JP6131190B2 - リン酸化ｎ−グリカンの脱マンノシル化 - Google Patents

Description

関連出願の引用
本願は、２０１０年９月２９日に出願した米国出願第６１／３８７，９２４号に対する優先権を主張する。この先の出願の開示は、その全体が参考として援用される。

（技術分野）
本発明は、基礎をなすマンノースがリン酸化される場合に末端α−１，２マンノースを加水分解することのできるα−マンノシダーゼに関する。

高性能発現系は、現に開発下にある大部分の生物薬剤（ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）（例えば、組換えタンパク質）を産生するのに必要とされる。これらの生物薬剤のうちの多くの生物活性は、それらの翻訳後修飾（例えば、リン酸化またはグリコシル化）に左右される。酵母を基にした発現系は、微生物の遺伝子操作および発酵の簡便さを、タンパク質を分泌および改変する能力と組み合わせている。しかしながら、酵母細胞において産生された組換え糖タンパク質は、主として異種性の高マンノースおよび過剰マンノースのグリカン構造を示し、該構造は、タンパク質の機能、下流のプロセシング、およびその後の治療的使用に有害である可能性があり、特に酵母細胞においては、グリコシル化は生物学的に重要な役割を担っている。

本文書は、基礎をなすマンノースがリン酸化される場合に末端α−１，２マンノース結合または末端α−１，２マンノース部分を加水分解することのできるマンノシダーゼの発見を基にしている。

一態様においては、本文書は、糖タンパク質におけるリン酸化Ｎ−グリカンを脱マンノシル化するための方法を特色にしている。本方法には、リン酸化Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を提供する工程、および上記糖タンパク質を、基礎をなすマンノースがリン酸化される場合に末端α−１，２マンノース結合または末端α−１，２マンノース部分を加水分解することのできるマンノシダーゼと接触させる工程を含む。上記マンノシダーゼは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｔｏｉまたはＣｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌａｎｓ由来であることができる。該方法にはさらに、脱マンノシル化したリン酸化Ｎ−グリカンを含有する糖タンパク質を単離する工程を含むことができる。
上記タンパク質は、真菌において発現するヒトタンパク質であり得る。例えば、真菌は、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａまたはＡｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓであり得る。上記真菌は、

上記タンパク質は、病原体タンパク質、リソソームタンパク質、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、抗体もしくはその抗原結合断片、または融合タンパク質であり得る。例えば、上記リソソームタンパク質は、リソソーム蓄積障害（ＬＳＤ）と関連したリソソーム酵素のようなリソソーム酵素であり得る。ＬＳＤは、ファブリー病、ムコ多糖症Ｉ型、ファーバー病、ゴーシェ病、ＧＭ１ガングリオシドーシス、テイ・サックス病、サンドホフ病、ＧＭ２活性化因子疾患、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ニーマン・ピック病、シェイエ病、ハンター病、サンフィリポ病、モルキオ病、マロトー・ラミー病、ヒアルロニダーゼ欠損症、アスパルチルグルコサミン尿症、フコース蓄積症、マンノース蓄積症、シンドラー病、１型シアリドーシス、ポンペ病、濃化異骨症、セロイドリポフスチン沈着症、コレステロールエステル貯蔵病、ウォルマン病、多発性スルファターゼ欠損症、ガラクトシアリドーシス、ムコリピドーシス、シスチン症、シアル酸蓄積障害、マリネスコ・シェーグレン症候群を伴うカイロミクロン蓄積症、ヘルマンスキー・パドラック症候群、チェディアック・東症候群、ダノン病、または幸福顔貌骨異形成症（Ｇｅｌｅｏｐｈｙｓｉｃ ｄｙｓｐｌａｓｉａ）であり得る。

本文書は、真菌における脱マンノシル化したリン酸化Ｎ−グリカンを有する標的タンパク質を産生する方法も特色にする。上記方法は、上記基礎をなすマンノースがリン酸化される場合に、末端α−１，２マンノース結合または末端α−１，２マンノース部分を加水分解することのできるマンノシダーゼをコードする核酸を含むよう遺伝子操作された真菌細胞を提供する工程、ならびに標的タンパク質をコードする核酸を該細胞へ導入する工程を含む。

本文書は、脱マンノシル化したリン酸化Ｎ−グリカンを含む糖タンパク質を産生するよう遺伝子操作された単離された真菌細胞も特色にする。上記真菌細胞は、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａまたはＡｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓであり得る。上記真菌細胞は、

上記真菌細胞はさらに、マンノシルリン酸化を促進することのできるポリペプチドをコードする核酸を含むことができる。上記真菌細胞は、ＯＣＨ１活性を欠損しているよう遺伝子操作され得る。上記真菌細胞はさらに、マンノシルリン酸化を促進することのできるポリペプチドをコードする核酸を含むことができ、ここで、該真菌細胞は、ＯＣＨ１活性を欠損しているよう遺伝子操作される。

真菌細胞にはさらに、糖タンパク質である標的タンパク質をコードする核酸を含むことができる。上記標的タンパク質は、ヒトタンパク質であり得る。上記標的タンパク質は、病原体タンパク質、リソソームタンパク質、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、抗体もしくはその抗原結合断片、または融合タンパク質であり得る。上記リソソームタンパク質は、リソソーム酵素であり得る。上記標的タンパク質は、ファブリー病、ムコ多糖症Ｉ型、ファーバー病、ゴーシェ病、ＧＭ１ガングリオシドーシス、テイ・サックス病、サンドホフ病、ＧＭ２活性化因子疾患、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ニーマン・ピック病、シェイエ病、ハンター病、サンフィリポ病、モルキオ病、マロトー・ラミー病、ヒアルロニダーゼ欠損症、アスパルチルグルコサミン尿症、フコース蓄積症、マンノース蓄積症、シンドラー病、１型シアリドーシス、ポンペ病、濃化異骨症、セロイドリポフスチン沈着症、コレステロールエステル貯蔵病、ウォルマン病、多発性スルファターゼ欠損症、ガラクトシアリドーシス、ムコリピドーシス、シスチン症、シアル酸蓄積障害、マリネスコ・シェーグレン症候群を伴うカイロミクロン蓄積症、ヘルマンスキー・パドラック症候群、チェディアック・東症候群、ダノン病、または幸福顔貌骨異形成症（Ｇｅｌｅｏｐｈｙｓｉｃ ｄｙｓｐｌａｓｉａ）のようなＬＳＤと関連したタンパク質であり得る。

マンノシルリン酸化を促進することのできるポリペプチドは、ＭＮＮ４ポリペプチド（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｌｙｔｉｃａポリペプチド、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅポリペプチド、Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａポリペプチド、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓポリペプチド、またはＣ．ａｌｂｉｃａｎｓポリペプチド）であり得る。マンノシルリン酸化を促進することのできるポリペプチドは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＰＮＯ１ポリペプチドであり得る。

さらに別の態様においては、本文書は、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ細胞、Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ細胞、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ細胞、Ａｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ細胞、またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ細胞の実質的に純粋な培養を特色にし、これらの細胞のうちのかなりの数は、脱マンノシル化したリン酸化Ｎ−グリカンを含有する糖タンパク質を産生するよう遺伝子操作される。上記細胞にはさらに、マンノシルリン酸化を促進することのできるポリペプチドをコードする核酸を含むことができる。上記細胞は、ＯＣＨ１活性を欠損しているよう遺伝子操作されることができる。上記細胞にはさらに、マンノシルリン酸化を促進することのできるポリペプチドをコードする核酸を含むことができ、かつＯＣＨ１活性を欠損しているよう遺伝子操作されることができる。

別段に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明の属する分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似のまたは等価の方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および材料を下記に説明する。本明細書において記載されている刊行物、特許出願、特許、Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）受託番号、および他の参考文献はすべて、それらの内容が全体として参照により援用されている。矛盾する場合においては、定義を含む本出願が支配する。材料、方法、および実施例は、例示的であるに過ぎず、制限するよう意図するものではない。

本発明の他の特色および利点は、以下の詳細な記載から、および特許請求の範囲から明らかである。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
糖タンパク質におけるリン酸化Ｎ−グリカンを脱マンノシル化するための方法であって、
ａ）リン酸化Ｎ−グリカンを有する該糖タンパク質を提供する工程、および
ｂ）該糖タンパク質を、基礎をなすマンノースがリン酸化される場合に末端α−１，２マンノース結合を加水分解することのできるマンノシダーゼと接触させる工程
を含む、方法。
（項目２）
前記マンノシダーゼはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｔｏｉ由来である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記マンノシダーゼはＣｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌａｎｓ由来である、項目１に記載の方法。

図１Ａは、太字のｌｉｐ２プレ配列を有するヒトαグルコシダーゼ（ＧＡＡ）のコドン最適化ヌクレオチド配列（配列番号１）の記述である。 図１Ｂは、太字のｌｉｐ２プレ配列を有するヒトＧＡＡのアミノ酸配列（配列番号２）の記述であり、ここで^＊は、終止コドンを表す。 図２は、ｈｕＧＡＡのクローン化に使用したＹ． ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ発現ベクターの概略図である。 図３は、ＤｓｂＡ−ＣｃＭａｎ５のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列（配列番号３）の記述である。 図３は、ＤｓｂＡ−ＣｃＭａｎ５のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列（配列番号３）の記述である。 図４は、ＤｓｂＡ−ＣｃＭａｎ４のＯＲＦのヌクレオチド配列（配列番号４）の記述である。 図４は、ＤｓｂＡ−ＣｃＭａｎ４のＯＲＦのヌクレオチド配列（配列番号４）の記述である。 図４は、ＤｓｂＡ−ＣｃＭａｎ４のＯＲＦのヌクレオチド配列（配列番号４）の記述である。 図５は、ｐＬＳＡＨＣｃＭａｎ５プラスミドおよびｐＬＳＡＨＣｃＭａｎ４プラスミドの概略図である。 図６は、基礎をなすマンノースがリン酸化されている場合、α−１，２−マンノシダーゼは末端α−１，２−マンノースも加水分解することができると想定する、潜在的な最終加水産物の概略図である。 図７は、ホスフェートのキャップを外す酵素（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｕｎｃａｐｐｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）を使用して得た反応産物の概略図である。 図８は、Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２および一リン酸化糖であるＭａｎＰ−Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２を含有するＮ−グリカン調製物（パネルＢ）のＨｊＭａｎおよびＡｓＭａｎによる加水分解についてのＤＳＡ−ＦＡＣＥ電気泳動図を含有している。 図９Ａは、Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２および一リン酸化糖であるＭａｎＰ−Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２を含有するＮ−グリカン調製物（パネルＢ）のＨｊＭａｎによる加水分解についてのＤＳＡ−ＦＡＣＥ電気泳動図である。ここでは、該ＭＮＮ４糖をホスフェートのキャップを外す酵素ＣｃＭａｎ５でまず処理した。 図９Ｂは、Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２および一リン酸化糖であるＭａｎＰ−Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２を含有するＮ−グリカン調製物（パネルＢ）のＡｓＭａｎによる加水分解についてのＤＳＡ−ＦＡＣＥ電気泳動図である。ここでは、該ＭＮＮ４糖をホスフェートのキャップを外す酵素ＣｃＭａｎ５でまず処理した。 図１０は、ＡｓＭａｎまたはＨｊＭａｎのいずれかを使用するＭＮＮ４調製物の加水分解についてのＤＳＡ−ＦＡＣＥ電気泳動図を含有している。 図１１は、α−１，２−マンノシダーゼ処理の前および後のＮ−グリカン特性を含有している。 図１２Ａは、ＭＮＮ４過剰発現株に由来する（ＡＰＴＳ）標識したＮ−グリカンにおけるペリプラズム溶液の活性のＤＳＡ−ＦＡＣＥ電気泳動図である。 図１２Ｂは、ＭＮＮ４過剰発現株に由来する（ＡＰＴＳ）標識したＮ−グリカンにおけるペリプラズム溶液の活性のＤＳＡ−ＦＡＣＥ電気泳動図である。 図１３は、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおいて発現したｈｕＧＡＡとのインキュベーション後のＣｃＭａｎ４およびＣｃＭａｎ５の活性のＤＳＡ−ＦＡＣＥ電気泳動図分析である。 図１４は、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおいて発現したｈｕＧＡＡとのインキュベーション後の組換え発現した小胞体ＭａｎＩまたはゴルジ体ＭａｎＩＡの活性のＤＳＡ−ＦＡＣＥ電気泳動図分析である。 図１５は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉ由来のマンノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号５）の記述である。

（詳細な説明）
一般に、本文書は、すぐ接して基礎をなすマンノースがリン酸化される場合に末端α−１，２マンノース結合または末端α−１，２マンノース部分を加水分解するための方法および材料を提供する。本明細書に記載される方法および材料は、リソソーム中の蓄積産物の分解に関与する触媒酵素のそこなわれた活性によるリソソーム中の該蓄積産物の蓄積を特徴とする遺伝性代謝障害の１つの異なる群であるリソソーム蓄積障害（ＬＳＤ）を有する患者を処置するための薬剤を生成するのに特に有用である。蓄積産物の集積は、細胞の機能障害および進行性の臨床症状をもたらす。異化酵素の欠損は、酵素補充療法（ＥＲＴ）によって修正することができるが、但し、投与される酵素が罹患した細胞のリソソームへ導かれることができることを条件とする。リソソーム酵素は、典型的には、小胞体（ＥＲ）において合成され、分泌経路を介してゴルジ体へ輸送され、次いでリソソームへ動員される糖タンパク質である。本明細書に記載される方法および材料を用いて、微生物を基にしたプロセスは、脱マンノシル化したリン酸化Ｎ−グリカンを有する治療タンパク質を得るために使用することができる。したがって、本明細書に記載される方法および材料は、ＬＳＤのような代謝障害の処置のために糖タンパク質を調製するのに有用である。

（マンノシダーゼ）
本文書は、基礎をなすマンノースがリン酸化される場合に、末端α−１，２マンノース結合または末端α−１，２マンノース部分を加水分解することができるマンノシダーゼをコードする単離された核酸を提供する。用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書においては互換可能に使用され、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、および核酸類似体を含有するＤＮＡ（またはＲＮＡ）を含む、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方を指す。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有することができる。核酸は、二本鎖または一本鎖（すなわち、センス鎖またはアンチセンス鎖）であることができる。ポリヌクレオチドの非限定例としては、遺伝子、遺伝子断片、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ミクロＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、枝分かれポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー、ならびに核酸類似体が挙げられる。

「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書においては互換可能に使用され、長さまたは翻訳後修飾に関わらず、アミノ酸の任意のペプチド結合鎖を意味する。典型的には、本明細書に記載されるポリペプチド（例えば、マンノシダーゼまたは脱マンノシル化した標的タンパク質）は、該ポリペプチドが、調製物中の総タンパク質の少なくとも６０重量％、例えば、試料中の総タンパク質の６０％を構成する場合、単離されている。一部の実施形態においては、本明細書に記載される「ポリペプチドは、調製物中の総タンパク質の少なくとも７５重量％、少なくとも９０重量％、または少なくとも９９重量％からなる。

「単離された核酸」は、天然に存在するゲノム（例えば、酵母ゲノム）における核酸の片側または両側に正常に隣接している核酸を含む、天然に存在するゲノムに存在する他の核酸分子から分離された核酸を指す。用語「単離された」は核酸に関して本明細書で使用する場合、天然に存在しない任意の核酸配列も含んでおり、なぜなら、このような非天然の配列は天然には見出されず、かつ天然に存在するゲノムにおいてじかに接触する配列を有さないからである。

