CN105408354B - H-nox蛋白的多聚形式 - Google Patents

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Abstract

本发明提供与单体H‑NOX蛋白相比以较长循环半衰期输送氧的多聚H‑NOX蛋白。多聚H‑NOX蛋白渗出到肿瘤组织中和优先在肿瘤组织中积累，以持续输送氧。本发明还提供H‑NOX蛋白作为放射增敏剂用于脑癌治疗的应用。

Description

H-NOX蛋白的多聚形式
关于联邦赞助研究或研发的声明
本发明得到批准号2R44CA138006-02的赞助。美国政府享有本申请的任何专利发行的权利。
技术领域
本申请涉及多聚H-NOX蛋白和用其输送氧的方法。多聚H-NOX蛋白提供向人和以兽医为目的向动物输送O2的新治疗手段。
发明背景
H-NOX蛋白(命名血红素-一氧化氮和氧结合域)是高度保守的、被充分表征的血红素蛋白家族的成员(Iyer,LM et al.(2003)BMC Genomics 4(1):5；Karow,DS et al.(2004)Biochemistry 43(31):10203-10211；Boon,EM et al.(2005)Nature Chem.Biol.1:53-59；Boon,EM et al.(2005)Curr.Opin.Chem.Biol.9(5):441-446；Boon,EM et al.(2005)J.Inorg.Biochem.99(4):892-902；Cary,SP et al.(2005)Proc Natl Acad SciUSA 102(37):13064-9；Karow DS et al.(2005)Biochemistry 44(49):16266-74；Cary,SPet al.(2006)Trends Biochem Sci 31(4):231-9；Boon,EM et al.(2006)J Biol Chem281(31):21892-902；Winger,JA et al.(2007)J Biol Chem.282(2):897-907)。H-NOX蛋白是一氧化氮中性的，不同于之前的基于血红蛋白的氧载体，H-NOX不清除循环的一氧化氮，因此不与高血压或肾副作用有关。固有的低NO反应性(和高NO稳定性)致使野生型和突变H-NOX蛋白成为期望的血液替代品，因为H-NOX蛋白因内源NO而失活的可能性较低并且内源NO被H-NOX蛋白清除的可能性较低。重要地，一些H-NOX蛋白中远侧口袋(distal pocket)酪氨酸的存在(Pellicena,P.et al.(2004)Proc Natl.Acad Sci USA101(35):12854-12859)暗示了不期望的高NO反应性，不适用作血液替代品。例如，照此类推，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)血红蛋白——具有在结构上相似的远侧口袋酪氨酸——与NO极快地反应，并且被分枝杆菌用来有效地清除和避免被感染宿主产生的防御性NO(Ouellet,H.et al.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U S A 99(9):5902-5907)。然而，惊讶地发现，H-NOX蛋白实际上具有的NO反应性远低于血红蛋白，这使其可能用作血液替代品。
发现通过引入单个氨基酸突变可使结合NO而不结合O2的H-NOX蛋白转化成结合NO和O2的H-NOX蛋白(参见WO 2007/139791和WO 2007/139767)。因此，可通过如下改变H-NOX蛋白对O2和NO的亲和力和H-NOX蛋白在O2和NO配体之间进行分辨的能力：引入一个或多个氨基酸突变，使得H-NOX蛋白经修饰以期望的亲和力结合O2或NO。可引入另外的突变来进一步改变O2和/或NO亲和力。H-NOX蛋白家族可因此被调控以呈现关于O2输送的提高的或最佳的动力学和热力学性质。例如，已生成O2结合的解离常数和/或解离率(off rate)改变的突变H-NOX蛋白，提高了H-NOX蛋白对于各种临床和工业应用的效用。调整H-NOX蛋白以结合和输送O2的能力是解决和克服当前O2载体的核心缺点的治疗手段。
H-NOX蛋白的尺寸相对较小，并且可滤过肾脏，导致循环半衰期短。某些治疗用途需要具有较长循环半衰期的可足够长时间地结合并输送O2和/或NO至远侧组织的H-NOX。本文提供了具有较长循环半衰期的多聚H-NOX蛋白。另外，H-NOX蛋白渗出到肿瘤中，在此其以不同的速率积累。多聚H-NOX蛋白被调整以运输氧穿过肿瘤的常氧区域并在肿瘤内的低氧区域深处释放氧。这种特征组合代表氧载体作为肿瘤低氧生态位的修饰剂，增加放射治疗、化学治疗和依靠肿瘤细胞氧合的其他抗癌治疗的效力的应用中的重大进步。
在此引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物，其全部内容被引入本文作为参考。
发明概述
在一些方面，本发明提供多聚H-NOX蛋白，其包括两个或更多个H-NOX结构域。在一些实施方式中，两个或更多个H-NOX结构域是同源H-NOX结构域。在其他实施方式中，H-NOX结构域是异源H-NOX结构域。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白是二聚体、三聚体、四聚体或五聚体。在一些实施方式中，H-NOX结构域共价连接。
在本发明的一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白包括单体，其中单体包括H-NOX结构域和聚合结构域。在一些实施方式中，H-NOX结构域共价连接至聚合结构域。在一些实施方式中，H-NOX结构域的C端共价连接至聚合结构域。在其他实施方式中，H-NOX结构域的N端共价连接至聚合结构域。在一些实施方式中，单体结合形成多聚H-NOX蛋白。
在本发明的一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白是三聚H-NOX蛋白。在一些实施方式中，三聚H-NOX蛋白包括一个或多个三聚结构域。在一些实施方式中，三聚H-NOX蛋白包括三个单体，其中单体包括H-NOX结构域和三聚结构域。在一些实施方式中，三聚结构域是噬菌体T4三聚结构域。在一些实施方式中，三聚结构域是折叠子(foldon)结构域。在一些实施方式中，折叠子结构域包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些实施方式中，H-NOX结构域共价连接至三聚结构域。在一些实施方式中，H-NOX结构域的C端共价连接至三聚结构域的N端。在其他实施方式中，H-NOX结构域的N端共价连接至三聚结构域的N端。
在上述任一种实施方式的一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白不包括鸟苷酰环化酶结构域。
在上述实施方式的一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白包括至少一个标签。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白包括至少一个His6标签。
在上述任一种实施方式的一些实施方式中，氨基酸连接物位于H-NOX结构域和/或聚合结构域和/或标签之间。在一些实施方式中，氨基酸连接物是Gly-Ser-Gly序列或Arg-Gly-Ser序列。
在上述任一种实施方式的一些实施方式中，H-NOX结构域中至少一个是腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)H-NOX结构域、嗜肺军团菌(L.pneumophilia)2H-NOX结构域、人类(Homo sapiens)β1H-NOX结构域、狼(Canis lupus)H-NOX结构域、褐鼠(Rattus norvegicus)β1H-NOX结构域、黑腹果蝇(Drosophilamelangaster)β1H-NOX结构域、黑腹果蝇(D.melangaster)CG14885-PA H-NOX结构域、秀丽隐杆线虫(Caenorhabdis elegans)GCY-35H-NOX结构域、点形念珠藻(Nostocpunctiforme)H-NOX结构域、新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)H-NOX结构域、奥奈达希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)H-NOX结构域或丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)H-NOX结构域。在一些实施方式中，H-NOX结构域相应于SEQ ID NO:2所示的腾冲嗜热厌氧菌(T.tengcongensis)H-NOX结构域。
在上述任一种实施方式的一些实施方式中，H-NOX结构域中至少一个包括一个或多个远侧口袋突变。在一些实施方式中，远侧口袋突变是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的L144的相应位点处的氨基酸置换。在一些实施方式中，H-NOX结构域中至少一个是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域，并且腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域中至少一个包括第144位的氨基酸置换。在一些实施方式中，第144位的氨基酸置换是L144F置换。在一些实施方式中，H-NOX结构域中至少两个是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域，并且腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域中至少两个包括第144位的氨基酸置换。在一些实施方式中，腾冲嗜热厌氧菌中至少一个的第144位氨基酸置换是L144F置换。在一些实施方式中，H-NOX结构域中至少一个包括至少两个远侧口袋突变。在一些实施方式中，至少两个远侧口袋突变是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的W9和L144的相应位点的氨基酸置换。在一些实施方式中，H-NOX结构域中至少一个是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域，并且腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域中至少一个包括第9和144位的氨基酸置换。在一些实施方式中，第9位的氨基酸置换是W9F置换，并且第144位的氨基酸置换是L144F置换。
在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白包括腾冲嗜热厌氧菌的三个野生型H-NOX结构域，每个H-NOX结构域其C端通过Gly-Ser-Gly氨基酸连接物共价连接至T4噬菌体折叠子结构域的N端。在一些实施方式中，His6标签通过Arg-Gly-Ser氨基酸连接物连接至折叠子结构域的C端。
在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白包括腾冲嗜热厌氧菌的三个L144F H-NOX结构域，每个H-NOX结构域其C端通过Gly-Ser-Gly氨基酸连接物共价连接至T4噬菌体折叠子结构域的N端。在一些实施方式中，His6标签通过Arg-Gly-Ser氨基酸连接物连接至折叠子结构域的C端。
在上述任一种实施方式的一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白的O2解离常数在血红蛋白的O2解离常数的2个数量级之内，并且其中H-NOX蛋白的NO反应性低于血红蛋白的NO反应性至少10倍。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃下在约1nM和约1000nM之间。在其他实施方式中，多聚H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃下在约1μM和约10μM之间。在再其他实施方式中，该H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃下在约10μM和约50μM之间。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白的NO反应性在20℃下小于约700s-1。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白的NO反应性低于血红蛋白的NO反应性至少100倍。在进一步实施方式，多聚H-NOX蛋白的NO反应性低于血红蛋白的NO反应性至少1,000倍。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白的氧气koff在20℃下小于或等于约0.65s-1。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白的氧气koff在20℃下在约0.21s-1和约0.65s-1之间。在一些实施方式中，该H-NOX蛋白的氧的koff在20℃下在约1.35s-1和约2.9s-1之间。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在37℃下小于约1h-1。
在上述实施方式的一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白大于50kDal、大于100kDal或大于150kDal。在一些实施方式中，与相应的包括单个H-NOX结构域的单体H-NOX蛋白相比，多聚H-NOX蛋白在给予动物H-NOX蛋白后优先在哺乳动物的一个或多个组织中积累。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白在给予哺乳动物H-NOX蛋白后存留在哺乳动物内1、2、3、4、6、12或24小时。在一些实施方式中，小于10％的多聚H-NOX在给予哺乳动物H-NOX蛋白后小于约1小时、2小时或3小时内通过肾脏被排出哺乳动物。
在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白包括SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
在一些方面，本发明提供重组H-NOX蛋白，其包括H-NOX结构域和聚合结构域。在一些实施方式中，H-NOX结构域共价连接至聚合结构域。在一些实施方式中，H-NOX结构域的C端连接至聚合结构域。在其他实施方式中，H-NOX结构域的N端连接至聚合结构域。在一些实施方式中，H-NOX结构域连接至聚合结构域的N端。在其他一些实施方式中，H-NOX结构域连接至聚合结构域的C端。在一些实施方式中，聚合结构域是三聚结构域。在进一步的实施方式中，三聚结构域是噬菌体T4三聚结构域。在再进一步的实施方式中，三聚结构域是折叠子结构域。在一些实施方式中，折叠子结构域包括SEQ ID NO:4。
在上述实施方式的一些实施方式中，重组H-NOX蛋白不包括鸟苷酰环化酶结构域。
在上述实施方式的一些实施方式中，重组H-NOX蛋白包括标签。在一些实施方式中，重组H-NOX蛋白包括His6标签。
在上述方面的一些实施方式中，氨基酸连接物位于H-NOX结构域和/或聚合结构域和/或标签之间。在一些实施方式中，氨基酸连接物是Gly-Ser-Gly序列或Arg-Gly-Ser序列。
在上述实施方式的一些实施方式中，H-NOX结构域是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域、嗜肺军团菌2H-NOX结构域、人类β1H-NOX结构域、狼H-NOX结构域、褐鼠β1H-NOX结构域、黑腹果蝇β1H-NOX结构域、黑腹果蝇CG14885-PA H-NOX结构域、秀丽隐杆线虫GCY-35H-NOX结构域、点形念珠藻H-NOX结构域、新月柄杆菌H-NOX结构域、奥奈达希瓦氏菌H-NOX结构域或丙酮丁醇梭菌H-NOX结构域。在一些实施方式中，H-NOX结构域相应于SEQ ID NO:2所示的腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域。
在上述实施方式的一些实施方式中，H-NOX结构域包括一个或多个远侧口袋突变。在一些实施方式中，远侧口袋突变是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的L144的相应位点的氨基酸置换。在一些实施方式中，H-NOX结构域中至少一个是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域，并且腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域中至少一个包括第144位的氨基酸置换。在一些实施方式中，第144位的氨基酸置换是L144F置换。在一些实施方式中，H-NOX结构域中至少一个包括至少两个远侧口袋突变。在一些实施方式中，至少两个远侧口袋突变是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的W9和L144的相应位点的氨基酸置换。在一些实施方式中，H-NOX结构域中至少一个是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域，并且腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域中至少一个包括第9和144位的氨基酸置换。在一些实施方式中，第9位的氨基酸置换是W9F置换，并且第144位的氨基酸置换是L144F置换。
在一些实施方式中，重组H-NOX蛋白包括腾冲嗜热厌氧菌的野生型H-NOX结构域，其C端通过Gly-Ser-Gly氨基酸连接物共价连接至T4噬菌体折叠子结构域的N端。在一些实施方式中，His6标签通过Arg-Gly-Ser氨基酸连接物连接至折叠子结构域的C端。
在一些实施方式中，重组H-NOX蛋白包括腾冲嗜热厌氧菌的L144F H-NOX结构域，其C端通过Gly-Ser-Gly氨基酸连接物共价连接至T4噬菌体折叠子结构域的N端。在一些实施方式中，His6标签通过Arg-Gly-Ser氨基酸连接物连接至折叠子结构域的C端。
在上述实施方式的一些实施方式中，其中重组H-NOX蛋白的O2解离常数在血红蛋白的O2解离常数的2个数量级之内，并且其中H-NOX蛋白的NO反应性低于血红蛋白的NO反应性至少10倍。在一些实施方式中，其中重组H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃下在约1nM和约1000nM之间。在其他实施方式中，其中重组H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃下在约1μM和约10μM之间。在再其他实施方式中，该H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃下在约10μM和约50μM之间。在一些实施方式中，重组H-NOX蛋白的NO反应性在20℃下小于约700s-1。在一些实施方式中，重组H-NOX蛋白的NO反应性低于血红蛋白的NO反应性至少100倍。在进一步的实施方式中，重组H-NOX蛋白的NO反应性低于血红蛋白的NO反应性至少1,000倍。在一些实施方式中，重组H-NOX蛋白的氧气koff在20℃下小于或等于约0.65s-1。在一些实施方式中，重组H-NOX蛋白的氧的koff在20℃下在约0.21s-1和约0.65s-1之间。在一些实施方式中，该H-NOX蛋白的氧气koff在20℃下在约1.35s-1和约2.9s-1之间。在一些实施方式中，重组H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在37℃下小于约1h-1。
在上述方面的一些实施方式中，重组H-NOX蛋白包括SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
在一些方面，本发明提供药物组合物，其包括多聚H-NOX蛋白，该多聚H-NOX蛋白包括两个或更多个H-NOX结构域。在一些实施方式中，药物组合物包括上述任一实施方式的多聚H-NOX蛋白。在一些实施方式中，药物组合物进一步包括药学上可接受的赋形剂。在一些实施方式中，药物组合物是无菌的。在一些实施方式中，药物组合物基本上不含内毒素。在一些实施方式中，重组H-NOX蛋白包括SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，药物组合物包括多聚H-NOX蛋白，该多聚H-NOX蛋白包括腾冲嗜热厌氧菌的三个野生型H-NOX结构域，每个H-NOX结构域其C端通过Gly-Ser-Gly氨基酸连接物共价连接至T4噬菌体折叠子结构域的N端。在一些实施方式中，His6标签通过Arg-Gly-Ser氨基酸连接物连接至折叠子结构域的C端。
在一些实施方式中，药物组合物包括多聚H-NOX蛋白，该多聚H-NOX蛋白包括腾冲嗜热厌氧菌的三个L144F H-NOX结构域，每个H-NOX结构域其C端通过Gly-Ser-Gly氨基酸连接物共价连接至T4噬菌体折叠子结构域的N端。在一些实施方式中，His6标签通过Arg-Gly-Ser氨基酸连接物连接至折叠子结构域的C端。
在一些方面，本发明提供药物组合物，其包括重组H-NOX蛋白，该重组H-NOX蛋白包括H-NOX结构域和聚合结构域。在一些实施方式中，药物组合物包括重组H-NOX蛋白，该重组H-NOX蛋白包括上述任一实施方式的H-NOX结构域和聚合结构域。在一些实施方式中，药物组合物进一步包括药学上可接受的赋形剂。在一些实施方式中，药物组合物是无菌的。在一些实施方式中，药物组合物基本上不含内毒素。在一些实施方式中，重组H-NOX蛋白包括SEQID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
在一些方面，本发明提供输送O2至患脑癌个体的脑肿瘤的方法，包括给予个体有效量的H-NOX蛋白。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的给予与放射治疗或化学治疗联合应用。
在一些方面，本发明提供治疗患脑癌个体的脑癌的方法，包括给予个体有效量的H-NOX蛋白，和给予个体有效量的辐射。
在一些方面，本发明提供减少患脑癌个体的脑肿瘤生长的方法，包括给予个体有效量的H-NOX蛋白，和给予个体有效量的辐射。
在上述方面的一些实施方式中，在给予H-NOX后1、2、3、4、5或6小时给予个体辐射或化学治疗。在一些实施方式中，辐射是X辐射。在一些实施方式中，给予约0.5戈瑞至约75戈瑞的X辐射。在一些实施方式中，重复H-NOX蛋白给予和/或辐射给予。在一些实施方式中，重复给予两次、三次或四次。在一些实施方式中，在一周、两周、三周或四周后重复给予。
在上述方面的一些实施方式中，脑癌是成胶质细胞瘤。在一些实施方式中，个体是哺乳动物。在一些实施方式中，哺乳动物是人。在其他实施方式中，哺乳动物是宠物、实验室研究动物或家畜。在进一步的实施方式中，宠物、研究动物或家畜是狗、猫、马、猴、兔、大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠、猪或牛。
在上述方面的一些实施方式中，H-NOX蛋白和辐射的给予与另一治疗联合应用。
在上述方面的一些实施方式中，H-NOX蛋白是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX、嗜肺军团菌2H-NOX、人类β1、褐鼠β1、黑腹果蝇β1、黑腹果蝇CG14885-PA、秀丽隐杆线虫GCY-35、点形念珠藻H-NOX、新月柄杆菌H-NOX、奥奈达希瓦氏菌H-NOX或丙酮丁醇梭菌H-NOX。在一些方面，H-NOX蛋白包括相应于SEQ ID NO:2所示的腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域的H-NOX结构域。在一些实施方式中，H-NOX包括一个或多个远侧口袋突变。在一些实施方式中，远侧口袋突变是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的L144的相应位点的氨基酸置换。在一些实施方式中，H-NOX是包括第144位的氨基酸置换的腾冲嗜热厌氧菌H-NOX。在一些实施方式中，第144位的氨基酸置换是L144F置换。在一些实施方式中，H-NOX包括至少两个远侧口袋突变。在一些实施方式中，至少两个远侧口袋突变是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的W9和L144的相应位点的氨基酸置换。在一些实施方式中，H-NOX是包括第9和144位的氨基酸置换的腾冲嗜热厌氧菌H-NOX。在一些实施方式中，第9位的氨基酸置换是W9F置换，并且第144位的氨基酸置换是L144F置换。
在上述方面的一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白不包括鸟苷酰环化酶结构域。
在上述方面的一些实施方式中，H-NOX蛋白包括标签。在一些方面，标签是His6标签。
在上述方面的一些实施方式中，H-NOX蛋白的O2解离常数在血红蛋白的2个数量级之内，并且其中H-NOX蛋白的NO反应性低于血红蛋白的NO反应性至少10倍。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃下在约1nM和约1000nM之间。在其他实施方式中，H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃下在约1μM和约10μM之间。在再其他实施方式中，H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃下在约10μM和约50μM之间。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的NO反应性在20℃下小于约700s-1。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的NO反应性低于血红蛋白的NO反应性至少100倍。在进一步的实施方式中，H-NOX蛋白的NO反应性低于血红蛋白的NO反应性至少1,000倍。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的氧气koff在20℃下小于或等于约0.65s-1。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的氧气koff在20℃下在约0.21s-1和约0.65s-1之间。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的氧气koff在20℃下在约1.35s-1和约2.9s-1之间。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在37℃下小于约1h-1。
在一些方面，本发明提供向有需要的个体输送氧的方法，所述方法包括给予个体有效量的多聚H-NOX蛋白。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的给予与放射治疗或化学治疗联合应用。
在一些方面，本发明提供治疗有需要的个体的癌症的方法，包括给予个体有效量的多聚H-NOX蛋白，和给予个体有效量的辐射。
在一些方面，本发明提供减少有需要的个体中的肿瘤生长的方法，包括给予个体有效量的H-NOX蛋白，和给予个体有效量的辐射。
在上述方面的一些实施方式中，在给予H-NOX后1、2、3、4、5或6小时给予个体辐射或化学治疗。在一些实施方式中，辐射是X辐射。在一些实施方式中，给予约0.5戈瑞至约75戈瑞的X辐射。在一些实施方式中，重复H-NOX蛋白给予和/或辐射给予。在一些实施方式中，重复给予两次、三次或四次。在一些实施方式中，在一周、两周、三周或四周后重复给予。
在上述实施方式的一些实施方式中，癌症是脑癌、肺癌、结直肠癌或皮肤癌。在一些实施方式中，个体是哺乳动物。在进一步的实施方式中，哺乳动物是人。在其他进一步实施方式中，哺乳动物是宠物、实验室研究动物或家畜。在再进一步的实施方式中，宠物、研究动物或家畜是狗、猫、马、猴、兔、大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠、猪或牛。
在上述方面的一些实施方式中，H-NOX蛋白和辐射的给予与另一治疗联合应用。
在上述方面的一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白包括两个或更多个H-NOX结构域。在一些实施方式中，两个或更多个H-NOX结构域是同源H-NOX结构域。在其他实施方式中，H-NOX结构域是异源H-NOX结构域。
在上述方面的一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白是二聚体、三聚体、四聚体或五聚体。在一些实施方式中，H-NOX结构域共价连接。
在上述方面的一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白包括单体，其中单体包括H-NOX结构域和聚合结构域。在一些实施方式中，H-NOX结构域共价连接至聚合结构域。在一些实施方式中，H-NOX结构域的C端共价连接至聚合结构域。在其他实施方式中，H-NOX结构域的N端共价连接至聚合结构域。在一些实施方式中，单体结合以形成多聚H-NOX蛋白。
在上述方面的一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白是三聚H-NOX蛋白。在一些实施方式中，三聚H-NOX蛋白包括一个或多个三聚结构域。在一些实施方式中，三聚H-NOX蛋白包括三个单体，其中单体包括H-NOX结构域和三聚结构域。在一些实施方式中，三聚结构域是噬菌体T4三聚结构域。在一些实施方式中，三聚结构域是折叠子结构域。在一些实施方式中，折叠子结构域包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些实施方式中，H-NOX结构域共价连接至三聚结构域。在其他实施方式中，H-NOX结构域的C端共价连接至三聚结构域的N端。在一些实施方式中，H-NOX结构域的N端共价连接至三聚结构域的N端。
在上述方面的一些实施方式中，标签共价连接至三聚结构域的C端。在一些实施方式中，His6标签共价连接至三聚结构域的C端。
在上述方面的一些实施方式中，氨基酸连接物位于H-NOX结构域和/或聚合结构域和/或标签之间。在一些实施方式中，氨基酸连接物是Gly-Ser-Gly序列或Arg-Gly-Ser序列。
在上述方面的一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白不包括鸟苷酰环化酶结构域。
在上述方面的一些实施方式中，H-NOX结构域中至少一个是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域、嗜肺军团菌2H-NOX结构域、人类β1H-NOX结构域、狼H-NOX结构域、褐鼠β1H-NOX结构域、黑腹果蝇β1H-NOX结构域、黑腹果蝇CG14885-PA H-NOX结构域、秀丽隐杆线虫GCY-35H-NOX结构域、点形念珠藻H-NOX结构域、新月柄杆菌H-NOX结构域、奥奈达希瓦氏菌H-NOX结构域或丙酮丁醇梭菌H-NOX结构域。在一些实施方式中，H-NOX结构域相应于SEQ ID NO:2所示的腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域。在上述方面的一些实施方式中，H-NOX蛋白是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX、嗜肺军团菌2H-NOX、人类β1、褐鼠β1、黑腹果蝇β1、黑腹果蝇CG14885-PA、秀丽隐杆线虫GCY-35、点形念珠藻H-NOX、新月柄杆菌H-NOX、奥奈达希瓦氏菌H-NOX或丙酮丁醇梭菌H-NOX。在一些实施方式中，H-NOX蛋白包括相应于SEQ ID NO:2所示的腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域的H-NOX结构域。在一些实施方式中，H-NOX包括一个或多个远侧口袋突变。在一些实施方式中，远侧口袋突变是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的L144的相应位点的氨基酸置换。在一些实施方式中，H-NOX是包括第144位的氨基酸置换的腾冲嗜热厌氧菌H-NOX。在一些实施方式中，第144位的氨基酸置换是L144F置换。在一些实施方式中，H-NOX包括至少两个远侧口袋突变。在一些实施方式中，至少两个远侧口袋突变是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的W9和L144的相应位点的氨基酸置换。在一些实施方式中，H-NOX是包括第9和144位的氨基酸置换的腾冲嗜热厌氧菌H-NOX。在一些实施方式中，第9位的氨基酸置换是W9F置换，并且第144位的氨基酸置换是L144F置换。
在一些实施方式中，方法的多聚H-NOX蛋白包括腾冲嗜热厌氧菌的三个野生型H-NOX结构域，每个H-NOX结构域其C端通过Gly-Ser-Gly氨基酸连接物共价连接至T4噬菌体折叠子结构域的N端。在一些实施方式中，His6标签通过Arg-Gly-Ser氨基酸连接物连接至折叠子结构域的C端。
