実施形態では、一般的または標的リガンドは、抗体またはその抗体の抗原結合性断片である。ライブラリまたはレパートリーのペプチドまたはポリペプチド中で実質的に保存されたペプチドまたはポリペプチドの構造的特徴と結合する抗体または抗原結合断片は、特に一般的リガンドとして有用である。プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドの単離、選択および／または回収のためのリガンドとしての使用に適した抗体と抗原結合性断片は、モノクローナルまたはポリクローナルであってもよく、任意の適切な方法で調製できる。
ライブラリ／レパートリー
エピトープ結合ドメインをコードしおよび／または含むライブラリは、任意の適切な方法を使って調製または入手可能である。ライブラリは、目的のドメインまたは足場（例えば、ライブラリから選択されたドメイン）に基づいてドメインをコードするように設計することも、本明細書記載の方法を使って別のライブラリから選択することも可能である。例えば、ドメインが豊富なライブラリは、適切なポリペプチドディスプレイシステムを使って調製可能である。
所望のタイプのドメインのレパートリーをコードしたライブラリは、任意の適切な方法を使って容易に作成可能である。例えば、所望のタイプのポリペプチド（例えば、免疫グロブリン可変ドメイン）をコードした核酸配列を得ることができ、例えば、エラープローンポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）システムを使ってまたは化学的変異誘発により(Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ., Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ., ２６９：９５３３ （１９９４）) 、または細菌の突然変異誘発株を使って（Ｌｏｗ ｅｔ ａｌ., Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ., ２６０：３５９ （１９９６）) 核酸を増幅することにより、それぞれが１つまたは複数の変異を含む核酸のコレクションが調整可能である。
他の実施形態では、核酸の特定の領域を多様化の標的にすることができる。選択位置を変異させる方法も当業者にはよく知られており、これには、例えば、ＰＣＲを使ってまたは使わないで、ミスマッチなオリゴヌクレオチドまたは変性オリゴヌクレオチドを使用する場合が含まれる。例えば、合成抗体ライブラリは、抗原結合ループに対する変異を標的にして作られている。ランダム化または半ランダム化抗体Ｈ３およびＬ３領域を、生殖細胞系列免疫グロブリンＶ遺伝子セグメントに付加して、非変異フレームワーク領域を有する大ライブラリが構築されている（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ （１９９２） ｓｕｐｒａ； Ｎｉｓｓｉｍ ｅｔ ａｌ. （１９９４） ｓｕｐｒａ； Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ. （１９９４） ｓｕｐｒａ； ＤｅＫｒｕｉｆ ｅｔ ａｌ. （１９９５） ｓｕｐｒａ）。このような多様化は、他の抗原結合ループを一部または全て含むまでに拡張されている（Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ. （１９９６） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ., ２：１００； Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ. （１９９５） Ｂｉｏ＼Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ, １３：４７５； Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ, ＷＯ ９７／０８３２０、上記）。他の実施形態では、核酸の特定の領域を多様化の標的にでき、例えば、２段階ＰＣＲ戦略では１回目のＰＣＲ生成物を「メガプライマー」として用いる(例えば、Ｌａｎｄｔ, Ｏ. ｅｔ ａｌ., Ｇｅｎｅ ９６：１２５−１２８ （１９９０）参照)。標的の多様化は、例えば、ＳＯＥ ＰＣＲを使っても達成できる(例えば、Ｈｏｒｔｏｎ, Ｒ.Ｍ. ｅｔ ａｌ., Ｇｅｎｅ ７７：６１−６８ （１９８９） 参照) 。
選択位置での配列多様性は、ポリペプチドの配列を特定するコード配列を変え、多くのアミノ酸（例えば２０全部またはそのサブセット）をその位置に組み込むことにより得ることができる。ＩＵＰＡＣ命名法を使って説明すると、最も用途の広いコドンはＮＮＫであり、これはＴＡＧ停止コドン並びに全アミノ酸をコードする。ＮＮＫコドンは、必要な多様性を導入するために使用可能である。同じ目的を有する他のコドン例えばＮＮＮも使用でき、これは追加の停止コドンＴＧＡとＴＡＡを作成する。このような標的化手法は、標的領域中の全配列空間を調査対象にすることができる。
一部のライブラリは、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであるドメイン（例えば、抗体またはその一部）を含む。例えば、ライブラリは既知の主鎖構造を有するドメインを含むことができる（例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ.,ＷＯ９９／２０７４９参照）。
ライブラリは適切なプラスミドまたはベクター中で調製できる。本明細書で使われるベクターは、異種のＤＮＡを細胞の中に導入し、その発現および／または複製をするのに使われる個別要素を指す。任意の適切なベクターを使うことができ、これにはプラスミド（例えば、細菌性プラスミド）、ウイルスまたはバクテリオファージベクター、人工染色体、およびエピソームベクターが含まれる。このようなベクターは、単純クローニングおよび突然変異生成のために使うことができ、または、発現ベクターは、ライブラリの発現を促進するために使うことができる。ベクターおよびプラスミドは、通常１つまたは複数のクローニング部位（例えば、ポリリンカー）、複製開始点、および少なくとも１つの選択可能なマーカー遺伝子を含む。発現ベクターは、ポリペプチドの転写と翻訳を促進するエレメント、例えば、エンハンサー、プロモータ、転写終結信号、シグナル配列等をさらに含むことができる。これらのエレメントは、かかる発現ベクターが発現に適切な条件下で維持された場合（例えば、適切な宿主細胞中で）に、ポリペプチドが発現し、産生されるように、ポリペプチドをコードしたクローン化挿入断片に作動可能にリンクして配置することが可能である。
クローニングおよび発現ベクターは、通常、１つまたは複数の選択宿主細胞中でベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。典型的には、クローニングベクター中では、これは、ベクターが宿主染色体ＤＮＡとは独立に複製するのを可能にし、しかも複製開始点または自己複製配列を含む配列である。このような配列は、種々の細菌、酵母およびウイルスでよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製開始点は、大抵のグラム陰性細菌に対し適切で、２ミクロンプラスミド開始点は、酵母に適切であり、また種々のウイルス開始点（例えば、ＳＶ４０、アデノウイルス）は、哺乳動物細胞中のクローニングベクターに有用である。ＣＯＳ細胞のような高レベル複製が可能な哺乳動物細胞で使われるのでなければ、通常、複製開始点は哺乳類の発現ベクターには必要でない。
クローニングまたは発現ベクターは、選択可能マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含むことができる。このようなマーカー遺伝子は、選択培養培地中で成長した形質転換宿主細胞の生存または成長に必要なタンパク質をコードしている。従って、選択遺伝子を含むベクターで形質転換されなかった宿主細胞は、その培地中で生存しないことになる。典型的な選択遺伝子は、抗生物質と他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートまたはテトラサイクリンに耐性を付与し、栄養要求性欠如を補完し、または成長培地中で得られない重要な栄養素を補給するタンパク質をコードしている。
適切な発現ベクターは多くの要素を含むことができる。例えば、複製開始点、選択可能マーカー遺伝子、１つまたは複数の発現調節エレメント、例えば、転写調節エレメント（例えば、プロモータ、エンハンサー、ターミネーター）および／または１つまたは複数の翻訳信号、シグナル配列またはリーダー配列等を含むことができる。発現調節エレメントおよび信号またはリーダー配列は、もしそれが存在するならば、ベクターまたは他の供給源から供給を受けることができる。例えば、抗体鎖をコードしたクローン化核酸の転写および／または翻訳調節配列は、発現を指図するのに使用可能である。
プロモータは、所望の宿主細胞中での発現のために組み込んでもよい。プロモータは、構成的であっても誘導可能であってもよい。例えば、プロモータは、核酸の転写を命令できるように、抗体、抗体鎖またはその一部をコードした核酸に作動可能にリンクされてもよい。種々の適切な原核生物用プロモータ（例えば、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーターシステム、アルカリフォスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモータシステム、大腸菌用のｌａｃ、Ｔ３、Ｔ７プロモータ）および真核生物（例えば、シミアンウイルス４０初期または後期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列プロモータ、サイトメガロウイルスプロモータ、アデノウイルス後期プロモーター、ＥＧ−１ａプロモータ）宿主が入手可能である。
さらに、発現ベクターは、通常、ベクターを保持している宿主細胞の選択に用いる選択可能マーカーを含み、複製可能な発現ベクターの場合には、複製開始点を含む。抗生物質または薬剤耐性を付与する産物をコードした遺伝子は、共通の選択可能マーカーであり、原核生物（例えば、β−ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性）、テトラサイクリン耐性用Ｔｅｔ遺伝子）および真核細胞（例えば、ネオマイシン（Ｇ４１８またはジェネテシン）、ｇｐｔ（ミコフェノール酸）、アンピシリン、またはヒグロマイシン耐性遺伝子）で使用可能である。ジヒドロ葉還元酵素標識遺伝子は、種々の宿主中でメトトレキサートの選択を可能にする。宿主の栄養要求性マーカーの遺伝子産物をコードした遺伝子（例えば、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３）は、酵母中の選択可能マーカーとして使われることが多い。ウイルス（例えば、バキュロウイルス）またはファージベクター、および宿主細胞のゲノムに統合可能なベクター、例えば、レトロウイルスベクター、の使用もまた意図されている。
原核生物（例えば、大腸菌等の細菌細胞）または哺乳動物細胞中での発現に適切な発現ベクターには、例えば、ｐＥＴベクター（例えば、ｐＥＴ−１２ａ、ｐＥＴ−３６、ｐＥＴ−３７、ｐＥＴ−３９、ｐＥＴ−４０、Ｎｏｖａｇｅｎ他）、ファージベクター（例えば、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＲＩＴ２Ｔ（プロテインＡ融合ベクター、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＣＤＭ８、ｐＣＤＮＡ１．１／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＥＦ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ｐＣＭＶ−ＳＣＲＩＰＴ、ｐＦＢ、ｐＳＧ５、ｐＸＴ１ (Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ, Ｌａ Ｊｏｌｌａ, ＣＡ), ｐＣＤＥＦ３ （Ｇｏｌｄｍａｎ, Ｌ.Ａ., ｅｔ ａｌ., Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ, ２１：１０１３−１０１５ （１９９６）),ｐＳＶＳＰＯＲＴ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）、ｐＥＦ−Ｂｏｓ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ, Ｓ., ｅｔ ａｌ., Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ., １８：５３２２ （１９９０）） 等、が挙げられる。種々の発現宿主、例えば、原核細胞（大腸菌）、昆虫細胞（ショウジョウバエ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｓ２細胞、Ｓｆ９）、酵母（メチロトローフ酵母Ｐ.ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、メタノール資化酵母Ｐ.ｐａｓｔｏｒｉｓ、出芽酵母Ｓ.ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および哺乳動物細胞（例えば、コス細胞）での使用に適切な発現ベクターが入手可能である。
ベクターのいくつかの例は、ポリペプチドライブラリメンバーに対応するヌクレオチド配列の発現を可能とする発現ベクターである。従って、一般的および／または標的リガンドの選択は、ポリペプチドライブラリメンバーを発現する単一クローンの別々の増殖と発現により行われる。上述のように、具体的な選択ディスプレイシステムは、バクテリオファージディスプレイである。従って、ファージまたはファージミドベクターは使用可能である。例えば、ベクターは大腸菌複製開始点（二本鎖複製用）および、ファージ複製起点（一本鎖ＤＮＡの産生用）を有するファージミドベクターであってもよい。このようなベクターの操作および発現は、当業者にはよく知られている （Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ （１９９２） ｓｕｐｒａ； Ｎｉｓｓｉｍ ｅｔ ａｌ. （１９９４）、上記）。簡単に述べれば、ベクターは、ファージミドおよび発現カセット上流のラックプロモーターに選択性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子を含むことができる。この遺伝子は、適切なリーダー配列、多重クローニング部位、１つまたは複数のペプチドタグ、１つまたは複数のＴＡＧ停止コドンおよびファージタンパク質ｐＩＩＩを含むことができる。従って、ベクターは、大腸菌の種々の抑制因子および非抑制因子株を使って、また、グルコース、イソ−プロピルチオ−β−Ｄガラクトシド（ＩＰＴＧ）またはＶＣＳＭ１３等のヘルパーファージを添加して、発現のないプラスミドとして複製することができ、大量のポリペプチドライブラリメンバーのみ、または産物ファージ（この内の一部はポリペプチド−ｐＩＩＩ融合体で、その表面に少なくとも１つのコピーを含む）、を産生することができる。
抗体可変ドメインは、標的リガンド結合部位および／または一般的リガンド結合部位を含んでもよい。特定の実施形態では、一般的リガンド結合部位は、プロテインＡ、プロテインＬまたはプロテインＧ等のスーパー抗原のための結合部位である。可変ドメインは、任意の所望の可変ドメイン、例えば、ヒトＶＨ（例えば、ＶＨ１ａ、ＶＨ１ｂ、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、ＶＨ６）、ヒトＶλ（例えば、Ｖλｌ、Ｖλｌｌ、Ｖλｌｌｌ、ＶλｌＶ、ＶλＶ、ＶλＶＩまたはＶκ１）またはヒトＶＫ（例えば、Ｖκ２、Ｖκ３、Ｖκ４、Ｖκ５、Ｖκ６、Ｖκ７、Ｖκ８、Ｖκ９またはＶκ１０）に基づくものであってもよい。
またさらなる技術カテゴリーには、人工区分によるレパートリーの選択が含まれ、これは遺伝子とその遺伝子産物との結びつきを可能にする。例えば、所望の遺伝子産物をコードした核酸が油中水乳剤を使って形成されたマイクロカプセル中で選択できる選択システムが、ＷＯ９９／０２６７１, ＷＯ００／４０７１２ および Ｔａｗｆｉｋ ＆ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６（７）, ６５２−６に記載されている。所望の活性を有する遺伝子産物をコードした遺伝因子がマイクロカプセル中に区分けされ、次に、転写、および／または翻訳されてそれぞれの遺伝子産物（ＲＮＡまたはタンパク質）をマイクロカプセル内に産生する。引き続き、所望の活性を有する遺伝子産物を産生する遺伝因子が選別される。この手法によって、種々の方法で所望の活性を検出することにより目的の遺伝子産物を選択できる。
エピトープ結合ドメインの特徴づけ
ＥＬＩＳＡを含む当業者に周知の方法によって、特異的抗原又はエピトープへのドメインの結合を試験することができる。一例として、結合は、モノクローナルファージＥＬＩＳＡを用いて試験される。
ファージＥＬＩＳＡは、任意の適切な手順に従って行われ得る。例示的なプロトコルを以下に説明する。
各選別で産出したファージ集団は、「ポリクローナル」ファージ抗体を同定するため、選択した抗原又はエピトープへの結合についてＥＬＩＳＡによってスクリーニングすることができる。これら集団由来の単一の感染バクテリアコロニーからのファージを、「モノクローナル」ファージ抗体を同定するため、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングすることができる。抗原又はエピトープへの結合に関して可溶性抗体断片のスクリーニングもまた所望され、これもまた、例えばＣ−又はＮ−末端タグに対する試薬を用いてＥＬＩＳＡによって実施することができる（例えばＷｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １２、４３３〜５５及びそこで引用された文献を参照のこと）。
ＰＣＲ産物のゲル電気泳動（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．１９９１、上記；Ｎｉｓｓｉｍ ｅｔ ａｌ．１９９４、上記）、プロービング（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９９２ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７、７７６）又はベクターＤＮＡのシークエンスにより、選択したファージモノクローナル抗体の多様性を評価することができる。
ｄＡｂの構造