単離された核酸は、例えば、ＤＮＡ分子であることができるが、但し、天然に存在するゲノムにおける該ＤＮＡ分子にじかに隣接することが通常見出されている核酸配列のうちの１つは、除去されており、または不在であることを条件とする。したがって、単離された核酸は、他の配列とは独立した別個の分子（例えば、化学的に合成された核酸、またはＰＣＲもしくは制限エンドヌクレアーゼ処理によって生成されたｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ断片）として存在するＤＮＡ分子、およびベクター、自律的に複製するプラスミド、ウイルス（例えば、任意のパラミクソウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、もしくはヘルペスウイルス）へと、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡへと組み込まれたＤＮＡを含むが、これらに限定されない。加えて、単離された核酸は、ハイブリッド核酸または融合核酸の一部であるＤＮＡ分子のような操作された核酸を含むことができる。例えばｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノムライブラリー内に、またはゲノムＤＮＡ制限消化物を含有するゲルスライス内にある何百〜何百万もの他の核酸のうちに存在する核酸は、単離された核酸とはみなされない。

用語「外来性」は、核酸および特定の宿主細胞に関して本明細書において使用する場合、天然に見出されるような特定の細胞において生じない（かつその細胞から得ることができない）任意の核酸を指す。したがって、天然に存在しない核酸は、宿主細胞へと一旦導入されると該宿主細胞に対して外来性であるとみなされる。天然に存在しない核酸が、天然に見出される核酸配列の核酸部分配列または断片を含有することができることを留意することは重要であり、但し、該核酸は全体として天然には存在しないことを条件とする。例えば、発現ベクター内にゲノムＤＮＡ配列を含有する核酸分子は天然に存在しない核酸であり、したがって、宿主細胞へと一旦導入されると該宿主細胞に対して外来性であり、なぜなら、該核酸分子は全体（ゲノムＤＮＡにベクターＤＮＡを加えたもの）として天然には存在しないからである。したがって、全体として天然には存在しない任意のベクター、自律的に複製するプラスミド、またはウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、またはヘルペスウイルス）は、天然に存在しない核酸であるとみなされる。ＰＣＲもしくは制限エンドヌクレアーゼ処理によって生成されたゲノムＤＮＡ断片ならびにｃＤＮＡは、天然には見出されない別個の分子として存在するので、天然に存在しない核酸であるとみなされるということになる。天然には見出されない配置のプロモーター配列およびポリペプチドをコードする配列（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を含有する任意の核酸が天然に存在しない核酸であることにもなる。天然に存在する核酸は、特定の細胞に対して外来性ともなり得る。例えば、酵母ｘの細胞から単離された全染色体は、一旦、該染色体が酵母ｙの細胞へと導入されると、酵母ｙの細胞に関して外来性の核酸である。

マンノシダーゼをコードする核酸は、配列番号３、または配列番号４において示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を有することができる。一部の実施形態においては、本明細書に記載される核酸は、配列番号５において示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９９、または１００％）の同一性を有するマンノシダーゼポリペプチドをコードすることができる。特定のアミノ酸配列と配列番号５において示されるアミノ酸配列の間の％同一性は、以下のとおり決定することができる。まず、ＢＬＡＳＴＰバージョン２．０．１４を含有する独立型バージョンのＢＬＡＳＴＺ由来のＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（Ｂｌ２ｓｅｑ）プログラムを使用してアミノ酸配列を整列させる。この独立型バージョンのＢＬＡＳＴＺは、Ｆｉｓｈ＆Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎのウェブサイト（例えば、ｗｗｗ．ｆｒ．ｃｏｍ／ｂｌａｓｔ／）または米国政府の国立バイオテクノロジー情報センターのウェブサイト（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から得ることができる。Ｂｌ２ｓｅｑプログラムを使用する方法を説明する指示は、ＢＬＡＳＴＺに添付のリードミーファイルにおいて見出すことができる。Ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使用して２つのアミノ酸配列間の比較を実行する。２つのアミノ酸配列を比較するために、Ｂｌ２ｓｅｑのオプションは、以下のとおり設定される。−ｉは、比較されるべき第一のアミノ酸配列を含有するファイル（例えば、Ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ）に対して設定され、−ｊは、比較されるべき第二のアミノ酸配列を含有するファイル（例えば、Ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ）に対して設定され、−ｐはｂｌａｓｔｐに対して設定され、−ｏは任意の所望のファイル名（例えば、Ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ）に対して設定され、かつ他のオプションはすべて該オプションのデフォルト設定のままである。例えば、２つのアミノ酸配列間の比較を含有する出力ファイルを生じるために、以下のコマンド、すなわちＣ：＼Ｂｌ２ｓｅｑ −ｉ ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ −ｊ ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ −ｐ ｂｌａｓｔｐ −ｏ ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔを使用することができる。この２つの比較される配列が相同性を共有する場合、指定された出力ファイルは、それらの相同性の領域を整列した配列として示す。この２つの比較される配列が相同性を共有しない場合、指定された出力ファイルは整列した配列を示さない。類似の手順は、ｂｌａｓｔｎを使用することを除き、核酸配列について行なわれてよい。

一旦整列すると、マッチ数は、同一のアミノ酸残基が両配列中に存在する位置の数を計数することによって決定される。％同一性は、マッチ数を全長のマンノシダーゼポリペプチドアミノ酸配列の長さによって除した後に、結果として生じる値に１００を乗じることによって決定される。

％同一性の値は、最も近い１０分の１の位に丸められることは留意される。例えば、７８．１１、７８．１２、７８．１３、および７８．１４は７８．１へと切り捨てられるのに対し、７８．１５、７８．１６、７８．１７、７８．１８、および７８．１９は７８．２と切り上げられる。長さの値が常に整数であることも留意される。

多くの核酸が特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができることは認識される。遺伝暗号の縮重は、当該技術分野に周知であり、すなわち、多くのアミノ酸について、アミノ酸のためのコドンとして機能する１つを超えるヌクレオチドのトリプレットがある。例えば、所与のマンノシダーゼポリペプチドについてのコード配列におけるコドンは、特定の種（例えば、細菌または真菌）における最適な発現が、該種のための適切なコドンバイアス表を使用して得られるよう改変され得る。

２つの核酸配列間の相同性を評価するために、ハイブリダイゼーションを使用することもできる。本明細書に記載される核酸配列、またはその断片もしくはバリアントは、標準的なハイブリダイゼーション技術に従ってハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。関心対象のプローブ（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉヌクレオチド配列の一部を含有するプローブ）の、試験源由来のＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリダイゼーションは、該試験源におけるプローブに対応するＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉヌクレオチド配列）の存在の指標である。ハイブリダイゼーション条件は当業者に公知であり、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．、６．３．１〜６．３．６、１９９１において得ることができる。中程度のハイブリダイゼーション条件は、３０℃での２×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）におけるハイブリダイゼーションに続く５０℃での１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける洗浄と等価として定義される。高度にストリンジェントな条件は、４５℃での６×塩酸ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）におけるハイブリダイゼーションに続く、６５℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける洗浄と等価として定義される。

本明細書における使用に好適なマンノシダーゼポリペプチドの他の候補物は、ヌクレオチドおよびポリペプチドの配列アラインメントの分析によって同定することができる。例えば、ヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のデータベースに関する質問を実行することにより、マンノシダーゼポリペプチドのホモログおよび／またはオルトログを同定することができる。配列分析は、公知のマンノシダーゼアミノ酸配列を使用する非重複データベースのＢＬＡＳＴ分析、Ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ＢＬＡＳＴ分析、またはＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ分析を包含することができる。４０％超の配列同一性を有するデータベースにおけるマンノシダーゼポリペプチドは、マンノシダーゼポリペプチドとしての好適性についてのさらなる評価のための候補物として同定することができる。アミノ酸配列類似性は、ある疎水性残基の別の疎水性残基との置き換えまたはある極性残基の別の極性残基との置き換えのような保存的アミノ酸置換を可能にする。所望の場合、さらに評価されるべき候補物の数を絞るために、このような候補物の手動点検を実施することができる。

本文書は、本明細書に記載されるマンノシダーゼの（ｉ）生物活性のあるバリアントおよび（ｉｉ）その生物活性のある断片または生物活性のあるバリアントも提供する。マンノシダーゼの生物活性のあるバリアントは、配列番号５に示すアミノ酸配列または配列番号３および４に示すヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列に対する付加、欠失、または置換を含有することができる。置換を有するタンパク質は一般的に、５０以下（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、または５０を超えない）の保存的アミノ酸置換を有する。保存的置換とは、あるアミノ酸の、類似の特徴を有する別のアミノ酸との置換である。保存的置換には、以下の群内の置換が含まれる：バリン、アラニン、およびグリシン；ロイシン、バリン、およびイソロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギンおよびグルタミン；セリン、システイン、およびトレオニン；リシンおよびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。非極性疎水性アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれる。極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれる。正に帯電した（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リシン、およびヒスチジンが含まれる。負に帯電した（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。上記の極性基、塩基性基、または酸性基のうちのある構成員の、同一群の別の構成員による任意の置換は、保存的置換であるとみなすことができる。対照的に、非保存的置換とは、あるアミノ酸の、類似していない特徴を有する別のアミノ酸との置換である。

欠失バリアントは、（２つ以上のアミノ酸の）１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０のアミノ酸セグメントまたは非連続的な単一のアミノ酸を欠失することができる。

付加（付加バリアント）には、（ａ）配列番号３もしくは４に示す核酸配列によってコードされるマンノシダーゼまたは配列番号５に示すアミノ酸配列を有するマンノシダーゼまたはその断片と、（ｂ）内部または末端（ＣまたはＮ）の無関係のまたは異種性のアミノ酸配列とを含有する融合タンパク質が含まれる。このような融合タンパク質の文脈においては、用語「異種性アミノ酸配列」は、（ａ）以外のアミノ酸配列を指す。異種性配列は例えば、組換えタンパク質（例えば、ＦＬＡＧ、ポリヒスチジン（例えば、ヘキサヒスチジン）、赤血球凝集素（ｈｅｍａｇｌｕｔｔａｎｉｎ）（ＨＡ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ））の精製に使用される配列であることができる。異種性配列は、診断用マーカーまたは検出可能なマーカーとして有用なタンパク質、例えば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）であることもできる。一部の実施形態においては、融合タンパク質は、別のタンパク質由来のシグナル配列を含有する。ある宿主細胞（例えば、酵母宿主細胞）においては、標的タンパク質の発現および／または分泌は、異種性シグナル配列の使用によって増大することができる。一部の実施形態においては、融合タンパク質は、例えば抗体産生のための免疫応答を惹起するのに有用なキャリア（例えば、ＫＬＨ）、または小胞体もしくはゴルジ装置の保持シグナルを含有することができる。異種性配列は多様な長さであることができ、一部の場合においては、異種性配列が結合する全長の標的タンパク質よりも長い配列であることができる。

マンノシダーゼの生物活性のある断片または生物活性のあるバリアントは、野生型の全長の成熟タンパク質のマンノシダーゼ活性（例えば、脱マンノシル化すること）の少なくとも４０％（例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは１００％、またはさらにそれより大）を有する。

本明細書に記載されるマンノシダーゼを使用して、脱マンノシル化した標的分子を生成することができる。該方法は、インビトロまたはインビボで実施することができる。

（糖タンパク質を脱マンノシル化する方法）
本明細書に記載する場合、リン酸化Ｎ−グリカンを含有する糖タンパク質は、基礎をなすマンノースがリン酸化される場合に末端α−１，２マンノース結合または末端α−１，２マンノース部分を加水分解することのできるマンノシダーゼを使用して脱マンノシル化することができる。このようなマンノシダーゼの非限定例としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｔｏｉ（Ａｓ）（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐｈｏｅｎｉｃｉｓとしても公知）由来のマンノシダーゼまたはＣｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌａｎｓ（例えば、ＣｃＭａｎ４）由来のマンノシダーゼが挙げられる。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｔｏｉマンノシダーゼのアミノ酸配列を配列番号５（図１５を参照されたい）およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＡ０８６３４に示す。ＣｃＭａｎ４ポリペプチドは、配列番号４に示すヌクレオチド配列（図４を参照されたい）によってコードされる。

Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｔｏｉマンノシダーゼおよびＣｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌａｎｓマンノシダーゼ（例えば、ＣｃＭａｎ４）を組換えで産生することができる。マンノシダーゼポリペプチドをコードする単離された核酸分子は、標準的な技術によって生成することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術は、本明細書に記載されるヌクレオチド配列を含有する単離された核酸を得るために使用することができる。ＰＣＲは、全ゲノムＤＮＡまたは全細胞ＲＮＡに由来する配列を含む、ＤＮＡならびにＲＮＡに由来する特定の配列を増幅するために使用することができる。一般的には、関心対象の領域の末端からのまたはそれを越えたところからの配列情報を使用して、増幅されるべきテンプレートの反対鎖と配列が同一または類似であるオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。種々のＰＣＲ戦略も利用可能であり、該戦略によって、部位特異的ヌクレオチド配列改変は、テンプレート核酸へと導入することができる。単離された核酸は、単一の核酸分子として（例えば、ホスホルアミダイト技法を使用する３’から５’への方向における自動ＤＮＡ合成を使用して）、または一連のオリゴヌクレオチドとしてのいずれかで、化学的に合成することもできる。例えば、オリゴヌクレオチド対がアニーリングされる場合に二本鎖が形成されるよう、各対が相補性のある短いセグメント（例えば、約１５ヌクレオチド）を含有する所望の配列を含有する、１対以上の長いオリゴヌクレオチド（例えば、１００ヌクレオチド超）を合成することができる。ＤＮＡポリメラーゼを使用してオリゴヌクレオチドを伸長し、結果として、オリゴヌクレオチド対あたり単一の二本鎖核酸分子を生じ、それを次にベクターへと連結することができる。単離された核酸は、例えば、天然に存在するＤＮＡの変異誘発によって得ることもできる。

マンノシダーゼポリペプチドを組換え生成するために、マンノシダーゼポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含有するベクターを使用する。本明細書で使用する場合、「プロモーター」は、遺伝子が転写されるようにすることができるＤＮＡ配列を指す。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼによって認識され、そのＲＮＡポリメラーゼが転写を開始する。したがって、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼが直接結合するかまたはＲＮＡポリメラーゼの動員に関与するかのいずれかであるＤＮＡ配列を含有する。プロモーター配列は、「エンハンサー領域」も含まれ得、該領域は、タンパク質（すなわち、トランス作用因子であり、ほとんどが１群の転写因子のようである）と結合して遺伝子クラスターにおける遺伝子の転写レベルを高めることのできるＤＮＡの１つ以上の領域（したがって、その名前を有する）である。エンハンサーは、コード領域の５’末端では典型的に、プロモーター配列とも異なることができる一方で、例えば、遺伝子のイントロン領域内または該遺伝子のコード領域に対して３’内にあることができる。

本明細書で使用する場合、「作動可能に連結された」は、発現制御配列が関心対象のコード配列の発現を有効に制御するよう、遺伝子コンストラクト（例えば、ベクター）へと組み込まれることを意味する。

発現ベクターは、コードされたポリペプチドの発現のために宿主細胞へと（例えば、形質転換またはトランスフェクションによって）導入したのち、精製することができる。マンノシダーゼポリペプチドの小規模または大規模な産生のために使用することのできる発現系は、上記核酸分子を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ発現ベクター、プラスミドＤＮＡ発現ベクター、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、および該核酸分子を含有する組換え真菌発現ベクターで形質転換された真菌（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ａｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓのような微生物を含むが、これらに限定されない。有用な発現系は、上記核酸分子を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系、および組換えウイルス発現ベクター（例えば、タバコモザイクウイルス）に感染させたまたは該核酸分子を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換した植物細胞系も含む。マンノシダーゼポリペプチドは、哺乳類細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳類ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーターおよびサイトメガロウイルスプロモーター）を含有する組換え発現コンストラクトを有する細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ヒト胎児由来腎臓２９３細胞、および３Ｔ３ Ｌ１細胞のような不死化した細胞系）を含む哺乳類発現系を使用して産生することもできる。

典型的には、組換えマンノシダーゼポリペプチドに、ＦＬＡＧ、ポリヒスチジン（例えば、ヘキサヒスチジン）、赤血球凝集素（ｈｅｍａｇｌｕｔｔａｎｉｎ）（ＨＡ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）のような異種性アミノ酸配列をタグ付けして、該タンパク質を精製するのを支援する。タンパク質を精製するための他の方法には、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性および逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性電荷誘導クロマトグラフィーなどのようなクロマトグラフィー技術が含まれる（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、第３版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；ＢｕｒｔｏｎおよびＨａｒｄｉｎｇ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ ８１４：７１〜８１（１９９８）を参照されたい）。

