FR3061716A1 - Nouveaux composes ciblant le cd160 humain - Google Patents

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Abstract

La présente invention a pour objet de nouveaux composés qui se lient spécifiquement au CD160 humain, comprenant un domaine variable de chaîne légère (VL) une séquence choisie définie par SEQ ID No:14 ou SEQ ID No:13 et un domaine variable de chaîne lourde (VH) une séquence choisie parmi SEQ ID No:11, SEQ ID No:25, SEQ ID No: 26, SEQ ID No:27, SEQ ID No: 28, SEQ ID No:29 ou SEQ ID No:30 leurs fragments ou leurs dérivés.

Description

® Mandataire(s) : CABINET GERMAIN & MAUREAU.
® NOUVEAUX COMPOSES CIBLANT LE CD160 HUMAIN.
@) La présente invention a pour objet de nouveaux composés qui se lient spécifiquement au CD160 humain, comprenant un domaine variable de chaîne légère (VL) une séquence choisie définie par SEQ ID No:14 ou SEQ ID No:13 et un domaine variable de chaîne lourde (VH) une séquence choisie parmi SEQ ID No:11, SEQ ID No:25, SEQ ID No: 26, SEQ ID No:27, SEQ ID No: 28, SEQ ID No:29 ou SEQ ID No:30 leurs fragments ou leurs dérivés.
FR 3 061 716 - A1
Figure FR3061716A1_D0001
La présente invention se rapporte à un composé qui se lie spécifiquement au CD160 humain, ayant pour domaine variable de chaîne légère (VL) une séquence définie par SEQ ID No:14 ou SED ID No : 13, et pour domaine variable de chaîne lourde (VH) une séquence choisie parmi SEQ ID No: 11, SEQ ID No:25, SEQ ID No: 26, SEQ ID No: 27, SEQ ID No: 28, SEQ ID No: 29 et SEQ ID No: 30, ses fragments ou ses dérivés.
Actuellement, les anticorps monoclonaux sont utilisés en tant que thérapies pour traiter une variété de pathologies incluant les cancers, les maladies auto-immunes, les maladies inflammatoires chroniques, les rejets de greffe, les maladies infectieuses, les maladies cardiovasculaires et certaines pathologies oculaires. Il n'existe pas moins d'une vingtaine d'anticorps monoclonaux ou certains de leurs fragments sur le marché, et plus de quatre cents en développement clinique.
Le choix d'un anticorps comme candidat potentiel en thérapie est donc d'un intérêt stratégique majeur. En particulier, l'anticorps sélectionné doit avoir une bonne affinité et une bonne spécificité pour sa cible, une efficacité optimale au regard de sa toxicité éventuelle, tout en étant le moins immunogène possible.
Parmi les anticorps existants se liant spécifiquement au récepteur CD160 figure l'anticorps CL1-R2. Il s'agit de l'anticorps monoclonal murin dirigé contre le récepteur CD160 humain décrit dans le brevet EP1776387B1. Cet anticorps CL1-R2 a pour domaine variable de chaîne lourde (VH) SEQ ID No:l, et pour domaine variable de chaîne légère (VL) SEQ ID No:2. Il présente des propriétés anti-angiogéniques ainsi que des propriétés immunomodulatrices. Cependant, son administration chez l'homme n'est pas possible, en raison de son immunogénicité trop importante, ce qui (i) induirait une neutralisation (ou accélération de son élimination) à terme de l'anticorps et ainsi de ses effets thérapeutiques et (ii) pourrait induire également un risque de toxicité potentielle (réactions immunitaires indésirables comme l'anaphylaxie ou des maladies sériques).
Il existe un besoin de disposer de composés, notamment d'anticorps efficaces dans le traitement de pathologies impliquant une néovascularisation en complément des traitements actuels anti-VEGFs disponibles. Ces composés devront avoir une bonne activité biologique et une affinité spécifique pour leurs cibles, tout en étant bien tolérés et notamment non immunogènes chez l'homme.
Il existe également un besoin de nouveaux agents pouvant être combinés aux traitements actuels notamment pour stimuler les cellules immunitaires effectrices telles que les cellules NKs et/ou en levant l'anergie des cellules T cytotoxiques.
La présente invention permet de résoudre ces problèmes. Elle a pour objet un composé qui se lie spécifiquement au CD160 humain et a pour domaine variable de chaîne légère (VL) une séquence choisie définie par SEQ ID No:14 ou SEQ ID No:13 et pour domaine variable de chaîne lourde (VH) une séquence choisie parmi SEQ ID No:ll,, SEQ ID No: 25, SEQ ID No: 26, SEQ ID No: 27, SEQ ID No: 28, SEQ ID No: 29 et SEQ ID No: 30, les fragments ou les dérivés dudit composé. Les composés de l'invention sont spécifiquement adaptés à une administration chez l'homme chez qui ils sont bien tolérés et non immunogènes.
Les composés de l'invention peuvent prendre la forme d'anticorps et plus particulièrement d'anticorps monoclonal, de fragments ou de dérivés et sont capables de se lier au CD160 humain, avec une très bonne affinité.
Les composés selon l'invention présentent une bien meilleure affinité que la version chimérique de CL1-R2. Ceci est très avantageux, car la version chimérique qui pourrait être compatible avec une administration chez l'homme, présente encore une certaine immunogénicité potentielle. En outre, de tels anticorps, leurs fragments et dérivés présentent une excellente activité.
Par « CD160 humain », on entend le récepteur CD160 humain. C'est un récepteur de 27 kDa reconnaissant les molécules HLA classiques (HLA A et C) et non classiques (HLA G), ancré à la membrane cellulaire par un motif GPI et appartenant à la super-famille des immunoglobulines (présence d'un domaine immunoglobulin like). Cette protéine est notamment présente à la surface des cellules endothéliales. L'ADNc de CD160 humain correspond à la séquence SEQ ID No: 1 décrite dans WO 98/21240. L'ARNm de CD160 humain est disponible dans Genbank sous le numéro d'accession AF060981. La séquence protéique du CD160 humain correspond à la séquence SEQ ID No: 2 décrite dans WO 98/21240, et est disponible sous le numéro d'accession AAC72302 dans Genbank.
Dans le cadre de la présente invention, on entend par région variable ou domaine variable d'un composé, une région ou domaine qui se rapporte aux domaines amino-terminaux de la chaîne lourde ou légère d'un anticorps. Le domaine variable de la chaîne lourde peut être appelé «VH». Le domaine variable de la chaîne légère peut être appelé «VL». Ces domaines sont généralement les parties les plus variables d'un anticorps et contiennent les sites de liaison à l'antigène. Ce composé peut prendre la forme d'un anticorps, notamment un anticorps monoclonal.
Une région variable de chaîne légère ou lourde (VL ou VH) consiste en une «région charpente» ou «framework» interrompue par trois régions hypervariables appelées régions déterminant la complémentarité ou CDR.
L'ensemble des 6 CDRs permet la fixation de l'anticorps à son antigène cible. Par exemple, l'anticorps CL1-R2 a comme CDRs les séquences SEQ ID No: 3 à 8 en accord avec la terminologie de CDR AbM (plus large et adaptée aux technologies de maturation d'affinité d'un anticorps). Ces CDRs sont présents dans les composés H5 et H7 de la présente invention.
Les composés selon l'invention présentent une excellente affinité pour leur cible, le CD160 humain et supérieure à celle du CL1-R2 ou à une forme chimérique de ce CL1-R2 (cf. Exemple 1).
De préférence, le composé de l'invention a pour domaine variable de chaîne lourde (VH) la séquence SEQ ID No: 11, et pour domaine variable de chaîne légère (VL) la séquence SEQ ID No: 14. Un tel anticorps correspond notamment à l'anticorps « H7 » cité dans l'exemple 1.
Dans une autre mise en œuvre de l'invention, le composé a pour domaine variable de chaîne lourde (VH) la séquence SEQ ID No: 11, et pour domaine variable de chaîne légère (VL) la séquence SEQ ID No: 13. Un tel anticorps correspond notamment à l'anticorps « H5 ».
Dans une autre mise en œuvre de l'invention, le composé a pour domaine variable de chaîne lourde (VH) la séquence SEQ ID No: 25, et pour domaine variable de chaîne légère (VL) la séquence SEQ ID No: 14. Un tel composé correspond notamment à l'anticorps « F04 ».
Dans une autre mise en œuvre de l'invention, le composé a pour domaine variable de chaîne lourde (VH) la séquence SEQ ID No: 26, et pour domaine variable de chaîne légère (VL) la séquence SEQ ID No: 14. Un tel anticorps correspond notamment à l'anticorps « D09 ».
Dans une autre mise en œuvre de l'invention, le composé a pour domaine variable de chaîne lourde (VH) la séquence SEQ ID No: Tl, et pour domaine variable de chaîne légère (VL) la séquence SEQ ID No: 14. Un tel anticorps correspond notamment à l'anticorps « A02 ».
Dans une autre mise en œuvre de l'invention, le composé a pour domaine variable de chaîne lourde (VH) la séquence SEQ ID No: 28, et pour domaine variable de chaîne légère (VL) la séquence SEQ ID No: 14. Un tel anticorps correspond notamment à l'anticorps « G05 ».
Dans une autre mise en œuvre de l'invention, le composé a pour domaine variable de chaîne lourde (VH) la séquence SEQ ID No: 29, et pour domaine variable de chaîne légère (VL) la séquence SEQ ID No: 14. Un tel anticorps correspond notamment à l'anticorps « D12 ».
Dans une autre mise en œuvre de l'invention, le composé a pour domaine variable de chaîne lourde (VH) la séquence SEQ ID No: 30, et pour domaine variable de chaîne légère (VL) la séquence SEQ ID No: 14. Un tel anticorps correspond notamment à l'anticorps « A09».
Dans une mise en œuvre particulière de l'invention, le composé est un anticorps monoclonal ciblant le CD160 humain, lequel a de préférence pour région constante, une région constante d'immunoglobuline (IgG), de préférence d'IgGl ou d'lgG4.
Par « domaine constant » ou « ou région constante» telle que définie ici, on entend une région constante dérivée d'un anticorps qui est codée par l'un des gènes de région constante d'immunoglobuline de chaîne légère ou lourde.
Par « chaîne légère constante » ou « région constante de chaîne légère » telle qu'utilisée dans le cadre de la présente invention, on entend la région d'un anticorps codé par les chaînes légères kappa (Ckappa) ou lambda (Clambda). La chaîne légère constante comprend typiquement un domaine unique et, comme défini ici, se réfère aux positions 108-214 de Ckappa, ou Clambda, où la numérotation est selon l'indice de l'UE (Kabat et al., 1991).
Par «chaîne lourde constante» ou «région constante de chaîne lourde», on entend ici la région d'un anticorps codé par les gènes mu, delta, gamma, alpha ou epsilon pour définir l'isotype de l'anticorps comme IgM, IgD, IgG, IgA, ou IgE, respectivement. Pour les anticorps IgG de longueur totale, la chaîne lourde constante, telle que définie ici, se réfère à l'extrémité N-terminale du domaine CH1 à l'extrémité C-terminale du domaine CH3, comprenant ainsi les positions 118-447, où la numérotation est selon l'indice UE.
De préférence, la région constante du composé ciblant le CD160 humain selon l'invention est une région constante d'IgG. Elle peut être choisie parmi les régions constantes d'IgGl, lgG2, lgG3 et lgG4.
De préférence, la région constante du composé ciblant le CD160 humain selon l'invention est une région constante d'IgGl (SEQ ID No:16), ou IgGl E345K (SEQ ID No:43) ou E430G (SEQ ID No:44) pour les indications en oncologie ou d'lgG4 S228P/R409K (SEQ ID No: 15) ou lgG4 -(S228P/R409K)+L235E (SEQ ID No: 31) ou IgGl N297Q ou bien les variantes lgG4-(S228P/R409K)+H310A/H435Q (SEQ ID No: 32), lgG4(S228P/R4O9K)+I253A (SEQ ID No: 33), lgGl-(N297Q)+H310A/H435Q (SEQ ID No: 34) et lgGl-(N297Q)+l253A (SEQ ID No: 35) et leurs mutants aglycosylés pour l'ophtalmologie.
La sous-classe lgG4 et ses variantes présente une très faible affinité pour les effecteurs impliqués dans la cascade du complément et les récepteurs Fc gamma (ou FcR incluant FcgRIla, FcgRIlla et FcgRI), ce qui la rend avantageuse dans les cas où l'effet CDC (cytotoxicité dépendante du complément ou Complement-Dependent Cytotoxicity) et/ou l'effet ADCC (cytotoxicité dépendante d'anticorps modulé par les cellules ou AntibodyDependent Cell-mediated Cytotoxicity) n'est pas recherché et où on souhaite limiter les risques éventuels de toxicité de l'anticorps obtenu.
A contrario, la sous-classe IgGl et ses variantes est responsable d'une forte activité ADCC et/ou CDC, ce qui la rend avantageuse pour augmenter la cytolyse des cellules cibles mais avec un risque de toxicité plus important.
Dans une mise en œuvre de l'invention, le composé est un anticorps monoclonal ciblant le CD160 humain ayant pour domaine constant de chaîne légère une séquence choisie parmi SEQ ID No: 22 (polymorphisme Km3 correspond à Alal53/Vall91), SEQ ID No: 23 (polymorphisme Kml correspond à Vall53/Leul91) et SEQ ID No:24 polymorphisme Kml,2 correspond à Alal53/Leul91) et a pour domaine constant de chaîne lourde une séquence choisie parmi SEQ ID No: 15, SEQ ID No: 16, SEQ ID No: 31, SEQ ID No: 32, SEQ ID No: 33, SEQ ID No:34 et SEQ ID No: 35, et leurs mutants aglycosylés.
Plus préférentiellement, le composé selon l'invention ciblant le CD160 humain a pour domaine constant de chaîne lourde une séquence choisie parmi SEQ ID
No: 15, SEQ ID No: 16, SEQ ID No: 31, SEQ ID No: 32, SEQ ID No: 33, SEQ ID No:34, SEQ ID No: 35, et leurs mutants aglycosylés, et pour domaine constant de chaîne légère la séquence SEQ ID No: 22.
Un composé selon l'invention peut être monospécifique ou monofonctionnel pour le CD160, en étant monovalent (un seul site de liaison à un antigène, en l'occurrence le CD160 humain), ou en étant multivalent (au moins 2 sites de liaison au CD160 humain).
Un composé selon l'invention peut également être un composé multispécifique, par exemple : un anticorps bispécifique (bsab) ou une molécule similaire. Les composés multispécifiques sont des composés qui ont des spécificités de liaison pour au moins deux épitopes différents, typiquement non chevauchants. Ces épitopes peuvent être sur des cibles identiques ou différentes. Si les épitopes sont sur des cibles différentes, ces cibles peuvent être sur la même cellule ou sur des cellules ou des types de cellules différents. Dans certains modes de réalisation, l'une des spécificités de liaison est CD160, en particulier le domaine extracellulaire de CD160 humain, et l'autre est pour un tout autre antigène.
Un composé multispécifique selon l'invention peut prendre la forme d'anticorps bispécifiques au format d'IgG (i.g. bsab, Fabs orthogonaux, strand exchange engineered domain SEED ou Seed-body), d'IgGs avec des fragments Fabs ou ScFvs rajoutés (i.g. : DVD Igs, Dual domain double head antibodies, Di-diabodies, Affibodies, Biomurex, Fynomab), de bsabs basés sur des fragments d'anticorps (e.g. fragments d'anticorps bispécifiques, dimères Fv, BITEs, ImmTACS, DART, BIKEs), d'anticorps trispécifiques, de bsab basés sur des protéines de fusion (e.g. scFV-fusions BsAb), d' anticorps agrégés, etc.
Les épitopes ciblés par les composés multi spécifiques (i.e. capables de se lier spécifiquement au CD160 et à au moins un autre antigène que le CD160) ou ciblés par l'anticorps différent du composé selon l'invention et présent dans une composition selon l'invention peuvent être présents dans les antigènes suivants qui sont des cibles dont l'activation ou la neutralisation peuvent avoir des rôles clés dans l'inhibition de l'angiogénèse ou de l'inflammation associée à ce processus d'angiogenèse comme les molécules suivantes : le VEGF (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C ou VEGF-D) ainsi que le PIGF (placental growth factor), le VEGF-R2, l'angiopoiétine 2; l'angiopoiétine like 4, le CD200, le CD200R, les PDGF (PDGF-AA, PDGF-B, PDGF-BB, PDGF-CC ou PDGF-DD), les PDGF-R, les FGF tels que le FGF2 ou FGF beta, la bêta-amyloïde, la sphingosine-l-phosphate (SIP),
C'5, l'IL6, MER TK, le CD115, le TNF alpha, l'IL8, HGF, le TGF beta, IGF1, IL1, IL2, EGF, KGF, G-CSF, GM-CSF, les intégrines apha-v beta-3 et alpha-v beta-5, le CD146 transmembranaire et soluble ; les métalloprotéases (comme les MMP 1, 2 et 9 et les MT1-MMP); TIMP-2; l'angiogénine ; le facteur de croissance de cellules endothéliales (PD-ECGF); le facteur d'activation plaquettaire; la prostaglandine E; la pléiotropine ou les CMH de classe II, HP59 ou CM101 ; ou des cibles dont l'activation ou la neutralisation peuvent avoir des rôles clés dans la ré-activation des lymphocytes T, dont l'immuno suppression est corrélée avec un mauvais pronostic et une progression du cancer, comme les molécules suivantes le CD3, le CD25, CD28, le CD40, PDI, CTLA4, 4-1BB, LAG-3 ou ICOS, ou des molécules dont le ciblage permettrait de rapprocher des acteurs clefs du système immunitaire des cellules CD160 positives telles que les molécules suivantes le CD16, le CD3 le CD47 ou encore des molécules dont le ciblage renforcerait la spécificité de l'anticorps bsabs pour les lymphomes B, comme les molécules suivantes : le CD20, le CD19, le CD5, le CD200 pour les CLLs, le CD180 pour les lymphomes de la zone marginale (MZL) et le CD148 pour les lymphomes du manteau ou bien encore des antigènes permettant une augmentation de la stabilité et de la pharmacocinétique du scFv, Fab ou tout autre dérivé, comme la sérum albumine humaine (HSA), CD180, CD200,, CD40, CD20, CD37, CD38, CD148, CD180 et tout autre antigène spécifique des lymphomes de type B.
