TW202228789A - 用於長效遞送治療劑之多能蛋白聚醣（ｖｇ１）的玻尿酸結合衍生物 - Google Patents

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什里尼克 查坦 梅塔
達文 布倫特 特薩爾
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塞門 西奧多 漢森
斯特凡 登革爾
休伯特 凱頓伯格
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Abstract

本發明提供一種結合物，該結合物可包含能夠結合至眼睛中之治療標靶的第一組分、能夠結合至玻尿酸的一種或多種第二組分，及包含玻尿酸的一種或多種第三組分，其中每種第二組分係共價地結合至該第一組分，且非共價地結合至第三組分；包含該結合物之組成物，該組成物用為藥物或用於治療眼睛疾病；及治療受試者之眼睛疾病的方法。此外，靶向患者之組織的治療分子可包含玻尿酸結合部分及治療活性劑，其中該玻尿酸結合部分包含至少兩個多能蛋白聚醣連接結構域。靶向患者之組織的治療分子可包含玻尿酸結合部分及治療活性劑，其中該玻尿酸結合部分包含結合 (即，預複合) 至玻尿酸之至少兩個多能蛋白聚醣連接結構域。遞送靶向患者之組織的治療分子的方法包含將本文所述之任何治療分子投予該患者，並允許該治療分子向標靶組織提供該治療活性劑的長效遞送。

Description

用於長效遞送治療劑之多能蛋白聚醣　(VG1)　的玻尿酸結合衍生物
採用結合至玻尿酸的融合蛋白及融合蛋白-玻尿酸結合物的長效療法及治療方法。
玻璃體內 (IVT) 注射通常用於投予藥物以治療各種眼睛疾病。IVT 注射允許將藥物直接施加至眼後，從而消除局部及全身投予常見的障礙。以這種方式直接施加藥物允許藥物在後段組織中具有更高之眼內生體可用率，從而更有效地治療眼後疾病。Stewart, M.W., Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology, 14(1):5-7 (2018)。接受經由 IVT 注射治療的常見疾病之實例包括年齡相關性黃斑退化 (AMD)、糖尿病性視網膜病變、視網膜靜脈阻塞及眼睛感染 (諸如眼內炎及視網膜炎)。美國視網膜專家學會基金會，asrs.org/patients/ retinal-diseases/33/IVT-injections (2017)。
儘管在阻止疾病及改善視力方面取得了令人鼓舞的結果，但 IVT 注射既不舒服又昂貴，並且需要視網膜專家來執行。已知 IVT 注射對一些患者造成不良反應，諸如感染、炎症、玻璃體出血、眼睛中存在之飛蚊增加、對光的敏感性增加、視力下降及視網膜剝離。美國視網膜專家學會基金會，asrs.org/patients/retinal-diseases/33/IVT-injections (2017)。IVT 注射亦可與感染性眼內炎、無菌性眼內炎症、裂孔性視網膜剝離、眼內壓力升高和眼出血有關。 出處同前。經眼長效遞送技術可無需重複注射藥物，從而改善患者依從性及臨床結果。延長玻璃體液中藥物半衰期的方法及組成物 (例如，維持藥物儲存能力、眼睛中之低轉換率、低保留標靶所介導之清除率及/或在高齡族群中看似穩定的特性) 促進藥物從注射部位到靶位點的緩慢釋放，從而能夠使用更高的劑量並減少所需之注射次數。
治療分子之玻璃體半衰期可藉由以下方式得以延長：將治療分子結合至玻尿酸 (HA)，以作為封裝或用聚合物進行化學修飾的替代方案。Cromwell, S 等人, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 59(9):235 (2018)；Ghosh, J.G. 等人, Nature Communications, 8:14837, doi:10.1038/ncomms14837 (2017)；Stewart, M.W., Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology, 14(1):5-7 (2018)。在一個特定實例中，長效抗 VEGF 抗體分別與人腫瘤壞死因子 (TNF)-刺激基因 6 蛋白(TSG-6) 之 HA 結合結構域 (HABD) 融合。Ghosh, J.G. 等人, Nature Communications, 8:14837, doi:10.1038/ncomms14837 (2017)。與未經修飾之抗 VEGF 抗體相比，融合蛋白表現出以下改善：(1) 半衰期增加 3 至 4 倍；(2) 在新生血管性視網膜疾病動物模型中，能夠在 3 至 4 倍長的時間內減弱 VEGF 所誘導之視網膜變化。Ghosh, J.G. 等人, Nature Communications, 8:14837, doi:10.1038/ncomms14837 (2017)。一種包含長效抗 VEGF 抗體與 TSG-6 融合的候選藥物 LMG324 已進入臨床試驗，用於評估單次遞增劑量的安全性及耐受性，以確定新生血管性年齡相關性黃斑退化 (nvAMD) 中的最大耐受劑量 (MTD)。clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02398500 (2019)。但是，由於嚴重不良事件 (包括玻璃體飛蚊、炎症及玻璃體後剝離)，這些試驗被暫停。
抗體片段與玻尿酸 (HA) 之化學結合可降低藥物從玻璃體的擴散率。但是，該方法需要對 HA 進行化學活化；使用非天然連接子可能導致受試者中活化 HA 產生非天然代謝物。
本發明人發現藉由提供包含以下的結合物，可避免上述缺點：(1) 能夠結合至眼睛中之治療標靶的第一組分，(2) 能夠結合至 HA 的一種或多種第二組分，及 (3) 包含 HA 之一種或多種第三組分；其中每種第二組分 (a) 共價地結合至第一組分並 (b) 非共價地結合至第三組分。與上述抗 VEGF 抗體及 TSG-6 融合蛋白 (LMG324) 不同，能夠結合至 HA 的第二組分與 HA 預複合。
本案揭示了增加包含能夠結合玻尿酸 (HA) 的融合蛋白的治療分子的眼內保留的材料與方法。在一些實施例中，融合蛋白包含：(1) 能夠結合至眼睛中之治療標靶的第一組分，及 (2) 能夠結合至 HA 的一種或多種第二組分；其中每種第二組分共價地結合至第一組分。
本案亦揭示了結合物，其中該融合體進一步包含一種或多種第三組分，該等第三組分包含 HA，其中每種第二組分進一步非共價地結合至第三組分。進一步地，能夠結合至 HA 的第二組分可與 HA 預複合。結合物與玻璃體相容，並對 HA 具有結合親和力。該等材料與方法為更長之長效藥物設計提供了一種平臺技術。
材料與方法涉及能夠結合至眼睛中之治療標靶且能夠結合至玻尿酸的治療分子及其結合物。提供了以下項目、態樣及實施例。
項目 1 為一種治療分子，該治療分子包含：(a) 能夠結合至眼睛中之治療標靶的第一組分，(b) 能夠結合至玻尿酸的一種或多種第二組分，其中該等一種或多種第二組分共價地結合至第一組分，及 (c) 視情況地，包含玻尿酸之一種或多種第三組分，其中，若存在該等一種或多種第三組分，該等一種或多種第三組分非共價地結合至該等一種或多種第二組分。
項目 2 為項目 1 之治療分子，其中該第一組分為蛋白質、肽、受體或其片段、受體之配體、darpin、核酸、RNA、DNA 或適體。
項目 3 為項目 1 或 2 之結合物，其中該第一組分係選自抗體、抗原結合片段，特定而言為抗體片段，更特定而言為至少缺少 Fc 結構域的抗體片段，尤其地其中該片段為或包含 (Fab') 2片段、Fab' 片段或 Fab 片段、VhH 片段、scFv 片段、scFv-Fc 片段及微抗體，更尤其為 Fab 片段。
項目 4 為項目 1 至 3 中任一者之治療分子，其中該第二組分包含玻尿酸受體 CD44 (CD44) 結構域、腦特異性連接蛋白 (BRAL1) 結構域、腫瘤壞死因子刺激基因 6 (TSG-6) 結構域、淋巴管內皮玻尿酸受體 1 (LYVE-1) 結構域、或玻尿酸結合蛋白 (HABP) 結構域、聚集蛋白聚醣 G1 (AG1) 結構域或多能蛋白聚醣 G1 (VG1) 結構域。
項目 5 為項目 1 至 4 中任一者之治療分子，其中該結合物包含一種第二組分或兩種彼此相同的第二組分。
項目 6 為項目 1 至 4 中任一者之治療分子，其中該第三組分為玻尿酸，其中該玻尿酸 (a) 具有 (i) 選自 3 kDa 至 60 kDa、4 kDa 至 30 kDa、5 kDa 至 20 kDa 或 400 Da 至 200 kDa 之分子量；(ii) 至少 2 kDa、3 kDa、4 kDa、5 kDa、6 kDa、7 kDa、8 kDa 或 9 kDa 之分子量；或 (iii) 至多 60 kDa、50 kDa、40 kDa、30 kDa、25 kDa、20 kDa 或 15 kDa 之分子量；(b) 對該等一種或兩種第二組分提供莫耳過量之結合當量；及 (c) 具有減少眼睛中玻尿酸降解的修飾。
項目 7 為項目 1 至 6 中任一者之治療分子，其中該第二組分能夠以 10 nM 至 10 µM、5 nM 至 8 µM 或 100 nM 至 5 µM 的 K D 結合至玻尿酸。
項目 8 為項目 1 至 7 中任一者之治療分子，其中 (a) 該等第一組分及第二組分包含在融合蛋白中，特定而言其中該等第二組分中之一種或兩種共價地結合至該第一組分的 N 端及/或 C 端，更特定而言其中該第一組分為抗體或抗原結合片段，且其中該等一種或兩種第二組分共價地結合至該第一組分的 C 端；及/或 (b) 該等一種或兩種第二組分直接地結合至該第一組分或經由連接子間接地結合至該第一組分，該連接子特定而言為至少 4 個胺基酸及/或至多 50 個或至多 25 個胺基酸的連接子，更特定而言該連接子為 (GxS) n或 (GxS) nG m，其中 G = 甘胺酸，S = 絲胺酸，(x = 3，n = 3、4、5 或 6，且 m = 0、1、2 或 3) 或 (x = 4，n = 2、3、4 或 5，且 m = 0、1、2 或 3)。
項目 9 為項目 1 至 8 中任一者之治療分子，其中該治療標靶為 VEGF、C2、C3a、C3b、C5、C5a、Htra1、IL-33、因子 P、因子 D、EPO、EPOR、IL-1β、IL-17A、IL-10、TNFα、FGFR2、PDGF 或 ANG2，尤其為 VEGF。
項目 10 為項目 1 至 9 中任一者之治療分子，其中 (a) 該第一組分為針對 VEGF 之抗體或抗原結合片段，特定而言為抗 VEGF Fab；及/或 (b) 該等一種或兩種第二組分中之各者包含 CD44 結構域或 TSG-6 結構域或 VG1 結構域；及/或 (c) 該第三組分為具 5 kDa 至 20 kDa 之分子量的玻尿酸。
項目 11 為項目 1 至 10 中任一者之治療分子，其中 (i) 該第一組分為抗 VEGF 抗體或抗原結合片段，該等一種或兩種第二組分包含 CD44 結構域，且該第三組分為具 5 kDa 至 20 kDa 之分子量的玻尿酸；(ii) 該第一組分為抗 VEGF 抗體或抗原結合片段，該等一種或兩種第二組分包含 TSG-6 結構域，且該第三組分為具 5 kDa 至 20 kDa 之分子量的玻尿酸；或 (iii) 該第一組分為抗 VEGF 抗體或抗原結合片段，該等一種或兩種第二組分包含 VG1 結構域，且該第三組分為具 5 kDa 至 20 kDa 之分子量的玻尿酸。
項目 12 為項目 1 至 11 中任一者之結合物，其中 (a) 該第一組分包含 (i) SEQ ID NO: 97、99、105、109 或 144 之 VH 結構域；及 (ii) SEQ ID NO: 98、100、106、110 或 115 之 VL 結構域；且 (b) 該第二組分包含 SEQ ID NO: 2。
項目 13 為項目 1 至 11 中任一者之結合物，其中 (a) 該第一組分包含 (i) SEQ ID NO: 97、99、105、109 或 144 之 VH 結構域；及 (ii) SEQ ID NO: 98、100、106、110 或 115 之 VL 結構域；且 (b) 該第二組分包含 SEQ ID NO: 4。
項目 14 為項目 1 至 11 中任一者之結合物，其中 (a) 該第一組分包含 (i) SEQ ID NO: 97、99、105、109 或 144 之 VH 結構域；及 (ii) SEQ ID NO: 98、100、106、110 或 115 之 VL 結構域；且 (b) 該第二組分包含 SEQ ID NO: 86、60、32 或 29。
項目 15 為項目 1 至 11 中任一者之治療分子，其中該等第二組分包含至少兩個多能蛋白聚醣連接結構域。
項目 16 為項目 15 之治療分子，其中該等第二組分包含結合至玻尿酸之至少兩個多能蛋白聚醣連接結構域。
項目 17 為項目 1 至 22 中任一者之治療分子，其中該玻尿酸允許玻尿酸與治療分子之比例範圍為自 1.5:1 至 1:1。
項目 18 為項目 14 至 17 中任一者之治療分子，其中該第二組分與 SEQ ID NO: 86、60、32 或 29 至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同。
項目 19 為項目 14 至 18 中任一者之治療分子，其中該第二組分與 SEQ ID NO: 86、60、32 或 29 至少 95% 相同。
項目 20 為項目 14 至 19 中任一者之治療分子，其中該第二組分包含至少 1 個、至少 2 個、至少 3 個、至少 4 個或至少 5 個突變。
項目 21 為項目 14 至 20 中任一者之治療分子，其中該第二組分包含 1 至 3 個突變，其中該等 1 至 3 個突變包含單胺基酸取代、雙胺基酸取代及截短。
項目 22 為項目 14 至 21 中任一者之治療分子，其中該第二組分包含 1 至 5 個突變，其中該等 1 至 5 個突變包含單胺基酸取代、雙胺基酸取代及截短。
項目 23 為項目 14 至 22 中任一者之治療分子，其中該第二組分相對於 SEQ ID NO: 29 具有截短突變。
項目 24 為項目 23 之治療分子，其中該截短突變包含在 N 端之 1 至 129 個胺基酸的截短。
項目 25 為項目 14 至 24 中任一者之治療分子，其中該第二組分為截短序列，其中不存在野生型多能蛋白聚醣之 Ig 結構域。
項目 26 為項目 14 至 25 中任一者之治療分子，其中該第二組分相對於 SEQ ID NO: 29 包含以下胺基酸中之至少一個：R160、Y161、E194、D197、Y208、R214、Y230、F261、D295 及 R233。
項目 27 為項目 14 至 26 中任一者之治療分子，其中該第二組分相對於 SEQ ID NO: 29 包含以下胺基酸中之 2 個、3 個、4 個、5 個、6 個、7 個、8 個、9 個或 10 個：R160、Y161、E194、D197、Y208、R214、Y230、F261、D295 及 R233。
項目 28 為項目 14 至 27 中任一者之治療分子，其中該第二組分相對於 SEQ ID NO: 29 包含在以下位置中之至少一個之突變：R160、Y161、E194、D197、Y208、R214、M222、Y230、R233、K260、F261、D295、Y296、H306、R312、L325、Y326 及 R327。
項目 29 為項目 14 至 28 中任一者之治療分子，其中該第二組分相對於 SEQ ID NO: 29 包含在以下位置中之 2 個、3 個、4 個、5 個、6 個、7 個、8 個、9 個、10 個、11 個、12 個、13 個、14 個、15 個、16 個、17 個或 18 個之突變：R160、Y161、E194、D197、Y208、R214、M222、Y230、R233、K260、F261、D295、Y296、H306、R312、L325、Y326 及 R327。
項目 30 為項目 14 至 29 中任一者之治療分子，其中該第二組分相對於 SEQ ID NO: 29 包含在以下位置中之 2 個、3 個、4 個、5 個或 6 個之突變：R160、Y161、E194、D197、Y208、R214、M222、Y230、R233、K260、F261、D295、Y296、H306、R312、L325、Y326 及 R327。
項目 31 為項目 14 至 30 中任一者之治療分子，其中該第二組分相對於 SEQ ID NO: 29 包含以下突變中之至少一個：R160A、Y161A、D197A、D197S、Y208A、Y208F、R214K、M222A、Y230A、Y230F、R233A、K260A、K260R、F261Y、KF260RY、D295A、D295S、Y296A、Y296F、DY295SF、H306A、R312A、L325A、Y326A、R327A 及 LYR325LFK。
項目 32 為項目 14 至 31 中任一者之治療分子，其中該第二組分包含 Y208A 及 H306A 中之至少一個。
項目 33 為項目 14 至 32 中任一者之治療分子，其中該第二組分相對於 SEQ ID NO: 29 包含以下突變中之至少 2 個、3 個、4 個、5 個、6 個、7 個、8 個、9 個、10 個、11 個、12 個、13 個、14 個、15 個、16 個或 17 個：R160A、Y161A、D197A、D197S、Y208A、Y208F、R214K、M222A、Y230A、Y230F、R233A、K260A、K260R、F261Y、KF260RY、D295A、D295S、Y296A、Y296F、DY295SF、H306A、R312A、L325A、Y326A、R327A 及 LYR325LFK。
項目 34 為項目 14 至 33 中任一者之治療分子，其中該第二組分相對於 SEQ ID NO: 29 包含以下突變中之至少 2 個、3 個、4 個、5 個或 6 個：R160A、Y161A、D197A、D197S、Y208A、Y208F、R214K、M222A、Y230A、Y230F、R233A、K260A、K260R、F261Y、KF260RY、D295A、D295S、Y296A、Y296F、DY295SF、H306A、R312A、L325A、Y326A、R327A 及 LYR325LFK。
項目 35 為項目 14 或 18 中任一者之治療分子，其中該第二組分為 SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58 或 SEQ ID NO: 59。
項目 36 為項目 1 至 35 中任一者之治療分子，其中該第一組分包含寡肽、蛋白質或核酸。
項目 37 為項目 1 至 36 中任一者之治療分子，其中該第一組分包含治療藥物、抗體、抗原結合片段、酶、生長因子、寡肽、半胱胺酸結肽、生長因子、反義寡核苷酸、鎖核酸或適體。
項目 38 為項目 37 之治療分子，其中該半胱胺酸結肽係與 SEQ ID NO: 92 至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同。
項目 39 為項目 37 之治療分子，其中該生長因子包含纖維母細胞生長因子、血小板衍生生長因子、神經生長因子 (NGF)、VEGF、纖維母細胞生長因子 (FGF) 及類胰島素生長因子 I (IGF-I)。
項目 40 為項目 1 至 39 中任一者之治療分子，其中該第一組分結合 VEGF。
項目 41 為項目 40 之治療分子，其中結合 VEGF 的該第一組分包含蘭尼單抗 (ranibizumab)、阿柏西普 (aflibercept)、布西組單抗-dbll (brolucizumab-dbll) 及貝伐珠單抗 (bevacizumab)。
項目 42 為項目 37 之治療分子，其中該適體係經聚乙二醇化。
項目 43 為項目 37 或 42 之治療分子，其中該適體為 Macugen®。
項目 44 為項目 1 至 43 中任一者之治療分子，其中該連接子包含 GGGGS (SEQ ID NO: 27) 或其多聚體，更尤其包含 (GGGGS)3 (SEQ ID NO: 28)。
項目 45 為項目 1 至 42 中任一者之治療分子，其中該連接子包含 GSGSGSGSGSGSGSGSGSGS (SEQ ID NO: 95)。
項目 46 為項目 45 之治療分子，其中該半胱胺酸結肽與該等一種或兩種第二組分經由連接子連接，該連接子包含序列 GSGSGSGSGSGSGSGSGSGS (SEQ ID NO: 95)。
項目 47 為項目 45 或 46 之治療分子，其中該序列包含 (a) 抗 VEGF 抗原結合片段；及 (b) 與 SEQ ID NO: 93 或 SEQ ID NO: 94 具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。
項目 48 為一種用為藥物之組成物，該組成物包含如項目 1 至 47 中任一者之治療分子及視情況的醫藥上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。
項目 49 為一種用於治療眼睛疾病或腦疾病之組成物，該組成物包含如項目 1 至 47 中任一者之結合物及視情況的醫藥上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。
項目 50 為項目 49 所使用之組成物，該組成物經調配用於眼內遞送，特定而言用於玻璃體內注射。
項目 51 為項目 48 至 50 中任一者所使用之組成物，其中 (a) 該組成物至多每三個月投予一次，特定而言至多每四個月投予一次，更特定而言至多每六個月投予一次；及/或 (b) 該結合物中該第一組分之消除半衰期相較於未結合之第一組分延長至少 3 倍、至少 4 倍或至少 5 倍。
項目 52 為項目 48 至 51 中任一者所使用之組成物，其中該眼睛疾病為年齡相關性黃斑退化 (AMD)，特定而言濕性 AMD 或新生血管性 AMD；糖尿病性黃斑水腫 (DME)；糖尿病性視網膜病變 (DR)，特定而言增殖性 DR 或非增殖性 DR；視網膜靜脈阻塞 (RVO)；或地圖狀萎縮 (GA)。
項目 53 為一種治療受試者之眼睛疾病的方法，該方法包含將項目 1 至 47 中任一者之治療分子或項目 48 至 52 中任一者所定義之組成物投予該受試者。
項目 54 為一種遞送靶向患者之組織的治療分子的方法，該方法包含將項目 1 至 47 中任一者之治療分子或項目 48 至 52 中任一者之組成物投予該患者，並允許該治療分子向標靶組織提供該第一組分的長效遞送。
項目 55 為項目 54 之方法，其進一步包含在投予步驟之前將該治療分子與玻尿酸結合。
項目 56 為項目 55 之方法，其進一步包含將包含該治療分子之第一溶液與包含該玻尿酸之第二溶液混合。
項目 57 為項目 56 之方法，其中該混合包含容器。
項目 58 為項目 57 之方法，其中該容器為兩室注射器。
項目 59 為項目 56 至 58 中任一者之方法，其中該混合產生結合至玻尿酸的治療分子，該治療分子準備用於投予受試者。
項目 60 為項目 54 至 59 中任一者之方法，其中該投予步驟為單次注射。
項目 61 為項目 54 至 60 中任一者之方法，其中該標靶組織包含眼睛或腦。
項目 62 為項目 54 至 61 中任一者之方法，其中相較於未經修飾之生物活性劑，該治療分子提供改良之玻璃體相容性、更長之玻璃體停留時間、更長之玻璃體半衰期及/或改良之藥理作用持續時間。
態樣 63 為一種結合物，該結合物包含 (a) 能夠結合至眼睛中之治療標靶的第一組分；(b) 能夠結合至玻尿酸的一種或多種第二組分；及 (c) 包含玻尿酸之一種或多種第三組分，(d) 其中每種第二組分共價地結合至第一組分並非共價地結合至第三組分。
態樣 64 為態樣 63 之結合物，其中該第一組分為蛋白質、肽、受體或其片段、受體之配體、darpin、核酸、RNA、DNA 或適體。
態樣 65 為態樣 63 或 64 之結合物，其中該第一組分為抗體或抗原結合抗體片段，特定而言為抗體片段，更特定而言為至少缺少 Fc 結構域的抗體片段，尤其地其中該片段為或包含 (Fab')2 片段、Fab' 片段或 Fab 片段，更尤其為 Fab 片段。
態樣 66 為態樣 63 至 65 中任一者之結合物，其中該第二組分包含玻尿酸受體 CD44 (CD44) 結構域、腦特異性連接蛋白 (BRAL1) 結構域、腫瘤壞死因子刺激基因 6 (TSG-6) 結構域、淋巴管內皮玻尿酸受體 1 (LYVE-1) 結構域、或玻尿酸結合蛋白 (HABP) 結構域、聚集蛋白聚醣 G1 (AG1) 結構域或多能蛋白聚醣 G1 (VG1) 結構域。
態樣 67 為態樣 63 至 66 中任一者之結合物，其中該結合物包含一種或兩種第二組分，特定而言包含兩種相同之第二組分。
態樣 68 為態樣 63 至 66 中任一者之結合物，其中該第三組分為玻尿酸，其中該玻尿酸 (a) 具 3 kDa 至 60 kDa、特定而言 4 kDa 至 30 kDa、更特定而言 5 kDa 至 20 kDa 之分子量；及/或 (b) 具至少 2 kDa、3 kDa、4 kDa、5 kDa、6 kDa、7 kDa、8 kDa 或 9 kDa 之分子量；及/或 (c) 具至多 60 kDa、50 kDa、40 kDa、30 kDa、25 kDa、20 kDa 或 15 kDa 之分子量；及/或 (d) 具有減少眼睛中玻尿酸降解的修飾。
態樣 69 為態樣 63 至 67 中任一者之結合物，其中 (a) 該等第一組分及第二組分包含在融合蛋白中，特定而言其中該等第二組分中之一種或兩種共價地結合至該第一組分的 N 端及/或 C 端，更特定而言其中該第一組分為抗體或抗原結合抗體片段，且其中該等第二組分中之一種或兩種共價地結合至該第一組分的 C 端；及/或 (b) 該等第二組分直接地結合至該第一組分或經由連接子間接地結合至該第一組分，該連接子特定而言為至少 4 個胺基酸及/或至多 50 個或至多 25 個胺基酸的連接子，更特定而言該連接子為 (GxS)n 或 (GxS)nGm，其中 G = 甘胺酸，S = 絲胺酸，(x = 3，n = 3、4、5 或 6，且 m = 0、1、2 或 3) 或 (x = 4，n = 2、3、4 或 5，且 m = 0、1、2 或 3)。
態樣 70 為態樣 63 至 69 中任一者之結合物，其中該治療標靶為 VEGF、C5、因子 P、因子 D、EPO、EPOR、IL-1β、IL-17A、IL-10、TNF
Figure 110138197-001
、FGFR2、PDGF 或 ANG2，尤其為 VEGF。
態樣 71 為態樣 63 至 70 中任一者之結合物，其中 (a) 該第一組分為針對 VEGF 之抗體或抗原結合抗體片段，特定而言為抗 VEGF Fab；及/或 (b) 該等一種或兩種第二組分中之各者包含 CD44 結構域或 TSG-6 結構域或 VG1 結構域；及/或 (c) 該第三組分為具 5 kDa 至 20 kDa 之分子量的玻尿酸，(d) 特定而言其中 (e) 該第一組分為抗 VEGF Fab，且其中該等一種或兩種第二組分中之各者包含 CD44 結構域，且其中該第三組分為具 5 kDa 至 20 kDa 之分子量的玻尿酸；或 (f) 該第一組分為抗 VEGF Fab，且其中該等一種或兩種第二組分中之各者包含 TSG-6 結構域，且其中該第三組分為具 5 kDa 至 20 kDa 之分子量的玻尿酸；或 (g) 該第一組分為抗 VEGF Fab，且其中該等一種或兩種第二組分中之各者包含 VG1 結構域，且其中該第三組分為具 5 kDa 至 20 kDa 之分子量的玻尿酸。
態樣 72 為態樣 63 至 71 中任一者之結合物，該第一組分為抗體，該抗體具有包含於 SEQ ID NO: 5 中之 VH 結構域及包含於 SEQ ID NO: 6 中之 VL 結構域，且該第二組分包含 SEQ ID NO: 4 或由其組成。
態樣 73 為用為藥物之組成物，該組成物包含如態樣 63 至 72 中任一者之結合物及視情況的醫藥上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。
態樣 74 為用於治療眼睛疾病之組成物，該組成物包含如態樣 63 至 73 中任一者之結合物及視情況的醫藥上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。
態樣 75 為態樣 73 或 74 所使用之組成物，該組成物經調配用於眼內遞送，特定而言用於玻璃體內注射。
態樣 76 為態樣 73 至 75 中任一者所使用之組成物，其中 (a) 該組成物至多每三個月投予一次，特定而言至多每四個月投予一次，更特定而言至多每六個月投予一次；及/或 (b) 該結合物中該第一組分之消除半衰期相較於未結合之第一組分延長至少 3 倍、至少 4 倍或至少 5 倍。
態樣 77 為態樣 73 至 76 中任一者所使用之組成物，其中該眼睛疾病為年齡相關性黃斑退化 (AMD)，特定而言濕性 AMD 或新生血管性 AMD；糖尿病性黃斑水腫 (DME)；糖尿病性視網膜病變 (DR)，特定而言增殖性 DR 或非增殖性 DR；視網膜靜脈阻塞 (RVO)；或地圖狀萎縮 (GA)。
態樣 78 為一種治療受試者之眼睛疾病的方法，該方法包含將態樣 63 至 72 中任一者之結合物或態樣 73 至 77 中任一者所定義之組成物投予該受試者。
實施例 79 為一種靶向患者之組織的治療分子，該治療分子包含玻尿酸結合結構域及治療活性劑，其中該玻尿酸結合結構域包含至少兩個多能蛋白聚醣連接結構域。
實施例 80 為一種靶向患者之組織的治療分子，該治療分子包含玻尿酸結合結構域及治療活性劑，其中該玻尿酸結合結構域包含至少兩個多能蛋白聚醣連接結構域，該等至少兩個多能蛋白聚醣連接結構域經由 HA 結合結構域結合至玻尿酸。
實施例 81 為實施例 79 或 80 之治療分子，其中該玻尿酸的範圍為自 400 Da 至 200 kDa。
實施例 82 為實施例 81 之治療分子，其中該玻尿酸為至少 5 kDa。
實施例 83 為實施例 81 或 82 之治療分子，其中該玻尿酸為 10 kDa。
實施例 84 為實施例 79 至 83 中任一者之治療分子，其中該玻尿酸對該等多能蛋白聚醣連接結構域提供莫耳過量之結合當量。
實施例 85 為實施例 79 至 84 中任一者之治療分子，其中該玻尿酸允許玻尿酸與治療分子之比例範圍為自 1.5:1 至 1:1。
實施例 86 為實施例 79 至 85 中任一者之治療分子，其中該玻尿酸結合結構域具有 10 nM 至 10 µM 的 K D 。
實施例 87 為實施例 79 至 86 中任一者之治療分子，其中該玻尿酸結合結構域具有 5 nM 至 8 µM 的 K D 。
實施例 88 為實施例 79 至 87 中任一者之治療分子，其中該玻尿酸結合結構域具有 100 nM 至 5 µM 的 K D 。
實施例 89 為實施例 79 至 88 中任一者之治療分子，其中該玻尿酸結合結構域係與 SEQ ID NO: 86、60、32 或 29 至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同。
實施例 90 為實施例 79 至 89 中任一者之治療分子，其中該玻尿酸結合結構域係與 86、60、32 或 29 至少 95% 相同。
實施例 91 為實施例 79 至 90 中任一者之治療分子，其中該玻尿酸結合結構域包含至少 1 個、至少 2 個、至少 3 個、至少 4 個或至少 5 個突變。
實施例 92 為實施例 79 至 91 中任一者之治療分子，其中該玻尿酸結合結構域包含 1 至 3 個突變，其中該等 1 至 3 個突變包含單胺基酸取代、雙胺基酸取代及截短。
實施例 93 為實施例 79 至 92 中任一者之治療分子，其中該玻尿酸結合結構域包含 1 至 5 個突變，其中該等 1 至 5 個突變包含單胺基酸取代、雙胺基酸取代及截短。
實施例 94 為實施例 79 至 93 中任一者之治療分子，其中該玻尿酸結合結構域相對於 SEQ ID NO: 29 具有截短突變。
實施例 95 為實施例 94 之治療分子，其中該截短突變包含在 N 端之 1 至 129 個胺基酸的截短。
實施例 96 為實施例 79 至 95 中任一者之治療分子，其中該玻尿酸結合結構域為截短序列，其中不存在野生型多能蛋白聚醣之 Ig 結構域。
實施例 97 為實施例 79 至 96 中任一者之治療分子，其中該玻尿酸結合結構域相對於 SEQ ID NO: 29 包含以下胺基酸中之至少一個：R160、Y161、E194、D197、Y208、R214、Y230、F261、D295 及 R233。
實施例 98 為實施例 79 至 97 中任一者之治療分子，其中該玻尿酸結合結構域相對於 SEQ ID NO: 29 包含以下胺基酸中之 2 個、3 個、4 個、5 個、6 個、7 個、8 個、9 個或 10 個：R160、Y161、E194、D197、Y208、R214、Y230、F261、D295 及 R233。
實施例 99 為實施例 79 至 98 中任一者之治療分子，其中該玻尿酸結合結構域相對於 SEQ ID NO: 29 包含在以下位置中之至少一個之突變：R160、Y161、E194、D197、Y208、R214、M222、Y230、R233、K260、F261、D295、Y296、H306、R312、L325、Y326 及 R327。
實施例 100 為實施例 79 至 99 中任一者之治療分子，其中該玻尿酸結合結構域相對於 SEQ ID NO: 29 包含在以下位置中之 2 個、3 個、4 個、5 個、6 個、7 個、8 個、9 個、10 個、11 個、12 個、13 個、14 個、15 個、16 個、17 個或 18 個之突變：R160、Y161、E194、D197、Y208、R214、M222、Y230、R233、K260、F261、D295、Y296、H306、R312、L325、Y326 及 R327。
實施例 101 為實施例 79 至 100 中任一者之治療分子，其中該玻尿酸結合結構域相對於 SEQ ID NO: 29 包含在以下位置中之 2 個、3 個、4 個、5 個或 6 個之突變：R160、Y161、E194、D197、Y208、R214、M222、Y230、R233、K260、F261、D295、Y296、H306、R312、L325、Y326 及 R327。
實施例 102 為實施例 79 至 101 中任一者之治療分子，其中該玻尿酸結合結構域相對於 SEQ ID NO: 29 包含以下突變至少一個：R160A、Y161A、D197A、D197S、Y208A、Y208F、R214K、M222A、Y230A、Y230F、R233A、K260A、K260R、F261Y、KF260RY、D295A、D295S、Y296A、Y296F、DY295SF、H306A、R312A、L325A、Y326A、R327A 及 LYR325LFK。
實施例 103 為實施例 79 至 102 中任一者之治療分子，其中該玻尿酸結合結構域包含 Y208A 及 H306A 中之至少一個。
實施例 104 為實施例 79 至 103 中任一者之治療分子，其中該玻尿酸結合結構域相對於 SEQ ID NO: 29 包含以下突變中之至少 2 個、3 個、4 個、5 個、6 個、7 個、8 個、9 個、10 個、11 個、12 個、13 個、14 個、15 個、16 個或 17 個：R160A、Y161A、D197A、D197S、Y208A、Y208F、R214K、M222A、Y230A、Y230F、R233A、K260A、K260R、F261Y、KF260RY、D295A、D295S、Y296A、Y296F、DY295SF、H306A、R312A、L325A、Y326A、R327A 及 LYR325LFK。
實施例 105 為實施例 79 至 104 中任一者之治療分子，其中該玻尿酸結合結構域相對於 SEQ ID NO: 29 包含以下突變中之至少 2 個、3 個、4 個、5 個或 6 個：R160A、Y161A、D197A、D197S、Y208A、Y208F、R214K、M222A、Y230A、Y230F、R233A、K260A、K260R、F261Y、KF260RY、D295A、D295S、Y296A、Y296F、DY295SF、H306A、R312A、L325A、Y326A、R327A 及 LYR325LFK。
實施例 106 為實施例 79 至 105 中任一者之治療分子，其中該玻尿酸結合結構域為 SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58 或 SEQ ID NO: 59。
實施例 107 為實施例 79 至 106 中任一者之治療分子，其中該治療活性劑包含寡肽、蛋白質或核酸。
實施例 108 為實施例 79 至 107 中任一者之治療分子，其中該治療活性劑包含抗體、抗原結合片段、半胱胺酸結肽、生長因子或適體。
實施例 109 為實施例 108 之治療分子，其中該治療活性劑能夠結合抗原。
實施例 110 為實施例 109 之治療分子，其中該治療活性劑能夠結合 VEGF、HtrA1、IL-33、C5、因子 P、因子 D、EPO、EPOR、IL-1β、IL-17A、IL-10、TNFα、FGFR2、PDGF 或 ANG2。
實施例 111 為實施例 109 或 110 中任一者之治療分子，其中該治療活性劑為抗體或其抗原結合片段 (包括但不限於 Fab 片段、F(ab')2 片段、Fab' 片段、VhH 片段、scFv 片段、scFv-Fc 片段或微抗體)。
實施例 112 為實施例 109 或 110 中任一者之治療分子，其中該治療活性劑為寡肽或蛋白質。
實施例 113 為實施例 102 之治療分子，其中該寡肽或蛋白質為半胱胺酸結肽或酶。
實施例 114 為實施例 103 之治療分子，其中該半胱胺酸結肽係與 SEQ ID NO: 92 至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同。
實施例 115 為實施例 79 至 108 中任一者之治療分子，其中該治療活性劑為生長因子，該生長因子包含纖維母細胞生長因子、血小板衍生生長因子、神經生長因子 (NGF)、VEGF、纖維母細胞生長因子 (FGF) 及類胰島素生長因子 I (IGF-I)。
實施例 116 為實施例 110 之治療分子，其中結合 VEGF 的該治療活性劑包含蘭尼單抗 (ranibizumab)、阿柏西普 (aflibercept)、布西組單抗-dbll (brolucizumab-dbll) 及貝伐珠單抗 (bevacizumab)。
實施例 117 為實施例 79 至 110 中任一者之治療分子，其中該治療活性劑為核酸。
實施例 118 為實施例 117 之治療分子，其中該核酸為適體、反義寡核苷酸及/或鎖核酸。
實施例 119 為實施例 118 之治療分子，其中該適體結合 VEGF。
實施例 120 為實施例 108、118 或 119 中任一者之治療分子，其中該適體係經聚乙二醇化。
實施例 121 為實施例 108 或實施例 118 至 120 中任一者之治療分子，其中該適體為 Macugen®。
實施例 122 為實施例 79 至 121 中任一者之治療分子，其中該治療活性劑經由連接子與該玻尿酸結合結構域共價地連接。
實施例 123 為實施例 122 之治療分子，其中該連接子為至少 4 個胺基酸。
實施例 124 為實施例 122 或 123 之治療分子，其中該連接子的長度不超過 50 個胺基酸。
實施例 125 為實施例 122 至 124 中任一者之治療分子，其中該連接子為 4 至 25 個胺基酸。
實施例 126 為實施例 122 至 125 中任一者之治療分子，其中該連接子包含 (GxS)n 或 (GxS)nGm，其中 G = 甘胺酸，S = 絲胺酸，且 (x = 3，n = 3、4、5 或 6，且 m = 0、1、2 或 3) 或 (x = 4，n = 2、3、4 或 5，且 m = 0、1、2 或 3)。
實施例 127 為實施例 122 至 126 中任一者之治療分子，其中該連接子包含 GGGS (SEQ ID NO: 84) 或其多聚體，更尤其包含 (GGGGS)3 (SEQ ID NO: 85)。
實施例 128 為實施例 122 至 125 中任一者之治療分子，其中該連接子包含 (GxS)n，其中 G = 甘胺酸，S = 絲胺酸，且 (n = 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10)。
實施例 129 為實施例 122 至實施例 125 或 128 中任一者之治療分子，其中該連接子包含 GSGSGSGSGSGSGSGSGSGS (SEQ ID NO: 95)。
實施例 130 為實施例 79 至 107 中任一者之治療分子，其中該治療活性劑包含抗 VEGF 抗原結合部分及半胱胺酸結肽。
實施例 131 為實施例 130 之治療分子，其中該半胱胺酸結肽經由連接子與該玻尿酸結合結構域連接，該連接子包含序列 GSGSGSGSGSGSGSGSGSGS (SEQ ID NO: 95)。
實施例 132 為實施例 130 或 131 之治療分子，其中該序列包含 (a) 抗 VEGF 抗原結合部分；及 (b) 與 SEQ ID NO: 93 或 SEQ ID NO: 94 具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。
實施例 133 為實施例 79 至 132 中任一者之治療分子，其中該玻尿酸結合結構域可非共價地結合至玻尿酸。
實施例 134 為一種遞送靶向患者之組織的治療分子的方法，其包含將如實施例 79 至 133 中任一者之治療分子投予該患者，並允許該治療分子向標靶組織提供該治療活性劑的長效遞送。
實施例 135 為實施例 134 之方法，其進一步包含在投予步驟之前將該治療分子與玻尿酸結合。
實施例 136 為實施例 135 之方法，其進一步包含將包含該治療分子之第一溶液與包含該玻尿酸之第二溶液混合。
實施例 137 為實施例 136 之方法，其中該混合包含容器。
實施例 138 為實施例 137 之方法，其中該容器為兩室注射器。
實施例 139 為實施例 136 至 138 中任一者之方法，其中該混合產生結合至玻尿酸的治療分子，該治療分子準備用於投予受試者。
實施例 140 為實施例 134 至 139 中任一者之方法，其中該投予步驟為單次注射。
實施例 141 為實施例 134 至 140 中任一者之方法，其中該標靶組織包含眼睛或腦。
實施例 142 為實施例 134 至 141 中任一者之方法，其中相較於未經修飾之治療活性劑，該治療分子提供改良之玻璃體相容性、更長之玻璃體停留時間、更長之玻璃體半衰期及/或改良之藥理作用持續時間。
附加之目的及優點將部分地如以下說明書所述，且部分地將從該說明書中顯而易見，或者可藉由實踐得知。該等目的及優點將藉由隨附申請專利範圍中特定指出之要素及組合來實現和獲得。
應理解，前述一般描述及以下詳細描述均僅為例示性及說明性的，且不限制申請專利範圍。
併入本說明書中並構成本說明書之一部分的附圖圖解說明一個（若干個）實施例，且與本說明一起用於闡釋本文所述之某些原理。
相關申請的交叉引用
本案主張 2020 年 10 月 15 日申請的美國臨時專利申請號 63/092,251、及 2021 年 9 月 20 日申請的美國臨時專利申請號 63/250,782 的優先權，兩者均與本案共同擁有，且兩者之全部內容藉由引用明確地併入本文，如同其在本文中完全闡述一樣。 序列說明
表 1 提供了本文所引用之某些序列之列表。提供的胺基酸序列從 N 端到 C 端。
表 1 ：序列說明。
說明 序列 SEQ ID NO
人 CD44 全長序列 MDKFWWHAAWGLCLVPLSLAQIDLNITCRFAGVFHVEKNGRYSISRTEAADLCKAFNSTLPTMAQMEKALSIGFETCRYGFIEGHVVIPRIHPNSICAANNTGVYILTSNTSQYDTYCFNASAPPEEDCTSVTDLPNAFDGPITITIVNRDGTRYVQKGEYRTNPEDIYPSNPTDDDVSSGSSSERSSTSGGYIFYTFSTVHPIPDEDSPWITDSTDRIPATTLMSTSATATETATKRQETWDWFSWLFLPSESKNHLHTTTQMAGTSSNTISAGWEPNEENEDERDRHLSFSGSGIDDDEDFISSTISTTPRAFDHTKQNQDWTQWNPSHSNPEVLLQTTTRMTDVDRNGTTAYEGNWNPEAHPPLIHHEHHEEEETPHSTSTIQATPSSTTEETATQKEQWFGNRWHEGYRQTPKEDSHSTTGTAAASAHTSHPMQGRTTPSPEDSSWTDFFNPISHPMGRGHQAGRRMDMDSSHSITLQPTANPNTGLVEDLDRTGPLSMTTQQSNSQSFSTSHEGLEEDKDHPTTSTLTSSNRNDVTGGRRDPNHSEGSTTLLEGYTSHYPHTKESRTFIPVTSAKTGSFGVTAVTVGDSNSNVNRSLSGDQDTFHPSGGSHTTHGSESDGHSHGSQEGGANTTSGPIRTPQIPEWLIILASLLALALILAVCIAVNSRRRCGQKKKLVINSGNGAVEDRKPSGLNGEASKSQEMVHLVNKESSETPDQFMTADETRNLQNVDMKIGV 1
Fab-HABD 中所使用之 CD44 HA 結合結構域序列 AQIDLNITCRFAGVFHVEKNGRYSISRTEAADLCKAFNSTLPTMAQMEKALSIGFETCRYGFIEGHVVIPRIHPNSICAANNTGVYILTYNTSQYDTYCFNASAPPEEDCTSVTDLPNAFDGPITITIVNRDGTRYVQKGEYRTNPEDIY 2
TNFAIP6；全長 TSG-6 MIILIYLFLLLWEDTQGWGFKDGIFHNSIWLERAAGVYHREARSGKYKLTYAEAKAVCEFEGGHLATYKQLEAARKIGFHVCAAGWMAKGRVGYPIVKPGPNCGFGKTGIIDYGIRLNRSERWDAYCYNPHAKECGGVFTDPKQIFKSPGFPNEYEDNQICYWHIRLKYGQRIHLSFLDFDLEDDPGCLADYVEIYDSYDDVHGFVGRYCGDELPDDIISTGNVMTLKFLSDASVTAGGFQIKYVAMDPVSKSSQGKNTSTTSTGNKNFLAGRFSHL 3
TSG-6 連接結構域 (TSG6; 36-133) GVYHREARSGKYKLTYAEAKAVCEFEGGHLATYKQLEAARKIGFHVCAAGWMAKGRVGYPIVKPGPNCGFGKTGIIDYGIRLNRSERWDAYCYNPHAKHHHHHH 4
VPDF-1xCD44 HC DLQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAADGWWFGYTDMSWVRQAPGKGLEWVGSISYKGGSTYYNTKFIGRFTISRDDDTNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDGYFDTWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGGGGSGGGGSGGGGSAQIDLNITCRFAGVFHVEKNGRYSISRTEAADLCKAFNSTLPTMAQMEKALSIGFETCRYGFIEGHVVIPRIHPNSICAANNTGVYILTYNTSQYDTYCFNASAPPEEDCTSVTDLPNAFDGPITITIVNRDGTRYVQKGEYRTNPEDIY 5
VPDF-1xCD44 LC AIYMHQEPSSLSASVGDRVTITCHGSYWLSNYLAWYQQKPGKAPKLLIYDGKEREHGVPSRFSGSGSHEDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYRYHPYTFGHGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE 6
VPDF-2xCD44 HC DLQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAADGWWFGYTDMSWVRQAPGKGLEWVGSISYKGGSTYYNTKFIGRFTISRDDDTNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDGYFDTWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGGGGSGGGGSGGGGSAQIDLNITCRFAGVFHVEKNGRYSISRTEAADLCKAFNSTLPTMAQMEKALSIGFETCRYGFIEGHVVIPRIHPNSICAANNTGVYILTYNTSQYDTYCFNASAPPEEDCTSVTDLPNAFDGPITITIVNRDGTRYVQKGEYRTNPEDIY 7
VPDF-2xCD44 LC AIYMHQEPSSLSASVGDRVTITCHGSYWLSNYLAWYQQKPGKAPKLLIYDGKEREHGVPSRFSGSGSHEDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYRYHPYTFGHGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSAQIDLNITCRFAGVFHVEKNGRYSISRTEAADLCKAFNSTLPTMAQMEKALSIGFETCRYGFIEGHVVIPRIHPNSICAANNTGVYILTYNTSQYDTYCFNASAPPEEDCTSVTDLPNAFDGPITITIVNRDGTRYVQKGEYRTNPEDIY 8