脱マンノシル化した糖タンパク質を産生するために、基礎をなすマンノースがリン酸化される末端α−１，２マンノース結合または末端α−１，２マンノース部分を含有する標的分子を、好適な条件下で、マンノシダーゼまたは組換え産生されたマンノシダーゼを含有する細胞溶解産物と接触させる。好適なマンノシダーゼは上述されている。細胞溶解産物は、真菌細胞、植物細胞、または動物細胞を含む遺伝子操作された任意の細胞由来であり得る。動物細胞の非限定例としては、線虫、昆虫、植物、鳥類、爬虫類、および、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、アレチネズミ、イヌ、ネコ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、クジラ、サル、またはヒトのような哺乳類が挙げられる。

標的分子（例えば、糖タンパク質）を精製されたマンノシダーゼまたは細胞溶解産物に接触させると、末端α−１，２マンノース結合を加水分解して、脱マンノシル化した標的分子を生成することができる。

細胞溶解産物におけるマンノシダーゼ活性の活性度または完全性を保存する該細胞溶解産物を得るのに好適な方法には、該細胞溶解産物におけるＮ−グリコシル化活性の変化を保存または最小化する適切なバッファならびに／またはヌクレアーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、およびホスファターゼ阻害剤を含む阻害剤の使用を含めることができる。このような阻害剤は例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコールビス（Ｐ−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ１，Ｎ１−四酢酸（ＥＧＴＡ）のようなキレート剤、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、アプロチニン、ロイペプチン、アンチパインなどのようなプロテアーゼ阻害剤、ならびにホスフェート、フッ化ナトリウム、バナデートなどのようなホスファターゼ阻害剤が挙げられる。酵素活性を含有する溶解産物を得るのに適切なバッファおよび条件は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（別冊４７）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９９９）；Ｔｉｅｔｚ、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３版、ＢｕｒｔｉｓおよびＡｓｈｗｏｏｄ編、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９９９）に記載されている。

細胞溶解産物は適宜、干渉する物質の存在を除去または最小化するようさらに処理することができる。所望の場合、細胞溶解産物は、細胞下分画（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）、およびイオン交換クロマトグラフィー、疎水性および逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性電荷誘導クロマトグラフィーなどのようなクロマトグラフィー技術を含む、当業者に周知の種々の方法によって分画することができる。

一部の実施形態においては、細胞溶解産物は、細胞小器官全体が無傷および／または機能的であるままで調製することができる。例えば、溶解産物は、無傷の粗面小胞体、無傷の滑面小胞体、または無傷のゴルジ装置のうちの１つ以上を含有することができる。無傷の細胞小器官を含有する溶解産物を調製して、該小器官の機能性について試験するのに好適な方法は、例えば、Ｍｏｒｅａｕら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（７）：４３２９〜４３３３；Ｍｏｒｅａｕら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（７）：４３２２〜４３２８；Ｒｅｘａｃｈら（１９９１）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１４（２）：２１９〜２２９；およびＰａｕｌｉｋら（１９９９）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３６７（２）：２６５〜２７３に記載されている。

標的分子は、本明細書で使用する場合、基礎をなすマンノースがリン酸化される場合の、末端α−１，２マンノース結合または末端α−１，２マンノース部分を含有する任意の分子を指す。一部の実施形態においては、標的タンパク質は、ヒト糖タンパク質である。好適な標的タンパク質には、破傷風トキソイドまたはジフテリア（ｄｉｐｔｈｅｒｉａ）トキソイドのような病原体タンパク質；サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）糖タンパク質Ｂ、Ｈ、およびｇＣＩＩＩ、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）エンベロープ糖タンパク質、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンベロープ糖タンパク質、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）エンベロープ糖タンパク質、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）エンベロープ糖タンパク質、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）エンベロープ糖タンパク質、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）エンベロープ糖タンパク質、インフルエンザウイルス糖タンパク質、ならびに肝炎ファミリー表面抗原のようなウイルス表面タンパク質、リソソームタンパク質（例えば、酸性αグルコシダーゼ、αガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、セレブロシダーゼ、またはガラクトセレブロシダーゼ）、インスリン、グルカゴン、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、ならびにこれらの抗体または断片を挙げることができる。増殖因子には、例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、骨形態形成因子（ＢＭＰ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、エリトロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）、増殖分化因子９（ＧＤＦ９）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦまたはＦＧＦ２）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）が含まれる。サイトカインには、例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−３３（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、またはＩＬ−１５）のようなインターロイキンが含まれる。ケモカインには、例えば、Ｉ−３０９、ＴＣＡ−３、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｃ１０、ＭＲＰ−２、ＭＡＲＣ、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−２、ＭＲＰ−２、ＣＣＦ１８、ＭＩＰ−１γ、エオタキシン、ＭＣＰ−５、ＭＣＰ−４、ＮＣＣ−１、Ｃｋβ１０、ＨＣＣ−１、ロイコタクチン−１、ＬＥＣ、ＮＣＣ−４、ＴＡＲＣ、ＰＡＲＣ、またはエオタキシン−２が含まれる。腫瘍糖タンパク質（例えば、腫瘍関連抗原）、例えば、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ヒトムチン、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、および前立腺特異抗原（ＰＳＡ）も含まれる［ＨｅｎｄｅｒｓｏｎおよびＦｉｎｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６２，ｐｐ．２１７〜５６（１９９６）］。

一部の実施形態においては、標的タンパク質は、リソソーム蓄積障害と関連したものであることができ、該標的タンパク質は、例えば酸性αグルコシダーゼ、αガラクトシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼ、β−Ｄ−マンノシダーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼ、アリールスルファターゼＢ、アリールスルファターゼＡ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、アスパルチルグルコサミニダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、α−グルコサミニド−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、β−Ｄ−グルクロニダーゼ（ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｄａｓｅ）、ヒアルロニダーゼ、α−Ｌ−マンノシダーゼ、α−ノイラミニダーゼ、ホスホトランスフェラーゼ、酸性リパーゼ、酸性セラミダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、チオエステラーゼ、カテプシンＫ、およびリポタンパク質リパーゼを含む。

一部の実施形態においては、標的タンパク質は、それが別のポリペプチド配列に、またはポリマー、キャリア、アジュバント、免疫毒素、もしくは検出可能な（例えば、蛍光、発光、または放射性）部分に融合した融合タンパク質である。例えば、標的タンパク質は、低分子タンパク質の分子量を増加させるために、および／または循環滞留時間を延長するために、ポリエチレングリコールのようなポリマーに結合することができる。

（糖タンパク質を脱マンノシル化するインビボでの方法）
本明細書に記載される遺伝子操作された細胞は、脱マンノシル化した標的分子を産生するために使用することができる。例えば、細胞を基にした方法は、基礎をなすマンノースがリン酸化される場合に、末端α−１，２マンノース結合または末端α−１，２マンノース部分を加水分解することのできるマンノシダーゼをコードする核酸を含むよう遺伝子操作された真菌細胞に標的分子をコードする核酸を導入する工程であって、ここで、該細胞は、脱マンノシル化したリン酸化Ｎ−グリカンを含有する標的分子を産生する工程を含むことができる。一部の実施形態においては、上記マンノシダーゼおよび標的分子をコードする核酸は、該マンノシダーゼおよび標的分子が共分泌されるよう、分泌配列を含有する。

本明細書に記載される遺伝子操作された細胞は、マンノシダーゼをコードする核酸を含有する。標的分子のインビボでの産生に好適な細胞は、

このような細胞は、本明細書に記載されるような遺伝子操作の前に、種々の商業的供給源および研究資源施設（例えば、米国培養細胞系統保存機関（米国メリーランド州ロックヴィルなど）から得ることができる。標的分子には、本明細書に記載される任意の標的タンパク質などのタンパク質が含まれる（上を参照されたい）。

細胞の遺伝子操作は、マンノシダーゼをコードする外来性核酸に加えて、（ｉ）外側鎖伸長（ＯＣＨ１）タンパク質をコードする内在性遺伝子の欠失、（ｉｉ）マンノシルリン酸化を促進してマンノース残基のリン酸化を増大させることができるポリペプチド（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｌｙｔｉｃａ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、もしくはＣ．ａｌｂｉｃａｎｓに由来するＭＮＮ４ポリペプチド、またはＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓに由来するＰＮＯ１ポリペプチド）をコードする組換え核酸の導入、（ｉｉｉ）ＯＣＨ１タンパク質の機能的発現に干渉するＲＮＡ分子の導入または発現、（ｉｖ）Ｎ−グリコシル化活性を有する野生型（例えば、内在性または外来性）タンパク質をコードする（すなわち、Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質を発現する）組換え核酸の導入、（ｖ）上記の標的分子をコードする組換え核酸の導入、あるいは（ｖ）Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質をコードする１つ以上の内在性遺伝子のプロモーターエレメントまたはエンハンサーエレメントを変更し、したがってそれらののコードタンパク質の発現を変更などの１種類以上の遺伝子改変を含むことができる。ＲＮＡ分子は、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が含まれる。遺伝子操作には、Ｎ−グリコシル化活性を有して、付加（例えば、異種性配列）、欠失、または置換（例えば、点変異のような変異、保存的変異または非保存的変異）を有するタンパク質を産生するタンパク質をコードする内在性遺伝子を変更することも含まれる。変異は、（例えば、部位特異的変異誘発または相同組換えによって）特異的に導入することができ、または無作為に導入することができる（例えば、細胞は、例えばＮｅｗｍａｎおよびＦｅｒｒｏ−Ｎｏｖｉｃｋ（１９８７）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０５（４）：１５８７）に記載されるように化学的に変異誘発され得る）。

本明細書に記載される遺伝子改変は結果的に、（ｉ）遺伝子改変細胞における１種類以上の活性の増大、（ｉｉ）遺伝子改変細胞における１種類以上の活性の低下、または（ｉｉｉ）遺伝子改変細胞における１種類以上の活性の局在性もしくは細胞内分布の変化、のうちの１つ以上を生じることができる。特定の活性の量の増大（例えば、マンノシルリン酸化を促進すること）は、マンノシルリン酸化を促進することのできる１種類以上のタンパク質を過剰発現させること、内在性遺伝子のコピー数の増加（例えば、遺伝子重複）、または内在性遺伝子によってコードされるタンパク質の発現の増大を刺激する該遺伝子のプロモーターもしくはエンハンサーの変更によることができる。１種類以上の特定の活性の低下は、変異体形態（例えば、ドミナントネガティブ形態）の過剰発現、特定の活性を有する１種類以上のタンパク質の発現を低下させる１種類以上の干渉性ＲＮＡ分子の導入もしくは発現、または特定の活性を有するタンパク質をコードする１種類以上の内在性遺伝子の欠失によることができる。

相同組換えによって遺伝子を破壊させるために、「遺伝子置換」ベクターは、選択可能なマーカー遺伝子を含むような方法で構築することができる。選択可能なマーカー遺伝子は、５’末端および３’末端の両方で、相同組換えを仲介するのに十分な長さの遺伝子の部分に作動可能に連結され得る。選択可能なマーカーは、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＥＵ２遺伝子、およびＨＩＳ３遺伝子を含む、宿主細胞栄養要求性を補完するかまたは抗生物質耐性を提供するかのいずれかである任意の数の遺伝子のうちの１つであることができる。他の好適な選択可能なマーカーには、酵母細胞に対してクロラムフェニコール耐性を与えるＣＡＴ遺伝子、またはβ−ガラクトシダーゼの発現による青色コロニーを結果として生じるｌａｃＺ遺伝子が挙げられる。次に、遺伝子置換ベクターの線状化ＤＮＡ断片を、当該技術分野で周知の方法を使用して上記細胞へと導入する（下記を参照されたい）。その線状断片のゲノムへの組込みおよび上記遺伝子の破壊は、選択マーカーを基にして決定することができ、例えば、サザンブロット分析によって実証することができる。選択可能なマーカーは、例えばＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムによって宿主細胞のゲノムから除去することができる（下記を参照されたい）。

あるいは、遺伝子置換ベクターは、破壊されるべき遺伝子の一部を含むような方法で構築することができ、該一部は、任意の内在性遺伝子プロモーター配列がまったくなく、かつ該遺伝子のコード配列のいずれもコードせず、または該コード配列の不活性断片をコードする。「不活性断片」とは、上記遺伝子の全長のコード配列から生成されるタンパク質の活性の例えば約１０％未満（例えば、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、または０％）を有するタンパク質をコードする遺伝子の断片である。上記遺伝子のこのような一部を、公知のプロモーター配列が該遺伝子配列に作動可能に連結されないものの、終止コドンおよび転写終結配列が該遺伝子配列の一部に作動可能に連結されるような方法で、ベクターに挿入する。このベクターはその後、遺伝子配列の一部において線状化し、細胞へと形質転換することができる。単一の相同組換えによって、この線状化ベクターを次に、上記遺伝子の内在性対応物に組み込む。

発現ベクターは、自律的または組込み型であることができる。組換え核酸（例えばマンノシダーゼをコードする組換え核酸）は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、またはウイルス粒子のような発現ベクターの形態で細胞へと導入することができる。組換え核酸は、染色体外で維持することができ、または酵母細胞染色体ＤＮＡへと組み込むことができる。発現ベクターは、所望の核酸で形質転換した細胞の検出および／または選択を可能にするために、選択された条件下で細胞生存度に必要なタンパク質をコードする選択マーカー遺伝子（例えば、ウラシル生合成に必要な酵素をコードするＵＲＡ３、またはトリプトファン生合成に必要な酵素をコードするＴＲＰ１）を含有することができる（例えば、米国特許第４，７０４，３６２号を参照されたい）。発現ベクターには、自律複製配列（ＡＲＳ）も含めることができる。例えば、米国特許第４，８３７，１４８号は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるプラスミドを維持するのに好適な手段を提供する自律複製配列を記載している。

統合型ベクターは、例えば、米国特許第４，８８２，２７９号において開示されている。統合型ベクターには一般的に、少なくとも１つの第一の挿入可能なＤＮＡ断片、１つの選択可能なマーカー遺伝子、および１つの第二の挿入可能なＤＮＡ断片からなる連続的に配置された配列が含まれる。第一および第二の挿入可能なＤＮＡ断片は各々、長さ約２００（例えば、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、または約１０００、またはそれより長い）ヌクレオチドであり、かつ形質転換されるべき種のゲノムＤＮＡの部分に対して相同的であるヌクレオチド配列を有する。発現のための関心対象の遺伝子（例えば、Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質をコードする遺伝子）を含有するヌクレオチド配列は、マーカー遺伝子の前であろうと後であろうと、このベクターにおいて、第一の挿入可能なＤＮＡ断片と第二の挿入可能なＤＮＡ断片の間に挿入される。統合型ベクターは、関心対象のヌクレオチド配列の宿主細胞ゲノムへの組込みを促進するために、酵母形質転換前に線状化され得る。

発現ベクターは、酵母（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ａｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、または他の好適な真菌種）プロモーターの制御下での組換え核酸の特色をなすことができ、該プロモーターによって、真菌細胞において発現することができる。好適な酵母プロモーターには、例えば、ＡＤＣ１プロモーター、ＴＰＩ１プロモーター、ＡＤＨ２プロモーター、ｈｐ４ｄプロモーター、ＰＯＸプロモーター、およびＧａｌ１０プロモーターが含まれる（例えば、Ｇｕａｒｅｎｔｅら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９（２３）：７４１０を参照されたい）。追加の好適なプロモーターは、例えば、ＺｈｕおよびＺｈａｎｇ（１９９９）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １５（７〜８）：６０８〜６１１ならびに米国特許第６，２６５，１８５号に記載されている。