Par « fragments » et « dérivés » d'un composé ciblant le CD160 humain selon l'invention, on entend respectivement des fragments et dérivés qui ont conservé l'affinité de liaison et la spécificité dudit composé pour le CD160 humain. De tels fragments et dérivés sont des équivalents fonctionnels dudit composé. Ils se lient substantiellement au même épitope que ledit composé, et/ou peuvent être compétitifs avec ledit composé pour se lier au CD160 humain, et ils conservent la spécificité de liaison au CD160 humain, qui est suffisante pour que les fragments ou dérivés ne se lient pas à des récepteurs HLA autres que le CD160 humain.
Les « fragments » et « dérivés » selon l'invention présentent une affinité similaire au composé de l'invention pour le CD160.
Par fragment d'un composé ciblant le CD160 humain selon l'invention, on entend de préférence un format tel qu'un Fab, un Fab' (réduction d'un F(ab')2, par exemple avec du béta-mercaptoéthanol), un F(ab')2 ou un fragment de chaîne lourde ou de chaîne légère. Les fragments ciblant le CD160 humain selon l'invention comprennent au moins un domaine variable de chaîne lourde (VH) et/ou un domaine variable de chaîne légère (VL) tels que définis ci-dessus.
Dans une mise en œuvre particulière de l'invention, le composé est un fragment comprenant une chaîne légère (VL) définie par SEQ ID No:57 et une chaîne lourde comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID No. 36, SEQ ID No. 37, SEQ ID No.38.
Par « dérivé » d'un composé ciblant le CD160 humain selon l'invention, on entend un format de ce composé comprenant au moins un domaine variable de chaîne lourde (VH) et/ou un domaine variable de chaîne légère (VL), fusionné à au moins une séquence différente de la séquence naturelle (par exemple un linker telle que la SEQ ID No.39 ou une séquence d'une autre protéine, notamment un récepteur ou un de ses fragments). Ledit dérivé a une affinité de liaison au CD160 humain comparable à celle de composé entier selon l'invention, ainsi qu'une spécificité de liaison au CD160 humain comparable à celle dudit composé. Dans le cadre de l'invention, le terme « comparable » signifie que l'affinité ou la spécificité de liaison peuvent varier dans une limite de 25%. Les dérivés peuvent être obtenus selon les connaissances générales de l'homme du métier, par réaction enzymatique, synthèse et/ou génie génétique.
Dans une mise en œuvre particulière de l'invention, le composé est un fragment comprenant une chaîne légère (VL) définie par SEQ ID No:57 et une chaîne lourde comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID No. 40 ou SEQ ID No.41.
Un dérivé selon l'invention peut être monovalent (un seul site de liaison à un antigène, en l'occurrence le CD160 humain), ou multivalent (au moins 2 sites de liaison à un antigène ou à plusieurs antigènes, dont au moins le CD160 humain). Des dérivés multivalents préférés incluent les dérivés bivalents, trivalents et tétravalents.
Dans un mode de réalisation de l'invention, le dérivé selon l'invention est un composé multispécifique ou multifonctionnel, par exemple un anticorps bispécifique (bsab) ou une molécule similaire dont les épitopes peuvent être sur des cibles identiques ou différentes. Dans un mode de réalisation, les anticorps bispécifiques peuvent se lier à deux épitopes différents de CD160. Dans un autre mode de réalisation les anticorps bispécifiques peuvent se lier à un épitope de CD160 et un épitope d'un antigène différent de CD160. Les épitopes d'intérêt ont été décrits plus haut dans la présente description.
Les dérivés d'anticorps Fv monocaténaire ou scFv comprennent les domaines VH et VL de l'anticorps, ces domaines étant présents dans une seule chaîne polypeptidique.
Un autre dérivé selon l'invention est un scFv multivalent monospécifique, qui peut être obtenu en liant au moins deux dérivés monovalents entre eux. La liaison peut être covalente ou non covalente. La présence de plusieurs sites de liaison au CD160 augmente la capacité de liaison à cet antigène.
Un autre dérivé selon l'invention est un scFv multivalent multispécifique.
Parmi les autres dérivés, on peut citer les diabodies qui désignent de petits dérivés d'anticorps avec deux sites de liaison à l'antigène, lesquels fragments comprennent un domaine variable de chaîne lourde (VH) relié à un domaine variable de chaîne légère (VL) dans la même chaîne polypeptidique (VH et VL). Les scFv multivalents sont de préférence choisis parmi les diabodies (qui sont bivalents et sont composés de 2 scFv), les triabodies (qui sont trivalents et sont composés de 3 scFv) et les scFv tétramériques.
Un autre dérivé multivalent selon l'invention est un dimère, chaque monomère comprenant un scFv lié à un fragment de chaîne lourde, par exemple à un fragment CH3 ; cela correspond à un minibody. Les 2 scFv présents dans le minibody peuvent être identiques (le minibody est alors monospécifique, car il se lie uniquement au CD160 humain) ou différents (le minibody est alors bispécifique, car il se lie d'une part au CD160 humain, mais également à un autre antigène).
Un autre dérivé multivalent selon l'invention est également un dimère, chaque monomère comprenant un scFv lié à des fragments de chaîne lourde, par exemple aux fragments CH2 et CH3. Une fois encore, les 2 scFv présents peuvent être identiques ou différents. Dans ce dernier cas, on parle d'anticorps bispécifiques.
Un autre dérivé multivalent selon l'invention est un fragment d'anticorps consistant en un domaine variable de chaîne lourde monomérique unique. Cela correspond à un single-domain antibody (VHH ou sdAb, appelé Nanobody par Ablynx).
Comme exemple de dérivés anti CD160 monospécifiques tétravalents, on peut aussi citer la molécule anti CD160 dans laquelle en amont de chaque région variable de la chaîne lourde, on vient dupliquer les régions VH et CH1 comme décrit dans la SEQ ID N°42 dans l'exemple 3. On peut alors co-exprimer en cellules de mammifères les gènes codant pour la SEQ ID N :42 et la chaîne légère anti CD160 définie par la SEQ ID N°57 pour obtenir une version fonctionnelle d'anti CD160 tétravalente monospécifique fonctionnelle.
ίο
Un autre dérivé selon l'invention est obtenu en générant un IgM de façon recombinante en utilisant l'une des versions de couples chaîne légère /chaîne lourde liant le CD160 humain, murines chimériques, selon l'invention.
Dans un autre mode de réalisation, l'invention a pour objet une composition comprenant au moins un composé selon l'invention. Dans une mise en œuvre particulière la composition comprend au moins un composé selon l'invention et au moins un anticorps différent du composé selon l'invention.
Dans une mise en œuvre de l'invention, le composé ou la composition tels que décrit plus haut sont utilisés comme médicament.
Le composé ciblant le CD160 humain selon l'invention, l'un de ses fragments et/ou l'un de ses dérivés, peut être présent dans une composition pharmaceutique ou médicament. Cette composition pharmaceutique comprend de façon préférée un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Le terme « pharmaceutiquement acceptable » se réfère à un matériel non toxique qui est compatible avec un système biologique tel qu'une cellule, une culture cellulaire, un tissu ou un organisme, et qui n'interfère pas avec l'efficacité de l'activité biologique des ingrédients actifs de la composition. Les caractéristiques du véhicule dépendront du mode d'administration.
La composition pharmaceutique ou médicament peut se présenter sous toute forme administrable à un patient, et inclut notamment les solutions, suspensions, poudres lyophilisées, capsules et comprimés.
La composition pharmaceutique ou médicament peut se présenter sous une forme compatible avec une injection, i.e. une injection locale, i.e. une injection intra vitréale, une administration à travers la muqueuse, une inhalation, une administration orale et plus généralement toute formulation appropriée pour le but visé.
La présente invention a également pour objet un produit comprenant un composé tel que décrit dans la présente demande et un anticorps se liant spécifiquement à au moins un autre antigène qui peut être identique ou différent du CD160 (notamment à un des épitopes des antigènes décrits ci-dessus) pour une utilisation simultanée, séparée ou séquentielle dans le traitement et/ou d'une prévention d'une pathologie provoquant une néovascularisation notamment choisie parmi les pathologies oculaires néovasculaires, la rétinopathie diabétique primaire ou la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA), le diabète, la cécité diabétique, la polyarthrite rhumatoïde, la prééclampsie, l'éclampsie ou les cancers
Par « prévenir une pathologie », on entend la prévention de l'apparition de cette maladie chez un sujet, en particulier un humain, chez qui la maladie ne s'est pas encore déclarée.
Par « traiter une pathologie », on entend l'inhibition de cette maladie, i.e. l'arrêt de son développement, sa régression, ou la disparition des symptômes et conséquences de la maladie, ou encore la disparition des causes de la maladie.
Plus préférentiellement, le composé selon ou la composition selon l'invention sont utilisés comme anti-angiogénique, immunomodulateur et/ou agent cytotoxique.
L'invention a plus particulièrement pour objet un composé selon l'invention pour son utilisation comme anti-angiogénique.
Dans le cadre de la présente invention, un «agent anti-angiogénique» ou «inhibiteur d'angiogenèse» désigne un composé qui inhibent l'angiogenèse, la vasculogenèse, ou encore une perméabilité vasculaire indésirable, soit directement, soit indirectement.
De préférence, le composé selon l'invention peut être utilisé pour prévenir et/ou traiter les pathologies néovasculaires, de préférence les pathologies oculaires néovasculaires, le diabète, la cécité diabétique, la rétiopathie diabétique primaire ou la dégénérescence maculaire induite par l'âge, la polyarthrite rhumatoïde, la pré-éclampsie, l'éclampsie ou les cancers.
Par «pathologies oculaires néovasculaires » on entend toutes les maladies ou troubles oculaires néovasculaires. Plusieurs troubles oculaires sont associés à une angiogenèse pathologique. Par exemple, le développement de la DMLA est associé à un processus appelé néovascularisation choroïdienne (NCV). L'œdème maculaire diabétique (OMD) est un autre trouble oculaire avec une composante angiogénique. LOMD est la cause la plus répandue de perte de vision modérée chez les patients atteints de diabète et est une complication commune de la rétinopathie diabétique, une maladie affectant les vaisseaux sanguins de la rétine.
Un autre trouble oculaire associé à une angiogenèse anormale est l'occlusion de la veine rétinienne centrale (OVRC). LOVRC est causée par l'obstruction de la veine centrale rétinienne qui conduit à une accumulation de sang et de liquide dans la rétine. La rétine peut également devenir ischémique, entraînant la croissance de nouveaux vaisseaux sanguins inappropriés qui peuvent causer une perte de vision supplémentaire et des complications plus graves.
On pourra citer aussi mais de façon non exhaustive d'autres pathologies oculaires néovasculaires notamment choisies parmi la maladie de Norrie; toutes les formes de néovascularisations choroïdales, vasculopathies polypoïdale rétino-choroïdes, néovaisseaux choroïdiens fovéolaires rétro associés à la myopie et la dystrophie de Sorsby ;les mélanomes uvéaux; et la rubeosis iridienne et le glaucome néovasculaire, la prolifération angiomateuse rétinienne (RAP), les néovascularisations survenant suite à des complications de greffes de cornée et/ou des infections de la cornée et/ou agressions cornéennes de l'environnement choisies parmi les infections pathogènes et des brûlures chimiques; ou toutes les formes de rétinopathies, y compris les ischémies diabétiques et oedémateuses, la rétinopathie diabétique prématurée, les formes prolifératives et non prolifératives des rétinopathies, l'œdème maculaire cystoïde, toutes les formes de dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA), notamment la forme humide, toutes les dégénérescences maculaires vitelliformes y compris la maladie de Best; les angiomes oculaires comme la maladie de Von Hippel-Lindau; La maladie de Eale; la maladie de Coast.
Par « diabète », on entend tout type de diabète, notamment le diabète sucré (en relation avec l'insuline) et le diabète insipide (en relation avec l'hormone antidiurétique). Parmi les formes de diabète sucré, on peut citer le diabète de type 1 (insulino-dépendant), le diabète de type 2 (diminution de sensibilité à l'insuline), le diabète gestationnel ou le diabète néonatal. Parmi les formes de diabète insipide, on peut citer le diabète central, dû à une faible synthèse de l'hormone antidiurétique par l'hypophyse, ou le diabète périphérique, dû à une faible sensibilité du rein à l'hormone antidiurétique.
Par « cancers », on entend toute prolifération anormale de cellules. Les cancers sont notamment choisis parmi les cancers du sein, le cancer colorectal, de la vessie, du poumon et de la prostate.
Un composé anti-angiogénique de l'invention pourrait être utilisé notamment dans le traitement des cancers où la composante de néovascularisation est un vecteur important de la propagation de la maladie. On cite notamment le cancer du sein, le cancer colorectal, le cancer du poumon non à petites cellules, le lymphome non hodgkinien, les tumeurs génito-urinaires comme le cancer du rein, le cancer de la prostate, le cancer de la vessie ou le carcinome rénal, le cancer du colon, le lymphome d'Hodgkins le cancer du foie, le cancer du col, le mélanome, le cancer de l'ovaire, le mésothéliome et le glioblastome.
Dans une mise en œuvre particulière, le composé de l'invention peut être utilisé comme agent cytotoxique.
Un «anticorps cytotoxique» ou «agent cytotoxique» ou « agent antitumoral » désigne un anticorps monoclonal thérapeutique (mAb) ou un de ses fragments ou dérivés qui induit une cytotoxicité induite par des cellules effectrices dépendante d'anticorps (ADCC), ou bien une cytotoxicité dépendante du complément, ou encore la phagocytose à médiation cellulaire dépendante d'anticorps (ADCP) et l'induction directe de l'apoptose dans les cellules tumorales.
Un autre dérivé selon l'invention est un composé avec une activité cytotoxique améliorée. Un composé avec une cytotoxicité améliorée peut être obtenu en greffant les chaînes variables des anti CD160 sur des formats d'IgG avec des glycosylations optimisées des régions Fc (par exemple une défucosylation) ou en modifiant par ingénierie la séquence en acides aminés du Fc de l'anticorps d'intérêt par exemple en introduisant le triple mutant DLE (S293D/A330L/I332E). Un tel composé peut aussi être obtenu en générant un format du composé selon le format Hexabody, ou bien BITE ou bien encore BiKE (avec une valence dirigée contre le CD160 et une seconde valence dirigé contre le CD16) ou TriKE. Des exemples de ces améliorations sont cités en exemple 03 de cette invention. Il est possible aussi de créer des composés de l'invention dans lesquels un ou plusieurs résidus d'un anticorps sont substitués par des résidus de cystéine et les groupements thiols libres peuvent être utilisés de façon à créer des d'agents thérapeutiques tels que les immunotoxines, les radio-immunoconjugués ou encore des ADC (Antibody-Drug Conjugates).
Dans un autre composé bispécifique bivalent de l'invention, il est aussi possible d'utiliser le CD160 en remplacement du CD16 comme valence dans un anticorps engageant les cellules NK d'une part et un antigène tumoral sur l'autre valence non CD160. En effet le CD160 est aussi un récepteur activateur exprimé sur toutes les cellules NK naturelles (voir exemples 15 et 16 de cette invention). L'interaction de ce composé avec le CD160 des cellules NKs aurait alors pour conséquence l'activation des cellules NKs ainsi que le rapprochement de ces cellules effectrices de leur cible tumorale.
Un autre dérivé selon l'invention est un composé avec une demi vie systémique améliorée pour améliorer son activité cytotoxique.
Le composé ou la composition selon l'invention peuvent être utilisés pour le traitement des cancers hématologiques ou des tumeurs solides. Des exemples de composés cytotoxiques selon l'invention sont présentés dans les exemples 3 et 4.
On sait que le CD160 est un antigène spécifique de certaines cellules tumorales en particulier dans la majorité des leucémies lymphoïdes chroniques B (LLC-B ainsi que des leucémies à tricholeucocytes (HCL)), et avec une expression plus hétérogène en fonction des patients dans des cas de lymphomes des zones marginales et dans les lymphomes du manteau. Mais le CD160 est un antigène qui ne s'exprime pas du tout sur les cellules B normales circulantes. On peut donc utiliser des anticorps anti CD160 pour tuer spécifiquement ou inhiber la croissance tumorale de ces lymphomes B.
Le composé de l'invention peut donc être utilisé dans le traitement des cancers hématologiques, notamment la leucémie lymphoïde chronique (LLC), la leucémie à tricholeucocytes, la leucémie aiguë myéloïde (LAM), le myélome multiple (MM), ou dans le traitement des tumeurs solides notamment le mélanome, le carcinome rénal, le cancer du poumon et notamment le cancer du poumon épidermoide, le neuroblastome, le carcinome ovarien, le cancer du sein, le cancer gastrique.
Le composé de l'invention peut aussi être utilisé dans le traitement des cancers hématologiques en combinaison avec au moins un autre anticorps comme les anticorps anti-CD20 notamment le rituximab, l'ofatumumab, l'obinutuzumab, l'ocaratuzumab, ou le veltuzumab, les anticorps anti-CD37, les anticorps anti-CD38 ou les anticorps anti-CD40.
Le composé anti CD160 de l'invention peut être utilisé pour moduler l'activité immunomodulatrice de CD160 sur les cellules NKs et T de l'immunité dans le traitement de cancers répondant favorablement aux inhibiteurs de points de contrôle immunologiques ou « immune checkpoints » notamment le mélanome, le cancer du poumon non-à petites cellules, les tumeurs génito-urinaires comme les cancers de la vessie ou le carcinome rénal, le cancer du colon, le lymphome d'Hodgkins, ou le cancer du sein.
Le terme activité CD160 immunomodulatrice désigne une ou plusieurs activités immunorégulatrices associées à CD160.
Les termes «module», «immunomodulateur» et leurs apparentés font référence à une réduction ou à une augmentation de l'activité de CD160 associée à une régulation positive des réponses de lymphocytes T ou des cellules NK due à son interaction avec un anticorps anti-CD160, où l'augmentation est relative à l'activité de CD160 en l'absence du même anticorps. Une réduction ou une augmentation d'activité est de préférence d'au moins environ 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou plus. Lorsque l'activité CD160 est réduite, les termes modulateur et module sont interchangeables avec les termes inhibiteur et inhibe. Lorsque l'activité CD160 est augmentée, les termes «modulateur» et «module» sont interchangeables avec les termes «activateur» et «active».
L'activité de CD160 peut être déterminée quantitativement en utilisant des mesures d'activation des NKs (par le dosage d'un marqueur tel que le CD69) ou de sécrétion de cytokines telle que l'IFN gamma comme décrit respectivement dans les exemples 14 et 15 ou encore de mesure de la prolifération de cellules T ou de sécrétion de cytokines.