ｄＡｂが、本明細書に記載したファージディスプレイ技術に用いて選択したＶ遺伝子レパートリーから選択される場合には、これらの可変ドメインは普遍的なフレームワーク領域を含み、本明細書で定義したような特定の一般的リガンドによって認識されるようになる。普遍的なフレームワーク、一般的リガンドなどの使用については国際公開第９９／２０７４９に記載されている。
Ｖ遺伝子レパートリーが使用される場合には、ポリペプチド配列における多様性が可変ドメインの構造的ループ内に局在する場合もある。それぞれの可変ドメインとその相補対との相互作用を高めるために、ＤＮＡシャッフリング又は変異生成によって、各可変ドメインのポリペプチド配列を変化させてもよい。ＤＮＡシャッフリングは当業者に周知であり、例えばＳｔｅｍｍｅｒ、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ、３７０：３８９〜３９１及び米国特許第６、２９７、０５３号に記載され、この両方は引用することにより本明細書に組み入れられる。突然変異生成のその他の方法もまた当業者に周知である。
ｄＡｂ構築物作成で使用される足場
ｉ．主鎖構造の選択
免疫グロブリンスーパーファミリーの全てのメンバーは、ポリペプチド鎖について類似した折り畳み部分を共有する。例えば、抗体はそれらの一次配列に関しては高度に多様化しているが、配列及び結晶学的な構造の比較は予想に反して、６つの抗体の抗原結合ループのうちの５つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）が限られた数の主鎖構造、又は標準的な構造をとることを明らかにした（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ、３４２：８７７）。したがって、ループ長及び鍵となる残基の解析はさらに、大部分のヒト抗体に見られるＨ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３の主鎖構造の予測を可能にした（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：７９９；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ．、１４：４６２８；Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６４：２２０）。Ｈ３領域は、（Ｄセグメントの使用により）配列、長さ及び構造においてはより多様であるが、ループ及び抗体フレームワークの鍵となる位置における特定の残基の長さ及び存在又は残基の型次第では、短いループ長においてはＨ３領域もまた限られた数の主鎖構造を形成する（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６３：８００；Ｓｈｉｒａｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、３９９：１）。
ｄＡｂはＶＨドメインライブラリ及び／又はＶＬドメインライブラリなどのドメインライブラリから有利に構築される。１つの態様においては、メンバーの主鎖構造が分かるように特定のループ長及び鍵となる残基を選択して、ドメインライブラリを設計する。都合の良いことに、これらは天然に見られる免疫グロブリンスーパーファミリーの実際の構造であり、上記で議論されたような機能を果たさない可能性を最小限にする。生殖細胞系Ｖ遺伝子セグメントは、抗体又はＴ細胞受容体ライブラリを構築するための１つの好適な基礎フレームワークとして機能するが、その他の配列もまた有用である。変異も低頻度で生じ得るが、機能性メンバーの少数が、その機能に影響を及ぼさない程度に変化した主鎖構造を有する可能性がある程度である。
標準的な構造の理論も、リガンドによってコードされる異なる主鎖構造の数の評価、リガンド配列に基づく主鎖構造の予測、及び標準的な構造に影響を及ぼさない多様化のための残基の選択に役立つ。ヒトＶκドメインにおいては、Ｌ１ループは４つの標準的な構造のうちの１つをとることができ、Ｌ２ループは単一の標準的な構造を有し、ヒトＶκドメインの９０％がＬ３ループのために４つまたは５つの標準的な構造のうちの１つをとることができることが知られている（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）上記）；従って、Ｖκドメインのみにおいて、異なる標準的な構造が結合し、異なる種類の主鎖構造を作り出すことが可能である。ＶλドメインがＬ１、Ｌ２及びＬ３ループの異なる種類の標準的な構造をコードし、Ｖκ及びＶλドメインがＨ１及びＨ２ループのいくつかの標準的な構造をコードする任意のＶＨドメインと対合することが可能なので、これら５つのループで見られる標準的な構造の組み合わせの数は非常に多くなる。このことは、様々な種類の結合特異性を生産するためには、主鎖構造の多様性の生成が必須である可能性を示唆する。しかしながら、予想に反し、実質的に全ての抗原を標的とするのに十分な多様性を生成するには、主鎖構造における多様性は必要ではないことが、単一の既知の主鎖構造に基づいて抗体ライブラリを構築することにより見いだされた。さらに驚くべきことに、単一の主鎖構造はコンセンサス構造である必要もなく、単一の天然に生じる構造を全ライブラリの基礎として用いることが可能である。従って、一つの特定の態様においては、ｄＡｂは単一の既知の主鎖構造を有する。
選択された単一の主鎖構造が、問題となる免疫グロブリンスーパーファミリータイプの分子間ではありふれたものであってもよい。その構造をとる有意数の天然に生じる分子が観察される場合、その構造はありふれたものとなる。従って、１つの態様においては、天然に生じる免疫グロブリンドメインのそれぞれの結合ループについて異なる主鎖構造を個別に検討し、その後、主鎖構造の所望の組み合わせを有する天然に生じる可変ドメインが異なるループのために選択される。何も得られかった場合には、最も近似した等価物を選択することができる。異なるループにおける主鎖構造の所望の組み合わせは、所望の主鎖構造をコードする生殖細胞系遺伝子セグメントを選択することにより作成できる。一例として、選択した生殖細胞系遺伝子セグメントは、天然にしばしば発現するものであり、特に、全ての天然の生殖細胞系遺伝子セグメント中で最も頻繁に発現するものであってもよい。
ライブラリの設計においては、６つの抗原結合ループそれぞれについて異なる主鎖構造の頻度を個別に検討してもよい。Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３においては、天然に生じる分子の抗原結合ループの２０％から１００％の範囲の特定の構造が選択される。典型的には、その観察される頻度は３５％超（すなわち３５％から１００％の間）、理想的には、５０％超又は６５％超である。Ｈ３ループの大部分が標準的な構造を有さないため、標準的な構造を示すかかるループ間でありふれた主鎖構造を選択するのが好ましい。従って、ループのそれぞれにおいては、天然のレパートリーにおいて最も頻繁に観察される構造が選択される。ヒト抗体においては、それぞれのループにおける最も一般的な標準的な構造（ＣＳ）は以下の通りである：Ｈ１−ＣＳ１（発現レパートリーの７９％）、Ｈ２−ＣＳ３（４６％）、Ｌ１−ＶκのＣＳ２（３９％）、Ｌ２−ＣＳ１（１００％）、Ｌ３−ＶκのＣＳ１（３６％）（計算ではκ：λ率が７０：３０であると推定される。Ｈｏｏｄｅｔ ａｌ．（１９６７）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．、４８：１３３）。標準的な構造を有するＨ３ループについては、９４番の残基から１０１番の残基である塩橋を有する７つの残基のＣＤＲ３の長さ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ及びＨｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）が最も一般的であることが見いだされた。ＥＭＢＬデータライブラリには、この構造を形成するために必要とされる長さのＨ３及び鍵となる残基を有するヒト抗体配列が少なくとも１６あり、及びタンパク質データバンク中には、抗体モデリングの基礎として使用可能な少なくとも２つの結晶学的な構造が存在する（２ｃｇｒ及び１ｔｅｔ）。最も頻繁に発現する生殖細胞系遺伝子セグメントの標準的な構造の組み合わせは、ＶＨセグメント３−２３（ＤＰ−４７）、ＪＨセグメントＪＨ４ｂ、ＶκセグメントＯ２／Ｏ１２（ＤＰＫ９）及びＪκセグメントＪκ１である。ＶＨセグメントＤＰ４５及びＤＰ３８もまた適している。これらのセグメントをさらに、所望の単一の主鎖構造を有するライブラリを構築するための基礎として、組み合わせることによって使用することができる。
また別の方法としては、単離において、それぞれの結合ループについて天然に生じる異なる主鎖構造の頻度に基づいて単一の主鎖構造を選択する代わりに、天然に生じる主鎖構造の組み合わせの頻度が、単一の主鎖構造を選択するための基礎として使用される。抗体の場合には、例えば、任意の２つ、３つ、４つ、５つ、６つの抗原結合ループについて、天然に生じる標準的な構造の組み合わせの頻度を決定することができる。ここで、選択される構造は天然に生じる抗体においてありふれたものであってもよく、かつ、天然のレパートリーにおいて最も頻繁に見られるものであってもよい。従って、ヒト抗体においては、例えば、５つの抗原結合ループであるＨ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３の天然の組み合わせについて検討する場合には、最も頻繁にみられる標準的な構造の組み合わせを決定し、その後、単一の主鎖構造を選択するための基礎として、Ｈ３ループにおける最も一般的な構造とそれを組み合わせる。
標準的な配列の多様化
選択された複数の既知の主鎖構造又は単一の既知の主鎖構造を選択したので、分子の結合部位を多様化することによりｄＡｂを構築し、構造的及び／又は機能的多様性を有するレパートリーを生成することができる。このことは、構造及び／又機能の面で十分な多様性を有する変異が生成され、幅のある活性を提供することができることを意味する。
所望の多様性は、典型的には、１つ以上の位置において選択した分子を多様化することにより生成される。変化させる位置は、ランダムであってもよいし、又は選択してもよい。変異は、内在性アミノ酸を任意のアミノ酸又は、天然若しくは合成のアナログにより置換し、ランダム化によって非常に膨大な数の変異を生成するか、又は内在性アミノ酸を１つ以上の定義されたアミノ酸サブセットにより置換し、限定数の変異を生成することにより達成できる。
それらの多様性を導入する様々な方法が報告されている。分子をコードする遺伝子中にランダムな突然変異を導入するためには、変異性ＰＣＲ（Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２６：８８９）、化学的突然変異誘発（Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９：９５３３）又は細菌の突然変異誘発遺伝子株（Ｌｏｗ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６０：３５９）を用いることができる。選択した位置に変異を導入するための方法も当該分野においては周知であり、これらにはＰＣＲの使用を介した又は介さない、ミスマッチオリゴヌクレオチド又は変性オリゴヌクレオチドの使用が含まれる。例えば、複数の合成抗体ライブラリが抗原結合ループに対するターゲティング突然変異によって作出された。ヒト破傷風トキソイド結合ＦａｂのＨ３領域が、新しい種類の結合特性を作出するためにランダム化された（Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４４５７）。変異のないフレームワーク領域を有する巨大ライブラリを生産するために、Ｈ３及びＬ３領域のランダム化又はセミランダム化が生殖細胞系Ｖ遺伝子セグメントに付加された（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ＆Ｗｉｎｔｅｒ（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１；Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４４５７；Ｎｉｓｓｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４）ＥＭＢＯＪ．、１３：６９２；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）ＥＭＢＯＪ．、１３：３２４５；Ｄｅ Ｋｒｕｉｆ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２４８：９７）。それらの多様化は、いくつか又は全てのその他の抗原結合ループを含むように拡大された（Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．、２：１００；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３：４７５；Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ、国際公開第９７／０８３２０号、上記）。
ループランダム化はＨ３だけで約１０１５を超える構造を作り出し、その他の５つのループについても類似した数の変異を生成する可能性があるため、全ての可能な組み合わせを発現するライブラリを構築するのに現在の形質転換技術を用いることも、無細胞系を用いることさえも適してはいない。リボソーム・ディスプレイのような技法を用いて６ｘ１０１０の異なる抗体を上回って構築される最大ライブラリーのいくつかに関してさえ、考え得る多様性の一分画だけが、この設計のライブラリーで示された（Ｈｅ ａｎｄ Ｔａｕｓｓｉｇ, Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９７ ２５（２４）： ５１３２）。
１つの実施形態においては、分子の所望の機能を作り出す又は変化させることに直接関係している残基のみが多様化される。多くの分子においては、その機能は標的に結合させることであり、従って多様性は、分子の全体的パッキング又は選択した主鎖構造の維持にとって重要な残基を変化させるのを避けながら、標的結合部位に集中させる必要がある。
１つの態様においては、抗原結合部位におけるそれらの残基のみが変異されたｄＡｂライブラリが使用される。これらの残基は特にヒト抗体レパートリーにおいて多様であり、かつ、高品質な抗体／抗原複合体と接触することが知られている。例えば、Ｌ２においては、５０及び５３番目の位置は天然に生じる抗体で多様であり、抗原との接触が観察されることが知られている。これとは対照的に、標準的な方法では、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１、上記）によって定義された対応する相補性決定領域（ＣＤＲ１）において全ての残基、すなわちライブラリにおいて２つが変化したのに対し７残基余りを多様化させなければならないだろう。これは、一連の抗原結合特性を作り出すのに必要な機能的多様性の面で、大幅な改善である。
天然においては、抗体の多様性は、生殖細胞系Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントの体細胞組換えによるナイーブ初代レパートリーの作成（いわゆる生殖細胞系及び接合多様性）、並びにその結果生じた再構成Ｖ遺伝子の体細胞超変異という２つの過程の結果である。ヒト抗体配列の解析により、初代レパートリーにおける多様性が抗原結合部位の中心に集中していること、一方で体細胞超変異は初代レパートリーにおいて高度に保存される抗原結合部位の末端の領域にまで多様性を広げることが示された（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５６：８１３を参照のこと）。この相補性はおそらく配列間隔を探すための効果的な方法として発展したものであろう。これは明かに抗体に特有なものではあるが、他のポリペプチドレパートリーに対しても容易に適用可能である。変異した残基は、標的への結合部位を形成する残基のサブセットである。標的結合部位における異なる（重複を含む）残基のサブセットは、必要に応じて選択の異なる段階において多様化される。
抗体レパートリーの例においては、初代「ナイーブ」レパートリーは、抗原結合部位のいくつかの（しかし全てではない）残基が多様化された場合に作り出される。この文脈で本明細書で使用される場合、「ナイーブ」又は「ダミー」という用語は、予め決められた標的を有さない抗体分子を意味する。これらの分子は、広範な種々の抗原刺激に曝されていない胎児及び新生児患者の場合と同様に、免疫多様化を受けていない個体の免疫グロブリン遺伝子によってコードされる分子に類似する。このレパートリーはその後、一連の抗原又はエピトープによって選択される。必要に応じて、さらなる多様性をその後、最初のレパートリーにおいて多様化された領域の外側に導入することができる。この成熟したレパートリーは、改変した機能、特異性又は親和性用に選択できる。
本明細書において記載された配列は、実質的に同一な配列、例えば少なくとも９０％同一な配列、本明細書で記載された配列と例えば少なくとも９１％、又は少なくとも９２％、又は少なくとも９３％、又は少なくとも９４％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一な配列を含むことを理解されたい。
核酸については、「実質的な同一性」という用語は、２つの核酸又はその指示された配列を、最適に整列又は比較した場合に、適切なヌクレオチドの挿入又は欠損を含めて、少なくとも約８０％のヌクレオチドが、通常は少なくとも約９０％から９５％、及びより好ましくは少なくとも約９８％から９９．５％のヌクレオチドが同一であることを示す。また、実質的な同一性は、選択的なハイブリダイゼーションの条件下でセグメントが相補鎖とハイブリダイズする場合にも存在する。
ヌクレオチド及びアミノ酸配列については、「同一」という用語は、適切な挿入又は欠損を含めて最適に整列し及び比較した場合の２つの核酸又はアミノ酸配列の同一性の度合いを意味する。また、実質的な同一性は、選択的なハイブリダイゼーションの条件下でＤＮＡセグメントが相補鎖とハイブリダイズする場合に存在する。
２つの配列間の同一性のパーセンテージは、その２つの配列を最適にアライメントするために導入が必要とされるギャップ及びそれぞれのギャップの長さを考慮した場合に、その配列が共有している同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一の位置の数／全位置の数ｘ１００）。２つの配列間の配列の比較及び同一性のパーセンテージの決定は、以下の限定しない実施例に記載した数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。