プロモーターは、構成的または誘導性（条件的）であることができる。構成的プロモーターは、は、標準的な培養条件下で発現が一定であるプロモーターであると理解されている。誘導性プロモーターとは、１つ以上の誘導指示（Ｃｕｅ）に対して応答性であるプロモーターである。例えば、誘導性プロモーターは、化学的に調節されることができ（例えば、アルコール、テトラサイクリン、ステロイド、金属、または他の低分子のような化学的誘導剤の存在または不在によってその転写活性が調節されるプロモーター）、または物理的に調節され得る（例えば、光または高温もしくは低温のような物理的誘導因子の存在または不在によってその転写活性が調節されるプロモーター）。誘導性プロモーターは、化学的指示または物理的指示によってそれ自体が直接的に調節される１種類以上の転写因子によって間接的に調節されることもできる。

遺伝子操作された他の改変も条件的であることができることは理解される。例えば、遺伝子は、例えばＣｒｅ−ｌｏｘＰ系のような部位特異的ＤＮＡ組換え酵素を使用して、条件的に欠失させることができる（例えば、Ｇｏｓｓｅｎら（２００２）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３６：１５３〜１７３および米国特許出願公開第２００６００１４２６４号を参照されたい）。

組換え核酸は、スフェロプラスト技術または全細胞塩化リチウム酵母形質転換法のような種々の方法を使用して、本明細書に記載された細胞へと導入することができる。プラスミドまたは線状核酸ベクターの細胞への形質転換に有用な他の方法は、例えば、米国特許第４，９２９，５５５号、Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２９、Ｉｔｏら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３、米国特許第４，８７９，２３１号、およびＳｒｅｅｋｒｉｓｈｎａら（１９８７）Ｇｅｎｅ ５９：１１５に記載されており、これらの各々の開示は、それらのすべての内容が全体として引用により本明細書に組み込まれている。電気穿孔法およびＰＥＧ１０００全細胞形質転換法も、ＣｒｅｇｇおよびＲｕｓｓｅｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｉｃｈｉａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第３章、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．、ｐｐ．２７〜３９（１９９８）に記載されているとおり使用してもよい。

形質転換した真菌細胞は、新たな表現型の選択および検出のために（細胞の栄養要求性により）必要とされる生化学的産物の不在下で形質転換後に栄養要求性細胞を培養すること、または形質転換体に含有される耐性遺伝子の不在下で酵母に対して毒性のある抗生物質の存在下で培養することを含むがこれらに限定されない適切な技術を使用することによって選択することができる。形質転換体は、例えばサザンブロットまたはＰＣＲ分析によって評価することのできる、ゲノムへの発現カセットの組込みによって選択および／または実証することもできる。

ベクターを関心対象の標的細胞に導入する前に、ベクターは、上に記載したとおり、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌細胞において増殖させる（例えば、増幅させる）ことができる。ベクターＤＮＡは、ベクターＤＮＡの細菌環境からの精製を結果として生じる、当該技術分野で公知の方法のうちの何らかによって、細菌細胞から単離することができる。精製されたベクターＤＮＡは、大腸菌タンパク質が哺乳類細胞に対して毒性であることができるので、これらのタンパク質がプラスミドＤＮＡ調製物中に存在しないことを確保するために、フェノール、クロロホルム、およびエーテルで徹底的に抽出することができる。

一部の実施形態においては、遺伝子操作された真菌細胞は、ＯＣＨ１遺伝子またはその遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質）を欠いており、ＯＣＨ１活性を欠損している。一部の実施形態においては、遺伝子操作された細胞は、マンノシルリン酸化を促進することのできるポリペプチド（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、もしくはＣ．ａｌｂｉｃａｎｓに由来するＭＮＮ４ポリペプチド、またはＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓに由来するＰＮＯ１ポリペプチド）を発現する。例えば、真菌細胞は、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のＭＮＮ４ポリペプチド（Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）受託番号：ＸＭ＿５０３２１７、Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ参照コード：ＹＡＬＩ０Ｄ２４１０１ｇ）を発現することができる。一部の実施形態においては、遺伝子操作された細胞は、ＯＣＨ１活性を欠損しており、マンノシルリン酸化を促進することのできるポリペプチドを発現する。

脱マンノシル化の後、標的分子は単離することができる。一部の実施形態においては、標的分子は、酵母細胞内で維持され、細胞溶解の際に放出される。一部の実施形態においては、標的分子は、上記細胞からの該分子の分泌を誘導する、（外来性核酸に対して天然であるかまたは発現ベクターへと操作されるかのいずれかである）コード配列によって提供される機序を介して培養培地へと分泌される。細胞溶解産物または培養培地中のキャップを外されかつ脱マンノシル化した標的分子の存在は、該分子の存在を検出するための種々の標準的なプロトコルによって実証することができる。例えば、変更した標的分子がタンパク質である場合、このようなプロトコルは、変更した標的タンパク質に特異的な抗体（または該標的タンパク質自体）を使用するイムノブロッティングまたは放射性免疫沈降、変更した標的タンパク質に特異的なリガンド（または該標的タンパク質自体）の結合、または変更した標的タンパク質（または該標的タンパク質自体）の酵素の比活性についての試験が含まれ得るが、これらに限定されない。

一部の実施形態においては、単離後に、脱マンノシル化した標的分子は、例えば酵素的手段または化学的手段を使用して異種性部分に結合することができる。「異種性部分」は、変更した標的分子に（例えば、共有結合でまたは非共有結合で）結合した任意の構成要素を指し、該構成要素は、変更した標的分子に元々存在する構成要素とは異なる。異種性部分には、例えばポリマー、キャリア、アジュバント、免疫毒素、または検出可能な（例えば、蛍光、発光、または放射性）部分を含む。一部の実施形態においては、追加のＮ−グリカンは、変更した標的分子に付加することができる。

標的分子のグリコシル化を検出するための方法には、ＤＮＡシーケンサー支援型（ＤＳＡ）、フルオロフォア支援型炭水化物電気泳動（ＦＡＣＥ）または表面支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析法（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）が挙げられる。例えば、分析は、例えば糖タンパク質を変性させた後に、例えばメンブラン上へ固定化するＤＳＡ−ＦＡＣＥを利用することができる。上記糖タンパク質は次に、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）またはβ−メルカプトエタノールのような好適な還元剤を用いて還元することができる。上記タンパク質のスルフヒドリル基は、ヨード酢酸のような酸を使用してカルボキシ化することができる。次に、Ｎ−グリカンは、Ｎ−グリコシダーゼＦのような酵素を使用して該タンパク質から放出することができる。Ｎ−グリカンは必要に応じて、還元アミノ化によって再構成および誘導体化することができる。誘導体化したＮ−グリカンは次に濃縮することができる。Ｎ−グリカン分析に好適な計測手段には、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７７ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）が含まれる。データ分析は、例えばＧＥＮＥＳＣＡＮ（登録商標）３．１ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施することができる。単離されたマンノプロテインは、そのＮ−グリカン状態を確認するために、仔ウシ腸ホスファターゼのような１種類以上の酵素を使用してさらに処理することができる。Ｎ−グリカン分析の追加の方法には、例えば、質量分析（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）、順相、逆相における高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、およびイオン交換クロマトグラフィー（例えば、グリカンが標識されていない場合にはパルス電流検出を使用し、グリカンが適切に標識されている場合、紫外吸収または蛍光を使用する）が含まれる。Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔら（２００１）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １１（４）：２７５〜２８１、およびＦｒｅｉｒｅら（２００６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１７（２）：５５９〜５６４も参照されたい。

（操作された細胞の培養物）
本文書は、本明細書に記載される遺伝子操作された細胞のうちの任意の実質的に純粋な培養物も提供する。本明細書において使用する場合、遺伝子操作された細胞の「実質的に純粋な培養物」とは、該培養物における生細胞の総数の約４０％未満（すなわち、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、約０．２５％未満、約０．１％未満、約０．０１％未満、約０．００１％未満、約０．０００１％未満、またはさらにより小）が遺伝子操作された細胞、例えば細菌細胞、真菌細胞（酵母を含む）、マイコプラズマ細胞、または原生動物細胞以外の生細胞である。本文脈における用語「約」とは、関連した百分率が、指定された百分率の１５％ほど指定された百分率を上回るまたは下回ることができることを意味する。したがって、例えば、約２０％とは、１７％〜２３％であることができる。遺伝子操作された細胞のこのような培養物には、細胞および、増殖媒体、保存媒体、または輸送媒体が含まれる。媒体は、液体、半固形（例えば、ゼラチン媒体）、または凍結であることができる。上記培養物には、液体または半固形媒体で増殖する細胞、または、凍結保存媒体または輸送媒体を含む保存媒体または輸送媒体中で保存または輸送される細胞が含まれる。上記培養物は、培養容器または保存容器または基材（例えば、培養皿、培養フラスコ、もしくは培養チューブ、または保存バイアルもしくは保存チューブ）の中にある。

本明細書に記載される遺伝子操作された細胞は、例えば、凍結した細胞懸濁液として、例えば、グリセロールまたはスクロースのような凍結保護物質を含有するバッファ中に、凍結乾燥した細胞として保存することができる。あるいは、上記細胞は、例えば、流動床乾燥もしくは噴霧乾燥、または任意の他の好適な乾燥方法によって得られる乾燥した細胞調製物として保存することができる。

（代謝障害）
脱マンノシル化した分子は、種々の代謝障害を処置するために使用することができる。代謝障害とは、個々のヒト（または動物）細胞内でのエネルギー産生に影響する障害である。ほとんどの代謝障害は遺伝性であるが、一部は、食事、毒素、感染症などの結果として「後天的」であることができる。遺伝性代謝障害は、先天性代謝異常としても公知である。一般に、遺伝性代謝障害は、細胞の代謝過程における一部のプロセスに必要な酵素を失うことまたは不適切に構成されることを結果的に生じる遺伝的欠陥に起因する。最大のクラスの代謝障害は、炭水化物代謝の障害、アミノ酸代謝の障害、有機酸代謝の障害（有機酸性尿）、脂肪酸酸化およびミトコンドリア代謝の障害、ポルフィリン代謝の障害、プリン代謝もしくはピリミジン代謝の障害、ミトコンドリア機能におけるステロイド代謝障害の障害、ペルオキシソーム機能の障害、およびリソソーム蓄積障害（ＬＳＤ）である。

脱マンノシル化した１つ以上の分子（または該分子の薬学的組成物）の投与によって処置することのできる代謝障害の例としては、遺伝性ヘモクロマトーシス、眼皮膚型白皮症、プロテインＣ欠乏症、遺伝性血管性浮腫Ｉ型、先天性スクラーゼイソマルターゼ欠損症、クリグラー・ナジャーＩＩ型、ラロン症候群、遺伝性ミエロペルオキシダーゼ、原発性甲状腺機能低下症、先天性ＱＴ延長症候群、チロキシン結合グロブリン欠損症、家族性高コレステロール血症、家族性乳糜血症、無ベータリポタンパク血症（ａｂｅｔａ−ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｅｍａ）、低い血漿リポタンパク質Ａレベル、肝損傷を伴う遺伝性気腫、先天性甲状腺機能低下症、骨形成不全症、遺伝性低フィブリノゲン血症、α１−アンチキモトリプシン欠損症、腎性尿崩症、神経下垂体性尿崩症、アデノシンデアミナーゼ欠損症、ペリツェウス・メルツバッハー病、フォンウィルブランド病ＩＩＡ型、複合第Ｖ因子・第ＶＩＩＩ因子欠損症、遅発性脊椎骨端異形成、コロイデレミア、Ｉ細胞病、バッテン病、毛細管拡張性運動失調、ＡＤＰＫＤすなわち常染色体優性多発嚢胞腎症、微絨毛性封入体病、結節硬化症、ローの眼脳腎症候群、筋萎縮性側索硬化症、骨髄異形成症候群、不全リンパ球症候群、タンジアー病、家族性肝内胆汁鬱滞、Ｘ染色体連鎖副腎白質ジストロフィー、スコット症候群、ヘルマンスキー・パドラック症候群１型および２型、ツェルヴェーガー症候群、近接短縮性点状軟骨異形成症、常染色体劣性原発性高シュウ酸尿症、モール・トラネビャエルグ（Ｔｒａｎｅｂｊａｅｒｇ）症候群、脊髄性および延髄性筋萎縮症（ｓｐｉｎａｌ ａｎｄ ｂｕｌｌａｒ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）、原発性線毛運動不全（カルタゲナー症候群）、巨人症および先端巨大症、乳汁漏出、アジソン病、副腎性男性化、クッシング症候群、ケトアシドーシス、原発性または続発性アルドステロン症、ミラー・ディカー症候群、滑沢脳、運動ニューロン疾患、アッシャー症候群、ヴィスコット・オールドリッチ症候群、オピッツ症候群（Ｏｐｔｉｚ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ハンチントン病、遺伝性膵炎、抗リン脂質抗体症候群、オーバーラップ結合組織病（ｏｖｅｒｌａｐ ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｄｉｓｅａｓｅ）、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、ブルガダ症候群、フィンランド型先天性腎炎症候群、デュービン・ジョンソン症候群，Ｘ染色体連鎖低リン酸血症（Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ ｈｙｐｏｐｈｏｓｐｈｏｓｐｈａｔｅｍｉａ）、ペンドレッド症候群、新生児持続性高インスリン性低血糖症、遺伝性球状赤血球症、無セルロプラスミン血症、乳児神経セロイドリポフスチン沈着症、偽性軟骨形成不全症および多発性骨端骨形成不全症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｅｐｉｐｈｙｓｅａｌ）、シュタルガルト様黄斑ジストロフィー、Ｘ染色体連鎖シャルコー・マリー・ツース病、常染色体優性網膜色素変性、ウォルコット・ラリソン症候群（Ｗｏｌｃｏｔｔ−Ｒａｌｌｉｓｏｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、クッシング病、肢帯筋ジストロフィー、ムコ多糖症（ｍｕｃｏｐｌｏｙ−ｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ）ＩＶ型、フィンランド型遺伝性家族性アミロイドーシス（ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｆａｍｉｌｉａｌ ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ ｏｆ Ｆｉｎｉｓｈ）、アンダーソン病、肉腫、慢性骨髄単球性白血病、心筋症、顔面生殖器形成不全症（ｆａｃｉｏｇｅｎｉｔａｌ ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、捻転症、ハンチントン運動失調および脊髄小脳性運動失調、遺伝性高ホモシステイン血症（ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｈｙｐｅｒｈｏｍｏｓｙｔｅｉｎｅｍｉａ）、多発ニューロパチー、下位運動ニューロン疾患、色素性網膜炎（ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ）、セロネガティブ多発性関節炎、間質性肺線維症、レイノー現象、ウエゲナー肉芽腫症（Ｗｅｇｎｅｒ’ｓ ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｓｉｓ）、タンパク尿（ｐｒｅｏｔｅｉｎｕｒｉａ）、ＣＤＧ−Ｉａ型、ＣＤＧ−Ｉｂ型、ＣＤＧ−Ｉｃ型、ＣＤＧ−Ｉｄ型、ＣＤＧ−Ｉｅ型、ＣＤＧ−Ｉｆ型、ＣＤＧ−ＩＩａ型、ＣＤＧ−ＩＩｂ型、ＣＤＧ−ＩＩｃ型、ＣＤＧ−ＩＩｄ型、エーラース・ダンロス症候群、多発性外骨腫症、グリセリ症候群（１型または２型）、またはＸ染色体連鎖非特異的精神遅滞を挙げることができる。加えて、代謝障害には、ファブリー病、ムコ多糖症Ｉ型、ファーバー病、ゴーシェ病、ＧＭ_１ガングリオシドーシス、テイ・サックス病、サンドホフ病、ＧＭ_２活性化因子疾患、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ニーマン・ピック病（Ａ型、Ｂ型、およびＣ型）、シェイエ病、ハンター病、サンフィリポ病、モルキオ病、マロトー・ラミー病、ヒアルロニダーゼ欠損症、アスパルチルグルコサミン尿症、フコース蓄積症、マンノース蓄積症、シンドラー病、１型シアリドーシス、ポンペ病、濃化異骨症、セロイドリポフスチン沈着症、コレステロールエステル貯蔵病、ウォルマン病、多発性スルファターゼ欠損症、ガラクトシアリドーシス、ムコリピドーシス（ＩＩ型、ＩＩＩ型、およびＩＶ型）、シスチン症、シアル酸蓄積障害、マリネスコ・シェーグレン症候群を伴うカイロミクロン蓄積症、ヘルマンスキー・パドラック症候群、チェディアック・東症候群、ダノン病、または幸福顔貌骨異形成症などだがこれらに限定されないリソソーム蓄積障害も含めることができる。

