KR101983572B1 - 만노스-1-포스포-6-만노스 결합의 캡핑제거 및 인산화 n-글리칸의 탈만노실이 가능한 만노시다제 및 당단백질의 활용을 통한 포유류 세포의 촉진방법 - Google Patents
만노스-1-포스포-6-만노스 결합의 캡핑제거 및 인산화 n-글리칸의 탈만노실이 가능한 만노시다제 및 당단백질의 활용을 통한 포유류 세포의 촉진방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101983572B1 KR101983572B1 KR1020137011110A KR20137011110A KR101983572B1 KR 101983572 B1 KR101983572 B1 KR 101983572B1 KR 1020137011110 A KR1020137011110 A KR 1020137011110A KR 20137011110 A KR20137011110 A KR 20137011110A KR 101983572 B1 KR101983572 B1 KR 101983572B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- disease
- ala
- gly
- thr
- val
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
- C12N9/2488—Mannanases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01024—Alpha-mannosidase (3.2.1.24)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Marine Sciences & Fisheries (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
만노스-1-포스포-6-만노스 반족(mannose-1-phospho-6-mannose moieties)의 캡핑제거(uncapping) 및 인산화 N-글리칸(phosphorylated N-glycans)의 탈만노실이 가능한 만노시다제(mannosidases)를 제공한다. 또한, 만노시다제를 이용하는 방법, 상기 방법을 이용하여 당단백질을 제조하는 방법뿐만 아니라, 당단백질의 활용을 통한 포유류 세포를 촉진하는 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 (i) 만노스-1포스포-6-만노스 결합 또는 반족(mannose-1-phospho-6-mannose linkage or moiety)을 포스포-6-만노스(phospho-6-mannose)로 가수분해(hydrolyze) 및 (ii) 글리칸을 함유하는 포스페이트와 같은 단말(terminal) 알파-1,2 만노스(alpha-1,2 mannose), 알파-1,3 만노스(alpha-1,3 mannose), 및/또는 알파-1,6 만노스(alpha-1,6 mannose) 연결(linkage) 또는 반족(moiety)을 가수분해할 수 있는 만노시다제(mannosidases)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 당단백질의 활용을 통한 포유류 세포의 촉진방법에 관한 것이다.
고성능 발현 시스템이 최근 연구가 진행 중인 대부분의 생물 약제(예를 들어, 재조합 단백질)를 생산하기 위하여 요구된다. 이들 생물 약제의 대부분의 생화학 활성은 번역 수정 (post-translational modification)(예를 들어, 인산화(phosphorylation) 또는 글리코실화(glycosylation))에 의존한다. 효모-기초 발현 시스템(yeast-based expression system)은 단백질을 은닉(secrete) 및 수정(modify)할 수 있는 유전자 조작(genetic manipulation) 및 미생물 유기체의 발효(fermentation)를 조합한다. 그러나, 효모세포에서 제조된 재조합 당단백질은 주로 다른 종류의 고-만노스 및 과-만노스 글리칸 구조(high-mannose and hyper-mannose glycan structures)를 나타낸다. 이러한 구조는 단백질 기능, 후속 공정 및 글리코실화(glycosylation)가 특히 생화학적으로 중요한 역할을 하는 추후 새로운 용도(subsequent therapeutic use)에 해로울 수 있다.
본 발명은 (i) 만노스-1-포스포-6-만노스 결합 또는 반족에서 포스포-6-만노스(또한 여기서 만노스-6-포스페이트와 관련)로의 가수분해(캡핑제거) 및 글리칸을 함유하는 포스페이트의 단말 알파-1,2 만노스, 알파-1,3 만노스 및/또는 알파-1,6 만노스 결합 또는 반족의 가수분해(탈만노실)를 할 수 있는 만노시다제 및 (ii) 포유류 세포 당단백질의 활용을 달성하기 위해 모두 캡핑제거 및 탈만노실(다른 효소 또는 단일 효소에 의한)이 요구되는 것을 발견한 것에 기초한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 만노스-1-포스포-6-만노스 결합 또는 반족의 캡핑제거하는방법 및 당단백질의 인산화 N-글리칸의 탈만노실하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 상기 만노스-1-포스포-6-만노스 결합 또는 반족을 함유하는 인산화 N-글리칸을 포함하는 상기 당단백질을 제공하는 단계 및 상기 당단백질을 (i) 만노스-1-포스포-6-만노스 결합 또는 반족에서 포스포-6-만노스로의 가수분해 및 (ii) 단말 알파-1,2 만노스, 알파-1,3 만노스 및/또는 알파-1,6 만노스 결합 또는 반족의 가수분해를 할 수 있는 만노시다제와 접촉하는 단계를 포함한다. 상기 만노시다제는 패밀리 38 글리코실 가수분해 효소(family 38 glycosyl hydrolase)일 수 있다. 상기 만노시다제는 작두콩(Canavalia ensiformis) 또는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)로부터 얻어질 수 있다.
본 발명은 또한 인산화 N-글리칸의 탈만노실하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 인산화 N-글리칸을 포함하는 당단백질을 제공하는 단계 및 상기 당단백질을 (i) 만노스-1-포스포-6-만노스 결합 또는 반족에서 포스포-6-만노스로의 가수분해 및 (ii) 단말 알파-1,2 만노스, 알파-1,3 만노스 및/또는 알파-1,6 만노스 결합 또는 반족의 가수분해를 할 수 있는 만노시다제와 접촉하는 단계를 포함한다. 상기 만노시다제는 패밀리 38 글리코실 가수분해 효소(family 38 glycosyl hydrolase)일 수 있다. 상기 만노시다제는 작두콩(Canavalia ensiformis) 또는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)로부터 얻어질 수 있다.
본 발명에서 설명된 상기 방법은 상기 당단백질을 제공하는 단계 및 상기 당단백질을 만노시다제와 접촉하는 단계 이후에, 포유류 세포를 탈만노실 인산화 N-글리칸과 접촉하는 단계를 더 포함할 수 있다. 여기서 상기 당단백질을 만노시다제와 접촉하는 단계 이후에 상기 당단백질은 포유류 세포(예를 들어, 인간 세포)의 내부로 이동될 수 있다.
본 발명에서 설명된 상기 방법은 상기 방법에 의하여 제조된 상기 당단백질을 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 단백질은 진균 유기체로 발현된 인간 단백질일 수 있다. 예를 들어, 상기 진균 유기체는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 또는 악설라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans)일 수 있다. 또한, 상기 진균 유기체는 메틸영약체 효모(methylotrophic yeast)(예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 피치아 메타노리카(Pichia methanolica), 오가타에아 미누타(Oogataea minuta), 또는 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)) 또는 사상균(filamentous fungus)(예를 들어, 아스퍼질러스 카에시엘러스(Aspergillus caesiellus), 아스퍼질러스 칸디더스(Aspergillus candidus), 아스퍼질러스 카네우스(Aspergillus carneus), 아스퍼질러스 크라바투스(Aspergillus clavatus), 아스퍼질러스 디플렉터스(Aspergillus deflectus), 아스퍼질러스 플라버스(Aspergillus flavus), 아스퍼질러스 퍼미가터스(Aspergillus fumigatus), 아스퍼질러스 글라우커스(Aspergillus glaucus), 아스퍼질러스 니더란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 오크라세우스(Aspergillus ochraceus), 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae), 아스퍼질러스 파라시티커스(Aspergillus parasiticus), 아스퍼질러스 페니시로이데스(Aspergillus penicilloides), 아스퍼질러스 레스트릭터스(Aspergillus restrictus), 아스퍼질러스 소자에(Aspergillus sojae), 아스퍼질러스 시도위(Aspergillus sydowi), 아스퍼질러스 타마리(Aspergillus tamari), 아스퍼질러스 데레우스(Aspergillus terreus), 아스퍼질러스 어스터스(Aspergillus ustus) 또는 아스퍼질러스 버시컬러(Aspergillus versicolor))일 수 있다. 상기 단백질은 병원체 단백질(pathogen protein), 리소좀 단백질(lysosomal protein), 성장인자(growth factor), 사이토카인(cytokine), 케모카인(chemokine), 항체(antibody), 이들의 항원-결합 조각(antigen-binding fragment) 또는 융합단백질(fusion protein)일 수 있다. 예를 들어, 상기 리소좀 단백질은 리소좀축적질병(lysosomal storage disorder; LSD)에 관련된 리소좀 효소일 수 있다. 상기 리소좀축적질병(LSD)는 파프리병(Fabry's disease), 점액 다당류증 I(mucopolysaccharidosis I), 파버병(Farber disease), 고셰병(Gaucher disease), GM1-강글리오시드증(GM1-gangliosidosis), 타이-작스병(Tay-Sachs disease), 샌드호프병(Sandhoff disease), GM2 활성체병(GM2 activator disease), 크라베병(Krabbe disease), 이염백질이영양증(metachromatic leukodystrophy), 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 샤이에병(Scheie disease), 헌터병(Hunter disease), 산필립포(Sanfilippo disease), 모스키오병(Morquio disease), 마로토-라미증후군(Maroteaux-Lamy disease), 히알루론산분해효소결핍증(hyaluronidase deficiency), 아스파르틸글루코사민뇨(aspartylglucosaminuria), 푸코시드축적증(fucosidosis), 만노시도시스(mannosidosis), 쉰들러병(Schindler disease), 사이알리도시스 1형(sialidosis type 1), 폼피병(Pompe disease), 피크노디소토시스(Pycnodysostosis), 세로이드 리포푸신증(ceroid lipofuscinosis), 콜레스테롤 에스테르 저장병(cholesterol ester storage disease), 월만병(Wolman disease), 다종 술파타아제결핍증(Multiple sulfatase deficiency), 갈락토시알리도시스(galactosialidosis), 뮤코리피드증(mucolipidosis), 시스틴축적증(cystinosis), 시알산저장 장해(sialic acid storage disorder), 마리네스코-쇠그렌 증후군의 킬로미크론 축적증(chylomicron retention disease with Marinesco-Sjgren syndrome), 헤르만스키-푸드락증후군(Hermansky-Pudlak syndrome), 체디아크-히가시 증후군(Chediak-Higashi syndrome), 다논병(Danon disease), 또는게레오피식 형성장애(Geleophysic dysplasia)일 수 있다.
본 발명은 또한 진균 유기체의 캡핑제거된 만노스-1-포스포-6-만노스 결합 또는 반족 및 탈만노실 인산화 N-글리칸을 포함하는 목표 단백질을 제조하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 만노스-1-포스포-6-만노스 반족(mannose-1-phospho-6-mannose moiety)을 만노스-6-포스페이트(mannose-6-phosphate)로 가수분해 및 글리칸을 함유하는 포스페이트와 같은 단말(terminal) 알파-1,2 만노스(alpha-1,2 mannose), 알파-1,3 만노스(alpha-1,3 mannose) 및/또는 알파-1,6-만노스(alpha-1,6 mannose) 연결(linkage)을 가수분해할 수 있는 만노시다제가 인코딩(encoding)된 핵산(nucleic acid)을 포함하기 위하여 유전적으로 조작된 진균 세포를 제공하는 단계 및 목표 단백질로 인코딩된 핵산을 상기 세포로 도입하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 당단백질을 제조하기 위하여 유전적으로 조작된 분리된 진균 세포를 특징으로 한다. 상기 당단백질은 캡핑제거된 만노스-6-포스페이트 및 탈만노실 인산화 N-글리칸을 포함한다. 상기 진균 세포는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 또는 악설라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans)일 수 있다. 또한, 상기 진균 세포는 메틸영약체 효모(methylotrophic yeast)(예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 피치아 메타노리카(Pichia methanolica), 오가타에아 미누타(Oogataea minuta), 또는 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)) 또는 사상균(filamentous fungus)(예를 들어, 아스퍼질러스 카에시엘러스(Aspergillus caesiellus), 아스퍼질러스 칸디더스(Aspergillus candidus), 아스퍼질러스 카네우스(Aspergillus carneus), 아스퍼질러스 크라바투스(Aspergillus clavatus), 아스퍼질러스 디플렉터스(Aspergillus deflectus), 아스퍼질러스 플라버스(Aspergillus flavus), 아스퍼질러스 퍼미가터스(Aspergillus fumigatus), 아스퍼질러스 글라우커스(Aspergillus glaucus), 아스퍼질러스 니더란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 오크라세우스(Aspergillus ochraceus), 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae), 아스퍼질러스 파라시티커스(Aspergillus parasiticus), 아스퍼질러스 페니시로이데스(Aspergillus penicilloides), 아스퍼질러스 레스트릭터스(Aspergillus restrictus), 아스퍼질러스 소자에(Aspergillus sojae), 아스퍼질러스 시도위(Aspergillus sydowi), 아스퍼질러스 타마리(Aspergillus tamari), 아스퍼질러스 데레우스(Aspergillus terreus), 아스퍼질러스 어스터스(Aspergillus ustus) 또는 아스퍼질러스 버시컬러(Aspergillus versicolor))일 수 있다. 상기 진균 세포는 만노시다제가 인코딩(encoding)된 핵산(nucleic acid)을 포함할 수 있다. 상기 만노시다제는 (i) 만노스-1-포스포-6-만노스 반족(mannose-1-phospho-6-mannose moiety)을 만노스-6-포스페이트(mannose-6-phosphate)로 가수분해 및 (ii) 단말(terminal) 알파-1,2 만노스(alpha-1,2 mannose), 알파-1,3 만노스(alpha-1,3 mannose) 및/또는 알파-1,6-만노스(alpha-1,6 mannose) 연결(linkage)을 가수분해할 수 있다. 상기 진균 세포는 만노실 인산화(mannosyl phosphorylation)를 촉진(promoting)할 수 있는 폴리펩티드(polypeptide)가 인코딩된 핵산을 더 포함할 수 있다. 상기 진균세포는 OCH1 활성(OCH1 activity)이 결여되도록 유전적으로 조작된 것 일 수 있다. 상기 진균 세포는 만노실 인산화(mannosyl phosphorylation)를 촉진(promoting)할 수 있는 폴리펩티드(polypeptide)가 인코딩된 핵산을 더 포함할 수 있으며, 여기서 상기 진균 세포는 OCH1 활성(OCH1 activity)이 결여되도록 유전적으로 조작된 것 일 수 있다. 상기 만노시다제는 분비 신호(secretion signal) 및/또는 상기 만노시다제를 세포내 구간(intracellular compartment)을 목표로 하기 위하여 목표 신호(targeting signal)를 포함할 수 있다.
진균 세포는 목표 단백질(target protein)이 인코딩(encoding)된 핵산을 더 포함할 수 있으며, 여기서 상기 목표 단백질은 당단백질일 수 있다. 상기 목표 단백질은 인간 단백질(human protein) 일 수 있다. 상기 목표 단백질은 병원체 단백질(pathogen protein), 리소좀 단백질(lysosomal protein), 성장인자(growth factor), 사이토카인(cytokine), 케모카인(chemokine), 항체(antibody), 이들의 항원-결합 조각(antigen-binding fragment) 또는 융합단백질(fusion protein)일 수 있다. 상기 리소좀 단백질은 리소좀 효소(lysosomal enzyme)일 수 있다. 상기 목표 단백질은 리소좀축적질병(LSD)와 관련된 것일 수 있다. 상기 리소좀축적질병(LSD)는 파프리병(Fabry's disease), 점액 다당류증 I(mucopolysaccharidosis I), 파버병(Farberdisease), 고셰병(Gaucher disease), GM1-강글리오시드증(GM1-gangliosidosis), 타이-작스병(Tay-Sachs disease), 샌드호프병(Sandhoff disease), GM2 활성체병(GM2 activator disease), 크라베병(Krabbe disease), 이염백질이영양증(metachromatic leukodystrophy), 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 샤이에병(Scheie disease), 헌터병(Hunter disease), 산필립포(Sanfilippo disease), 모스키오병(Morquio disease), 마로토-라미증후군(Maroteaux-Lamy disease), 히알루론산분해효소결핍증(hyaluronidase deficiency), 아스파르틸글루코사민뇨(aspartylglucosaminuria), 푸코시드축적증(fucosidosis), 만노시도시스(mannosidosis), 쉰들러병(Schindler disease), 사이알리도시스 1형(sialidosis type 1), 폼피병(Pompe disease), 피크노디소토시스(Pycnodysostosis), 세로이드 리포푸신증(ceroid lipofuscinosis), 콜레스테롤 에스테르 저장병(cholesterol ester storage disease), 월만병(Wolman disease), 다종 술파타아제결핍증(Multiple sulfatase deficiency), 갈락토시알리도시스(galactosialidosis), 뮤코리피드증(mucolipidosis), 시스틴축적증(cystinosis), 시알산 저장 장해(sialic acid storage disorder), 마리네스코-쇠그렌 증후군의 킬로미크론 축적증(chylomicron retention disease with Marinesco-Sjgren syndrome), 헤르만스키-푸드락증후군(Hermansky-Pudlak syndrome), 체디아크-히가시 증후군(Chediak-Higashi syndrome), 다논병(Danon disease), 또는 게레오피식 형성장애(Geleophysic dysplasia)일 수 있다.
만노실 인산화를 촉진할 수 있는 상기 폴리펩티드는 MNN4 폴리펩티드 일 수 있다. (예를 들어, 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), S. 세레비시에(S. cerevisiae), 오가타에아 미누타(Ogataea minuta), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 또는 C. 알비칸스(C. albicans) 폴리펩티드) 만노실 인산화를 촉진할 수 있는 상기 폴리펩티드는 P. 파스토리스 PNO1(P. pastoris PNO1) 폴리펩티드 일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명은 캡핑제거된 만노스-6-포스페이트 연결 또는 반족 및 탈만노실 인산화 N-글리칸을 함유하는 당단백질을 제조하기 위한 상당한 수의 유전적으로 조작된 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 오가타에아 미누타(Ogataea minuta), 피차아 메타놀리카(Pichia methanolica), 악설라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans), 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) 세포의 실질적인 순수 배양균(pure culture)을 특징으로 한다. 상당한 수라 함은 유전적으로 조작된 배양균 중에서 전체 생균수의 약 40% 이상을가리킨다. 상기 세포는 만노시다제가 인코딩(encoding)된 핵산(nucleic acid)을 포함하고, 상기 만노시다제는 (i) 만노스-1-포스포-6-만노스 반족(mannose-1-phospho-6-mannose moiety)을 만노스-6-포스페이트(mannose-6-phosphate)로 가수분해 및 (ii) 단말(terminal) 알파-1,2 만노스(alpha-1,2 mannose), 알파-1,3 만노스(alpha-1,3 mannose) 및/또는 알파-1,6-만노스(alpha-1,6 mannose) 연결(linkage)을 가수분해할 수 있다. 상기 세포는 만노실 인산화(mannosyl phosphorylation)를 촉진(promoting)할 수 있는 폴리펩티드(polypeptide)가 인코딩된 핵산을 더 포함할 수 있다. 상기 세포는 OCH1 활성(OCH1 activity)이결여되도록 유전적으로 조작된 것 일 수 있다. 상기 세포는 만노실 인산화(mannosyl phosphorylation)를 촉진(promoting)할 수 있는 폴리펩티드(polypeptide)가 인코딩된 핵산을 더 포함하고, OCH1 활성(OCH1 activity)이 결여되도록 유전적으로 조작된 것 일 수 있다. 상기 만노시다제는 분비 신호(secretion signal)를 포함 및/또는 상기 만노시다제를 세포내 구간(intracellular compartment)을 목표로 하기 위하여 목표 신호(targeting signal)를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 포유류 세포의 내부로 당단백질을 디렉팅(directing)하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 만노스-6-포스페이트 연결(mannose-6-phosphate)이 탈만노실(demannosylated) 당단백질을 제공하는 단계, 및 상기 세포를 상기 탈만노실 당단백질과 접촉하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 당단백질은 패밀리 47 글리코실 가수분해 효소 또는 패밀리 92 글리코실 가수분해효소(family 47 or family 92 glycosyl hydrolase)로 탈만노실(demannosylated) 될 수 있다. 상기 당단백질은 아스퍼질러스 사토이(Aspergillus satoi) 또는 셀룰로시마이크로비움 셀루란스(Cellulosimicrobium cellulans)로부터 얻어지는 만노시다제로 탈만노실 될 수 있다. 상기 당단백질은 작두콩(Canavalia ensiformis) 또는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)로부터 얻어지는 만노시다제와 같이 패밀리 38 글리코실 가수분해 효소(family 38 glycosyl hydrolase)로 탈만노실 될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명은 포유류 세포의 내부로 당단백질을 디렉팅(directing)하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 상기 세포의 만노스-6-포스페이트 수용체(mannose-6-phosphate receptor)에 실질적으로 결합되지 않은 인산화된 N-글리칸을 포함하는 당단백질을 제공하는 단계상기 탈만노실 이후에 상기 세포의 상기 만노스-6-포스페이트 수용체(mannose-6-phosphate receptor)에 실질적으로 결합된상기 당단백질과 탈만노실 당단백질을 제조하기 위하여 상기 하부 만노스가 인산화되면 단말 알파-1,2 만노스 결합 또는 반족(terminal alpha-1,2 mannose linkage or moiety)을 가수분해하는 만노시다제를 접촉하는 단계 및 상기 세포를 상기 탈만노실 당단백질과 접촉하는 단계를 포함한다. 상기 당단백질은 패밀리 47 글리코실 가수분해 효소 또는 패밀리 92 글리코실 가수분해 효소((family 47 or family 92 glycosyl hydrolase)로 탈만노실 될 수 있다. 상기 만노시다제는 아스퍼질러스 사토이(Aspergillus satoi) 또는 셀룰로시마이크로비움 셀루란스(Cellulosimicrobium cellulans)로부터 얻어질 수 있다. 상기 당단백질은 작두콩(Canavalia ensiformis) 또는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)로부터 얻어지는 만노시다제와 같이 패밀리 38 글리코실 가수분해 효소(family 38glycosyl hydrolase)로 탈만노실 될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 당단백질을 만노스-6-포스페이트 수용체(mannose-6-phosphate receptor)에 실질적으로 결합하지 않은 제1 형태(first form)로부터 포유류 세포에 만노스-6-포스페이트 수용체에 실질적으로 결합되지 않은 제2형태(second form)로 변환하는 방법에 있어서, 상기 제1형태에 있어서, 상기 당단백질은 제1 위치에서 제6 위치에 포스페이트 잔기를 함유하는 만노스 잔기에 연결된 하나 이상의 단말 만노스 잔기(terminal mannose residues)를 포함하는 하나 이상의 N-글리칸(N-glycans)을 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 방법은 상기 당단백질의 상기 제1 형태를 만노스 잔기를 탈만노실하는 만노시다제(mannosidase)와 접촉하는 단계를 포함한다. 상기 만노시다제는 캡핑제거 및 탈만노실 역할을 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 만노시다제는 작두콩(Canavalia ensiformis) 또는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)로부터 얻어질 수 있다. 일 실시예에 따르면, 상기 만노시다제는 캡핑제거 역할을 가지지 않을 수 있다(예를 들어, 아스퍼질러스 사토이(Aspergillus satoi) 또는 셀룰로시마이크로비움 셀루란스(Cellulosimicrobium cellulans)로부터 얻어지는 만노시다제).
본 발명은 또한 포유류 세포의 내부로 당단백질을 디렉팅(directing)하는 방법을 특징으로 한다. 상기 당단백질은 하나 이상의 만노스-1-포스포-6-만노스 결합 또는 반족(-1-phospho-6-mannose linkages or moiety)을 포함한다. 상기 방법은 (a) 세포의 만노스-6-포스페이트 수용체(mannose-6-phosphate receptor)에 실질적으로 결합되지 않은 당단백질(glycoprotein)의 하나 이상의 만노스-1-포스포-6-만노스 결합 또는 반족(-1-phospho-6-mannose linkage or moiety)에서 만노스-6-포스페이트(mannose-6-phosphate)로 캡핑제거(uncapping)하는 단계 및 (a) 단계 이후에, (b) 당단백질의 인산화 N-글리칸을 탈만노실하는 단계를 포함하며, 상기 캡핑제거하는 단계 및 상기 탈만노실하는 단계 이후에 상기 당단백질은세포의 만노스-6-포스페이트 수용체(mannose-6-phosphate receptor)에 실질적으로 결합되지 않는다. 상기 방법은 상기 (a), (b)단계 이후에 포유류 세포를 당단백질과 접촉하는 단계를 포함한다. (a) 및 (b) 단계는 2개의 상이한 효소에 의하여 반응촉진(catalyzed) 될 수 있다. (예를 들어, CcMan5와 같은 셀룰로시마이크로비움 셀루란스(Cellulosimicrobium cellulans) 만노시다제 또는 작두콩(Canavalia ensiformis) 만노시다제)
본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명은 포유류 세포의 내부로 당단백질을 디렉팅(directing)하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 캡핑제거 및 탈만노실된 인산화 N-글리칸을 포함하는 당단백질을 제공하는 단계, 및 상기 포유류 세포를 상기 당단백질에 접촉하는 단계를 포함한다.
본 발명에서 설명된 방법에 따르면, 상기 당단백질은 인간 단백질 일 수 있다.
본발명에서 설명된 방법에 따르면, 상기 당단백질은 병원체 단백질(pathogen protein), 리소좀 단백질(lysosomal protein), 성장인자(growth factor), 사이토카인(cytokine), 케모카인(chemokine), 항체(antibody), 이들의 항원-결합 조각(antigen-binding fragment) 또는 융합단백질(fusion protein) 일 수 있다. 상기 리소좀 단백질은 리소좀 효소(lysosomal enzyme) 일 수 있다. (예를 들어, 알파 글루코시다제(acid alpha glucosidase) 또는 알파 갈락토시다제(alpha galactosidase)) 상기 당단백질은 리소좀축적질병(LSD)와 관련된 것 일 수 있다. (예를 들어, 파프리병(Fabry's disease), 점액 다당류증 I(mucopolysaccharidosis I), 파버병(Farber disease), 고셰병(Gaucher disease), GM1-강글리오시드증(GM1-gangliosidosis), 타이-작스병(Tay-Sachs disease), 샌드호프병(Sandhoff disease), GM2 활성체병(GM2 activator disease), 크라베병(Krabbe disease), 이염백질이영양증(metachromatic leukodystrophy), 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 샤이에병(Scheie disease), 헌터병(Hunter disease), 산필립포(Sanfilippo disease), 모스키오병(Morquio disease), 마로토-라미증후군(Maroteaux-Lamy disease), 히알루론산분해효소결핍증(hyaluronidase deficiency), 아스파르틸글루코사민뇨(aspartylglucosaminuria), 푸코시드축적증(fucosidosis), 만노시도시스(mannosidosis), 쉰들러병(Schindler disease), 사이알리도시스 1형(sialidosis type 1), 폼피병(Pompe disease), 피크노디소토시스(Pycnodysostosis), 세로이드 리포푸신증(ceroid lipofuscinosis), 콜레스테롤 에스테르 저장병(cholesterol ester storagedisease), 월만병(Wolman disease), 다종 술파타아제결핍증(Multiple sulfatase deficiency), 갈락토시알리도시스(galactosialidosis), 뮤코리피드증(mucolipidosis), 시스틴축적증(cystinosis), 시알산 저장 장해(sialic acid storage disorder), 마리네스코-쇠그렌 증후군의 킬로미크론 축적증(chylomicron retention disease with Marinesco-Sjgren syndrome), 헤르만스키-푸드락증후군(Hermansky-Pudlak syndrome), 체디아크-히가시 증후군(Chediak-Higashi syndrome), 다논병(Danon disease),또는 게레오피식 형성장애(Geleophysic dysplasia))
본 발명은 또한 포유류 세포의 내부(interior)로 이동(transport)가능한 당단백질을 특징으로 한다. 상기 당단백질은 본 발명에서 설명된 방법 중 어느 하나로 처리되며, 포유류 세포(예를 들어, 인간 세포)는 당단백질을 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 당단백질을 제공하는 단계를 포함하는 처리 방법을 특징으로 한다.
이상 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허 청구의 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 본발명에서 언급된 모든 특허 공개, 특허 출원, 특허권, Genbank Acession Nos, 및 다른 참고 문헌들은 전부 참조로 추가되었다. 물질, 방법, 및 일부 실시예로 설명하였으나, 이에 한정하고자 하는 것이 아니다.
본 발명의 다른 특징이나 장점은 이후의 발명 및 청구항으로부터 명확해질 것이다.
도 1a는 립(lip)2 예비 서열(SEQ ID NO:1)을 갖는 휴먼 알파 글루코서데이스(GAA)의 코돈 최적화 염기서열의 디픽션(depiction)이다. 도 1b는 정지 코돈을 나타내는 립2 예비 서열(SEQ ID NO:2)을 갖는 휴먼 GAA의 아미노산 서열의 디픽션이며, *부호는 정지 코돈(stop codon)을 나타낸다.
도 2는 휴먼 GAA 클로닝에 사용되는 백터를 발현하는 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica)의 개략도(schematic)이다.
도 3a는 C-터미널 히스-택(C-terminal His-tag) (SEQ ID NO:3)을 갖는 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) AMS1의 전사해석틀(ORF)의 염기서열의 디픽션이다. 도 3b는 N-터미널 히스-택(C-terminal His-tag) (SEQ ID NO:4)을 갖는 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) AMS1의 전사해석틀(ORF)의 염기서열의 디픽션이다. 도 3c는 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) AMS1 폴리펩티드(SEQ ID NO:5)의 아미노산 서열의 디픽션이다.
도 4는 MNN4 N-글리칸으로부터 만노스 잔기를 완전히 제거한다고 가정할 때, Man8GlcNAc2 (M8), 모노 포스포릴레이티드(monophosphorylated) ManP-Man8GlcNAc2 (MP-M8) 및/또는 디포스포릴레이티드(diphosphorylated) (ManP)2-Man8GlcNAc2 ((MP) 2-M8) 슈가(MNN4 슈가 또는 MNN4 N-glycans클리칸이라고 불리는)를 함유하는 MNN4 과발현 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 균주(strain)로부터 추출된 8-아미노-1,3,6-피레네드리설포닉(pyrenetrisulfonic) 산(APTS)-레벨드 슈가로부터의 잠재적 최종 가수분해 산물의 개략도(schematic)이다.
도 5는 잭빈(jack bean,JB) 알파-만노시다제(alpha-manosidase)로 처리된 MNN4 N-글리칸(glycans)의 N-글리칸(glycan) 분석을 서술하는 일련의 일렉트로페로그램(electropherograms)이다. 분석은 DNA 시퀀서 지원형, 플루어로포(fluorophore) 지원형 카르보하이드레이트 일렉트로퍼리시스(carbohydrate electrophoresis) (DSA-FACE)를 사용하여 수행되었다. M1, M2, M3, M4, M5, M6, M8, 및 M9는 염기 N-아세틸글루코사민(base N-acetylglucosamine) 구조에 결합되는 만노스 잔기(mannose residues)의 수를 나타낸다. Y축은 각각의 N-글리칸(glycan) 구조의 양의 표시로서 상대적 형광 유닛들(fluorescence units)을 나타낸다. X축은 모세관을 통한 각각의 N-글리칸(glycan) 구조의 상대적 이동도를 나타낸다.
도 6은 야로위아 리폴리티카(YlAms1)에서 유래한 AMS1를 사용하는 디-만노실레이션(de-mannosylation) 및 포스페이트 캡핑제거 액티비티(phosphate uncapping activity)를 보여주는 일련의 일렉트로페로그램(electropherograms)이다.
도 7은 잭빈(jack bean,JB) 알파-1,2--만노시다제(alpha-1,2-mannosidase)처리 전후의 휴먼 GAA 의 N-글리칸(glycan) 프로파일을 서술하는 일련의 일렉트로페로그램(electropherograms)이다.
도 8a는 DsbA-셀룰로스마이크로비움 셀룰란스(Cellulosimicrobium cellulans) 만노시다제(mannosidase)5(CcMan5)(SEQ ID NO:6)의 전사해석틀(ORF)의 염기 서열의 디픽션(depicition)이다. 도 8b는 신호서열(SEQ ID NO:7)을 갖는 CcMan5 폴리펩티드(polypeptide)의 아미노산 서열의 디픽션이다. 도 8c는 신호서열(SEQ ID NO:8)을 갖지 않는 CcMan5 폴리펩티드(polypeptide)의 아미노산 서열의 디픽션이다. 신호서열을 갖지 않는 CcMan5 폴리펩티드(polypeptide)의 예상되는 분자량은 173 kDa 이다.
도 9a는 DsbA-셀룰란스(cellulans) 만노시다제(mannosidase)4(CcMan4)(SEQ ID NO:9)의 전사해석틀(ORF)의 염기 서열의 디픽션(depicition)이다. 도 9b는 신호서열(SEQ ID NO:10)을 갖는 CcMan4 폴리펩티드(polypeptide)의 아미노산 서열의 디픽션이다. 신호서열을 갖지 않는 CcMan4 폴리펩티드(polypeptide)의 예상되는 분자량은 184 kDa 이다.
도 10은 플라스미드(plasmids) pLSAHCcMan5 및 pLSAHCcMan4의 개략도(schematic)이다.
도 11은 CcMan4 및/또는 CcMan5로 처리된 휴먼 알파 글루코시다제(GAA)의 N-글리칸(glycan) 분석을 서술하는 일련의 일렉트로페로그램(electropherograms)이다.
도 12은 캡핑된 N-글리칸(glycan)의 개략적인 설명이다. P는 포스페이트(phosphate), 필드 스퀘어(filled square)는 GlcNac 반족(moiety), 오픈 서클은 베타-결합 만노스(beta-linked mannose) 필드 서클(filled circle)은 알파-결합 만노스(alpha-linked mannose)를 나타낸다.
도 13은 CcMan4로 처리된 미오자임(Myozyme)® 의 N-글리칸(glycan) 분석을 서술하는 일련의 일렉트로페로그램(electropherograms)이다.
도 14는 CcMan4 및/또는 CcMan5로 처리된 휴먼 GAA 의 N-글리칸(glycan) 분석을 서술하는 일련의 일렉트로페로그램(electropherograms)이다.
도 15는 JbMan으로 처리된 휴먼 GAA 의 N-글리칸(glycan) 분석을 서술하는 일련의 일렉트로페로그램(electropherograms)이다.
도 16은 JbMan으로 처리된 휴먼 GAA 의 N-글리칸(glycan) 분석을 서술하는 일련의 일렉트로페로그램(electropherograms)이다.
도 17은 미오자임(Myozyme)®의 세포내(intracellular) GAA 활동도(U/mg)(다이아몬드) 또는 표시된 엔자임(enzyme) 농도(U/mL)에서 (CcMan5 (정사각형), CcMan4 (삼각형), CcMan4 and CcMan5 (x), or JbMan (*)로 처리된 휴먼 GAA의 라인 그래프이다. 각각의 데이터 포인트는 복용량 표준 편차 값들의 평균을 나타낸다. 별표로 표시된 데이터 포인트들은 복용량 당 단일 자극(stimulation) 조건으로부터 얻어진 결과이다.
도 18은 표시된 엔자임(enzyme) 농도(U/mL)에서 미오자임 (Myozyme)® (다이아몬드), 미오자임® 플러스 M6P(Myozyme® plus M6P)(정사각형), CcMan4로 처리된 미오자임(삼각형), CcMan4 및 CcMan5로 처리된 미오자임® 플러스 M6P(Myozyme® treated with CcMan4, plus M6P(x), CcMan4 및 CcMan5로 처리된 휴먼 GAA(*), CcMan4 및 CcMan5로 처리된 휴먼 GAA 플러스 M6P (human GAA treated with CcMan4 and CcMan5, plus M6P)(원), JbMan으로 처리된 휴먼 GAA(1) 또는 JbMan으로 처리된 휴먼 GAA 플러스 M6P (human GAA treated with JbMan, plus M6P) ( )의 휴먼 GAA (U/mg)의 라인 그래프이다. 각 데이터 포인트는 복제 평균값에 각 투약량 ± 표준편차를 나타낸다. 별표로 표시된 데이터 포인트는 투약량 대비 단일 자극 상태(single stimulation condition)의 결과를 나타낸다.
도 19는 미오자임(Myozyme), JbMan 또는 CcMan4 및 CcMan5의 조합으로 14시간 또는 46시간 동안 배양된 폼페 섬유아세포(Pompe fibroblasts) 내에서의 세포내(intracellular) GAA 활동도(U/mg)의 바(bar) 그래프이다. 상기 복제(duplicates)의 평균값 ± 표준 편차가 표시된다.
도 20은 CcMan5 및 JbMan으로 처리된 휴먼 GAA의 의 N-글리칸(glycan) 분석을 서술하는 일련의 일렉트로페로그램(electropherograms)이다.
도 21은 정제되고, 캡핑되지 않고 탈만노실화(demannosylated)된 휴먼 GAA의 세포내(intracellular) 활동도에 대한 각각 휴먼 GAA 및 미오자임®을 갖는 셀(cell)들의 세포외 시뮬레이션(extracellular stimulation) 후의 미오자임(Myozyme)®의 새포내(intracellular) 활동도의 라인 그래프이다.
도 22는 아스페리길루스 사이토이(Aspergillus saitoi) (SEQ ID NO: 11)로부터 얻어진 만노시다제(mannosidase)의 아미노산 서열의 디픽션이다.
도 2는 휴먼 GAA 클로닝에 사용되는 백터를 발현하는 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica)의 개략도(schematic)이다.
도 3a는 C-터미널 히스-택(C-terminal His-tag) (SEQ ID NO:3)을 갖는 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) AMS1의 전사해석틀(ORF)의 염기서열의 디픽션이다. 도 3b는 N-터미널 히스-택(C-terminal His-tag) (SEQ ID NO:4)을 갖는 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) AMS1의 전사해석틀(ORF)의 염기서열의 디픽션이다. 도 3c는 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) AMS1 폴리펩티드(SEQ ID NO:5)의 아미노산 서열의 디픽션이다.
도 4는 MNN4 N-글리칸으로부터 만노스 잔기를 완전히 제거한다고 가정할 때, Man8GlcNAc2 (M8), 모노 포스포릴레이티드(monophosphorylated) ManP-Man8GlcNAc2 (MP-M8) 및/또는 디포스포릴레이티드(diphosphorylated) (ManP)2-Man8GlcNAc2 ((MP) 2-M8) 슈가(MNN4 슈가 또는 MNN4 N-glycans클리칸이라고 불리는)를 함유하는 MNN4 과발현 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 균주(strain)로부터 추출된 8-아미노-1,3,6-피레네드리설포닉(pyrenetrisulfonic) 산(APTS)-레벨드 슈가로부터의 잠재적 최종 가수분해 산물의 개략도(schematic)이다.
도 5는 잭빈(jack bean,JB) 알파-만노시다제(alpha-manosidase)로 처리된 MNN4 N-글리칸(glycans)의 N-글리칸(glycan) 분석을 서술하는 일련의 일렉트로페로그램(electropherograms)이다. 분석은 DNA 시퀀서 지원형, 플루어로포(fluorophore) 지원형 카르보하이드레이트 일렉트로퍼리시스(carbohydrate electrophoresis) (DSA-FACE)를 사용하여 수행되었다. M1, M2, M3, M4, M5, M6, M8, 및 M9는 염기 N-아세틸글루코사민(base N-acetylglucosamine) 구조에 결합되는 만노스 잔기(mannose residues)의 수를 나타낸다. Y축은 각각의 N-글리칸(glycan) 구조의 양의 표시로서 상대적 형광 유닛들(fluorescence units)을 나타낸다. X축은 모세관을 통한 각각의 N-글리칸(glycan) 구조의 상대적 이동도를 나타낸다.
도 6은 야로위아 리폴리티카(YlAms1)에서 유래한 AMS1를 사용하는 디-만노실레이션(de-mannosylation) 및 포스페이트 캡핑제거 액티비티(phosphate uncapping activity)를 보여주는 일련의 일렉트로페로그램(electropherograms)이다.
도 7은 잭빈(jack bean,JB) 알파-1,2--만노시다제(alpha-1,2-mannosidase)처리 전후의 휴먼 GAA 의 N-글리칸(glycan) 프로파일을 서술하는 일련의 일렉트로페로그램(electropherograms)이다.