２つのヌクレオチド配列間の同一性のパーセンテージは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス並びに４０、５０、６０、７０、又は８０のギャップウェート及び１、２、３、４、５、又は６の長さウェートを使用してＧＣＧソフトウェア中のＧＡＰプログラムを用いて決定することができる。２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の同一性のパーセンテージもまたＡＬＩＧＮｐｒｏｇｒａｍ（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）に組み込まれたＥ．Ｍｅｙｅｒｓ及びＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、４：１１〜１７（１９８８））のアルゴリズムを用い、ＰＡＭ１２０ウェート残基表、１２のギャップ長ペナルティ及び４のギャップペナルティを使用して決定することができる。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性のパーセンテージはＧＣＧソフトウェア中のＧＡＰプログラム中に組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４〜４５３（１９７０））のアルゴリズムを用い、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか及び１６、１４、１２、１０、８、６、又は４のギャップウェートと１、２、３、４、５、又は６の長さウェートを使用して決定することができる。
一例として、本発明のポリペプチド配列は、配列番号１４によってコードされる参照配列と１００％同一であってもよく、又は同一性のパーセンテージが１００％未満になるように、参照配列と比較した特定の整数までのアミノ酸変更を含んでもよい。それらの変更は、少なくとも１つのアミノ酸欠失、保存的置換及び非保存的置換を含む置換、又は挿入からなる群より選択される。ここで前記変更は、参照配列若しくは参照配列中の１つ以上の連続群のアミノ酸中に個別に散在して、参照ポリペプチド配列のアミノ又はカルボキシ末端又はそれら末端位置の間の任意の位置に生じてもよい。指定された同一性のパーセンテージにおけるアミノ酸変更の数は、配列番号１４によってコードされるポリペプチド配列中のアミノ酸の総数とそれぞれの同一性のパーセンテージの数字上のパーセンテージ（１００で割る）とを掛け、その後、配列番号１４によってコードされるポリペプチド配列中のアミノ酸の総数から得られた積を引くことによって決定する、又は：
Figure 2012528112
であり、
式中ｎａはアミノ酸変更の数、ｘａは配列番号１４によってコードされるポリペプチド配列中のアミノ酸の総数、及びｙは、例えば７０％の場合には０．７０、８０％の場合には０．８０、８５％の場合には０．８５などであり、並びにここでｘａ及びｙの数値がいずれの整数でもない場合には、ｘａから引く前に、最も近い整数まで切り捨てる。
実施例１
１．１ 二重標的化抗ＴＮＦα／抗ＶＥＧＦ ｍＡｂｄＡｂ（ＤＭＳ４０００）の生成
ｍＡｂ（アダリムマブ）重鎖のＣ末端とｄＡｂを融合することにより、抗ＴＮＦα／抗ＶＥＧＦ ｍＡｂｄＡｂ（ＤＭＳ４０００と呼ばれる）を産生した。重鎖発現カセットの構築のために、代替的ｍＡｂｄＡｂの重鎖をコードするベクターＤＮＡを出発点として採用した。制限酵素ＳａＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて、ｄＡｂ部分を切り取った。ＤＯＭ１５−２６−５９３、抗ＶＥＧＦ ｄＡｂを、ＰＣＲにより（ＳａＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ末端をコードするプライマーを用いて）増幅して、同一制限部位を用いてｄＡｂが切り出されていたベクター主鎖に結紮して、ｍＡｂおよびｄＡｂ間に「ＳＴＧ」（セリン、トレオニン、グリシン）のリンカーを生じた。
配列検証クローン（軽鎖および重鎖に関して、それぞれ配列番号１１および１３）を選択し、大規模ＤＮＡ調製を実行して、軽鎖および重鎖（配列番号１２および１４）の同時トランスフェクションによる一過性トランスフェクション技法を用いて、抗ＴＮＦα／ＶＥＧＦ ｍＡｂｄＡｂを哺乳動物ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞（カナダ国立研究機構）中で発現させた。
抗ＴＮＦα／ＶＥＧＦ ｍＡｂｄＡｂ重鎖の配列を、抗ＶＥＧＦ ｄＡｂに関するコドン最適化配列を有するようさらに修飾して、Ｌ２３５ＡおよびＧ２３７Ａ突然変異（カバト番号付け）を組入れて、ＦＣエフェクター機能を無力化した（ＤＭＳ４０００ ｍＡｂｄＡｂ重鎖Ｆｃ無力化配列番号４６および４７）。
１．２ 二重標的化抗ＴＮＦα／抗ＶＥＧＦ ｍＡｂｄＡｂ（ＤＭＳ４０００）の精製およびＳＥＣ分析
確立されたプロトコールに従って、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて、清澄化発現上清から抗ＴＮＦα／抗ＶＥＧＦ ｍＡｂｄＡｂ（ＤＭＳ４０００と呼ばれる）を精製した。２８０ｎｍでの吸光度の測定値から、分光分析により精製試料の濃度を確定した。精製試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図１）は、〜１７０ｋＤａで動作する非還元試料を示す。一方、還元試料は、それぞれ軽鎖およびｄＡｂ融合重鎖に対応する〜２５および〜６０ｋＤａで動作する２つの帯域を示す。
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析のために、抗ＴＮＦα／抗ＶＥＧＦ ｍＡｂｄＡｂを、予め平衡させ、０．５ｍｌ／分でＰＢＳ中で実行するＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００ １０／３０ＨＲカラム（Akta ExpressＦＰＬＣシステムに取り付けた）上に適用した。ＳＥＣプロフィールは、対称的ピークとして走行する単一種を示す（図２）。
１．３ 二重標的化抗ＴＮＦα／抗ＶＥＧＦ ｍＡｂｄＡｂ（ＤＭＳ４０００）の結合親和性
ＶＥＧＦ受容体結合検定
この検定は、ＶＥＧＦ１６５とＶＥＧＦ Ｒ２（ＶＥＧＦ受容体）との結合、ならびにこの相互作用を遮断する試験分子の能力を測定する。ＥＬＩＳＡプレートをＶＥＧＦ受容体（R&D Systems、カタログ番号３５７−ＫＤ−０５０）（０．２Ｍ炭酸ナトリウム 重炭酸塩（ｐＨ９．４）中最終濃度０．５μｇ／ｍｌ）で一晩被覆し、洗浄し、ＰＢＳ中２％ＢＳＡで遮断した。ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２９３−ＶＥ−０５０）および試験分子（０．０５％トゥイーン２０（商標）ＰＢＳ中０．１％ＢＳＡで希釈）１時間予備インキュベートした後、プレートに付加した（ＶＥＧＦ最終濃度３ｎｇ／ｍｌ）。ＶＥＧＦとＶＥＧＦ受容体との結合を、ビオチニル化抗ＶＥＧＦ抗体（最終濃度０．５μｇ／ｍｌ）（R&D Systems、カタログ番号ＢＡＦ２９３）およびペルオキシダーゼ接合抗ビオチン二次抗体（１：５０００希釈）（Ｓｔｒａｔｅｃｈ、カタログ番号２００−０３２−０９６）を用いて検出し、等容積の１Ｍ ＨＣｌで反応を停止後に、比色基質（シュアブルーＴＭＢペルオキシダーゼ基質、ＫＰＬ）を用いて、ＯＤ４５０で可視化した。
ＭＲＣ−５／ＴＮＦα検定
ヒトＴＮＦαがヒトＴＮＦＲ１と結合するのを阻止し、ＩＬ−８分泌を中和する試験分子の能力を、ヒト肺繊維芽細胞ＭＲＣ−５細胞を用いて確定した。試験試料の希釈シリーズを、ＴＮＦα（５００ｐｇ／ｍｌ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）とともに１時間インキュベートした。次いで、これを、ＭＲＣ−５細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＣＬ−１７１）（５×１０３細胞／ウェル）の懸濁液で２分の１に希釈した。一晩インキュベーション後、試料を１０分の１に希釈し、ＩＬ−８ ＡＢＩ ８２００細胞検出検定（ＦＭＡＴ）を用いて、ＩＬ−放出を確定したが、この場合、ＩＬ−８濃度は、抗ＩＬ−８（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２０８−ＩＬ）被覆ポリスチレンビーズ、ビオチニル化抗ＩＬ−８（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号ＢＡＦ２０８）およびストレプトアビジンＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ｓ３２３５７）を用いて確定した。検定読出しは６４７ｎｍでの限局性蛍光発光であり、未知のＩＬ−８濃度は、検定に包含されるＩＬ−標準曲線を用いて内挿した。
ＶＥＧＦおよびＴＮＦαに対する結合親和性を、上記のように確定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて、検定データを分析した。Ｓ状用量応答曲線を用いて効力値を確定し、最適適合モデルを用いてデータを適合させた。このｍＡｂｄＡｂの抗ＶＥＧＦ効力（図３）を５７ｐＭであると算定したが、一方、対照である抗ＶＥＧＦ ｍＡｂは３６６ｐＭというＥＣ５０値を示した。抗ＴＮＦαバイオアッセイ（図４）では、効力は１０ｐＭであったが、一方、抗ＴＮＦα対照ｍＡｂのＥＣ５０は２２ｐＭであった。要するに、この二重標的化ｍＡｂｄＡｂが両抗原（ＴＮＦαおよびＴＥＧＦ）に対して効力を有する、ということを検定データは示した。
１．４ 二重標的化抗ＴＮＦα／抗ＶＥＧＦ ｍＡｂｄＡｂ（ＤＭＳ４０００）のラットＰＫ
ラットにおけるｉｎ ｖｉｖｏ薬物動態特性に関して、この分子を試験した。抗ＴＮＦα／抗ＶＥＧＦ ｍＡｂｄＡｂを３匹のラットに静脈内投与し、１０日間（２４０時間）の期間に亘って血清試料を収集した。種々の時点で残存する薬剤の濃度を、ＴＮＦαおよびＶＥＧＦの両方に対するＥＬＩＳＡにより査定した。結果を、図５に示す。
この分子が抗ＴＮＦα ｍＡｂの場合と比較して、in vivo薬物動態特性を有する、ということをＰＫパラメーターは確証した。ＶＥＧＦ構成成分に関して観察されたより短いｔ1/2βは有意であるとはみなされず、検定人工産物であり得る。さらなる詳細を、表３に示す。
Figure 2012528112
１．５ 代替的抗ＴＮＦα／抗ＶＥＧＦ ｍＡｂｄＡｂ（ＤＭＳ４０３１）の生成
ＳＴＧリンカーを用いて重鎖のＣ末端上のＶＥＧＦ ｄＡｂに連結された同一抗ＴＮＦα ｍＡｂ（アダリムマブ）を用いて、実施例１．１に上記したのと同様の方法で、代替的抗ＴＮＦα／抗ＶＥＧＦ ｍＡｂｄＡｂ（ＤＭＳ４０３１と呼ばれる）を構築した。この場合に用いる抗ＶＥＧＦ ｄＡｂは、ＤＯＭ１５−１０−１１であった。軽鎖および重鎖（配列番号１２および１６）の同時トランスフェクションによる一過性トランスフェクション技法を用いて、哺乳動物ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞（カナダ国立研究機構）中でこの分子を発現させた。実施例１．２に記載されたものと類似の発現レベルのｍＡｂｄＡｂを得るよう発現したこの分子は、しかしながら、実施例１．３に記載したものと同一のＶＥＧＦ検定において効力に関して試験した場合、この検定においてＶＥＧＦ受容体と結合するＶＥＧＦの抑制レベルは検出可能でないことが判明した。
実施例２
二重標的化抗ＴＮＦα／抗ＶＥＧＦ ｍＡｂｄＡｂのＢｉａｃｏｒｅ分析
試験ｍＡｂｄＡｂをＢＩＡｃｏｒｅ分析に付して、それらの対応する抗原との結合に関して、動的会合および解離定数を確定した。ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）３０００計器で、分析を実施した。計器の温度を２５℃に設定した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を、作業緩衝液として用いた。計器の可能最高速度で、実験データを収集した。メーカーの使用説明書に従って、標準アミンカップリング化学を用いて、研究等級ＣＭ５チップ上の一フローセルをプロテインＡで被覆し、そして第二のフローセルを同じように処理したが、しかしプロテインＡの代わりに緩衝液を用いて、参照表面を生成した。次に、プロテインＡで被覆したフローセルを用いて、ｍＡｂｄＡｂを捕捉した。表２に詳述したように、一連の２×連続希釈液として抗原を注射した。数回希釈を、二重反復実験で実行した。バックグラウンド除去のために、リガンドの代わりに緩衝液単独の注射を用いた。計器ソフトウェアに固有の動的ウィザードを用いて、無作為順に、試料を注射した。１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５を注射することにより、各サイクル終了時に表面を再生した。ＢＩＡ評価ソフトウェア４．１を用いて、データ処理および動的適合をともに実施した。二重反復実験結果（同一実行から）の平均を示すデータを、表４に示す。ＤＭＳ４０３１に関して示される多重値は、別個の場合に実行した２つの実験を表す。分析したリガンドの濃度のため、７８７ｎＭという値は、おそらくは、親和性を過大評価する。
Figure 2012528112
実施例３
抗原結合タンパク質の化学量論的査定（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）を使用）
この実施例は、予測的である。それは、本発明の抗原結合タンパク質が試験され得る付加的検定を実行するための指針を提供する。
第一級アミンカップリングにより、抗ヒトＩｇＧをＣＭ５バイオセンサーチップ上に固定した。抗原結合タンパク質をこの表面上に捕捉し、その後、その上を単一濃度のＴＮＦαまたはＶＥＧＦが通過したが、この濃度は、結合表面を飽和するのに十分であり、そして、観察された結合シグナルは完全Ｒｍａｘに達した。次いで、所定の式を用いて、化学量論値を算定する：
Figure 2012528112
同時に結合する１つより多い分析物に関して化学量論値を算定する場合、飽和抗原濃度で逐次的に異なる抗原を通して、化学量論値を上記のように算定する。ＨＢＳ−ＥＰ作業緩衝液を用いて、２５℃で、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００で作業を実行し得る。
実施例４
ＧＳリンカーを介して抗ＶＥＧＦＲ２アドネクチンと融合されるＣＴＬＡ４−Ｉｇの設計および構築（ＢＰＣ１８２１）
ＣＴＬＡ４−Ｉｇをコードするコドン最適化ＤＮＡ配列（クローニングを助長するために、Ｎ末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＣ末端にＢａｍＨＩ部位を含んだ）を構築し、ＣＴ０１アドネクチンを含有する哺乳動物発現ベクター（修飾多重クローニング部位（ＭＣＳ）を有するカナダ国立研究機構からのｐＴＴ発現ベクター）中でクローン化した。これにより、アドネクチンは、ＧＳリンカーを介してＣＴＬＡ４−ＩｇのＣ末端上に融合された。その結果生じた抗原結合タンパク質を、ＢＰＣ１８２１と名づけた。ＢＰＣ１８２１のＤＮＡおよびタンパク質配列は、それぞれ、配列番号２６および２７で示される。
ＢＰＣ１８２１をコードする発現プラスミドを、２９３フェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１２３４７０１９）を用いて、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞（カナダ国立研究機構）中に一時的にトランスフェクトした。２４時間後にトリプトン餌を細胞培養に付加し、９６時間後に上清を採取した。プロテインＡカラムを用いてＢＰＣ１８２１を精製した後、結合検定で試験した。
実施例５
ＶＥＧＦＲ２およびＢ７−１結合ＥＬＩＳＡ（ＢＰＣ１８２１）
ＰＢＳ中の０．４μｇ／ｍｌの組換えヒトＶＥＧＦＲ２ Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、３５７−ＫＤ−０５０）で９６ウェル高結合プレートを被覆して、４℃で一晩保存した。０．０５％のトゥイーン２０を含有するトリス緩衝生理食塩水で、プレートを２回洗浄した。２００μＬの遮断溶液（ＤＰＢＳ緩衝液中５％ＢＳＡ）を各ウェルに付加し、室温で少なくとも１時間、プレートをインキュベートした。次いで、もう一度洗浄ステップを実施した。ＢＰＣ１８２１および２つの陰性対照抗体（Ｓｉｇｍａ１５１５４および二重特異性ＩＧＦ１Ｒ−ＶＥＧＦＲ２抗原結合構築物ＢＰＣ１８０１−重鎖配列番号１６３および軽鎖配列番号１６４）を、遮断溶液中のプレート全体で連続希釈した。１時間インキュベーション後、プレートを洗浄した。ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅからのＥＣＬビオチニル化モジュールを用いて、組換えヒトＢ７−１ Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１４０−Ｂ１−１００）をビオチニル化した。キット推奨レベルの４分の１で、標識化を実施した。ビオチニル化Ｂ７−１を遮断溶液中で希釈して１μｇ／ｍＬとして、５０μＬを各ウェルに付加した。プレートを１時間インキュベートし、次いで、洗浄した。ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ、Ｅ２８８６）を遮断溶液中で１０００分の１に希釈し、５０μＬを各ウェルに付加した。もう一度洗浄ステップを実施した後、５０μｌのＯＰＤ ＳｉｇｍａＦａｓｔ基質溶液を各ウェルに付加し、そして２５μＬの３Ｍ硫酸の付加により１５分後に反応を停止した。基本終点プロトコールを用いて、ＶｅｒｓａＭａｘ同調可能マイクロプレート読取り装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）により４９０ｎｍで、吸光度を読取った。
図６はＥＬＩＳＡの結果を示す。これは、二重特異性ＢＰＣ１８２１がＶＥＧＦＲ２およびＢ７−１の両方との結合を示すことを確証する。陰性対照抗体は、ＶＥＧＦＲ２およびＢ７−１の両方との結合を示さない。対照濃度は、２μｇ／ｍｌの出発濃度から希釈した。
実施例６
ＧＳリンカーを介して抗ＶＥＧＦ ｄＡｂと融合されるＣＴＬＡ４−Ｉｇの設計および構築（ＢＰＣ１８２５）
抗ＶＥＧＦＲ２アドネクチンと融合されたＣＴＬＡ４−Ｉｇを含有するＤＮＡプラスミドを、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ−抗ＶＥＧＦ ｄＡｂ二重特異性物質を構築するための基礎プラスミドとして用いた。基礎プラスミドをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化して、アドネクチン配列を除去することにより、ベクターを調製した。抗ＶＥＧＦ ｄＡｂをコードするＤＮＡ配列をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで制限して、ベクターに結紮した。その結果生じたＣＴＬＡ４−Ｉｇ−抗ＶＥＧＦ ｄＡｂ二重特異性物質をＢＰＣ１８２５と名づけた。この場合、ｄＡｂはＧＳリンカーを介してＣＴＬＡ４−ＩｇのＣ末端に融合された。ＢＰＣ１８２５のＤＮＡおよびタンパク質配列は、それぞれ、配列番号２８および２９で示される。