Dig-1xCD44 HC QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWIRQAPGKGLEWVSSINIGATYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPGSPYEYDKAYYSMAYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGGGGSGGGGSGGGGSAQIDLNITCRFAGVFHVEKNGRYSISRTEAADLCKAFNSTLPTMAQMEKALSIGFETCRYGFIEGHVVIPRIHPNSICAANNTGVYILTYNTSQYDTYCFNASAPPEEDCTSVTDLPNAFDGPITITIVNRDGTRYVQKGEYRTNPEDIY 9
Dig-1xCD44 LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIKNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYSSTLLSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSITLPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 10
Dig-2xCD44 HC QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWIRQAPGKGLEWVSSINIGATYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPGSPYEYDKAYYSMAYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGGGGSGGGGSGGGGSAQIDLNITCRFAGVFHVEKNGRYSISRTEAADLCKAFNSTLPTMAQMEKALSIGFETCRYGFIEGHVVIPRIHPNSICAANNTGVYILTYNTSQYDTYCFNASAPPEEDCTSVTDLPNAFDGPITITIVNRDGTRYVQKGEYRTNPEDIY 11
Dig-2xCD44 LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIKNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYSSTLLSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSITLPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSAQIDLNITCRFAGVFHVEKNGRYSISRTEAADLCKAFNSTLPTMAQMEKALSIGFETCRYGFIEGHVVIPRIHPNSICAANNTGVYILTYNTSQYDTYCFNASAPPEEDCTSVTDLPNAFDGPITITIVNRDGTRYVQKGEYRTNPEDIY 12
RabFab-1xTSG6 HC QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFTISSYHMSWVRQAPGKGLEWIGIMRNTANIYYASWAKGRFTISKTSPTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARGRPGDGALSLWGQGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTGGGGSGVYHREARSGKYKLTYAEAKAVCEFEGGHLATYKQLEAARKIGFHVCAAGWMAKGRVGYPIVKPGPNCGFGKTGIIDYGIRLNRSERWDAYCYNPHAKHHHHHH 13
RabFab-1xTSG6 LC ADVVMTQTPASVSAAVGGTVTIKCQASQSIGTALAWYQQKPGQPPKLLIYRTSTLESGVPSRFKGSGSGTDFTLTISDLECADAATYYCQSAYVSGGNIYTFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNGHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC 14
RabFab-2xTSG6 HC    QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFTISSYHMSWVRQAPGKGLEWIGIMRNTANIYYASWAKGRFTISKTSPTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARGRPGDGALSLWGQGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTGGGGSGVYHREARSGKYKLTYAEAKAVCEFEGGHLATYKQLEAARKIGFHVCAAGWMAKGRVGYPIVKPGPNCGFGKTGIIDYGIRLNRSERWDAYCYNPHAKHHHHHH 15
RabFab-2xTSG6 LC ADVVMTQTPASVSAAVGGTVTIKCQASQSIGTALAWYQQKPGQPPKLLIYRTSTLESGVPSRFKGSGSGTDFTLTISDLECADAATYYCQSAYVSGGNIYTFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNGHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDCGGGGSGVYHREARSGKYKLTYAEAKAVCEFEGGRLATYKQLEAARKIGFHVCAAGWMAKGRVGYPIVKPGSNCGFGKTGIIDYGIRLNRSERWDAYCYNPHAKDYKDDDDK 16
G6.31-1xTSG6 HC    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISDYWIHWVRQAPGKGLEWVAGITPAGGYTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARFVFFLPYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTGGGGSGVYHREARSGKYKLTYAEAKAVCEFEGGHLATYKQLEAARKIGFHVCAAGWMAKGRVGYPIVKPGPNCGFGKTGIIDYGIRLNRSERWDAYCYNPHAKHHHHHH 17
G6.31-1xTSG6 LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYGNPFTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 18
G6.31-2xTSG6 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISDYWIHWVRQAPGKGLEWVAGITPAGGYTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARFVFFLPYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTGGGGSGVYHREARSGKYKLTYAEAKAVCEFEGGHLATYKQLEAARKIGFHVCAAGWMAKGRVGYPIVKPGPNCGFGKTGIIDYGIRLNRSERWDAYCYNPHAKHHHHHH 19
G6.31-2xTSG6 LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYGNPFTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGVYHREARSGKYKLTYAEAKAVCEFEGGHLATYKQLEAARKIGFHVCAAGWMAKGRVGYPIVKPGPNCGFGKTGIIDYGIRLNRSERWDAYCYNPHAKDYKDDDDK 20
NVS24-1xTSG6 (Lava12) HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLTNYYYMTWVRQAPGKGLEWVGFIDPQNDPYYATWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGNHNSGWGLNIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCGSGGGGVYHREAISGKYYLTYAEAKAVCEFEGGHLATYKQLLAAQKIGFHVCAAGWMAKGRVGYPIVKPGPNCGFGKTGIIDYGIRLNRSERWDAYCYNPHA 21
NVS24-1xTSG6 (Lava12) LC EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQKIHSWLAWYQQKPGKAPKLLIYQASKLAKGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNVYLASTNGANFGQGTKLTVLKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 22
VPDF-1xTSG6 (Lava12) HC DLQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAADGWWFGYTDMSWVRQAPGKGLEWVGSISYKGGSTYYNTKFIGRFTISRDDDTNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDGYFDTWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTGGGGSGVYHREAISGKYYLTYAEAKAVCEFEGGHLATYKQLLAAQKIGFHVCAAGWMAKGRVGYPIVKPGPNCGFGKTGIIDYGIRLNRSERWDAYCYNPHAK 23
VPDF-1xTSG6 (Lava12) LC AIYMHQEPSSLSASVGDRVTITCHGSYWLSNYLAWYQQKPGKAPKLLIYDGKEREHGVPSRFSGSGSHEDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYRYHPYTFGHGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 24
VPDF-2xCD44 敲除 (ko) HC DLQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAADGWWFGYTDMSWVRQAPGKGLEWVGSISYKGGSTYYNTKFIGRFTISRDDDTNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDGYFDTWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGGGGSGGGGSGGGGSAQIDLNITCRFAGVFHVEKNGRSSISRTEAADLCKAFNSTLPTMAQMEKALSIGFETCRYGFIEGHVVIPRIHPNSICAANNTGVYILTYNTSQYDTYCFNASAPPEEDCTSVTDLPNAFDGPITITIVNRDGTRYVQKGEYRTNPEDIY 25
VPDF-2xCD44 敲除 (ko) LC AIYMHQEPSSLSASVGDRVTITCHGSYWLSNYLAWYQQKPGKAPKLLIYDGKEREHGVPSRFSGSGSHEDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYRYHPYTFGHGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSAQIDLNITCRFAGVFHVEKNGRSSISRTEAADLCKAFNSTLPTMAQMEKALSIGFETCRYGFIEGHVVIPRIHPNSICAANNTGVYILTYNTSQYDTYCFNASAPPEEDCTSVTDLPNAFDGPITITIVNRDGTRYVQKGEYRTNPEDIY 26
RabFab-VG1、PigFab-VG1、G6.31.Fab-VG1、VPDF-VG1、VPDF-VG1∆Ig、20D12v2.3-VG1 之連接子 GGGGS 27
連接子 GGGGSGGGGSGGGGS 28
WT VG1 LHKVKVGKSP PVRGSLSGKV SLPCHFSTMP TLPPSYNTSE FLRIKWSKIE VDKNGKDLKE TTVLVAQNGN IKIGQDYKGR VSVPTHPEAV GDASLTVVKL LASDAGLYRC DVMYGIEDTQ DTVSLTVDGV VFHYRAATSR YTLNFEAAQK ACLDVGAVIA TPEQLFAAYE DGFEQCDAGW LADQTVRYPI RAPRVGCYGD KMGKAGVRTY GFRSPQETYD VYCYVDHLDG DVFHLTVPSK FTFEEAAKEC ENQDARLATV GELQAAWRNG FDQCDYGWLS DASVRHPVTV ARAQCGGGLL GVRTLYRFEN QTGFPPPDSR FDAYCFKPKE GNSHHHHHHH H 29
VG Link1 GSGVVFHYRA ATSRYTLNFE AAQKACLDVG AVIATPEQLF AAYEDGFEQC DAGWLADQTV RYPIRAPRVG CYGDKMGKAG VRTYGFRSPQ ETYDVYCYVD HHHHHHHH 30
VG Link2 GDVFHLTVPS KFTFEEAAKE CENQDARLAT VGELQAAWRN GFDQCDYGWL SDASVRHPVT VARAQCGGGL LGVRTLYRFE NQTGFPPPDS RFDAYCFKPK EGNSHHHHHH HH 31
VG1∆Ig VVFHYRAATS RYTLNFEAAQ KACLDVGAVI ATPEQLFAAY EDGFEQCDAG WLADQTVRYP IRAPRVGCYG DKMGKAGVRT YGFRSPQETY DVYCYVDHLD GDVFHLTVPS KFTFEEAAKE CENQDARLAT VGELQAAWRN GFDQCDYGWL SDASVRHPVT VARAQCGGGL LGVRTLYRFE NQTGFPPPDS RFDAYCFKPK EGNSHHHHHH HH 32
R160A LHKVKVGKSP PVRGSLSGKV SLPCHFSTMP TLPPSYNTSE FLRIKWSKIE VDKNGKDLKE TTVLVAQNGN IKIGQDYKGR VSVPTHPEAV GDASLTVVKL LASDAGLYRC DVMYGIEDTQ DTVSLTVDGV VFHYRAATSA YTLNFEAAQK ACLDVGAVIA TPEQLFAAYE DGFEQCDAGW LADQTVRYPI RAPRVGCYGD KMGKAGVRTY GFRSPQETYD VYCYVDHLDG DVFHLTVPSK FTFEEAAKEC ENQDARLATV GELQAAWRNG FDQCDYGWLS DASVRHPVTV ARAQCGGGLL GVRTLYRFEN QTGFPPPDSR FDAYCFKPKE GNSHHHHHHH H 33
Y161A LHKVKVGKSP PVRGSLSGKV SLPCHFSTMP TLPPSYNTSE FLRIKWSKIE VDKNGKDLKE TTVLVAQNGN IKIGQDYKGR VSVPTHPEAV GDASLTVVKL LASDAGLYRC DVMYGIEDTQ DTVSLTVDGV VFHYRAATSR ATLNFEAAQK ACLDVGAVIA TPEQLFAAYE DGFEQCDAGW LADQTVRYPI RAPRVGCYGD KMGKAGVRTY GFRSPQETYD VYCYVDHLDG DVFHLTVPSK FTFEEAAKEC ENQDARLATV GELQAAWRNG FDQCDYGWLS DASVRHPVTV ARAQCGGGLL GVRTLYRFEN QTGFPPPDSR FDAYCFKPKE GNSHHHHHHH H 34
E194A LHKVKVGKSP PVRGSLSGKV SLPCHFSTMP TLPPSYNTSE FLRIKWSKIE VDKNGKDLKE TTVLVAQNGN IKIGQDYKGR VSVPTHPEAV GDASLTVVKL LASDAGLYRC DVMYGIEDTQ DTVSLTVDGV VFHYRAATSR YTLNFEAAQK ACLDVGAVIA TPEQLFAAYE DGFAQCDAGW LADQTVRYPI RAPRVGCYGD KMGKAGVRTY GFRSPQETYD VYCYVDHLDG DVFHLTVPSK FTFEEAAKEC ENQDARLATV GELQAAWRNG FDQCDYGWLS DASVRHPVTV ARAQCGGGLL GVRTLYRFEN QTGFPPPDSR FDAYCFKPKE GNSHHHHHHH H 35
D197A LHKVKVGKSP PVRGSLSGKV SLPCHFSTMP TLPPSYNTSE FLRIKWSKIE VDKNGKDLKE TTVLVAQNGN IKIGQDYKGR VSVPTHPEAV GDASLTVVKL LASDAGLYRC DVMYGIEDTQ DTVSLTVDGV VFHYRAATSR YTLNFEAAQK ACLDVGAVIA TPEQLFAAYE DGFEQCAAGW LADQTVRYPI RAPRVGCYGD KMGKAGVRTY GFRSPQETYD VYCYVDHLDG DVFHLTVPSK FTFEEAAKEC ENQDARLATV GELQAAWRNG FDQCDYGWLS DASVRHPVTV ARAQCGGGLL GVRTLYRFEN QTGFPPPDSR FDAYCFKPKE GNSHHHHHHH H 36
D197S LHKVKVGKSP PVRGSLSGKV SLPCHFSTMP TLPPSYNTSE FLRIKWSKIE VDKNGKDLKE TTVLVAQNGN IKIGQDYKGR VSVPTHPEAV GDASLTVVKL LASDAGLYRC DVMYGIEDTQ DTVSLTVDGV VFHYRAATSR YTLNFEAAQK ACLDVGAVIA TPEQLFAAYE DGFEQCSAGW LADQTVRYPI RAPRVGCYGD KMGKAGVRTY GFRSPQETYD VYCYVDHLDG DVFHLTVPSK FTFEEAAKEC ENQDARLATV GELQAAWRNG FDQCDYGWLS DASVRHPVTV ARAQCGGGLL GVRTLYRFEN QTGFPPPDSR FDAYCFKPKE GNSHHHHHHH H 37
Y208A LHKVKVGKSP PVRGSLSGKV SLPCHFSTMP TLPPSYNTSE FLRIKWSKIE VDKNGKDLKE TTVLVAQNGN IKIGQDYKGR VSVPTHPEAV GDASLTVVKL LASDAGLYRC DVMYGIEDTQ DTVSLTVDGV VFHYRAATSR YTLNFEAAQK ACLDVGAVIA TPEQLFAAYE DGFEQCDAGW LADQTVRAPI RAPRVGCYGD KMGKAGVRTY GFRSPQETYD VYCYVDHLDG DVFHLTVPSK FTFEEAAKEC ENQDARLATV GELQAAWRNG FDQCDYGWLS DASVRHPVTV ARAQCGGGLL GVRTLYRFEN QTGFPPPDSR FDAYCFKPKE GNSHHHHHHH H 38
Y208F LHKVKVGKSP PVRGSLSGKV SLPCHFSTMP TLPPSYNTSE FLRIKWSKIE VDKNGKDLKE TTVLVAQNGN IKIGQDYKGR VSVPTHPEAV GDASLTVVKL LASDAGLYRC DVMYGIEDTQ DTVSLTVDGV VFHYRAATSR YTLNFEAAQK ACLDVGAVIA TPEQLFAAYE DGFEQCDAGW LADQTVRFPI RAPRVGCYGD KMGKAGVRTY GFRSPQETYD VYCYVDHLDG DVFHLTVPSK FTFEEAAKEC ENQDARLATV GELQAAWRNG FDQCDYGWLS DASVRHPVTV ARAQCGGGLL GVRTLYRFEN QTGFPPPDSR FDAYCFKPKE GNSHHHHHHH H 39
R214A LHKVKVGKSP PVRGSLSGKV SLPCHFSTMP TLPPSYNTSE FLRIKWSKIE VDKNGKDLKE TTVLVAQNGN IKIGQDYKGR VSVPTHPEAV GDASLTVVKL LASDAGLYRC DVMYGIEDTQ DTVSLTVDGV VFHYRAATSR YTLNFEAAQK ACLDVGAVIA TPEQLFAAYE DGFEQCDAGW LADQTVRYPI RAPAVGCYGD KMGKAGVRTY GFRSPQETYD VYCYVDHLDG DVFHLTVPSK FTFEEAAKEC ENQDARLATV GELQAAWRNG FDQCDYGWLS DASVRHPVTV ARAQCGGGLL GVRTLYRFEN QTGFPPPDSR FDAYCFKPKE GNSHHHHHHH H 40
R214K LHKVKVGKSP PVRGSLSGKV SLPCHFSTMP TLPPSYNTSE FLRIKWSKIE VDKNGKDLKE TTVLVAQNGN IKIGQDYKGR VSVPTHPEAV GDASLTVVKL LASDAGLYRC DVMYGIEDTQ DTVSLTVDGV VFHYRAATSR YTLNFEAAQK ACLDVGAVIA TPEQLFAAYE DGFEQCDAGW LADQTVRYPI RAPKVGCYGD KMGKAGVRTY GFRSPQETYD VYCYVDHLDG DVFHLTVPSK FTFEEAAKEC ENQDARLATV GELQAAWRNG FDQCDYGWLS DASVRHPVTV ARAQCGGGLL GVRTLYRFEN QTGFPPPDSR FDAYCFKPKE GNSHHHHHHH H 41
M222A LHKVKVGKSP PVRGSLSGKV SLPCHFSTMP TLPPSYNTSE FLRIKWSKIE VDKNGKDLKE TTVLVAQNGN IKIGQDYKGR VSVPTHPEAV GDASLTVVKL LASDAGLYRC DVMYGIEDTQ DTVSLTVDGV VFHYRAATSR YTLNFEAAQK ACLDVGAVIA TPEQLFAAYE DGFEQCDAGW LADQTVRYPI RAPRVGCYGD KAGKAGVRTY GFRSPQETYD VYCYVDHLDG DVFHLTVPSK FTFEEAAKEC ENQDARLATV GELQAAWRNG FDQCDYGWLS DASVRHPVTV ARAQCGGGLL GVRTLYRFEN QTGFPPPDSR FDAYCFKPKE GNSHHHHHHH H 42
Y230A LHKVKVGKSP PVRGSLSGKV SLPCHFSTMP TLPPSYNTSE FLRIKWSKIE VDKNGKDLKE TTVLVAQNGN IKIGQDYKGR VSVPTHPEAV GDASLTVVKL LASDAGLYRC DVMYGIEDTQ DTVSLTVDGV VFHYRAATSR YTLNFEAAQK ACLDVGAVIA TPEQLFAAYE DGFEQCDAGW LADQTVRYPI RAPRVGCYGD KMGKAGVRTA GFRSPQETYD VYCYVDHLDG DVFHLTVPSK FTFEEAAKEC ENQDARLATV GELQAAWRNG FDQCDYGWLS DASVRHPVTV ARAQCGGGLL GVRTLYRFEN QTGFPPPDSR FDAYCFKPKE GNSHHHHHHH H 43
Y230F LHKVKVGKSP PVRGSLSGKV SLPCHFSTMP TLPPSYNTSE FLRIKWSKIE VDKNGKDLKE TTVLVAQNGN IKIGQDYKGR VSVPTHPEAV GDASLTVVKL LASDAGLYRC DVMYGIEDTQ DTVSLTVDGV VFHYRAATSR YTLNFEAAQK ACLDVGAVIA TPEQLFAAYE DGFEQCDAGW LADQTVRYPI RAPRVGCYGD KMGKAGVRTF GFRSPQETYD VYCYVDHLDG DVFHLTVPSK FTFEEAAKEC ENQDARLATV GELQAAWRNG FDQCDYGWLS DASVRHPVTV ARAQCGGGLL GVRTLYRFEN QTGFPPPDSR FDAYCFKPKE GNSHHHHHHH H 44
R233A LHKVKVGKSP PVRGSLSGKV SLPCHFSTMP TLPPSYNTSE FLRIKWSKIE VDKNGKDLKE TTVLVAQNGN IKIGQDYKGR VSVPTHPEAV GDASLTVVKL LASDAGLYRC DVMYGIEDTQ DTVSLTVDGV VFHYRAATSR YTLNFEAAQK ACLDVGAVIA TPEQLFAAYE DGFEQCDAGW LADQTVRYPI RAPRVGCYGD KMGKAGVRTY GFASPQETYD VYCYVDHLDG DVFHLTVPSK FTFEEAAKEC ENQDARLATV GELQAAWRNG FDQCDYGWLS DASVRHPVTV ARAQCGGGLL GVRTLYRFEN QTGFPPPDSR FDAYCFKPKE GNSHHHHHHH H 45
K260A LHKVKVGKSP PVRGSLSGKV SLPCHFSTMP TLPPSYNTSE FLRIKWSKIE VDKNGKDLKE TTVLVAQNGN IKIGQDYKGR VSVPTHPEAV GDASLTVVKL LASDAGLYRC DVMYGIEDTQ DTVSLTVDGV VFHYRAATSR YTLNFEAAQK ACLDVGAVIA TPEQLFAAYE DGFEQCDAGW LADQTVRYPI RAPRVGCYGD KMGKAGVRTY GFRSPQETYD VYCYVDHLDG DVFHLTVPSA FTFEEAAKEC ENQDARLATV GELQAAWRNG FDQCDYGWLS DASVRHPVTV ARAQCGGGLL GVRTLYRFEN QTGFPPPDSR FDAYCFKPKE GNSHHHHHHH H 46
F261A LHKVKVGKSP PVRGSLSGKV SLPCHFSTMP TLPPSYNTSE FLRIKWSKIE VDKNGKDLKE TTVLVAQNGN IKIGQDYKGR VSVPTHPEAV GDASLTVVKL LASDAGLYRC DVMYGIEDTQ DTVSLTVDGV VFHYRAATSR YTLNFEAAQK ACLDVGAVIA TPEQLFAAYE DGFEQCDAGW LADQTVRYPI RAPRVGCYGD KMGKAGVRTY GFRSPQETYD VYCYVDHLDG DVFHLTVPSK ATFEEAAKEC ENQDARLATV GELQAAWRNG FDQCDYGWLS DASVRHPVTV ARAQCGGGLL GVRTLYRFEN QTGFPPPDSR FDAYCFKPKE GNSHHHHHHH H 47
D295A LHKVKVGKSP PVRGSLSGKV SLPCHFSTMP TLPPSYNTSE FLRIKWSKIE VDKNGKDLKE TTVLVAQNGN IKIGQDYKGR VSVPTHPEAV GDASLTVVKL LASDAGLYRC DVMYGIEDTQ DTVSLTVDGV VFHYRAATSR YTLNFEAAQK ACLDVGAVIA TPEQLFAAYE DGFEQCDAGW LADQTVRYPI RAPRVGCYGD KMGKAGVRTY GFRSPQETYD VYCYVDHLDG DVFHLTVPSK FTFEEAAKEC ENQDARLATV GELQAAWRNG FDQCAYGWLS DASVRHPVTV ARAQCGGGLL GVRTLYRFEN QTGFPPPDSR FDAYCFKPKE GNSHHHHHHH H 48
Y296A LHKVKVGKSP PVRGSLSGKV SLPCHFSTMP TLPPSYNTSE FLRIKWSKIE VDKNGKDLKE TTVLVAQNGN IKIGQDYKGR VSVPTHPEAV GDASLTVVKL LASDAGLYRC DVMYGIEDTQ DTVSLTVDGV VFHYRAATSR YTLNFEAAQK ACLDVGAVIA TPEQLFAAYE DGFEQCDAGW LADQTVRYPI RAPRVGCYGD KMGKAGVRTY GFRSPQETYD VYCYVDHLDG DVFHLTVPSK FTFEEAAKEC ENQDARLATV GELQAAWRNG FDQCDAGWLS DASVRHPVTV ARAQCGGGLL GVRTLYRFEN QTGFPPPDSR FDAYCFKPKE GNSHHHHHHH H 49
H306A LHKVKVGKSP PVRGSLSGKV SLPCHFSTMP TLPPSYNTSE FLRIKWSKIE VDKNGKDLKE TTVLVAQNGN IKIGQDYKGR VSVPTHPEAV GDASLTVVKL LASDAGLYRC DVMYGIEDTQ DTVSLTVDGV VFHYRAATSR YTLNFEAAQK ACLDVGAVIA TPEQLFAAYE DGFEQCDAGW LADQTVRYPI RAPRVGCYGD KMGKAGVRTY GFRSPQETYD VYCYVDHLDG DVFHLTVPSK FTFEEAAKEC ENQDARLATV GELQAAWRNG FDQCDYGWLS DASVRAPVTV ARAQCGGGLL GVRTLYRFEN QTGFPPPDSR FDAYCFKPKE GNSHHHHHHH H 50
R312A LHKVKVGKSP PVRGSLSGKV SLPCHFSTMP TLPPSYNTSE FLRIKWSKIE VDKNGKDLKE TTVLVAQNGN IKIGQDYKGR VSVPTHPEAV GDASLTVVKL LASDAGLYRC DVMYGIEDTQ DTVSLTVDGV VFHYRAATSR YTLNFEAAQK ACLDVGAVIA TPEQLFAAYE DGFEQCDAGW LADQTVRYPI RAPRVGCYGD KMGKAGVRTY GFRSPQETYD VYCYVDHLDG DVFHLTVPSK FTFEEAAKEC ENQDARLATV GELQAAWRNG FDQCDYGWLS DASVRHPVTV AAAQCGGGLL GVRTLYRFEN QTGFPPPDSR FDAYCFKPKE GNSHHHHHHH H 51
R312K LHKVKVGKSP PVRGSLSGKV SLPCHFSTMP TLPPSYNTSE FLRIKWSKIE VDKNGKDLKE TTVLVAQNGN IKIGQDYKGR VSVPTHPEAV GDASLTVVKL LASDAGLYRC DVMYGIEDTQ DTVSLTVDGV VFHYRAATSR YTLNFEAAQK ACLDVGAVIA TPEQLFAAYE DGFEQCDAGW LADQTVRYPI RAPRVGCYGD KMGKAGVRTY GFRSPQETYD VYCYVDHLDG DVFHLTVPSK FTFEEAAKEC ENQDARLATV GELQAAWRNG FDQCDYGWLS DASVRHPVTV AKAQCGGGLL GVRTLYRFEN QTGFPPPDSR FDAYCFKPKE GNSHHHHHHH H 52
L325A LHKVKVGKSP PVRGSLSGKV SLPCHFSTMP TLPPSYNTSE FLRIKWSKIE VDKNGKDLKE TTVLVAQNGN IKIGQDYKGR VSVPTHPEAV GDASLTVVKL LASDAGLYRC DVMYGIEDTQ DTVSLTVDGV VFHYRAATSR YTLNFEAAQK ACLDVGAVIA TPEQLFAAYE DGFEQCDAGW LADQTVRYPI RAPRVGCYGD KMGKAGVRTY GFRSPQETYD VYCYVDHLDG DVFHLTVPSK FTFEEAAKEC ENQDARLATV GELQAAWRNG FDQCDYGWLS DASVRHPVTV ARAQCGGGLL GVRTAYRFEN QTGFPPPDSR FDAYCFKPKE GNSHHHHHHH H 53
Y326A LHKVKVGKSP PVRGSLSGKV SLPCHFSTMP TLPPSYNTSE FLRIKWSKIE VDKNGKDLKE TTVLVAQNGN IKIGQDYKGR VSVPTHPEAV GDASLTVVKL LASDAGLYRC DVMYGIEDTQ DTVSLTVDGV VFHYRAATSR YTLNFEAAQK ACLDVGAVIA TPEQLFAAYE DGFEQCDAGW LADQTVRYPI RAPRVGCYGD KMGKAGVRTY GFRSPQETYD VYCYVDHLDG DVFHLTVPSK FTFEEAAKEC ENQDARLATV GELQAAWRNG FDQCDYGWLS DASVRHPVTV ARAQCGGGLL GVRTLARFEN QTGFPPPDSR FDAYCFKPKE GNSHHHHHHH H 54
R327A LHKVKVGKSP PVRGSLSGKV SLPCHFSTMP TLPPSYNTSE FLRIKWSKIE VDKNGKDLKE TTVLVAQNGN IKIGQDYKGR VSVPTHPEAV GDASLTVVKL LASDAGLYRC DVMYGIEDTQ DTVSLTVDGV VFHYRAATSR YTLNFEAAQK ACLDVGAVIA TPEQLFAAYE DGFEQCDAGW LADQTVRYPI RAPRVGCYGD KMGKAGVRTY GFRSPQETYD VYCYVDHLDG DVFHLTVPSK FTFEEAAKEC ENQDARLATV GELQAAWRNG FDQCDYGWLS DASVRHPVTV ARAQCGGGLL GVRTLYAFEN QTGFPPPDSR FDAYCFKPKE GNSHHHHHHH H 55
RY160KF LHKVKVGKSP PVRGSLSGKV SLPCHFSTMP TLPPSYNTSE FLRIKWSKIE VDKNGKDLKE TTVLVAQNGN IKIGQDYKGR VSVPTHPEAV GDASLTVVKL LASDAGLYRC DVMYGIEDTQ DTVSLTVDGV VFHYRAATSK FTLNFEAAQK ACLDVGAVIA TPEQLFAAYE DGFEQCDAGW LADQTVRYPI RAPRVGCYGD KMGKAGVRTY GFRSPQETYD VYCYVDHLDG DVFHLTVPSK FTFEEAAKEC ENQDARLATV GELQAAWRNG FDQCDYGWLS DASVRHPVTV ARAQCGGGLL GVRTLYRFEN QTGFPPPDSR FDAYCFKPKE GNSHHHHHHH H 56
LYR325LFK LHKVKVGKSP PVRGSLSGKV SLPCHFSTMP TLPPSYNTSE FLRIKWSKIE VDKNGKDLKE TTVLVAQNGN IKIGQDYKGR VSVPTHPEAV GDASLTVVKL LASDAGLYRC DVMYGIEDTQ DTVSLTVDGV VFHYRAATSR YTLNFEAAQK ACLDVGAVIA TPEQLFAAYE DGFEQCDAGW LADQTVRYPI RAPRVGCYGD KMGKAGVRTY GFRSPQETYD VYCYVDHLDG DVFHLTVPSK FTFEEAAKEC ENQDARLATV GELQAAWRNG FDQCDYGWLS DASVRHPVTV ARAQCGGGLL GVRTLFKFEN QTGFPPPDSR FDAYCFKPKE GNSHHHHHHH H 57
KF260RY LHKVKVGKSP PVRGSLSGKV SLPCHFSTMP TLPPSYNTSE FLRIKWSKIE VDKNGKDLKE TTVLVAQNGN IKIGQDYKGR VSVPTHPEAV GDASLTVVKL LASDAGLYRC DVMYGIEDTQ DTVSLTVDGV VFHYRAATSR YTLNFEAAQK ACLDVGAVIA TPEQLFAAYE DGFEQCDAGW LADQTVRYPI RAPRVGCYGD KMGKAGVRTY GFRSPQETYD VYCYVDHLDG DVFHLTVPSR YTFEEAAKEC ENQDARLATV GELQAAWRNG FDQCDYGWLS DASVRHPVTV ARAQCGGGLL GVRTLYRFEN QTGFPPPDSR FDAYCFKPKE GNSHHHHHHH H 58
DY295SF LHKVKVGKSP PVRGSLSGKV SLPCHFSTMP TLPPSYNTSE FLRIKWSKIE VDKNGKDLKE TTVLVAQNGN IKIGQDYKGR VSVPTHPEAV GDASLTVVKL LASDAGLYRC DVMYGIEDTQ DTVSLTVDGV VFHYRAATSR YTLNFEAAQK ACLDVGAVIA TPEQLFAAYE DGFEQCDAGW LADQTVRYPI RAPRVGCYGD KMGKAGVRTY GFRSPQETYD VYCYVDHLDG DVFHLTVPSK FTFEEAAKEC ENQDARLATV GELQAAWRNG FDQCSFGWLS DASVRHPVTV ARAQCGGGLL GVRTLYRFEN QTGFPPPDSR FDAYCFKPKE GNSHHHHHHH H 59
WT VG1 共有序列 LHKVKVGKSP PVRGSLSGKV SLPCHFSTMP TLPPSYNTSE FLRIKWSKIE VDKNGKDLKE TTVLVAQNGN IKIGQDYKGR VSVPTHPEAV GDASLTVVKL LASDAGLYRC DVMYGIEDTQ DTVSLTVDGV VFHYRAATSR YTLNFEAAQK ACLDVGAVIA TPEQLFAAYE DGFEQC(D/S)AGW LADQTVRXPI RAP(R/K)VGCYGD KXGKAGVRTX GFRSPQETYD VYCYVDHLDG DVFHLTVPSX (F/Y)TFEEAAKEC ENQDARLATV GELQAAWRNG FDQC(D/S)XGWLS DASVRXPVTV AXAQCGGGLL GVRTXXXFEN QTGFPPPDSR FDAYCFKPKE    X = 任何胺基酸；(D/S) = Asp 或 Ser；(R/K) = Arg 或 Ser；粗體胺基酸 = 在一些實施例中未發生突變之野生型殘基，其旨在增強結合。 60
RabFab, LC ADVVMTQTPA SVSAAVGGTV TIKCQASQSI GTALAWYQQK PGQPPKLLIY RTSTLESGVP SRFKGSGSGT DFTLTISDLE CADAATYYCQ SAYVSGGNIY TFGGGTEVVV KGDPVAPTVL IFPPAADQVA TGTVTIVCVA NKYFPDVTVT WEVDGTTQTT GIENSKTPQN SADCTYNLSS TLTLTSTQYN GHKEYTCKVT QGTTSVVQSF NRGDC 61
RabFab, HC QSLEESGGRL VTPGTPLTLT CTVSGFTISS YHMSWVRQAP GKGLEWIGIM RNTANIYYAS WAKGRFTISK TSPTTVDLKM TSLTTEDTAT YFCARGRPGD GALSLWGQGT LVTVSSGQPK APSVFPLAPC CGDTPSSTVT LGCLVKGYLP EPVTVTWNSG TLTNGVRTFP SVRQSSGLYS LSSVVSVTSS SQPVTCNVAH PATNTKVDKT VAPSTCSKPT 62
RabFab-VG1, LC ADVVMTQTPA SVSAAVGGTV TIKCQASQSI GTALAWYQQK PGQPPKLLIY RTSTLESGVP SRFKGSGSGT DFTLTISDLE CADAATYYCQ SAYVSGGNIY TFGGGTEVVV KGDPVAPTVL IFPPAADQVA TGTVTIVCVA NKYFPDVTVT WEVDGTTQTT GIENSKTPQN SADCTYNLSS TLTLTSTQYN GHKEYTCKVT QGTTSVVQSF NRGDC 63
RabFab-VG1，HC QSLEESGGRL VTPGTPLTLT CTVSGFTISS YHMSWVRQAP GKGLEWIGIM RNTANIYYAS WAKGRFTISK TSPTTVDLKM TSLTTEDTAT YFCARGRPGD GALSLWGQGT LVTVSSGQPK APSVFPLAPC CGDTPSSTVT LGCLVKGYLP EPVTVTWNSG TLTNGVRTFP SVRQSSGLYS LSSVVSVTSS SQPVTCNVAH PATNTKVDKT VAPSTCSKPT GGGGSLHKVK VGKSPPVRGS LSGKVSLPCH FSTMPTLPPS YNTSEFLRIK WSKIEVDKNG KDLKETTVLV AQNGNIKIGQ DYKGRVSVPT HPEAVGDASL TVVKLLASDA GLYRCDVMYG IEDTQDTVSL TVDGVVFHYR AATSRYTLNF EAAQKACLDV GAVIATPEQL FAAYEDGFEQ CDAGWLADQT VRYPIRAPRV GCYGDKMGKA GVRTYGFRSP QETYDVYCYV DHLDGDVFHL TVPSKFTFEE AAKECENQDA RLATVGELQA AWRNGFDQCD YGWLSDASVR HPVTVARAQC GGGLLGVRTL YRFENQTGFP PPDSRFDAYC FKPKEGNSHH HHHHHH 64
PigFab-VG1, LC AIQLTQSPAS LAASLGDTVS ITCRASQDVS TAVAWYQQQA GKAPKLLIYS ASFLYSGVPS RFKGSGSGTD FTLTISGLQA EDVATYYCQQ GYGNPFTFGQ GTKLELKRAD AKPSVFIFPP SKEQLETQTV SVVCLLNSFF PREVNVKWKV DGVVQSSGIL DSVTEQDSKD STYSLSSTLS LPTSQYLSHN LYSCEVTHKT LASPLVKSFS RNECEA 65
PigFab-VG1, HC EEKLVESGGG LVQPGGSLRL SCVGSGFTIS DYWIHWVRQA PGKGLEWLAG ITPAGGYTYY ADSVKGRFTI SSDNSQNTAY LQMNSLRTED TARYYCARFV FFLPYAMDYW GPGVEVVVSS APKTAPSVYP LAPCSRDTSG PNVALGCLAS SYFPEPVTVT WNSGALSSGV HTFPSVLQPS GLYSLSSMVT VPASSLSSKS YTCNVNHPAT TTKVDKRVGT KTKGGGGSLH KVKVGKSPPV RGSLSGKVSL PCHFSTMPTL PPSYNTSEFL RIKWSKIEVD KNGKDLKETT VLVAQNGNIK IGQDYKGRVS VPTHPEAVGD ASLTVVKLLA SDAGLYRCDV MYGIEDTQDT VSLTVDGVVF HYRAATSRYT LNFEAAQKAC LDVGAVIATP EQLFAAYEDG FEQCDAGWLA DQTVRYPIRA PRVGCYGDKM GKAGVRTYGF RSPQETYDVY CYVDHLDGDV FHLTVPSKFT FEEAAKECEN QDARLATVGE LQAAWRNGFD QCDYGWLSDA SVRHPVTVAR AQCGGGLLGV RTLYRFENQT GFPPPDSRFD AYCFKPKE 66
G6.31.Fab-VG1, LC DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVS TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASFLYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDAATYYCQQ GYGAPFTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC 67
G6.31.Fab-VG1 HC EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTIS DYWIHWVRQA PGKGLEWVAG ITPAGGYTRY ADSVKGRFTI SADTSKNTAY LQMRSLRAED TAVYYCARFV FFLPYAMDYW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTGG GGSLHKVKVG KSPPVRGSLS GKVSLPCHFS TMPTLPPSYN TSEFLRIKWS KIEVDKNGKD LKETTVLVAQ NGNIKIGQDY KGRVSVPTHP EAVGDASLTV VKLLASDAGL YRCDVMYGIE DTQDTVSLTV DGVVFHYRAA TSRYTLNFEA AQKACLDVGA VIATPEQLFA AYEDGFEQCD AGWLADQTVR YPIRAPRVGC YGDKMGKAGV RTYGFRSPQE TYDVYCYVDH LDGDVFHLTV PSKFTFEEAA KECENQDARL ATVGELQAAW RNGFDQCDYG WLSDASVRHP VTVARAQCGG GLLGVRTLYR FENQTGFPPP DSRFDAYCFK PKE 68
VPDF-VG1, LC AIYMHQEPSS LSASVGDRVT ITCHGSYWLS NYLAWYQQKP GKAPKLLIYD GKEREHGVPS RFSGSGSHED YTLTISSLQP EDFATYYCQQ YRYHPYTFGH GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC 69
VPDF-VG1, HC DLQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAADGWWFG YTDMSWVRQA PGKGLEWVGS ISYKGGSTYY NTKFIGRFTI SRDDDTNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDD GYFDTWGQGT LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKSTSGGTAA LGCLVKDYFP EPVTVSWNSG ALTSGVHTFP AVLQSSGLYS LSSVVTVPSS SLGTQTYICN VNHKPSNTKV DKKVEPKSCD KTHTGGGGSL HKVKVGKSPP VRGSLSGKVS LPCHFSTMPT LPPSYNTSEF LRIKWSKIEV DKNGKDLKET TVLVAQNGNI KIGQDYKGRV SVPTHPEAVG DASLTVVKLL ASDAGLYRCD VMYGIEDTQD TVSLTVDGVV FHYRAATSRY TLNFEAAQKA CLDVGAVIAT PEQLFAAYED GFEQCDAGWL ADQTVRYPIR APRVGCYGDK MGKAGVRTYG FRSPQETYDV YCYVDHLDGD VFHLTVPSKF TFEEAAKECE NQDARLATVG ELQAAWRNGF DQCDYGWLSD ASVRHPVTVA RAQCGGGLLG VRTLYRFENQ TGFPPPDSRF DAYCFKPKE 70