도 8a는 DsbA-셀룰로스마이크로비움 셀룰란스(Cellulosimicrobium cellulans) 만노시다제(mannosidase)5(CcMan5)(SEQ ID NO:6)의 전사해석틀(ORF)의 염기 서열의 디픽션(depicition)이다. 도 8b는 신호서열(SEQ ID NO:7)을 갖는 CcMan5 폴리펩티드(polypeptide)의 아미노산 서열의 디픽션이다. 도 8c는 신호서열(SEQ ID NO:8)을 갖지 않는 CcMan5 폴리펩티드(polypeptide)의 아미노산 서열의 디픽션이다. 신호서열을 갖지 않는 CcMan5 폴리펩티드(polypeptide)의 예상되는 분자량은 173 kDa 이다.
도 9a는 DsbA-셀룰란스(cellulans) 만노시다제(mannosidase)4(CcMan4)(SEQ ID NO:9)의 전사해석틀(ORF)의 염기 서열의 디픽션(depicition)이다. 도 9b는 신호서열(SEQ ID NO:10)을 갖는 CcMan4 폴리펩티드(polypeptide)의 아미노산 서열의 디픽션이다. 신호서열을 갖지 않는 CcMan4 폴리펩티드(polypeptide)의 예상되는 분자량은 184 kDa 이다.
도 10은 플라스미드(plasmids) pLSAHCcMan5 및 pLSAHCcMan4의 개략도(schematic)이다.
도 11은 CcMan4 및/또는 CcMan5로 처리된 휴먼 알파 글루코시다제(GAA)의 N-글리칸(glycan) 분석을 서술하는 일련의 일렉트로페로그램(electropherograms)이다.
도 12은 캡핑된 N-글리칸(glycan)의 개략적인 설명이다. P는 포스페이트(phosphate), 필드 스퀘어(filled square)는 GlcNac 반족(moiety), 오픈 서클은 베타-결합 만노스(beta-linked mannose) 필드 서클(filled circle)은 알파-결합 만노스(alpha-linked mannose)를 나타낸다.
도 13은 CcMan4로 처리된 미오자임(Myozyme)® 의 N-글리칸(glycan) 분석을 서술하는 일련의 일렉트로페로그램(electropherograms)이다.
도 14는 CcMan4 및/또는 CcMan5로 처리된 휴먼 GAA 의 N-글리칸(glycan) 분석을 서술하는 일련의 일렉트로페로그램(electropherograms)이다.
도 15는 JbMan으로 처리된 휴먼 GAA 의 N-글리칸(glycan) 분석을 서술하는 일련의 일렉트로페로그램(electropherograms)이다.
도 16은 JbMan으로 처리된 휴먼 GAA 의 N-글리칸(glycan) 분석을 서술하는 일련의 일렉트로페로그램(electropherograms)이다.
도 17은 미오자임(Myozyme)®의 세포내(intracellular) GAA 활동도(U/mg)(다이아몬드) 또는 표시된 엔자임(enzyme) 농도(U/mL)에서 (CcMan5 (정사각형), CcMan4 (삼각형), CcMan4 and CcMan5 (x), or JbMan (*)로 처리된 휴먼 GAA의 라인 그래프이다. 각각의 데이터 포인트는 복용량 표준 편차 값들의 평균을 나타낸다. 별표로 표시된 데이터 포인트들은 복용량 당 단일 자극(stimulation) 조건으로부터 얻어진 결과이다.
도 18은 표시된 엔자임(enzyme) 농도(U/mL)에서 미오자임 (Myozyme)® (다이아몬드), 미오자임® 플러스 M6P(Myozyme® plus M6P)(정사각형), CcMan4로 처리된 미오자임(삼각형), CcMan4 및 CcMan5로 처리된 미오자임® 플러스 M6P(Myozyme® treated with CcMan4, plus M6P(x), CcMan4 및 CcMan5로 처리된 휴먼 GAA(*), CcMan4 및 CcMan5로 처리된 휴먼 GAA 플러스 M6P (human GAA treated with CcMan4 and CcMan5, plus M6P)(원), JbMan으로 처리된 휴먼 GAA(1) 또는 JbMan으로 처리된 휴먼 GAA 플러스 M6P (human GAA treated with JbMan, plus M6P) ( )의 휴먼 GAA (U/mg)의 라인 그래프이다. 각 데이터 포인트는 복제 평균값에 각 투약량 ± 표준편차를 나타낸다. 별표로 표시된 데이터 포인트는 투약량 대비 단일 자극 상태(single stimulation condition)의 결과를 나타낸다.
도 19는 미오자임(Myozyme), JbMan 또는 CcMan4 및 CcMan5의 조합으로 14시간 또는 46시간 동안 배양된 폼페 섬유아세포(Pompe fibroblasts) 내에서의 세포내(intracellular) GAA 활동도(U/mg)의 바(bar) 그래프이다. 상기 복제(duplicates)의 평균값 ± 표준 편차가 표시된다.
도 20은 CcMan5 및 JbMan으로 처리된 휴먼 GAA의 의 N-글리칸(glycan) 분석을 서술하는 일련의 일렉트로페로그램(electropherograms)이다.
도 21은 정제되고, 캡핑되지 않고 탈만노실화(demannosylated)된 휴먼 GAA의 세포내(intracellular) 활동도에 대한 각각 휴먼 GAA 및 미오자임®을 갖는 셀(cell)들의 세포외 시뮬레이션(extracellular stimulation) 후의 미오자임(Myozyme)®의 새포내(intracellular) 활동도의 라인 그래프이다.
도 22는 아스페리길루스 사이토이(Aspergillus saitoi) (SEQ ID NO: 11)로부터 얻어진 만노시다제(mannosidase)의 아미노산 서열의 디픽션이다.
전반적으로, 본 발명은 만노스-1-포스포-6-만노스 결합 또는 반족 포스포-6-만노스(mannose-1-phospho-6-mannose linkage or moiety to phospho-6-mannose)(또한, 여기서 만노스-6-포스포테이트 (mannose-6-phosphate)로 칭하는)를 가수분해(캡핑제거하는)하는 방법들 및 물질들 및 터미널 알파-1,2만노스(terminal alpha-1,2 mannose), 알파-1,3 만노스(alpha-1,3 mannose) 및/또는 글리칸(glycan)을 함유하는 포스페이트(phosphate)의 알파-1,6 만노스(alpha-1,6 mannose) 결합 또는 반족(linkage or moiety)를 가수분해(탈만노실화(demannosylating))하는 방법들 및 물질들을 제공한다. 또한, 글리코프(glycoproteins)의 동물세포 흡수를 달성하기 위해 캡핑제거 및 탈만노실화(분리된 엔자임 또는 단일 엔자임에 의해)들이 모두 필요하기 때문에, 동물세포에 의해 당단백(glycoproteins)의 흡수를 촉진하는 방법들이 제공된다. 여기서 설명되는 방법들 및 물질들은 리소즘 저장 질환(lysosomal storage disorders, LSDs) 환자, 저하에 관련된 이화 효소(catabolic enzymes)이 제기능을 못하여 리소좀에 저장물의 축적에 의한 유전적인 대사질환을 가진 다양한 그룹을 치료하는 물질(agents)을 생상하는데 특히 유용하다. 저장물의 증가는 세포 기능저하 및 점진적인 임상의 징후로 연결된다. 이화 효소(catabolic enzymes)의 결핍은 병든 세포들의 리소좀이 목표로 될 수 있는 승인된 효소가 제공되는 효소 보충 요법(enzyme replacement therapy, ERT)에 의해 수정될 수 있다. 리소좀 효소들은 일반적으로 소포체(ER)에서 합성되고, 분비성 통로를 통해 골지(Golgi)로 이송되며, 그리고 리소좀에 구성되는 당단백(glycoproteins)이다. 여기서 설명되는 방법들 및 물질들을 이용하여, 탈만노실화 포스포릴레이티드 N-글리칸(demannosylated phosphorylated N-glycans)을 포함하는 단백질 치료재를 얻기 위해 미생물기반 생산 공정이 이용될 수 있다. 따라서, 여기서 설명되는 방법들 및 물질들은 LSDs와 같은 대사 질환 치료를 위한 당단백을 준비하는데 유용하다.
만노시다제(Mannosidases)
이 발명은 만노스-1-포스포-6-만노스 결합 또는 반족 포스포-6-만노스(mannose-1-phospho-6-mannose linkage or moiety to phospho-6-mannose)를 가수분해할 수 있는(i) 및/또는 터미널 알파-1,2만노스(terminal alpha-1,2 mannose), 글리칸(glycan)을 함유하는 포스페이트(phosphate)의 알파-1,3 만노스(alpha-1,3 mannose) 및/또는 알파-1,6-만노스 결합 또는 반족을 가수분해 할 수 있는(ii) 만노시다제를 인코딩하는 고립된(isolated) 핵산들을 제공한다. 핵산(nucleic acid) 폴리뉴클레오티드(polynucleotide)들은 여기서 교환되어 사용될 수 있으며, cDNA, 제노믹 DNA(genomic DNA), 신세틱 DNA(synthetic DNA) 및 핵산 아날로그(nucleic acid analogs)를 함유하는 DNA (또는 RNA)를 포함하는 RNA 및 DNA를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드(polynucleotide)는 3차원 구조를 가질 수 있다. 핵산(nucleic acid)은 이중가닥 또는 단일가닥일 수 있다(즉, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥). 폴리뉴클레오티드의 제한되지 않는 예들은 유전자(genes), 유전자 조각들(gene fragments), 엑손(exons), 인트론(introns), 메신저 RNA(messenger RNA)(mRNA), 트랜스퍼 RNA(transfer RNA), 리보좀 RNA(ribosomal RNA), 에스아이 RNA(siRNA), 마이크로 RNA (micro-RNA), 리보자임(ribozymes), cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드(recombinant polynucleotides), 갈래 폴리뉴클레오티드(branched polynucleotides), 플라스미드(plasmids), 벡터(vectors), 서열의 분리된 DNA(isolated DNA), 서열의 분리된 RNA(isolated RNA), 핵산 프로브(nucleic acid probes) 및 프라이머(primers) 그리고 핵산 아날로그(nucleic acid analogs)를 포함한다.
"폴리펩티드(polypeptide)" 및 "단백질(protein)"은 여기서 교환되어 사용될 수 있으며, 길이 또는 전사 후 변형(post-translational modification)에 관계없이 아미노산의 펩티드결합 사슬을 의미한다. 일반적으로, 여기서 폴리펩티드(예를 들어, 만소시다제(mannosidase) 또는 캡핑되지 않고 탈만노실화된 타겟 단백질(uncapped and demannosylated target protein))는 조제용 물질에서 총 단백질의 적어도 60%, 예를 들어, 샘플에서 총 단백질의 60%를 구성할 때 분리된다. 일부 실시예에서, 여기서 설명되는 폴리펩티드(polypeptide)는 조제용 물질에서 총 단백질의 적어도 75%, 적어도 90% 또는 적어도 99%를 구성한다.
분리된 핵산(isolated nucleic acid)은 자연적으로 발생되는 게놈(예를 들어, 이스트 게놈)에서 핵산의 한측면 또는 양 측면인 핵산들을 포함하는 자연적으로 발생하는 게놈들에 존재하는 다른 핵산 분자들로부터 분리된 핵산을 지칭한다. 여기서 핵산에 대해 사용되는 분리된(isolated)이라는 용어는 비자연적발생 서열들은 자연에 기초하지 않고, 자연발생 게놈에서 직접적으로 연속 서열을 가지지 않으므로, 비자연 발생 핵산 서열도 포함한다.
분리된 핵산은 예를 들어, DNA 분자는 자연발생 게놈내의 DNA분자가 제거되거나 존재하지 않는 측면에 기초하는 핵산 서열중의 하나를 제공할 수 있다. 따라서, 분리된 핵산은 제한이 없고, 다른 서열들과 독립된DNA 분자(예를 들어, 화학적으로 조합된 핵산 또는 PCR 또는 제한 효소 처리에 의해 만들어진 cDNA 또는 유전체 DAN 조각) 뿐만 아니라, 벡터, 복제기점 플라스미드, 바이러스(예를들어, 파리믹소바이러스(paramyxovirus), 레트로바이러스(retrovirus), 렌티바이러스(lentivirus), 아데노바이러스(adenovirus) 또는 헤르페스 바이러스(herpes virus)) 또는 원핵생물 또는 진핵생물의 게노믹 DNA(genomic DNA)에 통합된 DNA 로서 존재한다. 게다가, 분리된 핵산은 하이브리드 또는 퓨전 핵산의 일부인 DNA 분자와 같이 변형된 핵산을 포함할 수 있다. cDNA 도서관, 유전자 도서관 또는 게놈 DNA 제한 다이제스트(genomic DNA restriction digest)를 포함하는 겔 슬라이스 내의 수백에서 수백만의 다른 핵산들은 분리된 핵산으로 간주되지 않는다.
여기서 핵산 및 특정 숙주 세포와 관련하여 사용되는 외인성(exogenous)은 자연에서 발견되는 특정세포 내에서 발생되지 않는(그리고 그로부터 얻어지지 않는) 핵산들을 지칭한다. 따라서, 비자연발생 핵산은 일단 숙주 세포로 주입된 숙주세포에 외인성(exogenous)로 간주된다. 전체로서 자연에 존재하지 않는 핵산이 제공되는 자연에서 발견되는 핵산 서열의 핵산 후속 서열 또는 조각들을 포함할 수 있는 것을 기억하는 것이 중요하다. 예를 들어, 발현 벡터 내에 유전자 DNA 서열을 포함하는 핵산 분자는 비자연발생 핵산이며, 따라서, 핵산 분자가 전체적으로 자연에 존재하지 않으므로, 숙주 세포에 도입된 숙주 세포에는 외인성(exogenous)이다. 따라서, 전체로서 자연에 존재하지 않는 벡터, 복제기점 플라스미드, 바이러스(예를들어, 레트로바이러스(retrovirus), 렌티바이러스(lentivirus), 아데노바이러스(adenovirus) 또는 헤르페스 바이러스(herpes virus))는 비자연 발생 핵산으로 간주된다. PCR 또는 제한 효소 처리에 의해 만들어진 유전체 DAN 조각뿐만 아니라, cDNA들은 자연에서 발견되지 않는 분리된 분자로서 존재하므로, 비자연발생 핵산으로 간주된다. 자연에서 발견되지 않는 배열에서 프로모터 서열 및 폴리펩티드 인코딩 서열(예를 들어, cDNA 또는 유전체 DNA)를 포함하는 핵산은 비자연발생 핵산으로 간주된다. 자연 발생되는 핵산은 특정 세포에 외인성(exogenous)일 수 있다. 예를 들어, 효모 x의 세포로부터 분리되는 전체 염색체는 효모 y의 세포에 도입되는 경우 효모 y의 세포에 대해 외인성(exogenous) 핵산이다.
만노시다제(mannosidase)를 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, or SEQ ID NO:9에 제시된 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 70%(예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)의 서열 아이덴티티를 가질 수 있다. 일부 실시예에서, 여기서 설명되는 핵산은 SEQ ID NOs: 5, 7, 8, 10, or 11에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 70%(예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)의 아이덴티티를 갖는 만노시다제 폴리펩티드(mannosidase polypeptides)를 암호화할 수 있다. 예를 들어, 핵산은 SEQ ID NOs: 5, 7, 8, 10, or 11 또는 그 일부에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 아이덴티티를 갖는 만노시다제(mannosidase)를 암호화 할 수 있다. 예를 들어, 핵산은 SEQ ID NOs: 8의 아미노산 잔기 1내지 774에 대해 적어도 90%의 아이덴티티를 갖는 만노시다제(mannosidase)를 암호화 할 수 있다. 특정 아미노산과 SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, or SEQ ID NO:11에 제시된 아미노산 사이의 퍼센트 아이덴티티는 다음과 같이 정의될 수 있다. 첫째, 아미노산 서열들은 BLASTP 버전 2.0.14를 포함하는 BLASTZ의 독립형 버전에서 유래한 BLAST 2 서열(Bl2seq) 프로그램을 사용하여 배열된다. 상기 BLASTZ의 독립형 버전은 Fish & Richardson의 웹사이트 (e.g., www.fr.com/blast/) 또는 미국 정부의 National Center for Biotechnology Information 웹사이트(www.ncbi.nlm.nih.gov)로부터 받을 수 있다. Bl2seq 프로그램의 사용방법은 BLASTZ에 수반하는 리드미 파일에서 찾을 수 있다. Bl2seq는 BLASTP 알고리즘을 사용하여, 두 개의 아미노산 서열들의 비교를 수행한다. 두 개의 아미노산 서열들을 비교하기 위해, Bl2seq의 옵션들은 다음과 같이 설정된다. i는 비교될 제1 아미노산 서열에 설정된다(예를 들어, C:\seq1.txt). j는 비교될 제1 아미노산 서열에 설정된다(예를 들어, C:\seq2.txt). p는 blastp로, -o는 바람직한 파일명으로 설정되며(예를 들어, C:\output.txt), 다른 옵션들은 초기값으로 좌측에 있다. 예를 들어, 다음 명령어는 두 개의 아미노산 서열들의 비교를 포함하는 출력파일을 생성한다: C:\Bl2seq i c:\seq1.txt j c:\seq2.txt p blastp o c:\output.txt. 만약 비교된 두 개의 서열들이 상동성을 공유한다면, 지정된 출력 파일은 배열된 서열로서 상동성의 영역을 보여줄 것이다. 만약 비교된 두 개의 서열들이 상동성을 공유하지 않는다면, 지정된 출력 파일은 배열된 서열들을 보여주지 않을 것이다. 유사한 절차들이 blastn이 사용되는 것을 제외하고 핵산 서열들에 사용될 수 있다.
일단 배열되면, 일치되는 수는 양 서열들에 동일한 아미노산 잔기가 보여진 위치들의 수를 세는것에 의해 결정된다. 퍼센트 아이덴티티는 100에 의해 중복하는 결과값에 의해 따라오는 총길이 만노시다제 폴리펩티드 아미노산 서열의 길이에 의해 일치되는 수를 분할하여 결정된다.
퍼센트 아이덴티티 값은 가장 가까운 열번째 수로 반올림된다. 예를 들어, 78.11, 78.12 78.13 및 78.14는 78.1로 다운되고, 78.15, 78.16, 78.17, 78.18 및 78.19는 78.2로 올려진다. 또한 길이값은 항상 정수이다.
특정 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩할 수 있는 핵산들의 수가 인식된다. 유전자 코드의 디제네러시(degeneracy)는 잘 알려진 기술이다. 즉, 아미노산을 위한 코돈으로서 작용하는 하나 이상의 삼중 뉴클레오티드로서 알려져 있다. 예를 들어, 만노시다제 폴리펩티드가 주어진 코팅 서열에서의 코돈들은 그 종에 적절한 코돈 바이어스 태블릿(codon bias tables)을 사용하여 특정한 종에서 최적을 발현이 얻어질 수 있도록 수정될 수 있다.
교잡 또한 두 개의 핵산 서열들 사이의 상동성을 평가하기 위해 이용될 수 있다. 여기서 설명되는 핵산 서열, 조각 또는 변종들은 표준 교잡 기술에 따라 교잡 프로브로서 사용될 수 있다. 상기 테스트 소스로부터의 DNA 또는 RNA와 관련되는 프로브의 교잡(예를 들어, 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) AMS1 핵산 서열의 일부를 포함하는 프로브)들은 그 테스트 소스에 대응되는 DNA 또는 RNA의 존재의 표지가 된다. 교잡 조건들은 통상의 기술자에게 자명하며, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 6.3.1-6.3.6, 1991에서 찾을 수 있다. 적당한 교잡 조건들은30C에서 2X 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC)에서의 교잡과 동일하며, 50C에서 1X SSC, 0.1%SDS에서 세척되는 것으로 정의된다. 고도의 엄격한 조건들은 45C에서 6X 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC)에서의 교잡과 동일하며, 65C에서 0.2X SSC, 0.1%SDS에서 세척되는 것으로 정의된다.
여기서 사용될 수 있도록 적합한 다른 만노시다제 폴리펩티드 후보들은 뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열 배열들의 분석에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열들의 데이터베이스에 대한 쿼리(query)를 수행하는 것은 만노시다제 폴리펩티드의 호몰로그들 및/또는 올소로그들을 확인할 수 있다. 서열분석은 알려진 만노시다제 아미노산 서열을 이용하는, 논리던던트 데이터베이스의 BLAST, 상호간의BLAST, 또는 PSI-BLAST 분석을 포함할 수 있다. 상기 데이터 베이스 내의 40%이상의 서열 아이덴티티를 갖는 폴리펩티드들은 만노시다제 폴리펩티드오서 적절한지에 대한 추가적인 평가의 후보로서 인정될 수 있다. 아미노산 서열의 유사성은 다른 것을 위한 하나의 가수분해 잔여물의 대용물 또는 다른것에 대한 극성 잔여물의 치환과 같이 적은 보존적 아미노산 치환물이 될 수 있다. 요구된다면, 추가적인 평가가 요구되는 후보들의 좁은 범위를 위해 후보들의 매뉴얼 조사(manual inspection)가 수행될 수 있다.
이 발명은 여기서 설명되는 만노시다제의 (i) 생물학적 활성 변형 및 (ii) 생물학적 활성 조각 또는 그것의 생물학적 활성 변형을 제공한다. 만노시다제의 생물학적 활성 변형은 SEQ ID NOs: 5, 7, 8, 10, and 11에 제시된 서열들에 대해 추가, 삭제 또는 치환을 포함할 수 있다. 치환물이 있는 단백질들은 일반적으로 50이상(예를 들어, 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,15,20,25,30,35,10 또는 50)의 보존적 아미노산 치환물들을 가질 것이다. 보존적 치환물(conservative substitution)은 유사한 특성을 갖는 다른 것을 위한 하나의 아미노산의 치환물이다. 보존적 치환물들(conservative substitutions)은 다음 그룹네의 치환물들을 포함한다. 발린(valine), 알라닌 및 글리신(alanine and glycine); 류신(leucine), 발린 및 이소류신(valine, and isoleucine); 아스파르트 산 및 글루타믹 산(aspartic acid and glutamic acid); 아스파라긴 및 글루타민(asparagine and glutamine); 세린(serine), 시스테인 및 트레오닌(cysteine, and threonine); 라이신 및 아르기닌(lysine and arginine); 및 페닐알라닌 및 티로신(phenylalanine and tyrosine). 비극성 소수성(non-polar hydrophobic) 아미노산은 알라닌(alanine), 류신(leucine), 이소류신(isoleucine), 발린(valine), 프롤린(proline), 페닐알라닌(phenylalanine), 트리토판(tryptophan) 및 메티오닌(methionine)을 포함한다. 극성 뉴트럴(polar neutral) 아미노산은 클리신(glycine), 세린(serine), 트레오닌(threonine), 시스테인(cysteine), 티로신(tyrosine), 아스파라긴(asparagine) 및 글루타민(glutamine)을 포함한다. 양전하(positively charged)(염기성) 아미노산은 아르기닌(arginine), 리신(lysine) 및 히스티딘(histidine)을 포함한다. 음전하(negatively charged)(산성)아미노산은 아스파틱 산(aspartic acid) 및 글루타믹 산(glutamic acid)을 포함한다. 동일한 그룹의 다른 멤버에 의해 위에 언급된 극성, 염기성 또는 산성 그룹들의 한 멤버의 치환물은 보존적 치환물로 여겨질 수 있다. 그에 반해, 비보존적 치환물은 유사하지 않은 특성을 갖는 다른 아미노산의 치환물이다.
삭제 변종들(deletion variants)은 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19 또는 20의 아미노산 세그먼트(둘 또는 이상이 아미노산) 또는 불연속 단일 아미노산들이 부족할 수 있다.
추가 변종들은 SEQ ID NOs: 5, 7, 8, 10, 11에 제시된 만노시다제 또는 그 조각들(a) 및 인터널 또는 터미널(C or N) 무관한 또는 비상동 아미노산 서열을 포함하는 퓨전 단백질을 포함한다. 상기 퓨전 단백질의 맥락에서, 비상동 아미노산 서열들(heterologous amino acid sequences)은 (a)와 다른 아미노산 서열을 의미한다. 비상동 서열은 예를 들어, 재조합 단백질(예를 들어, FLAG, 폴리히스티딘(polyhistidine), 헤마글루타닌(hemagluttanin)(HA), 글루타티오닌-S-트랜스퍼아제(glutathione-S-transferase)(GST), 또는 말토스-바인딩 프로테인(maltose-binding protein)(MBP))의 정제에 사용되는 서열일 수 있다. 비상동 서열들은 또한 예를 들어, 루시페라제(luciferase), 그린 플로레슨트 프로테인(green fluorescent protein)(GFP), 또는 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼아제(chloramphenicol acetyl transferase)(CAT)과 같은 진단 프로그램 또는 디텍터블 마커(detectable markers)일 수 있다. 일부 실시예에서, 퓨전 단백질은 다른 단백질로부터의 신호 서열을 포함한다. 특정 숙주 세포(예를 들어, 효모 숙주 세포)에서, 단백질의 발현 및/또는 분비는 비상동 신호 서열의 사용을 통하여 증가될 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 퓨전 단백질은 캐리어 또는 소포체 또는 골지체 보유 신호들을 포함한다. 비상동 서열들은 다양한 길이가 될 수 있으며, 일부의 경우에 비상동 서열들이 부착된 타겟 단백질의 총길이보다 길 수 있다.
만노시다제의 생물학적 활성 조각들 또는 생물학적 활성 변형들은 와일드 타입, 총 길이, 성숙 단백질의 만노시다제 활동도의 적어도 40%(예를 들어, 50%; 60%; 70%; 75%; 80%; 85%; 90%; 95%; 97%; 98%; 99%; 99.5%, 또는 100% 또는 심지어 그 이상)를 갖는다. 예를 들어, 만노스-1-포스포-6-만노스 결합 또는 반족 포스포-6-만노스(mannose-1-phospho-6-mannose linkage or moiety to phospho-6-mannose)를 가수분해 할 수 있는 만노시다제의 생물학적 활성 조각은 SEQ ID NO:8의 잔여물 1내지 774를 포함할 수 있다.
여기서 설명되는 만노시다제들은 캡핑제거되고 탈만노실화된 타겟 분자들을 만들기 위해 사용될 수 있다. 그 방법들은 생체 또는 생체 내에서 수행 될 수 있다.
탈만노실화 방법 또는 캡핑제거 및 탈만노실화 글리코프로테인 방법(Methods of Demannosylating, or Uncapping and Demannosylating Glycoproteins)
여기서 설명되는 것처럼, 포스포릴레이티드 N-글리칸(phosphorylated N-glycan)을 포함하는 글리코프로테인(glycoproteins)은 탈만노실화(demannosylated) 될 수 있으며, 만노스-1-포스포-6-만노스 결합 또는 반족 포스포-6-만노스(mannose-1-phospho-6-mannose linkage or moiety to phospho-6-mannose)를 포함하는 포스포릴레이티드 N-글리칸(phosphorylated N-glycan)을 포함하는 글리코프로테인(glycoproteins)은 (i) 만노스-1-포스포-6-만노스 결합 또는 반족 포스포-6-만노스(mannose-1-phospho-6-mannose linkage or moiety to phospho-6-mannose)를 가수분해할 수 있고, (ii) 터미널 알파-1,2만노스(terminal alpha-1,2 mannose), 알파-1,3 만노스(alpha-1,3 mannose) 및/또는 글리칸(glycan)을 함유하는 포스페이트(phosphate)의 알파-1,6 만노스(alpha-1,6 mannose) 결합 또는 반족(linkage or moiety)를 가수분해할 수 있는 만노스를 가진 글리코프로테인과 접촉함으로써, 캡핑제거되고 탈만노실화 될 수 있다. 상기 만노시다제의 비제한적인 예들은 카나발리아 엔시포미스(Canavalia ensiformis)(잭빈)(Jack bean) 만노시다제 및 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 만노시다제(예를 들어, AMS1)를 포함한다. 상기 잭빈 및 AMS1 만노시다제는 모두 패밀리 38 글리코시드 하이드로라제(glycoside hydrolases) 이다.
잭빈 만노시다제(Jack bean mannosidase)는 상업적으로 이용가치가 있으며, 예를 들어, Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)로부터 암모늄 황산염 서스펜션(ammonium sulfate suspension)(Catalog No. M7257)으로서 및 프로테믹스 그래이드 프리퍼레이션(proteomics grade preparation)(Catalog No. M5573)으로서 상업적으로 유용하다. 실시예 8에 설명된 것처럼, 상업적 조제물들은 예를 들어, 포스페타제(phosphatases)와 같은 함유물을 제거하기 위해 겔 필터레이션 크로마토그래피(gel filtration chromatography)에 의해 더 정제될 수 있다. 잭빈 만노시다제는 NKIPRAGWQIDPFGHSAVQG (SEQ ID NO:12)의 아미노산 서열을 갖는 세그먼트를 포함한다. Howard et al ., J. Biol . Chem ., 273(4):20672072, 1998.를 참고하라.
야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) AMS1만노시다제는 재조합형으로 만들어질 수 있다. C- 또는N- 터미널 폴리히스티딘 택(terminal polyhistidine tag)으로 AMS1을 인코딩하는 핵산 서열들은 각각 SEQ ID NOs. 3 및 4에 제시된다(도 3A 및 3B 참조). AMS1 폴리펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:5에 제시된다(도 3C 참조). 만노시다제 폴리펩티드를 인코딩하는 분리된 핵산 분자들은 표준 기술에 의해 만들어질 수 있다. 예를 들어, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 기술이 여기서 설명된 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 서열을 얻기 위해 사용될 수 있다. PCR은 총 유전체 DNA 또는 총 셀룰라RNA를 포함하는 DNA 뿐만 아니라 RNA로부터 특정 서열을 증폭시키는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 관심있는 영역 의 끝단들 또는 그것을 넘는 영역으로부터의 서열 정보는 증폭되는 주형 사슬의 반대편 사슬과 동일 또는 유사한 올리고뉴클레오티드 프리이머들(oligonucleotide primers)을 디자인하는데 이용된다. 다양한 PCR 전략들이 주형 핵산에 도입될 수 있는 장소 특수성 핵산 서열 수정들에 의해 이용가능하다. 분리된 핵산은 단일 핵산 분자(예를 들어, 포스포라미디트(phosphoramidite) 기술을 이용한 3'에서 5'방향의 자동화 DNA 분석을 이용하여)로 또는 일련의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides)로 화학적으로 합성된다. 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 긴 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides)들(예를 들어 100 올리고뉴클레오티드 이상)은 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides)가 열처리될 때 듀풀렉스(duplex)가 수행되도록 상보성의 짧은 세그먼트(segement)(예를들어, 약 15뉴클레오티드들)를 포함하는 각각의 쌍들을 갖는 요구되는 서열을 포함할 수 있도록 합성될 수 있다. DNA 폴리머라제가 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides)를 연장하는데 사용되고, 그 결과 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides)당 단일, 이중 가닥 핵산 분자가 벡터로 묶일 수 있다. 분리된 핵산은 또한 예를 들어 자연발생 DNA의 돌연변이 유발에 의해 얻어질 수 도 있다.
재조합으로 만노시다제 폴리펩티드를 생산하기 위해, 만노시다제 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산에 사용가능하게 연결되는 프로모터를 포함하는 벡터가 사용된다. 여기서 사용되는 것처럼, 프로모터은 유전자가 전사될 수 있게하는 DNA 서열을 의미한다. 상기 프로모터는 RNA 폴리머라제에 의해 인식되고, 전사를 초기화 한다. 따라서, 프로모터는 직접 묶이거나RNA 폴리머라제의 리므루트먼트(recruitment)에 포함되는 DNA 서열을 포함한다. 프로모터 서열은 유전자군(gene-cluster)의 유전자들의 전사 수준을 강화하기 위해 단백질과 묶일 수 있는 DNAdml 하나 또는 그 이상의 인핸서 영역을 포함한다. 일반적으로 코딩 영역의 5'단말에 있는 인핸서는 프로모터 서열로부터 분리될 수 있고, 유전자의 인트론 영역내 또는 3'단말에서 유전자의 코딩 영역이 될 수 있다.
여기서 사용되는 것처럼, "사용가능하게 결합되는(operably linked)"것은 발현 제어 서열들이 관심있는 코딩 서열의 발현을 효과적으로 제어할 수 있도록 유전적 구성물에 통합되는 것을 의미한다.
발현 벡터들은 인코딩된 풀리펩티드의 발현을 위해 숙주 세포들에 도입(예를 들어, 형질 전환 또는 형질 도입에 의해)될 수 있고, 이후 정제될 수 있다. 만노시다제 폴리펩티드의 작거나 큰 스케일의 생산을 위한 발현 시스템들은 제한되지 않고, 핵산 분자들을 포함하는 박테리로파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터들로 변형된 박테리아(예를 들어, E. coli) 및 핵산 분자들을 포함하는 재조합 균류 발현 벡터에 의해 변형된 균류(예를 들어, 세레비시에(S. cerevisiae), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 악설라 아데닌이보란스(Arxula adeninivorans), 피치아 파스포리스(Pichia pastoris), 한세눌라 폴리모파(Hansenula polymorpha), 또는 아스퍼길리스(Aspergillus)) 와 같은 미생물을 포함한다. 유용한 발현 시스템들은 또한 재조합 바이러스 발현 벡터들(예를 들어, 바큐로바이러스)에 의해 감염된 곤충 세포 시스템들, 재조합 바이러스 발현 벡터들(예를 들어, 토바코 모자익 바이러스)에 의해 감염되거나 또는 핵산 분자들을 포함하는 재조합 발현 벡터들(예를 들어, Ti 플라스미드)에 의해 변형된 식물 세포 시스템들을 포함한다. 만노시다제 폴리펩티드들은 동물세포들(예를 들어, 메탈로티오네인(metallothionein) 프로모터) 또는 동물 바이러스(예를 들어, 아데노 바이러스 레이트 프로모터 및 시토메갈로바이러스 프로모터)의 유전자들로부터 추출된 프로모터들을 포함하는 재조합 발현 구조들에 잠복하는 세포들(예를 들어, COS 세포들, 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary) 세포들, 헬라(HeLa) 세포들, 인체 배아 신장 (human embryonic kidney) 293 세포들 및 3T3 L1 세포들과 같은 불멸 세포 라인들)을 포함하는 동물 발현 시스템을이용하여 만들어질 수 있다.
일반적으로, 재조합 만노시다제 폴리펩티드들은 단백질을 정제하는데 도움이 되는 FLAG, 폴리히스티딘(polyhistidine) (예를 들어, 헥사히스티딘(hexahistidine)), 헤마글루타민(hemagluttanin)(HA), 글루타니오네-S-트랜스페라제(glutathione-S-transferase)(GST), 또는 말토스-바인딩 프로테인(maltose-binding protein)(MBP)와 같은 비상동(heterologous) 아미노산 서열에 의해 태그된다. 단백질을 태그하는 다른 방법들은 이온 교환(ion exchange), 소수성 및 역상(hydrophobic and reverse phase), 크기 배제(size exclusion), 친화도(affinity), 소수성 차지 인덕션 크로마토그래피(hydrophobic charge-induction chromatography)등 과 같은 크로마토그래피 기술을 포함한다.(예를 들어, Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, third edition, Springer-Verlag, New York (1993); Burton and Harding, J. Chromatogr. A 814:71-81 (1998) 참고.)
일부 실시예에서는, 캡핑제거 및 디마노실레이팅 단계들은 두개의 다른 효소들에 의해 촉진된다. 예를 들어, 만노스-1-포스포-6-만노스 결합 또는 반족의 언켑핑은 셀룰로시마이크로비움 셀룰란스(Cellulosimicrobium cellulans)(예를 들어, CcMan5)로부터의 만노시다제를 이용하여 수행될 수 있다. 신호 서열을 포함하는 CcMan5 폴리펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 7에 제시된다. 신호 서열을 포함하지 않는 CcMan5 폴리펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 8에 제시된다. CcMan5 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO: 6에 제시된다. 일부 실시예에서, CcMan5 폴리펩티드의 생물학적 활성 조각(biologically active fragment)이 사용된다. 예를 들어, 생물학적 활성 조각(biologically active fragment)은 SEQ ID NO: 8에 제시된 아미노산의 잔여물 1-774를 포함할 수 있다. 또한, WO 2011/039634 참고하라. CcMan5 만노시다제는 패밀리 92 글리코시드 하이드로라제(family 92 glycoside hydrolase)이다.
캡핑제거된 글리코프로테인(glycoprotein)의 탈만노실화는 아스퍼길리우스 사토이(Aspergillus satoi, AS)(또한, 아스퍼길리우스 포에니시스(Aspergillus phoenicis)로 알려진) 또는 셀룰로시마이크로비움 셀룰란스(Cellulosimicrobium cellulans)(예를 들어, CcMan4)로부터의 만노시다제를 이용하여 촉진될 수 있다. 아스퍼길리우스 사토이(Aspergillus satoi, AS)는 패밀리 47 글리코시드 하이드로라제(family 47 glycoside hydrolase)이며, CcMan4 만노시다제는 패밀리 92 글리코시드 하이드로라제(family 92 glycoside hydrolase)이다. 아스퍼길리우스 사토이(Aspergillus satoi) 만노시다제의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:11 및 GenBank Accession No. BAA08634에 제시된다(도 22참고). CcMan4 폴리펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:10에 제시된다. SEQ ID NO:9에 제시되는 핵산 서열은 SEQ ID NO:10의 폴리펩티드를 인코딩한다.
캡핑제거된 글리코프로테인(glycoprotein)의 탈만노실화는 카나발리아 엔시포미스(Canavalia ensiformis)(Jack bean) 만노시다제 또는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 만노시다제(예를 들어, AMS1)와 같은 패밀리 38 글리코시드 하이드로라제(family 47 glycoside hydrolase)를 이용하여 촉진될 수 있다. 예를 들어, 글리코프로테인으로의 만노스-1-포스포-6-만노스 반족 (mannose-1-phospho-6-mannose linkage or moiety)의 언켑핑을 위해 CcMan4가 이용될 수 있고, 캡핑제거된 글리코프로테인을 디만노실레이트 하기 위해 잭빈 만노시다제(Jack bean mannosidase)가 이용될 수 있다.
만노실레이티드된 글리코프로테인 또는 캡핑제거 및 만노실레이티드된 글리코프로테인을 만들기 위해 만노스-1-포스포-6-만노스 결합 또는 반족(mannose-1-phospho-6-mannose linkage or moiety)를 포함하는 타겟 분자는 적절한 만노시다제(들) 및/또는 재조합으로 생산된 만노시다제(들)을 포함하는 세포 용해물(cell lysate)과 적절한 조건하에서 접촉된다. 적절한 만노시다제는 위에서 설명되었다. 세포 용해물(cell lysate)은 균류 세포, 식물 세포 또는 동물 세포를 포함하는 유전적으로 가공된 세포로부터 얻어질 수 있다. 동물 세포의 비제한적인 예들은 선충,곤충, 식물, 새, 파충류, 쥐, 생쥐, 토끼, 햄스터, 개, 고양이,염소, 돼지, 소, 말, 고래, 원숭이 또는 인간과 같은 포유동물을 포함한다.
타겟 분자(예를 들어, 글리코프로테인)을 정제된 만노시다제 및/또는 세포 용해물(cell lysate)과 접촉시키자마자, 만노스-1-포스포-6-만노스 결합 또는 반족(mannose-1-phospho-6-mannose linkage or moiety)는 캡핑제거되고 디만실레이티드된 타겟 분자가 가수분해될 수 있는 글리칸을 포함하는 포스페이트와 같은 알파-1,6 만노스 결합(phospho-6-mannose)및 터미널 알파-1,2만노스(terminal alpha-1,2 mannose), 알파-1.3만노스(alpha-1,3 mannose) 및/또는 알파-1,6 만노스 결합 또는 반족(alpha-1,6 mannose linkage or moiety)로 가수분해 될 수 있다. 일부 실시예에서, 캡핑제거 및 디만실레이티드 단계를 촉진하는 하나의 만노시다제가 사용되다. 일부 실시예에서는 하나의 만노시다제가 캡핑제거 단계를 촉진하는데 사용되고, 다른 만노시다제가 디만실레이티드 단계를 촉진하는데 사용된다. 실시예 5에 설명된 방법들은 타겟 분자가 캡핑제거되고 탈만노실화 될지 여부를 결정하는데 사용된다. 만노시다제에 의한 다음 단계에서 타겟 분자가 분리될 수 있다.
