JP6467073B2 - H−noxタンパク質の重合体形態 - Google Patents
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Description
本発明は、助成金番号2 R44CA138006−02によって支援された。米国政府は、本願に関わる任意の特許における権利を有する。
H−NOXである。一部の態様において、H−NOXタンパク質は、配列番号2に示されるT.tengcongensisのH−NOXドメインに対応するH−NOXドメインを含む。一部の実施形態において、H−NOXは、1個または複数の遠位ポケット変異を含む。一部の実施形態において、遠位ポケット変異は、T.tengcongensis H−NOXのL144に対応する部位におけるアミノ酸置換である。一部の実施形態において、H−NOXは、144位にアミノ酸置換を含むT.tengcongensis H−NOXである。一部の実施形態において、144位におけるアミノ酸置換は、L144F置換である。一部の実施形態において、H−NOXは、少なくとも2個の遠位ポケット変異を含む。一部の実施形態において、少なくとも2個の遠位ポケット変異は、T.tengcongensis H−NOXのW9およびL144に対応する部位におけるアミノ酸置換である。一部の実施形態において、H−NOXは、9位および144位にアミノ酸置換を含むT.tengcongensis H−NOXである。一部の実施形態において、9位におけるアミノ酸置換は、W9F置換であり、144位におけるアミノ酸置換は、L144F置換である。
2 H−NOXドメイン、H.sapiens β1 H−NOXドメイン、C.lupus H−NOXドメイン、R.norvegicus β1 H−NOXドメイン、D.melangaster β1 H−NOXドメイン、D.melangaster
CG14885−PA H−NOXドメイン、C.elegans GCY−35 H−NOXドメイン、N.punctiforme H−NOXドメイン、C.crescentus H−NOXドメイン、S.oneidensis H−NOXドメインまたはC.acetobutylicum H−NOXドメインである。一部の実施形態において、H−NOXドメインは、配列番号2に示されるT.tengcongensisのH−NOXドメインに対応する。上述の態様の一部の実施形態において、H−NOXタンパク質は、T.tengcongensis H−NOX、L.pneumophilia 2 H−NOX、H.sapiens β1、R.norvegicus β1、D.melangaster β1、D.melangaster CG14885−PA、C.elegans GCY−35、N.punctiforme H−NOX、C.crescentus H−NOX、S.oneidensis H−NOXまたはC.acetobutylicum H−NOXである。一部の実施形態において、H−NOXタンパク質は、配列番号2に示されるT.tengcongensisのH−NOXドメインに対応するH−NOXドメインを含む。一部の実施形態において、H−NOXは、1個または複数の遠位ポケット変異を含む。一部の実施形態において、遠位ポケット変異は、T.tengcongensis H−NOXのL144に対応する部位におけるアミノ酸置換である。一部の実施形態において、H−NOXは、144位にアミノ酸置換を含むT.tengcongensis H−NOXである。一部の実施形態において、144位におけるアミノ酸置換は、L144F置換である。一部の実施形態において、H−NOXは、少なくとも2個の遠位ポケット変異を含む。一部の実施形態において、少なくとも2個の遠位ポケット変異は、T.tengcongensis H−NOXのW9およびL144に対応する部位におけるアミノ酸置換である。一部の実施形態において、H−NOXは、9位および144位にアミノ酸置換を含むT.tengcongensis
H−NOXである。一部の実施形態において、9位におけるアミノ酸置換は、W9F置換であり、144位におけるアミノ酸置換は、L144F置換である。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
2個以上のH−NOXドメインを含む重合体型H−NOXタンパク質。
(項目2)
前記2個以上のH−NOXドメインが、同種H−NOXドメインである、項目1に記載の重合体型H−NOXタンパク質。
(項目3)
前記H−NOXドメインが、異種H−NOXドメインである、項目1に記載の重合体型H−NOXタンパク質。
(項目4)
前記重合体型H−NOXタンパク質が、二量体、三量体、四量体または五量体である、項目1から3のいずれか一項に記載の重合体型H−NOXタンパク質。
(項目5)
前記H−NOXドメインが、共有結合により連結されている、項目4に記載の重合体型H−NOXタンパク質。
(項目6)
前記重合体型H−NOXタンパク質が、単量体を含み、該単量体が、H−NOXドメインおよび重合ドメインを含む、項目4に記載の重合体型H−NOXタンパク質。
(項目7)
前記H−NOXドメインが、前記重合ドメインに共有結合により連結されている、項目6に記載の重合体型H−NOXタンパク質。
(項目8)
前記H−NOXドメインのC末端が、前記重合ドメインに共有結合により連結されている、項目7に記載の重合体型H−NOXタンパク質。
(項目9)
前記H−NOXドメインのN末端が、前記重合ドメインに共有結合により連結されている、項目7に記載の重合体型H−NOXタンパク質。
(項目10)
単量体が会合して、前記重合体型H−NOXタンパク質を形成する、項目7に記載の重合体型H−NOXタンパク質。
(項目11)
三量体型H−NOXタンパク質である、項目1から10のいずれか一項に記載の重合体型H−NOXタンパク質。
(項目12)
前記三量体型H−NOXタンパク質が、1個または複数の三量体形成ドメインを含む、項目11に記載の重合体型H−NOXタンパク質。
(項目13)
前記三量体型H−NOXタンパク質が、3個の単量体を含み、該単量体が、H−NOXドメインおよび三量体形成ドメインを含む、項目11または12に記載の重合体型H−NOXタンパク質。
(項目14)
前記三量体形成ドメインが、バクテリオファージT4三量体形成ドメインである、項目13に記載の重合体型H−NOXタンパク質。
(項目15)
前記三量体形成ドメインが、フォルドンドメインである、項目13または14に記載の重合体型H−NOXタンパク質。
(項目16)
前記フォルドンドメインが、配列番号4のアミノ酸配列を含む、項目15に記載の重合体型H−NOXタンパク質。
(項目17)
前記H−NOXドメインが、前記三量体形成ドメインに共有結合により連結されている、項目13から16のいずれか一項に記載の重合体型H−NOXタンパク質。
(項目18)
前記H−NOXドメインのC末端が、前記三量体形成ドメインのN末端に共有結合により連結されている、項目17に記載の重合体型H−NOXタンパク質。
(項目19)
前記H−NOXドメインのN末端が、前記三量体形成ドメインのN末端に共有結合により連結されている、項目17に記載の重合体型H−NOXタンパク質。
(項目20)
グアニリルシクラーゼドメインを含まない、項目1から19のいずれか一項に記載の重合体型H−NOXタンパク質。
(項目21)
少なくとも1個のタグを含む、項目1から20のいずれか一項に記載の重合体型H−NOXタンパク質。
(項目22)
少なくとも1個のHis6タグを含む、項目1から21のいずれか一項に記載の重合体型H−NOXタンパク質。
(項目23)
前記H−NOXドメインのうち少なくとも1個が、Thermoanaerobacter tengcongensis H−NOXドメイン、L.pneumophilia 2 H−NOXドメイン、Homo sapiens β1 H−NOXドメイン、Rattus norvegicus β1 H−NOXドメイン、Canis lupus H−NOXドメイン、Drosophila melangaster β1 H−NOXドメイン、D.melangaster CG14885−PA H−NOXドメイン、Caenorhabdis elegans GCY−35 H−NOXドメイン、Nostoc punctiforme H−NOXドメイン、Caulobacter crescentus H−NOXドメイン、Shewanella oneidensis H−NOXドメインまたはClostridium acetobutylicum H−NOXドメインである、項目1から22のいずれか一項に記載の重合体型H−NOXタンパク質。
(項目24)
前記H−NOXドメインが、配列番号2に示されるT.tengcongensisのH−NOXドメインに対応する、項目1から23のいずれか一項に記載の重合体型H−NOXタンパク質。
(項目25)
前記H−NOXドメインのうち少なくとも1個が、1個または複数の遠位ポケット変異を含む、項目1から24のいずれか一項に記載の重合体型H−NOXタンパク質。
(項目26)
前記遠位ポケット変異が、T.tengcongensis H−NOXのL144に対応する部位におけるアミノ酸置換である、項目25に記載の重合体型H−NOXタンパク質。
(項目27)
前記H−NOXドメインのうち少なくとも1個が、T.tengcongensis H−NOXドメインであり、該T.tengcongensis H−NOXドメインのうち少なくとも1個が、144位にアミノ酸置換を含む、項目25に記載の重合体型H−NOXタンパク質。
(項目28)
144位における前記アミノ酸置換が、L144F置換である、項目27に記載の重合体型H−NOXドメイン。
(項目29)
前記H−NOXドメインのうち少なくとも2個が、T.tengcongensis H−NOXドメインであり、該T.tengcongensis H−NOXドメインのうち少なくとも2個が、144位にアミノ酸置換を含む、項目25に記載の重合体型H−NOXタンパク質。
(項目30)
144位における前記T.tengcongensisのうち少なくとも1個の前記アミノ酸置換が、L144F置換である、項目29に記載の重合体型H−NOXタンパク質。
(項目31)
前記H−NOXドメインのうち少なくとも1個が、少なくとも2個の遠位ポケット変異を含む、項目25に記載の重合体型H−NOXタンパク質。
(項目32)
前記少なくとも2個の遠位ポケット変異が、T.tengcongensis H−NOXのW9およびL144に対応する部位におけるアミノ酸置換である、項目31に記載の重合体型H−NOXタンパク質。
(項目33)
前記H−NOXドメインのうち少なくとも1個が、T.tengcongensis H−NOXドメインであり、該T.tengcongensis H−NOXドメインのうち少なくとも1個が、9位および144位にアミノ酸置換を含む、項目31に記載の重合体型H−NOXタンパク質。
(項目34)
9位における前記アミノ酸置換が、W9F置換であり、144位における前記アミノ酸置換が、L144F置換である、項目33に記載の重合体型H−NOXタンパク質。
(項目35)
前記重合体型H−NOXタンパク質のO2解離定数が、ヘモグロビンのO2解離定数の2桁以内であり、該H−NOXタンパク質のNO反応性が、ヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも10倍低い、項目1から34のいずれか一項に記載の重合体型H−NOXタンパク質。
(項目36)
前記重合体型H−NOXタンパク質のO2解離定数が、20℃において約1nM〜約1000nMの間である、項目1から34のいずれか一項に記載の重合体型H−NOXタンパク質。
(項目37)
前記重合体型H−NOXタンパク質のO2解離定数が、20℃において約1μM〜約10μMの間である、項目1から34のいずれか一項に記載の重合体型H−NOXタンパク質。
(項目38)
前記H−NOXタンパク質のO2解離定数が、20℃において約10μM〜約50μMの間である、項目1から34のいずれか一項に記載の重合体型H−NOXタンパク質。
(項目39)
前記重合体型H−NOXタンパク質のNO反応性が、20℃において約700s−1未満である、項目1から38のいずれか一項に記載の重合体型H−NOXタンパク質。
(項目40)
前記重合体型H−NOXタンパク質のNO反応性が、ヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも100倍低い、項目1から39のいずれか一項に記載の重合体型H−NOXタンパク質。
(項目41)
前記重合体型H−NOXタンパク質のNO反応性が、ヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも1,000倍低い、項目40に記載の重合体型H−NOXタンパク質。
(項目42)
前記重合体型H−NOXタンパク質の酸素に対するkoffが、20℃において約0.65s−1以下である、項目1から41のいずれか一項に記載の重合体型H−NOXタンパク質。
(項目43)
前記重合体型H−NOXタンパク質の酸素に対するkoffが、20℃において約0.21s−1〜約0.65s−1の間である、項目1から42のいずれか一項に記載の重合体型H−NOXタンパク質。
(項目44)
前記H−NOXタンパク質の酸素に対するkoffが、20℃において約1.35s−1〜約2.9s−1の間である、項目1から43のいずれか一項に記載の重合体型H−NOXタンパク質。
(項目45)
前記重合体型H−NOXタンパク質のヘム自動酸化の速度が、37℃において約1h−1未満である、項目1から44のいずれか一項に記載の重合体型H−NOXタンパク質。(項目46)
50kDalを超える、100kDalを超える、または150kDalを超える、項目1から45のいずれか一項に記載の重合体型H−NOXタンパク質。
(項目47)
項目1から46のいずれか一項に記載の重合体型H−NOXタンパク質であって、哺乳動物への該H−NOXタンパク質の投与後に、単一のH−NOXドメインを含む対応する単量体型H−NOXタンパク質と比較して、該哺乳動物における1種または複数の組織に優先的に蓄積する、重合体型H−NOXタンパク質。
(項目48)
項目47に記載の重合体型H−NOXタンパク質であって、哺乳動物への該H−NOXタンパク質の投与後に、該哺乳動物に1、2、3、4、6、12または24時間にわたって存続する、重合体型H−NOXタンパク質。
(項目49)
前記重合体型H−NOXの10%未満が、哺乳動物への該H−NOXタンパク質の投与後の約1時間、2時間または3時間未満以内に、腎臓によって該哺乳動物から排除される、項目47に記載の重合体型H−NOXタンパク質。
(項目50)
H−NOXドメインおよび重合ドメインを含む組換えH−NOXタンパク質。
(項目51)
前記H−NOXドメインが、前記重合ドメインに共有結合により連結されている、項目50に記載の組換えH−NOXタンパク質。
(項目52)
前記H−NOXドメインのC末端が、前記重合ドメインに連結されている、項目50または51に記載の組換えH−NOXタンパク質。
(項目53)
前記H−NOXドメインのN末端が、前記重合ドメインに連結されている、項目50または51に記載の組換えH−NOXタンパク質。
(項目54)
前記H−NOXドメインが、前記重合ドメインのN末端に連結されている、項目50から53のいずれか一項に記載の組換えH−NOXタンパク質。
(項目55)
前記H−NOXドメインが、前記重合ドメインのC末端に連結されている、項目50から53のいずれか一項に記載の組換えH−NOXタンパク質。
(項目56)
前記重合ドメインが、三量体形成ドメインである、項目50から55のいずれか一項に記載の組換えH−NOXタンパク質。
(項目57)
前記三量体形成ドメインが、バクテリオファージT4三量体形成ドメインである、項目56に記載の組換えH−NOXタンパク質。
(項目58)
前記三量体形成ドメインが、フォルドンドメインである、項目56または57に記載の組換えH−NOXタンパク質。
(項目59)
前記フォルドンドメインが、配列番号4を含む、項目58に記載の組換えH−NOXタンパク質。
(項目60)
グアニリルシクラーゼドメインを含まない、項目50から59のいずれか一項に記載の組換えH−NOXタンパク質。
(項目61)
タグを含む、項目50から60のいずれか一項に記載の組換えH−NOXタンパク質。(項目62)
His6タグを含む、項目50から61のいずれか一項に記載の組換えH−NOXタンパク質。
(項目63)