La combinaison d'immunomodulateurs sera la clé pour améliorer les réponses cliniques aux inhibiteurs de points de contrôles immunologiques.
Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, les composés de l'invention sont combinés avec l'un de ces immunomodulateurs préférentiellement avec un anti-PD1, un anti-CTLA-4 ou un anti-PD-Ll dans une composition, où ladite composition est utilisée comme immunomodulateur.
Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le composé anti CD160 est utilisé comme immunomodulateur pour le traitement des infections bactériennes pour stimuler la défense contre des bactéries pathogènes infectant l'intestin (notamment Escherichia coli, Clostridium difficile) ou les poumons (notamment Streptococcus pneumoniae en activant les cellules lymphoïdes innées intra-épithéliales exprimant le CD160.
L'invention a également pour objet un acide nucléique codant pour un composé selon l'invention, l'un de ses fragments ou l'un de ses dérivés. Par « acide nucléique », on entend une séquence d'ADN, d'ADNc ou d'ARN.
Un autre objet de l'invention est un vecteur d'expression comprenant le dit acide nucléique, ou une cassette d'expression comprenant ledit acide nucléique. Selon l'invention, les vecteurs d'expression appropriés peuvent comprendre au moins un élément de contrôle d'expression fonctionnellement lié à l'acide nucléique. Les éléments de contrôle d'expression sont insérés dans le vecteur et permettent de réguler l'expression de l'acide nucléique.
Un autre objet de l'invention est une cellule recombinante comprenant un vecteur d'expression tel que décrit ci-dessus, ou un ou plusieurs acide(s) nucléique(s) tel(s) que décrit(s) ci-dessus. Selon l'invention, des exemples de cellules qui peuvent être utilisées sont des cellules eucaryotes, comme les cellules animales, végétales, d'insectes et de levure ; et des cellules procaryotes, comme E. coli. Les moyens par lesquels le vecteur portant le gène peut être introduit dans les cellules comprennent notamment la microinjection, l'électroporation, la transduction ou la transfection à l'aide de DEAEdextran, la lipofection, le phosphate de calcium ou d'autres procédures connues de l'homme de l'art. Dans un mode de réalisation préféré, les vecteurs d'expression eucaryotes qui fonctionnent dans les cellules eucaryotes sont utilisés.
De tels vecteurs et acides nucléiques peuvent être utilisés en thérapie génique ou cellulaire, afin de faire produire la protéine d'intérêt, en l'occurrence le composé selon l'invention, par l'organisme hôte.
La présente invention a également pour objet une méthode de traitement d'un sujet, de préférence un humain, dans laquelle une quantité thérapeutiquement efficace d'un composé selon l'invention est administré audit sujet. Le composé selon l'invention est donc administré en une quantité thérapeutiquement efficace. Une quantité thérapeutiquement efficace correspond à une quantité suffisante pour prévenir et/ou traiter la pathologie néovasculaire visée. Cette quantité peut varier avec l'âge, le sexe du sujet et le stade de la maladie et sera déterminée par l'homme du métier. Une quantité thérapeutiquement efficace peut varier entre 0.01 mg/kg et 50 mg/kg, préférablement entre 0.1 mg/kg et 20 mg/kg, et plus préférablement entre 0.1 mg/kg et 2 mg/kg, en une ou plusieurs administrations quotidiennes, pendant un ou plusieurs jours.
Le mode d'administration peut être par injection ou par perfusion graduelle. L'injection peut être intraveineuse, intra-péritonéale, intramusculaire, sous-cutanée, transdermale, subconjonctivale, intra-oculaire ou intra-vitréenne. Pour une injection subconjonctivale ou intra-vitréenne, la quantité thérapeutiquement efficace du composé selon l'invention peut être comprise entre 0.1 mg et 10 mg.
Les préparations pour une administration parentérale peuvent inclure des solutions aqueuses ou non-aqueuses stériles, des suspensions ou des émulsions. Des exemples de solvants non-aqueux sont le propylène glycol, le polyéthylène glycol, des huiles végétales, telle que l'huile d'olive, ou des esters organiques injectables tels que l'éthyl oléate. Des véhicules aqueux comprennent l'eau, des solutions alcool/eau, des émulsions ou des suspensions. Les préparations pour une administration parentérale peuvent également inclure des sucres et/ou des sels.
Le composé selon l'invention peut être marqué. Des exemples de marqueurs comprennent les toxines, les enzymes, les radio-isotopes, les composés fluorescents, les métaux colloïdes, les composés chimioluminescents, et les composés bioluminescents. Les méthodes de liaison d'un marqueur à un anticorps sont bien connues de l'homme du métier.
Une autre technique de marquage consiste à coupler l'anticorps à des haptènes de faibles poids moléculaire, ces haptènes pouvant être spécifiquement modifiés au moyen d'une seconde réaction. Des exemples d'haptènes sont la biotine, qui réagit avec l'avidine, ou le dinitrophénol, le pyridoxal ou la fluorescéine, qui peuvent réagir avec des anticorps spécifiques anti-haptènes.
L'invention est maintenant illustrée par les exemples suivants.
Bref descriptif des figures :
Figure 1 : Liaison sur CHO-hCD160 vs CHO WT des candidats H7 et de ses variants A) au format IgGl et IgGl E345K B) au format lgG4 et lgG4 H310A-H435Q
Figure 2 : Evaluation de l'efficacité d'un anticorps anti-CD160 au format lgG4 (ELB01101) en comparaison avec Aflibercept (Eylea ®) dans un modèle de néovascularisation cornéale chez le rat.
Figure 3: Impact de l'anti CD160 H7 lgG4 (ELB01101) sur l'évolution du Nombre total de lésions cliniquement pertinentes dans un modèle de singes de néo vascularisation choroïdienne induite au laser (score combiné des grades 3 and 4 / 108 impacts laser). Le nombre total de lésions induites au laser était de 108 (correspondant à 12 yeux avec 9 impacts laser par yeux) pour les animaux traités avec l'anti CD160 (H7 lgG4 ELB 01101) ou avec le contrôle véhicule.
Figure 4: Impact de l'anti CD160 H7 (ELB01101) sur la cicatrisation des lésions induites au laser dans un modèle singe de néo-vascularisation choroïdienne.
L'état de cicatrisation et l'ouverture des lésions ont été individuellement estimés par analyse immunohistochimique après marquage avec un anticorps dirigé contre le facteur de von willebrand.
Le pourcentage (%) de spots en cours de cicatrisation (c'est-à-dire recouvert par la membrane RPE) par comparaison au pourcentage (%) de spots ouverts avec ou sans cicatrices est donné.
Figure 5 : L'anticorps anti-CD160 H7 au format IgGl reconnaît les cellules tumorales CD160-positives de patients LLC.
Les PBMC isolés de 7 patients LLC ont été marqués avec les anticorps CL1R2 (IgGl murin anti-CD160), anti-CD160 H7 selon l'invention en format IgGl, ou BY55 (IgM murin anti-CD160), dans un panel CD19/CD5/CD3/CD56. Les cellules tumorales CD5+CD19+ ont été analysées pour mesurer l'intensité de fluorescence du marquage CD160. L'expression du CD160 est détectable sur tous les échantillons de LLC avec des intensités variables. L'anticorps H7 IgGl se lie efficacement sur les cellules tumorales dans 6/7 des échantillons de LLC examinés.
auto= auto-fluorescence des cellules ; isotype = IgGl ou IgM murin irrelevant, contrôle négatif
Figure 6 : L'anticorps anti-CD160 H7 au format IgGl tue les cellules exprimant le CD160 par un mécanisme d'ADCC.
Des cellules NK purifiées du sang d'un donneur sain ont été utilisées comme effectrices dans un test mesurant l'activité ADCC de l'anticorps anti-CD160 H7 IgGl. Les cellules-cibles E300-CD160 (lignée cellulaire humaine pré-B transfectée exprimant le CD160) ont été marquées par du CFSE, et incubées avec les cellules NK effectrices en présence de l'anticorps H7 IgGl ou d'un contrôle isotypique IgGl humain, aux ratios effectrices/cibles indiqués (1/1, 1/5 et 1/10). Les pourcentages de cellules-cibles tuées ont été mesurés par marquage au 7AAD et analyse par cytométrie en flux. Les pourcentages de cellules mortes doublement marquées 7AAD+CFSE+ sont indiqués dans le cadrant supérieur droit sur les dot-plots présentés.
Figure 7 : L'anticorps anti-CD160 H7 au format IgGl active les cellules NK.
A) L'anticorps H7 IgGl se fixe sur des cellules NK humaines. Des cellules NK ont été purifiées du sang d'un donneur sain à l'aide d'un kit Miltenyi (ref. 130-092-657) et d'un autoMACS™ (Miltenyi ref. 130-092-545). Après saturation des récepteurs Fc de surface cellulaire avec du fragment Fc d'IgG humaines (Rockland ref. 009-0103) pendant 15 min, 5.E5 NK ont été incubées 20 min à 4°C avec 0,25 pg d'anticorps H7 IgGi ou d'un IgGi humain (contrôle isotypique), couplés à la phycoérythrine à l'aide d'un kit de conjugaison d'anticorps Lynx ref. PE LNK021RPE) et un anticorps CD56-APC. Les histogrammes présentent les profils de fluorescence obtenus avec H7 IgGi (noir) ou le contrôle hlgGi (gris), analysés sur la population CD56-positive.
B) H7 IgGi induit la production d'interféron-gamma (IFN-γ) par les cellules NK. Des cellules NK purifiées du sang d'un donneur sain ont été cultivées pendant 24h dans des puits de plaques 96-puits (l.E+6 cellules par puits) seules ou en présence de l'anticorps H7 IgGi, ou d'un contrôle isotypique IgGl humain, concentrés à 1 or 10 pg/mL. L'IFN-γ a été dosé par ELISA dans les surnageants de culture. Les résultats présentés sont des moyennes de triplicats +/- sem.
C) H7 IgGi induit l'expression du marqueur d'activation CD69 sur les cellules NK. Dans la même expérience, les cellules NK ont été collectées après 24h de culture et marquées avec un anticorps anti-CD69 conjugué au fluorochrome APC. Les pourcentages de cellules CD69-positives ont été analysés par cytométrie en flux. Les moyennes (+/sem) ont été calculées à partir de triplicats.
Figure 8 : L'anticorps anti-CD160 H7 au format IgGl, mais pas lgG4, active les cellules NK.
Des cellules NK purifiées du sang d'un donneur sain ont été cultivées seules ou en présence des anticorps suivants concentrés à 5 pg/mL : H7 IgGl, H7 lgG4, leurs contrôles isotypiques respectifs IgGl ou lgG4 humains, ou les anticorps ELB01103, ELB01104 et ELB01106, variants issus de l'anticorps H7 au format lgG4. L'anticorps antiCD16 (Ebioscience cat#16-0166) est utilisé comme contrôle positif. Les cellules NK (5.1E+S par puits) ont été collectées après 24h de culture et marquées avec un anticorps antiCD69 conjugué au fluorochrome APC. Les pourcentages de cellules CD69-positives ont été analysés par cytométrie en flux (moyennes de triplicats +/- SD). L'anti-CD160 H7 au format IgGl induit l'expression du marqueur d'activation CD69 sur cellules NK, alors que le même anticorps au format lgG4 n'a pas d'effet. Les variants du H7 lgG4 (ELB01103, ELB01104 et ELB01106) ne présentent pas non plus d'effet activateur sur les cellules NK.
Figure 9 : Les variants issus de l'anticorps anti-CD160 H7 aux formats IgGl et E345K/lgGl ont une capacité accrue à activer les cellules NK
Des cellules NK purifiées du sang d'un donneur sain ont été cultivées pendant 24h dans des puits de plaques 96-puits (l.E+6 cellules par puits), seules ou en présence de l'anticorps anti-CD160 H7 IgGl, ou des variants ELB02102, ELB02103, ELB02104 (tous trois au format IgGl), ELB02112, ELB02113 ou ELB02114 (tous trois au format E345K/lgGl) produits par EIsaLys, à des doses de 0.001 à 10 pg/mL. Un IgGl humain à 10 pg/mL a été utilisé comme contrôle isotypique négatif, et un anti-CD16 (Ebioscience cat#16-0166) comme contrôle positif.
A) L'IFN-γ a été dosé par ELISA dans les surnageants de culture. Les résultats présentés sont des moyennes de triplicats +/- sem.
B) Les cellules NK ont été collectées et marquées avec un anticorps anti-CD69 conjugué au fluorochrome APC. Les pourcentages de cellules CD69-positives ont été analysés par cytométrie en flux. Les moyennes (+/- sem) ont été calculées à partir de triplicats.
L'ensemble de ces résultats montre que les trois variants du H7 au format IgGi (ELB02102, ELB02103, ELB02104) sont nettement plus puissants que l'anticorps H7 IgGi d'origine pour activer les cellules NK, avec une amélioration de 2 à 3 logs des EC50.
Les trois variants de H7 au format E345K/lgGi présentent une capacité encore augmentée pour induire la production d'IFN-γ, avec une amélioration supplémentaire de 2-logs des EC50 (4-logs par rapport à l'anticorps H7 IgGi d'origine).
Figure 10 : Les variants issus de l'anticorps anti-CD160 H7 aux formats IgGl et E345K/lgGl marquent efficacement les cellules NK et T CD8+.
Les PBMC (cellules mononucléées du sang périphérique) de deux donneurs de sang ont été analysés par cytométrie en flux après un immunomarquage avec des anticorps anti-CD45, CD3, CD4, CD8 et CD19 et avec les anticorps anti-CD160 indiqués (0,25 pg pour 5.E+S PBMC). Un IgGl humain irrelevant (hlgGl) a été utilisé comme contrôle négatif. Barres Non hachurées : donneur 1; barres hachurées : donneur 2.
Exemple 1 : Etude de la liaison des anticorps selon l'invention
La détermination et la comparaison des affinités de l'anti hCD160 murin CL1-R2 ou dans ses formes dérivées (H7 IgGl, H7 lgG4,, chimérique IgGl et chimérique lgG4 décrits dans le tableau 1) ont été effectuées en utilisant le principe de l'interférométrie de biocouche sur un instrument Octet K2 (Pall ForteBio) équipé avec des biocapteurs à fibres optiques de différents types suivant les expériences. La capacité des anticorps selon l'invention à se fixer sur leur cible a été étudiée par mesure de l'interaction protéine CD160 humaine /anticorps.
Pour cela, les anticorps anti CD160 humain monomériques de haute pureté (purifié protéine A puis par gel filtration) ont été préparés par des techniques bien connues de l'homme du métier. La région protéique correspondant à la forme soluble de la protéine recombinante CD160 humaine porteuse d'une étiquette C-terminale de 6 résidus histidine (de chez R&D SYSTEMS) est utilisée dans sa formulation commerciale.
Les affinités des différents candidats anti CD160 à tester ont été comparées à celle des chimériques et du CL1-R2.
Toutes les expériences ont été réalisées à 30°C dans le tampon de course recommandé par Fortebio (PBS avec 0,1% (p / v) de sérum-albumine bovine (BSA) et 0,02% (v / v) Tween-20). Ce tampon a également été utilisé pour la dilution des différents ligands et analytes. Les échantillons déposés dans une microplaque de 96 puits (cat # 738-0026, Dustcher) ont été agités à 1000 tours par minute.
La protéine CD160 comportant une étiquette de 6 résidus histidine et biotinylée est utilisée comme ligand sur biocapteur streptavidine et les composés selon l'invention anti-hCD160 (formats IgGl et lgG4) et anti-CD160 et chimériques comme analytes
Cette protéine hCD160-his a été biotinylée en utilisant la méthode EZ-Link sulfo-NHS-LC-biotin (Thermo Fisher Scientific) selon les recommandations du fournisseur et validée pour son homogénéité, l'absence d'agrégats et sa capacité à être reconnue par les anti CD160 aussi bien que la protéine non biotinylée. Des essais d'immobilisation avec différentes concentrations en protéines ont montré qu'une concentration de 10 nM était optimale. La protéine CD160 biotinylée a donc été immobilisée à une concentration de 0.3pg/mL (soit 10 nM) sur des biocapteurs streptavidine pendant 10 min. Une immobilisation typique résulte en un signal de 2 +/-0.3nm.
Les constantes cinétiques (KD, kon et kOff encore appelée Kdis) ont été déterminées pour chacun des anticorps purifiés (de masse moléculaire 150 kDa) par l'addition de 6 concentrations d'anticorps (de 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50 et lOOnM). Entre les mesures, les surfaces du biocapteur ont été régénérées en les exposant à 3 cycles de 5 sec en glycine 10 mM, pH 2, suivis de 5 sec dans du tampon de course. Les phases d'association et de dissociation ont été mesurées pendant 300 secondes. Toutes les mesures ont été corrigées pour la dérive de base en soustrayant un puits de référence avec un ligand soumis uniquement au tampon de course.
Les constantes de dissociation, les constantes de vitesse d'association (kon) et de dissociation (kdis) pour chaque anticorps ont été calculées en appliquant un modèle d'interaction 1:1, avec une modélisation mathématique de courbes (fit) globale (Rmax lié par le capteur) sur le logiciel d'analyse de données ForteBio 9.0. Les courbes qui ne pouvaient pas être modélisées de façon fiable à l'aide du logiciel (la plupart du temps avec un R2 full <0,925), généralement causées par liaison selon un mode hétérogène ont été exclues des analyses.
Pour chaque anti CD160, les constantes de dissociation (KD), les constantes de vitesse d'association (kon) et de dissociation (kdis), ainsi que la réponse de liaison ont été comparées pour des concentrations en anticorps anti-CD160 de 50 nM et sont reportées dans le tableau 1.
Tableau 1 : Mesure par interférométrie de Biocouche (BLI) de l'affinité de l'interaction CD160 recombinant humain /anti hCD160 pour l'anticorps murin CL1-R2, les anticorps chimérisés (aux formats IgGl (chlgGl) ou lgG4 (chlgG4) humain) et l'anticorps H7 (au format IgGl (H7 IgGl) ou lgG4 (H7 lgG4) humain).