활성 또는 용해물 내에서 만노시다제 활성의 무결성을 보존하는 세포 용해물(cell lysate)을 얻기 위한 적절한 방법들은 적절한 버퍼 및/또는 뉴클레아제(nuclease), 프로테아제(protease) 및 포스파타제 억제제(phosphatase inhibitors)를 포함하는 세포 용해물(cell lysate) 내에서의 N-글리코실레이션(N-glycosylation) 활동도를 보존 또는 변화를 최소화하는 억제제의 이용을 포함할 수 있다. 그러한 억제제들은 얘를 들어, 에틸렌아민 테트라아세틱 산(ethylenediamine tetraacetic acid)(EDTA),에틸렌 글리콜 비스(ethylene glycol bis)((P-아미노에틸 에테르(P-aminoethyl ether)) N,N,N1,Nl- 테트라아세틱 산 (N,N,N1,Nl-tetraacetic acid)(EGTA)과 같은 킬레이터(chelator), 페닐메틸설포닐 프로라이드(phenylmethylsulfonyl fluoride)(PMSF), 아프로티닌 류펩틴(aprotinin, leupeptin), 안티파인(antipain) 등과 같은 프로테아제 억제제(protease inhibitors) 및 포스페이트(phosphate), 소디움 플로라이드(sodium fluoride), 바나데이트(vanadate) 등과 같은 포스파타제 억제제(phosphatase inhibitors)를 포함한다. 효소 활성을 포함하는 용해물을 얻기 위한 적절한 버퍼 및 조건들은 예를 들어, Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 47), John Wiley & Sons, New York (1999); Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1999); Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 3rd ed. Burtis and Ashwood, eds. W.B. Saunders, Philadelphia, (1999).에 설명된다.
세포 용해물(cell lysate)은 방해물질들의 존재를 제거하거나 최소화하기 위해 추가적인 단계가 진행될 수 있다. 만약 필요하다면, 서브셀룰러프렉셔네이션(subcellular fractionation) 및 이온 교환(ion exchange), 소수성 및 역상(hydrophobic and reverse phase), 크기 배제(size exclusion), 친화도(affinity), 소수성 차지 인덕션 크로마토그래피(hydrophobic charge-induction chromatography)등과 같은 크로마토그래피 기술과 같이 통상의 기술자들에게 널리 알려진 다양한 방법에 의해 세포 용해물(cell lysate)이 분별될 수 있다.
일부 실시예에서, 온전히 및/또는 기능적으로 남아있는 전체 세포의 세포기관에 세포 용해물(cell lysate)이 준비될 수 있다. 예를 들어, 용해물은 하나 또는 그 이상의 온전한 조면 소포체(rough endoplasmic reticulum), 온전한 활면 소포체(smooth endoplasmic reticulum) 또는 온전한 골지체(Golgi apparatus)를 포함할 수 있다. 온전한 세로의 세포 기관들을 포함하고 세포기관들의 기능을 테스트하기 위한 용해물을 제조하는 적절한 방법들은 예를 들어, Moreau et al. (1991) J. Biol. Chem. 266(7):4329-4333; Moreau et al. (1991) J. Biol. Chem. 266(7):4322-4328; Rexach et al. (1991) J. Cell Biol. 114(2):219-229; and Paulik et al. (1999) Arch. Biochem. Biophys. 367(2):265-273. 에 설명된다.
여기서 설명되는 것처럼, 타겟 분자들(target molecules)은 (i)터미널 만노스-1-포스포-6 만노스 결합 또는 반족(terminal mannose-1-phospho-6 mannose linkage or moiety)를 포함하는 분자; (ii)균류 기원의 세포에서 발현될 때, 만노스-1-포스포-6 만노스 결합 또는 반족(mannose-1-phospho-6 mannose linkage or moiety)를 포함하는 분자; (iii) 터미널 알파-1,2 만노스(terminal alpha-1,2 mannose), 알파-1,3만노스(alpha-1,3 mannose) 및/또는 글리칸을 포함하는 포스페이트의 알파-1,6만노스 결합 또는 반족(alpha-1,6 mannose linkage or moiety of a phosphate containing glycan)를 포함하는 분자; 또는 (iv) 균류 기원의 세포에서 발현될 때, 터미널 알파-1,2 만노스(terminal alpha-1,2 mannose), 알파-1,3만노스(alpha-1,3 mannose) 및/또는 글리칸을 포함하는 포스페이트의 알파-1,6만노스 결합 또는 반족(alpha-1,6 mannose linkage or moiety of a phosphate containing glycan)를 포함하는 분자를 지칭한다. 일부 실시예에서, 타겟 단백질(target protein)은 인간의 글리코르포테인(glycoprotein)이다. 적절한 타겟 단백질(target protein)은 파상풍톡소이드(tetanus toxoid) 또는 디프테리아톡소이드(diptheria toxoid);시토메갈로바이러스(cytomegalovirus)(CMV)글리코프로테인(glycoproteins) B, H 및 gCIII, 인간면역결핍바이러스1(human immunodeficiency virus 1) (HIV-1) 엔벨로프 글리코프로테인(envelope glycoproteins), 로우스 사르코마 바이러스(Rous sarcoma virus)(RSV) 엔벨로프 글리코프로테인 (envelope glycoproteins), 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus)(HSV) 엔벨로프 글리코프로테인(envelope glycoproteins), 엡스타인 바르 바이러스(Epstein Barr virus)(EBV) 엔벨로프 글리코프로테인(envelope glycoproteins), 바리셀라-조스터 바이러스(varicella-zoster virus)(VZV) 엔벨로프 글리코프로테인(envelope glycoproteins), 휴먼 파필로마 바이러스(human papilloma virus)(HPV) 엔벨로프 글리코프로테인(envelope glycoproteins), 인플루엔자바이러스 글리코프로테인 (Influenza virus glycoproteins) 및 헤파티티스 패밀피 서피스 안티젠(Hepatitis family surface antigen)과 같은 비랄 서피스 프로테인(viral surface proteins); 리소조말 프로테인(lysosomal proteins) (예를 들어, 액시드 알파글루코시다제(acid alpha glucosidase), 알파 글루코시다제(alpha galatosidase), 글루코세리브로시다제(glucocerebrosidase), 세레브로시다제(cerebrosidase) 또는 갈락토세리브로시다제(galactocerebrosidase)); 인슐린(insulin); 글루카곤(glucagons); 그로우쓰 팩터(growth factors); 사이토카인(cytokines); 체모카인(chemokines); 및 그것의 항체 또는 조각(antibodies or fragments)과 같은 파쏘젠 프로테인(pathogen proteins)을 포함한다. 그로우쓰 팩터(Growth factors)는 예를 들어, 바스쿨라 엔도테리알 그로우쓰 팩터(vascular endothelial growth factor)(VEGF), 인슐린-라이크 그로우쓰 팩터(Insulin-like growth factor)(IGF), 본 모포제닉 프로테인(bone morphogenic protein) (BMP), 그래뉼러사이트-클롤니 스티뮬레이팅 팩터(Granulocyte-colony stimulating factor) (G-CSF), 그래뉼러사이트-매크로파지 클롤니 스티뮬레이팅 팩터(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor)(GM-CSF), 너브 그로우쓰 팩터(Nerve growth factor)(NGF); 뉴로프로핀(Neurotrophin), 플라텔렛-디라이브드 그로우쓰 팩터(Platelet-derived growth factor)(PDGF), 에리트로포이에틴(Erythropoietin)(EPO), 트롬보포이에틴(Thrombopoietin)(TPO), 미오스타틴(Myostatin)(GDF-8), 그로우쓰 디퍼런시에이션 팩터-9(Growth Differentiation factor-9)(GDF9), 베이직 파이브로블라스트 그로우쓰 팩터(basic fibroblast growth factor)(bFGF or FGF2), 에피더말 그로우쓰 팩터(Epidermal growth factor)(EGF), 헤퍼터사이트 그로우쓰 팩터(Hepatocyte growth factor)(HGF)를 포함한다. 싸이토카인(Cytokines)은 예를 들어, IL-1 내지 IL-33과 같은 인터루킨(interleukins) (예를 들어, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, 또는 IL-15)를 포함한다. 체모카인(Chemokines)은 예를 들어, I-309, TCA-3, MCP-1, MIP-1, MIP-1, RANTES, C10, MRP-2, MARC, MCP-3, MCP-2, MRP-2, CCF18, MIP-1, Eotaxin, MCP-5, MCP-4, NCC-1, Ck10, HCC-1, Leukotactin-1, LEC, NCC-4, TARC, PARC, 또는 Eotaxin-2를 포함한다. 또한, 튜머 글리코프로테인(tumor glycoproteins)(예를 들어, 튜머-오쏘시에이티드 안티젠(tumor-associated antigens))는, 예를 들어, 카르시노엠브리오닉 안티젠(carcinoembryonic antigen)(CEA), 휴먼 뮤신(human mucins), HER-2/neu, 및 포스테이트-스페시픽 안티젠(prostate-specific antigen)(PSA)을 포함한다. [Henderson and Finn, Advances in Immunology, 62, pp. 217-56 (1996)].
일부 실시예에서, 타겟 단백질은 예를 들어, 액시드 알파 글루코시다제(acid alpha glucosidase), 알파 글루코시다제(alpha galactosidase), 알파-L-이두로니다제(alpha-L-iduronidase), 베타-D-갈락토시다제(beta-D-galactosidase), 베타-글루코시다제(beta-glucosidase), 베타-헥소사미니다제(beta-hexosaminidase), 베타-D-만나노시다제(beta-D-mannosidase), 알파-L-푸코시다제(alpha-L-fucosidase), 아릴설파타제 B(arylsulfatase B), 아릴설파타제 A(arylsulfatase A), 알파-N-아세틸갈락토사미니다제(alpha-N-acetylgalactosaminidase), 아스파틸글루코사미다제(aspartylglucosaminidase), 이두로나테-2-설파타제(iduronate-2-sulfatase), 알파-글루코사미니다제-N-아세틸트랜스퍼라제(alpha-glucosaminide-N-acetyltransferase), 베타-D-글루코로니다제(beta-D-glucoronidase), 히아루노니다제(hyaluronidase), 알파-L-만노시다제(alpha-L-mannosidase), 알파-뉴라미니다제(alpha-neuraminidase), 포스포트랜스퍼라제(phosphotransferase), 액시드 리파제(acid lipase), 액시드 세라미다제(acid ceramidase), 스핀고미엘린다제(sphingomyelinase), 티오에스테레다제(thioesterase), 카텝신 K(cathepsin K) 및 리포프로테인 리파제(lipoprotein lipase)를 포함한다.
일부 실시예에서는, 타겟 단백질들은 안에서 다른 폴리펩티드 서열 또는 폴리머(polymer), 캐리어(catrrier), 애저번트(adjuvant), 이뮤노톡신(immunotoxin) 또는 탐지가능한(예를 들어, 플로레센트(fluorescent), 루미네센트(luminescent) 또는 라디오액티브(radioactive))반족에 융합되는 퓨전 단백질이다. 예를 들어, 타겟 단백질은 작은 단백질들의 분자량을 증가시키기 위해 및/또는 순환체류 시간을 증가시키기 위해 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol)과 같은 폴리머(polymer)에 결합될 수 있다.
동물세포가 캡핑 제거되고 디만노실레이티든된 포스포릴레이티드 N-글리칸(phosphorylated N-glycan)을 포함하는 타겟 분자와 접촉하자 마자, 타겟 분자는 동물세포(예를 들어, 인간 세포)의 내부로 이송될 수 있다. 캡핑 제거되었지만 탈만노실화되지 않은 포스포릴레이티드 N-글리칸(phosphorylated N-glycan)을 갖는 글리코프로테인(glycoprotein)은 실질적으로 동물세포에 만노스-6-포스페이트 리셉터(mannose-6-phosphate receptors)를 결합시키지 않으며, 효율적으로 세포 내부로 이송되지 않는다. 여기서 사용되는 것처럼, "실질적으로 결합시키지 않는다"는 동물세포에 만노스-6-포스페이트 리셉터(mannose-6-phosphate receptors)를 결합시키는 글리코프로테인 분자의 15% 이하(예를 들어, 14%, 12%, 10%, 8%, 6%, 4%, 2%, 1%, 0.5%, 또는 그 이하 또는 0%)를 의미한다. 그러나, 근본적인 만노스가 포스포릴레이티드(phosphorylated)될 때, 글리코프로테인(glycoprotein)이 터미널 알파-1,2 만노스 결합 또는 반족(terminal alpha-1,2 mannose linkage or moiety)를 가수분해할 수 있는 만노스와 접촉한다면, 실질적으로 동물세포에 만노스-6-포스페이트 리셉터(mannose-6-phosphate receptors)를 결합시키며, 효율적으로 세포 내부로 이송되는 탈만노실화 글리코프로테인(demannosylated glycoprotein)이 만들어진다. 여기서 사용되는 것처럼, "실질적으로 결합시킨다"는 동물세포에 만노스-6-포스페이트 리셉터(mannose-6-phosphate receptors)를 결합시키는 글리코프로테인 분자의 15% 이상(예를 들어, 16%, 18%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상)을 의미한다. 캡핑 제거되었지만 탈만노실화되지 않은 포스포릴레이티드 N-글리칸(phosphorylated N-glycan)을 갖는 효소를 포함하는 제조물(예를 들어, 재조합 숙주 세포 또는 셀-프리 제조물)은 탈만노실화된 포스포릴레이티드 N-글리칸(phosphorylated N-glycan)으로 오염될 수 있다. 그러한 조제물과 접혹한 후의 타겟 단백질 샘플은 단지 캡핑 제거된 포스포릴레이티드 N-글리칸(phosphorylated N-glycan) 및 캡핑 제거되고 탈만노실화된 포스포릴레이티드 N-글리칸(phosphorylated N-glycan)을 포함할 수 있다. 자연적으로 캡핑 제거되고 탈만노실화된 포스포릴레이티드 N-글리칸(phosphorylated N-glycan)을 포함하는 그러한 단백질 분자는 실질적으로 만노스-6-포스페이트 리셉터(mannose-6-phosphate receptors)를 결합시킬 수 있다. 위에서 정의된 "실질적으로 결합시키지 않는다"는 단백질 분자위의 N-글리칸(phosphorylated N-glycan)는 캡핑 제거되고 탈만노실화되지 않는 특징을 가질 수 없으므로, 그러한 단백질 샘플에는 적용되지 않는다.
실시예 9 및 12에 제시된 것처럼, 캡핑제거되고 탈만노실화된 타겟 분자들은 캡핑제거된 포스포릴레이티드 N-글리칸(phosphorylated N-glycan)을 포함하는 분자들보다 효과적으로 동물 세포에 의해 흡수된다(taken up). 예를 들어, 탈만노실화된 타겟 분자들은 적어도 10번 이상(예를 들어, 15, 20, 25, 또는 30번 이상) 캡핑제거된 글리코프로테인 보다 효과적으로 흡수될(taken up) 수 있다.
따라서, 이 발명은 동물세포에 만노스-6-포스페이트 리셉터(mannose-6-phosphate receptors)를 묶지 않는 제1 형태에서 동물세포에 만노스-6-포스페이트 리셉터(mannose-6-phosphate receptors)를 묶는 제2형태로 글리코프로테인을 변형시키는 방법들을 제공한다. 제1 형태에서, 글리코프로테인은 1 위치에서, 6위치에서 포스페이트 잔기를 포함하는 만노에 잔여물에 결합되는 하나 또는 그 이상의 만노스 잔여물을 포함하는 하나 또는 그 이상의 N-글리칸을 포함한다. 그 방법에서, 글리코프로테인의 제1형태는 터미널 만노스 잔여물을 탈만노실화하여 만노스가 6 위치에서 터미널 만노스가 되는 포스포테이트를 포함하도록 하는 만노시다제(mannosidase)와 접촉한다. 일부 실시예에서, 만노시다제(mannosidase)는 캡핑제거되고 탈만노실화된 활성을 모두 갖는다(예를 들어, 카나발리아 엔시포미스(Canavalia ensiformis)(Jack bean) or 야로위아 리폴리티카 AMS1 만노시다제(Yarrowia lipolytica AMS1 mannosidase)). 일부 실시예에서, 만노시다제(mannosidase)는 캡핑제거 활성을 가지지 않는다(예를 들어, 아스퍼길리우스 사토이로부터의 만노시다제(mannosidase from Aspergillus satoi) 또는 셀룰로시마이크로비움 셀루란스로부터의 만노시다제(mannosidase from Cellulosimicrobium cellulans) (예를 들어, CcMan4)).
세포내부로의 글리코프로테인(glycoprotein 의 이송은 예 9에 제시된것과 같은 셀 업테이크 어세이(cell uptake assay)를 이용하여 가늠될 수 있다. 예를 들어, 동물 세포들 및 캡핑제거되고 탈만노실화 된 포스포릴레이티드 N-글리칸(phosphorylated N-glycan)을 포함하는 타겟 분자는 배양될 수 있고, 세포들은 세척되고 용해된다. 세포 용해물들(cell lysates)은 타겟 분자(예를 들어, 웨스턴 블로팅(by Western blotting))의 존재 또는 세포 용해물 내에서의 타겟 분자의 활성에 의해 가늠될 수 있다. 예를 들어, 타겟 분자가 휴먼 알파 글루코시다제(human alpha glucosidase)와 같은 글루코시다제(glucosidase)일 때, 흡수는 액시드 알파 글루코시다제 활성(acid alpha glucosidase activity)이 부족한 상태의 섬유아세포(fibroblasts)에서 가늠될 수 있다. 알파 글루코시다제(alpha glucosidase)의 세포내 활성(intracellular activity)은 4-메틸움벨리페릴-알파-D-글루코피라노시데 어세이(4-methylumbelliferyl-alpha-D-glucopyranoside (4-MUG) assay) 를 이용하여 가늠될 수 있다. 실시예 3을 참조하라. 글루코시다제(glucosidase)에 의한 기질(substrate) 4-MUG의 난할(cleavage)은 시각화될 수 있고, UV 광의 조사에 의해 탐지될 수 있는 프루오리제닉(fluorigenic) 산물 4-MU의 세대(generation)으로 이어진다.
당단백질을 캡핑제거(uncapping) 하고 탈만노실화(demannosylating)하는 생체실험 방법
본 실시예들의 유전공학된 세포들은 캡핑제거(uncapped)되고 탈만노실레이트(demannosylated)된 타겟 분자들을 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포 기반 방법은 만노스-1-포스포-6-만노스 결합(mannose-1-phospho-6-mannose linkage)을 가수분해할 수 있는 만노시다제(mannosidase)를 인코딩하는 핵산, 타겟 분자를 인코딩하는 핵산,을 포함하도록 유전공학된 (genetically engineered) 진균세포(fungal cell)로 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 세포는 캡핑제거된 인산화 N-글리칸(uncapped phosphorylated N-glycans)을 포함하는 타겟 분자를 생성한다. 상기 인산화 N-글리칸(phosphorylated N-glycans)은 전술한 대로 탈만노실레이트(demannosylated)될 수 있다. 본 발명의 다른 세포는 (i) 만노스-1-포스포-6-만노스 결합(mannose-1-phospho-6-mannose linkage)을 가수분해 또는 포스포-6만노스(phospho-6-mannose)를 반족(moiety)을 가수분해하고, (ii) 터미널 알파-1,2 만노스(terminal alpha-1,2 mannose), 알파-1,3 만노스(alpha-1,3 mannose) 및/또는 알파-1,6 만노스 결합(alpha-1,6 mannose linkage)을 가수분해하거나 또는 인산화(phosphate)를 포함하는 글리칸(glycan)의 반족(moiety)을 가수분해 할 수 있는 만노시다제(mannosidase)를 인코딩하는 핵산, 타겟 분자를 인코딩하는 핵산,을 포함하도록 유전공학된 진균 세포(fungal cell)를 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 세포는 캡핑제거(uncapped)되고 탈만노실레이트(demannosylated)된 타겟 분자들을 생산한다. 다른 실시예에서, 만노시다제(mannosidase) 및 타겟 분자를 인코딩하는 핵산은 분비 시퀀스(secretion sequence)를 포함하여, 만노시다제(mannosidase) 및 타겟 분자가 함께 분비된다(co-secreted).
본 실시예들의 유전공학된 세포들은 만노시다제(mannosidase)를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 타겟 분자들의 생체(in vivo) 생산에 적합한 세포들은 진균 기원(fungal origin)의 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 악술라 아데니니포란스(Arxula adeninivorans), 메틸로트로픽 이스트(methylotrophic yeast)(예를 들어, 칸디다(Candida), 한세눌라(Hansenula), 우가타에아(Oogataea), 피치아(Pichia) 또는 토룰롭시스(Torulopsis) 속(genus)의 메틸로트로픽 이스트) 또는 아스퍼길루스(Aspergillus), 트리초덜마(Trichoderma), 뉴로스포라(Neurospora), 푸사리움(Fusarium) 또는 크리소포리움(Chrysosporium) 속(genus)의 필라멘트 진균(filamentous fungi)일 수 있다. 진균류(fungal species)의 예로, 제한되지 않지만, 피치아 아노말라(Pichia anomala), 피치아 보비스(Pichia bovis), 피치아 카나덴시스(Pichia canadensis), 피치아 칼소니(Pichia carsonii), 피치아 파리노세(Pichia farinose), 피치아 펄멘탄스(Pichia fermentans), 피치아 프룩숨(Pichia fluxuum), 피치아 멤브라네파시엔스(Pichia membranaefaciens), 피치아 멤브라네파시엔스(Pichia membranaefaciens), 칸디다 바리다(Candida valida), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 아스카라피다룸(Candida ascalaphidarum), 칸디다 암픽시에(Candida amphixiae), 칸디다 안탈티카(Candida Antarctica), 칸디다 아틀란티카(Candida atlantica), 칸디다 아트모스페리카(Candida atmosphaerica), 칸디다 블라타에(Candida blattae), 칸디다 카포필라(Candida carpophila), 칸디다 세람비시다룸(Candida cerambycidarum), 칸디다 쵸리오데스(Candida chauliodes), 칸디다 코리다리스(Candida corydalis), 칸디다 도세이(Candida dosseyi), 칸디다 듀브리니엔시스(Candida dubliniensis), 칸디다 엘가텐시스(Candida ergatensis), 칸디다 프룩터스(Candida fructus), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 칸디다 펄멘타티(Candida fermentati), 칸디다 길리어몬디(Candida guilliermondii), 칸디다 해물로니(Candida haemulonii), 칸디다 인섹타멘스(Candida insectamens), 칸디다 인섹토룸(Candida insectorum), 칸디다 인터메디아(Candida intermedia), 칸디다 제프레시(Candida jeffresii), 칸디다 케피르(Candida kefyr), 칸디다 크루세이(Candida krusei), 칸디다 루시탄니에(Candida lusitaniae), 칸디다 릭소소필라(Candida lyxosophila), 칸디다 말토사(Candida maltosa), 칸디다 멤브라니파시엔스(Candida membranifaciens), 칸디다 밀레리(Candida milleri), 칸디다 오레오필라(Candida oleophila), 칸디다 오레고네시스(Candida oregonensis), 칸디다 파랍실로시스(Candida parapsilosis), 칸디다 쿠렐시트루사(Candida quercitrusa), 칸디다 셰하태(Candida shehatea), 칸디다 텀노치리(Candida temnochilae), 칸디다 테누이스(Candida tenuis), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 칸디다 츄치에(Candida tsuchiyae), 칸디다 시노라보란티움(Candida sinolaborantium), 칸디다 소재(Candida sojae), 칸디다 피스와나티이(Candida viswanathii), 칸디다 유틸리스(Candida utilis), 우가타에 미누타(Oogataea minuta), 피치아 멤브라내파시엔스(Pichia membranaefaciens), 피치아 실베스트리스(Pichia silvestris), 피치아 멤브라내파시엔스(Pichia membranaefaciens), 피치아 초다티(Pichia chodati), 피치아 멤브라내파시안스(Pichia membranaefaciens), 피치아 멤브라네파시엔스(Pichia menbranaefaciens), 피치아 미누스쿨레(Pichia minuscule), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 피치아 수도폴리몰파(Pichia pseudopolymorpha), 피치아 퀘쿰(Pichia quercuum), 피치아 로벨트시(Pichia robertsii), 피치아 사이토이(Pichia saitoi), 피치아 실베스트리시(Pichia silvestrisi), 피치아 스트라스벌젠시스(Pichia strasburgensis), 피치아 테리콜라(Pichia terricola), 피치아 바리지(Pichia vanriji), 수도지마 안탈티카(Pseudozyma Antarctica), 로도스포리디움 토루로이데스(Rhodosporidium toruloides), 로도도룰라 글루티니스(Rhodotorula glutinis), 사카로미세스 바랴누스(Saccharomyces bayanus), 사카로미세스 바야누스(Saccharomyces bayanus), 사카로미세스 몸드슈리쿠스(Saccharomyces momdshuricus), 사카로미세스 우바룸(Saccharomyces uvarum), 사카로미세스 바야누스(Saccharomyces bayanus), 사카로미세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 사카로미세스 비스포루스(Saccharomyces bisporus), 사카로미세스 셰바리에리(Saccharomyces chevalieri), 사카로미세스 엘브루에키(Saccharomyces delbrueckii), 사카로미세스 엑시구오우스(Saccharomyces exiguous), 사카로미세스 페르멘타티(Saccharomyces fermentati), 사카로미세스 프라기리스(Saccharomyces fragilis), 사카로미세스 말시아누스(Saccharomyces marxianus), 사카로미세스 멜리스(Saccharomyces mellis), 사카로미세스 로세이(Saccharomyces rosei), 사카로미세스 로욱시(Saccharomyces rouxii), 사카로미세스 우바룸(Saccharomyces uvarum), 사카로미세스 윌리아누스(Saccharomyces willianus), 사카로미코데스 루드위기(Saccharomycodes ludwigii), 사카로미코프시스 캡슐라리스(Saccharomycopsis capsularis), 사카로미코프시스 피부리게라(Saccharomycopsis fibuligera), 사카로미코프시스 피부리게라(Saccharomycopsis fibuligera), 엔도미세스 호르데이(Endomyces hordei), 엔도미코프시스 포부리게라(Endomycopsis fobuligera), 사투르니스포라 사이토이(Saturnispora saitoi), 쉬조사카로미세스 옥토스포루스(Schizosaccharomyces octosporus), 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 쉬완니오미세스 옥시덴타리스(Schwanniomyces occidentalis), 토루라스포라 델브루에키(Torulaspora delbrueckii), 토루라스포라 델부루에키(Torulaspora delbrueckii), 사카로미세스 다이렌시스(Saccharomyces dairensis), 토루라스포라 델브루에키(Torulaspora delbrueckii), 토루라스포라 펄멘타티(Torulaspora fermentati), 사카로미세스 페르멘타티(Saccharomyces fermentati), 토루라스포라 델브루에키(Torulaspora delbrueckii), 토루라스포라 로세이(Torulaspora rosei), 사카로미세스 로세이(Saccharomyces rosei), 토루라스포라 델브루에키(Torulaspora delbrueckii), 사카로미세스 로세이(Saccharomyces rosei), 토루라스포라 델브루에키(Torulaspora delbrueckii), 사카로미세스 델브루에키(Saccharomyces delbrueckii), 토루라스포라 델브루에키(Torulaspora delbrueckii), 사카로미세스 델브루에키(Saccharomyces delbrueckii), 지고사카로미세스 몽골리쿠스(Zygosaccharomyces mongolicus), 도루라스포라 글로보사(Dorulaspora globosa), 데바리오미세스 글로보수스(Debaryomyces globosus), 토루로프시스 글로보사(Torulopsis globosa), 트리초스포론 쿠타네움(Trichosporon cutaneum), 티리고노프시스 바리아비리스(Trigonopsis variabilis), 윌리오스포시스 캘리포니카(Williopsis californica), 윌리오프시스 사투르누스(Williopsis saturnus), 지고사카로미세스 비스포루스(Zygosaccharomyces bisporus), 지고사카로미세스 비스포루스(Zygosaccharomyces bisporus), 데바리오미세스 디스포루아(Debaryomyces disporua). 사카로미세스 비스포라스(Saccharomyces bisporas), 지고사카로미세스 비스포루스(Zygosaccharomyces bisporus), 사카로미세스 비스포루스(Saccharomyces bisporus), 지고사카로미세스 멜리스(Zygosaccharomyces mellis), 지고사카로미세스 프리오리아누스(Zygosaccharomyces priorianus), 지고사카로미세스 로욱심(Zygosaccharomyces rouxiim), 지고사카로미세스 로욱시(Zygosaccharomyces rouxii), 키고사카로미세스 바르케리(Zygosaccharomyces barkeri), 사카로미세스 로욱시(Saccharomyces rouxii), 지고사카로미세스 로욱시(Zygosaccharomyces rouxii), 지고사카로미세스 마조르(Zygosaccharomyces major), 사카로미세스 로우시(Saccharomyces rousii), 피치아 아노말라(Pichia anomala), 피치아 보비스(Pichia bovis), 피치아 카나덴시스(Pichia Canadensis), 피치아 카르소니(Pichia carsonii), 피치아 파리노세(Pichia farinose), 피치아 페르멘탄스(Pichia fermentans), 피치아 플룩숨(Pichia fluxuum), 피치아 멤브라네파시엔스(Pichia membranaefaciens), 피치아 수도폴리몰파(Pichia pseudopolymorpha), 피치아 퀘르쿰(Pichia quercuum), 피치아 로벨트시(Pichia robertsii), 수도지마 안탈티카(Pseudozyma Antarctica), 로도스포리디움 토루로이데스(Rhodosporidium toruloides), 로도스포리디움 토루로이데스(Rhodosporidium toruloides), 로도토루라 글루티니스(Rhodotorula glutinis), 사카로미세스 바야누스(Saccharomyces bayanus), 사카로미세스 바야누스(Saccharomyces bayanus), 사카로미세스 비스포루스(Saccharomyces bisporus), 사카로미세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로미세스 셰바리에리(Saccharomyces chevalieri), 사카로미세스 델브루에키(Saccharomyces delbrueckii), 사카로미세스 펄멘타티(Saccharomyces fermentati), 사카로미세스 프라기리스(Saccharomyces fragilis), 사카로미코데스 루드위기(Saccharomycodes ludwigii), 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 쉬와니오미세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis), 토루라스포라 델브루에키(Torulaspora delbrueckii), 토루라스포라 글로보사(Torulaspora globosa), 트리고놉시스 바리아빌리스(Trigonopsis variabilis), 윌리옵시스 칼리포니카(Williopsis californica), 윌리옵시스 사투르누스(Williopsis saturnus), 자고사카로미세스 비스포루스(Zygosaccharomyces bisporus), 자고사카로미세스 멜리스(Zygosaccharomyces mellis) 또는 자고사카로미세스 로욱시(Zygosaccharomyces rouxii)를 포함한다. filamentous fungi는 다양한 아스퍼길루스(Aspergillus)의 다양한 종들로 예를 들어, 제한되지 않지만, 아스퍼길루스 캐시엘루스(Aspergillus caesiellus), 아스퍼길루스 칸디두스(Aspergillus candidus), 아스파길루스 카르네우스(Aspergillus carneus), 아스퍼길루스 클라바투스(Aspergillus clavatus), 아스퍼길루스 데프렉투스(Aspergillus deflectus), 아스퍼길루스 플라부스(Aspergillus flavus), 아스퍼길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스퍼길루스 글라우쿠스(Aspergillus glaucus), 아스퍼길루스 니두란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼길루스 니거(Aspergillus niger), 아스퍼길루스 오크라세우스(Aspergillus ochraceus), 아스퍼길루스 오리재(Aspergillus oryzae), 아스퍼길루스 파라시티쿠스(Aspergillus parasiticus), 아스퍼길루스 페니실리오데스(Aspergillus penicilloides), 아스퍼길루스 레스트릭투스(Aspergillus restrictus), 아스퍼길루스 소재(Aspergillus sojae), 아스퍼길루스 시도위(Aspergillus sydowi), 아스퍼길루스 타마리(Aspergillus tamari), 아스퍼길루스 테레우스(Aspergillus terreus), 아스퍼길루스 우스투스(Aspergillus ustus) 또는 아스퍼길루스 베르시콜로(Aspergillus versicolor)를 포함한다. 상기 세포들은, 상술된 유전공학 단계에 앞서서, 상업적 경로 및 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection, Rockville, MD)과 같은 연구기관으로부터 얻어질 수 있다. 타겟 분자들은 전술한 타겟 단백질들 중의 하나를 포함할 수 있다.
세포의 유전공학은, 만노시다제를 인코딩하는 외인성의 핵산(exogenous nucleic acid) 이외에, (i)외부 채인 연장(Outer CHain elongation; OCH1) 단백질을 인코딩하는 외인성의 유전자를 삭제하는 단계; (ii) 만노실 인산화(mannosyl phosphorylation)(예를 들어, 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 에스 세레비시애(S. cerevisiae), 오가타에 미누타(Ogataea minuta), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 또는 씨 말비칸스(C. albicans)로부터의 MNN4 폴리펩티드, 또는 피 사스토리스(P. pastoris)로부터의 PNO1 폴리펩티드)를 증가시켜서 만노스 잔류물의 인산화를 증가시킬 수 있는 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 핵산을 도입하는 단계; (iii) OCH1 단백질의 기능적인 발현(functional expression)과 간섭하는 RNA 분자를 도입하거나 발현하는 단계; (iv) N-글리코실화 활동(N-glycosylation activity)(예를 들어, N-글리코실화 활동을 갖는 단백질을 발현하는)을 갖는 와일드-타입(예를 들어, 내인성의 또는 외인성의) 단백질을 인코딩하는 재조합 핵산을 도입하는 단계, (v) 전술한 타겟 분자를 인코딩하는 재조합 핵산을 도입하는 단계; 또는 (v) N-글리코실화 활동(N-glycosylation activity)을 갖는 단백질을 인코딩하여 상기 인코딩된 단백질의 발현을 변환하는 하나 또는 그 이상의 내인선의 유전자의 프로모터(promoter) 또는 개선제(enhancer)를 변환하는 단계와 같은 하나 또는 그 이상의 유전적 변형(genetic modification)을 포함할 수 있다. RNA 분자는, 예를 들어, 스몰-인터피어링 RNA (small-interfering RNS; siRNA), 숏 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA), 안티-센스 RNA(anti-sense RNA), 또는 마이크로 RNA(miRNA)를 포함한다. 유전공학은 N-글리코실화 활동(N-glycosylation activity)을 갖는 단백질을 인코딩해서 추가(예를 들어, 이종의 시퀀스), 삭제, 또는 치환(예를 들어, 포인트 돌연변이; 컨서버티브(conservative) 또는 논-컨서버티브(non-conservative) 돌연변이와 같은 돌연변이)을 포함하는 단백질을 생산하여 단백질 내인성의 유전자를 변환하는 단계를 포함한다. 돌연변이는 특별히(예를 들어, 사이트-디렉티드 돌연변이유발(site-directed mutagenesis) 또는 상동의 재조합(homologous recombination)) 도입되거나 또는 무작위적으로(예를 들어, Newman and Ferro-Novick (1987) J. Cell Biol. 105(4):1587에 나와있는 방식에 따라 세포들이 화학적으로 돌연변이화될 수 있다) 도입될 수 있다.
상술된 유전적 변이는 하나 또는 그 이상의 (i) 유전적으로 변이된 세포 내에서 하나 또는 그 이상의 활동의 증가, (ii) 유전적으로 변이된 세포 내에서 하나 또는 그 이상의 활동의 감소, 또는 (iii) 유전적으로 변이된 세포 내에서 하나 또는 그 이상의 활동의 로컬리제이션(localization) 또는 세포 내 분배(intracellular distribution)의 변화를 야기할 수 있다. 특정한 활동(예를 들어, 만노실 인산화의 촉진)의 양이 증가하는 것은 만노실 인산화를 촉진할 수 있는 하나 또는 그 이상의 단백질이 과발현되거나(overexpress), 세포내적인 유전자의 복재숫자의 증가(예를 들어, 유전자 복재), 또는 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 발현의 증가를 촉진하는 세포내적인 유전자의 프로모터 또는 개선제의 변환에 기인할 수 있다. 하나 또는 그 이상의 특정한 활동의 감소는 돌연변이 형태(mutant form)(예를 들어, 우세한 네거티브 형태(dominant negative form))의 과발현(overexpression), 특정한 활동을 갖는 하나 또는 그 이상의 단백질의 발현을 감소시키는 하나 또는 그 이상의 간섭하는 RNA 분자의 도입 또는 발현, 또는 특정한 활동을 갖는 단백질을 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 세포내적인 유전자의 삭제에 기인할 수 있다.
상동의 재조합(homologous recombination)에 의해 유전자를 파괴하기 위하여, "유전자 치환(gene replacement)" 벡터가 선택적 마커 유전자(selectable market gene)를 포함하는 방법으로 구성될(constructed) 수 있다. 상기 선택적 마커 유전자는, 5' 및 3' 단말 양쪽에, 상동의 재조합(homologous recombination)을 매개하기에(mediate) 충분한 길이의 유전자 단백질에 사용가능하게 링크될 수 있다. 상기 선택적 마커(selectable marker)는 호스트 셀의 영양요구(host cell auxotrophy)를 보완하거나 항생물질내성(antibiotic resistance)을 제공하는, URA3, LEU2 및 HIS3 유전자들을 포함하는, 어느 유전자들 중의 하나가 될 수 있다. 다른 선택적 마커(selectable marker)로는 CAT 유전자 또는 lacZ 유전자를 포함한다. CAT 유전자는 이스트 세포의 클로람페니콜(chloramphenicol) 저항성을 부여한다. lacZ 유전자는 b-갈락토시다제(b-galactosidase)의 발현으로 인한 청색 콜로니(blue colonies)를 발현한다. 유전자 치환 벡터(gene replacement vector)의 선형 DNA 조각은 후술될 널리 알려진 방법을 이용하여 세포내로 도입된다. 게놈(genome) 내로 선형조각들을 조합(integration)하는 것과 유전자를 파괴하는 것은 선택 마커(selection marker)에 의해 결정되며, 예를 들어, 서던 블롯(Southern blot) 분석방법에 의해 검증될 수 있다. 선택적 마커는 호스트 셀(host cell)의 게놈으로부터 후술될 Cre-loxP 시스템 등에 의해 제거될 수 있다.
다른 실시예로서, 유전자 치환 벡터는 내인성의 유전자 프로모터 시퀀스를 결여하여 유전자 인코딩되지 않거나 비활성화되어 파괴될 유전자의 일부를 포함하도록 구성될 수 있다. "비활성조각(inactive fragment)"은 예를 들어, 유전자의 전체길이 코딩 시퀀스에 의해 생성된 단백질의 활성도에 비해 10%이하(예를 들어, 9%이하, 8%이하, 7%이하, 6%이하, 5%이하, 4%이하, 3%이하, 2%이하, 1%이하 또는 0%)인 단백질을 인코딩하는 유전자의 조각이다. 상기 유전자의 단백질은 알려진 프로모터 시퀀스가 상기 유전자 시퀀스에 동작가능하게 연결되지 않도록 벡터에 삽입되지만, 스톱 코돈(stop codon) 및 전사 종료 시퀀스(transcription termination sequence)가 상기 유전자 시퀀스의 부분에 동작가능하도록 연결된다. 상기 벡터는 후속하여 상기 유전자 시퀀스의 부분에 선형적으로 연결되어(linealized) 세포 내로 변형될(transformed) 수 있다. 단일한 상동의 재조합(single homologous recombination)을 이용하여, 상기 선형 벡터(linealized vector)는 유전자의 내인성의 상대쪽(counterpart)에 조합된다(integrated).
발현 벡터(expression vector)는 자발적(autonomous)이거나 조합적일 수 있다. 재조합 핵산(예를 들어, 하나의 인코딩 만노시다제)은 세포 내에 플라스미드(plasmid), 페이그(phage), 트렌스포손(transposon), 코스미드(cosmid) 또는 바이러스 입자(virus particle) 등과 같은 발현 벡트(expression vector)의 형태로 도입될 수 있다. 상기 재조합 핵산은 염색체외에서(extrachromosomally) 유지되고나 이스트 세포 염색체 DNA(yeast cell chromosomal DNA) 내로 조합될 수 있다. 발현 벡터는 선택된 조건들에서 세포 생존력(viability)에 필요한 효소를 인코딩하여 원하는 핵산(예를 들어, 미국등록특허 제4,704,362호)으로 변형되는 상기 세포들을 감지 및/또는 선택하는 선택적 마커 유전자(selection marker genes)를 포함할 수 있다. 상기 선택적 조건들은, 예를 들어, 우라실 생합성(urasil biosynthesis)에 필요한 효소를 인코딩하는 URA3, 또는 트립토판 생합성(tryptophan biosynthesis)에 필요한 효소를 인코딩하는 TRP1을 포함한다. 발현 벡터들은 자발적인 복제 시퀀스(autonomous replication sequence; ARS)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 미국등록특허 제4,837,148호는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 내에서 플라스미드(plasmid)를 유지하기에 적합한 수단을 제공하는 자발적인 복제 시퀀스를 개시한다.