代謝障害の症状は多岐にわたっており、例えば、貧血、疲労、容易な紫斑形成、少ない血小板、肝腫脹、脾腫脹、骨格の弱化、肺の欠陥、感染症（例えば、胸部の感染症または肺炎）、腎臓の欠陥、進行性脳障害、発作、非常に濃い胎便、咳嗽、喘鳴、唾液または粘液の過剰産生、息切れ、腹痛、腸閉塞または消化管閉塞、妊孕性の問題、鼻の中のポリープ、指／足指の爪および皮膚の太鼓ばち指形成、手または足の疼痛、被角血管腫、少ない発汗、角膜およびレンズの混濁、白内障、僧帽弁逸脱症および／または僧帽弁逆流、心肥大、温度不耐症（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｉｎｔｏｌｅｒｎｃｅ）、歩行困難、嚥下困難、進行性失明、進行性聴覚喪失、緊張低下、巨舌、反射消失、腰痛、睡眠時無呼吸、起座呼吸、傾眠、脊柱前弯、あるいは脊柱側弯のうちの１種類以上を含むことができる。欠損しているタンパク質または存在しないタンパク質の多様な性質および結果として生じる疾患の表現型（例えば、代謝障害の症候的呈示）により、所与の障害が一般的には、その特定の障害に対して特徴的な症状のみを示すことは理解される。例えば、ファブリー病患者は、温度不耐症、角膜回転、疼痛、皮疹、吐き気、または下痢のような、しかしこれらに限定されない上記の症状の特定の部分集合を示し得る。ゴーシェ症候群患者は、巨脾腫症、硬変、痙攣、緊張亢進、無呼吸、骨粗鬆症、または皮膚変色を示し得る。

本明細書に記載される脱マンノシル化した１つ以上の分子の投与に加えて、代謝障害は、適切な栄養およびビタミン類（例えば、補因子療法）、理学療法、および疼痛用薬物適用によっても処置することができる。

所与の代謝障害の具体的な性質に応じて、患者は、いずれかの齢においてこれらの症状を示し得る。多くの症例においては、症状は、小児期にまたは青年期に示し得る。例えば、ファブリー病の症状は、少年期、例えば１０歳または１１歳で示し得る。

本明細書で使用する場合、「代謝障害を発達させる危険にある」被験体とは、障害を発達させる素因、すなわち、酸性αグルコシダーゼ、αガラクトシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼ、β−Ｄ−マンノシダーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼ、アリールスルファターゼＢ、アリールスルファターゼＡ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、アスパルチルグルコサミニダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、α−グルコサミニド−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、β−Ｄ−グルクロニダーゼ（ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｄａｓｅ）、ヒアルロニダーゼ、α−Ｌ−マンノシダーゼ、α−ノイラミニダーゼ、ホスホトランスフェラーゼ、酸性リパーゼ、酸性セラミダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、チオエステラーゼ、カテプシンＫ、またはリポタンパク質リパーゼのような酵素における変異の結果として代謝障害を発達させる遺伝素因を有する被験体である。明らかに、「代謝障害を発達させる危険にある」被験体とは、関心対象の種内の被験体すべてではない。

「障害を有すると疑われる」被験体とは、本明細書に記載される代謝障害のうちのいずれかなど代謝障害の１つ以上の症状を有する被験体である。

（薬学的組成物および処置方法）
脱マンノシル化した標的分子は、治療有効量の該分子と１種類以上のアジュバント、賦形剤、キャリア、および／または希釈剤とを含有する薬学的組成物へと組み込むことができる。許容し得る希釈剤、キャリア、および賦形剤は典型的には、受容者の恒常性（例えば、電解質平衡）に有害に影響することはない。許容し得るキャリアには、生体適合性、不活性、または生体吸収可能な塩、緩衝剤、オリゴ糖または多糖、ポリマー、粘度改善剤、保存剤などが含挙げられる。ある例示的なキャリアは、生理食塩水（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０〜７．４）である。別の例示的なキャリアは、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウムである。薬学的組成物の製剤化および投与についての技術に関するさらなる詳細は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、米国ペンシルバニア州イーストン）において得ることができる。補充用活性化合物も上記組成物中に組み込むことができる。

脱マンノシル化した分子を含有する薬学的組成物の投与は、全身性または局所性であることができる。薬学的組成物は、非経口投与および／または経口投与に好適であるよう製剤化することができる。具体的な投与様式には、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、経皮投与、髄腔内投与、経口投与、直腸投与、口腔投与、局所投与、鼻投与、眼投与、関節内投与、動脈内投与、くも膜下投与、気管支投与、リンパ投与、膣投与、および子宮内投与が含まれる。

投与は、薬学的組成物のボーラスによる周期的注入によることができるか、または外部（例えば、静脈内用の袋）または内部（例えば、生分解性埋没物、生体人工臓器、または植え込み型の改変Ｎ−グリコシル化分子産生細胞のコロニー）である貯蔵器からの静脈内投与または腹腔内投与によって中断されないでいることができ、もしくは持続的であることができる。例えば、米国特許第４，４０７，９５７号、同第５，７９８，１１３号、および同第５，８００，８２８号を参照されたい。薬学的組成物の投与は、ポンプ（例えば、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ，２７：９１２（１９９３）；Ｃａｎｃｅｒ、４１：１２７０（１９９３）；Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４４：１６９８（１９８４）を参照されたい）、マイクロカプセル封入（例えば、米国特許第４，３５２，８８３号、同第４，３５３，８８８号、および同第５，０８４，３５０号を参照されたい）、持続放出性ポリマー埋没物（例えば、Ｓａｂｅｌの米国特許第４，８８３，６６６号を参照されたい）、マクロカプセル封入（例えば、米国特許第５，２８４，７６１号、同第５，１５８，８８１号、同第４，９７６，８５９号、および同第４，９６８，７３３号、ならびにＰＣＴ公開特許出願ＷＯ９２／１９１９５号、ＷＯ９５／０５４５２号を参照されたい）、皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、もしくは他の好適な部位のいずれかへの注射、またはカプセル剤、液剤、錠剤、丸剤、もしくは持続放出製剤での経口投与のような好適な送達手段を使用して達成することができる。

非経口送達系の例としては、エチレン−酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、植え込み可能な注入系、ポンプ送達、被包細胞送達、リポソーム送達、針送達系注射、無針注射、ネブライザー、エーロゾライザー、電気穿孔法、および経皮パッチが挙げられる。

非経口投与に好適な製剤は、改変Ｎ−グリコシル化分子の滅菌水性調製物を便利に含有しており、好ましくは受容者の血液と等張である（例えば、生理学的塩類溶液）。製剤は、単位用量形態または複数回用量形態で提供することができる。

経口投与に好適な製剤は、各々、あらかじめ決めておいた量の改変Ｎ−グリコシル化分子を含有するカプセル剤、カシェ剤、錠剤、もしくはロゼンジ、またはシロップ剤、エリキシル剤、乳剤、もしくは頓服水剤（ｄｒａｕｇｈｔ）のような、水性リカーもしくは非水性液中の懸濁剤のような分離した単位として提供することができる。

局所投与に好適な脱マンノシル化した分子は、哺乳類（例えば、ヒト患者）へ、例えばクリーム、スプレー、泡状物質、ジェル、軟膏、塗薬、またはドライラブ（ｄｒｙ ｒｕｂ）として投与することができる。ドライラブは、投与部位で再含水することができる。このような分子は、包帯、ガーゼ、またはパッチへも直接注入することができ（例えば、浸漬して、および乾燥して）、次に、それは局所的に適用することができる。このような分子は、局所投与のための包帯、ガーゼ、またはパッチに半液状、ゲル状、または完全に液状で維持することもできる（例えば、米国特許第４，３０７，７１７号を参照されたい）。

治療有効量の薬学的組成物は、それを必要とする被験体へ、当業者によって確かめることのできる投与計画で投与することができる。例えば、組成物は、上記被験体へ、例えば１投薬あたり、被験体の体重１ｋｇあたり０．０１μｇ〜１０，０００μｇの薬用量で全身投与することができる。別の例においては、薬用量は、１投薬あたり、被験体の体重１ｋｇあたり１μｇ〜１００μｇである。別の例においては、薬用量は、１投薬あたり、被験体の体重１ｋｇあたり１μｇ〜３０μｇ、例えば、１投薬あたり、被験体の体重１ｋｇあたり３μｇ〜１０μｇである。

治療効能を最適化するために、脱マンノシル化した分子はまず、異なる投与計画で投与することができる。単位用量および計画は、例えば、哺乳類の種、その免疫状態、該哺乳類の体重を含む因子に左右される。典型的には、組織におけるこのような分子のレベルは、例えば、所与の処置計画の効能を決定するための臨床試験手順の一部として適切なスクリーニングアッセイを使用して監視することができる。

脱マンノシル化した分子についての投与頻度は、医療従事者（例えば、医師または看護師）の技術および臨床的判断のうちにある。典型的には、投与計画は、最適な投与パラメータを確立し得る臨床試験によって確立する。しかしながら、上記従事者は、被験体の年齢、健康状態、体重、性別、および医学的状態に従ってこのような投与計画を変更してもよい。投与の頻度は、処置が予防的であるかまたは治療的であるかに応じて変更することができる。

このような分子またはその薬学的組成物の毒性および治療的効能は、例えば細胞培養物または実験動物における公知の医薬手順によって決定することができる。これらの手順は、例えば、ＬＤ_５０（集団の５０％が致死する量）およびＥＤ_５０（集団の５０％における治療有効量）を決定するために使用することができる。毒性作用と治療効果の間の用量比は治療指数であり、それはＬＤ_５０／ＥＤ_５０の比として表すことができる。高い治療指数を示す薬学的組成物が好ましい。毒性のある副作用を示す薬学的組成物を使用することはできるが、正常細胞（例えば、非標的細胞）に対する潜在的な障害を最小化し、それにより副作用を低減するために、影響される組織の部位にこのような化合物を向ける送達系を設計するよう注意を払うべきである。

細胞培養アッセイおよび動物研究から得たデータは、適切な被験体（例えば、ヒト患者）における使用のためのある範囲の薬用量を製剤化する上で使用することができる。このような薬学的組成物の薬用量は一般的に、ほとんどまたはまったく毒性を有さないＥＤ_５０を含むある範囲の循環濃度内に収まる。薬用量は、採用される剤形および利用される投与経路に応じてこの範囲内で変化してもよい。（例えば、被験体における代謝障害を処置するために）本明細書に記載されるように使用される薬学的組成物については、治療有効量は、細胞培養アッセイから最初に概算することができる。用量は、細胞培養において決定されるようなＩＣ_５０（すなわち、症状の最大半量の阻害を達成する薬学的組成物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために、動物モデルにおいて処方することができる。このような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。

本明細書において定義する場合、脱マンノシル化した分子の「治療有効量」とは、処置された被験体における医学的に望ましい結果（例えば、代謝障害の１種類以上の症状の改善）を生むことのできる分子の量である。治療有効量（すなわち、有効薬用量）には、被験体の体重または試料の重量の１キログラムあたりの化合物のミリグラム量またはマイクログラム量（例えば、１キログラムあたり約１マイクログラム〜１キログラムあたり約５００ミリグラム、１キログラムあたり約１００マイクログラム〜１キログラムあたり約５ミリグラム、または１キログラムあたり約１マイクログラム〜１キログラムあたり約５０マイクログラム）を含めることができる。

被験体は、任意の哺乳類、例えばヒト（例えば、ヒト患者）または非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー、ヒヒ、またはサル）、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、アレチネズミ、ハムスター、ウマ、ある種の家畜（例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、またはヤギ）、イヌ、ネコ、またはクジラであることができる。

本明細書に記載される分子またはその薬学的組成物は、被験体へ、別の処置、例えば、代謝障害（例えば、リソソーム蓄積障害）のための処置との併用療法として投与することができる。例えば、併用療法には、被験体（例えば、ヒト患者）へ、代謝障害（例えば、リソソーム蓄積障害）を発達させる（または有すると疑われる）危険を有するまたは該危険にある被験体へ治療上の利点を提供する１種類以上の追加の薬剤を投与することを含めることができる。したがって、上記化合物または薬学的組成物および１種類以上の追加の薬剤は、同時に投与することができる。あるいは、上記分子を第一に投与し、かつ第二に上記１種類以上の追加の薬剤を投与することができ、またはその逆を行なうこともできる。

以前の治療薬が特に毒性である場合（例えば、重大な副作用特性を有する、代謝障害に対する処置）においては、本明細書に記載される分子の投与を用いて、以前の治療薬の量を、毒性を有さずに同じかまたは改良された治療上の利点を与えるのに十分なレベルまで代償するおよび／または低下させることができる。

本明細書に記載される薬学的組成物のうちの任意のものが、投与のための指示とともに、容器、パック、またはディスペンサーに含めることができる。

以下は、本発明の実施例である。該実施例は、本発明の範囲をいずれかの方法で制限するものとして解釈されるべきではない。

実施例１
（ｈｕＧＡＡ発現株の生成）
３コピーのヒトαグルコシダーゼ（酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）または酸性マルターゼＥＣ３．２．１．３としても公知）および２コピーのＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＭＮＮ４遺伝子を含有する、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株ＯＸＹＹ１５８９を構築した。ＯＸＹ１５８９株の遺伝子型は、以下のとおりである。

形質転換はすべて、異なる選択的マーカーについての改変を使用する十分に確立されたプロトコルに従って実施した。（別段の指定がない限り）すべての場合において、カナマイシン耐性遺伝子を発現プラスミドから除去するために、ｈｕＧＡＡ組込み断片をＮｏｔＩ制限消化によって得た。結果的に生じる断片をすべてアガロースゲル電気泳動によって分離した後に、正確なｈｕＧＡＡ断片をＱｉａｇｅｎカラムにより精製した。ヒトＧＡＡ（ｈｕＧＡＡ）をＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ発現ベクターへとまずクローニングして、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＭＮＮ４縦列発現ベクターを構築することによって、ＯＸＹＹ１５８９株を構築した。次に、最終のｈｕＧＡＡ産生株ＯＸＹＹ１５８９を得るために、３つの安定した組込み型形質転換を実施した。

（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａコドン最適化ｈｕＧＡＡ発現ベクター）
１１０ｋＤＡのヒトＧＡＡ（ｈｕＧＡＡ）前駆体をコードするヌクレオチド配列を化学的に合成し、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ発現についてコドン最適化した。合成コンストラクトにおいては、上記タンパク質がアミノ酸５７において開始するよう、プレｈｕＧＡＡシグナルペプチドおよびプロｈｕＧＡＡシグナルペプチドを除去した。ｈｕＧＡＡの合成オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（図１Ａ）をＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＬＩＰ２シグナル配列（プレ）の５’末端から３’末端までをインフレームで融合させ、２つのＸｘｘ−Ａｌａ切断部位のコード配列をその後に続け、発現ベクターへのクローニングのためのＢａｍＨＩ制限部位およびＡｖｒＩＩの制限部位を隣接させた。上記コンストラクトは、誘導性ＰＯＸ２プロモーターの制御下にある。融合タンパク質の完全なアミノ酸配列を図１Ｂに示す。