在一些实施方式中，方法的多聚H-NOX蛋白包括腾冲嗜热厌氧菌的三个L144F H-NOX结构域，每个H-NOX结构域其C端通过Gly-Ser-Gly氨基酸连接物共价连接至T4噬菌体折叠子结构域的N端。在一些实施方式中，His6标签通过Arg-Gly-Ser氨基酸连接物连接至折叠子结构域的C端。
在上述方面的一些实施方式中，H-NOX蛋白的O2解离常数在血红蛋白的O2解离常数的2个数量级之内，并且其中H-NOX蛋白的NO反应性低于血红蛋白的NO反应性至少10倍。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃下在约1nM和约1000nM之间。在其他实施方式中，H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃下在约1μM和约10μM之间。在再其他实施方式中，H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃下在约10μM和约50μM之间。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的NO反应性在20℃下小于约700s-1。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的NO反应性低于血红蛋白的NO反应性至少100倍。在进一步的实施方式中，H-NOX蛋白的NO反应性低于血红蛋白的NO反应性至少1,000倍。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的氧气koff在20℃下小于或等于约0.65s-1。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的氧气koff在20℃下在约0.21s-1和约0.65s-1之间。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的氧气koff在20℃下在约1.35s-1和约2.9s-1之间。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在37℃下小于约1h-1。
在上述方面的一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白大于50kDal、大于100kDal或大于150kDal。在一些实施方式中，与相应的包括单个H-NOX结构域的单体H-NOX蛋白相比，多聚H-NOX蛋白在给予H-NOX蛋白至动物后在哺乳动物的一个或多个组织中优先积累。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白在给予H-NOX蛋白至哺乳动物后在哺乳动物内存留1、2、3、4、6、12或24小时。在一些实施方式中，小于10％的多聚H-NOX在给予H-NOX蛋白至哺乳动物后小于约1小时、2小时或3小时之内通过肾脏被排出哺乳动物。
在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白包括SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
在一些方面，本发明提供编码本文描述的任何实施方式的多聚H-NOX蛋白的重组核酸。在一些实施方式中，核酸在载体中。本发明还提供包括编码本文描述的多聚H-NOX蛋白或单体H-NOX亚单位的核酸或载体的细胞。在一些实施方式中，核酸包括SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27所示的核酸序列。
在一些方面，本发明提供生产多聚H-NOX蛋白的方法，包括在适于生产多聚H-NOX蛋白的条件下培养包括编码多聚型H-NOX蛋白或单体H-NOX亚单位的核酸的细胞。在进一步的实施方式中，方法包括纯化H-NOX蛋白的步骤。
在一些方面，本发明提供试剂盒，其包括多聚H-NOX蛋白，该多聚H-NOX蛋白包括两个或更多个H-NOX结构域。在一些实施方式中，试剂盒进一步包括多聚H-NOX蛋白的使用说明。在一些实施方式中，两个或更多个H-NOX结构域是同源H-NOX结构域。在其他实施方式中，H-NOX结构域是异源H-NOX结构域。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白是二聚体、三聚体、四聚体或五聚体。在一些实施方式中，H-NOX结构域共价连接。
在本发明的一些实施方式中，试剂盒的多聚H-NOX蛋白包括单体，其中单体包括H-NOX结构域和聚合结构域。在一些实施方式中，H-NOX结构域共价连接至聚合结构域。在一些实施方式中，H-NOX结构域的C端共价连接至聚合结构域。在其他实施方式中，H-NOX结构域的N端共价连接至聚合结构域。在一些实施方式中，单体结合以形成多聚H-NOX蛋白。
在本发明的一些实施方式中，试剂盒的多聚H-NOX蛋白是三聚H-NOX蛋白。在一些实施方式中，三聚H-NOX蛋白包括一个或多个三聚结构域。在一些实施方式中，三聚H-NOX蛋白包括三个单体，其中单体包括H-NOX结构域和三聚结构域。在一些实施方式中，三聚结构域是噬菌体T4三聚结构域。在一些实施方式中，三聚结构域是折叠子结构域。在一些实施方式中，折叠子结构域包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些实施方式中，H-NOX结构域共价连接至三聚结构域。在一些实施方式中，H-NOX结构域的C端共价连接至三聚结构域的N端。在其他实施方式中，H-NOX结构域的N端共价连接至三聚结构域的N端。
在上述任一种实施方式的一些实施方式中，试剂盒的多聚H-NOX蛋白不包括鸟苷酰环化酶结构域。
在上述实施方式的一些实施方式中，试剂盒的多聚H-NOX蛋白包括至少一个标签。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白包括至少一个His6标签。
在上述任一种实施方式的一些实施方式中，氨基酸连接物位于H-NOX结构域和/或聚合结构域和/或标签之间。在一些实施方式中，氨基酸连接物是Gly-Ser-Gly序列或Arg-Gly-Ser序列。
在上述任一种实施方式的一些实施方式中，试剂盒的H-NOX结构域中至少一个是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域、嗜肺军团菌2H-NOX结构域、人类β1H-NOX结构域、狼H-NOX结构域、褐鼠β1H-NOX结构域、黑腹果蝇β1H-NOX结构域、黑腹果蝇CG14885-PA H-NOX结构域、秀丽隐杆线虫GCY-35H-NOX结构域、点形念珠藻H-NOX结构域、新月柄杆菌H-NOX结构域、奥奈达希瓦氏菌H-NOX结构域或丙酮丁醇梭菌H-NOX结构域。在一些实施方式中，H-NOX结构域相应于SEQ ID NO:2所示的腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域。
在上述任一种实施方式的一些实施方式中，试剂盒的H-NOX结构域中至少一个包括一个或多个远侧口袋突变。在一些实施方式中，远侧口袋突变是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的L144的相应位点的氨基酸置换。在一些实施方式中，H-NOX结构域中至少一个是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域，并且腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域中至少一个包括第144位的氨基酸置换。在一些实施方式中，第144位的氨基酸置换是L144F置换。在一些实施方式中，H-NOX结构域中至少两个是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域，并且腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域中至少两个包括第144位的氨基酸置换。在一些实施方式中，腾冲嗜热厌氧菌中至少一个的第144位氨基酸置换是L144F置换。在一些实施方式中，H-NOX结构域中至少一个包括至少两个远侧口袋突变。在一些实施方式中，至少两个远侧口袋突变是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的W9和L144的相应位点的氨基酸置换。在一些实施方式中，H-NOX结构域中至少一个是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域，并且腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域中至少一个包括第9和144位的氨基酸置换。在一些实施方式中，第9位的氨基酸置换是W9F置换，并且第144位的氨基酸置换是L144F置换。
在一些实施方式中，试剂盒的多聚H-NOX蛋白包括腾冲嗜热厌氧菌的三个野生型H-NOX结构域，每个H-NOX结构域其C端通过Gly-Ser-Gly氨基酸连接物共价连接至T4噬菌体折叠子结构域的N端。在一些实施方式中，His6标签通过Arg-Gly-Ser氨基酸连接物连接至折叠子结构域的C端。
在一些实施方式中，试剂盒的多聚H-NOX蛋白包括腾冲嗜热厌氧菌的三个L144FH-NOX结构域，每个H-NOX结构域其C端通过Gly-Ser-Gly氨基酸连接物共价连接至T4噬菌体折叠子结构域的N端。在一些实施方式中，His6标签通过Arg-Gly-Ser氨基酸连接物连接至折叠子结构域的C端。
在上述任一种实施方式的一些实施方式中，试剂盒的多聚H-NOX蛋白的O2解离常数在血红蛋白的O2解离常数的2个数量级之内，并且其中H-NOX蛋白的NO反应性低于血红蛋白的NO反应性至少10倍。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃下在约1nM和约1000nM之间。在其他实施方式中，多聚H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃下在约1μM和约10μM之间。在再其他实施方式中，H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃下在约10μM和约50μM之间。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白的NO反应性在20℃下小于约700s-1。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白的NO反应性低于血红蛋白的NO反应性至少100倍。在进一步的实施方式中，多聚H-NOX蛋白的NO反应性低于血红蛋白的NO反应性至少1,000倍。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白的氧的koff在20℃下小于或等于约0.65s-1。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白的氧气koff在20℃下在约0.21s-1和约0.65s-1之间。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的氧气koff在20℃下在约1.35s-1和约2.9s-1之间。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在37℃下小于约1h-1。
在上述实施方式的一些实施方式中，试剂盒的多聚H-NOX蛋白大于50kDal、大于100kDal或大于150kDal。在一些实施方式中，与相应的包括单个H-NOX结构域的单体H-NOX蛋白相比，多聚H-NOX蛋白在给予H-NOX蛋白至动物后在哺乳动物的一个或多个组织中优先积累。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白在给予H-NOX蛋白至哺乳动物后在哺乳动物内存留1、2、3、4、6、12或24小时。在一些实施方式中，小于10％的多聚H-NOX在给予H-NOX蛋白至哺乳动物后小于约1小时、2小时或3小时之内通过肾脏被排出哺乳动物。
在一些实施方式中，试剂盒包括本文描述的任一种多聚H-NOX蛋白。在一些实施方式中，试剂盒包括本文描述的任一种单体H-NOX亚单位。在一些实施方式中，试剂盒的多聚H-NOX蛋白包括SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
在一些方面，本发明提供制品，其包括本文描述的多聚H-NOX蛋白。在一些实施方式中，制品包括H-NOX蛋白和袋。在一些实施方式中，袋是IV袋。在一些实施方式中，制品的H-NOX蛋白用于输送O2至有需要的个体。在一些实施方式中，个体患有脑肿瘤。在一些实施方式中，脑肿瘤是成胶质细胞瘤。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白与放射治疗联合应用。
在一些方面，本发明提供本文描述的多聚H-NOX蛋白的单位剂量。在一些实施方式中，单位剂量的H-NOX蛋白用于输送O2至有需要的个体。在一些实施方式中，个体患有脑肿瘤。在一些实施方式中，脑肿瘤是成胶质细胞瘤。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白与放射治疗联合应用。
附图简述
图1显示噬菌体T4fibritin的折叠子结构域的核酸(SEQ ID NO:3)和氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。
图2A显示融合于腾冲嗜热厌氧菌L144F H-NOX序列的C端并且包括His6标签的噬菌体T4fibritin的折叠子结构域的核酸(SEQ ID NO:5)和氨基酸序列(SEQ ID NO:6)。图2B显示无His6标签的L144F H-NOX-折叠子单体的核酸(SEQ ID NO:7)和氨基酸序列(SEQ IDNO:8)。
图3A显示野生型腾冲嗜热厌氧菌H-NOX-折叠子-His6嵌合蛋白(上；SEQ ID NO:9)的DNA序列和编码H-NOX的L144F变体、具有融合折叠子和His6序列的克隆3I-A(下；SEQ IDNO:5)的测序数据的比对。L144F置换以及用于融合的Xho I和Hind III限制性位点被高亮显示。图3B显示野生型腾冲嗜热厌氧菌H-NOX-折叠子-His6单体(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列。图3C显示无His6标签的野生型H-NOX-折叠子-单体的核酸(SEQ ID NO:11)和氨基酸序列(SEQ IDNO:12)。图3D显示C端融合至噬菌体T4折叠子结构域的狼H-NOX(1-385)的核酸(SEQ ID NO:25)和氨基酸(SEQ ID NO:26)。图3E显示C端融合至噬菌体T4折叠子结构域的狼H-NOX(1-194)的核酸(SEQ ID NO:27)和氨基酸(SEQ ID NO:28)。
图4显示最初纯化H-NOX-折叠子融合蛋白的步骤的SDS-PAGE凝胶。梯度是NovexSharp Protein Standard(Invitrogen，Grand Island，NY)，具有跑完凝胶底部的3.5kDa带。Std泳道是已知量的His6标记的单体H-NOX蛋白(23kDa)。H-NOX-折叠子融合的诱导通过比较泳道4和5(融合单体具有26.7kDa的分子量)可见。泳道11、13、14和15所示的双带源于对于此量的蛋白质而言SDS-PAGE样品缓冲剂中的DTT不足。泳道1：梯度；泳道2：0.5μg标准品；泳道3：1.0μg标准品；泳道4：诱导前；泳道5：收集的上清液；泳道6：收集的团(pellet)；道7：溶解后；泳道8：离心后；泳道9：离心后的团(pellet)；泳道10：NiNTA流通；泳道11：NiNTA池(pool)；泳道12：NiNTA无用池(no-good pool)；泳道13：DEAE前样品；泳道14；DEAE后池；泳道15：最终产物。
图5显示H-NOX-折叠子融合蛋白的表达和纯化步骤的SDS PAGE凝胶。纯化后的H-NOX-折叠子融合蛋白>95％纯。在SDS-PAGE凝胶上的相对流动性与26.7kDa单体一致。泳道1：Precision Plus Protein Dual Color Markers；泳道2：诱导前；泳道3：诱导后；泳道4：溶解后；泳道5：加热后；泳道6：旋转后；泳道7：Ni柱流通；泳道8：Ni柱洗涤；泳道9：Ni柱后；泳道10：DEAE柱前；泳道11：DEAE柱后。
图6是显示来自H-NOX-折叠子融合蛋白分析的去褶积LC-MS数据的图。最终质量与H-NOX-折叠子单体单元的预测分子质量26,677AMU一致。
图7显示H-NOX-折叠子蛋白质的分析尺寸排阻色谱的色谱图。色谱图采用三个波长(254、280和418nm)监测蛋白质和血红素组分。H-NOX-折叠子蛋白质以14.24mL保留体积洗脱，并且估测分子大小为75.6kDa(类似于对H-NOX-折叠子三聚体预测的80.0kDa)。
图8显示H-NOX-折叠子蛋白质的光谱分析。折叠子结构域的融合不干扰H-NOX结构域的三级结构、卟啉IX与适当配位的结合或氧与卟啉的结合。包括Soret峰(415nm)和α/β峰(550-600nm)的特征谱峰全部保持在H-NOX单体和H-NOX-折叠子融合蛋白之间。
图9是核心处具有三聚型折叠子结构域的三聚型H-NOX蛋白的模型。卟啉IX辅因子和结合氧用球体显示。
图10显示在两个不同大鼠内静脉内弹丸注射(100mg/kg)后H-NOX三聚体的血浆特征。
图11显示响应大鼠体内H-NOX三聚体(50mg/kg)用药生成的IgG和IgM抗体。在第1、3、5和22日静脉内给予50mg/kg H-NOX三聚体的大鼠(显示个体大鼠的曲线)的血浆(稀释1：10,000)中的IgG或IgM抗体。血浆样品在ELISA分析上运行三次。平均值，+/-SEM。
图12显示H-NOX单体和H-NOX三聚体分布和保留在负有HCT-116结肠源性肿瘤的小鼠中。A)利用H-NOX蛋白抗体的肿瘤免疫组织化学染色显示H-NOX三聚体在肿瘤中存留60分钟，与之相比，H-NOX单体在60分钟时被部分排出。B)HCT-116肿瘤切片中的H-NOX蛋白染色强度定量。N＝6，所有小组。平均值+/-SEM。C)H-NOX在RIF1同系肉瘤肿瘤中的生物分布。
图13显示H-NOX单体和H-NOX三聚体减少负有HCT-116结肠源性肿瘤的小鼠的肿瘤缺氧。A)从利用介质、H-NOX单体或H-NOX三聚体治疗的小鼠分离的125mm3肿瘤的代表性肿瘤切片。B)肿瘤切片的抗哌莫硝唑(anti-pimonidazole)抗体(低氧探针(Hypoxyprobe)-1)强度的定量。N＝6，所有小组。平均值+/-SEM。*表示缺氧遍及肿瘤，**表示肿瘤无缺氧。
图14显示负有HCT-116结肠源性肿瘤的小鼠中通过H-NOX单体的肿瘤渗透和氧合。A)用抗H-NOX蛋白抗体染色的肿瘤切片。B)用低氧探针-1染色的肿瘤切片。C)每组六个小鼠的肿瘤中低氧探针-1作为与血管系统的距离的函数的定量。*表示缺氧遍及肿瘤，
Figure GDA0001939256630000171
表示肿瘤不缺氧。
图15显示H-NOX三聚体分布和保留在负有RIF-1同系肉瘤肿瘤的小鼠中。给予A)750mg/kg H-NOX三聚体或C)缓冲剂后120分钟从小鼠分离的400mm3肿瘤代表性切片的免疫荧光图像，和给予B)750mg/kg H-NOX三聚体或D)缓冲剂后120分钟从小鼠分离的800mm3肿瘤代表性切片的免疫荧光图像。H-NOX蛋白染色利用抗H-NOX抗体进行。图E和F显示负有RIF-1同系肉瘤肿瘤的小鼠中通过H-NOX三聚体进行的肿瘤氧合。E)H-NOX或缓冲剂对照给予后2小时肿瘤切片用抗哌莫硝唑抗体染色。显示全肿瘤照片。F)H-NOX或缓冲剂对照给予后2小时肿瘤切片用抗哌莫硝唑抗体(低氧探针-1)和抗CD31抗体(BD Bioscience)染色。显示高放大率照片。G)H-NOX在RIF1同系肉瘤肿瘤中的生物分布。静脉内注射后2小时，H-NOX三聚体从血管系统扩散到肿瘤组织中。肿瘤切片用H-NOX抗体和CD31抗体(血管系统标记物，BD Bioscience)进行免疫组织化学染色。注射缓冲剂的小鼠中未检测到荧光染色。
图16显示负有肉瘤源性肿瘤的小鼠中H-NOX三聚体渗透的肿瘤和减少的肿瘤缺氧。A)蛋白质印迹膜用抗H-NOX抗体探测以检测H-NOX三聚体，用低氧探针-1探测以检测缺氧相关蛋白质，或用抗肌动蛋白抗体探测以评估总蛋白水平。B)肿瘤切片中哌莫硝唑染色强度的定量。C)肿瘤切片中抗HIF-1α染色强度的定量。
图17是免疫组织化学图像图，显示负有U251正位脑肿瘤的小鼠中H-NOX三聚体的肿瘤渗透和减少的脑肿瘤缺氧。A)给予H-NOX三聚体或盐水(对照)后2小时U251肿瘤中利用抗H-NOX抗体的H-NOX三聚体染色。B)给予H-NOX三聚体或盐水(对照)后2小时U251肿瘤中的低氧探针-1染色。显示肿瘤一部分的放大图像。
图18显示负有U251正位脑肿瘤的小鼠中H-NOX三聚体的肿瘤渗透和减少的脑肿瘤缺氧。A)给予H-NOX三聚体(右图)或盐水(缓冲剂，左图)后2小时U251肿瘤中低氧探针-1染色的免疫荧光图像。B)根据免疫荧光图像(H-NOX三聚体-右图或盐水-左图)的低氧探针-1染色定量。C)给予H-NOX三聚体或盐水(缓冲剂)后2小时U251肿瘤中HIF-1α染色的免疫荧光图像。D)根据免疫荧光图像的HIF-1α染色定量。
图19显示H-NOX三聚体在U251正位脑肿瘤和健康脑中的生物分布。A)给予H-NOX三聚体后2小时U251肿瘤中利用抗H-NOX抗体的H-NOX三聚体染色。B)U251肿瘤的核DAPI染色，显示脑中肿瘤定位。C)和D)来自A)的肿瘤的一部分的放大图像显示肿瘤内的H-NOX扩散模式和肿瘤外的血管限制模式。E)健康小鼠脑中利用抗H-NOX抗体的H-NOX三聚体染色和利用抗CD31抗体(BD Bioscience)的血管系统染色。
图20显示小鼠U251正位成胶质细胞瘤肿瘤中H-NOX单体或H-NOX三聚体的实时荧光图像。A)H-NOX单体通过2小时排出。B)H-NOX三聚体在肿瘤中存留，在1-4小时达到峰值。图像通过IVIS获得；箭头表示具体阈值以上的荧光区域；星号表示荧光强度的峰值水平。
图21显示小鼠BT-12正位成胶质细胞瘤肿瘤中H-NOX单体或H-NOX三聚体的离体荧光图像。切除负有BT-12肿瘤的脑：A)在750mg/kg H-NOX单体给予后30分钟，B)在750mg/kgH-NOX单体给予后60分钟，C)在750mg/kg H-NOX三聚体给予后60分钟，或D)在介质给予后60分钟。
图22显示小鼠U251正位成胶质细胞瘤肿瘤中H-NOX单体的实时荧光图像。成像在H-NOX单体给予后A)30分钟，B)60分钟，C)120分钟，和D)240分钟获得。
图23显示小鼠U251正位成胶质细胞瘤肿瘤中H-NOX三聚体的实时荧光图像。成像在H-NOX三聚体给予后A)30分钟，B)60分钟，C)120分钟，和D)240分钟获得。箭头表示荧光区域；星号表示荧光强度峰值水平。
图24显示小鼠U251正位成胶质细胞瘤肿瘤中H-NOX单体的实时荧光图像。H-NOX单体给予后A)30分钟和B)60分钟肾脏中的H-NOX单体积累。
图25显示小鼠GBM-43正位成胶质细胞瘤颅内和脊柱肿瘤中H-NOX三聚体的实时荧光图像。A)在H-NOX三聚体给予前和H-NOX三聚体给予后B)0.5小时、C)1小时、D)2小时、E)4小时和F)6小时H-NOX三聚体在脊柱中的分布。
图26显示小鼠U251正位成胶质细胞瘤颅内肿瘤中H-NOX三聚体的实时荧光图像。上图显示在H-NOX三聚体给予前(0分钟)和H-NOX三聚体给予后30min、1小时、2小时、4小时、6小时和72小时H-NOX三聚体在脑中的分布。下图显示H-NOX单体的分布。
图27显示小鼠U251正位成胶质细胞瘤颅内和脊柱肿瘤中H-NOX三聚体的实时生物发光图像。A)在H-NOX三聚体给予前和在H-NOX三聚体以295mg/kg的剂量给予后B)30min、C)1小时、D)2小时、E)4小时和F)6小时的H-NOX三聚体分布。
图28显示小鼠U251正位成胶质细胞瘤肿瘤中H-NOX三聚体的实时荧光图像。A)在H-NOX三聚体给予前和在H-NOX三聚体以30mg/kg的剂量给予后B)30min、C)1小时、D)2小时、E)4小时和F)6小时H-NOX三聚体的分布。
图29显示包含小颅内肿瘤的U251正位成胶质细胞瘤小鼠模型中的H-NOX三聚体L144F变体分布的实时荧光图像。A)在H-NOX三聚体给予前和在H-NOX三聚体L144F变体以30mg/kg的剂量给予后B)30min、C)1小时、D)2小时、E)4小时和F)6小时的H-NOX三聚体L144F变体分布。根据生物发光(BLI)评分确定，小肿瘤小于大肿瘤1000倍。
图30显示H-NOX三聚体分布的荧光图像。给予了A)30mg/kg H-NOX三聚体或B)750mg/kg H-NOX三聚体的GBM43正位成胶质细胞瘤小鼠模型的离体荧光图像。给予295mg/kg H-NOX三聚体后包含C)大颅内肿瘤或D)小颅内肿瘤的U251正位成胶质细胞瘤小鼠模型的实时生物发光成像。
图31显示两个正位成胶质细胞瘤肿瘤小鼠模型(U251和GBM-43)和一个非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤(AT/RT)模型中H-NOX三聚体分布的实时荧光图像。图像在H-NOX三聚体给予后60分钟拍摄，并且优化各图像色度。
图32显示三个正位成胶质细胞瘤肿瘤小鼠模型的肿瘤负载半球中H-NOX蛋白分布的离体荧光图像。A)GBM43正位成胶质细胞瘤小鼠模型中给予后60分钟的H-NOX三聚体分布，B)U251正位成胶质细胞瘤小鼠模型中给予后6日的H-NOX三聚体分布，C)BT-12非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤(AT/RT)小鼠模型中给予后30分钟的H-NOX单体分布，D)BT-12正位AT/RT小鼠模型中给予后60分钟的H-NOX三聚体分布，和E)BT-12正位AT/RT小鼠模型中介质给予后30分钟无H-NOX蛋白信号。
图33是显示正位成胶质细胞瘤肿瘤小鼠模型中H-NOX三聚体从血管系统逸出并扩散遍及U251脑肿瘤的免疫荧光图像。肿瘤切片用抗H-NOX抗体(上图)和抗CD31抗体(血管系统)(下图)染色。
图34显示健康小鼠脑中H-NOX三聚体的夹心ELISA分析。A)静脉内注射H-NOX三聚体(750mg/kg)后的脑ELISA分析。B)静脉内注射H-NOX三聚体(200mg/kg)后的脑ELISA分析。C)H-NOX三聚体(750mg/kg)的脑/血浆比。D)H-NOX三聚体(200mg/kg)的脑/血浆比。血浆和脑在H-NOX三聚体给予后30、60、90和120min收集。N＝3，所有小组。平均值+/-SEM。
图35是系列图，显示人成胶质细胞瘤的U251小鼠模型中H-NOX三聚体致使颅内异种移植物对分次放射治疗敏感。A)两治疗组小鼠的平均生物发光成像(BLI)评分+/-SEM，以及未治疗对照组(无H-NOX，无RT)。N＝9，所有小组。B)RT和RT+H-NOX三聚体组在第29日的个体BLI评分(A中的方框)。直线显示组平均值，+\-SEM。RT+H-NOX三聚体小鼠的BLI评分显著低于用RT单独治疗的小鼠的BLI评分(p＝0.039，Student氏t测验)。C)H-NOX三聚体组显示与仅接受放射治疗的小鼠相比显著增强的存活率(p＝0.025，时序检验)。
图36是系列图，显示两个人成胶质细胞瘤小鼠模型中H-NOX三聚体致使颅内异种移植物对分次放射治疗敏感。A)给予2Gy放射治疗(2Gy)、H-NOX三聚体L144F变体(L144F三聚体)、2Gy放射治疗联合H-NOX三聚体L144F变体(2Gy+L144F三聚体)或治疗缓冲剂(TB)的U251正位成胶质细胞瘤小鼠模型的存活百分率。时序p值：2Gy与2Gy+L144F三聚体(p＝0.158)，2Gy与TB(p＝0.0612)，和L144F三聚体与TB(p＝0.326)。B)给予2Gy放射治疗(2Gy)、4Gy放射治疗(4Gy)、8Gy放射治疗(8Gy)、2循环4Gy放射治疗(4Gy×2)、4Gy放射治疗联合H-NOX三聚体(4Gy+H-NOX)或治疗缓冲剂(未治疗)的GBM43正位成胶质细胞瘤小鼠模型的存活百分率。时序p值：4Gy与4Gy+H-NOX(p＝0.597)，4Gy与4Gy×2(p＝0.038)，和4Gy×2与4Gy+H-NOX(p＝0.111)。
图37显示H-NOX蛋白的核酸和氨基酸序列。A.野生型腾冲嗜热厌氧菌H-NOX(SEQID NO：1和2)。B.野生型嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)Orf2H-NOX(SEQ ID NO：13和14)。C.野生型嗜肺军团菌Orf1H-NOX(SEQ ID NO：15和16)。D.人类β1(1-385)H-NOX(SEQID NO：17和18)。E.人类β2(1-217)H-NOX(SEQ ID NO：19和20)。F.褐鼠β1H-NOX(SEQ ID NO：21和22)。G.褐鼠β2H-NOX(SEQ ID NO：23和24)。
发明详述
本发明部分基于令人惊讶的发现：多聚H-NOX蛋白优先渗出和积累在诸如脑的组织中，从而与单体H-NOX蛋白相比提供较长氧合窗和较长循环半衰期。包括来自腾冲嗜热厌氧菌的三个H-NOX结构域并且包括L144F突变的三聚H-NOX蛋白已显示有效用于输送氧至低氧肿瘤组织，如成胶质细胞瘤肿瘤组织，从而增强癌症的放射治疗。因此，本发明提供输送氧的蛋白质、组合物、试剂盒和方法；例如，作为放射治疗的辅助手段。
定义
除非另外限定，本文使用的所有技术和科学术语的含义是本发明所属领域技术人员普遍理解的含义。本领域技术人员还将理解，任何类似于或等同于本文所述的方法和材料也可用来实践或测试本发明。
在本文使用时，除非另外指明，术语“一(a)”、“一(an)”及类似术语指代一个(种)或多个(种)。
在本申请中，除非明确说明或本领域技术人员明显理解，“或”的使用意为“和/或”。在多项从属权利要求的情况下，“或”的使用也指代多于一项在前独立或从属权利要求。
本文“大约”一个数值或参数的指代包括(和描述)针对该数值或参数本身的实施方式。例如，涉及“约X”的描述包括“X”的描述。
要理解，本文描述的本发明的方面和实施方式包括“包括方面和实施方式”、“由方面和实施方式组成”和“主要由方面和实施方式组成”。
术语“多肽”和“蛋白质”可互换地用来指代氨基酸残基多聚体，并且不限于最小长度。这种氨基酸残基多聚体可包含天然或非天然氨基酸残基，并且包括但不限于肽、寡肽、氨基酸残基二聚体、三聚体和多聚体。全长蛋白质和其片段均被该定义涵盖。该术语还包括多肽的表达后修饰，例如，糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化及类似修饰。此外，基于本发明，“多肽”指代包括天然序列的修饰如删除(缺失，deletion)、添加和取代(置换，substitution)(通常实质上保守型)的蛋白质，只要该蛋白质保持期望的活性。这些修饰可以是故意的，如通过位点指向性诱变，或可以是偶然的，如通过由于PCR扩增产生蛋白质或错误的宿主突变。如本文所用，蛋白质可包括共价或非共价结合的两个或更多个亚单位；例如，蛋白质可包括两个或更多个结合单体。
术语“核酸分子”，“核酸”和“多核苷酸”可互换地使用，并且指代核苷酸多聚体。这种核苷酸多聚体可包含天然和/或非天然核苷酸，并且包括但不限于，DNA、RNA和PNA。“核酸序列”指代包括核酸分子或多核苷酸的核苷酸线性序列。
如本文所用，“H-NOX蛋白”意为具有H-NOX结构域(命名为血红素-一氧化氮和氧结合域)的蛋白质。H-NOX蛋白可包含或可不包含H-NOX结构域以外的一个或多个其他结构域。在一些实例中，H-NOX蛋白不包括鸟苷酰环化酶结构域。H-NOX蛋白可包括或可不包括聚合结构域。
如本文所用，“多聚H-NOX蛋白”是包括两个或更多个H-NOX结构域的H-NOX蛋白。H-NOX结构域可共价或非共价结合。
如本文所用，“H-NOX结构域”是通过血红素结合一氧化氮和/或氧的蛋白质的整体或部分。H-NOX结构域可包括血红素，或可被发现是能够结合血红素的脱辅基蛋白质(apoproprotein)。在一些实例中，H-NOX结构域包括六个α-螺旋，然后两个β-链，然后一个α-螺旋，然后两个β链。在一些实例中，H-NOX结构域相应于SEQ ID NO：2所示的腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的H-NOX结构域。例如，H-NOX结构域可与SEQ ID NO：2所示的腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的H-NOX结构域具有至少约10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性。在一些实施方式中，H-NOX结构域可与SEQ ID NO：2所示的腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的H-NOX结构域具有10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％、90％-95％、95％-99％或100％同一性。