VG1-Fc (2x) LHKVKVGKSP PVRGSLSGKV SLPCHFSTMP TLPPSYNTSE FLRIKWSKIE VDKNGKDLKE TTVLVAQNGN IKIGQDYKGR VSVPTHPEAV GDASLTVVKL LASDAGLYRC DVMYGIEDTQ DTVSLTVDGV VFHYRAATSR YTLNFEAAQK ACLDVGAVIA TPEQLFAAYE DGFEQCDAGW LADQTVRYPI RAPRVGCYGD KMGKAGVRTY GFRSPQETYD VYCYVDHLDG DVFHLTVPSK FTFEEAAKEC ENQDARLATV GELQAAWRNG FDQCDYGWLS DASVRHPVTV ARAQCGGGLL GVRTLYRFEN QTGFPPPDSR FDAYCFKRKC LIPFGNSVTD KTHTCPPCPA PELLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK 71
VPDF-VG1∆Ig, LC AIYMHQEPSS LSASVGDRVT ITCHGSYWLS NYLAWYQQKP GKAPKLLIYD GKEREHGVPS RFSGSGSHED YTLTISSLQP EDFATYYCQQ YRYHPYTFGH GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC 72
VPDF-VG1∆Ig, HC DLQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAADGWWFG YTDMSWVRQA PGKGLEWVGS ISYKGGSTYY NTKFIGRFTI SRDDDTNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDD GYFDTWGQGT LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKSTSGGTAA LGCLVKDYFP EPVTVSWNSG ALTSGVHTFP AVLQSSGLYS LSSVVTVPSS SLGTQTYICN VNHKPSNTKV DKKVEPKSCD KTHTGGGGSG VVFHYRAATS RYTLNFEAAQ KACLDVGAVI ATPEQLFAAY EDGFEQCDAG WLADQTVRYP IRAPRVGCYG DKMGKAGVRT YGFRSPQETY DVYCYVDHLD GDVFHLTVPS KFTFEEAAKE CENQDARLAT VGELQAAWRN GFDQCDYGWL SDASVRHPVT VARAQCGGGL LGVRTLYRF ENQTGFPPPD SRFDAYCFKP KE 73
20D12v2.3-VG1, LC DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQNVD TDVAWFQQKP GKAPKGLIRS ASSRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNNYPLTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC 74
20D12v2.3-VG1, HC EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYYMYWVRQA PGQGLEWIGE INPTSGGTNF NEKFKSRATL TVDTSTSTAY LELSSLRSED TAVYYCAREG GFAYWGQGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KSTSGGTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL SSVVTVPSSS LGTQTYICNV NHKPSNTKVD KKVEPKSCDK THTGGGGSLH KVKVGKSPPV RGSLSGKVSL PCHFSTMPTL PPSYNTSEFL RIKWSKIEVD KNGKDLKETT VLVAQNGNIK IGQDYKGRVS VPTHPEAVGD ASLTVVKLLA SDAGLYRCDV MYGIEDTQDT VSLTVDGVVF HYRAATSRYT LNFEAAQKAC LDVGAVIATP EQLFAAYEDG FEQCDAGWLA DQTVRYPIRA PRVGCYGDKM GKAGVRTYGF RSPQETYDVY CYVDHLDGDV FHLTVPSKFT FEEAAKECEN QDARLATVGE LQAAWRNGFD QCDYGWLSDA SVRHPVTVAR AQCGGGLLGV RTLYRFENQT GFPPPDSRFD AYCFKPKE 75
蘭尼單抗 (ranibizumab)-VG1, LC DIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF TSSLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YSTVPWTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC 76
蘭尼單抗-VG1，HC EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYDFT HYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAED TAVYYCAKYP YYYGTSHWYF DVWGQGTLVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH KPSNTKVDKK VEPKSCDKTH TGGGGLHKVK VGKSPPVRGS LSGKVSLPCH FSTMPTLPPS YNTSEFLRIK WSKIEVDKNG KDLKETTVLV AQNGNIKIGQ DYKGRVSVPT HPEAVGDASL TVVKLLASDA GLYRCDVMYG IEDTQDTVSL TVDGVVFHYR AATSRYTLNF EAAQKACLDV GAVIATPEQL FAAYEDGFEQ CDAGWLADQT VRYPIRAPRV GCYGDKMGKA GVRTYGFRSP QETYDVYCYV DHLDGDVFHL TVPSKFTFEE AAKECENQDA RLATVGELQA AWRNGFDQCD YGWLSDASVR HPVTVARAQC GGGLLGVRTL YRFENQTGFP PPDSRFDAYC FKPKE 77
EETI-VG1 GCPRILMRCK QDSDCLAGCV CGPNGFCGGS GSGSGSGSLH KVKVGKSPPV RGSLSGKVSL PCHFSTMPTL PPSYNTSEFL RIKWSKIEVD KNGKDLKETT VLVAQNGNIK IGQDYKGRVS VPTHPEAVGD ASLTVVKLLA SDAGLYRCDV MYGIEDTQDT VSLTVDGVVF HYRAATSRYT LNFEAAQKAC LDVGAVIATP EQLFAAYEDG FEQCDAGWLA DQTVRYPIRA PRVGCYGDKM GKAGVRTYGF RSPQETYDVY CYVDHLDGDV FHLTVPSKFT FEEAAKECEN QDARLATVGE LQAAWRNGFD QCDYGWLSDA SVRHPVTVAR AQCGGGLLGV RTLYRFENQT GFPPPDSRFD AYCFKPKEGN SHHHHHHHH 78
EETI-TEV-VG1 GCPRILMRCK QDSDCLAGCV CGPNGFCGEN LYFQGSGSGS GSGSLHKVKV GKSPPVRGSL SGKVSLPCHF STMPTLPPSY NTSEFLRIKW SKIEVDKNGK DLKETTVLVA QNGNIKIGQD YKGRVSVPTH PEAVGDASLT VVKLLASDAG LYRCDVMYGI EDTQDTVSLT VDGVVFHYRA ATSRYTLNFE AAQKACLDVG AVIATPEQLF AAYEDGFEQC DAGWLADQTV RYPIRAPRVG CYGDKMGKAG VRTYGFRSPQ ETYDVYCYVD HLDGDVFHLT VPSKFTFEEA AKECENQDAR LATVGELQAA WRNGFDQCDY GWLSDASVRH PVTVARAQCG GGLLGVRTLY RFENQTGFPP PDSRFDAYCF KPKEGNSHHH HHHHH 79
VG1-EETI MGGTAARLGA VILFVVIVGL HGVRHHHHHH HHGENLYFQG SLHKVKVGKS PPVRGSLSGK VSLPCHFSTM PTLPPSYNTS EFLRIKWSKI EVDKNGKDLK ETTVLVAQNG NIKIGQDYKG RVSVPTHPEA VGDASLTVVK LLASDAGLYR CDVMYGIEDT QDTVSLTVDG VVFHYRAATS RYTLNFEAAQ KACLDVGAVI ATPEQLFAAY EDGFEQCDAG WLADQTVRYP IRAPRVGCYG DKMGKAGVRT YGFRSPQETY DVYCYVDHLD GDVFHLTVPS KFTFEEAAKE CENQDARLAT VGELQAAWRN GFDQCDYGWL SDASVRHPVT VARAQCGGGL LGVRTLYRFE NQTGFPPPDS RFDAYCFKPK EGNSGSGSGS GSGSGCPRIL MRCKQDSDCL AGCVCGPNGF CG 80
VG1-TEV-EETI MGGTAARLGA VILFVVIVGL HGVRHHHHHH HHGENLYFQG SLHKVKVGKS PPVRGSLSGK VSLPCHFSTM PTLPPSYNTS EFLRIKWSKI EVDKNGKDLK ETTVLVAQNG NIKIGQDYKG RVSVPTHPEA VGDASLTVVK LLASDAGLYR CDVMYGIEDT QDTVSLTVDG VVFHYRAATS RYTLNFEAAQ KACLDVGAVI ATPEQLFAAY EDGFEQCDAG WLADQTVRYP IRAPRVGCYG DKMGKAGVRT YGFRSPQETY DVYCYVDHLD GDVFHLTVPS KFTFEEAAKE CENQDARLAT VGELQAAWRN GFDQCDYGWL SDASVRHPVT VARAQCGGGL LGVRTLYRFE NQTGFPPPDS RFDAYCFKPK EGNSGSGSGS GSGSENLYFQ GGCPRILMRC KQDSDCLAGC VCGPNGFCG 81
VG1-Fc (2x) 之連接子 RKCLIPFGNSVT 82
蘭尼單抗 (ranibizumab)-VG1 之連接子 GGGG 83
EETI-VG1、VG1-EETI 之連接子 GSGSGSGSGS 84
EETI-TEV-VG1、VG1-TEV-EETI 之連接子 ENLYFQGSGSGSGSGS 85
VG1∆Ig 共有序列 VVFHYRAATS RYTLNFEAAQ KACLDVGAVI ATPEQLFAAY EDGFEQC(D/S)AG WLADQTVRXP IRAP(R/K)VGCYG DKXGKAGVRT XGFRSPQETY DVYCYVDHLD GDVFHLTVPS X(F/Y)TFEEAAKE CENQDARLAT VGELQAAWRN GFDQC(D/S)XGWL SDASVRXPVT VAXAQCGGGL LGVRTXXXFE NQTGFPPPDS RFDAYCFKPK E    X = 任何胺基酸；(D/S) = Asp 或 Ser；(R/K) = Arg 或 Ser；粗體胺基酸 = 在一些實施例中未發生突變之野生型殘基，其旨在增強結合。 86
連接子 (GGGS) 3-6 87
連接子 (GGGGS) 2-5 88
連接子 (GGGS) 3-6(G) 0-3 89
連接子 (GGGGS) 2-5(G) 0-3 90
連接子 GGGS 91
抗 VEGF 半胱胺酸結肽 (CKP)，用於經 VG1 融合修飾之 L3.54.90.67.F8Y.M5 VC072M GCNIMLPYWGCGRDFECMEQCICQYYQSCG    92
融合物 5；VC072M.GS10X.VG1CTH GCNIMLPYWGCGRDFECMEQCICQYYQSCG.GS10X.VG1CTH GS10X = (GS) 10；VG1CTH = SEQ ID NO: 29 93
融合物 6；VG1NTH.GS10X.VC072M VG1NTH.GS10X.GCNIMLPYWGCGRDFECMEQCICQYYQSCG GS10X = (GS) 10；VG1NTH = VG1，帶有 N 端 His 標籤 94
SEQ ID NO: 93及 SEQ ID NO: 94 中所使用之連接子 GSGSGSGSGSGSGSGSGSGS 95
CD44-ko 結構域 AQIDLNITCR FAGVFHVEKN GRSSISRTEA ADLCKAFNST LPTMAQMEKA LSIGFETCRY GFIEGHVVIP RIHPNSICAA NNTGVYILTY NTSQYDTYCF NASAPPEEDC TSVTDLPNAF DGPITITIVN RDGTRYVQKG EYRTNPEDIY 96
PigFab VH EEKLVESGGG LVQPGGSLRL SCVGSGFTIS DYWIHWVRQA PGKGLEWLAG ITPAGGYTYY ADSVKGRFTI SSDNSQNTAY LQMNSLRTED TARYYCARFV FFLPYAMDYW GPGVEVVVSS 97
PigFab VL AIQLTQSPAS LAASLGDTVS ITCRASQDVS TAVAWYQQQA GKAPKLLIYS ASFLYSGVPS RFKGSGSGTD FTLTISGLQA EDVATYYCQQ GYGNPFTFGQ GTKLELK 98
VPDF VH DLQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAADGWWFG YTDMSWVRQA PGKGLEWVGS ISYKGGSTYY NTKFIGRFTI SRDDDTNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDD GYFDTWGQGT LVTVSS 99
VPDF VL AIYMHQEPSS LSASVGDRVT ITCHGSYWLS NYLAWYQQKP GKAPKLLIYD GKEREHGVPS RFSGSGSHED YTLTISSLQP EDFATYYCQQ YRYHPYTFGH GTKVEIK 100
VPDF (未經修飾) HC DLQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAADGWWFG YTDMSWVRQA PGKGLEWVGS ISYKGGSTYY NTKFIGRFTI SRDDDTNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDD GYFDTWGQGT LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKSTSGGTAA LGCLVKDYFP EPVTVSWNSG ALTSGVHTFP AVLQSSGLYS LSSVVTVPSS SLGTQTYICN VNHKPSNTKV DKKVEPKSCD KTHT 101
VPDF (未經修飾) LC AIYMHQEPSS LSASVGDRVT ITCHGSYWLS NYLAWYQQKP GKAPKLLIYD GKEREHGVPS RFSGSGSHED YTLTISSLQP EDFATYYCQQ YRYHPYTFGH GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC 102
G6.31 Fab (未經修飾) HC EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTIS DYWIHWVRQA PGKGLEWVAG ITPAGGYTRY ADSVKGRFTI SADTSKNTAY LQMRSLRAED TAVYYCARFV FFLPYAMDYW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHT 103
G6.31 Fab (未經修飾) LC DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVS TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASFLYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDAATYYCQQ GYGAPFTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC 104
G6.31 VH EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTIS DYWIHWVRQA PGKGLEWVAG ITPAGGYTRY ADSVKGRFTI SADTSKNTAY LQMRSLRAED TAVYYCARFV FFLPYAMDYW GQGTLVTVSS 105
G6.31 VL DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVS TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASFLYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDAATYYCQQ GYGAPFTFGQ GTKVEIK 106
RabFab VH QSLEESGGRL VTPGTPLTLT CTVSGFTISS YHMSWVRQAP GKGLEWIGIM RNTANIYYAS WAKGRFTISK TSPTTVDLKM TSLTTEDTAT YFCARGRPGD GALSLWGQGT LVTVSS 107
RabFab VL ADVVMTQTPA SVSAAVGGTV TIKCQASQSI GTALAWYQQK PGQPPKLLIY RTSTLESGVP SRFKGSGSGT DFTLTISDLE CADAATYYCQ SAYVSGGNIY TFGGGTEVVV K 108
NVS24 VH EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCTASGFSLT NYYYMTWVRQ APGKGLEWVG FIDPQNDPYY ATWAKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAGGN HNSGWGLNIW GQGTLVTVSS 109
NVS24 VL EIVMTQSPST LSASVGDRVI ITCQASQKIH SWLAWYQQKP GKAPKLLIYQ ASKLAKGVPS RFSGSGSGAE FTLTISSLQP DDFATYYCQN VYLASTNGAN FGQGTKLTVL 110
20D12v2.3 VH EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYYMYWVRQA PGQGLEWIGE INPTSGGTNF NEKFKSRATL TVDTSTSTAY LELSSLRSED TAVYYCAREG GFAYWGQGTL VTVSS 111
20D12v2.3 VL DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQNVD TDVAWFQQKP GKAPKGLIRS ASSRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNNYPLTFGQ GTKVEIK 112
TSG6 (Lava12) GVYHREAISG KYYLTYAEAK AVCEFEGGHL ATYKQLLAAQ KIGFHVCAAG WMAKGRVGYP IVKPGPNCGF GKTGIIDYGI RLNRSERWDA YCYNPHA 113
蘭尼單抗 (ranibizumab) VH EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYDFT HYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAED TAVYYCAKYP YYYGTSHWYF DVWGQGTLVT VSS 114
蘭尼單抗 VL DIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF TSSLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YSTVPWTFGQ GTKVEIK 115
抗 HtrA1 VH EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYKFT DSEMHWVRQA PGQGLEWIGG VDPETEGAAY NQKFKGRATI TRDTSTSTAY LELSSLRSED TAVYYCTRGY DYDYALDYWG QGTLVTVSS 116
抗 HtrA1 VL DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASSSVE FIHWYQQKPG KAPKPLISAT SNLASGVPSR FSGSGSGTDF TLTISSLQPE DFATYYCQQW SSAPWTFGQG TKVEIK 117
抗 HtrA1-VG1 HC EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTDSEMHWVRQAPGQGLEWIGGVDPETEGAAYNQKFKGRATITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCTRGYDYDYALDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTGGGGLHKVKVGKSPPVRGSLSGKVSLPCHFSTMPTLPPSYNTSEFLRIKWSKIEVDKNGKDLKETTVLVAQNGNIKIGQDYKGRVSVPTHPEAVGDASLTVVKLLASDAGLYRCDVMYGIEDTQDTVSLTVDGVVFHYRAATSRYTLNFEAAQKACLDVGAVIATPEQLFAAYEDGFEQCDAGWLADQTVRYPIRAPRVGCYGDKMGKAGVRTYGFRSPQETYDVYCYVDHLDGDVFHLTVPSKFTFEEAAKECENQDARLATVGELQAAWRNGFDQCDYGWLSDASVRHPVTVARAQCGGGLLGVRTLYRFENQTGFPPPDSRFDAYCFKPKE 118
抗 HtrA1-VG1 LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVEFIHWYQQKPGKAPKPLISATSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSAPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 119
抗 gD Fab HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSITSDFAWNWVRQAPGKGLEWVGYISYSGTTSYNPSLKSRITISRDNSKNTFYLQMNSLRAEDTAVYYCARENYYGRSHVGYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT 120
抗 gD Fab LC (在本文中亦稱為 BRD 之抗 gD IgG LC 及抗 gD Fab-VG1 LC) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASASVDSYGNSFIHWYQQKPGKAPKLLIYRASDLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNYADPFTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 121
抗 gD IgG HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSITSDFAWNWVRQAPGKGLEWVGYISYSGTTSYNPSLKSRITISRDNSKNTFYLQMNSLRAEDTAVYYCARENYYGRSHVGYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 122
BRD 之抗 gD Fab-VG1 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSITSDFAWNWVRQAPGKGLEWVGYISYSGTTSYNPSLKSRITISRDNSKNTFYLQMNSLRAEDTAVYYCARENYYGRSHVGYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTGGGGSLHKVKVGKSPPVRGSLSGKVSLPCHFSTMPTLPPSYNTSEFLRIKWSKIEVDKNGKDLKETTVLVAQNGNIKIGQDYKGRVSVPTHPEAVGDASLTVVKLLASDAGLYRCDVMYGIEDTQDTVSLTVDGVVFHYRAATSRYTLNFEAAQKACLDVGAVIATPEQLFAAYEDGFEQCDAGWLADQTVRYPIRAPRVGCYGDKMGKAGVRTYGFRSPQETYDVYCYVDHLDGDVFHLTVPSKFTFE EAAKECENQDARLATVGELQAAWRNGFDQCDYGWLSDASVRHPVTVARAQCGGGLLGVRT LYRFENQTGFPPPDSRFDAYCFKPKE 124
I. 定義
除非另有定義，否則本文所使用之所有技術及科學術語以及任何縮寫字皆具有與一般熟習本揭露之技術領域者通常所理解相同的含義。儘管類似或等效於本文所述之彼等的任意方法及材料皆可用於本發明之實踐，但具體方法及材料如本文所述。
除非另有說明，否則本文所使用之以下術語及短語旨在具有以下含義：
如本文所使用，術語「抗體 (antibody)」意指全 (完全或完整) 抗體。抗體為醣蛋白，其包含藉由二硫鍵互連的至少兩條重 (H) 鏈及兩條輕 (L) 鏈。每條重鏈由重鏈可變區 (本文縮寫為 VH) 及重鏈恆定區組成。重鏈恆定區由三個結構域 (CH1、CH2 及 CH3) 組成。每條輕鏈由輕鏈可變區 (本文縮寫為 VL) 及輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由一個結構域 (CL) 組成。VH 及 VL 區可進一步細分為高度可變區，稱為互補決定區 (CDR)，中間散佈更保守之區域，稱為骨架區 (FR)。每個 VH 和 VL 由三個 CDR 和四個 FR 按照以下順序從胺基端到羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合域。抗體之恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子之結合，包括免疫系統的各種細胞 (例如，效應細胞) 及經典補體系統之第一組分 (CIq)。
如本文所使用，術語「抗原結合片段 (antigen-binding fragment)」或「抗體片段 (antibody fragment)」是指抗體中保留與給定抗原 (例如，眼睛中之治療標靶，諸如 VEGF) 特異性結合之能力並由此表現出所需之抗原結合活性的一個或多個片段。抗體之抗原結合功能可藉由完整抗體之片段來執行。涵蓋於術語「抗體之抗原結合片段」內的結合片段的實例包括但不限於以下抗體片段之實例，其中包括但不限於：Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’) 2；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子 (例如，scFv 及 scFab)；單結構域抗體 (dAb)；及由抗體片段形成的多特異性抗體；由 VH 及 CH1 結構域組成的 Fd 片段；由抗體單臂之 VL 和 VH 結構域組成的 Fv 片段；單結構域抗體 (dAb) 片段，其由 VH 結構域或 VL 結構域組成；及分離之互補決定區 (CDR)。關於某些抗體片段的綜述，參見 Holliger 及 Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136 (2005)。此外，儘管 Fv 片段之兩個結構域 VL 及 VH 由單獨基因編碼，但它們可使用重組方法藉由人工肽連接子連接，使其能夠成為單個蛋白質鏈，其中 VL 及 VH 區配對以形成單價分子 (稱為單鏈 Fv (scFv))。該等單鏈抗體可包括抗體之一種或多種抗原結合片段。這些抗原結合片段係使用本領域技術人員所已知之習用技術獲得，並且片段之效用按照與完整抗體相同之方式進行篩選。抗原結合片段亦可併入單結構域抗體、大抗體、微抗體、內抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、v-NAR 及 bis-scFv。抗原結合片段可併入包含一對串聯 Fv 片段 (VH-CH1-VH-CH1) 的單鏈分子中，與互補之輕鏈多肽一起形成一對抗原結合區。術語「抗體 (antibodies)」包括多株抗體及單株抗體。
適體為結合至特定標靶分子之寡核苷酸或肽分子。適體通常藉由從大型隨機序列池中選擇它們來創建，但天然適體亦存在於核醣開關（riboswitch）中。適體可作為巨分子藥物用於基礎研究及臨床目的。適體可與核酶結合，在標靶分子存在下進行自切割。這些化合物分子具有額外之研究、工業及臨床用途。更具體而言，適體可分為 DNA 或 RNA 或 XNA 適體，它們由 (通常為短的) 寡核苷酸股組成，並且由一個 (或多個) 短的可變肽結構域組成的肽適體在其兩端接附至蛋白質支架。DNA 及 RNA 適體皆表現出對各種標靶之穩定的結合親和力。已針對同一標靶選擇了 DNA 及 RNA 適體。這些標靶包括溶菌酶、凝血酶、干擾素 γ、血管內皮生長因子 (VEGF)、多巴胺。在例如 VEGF 的情況下，DNA 適體為 RNA 適體之類似物，其中胸腺嘧啶代替了尿嘧啶。
「共價鍵 (covalent bond)」亦稱為分子鍵，是一種涉及在原子之間共享電子對的化學鍵。這些電子對被稱為共享電子對或鍵合電子對，當它們共享電子時，原子間吸引力及排斥力的穩定平衡被稱為共價鍵結。
如本文所使用，術語「DARPin」(經設計之錨蛋白重複蛋白 (designed ankyrin repeat protein) 之縮寫字」) 是指通常表現出高特異性及高親和力的標靶蛋白質結合的抗體模擬蛋白質。它們通常是經過基因改造，來源於天然錨蛋白，並由至少三個、通常為四個或五個這些蛋白質之重複模體組成。對於四或五重複 DARPin，它們的分子量分別為約 14 kDa 或 18 kDa。DARPin 之實例可參見例如美國專利 7,417,130。
藥劑例如醫藥組成物的「治療有效量」係指在所需之給藥劑量和時間段內有效實現所需的治療或預防效果的量。
如本文中所使用之術語「眼睛疾病」包括與病理性血管生成及/或萎縮相關的任何眼睛疾病。術語「眼睛疾病 (eye disease)」與術語「眼睛病症 (eye condition)」、「眼睛障礙 (eye disorder)」、「眼部病症 (ocular condition)」、「眼部疾病 (ocular disease)」及「眼部障礙 (ocular disorder)」同義。
如本文所使用，「Fab-玻尿酸結合結構域 (Fab-hyaluronan-binding domain)」及「Fab-HABD」是指包含 Fab 及玻尿酸結合結構域的融合蛋白。這些術語同義並可在本揭露全文中互換使用。
如本文所使用，「玻尿酸 (hyaluronan)」、「透明質酸 (hyaluronic acid)」、「玻尿酸鹽 (hyaluronate)」及「HA」是指具有化學式 (C 14H 21NO 11) n的非硫酸化葡糖胺聚醣及其鹽類。
如本文所使用，「玻尿酸結合結構域 (hyaluronic acid binding domain)」、「玻尿酸結合部分 (hyaluronic acid binding moiety)」、「HA 結合結構域 (HA binding domain)」或「HABD」是指能夠結合玻尿酸的任何部分。在一些情況下，HABD 可為 HA-結合蛋白之結構域。
配體是與生物分子形成複合物或結合物以達到其生物目的的物質。在蛋白質-配體結合中，配體通常為藉由結合至標靶蛋白上之位點以產生訊息的分子。該結合通常導致標靶蛋白之構象異構 (conformation) 發生變化。在 DNA-配體結合研究中，配體可為結合至 DNA 雙螺旋的小分子、離子或蛋白質。配體與結合配偶體之間的關係為電荷、疏水性及分子結構的函數。結合之情況發生於無限小之時間及空間範圍內，因此速率常數通常是非常小的數字。配體可為天然存在之配體或非天然存在之配體。此外，它可能是促效劑、部分促效劑、拮抗劑或反向促效劑。
「非共價交互作用 (non-covalent interaction)」與共價鍵之不同之處在於它不涉及電子之共享，而是涉及分子間或分子內之電磁交互作用的更分散的變化。非共價交互作用可分為不同的類別，諸如靜電、π-效應、凡得瓦力及疏水效應。較佳的是，結合物以分離之形式提供。第一組分及第二組分可經由連接子或直接彼此共價地結合。
核酸是由核苷酸組成的生物聚合物，其為三種組分所形成之單體：5-碳醣、磷酸酯基及含氮鹼基。術語「核酸 (nucleic acid)」為 DNA 及 RNA 的總稱。如果糖為複合核醣，則該聚合物為 RNA (核醣核酸)；如果糖為來源於核醣的脫氧核醣，則該聚合物為 DNA (去氧核醣核酸)。
如本文所使用，術語「肽連接子 (peptide linker)」表示含胺基酸序列的肽，其較佳地為合成來源。
蛋白質是由一個或多個胺基酸殘基之長鏈所組成之大分子生物聚合物 (多肽)。蛋白質在生物體內執行一系列功能，包括催化代謝反應、DNA 複製、對刺激產生反應、為細胞和生物體提供結構以及將分子從一個位置運輸到另一個位置。蛋白質之間的區別主要在於其胺基酸序列，而胺基酸序列由其基因之核苷酸序列決定，且通常導致蛋白質折疊為特定之三維結構，該三維結構決定其活性。含有少於 20-30 個殘基的短多肽通常稱為肽。
如本文所使用，「蛋白質結合物 (protein conjugate)」或「結合物 (conjugate)」是指非共價地結合至玻尿酸的蛋白質。
受體為通常由蛋白質組成的化學結構，其接收並轉導可能整合至生物系統中的訊息。這些訊息通常為化學信使 (配體)，其結合至受體，引起某種形式之細胞/組織反應，例如細胞活性之變化。受體之作用方式主要可分為三種：訊息中繼、放大或整合。中繼將訊息向前發送，放大增加單個配體之效應，整合則允許將訊息併入另一條生化途徑。在此意義上，受體是一種識別並響應內源性化學訊息的蛋白質分子。因此，在本發明的上下文中，包含配體結合位點的受體或片段及其配體為合適的結合對應物 (第一組分及治療標靶)。
如本文所用，「治療」(及其語法變體，諸如「治療過程」或「治療中」)，係指試圖改變受治療個體之疾病自然病程的臨床干預，並且可進行預防或在臨床病理過程中執行。期望之治療效果包括但不限於預防疾病之發生或複發、減輕症狀、減輕疾病之任何直接或間接病理後果、預防轉移、降低疾病進展之速度、改善或減輕疾病狀態、緩解或改善預後。在一些態樣中，本發明之抗體用於延遲疾病之發展或減慢疾病之進展。
數字範圍包括定義範圍的數字。考慮到有效數字以及與測量相關之誤差，實測值及可測量值應理解為近似值。此外，「包含 (comprise/comprises/comprising)」、「含有 (contain/contains)」及「包括 (include/includes/including)」之使用並非旨在限制。應理解，前述一般描述及詳細描述均僅為例示性及說明性的，且不限制教示。
說明書及申請專利範圍中之所有數字皆由術語「約 (about)」修飾。這意味著每個數字皆包括微小變化，其定義為所述數值或範圍的 10%。
除非說明書中特別指出，否則說明書中引用「包含各種組分」的實施例亦被認為「由所引用之組分組成」或「基本上由所引用之組分組成」；說明書中引用「由各種組分組成」的實施例亦被認為「包含所引用之組分」或「基本上由所引用之組分組成」；且說明書中引用「基本上由各種組分組成」的實施例亦被認為「由所引用之組分組成」或「包含所引用之組分」 (該互換性不適用於申請專利範圍中這些術語的使用)。除非上下文另外明確指出，否則術語「或 (or)」以包含之意義使用，亦即等同於「及/或 (and/or)」。
現在將詳細參考本發明之某些實施例，其實例於所附隨的圖式、實例及實施例中說明。應理解，圖式、實例及實施例 (除非另有具體指出) 並非旨在將本發明之範圍限制在本文所述之特定方法、方案及試劑，因為它們可以變化。本發明旨在涵蓋可包括在由所附申請專利範圍及所包括之實施例所限定的本發明內的所有替代、修改及等同形式。此外，本文所用之技術係僅用於揭示特定實施例之目的，而非試圖限制本揭露之範疇。除非上下文另外明確指出，否則如本文及所附申請專利範圍中所使用之單數形式「一個 (a)」、「一種 (an)」和「該 (the)」包括複數指示物。類似地，字詞「包含 (comprise)」、「含有 (contain)」及「涵蓋 (encompass)」應解釋為包含性而非排他性。
本文使用的章節標題僅用於組織目的，而不應被解釋為以任何方式限制所需之標的。本文引用的所有出版物 (科學及專利出版物) 皆藉由引用併入。如果藉由引用併入的任何材料與本說明書中定義的任何術語或本說明書的任何其他明確內容相矛盾，則以本說明書為準。雖然本教示合各種實施例予以描述，但並非旨在將本教示限制於該等實施例。相反，如本領域技術人員所理解的，本教示涵蓋各種替代、修改及等同形式。 II. 包含治療活性劑 ( 亦即，第一組分 ) 及玻尿酸結合結構域 (HABD ；亦即，第二組分 ) 的治療分子
本案提供靶向患者之組織的治療分子，該等治療分子包含治療活性劑及 HA-結合結構域 (HABD)。每個治療分子包含第一組分及一種或多種第二組分。該第一組分能夠結合至眼睛中之治療標靶。該等第二組分能夠結合至 HA，因此包含 HA 結合結構域 (HABD)。
在一些實施例中，治療分子為包含第一組分及一種或多種第二組分的融合蛋白。第一組分及第二組分彼此共價地結合，從而形成融合蛋白。在一些實施例中，治療分子進一步包含肽連接子。
在一些實施例中，治療分子包含一種第二組分。在一些實施例中，治療分子包含兩種或更多種第二組分。特定而言，如果使用由兩種蛋白質 (亦即，一條重鏈或其片段及一條輕鏈或其片段) 組成的抗體或其抗原結合片段，治療分子可包含兩種第二組分。在這些實施例中，第一第二組分連接至抗體或抗原結合片段之重鏈，且第二第二組分連接至抗體或抗原結合片段之輕鏈。在一些實施例中，第一第二組分連接至 Fab 片段之重鏈的 C 端，且第二第二組分連接至 Fab 片段之輕鏈的 C 端。
在一些實施例中，治療分子進一步包含 (除第一組分及第二組分以外) 一種或多種第三組分。第二組分共價地結合至第一組分，且第二組分非共價地結合至第三組分。在一些實施例中，第三組分為玻尿酸 (HA)。在這些實施例的一些中，第二組分能夠結合 HA，且治療分子蛋白質 (亦即，共價地連接至第二組分的第一組分) 可與 HA (亦即，第三組分) 預複合。在這些實施例的一些中，第一組分、第二組分及第三組分形成結合物。
本文提供了第一組分、第二組分及第三組分的非限制性實例。 A. 第一組分 – 治療活性劑
在許多實施例中，第一組分能夠結合至治療標靶，使其成為生物活性劑或治療活性劑。在一些實施例中，第一組分能夠結合至眼睛中之治療標靶。如本文所使用，術語「能夠結合 (capable of binding)」意指物質或試劑或組分可特異性結合至標靶並視情況調節該標靶之活性。換言之，第一組分由於結合至眼睛中之治療標靶，在眼睛中具有治療活性。在一些實施例中，第一組分結合至治療標靶後可活化、去活化、增加或減少該治療標靶之活性。在一些實施例中，治療標靶為眼睛中之合適結構，其活性與待治療之眼睛疾病相關聯。在一些實施例中，第一組分結合至訊息轉導級聯中直接處於治療標靶上游或下游的組分。在一些實施例中，第一組分包含用於治療眼睛疾病的已知治療藥物。
較佳的是，特異性結合組分或結合結構域對其對應的標靶分子具有至少 10 6l/mol 的親和力。較佳的是，特異性結合結構域對其標靶分子具有 10 7l/mol、或甚至更佳的 10 8l/mol 或甚至最佳的 10 9l/mol 的親和力。「親和力」係指分子 (例如抗體) 之單一結合位點與其結合配偶體 (例如抗原) 之間的非共價交互作用總和的強度。除非另有說明，否則如本文中所使用的「結合親和力」，係指反映結合對成員 (例如抗體及抗原) 之間 1:1 交互作用之內在結合親和力。分子 X 對於其搭配物 Y 之親和力通常可藉由解離常數 ( K D ) 來表示。可以藉由本領域已知的常規方法測量親和力。如技術人員將理解的，術語「特異性 (specific)」用於表示存在的其他生物分子不顯著地結合至結合結構域之特異性結合劑。較佳的是，與標靶分子之外的生物分子的結合水平導致結合親和力分別僅為與標靶分子的親和力的 10% 或更小，更佳地僅為 5% 或更小。較佳的特異性結合劑將滿足上述親和力以及特異性之最低標準。
在一些實施例中，該第一組分包含蛋白質諸如受體或其片段，該蛋白質結合治療標靶、抗體或其片段、生長因子、半胱胺酸結肽、酶或 DARpin。在一些實施例中，該蛋白質的大小可涵蓋從小到大的範圍。在一些實施例中，該蛋白質為包含 2 至 20 個胺基酸的肽。在一些實施例中，該蛋白質為包含 21 至 50 個胺基酸的多肽。在一些實施例中，該蛋白質為包含多於 50 個胺基酸的多肽。在一些實施例中，該蛋白質為包含兩個或更多個鏈或胺基酸的蛋白複合物，其中每條胺基酸鏈可包含任意數量的胺基酸。在一些實施例中，第一組分不大於 80 kDa。在一些實施例中，第一組分大於 80 kDa。
在一些實施例中，第一組分包含可為 DNA 或 RNA 的核酸。該核酸可與標靶相關之核酸互補 (例如，核酸與標靶之 mRNA 或其相關部分互補)。在一些實施例中，該核酸為適體。在一些實施例中，該核酸包含反義寡核苷酸。在一些實施例中，該核酸包含鎖核酸。 1. 眼睛中之治療標靶
在一些實施例中，第一組分結合至眼睛中之治療標靶。眼睛中可存在許多治療標靶。隨著有效靶向這些分子及途徑的療法的開發，將需要提供視力結果之改善，同時減少與頻繁 IVT 注射相關聯之治療負擔及風險。 a) 促血管生成、炎症及生長因子介質
在一些實施例中，第一組分結合至治療標靶，該治療標靶為促血管生成、炎症及/或生長因子介質。促血管生成、炎症及生長因子介質參與視網膜疾病，例如新生血管性年齡相關性黃斑退化 (AMD；濕式 AMD)、糖尿病性視網膜病變及視網膜靜脈阻塞。
這些促血管生成、炎症或生長因子介質分子的實例包括但不限於血小板源性生長因子 (PDGF)、血管生成素、S1P、整合素 ανβ3、整合素 ανβ5、整合素 α5β1、β 細胞素 (betacellulin)、apelin/APJ、紅血球生成素、補體因子 D 及 TNFα。 b) 年齡相關性黃斑退化 (AMD) 中之蛋白質
在一些實施例中，第一組分結合至蛋白質，其通常與年齡相關性黃斑退化 (AMD) 風險增加有關。在一些實施例中，第一組分結合至補體途徑組分，諸如 C2、因子 B、因子 H、CFHR3, C3b、C5、C5a 及 C3a。在一些實施例中，第一組分結合至 HtrA1、ARMS2、TIMP3、HLA、IL-8、CX3CR1、TLR3、TLR4、CETP、LIPC 或 COL10A1。 c) 血管內皮生長因子 (VEGF)
在一些實施例中，第一組分結合至血管內皮生長因子 (VEGF)。已知 VEGF 與多種眼睛疾病相關，例如與糖尿病性視網膜病變或黃斑水腫相關聯之疾病或病症。(見下文第 III 節。)
術語「VEGF」是指 165-胺基酸血管內皮細胞生長因子、相關的 121-、189- 及 206-胺基酸血管內皮細胞生長因子以及那些生長因子的天然生成之對偶基因及經處理形式。VEGF 可以指來自任何物種的 VEGF 蛋白質。
VEGF 在正常發育及病理性血管生成中為必需的。缺氧誘導星狀細胞分泌 VEGF 是引導視網膜血管形成的關鍵因素。VEGF 水平升高亦誘導視網膜及脈絡膜中新血管之病理性生長。抑制血管生成因子 (例如 VEGF) 已成為設計用於治療病理性眼部血管生成 (包括年齡相關性黃斑退化、增生性視網膜病變及早產兒視網膜病變) 的治療方法的主要策略。
術語「VEGF 所介導之病症 (VEGF-mediated disorder)」是指其症狀或疾病狀態之發生、進展或持續需要 VEGF 參與的任何病症。示例性 VEGF 所介導之病症包括但不限於：年齡相關性黃斑退化、新生血管性青光眼、糖尿病性視網膜病變、黃斑水腫、糖尿病性黃斑水腫、病理性近視、視網膜靜脈阻塞、早產兒視網膜病變、與晶狀體病 (phacomatoses) 相關聯之異常血管增生、水腫 (諸如與腦腫瘤相關聯之水腫)、Meigs 症候群、類風濕性關節炎、銀屑病及動脈粥樣硬化。
在一些實施例中，第一組分為 VEGF 受體，諸如 VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、mbVEGFR 或 sVEGFR。
在一些實施例中，第一組分為針對 VEGF 之抗體或抗原結合片段，更特定而言為抗 VEGF Fab。本揭露提供了 VEGF 抗體及抗原結合片段。可使用的其他抗 VEGF 抗體、VEGF 拮抗劑及 VEGF 受體拮抗劑包括例如：蘭尼單抗 (ranibizumab)、貝伐珠單抗 (bevacizumab)、阿柏西普 (aflibercept)、哌加他尼 (pegaptanib)、CT-322 及抗 VEGF 抗體及其片段，如 US 2012/0014958、WO 1998/045331 及 WO 2015/198243 中所述，這些專利藉由引用整體而併入本文。在一些實施例中，第一組分包含靶向 VEGF 的藥物，諸如下文第 II.A.2.a) 節所揭示的那些。 d) 紅血球生成素 (EPO)
在一些實施例中，第一組分結合至紅血球生成素 (EPO)。在一些實施例中，第一組分結合至紅血球生成素受體 (EPOR)。在許多物種中，EPO 是指紅血球生成素蛋白質。人、獼猴、小鼠、大鼠、兔 EPO 的蛋白質序列可公開獲得。人 EPO 亦可發生高糖基化。術語「EPO 受體 (EPO Receptor)」或「EPOR」可互換使用，是指不同物種中的紅血球生成素受體蛋白質。 e) 血管生成素
在一些實施例中，第一組分結合至血管生成素諸如血管生成素 2 (ANG2)。已知 ANG2 為濕性 AMD 的候選治療藥物，因為它在血管生成及免疫活化中皆發揮作用，這兩個過程皆涉及眼部病理性新血管形成。在人眼中，較高水平的 ANG2 與濕性 AMD 之疾病嚴重程度相關。眼內 ANG2 水平之升高亦在糖尿病性視網膜病變及視網膜靜脈阻塞患者中檢測到，表明靶向眼內 ANG2 具有潛在的醫學意義。ANG2 是指不同物種中的蛋白質。亦有研究人員建議使用 VEGF-A/ANG2 之聯合抑制來大幅減少血管滲漏、免疫反應性及細胞凋亡。 f) 介白素
在一些實施例中，第一組分結合至介白素，諸如介白素 (IL-) 1β (IL-1β)、IL-6、IL-10、IL-17A 及 IL-19。介白素與眼睛疾病諸如眼色素層炎 (一種可能致盲的炎症性疾病) 相關聯。介白素可來源於任何物種。 g) 血小板衍生生長因子 (PDGF)
在一些實施例中，第一組分結合至治療標靶，該治療標靶為血小板衍生生長因子 (PDGF) 或血小板衍生生長因子次單元 B (PDGF-BB)。PDGF 及 PDGF-BB 可來源於任何物種。在一些實施例中，第一組分包含 PDGF 拮抗劑，諸如下文第 II.A.2.e) 節所揭示的那些。 h)   VPDF
在一些實施例中，第一組分結合至 VEGF 及 PDGF。各種蛋白質、抗體、抗體片段、結合結構域、促效劑及拮抗劑可結合至 VEGF 及 PDGF。如本文所使用，術語「抗 VP (anti-VP)」是指結合至 VEGF 及 PDGF 的雙特異性抗體或其片段。
在一些實施例中，第一組分為雙靶向 Fab，亦即 dutaFab。如本文所使用，「抗 VPDF (anti-VPDF)」是指結合至 VEGF 及 PDGF 的 dutaFab。 i)    HtrA 蛋白
在一些實施例中，第一組分結合至絲胺酸蛋白酶的 HtrA 家族的成員。HtrA 蛋白具有包含至少一個 C 端 PDZ 結構域的催化結構域以及與蛋白質代謝及細胞命運相關的獨立於 ATP 的蛋白酶伴護蛋白。Clausen 等人, Molecular cell 10(3):443-445 (2002)。人體內存在四種 HtrA 蛋白：HtrA1、HtrA2、HtrA3 及 HtrA4。在人類中，HtrA1、HtrA3 及 HtrA4 共享相同的結構域架構：N 末端 IGFBP 樣模塊及 Kazal 樣模塊、包含胰蛋白酶樣折疊的蛋白酶結構域以及 C 端 PDZ 結構域。人類遺傳學研究已經發現，年齡相關性黃斑退化 (AMD) 之進展與 HtrA1 啟動子區域中之單核苷酸多態性 (SNP) 之間存在強相關性，導致 HtrA1 轉錄本水平升高。Dewan 等人, Science 314:989-992 (2006)；Yang 等人, Science 314:992-933 (2006)。