조합 벡터들(integrative vectors)은 예를 들어, 미국등록특허 제 4,882,279에 개시되어 있다. 조합 벡트들은 일반적으로 제1 삽입가능한 DNA 조각(insertable DNA fragment), 선택가능한 마커 유전자(selectable marker gene), 및 제2 삽입가능한 DNA 조각으로 구성되는 직렬로 배열된 시퀀스를 포함한다. 상기 제1 및 제2 삽입가능한 DNA 조각들 각각은 길이방향으로 200개의 뉴클레오티드(nucleotide)이며 변환될 상기 종들(species)의 게놈 DNA(genomic DNA)의 부분들과 상동인(homologous) 뉴클레오티드 시퀀스를 포함한다. 발현을 위하여 관심있는 유전자를 포함하는 뉴클레오티드 시퀀스는 상기 벡터에서 상기 머커 유전자(marker gene)의 전 또는 후에서 상기 제1 및 제2 삽입가능한 DNA 조각 사이에 삽입된다. 상기 관심있는 유전자는, 예를 들어, N-글리코실레이션 활동(N-glycosylation activity)을 갖는 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함한다. 조합 펙터들은 이스트 변환(yeast transformation) 전에 선형화되어(linearized) 상기 관심있는 뉴클레오티드 시퀀스가 상기 호스트 세포 게놈 내로 조합되도록 촉진한다.
발현벡터는 이스트 프로모터(yeast promoter)의 제어에 의해 재조합 핵산을 형상화(feature)할 수 있다. 상기 이스트는, 예를 들어, 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica), 알술라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans), 피 파스토리스(P. pastoris) 또는 그 밖의 적합한 진균을 포함할 수 있다. 상기 이스트 푸로모터는 상기 재조합 핵산이 진균 세포 내에서 발현되도록 한다. 상기 이스트 프로모터는, 예를 들어, ADC1, TPI1, ADH2, hp4d, POX 및 Gal10 (예를 들어, Guarente et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79(23):7410에 개시되어 있다) 프로모터들을 포함한다. 추가적인 프로모터의 예로, Zhu and Zhang (1999) Bioinformatics 15(7-8):608-611 및 미국등록특허 제6,265,185호에 개시된 프로모터들을 포함한다.
프로모터는 구성적이거나(constitutive) 유도적(inducible)(또는 조건적(conditional))일 수 있다. 구성적 프로모터는 표준 배양 조건(standard culturing condition)에서 균일하게 발현되는 프로모터를 의미한다. 유도적 프로모터는 하나 또는 그 이상의 유도신호(induction cue)에 반응하는 프로모터를 의미한다. 예를 들어, 유도 프로모터는 화학적으로 규정된 프로모터(chemically regulated promoter) 또는 물리적으로 규정된 프로모터(physically regulated promoter)일 수 있다. 상기 화학적으로 규정된 프로모터는, 예를 들어, 전사활동(transcriptional activity)이 알코올, 테트라사이실린(tetracycline), 스테로이드(steroid), 금속 또는 다른 작은 분자와 같은 화학적 유도 인자(chemical inducing agent)의 존재 또는 부존재에 의해 규정되는 프로모터를 의미한다. 물리적으로 규정된 프로모터는 전사활동이 빛 또는 높은 온도 또는 낮은 온도와 같은 물리적 유도 인자(physical inducer)에 의하여 규정되는 프로모터를 의미한다. 유도 프로모터는 화학적 또는 물리적 신호에 의해 직접 규정되는 하나 또는 그 이상의 전사 요소들(transcription factors)에 의해 간접적으로 규정될 수 있다.
다른 유전공학 변이들(modifications)은 조건적(conditional)일 수 있다. 예를 들어, 유전자는 특정 지점을 위해 설계된(site-specific) DNA 재조합효소(recombinase)를 이용하여 조건적으로 삭제(conditionally deleted)될 수 있다. 상기 특정 지점을 위해 설계된 DNA 재조합효소는, 예를 들어, Cre-loxP 시스템(예를 들어, Gossen et al. (202) Ann. Rev. Genetics 36:153-173 및 미국공개특허 제20060014264호에 개시된다)을 포함할 수 있다.
재조합 핵산은 스페로플라스트 기술(spheroplast technique) 또는 전체-세포 염화리듐 이스트 변환 방법(whole-cell lithium chloride yeast transformation method) 등과 같은 다양한 방법들을 통하여 전술한 세포 내에 도입될 수 있다. 플라스미드의 변환 또는 선형 핵산 벡터를 세포 내로 도입하는 다른 방법들로는, 예를 들어, 미국등록특허 제4,929,555호; Hinnen et al. (1978) Proc. Nat. Acad. Sci. USA75:1929; Itoetal. (1983) J. Bacteriol. 153:163; 미국등록특허 제 4,879,231호; 및 Sreekrishna et al. (1987) Gene 59:115를 포함한다. 상기 개시된 방법들은 그 전체로서 본 발명의 실시예를 구성한다. 전기천공법(electroporation) 및 PEG1000 전체셀 변형 방법(PEG1000 whole cell transformation procedure)도 Cregg 및 Russel, Mehtods in Molecular Biology: Pichia Protocols, 제3장, Humana 출판사, Totowa, N.J., 페이지 27-39 (1998)에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다.
변환된 진균 세포들은 적합한 기술을 이용하여 선택될 수 있다. 상기 진균 세포들의 선택에 이용되는 적합한 기술들은, 예를 들어, 필요한 생화학적인 성분이 결여된 상태(세포의 영양요구로 인하여)에서 영양요구 세포(culturing auxotrophic cells)를 배양하는 방법, 새로운 발현형(phenotype)을 선택하고 감지하는 방법, 또는 이스트에 유독성인 항생물질이 있으나 변환체(transformant) 내에는 그에 저항하는 유전자가 결여된 상태에서 배양하는 방법 등을 포함한다. 변환체는 발현 카세트(expression cassette)의 조합(integration)을 게놈 내로 삽입함으로써 선택 및/또는 검증될 수 있다. 상기 발현 카세트는, 예를 들어, 서던 블롯(Southern blot) 또는 PCR 분석을 통해 평가될 수 있다.
상기 벡터를 관심있는 타겟 세포 내로 도입하기 전에, 상기 벡터들은 박테리아 세포 내에서 배양(예를 들어, 증폭)될 수 있다. 상기 배양을 위한 박테리아 세포는, 예를 들어, 전술한 대장균(Escherichia coli; E. coli)을 포함한다. 상기 벡터 DNA는 박테리아 환경(bacterial milieu)으로부터 벡터 DNA를 정제(purification)하는 종래에 알려진 다양한 방법을 통하여 박테리아 세포로부터 격리될 수 있다. 상기 정제된 벡터 DNA는 페놀, 클로로폼 등을 이용하여 집중적으로 추출되어 플라스미드 DNA 조합(plasmid DNA preparation) 내에서 어떠한 대장균(E. coli)도 남아있지 않도록 할 수 있다. 이러한 정제를 하는 이유는 상기 대장균의 단백질이 포유류 세포(mammalian cell)에 유독할 수 있기 때문이다.
다른 실시예에서, 유전공학된 진균 세포는 OCH1 유전자 또는 그 유전 산물(예를 들어, mRNA 또는 단백질)이 결여되고, OCH1 활동이 부족하다. 다른 실시예에서, 유전공학 세포는 만노실 인산화(mannosyl phosphorylation)를 향상시킬 수 있는 폴리펩티드를 발현할 수 있다. 상기 만노실 인산화는, 예를 들어, 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica), 에스 세레비시애(S.cerevisiae), 오가타에 미누타(Ogataea minuta), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 또는 씨 알비칸스(C. albicans)와 같은 MNN4 폴리펩티드, 또는 피 파스토리스(P.pastoris)와 같은 PNO1 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, 상기 진균 세포는 와이 리포리티카(Y. lipolytica)로부터 MNN4 폴리펩티드를 발현할 수 있다(Genbank® Accession Nos: XM_503217, Genolevures Ref: YALI0D24101g). 일 실시예에서, 상기 유전공학된 세포는 OCH1 활동이 결여되고 만노실 인산화를 촉진하는 폴리펩티드를 발현한다.
후술하는 캡핑제거(unping) 및 탈만노실레이션(demannosylation)에서, 타rpt 분자는 격리될 수 있다. 일 실시예에서, 상기 타겟 분자는 상기 이스트 세포(yeast cell) 내에서 보유되고 세포용해(cell lysis)에 의해 배출된다. 일 실시예에서, 타겟 분자는 코딩 시퀀스(coding sequence)에 의한 메커니즘에 따라서 상기 배지(culture medium) 내로 분비된다. 상기 타겟 분자를 위한 코딩 시퀀스는 세포외 핵산에 기원하거나 발현 벡터 내에서 유전공학될 수 있다. 상기 코딩 시퀀스는 상기 분자가 상기 세포로부터 분비되는 것을 지시한다. 상기 캡핑제거되고(uncapped) 탈만노실레이트된(demannosylated) 타겟 분자의 세포 용해물 또는 배지 내에서의 존재는 분자의 존재를 검사하는 다양한 표준화된 프로토콜을 이용하여 검증될 수 있다. 예를 들어, 변환된 타겟 분자가 단백질인 경우, 상기 프로토콜은 상기 변환된 타겟 단백질(또는 타겟 단백질 자체)에 대한 특이 항체를 이용한 이뮤노블로팅(immunoblotting) 또는 방사성면역침전(radioimmunoprecipitation) 방법, 상기 변환된 타겟 단백질(또는 타겟 단백질 자체)에 대한 특이 리간드(ligand specific) 바인딩(binding) 방법, 또는 상기 변환된 타겟 단백질(또는 타겟 단백질 자체)에 대한 특이 효소 반응을 테스트하는 방법을 통하여 검사될 수 있다.
일 실시예에서, 격리단계에 이어서, 상기 캡핑제거되고 탈만노실레이트된 타겟 분자는 예를 들어 효소적인 또는 화학적인 수단을 이용하는 이종의 반족(heterologous moiety)에 의해 공격받을 수 있다. "이종의 반족(heterologous moiety)"이라 함은 변환된 타겟 분자에 결합되는 임의의 구성, 예를 들어, 공유결합(covalently)이거나 비공유결합(non-covalently)인,을 의미한다. 이종의 반족의 구성은 상기 변환된 타겟 분자의 본래 구성과 다르다. 이종의 반족은, 예를 들어, 고분자(polymer), 캐리어(carrier), 보조제(adjuvant), 항체(immunotoxin) 또는 (형광, 발광, 또는 방사성과 같은) 검출가능한 반족을 포함한다. 일 실시예에서, 추가적인 N-글리칸(N-glycan)은 상기 변환된 타겟 분자에 추가될 수 있다.
타겟 분자의 글리코실화(glycosylation)를 검출하는 방법은 DNA 서열검출기반(DNA sequencerassisted; DSA) 방법, 형광투시기반 탄수화물 전기이동 (FACE) 방법, 또는 서피스 인헨스드 레이저 디솝션/이오니제이션 타임-오브-플라이트 매스 스팩트로매트리(surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry; SELDI-TOF MS) 방법 등을 포함한다. 예를 들어, DSA-FACE를 이용한 분석방법에서는, 예를 들어, 당단백질(glycoprotein)이 멤브레인(membrane) 등에 의해 고정된 후에 변질된(denatured)다. 이후, 상기 당단백질은 디디오트레이톨(dithiothreitol; DTT) 또는 9-멀캡토에타놀(9-mercaptoethanol)과 같은 적절한 환원제를 이용하여 환원된다. 상기 단백질의 설히드릴(sulfhydryl) 그룹은 이오도아세트산(iodoacetic acid)과 같은 산을 이용하여 카복실화될(carboxylated) 수 있다. 이후에, 상기 N-글리칸(N-glycan)은 N-글리코시다제 F(N-glycosidase F) 등과 같은 효소를 이용하여 단백질로부터 배출될 수 있다. N-글리칸은, 선택적으로, 환원 아미노화(reductive amination)를 통하여 재조합되고(reconstituted) 유도될(derivatized) 수 있다. 상기 유도된 N-글리칸은 농축될 수 있다. 산업화에 적합한 N-글리칸 분석은, 예를 들면, 어플라이드 바이오시스템사(Applied Biosystems)의 ABI PRISM® 377 DNA 시퀀서에 의해 수행될 수 있다. 데이터 분석은, 예를 들면, 어플라이드 바이오시스템사의 GENESCAN® 3.1 소프트웨어에 의해 수행될 수 있다. 분리된 만노프로틴은 이후 송아지 내장의 포스파타제(calf intestine phosphatase)와 같은 하나 또는 그 이상의 효소들에 의해 처리되어 N-글리칸 상태가 될 수 있다. N-글리칸 분석을 위한 추가적인 방법들은, 예를 들어, MALDI-TOF-MS와 같은 매스 스팩트로메트리(mass spectrometry), 정상 페이스에서(normal phase) 및 역전된 페이스에서(reversed phase) 고압 액체 크로마토그래피(high-pressure liquid chromatography; HPLC), 및 이온교환 크로마토 그래피(ion exchange chromatography)(예를 들어, 글리칸이 표지되지 않은 경우(not labeled)에는 펄스 엠퍼로메트릭 검사(pulsed amperometric detection)에 의하고, 글리칸이 적절하게 표지된(labeled) 경우에는 UV 흡수 분석(UV absorbance)에 의한다)를 포함한다. 또한, Callewert et al. (2001) Glycobiology 11(4):275-281 및 Freire et al. (2006) Bioconjug. Chem. 17(2):559-564를 참조한다.
유전공학된 세포의 배양(Cultures of Engineered Cells)
본 발명의 실시예들에서 서술된 유전공학된 어느 세포에 대한 실질적으로 순수한 배양방법이 개시된다. 이하, 유전공학된 세포의 "실질적으로 순수한 배양(substantially pure culture)"은 상기 세포의 배양을 나타내며, 상기 배양내의 생존하는 세포들의 전체 숫자의 40%이하(즉, 35%이하; 30%이하; 25%이하; 20%이하; 15%이하; 10%이하; 5%이하; 2%이하; 1%이하; 0.5%이하; 0.25%이하; 0.1%이하; 0.01%이하; 0.001%이하; 0.0001%이하; 또는 이보다 적은 것을 의미한다)가 유전공학된 세포, 예를 들어, 박테리아의(bacterial), 진균의(fungal)(이스트를 포함한다), 미코플라스말(mycoplasmal), 또는 프로토조안(protozoan) 세포,인 것을 의미한다. "약(about)"이라고 함은 특정된 퍼센트에서 15%가 높거나 15% 낮은 범위를 의미한다. 따라서, 예를 들어, 약 20%라고 함은 17% 내지 23%를 의미한다. 유전공학된 세포의 배양은 상기 세포들의 성장, 저장, 또는 이동하는 매질을 포함한다. 매질은 액체, 반고체(semi-solid)(예를 들어, 젤라틴 매질), 또는 고체 매질일 수 있다. 상기 배양은 액체 또는 반고체 매질의 내부/표면에서 세포들이 자라는 것 또는 고체 저장 매질이나 이동 매질(transport medium)을 포함하는 저장이나 이동 매질 내에서 세포들이 저장되거나 이동되는 것을 포함한다. 상기 배양은 배양 용기(culture vessel) 내부 또는 저장용기(storage vessel) 내부 또는 기판(예를 들어, 배양 디스크, 플라스크, 또는 튜브 또는 저장 바이알(storage vial)이나 튜브를 포함한다) 내에서 수행된다.
상기 유전공학된 세포들은 냉동 세포 서스펜션(frozen cell suspension)으로 저장될 수 있다. 상기 냉동 세포 서스펜션은, 예를 들어, 글리세롤(glycerol) 또는 수크로스(sucrose)와 같은 동해방지제(cryoprotectant)를 포함하는 버퍼 내에서, 동결건조된 세포로 저장할 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 유전공학된 세포들은, 예를 들어, 액화 베드 건조(fluidized bed drying) 또는 스프레이 건조(spray drying)에 의해 얻어진 건조된 세포 방식으로, 또는 다른 적절한 건조방식으로 저장될 수 있다.
신진대사 장애(Metabolic Disorder)
캡핑제거되고(uncapped) 탈만노실된(demannosylated) 분자들은 다양한 신진대사 장에의 처치에 사용될 수 있다. 신진대사 장애는 개별적인 인간(또는 동물)의 세포 내에서 에너지를 생성하는데 영향을 미친다. 대부분의 신진대사 장애는 유전적이며, 일부는 다이어트, 독(toxin), 감염 등에 의해 "생득(acquired)"될 수 있다. 유전적인 신진대사 장애는 선천적인 신진대사의 오류로 알려져 있다. 일반적으로, 상기 유전적인 신진대사 장애는 세포 내에서 신진대사 프로세서의 어느 단계에서 필요한 효소들의 결핍 또는 부적절한 구성을 야기하는 유전적 결함에 기인한다. 신진대사 장애의 가장 큰 분류는 탄수화물 대사 장애, 아미노산 대사장애, 유기산(유기 산뇨) 대사장애, 지방산 산화(fatty acid oxidation) 및 미토콘드리아 대사장애, 포르피린(porphyrin) 대사장애, 푸린 또는 피리미딘 대사장애, 스테로이드 대사장애, 미토콘드리아 기능 장애, 페록시소말(peroxisomal) 기능 장애, 및 리소소말(lysosomal) 저장 장애(LSDs)를 포함한다.
하나 또는 그 이상의 캡핑제거되고(uncapped) 탈만노실된(demannosylated) 분자들(또는 이들의 제약조성물(pharmaceutical composition))의 투여로 치료될 수 있는 신진대사장애들은 유전성 혁색소 침착증(hereditary hemochromatosis), 오큐로쿠다네스 백색증(oculocutaneous albinism), 단백질 C 결핍증(protein C deficiency), 타입 I 유전적 혈관 부종(type I hereditary angioedema), 선천성 수크라세-이소말타제 결핍증(congenital sucrase-isomaltase deficiency), 크리글러-나자르 타입II(Crigler-Najjar type II), 라론 신드롬(Laron syndrome), 유전적인 미에로퍼록시다제(hereditary Myeloperoxidase), 주요 갑상선기능저하증(primary hypothyroidism), 선천성 긴 QT 증후군(congenital long QT syndrome), 티록신 결합 글로불린 결핍증(tyroxine binding globulin deficiency), 가족력의 고 콜레스테롤혈증(familial hypercholesterolemia), 가족력의 키로마이크론혈증(familial chylomicronemia), 아베타-리포프로테이네마(abeta-lipoproteinema), 낮은 혈장 단백증(low plasma lipoprotein Alevels), 간손상과 유전적인 폐기종(hereditary emphysema with liver injury), 선천성 갑상선 기능저하증(congenital hypothyroidism), 골형성 부전증(osteogenesis imperfecta), 유전적인 히포피브리노게네혈증(hereditary hypofibrinogenemia), 알파-1안티키모트립신 결핍증(alpha-1antichymotrypsin deficiency), 신원성 요붕증(nephrogenic diabetes insipidus), 뉴로히포시실 요붕증(neurohypophyseal diabetes insipidus), 아데노신 탈아미노효소 결핍증(adenosine deaminase deficiency), 페리캐우스 메크바처 질환(Pelizaeus Merzbacher disease), 폰 빌레 브란트 질환 타입 IIA(von Willebrand disease type IIA), 인자 V와 VIII의 결핍증(combined factors V and VIII deficiency), 스폰디로-골단 이형성 지체증(spondylo-epiphyseal dysplasia tarda), 맥락막결여증(choroideremia), I 세포 질환(I cell disease), 바텐 질환(Batten disease), 아텍시아 테란지타시아스(ataxia telangiectasias), 염색체 우성 다낭성 신장 질환(autosomal dominant polycystic kidney disease; ADPKD), 마이크로 바이러스 포함 질환(microvillus inclusion disease), 결절성 경화증(tuberous sclerosis), 로웨의 오쿨로세레브로-신장 증후군(oculocerebro-renal syndrome of Lowe), 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis), 골수 이형성 증후군(myelodysplastic syndrome), 바레 림프구 증후군(Bare lymphocyte syndrome), 탄기어 질환(Tangier disease), 가족성 간내 담즙증(familialintrahepatic cholestasis), X-링크 아데노-루코디스트로피(X-linked adreno-leukodystrophy), 스콧 증후군(Scott syndrome), 허만스키-푸드락 증후군 타입 1 및 2(Hermansky-Pudlak syndrome types 1 and 2), 젤위거 증후군(Zellweger syndrome), 리코멜릭 콘드로디스플라시아 눈물증(rhizomelic chondrodysplasia puncta), 상 염색체 열성 주요 수산과잉뇨증(autosomal recessive primary hyperoxaluria), 모어 트라넵저르그 증후군(Mohr Tranebjaerg syndrome), 시피널 및 불라 근 위축증(spinal and bullar muscular atrophy), 주요 실리너리 디스케네시아(primary ciliary diskenesia) (카타게너 증후군, Kartagener's syndrome), 거대증 및 단말 비대증(giantism and acromegaly), 유즙분비증(galactorrhea), 애디슨 병(Addison's disease), 부신성 남성화증(adrenal virilism), 쿠싱 증후군(Cushing's syndrome), 케톤산증(ketoacidosis), 주요 또는 보조적인 알도스테론증(primary or secondary aldosteronism), 밀러 디커 증후군(Miller Dieker syndrome), 뇌회결손증(lissencephaly), 모터 신경 질환(motor neuron disease), 어셔 증후군(Usher's syndrome), 위스콧-알드리치 증후군(Wiskott-Aldrich syndrome), 옵티즈 증후군(Optiz syndrome), 헌팅턴 질환(Huntington's disease), 유전성 췌장염(hereditary pancreatitis), 반-인지질 증후군(anti-phospholipid syndrome), 중첩 연결 조직 질환(overlap connective tissue disease), 쇼그렌 증후군(Sjㆆgren's syndrome), 뻣뻣한 사람 증후군(stiff-man syndrome), 브루가다 증후군(Brugada syndrome), 핀란드 타입의 선천성 신장 증후군(congenital nephritic syndrome of the Finnish type), 두빈-존슨 증후군(Dubin-Johnson syndrome), X-링크 히포포스포스파테혈증(X-linked hypophosphosphatemia), 펜드레드 증후군(Pendred syndrome), 유아기의 지속적인 인슐린 저혈당증(persistent hyperinsulinemic hypoglycemia of infancy), 유전적인 구형 적혈구증(hereditary spherocytosis), 아케루로플라스미네혈증(aceruloplasminemia), 유아 신경 세로이드 리포푸신증(infantile neuronal ceroid lipofuscinosis), 소인증 및 다중 골단증(pseudoachondroplasia and multiple epiphyseal), 스탈가르트-유사 황반 영양 장애증(Stargardt-like macular dystrophy), X-링크 샤콧-마리-투스 질환(X-linked Charcot-Marie-Tooth disease), 상염색체 우성 색소성 망막염(autosomal dominant retinitis pigmentosa), 볼콧-랄리손 증후군(Wolcott-Rallison syndrome), 쿠싱 질환(Cushing's disease), 사지 띠 근육 위축증(limb-girdle muscular dystrophy), 무코프로이-사카리도시스 타입 IV(mucoploy-saccharidosis type IV), 유전적인 가족성 아밀로이드증(hereditary familial amyloidosis of Finish), 앤더슨 질병(Anderson disease), 육종(sarcoma), 만성적인 골수성 백혈병(chronic myelomonocytic leukemia), 심근병(cardiomyopathy), 안면생식기 이형성증(faciogenital dysplasia), 토시온 질병(Torsion disease), 헌팅턴 및 척수 소뇌 운동 실조증(Huntington and spinocerebellar ataxias), 유전적인 히퍼호모시테이네혈증(hereditary hyperhomosyteinemia), 다발성 신경장애(polyneuropathy), 낮은 모터 뉴론 질병(lower motor neuron disease), 색소성 망막염(pigmented retinitis), 혈청 음성 다발성 관절염(seronegative polyarthritis), 간질성 폐 섬유종(interstitial pulmonary fibrosis), 레이나드 증상(Raynaud's phenomenon), 웨그너의 육아종증(Wegner's granulomatosis), 프레오테이누리아(preoteinuria), CDG-Ia, CDG-Ib, CDG-Ic, CDG-Id, CDG-Ie, CDG-If, CDG-IIa, CDG-IIb, CDG-IIc,CDG-IId, 엘러스-단로스 증후군(Ehlers-Danlos syndrome), 다발성 외골증(multiple exostoses), 그리셀리 증후군(타입 1 또는 타입 2)(Griscelli syndrome (type 1 or type 2)), 또는 X-링크된 비특이적 정신 지페(X-linked non-specific mental retardation)를 포함한다. 또한, 신진대사 장애들은 파즈리 질환(Fabry disease), 점액성 다당류증(mucopolysaccharidosis) I, 파버 질환(Farber disease), 고셔 질환(Gaucher disease), GM1-갱글리오사이드 축적증(GM1-gangliosidosis), 테이 삭스 병(Tay-Sachs disease), 생드호프(Sandhoff) 질환, GM2 활성 질환(GM2 activator disease), 크라베 질환(Krabbe disease), 변색성 백질이영양증(metachromatic leukodystrophy), 니만-픽 질환(Niemann-Pick disease) (타입 A, B 및 C), 셰이에(Scheie) 질환, 헌터(Hunter) 질환, 샌필리포(Sanfilippo) 질환, 몰퀴오(Morquio) 질환, 마로 - 라미(Maroteaux-Lamy) 질환, 히알루 결핍(hyaluronidase deficiency), 아사프르틸글루코사민뇨증(aspartylglucosaminuria), 푸쿠시드축적증(fucosidosis), 만노시도시스(mannosidosis), 쉰들러(Schindler) 질환, 사이알리도시스(sialidosis) 타입 1, 폼페(Pompe) 질환, 피크노디소스토시스(Pycnodysostosis), 세로이드 리포푸신증(ceroid lipofuscinosis), 콜레스테롤 에스테르 저장 질병, 월맨(Wolman) 질환, 다중 설퍼타아제(sulfatase) 결핍증, 갈락토시알리도시스(galactosialidosis), 뮤코리피도증(mucolipidosis) (타입 II, III 및 IV), 시스틴 증(cystinosis), 시알 산(sialic acid) 저장 장애, 마리네스코-쇼그렌(Marinesco-Sjㆆgren) 증후군과 함께 나타나는 카일로 마이크론 보존(chylomicron retention) 질환, 허만스키-푸드락(Hermansky - Pudlak) 증후군, 셰디악-히가시(Chediak-Higashi) 증후군, 도만(Danon) 질병, 또는 겔레오시직(Geleophysic) 이형성증과 같은 리소좀 저장 장애를 포함한다.
신진대사 장애 증상들은 그 수가 많으며 다양하다. 상기 신진대사 장애 증상들은 하나 또는 그 이상의 빈혈, 피로, 쉽게 멍드는 증상, 낮은 혈소판, 간 비대, 비장 비대, 골격 약화, 폐 손상, 감염 (예를 들면, 가슴 감염이나 폐렴), 신장 장애, 진행성인 뇌 손상, 발작, 과도한 태변(extra thick meconium), 기침, 천명(sheezing), 과도한 타액이나 점액 생산, 호흡 곤란, 복통, 폐색 창자 또는 내장, 불임 문제, 코의 폴립, 손가락 / 발가락 손톱과 피부의 클럽(clubbing), 손이나 발의 통증, 각화 혈관종(angiokeratoma), 발한 감소, 각막 렌즈의 혼탁, 백내장, 승모판 탈출증 및 / 또는 역류, 심장 비대, 온도 과민증(temperature intolerance), 보행 장애, 연하 장애, 진행성의 시력 상실, 진행성의 청력 감소, 근력 저하, 대설증(macroglossia), 반사 소실, 요통(lower back pain), 수면 무호흡증, 좌위호흡(orthopnea), 졸음, 척추 전만 또는 척추 측만증을 포함한다. 상기 증상들은 단백질의 부족이나 결함의 다양한 기원을 가지며 다양한 질병 발현형(disease phenotype)(예를 들어, 신진대사 장애의 나열된 증상들)을 나타낸다. 상기 장애들은 특정한 장애에 대한 특정 증상들만을 나열하였다. 예를 들어 파브리(Fabry)병 환자는 전술한 증상들의 조합을 나타낼 수도 있지만, 이에 제한되지 않고, 온도 과민 반응, 각막 회전(corneal whirling), 통증, 피부발진, 메스꺼움, 또는 설사 등을 나타낼 수 있다. 가우처(Gaucher) 증후군의 환자는 전술한 증상들의 조합을 나타낼 수도 있지만, 이에 제한되지 않고, 비장비대증, 간경변, 경련(convulsion), 긴장항진증(hypertonia), 무호흡증(apnea), 골다공증 또는 피부변색 등을 나타낼 수 있다.
하나 또는 그 이상의 전술한 캡핑제거되고(uncapped) 탈만노실된(demannosylated) 분자들의 투약에 추가하여, 신진대사 장애는 적절한 영양 및 비타민(예를 들어, 공통인자 치료법(cofactor therapy), 물리치료법, 및 통증치료법 등도 함께 처치될 수 있다.
신진대사 장애의 특성에 따라, 환자는 나이에 따라 상기 증상들을 겪을 수 있다. 다양한 경우에, 증상들은 아동기 또는 성인기 초기에 나타난다. 예를 들어, 파브리(Fabry) 질환의 증상들은 10세 또는 11세의 어린 나이에 나타난다.
상술되는, "신진대사 장애의 진행의 위험에서(at risk of developing a metabolic disorder)"라는 주제는 장애가 진행하는 경향이 있다. 즉, 신진대사 장애는 효소의 돌연변이의 결과로 인하여 신진대사 장애가 진행한다. 상기 돌연변이되는 효소는, 예를 들어, 산 알파 글루코시다제(acid alpha glucosidase), 알파 갈락토시다제(alpha galactosidase), 알파-L-이두로니다제(alpha-L-iduronidase), 베타-D-갈락토시다제(beta-D-galactosidase), 베타-글루코시다제(beta-glucosidase), 베타-헥소사미니다제(beta-hexosaminidase), 베타-D-만노시다제(beta-D-mannosidase), 알파-L-푸코시다제(alpha-L-fucosidase), 아릴설파타제 B(arylsulfatase B), 아릴설파타제 A(arylsulfatase A), 알파-N-악틸갈락토사미니다제(alpha-N-acteylgalactosaminidase), 아스파틸글루코사미니다제(aspartylglucosaminidase), 이두로나테-2-설파타제(iduronate-2-sulfatase), 알파-글루코사미니데-N-마세틸트란스페라제(alpha-glucosaminide-N-acetyltransferase), 베타-D-글루코로니다제(beta-D-glucoronidase), 할루로니다제(hyaluronidase), 알파-L-만노시다제(alpha-L-mannosidase), 알파-뉴로미니다제(alpha-neurominidase), 포스포트란스페라제(phosphotransferase), 산 리파제(acid lipase), 산 세라미다제(acid ceramidase), 시피노그메리나제(sphinogmyelinase), 티오에스테라제(thioesterase), 카텝신 K(cathepsin K), 또는 리포프로틴 리파제(lipoprotein lipase)를 포함한다. 명확하게는, "신진대사 장애의 진행의 위험에서(at risk of developing a metabolic disorder)"라는 주제는 관심있는 종류의 모든 주제들을 포괄하는 것은 아니다.
"장애를 가질 것으로 의심되는(suspected of having a disorder)"이라는 주제가 상술되는 신진대사 이상의 하나 또는 그 이상의 증상들에 대응된다.
제약 조성물 및 투약 방법(Pharmaceutical Compositions and Methods of Treatment)
캡핑제거되고(uncapped) 탈만노실된(demannosylated) 타겟 분자는 상기 분자 및 하나 또는 그 이상의 보조제(adjuvant), 첨가제(excipient), 캐리어(carrier) 및/또는 희석제(diluent)의 치료상 효과적인 양을 포함하는 제약 조성물로 구성될 수 있다. 수용가능한 희석제, 캐리어 및 첨가제는 통상 환자의 향상성(homeostasis)(예를 들어, 전해질 균형(electrolyte balance))에 영향을 주는 부작용이 없다. 수용가능한 캐리어는 생체에 적합하고(biocompatible), 불활성 또는 생체흡수성 염, 완충 에이전트(buffering agent), 올리고- 또는 다당류, 폴리머, 점도-향상 에이전트, 방부제 등을 포함한다. 상기 캐리어의 예로 생리적 염(physiologic saline)(0.15M NaCl, pH 7.0 to 7.4)이 있다. 캐리어의 다른 예로 50mM의 인산 나트륨, 100mM의 염화나트륨이 있다. 제약 조성물의 구조식 및 누여의 기술은, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, Pa.)에 상술된다. 추가적인 활성 화합물(supplementary active compound)이 상기 조성물에 구성될 수 있다.
캡핑제거되고(uncapped) 탈만노실된(demannosylated) 분자들을 포함하는 제약 조성물의 투약은 인체 전체에 영향을 주거나(systemic) 일부에만 영향을 줄 수 있다. 제약조성물은 비경구용(parenteral) 및/또는 경구용(non-parenteral) 투약에 적합하도록 제조될 수 있다. 특정 투약의 방식으로는 피하(subcutaneous), 정맥 주사(intravenous), 근육 내(intramuscular), 복강(intraperitoneal), 경피(transdermal), 척수강 내(intrathecal), 구강(oral), 직장(rectal), 볼으로(buccal), 국부로(topical), 코(nasal), 눈(ophthalmic), 내 관절(intra-articular), 동맥내(intra-arterial), 지주막하의(sub-arachnoid), 기관지의(bronchial), 림프의(lymphatic), 질의(vaginal) 및 자궁내의(intra-uterine) 투약이 가능하다.
투약은 제약 조성물의 볼루스(bolus)의 주기적인 주사에 의하거나, 외부 또는 내부 저장소로부터 방해받지 않거나 지속적인 정맥투약 또는 복강투약의 방법에 의할 수 있다. 상기 외부 저장소의 예로는 IV 백(IV bag)이 있으며, 상기 내부 저장소의 예로는 바이오에로더블 임플란트(bioerodable implant), 생체공학 기관(bioartificial organ) 또는 임플란트되고 변환된 N-클리코실화 분자 생산 세포의 콜로니(colony of implanted altered N-glycosylation molecule production cells)을 포함한다. 미국등록특허 제4,407,957호, 제5,798,113호 및 제5,800,828호를 참조한다. 제약 조성물의 투약은 적절한 운송수단을 통해 수행될 수 있다. 상기 운송수단의 예로는 펌프, 마이크로엔캡슐레이션(microencapsulation); 지속적으로 배출하는 폴리머 임플란트(continuous release polymer implant); 마크로앤캡슐레이션(macroencapsulation); 피하, 정맥, 동맥내, 근육내 또는 기타 적절한 위치에의 주사; 또는 캡슐, 액체, 정제, 알약 또는 장기간 방출용 제제를 통한 구강투여의 방법을 포함한다. 상기 펌프는, 예를 들어, Annals of Pharmacthoerapy, 27:912 (1993); Cancer, 41:1270 (1993); Cancer Research, 44:1698 (1984)에 개시된 방법이 있다. 상기 마이크로엔캡슐레이션은, 예를 들어, 미국등록특허 제 4,532,883호, 제4,353,888호 및 제5,084,350호에 개시된 방법이 있다. 상기 지속적으로 배출하는 폴리머 임플란트는, 예를 들어, Sabel의 미국등록특허 제4,883,666호에 개시된 방법이 있다. 상기 마크로엔캡슐레이션은, 예를 들어, 미국등록특허 제5,284,761호, 제5,158,881호, 제4,976,859호 및 제4,968,733호 및 국제공개특허 제WO92/19195호, 제WO95/05452호에 개시된 방법이 있다.
비경구 전달 시스템의 예는 에틸렌 - 비닐 아세테이트 공중 합체 입자, 삼투 펌프, 이식 주입 시스템(implantable infusion system), 펌프 전달(pump delivery), 캡슐화 된 세포 전달, 리포좀 전달, 바늘을 이용한 전달용 주사, 바늘 없는 주사, 분무기, 에어로졸(aerosolizer), 전기천공법(electroporation) 및 경피 패치(transdermal patch)를 포함한다.
편리한 비경구 투약 시스템의 방식은 변환된 N-글리코실화 분자의 살균된 수용성 제제(sterile aqueous preparation of the altered N-glycosylation molecule)를 포함한다. 바람직하게는 환자의 혈액과 등장성(isotonic)인 것(예를 들어 생리 식염수)이 바람직하다. 상기 방식은 단위-투약(unit-dose)의 형태 또는 복수-투약(multi-dose)의 형태를 가질 수 있다.
경구 투약의 방식으로는 캡슐, 카세트(cachet), 정제 또는 당의정(lozenge) 같은 개별 유닛(discrete unit)이 될 수 있다. 상기 각 개별 유닛은 N-글리코실화 분자(N-glycosylation molecule)가 소정의 양만큼 있는 형태이거나; 또는 시럽, 엘릭서(elixir), 에멀전(emulsion)이나 드라우트(draught)과 같은 수용성 액체 상태의 서스펜션(suspension) 또는 비수용성 액체 형태 일 수 있다.
국부적인(topical) 투약을 위한 캡핑제거되고(uncapped) 탈만노실된(demannosylated) 분자들은 포유류(예를 들어, 인간 환자)에 투약될 수 있다. 상기 투약의 방법은, 예를 들어, 크림, 스프레이, 거품, 겔(gel), 연고(ointment), 연고(salve) 또는 건조 마찰 방식(dry rub)을 포함한다. 상기 건조 마찰 방식(dry rub)은 투약장소에서 다시 물을 가할 수 있다(rehydrated). 상기 분자들은 붕대, 거즈, 또는 패치로 직접 혼합되어(예를 들어, 적시거나 건조시킨다) 국부적으로 적용될 수 있다. 상기 분자들은 국부적인 투약을 위하여 붕대, 거즈 또는 패치 내에서 반액체(semi-liquid), 겔(gelled), 또는 완전액체(fully-liquid) 상태로 유지될 수 있다(예를 들어, 미국등록특허 제4,307,717호 참조).
제약 조성물의 치료적으로 유효한 양은 당업자가 판단할 수 있는 적절한 필요량에 따라 투약될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 대상의 체중에 따라 0.01μg/kg에서 10,000μg/kg의 양으로 대상에 투약될 수 있다. 다른 실시예에서, 조성물은 대상의 체중에 따라 1μg/kg에서 100μg/kg의 양으로 대상에 투약될 수 있다. 다른 실시예에서, 조성물은 대상의 체중에 따라 1μg/kg에서 30μg/kg의 양으로, 또는 3μg/kg에서 10μg/kg의 양으로 대상에 투약될 수 있다.
치료적 효과를 최적화하기 위하여, 캡핑제거되고(uncapped) 탈만노실된(demannosylated) 분자들은 다른 처방량(dosing regimen)으로 1차 투약될 수 있다. 단위 투약량(unit dose) 및 처방량(regimen)은 포유류의 종, 면역상태, 포유류의 체중 등 다양한 요인들에 의해 결정된다. 일반적으로, 조직 내 분자의 레벨은 치료적인 테스트 과정의 일부로서 적적한 스크린 분석(screening assay)을 통해 모니터될 수 있다. 상기 치료적인 테스트 과정은, 예를 들어, 소정의 처방량(regimen)의 효율을 결정한다.
캡핑제거되고(uncapped) 탈만노실된(demannosylated) 분자들의 투약 주기는 의학적인 전문가(예를 들어, 의사나 간호사)의 의학적 판단 및 전문기술에 의해 결정된다. 일반적으로, 투약 판단(admistration regime)은 치료적인 시행착오(clinical trial)를 통해 최적화된 투약 파라메터(optimal administration parameter)를 구축한다. 그러나, 상기 전문가는 대상의 나이, 건강상태, 체중, 성멸 및 의학적 상태에 따라 투약 판단을 변경할 수 있다. 투약의 주기는 예방학적(prophylactic) 또는 치료적(therapeutic)인 처리에 따라 변경될 수 있다.