前記H−NOXドメインが、Thermoanaerobacter tengcongensis H−NOXドメイン、L.pneumophilia 2 H−NOXドメイン、Homo sapiens β1 H−NOXドメイン、Rattus norvegicus β1 H−NOXドメイン、Canis lupus H−NOXドメイン、Drosophila melangaster β1 H−NOXドメイン、D.melangaster CG14885−PA H−NOXドメイン、Caenorhabdis elegans GCY−35 H−NOXドメイン、Nostoc punctiforme H−NOXドメイン、Caulobacter crescentus H−NOXドメイン、Shewanella oneidensis H−NOXドメインまたはClostridium acetobutylicum H−NOXドメインである、項目50から62のいずれか一項に記載の組換えH−NOXタンパク質。
(項目64)
前記H−NOXドメインが、配列番号2に示されるT.tengcongensisのH−NOXドメインに対応する、項目50から63のいずれか一項に記載の組換えH−NOXタンパク質。
(項目65)
前記H−NOXドメインが、1個または複数の遠位ポケット変異を含む、項目50から64のいずれか一項に記載の組換えH−NOXタンパク質。
(項目66)
前記遠位ポケット変異が、T.tengcongensis H−NOXのL144に対応する部位におけるアミノ酸置換である、項目65に記載の組換えH−NOXタンパク質。
(項目67)
前記H−NOXドメインのうち少なくとも1個が、T.tengcongensis H−NOXドメインであり、該T.tengcongensis H−NOXドメインのうち少なくとも1個が、144位にアミノ酸置換を含む、項目65に記載の組換えH−NOXタンパク質。
(項目68)
144位における前記アミノ酸置換が、L144F置換である、項目67に記載の組換えH−NOXドメイン。
(項目69)
前記H−NOXドメインのうち少なくとも1個が、少なくとも2個の遠位ポケット変異を含む、項目65に記載の組換えH−NOXタンパク質。
(項目70)
前記少なくとも2個の遠位ポケット変異が、T.tengcongensis H−NOXのW9およびL144に対応する部位におけるアミノ酸置換である、項目69に記載の組換えH−NOXタンパク質。
(項目71)
前記H−NOXドメインのうち少なくとも1個が、T.tengcongensis H−NOXドメインであり、該T.tengcongensis H−NOXドメインのうち少なくとも1個が、9位および144位にアミノ酸置換を含む、項目69に記載の組換えH−NOXタンパク質。
(項目72)
9位における前記アミノ酸置換が、W9F置換であり、144位における前記アミノ酸置換が、L144F置換である、項目71に記載の組換えH−NOXタンパク質。
(項目73)
前記組換えH−NOXタンパク質のO2解離定数が、ヘモグロビンのO2解離定数の2桁以内であり、該H−NOXタンパク質のNO反応性が、ヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも10倍低い、項目50から72のいずれか一項に記載の組換えH−NOXタンパク質。
(項目74)
前記組換えH−NOXタンパク質のO2解離定数が、20℃において約1nM〜約1000nMの間である、項目50から72のいずれか一項に記載の組換えH−NOXタンパク質。
(項目75)
前記組換えH−NOXタンパク質のO2解離定数が、20℃において約1μM〜約10μMの間である、項目50から72のいずれか一項に記載の組換えH−NOXタンパク質。
(項目76)
前記H−NOXタンパク質のO2解離定数が、20℃において約10μM〜約50μMの間である、項目50から72のいずれか一項に記載の組換えH−NOXタンパク質。
(項目77)
前記組換えH−NOXタンパク質のNO反応性が、20℃において約700s−1未満である、項目50から76のいずれか一項に記載の組換えH−NOXタンパク質。
(項目78)
前記組換えH−NOXタンパク質のNO反応性が、ヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも100倍低い、項目50から77のいずれか一項に記載の組換えH−NOXタンパク質。
(項目79)
前記組換えH−NOXタンパク質のNO反応性が、ヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも1,000倍低い、項目78に記載の組換えH−NOXタンパク質。
(項目80)
前記組換えH−NOXタンパク質の酸素に対するkoffが、20℃において約0.65s−1以下である、項目50から79のいずれか一項に記載の組換えH−NOXタンパク質。
(項目81)
前記組換えH−NOXタンパク質の酸素に対するkoffが、20℃において約0.21s−1〜約0.65s−1の間である、項目50から80のいずれか一項に記載の組換えH−NOXタンパク質。
(項目82)
前記H−NOXタンパク質の酸素に対するkoffが、20℃において約1.35s−1〜約2.9s−1の間である、項目50から81のいずれか一項に記載の組換えH−NOXタンパク質。
(項目83)
前記組換えH−NOXタンパク質のヘム自動酸化の速度が、37℃において約1h−1未満である、項目50から82のいずれか一項に記載の組換えH−NOXタンパク質。
(項目84)
2個以上のH−NOXドメインを含む重合体型H−NOXタンパク質を含む医薬組成物。
(項目85)
前記重合体型H−NOXタンパク質が、項目1から49のいずれか一項に記載の重合体型H−NOXタンパク質である、項目84に記載の医薬組成物。
(項目86)
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、項目84または85に記載の医薬組成物。
(項目87)
滅菌されている、項目84から86のいずれか一項に記載の医薬組成物。
(項目88)
エンドトキシンを本質的に含まない、項目84から87のいずれか一項に記載の医薬組成物。
(項目89)
H−NOXドメインおよび重合ドメインを含む組換えH−NOXタンパク質を含む医薬組成物。
(項目90)
前記組換えH−NOXタンパク質が、項目50から83のいずれか一項に記載の組換えH−NOXタンパク質である、項目89に記載の医薬組成物。
(項目91)
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、項目89または90に記載の医薬組成物。
(項目92)
滅菌されている、項目89から91のいずれか一項に記載の医薬組成物。
(項目93)
エンドトキシンを本質的に含まない、項目89から92のいずれか一項に記載の医薬組成物。
(項目94)
脳がんを有する個体における脳腫瘍へとO2を送達する方法であって、有効量のH−NOXタンパク質を該個体に投与するステップを含む方法。
(項目95)
前記H−NOXタンパク質の前記投与が、放射線療法または化学療法と組み合わせて使用される、項目94に記載の方法。
(項目96)
脳がんを有する個体における脳がんを処置する方法であって、
a)有効量のH−NOXタンパク質を該個体に投与するステップと、
b)有効量の放射線を該個体に投与するステップと
を含む方法。
(項目97)
脳がんを有する個体における脳腫瘍成長を低下させる方法であって、
a)有効量のH−NOXタンパク質を該個体に投与するステップと、
b)有効量の放射線を該個体に投与するステップと
を含む方法。
(項目98)
前記放射線または化学療法が、前記H−NOXが投与されてから1、2、3、4、5または6時間後に前記個体に投与される、項目95から97のいずれか一項に記載の方法。(項目99)
前記放射線が、X線照射である、項目94から98のいずれか一項に記載の方法。
(項目100)
前記X線照射が、約0.5グレイ〜約75グレイで投与される、項目99に記載の方法。
(項目101)
前記H−NOXタンパク質の前記投与および/または前記放射線の前記投与が反復される、項目95から100のいずれか一項に記載の方法。
(項目102)
前記投与が、2、3または4回反復される、項目101に記載の方法。
(項目103)
前記投与が、1週間、2週間、3週間または4週間後に反復される、項目101または102に記載の方法。
(項目104)
前記脳がんが神経膠芽腫である、項目94から103のいずれか一項に記載の方法。
(項目105)
前記個体が哺乳動物である、項目94から104のいずれか一項に記載の方法。
(項目106)
前記哺乳動物がヒトである、項目105に記載の方法。
(項目107)
前記哺乳動物が、ペット、実験研究用動物または家畜である、項目105に記載の方法。
(項目108)
前記ペット、研究用動物または家畜が、イヌ、ネコ、ウマ、サル、ウサギ、ラット、マウス、モルモット、ハムスター、ブタまたはウシである、項目107に記載の方法。
(項目109)
前記H−NOXタンパク質および前記放射線の前記投与が、別の療法と組み合わせて使用される、項目94から108のいずれか一項に記載の方法。
(項目110)
前記H−NOXタンパク質が、T.tengcongensis H−NOX、L.pneumophilia 2 H−NOX、H.sapiens β1、R.norvegicus β1、C.lupus H−NOXドメイン、D.melangaster
β1、D.melangaster CG14885−PA、C.elegans GCY−35、N.punctiforme H−NOX、C.crescentus H−NOX、S.oneidensis H−NOXまたはC.acetobutylicum H−NOXである、項目94から109のいずれか一項に記載の方法。
(項目111)
前記H−NOXタンパク質が、配列番号2に示されるT.tengcongensisのH−NOXドメインに対応するH−NOXドメインを含む、項目94から110のいずれか一項に記載の方法。
(項目112)
前記H−NOXが、1個または複数の遠位ポケット変異を含む、項目94から111のいずれか一項に記載の方法。
(項目113)
前記遠位ポケット変異が、T.tengcongensis H−NOXのL144に対応する部位におけるアミノ酸置換である、項目112に記載の方法。
(項目114)
前記H−NOXが、144位にアミノ酸置換を含むT.tengcongensis H−NOXである、項目113に記載の方法。
(項目115)
144位における前記アミノ酸置換が、L144F置換である、項目114に記載の方法。
(項目116)
前記H−NOXが、少なくとも2個の遠位ポケット変異を含む、項目112に記載の方法。
(項目117)
前記少なくとも2個の遠位ポケット変異が、T.tengcongensis H−NOXのW9およびL144に対応する部位におけるアミノ酸置換である、項目116に記載の方法。
(項目118)
前記H−NOXが、9位および144位にアミノ酸置換を含むT.tengcongensis H−NOXである、項目116に記載の方法。
(項目119)
9位における前記アミノ酸置換が、W9F置換であり、144位における前記アミノ酸置換が、L144F置換である、項目118に記載の方法。
(項目120)
前記重合体型H−NOXタンパク質が、グアニリルシクラーゼドメインを含まない、項目95から119のいずれか一項に記載の方法。
(項目121)
前記H−NOXタンパク質のO2解離定数が、ヘモグロビンのO2解離定数の2桁以内であり、該H−NOXタンパク質のNO反応性が、ヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも10倍低い、項目95から120のいずれか一項に記載の方法。
(項目122)
前記重合体型H−NOXタンパク質のO2解離定数が、20℃において約1nM〜約1000nMの間である、項目95から121のいずれか一項に記載の方法。
(項目123)
前記H−NOXタンパク質のO2解離定数が、20℃において約1μM〜約10μMの間である、項目95から121のいずれか一項に記載の方法。
(項目124)
前記H−NOXタンパク質のO2解離定数が、20℃において約10μM〜約50μMの間である、項目95から121のいずれか一項に記載の方法。
(項目125)
前記H−NOXタンパク質のNO反応性が、20℃において約700s−1未満である、項目95から124のいずれか一項に記載の方法。
(項目126)
前記H−NOXタンパク質のNO反応性が、ヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも100倍低い、項目95から125のいずれか一項に記載の方法。
(項目127)
前記H−NOXタンパク質のNO反応性が、ヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも1,000倍低い、項目126に記載の方法。
(項目128)
前記H−NOXタンパク質の酸素に対するkoffが、20℃において約0.65s−1以下である、項目95から127のいずれか一項に記載の方法。
(項目129)
前記H−NOXタンパク質の酸素に対するkoffが、20℃において約0.21s−1〜約0.65s−1の間である、項目95から128のいずれか一項に記載の方法。
(項目130)
前記H−NOXタンパク質の酸素に対するkoffが、20℃において約1.35s−1〜約2.9s−1の間である、項目95から129のいずれか一項に記載の方法。
(項目131)
前記H−NOXタンパク質のヘム自動酸化の速度が、37℃において約1h−1未満である、項目95から130のいずれか一項に記載の方法。
(項目132)
酸素の送達を必要とする個体へと酸素を送達する方法であって、該個体に有効量の重合体型H−NOXタンパク質を投与するステップを含む方法。
(項目133)
前記H−NOXタンパク質の前記投与が、放射線療法または化学療法と組み合わせて使用される、項目132に記載の方法。
(項目134)
がんの処置を必要とする個体におけるがんを処置する方法であって、
a)有効量の重合体型H−NOXタンパク質を該個体に投与するステップと、
b)有効量の放射線を該個体に投与するステップと
を含む方法。
(項目135)
腫瘍成長の低下を必要とする個体における腫瘍成長を低下させる方法であって、
a)有効量のH−NOXタンパク質を該個体に投与するステップと、
b)有効量の放射線を該個体に投与するステップと
を含む方法。
(項目136)
前記放射線または化学療法が、前記H−NOXが投与されてから1、2、3、4、5または6時間後に前記個体に投与される、項目133から135のいずれか一項に記載の方法。
(項目137)
前記放射線が、X線照射である、項目133から136のいずれか一項に記載の方法。
(項目138)
前記X線照射が、約0.5グレイ〜約75グレイで投与される、項目137に記載の方法。
(項目139)
前記H−NOXタンパク質の前記投与および/または前記放射線の前記投与が反復される、項目133から138のいずれか一項に記載の方法。
(項目140)
前記投与が、2、3または4回反復される、項目139に記載の方法。
(項目141)
前記投与が、1週間、2週間、3週間または4週間後に反復される、項目139または140に記載の方法。
(項目142)
がんが脳がんである、項目134から141のいずれか一項に記載の方法。
(項目143)
前記個体が哺乳動物である、項目132から142のいずれか一項に記載の方法。
(項目144)
前記哺乳動物がヒトである、項目143に記載の方法。
(項目145)
前記哺乳動物が、ペット、実験研究用動物または家畜である、項目143に記載の方法。
(項目146)
前記ペット、研究用動物または家畜が、イヌ、ネコ、ウマ、サル、ウサギ、ラット、マウス、モルモット、ハムスター、ブタまたはウシである、項目145に記載の方法。
(項目147)
前記H−NOXタンパク質および前記放射線の前記投与が、別の療法と組み合わせて使用される、項目132から146のいずれか一項に記載の方法。
(項目148)
前記重合体型H−NOXタンパク質が、2個以上のH−NOXドメインを含む、項目132から147のいずれか一項に記載の方法。
(項目149)
前記2個以上のH−NOXドメインが、同種H−NOXドメインである、項目148に記載の方法。
(項目150)
前記H−NOXドメインが、異種H−NOXドメインである、項目148に記載の方法。
(項目151)
前記重合体型H−NOXタンパク質が、二量体、三量体、四量体または五量体である、項目132から150のいずれか一項に記載の方法。
(項目152)
前記H−NOXドメインが、共有結合により連結されている、項目132から151のいずれか一項に記載の方法。
(項目153)
前記重合体型H−NOXタンパク質が、単量体を含み、該単量体が、H−NOXドメインおよび重合ドメインを含む、項目132から151のいずれか一項に記載の方法。
(項目154)
前記H−NOXドメインが、前記重合ドメインに共有結合により連結されている、項目153に記載の方法。
(項目155)
