CN110381999B - 结合人cd160的化合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及与人CD160特异性结合的新颖化合物，该化合物包含：由SEQ ID No:14或SEQ ID No:13序列限定的轻链可变结构域(VL)，和选自SEQ ID No:11、SEQ ID No:25、SEQ ID No:26、SEQ ID No:27、SEQ ID No:28、SEQ ID No:29或SEQ ID No:30的序列的重链可变结构域(VH)，其片段或其衍生物。

Description

结合人CD160的化合物及其用途
本发明涉及一种与人CD160特异性结合的化合物，所述化合物具有由SEQ ID No:14或SEQ ID No:13限定的序列作为轻链可变结构域(VL)和选自SEQ ID No:11、SEQ ID No:25、SEQ ID No:26、SEQ ID No:27、SEQ ID No:28、SEQ ID No:29和SEQ ID No:30的序列作为重链可变结构域(VH)；其片段或其衍生物。
目前，单克隆抗体被用于作为治疗多种病理状况的治疗药物，所述病理状况包括癌症、自身免疫性疾病、慢性炎性疾病、移植排斥、传染性疾病、心血管疾病和某些眼部病理状况。市场上存在不少于约二十种单克隆抗体或其些片段，并且超过四百种正处于临床开发中。
选择作为疗法中潜在候选者的抗体因此具有重大战略意义。尤其，选择的抗体必须对其靶标具有良好亲和力和良好特异性，相对其可能的毒性而言疗效最佳，与此同时尽可能无免疫原性。
CL1-R2抗体属于与CD160受体特异性结合的现有抗体。它是专利EP1776387B1中描述的针对人CD160受体的鼠单克隆抗体。这种CL1-R2抗体具有SEQ ID No:1作为重链可变结构域(VH)，以及SEQ ID No:2作为轻链可变结构域(VL)。它具有抗血管生成特性并且还具有免疫调节特性。但是，其在人体中的施用受限，原因在于人抗鼠(小鼠)抗体(HAMA)形成的“HAMA反应”所致的过多免疫原性，所述反应(i)最终将引起对抗体的中和(或加速其清除)并且因此抵消其治疗效果并且(ii)还可能引起潜在的毒性风险(不良免疫反应，如过敏反应或血清疾病)。
除了目前可用的涉及血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂的抗VEGF治疗之外，需要提供有效治疗涉及新生血管的病理状况的化合物，尤其抗体。
实际上，血管生成是从在先存在的血管系统形成新血管，在生理上发生。但是，它还在多种病变中发挥作用，如角膜-视网膜新生血管性疾病，主要为缺血性视网膜病变(IR)或脉络膜性视网膜病变如渗出性或“湿性”年龄相关性黄斑变性(wAMD)。总之，它们构成发达国家中中度和重度视力减退的首要病因。
对wAMD和IR中血管生成和其病因学的认识日益增加已经导致开发靶向VEGF途径的药物。过去十年，玻璃体内(IVT)注射抗VEGF治疗药已经作为wAMD、视网膜静脉闭塞(RVO)和黄斑水肿(DME)中的一线治疗出现。
即使一般人群中抗VEGF疗法似乎安全，但与疗效和安全性相关的几个局限性已经明确浮现：经常需要频繁的IVT注射以实现完整疗效；长期使用抗VEGF导致长期疗效降低，与快速耐受或耐受性现象有关。超过30％的wAMD患者仍反应不良并且因此对抗VEGF具有抗性。另外，抗VEGF重复给药后，局部和全身性不良反应如血压升高、卒中和心肌梗死的风险升高已经在wAMD患者中报道。
这些局限性突出了在不增加耐受性的比率或安全问题以及减少注射次数的情况下，改进抗VEGF持续递送方案的必要。增加患者反应率的增加对解决大量的不良反应者或无反应者至关重要。因此迫切需要开发不依赖VEGF的补充性和协同性治疗药物，它们抑制病理性新血管化，同时对正常成熟组织的血管系统具有轻微影响或没有影响。
这些化合物将必需具有良好的生物学活性和对其靶标的特异亲和力，与此同时在人类中耐受良好并且尤其无免疫原性。
还需要新药物，其可以与现有疗法组合，尤其用于刺激免疫效应细胞如NK细胞和/或通过提高细胞毒性T细胞的无反应性。
本发明使得解决这些问题成为可能。本发明的主题是一种与人CD160特异性结合并且具有由SEQ ID No:14或SEQ ID No:13限定的选定序列作为轻链可变结构域(VL)和选自SEQ ID No:11、SEQ ID No:25、SEQ ID No:26、SEQ ID No:27、SEQ ID No:28、SEQ ID No:29和SEQ ID No:30的序列作为重链可变结构域(VH)的化合物和所述化合物的片段或衍生物。本发明的化合物特别地适合施用于对它们良好耐受并且无免疫原性的人类中。
本发明的化合物可以表现为抗体的形式，更特别是单克隆抗体、片段或衍生物的形式，并且能够以很好的亲和力与人CD160结合。
已经发现，相比于亲本CL1-R2抗体或其具有相同可变区和人类恒定区的重组嵌合形式，本发明的化合物对重组CD160蛋白和对CD160阳性细胞显示出好得多的亲和力。这非常有利，因为可以与人类中施用相容的嵌合形式仍显示一定量的潜在免疫原性。此外，这类抗体和片段及其衍生物具有优异的活性。
在以下的实施例中并且尤其在实施例1中佐证了这点，其中亲和测量出乎意料地明确显示，相比于鼠CL1-R2和其各自嵌合人IgG1和IgG4形式，IgG1样式和IgG4样式的H7对人CD160具有好得多的亲和力。与亲本CL1-R2抗CD160的KD相比，人IgG1样式和IgG4样式的H7的KD增长(参见实施例1，表1，第8列，KD增长)分别是约3.75和3.34。对于完全相同的50nM抗体浓度，相比H7 IgG4和CL1-R2，H7 IgG1获得更好反应，和嵌合样式的两种抗CD160的更差反应(参见实施例1，表1，第9列)。
另外，如实施例8中所述，与CL1-R2和与代表性人IgG1(贝伐单抗)相比，本发明的全部化合物均具有非常不同的血流中消除特征，血清中清除更快，如兔中全身性药效动力学参数所测量。
术语“人CD160”意指人CD160受体。它是识别常规HLA分子(HLA A和C)和非常规HLA分子(HLA G)和HVEM(疱疹病毒进入介体)、由糖基磷脂酰肌醇(GPI)基序锚定到细胞膜并且属于免疫球蛋白超家族(其存在免疫球蛋白样结构域)的27kDa受体。这种蛋白质进一步命名为CD160 GPI。这种蛋白质由免疫细胞：NK CD56dim CD16bright、T细胞亚群CD8、Tγ-δ和T细胞亚群CD4生理表达。CD160还在病理状况下如在血液癌中的B细胞(如B-CLL)或在新生血管性眼病变的活化内皮细胞上上调。人CD160的cDNA对应于WO 98/21240中描述的序列SEQ IDNo:1。人CD160的mRNA可在Genbank中按照登录号AF060981获得。人CD160的蛋白质序列对应于WO 98/21240中描述的序列SEQ ID No:2，并且可在Genbank中按照登录号AAC72302获得。
应当指出，CD160蛋白还存在另一个具有跨膜(TM)结构域的同工型，此后命名为CD160 TM。CD160 GPI同工型蛋白的蛋白质序列与CD160 TM同工型蛋白质序列的76.5％第一N末端部分的具有100％同源性。WO 2008/155363中描述人CD160 TM同工型的cDNA。人CD160的mRNA可在Genbank中按照登录号EU016100.1获得。人CD160 TM的蛋白质序列可按照登录号ABV89736.1在Genbank中获得。
BY55商业抗CD160 IgM和CL1-R2对CD160 GPI形式有特异性并且不能够识别CD160TM同工型，如(Giustiniani等人,2009)和(El-Far等人,2014)中分别描述。在现有技术中，不存在识别两种同工型CD160的抗CD160 mAb的描述。
本发明化合物的另一个有利特征是，它们能够识别两种同工型CD160(TM和GPI)，而亲本CL1-R2抗体不能识别，这将拓宽当这两个同工型在同一细胞上存在(例如，正如T淋巴瘤和NK淋巴瘤中那样)时的适应症。
在本发明的上下文中，术语化合物的“可变区”或“可变结构域”意指与抗体重链或轻链的氨基末端结构域相关的区域或结构域。重链可变结构域可以称作“VH”。轻链可变结构域可以称作“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变部分并且含有抗原结合位点。这种化合物可以表现为抗体形式，尤其单克隆抗体形式。
轻链可变区或重链可变区(VL或VH)由被三个称作“互补决定区”或“CDR”的高变区间隔的“框架区”组成。
全部6个CDR均能够实现抗体与其靶抗原的结合。例如，根据AbM CDR术语(更广和适应于抗体亲和力成熟技术)，CL1-R2抗体具有序列SEQ ID Nos:3至8作为CDR。这些CDR存在于本发明的化合物H7中。
本发明的化合物对其靶标(人CD160)具有优异的亲和力，其亲和力大于CL1-R2或CL1-R2的嵌合形式的亲和力(参见实施例1)。优选地，本发明的化合物具有序列SEQ ID No:11作为重链可变结构域(VH)和序列SEQ ID No:14作为轻链可变结构域(VL)。这种抗体尤其对应于实施例1中提到的“H7”抗体。
已经如实施例2中所述那样获得H7抗体的变体。
在本发明的另一个实施方式中，化合物具有序列SEQ ID No:25作为重链可变结构域(VH)和序列SEQ ID No:14作为轻链可变结构域(VL)。这种化合物尤其对应于“F04”抗体。
在本发明的另一个实施方式中，化合物具有序列SEQ ID No:26作为重链可变结构域(VH)和序列SEQ ID No:14作为轻链可变结构域(VL)。这种化合物尤其对应于“D09”抗体。
在本发明的另一个实施方式中，化合物具有序列SEQ ID No:27作为重链可变结构域(VH)和序列SEQ ID No:14作为轻链可变结构域(VL)。这种化合物尤其对应于“A12”抗体。
在本发明的另一个实施方式中，化合物具有序列SEQ ID No:28作为重链可变结构域(VH)和序列SEQ ID No:14作为轻链可变结构域(VL)。这种化合物尤其对应于“G05”抗体。
在本发明的另一个实施方式中，化合物具有序列SEQ ID No:29作为重链可变结构域(VH)和序列SEQ ID No:14作为轻链可变结构域(VL)。这种化合物尤其对应于“D12”抗体。
在本发明的另一个实施方式中，化合物具有序列SEQ ID No:30作为重链可变结构域(VH)和序列SEQ ID No:14作为轻链可变结构域(VL)。这种化合物尤其对应于“A09”抗体。
在本发明的一个具体实施方式中，化合物是靶向人CD160的单克隆抗体，所述单克隆抗体优选地具有免疫球蛋白(IgG)的恒定区，优选IgG1或IgG4的恒定区作为恒定区。
如本文定义的术语“恒定结构域”或“恒定区”意指来源于抗体的恒定区，其由重链或轻链免疫球蛋白恒定区之一的基因编码。
如本发明背景下所用，术语“恒定轻链”或“轻链恒定区”意指由κ(Cκ)或λ(Cλ)轻链编码的抗体区域。恒定轻链一般包含独特结构域，并且如本文定义，涉及Cκ或Cλ的108-214位置，其根据EU index进行编号(Kabat等人,1991)。
术语“恒定重链”或“重链恒定区”在此意指由μ、δ、γ、α或ε基因编码的，旨在将抗体的同种型分别规定为IgM、IgD、IgG、IgA或IgE的抗体区域。对于全长IgG抗体，如本文定义的恒定重链是指CH1结构域的N末端至CH3结构域的C末端，因此包含118-447位置，其根据EUindex进行编号。
优选地，靶向人CD160的本发明化合物的恒定区是IgG的恒定区。它可以选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的恒定区。
优选地，靶向人CD160的本发明化合物的恒定区是用于肿瘤中适应症的IgG1(SEQID No:16)、或IgG1 E345K(SEQ ID No:43)或E430G(SEQ ID No:44)的恒定区或用于眼科的IgG4 S228P/R409K(SEQ ID No:15)或IgG4-(S228P/R409K)+L235E(SEQ ID No:31)或IgG1N297Q或者者其他变体IgG4-(S228P/R409K)+H310A/H435Q(SEQ ID No:32)、IgG4-(S228P/R409K)+I253A(SEQ ID No:33)、IgG1-(N297Q)+H310A/H435Q(SEQ ID No:34)和IgG1-(N297Q)+I253A(SEQ ID No:35)及其非糖基化变体的恒定区。
IgG4亚类及其变体对涉及补体级联反应的效应子和Fcγ受体(或FcR，包括FcgRIIa、FcgRIIIa和FcgRI)具有很低的亲和力，这使其在以下情况时有利：不需要CDC(补体依赖的细胞毒性)效应和/或ADCC(抗体依赖性细胞介导细胞毒性)效应和/或ADCP(抗体依赖性细胞吞噬)和需要限制所获得抗体的可能毒性风险。
相反，IgG1亚类及其变体负责强烈的ADCC和/或CDC活性和/或ADCP，这使得它们有利于增加靶细胞的细胞裂解，但毒性风险更大。
在本发明的一个实施中，化合物是靶向人CD160的单克隆抗体，所述单克隆抗体具有选自SEQ ID No:22(Km3多态性对应于Ala153/Val191)、SEQ ID No:23(Km1多态性对应于Val153/Leu191)和SEQ ID No:24(Km1,2多态性对应于Ala153/Leu191)的序列作为轻链恒定结构域，以及选自SEQ ID No:15、SEQ ID No:16、SEQ ID No:31、SEQ ID No:32、SEQ IDNo:33、SEQ ID No:34和SEQ ID No:35的序列及其非糖基化变体作为重链恒定区。
更优选地，靶向人CD160的本发明化合物具有选自SEQ ID No:15、SEQ ID No:16、SEQ ID No:31、SEQ ID No:32、SEQ ID No:33、SEQ ID No:34、SEQ ID No:35及其非糖基化变体的序列作为重链恒定结构域，和序列SEQ ID No:22作为轻链恒定结构域。
本发明的化合物可以对CD160为单特异性或单官能性，同时为单价(单个抗原结合位点，在一个例子中是人CD160)，或同时为多价(至少2个位点与人CD160结合的)。
本发明的化合物也可以是多特异性化合物，例如：双特异性抗体(bsab)或相似分子。多特异性化合物是对至少两个不同表位(一般为非重叠)具有结合特异性的化合物。这些表位可以在相同或不同的靶标上。如果表位在不同的靶标上，这些靶标可以在相同的细胞上或在不同的细胞或不同的细胞类型上。在某些实施方案中，这些结合特异性之一是CD160，尤其人CD160的胞外结构域，另一个结合特异性是针对另外一种抗原。
本发明的多特异性化合物可以表现为以下形式：IgG形式下的双特异性抗体(例如，bsab、Fab臂交换(orthogonal Fabs)、链交换工程化结构域(strand exchangeengineered domain，SEED)或种子库体(Seed-body))、添加了Fab片段或ScFv片段的IgG(例如，DVD Ig、双结构域双头抗体(Dual domain double head antibodies,Di diabodies)，双-双抗体(Di diabodies)、亲和体(Affibodies)、Biomunex、Fynomab基于抗体片段(例如，双特异性抗体片段、Fv二聚体、BITE、ImmTACS、DART、BIKE)的bsab、三特异性抗体、基于融合蛋白(例如，scFV-融合物BsAb)的bsab、聚集的抗体等。
由多特异性化合物靶向(即能够与CD160和除CD160之外的至少一种抗原特异性结合)或由不同于本发明化合物并存在于本发明组合物中的抗体靶向的表位可以呈现于以下的抗原中：所述抗原是这样的靶标，其中激活或中和所述靶标可能在抑制血管生成或与这种血管生成过程相关的炎症中具有关键作用，如以下分子：VEGF(VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C或VEGF-D)和还PlGF(胎盘生长因子)、VEGF-R2、血管生成素2；血管生成素样4、CD200、CD200R、PDGF(PDGF-AA、PDGF-B、PDGF-BB、PDGF-CC或PDGF-DD)、PDGF-R、FGF如FGF2或FGFβ、β-淀粉样蛋白、鞘氨醇-1-磷酸(S1P)、C’5、IL6、MER TK、CD115、TNFα、IL8、HGF、TGFβ、IGF1、IL1、IL2、EGF、KGF、G-CSF、GM-CSF、α-v,β-3或α-v,β-5整联蛋白、跨膜和可溶性CD146；金属蛋白酶(如MMP1、2和9和MT1-MMP)；TIMP-2；血管生成素；内皮细胞生长因子(PD-ECGF)；血小板活化因子；前列腺素E；多效生长因子(pleiotropin)或MHC II类分子、HP59或CM101；或是这样的靶标，其中激活或中和所述靶标可能在T淋巴细胞复活化具有关键作用、其免疫抑制与不良预后和进展癌症相关，如以下分子：CD3、CD25、CD28、CD40、PD1、CTLA4、4-1BB、LAG-3或ICOS，或是这样的分子，其中靶向所述分子将使得接近免疫系统的关键因素CD160阳性细胞成为可能，如以下分子：CD16、CD3、CD47，或是这样的其他分子，其中靶向所述其他分子将强化B淋巴瘤的bsabs抗体的特异性，如以下分子：CLL的CD20、CD19、CD5、CD200、边缘区淋巴瘤(MZL)的CD180和套细胞淋巴瘤的CD148；或是这样的其他抗原，所述其他抗原使得增加scFv、Fab或任何其他衍生物如人血清白蛋白(HSA)的稳定性和药代动力学成为可能、CD180、CD200、CD40、CD20、CD37、CD38、CD148、CD180和任何其他B淋巴瘤特异性抗原。
术语靶向人CD160的本发明化合物的“片段”和“衍生物”分别意指已经保留所述化合物对人CD160的结合亲和力和特异性的片段和衍生物。这类片段和衍生物是所述化合物的功能性等同物。它们与所述化合物基本上结合相同的表位，和/或可以与所述化合物竞争结合人于CD160，并且它们保留针对人CD160的结合特异性，所述结合特异性足以使片段或衍生物不结合于除人CD160之外的HLA受体。
本发明的“片段”和“衍生物”对CD160具有类似于本发明化合物的亲和力。
术语靶向人CD160的本发明化合物的“片段”优选地意指一种形式，如Fab、Fab’(还原F(ab’)2，例如用β-巯基乙醇)、F(ab’)2或重链或轻链片段。靶向人CD160的本发明片段包含如上文限定的至少一个重链可变结构域(VH)和/或一个轻链可变结构域(VL)。
在本发明的一个具体实施方式中，所述化合物是包含轻链(VL)和重链的片段，所述轻链由SEQ ID No:57限定，所述重链包含选自SEQ ID No:36、SEQ ID No:37和SEQ IDNo:38的序列。
术语靶向人CD160的本发明化合物的“衍生物”意指这种化合物的样式，所述样式包含与至少一个不同于天然序列的序列(例如，接头如SEQ ID No.39，或另一种蛋白质、尤其是受体或其片段的序列)融合的至少一个重链可变结构域(VH)和/或一个轻链可变结构域(VL)。所述衍生物对人CD160具有与本发明完整化合物可比的结合亲和力，并且还对人CD160具有与本发明化合物可比的结合特异性。在本发明背景下，术语“可比的”意指结合亲和力或结合特异性可以在25％的限值范围内变动。可以根据本领域技术人员的常识，通过酶促反应、合成和/或基因工程，获得衍生物。
在本发明的一个具体实施中，化合物是包含轻链(VL)和重链的片段，所述轻链由SEQ ID No:57限定，所述重链包含选自SEQ ID No:40或SEQ ID No:41的序列。
本发明的衍生物可以为单价(单个位点结合抗原，所述抗原具体例子是人CD160)或为多价(至少2位点结合某抗原或几种抗原，所述抗原至少包括人CD160)。优选的多价衍生物包括双价、三价和四价衍生物。
在本发明的一个实施方案中，本发明的衍生物是多特异性或多功能化合物，例如双特异性抗体(bsab)或相似分子，其表位可以在相同或不同的靶标上。在一个实施方案中，双特异性抗体可以与CD160的两个不同表位结合。在另一个实施方案中，双特异性抗体可以与CD160的表位和除CD160之外的抗原的表位结合。上文已经在本说明书中描述感兴趣的表位。
“单链Fv”或“scFv”抗体衍生物包含抗体的VH结构域和VL结构域，这些结构域存在于一条多肽链中。
本发明的另一种衍生物是多价单特异性scFv，其可以通过至少两个单价衍生物彼此结合来获得。结合可以是共价或非共价的。几个CD160结合位点的存在增加了对这种抗原的结合容量。
本发明的另一种衍生物是多价多特异性scFv。
在其他衍生物当中，涉及到“双抗”，其指具有两个抗原结合位点的小型抗体衍生物，所述片段包含在一条多肽链((VH和VL)中与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。多价scFv优选自双抗(为双价并且由2个scFv组成)、三抗(为三价并且由3个scFv组成)和四聚体scFv。
本发明的另一种多价衍生物是二聚体，每个单体包含与重链片段(例如与CH3片段)结合的scFv；这对应于迷你抗体。迷你抗体中存在的2个scFv可以相同(迷你抗体则为单特异性，因为它仅结合人CD160)或不同(迷你抗体则为双特异性，因为它一方面结合于人CD160，还结合于另一种抗原)。
本发明的另一种多价衍生物还是二聚体，每个单体包含与重链片段(例如与CH2和CH3片段)结合的scFv。再次，存在的2个scFv可以相同或不同。在后一种情况下，它们称作双特异性抗体。
本发明的另一种多价衍生物是由一条单个的重链可变结构域组成的抗体片段。这对应于单域抗体(VHH或sdAb，由Ablynx称作纳米抗体)。
作为四价单特异性抗CD160衍生物的例子，还可以提到抗CD160分子，其中每个重链可变区上游，VH和CH1区如实施例3的SEQ ID No:42中所述那样重复。随后可以在哺乳动物细胞中共表达编码SEQ ID No:42和由SEQ ID No:57限定的抗CD160轻链的基因，旨在获得有四价功能单特异性抗CD160的功能形式。
本发明的另外一个衍生物是通过使用结合人CD160的嵌合鼠轻链/重链对子之一，重组产生IgM而获得的。
在另一个实施方案中，本发明的主题是包含至少一种本发明化合物的组合物。在一个具体实施中，组合物包含至少一种本发明化合物和除本发明化合物之外的至少一种抗体。
在本发明的一个实施方式中，如上文所述的化合物或组合物用作药物。
靶向人CD160的本发明化合物、其片段和/或其衍生物可以存在于药物组合物或药物中。这种药物组合物优选地包含药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的”指与生物系统如细胞、细胞培养物、组织或生物体相容，并且不干扰组合物中活性成分的生物学活性疗效的无毒材料。载体的特征将取决于施用方法。
药物组合物或药物可以是可施用至患者的任何形式，并且尤其包括溶液剂、混悬剂、冻干粉剂、胶囊剂和片剂。
药物组合物或药物可以是与注射，即局部注射、即玻璃体内注射、经粘膜施用、吸入、口服施用和更一般地适于预期目的任何制剂相容的形式。