상기 분자들 또는 그 제약 조성물의 독성(toxicity) 및 치료 효율(therapeutic efficacy)은 알려진 제약의 과정을 통해 결정될 수 있다. 상기 알려진 제약의 과정은, 예를 들어, 세포배양이나 실험동물이 있다. 상기 제약의 과정은, 예를 들어, LD50 (군집내(population)에서 치사량의 50% 투여방법) 및 ED50(군집의 50% 내에서 치료적으로 효과가 있는 투약량) 방식을 포함한다. 독성(toxic) 및 치료효과(therapeutic effect)의 투약비가 치료용 색인(therapeutic index)이 되며, 의 LD50/ED50의 비율로 표시된다. 높은 치료효과를 나타내는 제약 조성물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 제약 조성물이 사용되는 경우, 정상적인 세포(예를 들어, 타겟이 아닌 세포)의 잠재적인 손상을 최소화하기 위하여 영향을 받는 조직의 사이트로 상기 조성물이 전달될 수 있도록 전달 시스템(delivery system)을 고안해야한다. 이는 상기 제약 조성물의 부작용을 줄이기 위함이다.
상기 세포 배양 분석 및 동물실험을 통해 얻어진 데이터는 적절한 대상(예를 들어, 인간 환자)에 사용될 수 있는 투약량의 범위를 결정할 수 있다. 상기 제약 조성물의 투약량은 일반적으로 독성이 적거나 거의 없는 ED50을 포함하는 순환농도(circulating concentration)의 범위 내에 위치한다. 상기 투약량은 상기 범위 내에서 투약이 사용되는 투약형태 및 투약경로에 따라 변경될 수 있다. 상술한 제약 조성물에서(예를 들어, 대상의 신진대사 장애에 사용되는 제약 조성물) 치료적 효과가 있는 투약량은 최초에 세포 배양 실험을 통해 결정될 수 있다. 투약량은 동물 모델에 의해 결정되어 세포 배양에 있어서 IC50을 포함하는 순환 플라즈마 농도 영역(circulating plasma concentration range)을 만족하도록 결정될 수 있다. IC50는 최대 증상의 절반을 억제할 수 있는 제약조성물의 농도를 의미한다. 상기 정보는 인간에 사용가능한 투약량을 보다 정확하게 결정하는데 이용될 수 있다. 플라스마의 레벨은, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography)에 의해 측정될 수 있다.
이하, 캡핑제거되고(uncapped) 탈만노실된(demannosylated) 분자의 "치료적으로 효과적인 양(therapeutically effective amount)"이라 함은 처치 주제(treated subject)에서 의학적으로 기대하는 결과를 생성하는데 필요한 분자의 양을 의미한다. 상기 의학적으로 기대하는 결과라 함은, 예를 들어, 신진대사 장애에서 하나 또는 그 이상의 증상의 개선을 의미한다. 치료적으로 효과적인 양(즉, 효과적인 투약량)은 대상 또는 샘플의 체중의 각 킬로그람에 대하여 밀리그람 또는 마이크로그람의 양을 갖는 분자들을 포함한다. 예를 들어, 킬로그람 당 1 마이크로그람이거나, 킬로그람 당 100마이크로그람에서 킬로그람 당 5 밀리그람이거나, 킬로그람 당 1 마이크로그람에서 킬로그람 당 50 마이크로그람인 것을 나타낼 수 있다.
상기 대상은 어떠한 종류의 포유류일 수 있다. 예를 들어, 인간(예를 들어, 인간 환자) 또는 인간은 아닌 영장류(예를 들어, 침팬지, 개코원숭이, 또는 원숭이), 생쥐, 쥐, 토끼, 기니피그, 저빌(gerbil), 햄스터, 말, 가축류(예를 들어, 소, 돼지, 양, 또는 염소), 개, 고양이, 또는 고래가 될 수 있다.
상술된 분자 또는 그 제약 조성물은 다른 치료법과의 결합치료법으로 처방될 수 있다. 상기 다른 치료법으로는, 예를 들어, 리소솜 저장 장애(lysosomal storage disorder)와 같은 신진대사 장애의 치료법일 수 있다. 예를 들어, 상기 결합 치료법은 하나 또는 그 이상의 추가적인 인자(agent)를 대상(예를 들어, 인간 환자)에 투약하는 방법을 포함할 수 있다. 상기 추가적인 인자는 신진대사 장애(예를 들어, 리소좀 저장 장애)가 진행성(또는 의심되는)의 위험이 있는 대상에 치료적인 이익을 제공한다. 따라서, 상기 조성물 또는 제약 조성물 및 상기 하나 또는 그 이상의 추가적인 인자는 동시에 투약될 수 있다. 다른 실시예로서, 상기 분자는 1차로 투약되고 상기 하나 또는 그 이상의 추가적인 인자는 2차로 투약될 수 있고, 반대순서로 투약될 수도 있다.
이는 이전 치료법에 특별한 독성(예를 들어, 심각한 부작용 이력이 있는 신진대사 장애 치료법)이 있는 경우에 적합하다. 상술된 투약은 상기 이전 치료법의 양을 상쇄(offset)시키거나 및/또는 감소(lessen)시켜서 독성은 없으면서도 동등하거나 개선된 치료적 이익을 얻도록 하는데 사용될 수 있다.
상술된 제약 조성물들 중의 하나는 투약을 위한 기구와 함께 용기, 팩, 또는 디스펜서(dispenser) 내에 포함될 수도 있다.
후술되는 실시예는 본 발명의 실제 실험예들이다. 후술될 실험예들은 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니다.
실시예 1
인간 알파 글루코시다아제(human alpha glucosidase) 발현 균주(expression strain)의 생성
Y.리폴리티카(Y. lipolytica) 균주 OXYY1589는 다음과 같이 구성되었으며 3개의 인간 알파 글루코시다아제 복제 유전자들 (huGAA, 잘 알려진 산 알파-글루코시다아제(acid alpha glucosidase) 또는 산 말타아제 EC3.2.1.3 (acid maltase EC3.2.1.3)) 및 2개의 Y.리폴리티카 MNN4 복제 유전자들을 포함한다.
상기 균주 OXY1589의 유전자형은 다음과 같다:
MatA, leu2-958, ura3-302, xpr2-322,
gut2-744, ade2-844
POX2-Lip2pre-huGAA:URA3Ex::zeta(제타)
POX2-Lip2pre-huGAA:LEU2Ex::zeta(제타)
POX2-Lip2pre-hGM-CSF:GUTEx::zeta(제타)
YlMNN4-POX2-hp4d-YLMNN4::PT 표지된(targeted)
모든 변형(transformation)들은 다른 선택적인 마커(marker)들에 대한 수정 사항들을 잘 설립된 프로토콜에 따라 수행되었다. 별도의 규정이 없는 한, 상기 huGAA 통합 조각(integration fragment)은 카나마이신(kanamycin) 저항 유전자를 제거하기 위하여 발현 플라스미드(plasmid)의 NotI 제한 소화(restriction digestion)에 의해 얻었다. 제한 효소(restriction digest)로 인한 상기 조각들은 상기 huGAA 조각의 Qiagen 컬럼(column) 정제(purification)에 의해 나타내어진 아로로오스 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis)에 의해 분리되었다. 3개의 안정된 통합 변형들은 최종 huGAA 생산 균주 OXYY1589를 얻기 위하여 수행되었다.
최적화된 huGAA 발현 벡터(vector) Y.리폴리티카 코돈(codon): 110 kDA huGAA 전구체(precursor)를 인코딩(encoding) 하는 누클레오타이드 서열(nucleotide sequence)은 화학적으로 합성되어지고 코돈은 Y.리폴리티카 발현을 위하여 최적화 되었다. 표 1은 Y.리폴리티카의 코돈 사용량을 보여준다. 데이터는 5,967 코딩 서열에 존재하는 2,945,919 코돈으로부터 얻었다. 표 1의 내용은 코돈 사용량 데이터베이스(Codon Usage Database)로부터 얻었으며, 이것은 인터넷 kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=284591에서 찾아볼 수 있다.
UUU 15.9( 46804) | CU 21.8( 64161) | AU 6.8( 20043) | GU 6.1( 17849) |
UUC 23.0( 67672) | CC 20.6( 60695) | AC 23.1( 68146) | GC 6.1( 17903) |
UUA 1.8( 5280) | CA 7.8( 22845) | AA 0.8( 2494) | GA 0.4( 1148) |
UUG 10.4( 30576) | CG 15.4( 45255) | AG 0.8( 2325) | GG 12.1( 35555) |
CUU 13.2( 38890) | CU 17.4( 51329) | AU 9.6( 28191) | GU 6.0( 17622) |
CUC 22.6( 66461) | CC 23.3( 68633) | AC 14.4( 42490) | GC 4.4( 12915) |
CUA 5.3( 15548) | CA 6.9( 20234) | AA 9.8( 28769) | GA 21.7( 63881) |
CUG 33.5( 98823) | CG 6.8( 20042) | AG 32.1( 94609) | GG 7.7( 22606) |
AUU 22.4( 66134) | CU 16.2( 47842) | AU 8.9( 26184) | GU 6.7( 19861) |
AUC 24.4( 71810) | CC 25.6( 75551) | AC 31.3( 92161) | GC 9.8( 28855) |
AUA 2.2( 6342) | CA 10.5( 30844) | AA 12.4( 36672) | GA 8.4( 24674) |
AUG 22.6( 66620) | CG 8.5( 25021) | AG 46.5(136914) | GG 2.4( 7208) |
GUU 15.8( 46530) | CU 25.5( 75193) | AU 21.5( 63259) | GU 16.6( 48902) |
GUC 21.5( 63401) | CC 32.7( 96219) | AC 38.3(112759) | GC 21.8( 64272) |
GUA 4.0( 11840) | CA 11.2( 32999) | AA 18.8( 55382) | GA 20.9( 61597) |
GUG 25.7( 75765) | CG 8.9( 26190) | AG 46.2(136241) | GG 4.4( 12883) |
표의 내용은 [트리플릿(triplet)][주파수: 천 당]([수])을 나타낸다.
합성 구조에서, pre- 및 pro-huGAA 신호 펩티드(signal peptide)들은 아미노산 57(amino acid 57)에서 시작하는 단백질(protein)과 같이 제거된다. huGAA (도 1a)의 합성 개방형 해독 틀(open reading frame,ORF)은 두 Xxx-Ala cleavage 부위들(sites)의 코딩 서열을 따르고, 발현 벡터의 클로닝(cloning)에 대한 BamHI 및 AvrII 제한 부위들의 측면에 위치하고 있는 Y.리폴리티카 LIP2 신호 서열(pre)의 3' 단말에서 5' 단말의 프레임에 융융(fused)되었다. 구조에서, 융융된 폴리펩타이드 (polypeptide) 인코딩 서열은 유도성의(inducible) POX2 프로모터(promoter)의 조절 하에 있었다. 융합 구조의 전 아미노산 서열(complete amino acid sequence)은 도 1b에 도시된다.
Y.리폴리티카 발현 벡터의 일반적인 도식은 도 2에 도시된다. 박테리아의 일부(bacterial moiety)는 플라스미드(plasmid) pHSS6으로부터 얻어지며, 박테리아 복제 분기점(ori) 및 카나마이신(kanamycin) (KanR)에 저항성을 부여하는 카나마이신-저항 유전자 (kanamycin-resistance gene)를 포함한다. 통합 카세트(integration cassette)는 a) 야로이야 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 변형에 대한 선택 마커, b) 프로모터로 구성된 발현 카세트, c) 신호 서열 프레임에 huGAA를 삽입하는 제한 효소 자리 (multiple cloning site)(MCS) 및 d) LIP2 유전자의 종결자(terminator)를 포함한다. 상기 통합 카세트는 Y.리폴리티카 게놈(genome) 내에 안정한 비-상동 통합(non-homologous integration)을 위하여 제타 서열(zeta sequences)로 인해 측면에 위치되어진다. 두 NotI 저항 부위들은 변형 전에 발현 카세트의 분리를 가능하게 한다. 각각 URA3, LEU2 및 GUT2 변형 마커를 포함하는 huGAA 발현 벡터 pRAN058, pRAN059 및 pRAN060을 발생시키기 위하여 플라스미드 pRAN034, pRAN036 및 OXYP183이 사용되었다.
탠덤(Tandem) YlMNN4 발현 벡터 OXYP1470B: Y.리폴리티카 MNN4 (YlMNN4) 유전자는 유도성의 pPOX2 프로모터의 조절 및 (반)구성적인 hp4d 프로모터의 조절 하에 복제되었다. 상기 YlMNN4의 두 발현 카세트 들은 선택 마커(selection marker)로서의 ADE2 유전자 및 게놈(genome) 및 ADE2 유전자의 ADE2 장소(locus) 내에 표지된 통합(targeted integration)을 위한 ADE2 유전자의 측면에 위치하는 영역(region)(PT)들을 운반하는 탠덤 구조체(tandem construct)로서의 하나의 벡터 내에 서브클론(subcloned) 되었다.
중간 (Intermediate) 균주 OXYY1569: 제1 변형은 중간 재조합 균주(intermediate recombinant strain) OXYY1569를 생산하는 URA3 및 LEU2마커들을 사용하는, pRAN058 및 pRAN059 벡터들로부터 정제된 발현 카세트들과 Y.리폴리티카의 균주 G014의 공동 형질전환(co-transformation)이었다. 따라서, OXYY1569는 균주 G014 게놈 내에 무작위로 통합된 pPOX2 프로모터의 조절 하에 huGAA의 두 개의 발현 구조체들을 운반한다.
OXYY1569는 다음과 같이 선택되었다. Y.리폴리티카의 게놈 내의 huGAA DNA 통합은 게놈의 DNA PCR 검사(PCR screening)에 의해 확인되었다. PCR 반응들의 프라이머(Primer)들은 huGAA 누클레오타이드 서열의 2552bp 조각을 증폭(amplify)시키기 위하여 설계(design) 되었다. 게놈의 DNA 서던 블롯 분석(Southern blot analysis)은 또한 적어도 2개의 복제 huGAA DNA들의 통합을 확인하기 위하여 수행되었다. 특히, OXYY1569 클론(clone)들로부터의 게놈의 DNA들은 제한효소 Hind III와 소화되고 특정 프로브(probe)로 분류된 huGAA DIG와 프로브 되었다.
huGAA의 높은 레벨의 분비하는 (secreting) 클론을 선택하기 위하여, 몇몇의 무작위로 선택된 클론들과 적어도 두 개의 복제들의 통합이 확인된 클론들을 1%의 효모 추출물(yeast extract), 2%의 펩톤(peptone) 및 5%의 유화 올레산(emulsified oleic acid) 을 포함하는 매개체(medium)를 사용하는 POX2 유도 조건(inducing condition)하에 진동 플라스크(shake flask)에 키웠다. 모든 경우에서, 배양 상층액(culture supernatant)은 72시간 후-유도(post-induction)로 모이고(pooled) 실시예 3에 설명된 4-MUG 분석법을 사용하는 표준 웨스턴 블롯(Western blot) 분석법 및 효소 활성 분석법(enzyme activity assay)에서 선별되었다. OXYY1569의 주된 구조(predominant structure)를 나타내는 OXYY1569의 N-Glycan 분석법은 Man8GlcNAc2이었다.
■중간 균주 OXYYl584: 재조합 균주 OXYYl569는 OXYY1584를 생산하는 게놈에 Y.리폴리티카 MNN4의 두 개의 복제들의 통합을 위하여 플라스미드 OXYP1479B로부터 잘라진(excise) 발현 카세트와 변형되어진다. 상기 발현 카세트는 플라스미드 OXYP1479B와 SacII/XmaI 제한 소화로부터 잘라진다. 상기 발현 카세트는 Y.리폴리티카 게놈의 AD2 장소 내에 표지된 통합을 위하여 설계된다. 상기 재조합 균주는 인산화(phosphorylation) 증가에 대한 균주 행동을 평가하는 서던 블롯팅 (Southern blotting) 및 글리칸(glycan) 분석 후에 선택된다. 몇몇의 임의로 선택된 형질 전환체 게놈의 DNA는 SpeI와 소화되고 프로브로 분류된 MNN4 특정 DIG와 프로브 된다. Spei 소화 후에 5308BP 및 5683BP 밴드(band)들이 생산된 Y. 리폴리티카 게놈의 ADE2 장소 내에 MNN4 발현 카세트의 표지된 통합이 올바르다. 포지티브 클론(positive clone)들은 표준 진동 플라스크 절차로 키워진다. 중간 클론 OXYY1584를 선택하기 위하여 분비된 단백질들의 N-글리칸 분석이 수행되어진다. 모 균주 (parent stain) OXXY1569에 비하여, MNN4 과-발현(over-expression) 후의 주된 구조들은 Man8GlcNAc2(PMan)1 및 Man8GlcNAc2 (PMan)2 이었다.
생산 균주 OXYYl589: 최종 자가영양(prototrophic) 생산 균주 OXYY1589를 생성하기 위하여, huGAA의 제3 복제는 재조합 OXYY1584 균주 게놈 내에 통합되어진다. 상기 변형은 pRAN069로부터의 발현 카세트가 잘라진 Not I와 함께 수행된다. 상기 형질 전환체들의 게놈의 DNA는 huGAA의 추가적인 복제의 존재에 대한 PCR에 의해 맨 처음으로 검사된다. huGAA의 생산을 평가하기 위하여, 임의로 선택된 PCR 포지티브 클론들은 표준 진동 플라스크 배양 후의 발현에 대해 추가적으로 분석된다. huGAA (OXYY1589)의 가장 높은 레벨을 발현하는 클론은 웨스턴 블롯 분석법 및 효소 활성 분석법(실시예 3에 설명된 4-MUG 분석법) 후에 선택되어진다. 이것은 또한 재확인 된다. M8 내지 MP2-M8 및 MP-M8 N-글리칸의 전환 레벨(conversion level)은 추가적인 huGAA 발현 카세트의 존재에 의해 영향을 받지 않게 되었다.
실시예 2
유가 배양 균주(Fed Batch Cultivation of Strain) OXYY1589
균주 OXYY1589 (실시예 1) 로부터의 huGAA를 생산하기 위하여, 유가 배양 공정은 10 L 교반 탱크, 6-8 리터(liter)의 작동 용량(working volume)을 사용하여 설립된다. 상기 공정은 2개의 단계로 나뉜다:
1) 바이오매스(biomass) 형성을 위한 글루코오스(glucose)에 배치(batch) 성장
2) 제한된 올레산 피드(feed)의 도움의 유도로 인한 생성물 형성
일반적으로 배치 단계는 약 20시간 (h) 및 생산 단계는 약 72시간이다. 공정의 마지막에는, 배양액(culture broth)을 원심 분리하여(centrifuged) 상층액(supernatant)을 수집하였다. 상기 상층액은 huGAA의 정제를 위하여 시작 물질로 사용되었다. (실시예 3 참조)
다음의 매개 변수는 발효(fermentation) 중에 조절되어졌다. 급기(Aeration)는 1.5 vvm 공기 (분(minute) 당 부피 당 부피)의 일정한 값에서 유지되었다. 용존 산소량(Dissolved oxygen) (DO)은 처음에 30%로 유지했다. 교반은 DO 레벨에 따라 600부터 1200rpm으로 증가되었다. 일단 1200rpm의 최대로 도달이 되면, 그 속도는 일정하게 유지되고 DO-설정 값(DO-setpoint)은 10%로 설정된다. 10%의 DO를 유지하기 위하여, 산소는 50%의 최대 비율로 반응기에 첨가 하였다. 거품 변화 (Foam evolution)는 거품 프로브에 의해 조절된다. 만약 거품이 검출되는 경우, 소포제(antifoam)는 바이오반응기(생물 반응기(bioreactor)에 추가된다. pH는 pH 6.8의 값을 유지하기 위하여 14%(v/v)의 암모니아(염기)(v/v) 또는 10%의 인산(phosphoric acid)을 첨가하여 조절된다. 온도는 전체 공정에서 28℃로 유지된다.
바이오매스는 600nm(OD600)에서 광학 밀도(optical density)의 측정에 의해 모니터 된다. 샘플들은 분광 광도계(spectrophotometer)의 선형 값을 얻기 위하여 2-1000배로 증류수(distilled water)에 희석되었다. 생성물의 생성은 웨스턴 블롯 분석법 및 특정 효소 활성도 검사에 의하여 발견된다.
실시예 3
재조합 huGAA(rhGAA)의 정제(Purification)
배양 후 상층액(supernatant)은 (실시예 2 참조) 심층 여과(depth filtration)를 통하여 명확해졌다. 결과적인 물질은 다음 tangential flow filtration (TFF)을 통해 20배로 농축하고 10kDa MWCO 막 (밀리포아) (Millipore)을 사용하여 pH 6의 20 mM 인산 나트륨(sodium phosphate) 및 100 mM의 NaCl에 대해 초여과(diafilter) 되어 진다.
rhGAA의 정제는 최대 1M의 농도의 황산암모늄(ammonium sulphate)의 추가에 의해 시작된다. 원심분리 후에, 상층액은 XK16/40 컬럼이 포장된 Toyopearl-Phenyl 650M (Tosoh Biosciences)에 로드(load)된다. 1 내지 0M의 황산암모늄은 용리법(elution)에 적용 되었다. 이러한 rhGAA를 포함한 분획물(fraction)은 모이고 10 mM BIS-TRIS pH6 내에 버퍼(buffer) 교환(exchange) 대상이 된다. 추가 정제는 0 내지 1M의 NaCl의 선형 염분 기울기(linear salt gradient)를 사용하는 Tricorn 10/50 또는 XK25/20 컬럼 (GE Healthcare)이 포장된 소스(source) 30Q 음이온 교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography)를 통하여 이루어진다. 결과적인 GAA-함유 분획물은 최종 Hiload 16/60 superdex 200 겔(gel) 여과 컬럼 (GE Healthcare)에 로드하기 전에 농축되며 pH 6의 50 mM 황산암모늄 및 200 mM NaCl과 전-평형화(pre-equilibrated)된다. 분획물들은 Coomassie-발현된 SDS-PAGE 겔들의 특정 활성도 및 순도(purity) 기준으로 선택되고 다음 조합되며 최종 농도 5-10 mg/ml로 농축된다. 단백질들은 10 kDa의 MWCO로 15 ml Amicon 울트라 원심분리기(Amicon Ultra centrifugal device) (Millipore)를 사용하여 농축되었다.
4-메틸엄벨리페릴-알파-D-글루코피라노시드(4-methylumbelliferyl-alpha-D-glucopyranoside) (4-MUG) 분석법은 rhGAA를 검사하는데 사용된다. 글루코시다아제(glucosidase)에 의한 4-MUG 기질(substrate)의 분열(Cleavage)은, 불소 형성 생성물 4-MU의 형성을 이끌며, UV 광의 조사(irradiation)에 의하여 가시화 또는 검출될 수 있다. rhGAA에 대한 품질 선별에 대한 반응은 10:1 또는 20:1 부피 비율에 5 또는 10μl의 용리 분획(elution fraction)으로 0.35 mM 4-MUG, 0.1% BSA 및 100 mM pH 4의 아세트산나트륨(sodium acetate)으로 구성된 반응 버퍼의 추가에 의해 시작된다. 모든 반응은 96-도 평면-바닥 미세적정 플레이트(96-well flat-bottom microtiter plate) 내에서 수행하였다. 37℃에서 1시간 30분의 잠복기(incubation period) 후, 반응을 중지하기 위하여 pH 11의 100 mM 글리신(glycine)을 동일한 부피로 추가되고 형광성(fluorogenic) 반응 생성물 4-methylumbelliferone (4MU)의 방출이 UV-광에 의해 관찰되었다. 특정 활성도 (units/mg 단백질)는 합성 기질 p-니트로페닐--D-글루코피라노시드(p-nitrophenyl--D-glucopyranoside) (PNPG)와 표색계 방법 (colorimetric assay)을 사용하며 노란색의 p-니트로페놀레이트(nitrophenolate) 반응 생성물의 효소 방출을 측정한다. 이러한 반응은 미세 적정 플레이트의 반응 우물(well)에 효소 용액 10μl 및 기질 반응 버퍼 90μl (pH 4 150mM 구연산-인산(citrate-phosphate) 버퍼 내 2mM PNPG, 1% BSA)의 혼합에 의해 시작되며 37℃에서 연속적으로 배양 되었다. 1 내지 2시간 동안의 배양 후, 이온화 된 상태의 방출된 p-니트로페놀(PNP)을 가지고 반응을 퀀치(quench)하기 위해 중지 버퍼의 동일한 부피로, pH 12 10% 탄산나트륨(sodium carbonate)이 추가된다. 배경-수정된 흡광도(Background-corrected absorbance) 및 p-니트로페놀레이트 표준은 파장 405 nm에서 측정되며 특정 활성도가 계산된다. 단백질 농도는 bicinchoninic acid (BCA)법에 의해 측정된다. 하나의 단위는 pH 4.0, 구연산-인산 버퍼 내의 2mM의 최종 기질 농도에서 37℃에서 1nmol PNPG 1nmol PNP 및 분(min) 당 D-글루코오스의 변화로 촉매 작용하는 효소의 양으로 정의하였다.
실시예 4
YlAMS1의 클로닝 및 발현
야로이야 리폴리티카 (YlAms1)로부터의 Ams1 유전자는 유전자 특정 프라이머(primer)를 사용하는 야로이야 게놈의 DNA로부터 PCR 증폭(amplified)된다. HIS6-태그(tag) 코딩 서열은 YlAMS1 단백질과 C-단말(terminal) 히스티딘-태그(His-tag)가 생성될 수 있도록 YlAms1 ORF의 3' 단말로 융융되고, 또한 YLAMS1 단백질과 N-단말 히스티딘-태그가 생성될 수 있도록 YlAms1 ORF의 5' 단말로 융융된다. 두 ORF들은 반 구성적인 hp4d 프로모터(도 3a 및 도 3b)의 조절 하에 복제되었으며 발현 카세트는 야로이야 리폴리티카 내에서 변형되었다. 세포(cell)들은 복합 매개체(complex medium) (YPD) 내에서 키워지고 72시간 성장 후 채취(harvest)된다. 초음파(sonication)로 세포들을 방해(disrupt)한 후, AMS1 단백질은 NTA컬럼을 사용하여 정제된다. 정제된 물질은 기질로서 PNP-만노오스(mannose)를 사용하여 활성도에 대해 분석된다. 활동 분획물은 모이고 글리칸 분석에 대하여 보관된다.
실시예 5
APTS-표시된 인산화된 N-글리칸과 GH38 알파-만노시다제를 캡핑 제거한 탈만노실화 및 인산염(De-mannosylation and phosphate uncapping of APTS-labeled phosphorylated N-glycans with GH38 a-mannosidases)
잭 콩 알파-만노시다제(Jack bean a-mannosidase) (Canavalia ensiformis)은 시그마-올드리치(Sigma-Aldrich)로부터 얻어진다. 두 3.0 M 황산암모늄 현탁액(suspension) (Sigma-M7257) 및 단백체(proteomics) 등급(grade) 잭 콩 알파-만노시다제 (Sigma-M5573)는 N-글리칸 분석에 사용된다. 두 배치들은 동일한 결과를 주고 추가적인 발명에 JbMan 이름이 지정된다. YlAms1은 실시예 4에 설명된 내용으로 발현되고 정제된다. JbMan 및 YlAMS1은 혼합물 야로이야 리폴리티카 균주를 과발현하는(overexpressing) MNN4 로부터 얻어진 8-아미노-1,3,6,-피렌트리설폰산(8-amino-1,3,6,-pyrenetrisulfonic acid) (APTS)-표시된 설탕(sufar)들의 혼합물에 시험(test) 되고, 이는 Man8GlcNAc2(M8),모노인산화(monophosphorylated) ManP-Man8GlcNAc2 (MP-M8) 및/또는 디인산화(diphosphorylated) (ManP)2-Man8GlcNAc2 ((MP) 2-M8) 설탕 (MNN4 설탕 또는 MNN4 N-글리칸이라고도 함). 도 4에서, 잠재적인 최종 가수분해 물(hydrolysis product)은 개략적으로 도시되며, 상기 알파-만노시다제는 또한 비-인산화된 (non-phosphorylated) 가지(arm)의 가수분해를 포함하는, a-1,2-만노오스(mannose) 단말의 가수분해를 포함하는, 및/또는 기본적인 만노오스가 인산화 되어있는 경우, 및/또는 만노오스-1-포스포-6-만노오스(mannose-1-phospho-6-mannose) 결합(linkage) 내의 인산염의 캡핑 제거를 포함하는 MNN4 N-글리칸을 완전히 잘라낼 수(trim) 있다고 가정한다.
다른 실시예에서, APTS-표시된 JbMan 및 YlAMS1과 시작된 모든 반응이 언급되지 않는 한, N-글리칸은 2mM 염화칼슘(CaCl2)과 10mM, pH5.0의 초산암모늄(ammonium acetate) 버퍼에서 밤새 37℃에서 수행된다.
도 5에서, DSA-FACE 전기영동도(DSA-FACE electroferograms)는 JbMan과 MNN4 N-글리칸의 가수분해 묘사가 제공된다. 샘플은 피크(peak)가 새로 나타남이 확인 가능하도록 기질로서 Man8GlcNAc2와 포함된다(패널 B)(Panel B). JbMan과 순차적으로 가수 분해된 Man8GlcNAc2 까지 (패널 C) 단지 Man1GlcNAc2는 밤새 배양 후에 얻어진다 (패널 D). Man8GlcNAc2 및 ManP-Man8GlcNAc2를 포함하는 (패널 E) 기질 용액(solution)의 가수분해는 더욱 복잡했다. 활성도를 캡핑 제거한 두 탈만노실화 및 인산염들은 기질이 JbMan과 2시간 동안 배양된 경우 (패널 F) 전기영동도의 왼쪽에 있는 고속-실행 피크(fast-running peak)의 모양(appearance)에 대한 책임이 있다. 탈만노실화와 함께 인산염의 추가 비용(extra charge)은 고속 전기영동도 이동성(movility)을 표시하는 피크의 모양에 대한 책임이 있다. 그럼에도 불구하고, 밤새 배양 후에, 단지 Man1GlcNAc2로서 확인된 피크가 관찰된다 (패널 G). 상업용 JbMan 준비에 존재하는 인산 활성도는 이 결과에 대한 책임이 있다.
JbMan과 MNN4 설탕들의 소화는 ManP-Man8GlcNAc2 및 (ManP)2-Man8GlcNAc2를 포함하는 기질 용액과 반복되어진다 (패널 H). 2시간 동안 배양 후, 잠재적으로 캡핑 제거된(uncapped) 피크가 나타나고 "P-Mx" 및 "P2Mx"와 패널 I에 나타난다. 고속 전기영동도 이동성 영역(region)에서, 최대 해상도(peak resolution)는 작고 모노- 및 디인산화 캡핑 제거된 구조들, 예를 들어, P-Man4GlcNAc2 및 P2-Man6GlcNac2와 함께 실행될 가능성이 있다. 결과는 밤새 소화 후에 추가적인 날만노실화을 시사한다. 패널 J 내 P-My 및 P2-My와 나타난 피크들은 P-Man3GlcNAc2 및 P2-Man5GlcNAc2이 될 수 있으나, 중립적인(neutral) Man1GlcNAc2, Man2GlcNAc2 및 Man3GlcNAc2 도 또한 패널 J 내에서 관찰된다. Man8GlcNAc2가 기질 용액 내에 존재하지 않음으로서, 이러한 피크들은 인산염 활성도 및 추가 만노오스 트리밍을 잠재적 오염하는 결과이다.
패널 J에 캡핑 제거된 피크들을 나타내기 위하여, 반응 혼합물은 카프 인테스틴 포스파타아제 (calf intestine phosphatase) (CIP)와 처리된다. 중립 올리고당(oligosaccharides)으로 인한 캡핑 제거된 글리칸의 처리는 (따라서 인산 단말을 포함하는) 훨씬 더 낮은 속도로 실행하며 전기영동도에서 더 오른쪽으로 나타났다. 실제로, Man6GlcNac2를 통한 Man3GlcNAc2은 패널 K에 나타난다. 비록 활성도가 상업용 JbMan 준비에서 인산 활성의 존재에 의해 방해 되었으나, 공개 자료로 제시된 JbMan과 APTS-표시된 MNN4 설탕들을 처리하는 경우 탈만노실화된 및 인산 캡핑 제거 구조 (즉, P-Man3GlcNAc2 및 P2-Man5GlcNAc2)은 얻어질 수 있다.
활성도를 캡핑 제거 하는 탈만노실화 및 인산염은 YlAMS1과 함께 도 6에서 도시된 것처럼 관찰된다. YlAMS1은 Man1GlcNAc2를 통해 완전히 Man8GlcNAc2를 가수분해 한다(panel C). Man8GlcNAc2 및 ManP-Man8GlcNAc2를 포함하는 (Panel D) 기질 용액과의 YlAMS1의 배양은 고속 전기영동도 이동성의 생성물 아마도 인산 캡핑 제거 글리칸을 얻는다(Panel E). 2시간 배양 동안의 희석된 YIAMS1의 샘플들과 반응이 반복되는 경우 캡핑 제거된 N-글리칸의 계열이 관찰되었다(패널 F). 캡핑 제거된 인산의 존재는 중립-글리칸 계열들을 생산한, CIP와 반응 혼합물의 처리에 의해 확인되었다 (패널 G). 따라서 패널 I의 관찰로, YlAMS1는 (ManP)2-Man8GlcNAc2을 캡핑 제거 할 수 있으나, P2- Man8GlcNAc2 또는 추가 만노오스 트리밍된 글리칸이 형성되는 생성물은 아직은 명확하지 않다.
실시예 6
GH38 알파-만노시다제와 인산화된 N-글리칸들의 높은 수준의 야로이야 리폴리티카 균주에서 발현된 당단백질을 캡핑 제거한 탈만노실화 및 인산염 (De-mannosylation and phosphate uncapping of glycoproteins expressed in a Yarrowia lypolytica strain with a higher degree of phosphorylated N-glycans with GH38 a-mannosidases)
인간의 리소좀(lysosomal) 알파-글루코시다아제 huGAA는 인산화된 N-글리칸 구조의 높은 수준과 당단백질을 얻기 위하여 Y. 리폴리티카 균주 OXYY1589에서 발현된다. 상기 huGAA는 실시예 3에 설명된 대로 정제된다.
잭 콩 알파-만노시다제 (JbMan)는 2 mM 염화칼슘과 pH 5.0 100mM 초산암모늄에서의 huGAA 용액에 추가된다. 상기 반응 혼합물은 밤새 상온에서 배양된다. N-글리칸은 PNGaseF로 방출되고, APTS로 표시되고 후에 DSA-FACE에서 분석되고, 기본적으로 Laroy, 등, Nature Protocols, 1:397-405 (2006)에서 설명되었다. 알파-1,2-만노시다제 처리 전 및 후의 N-글리칸의 프로파일(profile)들은 도 7에 도시된다. 정제된 huGAA로부터 방출된 N-글리칸 혼합물은 주로 ManP-Man8GlcNAc2 및 (ManP) 2-Man8GlcNAc2 으로 구성된다(panel B). 약간 ManP-Man8GlcNAc2 보다 빠른 피크 실행은 ManP-Man7GlcNAc2에 지정된다. Man8GlcNAc2 및 Man7GlcNAc2의 매우 적은 소량의 양이 존재했다. JbMan은 당단백질이기 때문에, 조절 샘플은 잭 콩 특정 N-글리칸의 명확함(correct)을 위하여 패널 C에 존재한다. 패널 D에서, 상기 JbMan과 huGAA가 배양한 후에 얻어진 N-글리칸이 존재한다. ManP-Man8GlcNAc2 및 (ManP)2-Man8GlcNAc2에 해당하는 피크는 더 이상 존재하지 않는다. 대신에, 피크의 수(number)는 Man1GlcNAc2와 함께 전기영동도(잠재적인 인산 캡핑 제거된 N-글리칸)의 왼쪽에 나타났다. 인산 활동으로부터 주로 인한 마지막(latter)은 상업용 JbMan 준비 및 중립 N-글리칸을 얻은 추가 탈만노실화에 존재한다.
실시예 7
CcMan5와 CcMan4의 처리로 인한 재조합 인간 글루코시다아제(glucosidase, huGAA)의 캡핑제거와 탈만노실화
셀룰로시마이크로비움 셀룰란스 만노시다이제 4(Cellulosimicrobium cellulans mannosidase 4,CcMan4) 와 셀룰로시마이크로비움 셀룰란스 만노시다이제 5)Cellulosimicrobium cellulans mannosidase 5,CcMan5)을 인코딩하는 핵산은 pLSAH36 벡터로 복제되고, pLSAH36 벡터는 Dsb A 신호를 포함하여, N-단말(N-terminal)의 HIS꼬리를 가진 단백질의 발현을 나타낸다. 도 8 및 9에서는 각각의 DsbA-CcMan5 및 DsbA-CcMan4의 오픈 리딩 구조 염기서열을 도시하고 있다. 단백질들은 대장균 B21(E.coli B21)세포에서 발현되었고, 주변세포질에 존재하는 단백질들은 분리되어 탈론 컬럼(Talon column)을 이용해 정제되었다. 상기 플라스미드 pLSAHCcMan5와pLSAHCcMan4의 시각적 도시도 그림10에 나타나있다.
일련의 CcMM5의 캡핑제거와 CcMan4의 탈만노신화 실험들은 예시3에서 설명된 바와 같이 정제된 100 μg huGAA의 회분들에 의해 수행되었다. 100mM 만니톨(Mannitol)이 첨가된 3.7 mg/mL, huGAA30 L은 (pH 6.0 의 25mM 포스페이트 완충용액에서의) 3 mM CaCl2 이 첨가된 의 pH 7.0 의 46 μL의 100 mM HEPES 용액에 첨가된다. 일 실시예에서(huGAA_CcMan4라고 칭함), CcMan4 (PBS에서 만들어진 80 g/ml)이 상기 huGAA용액에 첨가될 때, huGAA 와 CcMan4의 질량 비율이 100:1로 사용되었고, 대장균 B21(E.coli B21)이 huGAA용액에 첨가된다. 다른 실시예에서(huGAA_CcMan5 라고 칭함), huGAA 와 CcMan5의 질량 비율이 100:2로 사용될 때, 14 μL CcMan5 (PBS에서 만들어진 154 g/ml)가 상기 huGAA용액에 첨가된다. 결합된 예에서 (huGAA_CcMan4/5 라고 칭함), 14 μL CcMan5 및 14 μL CcMan5 가 30 μL huGAA 와 3 mM CaCl2이 첨가된 pH 7.0 32 μL 100 mMHEPES 완충용액에, 의 용액에 첨가될 때, huGAA, CcMan5, CcMan4의 질량 비율이 100:2:1로 사용되었다. 대조실험에서(huGAA_대조실험), 10 μL 의huGAA가 3mM Cacl2첨가된 pH 7.0의 100mM HEPES 완충용액 20 μL에 희석되었다. 30°C 에서 16시간 동안 모든 샘플을 배양한 후에, 사용될 때까지 4°C 에서 보관되었다.