ＢＰＣ１８２５をコードする発現プラスミドを、２９３フェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１２３４７０１９）を用いて、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞（カナダ国立研究機構）中に一時的にトランスフェクトした。２４時間後にトリプトン餌を細胞培養に付加し、９６時間後に上清を採取した。上清を、結合検定における試験物質として用いた。
実施例７
ＶＥＧＦおよびＢ７−１結合ＥＬＩＳＡ（ＢＰＣ１８２５）
ＰＢＳ中の０．４μｇ／ｍｌのヒトＶＥＧＦ１６５（企業内物質）で９６ウェル高結合プレートを被覆して、４℃で一晩保存した。０．０５％のトゥイーン２０を含有するトリス緩衝生理食塩水で、プレートを２回洗浄した。２００μＬの遮断溶液（ＤＰＢＳ緩衝液中５％ＢＳＡ）を各ウェルに付加し、室温で少なくとも１時間、プレートをインキュベートした。次いで、もう一度洗浄ステップを実施した。ＢＰＣ１８２５および２つの陰性対照抗体（Sigma１５１５４およびＢＰＣ１８２４− ＣＴＬＡ４−Ｉｇ抗ＩＬ−１３ ｄＡｂ融合物 −配列番号１６５）を、遮断溶液中のプレート全体で連続希釈した。１時間インキュベーション後、プレートを洗浄した。ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅからのＥＣＬビオチニル化モジュールを用いて、組換えヒトＢ７−１ Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１４０−Ｂ１−１００）をビオチニル化した。キット推奨レベルの４分の１で、標識化を実施した。ビオチニル化Ｂ７−１を遮断溶液中で希釈して１μｇ／ｍＬとして、５０μＬを各ウェルに付加した。プレートを１時間インキュベートし、次いで、洗浄した。ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎペルオキシダーゼ（Sigma、Ｅ２８８６）を遮断溶液中で１０００分の１に希釈し、５０μＬを各ウェルに付加した。もう一度洗浄ステップを実施した後、５０μｌのＯＰＤ ＳｉｇｍａＦａｓｔ基質溶液を各ウェルに付加し、そして２５μＬの３Ｍ硫酸の付加により１５分後に反応を停止した。基本終点プロトコールを用いて、ＶｅｒｓａＭａｘ同調可能マイクロプレート読取り装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）により４９０ｎｍで、吸光度を読取った。
図７はＥＬＩＳＡの結果を示す。これは、二重特異性ＢＰＣ１８２５がＶＥＧＦおよびＢ７−１の両方との結合を示すことを確証する。陰性対照抗体は、ＶＥＧＦおよびＢ７−１の両方との結合を示さない。Sigma１５１５４の濃度は、２μｇ／ｍｌの出発濃度から希釈した。
実施例８
ＳＴＧまたはＴＶＡＡＰＰＳＴＧリンカーを介してＶＥＧＦ ｄＡｂと融合されるＴＮＦα受容体Ｆｃ融合物の設計および構築
ヒトＴＮＦα受容体Ｆｃ融合物（エタネルセプト）をコードするコドン最適化ＤＮＡ配列を構築し、ＤＭＳ４０００からのＤＯＭ１５−２６−５９３抗ＶＥＧＦ ｄＡｂとともに哺乳動物発現ベクター（ｐＴＴ５）中でクローン化した。
受容体Ｆｃの側面に付加的配列を配置して、Ｎ末端Ｃａｍｐａｔｈ１シグナルペプチドを提供し、そしてＳＴＧリンカーまたはＴＶＡＡＰＳＴＶＡＡＰＳＴＶＡＡＰＳＴＶ英々ＰＳＴＧリンカーをＣ末端に提供して、ｄＡｂと融合させた。フランキング配列は、ｄＡｂを有するベクター中でのクローニングを助長するために、ＡｇｅＩ制限部位およびＳａＩＩ制限部位を含んだ。その結果生じた抗原結合タンパク質を、それぞれＥｔａｎＳＴＧ５９３およびＥｔａｎＴＶ４５９３と名づけた。ＥｔａｎＳＴＧ５９３のＤＮＡおよびタンパク質配列を、それぞれ配列番号４８および４９で示し、ＥｔａｎＴＶ４５９３のそれぞれの配列を、配列番号５０および５１で示す。
実施例９
ＥｔａｎＳＴＧ５９３およびＥｔａｎＴＶ４５９３精製ならびにＶＥＧＦおよびＴＮＦα結合分析
トランスフェクションのために２９３フェクチン（Invitrogen）を用いて、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞（カナダ国立研究機構）中で、ＥｔａｎＳＴＧ５９３およびＥｔａｎＴＶ４５９３プラスミドを独立して発現させた。ＥｔａｎＳＴＧ５９３およびＥｔａｎＴＶ４５９３を５日後に収穫し、ＭＡｂ Ｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ（GE Healthcare）アフィニティークロマトグラフィーにより精製して、それぞれ、バッチ試料Ｍ４００４およびＭ４００５を得た。タンパク質を、Ｆ１緩衝液（０．１Ｍクエン酸、ｐＨ６、１０％ＰＥＧ３００、５％スクロース）またはＥＴ緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、４％Ｄ−マンニトール、１％スクロース）中に処方した。ＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ２００ １０／３００ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でのサイズ排除クロマトグラフィーによりタンパク質をさらに精製して、凝集物のレベルを低減した。
ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６機（ＢｉｏＲａｄ ＴＭ）で、結合分析を実行した。第一級アミンカップリングにより、ＧＬＭチップ上にプロテインＡを固定した。試験すべき構築物を、このプロテインＡ表面に捕捉した。分析物ＴＮＦ亜アルファおよびＶＥＧＦを、２５６ｎＭ、６４ｎＭ、１６ｎＭ、４ｎＭおよび１ｎＭで用いた。０ｎＭ（すなわち、緩衝液単独）ＴＮＦαおよびＶＥＧＦを用いて、二重参照結合曲線とした。
ＰｒｏｔｅＯｎの新規の６×６フローセル設置は、１サイクル当たり全３６の相互作用を生じるに際して、６個までの構築物の同時捕捉を可能にし、そして捕捉抗体（単数または複数）上に６種類の濃度の分析物を流すことも可能にする。
プロテインＡ表面を再生するために、５０ｍＭのＮａＯＨを用いた。これは、捕捉構築物（単数または複数）を除去し、別の捕捉を可能にして、結合サイクルを開始させる。得られたデータを、ＰｒｏｔｅＯｎ分析ソフトウェアにｕの１：１モデルと適合させた。作業緩衝液としてＨＢＳ−ＥＰを用いて、２５℃で、操作を実行した。
Figure 2012528112
Figure 2012528112
実施例１０ − 予測実施例
１０．１ 二重標的化抗原結合タンパク質の生成
２つの予め同定された抗原結合タンパク質、例えば抗体断片または全体モノクローナル抗体の間に物理的連結を導入することにより、二重標的化抗原結合構築物を工学処理し得る。物理的連結は、２つの部分の間の遺伝子リンカー配列をコードすることにより、導入され得る。長さおよびアミノ酸組成に関するリンカーの性質は、二重特異性作用物質中の部分の一方または両方の特性との関連を有し得る。二重特異性物質を生成するために多重抗体または抗体断片を有するという場合、一番手の最適な組合せを同定するためには、経験的アプローチを適合し得る。
潜在力、効力および生物物理的行動についての既知の特性を有する作用物質を送達するために、種々の十分に実証されたｉｎ ｖｉｖｏ（例えば、Ｈａｒｌｏｗ, Ｅ ａｎｄ Ｌａｎｅ, Ｄ （１９９８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ, Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）およびｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば、Ｂａｒｂａｓ ＩＩＩ, ＣＦ ｅｔ ａｌ （２００１） Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ, Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）技法を用いて、単離に際して、限定標的に対する個々の結合部分、例えばｍＡｂ、ＦＡｂ、ＳｃＦｖ、ｄＡｂ等が同定され、開発され得る。これらの個々の作用物質から、多数の異なる二重特異的状況が生じるが、これは、それらを作製するために必要とされる分子工学の複雑さの程度によってのみ制限される。所望の分子構造は、普通は、処置される症状の性質によって決定される。例えば、長期投与のためには、本質的に長いｉｎ ｖｉｖｏ半減期を送達する分子フォーマットが選択されるべきものである。これは、サルベージ再利用経路に基づいて長い最終消失半減期を送達するＩｇＧ抗体のＦｃ領域を含むことにより、最も容易に達成し得る。したがって、ｍＡｂまたは他のＦｃベースの二重特異性物質は、高頻度に用いられるフォーマットである。
ｍＡｂベースの二重標的化分子を開発するために、考え得る一アプローチは、完全ＩｇＧに抗体断片を付けることである。分子レベルでは、これは、ｍＡｂ鎖の末端の１つに制限部位を導入し、ｍＡｂ鎖が付加的機能単位を伴って伸長されるよう、抗体断片を挿入することにより実行され得る。機能的単位間のリンカーの性質は、二重特異性物質の全体的特性を最適化するよう変えられる必要があり得る。同一標的を取り扱う一連の異なる抗体断片が利用可能である場合、これらは、このアプローチを用いて互いに直接的に比較され得る。この性質を有する二重特異性物質は、普通は、哺乳動物細胞で、典型的にはＨＥＫ２９３細胞中で一時的に、しかし安定細胞株および大規模製造のためにはＣＨＯ細胞中で発現されることになる。ＴＮＦ／ＶＥＧＦ二重特異性物質に関して、抗ＴＮＦα ｍＡｂは、このようにしてＶＥＧＦ結合タンパク質、例えば抗体断片と連結され得るし、あるいは抗ＶＥＧＦ ｍＡｂが抗ＴＮＦα結合タンパク質と連結され得る。例えば、このように利用され得るＴＮＦαおよびＶＥＧＦアンタゴニストは、それぞれ表１および２に列挙されている。このような実施においては、全ての考え得る試薬が利用可能であり、全ての潜在的組合せが試験される。
非ｍＡｂベースの二重特異性物質は、遺伝子融合物として一緒に、一般的に同様の方法で抗原を結合する２つの抗体断片または他のタンパク質を連結することにより作製され得る。２つのユニットの接合は、普通は、経験的に決定され得る長さおよび配列組成を有するリンカーにより表される。このような分子は、それらのモジュラ、一本鎖性のために自由に分子工学処理できるし、哺乳動物細胞以外の系における発現の可能性をもたらす。
図８は、本発明にしたがってたって使用可能な考え得る二重標的化構築物のマトリックスを示す。図８で示される多数の考え得る二重標的化構築物は、配列番号７３〜１４０で示される。これらの具体的二重標的化分子では、「ＴＶＡＡＰＳ」リンカー（配列番号４）を用いて構成成分部分を連結するが、但し、Ｎ末端ＳｃＦｖを有するＤＶＤ−Ｉｇ、ＤＶＤ−Ｆａｂ融合物（配列番号１１６〜１１８）およびＮ末端ＶＨｄＡｂを有する融合物（配列番号１３３、１３４）（この場合、リンカーは「ＡＳＴＫＧＰＳ」（配列番号６）である）中の重鎖は例外である。配列番号７３〜１４０は単なる実例であって、他のリンカーおよび構築が考えられると当業者は理解している。
Figure 2012528112
１０．２ 必要とされる特質に関する二重標的化抗原結合タンパク質の試験
潜在力／親和性： さらなる開発に適した二重特異性分子の基本的特性は、抗原に関する動的結合親和性（通常は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の一型、例えばＢＩＡｃｏｒｅにより決定される）であり、これは、順次、抗原の濃度および利用可能性についての従来の知識に基づいた所定の治療用量後の最小薬理学的有効濃度を予測するために用いられることになる。特定の薬理学的作用を媒介する化合物の濃度を決定するin vitro検定により普通は査定される属性である中和能力に関連して、親和性も予測し得る。これは、受容体／リガンド結合事象の抑制、あるいは下流応答経路の刺激／抑制であり得る。例えば、ＴＮＦアンタゴニストの潜在力は、それが、ＴＮＦにより調節される他のサイトカインの産生を防止する程度により査定され得る。この一般型は、ＴＮＦに応答するＭＲＣ−５細胞からのＩＬ８の分泌の低減である。ＶＥＧＦアンタゴニストに関しては、受容体リン酸化が低減される程度は、抗ＶＥＧＦ作用物質の抑制能力の直接結果であるが、一方、ＨＵＶＥＣ細胞の増殖の低減はこの作用の生物学的相関物である。動的親和性の場合と同様に、二重特異性物質は、両抗原に関する標的潜在力を実証するために必要とされる。
生物物理学： 慣用的ｍＡｂは良好な発現を示すことが知られているため、同様の特質を実証するためには任意の開発可能な二重特異性分子が必要とされる。発現レベルは、一過性および安定細胞培養中に決定され、慣用的治療用抗体と同じ正常範囲であることが必要とされる。二重特異性物質は、ｍＡｂと同様の精製プロセス（例えば、プロテインＡ捕捉）、ならびに臨床等級物質の製造に必要とされる他の下流プロセシング（ＤＳＰ）ステップが容易であることが必要である。精製タンパク質は、明瞭な対称的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）プロフィール、生体適合性緩衝液中の高（＞２５ｍｇ／ｍｌ）タンパク質濃度での安定性、および一連のストレス条件（温度、ｐＨ、凍結−解凍、脱アミド化条件等）に対する抵抗性を実証する必要がある。
薬物動態（ＰＫ）／薬力学（ＰＤ）： 二重特異性抗原結合タンパク質の薬物動態プロフィールは、標的の性質および疾患設定と一致することが必要である。大多数の症例では、抗体はその長い血清半減期に基づいて決定的に区別され、これは、通常は、所望されるプロフィールである。齧歯類および霊長類の両方で普通に査定されるようなＰＫ、ならびに二重特異性物質の最終半減期（ｔ1/2β）は、同一標的に対する抗体作用物質のものに匹敵するはずである（二重特異性物質は、２つの活性が根本的に異なる速度で代謝される場合、より迅速に取り除かれる種を反映する、と考えられる）。二重特異性分子に関するＰＫ検定は、理想的には、単一検定（架橋検定）で２つの活性を測定し、それにより、循環中の残留薬剤が無傷で且つ完全に二重機能性である（例えば、ＴＮＦはプレート上に固定され、薬剤を含有する試料がプレートに付加されて、例えば、抗ビオチン物質によりそれ自体検出されるビオチニル化ＶＥＧの付加により、存在する二重特異性物質の量が検定される）、という確信を提供する。二重特異性化合物に関する他のｉｎ ｖｉｖｏ分析としては、このようなモデルが存在し、二重特異性物質と宿主種との交差反応性が十分に理解される条件下での、疾患のモデルにおける試験が挙げられる。ＴＮＦ／ＶＥＧＦ二重特異性物質に関して、これは、血管漏出または血管増殖性症状の増大により炎症が悪化させられる炎症性症状（この場合、局所環境におけるマクロファージの活性化が疾患状態を悪化させる）を包含し得る。霊長類では、このようなモデルは、用量等の算定においてある役割を果たし得る活性のある種の薬力学的マーカーの誘導体化も可能にし得る。
安全性： 二重特異性フォーマットの相対的新規性は（構成成分および標的が先行される場合でも）、安全性および耐容性の問題を生じる。任意の生物学的薬剤の場合と同様、全範囲の毒物学的試験が必要であり、二重特異性分子フォーマットに関連したあらゆる仮説的懸念が強調されるようになる。これは、さらなる予測できない薬理学知見または免疫原性増大の可能性を含み得る。後者の見込みは、この分子態様に関する危険プロフィールを構築するために用いられ得るＴ細胞エピトープを探すためのｉｎ ｓｉｌｉｃｏツールを用いて、取り組み得る。
親和性、潜在力および生物物理的行動の同一判定基準の多くに関して、非ｍＡｂベースの二重特異性フォーマット（例えば、２つの抗体または抗体様断片の直接融合物）が判定可能であるが、しかし、いくつかの属性、特にＰＫは、異なる分子フォーマットに伴って変わり得る。このような分子は、異なる発現系（例えば原核生物細胞において）でも産生され得るし、これは、それ自体、特に精製、ＤＳＰおよび安全性研究に関して、異なる要件を作り出し得る。
実施例１１
ＴＮＦ／ＶＥＧＦ ｄＡｂ−ｄＡｂ直列融合物（ＩＬＦ）
ＴＮＦ−ＶＥＧＦ二重特異性物質を作製するために、ｄＡｂ−ｄＡｂ直列融合物の構築方法を、以下に詳述する。しかしながら、実施例１０で上記したように、類似の標的特異性を有する抗体または抗体断片を基礎にした任意の他の二重特異性物質を生成するために、同一アプローチを用い得る。
２つの単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）を遺伝子融合してｄＡｂ−ｄＡｂ直列融合物（ＩＬＦ）にすることにより、ＴＮＦαおよびＶＥＧＦの両方を抑制する能力を有する二重特異性分子を構築した。これらの分子を構築するために、２つの標的に対して独立して選択したｄＡｂをファージ表示により単離して、一連の適切な技法を用いて数回の親和性成熟により、標的に対する高親和性および潜在性を達成した。ＩＬＦに関して選択した最終分子は、ＤＯＭ１５−２６−５９３（抗ＶＥＧＦ）（配列番号１）およびＰＥＰ１−５−１９（抗ＴＮＦα）（配列番号３５）であった。
ＤＯＭ１５−２６−５９３は、約１ｎＭのヒトＶＥＧＦ−Ａに関する単量体親和性を有するＶＨ ｄＡｂである。ＰＥＰ１−５−１９は、約８ｎＭのヒトＴＮＦαに関する単量体親和性を有するＶｋ ｄＡｂである。２つの異なるＩＬＦ構築物を作製したが、一方はアミノ末端にＤＯＭ１５−２６−５９３ ｄＡｂを有し（以下では「ＤＯＭ−ＰＥＰ」と略す）、もう一方はこの位置にＰＥＰ１−５−１９ ｄＡｂを有する（「ＰＥＰ−ＤＯＭ」）。ＶＨまたはＶｋ ｄＡｂのＣ末端と天然に会合する配列由来の短いリンカーにより、ＩＬＦ中の２つのｄＡｂは分離された。それゆえ、Ｎ末端にＶＨ ｄＡｂを有するＩＬＦは、リンカー「ＡＳＴＫＧＰＳ」（配列番号６ − ＶＨからＣＨ１への天然伸長）を含み、Ｎ末端にＰＥＰ１−５−１９を有するＩＬＦは、リンカー配列「ＴＶＡＡＰＳ」（配列番号４ − ＶｋからＣｋへの天然伸長）を含んだ。
ＩＬＦを作製するために、哺乳動物一過性発現ベクターｐＴＴ５（NRC, カナダ）を、分泌シグナルおよび適切なクローニング部位を含むよう修飾した。これらを、以下の表８で詳述する。ＤＯＭ−ＰＥＰ構築物を作製するために、ＤＯＭ１５−２６−５９３ ｄＡｂおよびＰＥＰ１−５−９ドメインｄＡｂに対応する個々の断片を、下記のそれぞれの遺伝子特異的プライマーを用いて増幅した。リンカー配列および制限部位を、プライマー配列内に組入れた。
Figure 2012528112
Figure 2012528112