如本文所用，“聚合结构域”是促进单体部分结合形成聚合结构的结构域(例如，多肽结构域)。例如，聚合结构域可促进单体H-NOX结构域结合生成多聚H-NOX蛋白。示例性聚合结构域是T4噬菌体的折叠子结构域，其促进三聚多肽形成。聚合结构域的其他实例包括但不限于，Arc、POZ、盘旋螺旋(coiled coil)结构域(包括GCN4、亮氨酸拉链、Velcro)、子宫珠蛋白、胶原蛋白、3链盘旋螺旋(matrilin-1)、血小板反应素(thrombosporins)、TRPV1-C、P53、Mnt、avadin、抗生蛋白链菌素、Bcr-Abl、COMP、verotoxin亚单位B、CamKII、RCK和来自N乙基马来酰亚胺敏感性融合蛋白的结构域、STM3548、KaiC、TyrR、Hcp1、CcmK4、GP41、炭疽保护抗原、气单胞菌溶素、a-溶血素、C4b结合蛋白、Mi-CK、芳基硫酸酯酶A和病毒壳体蛋白。
如本文所用，“氨基酸连接物序列”或“氨基酸间隔序列”是可用于连接蛋白质的两个结构域的短多肽序列。在一些实施方式中，氨基酸连接物序列的长度是一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或超过十个氨基酸。示例性氨基酸连接物序列包括但不限于Gly-Ser-Gly序列和Arg-Gly-Ser序列。
如本文所用，“His6标签”指代附接至多肽的包括六个His残基的肽。His6标签可用于促进蛋白质纯化；例如，利用针对His6标签的层析。在纯化后，可利用外肽酶酶切His6标签。
术语“基本上相似”或“基本上相同”，如本文所用，表示两个或更多个数值之间的相似度足够高，以使本领域技术人员认为这两个或更多个数值之间的差别在所述数值测量的生物学特征的环境内几乎不具有或不具有生物学和/或统计学意义。在一些实施方式中，两个或更多个基本上相似的数值差别不大于约5％、10％、15％、20％、25％或50％中的任一个。
短语“显著减少”或“显著不同”，如本文所用，表示两个数值之间的差异度足够高，以使本领域技术人员认为这两个数值之间的差别在所述数值测量的生物学特征的环境内具有统计学意义。在一些实施方式中，两个显著不同的数值差别大于约10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％或90％中的任一个。在一些实施方式中，两个显著不同的数值差别约10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％、90％-95％、95％-99％或100％中的任一个。
“天然序列”多肽包括与自然界发现的多肽具有相同氨基酸序列的多肽。因此，天然序列多肽可具有来自任何有机体的天然存在的多肽的氨基酸序列。这种天然序列多肽可从自然界分离，或可通过重组或合成手段生成。术语“天然序列”多肽具体包括多肽的天然存在的截短或分泌形式(例如，胞外结构域序列)、天然存在的变体形式(例如，可选地，剪接形式)和多肽的天然存在的等位基因变体。
多肽“变体”意为在比对序列和引入空位(如需，以实现最大序列同一性百分率)后并且不考虑任何保守型取代作为序列同一性的一部分时，与天然序列多肽具有至少约80％氨基酸序列同一性的生物学活性多肽。这种变体包括，例如，其中在多肽N端或C端添加或删除一个或多个氨基酸残基的多肽。在一些实施方式中，变体将与天然序列多肽具有至少约80％、90％或95％氨基酸序列同一性中的任一种。在一些实施方式中，变体将与天然序列多肽具有约80％-90％、90％-95％或95％-99％氨基酸序列同一性中的任一种。
如本文所用，“突变蛋白质”意为与自然界中存在的蛋白质相比具有一个或多个突变的蛋白质。在一个实施方式中，突变蛋白质具有与自然界中存在的所有蛋白质均不同的序列。在不同实施方式中，突变蛋白质的氨基酸序列与自然界中存在的蛋白质的相应区域的氨基酸序列具有至少约10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、95、97，98、99或99.5％同一性中的任一种。在一些实施方式中，突变蛋白质的氨基酸序列与自然界中存在的蛋白质的相应区域的氨基酸序列具有至少约10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％、90％-95％、95％-99％或100％同一性中的任一种。在一些实施方式中，突变蛋白质是包含全长蛋白质的至少约25、50、75、100、150、200、300或400个连续氨基酸中的任一种的蛋白质片段。在一些实施方式中，突变蛋白质是包含全长蛋白质的约25-50、50-75、75-100、100-150、150-200、200-300或300-400个连续氨基酸中的任一种的蛋白质片段。可测量序列同一性——例如，利用其中指定默认参数的序列分析软件(例如，Genetics Computer Group，University of Wisconsin BiotechnologyCenter，1710University Avenue，Madison，WI 53705的序列分析软件包)。此软件程序通过指定与不同氨基酸置换、删除和其他修饰的同源性程度来匹配相似序列。
如本文所用，“突变”意为自然界中存在的参照核酸或氨基酸序列的改变。示例性核酸突变包括插入、删除、框移突变、沉默突变、无义突变或错义突变。在一些实施方式中，核酸突变不是沉默突变。示例性蛋白质突变包括插入一个或多个氨基酸(例如，插入2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)，删除一个或多个氨基酸(例如，删除N端、C端和/或内部残基，如删除至少约5、10、15、25、50、75、100、150、200、300或更多个氨基酸中的任一种或删除约5-10、10-15、15-25、25-50、50-75、75-100、100-150、150-200、200-300或300-400个氨基酸中的任一种)，取代一个或多个氨基酸(例如，取代1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)或前述两种或更多种的组合。用于指代具体氨基酸突变的命名首先确定野生型氨基酸，然后残基编号，最后取代氨基酸。例如，Y140L意为残基编号140的酪氨酸被亮氨酸取代。同样，可通过H-NOX蛋白的氨基酸变化指代变体H-NOX蛋白。例如，腾冲嗜热厌氧菌Y140L H-NOX蛋白指代其中位号140的酪氨酸残基被亮氨酸残基取代的腾冲嗜热厌氧菌H-NOX蛋白，腾冲嗜热厌氧菌W9F/Y140L H-NOX蛋白指代其中第9位的色氨酸残基被苯丙氨酸残基取代并且位号140的酪氨酸残基被亮氨酸残基取代的腾冲嗜热厌氧菌H-NOX蛋白。
“进化保守的突变”是一种蛋白质中的氨基酸被相同蛋白质家族的另一种蛋白质的相应位置的氨基酸置换。
如本文所用，“衍生自”指代在其中引入一个或多个突变的蛋白质来源。例如，“衍生自哺乳动物蛋白质”的蛋白质指代通过在野生型(即，自然界中存在的序列)哺乳动物蛋白质的序列中引入一个或多个突变所产生的目标蛋白质。
如本文所用，关于肽、多肽或抗体序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”和“同源性”被定义为，在比对序列和引入空位(如需，从而实现最大序列同一性百分率)后并且不考虑任何保守型取代作为序列同一性的一部分时，候选序列中与具体肽或多肽序列的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。为了确定氨基酸序列同一性百分比而进行的比对可以本领域技术范围内的不同方式实现，例如，利用公众可获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGNTM(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定适当的参数用于测定比对，包括实现对比序列全长的最大限度比对所需的任何算法。
如本文所用，“koff”指代解离速率，如O2或NO从蛋白质释放的速率。越低数值的koff表示越慢的解离速率。
如本文所用，“kon”指代结合速率，如O2或NO结合至蛋白质的速率。越低数值的kon表示越慢的结合速率。
如本文所用，“解离常数”指代“动力学解离常数”或“计算解离常数”。“动力学解离常数”或“KD”是动力学解离率(koff)与动力学结合率(kon)的比，如利用包括技术人员已知和/或本文描述的方法的标准方法(例如，标准光谱法、停流法或闪光光解法)以绝对值确定的KD值。“计算解离常数”或“计算KD”指代基于测量的koff的动力学解离常数的近似值。kon的值通过本文描述的动力学KD和koff之间的相关性得到。
如本文所用，“氧亲和力”是定性术语，指代氧结合至蛋白质的血红素部分的强度。这种亲和力受氧气的koff和kon影响。数值越低的氧气KD值表示越高的亲和力。
如本文所用，“NO亲和力”是定性术语，指代NO结合至蛋白质(如结合至蛋白质相关的血红素基团或结合至已结合于血红素基团的氧)的强度。这种亲和力受NO的koff和kon影响。数值越低的NO KD值表示越高的亲和力。
如本文所用，“NO稳定性”指代在氧存在的情况下蛋白质对于NO氧化的稳定性或抗性。例如，蛋白质在氧存在的情况下在结合至NO时不被氧化的能力指示蛋白质的NO稳定性。在一些实施方式中，在20℃下培育约1、2、4、6、8、10、15或20小时中的任一种后，小于约50、40、30、10或5％中的任一种的H-NOX蛋白被氧化。
如本文所用，“NO反应性”指代在氧存在的情况下血红素结合蛋白的血红素中的铁被NO氧化的速率。越低数值的以单位s-1表示的NO反应性表示越低的NO反应性。
如本文所用，“自氧化速率”指代血红素结合蛋白的血红素中的铁自氧化的速率。越低数值的以单位s-1表示的自氧化速率表示越低的自氧化速率。
术语“载体”用于描述可被改造以包含可在宿主细胞中繁殖的克隆多核苷酸(一个或多个)的多核苷酸。载体可包括下列元素中的一个或多个：复制起点、调控目标多肽表达的一个或多个调控序列(如，例如，启动子和/或增强子)和/或一个或多个可选的标记物基因(如，例如，抗-抗生素基因和可用于比色分析的基因，例如，β-半乳糖苷酶)。术语“表达载体”指代用于在宿主细胞中表达目标多肽的载体。
“宿主细胞”指代可以是或已经是载体或分离的多核苷酸的受体的细胞。宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。示例性真核细胞包括哺乳动物细胞，如灵长类或非灵长类动物细胞；真菌细胞，如酵母；植物细胞；和昆虫细胞。示例性原核细胞包括细菌细胞；例如，大肠杆菌(E.coli)细胞。
术语“分离的”，如本文所用，指代从一般自然界发现的或生产的组分其中至少一些分离的分子。例如，当多肽被从其生成细胞的至少一些组分中分离时，该多肽被称为“分离的”。在多肽在表达后被细胞分泌时，从其生成细胞物理分离包含该多肽的上清液，这被认为是“分离”多肽。类似地，多核苷酸在如下情况时被称为“分离的”：在其不是一般自然界发现其所在的较大多核苷酸(如，例如，在DNA多核苷酸的情况下，基因组DNA或线粒体DNA)的部分，或其被从其生成细胞的至少一些组分中分离时——例如，在RNA多核苷酸的情况下。因此，宿主细胞内的载体包含的DNA多核苷酸可被称为“分离的”。
术语“个体”或“对象”在本文中可互换使用，指代动物；例如哺乳动物。在一些实施方式中，提供治疗哺乳动物的方法，该哺乳动物包括但不限于，人、啮齿动物、猿猴、猫、犬、马、牛、猪、绵羊、山羊、实验室哺动物、家畜哺乳动物、体育哺乳动物和宠物哺乳动物。在一些实例中，“个体”或“对象”指代需要疾病或障碍治疗的个体或对象。
“疾病”或“障碍”，如本文所用，指代需要治疗的状况。
术语“癌症”指代与细胞增殖不受控、细胞生长不受限制和通过凋亡细胞死亡减少相关的恶性增殖性障碍。
术语“肿瘤”在本文中用来指代呈现异常高水平增殖和生长的细胞群。肿瘤可以是良性、恶性前或恶性的；恶性肿瘤细胞是癌性的。肿瘤细胞可以是实体肿瘤细胞或白血病肿瘤细胞。术语“肿瘤生长”在本文中用来指代导致肿瘤尺寸相应增加的、构成肿瘤的一个或多个细胞的增殖或生长。
如本文所用，“治疗”是获得有益的或期望的临床效果的方法。“治疗”，如本文所用，涵盖哺乳动物(包括人)疾病治疗剂的任何给予或施用。基于本发明，有益的或期望的临床效果包括但不限于下列中的任何一个或多个：缓解一个或多个症状、减轻疾病程度、阻止或延迟疾病蔓延(例如，转移，例如转移至肺或淋巴结)、阻止或延迟疾病复发、延迟或减缓疾病进程、改善疾病状态、抑制疾病或疾病进程、抑制或减缓疾病或其进程、制止其发展和缓和(无论部分或全部)。“治疗”还包括减少增殖性疾病的病理影响。本发明的方法考虑这些治疗方面中的任意一个或多个。
在癌症情况下，术语“治疗”包括下列中的任一种或全部：抑制肿瘤细胞或癌细胞生长、抑制肿瘤细胞或癌细胞复制、减少总肿瘤负荷和改善疾病相关的一个或多个症状。
术语“抑制”指代任何表型特征的减少或中止或该特征的发生、程度或可能性的减少或中止。“减少(降低)”或“抑制”是与参照相比减少、降低或制止活性、功能和/或量。在某些实施方式中，“减少(降低)”或“抑制”意为导致总体减少20％或更多的能力。在另一实施方式中，“减少(降低)”或“抑制”意为导致总体减少50％或更多的能力。在再另一实施方式中，“减少(降低)”或“抑制”意为导致总体减少75％、85％、90％、95％或99％的能力。
如本文所用，“延迟疾病发展”意为推迟、阻碍、减缓、拖延、稳定、抑制和/或延缓疾病(如癌症)的发展。这种延迟可以是不同时间长度，取决于疾病史和/或在治疗个体。对于本领域技术人员显而易见的是，充分或显著的延迟事实上可包括预防，即个体不发展该疾病。例如，可延迟晚期癌症，如转移发展。
“参照”，如本文所用，指代用于比较目的任何样品、标准或水平。参照可从健康和/或非患病样品获得。在一些实例中，参照可从未处理样品获得。在一些实例中，参照从对象个体的未患病或未治疗样品获得。在一些实例中，参照从不是对象或患者的一个或多个健康个体获得。
“预防”，如本文所用，包括提供关于疾病在可能易患该疾病但还未被诊断患有该疾病的对象体内的发生或复发的预防。
剂的“有效量”指代在必要的剂量和时间有效实现期望的治疗或预防效果的量。
本发明的物质/分子、激动剂或拮抗剂的“治疗有效量”可根据如下因素变化，如个体的疾病状态、年龄、性别和重量，和物质/分子、激动剂或拮抗剂在个体中引起期望响应的能力。治疗有效量是治疗有益效果胜于物质/分子、激动剂或拮抗剂的任何毒性或不利影响的量。治疗有效量可以一次或多次给予来输送。
“预防有效量”指代在必要的剂量和时间有效实现期望的预防效果的量。一般，但不一定，由于预防性剂量在患病前或在疾病较早阶段用于对象，因而预防有效量小于治疗有效量。
术语“药物制剂”和“药物组合物”指代使活性成分(一种或多种)的生物学活性有效的形式，并且不包含对制剂给予对象而言具有不可接受的毒性的其他组分的制剂。这种制剂可以是无菌的，并且基本上不含内毒素。
“药学上可接受的载体”指代本领域与治疗剂一起应用构成用于给予对象的“药物组合物”的常规的非毒性固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料、配制辅助剂或载体。药学上可接受的载体在所用剂量和浓度下对受体无毒，并且可与制剂其他成分相容。药学上可接受的载体适于所用制剂。
“无菌”制剂是无菌的，或基本上不含活的微生物和其孢子。
“组合”一种或多种进一步治疗剂的给予包括同时(同步)和以任何顺序连续或相继给予。
术语“同步”在本文中用来指代两种或更多种治疗剂的给予，其中至少部分给予在时间上重叠或一种治疗剂的给予落入相对于另一种治疗剂的给予的短时间段内。例如，给予两种或更多种治疗剂的时间间隔不长于约60分钟，如不长于约30、15、10、5或1分钟中的任一种。
术语“相继”在本文中用来指代两种或更多种治疗剂的给予，其中一种或多种剂的给予接续在中断一种或多种其他剂的给予之后。例如，施加两种或更多种治疗剂的给予的时间间隔长于约15分钟，如约20、30、40、50或60分钟、1日、2日、3日、1周、2周或1个月中的任一种。
如本文所用，“联合”指代给予一种治疗形式外加另一治疗形式。因此，“联合”指代给予个体一种治疗形式之后、期间或之前给予另一种治疗形式。
术语“包装说明书”用于指代治疗性产品的商品包装通常包括的说明，其包含关于这种治疗性产品的使用相关的适应症、用法、剂量、给予、组合治疗、禁忌症和/或警示的信息。
“制品”是任何产品(例如，包装或容器)或试剂盒，其包括至少一种试剂，例如，治疗疾病或障碍(例如，癌症)的药物或本文描述的特异性检测生物标记物的探针。在某些实施方式中，该产品或试剂盒作为实施本文描述的方法的单位被促销、分销或售卖。
H-NOX蛋白
H-NOX蛋白家族概况
除非另外指明，任何野生型或突变H-NOX蛋白可用于本文描述的组合物、试剂盒和方法。如本文所用，“H-NOX蛋白”意为具有H-NOX结构域(命名血红素-一氧化氮和氧结合域(Heme-Nitric oxide and OXygen binding domain))的蛋白质。H-NOX蛋白可还包含或可不包含除H-NOX结构域外的一个或多个其他结构域。H-NOX蛋白是高度保守的充分表征的血红素蛋白家族的成员(Iyer,L.M.et al.(2003年2月3日).BMC Genomics 4(1):5；Karow,D.S.et al.(2004年8月10日).Biochemistry 43(31):10203-10211；Boon,E.M.et al.(2005).Nature Chem.Biol.1:53-59；Boon,E.M.et al.(2005年10月).Curr.Opin.Chem.Biol.9(5):441-446；Boon,E.M.et al.(2005).J.Inorg.Biochem.99(4):892-902)。H-NOX蛋白还被称为Pfam 07700蛋白或HNOB蛋白(Pfam——蛋白质结构域家族比对和Hidden Markov模型数据库，版权(C)1996-2006The Pfam Consortium；GNU LGPLFree Software Foundation,Inc.,59Temple Place-Suite 330,Boston,MA 02111-1307,USA)。在一些实施方式中，H-NOX蛋白具有或预期具有这样的二级结构：包括六个α-螺旋，然后两个β-链，然后一个α-螺旋，然后两个β-链。H-NOX蛋白可以是能够结合血红素或结合有血红素的全蛋白的脱辅基蛋白质。H-NOX蛋白可共价或非共价地结合血红素基团。一些H-NOX蛋白结合NO但不结合O2，而其他结合NO和O2两者。从兼性需氧菌分离的H-NOX结构域结合NO，但不结合O2。专性需氧原核生物、秀丽隐杆线虫和黑腹果蝇的H-NOX蛋白结合NO和O2。哺乳动物具有两种H-NOX蛋白：β1和β2。小鼠、大鼠、牛和人H-NOX序列的比对显示，这些物种共享>99％的同一性。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的H-NOX结构域或整个H-NOX蛋白与天然存在的腾冲嗜热厌氧菌H-NOX蛋白(例如，SEQ ID NO：2)或天然存在的sGC蛋白(例如，天然存在的sGCβ1蛋白)的相应区域具有至少约10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、95、97、98、99或99.5％中任一种的同一性。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的H-NOX结构域或整个H-NOX蛋白与天然存在的腾冲嗜热厌氧菌H-NOX蛋白(例如，SEQ ID NO：2)或天然存在的sGC蛋白(例如，天然存在的sGCβ1蛋白)的相应区域具有至少约10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-95％、95-99或99-99.9％中任一种的同一性。如本文进一步讨论，相对于相应的天然存在的H-NOX蛋白，H-NOX蛋白可任选地包含一个或多个突变。在一些实施方式中，H-NOX蛋白除H-NOX结构域外还包括一个或多个结构域。在具体实施方式中，H-NOX蛋白包括另一蛋白质的一个或多个结构域或完整序列。例如，H-NOX蛋白可以是包括H-NOX结构域和另一蛋白质如白蛋白(例如，人血清白蛋白)的部分或全部的融合蛋白。在一些实施方式中，仅存在H-NOX结构域。在一些实施方式中，H-NOX蛋白不包括鸟苷酰环化酶结构域。在一些实施方式中，H-NOX蛋白包括标签；例如，His6标签。
多聚H-NOX蛋白
在一些方面，本发明提供多聚H-NOX蛋白，其包括两个或更多个H-NOX结构域。两个或更多个H-NOX结构域可共价连接或非共价连接。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白是二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体或十聚体形式。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白包括同源H-NOX结构域。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白包括异源H-NOX结构域；例如，H-NOX结构域可包括H-NOX结构域的具体物种的氨基酸变体，或可包括不同物种的H-NOX结构域。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白的H-NOX结构域中至少一个包括相应于腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的L144F突变的突变。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白的H-NOX结构域中至少一个包括相应于腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的W9F/L144F突变的突变。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白包括一个或多个聚合结构域。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白是三聚H-NOX蛋白。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白包括至少一个三聚结构域。在一些实施方式中，三聚H-NOX蛋白包括三个腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域。在一些实施方式中，三聚H-NOX结构域包括三个腾冲嗜热厌氧菌L144F H-NOX结构域。在一些实施方式中，三聚H-NOX结构域包括三个腾冲嗜热厌氧菌W9F/L144F H-NOX结构域。
在本发明一些方面，多聚H-NOX蛋白包括两个或更多个结合单体。单体可共价连接或非共价连接。在一些实施方式中，生成多聚H-NOX蛋白的单体亚单位，此时单体亚单位在体外或体内结合形成多聚H-NOX蛋白。在一些实施方式中，单体包括H-NOX结构域和聚合结构域。在一些实施方式中，聚合结构域共价连接至H-NOX结构域；例如，H-NOX结构域的C端共价连接至聚合结构域的N端或C端。在其他实施方式中，H-NOX结构域的N端共价连接至聚合结构域的N端或C端。在一些实施方式中，氨基酸间隔物共价连接在H-NOX结构域和聚合结构域之间。“氨基酸间隔物”和“氨基酸连接物”在本文中可互换使用。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白的单体亚单位中至少一个包括相应于腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的L144F突变的突变。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白的单体亚单位中至少一个包括相应于腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的W9F/L144F突变的突变。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白是三聚H-NOX蛋白。在一些实施方式中，三聚H-NOX蛋白的单体包括H-NOX结构域和T4噬菌体的折叠子结构域。在一些实施方式中，三聚H-NOX蛋白的单体包括腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域和折叠子结构域。在一些实施方式中，三聚H-NOX蛋白的单体包括腾冲嗜热厌氧菌L144F H-NOX结构域和折叠子结构域。在一些实施方式中，三聚H-NOX蛋白的单体包括腾冲嗜热厌氧菌W9F/L144FH-NOX结构域和折叠子结构域。在一些实施方式中，三聚体H-NOX蛋白包括三个单体，每个单体包括腾冲嗜热厌氧菌L144F H-NOX结构域和折叠子结构域。在一些实施方式中，H-NOX结构域通过氨基酸连接物连接至折叠子结构域；例如Gly-Ser-Gly连接物。在一些实施方式中，至少一个H-NOX结构域包括标签。在一些实施方式中，至少一个H-NOX结构域包括His6标签。在一些实施方式中，His6标签通过氨基酸连接物连接至折叠子结构域；例如Arg-Gly-Ser连接物。在一些实施方式中，所有H-NOX结构域均包括His6标签。在一些实施方式中，三聚H-NOX蛋白包括SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列。
示例性的腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域大约26.7kDal。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白的原子质量大于约50kDal、75kDal、100kDal、125kDal至约150kDal中的任一种。
本发明提供，与相应的包括单个H-NOX结构域的单体H-NOX蛋白相比，多聚H-NOX蛋白在给予H-NOX蛋白至个体后显示在个体的一个或多个组织中积累较多。相应的H-NOX蛋白指代包括多聚H-NOX蛋白的H-NOX结构域中的至少一个的H-NOX蛋白的单体形式。多聚H-NOX优先积累的组织包括但不限于肿瘤和血管系统损坏的组织。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白在给予H-NOX蛋白至个体后在哺乳动物内存留至少约1、2、3、4、6、12或24小时。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白在给予H-NOX蛋白至个体后在哺乳动物内存留约1-2、2-3、3-4、4-6、6-12或12-24小时。在一些实施方式中，小于约10％的多聚H-NOX在给予H-NOX蛋白至个体后小于约1小时、2小时或3小时中的任一种之内通过肾脏被排出哺乳动物。
H-NOX蛋白和H-NOX结构域的来源
来自任何种属或物种的H-NOX蛋白和H-NOX结构域可用于本文描述的组合物、试剂盒和方法。在不同实施方式中，多聚H-NOX蛋白的H-NOX蛋白或H-NOX结构域是来自哺乳动物(例如，灵长类(例如，人、猴、猩猩、猿、狐猴、等)、牛、马、猪、犬或猫)、昆虫、酵母或细菌的蛋白质或结构域，或衍生自这种蛋白质。示例性哺乳动物H-NOX蛋白包括野生型人和大鼠可溶性鸟苷酸环化酶(如β1亚单位)。H-NOX蛋白的实例包括野生型哺乳动物H-NOX蛋白，例如，人类、小家鼠(M.musculus)、家犬(C.familiaris)、牛(B.Taurus)、狼(C.lupus)和褐鼠；和野生型非哺乳动物脊椎动物H-NOX蛋白，例如、非洲爪蛙(X.laevis)、青鳉(O.latipes)、O.curivatus和红鳍东方鲀(F.rubripes)。非哺乳动物野生型NO结合H-NOX蛋白的实例包括黑腹果蝇、冈比亚按蚊(A.gambiae)和烟草天蛾(M.sexta)的野生型H-NOX蛋白；非哺乳动物野生型O2结合H-NOX蛋白的实例包括下列的野生型H-NOX蛋白：秀丽隐杆线虫gcy-31、gcy-32、gcy-33、gcy-34、gcy-35、gcy-36和gcy-37；黑腹果蝇CG14885、CG14886和CG4154；和烟草天蛾β-3；原核野生型H-NOX蛋白的实例包括腾冲嗜热厌氧菌、霍乱弧菌(V.cholera)、费希尔氏弧菌(V.fischerii)、点形念珠藻、脱硫弧菌(D.desulfuricans)、嗜肺军团菌(L.pneumophila)1、嗜肺军团菌2和丙酮丁酸梭菌。
示例性H-NOX蛋白的NCBI登录号包括下列：人类β1[gi：2746083]、褐鼠β1[gi：27127318]、黑腹果蝇β1[gi：861203]、黑腹果蝇CG14885-PA[gi：23171476]、秀丽隐杆线虫GCY-35[gi：52782806]、点形念珠藻[gi：23129606]、新月柄杆菌[gi：16127222]、奥奈达希瓦氏菌[gi：24373702]、Legionella pneumophila(ORF 2)[CUCGC_272624]、丙酮丁醇梭菌[gi：15896488]和腾冲嗜热厌氧菌[gi：20807169]。狼H-NOX由GenBank登录号DQ008576提供。示例性H-NOX蛋白和结构域的核酸和氨基酸序列提供在图37中。
示例性H-NOX蛋白还包括下列H-NOX蛋白——通过其基因名称，然后其物种缩写词和Genbank标识符列举(如从2006年5月21日；2006年5月22日；2007年5月21日；或2007年5月22日可获得的下列蛋白质序列，其全部内容均被引入本文作为参考)：Npun5905_Npu_23129606、alr2278_Ana_17229770、SO2144_Sone_24373702、Mdeg1343_Mde_23027521、VCA0720_Vch_15601476、CC2992_Ccr_16127222、Rsph2043_Rhsp_22958463(gi：46192757)、Mmc10739_Mcsp_22999020、Tar4_Tte_20807169、Ddes2822_Dde_23475919、CAC3243_Cac_15896488、gcy-31_Ce_17568389、CG14885_Dm_24647455、GUCY1B3_Hs_4504215、HpGCS-β1_Hpul_14245738、Gycβ100B_Dm_24651577、CG4154_Dm_24646993(gi：NP_650424.2、gi：62484298)、gcy-32_Ce_13539160、gcy-36_Ce_17568391(gi：32566352、gi：86564713)、gcy-35_Ce-17507861(gi：71990146)、gcy-37_Ce_17540904(gi：71985505)、GCY1a3_Hs_20535603、GCY1a2-Hs_899477或GYCa-99B_Dm_729270(gi：68067738)(Lakshminarayan etal.(2003).BMG Genomics 4:5-13)。这些名称使用的物种缩写词包括Ana–鱼腥藻属(Anabaena Sp.)；Ccr–新月柄杆菌；Cac–丙酮丁醇梭菌；Dde–脱硫弧菌(Desulfovibriodesulfuricans)；Mcsp–磁球菌属(磁球菌属.)；Mde–Microbulbifer degradans；Npu–点形念珠藻；Rhsp–类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)；Sone–奥奈达希瓦氏菌；Tte–腾冲嗜热厌氧菌；Vch–霍乱弧菌(Vibrio cholerae)；Ce–秀丽隐杆线虫；Dm–黑腹果蝇；Hpul–马粪海胆(Hemicentrotus pulcherrimus)；Hs–人类。