本发明的主题还是一种包含如本申请中所述的化合物和与至少一种其他抗原特异性结合的抗体的产品，其中所述其他抗原可以与CD160(尤其与上文描述的抗原的表位之一)相同或不同，所述产品用于同时、单独或依次治疗和/或预防引起新血管化的病理状况，所述的病理状况尤其选自新生血管性眼病理状况、原发性糖尿病性视网膜病变或年龄相关性黄斑变性(ARMD)、糖尿病、糖尿病性失明、类风湿性关节炎、先兆子痫、子痫或癌。
术语“预防病理状况”意指防止这种疾病在尚未出现该疾病的受试者，尤其人类中发生。
术语“治疗病理状况”意指抑制这种疾病，即其发展的停滞、其消退，或疾病的症状和结果消失，或者疾病的病因消失。
更优选地，使用本发明的化合物或本发明的组合物作为抗血管生成剂、免疫调节剂和/或细胞毒药物。
本发明的主题更具体地是本发明的化合物，其用作为抗血管生成剂。
在本发明的上下文中，“抗血管生成剂”或“血管生成抑制剂”指直接或间接地抑制血管生成、血管新生或其他不想要的血管通透性的化合物。
优选地，本发明的化合物可以用于预防和/或治疗新生血管性病理状况、优选地新生血管性眼病理状况、糖尿病、糖尿病性失明，原发性糖尿病性视网膜病变或年龄相关性黄斑变性、类风湿性关节炎、先兆子痫、子痫或癌。
术语“新生血管性眼病理状况”意指全部新生血管性眼部疾病或病症。几种眼部病症与病理性血管生成相关。例如，ARMD的形成与称作脉络膜血管新生(CNV)的过程相关。糖尿病黄斑水肿(DME)是另一种具有血管生成组分的眼部病症。DME是糖尿病患者中度视力丧失的最广泛病因并且是糖尿病性视网膜病变(影响视网膜的血细胞的疾病)的常见并发症。
另一种与异常血管发生相关的眼部病症成是视网膜中央静脉闭塞(CRVO)。CRVO是因血液和流体蓄积在视网膜中，导致视网膜中央静脉阻塞引起。视网膜还可以变得局部缺血，导致不适宜的新血管生长，所述生长可能造成附加的视力丧失和更严重的并发症。
还可以、但非排他性提到其他的新生血管性眼病理状况，尤其选自Norrie病；全部形式的脉络膜血管新生、息肉样脉络膜视网膜血管病变、与近视和Sorsby营养障碍相关的反中心凹(retrofoveolar)脉络膜新生血管；葡萄膜黑色素瘤；和虹膜红变和新生血管性青光眼、视网膜血管瘤样增生(RAP)、在角膜移植并发症和/或角膜感染和/或角膜遭环境(选自致病性感染和化学烧伤)攻击后出现的新血管化；或全部形式的视网膜病变，包括糖尿病性和水肿性缺血、早熟糖尿病性视网膜病变、增生和非增生形式的视网膜病变、囊样黄斑水肿、全部形式的年龄相关性黄斑变性(ARMD)，尤其湿性、全部的卵黄状黄斑变性，包括Best病；眼血管瘤如Von Hippel-Lindau病；视网膜静脉周围炎；Coast病。
术语“糖尿病”意指任何类型的糖尿病，尤其糖尿病(与胰岛素有关)和尿崩症(与抗利尿激素有关)。在糖尿病的形式当中，可以提到I型糖尿病(胰岛素依赖性)、II型糖尿病(胰岛素敏感性下降)、妊娠糖尿病或新生儿糖尿病。在尿崩症形式当中，可以提到因垂体腺合成抗利尿激素少所致的中枢性糖尿病或因肾对抗利尿激素的敏感性低所致的外周性糖尿病。
术语“癌”意指细胞的任何异常增生。癌尤其是选自乳腺癌、结直肠癌、膀胱癌、肺癌和前列腺癌。
本发明的抗血管生成化合物可以尤其用于治疗其中新血管化组分是疾病传播的重要媒介的癌。尤其提到乳腺癌、结直肠癌、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、泌尿生殖系统肿瘤如肾癌、前列腺癌、膀胱癌或肾癌、结肠癌、霍奇金淋巴瘤、肝癌、宫颈癌、黑色素瘤、卵巢癌、间皮瘤和胶质母细胞瘤。
在一个具体实施中，可以使用本发明的化合物作为细胞毒性剂。
“细胞毒性抗体”或“细胞毒性剂”或“抗肿瘤剂”指治疗性单克隆抗体(mAb)或其片段或衍生物，其诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或者诱导补体依赖的细胞毒性，或者诱导抗体依赖的细胞介导的吞噬(ADCP)和在肿瘤细胞中直接诱导凋亡。
本发明的另一种衍生物是细胞毒活性改善的化合物。可以通过移植抗CD160的可变链到Fc区糖基化(例如去岩藻糖化)优化过的IgG样式上或通过工程化目的抗体的Fc的氨基酸序列(例如引入DLE三重突变(S293D/A330L/I332E))进行修饰，获得细胞毒活性改善的化合物。也可以通过以下方式获得这种化合物：根据Hexabody样式，或者根据BITE或备选地BiKE样式(具有针对CD160的一个价态和针对CD16的第二价态)或TriKE样式，产生该化合物的样式。本发明的实施例03中提到这些改进的例子。还可以产生这样的本发明化合物，其中抗体的一个或多个残基替换为半胱氨酸残基，并且用游离巯基从而产生治疗剂如免疫毒素、放射免疫缀合物或者ADC(抗体-药物缀合物)。
在本发明的另一个双价双特异性化合物中，在一个涉及NK细胞的抗体中，还可以在一方面使用CD160作为CD16价态的替换，以及在另一方面使用非CD160价态的肿瘤抗原。这是因为CD160也是天然NK细胞上表达的活化受体(参见本发明的实施例15和实施例16)。这种化合物与NK细胞的CD160相互作用将随后导致NK细胞活化并且还带领这些效应细胞接近于其肿瘤靶标。
本发明的另一种衍生物是全身性半衰期改善以改善其细胞毒活性的化合物。
本发明的化合物或组合物可以用于治疗血液癌或实体瘤。实施例3和实施例4中呈现本发明的细胞毒化合物例子。
已知CD160是某些肿瘤细胞特有的、尤其在大部分B细胞慢性淋巴白血病(B-CLL，还有毛细胞白血病(HCL))中特有的抗原，并且在边缘区淋巴瘤的病例中和套细胞淋巴瘤中随患者变化而具有更为异质的表达。但是，CD160是一种在正常循环型B细胞上完全不表达的抗原。抗CD160抗体可以因此用来特异性杀伤或抑制这些B淋巴瘤的肿瘤生长。
本发明的化合物可以因此用于治疗血液癌、尤其慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病、急性髓性白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)，或用于治疗实体瘤、尤其黑色素瘤、肾癌、肺癌和尤其表皮样肺癌、神经母细胞瘤、卵巢癌、乳腺癌、胃癌。
本发明的化合物也可以与至少一种其他抗体，如抗CD20抗体、尤其利妥昔单抗(rituximab)、奥法木单抗(ofatumumab)、阿托珠单抗(obinutuzumab)、奥卡拉珠单抗(ocaratuzumab)、或维妥珠单抗(veltuzumab)、抗CD37抗体、抗CD38抗体或抗CD40抗体，联合用于治疗血液癌。
本发明的抗CD160化合物可以在治疗有利地响应于免疫检查点抑制剂的癌，尤其黑色素瘤、非小细胞肺癌、泌尿生殖系统肿瘤如膀胱癌或肾癌、结肠癌、霍奇金淋巴瘤、或乳腺癌中，用于调节免疫性NK细胞和T细胞上CD160的免疫调节活性。
术语“CD160免疫调节活性”指一种或多种与CD160相关的免疫调节活性。
术语“调节”和“免疫调节剂”及其相关术语指与因其与抗CD160抗体相互作用而上调T淋巴细胞应答或NK细胞应答相关的CD160活性降低或增加，其中增加是相对于相同抗体不存在的情况下CD160的活性而言。活性降低或增加优选地达至少大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。当降低CD160活性时，术语“调节剂”和“调节”与术语“抑制剂”和“抑制”可互换。当增加CD160活性时，术语“调节剂”和“调节”与术语“活化剂”和“活化”可互换。
可以分别如施例14和实施例15中所述那样，利用NK活性测量(通过分析标志物如CD69)或细胞因子(如IFNγ)分泌的测量，定量地确定CD160活性。也可以通过如实施例19中所述那样测量增殖、细胞因子分泌或活化标志物如CD69，利用T细胞活性评估确定CD160的活性。
免疫调节剂的组合将对改善针对免疫检查点抑制剂的临床反应至关重要。
因此，在一个具体实施方案中，本发明的化合物在组合物中与一个这些免疫调节剂之一，优选地与抗PD-1、抗CTLA-4或抗PD-L1组合，其中使用所述组合物作为免疫调节剂。
在本发明的另一个具体实施方案中，使用抗CD160化合物作为免疫调节剂以通过活化表达CD160的上皮内天然淋巴样细胞，刺激对病原菌的防疫，以治疗细菌性感染，其中所述病原菌感染肠(尤其大肠杆菌(Escherichia coli)、艰难梭菌(Clostridiumdifficile))或肺(尤其肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae))。
本发明的主题还是编码本发明化合物的核酸或其片段或其衍生物。术语“核酸”意指DNA、cDNA或RNA序列。
本发明的另一个主题是包含所述核酸的表达载体或包含所述核酸的表达盒。根据本发明，适宜的表达载体可以包含至少一个与所述核酸功能性连接的表达控制元件。表达控制元件插入载体中并且使得调节核酸表达成为可能。
本发明的另一个主题是重组细胞，其包含如上文所述的表达载体或如上文所述的一个或多个核酸。根据本发明，可以使用的细胞的例子是真核细胞，如动物、植物、昆虫和酵母细胞；和原核细胞，如大肠杆菌。可以向细胞中引入携带基因的载体的手段尤其包括微量注射法、电穿孔法、使用DEAE葡聚糖转导或转染法、脂质体转染法、磷酸钙法或本领域技术人员已知的其他方法。在一个优选的实施方案中，使用在真核细胞中发挥功能的真核表达载体。
这类载体和核酸可以用于基因或细胞治疗，旨在引起宿主生物产生目的蛋白，在具体例子时，本发明化合物。
本发明的主题还是一种用于治疗受试者，优选人类的方法，其中将治疗有效量的本发明化合物施用至所述受试者。本发明化合物因此以治疗有效量施用。治疗有效量对应于足以预防和/或治疗所靶向的新生血管性病理状况的量。这种量可以随受试者年龄、性别和疾病阶段变动并且将由本领域技术人员决定。治疗有效量可以在每日一次或多次施用时，在0.01mg/kg和50mg/kg之间、优选地在0.1mg/kg和20mg/kg之间和更优选地在0.1mg/kg和2mg/kg之间变动，持续一天或多天。
施用方法可以是通过注射或通过逐步输注。注射可以是静脉内、腹膜内、肌内、皮下、经皮、结膜下、眼内或玻璃体内注射。对于结膜下或玻璃体内注射，本发明化合物的治疗有效量可以在0.1mg和10mg之间。
用于肠胃外施用的制剂可以包括无菌水溶液剂或非水溶液剂、混悬剂或乳剂。非水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油，如橄榄油、或注射用有机酯如油酸乙酯。含水载体包括水、醇/水溶液、乳液或混悬液。用于肠胃外施用的制剂还可以包含糖和/或盐。
本发明的化合物可以被标记。标记物的例子包括毒素、酶、放射性同位素、荧光化合物、胶质材料、化学发光化合物和生物发光化合物。用于将标记物与抗体结合的方法是本领域技术人员熟知的。
另一个标记技术在于偶联抗体至低分子量半抗原，可能借助第二反应特异性修饰这些半抗原。半抗原的例子是与抗生物素蛋白反应的生物素，或可以与抗半抗原特异性抗体反应的二硝基酚、吡哆醛或荧光素。
本发明现在通过以下实施例和附图说明。
附图说明
图1：
A)IgG1样式和IgG1 E345K样式的H7候选物及其变体与CHO WT和CHO-hCD160结合的比较
B)IgG4样式和IgG4 H310A-H435Q样式的H7候选物及其变体与CHO WT和CHO-hCD160结合的比较
C)H7候选物IgG4(ELB01101)、处于IgG4样式的H7 D12变体(ELB01103)、具有附加FcRn无效突变H7 D12变体(ELB01104)、Fab样式的H7 D12变体(ELB01122)和依据Fab-接头-Fab样式的H7 D12变体(ELB01132)与YT2C2(NK细胞系)的结合黑色圆圈：人IgG4；黑色三角形：ELB01101(H7 IgG4)；黑色倒三角形：ELB01103；黑色正方形：ELB01104；黑色菱形：ELB01122；黑色星形：ELB01132。
图2：大鼠角膜新生血管模型中与阿柏西普(Aflibercept)相比，评价IgG4样式的抗CD160抗体(ELB01101)随时间推移的疗效。在这个条形图上报告了平均值和误差标准。白色条：在第8天的血管化％，黑色条：在第12天的血管化％。
图3：在兔中与亲本CL1-R2、贝伐单抗和来尼珠单抗(ranibizumab)相比，两个施用途径即玻璃体内途径(图3A)与静脉内途径(图3B)后，不同IgG样式的H7和H7变体随时间变化的平均血清浓度。
图4：抗CD160 H7 IgG4(ELB01101)对激光所致脉络膜血管新生猴模型中有临床意义病灶(3级和4级)的总数的影响(3级和4级/108次激光冲击的合并评分)。用抗CD160(H7IgG4 ELB 01101)或用载体对照处理的动物的激光所致病灶总数是108(对应于12只眼，每只眼9次冲击)。
图5：脉络膜血管新生猴模型中抗CD160 H7(ELB01101)对激光所致病灶的瘢痕伤口愈合情况的影响。用针对血管性血友病因子的抗体标记后，通过免疫组织化学分析分别估计愈合状态和病灶开放情况。与愈合或未愈合的开放斑点百分数(％)相比，愈合期间的斑点百分数(％)(也就是说，被RPE膜覆盖)表现为条形图。在该图上，具有中央脉络膜瘢痕的开放斑点％表现为纯黑色条，无中央脉络膜瘢痕的开放斑点％表现为黑色对角线条，正在愈合的斑点％(被RPE瘢痕覆盖的斑点)表现为白色点染条。
图6：激光所致ChNV猴模型中，IgG4样式的H7 D12(ELB01103)的剂量疗效数据总结。
在小图A中报告了ELB01103随时间推移(在第0天及第14天和第0天及第28天之间)对有临床意义病灶(3级+4级)/斑点总数％的影响/影响程度。第14天和第28天时的疗效数据分别表现为纯黑色条和对角线黑色条。这个模型中如文献中报道的抗VEGF的平均疗效水平由黑色箭头指示。
在小图B中报告了ELB01103随时间推移对泄漏严重程度演变情况的影响。依据有临床意义的独立ChNV病灶的等级评分随时间推移(第14天至第28天)的变化，观察泄漏严重程度的演变情况。
在小图C中，描述ELB01103剂量递增(0.3至3mg)对第14天至第28天有临床意义病灶的ChNV面积平均变化的影响。
在小图D中，描述了ELB01103剂量(1mg)对第14天和第28天之间几个类型病灶的视网膜厚度平均变化的影响。以灰色报告对全部病灶(1级+2级+3级+4级)的影响，以对角线灰色条报告对有临床意义病灶(3级+4级)的影响并且以黑色报告仅考虑4级病灶时的影响。
图7：激光所致ChNV猴模型中，Fab接头Fab样式的H7 D12(ELB01132)的剂量疗效数据总结。
在小图A中报告了ELB01132随时间推移(在第0天及第14天和第0天及第28天之间)对有临床意义病灶(3级+4级)/斑点总数％的影响/影响程度。第14天和第28天时的疗效数据分别表现为纯黑色条和对角线黑色条。这个模型中如文献中报道的抗VEGF的平均疗效水平由黑色箭头指示。
在小图B中报告了ELB01132随时间推移对泄漏严重程度演变情况的影响。依据有临床意义的独立ChNV病灶的等级评分随时间推移(第14天至第28天)的变化，观察泄漏严重程度的演变情况。
在小图C中，描述ELB01132剂量递增(0.25至2mg)对第14天至第28天有临床意义病灶的ChNV面积平均变化的影响。
在小图D中，描述了ELB01132剂量(0.6mg)对第14天和第28天之间几个类型病灶的视网膜厚度平均变化的影响。以灰色报告对全部病灶(1级+2级+3级+4级)的影响，以对角线灰色条报告对有临床意义病灶(3级+4级)的影响并且以黑色报告仅考虑4级病灶时的影响。
图8：IgG1样式的抗CD160 H7抗体识别CLL患者的CD160阳性肿瘤细胞。
在CD19/CD5/CD3/CD56板(panel)中，用抗体CL1-R2(鼠抗CD160IgG1)、IgG1样式的本发明抗CD160 H7或BY55(鼠抗CD160 IgM)标记分离自7名CLL患者的PBMC。分析CD5+CD19+肿瘤细胞以测量CD160标记的荧光强度。CD160表达在全部CLL样品上以可变强度均可检测。在6/7所检查的CLL样品中，H7 IgG1抗体与肿瘤细胞高效结合。
auto＝细胞自身的荧光；同种型(isotype)＝IgG1或IgM，鼠，不相关，阴性对照
图9：IgG1样式的抗CD160 H7抗体通过ADCC机制杀伤表达CD160的细胞。
在测量抗CD160 H7 IgG1抗体的ADCC活性的试验中，使用从健康供体血液纯化的NK细胞作为效应子。将E300-CD160靶细胞(转染的表达CD160前B人细胞系)用CFSE标记，并且在H7 IgG1抗体或人IgG1同种型对照存在下，按所示的效应子/靶标比率(1/1、1/5和1/10)与效应子NK细胞温育。通过用7AAD标记和流式细胞分析，测量已杀伤靶标细胞的百分比。在呈现的点图上右上象限内指示双重标记的7AAD+CFSE+死细胞的百分数。
图10：IgG1样式的抗CD160 H7抗体活化NK细胞。
A)H7 IgG1抗体与人NK细胞结合。使用Miltenyi试剂盒(参考号130-092-657)和autoMACSTM(Miltenyi ref.130-092-545)，从健康供体的血液纯化NK细胞。用人IgG/Fc片段(Rockland ref.009-0103)饱和细胞表面Fc受体15分钟后，5×105个NK在4℃与0.25μg H7IgG1抗体或人IgG1(同种型对照)温育20分钟，使用抗体缀合试剂盒(Lynx ref.PELNK021RPE)和CD56-APC与藻红蛋白偶联。直方图显示用H7 IgG1(黑色)或hIgG1对照(灰色)对CD56阳性群体分析获得的荧光曲线。
B)H7 IgG1诱导NK细胞产生干扰素-γ(IFN-γ)。将纯化自健康供体血液的NK细胞在96孔板的孔中单独或在浓缩至1或10μg/ml的H7 IgG1抗体或人IgG1同种型对照存在下培养24小时(1×10+6个细胞/孔)。通过ELISA分析培养上清液中的IFN-γ。呈现的结果是三次重复的均数+/-sem。
C)H7 IgG1诱导NK细胞上的活化标志物CD69表达。在相同实验中，将NK细胞在培养24小时后收集并用缀合于荧光物质APC的抗CD69抗体标记。通过流式细胞术分析CD69阳性细胞的百分数。从三次重复计算出均数(+/-sem)。
图11：IgG1样式而非IgG4样式的抗CD160 H7抗体活化NK细胞。
将纯化自健康供体血液的NK细胞单独或在浓缩至5μg/ml的以下抗体存在下培养：H7 IgG1、H7 IgG4、它们各自的人IgG1或IgG4同种型对照，或抗体ELB01103、ELB01104和ELB01106，它们是从IgG4样式的H7抗体衍生的变体。使用抗CD16抗体(Ebiosciencecat#16-0166)作为阳性对照。将NK细胞(5×10+5个/孔)在培养24小时后收集并用缀合荧光物质APC的抗CD69抗体标记。通过流式细胞术分析CD69阳性细胞的百分数(三次重复的均数+/-SD)。IgG1样式的抗CD160 H7诱导NK细胞上活化标志物CD69表达，而IgG4样式的相同抗体无效果。H7变体IgG4(ELB01103、ELB01104和ELB01106)也不对NK细胞显示任何活化效果。
图12：从IgG1样式和E345K/IgG1样式的抗CD160 H7抗体衍生的变体具有增加的NK细胞活化能力。
将纯化自健康供体血液的NK细胞在96孔板的孔中(1×10+6个细胞/孔)单独或在剂量0.001至10μg/ml的抗CD160 H7 IgG1抗体或ElsaLys产生的变体ELB02102、ELB02103、ELB02104(全部三者均为IgG1样式)、ELB02112、ELB02113或ELB02114(全部三者均为E345K/IgG1样式)存在下培养24小时。使用10μg/ml的人IgG1作为阴性同种型对照，并且使用抗CD16(Ebioscience cat#16-0166)作为阳性对照。
A)通过ELISA分析培养上清液中的IFN-γ。呈现的结果是三次重复的均数+/-sem。
B)将NK细胞收集并用缀合荧光物质APC的抗CD69抗体标记。通过流式细胞术分析CD69阳性细胞的百分数。从三次重复计算出均数(+/-sem)。
全部这些结果均显示，就活化NK细胞而言，IgG1样式的三种H7变体(ELB02102、ELB02103、ELB02104)比原始H7 IgG1抗体强有力得多，EC50值改善2至3个对数。
E345K/IgG1样式的三种H7变体显示诱导IFN-γ产生的能力进一步增加，EC50值额外改善2个对数(与原始H7 IgG1抗体相比，4个对数)。
图13：从IgG1样式和E345K/IgG1样式的抗CD160 H7抗体衍生的变体高效标记NK细胞(图13A)和CD8+T细胞(图13B)。
用抗CD45、CD3、CD4、CD8和CD19抗体，并用所示的抗CD160抗体(对于5×10+5个PBMC，0.25μg)免疫标记后，通过流式细胞术分析来自两名健康供体的PBMC(外周血单核细胞)。使用无关的人IgG1(hIgG1)作为阴性对照。不加阴影的条：供体1；加阴影的条：供体2。
图14：ELB02101(H7 IgG1)候选物和变体ELB02104、ELB02114和ELB01103与CHO-CD160 TM(跨膜)、CHO-CD160 GPI(糖基磷脂酰肌醇)和CL1R2的CHO的结合。
人源化ELB02101(H7 IgG1)和变体ELB02104、ELB02114和ELB01103出乎意料地与重组表达的人CD160-TM的CHO-S细胞结合，而亲本CL1R2mAb并不结合。黑色条：CHO；加阴影的条：CHO-CD160-GPI(糖基磷脂酰肌醇)、棋盘条：CHO-CD160TM(跨膜)
图15：通过IgG1样式的H7 A09变体(ELB02104)阻断HVEM-CD160相互作用的T CD4再活化。
将纯化自健康供体血液的T CD4淋巴细胞在96孔板中(1×10+6个细胞/孔)，在抗CD160 mAb：ELB02104或者具有10μg/ml的适宜同种型对照存在下，并与平板上包被的抗CD3(克隆UTCH1)mAb+/-抗CD28(克隆CD28.2)mAb+/-HVEM蛋白(10334-H08H，Sino biological)一起培养16小时。收集T CD4淋巴细胞并用以下标记：存活标志物：Zombie NIR、靶向初始/记忆细胞的与荧光物质BB515缀合的抗CD45RA抗体、靶向表达CD160细胞的与荧光物质Alexa fluor 647缀合的抗CD160(克隆BY55)抗体和靶向已活化细胞的与荧光物质PE缀合的抗CD69抗体。通过流式细胞术分析Zombie NIR-/CD45RAhigh+/CD160+/CD69+阳性细胞的百分数。从两次重复计算出均数(+/-sem)。ELB02104阻断HVEM-CD160相互作用并且移除HVEM蛋白诱导对T CD4细胞的抑制，如通过T CD4CD45RAhighCD160+细胞表达的活化标志物CD69上调所示。白色条：人IgG1同种型对照；黑色条：ELB02104
实施例1：研究本发明抗体的结合作用