在一些實施例中，第一組分結合至 HtrA1。在一些實施例中，第一組分結合至 HtrA2。在一些實施例中，第一組分結合至 HtrA3。在一些實施例中，第一組分結合至 HtrA4。 j) 其他治療標靶
在一些實施例中，第一組分結合至以下治療標靶中之一者：因子 P、因子 D、TNFα、FGFR、IL-6R、Tie2、S1P、整合素 αvβ3、整合素 αvβ5、整合素 α5β1、β 細胞素 (betacellulin)、apelin/APJ、補體因子 D、TNFα、HtrA1、ST-2 受體、胰島素、人生長因子、補體因子 H、CD35、CD46、CD55、CD59、補體受體 1 相關 (CRRY)、神經生長因子、色素上皮衍生因子、內皮抑素、睫狀神經營養因子、補體因子 1 抑制劑、補體因子樣 1、補體因子 I 等。
術語「因子 D」是指來源於任何物種的因子 D 蛋白。
術語「因子 P」是指來源於任何物種的因子 P 蛋白。人因子 P 可獲自 Complement Tech (Tyler, TX)。獼猴因子 P 可從獼猴血清中純化 (方案改編自 Nakano 等人，1986，J Immunol Methods 90:77-83）。因子 P 在本領域中亦稱為「備解素（Properdin）」。
術語「FGFR2」是指來源於任何物種的纖維母細胞生長因子受體 2。 2. 治療藥物
用於治療眼睛疾病的任何合適的治療劑皆可用作第一組分 (如下面第 III 節中所述)。在一些實施例中，第一組分包含結合至眼睛中之標靶的公認的治療藥物。在一些實施例中，第一組分結合至人源性標靶。在一些實施例中，第一組分包含用於治療眼睛疾病的公認的治療藥物。 a) 靶向 VEGF 的藥物
在一些實施例中，第一組分包含 VEGF 拮抗劑，其包括例如但不限於：(1) 抗 VEGF 抗體 (例如，LUCENTIS ®(蘭尼單抗 (ranibizumab))、RTH-258 (原 ESBA-1008，抗 VEGF 單鏈抗體片段；Novartis) 或雙特異性抗 VEGF 抗體 (例如，抗 VEGF/抗血管生成素 2 雙特異性抗體諸如 RG-7716；Roche))；(2) 可溶性 VEGF 受體融合蛋白 (例如，EYLEA ®；阿柏西普 (aflibercept)))；(3) 抗 VEGF DARPin ®(例如，abicipar pegol；Molecular Partners AG/Allergan)；或 (4) 抗 VEGF 適體 (例如，MACUGEN ®；哌加他尼鈉 (pegaptanib sodium))。
在一些實施例中，第一組分包含 LUCENTIS ®(蘭尼單抗 (ranibizumab))，其特定而言用於治療眼睛疾病。在一些情況下，眼睛疾病為年齡相關性黃斑退化 (AMD；例如，濕性 AMD)。在一些情況下，眼睛疾病為地圖狀萎縮 (GA)。在一些情況下，眼睛疾病為糖尿病性黃斑水腫 (DME) 及/或糖尿病性視網膜病變 (DR；例如，非增生性 DR (NPDR) 或增生性 DR (PDR))。
在一些實施例中，第一組分包含 RTH-258，其特定而言用於治療眼睛疾病。在一些情況下，眼睛疾病為 AMD (例如，濕性 AMD)。在一些情況下，眼睛疾病為 GA。
在一些實施例中，第一組分包含 EYLEA ®(阿柏西普 (aflibercept))，其特定而言用於治療眼睛疾病。在一些情況下，眼睛疾病為 AMD (例如，濕性 AMD)。在一些情況下，眼睛疾病為 GA。在一些情況下，眼睛疾病為 DME 及/或 DR (例如，NPDR 或 PDR)。
在一些實施例中，第一組分包含 abicipar pegol，其特定而言用於治療眼睛疾病。在一些情況下，眼睛疾病為 AMD (例如，濕性 AMD)。在一些情況下，眼睛疾病為 GA。
在一些實施例中，第一組分包含 MACUGEN ®(哌加他尼鈉 (pegaptanib sodium))，其特定而言用於治療眼睛疾病。在一些情況下，眼睛疾病為 AMD (例如，濕性 AMD)。在一些情況下，眼睛疾病為 GA。 b) 抗血管生成劑
在一些實施例中，第一組分包含抗血管生成劑。抗血管生成劑非限制性實例包括：抗 VEGF 抗體 (例如，抗 VEGF Fab LUCENTIS ®(蘭尼單抗 (ranibizumab))、RTH-258 (原 ESBA-1008、抗 VEGF 單鏈抗體片段；Novartis)、雙特異性抗 VEGF 抗體 (例如，抗 VEGF/抗血管生成素 2 雙特異性抗體諸如 RG-7716；Roche)、可溶性重組受體融合蛋白 (例如，EYLEA ®(阿柏西普 (aflibercept))；亦稱為 VEGF Trap Eye；Regeneron/Aventis)、VEGF 變異體、可溶性 VEGF 受體 (VEGFR) 片段、能夠阻斷 VEGF 的適體 (例如，抗 VEGF 聚乙二醇化適體 MACUGEN ®(哌加他尼鈉；NeXstar Pharmaceuticals/OSI Pharmaceuticals))、能夠阻斷 VEGFR 的適體、中和抗 VEGFR 抗體的適體、VEGFR 酪胺酸激酶之小分子抑制劑、抗 VEGF DARPin ®(例如，abicipar pegol；Molecular Partners AG/Allergan)、抑制 VEGF 或 VEGFR 表現的小干擾 RNA、VEGFR 酪胺酸激酶抑制劑 (例如，4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶)-4-基甲氧基)喹唑啉 (ZD6474)、4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯啶-1-基丙氧基)喹唑啉 (AZD2171)、瓦塔拉尼 (vatalanib) (PTK787)、色瑪米尼 (semaxaminib) (SU5416; SUGEN) 及 SUTENT ®(舒尼替尼 (sunitinib))) 以及它們的組合。 c) 抗新血管形成劑
在一些實施例中，第一組分包含具有抗新生血管形成活性的藥劑以用於治療眼睛疾病，該藥劑為諸如抗炎藥物、哺乳動物靶向之雷帕黴素 (mTOR) 抑制劑 (例如，雷帕黴素、AFINITOR ®(依維莫司 (everolimus)) 及 TORISEL ®(西羅莫司 (temsirolimus)))、環孢素、腫瘤壞死因子 (TNF) 拮抗劑 (例如，抗 TNFα 抗體或其抗原結合片段 (例如，英夫利昔單抗、阿達木單抗、賽妥珠單抗 (certolizumab pegol) 及戈利木單抗) 或可溶性受體融合蛋白 (例如，依那西普 (etanercept)))、抗補體藥物、非類固醇抗炎藥物 (NSAID) 或其組合。 d) 神經保護劑
在一些實施例中，第一組分包含具有神經保護作用並可潛在地減少疾病進展的藥劑。例如，該藥劑可減少乾性 AMD 向濕性 AMD 之進展。神經保護劑之實例包括被稱為「神經類固醇類」之一類藥物，其包括藥物諸如去氫表雄固酮 (DHEA) (PRASTERA ™及 FIDELIN ®)、去氫表雄固酮硫酸酯及孕烯醇酮硫酸酯。 e)    PDGF 拮抗劑
在一些實施例中，第一組分包含 PDGF 拮抗劑。在一些實施例中，PDGF 拮抗劑為 (1) 抗 PDGF 抗體 (例如，REGN2176-3)、(2) 抗 PDGF-BB 聚乙二醇化適體 (例如，FOVISTA ®；E10030；Ophthotech/Novartis)、(3) 可溶性 PDGFR 受體融合蛋白、(4) 雙 PDGF/VEGF 拮抗劑/抑制劑 (例如，DE-120 (Santen) 或 X-82 (TyrogeneX))、(5) 雙特異性抗 PDGF/抗 VEGF 抗體、(6) 抗 PDGFR 抗體或 (7) 小分子抑制劑 (例如，角鯊胺)。 f) 補體系統拮抗劑
在一些實施例中，第一組分包含補體系統拮抗劑。補體系統拮抗劑之實例包括：補體因子 C5 拮抗劑 (例如，小分子抑制劑 (例如，ARC-1905；Opthotech))、抗 C5 抗體 (例如，LFG-316；Novartis)、備解素拮抗劑 (例如，抗備解素抗體；CLG-561；Alcon)、補體因子 D 拮抗劑 (例如，抗補體因子 D 抗體；蘭帕麗珠單抗 (lampalizumab)；Roche) 及 C3 阻斷肽 (例如，APL-2；Appellis)。 g) 用於治療眼睛疾病的公認藥物
在一些實施例中，第一組分包含用於治療眼睛疾病的公認的治療藥物。眼睛疾病之治療如下面的第 III 節所述。公認藥物之實例包括：非類固醇抗炎藥物 (NSAID)、類固醇 (例如，用於減少炎症及/或纖維化)、抗生素、局部眼科麻醉劑、眼科粘合劑 (例如，用於術後傷口閉合)、酶製劑 (用於玻璃體手術)、DNA 或 RNA (例如用於基因治療技術)、介導神經保護作用的藥劑 (諸如提供神經營養因子、阻斷過量谷胺酸刺激、穩定 Ca 2+恆定、防止細胞凋亡、經由疫苗接種調節免疫狀態、誘導內源性神經保護機制、抗氧化劑、維生素及礦物質補充劑)。
在一些實施例中，第一組分包含任何合適的 DME 及/或 DR 治療劑，特定而言用於治療眼睛疾病，包括但不限於 VEGF 拮抗劑 (例如，LUCENTIS ®或 EYLEA ®)、皮質類固醇 (例如，皮質類固醇植入物，OZURDEX ®；地塞米松 IVT 植入物；或 ILUVIEN ®，丙酮氟洛皮質醇 IVT 植入物) 或配製用於藉由 IVT 注射投予的皮質類固醇 (例如，丙酮特安皮質醇) 或其組合。在一些情況下，眼睛疾病為 DME 及/或 DR。
適合用作第一組分條件的用於治療眼睛疾病的公認藥物的更多實例包括但不限於：VISUDYNE ®(維替泊芬 (verteporfin)；一種光活化之藥物，其通常與使用非熱學雷射進行之光動力治療協同使用)、PKC412、恩多維昂 (Endovion) (NS 3728；NeuroSearch A/S)、神經滋養因子 (例如，源自膠細胞之神經滋養因子 (GDNF) 及睫狀神經滋養因子 (CNTF))、地爾硫卓 (diltiazem)、多佐胺 (dorzolamide)、PHOTOTROP ®、9-順式視黃醛、眼部藥物 (例如，碘磷靈 (phospholine iodide)、二乙氧磷醯硫膽鹼 (echothiophate) 或碳酸酐酶抑制劑)、維沃司他 (veovastat) (AE-941；AEterna Laboratories, Inc.)、Sirna-027 (AGF-745；Sima Therapeutics, Inc.)、神經滋養素 (包括，僅作示例，NT-4/5，Genentech)、Cand5 (Acuity Pharmaceuticals)、INS-37217 (Inspire Pharmaceuticals)、整合素拮抗劑 (包括彼等來自 Jerini AG 及 Abbott Laboratories 者)、EG-3306 (Ark Therapeutics Ltd.)、BDM-E (BioDiem Ltd.)、沙利多邁 (如例如 EntreMed, Inc. 所用)、心肌營養素-1 (Genentech)、2-甲氧基雌二醇 (Allergan/Oculex)、DL-8234 (Toray Industries)、NTC-200 (Neurotech)、四硫代鉬酸鹽 (University of Michigan)、LYN-002 (Lynkeus Biotech)、微藻化合物 (Aquasearch/Albany, Mera Pharmaceuticals)、D-9120 (Celltech Group plc)、ATX-S10 (Hamamatsu Photonics)、TGF-β 2 (Genzyme/Celtrix)、酪胺酸激酶抑制劑 (例如，美國專利號 7,771,742 中所述的那些，及 VEGFR 抑制劑 SUGEN (SU5416)，或 Pfizer 的 Inlyta (達克替尼 (dacomitinib))、LORBRENA ®(勞拉替尼 (lalorlatinib)))、NX-278-L (NeXstar Pharmaceuticals/Gilead Sciences)、Opt-24 (OPTIS France SA)、視網膜細胞神經節神經保護劑 (Cogent Neurosciences)、N-硝基吡唑衍生物 (Texas A&M University System)、KP-102 (Krenitsky Pharmaceuticals)、環孢素 A、用於光動力治療中之治療劑 (例如，VISUDYNE ®；受體靶向之 PDT，Bristol-Myers Squibb, Co.；用於與 PDT 一起注射之卟吩姆鈉 (porfimer sodium)；維替泊芬，QLT Inc.；與 PDT 合用之羅他泊芬 (rostaporfin)，Miravent Medical Technologies；與 PDT 合用之塔拉泊芬鈉 (talaporfin sodium)，Nippon Petroleum；以及莫特沙芬鎦 (motexafin lutetium)，Pharmacyclics、Inc.)、反義寡核苷酸 (包括，舉例而言，由 Novagali Pharma SA 測試之產品以及 ISIS-13650，Ionis Pharmaceuticals) 及其組合。
在一些實施例中，第一組分包含組織因子拮抗劑 (例如，hI-con1；Iconic Therapeutics)、α-腎上腺素受體促效劑 (例如，酒石酸溴莫尼定 (brimonidine tartrate)；Allergan)、肽疫苗 (例如，S-646240；Shionogi)、澱粉樣蛋白 β 拮抗劑 (例如，抗 β 澱粉樣蛋白單株抗體；GSK-933776)、S1P 拮抗劑 (例如，抗 S1P 抗體；iSONEP™；Lpath Inc)、ROBO4 拮抗劑、抗 ROBO4 抗體 (例如，DS-7080a；Daiichi Sankyo)。
在一些實施例中，第一組分包含色胺酸-tRNA 合成酶 (TrpRS)、角鯊胺、RETAANE ®(用於長效懸浮液的醋酸阿奈可他；Alcon, Inc.)、康普瑞汀 (Combretastatin) A4 前驅藥 (CA4P)、MIFEPREX ®(美服培酮-ru486))、結膜下丙酮特安皮質醇 (subtenon triamcinolone acetonide)、IVT 結晶丙酮特安皮質醇、基質金屬蛋白酶抑制劑 (例如，普林斯他 (Prinomastat)；AG3340；Pfizer)、丙酮氟洛皮質醇 (包括氟洛皮質醇眼內植入物；Bausch & Lomb/控制遞送系統)、力諾胺 (linomide)、整合素 β3 功能之抑制劑、血管抑素及其組合。這些及其他治療劑敘述於例如美國專利申請號 US 2014/0017244 中，該專利申請藉由引用而以其整體併入本文。 3. 抗體及抗原結合片段
在一些實施例中，第一組分包含或來源於能夠結合抗原的抗體或其抗原結合片段。抗體或抗原結合片段結合至無關、非標靶蛋白質的程度低於該抗體與標靶結合約 10%，其藉由例如表面電漿子共振 (SPR) 所量測。在某些態樣中，結合至該標靶的抗體或抗原結合片段之解離常數 ( K D ) 為 ≤ 1μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM、或≤ 0.001 nM (例如 10 -8M 或更低，例如 10 -8M 至 10 -13M，例如 10 -9至 10 -13M)。當抗體的 K D 為 1 μM 或更小時，稱該抗體或其抗原結合片段與標靶「特異性結合」。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含雙特異性抗體、至少缺少 Fc 結構域的抗體，Fab 片段、(Fab’) 2片段、Fab’ 片段、VhH 片段、scFv 片段、scFv-Fc 片段或微抗體。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段結合至存在於眼睛中之抗原。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段可結合至 VEGF、HtrA1、IL-33、C5、因子 P、因子 D、EPO、EPOR、IL-1β、IL-17A、IL-10、TNFα、FGFR2、PDGF 或 ANG2。
在一些實施例中，第一組分為抗 VEGF 抗體或抗體結合片段、抗 PDGF 抗體或抗體-結合片段、抗 ANG2 抗體或抗體結合片段或抗 IL-1β 抗體或抗體結合片段。結合 VEGF 的抗體之實例包括 Lucentis ®(蘭尼單抗 (ranibizumab))、Eylea ®(阿柏西普 (aflibercept))、Beovu ®(布西組單抗-dbll (brolucizumab-dbll)) 及 Avastin ®(貝伐珠單抗 (bevacizumab))。
在一些實施例中，抗體包含雙特異性抗體。在一些實施例中，雙特異性抗體為抗 VEGF/抗 Ang2 雙特異性抗體，諸如 RG-7716 或 WO 2010/069532 或 WO 2016/073157 中揭露之任意雙特異性抗 VEGF/抗 Ang2 雙特異性抗體或其變異體。在一些實施例中，雙特異性抗體為抗 VPDF 抗體，亦即抗 VEGF 及抗 PDGF dutaFab 抗體。
在一些實施例中，第一組分為抗 IL-6 抗體，例如 EBI-031 (Eleven Biotherapeutics；參見例如 WO 2016/073890)、斯妥昔單抗 (siltuximab; SYLVANT ®)、奧羅珠單抗 (olokizumab)、克拉扎珠單抗 (clazakizumab)、斯魯庫單抗 (sirukumab)、艾西莫單抗 (elsilimomab)、OPR-003、MEDI5117、PF-04236921 或其變異體。
在一些實施例中，第一組分為抗 IL-6R 抗體，例如托西利珠單抗 (tocilizumab; ACTEMRA ®) (參見例如 WO 1992/019579)、沙立蘆人單抗 (sarilumab)、ALX-0061、SA237 或其變異體。
在一些實施例中，第一組分為 RabFab，其為來源於在兔體內產生的親本單株抗體 (G10) 的抗原結合 Fab 片段，針對來源於人 cMET 受體的細胞內結構域的磷酸化肽，因此不結合眼睛中之細胞外標靶。Shatz, W. 等人, Mol. Pharm., 13(9):2996-3003 (2016)。
在一些實施例中，抗原結合片段包含並非抗體或其抗原結合片段的肽或多肽。 4. 生長因子
在一些實施例中，第一組分包含生長因子。在一些實施例中，生長因子包含纖維母細胞生長因子、血小板衍生生長因子、神經生長因子 (NGF)、VEGF、纖維母細胞生長因子 (FGF) 及類胰島素生長因子-I (IGF-I)。 5. 半胱胺酸結肽
在一些實施例中，第一組分包含半胱胺酸結肽。在一些實施例中，半胱胺酸結肽包含與 SEQ ID NO: 92 (半胱胺酸結肽序列) 的至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。
半胱胺酸結肽可共價地連接至另一種分子以形成第一組分，包括上文第 II.A.2 節至上文第 II.A.4 節中所述之示例性第一組分中之任一者。在一些實施例中，第一組分包含半胱胺酸結肽，其共價地連接至抗 VEGF 抗原結合片段。
在一些實施例中，HABD (亦即，第二組分) 共價地連接至第一組分的半胱胺酸結肽處。在一些實施例中，共價連接子包含與 SEQ ID NO: 95 的至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在一些實施例中，共價連接子包含序列 GSGSGSGSGSGSGSGSGSGS (SEQ ID NO: 95)。在一些實施例中，半胱胺酸結肽共價地連接至帶有 C 端 His 標籤的 VG1 (SEQ ID NO: 29)。在一些實施例中，半胱胺酸結肽共價地連接至具有 Ig 結構域缺失及 C 端 His 標籤的 VG1 (SEQ ID NO: 32)。在一些實施例中，半胱胺酸結肽共價地連接帶有 N 端 His 標籤的 VG1。在一些實施例中，半胱胺酸結肽共價地連接至具有 Ig 結構域缺失及 N 端 His 標籤的 VG1。 B. 第二組分 – 玻尿酸結合結構域 (HABD)
在許多實施例中，第二組分包含或來源於 HA 結合蛋白 (其包含 HA 結合結構域；HABD)。在一些實施例中，第二組分包含 HABD。包含 HABD 的蛋白質之實例包括 CD44、腫瘤壞死因子刺激基因-6 (TSG6)、多能蛋白聚醣、腦特異性連接蛋白 (BRAL1)、淋巴管內皮玻尿酸受體 1 (LYVE-1) 及聚集蛋白聚醣。
在一些實施例中，兩種第二組分可不同或相同。例如，治療分子可包含第二組分，該第二組分包含兩個 CD44 結構域、兩個 TSG-6 結構域、兩個 VG1 結構域或前述結構域中之任意組合以形成一對兩個不同的結構域。
眼睛是一種複雜的組織，其具有幾個不同的隔室，包括角膜、眼房液、晶狀體、玻璃體液、視網膜、視網膜色素上皮及脈絡膜。這些隔室包括細胞外大分子諸如 HA。
術語「玻尿酸結合蛋白 (hyaluronan-binding protein)」或「HA 結合蛋白 (HA-binding protein)」是指結合 HA 的蛋白質或蛋白質家族。通常，這些 HA 結合蛋白包含 HABD。各種 HA 結合分子是本領域所熟知的，可用為第二組分 (參見例如：Day 等人, 2002, J Bio.Chem 277: 4585；及 Yang 等人, 1994, EMBO J 13: 286-296)。示例性 HA 結合蛋白包括 CD44、LYVE-1、聚集蛋白聚醣、多能蛋白聚醣、Brevican、Neurocan、玻尿酸結合蛋白 1 (HABP1；亦稱為 C1qBP/C1qR 及 p32)、HAPLN1 (亦稱為連接蛋白質及 CRTL1)、玻尿酸及蛋白聚醣連接蛋白質 4 (HAPLN4；亦稱為腦連接蛋白 2)、Layilin、Stabilin-1、Stabilin-2、腦特異性連接蛋白 (BRAL1) 或腫瘤壞死因子刺激基因 6 (TSG-6)、RHA M、細菌 HA 合成酶及 VI 型膠原。
許多 HA 結合蛋白及肽片段含有共同的結構域，其長度約 100 個胺基酸，參與 HA 結合；該結構域被稱為「連接結構域 (LINK Domain)」 (Yang 等人, EMBO J 13:2, 286-296 (1994) 及 Mahoney 等人, J Bio.Chem 276:25, 22764-22771 (2001))。任何該等蛋白質皆可用於本發明中。任何 HA 結合蛋白諸如上述示例性蛋白質之 HABD 皆可包含於第二組分中以給予與 HA 結合的能力。較佳的是，第二組分包含 CD44 (CD44) 結構域、腦特異性連接蛋白 (BRAL1) 結構域、腫瘤壞死因子刺激基因 6 (TSG-6) 結構域、淋巴管內皮玻尿酸受體 1 (LYVE-1) 結構域、玻尿酸結合蛋白 (HABP) 結構域、聚集蛋白聚醣 G1 (AG1) 結構域或多能蛋白聚醣 G1 (VG1) 結構域。用於眼睛中之示例性及合適之 HA 結合分子 (包括肽標籤) 描述於 WO 2014/99997 和 WO 2015/19824 中，其內容藉由引用整體併入本文。其中所述之任何序列皆可用於本發明中。
在一些實施例中，第二組分共價地連接至第一組分以便減少第一組分從眼睛中之清除，從而延長其眼內半衰期。第一組分可得益於更長之眼睛保留時間及/或更長之作用於眼睛疾病的時間。
此外，第二組分可非共價地結合至包含 HA 的第三組分以形成結合物。在一些實施例中，結合物中之各第二組分可結合至 HA 之單獨分子。在一些實施例中，兩種或多種第二組分可結合至相同 HA 分子。
在許多實施例中，HABD 對 HA 之結合親和力可處於若干範圍內；結合親和力可根據治療活性劑之作用機制進行調節。例如，如果作用位置在玻璃體液中，則高結合親和力可能有助於生物製劑保留在玻璃體液中。相反，如果作用位置在視網膜中，則較低之結合親和力可能有助於生物製劑穿過玻璃體以到達視網膜。
在許多實施例中，HABD 對 HA 之結合親和力可使用包含表面電漿子共振 (SPR) 在內的方法進行量測。不受理論的束縛，在一些實施例中，HABD 對 HA 之結合親和力 ( K D ) 範圍包含 10 nM 至 10 µM、5 nM 至 10 nM 及 100 nM 至 5 µM。
在許多實施例中，可觀察 HABD 與 HA 之交互作用。在一些實施例中，使用包括螢光相關光譜 (FCS) 的方法觀察交互作用。在 FCS 中，分子之擴散可藉由監測溶液中之小體積部分之螢光強度來確定。螢光強度因分子之運動而產生波動，對這些波動的定量分析可得出分子的擴散時間。藉由使用具有適當光譜特性之螢光染料，可確定生物基質中之擴散。在一些實施例中，FCS 之觀測值與 SPR 之測量值相關。
在一些實施例中，HABD 包含相較於其來源蛋白質的野生型序列。在一些實施例中，HABD 在其蛋白質序列中可包含相較於其來源蛋白質的一個或多個突變。在許多實施例中，這些突變包含單胺基酸取代、雙胺基酸取代、添加、缺失及截短。
在一些實施例中，HABD 包含單胺基酸取代或雙胺基酸取代。在許多實例中，取代可包含保留突變，其中胺基酸取代將原始胺基酸改變為具有相似生化特性的不同胺基酸。在其他實例中，取代可包含非保留突變，其中胺基酸取代將原始胺基酸改變為具有不同生化特性的不同胺基酸。
在一些實施例中，HABD 包含有助於 HA 結合的胺基酸。在一些實施例中，這些胺基酸可保留以維持 HA 結合親和力。在一些實施例中，這些胺基酸可被取代以改變 HA 結合親和力，具體取決於長效治療所需之親和力及所需之持續時間。
在一些實施例中，HABD 包含有助於 HABD 及/或治療分子之熱穩定性的胺基酸。在一些實施例中，這些胺基酸可保留以維持熱穩定性。在一些實施例中，這些胺基酸可被取代以改變熱穩定性。
在一些實施例中，HABD 包含相對於本文所揭示之參照序列之一的至少 1 個、至少 2 個、至少 3 個、至少 4 個或至少 5 個突變。在一些實施例中，HABD 包含 1 至 3 個突變，其中該等 1 至 3 個突變獨立地包含單胺基酸取代、雙胺基酸取代、添加、缺失及截短。在一些實施例中，HABD 包含 1 至 5 個突變，其中該等 1 至 5 個突變獨立地包含單胺基酸取代、雙胺基酸取代、添加、缺失及截短。
在一些實施例中，第二組分包含或來源於 CD44、TSG6 或多能蛋白聚醣。在一些實施例中，第二組分包含 CD44 結構域、TSG6 結構域或多能蛋白聚醣結構域。 1.    CD44
在一些實施例中，第二組分來源於 CD44 (SEQ ID NO: 1)。CD44 受體包含連接結構域、GAG 附著結構域、跨膜結構域及細胞質結構域。描述了藉由替代剪接處理的具有不同模塊化組成物的幾種同功型。在一些實施例中，第二組分來源於或包含 CD44 HA 受體結構域。在一些實施例中，第二組分來源於或包含 SEQ ID NO: 2。 2. 腫瘤壞死因子刺激基因 6 (TSG6)
在一些實施例中，第二組分來源於 TSG6。TSG-6，亦稱為 TNFAIP6，由 HA 結合連接結構域接以 CUB 結構域組成。在一些實施例中，第二組分來源於或包含 TSG6 HA 結合連接結構域。在一些實施例中，第二組分來源於或包含 SEQ ID NO: 4。 3. 多能蛋白聚醣
在一些實施例中，第二組分來源於多能蛋白聚醣。多能蛋白聚醣包含以下結構域：VG1、GAG 附著結構域及 G3 結構域 (圖 8A)。VG1 結構域 (SEQ ID NO: 29) 包含 Ig 結構域、Link1 及 Link2 (圖 8A)。在一些實施例中，第二組分包含 Link1 (SEQ ID NO: 30) 及/或 Link2 (SEQ ID NO: 31)，其中 Link1 及/或 Link2 能夠結合 HA。 a) 野生型 VG1
在一些實施例中，HABD 包含野生型 (WT) VG1，其胺基酸序列如 SEQ ID NO: 29 所示。在一些實施例中，HABD 包含如 Link1 (SEQ ID NO: 30) 及/或 Link2 (SEQ ID NO: 31) 中所示之胺基酸序列。 b) 突變 VG1
在一些實施例中，HABD 包含突變 VG1。在許多實施例中，VG1 突變係相對於如 SEQ ID NO: 29 (WT VG1)、32 (VG1∆Ig)、60 (WT VG1 共有序列) 或 86 (VG1∆Ig 共有序列) 所示之胺基酸序列。在一些實施例中，HABD 包含與 SEQ ID NO: 29 (WT VG1)、32 (VG1∆Ig)、60 (WT VG1 共有序列) 或 86 (VG1∆Ig 共有序列) 至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之序列。在一些實施例中，HABD 包含與 SEQ ID NO: 29 (WT VG1)、32 (VG1∆Ig)、60 (WT VG1 共有序列) 或 86 (VG1∆Ig 共有序列) 至少 95% 相同之序列。 c) 截短 VG1
在一些實施例中，HABD 相對於 SEQ ID NO: 29 (WT VG1) 或 60 (WT VG1 共有序列) 包含截短突變。在一些實施例中，HABD 包含從多能蛋白聚醣之 N 端的 1 至 129 個胺基酸之截短。在一些實施例中，HABD 包含截短序列，其中不存在野生型多能蛋白聚醣之 Ig 結構域。在一些實施例中，HABD 包含與 SEQ ID NO: 32 (VG1∆Ig) 或 SEQ ID NO: 86 (VG1∆Ig 共有序列) 至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之序列。在一些實施例中，HABD 包含與 SEQ ID NO: 32 (VG1∆Ig) 或 SEQ ID NO: 86 (VG1∆Ig 共有序列) 至少 95% 相同之序列。在一些實施例中，HABD 包含 SEQ ID NO: 32 (VG1∆Ig)。 d) 胺基酸取代
在一些實施例中，HABD 相對於 SEQ ID NO: 29 包含以下胺基酸中之至少一者：R160、Y161、E194、D197、Y208、R214、Y230、F261、D295 及 R233。在一些實施例中，HABD 相對於 SEQ ID NO: 29 包含以下胺基酸中之 2 個、3 個、4 個、5 個、6 個、7 個、8 個、9 個或 10 個：R160、Y161、E194、D197、Y208、R214、Y230、F261、D295 及 R233。
在一些實施例中，HABD 包含序列，其中胺基酸可相對於野生型發生突變以提高或降低 HA 結合親和力。在一些實施例中，HABD 相對於 SEQ ID NO: 29 包含在以下位置中之至少一個之突變：R160、Y161、E194、D197、Y208、R214、M222、Y230、R233、K260、F261、D295、Y296、H306、R312、L325、Y326 及 R327。在一些實施例中，HABD 相對於 SEQ ID NO: 29 包含在以下位置中之 2 個、3 個、4 個、5 個、6 個、7 個、8 個、9 個、10 個、11 個、12 個、13 個、14 個、15 個、16 個、17 個或 18 個之突變：R160、Y161、E194、D197、Y208、R214、M222、Y230、R233、K260、F261、D295、Y296、H306、R312、L325、Y326 及 R327。在一些實施例中，HABD 相對於 SEQ ID NO: 29 包含在以下位置中之 2 個、3 個、4 個、5 個或 6 個之突變：R160、Y161、E194、D197、Y208、R214、M222、Y230、R233、K260、F261、D295、Y296、H306、R312、L325、Y326 及 R327。
在一些實施例中，HABD 相對於 SEQ ID NO: 29 包含以下突變中之至少一者：R160A、Y161A、D197A、D197S、Y208A、Y208F、R214K、M222A、Y230A、Y230F、R233A、K260A、K260R、F261Y、KF260RY、D295A、D295S、Y296A、Y296F、DY295SF、H306A、R312A、L325A、Y326A、R327A 及 LYR325LFK。在一些實施例中，HABD 包含 Y208A 及 H306A 中之至少一者。
在一些實施例中，HABD 相對於 SEQ ID NO: 29 包含以下突變中之至少 2 個、3 個、4 個、5 個、6 個、7 個、8 個、9 個、10 個、11 個、12 個、13 個、14 個、15 個、16 個或 17 個：R160A、Y161A、D197A、D197S、Y208A、Y208F、R214K、M222A、Y230A、Y230F、R233A、K260A、K260R、F261Y、KF260RY、D295A、D295S、Y296A、Y296F、DY295SF、H306A、R312A、L325A、Y326A、R327A 及 LYR325LFK。在一些實施例中，HABD 相對於 SEQ ID NO: 29 包含以下突變中之至少 2 個、3 個、4 個、5 個或 6 個：R160A、Y161A、D197A、D197S、Y208A、Y208F、R214K、M222A、Y230A、Y230F、R233A、K260A、K260R、F261Y、KF260RY、D295A、D295S、Y296A、Y296F、DY295SF、H306A、R312A、L325A、Y326A、R327A 及 LYR325LFK。
在一些實施例中，HABD 為 SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58 或 SEQ ID NO: 59。 4. 腦特異性連接蛋白 (BRAL1)
在一些實施例中，第二組分來源於 BRAL1。BRAL1 包含免疫球蛋白結構域、連接結構域模塊 1 及連接結構域模塊 2。連接結構域模塊 1 及 2 能夠結合 HA。在一些實施例中，第二組分包含來自 BRAL1 之連接結構域模塊 1 及/或連接結構域模塊 2。 5. 淋巴管內皮玻尿酸受體 1 (LYVE-1)
在一些實施例中，第二組分來源於 LYVE-1。LYVE-1 為 CD44 之同源物，其包含結合至 HA 的連接結構域。在一些實施例中，第二組分包含來自 LYVE-1 之連接結構域。 6. 聚集蛋白聚醣
在一些實施例中，第二組分來源於聚集蛋白聚醣。聚集蛋白聚醣包含三個球狀結構域：G1 結構域具有連接蛋白之結構模體並與 HA 交互作用；G2 結構域與 G1 結構域同源並參與產物加工；G3 結構域構成核心蛋白之羧基末端。在一些實施例中，第二組分包含來自聚集蛋白聚醣的 G1 結構域。 C. 第三組分 – 玻尿酸 (HA)
在一些實施例中，治療分子進一步包含一種或多種第三組分。在一些實施例中，第三組分包含 HA。在一些實施例中，治療分子 (包含第一組分及第二組分) 與 HA 預複合以形成結合物。在一些實施例中，第三組分為具 5 kDa 至 20 kDa 之分子量的 HA。
在一些實施例中，治療分子之第二組分非共價地結合至第三組分以形成結合物。在一些實施例中，治療分子之第二組分共價地結合至第三組分以形成結合物。
較佳的是，共價地連接第一組分的第二組分以小於或等於 10.0 µM 的 K D 結合至第三組分 (亦即，玻尿酸)。例如，第二組分可以小於或等於 9.0 µM、8.0 µM、7.0 µM、6.0 µM、5.0 µM、4.0 µM、3.0 µM、2.0 µM、1.5 µM、1.0 µM 或 0.5 µM 的 K D 結合 HA。 1. 玻尿酸 (HA)
玻尿酸 (HA) 是一種存在於細胞外基質及細胞表面的線性醣胺聚醣。HA 含有重複之 N-乙醯基葡糖胺 (GlcNac) 及葡萄醣醛酸 (GlcUA) 的雙醣單元，它們通過交替的 β1→3 葡萄醣醛酸及 β1→4 葡糖胺 (glucosaminidic) 鍵連接，形成線性聚合物。HA 進一步描述於以下文獻中：Necas 等人, 2008, Veterinarni Medicina, 53: 397-411。醣胺聚醣普遍存在於所有脊椎動物之細胞外基質中，亦存在於某些鏈球菌菌株之莢膜中。在功能上，HA 分子對於維持組織中高度水合之細胞外基質很重要，其參與細胞黏著並支持細胞遷移。玻璃體液除水之外，主要由 HA 組成，其在保留眼睛中央部分之水分及結構方面表現優異。它有助於保持眼睛潤滑並補充失去的任何水分。HA 亦藉由與大量 HA 結合蛋白及細胞表面受體諸如 CD44 及淋巴管內皮玻尿酸受體 1 (LYVE-1) 交互作用，表現出多種生物學功能。HA 結合蛋白及 HABD 之實例在上文第 II.B 節中有所描述。
HA 具有 1000 Da 至 10000000 Da 的寬分子量範圍。組織中之天然高分子量 HA 在通過淋巴系統、淋巴結、肝臟及腎臟的代謝途徑中降解為小分子。雖然已知 HA 在血漿中之半衰期為大約 2.5 分鐘至 5.5 分鐘，但是據報導，其在眼睛之玻璃體中的半衰期為大約 70 天。HA 獨特的理化性質及各種生物學功能使其在生物醫學領域 (諸如藥物遞送、關節炎治療、眼科手術及組織工程) 得到廣泛應用。特別而言，HA 用於生物/藥物通過各種遞送途徑之靶向特異性及長效遞送已得到廣泛研究。利用其粘彈性及黏膜粘附特性，HA 已被開發為一種有效的局部眼科藥物之遞送載劑。
已表明，具有限定尺寸之 HA 適合於本發明。據此，HA 可具有至少 2、3、4、5、6、7、8 或 9 kDa 之分子量及/或至多 60、50、40、30、25、20 或 15 kDa 之分子量。特定而言，分子量之合適範圍為 3 kDa 至 60 kDa，特定而言 4 kDa 至 30 kDa，更特定而言 5 kDa 至 20 kDa。
在一些實施例中，較佳地使用未經修飾之天然存在的 HA。在這些實施例中，使用未經修飾之天然存在的 HA 減小了副作用。例如，將 HABD 與 10 kDa 之 HA 預複合，可減少玻璃體液中之活體外沉澱，並減輕在豬及兔中觀察到的眼內毒性。在其他實例中，在 HABD 為 TSG-6 或 CD44 的情況下，當 TSG-6 或 CD44 未與 HA 預複合時，觀察到眼內毒性諸如炎症及視網膜。
在一些實施例中，HA 為透明質酸鹽，其包括但不限於透明質酸鉀、透明質酸鎂及透明質酸鈣。
在一些實施例中，HA 可具有較小之化學修飾。化學修飾可用於減少 HA 降解、增加或減少水溶性、改變 HA 擴散速率及/或 HA 粘度。已知本領域有兩種對 HA 進行化學修飾的一般方法 – (1) 使用功能性化學試劑交聯 HA 及 (2) 使用單功能試劑偶合 HA。二乙烯基砜、雙環氧化物、甲醛及雙鹵化物為用於交聯 HA 的雙功能試劑。經化學修飾之 HA 製劑包括但不限於甲基丙烯酸氨基乙酯 HA、己二酸二醯肼接枝 HA、二甲醚複合 HA、HA-半胱胺酸乙酯、尿素交聯 HA 及 N-乙醯基半胱胺酸 HA。特別受關注的是減少 HA 眼睛中之 HA 降解的修飾。 2. 治療分子與玻尿酸 (HA) 預複合以形成結合物
在一些實施例中，治療分子與 HA 預複合以形成結合物。治療分子中包含的遊離 HABD 在注射部位的初始濃度可能很高，導致不利影響，如下面的實例 5 中所述。在一些情況下，這些影響可能係由遊離 HABD 在注射部位與 IVT HA 之接觸引起。HABD 與 HA 之預複合藉由給予 HABD 時間從注射部位擴散到玻璃體之其餘部分，減少了這些不利影響。當 HABD 從與預複合之 HA 交互作用轉變為與 IVT HA 交互作用時，擴散時間減慢，且玻璃體半衰期延長。因此，在一些實施例中，治療分子為結合物，包含該治療分子，並且進一步包含一種或多種包含 HA 的第三組分。
在一些實施例中，結合物包含治療分子與 HA 之間之非共價交互作用。在一些實施例中，結合物包含治療分子與 HA 之間之共價交互作用。
在一些實施例中，結合物可為經分離之結合物，亦即，該結合物不在待治療的個體內。在一些態樣中，將結合物純化至純度高於 95% 或 99%，該純度藉由例如電泳 (例如，SDS-PAGE、等電位聚焦 (IEF)、毛細管電泳) 或層析 (例如，離子交換或反相 HPLC) 來測定。關於評估抗體純度之方法的綜述，參見例如：Flatman 等人, J Chromatogr B 848:79-87 (2007)。 D. 融合蛋白
在一些實施例中，第一組分及第二組分為蛋白質，更佳地包含於融合蛋白中；該第一組分及第二組分經由共價連接子連接。
融合蛋白係由兩種或更多種原本分離之蛋白質或肽連接而成的蛋白質。該方法得到具有來源於原始、單獨蛋白質中之各者的功能特性之單一多肽。蛋白質可直接彼此融合。蛋白質亦可經由連接子融合，該連接子可提高蛋白質彼此獨立折疊並按預期表現的可能性。二聚體或多聚體融合蛋白可通過遺傳工程藉由與誘導蛋白質複合 (諸如與抗體結構域) 的肽結構域的原始蛋白質融合來生產。
在一些實施例中，第二組分直接結合至第一組分。這意味著第二組分直接跟在第一組分之後 (反之亦然)，該等兩種組分之間不存在其他化學元素 (原子或基團)。在一些實施例中，第一組分之最後一個胺基酸緊鄰第二組分之第一胺基酸。在一些實施例中，第二組分之最後一個胺基酸緊鄰第一組分之第一胺基酸。
在一些實施例中，第二組分經由連接子 (特定而言肽連接子) 間接地結合至第一組分。在一些實施例中，這意味著肽連接子處於第一組分與第二組分之間。在一些實施例中，肽連接子處於第一組分之最後一個胺基酸與第二組分之第一胺基酸之間。在一些實施例中，肽連接子處於第二組分之最後一個胺基酸與第一組分之第一胺基酸之間。
在一些實施例中，該等一種或兩種第二組分共價地結合至第一組分之 N 端及/或 C 端。在一些實施例中，第一組分為抗體或抗原結合片段，且該等一種或兩種第二組分共價地結合至第一組分之 C 端 (直接結合或經由肽連接子結合）。在融合蛋白為 Fab-HABD 的實施例中，HABD 共價地結合至 Fab 之 C 端。 1. 肽連接子
在許多實施例中，肽連接子連接治療活性劑 (亦即第一組分) 與 HABD (亦即第二組分)。在一些實施例中，連接子包含至少 4 個胺基酸。在一些實施例中，連接子包含 4 至 25 個胺基酸。在一些實施例中，連接子包含 5 至 100 個胺基酸。在一些實施例中，連接子包含 10 至 50 個胺基酸。在一些實施例中，連接子的長度不超過 25 個胺基酸。在一些實施例中，連接子的長度不超過 50 個胺基酸。
在一些實施例中，肽連接子包含柔性殘基 (如甘胺酸及絲胺酸)，使得相鄰蛋白質結構域可相對於彼此自由移動。因此，在一些實施例中，肽連接子為甘胺酸-絲胺酸連接子，亦即，由甘胺酸及絲胺酸殘基模式所組成之肽連接子。在一個實施例中，該肽連接子為 (GxS) n或 (GxS) nG m，其中 G = 甘胺酸，且 S = 絲胺酸。在這些實施例中，x = 3；n = 3、4、5 或 6；且 m = 0、1、2 或 3。在其他實施例中，x = 4；n = 2、3、4 或 5；且 m = 0、1、2 或 3。在一些實施例中，x = 4 且 n = 2 或 3。在一些實施例中，x = 4 且 n = 2。
在一些實施例中，肽連接子由 GGGGS (SEQ ID NO: 27) 或其多聚體組成，更尤其由 (GGGGS) 3(SEQ ID NO: 28) 組成。
在一些實施例中，肽連接子包含 (GS) n，其中 G 為甘胺酸，且 S 為絲胺酸。在這些實施例中，n = 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10。在一些實施例中，n = 10.在一些實施例中，連接子為 SEQ ID NO: 95。 E. 治療分子及結合物的某些實施例 1.    VEGF
在一些實施例中，治療分子包含 (1) 第一組分，其包含抗 VEGF 抗體、抗體片段、抗原結合片段或 Fab；(2) 一種或兩種第二組分，其中第二組分包含 CD44 HA 受體結構域、TSG6 結構域及/或 VG1 結構域。
在一些實施例中，結合物包含 (1) 第一組分，其包含抗 VEGF 抗體、抗原結合片段、抗體片段或 Fab；(2) 一種或兩種第二組分；及 (3) 分子量範圍為 5 kDa 至 20 kDa 的 HA。 a)   G6.31
在一些實施例中，第一組分為包含 G6.31 抗 VEGF Fab 的抗體。在一些實施例中，第一組分為具有包含於 SEQ ID NO: 17 中的 VH 結構域的抗體。在一些實施例中，第一組分為具有包含於 SEQ ID NO: 18 中的 VL 結構域的抗體。在一些實施例中，第一組分為包含如 SEQ ID NO: 105 所示之 VH 結構域的抗體。在一些實施例中，第一組分為包含如 SEQ ID NO: 106 所示之 VL 結構域的抗體。 b)   PigFab
在一些實施例中，第一組分為包含 PigFab 抗 VEGF Fab 的抗體。在一些實施例中，第一組分為具有包含於 SEQ ID NO: 66 中的 VH 結構域的抗體。在一些實施例中，第一組分為具有包含於 SEQ ID NO: 65 中的 VL 結構域的抗體。在一些實施例中，第一組分為包含如 SEQ ID NO: 97 所示之 VH 結構域的抗體。在一些實施例中，第一組分為包含如 SEQ ID NO: 98 所示之 VL 結構域的抗體。 c) 蘭尼單抗
在一些實施例中，第一組分為包含蘭尼單抗 (ranibizumab) 的抗體。在一些實施例中，第一組分為具有包含於 SEQ ID NO: 77 中的 VH 結構域的抗體。在一些實施例中，第一組分為具有包含於 SEQ ID NO: 76 中的 VL 結構域的抗體。在一些實施例中，第一組分為包含如 SEQ ID NO: 114 所示之 VH 結構域的抗體。在一些實施例中，第一組分為包含如 SEQ ID NO: 115 所示之 VL 結構域的抗體。 d)   CD44
在一些實施例中，該等一種或兩種第二組分包含 CD44 HA 受體結構域。在一些實施例中，第二組分包含 SEQ ID NO: 2。 e)    TSG6
在一些實施例中，該等一種或兩種第二組分包含 TSG6 結構域。在一些實施例中，該等一種或兩種第二組分包含 SEQ ID NO: 4。
在一些實施例中，治療分子包含 SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19 及/或 SEQ ID NO: 20。 f)    VG1
在一些實施例中，該等一種或兩種第二組分包含 VG1 結構域。在一些實施例中，該等一種或兩種第二組分包含以下 SEQ ID NO: 29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60 或 87 中之一者或兩者。
在一些實施例中，治療分子包含 SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 76 及/或 SEQ ID NO: 77。 g) 半胱胺酸結肽 (CKP)
在一些實施例中，第一組分在包含抗 VEGF 抗原結合片段之外，視情況進一步包含半胱胺酸結肽 (CKP)。在一些實施例中，CKP 與 SEQ ID NO: 92 具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。
在一些實施例中，治療分子與 SEQ ID NO: 93 具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在一些實施例中，抗 VEGF 抗原結合片段與 SEQ ID NO: 94 具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。
在一些實施例中，該治療分子包含第一組分，該第一組分包含抗 VEGF 抗原結合片段，且半胱胺酸結肽可進一步包含第二組分，該第二組分包含如上文第 II.B 節所述之 HABD。
在一些實施例中，結合物包含 (1) 第一組分，其包含抗 VEGF 抗原結合片段，(2) 一種或兩種第二組分，其包含 HABD，及 (3) 分子量範圍為 5 kDa 至 20 kDa 的 HA。 2.    NVS24
在一些實施例中，治療分子包含 (1) 第一組分，其包含抗 VEGF 抗體 NVS24，及 (2) 一種第二組分，該第二組分包含 TSG6 (Lava12) 結構域。
在一些實施例中，第一組分包含 NVS24 抗體。在一些實施例中，第一組分為具有包含於 SEQ ID NO: 21 中的 VH 結構域的抗體。在一些實施例中，第一組分為具有包含於 SEQ ID NO: 22 中的 VL 結構域的抗體。在一些實施例中，第一組分為包含如 SEQ ID NO: 109 所示之 VH 結構域的抗體。在一些實施例中，第一組分為包含如 SEQ ID NO: 110 所示之 VL 結構域的抗體。 a)   TSG6 (Lava12)
在一些實施例中，第二組分包含 TSG6 (Lava12) 結構域。在一些實施例中，第二組分包含 SEQ ID NO: 113。
在一些實施例中，治療分子包含 SEQ ID NO: 21 及/或 SEQ ID NO: 22。 3. 抗 VEGF 及抗 PDGF 雙靶向抗體 ( 抗 VP-dutaFab ；抗 VPDF)
在一些實施例中，治療分子包含 (1) 第一組分，其能夠結合 VEGF 及 PDGF (諸如雙特異性抗體或雙靶向抗體，dutaFab)，如上文 II.A.1.h) 節所述；及 (2) 一種或兩種第二組分，其包含 CD44 HA 受體結構域、TSG6 結構域及/或 VG1 結構域。
在一些實施例中，第一組分為具有包含於 SEQ ID NO: 5 中的 VH 結構域的抗體。在一些實施例中，第一組分為具有包含於 SEQ ID NO: 6 中的 VL 結構域的抗體。在一些實施例中，第一組分為包含如 SEQ ID NO: 99 所示之 VH 結構域的抗體。在一些實施例中，第一組分為包含如 SEQ ID NO: 100 所示之 VL 結構域的抗體。 a)   CD44
在一些實施例中，該等一種或兩種第二組分包含 CD44 HA 受體結構域。在一些實施例中，該等一種或兩種第二組分包含 SEQ ID NO: 2。
在一些實施例中，治療分子包含 SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7 及/或 SEQ ID NO: 8.