AntihCD160 (lot) KD (nM) Kd Error (*1E-11) kon (ie+7 Ms) kon Error (*1E+03) kdis (ΙΕ °7s) kdis Error (* 1E05) KD gain (/ Kd parental CL1-R2) Réponse de liaison, à 50 nM d’anti CD160 (unité arbitraire nm)
H7 IgGl 4.00 2.83E- 11 5.87 3.06 2.35 1.12 3.75 1.01
chlgGl 14.3 16.5E- 11 2.08 1.94 2.97 2.06 1.07 0.41
H7 lgG4 4.49 5.39E- 11 3.50 2.65 1.57 1.47 3.34 0.60
chlgG4 14.8 1.52E- 10 2.18 1.83 3.23 1.92 1.04 0.41
CL1-R2 15.4 1.74E- 10 1.83 1.69 2.83 1.83 1 0.60
Les mesures d'affinité montrent ici clairement, et de façon inattendue, que les H7 au format IgGl et lgG4 ont une bien meilleure affinité pour le CD160 que le CL1-R2 murin et que leur forme chimérique respective. Le gain en KD (cf. KD gain colonne 8 tableau 1) par rapport au KD de l'anti CD160 parental CL1-R2 est de l'ordre 3.75 et 3.34 pour H7 au format IgGl et lgG4 humain respectivement. Pour une même concentration de 50 nM en anticorps, on notera aussi une meilleure réponse pour le H7 IgGl que pour H7 lgG4 et CL1-R2 et une réponse inférieure pour les deux anti-CD160 aux formats chimériques (colonne 9).
Il a aussi été vérifié que le H7 et le H5 (résultant de différentes combinaisons) se fixaient bien sur leur cible par étude de cytométrie de flux sur des cellules recombinantes E300-hCD160 sur-exprimant le CD160 humain et par ELISA sur protéine CD160 et sur peptide d'une séquence protéique nécessaire et suffisante pour qu'il y ait liaison de l'anticorps anti-hCD160 identifié par peptide scanning de la séquence du CD160 humain.
Le candidat H7 est le candidat choisi pour la suite des expériences, notamment pour être maturé en affinité et pour être dérivé en différents formats d'IgG ou de fragments d'IgG adaptés aux différentes indications cliniques ciblées.
Le candidat anti CD160 H5 défini par une VH SEQ ID N°ll et une VL SEQ ID N°13, différente de celle du H7 constitue un autre composé selon l'invention mais qui n'a pas été exemplifié.
Exemple 2 : Les variant de l'anticorps H7
Profil de liaison par ELISA, FACS et SPR d'un panel de variants de H7 sous forme de phages et des Fabs solubles produits en extraits périplasmiques de bactéries.
Afin d'obtenir des variants dérivés du candidat anti CD160 humanisé H7 une mutagenèse dirigée des résidus des régions spécifiques déterminant la complémentarité (CDR) des domaines variables des chaînes lourde et légère (VH et VL respectivement) de l'anticorps H7 a été combinée avec une sélection sur protéine et sur cellules CHO surexprimant le hCD160 par phage display des variants au format Fab.
Ainsi, des clones de phages ont été générés et ont aussi permis de produire des extraits périplasmiques de bactéries contenant des Fabs solubles non purifiés. Les clones individuels ont été sélectionnés pour leur capacité de liaison à la protéine CD160 humaine en ELISA et à des cellules exprimant le CD160 humain par FACS, et ce i) soit sous forme de protéines de fusion du gène lll-Fab exprimée à la surface du phage filamenteux soit ii) sous forme d'extraits périplasmiques contenant des fragments de Fabs solubles non purifiés. Les résultats des expériences dites phage ELISA et phage FACS sont reportés dans le tableau 2. Les clones individuels (sous forme d'extraits périplasmiques contenant des fragments de Fabs solubles) ont également été classés en fonction de leur constante cinétique de dissociation (kdis)Le résumé des données obtenues pour les 6 variants du H7 et sous forme d'extraits périplasmiques contenant des fragments de Fabs solubles non purifiés (PE ELISA et PE FACS) est donné dans le tableau 2.
D'un point de vue pratique, La liaison du phage au CD160 humain a été détectée en utilisant un anticorps conjugué anti-M13 HRP. La liaison du phage aux cellules exprimant CD160 a été détectée en utilisant un anticorps anti-M13-biotine de souris suivi de Streptavidine-PE.
Dans le phage ELISA, la plupart des phages ont pu lier la protéine CD160 humaine avec des valeurs de densité optique élevée (DO) à 450 nm (DO 450: 1,0-6,0) et avec un taux de succès de liaison de 83% (DO à 450 nm > 10 moyenne du bruit de fond). Il est important de remarquer que pour le phage H7 WT Fab les valeurs de DO 450 obtenues étaient aussi faibles que 0,06-0,07.
Des résultats similaires ont été obtenus à partir de l'essai phage FACS, où un taux de succès de 91% (clones avec plus de 5% de liaison sur des cellules exprimant CD160, 3 fois les valeurs vierges MFI et aucune liaison aux cellules CHO-S WT a été considéré positif). Comme dans le phage ELISA, les valeurs de liaison obtenues pour le phage FACS Fab H7 WT étaient beaucoup plus faibles comparées aux autres clones.
La liaison des clones sélectionnés (des tours de sélection sur protéine CD160 et sur des cellules CHO-CD160) en tant que Fab soluble a également été abordée par ELISA et FACS en utilisant des extraits périplasmiques (P.E). La liaison des Fabs solubles à la protéine CD160 humaine par ELISA a été détectée en utilisant un anticorps anti-c-myc suivi d'un anticorps anti-HRP conjugué à la souris. La liaison des Fabs solubles aux cellules CHO sur-exprimant le CD160 humain a été détectée en utilisant un anticorps anti-c-myc suivi d'un anticorps de chèvre conjugué anti-APC de souris. Les résultats des expériences ELISA et FACS à partir de Fabs exprimés à la surface des phages ou en extraits périplasmiques ont confirmé la capacité de liaison de chacun des clones maturés en affinité de H7 au CD160 humain.
Tableau 2 : Classe de variants de chaînes lourdes de H7 maturés en affinité sous forme de phages et des Fabs solubles produits en extraits périplasmiques de bactéries, clone identification, profil de liaison par ELISA, FACS et SPR.
Clone de phage anti CD160 Famille VH H7 n° VH Phage ELISA D.O 450nm sur CD 160biotinylée P.E ELISA D.O 450nm sur CD 160biotinylée Phage FACS (Binding %) P.E FACS (Binding %)
FJ1516MP02F04 1 SEQID No. 25 3.323 0.436 96.53 9.86
FJ1516MP02D09 2 SEQID No. 26 3.63 0.174 76.36 1.08
FJ1516MP02A12 3 SEQID No. 27 6 0.148 92.06 1.23
FJ1516MP02G05 4 SEQID No. 28 3.458 0.141 86.86 1.06
FJ1516MP02D12 5 SEQID No. 29 6 0.312 95.09 1.89
FJ1516MP02A09 6 SEQID No. 30 6 0.124 94.19 0.54
FJ1516MP02E07* WT 3.209 0.145 70.44 0.21
FJ1516MP02G12** WT 1.007 0.131 11.75 0.26
WT H7 obtenu dans le crible
Fab H7 WT control produit
Les séquences d'acides aminés des différents clones provenent de tours de sélection différents (FJ1516MP02 et FJ1516MP03) ont été extraites en utilisant le logiciel CLC Main Workbench. Les séquences Vk et VH mutantes ont été alignées séparément par rapport aux séquences Vk et VH H7 de référence. Tous les clones sélectionnés contiennent une séquence Vk correspondant à la séquence Vk du H7 WT. Pour la chaîne lourde, à partir de 156 séquences valides, six correspondaient également à la séquence VH du H7 WT. Toutes les autres séquences VH contenaient 2 à 6 mutations (telles que conçues dans la bibliothèque) par rapport à WT et ont été groupées dans 6 classes différentes (variant VH séquence 1 à 6) (voir colonne 2 famille de VH dans le tableau 2 cidessus).
Pour la suite des expériences de caractérisation, un panel contenant un clone représentatif de chaque variant VH différent pour la production de phage et de Fab soluble dans P.E a été sélectionné. La liste des représentants sélectionnés est donnée dans la colonne 1 du tableau 2 et leur famille de VH correspondant dans la colonne 2. Le clone représentatif de la classe 5 est le D12, celui de la classe 1 le F04 et celui de la classe 6 le A09. Les séquences en acides aminés VH des clones représentants les différentes classes 1 à 6 des variants de l'anti CD160 H7 sont mentionnées dans le tableau 2.
L'alignement des séquences protéiques des régions VH de ces 6 classes de variants de H7 a montré des constantes communes entre les différentes classes de variants dans les positions des résidus mutés et dans la nature des mutations introduites.
Mesure d'interaction avec le CD160 humain par SPR des 6 Fabs variants de H7 en utilisant des Fabs solubles produits en extraits périplasmiques bactériens
La capacité de liaison des variants de H7 a également été testée par résonance plasmonique de surface (SPR). Pour cela un Biacore 3000 (GE Healthcare) a été utilisé. 50 pg / ml de CD160 humain (R & D System) dans un tampon d'acétate pH 4,5 ont été immobilisés sur une puce CM5 (GE Healthcare) à 1250-2000 unités de résonance (RUs). L'intégrité du CD160 humain immobilisé a été confirmée en utilisant l'IgGl antihuCD160 H7. Pour les mesures cinétiques, on injecte dans du PBS, avec un tampon P20 Biacore à 25 ° C, un débit de 30 μΙ / min, à deux reprises des concentrations en cascade d'ECD160 humain avec des dillutions au demi (0,15 μΜ -10 μΜ).
Les conditions de régénération ont été testées et 10 pi de NaOH 10 mM / NaCI IM ont été injectés pour la régénération entre les injections d'échantillon. Pour analyser la liaison des clones au CD160 humain, on a dilué les extraits périplasmiques contenant les Fabs solubles au 1: 5 dans du tampon P20 BIACORE (10 mM Hepes, 150 mM NaCI, 3 mM EDTA, 0,005% Tween-20) avec un débit de 30pl/min pendant 120 secondes pour l'association., la dissociation a été mesurée pendant 300 secondes.
Tableau 3 : Réponse absolue de la liaison des extraits périplasmiques contenant des Fab solubles représentatifs des différentes classes de variants H7 maturés en affinité
Clone de phage anti CD160 Famille VH H7 n° Réponse de binding, RU unité arbitraire (à t=120 s post mab injection) Biacore R.U Ratio (Variant /H7 WT ) Biacore R.U Ratio (Variant/FaWT 2E07)
FJ1516MP02F04 1 50.6401 8.3 3.9
FJ1516MP02D09 2 19.2957 3.2 1.5
FJ1516MP02A12 3 20.1003 3.3 1.5
FJ1516MP02G05 4 16.0439 2.6 1.2
FJ1516MP02D12 5 43.7766 7.2 3.3
FJ1516MP02A09 6 16.7186 2.7 1.3
FJ1516MP02E07* WT 13.1271 2.2 1
FJ1516MP02G12** WT 6.08838 1 0.5
* WT H7 obtenu par sélection dans le crible ** Fab H7 WT contrôle produit
La réponse absolue maximale du binding de chacun de ces variants (exprimée en mesure d'unités de réponse arbitraires à temps =120 secondes post injection de l'anticorps) a été évaluée sur une surface tapissée de protéine CD160. Ces données se trouvent dans le tableau 3.
Il a été possible ensuite de calculer le ratio de liaison de chaque variant sur celui du Fab H7 produit en contrôle ou un Fab H7 isolé sur un phage lors du screening (cf. tableau 3 colonnes 4 et 5).
Les données regroupées dans le tableau 3 démontrent que les Fab solubles sont capables de lier le CD160 humain en accord avec ce qui a été observé précédemment par ELISA et FACS.
Les clones F04, D12 et A09 (VH variant des classes 1, 5 et 6 respectivement) ont montré des valeurs de binding (RU) les plus élevées ainsi que des rapports RU (cf. colonne 4 Variant RU / WT RU tableau 3) aussi élevés de 8,3; 7,2 et 2,7 fois, respectivement.
Exemple 3 : Design et génération de différents formats d'anticorps monospécifiques pour les variants pour les indications oncologie et ophtalmologie
Les clones FJ1516MP02F04 ou F04 et FJ1516MP02D12 ou D12 ont été formatés en IgG afin d'étudier si les mutations présentes pourraient permettre de se fixer au CD160 avec des affinités supérieures à celle de l'anticorps H7. Le variant FJ1516MP02A09 ou A09 est le seul représentant présentant un profil d'association / dissociation très différent des autres et, à ce titre, sera lui aussi étudié plus avant au format IgG
1. Séquences protéiques des constructions anti CD160 à tester en Ophtalmologie à partir du H7 et de ses variants
Ainsi pour l'ophtalmologie, les variants F04 et D12 ont été générés sous des formats (lgG4 ou IgGl N297Q par exemple) choisis pour ne pas interagir ou de façon minimale avec les Fc Récepteurs (FcR), et/ou d'autres pour réduire la demi-vie systémique de l'anticorps ou du fragment d'anti CD160 thérapeutique, sans trop réduire sa demi vie intravitréale en réalisant ici soit des mutations réduisant la demi-vie systémique de l'anticorps soit en proposant des formats de fragments d'anticorps sans région Fc.
Pour cela l'une des possibilités est de formater l'anti CD160 en clonant les régions variables du H7 et de ses variants sur une structure lgG4 S228P-R409K ou IgGl N297Q.
Tableau 4 : Nom des composés et séquences des VH et VL.
Code ELB Nom/code Anti CD160 Chaîne Lourde Chaîne légère
ELB01101 H7 lgG4 S228P/R409K SEQID No. 58 SEQID No. 57
ELB01103 D12 lgG4 S228P/R409K SEQID No. 60 SEQID No. 57
ELB01106 F04 lgG4 S228P/R409K SEQID No. 61 SEQID No. 57
ELB01111 H7 IgGl N297Q SEQID No. 59 SEQID No. 57
ELB01102 H7 lgG4 S228P/R409K/H310A/H435Q SEQID No. 62 SEQID No. 57
ELB01104 D12 lgG4 S228P/R409K/H310A/H435Q SEQID No. 63 SEQID No. 57
- F04 lgG4 S228P/R409K/H310A/H435Q SEQID No. 10 SEQID No. 57
- D12 lgG4 S228P/R409K/I253A SEQID No. 9 SEQID No. 57
- F04 lgG4 S228P/R409K/I253A SEQID No. 12 SEQID No. 57
La SEQ ID N° 57 résulte de la fusion de la région variable définie par la SEQ ID No. 14 à la région constante définie par la SEQ ID No. 22.
Réduction de la demi vie systémique et de l'engagement des FcR et des FcRns par le formatage du candidat H7 et de ses variants en Fragments d'anticorps
Afin de pour réduire la demi vie systémique ainsi que l'engagement des FcRs et des FcRns d'un anticorps thérapeutique injecté en IVT l'anticorps H7 et ses variants ont été formatés en fragments d'anticorps (Fab, Fab'2 par exemple). Ainsi, le H7 et ses variants sont formatés en format Fab (avec la chaîne constante suivante Fab synthétisée par génie génétique et produite en bactérie ou en cellules CHO) en combinant la chaîne légère du H7 (SEQ ID No. 57) à l'une des chaînes lourdes suivantes pour réaliser le format correspondant.
- Fab CH1 IgGl ELB01121 (SEQ ID N°: 36)
- Fab CH1 IgGl D12 ELB01122 (SEQ ID N°: 37)
Le format Fab'2 est réalisé pour le variant D12 (SEQ ID N°: 38) (de façon recombinante ou par coupure enzymatique (Ides fabricator, GeNovis) avec deux ponts disulfures au lieu d'un ou avec ou sans leucine zipper.
Un Fab linker Fab a été généré dans lequel les deux séquences des chaînes lourdes sont associées entre le C terminal du premier Fab avec le N-terminal du second Fab par l'intermédiaire d'une séquence protéique linker (SEQ ID No. 39), ce qui donne une chaîne lourde de la molécule Fab-linker fab ELB01131 défini par SEQ ID N°: 40 et ELB01132, défini par SEQ ID N°: 41.
Un format tétravalent avec 4 Fabs D12 anti-CD160 a été créé en utilisant comme chaîne lourde du tétravalent l'IgGl N297Q H310A-H435Q D12 (SEQ ID NO°: 42 ; ELB012001)
L'ensemble des séquences de ces chaînes lourdes sont les séquences d'une chaîne lourde mature et on se doit d'ajouter en N-terminal la séquence d'un peptide signal comme une de celles décrites dans la SEQ ID NO°: 18 ou 19.
2. Séquences protéiques des constructions anti CD160 à tester en Oncologie à partir du H7 et de ses variants.
Les formats différents qui ont été comparés pour l'oncologie sont le H7 et ses trois variants D12, F04 et A09 au format IgGl, ainsi qu'au format Hexabody de Genmab et au format Bite pour le D12.
Le format Hexabody (Diebolder et al., 2014; de long et al., 2016) a été généré de façon à optimiser la cytotoxicité de l'anti CD160 afin d'activer le complément et d'améliorer la capacité de l'anticorps à induire la lyse par CDC et ADCC des cellules tumorales CD160 positives. Wang et al (Wang et al., 2016) ont identifié des mutations E345K (SEQID NO°:43) ou E430G (SEQID NO :44) qui permettent la production d'un Hexabody monomérique avec des fonctions effectrices améliorées (CDC et ADCC) tout en conservant une pharmacocinétique régulière et une développabilité pharmaceutique. L'IgGl ainsi muté s'hexamérise suite à la liaison de l'anticorps à l'antigène exprimé par la cellule cible et cette hexamérisation améliore les fonctions effectrices (CDC et ADCC) de l'anticorps.
On a aussi réalisé la construction moléculaire des variants D12 et F04 au format lgG2a/kappa murin à titre d'outils précliniques.
Tableau 5 : Nom des composés et séquences des VH et VL
Code ELB Nom/code Anti CD160 Chaîne Lourde Chaîne légère
ELB02101 H7 IgGl humain SEQID N°64 SEQID No. 57
ELB02102 D12 au format IgGl () SEQ ID No. 45 SEQID No. 57
ELB02103 F04 au format IgGl, SEQID No. 46 SEQID No. 57
ELB02104 A09 au format IgGl, SEQID No. 47 SEQID No. 57
ELB02111 H7 au format IgGl E345K SEQID No. 48 SEQID No. 57
ELB02112 D12 au format IgGl E345K SEQID No. 49 SEQID No. 57
ELB02113 F04 au format IgGl E345K SEQID No. 50 SEQID No. 57
ELB02114 A09 au format IgGl E345K SEQID No. 51 SEQID No. 57
ELB02102-02 D12 au format lgG2a murin, SEQID No. 53 -SEQID NO°: 54
ELB02103-02 F04 au format lgG2a murin SEQID No. 55 SEQID No; 56
Par ailleurs, la séquence protéique du variant D12 au format BITE, ELB02122 est définie par SEQ ID NO°: 52
Exemple 4 : Caractérisation biophysique des variants de H7 aux formats lgG4, IgGl et IgGl E345K
4.1 - Evaluation de l'impact des mutations des variants du H7sur la thermostabilité des anti CD160.