利用生物膜层干涉测量原理，根据实验配备各种类型光纤生物传感器的Octet K2仪(Pall ForteBio)上实施表1中所述的鼠抗hCD160 CL1-R2或其衍生形式(嵌合IgG1和嵌合IgG4)或本发明化合物(H7 IgG1、H7 IgG4)的亲和力测定和比较。通过测量人CD160蛋白/抗体相互作用，研究本发明抗体与其靶标结合的能力。
为此目的，通过本领域技术人员熟知的技术制备高纯度(在蛋白A上并且随后通过凝胶过滤纯化)的单体抗人CD160抗体。与可溶性形式的携带6个组氨酸残基的C末端标签的重组人CD160蛋白相对应的蛋白质区域(来自R&D SYSTEMS)按其商业制剂使用。
将多种待测试的抗CD160候选物(即本发明化合物)的亲和力与嵌合抗体的亲和力和CL1-R2的亲和力比较。
全部实验均在30℃在Fortebio推荐的运行缓冲液(含0.1％(p/v)牛血清白蛋白(BSA)和0.02％(v/v)Tween-20的PBS)中实施。这种缓冲液还用于稀释多种配体和分析物。沉积在96孔微量平板(cat#738-0026，Dutscher)中的样品以1000转/分钟振摇。
使用生物素酰化的包含6-组氨酸-残基标签的CD160蛋白作为链霉亲和素生物传感器上的配体，并且使用本发明化合物,抗hCD160(IgG1样式和IgG4样式)、和抗CD160、和嵌合化合物作为分析物。
根据供应商的建议，使用EZ-连接磺基-NHS-LC-生物素(EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin)方法(Thermo Fisher Scientific)，生物素酰化这种hCD160-his蛋白质，验证其均匀性、聚集物缺失情况和其为抗CD160所识别的能力，同时验证非生物素酰化的蛋白质。采用多种蛋白质浓度的固定试验显示，浓度10nM为最佳。生物素酰化的CD160蛋白因此按浓度0.3μg/ml(即10nM)在链霉亲和素生物传感器上固定10分钟。常见的固定产生2+/-0.3nm的信号。
通过添加6个抗体浓度(3.125、6.25、12.5、25、50和100nM)，测定每种纯化抗体(分子量150kDa)的动力学常数(KD、kon和koff，也称作Kdis)。在测量之间，通过暴露于以下3个循环：在10mM甘氨酸，pH 2中5秒，随后在运行缓冲液中5秒，再生生物传感器的表面。测量结合和解离阶段300秒。通过扣减配体仅经历运行缓冲液的参考孔，将全部量值均对基础漂移修正。
通过应用1:1相互作用模型计算每种抗体的解离常数和缔合速率常数(kon)和解离速率常数(kdis)，依据ForteBio 9.0数据分析软件进行曲线的总体数学建模(拟合)(由传感器结合的Rmax)。从分析中排除不能使用该软件可靠建模(这通常由根据异质模型的结合作用引起)的曲线(大多数情况下R2总体<0.925)。
对于每种抗CD160，比较50nM抗CD160抗体浓度的解离常数(KD)和缔合速率常数(kon)和解离速率常数(kdis)，且还比较结合响应，并且在表1中报告。
表1：通过生物层干涉测量(BLI)鼠CL1-R2抗体、从CL1-R2(人IgG1(chIgG1)样式或IgG4(chIgG4)样式)嵌合的抗体、和本发明H7抗体(人IgG1(H7 IgG1)样式或IgG4(H7 IgG4)样式)与重组人CD160/抗hCD160相互作用亲和力的量值。
亲和力量值出乎意料地明确显示了，相比鼠CL1-R2和其相应的人嵌合IgG1形式和IgG4形式，IgG1样式和IgG4样式的H7对人CD160具有好得多的亲和力。与亲本CL1-R2抗CD160的KD相比，人IgG1样式和IgG4样式的H7的KD增长(参考KD增长，表1，第8列)分别是约3.75和3.34。对于完全相同的50nM抗体浓度，H7 IgG1相比于H7 IgG4和CL1-R2获得更好的反应，嵌合样式的两种抗CD160的获得更差反应(表1，第9列)。
通过流式细胞术研究过量表达人CD160的重组E300-hCD160细胞，通过ELISA研究CD160蛋白或含有与抗hCD160抗体结合是必需和足够的多肽，通过肽扫描鉴定人CD160序列，验证了H7良好地与其靶标结合。H7候选物是针对实验其余部分、尤其是针对亲和力成熟和针对衍生成为适于所靶向的各种临床适应症的IgG或IgG片段的各种样式所选择的候选物。
实施例2：H7抗体的变体
依据ELISA、FACS和SPR，细菌周质提取物中产生的一组处于噬菌体形式和可溶性Fab形式的H7变体的结合特征。
为了获得衍生自人源化抗CD160候选物H7的变体，将H7抗体重链可变结构域和轻链可变结构域(分别是VH和VL)的特定互补性决定区(CDR)的残基定向诱变，通过噬菌体展示Fab样式突变体，与蛋白质上和过量表达hCD160的CHO细胞选择结合。
因此，生成噬菌体克隆，并且还使其可以产生含有未纯化的可溶性Fab的细菌周质提取物。通过ELISA，根据结合人CD160蛋白的能力,以及通过FACS，根据结合表达人CD160的细胞的能力，选择各个克隆，这是i)处于表达在丝状噬菌体表面的基因III-Fab融合蛋白形式或ii)处于含有未纯化可溶性Fab的片段的周质提取物形式。表2中报告了噬菌体ELISA和噬菌体FACS的实验的结果。各个克隆(处于含有可溶性Fab的片段的周质提取物形式)还根据其动力学解离常数(kdis)分类。
表2中给出对6个H7变体和处于含有未纯化可溶性Fab的片段的周质提取物形式(PE ELISA和PE FACS)所获得的数据的总结。
从实际观点看，使用抗M13 HRP缀合的抗体检测到噬菌体与人CD160的结合。使用小鼠抗M13-生物素抗体随后链霉亲和素-PE检测到噬菌体与表达CD160的细胞的结合。
在噬菌体ELISA中，大部分的噬菌体能够以450nm处的高的光密度(OD)值(OD450：1.0-6.0)和83％的结合成功程度(450nm的OD≥10个背景噪声均数)结合人CD160蛋白。重要的是要注意到一点，对于H7 WT Fab噬菌体，获得的OD450值低至0.06-0.07。
从噬菌体FACS测定法获得了相似的结果，成功程度为91％(与表达CD160的细胞结合超过5％、3倍于初始MFI值并且不与CHO-S WT细胞的克隆结合视为阳性)。如噬菌体ELISA中那样，与其他克隆相比，Fab H7 WT噬菌体FACS获得的结合值低得多。
使用周质提取物(P.E),通过ELISA和FACS，研究作为可溶性Fab的克隆(来自CD160蛋白上和CHO-CD160细胞上的选择轮次)的选择结合。使用ELISA，利用抗c-myc抗体随后HRP缀合的抗小鼠抗体，检测到可溶性Fab与人CD160蛋白的结合。利用抗c-myc抗体随后APC缀合的山羊抗小鼠抗体，检测到可溶性Fab与过量表达人CD160的CHO细胞的结合。使用在噬菌体表面或周质提取物中表达的Fab的ELISA实验和FACS实验的结果证实了每种亲和力成熟的H7克隆与人CD160的结合能力。
表2：细菌周质提取物中产生的噬菌体形式和可溶性Fab形式的亲和力成熟的重链H7变体的类别，克隆鉴定，依据ELISA、FACS和SPR的结合特征。
*筛选中获得的WT H7
**产生的Fab H7 WT对照
使用CLC Main Workbench软件，提取源自不同轮次(rounds)选择的多种克隆(FJ1516MP02和FJ1516MP03)的氨基酸序列。突变体Vκ序列和VH序列分别地与参考H7 VH序列和Vκ序列比对。选择的全部克隆均含有与H7WT的Vκ序列相对应的Vκ序列。对于重链，从156个有效序列开始，六个序列也对应于H7 WT的VH序列。全部其他VH序列均相对于WT含有2至6个突变(如文库中设计那样)并且一起分组于6个不同的类别(VH变体序列1至6)(参见第2列，上表2中的VH家族)。
对于剩余的表征实验的，选择含有代表每个不同VH变体的克隆的组用来产生P.E中的噬菌体和可溶性Fab。在表2第1列中给出选定代表的清单和第2列中给出它们的相应VH家族。类别5的克隆代表是D12，类别1的克隆代表是F04，类别6的克隆代表是A09。类别1-6的各种抗CD160 H7突变体的克隆的VH氨基酸序列如表2所列。
这6类别的H7变体的VH区的蛋白质序列的比对结果显示了各种变体之间在突变残基的位置和引入突变的性质显示出共同恒定之处。
使用细菌周质提取物中产生的可溶性Fab，SPR测量H7的6种Fab变体与人CD160的相互作用
还通过表面等离子体共振(SPR)测试H7变体的结合能力。为此，使用BIAcore 3000(GE Healthcare)。pH 4.5乙酸盐缓冲液中的50μg/ml人CD160(R&D SYSTEMS)按1250-2000共振单位(RU)固定在CM5芯片(GE Healthcare)上。使用抗huCD160 H7 IgG1抗体确认固定的人CD160的完整性。对于动力学测量，在25℃并且按流速30μl/分钟，将PBS中两倍稀释度(0.15μM-10μM)的人ECD160系列的各浓度随BIAcore P20缓冲液一起注射两次。
测试再生条件并且在样品注射之间注射10pi的10mM NaOH/1M NaCl用于再生。为了分析克隆与人CD160的结合，将含有可溶性Fab的周质提取物在BIACORE P20缓冲液(10mMHepes，150mM NaCl，3mM EDTA，0.005％Tween-20)中用流量30μl/分钟稀释到1:5持续120秒，以便结合；将解离测量300秒。
表3：含有可溶性Fab(代表各种类别的亲和力成熟的H7变体)的周质提取物的结合的绝对响应
*筛选中通过选择所获得的WT H7
**产生的Fab H7 WT对照
在CD160蛋白包覆的表面上评价这些变体各自的最大绝对响应(为在注射抗体后时间＝120秒处任意响应单位的量值)。这些数据在表3中：
随后可以计算每种变体与筛选期间作为对照产生的H7 Fab或在噬菌体上分离的H7 Fab的结合比率(参考表3，第4列和第5列)。
克隆F04、D12和A09(分别是类别1、5和6的变体VH)显示最高的结合值(RU)并且还显示分别还高8.3倍；7.2倍和2.7倍的RU比率(参考第4列，变体RU/WT RU表3)。
实施例3：设计和生产用于肿瘤学和眼科适应症的变体的各种单特异性抗体样式
设置克隆FJ1516MP02F04或F04和FJ1516MP02D12或D12为IgG样式，以便研究突变是否存在可能以高于H7抗体的亲和力与CD160结合。FJ1516MP02A09或A09变体是还具有与其他变体很不同的结合/解离特征的唯一代表，并且在这个方面，还将以IgG样式进一步加以研究。
3.1)使用H7及其变体在眼科学中测试的抗CD160构建体的蛋白质序列
因此，对于眼科学，将F04和D12变体以这样的样式(例如，IgG4或IgG1N297Q)生成，其与Fc受体(FcR)和/或其他受体不相互作用或最小相互作用，以减少治疗用抗CD160抗体或片段的全身性半衰期，在这种情况下通过产生减少抗体的全身性半衰期的突变或通过提出无Fc区的抗体片段样式，不会过多地减少其玻璃体内半衰期。
通过使H7候选物及其变体处于IgG4或IgG1N297Q+/-FcRn无效突变样式，减少全身 性半衰期并减少FcR和FcRn结合
因此，对于眼科学，减少治疗用抗CD160抗体的全身性半衰期的第一种可能性是通过在IgG4 S228P-R409K或IgG1 N297Q结构上克隆可变区，设置F04和D12变体，其中选择所述结构不相互作用于或最小相互作用于Fc受体(FcR)。在这个主链上还可以在Mab的Fc区中插入S228P/R409K/H310A/H435Q或I253A突变，以减少其与人新生儿Fc受体(FcRn和“FcRn无效突变”)的相互作用(Olafsen,2012)。可以通过如表4中所述的重链序列和轻链序列的不同组合，实现这点。
表4：化合物名称和VH序列与VL序列
ELB代码 抗CD160名称/代码 重链 轻链
ELB01101 H7 IgG4 S228P/R409K SEQ ID No:58 SEQ ID No:57
ELB01103 D12 IgG4 S228P/R409K SEQ ID No:60 SEQ ID No:57
ELB01106 F04 IgG4 S228P/R409K SEQ ID No:61 SEQ ID No:57
ELB01111 H7 IgG1 N297Q SEQ ID No:59 SEQ ID No:57
ELB01102 H7 IgG4 S228P/R409K/H310A/H435Q SEQ ID No:62 SEQ ID No:57
ELB01104 D12 IgG4 S228P/R409K/H310A/H435Q SEQ ID No:63 SEQ ID No:57
-- F04 IgG4 S228P/R409K/H310A/H435Q SEQ ID No:10 SEQ ID No:57
-- D12 IgG4 S228P/R409K/I253A SEQ ID No:9 SEQ ID No:57
-- F04 IgG4 S228P/R409K/I253A SEQ ID No:12 SEQ ID No:57
SEQ ID No:57由SEQ ID No:14限定的可变区与SEQ ID No:22限定的恒定区融合而产生。
通过使H7候选物及其变体处于抗体片段样式，减少全身性半衰期并减少FcR和 FcRn结合。
IVT中注射的治疗性抗体的减少全身性半衰期以及减少其FcR和FcRn结合的另一个方式是使H7候选物及其突变体处于抗体片段样式(例如Fab、Fab’2)。因此，通过将H7的轻链(SEQ ID No:57)与以下重链之一组合以产生相应样式(参见表4)，使H7及其变体处于Fab样式(具有通过基因工程法合成并在细菌中或CHO细胞中产生的以下Fab恒定链)。
-Fab CH1 IgG1 ELB01121(SEQ ID No:36)
-Fab CH1 IgG1 D12 ELB01122(SEQ ID No:37)
Fab’2样式是(重组或通过酶促裂解(Ides fabricator,GeNovis))产生D12变体(SEQ ID No:38)的，其具有两个而非一个二硫键或具有或没有亮氨酸拉链。
成Fab接头Fab，其中重链的两个序列在第一Fab的C端与第二Fab的N末端之间借助接头蛋白序列(SEQ ID No:39)连接，产生了Fab-接头-Fab分子(SEQ ID No:40限定的ELB01131和SEQ ID No:41限定的ELB01132)的重链。
使用四价IgG1 N297Q H310A-H435Q D12(SEQ ID No:42；ELB012001)样式的重链，产生具有4个抗CD160 D12 Fab的四价样式。
这些重链的全部序列均是成熟重链的序列，且必须在N末端位置添加信号肽(如SEQ ID No:18或19中所述的那些之一)的序列。
3.2)使用H7及其变体在肿瘤学中测试抗CD160构建体的蛋白质序列。
针对肿瘤学比较的不同样式是：H7、及其处于IgG1样式的三种变体D12、F04和A09，以及Genmab的Hexabody样式，以及还处于Bite样式的D12。
生成Hexabody样式(Diebolder et al.,2014；de Jong et al.,2016)从而优化抗CD160的细胞毒性，旨在激活补体并改善抗体通过CDC和ADCC诱导的CD160阳性肿瘤细胞溶胞的能力。Wang等人(Wang et al.,2016)鉴定了突变E345K(SEQ ID No:43)或E430G(SEQID No:44)，其允许产生效应子功能(CDC和ADCC)改善，同时保留等效的药代动力学和药物开发性的单聚体Hexabody。在抗体与靶细胞表达的抗原结合后，如此突变的IgG1六聚化，且这种六聚化改善了抗体的效应子功能(CDC和ADCC)。作为临床前工具，还实施了IgG2a/鼠κ样式的D12和F04变体的分子构建。
表5：化合物的名称和ElsaLys代码(ELB)及VH序列和VL序列
ELB代码 抗CD160名称/代码 重链 轻链
ELB02101 人H7 IgG1 SEQ ID No:64 SEQ ID No:57
ELB02102 IgG1样式的D12 SEQ ID No:45 SEQ ID No:57
ELB02103 IgG1样式的F04 SEQ ID No:46 SEQ ID No:57
ELB02104 IgG1样式的A09 SEQ ID No:47 SEQ ID No:57
ELB02111 IgG1 E345K样式的H7 SEQ ID No:48 SEQ ID No:57
ELB02112 IgG1 E345K样式的D12 SEQ ID No:49 SEQ ID No:57
ELB02113 IgG1 E345K样式的F04 SEQ ID No:50 SEQ ID No:57
ELB02114 IgG1 E345K样式的A09 SEQ ID No:51 SEQ ID No:57
ELB02102-02 鼠IgG2a样式的D12 SEQ ID No:53 -SEQ ID No:54
ELB02103-02 鼠IgG2a样式的F04 SEQ ID No:55 SEQ ID No:56
另外，Bite样式的D12变体ELB02122的蛋白质序列由SEQ ID No:52限定。
实施例4：IgG4样式、IgG1样式和IgG1 E345K样式的H7变体的生物物理表征
4.1)评价H7变体对抗CD160的热稳定性的影响。
热稳定性是用于研究蛋白质稳定性的常见方法。热稳定性因以下所致：i)蛋白质内在稳定性(形成聚集物的倾向性)，这与因其一级序列产生的三维结构有关，和ii)样品储存和配制条件(pH、盐和样品组分)。根据基于Sypro Orange(Thermofischer Scientific,S-6650,批次1608495)与天然或变性形式的蛋白质的疏水性区域结合的差异能力的方法，评价各种IgG样式的抗hCD160 H7候选物的变体的热稳定性。
样品在96孔PCR平板中，按终体积30μl，终浓度0.1mg/ml，在1x PBS，5x SyproOrange中，一式四份测试。将Sypro Orange母液(100％DMSO中5000x原液)按10x终浓度在1xPBS中配制。平板随后在Applied 7500实时PCR系统仪中经历22℃至99℃的温度梯度(在大约1小时30分期间)。使用Protein Thermal Shift(ThermofischerScientific)软件，实施数据分析(给出每个抗体结构域的Tm原始数据和一阶导数的Tm)。下表中展示结果：
表6：IgG4样式、IgG1样式和IgG1 E345K样式的H7和H7变体的Tm结果
对表6结果的分析显示，与IgG4样式的H7(H7 IgG4 WT)相比，IgG1样式的H7(H7IgG1 WT)的平均Tm高3.5℃。关于H7变体，抗体具有非常接近于H7的Tm。
4.2)BLI测量以比较不同IgG样式的H7及其不同变体对重组人CD160的亲和力
这里采用其中生物素酰化的CD160蛋白在链霉亲和素生物传感器上按10nM捕获和其中分析物是抗CD160的设计，如实施例2中所述那样测量亲和力。测试的抗CD160浓度是3.13、6.25、12.5、25、50和100nM，和用于每次再生的pH 2甘氨酸浓度是10mM。
下表中呈现了CD160蛋白、抗CD160 H7抗体及其变体的传感图和测量的亲和力：
表7：测量IgG4 S228P-R409Q样式的抗CD160 H7抗体及其D12变体对CD160蛋白的亲和力
参考IgG，编号 KD(M) kon(1/Ms) kdis(1/s) Rmax Full X^2 Full R^2
ELB01101H7 IgG4 2.61E-09 4.69E+05 1.23E-03 0.4394 0.1146 0.9907
ELB01103 1.52E-09 4.94E+05 7.52E-04 0.8059 0.2698 0.9947
表8：测量IgG4 S228P-R409Q-H310A-H435Q样式的抗CD160 H7抗其变体对CD160蛋白的亲和力
表9：测量IgG1样式的抗CD160 H7抗体及其变体对CD160蛋白的亲和力
参考IgG，编号 KD(M) kon(1/Ms) kdis(1/s) Rmax Full X^2 Full R^2
ELB02101H7 IgG1 2.94E-09 3.70E+05 1.09E-03 0.533 0.1222 0.9923
ELB02102 1.55E-09 4.22E+05 6.54E-04 0.9513 0.2779 0.9958
ELB02103 1.43E-09 3.71E+05 5.31E-04 0.8735 0.237 0.9955
ELB02104 1.47E-09 4.42E+05 6.51E-04 0.8788 0.3971 0.9933
表10：测量IgG1 E345K样式的抗CD160 H7抗体及变体对CD160蛋白的亲和力
参考IgG，编号 KD(M) kon(1/Ms) kdis(1/s) Rmax Full X^2 Full R^2
ELB02101H7 IgG1 2.94E-09 3.70E+05 1.09E-03 0.533 0.1222 0.9923
ELB02112 1.52E-09 4.47E+05 6.79E-04 1.2637 0.8515 0.993
ELB02113 1.55E-09 4.27E+05 6.62E-04 1.1864 0.6878 0.9934
ELB02114 1.93E-09 4.27E+05 8.25E-04 1.1987 0.6949 0.9931
与相应的H7相比，无论变体是什么，并且无论同种型的性质是什么(IgG4、IgG4H310A-H435Q、IgG1和IgG1 E345K)，变体对重组CD160的亲和力总是具有至少2倍改善，如两倍厚的生物双膜层，反映更好的kon，和低于相应亲本H7两倍的解离常数。
无论变体是什么，并且无论同种型的性质是什么(IgG4、IgG4 H310A-H435Q、IgG1和IgG1 E345K)，H7变体具有比H7更好的动力学特征。4.3–Biacore(SPR)测量以比较不同IgG样式的H7及其不同变体对重组人CD160的亲和力。
为了比较H7及其处于不同IgG样式的不同变体，对重组人CD160的亲和力，还按照接近于实施例2中所述的设计中描述那样实施BIAcore(SPR)测量。
表11通过BIAcore(SPR)和通过生物膜层干涉测量法(BLI)测量的不同样式的H7抗体及其变体的重组人CD160/抗hCD160相互作用亲和力
表11中，观察到，采用第二项技术(SPR)测量所获得的抗CD160/CD160相互作用测量结果，正如通过BLI测量相同的这些抗体，与相应的H7相比，无论同种型(IgG4、IgG4H310A-H435Q、IgG1和IgG1 E345K)的性质是什么，H7的变体获得的增益，与相应亲本H7相比，对重组CD160的亲和力总是至少2倍的改善，两倍更高的Rmax，反映更好的kon，和低于相应亲本H7两倍的解离常数。
实施例5：IgG4样式和IgG1样式及IgG1E345K样式的抗hCD160H7及其H7变体在CHO CD160细胞上和未转染的CHO细胞上和NK细胞系YT2C2 CD160细胞的结合