在一些實施例中，該等一種或兩種第二組分包含 CD44-ko 結構域。在一些實施例中，該等一種或兩種第二組分包含如 SEQ ID NO: 25 及/或 SEQ ID NO: 26 所示之 CD44-ko 結構域。
在一些實施例中，治療分子包含 SEQ ID NO: 25 及/或 SEQ ID NO: 26。 b)   TSG6 (Lava12)
在一些實施例中，第二組分包含 TSG6 (Lava12) 結構域。在一些實施例中，第二組分包含 SEQ ID NO: 113。
在一些實施例中，治療分子包含 SEQ ID NO: 23 及/或 SEQ ID NO: 24。 c)    VG1
在一些實施例中，該等一種或兩種第二組分包含 VG1 結構域。在一些實施例中，該等一種或兩種第二組分包含以下 SEQ ID NO: 29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60 或 87 中之一者或兩者。
在一些實施例中，治療分子包含 SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 72 及/或 SEQ ID NO: 73。 4.    RabFab
在一些實施例中，治療分子包含 (1) 第一組分，其包含 RabFab 抗體 (如上文第 II.A.3 節所述)；及 (2) 一種或兩種第二組分，其包含 TSG6 結構域及/或 VG1 結構域。
在一些實施例中，RabFab 抗體包含 RabFab VH 及 VL 結構域。在一些實施例中，RabFab 抗體包含：VH 結構域，其包含於 SEQ ID NO: 13 中；及 VL 結構域，其包含於 SEQ ID NO: 14 中。在一些實施例中，RabFab 抗體包含 SEQ ID NO: 107 所示之 VH 結構域。在一些實施例中，RabFab 抗體包含 SEQ ID NO: 108 所示之 VL 結構域。 a)   TSG6
在一些實施例中，該等一種或兩種第二組分包含 TSG6 結構域。在一些實施例中，該等一種或兩種第二組分包含 SEQ ID NO: 4。
在一些實施例中，治療分子包含 SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15 及/或 SEQ ID NO: 16。 b)   VG1
在一些實施例中，該等一種或兩種第二組分包含 VG1 結構域。在一些實施例中，該等一種或兩種第二組分包含以下 SEQ ID NO: 29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60 或 87 中之一者或兩者。
在一些實施例中，治療分子包含 SEQ ID NO: 63 及/或 SEQ ID NO: 64。 5.    20D12v2.3
在一些實施例中，第一組分為包含抗補體因子 D 抗體 Fab (20D12v2.3) 的抗體。在一些實施例中，第一組分為具有包含於 SEQ ID NO: 75 中的 VH 結構域的抗體。在一些實施例中，第一組分為具有包含於 SEQ ID NO: 74 中的 VL 結構域的抗體。在一些實施例中，第一組分為包含如 SEQ ID NO: 111 所示之 VH 結構域的抗體。在一些實施例中，第一組分為包含如 SEQ ID NO: 112 所示之 VL 結構域的抗體。 a)   VG1
在一些實施例中，該等一種或兩種第二組分包含 VG1 結構域。在一些實施例中，該等一種或兩種第二組分包含以下 SEQ ID NO: 29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60 或 87 中之一者或兩者。
在一些實施例中，治療分子包含 SEQ ID NO: 74 及/或 SEQ ID NO: 75。 6.    HtrA1
在一些實施例中，第一組分為包含能夠結合人 HtrA1 的抗體或抗體片段的抗體。在一些實施例中，第一組分為具有包含於 SEQ ID NO: 118 中的 VH 結構域的抗體。在一些實施例中，第一組分為具有包含於 SEQ ID NO: 119 中的 VL 結構域的抗體。在一些實施例中，第一組分為包含如 SEQ ID NO: 116 所示之 VH 結構域的抗體。在一些實施例中，第一組分為包含如 SEQ ID NO: 117 所示之 VL 結構域的抗體。 a)   VG1
在一些實施例中，該等一種或兩種第二組分包含 VG1 結構域。在一些實施例中，該等一種或兩種第二組分包含以下 SEQ ID NO: 29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60 或 87 中之一者或兩者。
在一些實施例中，治療分子包含 SEQ ID NO: 118 及/或 SEQ ID NO: 119。 III. 眼睛疾病之治療
在眼睛疾病之治療中使用材料及方法。眼睛疾病之特徵可以為經改變或不受調控之新血管擴增及/或侵入眼部組織諸如視網膜或角膜之結構內。眼睛疾病之特徵可以為視網膜組織 (光受器及下方視網膜色素上皮細胞 (RPE) 及脈絡膜毛細管) 之萎縮。非限制性眼睛疾病包括例如年齡相關性黃斑退化 (AMD)（例如，濕性 AMD、乾性 AMD、中期 AMD、晚期 AMD、及地圖狀萎縮 (GA)）、黃斑部病變、黃斑部水腫、糖尿病性黃斑水腫 (DME)（例如，局灶性、非中心性 DME 和瀰漫性、涉及中心的 DME）、視網膜病變、糖尿病性視網膜病變 (DR)（例如，增生性 DR (PDR)、非增生性 DR (NPDR) 及高海拔 DR)、其他與缺血相關的視網膜病變、ROP、視網膜靜脈阻塞 (RVO)（例如中心 (CRVO) 和分支 (BRVO) 形式）、CNV（例如近視 CNV）、角膜血管新生、與角膜血管新生相關的疾病、視網膜血管新生、與視網膜/脈絡膜血管新生相關的疾病、中心性漿液視網膜病變 (CSR)、病理性近視、逢希伯-林道疾病、眼組織胞漿病、FEVR、柯氏症、諾氏病、與骨質疏鬆-假性神經膠質瘤症候群 (OPPG) 相關的視網膜異常、結膜下出血、紅腫、眼血管新生疾病、血管新生性青光眼、色素性視網膜炎 (RP)、高血壓性視網膜病變、視網膜血管瘤增生、黃斑部毛細血管擴張、虹膜血管新生、眼內血管新生、視網膜病變、黃斑部囊樣水腫 (CME)、管脈炎、視乳頭水腫、視網膜炎，包括但不限於 CMV 視網膜炎、眼黑色素瘤、視網膜母細胞瘤、結膜炎（例如，感染性結膜炎和非感染性（例如，過敏性）結膜炎）、萊伯先天性黑蒙症（亦稱為萊伯氏先天性黑蒙症或 LCA）、眼色素層炎（包括感染性和非感染性眼色素層炎）、脈絡膜炎（例如多灶性脈絡膜炎）、眼組織漿菌症、瞼緣炎、乾眼症、眼外傷、修格倫氏病及其他眼科疾病，其中，該疾病或病症與血管新生、血管滲漏及/或視網膜水腫或視網膜萎縮有關。其他示例性眼睛疾病包括由纖維血管或纖維組織異常增生所引起之疾病，包括所有形式之增生性玻璃體視網膜病變。
與角膜新生血管形成 (虹膜新生血管形成、角部新生血管形成或皮膚發紅) 相關聯之示例性疾病包括但不限於，流行性角膜結膜炎、維生素 A 缺乏症、隱形眼鏡過度磨損、過敏性角膜炎、上邊緣性角膜炎、角膜病乾燥性角膜炎 (terygium keratitis sicca)、Sjögren 氏症候群、痤瘡、泡性角結膜炎、梅毒、分枝桿菌感染、脂質退化、化學品燒傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、單純性皰疹病毒感染、帶狀皰疹病毒感染、原蟲感染、卡波西肉瘤、蠶蝕性角膜潰瘍、Terrien 氏邊際退化、邊際性角質退化、類風濕性關節炎、全身性狼瘡、多動脈炎、創傷、Wegener 類肉瘤病、鞏膜炎、Stevens-Johnson 氏症候群、類天皰瘡放射狀角膜切開術及角膜圖像排斥反應 (corneal graph rejection)。
與脈絡膜新血管形成及視網膜血管系缺陷 (包括增加之血管滲漏、動脈瘤及毛細血管滴落) 相關的示例性眼睛疾病包括但不限於，糖尿病性視網膜病變、黃斑退化、鐮狀細胞貧血、肉瘤、梅毒、彈性纖維假黃瘤、Paget 氏病、靜脈阻塞、動脈阻塞、頸動脈阻塞性疾病、慢性眼色素層炎/玻璃體炎、分支桿菌感染、Lyme 氏病、全身性紅斑狼瘡、早產兒視網膜病變、視網膜水腫 (包括黃斑水腫)、Eales 病、貝塞特氏病、視網膜炎或脈絡膜炎造成之感染(例如，多灶性脈絡膜)、預設性眼部組織胞漿菌病、Best 氏病 (卵黃狀黃斑退化)、近視、視盤小凹 (optic pits)、睫狀體扁平部炎、視網膜剝離 (例如，慢性視網膜剝離)、血液高度黏稠症、弓蟲症、創傷及雷射後併發症。
與視網膜組織 (光受器及下方 RPE) 相關聯之示例性眼睛疾病包括但不限於，萎縮性或非滲出性 AMD (例如，地圖狀萎縮或晚期乾性 AMD)、黃斑萎縮 (例如，與新血管形成相關之萎縮及/或地圖狀萎縮)、糖尿病性視網膜病變、斯特格氏病、Skorsby 眼底萎縮症、視網膜劈裂症 (視網膜神經感覺層之異常分裂) 及色素性視網膜炎。
在根據 (或如應用於) 上述任何實施例之某些實施例中，眼睛疾病為選自由以下所組成之群組的眼內新血管疾病：增生性視網膜病變、脈絡膜新血管形成 (CNV)、年齡相關性黃斑退化 (AMD)、糖尿病性及其他局部缺血相關性視網膜病變、糖尿病性黃斑水腫,、病理性近視、逢希伯-林道病、眼睛組織胞漿菌病、視網膜靜脈阻塞 (RVO) (包括 CRVO 及 BRVO)、角膜新血管形成、視網膜新血管形成及早產兒視網膜病變 (ROP)。在本發明之一個較佳的實施例中，眼睛疾病為年齡相關性黃斑退化 (AMD)，特定而言濕性 AMD 或新生血管性 AMD；糖尿病性黃斑水腫 (DME)；糖尿病性視網膜病變 (DR)，特定而言增殖性 DR 或非增殖性 DR；視網膜靜脈阻塞 (RVO)；或地圖狀萎縮 (GA)。
本文所揭示之治療分子、結合物及組成物可用為治療哺乳動物受試者中眼睛疾病的藥物。哺乳動物之實例包括但不限於馴養的動物 (例如牛、綿羊、貓、狗和馬)、靈長類動物 (例如人及非人類靈長類動物，例如猴)、兔以及囓齒類動物 (例如小鼠及大鼠)。較佳的是，受試者為人類。在一些實施例中，治療分子、結合物及組成物之治療標靶為人眼中之標靶。 IV. 治療方法
本文提供治療眼睛疾病的方法，該方法包含將治療分子、結合物或組成物遞送至患者之組織。在許多實施例中，該等方法包含投予治療分子，使得該治療分子可向標靶組織提供治療活性劑之長效遞送。在許多實施例中，標靶組織係在眼睛中。 A. 投予方法
治療分子、結合物或組成物可以任何有效、方便的方式投予，包括例如藉由局部、口服、靜脈內、腹膜內、肌內、皮下、鼻內、氣管內或皮內途徑等投予。較佳的是，組成物適合於投予眼睛，更具體而言，組成物可適合於 IVT 投予。因此，在一較佳的實施例中，組成物係經調配用於眼內遞送，特定而言用於 IVT 注射。在治療中或作為預防劑時，治療分子、結合物或組成物可作為可注射之組成物 (例如作為無菌水分散體) 投予個體。
不受該理論之束縛，認為注射結合物可促進 HA 在與 IVT HA 交互作用之前從預複合之 HABD 擴散。由於解離緩慢，因此玻璃體中遊離 HABD 之濃度較低。與未與 HA 預複合的治療分子相比，玻璃體內較低濃度的遊離 HABD 可能對眼睛的危害更小。
在一些實施例中，投予步驟係單次注射。在一些實施例中，投予步驟包含多於一次單次注射。 B. 組成物
本文提供用為藥物、特定而言用於治療眼睛疾病之組成物。組成物可被稱為醫藥組成物，因為它們旨在用於製藥領域或用為藥物，是指以下製劑，其形式為允許其中所含之活性成分的生物活性有效，並且不含對組成物將投予之受試者具有不可接受之毒性的其他組分。
在一些實施例中，組成物包含治療分子。在一些實施例中，組成物包含結合物。
在一些實施例中，組成物視情況包含醫藥上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑，諸如緩衝物質、穩定劑、防腐劑或其他成分，尤其是與醫藥組成物相關的一般所知的成分。
一般而言，視情況選用的成分或附加成分的性質將取決於組成物之特定形式以及所採用的投予方式。醫藥上可接受之載劑可增強或穩定組成物，或可用於促進組成物之製備。該等載劑可包括但不限於生理相容性鹽水、緩衝鹽水、右旋糖、水、甘油、溶劑、分散介質、包衣、抗菌劑及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑等以及它們的組合。組成物可另外包含一種或多種其他治療劑，特定而言包含那些適合治療或預防例如與眼睛疾病諸如視網膜血管疾病相關聯之疾病或病症的那些。調配物應適應投予方式。例如，腸胃外調配物通常包含可注射流體，其包括用為媒劑的醫藥上及生理學上可接受之流體，例如水、生理鹽水、平衡鹽溶液、右旋糖水溶液、甘油等。除生物學中性載劑以外，待投予之醫藥組成物可含有少量無毒的輔助物質，諸如潤濕劑或乳化劑、防腐劑及 pH 緩沖劑等。
組成物可包含穩定劑。術語「穩定劑 (stabilizer)」是指保護組成物免受不利條件 (諸如在加熱或冷凍期間發生的那些條件) 影響及/或延長本發明之結合物在某種條件或狀態下的穩定性或保存期限的物質。穩定劑的實例包括但不限於：醣類，諸如蔗糖、乳糖及甘露糖；糖醇，諸如甘露醇；胺基酸，諸如甘胺酸或麩胺酸；及蛋白質，諸如人血清白蛋白或明膠。 C. 有效劑量
通常，在本揭露之醫藥組成物中採用治療有效量或有效劑量的治療分子或結合物。藉由本領域技術人員已知的習用方法將治療分子及結合物配製為醫藥上可接受之劑型。調整給藥方案以提供最佳所需之反應 (例如，治療反應)。例如，可投予單次推注，可隨時間的推移投予若干分開的劑量，或者可根據治療情況的緊急程度按比例減少或增加劑量。以劑量單位形式配製腸胃外組成物尤其有利，其便於投予並確保劑量之均勻性。如本文所使用的劑量單位形式是指適合用為待治療之受試者的單一劑量的物理離散單位；每個單位含有預定量之活性化合物，其用量經計算可產生與所需之醫藥載劑相關聯之所需治療效果。
可改變醫藥組成物中活性成分 (亦即治療分子及結合物) 的實際劑量水平，以獲得可有效實現特定患者所需之治療反應、組成物以及對患者無毒的投予模式的活性成分的量。所選擇的劑量水平取決於多種藥物動力學因素，該等因素包括：所採用的本發明的特定組成物的活性；投予途徑；投予時間；所採用的特定化合物的排泄速率；治療持續時間；與所採用的特定組成物結合使用的其他藥物、化合物及/或材料；接受治療的患者的年齡、性別、體重、疾病、一般健康狀況及既往病史；以及類似因素。可選擇及/或調整劑量水平以實現使用本文所述之一種或多種眼部/視覺評估所確定的治療反應。醫師或獸醫可從劑量低於實現預期治療效果所需的水平開始投予醫藥組成物中所採用的結合物的治療分子，並逐漸增加劑量，直至實現所需之效果。一般而言，本文所述的用於治療眼睛疾病的組成物的有效劑量取決於許多不同的因素，該等因素包括投予方式、標靶部位、患者的生理狀態、患者是人還是動物、投予的其他藥物以及治療是預防性還是治療性的。
需要滴定治療劑量以優化安全性及有效性。使用本發明之結合物進行 IVT 投予的劑量可在每次注射 0.1 mg/眼至 10 mg/眼的範圍內。每隻眼睛的單一劑量可藉由對每隻眼睛進行 1 次或多次注射來實施。例如，20 mg/眼的單一劑量可分 2 次遞送，每次注射 10 mg，使總劑量為 20 mg。每次注射的體積可在 10 微升與 50 微升之間，而每個劑量的體積可在 10 微升與 100 微升之間。考慮經美國食品暨藥物管理局 (FDA) 批准的適用於 Lucentis 的劑量和方案。適用於抗 VEGF 抗體或抗原結合片段的其他劑量和方案描述於 US 2012/0014958 中，并藉由引用將其全文併入本文。
組成物可多次投予。單一劑量之間的投予間隔可為每週、每月或每年。間隔亦可為不規則的，根據患者所需的再治療確定，基於例如視覺敏銳度或黃斑水腫。此外，替代給藥間隔可由醫師確定並每月投予一次或在必要時投予以發揮效用。有效性基於眼睛的情況以及眼睛疾病的種類及嚴重程度，例如，特徵在於病變性生長、抗 VEGF 治療率、藉由光同調斷層掃描 (OCT) 所測定之視網膜厚度及視覺敏銳度。劑量和頻率可根據本發明之結合物在患者體內的半衰期及治療標靶 (例如，VEGF、C5、EPO、因子 P 等) 的水平而變化。然而，在本發明之一個較佳的實施例中，組成物至多每三個月投予一次，特定而言至多每四個月投予一次，更特定而言每六個月投予一次。這反映了結合物中第一組分相較於相應的未結合 (遊離) 第一組分的延長的半衰期 (並因此延長了有效性之持續時間)。據此，結合物中第一組分的消除半衰期相較於未結合的第一組分延長了至少 3 倍、至少 4 倍或至少 5 倍。結合物中第一組分之消除半衰期相較於遊離之第一組分的相對增加可藉由 IVT 注射投予該等分子並使用本領域已知的分析方法測量不同時間點的剩餘濃度來確定，該等分析方法為例如 ELISA、質譜法、西方墨點法、放射免疫分析法或螢光標記法。亦可測量血液濃度，並將其用於計算從眼睛中清除的速率 (Xu L 等人, invest Ophthalmol Vis ScL, 54(3):1816-24 (2013))。一般而言，作為結合物的一部分的分子 (例如，抗體或片段) 表現出長於遊離分子的眼內半衰期。眼睛中之結合物之半衰期相較於遊離之第一組分可增加 25% (例如，從 5 天增加至 6.25 天)，其半衰期相較於遊離之第一組分增加 50% (例如，從 5 天增加至 7.5 天)，其半衰期相較於遊離之第一組分增加 75% (例如，從 5 天增加至 8.75 天)，其半衰期相較於遊離之第一組分增加 100% (例如，從 5 天增加至 10 天)，在某些態樣中，預期結合物之半衰期相較於遊離之第一組分可增加 100% 以上 (例如，從 5 天增加至 15 天、20 天或 30 天；從 1 周增加至 3 週、4 週或更長時間；等等)。 D. 組合療法
組合療法涵蓋聯合投予 (其中兩種或多種治療劑包含於同一或單獨的調配物中) 以及單獨投予，在單獨投予的情況下，治療分子及結合物之投予可在投予另外之一種或多種治療劑之前、同時及/或之後發生。在某些實施例中，治療分子、結合物或組成物與另外化合物同時投予。在某些實施例中，治療分子、結合物或組成物在另外化合物之前或之後投予。在一些實施例中，治療分子、結合物或組成物之投予與另外治療劑之投予彼此在約一個、兩個、三個、四個或五個月內或者在約一週、兩週或三週內或者在約一天、兩天、三天、四天、五天或六天內。
任何合適的治療眼睛疾病之治療劑皆可用為該另外化合物，特定而言用為治療眼睛疾病之藥劑。眼睛疾病如上文第 III 節所述。此外，上文第 II.A 節所述之作為治療分子之組分的任何分子亦可用為組合療法中所使用之另外化合物。
在一些實施例中，另外化合物為上文第 II.A.1.h) 節及 Carmeliet 等人在 Nature 407:249-257 (2000) 中所述之抗血管生成劑。其他合適之抗血管生成劑包括皮質類固醇、血管生成抑制性類固醇、醋酸阿奈可他、血管抑素、內皮抑素、酪胺酸激酶抑制劑、基質金屬蛋白酶 (MMP) 抑制劑、似胰島素生長因子結合蛋白 3 (IGFBP3)、源自基質細胞之因子 (SDF-1) 拮抗劑 (例如，抗 SDF-1 抗體)、源自色素上皮細胞之因子 (PEDF)、似 γ-分泌酶 δ 配體 4、整合素拮抗劑、缺氧誘導因子 (HIF)-1α 拮抗劑、蛋白質激酶 CK2 拮抗劑、抑制位於新血管形成位點處之幹細胞 (例如，內皮祖細胞) 的藥物 (例如，抗血管內皮鈣黏蛋白 (CD-144) 抗體及/或抗 SDF-1 抗體) 及其組合。
治療分子、結合物或組成物亦可與治療或手術方法聯合投予以用於治療眼睛疾病 (例如 AMD、DME、DR、RVO 或 GA)，該治療或手術方法包括例如：雷射光凝 (例如，全視網膜光凝 (PRP))、隱結雷射作用、黃斑裂孔手術、黃斑轉位手術、可植入袖珍望遠鏡、PHI-運動血管造影 (亦稱為微雷射治療及分支血管治療 (feeder vessel treatment))、光子束治療、微刺激治療、視網膜剝離及玻璃體手術、鞏膜屈曲 (scleral buckle)、黃斑下手術、經瞳孔熱療、光系統 I 治療、RNA 干擾 (RNAi) 之使用、體外流變過程 (亦稱為膜差濾及流變治療)、微晶片植入、幹細胞治療、基因替換治療、核醣核酸酵素基因治療 (包括用於缺氧反應元件之基因治療，Oxford Biomedica；Lentipak，Genetix；以及 PDEF 基因治療，GenVec)、光受器/視網膜細胞移植 (包括可移植視網膜上皮細胞，Diacrin, Inc.；視網膜細胞移植物，例如，Astellas Pharma US, Inc., ReNeuron, CHA Biotech)、針灸術及其組合。
治療分子、結合物或組成物亦可與視覺週期調節劑 (例如，依米司他鹽酸鹽 (emixustat hydrochloride))；角鯊胺 (例如，OHR-102；Ohr Pharmaceutical)；維生素及礦物質補充劑 (例如，彼等揭示於 Age-Related Eye Disease Study 1 (AREDS1；鋅及/或抗氧化劑) 及 Study 2 (AREDS2；鋅、抗氧化劑、葉黃素、玉米黃素及/或 ω-3 脂肪酸))；基於細胞之治療，例如，NT-501 (Renexus)；PH-05206388 (Pfizer)、huCNS-SC 細胞移植 (StemCells)、CNTO-2476 (臍帶幹細胞系；Janssen)、OpRegen (RPE 細胞之懸浮液；Cell Cure Neurosciences) 或 MA09-hRPE 細胞移植 (Ocata Therapeutics) 組合投予。
在一些實施例中，該另外治療劑為 AMD 治療劑。例如，抗 PDGFR 抗體 REGN2176-3 可與阿柏西普 (aflibercept) (EYLEA ®) 共同調配。在一些情況下，該等共調配物可與治療分子、結合物或組成物組合投予。
在一些實施例中，該另外化合物包含表現內皮抑素及血管抑制素的慢病毒載體 (例如，RetinoStat)。
在某些實施例中，該另外化合物與選自由以下所組成之群組的第二生物分子結合：IL-1β；IL-6；IL-6R；IL-13；IL-13R；PDGF；血管生成素；Ang2；Tie2；S1P；整合素 αvβ3、αvβ5 及 α5β1；β 細胞素 (betacellulin)；apelin/APJ；紅血球生成素；補體因子 D；TNFα；HtrA1；VEGF 受體；ST-2 受體；以及在基因上與 AMD 風險關聯之蛋白質，諸如補體途徑成分 C2、因子 B、因子 H、CFHR3、C3b、C5、C5a 及 C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；介白素-8 (IL-8)；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC；COL10A1；以及 TNFRSF10A。在某些實施例中，該另外化合物為抗體或其抗原結合片段，包括上文第 II.A.3 節所述之抗體及抗原結合片段之實例。 E. 標靶組織
在一些實施例中，標靶組織包含眼睛、腦、骨骼及/或腫瘤。在一些實施例中，組織包含視網膜。在一些實施例中，將治療分子、結合物或組成物注射到眼睛、腦、骨骼或腫瘤中。在一些實施例中，將治療分子、結合物或組成物注射到玻璃體液、腦脊液或滑液中。在一些實施例中，治療分子、結合物或組成物經皮下注射。
在一些實施例中，治療分子、結合物或組成物相較於未經修飾之治療活性劑提供了改良之相容性、更長之停留時間及/或相對於注射部位的更長之半衰期。在一些實施例中，治療分子、結合物或組成物相較於未經修飾之治療活性劑可進一步提供在標靶組織中之更長之藥理作用持續時間。
在一些實施例中，治療分子、結合物或組成物相較於未經修飾之治療活性劑提供了改良之玻璃體相容性、更長之玻璃體停留時間、更長之玻璃體半衰期及/或改良之藥理作用持續時間。在一些實施例中，治療分子、結合物或組成物相較於未經修飾之治療活性劑提供了改良之相容性、更長之停留時間、更長之半衰期及/或在腦中之更長之藥理作用持續時間。 F. 將治療分子結合至 HA
在一些實施例中，方法包含在投予步驟之前將治療分子結合至 HA (亦即，將治療分子與 HA 預複合以形成結合物)。在這些實施例中，預複合允許治療分子結合至 HA。在這些實施例的一些中，將 HA 結合至治療分子之 HABD。HABD 之實例在上文第 II.B 節中有所描述。
在一些實施例中，方法包含將包含治療分子之第一溶液與包含 HA 之第二溶液混合。在一些實施例中，該混合包含容器。容器之實例包括小瓶、單室注射器及兩室注射器。在一些實施例中，混合產生結合至 HA 的治療分子，其準備用於投予受試者。
在一些實施例中，HA 的大小範圍為 400 Da 至 200 kDa。在一些實施例中，HA 為至少 5 kDa。在一些實施例中，HA 為 10 kDa。在一些實施例中，HA 大小/含量允許相對於 HA 結合位點的莫耳過量之 HA 存在於結合或預複合混合物中。在一些實施例中，HA 大小/含量為 HABD 提供莫耳過量之結合當量。在一些實施例中，HA 大小/數量允許 HA 與治療分子的比率在 1.5:1 至 1:1 的範圍內。 實例
以下為本發明之方法和組成物的實例。應當理解，鑒於上文給出的一般描述，可以實施各種其他實施例。
以下實例討論了包含 Fab 片段或肽及玻尿酸結合結構域的融合蛋白，亦即 Fab-HABD。實例 1 至 7 涉及 CD44 及/或 TSG6 HABD。實例 8 至 18 涉及 VG1 HABD。 實例 1. 生成 Fab- 玻尿酸結合結構域融合蛋白 (Fab-HABD) 並與 HA 複合
生成 Fab 片段與玻尿酸結合結構域之融合蛋白 (下文稱為 Fab-HABD) (表 2)。藉由經含 Gly-Ser 的連接子序列將 HABD 重組融合至 Fab 片段之重鏈的 C 端，形成 Fab-HABD (在本文中稱為「1x 版」)。在一些情況下，將另外之 HABD 融合至 Fab 片段之輕鏈中的 C 端 (在本文中稱為「2x 版」)。
使用特異性結合至 VEGF 及 PDGF (稱為「VPDF」)、長葉毛地黃 (稱為「Dig」) 及 VEGF (選殖株「G6.31」) 的 Fab 片段生成e Fab-HABD。
HABD 來源於 CD44 (SEQ ID NO: 2) 或 TSG6 (SEQ ID NO: 4)。
將 Dig 抗體與一個或兩個 CD44 HA 受體結構域共價地連接，並用為非結合對照分子 (SEQ ID NO: 9 至 12)。
表 2 ：實施例中使用的 Fab-HABD 的胺基酸序列。
名稱 HC LC
VPDF-1xCD44 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6
VPDF-2xCD44 SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8
Dig-1xCD44 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 10
Dig-2xCD44 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12
RabFab-1xTSG6 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 14
RabFab-2xTSG6 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 16
G6.31-1xTSG6 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 18
G6.31-2xTSG6 SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 20
NVS24-1xTSG6 (Lava12) SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 22
VPDF-1xTSG6 (Lava12) SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 24
VPDF-2xCD44-ko (對照) SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 26
A. 材料與方法 1. 蛋白質表現
藉由使用標準分子生物學技術進行限制性選殖或基因合成來生成各種 Fab-HABD 之表現質體。針對每條多肽鏈生成單獨的表現載體。在 HEK293 細胞 (ThermoFisher) 中進行表現，並以 1:1 的比率混合表現質體。
在一些情況下，TSG6 在大腸桿菌中表現。
在一些情況下，RabFab-1xTSG6 及 RabFab-2xTSG6 由穩定轉染之中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞分泌產生。 2. 蛋白質純化
藉由在 4000 rpm、4℃ 下離心 20 分鐘來收集上清液。此後，無細胞上清液通過 0.22 µm 瓶頂過濾器過濾並儲存在冰箱 (-20℃) 中。
藉由親和層析法，使用抗 Ckappa 及抗 CH1 樹脂以及粒徑篩析層析法 (SEC) 從細胞培養上清液中純化 Fab-HABD。
簡言之，在經 1 x PBS 緩衝液 (10 mM Na 2HPO 4、1 mM KH 2PO 4、137 mM NaCl 及 2.7 mM KCl，pH 7.4) 平衡的 KappaSelect 樹脂 (GE Healthcare) 上捕獲經無菌過濾的細胞培養上清液，用平衡緩衝劑洗滌，並用 100 mM 檸檬酸鈉 (pH 2.8) 進行洗脫。合併洗脫的抗體級分並將 pH 調節至 7.5。然後在經 1 x PBS 緩衝液 (10 mM Na 2HPO 4、1 mM KH 2PO 4、137 mM NaCl 及 2.7 mM KCl，pH 7.4) 平衡的 CaptureSelect IgG-CH1 樹脂 (Life Technologies) 上捕獲蛋白質，用洗脫緩衝劑洗滌，並用 100 mM 檸檬酸鈉 (pH 2.8) 進行洗脫。在 Nanodrop 800 分光光度計 (Thermo Scientific) 上在 280 nm 下測定蛋白質樣品的濃度。
分析型 SEC 經由 HiLoad 16/60 Superdex 200 製備級管柱 (GE Healthcare) 使用 20 mM 組胺酸、140 mM NaCl (pH 6.0) 緩衝劑在 1.5 mL/min 的流速下進行。
將粒徑篩析層析法所得到的含抗體的合併級分於 -80℃ 下冷凍並儲存以備進一步使用。
在一些情況下，TSG6 從大腸桿菌中純化得出。簡言之，使用由 7 M 鹽酸胍、50 mM Tris-HCl、100 mM 四硫磺酸鈉及 20 mM 亞硫酸鈉組成的緩衝劑提取大腸桿菌細胞。使用 Polytron ®均質器均質化、離心並過濾上清液後，在經 6 M 鹽酸胍、25 mM Tris-HCl (pH 8.6) 平衡的 Ni-NTA 管柱 (GE Healthcare) 上捕獲帶有 His 標籤的蛋白質。將管柱用 25 mM Tris-HCl (pH 8.6)、0.1% Triton X-114 洗滌，並用含有 250 mM 咪唑的緩衝劑進行洗脫。將從管柱上洗脫的 TSG6 藉由以下方法再折疊：將其稀釋至 1.5 mg/mL，然後在 4℃ 的溫度下用 0.5 M 鹽酸胍、0.5 M L-精胺酸、1 mM 還原型麩胱甘肽 (GSH) 及 1 mM 氧化型麩胱甘肽 (GSSG) 的溶液進行透析過夜。在將緩衝劑交換為 25 mM 乙酸鈉 (pH 5.0) 後，藉由 SP-Sepharose™ (GE Healthcare) 上的陽離子交換層析純化再折疊的材料。
在一些情況下，RabFab-1xTSG6 及 RabFab-2xTSG6 由穩定轉染的中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞分泌並從細胞培養基中純化。這些蛋白質無需再折疊。RabFab-1xTSG6 具有經由 gly-gly-gly-gly-ser 連接子融合至 TSG 的該 Fab；HABD 在 HC 之 C 端。RabFab-2xTSG6 具有經由 gly-gly-gly-gly-ser 連接子融合至 TSG6 的該 Fab；一個 HABD 在 HC 之 C 端，而另一個則在 LC 之 C 端。兩種蛋白質在重鏈之 C 端皆有 His 標籤，其用於純化。這些 Fab-HABD 使用 3 個柱層析步驟從 CHO 上清液中純化得到，該等步驟包括：(1) 在抗原親和柱上捕獲，如 Shatz, W. 等人, Mol. Pharm., 13(9):2996-3003 (2016) 中所述，(2) 在 Nickel-NTA 管柱上分離帶有 His 標簽的材料，然後 (3) 在 SP-Sepharose 上進行陽離子交換層析。 3. 與玻尿酸 (HA) 與複合
將 Fab-HABD 與 10 kDa 透明質酸鈉 (Lifecore, Biomedical) 以 1:1 (w/w) 的比例混合，以形成 Fab-HABD-HA 結合物 (下文稱為 Fab-HABD-HAs)。混合後，將結合物濃縮，並用 Amicon Ultra 10 kDa 截留濃縮器 (Millipore) 重新緩衝。最終調配物為 20 mM 組胺酸 pH 6.0、260 mM 蔗糖、140 mM NaCl、0.02% Tween 20。最後，將結合物用 0.22 µm 過濾器 (Ultrafree-MC, Centrifugal Units 0.22 µm, GV Durapore) 過濾。藉由相較於相應的 Fab-HABD 在 SEC 中向更短之保留時間偏移來監測蛋白質-HA 結合物之形成 (見圖 1)。 實例 2. Fab-HABD 之分子特性 實例 2.1. 與 HA 的交互作用 A. 材料與方法
檢查 Fab-HABD 的 HABD 與 HA 結合的能力。使用 Biacore T200 儀器 (GE Healthcare) 藉由 SPR 測試 Fab-CD44 及 Fab-TSG6 Fab-HABD 與 HA 之結合 (表 3)。簡言之，將 Fab-CD44 Fab-HABD 在 80 秒或 120 秒內注射到由 HA 包被的晶片 (SCBS HY, Xantect Bioanalytics GmbH, Germany) 上，其濃度範圍各自為 3.7 nM 至 300 nM。在一些實驗中，藉由將生物素-HA (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri U.S.) 間接偶合到塗布有卵白素 (GE Healthcare) 的 S 系列感測晶片 SA 上來製備經 HA 塗布的晶片。監測解離相 600 秒。隨後，藉由注入 10 mM 甘胺酸 (pH 1.5) 並持續 60 秒或注入 3 M MgCl 2並持續 30 秒來再生表面。藉由扣除由緩衝劑注射所獲得之反應，以校正本體折射率差。所有實驗皆於 25℃ 下使用 PBS-T (10 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl pH 7.4, 0.05% Tween-20) 進行。使用 BIAevaluation 軟體，將得出之曲線擬合至 1:1 Langmuir 結合模型。所有實驗皆於 25℃ 下使用 PBS-T (10 mM Na 2HPO 4, 1 mM KH 2PO 4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl pH 7.4, 0.05% Tween-20) 進行。
此外，藉由等溫滴定熱量測定術 (ITC) 測試 VDPF-2xCD44 與 HA 之交互作用。簡言之，將 Fab-CD44 融合物用 PBS (10 mM Na 2HPO 4, 1 mM KH 2PO 4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl pH 7.4) 透析。透析後，利用剩餘之緩衝劑量溶解 HA，因此所有分子皆處於完全相同之緩衝劑條件下，以避免任何與緩衝劑相關之錯配。將 HA 分子分別以 10 µM (10 kDa HA) 或 2 µM (50 kDa HA) 之濃度加載至樣品池中。向參照池中加載去離子水。用濃度為 150 µM 的 Fab-CD44 融合蛋白填充注射器。滴定實驗在 25℃ 下進行。使用 Origin 7.0 (OriginLab Corporation) 中的一組位點模型計算親和常數 K 以及化學計量比 N。
類似地，使用 ITC 測量 TSG6 與 10 kDa HA 之交互作用 (表 4)，不同之處在於，在這些實驗中，將 TSG6 (20 µM) 置於量熱儀池中並用注射器中之 HA (50 µM) 進行滴定。如上所述，製備含有 PBS 的溶液，且測量溫度為 25℃ 或 37℃。這些測量在 Auto PEAQ ITC 儀器 (Malvern Instruments) 上進行。資料分析如前一段落所述，不同之處在於 N 固定為 1.0，且 HA 濃度及親和常數 K 為可變參數。 B. 結果
藉由 SPR 所測得之 Fab-CD44s 及 Fab-TSG6s 與 HA 結合的 K D 如表 3 所示。
表 3 ： Fab-CD44 及 Fab-TSG6 分子與 HA 之間的交互作用 (SPR) 。
SEQ ID NO 分子 K D [µM]
5, 6 VPDF-1xCD44 ＞10
7, 8 VPDF-2xCD44 ~ 0.6
25, 26 VPDF-2xCD44-ko 無結合
11, 12 Dig-2xCD44 ~ 0.6
17, 18 G6.31-1xTSG6 1.5
19, 20 G6.31-2xTSG6 0.01
23, 24 VPDF-1xTSG6 (Lava12) 1.5
4 TSG6 0.9
13, 14 RabFab-1xTSG6 1.6
15, 16 RabFab-2xTSG6 0.09
21, 22 NVS24-1xTSG6 (Lava12) 1.2
交互作用之強度由 HABD 序列以及交互之結合性決定 (亦即，2x 版經由密切結合至 HA 而表現出更高之功能親和力)。
ITC 分析 (表 4) 得出如下所示之 HA 親和力，計算得出其結合位點濃度為 400-745 µM，表明估計化學計量比為每條 10 kDa HA 鏈對應於 8-15 個 TSG6 分子。使用池中 50 µM VPDF-2xCD44 及注射器中 150 µM 10 kDa HA 的類似實驗，得到 K D 為 25 µM，且表觀化學計量比為每條 10 kDa HA 鏈對應於 4.5 個 VPDF-2xCD44。CD44 較弱之 HA 結合親和力要求在 ITC 實驗中使用更高的濃度。由 2xCD44 融合物的二價 HA 結合性質以及 CD44 相較於 TSG6 的更高的分子量可以預期，10kDa 的結合化學計量比對於 1xTSG6 相較於 2xCD44 大 2-3 倍。交互作用之強度由 HABD 序列以及交互之結合性決定 (亦即，2x 版經由密切結合至 HA 而表現出更高之功能親和力)。