其他示例性H-NOX蛋白包括下列H-NOX蛋白——通过其有机体名称和Pfam数据库登录号列举(如从2006年5月21日；2006年5月22日；2007年5月17日；2007年5月21日；或2007年5月22日可获得的下列蛋白质序列，其全部内容均被引入本文作为参考)：广杆属线虫(Caenorhabditis briggsae)Q622M5_CAEBR、广杆属线虫Q61P44_CAEBR、广杆属线虫Q61R54_CAEBR、广杆属线虫Q61V90_CAEBR、广杆属线虫Q61A94_CAEBR、广杆属线虫Q60TP4_CAEBR、广杆属线虫Q60M10_CAEBR、秀丽隐杆线虫GCY37_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY31_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY36_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY32_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY35_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY34_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY33_CAEEL、弓背青鱂(Oryzias curvinotus)Q7T040_ORYCU、弓背青鱂Q75WF0_ORYCU、青鱂(Oryzias latipes)P79998_ORYLA、青鱂Q7ZSZ5_ORYLA、绿河豚(Tetraodon nigroviridis)Q4SW38_TETNG、绿河豚Q4RZ94_TETNG、绿河豚Q4S6K5_TETNG、红鳍东方鲀(Fugu rubripes)Q90VY5_FUGRU、非洲爪蛙(Xenopuslaevis)Q6INK9_XENLA、HUMAN类Q5T8J7_HUMAN、HUMAN类GCYA2_HUMAN、HUMAN类GCYB2_HUMAN、人类GCYB1_HUMAN、大猩猩(Gorilla gorilla)Q9N193_9PRIM、婆罗洲猩猩(Pongopygmaeus)Q5RAN8_PONPY、黑猩猩(Pan troglodytes)Q9N192_PANTR、普通猕猴(Macacamulatta)Q9N194_MACMU、白掌长臂猿(Hylobates lar)Q9N191_HYLLA、小家鼠Q8BXH3_MOUSE、小家鼠GCYB1_MOUSE、小家鼠Q3UTI4_MOUSE、小家鼠Q3UH83_MOUSE、小家鼠Q6XE41_MOUSE、小家鼠Q80YP4_MOUSE、褐鼠Q80WX7_RAT、褐鼠Q80WX8_RAT、褐鼠Q920Q1_RAT、褐鼠Q54A43_RAT、褐鼠Q80WY0_RAT、褐鼠Q80WY4_RAT、褐鼠Q8CH85_RAT、褐鼠Q80WY5_RAT、褐鼠GCYB1_RAT、褐鼠Q8CH90_RAT、褐鼠Q91XJ7_RAT、褐鼠Q80WX9_RAT、褐鼠GCYB2_RAT、褐鼠GCYA2_RAT、家犬(Canis familiaris)Q4ZHR9_CANFA、家牛(Bos taurus)GCYB1_BOVIN、野猪(Sus scrofa)Q4ZHR7_PIG、双斑蟋(Gryllus bimaculatus)Q59HN5_GRYBI、烟草天蛾O77106_MANSE、烟草天蛾O76340_MANSE、意大利蜜蜂(Apis mellifera)Q5UAF0_APIME、意大利蜜蜂Q5FAN0_APIME、意大利蜜蜂Q6L5L6_APIME、冈比亚按蚊str PEST Q7PYK9_ANOGA、冈比亚按蚊str PEST Q7Q9W6_ANOGA、冈比亚按蚊str PEST Q7QF31_ANOGA、冈比亚按蚊strPEST Q7PS01_ANOGA、冈比亚按蚊str PEST Q7PFY2_ANOGA、冈比亚按蚊Q7KQ93_ANOGA、黑腹果蝇Q24086_DROME、黑腹果蝇GCYH_DROME、黑腹果蝇GCY8E_DROME、黑腹果蝇GCYDA_DROME、黑腹果蝇GCYDB_DROME、黑腹果蝇Q9VA09_DROME、拟暗果蝇(Drosophila pseudoobscura)Q29CE1_DROPS、拟暗果蝇Q296C7_DROPS、拟暗果蝇Q296C8_DROPS、拟暗果蝇Q29BU7_DROPS、加洲海兔(Aplysia californica)Q7YWK7_APLCA、马粪海胆Q95NK5_HEMPU、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)Q5YLC2_CHLRE、鱼腥藻属Q8YUQ7_ANASP、黄杆菌细菌(Flavobacteria bacterium)BBFL7Q26GR8_9BACT、Psychroflexus torquis ATCC700755Q1VQE5_9FLAO、海洋γ-变形菌HTCC2207Q1YPJ5_9GAMM、海洋γ-变形菌HTCC2207Q1YTK4_9GAMM、新月柄杆菌Q9A451_CAUCR、隐藏嗜酸菌(Acidiphilium cryptum)JF-5Q2DG60_ACICY、类球红细菌Q3J0U9_RHOS4、Silicibacter pomeroyi Q5LPV1_SILPO、脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)PD1222、Q3PC67_PARDE、Silicibacter属TM1040Q3QNY2_9RHOB、Jannaschia sp Q28ML8_JANSC、磁球菌属MC-1Q3XT27_9PROT、嗜肺军团菌Q5WXP0_LEGPL、嗜肺军团菌Q5WTZ5_LEGPL、嗜肺军团菌Q5X268_LEGPA、嗜肺军团菌Q5X2R2_LEGPA、嗜肺军团菌嗜肺亚种(Legionella pneumophila subsp pneumophila)Q5ZWM9_LEGPH、嗜肺军团菌嗜肺亚种Q5ZSQ8_LEGPH、Colwellia psychrerythraea Q47Y43_COLP3、大西洋假交替单胞菌(Pseudoalteromonas atlantica T6c)T6c Q3CSZ5_ALTAT、奥奈达希瓦氏菌Q8EF49_SHEON、Saccharophagus degradans Q21E20_SACD2、Saccharophagusdegradans Q21ER7_SACD2、Vibrio angustum S14Q1ZWE5_9VIBR、创伤弧菌(Vibriovulnificus)Q8DAE2_VIBVU、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)12G01 Q1VCP6_VIBAL、弧菌属DAT722Q2FA22_9VIBR、副溶血性弧菌Q87NJ1_VIBPA、费希尔氏弧菌(Vibrio fischeri)Q5E1F5_VIBF1、创伤弧菌Q7MJS8_VIBVY、发光杆菌属(Photobacterium sp)SKA34Q2C6Z5_9GAMM、Hahella chejuensis Q2SFY7_HAHCH、海洋螺菌属(Oceanospirillum sp)MED92Q2BKV0_9GAMM、海洋杆菌属(Oceanobacter sp)RED65Q1N035_9GAMM、脱硫弧菌Q310U7_DESDG、Halothermothrix orenii H 168Q2AIW5_9FIRM、腾冲嗜热厌氧菌Q8RBX6_THETN、Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903 Q2ZH17_CALSA、丙酮丁醇梭菌Q97E73_CLOAB、Alkaliphilus metalliredigenes QYMF Q3C763_9CLOT、破伤风梭菌(Clostridium tetani)Q899J9_CLOTE和拜氏梭菌(Clostridium beijerincki)NCIMB8052Q2WVN0_CLOBE。基于利用本文描述的Pfam数据库鉴定这些蛋白质属于H-NOX蛋白家族，预期这些序列编码H-NOX蛋白。
可利用标准方法鉴定另外的可适用于本文描述的药物组合物和方法的H-NOX蛋白、多聚H-NOX蛋白的H-NOX结构域和核酸。例如，可基于其初级结构和/或预测蛋白质二级结构与已知H-NOX蛋白和核酸的相似性，利用标准序列比对和/或结构预测程序鉴定另外的H-NOX蛋白和核酸。例如，Pfam数据库利用限定的比对算法和Hidden Markov模型(如Pfam21.0)将蛋白质分成多个家族，如H-NOX蛋白家族(Pfam-蛋白质结构域家族比对和HiddenMarkov模型的数据库，版权(C)1996-2006The Pfam Consortium；GNU LGPL Free SoftwareFoundation,Inc.,59Temple Place-Suite 330,Boston,MA 02111-1307,USA)。也可利用标准数据库，如the swissprot-trembl数据库(万维网“expasy.org”，Swiss Institute ofBioinformatics Swiss-Prot group CMU-1rue Michel Servet CH-1211Geneva 4，瑞士)，鉴定H-NOX蛋白家族的成员。H-NOX蛋白的二级和/或三级结构可采用标准结构预测程序——如PredictProtein(630West,168Street,BB217,New York,N.Y.10032,USA)——的默认设置来预测。可选地，H-NOX蛋白的实际二级和/或三级结构可利用标准方法来确定。
在一些实施方式中，H-NOX结构域在相应位置处具有与腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的下列远侧口袋残基中的任一个相同的氨基酸：Thr4、Ile5、Thr8、Trp9、Trp67、Asn74、Ile75、Phe78、Phe82、Tyr140、Leu144或前述两个或更多个的任意组合。在一些实施方式中，H-NOX结构域，基于其氨基酸序列的序列比对，在相应于腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的Pro115或Arg135位置的位置处分别具有脯氨酸或精氨酸。在一些实施方式中，H-NOX结构域相应于褐鼠β1H-NOX的His105具有组氨酸。在一些实施方式中，H-NOX结构域具有或预测具有二级结构：包括六个α-螺旋，然后两个β-链，然后一个α-螺旋，然后两个β-链。H-NOX蛋白的这种二级结构已被报道。
如需，可利用标准方法测试新鉴定的H-NOX蛋白或H-NOX结构域，以确定其是否结合血红素。可利用标准方法(如本文描述那些)通过确定H-NOX结构域是否结合O2来测试H-NOX结构域充当O2载体的能力。如需，可将本文描述的突变中的一个或多个引入H-NOX结构域，以优化其作为O2载体的特征。例如，可引入一个或多个突变来改变其O2解离常数、氧气koff、血红素自氧化速率、NO反应性、NO稳定性或前述两种或更多种的任意组合。可利用标准技术(如本文所述那些)测量这些参数。
突变H-NOX蛋白
如本文进一步讨论，H-NOX蛋白或多聚H-NOX蛋白的H-NOX结构域可包含一个或多个突变，如与相应的野生型蛋白质相比改变O2解离常数、氧气koff、血红素自氧化速率、NO反应性、NO稳定性或前述两种或更多种的任意组合的突变。在一些实施方式中，本发明提供多聚H-NOX蛋白，其包括一个或多个H-NOX结构域，该H-NOX结构域可包含一个或多个突变，如与相应的野生型蛋白质相比改变O2解离常数、氧气koff、血红素自氧化速率、NO反应性、NO稳定性或前述两种或更多种的任意组合的突变。基于本文提供的教导，利用本文描述的以及技术人员已知的技术，通过随机诱变，然后经验筛选需要的或期望的解离常数、解离速率、NO-反应性、稳定性、生理相容性或前述两种或更多种的任意组合，可生成改造的H-NOX结构域的小组。可选地，诱变可选择性地靶向具体区域或残基，如由H-NOX蛋白的实验确定或预测的三维结构显见的远侧口袋残基(参见，例如，Boon,E.M.et al.(2005).NatureChemical Biology 1:53-59，其全部内容被引入本文作为参考，尤其关于野生型和突变H-NOX蛋白的序列)或通过序列比对鉴定的进化保守的残基(参见，例如，Boon E.M.et al.(2005).Nature Chemical Biology 1:53-59，其全部内容被引入本文作为参考，尤其关于野生型和突变H-NOX蛋白的序列)。
在本发明的一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白的突变H-NOX蛋白或突变H-NOX结构域的序列区别于自然界中存在的所有H-NOX蛋白或结构域的序列。在不同实施方式中，突变蛋白质的氨基酸序列与自然界中存在的H-NOX蛋白的相应区域的氨基酸序列具有至少约10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、95、97、98、99或99.5％中任一种的同一性。在不同实施方式中，突变蛋白质的氨基酸序列与自然界中存在的H-NOX蛋白的相应区域的氨基酸序列具有约10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-95％、95-99％或99.5％同一性。在一些实施方式中，突变蛋白质是包含全长蛋白质的至少约25、50、75、100、150、200、300或400个连续氨基酸中任一种的蛋白质片段。在一些实施方式中，突变蛋白质是包含全长蛋白质的25-50、50-75、75-100、100-150、150-200、200-300或300-400个连续氨基酸的蛋白质片段。可测量序列同一性——例如，利用序列分析软件，其中设定默认参数(例如，Genetics Computer Group，University of WisconsinBiotechnology Center，1710University Avenue，Madison，WI 53705的序列分析软件包)。该软件程序通过指定与不同氨基酸置换、删除和其他修饰的同源性程度来匹配相似序列。
在本发明的一些实施方式中，突变H-NOX蛋白或多聚H-NOX蛋白的突变H-NOX结构域包括一个或多个氨基酸的插入(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的插入)。在本发明的一些实施方式中，突变H-NOX蛋白或突变H-NOX结构域包括一个或多个氨基酸的删除(例如，N端、C端和/或内部残基的删除，如至少约5、10、15、25、50、75、100、150、200、300或更多个氨基酸中的任一种的删除或5-10、10-15、15-25、25-50、50-75、75-100、100-150、150-200、200-300或300-400个氨基酸的删除)。在本发明的一些实施方式中，突变H-NOX蛋白或突变H-NOX结构域包括一个或多个氨基酸的取代(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的取代)或前述两种或更多种的组合。在一些实施方式中，突变蛋白质与自然界中存在的蛋白质相比有至少一个氨基酸改变。在一些实施方式中，突变型核酸序列编码与自然界中存在的蛋白质相比有至少一个氨基酸改变的蛋白质。在一些实施方式中，核酸不是编码具有与自然界中存在的蛋白质相同的氨基酸序列的蛋白质的自然界中存在的核酸的变性形式。
在一些实施方式中，H-NOX蛋白或多聚H-NOX蛋白的H-NOX结构域的突变是进化保守的突变(也被称为第I类突变)。第I类突变的实例列于表1A中。在表1A中，突变是根据人β1H-NOX的序列来编号/注释的，但对于所有H-NOX序列而言是相似的。因此，任何其他H-NOX蛋白的相应位置可突变成所示残基。例如，人β1H-NOX的Phe4可突变成酪氨酸，因为其他H-NOX蛋白的这个位置具有酪氨酸。任何其他H-NOX蛋白的相应苯丙氨酸残基可突变成酪氨酸。在具体实施方式中，一个或多个突变限于进化保守的残基。在一些实施方式中，一个或多个突变可包括至少一个进化保守的突变和至少一个非进化保守的突变。如需，基于本文提供的教导，使这些突变H-NOX蛋白经历NO/O2解离常数、NO-反应性、稳定性和生理相容性的经验筛选。
表1A.靶向进化保守的残基的示例性第I类H-NOX突变
Figure GDA0001939256630000381
在一些实施方式中，突变是远侧口袋突变，如α-螺旋A、D、E或G(Pellicena,P.etal.(2004年8月31日).Proc Natl.Acad Sci USA 101(35):12854-12859)中的残基突变。示例性远侧口袋突变(也被称为第II类突变)列于表1B中。在表1B中，突变是根据人β1H-NOX的序列来编号/注释的，但对于所有H-NOX序列而言都是相似的。由于几种取代提供每个所列残基处的可能的突变，因此每个所示位置的残基可变成任何其他天然或非天然存在的氨基酸(命名为“X”)。这种突变可产生具有多种期望的亲和力、稳定性和反应性特征的H-NOX蛋白。
表1B.靶向远侧口袋残基的示例性第II类H-NOX突变
V8X M73X I145X
L9X F77X I149X
F70X C78X
在具体实施方式中，突变是血红素远侧口袋突变。如本文描述，防止H-NOX家族的NO结合成员结合O2的关键分子决定因素是血红素远侧口袋中不具有H键供体。因此，在一些实施方式中，突变改变H-NOX结构域和远侧口袋内配体之间的H键合。在一些实施方式中，突变破坏远侧口袋的H键供体，和/或使O2配体结合相对于相应的野生型H-NOX结构域减少。示例性远侧口袋残基包括腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的Thr4、Ile5、Thr8、Trp9、Trp67、Asn74、Ile75、Phe78、Phe82、Tyr140和Leu144以及任何其他H-NOX蛋白中的相应残基。在一些实施方式中，H-NOX蛋白或多聚H-NOX蛋白的H-NOX结构域包括一个或多个远侧口袋突变。在一些实施方式中，H-NOX蛋白或多聚H-NOX蛋白的H-NOX结构域包括一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或超过十个远侧口袋突变。在一些实施方式中，远侧口袋突变相应于腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的L144F突变。在一些实施方式中，远侧口袋突变是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的L144F突变。在一些实施方式中，H-NOX蛋白或多聚H-NOX蛋白的H-NOX结构域包括两个远侧口袋突变。在一些实施方式中，H-NOX蛋白或多聚H-NOX蛋白的H-NOX结构域相应于腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的W9F/L144F突变。在一些实施方式中，H-NOX蛋白或多聚H-NOX蛋白的H-NOX结构域是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的W9F/L144F突变。
不在远侧口袋内的残基也可影响血红素基团的三维结构；这种结构进而影响血红素基团中的O2和NO与铁的结合。因此，在一些实施方式中，H-NOX蛋白或多聚H-NOX蛋白的H-NOX结构域具有在远侧口袋外的一个或多个突变。可以突变但不在远侧口袋内的残基的实例包括腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的Pro115和Arg135。在一些实施方式中，突变在近侧口袋内，该近侧口袋包括His105作为连接至血红素铁的残基。
在一些实施方式中，当存在两个或更多个突变时；至少一个突变在远侧口袋内，并且至少一个突变在远侧口袋外(例如，近侧口袋内的突变)。在一些实施方式中，所有突变都在远侧口袋内。
为降低衍生自非人来源的H-NOX蛋白或H-NOX结构域的免疫原性，可使H-NOX蛋白或H-NOX结构域中的氨基酸突变成人H-NOX中的相应氨基酸。例如，非人H-NOX蛋白或H-NOX结构域的三级结构表面上的一个或多个氨基酸可被突变成人H-NOX蛋白或H-NOX结构域中的相应氨基酸。在一些变体中，一个或多个表面氨基酸的突变可组合两个或更多个远侧口袋残基的突变、远侧口袋外一个或多个残基的突变(例如，近侧口袋内的突变)或前述两种或更多种的组合。
本发明还涉及本文描述的突变的任意组合，如双突变、三突变或更多突变。例如，可在相同H-NOX蛋白中进行本文描述的突变中的任意一种的组合。注意，本发明还包括其他哺乳动物或非哺乳动物H-NOX蛋白中同等位置的突变。示例性突变H-NOX蛋白或突变H-NOX结构域包括使O2或NO配体结合相对于相应的野生型H-NOX结构域改变并且有效作为生理相容性哺乳动物O2血液气体载体的一个或多个突变。
突变的残基编号表示在所述具体H-NOX蛋白的序列中的位置。例如，腾冲嗜热厌氧菌I5A指代腾冲嗜热厌氧菌H-NOX中第5位的异亮氨酸被丙氨酸取代。相同的异亮氨酸至丙氨酸的突变可在任何其他H-NOX蛋白或H-NOX结构域中的相应残基处进行(此残基可以是或可以不是其他H-NOX蛋白序列中的第5个残基)。由于哺乳动物β1H-NOX结构域的氨基酸序列至多有两个氨基酸不同，在被引入野生型大鼠β1H-NOX蛋白时生成期望的突变H-NOX蛋白或H-NOX结构域的突变也被预期在被引入其他哺乳动物如人的野生型β1H-NOX蛋白或H-NOX结构域时生成期望的突变H-NOX蛋白或H-NOX结构域。
在一些实施方式中，H-NOX蛋白是三聚体，其包括三个腾冲嗜热厌氧菌L144F H-NOX结构域和三个折叠子结构域。在一些实施方式中，H-NOX蛋白是三聚体，其包括三个腾冲嗜热厌氧菌W9F/L144F H-NOX结构域和三个折叠子结构域。在一些实施方式中，H-NOX蛋白是三聚体，其包括三个腾冲嗜热厌氧菌野生型H-NOX结构域和三个折叠子结构域。
对H-NOX蛋白的修饰
可利用标准方法来修饰和/或配制野生型或突变H-NOX蛋白(包括多聚H-NOX蛋白)中的任一种，以提高医疗或工业应用。例如，具体地在用于异种的改造后的H-NOX蛋白时，本领域已知多种方法使这种药剂免受免疫监视，包括交联、PEG化、糖修饰等(例如，Rohlfs,R.J.et al.(May 15,1998).J.Biol.Chem.273(20):12128-12134；Migita,R.et al.(June1997).J.Appl.Physiol.82(6):1995-2002；Vandegriff,K.D.et al.(August 15,2004).Biochem J.382(Pt 1):183-189，其全部内容均被引入本文作为参考，尤其关于蛋白质的修饰)以及技术人员已知的其他技术。融合H-NOX蛋白(包括多聚H-NOX蛋白)与人蛋白质(如人血清白蛋白)可增加血清半衰期、粘度和胶粒渗透压。在一些实施方式中，H-NOX蛋白在其合成期间或之后被修饰，以减少其免疫原性和/或增加其血浆保留时间。H-NOX蛋白也可被包封(如包封在脂质体或纳米颗粒内)。
在一些实施方式中，H-NOX蛋白包括一个或多个标签；例如协助纯化H-NOX蛋白。标签的实例包括但不限于His6、FLAG、GST和MBP。在一些实施方式中，H-NOX蛋白包括一个或多个His6标签。一个或多个His6标签可在使用多聚H-NOX蛋白前被去除；例如，通过用外肽酶处理。在一些实施方式中，H-NOX蛋白是三聚体，包括三个腾冲嗜热厌氧菌L144F H-NOX结构域、三个折叠子结构域和三个His6标签。在一些实施方式中，H-NOX蛋白是三聚体，包括三个腾冲嗜热厌氧菌W9F/L144F H-NOX结构域、三个折叠子结构域和三个His6标签。在一些实施方式中，H-NOX蛋白是三聚体，包括三个腾冲嗜热厌氧菌野生型H-NOX结构域、三个折叠子结构域和三个His6标签。
聚合结构域
在一些方面，本发明提供多聚H-NOX蛋白，其包括两个或更多个H-NOX结构域和一个或多个聚合结构域。聚合结构域用于连接两个或更多个H-NOX结构域，以形成多聚H-NOX蛋白。一个或多个聚合结构域可用于生成H-NOX蛋白的二聚体、三聚体、四聚体、五聚体等。聚合结构域在本领域已知，如：T4噬菌体fibritin的折叠子、Arc、POZ、盘旋螺旋结构域(包括GCN4、亮氨酸拉链、Velcro)、子宫珠蛋白、胶原蛋白、3链盘旋螺旋(matrilin-1)、血小板反应素、TRPV1-C、P53、Mnt、avadin、抗生蛋白链菌素、Bcr-Abl、COMP、verotoxin亚单位B、CamKII、RCK和N乙基马来酰亚胺敏感性融合蛋白的结构域、STM3548、KaiC、TyrR、Hcp1、CcmK4、GP41、炭疽保护抗原、气单胞菌溶素、a-溶血素、C4b结合蛋白、Mi-CK、芳基硫酸酯酶A和病毒壳体蛋白。聚合结构域可共价或非共价地连接至H-NOX结构域。在一些实施方式中，聚合结构域连接至H-NOX结构域，形成单体亚单位，使得多个单体亚单位的聚合结构域结合形成多聚H-NOX结构域。在一些实施方式中，H-NOX结构域的C端连接至聚合结构域的N端。在其他实施方式中，H-NOX结构域的N端连接至聚合结构域的N端。在再其他实施方式中，H-NOX结构域的C端连接至聚合结构域的C端。在一些实施方式中，H-NOX结构域的N端连接至聚合结构域的C端。
可利用连接物将聚合结构域连接至H-NOX结构域；例如，例如，氨基酸连接物。在一些实施方式中，包括一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或超过十个氨基酸中任一种的连接物可被布置在聚合结构域和H-NOX结构域之间。示例性连接物包括但不限于Gly-Ser-Gly和Arg-Gly-Ser连接物。
噬菌体T4fibritin三聚结构域
示例性聚合结构域是噬菌体T4的折叠子结构域。噬菌体T4的wac基因编码fibritin蛋白——486个氨基酸的蛋白质，具有C端三聚结构域(残基457-483)(Efimov,V.P.et al.(1994)J Mol Biol 242:470-486)。该结构域能够在体外和体内三聚化fibritin(Boudko,S.P.et al.(2002)Eur J Biochem 269:833-841；Letarov,A.V.,etal.,(1999)Biochemistry(Mosc)64:817-823；Tao,Y.,et al.,(1997)Structure 5:789-798)。分离的27个残基的三聚结构域，通常被称为“折叠子结构域”，已被用于构建多种不同蛋白质中的嵌合三聚体(包括HIV包膜糖蛋白(Yang,X.et al.,(2002)J Virol 76:4634-4642)、腺病毒粘附素(Papanikolopoulou,K.,et al.,(2004)J Biol Chem 279:8991-8998；Papanikolopoulou,K.et al.(2004)J Mol Biol 342:219-227)、胶原蛋白(Zhang,C.,et al.(2009)Biotechnol Prog 25:1660-1668)、噬菌体P22gp26(Bhardwaj,A.,et al.(2008)Protein Sci 17:1475-1485)和狂犬病毒糖蛋白(Sissoeff,L.,et al.(2005)J GenVirol 86:2543-2552)。折叠子结构域的示例性序列显示在图1中，并且通过SEQ ID NO：4提供。
分离的折叠子结构域折叠成单个β-发夹结构，并三聚成包括三个发夹的β-螺旋浆结构(Guthe,S.et al.(2004)J Mol Biol 337:905-915)。单独折叠子结构域的结构已通过NMR确定(Guthe,S.et al.(2004)J Mol Biol 337:905-915)，与折叠子结构域三聚的几种蛋白质的结构已通过X射线晶体学解释(Papanikolopoulou,K.,et al.,(2004)J BiolChem 279:8991-8998；Stetefeld,J.et al.(2003)Structure 11:339-346；Yokoi,N.etal.(2010)Small 6:1873-1879)。该结构域快速折叠并且三聚，减少错误折叠中间体或旁路(off-pathway)寡聚产物的机会(Guthe,S.et al.(2004)J Mol Biol 337:905-915)。折叠子结构域非常稳定，能够在>10％SDS，6.0M盐酸胍或80℃下保持三级结构和寡聚(Bhardwaj,A.,et al.(2008)Protein Sci 17:1475-1485；Bhardwaj,A.,et al.(2007)JMol Biol 371:374-387)，并且能够提高融合至折叠子结构域的序列的稳定性(Du,C.etal.(2008)Appl Microbiol Biotechnol 79:195-202)。
在一些实施方式中，H-NOX结构域的C端连接至折叠子结构域的N端。在其他实施方式中，H-NOX结构域的N端连接至折叠子结构域的N端。在再其他实施方式中，H-NOX结构域的C端连接至折叠子结构域的C端。在一些实施方式中，H-NOX结构域的N端连接至折叠子结构域的C端。
在一些实施方式中，利用连接物将折叠子结构域连接至H-NOX结构域。在一些实施方式中，包括一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或超过十个氨基酸中任一种的连接物可被布置在聚合结构域和H-NOX结构域之间。示例性连接物包括但不限于Gly-Ser-Gly和Arg-Gly-Ser连接物。在一些实施方式中，本发明提供三聚H-NOX蛋白，从N端至C端包括：腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域、Gly-Ser-Gly氨基酸连接物和折叠子结构域。在一些实施方式中，本发明提供三聚H-NOX蛋白，从N端至C端包括：腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域、Gly-Ser-Gly氨基酸连接物、折叠子结构域、Arg-Gly-Ser氨基酸连接物和His6标签。在一些实施方式中，腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域包括L144F突变。在一些实施方式中，腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域包括W9F突变和L144F突变。在一些实施方式中，腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域是野生型H-NOX结构域。
单体H-NOX结构域亚单位
一方面，本发明提供重组单体H-NOX蛋白(即，多聚H-NOX蛋白的单体H-NOX亚单位)，其可结合形成多聚H-NOX蛋白。在一些实施方式中，本发明提供重组H-NOX蛋白，其包括本文描述的H-NOX结构域和聚合结构域。H-NOX结构域和聚合结构域可共价连接或非共价连接。在一些实施方式中，重组单体H-NOX蛋白的H-NOX结构域的C端连接至聚合结构域的N端。在其他实施方式中，重组单体H-NOX蛋白的H-NOX结构域的N端连接至聚合结构域的N端。在再其他实施方式中，重组单体H-NOX蛋白的H-NOX结构域的C端连接至聚合结构域的C端。在一些实施方式中，重组单体H-NOX蛋白的H-NOX结构域的N端连接至聚合结构域的C端。在一些实施方式中，重组单体H-NOX蛋白不包括鸟苷酰环化酶结构域。
在一些实施方式中，单体H-NOX蛋白包括野生型H-NOX结构域。在本发明的一些实施方式中，单体H-NOX蛋白在H-NOX结构域中包括一个或多个突变。在一些实施方式中，与相应的野生型H-NOX结构域相比，一个或多个突变改变O2解离常数、氧气koff、血红素自氧化速率、NO反应性、NO稳定性或前述两种或更多种的任意组合。在一些实施方式中，突变是远侧口袋突变。在一些实施方式中，突变包括不在远侧口袋内的突变。在一些实施方式中，远侧口袋突变相应于腾冲嗜热厌氧菌的L144突变(例如，L144F突变)。在一些实施方式中，重组单体H-NOX蛋白包括两个远侧口袋突变，相应于腾冲嗜热厌氧菌的W9和L144突变(例如，W9F/L144F突变)。
在一些方面，本发明提供重组单体H-NOX蛋白，其结合形成三聚H-NOX蛋白。在一些实施方式中，重组H-NOX蛋白包括H-NOX结构域和三聚结构域。在一些实施方式中，三聚结构域是本文讨论的折叠子结构域。在一些实施方式中，H-NOX结构域是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域。在一些实施方式中，腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域的C端共价连接至折叠子结构域的N端。在一些实施方式中，腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域的C端共价连接至折叠子结构域的C端。在一些实施方式中，腾冲嗜热厌氧菌结构域是L144F H-NOX结构域。在一些实施方式中，腾冲嗜热厌氧菌结构域是W9F/L144F H-NOX结构域。在一些实施方式中，腾冲嗜热厌氧菌结构域是野生型H-NOX结构域。
在一些实施方式中，H-NOX结构域利用氨基酸连接物序列共价连接至聚合结构域。在一些实施方式中，氨基酸连接物序列的长度是一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或超过十个氨基酸。示例性氨基酸连接物序列包括但不限于Gly-Ser-Gly序列和Arg-Gly-Ser序列。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白是三聚H-NOX蛋白，包括三个H-NOX结构域和三个三聚序列，其中H-NOX结构域通过氨基酸连接物序列共价连接至三聚结构域。在一些实施方式中，单体H-NOX蛋白从N端至C端包括下列：L144F腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域，Gly-Ser-Gly氨基酸连接物序列，和折叠子结构域。在一些实施方式中，单体H-NOX蛋白从N端至C端包括下列：W9F/L144F腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域，Gly-Ser-Gly氨基酸连接物序列，和折叠子结构域。在一些实施方式中，单体H-NOX蛋白从N端至C端包括下列：野生型腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域，Gly-Ser-Gly氨基酸连接物序列，和折叠子结构域。