在标记重组系CHO-S-hCD160(克隆2G10)中表达的表面CD160期间，与未转染的CHO-S细胞相比，通过测量中位荧光指数(MFI)，评价IgG4样式和IgG1样式及IgG1 E345K样式的抗CD160 H7抗体及其变体(D12和A09)的结合能力(参见图1)。为此，用2μg这些抗体中每一且还用适宜的同种型对照，标记5×10+5个2G10(CHO-S–CD160)和未转染的CHO-S细胞。在图1中，测试的全部抗CD160(无论是什么同种型或IgG样式或变体)均特异性识别重组表达的人CD160的CHO-S细胞。
在图1A中，IgG1变体比H7 IgG1更高效结合于CHO-hCD160转染子(与H7 IgG1相比，其导致中位荧光升高3倍)。对于IgG1样式或IgG E345K样式，也是如此。Fc变体中E345K突变的存在并不改善它们与这些细胞的结合。
在图1B中，IgG4变体比H7更高效结合于CHO-hCD160转染子(与H7IgG4 ELB01101或与H7 IgG4 H310A-H435Q ELB01102相比，其导致中位荧光升高2倍)，甚至在H310A-H435Q突变存在下也是如此。实际上，抗CD160的Fc中H310A-H435Q突变的存在不妨碍它们与其靶标结合，如ELB01101和ELB01102之间比较结合作用时可以见到。
在NK细胞系的克隆(YT2C2)上天然表达的表面CD160期间，通过测量标记的细胞百分数＝结合百分数，评价IgG4样式、Fab样式和Fab-接头Fab样式的抗CD160 H7抗体和H7D12变体的结合能力(参见图1C)。为此，将2×10+5个YT2C2细胞用渐增浓度(从50nM至0.39nM)的抗体并还用适宜的同种型对照标记。使用GraphPad Prism软件分析这些结果，以生成非线性回归曲线(Log(agonist)vs response,3-parameter equations)并计算有效中浓度(EC50)。在图1C中，IgG4变体ELB01103和ELB01104比H7 IgG4 ELB01101更高效结合于YT2C2细胞(与H7 IgG4相比，其导致EC50升高10倍)。对于Fab-接头-Fab样式ELB01132，也是如此。相反，Fab样式的ELB01122比H7 IgG4 ELB01101更低效地结合于YT2C2细胞(与H7IgG4相比，其EC50降低2倍)。这当然归因于单价的Fab样式。
实施例6：本发明的抗CD160抗体抑制HUVEC小管形成和诱导HUVEC上CD160表达的 影响表征
Cell Player GFP-AngioKit测定法(Essen Biosciences)评价十种抗体对VEGF或FGF诱导的血管形成的影响。该组样品包含抗VEGF抗体Avastin和Lucentis抗体片段。将使用慢病毒表达系统以荧光蛋白(绿色荧光蛋白或GFP)预标记的冷冻的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)解冻，并与人皮肤成纤维细胞在六块96孔分析平板上共培养2天。将抗体和参考试剂(VEGF、FGF-2、对照培养基)按各种浓度加至各孔中，然后将分析平板置于IncuCyte活细胞成像系统中。每12小时拍摄荧光图像和相差(10x)图像，持续10天，并且分析血管的长度和分支点的数目。每2-3天更换培养基(如果需要，含抗体)和分析上清液。
实施例7：在大鼠角膜新生血管模型中，评价结膜下注射IgG4样式的抗CD160H7候 选物(ELB01101)，与阿柏西普 相比，随时间推移的疗效：
在大鼠中开发了角膜新生血管模型。该模型尤其允容易地观察监测角膜中新血管出现，这使得评价具有抗血管生成特性的分子(包括本发明抗体)成为可能。
根据制备玻璃体内注射和结膜下注射用批次的工艺生成、生产、纯化抗体批次并检验合格。
使用6周龄雄性Lewis大鼠群体。
在大鼠中诱导角膜新生血管形成
第0天(D0)：麻醉后，在手术显微镜下对每只大鼠的一只眼实施手术介入。为此，施加70℃的乙醇使角膜完全去上皮化，随后切开角膜缘，这导致角膜新血管从第4天起出现。
仅使用右眼。通过右股中间肌注射氯胺酮(Imalgene 500)(100μl/大鼠)和赛拉嗪(Rompun 2％)(100μl/大鼠)，使动物麻醉。将一滴丁卡因滴入右眼中。在手术显微镜下实施操作。通过施加70％乙醇中浸泡的“微海绵”至角膜的表面以破坏角膜上皮，诱导新血管生成。同时，用显微剪摘除角膜缘周围厚度大约1.5mm的结膜。向眼施加抗生素软膏(褐霉酸钠)。缝合(5-0丝线)后，随后保持瞳孔封闭4天。在4天后，通过移除丝线张开瞳孔；在第4天、第8天和第12天，麻醉后，在手术显微镜下检查角膜新血管的变化。
处理
每组10只大鼠(例外是IgG4同种型对照为3只)按以下方式使用：
第0天：如上文所述，对动物的一只眼进行手术；
第8天：拍照并将动物分成8个组，每组10只大鼠，以便在进行过手术的眼上接受处理：
在第4天和第8天，使用装配291/2G针头的注射器(Myjector)，动物接受结膜下注射产品。
-组1：结膜下注射50μl PBS(阴性对照)，
-组2：结膜下注射50μl中的250μg(Eylea)，
-组3：结膜下注射50μl中的500μg IgG4同种型对照，
-组4：结膜下注射50μl中的500μg本发明H7 IgG4抗体
在第8天和第12天：在手术显微镜下观察后，对进行过手术的眼拍照，以评价处理对角膜新血管化的影响。在D+12处死后，取血清和玻璃体液样品。
使用软件(Calopix，TRIBVN)，分析大鼠眼照片(.JPEG)。在不知道分组或照片时序的情况下，盲法实施分析。使用定量软件，确定血管化的评估结果。血管化估计为相对于所分析眼的总表面积的血管表面积(也就是去上皮化面积)。在图2的曲线中报告了照片中相对于总表面积的新血形成百分比。
结果：
在第0天和在不同的2天(第7天和第12天)拍摄进行过手术的眼的照片。拍摄的照片显示角膜新血管形成的变化，尤其是在在同种型对照中，直至第12天为止，血管密度和血管长度的发展。
图2中展示的结果显示，与阴性对照(在这种情况下为IgG4同种型对照)注射的动物相比，本发明H7单克隆抗体处理的动物中血管密度下降。
还观察到，尽管对大鼠CD160具有微弱交叉反应性(数据未显示)，在该大鼠模型中，H7 IgG4(ELB01101)的剂量与250μg剂量的VEGF高亲和力可溶性受体-—融合蛋白(一种用于治疗年龄相关性黄斑变性(ARM D)的抗血管生成药)相当的方式减少了角膜新血管形成。IgG1 N297Q样式的H7抗体也获得这个结果。
因此，本发明的IgG4样式和IgG1 N297Q样式的H7抗体具有抗血管生成活性。
实施例8：在玻璃体内施用和静脉内施用亲本CL1-R2、贝伐单抗和来尼珠单抗之一 后的兔中比较各种样式的抗hCD 160ELB候选物的全身性和眼部药物代谢动力学(PK)特征
这项研究的目标是比较各种样式的抗hCD 160ELB候选物(包括ELB011候选物)与亲本鼠IgG1抗CD160 CL1-R2和贝伐单抗的全身性和眼部药物代谢动力学(PK)特征。为了筛选具有眼中良好滞留时间和最低的全身性半衰期的优化抗CD160候选物，使用54只色素兔(HY79b品系)进行PK研究。在兔中通过玻璃体内(IVT)或静脉内(IV)注射，施用相同剂量(0.5mg)的待测试产品，并且通过针对ELB011先导物leads(和来自ELB021产品的ELB02104和ELB02114抗CD160 mAb)的LC-MS/MS或通过使用针对CL1-R2和针对IgG和Fab对照物(这里分别是上市制剂中的贝伐单抗(Avastin)和来尼珠单抗(Lucentis))的商业ELISA，测定血清抗体浓度。这允许静脉内快速推注(IV)每种候选物后进行药代动力学参数建模，因而计算每种药物的输出动力学参数。
玻璃体内注射的方法(受测组和PK血液样品)
在新西兰白兔中实施了通过玻璃体内(IVT)注射单次施用500μg各种抗CD160及其对照的药代动力学(PK)研究。
用健康状态良好的兔实施研究(已知动物的细菌状态和病毒状态，一个性别)(KBLCharles River)(体重2750-3000g，开始处理时的年龄：14-18周)。在随机化之前的一周，以及在研究期间连续4周(动物将按照1至2只动物/笼圈养)，这些动物置于常规照护单元的笼中。在开始之前，实验方案经提供商的伦理委员会审查。
表12中描述本实验的实验设计。这个实验含有8组，3兔/组，包括浓度5mg/ml同时内毒素水平0.5EU/ml的6个不同样式的抗CD160(参见下表12)和2种对照—贝伐单抗(Avastin)和来尼珠单抗(Lucentis)。
全身麻醉下按终体积50μl双侧注射250μg每种药物，进行药物施用(50μl/眼/施用)。
通过以下方式追踪兔子：每周监测临床体征和体重，并且肉眼观察眼耐受性以追索眼刺激作用的肉眼可见迹象(甚至是极轻微的)并且对眼底进行充分眼科检查(使用裂隙灯和间接眼底镜检法检查视神经乳头完整性、(视网膜和脉络膜)血管网和RPE及Bruch色素沉着膜/着色)。
在动物处死后，摘出双眼并且立即在-80℃冷冻。在分析之前，将冷冻的眼分离成三个部分–玻璃体、前房液和视网膜/脉络膜。测量(均化和离心后)前房液样品和玻璃体样品的体积。冷冻的视网膜/脉络膜称重。
在施用前(给药前T0)和施用后2小时、6小时、12小时、24小时、48小时(第2天)、96小时(第4天)、168小时(第7天)和336小时(第14天)，在无抗凝剂的管中从兔耳中央动脉取得大约0.5ml总血液样品。冷冻储存血清直至分析。分析血清样品以测定抗CD160浓度。
静脉内注射的方法(受测组和PK血液样品)
表12中描述本实验的实验设计。这个实验含有10组，3兔/组，包括浓度5mg/ml同时内毒素水平0.5EU/ml的8个不同样式的抗CD160(参见下表12)和2种对照—贝伐单抗(Avastin)和来尼珠单抗(Lucentis)。
全身麻醉下通过最多50-200μl内单次静脉内快速推注500μg(对于完整IgG或mAb片段的摩尔等同物)，进行药物施用。
在施用前(T0前)和施用后5分钟、15分钟、30分钟、60分钟、2小时、6小时、12小时、24小时、48小时(第2天)、96小时(第4天)、168小时(第7天)和336小时(第14天)，在无抗凝剂的管中采集大约0.5ml总血液样品。冷冻储存血清直至分析。分析血清样品以测定抗CD160浓度。
表12：IV和IVT施用0.5mg(0.19mg/Kg)后兔中的药代动力学研究分组
生物分析兔血清样品中ELB011和ELB021 H7衍生的抗CD160 mAb及片段中随时间 推移的浓度
使用高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)法，定量两种注射途径(静脉内(IV)与玻璃体内(IVT))后兔血清样品中不同的ELB011抗人CD160候选物(作为完整IgG和IgG片段)。方法开发策略旨在获得一种适于测定兔血清中全部ELB011(和ELB021)药物的浓度的通用LC-MS/MS法。通过以下方式制备样品：在磁珠上通过蛋白质L亲和纯化法富集目的药物，随后使用DTT和碘乙酰胺还原并烷基化，之后进行胰蛋白酶消化。通过HPLC联合使用阳离子电喷雾的MS/MS检测，分析最终提取物。在多重反应监测(MRM)中监测基于H7人源化候选物的全部抗CD160(来自ELB011和ELB021项目)共有的一个胰蛋白酶肽(ASQSISNHLHWYQQKPGQAPR，其包含VL轻链的一个CDR)。轻链CDR区中的选定肽谱允许该测定法直接转移至其他临床前(matrix)并可能用于人体基质的分析。随后，首先使该方法合格并且随后应用于定量兔血清中的每种化合物。
还采用相同的方法定量了测试了注射时仅IV途径的两种其他抗CD160mAb(ELB02104和ELB02114，分别作为IgG1样式和六聚体IgG1 E345K样式的H7-A09抗CD160)。
生物分析兔血清样品中CL1-R2、贝伐单抗和来尼珠单抗随时间推移的浓度
为了比较H7和H7的变体与亲本鼠抗人CD160 CL1-R2的药代动力学参数，根据生产商的推荐使用小鼠IgG1 ELISA定量商业套装(来自Bethyl Laboratories的目录号E90-105，批号E90-105-39)，使用酶联免疫吸附测定(ELISA)，测量兔血清中的小鼠IgG1浓度。
因其分子样式(各自为IgG1和Fab)，选择来尼珠单抗和贝伐单抗作为对照。分别使用Biovision的E4312-100确定来尼珠单抗(Lucentis)的量，以及使用Biovision的K4254-100确定贝伐单抗(AVASTIN)的量，在兔血清中定量这些化合物。
用于药代动力学参数分析的方法
对于两种注射途径，使用非房室分析，观察并使用测得的血清浓度计算以下药代动力学参数：
对于全部血清浓度时间曲线
-Cmax(mg/ml)(曲线中出现的血清最高浓度)，
-Tmax(H)(血清最高浓度的时间)，
-TLag(H)(在药物施用和第一个观测血清浓度之间的延迟(当数据充分时)，
-AUC0-t obs(H.μg/ml)(从0至Clast的血清浓度时间曲线下面积，使用对数梯形法)，
-AUC0-inf obs(H.μg/ml)(从0外推至无限的血清浓度时间曲线下面积(AUC0-t+Clast/Ke))，
-Clast(最后观测浓度)，
-消除Ke(H-1)(血清浓度时间-曲线终末部分的斜率，通过对数线性回归获得(如果数据充分))，
-终末T1/2(H)(观测消除半衰期或终末半衰期，计算为“T1/2＝-ln2/Ke”)，
-Vd(静脉内快速推注后的分布容积(L)Vd＝剂量/(Ke x AUC0-inf)(仅静脉内快速推注))，
-CL(清除率(L/H)CL＝Ke x Vd(仅静脉内快速推注))。
对于仅通过IVT注射的产品，其他参数的评估方式如下。
F％(AUC0-t)(相对于参比静脉内快速推注的绝对生物利用率＝AUC0-t测试x参比剂量/AUC0-t Ref x测试剂量)和
F％(AUC0-inf)(相对于参比形式的绝对生物利用率＝AUC0-inf测试x参比剂量/AUC0-inf Ref x测试剂量)(如果AUC0-inf可测量)。
随后，进行静脉内快速推注药代动力学两步骤模型以计算动力学的参数和速率常数，旨在提供药物内源处置(分布和消除)的区室模型和信息(如Wagner,J.G.1975中所述)。每种候选物的处置模型和静脉内快速推注剂量的模型依赖性药代动力学参数可用于通过反卷积方法计算IVT剂量之后的IVT输出。进行该模型化以确定每只兔的血清中每种受测产品的药代动力学模型。
-在这个阶段，使用计算的药物静脉内快速推注处置模型，通过区室反卷积方法计算血清中药物的眼部消除动力学和IVT施用后血清中消除的剂量的分数。如果观察2个或更多个区室，则使用Loo-Riegelm法(JC,Riegelman S.,1968)，如果观察1个区室，则使用Wagner Nelson法(Wagner JG,Nelson E.1968)。结果是进入血清的药物的累积量(药物输入)和速率(药物输入速率)与时间的关系。在IVT施用药物后，累积性血清输入特征是眼输出特征并且比率是输出率。同时，还可以测定以下其他参数。
-Tlag(H)滞后时间(当数据充分时)
-眼输出(mg)：血清中释放的药物总原型量
-输出量(剂量％)：血清中释放的药物的剂量％(这是IVT后眼剂量的绝对生物利用率)
-50％(±)的输出时间：观察到50％已注射剂量已经进入血清的时间(图形化估计)
-％Max(H)的时间：抵达已累积药物输出动力学平台的时间＝药物滞留眼部的持续时间
-输出率(mg/H)：血清中的药物输入率
-最大输出率(mg/H)：输出率曲线的峰
-最大输出率的时间(H)：峰时间。
表13：在静脉内(IV)施用0.5mg(0.19mg/Kg)剂量后观察的主要药代动力学参数
表14：在玻璃体内(IVT)施用0.5mg(0.19mg/Kg)剂量后血清中观察的主要药代动力学参数
如表13(IV途径)和表14(IVT途径)中所示，静脉内(IV)或玻璃体内(IVT)施用0.5mg(0.19mg/Kg)剂量后ELB011候选物和ELB021候选物的预期血清PK特征(即观测的主要血清药代动力学参数)及其血清半衰期(还指出T1/2)的排序与预期的差异一致，原因在于其相应的样式(如Gadkar等人,2015前述)。
静脉内快速推注观察和模型化
如图3A中所示，在静脉内快速推注后，ELB01101、ELB01103、ELB01104、ELB01122、ELB01132、ELB02104和ELB02114的血清浓度在注射后快速下降(分布阶段)，随后是经典缓慢消除阶段的第2步骤(T1/2范围：52至188H)，例外是ELB01122和ELB01132(其为：1.9和4.6H)。如表13中所示，在ELB01122、ELB01132、ELB02104和ELB02114的第一采样时间0.083H(2分钟)处、但在ELB01101、ELB01103和ELB01104的最长时间(0.139至0.444H)后观察到Cmax(3.360至4.297μg/ml)。平均分布容积和清除率分别从0.05至0.33L和0.005至0.1051L/H变动。
如预期，与类IgG样式相比，抗CD160片段具有静脉内注射后降低的血清PK参数。尤其，ELB01132的血清半衰期似乎略高于ELB01122的血清半衰期。
关于静脉内施用贝伐单抗后的药代动力学参数，当观测数据与文献数据比较时，兔血清中观测的贝伐单抗血清T1/2与文献相比相当低(3天vs 5.32天，贝伐单抗(Avastin)的EMEA文件)。
关于IgG样式的ELB011候选物和ELB021候选物，ELB01101具有最长的血清半衰期，甚至长于CL1-R2或贝伐单抗(Avastin)之一。相比贝伐单抗，ELB01103和ELB02104具有大致相同的血清半衰期，而与贝伐单抗和ELB01103和ELB02104相比，ELB01104、ELB02114和CL1-R2具有缩减的血清半衰期。但是，当AUC、Cmax和Tmax参数与贝伐单抗和CL1-R2的那些参数比较时，ELB011候选物(以及ELB021候选物)的这些参数显著降低。实际上，CL1-R2和贝伐单抗的血清浓度并不类似于ELB011候选物和ELB021候选物，在0.389H时CL1-R2和24.7H贝伐单抗的Cmax为最高：6.980和6.091μg/ml(对应于缓慢输注贝伐单抗的非预期Tmax)。CL1-R2和贝伐单抗的T1/2、Vd和CL分别是：54.5和74H；0.05和0.09L；0.0010和0.0009L/H。这可能归因于贝伐单抗和CL1-R2具有可能最低分解代谢作用的事实。
当ELB01101(非亲和力成熟的变体)的药代动力学参数与其他亲和力成熟的ELB011候选物和ELB021候选物比较时，亲和力成熟的抗CD160 mAb降低了在兔中的血清半衰期。的确，全部亲和力成熟的候选物的血清中清除率增加，相比于ELB01101和贝伐单抗，ELB01103、ELB01104、ELB02104和ELB02114的血清中半衰期显著缩减尤其证实了这点。这种更快的清除可以归因于CD160驱动的特定生物学过程，例如血液中CD160阳性细胞上抗CD160 mAb内化增加。应当在其他物种中检查这点，以确信因对CD160的高亲和力抗CD160清除的影响。
ELB01103和ELB02104具有与ELB01104(具有附加FcRn无效突变以通过新生儿FcRn受体阻止IgG再循环的、亲和力成熟的变体)等同、而不与非亲和力成熟的天然ELB01101等同的血清T1/2。在ELB01104的情况下，(如预期和(Olafsen，2012中前述)，相比ELB01103的血清半衰期，FcRn突变似乎略微缩减ELB01104的血清半衰期。但是，由于不可获得一种具有相同FcRn无效突变的ELB01101的药代动力学参数，故难以评价单独FcRn突变的影响。但是，ELB01103和ELB01104相比于ELB01101的PK特征差异，比ELB01103和ELB01104之间的响应差异更重要。相比减少IgG再循环的重要性，亲和力成熟对ELB01104 PK参数的重要性更有影响。
IVT结果观察
如图3B中所述，根据药物从眼中缓慢输出，注射后血清浓度缓慢增加，在玻璃体内施用贝伐单抗后观察到曲线最高水平并且在玻璃体施用ELB01122和ELB01132后观察到曲线最低水平。
如表14中报道，CL1-R2、ELB01103、ELB01104和ELB01101的平均Cmax在0.567至0.787μg/ml的范围内，但ELB01122和ELB01132的平均Cmax最低(0.041和0.114μg/ml)，且贝伐单抗的平均Cmax最高(1.736μg/ml)。观察到Tmax在48和168H之间，全部兔中T1/2均不可测定(在观察血清消除斜率的眼输出结束后，无数据或数据不足)。
当玻璃体内施用时，与贝伐单抗相比，全部ELB011候选物以及亲本CL1-R2均具有较低的全身性Cmax、降低的Tmax和降低的平均AUC。如预期，与玻璃体内注射的全部IgG样式相比，ELB011抗CD160片段(ELB01132和ELB01122)具有降低的观测血清PK参数。相比全部基于IgG的分子，这些片段从血流中更快地消除(与ELB01101相比，血清T1/2减少至少30倍)。在IVT注射后，ELB01132的血清半衰期似乎再次略高于ELB01122的血清半衰期，如静脉内注射后所见。
在IVT注射后，ELB011 IgG候选物(ELB01101、ELB01103、ELB01104)的观测血清PK参数接近于CL1-R2的那些参数并且是玻璃体内施用IgG样式所预期(例如，如(Gadkar等人,2015)中所述)。Tmax是对每种样式所预期的，例外是ELB01103。ELB01103具有在IgG4(ELB01101)和没有FcRn再循环(ELB01104)的IgG之间的中间行为(如通过其PK参数所示)。与文献相比时，这里再次如静脉内注射后所观察到那样(数据来自Gadkar等人2015)，FcRn突变对ELB01104的Cmax、Cmax比(相对ELB01101)、血清AUC0-t和血清AUC比(相对ELB01101)的影响相比预期较不明显。
IVT输出动力学确定
表15：每种产品的两个施用途径后，兔中反卷积分析平均血清浓度之后ELB011候选物的药代动力学参数
*假定在Cmax和Tmax时平均兔血体积为125mL
**基于最大％的时间
基于IVT注射后血清中的Cmax并基于假定平均兔血体积为125mL，还可以计算Tmax时产品的最大浓度并且将它表述为Cmax和Tmax血清中初始IVT剂量的最大百分数(初始IVT剂量的最大％)。对通过两种途径注射的抗CD160候选物中每者并且还对CL1-R2和贝伐单抗计算这种百分数。
表15中总结了计算的药代动力学参数，在IVT注射0.5mg后，与ELB01101、ELB01103、ELB01104，CL1-R2和贝伐单抗的计算血清输入相对应的眼输出分别是0.341、0.184、0.346、0.176和0.420mg，分别对应于玻璃体剂量的68％、55％、69％、35％和84％。眼输出平均持续时间(最大％的时间)分别是168、96、88、104和168H。
首先，当ELB011 IgG(并且还有片段)候选物与贝伐单抗比较时，全部ELB011候选物的全身性暴露量(例如，ELB01101的最大值为19％，ELB01103为16.75％)均显著低于贝伐单抗(43％)。这意味，对于ELB011候选物，体内注入的IVT注射产品的量少于贝伐单抗。的确，与全部ELB011候选物相比，贝伐单抗的眼输出、输出剂量和初始IVT剂量的最大百分数极高。