前記H−NOXドメインのC末端が、前記重合ドメインに共有結合により連結されている、項目154に記載の方法。
(項目156)
前記H−NOXドメインのN末端が、前記重合ドメインに共有結合により連結されている、項目154に記載の方法。
(項目157)
単量体が会合して、前記重合体型H−NOXタンパク質を形成する、項目153から156のいずれか一項に記載の方法。
(項目158)
前記重合体型H−NOXタンパク質が、三量体型H−NOXタンパク質である、項目132から157のいずれか一項に記載の方法。
(項目159)
前記三量体型H−NOXタンパク質が、1個または複数の三量体形成ドメインを含む、項目158に記載の方法。
(項目160)
前記三量体型H−NOXタンパク質が、3個の単量体を含み、該単量体が、H−NOXドメインおよび三量体形成ドメインを含む、項目159に記載の方法。
(項目161)
前記三量体形成ドメインが、バクテリオファージT4三量体形成ドメインである、項目160に記載の方法。
(項目162)
前記三量体形成ドメインが、フォルドンドメインである、項目160または166に記載の方法。
(項目163)
前記フォルドンドメインが、配列番号4のアミノ酸配列を含む、項目162に記載の方法。
(項目164)
前記H−NOXドメインが、前記三量体形成ドメインに共有結合により連結されている、項目160から163のいずれか一項に記載の方法。
(項目165)
前記H−NOXドメインのC末端が、前記三量体形成ドメインのN末端に共有結合により連結されている、項目164に記載の方法。
(項目166)
前記H−NOXドメインのN末端が、前記三量体形成ドメインのN末端に共有結合により連結されている、項目164に記載の方法。
(項目167)
タグが、前記三量体形成ドメインのC末端に共有結合により連結されている、項目165に記載の方法。
(項目168)
His6タグが、前記三量体形成ドメインのC末端に共有結合により連結されている、項目167に記載の方法。
(項目169)
前記重合体型H−NOXタンパク質が、グアニリルシクラーゼドメインを含まない、項目132から168のいずれか一項に記載の方法。
(項目170)
前記H−NOXドメインのうち少なくとも1個が、T.tengcongensis H−NOXドメイン、L.pneumophilia 2 H−NOXドメイン、H.sapiens β1 H−NOXドメイン、R.norvegicus β1 H−NOXドメイン、C.lupus H−NOXドメイン、D.melangaster β1
H−NOXドメイン、D.melangaster CG14885−PA H−NOXドメイン、C.elegans GCY−35 H−NOXドメイン、N.punctiforme H−NOXドメイン、C.crescentus H−NOXドメイン、S.oneidensis H−NOXドメインまたはC.acetobutylicum H−NOXドメインである、項目132から169のいずれか一項に記載の方法。
(項目171)
前記H−NOXドメインが、配列番号2に示されるT.tengcongensisのH−NOXドメインに対応する、項目132から170のいずれか一項に記載の方法。
(項目172)
前記H−NOXドメインのうち少なくとも1個が、1個または複数の遠位ポケット変異を含む、項目132から171のいずれか一項に記載の方法。
(項目173)
前記遠位ポケット変異が、T.tengcongensis H−NOXのL144に対応する部位におけるアミノ酸置換である、項目172に記載の方法。
(項目174)
前記H−NOXドメインのうち少なくとも1個が、T.tengcongensis H−NOXドメインであり、該T.tengcongensis H−NOXドメインのうち少なくとも1個が、144位にアミノ酸置換を含む、項目172に記載の方法。
(項目175)
144位における前記アミノ酸置換が、L144F置換である、項目174に記載の重合体型H−NОXドメイン。
(項目176)
前記H−NOXドメインのうち少なくとも2個が、T.tengcongensis H−NOXドメインであり、該T.tengcongensis H−NOXドメインのうち少なくとも2個が、144位にアミノ酸置換を含む、項目172に記載の方法。
(項目177)
144位における前記T.tengcongensisのうち少なくとも1個の前記アミノ酸置換が、L144F置換である、項目176に記載の方法。
(項目178)
前記H−NOXドメインのうち少なくとも1個が、少なくとも2個の遠位ポケット変異を含む、項目172に記載の方法。
(項目179)
前記少なくとも2個の遠位ポケット変異が、T.tengcongensis H−NOXのW9およびL144に対応する部位におけるアミノ酸置換である、項目178に記載の方法。
(項目180)
前記H−NOXドメインのうち少なくとも1個が、T.tengcongensis H−NOXドメインであり、該T.tengcongensis H−NOXドメインのうち少なくとも1個が、9位および144位にアミノ酸置換を含む、項目179に記載の方法。
(項目181)
9位における前記アミノ酸置換が、W9F置換であり、144位における前記アミノ酸置換が、L144F置換である、項目180に記載の方法。
(項目182)
前記重合体型H−NOXタンパク質のO2解離定数が、ヘモグロビンのO2解離定数の2桁以内であり、該H−NOXタンパク質のNO反応性が、ヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも10倍低い、項目132から181のいずれか一項に記載の方法。
(項目183)
前記重合体型H−NOXタンパク質のO2解離定数が、20℃において約1nM〜約100nMの間である、項目132から181のいずれか一項に記載の方法。
(項目184)
前記重合体型H−NOXタンパク質のO2解離定数が、20℃において約100nM〜約500nMの間である、項目132から181のいずれか一項に記載の方法。
(項目185)
前記H−NOXタンパク質のO2解離定数が、20℃において約500nM〜約1000nMの間である、項目132から181のいずれか一項に記載の方法。
(項目186)
前記重合体型H−NOXタンパク質のNO反応性が、20℃において約700s−1未満である、項目132から185のいずれか一項に記載の方法。
(項目187)
前記重合体型H−NOXタンパク質のNO反応性が、ヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも100倍低い、項目132から186のいずれか一項に記載の方法。
(項目188)
前記重合体型H−NOXタンパク質のNO反応性が、ヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも1,000倍低い、項目187に記載の方法。
(項目189)
前記重合体型H−NOXタンパク質の酸素に対するkoffが、20℃において約0.65s−1以下である、項目132から188のいずれか一項に記載の方法。
(項目190)
前記重合体型H−NOXタンパク質の酸素に対するkoffが、20℃において約0.21s−1〜約0.65s−1の間である、項目132から189のいずれか一項に記載の方法。
(項目191)
前記H−NOXタンパク質の酸素に対するkoffが、20℃において約1.35s−1〜約2.9s−1の間である、項目132から190のいずれか一項に記載の方法。
(項目192)
前記重合体型H−NOXタンパク質のヘム自動酸化の速度が、37℃において約1h−1未満である、項目132から191のいずれか一項に記載の方法。
(項目193)
前記重合体型H−NOXタンパク質が、50kDalを超える、100kDalを超える、または150kDalを超える、項目132から192のいずれか一項に記載の方法。
(項目194)
前記重合体型H−NOXタンパク質が、哺乳動物への該H−NOXタンパク質の投与後に、単一のH−NOXドメインを含む対応する単量体型H−NOXタンパク質と比較して、該哺乳動物における1種または複数の組織に蓄積する、項目132から193のいずれか一項に記載の方法。
(項目195)
前記重合体型H−NOXタンパク質が、哺乳動物への該H−NOXタンパク質の投与後に、該哺乳動物に1、2、3、4、6、12または24時間にわたって存続する、項目194に記載の方法。
(項目196)
前記重合体型H−NOXの10%未満が、哺乳動物への該H−NOXタンパク質の投与後の約1時間、2時間または3時間未満以内に、腎臓によって該哺乳動物から排除される、項目194に記載の方法。
(項目197)
項目1から5のいずれか一項に記載の重合体型H−NOXタンパク質をコードする組換え核酸。
(項目198)
項目197に記載の核酸を含むベクター。
(項目199)
項目197に記載の核酸または項目198に記載のベクターを含む細胞。
(項目200)
重合体型H−NOXタンパク質を産生する方法であって、該重合体型H−NOXタンパク質の産生に適した条件下で、項目199に記載の細胞を培養するステップを含む方法。(項目201)
前記H−NOXタンパク質を精製するステップをさらに含む、項目200に記載の方法。
(項目202)
項目50から83のいずれか一項に記載の組換えH−NOXタンパク質をコードする組換え核酸。
(項目203)
項目202に記載の核酸を含むベクター。
(項目204)
項目202に記載の核酸または項目203に記載のベクターを含む細胞。
(項目205)
重合体型H−NOXタンパク質を産生する方法であって、項目204に記載の細胞を、該細胞の前記組換えH−NOXタンパク質が発現され、会合して重合体型H−NOXタンパク質を形成する条件下で、培養するステップを含む方法。
(項目206)
前記重合体型H−NOXタンパク質を精製するステップをさらに含む、項目205に記載の方法。
(項目207)
重合体型H−NOXタンパク質を含むキット。
(項目208)
前記重合体型H−NOXタンパク質の使用のための指示をさらに含む、項目207に記載のキット。
(項目209)
前記重合体型H−NOXタンパク質が、2個以上のH−NOXドメインを含む、項目207または208に記載のキット。
(項目210)
前記2個以上のH−NOXドメインが、同種H−NOXドメインである、項目209に記載のキット。
(項目211)
前記H−NOXドメインが、異種H−NOXドメインである、項目209に記載のキット。
(項目212)
前記重合体型H−NOXタンパク質が、二量体、三量体、四量体または五量体である、項目217から211のいずれか一項に記載のキット。
(項目213)
前記H−NOXドメインが、共有結合により連結されている、項目209から212のいずれか一項に記載のキット。
(項目214)
前記重合体型H−NOXタンパク質が、単量体を含み、該単量体が、H−NOXドメインおよび重合ドメインを含む、項目207から212のいずれか一項に記載のキット。
(項目215)
前記H−NOXドメインが、前記重合ドメインに共有結合により連結されている、項目214に記載のキット。
(項目216)
前記H−NOXドメインのC末端が、前記重合ドメインに共有結合により連結されている、項目215に記載のキット。
(項目217)
前記H−NOXドメインのN末端が、前記重合ドメインに共有結合により連結されている、項目215に記載のキット。
(項目218)
単量体が会合して、前記重合体型H−NOXタンパク質を形成する、項目214から217のいずれか一項に記載のキット。
(項目219)
前記重合体型H−NOXタンパク質が、三量体型H−NOXタンパク質である、項目214から218のいずれか一項に記載のキット。
(項目220)
前記三量体型H−NOXタンパク質が、1個または複数の三量体形成ドメインを含む、項目219に記載のキット。
(項目221)
前記三量体型H−NOXタンパク質が、3個の単量体を含み、該単量体が、H−NOXドメインおよび三量体形成ドメインを含む、項目219または220に記載のキット。
(項目222)
前記三量体形成ドメインが、バクテリオファージT4三量体形成ドメインである、項目221に記載のキット。
(項目223)
前記三量体形成ドメインが、フォルドンドメインである、項目220から222のいずれか一項に記載のキット。
(項目224)
前記フォルドンドメインが、配列番号4のアミノ酸配列を含む、項目223に記載のキット。
(項目225)
前記H−NOXドメインが、前記三量体形成ドメインに共有結合により連結されている、項目220から224のいずれか一項に記載のキット。
(項目226)
前記H−NOXドメインのC末端が、前記三量体形成ドメインのN末端に共有結合により連結されている、項目225に記載のキット。
(項目227)
タグが、前記三量体形成ドメインのC末端に共有結合により連結されている、項目226に記載のキット。
(項目228)
His6タグが、前記三量体形成ドメインのC末端に共有結合により連結されている、項目226に記載のキット。
(項目229)
前記H−NOXドメインのN末端が、前記三量体形成ドメインのN末端に共有結合により連結されている、項目225に記載のキット。
(項目230)
前記重合体型H−NOXタンパク質が、グアニリルシクラーゼドメインを含まない、項目207から229のいずれか一項に記載のキット。
(項目231)
前記H−NOXドメインのうち少なくとも1個が、T.tengcongensis H−NOXドメイン、L.pneumophilia 2 H−NOXドメイン、H.sapiens β1 H−NOXドメイン、R.norvegicus β1 H−NOXドメイン、C.lupus H−NOXドメイン、D.melangaster β1
H−NOXドメイン、D.melangaster CG14885−PA H−NOXドメイン、C.elegans GCY−35 H−NOXドメイン、N.punctiforme H−NOXドメイン、C.crescentus H−NOXドメイン、S.oneidensis H−NOXドメインまたはC.acetobutylicum H−NOXドメインである、項目207から230のいずれか一項に記載のキット。
(項目232)
前記H−NOXドメインが、配列番号2に示されるT.tengcongensisのH−NOXドメインに対応する、項目207から231のいずれか一項に記載のキット。(項目233)
前記H−NOXドメインのうち少なくとも1個が、1個または複数の遠位ポケット変異を含む、項目207から232のいずれか一項に記載のキット。
(項目234)
前記遠位ポケット変異が、T.tengcongensis H−NOXのL144に対応する部位におけるアミノ酸置換である、項目233に記載のキット。
(項目235)
前記H−NOXドメインのうち少なくとも1個が、T.tengcongensis H−NOXドメインであり、該T.tengcongensis H−NOXドメインのうち少なくとも1個が、144位にアミノ酸置換を含む、項目233に記載のキット。
(項目236)
144位における前記アミノ酸置換が、L144F置換である、項目235に記載の重合体型H−NОXドメイン。
(項目237)
前記H−NOXドメインのうち少なくとも2個が、T.tengcongensis H−NOXドメインであり、該T.tengcongensis H−NOXドメインのうち少なくとも2個が、144位にアミノ酸置換を含む、項目233に記載のキット。
(項目238)
144位における前記T.tengcongensisのうち少なくとも1個の前記アミノ酸置換が、L144F置換である、項目237に記載のキット。
(項目239)
前記H−NOXドメインのうち少なくとも1個が、少なくとも2個の遠位ポケット変異を含む、項目233に記載のキット。
(項目240)
前記少なくとも2個の遠位ポケット変異が、T.tengcongensis H−NOXのW9およびL144に対応する部位におけるアミノ酸置換である、項目233に記載のキット。
(項目241)
前記H−NOXドメインのうち少なくとも1個が、T.tengcongensis H−NOXドメインであり、該T.tengcongensis H−NOXドメインのうち少なくとも1個が、9位および144位にアミノ酸置換を含む、項目240に記載のキット。
(項目242)
9位における前記アミノ酸置換が、W9F置換であり、144位における前記アミノ酸置換が、L144F置換である、項目241に記載のキット。
(項目243)
前記重合体型H−NOXタンパク質のO2解離定数が、ヘモグロビンのO2解離定数の2桁以内であり、該H−NOXタンパク質のNO反応性が、ヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも10倍低い、項目207から242のいずれか一項に記載のキット。
(項目244)