ＤＯＭ−ＰＥＰ構築物に関してはＤＯＭ１５−２６−５９３を、ＡＶＧ１８およびＡＶＧ１９を用いて増幅し、ＤＯＭ−ＰＥＰ構築物に関してはＰＥＰ１−５−１９を、ＡＶＧ２６およびＡＶＧ２１を用いて増幅した。精製後、ＰＣＲ断片をＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩ、ならびにＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでそれぞれ消化し、断片を精製した。次に、それらを、修飾型のベクターｐＴＴ５（真核生物プロモーターの下流のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片の挿入を可能にする多重クローニング部位を含有した）を有する３−断片結紮物に付加した。結紮、形質転換およびその結果生じたコロニーの分析を、標準技法を用いて実行し、ヌクレオチド配列分析は、結果的に生じるベクターが配列番号６１で並べられるような配列を有する挿入物を含有することを確証し、配列番号６２で示される翻訳産物を予測した。
ＰＥＰ−ＤＯＭ構築物に関して、ＰＥＰ１−５−１９ ｄＡｂをＡＶＧ２２およびＡＶＧ３６で、そしてＤＯＭ１５−２６−５９３ ｄＡｂをＡＶＧ３７およびＡＶＧ２５で増幅した。これらの断片を、それぞれ、ＢａｍＨＩおよびＢｓｉＷＩ（ＰＥＰ）ならびにＢｓｉＷＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（ＤＯＭ）で消化した。ＤＯＭ断片は、消化が不十分であり、これがプライマーの５’末端での短いオーバーハングの原因であることが判明した。したがって、ＰＣＲ産物を、ＡＶＧ２５およびＡＶＧ２４を用いて再増幅して、オーバーハングを伸長させて、消化を反復し、断片を、上記のように消化ＰＥＰ挿入物およびｐＴＴ５ベクターとともに３−断片結紮物に付加した。結紮、形質転換およびその結果生じたコロニーの分析を、標準技法を用いて実行し、ヌクレオチド配列分析は、結果的に生じるベクターが配列番号６３で並べられるような配列を有する挿入物を含有することを確証し、配列番号６４で示される翻訳産物を予測した。
シーケンシング化クローンをＤＮＡマキシプレプによりトランスフェクトのために調製し、標準方法を用いて、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞（カナダ国立研究機構）中にＤＮＡをトランスフェクトした。培地の清澄化後、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより組換えタンパク質をトランスフェクト化細胞上清から収穫し、生成物質緩衝液をＰＢＳに交換して、定量した。次に、ＴＮＦαおよびＶＥＧＦの両方を結合するこれらのタンパク質の能力を、下記のように表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により査定した。
ｄＡｂ ＣＤＲ領域から離れたＶＨまたはＶｋ ｄＡｂと結合すると考えられる多数のモノクローナル抗体（代替的には、プロテインＡまたはプロテインＬを用い得る）を用いて、ＤＯＭ−ＰＥＰおよびＰＥＰ−ＤＯＭタンパク質をｍＡｂを介してセンサー表面に捕捉し、ＴＮＦおよびＶＥＧＦリガンドを捕捉二重特異性物質全体に流して、結合特質を分析した。試験した２つの異なる抗Ｖｋ ｄＡｂのうちの一方で化合物を捕捉した場合、ＴＮＦリガンドの結合は減損された、ということが分析により確定されたが、これは、この捕捉抗体がリガンド結合を立体的に妨害していることを示唆する。したがって、今後の分析は、抗ＶＨ ｄＡｂモノクローナル抗体により捕捉される二重特異性物質に限定された。
プロテインＡ表面に約１６００応答単位（ＲＵ）の抗ＶＨモノクローナル抗体を捕捉し、試験化合物を複合体上に通した。結合活性の定量的よりむしろ定性的測定を提供するよう実験設定を設計し、したがって動力学等の概算はできなかった。ＰＥＰ−ＤＯＭタンパク質に関して非常に明白なデータを得たが、この場合、２つのｄＡｂはともに、付加的結合曲線により立証されたように（図９＆１０）、明らかに、独立して且つ同時に、リガンドと結合可能であった。
図９における結合事象のより厳密な分析は、ＰＥＰ−ＤＯＭタンパク質との両リガンドの結合を実証する。
ＴＮＦαおよびＶＥＧＦの両方とＤＯＭ−ＰＥＰが結合する可能性も認められる（データは示されていない）。
実施例１２
in vivo試験：ラットにおけるレーザー誘導性脈絡膜新血管新生（ＣＮＶ）：ＤＭＳ１５７１（ＶＥＧＦ−ｄａｂ）およびエンブレル（商標）を別々に試験する
論理的根拠
前の実験で得た結果は、抗ＶＥＧＦアンタゴニスト ＤＭＳ１５７１（ＤＯＭ１５−２６−５９３抗ＶＥＧＦ ｄＡｂのＦｃフォーマット化バージョン、 これは、配列番号６５の二量体として存在する）が、ラットレーザー誘導性脈絡膜新血管新生（ＣＮＶ）モデルにおいて有効である、ということを示した。この実験の目的は、ラットＣＮＶモデルにおけるこの分子の用量変動をさらに評価すること、さらに、同一モデルにおけるＴＮＦαアンタゴニスト（エンブレル（商標））の用量変動試験を意図することであった。
方法
動物
１２週齢Ｄａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット（Ｈａｒｌｏｎ Ｏｌａｃ）を、これらの試験に用いた。手順の前に、ケタミン（３７．５％、Ｄｏｄｇｅ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｌｔｄ.）、ドルミトール（２５％、Ｐｆｉｚｅｒ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ, Ｋｅｎｔ）および滅菌水（Ｐｆｉｚｅｒ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ, Ｅｘｔｏｎ, ＰＡ）の混合物を、０．１７５ｍｌ／１００ｇで腹腔内注射することにより、動物を外科的に麻酔し、局所的１％トロピカミド（Ａｌｃｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ, Ｆｏｒｔ Ｗｏｒｔｈ, ＴＸ）および２．５％フェニレフリン（Ａｋｏｒｎ, Ｉｎｃ., Ｄｅｃａｔｕｒ, ＩＬ）の組合せで瞳孔を拡大させた。動物実験は全て、眼および視覚研究における動物の使用に関するＡＲＶＯ宣言に従った。
実験的ＣＮＶ
レーザー光凝固（ＰＣ）を用いてブルッフ膜を破裂させることにより、２〜４月齢雌ＤＡラットの群で、実験的ＣＮＶを片側に誘導した。スリットランプ検眼鏡に取り付けたダイオード励起、５３２ｎｍアルゴンレーザー（Ｎｏｖｕｓ Ｏｍｎｉ Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ｉｎｃ., Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ, ＣＡ）、ならびに視力を中和するために角膜に適用されるハンドヘルド平凹コンタクトレンズ（Ｍｏｏｒｆｉｅｌｄｓ Ｅｙｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌ, Ｌｏｎｄｏｎ, ＵＫ）を用いて、色素レーザーＰＣを実施した。乳頭周囲に分布し、標準化した方法で、半径５００μｍ（視神経円板から１〜１．５ｍｍで）で視神経を中心に、各眼の主要血管を避けて、８つの病変（５３２ｎｍ、１５０ｍＷ、０．１５秒、直径１００μｍ）を作った。レーザー損傷の形態学的終点を、ブルッフ膜の崩壊に関連した徴候である空洞化気泡の一過性出現として確認した（バックグラウンド参照に関しては、一般的方法は、Ｃａｍｐｏｓ, Ａｍａｒａｌ, Ｂｅｃｅｒｒａ, ＆ Ｆａｒｉｓｓ, ２００６ Ａ ｎｏｖｅｌ ｉｍａｇｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｈｏｒｏｉｄａｌ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ. Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ, ４７（１２）, ５１６３−５１７０（この記載内容は参照により本明細書中に組入れられる）に開示されている）。空洞化気泡を形成しなかったレーザースポットは、試験から除外した。
in vivo画像処理
損傷生成後７日目に、共焦点高解像度走査レーザー検眼鏡（ＳＬＯ）フルオレセイン血管造影（ＦＡ）（０．３ｍｌの５％腹腔内注射フルオレセインナトリウム（ＦＳ：Ｍｏｏｒｆｉｅｌｄｓ Ｅｙｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌ, Ｌｏｎｄｏｎ, ＵＫから入手））を用いて、ＣＮＶおよび関連漏出のin vivo画像データを生成し、その１４日後に、第二画像処理を実施した。非処置ラットにおけるレーザーＰＣ後に得られた血管造影におけるフルオレセイン染色の強度および面積の変化の時間経過に関する従来の歴史的対照試験に基づいて、時点を選択した。これらの歴史的研究は、フルオレセイン染色がＰＣの４日後に最初に観察され、次いで、染色の強度が迅速に増大して、光凝固後約１４日でそのピークに達する、ということを示した（方法における一般バックグラウンドに関しては、Ｋａｍｉｚｕｒｕ ｅｔ ａｌ., ２００１； Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｒｕｇ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｏ ｃｈｏｒｏｉｄａｌ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ. Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ, ４２（１１）, ２６６４−２６７２；Ｔａｋｅｈａｎａ ｅｔ ａｌ., １９９９ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｌａｓｅｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｈｏｒｏｉｄａｌ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｏｒａｌ ｔｒａｎｉｌａｓｔ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ. Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ, ４０（２）, ４５９−４６６（これらの記載内容は参照により本明細書中に組入れられる）を参照）。これらの試験における実験的ＣＮＶの時間経過は、光凝固の約５週間後にフルオレセイン漏出が減少し始めた、ということを示したので、さらなる査定は実施しなかった。基線反射率（４８８ｎｍおよび７９０ｎｍでの）および自家蛍光（励起：４８８ｎｍ、発光：＞４９８ｎｍ）画像を得た後、ＦＡ画像における病変位置を突き止めるのを手助けするためにＦＳを注射した。ＦＳ注射直後に、動脈−静脈相を記録した。その後、フルオレセイン血管造影を注射の１分後に、そして注射の４分後に再び記録した。後者の４分データ組は、統計学的分析のために用いた。
画像データの評価および統計学的分析
後期（ＦＳ注射後４±１分）フルオレセイン血管造影法の定量的査定により、薬剤処置の作用を評価した。反射画像における病変に対応する過蛍光域の存在として、漏出を定義した。定量前に、分析に用いた画像全ての増分および輝度を正規化した。漏出直径（μｍ）にその領域での平均ピクセル輝度値（０〜１）を掛けることにより、後期フルオレセイン血管造影における漏出の強度および面積を定量した。非対合ｔ検定を用いて、試験群間の結果を比較した。Ｐ＜０．０５という値は、統計学的に有意であるとみなされた。別記しない限り、データは平均±ＳＥＭとして示される。画像分析を実施する前に、同定を取り急ぎ実施して、隠蔽方式で定量を実行した。
ラットＣＮＶ病変におけるマクロファージの免疫組織化学的検出
ＣＮＶ試験において蛍光血管造影を予め施しておいた眼を、直ちに摘出して、４％ｐ−ホルムアルデヒド中で固定した。次に、眼杯を各動物の処置眼から調製し、蝶形に４つの切れ込みを入れた後、平坦封入した。ＥＤ１ ｍＡｂを用いた免疫組織化学的染色により血管病変のマクロファージ含量を確定し、その後、ＥＤ１陽性細胞 −ＥＤ１（ＣＤ６８）ｍＡｂ（カタログ番号ＭＣＡ３４１ Serotech, Kidlington, Oxford, UK）を計数することにより定量した。
処置
以下の表（表９）は、各実験群に施された処置を示す。
Figure 2012528112
Figure 2012528112
各症例において、レーザーＰＣの直前に硝子体内注射することにより、化合物を投与した。
レーザー誘導性ＣＮＶ試験の結果
処置眼において、ＰＣ後７日目および１４日目の２つの時点で、高倍率フルオレセイン血管造影を実施した。実験的ＣＮＶに関連した脈絡膜漏出、ならびに特に言及した処置に関連した他の血管性異常に関して、画像を等級分けした。近赤外線反射率（ＩＲ）および自家蛍光モード（ＡＦ）の両方で、画像を記録した。ＩＲ画像を用いて、網膜中の病変を突き止めた後、フルオレセイン造影剤を注射した。ＲＰＥ（網膜色素上皮）のレベルで、全画像を記録した。
ラットＣＮＶにおけるＤＭＳ１５７１（ＶＥＧＦ−Ｄａｂ）およびエンブレル（商標）の作用
Figure 2012528112
ＤＭＳ１５７１に関して７日目および１４日目に査定したＣＮＶ漏出に関する平均＋／−ＳＥＭ。１．０−ビヒクル、 ２．０−２μｇ ＤＭＳ１５７１、 ３．０−１μｇ ＤＭＳ１５７１、 ４．０−０．５μｇ ＤＭＳ１５７１、 ５．０−０．２μｇ ＤＭＳ１５７１、 ６．０−０．１μｇ ＤＭＳ１５７１。レーザー損傷の導入直前に、作用物質を注射した。Ｎ＝５匹の動物／群（全症例で）。化合物は全て、２μｌの容量で硝子体内注射により投与した。
図１１は、表１０に示したデータのグラフである。化合物は全て、２μｌの容量で硝子体内注射により投与した。黒色バーは、７日目結果を表わす。白色バーは、１４日目結果を表わす。
Figure 2012528112
試験エンブレル（商標）に関して７日目および１４日目に査定したＣＮＶ漏出に関する平均＋／−ＳＥＭ。７．０−ビヒクル、 ８．０−３０μｇ エンブレル（商標）、 ９．０−１０ｕｇ エンブレル（商標）１、 １０．０−３μｇ エンブレル。 １１．０−１μｇ エンブレル（商標）、 １２．０−０．３μｇ エンブレル（商標）。レーザー損傷の導入直前に、作用物質を注射した。Ｎ＝５匹の動物／群（全症例で）。化合物は全て、２μｌの容量で硝子体内注射により投与した。
図１２は、表１１に示したデータのグラフである。化合物は全て、２μｌの容量で硝子体内注射により投与した。黒色バーは、７日目結果を表わす。白色バーは、１４日目結果を表わす。
図１３は、レーザーＰＣ後７日目（ＦＳ初回）および１４日目（ＦＳ２回目）での、赤外線（ＩＲ、上左パネル）、自家蛍光（ＡＦ、下左パネル）およびフルオレセイン血管造影（ＦＳ、大型パネル）を示す −画像例を示す：１． ビヒクル処置眼、 ２． ２μｇのＤＭＳ１５７１で処置した眼、および８． ３０μｇのエンブレル（商標）で処置した眼。ＣＮＶ病変は、ＤＭＳ１５７１による処置に応答する病変より断続的に現れ、低散在性である、ということは注目に値する。矢印は、対照およびエンブレル（商標）処置動物の両方で示された新血管新生を示す。しかしＤＭＳ１５７１動物では示されなかった。
Figure 2012528112
ＤＭＳ４０００に関して７日目および１４日目に査定したＣＮＶ漏出に関する平均＋／−ＳＥＭ。１３．０−２μｇ ＤＭＳ４０００、 １４．０−ビヒクル。レーザー損傷の導入直前に、作用物質を注射した。Ｎ＝５匹の動物／群（全症例で）。化合物は全て、２μｌの容量で硝子体内注射により投与した。
図１４は、表１２に示したデータのグラフである。化合物は全て、２μｌの容量で硝子体内注射により投与した。
ラットＣＮＶ病変のマクロファージ含量に及ぼすＤＭＳ１５７１（ＶＥＧＦ−ｄａｂ）およびエンブレル（商標）の作用
Figure 2012528112
＊ｐ＜０．００１６（対対照）、ｎ＝５（各症例における眼の数）
図１５は、ＥＤ１ ｍａｂで染色した平坦封入網膜の顕微鏡写真例を示す。パネル１Ａ〜１Ｂおよびパネルエンブレル８．４は、抗ＶＥＧＦ（ＤＭＳ１５７１）（１Ａ）、ビヒクルのみ（１Ｂ）またはエンブレル（エンブレル８．４）で処置した眼からの網膜の平坦封入を示す。レーザー熱傷部位に関連したマクロファージを、いいＤ１で可視化した（ＣＤ６８、黒色）（倍率２０倍）。パネル１Ｄは、網膜の内顆粒層（ＩＮＬ）に侵入した、レーザー熱傷部位に伴うマクロファージ（ＥＤ１＋、黒色）を示す網膜のクリオスタット切片（２０μｍ）である。ＲＧＣ 網膜神経節細胞層；ＢＶ 血管。（倍率２０倍）
結論
結果は、ＤＭＳ１５７１がＣＮＶ疾患を有意に減衰させるのに有効である、ということを例証している。１μｇを上回る用量で、強力且つ活発な作用が認められた。０．５μｇの用量は準最大作用を示し、０．５μｇ未満の用量では、治療薬は有効でなかった。３０μｇの用量のエンブレル（商標）も当該モデルにおいて有効であり、それより引く用量では有効でない、ということが実験で示された。ＶＥＧＦ阻害剤（例えばＤＭＳ１５７１）およびＴＮＦαの阻害剤（例えばエンブレル（商標））がともに、独立して、齧歯類モデルにおける脈絡膜新血管性疾患を減衰し得るという知見は、ＶＥＧＦおよびＴＮＦα能力の両方を含む単一治療薬（例えばＤＭＳ４０００）が脈絡膜新血管性ＡＭＤの治療に有用である、ということを示唆する。ＤＭＳ４０００（ＴＮＦα結合機能はラットＴＮＦアルファの結合と互換性がない）は、等価用量でのＤＭＳ１５７１と同様にラットＣＮＶモデルにおいて等しく良好に作動する、ということが観察される。
ＤＭＳ１５７１処置眼をエンブレル（商標）処置眼と比較した場合、エンブレル（商標）眼は、ＤＭＳ１５７１処置眼と比較して病変がより断続的且つ低散在的に現れる特有のパターンを示す、ということが蛍光血管造影写真から認められる。病変パターンにおけるこれらの差異は、ＤＭＳ１５７１（ＶＥＧＦアンタゴニスト）およびエンブレル（商標）（ＴＮＦαアンタゴニスト）治療薬の個々の機序を明確に示唆している。この主張は、エンブレル（商標）処置群において、有意に少数のマクロファージがＣＮＶ血管病変に動員される、という知見によりさらに支持される。
実施例１３ in vivo試験：ラットにおけるレーザー誘導性脈絡膜新血管新生（ＣＮＶ）：組合せでのＤＭＳ１５７１（ＶＥＧＦ−ｄａｂ）およびエンブレル（商標）の試験
本実施例に用いた方法は、実施例１２に示したものと本質的に同じであった。
Figure 2012528112
＊ビヒクル − ５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、１０ｍＭ トリスＨＣｌ、ｐＨ７．４、１０４ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２５％トゥイーン８０、４％マンニトール、１％スクロース。
＃ＤＭＳ１５７１およびエンブレル（商標）がともに、一緒に投与される場合には、各々１μｌが投与される。