表 4 ： Fab-CD44 及 Fab-TSG6 分子與 HA 之間的交互作用 (ITC) 。
SEQ ID NO 分子 HA K D [µM] 估計化學計量比
7, 8 VPDF-2xCD44 10 kDa 2.2-5 1.5
7, 8 VPDF-2xCD44 50 kDa 0.7 5
4 TSG6 10 kDa 9.2 (溫度 = 25℃) 14.9
13, 14 RabFab-1xTSG6 10 kDa 17.7 (溫度= 25℃) 12.3
13, 14 RabFab-1xTSG6 10 kDa 7.9 (溫度= 37℃) 8.2
7, 8 VPDF-2xCD44 10 kDa 25.0 (溫度.= 37℃) 4.5
在交互作用之化學計量比方面，發現平均每個 10 kDa HA 分子可結合 1.5 個 VPDF-2xCD44，而每個 50 kDa HA 分子可結合 5 個 VPDF-2xCD44。
根據 SPR 測量結果，VPDF-2xCD44 能夠同時結合 VEGF 及 PDGF 配體。對 VEGF 及 PDGF 與 VPDF-2xCD44 之結合與它們與未經修飾之 VPDF 之結合進行比較。簡言之，使用標準偶合化學將 PDGF 偶合至 S 系列感測器晶片 CM5 (GE Healthcare) 上，得到約4000 共振單位 (RU) 的表面密度。注入濃度分別為 3 µg/mL 的 VPDF-2xCD44 融合物以及未經修飾之 VPDF 對照後，注入濃度為 5 µg/mL 的 VEGF，以證明 Fab 同時結合至配體 PDGF 及 VEGF。隨後，藉由注入 10 mM 甘胺酸 pH 2.0 並持續 60 秒來再生表面。SPR 測量結果確認 HABD 與 VPDF Fab 片段重鏈之 C 端之融合不干擾配體與標靶蛋白之交互作用。 實例 2.2. Fab-HABD 的穩定性
將 Fab-HABD 用於眼睛中之長效遞送，需要蛋白質在長達數月的範圍內在體溫下保持穩定。其先決條件是 Fab-HABD 之熱穩定性高於 37℃。 A. 材料與方法
VPDF-2xCD44 及 TSG6 之熱穩定性藉由靜態光散射及蛋白質自體螢光來測試。將樣品稀釋至約 1 mg/mL，並使用 Optim 儀器 (Avacta Inc.) 以 0.1℃/min 的加熱速率使溫度從 25℃ 升至 80℃。在此過程中，記錄用 266 nm 雷射照射後的光散射及螢光資料。測得聚集開始溫度為約 75℃，該溫度被定義為散射強度增加的溫度。同時，記錄螢光發射光譜。
對於 VPDF-CD44，當繪製螢光光譜之重心均值與溫度之關係時，在約 56℃ 及 79℃ 處測得兩次轉變。這些轉變表明蛋白質 (可能為 Fab 及 CD44 結構域) 變性。因此，與熱解折疊相關的任何散射或光譜變化皆遠高於 37℃，表明該 Fab-HABD 具有良好的穩定性。 B. 結果
測得 VPDF-2xCD44 的兩次轉變分別在 56℃ 及 79℃ 下。這兩個 T m表明 VPDF-2xCD44 變性的轉變，其中 CD44 結構域在 56℃ 下變性，Fab 在 79℃ 下變性。
對於 TSG6，測得觀察到的 T m onset為 35℃，實測 T m為 43℃。 實例 3. 大鼠雷射脈絡膜新血管形成 (CNV) 中之活體內功效 A. 材料與方法
在雷射誘導之脈絡膜新血管形成的活體內大鼠模型 (大鼠雷射 CNV) 中研究 Fab-HABD 以測試以下假設：(1) Fab-HABD 儘管結合至 IVT HA，但在活體內有效 (亦即，Fab-HABD 可抑制新血管形成)；及 (2) Fab-HABD 相較於相應的未經修飾之 Fab 片段具有更長效之活體內功效。
為此，大鼠在接受雷射損傷 (每隻眼睛接受 6 次雷射灼傷) 前 1 週或 3 週接受蛋白質調配物之 IVT 注射。在設定雷射損傷後一周，使用螢光血管造影 (FA) 成像分析血管生長之病變。
對 Fab-HABD 與相應的未經修飾之 Fab 片段進行比較。為偵測 Fab-HABD 之持久功效，將未經修飾之 Fab 的劑量滴定至「最低效應劑量」 (亦即，在大鼠模型的持續時間內，與媒劑相比，僅存在低程度之可檢出新血管形成之抑制)，表明在模型的相同劑量及持續時間內，Fab-HABD 具有更持久之功效。 B. 結果
所有測試之 Fab-HABD 皆表現出活體內新血管形成之抑制作用 (表 5)。這一結果表明，Fab-HABD 儘管在玻璃體內結合至 HA，但到達相關組織以發揮藥理作用。
表 5 ：大鼠雷射 CNV 中之活體內功效。
SEQ ID NO 分子 劑量 % 抑制 CNV ， 1 週模型 % 抑制 CNV ， 3 週模型
n/a 媒劑 - 0 0
101, 102 VPDF (未經修飾) 0.01 µg 44 34
5, 6 VPDF-1xCD44 0.01 µg 84 82
7, 8 VPDF-2xCD44 + 10 kDa HA* 0.01 µg 72 81
23, 24 VPDF-1xTSG6 (Lava12) 0.01 µg N/A 69
*測試 VPDF-2xCD44 與 10 kDa HA 之預複合
在相同的模型設置內及相同的劑量下，所有測試的 Fab-HABD 相較於未經修飾之 Fab 片段表現出持續時間更長的藥理作用 (表 5)。這表明結合至 IVT HA 的能力可延長活體內藥理作用。
儘管對 HA 的親和力存在顯著差異，但活體內模型的分辨率不足以區分不同分子之功效的持久性。在模型中應用的低非治療劑量下，未偵測到耐受性問題。接受 Fab-HABD 劑量的大鼠的所有眼睛皆完全正常，無任何干擾徵象，與僅在活體階段接受緩衝劑的眼睛相當。 實例 4. 使用 RabFab 、 RabFab-1xTSG6 及 RabFab-2xTSG6 進行的兔藥物動力學 (PK) 研究 A. 材料與方法
用於動物研究的蛋白質經由透析在 20 mM 組胺酸-乙酸鹽、150 mM NaCl (pH 5.5) 或磷酸鹽緩衝鹽水 (PBS) (pH 7.4) 中進行配製。調配物係等滲的，藉由冰點法所測得的滲透壓在 300 mOsm/kg 與 340 mOsm/kg 之間。粒徑篩析層析法 (SEC) 分析表明，這些調配物中所有蛋白質的單體比例皆為 ≥ 95%。在最終給藥濃度下，內毒素水平經評估為每隻眼小於 0.1 EU。
在玻璃體半衰期研究中，進行額外的藥物動力學研究，其中藉由 ITV 注射向雌性兔之雙眼投予對照品 (PBS, n=1)、0.15 mg/眼的 AlexaFluor-488 標記的 RabFab (n=2) 或劑量為 0.05 mg/眼 (n=2)、0.15mg/眼 (n=2) 及 2.5 mg/眼 (n=4) 的 AlexaFluor-488 (AF-488) 標記的 RabFab-2xTSG6，總體積為 50 μL。如先前所述，使用螢光光度測定法測量指定時間點的玻璃體及眼房液中的試驗品濃度。Dickmann, L.J. 等人, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 56(11): 6991-6999 (2015)。使用 Phoenix WinNonlin (Certara Inc., Mountain View, CA)，藉由非房室分析用濃度-時間型態來估計藥物動力學參數。對於使用螢光光度法生成的濃度-時間型態，由於高度可變性，將給藥後前 48 小時內的採樣結果排除在 PK 分析之外，該可變性可能歸因於投予部位的個體差異及隨後的試驗品通過玻璃體的擴散。Dickmann, L.J. 等人, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 56(11): 6991-6999 (2015)。PK 分析使用非房室分析方法進行，清除率 (CL) 的計算公式為 CL = 劑量/AUC，其中劑量為已知的且 AUC 使用線性梯形方法測得。穩態分佈容積的計算公式為 V = CL/kel，使用清除率值以及由終末階段斜率所獲得的消除速率常數進行計算。消除半衰期的計算公式為 t1/2 = ln(2)/kel。 B. 結果
最初使用紐西蘭白兔的藥物動力學 (PK) 實驗檢查 HA 結合影響眼內停留時間的能力。儘管兔玻璃體的 HA 濃度 (約 65 µg/mL) 遠低於人類玻璃體 (100-400 µg/mL) 或其他臨床前物種諸如豬 (其玻璃體 HA 為約 180 µg/mL) 或食蟹獼猴 (其玻璃體 HA 為約 150 µg/mL)，但是兔常被用於試驗品 IVT 給藥後的早期 PK 研究。研究設計為採用 IVT 注射 0.3 mg/眼的 RabFab、0.3 mg/眼的 RabFab-1xTSG6 或 0.5 mg/眼的 RabFab-2xTSG6。使用離體添加之玻璃體液中的蛋白質的回收實驗表明，可使用 ELISA 與先前描述的抗個體遺傳型偵測抗體 (Shatz 等人, 2016 Molecular Pharmaceutics) 對 RabFab 及 RabFab-1xTSG6 進行定量。然而，藉由 ELISA 獲得的使用 RabFab-2xTSG6 時的回收率較差，使得對該材料的玻璃體濃度進行放射化學測定。在 PK 研究中，將 RabFab-2xTSG6 用 125碘進行放射性標記。
如圖 2A 所示，PK 參數匯總於表 6 中，RabFab-1xTSG6 及 RabFab-2xTSG6 相較於遊離的 RabFab 皆表現出更長之玻璃體停留時間。RabFab-1xTSG6 的半衰期比 RabFab 長 1.4 倍，而 RabFab-2xTSG6 的半衰期則增加了 2.2 倍。這些結果表明，Fab 與 HABD 之融合可增加這些分子在眼室中的保留時間。鑑於其他物種的玻璃體 HA 濃度較高，預計 Fab-HABD 在那些動物中的半衰期將獲得更大幅度的延長。
表 6 ：兔 PK 研究參數。
SEQ ID NO 試驗品 t 1/2( 天 ) CL (mL/ 天 )
15, 16 RabFab-2xTSG6 7.1 0.15
13, 14 RabFab-1xTSG6 4.3 0.19
61, 62 RabFab 3.1 0.28
此外，玻璃體半衰期研究表明，與藉由螢光光度測定法觀察到的 RabFab 相比，RabFab-2xTSG6 的玻璃體半衰期增加了約 3 至 4 倍，在評估的範圍內對劑量無明顯依賴性 (圖 2B)；然而，21 天的研究持續時間不足以可靠地確定藥物動力學參數，估計在研究結束時，大約 40% 的 RabFab-2xTSG6 仍殘留在玻璃體內。 實例 5. RabFab-1xTSG6 及 TSG6 的兔眼耐受性 A. 材料與方法
在紐西蘭白兔中評估遊離 TSG6 及 RabFab-1xTSG6 單次 ITV 給藥的毒性。設計并執行持續 4 週的單次 IVT 給藥研究 (表 7)。藉由 ELISA 測量血清中針對 RabFab-1xTSG6 或遊離 TSG6 的抗藥物抗體 (ADA)。將平板用 RabFab-1xTSG-6 或遊離 TSG6 包被，與採集自研究動物的血清孵育，然後用 HRP-結合的山羊抗兔 Fc 抗體偵測抗藥物抗體。
表 7. 兔眼耐受性研究 (18-2244) 設計。
組 試驗品 # 動物 劑量 (mg/ 眼 ) 給藥體積 (µL) 評估
1 遊離 TSG6 (SEQ ID NO: 4) 4 (各 2 隻在第 4 天和第 30 天時接受驗屍) 0.5 50 OE-第 3、8、15、22、29 天 TK-給藥前，第 1 天 (1 小時、6 小時)、第 2、4、8、15、22、30 天 ADA-給藥前，第 4、8、15、22、30 天 組織病理學和電子顯微鏡
2 RabFab-1xTSG6 (SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14) 4 (各 2 隻在第 4 天和第 30 天時接受驗屍) 2.0 50
OE= 眼科檢查；TK=毒物動力學；ADA=抗藥物抗體
B. 結果
一般而言，接受 RabFab-1xTSG-6 的動物比接受遊離 TSG6 投予的動物具有嚴重程度更低的結果。接受遊離 TSG6 投予的動物具有顯著的臨床觀察結果。儘管 4 隻動物在第 4 天按計劃接受驗屍，但由於顯著的臨床觀察結果以及動物福利問題，在第 12 天或第 17 天而不是第 30 天將其他 4 隻動物提前犧牲。這些臨床觀察結果包括眼瞼及結膜腫脹和發紅、動物在工作人員接近時眼睛保持閉合以及眼部炎症和刺激。截至給藥後 3 天，接受遊離 TSG6 投予的動物表現出明顯的後部初期白內障及可變的視網膜血管減弱，這些結果與晶狀體及外部至完全視網膜病變的鏡檢結果相關。在接受 RabFab-1xTSG6 給藥的動物中也存在類似但不太嚴重的結果。從給藥後第 7 天開始，所有動物皆出現明顯的主要為單核細胞的炎症。炎症及視網膜病變與視網膜剝離、肥大及波形蛋白之周邊遷移、膠質纖維酸性蛋白 (GFAP) 和麩醯胺酸合成酶陽性 Müller 細胞的證據呈多灶性相關聯。示出 TSG6 經由 IVT 給藥後 4 天的視網膜病變的組織病理學影像如圖 3 所示。
接受 RabFab-1xTSG6 投予並於第 4 天接受驗屍的兩隻動物在第 4 天的血清中皆存在抗藥物抗體 (ADA) 的證據。然而，其中一隻動物接受了 ADA 預給藥，而該治療組中的其餘 3 隻動物則未接受 ADA 預給藥。該組中接受後期驗屍的動物在第 4 天和第 8 天的血清 ADA 呈陰性，但在第 15 天變為 ADA 陽性。由於該測定的靈敏度不佳，因此對接受遊離 TSG6 治療的動物的血清 ADA 反應的分析尚無定論。
一般而言，接受 RabFab-1xTSG6 的動物比接受遊離 TSG6 投予的動物具有嚴重程度更低的結果 (表 8)。每隻動物皆存在白內障，但白內障本質上是點狀的，並且在顯微切片中未發現相關性。無視網膜病變的臨床證據，但在單隻眼睛中存在極輕微至輕度外層視網膜病變的顯微證據。從第 8 天開始出現類似的中度至重度玻璃體及房水細胞。在第 4 天和第 17 天對動物實施安樂死。
表 8. 接受雙側投予 2 mg/ 眼的 RabFab-TSG6 或 0.5 mg/ 眼的遊離 TSG6 的動物的顯微病變。
動物 第 4 天 研究終點
遊離 TSG6 RabFab-1xTSG6 遊離 TSG6 RabFab-1xTSG6
1 2 5 6 3 4 7 8
視網膜病變 (OD/OS) 2/4 2/4 0/1 2/0 2/3 4/2 2/2 1/1  
晶狀體病變 (OD/OS) 0/2 2/2 0/0 0/0 0/0 3/0 0/0 0/0
炎症 (OD/OS) 2/1 1/1 0/1 1/1 1/1 3/2 3/3 1/1
對每種病變採用 5 分制進行分級 (1-極輕微，5-嚴重)。
由於 3/8 動物在給藥前的值高於截止值 (2 隻動物接受遊離 TSG6 投予，1 隻動物接受 RabFab-1xTSG6 投予)，對抗 RabFab 反應的評估變得複雜。然而，在投予試驗品後，接受 RabFab-1xTSG6 投予的 3/4 動物出現新的 ADA 滴度或增加的 ADA 滴度：在第 4 天將其中 1 隻動物處以安樂死，第 17 天將另外兩隻動物處以安樂死。相比之下，相較於給藥前，僅接受遊離 TSG6 投予的動物 1 (在第 4 天進行驗屍) 具有升高的 ADA 滴度。
臨床徵象及微觀病變的早期發作表明 TSG6 在視網膜和晶狀體病變中的直接作用；然而，稍後時間點的發現與出乎意料強烈的 ADA 反應混淆。斷定 Müller 細胞之周邊遷移為兔視網膜損傷或剝離視網膜後的非特異性反應。 實例 6. 小型豬中治療劑量的藥物動力學 (PK)
本研究的目的是確定 Fab-HABD 及 Fab-HABD-HAs 的眼內及全身 PK 參數以及由此導致的眼內半衰期 (t 1/2) 延長，其中藉由 IVT 注射 (IVT) 向小型豬投予一次。此外，對抗藥物抗體 (ADA)、眼內耐受性及眼科病理學 (在一些研究受試者中) 進行研究。 A. 材料與方法
14 隻 Göttingen SPF 小型豬雙眼接受治療劑量的以下試驗品 (50 μL/眼) (表 9)。
表 9. 小型豬藥物動力學 (PK) 研究。
供試項目 VPDF ( 未經修飾 ) VPDF-2xCD44 (SEQ ID NO: 7 及 SEQ ID NO: 8) VPDF-2xCD44 (SEQ ID NO: 7 及 SEQ ID NO: 8) + 10 kDa HA
動物數量 4 5 5
蛋白質劑量 [µg/ 眼 ] 500 871.5 871.5
劑量 [nmol/ 眼 ] 10.5 10.5 10.5
給藥體積 [µl/ 眼 ] 50 50 50
蛋白質濃度 [mg/mL] 10 17.4 17,4
眼睛總計 8 10 10
在 IVT 給藥後，在整個研究期間 (最多 9 週) 定期採集接受試驗品給藥的動物的血液和眼房液樣品，並在計劃的安樂死後不久收集玻璃體液，以跟蹤試驗品的全身及眼內 PK。分析血漿、眼房液及玻璃體液中的試驗品濃度，進一步分析血漿及玻璃體樣品中是否存在 ADA。
B.   結果：在該研究的活體階段，關於接受 VPDF-2xCD44 的 5 隻動物中的 2 隻動物的眼睛的肉眼觀察結果表明，豬眼無法耐受該試驗品的 IVT 注射，導致提前犧牲這些動物。提供每隻動物的一隻眼睛用於組織病理學評估。簡言之，該等肉眼觀察結果為：玻璃體混濁，低於正常的玻璃體粘度，最後是視力喪失的行為徵象。眼睛中之組織病理學發現包括血管周圍/血管的中度混合細胞炎症，主要是虹膜、睫狀體、小梁網及視網膜的單核細胞浸潤。視網膜病變包括神經節細胞退化、INL 中的細胞丟失、光受體聚集及 PR 層的細胞核移位。此外，在玻璃體內觀察到嗜酸性蛋白性物質以及混合細胞浸潤及纖維絲。在視神經中無異常發現。
相較於 VPDF-2xCD44，接受 VPDF-2xCD44 + 10 kDa HA 的 5 隻動物中至少 1 隻動物的眼睛的肉眼觀察結果明顯不太嚴重。短暫注意到雙眼前房中的發紅/白色膜在角膜後積聚，但不認為需要提前終止。
總之，VPDF-2xCD44 與 HA 之複合 (亦即，在 IVT 注射前用 HA 佔據 CD44 HA 結合位點) 的確改善了 VPDF-2xCD44 的眼內耐受性。
在接受未經修飾之 VPDF 的動物組中未發現肉眼觀察結果或耐受性問題。
試驗品 VPDF-2xCD44 及 VPDF-2xCD44 + 10 kDa HA 的 PK 結果來自眼房液及玻璃體，其藉由非房室分析由個體濃度時間資料計算得出，並以圖形方式呈現於圖 4A 至圖 4B 中。
雖然 5.8 天的未經修飾之 VPDF 的 IVT t 1/2位於此類分子的預期範圍內，但 48 天的 VPDF-2xCD44 + 10 kDa HA 的 IVT t 1/2對應於眼內停留時間相較於未經修飾之 VPDF 增加約 8 倍。總之，VPDF-2xCD44 + 10 kDa 相較於未與 HA 複合的 VPDF-2xCD44 表現出顯著改善的耐受性，且相較於未經修飾之 VPDF 表現出顯著改善的眼內半衰期。 實例 7. 與 HA 預複合以改善玻璃體相容性
來自活體內小型豬研究的肉眼觀察結果 (亦即，玻璃體混濁) 表明,VPDF-2xCD44 與豬玻璃體的不相容性 (亦即形成沉澱) 可藉由 VPDF-2xCD44 與純 HA 預複合來減輕。為進一步檢查這些效應並測試這些觀察結果僅限於 VPDF-2xCD44 分子還是亦可針對其他 Fab-HABD 檢出，我們開發出離體測試系統來偵測玻璃體變性。
開發出活體外「液滴」測試來評估幾種 Fab-HABD 與 HA 預複合時的玻璃體相容性。本實例說明，與 HA 預複合的 Fab-HABD (亦即，結合物) 在活體外實驗中與玻璃體相容。之前觀察到的玻璃體不相容性可能係由遊離 HABD 引起，其藉由 HA 預複合而得以減輕。結果顯示，Fab-HABD 與遊離 HABD 的不相容性取決於濃度。此外，CD44ko (一種包含使 HA 結合失效的點突變的 Fab-HABD 突變體) 在預複合形式及經分離之形式中皆與玻璃體相容。 實例 7.1. VPDF-2xCD44 與 10 kDa HA 之預複合改善了玻璃體內 (IVT) 耐受性 A. 材料與方法
在第一項測試中，將豬玻璃體在 Dounce 均質器中均質化 10x，並藉由以 10000 g 離心 2 分鐘以清除碎片。然後將一滴 2 µl 經均質化之玻璃體施加至玻璃顯微鏡載玻片上。此外，將 2 μl 供試樣品 (亦即，指定濃度的 Fab-HABD 或 Fab-HABD-HA) 加入玻璃體滴的頂部，無需進一步混合。在液滴合併後 1 分鐘，藉由光學顯微鏡以 40 倍之放大倍數在明場模式下檢查樣品的不均勻性及沉澱。 B. 結果
與濃度為 200 mg/mL 的未經修飾之 VPDF 在 20 mM 組胺酸、140 mM NaCl (pH 6.0) 中混合的豬玻璃體為均勻且透明的 (圖 5A)，而與濃度為 20 mg/mL 的 VPDF-2xCD44 在 20 mM 組胺酸、140 mM NaCl (pH 6.0) 中混合的豬玻璃體為不均勻的，且表現出透明的沉澱徵象 (圖 5B)。
該結果表明，在活體內 IVT 注射後，VPDF-2xCD44 亦與豬玻璃體不相容。因此，玻璃體不相容性可能是導致 VPDF-2xCD44 活體內耐受性問題的一個根本原因。
濃度為 20 mg/mL 的 VPDF-2xCD44 與 1% (w/v) HA (10 kDa, Lifecore, Biomedical) 在 20 mM 組胺酸、140 mM NaCl (pH 6.0) 中的預複合導致玻璃體相容性 (圖 5C)。該結果反映了上述小型豬活體內研究的結果，該研究表明 VPDF-2xCD44 與 10 kDa HA 的預複合改善了 IVT 耐受性。 實例 7.2. VPDF-2xCD44 的玻璃體不相容性依賴於濃度 A. 材料與方法
為測試 VPDF-2xCD44 之玻璃體不相容性的濃度依賴性，將 2 µl 豬玻璃體與 VPDF-2xCD44 的 1:4 稀釋液在 20 mM 組胺酸、140 mM NaCl (pH 6.0) 中以 37.5 mg/mL 的起始濃度混合。藉由光學顯微鏡檢查玻璃體與蛋白質的混合物中的玻璃體不均勻性。 B. 結果
偵測到的不均勻性取決於蛋白質濃度 (表 10；圖 6A 至圖 6F)。VPDF-2xCD44 的玻璃體相容性達到 0.6 至 0.15 mg/mL 之間。將這些結果與上述活體內小型豬研究的結果 (VPDF-2xCD44 的濃度 = 17.4 mg/mL) 關聯起來，表明 IVT 注射濃度為 17.4 mg/mL 的 VPDF-2xCD44 溶液可能導致的類似的不均勻性可能是觀察到的耐受性問題的根本原因。
表 10.VPDF-2xCD44 (SEQ ID NO: 7 及 SEQ ID NO: 8) 之玻璃體不相容性的濃度依賴性。
VPDF-2xCD44 濃度 [mg/mL] 37.5 9.4 2.4 0.6 0.15 0.04
玻璃體不均勻性 +++ +++ ++ + - -
+++ 強 / ++ 中等 / + 輕 / - 無
實例 7.3. VPDF-2xCD44 之玻璃體不相容性與其與玻璃體內 (IVT) HA 的交互作用有關 A. 材料與方法
為測試 VPDF-2xCD44 之玻璃體不相容性是否由 VPDF-2xCD44 與 IVT HA 之交互作用引起，我們設計了該分子的變異體 (VPDF2xCD44-ko)，該變異體在 CD44 的 HA 結合位點內含有消除與 HA 之結合的點突變，且同時保留蛋白質其餘部分完整結合 (在本文中稱為「ko 變異體」)。 B. 結果
CD44ko 變異體在瞬時表現、純化及生物物理特性 (分析級粒徑篩析、變性 SDS 毛細管電泳) 方面表現出相同之行為，並且其同一性身份藉由質譜法確認。HA 結合位點突變之引入導致親和力完全喪失，如 SPR 結果所示 (使用與實例 2 相同的方法進行測試)。
當按照上述實例 7.2 中所述，在與 2x VPDF 相同之濃度下測試該 VPDF-2xCD44-ko 變異體之玻璃體相容性時，未偵測到玻璃體不均勻性，表明具有玻璃體相容性 (表 11)。
表 11.VPDF-2xCD44 及相應的剔除變異體的玻璃體相容性。
分子 VPDF-2xCD44 (SEQ ID NO: 7 及 SEQ ID NO: 8) VPDF-2xCD44ko (SEQ ID NO: 25 及 SEQ ID NO: 26)
濃度 [mg/mL] 20 20
玻璃體不均勻性 +++ -
++ 強 / ++ 中等 / + 輕 / - 無
實例 7.4. VPDF-2xCD44 經玻尿酸酶預處理後與玻璃體相容 A. 材料與方法
此外，我們在用玻尿酸酶預處理以降解 HA 的豬玻璃體中測試了 VPDF-2xCD44 的玻璃體相容性。為此，將來自豬睾丸的玻尿酸酶 (Sigma) 以 2 mg/mL (＞1.5 U/µL) 的濃度溶於 PBS 中。將 1 µL 玻尿酸酶溶液加入 50 µL 豬玻璃體中，并於 37℃ 下孵育 2 小時。對照樣品僅用 PBS 緩衝液處理。 B. 結果
結果，VPDF-2xCD44 在 20 mg/mL 的濃度下與經玻尿酸酶預處理的玻璃體混合時未表現出不均勻性，可能是由於高分子量的 HA 降解所致。
總之，這些結果表明玻璃體不相容性可能是 VPDF-2xCD44 活體內耐受性問題與 CD44-HABD 與高分子量 IVT HA 之交互作用有關的根本原因。 實例 7.5. Fab-HABD 的玻璃體不相容性與在特定濃度下 HABD 與玻璃體 HA 的交互作用有關 A. 材料與方法
為測試玻璃體不相容性是否僅為 VPDF-2xCD44 的特點，我們按照上文實例 7.2 及 7.3 所述，對其他 Fab-HABD 或單獨 HABD 的玻璃體不均勻性進行測試。所測試的蛋白質如實例 1 所述。 B. 結果
VPDF-1xCD44 表現出與 VPDF-2xCD44 相當的玻璃體不均勻性。結果表明，2x 版 HA 聚合物的結合性及潛在交聯的增加與玻璃體不相容性無關。結果表明，CD44 HABD 與 IVT HA 之間的交互作用與玻璃體不相容性有關 (表 12)。
表 12. 包含 HABD TSG6 的指示分子相較於 VPDF-1xCD44 的玻璃體相容性。
分子 VPDF-1xCD44 G6.31 G6.31-1xTSG6 G6.31-2xTSG6 NVS24-1xTSG6 (Lava12) TSG6
SEQ ID NO 5, 6 103, 104 17, 18 19, 20 21, 22 4
濃度 [mg/mL] 20 5 5 2.3 5 5
玻璃體不均勻性 +++ - ++ ++ ++ ++
++ 強 / ++ 中等 / + 輕 / - 無
包含 TSG6 結構域的 Fab-HABD 表現出與包含 CD44 的 Fab-HABD 相當的玻璃體不均勻性。Fab 組分 G6.31 在相同濃度下未表現出玻璃體不均勻性，而孤立的 TSG6 結構域則表現出玻璃體不均勻性。這一結果再次支持玻璃體不相容性與特定濃度下 HABD 與玻璃體 HA 的交互作用有關的觀點。 實例 7.6. 玻璃體不相容性可藉由與 HA 預複合來解決 A. 材料與方法
為測試偵測到的 VPDF-1xCD44 及 TSG6 變異體的玻璃體不相容性能否藉由與 HA 預複合來解決，我們生成表 13 中所示的結合物，其中包含 1% (w/v) HA (10 kDa, Lifecore, Biomedical)。 B. 結果
藉由與 10 kDa HA 預複合，測試的所有 Fab-HABD 的玻璃體不均勻性均得到解決 (表 13)。這些結果表明，HA 結合蛋白與純 HA 之預複合可作為一種改善玻璃體相容性並由此改善這些分子的潛在的耐受性問題的方法。
表 13. 包含 TSG6 HABD 的 Fab-HABD 與 1% HA 10 kDa 預複合後的玻璃體相容性。
Fab-HABD + 1% HA 10 kDa VPDF-1xCD44 G6.31Fab G6.31-1xTSG6 G6.31-2xTSG6 NVS24-1xTSG6 (Lava12) TSG6
SEQ ID NO 5, 6 103, 104 17, 18 19, 20 21, 22 4
濃度 [mg/mL] 20 5 5 2.3 5 5
玻璃體不均勻性 - - - - - -
++ 強 / ++ 中等 / + 輕 / - 無
實例 7.7. Fab-HABD 的玻璃體不相容性並非豬玻璃體所特有 A. 材料與方法
為測試偵測到的含有 CD44 及 TSG6 的 Fab-HABD 的玻璃體不相容性是否係僅發生於豬玻璃體中的效應，我們使用兔玻璃體代替豬玻璃體，按照上述實例 7.1 至 7.6 所述進行相容性測試。 B. 結果
對於所有測試的 Fab-HABD，皆偵測到與豬玻璃體相同的玻璃體不相容性。此外，在兔玻璃體中偵測到的所有玻璃體不相容性皆可藉由 Fab-HABD 與 10 kDa HA 之預複合來解決。
這些結果表明玻璃體不相容性並非豬玻璃體所特有。 實例 7.8. 活體內注射誘導玻璃體不均勻性 A. 材料與方法
為得到離體玻璃體相容性測試結果與活體內小型豬研究的耐受性結果之間的聯繫，我們測試了在整個豬眼中能否偵測到玻璃體不均勻性以及該玻璃體不均勻能否藉由 HA 預複合得到解決。
為此，屠宰後立即收集整隻豬眼，並向其中注射 50 µl 濃度為 17.4 mg/mL 的 VPDF-2xCD44 於 20 mM 組胺酸、140 mM NaCl (pH 6.0) 中之溶液 +/- 1% (w/v) HA 10 kDa。眼睛 (與上述活體內小型豬研究相同)。然後將眼睛轉移至 HBSS (Lonza, Biowhittaker) 中，並於 37℃ 下保存 4 小時。孵育後，打開眼睛，取出玻璃體檢查不均勻性。 B. 結果
如圖 7A 至圖 7C 所示，注射時的玻璃體不相容性可藉由 Fab-HABD 與 HA 之預複合來解決。注射緩衝劑並不導致 IVT 不均勻，結果得到透亮玻璃體 (圖 7A)。注射 VPDF-2xCD44 導致注射側周圍玻璃體內出現緻密的白色不均勻物 (沉澱樣) (圖 7B)。注射與純 HA 預複合的 VPDF 的眼睛的玻璃體表現出顯著差異 (圖 7C)：儘管偵測到不均勻物，但該不均勻物在整個玻璃體內的密度及厚度明顯下降。
這些結果表明，VPDF-2xCD44 所誘導的不均勻性亦發生於整個豬眼中的注射部位附近。不受該理論之束縛，我們認為在活體內注射時誘導相同之不均勻性，且該不均勻性可能是觀察到的耐受性問題的根本原因。
此外，VPDF-2xCD44 與 HA 之預複合減少了在注射部位周圍觀察到的不均勻性。我們認為，同樣的效應導致了在活體內觀察到 VPDF-2xCD44-HA 具有改善之耐受性。與實例 7.5 及 7.6 中玻璃體不相容性亦發生於另一種 TSG6 HABD 且同樣可藉由與純 HA 預調配來解決的觀察結果相結合，我們認為該方法是一種改善玻璃體相容性並由此改善含有 HABD 的蛋白質的 IVT 耐受性的一般原則。 實例 8. 多能蛋白聚醣 VG1 及 VG1ΔIg HABD 能夠結合 HA
研究多能蛋白聚醣之 HABD，以確定它們能否用為提供優於 TSG6 及 CD44 HABD 的眼內耐受性及眼內停留時間的 HABD。
多能蛋白聚醣經鑑定具有串聯重複的連接模塊。如圖 8A 中所示，多能蛋白聚醣之胺基酸序列編碼 Ig 樣結構域，該結構域接以兩個連接模塊，使得多能蛋白聚醣之 N 端片段 (本文中將其命名為 WT VG1) 包含 N 端 Ig 樣結構域及 2 個連接結構域。在本實例中，我們得到 WT VG1 及不含 Ig 結構域的截短變異體 VG1ΔIg，並測試它們能否結合至 HA。此外，在以下實例中，測試 WT VG1 以及由 Fab 及 WT VG1 所組成之 Fab-HABD 的活體外玻璃體相容性及 IVT 注射給兔及小型豬時的耐受性。 A. 材料與方法
藉由使用標準分子生物學技術進行限制性選殖及/或基因合成來生成各種蛋白質之表現質體。在 CHO 或 HEK293 細胞中進行表現。
藉由在 4000 rpm、4℃ 下離心 20 分鐘來收集上清液。此後，無細胞上清液通過 0.22 µm 瓶頂過濾器過濾並儲存在冰箱 (-20℃) 中。
藉由使用 Ni-NTA 樹脂的親和層析法以及 SEC，從細胞培養上清液中純化 WT VG1 及 VG1ΔIg 的帶有 His 標記的突變體。簡言之，在 HisTrap 樹脂上捕獲經無菌過濾的細胞培養上清液，使用含有高濃度咪唑的緩衝劑進行洗滌和洗脫。將洗脫的蛋白質級分合併並濃縮，然後使用 20 mM 組胺酸-乙酸鹽、150 mM NaCl (pH 5.5) 作為運行緩衝液對其進行 SEC 分析。
使用 Biacore T200 儀器 (GE Healthcare)，藉由 SPR 測試 WT VG1 及 VG1ΔIg 與 HA 之結合。簡言之，在 80 秒或 120 秒內，將 WT VG1 及 VG1ΔIg 注入 S 系列 CM5 晶片 (GE Healthcare Life Science Solutions) 上，該晶片通過固定化卵白素間接包被有生物素-HA (Creative PEGWorks, North Carolina)。注射濃度範圍為 0.5 nM 至 1 µM。監測解離相 300 秒至 600 秒。隨後，藉由注入 1 M MgCl 2並持續 15 秒以使表面再生。所有實驗皆於 25℃ 下使用 PBS (10 mM Na 2HPO 4, 1 mM KH 2PO 4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, pH 7.4) 進行。使用 BIAevaluation 軟體，將得出之 HA 結合曲線擬合至 1:1 Langmuir 結合模型。 B. 結果
多能蛋白聚醣 HABD 能夠結合 HA。各種蛋白質之 HA 結合 K D 如表 14 中所示。
表 14. 藉由 SPR 評估 WT VG1 及 VG1∆Ig 片段與 HA 之結合。
SEQ ID NO 蛋白質 K D [µM]
29 WT VG1 0.17
32 VG1ΔIg 0.23
實例 9. WT VG1 及 TSG6 蛋白質之醣胺聚醣結合型態 A. 材料與方法
使用 Biacore T200 儀器 (GE Healthcare) 藉由 SPR 測量與硫酸肝素及硫酸軟骨素之結合來確定 WT VG1 及 TSG6 的醣胺聚醣 (GAG) 結合型態。簡言之，在 180 秒內將蛋白質注入通過卵白素間接包被有生物素-硫酸肝素或生物素-硫酸軟骨素的 S 系列 CM5 晶片 (GE Healthcare Life Science Solutions) 上。注射濃度範圍分別為約 5 nM 至 1000 nM。監測解離相 120 秒。隨後，藉由注入 1 M MgCl 2並持續 30 秒以使表面再生。 B. 結果
結果表明，WT VG1 在結合方面比 TSG6 更具選擇性 (表 15)。未觀察到 WT VG1 結合至硫酸肝素或硫酸軟骨素，而 TSG6 與肝素及硫酸軟骨素皆發生緊密結合。
表 15. 藉由 SPR 測量硫酸肝素及硫酸軟骨素結合。
SEQ ID NO 分子 硫酸肝素結合 K D [µM] 硫酸軟骨素結合 K D [µM]
29 WT VG1 無結合 無結合
4 TSG6 0.01 0.01
實例 10. 包含 VG1 HABD 的 Fab-HABD 能夠結合抗原及 HA A. 材料與方法 A.1. 構建體設計
Fab-HABD 係通過或可通過 WT VG1 序列與 Fab 片段重鏈之 C 端或 IgG1 重鏈之 N 端重組融合產生。對於肽-VG1 融合物，產生或可產生同時接附至 WT VG1 (EETI-VG1) 之 N 端及 WT VG1 (VG1-EETI) 之 C 端的肽 (EETI)。亦產生兩種額外之構建體，其中在 EETI 與 WT VG1 (EETI-TEV-VG1 與 VG1-TEV-EETI) 之間引入 TEV 裂解位點。使用或可能使用的連接子如表 16 中所示。
表 16. 連接子序列。
連接子 SEQ ID NO 蛋白質 連接子
27 RabFab-VG1 GGGGS
27 PigFab-VG1 GGGGS
27 G6.31.Fab-VG1 GGGGS
27 VPDF-VG1 GGGGS
82 VG1-Fc (2x)* RKCLIPFGNSVT
27 VPDF-VG1ΔIg (預定構建體) GGGGS
88 20D12v2.3-VG1 GGGGSGGGGS
88 蘭尼單抗 (ranibizumab)-VG1 GGGGSGGGGS
83 抗 HtrA1-VG1 GGGG
84 EETI-VG1 GSGSGSGSGS
85 EETI-TEV-VG1 ENLYFQGSGSGSGSGS
84 VG1-EETI GSGSGSGSGS
85 VG1-TEV-EETI ENLYFQGSGSGSGSGS
* 將 VG1 與 Fc 融合使融合細胞成為同源二聚體，使每個分子具有 2 個 VG1 拷貝。因此，蛋白質名稱中帶有記號「2x」。
A.2. 與物種匹配的替代豬抗 VEGF Fab 之產生
由於對 abYsis 資料庫的搜索未得到豬( Sus scrofa) IgG 的重鏈及輕鏈配對的已知實例，因此我們試圖藉由從抗 VEGF Fab (G6.31.AARR) 之 CDR 移植以生成與已知抗原主動結合之抗體。在表現 NCBI 的序列標籤 (EST) 資料庫中搜索與 G6.31 骨架 (V H4/V LK2) 具有高序列同一性的豬 mRNA EST。選擇幾個序列，並將來自 G6.31.AARR 的 CDR 移植到適當的骨架區內以生成「豬源性」 G6.31.AARR。將重鏈及輕鏈序列隨機配對並在 30 mL 培養物中的 293Expi 或 CHO 細胞中表現。在 Capto L 樹脂上進行純化，然後進行粒徑篩析層析法分析，藉由 SDS-PAGE、質譜檢查純化後之細胞，並評估其與人及豬 VEGF 之結合。選擇一個對 VEGF 具有良好親和力的序列用於放大及隨後的 tox/PK 分析，並將該序列與 VG1 重組融合以生成 PigFab-VG1。 A.3. 蛋白質表現與純化
藉由將 DNA 構建體之陽離子脂質轉染至 CHO 或 293Expi 細胞中進行蛋白質表現。培養物體積為 30 mL 至 35 L。對於一些構建體，生成快速穩定的細胞株以增加單位培養物體積的蛋白質產量。
藉由親和層析進行純化，其中將 Ni-NTA 樹脂用於帶有 6x-組胺酸標記分子，或將 Gamma bind Plus 樹脂用於 Fab 融合。在一些情況下，在 Sephadex 樹脂上進行最終粒徑篩析步驟之前，執行二次離子交換步驟。 A.4. HA 結合