La thermostabilité est une méthode commune utilisée pour étudier la stabilité d'une protéine. La thermostabilité résulte i) de la stabilité intrinsèque d'une protéine (propension à former des agrégats) liée à sa structure tridimensionnelle résultant de sa séquence primaire et ii) des conditions de stockage et de formulation de l'échantillon (pH, sels, et composants de l'échantillon). D'après la méthode basée sur la capacité différentielle du Sypro Orange (Thermofischer Scientific, S-6650, lot 1608495) à se fixer aux zones hydrophobes de la protéine sous forme native ou dénaturée, nous avons évalué la thermostabilité des variants du candidat H7 anti hCD160 sous différents formats d'IgGs.
Les échantillons sont testés en quadruplicat dans une plaque PCR 96 puits, dans un volume final de 30 μΙ à une concentration finale de 0,1 mg/ml dans du PBSlx, 5x Sypro Orange. La solution mère de Sypro Orange (stock 5000 x dans du DMSO 100%) est préparée à une concentration finale de lOx dans du PBS lx. On soumet ensuite la plaque à un gradient de température de 22°C à 99°C (en lh30 environ) dans un appareil Applied
Biosystems® 7500 Real-Time PCR Systems. L'analyse des données (données brutes et première dérivé donnant le Tm pour chaque domaine d'anticorps) a été réalisée à l'aide du logiciel: Protein Thermal Shift (Thermofischer Scientific). Les résultats sont présentés dans le tableau suivant :
Tableau 6 : Résultats des Tm pour le H7 et les variants du H7 aux formats lgG4, IgGl et IgGl E345K
Code Protéine Tml moyenne ,°C Écart type Tml Tm2 moyenne, °C Écart type Tm2
ELB01101 H7 lgG4 WT 65.49 0.10
ELB02101 H7 IgGl WT 68.98 0.12
ELB01103 D12 lgG4 65.02 0.07 72.62 0.07
ELB01106 F04 lgG4 H310A- H435Q 60.66 0.07 69.85 0.07
ELB01102 H7 lgG4 H310A- H435Q 60.77 0.04 69.13 0.04
ELB01104 D12 lgG4 H310A- H435Q 60.55 0.09 71.61 0.09
ELB02104 A09 IgGl 69.38 0.21 74.75 0.07
ELB02103 F04 IgGl 69.63 0.07
ELB02102 D12 IgGl 69.60 0.07
ELB02113 F04 IgGl E345K 69.52 0.12
ELB02114 A09 IgGl E345K 69.05 0.04 74.28 0.00
ELB02112 D12 IgGl E345K 69.67 0.06
ELB01111 H7 IgGl N297Q. 59.58 0.16 70.50 0.11
ELB01112 H7 IgGl N297Q. H310A-H435Q 53.96 0.00 70.17 0.04
L'analyse des résultats du tableau 6 nous montre que le Tm moyen du H7 au format IgGl (H7 IgGl WT) est supérieur de 3,5°C par rapport au H7 au format lgG4 (H7 lgG4 WT). En ce qui concerne les variants de H7, les anticorps ont un Tm très proche de celui du H7.
4.2 - Mesure par BLI pour comparaison de l'affinité pour le CD160 recombinant humain de H7 et de ses différents variants et ce en différents formats çNgG
Les affinités ici ont été mesurées comme décrit dans l'exemple 2 avec un design où la protéine CD160 biotinylée est capturée à lOnM sur biosensor streptavidine et où se sont les anti- CD160 qui sont les analytes. Les concentrations en anti-CD160 testées étaient de 3.13, 6.25, 12.5, 25, 50 et 100 nM et la concentration en glycine pH2 étaient de 10 mM pour chaque régénération.
Les sensorgrammes et les affinités mesurées pour la protéine CD160 des anti CD160 H7 et de ses variants sont présentés dans les tableaux suivant :
Tableau 7 : Mesure des affinités pour la protéine CD160 de l'anticorps antiCD160 H7 et de son variant D12 au format lgG4 S228P-R409Q
reference IgG, N° KD (M) kon(l/Ms) kdis(l/s) RMax Full ΧΛ2 Full RA2
ELB01101 H7 lgG4 2.61 E-09 4.69E+05 1.23E-03 0.4394 0.1146 0.9907
ELB01103 1.52E-09 4.94E+05 7.52E-04 0.8059 0.2698 0.9947
Tableau 8 : Mesure des affinités pour la protéine CD160 de l'anticorps antiCD160 H7 et de ses variants au format lgG4 S228P-R409Q-H310A-H435Q.
reference IgG, N° KD (M) kon(l/Ms) kdis(l/s) RMax Full ΧΛ2 Full RA2
ELB01102 H7lgG4 H310A-H435Q 2.91 E-09 5.07E+05 1.48E-03 0.4832 0.1092 0.9924
ELB01104 1.49E-09 4.99E+05 7.44E-04 0.7845 0.3143 0.9935
ELB01106 1.63E-09 4.53E+05 7.36E-04 0.7779 0.1797 0.996
Tableau 9 : Mesure des affinités pour la protéine CD160 de l'anticorps antiCD160 H7 et de ses variants au format IgGl
reference IgG, N° KD (M) kon(l/Ms) kdis(l/s) RMax Full ΧΛ2 Full RA2
ELB02101H7IgGl 2.94E-09 3.70E+05 1.09E-03 0.533 0.1222 0.9923
ELB02102 1.55E-09 4.22E+05 6.54E-04 0.9513 0.2779 0.9958
ELB02103 1.43E-09 3.71 E+05 5.31 E-04 0.8735 0.237 0.9955
ELB02104 1.47E-09 4.42E+05 6.51 E-04 0.8788 0.3971 0.9933
Tableau 10 : Mesure des affinités pour la protéine CD160 de l'anticorps antiCD160 H7 et de ses variants au format IgGl E345K.
reference IgG, N° KD (M) kon(l/Ms) kdis(l/s) RMax Full ΧΛ2 Full RA2
ELB02101H7IgGl 2.94E-09 3.70E+05 1.09E-03 0.533 0.1222 0.9923
ELB02112 1.52E-09 4.47E+05 6.79E-04 1.2637 0.8515 0.993
ELB02113 1.55E-09 4.27E+05 6.62E-04 1.1864 0.6878 0.9934
ELB02114 1.93E-09 4.27E+05 8.25E-04 1.1987 0.6949 0.9931
Quel que soit le variant, et quelle que soit la nature de l'isotype (lgG4, lgG4 H310A-H435Q, IgGl et IgGl E345K), les variants ont toujours au minimum un facteur 2 d'amélioration d'affinité pour le CD160 recombinant comparé au H7 correspondant, une biocouche deux fois plus épaisse traduisant un meilleur kon et une constante de dissociation deux fois plus faible que le H7 parental correspondant.
Les variants de H7, quel que soit le variant et quelle que soit la nature de l'isotype (lgG4, lgG4 H310A-H435Q, IgGl et IgGl E345K) ont de meilleures caractéristiques cinétiques que le H7.
4.3 - Mesure par Biacore (SPR) pour comparaison de l'affinité pour le CD160 recombinant humain de H7 et de ses différents variants et ce en différents formats d'IgG
De façon à comparer l'affinité pour le CD160 recombinant humain de H7 et de ses différents variants, des mesures par Biacore (SPR) ont également été effectuées comme décrit dans un design proche de celui décrit dans l'exemple 2.
Tableau 11 Affinités de l'interaction CD160 recombinant humain /Anti hCD160 l'anticorps H7 et ses variants en différents formats mesurés par Biacore (SPR) et par interférométrie de Biocouche (BLI)
Code Anti CD160 Méthode de mesure kon (1/Ms) kdis (1/s) Rmax (RU) KD(nM) Gain en KD / IgG respectif Chi2 (SPR) ou Full ΧΛ2 (BLI) Full RA2 BLI
ELB02101 H7 IgGl WT SPR 2.09E+05 2.51E-03 630 12 12.60
BLI 3.70E+05 1.09E-03 0.533 2.94 0.12 0.99
ELB02101 H7 IgGl D12 SPR 2.51E+05 1.13E-03 1200 4.5 2.7 57.70
BLI 4.22E+05 6.54E-04 0.9513 1.55 1.9 0.28 1.00
ELB02101 H7 IgGl F04 SPR 2.00E+05 7.26E-04 1280 3.6 3.3 23.30
BLI 3.71E+05 5.31E-04 0.8735 1.43 2.1 0.24 1.00
ELB02101 H7 IgGl A09 SPR 2.23E+05 8.77E-04 1250 3.9 3.0 36.30
BLI 4.42E+05 6.51E-04 0.8788 1.47 2.0 0.40 0.99
ELB01101 H7 lgG4 WT SPR 2.18E+05 2.85E-03 533 13.1 15.40
BLI 4.69E+05 1.23E-03 0.0021 2.61 0.11 0.99
ELB01103 H7 lgG4 D12 SPR 2.92E+05 1.22E-03 990 4.2 3.1 54.40
BLI 4.94E+05 7.52E-04 0.0026 1.52 1.7 0.27 0.99
ELB01102 H7 lgG4 WT S228P/R409K/ H310A/H435Q SPR 2.05E+05 2.97E-03 636 14.5 11.50
BLI 5.07E+05 1.48E-03 0.0019 2.91 0.11 0.99
ELB01104 H7 lgG4 D12 S228P/R409K/ H310A/H435Q SPR 2.44E+05 1.23E-03 1020 5 2.9 34.40
BLI 4.99E+05 7.44E-04 0.0028 1.49 2.0 0.31 0.99
ELB01106 H7 lgG4 F04 S228P/R409K/ H310A/H435Q SPR 1.76E+05 7.21E-04 1010 4.1 3.5 8.55
BLI 4.53E+05 7.36E-04 0.0024 1.63 1.8 0.18 1.00
Dans le tableau 11, on voit que les résultats obtenus de mesure d'interactions Anti CD160/ CD160 avec une seconde technique (SPR) démontrent, tout comme les mesures d'affinité de ces mêmes anticorps par BLI, que le gain obtenu pour les variants de H7, et ce quel que soit la nature de l'isotype (lgG4, lgG4 H310A-H435Q, IgGl et IgGl E345K), est toujours au minimum d'un facteur 2 d'amélioration d'affinité pour le CD160 recombinant comparé au H7 correspondant, un Rmax deux fois plus 10 important traduisant un meilleur kon et une constante de dissociation deux fois plus faible que le H7 parental correspondant.
Exemple 5 : Liaison de l'anti hCD160 H7 et de ses variants au format lgG4, IgGl et au format IgGl E345K sur cellules CHO CD160 et sur cellules CHO non transfectées
La capacité de fixation des anti CD160 H7 et de ses variants au format H7 lgG4, H7 IgGl et au format IgGl E345K a été évaluée lors du marquage du CD160 de surface exprimée dans une lignée recombinante CHO-S-hCD160 (Clone 2G10) en comparaison avec des cellules CHO-S non transfectées en mesurant l'index de médiane de fluorescence (MFI) (voir Figure 1). Pour cela, 5.10+5 cellules 2G10 (CHO-S - CD160) et CHO-S non transfectées ont été marquées avec 2pg de chacun de ces anticorps ainsi qu'avec les isotypes contrôles adéquats. Sur la Figure 1, tous les anti CD160 testés (quels que soient l'isotype ou le format d'IgG ou le variant) reconnaissent spécifiquement le CD160 humain exprimé de façon recombinante par les cellules CHO-S.
Sur la Figure IA, les variants IgGl se fixent plus efficacement aux transfectants CHO-hCD160 que le H7 IgGl (ce qui se traduit par une médiane de fluorescence augmentée d'un facteur 3 par rapport au H7 IgGl). Ceci est vrai pour le format IgGl ou IgG E345K. La présence de la mutation E345K dans le Fc des variants n'améliorent pas leur binding sur ces cellules.
Sur la Figure IB, les variants lgG4 se fixent plus efficacement aux transfectants CHO-hCD160 que le H7 (ce qui se traduit par une médiane de fluorescence augmentée d'un facteur 2 par rapport au H7 lgG4 ELB01101 ou au H7 lgG4 H310A-H435Q ELB01102) et ce même en présence des mutations H310A-H435Q. En effet, la présence des mutations H310A-H435Q dans le Fc des anti CD160 ne gênent pas leur fixation à leur cible comme on peut le voir quand on compare la liaison entre ELB01101 et ELB01102.
Exemple 6: Effet des anticorps anti CD160 selon l'invention sur l'inhibition de la formation de tubes d'HUVECs et caractérisation de l'induction de l'expression du CD160 sur les HUVECs
Dix anticorps ont été évalués pour leurs effets sur la formation de tube vasculaire induite par VEGF ou FGF dans un essai de Cell Player GFP-AngioKit (Essen Biosciences). Cet ensemble d'échantillons comprend l'anticorps anti-VEGF Avastin et le fragment d'anticorps Lucentis. Des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine congelées (HUVEC) pré-marquées avec une protéine Fluorescente (Green Fluorescent Protein ou GFP) en utilisant un système d'expression lentiviral, ont été décongelées et co-cultivées avec des fibroblastes humains du derme sur six plaques d'essai à 96 puits pendant 2 jours. Les anticorps et les agents de référence (VEGF, FGF-2, milieu témoin) ont été ajoutés à différents puits à différentes concentrations et la plaque d'essai a ensuite été placée dans un système d'imagerie de cellules vivantes IncuCyte. Des images fluorescentes et de contraste de phase (lOx) ont été recueillies toutes les 12 h pendant 10 jours et analysées pour la longueur du tube et le nombre de points de branchement. Les milieux de culture (avec anticorps si besoin) et les surnageants d'essai ont été remplacés tous les 2-3 jours.
Exemple 7 : Evaluation de l'efficacité de l'injection sub conjonctivale des candidats anti-CD160 H7 au format lgG4 (ELB01101) en comparaison avec Aflibercept (Eylea ®) dans un modèle de néovascularisation de la cornée chez le rat :
Un modèle de néovascularisation de la cornée a été développé chez le rat. Ce modèle permet en particulier une observation facile du suivi de l'apparition des néovaisseaux au niveau de la cornée, ce qui permet une évaluation des molécules ayant des propriétés anti-angiogéniques, dont les anticorps selon l'invention.
Les lots d'anticorps ont été générés, produits, purifiés et qualifiés selon le processus pour préparation de lots pour injections intra vitréennes et sub-conjonctivales.
Des groupes de rats Lewis mâles âgés de 6 semaines ont été utilisés.
Induction de la néovascularisation de la cornée chez le rat
Jo : L'intervention chirurgicale sous microscope opératoire est pratiquée sur un œil de chacun des rats, après anesthésie. Pour cela, la cornée est entièrement désépithélialisée par application d'éthanol à 70°C suivie d'une incision du limbe ce qui entraîne l'apparition de néovaisseaux cornéens dès J4.
Seul l'œil droit est utilisé. Les animaux sont anesthésiés avec une injection dans le muscle fémoral droit de kétamine (IMALGENE 500), 100 μΙ par rat et xylazine (ROMPUN 2%), 100 μΙ par rat. Une goutte de tétracaïne est instillée dans l'œil droit. Les manipulations se font sous microscope opératoire. La néovascularisation est induite en détruisant l'épithélium de la cornée en appliquant un « éponge microsponge » imbibé d'alcool 70% sur la surface de la cornée. En parallèle, une épaisseur d'environ 1,5 mm de conjonctive est enlevée autour du limbe avec des micro ciseaux. Une pommade antibiotique (Fucidine) est appliquée sur l'œil. Ensuite, les paupières sont maintenues fermées 4 jours après suture (fil de soie 5-0). Après 4 jours, les paupières sont ouvertes en retirant les fils ; l'évolution des néovaisseaux de la cornée est examinée au microscope opératoire à J4, J8 et J12 après anesthésie.
Traitements rats par groupe (sauf 3 pour l'isotype control lgG4) sont utilisés de la manière suivante :
Jo : Les animaux sont opérés d'un œil tel que décrit ci-dessus;
J8 : Des photos sont prises et les animaux sont divisés en 8 groupes de 10 rats chacun, afin d'être traités sur l'œil opéré:
Les animaux sont injectées avec les produits par voie sous-conjonctivale à l'aide d'une seringue munie d'une aiguille 29 % G (MYJECTOR) à J4 et J8.
- Groupe 1 : injection sous-conjonctivale de 50 pl de PBS (contrôle négatif),
- Groupe 2 : injection sous conjonctivale de 250 pg d'Aflibercept ® (Eylea) dans 50 pl
- Groupe 3 : injection sous-conjonctivale de 500 μΙ d'isotype control lgG4 dans 50 μΙ
- Groupe 4 : injection sous-conjonctivale de 500 pg d'anticorps H7 lgG4 dans 50 pl selon l'invention
A J8 et J12 : Des photos des yeux opérés sont prises après observation sous microscope opératoire afin d'évaluer l'effet du traitement sur la néovascularisation de la cornée. Les sérums et les humeurs vitrées sont prélevés à J+12 post mortem.
Les photos (.JPEG) d'œil de rats ont été analysées par le logiciel (Calopix, TRIBVN). L'analyse a été réalisée en aveugle, sans connaissance du groupe ni du timing de la prise de vue. L'évaluation de la vascularisation est déterminée en utilisant un logiciel de quantification. La vascularisation a été estimée comme étant la surface des vaisseaux sanguins rapportée à la surface totale de l'œil analysée (c'est à dire la zone désépithélialisée). Les photos sont reportées et les % de néovascularisation par rapport à la surface totale sont reportés dans le graphe de la Figure 2.
Résultats :
Des photos de l'œil opéré sont prises à Jo et à 2 jours différents : J7 et Ji2. Les photos prises montrent l'évolution de la néovascularisation cornéenne, en particulier le développement de la densité vasculaire et de la longueur des vaisseaux jusqu'à Ji2 chez le contrôle Isotype.
Les résultats présentés dans la Figure 2 montrent une diminution de la densité vasculaire chez les animaux traités avec l'anticorps monoclonal H7 selon l'invention, par rapport aux animaux injectés avec un contrôle négatif, ici l'isotype contrôle lgG4.
On voit aussi que la dose de H7 lgG4 (ELB01101), malgré une faible réactivité croisée pour le CD160 de rat (données non montrées), réduit la néovascularisation cornéenne dans ce modèle de rat de façon comparable à une dose de 250pg d'un récepteur soluble de haute affinité pour le VEGF la protéine de fusion (Aflibercept®), un anti-angiogénique utilisé pour le traitement de la dégénérescence maculaire lié à l'age (DMLA). Ceci a été aussi obtenu avec l'anticorps H7 au format IgGl N297Q.