第二，当ELB011的IgG候选物与CL1-R2比较时，与ELB01103和CL1-R2相比，ELB01101和ELB01104具有略高的眼总输出和初始剂量的输出％。FcRn无效突变和亲和力成熟似乎均不对眼输出和输出剂量产生重大影响。对于ELB01103，与ELB01101和ELB01104(68％和69％)相比，进入血清的产品的量较少(小于初始IVT总剂量的50％)。ELB01103是具有比ELB01101低的血清半衰期的IgG候选物，从而即便一些产品进入血清，则ELB01103全身性产品将比ELB01101全身性产品快两倍地被清除。
就输出率而言，输出率为0.004至0.009mg/h。ELB01104具有最高输出率，随后ELB01103和ELB01132具有相同的输出率，最后ELB01101和ELB01122具有最低输出率。
当ELB011片段候选物与其他ELB011 IgG候选物比较时，显而易见，玻璃体内施用ELB01132和ELB01122后的消除总体上明确地与IgG样式的抗CD160不同。两种片段具有从眼中消除的相似PK特征(相同眼总输出和几乎相同的输出剂量)。另外，由于ELB01132和ELB01122比全部基于IgG的分子更快地从血流消除，这两种产品中任一者存在于全身性区室中很低含量的(小于Tmax时2.85％的初始IVT剂量最大％)。对于Lucentis也是如此，在相同条件下IVT注射500μg后，未在任何的兔血清中检出产品。
将ELB01132和ELB01122一起比较时，ELB01122与ELB01132的消除方式不同。关于IVT后的消除过程，ELB01122是从血流中消除最快的产品。的确，它具有进入血流的初始IVT剂量最低％及最低眼输出。从眼消除的ELB01132产品略微更多(眼输出两倍于ELB01122)。ELB01132似乎比ELB01122略微更快地进入血流。ELB01132具有较长的消除T1/2(血清半衰期)，这影响其他PK参数。对于ELB01122，75％的初始IVT注射剂量似乎留在眼中，相比之下ELB01132为60％。但是，ELB01132的眼中平均滞留时间似乎比ELB01122略微更好。因此，两种片段候选物提供了非常有利的眼中T1/2/在全身性T1/2的比率，好于IgG候选物，但是它们具有比IgG样式的候选物更小的眼中滞留时间。
注：来自ELB01132和ELB01122反卷积的药物血清输入比其他ELB011IgG候选物更不准确，原因在于具有可检测血清浓度的时间点的数目较少、血清半衰期非常短，以及产品从眼释放的初始延迟。
总结-关于IV施用、IVT施用ELB011和ELB021候选物后全部PK参数的结论
静脉内(IV)或玻璃体内(IVT)施用0.5mg(0.19mg/Kg)剂量后ELB011候选物和ELB021候选物的预期血清PK特征(即观测的主要血清药代动力学参数)及其血清半衰期(还指出T1/2)的排序与预期的差异一致，原因在于其相应的样式(如Gadkar等人,2015前述)。
不存在FcRn无效突变或亲和力成熟对眼中PK参数的影响。
相比CL1-R2和贝伐单抗，ELB011候选物和ELB021候选物具有不同的血清PK参数，在血清中清除更快，但是应当在其他物种(在专门研究中的小鼠和非人灵长类)中检查这点。
关于血清T1/2，排序十分类似于眼中滞留时间的排序(如Gadkar等人,2015中所述)：ELB01101>>ELB01103～ELB01104>ELB01132～ELB01122。惊喜来自于ELB01103。相比于IgG4，ELB01103的行为更接近于无FcRn结合作用的IgG4。采用不同的抗CD160样式，玻璃体内注射的在全身性消逝的抗体％以及血清T1/2大幅度降低，并且在后ELB011候选物IVT后的全身暴露量等同于CL1-R2和低于贝伐单抗。
与ELB01103相比，IgG样抗CD160 ELB01101和ELB01104初始剂量的眼总输出和输出％高。
就眼中停留的剂量％而言，ELB01122好于>ELB01132>ELB01103>ELB01104>ELB01101。就来自眼的输出率而言，输出率为0.004至0.009mg/h。ELB01104具有最高输出率，随后ELB01103和ELB01132具有相同的输出率，最后ELB01101和ELB01122具有最低输出率。
就眼中滞留时间而言(参见表15中最大％的时间列)，ELB011各候选物之间的排序如下：ELB01101>>ELB01103～ELB01104>>ELB01132～ELB01122。
在体内临床前模型中进一步测试的先导物的选择。
在潜在的ELB011候选物当中，最终选择两种先导物：一个IgG片段和一个完整IgG，以在适当的NHP模型中剂量疗效研究比较。
关于筛选具有良好滞留时间和最低全身性半衰期的优化抗CD160候选物，在一方面，对于IgG样mAb，ELB01104的眼中滞留时间/T1/2血清比率较好，随后是ELB01103，最终是ELB01101(ELB01104>ELB01103>>ELB01101)。但是，在另一方面，对于ELB01104，70％的初始剂量进入全身(ELB01103仅50％)，即，相比ELB01103，ELB01104在眼中停留的产品较少。因此，IgG样式的ELB011各候选物之间的最终排序是ELB01103>ELB01104>ELB01101。
对于Mab片段选择，两种片段具有从眼中消除的相似PK特征(相同眼总输出和几乎相同的输出剂量)。两种片段候选物提供了非常有利的眼中T1/2/全身中T1/2比率，好于IgG候选物。ELB01132的眼中平均滞留时间似乎比ELB01122略微更好。最后，就PK参数而言并考虑到其他可发展性参数(理想CD160结合亲合力要求，以及生产产量和所产生片段质量的问题)，建议选择ELB01132(Fab接头Fab)用于进一步疗效测试。
实施例9：在非人灵长类(NHP)食蟹猴(macaca fascicularis)的激光所致脉络膜 血管新生模型中玻璃体内注射抗hCD160 H7(IgG4(ELB01101))和H7(IgG1 N297Q (ELB01111))的疗效/耐受性初步研究。
这项研究的目标是(1)确定在食蟹猴中借助单次玻璃体内注射施用时，两种样式的抗hCD160(H7 IgG4(ELB01101)和非糖基化H7 IgG1(ELB01111))的眼耐受性，和(2)评价这些同工型之一对食蟹猴模型中激光所致脉络膜血管新生的潜在预防作用。
模型选择、测试系统暴露途径和动物数的论证
在最相关的NHP激光所致chNV模型中启动疗效(预防作用)的安全性和剂量评估。的确，这种动物模型具有确立的记录，作为患有新生血管形式或湿性年龄相关性黄斑变性的人类中抗新生血管性药物的药理疗效预测物。
选择眼暴露途径，因为这是预期的人暴露途径。
选择食蟹猴作为这项研究的动物模型，因为它是被监管机构接受用于临床前眼毒性试验的非啮齿类物种。这项研究中待用动物的总数认定为正确表征供试抗体效果所需要的最小数目。如此设计这项研究，从而它不需要不必要数目的动物以实现其目标。
在Charles River(Senneville，加拿大)评价激光所致ChNV模型中单次玻璃体内注射每只眼1mg ELB01101 IgG4 mAb、ELB01111(仅耐受性)或对照载体的眼耐受性、临床参数和预防作用。用于这项NHP模型研究的全部程序是来自Charles River的标准程序并简述如下。与Ryan SJ,1982最初开发的原始猴模型方案相比，做出一些轻微变更。
研究/实验方案
动物和动物饲养条件
收集总计17只雄性食蟹猴(2岁至3岁)，且在开始给药时体重在2.7和3.2kg之间。在接收动物和开始处理之间允许的最小适应时间为4周，以使动物适应实验室环境。将动物群体圈养(多达3只/组/笼)在配备自动饮水阀的不锈钢笼子中。正常情况下维持20℃至26℃的温度，以及30％至70％的相对湿度。维持12小时光照/12小时黑暗循环。食物按适宜于动物体格和年龄的量提供(一日两次提供PMI营养国际认证灵长类饲料第5048号，PMINutrition International Certified Primate Chow No.5048)。每只动物通过自动供水系统可自由获得通过反渗透和紫外辐射处理后的水。根据ARVO眼科研究中动物使用宣言使用猴。
实验设计
如表16中所示，在第一阶段，在3只非激光诱导的猴眼中比较玻璃体内施用1mg两种IgG样式(IgG4和IgG1 N297Q)的H7变体的耐受性(总体和眼耐受性)。
在第二阶段，在激光所致ChNV模型中评估毒性较小的同工型或(如果耐受性等同)处于其IgG4样式的H7(ELB01101)的疗效。
表16：第1阶段耐受性和第2阶段期疗效/延长耐受性实验方案的总结
RE：右眼，LE：左眼。
待测试产品的配制
在使用当日，通过用参比产品(PBS)在适宜满足剂量要求的浓度稀释，按20mg/ml配制待测试的产品(无聚集物并具有很低内毒素含量(<0.025EU/mg)(参见表17))。
表17：所测试产品和载体对照的鉴定
监测的参数
这项研究期间评价以下参数：死亡率和临床体征、体重、体重变化、食欲、眼科、荧光素血管造影术、大体病理学和免疫组织化学。
实施程序、观察结果和量值
整个研究期间，正常情况下一日两次实施死亡/濒死控制措施，一次在早晨，一次在下午。每周对剂量和观察期实施详细检查。每周测量个体体重。每日通过视检总体食欲评价独立的进食评估。
在第1阶段期间实施眼科检查，在研究前和在第2、5和7天一次，以及在第2阶段期间实施眼科检查，在诱导激光所致CNV后的研究前、在第1天、第9天实施一次，并在第28天再次实施一次。
眼底镜检查和活组织镜检查(裂隙灯)由认证的兽医眼科医生实施检查。使用的散瞳滴剂是1％托吡卡胺。在适宜的禁食期后，通过肌内注射施用镇静剂，注射用(HCl)，USP。
成像程序
通过荧光素血管造影术(FA)评估活跃ChNV病灶的发展，在损伤之前进行预研究及激光损伤后第14天和第29天一次。由第14天和第29天的静止图像半定量评价独立激光斑点限定的ChNV病灶的泄漏情况。
荧光血管造影
在第2阶段药效评价期间，在第1天测定影像学数据(荧光素血管造影或荧光血管造影)(在激光后，给药前)并在第14天和第29天光凝后再次如下收集：
程序：在试验之前至少25分钟，施加散瞳滴剂(1％托吡卡胺)至每只眼。通过频繁灌入盐水溶液维持眼的水化状态。动物接受肌内注射氯胺酮(5mg/kg)、甘罗溴铵(0.01mg/kg)和右美托咪定(0.01mg/kg)的镇静剂混合物，并且随后用气管导管插管以便施用异氟烷/氧混合物。一旦血管造影术完成，则动物酌情接受0.1mg/kg阿替美唑(右美托咪定的逆转剂)肌内注射。获得自由红外模式和/或红色模式下的简单和/或实时视网膜图像，从而充当血管造影的参比图像。通过快速静脉内注射(头静脉或隐静脉)施用1.0ml 10％注射用荧光素钠U.S.P.，随后进行0.5ml盐水溶液的水冲洗。在注射荧光素后至少2分钟并在最后5分钟记录两只眼的固定图像。此外，在注射荧光素后至少8分钟并在最后11分钟记录两只眼的固定图像。为了确保掩蔽数据，荧光血管造影术图像依据动物抵达编号识别，而不依据随机分配的动物的编号识别。由2名设盲和有经验丰富的独立判读员在固定图像上依据荧光素泄漏程度按评分0-4评价病变严重程度的水平(与每个独立激光病灶相对应的等级)，所述判读员随后使用以下量表确定共识：0级：无泄漏；1级：最少泄漏；2级：轻微泄漏；3级：中度泄漏(半牢固至牢固的强荧光(semisolid to solid hyper-fluorescence)一般留在激光所致缺损区域的边界内部)；4级：明显泄漏(牢固的强荧光区域延伸超出激光所致缺损区域的边界)。
将总数和有临床意义病灶％(3级和4级)计数总计。第1天图像用于确认程序和激光斑点形成。
有临床意义病灶的数目由3级和4级病灶合计限定。
还可以通过如(Krzystolik等人,2002)中所定义的发生率和发生率比，表述对有临床意义病灶的影响程度。发生率定义为(给定间隔时间期间出现的)有临床意义的病灶数除以激光所致病灶/点的总数。发生率还可以按百分数表述。随后，它们计算发生率比(IRR)，其指预防眼中有临床意义病灶的发生率相对于对照眼中发生率的比率。IRR为1将预示发生率之间无差异。远小于1的IRR数值将表示相对于对照组，预防组中有临床意义病灶的发生情况减少。
借助von Willebrand(vwf)标记的免疫组织化学
在安乐死后，摘出眼，并且收集玻璃体液并置于干冰上，随后储存在设定成维持-80℃的冰箱中。来自全部第2阶段动物的左眼的剩余组织用于免疫组织化学分析。制备指定左眼的脉络膜，作为“铺片”封装并通过IHC研究用血管性血友病因子(vWF)染色。简而言之，将铺片在每个步骤之间在PBS+1％Triton缓冲液中洗涤至少3次5分钟，在PBS+1％Triton+0.1％叠氮钠的1％BSA内封闭30分钟，在4℃经针对血管性血友病因子的兔多克隆(1/200的ab6994，Abcam)或阴性试剂对照(1/350X0936 Dako/NRbIgG靶)处理48小时，并最终在4℃，加入AlexaFluor488偶联驴抗山羊IgG(A11008/Life Technologies)处理过夜。半定量逐一评价抗CD160处理或未处理的激光斑点病灶的阳性vWF染色，并且采用20X物镜放大率的视野相比，基于病灶的大小和性质，给出评分1、2或3。如果需要，使用共聚焦显微镜进行进一步分析以确认病灶性质。
按半定量方式逐一评价激光病灶的vWF阳性染色，并且对激光病灶的大小和性质给出评分。根据点病灶是否开放和具有中央脉络膜瘢痕或被RPE瘢痕完全覆盖，表征病灶。存在斑点荧光的评分为轻微(1)，存在vWF阳性血管/毛细血管的评定为轻度(2)，并且血管数量高于目的区域(斑点的中心和周缘)内平均数时的评定为中度(3)。在激光斑点的中心和环绕其周缘单独评价vWF阳性血管的存在。
用于将来检查的血液样品
通过股静脉穿刺取得猴血液：
-对于第1阶段耐受性：在开始处理之前和在第1、2、3、6和7天；
-对于第2阶段疗效：在开始处理之前和在第1、2、3、6、12和28天。
将样品温和地混合并在环境条件下维持直至离心，尽快实施离心。将样品根据标准程序离心。将所得的血清分离，转移至唯一标记的透明聚丙烯管并在干冰上立即冷冻并转移至-80℃冰箱。可能的后续检查包括IVT注射后测量全身性区室中的抗CD160抗体浓度。
终末程序
在计划的尸体剖检之前，对存活直至计划内安乐死为止的动物禁食过夜。从自动物室运输至尸体剖检区之前，通过肌内注射施用镇静剂(注射用氯胺酮HCl，U.S.P.)。通过静脉内注射戊巴比妥钠进行麻醉后切开腋动脉或股动脉，对动物进行放血。
食蟹猴眼中IVT注射两种样式(H7 IgG4(ELB01101)和H7 IgG1 N297Q(ELB01111)) 的抗hCD160的耐受性。
将局部用抗生素(0.3％妥布霉素)在处理前、注射后当日、以及注射后一天向两只眼施加两次。
在给药方案之前，用于评价耐受性的第1阶段动物接受肌内注射氯胺酮(5mg/kg)和右美托咪定(0.01mg/kg)的镇静剂混合物，随后通过面罩接受经判定为维持麻醉所必要的异氟烷/氧混合物。在完成给药程序后(如果判定为必要)，动物酌情接受肌内注射0.1mg/kg阿替美唑(其为右美托咪定的逆转剂)。
在第一阶段期间，验证对玻璃体内(IVT)注射1mg的抗hCD160 H7 IgG4和H7 IgG1N297Q的耐受性，通过注射到3只猴眼(右眼H7 IgG4和左眼H7IgG1 N297Q)。
在第1天，抗CD160 H7 IgG4抗体和参比载体对照由兽医眼科医生通过双侧玻璃体内注射施用至适宜的动物。每只动物的目标给药体积是50μl/眼。
使用1ml注射器和1/2英寸的30号针，施用第1阶段剂量。在第1阶段期间，将H7IgG4施用至右眼中并将非糖基化的H7 IgG1 N297Q施用至左眼中。
与载体(PBS)相比，通过IVT注射H7 IgG4对激光所致脉络膜血管新生的预防作用 证明疗效
在6只雄性食蟹猴(食蟹猴(Macaca fascicularis))(1.5至3.5岁，体重1.5至6kg)的两组中，如下诱导脉络膜血管新生(CNV)。在眼科洗涤之前，将散瞳滴剂(苯扎氯铵(ZephiranTM))在任何程序前施加至每只眼。
如同那些耐受性阶段动物那样麻醉第2阶段(疗效)动物(参见先前部分)。
在第1天，将抗CD160 H7 IgG4抗体和参比对照载体施用至适宜的动物。在第1天，由兽医眼科医生通过双侧玻璃体内IVT注射50μl，按20mg/ml/眼的H7 IgG4(第1阶段后选择的同工型)或50μl/眼的载体注射它们。每只动物的目标给药体积是50μl/眼，含有1mg化合物。使用具有口径29×1/2英寸针的Exelint U-1000.5cc胰岛素注射器，施用第2阶段剂量。在给药后，将局部用抗生素滴注于所述的每个眼中。
激光诱导脉络膜血管新生(ChNV)程序-第2阶段
在第2阶段的第1天，在ChNV程序之前，将散瞳滴剂施加至双眼。对于激光所致病灶阶段或在玻璃体内(IVT)注射之前，动物接受镇静剂氯胺酮(5mg/kg)、甘罗溴铵(0.01mg/kg)和右美托咪定(0.01mg/kg)的混合物肌内注射，并且随后如适宜，用气管导管插管以便施用异氟烷/氧混合物以维持麻醉，并且将动物用氯胺酮(5mg/kg)混合物麻醉。在给药程序完成后(如果认定必要)，如果认定必要，动物接受0.1mg/kg阿替美唑(其为右美托咪定的逆转剂)肌内注射。动物也已经划入各治疗组并依据体重随机化。
在第1天麻醉期间，实施激光处理，相对于中心凹同心产生9个病灶/眼，1个病灶在黄斑区和8个病灶在视网膜主要血管之间的黄斑周围区。使用810nm二极管激光器，按初始功率300mW和持续时间0.1秒产生初始病灶尺寸为80μm的激光病灶。从而，评价每种处理总数为108个激光部位/组(依据待测试产品，6只动物/组，2只眼/动物，9个部位/眼)。反复实施激光处理，并且依据视网膜中出现小气泡(Bruch膜撕裂特征)核实之。不直接在中心凹上产生病灶。按要求调节激光参数，以确保Bruch膜破裂(与气泡形成相关)，并记录于本研究的数据中。对每个激光病灶记录全部值得注意的事件，如视网膜出血。在这个手术期间，酌情用盐水和/或1.0％羟甲基纤维素纳溶液使眼保持水化。在每次处理完成后，通过缝裂灯活组织显微镜检查和/或间接检眼镜检查，检查双眼，以确认给药的位置和外观及记录给药程序引起的任何畸形。
结果分析
耐受结果，总结：
死亡率和临床体征
临床检查和眼科检查显示，除了一些视为次要的或程序相关的和实验室圈养灵长类常见的影响外，对出血或体重改变或肉眼可见的结果不存在治疗相关的影响。对体重或体重增长不存在与治疗相关的影响。对体重不存在与处理相关的影响并且不存在肉眼可见结果。在第28天，在接受H7 IgG1N297Q的动物中观察到非常轻微的玻璃体浑浊。它们不被认为具有临床重要性，且使用玻璃体内施用途径时，常观察到这类变化。
眼耐受性-眼科观察结果
在处理前记录到一些轻微的次要观察结果；然而，判定全部动物均能够参与研究。在第I阶段期间，给药后仅观察到轻微变化。在3/6只眼(第1002号和第1003号)中，玻璃体和前房中注意到少量的细胞。
在第II阶段，激光照射在全部处理的眼中均导致相似的程序相关眼部变化，包括视网膜瘢痕化、出血和中心凹出血。脉络膜视网膜出血随时间推移改善，且截至第28天，在大部分眼中已经消退。在给予1mg H7 IgG4(ELB01101)的12只眼中的9只眼中，在第28天注意到玻璃体前部非常轻微的细胞样浑浊。给予D-PBS的第2004号对照动物也在第9天和第28天双侧注意到这些细胞。
通过对激光所致脉络膜血管新生的预防作用评估IVT注射H7 IgG4的疗效
荧光血管造影术结果分析
在第1天，全部动物的眼均成功地接受用于评价脉络膜血管新生(CNV)的9个激光病灶方案/设计。尽管一些动物注意到出现多于9个病灶，但仅评价9个病灶。
从图4中和下表18中总结的结果可以看出，当考虑有临床意义病灶的数目(3级：中度泄漏；和4级：明显泄漏；合计)时，在第14天和第29天，载体组中这些病灶的数目更多。在第14天，与载体对照相比，IgG4 H7(ELB01101)对ChNV减少存在轻微影响。在评估的第29天病灶，有利于用抗CD160 H7 IgG4处理的动物，差异更明显。的确，在第29天，与载体(PBS)组(25)相比，接受(ELB01101)的动物显示出更少数目(13)的有临床意义病灶(3级：中度泄漏；和4级：明显泄漏；合计)。相对于激光病灶的总数，在施用H7 IgG4的眼中有临床意义病灶的发生率是12％，相比之下，载体组为23.1％。当考虑有临床意义的病灶数目，在第14天和第29天，PBS组中这些病灶的数目更高。
如表18中报道，还应当注意到，对于ELB01101，第14天时0级病灶的数目高于载体，并且在第29天时1级和2级病灶的数目高于载体，这表明除了对一些大病灶的预防作用之外，对于其他微小病灶，ELB01101似乎延迟了病灶进展。
表18：载体对照处理或H7 IgG4处理对猴眼中观察到的激光所致ChNV病灶的等级的影响
当计算这项研究的发生率和发生率比时(如(Krzystolik等人,2002))中所规定)，在第29天，相对于激光斑点总数，施用ELB01101的眼中有临床意义病灶的发生率(IR)是0.12(13/108)或12％(以百分数计)，与之相比，载体组中为0.231(25/108)或23.1％(以百分数计)，对应于的发生率比(IRR)为0.519。
在NHP组织上通过免疫组织化学依据血管性血友病因子(vWF)评价激光病灶
按半定量方式逐一评价激光病灶的vWF阳性染色，并且对激光病灶的大小和性质给出评分。
使用最低分类
(1)对于存在荧光标记，轻微
(2)对于存在vWF阳性血管/毛细血管，中度
(3)血管数量大于目的区域(病灶的中心和周缘)内的平均数时。
与单独的处理相比，在接受H7 IgG4的组中，vWF阳性染色的平均评分在激光病灶的中心略微较高(大约10％)，而对照组在病灶周缘具有略较高的评分(大约6％)。
点状病灶评分
在放大率20X时，根据病灶相对于视野的大小，激光病灶点收到评分1、2或3，并且病灶特征在于，点状病灶是开放的，或具有中央脉络膜瘢痕或被RPE瘢痕完全覆盖。
开放病灶意味着病灶缺少Bruch膜和RPE膜覆盖。脉络膜瘢痕特征在于(往往在部位的中心)存在致密的组织聚集物，其显示为纤维状并具有高背景荧光。同样，RPE瘢痕指RPE细胞或具有高背景的中心细纤维状聚集体改变的结合。正如vWF荧光结果那样，H7 IgG4处理的组中病灶大小评分并未明显差异于对照组。
但是，如果通过评价病灶点的RPE覆盖状态、其开放情况和是否存在脉络膜瘢痕，来认定病灶的出现，则用H7 IgG4处理的组具有更高总数的通过愈合而被RPE膜完全覆盖的激光病灶(32至16个病灶)，而对照组具有更高数目的存在或不存在中央瘢痕的开放病灶(26至19个病灶)(表19)。这提示在激光病灶初始诱导过程期间不存在差异的条件下，H7IgG4处理的组中正在愈合的点的数目更高。未对第2101号动物记录，因为在取出视网膜和取出所附RPE膜期间，病灶覆盖完整性受到影响。
表19：表征存在的激光病灶
总结：
如图4和图5中和表18和表19中所见，与载体(PBS)相比，IVT注射H7 IgG4的疗效和对激光所致脉络膜血管新生的预防作用如下所示。