Figure 2012528112
実施例１４ − ＤＭＥモデル − 予測実施例
本明細書中に開示される抗原結合タンパク質は、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）を治療しおよび／または予防するのに有効であると予測される。これは、糖尿病性黄斑浮腫モデルで立証され得る。この場合、でＭＥおよび網膜血管漏出は、高血糖症の開始後に観察される（Ｉｓｈｉｄａ, Ｔ. Ｕｓｕｉ ａｎｄ Ｋ. Ｙａｍａｓｈｉｒｏ ｅｔ ａｌ. （ＶＥＧＦ１６４ ｉｓ ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒｅｔｉｎａ, Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ４４ （２００３）， ｐｐ. ２１５５−２１６２）。
配列
Figure 2012528112
Figure 2012528112
Figure 2012528112
Figure 2012528112
Figure 2012528112
配列番号1
EVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSS

配列番号2
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDTHNAYNGYYRITYGETGGNSPVREFTVPHPEVTATISGLKPGVDDTITVYAVTNHHMPLRIFGPISINHRT

配列番号3
GGGGS

配列番号4
TVAAPS

配列番号5
ASTKGPT

配列番号6
ASTKGPS

配列番号7
GS

配列番号8
TVAAPSGS

配列番号9
MGWSCIILFLVATATGVHS

配列番号10
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号11
GATATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCTCTGTGGGCGATAGAGTGACCATCACCTGCCGGGCCAGCCAGGGCATCAGAAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGCCGCCAGCACCCTGCAGAGCGGCGTGCCCAGCAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACGTGGCCACCTACTACTGCCAGCGGTACAACAGAGCCCCTTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTCAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAAGTGCAGTGGAAAGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAAGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC

配列番号12
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

配列番号13
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCCGGCAGAAGCCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGACGACTACGCCATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCGCCATCACCTGGAATAGCGGCCACATCGACTACGCCGACAGCGTGGAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAAGGTGTCCTACCTGAGCACCGCCAGCAGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTCTCGAGCGCTAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAATAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACTCCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAAGTGGACAAGAAAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGATAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGACCTAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGCGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGAGCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGAGAGCCCCAGGTCTACACCCTGCCTCCCTCCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGTCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTCGACCGGTGAGGTGCAGCTGTTGGTGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAAGGCTTATCCGATGATGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTTTCAGAGATTTCGCCTTCGGGTTCTTATACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGATCCTCGGAAGTTAGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC

配列番号14
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSTGEVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSS

配列番号15
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号16
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSTGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGPELRWYQQKPGKAPKLLIYHTSILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYMFQPMTFGQGTKVEIKR

配列番号17
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAHETMVWVRQAPGKGLEWVSHIPPDGQDPFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYHCALLPKRGPWFDYWGQGTLVTVSS

配列番号18
EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT

配列番号19
DGGGIRRSMSGTWYLKAMTVDREFPEMNLESVTPMTLTLLKGHNLEAKVTMLISGRCQEVKAVLGRTKERKKYTADGGKHVAYIIPSAVRDHVIFYSEGQLHGKPVRGVKLVGRDPKNNLEALEDFEKAAGARGLSTESILIPRQSETCSPG

配列番号20
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号21
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

配列番号22
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号23
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKFDYWGQGTLVTVSS

配列番号24
EVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号25
STG

配列番号26
ATGCATGTCGCCCAGCCAGCGGTGGTGCTGGCCAGCTCCCGCGGCATTGCCTCCTTCGTGTGCGAGTACGCCAGCCCCGGCAAGGCCACCGAGGTGCGCGTCACGGTGCTCCGCCAGGCCGATAGCCAGGTGACCGAAGTGTGTGCCGCTACGTACATGATGGGGAACGAGCTGACCTTCCTGGACGACTCTATCTGCACCGGGACCTCGAGCGGGAACCAGGTGAACCTGACCATCCAGGGCCTGCGCGCGATGGACACGGGCCTGTACATCTGCAAGGTGGAGTTGATGTACCCCCCCCCGTACTACCTGGGGATCGGCAACGGCACGCAGATCTACGTCATCGACCCCGAACCTTGCCCTGACAGCGACCAGGAGCCCAAGTCTAGTGACAAGACCCATACCTCTCCCCCCAGCCCCGCTCCAGAGCTGCTGGGGGGCTCCAGCGTGTTCCTGTTTCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCAGAACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTCGTGGATGTGAGTCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGGGTGGAGGTGCATAACGCCAAGACCAAGCCTCGCGAGGAGCAGTACAACAGTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCATCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAACAAGGCCTTGCCCGCCCCCATCGAGAAAACAATCTCCAAGGCCAAAGGGCAGCCCAGGGAACCTCAGGTGTACACCCTCCCTCCAAGCCGTGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTCTCTCTGACCTGCTTGGTGAAGGGCTTCTACCCTAGCGACATCGCTGTGGAGTGGGAGTCCAACGGGCAGCCCGAGAACAACTACAAAACCACCCCGCCCGTGCTGGACTCTGACGGCTCCTTCTTCCTGTACAGCAAACTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGAAACGTGTTCAGCTGCAGCGTCATGCATGAGGCCCTGCATAACCATTACACACAGAAGAGCCTGTCCCTGAGCCCCGGCAAGGGATCCGAGGTGGTGGCCGCCACCCCCACCAGCCTGCTGATTTCCTGGAGGCACCCCCACTTCCCCACACGCTACTACAGGATCACCTACGGCGAGACCGGCGGCAACAGCCCCGTGCAGGAGTTCACCGTGCCCCTGCAGCCTCCCACTGCCACCATCAGCGGCCTCAAGCCCGGCGTGGACTACACCATCACCGTGTACGCCGTCACCGACGGAAGGAACGGCAGGCTGCTGAGCATCCCCATCAGCATCAACTACAGGACC

配列番号27
MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT

配列番号28
ATGCATGTCGCCCAGCCAGCGGTGGTGCTGGCCAGCTCCCGCGGCATTGCCTCCTTCGTGTGCGAGTACGCCAGCCCCGGCAAGGCCACCGAGGTGCGCGTCACGGTGCTCCGCCAGGCCGATAGCCAGGTGACCGAAGTGTGTGCCGCTACGTACATGATGGGGAACGAGCTGACCTTCCTGGACGACTCTATCTGCACCGGGACCTCGAGCGGGAACCAGGTGAACCTGACCATCCAGGGCCTGCGCGCGATGGACACGGGCCTGTACATCTGCAAGGTGGAGTTGATGTACCCCCCCCCGTACTACCTGGGGATCGGCAACGGCACGCAGATCTACGTCATCGACCCCGAACCTTGCCCTGACAGCGACCAGGAGCCCAAGTCTAGTGACAAGACCCATACCTCTCCCCCCAGCCCCGCTCCAGAGCTGCTGGGGGGCTCCAGCGTGTTCCTGTTTCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCAGAACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTCGTGGATGTGAGTCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGGGTGGAGGTGCATAACGCCAAGACCAAGCCTCGCGAGGAGCAGTACAACAGTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCATCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAACAAGGCCTTGCCCGCCCCCATCGAGAAAACAATCTCCAAGGCCAAAGGGCAGCCCAGGGAACCTCAGGTGTACACCCTCCCTCCAAGCCGTGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTCTCTCTGACCTGCTTGGTGAAGGGCTTCTACCCTAGCGACATCGCTGTGGAGTGGGAGTCCAACGGGCAGCCCGAGAACAACTACAAAACCACCCCGCCCGTGCTGGACTCTGACGGCTCCTTCTTCCTGTACAGCAAACTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGAAACGTGTTCAGCTGCAGCGTCATGCATGAGGCCCTGCATAACCATTACACACAGAAGAGCCTGTCCCTGAGCCCCGGCAAGGGATCCGAGGTGCAGCTCCTGGTCAGCGGCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGGAGGCTCACTGAGGCTGAGCTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAAGGCCTACCCCATGATGTGGGTCAGGCAGGCCCCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGGTGTCTGAGATCAGCCCCAGCGGCAGCTACACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCTCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGGACCCCAGGAAGCTGGACTATTGGGGCCAGGGCACTCTGGTGACCGTGAGCAGC

配列番号29
MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSEVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSS

配列番号30
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGNGLEWVAFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGIAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
配列番号31
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKR
配列番号32
EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFIFSNHWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRSKSINSATHYAESVKGRFTISRDDSKSAVYLQMTDLRTEDTGVYYCSRNYYGSTYDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号33
DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQFVGSSIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESMSGIPSRFSGSGSGTDFTLSINTVESEDIADYYCQQSHSWPFTFGSGTNLEVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号34
LPAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMCCSKCSPGQHAKVFCTKTSDTVCDSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRICTCRPGWYCALSKQEGCRLCAPLRKCRPGFGVARPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDICRPHQICNVVAIPGNASMDAVCTSTSPTRSMAPGAVHLPQPVSTRSQHTQPTPEPSTAPSTSFLLPMGPSPPAEGSTGDEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号35
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASELQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
配列番号36
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
配列番号37
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLIPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
配列番号38
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDVVWYQQRPGKAPKLLIYSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSSGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTHYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRFTFSLETSASTVYMELTSLTSDDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSS
配列番号39
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYDFTHYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPYYYGTSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHL
配列番号40
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

配列番号41
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGFDPEDGETIYAQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATGRSMFRGVIIPFNGMDVWGQGTTVTVSS
配列番号42
DIRMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKR
配列番号43
SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号44
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGPELRWYQQKPGKAPKLLIYHTSILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYMFQPMTFGQGTKVEIRG
配列番号45
EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT
配列番号46
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCCGGCAGAAGCCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGACGACTACGCCATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCGCCATCACCTGGAATAGCGGCCACATCGACTACGCCGACAGCGTGGAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAAGGTGTCCTACCTGAGCACCGCCAGCAGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTCTCGAGCGCTAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAATAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACTCCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAAGTGGACAAGAAAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGATAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGGCCGGCGCCCCTAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGCGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGAGCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGAGAGCCCCAGGTCTACACCCTGCCTCCCTCCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGTCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTCGACCGGTGAGGTGCAGCTGCTGGTGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAAGGCCTACCCCATGATGTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGTCCGAGATCAGCCCCAGCGGCAGCTACACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGGACCCCCGGAAGCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC
配列番号47
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSTGEVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSS
配列番号48
CTGCCCGCTCAGGTGGCCTTCACTCCCTACGCCCCAGAGCCCGGCTCTACCTGCAGGCTGAGGGAGTACTACGACCAGACCGCCCAGATGTGCTGCAGCAAGTGCAGCCCCGGCCAGCACGCCAAAGTGTTCTGCACCAAGACCAGCGACACCGTGTGCGATAGCTGCGAGGACAGCACCTACACCCAGCTGTGGAACTGGGTCCCCGAGTGCCTGAGCTGCGGCTCTAGGTGTAGCAGCGACCAGGTCGAGACCCAGGCCTGCACCAGGGAACAGAACCGGATCTGCACATGCAGGCCCGGCTGGTACTGCGCCCTCAGCAAACAGGAGGGCTGCAGGCTGTGTGCCCCCCTCAGGAAGTGCAGGCCCGGGTTTGGCGTGGCCAGGCCCGGAACCGAGACTAGCGACGTGGTGTGCAAACCCTGCGCCCCCGGCACCTTCAGCAATACCACTAGCAGCACCGACATCTGCAGGCCTCACCAGATCTGCAACGTGGTGGCCATTCCCGGCAACGCAAGCATGGACGCCGTGTGCACCAGCACCAGCCCCACCAGGTCAATGGCCCCTGGAGCCGTGCATCTGCCCCAGCCCGTGAGCACCAGAAGCCAGCACACCCAGCCTACCCCCGAGCCCAGCACCGCCCCTAGCACCAGCTTCCTGCTGCCTATGGGCCCCTCCCCTCCCGCCGAGGGCTCAACCGGCGACGAACCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCACCAGAACTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGAGCGTCCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAAGGCCAGCCCAGGGAGCCACAGGTGTACACACTGCCCCCCAGCAGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTATCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTCCTGGACTCCGACGGGAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAGTCGACCGGTGAGGTGCAGCTGCTGGTGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAAGGCCTACCCCATGATGTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGTCCGAGATCAGCCCCAGCGGCAGCTACACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGGACCCCCGGAAGCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC
配列番号49
LPAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMCCSKCSPGQHAKVFCTKTSDTVCDSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRICTCRPGWYCALSKQEGCRLCAPLRKCRPGFGVARPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDICRPHQICNVVAIPGNASMDAVCTSTSPTRSMAPGAVHLPQPVSTRSQHTQPTPEPSTAPSTSFLLPMGPSPPAEGSTGDEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSTGEVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSS
配列番号50
CTGCCCGCTCAGGTGGCCTTCACTCCCTACGCCCCAGAGCCCGGCTCTACCTGCAGGCTGAGGGAGTACTACGACCAGACCGCCCAGATGTGCTGCAGCAAGTGCAGCCCCGGCCAGCACGCCAAAGTGTTCTGCACCAAGACCAGCGACACCGTGTGCGATAGCTGCGAGGACAGCACCTACACCCAGCTGTGGAACTGGGTCCCCGAGTGCCTGAGCTGCGGCTCTAGGTGTAGCAGCGACCAGGTCGAGACCCAGGCCTGCACCAGGGAACAGAACCGGATCTGCACATGCAGGCCCGGCTGGTACTGCGCCCTCAGCAAACAGGAGGGCTGCAGGCTGTGTGCCCCCCTCAGGAAGTGCAGGCCCGGGTTTGGCGTGGCCAGGCCCGGAACCGAGACTAGCGACGTGGTGTGCAAACCCTGCGCCCCCGGCACCTTCAGCAATACCACTAGCAGCACCGACATCTGCAGGCCTCACCAGATCTGCAACGTGGTGGCCATTCCCGGCAACGCAAGCATGGACGCCGTGTGCACCAGCACCAGCCCCACCAGGTCAATGGCCCCTGGAGCCGTGCATCTGCCCCAGCCCGTGAGCACCAGAAGCCAGCACACCCAGCCTACCCCCGAGCCCAGCACCGCCCCTAGCACCAGCTTCCTGCTGCCTATGGGCCCCTCCCCTCCCGCCGAGGGCTCAACCGGCGACGAACCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCACCAGAACTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGAGCGTCCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAAGGCCAGCCCAGGGAGCCACAGGTGTACACACTGCCCCCCAGCAGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTATCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTCCTGGACTCCGACGGGAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAGACCGTGGCGGCGCCCAGCACGGTGGCCGCCCCCTCCACCGTCGCCGCGCCAAGCACCGTGGCTGCTCCGTCGACCGGTGAGGTGCAGCTGCTGGTGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAAGGCCTACCCCATGATGTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGTCCGAGATCAGCCCCAGCGGCAGCTACACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGGACCCCCGGAAGCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC
配列番号51
LPAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMCCSKCSPGQHAKVFCTKTSDTVCDSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRICTCRPGWYCALSKQEGCRLCAPLRKCRPGFGVARPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDICRPHQICNVVAIPGNASMDAVCTSTSPTRSMAPGAVHLPQPVSTRSQHTQPTPEPSTAPSTSFLLPMGPSPPAEGSTGDEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSTVAAPSTVAAPSTVAAPSTGEVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSS
配列番号52
ATTATGGGATCCACCGGCGAGGTGCAGCTGTTGGTGT
配列番号53
GCTGGGGCCCTTGGTGCTAGCGCTCGAGACGGTGACCAGG
配列番号54
CTCGAGCGCTAGCACCAAGGGCCCCAGCGACATCCAGATGACCC
配列番号55
TTATGTCAAGCTTTTACCGTTTGATTTCCACCTTGGT
配列番号56
ATTATGGGATCCACCGGCGACATCCAGATGACCCAGTCTCC
配列番号57
GCGCCGCCACCGTACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCC
配列番号58
CAAACGTACGGTGGCGGCGCCGAGCGAGGTGCAGCTGTTGGTGTC
配列番号59
TTATGTCAAGCTTTTAGCTCGAGACGGTGACCAG
配列番号60
GGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCGGCGCCGAGCGA
配列番号61
GAGGTGCAGCTGTTGGTGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAAGGCTTATCCGATGATGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTTTCAGAGATTTCGCCTTCGGGTTCTTATACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGATCCTCGGAAGTTAGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCTAGCACCAAGGGCCCCAGCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCTCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGATAGTTATTTACATTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAGTGCATCCGAGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGGTTGTGTGGCGTCCTTTTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG
配列番号62
EVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASELQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
配列番号63
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCTCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGATAGTTATTTACATTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAGTGCATCCGAGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGGTTGTGTGGCGTCCTTTTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCGGCGCCGAGCGAGGTGCAGCTGTTGGTGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAAGGCTTATCCGATGATGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTTTCAGAGATTTCGCCTTCGGGTTCTTATACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGATCCTCGGAAGTTAGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
配列番号64
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASELQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKRTVAAPSEVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSS
配列番号65
EVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSSASTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSEQKLISEEDLN
配列番号66
GSTVAAPSGSTVAAPSGS
配列番号67
GSTVAAPSGSTVAAPSGSTVAAPSGS
配列番号68
GSTVAAPSGSTVAAPSGSTVAAPSGSTVAAPSGS
配列番号69
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSTVAAPSGSEVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSS
配列番号70
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSTVAAPSGSTVAAPSGSEVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSS

配列番号71
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSTVAAPSGSTVAAPSGSTVAAPSGSEVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSS
配列番号72
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSTVAAPSGSTVAAPSGSTVAAPSGSTVAAPSGSEVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSS
配列番号73
LPAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMCCSKCSPGQHAKVFCTKTSDTVCDSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRICTCRPGWYCALSKQEGCRLCAPLRKCRPGFGVARPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDICRPHQICNVVAIPGNASMDAVCTSTSPTRSMAPGAVHLPQPVSTRSQHTQPTPEPSTAPSTSFLLPMGPSPPAEGSTGDEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSEVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSS
配列番号74
LPAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMCCSKCSPGQHAKVFCTKTSDTVCDSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRICTCRPGWYCALSKQEGCRLCAPLRKCRPGFGVARPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDICRPHQICNVVAIPGNASMDAVCTSTSPTRSMAPGAVHLPQPVSTRSQHTQPTPEPSTAPSTSFLLPMGPSPPAEGSTGDEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGPELRWYQQKPGKAPKLLIYHTSILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYMFQPMTFGQGTKVEIKR
配列番号75
LPAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMCCSKCSPGQHAKVFCTKTSDTVCDSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRICTCRPGWYCALSKQEGCRLCAPLRKCRPGFGVARPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDICRPHQICNVVAIPGNASMDAVCTSTSPTRSMAPGAVHLPQPVSTRSQHTQPTPEPSTAPSTSFLLPMGPSPPAEGSTGDEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSDGGGIRRSMSGTWYLKAMTVDREFPEMNLESVTPMTLTLLKGHNLEAKVTMLISGRCQEVKAVLGRTKERKKYTADGGKHVAYIIPSAVRDHVIFYSEGQLHGKPVRGVKLVGRDPKNNLEALEDFEKAAGARGLSTESILIPRQSETCSPG
配列番号76
EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFIFSNHWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRSKSINSATHYAESVKGRFTISRDDSKSAVYLQMTDLRTEDTGVYYCSRNYYGSTYDYWGQGTTLTVSSASTKGPSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV
配列番号77
DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQFVGSSIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESMSGIPSRFSGSGSGTDFTLSINTVESEDIADYYCQQSHSWPFTFGSGTNLEVKRTVAAPSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号78
EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFIFSNHWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRSKSINSATHYAESVKGRFTISRDDSKSAVYLQMTDLRTEDTGVYYCSRNYYGSTYDYWGQGTTLTVSSASTKGPSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGFDPEDGETIYAQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATGRSMFRGVIIPFNGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号79
DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQFVGSSIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESMSGIPSRFSGSGSGTDFTLSINTVESEDIADYYCQQSHSWPFTFGSGTNLEVKRTVAAPSDIRMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号80
EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFIFSNHWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRSKSINSATHYAESVKGRFTISRDDSKSAVYLQMTDLRTEDTGVYYCSRNYYGSTYDYWGQGTTLTVSSASTKGPSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYDFTHYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPYYYGTSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHL
配列番号81
DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQFVGSSIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESMSGIPSRFSGSGSGTDFTLSINTVESEDIADYYCQQSHSWPFTFGSGTNLEVKRTVAAPSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号82
EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFIFSNHWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRSKSINSATHYAESVKGRFTISRDDSKSAVYLQMTDLRTEDTGVYYCSRNYYGSTYDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSEVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSS
配列番号83
EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFIFSNHWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRSKSINSATHYAESVKGRFTISRDDSKSAVYLQMTDLRTEDTGVYYCSRNYYGSTYDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGPELRWYQQKPGKAPKLLIYHTSILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYMFQPMTFGQGTKVEIKR
配列番号84
EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFIFSNHWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRSKSINSATHYAESVKGRFTISRDDSKSAVYLQMTDLRTEDTGVYYCSRNYYGSTYDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSDGGGIRRSMSGTWYLKAMTVDREFPEMNLESVTPMTLTLLKGHNLEAKVTMLISGRCQEVKAVLGRTKERKKYTADGGKHVAYIIPSAVRDHVIFYSEGQLHGKPVRGVKLVGRDPKNNLEALEDFEKAAGARGLSTESILIPRQSETCSPG
配列番号85
DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQFVGSSIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESMSGIPSRFSGSGSGTDFTLSINTVESEDIADYYCQQSHSWPFTFGSGTNLEVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECTVAAPSEVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSS
配列番号86
DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQFVGSSIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESMSGIPSRFSGSGSGTDFTLSINTVESEDIADYYCQQSHSWPFTFGSGTNLEVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECTVAAPSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGPELRWYQQKPGKAPKLLIYHTSILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYMFQPMTFGQGTKVEIKR
配列番号87
DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQFVGSSIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESMSGIPSRFSGSGSGTDFTLSINTVESEDIADYYCQQSHSWPFTFGSGTNLEVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECTVAAPSDGGGIRRSMSGTWYLKAMTVDREFPEMNLESVTPMTLTLLKGHNLEAKVTMLISGRCQEVKAVLGRTKERKKYTADGGKHVAYIIPSAVRDHVIFYSEGQLHGKPVRGVKLVGRDPKNNLEALEDFEKAAGARGLSTESILIPRQSETCSPG
配列番号88
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号89
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号90
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGFDPEDGETIYAQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATGRSMFRGVIIPFNGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号91
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSDIRMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号92
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYDFTHYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPYYYGTSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHL
配列番号93
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号94
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSDGGGIRRSMSGTWYLKAMTVDREFPEMNLESVTPMTLTLLKGHNLEAKVTMLISGRCQEVKAVLGRTKERKKYTADGGKHVAYIIPSAVRDHVIFYSEGQLHGKPVRGVKLVGRDPKNNLEALEDFEKAAGARGLSTESILIPRQSETCSPG
配列番号95
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECTVAAPSEVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSS
配列番号96
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECTVAAPSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGPELRWYQQKPGKAPKLLIYHTSILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYMFQPMTFGQGTKVEIKR
配列番号97
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECTVAAPSDGGGIRRSMSGTWYLKAMTVDREFPEMNLESVTPMTLTLLKGHNLEAKVTMLISGRCQEVKAVLGRTKERKKYTADGGKHVAYIIPSAVRDHVIFYSEGQLHGKPVRGVKLVGRDPKNNLEALEDFEKAAGARGLSTESILIPRQSETCSPG
配列番号98
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGNGLEWVAFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGIAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号99
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKRTVAAPSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号100
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGNGLEWVAFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGIAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGFDPEDGETIYAQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATGRSMFRGVIIPFNGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号101
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKRTVAAPSDIRMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号102
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGNGLEWVAFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGIAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYDFTHYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPYYYGTSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHL
配列番号103
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKRTVAAPSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号104
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGNGLEWVAFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGIAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSEVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSS

配列番号105
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGNGLEWVAFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGIAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGPELRWYQQKPGKAPKLLIYHTSILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYMFQPMTFGQGTKVEIKR
配列番号106
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGNGLEWVAFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGIAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSDGGGIRRSMSGTWYLKAMTVDREFPEMNLESVTPMTLTLLKGHNLEAKVTMLISGRCQEVKAVLGRTKERKKYTADGGKHVAYIIPSAVRDHVIFYSEGQLHGKPVRGVKLVGRDPKNNLEALEDFEKAAGARGLSTESILIPRQSETCSPG
配列番号107
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECTVAAPSEVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSS
配列番号108
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECTVAAPSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGPELRWYQQKPGKAPKLLIYHTSILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYMFQPMTFGQGTKVEIKR
配列番号109
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECTVAAPSDGGGIRRSMSGTWYLKAMTVDREFPEMNLESVTPMTLTLLKGHNLEAKVTMLISGRCQEVKAVLGRTKERKKYTADGGKHVAYIIPSAVRDHVIFYSEGQLHGKPVRGVKLVGRDPKNNLEALEDFEKAAGARGLSTESILIPRQSETCSPG
配列番号110
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTHYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRFTFSLETSASTVYMELTSLTSDDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号111
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDVVWYQQRPGKAPKLLIYSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKLEVKRTVAAPSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号112
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTHYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRFTFSLETSASTVYMELTSLTSDDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGFDPEDGETIYAQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATGRSMFRGVIIPFNGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号113
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDVVWYQQRPGKAPKLLIYSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKLEVKRTVAAPSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKRTVAAPSDIRMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号114
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTHYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRFTFSLETSASTVYMELTSLTSDDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYDFTHYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPYYYGTSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHL
配列番号115
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDVVWYQQRPGKAPKLLIYSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKLEVKRTVAAPSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号116
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDVVWYQQRPGKAPKLLIYSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSSGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTHYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRFTFSLETSASTVYMELTSLTSDDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSEVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSS
配列番号117
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDVVWYQQRPGKAPKLLIYSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSSGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTHYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRFTFSLETSASTVYMELTSLTSDDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGPELRWYQQKPGKAPKLLIYHTSILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYMFQPMTFGQGTKVEIKR
配列番号118
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDVVWYQQRPGKAPKLLIYSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSSGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTHYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRFTFSLETSASTVYMELTSLTSDDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSDGGGIRRSMSGTWYLKAMTVDREFPEMNLESVTPMTLTLLKGHNLEAKVTMLISGRCQEVKAVLGRTKERKKYTADGGKHVAYIIPSAVRDHVIFYSEGQLHGKPVRGVKLVGRDPKNNLEALEDFEKAAGARGLSTESILIPRQSETCSPG
配列番号119
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASELQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKRTVAAPSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGPELRWYQQKPGKAPKLLIYHTSILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYMFQPMTFGQGTKVEIKR
配列番号120
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASELQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKRTVAAPSDGGGIRRSMSGTWYLKAMTVDREFPEMNLESVTPMTLTLLKGHNLEAKVTMLISGRCQEVKAVLGRTKERKKYTADGGKHVAYIIPSAVRDHVIFYSEGQLHGKPVRGVKLVGRDPKNNLEALEDFEKAAGARGLSTESILIPRQSETCSPG
配列番号121
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDTHNAYNGYYRITYGETGGNSPVREFTVPHPEVTATISGLKPGVDDTITVYAVTNHHMPLRIFGPISINHRTTVAAPSEVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSS
配列番号122
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDTHNAYNGYYRITYGETGGNSPVREFTVPHPEVTATISGLKPGVDDTITVYAVTNHHMPLRIFGPISINHRTTVAAPSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGPELRWYQQKPGKAPKLLIYHTSILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYMFQPMTFGQGTKVEIKR
配列番号123
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDTHNAYNGYYRITYGETGGNSPVREFTVPHPEVTATISGLKPGVDDTITVYAVTNHHMPLRIFGPISINHRTTVAAPSDGGGIRRSMSGTWYLKAMTVDREFPEMNLESVTPMTLTLLKGHNLEAKVTMLISGRCQEVKAVLGRTKERKKYTADGGKHVAYIIPSAVRDHVIFYSEGQLHGKPVRGVKLVGRDPKNNLEALEDFEKAAGARGLSTESILIPRQSETCSPG
配列番号124
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSDIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDVVWYQQRPGKAPKLLIYSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSSGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTHYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRFTFSLETSASTVYMELTSLTSDDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSS
配列番号125
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECTVAAPSDIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDVVWYQQRPGKAPKLLIYSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSSGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTHYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRFTFSLETSASTVYMELTSLTSDDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSS
配列番号126
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASELQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
配列番号127
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECTVAAPSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASELQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
配列番号128
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDTHNAYNGYYRITYGETGGNSPVREFTVPHPEVTATISGLKPGVDDTITVYAVTNHHMPLRIFGPISINHRT
配列番号129
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECTVAAPSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDTHNAYNGYYRITYGETGGNSPVREFTVPHPEVTATISGLKPGVDDTITVYAVTNHHMPLRIFGPISINHRT
配列番号130
SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSDIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDVVWYQQRPGKAPKLLIYSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSSGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTHYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRFTFSLETSASTVYMELTSLTSDDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSS
配列番号131
SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASELQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
配列番号132
SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDTHNAYNGYYRITYGETGGNSPVREFTVPHPEVTATISGLKPGVDDTITVYAVTNHHMPLRIFGPISINHRT
配列番号133
EVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSDIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDVVWYQQRPGKAPKLLIYSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSSGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTHYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRFTFSLETSASTVYMELTSLTSDDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSS
配列番号134
EVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSSASTKGSPVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDTHNAYNGYYRITYGETGGNSPVREFTVPHPEVTATISGLKPGVDDTITVYAVTNHHMPLRIFGPISINHRT
配列番号135
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGPELRWYQQKPGKAPKLLIYHTSILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYMFQPMTFGQGTKVEIKRTVAAPSDIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDVVWYQQRPGKAPKLLIYSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSSGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTHYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRFTFSLETSASTVYMELTSLTSDDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSS
配列番号136
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGPELRWYQQKPGKAPKLLIYHTSILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYMFQPMTFGQGTKVEIKRTVAAPSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASELQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
配列番号137
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGPELRWYQQKPGKAPKLLIYHTSILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYMFQPMTFGQGTKVEIKRTVAAPSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDTHNAYNGYYRITYGETGGNSPVREFTVPHPEVTATISGLKPGVDDTITVYAVTNHHMPLRIFGPISINHRT
配列番号138
DGGGIRRSMSGTWYLKAMTVDREFPEMNLESVTPMTLTLLKGHNLEAKVTMLISGRCQEVKAVLGRTKERKKYTADGGKHVAYIIPSAVRDHVIFYSEGQLHGKPVRGVKLVGRDPKNNLEALEDFEKAAGARGLSTESILIPRQSETCSPGTVAAPSDIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDVVWYQQRPGKAPKLLIYSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSSGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTHYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRFTFSLETSASTVYMELTSLTSDDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSS
配列番号139
DGGGIRRSMSGTWYLKAMTVDREFPEMNLESVTPMTLTLLKGHNLEAKVTMLISGRCQEVKAVLGRTKERKKYTADGGKHVAYIIPSAVRDHVIFYSEGQLHGKPVRGVKLVGRDPKNNLEALEDFEKAAGARGLSTESILIPRQSETCSPGTVAAPSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASELQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
配列番号140
DGGGIRRSMSGTWYLKAMTVDREFPEMNLESVTPMTLTLLKGHNLEAKVTMLISGRCQEVKAVLGRTKERKKYTADGGKHVAYIIPSAVRDHVIFYSEGQLHGKPVRGVKLVGRDPKNNLEALEDFEKAAGARGLSTESILIPRQSETCSPGTVAAPSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDTHNAYNGYYRITYGETGGNSPVREFTVPHPEVTATISGLKPGVDDTITVYAVTNHHMPLRIFGPISINHRT
配列番号141
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCCGGCAGAAGCCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGACGACTACGCCATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCGCCATCACCTGGAATAGCGGCCACATCGACTACGCCGACAGCGTGGAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAAGGTGTCCTACCTGAGCACCGCCAGCAGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTCTCGAGCGCTAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAATAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACTCCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAAGTGGACAAGAAAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGATAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGGCCGGCGCCCCTAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGCGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGAGCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGAGAGCCCCAGGTCTACACCCTGCCTCCCTCCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGTCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGATCCACCGTGGCCGCTCCCAGCGGATCAGAGGTGCAGCTGCTGGTGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAAGGCCTACCCCATGATGTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGTCCGAGATCAGCCCCAGCGGCAGCTACACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGGACCCCCGGAAGCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC
配列番号142
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCCGGCAGAAGCCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGACGACTACGCCATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCGCCATCACCTGGAATAGCGGCCACATCGACTACGCCGACAGCGTGGAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAAGGTGTCCTACCTGAGCACCGCCAGCAGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTCTCGAGCGCTAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAATAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACTCCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAAGTGGACAAGAAAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGATAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGGCCGGCGCCCCTAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGCGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGAGCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGAGAGCCCCAGGTCTACACCCTGCCTCCCTCCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGTCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGATCCACAGTGGCTGCACCTTCCGGGTCAACCGTCGCCGCCCCCAGCGGAAGCGAGGTGCAGCTGCTGGTGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAAGGCCTACCCCATGATGTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGTCCGAGATCAGCCCCAGCGGCAGCTACACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGGACCCCCGGAAGCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC
配列番号143
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCCGGCAGAAGCCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGACGACTACGCCATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCGCCATCACCTGGAATAGCGGCCACATCGACTACGCCGACAGCGTGGAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAAGGTGTCCTACCTGAGCACCGCCAGCAGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTCTCGAGCGCTAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAATAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACTCCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAAGTGGACAAGAAAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGATAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGGCCGGCGCCCCTAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGCGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGAGCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGAGAGCCCCAGGTCTACACCCTGCCTCCCTCCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGTCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGATCCACCGTCGCCGCACCAAGCGGGTCAACAGTGGCCGCTCCCTCCGGCAGCACTGTGGCTGCCCCCAGCGGAAGCGAGGTGCAGCTGCTGGTGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAAGGCCTACCCCATGATGTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGTCCGAGATCAGCCCCAGCGGCAGCTACACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGGACCCCCGGAAGCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC
配列番号144
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCCGGCAGAAGCCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGACGACTACGCCATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCGCCATCACCTGGAATAGCGGCCACATCGACTACGCCGACAGCGTGGAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAAGGTGTCCTACCTGAGCACCGCCAGCAGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTCTCGAGCGCTAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAATAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACTCCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAAGTGGACAAGAAAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGATAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGGCCGGCGCCCCTAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGCGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGAGCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGAGAGCCCCAGGTCTACACCCTGCCTCCCTCCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGTCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGATCCACCGTCGCCGCACCAAGCGGATCTACCGTCGCAGCCCCTTCCGGGTCAACAGTGGCCGCTCCCTCCGGCAGCACTGTGGCTGCCCCCAGCGGAAGCGAGGTGCAGCTGCTGGTGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAAGGCCTACCCCATGATGTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGTCCGAGATCAGCCCCAGCGGCAGCTACACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGGACCCCCGGAAGCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC
配列番号145
PASGS