前記重合体型H−NOXタンパク質のO2解離定数が、20℃において約1nM〜約1000nMの間である、項目207から243のいずれか一項に記載のキット。
(項目245)
前記重合体型H−NOXタンパク質のO2解離定数が、20℃において約1μM〜約10μMの間である、項目207から243のいずれか一項に記載のキット。
(項目246)
前記H−NOXタンパク質のO2解離定数が、20℃において約10μM〜約50μMの間である、項目207から243のいずれか一項に記載のキット。
(項目247)
前記重合体型H−NOXタンパク質のNO反応性が、20℃において約700s−1未満である、項目207から246のいずれか一項に記載のキット。
(項目248)
前記重合体型H−NOXタンパク質のNO反応性が、ヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも100倍低い、項目207から247のいずれか一項に記載のキット。
(項目249)
前記重合体型H−NOXタンパク質のNO反応性が、ヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも1,000倍低い、項目248に記載のキット。
(項目250)
前記重合体型H−NOXタンパク質の酸素に対するkoffが、20℃において約0.65s−1以下である、項目207から249のいずれか一項に記載のキット。
(項目251)
前記重合体型H−NOXタンパク質の酸素に対するkoffが、20℃において約0.21s−1〜約0.65s−1の間である、項目207から250のいずれか一項に記載のキット。
(項目252)
前記H−NOXタンパク質の酸素に対するkoffが、20℃において約1.35s−1〜約2.9s−1の間である、項目207から251のいずれか一項に記載のキット。(項目253)
前記重合体型H−NOXタンパク質のヘム自動酸化の速度が、37℃において約1h−1未満である、項目207から252のいずれか一項に記載のキット。
(項目254)
前記重合体型H−NOXタンパク質が、50kDalを超える、100kDalを超える、または150kDalを超える、項目207から253のいずれか一項に記載のキット。
(項目255)
前記重合体型H−NOXタンパク質が、哺乳動物への該H−NOXタンパク質の投与後に、単一のH−NOXドメインを含む対応する単量体型H−NOXタンパク質と比較して、該哺乳動物における1種または複数の組織に蓄積する、項目207から254のいずれか一項に記載のキット。
(項目256)
前記重合体型H−NOXタンパク質が、哺乳動物への該H−NOXタンパク質の投与後に、該哺乳動物に1、2、3、4、6、12または24時間にわたって存続する、項目255に記載のキット。
(項目257)
前記重合体型H−NOXの10%未満が、哺乳動物への該H−NOXタンパク質の投与後の約1時間、2時間または3時間未満以内に、腎臓によって該哺乳動物から排除される、項目255に記載のキット。
(項目258)
項目1から49のいずれか一項に記載の重合体型H−NOXタンパク質を含むキット。(項目259)
項目50から83のいずれか一項に記載の組換えH−NOXタンパク質を含むキット。(項目260)
使用のための指示を含む、項目258または259に記載のキット。
(項目261)
項目1から49のいずれか一項に記載の重合体型H−NOXタンパク質を含む製造品。(項目262)
H−NOXタンパク質およびバッグを含む、項目261に記載の製造品。
(項目263)
前記バッグがIVバッグである、項目262に記載の製造品。
(項目264)
前記H−NOXタンパク質が、O2の送達を必要とする個体へとO2を送達するためのものである、項目262または263に記載の製造品。
(項目265)
前記個体が脳腫瘍を有する、項目264に記載の製造品。
(項目266)
前記脳腫瘍が神経膠芽腫である、項目265に記載の製造品。
(項目267)
前記重合体型H−NOXタンパク質が、放射線療法と併せて使用される、項目265に記載の製造品。
(項目268)
重合体型H−NOXタンパク質の単位用量。
(項目269)
前記H−NOXタンパク質が、O2の送達を必要とする個体へとO2を送達するためのものである、項目268に記載の単位用量。
(項目270)
前記個体が脳腫瘍を有する、項目269に記載の単位用量。
(項目271)
前記脳腫瘍が神経膠芽腫である、項目269に記載の単位用量。
(項目272)
前記重合体型H−NOXが、放射線療法と併せて使用される、項目271に記載の単位用量。
他に特段の定めがなければ、本明細書に使用されているあらゆる技術および科学用語の意味は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味である。当業者であれば、本明細書に記載されている方法および材料と同様または均等ないずれかの方法および材料を使用して、本発明を実施または試験してよいことも十分に理解されよう。
H−NOXタンパク質ファミリーの概要
他に特段の断りがなければ、本明細書に記載されている組成物、キットおよび方法において、いかなる野生型または変異体H−NOXタンパク質を使用してもよい。本明細書において使用する場合、「H−NOXタンパク質」は、H−NOXドメイン(ヘム−一酸化窒素および酸素(Heme−Nitric oxide and OXygen)結合ドメインにちなみ命名)を有するタンパク質を意味する。H−NOXタンパク質は、H−NOXドメインに加えて1個または複数の他のドメインを含有しても含有しなくてもよい。H−NOXタンパク質は、ヘムタンパク質の高度に保存され十分に特徴付けされたファミリーのメンバーである(Iyer, L. M.ら(2003年2月3日)BMC Genomics 4巻(1号):5頁;Karow, D. S.ら(2004年8月10日)Biochemistry 43巻(31号):10203〜10211頁;Boon, E. M.ら(2005年)Nature Chem. Biol.1巻:53〜59頁;Boon, E. M.ら(2005年10月)Curr. Opin. Chem. Biol.9巻(5号):441〜446頁;Boon, E. M.ら(2005年)J. Inorg. Biochem.99巻(4号):892〜902頁)。H−NOXタンパク質は、Pfam 07700タンパク質またはHNOBタンパク質とも称される(Pfam − タンパク質ドメインファミリーアライメントおよび隠れマルコフモデルのデータベース、著作権(C)1996〜2006年、The Pfam Consortium;GNU LGPL Free Software Foundation,Inc.、59 Temple Place − Suite 330、Boston、MA 02111−1307、USA)。一部の実施形態において、H−NOXタンパク質は、6個のアルファ−ヘリックスと、続く2個のベータ鎖と、続く1個のアルファ−ヘリックスと、続く2個のベータ鎖を含む二次構造を有するまたは有すると予測される。H−NOXタンパク質は、ヘムに結合することができるアポタンパク質またはヘムが結合したホロタンパク質であり得る。H−NOXタンパク質は、ヘム基に共有結合または非共有結合により結合することができる。一部のH−NOXタンパク質は、NOに結合するが、O2には結合せず、その他は、NOおよびO2の両方に結合する。単離された通性好気性菌由来のH−NOXドメインは、NOに結合するが、O2には結合しない。偏性好気性原核生物、C.elegansおよびD.melanogaster由来のH−NOXタンパク質は、NOおよびO2に結合する。哺乳動物は、2種のH−NOXタンパク質:β1およびβ2を有する。マウス、ラット、ウシおよびヒトH−NOX配列のアライメントは、これらの種が、>99%同一性を共有することを示す。一部の実施形態において、H−NOXタンパク質のH−NOXドメインまたはH−NOXタンパク質全体は、天然起源のThermoanaerobacter tengcongensis H−NOXタンパク質(例えば、配列番号2)または天然起源のsGCタンパク質(例えば、天然起源のsGC β1タンパク質)の対応する領域のそれに対し、少なくとも約10、約15、約20、約25、約30、約40、約50、約60、約70、約80、約90、約95、約97、約98、約99または約99.5%同一のうちいずれかである。一部の実施形態において、H−NOXタンパク質のH−NOXドメインまたはH−NOXタンパク質全体は、天然起源のThermoanaerobacter tengcongensis H−NOXタンパク質(例えば、配列番号2)または天然起源のsGCタンパク質(例えば、天然起源のsGC β1タンパク質)の対応する領域のそれに対し、少なくとも約10〜約20%、約20〜約30%、約30〜約40%、約40〜約50%、約50〜約60%、約60〜約70%、約70〜約80%、約80〜約90%、約90〜約95%、約95〜約99または約99〜約99.9%同一のうちいずれかである。本明細書にさらに記述されている通り、H−NOXタンパク質は、対応する天然起源のH−NOXタンパク質と比べて、1個または複数の変異を必要に応じて含有することができる。一部の実施形態において、H−NOXタンパク質は、H−NOXドメインに加えて1個または複数のドメインを含む。特定の実施形態において、H−NOXタンパク質は、別のタンパク質由来の1個もしくは複数のドメインまたは配列全体を含む。例えば、H−NOXタンパク質は、H−NOXドメインと、アルブミン(例えば、ヒト血清アルブミン)等の別のタンパク質の一部または全体とを含む融合タンパク質であり得る。一部の実施形態において、H−NOXドメインのみが存在する。一部の実施形態において、H−NOXタンパク質は、グアニリルシクラーゼドメインを含まない。一部の実施形態において、H−NOXタンパク質は、タグ;例えば、His6タグを含む。
一部の態様において、本発明は、2個以上のH−NOXドメインを含む重合体型H−NOXタンパク質を提供する。2個以上のH−NOXドメインは、共有結合により連結または非共有結合により連結されていてよい。一部の実施形態において、重合体型H−NOXタンパク質は、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体(octomer)、九量体(nanomer)または十量体の形態である。一部の実施形態において、重合体型H−NOXタンパク質は、同種H−NOXドメインを含む。一部の実施形態において、重合体型H−NOXタンパク質は、異種H−NOXドメインを含む;例えば、H−NOXドメインは、特定の種のH−NOXドメインのアミノ酸バリアントを含むことができる、あるいは異なる種由来のH−NOXドメインを含むことができる。一部の実施形態において、重合体型H−NOXタンパク質のH−NOXドメインのうち少なくとも1個は、T.tengcongensis H−NOXのL144F変異に対応する変異を含む。一部の実施形態において、重合体型H−NOXタンパク質のH−NOXドメインのうち少なくとも1個は、T.tengcongensis H−NOXのW9F/L144F変異に対応する変異を含む。一部の実施形態において、重合体型H−NOXタンパク質は、1個または複数の重合ドメインを含む。一部の実施形態において、重合体型H−NOXタンパク質は、三量体型H−NOXタンパク質である。一部の実施形態において、重合体型H−NOXタンパク質は、少なくとも1個の三量体形成ドメインを含む。一部の実施形態において、三量体型H−NOXタンパク質は、3個のT.tengcongensis H−NOXドメインを含む。一部の実施形態において、三量体型H−NOXドメインは、3個のT.tengcongensis L144F H−NOXドメインを含む。一部の実施形態において、三量体型H−NOXドメインは、3個のT.tengcongensis W9F/L144F H−NOXドメインを含む。
本明細書に記載されている組成物、キットおよび方法において、いかなる属または種由来のH−NOXタンパク質およびH−NOXドメインを使用することもできる。様々な実施形態において、H−NOXタンパク質または重合体型H−NOXタンパク質のH−NOXドメインは、哺乳動物(例えば、霊長類(例えば、ヒト、サル、ゴリラ、類人猿、キツネザル等)、ウシ、ウマ、ブタ、イヌまたはネコ)、昆虫、酵母または細菌由来のタンパク質またはドメインである、あるいはこのようなタンパク質に由来する。例示的な哺乳動物H−NOXタンパク質として、野生型ヒトおよびラット可溶性グアニル酸シクラーゼ(β1サブユニット等)が挙げられる。H−NOXタンパク質の例として、野生型哺乳動物H−NOXタンパク質、例えば、H.sapiens、M.musculus、C.familiaris、B.Taurus、C.lupusおよびR.norvegicus;ならびに野生型非哺乳動物脊椎動物H−NOXタンパク質、例えば、X.laevis、O.latipes、O.curivatusおよびF.rubripesが挙げられる。非哺乳動物野生型NO結合H−NOXタンパク質の例として、D.melanogaster、A.gambiaeおよびM.sextaの野生型H−NOXタンパク質が挙げられる;非哺乳動物野生型O2結合H−NOXタンパク質の例として、C.elegans gcy−31、gcy−32、gcy−33、gcy−34、gcy−35、gcy−36およびgcy−37;D.melanogaster CG14885、CG14886およびCG4154;ならびにM.sextaベータ−3の野生型H−NOXタンパク質が挙げられる;原核生物野生型H−NOXタンパク質の例として、T.tengcongensis、V.cholera、V.fischerii、N.punctiforme、D.desulfuricans、L.pneumophila 1、L.pneumophila 2およびC.acetobutylicumが挙げられる。
CG14885−PA[gi:23171476]、Caenorhabditis elegans GCY−35[gi:52782806]、Nostoc punctiforme[gi:23129606]、Caulobacter crescentus[gi:16127222]、Shewanella oneidensis[gi:24373702]、Legionella pneumophila (ORF 2)[CUCGC_272624]、Clostridium acetobutylicum[gi:15896488]、およびThermoanaerobacter tengcongensis[gi:20807169]。Canis lupus H−NOXは、GenBank受託番号DQ008576により提供される。例示的なH−NOXタンパク質およびドメインの核酸およびアミノ酸配列を図37に提示する。
nigroviridis Q4S6K5_TETNG、Fugu rubripes
Q90VY5_FUGRU、Xenopus laevis Q6INK9_XENLA、Homo sapiens Q5T8J7_HUMAN、Homo sapiens
GCYA2_HUMAN、Homo sapiens GCYB2_HUMAN、Homo sapiens GCYB1_HUMAN、Gorilla gorilla Q9N193_9PRIM、Pongo pygmaeus Q5RAN8_PONPY、Pan troglodytes Q9N192_PANTR、Macaca mulatta Q9N194_MACMU、Hylobates lar Q9N191_HYLLA、Mus musculus Q8BXH3_MOUSE、Mus musculus GCYB1_MOUSE、Mus musculus Q3UTI4_MOUSE、Mus musculus Q3UH83_MOUSE、Mus musculus Q6XE41_MOUSE、Mus musculus Q80YP4_MOUSE、Rattus norvegicus Q80WX7_RAT、Rattus norvegicus Q80WX8_RAT、Rattus norvegicus Q920Q1_RAT、Rattus norvegicus Q54A43_RAT、Rattus norvegicus Q80WY0_RAT、Rattus norvegicus Q80WY4_RAT、Rattus norvegicus Q8CH85_RAT、Rattus norvegicus Q80WY5_RAT、Rattus norvegicus GCYB1_RAT、Rattus norvegicus Q8CH90_RAT、Rattus norvegicus Q91XJ7_RAT、Rattus norvegicus Q80WX9_RAT、Rattus norvegicus GCYB2_RAT、Rattus norvegicus GCYA2_RAT、Canis familiaris Q4ZHR9_CANFA、Bos taurus GCYB1_BOVIN、Sus scrofa Q4ZHR7_PIG、Gryllus bimaculatus Q59HN5_GRYBI、Manduca sexta O77106_MANSE、Manduca sexta O76340_MANSE、Apis mellifera Q5UAF0_APIME、Apis mellifera Q5FAN0_APIME、Apis mellifera Q6L5L6_APIME、Anopheles gambiae str PEST Q7PYK9_ANOGA、Anopheles gambiae str PEST Q7Q9W6_ANOGA、Anopheles gambiae str PEST Q7QF31_ANOGA、Anopheles gambiae str PEST Q7PS01_ANOGA、Anopheles gambiae str PEST Q7PFY2_ANOGA、Anopheles gambiae Q7KQ93_ANOGA、Drosophila melanogaster Q24086_DROME、Drosophila melanogaster GCYH_DROME、Drosophila melanogaster GCY8E_DROME、Drosophila melanogaster GCYDA_DROME、Drosophila melanogaster GCYDB_DROME、Drosophila melanogaster Q9VA09_DROME、Drosophila pseudoobscura