실시예 6에 설명된 바와 같이 각각의 2 L의 샘플이 N-글라이칸 분석에 사용되었다. huGAA처리된 샘플들의 DSA-FACE 전기영동도는 도 11에 도시되어 있다. CcMan4처리로 ManP-Man8GlcNAc2와(ManP)2-Man8GlcNAc2을 완벽하게 탈만노신 화 함으로써, ManP-Man5GlcNAc2, ManP-Man6GlcNAc2 와 (ManP) 2-Man6GlcNAc2 (도 11, 세 번째 패널)을 형성하였다. 상기 반응 상태 하에서, CcMan5인산 캡핑제거는 완벽하게 ManP-Man8GlcNAc2 N- 글라이칸을 P-Man8GlcNAc2로 형성하였다. 인산기가 두 개인(diphoshpyrlated) N-글라이칸 (ManP)2-Man8GlcNAc2 도 완벽하게 캡핑제거된 P2-Man8GlcNAc2로 가수분해 되었을 뿐만 아니라, 부분적으로 캡핑제거된 (ManP)-Man8-(P)GlcNAc2 (부분적으로 a-1,6 arm 의 인산 캡핑제거된 것과 N-글라이칸의 a-1,3 arm 의 캡핑이 존재하는 것에 해당)의 상당한 피크 높이를 가진 느린 실행 피크가 관찰되었다. (도 11, 4번째 패널). 캡핑제거 되고 탈만노실화된 huGAA는 CcMan5 와 CcMan4을 처리하여 얻어졌고, P2-Man6GlcNAc2, (ManP)-Man6-(P)GlcNAc2, 와 P-Man5GlcNAc2으로 구성되는N-글라이칸을 결과적으로 얻게 되었다. Man5 와 P-Man6GlcNAc2, P-Man7GlcNAc2, ManP-Man7GlcNAc2 (후자의 인산화된 N-글라이칸은 a-1,3-arm에 잠재적으로 인사화된 후자의 N-글라이칸) 에 대응하는 소수피크가 관측되었다(도 11, 5번째 패널). 캡핑제거된 N-글라이칸의 도시도는 도 12b에있다
다른 CcMan5/CcMan4 캡핑제거와 탈만노실화 실험은 같은 정제 회분에서비롯된 huGAA로부터 수행되었다. 상기 실험은 huGAA에 대한 실험 완충용액만 제외하고 상기 언급한 바와 본질적으로 비슷하였는데, 상기 실험 완충용액은 100mM의 만니톨(mannitol)이 포함된 pH 6.0의 2m M포스페이트(phosphate) 완충용액 대신에 2mM 다이클로로 칼슘(Cacl2)이 포함된 PH 7.0의 100mM HEPES 와100mM 만니톨(mannitol)이었다. huGAA: CcMan5: CcMan4의 질량비율은 100:3:5이 사용되었다. 상기 반응은 24 시간 동안 37°C에서 배양 되었다. 상용 가능한 인간의 알파-글루코시다아제(α-glucosidase) 샘플, Myozyme® (알글루코사이다이제 알파, Genzyme사 제조)은 Myozyme: CcMan4의 질량비율을 100:5로 하는 CcMan4가 동일한 실험조건에서 수행되었다.이러한 샘플들의 N-글라이칸 분석은 상기 논의한 바와 같이 수행되었다. 도 11에서 나타난 바와 유사하게정제된 huGGA의 N-글라이칸 프로파일이 형성되고, CcMan5와 CcMan4이 처리되었다. CcMan4가 처리된 Myozyme® DSA-FACE의 전기영동도는 도 13에 도시되었다.
세포의 huGAA처리를 (샘플 10 참조) 살펴보면, CcMan5/CcMan4의 캡핑제거와 탈만노실화 실험은 다른 정제회분으로부터 생성된 huGAA로 수행되었다. 상기 정화는 상기 논의된 정화 조건과 유사하게 수행되고, 2mM 염화칼슘(Cacl2)가 포함된 PH 7.0의 100mM HEPES 와 100mM 만니톨(mannitol)은 huGAA제조 완충용액으로 다시 사용되었다. 캡핑제거와 탈만노실화는 huGAA: CcMan5: CcMan4의 질량비율이 100:3:0.5로 수행되었고, 반응 혼합물은 30 C에서 24시간 동안 배양되었다. 상기 N-글라이칸의 프로파일은 도 14에 도시되었다. 이 실험에서, 인산기를 두 개가진(diphosphorlated) N-글라이칸 P2-Man6GlcNAc2 과 (ManP)-Man6-(P)GlcNAc2 N 은 각각 P-Man6GlcNAc2, (ManP)-Man6GlcNAc2으로 부분적으로 탈인산화되었다. 인산가수분해효소인 포스파타아제(phosphatase) 활동은 1mM의 다이클로로마그네슘(MgCl2)이 포함된 pH 7.5의 100mM HEPES 완충용액 하에서 일반적인 포스파타아제(phosphatase) 기질인 파라나이트로페닐 포스페이트(phosphatase substrate paranitrophenyl-phosphate NPP)을 이용한 huGAA 샘플에서 검출되었다.
실시예 8
잭 콩 알파-
만노시다아제
(
Jack
bean
a-
mannosidase
)을 사용한 재조합
huGAA
의
캡핑제거와
탈만노실화
실시예6의 캡핑제거와 탈만노실화 실험은 JbMan을 암모늄 셀페이트 현탁액(ammonium sulphate suspension)을 Superdex 200칼럼을 이용한 젤 투과에 의해추가적으로 정제된 후에 다시 반복되었는데, 그것은 포스파타아제(phosphatase) 활동으로 인한 오염을 제거하기 위한 것이다.
huGAA_JbMan으로 언급된 한 실험에서, 100:15의 질량비율을 가진 huGAA: JbMan이 사용되었다. 10 μl의 JbMan(PBS내에서 15mg/ml)을 30 μl의 huGAA(100mM 맨니톨(mannitol)이 함유된 pH 6인 25mM 포스페이트(phosphate)완충액 내 3.7 mg/ml)와 50 μl의 100mM, pH 5인 소듐 아세테이트(sodium acetate) 완충액에 첨가하였다. 대조군은(huGAA_제어)은 JbMan이 없는 huGAA을 포함하고 있었다. 30C에서 16시간 배양한 후에, 상기 샘플들은 사용될 때까지 4°C에서 유지되었다. N-글라이칸 분석을 위해, 각각 2 μL 의 샘플을 풀고, 실시예 6에 설명된 바대로 N-글라이칸을 표시하였다. JbMan 처리된 huGAA로부터의 N-글라이칸의 DSA-FACE 전기영동 도는 도 15에 도시되어 있다. JbMan의 처리는 huGAA의 ManP-Man8GlcNAc2 and (ManP)2-Man8GlcNAc2 의 부분적인 캡핑제거와 탈만노실화를 나타냈는데, 주로 P-Man5GlcNAc2 와 (ManP)-Man6-(P)GlcNAc2을 형성하였다. 후자의 N-글라이칸은 전기영동 도에서 P-Man5GlcNAc2와 함께 진행되었다. 완벽하게 캡핑이 제거된 소량의 P2-Man6GlcNAc2 도 존재하였다. P-Man5GlcNAc2에서 보다 천천히 진행되는 피크는 아마 중성 Man3GlcNAc2일 것이다. P2-Man6GlcNAc2 과 P-Man4GlcNAc2 은 더 이상 JbMan에 의해 탈만노실화 되지 않는다(도 15, 세 번째 패널).
똑같은 정제 회분으로부터의 huGAA를 이용하여 두 번째 JbMan의 캡핑제거와 탈만노실화 실험이 진행되었다. 상기 논의한 바와 같이 실질적으로 실험이 진행되었는데, 1mM 다이클로로 징크(ZnCl2)가 첨가된 pH 5.0의 100mM의 소듐 아세테이트(sodium acetate)와 100mM 만니톨을 huGAA 제조 완충액으로 사용되었다. huGAA: JbMan의 질량비율은 100:10으로 사용되었다. 상기 반응은 24시간 동안 37°C에서 배양되었다. JbMan이 처리된 이 샘플들의 N-글라이칸 프로파일은 도 15에서 보여진 N-글라이칸의 프로파일과 비슷하였다.
세포의 huGAA처리를 (샘플 10 참조) 살펴보면, JbMan의 캡핑제거와 탈만노실화 실험은 다른 정제 회분으로부터 생성된 huGAA로 수행되었다. 상기 설명한 실험 조건과 유사한 실험 조건이 사용된다. 1mM 다이클로로 징크 (Zncl2)가 포함된 PH 5.0의 100mM 소듐 아세테이트(sodium acetate)와 100mM 만니톨(mannitol)은 huGAA제조 완충용액으로 사용되었다. 캡핑제거와 탈만노실화는 huGAA: JbMan의 질량비율이 100:10로 수행되고, 반응 혼합물은 30°C에서 24시간 동안 배양되었다. 상기 N-글라이칸의 프로파일은 도 16에 도시되었다. 두 개의 인산기를 가진(diphosphorylated) N-글라이칸 P2-Man6GlcNAc2 은 전기영동도에서 관측되지 않았다. huGAA 샘플에서 포스페테이제(phosphatase) 활동의 존재로 인해 부분적인 탈인산화가 일어났기 때문이며, 결과적으로 중성의 N-글라이칸인 Man3GlcNAc2 에서 Man6GlcNAc으로 변화와 함께 하나의 포스포릴기를 가진(mono phosphoryllated) P-Man6GlcNAc2 and ManP-Man6GlcNAc2 의 상대적으로 높은 양도 검출되었다.
실시예9
재조합 huGAA의 폼프 섬유아세포(Pompe fibroblast) 로의 흡수
실시예 7과 8에서의 Myozyme과 huGAA(CcMan4로 처리되지않은 그리고 처리된) 캡핑제거와 탈만노실화는 세포 흡수 실험에서 사용되었다. 캡핑된 huGAA 혹은 CcMan5 (huGAA_CcMan5) 혹은 Ccman4 (huGAA_CcMan4), CcMan4 과 CcMan5 (huGAA_CcMan4/5)의 조합 또는 잭콩 만논시다아제(Jack Bean mannosidase) (huGAA_JBMan) 처리된 huGAA (실시예 7과 8 참조)의 특정 효소 활동들이 4-MUG 분석을 이용하여 실험되었다. 글루코다아제(glucosidase)에 의한 기질 4-MUG의 절단은 형광물질 4-MU을 형성하고, 그 물질은 UV 빛의 조사되거나 시작적으로 감지될 수 있다. 실시예 3을 참조하라. huGAA의 활동이 Myozyme의 활동과 비교되었다. 효소들은 0.1 % BSA(실제 버퍼)를 포함하는 100mM pH 4.0 소듐 아세테이트 완충용액에서 3가지 다른 농도로 희석되며(125 ng/ml, 62.5 ng/ml, and 31.25 ng/ml) 각각의 50 μl 의 희석액은 세 개의 96-웰 접시에 첨가되었다. 상기 4-MUG기질(시그마사)은 4mM 반응 완충용액에 희석되었고, 상기 희석된 기질의 50 μl은 각각의 웰에 첨가되었다. 반응을 억제하기 위해 pH 11.5의 100 μl 150 mM EDTA- Na2 염 을 첨가한 후, 효소반응은 37°C에서 60분 동안 배양되었다. 그 형광물질은 여기 360/40 (excitation 360/40)nm와 발광 460/40(emission 460/40)nm서 측정되었다. 4-메틸륨라이페론(4-MU)의 일반적인 커브는 특정 활성도를 계산하기 위해 측정되었다. 다양한 효소들의 활동은 U/mg로 기록되었으며, U/mg에서 1 단위는 0.1 % BSA와 pH 4.0의 100nM 소듐 아세테이트(sodium acetate)완충용액내의 2mM의 기질농도에서 단위 시간당 1nmol 기질의 가수분해를 촉진시키는 효소의 양이다. 각각 효소의 특정 활성도는 대략 200 x 103 U/mg 이었다.
CcMan5 (huGAA_CcMan5) 혹은 Ccman4 (huGAA_CcMan4), CcMan4 과 CcMan5 (huGAA_CcMan4/5)의 조합 또는 잭콩 만논시다아제(Jack Bean mannosidase) (huGAA_JBMan)가 처리된 huGAA의 흡수는 인간의 폼프 섬유아세포 세포주(human Pompe fibroblast cell line) (Coriell Cell Repository, Camden, NJ에서 참조) 인 GM00248 섬유아세포(fibroblasts)에서 측정되었다. GM00248 섬유아세포(fibroblast)는 산성의 알파 글루시다아제(alpha glucosidase) 활동(보통의 0.27%)이 부족하고, 측정할 수 있는 만한 정도의 GAA mRNA 혹은 단백질을 가지고 있지 않다. GM00248 섬유아세포들(fibroblasts)은 Eagle의 염과 15%의 FCS와 2mM의 글루타민으로 보충된 비필수 아미노산을 포함하는 최소 필수배지(Minimum Essential Medium) (MEM, Invitrogen사 제조) 에서 자리잡고 성장하였다. 효소를 투여하기 하루 전에 세포들은 5% 열에 의해 불활성화된 FCS로 보충된 Ham의 F-10 배양액 (Ham's F10 medium)안의 24-well pate에서 자리잡게 된다. (56°C에서 30분)
실험 날, 캡핑된 huGAA와 캡핑제거된 huGAA는 0.22 μm의 필터를 통해 여과 한 다음 다양한 효소활동을 할 흡수 매개체에서 희석되었다. 각각의 흡수 매개체에서의 효소희석활동은 세포에 첨가된 실제 효소 활동을 측정하기 위해 4-MUG 분석을 이용해 다시 측정되었다.
상기 GM00248 섬유아세포(fibroblasts)는 효소와 함께 16시간동안 배양되었고, 얼음처럼 차가워진 PBS로 두 번 세척되고 나서, 단백질 분해효소인 포스티아제 억제제(protease inhibitors)로 보충된 0.5 ml PBS와 0.5% Triton X100(30분, 4°C)로 용해되었다. 세포 용해물은 세포 잔해를 제거하기 위해, 10000xg에서 회전되었다. huGAA의 세포내의 활동은 상기 설명된 바와 같이 4-MUG 활동 분석을 이용해 측정되었다. 단백질 농도는 제조 업체의 프로토콜에 따라 bicinchoninic 산 방법(bicinchoninic acid method) (Pierce사의 microBCA kit)에 의해 측정되었다. huGAA의 세포 활동은 총 단백질 mg당 단위(U/MG)로 표시된다.
도 17은 인간 폼프 섬유아세포(human Pompe fibroblasts)인 GM00248에서의 huGAA의 세포내 활동을 보여준다. ManP-Man8GlcNAc2 와 (ManP)2-Man8GlcNAc2 N-글라이칸의 혼합물을 포함하는 캡핑된 huGAA(도 11, 두 번째 패널 참조)는 세포들 안으로 들어가지 않았다. 캡핑된 huGAA로 처리된 세포의 세포 내 활동은 처리되지 않은 세포들과 유사하였다(데이터가 존재하지 않음). 완벽하게 탈만노실화된 HuGAA_CcMan4(도 11, 세 번째 패널참조)도 폼프 섬유아세포(Pompe fibroblasts)에서 흡수되지 않았다. CcMan5처리가 캡핑이 제거된 인산기가 하나인(monophosphorylate) P-Man8GlcNAc2 을 형성하고, 완전히 캡핑이 제거된 인산기가 두 개인(diphosphorylated) P2-Man8GlcNAc2,를 형성하더라도, 시험용량범위 내에서는 세포 내로 흡수하는 것이 관측되지 않았다. CcMan4 과 CcMan5 (huGAA_CcMan4/5) 혹은 잭콩만논시다아제 (Jack Bean mannosidase, huGAA_JBMan)처리된 캡핑 제거되거나탈만노신화된 huGAA에서 용량의존적인 세포 흡수가 관찰되었다. CcMan4/5 혹은 JbMan 중 하나가 처리된 huGAA의 세포 내 활동은 500-100U/ml의 일정한 정도에 도달된 반면에, Myozyme®의 세포 내 활동은 일정한 2500 U/ml 정도에 도달하지 않았다. 인산 캡핑이 제거되고 탈만노실화된 huGAA는 Myozyme®보다 대략적으로 2.5배는 더 효율적이었다.
두 번째 세트의 실험은 흡수가 만노스-6-포스페이트(mannose-6-phosphate, M6P) 수용체와의 결합에 의한 것이지 여부를 조사하기 위해 수행되었다. 이 실험의 경우, 실시예 7에 설명된 바와 같이 글리칸(glycan)에 결합된 만노스-1-포스페이트-6-만노스(mannose-1-phosphate-6-mannose)를 제거하기 위해 상기 실험에서 사용된 것과 동일한 정제 회분으로부터의 huGAA에 CcMan4 그리고 CcMan5 만논시다아제 (mannosidases) 혹은 실시예 8에서 설명된 바와 같은 잭 콩 만논시다아제(Jack Bean mannosidase)가 처리되었다. Myozyme®은 참조용으로 사용되었다. huGAA의 흡수량에 대한 단말 알파-1,2 만노스(a-1,2 mannoses)의 효과를 조사하기 위해, Myozyme®은 CcMan4 만논시다아제(mannosidase)로 처리 되었다. 효소의 특정 활성은 상기 설명된 바와 같이 4-MUG 분석을 사용해 측정되었다. 흡수 분석은 상기 설명된 바대로 수행되었다. 효소들은 흡수 매개체의 동일한 효소 활동도를 갖게 희석되고 정제된 다음, 다양한 용량이 5mM M6P(시그마)의 존재 유무와 관계 없이 GM00248 섬유아세포(fibroblasts)에 첨가되었고, 16시간 동안 배양되었다. 각각의 세포 흡수 실험은 중복적으로 수행되었다. 배양 후에 세포들은 얼음처럼 차가워진 PBS로 세척되었고, 단백질 분해효소 억제제(protease inhibitors)로 보충된 0.5 ml PBS와 0.5 % Triton X100로 용해되었고, huGAA의 세포내의 활동은 4-MUG 활동 분석을이용해 측정되었다.
도 18은 GM00248 섬유아세포(fibroblasts)에서 huGAA 효소의 흡수를 도시한 것이다. CcMan4을 Myozyme®에 처리한 것은 Myozyme®의 N-글라이칸 프로파일(도 13, 세번째 패널) 혹은 흡수 효울성도 변화시키지 못하였다. Myozyme®의 흡수는 자유 M6P의 추가에 의해 억제되었다. 도 18에 있는 결과는 huGAA의 캡핑제거와 탈만노실화(huGAA_CcMan4/5, huGAA_JBMan)의 용량 의존적인 흡수를 나타내고, 그것은 M6P의 첨가에 의해 억제된다. 이러한 결과는, 캡핑 제거되고 탈만노실화된 huGAA의 흡수는 M6P 수용체를 통해 중재된다는 것을나타낸다.
실시예 10
폼프 섬유아세포(Pompe fibroblasts)의 리소좀(lysosome)에서의 huGAA의 처리
HuGAA는 110 kDa의 전구체로 소포체에서 생산된다. 이것은 골지체에서 N-글라이칸 처리를 거치고, 추가적으로 95kDa의 중간분자형태를 거쳐 76 kDa와 70kDA의 활성 단백질로 리소좀에서 가수분해 처리된다. 활성 단백질들은 그것의 자연적 기질 글라이코겐(natural substrate glycogen)의 분해의 원인이 된다. 다음의 실험에 따르면, 야로이아 라이포리티카(Y. lipolytica)내에서 110kDa 단백질로 생산되어 정제된 재조합 huGAA의 세포내 처리가 조사되었다. 이러한 예에서, 제조 완충용액은 2mM의 염화칼슘이 첨가된 pH 7의 100mM HEPES 와 100mM 만니톨(mannitol)(실시예 7참조)로 전환되었던 실시예9에서 사용된 것이 아닌 다른 정제 회분으로부터의 huGAA가 사용되고, 실시예 7에서 설명된 바와 같이 CcMan4 와 CcMan5의 혼합물 혹은 잭 콩 만논시다아제(Jack Bean mannosidase)가 huGAA에 처리된다. 캡핑제거된 효소의 특정 활성도는 4-MUG분석법을 의해 측정된다. 실험 하루 전에 GM00248 섬유아세포(fibroblasts)가 상기 설명된 바와 같은 흡수 매개체에 5 x 105 세포들/웰 (cells/well) 의 밀도로 6-웰 접시에 자리잡는다. 다음날, 상기 섬유아세포(fibroblasts)들은 2ml 흡수 매개체에서 1000 U/ml huGAA_CcMan4/5 혹은 huGAA_JBMan와 함께 14시간 혹은 46시간 동안 배양되었다. 참고로, 세포는 Myozyme® 와 함께 배양하고, 효소 배양되지 않은 세포는 대조군으로 사용 하였다. 각 셀의 흡수 실험은 중복으로 수행되었다. 배양 후, GM00428 섬유아세포(fibroblasts)는 얼음처럼 차가워진 PBS에 의해 세척되었고, 트립신처리(trypsinization)(0.53 mM의 EDTA와 0.05 %의 트립신(trypsin))에 의해 채취되었다. 세포들은 원심분리되고 및 프로테아제 억제제로 보충된(supplemented with protease inhibitors) 0.5 ML PBS 와0.5 % TritonX100 에 의해 용해 되었다. 세포 용해물은 세포 파편을 제거하기 위해 원심 분리되고 상기 설명한 바와 같이 4-MUG 분석을 이용해 세포 내 GAA 활동을 분석하였다. 단백질 농도는 BCA 방법으로 측정 하였다.
도 19는 새포내 huGAA 활동을 보여준다. 비록 huGAA_Ccman4/5이 P-Man6GlcNA2와(ManP)-Man6GlcNac2 (도 14, 세 번째 패널)으로 부분적으로 탈인산화되었지만, 상기 효소는 시험된 배양 시간 에서 모두 Myozyme®보다 1.8배 더효율적이었다. HuGAA_JBMan 역시 Myozyme®보다 더 효율적이긴 했지만, huGAA_CcMan4/5 처리에 비해서는 덜 효율적이었고, 아마 인산기가 두 개 이(diphosphorylated) N-글라이칸 P2-Man6GlcNAc2 의 부재 때문일 것이다(도 16, 세 번째 패널).
이 실험의 목적은 섬유아세포에 의해 자리잡은(taken up by the fibroblasts) huGAA가 76kDa 와 70kDA의 활성 상태로 처리되는지 여부를 시험하는 것이었다. 따라서, 세포샘풀은 트리클르로 아세틱 산(trichloroacetic acid, TCA)/ 디옥시초레이트 (deoxycholate, DOC) 방법으로 침전되었다. 샘플들(500 μl, 단백질 160 μg 포함)은 50 μl of 0.5% DOC 에 섞이고 얼음에서 30분간 배양되었다. 15%의 최종 TCA의 농도를 얻기 위해서 TCA 100 % (100 μl)를 첨가한 후에, 샘플들이 혼합되었고, 밤새 -20°C에서 침전되었다. 침전물은 팔렛으로부터 TCA를 흡인한 후에, 30분 동안 microcentrifuge에서 13000 rpm으로 원심분리 되었다. 상기 팔렛은 얼음처럼 차가운 500-700 μl의 아세톤(acetone)에 의해 세척되었고 혼합되어 13000 rpm에서 원심분리 되었다. 상기 팔렛은 NuPAGE 샘플 환원제를 포함하는 1x NuPAGE® LDS 완충용액에서 재가용화(re-solubilization) 된 후 50C 에서 10분 건조 되었다. 상기 샘플을 100°C 에서 3분 끓인 다음에, 20 μg 단백질 (10 μl)은 500 μl of NuPAGE® 산화방지제를 포함하는 1x MOPS SDS 실행 완충제와 함께 4-12% NuPAGE® Bis-Tris gel (Invitrogen사) 로딩되었다. Myozyme® (50 ng)은 참고용으로 젤에 로딩되었다. 샘플들은 니트로셀루로우즈(nitrocellulose) 막에 밤새 도말되었고, 세포내 huGAA는 일차 항체로 다클론성 토기 안티-huGAA 세럼들(1/2000 희석)과 두 번째 항체로 염소의 안티-토끼 IgG의 과산화효소(peroxidase)가 결합된 항체(1/5000희석, Sigma사)를 이용해 검출되었다. PBS/Tween으로 상기 막을 세척한 후에, 상기 막은 ECL western blotting detection 시약 (GeHealthcare사) 으로 현상되었다. 상기 캡핑막이 제거된 효소 및 Myozyme® 의 14시간 동안의 잠복기는 주된 선구체 단백질이 존재하게 되었다. huGAA_Ccman4/5를 처리한 세포에서는 소량의 76 kDa 단백질이 관찰되었다. 46시간의 배양 후에, 캡핑제거된 효소들은 76kPD 활성 폴리펩티드(polypeptide)로 처리되었다. Myozyme® 역시 활성 폴리펩티드로 처리되었지만, 밴드들이 덜 강렬했다.
실시예 11
CcMan5와 잭 콩 알파-만논시다아제(-mannosidase)를 이용한 재조합 huGAA의 캡핑제거 및 탈만노실화
재조합 huGAA는 huGAA: CcMan5: JbMan의 질량비율이 100:5:10일 때, CcMan5 과 JBMan에 의해 캡핑제거되고 탈만노실화 된다. 1.08ml의 huGAA 용액에 (소듐 클로라이드(Nacl)가 첨가된 pH 6.0의 10mM 소듐 포스페이트 (sodium phosphate) 완충용액에서 4.8mg/ml), CcMan5 1.69ml(PBS완충용액에서 0.154mg/ml) 그리고 JbMan 1.04 ml(PBS 완충용액에서 0.5mg/ml)이 첨가되었다. 총 반응 부피는 2mM 다이클로로 칼슘(CaCl2)을 포함하는 pH5.0의 100mM 소듐 아세테이트(sodium acetate) 완충용액을 이용해 5.2ml로 조정되었다. 반응 혼합물은 15시간 동안 30°C에서 배양되었다. 캡핑제거되고 탈만노실화된 huGAA는 실시예 3에 설명된 바와 같이 Hiload 16/60 superdex 200 젤여과 칼럼(GE Healthcare사)를 이용해 정제되었다.
상기 N-글라이칸들은 최종 정제된 huGAA의 10 μg로부터 방출되고, 실시예6에서 설명된 바와 같이 표시되었다. CcMan5 와 JbMan이 모두 처리된 huGAA으로부터 나온 N-글라이칸의 DSA-FACE전기영동도는 도 20에 도시되어 있다. 캡핑제거와 탈만노실화 후에 측정된 주된 피크들은 두 개의 인산기를 가지는 (double phosphorylated) P2-Man6GlcNAc2 와 하나의 인산기를 가지는(monophosphorylated) P-Man4GlcNAc2, P-Man5GlcNAc2 and P-ManGlcNAc2이었다.
실시예 12
CcMan5와 JbMan으로 캡핑제거되고탈만노실화된 재조합 huGAA의 폼프 섬유아세포 (Pompe fibroblasts) 로의 흡수
캡핑제거 및 탈만논실화 후 정제된 huGAA의 세포 흡수는 (실시예 11에서 설명된 바와같이 JbMan과 CcMan5로 처리된)은 실시예 9에서 설명된 바와 같이 GM00248 섬유아세포(fibroblast)세포주를 이용한 Myozyme의 세포 흡수와 대조되었다.
도 21은 정제된 캡핑제거되고 탈만노실화된 huGAA의 세포내 활동 과 미오짐(Myozyme)의 세포내 활동을 비교하여 나타낸다. Kuptake 계산을 위해 상기 세포에 첨가된 효소의 양(효소 활성 단위들로 표현됨)은 효소 농도(nM으로 표현됨)으로 전환되었고, 특정 활동도(U/mg으로 표시됨)와 비교하여 도시되어 있다. Kuptake과 표준 편차는 GraphPrism에서 비선형 회귀 분석을 사용하여 14 데이터 포인트 huGAA (농도 당 2 데이터 포인트) 및 Myozyme 12 데이터 포인트를 통해 계산 하였다. 용량의존적인 세포 흡수는 huGAA에서 관측되었고, 대략 25nM와 1.7 0.2 nM의 Kuptake 의 일정 수준에 도달하였다. 반면에, Myozyme 세포 활동은 200nM의 일정수준에 도달하지 못하였고 64 5 nM의 Kuptake를 나타내었다. 야로이아 립포리티카(Yarrowia lipolytica)에서 생성된 캡핑제거되고 탈만노실화된 huGAA는 폼프 섬유아세포 (Pompe fibroblasts)에서 Myozyme보다 30배나 더 효율적이었다.
실시예 13
폼프 섬유아세포에서(lysosomes of Pompe fibroblasts) CcMan 5 와JbMan 로 캡핑제거되고 탈만노실화된 재조합 huGAA
실시예 11에서 설명된 바와 같이 CcMan5와 JbMan이 처리된 야로이아(Yarrowia)에서 생성된 huGAA가 리소좀에서 그것의 성숙한 형태로 처리될 수 있는지 여부를 확인하기 위해 수행되었다. 실험 하루 전날에 GM00248 섬유아세포(fibroblasts)가 흡수 매개체에서 3x105 세포들/웰(cells/well)의 밀도로 6-웰접시 안에 자리잡았다. (is seeded) 다음날, 섬유아세포(fibroblasts)는 8시간 혹은 24시간 동안 2ml 흡수 매개체 안에서 2000U/ml huGAA로 활성화되거나, 혹은 24시간 동안 자극된다(펄스 기간, pulse period). 그 이후, 상기 세포들은 세척된다. 그 후에 2ml 성장 매개체들이 최대 100시간까지 추적 기간을 위해 상기 세포들에게 첨가된다. 효소가 첨가되지 않은 세포들은 대조군으로 사용되었다.
배양 후에, 세포들은 세척되고,세포 용해물들은 실시예 10에서 설명한 바와 같이 DOC/TCA방법을 이용해 침전되었고, 웨스턴 블롯팅(Western blotting) 방법에 의해 실험대상이 되었다. 참고로, 정제된 huGAA(30ng)이 젤에 로드 되었다. 샘플들은 밤새 도말되었고, 세포 내 huGAA는 일차 항체로 다클론성 토끼 안티-huGAA 세럼들(1/2000 희석)과 두번째 항체로 염소의 안티-토끼 IgG의 과산화효소(peroxidase)가 결합된 항체(1/8000희석,Abcam사)를이용해 검출되었다. 상기 막은 ECL western blotting detection 시약 (GeHealthcare사)으로 현상되었다.
캡핑이 제거고 탈만노실화된 효소를 8시간 배양한 결과, 선구체 단백질(110kDa) 이 되었다. 24시간 배양한 결과,상기 선구체 단백질과 처리된 단백질(76kD)이 된 반면. 24시간 펄스와 최대 100시간의 추적기간 후에는 대부분의 단백질이 76kD의 활성 폴리펩티드 (polypeptide) 가 되었다. 이러한 결과는 캡핑이 제거되고 탈 마노신화된 huGAA는 섬유아세포에 의해 흡수될 수 있고(take up) 그것의 리소좀에서 활성 폴리펩티드로 처리됨을 증명하는 것이다.
다른 실시예들
발명이 발명과 관련된 상세한 설명에 의해 설명되었지만, 이는 단지 설명하기 위한 목적일 뿐이고 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해 정해진다. 다른 측면, 장점, 또는 변형들은 다음의 청구항 범위 내에 존재한다.