発現ベクターの一般的な概略図を図２に示す。細菌部分は、ｐＨＳＳ６プラスミドに由来したので、細菌複製起点（ｏｒｉ）およびカナマイシンに対する耐性を与えるカナマイシン耐性遺伝子（ＫａｎＲ）を含む。組込みカセットは、ａ）Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａへの形質転換のための選択マーカー（ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＧＵＴ２）、ｂ）プロモーターから構成される発現カセット、ｃ）インフレームでシグナル配列とともにｈｕＧＡＡを挿入するためのマルチプルクローニングサイト（ＭＣＳ）、およびｄ）ＬＩＰ２遺伝子のターミネーターを含んでいた。組込みカセットは、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａゲノムへの安定した非相同組込みのためにζ配列によって隣接させた。２つのＮｏｔＩ制限部位は、形質転換前の発現カセットの単離を可能にする。ｐＲＡＮ０３４プラスミド、ｐＲＡＮ０３６プラスミド、およびＯＸＹＰ１８３プラスミドを使用して、ＵＲＡ３形質転換マーカー、ＬＥＵ２形質転換マーカー、およびＧＵＴ２形質転換マーカーをそれぞれ含有するｈｕＧＡＡ発現ベクターｐＲＡＮ０５８、ｐＲＡＮ０５９、およびｐＲＡＮ０６０を生成した。

（縦列ＹｌＭＮＮ４発現ベクター）
ＹｌＭＮＮ４遺伝子を、誘導性ｐＰＯＸ２プロモーターの制御下で、かつ（半）構成的ｈｐ４ｄプロモーターの制御下でクローン化した。ＹｌＭＮＮ４のこれら２つの発現カセットを１つのベクターへと、ゲノムのＡＤＥ２遺伝子座への標的化組込みのためのＡＤＥ２遺伝子と選択的マーカーとしてのＡＤＥ２遺伝子からなる隣接領域（ＰＴ）を保有する縦列コンストラクトとしてサブクローニングした。

（中間株ＯＸＹＹ１５６９）
第一の形質転換は、中間の組換え株ＯＸＹＹ１５６９を作製するため、ＵＲＡ３マーカーおよびＬＥＵ２マーカーを使用して、ｐＲＡＮ０５８ベクターおよびｐＲＡＮ０５９ベクターから精製した発現カセットの共形質転換であった。ＯＸＹＹ１５６９は、Ｇ０１４株のゲノムに無作為に組み込まれたｐＰＯＸ２プロモーターの制御下でｈｕＧＡＡの２つの発現コンストラクトを保有している。

ＯＸＹＹ１５６９を以下のとおり選択した。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのゲノムへの外来性ｈｕＧＡＡ ＤＮＡの組込みを確認するために、ゲノムＤＮＡのＰＣＲスクリーニングを実施した。プライマーは、ｈｕＧＡＡヌクレオチド配列由来の２５５２塩基対の断片を増幅させるよう設計した。少なくとも２コピーのｈｕＧＡＡ ＤＮＡの組込みを確認するために、ゲノムＤＮＡのサザンブロット分析も実施した。詳細には、ＯＸＹＹ１５６９クローン由来のゲノムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｈｕＧＡＡ ＤＩＧ標識した特異的プローブを使用して探査した。

高レベルのｈｕＧＡＡを分泌するクローンを選択するために、ＰＣＲスクリーニングおよびサザンブロットにおいて陽性として同定された無作為に選択したいくつかのクローンを、ＰＯＸ２誘導条件下で標準的な手順に従って振盪フラスコ中で増殖させた。すべての場合において、培養上清を誘導７２時間後に回収し、標準的なウェスタンブロットおよび酵素活性アッセイ分析においてスクリーニングした。ＯＸＹＹ１５６９のＮ−グリカン分析は、ＯＸＹＹ１５６９における支配的な構造がＭａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２であることを示した。

（中間の株ＯＸＹＹ１５８４）
Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＭＮＮ４遺伝子の２つのコピーをそのゲノムに組み込んで、ＯＸＹＹ１５８４を生成するために、組換え株ＯＸＹＹ１５６９を形質転換した。プラスミドＯＸＹＰ１４７９Ｂから切り出したＳａｃＩＩ／ＸｍａＩ由来の発現カセットを使用して、形質転換を実施した。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａゲノムのＡＤＥ２遺伝子座への標的化組込みのために発現カセットを設計した。組換え株をサザンブロット法およびグリカン分析の後に選択して、増大したリン酸化に関する該株の挙動を評価した。任意に選択したいくつかの形質変換体のゲノムＤＮＡをＳｐｅＩで消化し、ＭＮＮ４特異的なＤＩＧ標識したプローブを使用して探査した。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａゲノムのＡＤＥ２遺伝子座へのＭＮＮ４発現カセットの正確な標的化組込みは、４２０７塩基対および５６８３塩基対のバンドを生じるべきである。サザンブロット陽性クローンを標準的な振盪フラスコ手順で増殖させた。中間のクローンＯＸＹＹ１５８４を選択するために、分泌したタンパク質のＮ−グリカン分析を実施した。親株ＯＸＸＹ１５６９と比較して、ＭＮＮ４過剰発現後の支配的な構造は、Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２（ＰＭａｎ）_１およびＭａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２（ＰＭａｎ）_２であった。

（産生株ＯＸＹＹ１５８９）
最終の原栄養体産生株ＯＸＹＹ１５８９を生成するために、ｈｕＧＡＡの第三のコピーを組換えＯＸＹＹ１５８４株のゲノムに組み込んだ。ｐＲＡＮ０６９からＮｏｔＩで切り出した発現カセットを使用して形質転換を実施した。最初に、ｈｕＧＡＡの追加のコピーの存在について、形質転換体のｇＤＮＡに関するＰＣＲによってスクリーニングした。ｈｕＧＡＡ産生を評価するために、標準的な振盪フラスコ培養後の発現について、任意に選択したＰＣＲ陽性クローンをさらに分析した。最高レベルのｈｕＧＡＡを発現するクローン（ＯＸＹＹ１５８９）をウェスタンブロット分析および酵素活性アッセイ後に選択した。Ｍ８のＭＰ２−Ｍ８ Ｎ−グリカンおよびＭＰ−Ｍ８ Ｎ−グリカンへの転換レベルが追加のｈｕＧＡＡ発現カセットの存在によって影響されないことも再確認した。

実施例２
（ＯＸＹＹ１５８９株の流加培養）
ＯＸＹＹ１５８９株（実施例１）からｈｕＧＡＡを産生するために、作業容積６〜８Ｌを有する撹拌した１０Ｌタンクを使用して流加プロセスを確立した。上記プロセスを２つの相に分割した。

１）バイオマス形成のためのグルコースに関するバッチ増殖
２）限定されたオレイン酸供給の支援による誘導による産物形成。

典型的には、バッチ相は約２０時間（ｈ）であり、産生相はおよそ７２時間であった。上記プロセスの終了時点で、培養ブロスを遠心分離し、上清を回収した。上清をＧＡＡの精製のための出発材料として使用した（実施例３を参照されたい）。

以下のパラメータを発酵中に制御した。エアレーションを１．５ｖｖｍ空気（１分間あたり１容積あたりの容積）の一定値で維持した。溶存酸素（ＤＯ）を初期には３０％で維持した。撹拌を６００ｒｐｍから１２００ｒｐｍへとＤＯレベルに応じて増大させた。一旦撹拌が最大値１２００ｒｐｍに到達すると、その速度を一定のままにし、ＤＯ設定値を１０％に設定した。１０％ＤＯを維持するために、酸素を５０％の最大百分率で反応器へと加えた。泡沫の発生（ｆｏａｍ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）を泡沫プローブによって制御した。泡沫検出のケースでは、消泡剤をバイオリアクターへ添加した。ｐＨ６．８の一定値を維持するために、１４％（ｖ／ｖ）アンモニア（塩基）または１０％リン酸を添加することによって、ｐＨを制御した。全プロセスの間中、温度を２８℃で一定のままにした。

バイオマスを、６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ６００）の測定によって監視した。試料を蒸留水で２〜１０００倍希釈して、分光光度計の直線範囲で値を得た。産物形成をウェスタンブロット分析および特異的酵素活性試験によって検出した。

実施例３
（組換えｈｕＧＡＡ（ｒｈＧＡＡ）の精製）
培養後の上清（実施例２を参照されたい）を、デプス濾過を介して清澄化した。次に、結果として生じる材料を、ＴＦＦを介して２０倍濃縮し、１０ｋＤａのＭＮＣＯメンブラン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６）および１００ｍＭ ＮａＣｌに対して透析濾過した。

ｒｈＧＡＡの精製を、最高１Ｍ濃度までの硫酸アンモニウムを添加することによって開始した。遠心分離後、上清をＴｏｙｏｐｅａｒｌ−Ｐｈｅｎｙｌ ６５０Ｍ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を充填したＸＫ１６／４０カラムにのせた。１Ｍから０Ｍへの硫酸アンモニウムの直線勾配を溶出に適用した。次に、ｒｈＧＡＡを含有する画分をプールし、１０ｍＭ ＢＩＳ−ＴＲＩＳ（ｐＨ６）へのバッファ交換に供した。０Ｍから１ＭへのＮａＣｌの直線塩勾配を使用する、ソース３０Ｑを充填したＴｒｉｃｏｒｎ １０／５０またはＸＫ２５／２０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の陰イオン交換クロマトグラフィーを介して、さらなる精製を達成した。次に、結果として生じるＧＡＡ含有画分を濃縮した後、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６）および２００ｍＭ ＮａＣｌであらかじめ平衡化しておいた最終のＨｉｌｏａｄ １６／６０ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲル濾過カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にのせた。比活性およびクーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおける純度を基にして画分を選択した後、合一して、５〜１０ｍｇ／ｍｌの終濃度へと濃縮した。１０ｋＤａの分子量カットオフを備えた１５ｍｌのＡｍｉｃｏｎ超遠心分離デバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、タンパク質を濃縮した。

ｒｈＧＡＡについての定性的スクリーニングの反応を、１０：１または２０：１の容積比で、０．３５ｍＭ４−ＭＵＧ、０．１％ＢＳＡ、および１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４）からなる反応緩衝液を１０μｌまたは５μｌの溶出画分へ添加することによって開始した。すべての反応を９６ウェル平底マイクロタイタープレートにおいて実施した。３７℃で３０分間〜１時間のインキュベーション時間後、等容積の１００ｍＭグリシン（ｐＨ１１）を添加して、反応を停止させ、蛍光原性反応産物４−メチルウンベリフェロンの放出を紫外光の下で観察した。比活性（単位／ｍｇタンパク質）を、黄色のｐ−ニトロフェノラート反応産物の酵素放出を測定する合成基質ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピラノシド（ＰＮＰＧ）を用いる比色アッセイを使用して決定した。上記反応は、１０μｌの酵素溶液および９０μｌの基質反応緩衝液（１５０ｍＭクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ４）、１％ＢＳＡ中の２ｍＭ ＰＮＰＧ）をマイクロタイタープレートの反応ウェル中で混合することによって開始し、その後３７℃でインキュベートした。１〜２時間後、等容積の停止バッファ１０％炭酸ナトリウム（ｐＨ１２）を添加して、その反応をクエンチし、放出されたｐ−ニトロフェノール（ＰＮＰ）をイオン化状態に転換した。バックグラウンド補正した吸光度およびｐ−ニトロフェノラート標準物質を４０５ｎｍの波長で測定し、比活性を算出した。タンパク質濃度をビシンコニン酸（ＢＣＡ）法を用いて決定した。１単位を、クエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ４．０）中の２ｍＭの最終基質濃度において３７℃、１分間当たり１ｎｍｏｌのＰＮＰＧから１ｎｍｏｌのＰＮＰおよびＤ−グルコースへの変換を触媒する酵素の量として定義した。

実施例４
（ＣｃＭａｎ５およびＣｃＭａｎ４の発現）
ＣｃＭａｎ４のＯＲＦおよびＣｃＭａｎ５のＯＲＦを、ＤｓｂＡシグナル配列を含有して結果的にＮ末端ポリヒスチジンタグを有するタンパク質の発現を生じるｐＬＳＡＨ３６ベクターへとクローン化した。上記タンパク質の発現を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１細胞において実施した。ペリプラズムに存するタンパク質を、Ｔａｌｏｎカラムを使用して単離および精製した。ＤｓｂＡ−ＣｃＭａｎ５およびＤｓｂＡ−ＣｃＭａｎ４のＯＲＦのヌクレオチド配列を図３および図４に提供する。ｐＬＳＡＨＣｃＭａｎ５プラスミドおよびｐＬＳＡＨＣｃＭａｎ４プラスミドの図解表示を図５に与える。

実施例５
（ＡＰＴＳ標識したリン酸化Ｎ−グリカンのＧＨ４７α−マンノシダーゼによる脱マンノシル化）
Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｊｅｃｏｒｉｎａ（Ｈｊ）（アナモルフ：Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）由来のＧＨ４７α−１，２−マンノシダーゼは、オリゴ糖Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２由来の４つのα−１，２結合型マンノース糖をすべて逐次的に切断することができる（Ｍａｒａｓ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、７７：２５５〜２６３（２０００））。類似の活性をＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｔｏｉ（Ａｓ）（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐｈｏｅｎｉｃｉｓとしても公知）由来のα−１，２−マンノシダーゼについて記載されている（Ｉｃｈｉｓｈｉｍａ Ｅ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３３９：５８９〜５９７）。

ＨｊＭａｎ（Ｇｅｎｂａｎｋ ｎｒ ＡＡＦ３４５７９）をＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて発現させ、Ｍａｒａｓ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，７７：２５５〜２６３（２０００）に記載されるとおり精製した。ＡｓＭａｎ（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＢＡＡ０８６３４）の市販の酵素調製物は、Ｐｒｏｚｙｍｅ−Ｇｌｙｃｏ社から入手可能である。

Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａおよびＡ．ｓａｔｏｉ由来のα−１，２−マンノシダーゼを、Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２（Ｍ８）糖、一リン酸化したＭａｎＰ−Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２（ＭＰ−Ｍ８）糖、および／または二リン酸化した（ＭａｎＰ）_２−Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２（（ＭＰ）２−Ｍ８）糖を含有する、ＭＮＮ４遺伝子を過剰発現するＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞に由来する８−アミノ−１，３，６，−ピレントリスルホン酸（ＡＰＴＳ）標識した糖の混合物に関して試験した。図６においては、潜在的な最終加水分解産物を概略的呈示で示しており、基礎をなすマンノースがリン酸化される場合に、α−１，２−マンノシダーゼは末端α−１，２−マンノースも加水分解できると想定される。キャップの外されたホスフェート残基を有するリン酸化Ｎ−グリカン（したがって、末端ホスフェートが存在するオリゴ糖）でα−１，２−マンノシダーゼの活性を試験することができるよう、ＭＮＮ４糖を、ホスフェートのキャップ外し活性を有するＣｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌａｎｓ由来のＧＨ９２酵素であるＣｃＭａｎ５で処理した（図７）。ＣｃＭａｎ５は、マンノース−ホスホ−マンノースジエステル結合における末端マンノースを除去する。

別段の記載がない限り、ＡｓＭａｎおよびＨｊＭａｎによるＡＰＴＳ標識したＮ−グリカンへの反応はすべて、２ｍＭ ＣａＣｌ_２を含む１０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．０）中で３７℃、一晩実施した。ＣｃＭａｎ５反応を室温かつｐＨ７．０で、２ｍＭ ＣａＣｌ_２を添加した１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液を使用して実施した。ホスフェートがキャップを外されたグリカンの存在を確認するために、または末端ホスフェートを有する迅速に泳動されるグリカンの構造を同定することができるよう、仔ウシ腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）をその後、反応混合物に添加した。ホスフェート加水分解後に中性Ｎ−グリカンが得られるが、それはＲＮＡｓｅＢから放出されたＡＰＴＳ標識したＮ−グリカン由来の電気泳動図との比較を通じて同定することができる（Ｍａｎ９−５ＧｌｃＮＡｃ２）。