Q29CE1_DROPS、Drosophila pseudoobscura Q296C7_DROPS、Drosophila pseudoobscura Q296C8_DROPS、Drosophila pseudoobscura Q29BU7_DROPS、Aplysia californica Q7YWK7_APLCA、Hemicentrotus pulcherrimus Q95NK5_HEMPU、Chlamydomonas reinhardtii、Q5YLC2_CHLRE、Anabaena sp Q8YUQ7_ANASP、Flavobacteria bacterium BBFL7 Q26GR8_9BACT、Psychroflexus torquis ATCC 700755 Q1VQE5_9FLAO、海洋ガンマプロテオバクテリアHTCC2207 Q1YPJ5_9GAMM、海洋ガンマプロテオバクテリア HTCC2207 Q1YTK4_9GAMM、Caulobacter crescentus Q9A451_CAUCR、Acidiphilium cryptum JF−5 Q2DG60_ACICY、Rhodobacter sphaeroides Q3J0U9_RHOS4、Silicibacter pomeroyi Q5LPV1_SILPO、Paracoccus denitrificans PD1222、Q3PC67_PARDE、Silicibacter sp TM1040 Q3QNY2_9RHOB、Jannaschia sp Q28ML8_JANSC、Magnetococcus sp MC−1 Q3XT27_9PROT、Legionella pneumophila Q5WXP0_LEGPL、Legionella pneumophila Q5WTZ5_LEGPL、Legionella
pneumophila Q5X268_LEGPA、Legionella pneumophila Q5X2R2_LEGPA、Legionella pneumophila subsp pneumophila Q5ZWM9_LEGPH、Legionella pneumophila subsp pneumophila Q5ZSQ8_LEGPH、Colwellia psychrerythraea Q47Y43_COLP3、Pseudoalteromonas atlantica T6c
Q3CSZ5_ALTAT、Shewanella oneidensis Q8EF49_SHEON、Saccharophagus degradans Q21E20_SACD2、Saccharophagus degradans Q21ER7_SACD2、Vibrio angustum S14 Q1ZWE5_9VIBR、Vibrio vulnificus Q8DAE2_VIBVU、Vibrio alginolyticus 12G01 Q1VCP6_VIBAL、Vibrio sp DAT722 Q2FA22_9VIBR、Vibrio parahaemolyticus Q87NJ1_VIBPA、Vibrio fischeri Q5E1F5_VIBF1、Vibrio vulnificus Q7MJS8_VIBVY、Photobacterium sp SKA34 Q2C6Z5_9GAMM、Hahella
chejuensis Q2SFY7_HAHCH、Oceanospirillum
sp MED92 Q2BKV0_9GAMM、Oceanobacter sp RED65 Q1N035_9GAMM、Desulfovibrio desulfuricans Q310U7_DESDG、Halothermothrix orenii H 168 Q2AIW5_9FIRM、Thermoanaerobacter tengcongensis Q8RBX6_THETN、Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903 Q2ZH17_CALSA、Clostridium acetobutylicum Q97E73_CLOAB、Alkaliphilus metalliredigenes QYMF
Q3C763_9CLOT、Clostridium tetani Q899J9_CLOTE、およびClostridium beijerincki NCIMB 8052 Q2WVN0_CLOBE。これらの配列は、本明細書に記載されているPfamデータベースを使用して、これらのタンパク質がH−NOXタンパク質ファミリーに属するという同定に基づき、H−NOXタンパク質をコードすると予測される。
本明細書にさらに記述されている通り、H−NOXタンパク質または重合体型H−NOXタンパク質のH−NOXドメインは、対応する野生型タンパク質のH−NOXドメインと比較して、O2解離定数、酸素に対するkoff、ヘム自動酸化の速度、NO反応性、NO安定性または上記のうち2種以上のいずれかの組合せを変更する変異等、1個または複数の変異を含有することができる。一部の実施形態において、本発明は、O2解離定数、酸素に対するkoff、ヘム自動酸化の速度、NO反応性、NO安定性または上記のうち2種以上のいずれかの組合せを、対応する野生型タンパク質のそれと比較して、変更する変異等の1個または複数の変異を含有し得る1個または複数のH−NOXドメインを含む重合体型H−NOXタンパク質を提供する。操作されたH−NOXドメインのパネルは、本明細書に提供されている教示を考慮して、本明細書に記載の、当業者に公知の技法を使用して、ランダム変異誘発と、続く必要なまたは所望の解離定数、解離速度、NO反応性、安定性、生理的適合性または上記のうち2種以上のいずれかの組合せに関する経験的スクリーニングによって作製することができる。あるいは、変異誘発は、H−NOXタンパク質の実験的に決定されるもしくは予測される三次元構造から明らかとなる遠位ポケット残基(特に、野生型および変異体H−NOXタンパク質の配列に関して、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Boon, E. M.ら(2005年)Nature Chemical Biology 1巻:53〜59頁を参照)または配列アライメントから同定される進化的に保存された残基(特に、野生型および変異体H−NOXタンパク質の配列に関して、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Boon E.M.ら(2005年)Nature Chemical Biology 1巻:53〜59頁を参照)等の特定の領域または残基を選択的に標的化することができる。
Analysis Software Package of the Genetics Computer Group、University of Wisconsin Biotechnology Center、1710 University Avenue、Madison、WI 53705)。このソフトウェアプログラムは、様々なアミノ酸置き換え、欠失、および他の改変に相同性の程度を割り当てることにより、類似の配列をマッチさせる。
H−NOXのPhe4をチロシンへと変異させることができるが、その理由として、他のH−NOXタンパク質が、この位置にチロシンを有するためである。他のいずれかのH−NOXタンパク質において、対応するフェニルアラニン残基をチロシンへと変異させることができる。特定の実施形態において、1個または複数の変異は、進化的に保存された残基に限定される。一部の実施形態において、1個または複数の変異は、少なくとも1個の進化的に保存された変異および少なくとも1個の進化的に保存されていない変異を含むことができる。必要な場合、これらの変異体H−NOXタンパク質は、本明細書に提供される教示を考慮して、NO/O2解離定数、NO反応性、安定性および生理的適合性に関する経験的スクリーニングに付される。
重合体型H−NOXタンパク質を含む、野生型または変異体H−NOXタンパク質のいずれかは、治療上または産業上の利用を増強するための標準方法を使用して改変および/または製剤化することができる。例えば、そして特に、異種の操作されたH−NOXタンパク質に適用される場合、架橋、ペグ化、炭水化物デコレーション等を含む、免疫監視機構からこのような薬剤を遮蔽するための種々の方法(特に、タンパク質の改変に関して、例えば、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Rohlfs, R. J.ら(1998年5月15日)J. Biol. Chem.273巻(20号):12128〜12134頁;Migita, R.ら(1997年6月)J. Appl. Physiol.82巻(6号):1995〜2002頁;Vandegriff, K. D.ら(2004年8月15日)Biochem J.382巻(Pt 1):183〜189頁)と共に当業者に公知の他の技法が、当技術分野において公知である。ヒト血清アルブミン等のヒトタンパク質と、重合体型H−NOXタンパク質を含むH−NOXタンパク質との融合は、血清半減期、粘性およびコロイド性膠質浸透圧を増加させることができる。一部の実施形態において、H−NOXタンパク質は、その合成の最中または後に改変されて、その免疫原性を減少させる、および/またはその血漿保持時間を増加させる。H−NOXタンパク質は、カプセル封入することもできる(リポソームまたはナノ粒子内へのカプセル封入等)。
H−NOXドメイン、3個のフォルドンドメインおよび3個のHis6タグを含む三量体である。一部の実施形態において、H−NOXタンパク質は、3個のT.tengcongensis野生型H−NOXドメイン、3個のフォルドンドメインおよび3個のHis6タグを含む三量体である。
一部の態様において、本発明は、2個以上のH−NOXドメインと、1個または複数の重合ドメインとを含む重合体型H−NOXタンパク質を提供する。重合ドメインは、2個以上のH−NOXドメインを連結して、重合体型H−NOXタンパク質を形成するために使用される。1個または複数の重合ドメインは、H−NOXタンパク質の二量体、三量体、四量体、五量体等を産生するために使用することができる。T4バクテリオファージフィブリチンのフォルドン、Arc、POZ、コイルドコイルドメイン(GCN4、ロイシンジッパー、Velcroを含む)、ウテログロビン、コラーゲン、3本鎖コイルドコイル(colis)(マトリリン−1)、トロンボスポリン、TRPV1−C、P53、Mnt、アビジン(avadin)、ストレプトアビジン、Bcr−Abl、COMP、ベロ毒素サブユニットB、CamKII、RCKおよびNエチルマレイミド感受性融合タンパク質由来のドメイン、STM3548、KaiC、TyrR、Hcp1、CcmK4、GP41、炭疽菌防御抗原、アエロリジン、a−ヘモリジン、C4b−結合タンパク質、Mi−CK、アリールスルファターゼ(arylsurfatase)Aならびにウイルスカプシドタンパク質等、重合ドメインは、当技術分野において公知である。重合ドメインは、H−NOXドメインに共有結合または非共有結合により連結され得る。一部の実施形態において、複数の単量体サブユニット由来の重合ドメインが会合して、重合体型H−NOXドメインを形成するように、重合ドメインがH−NOXドメインに連結されて、単量体サブユニットを形成する。一部の実施形態において、H−NOXドメインのC末端が、重合ドメインのN末端に連結される。他の実施形態において、H−NOXドメインのN末端が、重合ドメインのN末端に連結される。さらに他の実施形態(emodiment)において、H−NOXドメインのC末端が、重合ドメインのC末端に連結される。一部の実施形態(emodiment)において、H−NOXドメインのN末端が、重合ドメインのC末端に連結される。
例示的な重合ドメインは、バクテリオファージT4のフォルドンドメインである。バクテリオファージT4由来のwac遺伝子は、C末端三量体形成ドメイン(残基457〜483)を有する486アミノ酸のタンパク質である、フィブリチンタンパク質をコードする(Efimov, V. P.ら(1994年)J Mol Biol 242巻:470〜486頁)。このドメインは、in vitroおよびin vivoの両方でフィブリチンを三量体形成させることができる(Boudko, S. P.ら(2002年)Eur J Biochem 269巻:833〜841頁;Letarov, A. V.,ら(1999年)Biochemistry (Mosc)64巻:817〜823頁;Tao, Y.,ら(1997年)Structue 5巻:789〜798頁)。多くの場合「フォルドンドメイン」と称される、単離された27残基の三量体形成ドメインは、多数の異なるタンパク質においてキメラ三量体の構築に使用されてきた(HIV外被糖タンパク質(Yang, X.ら(2002年)J Virol 76巻:4634〜4642頁)、アデノウイルスアドヘシン(Papanikolopoulou, K.,ら(2004年)J Biol Chem 279巻:8991〜8998頁;Papanikolopoulou, K.ら(2004年)J Mol Biol 342巻:219〜227頁)、コラーゲン(Zhang, C.,ら(2009年)Biotechnol Prog 25巻:1660〜1668頁)、ファージP22 gp26(Bhardwaj, A.,ら(2008年)Protein Sci 17巻:1475〜1485頁)および狂犬病ウイルス糖タンパク質(Sissoeff, L.,ら(2005年)J Gen Virol 86巻:2543〜2552頁)を含む)。フォルドンドメインの例示的な配列を図1に示し、配列番号4に提示する。
一態様において、本発明は、会合して、重合体型H−NOXタンパク質を形成することができる、組換え単量体型H−NOXタンパク質(即ち、重合体型H−NOXタンパク質の単量体型H−NOXサブユニット)を提供する。一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されているH−NOXドメインおよび重合ドメインを含む、組換えH−NOXタンパク質を提供する。H−NOXドメインおよび重合ドメインは、共有結合により連結または非共有結合により連結され得る。一部の実施形態において、組換え単量体型H−NOXタンパク質のH−NOXドメインのC末端は、重合ドメインのN末端に連結される。他の実施形態において、組換え単量体型H−NOXタンパク質のH−NOXドメインのN末端は、重合ドメインのN末端に連結される。さらに他の実施形態(emodiment)において、組換え単量体型H−NOXタンパク質のH−NOXドメインのC末端は、重合ドメインのC末端に連結される。一部の実施形態(emodiment)において、組換え単量体型H−NOXタンパク質のH−NOXドメインのN末端は、重合ドメインのC末端に連結される。一部の実施形態において、組換え単量体型H−NOXタンパク質は、グアニリルシクラーゼドメインを含まない。