SEQUENCE LISTING
<110> Oxyrane UK Limited
<120> Mannosidases Capable of Uncapping
Mannose-1-Phospho-6-Mannose Linkages and Demannosylating
Phosphorylated N-glycans and Methods of Facilitating
Mammalian Cellular Uptake of Glycoproteins
<130> 18990-0032WO1
<140> PCT/IB2011/002770
<141> 2011-09-29
<150> US 61/477,014
<151> 2011-04-19
<150> US 61/387,940
<151> 2010-09-29
<160> 11
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 2743
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Yarrowia codon optimized sequence encoding alpha
glucosidase
<400> 1
atgaagcttt ccaccatcct cttcacagcc tgcgctaccc tggctgccgc ccagcaggga 60
gcctctcgac ccggaccccg agatgcccag gctcaccccg gacgacctcg agctgtgccc 120
acccagtgtg acgtgccccc caactctcga ttcgactgtg cccccgacaa ggccatcacc 180
caggagcagt gcgaggcccg aggctgttgt tacatccccg ctaagcaggg cctgcagggc 240
gctcagatgg gccagccctg gtgtttcttc cccccctctt acccctccta caagctggag 300
aacctgtcct cttcggagat gggctacacc gccaccctga cccgaaccac ccccaccttt 360
ttccccaagg acatcctgac cctgcgactg gacgtgatga tggagaccga gaaccgactg 420
cacttcacca tcaaggaccc cgccaaccga cgatacgagg tgcccctgga gaccccccac 480
gtgcactctc gagccccttc ccccctgtac tctgtggagt tctctgagga gcccttcggc 540
gtgatcgtgc gacgacagct ggacggccga gtgctgctga acaccaccgt ggcccccctg 600
ttcttcgccg accagttcct gcagctgtct acctctctgc cctctcagta catcaccggc 660
ctggccgagc acctgtcccc cctgatgctg tccacctctt ggactcgaat caccctgtgg 720
aaccgagacc tggcccccac ccccggtgcc aacctgtacg gctctcaccc cttctacctg 780
gccctggagg acggcggctc tgcccacggc gtgtttctgc tgaactctaa cgccatggac 840
gtggtgctgc agccctctcc cgccctgtct tggcgatcta ccggcggcat cctggacgtg 900
tacatcttcc tgggccctga gcccaagtct gtggtccagc agtacctgga cgtggtcgga 960
taccccttca tgccccccta ctggggcctg ggcttccacc tgtgtcgatg gggctactct 1020
tctaccgcca tcacccgaca ggtggtggag aacatgaccc gagcccactt ccccctggac 1080
gtgcaatgga acgacctgga ctacatggac tctcgacgag acttcacctt caacaaggac 1140
ggcttccgag acttccccgc catggtccag gagctgcacc agggaggacg acgatacatg 1200
atgatcgtgg accccgccat ctcttcttcc ggacccgccg gatcttaccg accctacgac 1260
gagggcctgc gacgaggcgt gttcatcacc aacgagaccg gccagcccct gatcggcaag 1320
gtgtggcccg gctctaccgc cttccccgac ttcaccaacc ccaccgccct ggcttggtgg 1380
gaggacatgg tggccgagtt ccacgaccag gtgcccttcg acggcatgtg gatcgacatg 1440
aacgagccct ctaacttcat ccgaggctct gaggacggct gtcccaacaa cgagctggag 1500
aaccccccct acgtgcccgg cgtggtgggc ggaaccctgc aggccgccac catctgtgcc 1560
tcttcgcacc agtttctgtc tacccactac aacctgcaca acctgtacgg actgaccgag 1620
gccattgcct ctcaccgagc cctggtgaag gcccgaggca cccgaccctt cgtgatctct 1680
cgatctacct tcgccggcca cggccgatac gccggacact ggaccggcga tgtgtggtcc 1740
tcttgggagc agctggcctc ttctgtgccc gagatcctgc agttcaacct gctgggcgtg 1800
cccctggtgg gcgccgacgt gtgtggcttc ctgggcaaca cctctgagga gctgtgtgtt 1860
cgatggaccc agctcggcgc cttctaccct ttcatgcgaa accacaactc cctgctgtct 1920
ctgccccagg agccctactc gttctctgag cccgctcagc aggccatgcg aaaggctctg 1980
accctgcgat acgccctgct gccccacctg tacaccctgt tccaccaggc ccacgtggct 2040
ggagagaccg tggcccgacc cctgttcctg gagttcccta aggactcttc tacctggacc 2100
gtggaccatc agctgctgtg gggcgaggcc ctcctgatca cccccgtgct gcaggccggc 2160
aaggctgagg tgaccggcta cttccctctg ggcacctggt acgacctgca gaccgtgcct 2220
gtggaggccc tgggatctct gccccctcct cccgccgctc cccgagagcc cgccatccac 2280
tctgagggcc agtgggtgac cctgcccgct cccctggaca ccatcaacgt gcacctgcga 2340
gccggctaca tcatccctct gcagggaccc ggcctgacca ccaccgagtc tcgacagcag 2400
cccatggccc tggccgtggc tctgaccaag ggcggagagg cccgaggcga gctgttctgg 2460
gacgatggcg agtctctgga ggtgctggag cgaggcgcct acacccaggt gatctttctg 2520
gcccgaaaca acaccatcgt gaacgagctg gtgcgagtga cctctgaggg cgctggtctg 2580
cagctccaga aggtgaccgt cctgggcgtg gccaccgctc cccagcaggt cctgtctaac 2640
ggcgtgcccg tgtctaactt cacctactct cccgacacca aggtgctgga catctgtgtg 2700
tctctgctga tgggcgagca gttcctggtg tcttggtgtt aac 2743
<210> 2
<211> 913
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fusion of Yarrowia LIP2 signal sequence to human
alpha glucosidaseglucosidase
<400> 2
Met Lys Leu Ser Thr Ile Leu Phe Thr Ala Cys Ala Thr Leu Ala Ala
1 5 10 15
Ala Gln Gln Gly Ala Ser Arg Pro Gly Pro Arg Asp Ala Gln Ala His
20 25 30
Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr Gln Cys Asp Val Pro Pro Asn
35 40 45
Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys
50 55 60
Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly
65 70 75 80
Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser
85 90 95
Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr
100 105 110
Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu
115 120 125
Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu Asn Arg Leu His Phe Thr Ile
130 135 140
Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu Val Pro Leu Glu Thr Pro His
145 150 155 160
Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu
165 170 175
Glu Pro Phe Gly Val Ile Val Arg Arg Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu
180 185 190
Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln
195 200 205
Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr Ile Thr Gly Leu Ala Glu His
210 215 220
Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp
225 230 235 240
Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His
245 250 255
Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser Ala His Gly Val Phe
260 265 270
Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala
275 280 285
Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu
290 295 300
Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly
305 310 315 320
Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly Phe His Leu Cys Arg
325 330 335
Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr Arg Gln Val Val Glu Asn Met
340 345 350
Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr
355 360 365
Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp
370 375 380
Phe Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met
385 390 395 400
Met Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr
405 410 415
Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu
420 425 430
Thr Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe
435 440 445
Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp Trp Glu Asp Met Val
450 455 460
Ala Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe Asp Gly Met Trp Ile Asp Met
465 470 475 480
Asn Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn
485 490 495
Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly Val Val Gly Gly Thr
500 505 510
Leu Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser Ser His Gln Phe Leu Ser Thr
515 520 525
His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser
530 535 540
His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser
545 550 555 560
Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly
565 570 575
Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile
580 585 590
Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro Leu Val Gly Ala Asp Val Cys
595 600 605
Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln
610 615 620
Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg Asn His Asn Ser Leu Leu Ser
625 630 635 640
Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met
645 650 655
Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr
660 665 670
Leu Phe His Gln Ala His Val Ala Gly Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu
675 680 685
Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp Thr Val Asp His Gln
690 695 700
Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly
705 710 715 720
Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu
725 730 735
Gln Thr Val Pro Val Glu Ala Leu Gly Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala
740 745 750
Ala Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser Glu Gly Gln Trp Val Thr Leu
755 760 765
Pro Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val His Leu Arg Ala Gly Tyr Ile
770 775 780
Ile Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln
785 790 795 800
Pro Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly
805 810 815
Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly
820 825 830
Ala Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala Arg Asn Asn Thr Ile Val Asn
835 840 845
Glu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly Ala Gly Leu Gln Leu Gln Lys
850 855 860
Val Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln Gln Val Leu Ser Asn
865 870 875 880
Gly Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro Asp Thr Lys Val Leu
885 890 895
Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp
900 905 910
Cys
<210> 3
<211> 3258
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Yarrowia lipolytica nucleotide sequence encoding
AMS1 with C-terminal His-tag
<400> 3
atgtattcgc acttcaacaa cgagcctgtg gcgaagcggg tgaacaacct gtttaccgac 60
cgacttcgcc agttcaccag cgacggcgaa taccggtctc tcaacctgcc agctttctac 120
gagcgagaac gactggatgg caagaaccat gtggcgattg aaacgtatgc cgtttcagat 180
ctacgacggc cactgttcaa agacgccctc aaagaggcag atggccactg gaaaccagca 240
aagaagggct ccgagtacgg accttcctgg gccactcact ggttcaagat ccaggtctgt 300
gtgcccccag agtggaagaa gaactactac aaaaagggcg acctggtggt gttcaattgg 360
aatctcaact gtgagggtct cgtgttcagc gagtctggag aagctcttat tggtttatcc 420
ggcgaggaac gacgagaatg gcccattccc gacaactggt tcgacggaaa gtgccatacc 480
ttttacattg aggccagttg caatggcatg ttcggcaacg caacgggatc ttccatccag 540
ccccccagcg acaacagata tttcagactg gactctgcag acctcgttgt catcaactcc 600
gaggcccgac atctctttgt ggatttttgg attatcggag atgcggcccg ggagttccca 660
ggggattcgt ggcaacgtgg aaaggcacta gatgtcgcta acaagatcat ggatgccttt 720
gatcctgaaa acccagatga gagtatcgcc gagggccgaa aacttgccaa ggaatacctc 780
ggagatacta caaaggccta caagcaacag ctaccattcg ctgatggcct agtttacgca 840
ctcggtaact gccacatcga taccgcgtgg ctatggccct ttgctgagac tcgtcgaaag 900
gcaggtcgat cttgggcttc tcaacttgag ctcatcgaca agtaccccga gtacgtgttt 960
gtggcttccc aggcccagca gttcaagtgg ctcaaggaag actaccccga cttgtttgcc 1020
aagattcaaa agcaggctaa gaagggccgc ttccttcctg tcggaggcgc ctggaccgag 1080
tgtgacacta acctgccctc tggagagtct ctcctgcgcc agttcctgct tggtcagcga 1140
ttcttcctcg aacactttgg ctccctttct gacactttct ggctgcctga cactttcgga 1200
tactctgctc aggttcctca gctgtgtcga ttggctggca tggaccgttt cttgacccag 1260
aagttgtcct ggaataacat caactcgttc cccaattcaa catttaattg ggtggctctg 1320
gatggctcgc aggtgctctg tcacatgcca cccaacaaca cctacacttc tatggccaac 1380
tttggtgacg tctcacgaac tcagaaacag aacaagaatc ttgacaccac tcgaaactcc 1440
ctcatgctct atggccacgg agacggagga ggaggcccca ctgctgagat gctggagaag 1500
ctgcgtcgat gccgaggtgt gtccaacacc gtcggggaac ttcctcctgt aatccaggga 1560
caatctgtga ccgacttcta caatgagctt cttgatcaga ctaacaacgg caaggatctc 1620
gtaacctggg tcggggagct gtactttgag ttccaccgtg gtacctacac cagtcaagcc 1680
cagactaaaa agggtaaccg agtgtcggag aacctgctac acgatgtcga gttgttggcc 1740
actctggcca gtattcgaga ctcatcttac aagtacccct ttgcacagct tgagtctctc 1800
tgggaggatg tgtgtctttg ccagttccat gatgttcttc ctggatcatg cattgagatg 1860
gtctacaagg atgttaaaaa gatccatgga cgggttattg atactgcttc ccacctcatt 1920
gataaagccg cttctgcctt gggtctttct ggtcaccctt ccaaggactc cttcgactgc 1980
actcctgttg ctctcaacac catgccttgg tcgcgaaccg aggtcgtcgc tgttccccag 2040
ccacattggg atgccaccgt ggagcttgct gagggtgtcg agatccaaga agactcgggc 2100
aatgccctcg tcatgatgtc tgaatctgga cctgttgtca ccactcaatc tgtagacttg 2160
ttcaagtctg aagacgccta catccttgag aatagccagg tcaaggtgac gatttgcaag 2220
gatgatggta ccctcaccag catttacgac aaagagaatg accgtcgggt cctgtctgga 2280
acaggtaacc gactggtatt gttcgacgac cagccgttgt cgtggcaggc ttgggacact 2340
gaggtgtttt ctcttggtaa gaagcagtac attggtgccg agaatgtgac tcgtcattcc 2400
atcgtctctt ctggccctct gcgatcaact gtcgccttca cttacgaatt caacaaatct 2460
gttgtcacaa ccgagatttc tctcgacgct aactcgcctc tggtaacttt taacacccgt 2520
gccgactggc atgaaacttg caagtttcta aaggtggaat ttcctgtgga cgtccacagt 2580
gagtctgctt cgtacgagtc tcagtttggt gttgttaagc gccccactca ttacaacacc 2640
tcttgggacg tggccaagtt tgaggtatgc tgccacaagt ttgcggatct gtccgaactc 2700
gactacggcg tgtccatctt gaatgactgc aagtatggat tcgccaccca tggtaatctc 2760
atgcgactgt cgctgctgcg ggcccctaag gctcccgacg ctcatgctga tatgggtcat 2820
catgagttca agtacggagt ccttgctcac aagggacccc ttggtgctac aactgttcgg 2880
gccgcttaca acttcaacaa ccctcttcgg gtcaagtatg tgggtctctc tgaagtttcc 2940
accaagcagg ccttttctct caaaggccct gcgaatctgg tgctcagcca ggttaagagg 3000
gccgaagttg accgatctaa gaagtccacc aatgtcatct tgcgagttta cgaggctctc 3060
ggaggccgaa ctcgaggcaa actcgttatc gacttgccca acgtggtgtc tgtgaccaag 3120
acctgtgctc tggagtactc caaggagaaa caggttgttg ccaagagcga gggtgtcact 3180
tctgtagaca tttctctacg tgcttttgag gttgccacct acaaggttga gttggctcat 3240
catcaccatc accactag 3258
<210> 4
<211> 3258
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Yarrowia lipolytica nucleotide sequence encoding
AMS1 with N-terminal His-tag
<400> 4
atgcatcatc accatcacca ctattcgcac ttcaacaacg agcctgtggc gaagcgggtg 60
aacaacctgt ttaccgaccg acttcgccag ttcaccagcg acggcgaata ccggtctctc 120
aacctgccag ctttctacga gcgagaacga ctggatggca agaaccatgt ggcgattgaa 180
acgtatgccg tttcagatct acgacggcca ctgttcaaag acgccctcaa agaggcagat 240
ggccactgga aaccagcaaa gaagggctcc gagtacggac cttcctgggc cactcactgg 300
ttcaagatcc aggtctgtgt gcccccagag tggaagaaga actactacaa aaagggcgac 360
ctggtggtgt tcaattggaa tctcaactgt gagggtctcg tgttcagcga gtctggagaa 420
gctcttattg gtttatccgg cgaggaacga cgagaatggc ccattcccga caactggttc 480
gacggaaagt gccatacctt ttacattgag gccagttgca atggcatgtt cggcaacgca 540
acgggatctt ccatccagcc ccccagcgac aacagatatt tcagactgga ctctgcagac 600
ctcgttgtca tcaactccga ggcccgacat ctctttgtgg atttttggat tatcggagat 660
gcggcccggg agttcccagg ggattcgtgg caacgtggaa aggcactaga tgtcgctaac 720
aagatcatgg atgcctttga tcctgaaaac ccagatgaga gtatcgccga gggccgaaaa 780
cttgccaagg aatacctcgg agatactaca aaggcctaca agcaacagct accattcgct 840
gatggcctag tttacgcact cggtaactgc cacatcgata ccgcgtggct atggcccttt 900
gctgagactc gtcgaaaggc aggtcgatct tgggcttctc aacttgagct catcgacaag 960
taccccgagt acgtgtttgt ggcttcccag gcccagcagt tcaagtggct caaggaagac 1020
taccccgact tgtttgccaa gattcaaaag caggctaaga agggccgctt ccttcctgtc 1080
ggaggcgcct ggaccgagtg tgacactaac ctgccctctg gagagtctct cctgcgccag 1140
ttcctgcttg gtcagcgatt cttcctcgaa cactttggct ccctttctga cactttctgg 1200
ctgcctgaca ctttcggata ctctgctcag gttcctcagc tgtgtcgatt ggctggcatg 1260
gaccgtttct tgacccagaa gttgtcctgg aataacatca actcgttccc caattcaaca 1320
tttaattggg tggctctgga tggctcgcag gtgctctgtc acatgccacc caacaacacc 1380
tacacttcta tggccaactt tggtgacgtc tcacgaactc agaaacagaa caagaatctt 1440
gacaccactc gaaactccct catgctctat ggccacggag acggaggagg aggccccact 1500
gctgagatgc tggagaagct gcgtcgatgc cgaggtgtgt ccaacaccgt cggggaactt 1560
cctcctgtaa tccagggaca atctgtgacc gacttctaca atgagcttct tgatcagact 1620
aacaacggca aggatctcgt aacctgggtc ggggagctgt actttgagtt ccaccgtggt 1680
acctacacca gtcaagccca gactaaaaag ggtaaccgag tgtcggagaa cctgctacac 1740
gatgtcgagt tgttggccac tctggccagt attcgagact catcttacaa gtaccccttt 1800
gcacagcttg agtctctctg ggaggatgtg tgtctttgcc agttccatga tgttcttcct 1860
ggatcatgca ttgagatggt ctacaaggat gttaaaaaga tccatggacg ggttattgat 1920
actgcttccc acctcattga taaagccgct tctgccttgg gtctttctgg tcacccttcc 1980
aaggactcct tcgactgcac tcctgttgct ctcaacacca tgccttggtc gcgaaccgag 2040
gtcgtcgctg ttccccagcc acattgggat gccaccgtgg agcttgctga gggtgtcgag 2100
atccaagaag actcgggcaa tgccctcgtc atgatgtctg aatctggacc tgttgtcacc 2160
actcaatctg tagacttgtt caagtctgaa gacgcctaca tccttgagaa tagccaggtc 2220
aaggtgacga tttgcaagga tgatggtacc ctcaccagca tttacgacaa agagaatgac 2280
cgtcgggtcc tgtctggaac aggtaaccga ctggtattgt tcgacgacca gccgttgtcg 2340
tggcaggctt gggacactga ggtgttttct cttggtaaga agcagtacat tggtgccgag 2400
aatgtgactc gtcattccat cgtctcttct ggccctctgc gatcaactgt cgccttcact 2460
tacgaattca acaaatctgt tgtcacaacc gagatttctc tcgacgctaa ctcgcctctg 2520
gtaactttta acacccgtgc cgactggcat gaaacttgca agtttctaaa ggtggaattt 2580
cctgtggacg tccacagtga gtctgcttcg tacgagtctc agtttggtgt tgttaagcgc 2640
cccactcatt acaacacctc ttgggacgtg gccaagtttg aggtatgctg ccacaagttt 2700
gcggatctgt ccgaactcga ctacggcgtg tccatcttga atgactgcaa gtatggattc 2760
gccacccatg gtaatctcat gcgactgtcg ctgctgcggg cccctaaggc tcccgacgct 2820
catgctgata tgggtcatca tgagttcaag tacggagtcc ttgctcacaa gggacccctt 2880
ggtgctacaa ctgttcgggc cgcttacaac ttcaacaacc ctcttcgggt caagtatgtg 2940
ggtctctctg aagtttccac caagcaggcc ttttctctca aaggccctgc gaatctggtg 3000
ctcagccagg ttaagagggc cgaagttgac cgatctaaga agtccaccaa tgtcatcttg 3060
cgagtttacg aggctctcgg aggccgaact cgaggcaaac tcgttatcga cttgcccaac 3120
gtggtgtctg tgaccaagac ctgtgctctg gagtactcca aggagaaaca ggttgttgcc 3180
aagagcgagg gtgtcacttc tgtagacatt tctctacgtg cttttgaggt tgccacctac 3240
aaggttgagt tggcttag 3258
<210> 5
<211> 1079
<212> PRT
<213> Yarrowia lipolytica
<400> 5
Met Tyr Ser His Phe Asn Asn Glu Pro Val Ala Lys Arg Val Asn Asn
1 5 10 15
Leu Phe Thr Asp Arg Leu Arg Gln Phe Thr Ser Asp Gly Glu Tyr Arg
20 25 30
Ser Leu Asn Leu Pro Ala Phe Tyr Glu Arg Glu Arg Leu Asp Gly Lys
35 40 45
Asn His Val Ala Ile Glu Thr Tyr Ala Val Ser Asp Leu Arg Arg Pro
50 55 60
Leu Phe Lys Asp Ala Leu Lys Glu Ala Asp Gly His Trp Lys Pro Ala
65 70 75 80
Lys Lys Gly Ser Glu Tyr Gly Pro Ser Trp Ala Thr His Trp Phe Lys
85 90 95
Ile Gln Val Cys Val Pro Pro Glu Trp Lys Lys Asn Tyr Tyr Lys Lys
100 105 110
Gly Asp Leu Val Val Phe Asn Trp Asn Leu Asn Cys Glu Gly Leu Val
115 120 125
Phe Ser Glu Ser Gly Glu Ala Leu Ile Gly Leu Ser Gly Glu Glu Arg
130 135 140
Arg Glu Trp Pro Ile Pro Asp Asn Trp Phe Asp Gly Lys Cys His Thr
145 150 155 160
Phe Tyr Ile Glu Ala Ser Cys Asn Gly Met Phe Gly Asn Ala Thr Gly
165 170 175
Ser Ser Ile Gln Pro Pro Ser Asp Asn Arg Tyr Phe Arg Leu Asp Ser
180 185 190
Ala Asp Leu Val Val Ile Asn Ser Glu Ala Arg His Leu Phe Val Asp
195 200 205
Phe Trp Ile Ile Gly Asp Ala Ala Arg Glu Phe Pro Gly Asp Ser Trp
210 215 220
Gln Arg Gly Lys Ala Leu Asp Val Ala Asn Lys Ile Met Asp Ala Phe
225 230 235 240
Asp Pro Glu Asn Pro Asp Glu Ser Ile Ala Glu Gly Arg Lys Leu Ala
245 250 255
Lys Glu Tyr Leu Gly Asp Thr Thr Lys Ala Tyr Lys Gln Gln Leu Pro
260 265 270
Phe Ala Asp Gly Leu Val Tyr Ala Leu Gly Asn Cys His Ile Asp Thr
275 280 285
Ala Trp Leu Trp Pro Phe Ala Glu Thr Arg Arg Lys Ala Gly Arg Ser
290 295 300
Trp Ala Ser Gln Leu Glu Leu Ile Asp Lys Tyr Pro Glu Tyr Val Phe
305 310 315 320
Val Ala Ser Gln Ala Gln Gln Phe Lys Trp Leu Lys Glu Asp Tyr Pro
325 330 335
Asp Leu Phe Ala Lys Ile Gln Lys Gln Ala Lys Lys Gly Arg Phe Leu
340 345 350
Pro Val Gly Gly Ala Trp Thr Glu Cys Asp Thr Asn Leu Pro Ser Gly
355 360 365
Glu Ser Leu Leu Arg Gln Phe Leu Leu Gly Gln Arg Phe Phe Leu Glu
370 375 380
His Phe Gly Ser Leu Ser Asp Thr Phe Trp Leu Pro Asp Thr Phe Gly
385 390 395 400
Tyr Ser Ala Gln Val Pro Gln Leu Cys Arg Leu Ala Gly Met Asp Arg
405 410 415
Phe Leu Thr Gln Lys Leu Ser Trp Asn Asn Ile Asn Ser Phe Pro Asn
420 425 430
Ser Thr Phe Asn Trp Val Ala Leu Asp Gly Ser Gln Val Leu Cys His
435 440 445
Met Pro Pro Asn Asn Thr Tyr Thr Ser Met Ala Asn Phe Gly Asp Val
450 455 460
Ser Arg Thr Gln Lys Gln Asn Lys Asn Leu Asp Thr Thr Arg Asn Ser
465 470 475 480
Leu Met Leu Tyr Gly His Gly Asp Gly Gly Gly Gly Pro Thr Ala Glu
485 490 495
Met Leu Glu Lys Leu Arg Arg Cys Arg Gly Val Ser Asn Thr Val Gly
500 505 510
Glu Leu Pro Pro Val Ile Gln Gly Gln Ser Val Thr Asp Phe Tyr Asn
515 520 525
Glu Leu Leu Asp Gln Thr Asn Asn Gly Lys Asp Leu Val Thr Trp Val
530 535 540
Gly Glu Leu Tyr Phe Glu Phe His Arg Gly Thr Tyr Thr Ser Gln Ala
545 550 555 560
Gln Thr Lys Lys Gly Asn Arg Val Ser Glu Asn Leu Leu His Asp Val
565 570 575
Glu Leu Leu Ala Thr Leu Ala Ser Ile Arg Asp Ser Ser Tyr Lys Tyr
580 585 590
Pro Phe Ala Gln Leu Glu Ser Leu Trp Glu Asp Val Cys Leu Cys Gln
595 600 605
Phe His Asp Val Leu Pro Gly Ser Cys Ile Glu Met Val Tyr Lys Asp
610 615 620
Val Lys Lys Ile His Gly Arg Val Ile Asp Thr Ala Ser His Leu Ile
625 630 635 640
Asp Lys Ala Ala Ser Ala Leu Gly Leu Ser Gly His Pro Ser Lys Asp
645 650 655
Ser Phe Asp Cys Thr Pro Val Ala Leu Asn Thr Met Pro Trp Ser Arg
660 665 670
Thr Glu Val Val Ala Val Pro Gln Pro His Trp Asp Ala Thr Val Glu
675 680 685
Leu Ala Glu Gly Val Glu Ile Gln Glu Asp Ser Gly Asn Ala Leu Val
690 695 700
Met Met Ser Glu Ser Gly Pro Val Val Thr Thr Gln Ser Val Asp Leu
705 710 715 720
Phe Lys Ser Glu Asp Ala Tyr Ile Leu Glu Asn Ser Gln Val Lys Val
725 730 735
Thr Ile Cys Lys Asp Asp Gly Thr Leu Thr Ser Ile Tyr Asp Lys Glu
740 745 750
Asn Asp Arg Arg Val Leu Ser Gly Thr Gly Asn Arg Leu Val Leu Phe
755 760 765
Asp Asp Gln Pro Leu Ser Trp Gln Ala Trp Asp Thr Glu Val Phe Ser
770 775 780
Leu Gly Lys Lys Gln Tyr Ile Gly Ala Glu Asn Val Thr Arg His Ser
785 790 795 800
Ile Val Ser Ser Gly Pro Leu Arg Ser Thr Val Ala Phe Thr Tyr Glu
805 810 815
Phe Asn Lys Ser Val Val Thr Thr Glu Ile Ser Leu Asp Ala Asn Ser
820 825 830
Pro Leu Val Thr Phe Asn Thr Arg Ala Asp Trp His Glu Thr Cys Lys
835 840 845
Phe Leu Lys Val Glu Phe Pro Val Asp Val His Ser Glu Ser Ala Ser
850 855 860
Tyr Glu Ser Gln Phe Gly Val Val Lys Arg Pro Thr His Tyr Asn Thr
865 870 875 880
Ser Trp Asp Val Ala Lys Phe Glu Val Cys Cys His Lys Phe Ala Asp
885 890 895
Leu Ser Glu Leu Asp Tyr Gly Val Ser Ile Leu Asn Asp Cys Lys Tyr
900 905 910
Gly Phe Ala Thr His Gly Asn Leu Met Arg Leu Ser Leu Leu Arg Ala
915 920 925
Pro Lys Ala Pro Asp Ala His Ala Asp Met Gly His His Glu Phe Lys
930 935 940
Tyr Gly Val Leu Ala His Lys Gly Pro Leu Gly Ala Thr Thr Val Arg
945 950 955 960
Ala Ala Tyr Asn Phe Asn Asn Pro Leu Arg Val Lys Tyr Val Gly Leu
965 970 975
Ser Glu Val Ser Thr Lys Gln Ala Phe Ser Leu Lys Gly Pro Ala Asn
980 985 990
Leu Val Leu Ser Gln Val Lys Arg Ala Glu Val Asp Arg Ser Lys Lys
995 1000 1005
Ser Thr Asn Val Ile Leu Arg Val Tyr Glu Ala Leu Gly Gly Arg Thr
1010 1015 1020
Arg Gly Lys Leu Val Ile Asp Leu Pro Asn Val Val Ser Val Thr Lys
1025 1030 1035 1040
Thr Cys Ala Leu Glu Tyr Ser Lys Glu Lys Gln Val Val Ala Lys Ser
1045 1050 1055
Glu Gly Val Thr Ser Val Asp Ile Ser Leu Arg Ala Phe Glu Val Ala
1060 1065 1070
Thr Tyr Lys Val Glu Leu Ala
1075
<210> 6
<211> 5060
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence encoding fusion of DsbA signal
sequence to Cellulosimicrobium cellulans
mannosidase 5
<400> 6
atgaaaaaga tttggctggc gctggctggt ttagttttag cgtttagcgc atcggccggc 60
catcaccatc atcaccacgt ggggcccggc tcggacgaag tggatgcacc ggaacctccg 120
agcgcagatt atgcaagcct ggttgatgtt tttgttggca ccgaaggtga ttttggtaat 180
gatatgcctg cagcacaggc accgaatggt ctggcaaaag ttaatccgcg taccacaccg 240
ggtcgtaata ataccggtta tgattatgcc cagagcaaaa ttagcggttt tacccatacc 300
aatctggatg gtgttggtgg tagcggtggt ggtggtgatc tgctggttgt tccgaccagc 360
ggtagctata ccgcacgtcc gggtacaggc acctatgcac atccgtttag ccatgatgat 420
gaagatgcag gtccgggttt ttatagcgtt ggtctgggta atgttgcagg caccgatggt 480
gcaattaccg gtgctccggg tacaattgaa gcagaagttg cagcagcaac ccgtagcggt 540
gttcatcgtt atgcatttcc ggcaggtagc accccgagcc tggttgttga tctggaaacc 600
aataatacca gccgtcgtag cagcagcgtt caggttgaaa cccgtgcaga tggcaccgtt 660
gaactgagcg gtcaggttac cggctatttt tataatgcag cctataccct gtattatacc 720
gcacgcaccc tgcagcctgc aaccgttcag acctggggtg atgatgatcg tctggttgat 780
gcaaccgcac aggatggtgt tgataccggt gcaattctga cctttgatcc ggcagatgcc 840
ggtgaaattg gtctgcaggt taccctgtct ccggttagcg ttgaacaggc acgtattgat 900
cagcaggttg aactgggtga tctgagcttt gatgcaattc gtgatcgtac ccgtgcagaa 960
tggaatgcaa ccctgggtcg tgttgcaatt gatgcaagca ccgcaaccga tccgaccggt 1020
gaactgcagc gtctgtttta tacccatctg tatcgcatgt ttgcaatgcc gatgaatgca 1080
accagcacca gcggcaccta tcgtggtgtt gatggtgcag ttcatgcagc acagggcttt 1140
acctattatg atagctgggc aacctgggat gattttcgca aatttagcgt gattgcctat 1200
attgatccgg cactgtatcg tgatatggtt cagagcctgg tttacctgtt tgcagatgca 1260
gaagcaaccg gtacaggcgg tggtctgggt ggttttgttc atagcgttcc gaccgttcgt 1320
tgggaacgta gcagcgttgt tgttgcagat gcaattgcca aaggctttga tggttttgat 1380
cgtctggatg aagcatatcc ggcactgcag cgcctggttg gtcagtatag cgcagatgaa 1440
ctgcgtcgtg gttatgttgc aggtaatccg ggtgcaagcg ttcagcgtgg ttatgatcag 1500
tatggtctga gcgttattgc cgatgaactg ggtctgaccg aagaagcaga aaccctgcgc 1560
gaacaggcaa gctggccgat tgaaaaactg accaaaccgg gtgcatggac cgcagcagat 1620
ggtacacagg ttggtctgct gacaccgcgt gcagccgatg gtagctggca gagcgcagat 1680
catgccaaat ttgaagcagc aggtctgtat cagggcaccc tgtggcagta tcattggtat 1740
gatgcctatg atatggatgc actggttgaa gcaatgggtg gtcatgaagc agcccgtctg 1800
ggtatgcgtc atatgtttgg tgaacatgca ccggatgatg gtaaagcaat gctgcatagc 1860
aatgccaatg aaattgatct gcaggcaccg tacctgttta attataccgg tgaaccgagc 1920
ctgacccaga aatgggcacg tgcaatttat accaaagaaa cctggaatcg ctatattgca 1980
accggtagca gctctgcagt tccgtcaggt ggtggtgaat ttacacctcc gctgaaaacc 2040
aaagtttatc gtctggaccc tcgtggtatg ctgccgacca tggataatga tgcaggtaca 2100
atgagcacca tgtttgttgc agcagccgtt ggtctgtttc cggttaccgc aggtagcagc 2160
cagtttcagg ttggtagccc gttttttgat agcaccacca ttacctatga tgatggtagc 2220
gcatttaccg ttaccgcaga tggtgttagc gaagatgcct tttatgttca gagcgcaacc 2280
ctggatggtg caacctttgg taatacctgg gttgattatg caaccgttgt tggtggtgca 2340
gatctggcat ttcgtatggg tgaacagccg agcgattggg gcaccgatac cgcaccggca 2400
tttagcatga gcaccgccac cgatgaaccg gcagaaggtc ctcgcgttag cgcagaaccg 2460
accaccgtgc agaccggtga tggtggtgca ctggatgcaa ccgttaccct gacactggat 2520
ggcgcacgtc tggcagcacc ggcaggtaca gatctggtta ccagcggtgc agcaagcgtt 2580
gttggtctgc cggatggtgt taccgcagca gttaccgttg caagcccgac cgcactgacc 2640
gttagcctga ccggcaccgc atcagcagat gcacgttttt ttgtgcatct gcgtgatgca 2700
gcactggccg atggtgttgc agccgcaagc ctgcagggtc agggtgttag cgttcgttct 2760
ccgctgcgtc tgagcgttgc aagcgcagaa cgtgatgcac tggcagcact ggttgatgat 2820
gccgttctgg ttcgtcatgg taattatagc agcgttacct ttgatcgttt agcaccgctc 2880
tgacaaaagc acaggaagca ctgggcgacg aagcagcaac cagcattgca ctgcgttttg 2940
cagcagatcg tctgggtgca gcagcagatg cactggatct gaccggtggt ggttatcgta 3000
ccctggaagc agaacagagc gaagcatggt ctggtggtga actgaaaaat gaagccaata 3060
gcagcagcgg taatctgggt ggtgttcgta gcggtagctg ggttcagtat cgcgatatga 3120
cctttgaaac cgcagccggt gatacacctc cgcgttttct gaccgttcgt tatgatacca 3180
gctttgcacc gaccgatacc ccgagcaccg ttcgtgttca tgccggtgat gtttctggtc 3240
cggttgttgc aaccgttgat ctgaaaggca ccagcggttg gggtaaatat accgaagtta 3300
ccgcagaact gggtgatgtt caggccctgg ttgatgccca ggttgttacc tttgaactgc 3360
tggcaccgag cggtcgtagc tgggttggta attttgattg gtttcgcttt agcgcagaag 3420
atccggcagc accgggtcag cctggtgaaa gcccgaccgt taccattgaa gccgaagatt 3480
ggaccgcaag cagcggtcgt ggtctgaaaa aagaaagcag cacctggacc agcggtccgg 3540
tgaccaatgt tggtggtaca gcagatggtg attggattgc ctatggtgaa gttgatctgg 3600
gtgaactgcc gctgggcgaa ctgagcgttc attatgtgca taatagcaat cgcagcggta 3660
ataatagcgc actgagcgtt tatctggatg catttgatcc ggctaatccg ggtgaaccgt 3720
ttgttaccgt tccgctgccg accaccggta gcagttggac cgcagatggc acagccaccg 3780
ttgttctgcc ggaaaccgtg cagggcaccc atgaagtttt tgttcgtctg agcaccgaac 3840
cgtatgcaga tcatccgtat gttgcaaatc tggatagcct gacctttgca ccgggtggtc 3900
cgaccagcgt tgtggttgaa agcgaagcct ggaccagcaa ttctggtcgt ggcctgaaaa 3960
atgaatcttc tacctggacc tctggtccgg ttacaaatgt gggtggcacc gctgatggcg 4020
attggctggc atatggcgaa attgatctgg gcagcgcagc actggatcag ctgtctgtgc 4080
attatgttca taattctaat cgctctggtc gtaattctgc actgtctgtg tatctggatg 4140
cctttgatcc ggcaaatccg ggtgaaccgt ttgtgacagt gccgctggca aataccggta 4200
gctcttggac caccgatggt actgcagttg tggatctgcc gtctaccgtt cgtggtaaac 4260
atcaggtttg ggttcgtctg tctaccgaag catatgccga tcatccgtat gtggccaatc 4320
tggattctat gcgctttttt accgatgcat atgatgttga agttcctccg accgatacag 4380
cagcactggc agccgttgtt gatgcagcag gtacaccgga agcagaaatt gcacgttatg 4440
gtcgtattga tgcccgtgtt tttacccgtg aactggcagc agcacgtagc gttctggccg 4500
atgccggtgc aacacaggca caggcagatg aacgtgctcg tcgtctgggt ctggcaaccg 4560
atcagctggt tccggcagaa cgtcgtcgtc tggaaaatct ggttgccagc gcagaagcac 4620
tgaccgacga aggttattct ccggaaagct ggcaggcatt tcgtaccgca ctggctgctg 4680
caaccggcac cctggatgat gcagcagcat ctgatgaagc actgcatgat gcacgtctgg 4740
cgctgcaggg tgcagttgat gcactggaag aaccggcaga tgttgttctg gttgaagttg 4800
aagtttctcc gcgttgtctg gcaggtaaac cgtatgttgc cgttcgtgca gttaatgttt 4860
ctgatgcagc cgttgatgtt gaactggcaa gctctctggg cacccgtagc tttgttggtg 4920
tggcaccggg tgcgagcgca tatcagagct ttgcagcccg tagcgcaacc ggtgatctgg 4980
atgttaccgt gaccgcaacc ggtgcagatg gtactcagac cgttgaacag gttgtgaccg 5040
ttccgagctg tagctaataa 5060
<210> 7
<211> 1665
<212> PRT
<213> Cellulosimicrobium cellulans
<400> 7
Ala Leu Ala Val Val Gly Leu Ala Pro Ala Thr Ala Ala Ser Ala Ala
1 5 10 15
Pro Glu Pro Pro Ser Ala Asp Tyr Ala Ser Leu Val Asp Val Phe Val
20 25 30
Gly Thr Glu Gly Asp Phe Gly Asn Asp Met Pro Ala Ala Gln Ala Pro
35 40 45
Asn Gly Leu Ala Lys Val Asn Pro Arg Thr Thr Pro Gly Arg Asn Asn
50 55 60
Thr Gly Tyr Asp Tyr Ala Gln Ser Lys Ile Ser Gly Phe Thr His Thr
65 70 75 80
Asn Leu Asp Gly Val Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Asp Leu Leu Val
85 90 95
Val Pro Thr Ser Gly Ser Tyr Thr Ala Arg Pro Gly Thr Gly Thr Tyr
100 105 110
Ala His Pro Phe Ser His Asp Asp Glu Asp Ala Gly Pro Gly Phe Tyr
115 120 125
Ser Val Gly Leu Gly Asn Val Ala Gly Thr Asp Gly Ala Ile Thr Gly
130 135 140
Ala Pro Gly Thr Ile Glu Ala Glu Val Ala Ala Ala Thr Arg Ser Gly
145 150 155 160
Val His Arg Tyr Ala Phe Pro Ala Gly Ser Thr Pro Ser Leu Val Val
165 170 175
Asp Leu Glu Thr Asn Asn Thr Ser Arg Arg Ser Ser Ser Val Gln Val
180 185 190
Glu Thr Arg Ala Asp Gly Thr Val Glu Leu Ser Gly Gln Val Thr Gly
195 200 205
Tyr Phe Tyr Asn Ala Ala Tyr Thr Leu Tyr Tyr Thr Ala Arg Thr Leu
210 215 220
Gln Pro Ala Thr Val Gln Thr Trp Gly Asp Asp Asp Arg Leu Val Asp
225 230 235 240
Ala Thr Ala Gln Asp Gly Val Asp Thr Gly Ala Ile Leu Thr Phe Asp
245 250 255
Pro Ala Asp Ala Gly Glu Ile Gly Leu Gln Val Thr Leu Ser Pro Val
260 265 270
Ser Val Glu Gln Ala Arg Ile Asp Gln Gln Val Glu Leu Gly Asp Leu
275 280 285
Ser Phe Asp Ala Ile Arg Asp Arg Thr Arg Ala Glu Trp Asn Ala Thr
290 295 300
Leu Gly Arg Val Ala Ile Asp Ala Ser Thr Ala Thr Asp Pro Thr Gly
305 310 315 320
Glu Leu Gln Arg Leu Phe Tyr Thr His Leu Tyr Arg Met Phe Ala Met
325 330 335
Pro Met Asn Ala Thr Ser Thr Ser Gly Thr Tyr Arg Gly Val Asp Gly
340 345 350
Ala Val His Ala Ala Gln Gly Phe Thr Tyr Tyr Asp Ser Trp Ala Thr
355 360 365
Trp Asp Asp Phe Arg Lys Phe Ser Val Ile Ala Tyr Ile Asp Pro Ala