在一些实施方式中，重组单体H-NOX蛋白包括标签；例如，His6、FLAG、GST或MBP标签。在一些实施方式中，重组单体H-NOX蛋白包括His6标签。在一些实施方式中，重组单体H-NOX蛋白不包括标签。在一些实施方式中，标签(例如，His6标签)利用氨基酸间隔序列共价连接至聚合结构域。在一些实施方式中，氨基酸连接物序列的长度是一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或超过十个氨基酸。示例性氨基酸连接物序列包括但不限于Gly-Ser-Gly序列和Arg-Gly-Ser序列。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白是三聚H-NOX蛋白，包括三个H-NOX结构域、三个三聚序列和三个His6标签，其中H-NOX结构域通过氨基酸连接物序列共价连接至三聚结构域，并且三聚结构域通过氨基酸连接物序列共价连接至His6标签。在一些实施方式中，单体H-NOX蛋白从N端至C端包括下列：L144F腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域，Gly-Ser-Gly氨基酸连接物序列，折叠子结构域，Arg-Gly-Ser连接物序列，和His6标签。在一些实施方式中，单体H-NOX蛋白从N端至C端包括下列：W9F/L144F腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域，Gly-Ser-Gly氨基酸连接物序列，折叠子结构域，Arg-Gly-Ser连接物序列，和His6标签。在一些实施方式中，单体H-NOX蛋白从N端至C端包括下列：野生型腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域，Gly-Ser-Gly氨基酸连接物序列，折叠子结构域，Arg-Gly-Ser连接物序列，和His6标签。
在一些实施方式中，重组单体H-NOX蛋白包括SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：10或SEQ ID NO：12的氨基酸序列。
野生型和突变H-NOX蛋白的特征
如本文描述，生成多种不同的H-NOX突变蛋白质，其包括多聚H-NOX蛋白，提供多范围的NO和O2解离常数、O2koff、NO反应性和稳定性。为提供有效血液气体载体，可利用H-NOX蛋白在功能上取代或补充内源O2载体，如血红蛋白。在一些实施方式中，利用H-NOX蛋白，如多聚H-NOX蛋白，输送O2至低氧肿瘤组织(例如，成胶质细胞瘤)，作为放射治疗或化学治疗的辅助手段。因此，在一些实施方式中，与内源O2载体如血红蛋白相比，H-NOX蛋白具有相似或提高的O2结合速率、O2解离速率、O2结合的解离常数、NO稳定性、NO反应性、自氧化速率、血浆保留时间或前述两种或更多种的任意组合。在一些实施方式中，H-NOX蛋白是多聚H-NOX蛋白。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白是三聚H-NOX蛋白，包括三个单体，每个单体包括腾冲嗜热厌氧菌L144F H-NOX结构域和折叠子结构域。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白是三聚H-NOX蛋白，包括三个单体，每个单体包括腾冲嗜热厌氧菌W9F/L144F H-NOX结构域和折叠子结构域。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白是三聚H-NOX蛋白，包括三个单体，每个单体包括腾冲嗜热厌氧菌L144F H-NOX结构域和折叠子结构域。
在不同实施方式中，H-NOX蛋白(包括多聚H-NOX蛋白)的O2koff在20℃下在下列之间：约0.01至约200s-1，如约0.1至约200s-1、约0.1至100s-1、约1.0至约16.0s-1、约1.35至约23.4s-1、约1.34至约18s-1、约1.35至约14.5s-1、约0.21至约23。4s-1、约1.35至约2.9s-1、约2至约3s-1、约5至约15s-1或约0.1至约1s-1。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的氧气koff在20℃下小于或等于约0.65s-1(如在20℃下在约0.21s-1至约0.65s-1之间)。
在不同实施方式中，H-NOX蛋白(包括多聚H-NOX蛋白)的O2kon在20℃下在下列之间：约0.14至约60μM-1s-1，如约6至约60μM-1s-1、约6至12μM-1s-1、约15至约60μM-1s-1、约5至约18μM-s-1或约6至约15μM-1s-1。
在不同实施方式中，H-NOX蛋白(包括多聚H-NOX蛋白)的O2结合的动力学或计算KD在下列之间：约1nM至1mM、约1μM至约10μM或约10μM至约50μM。在一些实施方式中，O2结合的计算KD在20℃下是约2nM至约2μM、约2μM至约1mM、约100nM至约1μM、约9μM至约50μM、约100μM至约1mM、约50nM至约10μM、约2nM至约50μM、约100nM至约1.9μM、约150nM至约1μM或约100nM至约255nM、约20nM至约2μM，20nM至约75nM、约1μM至约2μM、约2μM至约10μM、约2μM至约9μM或约100nM至500nM中的任一种。在一些实施方式中，O2结合的动力学或计算KD在20℃下小于约100nM、80nM、50nM、30nM、25nM、20nM或10nM中的任一种。
在不同实施方式中，H-NOX蛋白(包括多聚H-NOX蛋白)的O2结合的动力学或计算KD在相同条件下(如在20℃下)的血红蛋白的约0.01至约100倍之内，如相同条件下(如在20℃下)的血红蛋白的约0.1至约10倍之间或约0.5至约2倍之间。在不同实施方式中，H-NOX蛋白的NO结合的动力学或计算KD在相同条件下(如在20℃下)的血红蛋白的约0.01至约100倍之内，如相同条件下(如在20℃下)的血红蛋白的约0.1至约10倍之间或约0.5至约2倍之间。
在一些实施方式中，H-NOX蛋白(包括多聚H-NOX蛋白)的小于约50、40、30、10或5％中的任一种在20℃下培育约1、2、4、6、8、10、15或20小时中的任一种后被氧化。
在不同实施方式中，H-NOX蛋白(包括多聚H-NOX蛋白)的NO反应性在20℃下小于约700s-1，如在20℃下小于约600s-1、500s-1、400s-1、300s-1、200s-1、100s-1、75s-1、50s-1、25s-1、20s-1、10s-1、50s-1、3s-1、2s-1、1.8s-1、1.5s-1、1.2s-1、1.0s-1、0.8s-1、0.7s-1或0.6s-1。在不同实施方式中，H-NOX蛋白的NO反应性在20℃下在约0.1至约600s-1之间，如在20℃下在约0.5至约400s-1之间、约0.5至约100s-1、约0.5至约50s-1、约0.5至约10s-1、约1至约5s-1或约0.5至约2.1s-1。在不同实施方式中，H-NOX蛋白的反应性比相同条件下(如在20℃下)的血红蛋白的反应性低至少约10、100、1,000或10,000倍。
在不同实施方式中，H-NOX蛋白(包括多聚H-NOX蛋白)的血红素自氧化速率在37℃下小于约1.0h-1，如在37℃下小于约0.9h-1、0.8h-1、0.7h-1、0.6h-1、0.5h-1、0.4h-1、0.3h-1、0.2h-1、0.1h-1或0.05h-1中的任一种。在不同实施方式中，H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在37℃下在约0.006至约5.0h-1之间，如在37℃下约0.006至约1.0h-1、0.006至约0.9h-1或约0.06至约0.5h-1。
在不同实施方式中，突变H-NOX蛋白(包括多聚H-NOX蛋白)具有(a)在血红蛋白的2个数量级之内的O2或NO解离常数、结合速率(O2或NO的kon)或解离速率(O2或NO的koff)；(b)分别具有比sGCβ1弱(例如，弱至少约10倍、100倍或1000倍)的NO亲和力；(c)小于血红蛋白的与结合O2的NO反应性至少1000倍；(d)长于血红蛋白的体内血浆保留时间至少2、10、100或1000倍；或(e)前述两种或更多种的任意组合。
示例性的适当O2载体提供在血红蛋白的2个数量级之内的解离常数，即，血红蛋白的解离常数的约0.01和100倍之间，如约0.1和10倍之间或约0.5和2倍之间。多种已建立的技术可用于定量解离常数，如本文描述的技术(Boon,E.M.et al.(2005).NatureChem.Biol.1:53-59；Boon,E.M.et al.(2005年10月).Curr.Opin.Chem.Biol.9(5):441-446；Boon,E.M.et al.(2005).J.Inorg.Biochem.99(4):892-902；Vandegriff,K.D.et al.(2004年8月15日).Biochem J.382(Pt 1):183-189，其全部内容均被引入本文作为参考，尤其关于解离常数的测量)，以及技术人员已知的技术。示例性O2载体提供H-NOX蛋白与结合O2的低NO反应性或最小化NO反应性，如低于血红蛋白的NO反应性。在一些实施方式中，NO反应性远低于血红蛋白，如低于血红蛋白的NO反应性至少约10、100、1,000或10,000倍。多种已建立的技术可用于定量NO反应性(Boon,E.M.et al.(2005).Nature Chem.Biol.1:53-59；Boon,E.M.et al.(2005年10月).Curr.Opin.Chem.Biol.9(5):441-446；Boon,E.M.et al.(2005).J.Inorg.Biochem.99(4):892-902；Vandegriff,K.D.et al.(2004年8月15日).Biochem J.382(Pt 1):183-189，其全部内容均被引入本文作为参考，尤其关于NO反应性的测量)以及技术人员已知的技术。由于野生型腾冲嗜热厌氧菌H-NOX具有这种低NO反应性，其他野生型H-NOX蛋白和突变H-NOX蛋白可具有相似的低NO反应性。例如，腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140H具有类似于野生型腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的NO反应性。
另外，适当的O2载体提供高稳定性或最大化稳定性，特别是体内稳定性。多种稳定性度量可用，如氧化稳定性(例如，自氧化或NO氧化稳定性)、温度稳定性和体内稳定性。多种已建立的技术可用于定量稳定性，如本文描述的技术(Boon,E.M.et al.(2005).NatureChem.Biol.1:53-59；Boon,E.M.et al.(2005年10月).Curr.Opin.Chem.Biol.9(5):441-446；Boon,E.M.et al.(2005).J.Inorg.Biochem.99(4):892-902)，以及技术人员已知的技术。关于在血浆、血液或组织中的体内稳定性，示例性的稳定性度量包括保留时间、清除速率和半衰期。来自嗜热有机体的H-NOX蛋白预期在高温下稳定。在不同实施方式中，血浆保留时间大于血红蛋白的血浆保留时间至少约2倍、10倍、100倍或1000倍(例如，Bobofchak,K.M.et al.(August 2003).Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.285(2):H549-H561)。技术人员将理解，基于血红蛋白的血液替代品受制于无细胞血红蛋白从血浆的快速清除——因为存在从血浆去除无细胞血红蛋白的血红蛋白受体。由于血浆中没有H-NOX蛋白的受体，野生型和突变H-NOX蛋白预期具有比血红蛋白更长的血浆保留时间。如需，可利用标准方法(如本文所述那些和技术人员已知那些)PEG化或交联H-NOX蛋白或融合H-NOX蛋白与另一蛋白质来增加血浆保留时间。
在不同实施方式中，H-NOX蛋白(包括多聚H-NOX蛋白)的O2解离常数在20℃下在约1nM至约1mM之间，并且其NO反应性低于相同条件下(如在20℃下)的血红蛋白至少约10倍。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃下在约1nM至约1mM之间并且其NO反应性在20℃下小于约700s-1(例如，在20℃下小于约600s-1、500s-1、100s-1、20s-1或1.8s-1)。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的O2解离常数在血红蛋白的O2解离常数的2个数量级之内，并且其NO反应性低于相同条件(如在20℃下)的血红蛋白的NO反应性至少约10倍。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的氧气koff在20℃下在约0.01至约200s-1之间并且其NO反应性低于相同条件下(如在20℃下)的血红蛋白的NO反应性至少约10倍。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的氧气koff在20℃下小于约0.65s-1(如在20℃下在约0.21s-1至约0.64s-1之间)，并且其NO反应性低于相同条件下(如在20℃下)的血红蛋白的NO反应性至少约10倍。在本发明的一些实施方式中，H-NOX蛋白的O2解离常数在约1nM至约1μM(1000nM)、约1μM至约10μM或约10μM至约50μM之间。在具体实施方式中，H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃下在约2nM至约50μM、约50nM至约10μM、约100nM至约1.9μM、约150nM至约1μM或约100nM至约255nM之间。在不同实施方式中，H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃下小于约80nM，如在20℃下约20nM至约75nM之间。在一些实施方式中，在相同条件下，如在20℃下，H-NOX蛋白的NO反应性低于血红蛋白的NO反应性至少约100倍或约1,000倍。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的NO反应性在20℃下小于约700s-1，如在20℃下小于约600s-1、500s-1、400s-1、300s-1、200s-1、100s-1、75s-1、50s-1、25s-1、20s-1、10s-1、50s-1、3s-1、2s-1、1.8s-1、1.5s-1、1.2s-1、1.0s-1、0.8s-1、0.7s-1或0.6s-1。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的氧气koff在20℃下在0.01至200s-1之间，如约0.1至约200s-1、约0.1至100s-1、约1.35至约23.4s-1、约1.34至约18s-1、约1.35至约14.5s-1、约0.21至约23.4s-1、约2至约3s-1、约5至约15s-1或约0.1至约1s-1。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃下在约100nM至约1.9μM之间，并且H-NOX蛋白的氧气koff在20℃下在约1.35s-1至约14.5s-1之间。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在37℃下小于约1h-1，如小于约0.9h-1、0.8h-1、0.7h-1、0.6h-1、0.5h-1、0.4h-1、0.3h-1、0.2h-1或0.1h-1中的任一种。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的氧气koff在20℃下在约1.35s-1至约14.5s-1之间，并且H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在37℃下小于约1h-1。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的氧气koff在20℃下在约1.35s-1至约14.5s-1之间，并且H-NOX蛋白的NO反应性在20℃下小于约700s-1(例如，在20℃下小于约600s-1、500s-1、100s-1、20s-1或1.8s-1)。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在37℃下小于约1h-1，并且H-NOX蛋白的NO反应性在20℃下小于约700s-1(例如，在20℃下小于约600s-1、500s-1、100s-1、20s-1或1.8s-1)。
在一些实施方式中，H-NOX蛋白溶液(包括多聚H-NOX蛋白溶液)的粘度在1和4厘泊(cP)之间。在一些实施方式中，H-NOX蛋白溶液的胶粒渗透压在20和50mm Hg之间。
O2和/或NO结合的测量
本领域技术人员通过本领域已知的方法和下文描述的非限制性示例性方法可容易确定任何H-NOX蛋白(包括多聚H-NOX蛋白如三聚H-NOX蛋白)的氧和一氧化氮结合特征。
动力学KD：：koff与kon的比
基本上如Boon,E.M.et al.(2005).Nature Chemical Biology 1:53-59所述，确定包括多聚型H-NOS蛋白的野生型和突变H-NOX蛋白的动力学KD值，其全部内容被引入本文作为参考，尤其关于O2结合速率、O2解离速率、O2结合的解离常数、自氧化速率和NO解离速率的测量。
kon(O2结合速率)
在20℃下利用闪光光解测量O2与血红素的结合。FeII-O2络合物不能由于非常快速的双生重组动力学而被闪光剥离(flash off)；因此，利用560nm下的激光(Hewlett-Packard，Palo Alto，CA)使FeII-CO络合物进行闪光光解，生成5配位的FeII中间体，其然后在不同波长下与分子O2结合。利用10mM连二亚硫酸盐通过厌氧还原作用制成蛋白质样品，然后在PD-10柱(Millipore，Inc.，Billerica，MA)上脱盐。然后将样品在气氛受控的尺寸100μL至1mL和路径长度1-cm的石英管中在50mM TEA，50mM NaCl，pH 7.5缓冲剂中稀释至20μm血红素。使CO气在该管顶部区域流过10分钟，形成FeII-CO络合物，其形成通过紫外可见光谱(Soret最大值423nm)来验证。该样品然后用于在闪光光解后但仍在1个大气压的CO气下测量CO再结合动力学，或其被敞开在空气中并且搅拌30分钟，从而在闪光光解前充分氧化缓冲剂，以观察O2再结合情况。在多个波长-对-时间下监测O2与血红素的结合。利用IgorPro软件(Wavemetrics,Inc.,Oswego,OR；最新2005版)通过单指数(single exponential)将这些踪迹拟合。该速率与观察波长无关，但与O2浓度有关。自始至终利用紫外可见光谱来确认所有络合物和中间体(Cary 3K,Varian,Inc.Palo Alto,CA)。利用Dmochowski,I.J.etal.(2000年8月31日).J Inorg Biochem.81(3):221-228描述的仪器收集瞬态吸收数据，该文献其全部内容被引入本文作为参考，尤其关于仪器。该仪器具有20ns的响应时间，并且数据在200兆样品s-1下数字化。
koff(O2解离速率)
为测量koff，将蛋白质(5μm血红素)的FeII-O2络合物稀释在无氧50mM TEA，50mMNaCl，pH 7.5缓冲剂中，并与等体积的包含不同浓度的连二亚硫酸盐和/或饱和CO气体的相同缓冲剂(无氧)快速混合。数据在配备有设置在20℃的Neslab RTE-100恒温浴的HI-TECHScientific SF-61停流分光光度计(TGK Scientific LTD.，Bradford On Avon，英国)上获得。根据吸光度增加，监测O2从血红素的解离，在437nm下FeII-FeII-O2差异光谱的最大值，或在425nm下FeII-FeII-CO差异光谱的最大值。利用作为仪器部分的软件，将最终踪迹拟合成单指数。每次实验进行最小六次，并且所得速率取平均。测量的解离速率与连二亚硫酸盐浓度无关并且与饱和捕获还原后物质的CO无关，二者均在有和无10mM连二亚硫酸盐存在的情况下进行。
动力学KD
通过利用上述koff和kon测量计算koff与kon的比，确定动力学KD。
计算KD
为测量计算KD，将如上所述获得的koff和动力学KD的值作图。通过方程式(y＝mx+b)限定koff和动力学KD之间的线性关系。然后将koff值沿该直线内插，从而利用Excel：MAC2004(Microsoft，Redmond，WA)获得计算KD。在不存在测量kon的情况下，这种内插提供一种关联koff与KD的方式。
自氧化速率
为测量自氧化速率，将蛋白质样品无氧还原，然后在无氧50mM TEA，50mM NaCl，pH7.5缓冲剂中稀释至5μM血红素。然后将这些样品在配备有设定在37℃的Neslab RTE-100恒温浴的Cary 3E分光光度计中培育，并定期扫描(Cary 3E，Varian，Inc.，Palo Alto，CA)。通过对时间绘制的FeIII-FeII差异光谱的最大值和最小值之间的差，确定自氧化速率，并利用Excel：MAC 2004(Microsoft，Redmond，WA)用单指数拟合。
与NO的反应速率
利用在缓冲剂A中制备的2μM纯化的蛋白质(H-NOX，多聚H-NOX，人类血红蛋白(HsHb)等)和在缓冲剂A(缓冲剂A：50mM Hepes，pH 7.5，50mM NaCl)中制备的200μM NO，测量NO反应性。数据在配备有设置在20℃的Neslab RTE-100恒温浴的HI-TECH Scientific SF-61停流分光光度计(TGK Scientific LTD.，Bradford On Avon，United Kingdom)上获得。通过0.00125sec的积分时间(integration time)，将蛋白质与NO以1：1的比例快速混合。利用作为光谱仪部分的软件，将最大变化的波长拟合成单指数，基本上测量了NO氧化的速率限制性步骤。HNOX蛋白质的反应终产物是铁-NO，Hs Hb的反应终产物是铁-水。
p50测量
如需，如Guarnone,R.et al.(1995年9月/10月).Haematologica 80(5):426-430所述，可测量突变型或野生型H-NOX蛋白的p50值，其全部内容被引入本文作为参考，尤其关于p50值的测量。p50值利用HemOx分析仪来确定。测量室始于0％氧，并且向100％氧缓慢地逐渐增加。室中的氧探针测量氧饱和度％。第二探针(UV-Vis光)测量适应血红素蛋白(例如，诸如与血红素络合的H-NOX的蛋白质)UV-Vis光谱的α和β峰的两个波长的吸光度。这些吸收峰随着血红素蛋白结合氧而线性增加。然后相对于氧值％绘制从未结合至100％结合的变化百分率，生成曲线。p50是曲线上50％的血红素蛋白结合氧的点。
具体地，Hemox-分析仪(TCS Scientific Corporation，New Hope，PA)通过将50μL血液或血红素蛋白暴露于渐增分压的氧气和利用氮气使其脱氧来确定氧合血红素蛋白解离曲线(ODC)。Clark氧电极检测氧压变化，该氧压变化被记录在x-y记录器的x轴上。得到的氧合血红素蛋白分数增加通过560nm和576nm下的双波长分光光度法来监测，并显示在y轴上。血液样品取自前内侧静脉(antemedial vein)，用肝素凝固，并保持在在4℃下湿冰上，直到分析。将50μL的全血在5μL Hemox-溶液(制造商提供的保持溶液pH处于7.4±0.01的数值的缓冲剂)中稀释。将样品-缓冲剂吸入作为Hemox-分析仪部分的管，并使混合物温度平衡并达到37℃；然后用空气将样品氧化至100％。在调节pO2值后，用氮气使样品脱氧；在脱氧过程中，在图纸上记录曲线。利用作为Hemox-分析仪部分的软件，根据O2饱和度为50％的点，在x轴上推断P50值。完整记录所需的时间为约30分钟。
H-NOX核酸
本发明还描述编码本文描述的突变H-NOX蛋白、多聚H-NOX或重组单体H-NOX蛋白亚单位中的任一种的核酸。
在具体实施方式中，核酸包括编码H-NOX蛋白或H-NOX结构域的核酸中的任一种的部分或完整核酸序列。在一些实施方式中，核酸包括来自H-NOX核酸的至少约50、100、150、200、300、400、500、600、700、800或更多个连续核苷酸，并且与其来源H-NOX核酸相比包含一个或多个突变(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变)。在不同实施方式中，突变H-NOX核酸，与其来源H-NOX核酸相比，包含小于约20、15、12、10、9、8、7、6、5、4、3或2个突变。本发明还描述了编码突变H-NOX蛋白的任何核酸的变性变体。
在一些实施方式中，核酸包括编码两个或更多个H-NOX结构域的核酸。在一些实施方式中，包括两个或更多个H-NOX结构域的核酸连接，使得该核酸表达出多聚H-NOX蛋白。在进一步的实施方式中，核酸包括编码一个或多个聚合结构域的核酸。在一些实施方式中，包括两个或更多个H-NOX结构域和一个或多个聚合结构域的核酸连接，使得该核酸表达出多聚H-NOX蛋白。
在一些实施方式中，核酸包括编码聚合结构域的任何核酸的部分或完整核酸序列。在一些实施方式中，核酸包括编码H-NOX结构域和聚合结构域的核酸。在一些实施方式中，编码H-NOX结构域的核酸和编码聚合结构域的核酸连接，使得生成的多肽是包括H-NOX结构域和聚合结构域的融合蛋白。
在一些实施方式中，核酸包括编码一个或多个His6标签的核酸。在一些实施方式中，核酸进一步包括定位在编码H-NOX结构域、聚合结构域和/或His6标签的核酸之间的、编码连接物序列的核酸。
在一些实施方式中，本发明提供编码H-NOX结构域和折叠子结构域的核酸。在一些实施方式中，H-NOX结构域是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域。在一些实施方式中，H-NOX结构域是野生型腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域。在一些实施方式中，H-NOX结构域是腾冲嗜热厌氧菌L144F H-NOX结构域。在一些实施方式中，H-NOX结构域是腾冲嗜热厌氧菌W9F/L144FH-NOX结构域。
在一些实施方式中，本发明提供核酸，该核酸从5’至3’编码：L144F腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域、Gly-Ser-Gly氨基酸连接物序列和折叠子结构域。在一些实施方式中，本发明提供核酸，该核酸从5’至3’编码：W9F/L144F腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域、Gly-Ser-Gly氨基酸连接物序列和折叠子结构域。在一些实施方式中，本发明提供核酸，该核酸从5’至3’编码：野生型腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域、Gly-Ser-Gly氨基酸连接物序列和折叠子结构域。
在一些实施方式中，本发明提供核酸，该核酸从5’至3’编码：L144F腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域、Gly-Ser-Gly氨基酸连接物序列、折叠子结构域、Arg-Gly-Ser连接物序列和His6标签。在一些实施方式中，本发明提供核酸，该核酸从5’至3’编码：W9F/L144F腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域、Gly-Ser-Gly氨基酸连接物序列、折叠子结构域、Arg-Gly-Ser连接物序列和His6标签。在一些实施方式中，本发明提供核酸，该核酸从5’至3’编码：野生型腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域、Gly-Ser-Gly氨基酸连接物序列、折叠子结构域、Arg-Gly-Ser连接物序列和His6标签。
在一些实施方式中，该核酸包括SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9或SEQID NO：11所示的核酸序列。
本发明还包括包含至少一种编码本文描述的突变H-NOX蛋白的核酸的细胞或细胞群。示例性细胞包括昆虫、植物、酵母、细菌和哺乳动物细胞。这些细胞可用于利用标准方法(如本文所述那些)生产突变H-NOX蛋白。
在一些实施方式中，本发明提供包括编码H-NOX结构域和折叠子结构域的核酸的细胞。在一些实施方式中，H-NOX结构域是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域。在一些实施方式中，H-NOX结构域是野生型腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域。在一些实施方式中，H-NOX结构域是腾冲嗜热厌氧菌L144F H-NOX结构域。在一些实施方式中，H-NOX结构域是腾冲嗜热厌氧菌W9F/L144F H-NOX结构域。在一些实施方式中，本发明提供细胞，该细胞包括包含SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11所示的核酸序列的核酸。
H-NOX蛋白的制剂
本文描述的任何包括多聚H-NOX蛋白的野生型或突变H-NOX蛋白可用于配制药物或非药物组合物。在一些实施方式中，制剂包括单体H-NOX蛋白，其包括H-NOX结构域和聚合结构域，使得单体H-NOX蛋白在体外或体内结合生成多聚H-NOX蛋白。如下文进一步讨论，这些制剂可用于多种医疗和工业应用。
在一些实施方式中，药物组合物包括包括多聚H-NOX蛋白的本文描述的一种或多种野生型或突变H-NOX蛋白和药学上可接受的载体或赋形剂。药学上可接受的载体或赋形剂的实例包括但不限于，标准药物载体或赋形剂中的任意种，如磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳液如油/水乳液和多种类型的润湿剂。用于气溶胶或胃肠外给予的示例性稀释剂是磷酸盐缓冲盐水或生理(0.9％)盐水。包括这种载体的组合物通过公知的常规方法配制(参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,18th edition,A.Gennaro,ed.,MackPublishing Co.,Easton,PA,1990；和Remington,The Science and Practice ofPharmacy 20th Ed.Mack Publishing,2000，其全部内容均被引入本文作为参考，尤其关于制剂)。在一些实施方式中，制剂是无菌的。在一些实施方式中，制剂基本上不含内毒素。
虽然任何本领域技术人员已知的适当载体都可用于本发明的药物组合物，但载体类型将根据给药方式而变化。组合物可被配制用于任何适当的给药方式，包括，例如，静脉内、动脉内、囊内、吸入、腹膜内、肺内、肌内、皮下、气管内、经粘膜、眼内、鞘内或经皮给予。关于胃肠外给予，如皮下注射，载体可包括，例如，水、盐水、醇、脂肪、蜡或缓冲剂。关于口服给予，可使用上述载体中的任一种或固体载体，如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖或碳酸镁。可生物降解的微球(例如，聚乳酸聚乙醇酸酯(polylactate polyglycolate))也可用作载体。
在一些实施方式中，药物或非药物组合物包括缓冲剂(例如，中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等)、糖类(例如，葡萄糖、甘露糖、蔗糖、葡聚糖等)、抗氧化剂、螯合剂(例如，EDTA、谷胱甘肽等)、防腐剂、可用于结合和/或运输氧的另外的化合物、非活性成分(例如，稳定剂、填充剂等)或前述两种或更多种的组合。在一些实施方式中，组合物被配制为冻干产物。H-NOX蛋白也可利用公知的技术被包封在脂质体或纳米颗粒内。可用于H-NOX蛋白的其他示例性制剂被描述于例如，美国专利号6,974,795和6,432,918，其全部内容均被引入本文作为参考，尤其关于蛋白质制剂。
本文描述的组合物可作为持续释放制剂(例如，诸如胶囊或海绵的制剂，其在给予后产生化合物的缓慢释放)的部分被给予。这种制剂通常可利用公知的技术制备，并通过例如口服、直肠或皮下植入或通过在期望的目标位点植入来给予。持续释放制剂可包含H-NOX蛋白，该H-NOX蛋白被分散在载体基质中和/或包含在储器内，该储器被速率控制膜包围。用于这种制剂的载体是可生物相容的，并且也可以是可生物降解的。在一些实施方式中，制剂提供相对恒定的H-NOX蛋白释放水平。持续释放制剂中包含的H-NOX蛋白量取决于植入位点、释放速率和预期持续时间、以及待治疗或预防的状况本质。
在一些实施方式中，药物组合物包含有效量的野生型或突变H-NOX蛋白。在一些实施方式中，药物组合物包含有效量的多聚H-NOX蛋白，该多聚H-NOX蛋白包括两个或更多个野生型或突变H-NOX结构域。在一些实施方式中，药物组合物包含有效量的重组单体H-NOX蛋白，该重组单体H-NOX蛋白包括本文描述的野生型或突变H-NOX结构域和聚合结构域。在一些实施方式中，制剂包括三聚H-NOX蛋白，该三聚H-NOX蛋白包括三个单体，每个单体包括腾冲嗜热厌氧菌L144F H-NOX结构域和折叠子结构域。在一些实施方式中，制剂包括三聚H-NOX蛋白，该三聚H-NOX蛋白包括三个单体，每个单体包括腾冲嗜热厌氧菌W9F/L144F H-NOX结构域和折叠子结构域。在一些实施方式中，制剂包括三聚H-NOX蛋白，该三聚H-NOX蛋白包括三个单体，每个单体包括腾冲嗜热厌氧菌L144F H-NOX结构域和折叠子结构域。