図８においては、Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２および一リン酸化糖ＭａｎＰ−Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２を含有するＮ−グリカン調製物（パネルＢ）の、ＨｊＭａｎおよびＡｓＭａｎによる加水分解についてのＤＳＡ−ＦＡＣＥ電気泳動図を示す。両α−１，２−マンノシダーゼによって、Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２はＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２へと加水分解されたのに対し、ＭａｎＰ−Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２の加水分解についての差が観察された。ＨｊＭａｎは、２つのα−１，２結合型マンノースを放出した可能性が高い（パネルＣにおけるＭａｎＰ−Ｍａｎ_６ＧｌｃＮＡｃ_２）。ＡｓＭａｎ処理後に現れるわずかに迅速に泳動されるピークは、３つのα−１，２結合型マンノースの放出、したがって、ＭａｎＰ−Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２の形成を示唆した（パネルＤ）。新たに形成された産物は、仔ウシ腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）による処理後に消失せず、ホスフェートがなおもマンノースでキャップ形成されていることが確認された（パネルＥおよびパネルＦ）。

パネルＥにおける迅速に泳動するピークがＭａｎＰ−Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２でありかつパネルＤにおける該ピークがＭａｎＰ−Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２であることを確認するために（図８）、ＨｊＭａｎおよびＡｓＭａｎによる実験をＭＮＮ４糖に関して反復し、まず該糖をホスフェートのキャップを外す酵素ＣｃＭａｎ５（Ｐ−Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２を生じる、図８におけるパネルＣ）で処理した。α−１，２−マンノシダーゼとともに３７℃で２０分間、４０分間、および１８０分間インキュベートした後、この反応混合物を１００℃で３分間加熱することによって、この反応を停止させた。次に、ＣＩＰ処理を実施した。ＨｊＭａｎによる結果を図９Ａに示す。ＨｊＭａｎは、Ｐ−Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２をＰ−Ｍａｎ_７ＧｌｃＮＡｃ_２およびＰ−Ｍａｎ_６ＧｌｃＮＡｃ_２へと逐次的に切断した（パネルＤ〜パネルＦ）。ＡｓＭａｎは、３つのα−１，２結合型マンノースを逐次的に除去して、Ｐ−Ｍａｎ_７ＧｌｃＮＡｃ_２、Ｐ−Ｍａｎ_６ＧｌｃＮＡｃ_２、およびＰ−Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２の形成を結果として生じた。図９Ｂを参照されたい。

上記の結果（図９Ａおよび図９Ｂ）は、ＭＮＮ４グリカンのα−１，２−マンノシダーゼによる一晩の消化（図８）とともに、α−１，６アーム（Ｎ−グリカンの右側のアーム（図６Ａおよび図６Ｂにおいて概略的に示されている））のみがリン酸化されているかどうかを説明し得るに過ぎない。基礎をなすマンノースがリン酸化される場合、Ａ．ｓａｔｏｉ α−１，２−マンノシダーゼのみが、末端α−１，２−マンノースを加水分解できる（リン酸残基は、マンノース残基でキャップ形成されており、またはキャップ形成されていない）。ＨｊＭａｎのみが、２つのα−１，２結合型マンノースを非リン酸化型α−１，３アームから除去する。

基礎をなすマンノースがリン酸化されている場合にＡｓＭａｎが末端α−１，２−マンノースを除去できかつＨｊＭａｎは除去できないという事実も、一リン酸化したＭａｎＰ−Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２および二リン酸化した（ＭａｎＰ）_２−Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２から構成されるＭＮＮ４調製物が使用される場合に確認される（図１０、パネルＣ）。ＡｓＭａｎは、パネルＤにおける迅速に泳動される２つの特別のピーク（（ＭａｎＰ）_２−Ｍａｎ_７ＧｌｃＮＡｃ_２および（ＭａｎＰ）_２−Ｍａｎ_６ＧｌｃＮＡｃ_２の可能性が高い）の出現から観察されたように、（ＭａｎＰ）_２−Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２を加水分解することができる。ＨｊＭａｎは、（ＭａｎＰ）_２−Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２を加水分解しなかった（図１０、パネルＥ）。

実施例６
（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｙｐｏｌｙｔｉｃａ株において発現する高次のリン酸化Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質のＧＨ４７α−マンノシダーゼによる脱マンノシル化）
ヒトリソソームα−グルコシダーゼｈｕＧＡＡをＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株ＯＸＹＹ１５８９において発現させて、高次のリン酸化Ｎ−グリカン構造を有する糖タンパク質を得た。ｈｕＧＡＡを実施例３に記載したとおり精製した。

ＨｊＭａｎおよびＡｓＭａｎを２ｍＭ ＣａＣｌ_２を有する１００ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ５．０）中のｈｕＧＡＡの溶液に添加した。この反応混合物を室温で一晩インキュベートした。本質的にはＬａｒｏｙ Ｗ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、１：３９７〜４０５（２００６）に記載されるとおり、Ｎ−グリカンをＰＮＧａｓｅＦで放出させ、ＡＰＴＳで標識した後、ＤＳＡ−ＦＡＣＥにおいて分析した。α−１，２−マンノシダーゼ処理の前および後のＮ−グリカン特性を図１１に示す。精製されたｈｕＧＡＡから放出されたＮ−グリカン混合物は、主としてＭａｎＰ−Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ２および（ＭａｎＰ）_２−Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２から構成されていた（図１１、パネルＢおよびパネルＥ）。ＭａｎＰ−Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２よりのわずかに迅速に泳動されるピークは、ＭａｎＰ−Ｍａｎ_７ＧｌｃＮＡｃ_２と定めることができた。非常に微量のＭａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２およびＭａｎ_７ＧｌｃＮＡｃ_２しか存在しなかった。ｈｕＧＡＡのＨｊＭａｎとのインキュベーション後、ＭａｎＰ−Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２からＭａｎＰ−Ｍａｎ_７ＧｌｃＮＡｃ_２およびＭａｎＰ−Ｍａｎ_６ＧｌｃＮＡｃ_２への転換を観察したのに対し、（ＭａｎＰ）_２−Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２は加水分解されなかった（図１１、パネルＣ）。パネルＤにおける電気泳動図は、ｈｕＧＡＡのＡｓＭａｎによる処理の後に得られた糖を示している。ＡｓＭａｎは、（ＭａｎＰ）_２−Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２を加水分解し、それとともに電気泳動図の左側には（ＭａｎＰ）_２−Ｍａｎ_７ＧｌｃＮＡｃ_２および（ＭａｎＰ）_２−Ｍａｎ_６ＧｌｃＮＡｃ_２を、ＭａｎＰ−Ｍａｎ_７ＧｌｃＮＡｃ_２およびＭａｎＰ−Ｍａｎ_６ＧｌｃＮＡｃ_２の隣に形成した。ＭａｎＰ−Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２は、ＭａｎＰ−Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２の加水分解からも形成された。これらのデータは、α−１，６アームがＭａｎＰ−Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２構造においてリン酸化されること、および基礎をなすマンノースがリン酸化される場合に、糖タンパク質レベルにおいて、ＡｓＭａｎが末端α−１，２−マンノースを加水分解することができることを確認している。ＨｊＭａｎ活性は、中性Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンからのα−１，２結合型マンノースの放出、またはＭａｎＰ−Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２の非リン酸化型α−１，３アームにおける２つのα−１，２結合型マンノースの除去に限定されていた。

実施例７
（ＡＰＴＳ標識したリン酸化Ｎ−グリカンのＧＨ９２α−マンノシダーゼによる脱マンノシル化）
ＣｃＭａｎ４およびＣｃＭａｎ５を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現させ、異なる細胞画分を実施例４に記載したとおり単離した。ペリプラズム溶液の活性をＭＮＮ４過剰発現株に由来する（ＡＰＴＳ）標識したＮ−グリカンに関して試験し、ＤＳＡ−ＦＡＣＥにおいて分析した（図１２）。Ｎ−グリカンを、２ｍＭ ＣａＣｌ_２を有する１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）におけるＣｃＭａｎ４、ＣｃＭａｎ５とともに、または両酵素の混合物とともに室温で一晩インキュベートした。ＡｓＭａｎを使用する対照実験が含まれ、実施例５に記載したとおり実施した。図１２Ａに示す実験においては、主としてＭａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２（Ｍ８）および一リン酸化したＭａｎＰ−Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２（ＭＰ−Ｍ８）を含有するＭＮＮ４画分を使用した（パネルＢ）。ＣｃＭａｎ４は、Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２およびＭａｎＰ−Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２をそれぞれＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２およびＭａｎＰ−Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２に加水分解した（パネルＣ）。ＡｓＭａｎを使用して同じ反応産物を得た（パネルＤおよび実施例５）。ＣｃＭａｎ５は、２つのα−１，２マンノースの間のグリコシド結合を加水分解しなかった（したがって、Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２ピークのシフトなし）が、ＭａｎＰ−Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２におけるホスフェートのキャップを外し、迅速に泳動されるＰ−Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２のピークを生じた（パネルＥ）。この反応混合物のＣＩＰとのインキュベーション後、Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２に対応するピークのみを観察している（パネルＦ）。ＣｃＭａｎ４およびＣｃＭａｎ５の混合物は、Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２およびＭａｎＰ−Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２をＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２およびＰ−Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２にそれぞれ加水分解した（パネルＧ）。それゆえ、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２に対応するピークのみがＣＩＰ処理後に観察される（パネルＨ）。ＣｃＭａｎ４はまた、ＡｓＭａｎを使用しても観察されたように（パネルＫおよび実施例５）、二リン酸化した（ＭａｎＰ）_２−Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２を（ＭａｎＰ）_２−Ｍａｎ_６ＧｌｃＮＡｃ_２に加水分解した（図１２Ｂ、パネルＪ）。ＣｃＭａｎ４およびＣｃＭａｎ５の混合物は、Ｐ２−Ｍａｎ_６ＧｌｃＮＡｃ_２およびＰ−Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２を生成した（パネルＮ）。

ＣｃＭａｎ４はしたがって、基礎をなすマンノースがリン酸化される場合に末端α−１，２−マンノースを加水分解することもできるα−１，２−マンノシダーゼである。ＣｃＭａｎ４は、ホスフェートのキャップを外す酵素であるＣｃＭａｎ５と併用することができる。

実施例８
（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｙｐｏｌｙｔｉｃａ株において発現する高次のリン酸化Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質のＧＨ９２α−マンノシダーゼによる脱マンノシル化）
ＣｃＭａｎ４およびＣｃＭａｎ５をＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおいて発現するｈｕＧＡＡとともにインキュベートした。この分析を実施例６に記載したとおり実施した。２ｍＭ ＣａＣｌ_２を有する１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）をＣｃＭａｎ４およびＣｃＭａｎ５の両方について室温での一晩のアッセイにおいて使用した。ＤＳＡ−ＦＡＣＥ分析を図１３に示す。精製されたｈｕＧＡＡから放出されたＮ−グリカン混合物は主として、ＭａｎＰ−Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２および（ＭａｎＰ）_２−Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２から構成された（パネルＢ）。ＭａｎＰ−Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２よりもわずかに迅速に泳動されるピークは、ＭａｎＰ−Ｍａｎ_７ＧｌｃＮＡｃ_２と定めることができた。

ＣｃＭａｎ４は、ｈｕＧＡＡ糖タンパク質を脱マンノシル化した。電気泳動図（パネルＣ）においては、（ＭａｎＰ）_２−Ｍａｎ_６ＧｌｃＮＡｃ_２、ＭａｎＰ−Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２、およびＭａｎＰ−Ｍａｎ_６ＧｌｃＮＡｃ_２に対応するピークが観察された。ＣｃＭａｎ５との併用においては、ホスフェートがキャップを外された産物Ｐ２−Ｍａｎ_６ＧｌｃＮＡｃ_２、Ｐ−Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２、およびＰ−Ｍａｎ_６ＧｌｃＮＡｃ_２をパネルＥに示すとおり形成した。

実施例９
（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｙｐｏｌｙｔｉｃａ株において発現する高次のリン酸化Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質のＧＨ４７α−マンノシダーゼによる脱マンノシル化に関する追加の例）
小胞体ＭａｎＩおよびゴルジ体ＭａｎＩＡは、ＧＨ４７ファミリーに属する２クラスのＩα−１，２−マンノシダーゼである。組換え発現した小胞体ＭａｎＩおよびゴルジ体ＭａｎＩＡを室温で一晩、Ｙ． ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおいて発現したｈｕＧＡＡとともにインキュベートした。この分析を実施例６および図１０に記載したとおり実施した。２ｍＭ ＣａＣｌ_２を有する１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を小胞体ＭａｎＩについて使用したのに対し、ゴルジ体ＭａｎＩＡとのインキュベーションは、２ｍＭ ＣａＣｌ_２を有する１００ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）において実施する。ＤＳＡ−ＦＡＣＥ分析を図１４に示す。

小胞体ＭａｎＩおよびゴルジ体ＭａｎＩＡの両方は、ｈｕＧＡＡ糖タンパク質を脱マンノシル化することができたが、該両方の活性は、ＭａｎＰ−Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２のＭａｎＰ−Ｍａｎ_６ＧｌｃＮＡｃ_２への加水分解に限定された（それぞれ、パネルＤおよびＥ）。この結果は、また、Ｈ．Ｊｅｃｏｒｉｎａ由来のＧＨ４７α−１，２−マンノシダーゼ（ＨｊＭａｎ、図１１、パネルＣ）を使用して得られたのに対し、Ａ．ｓａｔｏｉ由来のＧＨ４７α−１，２−マンノシダーゼ（ＡｓＭａｎ、図１１、パネルＦ）およびＧＨ９２ ＣｃＭａｎ４（図１２、パネルＣ）は、（ＭａｎＰ）_２−Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２およびＭａｎＰ−Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２を（ＭａｎＰ）_２−Ｍａｎ_６ＧｌｃＮＡｃ_２およびＭａｎＰ−Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２へそれぞれ刈り込んだ。

（他の実施形態）
本発明は、その詳細な説明とともに記載されてきたが、上の記載は、本発明の範囲を明示するよう意図されており、かつ該範囲を限定するものではなく、添付の特許請求の範囲によって定義される。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲内である。

Claims (73)