為確認 VG1 作為 Fab-HABD 保留其 HA 結合特性，如先前在實例 2.1 中所述使用 SPR。使用單循環動力學進行實驗，並監測解離長達 600 秒。測試的蛋白質濃度在不同蛋白質之間變化，但範圍在 500 nM 與 6.25 nM 之間。 A.5. 抗原結合
藉由將相應抗原直接固定在 S 系列 CM5 晶片 (GE Healthcare) 上並按照實例 2.1 所述的 SPR 測量結合，對抗原結合進行測試。基於已知的交互作用親和力，使用不同的蛋白質濃度。 B. 結果 B.1. 玻尿酸 (HA) 結合
使用 BIAevaluation 軟體，將所有 HA 結合資料擬合至 1:1 Langmuir 結合模型。各種蛋白質之 K D 如表 17 中所示。
表 17.VG1 Fab-HABD 之 HA 結合。
SEQ ID NO 蛋白質 K D [µM]
63, 64 RabFab-VG1 0.13
65, 66 PigFab-VG1 0.12
67, 68 G6.31.Fab-VG1 0.15
69, 70 VPDF-VG1 0.12
118, 119 抗 HtrA1-VG1 0.08
71 VG1-Fc (2x) 0.017
78 EETI-VG1 0.16
79 EETI-TEV-VG1 0.22
80 VG1-EETI 0.16
81 VG1-TEV-EETI 0.18
93 VC072M.GS10X.VG1CTH 0.0082
94 VG1NTH.GS10X.VC072M 0.033
B.2. 抗原結合
表 18 示出分析其抗原結合能力的蛋白質以及實測 K D 。VG1 與各種 Fab 重鏈的 C 端融合不影響抗原結合。對於 EETI-VG1 融合，連接子及附著位點的靈活性影響抗原結合。較佳的是更靈活的連接子及 C 端融合。
表 18. 抗原結合。
SEQ ID NO 蛋白質 抗原 K D [µM]
63, 64 RabFab-VG1 不可用 不可用
65, 66 PigFab-VG1 VEGF 未測定
67, 68 G6.31.Fab-VG1 VEGF 0.0001
69, 70 VPDF-VG1 VEGF 未測定
71 VG1-Fc (2x) 不可用 不可用
78 EETI-VG1 胰蛋白酶 0.43
79 EETI-TEV-VG1 胰蛋白酶 0.14
80 VG1-EETI 胰蛋白酶 0.013
81 VG1-TEV-EETI 胰蛋白酶 0.007
93 VC072M.GS10X.VG1CTH VEGF 0.00075
94 VG1NTH.GS10X.VC072M VEGF 0.00055
實例 11. HABD 之活體外玻璃體相容性 A. 材料與方法
本實例描述了玻璃體液中 VG1 結構域溶解度的測試。使用 Dounce 均質器製備玻璃體液，然後以 10000 x g 離心 2 分鐘以去除碎片，將其用於這些研究。
額外的實驗利用 Alexa488 標記的蛋白質，使得明場及螢光顯微鏡皆可用於監測離體玻璃體液中的沉澱。藉由連續注入三合一三通道 鸟-載玻片 (ibidi, USA, Inc. Cat#80316) 的兩個通道中的每一個，將等體積之試驗品與玻璃體液混合，並藉由顯微鏡目視監測混合界面。 B. 結果
將 TSG6 與預先用 PBS (pH 7.4) 按 1:4 稀釋的豬玻璃體液混合後，溶液變得混濁 (圖 9A)，並且在混合物離心後觀察到沉澱。相比之下，VG1 與豬玻璃體以 1:4 和 1:1 的比例混合後，溶液保持澄清 (圖 9B)，並且離心後未觀察到沉澱。
進一步地，在離體豬玻璃體中觀察到 RabFab-TSG6 沉澱 (圖 10A)，而對於 RabFab-VG1 則未觀察到沉澱 (圖 10B)。類似地，比較 VG1 (圖 11A)、RabFab-VG1 (圖 11B) 或含有等濃度 (基於質量) 的 RabFab-VG1 和 10 kDa HA 的調配物 (圖 11C)，在離體兔玻璃體中未觀察到沉澱。
與 TSG6 相比，VG1 與 10 kDa HA 的預調配物並不總是防止體外玻璃體液中產生沉澱所需的。 實例 12. VG1 與玻璃體液之離體交互作用 A. 材料與方法
利用螢光相關光譜 (FCS) 檢查分離之 VG1 及 Fab-VG1 Fab-HABD 與離體玻璃體液的交互作用。VG1 及 Fab-VG1 使用 PEG4-DY647-N-羥基琥珀醯亞胺酯共價標記在離胺酸殘基上。DY647 之螢光發射可藉由 594 nm 或 633 nm 的雷射激發並在更長的波長下進行偵測。控制反應化學，使得每個分子的標記水平不大於 1 個螢光染料。從剛屠宰的動物的眼睛中收集豬玻璃體液，並使用 Dounce 均質器進行均質化。將此材料用磷酸鹽緩衝鹽水 (PBS) pH 7.4 按 1:3 連續稀釋。將標記的試驗品添加至每個稀釋的等分試樣中，使其最終濃度為 20 nM。試驗品為 (1) 遊離 VG1、(2) pigFab-VG1、(3) 與 10 kDa HA 以 1:1 等重量比混合的 pigFab-VG1、(4) RabFab-VG1 及 (5) 與 10 kDa HA 以 1:1 等重量比混合的 RabFab-VG1。在室溫下孵育 2 小時後，進行 FCS。 B. 結果
FCS 測量結果如圖 12 中所示。與單獨在緩衝液 (PBS) 中孵育相比，所有樣品與未稀釋或略微稀釋的玻璃體一起孵育時皆表現出顯著延遲的擴散。對於遊離 VG1、PigFab-VG1 及 RabFab-VG1，該延遲擴散一直持續到玻璃體被稀釋超過 6000 倍 (圖 12，第 3、4、6 和 7 行；從未稀釋到稀釋係數達到 6561)。對於與 10 kDa HA 共配製的樣品，也觀察到緩慢擴散，但當玻璃體液之稀釋倍數 ≥729 倍時，該效應消失 (圖 12，第 5 行：PigFab-VG1+10 kDa HA (1:1)，及第 8 行：RabFab-VG1+10 kDa HA (1:1)；從稀釋係數為 729 到 PBS)。這些結果表明玻璃體組分 (最有可能是玻璃體液內源性高分子量 HA) 與含有 VG1 的試驗品之間存在強烈的交互作用。即使存在低分子量 HA，在玻璃體液稀釋度較小時 (圖 12，第 5 行：PigFab-VG1+10 kDa HA (1:1)，及第 8 行：RabFab-VG1+10 kDa HA (1:1))，VG1 亦可與內源性 HA 發生交互作用。這表明 VG1 及 Fab-VG1 可從 10 kDa HA 上解離並結合至玻璃體液中存在的 HA。然而，一旦玻璃體液被大幅稀釋，將不存在濃度足夠高的高分子量 HA 競爭與低分子量 HA 結合的 VG1 (圖 12，第 5 行：PigFab-VG1+10 kDa HA (1:1)，及第 8 行：RabFab-VG1+10 kDa HA (1:1)；從稀釋係數為 729 到 PBS)。與未結合的材料相比，結合至低 MW HA 的 VG1 發生很小或可以忽略不計的擴散減慢 (圖 12，PBS 對照用於第 5 行：PigFab-VG1+10 kDa HA (1:1)，及第 8 行：RabFab-VG1+10 kDa HA (1:1)；這些樣品具有未添加玻璃體的 10 kDa HA)。 實例 13. 與 10 kDa HA 預複合對 Fab-VG1 之熱應力穩定性的影響 A. 材料與方法
使用抗 HtrA1-VG1 蛋白質測試 Fab-VG1 與 10 kDa HA 之預複合對熱應力穩定性的影響。在這些實驗中，用磷酸鹽緩衝鹽水 (PBS) pH 7.4 配製濃度為 3 mg/mL 的抗 HtrA1-VG1，並向其中添加或不添加 1.8 mg/mL 的 10 kDa HA。10 kDa HA 的 1.8 mg/mL (180 µM) 的濃度相對於抗 HtrA1-VG1 濃度 (35 µM) 莫耳過量 5 倍。將這些調配物在 37℃ 的溫度下孵育 4 週，然後藉由非還原型毛細管電泳十二烷基硫酸鈉 (NR CE-SDS) 進行分析，如 Michels 等人 2007 (Anal. Chem. 79, 5963) 所述。除單體種類及片段以外，藉由 NR CE-SDS 可檢測抗 SDS 變性的聚集體。 B. 結果
如圖 13 中所示且匯總於表 19 中，與 10 kDa HA 之預複合抑制抗 HtrA1-VG1 中 SDS 穩定聚集體的形成。高分子量形式 (HMWF) 之形成率從每週 1.2% 降至每週 0.1%。10 kDa HA 的存在似乎亦影響片段化，儘管比對聚集的影響小，但是當與 HA 複合時，低分子量形式 (LWMF) 之形成速率降低約 2 倍。這些結果表明，在中性 pH 下，調配物中包含 10 kDa HA 使抗 HtrA1-VG1 在熱應力條件下保持穩定。
表 19. 藉由 NR CE-SDS 分析熱應力樣品的結果總結。
樣品 HMWF % 主峰 % LWMF %
抗 HtrA1-VG1 – 未孵育對照 1.2 92.8 6.0
抗 HtrA1-VG1 – 孵育 4 週後 6.0 80.3 13.8
抗 HtrA1-VG1 + 10 kDa HA – 未孵育對照 1.1 93.0 5.8
抗 HtrA1-VG1 + 10 kDa HA – 孵育 4 週後 1.5 88.8 9.7
實例 14. Göttingen Minipig ® 中 VG1 及 VG1 Fab-HABD 的眼內耐受性 A. 材料與方法 A.1. 玻璃體內 (IVT) 注射及終點評估
使用 Göttingen Minipig ®評估 VG1 及 Fab-VG1 Fab-HABD 的 IVT 注射的耐受性。該研究的設計如表 20 中所示。
表 20. 小型豬中 VG1 及 Fab-HABD 的眼內耐受性研究的設計。
組號    劑量水平 (mg/ 眼 ) 給藥體積 (µL/ 眼 ) 給藥濃度 (mg/mL) 雄性動物數量
試驗品 a 第 4 天驗屍 第 30 天驗屍
1 媒劑對照 0 50 0 3 -
2 WT VG1 (SEQ ID NO: 29) 1.13 50 22.5 2 4
3 PigFab-VG1 (SEQ ID NO: 65 和 SEQ ID NO: 66) 1.8 50 36 2 4
4 PigFab-VG1 + 10 kDa HA 1.8 50 36 2 4
a在第 1 天經由一次雙側 IVT 注射投予所有試驗品及媒劑對照。
每隻小型豬的雙眼經由 IVT 接受投予 50 µL 的單次注射液。基於歷史資料，該體積在小型豬中具有良好的耐受性。IVT 注射程序由經過專業認證的獸醫眼科醫生執行。第 1 組小型豬接受媒劑對照注射液治療。第 2 組小型豬接受經分離之 WT VG1 (按照上文實例 8 中所述產生) 治療。第 3 組小型豬接受 pigFab-VG1 (按照上文實例 10 中所述產生) 治療第 4 組小型豬接受與等重量之 10 kDa HA 預配製的 pigFab-VG1 治療。所有試驗品皆用 20 mM 組胺酸-乙酸鹽、150 mM NaCl (pH 5.5) 配製為指定的蛋白質濃度。第 3 組及第 4 組中 pigFab-VG1 之劑量代表使總內毒素水平保持為每隻眼小於 0.05 內毒素單位 (EU) 的最大可行劑量。先前在小型豬眼內研究中已發現該水平的內毒素可耐受。鑑於 WT VG1 (約 30 kDa) 與 pigFab-VG1 (約 80 kDa) 之間的分子量差異，相較於第 3 組及第 4 組，第 2 組中的劑量水平代表每個劑量 1.6 HA 結合摩爾當量。
在本研究評估了以下參數及終點：死亡率、臨床徵象、體重、眼科 (檢查、眼內壓力測量、寬視野彩色眼底成像、OCT 成像及視網膜電圖 [ERG])、生物分析、毒物動力學參數、抗藥物抗體評估、總體驗屍結果及組織病理學檢查。
由經過專業認證的獸醫眼科醫生經由間接檢眼鏡及裂隙燈生物顯微鏡對所有存活動物之雙眼進行檢眼鏡檢查。在治療前及第 1 天 (給藥後)、第 3、5、8、15、17、22 和 29 天對所有動物進行眼科檢查。
眼內壓力 (IOP) 係由經過專業認證的眼科醫生在進行眼科檢查的同時藉由壓平眼壓法對所有存活動物的雙眼測得。在治療前及第 1 天 (給藥後)、第 3、5、8、15、17、22 和 29 天對所有動物的眼內壓力進行測量。
第 29 天，使用 Clarity RetCam Shuttle 在對所有存活的動物進行寬視野彩色眼底成像。如果可見，嘗試拍攝所投予之試驗品。
第 29 天，使用 Heidelberg Spectralis HRA/OCT 系統進行光同調斷層掃描；通過光神經進行單次、垂直、高分辨率線掃描。
第 29 天對所有存活的動物進行 ERG 評估。動物在 ERG 之前最少在暗處適應 1 小時。具有 Ganzfeld 圓頂刺激的全場閃光 ERG (閃光強度符合 ISCEV 標準參數且光適應時間為 5 分鐘 (Retiport Gamma, Roland Consult))；幅度和延遲值由描記中測得。
通過胸廓入口經由前腔靜脈採集所有存活動物的血樣 (約 0.5 mL)，用於測定試驗品的血清濃度。動物在採血前不禁食，但與其他程序禁食相一致的時間間隔除外。在治療前、第 1 天 (給藥後 6 小時及 12 小時) 及第 2、3、5、8、12、15、22 和 29 天分別進行一次採血。
將血樣收集到血清分離管中，並使其在受控室溫下形成凝塊，直至在收集後 60 分鐘內在受控室溫下以 1300 g 離心 10 分鐘。在離心開始後 30 分鐘內，將所得血清製成 1 個等分試樣，放入預先標記的 0.50 mL 二維條形碼 Matrix 管 (Thermo Cat 3744) 中。所有等分試樣皆在乾冰上快速冷凍，並於 -60℃ 至 -90℃ 下冷凍保存。
在 ELISA 測定中檢測血清樣品中抗藥物抗體 (ADA) 之存在。將試驗品固定在測定板上，與血清孵育並洗滌，然後用抗豬 IgG 試劑偵測免疫複合物，該試劑具有與辣根過氧化物酶結合的 Fc 部分用於酵素性偵測。
第 15 天，由經過專業認證的獸醫眼科醫生採集所有動物的眼房液。使用結膜鉗固定眼球位置以進行眼房液採集，同時將 31 號針的尖端以大約 90 度角斜插入角膜緣後的鞏膜。然後在針頭進入虹膜與角膜之間的前房之前，將針頭的角度變淺。緩慢抽出注射器柱塞以吸取最大可獲得體積的眼房液，其最多可達 50 µL。取出針頭，將鞏膜外組織靠近穿刺部位並用結膜鉗夾住。對側眼實施相同的樣品採集程序。將採集的樣品儲存於 1.0 mL 玻璃基質 trakmates 2D 條形碼儲存管中，然後蓋上 TPE 帽。將樣品在液氮中冷凍，並冷凍儲存於 -60℃ 至 -90℃。使用基於質譜的測定法測定眼房液中的試驗品含量。 A.2. 樣品製備
PigFab 標準校準曲線係藉由將不同量的 PigFab 添加至用 25 mM 碳酸氫銨稀釋的豬水性基質中來進行。然後將標準品/樣品處理如下：將來自半胱胺醯殘基的二硫鍵在 60℃ 下用 10 mM DTT 還原 1 小時，然後將硫醇基團用 55 mM 碘乙醯胺在室溫下於暗處烷基化 45 分鐘。然後將標準品/樣品用 36 µg/mL 胰蛋白酶 (測序級胰蛋白酶，V5111，Promega) 消化並在 37℃ 下孵育過夜。消化後，將重肽加入標準品和樣品溶液中。在 0.5 – 12 µg/mL 濃度範圍獲得線性校準曲線。 A.3. 帶有標記的肽
購得在 R (LLIYSASFLYSGVPSR m/z: 891.98+2) 胺基酸中含有重同位素標記的肽標準品 (New England Peptide, Gardner, MA, USA)。表徵及濃度資料由製造商提供。帶有標記的肽於 -80℃ 下儲存於 1 mL 水中。 A.4. 藉由質譜 (MS) 進行分析
在 Acquity UPLC (Waters Corporation, Milford, MA) 上使用 ACQUITY UPLC CSH C18 肽分析專用柱 (130 Å, 1.7 µm, 1 mm × 100 mm) 在梯度洗脫條件下分離來自 PigFab 的消化物。層析柱保持於 50℃ 下，且自動進樣器樣品盤保持於 8℃ 下。流動相為含有 0.1% FA 的水 (A) 及含有 0.1% FA 的乙腈 (B)，流速為 0.04 mL/min。用以下梯度洗脫樣品：B 在 2 分鐘內從 2% 增加至 90%，然後在 2 分鐘降至 2% B 以重新平衡層析柱。進樣體積為 10 μL。
Triple Quad 6500 質譜儀 (Ab Sciex, Framington, MA) 在正離子多重反應監測 (MRM) 模式下操作，其配備有 OptiFlow ®Turbo V 離子源。監測的 PigFab 前驅物 (Q1) 離子為 LLIYSASFLYSGVPSR (m/z: 886.98+2)，採用 90 V 的去簇電位，且監測到的產物 (Q3) 離子為 359.20 m/z，碰撞能量為 29 eV。亦監測另外兩個其他產物離子 (765.39 m/z 及 602.33 m/z) 作為定性離子，其碰撞能量分別為 37 eV 及 30 eV。MS/MS 設置參數如下：離子噴霧電壓，4500 V；氣簾，30 psi；霧化器氣體 (GS1)，25 psi；溫度，300℃；駐留時間，50 ms。還生成 PigFab 之重肽 (891.97 m/z)，並使用 369.204 m/z 之躍遷進行定量，其碰撞能量為 29 eV。
使用 Sciex Analyst 軟體版本 1.7.1 (TripleTOF) 進行資料採集。用 PeakView 2.2 顯示原始資料。 B. 結果
所有動物皆存活至計劃之終止日期。因此，無需實施計劃外安樂死。試驗品相關的眼科檢查結果包括試驗品注射區域內的玻璃體混濁及極輕微的後眼色素層炎。
眼科檢查結果如下：
(1) 第 2 組 (WT VG1) – 第 1 天，6 隻動物中的 2 隻在顳玻璃體內觀察到極輕微的混濁。該結果在第 3 天消退，且截至研究終止一直不存在。4 隻動物中的 1 隻在第 15 天發生極輕微的後眼色素層炎，其在第 17 天消退。認為極輕微的後眼色素層炎無臨床意義。
(2) 第 3 組 (pigFab-VG1) – 第 1 天，所有 6 隻動物在試驗品注射區域的顳玻璃體內皆表現出玻璃體混濁。第 3 天，該結果在所有 6 隻動物中持續存在，並且在第 5 天，4/4 隻動物表現出涉及中央玻璃體的擴散徵象。從第 8 天至第 22 天，我們觀察到受影響之玻璃體區域減小，而在第 29 天，4 隻動物中僅有 2 隻在顳玻璃體內發生輕微混濁。區域性玻璃體混濁在本質上似乎並非炎症，但似乎對玻璃體稠度具有局部影響。
(3) 第 4 組 (pigFab-VG1 + 10 kDa HA) – 在研究持續期間，未獲得與試驗品相關的眼科檢查結果。
在整個研究期間的所有時間點，所有動物的眼內壓力值皆處於正常範圍內。
在任何時間點，所有動物皆未表現出針對試驗品的抗藥物抗體 (ADA)。
第 29 天拍攝的彩色眼底照片及光同調斷層掃描影像顯示，所有第 2 組及第 4 組動物皆具有正常的玻璃體和視網膜形態。所有第 3 組動物在眼底照片上具有極輕微的局部玻璃體混濁，且在 OCT 上具有極輕微的玻璃體後高敏性，與眼科檢查結果一致。
在第 29 天對所有動物進行視網膜電圖分析。在 Scotopic 0.01 光強度下，動物編號 3006 雙眼的 b 波振幅發生中等程度之減小。所有其他光強度皆處於正常範圍內，表明該動物具有影響昏暗視網膜功能的背景異常。動物編號 2005 及 4003 在眼睛之間表現出一些不對稱性，其幅值 OD 相較於 OS 發生輕度減小。這一結果疑似與記錄條件有關，包括非中心眼定位 OD。在任何動物中均未發現任何表明試驗品效應的結果。
在眼睛或視神經中，不存在與試驗品有關的肉眼檢查發現。
接受試驗品治療的動物的所有肉眼觀察結果為該物種的背景發現，或被視為偶然發現且與試驗品無關。這些觀察結果發生率低，在發生率或嚴重程度方面缺乏明確的劑量關係，且/或不存在相關的與試驗品有關的鏡檢發現。
在眼睛或視神經中，不存在與試驗品有關的鏡檢發現。
所有鏡檢觀察結果皆被視為是偶然發現且與試驗品無關。這些觀察結果是該物種的已知背景發現，且/或對於接受對照及試驗品治療的動物具有相似的發生率和嚴重程度。
藉由質譜法測定眼房液樣品中 PigFab-VG1 的含量。在小型豬眼中 IVT 注射 1.8 mg/眼的 PigFab-VG1 或與等質量的 10 kDa HA 預複合的 PigFab-VG1 後，獲得高眼房液水平並保持 30 天 (圖 14)。這些結果表明，在為期 4 週的研究期間，小型豬眼中存在可測量水平的試驗品。30 天時的濃度至少比未經修飾之 Fab 的實測值高一個數量級 (圖 4A)。
在 Gottingen 小型豬中，藉由單次 IVT 投予各個劑量水平的 WT VG1 (1.13 mg/眼)、pigFab-VG1 (1.8 mg/眼) 或 pigFab-VG1 + 10 kDa HA (1.8 mg/眼) 具有良好的耐受性。所有動物皆存活至計劃的終止時間，無異常臨床觀察結果，且體重不受影響。在研究期間使用單次注射時缺少針對試驗品的可檢測到的免疫反應，由此允許評估試驗品的直接效應。眼科檢查結果僅限於：在試驗品注射部位發生短暫極輕微之玻璃體混濁，其在第 3 天消退 (WT VG-1)；以及在試驗品注射部位附近發生玻璃體混濁，其在研究終止時未完全消退 (pigFab-VG1)。不存在有關 pigFab-VG1 + 10 kDa HA 的檢眼鏡發現，所有動物的 IOP、OCT 及 ERG 結果皆正常。在眼睛或視神經中，不存在與試驗品有關的肉眼觀察或鏡檢效應。 實例 15. VPDF-VG1 在大鼠雷射誘導之脈絡膜新血管形成 ( 大鼠雷射 CNV) 中的功效
在雷射誘導之脈絡膜新血管形成的活體內大鼠模型 (大鼠雷射 CNV) 中研究 Fab-HABD 以測試以下假設：(1) Fab-HABD 在活體內有效 (亦即，Fab-HABD 可抑制新血管形成)；及 (2) Fab-HABD 之活體內功效持續時間相當於或優於未經修飾之 Fab 片段。 A. 材料與方法
大鼠在接受雷射損傷 (每隻眼睛接受 6 次雷射灼傷) 前 1 週或 3 週接受蛋白質調配物之 IVT 注射。在設定雷射損傷後一周，使用螢光血管造影 (FA) 成像分析血管生長之病變。
對 Fab-HABD 與相應的未經修飾之 Fab 片段進行比較。為偵測 Fab-HABD 之持久功效，將未經修飾之 Fab 的劑量滴定至「最低效應劑量」 (亦即，在大鼠模型的持續時間內，與媒劑相比，僅存在低程度之可檢出新血管形成之抑制)，表明在模型的相同劑量及持續時間內，Fab-HABD 具有更持久之功效。 B. 結果
如圖 15 所示，在雷射治療前 7 或 21 天投予 VPDF-VG1，有效抑制了 CNV 病變。在本研究中，VPDF-VG1 之效果的持久性與未經修飾的 Fab 相當。 實例 16. 紐西蘭白兔中 VG1 及 VG1 Fab-HABD 的眼內耐受性 A. 材料與方法
本研究的目的是確定試驗品 WT VG1、RabFab-VG1 以及與 1:1 (w/w) 10 kDa HA 預配製的 RabFab-VG1 在單次雙側 IVT 注射給雄性紐西蘭白兔後 30 天觀察期內的眼內耐受性。研究設計如表 21 中所示。
表 21. 紐西蘭白兔中 VG1 及 Fab-HABD 的眼內耐受性研究的設計。
組號    劑量水平 (mg/ 眼 ) 給藥體積 (µL/ 眼 ) 給藥濃度 (mg/mL) 動物數量
試驗品 a 第 4 天驗屍 第 30 天驗屍
1 媒劑對照 0 50 0 3 -
2 WT VG1 (SEQ ID NO: 29) 0.53 50 10.6 2 4
3 RabFab-VG1 (SEQ ID NO: 63 及 SEQ ID NO: 64 0.85 50 17 2 4
4 RabFab-VG1 + 10 kDa HA 0.85 50 17 2 4
No. – 數量 - 不適用 a在第 1 天經由雙側 IVT 注射一次投予所有試驗品及媒劑對照。
在本研究評估了以下參數及終點：死亡率、臨床徵象、體重、攝食量、眼科 (亦即，檢查、眼內壓力測量、寬視野彩色眼底成像、OCT 及 ERG)、生物分析、毒物動力學參數、抗藥物抗體評估、總體驗屍結果及組織病理學檢查。 B. 結果
基於對體重及攝食量的評估，不存在全身性試驗品相關效應。也不存在肉眼宏觀驗屍發現，認為所有組織皆處於正常範圍內。
在給藥前及研究的第 8、15、22 和 29 天測定兔血清中抗藥物抗體 (ADA) 的存在。給藥前，指定接受 WT VG1 給藥的 6 隻動物中的 3 隻具有可測量之血清 ADA。類似地，分別指定接受 RabFab-VG1 或 RabFab-VG1 + 10 kDa HA 治療的 1/6 和 0/6 動物具有針對試驗品的預先存在的血清 ADA。在第 8 天，WT VG1 及 RabFab-VG1 組中的所有動物在血清中皆表現出針對試驗品的 ADA，並且在研究期間保持陽性，而在 RabFab-VG1 + 10 kDa HA 組中，則有 2/3 的動物具有血清 ADA。在第 15 天，所有動物的血清 ADA 皆呈陽性，並一直持續到研究結束。
在接受 WT VG1、RabFab-VG1 以及 RabFab-VG1 + 10 kDa HA 治療的動物中，臨床檢眼鏡結果與前眼色素層炎及後眼色素層炎的發展一致，但治療組之間的嚴重程度有所不同。例如，WT VG1 導致在第 22 天發生中度前眼色素層炎及後眼色素層炎，包括一些眼睛的後囊下白內障。相比之下，接受 RabFab-VG1 治療的大多數動物在同一時間點表現出輕度眼色素層炎。此外，接受 RabFab-VG1 + 10 kDa HA 治療的動物僅表現出極輕微至輕度前眼色素層炎及後眼色素層炎。在各個治療組中，在第 18 天開始全身抗炎症治療 (其中亦包括對接受 WT VG1 給藥的動物進行局部眼睛治療) 後，在第 29 天發生眼色素層炎徵象得到改善。眼內壓力下降與活動性眼色素層炎一致，而玻璃體混濁的變化程度也對應於不同組中眼色素層炎的嚴重程度。在這些情況下，在接受 RabFab-VG1 + 10 kDa HA 治療的動物中，玻璃體混濁僅限於微弱的玻璃體混濁，而 WT VG1 動物則表現出中度混濁及後極白內障。藉由 OCT 及 ERG 亦觀察到治療依賴性效應嚴重程度，其中暗視和明視幅值減小表明接受 WT VG1 治療的眼睛的視網膜功能發生嚴重改變及病變。
相較於其他試驗品 (其中 RabFab-VG1 效應 (圖 16B) 不太嚴重且 RabFab-VG1 + 10 kDa HA 效應 (圖 16C) 僅限於玻璃體且嚴重程度僅為極輕微至輕度)，在接受 WT VG1 治療的眼睛中，眼內鏡檢效應亦為最顯著 (圖 16A)。WT VG1 相關的玻璃體炎症包括視神經乳頭附近的區域、視網膜剝離及不同程度的壞死以及與晶狀體後囊相鄰的炎症細胞層。此外，前房內含有均質的嗜酸性粒細胞物質，該物質與血清蛋白相一致。在視網膜中，WT VG1 相關炎症之特徵在於混合細胞類型延伸至視網膜實質，且伴隨極輕微至顯著壞死與血管及血管周圍炎症。在視網膜中央觀察到反應性 Muller 細胞。
與 WT VG1 類似，接受 RabFab-VG1 治療的眼睛表現出極輕微至中度瀰漫性光受體病變，其通常與反應性 Muller 細胞有關。然而，RabFab-VG1 光受體層病變與 WT VG1 相關的視網膜壞死不同，因為該病變僅對光受體層有選擇性，而視網膜壞死則涉及多個視網膜層。此外，接受 WT VG1 及 RabFab-VG1 治療的眼睛皆存在玻璃體中之纖維血管膜特徵。在這些情況下，膜由纖維母細胞、大量新血管及早期膠原沉積組成。亦觀察到與膜分離的牽引帶。與 WT VG1 和 RabFab-VG1 相比，RabFab-VG1 + 10 kDa HA 相關效應僅限於極輕微至輕度單核炎症，該炎症局限於玻璃體及內界膜。
總之，向紐西蘭白兔單次 IVT 投予 WT VG1、RabFab-VG1 或 RabFab-VG1 + 10 kDa HA 導致前眼色素層炎及後眼色素層炎的發展，在投予 WT VG1 的動物中最嚴重，在投予 RabFab-VG1 的動物中呈中度，且在投予 RabFab-VG1 + 10 kDa HA 的動物中呈輕度至中度。在鏡檢中，除炎症以外，WT VG1 和 RabFab-VG1 分別存在顯著的視網膜壞死及視網膜病變，其與 ERG 幅值減小相關。研究結束時，RabFab-VG1 +10 kDa HA 眼睛中不存在活動性前眼色素層炎的徵象，並且僅觀察到極輕微的慢性後眼色素層炎。儘管這些結果的解釋與第 15 天針對所有試驗品的 ADA 觀察結果混淆，但 RabFab-VG1 與 10 kDa HA 之預複合或結合似乎的確改善了該 Fab-HABD 在兔眼中的耐受性。 Fab-VG1 之腦保留
藉由小鼠腦室內注射測試通過 VG1 進行 HA 結合以實現在腦中保留的能力。出於這些目的，將非標靶結合抗體抗單純皰疹病毒-1 醣蛋白 D (抗 gD) 用為 Fab 片段 (抗 gD Fab)、完整 IgG (抗 gD IgG) 或作為與 VG1 之融合蛋白 (抗 gD Fab-VG1；BRD)。 A. 材料與方法 A.1. 動物
在這些研究中使用的野生型 C57BL/6 小鼠獲自堪薩斯大學繁殖群。使用活體動物的方案 (AUS 75-15；批准日期：2021 年 1 月 25 日) 獲得堪薩斯大學機構動物護理與使用委員會 (IACUC) 的批准。所有動物皆由動物護理單位 (ACU) 人員及獸醫在溫度控制的環境下進行照護，其中採用 12 小時暗/光循環，並且動物不受限制地獲得飼料及水。 A.2. 抗體與 IRDye800CW NHS 酯的結合
根據製造商的說明，將抗體與 IRDye800 結合。簡言之，將抗體在含有 10% 磷酸鉀緩衝劑 pH 9 (v/v) 的 PBS 中與 IRDye800 在 25℃ 下反應 2 小時。使用截留分子量為 7 kDa 的 Zeba Spin 脫鹽柱 (Fisher Scientific) 去除多餘的染料。使用 SDS-PAGE 評估結合的抗體純度。使用 Odyssey CLx NIR 掃描儀在 800 nm 下掃描 SDS-PAGE 凝膠，確認所有多餘的染料皆已去除。 A.3. 腦室內注射
使用 1.5-2% 異氟醚麻醉 5-10 週齡的健康 C57BL/6 小鼠並將其放入立體定位儀 (Stoelting Co.) 中。做中線矢狀切口以暴露小鼠的頭骨並標識前囟。在顱骨右側 1.0 mm 及前囟前 0.3 mm 處開一個小孔。將帶有 33 號可拆卸針頭的 10 μL Hamilton 注射器 (編號 7762-06) 裝配到立體定位儀上，並用於將 5 μL 濃度為 1 mg/mL 的抗體溶液注入小鼠側腦室 2.25 mm 的深度。以 1 μL/min 的速率輸注抗體。在臨安樂死前，將來自下頜下靜脈的血樣 (約 100 μL) 採集到含有肝素鋰作為抗凝劑的冷凍血漿收集管中。將樣品保存在冰上直至以 10000×g 離心 3 分鐘，並將血漿儲存於 -80℃ 直至分析。在不同時間點之後，用 4-5% 異氟醚深度麻醉小鼠的同時經由經心灌注含 0.1% Tween-20 的 HBSS 冰冷溶液以犧牲小鼠。收集腦、心、肺、肝、脾和腎並保存在冰上直至分析。 A.4. 抗體器官定量
對分離之器官稱重，並在 1 mL PBS 中機械均質化。標準近紅外螢光 (NIRF) 抗體溶液藉由用不同量的 PBS 稀釋儲備液來製得。然後在 96 孔板中藉由將 10 μL 標準溶液添加至 100 μL 均質空白器官中並使用 Odyssey Clx 掃描儀掃描各孔，為每個器官生成校準曲線。將各孔的螢光強度與每克器官的抗體濃度製圖以獲得線性曲線。對來自接受腦室內注射的小鼠的器官與校準曲線進行比較，以確定抗體沉積。類似地，用首先稀釋 5 倍的空白血漿進行血漿分析。然後，向 100 μL 稀釋血漿的等分試樣中添加 10 μL 抗體標準品以生成標準曲線，與接受腦室內注射的小鼠的血漿樣品進行比較。 B. 結果
如圖 17 所示，與等效劑量的抗 gD Fab (SEQ ID NO: 120 及 SEQ ID NO: 121) 或抗 gD IgG (SEQ ID NO: 121 及 SEQ ID NO: 122) 相比，抗 gD Fab-VG1 (BRD；SEQ ID NO: 121 及 SEQ ID NO: 124) 在腦中持續時間更長，並提供更大的暴露水平 (以曲線下面積 (AUC) 表示)。這些暴露水平的差異具有統計學顯著性，抗 gD Fab-VG1 與抗 gD Fab 相比，p 值小於 0.01；抗 gD Fab-VG1 與抗 gD IgG 相比，p 值小於 0.001。 實例 18. VG1 親和變異體的生成 A. 材料與方法 A.1. WT VG1 的結晶及 HA 結合殘基的鑑定
使用商業結晶篩選 (Hampton Research 及 Qiagen) 確定與 HA 結合的 WT VG1 的結晶條件。HA 結合的 VCAN 的結構係藉由用 HA6-mer 浸泡晶體獲得。收穫晶體並在不含冷凍保護劑的液氮中快速冷凍。使用 Stanford 同步輻射光源 (SSRL) 光束線 12-2 或 14-1，分別在 Pilatus 6M 或 Eiger 16M 偵測器 (Dectris) 上收集衍射資料。藉由在 COOT 中建立模型對結構進行迭代細化，然後用 REFMAC5、BUSTER 或 Phenix-Refine 進行精修。Adams, P.D. 等人, Acta Crystallogr.D Biol. Crystallogr., 66(Pt 2):213-221 (2010)；Blanc, E. 等人, Acta Crystallogr.D Biol. Crystallogr., 60:2210-2221 (2004)；Emsley, P. 等人, Acta Crystallogr.D Biol. Crystallogr., 66:486-501 (2010)；Emsley 和 Cowtan, Acta Crystallogr.D Biol. Crystallogr., 66:2126-2132 (2004)；Murshudov, G.N. 等人, Acta Crystallogr.D Biol. Crystallogr., 67:355-367, (2011)。
使用 PyMol 及/或 Chimera 分析 WT VG1-HA 結合物結構 (圖 18)，並基於氫鍵、靜電及疏水性交互作用電位鑑定與 HA 發生交互作用的殘基。 A.2. 微差掃描螢光法 (DSF)
使用微差掃描螢光 (DSF) 測量 WT VG1 及單一胺基酸變異體的熱穩定性。簡言之，將 0.1 mg/mL 純化的蛋白質與 Sypro Orange 染料在 PBS 中混合。在 25℃ 至 95℃ 的溫度梯度範圍內以 0.05°/秒的增量處理各樣品，並在 585 nm 下監測螢光的增加。使用自定義 excel 宏將原始螢光單位繪製為負導數併計算 Tm。 A.3. 基於 WT VG1-HA 結合物晶體結構設計的 VG1 變異體
根據 WT VG1-HA 結合物晶體結構 (圖 18)，發現 HA 僅結合至 link 1 結構域。因此，使用建模來預測可能參與 HA 結合的 link 2 殘基。為驗證晶體結構並鑑定減弱 WT VG1 之 HA 結合親和力的突變體，使晶體接觸的殘基突變為丙胺酸，或在一些情況下，突變為替代胺基酸。此外，一些 WT VG1 殘基與 HA 不產生晶體接觸但對於 TSG6 中的 HA 結合很重要 (基於 VG1 連接域結構與 TSG-6 連接結構域之間的序列比對；圖 8B)，它們亦突變為丙胺酸。為檢查突變之組合效應，形成幾種雙位點突變異體，例如 Lys260 及 Phe261 分別變成 Arg 及 Tyr (KF260RY)，並測試 HA 結合能力。表 22 列出如實例 10 中所述的方法所產生的 VG1 變異體。產生和測試的 VG1 變異體的胺基酸序列比對如圖 19 所示。
表 22. 針對 VG1 產生的合理突變體。
VG1 殘基 * 突變 原因
R160 A 晶體接觸
Y161 A 晶體接觸
E194 A TGS6 中重要的相應殘基
D197 A 晶體接觸
D197 S 晶體接觸
Y208 A 晶體接觸
Y208 F 晶體接觸
R214 A 晶體接觸
R214 K 晶體接觸
M222 A TGS6 中重要的相應殘基
Y230 A 晶體接觸
Y230 F 晶體接觸
R233 A 通過水分子發生晶體接觸
K260 A 預計結合 HA
F261 A 預計結合 HA
D295 A 預計結合 HA
Y296 A 預計結合 HA
H306 A 預計結合 HA
R312 A 預計結合 HA
R312 K 預計結合 HA
L325 A 預計結合 HA
Y326 A 預計結合 HA
R327 A 預計結合 HA
*使用胺基酸的單字母代碼
A.4. 分子特性
如實例 10 中所述，藉由 SPR 測量 HA 結合。注射突變體 120 秒並監測解離 180 秒。 B. 結果 B.1. VG1 變異體具有降低的 HA 結合水平
突變體 R160A、Y161A 及 D197A 在 2 至 7 µM 範圍內表現出減弱的 HA 結合。表 23 示出藉由 SPR 所測得的各 VG1 變異體的實測 k a (M -1s -1)、 k d (s -1) 及 K D (M)。
表 23.VG1 點突變體的 HA 結合。
SEQ ID NO 突變體 k a (M -1s -1) k d (s -1) K D (M)
29 WT VG1 5.36E+4 0.0099 1.840E-7
33 R160A 5.92E+04 0.127 2.14E-06
34 Y161A 2.78E+04 0.056 2.02E-06
35 E194A 無結合 無結合 無結合
36 D197A 1.11E+04 0.082 7.41E-06
37 D197S 6.98E+04 0.046 6.59E-07
38 Y208A 3.85E+04 0.0095 2.47E-07
39 Y208F 2.00E+05 0.043 2.13E-07
40 R214A 無結合 無結合 無結合
41 R214K 5.25E+04 0.0253 4.82E-07
42 M222A 2.14E+04 0.0091 4.25E-07
43 Y230A 4.02E+04 0.0080 2.00E-07
44 Y230F 1.07E+05 0.0386 3.60E-07
45 R233A 6.30E+04 0.0488 7.75E-07
46 K260A 2.26E+04 0.0096 4.23E-07
47 F261A 無結合 無結合 無結合
48 D295A 3.22E+05 0.2825 8.77E-07
49 Y296A 1.24E+05 0.0389 3.13E-07
50 H306A 3.50E+04 0.0114 3.25E-07
51 R312A 3.00E+04 0.0122 4.06E-07
52 R312K 3.63E+04 0.0073 2.01E-07
53 L325A 4.02E+04 0.0083 2.07E-07