本明細書に記載されている通り、様々なNOおよびO2解離定数、O2 koff、NO反応性および安定性をもたらす、重合体型H−NOXタンパク質を含む多数の多様なH−NOX変異体タンパク質が作製された。実働性の血液ガスキャリアを提供するために、H−NOXタンパク質を使用して、ヘモグロビン等の内在性O2キャリアを機能的に置き換えるまたは補充することができる。一部の実施形態において、重合体型H−NOXタンパク質等のH−NOXタンパク質は、放射線療法または化学療法に対するアジュバントとして、低酸素腫瘍組織(例えば、神経膠芽腫)へのO2の送達に使用される。したがって、一部の実施形態において、H−NOXタンパク質は、ヘモグロビン等の内在性O2キャリアと比較して、同様のまたは改善されたO2会合速度、O2解離速度、O2結合に対する解離定数、NO安定性、NO反応性、自動酸化速度、血漿保持時間または上記のうち2種以上のいずれかの組合せを有する。一部の実施形態において、H−NOXタンパク質は、重合体型H−NOXタンパク質である。一部の実施形態において、重合体型H−NOXタンパク質は、3個の単量体を含む三量体型H−NOXタンパク質であり、各単量体は、T.tengcongensis L144F H−NOXドメインおよびフォルドンドメインを含む。一部の実施形態において、重合体型H−NOXタンパク質は、3個の単量体を含む三量体型H−NOXタンパク質であり、各単量体は、T.tengcongensis W9F/L144F H−NOXドメインおよびフォルドンドメインを含む。一部の実施形態において、重合体型H−NOXタンパク質は、3個の単量体を含む三量体型H−NOXタンパク質であり、各単量体は、T.tengcongensis L144F H−NOXドメインおよびフォルドンドメインを含む。
Inorg. Biochem.99巻(4号):892〜902頁)、Vandegriff, K. D.ら(2004年8月15日)Biochem J.382巻(Pt 1):183〜189頁)と共に当業者に公知の技法等、種々の確立された技法を使用して、解離定数を定量化することができる。例示的なO2キャリアは、ヘモグロビンのNO反応性よりも低いNO反応性等、結合したO2を有するH−NOXタンパク質の低いまたは最小化されたNO反応性をもたらす。一部の実施形態において、上記NO反応性は、ヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも約10、100、1,000または10,000倍低い等、さらにより低い。種々の確立された技法(特にNO反応性の測定に関して、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Boon, E. M.ら(2005年)Nature Chem. Biol.1巻:53〜59頁;Boon, E. M.ら(2005年10月)Curr. Opin. Chem. Biol.9巻(5号):441〜446頁;Boon, E. M.ら(2005年)J. Inorg. Biochem.99巻(4号):892〜902頁)、Vandegriff, K. D.ら(2004年8月15日)Biochem J.382巻(Pt 1):183〜189頁)と共に当業者に公知の技法を使用して、NO反応性を定量化することができる。野生型T.tengcongensis H−NOXは、このように低いNO反応性を有するため、他の野生型H−NOXタンパク質および変異体H−NOXタンパク質も同様の低いNO反応性を有し得る。例えば、T.tengcongensis
H−NOX Y140Hは、野生型T.tengcongensis H−NOXのNO反応性と同様のNO反応性を有する。
当業者であれば、当技術分野において公知の方法および後述する非限定的な例示的な方法によって、三量体型H−NOXタンパク質等、重合体型H−NOXタンパク質を含むいずれかのH−NOXタンパク質の酸素および一酸化窒素結合の特徴を容易に決定することができる。
重合体型H−NOSタンパク質を含む野生型および変異体H−NOXタンパク質の動力学的KD値は、特にO2会合速度、O2解離速度、O2結合に対する解離定数、自動酸化速度およびNO解離速度の測定に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Boon, E.M.ら(2005年)Nature Chemical Biology 1巻:53〜59頁に本質的に記載されている通りに決定される。
ヘムへのO2会合は、20℃において閃光光分解を使用して測定される。非常に速い対再結合動力学の結果としてのFeII−O2複合体を閃光除去する(flash off)ことは不可能である;よって、FeII−CO複合体は、560nmのレーザー光による閃光光分解に付され(Hewlett−Packard、Palo Alto、CA)、5配位FeII中間体を産生し、これに対し、分子O2の結合が様々な波長で追跡される。タンパク質試料は、10mM亜ジチオン酸塩による嫌気的還元と、続くPD−10カラム(Millipore, Inc.、Billerica、MA)における脱塩によって作製される。次に、100μL〜1mLサイズで1cm路長のガス制御(controlled−atmosphere)石英キュベット内で50mM TEA、50mM NaCl、pH7.5バッファーにおける20μMヘムへと試料を希釈する。このキュベットのヘッドスペースを通して10分間COガスを流動させて、FeII−CO複合体を形成させ、この形成をUV−可視分光法により確かめる(ソーレー最大423nm)。次に、この試料は、1気圧のCOガス下のままで閃光光分解後のCO−再結合動態の測定に使用される、あるいは開放して、空気中で30分間撹拌して、閃光光分解前にバッファーを完全に酸素化して、O2再結合事象を観察する。ヘムへのO2会合は、時間に対して複数の波長でモニターされる。Igor Proソフトウェア(Wavemetrics,
Inc.、Oswego、OR;最新2005年バージョン)を使用した単一指数関数により、これらのトレースを適合させる。この速度は、観察波長に非依存性であるが、O2濃度に依存性である。全体を通してUV−可視分光法が使用されて、あらゆる複合体および中間体を確認する(Cary 3K、Varian, Inc.、Palo Alto、CA)。特に機器使用に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Dmochowski, I. J.ら(2000年8月31日)J Inorg Biochem.81巻(3号):221〜228頁に記載されている機器を使用して、一過性吸収データが収集される。この機器は、20nsの応答時間を有し、データは200メガ試料s−1でデジタル化される。
koffを測定するために、タンパク質(5μMヘム)のFeII−O2複合体を嫌気的50mM TEA、50mM NaCl、pH7.5バッファーに希釈し、様々な濃度の亜ジチオン酸塩および/または飽和COガスを含有する等体積の同じバッファー(嫌気的)と迅速に混合する。20℃に設定したNeslab RTE−100恒温槽を備えるHI−TECH Scientific SF−61ストップトフロー分光光度計においてデータを取得する(TGK Scientific LTD.、Bradford On Avon、United Kingdom)。437nm(FeII−FeII−O2差スペクトルにおける最大)、または425nm(FeII−FeII−CO差スペクトルにおける最大)における吸光度の増加として、ヘムからのO2の解離をモニターする。機器の一部であるソフトウェアを使用して、最終トレースを単一指数関数に適合させる。各実験を最小で6回行い、得られた速度を平均化する。測定された解離速度は、亜ジチオン酸塩濃度に非依存性であり、10mM亜ジチオン酸塩の存在および非存在の両方において、還元種のトラップとしての飽和COに非依存性である。
動力学的KDは、上述のkoffおよびkonの測定値を使用して、koffのkonに対する比を計算することにより決定される。
計算されたKDを測定するために、上述の通りに得られるkoffおよび動力学的KDの値をグラフにする。koffおよび動力学的KDの間の直線関係性は、等式(y=mx+b)によって定義される。次に、Excel:MAC 2004(Microsoft、Redmond、WA)を使用して、koff値を線に沿って内挿して、計算されたKDを導く。測定されたkonの非存在下において、この内挿は、koffをKDに関係付ける仕方をもたらす。
自動酸化の速度を測定するために、タンパク質試料を嫌気的に還元し、続いて好気的50mM TEA、50mM NaCl、pH7.5バッファーにおける5μMヘムへと希釈した。次に、37℃に設定したNeslab RTE−100恒温槽を備えるCary
3E分光光度計において、これらの試料をインキュベートし、定期的に走査する(Cary 3E、Varian, Inc.、Palo Alto、CA)。自動酸化の速度は、Excel:MAC 2004(Microsoft、Redmond、WA)を使用して、時間に対してプロットされ、単一指数関数と適合されたFeIII−FeII差スペクトルの最大および最小の間の差から決定される。
NO反応性は、バッファーAにおいて2μMとなるよう調製された精製タンパク質(H−NOX、重合体型H−NOX、Homo sapiensヘモグロビン(Hs Hb)等)およびバッファーAにおいて200μMとなるよう調製されたNOを使用して測定される(バッファーA:50mM Hepes、pH7.5、50mM NaCl)。20℃に設定したNeslab RTE−100恒温槽を備えるHI−TECH Scientific SF−61ストップトフロー分光光度計において、データを取得する(TGK Scientific LTD.、Bradford On Avon、United Kingdom)。0.00125秒の積分時間を伴い、タンパク質をNOと1:1比で迅速に混合する。NOによる酸化の律速段階を本質的に測定して、分光計の一部であるソフトウェアを使用して、最大変化の波長を単一指数関数に適合させる。反応の最終産物は、HNOXタンパク質に関しては三価鉄(ferric)−NOであり、Hs Hbに関しては三価鉄−水和(aquo)である。
所望の場合、特にp50値の測定に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Guarnone, R.ら(1995年9月/10月)Haematologica 80巻(5号):426〜430頁に記載されている通り、変異体または野生型H−NOXタンパク質のp50値を測定することができる。p50値は、HemOx分析計を使用して決定される。測定チャンバーは、0%酸素で開始し、100%酸素に向けてゆっくりと徐々に上げる。チャンバーにおける酸素プローブは、酸素飽和%を測定する。第2のプローブ(UV−Vis光)は、ヘムタンパク質(例えば、ヘムと複合体形成したH−NOX等のタンパク質)UV−Visスペクトルのアルファおよびベータピークに調整される、吸収の2波長を測定する。これらの吸収ピークは、ヘムタンパク質が酸素に結合するにつれて直線的に増加する。次に、非結合から100%結合へのパーセント変化を%酸素値に対しプロットして、曲線を作成する。p50は、ヘムタンパク質の50%が酸素に結合する、曲線上の点である。
H−NOX核酸
本明細書に記載されている重合体型H−NOXタンパク質を含むいずれかの野生型または変異体H−NOXタンパク質を、医薬組成物または非医薬組成物の製剤に使用することができる。一部の実施形態において、製剤は、単量体型H−NOXタンパク質がin vitroまたはin vivoで会合して、重合体型H−NOXタンパク質を産生するように、H−NOXドメインおよび重合ドメインを含む単量体型H−NOXタンパク質を含む。さらに後述する通り、これらの製剤は、種々の治療上および産業上の利用において有用である。
Publishing Co.、Easton、PA、1990年;およびRemington, The Science and Practice of Pharmacy、第20版、Mack Publishing、2000年を参照)。一部の実施形態において、製剤は、滅菌されている。一部の実施形態において、製剤は、エンドトキシンを本質的に含まない。
本明細書に記載されている重合体型H−NOXタンパク質を含む野生型または変異体H−NOXタンパク質のいずれかまたは医薬組成物を治療適用において使用することができる。
重合体型H−NOXタンパク質を含む本明細書に記載されているH−NOXタンパク質のうちいずれかと、適したパッケージングとを含む製造品およびキットも提供される。一部の実施形態において、本発明は、(i)H−NOXタンパク質(本明細書に記載されている野生型もしくは変異体H−NOXタンパク質または本明細書に記載されているその製剤等)と、(ii)個体へのO2の送達にキットを使用するための指示とを有するキットを含む。様々な実施形態において、本発明は、(i)H−NOXタンパク質(本明細書に記載されている野生型もしくは変異体H−NOXタンパク質または本明細書に記載されているその製剤等)と、(ii)本明細書に記載されている産業使用のうちいずれかにキットを使用するための指示(例えば、参照標準を必要とする分析的機器使用のための参照標準としてのH−NOXタンパク質の使用、in vitroでO2レベルを維持もしくは増加させることによる細胞培養における細胞成長の増強、溶液へのO2の添加、または溶液からのO2の除去)とを有するキットを特色とする。
本発明は、また、本明細書に記載されている重合体型H−NOXタンパク質のいずれかの産生のための方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、重合体型H−NOXタンパク質の産生に適した条件下で、重合体型H−NOXタンパク質をコードする核酸を有する細胞を培養するステップを包含する。様々な実施形態において、重合体型H−NOXはまた、精製される(細胞または培養培地からのH−NOXタンパク質の精製等)。一部の実施形態において、本方法は、H−NOXドメインおよび重合ドメインを含む単量体H−NOXタンパク質をコードする核酸を有する細胞を培養するステップを包含する。続いてこの単量体は、in vivoまたはin vitroで会合して、重合体型H−NOXタンパク質を形成する。異種H−NOXドメインを含む重合体型H−NOXタンパク質は、所望のH−NOXドメインを有する単量体型H−NOXタンパク質をコードする2種以上の核酸を共導入することにより作製することができ、該2種以上の単量体型H−NOXタンパク質は、同じ重合ドメインを含む。
(実施例1)
三量体形成されたH−NOXタンパク質の作製および発現
Thermoanaerobacter tengcongensis H−NOX配列のC末端のXhoI制限部位およびフォルドンドメインの最初のグリシンの間に3アミノ酸(Gly−Ser−Gly)リンカーを使用して、フォルドンドメインを該H−NOX配列のC末端に遺伝子融合した。フォルドンドメインおよびHis6タグの間に3アミノ酸(Arg−Gly−Ser)リンカーを使用して、His6タンパク質精製タグをフォルドンドメインのC末端に付加した。完全融合タンパク質のDNAおよびアミノ酸配列を図2に示す。全長融合タンパク質は、26,677AMU(単量体として)の分子量を有する229アミノ酸のタンパク質をコードする。
H−NOX−フォルドン融合配列の構築をデザインして、制限エンドヌクレアーゼを使用して親H−NOXプラスミドからHis6および終止コドンをコードするDNAセグメントを切除し、これをフォルドン配列、His6タグおよび終止コドンをコードするカセットに置き換えた。制限酵素部位(5’端にXhoIならびにHis6タグおよび終止コドン後の3’端にHindIII)に挟まれたフォルドンドメイン、His6タグおよび終止コドンをコードするDNAをGenScript(Piscataway、NJ)から購入した。この配列をGenScriptクローニングベクターpUC57に送達した。
pCW親ベクター(Gegner, JA & Dahlquist, FW(1991年)Proc Natl Acad Sci USA 88巻、750〜75頁;Muchmore, DCら(1989年)Methods Enzymol 177巻:44〜73頁)に由来するv01−f002プラスミドは、複数のtac(ハイブリッドtrp−lac)プロモーターによるf002オープンリーディングフレームの発現をコードする。ヘム結合H−NOXタンパク質の効率的な発現のために、コンピテントE.coli株RP523(Li, JMら(1988年)J Bacteriol 170巻:1021〜1025頁)をプラスミドv01−f002で形質転換した。様々な誘導温度において(37℃、30℃、18℃)、また、Rosetta2細胞(Merck Millipore、Darmstadt、Germany)においても、発現を試験した。
多数の技法を使用して、精製されたH−NOX−フォルドンタンパク質を特徴付けた。最終精製タンパク質の純度をSDS−PAGEにより解析した(図4および図5を参照)。ゲル電気泳動は、熱処理および2回のクロマトグラフィーステップの後に、H−NOX−フォルドン融合タンパク質が、>95%純粋であることを示す。変性SDS−PAGEゲルにおいて、H−NOX−フォルドン融合体は、単量体として泳動し、移動度は、単量体の分子量26.7kDaと一致した。