作为血液替代品的血红蛋白的示例性剂量为每千克患者体重约10mg至约5克或更多的胞外血红蛋白。因此，在一些实施方式中，给予人的有效量的H-NOX蛋白在几克至超过约350克之间。H-NOX蛋白的其他示例性剂量包括约4.4、5、10或13G/DL中的任一种(其中G/DL是H-NOX蛋白溶液在灌入循环前的浓度)——在适当的灌注速率下，如约0.5ml/min(参见，例如，Winslow,R.Chapter 12In Blood Substitutes)。要理解，每种剂型的个体剂量包含的活性成分的单位含量无需自身构成有效量，因为所需有效量可通过多次给予的组合效果来实现。包括在药物组合物中的H-NOX蛋白量的选择取决于所用剂型、所治疗的状况和根据本领域普通技术人员确定的所要实现的具体目的。
示例性组合物包括基因工程重组H-NOX蛋白，该基因工程重组H-NOX蛋白可以是分离的或纯化的，相对于相应的野生型H-NOX蛋白包括一个或多个突变——该突变共同赋予改变的O2或NO配体结合，和有效作为生理相容性哺乳动物血气载体。例如，本文描述的突变H-NOX蛋白。在一些实施方式中，H-NOX蛋白是多聚H-NOX蛋白。在一些实施方式中，H-NOX蛋白是重组单体H-NOX蛋白，其包括本文描述的野生型或突变H-NOX结构域和聚合结构域。在一些实施方式中，组合物包括三聚H-NOX蛋白，其包括三个单体，每个单体包括腾冲嗜热厌氧菌L144F H-NOX结构域和折叠子结构域。在一些实施方式中，组合物包括三聚H-NOX蛋白，其包括三个单体，每个单体包括腾冲嗜热厌氧菌W9F/L144F H-NOX结构域和折叠子结构域。在一些实施方式中，组合物包括三聚H-NOX蛋白，其包括三个单体，每个单体包括腾冲嗜热厌氧菌L144F H-NOX结构域和折叠子结构域。
为减少或防止被给予药物组合物的人对象的免疫应答，可使用人H-NOX蛋白或结构域(野生型人蛋白质或其中已引入一个或多个突变的人蛋白质)或其他非抗原H-NOX蛋白或结构域(例如，哺乳动物H-NOX蛋白)。为减少或消除衍生自非人来源的H-NOX蛋白的免疫原性，可将H-NOX蛋白或H-NOX结构域中的氨基酸突变成人H-NOX中的相应氨基酸。例如，非人H-NOX蛋白三级结构表面上的一个或多个氨基酸可突变成人H-NOX蛋白中的相应氨基酸。
H-NOX蛋白的治疗应用
本文描述的包括多聚H-NOX蛋白的野生型或突变H-NOX蛋白或药物组合物中的任一种可用于治疗应用。
包括多聚H-NOX蛋白的具体H-NOX蛋白可基于针对被治疗的具体适应症期望的O2结合速率、O2解离速率、O2结合的解离常数、NO稳定性、NO反应性、自氧化速率、血浆保留时间或前述两种或更多种的任意组合被选择用于这种应用。H-NOX蛋白可用于治疗心血管疾病、神经系统疾病、肿瘤缺氧、失血或伤口。例如，O2结合H-NOX蛋白可用于大多数当前应用血红细胞或血浆扩容剂的情况。具体地，H-NOX蛋白可用作血红细胞替代品，治疗创伤(例如，战场、救灾或事故)、出血、出血性休克、手术(例如，腹主动脉瘤手术、矫形手术如髋关节置换手术或产生高度失血的任何其他手术)、血稀释、血液延伸应用(例如，补充自体献血(supplementing auto-donation))和血液体积损失或O2携带能力下降的任何其他情况。伤口修复应用的实例包括辐射后伤口修复(例如，高压氧效应)、术后修复、糖尿病性溃疡修复和烧伤。
氧结合多聚H-NOX也可用于在自体血液返回个体前、在预先自体献血期间或之后暂时增加O2输送(如在个体血液被移出并储存用于在手术结尾或恢复期间重新灌注的外科程序过程中移出的血液的替代品)。在一些实施方式中，H-NOX蛋白还充当简单体积扩张剂，由于大H-NOX蛋白分子的存在来提供血液渗透压。
由于胞外H-NOX蛋白在血管系统中的分布不受血红细胞尺寸限制，本发明的多聚H-NOX蛋白可用于将O2输送至血红细胞无法渗透的区域。这些区域可包括任何位于血红细胞流动梗阻下游的组织区域，如一个或多个血栓、镰状细胞阻断、动脉阻断、外周血管阻断、血管成形球囊、外科器械、遭受缺氧或低氧的组织、及类似情况下游的区域。另外，所有类型的组织缺血均可利用H-NOX蛋白治疗。这种组织缺血包括，例如，围术期缺血、中风、紧急中风(emerging stroke)、短暂缺血发作、心肌顿抑和冬眠、急性或不稳定心绞痛、紧急心绞痛(emerging angina)和心肌梗塞(例如，ST段抬高型心肌梗塞)。可利用H-NOX蛋白治疗的其他示例性心血管适应症包括心脏停跳和镰状细胞贫血。示例性目标适应症包括血红蛋白功能缺陷的状况，如指示需要血液替代品或O2载体的情况，包括失血、缺氧等。
包括多聚H-NOX蛋白的H-NOX蛋白也可用作辐射或化学治疗的辅助手段，用于癌症治疗。在一些实施方式中，H-NOX蛋白用作实体肿瘤(例如，不良转移前预后的个体)的放射治疗辅助手段或表面肿瘤(例如，结肠癌、肺癌或皮肤癌或其他可及表面或位置的癌症)的PDT治疗辅助手段。H-NOX蛋白可用于治疗贫血——通过在罹患贫血的患者体内提供另外的携氧能力。示例性神经系统适应症包括缺血性中风、创伤性脑损伤和脊髓损伤。方法和组合物可用于急性(向组织或具体位点(例如，急性心肌梗塞)提供快速氧、急性局部或全身性组织氧合或血液输注)，和慢性情况(例如，心肌梗塞急性恢复后)。
在具体方面，本发明提供利用H-NOX蛋白输送O2至脑肿瘤(例如，成胶质细胞瘤)的方法。在一些实施方式中，H-NOX的给予用作放射治疗或化学治疗的辅助手段。在一些实施方式中，本发明提供通过给予有效量的H-NOX蛋白和给予个体有效量的辐射治疗个体的脑癌(例如，成胶质细胞瘤)的方法。在一些实施方式中，本发明提供通过给予有效量的H-NOX蛋白和给予个体有效量的辐射减少个体脑肿瘤生长(例如，成胶质细胞瘤生长)的方法。在一些实施方式中，H-NOX蛋白是多聚H-NOX蛋白(例如，三聚H-NOX蛋白)。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白包括一个或多个H-NOX结构域，该H-NOX结构域包括在相应于腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的L144的位置处的突变。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白包括一个或多个H-NOX结构域，该H-NOX结构域包括相应于腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的L144F突变的突变。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白包括一个或多个H-NOX结构域，该H-NOX结构域包括在相应于腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的W9和L144的位置处的突变。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白包括一个或多个H-NOX结构域，该H-NOX结构域包括相应于腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的W9F/L144F突变的突变。在一些实施方式中，H-NOX结构域是人H-NOX结构域。在一些实施方式中，H-NOX结构域是犬H-NOX结构域。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白包括L144F腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白包括W9F/L144F腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域和折叠子结构域。
在不同实施方式中，本发明描述输送O2至个体(例如，哺乳动物，如灵长类(例如，人、猴、猩猩、猿、狐猴等)、牛、马、猪、犬或猫)的方法——通过给予有需要的个体足以输送O2至个体的量的野生型或突变H-NOX蛋白，该野生型或突变H-NOX蛋白包括多聚H-NOX蛋白。在一些实施方式中，本发明提供携带或输送血气至个体如哺乳动物的方法，包括步骤：向个体(例如，哺乳动物)的血液输送(例如，输注等)一种或多种H-NOX组合物。输送O2载体至血液或组织(例如，哺乳动物血液或组织)的方法在本领域已知。在不同实施方式中，H-NOX蛋白是能够结合血红素的脱辅基蛋白质，或是结合有血红素的全蛋白。在H-NOX蛋白给予个体前，H-NOX蛋白可具有或可不具有结合的血红素。在一些实施方式中，O2在H-NOX蛋白输送至个体前结合至H-NOX蛋白。在其他实施方式中，在H-NOX蛋白质给予个体前，O2不结合至H-NOX蛋白，并且H-NOX蛋白将O2从个体内的一个位置运输至个体内的另一位置。
预期具有相对低的O2KD(如小于约80nM或小于约50nM)的包括多聚H-NOX蛋白的野生型和突变H-NOX蛋白尤其可用于治疗低氧压组织(如肿瘤、一些伤口或氧压很低的其他区域，如p50在1mm Hg以下)。这种H-NOX蛋白对O2的高亲和力可增加O2保持结合至H-NOX蛋白的时间长度，从而减少在H-NOX蛋白到达待治疗组织前释放的O2量。
在一些实施方式中，关于结合有O2的H-NOX蛋白直接输送至身体具体位点(如成胶质细胞瘤)，O2的koff比KD值更重要，因为O2已经结合至蛋白质(致使kon不太重要)，并且需要在身体具体位点处或其附近释放氧气(以受koff影响的速率)。在一些实施方式中，koff在H-NOX蛋白在存在红细胞的情况下处于循环中时也可非常重要，此时其促进O2从红细胞扩散，并且可能延长稀释的红细胞将O2运输至血管系统的更远位点的能力。
在一些实施方式中，关于在个体血流中循环的H-NOX蛋白的输送，H-NOX蛋白在肺中结合O2，并在身体的一个或多个其他位点处释放O2。对于这些应用中的一些，KD值比koff更重要，因为O2结合处于或接近平衡。在一些实施方式中，关于极端血稀释，在H-NOX蛋白是主要O2载体时，KD比koff更重要，因为H-NOX蛋白在其经过循环时将持续结合和释放O2。由于血红蛋白的p50为14mm Hg，红细胞(其作用如同电容器)的p50为～30mm Hg，并且已建立5mmHg和90mm Hg之间范围的HBOC，一些应用的H-NOX蛋白的最佳KD范围因此可在～2mm Hg至～100mm Hg之间。
多聚H-NOX蛋白也可用于成像。具体地，红细胞使光成像(例如，光学相干断层扫描术；参见，例如，Villard,J.W.(2002).Circulation 105:1843-1849，其全部内容被引入作为参考，尤其关于光学相干断层扫描术)模糊不清。H-NOX溶液灌注致使循环和血管壁图像更清楚，因为H-NOX蛋白远小于红细胞。
本发明的包括多聚H-NOX蛋白的H-NOX蛋白和药物组合物可通过任何常规手段被给予个体，如通过口服、局部、眼内、鞘内、肺内、气管内或气溶胶给予；通过经皮或粘膜吸收；或通过注射(例如，皮下、静脉内、动脉内、囊内或肌内注射)。H-NOX蛋白也可被包括在用作血液替代品的大体积胃肠外溶液内。在示例性实施方式中，H-NOX蛋白被给予至个体的血液(例如，给予至血管，如静脉、动脉或毛细血管)、伤口、肿瘤、低氧组织或低氧器官。
在一些实施方式中，使用组合物的持续连续释放制剂。H-NOX蛋白的给予可进行，例如，数秒至数小时时间，取决于给予目的。例如，作为血液输送介质，示例性给予时程是尽可能快的。其他示例性时程包括约10、20、30、40、60、90或120分钟中的任一种。H-NOX溶液作为血液替代品的示例性灌注速率为约30mL/小时至约13,260mL/小时，如约100mL/小时至约3,000mL/小时。H-NOX蛋白的示例性总剂量为约900mg/kg，经20分钟以13,260mL/小时给予。对于猪而言H-NOX蛋白的示例性总剂量为约18.9克。
示例性用药频率包括但不限于，一周至少1、2、3、4、5、6或7次(即，每日)。在一些实施方式中，H-NOX蛋白被一日给予至少2、3、4或6次。H-NOX蛋白可例如经数日或数周的时间被给予。在一些实施方式中，H-NOX蛋白被给予较长时间，如数月或数年。组合物的用药频率可在疗程中基于给药医师的判断被调整。
在本发明的一些实施方式中，H-NOX蛋白(例如，多聚H-NOX蛋白)用作放射治疗或化学治疗的辅助手段。例如，用于成胶质细胞瘤的治疗。在一些实施方式中，在给予辐射或化学治疗前至少1、2、3、4、5或6小时中的任一种，将H-NOX给予个体。在一些实施方式中，辐射是X射线辐射。在一些实施方式中，X射线辐射的剂量为约0.5gy至约75gy中的任一种。在一些实施方式中，H-NOX给予和辐射给予的循环重复一次、两次、三次、四次、五次或六次中的任一种。在一些实施方式中，H-NOX给予和辐射给予的循环在约1周、2周、3周、4周、5周或6周中的任一种后重复。在一些实施方式中，H-NOX和放射治疗的给予与另一种治疗联合应用；例如，化学治疗。
如上所述，H-NOX蛋白剂量的选择取决于所用剂型、给予频率和数量、被治疗的状况和根据本领域普通技术人员确定的所要实现的具体目的。在一些实施方式中，给予人的H-NOX蛋白的有效量在几克至超过350克之间。
在一些实施方式中，两种或更多种不同的H-NOX蛋白被同时、相继或同步给予。在一些实施方式中，可用于输送O2的另一化合物或治疗与一种或多种H-NOX蛋白的给予同时、相继或同步地给予。
可使用H-NOX蛋白的其他示例性治疗应用被描述于例如，美国专利号6,974,795和6,432,918，其全部内容均被引入本文作为参考，尤其关于O2载体的治疗应用。
具有H-NOX蛋白的试剂盒
还提供包括本文描述的包括多聚H-NOX蛋白的H-NOX蛋白中的任一种和适当的包装的制品和试剂盒。在一些实施方式中，本发明包括试剂盒，其具有(i)H-NOX蛋白(如本文描述的野生型或突变H-NOX蛋白或本文描述的其制剂)和(ii)使用试剂盒输送O2至个体的说明。在不同实施方式中，本发明描述了试剂盒，其具有(i)H-NOX蛋白(如本文描述的野生型或突变H-NOX蛋白或本文描述的其制剂)和(ii)使用试剂盒用于本文描述的工业用途中的任一种的说明(例如，H-NOX蛋白作为需要这种参照标准品的分析仪器的参照标准品在应用、通过保持或增加体外O2水平增强细胞培养中的细胞生长、添加O2至溶液或从溶液去除O2)。
在一些实施方式中，试剂盒被提供用于治疗脑癌(例如，成胶质细胞瘤)。在一些实施方式中，试剂盒包括多聚H-NOX蛋白。在一些实施方式中，试剂盒包括有效量的多聚H-NOX蛋白，该多聚H-NOX蛋白包括两个或更多个野生型或突变H-NOX结构域。在一些实施方式中，试剂盒包括有效量的重组单体H-NOX蛋白，该重组单体H-NOX蛋白包括本文描述的野生型或突变H-NOX结构域和聚合结构域。在一些实施方式中，试剂盒包括三聚H-NOX蛋白，该三聚H-NOX蛋白包括三个单体——每个单体包括相应于腾冲嗜热厌氧菌L144F H-NOX突变的突变——和三聚结构域。在一些实施方式中，试剂盒包括三聚H-NOX蛋白，该三聚H-NOX蛋白包括三个单体——每个单体包括相应于腾冲嗜热厌氧菌W9F/L144F H-NOX突变的突变和三聚结构域。在一些实施方式中，三聚H-NOX蛋白包括人H-NOX结构域。在一些实施方式中，三聚H-NOX蛋白包括犬H-NOX结构域。在一些实施方式中，试剂盒包括三聚H-NOX蛋白，该三聚H-NOX蛋白包括三个单体，每个单体包括腾冲嗜热厌氧菌L144F H-NOX结构域和折叠子结构域。在一些实施方式中，试剂盒包括三聚H-NOX蛋白，该三聚H-NOX蛋白包括三个单体，每个单体包括腾冲嗜热厌氧菌W9F/L144F H-NOX结构域和折叠子结构域。在一些实施方式中，试剂盒包括三聚H-NOX蛋白，该三聚H-NOX蛋白包括三个单体，每个单体包括腾冲嗜热厌氧菌L144F H-NOX结构域和折叠子结构域。
适于本文描述的组合物的包装在本领域已知，包括例如小瓶(vials)(例如，密封小瓶)、容器(vessels)、安瓿瓶、长瓶(bottles)、罐(jars)、柔性包装(例如，密封Mylar或塑料袋)、及类似物。这些制品可被进一步灭菌和/或密封。还提供包括本文描述的组合物的单位剂量型。这些单位剂量型可以单个或多个单位剂量储存在适当的包装中，并且也可被进一步灭菌和密封。本发明的试剂盒中提供的说明一般是在标签或包装说明书(例如，试剂盒中包括的纸片)上的书面说明，但机器可读的说明(例如，在存储磁盘或光盘上承载的说明)也是可接受的。关于H-NOX蛋白使用的说明一般包括关于基于目的治疗或工业用途的剂量、用药安排和给药途径的信息。试剂盒可进一步包括选择适合治疗的个体的描述。
容器可以是单位剂量、整装包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。例如，也可提供这样的试剂盒：包含充足剂量的本文公开的H-NOX蛋白，从而长期提供个体有效治疗，如约1周、2周、3周、4周、6周、8周、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月或更多中的任一种。试剂盒还可包括多单位剂量的H-NOX蛋白和使用说明，并且以药房中储存和使用的充足数量包装，例如，医院药房和配制药房。在一些实施方式中，试剂盒包括干燥的(例如，冻干的)组合物，其可重构、重悬浮或再水合，形成总体上稳定的H-NOX蛋白水悬浮液。
H-NOX蛋白的示例性生产方法
本发明还提供生产本文描述的任一种多聚H-NOX蛋白的方法。在一些实施方式中，方法包括在适于生产多聚H-NOX蛋白的条件下培养具有编码多聚H-NOX蛋白的核酸的细胞。在不同实施方式中，还纯化多聚H-NOX(如从细胞或培养基纯化H-NOX蛋白)。在一些实施方式中，方法包括培养细胞，该细胞具有编码单体H-NOX蛋白的核酸，该单体H-NOX蛋白包括H-NOX结构域和聚合结构域。然后单体在体内或在体外结合形成多聚H-NOX蛋白。包括异种H-NOX结构域的多聚H-NOX蛋白可通过如下生成：共同引入两种或更多种编码具有期望的H-NOX结构域的单体H-NOX蛋白的核酸，并且其中这两种或更多种单体H-NOX蛋白包括相同的聚合结构域。
在一些实施方式中，包括异种H-NOX结构域的多聚H-NOX蛋白通过如下制备：单独制备包括同种单体H-NOX亚单位的多聚H-NOX蛋白，该同种单体H-NOX亚单位包括期望的H-NOX结构域和共同的聚合结构域。在期望比例的异种H-NOX亚单位下混合不同的同种H-NOX蛋白，解离同种的多聚H-NOX蛋白(例如，通过热、变性剂、高盐等)，然后使其结合形成异种的多聚H-NOX蛋白。可通过基于期望的亚单位以期望比例存在的选择来进一步纯化异种多聚H-NOX蛋白的混合物。例如，每种不同H-NOX单体可具有独特的标签，以有助于纯化异种多聚H-NOX蛋白以及鉴定和定量异种亚单位。
如上所述，几种野生型H-NOX蛋白和核酸的序列是已知的，并且可用于生成本发明的突变H-NOX结构域和核酸。重组H-NOX蛋白的突变、表达和纯化技术已被描述于，例如，Boon,E.M.et al.(2005).Nature Chemical Biology 1:53-59和Karow,D.S.et al.(August 10,2004).Biochemistry 43(31):10203-10211，其全部内容被引入本文作为参考，尤其关于重组H-NOX蛋白的突变、表达和纯化。这些技术或其他标准技术可用于生成任何突变H-NOX蛋白。
具体地，本文描述的突变H-NOX蛋白可通过本领域已知的多种方法生成。突变可在氨基酸水平上进行——通过化学修饰氨基酸——或在密码子水平上进行——通过改变编码给定氨基酸的核苷酸序列。蛋白质任何给定位置处的氨基酸置换可改变编码该氨基酸的密码子来实现。这可利用下列通过位点指向性诱变完成：例如：(i)Amersham技术(Amersham诱变试剂盒，Amersham,Inc.,Cleveland,Ohio)，基于Taylor,J.W.et al.(1985年12月20日).Nucleic Acids Res.13(24):8749-8764；Taylor,J.W.et al.(1985年12月20日).Nucleic Acids Res.13(24):8765-8785；Nakamaye,K.L.et al.(1986年12月22日).Nucleic Acids Res.14(24):9679-9698；和Dente et al.(1985).in DNA Cloning,Glover,Ed.,IRL Press,pages 791-802的方法；(ii)Promega试剂盒(Promega Inc.,Madison,Wis.)；或(iii)Biorad试剂盒(Biorad Inc.,Richmond,Calif.)，基于Kunkel,T.A.(January 1985).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(2):488-492；Kunkel,T.A.(1987).Methods Enzymol.154:367-382；Kunkel,美国专利号4,873,192的方法，其全部内容均被引入本文作为参考，尤其关于蛋白质诱变。诱变也可通过其他市售或非商品手段完成，如利用突变型寡核苷酸的位点指向性诱变的那些手段。
位点指向性诱变也可利用基于PCR的诱变完成，如Zhengbin et al.(1992).PCR方法和应用的第205-207页,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York；Jones,D.H.et al.(1990年2月).Biotechniques 8(2):178-183；Jones,D.H.et al.(1991年1月).Biotechniques 10(1):62-66描述的那种，其全部内容均被引入本文作为参考，尤其关于蛋白质诱变。位点指向性诱变也可通过本领域技术人员已知的技术利用盒诱变完成。
突变H-NOX核酸和/或聚合结构域可利用标准技术被并入载体，如表达载体。例如，可利用限制性酶酶切突变H-NOX核酸和载体。然后，可连接酶切后的突变H-NOX核酸和酶切后的载体的相容性末端。所得载体可利用标准技术(例如，电穿孔)被插入细胞(例如，昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞或细菌细胞)，以表达编码的H-NOX蛋白。
具体地，异种蛋白已在多个生物学表达系统中被表达，如昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞和细菌细胞。因此，任何适当的生物学蛋白质表达系统可被应用生产大量重组H-NOX蛋白。在一些实施方式中，H-NOX蛋白(例如，突变型或野生型H-NOX蛋白)是分离的蛋白质。
如需，可利用标准技术纯化H-NOX蛋白。在一些实施方式中，在生成蛋白质时，蛋白质按重量计至少约60％从存在的其他组分脱离出来。在不同实施方式中，蛋白质按重量计至少约75％、90％或99％纯。可获得纯化的蛋白质——例如，通过从天然来源、重组表达系统或化学合成的反应混合物纯化(例如，提取)。示例性纯化方法包括免疫沉淀、柱层析如免疫亲和层析、磁珠免疫亲和纯化和用平板结合抗体抗体淘选(panning)、以及技术人员已知的其他技术。纯度可通过任何适当的方法测定，例如，通过柱色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析。在一些实施方式中，纯化的蛋白质被并入本发明的药物组合物或用于本发明的方法。本发明的药物组合物除纯化的蛋白质外还可具有添加剂、载体或其他组分。
在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白包括一个或多个His6标签。包括至少一个His6标签的H-NOX蛋白可利用层析法纯化；例如，利用Ni2+-亲和层析。在纯化后，His6标签可被去除；例如，通过利用外肽酶。在一些实施方式中，本发明提供纯化的多聚H-NOX蛋白，其中多聚H-NOX蛋白通过His6标签的应用被纯化。在一些实施方式中，用外肽酶处理纯化的H-NOX蛋白，以去除His6标签。
实施例
实施例意图只是示例本发明，因此不应以任何方式被认为限制本发明，并且描述和具体说明上文讨论的本发明的方面和实施方式。实施例并非意图表示下文实验是进行的全部或仅有的实验。除非另外指明，温度以摄氏度表示，并且压力处于或接近大气压。
实施例1.三聚型H-NOX蛋白的生成和表达
为增加H-NOX蛋白的循环半衰期，设计嵌合融合蛋白以组合腾冲嗜热厌氧菌H-NOX序列与来自噬菌体T4fibritin蛋白的三聚结构域。这种融合测量导致分子量超过3倍的增加，并且完全模块化(三聚结构域可被添加至任何H-NOX序列，甚至用于将多个H-NOX序列组合在单个三聚体分子中)。
折叠子结构域与H-NOX的融合
利用H-NOX序列C端Xho I限制性位点和折叠子结构域初始甘氨酸之间的三氨基酸(Gly-Ser-Gly)连接物，折叠子结构域被基因融合于腾冲嗜热厌氧菌H-NOX序列的C端。利用折叠子和His6标签之间的三个氨基酸(Arg-Gly-Ser)连接物，His6蛋白质纯化标签被添加至折叠子结构域的C端。完整的融合蛋白的DNA和氨基酸序列显示在图2中。全长融合蛋白编码229个氨基酸的蛋白质，其分子量为26,677AMU(作为单体)。
H-NOX-折叠子融合蛋白序列的构建
H-NOX-折叠子融合序列的构建被设计以利用限制性内切酶从亲本H-NOX质粒切除编码His6和终止密码子的DNA区段，并用编码折叠子序列、His6标签和终止密码子的盒将其取代。侧接限制性酶位点(5’端Xho I和3’端Hind III，在His6标签和终止密码子后)的编码折叠子结构域、His6标签和终止密码子的DNA购自GenScript(Piscataway，NJ)。在GenScript克隆载体pUC57中输送序列。
利用限制性酶Xho I和Hind III消化pUC57质粒，释放折叠子-His6片段(147个碱基对的长度)。编码腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的L144F变体的pCW载体也用Xho I和Hind III消化，以从H-NOX序列去除编码His6标签和终止密码子的48个碱基对片段。通过制备型琼脂糖凝胶电泳分离来自限制性酶切反应的期望片段，并从琼脂糖纯化DNA片段。利用T4连接酶连接编码H-NOX序列和折叠子-His6标签的片段，并利用连接反应转化感受态大肠杆菌细胞。通过pCW特异性测序引物测序确认其中一个大肠杆菌克隆(克隆3I-A)匹配期望的融合序列并且编码完整H-NOX-折叠子-His6嵌合蛋白(图3A显示与期望序列比对的测序数据)。克隆3I-A序列被重新命名为v01-f002，来命名编码L144F H-NOX序列(002)和融合折叠子结构域(f)的pCW载体(v01)。具有和不具有His6标签的野生型腾冲嗜热厌氧菌H-NOX-折叠子单体的序列和狼H-NOX-折叠子单体的序列显示在图3中。
H-NOX-折叠子融合蛋白的表达和纯化
衍生自pCW亲本载体(Gegner,JA&Dahlquist,FW(1991)Proc Natl Acad Sci USA88,750-75；Muchmore,DC,et al.(1989)Methods Enzymol 177:44-73)的v01-f002质粒编码用于通过多个tac(混合trp-lac)启动子表达f002开放阅读框。质粒v01-f002被转化到感受态大肠杆菌菌种RP523(Li,JM,et al.,(1988)J Bacteriol 170:1021-1025)中，以有效表达血红素结合的H-NOX蛋白。在一定范围的诱导温度(37℃、30℃、18℃)下并且在Rosetta2细胞(Merck Millipore，Darmstadt，德国)中测试表达。
利用在30℃下生长的补充有100mg/L氨苄西林和30mg/L氯高铁血红素的Luria肉汤的最初过夜起子培养物，在RP523细胞中实现v01-f002质粒的稳健表达。然后利用该起子培养物接种补充有100mg/L氨苄西林、30mg/L氯高铁血红素和1.5％葡萄糖的Terrific肉汤的6L表达培养物。使该表达培养在30℃下生长至～0.5的OD600，然后通过添加IPTG诱导蛋白质表达至0.1mM的最终浓度。表达在30℃下持续过夜(24.5小时诱导)，然后通过离心收获细胞，并在-80℃下冷冻，用于纯化。
利用热处理步骤和两个层析步骤从表达的细胞团纯化融合蛋白。首先，将表达的细胞团重悬浮于50mM磷酸钠、500mM NaCl、20mM咪唑和5％甘油的pH 7.9的缓冲剂中。利用EmulsiFlex C-50均质机(Avestin，Ottawa，Canada)均质化该溶液，以溶解细菌细胞。将细胞溶解产物在75℃下加热15分钟，以沉淀非热稳定的蛋白质。通过27,000g下离心15分钟去除沉淀，获得澄清的上清液。将澄清的上清液施加于HisTrap FastFlow柱(GE，Piscataway，NJ)，以结合His6-标记的融合蛋白。利用50mM磷酸钠、500mM NaCl、250mM咪唑和5％甘油的pH 7.9的缓冲剂洗脱结合的蛋白质。将洗脱的蛋白质缓冲剂交换到30mM三乙醇胺、50mMNaCl、pH 7.4的缓冲剂中，用于施加至DEAE Sepharose FastFlow柱(GE，Piscataway，NJ)。H-NOX-折叠子融合蛋白流过DEAE柱，而宿主细胞污染物和内毒素留在柱上。然后可浓缩H-NOX-折叠子融合蛋白，以在-80℃下储存。显示最初纯化的纯化过程各阶段的H-NOX-折叠子融合蛋白的SDS-PAGE凝胶显示在图4中。
纯化的H-NOX-折叠子融合蛋白的表征
利用多种技术表征纯化的H-NOX-折叠子蛋白质。通过SDS-PAGE分析最终纯化蛋白质的纯度(参见图4和5)。凝胶电泳显示，在热处理和两个层析步骤后，H-NOX-折叠子融合蛋白为>95％纯。在变性SDS-PAGE凝胶时，H-NOX-折叠子融合物如同单体运行，其流动性与26.7kDa的单体分子量一致。
利用LC-MS确定单体单位的精确质量和利用分析型尺寸排阻色谱估测三聚体的尺寸和在标准品缓冲剂溶液中的分散，获得了融合蛋白尺寸的更多定量性评价。图6显示H-NOX-折叠子融合蛋白的LC-MS分析。LC-MS得到的26,678AMU的质量与单体H-NOX-折叠子融合物的预测质量26,677AMU一致。图7显示利用Superdex 200 10/300GL(GE，Piscataway，NJ)柱和30mM三乙醇胺、50mM NaCl、pH 7.4缓冲剂的分析尺寸排阻色谱。在分析型SEC条件下，H-NOX-折叠子融合物应保持三聚，并且所得保留体积与H-NOX-折叠子三聚体的预测分子量80.0kDa一致。
利用血红素蛋白的光谱表征血红素中铁原子的结合配体性质和氧化状态。H-NOX-折叠子蛋白质的UV-vis光谱分析显示，折叠子结构域的融合不改变H-NOX特征光谱。包括Soret峰(415nm)和α/β峰(550-600nm)的特征谱峰全部保持在H-NOX单体和H-NOX-折叠子融合蛋白之间，并且表示H-NOX-折叠子融合物以类似于原始H-NOX单体的方式结合血红素辅因子和二原子氧气(图8)。
利用RCSB蛋白质数据库中找到的折叠子结构域(1V1H)和腾冲嗜热厌氧菌H-NOX单体(1U4H)的晶体结构，构建了H-NOX-折叠子三聚体的结构模型(图9)。
实施例2.证实半衰期延长和一定范围的氧亲和力的H-NOX三聚体群的生成。
利用基于结构计算的设计，系统地突变H-NOX氨基酸，生成以一定范围的亲和力结合氧的H-NOX单体变体群。确定23kDa的小H-NOX单体以30分钟的半衰期被排出大鼠循环系统。假设通过使分子量增加至肾过滤限值以上，H-NOX蛋白的循环半衰期就可能增加，并因此允许较长时间持续氧合。为确定增加的分子量是否可增加H-NOX蛋白的循环半衰期，通过三聚H-NOX单体生成较大分子量的H-NOX变体，其在供氧低氧组织时已经成功。为生成三聚变体群，将fibritin蛋白的小氨基酸三聚基序——被称为“折叠子”结构域——基因连接至几种具有1至20mmHg范围的不同氧亲和力的H-NOX单体的C端。该群包括利用野生型H-NOX、H-NOX变体L144F、C端无His6标签的H-NOX变体L144F、H-NOX变体L144F/L189C、H-NOX和折叠子之间无连接物的H-NOX变体L144F、H-NOX和折叠子之间有三氨基酸连接物的H-NOX变体L144F、H-NOX和折叠子之间有九氨基酸连接物的H-NOX变体或H-NOX变体W9F/L144F组装的H-NOX三聚体。折叠子结构域由27个氨基酸残基，GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQ IDNO：4)组成，相应于fibritin的氨基酸残基457至483，并且预测质量为3.08kDa。如上所述，折叠子结构域此前已显示增加蛋白质稳定性并且已被广泛用于在体外和体内三聚蛋白质。简而言之，将包含编码折叠子结构域并且在5'和3'端分别具有XhoI和HindIII限制性位点的基因的质粒用XhoI和HindIII限制性酶消化，以将折叠子结构域基因克隆到编码H-NOX蛋白单体的质粒中。质粒在细菌细胞(大肠杆菌)中表达后，将H-NOX+折叠子蛋白纯化并测试，以验证H-NOX+折叠子单体三聚成H-NOX+折叠子三聚体(例如，H-NOX三聚体)。关于纯化，将细菌细胞用溶菌酶溶解，并均质化。收集上清液，并在75℃下热处理15分钟，然后在JA-17旋转器中在14krpm下离心，去除不溶性蛋白质。将可溶性H-NOX+折叠子结合至HisTrap(IMAC)柱，并用咪唑洗脱，洗脱的样品经过缓冲剂交换，在无咪唑的低盐缓冲剂中提供蛋白质样品。通过使蛋白质样品经过DEAE离子交换柱去除样品中另外的污染蛋白，并将洗脱的蛋白质样品浓缩，然后分析。利用质谱和尺寸排阻层析分别验证单体分子量(约26.7kDa)和三聚分子量(约80.1kDa)。测试每种三聚变体，确定其是否符合生物化学参数，包括：均质的分子量、通过koff和内插已知kon值得出Kd的测量的相应于mmHg的氧结合亲和力在1和20mmHg之间、在通过koff测量时同质三聚体的Koff与相应单体基本上相同、最低一氧化氮(NO)反应性、低自氧化速率和3小时或更长的循环存留时间(表2)。利用光谱确定在STP结合的气体的属性，并利用停流光谱确定氧解离的动力学速率常数。根据分析，H-NOX三聚体被确定具有2μM的氧亲和力——可能致使低氧水平组织中的氧释放的亲和力。H-NOX三聚体还证实约小于1μM-1s-1的一氧化氮反应性，认为其与血红蛋白相比是很小的，血红蛋白的一氧化氮反应性为58μM-1s-1——此前已被证明具有血管作用性和毒性。