54 Y326A 3.43E+04 0.0084 2.46E-07
55 R327A 3.76E+04 0.0172 4.57E-07
56 RY160KF 無結合 無結合 無結合
57 LYR325LFK 2.95E+04 0.0090 3.05E-07
58 KF260RY 5.31E+04 0.0086 1.62E-07
59 DY295SF 6.53E+04 0.0402 6.15E-07
B.2. VG1 變異體的穩定性
表 24 使出產生的 VG1 突變體以及各突變體的實測 Tm (解鏈溫度；℃)。雖然大多數突變相較於 WT VG1 對熱穩定性的影響輕微降低或無影響，但 Y208A 及 H306A 之 Tm 分別表現出 2.16℃ 及 2.81℃ 的改善。
表 24. 結合位點突變體的熱穩定性測量。
SEQ ID NO 突變體 Tm ( ℃ )
29 WT VG1 54.7±0.1
32 VG∆Ig 55.8±0.8
33 R160A 55.2
34 Y161A 54.9
35 E194A 54.2
36 D197A 56.0
37 D197S 54.8
38 Y208A 57.0
39 Y208F 55.2
40 R214A 55.5
41 R214K 55.1
42 M222A 55.5
43 Y230A 54.6
44 Y230F 55.6
45 R233A 54.6
46 K260A 52.7
47 F261A 51.3
48 D295A 55.6
49 Y296A 54.8
50 H306A 57.6
51 R312A 54.8
52 R312K 54.0
53 L325A 52.1
54 Y326A 53.8
55 R327A 55.2
56 RY160KF 54.2
57 LYR325LFK 51.9
58 KF260RY 54.0
59 DY295SF 55.3
均等形式
認為前述書面說明足以使熟習此項技術者能夠實踐本實施例。前述說明及實例詳述了某些實施例並描述了發明人設想的最佳模式。然而，應當理解的是，無論前述內容在文本中的詳細程度如何，實施例皆可以多種方式實踐，並應根據所附申請專利範圍及其任何均等形式進行解釋。
如本文所使用，術語「約」係指數值 (包括例如整數、分數及百分比)，無論是否明確指出皆如此。術語「約」一般是指本領域普通技術人員將認為等同於所述值 (例如，具有相同之功能或結果) 的數值範圍 (例如，所述範圍 +/-5-10%)。當諸如「至少」及「約」等術語位於數值或範圍列表之前時，這些術語將修改列表中所提供之所有值或範圍。在一些情況下，術語「約」可包括四捨五入到最接近之有效數字的數值。
無
[圖1] 示出與 10 kDa 玻尿酸 (HA) 預複合或未預複合的 Fab-玻尿酸結合結構域 (Fab-HABD) 融合蛋白 VPDF-2xCD44 的粒徑篩析層析法 (SEC；TSKgel UP-SW3000，2 μm，4.6 × 150 mm；運行緩衝劑 0.2M KPh，0.25 M KCl，pH 6.2) 分析結果。Fab-HABD 如實例 1 所述進行製備，並如實例 2 所述進行測試。 [圖2A至2B] 示出在紐西蘭白兔中進行劑量標準化玻璃體內 (IVT) 注射後，兔抗 c-Met Fab (RabFab) 及兔抗 c-Met Fab-VG1 Fab-HABD (RabFab-Fab-HABDs) 的玻璃體藥物動力學 (PK)。圖 2A 示出 IVT 後玻璃體內存在的 RabFab 或 RabFab-Fab-HABD 之含量隨時間的變化。示出 RabFab 融合物之資料，亦即 125I-RabFab-2xTSG6 (SEQ ID NO: 15 及 SEQ ID NO: 16；0.5 mg/眼) 及 RabFab-1xTSG6 (SEQ ID NO: 13 及 SEQ ID NO: 14；0.3 mg/眼)、RabFab (SEQ ID NO: 61 及 SEQ ID NO: 62；0.3 mg/眼) 及 125I-蘭尼單抗 (ranibizumab) ( 125I-Lucentis ®) 對照 (0.5 mg/眼)。資料點係經劑量標準化。圖 2B 藉由螢光光度測定法監測的 RabFab (0.15 mg/眼) 或 RabFab-2xTSG6 (0.026 mg/眼、0.15 mg/眼或 2.5 mg/眼) 之玻璃體藥物動力學。 [圖3] 示出 OS 兔眼之組織病理學影像，其中示出在 TSG6 (SEQ ID NO: 32) 經由 IVT 給藥後 4 天的視網膜病變。 [圖4A至4B] 示出眼房液及玻璃體液中之 VPDF (未經修飾；圖 4A) 及 VPDF-2xCD44 + 10 kDa HA (圖 4B) 之 IVT 藥物動力學 (PK) 型態 (藥物平均濃度隨時間之變化)。 [圖5A至5C] 示出與豬玻璃體之不同混合物。圖 5A 示出與未經修飾之抗 VEGF/抗 PDGF Fab 片段 (VPDF) 混合之豬玻璃體，其係均勻的 (透亮)。圖 5B 示出與 VPDF-2xCD44 混合之豬玻璃體，其係不均勻的 (沉澱)。圖 5C 示出與 1% (w/v) HA 10 kDa 之 VPDF-2xCD44 預複合物混合之豬玻璃體，其係均勻的 (透亮)。 [圖6A至6F] 示出與不同濃度之 VPDF-2xCD44 混合之豬玻璃體。圖 6A：37.5 mg/mL VPDF-2xCD44。圖 6B：9.4 mg/mL VPDF-2xCD44。圖 6C：2.4 mg/mL VPDF-2xCD44。圖 6D：0.6 mg/mL VPDF-2xCD44。圖 6E：0.15 mg/mL VPDF-2xCD44。圖 6F：0.04 mg/mL VPDF-2xCD44。+++ 嚴重沉澱；++ 中度沉澱；+ 輕度沉澱；- 透亮玻璃體。 [圖7A至7C] 示出注射指定 VPDF-2xCD44 樣品後整個豬眼之玻璃體不均勻性。圖 7A：緩衝劑對照。圖 7B：未經複合之 VPDF-2xCD44。圖 7C：與 HA 複合之 VPDF-2xCD44。 [圖8A至8B] 示出多能蛋白聚醣之結構域結構及連接結構域之胺基酸序列。多能蛋白聚醣為玻璃體液內源性物質。圖 8A 示出多能蛋白聚醣結構域：VG1 結構域、GAG 附著結構域及 G3 結構域。VG1 結構域 (WT VG1; SEQ ID NO: 29) 包含 Ig 樣結構域接以兩個連接結構域 (亦即 Link1 及 Link2)，該等兩個連接結構域負責 HA 結合。圖 8B 示出包括 TSG6 LD (SEQ ID NO: 4)、VG1 Link1 (SEQ ID NO: 30) 及 VG1 Link2 (SEQ ID NO: 31) 的連接結構域之序列比對。 [圖9A至9B] 示出豬玻璃體液中之 TSG6 但非 WT VG1 之沉澱。將 TSG6 (但非 WT VG1) 與 1:4 稀釋 (PBS) 之豬玻璃體混合後，觀察濁度。玻璃體中之 TSG6 及 WT VG1 之最終濃度為約 1 mg/mL。圖 9A 示出 TSG6 vs. 對照 – 離心後觀察到沉澱物。圖 9B 示出 WT VG1 vs. 對照 – 離心後未觀察到沉澱物。 [圖10A至10B] 示出 RabFab-TSG6 在豬玻璃體中發生沉澱，而 RabFab-VG1 未發生沉澱。TSG6 或 VG1 各自重組接附至 RabFab 並經由 N-羥基琥珀醯亞胺 (NHS) 一級胺標記化學結合至 Alexa488。圖 10A 示出 RabFab-TSG6。圖 10B 示出 RabFab-VG1。 [圖11A至11C] 示出 VG1 及 RabFab-VG1 在兔玻璃體液中未發生沉澱。圖 11A 示出約 40 g/L 之 VG1。圖 11B 示出約 40 g/L 之 RabFab-VG1。圖 11C 示出約 17 g/L 之 RabFab-VG1 + 10 kDa HA。在任何條件下均未觀察到沉澱。 [圖12] 示出 VG1 與離體玻璃體液交互作用之螢光相關光譜 (FCS) 測量結果。示出緩慢擴散之測量結果表明，蛋白質與玻璃體液發生交互作用，而快速擴散則表明不發生交互作用。玻璃體液之稀釋係數顯示於熱圖的頂部 – 最左側一列示出未經稀釋之對照/樣品；最右側一列示出磷酸鹽緩衝鹽水 (PBS)，pH 7.4；中間之列示出從左到右增加的稀釋係數。未結合對照之測量結果顯示於頂部兩行中。以下樣品之測量結果顯示於第 3-8 行：遊離 VG1、PigFab-VG1、PigFab-VG1 + 10 kDa HA (1:1)、遊離 VG1、RabFab-VG1 及 RabFab-VG1 + 10 kDa HA (1:1)。未結合對照示出最快速之擴散 (圖 12，第 1 行及第 2 行)。雖然所有樣品相對於對照皆表現出顯著之延遲擴散，但遊離 VG1、PigFab-VG1 及 RabFab-VG1 在玻璃體稀釋超過 6000 倍之前皆表現出延遲擴散 (圖 12，第 3、4、6 和 7 行；從未稀釋到稀釋係數為 6,561)。觀察到與 10 kDa HA 共同配製之樣品緩慢擴散，但當稀釋係數大於 729 倍時，該效應消失 (圖 12，第 5 行：PigFab-VG1+10 kDa HA (1:1)，及第 8 行：RabFab-VG1+10 kDa HA (1:1)；從稀釋係數為 729 到 PBS)。這些結果表明 VG1 可與內源性 HA 發生交互作用。 [圖13] 示出 37℃ 下之抗 HtrA1-VG1 之熱應力 (亦即蛋白質穩定性) 分析結果。T0 = 未孵育對照。T4wk = 孵育 4 週後。 [圖14] 示出豬眼房液中 pigFab-VG1 之平均濃度。在經由 IVT 單獨注射 1.8 mg pigFab-VG1 或與相等質量濃度的 10 kDa HA 預複合的 pigFab-VG1 後，藉由質譜法測量濃度。示出幾隻動物的平均值，誤差條表示標準差。 [圖15] 示出 VPDF VG1 在大鼠雷射誘導之脈絡膜新血管形成 (大鼠雷射 CNV) 中對新血管形成之抑制百分比。 [圖16A至16C] 示出在處理後 30 天經試驗品處理的兔眼的組織病理學。圖 16A 示出 WT VG1，圖 16B 示出 RabFab-VG1，且圖 16C 示出與 HA 結合之 RabFab-VG1。 [圖17A至17B] 示出小鼠接受腦室內注射後的腦含量。圖 17A 示出隨時間的推移保留在腦中的蛋白質的量。圖 17B 示出藉由曲線下面積 (AUC) 所量測之腦中暴露水平。** 指示 p＜0.01，且 *** 指示 p＜0.001，用於在組間比較。抗 gD = 抗單純皰疹病毒-1 醣蛋白 D。BRD = 抗 gD Fab-VG1。 [圖18] 示出 WT VG1 及 HA 結合物之晶體結構。VG1 的 Ig 結構域顯示於圖的頂部，Link1 結構顯示於圖的底部右側，Link2 結構域顯示於圖的底部左側。HA 之結合以 VG1 分子右下方較小之 HA 分子表示。 [圖19] 示出 VG1 變異體 SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 33-59 之比對。N 末端之前 20 個胺基酸為多能蛋白聚醣訊息序列 (示出為帶有 *)。框內胺基酸為保守殘基。所有這些蛋白質皆帶有用於純化之 C 端 His 標籤。

Claims (95)

  1. 一種靶向患者之組織的治療分子，其包含玻尿酸結合結構域及治療活性劑，其中該玻尿酸結合結構域包含至少兩個多能蛋白聚醣（Versican）連接結構域。
  2. 一種靶向患者之組織的治療分子，其包含玻尿酸結合結構域及治療活性劑，其中該玻尿酸結合結構域包含至少兩個多能蛋白聚醣連接結構域，該等至少兩個多能蛋白聚醣連接結構域經由 HA 結合結構域結合至玻尿酸。
  3. 如請求項 1 或 2 之治療分子，其中該玻尿酸的範圍為自 400 Da 至 200 kDa。
  4. 如請求項 3 之治療分子，其中該玻尿酸為至少 5 kDa。
  5. 如請求項 3 或 4 之治療分子，其中該玻尿酸為 10 kDa。
  6. 如請求項 1 至 5 中任一項之治療分子，其中該玻尿酸對該等多能蛋白聚醣連接結構域提供莫耳過量之結合當量。
  7. 如請求項 1 至 6 中任一項之治療分子，其中該玻尿酸允許玻尿酸與治療分子之比例範圍為自 1.5:1 至 1:1。
  8. 如請求項 1 至 7 中任一項之治療分子，其中該玻尿酸結合結構域具有 10 nM 至 10 µM 的 K D。
  9. 如請求項 1 至 8 中任一項之治療分子，其中該玻尿酸結合結構域具有 5 nM 至 8 µM 的 K D。
  10. 如請求項 1 至 9 中任一項之治療分子，其中該玻尿酸結合結構域具有 100 nM 至 5 µM 的 K D。
  11. 如請求項 1 至 10 中任一項之治療分子，其中該玻尿酸結合結構域係與 SEQ ID NO: 86、60、32 或 29 至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同。
  12. 如請求項 1 至 11 中任一項之治療分子，其中該玻尿酸結合結構域係與 SEQ ID NO: 86、60、32 或 29 至少 95% 相同。
  13. 如請求項 1 至 12 中任一項之治療分子，其中該玻尿酸結合結構域包含至少 1 個、至少 2 個、至少 3 個、至少 4 個或至少 5 個突變。
  14. 如請求項 1 至 13 中任一項之治療分子，其中該玻尿酸結合結構域包含 1 至 3 個突變，其中該等 1 至 3 個突變包含單胺基酸取代、雙胺基酸取代及截短。
  15. 如請求項 1 至 14 中任一項之治療分子，其中該玻尿酸結合結構域包含 1 至 5 個突變，其中該等 1 至 5 個突變包含單胺基酸取代、雙胺基酸取代及截短。
  16. 如請求項 1 至 15 中任一項之治療分子，其中該玻尿酸結合結構域相對於 SEQ ID NO: 29 具有截短突變。
  17. 如請求項 16 之治療分子，其中該截短突變包含在 N 端之 1 至 129 個胺基酸的截短。
  18. 如請求項 1 至 17 中任一項之治療分子，其中該玻尿酸結合結構域為截短序列，其中不存在野生型多能蛋白聚醣之 Ig 結構域。
  19. 如請求項 1 至 18 中任一項之治療分子，其中該玻尿酸結合結構域相對於 SEQ ID NO: 29 包含以下胺基酸中之至少一個：R160、Y161、E194、D197、Y208、R214、Y230、F261、D295 及 R233。
  20. 如請求項 1 至 19 中任一項之治療分子，其中該玻尿酸結合結構域相對於 SEQ ID NO: 29 包含以下胺基酸中之 2 個、3 個、4 個、5 個、6 個、7 個、8 個、9 個或 10 個：R160、Y161、E194、D197、Y208、R214、Y230、F261、D295 及 R233。
  21. 如請求項 1 至 20 中任一項之治療分子，其中該玻尿酸結合結構域相對於 SEQ ID NO: 29 包含在以下位置中之至少一個之突變：R160、Y161、E194、D197、Y208、R214、M222、Y230、R233、K260、F261、D295、Y296、H306、R312、L325、Y326 及 R327。
  22. 如請求項 1 至 21 中任一項之治療分子，其中該玻尿酸結合結構域相對於 SEQ ID NO: 29 包含在以下位置中之 2 個、3 個、4 個、5 個、6 個、7 個、8 個、9 個、10 個、11 個、12 個、13 個、14 個、15 個、16 個、17 個或 18 個之突變：R160、Y161、E194、D197、Y208、R214、M222、Y230、R233、K260、F261、D295、Y296、H306、R312、L325、Y326 及 R327。
  23. 如請求項 1 至 22 中任一項之治療分子，其中該玻尿酸結合結構域相對於 SEQ ID NO: 29 包含在以下位置中之 2 個、3 個、4 個、5 個或 6 個之突變：R160、Y161、E194、D197、Y208、R214、M222、Y230、R233、K260、F261、D295、Y296、H306、R312、L325、Y326 及 R327。
  24. 如請求項 1 至 23 中任一項之治療分子，其中該玻尿酸結合結構域相對於 SEQ ID NO: 29 包含以下突變中之至少一個：R160A、Y161A、D197A、D197S、Y208A、Y208F、R214K、M222A、Y230A、Y230F、R233A、K260A、K260R、F261Y、KF260RY、D295A、D295S、Y296A、Y296F、DY295SF、H306A、R312A、L325A、Y326A、R327A 及 LYR325LFK。
  25. 如請求項 1 至 24 中任一項之治療分子，其中該玻尿酸結合結構域包含 Y208A 及 H306A 中之至少一個。
  26. 如請求項 1 至 25 中任一項之治療分子，其中該玻尿酸結合結構域相對於 SEQ ID NO: 29 包含以下突變中之至少 2 個、3 個、4 個、5 個、6 個、7 個、8 個、9 個、10 個、11 個、12 個、13 個、14 個、15 個、16 個或 17 個：R160A、Y161A、D197A、D197S、Y208A、Y208F、R214K、M222A、Y230A、Y230F、R233A、K260A、K260R、F261Y、KF260RY、D295A、D295S、Y296A、Y296F、DY295SF、H306A、R312A、L325A、Y326A、R327A 及 LYR325LFK。
  27. 如請求項 1 至 26 中任一項之治療分子，其中該玻尿酸結合結構域相對於 SEQ ID NO: 29 包含以下突變中之至少 2 個、3 個、4 個、5 個或 6 個：R160A、Y161A、D197A、D197S、Y208A、Y208F、R214K、M222A、Y230A、Y230F、R233A、K260A、K260R、F261Y、KF260RY、D295A、D295S、Y296A、Y296F、DY295SF、H306A、R312A、L325A、Y326A、R327A 及 LYR325LFK。
  28. 如請求項 1 至 27 中任一項之治療分子，其中該玻尿酸結合結構域為 SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58 或 SEQ ID NO: 59。
  29. 如請求項 1 至 28 中任一項之治療分子，其中該治療活性劑包含寡肽、蛋白質或核酸。
  30. 如請求項 1 至 29 中任一項之治療分子，其中該治療活性劑包含抗體、抗原結合片段、半胱胺酸結肽、生長因子或適體。
  31. 如請求項 30 之治療分子，其中該治療活性劑能夠結合抗原。
  32. 如請求項 31 之治療分子，其中該治療活性劑能夠結合 VEGF、HtrA1、IL-33、C5、因子 P、因子 D、EPO、EPOR、IL-1β、IL-17A、IL-10、TNFα、FGFR2、PDGF 或 ANG2。
  33. 如請求項 31 或 32 之治療分子，其中該治療活性劑為抗體或其抗原結合片段 (包括但不限於 Fab 片段、F(ab')2 片段、Fab' 片段、VhH 片段、scFv 片段、scFv-Fc 片段或微抗體)。
  34. 如請求項 31 或 32 之治療分子，其中該治療活性劑為寡肽或蛋白質。
  35. 如請求項 29 或 34 之治療分子，其中該寡肽或蛋白質為半胱胺酸結肽或酶。
  36. 如請求項 113 之治療分子，其中該半胱胺酸結肽係與 SEQ ID NO: 92 至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同。
  37. 如請求項 1 至 108 中任一項之治療分子，其中該治療活性劑為生長因子，該生長因子包含纖維母細胞生長因子、血小板衍生生長因子、神經生長因子 (NGF)、VEGF、纖維母細胞生長因子 (FGF) 及類胰島素生長因子 I (IGF-I)。
  38. 如請求項 110 之治療分子，其中結合 VEGF 的該治療活性劑包含蘭尼單抗 (ranibizumab)、阿柏西普 (aflibercept)、布西組單抗-dbll (brolucizumab-dbll) 及貝伐珠單抗 (bevacizumab)。
  39. 如請求項 1 至 110 中任一項之治療分子，其中該治療活性劑為核酸。
  40. 如請求項 117 之治療分子，其中該核酸為適體、反義寡核苷酸及/或鎖核酸。
  41. 如請求項 118 之治療分子，其中該適體結合 VEGF。
  42. 如請求項 108、118 或 119 中任一項之治療分子，其中該適體係經聚乙二醇化。
  43. 如請求項 108 或 118 至 120 中任一項之治療分子，其中該適體為 Macugen®。
  44. 如請求項 1 至 121 中任一項之治療分子，其中該治療活性劑經由連接子與該玻尿酸結合結構域共價地連接。
  45. 如請求項 122 之治療分子，其中該連接子為至少 4 個胺基酸。
  46. 如請求項 122 或 123 之治療分子，其中該連接子不長於 50 個胺基酸。
  47. 如請求項 122 至 124 中任一項之治療分子，其中該連接子為 4 至 25 個胺基酸。
  48. 如請求項 122 至 125 中任一項之治療分子，其中該連接子包含 (GxS)n 或 (GxS)nGm，其中 G = 甘胺酸，S = 絲胺酸，且 (x = 3，n = 3、4、5 或 6，且 m = 0、1、2 或 3) 或 (x = 4，n = 2、3、4 或 5，且 m = 0、1、2 或 3)。
  49. 如請求項 122 至 126 中任一項之治療分子，其中該連接子包含 GGGS (SEQ ID NO: 84) 或其多聚體，更尤其包含 (GGGGS)3 (SEQ ID NO: 85)。
  50. 如請求項 122 至 125 中任一項之治療分子，其中該連接子包含 (GxS)n，其中 G = 甘胺酸，S = 絲胺酸，且 (n = 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10)。
  51. 如請求項 122 至 125 或 128 中任一項之治療分子，其中該連接子包含 GSGSGSGSGSGSGSGSGSGS (SEQ ID NO: 95)。
  52. 如請求項 1 至 107 中任一項之治療分子，其中該治療活性劑包含抗 VEGF 抗原結合部分及半胱胺酸結肽。
  53. 如請求項 30、35、36 或 52 之治療分子，其中該半胱胺酸結肽經由連接子與該玻尿酸結合結構域連接，該連接子包含序列 GSGSGSGSGSGSGSGSGSGS (SEQ ID NO: 95)。
  54. 如請求項 52 或 53 之治療分子，其中該序列包含 (a) 抗 VEGF 抗原結合部分；及 (b) 與 SEQ ID NO: 93 或 SEQ ID NO: 94 具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。
  55. 如請求項 1 至 54 中任一項之治療分子，其中該玻尿酸結合結構域可非共價地結合至玻尿酸。
  56. 一種遞送靶向患者之組織的治療分子的方法，其包含將如請求項 1 至 133 中任一項之治療分子投予該患者，並允許該治療分子向標靶組織提供該治療活性劑的長效遞送。
  57. 如請求項 56 之方法，其進一步包含在投予步驟之前將該治療分子與玻尿酸結合。
  58. 如請求項 57 之方法，其進一步包含將包含該治療分子之第一溶液與包含該玻尿酸之第二溶液混合。
  59. 如請求項 58 之方法，其中該混合包含容器。
  60. 如請求項 59 之方法，其中該容器為兩室注射器。
  61. 如請求項 58 至 60 中任一項之方法，其中該混合產生結合至玻尿酸的治療分子，該治療分子準備用於投予受試者。
  62. 如請求項 56 至 61 中任一項之方法，其中該投予步驟為單次注射。
  63. 如請求項 56 至 62 中任一項之方法，其中該標靶組織包含眼睛或腦。
  64. 如請求項 56 至 63 中任一項之方法，其中相較於未經修飾之治療活性劑，該治療分子提供改良之玻璃體相容性、更長之玻璃體停留時間、更長之玻璃體半衰期及/或改良之藥理作用持續時間。
  65. 一種治療分子，其包含： a.  能夠結合至眼睛中之治療標靶的第一組分， b. 能夠結合至玻尿酸的一種或多種第二組分，其中該等一種或多種第二組分與該第一組分共價地結合，及 c.  視情況地，包含玻尿酸之一種或多種第三組分， 其中，若存在該等一種或多種第三組分，該等一種或多種第三組分非共價地結合至該等一種或多種第二組分。
  66. 如請求項 65 之治療分子，其中該第一組分為蛋白質、肽、受體或其片段、受體之配體、darpin、核酸、RNA、DNA 或適體。
  67. 如請求項 65 或 67 之治療分子，其中該第一組分係選自抗體、抗原結合片段，特定而言抗體片段，更特定而言至少缺少 Fc 結構域的抗體片段，尤其地其中該片段為或包含 (Fab') 2片段、Fab' 片段、Fab 片段、VhH 片段、scFv 片段、scFv-Fc 片段及微抗體，更尤其為 Fab 片段。
  68. 如請求項 65 至 68 中任一項之治療分子，其中該第二組分包含玻尿酸受體 CD44 (CD44) 結構域、腦特異性連接蛋白 (BRAL1) 結構域、腫瘤壞死因子刺激基因 6 (TSG-6) 結構域、淋巴管內皮玻尿酸受體 1 (LYVE-1) 結構域、或玻尿酸結合蛋白 (HABP) 結構域、聚集蛋白聚醣 G1 (AG1) 結構域或多能蛋白聚醣 G1 (VG1) 結構域。
  69. 如請求項 65 至 69 中任一項之治療分子，其中結合物包含一種第二組分或兩種彼此相同的第二組分。
  70. 如請求項 65 至 69 中任一項之治療分子，其中該第三組分為玻尿酸，其中該玻尿酸 a.  具有 i.        選自 3 kDa 至 60 kDa、4 kDa 至 30 kDa、5 kDa 至 20 kDa 或 400 Da 至 200 kDa 之分子量； ii.       至少 2 kDa、3 kDa、4 kDa、5 kDa、6 kDa、7 kDa、8 kDa 或 9 kDa 之分子量；或 iii.      至多 60 kDa、50 kDa、40 kDa、30 kDa、25 kDa、20 kDa 或 15 kDa 之分子量； b. 對該等一種或兩種第二組分提供莫耳過量之結合當量；及 c.  具有減少眼睛中玻尿酸降解的修飾。
  71. 如請求項 65 至 69 中任一項之治療分子，其中該第二組分能夠以 10 nM 至 10 µM、5 nM 至 8 µM 或 100 nM 至 5 µM 的 K D結合至玻尿酸。
  72. 如請求項 65 至 71 中任一項之治療分子，其中 a.  該等第一組分及第二組分包含在融合蛋白中，特定而言其中該等第二組分中之一種或兩種共價地結合至該第一組分的 N 端及/或 C 端，更特定而言其中該第一組分為抗體或抗原結合片段，且其中該等一種或兩種第二組分共價地結合至該第一組分的 C 端；及/或 b. 該等一種或兩種第二組分直接地結合至該第一組分或經由連接子間接地結合至該第一組分，該連接子特定而言為至少 4 個胺基酸及/或至多 50 個或至多 25 個胺基酸的連接子，更特定而言該連接子為 (GxS) n或 (GxS) nG m，其中 G = 甘胺酸，S = 絲胺酸，(x = 3，n = 3、4、5 或 6，且 m = 0、1、2 或 3) 或 (x = 4，n = 2、3、4 或 5，且 m = 0、1、2 或 3)。
  73. 如請求項 65 至 72 中任一項之治療分子，其中該治療標靶為 VEGF、C2、C3a、C3b、C5、C5a、HtrA1、IL-33、因子 P、因子 D、EPO、EPOR、IL-1β、IL-17A、IL-10、TNFα、FGFR2、PDGF 或 ANG2。
  74. 如請求項 65 至 73 中任一項之治療分子，其中 a.  該第一組分為針對 VEGF 之抗體或抗原結合片段；及/或 b. 該等一種或兩種第二組分中之各者包含 CD44 結構域或 TSG-6 結構域或 VG1 結構域；及/或 c.  該第三組分為具 5 kDa 至 20 kDa 之分子量的玻尿酸。
  75. 如請求項 65 至 74 中任一項之治療分子，其中 a.  該第一組分為抗 VEGF 抗體或抗原結合片段，該等一種或兩種第二組分包含 CD44 結構域，且該第三組分為具 5 kDa 至 20 kDa 之分子量的玻尿酸； b. 該第一組分為抗 VEGF 抗體或抗原結合片段，該等一種或兩種第二組分包含 TSG-6 結構域，且該第三組分為具 5 kDa 至 20 kDa 之分子量的玻尿酸；或 c.  該第一組分為抗 VEGF 抗體或抗原結合片段，該等一種或兩種第二組分包含 VG1 結構域，且該第三組分為具 5 kDa 至 20 kDa 之分子量的玻尿酸。
  76. 如請求項 65 至 75 中任一項之治療分子，其中 a.  該第一組分包含 i.        SEQ ID NO: 97、99、105、109 或 114 之 VH 結構域；及 ii.       SEQ ID NO: 98、100、106、110 或 115 之 VL 結構域；及 b. 該第二組分包含 SEQ ID NO: 2。
  77. 如請求項 65 至 75 中任一項之治療分子，其中 a.  該第一組分包含 i.        SEQ ID NO: 97、99、105、109 或 114 之 VH 結構域；及 ii.       SEQ ID NO: 98、100、106、110 或 115 之 VL 結構域；及 b. 該第二組分包含 SEQ ID NO: 4。
  78. 如請求項 65 至 75 中任一項之治療分子，其中 a.  該第一組分包含 i.        SEQ ID NO: 97、99、105、109 或 114 之 VH 結構域；及 ii.       SEQ ID NO: 98、100、106、110 或 115 之 VL 結構域；及 b. 該第二組分包含 SEQ ID NO: 86、60、32 或 29。
  79. 如請求項 78 之治療分子，其中該第二組分係與 SEQ ID NO: 86、60、32 或 29 至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同。
  80. 如請求項 78 或 79 之治療分子，其中該第二組分包含 1 至 5 個突變，其中該等 1 至 5 個突變包含單胺基酸取代、雙胺基酸取代及/或截短。
  81. 如請求項 78 至 80 中任一項之治療分子，其中該第二組分相對於 SEQ ID NO: 29 具有截短突變。
  82. 如請求項 81 之治療分子，其中該截短突變包含在 N 端之 1 至 129 個胺基酸的截短。
  83. 如請求項 78 至 82 中任一項之治療分子，其中該第二組分為截短序列，其中不存在野生型多能蛋白聚醣之 Ig 結構域。
  84. 如請求項 78 至 83 中任一項之治療分子，其中該第二組分相對於 SEQ ID NO: 29 包含在以下位置中之 1 個、2 個、3 個、4 個、5 個或 6 個之突變：R160、Y161、E194、D197、Y208、R214、M222、Y230、R233、K260、F261、D295、Y296、H306、R312、L325、Y326 及 R327。
  85. 如請求項 78 至 84 中任一項之治療分子，其中該第二組分相對於 SEQ ID NO: 29 包含以下突變中之至少 1 個、2 個、3 個、4 個、5 個或 6 個：R160A、Y161A、D197A、D197S、Y208A、Y208F、R214K、M222A、Y230A、Y230F、R233A、K260A、K260R、F261Y、KF260RY、D295A、D295S、Y296A、Y296F、DY295SF、H306A、R312A、L325A、Y326A、R327A 及 LYR325LFK。
  86. 如請求項 78 至 85 中任一項之治療分子，其中該第二組分包含 Y208A 及 H306A 中之至少一個。
  87. 如請求項 78 或 79 之治療分子，其中該第二組分為 SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58 或 SEQ ID NO: 59。
  88. 如請求項 65 至 87 中任一項之治療分子，其中該第一組分進一步包含半胱胺酸結肽。
  89. 如請求項 88 之治療分子，其中該半胱胺酸結肽係與 SEQ ID NO: 92 具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 之同一性。
  90. 如請求項 88 或 89 之治療分子，其中胺基酸序列與 SEQ ID NO: 93 或 SEQ ID NO: 94 具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 之同一性。
  91. 一種用為藥物之組成物，該組成物包含如請求項 65 至 90 中任一項之治療分子及視情況的醫藥上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。
  92. 一種用於治療眼睛疾病或腦疾病之組成物，該組成物包含如請求項 65 至 90 中任一項之治療分子及視情況的醫藥上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。
  93. 如請求項 92 所使用之組成物，其經調配用於眼內遞送，特定而言用於玻璃體內注射。
  94. 如請求項 92 或 93 所使用之組成物，其中該眼睛疾病為年齡相關性黃斑退化 (AMD)，特定而言為濕性 AMD 或新生血管性 AMD；糖尿病性黃斑水腫 (DME)；糖尿病性視網膜病變 (DR)，特定而言增殖性 DR 或非增殖性 DR；視網膜靜脈阻塞 (RVO)；或地圖狀萎縮 (GA)。
  95. 一種遞送靶向患者之組織的治療分子的方法，其包含將如請求項 65 至 90 中任一項之治療分子或如請求項 91 至 94 中任一項之組成物投予該患者，並允許該治療分子向標靶組織提供該第一組分的長效遞送。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5144088A (en) 1991-04-26 1992-09-01 Aristech Chemical Corporation Manufacture of neopentyl glycol (I)
DK0973804T3 (da) 1997-04-07 2007-05-07 Genentech Inc Anti-VEGF-antistoffer
ES2335861T3 (es) 2000-09-08 2010-04-06 Universitat Zurich Grupos de proteinas repetitivas que comprenden modulos repetitivos.
US7771742B2 (en) 2004-04-30 2010-08-10 Allergan, Inc. Sustained release intraocular implants containing tyrosine kinase inhibitors and related methods
DK3216803T3 (da) 2008-06-25 2020-06-02 Novartis Ag Stabile og opløselige antistoffer, der hæmmer vegf
US20140248296A1 (en) * 2008-10-16 2014-09-04 Kathleen Cogan Farinas Sustained drug delivery system
US8133979B2 (en) 2008-12-16 2012-03-13 Hoffmann-La Roche Inc. Antibodies against human angiopoietin 2
PE20150361A1 (es) 2012-07-13 2015-03-14 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos anti-vegf/anti-ang-2 y su utilizacion en el tratamiento de enfermedades vasculares oculares
CA2891686A1 (en) 2012-12-18 2014-06-26 Novartis Ag Compositions and methods that utilize a peptide tag that binds to hyaluronan
US10434188B1 (en) * 2013-06-04 2019-10-08 The Trustees Of Indiana University Hyaluronic acid binding domain-growth factor fusion protein cDNAs and fusion proteins for cartilage matrix preservation and repair
JP5684438B1 (ja) 2013-08-06 2015-03-11 オリンパス株式会社 光源光学系、ファイバ光源、顕微鏡および自動車用前照灯
WO2015198243A2 (en) 2014-06-25 2015-12-30 Novartis Ag Compositions and methods for long acting proteins
WO2016073157A1 (en) 2014-11-06 2016-05-12 Genentech, Inc. Anti-ang2 antibodies and methods of use thereof
JP6594438B2 (ja) 2014-11-07 2019-10-23 セセン バイオ， インコーポレイテッド 改善されたｉｌ−６抗体
WO2017139417A1 (en) * 2016-02-08 2017-08-17 Vitrisa Therapeutics, Inc. Compositions with improved intravitreal half-life and uses thereof

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