L'anticorps H7, aux formats lgG4 et IgGl N297Q, selon l'invention a donc une activité antiangiogénique.
Exemple 8 - Comparaison de la pharmacocinétique systémique (PK) en lapin après injection intravitréenne de différents formats d'anti -hCD160 avec celle du CL1-R2, de l'Avastin et du Lucentis
Objectifs
L'étude de la pharmacocinétique (PK) des différents anti CD160 et de leurs contrôles après une administration unique de 500 pg par injection intravitréenne (IVT) est effectuée chez le lapin blanc de Nouvelle-Zélande à la pré-dose T0, T2h, T6h, T24h, T48h, T96h, T168h, T336h et T504h pour des prélèvements sanguins;
Le protocole expérimental a été soumis au comité d'éthique du prestataire avant de commencer.
PK systémique après injection intra-vitréenne (groupes testés et prélèvements sanguins PK)
- 8 formats différents d'anti CD160 (voir tableau 12 ci-dessous à une concentration de 5 mg/mL minimum avec un niveau d'endotoxines de 0.5EU/mL
- 2 contrôles bevacizumab (Avastin) et ranibizumab (Lucentis)
Soit 10 groupes
Étude pharmacocinétique (résumé dans le tableau 12 ci-dessous)
-Identification des animaux à D0
-Randomisation de lapins dans 10 groupes / TS (3 lapins / groupe),
-Préparation des substances d'essai
-Traitement intravitréen (IVT) de lapins à T0 min (10 items à tester) (50μΙ)
-Surveillance hebdomadaire des signes cliniques et du poids corporel
-Collecte du sang à partir l'artère centrale de l'oreille des lapins à la pré-dose T0, T2h, T6h, T24h, T48h, T96h, T168h, T336h, T504h
L'étude est réalisée avec des lapins blancs en bonne santé (statut bactérien et viral de l'animal connu, un sexe) de Nouvelle-Zélande (KBL Charles River) (2750-3000 g de poids corporel Âge au début du traitement: 14-18 semaines). Ces animaux ont été mis en cage dans l'unité de soins classiques pendant une semaine avant la randomisation et pendant 4 semaines consécutives pendant l'étude (les animaux seront logés à raison de 1 à 2 animaux / cage). Dix groupes ont été constitués avec 3 animaux par groupe, soit un total de 30 lapins.
Design de l'expérience
- Voies d'administration: injection intravitréenne (bilatérale) sous anesthésie générale
- Volume de dose: 50 μΙ_ au maximum / oeil / administration
Paramètres de vie
- Durée de la période d'observation: jusqu'à 28 jours.
- Mortalité / Morbidité: deux fois par jour.
- Signes cliniques: une fois par jour.
- Observations oculaires: quelques minutes après le traitement IVT, les deux yeux de chaque animal seront grossièrement examinés pour rechercher des signes macroscopiques d'irritation oculaire (même minime)
- Ophtalmologie : des examens détaillés en fond d'œil ont été réalisés
Bio-analyse de la concentration de chacun des formats au cours du temps
Sang PK
Environ 0,5 ml de sang total est prélevé dans un tube sans anticoagulant avant administration (prédose T0) et après administration à 2h, 6h, 12h, 24h, 48h (D2), 96h (D4), 168h (D7), 336h (D14) .
Le sérum est conservé congelé jusqu'à l'analyse.
Les échantillons de sérum sont analysés pour la détermination de la concentration en anti CD160.
Examens ophtalmologiques poussés : prétest (30 lapins) et les jours 14 (30 lapins) et jour 28 (30 lapins). Un agent mydriatique (Tropicamide) est instillé dans les yeux avant l'examen. Ensuite des examens ophtalmiques sont effectués pour les deux yeux de chaque animal:
- lampe à fente (Kowa SL 14 ou SL 15),
- ophtalmoscopie indirecte (Heine Oméga 180) avec évaluation du fond de chaque œil pour l'intégrité des caractéristiques de la tête du nerf optique, réseau vasculaire (rétinien et choroïdien) et membranes RPE et de Bruch Pigmentation / coloration.
Bio-distribution des tissus oculaires
Après la mort des animaux, les deux yeux sont énucléés et immédiatement congelés à -80 ° C. Avant l'analyse, les yeux gelés sont séparés en trois parties - le vitré, l'humeur aqueuse, et la rétine / choroïde. Le volume des échantillons d'humeur aqueuse et des échantillons vitreux (après homogénéisation et centrifugation) est mesuré. La rétine / choroïde gelée sera pondérée.
PK systémique après injection intra veineuse (groupes testés et prélèvements sanguins PK) méthode
- Lapins - un sexe
- 3 animaux/groupe
-Total de 33 lapins
- Éléments d'épreuves pour les injections intraveineuses: 9 formats de médicaments candidats mAb + 2 références
- Formules d'épreuve: prêt à l'emploi (ou à diluer uniquement)
- Voie d'administration: injection intraveineuse sous anesthésie générale
- Volume de la dose: 50-200 pL au maximum / administration
- Pour chaque format à tester, au jour 0, il n'y aura qu'une seule injection de
500 pg (pour IgG entière ou équivalent molaire pour le fragment d'AcM)
- Sacrifice au jour 14 après administration de mAb
Paramètres de vie
- Durée de la période d'observation: jusqu'à 14 jours.
- Mortalité / Morbidité
- Signes cliniques, poids corporel et consommation alimentaire
Sang PK
Environ. 0,5 ml de sang total est recueilli dans un tube sans anticoagulant avant administration (pré-TO) et après administration à 5 min, 15 min, 30 min, 60 min, 2 h, 6 h, 12 h, 24h, 48 h (D2), 96 h (D4), 168h (D7), 336h (D14).
Le sérum est conservé congelé jusqu'à l'analyse.
Tableau 12 : Groupes de l'étude de pharmacocinétique chez le lapin
Groupe de traitement Route d'injection et fréquence Nombre d'animaux Route d'injection et fréquence Nombre d'animaux
1 ELB01101 (H7 G4) 250pg/50pl IVT, une fois à JO, bilatéral 3 500 pg / 100 pl bolus à Jo 3
2 ELB01103 (D12G4) 3 3
3 ELB01104 (D12 H310A - R435Q) 3 3
4 ELB01122 (D12 Fab) 3 3
5 ELB01132 (D12 Fab linker Fab) 3 3
6 ELB01142 (D12 Fab'2) 3 3
7 ELB0210 (D12 IgGl) 3 3
8 CL1R2 3 3
9 Bevacizumab 3 3
10 Ranibizumab 3 3
Le sérum est conservé congelé jusqu'à l'analyse. Les échantillons de sérum seront analysés pour la détermination de la concentration en anti CD160.
Exemple 9 : Efficacité /tolérance d'une injection intravitréale de l'anti hCD160 H7 (lgG4 (ELB01101)) et H7 (IgGl N297Q (ELB01111)) dans un modèle de néo10 vascularisation choroïdienne induite au laser chez le primate non humain (NHP) Macaca fascicularis.
Les objectifs de cette étude sont de (1) déterminer la tolérance oculaire de deux formats d'anti-hCD160, H7 lgG4 et H7 IgGl aglycosylée, lorsqu'ils sont administrés par une seule injection intravitréenne à des singes cynomolgus et (2) d'évaluer l'effet 15 préventif potentiel d'une de ces isoformes sur la néovascularisation choroïdienne induite au laser dans un modèle de singe cynomolgus (Macaca fascicularis).
Schéma de l'étude/expérience.
Animaux et conditions d'élevage
Un total de 17 singes cynomolgus mâles (âgés de 2 à 3 ans) ont été reçus et pesaient entre 2,7 et 3,2 kg à l'initiation du dosage. Une période d'acclimatation minimale de 4 semaines a été permise entre la réception des animaux et le début du traitement afin d'accoutumer les animaux à l'environnement du laboratoire. Les animaux étaient logés socialement (jusqu'à 3 / groupe / cage) dans des cages en acier inoxydable équipées d'une vanne d'arrosage automatique. Des températures de 20°C à 26°C avec une humidité relative de 30% à 70% ont été normalement maintenues. Un cycle de 12 heures d'éclairage / 12 heures d'obscurité a été maintenu. La nourriture était fournie en quantités appropriées à la taille et à l'âge des animaux (PMI Nutrition International Certified Primate Chow n ° 5048 a été fourni deux fois par jour. L'eau après traitement par osmose inverse et irradiation ultraviolette était librement disponible pour chaque animal via un système d'arrosage automatique. Les singes ont été utilisés conformément à la Déclaration ARVO pour l'utilisation d'animaux dans le cadre de recherche ophtalmiques.
Justification du système de test et le nombre d'animaux
Le singe cynomolgus a été choisi comme modèle animal pour cette étude car c'est une espèce non-rongeur acceptée pour les tests de toxicité oculaire préclinique par les organismes de réglementation. Le nombre total d'animaux à utiliser dans cette étude est considérée comme le minimum requis pour caractériser correctement les effets de l'anticorps d'essai. Cette étude a été conçue de telle sorte qu'elle ne nécessite pas un nombre inutile d'animaux pour atteindre ses objectifs.
Préparation des items à tester
Le jour d'utilisation, les items à tester (sans agrégats et avec un contenu en endotoxines très bas (< 0,025 EU/mg) (voir tableau 13) ont été préparés à 20mg/ml par dilution avec le produit de référence (PBS) à des concentrations appropriées pour satisfaire aux exigences de dosage.
Tableau 13: Identification des items et témoin véhicule testés
Test Item 1 (anti CD160 format 1) Test Item 2 (Anti CD160 format 2) Reference Item/ Vehicle
Identification H7 lgG4 H7 IgGl aglycosylé. PBS pourr injection
Lot No. Prod 2 28Dec2015 Prod 04Mar2016 *
Description Liquide Liquide Liquid
Pureté 99.5% 99.5% n/a
Concentration 22.7 mg/mL 22.7 mg/mL n/a
Niveau d'endotoxine (Endosafe®-PTS™; Charles River) < 0,5 EU/mL < 0,025 EU/mg < 0,5 EU/mL < 0,025 EU/mg < 0,5 EU/mL
Conditions stockage 2°C to 8°C 2°C to 8°C 2°C to 8°C
Tableau 14 : Résumé du schéma expérimental phase 1 Tolérablité et phase efficacité/Tolérabilité étendue
Group No. Matériel testé Dose (mg/oeil) Dose Volume (pL/oeil) Dose Concentration (mg/mL) Nombre d' animaux
OD OG Males
Phase 1 1 H7 lgG4 H7 IgGl aglyc. 1.0 50 20 3
Phase 2 2 PBS for injection 0 50 0 6
3 H7 lgG4 1.0 50 20 6
OD: oeil droit, OG: oeil gauche.
Paramètres suivis
Les paramètres suivants ont été évalués au cours de cette étude : mortalité et signe clinique, poids corporel, changements de poids corporel, appétit, ophtalmologie, angiographie par fluorescéine, pathologie macroscopique et immunohistochimie.
Procédures en vigueur, observations et mesures
Les contrôles de mortalité / moribondité étaient normalement effectués deux fois par jour, une fois le matin et une après-midi, tout au long de l'étude. Des examens détaillés ont été effectués chaque semaine pendant les périodes de dosage et d'observation. Les poids corporels individuels ont été mesurés chaque semaine. L'évaluation individuelle des aliments a été évaluée quotidiennement par inspection visuelle de l'appétit général.
Des examens ophtalmologiques ont été effectués au cours de la Phase 1 une fois en pré-étude et aux Jours 2, 5 et 7 et pendant la Phase 2 une fois en pré-étude, après l'induction de CNV induite par laser le Jour 1, Jour 9 et de nouveau le Jour 28.
Examens ophtalmoscopique et biomicroscopiques (lampe à fente). Les examens ont été effectués par un vétérinaire ophtalmologiste certifié. Les gouttes mydriatiques utilisées étaient le tropicamide à 1%. Un sédatif, Ketamine® HCl pour injection, USP, a été administré par injection intramusculaire après une période appropriée de jeûne.
Procédure d'imagerie
Fluoro-angiogrammes
Lors de la Phase 2 d'évaluation de l'efficacité, des données d'imagerie (les angiographies à la fluorescéine ou fluoro-angiogrammes) ont été pratiquées Jour 1 (après laser, en prédose) et ont été collectées de nouveau aux jours 14 et 29 postphotocoagulation comme suit :
Procédure: des gouttes mydriatiques (1% tropicamide) ont été appliquées à chaque oeil au moins 25 minutes avant l'essai. L'hydratation des yeux a été maintenue par l'irrigation fréquente avec une solution saline. Les animaux reçoivent une injection intramusculaire d'un cocktail sédatif de kétamine (5 mg / kg), glycopyrrolate (0,01 mg / kg) et dexmetedomidine (0,01 mg / kg), puis ont été intubés avec un tube endo-trachéal afin d'administrer un mélange isoflurane / d'oxygène. Une fois l'angiographie achevée, les animaux reçoivent, si nécessaire, une injection intramusculaire de 0,1 mg / kg atipamézole, un agent d'inversion pour la dexmetedomidine. Les images rétiniennes simples et / ou en temps réel dans les modes libres infrarouges et / ou rouges ont été obtenues pour servir d'images de référence pour les angiographies. 1,0 ml de 10% de fluorescéine sodique injectable U.S.P. a été administré par injection intraveineuse rapide (céphalique ou saphène), suivie d'une chasse d'eau de 0,5 ml de solution saline. Les images fixes ont été enregistrées pour les deux yeux au moins 2 minutes et au plus tard 5 minutes après l'injection de fluorescéine. En outre, les images fixes des deux yeux ont été enregistrées au moins 8 minutes et au plus tard 11 minutes après l'injection de fluorescéine. Afin d'assurer que les données soient masquées, les images d'angiofluorographie ont été identifiées par un numéro d'arrivée de l'animal, et non par le nombre d'animaux randomisés. Les niveaux de sévérité des lésions (grades correspondant à chaque lésion laser individuelle ont été évaluées sur les images fixes par l'étendue de la fuite en fluorescéine sur une échelle de 0-4 par 2 lecteurs indépendants avec réconciliation finale des résultats et détermination d'un score consensus. Le nombre total et le % des lésions cliniquement pertinentes (Grade 3 et 4) ont été totalisées (voir Figure5 : Les images du jour 1 ont été utilisées pour la confirmation de la procédure et la formation de lésions au laser.
Immunohistochimie par marquage von willebrand (vwf)
La zone des lésions cliniquement pertinentes a été confirmée par marquage du facteur von willebrand en immuno histochimie en utilisant un anticorps commercial.
Prélèvements sanguins pour futur examen
Le sang de singe a été prélevé par ponction veineuse fémorale:
- pour la phase 1 de tolérance : avant le début du traitement et aux jours 1,
2, 3, 6 et 7.
- Pour la phase 2 d'efficacité : avant le début du traitement et aux jours 1, 2,
3, 6, 12 et 28.
Les échantillons ont été mélangés doucement et maintenus dans des conditions ambiantes jusqu'à centrifugation, ce qui a été réalisé dès que possible. Les échantillons ont été centrifugés selon les procédures standard. Le sérum résultant a été séparé, transféré sur des tubes de polypropylène transparents marqués de manière unique et congelé immédiatement sur de la glace sèche et transféré dans un congélateur -80 ° C. Les examens ultérieurs possibles incluent la mesure de la concentration en anticorps anti CD160 dans le compartiment systémique après injection IVT.
Procédure terminale
Les animaux d'étude ont jeûnés pendant la nuit avant leur nécropsie programmée. Avant le transport de la salle des animaux à la zone d'autopsie, on a administré un sédatif (Ketamine HCl pour injection, U.S.P.) par injection intramusculaire. Les animaux ont subi une exsanguination par incision des artères axillaires ou fémorales après l'anesthésie par injection intraveineuse de pentobarbital de sodium.
Histologie
Après la collecte de l'humeur vitreuse, le tissu restant des yeux gauches de tous les animaux de la phase 2 a été utilisé pour l'analyse immunohistochimique.
Immunohistochimie
Les membranes choroïdiennes des yeux gauches spécifiés des animaux de la Phase 2 ont été préparées, montées en « fiat mount » et colorées par un anticorps reconnaissant le facteur Von Willebrand (vWF). La coloration immunohistochimique du facteur Von Willebrand sur un support plat choroïdien a été évaluée.
Tolérance de l'injection IVT de l'anti hCD160 dans deux formats (H7 lqG4 (ELBO11O1) et H7 IgGl N297Q (ELBO1111)) dans l'œil de cynomolqus.
Des antibiotiques topiques (tobramycine à 0,3%) ont été appliqués aux deux yeux deux fois la veille du traitement, après l'injection et deux fois le jour suivant l'injection.
Avant la posologie, les animaux de la phase 1 d'évaluation de la tolérance ont reçu une injection intramusculaire d'un cocktail sédatif de kétamine (5 mg / kg) et de dexmétedomidine (0,01 mg / kg) suivi d'un mélange isoflurane / oxygène à travers un masque, jugé nécessaire pour maintenir l'anesthésie. Après achèvement de la procédure de dosage (si cela est jugé nécessaire), les animaux ont reçu une injection intramusculaire de 0,1 mg / kg d'atipamezole, un agent d'inversion de la dexmédomidine, si nécessaire.
Lors d'une première phase, la tolérance de l'injection intravitréale (IVT) de 1 mg de chacun des anti-hCD160 H7 lgG4 et H7 IgGl N297Q a été vérifiée par injection dans 3 yeux de singe (H7 lgG4 dans les yeux droits et H7 IgGl N297Q dans les yeux gauches.
L'anticorps anti CD160 H7 lgG4) et le contrôle véhicule de référence ont été administrés par un ophtalmologiste vétérinaire aux animaux appropriés par injection intravitréale bilatérale le jour 1. Le volume de dose cible pour chaque animal était de 50 μΙ / oeil.
Les doses de phase 1 ont été administrées en utilisant une seringue de 1 ml et une aiguille de 30 pouces de % pouce. Au cours de la phase 1, H7 lgG4 a été administré aux yeux droits et H7 IgGl aglycosylé N297Q a été administré aux yeux gauches.
Démonstration de l'efficacité et l'effet préventif sur la néo-vascularisation choroïdienne induite au laser de l'injection IVT du H7 lqG4 vs le véhicule (PBS).