在第14天，与PBS对照相比，IgG4 H7在减少脉络膜血管新生方面的作用是明显的。在第29天，在动物用H7 IgG4处理的情况下，差异甚至更明显。在第29天，在施用H7 IgG4的眼中，相对于激光病灶的总数，有临床意义病灶的发生率是12％，相比之下，PBS组为23.1％。如可以在图4中见到，当考虑有临床意义病灶的合计数目(3级：中度泄漏；和4级：明显泄漏)时，在第14天和第29天，PBS组中存在更多数目的这些病灶。
如图5中所见，当使用vWF IHC评价每个斑点病灶的视网膜色素上皮(RPE)覆盖状态时(如图5中所示)，ELB01101处理的动物和对照动物之间斑点大小评分并无不同。H7IgG4施用与血管化评分相关，其中相比对照处理，所述血管化评分在激光病灶点的中心处略高，但在周缘略微低，如通过vWF阳性染色所示，并且这与H7 IgG4对有临床意义病灶的影响相关。此外，与对照动物相比，被RPE瘢痕完全覆盖的激光病灶的发生率较高，对照动物具有存在或不存在中央脉络膜瘢痕的“开放”激光病灶的发生率升高。这些结果提示在对照动物和处理的动物之间激光产生的初始病灶相似的条件下，接受H7 IgG4的动物中病灶加速愈合的过程。在IgG4处理的动物和对照动物之间点大小评分并无不同。
总之，通过单次双侧玻璃体内注射1mg/眼施用H7 IgG4(ELB01101)，在食蟹猴中具有临床上良好耐受。对于IgG1 N297Q样式的抗CD160 H7(ELB01111)，也是如此。与载体对照(PBS)相比，H7 IgG4与脉络膜血管新生减少相关，同时，诱导的病灶的中心处的血管化比周缘略高和存在RPE膜愈合的病灶的发生率更高，这提示抗CD160 H7 IgG4(ELB01101)处理的眼中加速康复的过程。
实施例10：在NHP的激光所致(ChNV)模型中玻璃体内注射两种优化的抗CD160 mAb 样式(作为IgG4(ELB01103)样式和作为Fab-接头Fab样式(ELB01132)的H7变体D12)的耐受 性和剂量疗效评估。
如实施例9中所述，相对于激光斑点总数，每只眼单次玻璃体内注射1mg非优化的抗CD160 IgG4(ELB01101)阻止有临床意义的病灶发生达50％，同时无重大眼毒性迹象。
随后如实施例2中所述那样，通过亲和力成熟过程优化这种第一代抗CD160抗体，并且如实施例3中所述设计不同mAb样式。在实施例8中，在兔的药代动力学试验中比较了针对眼科目的设计的不同样式的抗CD160，并且选定其中两者，ELB01103(作为IgG4的亲和力优化的抗CD160)和ELB01132(作为Fab-接头-Fab的亲和力成熟的抗CD160)。
与ELB01101相比，ELB01103具有缩减的全身性半衰期和仍然良好的玻璃体内半衰期(兔中4天)。由于其亲和力成熟，它应该具有比ELB01101更高或相当的功效。这种亲和力优化的抗CD160还作为Fab-接头Fab样式生成，以增加眼通透性，与ELB01103相比玻璃体内半衰期略微缩减并且全身性半衰期极为缩短。基于与ELB01103的等摩尔基础，计算待测试的ELB01132剂量。的确，对于IgG ELB01103，抗CD160的分子质量大致为150KDa，并且对于ELB01132，减少至90KDa。
这项研究中用于随访动物并评估耐受性和疗效供试品(ELB011的候选物)的方案是前文实施例9中描述的那些，附带以下变更。表20中描述了每种抗CD160同种型功效的安全性和剂量评估的实验设计，7组，5只动物/组，仅为雄性。这项研究中用于追踪动物并评估耐受性和疗效供试品(ELB011的候选物)的方案在前文实施例9中描述的那些，附带以下变更。表20中用(仅雄性)5只动物/组的7个组描述用于每种抗CD160同工型疗效的安全性和剂量评估的实验设计。
表20NHP实验的剂量疗效实验设计
实验设计
在第0天通过双侧玻璃体内注射施用表21中描述的供试品和参比品。每只动物的目标给药体积是采用待测试产品剂量时50μL/眼。使用1mL注射器和具有29号x1/2-英寸针的Exelint U-100胰岛素0.5cc注射器，给药剂量。
下表21中详述测试的产品的批次
表21剂量疗效研究中注射的产品
**通过溶解这些项在PBS1X里准备这些溶液。
激光所致脉络膜血管新生(ChNV)程序和活跃ChNV的评估
激光所致ChNV程序与实施例9中所述的程序相同。在第1天，为了评估ChNV，使用810nm二极管激光器按初始功率设定300mW、初始斑点大小80μm和持续时间0.1秒，每组5只动物的眼均成功地接受视网膜大血管之间每只眼的黄斑区域周围9斑点激光伤害样式处理。评价每种处理总数90个激光部位/组(依据待测试产品，5只动物/组，2只眼/动物，9个部位/眼)。
通过荧光素血管造影术(FA)评估活跃ChNV病灶的形成，在损伤之前研究前及激光损伤后第14天和第28天一次，并且还由2名独立判读员彩玉与实施例9中先前所述相同的程序，按评分0-4半定量评价静止图像上独立激光斑点的泄漏情况。
谱域-光学相干断层摄影术(SD-OCT)
为了评估抗CD160先导候选物对病灶层面部位处视网膜厚度的影响，存在谱域光学相干断层摄影术(SD OCT)分析视网膜和不同病灶部位的一个附加步骤。在第14天和第28天仅对中等给药组(ELB01103为1mg和ELB01132为0.6mg)和溶媒组进行SD-OCT分析。为此目的，将(1％托吡卡胺和/或2.5％去氧肾上腺素)扩瞳。将使动物麻醉以便进行荧光素血管造影术，如实施例9中所示。捕获穿过双眼中每个病灶的5张切片的穿激光病灶连续图像。测量每张切片的纤维血管膜面积并计算每个斑点的总量。将每个病灶部位中视网膜厚度的测量与病灶外部的三个量值比较(正常视网膜厚度估计值)。如认定为必要，获得附加的扫描或图像。
每个有临床意义病灶的独立视网膜厚度随时间推移的演变可以作为独立视网膜厚度随时间推移(在第14天和第28天之间)的平均变化追踪。随后通过探查候选物对每个有临床意义病灶(3级+4级)或每个4级病灶的视网膜厚度的影响程度和对病灶部位处视网膜厚度随时间推移(在第14天和第28天之间)演变的影响程度，确认ELB011的候选物的疗效。
终末程序和生物分析(TK)
用于动物的终末程序与实施例9中所述的程序相同。动物将经历有限的尸体剖检检查，这将由评估采集的组织组成。
单独采集巩膜-脉络膜-RPE复合物、玻璃体和眼房水并保持冷冻在-80℃直至分析为止。
使用经股静脉采集法，随时间推移采集全部动物的一些血清样品(0.75mL)(每个研究一次；给药后2、6、12、24和48小时；第4、7、14和28天)。这些血清样品保存在-80℃直至生物分析为止，以评估抗CD160先导候选物浓度和或检索并定量任何针对抗CD160先导物的最终抗药物抗体。
评价先导候选物的预防和治疗疗效
在这项研究中，与实施例9中所述的研究相比，存在评估这两种抗CD160先导候选物的疗效的更多分析读出。的确，为了评估每种抗CD160同工型的疗效，首先，在第14天和第28天评价它们各自的预防作用
-依据各个有临床意义的激光所致病灶的数目和等级评分
-依据各个有临床意义病灶的ChNV面积和视网膜厚度
-并且，其次，通过探查以下项随时间推移(在第14天和第28天之间)对第14天时已建立的活跃病灶的影响，评价其各自的治疗效果
-有临床意义病灶的平均等级评分，
-有临床意义病灶的独立和平均ChNV面积(以像素计)
-随病灶类型(全部等级，有临床意义的病灶(3级+4级)和仅4级)变化的独立和平均视网膜厚度(对于两种中等剂量(ELB01103为1mg和ELB01132为0.6mg)。
结果
在NHP ChNV模型中就疗效和耐受性进行ELB01103剖析和ELB01132剖析并且下文呈献结果。
ELB01103和ELB01132安全性评估
就ELB01101而言并且无论所用ELB01103或ELB01132玻璃体内剂量是什么，临床检查和眼科检查均显示，除了一些视为次要或程序相关和实验室圈养灵长类常见的影响外，对出血或体重改变或眼观变化不存在ELB01103和ELB01132处理相关的影响。激光暴露在全部处理的眼中均导致相似的程序相关眼部变化，包括视网膜瘢痕化、出血和中心凹出血。脉络膜视网膜出血随时间推移改善并且截至第28天，在大部分眼中已经消散。
NHP ChNV模型中ELB01103相对于溶媒对照和ELB01101(H7 IgG4)的剂量疗效
如图6小图A中所述，首先通过以下方式评价作为IgG4的H7变体D12(ELB01103)的预防背景下的疗效：探查随时间推移(在第0天和第14天之间及第0天和第28天之间)其对与明显荧光素泄漏相关的高等级(3级+4级)的有临床意义病灶的影响程度。存在几种可能性呈献通过半定量评估荧光素血管造影照片所获得的疗效数据。
首先，可以通过如图6小图A中所述的所测试产品对有临床意义病灶的百分数(％)/激光所致病灶总数的影响，呈现疗效数据。这个百分数对应于(有临床意义病灶的数目除以10只激光所致猴眼的潜在病灶总数(这里是90个))*100。在ELB01103的两个最高剂量(1mg和3mg)浮现明确的剂量依赖性疗效。对于0.3mg组和1mg组，对病灶的影响似乎在第28天比第14天更强烈。在第14天，达到3mg剂量的最大影响。在第28天，1mg ELB01103(亲和力成熟的mAb)具有比等效剂量的ELB01101(非亲和力成熟的H7 IgG4候选物)更大的疗效。
还可能呈献探查影响具有至少1个4级病灶的眼％的疗效数据或依据对具有至少一个有临床意义病灶(3级+4级)的眼％的影响呈献疗效数据。当跨组(3/4级)并且纵向(具有至少一个4级病灶的眼数目或眼％，数据未显示)比较有临床意义的泄漏时追踪这些读出的情况下，也观察到ELB01103的剂量疗效。
随后，评估ELB01103对泄漏严重程度随时间推移演变情况的影响并且这种影响在图6的小图B中展示。依据有临床意义的独立ChNV病灶的等级评分随时间推移(第14天至第28天)的变化，观察泄漏严重程度的演变情况。在小图B中，当玻璃体内注射ELB01103时，在第14天和第28天之间临床独立的病灶的泄漏严重程度平均降低，尤其在中等剂量(1mg/眼)和在低剂量(0.3mg/眼)时如此。的确，在第14天和第28天之间等级评分的平均变化伴随这些剂量明确降低。对于3mg剂量，随时间推移对泄漏严重程的控制似乎较低，但仅对3mg剂量的第14天和第28天之间演变的9个病灶做出分析，原因是在第14天抗体的疗效更好。但是，3mg剂量对泄漏严重程度的控制仍好于对照组。
在图6的小图C中描述ELB01103剂量递增(0.3至3mg)对第14天至第28天有临床意义的病灶的ChNV面积平均变化的影响。病灶面积测量显示ELB01103处理的眼在第天14可比于对照并且截至第28天与对照相比时，在全部剂量水平均具有较低泄漏。的确，尽管溶媒对照组中CHNV面积随时间推移进展，但添加ELB01103时，在第14天和第28天之间制止了在第14天未阻止的有临床意义病灶的进展并且这伴随着剂量-应答作用无论ELB01103剂量是多少，在第14天和第28天之间总是存在平均ChNV面积演变(个体数据未显示)和平均ChNV面积的重大减少并且这伴随着剂量-应答作用
在图6的小图D中描述了ELB01103剂量(1mg)对第14天和第28天之间取决于病灶评分的视网膜厚度平均变化的影响。尽管溶媒对照组中视网膜厚度随时间推移增加，但添加ELB01103时，在第14天和第28天之间制止了有临床意义病灶的增长，随后制止其视网膜厚度增长。在第14天和第28天之间这种由ELB01103诱导的平均视网膜厚度减少与所分析病灶的等级无关。
NHP ChNV模型中ELB01132相对于溶媒对照和ELB01101(H7 IgG4)的剂量疗效
如图7小图A中所述，首先通过以下方式评价作为Fab接头Fab的H7变体D12(ELB01132)的预防背景下的疗效：探查随时间推移其对与明显荧光素泄漏相关的高等级(3级+4级)的有临床意义病灶的影响程度。存在两种最低剂量(0.23mg和0.6mg)的疗效。但是，在全部最高剂量(2mg)时根本不存在ChNV病灶预防作用。截至第14天，ELB01132的中等剂量(0.6mg)始终如一非常高效地阻止ChNV病灶出现，无论观测的疗效读出是什么(数据未显示)。当跨组(3/4级)并且纵向(具有至少一个4级病灶的眼数目或眼％，数据未显示)比较有临床意义的泄漏时追踪这些读出的情况下，也是如此。0.6mg剂量ELB01132的疗效好于ELB01101的疗效。
随后，评估ELB01132对泄漏严重程度随时间推移演变情况的影响并且这种影响在图7的小图B中展示。依据有临床意义的独立ChNV病灶的等级评分随时间推移(第14天至第28天)的变化，观察泄漏严重程度的演变情况。在图7的小图B中，当玻璃体内注ELB01132射时，仅在低剂量控制ChNV病灶演变。相反，当使用中等和高剂量时，泄漏增加。在中等剂量，展示了2mg剂量随时间推移对泄漏严重程的控制，但在第14天因抗体疗效而仅对5个病灶做出分析。关于获得自最高剂量(2mg)的数据，ELB01132在这个剂量对泄露完全无控制。
在图7的小图C中描述ELB01132剂量递增(0.25至2mg)对第14天至第28天有临床意义的病灶的ChNV面积平均变化的影响。
在给予ELB01132的眼中，与对照眼相比时，在第14天和第28天在中等剂量(0.6mg/眼)观察到更小的病灶面积。在第14天和第28天之间，泄漏进展仅略微地低于对照眼中。仅两种最高剂量倾向于略微减少第14天和第28天之间平均ChNV面积的增加演变。
在图7的小图D中描述了0.6mg剂量的ELB01132对几个类型病灶的视网膜厚度平均变化随时间推移的影响。尽管溶媒对照组中视网膜厚度在第14天和第28天之间增加，取决于病灶等级，0.6mg剂量的ELB01132对病灶的平均视网膜厚度随时间推移变化的控制具有比ELB01103大得多的变异性。的确，考虑有临床意义的3级和4级病灶时，视网膜厚度的平均变化随0.6mg ELB01132大幅度减少，但是考虑全部等级的病灶时或当仅单独考虑4级病灶时，情况不再如此(参见图14)。但是，在分析4级病灶的情况下，在第14天因抗体疗效而仅对5个4级病灶做出分析。
结论
在高达3mg ELB01103/眼和2mg ELB01132/眼，食蟹猴中临床上良好耐受通过单次双侧玻璃体内注射法施用H7变体D12抗CD160的两种同工型。两种供试品均与ChNV进展减少相关，如与对照相比时，有临床意义病灶面积和/或厚度变化所测量。总体上，ELB01103的疗效高于对ELB01132所观测的疗效。的确，存在明确的ELB01103剂量影响，无论分析的疗效读出实施什么，同时ELB011032疗随剂量变化并随疗效读出变化具有大得多的变异性。但是，ELB01132的中等剂量(0.6mg)始终如一非常高效地阻止ChNV病灶出现。
实施例11：H7IgG1抗体在CLL患者的肿瘤细胞上结合
在CD19/CD5/CD3/CD56组中，用抗体CL1-R2(鼠抗CD160IgG1)、IgG1样式的抗CD160H7或BY55(鼠抗CD160 IgM)标记分离自7名CLL患者的PBMC(参见图8)。分析CD5+CD19+肿瘤细胞以测量CD160标记的荧光强度。可变强度的CD160表达在全部CLL样品上均可检测。如图8，在6/7所检查的CLL样品中，H7 IgG1抗体与肿瘤细胞高效结合，并且这种抗体好于CL1-R2或商业BY55抗CD160 mAb。
IgG1样式的H7抗体因此能够与CLL中的肿瘤细胞结合，并且可以因此用来通过细胞毒性机制(尤其如ADCC或CDC)靶向并杀伤这些恶性细胞。
实施例12：CD160阳性细胞上IgG1样式的H7抗体诱导的ADCC的体外评估
IgG1样式的抗CD160抗体H7通过ADCC机制杀伤表达CD160的细胞(参见图9)。
在测量抗CD160 H7 IgG1抗体的ADCC活性的试验中，使用从健康供体血液纯化的NK细胞作为效应子。将E300-CD160靶细胞(转染的表达CD160前B人细胞系)用CFSE标记，并且在H7 IgG1抗体或人IgG1同种型对照存在下，按所示的效应子/靶比率(1/1、1/5和1/10)与效应子NK细胞温育。通过用7AAD标记和流式细胞分析，测量已杀伤靶细胞的百分数。在呈现的点图上右上象限内指示双重标记的7AAD+CFSE+死细胞的百分数。
这些结果以及图8中展示的那些结果(实施例11)显示，IgG1样式的H7抗体可以用来通过ADCC机制在表达CD160的细胞的表面靶向并杀伤它们。
实施例13：通过IgG1样式的H7抗体活化NK细胞及激活其干扰素-γ的产生
如图10、图11和图12的结果所示，IgG1样式的抗CD160 H7抗体活化NK细胞。
如图10小图A中所示，H7 IgG1抗体能够与纯化自外周血的人NK细胞的表面结合。
图10小图B显示H7 IgG1诱导NK细胞产生干扰素-γ(IFN-γ)。将纯化自健康供体血液的NK细胞在96孔板的孔中单独或在浓缩至1或10μg/ml的H7 IgG1抗体或人IgG1同种型对照存在下培养24小时(1×10+6个细胞/孔)。通过ELISA分析培养上清液中的IFN-γ。呈现的结果是三次重复的均数+/-sem。
图10小图C显示H7 IgG1诱导NK细胞上的CD69活化标志物表达。在与小图B相同的实验中，将NK细胞在培养24小时后收集并用缀合于荧光物质APC的抗CD69抗体标记。通过流式细胞术分析CD69阳性细胞的百分数。从三次重复计算出均数(+/-sem)。
如图11中所显示，IgG1样式而非IgG4样式的抗CD160 H7抗体活化NK细胞。将纯化自健康供体血液的NK细胞单独或在浓缩至5μg/ml的以下抗体存在下培养：H7 IgG1、H7IgG4、它们各自的人IgG1或IgG4同种型对照，或抗体ELB01103、ELB01104和ELB01106，它们是从IgG4样式的H7抗体衍生的变体。全部抗体均设对照，以核实缺少内毒素所致污染。使用抗CD16抗体(ebioscience目录号16-0166)作为阳性对照。将NK细胞(5×10+5个/孔)在培养24小时后收集并用缀合于荧光物质APC的抗CD69抗体标记。通过流式细胞术分析CD69阳性细胞的百分数(三次重复的均数+/-SD)。IgG1样式的抗CD160 H7诱导NK细胞上CD69活化标志物表达，而IgG4样式的相同抗体无效果。人IgG4样式的H7的变体(ELB01103、ELB01104和ELB01106)对NK细胞也不展示任何活化效果。
实施例14：IgG1样式和E345K/IgG1样式的H7的不同变体增加NK细胞刺激活性
如图12的结果所示，从IgG1样式和E345K/IgG1样式的抗CD160 H7抗体衍生的变体具有增加的NK细胞活化能力。将纯化自健康供体血液的NK细胞在96孔板的孔中(1×10+6个细胞/孔)单独或在剂量0.001至10μg/ml的抗CD160 H7 IgG1抗体或ElsaLys生产的变体ELB02102、ELB02103、ELB02104(全部三者均为IgG1样式)、ELB02112、ELB02113或ELB02114(全部三者均为E345K/IgG1样式)存在下培养24小时。使用10μg/ml的人IgG1作为阴性同种型对照，并且使用抗CD16(ebioscience目录号16-0166)作为阳性对照。
通过ELISA分析培养上清液中的IFN-γ。呈现的结果是三次重复的均数+/-sem。
将NK细胞收集并用缀合于荧光物质APC的抗CD69抗体标记。通过流式细胞术分析CD69阳性细胞的百分数。从三次重复计算出均数(+/-sem)。
使用GraphPad Prism软件分析这些结果，以生成非线性回归曲线(对数(活化剂)vs响应，3-参数等式)并计算中位有效浓度(EC50)。不对3种变体ELB02112、ELB02113或ELB02114计算诱导CD69的EC50，因为随浓度大于或等于0.1μg/ml观察到死亡。这些E345K/IgG1形式刺激的NK的死亡率可能是在细胞强烈活化后诱导的。
全部这些结果均显示，对于活化NK细胞，IgG1样式的H7的三种变体(ELB02102、ELB02103、ELB02104)比原始H7 IgG1抗体(ELB02101)强有力得多，EC50改善2至3个对数。
E345K/IgG1样式的H7的三种变体(也就是ELB02112、ELB02113、ELB02114)展示出诱导IFN-γ产生的能力进一步增加，EC50额外改善2个对数(相对于原始H7 IgG1抗体(ELB02101)，4个对数)。
实施例13和实施例14中展示的结果显示，IgG1样式和E345K/IgG1样式的H7抗体及其变体能够活化NK细胞并诱导它们产生IFN-γ。这些特性使它们能够借助NK细胞刺激并借助IFN-γ(已知激活Th1型反应的细胞因子)所活化的T淋巴细胞和抗原呈递细胞间接地刺激癌症患者中的免疫应答。
另外，这些特性使得从IgG1样式和E345K/IgG1样式的H7衍生的抗体潜在地能够增加由拥有这种作用模式的将会共施用的其他抗体所诱导的ADCC细胞毒活性，并且因此将使得改善这些抗体的治疗效果成为可能。
实施例15：通过IgG1样式和E345K/IgG1样式的H7抗体的变体标记NK细胞和CD8+T 细胞
从IgG1样式和E345K/IgG1样式的抗CD160 H7抗体衍生的变体更高效地标记NK细胞和CD8+T细胞(图13)。
用抗CD45、CD3、CD4、CD8和CD19抗体并用所示的与PE缀合(Lynx Rapid RPE抗体缀合试剂盒，参考号LNK022RPE)的抗CD160抗体(对于5×10+5个PBMC，0.25μg)免疫标记后，通过流式细胞术分析两名健康供体的PBMC(外周血单核细胞)。使用无关的人IgG1(hIgG1)作为阴性对照。用人Fc(Rockland)饱和Fc受体，15分钟AT。
在图13小图A中：IgG1样式(ELB02102、ELB02103、ELB02104)或E345K/IgG1样式(ELB02112、ELB02113、ELB02114)的H7的变体比原始H7 IgG1抗体更高效地与NK细胞结合，60％至80％的NK细胞阳性标记。在图13小图B中：在供体2中明确检测到的CD8+T细胞群体，也被H7变体更高效地标记。
这些结果显示，从IgG1样式和E345K/IgG1样式的抗CD160 H7抗体衍生的变体比原始H7 IgG1抗体更高效地与NK细胞和CD8+T细胞结合。
这些结果和先前实施例中展示的那些结果显示，IgG1样式和E345K/IgG1样式的H7IgG1抗体及其变体不仅可以与NK细胞结合并刺激它们的活性，还与它们也可以调节其活性的CD8+CD160+T淋巴细胞群体结合。
实施例16：设计和产生抗CD160候选物的针对眼科学和肿瘤学优化的双特异性抗 体(bsabs)
针对眼科学适应症的具有抗CD160的可能的双特异性抗体(bsabs)：潜在第二价态的与抗CD160 H7或亲和力成熟结合。
由(Labrijn等人,2014)描述的策略，用于从亲本抗体：抗hCD160 IgG1F405L(克隆H7)或其衍生物)和由抗hAngiopoietin 2组成的IgG1 K409R中开发双特异性IgG作为概念验证。
抗体之一选自表22(眼科学应用)或选自表23(肿瘤学应用)。这种第一抗体为眼科学用IgG1 N297Q H310A-H435Q K409R样式或肿瘤学用IgG1K409R样式。第二抗体是抗CD160H7(或其变体)。这种第二抗体为眼科学用IgG1 N297Q H310A-H435Q F405L样式或肿瘤学用IgG1 F405L样式。
表22：可以在眼科学中作为第二潜在价态用于产生抗CD160 bsab或在联合疗法中配合抗CD160 H7或其变体使用的靶向抗原的抗体。