表2.多聚H-NOX三聚体的生物化学性质和清除性质
Figure GDA0001939256630000671
生成具有高纯度和低内毒素水平的三聚体，用于大鼠体内的清除研究。H-NOX三聚体在150mM NaCl、25mM HEPES缓冲剂(pH 7.4)的生理缓冲剂中配制用于体内注射，并且浓缩至100mg/mL，以上至100mg/kg的剂量使用。为检验H-NOX三聚体的延长循环存留时间，利用四只一组的雄性Wister大鼠测试每种候选三聚体。在诱导室(induction chamber)中用N2O：O2(2：1)中2-3％的异氟烷诱导麻醉，并通过鼻锥体以1-1.5％异氟烷保持。通过无后肢夹(hind limb pinch)撤回和丧失眼盲反射(eye blind reflex)评估麻醉深度适当。动物接受腹膜内注射40mg/kg头孢唑啉钠和0.1mg/kg皮下丁丙诺啡。在清除测试前一天，股静脉和动脉导管通过外科植入每只动物，以分别允许注射和血液移出。将候选H-NOX三聚体以100mg/kg的剂量在0时通过静脉内弹丸注射注入静脉导管。在候选H-NOX三聚体或缓冲剂对照注射后第5min、30min、1hr、1.5hr、2hr、3hr、4hr、6hr、8hr和24hr，从每只大鼠的动脉导管收集约250μL血液。处理收集的血液得到血清和血浆，并随后通过抗H-NOX蛋白多克隆抗体利用ELISA和SDS-PAGE测定分析是否存在H-NOX三聚体。
表3：在作为静脉内弹丸(100mg/kg)给予大鼠时HNOX单体和三聚体的药代动力学参数
Figure GDA0001939256630000681
ND-未确定
除每种三聚体清除时间的测量外，还监测动物体内初步安全性。H-NOX单体的良好实验室实践(Good Laboratory Practice，GLP)类安全性研究在48小时没有显示主要不良事件或免疫学事件，甚至在最大可行剂量1g/kg的情况下。通过在最初注射后长至4周监测总毒性、血液化学和抗治疗剂抗体，类似地测试了候选H-NOX三聚体。关于初步安全性测试，通过静脉内弹丸注入尾静脉在0时以750mg/kg的剂量给予六只小鼠的小组候选H-NOX三聚体或缓冲剂对照。在给予H-NOX三聚体前从每只大鼠的颈静脉收集血液样品，并与给予H-NOX三聚体后长至四周每周收集的血液进行比较。处理收集的血液得到血清和血浆，并随后进行临床化学分析和通过ELISA检测抗治疗剂抗体生成。每日观察所有动物，以监测任何总毒性(gross toxicity)迹象。
两只不同大鼠的静脉内弹丸注射(100mg/kg)后H-NOX三聚体的血浆特征显示在图10中。H-NOX三聚体给予后的IgG和IgM抗体响应显示在图11中。
实施例3.证实在缺血体内小鼠模型中脑组织渗透和缺氧减少的候选H-NOX三聚体的鉴定。
在缺血性中风暂时MCA阻断啮齿动物模型(tMCAO)中测试循环半衰期为至少3小时的候选H-NOX三聚体，以鉴定灌入和存留在脑组织中的H-NOX三聚体。主要候选H-NOX三聚体各利用24只一组的雄性Wister大鼠进行测试。在诱导室中用N2O：O2(2：1)中2-3％的异氟烷诱导麻醉，并通过鼻锥体以1-1.5％异氟烷保持。通过无后肢夹撤回和丧失眼盲反射评估麻醉深度适当。动物接受腹膜内注射40mg/kg头孢唑啉钠和0.1mg/kg皮下丁丙诺啡。利用标准缝线系外科技术在第0日开始暂时大脑中动脉阻断。简而言之，在右总颈动脉(CCA)上方制造皮肤切口，以允许暂时夹住CCA和结扎外颈动脉(ECA)的远侧部分。将尼龙缝线通过近侧ECA插入并推入内颈动脉(ICA)，以阻断通向脑的血液流动。移除CCA夹，并用外科缝合钉闭合皮肤切口，并且使动物清醒。在阻断大脑中动脉后30分钟，通过尾静脉注射，将750mg/kg剂量的候选H-NOX三聚体灌注到大鼠体内。为分析组织缺氧，在H-NOX三聚体注射后约15分钟腹膜内注射60mg/kg的缺氧标记物哌莫硝唑，从而不可逆地标记缺血性组织。通过向大鼠提供麻醉，再打开伤口和从ECA移除血管内缝线，然后再次闭合伤口，在H-NOX三聚体灌注后30分钟释放阻断，从而在再灌注前提供总共1小时的阻断。为分析H-NOX三聚体的组织分布和定量缺氧减少，在再灌注后2、4、12和24小时处死大鼠(每种H-NOX三聚体每个时间点N＝6大鼠)，并收集脑组织和血液。将安乐死动物的脑切片并染色，通过分别利用H-NOX的多克隆抗体和哌莫硝唑缺氧标记物的Hydroxyprobe抗体(Hydroxyprobe International)得到H-NOX分布和组织缺氧，用于随后的免疫组织化学分析。利用配备有摄像装置的显微镜拍摄图像，并定量染色。已知缺血和再灌注引发神经元细胞死亡，并产生炎性响应，导致缺血后损伤。作为次级终点，通过如下测量脑组织凋亡：TUNEL测定染色(Roche)和计数TUNEL阳性细胞，和染色凋亡标记物，该凋亡标记物包括酶切半胱天冬酶(Caspase)-1、-3、Bax和Bcl-2。对多个时间点取得的样品进行血液化学分析，以评估炎性标记物的减少和由于使用候选H-NOX三聚体而产生的任何造血性和系统性效果。利用ELISA(Signosis大鼠炎症ELISA试剂盒)和RT-PCR定量来自大鼠血清的包括TNFα、IL-1α、IL-1β、IL-6、MCP-1、Rantes和MIP的促炎性细胞因子的上调。鉴定了渗透到缺血性组织中和显著减少缺氧的候选H-NOX三聚体。
实施例4：H-NOX三聚体在缺血体内小鼠模型中减少梗塞体积和改善神经系统结果。
验证了脑组织渗透和组织缺氧减少的候选H-NOX三聚体在大鼠tMCAO中风啮齿动物模型中被进一步评价，聚焦于缺血和再灌注后长时间点的临床相关评估。主要候选H-NOX三聚体各利用12只一组的雄性Wister大鼠进行测试。在诱导室中用N2O：O2(2：1)中2-3％的异氟烷诱导麻醉，并通过鼻锥体以1-1.5％异氟烷保持。通过无后肢夹撤回和丧失眼盲反射评估麻醉深度适当。动物接受腹膜内注射40mg/kg头孢唑啉钠和0.1mg/kg皮下丁丙诺啡。利用标准缝线系外科技术在第0日开始暂时大脑中动脉阻断。简而言之，在右总颈动脉(CCA)上方制造皮肤切口，以允许暂时夹住CCA和结扎外颈动脉(ECA)的远侧部分。将尼龙缝线通过近侧ECA插入并推入内颈动脉(ICA)，以阻断通向脑的血液流动。移除CCA夹，并用外科缝合钉闭合皮肤切口，并且使动物清醒。在大脑中动脉阻断开始后30分钟，通过尾静脉注射，将750mg/kg剂量的候选H-NOX三聚体或缓冲剂对照灌注到大鼠体内。通过向大鼠提供麻醉，再打开伤口和从ECA移除血管内缝线，然后再次闭合伤口，在H-NOX三聚体灌注后30分钟释放阻断，从而在再灌注前提供总共1小时的阻断。关于神经系统测试，在再灌注后72小时、1周、2周、3周和4周评价每只动物。通过在0-4级上评级来评估动物的神经功能缺损，其中0表示无缺损，1表示不能在放置时伸展前肢，2表示盘旋(circling)，3表示一侧无力，和4表示无自主运动能力，如此前所述。参见Borlongan,C.V.,et al.,(1998)Exp Neurol.,149:310-321，其全部内容被引入本文作为参考。在再灌注后四周，处死动物并收集脑组织，用于H&E染色和随后的组织学分析，以评估梗塞体积。关于梗塞体积测量，通过数码摄像装置拍摄来自各动物脑的七个切片(与前囱相比，分别为+4.7、+2.7、+0.7、-1.3、-3.3、-5.3和-7.3)。利用“间接方法”(完整对侧[左]半球面积-同侧[右]半球完整区域面积)通过Image J定量每个切片的梗塞区域，以校正脑浮肿。切片梗塞面积加和并乘以切片厚度，得到梗塞总体积，其以完整对侧半球体积的百分比表示。测量梗塞体积用于与缓冲剂对照动物比较，并且每组评分通过ANOVA和Newman-Keuls多范围检验(multi range test)进行比较，其中显著性水平为0.05。再灌注后长至4周的长期评估确保任何神经系统功能改善或梗塞体积减少都是来源自H-NOX蛋白的神经保护作用，而非仅仅是因梗塞缓慢形成而导致的神经系统后果发作延迟。
实施例5.H-NOX蛋白在癌症体内小鼠模型中证实了肿瘤渗透和氧合。
氧是增强辐射诱导的DNA损伤和肿瘤杀死的关键因素。实体肿瘤内的低氧水平或缺氧可钝化肿瘤治疗的治疗效果。例如，发现肿瘤低氧区域中放射治疗的有效性比常氧水平的肿瘤区域低三倍。由此，很多患有包含缺氧区域的肿瘤的患者通常对常规肿瘤治疗显示不完全响应，并且具有不良存活预后。已在产生前列腺癌、肉瘤、胰腺癌、头颈癌、宫颈癌和脑癌等的大范围肿瘤中观察了缺氧与不良患者结果的关系。参见Moeller,BJ et al.(2007)Cancer Metastasis Rev 26:241-248；Vaupel,P,(2004)Semin Radiat Oncol,14:198-206；Varlotto,J,et al.(2005)Int J Radiat Oncol Biol Phys,63:25-36；Rockwell,S,et al.(2009)Curr Mol Med.9:442-458；其全部内容均被引入本文作为参考。
为确定H-NOX蛋白渗透肿瘤的能力，6只负有皮下HCT116结肠源性肿瘤小鼠的多个小组通过尾静脉注射750mg/kg H-NOX单体、750mg/kg腾冲嗜热厌氧菌L144F H-NOX三聚体或盐水对照。随后在注射后30分钟或60分钟处死小鼠。将肿瘤切除，切片，用抗H-NOX抗体染色，并成像，得到H-NOX染色强度(图12A)。染色后的HCT-116肿瘤切片的定量证实，23kDa腾冲嗜热厌氧菌L144F H-NOX单体通过30分钟在肿瘤中积累，并通过60分钟呈现部分清除(图12B)。相比之下，80kDa L144F H-NOX三聚体通过30分钟在肿瘤中积累，并在注射后60分钟继续存留在肿瘤中，其中积累在注射后4小时达到峰值(图12B)。在静脉内注射后2小时，H-NOX三聚体从血管系统扩散到肿瘤组织中(图12C)。利用H-NOX抗体和CD31抗体(血管系统标记物，BD Bioscience)进行肿瘤切片的免疫组织化学染色。注射了缓冲剂的小鼠未检测到荧光染色。
为确定H-NOX蛋白是否减少肿瘤缺氧，6只负有皮下HCT116结肠源性肿瘤的小鼠的多个小组通过尾静脉注射750mg/kg L144F H-NOX单体、750mg/kg L144F H-NOX三聚体或盐水对照。在安乐死前，小鼠被通过腹膜内注射给予缺氧标记物哌莫硝唑，和通过静脉内注射给予活性血管系统标记物DiOC73。在H-NOX蛋白注射后30分钟或60分钟收集肿瘤，并通过免疫组织化学以Hydroxyprobe-1单克隆抗体测定哌莫硝唑和以抗CD31抗体测定总血管系统(图13A)。染色后的HCT-116肿瘤切片的定量证明，与对照治疗的小鼠相比，23kDa H-NOX单体在注射后30分钟减少缺氧，但在注射后60分钟缺氧无恢复(图13B)。相比之下，80kDaL144F H-NOX三聚体在注射后30分钟不显示减少缺氧，但在注射后60分钟显著减少缺氧(图13B)。进一步实验验证，在负有皮下HCT116结肠源性肿瘤的小鼠体内，H-NOX单体遍及肿瘤组织分布(图14A，下方图)，并通过抗哌莫硝唑抗体检测到减轻与血管系统远距处的肿瘤缺氧(图14B，下方图)。通过染色量作为与血管系统的距离的函数，定量从六只小鼠分离的肿瘤组织中的低氧探针-1(抗哌莫硝唑抗体)染色。发现在与最接近的血管距离约150μm处，平均低氧探针-1染色从盐水治疗小鼠的约13μM减少至H-NOX单体治疗的小鼠的5μM(图14C)。这些结果在负有小鼠RIF-1肉瘤异种移植物的小鼠中被进一步确认。
负有RIF-1肉瘤肿瘤的小鼠通过尾静脉注射750mg/kg腾冲嗜热厌氧菌L144F H-NOX三聚体或盐水对照。在安乐死前，小鼠通过腹膜内注射被给予缺氧标记物哌莫硝唑。在L144F H-NOX三聚体注射后120分钟收集肿瘤，并通过免疫荧光成像测定H-NOX三聚体分布(图15)，或通过蛋白质印迹以Hydroxyprobe-1单克隆抗体测定哌莫硝唑，以抗HIF-1α抗体测定缺氧诱导性因子1(HIF-1α)，以抗H-NOX抗体测定H-NOX蛋白，和以抗肌动蛋白抗体测定总蛋白(图16)。免疫荧光染色显示了L144F H-NOX三聚体在肿瘤切片中的分布，该肿瘤切片由尺寸约400mm3和800mm3的大分离肿瘤制备(图15)。来自收集的被治疗小鼠的肿瘤的细胞溶解产物的蛋白质印迹分析显示，L144F H-NOX三聚体定位至肿瘤组织，并且这些肿瘤与未治疗小鼠相比具有减少的哌莫硝唑蛋白质加合物(图16A)。蛋白质印迹的定量进一步确认与盐水治疗小鼠相比被治疗小鼠的肿瘤中哌莫硝唑蛋白质加合物水平低以及HIF-1α蛋白水平低(图16B和16C)。
实施例6.H-NOX蛋白在成胶质细胞瘤体内小鼠模型中证实了肿瘤渗透和氧合。
为进一步表征H-NOX蛋白渗入肿瘤组织的能力，利用三个成胶质细胞瘤小鼠模型评估腾冲嗜热厌氧菌L144F H-NOX单体和腾冲嗜热厌氧菌L144F H-NOX三聚体在脑肿瘤中的分布。BT-12细胞——一种高度侵入脊柱的幼儿非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤婴儿脑肿瘤系——被用于生成幼儿成胶质细胞瘤的小鼠模型，GBM-43细胞被用于生成成年成胶质细胞瘤的抗辐射模型，和U251细胞被用于生成成年成胶质细胞瘤的低氧模型。成胶质细胞瘤小鼠模型如此前所述生成。参见Ozawa,T,et al.,(2010)J Vis Exp,Jul 13；(41)，其全部内容被引入本文作为参考。简而言之，收集BT-12细胞、U251细胞或GBM-42细胞，用于颅内注射，并以约1×108细胞/mL的浓度重悬浮于达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco'sModified Eagle Medium，DMEM)。通过腹膜内(IP)注射氯胺酮(100mg/kg)和赛拉嗪(10mg/kg)麻醉小鼠。在第一次切口前以及在程序期间定期通过夹住双足的足垫利用踏板撤回反射(pedal withdrawal reflex)监测麻醉深度。沿头皮制造1cm矢状切口，并暴露颅骨缝合线。通过用25g针穿刺在前囱3mm侧和0.5mm前形成小孔。利用无菌的Hamilton注射器(Stoelting)，将3μl中的3×105细胞经60秒时间注射在3mm深度。注射后，使注射器保持原位1分钟，然后缓慢移出。用3％过氧化氢清洁颅骨，然后用骨蜡密封，然后利用7mm外科缝合钉(Stoelting)闭合头皮。将接受了0.1mg/kg丁丙诺啡皮下注射的小鼠放置在加热垫上并监测，直到其恢复活动能力，以用于这些研究。
为确定L144F H-NOX三聚体是否可渗透脑组织，负有U251正位脑肿瘤的小鼠通过尾静脉注射750mg/kg腾冲嗜热厌氧菌L144F H-NOX单体或750mg/kg腾冲嗜热厌氧菌L144FH-NOX三聚体。在安乐死前，小鼠通过腹膜内注射被给予缺氧标记物哌莫硝唑。关于免疫组织化学分析，在H-NOX蛋白给予后约2小时，将脑分离，切片，并用Hydroxyprobe-1单克隆抗体染色哌莫硝唑，用抗HIF-1α抗体染色缺氧诱导性因子1(HIF-1α)，用抗H-NOX抗体染色H-NOX蛋白，和用抗HLA-ABC抗体(NvusBiological大鼠单克隆抗体克隆#YTH862.2)染色HLA-ABC蛋白。脑组织样品组进一步用二级抗体染色，该二级抗体结合至抗兔抗体，该抗兔抗体结合有Jackson ImmunoResearch制造的FITC(绿色通道)和DAPI，用于免疫荧光成像。H-NOX三聚体治疗的小鼠与对照治疗的小鼠相比显示H-NOX染色增加，表明H-NOX三聚体渗透了脑组织(图17A)。另外，哌莫硝唑的Hydroxyprobe-1单克隆抗体染色减少证明H-NOX三聚体给予在注射后60分钟显著减少缺氧(图17B)。在免疫荧光图像中进一步观察到哌莫硝唑和HIF-1α蛋白的染色减少(图18A和18C)。免疫荧光图像的定量显示，与盐水治疗的小鼠相比，L144F H-NOX三聚体治疗的小鼠的肿瘤的低水平哌莫硝唑染色以及低水平HIF-1α蛋白染色(图18B和18D)。
图19显示H-NOX三聚体在U251正位脑肿瘤和健康脑中的生物分布。高放大率下的H-NOX三聚体荧光成像显示健康脑中血管外的弱扩散。
为在腾冲嗜热厌氧菌L144F H-NOX单体和腾冲嗜热厌氧菌L144F H-NOX三聚体之间比较渗透和保留时间，负有正位脑肿瘤的小鼠通过尾静脉注射750mg/kg Alexa-647标记的H-NOX单体或750mg/kg Alexa-647标记的H-NOX三聚体，并在不同时间点进行生物发光成像。Alexa-647标记的H-NOX蛋白被生成，以确认荧光标记的H-NOX蛋白的如下荧光激励和发射光谱。
将纯化蛋白、H-NOX单体蛋白、H-NOX三聚体或BSA(Sigma，用作对照)在冰上解冻，并利用无内毒素透析盒(Pierce Slide-A-Lyzer，7kDa MWCO)，缓冲剂交换到无内毒素的标记缓冲剂(Labeling Buffer)(50mM HEPES，50mM NaCl，pH 8.0)中。通过UV-vis光谱确定透析到标记缓冲剂后的蛋白质浓度。Alexa 647染料(Alexa
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647羧酸，琥珀酰亚胺酯，Invitrogen#A-20006)在添加至标记反应前夕制备。使染料升温至室温，然后溶解在DMSO中，最终浓度为10mg/mL。将混合物涡旋10秒，然后将染料添加至各标记反应。标记反应采用一定范围的蛋白质：染料比例，以控制Alexa标记程度。反应由蛋白质(在标记缓冲剂中)和染料组成，最终DMSO浓度为5-10％。反应在室温下温育1小时(避光)，伴以温和振荡。反应后，利用无内毒素透析盒(Pierce Slide-A-Lyzer，7kDa MWCO中止(cutoff))，通过广泛透析到无内毒素配制缓冲剂(30mM三乙醇胺，50mM NaCl，pH 7.4)中，去除游离Alexa染料。
透析到配制缓冲剂中后，利用H-NOX(280和415nm)和Alexa染料(653nm)的固有吸光度，通过UV-vis光谱确定蛋白质浓度和标记程度，从而确定标记后染料与蛋白质的摩尔比。通过在647nm下的激励，分析被标记的蛋白质的荧光，从而收集发射光谱。被标记的蛋白质的发射光谱与公开数据和Invitrogen数据一致。通过尺寸排阻色谱进一步分析被标记的蛋白质，以确保标记不影响蛋白质的寡聚状态。利用Charles River LAL Gel Clot测定(0.03EU/mL灵敏度)，确定被标记的蛋白质的最终内毒素污染。
关于生物发光成像，通过IP注射氯胺酮(100mg/kg)和赛拉嗪(10mg/kg)麻醉小鼠，然后通过IP注射溶解在无菌盐水中的33.3mg D-荧光素(钾盐，Gold Biotechnology,St.Louis,MO,USA)。在荧光素注射后10分钟，利用IVIS Lumina系统(Caliper LifeSciences，Alameda，CA，USA)和LivingImage软件，确定肿瘤生物发光，其为通过25％峰像素强度的下阈值限定的目标区域的每秒光子计数总和。成像获得是非侵入性的，并且利用被加热的成像平台保持动物体温。关于用H-NOX单体或H-NOX三聚体治疗的BT-12小鼠，成像在注射后0、0.5、1、2和4hrs进行。关于用H-NOX单体或H-NOX三聚体治疗的GBM-41小鼠，成像在注射后0、0.5、1、2、4和6hrs进行。关于用H-NOX单体或H-NOX三聚体治疗的U251小鼠，成像在注射后0、0.5、1、2、4、6和72hrs进行。之前已显示肿瘤生物发光与负有正位GB异种移植物的小鼠体内的肿瘤体积成正例。参见Moeller,BJ et al.,(2007)Cancer Metastasis Rev,26:241-248，其全部内容被引入本文作为参考。H-NOX单体与三聚体生物分布的比较显示，在成胶质细胞瘤BT-12小鼠模型中，L144F H-NOX单体(图20A)和L144F H-NOX三聚体(图20B)均渗透脑肿瘤。与H-NOX单体相比，H-NOX三聚体在肿瘤具有明显较长的保留时间。HNOX单体通过2小时大部分从肿瘤清除(图20A)，但H-NOX三聚体在肿瘤中持续积累数小时(图20B)。通过从小鼠分离的脑组织的离体成像，确定了注射H-NOX单体后30和60分钟(图21A和18B)和注射H-NOX三聚体后60分钟(图21C)的H-NOX颅内定位。注射后30、60、120和240分钟生物发光的进一步可视化显示，H-NOX单体(图22)和H-NOX三聚体(图23)也定位至脊柱中的转移群体。虽然与H-NOX三聚体(图23A)相比，H-NOX单体在30分钟时在脊柱中显著积累(图22A)，但其通过2小时被大部分消除(图22B-D)，而H-NOX三聚体在脊柱中持续积累数小时(图23B-D)。通过使用较少量的被标记的蛋白质和增加信号强度，揭示了H-NOX单体随时间过去在肾脏中积累，启示了一种消除途径(图24)。
在GBM-43(图25)和U251小鼠模型中验证了L144F H-NOX三聚体在脑和脊柱中的积累(图26)。在注射了295mg/kg的较高H-NOX三聚体剂量和30mg/kg的较低剂量的U251小鼠中进一步考察了L144F H-NOX三聚体的定位。注射后第0、0.5、1、2、4和6hr的生物发光成像显示，高浓度和低浓度H-NOX三聚体给予(分别为图27和28)均在小鼠脑肿瘤中积累L144F H-NOX三聚体。相比之下，由H-NOX单体L144F变体组装的H-NOX三聚体的定位不在小型脑肿瘤中积累，如通过注射30mg/kg(图29)后0、0.5、1、2、4和6hr的生物发光图像证明。从30mg/kgL144F H-NOX三聚体(图30A)或750mg/kg L144F三聚体(图30B)治疗的小鼠分离的脑的离体生物发光成像显示，单个剂量中的H-NOX蛋白量对H-NOX至颅内肿瘤的定位影响极小。此外，负有大型(图30C)或小型肿瘤(图30D)的小鼠的实时生物发光成像显示，在给予295mg/kgL144F H-NOX三聚体后，三聚体不论肿瘤尺寸地分布至颅内肿瘤(图30B)。三个成胶质细胞瘤小鼠模型GBM、U251和BT-12的实时和离体生物发光成像显示，L144F H-NOX三聚体在全部三个模型中分布至颅内肿瘤和脊柱肿瘤(图31和32)。用H-NOX蛋白和血管系统的抗体染色的肿瘤切片的免疫荧光成像显示，L144F H-NOX三聚体留在血管系统中和扩散遍及脑肿瘤(图33)。总体上，这些数据通过临床相关肿瘤生物分布特征鉴定了H-NOX蛋白。
为检验H-NOX三聚体在血浆和脑之间的划分，利用三只雌性FVB小鼠(图34)为一组，测试L144F三聚体。将候选H-NOX三聚体以200和750mg/kg的剂量通过静脉内弹丸注射在0时注入尾静脉。在候选H-NOX三聚体或缓冲剂对照注射后30min、1hr、1.5hr和2hr，处死小鼠。通过心脏内穿刺收集约1ml血液，并收集脑。处理收集的血液，得到血浆，并溶解脑样品以提取蛋白质。随后通过抗H-NOX蛋白多克隆抗体利用ELISA分析分析血浆和脑是否存在H-NOX三聚体。
实施例7.H-NOX三聚体增强辐射在成胶质细胞瘤体内小鼠模型中的效果。
为确定由H-NOX渗透导致的低氧肿瘤的氧合是否可增强辐射引起的肿瘤杀死，以10只负有颅内成胶质细胞瘤肿瘤的无胸腺U251小鼠的多个小组进行研究，评价放射治疗(RT)在H-NOX三聚体存在下的效果。在给予或不给予通过静脉内注射输送的750mg/kgAlexa-647标记的腾冲嗜热厌氧菌L144F H-NOX三聚体的情况下，通过三部分的放射治疗来治疗小鼠，每部分为2Gy，在肿瘤植入后15、17和20日进行。小鼠被监测长至29日，并在第15、17、20、22、24和29日进行生物发光成像。每个治疗组确定的平均生物发光成像(BLI)评分显示，多剂量的L144F H-NOX三聚体导致统计学显著的肿瘤生长延迟(图35A和35B)，并且不管被治疗的U251正位肿瘤是重度还是轻度低氧性质，L144F H-NOX治疗组中的动物存活率也得到增加(图35C)。同样收集肿瘤用于免疫组织化学染色和分析。
在两个负有颅内成胶质细胞瘤肿瘤的小鼠模型U251和GBM43中进一步考察腾冲嗜热厌氧菌L144F H-NOX三聚体对人成胶质细胞瘤放射治疗的影响。在一个研究中，10只负有颅内成胶质细胞瘤肿瘤的雌性无胸腺U251小鼠的多个小组通过下列治疗：1)仅治疗缓冲剂、2)治疗缓冲剂组合单剂量的2Gy辐射(辐射器设定＝0.81；辐射铯的施用速率为247CGy/min)、3)仅750mg/kg L144F H-NOX三聚体IV或4)L144F H-NOX三聚体组合单剂量的2Gy辐射(辐射器设定＝0.81；辐射铯的施用速率为247CGy/min)。接受组合治疗的小鼠在脑幕上部分处输送L144F H-NOX三聚体后被辐射2小时。所有小鼠的治疗在小鼠颅内注射3.0×105U251细胞后14日开始。发现接受L144F H-NOX三聚体和2Gy辐射组合治疗的小组中动物存活率增加(图36A)。在另一研究中，10只负有颅内成胶质细胞瘤肿瘤的GBM43小鼠的多个小组通过下列治疗：1)2Gy放射治疗；2)4Gy放射治疗；3)8Gy放射治疗；4)2轮4Gy放射治疗；5)4Gy放射治疗组合L144F H-NOX三聚体；或6)治疗缓冲剂。接受组合治疗的小鼠在H-NOX三聚体输送后被辐射1至1.5小时，并且接受多剂量RT的小鼠的RT给予间隔4日。所有RT小组在脑的幕上部分处给予辐射治疗。所有小鼠的治疗在肿瘤植入后7日开始。发现接受L144F H-NOX三聚体和4Gy辐射组合治疗的小组的动物存活率类似于接受单独4Gy治疗的小组的动物存活率(图36B)。
实施例8.H-NOX蛋白的毒理学测试。
为评估在IND启用毒理学研究预测中H-NOX单体的安全性特征，在FDA委托的独立合同研究组织(MPI研究实验室(MPI Research Laboratories))进行Sprague-Dawley大鼠的初步GLP类毒理学研究。100和300mg/kg剂量的腾冲嗜热厌氧菌L144F H-NOX单体注射(IV)后48小时没有检测到不利事件或与对照的差异。在1000mg/kg最大可行剂量下，观察到一些轻微的毒性标志(表4)。在48小时升高的血液白细胞计数可能是因为蛋白质制剂中存在的痕量内毒素，并且这些水平在生产环节下降100倍，以进一步研究。在单独的研究中，大鼠被注射50mg/kg L144F H-NOX单体或L144F H-NOX三聚体，并且贯彻(followed out)到第32日。IgM和IgG抗治疗剂抗体生成，但无过敏性休克事件，不论是H-NOX变体还是多剂量(测试上至4剂量)。
表4.H-NOX单体在大鼠体内被良好耐受。
Figure GDA0001939256630000771
实施例9.成胶质细胞瘤体内动物模型中最少H-NOX三聚体用药安排的表征。
为最佳地展示IND启用毒性研究和临床研究的设计，利用U251成胶质细胞瘤小鼠模型描述主要H-NOX三聚体的剂量水平和安排。在另外的成胶质细胞瘤动物模型中验证这些研究的结果，从而最佳地展示患者选择。
确定增强RT的主要H-NOX三聚体的最小有效剂量
为最小化接受主要H-NOX三聚体的患者体内的不利事件和定量主要H-NOX三聚体在氧合和放射增敏肿瘤中的药效动力学(PD)，确定U251成胶质细胞瘤小鼠模型中H-NOX三聚体的最小有效剂量(MED)。初步研究显示，750mg/kg剂量的H-NOX三聚体在给予后2小时造成肿瘤缺氧显著减少(图17A和17B)，并且这个效果足以明显增强肿瘤对RT的响应(图35)。其他异种移植物肿瘤研究显示，H-NOX三聚体在低至10mg/kg的剂量下在肿瘤中积累，建立宽可能范围的有效剂量。为确定H-NOX三聚体的MED，利用7.5mg/kg至750mg/kg范围的剂量增强肿瘤的RT响应。
为确定H-NOX三聚体的MED，比较75mg/kg和7.5mg/kg剂量与此前建立的750mg/kg的有效剂量的放射增敏效果(表5)。利用荧光素酶修饰的U251人GB细胞系，测试针对GB正位小鼠模型的效力。一组10只小鼠用于通过生物发光成像跟踪肿瘤生长和跟踪存活率。再有三组3只小鼠分别用于考察H-NOX三聚体作用的背后的分子机制，包括通过免疫组织化学和定量ELISA考察H-NOX三聚体定位，利用EF5作为缺氧标记物通过免疫组织化学考察肿瘤氧合，和利用γH2AX染色通过免疫组织化学评估DNA损伤(表5)。
关于这些研究，将U251细胞以约1×108细胞/mL的浓度重悬浮于达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)中。通过腹膜内(IP)注射氯胺酮(100mg/kg)和赛拉嗪(10mg/kg)麻醉无胸腺小鼠。沿头皮制造1cm矢状切口，并通过用25g针穿刺在前囱3mm侧和0.5mm前形成小孔。利用无菌Hamilton注射器(Stoelting)，将3μl体积的3×105细胞经60秒时间注射在3mm深度。注射后，移出注射器，并用骨蜡密封颅骨，然后利用7mm外科缝合钉(Stoelting)闭合头皮。参见Ozawa,T et al.,(2010)J Vis Exp,Jul 13；(41)。小鼠接受皮下注射0.1mg/kg丁丙诺啡并被监测，直到其重获活动能力。在肿瘤植入后第21和25日之间，在RT前2小时通过尾静脉注射给予每组指示剂量的H-NOX三聚体，RT以2Gy/剂给予至整个幕上脑(表6)。关于全脑RT给予，使用输送约280cGy/min剂量速率的137Cs来源，并且辐射小鼠以产生2Gy的时间长度。
表5.H-NOX三聚体剂量降阶研究组
Figure GDA0001939256630000791
所有RT安排由每周3剂的2Gy/剂组成。
在整个研究过程中通过生物发光成像监测非侵入性肿瘤生长。关于生物发光成像，通过IP注射氯胺酮(100mg/kg)和赛拉嗪(10mg/kg)麻醉小鼠，然后其被通过IP注射溶解在无菌盐水中的33.3mg D-荧光素(钾盐，Gold Biotechnology,St.Louis,MO,USA)。利用IVIS Lumina系统(Caliper Life Sciences，Alameda，CA，USA)和LivingImage软件，确定荧光素注射后10分钟的肿瘤生物发光，其为通过25％峰像素强度的下阈值限定的目标区域的每秒光子计数总和。关于存活率分析，小鼠在体重减少多于15％时或在观察到神经功能缺损时被处以安乐死(N效力，表5)。
为考察肿瘤氧合或缺氧减少和H-NOX三聚体在肿瘤中的定位，每个剂量组的三只小鼠通过IV注射10mM EF5——缺氧临床生物标记物，并在RT后被立即处死，进行全脑切片的IHC分析(N缺氧和H-NOX三聚体IHC，表5)。另外组的三个小鼠在RT后被立即处死，并切除肿瘤，通过定量ELISA进行H-NOX三聚体含量分析(NH-NOX三聚体ELISA，表5)。在RT完成后2小时，另外组的三个小鼠被处死，通过全脑切片的γH2AX IHC进行DNA损伤分析(NDNA Damage IHC，表5)。关于RT效力分析和缺氧、肿瘤定位和DNA损伤的分子分析，通过ANOVA和随后成对t检验进行统计学分析，并将P≤0.05的变化视作统计学显著的。关于存活率分析，采用时序检验(其中双尾α等于0.05——88％功率(power))检测1.5的效应规模(effect size)。效应规模被定义为平均存活率之差除以处理中的标准偏差。
主要H-NOX三聚体的相关停留时间和具有放射增敏作用的肿瘤氧合
为更好地展示H-NOX三聚体的目标临床特征，考察了H-NOX三聚体在肿瘤中导致放射增敏的氧合作用的寿命。基于H-NOX三聚体的颅内肿瘤定位峰值时间框，在一定范围的时间点给予RT(图26)，并且利用H-NOX三聚体的MED，改变H-NOX三聚体给予和RT之间的时间长度(表6)。类似于确定H-NOX三聚体MED的研究，评价几个药效动力学参数，如肿瘤组织中的H-NOX三聚体分布、缺氧减少、DNA损伤、肿瘤生长延迟和总体存活率增加。
表6.放射增敏研究的长度小组
Figure GDA0001939256630000801
所有RT安排由每周3剂的2Gy/剂组成。
GB其他分类中H-NOX三聚体介导的放射增敏再现性
关于H-NOX三聚体介导的放射增敏，对三个分子定义的临床GB子类进行研究。衍生自这三个子类的细胞系(GBM43、GBM6和GBM14)的异种移植物模型如此前所述建立。参见Verhaak et al.,(2010)Cancer Cell,17:98-110和Phillips et al.,(2006)CancerCell,9:157-173。简而言之，关于生成这些三种小鼠模型，用手术刀切碎这三种癌类的皮下肿瘤，并经历三轮通过40μm孔过滤器，并且在每轮过滤后以158×g，355×g，631×g的渐增速度各离心10分钟。在最后一轮离心后，将细胞重悬浮于1mL无菌DMEM介质，计数，并稀释至1×108细胞/mL，用于颅内注射。另外，在GB免疫感受态模型(GL261)中研究H-NOX三聚体介导的放射增敏，该模型复制了GB患者的完整免疫系统。关于GL261小鼠模型的生成，肿瘤细胞收集和注射类似于U251模型利用C57BL/6小鼠同系基因型的小鼠GB细胞系进行。参见Newcomb et al.,(2006)Cell Cycle,(5):93-99。关于效力测试，每个肿瘤模型使用四个实验组(表7)。如同U251模型，治疗开始在肿瘤模型75％完成时进行，通过反映100％完成的存活率的平均天数。类似于确定H-NOX三聚体MED的研究，评价药效动力学参数，如肿瘤组织中的H-NOX三聚体分布、缺氧减少、DNA损伤、肿瘤生长延迟和总体存活率增加。
表7.其他GB模型研究小组
Figure GDA0001939256630000811
所有RT安排由每周3剂的2Gy/剂组成。
实施例10.成胶质细胞瘤体内动物模型中H-NOX三聚体单剂量毒性的药效动力学表征。
为证明IND启用GLP毒性研究的物种选择和展示1b期临床试验，探索性非GLP毒性和GB PD研究在大鼠(啮齿动物)和犬(非啮齿动物)中进行。由于H-NOX三聚体不与人特异性靶结合或反应，非灵长类物种对于FDA是可接受的。