Dans deux groupes de 6 singes cynomolgus (Macaca fascicularis) males (de 1.5 à 3.5 ans, de poids allant de 1.5 à 6 kg), l'induction de la néo-vascularisation choroïdienne (NVC) a été réalisée comme suit. Après lavage ophtalmique, des gouttes mydriatiques (chlorure de benzalkonium (Zephiran ™)) ont été appliquées sur chaque œil avant toute procédure.
Les animaux de la phase 2 (d'efficacité) ont été anesthésiés tout comme ceux de la phase de tolérance (voir section précédente).
L'anticorps anti CD160 H7 lgG4 et le véhicule contrôle de référence ont été administrés aux animaux appropriés le jour 1. Le jour 1 sont injectés par un ophtalmologiste vétérinaire par injection intravitréale bilatérale IVT 50 μΙ à 20mg/mL/œil du H7 lgG4 (l'isoforme sélectionnée après la phase 1) ou 50 μΙ/œil du véhicule. Le volume de dose cible pour chaque animal était de 50 μΙ / œil. Les doses de phase 2 ont été administrées en utilisant une seringue Exelint U-100 insuline 0,5 cc avec une aiguille de calibre 29 x Vi pouce. Un antibiotique topique a été instillé dans chaque oeil posé après l'administration de la dose.
Procédure d'induction au laser de la néovascularisation choroïdienne (NVC) Phase 2
Au jour 1 de la phase 2, avant la procédure CNV, des gouttes mydriatiques ont été appliquées aux deux yeux. Pour la phase d'induction des lésions au laser ou avant les injections intravitréales (IVT), les animaux reçoivent une injection intramusculaire d'un cocktail de kétamine sédatif (5 mg/kg) de glycopyrrolate (0,01 mg / kg) et de dexmétedomidine (0,01 mg / kg), puis intubés avec un tube endotrachéal afin d'administrer le mélange isoflurane / oxygène pour maintenir l'anesthésie, comme cela était approprié et les animaux ont été anesthésiés avec un cocktail de kétamine (5 mg / kg). Après l'achèvement de la procédure de dosage (comme jugé nécessaire), les animaux reçoivent une injection intramusculaire de 0,1 mg / kg atipamézole, un agent d'inversion pour dexmetedomidine, si jugée nécessaire. Les animaux ont été également répartis en groupes de traitement et randomisés en poids.
Pendant l'anesthésie, le traitement laser est effectué par la génération de 9 lésions par œil de façon concentrique à la fovéa avec 1 lésion dans la zone maculaire et 8 lésions dans la zone péri maculaire entre les vaisseaux majeurs de la rétine. Les lésions laser avec une taille de lésion initiale de 80 pm ont été créées en utilisant un laser à diode de 810 nm à un puissance initiale de 300 mW et une durée de 0,1 sec. Le traitement laser a été effectué de façon reproductible et vérifié par l'apparition de petites bulles de vapeur dans la rétine caractéristique de la rupture de la membrane de Bruch. Aucune lésion n'a été générée directement sur la fovéa. Les paramètres laser ont été ajustés au besoin pour assurer la rupture de la membrane de Bruch (corrélée à la formation de bulles) et sont documentés dans les données de l'étude. Tous les événements notables, tels que l'hémorragie rétinienne ont été documentés pour chaque lésion laser. L'hydratation des yeux a été maintenue avec une solution saline et / ou carboxyméthylcellulose sodique 1,0% au cours de la procédure, si nécessaire. Les deux yeux ont été examinés par biomicroscopie à lampe à fente et/ou ophtalmoscopie indirecte après l'achèvement de chaque traitement pour confirmer l'emplacement et l'apparence de la dose et documenter toute anomalie provoquée par la procédure d'administration.
Analyse résultats
Résultats tolérance, résumé:
Il n'y a pas eu de décès pendant l'étude et il n'y avait pas de signes cliniques liés au traitement. Il n'y avait aucun effet lié au traitement sur le poids corporel et il n'y avait pas de résultats macroscopiques. Des opacités vitréennes très légères ont été observées chez des animaux recevant H7 IgGI N297Q le jour 28. Celles-ci n'ont pas été considérées comme cliniquement importants et de tels changements sont couramment observés en utilisant la voie d'administration intravitréenne.
Mortalité et signes cliniques
Il n'y a pas eu de décès pendant l'étude. Il n'y avait pas de signes cliniques liés au traitement. Les signes cliniques observés ont été considérés comme incidents ou liés aux procédures (par exemple, collecte du sang) et typiques des primates hébergés en laboratoire.
Poids corporel
Il n'y avait aucun effet lié au traitement sur les poids corporels ou les gains de poids corporel.
Ophtalmologie
Au prétraitement, quelques observations secondaires mineures ont été enregistrées ; toutefois, tous les animaux ont été jugés aptes à être affectés à l'étude. Au cours de la phase I, seuls des changements mineurs ont été observés après l'administration de la dose. Un petit nombre de cellules a été notée dans la chambre vitrée et antérieure dans 3/6 yeux (N ° 1002 et 1003).
Dans la phase II, l'exposition au laser a entraîné des modifications oculaires similaires liées à la procédure dans tous les yeux traités, qui comprenaient des cicatrices rétiniennes, des hémorragies et des hémorragies fovéales. Les hémorragies choriorétiniennes se sont améliorées au fil du temps et se sont résorbées dans la plupart des yeux au jour 28. De très légères opacifications cellulaires dans la partie antérieure du vitré ont été notées le jour 28 dans 9/12 yeux avec 1 mg H7 lgG4. On a également noté bilatéralement ces observations de cellules dans l'animal n ° 2004 ayant reçu le PBS de contrôle aux jours 9 et 28.
Efficacité et l'effet préventif sur la néo-vascularisation choroïdienne induite au laser de l'injection IVT du H7 lqG4
Analyse des résultats de Fluoro angiogrammes - Angiographie par fluorescéine
Le jour 1, les yeux de tous les animaux ont été soumis avec succès à un schéma/motif de 9 lésions laser pour l'évaluation de la néo-vascularisation choroïdienne (NVC). Alors que quelques animaux ont été notés avec plus de 9 lésions, seulement 9 lésions ont été évaluées.
Comme on peut le voir sur les résultats résumés sur la Figure 3 et ci-dessous dans le tableau 15, au jour 14, il y avait l'apparition d'un léger effet de l'lgG4 H7 dans la réduction de la NVC par rapport au témoin PBS. Suite à l'évaluation des lésions du Jour 29, la différence est plus marquée en faveur des animaux traités avec l'anti-CD160 H7 lgG4.
Au jour 29, les animaux recevant H7 lgG4 présentaient un nombre plus faible (13) de lésions cliniquement pertinentes (grade 3: fuite modérée et grade 4: fuite importante, combinée) par rapport au groupe PBS (25). L'incidence des lésions cliniquement pertinentes par rapport au nombre total de lésions laser était de 12% chez les yeux administrés H7 lgG4 comparativement à 23 ;1% pour le groupe PBS. En considérant le Nombre de lésions cliniquement pertinentes, il y avait un plus grand nombre de ces lésions dans le groupe PBS aux jours 14 et 29.
Tableau 15 : Impact des traitements Véhicule ou H7 lgG4 sur les grades des lésions lasers de néovascularisation choroïdienne observées dans les yeux de singe
Jour Grade des lésions lasers PBS Nombre de lésions (% /108 lésions totales évaluées) H7 lgG4 Nombre de lésions (% /108 lésions totales évaluées
14 0 2 (1.9%) 11 (10.2%)
1&2 89 (82.4%) 86 (79.6%)
3 &4 17 (15.7%) 11 (10.2%)
29 0 4(3.7%) 4(3.7%)
1&2 79 (73.1%) 91 (84.3%)
3 &4 25 (23.1%) 13 (12.0%)
Immunohistochimie
Evaluation des lésions laser par immunomarquage facteur de von Willebrand (vWF).
Les lésions laser ont été évaluées individuellement de manière semiquantitative pour la coloration positive du vWF et un score a été donné à la taille et à la nature de la lésion laser. La présence de vaisseaux vWF-positifs a été évaluée séparément au centre de la lésion laser et autour de sa périphérie. Une classification minimale a été utilisée (1) pour la présence de marquage fluorescent, légère (2) pour la présence de vaisseaux sanguins / capillaires vWF-positifs et modérée (3) lorsque la quantité de vaisseaux sanguins était supérieure à la moyenne dans les zones d'intérêt, centre et Périphérie de la lésion.
Le score moyen de coloration par vWF-positif était légèrement plus élevé (environ 10%) dans les groupes recevant H7 lgG4 au centre de la lésion laser. Alors que le groupe témoin avait un score légèrement plus élevé (environ 6%) à la périphérie des lésions par rapport au traitement seul.
Score des lésions ponctuelles
A un grossissement de 20X, le point de lésion laser a reçu un score de 1, 2 ou 3 en fonction de la taille de la lésion par rapport au champ visuel et la lésion a été caractérisée par le fait que la lésion ponctuelle était ouverte, ou avait une cicatrice choroïdienne centrale ou était complètement recouverte de cicatrice RPE.
Une lésion ouverte signifie qu'il y a absence du recouvrement de la lésion par les membranes de Bruch et de RPE. Une cicatrice choroïdienne se caractérise par la présence d'agrégats denses de tissu, fréquemment au centre de l'endroit qui semble fibreux et a une fluorescence de fond élevée. De même, la cicatrice RPE fait référence à une conjonction altérée de cellules RPE ou d'agrégats avec une structure fibreuse fine centrale avec une fluorescence de fond élevée. Tout comme avec les résultats de fluorescence de vWF, le score de taille de lésion dans les groupes traités avec lgG4 de H7 n'était pas très différent des témoins.
Cependant, si l'on considère l'apparition de la lésion par l'évaluation de l'état de couverture du point lésion par la RPE, son ouverture et la présence ou absence de cicatrice choroïdienne, les groupes traités par H7 lgG4 ont eu un nombre total plus élevé de lésions laser (32 à 16 lésions) complètement recouvertes par une cicatrisation avec de la membrane RPE alors que les groupes témoins avaient un nombre plus élevé de lésions ouvertes avec ou sans cicatrice centrale (26 à 19 lésions) (Tableau 16). Cela suggère un nombre plus élevé de points de cicatrisation dans les groupes traités par lgG4 H7, à condition qu'il n'y ait pas eu de différence pendant l'induction initiale de la lésion laser. Aucun enregistrement n'a été effectué pour l'animal N ° 2101 car l'intégrité de la couverture de la lésion a été affectée lors de l'élimination de la rétine et de la membrane RPE attachée.
Tableau 16 : Caractérisation des lésions laser présentes
Groupe Saline Control H7 lgG4
Nbre total de lésions Q. Q.
par animal t—1 CM en m LD 3 O t—1 CM M m 10 3 O
o O o o o O o O O o o o
t—1 o o o o o ÛJO o t—1 O o o o ÛJO
CM CM CM CM CM CM o M M M M M M o
Z Z
Lésions recouvertes
de cicatrisation
par la membrane RPE 1 5 1 0 9 16 4 2 5 8 6 7 32
Lésions ouvertes 2 2 5 8 0 17 1 4 1 0 0 2 7
Lésions ouvertes avec
une cicatrisation
centrale choroïdienne 4 2 2 1 0 9 4 3 1 1 3 0 12
Résumé :
Comme on le voit sur les Figures 3 et 4 et dans les tableaux 15 et 16, l'efficacité et l'effet préventif sur la néo-vascularisation choroïdienne induite au laser de l'injection IVT du H7 lgG4 vs le véhicule (PBS) ont été démontré comme suit.
Au jour 14, il y avait l'apparition d'un effet de l'lgG4 H7 dans la réduction de la néo-vascularisation choroïdienne par rapport au témoin PBS. Au jour 29, la différence est encore plus marquée dans le cas des animaux traités par l'lgG4 H7. Au jour 29, l'incidence de lésions cliniquement significatives par rapport au nombre total de lésions laser était de 12% chez les yeux administrés par lgG4 H7 comparativement à 23.1% pour le groupe PBS. En considérant le nombre combiné de lésions cliniquement pertinentes (grade 3: fuite modérée et grade 4: fuite importante,), il y avait un plus grand nombre de ces lésions dans le groupe PBS aux jours 14 et 29 comme on peut le voir Figure 3.
Comme on le voit Figure 4, l'administration d'lgG4 de H7 a été associée à un score de vascularisation légèrement plus élevé au centre des points de lésion laser, mais légèrement plus faible à la périphérie que dans le traitement témoin, comme le montre la coloration positive par le vWF et ceci est corrélé à l'impact du H7 lgG4 sur les lésions cliniquement pertinentes. En outre, il y avait une incidence plus élevée de lésions laser complètement recouvertes de cicatrice RPE par rapport aux animaux témoins qui eux avaient une incidence accrue de lésions lasers dites « ouvertes » avec ou sans une cicatrice choroïde centrale. Ces résultats suggèrent un processus de cicatrisation accéléré des lésions chez les animaux recevant le H7 lgG4, à condition que la lésion initiale créée par le laser soit similaire entre les animaux témoins et les animaux traités. Les scores de taille ponctuelle ne sont pas différents entre les animaux traités par lgG4 et les animaux témoins.
En conclusion, l'administration d'lgG4 de H7 (ELB01101) par injection intravitréenne unique bilatérale de 1 mg / oeil a été cliniquement bien tolérée chez des singes cynomolgus. Cela a été aussi le cas de l'anti CD160 H7 au format IgGl N297Q (ELB01111). H7 lgG4 a été associé à une réduction de la néo-vascularisation choroïdienne par rapport au contrôle véhicule (PBS) conjointement à une vascularisation légèrement plus élevée au centre de la lésion induite qu'en périphérie et une incidence plus élevée de lésions avec cicatrisation de la membrane RPE, ce qui suggère un processus de guérison accélérée dans les yeux traitées par l'anti CD160 H7 lgG4 (ELB01101).
Exemple 10 : Liaison de l'anticorps H7 IgGl sur des cellules tumorales de patients LLC
Les PBMC isolés de 7 patients LLC ont été marqués avec les anticorps CL1R2 (IgGl murin anti-CD160), anti-CD160 H7 en format IgGl, ou BY55 (IgM murin antiCD160), dans un panel CD19/CD5/CD3/CD56 (Voir Figure 5). Les cellules tumorales CD5+CD19+ ont été analysées pour mesurer l'intensité de fluorescence du marquage
CD160. L'expression du CD160 est détectable sur tous les échantillons de LLC avec des intensités variables. Comme on peut l'observer Figure 5, l'anticorps H7 IgGl se lie efficacement sur les cellules tumorales dans 6/7 des échantillons de LLC examinés.
L'anticorps H7 au format IgGl est donc capable de se fixer sur les cellules tumorales dans la LLC, et peut donc être utilisé pour cibler et tuer ces cellules malignes par un mécanisme de cytotoxicité tel notamment que l'ADCC ou la CDC.
Exemple 11 : Evaluation in vitro de l'ADCC induite par l'anticorps H7 au format IgG^sur des cellules CD160-positives
L'anticorps anti-CD160 H7 au format IgGl tue les cellules exprimant le CD160 par un mécanisme d'ADCC (voir Figure 6)
Des cellules NK purifiées du sang d'un donneur sain ont été utilisées comme effectrices dans un test mesurant l'activité ADCC de l'anticorps anti-CD160 H7 IgGl. Les cellules-cibles E300-CD160 (lignée cellulaire humaine pré-B transfectée exprimant le CD160) ont été marquées par du CFSE, et incubées avec les cellules NK effectrices en présence de l'anticorps H7 IgGl ou d'un contrôle isotypique IgGl humain, aux ratios effectrices/cibles indiqués (1/1, 1/5 et 1/10). Les pourcentages de cellules-cibles tuées ont été mesurés par marquage au 7AAD et analyse par cytométrie en flux. Les pourcentages de cellules mortes doublement marquées 7AAD+CFSE+ sont indiqués dans le quadrant supérieur droit sur les dot plots présentés.
Ces résultats ainsi que ceux présentés en Figure 5 (Exemple 10) montrent que l'anticorps H7 au format IgGi peut être utilisé pour cibler et tuer des cellules exprimant à leur surface le CD160, par un mécanisme d'ADCC.
Exemple 12 : Activation des cellules NK et de leur production d'interférongamma par l'anticorps H7 au format IgGi
Comme le montrent les résultats des Figures 7, 8 et 9, l'anticorps anti-CD160 H7 au format IgGi active les cellules NK.
Comme le montre la Figure 7, panneau A, l'anticorps H7 IgGl est capable de se fixer à la surface de cellules NK humaines purifiées du sang périphérique.
La Figure 7, panneau B, montre que le H7 IgGl induit la production d'interféron-gamma (IFN-γ) par les cellules NK. Des cellules NK purifiées du sang d'un donneur sain ont été cultivées pendant 24h dans des puits de plaques 96-puits (1 E+6 cellules par puits) seules ou en présence de l'anticorps H7 IgGl, ou d'un contrôle isotypique IgGl humain, concentrés à 1 ou 10 pg/mL. L'IFN-γ a été dosé par ELISA dans les surnageants de culture. Les résultats présentés sont des moyennes de triplicats +/sem.
La Figure 7, panneau C, montre que le H7 IgGl induit l'expression du marqueur d'activation CD69 sur les cellules NK. Dans la même expérience qu'en panneau B, les cellules NK ont été collectées après 24h de culture et marquées avec un anticorps anti-CD69 conjugué au fluorochrome APC. Les pourcentages de cellules CD69-positives ont été analysés par cytométrie en flux. Les moyennes (+/- sem) ont été calculées à partir de triplicats.
L'anticorps anti-CD160 H7 au format IgGl, mais pas au format lgG4, active les cellules NK, comme le montre la Figure 8. Des cellules NK purifiées du sang d'un donneur sain ont été cultivées seules ou en présence des anticorps suivants concentrés à 5 pg/mL : H7 IgGl, H7 lgG4, leurs contrôles isotypiques respectifs IgGl ou lgG4 humains, ou les anticorps ELB01103, ELB01104 et ELB01106, variants issus de l'anticorps H7 au format lgG4. Tous les anticorps ont été contrôlés pour vérifier l'absence de contamination par des endotoxines. L'anticorps anti-CD16 (ebioscience cat#16-0166) est utilisé comme contrôle positif. Les cellules NK (5.1E+S par puits) ont été collectées après 24h de culture et marquées avec un anticorps anti-CD69 conjugué au fluorochrome APC. Les pourcentages de cellules CD69-positives ont été analysés par cytométrie en flux (moyennes de triplicats +/- SD). L'anti-CD160 H7 au format IgGl induit l'expression du marqueur d'activation CD69 sur cellules NK, alors que le même anticorps au format lgG4 n'a pas d'effet. Les variants du H7 au format lgG4 humain (ELB01103, ELB01104 et ELB01106) ne présentent pas non plus d'effet activateur sur les cellules NK.