(実施例2)
半減期の延長および様々な酸素親和性を実証するH−NOX三量体のパネルの生成
(実施例3)
虚血のin vivoマウスモデルにおける脳組織浸透および低酸素の低下を実証するH−NOX三量体候補の同定
(実施例4)
H−NOX三量体は、虚血のin vivoマウスモデルにおいて梗塞体積を低下させ、神経学的転帰を改善した
C.V.ら(1998年)Exp Neurol.、149巻:310〜321頁を参照されたい。再灌流後4週間目に動物を屠殺し、H&E染色およびその後の組織学的解析のために脳組織を採取して、梗塞体積を評価した。梗塞体積測定のために、各動物脳から得た7枚の切片(+4.7、+2.7、+0.7、−1.3、−3.3、−5.3および−7.3、それぞれブレグマと比較)をデジタルカメラにより撮影した。脳浮腫を補正するための「間接的方法」(インタクト対側性[左]半球の区域 − 同側性[右]半球のインタクト領域の区域)を使用して、Image Jにより各スライスの梗塞(infract)区域を定量化した。スライス間の梗塞区域を合計し、スライスの厚さを乗じて、インタクト対側性半球体積のパーセンテージとして表される総梗塞体積を得た。バッファー対照動物との比較のために梗塞体積を測定し、0.05レベルの有意性によるANOVAおよびNewman−Keuls多重範囲検定により、群毎のスコアを比較した。再灌流4週間後までの長期評価は、神経学的機能の改善または梗塞体積の低下のいずれも、H−NOXタンパク質の神経保護効果に起因し、単に、梗塞の遅い成熟による神経学的結果の発病の遅延によるものではないことを保証した。
(実施例5)
H−NOXタンパク質は、がんのin vivoマウスモデルにおける腫瘍浸透および酸素化を実証した
(実施例6)
H−NOXタンパク質は、神経膠芽腫のin vivoマウスモデルにおける腫瘍浸透および酸素化を実証した
Fluor(登録商標)647カルボン酸、スクシンイミジルエステル、Invitrogen#A−20006)を調製した。色素を室温に温め、次に、最終濃度10mg/mLとなるようDMSOに溶解した。この混合物を10秒間ボルテックスし、続いて色素を各標識反応に添加した。標識反応は、様々なタンパク質:色素比を使用して、Alexa標識の程度を制御した。反応物は、最終DMSO濃度5〜10%に対してタンパク質(標識バッファーに溶解)および色素からなった。穏やかに振盪しつつ、反応物を1時間室温でインキュベートした(光から保護した)。反応後に、エンドトキシンフリー透析カセット(Pierce Slide−A−Lyzer、7kDa MWCOカットオフ)を使用したエンドトキシンフリー製剤バッファー(30mMトリエタノールアミン、50mM NaCl、pH7.4)への大規模透析により、遊離Alexa色素を除去した。
(実施例7)
H−NOX三量体は、神経膠芽腫のin vivoマウスモデルにおける放射線の効果を増強した
H−NOX処置群において動物生存も有意に増強された(図35C)ことを実証した。免疫組織化学染色および解析のためにも腫瘍を収集した。
H−NOX三量体の効果をさらに調査した。1試験において、頭蓋内神経膠芽腫腫瘍を有する10匹の雌胸腺欠損U251マウスの群を、1)処置バッファー単独、2)単一線量の2Gy放射線(照射器セットアップ=0.81;セシウム照射器の線量率は247CGy/分)と組み合わせた処置バッファー、3)IVによる750mg/kg L144F H−NOX三量体単独または4)単一線量の2Gy放射線(照射器セットアップ=0.81;セシウム照射器の線量率は247CGy/分)と組み合わせたL144F H−NOX三量体のいずれかで処置した。L144F H−NOX三量体送達の2時間後に、併用処置を与えるマウスの脳のテント上部分(supratentorial portion)に照射を行った。3.0×105 U251細胞によるマウスの頭蓋内注射の14日後に、全マウスの処置を始めた。動物生存が、L144F H−NOX三量体および2Gy放射線の併用処置を与えたコホートにおいて増加したことが判明した(図36A)。別の試験において、頭蓋内神経膠芽腫腫瘍を有する10匹のGBM43マウスの群を、1)2Gy放射線療法;2)4Gy放射線療法;3)8Gy放射線療法;4)2サイクルの4Gy放射線療法;5)L144F H−NOX三量体と組み合わせた4Gy放射線療法または6)処置バッファーのいずれかで処置した。H−NOX三量体送達の1〜1.5時間後に併用処置を与えるマウスを照射し、RTの複数線量を与えるマウスは、4日間空けてRTを投与した。全RT群において、脳のテント上部分に放射線処置を投与した。腫瘍植え込み7日後に全マウスの処置を始めた。L144F H−NOX三量体および4Gy放射線の併用処置を与えたコホートにおける動物生存が、4Gy処置単独を与えたコホートにおける動物生存と同様であったことが判明した(図36B)。
(実施例8)
H−NOXタンパク質の毒性試験
神経膠芽腫のin vivo動物モデルにおける最小H−NOX三量体投薬スケジュールの特徴付け
リードH−NOX三量体を与えた患者における有害事象を最小化するために、また、腫瘍の酸素化および放射線増感におけるリードH−NOX三量体の薬力学(PD)を定量化するために、U251神経膠芽腫マウスモデルにおけるH−NOX三量体の最小有効用量(MED)を同定する。予備試験は、750mg/kg H−NOX三量体の用量において、投与2時間後に腫瘍低酸素の実質的な低下がもたらされ(図17Aおよび図17B)、この効果がRTに対する腫瘍応答を有意に増強するのに十分であった(図35)ことを実証した。他の異種移植腫瘍試験は、H−NOX三量体が、10mg/kgもの低さの用量で腫瘍に蓄積したことを実証し、効果的な用量の広範な潜在的範囲を確立した。H−NOX三量体のMEDを同定するため、RTに対する腫瘍応答の増強に7.5mg/kg〜750mg/kgに及ぶ投薬量を使用する。
EF5をIVにより注射し、全脳切片におけるIHC解析のためにRTの直後に屠殺する(N低酸素およびH−NOX三量体IHC、表5)。RTの直後に3匹のマウスの追加のコホートを屠殺し、定量的ELISAによるH−NOX三量体含有量の解析のために腫瘍を切除する(NH−NOX三量体ELISA、表5)。RT完了の2時間後に、全脳切片におけるγH2AX IHCによるDNA損傷の解析のために3匹のマウスの追加のコホートを屠殺する(NDNA損傷IHC、表5)。RT有効性解析ならびに低酸素、腫瘍局在化およびDNA損傷の分子解析のため、ANOVAとその後の対応するt検定により統計学的解析を行い、P≦0.05における変化を統計学的に有意であるとみなす。生存解析のため、ログランク検定は、1.5のエフェクトサイズを検出する88%検出力のための0.05に等しい両側アルファで使用する。エフェクトサイズは、処置内標準偏差で割った平均生存の差として定義される。
H−NOX三量体の標的臨床プロファイルをより良く通知するために、放射線増感をもたらす腫瘍におけるH−NOX三量体酸素化効果の長寿命を調査する。H−NOX三量体のピーク頭蓋内腫瘍局在化時間枠に基づき、様々な時点でRTを投与し(図26)、H−NOX三量体のMEDを使用して、H−NOX三量体投与およびRTの間の時間の長さを変える(表6)。H−NOX三量体のMEDを決定するための試験と同様に、腫瘍組織におけるH−NOX三量体分布、低酸素低下、DNA損傷、腫瘍成長遅延および生存全体の増強等、数種類の薬力学的パラメータを評価する。
H−NOX三量体媒介性放射線増感に関して、3種の分子的に定義される臨床GBサブクラスが試験される。以前に記載された通りに、これら3種のサブクラスの細胞系(GBM43、GBM6およびGBM14)に由来する異種移植モデルを確立する。Verhaakら(2010年)Cancer Cell、17巻:98〜110頁およびPhillipsら(2006年)Cancer Cell、9巻:157〜173頁を参照されたい。簡潔に説明すると、これら3種のマウスモデルの作製のために、これら3種のがん型の皮下腫瘍をメスで刻み、40μmポアフィルターによる3ラウンドの通過に供し、濾過の各ラウンド後に、158×g、355×g、631×gと増加するスピードで各10分間、遠心分離を行う。最終ラウンドの遠心分離後に、細胞を1mLの滅菌DMEM培地に再懸濁し、計数し、頭蓋内注射のため1×108細胞/mLとなるよう希釈する。その上、GBの免疫適格性モデルにおいて(GL261)、H−NOX三量体媒介性放射線増感を試験するが、これは、GB患者におけるインタクト免疫系を再現する。GL261マウスモデルの作製のため、C57BL/6マウスと同系のマウスGB細胞系を使用して、U251モデルと同様に腫瘍細胞収集および注射を行う。Newcombら(2006年)Cell Cycle(5巻):93〜99頁を参照されたい。有効性試験のため、腫瘍モデル毎に4種の実験群を使用する(表7)。U251モデルと同様に、腫瘍モデルが75%完了したら処置が開始され、生存の平均日数が100%完了を反映する。H−NOX三量体のMEDを決定するための試験と同様に、腫瘍組織におけるH−NOX三量体分布、低酸素低下、DNA損傷、腫瘍成長遅延および生存全体の増強等、薬力学的パラメータを評価する。
神経膠芽腫のin vivo動物モデルにおけるH−NOX三量体単回用量毒性の薬力学的特徴付け
H−NOX三量体の最大耐量(MTD)を同定し、H−NOX三量体の毒性および毒物動態(TK)プロファイルを特徴付けするために、スプラーグドーリー(SD)ラットにおける非GLP単回用量試験を行う。
H−NOX腫瘍分布および低酸素低下が、ラットおよびマウスで同様であることを確かめるために、ラット9L神経膠腫モデルにおけるH−NOX三量体の腫瘍分布およびPDを評価する。ラット9L神経膠腫モデルを作製するために、以前に記載された通りに、ウィスター(Wistar)ラットの頭蓋内に9L神経膠腫細胞を植え込む。Stojiljkovicら(2003年)J. Neurooncol(63巻):1〜7頁を参照されたい。簡潔に説明すると、頭蓋内注射のためにラット神経膠腫細胞系である9L細胞を単層トリプシン処理により収集し、DMEMへ再懸濁して5μL中4×104細胞の濃度にする。10mMケタミンおよび7.5mg/kgキシラジンのIP注射により麻酔を導入する。頭皮に沿って2cmの矢状切開を行い、ブレグマの3mm側方および0.5mm前方において、小型の歯科用ドリルを使用して穿頭孔を作製する。滅菌Hamiltonシリンジ(Stoelting)を使用して、4.5mmの深さに60秒間の期間にわたり、10μl中の5×105細胞を注射する。注射後にシリンジを除去し、頭蓋を骨ろうで密封し、その後、7mm外科的ステープル(Stoelting)を使用して頭皮を閉鎖する。10mL/kgを超えない投薬容量で、27g針を使用した尾静脈注射によりH−NOX三量体をラットに投与する。H−NOX三量体投与の1時間後に、ラットに10mM用量の低酸素マーカー、EF5をIVにより与える。H−NOX投与の2時間後に、免疫組織化学解析によるH−NOX三量体局在化および低酸素定量化のためまたはELISAによるH−NOX三量体定量化のために、ラットを安楽死させ、腫瘍を有する脳を収集する(表10)。
ビーグル犬においてH−NOX三量体の毒性および毒物動態を調査する。簡潔に説明すると、少なくとも5か月齢の雄および雌ビーグル犬を4投薬群に割り当てる(表11)。H−NOX三量体用量レベルは、この種に計算された均等量としてのほぼMEDから最大実行可能用量に及ぶ。橈側皮静脈を介した緩徐なIVボーラスにより、各動物にH−NOX三量体を与える。投薬後に一定間隔で血漿試料を採取して、H−NOX三量体の血漿薬物動態(PK)を評価する。毒物動態解析の時点は、PK結果に基づく。動物の直近の体重に基づき、用量を容積測定的に投与する。次の用量を選択する前に臨床観察、体重、摂食量および臨床的病状をよく調べる(表12)。最大14日間の回復期間は、いずれかの毒性事象の残留性、発生遅延および回復の評価を可能にする。Graph Pad Prism(バージョン4.03)を使用して統計学的解析を行う。パラメトリック(例えば、反復測定分散分析と、続くダネットの多重比較t検定)またはノンパラメトリック(例えば、フリードマン検定およびダンの事後検定)統計学的手順のいずれかを使用して、各対応するデータ解析時点において、媒体およびH−NOX三量体試験群の間で比較を行う。パラメトリックまたはノンパラメトリック統計学の選択は、比較される群が分散基準の均一性を満たすかどうかに基づく。媒体およびH−NOX三量体処置の間の差は、p<0.05として記述される。
齧歯類GBモデルに観察された腫瘍分布および酸素化が、ヒト腫瘍と同様に腫瘍に代表的であることを確認するために、GBを有するイヌにおける第1b相様試験を行って、自発的脳腫瘍におけるH−NOX三量体蓄積を測定し、低酸素のための臨床的に意義のあるリアルタイムPETプローブ(およびPETプローブを使用することができる;例えば、18F−MISOの18F−EF5)を使用して低酸素の変化を定量化する。クライアントが所有する、自発的GBを有する10匹のイヌ(本明細書において「イヌ患者」と称される)を本試験に登録する。全体的に見て、イヌ患者に、前または後の18F−EF5 PET走査を伴う単回用量のH−NOX三量体を与えて、H−NOX三量体処置に起因する腫瘍低酸素のいずれかの変化を評価する。H−NOX三量体投与に先立ち、低酸素腫瘍(腫瘍:正常脳比2.0として定義)がないイヌを本試験から除外する。十分に低酸素腫瘍を有するイヌ患者について、初期PET走査の72時間以上後に、H−NOX三量体による処置を予定する。10mL/kgを超えない投薬容量のボーラスIV注射としてH−NOX三量体を投与する。H−NOX三量体投薬量レベルは、MEDから始まり、3+3用量漸増デザインに従って漸増する。3用量レベル後にまたは1匹以上のイヌにおいて用量規制毒性に達したら用量漸増を停止する。H−NOX三量体投与の2時間後に、イヌ患者は、第2のPET走査を受け、腫瘍低酸素をスコア化する。PET走査のため、麻酔に先立つ12時間食物を与えない。各イヌ患者に静脈内カテーテルを置き、10〜25mg/kgチオペンタールまたは6mg/kgプロポフォールにより麻酔を導入し、酸素中の1〜5%イソフルランにより維持する。麻酔が導入された直後に18F−EF5を投与し、18F−EF5投与の1時間後にPET/CT走査を開始する。標準治療の一環として外科手術を受けるイヌ患者について、H−NOX三量体含有量の解析のために切除された腫瘍の一部を確保する。H−NOX三量体腫瘍局在化を評価するために、H−NOXタンパク質およびピモニダゾールに対する抗体を使用した定量的IHCまたはELISAにより、切除された腫瘍を評価する。最大耐量等、安全性パラメータの解析のため、また、抗治療抗体の存在をアッセイするため、投薬前ならびにH−NOX三量体投与の24時間、48時間および14日後に少量の全血を得る。投薬前および投薬14日後に安全性データを収集する。銅(II)(ジアセチル−ビス(N4−メチルチオセミカルバゾン))(64Cu−ATSM)等、追加の低酸素バイオマーカーを本試験において使用する。
(実施例11)
H−NOX三量体のGMP生産
毒性試験、ラットおよびイヌPD試験ならびに臨床試験を支持するための大量(例えば、キログラム量)のGMPタンパク質を生産する。細胞の成長およびGMP細胞バンクの作製に必要な細胞系、プラスミドおよび培養成長条件を本明細書に提供する。ODが115もの高さに達する、4L発酵からH−NOX三量体を産生するための方法も本明細書に提供する。12Lの細胞培養物から最大1gの精製されたH−NOX三量体タンパク質を作製することができる、H−NOX三量体のタンパク質精製のための方法が、本明細書にさらに提供される。本明細書において、SDS−PAGE、UV/Visスペクトル解析、LC−MS、分析的SEC、SEC−HPLC、エンドトキシン試験、微粒子の濾過試験、ウイルス混入試験および有効性のための酸素放出速度等が挙げられるがこれらに限定されない、H−NOX三量体の品質管理アッセイも提供される。本明細書においてさらに、マイクロリアクターシステム、プロセススケール機器、ポンプおよびフィルターが挙げられるがこれらに限定されない、H−NOX三量体の産生のためのシステムも提供される。H−NOX三量体は、前臨床および臨床試験に提供する前に、QC/QA試験および検証を受ける。