配列番号146
PASPASGS

配列番号147
PASPASPASGS

配列番号148
GGGGSGGGGS

配列番号149
GGGGSGGGGSGGGGS

配列番号150
TVAAPSTVAAPSGS

配列番号151
TVAAPSTVAAPSTVAAPSGS

配列番号152
GSTVAAPSGSTVAAPSGSTVAAPSGSTVAAPSGSTVAAPSGS

配列番号153
GSTVAAPSGSTVAAPSGSTVAAPSGSTVAAPSGSTVAAPSGSTVAAPSGS

配列番号154
PAVPPPGS

配列番号155
PAVPPPPAVPPPGS

配列番号156
PAVPPPPAVPPPPAVPPPGS

配列番号157
TVSDVPGS

配列番号158
TVSDVPTVSDVPGS

配列番号159
TVSDVPTVSDVPTVSDVPGS

配列番号160
TGLDSPGS

配列番号161
TGLDSPTGLDSPGS

配列番号162
TGLDSPTGLDSPTGLDSPGS

配列番号163
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT

配列番号164
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVQSNGDTYLEWYLQKPGQSPQLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

配列番号165
MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSGVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFVFPWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDWHGKITYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSS

Claims (51)

  1. 眼の疾患を防止するかまたは治療するのに用いるためのＴＮＦαアンタゴニストおよびＶＥＧＦアンタゴニストを含む組成物。
  2. 前記ＴＮＦαアンタゴニストおよびＶＥＧＦアンタゴニストが抗原結合タンパク質である請求項１記載の組成物。
  3. 前記ＴＮＦαアンタゴニストおよびＶＥＧＦアンタゴニストが二重標的化タンパク質の形態で存在する請求項１または請求項２記載の組成物。
  4. 前記二重標的化タンパク質が、ＴＮＦαまたはＴＮＦα受容体を結合する少なくとも１つの対合ＶＨ／ＶＬドメイン、ならびにＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体を結合する少なくとも１つの対合ＶＨ／ＶＬドメインを含む請求項３記載の組成物。
  5. 前記二重標的化分子がＤＶＤ−Ｉｇである請求項４記載の組成物。
  6. 前記二重標的化タンパク質が二重特異性抗体である請求項３または４記載の組成物。
  7. 前記二重標的化タンパク質がｄＡｂ−ｄＡｂインライン融合体である請求項３記載の組成物。
  8. 前記二重標的化タンパク質が、1つまたは複数のエピトープ結合ドメインと連結される受容体−Ｆｃ融合体である請求項３記載の組成物。
  9. 前記ＴＮＦαアンタゴニストが抗ＴＮＦα抗体である請求項２記載の組成物。
  10. 前記ＶＥＧＦアンタゴニストが抗ＶＥＧＦ抗体である請求項２記載の組成物。
  11. 前記二重標的化タンパク質の前記ＴＮＦαアンタゴニスト部分が抗ＴＮＦ抗体であり、前記二重標的化タンパク質の前記ＶＥＧＦアンタゴニスト部分が抗ＶＥＧＦエピトープ結合ドメインである請求項３記載の組成物。
  12. 前記二重標的化タンパク質の前記ＶＥＧＦアンタゴニスト部分が抗ＶＥＧＦ抗体であり、前記二重標的化タンパク質の前記ＴＮＦアルファアンタゴニスト部分が抗ＴＮＦエピトープ結合ドメインである請求項３記載の組成物。
  13. 前記エピトープ結合ドメインがｄＡｂである請求項８、１１または１２記載の組成物。
  14. 前記ｄＡｂがヒトｄＡｂである請求項１３記載の組成物。
  15. 前記エピトープ結合ドメインが非Ｉｇ足場に由来する請求項８、１１または１２記載の組成物。
  16. 前記エピトープ結合ドメインが、ＣＴＬＡ−４（エビボディ）；リポカリン；プロテインＡ由来分子、例えばプロテインＡのＺ−ドメイン（アフィボディ、ＳｐＡ）、Ａ−ドメイン（アビマー／マキシボディ）；熱ショックタンパク質、例えばＧｒｏＥＩおよびＧｒｏＥＳ；トランスフェリン（トランスボディ）；アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）；ペプチドアプタマー；Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン）；ヒトγ−クリスタリンおよびヒトユビキチン（アフィリン）；ＰＤＺドメイン；ヒトプロテアーゼ阻害剤のサソリ・トキシンクニッツ型ドメイン；およびフィブロネクチン（アドネクチン）から選択される請求項１５記載の組成物。
  17. 前記エピトープ結合ドメインが、１〜３０アミノ酸からなるリンカーを介して抗原結合タンパク質と直接的に結合される請求項８または請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
  18. 前記リンカーが配列番号３〜８および２５で記述されるもの、あるいはその任意の組合せまたは倍数である請求項１７記載の組成物。
  19. 前記エピトープ結合ドメインが、抗原結合タンパク質重鎖のＮ末端と連結される請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
  20. 前記エピトープ結合ドメインが、抗原結合タンパク質軽鎖のＮ末端と連結される請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
  21. 前記エピトープ結合ドメインが、抗原結合タンパク質重鎖のＣ末端と連結される請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
  22. 前記エピトープ結合ドメインが、抗原結合タンパク質軽鎖のＣ末端と連結される請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
  23. 前記抗原結合タンパク質が、配列番号１０で記述される重鎖中に含有されるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３、ならびに配列番号１２で記述される軽鎖中に含有されるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含む請求項２〜７または８〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
  24. 配列番号１４、１５、４７、６９、７０、７１または７２の重鎖配列、ならびに配列番号１２の軽鎖配列を含む請求項２３記載の組成物。
  25. ４〜６週毎に硝子体内投与されるべきものである請求項３〜８または１１〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
  26. さらなる活性作用物質、任意に抗炎症剤を含む請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
  27. 眼の疾患を予防するかまたは治療するのに用いるための医薬剤の製造のための請求項１〜２６のいずれか一項に記載の組成物の使用。
  28. 眼疾患を予防するかまたは治療するのに用いるための、アダリムマブ、インフリキシマブ、エタネルセプト、ＥＳＢＡ１０５、ＰＥＰ−１−５−１９、ＰＥＰ１−５−４９０、ＰＥＰ１−５−４９３、配列番号２のアドネクチン、ゴリムマブ、セルトリズマブ、ＡＬＫ−６９３１、ならびに配列番号３０の重鎖および配列番号３１の軽鎖を含む抗体からなる群から選択されるＴＮＦαアンタゴニストであって、ベバシズマブ、ラニビズマブ、ｒ８４、アフリベルセプト、ＣＴ０１、ＤＯＭ１５−１０−１１、ＤＯＭ１５−２６−５９３、ＰＲＳ−０５０、ＰＲＳ−０５１、ＭＰ００１２、ＣＴ−３２２、ＥＳＢＡ９０３、ＥＰＩ−００３０、ＥＰＩ−００１０およびＤＭＳ１５７１からなる群から選択されるＶＥＧＦアンタゴニストと組合せて投与されるべきものであるＴＮＦαアンタゴニスト。
  29. 眼疾患を防止するかまたは治療するのに用いるための、ベバシズマブ、ラニビズマブ、ｒ８４、アフリベルセプト、ＣＴ０１、ＤＯＭ１５−１０−１１、ＤＯＭ１５−２６−５９３、ＰＲＳ−０５０、ＰＲＳ−０５１、ＭＰ００１２、ＣＴ−３２２、ＥＳＢＡ９０３、ＥＰＩ−００３０、ＥＰＩ−００１０およびＤＭＳ１５７１からなる群から選択されるＶＥＧＦアンタゴニストであって、アダリムマブ、インフリキシマブ、エタネルセプト、ＥＳＢＡ１０５、ＰＥＰ１−５−１９、ＰＥＰ１−５−４９０、ＰＥＰ１−５−４９３、配列番号２のアドネクチン、ゴリムマブ、セルトリズマブ、ＡＬＫ−６９３１、ならびに配列番号３０の重鎖および配列番号３１の軽鎖を含む抗体からなる群から選択されるＴＮＦαアンタゴニストと組合せて投与されるべきものであるＶＥＧＦアンタゴニスト。
  30. ＴＮＦαアンタゴニストがアダリムマブであり、ＶＥＧＦアンタゴニストがラニビズマブである請求項２８で主張されたようなＴＮＦαアンタゴニストまたは請求項２９で主張されたようなＶＥＧＦアンタゴニスト。
  31. 請求項１〜２４のいずれか一項で主張された組成物および製薬上許容可能な担体を含む薬学的組成物。
  32. 前記組成物がさらなる活性作用物質を、任意に抗炎症剤を含む請求項３１で主張されたような薬学的組成物。
  33. 請求項２〜２４のいずれか一項で主張されたような抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列。
  34. 請求項５、６または９〜２４のいずれか一項に記載の組成物の重鎖または軽鎖をコードするポリヌクレオチド配列。
  35. 前記配列が配列番号１１、１３または４６で記述されるものである請求項３４で主張されたようなポリヌクレオチド配列。
  36. 請求項３３〜３５のいずれか一項で主張されたような1つまたは複数のポリヌクレオチド配列を含む組換え形質転換またはトランスフェクト化宿主細胞。
  37. 請求項２〜２４のいずれか一項に記載の組成物の製造方法であって、請求項３６記載の宿主細胞を培養し、前記抗原結合タンパク質を単離するステップを包含する方法。
  38. 硝子体内経路による送達のためである請求項１〜２４のいずれか一項で主張されたような組成物。
  39. 眼球周囲経路による送達のためである請求項１〜２４のいずれか一項で主張されたような組成物。
  40. 経強膜、結膜下、腱下、眼球周囲、局所、眼球後経路による送達のためであるか、あるいは下、上または外側直筋への送達のためである請求項３９記載の組成物。
  41. 前記眼の疾患が糖尿病性黄斑浮腫、類嚢胞黄斑浮腫、ブドウ膜炎、ＡＭＤ（加齢性黄斑変性）、脈絡膜血管新生性ＡＭＤ、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症ならびにその他の黄斑症および眼性血管障害である請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
  42. 眼疾患に悩まされる患者を防止するかまたは治療する方法であって、予防的または治療的有効量の請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組成物または二重標的化タンパク質を全身的または局所的に患者の眼に投与することを包含する方法。
  43. 前記患者が、以下の疾患または障害：糖尿病性黄斑浮腫、類嚢胞黄斑浮腫、ブドウ膜炎、ＡＭＤ（加齢性黄斑変性）、脈絡膜血管新生性ＡＭＤ、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症ならびにその他の黄斑症および眼性血管障害のうちの少なくとも１つに罹患している請求項４２記載の方法。
  44. ＴＮＦαアンタゴニスト部分、ＶＥＧＦアンタゴニスト部分ならびに前記ＴＮＦαアンタゴニスト部分を前記ＶＥＧＦアンタゴニスト部分と連結するリンカーを含む二重標的化抗原結合分子であって、
    前記ＴＮＦαアンタゴニスト部分が表１に列挙されたＴＮＦαアンタゴニストのうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み；
    前記ＶＥＧＦアンタゴニスト部分が表２に列挙されたＶＥＧＦアンタゴニストのうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み；
    前記リンカーが１〜１５０アミノ酸長のアミノ酸配列であり；そして
    前記二重標的化分子がＤＭＳ４０００またはＤＭＳ４０３１でない
    二重標的化抗原結合分子。
  45. ＴＮＦαアンタゴニスト部分、ＶＥＧＦアンタゴニスト部分ならびに前記ＴＮＦαアンタゴニスト部分を前記ＶＥＧＦアンタゴニスト部分と連結するリンカーを含む二重標的化抗原結合分子であって、
    前記ＴＮＦαアンタゴニスト部分が表１に列挙されたＴＮＦαアンタゴニストのうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み；
    前記ＶＥＧＦアンタゴニスト部分が表２に列挙されたＶＥＧＦアンタゴニストのうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み；
    前記リンカーが１〜１５０アミノ酸長のアミノ酸配列である
    二重標的化抗原結合分子であって、前記眼の疾患を防止するかまたは治療するのに用いるためのものであり、４〜６週毎に硝子体内に投与されるべきものである二重標的化抗原結合分子。
  46. 前記リンカーが、配列番号３〜８、２５、６６〜６８および１４５〜１６２で記述されるもの、あるいはその任意の組合せまたは倍数である請求項４４または４５で主張されたような二重標的化分子。
  47. 配列番号６２または配列番号６４のアミノ酸配列からなる請求項４４〜４６のいずれか一項で主張されたような二重標的化抗原結合分子。
  48. 配列番号６９、７０、７１または７２の重鎖配列および配列番号１２の軽鎖配列を含む抗原結合タンパク質。
  49. 請求項４８で主張されたような抗原結合タンパク質、およびさらなる活性作用物質、任意に抗炎症剤を含む薬学的組成物。
  50. 請求項４８の前記抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列。
  51. 前記ポリヌクレオチドが配列番号１４１、１４２、１４３または１４４、および配列番号１１を含む請求項５０で主張されたようなポリヌクレオチド配列。
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