Exemple 13 : Activité stimulatrice des cellules NK augmentée avec les différents variants du H7 aux format IgGi et E345K/lgGi
Comme le montrent les résultats de la Figure 9 : Les variants issus de l'anticorps anti-CD160 H7 aux formats IgGl et E345K/lgGl ont une capacité accrue à activer les cellules NK. Des cellules NK purifiées du sang d'un donneur sain ont été cultivées pendant 24h dans des puits de plaques 96-puits (1 E+6 cellules par puits), seules ou en présence de l'anticorps anti-CD160 H7 IgGl, ou des variants ELB02102, ELB02103, ELB02104 (tous trois au format IgGl), ELB02112, ELB02113 ou ELB02114 (tous trois au format E345K/lgGl) produits par EIsaLys, à des doses de 0.001 à 10 pg/mL. Un IgGl humain à 10 pg/mL a été utilisé comme contrôle isotypique négatif, et un anti-CD16 (ebioscience cat#16-0166) comme contrôle positif.
L'IFN-gamma a été dosé par ELISA dans les surnageants de culture. Les résultats présentés sont des moyennes de triplicats +/- sem.
Les cellules NK ont été collectées et marquées avec un anticorps anti-CD69 conjugué au fluorochrome APC. Les pourcentages de cellules CD69-positives ont été analysés par cytométrie en flux. Les moyennes (+/- sem) ont été calculées à partir de triplicats.
Ces résultats ont été analysés à l'aide du logiciel GraphPad Prism pour générer des courbes de régression non linéaire (Log(agonist) vs response, 3-parameter équations) et calculer les concentrations efficaces médianes (EC50). Les EC50 d'induction du CD69 n'ont pas été calculées pour les 3 variants ELB02112, ELB02113 ou ELB02114, à cause de la mortalité observée aux concentrations supérieures ou égales à 0.1 pg/mL. La mortalité des NK stimulées par ces formats E345K/lgGl est probablement induite suite à la forte activation des cellules.
L'ensemble de ces résultats montre que les trois variants du H7 au format IgGl (ELB02102, ELB02103, ELB02104) sont nettement plus puissants que l'anticorps H7 IgGl d'origine (ELB02101) pour activer les cellules NK, avec une amélioration de 2 à 3 logs des EC50.
Les trois variants du H7 au format E345K/lgGl (soit ELB02112, ELB02113, ELB02114) présentent une capacité encore augmentée pour induire la production d'IFNgamma, avec une amélioration supplémentaire de 2-logs des EC50 (4-logs par rapport à l'anticorps H7 IgGl d'origine (ELB02101).
Les résultats présentés dans les exemples 12 et 13 montrent que les anticorps H7 et ses variants aux formats IgGi et E345K/lgGi sont capables d'activer les cellules NK et d'induire leur production d'IFN-γ. Ces propriétés les rendent susceptibles de stimuler la réponse immunitaire chez des patients atteints de cancer, via les cellules NK, et indirectement via les lymphocytes T et les cellules présentatrices d'antigènes activés par l'IFN-γ, une cytokine connue pour activer les réponses de type Thl.
De plus, ces propriétés rendent les anticorps dérivés du H7 aux formats IgGi et E345K/lgGi potentiellement capables d'augmenter l'activité cytotoxique ADCC induite par d'autres anticorps dotés de ce mode d'action qui seraient co-administrés, et donc permettrait d'améliorer leurs effets thérapeutiques.
Exemple 14 : Marquage des cellules NK et T CD8+ par les variants de l'anticorps H7 aux formats IgGl et E345K/lgGl
Les variants issus de l'anticorps anti-CD160 H7 aux formats IgGl et E345K/lgGl marquent plus efficacement les cellules NK et T CD8+ (Figure 10).
Les PBMC (cellules mononucléées du sang périphérique) de deux donneurs de sang ont été analysés par cytométrie en flux après un immunomarquage avec des anticorps anti-CD45, CD3, CD4, CD8 et CD19 et avec les anticorps anti-CD160 indiqués conjugués PE (LYNX Rapid RPE Antibody Conjugation Kit ref LNK022RPE) (0,25 pg pour 5E+S PBMC). Un IgGl humain irrelevant (hlgGl) a été utilisé comme contrôle négatif, les Fc récepteurs ont été saturés par un Fc humain (Rockland), 15min RT.
Sur la Figure 10, panneau A : Les variants du H7 au format IgGl (ELB02102, ELB02103, ELB02104) ou E345K/lgGl (ELB02112, ELB02113, ELB02114) se lient plus efficacement que l'anticorps H7 IgGl d'origine aux cellules NK, avec 60 à 80% de cellules NK marquées positivement. Sur la Figure 10, panneau B : Une population de cellules T CD8+, détectée nettement chez le donneur 2, est également marquée plus efficacement avec les variants du H7.
Ces résultats montrent que les variants issus de l'anticorps anti-CD160 H7 aux formats IgGi et E345K/lgGi se fixent sur les cellules NK et T CD8+ plus efficacement que l'anticorps H7 IgGi d'origine.
Ces résultats et ceux présentés dans les exemples précédents montrent que l'anticorps H7 IgGl et ses variants aux formats IgGl et E345K/lgGi peuvent se fixer non seulement sur les cellules NK et stimuler leur activité, mais aussi sur une population de lymphocytes T CD8+CD160+ dont ils pourraient également moduler l'activité.
Exemple 15 : Design et génération d'anticorps bispécifiques (bsabs) pour les candidats anti-CD160 et optimisés pour l'ophtalmologie et l'oncologie
Bispécifiques (bsabs) possibles avec un anti CD160 pour les indications ophtalmologie : seconde valence potentielle à combiner avec un anti -CD160 H7 ou maturé en affinité.
La stratégie décrite par Labrijn et al., 2014 a été appliquée pour développer une IgG bispécifique à partir des anticorps parentaux IgGl F405L anti hCD160 (clone H7) ou un de ses variants) et IgGl K409R constitué d'un anti hAngiopoietine 2 comme preuve de concept.
Un des anticorps est choisi dans le tableau 17 (pour l'application ophtalmologie) ou dans le tableau 18 (pour l'application oncologie). Ce premier anticorps est au format IgGl N297Q H310A-H435Q K409R pour l'ophtalmologie ou IgGl K409R pour l'oncologie. Le second anticorps est l'anti-CD160 H7 (ou un de ses variants). Ce second anticorps est au format IgGl N297Q H310A-H435Q F405L pour les indications ophtalmiques ou au format IgGl F405L pour l'oncologie.
Tableau 17 : Anticorps ciblant des antigènes utilisablesen ophtalmologie comme seconde valence potentielle pour réaliser un bsab anti CD160 ou à utiliser en combothérapie avec un anti -CD160 H7 ou un de ses variants.
anticorps contre Antigène humain ciblé bsab ou combothérapie Rationnel
Anti Angiopoietin 2 Combothérapie ou bsab Inhibe la néo-angiogenèse
bloquant de la voie Inhibe les TEM et l'inflammation
Anti CD200R Combothérapie ou bsab Inhibe les TEM et l'inflammation
(agoniste) Inhibe la sécrétion du VEGF par les Macrophages (inhibition de la néoangiogenèse? )
Anti Angiopoïétine like 4 Combothérapie ou bsab Inhibe la néo-angiogenèse en ciblant des sigaux anti apoptotiques
pas d'impact sur l'inflammation
Anti PDGF BB Combothérapie ou bsab Inhibe la stabilisation des péricytes
Anti VEGF (avastin or lucentis) combo Inhibe la néo-angiogenèse en ciblant des facteurs pro-angiogéniques
Anti amyloid beta Combothérapie ou bsab Inhibe l'inflammation
Anti PS Combothérapie ou bsab Inhibe la néo-angiogénèse en ciblant la vascularisation anormale
Anti Shingosine 1 Phosphate Combothérapie ou bsab Inhibe la néo-angiogenèse en ciblant la vascularisation anormale
Anti C'5 Combothérapie ou bsab Inhibe l'inflammation
Anti CD115 Combothérapie M1/M2 Polarisation
Tableau 18 : Anticorps ciblant des antigènes utilisables en oncologie comme seconde valence potentielle pour réaliser un bsab anti CD160 ou à utiliser en combothérapie avec un anti -CD160 H7 ou un de ses variants.
anticorps contre Antigène humain ciblé bsab ou combotherapie Rationnel
Anti-Ang2 Combothérapie ou bsab Inhibe la néo-angiogenèse
Inhibe les TEM et l'inflammation
Anti CD200R Combothérapie ou bsab Inhibe les TEM et l'inflammation
Inhibe la sécrétion du VEGF par les Macrophages (inhibition de la néoangiogenèse? )
Anti CD19 ou CD20 Combothérapie ou bsab Ciblage simultané de deux antigènes sur les CLLs pour augmenter spécificité tumorale et l'efficacité de lyse des B CLL cells.
Anti CD200 comme CLLTAAtaa Combothérapie ou bsab Ciblage simultané de deux antigènes sur les CLLs pour augmenter spécificité tumorale et l'efficacité de lyse des B CLL cells.
Anti CD180 Combothérapie ou bsab Ciblage simultané de deux antigènes sur les CLLs et sur les lymphomes de la zone marginale (MZL) pour augmenter spécificité tumorale et l'efficacité de lyse des lymphomes B.
Anti CD148 Combothérapie ou bsab Ciblage simultané de deux antigènes sur les CLLs et sur les tumeurs du manteau (MCL) pour augmenter spécificité tumorale et l'efficacité de lyse des lymphomes B.
Anti CD47 Combothérapie ou bsab augmentation de l'ADCP en + de l'ADCC
Cette technologie peut être employée pour générer les candidats bsabs anti 5 CD160 selon les indications ciblées ophtalmologie, oncologie ou immunothérapie.
Exemple 16 : Evaluation des combothérapies et des bispécifiques anti hCD160 / anti human angiopoïétine 2 ou anti hCD160 / anti human CD200R
Les combothérapies anti CD160 et son anticorps partenaire anti-X (en particulier où X est l'angiopoiétine 2 ou le CD200R) et des bispécifiques anti-CD160/antiX sont évaluées pour leur efficacité et pour l'additivité et/ou la synergie de leur efficacité dans le modèle lapin de néo-vascularisation cornéenne induit en tampon soude (NaOH) comme décrit dans (campos-mollo et al 2011) à deux doses de chaque anticorps (100 et 500pg) ou 100 et 500pg du bsab.

Claims (18)

  1. REVENDICATIONS
    1. . Composé qui se lie spécifiquement au CD160 humain, comprenant un domaine variable de chaîne légère (VL) choisi parmi SEQ ID No:14 ou SEQ ID No:13 et un domaine variable de chaîne lourde (VH) choisi parmi SEQ ID No:ll, SEQ ID No:25, SEQ ID No: 26, SEQ ID No:27, SEQ ID No: 28, SEQ ID No:29 et SEQ ID No:30;
  2. 2. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ce composé est un anticorps monoclonal, lequel a de préférence pour région constante, une région constante d'IgG, de préférence d'IgGl ou d'lgG4.
  3. 3. Composé selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que qu'il s'agit d'un anticorps monoclonal qui a pour domaine constant de chaîne lourde une séquence choisie parmi SEQ ID No:15, SEQ ID No: 16, SEQ ID No 31 à 35, SEQ ID No 43 et 44 et leurs mutants aglycosylés et pour domaine constant de chaîne légère une séquence choisie parmi SEQ ID No:22, SEQ ID No: 23 et SEQ ID No:24.
  4. 4. Composé selon l'une des revendications précédentes ayant une chaîne légère définie par SEQ ID No : 57 et une chaîne lourde dont la séquence est choisie parmi SEQ ID No : 45 à 51, SEQ ID No : 9, SEQ ID No 10, SEQ ID No : 12 et SEQ ID No : 58 à 64.
  5. 5. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un fragment choisi parmi un Fab, un Fab', un F(ab')2, et comprenant une chaîne légère définie par SEQ ID No :57 et une chaîne lourde comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID No. ID 36, SEQ ID No. 37 et SEQ ID No.38.
  6. 6. Composé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un dérivé du composé notamment choisi parmi les scFv, les scFv multimériques fusionnés à un fragment Fc, les diabodies, les triabodies, les scFv tétramériques, les dimères dont chaque monomère comprend un scFv lié à un fragment de chaîne lourde, les dimères dont chaque monomère comprend un scFv lié à des fragments de chaîne lourde, les F(ab')2 fusionnés en C-terminal à un domaine leucine zipper, les single3061716 domain antibodies, les formes comprenant au moins 2 Fabs liés en têteà-queue notamment le composé comprenant une chaîne lourde définie par la SEQ ID N° 40 ou SEQ ID No. 41 et une chaîne légère, SEQ ID No. 57, un anticorps tétravalent notamment le composé comprenant une chaîne lourde définie par la SEQ ID N° 42 et une chaîne légère SEQ ID No. 57.
  7. 7. Composé selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce qu'il s'agit un dérivé multi spécifique au moins bispécifique et qu'il comprend au moins un site de liaison au CD160 et un site de liaison à un autre antigène caractérisé en ce que l'autre antigène est notamment choisi parmi les antigènes suivants : VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PIGF, VEGF-R2, angiopoïétine 2; angiopoïétine like 4, CD200R, PDGF-AA, PDGFAB, PDGF-BB, PDGF-CC, PDGF-DD, PDGF-R, FGF tels que le FGF2 ou FGF beta, bêta-amyloïde, sphingosine-l-phosphate (S1P), C'5, IL6, MER TK, CD115, TNF alpha, IL8, HGF, TGF beta, IGF1, IL1, IL2, EGF, KGF, G-CSF, GM-CSF, intégrines apha-v beta-3 ou alpha-v beta-5, CD146 transmembranaire ou soluble ; MMP 1, MMP 2, MMP 9, MT1-MMP, TIMP-2; angiogénine ; PD-ECGF, le facteur d'activation plaquettaire; la prostaglandine E, pléiotropine, CMH de classe II, t HP59, CM101, CD3, CD25, CD28, , PDI, CTLA4, 4-1BB, LAG-3, ICOS, CD16, CD3, CD47, CD20, CD19, CD5, CD180, CD200, CD40, CD20, CD37, CD38, CD148 ou CD180 et notamment le composé défini par SEQ ID No.52.
  8. 8. Composition comprenant au moins un composé selon d'une des revendications 1 à 7.
  9. 9. Composition selon la revendication 8, comprenant en outre au moins un autre anticorps notamment dirigé contre l'un des antigènes suivant les antigènes suivants : VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PIGF, VEGF-R2, angiopoïétine 2; angiopoïétine like 4, CD200, CD200R, PDGF-AA, PDGFAB, PDGF-BB, PDGF-CC, PDGF-DD, PDGF-R, FGF tels que le FGF2 ou FGF beta, bêta-amyloïde, sphingosine-l-phosphate (S1P), C'5, IL6, MER TK, CD115, TNF alpha, IL8, HGF, TGF beta, IGF1, IL1, IL2, EGF, KGF, G-CSF, GM-CSF, intégrines apha-v beta-3 ou alpha-v beta-5, CD146 transmembranaire ou soluble ; MMP 1, MMP 2, MMP 9, MT1-MMP, TIMP-2 ; angiogénine ; PD-ECGF, le facteur d'activation plaquettaire; la prostaglandine E, pléiotropine, CMH de classe II, HP59, CM101, CD37, CD38, CD25, CD28, CD40, PDI, CTLA4, 4-1BB, LAG-3, ICOS, CD16, CD3, CD47, CD20, CD19, CD5, CD180, CD200, CD40, CD20, CD37, CD38,
    CD148, CD180, le rituximab, l'ofatumumab, l'obinutuzumab, l'ocaratuzumab, ou le veltuzumab.
  10. 10. Composé selon l'une des revendications 1 à 7 ou composition selon la revendication 8 ou 9, pour utilisation comme médicament.
  11. 11. Composé ou composition selon la revendication 10, pour utilisation comme anti-angiogénique, immunomodulateur et/ou agent cytotoxique
  12. 12. Composé selon la revendication 10 ou 11 pour son utilisation pour prévenir et/ou traiter les pathologies notamment choisies parmi les pathologies oculaires néovasculaires, le diabète, la cécité diabétique, la rétiopathie diabétique primaire ou la dégénérescence maculaire induite par l'âge, la polyarthrite rhumatoïde, la pré-éclampsie, l'éclampsie ou les cancers.
  13. 13. Composé selon l'une des revendications 1 à 7 ou composition selon la revendication 8 ou 9 pour son utilisation dans le traitement des cancers tels que le cancer du sein, le cancer colorectal, le cancer du poumon non à petites cellules, le lymphome non hodgkinien, les tumeurs génitourinaires comme le cancer du rein, le cancer de la prostate, le cancer de la vessie ou le carcinome rénal, le cancer du colon, le lymphome d'Hodgkins, le cancer du foie, le cancer du col, le cancer de l'ovaire, le mésothéliome et le glioblastome, les cancers hématologiques, notamment AML, MM, les lymphomes, la leucémie lymphoïde chronique ou la leucémie à tricholeucocytes ou dans le traitement des tumeurs solides notamment le mélanome, RCC, le cancer du poumon et notamment le cancer du poumon épidermoide, le neuroblastome, le carcinome ovarien, le cancer gastrique.
  14. 14. Composé selon l'une des revendication 1 à 7 ou composition selon la revendication 8 ou 9 pour son utilisation dans le traitement des cancers hématologiques en combinaison avec au moins un autre anticorps antiCD20 notamment le rituximab, l'ofatumumab, l'obinutuzumab, l'ocaratuzumab, ou le veltuzumab ; anti-CD37 ; anti-CD38 ou anti-CD40.
  15. 15. Acide nucléique isolé codant pour l'un des composés selon l'une des revendications 1 à 7.
  16. 16. Vecteur comprenant un acide nucléique de la revendication 15.
  17. 17. Cellule hôte comprenant le vecteur de la revendication 16 ou un acide nucléique selon la revendication 15.
  18. 18. Procédé de production composé selon l'une des revendications 1 à 7 comprenant la culture de la cellule hôte selon la revendication 17.
    1/10
    CHOWT BCHOCD160
    B
    7 ...............................................................................................................................
    6 .....................................................
    ELB01101 null ELB01102
    WT BCHOCD160
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