表23：可以在肿瘤学中作为潜在第二价态用于产生抗CD160 bsab或在联合疗法中配合抗CD160 H7或其变体使用的靶向抗原的抗体。
这项技术可以用来根据靶向的眼科学、肿瘤学或免疫治疗适应症，产生抗CD160bsab候选物。
实施例17：评价抗hCD160/抗人血管生成素2或抗hCD160/抗人CD200R联合疗法和 双特异性
如(Campos-Mollo等人,2011)中所述，在氢氧化钠(NaOH)缓冲液诱导的角膜新血管形成兔模型中，在每种抗体的两种剂量(100和500μg)或100和500μg的bsab时，评价抗CD160及其抗X配偶抗体(尤其其中X是血管生成素2或CD200R)和抗CD160/抗X双特异性抗体的联合疗法的疗效和其疗效的叠加作用和/或协同作用。
实施例18：本发明的抗体能够结合在CD160GPI和CD160TM上，但CL1-R2抗体仅识别 CD160 GPI。
在标记重组细胞系CHO-S-hCD160-GPI(克隆2G10)中表达的人表面CD160-GPI(糖基磷脂酰肌醇)期间和在标记重组细胞系CHO-S-hCD160-TM中表达的人表面CD160-TM(跨膜)期间，与未转染的CHO-S细胞相比，通过测量标记的细胞百分数＝结合百分数，评价抗CD160CL1-R2、ELB02101(H7IgG1)抗体和ELB02104、ELB02114和ELB01103样式的H7变体的结合能力(参见图14)。为此，用1μg这些抗体以及适宜的同种型对照分别标记2×10+5个CHO-S-hCD160-GPI、CHO-S-hCD160-TM和未转染的CHO-S细胞。
在图14中，测试的全部抗CD160-GPI(无论是同种型或IgG样式或变体)均特异性识别CHO-S细胞重组表达的人CD160。人源化ELB02101(H7 IgG1)及其不同样式的H7变体ELB02104、ELB02114和ELB01103比亲本CL1-R2更高效地与CHO-hCD160-GPI转染子结合。出乎意料地，人源化ELB02101(H7 IgG1)和变体ELB02104、ELB02114和ELB01103还与CHO-S细胞重组表达的人CD160-TM结合，而亲本CL1-R2 mAb不能够结合，无论测试的剂量为多少。
实施例19：通过H7变体ELB02104阻断HVEM-CD160相互作用来再活化T CD4
如图15的结果所示，与同种型对照相比，从IgG1样式的抗CD160 H7抗体衍生的A09变体(ELB02104)能够再活化T CD4 CD45High CD160+淋巴细胞。通过阻断HVEM-CD160相互作用，ELB02104解除由HVEM蛋白诱导对T CD4细胞的抑制。
将纯化自健康供体血液的T CD4淋巴细胞在96孔板中(1×10+6个细胞/孔)，在抗CD160 mAb：ELB02104存在下或者与10μg/ml的适宜同种型对照并与平板上包被的抗CD3(克隆UTCH1)mAb+/-抗CD28(克隆CD28.2)mAb+/-HVEM蛋白(10334-H08H，Sino biological)一起培养16小时。
收集T CD4淋巴细胞并用活力标志物：Zombie NIR、靶向初始/记忆细胞的与荧光物质BB515缀合的抗CD45RA抗体、用靶向CD160表达细胞的与荧光物质Alexa fluor 647缀合的抗CD160(克隆BY55)抗体和与靶向已活化细胞的与荧光物质PE缀合的抗CD69抗体标记。通过流式细胞术分析Zombie NIR-/CD45RAhigh+/CD160+/CD69+阳性细胞的百分数。从两次重复计算出均数(+/-sem)。结果显示，IgG1样式的H7 A09变体(ELB02104)阻断HVEM-CD160相互作用并且移除HVEM蛋白诱导对T CD4细胞的抑制，如通过T CD4 CD45RAhighCD160+细胞表达的活化标志物CD69上调所示。
HVEM由几种癌表达并在肿瘤进展和免疫逃避中发挥作用。阻断T CD4细胞上的HVEM-CD160轴可以通过T CD8细胞毒性生成来恢复抗肿瘤应答。
实施例20：DC(树状细胞)通过NK细胞刺激活性的H7 IgG1(ELB02101)和IgG1 (ELB02104)样式和E345K/IgG1(ELB02114)样式的H7 A09成熟
与H7 IgG1(ELB02101)相比和与亲本CL1-R2 mAb相反，IgG1(ELB02104)样式和E345K/IgG1(ELB02114)样式的H7 A09变体抗体具有增加的通过NK细胞刺激活性诱导DC成熟细胞的能力。
从健康供体血液纯化的单核细胞在未成熟的树状细胞中伴随GM-CSF(100ng/mL)和IL-4(20ng/mL)分化6天。将纯化自健康供体血液的NK细胞在96孔板中(1×10+6个细胞/孔)单独或在10μg/ml的抗CD160 mAb：CL1-R2、H7 IgG1(ELB02101)、或变体ELB02104(IgG1样式)、ELB02114(E345K/IgG1样式)或ELB01103(IgG4样式)存在下并且还与适宜的同种型对照一起培养16小时。将未成熟的DC(1×10+5个细胞/孔)，与事先和抗CD160 mAb温育的NK共培养24小时。
收集DC/NK共培养细胞并以下标记：存活标志物：Zombie NIR、靶向DC细胞的与荧光物质PE-Cy7缀合的抗CD11c抗体、靶向NK细胞的与荧光物质Viobright 515缀合的抗CD56抗体、和与靶向成熟DC细胞的与荧光物质BV421缀合的抗CD86抗体标记。通过流式细胞术分析Zombie NIR-/CD11c+/CD86+阳性细胞的百分数。从两次重复计算出均数(+/-sem)。
结果显示，与H7 IgG1(ELB02101)相比，IgG1(ELB02104)样式和E345K/IgG1(ELB02114)样式的H7 A09变体具有增加的通过NK细胞刺激活性诱导DC成熟细胞的能力(如通过CD86上调所示)。令人惊讶地，亲本CL1R2 mAb没有这种诱导DC成熟的特性。
实施例13和实施例14中的结果显示，IgG1样式和E345K/IgG1样式的H7抗体及其变体能够活化NK细胞并诱导它们产生IFN-γ。这些特性使得它们能够刺激并刺激成熟DC细胞，以及间接地通过成熟DC细胞和T淋巴细胞之间的相互作用，驱动具有抗肿瘤特性的细胞毒性T淋巴细胞在癌症患者中生成。
参考文献
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序列表
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ELSALYS BIOTECH
<120> 结合人CD160的化合物及其用途
<130> BR097755/NJO/CCU
<160> 64
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 121
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 1
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Trp Met Gln Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Asp Ala Arg Tyr Thr Gln Lys Phe
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Ala Arg Arg Gly Ile Ala Ala Val Val Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly
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<213> 小鼠
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Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
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Asn Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn His
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Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Asp Ala Arg Val Thr Gln Lys Phe
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化序列
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Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn His
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Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Trp Met Gln Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化序列
<400> 14
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn His
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<212> PRT
<213> 智人
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<400> 16
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Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
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Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
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Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
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<213> 智人
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 19
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20
<210> 20
<211> 20
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<213> 人工序列
<220>
<223> 肽信号
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<213> 人工序列
<220>
<223> 肽信号
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<213> 智人
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100 105 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
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Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
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Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
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<213> 智人
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 40
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85 90 95
Ala Arg Arg Gly Ile Ala Ala Val Val Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
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115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Trp Met Gln Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Asp Ala Arg Tyr Thr Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Ile Ala Ala Val Val Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Lys Pro Gln Val
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 49
<211> 450
<212> PRT
<213> 智人
<400> 49
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Phe
20 25 30
Trp Met Gln Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Asp Ala Arg Val Thr Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Ile Ala Ala Val Val Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
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115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
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195 200 205
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Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Lys Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
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His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 50
<211> 450
<212> PRT
<213> 智人
<400> 50
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Trp Met Gln Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Asp Ala Arg Tyr Thr Gln Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Ala Arg Arg Gly Ile Ala Ala Val Val Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
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Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
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290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
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Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Lys Pro Gln Val
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Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
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His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 51
<211> 450
<212> PRT
<213> 智人
<400> 51
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe
20 25 30
Trp Met Gln Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Asp Ala Arg Val Thr Gln Lys Phe
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65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Ile Ala Ala Val Val Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
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Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
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Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
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Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
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260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 52
<211> 497
<212> PRT
<213> 智人
<400> 52
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn His
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln
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Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys
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Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Phe Trp Met Gln Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly
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Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly
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Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr
260 265 270
Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg
275 280 285
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly
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Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr
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Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val
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Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro
385 390 395 400
Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr
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Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile
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Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly
435 440 445
Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala
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Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu
465 470 475 480
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys His His His His His
485 490 495
His
<210> 53
<211> 450
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 53
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Phe
20 25 30
Trp Met Gln Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Asp Ala Arg Val Thr Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Ile Ala Ala Val Val Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser
115 120 125
Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val
130 135 140
Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu
145 150 155 160
Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr
210 215 220
Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met
245 250 255
Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu
260 265 270
Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val
275 280 285
His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu
290 295 300
Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly
305 310 315 320
Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr
355 360 365
Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu
370 375 380
Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val
405 410 415
Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val
420 425 430
His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 54
<211> 213
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 54
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn His
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Asp Ala Ala Pro
100 105 110
Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 55
<211> 450
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 55
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Trp Met Gln Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Asp Ala Arg Tyr Thr Gln Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser
115 120 125
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130 135 140
Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu
145 150 155 160
Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr
180 185 190
Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro
195 200 205
Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr
210 215 220
Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met
245 250 255
Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu
260 265 270
Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val
275 280 285
His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu
290 295 300
Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly
305 310 315 320
Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr
355 360 365
Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu
370 375 380
Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val
405 410 415
Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val
420 425 430
His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 56
<211> 213
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 56
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn His
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Asp Ala Ala Pro
100 105 110
Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn
130 135 140
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145 150 155 160
Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr
180 185 190
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195 200 205
Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 57
<211> 214
<212> PRT
<213> 智人
<400> 57
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn His
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 58
<211> 447
<212> PRT
<213> 智人
<400> 58
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Trp Met Gln Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Asp Ala Arg Tyr Thr Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Ile Ala Ala Val Val Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 59
<211> 450
<212> PRT
<213> 智人
<400> 59
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Trp Met Gln Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Asp Ala Arg Tyr Thr Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Ile Ala Ala Val Val Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 60
<211> 447
<212> PRT
<213> 智人
<400> 60
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Phe
20 25 30
Trp Met Gln Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Asp Ala Arg Val Thr Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Ile Ala Ala Val Val Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 61
<211> 443
<212> PRT
<213> 智人
<400> 61
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Trp Met Gln Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Asp Ala Arg Tyr Thr Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Ile Ala Ala Val Val Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
260 265 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290 295 300
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305 310 315 320
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
325 330 335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
340 345 350
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
355 360 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385 390 395 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440
<210> 62
<211> 447
<212> PRT
<213> 智人
<400> 62
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Trp Met Gln Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Asp Ala Arg Tyr Thr Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Ile Ala Ala Val Val Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu Ala Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn Gln Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 63
<211> 447
<212> PRT
<213> 智人
<400> 63
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Phe
20 25 30
Trp Met Gln Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Asp Ala Arg Val Thr Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Ile Ala Ala Val Val Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu Ala Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn Gln Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 64
<211> 450
<212> PRT
<213> 智人
<400> 64
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Trp Met Gln Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Asp Ala Arg Tyr Thr Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Ile Ala Ala Val Val Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450

Claims (20)

1.与人CD160特异性结合的化合物，其选自抗体、抗体片段以及抗体衍生物构成的组，所述化合物包含：
SEQ ID No:14轻链可变结构域(VL)，
以及选自SEQ ID No:11、SEQ ID No:25、SEQ ID No:26、SEQ ID No:27、SEQ ID No:28、SEQ ID No:29和SEQ ID No:30的重链可变结构域(VH)。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中，这种化合物是单克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中，它是单克隆抗体，所述单克隆抗体具有：选自SEQ ID No:15、SEQ ID No:16、SEQ ID No 31至35、SEQ ID No 43和44的序列及其非糖基化变体作为重链恒定结构域，以及选自SEQ ID No:22、SEQ ID No:23和SEQ ID No:24的序列作为轻链恒定结构域。
4.根据权利要求1所述的化合物，所述化合物具有：由SEQ ID No:57限定的轻链，以及选自SEQ ID No:45至51、SEQ ID No:9、SEQ ID No:10、SEQ ID No:12和SEQ ID No:58至64的序列作为重链。
5.根据权利要求1所述的化合物，其中，它是选自Fab、Fab’和F(ab’)2的片段，并且包含轻链和重链，所述轻链由SEQ ID No:57限定，所述重链包含选自SEQ ID No:ID 36、SEQ IDNo:37和SEQ ID No:38的序列。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的化合物，其中，它是下述化合物的衍生物：选自scFv、与Fc片段融合的多聚体ScFv、双抗体、三抗体、ScFv四聚体、每个单体包含与重链片段结合的scFv的二聚体、每个单体包含与多个重链片段结合的scFv的二聚体、在C末端位置与亮氨酸拉链结构域融合的F(ab’)2、单域抗体、包含至少2个头-对-尾结合的Fab的形式，以及四价抗体。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的化合物，其中它是多特异性或至少双特异性衍生物，以及在于它包含至少一个CD160结合位点和用于结合另一种抗原的一个位点。
8.根据权利要求7所述的化合物，其中，所述另一种抗原选自以下抗原：VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PlGF、VEGF-R2、血管生成素2；血管生成素样4、CD200R、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-CC、PDGF-DD、PDGF-R、FGF、β-淀粉样蛋白、鞘氨醇-1-磷酸(S1P)、C’5、IL6、MER TK、CD115、TNFα、IL8、HGF、TGFβ、IGF1、IL1、IL2、EGF、KGF、G-CSF、GM-CSF、α-v,β-3或α-v,β-5整联蛋白、跨膜或可溶性CD146；MMP 1、MMP 2、MMP 9、MT1-MMP、TIMP-2；血管生成素；PD-ECGF、血小板活化因子；前列腺素E、多效生长因子、MHC II类分子、t HP59、CM101、CD3、CD25、CD28、PD1、CTLA4、4-1BB、LAG-3、ICOS、CD16、CD3、CD47、CD20、CD19、CD5、CD180、CD200、CD40、CD20、CD37、CD38、CD148、CD180和任何对B型淋巴瘤特异的其他抗原。
9.组合物，包含至少一种根据权利要求1至7中任一项所述的化合物。
10.根据权利要求9所述的组合物，所述组合物还包含至少一种其他抗体，所述抗体是针对以下抗原之一的抗体：VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PlGF、VEGF-R2、血管生成素2；血管生成素样4、CD200、CD200R、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-CC、PDGF-DD、PDGF-R、FGF、β-淀粉样蛋白、鞘氨醇-1-磷酸(S1P)、C’5、IL6、MER TK、CD115、TNFα、IL8、HGF、TGFβ、IGF1、IL1、IL2、EGF、KGF、G-CSF、GM-CSF、α-v,β-3或α-v,β-5整联蛋白、跨膜或可溶性CD146；MMP 1、MMP 2、MMP 9、MT1-MMP、TIMP-2；血管生成素；PD-ECGF、血小板活化因子；前列腺素E、多效生长因子、MHC II类分子、HP59、CM101、CD37、CD38、CD25、CD28、CD40、PD1、CTLA4、4-1BB、LAG-3、ICOS、CD16、CD3、CD47、CD20、CD19、CD5、CD180、CD200、CD40、CD20、CD37、CD38、CD148、CD180和任何对B型淋巴瘤特异的其他抗原。
11.一种药物，其包含根据权利要求1至8中任一项所述的化合物或根据权利要求9或10所述的组合物。
12.一种产品的用途，所述产品包含：
根据权利要求1至8中任一项所述的化合物，和
针对以下抗原之一的至少一种抗体：VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PlGF、VEGF-R2、血管生成素2；血管生成素样4、CD200、CD200R、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-CC、PDGF-DD、PDGF-R、FGF、β-淀粉样蛋白、鞘氨醇-1-磷酸(S1P)、C’5、IL6、MER TK、CD115、TNFα、IL8、HGF、TGFβ、IGF1、IL1、IL2、EGF、KGF、G-CSF、GM-CSF、α-v,β-3或α-v,β-5整联蛋白、跨膜或可溶性CD146；MMP 1、MMP 2、MMP 9、MT1-MMP、TIMP-2；血管生成素；PD-ECGF、血小板活化因子；前列腺素E、多效生长因子、MHC II类分子、HP59、CM101、CD37、CD38、CD25、CD28、CD40、PD1、CTLA4、4-1BB、LAG-3、ICOS、CD16、CD3、CD47、CD20、CD19、CD5、CD180、CD200、CD40、CD20、CD37、CD38、CD148、CD180和任何对B型淋巴瘤特异的其他抗原；
其中所述产品用于制备下述药物，所述药物在引起新血管化的病理状况的治疗中同时使用、单独使用或依次使用，所述的病理状况选自新生血管性眼病理状况、糖尿病、糖尿病性失明、原发性糖尿病性视网膜病变或年龄相关性黄斑变性、类风湿性关节炎、先兆子痫、子痫或癌。
13.根据权利要求11所述的药物的用途，其用于制备抗血管生成药物、免疫调节剂药物和/或细胞毒药物。
14.根据权利要求11所述的药物的用途，其用于制备治疗病理状况的药物，所述病理状况选自新生血管性眼病理状况、糖尿病、糖尿病性失明、原发性糖尿病性视网膜病变或年龄相关性黄斑变性、类风湿性关节炎、先兆子痫、子痫或癌。
15.根据权利要求1至8中任一项所述的化合物或根据权利要求9或10所述的组合物的用途，其用于制备治疗癌症的药物。
16.根据权利要求1至8中任一项所述的化合物或根据权利要求9或10所述的组合物的用途，其用于与至少一种下述其他抗体联合制备治疗血液癌的药物：抗CD20抗体；抗CD37抗体；抗CD38抗体或抗CD40抗体。
17.分离的核酸，所述分离的核酸编码权利要求1至8中任一项所述的化合物之一。
18.载体，包含权利要求17所述的核酸。
19.宿主细胞，包含权利要求18所述的载体。
20.用于产生权利要求1至7中任一项所述的化合物的方法，所述方法包括：培养权利要求19所述的宿主细胞，以产生与人CD160特异性结合的化合物。
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