ICHガイドラインS6(R1)およびS9に従ってGLP毒性試験を行う。ICHガイドラインの通りに、齧歯類(スプラーグドーリーラット)および非齧歯類(ビーグル犬)種において毒性試験を行う。ラット7日間反復用量試験のため、雄および雌スプラーグドーリーラットを4処置群に割り当てる(表14)。H−NOX三量体用量レベルは、ほぼMEDから最大実行可能用量または最大耐量に及ぶ。各動物に、緩徐なIVボーラスにより、尾静脈において最大10mL/kgの容量で媒体またはH−NOX三量体を与える。動物の直近の体重に基づき、容積測定的に用量を投与する。1日1回を7日間連続で動物に投薬する。終末剖検に指定された動物(最大で最初の10匹のラット/性別/群)を8日目に剖検する。回復剖検に指定された動物(最大で最後の5匹のラット/性別/群)は、7日間の投薬と、続く7日間の回復を経て、15日目に剖検し、H−NOX三量体の毒性および毒物動態を評価する。生命維持に不可欠な臓器(呼吸器、心血管および中枢神経系)の評価を含む標準毒性パラメータをモニターする(表15)。
Prism(バージョン4.03)を使用して、血行動態およびECGデータの統計学的解析を行う。パラメトリック(例えば、反復測定分散分析と、続くダネットの多重比較t検定)またはノンパラメトリック(例えば、フリードマン検定およびダンの事後検定)統計学的手順のいずれかを使用して、各対応するデータ解析時点において媒体およびH−NOX三量体処置群の間で比較を行う。パラメトリックまたはノンパラメトリック統計学の選択は、比較される群が、分散基準の均一性を満たすかどうかに基づく。媒体およびH−NOX三量体処置の間の差は、p<0.05として記述される。
神経膠芽腫患者(patent)におけるH−NOX三量体の使用のための第1相臨床試験
第1の第1b相試験は、第2の切除の候補である反復性GBを有する患者のための単回用量標的化エンドポイント漸増試験である。本試験は、臨床的に意義のある集団における用量レベルおよび投与経路の選択の観点から方向性を提供する。算入および除外基準を満たす反復性GBを有する20名の患者が本試験に含まれる。
1.標準治療の一環として反復切除を計画する、反復性GBのイメージング証拠を有する患者が適格である。
2.元の組織学的診断が低悪性度神経膠腫であり、その後の組織学的診断がGBである場合の患者は適格である。
3.全患者は、患者が本試験の治験的性質を承知していることを示すインフォームドコンセントにサインしなければならない。患者は、保護される健康情報の公開の承諾にサインしていなければならない。患者は、試験薬物による処置に先立ちデータベースに登録しなければならない。
4.患者は18歳以上でなければならず、平均余命>8週間でなければならない。
5.患者は、>60のカルノフスキーパフォーマンスステータスを有していなければならない。
6.登録時に:患者は、先行する治療の毒性効果から回復していなければならず:あらゆる治験剤から>28日間、先行する細胞傷害性治療から>28日間、ビンクリスチンから>14日間、ニトロソウレアから>42日間、プロカルバジン投与から>21日間、非細胞傷害性薬剤、例えば、インターフェロン、タモキシフェン、サリドマイド、シス−レチノイン酸等から>7日間でなければならない。非細胞傷害性薬剤の定義に関するいずれかの質問は、試験責任者(Chair)に尋ねるべきである。
7.患者は、治療の開始前に、適切な骨髄機能(WBC>3,000/μl、ANC>1,500/mm3、血小板数>100,000/mm3およびヘモグロビン>10gm/dl)、適切な肝機能(SGOTおよびビリルビン<ULNの2倍)および適切な腎機能(クレアチニン<1.5mg/dL)を有していなければならない。これらの検査は、登録に先立つ14日間以内に行われなければならない。ヘモグロビンの適格性レベルは、輸血によって達成することができない。
8.患者は、MRIまたはCTにより腫瘍進行の明解なX線検査証拠を示していなければならない。登録に先立ち14日間以内に、少なくとも5日間安定的なステロイド用量において走査を行うべきである。イメージングおよび登録の日の間にステロイド用量が増加する場合、新たなベースラインMR/CTが要求される。腫瘍測定のためのプロトコール処置期間を通じて、同じ種類の走査、即ち、MRIまたはCTを使用しなければならない。9.患者は、いかなる回数の以前の再燃を処置されていてよい。
10.出産の可能性がある女性は、登録に先立ち14日間以内にB−HCG妊娠検査が陰性であることを実証づけられなければならない。
1.患者は、ベバシズマブ(アバスチン)、他のVEGFもしくはVEGFR剤または抗血管新生剤とみなされる他の薬剤による先行する治療を受けていてはならない。
2.低い低酸素分画(SUV腫瘍/SUV小脳比2.0)のPET証拠を有するいかなる患者も除外される。
3.抗高血圧薬治療中のいかなる患者も除外される。
4.患者は、治験責任医師の所見において、適切な治療により適切に制御できない、あるいは本治療に耐容性を示す患者の能力を損ないかねない、いかなる有意な医学的疾病も有してはならない。
5.完全寛解し最小3年間該疾患のあらゆる治療を絶った場合を除き、他のいずれかのがん(非メラノーマ皮膚がんまたは子宮頸部の上皮内癌を除く)の病歴を有する患者は不適格である。
6.患者は、活動性感染症または重篤な介入性医学的疾病を有してはならない。
7.患者は、毒性を不明瞭にするまたは薬物代謝を危険に変更するいかなる疾患も有してはならない。
1.グレード3血小板減少症
2.グレード4貧血症および/またはグレード4好中球減少症
3.いずれかの非血液学的グレード3毒性、脱毛症を除外。
第2の第1b相試験は、新たに診断されたGBのための現在の標準治療による治療とH−NOX三量体とを組み合わせる、古典的3+3用量漸増試験である。診断および初期切除後に、GB患者には現在、経口DNAアルキル化化学療法であるテモゾロミド(TMZ)と併せて、分割されたRTにおいておよそ60Gyを与えている。H−NOX三量体の作用機序は、固形腫瘍における低酸素の低下に関与するため、部分的(即ち、亜全)切除を有する患者のみが本試験に登録される。算入および除外基準を満たす新たに診断されたGBを有する20名の患者が、本試験に含まれる。
1.組織学的に証明された新たに診断された頭蓋内GBを有する患者は、本プロトコールに適格である。
2.患者は、治療開始前に為される18F−EF5 PETイメージングにおいて有意な低酸素分画を有していなければならない。
3.新たに診断されたGBの切除後に残留する評価可能な疾患は、本試験への適格性を義務付けられる。術後に残留する疾患の程度を最も良く評価するために、手術直後期間の96時間以内に、または少なくとも術後4週間に、登録に先立つ14日間以内にCT/MRIを行うべきである。96時間走査が、登録前の14日間を超える場合、走査は反復される必要がある。イメージングおよび登録の日の間にステロイド用量が増加する場合、少なくとも5日間の安定的ステロイド投薬量における新たなベースラインMRI/CTが要求される。
4.生検または切除は、処置に先立つ5週間以内に行われていなければならない。
5.全患者は、患者が本試験の治験的性質を承知していることを示すインフォームドコンセントにサインしなければならない。患者は、保護される健康情報の公開の承諾にサインしていなければならない。患者は、試験薬物による処置に先立ちデータベースに登録しなければならない。
6.患者は18歳以上でなければならず、平均余命>8週間でなければならない。
7.患者は、>60のカルノフスキーパフォーマンスステータスを有していなければならない。
8.患者は、治療開始前に適切な骨髄機能(WBC>3,000/μl、ANC>1,500/mm3、血小板数>100,000/mm3およびヘモグロビン>10gm/dl)、適切な肝機能(SGOTおよびビリルビン<ULNの2倍)および適切な腎機能(クレアチニン<1.5mg/dL)を有していなければならない。これらの検査は、登録に先立つ14日間以内に行われなければならない。ヘモグロビンの適格性レベルは、輸血によって達成することができない。
9.出産の可能性がある女性は、登録に先立ち14日間以内にB−HCG妊娠検査が陰性であることを実証づけられなければならない。
10.患者は、先行する細胞傷害性薬物治療、非細胞傷害性薬物治療または脳腫瘍のための実験的薬物治療を受けていてはならない。元の切除時にカルムスチン留置(ギリアデル)ウェーハによりポリフェスパン(polifespan)20を与えた患者は除外される。
11.患者は、H−NOX三量体およびテモゾロミド開始の翌日に部分的脳放射線療法の開始を計画しなければならない。放射線療法は、放射線腫瘍学者が、本プロトコールに指定される通りに放射線が行われ得ることの保証を与えることができるように、提携機関において為されなければならない。放射線療法は、1.8〜2.0Gyの毎日の分割線量における部分的脳領域への外部照射によって与えられて、59.4〜61.0Gyの腫瘍に計画される総線量とならなければならない。定位放射線手術(例えば、ガンマ−ナイフ処置)および近接照射療法は許可されない。
12.患者は、H−NOX三量体およびテモゾロミドで処置されつつ、腫瘍に対する他の細胞傷害性および非細胞傷害性薬物治療に進む意思がなければならない。
13.生殖能を有する男性および女性患者は、試験処置の間および試験処置中断後の3カ月間、適切であれば、承認された避妊法を使用しなければならない(例えば、子宮内避妊具[IUD]、経口避妊薬またはバリアデバイス)。出産の可能性がある女性は、処置に先立つ14日間以内に、ベータ−HCG妊娠検査で陰性であることが実証されなければならない。バリアー避妊としてコンドームを使用する場合、殺精子剤が添加されて妊娠が起こらないことを確実にするべきである。本試験に参加しながら女性が妊娠したまたは妊娠が疑われる場合、女性は、自身の処置担当の医師に直ちに伝えるべきである。
1.患者は、ベバシズマブ(アバスチン)、他のVEGFもしくはVEGFR剤または抗血管新生剤とみなされる他の薬剤による先行する同時療法を受けていてはならない。
2.低い低酸素分画の18F−EF5 PET証拠は除外をもたらす。
3.抗高血圧薬治療中のいかなる患者も除外される。
4.患者は、治験責任医師の所見において、適切な治療により適切に制御することができない、あるいは本治療に耐容性を示す患者の能力を損ないかねない、いかなる有意な医学的疾病も有してはならない。
5.完全寛解し最小3年間該疾患のあらゆる治療を絶った場合を除き、他のいずれかのがん(非メラノーマ皮膚がんまたは子宮頸部の上皮内癌を除く)の病歴を有する患者は不適格である。
6.患者は、活動性感染症または重篤な介入性医学的疾病を有してはならない。
7.患者は、毒性を不明瞭にするまたは薬物代謝を危険に変更するいかなる疾患も有してはならない。
8.著しい完全切除を有する患者は除外される。
9.患者は、先行する頭蓋放射線療法を受けていてはならない。
1.7日間を超えて持続する、いずれかのグレード3もしくは4血小板減少症、グレード4貧血症またはグレード4好中球減少症
2.いずれかの熱性好中球減少症
3.最大限の医学的治療にもかかわらず生じる、いずれかの非血液学的グレード3以上の毒性、脱毛症を除外。発疹、悪心、嘔吐および下痢等、非血液学的毒性は、最大限の医学的治療にもかかわらずグレード3以上のままである場合にのみDLTとみなされる。
4.いずれかのグレード4放射線誘導性皮膚変化。
Claims (28)
- 3個のH−NOX単量体を含む三量体型H−NOXタンパク質であって、各H−NOX単量体が、T.tengcongensis H−NOXドメインおよび三量体形成ドメインを含み、各H−NOX単量体における該H−NOXドメインが、L144F置換を含み、各H−NOX単量体における該三量体形成ドメインが、バクテリオファージT4フィブリチンのフォルドンドメインであり、各H−NOX単量体における該H−NOXドメインが、アミノ酸リンカーを介してバクテリオファージT4フィブリチンの該フォルドンドメインに融合している、三量体型H−NOXタンパク質。
- 前記3個のH−NOX単量体の各々がPEG化されている、請求項1に記載の三量体型H−NOXタンパク質。
- 各H−NOX単量体における前記H−NOXドメインのC末端が、アミノ酸リンカーを介してバクテリオファージT4フィブリチンのフォルドンドメインに融合している、請求項1または2に記載の三量体型H−NOXタンパク質。
- 前記アミノ酸リンカーが、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸の長さである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の三量体型H−NOXタンパク質。
- 前記アミノ酸リンカーが、3個のアミノ酸の長さである、請求項4に記載の三量体型H−NOXタンパク質。
- 前記アミノ酸リンカーが、Gly−Ser−Glyリンカーである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の三量体型H−NOXタンパク質。
- 各H−NOX単量体が、配列番号8のアミノ酸配列を含む、請求項1または2に記載の三量体型H−NOXタンパク質。
- 前記三量体型H−NOXタンパク質のNO反応性が、20℃で700s −1 未満である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の三量体型H−NOXタンパク質。
- 前記三量体型H−NOXタンパク質の酸素に対するk off が、20℃で0.65s −1 以下である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の三量体型H−NOXタンパク質。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載の三量体型H−NOXタンパク質および薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤を含む医薬組成物。
- 密閉されたバイアル中の請求項1〜7のいずれか一項に記載の前記三量体型H−NOXタンパク質を含むキット。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載の三量体型H−NOXタンパク質を含む静脈内バッグ。
- T.tengcongensis H−NOXドメインおよび三量体形成ドメインを含む融合H−NOXタンパク質であって、該T.tengcongensis H−NOXドメインが、配列番号2におけるL144Fアミノ酸置換を除き配列番号2のアミノ酸配列を有し、
該三量体形成ドメインが、バクテリオファージT4フィブリチンのフォルドンドメインであり、
該H−NOXドメインが、アミノ酸リンカーを介して該バクテリオファージT4フィブリチンのフォルドンドメインに融合している、融合H−NOXタンパク質。 - 前記H−NOXドメインのC末端が、アミノ酸リンカーを介して前記バクテリオファージT4フィブリチンのフォルドンドメインに融合している、請求項13に記載の融合H−NOXタンパク質。
- 前記アミノ酸リンカーが、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸の長さである、請求項13または14に記載の融合H−NOXタンパク質。
- 前記アミノ酸リンカーが、3個のアミノ酸の長さである、請求項15に記載の融合H−NOXタンパク質。
- 前記アミノ酸リンカーが、Gly−Ser−Glyリンカーである、請求項13または14に記載の融合H−NOXタンパク質。
- 前記融合タンパク質が、配列番号8のアミノ酸配列を含む、請求項13に記載の融合H−NOXタンパク質。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載の三量体型H−NOXタンパク質を含む、がんの治療を必要とする哺乳動物におけるがんを治療するための医薬組成物。
- 前記がんが、脳がん、肺がん、結腸直腸がん、または皮膚がんである、請求項19に記載の医薬組成物。
- 前記がんが脳がんである、請求項20に記載の医薬組成物。
- 前記脳がんが神経膠芽腫である、請求項21に記載の医薬組成物。
- 前記がんが神経膠腫である、請求項19に記載の医薬組成物。
- 前記治療が、前記哺乳動物への放射線の投与をさらに含む、請求項19〜23のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記治療が、前記哺乳動物への化学療法の投与をさらに含む、請求項19〜24のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載の三量体型H−NOXタンパク質を含む、腫瘍低酸素の低下を必要とする哺乳動物における腫瘍低酸素を低下させるための医薬組成物。
- 前記哺乳動物がヒトである、請求項19〜26のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 静脈内投与のための、請求項19〜27のいずれか一項に記載の医薬組成物。
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