1. 糖タンパク質におけるリン酸化Ｎ−グリカンを脱マンノシル化するための方法であって、
   基礎をなすマンノースがリン酸化されている末端α−１，２マンノース結合を含む糖タンパク質を、基礎をなすマンノースがリン酸化される場合に末端α−１，２マンノース結合を加水分解する、マンノシダーゼまたは該マンノシダーゼの生物学的に活性な断片と接触させる工程
   を含み、ここで、該接触させる工程が、該末端α−１，２マンノース結合の加水分解をもたらして、脱マンノシル化糖タンパク質を生成し、該マンノシダーゼは、ＧＨ４７ファミリーのマンノシダーゼまたはＧＨ９２ファミリーのマンノシダーゼである、方法。
2. 脱マンノシル化されたリン酸化Ｎ−グリカンを含む糖タンパク質を生成する方法であって、真菌細胞に、該糖タンパク質をコードする核酸を導入する工程を含み、そして該糖タンパク質は、基礎をなすマンノースがリン酸化されている末端α−１，２マンノース結合を含み、ここで、該真菌細胞は、該基礎をなすマンノースがリン酸化される場合に末端α−１，２マンノース結合を加水分解して脱マンノシル化された糖タンパク質を生成する、マンノシダーゼまたは該マンノシダーゼの生物学的に活性な断片をコードする核酸を含むように遺伝子操作されており、該マンノシダーゼは、ＧＨ４７ファミリーのマンノシダーゼまたはＧＨ９２ファミリーのマンノシダーゼである、方法。
3. 請求項１または２に記載の方法であって、前記マンノシダーゼは：
   （ａ）野生型ＧＨ４７ファミリーポリペプチドまたは野生型ＧＨ９２ファミリーポリペプチド；
   （ｂ）（ａ）のポリペプチドであるが、各々が２アミノ酸からなるアミノ酸セグメント最大２０個を欠失する、欠失バリアント；
   （ｃ）（ａ）のポリペプチドまたは（ｂ）のバリアントであるが、（ａ）のポリペプチドまたは（ｂ）のバリアントの非連続な個別のアミノ酸最大２０個を欠失する、欠失バリアント；あるいは
   （ｄ）（ａ）のポリペプチド、（ｂ）のバリアント、または（ｃ）のバリアントであるが、１０個以下の保存的置換を有する、置換バリアント
   である、方法。
4. 前記マンノシダーゼはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｔｏｉ由来であるか、または
   前記マンノシダーゼはＣｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌａｎｓ由来である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記マンノシダーゼは、配列番号５と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記マンノシダーゼは、配列番号５と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記マンノシダーゼは、配列番号５と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記マンノシダーゼは、配列番号５を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記マンノシダーゼは、配列番号４に少なくとも８５％同一である核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記マンノシダーゼは、配列番号４に少なくとも９５％同一である核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記マンノシダーゼは、配列番号４と少なくとも９８％同一である核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記マンノシダーゼは、配列番号４によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記脱マンノシル化された糖タンパク質を単離する工程をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記糖タンパク質は、ヒトタンパク質である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記接触させる工程が、真菌内で起こる、請求項１、４〜１４のいずれかに記載の方法。
16. 前記真菌が、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａまたはＡｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓである、請求項１５に記載の方法。
17. 前記真菌が、メチロトローフの酵母であるか、または
    前記真菌が、糸状菌である、請求項１５に記載の方法。
18. 前記メチロトローフの酵母は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｏｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａおよびＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａからなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
19. 前記糸状菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃａｅｓｉｅｌｌｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃａｎｄｉｄｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃａｒｎｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃｌａｖａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｄｅｆｌｅｃｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｃｈｒａｃｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐｅｎｉｃｉｌｌｏｉｄｅｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｒｅｓｔｒｉｃｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｙｄｏｗｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔａｍａｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｕｓｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、ＦｕｓａｒｉｕｍおよびＣｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍからなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
20. 前記糖タンパク質は、病原体タンパク質、リソソームタンパク質、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、抗体もしくはその抗原結合断片、または融合タンパク質である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記リソソームタンパク質は、リソソーム酵素である、請求項２０に記載の方法。
22. 前記リソソーム酵素は、リソソーム蓄積障害（ＬＳＤ）と関連している、請求項２１に記載の方法。
23. 前記ＬＤＳは、ファブリー病、ムコ多糖症Ｉ型、ファーバー病、ゴーシェ病、ＧＭ１ガングリオシドーシス、テイ・サックス病、サンドホフ病、ＧＭ２活性化因子疾患、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ニーマン・ピック病、シェイエ病、ハンター病、サンフィリポ病、モルキオ病、マロトー・ラミー病、ヒアルロニダーゼ欠損症、アスパルチルグルコサミン尿症、フコース蓄積症、マンノース蓄積症、シンドラー病、１型シアリドーシス、ポンペ病、濃化異骨症、セロイドリポフスチン沈着症、コレステロールエステル貯蔵病、ウォルマン病、多発性スルファターゼ欠損症、ガラクトシアリドーシス、ムコリピドーシス、シスチン症、シアル酸蓄積障害、マリネスコ・シェーグレン症候群を伴うカイロミクロン蓄積症、ヘルマンスキー・パドラック症候群、チェディアック・東症候群、ダノン病、または幸福顔貌骨異形成症である、請求項２２に記載の方法。
24. 基礎をなすマンノースがリン酸化される場合に、末端α−１，２マンノース結合を加水分解する、マンノシダーゼまたは該マンノシダーゼの生物学的に活性な断片を発現するように遺伝子操作された単離された真菌細胞であって、該マンノシダーゼは、ＧＨ４７ファミリーのマンノシダーゼまたはＧＨ９２ファミリーのマンノシダーゼである、真菌細胞。
25. 基礎をなすマンノースがリン酸化される場合に、末端α−１，２マンノース結合を加水分解する、マンノシダーゼまたは該マンノシダーゼの生物学的に活性な断片を発現するように遺伝子操作された真菌細胞の培養物であって、該マンノシダーゼは、ＧＨ４７ファミリーのマンノシダーゼまたはＧＨ９２ファミリーのマンノシダーゼであり、該培養物中の生細胞の総数の４０％未満が、該遺伝子操作された真菌細胞以外の生細胞である、培養物。
26. 請求項２４に記載の真菌細胞であって、前記マンノシダーゼは：
    （ａ）野生型ＧＨ４７ファミリーポリペプチドまたは野生型ＧＨ９２ファミリーポリペプチド；
    （ｂ）（ａ）のポリペプチドであるが、各々が２アミノ酸からなるアミノ酸セグメント最大２０個を欠失する、欠失バリアント；
    （ｃ）（ａ）のポリペプチドまたは（ｂ）のバリアントであるが、（ａ）のポリペプチドまたは（ｂ）のバリアントの非連続な個別のアミノ酸最大２０個を欠失する、欠失バリアント；あるいは
    （ｄ）（ａ）のポリペプチド、（ｂ）のバリアント、または（ｃ）のバリアントであるが、１０個以下の保存的置換を有する、置換バリアント
    である、真菌細胞。
27. 前記マンノシダーゼは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｔｏｉ由来であるか、または前記マンノシダーゼがＣｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌａｎｓ由来である、請求項２４または２６に記載の真菌細胞。
28. 前記マンノシダーゼは、配列番号５と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２４、２６および２７のいずれか一項に記載の真菌細胞。
29. 前記マンノシダーゼは、配列番号５と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２４、２６および２７のいずれか一項に記載の真菌細胞。
30. 前記マンノシダーゼは、配列番号５と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２４、２６および２７のいずれか一項に記載の真菌細胞。
31. 前記マンノシダーゼは、配列番号５を含む、請求項２４、２６および２７のいずれか一項に記載の真菌細胞。
32. 前記マンノシダーゼは、配列番号４と少なくとも８５％同一である核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項２４、２６および２７のいずれか一項に記載の真菌細胞。
33. 前記マンノシダーゼは、配列番号４と少なくとも９５％同一である核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項２４、２６および２７のいずれか一項に記載の真菌細胞。
34. 前記マンノシダーゼは、配列番号４と少なくとも９８％同一である核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項２４、２６および２７のいずれか一項に記載の真菌細胞。
35. 前記マンノシダーゼは、配列番号４によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項２４、２６および２７のいずれか一項に記載の真菌細胞。
36. 前記真菌細胞は、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａまたはＡｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓの細胞である、請求項２４および２６〜３５のいずれか一項に記載の真菌細胞。
37. 前記真菌細胞は、メチロトローフの酵母の細胞であるか、または
    前記真菌細胞は、糸状菌の細胞である、請求項２４および２６〜３５のいずれか一項に記載の真菌細胞。
38. 前記メチロトローフの酵母は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｏｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａおよびＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａからなる群より選択される、請求項３７に記載の真菌細胞。
39. 前記糸状菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃａｅｓｉｅｌｌｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃａｎｄｉｄｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃａｒｎｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃｌａｖａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｄｅｆｌｅｃｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｃｈｒａｃｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐｅｎｉｃｉｌｌｏｉｄｅｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｒｅｓｔｒｉｃｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｙｄｏｗｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔａｍａｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｕｓｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、ＦｕｓａｒｉｕｍおよびＣｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍからなる群より選択される、請求項３７に記載の真菌細胞。
40. 前記細胞は、マンノシルリン酸化を促進することができるポリペプチドをコードする核酸をさらに含むか、または
    前記細胞が、ＯＣＨ１活性が欠損するように遺伝子操作されているか、または
    前記細胞は、マンノシルリン酸化を促進することができるポリペプチドをコードする核酸をさらに含み、かつ該細胞がＯＣＨ１活性が欠損するように遺伝子操作されている、
    請求項２４および２６〜３９のいずれか一項に記載の真菌細胞。
41. 前記細胞は、標的糖タンパク質をコードする核酸をさらに含む、請求項２４および２６〜３９のいずれか一項に記載の真菌細胞。
42. 前記標的糖タンパク質は、ヒトタンパク質である、請求項４１に記載の真菌細胞。
43. 前記標的糖タンパク質は、病原体タンパク質、リソソームタンパク質、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、抗体もしくはその抗原結合断片、または融合タンパク質である、請求項４１または４２に記載の真菌細胞。
44. 前記リソソームタンパク質は、リソソーム酵素である、請求項４３に記載の真菌細胞。
45. 前記標的糖タンパク質は、ＬＳＤと関連したタンパク質である、請求項４１〜４４のいずれか一項に記載の真菌細胞。
46. 前記ＬＳＤは、ファブリー病、ムコ多糖症Ｉ型、ファーバー病、ゴーシェ病、ＧＭ１ガングリオシドーシス、テイ・サックス病、サンドホフ病、ＧＭ２活性化因子疾患、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ニーマン・ピック病、シェイエ病、ハンター病、サンフィリポ病、モルキオ病、マロトー・ラミー病、ヒアルロニダーゼ欠損症、アスパルチルグルコサミン尿症、フコース蓄積症、マンノース蓄積症、シンドラー病、１型シアリドーシス、ポンペ病、濃化異骨症、セロイドリポフスチン沈着症、コレステロールエステル貯蔵病、ウォルマン病、多発性スルファターゼ欠損症、ガラクトシアリドーシス、ムコリピドーシス、シスチン症、シアル酸蓄積障害、マリネスコ・シェーグレン症候群を伴うカイロミクロン蓄積症、ヘルマンスキー・パドラック症候群、チェディアック・東症候群、ダノン病、または幸福顔貌骨異形成症である、請求項４５に記載の真菌細胞。
47. 前記マンノシルリン酸化を促進することができるポリペプチドは、ＭＮＮ４ポリペプチドである、請求項４０に記載の真菌細胞。
48. 前記ＭＮＮ４ポリペプチドは、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａポリペプチド、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅポリペプチド、Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａポリペプチド、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓポリペプチドもしくはＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓポリペプチドである、請求項４７に記載の真菌細胞。
49. 前記マンノシルリン酸化を促進することができるポリペプチドは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＰＮＯ１ポリペプチドである、請求項４０に記載の真菌細胞。
50. 請求項２５に記載の培養物であって、前記マンノシダーゼは：
    （ａ）野生型ＧＨ４７ファミリーポリペプチドまたは野生型ＧＨ９２ファミリーポリペプチド；
    （ｂ）（ａ）のポリペプチドであるが、各々が２アミノ酸からなるアミノ酸セグメント最大２０個を欠失する、欠失バリアント；
    （ｃ）（ａ）のポリペプチドまたは（ｂ）のバリアントであるが、（ａ）のポリペプチドまたは（ｂ）のバリアントの非連続な個別のアミノ酸最大２０個を欠失する、欠失バリアント；あるいは
    （ｄ）（ａ）のポリペプチド、（ｂ）のバリアント、または（ｃ）のバリアントであるが、１０個以下の保存的置換を有する、置換バリアント
    である、培養物。
51. 前記マンノシダーゼは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｔｏｉ由来であるか、または前記マンノシダーゼがＣｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌａｎｓ由来である、請求項２５または５０に記載の培養物。
52. 前記マンノシダーゼは、配列番号５と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２５、５０および５１のいずれか一項に記載の培養物。
53. 前記マンノシダーゼは、配列番号５と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２５、５０および５１のいずれか一項に記載の培養物。
54. 前記マンノシダーゼは、配列番号５と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２５、５０および５１のいずれか一項に記載の培養物。
55. 前記マンノシダーゼは、配列番号５を含む、請求項２５、５０および５１のいずれか一項に記載の培養物。
56. 前記マンノシダーゼは、配列番号４と少なくとも８５％同一である核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項２５、５０および５１のいずれか一項に記載の培養物。
57. 前記マンノシダーゼは、配列番号４と少なくとも９５％同一である核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項２５、５０および５１のいずれか一項に記載の培養物。
58. 前記マンノシダーゼは、配列番号４と少なくとも９８％同一である核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項２５、５０および５１のいずれか一項に記載の培養物。
59. 前記マンノシダーゼは、配列番号４によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項２５、５０および５１のいずれか一項に記載の培養物。
60. 前記真菌細胞は、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａまたはＡｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓの細胞である、請求項２５および５０〜５９のいずれか一項に記載の培養物。
61. 前記真菌細胞は、メチロトローフの酵母の細胞であるか、または
    前記真菌細胞は、糸状菌の細胞である、請求項２５および５０〜５９のいずれか一項に記載の培養物。
62. 前記メチロトローフの酵母は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｏｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａおよびＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａからなる群より選択される、請求項６１に記載の培養物。
63. 前記糸状菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃａｅｓｉｅｌｌｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃａｎｄｉｄｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃａｒｎｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃｌａｖａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｄｅｆｌｅｃｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｃｈｒａｃｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐｅｎｉｃｉｌｌｏｉｄｅｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｒｅｓｔｒｉｃｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｙｄｏｗｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔａｍａｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｕｓｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、ＦｕｓａｒｉｕｍおよびＣｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍからなる群より選択される、請求項６１に記載の培養物。
64. 前記遺伝子操作された真菌細胞は、マンノシルリン酸化を促進することができるポリペプチドをコードする核酸をさらに含むか、または
    前記遺伝子操作された真菌細胞が、ＯＣＨ１活性が欠損するように遺伝子操作されているか、または
    前記遺伝子操作された真菌細胞は、マンノシルリン酸化を促進することができるポリペプチドをコードする核酸をさらに含み、かつ該遺伝子操作された真菌細胞がＯＣＨ１活性が欠損するように遺伝子操作されている、請求項２５および５０〜６３のいずれか一項に記載の培養物。
65. 前記遺伝子操作された真菌細胞は、標的糖タンパク質をコードする核酸をさらに含む、請求項２５および５０〜６３のいずれか一項に記載の培養物。
66. 前記標的糖タンパク質は、ヒトタンパク質である、請求項６５に記載の培養物。
67. 前記標的糖タンパク質は、病原体タンパク質、リソソームタンパク質、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、抗体もしくはその抗原結合断片、または融合タンパク質である、請求項６５または６６に記載の培養物。
68. 前記リソソームタンパク質は、リソソーム酵素である、請求項６７に記載の培養物。
69. 前記標的糖タンパク質は、ＬＳＤと関連したタンパク質である、請求項６５〜６８のいずれか一項に記載の培養物。
70. 前記ＬＳＤは、ファブリー病、ムコ多糖症Ｉ型、ファーバー病、ゴーシェ病、ＧＭ１ガングリオシドーシス、テイ・サックス病、サンドホフ病、ＧＭ２活性化因子疾患、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ニーマン・ピック病、シェイエ病、ハンター病、サンフィリポ病、モルキオ病、マロトー・ラミー病、ヒアルロニダーゼ欠損症、アスパルチルグルコサミン尿症、フコース蓄積症、マンノース蓄積症、シンドラー病、１型シアリドーシス、ポンペ病、濃化異骨症、セロイドリポフスチン沈着症、コレステロールエステル貯蔵病、ウォルマン病、多発性スルファターゼ欠損症、ガラクトシアリドーシス、ムコリピドーシス、シスチン症、シアル酸蓄積障害、マリネスコ・シェーグレン症候群を伴うカイロミクロン蓄積症、ヘルマンスキー・パドラック症候群、チェディアック・東症候群、ダノン病、または幸福顔貌骨異形成症である、請求項６９に記載の培養物。
71. 前記マンノシルリン酸化を促進することができるポリペプチドは、ＭＮＮ４ポリペプチドである、請求項６４に記載の培養物。
72. 前記ＭＮＮ４ポリペプチドは、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａポリペプチド、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅポリペプチド、Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａポリペプチド、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓポリペプチドもしくはＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓポリペプチドである、請求項７１に記載の培養物。
73. 前記マンノシルリン酸化を促進することができるポリペプチドは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＰＮＯ１ポリペプチドである、請求項６４に記載の培養物。

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