大鼠的非GLP单剂量范围毒性研究
为确定H-NOX三聚体的最大耐受剂量(MTD)和表征毒性和毒性动力学(TK)特征，进行Sprague-Dawley(SD)大鼠的非GLP单剂量研究。
至少6至8周龄的雄性和雌性SD大鼠被分配给5个研究组(表8)。每只动物通过尾静脉中缓慢IV弹丸注射(4-5分钟)给予接受上至10mL/kg体积的介质或H-NOX三聚体。一组动物以每剂之间3日的时间用药。H-NOX三聚体剂量水平的范围为大约MED至最大可行剂量。用药后定期采集血浆样品，以评价H-NOX三聚体的血浆药代动力学(PK)。毒性动力学分析的时间点基于PK结果。剂量基于动物最近体重按体积计给予。在选择下一个剂量前，考虑临床观察结果、体重、采食量和临床病理(表9)。上至14日的恢复期允许评估任何毒性事件的存留、延迟发生和恢复。
表8.大鼠单剂量毒性研究小组
研究小组 H-NOX三聚体剂量 N<sub>雄性</sub> N<sub>雌性</sub> N<sub>毒性动力学雄性</sub> N<sub>毒性动力学雌性</sub>
1 介质 2 2 3 3
2 低剂量 3 3 6 6
3 中剂量 3 3 6 6
4 高剂量 3 3 6 6
5 更高剂量 3 3 6 6
表9.大鼠单剂量毒性研究的测量和观察
Figure GDA0001939256630000821
Figure GDA0001939256630000831
评价GB大鼠模型中的H-NOX三聚体肿瘤分布和PD
为验证H-NOX肿瘤分布和缺氧减少在大鼠和小鼠中相似，评价H-NOX三聚体在大鼠9L神经胶质瘤模型中的肿瘤分布和PD。为生成大鼠9L神经胶质瘤模型，如此前描述在Wistar大鼠颅内植入9L神经胶质瘤细胞。参见Stojiljkovic et al.,(2003)J.Neurooncol,(63):1-7。简而言之，收集用于通过单层胰酶消化进行颅内注射的大鼠神经胶质瘤细胞系9L细胞，并重悬浮于5μL、4×104细胞浓度的DMEM。通过IP注射10mM氯胺酮和7.5mg/kg赛拉嗪诱导麻醉。沿头皮制造2cm矢状切口，并利用小牙钻(dental drill)在前囱3mm侧和0.5mm前生成钻孔。利用无菌Hamilton注射器(Stoelting)，将10μl的5×105细胞经60秒时间注射在4.5mm的深度。注射后，移出注射器，并利用骨蜡密封颅骨，然后利用7mm外科缝合钉(Stoelting)闭合头皮。将H-NOX三聚体利用27g针通过尾静脉注射以不超过10mL/kg的用药体积给予大鼠。H-NOX三聚体给予后1小时，大鼠通过IV接受10mM剂量的缺氧标记物EF5。H-NOX给予后2小时，将大鼠处以安乐死，并收集负有肿瘤的脑，通过免疫组织化学分析进行H-NOX三聚体定位和缺氧定量或通过ELISA进行H-NOX三聚体定量(表10)。
表10.大鼠H-NOX三聚体生物分布和氧合研究小组。
研究小组 N<sub>缺氧和H-NOX三聚体IHC</sub> N<sub>H-NOX三聚体ELISA</sub>
介质 3 3
H-NOX三聚体–低剂量 3 3
H-NOX三聚体–中剂量 3 3
H-NOX三聚体–最大耐受剂量 3 3
犬体内非GLP单剂量范围毒性研究
在比格犬(Beagle dogs)中考察H-NOX三聚体的毒性和毒性动力学。简而言之，至少5月龄的雄性和雌性比格犬被分配至4个用药组(表11)。H-NOX三聚体剂量水平的范围为大约MED——作为此物种的计算相当量(calculated equivalent)——至最大可行剂量。每只动物通过经由头静脉缓慢IV弹丸注射接受H-NOX三聚体。在用药后定期采集血浆样品，以评价血浆H-NOX三聚体的药代动力学(PK)。毒性动力学分析的时间点基于PK结果。剂量基于动物最近体重按体积计给予。在选择下一剂量前考虑临床观察结果、体重、采食量和临床病理(表12)。长至14日的恢复期允许评估任何毒性事件的存留、延迟发生和恢复。利用GraphPad Prism(版本4.03)进行统计学分析。在每个相应的数据分析时间点，利用参数型(例如，方差重复测量分析，然后Dunnett多次比较t检验)或非参数型(例如，Friedman检验和Dunn事后检验)统计学程序，在介质和H-NOX三聚体研究小组之间进行比较。参数型或非参数型统计学的选择基于比较组是否满足标准方差同质性。p<0.05时表示介质和H-NOX三聚体治疗之间有差异。
表11.犬体内单剂量毒性研究小组
Figure GDA0001939256630000841
表12.犬体内单剂量毒性研究的测量和观察
Figure GDA0001939256630000842
评价GB犬模型中的H-NOX三聚体肿瘤分布和PD
为确定啮齿动物GB模型中显示的肿瘤分布和氧合代表了类似于人肿瘤的肿瘤，进行GB犬的1b期样试验，以测量自发性脑肿瘤中的H-NOX三聚体积累和定量缺氧变化——利用临床相关的实时缺氧PET探针(可使用PET探针；例如，18F-MISO的18F-EF5)。十只客户拥有的患有自发性GB的犬(client-owned dogs)(在本文中被称为“犬患者”)入选研究。总体而言，犬患者接受单剂量的H-NOX三聚体，附带前后18F-EF5PET扫描，以评价H-NOX三聚体治疗造成的任何肿瘤缺氧变化。在H-NOX三聚体给予前，从研究剔除不具有低氧肿瘤(定义为肿瘤：正常脑比例为2.0)的犬。具有充分低氧肿瘤的犬患者被安排在最初PET扫描后不少于72小时用H-NOX三聚体治疗。H-NOX三聚体的给予为弹丸IV注射，用药体积不超过10mL/kg。H-NOX三聚体剂量水平始于MED，并且按照3+3剂量递增设计递增。剂量递增在3剂量水平后或在一只或多犬体内达到剂量限制性毒性时停止。在H-NOX-三聚体给予后2小时，犬患者进行第二次PET扫描，并且对肿瘤缺氧评分。关于PET扫描，在麻醉前停食12小时。将静脉内导管置于每只犬患者，并利用10-25mg/kg硫喷妥(thiopental)或6mg/kg异丙酚(propofol)诱导麻醉和利用氧气中1-5％的异氟烷保持麻醉。麻醉诱导后立刻给予18F-EF5，并在18F-EF5给予后1小时启动PET/CT扫描。关于进行手术(作为医疗标准的部分)的犬患者，切除肿瘤的部分被留用于H-NOX三聚体含量分析。为评价H-NOX三聚体肿瘤定位，利用H-NOX蛋白和哌莫硝唑的抗体，通过定量IHC或ELISA，评价切除的肿瘤。在用药前和在H-NOX三聚体给予后24小时、48小时和14日获得少量全血，用于安全性参数如最大耐受剂量的分析，和测定是否存在抗治疗剂抗体。在用药前和用药后14日获取安全性数据。另外的缺氧生物标记物被用于本研究，如(二乙酰基-双(N4-甲基硫代缩氨基脲))铜(II)(64Cu-ATSM)。
犬体内H-NOX三聚体介导的放射增敏
利用来自犬体内单剂量毒性研究的信息，在这些动物中进一步研究H-NOX三聚体介导的放射增敏。至少5月龄的雄性和雌性比格犬被分配给用药组，该用药组由伴有或不伴有单部分8Gy的高剂量放射治疗的H-NOX三聚体或介质治疗组成。切除这些犬患者的肿瘤，用于H-NOX三聚体含量分析。关于H-NOX三聚体肿瘤定位，利用H-NOX蛋白和哌莫硝唑的抗体，通过定量IHC或ELISA，评价切除的肿瘤。另外的缺氧生物标记物被用于本研究，如64Cu-ATSM。
实施例11.H-NOX三聚体的GMP产生。
考察了H-NOX三聚体的发展，包括cGMP产生、GLP安全性测试和实现FDA批准开始临床试验所需的调控制备。
候选H-NOX三聚体的GMP生产
生产了大量(例如，千克量)GMP蛋白，以支持毒理学测试、大鼠和犬PD研究和临床试验。本文提供了生长细胞和产生GMP细胞库所需的细胞系、质粒和培养物生长条件。本文还提供OD高达115的4L发酵生产H-NOX三聚体的方法。本文进一步提供H-NOX三聚体蛋白质纯化方法，其可从12L细胞培养物生成上至1g纯化H-NOX三聚体蛋白。本文还提供H-NOX三聚体的定性控制测定，包括但不限于，SDS-PAGE、UV/Vis光谱分析、LC-MS、分析型SEC、SEC-HPLC、内毒素测试、颗粒过滤测试、病毒污染测试和有效氧释放速率。本文进一步提供H-NOX三聚体的生产系统，包括但不限于微反应器系统、工艺规模设备、泵和过滤器。H-NOX三聚体在发布用于临床前和临床研究前进行QC/QA检验和验证。
大鼠和犬体内H-NOX三聚体的GLP毒性测试
GLP毒性研究按照ICH指导S6(R1)和S9进行。根据ICH指导，在啮齿动物(Sprague-Dawley大鼠)和非啮齿动物(比格犬)物种中进行毒理学测试。关于大鼠7日重复剂量研究，雄性和雌性Sprague-Dawley大鼠被分配至四个治疗组(表14)。H-NOX三聚体剂量水平的范围为大约MED至最大可行剂量或最大耐受剂量。每只动物通过在尾静脉中以上至10mL/kg的体积缓慢IV弹丸给予接受介质或H-NOX三聚体。剂量基于动物的最近体重按体积计给予。动物被每日一次连续7日用药。选定末期尸检的动物(上至前10只大鼠/性别/小组)在第8日进行尸检。选定恢复尸检的动物(上至后5只大鼠/性别/小组)经历7日用药，然后7日恢复，并在第15日进行尸检，以评价H-NOX三聚体的毒性和毒性动力学。监测标准毒性参数，包括重要器官(呼吸、心血管和中枢神经系统)的评估(表15)。
表14.大鼠GLP毒性研究小组
Figure GDA0001939256630000861
Figure GDA0001939256630000871
表15.大鼠GLP毒性研究的测量和观察
Figure GDA0001939256630000872
关于犬7日重复剂量研究，至少5月龄的雄性和雌性纯种比格犬被分配至4个小组(表16)。H-NOX三聚体剂量水平的范围为大约MED至最大可行剂量或最大耐受剂量。每只动物通过在头静脉中以上至10mL/kg的体积缓慢IV弹丸给予接受介质或H-NOX三聚体。动物被给予介质或H-NOX三聚体一日一次，连续7日。选定末期尸检的动物(上至前3只犬/性别/小组)在第8日仅尸检。选定恢复期尸检的动物(上至后2只犬/性别/小组)经历7日用药，然后7日恢复，并在第15日进行尸检，以评价H-NOX三聚体的毒性和毒性动力学。监测标准毒性参数，包括重要器官(呼吸、心血管和中枢神经系统)的评估(表17)。通过监测用药期期间的心电图(ECGs)评价心脏安全性，作为本研究一部分。
表16.犬体内GLP毒性研究小组
Figure GDA0001939256630000881
表17.犬体内GLP毒性研究的测量和观察
Figure GDA0001939256630000882
此外，由于H-NOX三聚体是新型蛋白质治疗剂，进行犬的独立心脏安全性研究，以监测对心脏功能和血管活性的影响。四只之前植入了无线电遥测装置(DSI：TL11M2-D70-PCT)的非天然雄性比格犬(9至18kg)被通过IV弹丸注射用药。利用递增或Latin Square用药方案给予该犬介质和3剂量水平的H-NOX三聚体(表18)。每只动物每周一次(用药期第1、8、15和22日)接受4个剂量中的1个剂量(以预先确定的顺序)。基于此前在犬中进行的研究来选择剂量。在用药日频繁观察所有动物的H-NOX三聚体或介质的反应临床相关标志，然后在研究的生存期(in-life phase)期间每日至少一次观察笼边(cage side)。记录血液动力学参数(动脉血压，心率，和铅II心电图[ECG])。记录在用药前至少1小时开始，并在用药后继续至少24小时。评价的参数包括；收缩、舒张和平均动脉血压、心率、PR、QRS、QT和RR间隔、QRS持续时间和QTcVW和QTcI校正的QT间隔(表19)。目视检查数据的准确性，并且基于测试制品药代动力学将10个预定时间点的数值列表。增加所有ECG波形节律干扰和波形形态的目视检查。利用Graph Pad Prism(版本4.03)进行血液动力学和ECG数据的统计学分析。在每个相应的数据分析时间点，利用参数型(例如，方差重复测量分析，然后Dunnett多次比较t检验)或非参数型(例如，Friedman检验和Dunn事后测试)统计学程序，在介质和H-NOX三聚体治疗组之间进行比较。参数型或非参数型统计学的选择基于比较组是否满足标准方差的同质性。p<0.05表示介质和H-NOX三聚体治疗之间有差异。
表18.犬心血管遥测研究小组
Figure GDA0001939256630000891
表19.犬心血管遥测研究的测量和观察
Figure GDA0001939256630000901
实施例11.H-NOX三聚体在成胶质细胞瘤患者中应用的1期临床试验。
进行1b期研究，以评估复发GB患者中的H-NOX三聚体安全性、肿瘤中生物分布和缺氧减少。进行第二个1b期研究，以评估新诊断患有GB的患者中的H-NOX三聚体安全性。
复发GB患者的1b期试验
第一个1b期试验是复发GB患者的单剂量目标终点递增研究，该复发GB患者是第二切除术的候选者。此研究提供关于选择在临床相关群体中的剂量水平和给予方式的方向。研究包括20个符合入选和淘汰标准的复发GB患者。
入选标准：
1.打算接受重复切除术(作为医疗标准的部分)的具有复发GB成像迹象的患者是合格的。
2.如果原来的组织学诊断是低级神经胶质瘤并且后来的组织学诊断是GB，则患者是合格的。
3.所有患者必须签署知情同意书，表示其清楚本研究的考察性质。患者必须已经签署其受保护健康信息的公布授权书。患者必须在用研究药物治疗前登记数据库。
4.患者必须为18岁或以上，并且预期寿命>8周。
5.患者必须具有>60的Karnofsky表现状态。
6.在登记时：患者必须已经从在前治疗的毒性效应恢复：脱离任何研究试剂>28日，脱离在前细胞毒性治疗>28日，脱离长春新碱>14日，脱离亚硝基脲类>42日，脱离甲基苄肼给予>21日，和脱离非毒性毒性试剂(例如，干扰素、他莫昔芬(tamoxifen)、沙利度胺(thalidomide)、顺式维甲酸(cis-retinoic acid)等)>7日。任何与非毒性毒性试剂的限定有关的问题应询问研究主席。
7.患者必须在开始治疗前具有适当的骨髓功能(WBC>3,000/μl，ANC>1,500/mm3，血小板计数>100,000/mm3，和血红蛋白>10gm/dl)、适当的肝功能(SGOT和胆红素<2倍ULN)和适当的肾功能(肌酸酐(creatinine)<1.5mg/dL)。这些测试必须在登记前14日内进行。血红蛋白的合格水平不可通过输注达到。
8.患者必须已经通过MRI或CT显示出肿瘤进程的明确放射照像证据。扫描应在登记前14日内并且类固醇剂量已稳定至少5日的基础上进行。如果类固醇剂量在成像日和登记日之间增加，则需要新的基线MR/CT。治疗方案全程必须使用相同的扫描类型，即，MRI或CT，以进行肿瘤测量。
9.患者可已经接受过针对任何数量的在前复发的治疗。
10.有生育能力的女性必须在登记前14日内记档阴性B-HCG妊娠测试。
淘汰标准：
1.患者必须没有接受过利用贝伐单抗(Avastin)、其他VEGF或VEGFR试剂或被认为是抗血管生成试剂的其他试剂在前治疗。
2.任何具有低的低氧分数(SUV肿瘤/SUV小脑比为2.0)的PET证据患者被淘汰。
3.任何处于抗高血压药物治疗中的患者被淘汰。
4.患者必须未患有任何显著的、研究人员认为无法通过适当的治疗来适当控制或会有损患者耐受本治疗的能力的医学疾病。
5.有任何其他癌症(除非黑素瘤皮肤癌或宫颈原位癌外)历史的患者——除非完全缓解并且脱离该疾病的所有治疗最少3年——是不合格的。
6.患者必须不患有活跃感染或严重的间发性医学疾病。
7.患者必须不患有任何掩盖毒性或危险地改变药物代谢的疾病。
本研究中的患者只接受H-NOX三聚体，无其他同步治疗。有四个剂量水平，其中确切的剂量水平由临床前毒理学研究中认定为良好耐受的水平来确定，并且按照3+3设计递增。停止点和剂量递增主要基于缺氧减少，因为单剂量的H-NOX三聚体被预期具有低毒性。基于H-NOX蛋白的初步毒性测试，预期极少或无毒性与H-NOX三聚体相关。然而，如果观察到剂量限制毒性(DLT)，则要立即改变递增标准，以基于DLT和递增规律(基于标准3+3设计)。用于研究的DLT被限定为下列可归因于H-NOX三聚体的事件中的任意种：
1.三级血小板减少
2.四极贫血和/或4级中性粒细胞减少
3.任何非血液3级毒性，不包括秃发。
为评价H-NOX三聚体的生物学活性，患者在H-NOX三聚体施用前72小时接受18F-EF5PET扫描。PET扫描允许定量低氧分数，表征为肿瘤的标准摄取值(SUV)与小脑(正常脑)的SUV的比，并且建立手术前肿瘤缺氧的基线水平。具有低水平缺氧(限定为肿瘤：正常脑比例在2.0以下)的患者被淘汰。充分低氧肿瘤患者静脉内接受单剂量的H-NOX，并且在H-NOX三聚体施用后2小时接受第二个18F-EF5PET扫描，以评估低氧分数的变化。评分第二个PET扫描，并记录任何相对于基线的变化。至少15％的低氧分数变化被认为是临床有希望的，并且构成“阳性”变化，而小于15％的变化被称为“阴性”变化。计划的外科切除术在H-NOX三聚体施用24小时内进行。通过定量免疫组织化学(IHC)检查切除肿瘤的H-NOX三聚体渗透，以及通过定量IHC检查EF5染色，以确认PET结果。在可能时，利用均质化组织样品，通过定量ELISA，确认H-NOX三聚体分布数据。在用药前和用药后24小时、48小时和14日进行所有常规的安全性临床实验室测试(例如，肝功能、肾功能、CBC)。利用这些时间点中每个时间点的血液样品来确定血浆药代动力学(PK)以及测定是否存在抗治疗剂抗体(ATA)。初级端点包括单剂安全性，二级终点包括肿瘤PK、缺氧减少和ATA生成时间。
新诊断GB患者的1b期试验
第二个1b期试验是结合H-NOX三聚体与当前医疗标准用于新诊断GB的经典3+3剂量递增研究。在诊断和最初切除术后，GB患者立即接受约60Gy分级RT联合替莫唑胺(TMZ)——口服DNA烷化化学治疗。由于H-NOX三聚体的作用机制涉及减少实体肿瘤中的缺氧，只有经过部分(即，全部以下(sub-total))切除术的患者入选研究。研究包括20个符合入选和淘汰标准的新诊断有GB的患者。
入选标准：
1.患有组织学证实的、新诊断的颅内GB的患者对于本方案将是合格的。
2.患者必须在开始治疗前基于18F-EF5PET成像具有显著的低氧分数。
3新诊断GB切除术后残留的并且可评价的疾病被授予合格进入本研究。为最佳地评估术后残留疾病的程度，CT/MRI应在术后即刻时期不晚于96小时或术后至少4周、登记前14日内进行。如果96小时扫描大于登记前14日，则需要重复进行扫描。如果类固醇剂量在成像日和登记日之间增加，则需要在类固醇剂量稳定至少5日基础上的新基线MRI/CT。
4.活组织检查或切除术必须在治疗前不超过5周进行。
5.所有患者必须签署知情同意书，表示其清楚本研究的考察性质。患者必须签署其受保护的健康信息的公布授权书。患者在用研究药物治疗前必须在数据库登记。
6.患者必须18岁或以上，并且预期生命>8周。
7.患者必须具有>60的Karnofsky表现状态。
8.患者必须在开始治疗前具有适当的骨髓功能(WBC>3,000/μl，ANC>1,500/mm3，血小板计数>100,000/mm3，和血红蛋白>10gm/dl)、适当的肝功能(SGOT和胆红素<2倍ULN)和适当的肾功能(肌酸酐(creatinine)<1.5mg/dL)。这些测试必须在登记前14日内进行。血红蛋白的合格水平不可通过输注达到。
9.有生育能力的女性必须在登记前14日内记档阴性B-HCG妊娠测试。
10.患者必须没有接受过在前的脑肿瘤的细胞毒性药物治疗、非细胞毒性药物治疗或实验药物治疗。在最初切除术时接受了polifespan 20和卡莫司汀(carmustine)植入(Gliadel)晶片的患者将被淘汰。
11.患者必须计划在开始H-NOX三聚体和替莫唑胺后次日开始部分脑放射治疗。放射治疗必须处于接纳位点(affiliated site)，使得辐射肿瘤医师可提供保证：辐射可按照本方案指定进行。放射治疗必须通过外束以1.8至2.0Gy的每日部分被给予部分脑场，达到59.4至61.0Gy的肿瘤计划总剂量。不允许趋实体放射手术(例如，γ-刀治疗)和近距离放射治疗(brachytherapy)。
12.患者必须愿意在用H-NOX三聚体和替莫唑胺治疗时放弃针对肿瘤的其他细胞毒性和非细胞毒性药物治疗。
13.有生育能力的男性和女性患者必须在研究治疗和其中止后3个月期间采用被批准的避孕方法，如适合(例如，子宫内避孕器[IUD]，避孕药或隔离装置)。有生育能力的女性必须在治疗前14日内记档阴性β-HCG妊娠测试。如果利用避孕套作为隔离避孕工具，则应增加杀精子剂以确保妊娠不会发生。如果女性在参与本研究时有孕或怀疑有孕，其应立即通知其治疗医师。
淘汰标准：
1.患者必须没有接受过在前或同步的利用贝伐单抗(Avastin)、其他VEGF或VEGFR试剂或其他被认为是抗血管生成剂的试剂进行的治疗。
2.低的低氧分数的18F-EF5PET证据会导致淘汰。
3.任何处于抗高血压药物治疗中的患者被淘汰。
4.患者必须不患有任何显著的、研究人员认为无法通过适当治疗来适当控制或会有损患者耐受本治疗的能力的医学疾病。
5.有任何其他癌症(除非黑素瘤皮肤癌或宫颈原位癌外)历史的患者——除非处于完全缓解并且脱离该疾病的所有治疗最小3年——是不合格的。
6.患者必须未患有活性感染或严重间发性医学疾病。
7.患者必须未患有任何会掩盖毒性或危险地改变药物代谢的疾病。
8.经过全体切除术的那些患者被淘汰。
9.患者必须未接受过在前的颅放射治疗。
进行基线18F-EF5-PET扫描，和常氧肿瘤(限定为肿瘤：正常脑之比<2.0)患者被排除在研究之外。始于RT治疗第一日，患者在RT前2小时通过IV接受一个剂量的H-NOX三聚体。为最小化H-NOX三聚体蛋白过敏反应的可能，用药限于RT前5日，此时残留肿瘤最大。该方案在每日基础上持续5日，其中剂量水平按照3+3设计递增。将毒性如第一1b期研究描述分级，其中DLT限定有所改动。DLT被限定为下列在研究第10周发生并且归因于单独的H-NOX三聚体或组合TMZ和RT施用的H-NOX三聚体事件中的任一种：
1.任何持续超过7日的3级或4级血小板减少、4级贫血或4级中性粒细胞减少。
2.任何发热性中性粒细胞减少。
3.任何非血液3级或更高级毒性，不包括秃发，尽管是最大限度的医学治疗。非血液毒性，如皮疹、恶心、呕吐和腹泻，将仅被认为是DLT——如果其保持3级或更高级，尽管是最大限度的医学治疗。
4.任何4级辐射引起的皮肤变化。
由同步RT和替莫唑胺组成的当前GB医疗标准在约1/6患者中引起剂量限制毒性。H-NOX三聚体剂量的逐组递增持续，只要该剂量在≤1/3患者中或≤2/6患者(如果小组规模增加)中产生DLT。小组规模略高于更常规的3患者规模，因为在用RT和替莫唑胺治疗期间已知和预期毒性的频率相对较高。如果用药小组由于退出不具有3个可评价的患者入选，或如果3/6患者经历了DLT，则使上至3个另外的患者一次一个地入选小组(表20)。
表20.第二1b期研究规定的剂量递增
Figure GDA0001939256630000951
在H-NOX三聚体施用完成后，同步辐射/TMZ期期间(一般六周时间)内每周评价患者的不利事件。患者被跟踪12月，在治疗后6个月和12个月确定无进展存活率。H-NOX三聚体的MTD是小于或等于三分之一患者经历DLT的剂量。MTD基于同步辐射和TMZ过程中观察到的DLT，并且被限定用于后续的2期研究。初级终点包括标准医疗组合的安全性，二级终点包括ATA产生和PFS-12的时间。
由于H-NOX三聚体预期低毒性，第一1b期研究能够发现生物学适当的剂量，即，产生80％响应率的剂量。成比例[4/6]设计将利用正/负低氧分数变化的双重响应实施。参见Brown et al.,(2010)Int J Radiat Oncol Biol Phys 78:323-327。该设计确保如果与剂量相关的实际响应率很低(在此限定为0.3)，则递增至下一剂量的可能性很高；而高实际响应率(限定为0.8)导致进一步递增的可能性低。只要观察到≤1/3响应，则将3员小组用于递增。当观察到≥2/3响应时，使小组扩张至6员。如果观察到≤3/6响应，则递增继续。推荐用于第二1b期试验的剂量是实现≥4/6响应或最大剂量水平(即100mg/kg)的剂量。如果5mg/kg的起始剂量实现≥4/6响应，则考察较低剂量的充分活性。与标准毒性设计相比，如果知道停止在某个剂量的响应标准不被满足(即，观察到0/2或2/5响应)，则会发生很早递增至较高剂量。实际比率＝0.3时的递增可能性为0.94，而实际比率为0.8时的递增可能性为0.15。如果是四个剂量水平，则采用最少9个和最多24个患者。
如果观察到毒性，将试验从目标终点递增研究转换至基于DLT的递增研究。由此，MTD基于H-NOX三聚体治疗后两周期间的DLT评估，并且被限定为少于三分之一患者经历DLT的剂量；即，MTD是0/3或1/6患者经历DLT并且再高一级剂量有至少2/3或2/6患者遭遇DLT的剂量水平。如果如上限定的DLT在上至100mg/kg的剂量水平时均未在任何小组中实现，则不进行进一步递增。

Claims (72)

1.三聚H-NOX蛋白，包括三个H-NOX单体，其中每个H-NOX单体包括腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)H-NOX结构域和三聚结构域，
其中每个H-NOX结构域包括L144F置换，
其中所述三聚结构域是噬菌体T4 fibritin的折叠子结构域，
其中所述腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成但在SEQ IDNO：2中有L144F氨基酸置换，且
其中所述折叠子结构域由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成。
2.权利要求1所述的三聚H-NOX蛋白，其中所述H-NOX结构域的C端共价连接至所述三聚结构域。
3.权利要求1所述的三聚H-NOX蛋白，其中所述三聚H-NOX蛋白的O2解离常数在血红蛋白的O2解离常数的2个数量级之内，并且其中所述三聚H-NOX蛋白的NO反应性比血红蛋白的NO反应性低至少10倍。
4.权利要求1所述的三聚H-NOX蛋白，其中所述三聚H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃下在1nM和1000nM之间。
5.权利要求1所述的三聚H-NOX蛋白，其中所述三聚H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃下在1μM和10μM之间。
6.权利要求1所述的三聚H-NOX蛋白，其中所述三聚H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃下在10μM和50μM之间。
7.权利要求1所述的三聚H-NOX蛋白，其中所述三聚H-NOX蛋白的NO反应性在20℃下小于700s-1。
8.权利要求1所述的三聚H-NOX蛋白，其中所述三聚H-NOX蛋白的NO反应性比血红蛋白的NO反应性低至少100倍。
9.权利要求1所述的三聚H-NOX蛋白，其中所述三聚H-NOX蛋白的NO反应性比血红蛋白的NO反应性低至少1,000倍。
10.权利要求1所述的三聚H-NOX蛋白，其中所述三聚H-NOX蛋白的氧气koff在20℃下小于或等于0.65s-1。
11.权利要求1所述的三聚H-NOX蛋白，其中所述三聚H-NOX蛋白的氧气koff在20℃下在0.21s-1和0.65s-1之间。
12.权利要求1所述的三聚H-NOX蛋白，其中所述三聚H-NOX蛋白的氧气koff在20℃下在1.35s-1和2.9s-1之间。
13.根据权利要求1所述的三聚H-NOX蛋白，其中所述三聚H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在37℃下小于1h-1。
14.权利要求1所述的三聚H-NOX蛋白，其中与相应的包括单个H-NOX结构域的单体H-NOX蛋白相比，所述三聚H-NOX蛋白在给予H-NOX蛋白至哺乳动物后在哺乳动物的一个或多个组织中优先积累。
15.权利要求1所述的三聚H-NOX蛋白，其中每一个H-NOX单体的H-NOX结构域通过氨基酸连接物融合至T4噬菌体fibritin的折叠子结构域。
16.权利要求15所述的三聚H-NOX蛋白，其中每一个H-NOX单体被PEG化。
17.包含三个H-NOX单体的三聚H-NOX蛋白，其中每一个H-NOX单体包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
18.权利要求15所述的三聚H-NOX蛋白，其中所述氨基酸连接物是Gly-Ser-Gly连接物。
19.权利要求16所述的三聚H-NOX蛋白，其中所述氨基酸连接物是Gly-Ser-Gly连接物。
20.权利要求17所述的三聚H-NOX蛋白，其被PEG化。
21.权利要求20所述的三聚H-NOX蛋白，其中每一个H-HNOX单体被PEG化。
22.权利要求1所述的三聚H-NOX蛋白，其中每一个H-NOX单体被PEG化。
23.权利要求15所述的三聚H-NOX蛋白，其中所述氨基酸连接物的长度是三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸。
24.权利要求15所述的三聚H-NOX蛋白，其中所述氨基酸连接物的长度是三个氨基酸。
25.权利要求23所述的三聚H-NOX蛋白，其中每一个H-NOX单体被PEG化。
26.权利要求24所述的三聚H-NOX蛋白，其中每一个H-NOX单体被PEG化。
27.权利要求2所述的三聚H-NOX蛋白，其中该H-NOX结构域通过Gly-Ser-Gly氨基酸连接物被共价连接至该三聚结构域。
28.融合H-NOX蛋白，包括腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)H-NOX结构域和三聚结构域，其中腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成但在SEQ ID NO：2中有L144F氨基酸置换，其中所述三聚结构域是噬菌体T4 fibritin的折叠子结构域，且其中所述折叠子结构域由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成。
29.融合H-HOX蛋白，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
30.药物组合物，包括权利要求1-27任一项所述的三聚H-NOX蛋白和药学上可接受的载体或赋形剂。
31.权利要求30所述的药物组合物，其中所述药物组合物是无菌的。
32.权利要求30所述的药物组合物，其中所述药物组合物不含内毒素。
33.试剂盒，包括权利要求1-27中任一项所述的三聚H-NOX蛋白。
34.试剂盒，包括在密封小瓶中的权利要求1-27中任一项所述的三聚H-NOX蛋白。
35.静脉注射袋，包括权利要求1-27中任一项所述的三聚H-NOX蛋白。
36.药物组合物，包括单位剂量的如权利要求1-27任一项所述的三聚H-NOX蛋白。
37.权利要求1-27任一项所述的三聚H-NOX蛋白在制备治疗哺乳动物的癌症的药物中的应用。
38.权利要求37所述的应用，其中所述癌症是脑癌、肺癌、结肠癌或皮肤癌。
39.权利要求37所述的应用，其中所述癌症是脑癌。
40.权利要求39所述的应用，其中所述脑癌是成胶质细胞瘤。
41.权利要求37所述的应用，其中所述癌症是神经胶质瘤。
42.权利要求37所述的应用，其中所述药物用于和放射治疗联用。
43.权利要求39所述的应用，其中所述药物用于和放射治疗联用。
44.权利要求37所述的应用，其中所述药物用于和放射治疗联用。
45.权利要求39所述的应用，其中所述药物用于和放射治疗联用。
46.权利要求37所述的应用，其中所述哺乳动物是人。
47.权利要求39所述的应用，其中所述哺乳动物是人。
48.权利要求42所述的应用，其中所述哺乳动物是人。
49.权利要求43所述的应用，其中所述哺乳动物是人。
50.权利要求37所述的应用，其中所述药物静脉内给予。
51.权利要求39所述的应用，其中所述药物静脉内给予。
52.权利要求1-27任一项所述的三聚H-NOX蛋白在制备减少有需要的哺乳动物中的肿瘤低氧的药物中的应用。
53.权利要求52所述的应用，其中所述肿瘤是脑瘤。
54.权利要求53所述的应用，其中所述脑瘤是成胶质细胞瘤。
55.权利要求52所述的应用，其中所述药物用于和放射治疗联用。
56.权利要求52所述的应用，其中所述哺乳动物是人。
57.权利要求52所述的应用，其中所述药物静脉内给予。
58.权利要求1-27任一项所述的三聚H-NOX蛋白在制备输送O2至患脑癌哺乳动物的脑肿瘤的药物中的应用。
59.权利要求58所述的应用，其中所述药物与放射治疗联合应用。
60.权利要求58所述的应用，其中所述药物与化学治疗联合应用。
61.权利要求58所述的应用，其中所述脑癌是成胶质细胞瘤。
62.权利要求58所述的应用，其中所述哺乳动物是人。
63.权利要求59所述的应用，其中所述哺乳动物是人。
64.权利要求58所述的应用，其中所述药物静脉内给予。
65.权利要求59所述的应用，其中所述药物静脉内给予。
66.权利要求1-27任一项所述的H-NOX蛋白在制备与辐射治疗联合用于减少有需要的哺乳动物中的肿瘤生长的药物中的应用。
67.权利要求66所述的应用，其中所述哺乳动物是人。
68.权利要求66所述的应用，其中所述药物静脉内给予。
69.权利要求1-27任一项所述的三聚H-NOX蛋白在制备治疗有需要的哺乳动物组织缺血的药物中的应用。
70.权利要求69所述的应用，其中所述组织缺血是围术期缺血、中风、紧急中风、短暂缺血发作、心肌顿抑和冬眠、急性或不稳定心绞痛、紧急心绞痛或心肌梗塞。
71.权利要求1-27任一项所述的三聚H-NOX蛋白在制备治疗有需要的哺乳动物心脏停跳的药物中的应用。
72.权利要求1-27任一项所述的三聚H-NOX蛋白在制备治疗有需要的哺乳动物镰状细胞贫血的药物中的应用。
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