370 375 380
Leu Tyr Arg Asp Met Val Gln Ser Leu Val Tyr Leu Phe Ala Asp Ala
385 390 395 400
Glu Ala Thr Gly Thr Gly Gly Gly Leu Gly Gly Phe Val His Ser Val
405 410 415
Pro Thr Val Arg Trp Glu Arg Ser Ser Val Val Val Ala Asp Ala Ile
420 425 430
Ala Lys Gly Phe Asp Gly Phe Asp Arg Leu Asp Glu Ala Tyr Pro Ala
435 440 445
Leu Gln Arg Leu Val Gly Gln Tyr Ser Ala Asp Glu Leu Arg Arg Gly
450 455 460
Tyr Val Ala Gly Asn Pro Gly Ala Ser Val Gln Arg Gly Tyr Asp Gln
465 470 475 480
Tyr Gly Leu Ser Val Ile Ala Asp Glu Leu Gly Leu Thr Glu Glu Ala
485 490 495
Glu Thr Leu Arg Glu Gln Ala Ser Trp Pro Ile Glu Lys Leu Thr Lys
500 505 510
Pro Gly Ala Trp Thr Ala Ala Asp Gly Thr Gln Val Gly Leu Leu Thr
515 520 525
Pro Arg Ala Ala Asp Gly Ser Trp Gln Ser Ala Asp His Ala Lys Phe
530 535 540
Glu Ala Ala Gly Leu Tyr Gln Gly Thr Leu Trp Gln Tyr His Trp Tyr
545 550 555 560
Asp Ala Tyr Asp Met Asp Ala Leu Val Glu Ala Met Gly Gly His Glu
565 570 575
Ala Ala Arg Leu Gly Met Arg His Met Phe Gly Glu His Ala Pro Asp
580 585 590
Asp Gly Lys Ala Met Leu His Ser Asn Ala Asn Glu Ile Asp Leu Gln
595 600 605
Ala Pro Tyr Leu Phe Asn Tyr Thr Gly Glu Pro Ser Leu Thr Gln Lys
610 615 620
Trp Ala Arg Ala Ile Tyr Thr Lys Glu Thr Trp Asn Arg Tyr Ile Ala
625 630 635 640
Thr Gly Ser Ser Ser Ala Val Pro Ser Gly Gly Gly Glu Phe Thr Pro
645 650 655
Pro Leu Lys Thr Lys Val Tyr Arg Leu Asp Pro Arg Gly Met Leu Pro
660 665 670
Thr Met Asp Asn Asp Ala Gly Thr Met Ser Thr Met Phe Val Ala Ala
675 680 685
Ala Val Gly Leu Phe Pro Val Thr Ala Gly Ser Ser Gln Phe Gln Val
690 695 700
Gly Ser Pro Phe Phe Asp Ser Thr Thr Ile Thr Tyr Asp Asp Gly Ser
705 710 715 720
Ala Phe Thr Val Thr Ala Asp Gly Val Ser Glu Asp Ala Phe Tyr Val
725 730 735
Gln Ser Ala Thr Leu Asp Gly Ala Thr Phe Gly Asn Thr Trp Val Asp
740 745 750
Tyr Ala Thr Val Val Gly Gly Ala Asp Leu Ala Phe Arg Met Gly Glu
755 760 765
Gln Pro Ser Asp Trp Gly Thr Asp Thr Ala Pro Ala Phe Ser Met Ser
770 775 780
Thr Ala Thr Asp Glu Pro Ala Glu Gly Pro Arg Val Ser Ala Glu Pro
785 790 795 800
Thr Thr Val Gln Thr Gly Asp Gly Gly Ala Leu Asp Ala Thr Val Thr
805 810 815
Leu Thr Leu Asp Gly Ala Arg Leu Ala Ala Pro Ala Gly Thr Asp Leu
820 825 830
Val Thr Ser Gly Ala Ala Ser Val Val Gly Leu Pro Asp Gly Val Thr
835 840 845
Ala Ala Val Thr Val Ala Ser Pro Thr Ala Leu Thr Val Ser Leu Thr
850 855 860
Gly Thr Ala Ser Ala Asp Ala Arg Phe Phe Val His Leu Arg Asp Ala
865 870 875 880
Ala Leu Ala Asp Gly Val Ala Ala Ala Ser Leu Gln Gly Gln Gly Val
885 890 895
Ser Val Arg Ser Pro Leu Arg Leu Ser Val Ala Ser Ala Glu Arg Asp
900 905 910
Ala Leu Ala Ala Leu Val Asp Asp Ala Val Leu Val Arg His Gly Asn
915 920 925
Tyr Ser Ser Val Thr Phe Asp Arg Phe Ser Thr Ala Leu Thr Lys Ala
930 935 940
Gln Glu Ala Leu Gly Asp Glu Ala Ala Thr Ser Ile Ala Leu Arg Phe
945 950 955 960
Ala Ala Asp Arg Leu Gly Ala Ala Ala Asp Ala Leu Asp Leu Thr Gly
965 970 975
Gly Gly Tyr Arg Thr Leu Glu Ala Glu Gln Ser Glu Ala Trp Ser Gly
980 985 990
Gly Glu Leu Lys Asn Glu Ala Asn Ser Ser Ser Gly Asn Leu Gly Gly
995 1000 1005
Val Arg Ser Gly Ser Trp Val Gln Tyr Arg Asp Met Thr Phe Glu Thr
1010 1015 1020
Ala Ala Gly Asp Thr Pro Pro Arg Phe Leu Thr Val Arg Tyr Asp Thr
1025 1030 1035 1040
Ser Phe Ala Pro Thr Asp Thr Pro Ser Thr Val Arg Val His Ala Gly
1045 1050 1055
Asp Val Ser Gly Pro Val Val Ala Thr Val Asp Leu Lys Gly Thr Ser
1060 1065 1070
Gly Trp Gly Lys Tyr Thr Glu Val Thr Ala Glu Leu Gly Asp Val Gln
1075 1080 1085
Ala Leu Val Asp Ala Gln Val Val Thr Phe Glu Leu Leu Ala Pro Ser
1090 1095 1100
Gly Arg Ser Trp Val Gly Asn Phe Asp Trp Phe Arg Phe Ser Ala Glu
1105 1110 1115 1120
Asp Pro Ala Ala Pro Gly Gln Pro Gly Glu Ser Pro Thr Val Thr Ile
1125 1130 1135
Glu Ala Glu Asp Trp Thr Ala Ser Ser Gly Arg Gly Leu Lys Lys Glu
1140 1145 1150
Ser Ser Thr Trp Thr Ser Gly Pro Val Thr Asn Val Gly Gly Thr Ala
1155 1160 1165
Asp Gly Asp Trp Ile Ala Tyr Gly Glu Val Asp Leu Gly Glu Leu Pro
1170 1175 1180
Leu Gly Glu Leu Ser Val His Tyr Val His Asn Ser Asn Arg Ser Gly
1185 1190 1195 1200
Asn Asn Ser Ala Leu Ser Val Tyr Leu Asp Ala Phe Asp Pro Ala Asn
1205 1210 1215
Pro Gly Glu Pro Phe Val Thr Val Pro Leu Pro Thr Thr Gly Ser Ser
1220 1225 1230
Trp Thr Ala Asp Gly Thr Ala Thr Val Val Leu Pro Glu Thr Val Gln
1235 1240 1245
Gly Thr His Glu Val Phe Val Arg Leu Ser Thr Glu Pro Tyr Ala Asp
1250 1255 1260
His Pro Tyr Val Ala Asn Leu Asp Ser Leu Thr Phe Ala Pro Gly Gly
1265 1270 1275 1280
Pro Thr Ser Val Val Val Glu Ser Glu Ala Trp Thr Ser Asn Ser Gly
1285 1290 1295
Arg Gly Leu Lys Asn Glu Ser Ser Thr Trp Thr Ser Gly Pro Val Thr
1300 1305 1310
Asn Val Gly Gly Thr Ala Asp Gly Asp Trp Leu Ala Tyr Gly Glu Ile
1315 1320 1325
Asp Leu Gly Ser Ala Ala Leu Asp Gln Leu Ser Val His Tyr Val His
1330 1335 1340
Asn Ser Asn Arg Ser Gly Arg Asn Ser Ala Leu Ser Val Tyr Leu Asp
1345 1350 1355 1360
Ala Phe Asp Pro Ala Asn Pro Gly Glu Pro Phe Val Thr Val Pro Leu
1365 1370 1375
Ala Asn Thr Gly Ser Ser Trp Thr Thr Asp Gly Thr Ala Val Val Asp
1380 1385 1390
Leu Pro Ser Thr Val Arg Gly Lys His Gln Val Trp Val Arg Leu Ser
1395 1400 1405
Thr Glu Ala Tyr Ala Asp His Pro Tyr Val Ala Asn Leu Asp Ser Met
1410 1415 1420
Arg Phe Phe Thr Asp Ala Tyr Asp Val Glu Val Pro Pro Thr Asp Thr
1425 1430 1435 1440
Ala Ala Leu Ala Ala Val Val Asp Ala Ala Gly Thr Pro Glu Ala Glu
1445 1450 1455
Ile Ala Arg Tyr Gly Arg Ile Asp Ala Arg Val Phe Thr Arg Glu Leu
1460 1465 1470
Ala Ala Ala Arg Ser Val Leu Ala Asp Ala Gly Ala Thr Gln Ala Gln
1475 1480 1485
Ala Asp Glu Arg Ala Arg Arg Leu Gly Leu Ala Thr Asp Gln Leu Val
1490 1495 1500
Pro Ala Glu Arg Arg Arg Leu Glu Asn Leu Val Ala Ser Ala Glu Ala
1505 1510 1515 1520
Leu Thr Asp Glu Gly Tyr Ser Pro Glu Ser Trp Gln Ala Phe Arg Thr
1525 1530 1535
Ala Leu Ala Ala Ala Thr Gly Thr Leu Asp Asp Ala Ala Ala Ser Asp
1540 1545 1550
Glu Ala Leu His Asp Ala Arg Leu Ala Leu Gln Gly Ala Val Asp Ala
1555 1560 1565
Leu Glu Glu Pro Ala Asp Val Val Leu Val Glu Val Glu Val Ser Pro
1570 1575 1580
Arg Cys Leu Ala Gly Lys Pro Tyr Val Ala Val Arg Ala Val Asn Val
1585 1590 1595 1600
Ser Asp Ala Ala Val Asp Val Glu Leu Ala Ser Ser Leu Gly Thr Arg
1605 1610 1615
Ser Phe Val Gly Val Ala Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gln Ser Phe Ala
1620 1625 1630
Ala Arg Ser Ala Thr Gly Asp Leu Asp Val Thr Val Thr Ala Thr Gly
1635 1640 1645
Ala Asp Gly Thr Gln Thr Val Glu Gln Val Val Thr Val Pro Ser Cys
1650 1655 1660
Ser
1665
<210> 8
<211> 1650
<212> PRT
<213> Cellulosimicrobium cellulans
<400> 8
Ala Pro Glu Pro Pro Ser Ala Asp Tyr Ala Ser Leu Val Asp Val Phe
1 5 10 15
Val Gly Thr Glu Gly Asp Phe Gly Asn Asp Met Pro Ala Ala Gln Ala
20 25 30
Pro Asn Gly Leu Ala Lys Val Asn Pro Arg Thr Thr Pro Gly Arg Asn
35 40 45
Asn Thr Gly Tyr Asp Tyr Ala Gln Ser Lys Ile Ser Gly Phe Thr His
50 55 60
Thr Asn Leu Asp Gly Val Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Asp Leu Leu
65 70 75 80
Val Val Pro Thr Ser Gly Ser Tyr Thr Ala Arg Pro Gly Thr Gly Thr
85 90 95
Tyr Ala His Pro Phe Ser His Asp Asp Glu Asp Ala Gly Pro Gly Phe
100 105 110
Tyr Ser Val Gly Leu Gly Asn Val Ala Gly Thr Asp Gly Ala Ile Thr
115 120 125
Gly Ala Pro Gly Thr Ile Glu Ala Glu Val Ala Ala Ala Thr Arg Ser
130 135 140
Gly Val His Arg Tyr Ala Phe Pro Ala Gly Ser Thr Pro Ser Leu Val
145 150 155 160
Val Asp Leu Glu Thr Asn Asn Thr Ser Arg Arg Ser Ser Ser Val Gln
165 170 175
Val Glu Thr Arg Ala Asp Gly Thr Val Glu Leu Ser Gly Gln Val Thr
180 185 190
Gly Tyr Phe Tyr Asn Ala Ala Tyr Thr Leu Tyr Tyr Thr Ala Arg Thr
195 200 205
Leu Gln Pro Ala Thr Val Gln Thr Trp Gly Asp Asp Asp Arg Leu Val
210 215 220
Asp Ala Thr Ala Gln Asp Gly Val Asp Thr Gly Ala Ile Leu Thr Phe
225 230 235 240
Asp Pro Ala Asp Ala Gly Glu Ile Gly Leu Gln Val Thr Leu Ser Pro
245 250 255
Val Ser Val Glu Gln Ala Arg Ile Asp Gln Gln Val Glu Leu Gly Asp
260 265 270
Leu Ser Phe Asp Ala Ile Arg Asp Arg Thr Arg Ala Glu Trp Asn Ala
275 280 285
Thr Leu Gly Arg Val Ala Ile Asp Ala Ser Thr Ala Thr Asp Pro Thr
290 295 300
Gly Glu Leu Gln Arg Leu Phe Tyr Thr His Leu Tyr Arg Met Phe Ala
305 310 315 320
Met Pro Met Asn Ala Thr Ser Thr Ser Gly Thr Tyr Arg Gly Val Asp
325 330 335
Gly Ala Val His Ala Ala Gln Gly Phe Thr Tyr Tyr Asp Ser Trp Ala
340 345 350
Thr Trp Asp Asp Phe Arg Lys Phe Ser Val Ile Ala Tyr Ile Asp Pro
355 360 365
Ala Leu Tyr Arg Asp Met Val Gln Ser Leu Val Tyr Leu Phe Ala Asp
370 375 380
Ala Glu Ala Thr Gly Thr Gly Gly Gly Leu Gly Gly Phe Val His Ser
385 390 395 400
Val Pro Thr Val Arg Trp Glu Arg Ser Ser Val Val Val Ala Asp Ala
405 410 415
Ile Ala Lys Gly Phe Asp Gly Phe Asp Arg Leu Asp Glu Ala Tyr Pro
420 425 430
Ala Leu Gln Arg Leu Val Gly Gln Tyr Ser Ala Asp Glu Leu Arg Arg
435 440 445
Gly Tyr Val Ala Gly Asn Pro Gly Ala Ser Val Gln Arg Gly Tyr Asp
450 455 460
Gln Tyr Gly Leu Ser Val Ile Ala Asp Glu Leu Gly Leu Thr Glu Glu
465 470 475 480
Ala Glu Thr Leu Arg Glu Gln Ala Ser Trp Pro Ile Glu Lys Leu Thr
485 490 495
Lys Pro Gly Ala Trp Thr Ala Ala Asp Gly Thr Gln Val Gly Leu Leu
500 505 510
Thr Pro Arg Ala Ala Asp Gly Ser Trp Gln Ser Ala Asp His Ala Lys
515 520 525
Phe Glu Ala Ala Gly Leu Tyr Gln Gly Thr Leu Trp Gln Tyr His Trp
530 535 540
Tyr Asp Ala Tyr Asp Met Asp Ala Leu Val Glu Ala Met Gly Gly His
545 550 555 560
Glu Ala Ala Arg Leu Gly Met Arg His Met Phe Gly Glu His Ala Pro
565 570 575
Asp Asp Gly Lys Ala Met Leu His Ser Asn Ala Asn Glu Ile Asp Leu
580 585 590
Gln Ala Pro Tyr Leu Phe Asn Tyr Thr Gly Glu Pro Ser Leu Thr Gln
595 600 605
Lys Trp Ala Arg Ala Ile Tyr Thr Lys Glu Thr Trp Asn Arg Tyr Ile
610 615 620
Ala Thr Gly Ser Ser Ser Ala Val Pro Ser Gly Gly Gly Glu Phe Thr
625 630 635 640
Pro Pro Leu Lys Thr Lys Val Tyr Arg Leu Asp Pro Arg Gly Met Leu
645 650 655
Pro Thr Met Asp Asn Asp Ala Gly Thr Met Ser Thr Met Phe Val Ala
660 665 670
Ala Ala Val Gly Leu Phe Pro Val Thr Ala Gly Ser Ser Gln Phe Gln
675 680 685
Val Gly Ser Pro Phe Phe Asp Ser Thr Thr Ile Thr Tyr Asp Asp Gly
690 695 700
Ser Ala Phe Thr Val Thr Ala Asp Gly Val Ser Glu Asp Ala Phe Tyr
705 710 715 720
Val Gln Ser Ala Thr Leu Asp Gly Ala Thr Phe Gly Asn Thr Trp Val
725 730 735
Asp Tyr Ala Thr Val Val Gly Gly Ala Asp Leu Ala Phe Arg Met Gly
740 745 750
Glu Gln Pro Ser Asp Trp Gly Thr Asp Thr Ala Pro Ala Phe Ser Met
755 760 765
Ser Thr Ala Thr Asp Glu Pro Ala Glu Gly Pro Arg Val Ser Ala Glu
770 775 780
Pro Thr Thr Val Gln Thr Gly Asp Gly Gly Ala Leu Asp Ala Thr Val
785 790 795 800
Thr Leu Thr Leu Asp Gly Ala Arg Leu Ala Ala Pro Ala Gly Thr Asp
805 810 815
Leu Val Thr Ser Gly Ala Ala Ser Val Val Gly Leu Pro Asp Gly Val
820 825 830
Thr Ala Ala Val Thr Val Ala Ser Pro Thr Ala Leu Thr Val Ser Leu
835 840 845
Thr Gly Thr Ala Ser Ala Asp Ala Arg Phe Phe Val His Leu Arg Asp
850 855 860
Ala Ala Leu Ala Asp Gly Val Ala Ala Ala Ser Leu Gln Gly Gln Gly
865 870 875 880
Val Ser Val Arg Ser Pro Leu Arg Leu Ser Val Ala Ser Ala Glu Arg
885 890 895
Asp Ala Leu Ala Ala Leu Val Asp Asp Ala Val Leu Val Arg His Gly
900 905 910
Asn Tyr Ser Ser Val Thr Phe Asp Arg Phe Ser Thr Ala Leu Thr Lys
915 920 925
Ala Gln Glu Ala Leu Gly Asp Glu Ala Ala Thr Ser Ile Ala Leu Arg
930 935 940
Phe Ala Ala Asp Arg Leu Gly Ala Ala Ala Asp Ala Leu Asp Leu Thr
945 950 955 960
Gly Gly Gly Tyr Arg Thr Leu Glu Ala Glu Gln Ser Glu Ala Trp Ser
965 970 975
Gly Gly Glu Leu Lys Asn Glu Ala Asn Ser Ser Ser Gly Asn Leu Gly
980 985 990
Gly Val Arg Ser Gly Ser Trp Val Gln Tyr Arg Asp Met Thr Phe Glu
995 1000 1005
Thr Ala Ala Gly Asp Thr Pro Pro Arg Phe Leu Thr Val Arg Tyr Asp
1010 1015 1020
Thr Ser Phe Ala Pro Thr Asp Thr Pro Ser Thr Val Arg Val His Ala
1025 1030 1035 1040
Gly Asp Val Ser Gly Pro Val Val Ala Thr Val Asp Leu Lys Gly Thr
1045 1050 1055
Ser Gly Trp Gly Lys Tyr Thr Glu Val Thr Ala Glu Leu Gly Asp Val
1060 1065 1070
Gln Ala Leu Val Asp Ala Gln Val Val Thr Phe Glu Leu Leu Ala Pro
1075 1080 1085
Ser Gly Arg Ser Trp Val Gly Asn Phe Asp Trp Phe Arg Phe Ser Ala
1090 1095 1100
Glu Asp Pro Ala Ala Pro Gly Gln Pro Gly Glu Ser Pro Thr Val Thr
1105 1110 1115 1120
Ile Glu Ala Glu Asp Trp Thr Ala Ser Ser Gly Arg Gly Leu Lys Lys
1125 1130 1135
Glu Ser Ser Thr Trp Thr Ser Gly Pro Val Thr Asn Val Gly Gly Thr
1140 1145 1150
Ala Asp Gly Asp Trp Ile Ala Tyr Gly Glu Val Asp Leu Gly Glu Leu
1155 1160 1165
Pro Leu Gly Glu Leu Ser Val His Tyr Val His Asn Ser Asn Arg Ser
1170 1175 1180
Gly Asn Asn Ser Ala Leu Ser Val Tyr Leu Asp Ala Phe Asp Pro Ala
1185 1190 1195 1200
Asn Pro Gly Glu Pro Phe Val Thr Val Pro Leu Pro Thr Thr Gly Ser
1205 1210 1215
Ser Trp Thr Ala Asp Gly Thr Ala Thr Val Val Leu Pro Glu Thr Val
1220 1225 1230
Gln Gly Thr His Glu Val Phe Val Arg Leu Ser Thr Glu Pro Tyr Ala
1235 1240 1245
Asp His Pro Tyr Val Ala Asn Leu Asp Ser Leu Thr Phe Ala Pro Gly
1250 1255 1260
Gly Pro Thr Ser Val Val Val Glu Ser Glu Ala Trp Thr Ser Asn Ser
1265 1270 1275 1280
Gly Arg Gly Leu Lys Asn Glu Ser Ser Thr Trp Thr Ser Gly Pro Val
1285 1290 1295
Thr Asn Val Gly Gly Thr Ala Asp Gly Asp Trp Leu Ala Tyr Gly Glu
1300 1305 1310
Ile Asp Leu Gly Ser Ala Ala Leu Asp Gln Leu Ser Val His Tyr Val
1315 1320 1325
His Asn Ser Asn Arg Ser Gly Arg Asn Ser Ala Leu Ser Val Tyr Leu
1330 1335 1340
Asp Ala Phe Asp Pro Ala Asn Pro Gly Glu Pro Phe Val Thr Val Pro
1345 1350 1355 1360
Leu Ala Asn Thr Gly Ser Ser Trp Thr Thr Asp Gly Thr Ala Val Val
1365 1370 1375
Asp Leu Pro Ser Thr Val Arg Gly Lys His Gln Val Trp Val Arg Leu
1380 1385 1390
Ser Thr Glu Ala Tyr Ala Asp His Pro Tyr Val Ala Asn Leu Asp Ser
1395 1400 1405
Met Arg Phe Phe Thr Asp Ala Tyr Asp Val Glu Val Pro Pro Thr Asp
1410 1415 1420
Thr Ala Ala Leu Ala Ala Val Val Asp Ala Ala Gly Thr Pro Glu Ala
1425 1430 1435 1440
Glu Ile Ala Arg Tyr Gly Arg Ile Asp Ala Arg Val Phe Thr Arg Glu
1445 1450 1455
Leu Ala Ala Ala Arg Ser Val Leu Ala Asp Ala Gly Ala Thr Gln Ala
1460 1465 1470
Gln Ala Asp Glu Arg Ala Arg Arg Leu Gly Leu Ala Thr Asp Gln Leu
1475 1480 1485
Val Pro Ala Glu Arg Arg Arg Leu Glu Asn Leu Val Ala Ser Ala Glu
1490 1495 1500
Ala Leu Thr Asp Glu Gly Tyr Ser Pro Glu Ser Trp Gln Ala Phe Arg
1505 1510 1515 1520
Thr Ala Leu Ala Ala Ala Thr Gly Thr Leu Asp Asp Ala Ala Ala Ser
1525 1530 1535
Asp Glu Ala Leu His Asp Ala Arg Leu Ala Leu Gln Gly Ala Val Asp
1540 1545 1550
Ala Leu Glu Glu Pro Ala Asp Val Val Leu Val Glu Val Glu Val Ser
1555 1560 1565
Pro Arg Cys Leu Ala Gly Lys Pro Tyr Val Ala Val Arg Ala Val Asn
1570 1575 1580
Val Ser Asp Ala Ala Val Asp Val Glu Leu Ala Ser Ser Leu Gly Thr
1585 1590 1595 1600
Arg Ser Phe Val Gly Val Ala Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gln Ser Phe
1605 1610 1615
Ala Ala Arg Ser Ala Thr Gly Asp Leu Asp Val Thr Val Thr Ala Thr
1620 1625 1630
Gly Ala Asp Gly Thr Gln Thr Val Glu Gln Val Val Thr Val Pro Ser
1635 1640 1645
Cys Ser
1650
<210> 9
<211> 5388
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence encoding fusion of DsbA signal
sequence to Cellulosimicrobium cellulans
mannosidase 4
<400> 9
atgaaaaaga tttggctggc gctggctggt ttagttttag cgtttagcgc atcggccggc 60
catcaccatc atcaccacgt ggggcccggc tcggacgaag tggatgcaga accgggtgat 120
tttagcagca gctttgaatc tggcgatccg gcagcactgc cgaccaccgt tgcagaacgt 180
gatggtgcac cgtggcaggc aaatgttggt agctttaccg caggtctgcc tggtagcgtt 240
ctgggtcagc tgaaaggtgt taccgcaagc gcacagaatc tgccgaatga aggtgcagca 300
aatctggcag atggtagcag cggcaccaaa tggctggcat ttgcaagcac cggttgggtt 360
cgttatgaat ttgcagaacc ggttagcttt gttgcatata ccatgaccag cggtgatgat 420
gccgcaggtc gtgatccgaa aacctggacc gttgaaggta gcaatgatgg ttctacctgg 480
gcagcactgg atcgtcgtac cgatgaagat tttccgaatc gtcagcagac ccgtaccttt 540
gaactggaag caccgaccgc agcatatacc tatctgcgtc tgaatgttac cgcaaatagc 600
ggtgatagca ttgttcagct ggcaggttgg gatctgagcg cagatctgtc tgcaggtccg 660
agcgcagcac cgatgaccac caaagttggc accggtccgc gtgttagctt taccaataaa 720
gccggtgttg gttttagcgg tctgcatagc ctgcgttatg atggtagcca tctggccgat 780
ggtgaaacct atgcaaccaa tgtgctgtat gatgatgttg atgttgtggt tggtgaagat 840
acccgtctga gctataccat ttttccggaa ctgctggatg atctgcagta tccgagcacc 900
tatgcagcag ttgatgttct gtttaccgat ggcacctatc tgagcgatct gggtgcacgt 960
gatgcacatg aaaccgttgc aaccgcacag gcacagggtg aaggtaaaat tctgtatgcc 1020
gatcagtgga atagcgttcg tgttgatctg ggtgatgttg cagaaggtaa aaccgttgat 1080
caggttctgc tgggttatga taatccgggt ggtcatgcag gcaccaaatt tgcaggttgg 1140
ctggatgatg ttgaaattac cgcagaaccg gcaaccattg atggtagctc actggcaaat 1200
tatgttgata cccgtcgtgg caccctggca agcggtagct ttagccgtgg taataatatt 1260
ccggcaaccg caaccccgaa tggttttaat ttttggaccc cgtataccaa tgcaagcagc 1320
cagagctggc tgtatgaata tcataaagcc aataatgcga ataataaacc ggttctgcag 1380
ggttttggta ttagccatga accgagcccg tggatgggtg atcgtaatca gctgaccttt 1440
ctgccgagca ccgcaagcgg tacaccggat gcaaccctga gcacccgtgg tctggaattt 1500
gatcatgcag atgaaaccgc acgtccggat tattatggtg tgacctttac caatggtagc 1560
gcaattgaag caaccccgac cgatcatggt gcagttctgc gttttagcta tccgggtgca 1620
aaaggtcatg ttctggtgga taaagttgat ggtagcagta aactgaccta tgatcaggca 1680
accggcacca ttagcggttg ggttgaaaat ggtagcggtc tgagcgttgg tcgtacccgt 1740
atgtttgttg caggcacctt tgatcgtagc ccgaccgcag ttggcacagc agcaggtaat 1800
cgtgcagatg cacgttttgc aacctttgaa accagcagcg ataaaaccgt ggaactgcgt 1860
gttgcaacca gctttattag cctggatcag gcacgtaaaa atctggatct ggaagttacc 1920
ggtaaaacct ttaccgaagt taaagcagca gcagcacagg catggaatga tcgtctgggt 1980
gttattgaag ttgaaggtgc aagcgaagat cagctggtta ccctgtatag caatctgtat 2040
cgcctgaatc tgtatccgaa tagccagttt gaaaataccg gcaccgcaca ggaaccggtt 2100
tatcgttacg catctccggt tagcgcaacc accggtagcg caaccgatac ccagaccaat 2160
gccaaaattg tggatggcaa aatttatgtg aataatggct tttgggatac ctatcgtacc 2220
gcatggcctg catatagcct gctgtatccg gaactggcag cagaactggt tgatggtttt 2280
gttcagcagt atcgtgatgg tggttggatt gcacgttgga gcagtccggg ttatgcagat 2340
ctgatgaccg gtacaagctc tgatgttgca tttgcagatg cctatctgaa aggtagcctg 2400
ccgaccggta cagcactgga agcatatgat gcagcactgc gtaatgcaac cgttgcacct 2460
ccgagcaatg cagttggtcg taaaggtctg cagacaagcc cgtttctggg ttttacaccg 2520
gaaagcaccc atgaaagcgt tagctggggt ctggaaggtc tggttaatga ttttggcatt 2580
ggcaatatgg ctgcagcact ggcagaagat ccggcaacac cggaagaacg tcgtgaaacc 2640
ctgcgtgaag aaagcgcata ttttctggaa cgtgccaccc attatgttga actgtttgat 2700
ccggaagtgg atttttttgt tccgcgtcat gaagatggta catgggcagt tgatccggaa 2760
acctatgatc cggaagcatg gggtggtggt tataccgaaa ccaatggctg gaattttgca 2820
tttcatgcac cgcaggatgg tcagggtctg gcaaatctgt atggtggtaa acagggtctg 2880
gaagataaac tggatgaatt ttttagcaca ccggaaaaag gtgcaggtaa tggtggtatt 2940
catgaacagc gtgaagcacg tgatgttcgt atgggtcagt ggggtatgag caatcaggtt 3000
agccatcata ttccgtggct gtatgatgca gccggtgctc cgagcaaagc acaggaaaaa 3060
gttcgcgaag ttacccgtcg tctgtttgtt ggtagcgaaa ttggtcaggg ttatccgggt 3120
gatgaagata atggtgaaat gtcctcctgg tggatttttg caagcctggg tttttatccg 3180
ctgcaggttg gtagcgatca gtatgcagtt ggttctccgc tgtttgataa agcaaccgtt 3240
catctgccgg atggtgatct ggttgttaat gccgaaaata atagcgtgga taatgtgtat 3300
gttcagagcc tggcagttga tggtgaagca cgtaccagca ccagcctgag ccaggcagat 3360
ctgagcggtg gcaccaccct ggattttgtt atgggtccgg aaccgagcga ttggggcacc 3420
ggtgaagatg atgcacctcc gtcactgacc gaaggtgatg aacctccgac accggttcag 3480
gatgcaacca ccgcaggcct gggcaccacc accgttgccg atggtgatgc caccacctct 3540
gcagcagccc tgaccgataa taccagcggc acccgtacca cctttgcaac caccaccccg 3600
agcattacat gggcaggtaa tggcattcgt ccgaccgttg gtagctatac cctgacctct 3660
ggtgcaagcg gcaccgcaag cccgtctgca tggaccctgg aaggttctga tgatggcgaa 3720
acctggacca cactggatga acgtagcggt gaacagtttc gttgggcact gcagacccgt 3780
ccgtttaccg ttgccgaacc gaccgcattt gcacgttatc gtgttaccgt taccgcaacc 3840
agcggttctg gtgcactgag cctggcagaa gttgaactgc tggcagatcc gaaagaaagc 3900
ggtgcagaag aactgaccct gtctgcagca ccggatcgtg atggcgttac cggtcgtgaa 3960
gttagcggtt cttttgcaac cctgaccggt gttgaaggtg atgttgccgc actggatgtt 4020
caggttgcat ttggtgatgg tagcgaaccg gttgcaggta cactgcgtgc cggtgcattt 4080
ggtggttatg cagttgatgc agcacatacc tggaccgcac cgggtgttta tccggttacc 4140
gtgaccgtta gcggtgaagg tattgaaacc gttagcgcaa gcagctatgt tagcgttagc 4200
ctgctgcgtg aaggttctct gctggcagca tatgataatg tgtgcattgg tgatgcaggt 4260
acaaccgttg gttcttgtga tggtcagggc gttttttttg atcgtgcaca gctggcagca 4320
aaaggttttg tgcagggtga acgtgcaacc gttccgggta cagatctggc atttgatgtt 4380
ccggcagttc cggctggtca gcctgataat gcaaccggtg atggtcagac cattgaactg 4440
gatgttccgg ctgatgcaga acagctgagc gttattggca ccggcaccga aaaaaatcag 4500
caggcaaccg gtacactgac ctttgatgat ggttctaccc agccgattga tctgagcttt 4560
ggtgattgga gcggtgcagc acgtaatccg gtgtttggta atattccggt tgcagttacc 4620
gatagccgtc tgcgtggtgg ttctccgcag accggtacac cggcagcatt ttttgccacc 4680
gcaccgatta ccctgccgga aggtaaacgt ccggttagcc tgaccctgcc ggatcagcct 4740
ggtgaactga gccgtgatgg tcgtattcat gttgttgcag ttgcacatga tggcaccttt 4800
gcagaacatc ctgcactgga agtgaccgca gcagaaggtg ttaccctggc agttggtcag 4860
acctcagatg ttgcactggc acaggttgcc ggtggtcgtg aaggtgcaga tctgcgtgcc 4920
gcagttacct ggggtgatgg ttctgatgtg gcagccggtg ccgttaccga tggtagcgtt 4980
agcggtagcc atgcatatac cgcagcaggc acctataccg catatgttgt tgtggatgat 5040
ggttggacca gccaggttgt tgaagttccg gtgaccgtta cagaagccga accggcactg 5100
gccgttgatg tcaccgttag cacccgttgc ctggcaggta aagcatatgt tgcagtgcgt 5160
gcagaaaatg gtgaagatgt tccgctggca attcgtctgg ttaccccgtt tggcaccaaa 5220
gaagttgcag cagttgctcc gggagccaat gcatatcaga gctttgcaac ccgtgttacc 5280
gcagttgaag caggcaccgt taccgttgaa gccacccgtg gcaccggtga tgaagaagtt 5340
accgccagca ttcaggcaga ttatgcagcc gttacctgcg gttaataa 5388
<210> 10
<211> 3622
<212> PRT
<213> Cellulosimicrobium cellulans
<400> 10
Met Thr Arg Pro Leu Pro Pro Gly Arg Ala Val Ala Arg Ser Gly Ser
1 5 10 15
Gly Arg Ala Arg Pro Leu Gly Leu Val Leu Ala Ala Ala Leu Ala Val
20 25 30
Pro Leu Gly Val Pro Leu Ala Ala Pro Ala Gly Ala Leu Ala Ala Ala
35 40 45
Pro Ala Ala Ala Ala Glu Pro Gly Asp Phe Ser Ser Ser Phe Glu Ser
50 55 60
Gly Asp Pro Ala Ala Leu Pro Thr Thr Val Ala Glu Arg Asp Gly Ala
65 70 75 80
Pro Trp Gln Ala Asn Val Gly Ser Phe Thr Ala Gly Leu Pro Gly Ser
85 90 95
Val Leu Gly Gln Leu Lys Gly Val Thr Ala Ser Ala Gln Asn Leu Pro
100 105 110
Asn Glu Gly Ala Ala Asn Leu Ala Asp Gly Ser Ser Gly Thr Lys Trp
115 120 125
Leu Ala Phe Ala Ser Thr Gly Trp Val Arg Tyr Glu Phe Ala Glu Pro
130 135 140
Val Ser Phe Val Ala Tyr Thr Met Thr Ser Gly Asp Asp Ala Ala Gly
145 150 155 160
Arg Asp Pro Lys Thr Trp Thr Val Glu Gly Ser Asn Asp Gly Ser Thr
165 170 175
Trp Ala Ala Leu Asp Arg Arg Thr Asp Glu Asp Phe Pro Asn Arg Gln
180 185 190
Gln Thr Arg Thr Phe Glu Leu Glu Ala Pro Thr Ala Ala Tyr Thr Tyr
195 200 205
Leu Arg Leu Asn Val Thr Ala Asn Ser Gly Asp Ser Ile Val Gln Leu
210 215 220
Ala Gly Trp Asp Leu Ser Ala Asp Leu Ser Ala Gly Pro Ser Ala Ala
225 230 235 240
Pro Met Thr Thr Lys Val Gly Thr Gly Pro Arg Val Ser Phe Thr Asn
245 250 255
Lys Ala Gly Val Gly Phe Ser Gly Leu His Ser Leu Arg Tyr Asp Gly
260 265 270
Ser His Leu Ala Asp Gly Glu Thr Tyr Ala Thr Asn Val Leu Tyr Asp
275 280 285
Asp Val Asp Val Val Val Gly Glu Asp Thr Arg Leu Ser Tyr Thr Ile
290 295 300
Phe Pro Glu Leu Leu Asp Asp Leu Gln Tyr Pro Ser Thr Tyr Ala Ala
305 310 315 320
Val Asp Val Leu Phe Thr Asp Gly Thr Tyr Leu Ser Asp Leu Gly Ala
325 330 335
Arg Asp Ala His Glu Thr Val Ala Thr Ala Gln Ala Gln Gly Glu Gly
340 345 350
Lys Ile Leu Tyr Ala Asp Gln Trp Asn Ser Val Arg Val Asp Leu Gly
355 360 365
Asp Val Ala Glu Gly Lys Thr Val Asp Gln Val Leu Leu Gly Tyr Asp
370 375 380
Asn Pro Gly Gly His Ala Gly Thr Lys Phe Ala Gly Trp Leu Asp Asp
385 390 395 400
Val Glu Ile Thr Ala Glu Pro Ala Thr Ile Asp Gly Ser Ser Leu Ala
405 410 415
Asn Tyr Val Asp Thr Arg Arg Gly Thr Leu Ala Ser Gly Ser Phe Ser
420 425 430
Arg Gly Asn Asn Ile Pro Ala Thr Ala Thr Pro Asn Gly Phe Asn Phe
435 440 445
Trp Thr Pro Tyr Thr Asn Ala Ser Ser Gln Ser Trp Leu Tyr Glu Tyr
450 455 460
His Lys Ala Asn Asn Ala Asn Asn Lys Pro Val Leu Gln Gly Phe Gly
465 470 475 480
Ile Ser His Glu Pro Ser Pro Trp Met Gly Asp Arg Asn Gln Leu Thr
485 490 495
Phe Leu Pro Ser Thr Ala Ser Gly Thr Pro Asp Ala Thr Leu Ser Thr
500 505 510
Arg Gly Leu Glu Phe Asp His Ala Asp Glu Thr Ala Arg Pro Asp Tyr
515 520 525
Tyr Gly Val Thr Phe Thr Asn Gly Ser Ala Ile Glu Ala Thr Pro Thr
530 535 540
Asp His Gly Ala Val Leu Arg Phe Ser Tyr Pro Gly Ala Lys Gly His
545 550 555 560
Val Leu Val Asp Lys Val Asp Gly Ser Ser Lys Leu Thr Tyr Asp Gln
565 570 575
Ala Thr Gly Thr Ile Ser Gly Trp Val Glu Asn Gly Ser Gly Leu Ser
580 585 590
Val Gly Arg Thr Arg Met Phe Val Ala Gly Thr Phe Asp Arg Ser Pro
595 600 605
Thr Ala Val Gly Thr Ala Ala Gly Asn Arg Ala Asp Ala Arg Phe Ala
610 615 620
Thr Phe Glu Thr Ser Ser Asp Lys Thr Val Glu Leu Arg Val Ala Thr
625 630 635 640
Ser Phe Ile Ser Leu Asp Gln Ala Arg Lys Asn Leu Asp Leu Glu Val
645 650 655
Thr Gly Lys Thr Phe Thr Glu Val Lys Ala Ala Ala Ala Gln Ala Trp
660 665 670
Asn Asp Arg Leu Gly Val Ile Glu Val Glu Gly Ala Ser Glu Asp Gln
675 680 685
Leu Val Thr Leu Tyr Ser Asn Leu Tyr Arg Leu Asn Leu Tyr Pro Asn
690 695 700
Ser Gln Phe Glu Asn Thr Gly Thr Ala Gln Glu Pro Val Tyr Arg Tyr
705 710 715 720
Ala Ser Pro Val Ser Ala Thr Thr Gly Ser Ala Thr Asp Thr Gln Thr
725 730 735
Asn Ala Lys Ile Val Asp Gly Lys Ile Tyr Val Asn Asn Gly Phe Trp
740 745 750
Asp Thr Tyr Arg Thr Ala Trp Pro Ala Tyr Ser Leu Leu Tyr Pro Glu
755 760 765
Leu Ala Ala Glu Leu Val Asp Gly Phe Val Gln Gln Tyr Arg Asp Gly
770 775 780
Gly Trp Ile Ala Arg Trp Ser Ser Pro Gly Tyr Ala Asp Leu Met Thr
785 790 795 800
Gly Thr Ser Ser Asp Val Ala Phe Ala Asp Ala Tyr Leu Lys Gly Ser
805 810 815
Leu Pro Thr Gly Thr Ala Leu Glu Ala Tyr Asp Ala Ala Leu Arg Asn
820 825 830
Ala Thr Val Ala Pro Pro Ser Asn Ala Val Gly Arg Lys Gly Leu Gln
835 840 845
Thr Ser Pro Phe Leu Gly Phe Thr Pro Glu Ser Thr His Glu Ser Val
850 855 860
Ser Trp Gly Leu Glu Gly Leu Val Asn Asp Phe Gly Ile Gly Asn Met
865 870 875 880
Ala Ala Ala Leu Ala Glu Asp Pro Ala Thr Pro Glu Glu Arg Arg Glu
885 890 895
Thr Leu Arg Glu Glu Ser Ala Tyr Phe Leu Glu Arg Ala Thr His Tyr
900 905 910
Val Glu Leu Phe Asp Pro Glu Val Asp Phe Phe Val Pro Arg His Glu
915 920 925
Asp Gly Thr Trp Ala Val Asp Pro Glu Thr Tyr Asp Pro Glu Ala Trp
930 935 940
Gly Gly Gly Tyr Thr Glu Thr Asn Gly Trp Asn Phe Ala Phe His Ala
945 950 955 960
Pro Gln Asp Gly Gln Gly Leu Ala Asn Leu Tyr Gly Gly Lys Gln Gly
965 970 975
Leu Glu Asp Lys Leu Asp Glu Phe Phe Ser Thr Pro Glu Lys Gly Ala
980 985 990
Gly Asn Gly Gly Ile His Glu Gln Arg Glu Ala Arg Asp Val Arg Met
995 1000 1005
Gly Gln Trp Gly Met Ser Asn Gln Val Ser His His Ile Pro Trp Leu
1010 1015 1020
Tyr Asp Ala Ala Gly Ala Pro Ser Lys Ala Gln Glu Lys Val Arg Glu
1025 1030 1035 1040
Val Thr Arg Arg Leu Phe Val Gly Ser Glu Ile Gly Gln Gly Tyr Pro
1045 1050 1055
Gly Asp Glu Asp Asn Gly Glu Met Ser Ser Trp Trp Ile Phe Ala Ser
1060 1065 1070
Leu Gly Phe Tyr Pro Leu Gln Val Gly Ser Asp Gln Tyr Ala Val Gly
1075 1080 1085
Ser Pro Leu Phe Asp Lys Ala Thr Val His Leu Pro Asp Gly Asp Leu
1090 1095 1100
Val Val Asn Ala Glu Asn Asn Ser Val Asp Asn Val Tyr Val Gln Ser
1105 1110 1115 1120
Leu Ala Val Asp Gly Glu Ala Arg Thr Ser Thr Ser Leu Ser Gln Ala
1125 1130 1135
Asp Leu Ser Gly Gly Thr Thr Leu Asp Phe Val Met Gly Pro Glu Pro
1140 1145 1150
Ser Asp Trp Gly Thr Gly Glu Asp Asp Ala Pro Pro Ser Leu Thr Glu
1155 1160 1165
Gly Asp Glu Pro Pro Thr Pro Val Gln Asp Ala Thr Thr Ala Gly Leu
1170 1175 1180
Gly Thr Thr Thr Val Ala Asp Gly Asp Ala Thr Thr Ser Ala Ala Ala
1185 1190 1195 1200
Leu Thr Asp Asn Thr Ser Gly Thr Arg Thr Thr Phe Ala Thr Thr Thr
1205 1210 1215
Pro Ser Ile Thr Trp Ala Gly Asn Gly Ile Arg Pro Thr Val Gly Ser
1220 1225 1230
Tyr Thr Leu Thr Ser Gly Ala Ser Gly Thr Ala Ser Pro Ser Ala Trp
1235 1240 1245
Thr Leu Glu Gly Ser Asp Asp Gly Glu Thr Trp Thr Thr Leu Asp Glu
1250 1255 1260
Arg Ser Gly Glu Gln Phe Arg Trp Ala Leu Gln Thr Arg Pro Phe Thr
1265 1270 1275 1280
Val Ala Glu Pro Thr Ala Phe Ala Arg Tyr Arg Val Thr Val Thr Ala
1285 1290 1295
Thr Ser Gly Ser Gly Ala Leu Ser Leu Ala Glu Val Glu Leu Leu Ala
1300 1305 1310
Asp Pro Lys Glu Ser Gly Ala Glu Glu Leu Thr Leu Ser Ala Ala Pro
1315 1320 1325
Asp Arg Asp Gly Val Thr Gly Arg Glu Val Ser Gly Ser Phe Ala Thr
1330 1335 1340
Leu Thr Gly Val Glu Gly Asp Val Ala Ala Leu Asp Val Gln Val Ala
1345 1350 1355 1360
Phe Gly Asp Gly Ser Glu Pro Val Ala Gly Thr Leu Arg Ala Gly Ala
1365 1370 1375
Phe Gly Gly Tyr Ala Val Asp Ala Ala His Thr Trp Thr Ala Pro Gly
1380 1385 1390
Val Tyr Pro Val Thr Val Thr Val Ser Gly Glu Gly Ile Glu Thr Val
1395 1400 1405
Ser Ala Ser Ser Tyr Val Ser Val Ser Leu Leu Arg Glu Gly Ser Leu
1410 1415 1420
Leu Ala Ala Tyr Asp Asn Val Cys Ile Gly Asp Ala Gly Thr Thr Val
1425 1430 1435 1440
Gly Ser Cys Asp Gly Gln Gly Val Phe Phe Asp Arg Ala Gln Leu Ala
1445 1450 1455
Ala Lys Gly Phe Val Gln Gly Glu Arg Ala Thr Val Pro Gly Thr Asp
1460 1465 1470
Leu Ala Phe Asp Val Pro Ala Val Pro Ala Gly Gln Pro Asp Asn Ala
1475 1480 1485
Thr Gly Asp Gly Gln Thr Ile Glu Leu Asp Val Pro Ala Asp Ala Glu
1490 1495 1500
Gln Leu Ser Val Ile Gly Thr Gly Thr Glu Lys Asn Gln Gln Ala Thr
1505 1510 1515 1520
Gly Thr Leu Thr Phe Asp Asp Gly Ser Thr Gln Pro Ile Asp Leu Ser
1525 1530 1535
Phe Gly Asp Trp Ser Gly Ala Ala Arg Asn Pro Val Phe Gly Asn Ile
1540 1545 1550
Pro Val Ala Val Thr Asp Ser Arg Leu Arg Gly Gly Ser Pro Gln Thr
1555 1560 1565
Gly Thr Pro Ala Ala Phe Phe Ala Thr Ala Pro Ile Thr Leu Pro Glu
1570 1575 1580
Gly Lys Arg Pro Val Ser Leu Thr Leu Pro Asp Gln Pro Gly Glu Leu
1585 1590 1595 1600
Ser Arg Asp Gly Arg Ile His Val Val Ala Val Ala His Asp Gly Thr
1605 1610 1615
Phe Ala Glu His Pro Ala Leu Glu Val Thr Ala Ala Glu Gly Val Thr
1620 1625 1630
Leu Ala Val Gly Gln Thr Ser Asp Val Ala Leu Ala Gln Val Ala Gly
1635 1640 1645
Gly Arg Glu Gly Ala Asp Leu Arg Ala Ala Val Thr Trp Gly Asp Gly
1650 1655 1660
Ser Asp Val Ala Ala Gly Ala Val Thr Asp Gly Ser Val Ser Gly Ser
1665 1670 1675 1680
His Ala Tyr Thr Ala Ala Gly Thr Tyr Thr Ala Tyr Val Val Val Asp
1685 1690 1695
Asp Gly Trp Thr Ser Gln Val Val Glu Val Pro Val Thr Val Thr Glu
1700 1705 1710
Ala Glu Pro Ala Leu Ala Val Asp Val Thr Val Ser Thr Arg Cys Leu
1715 1720 1725
Ala Gly Lys Ala Tyr Val Ala Val Arg Ala Glu Asn Gly Glu Asp Val
1730 1735 1740
Pro Leu Ala Ile Arg Leu Val Thr Pro Phe Gly Thr Lys Glu Val Ala
1745 1750 1755 1760
Ala Val Ala Pro Gly Ala Asn Ala Tyr Gln Ser Phe Ala Thr Arg Val
1765 1770 1775
Thr Ala Val Glu Ala Gly Thr Val Thr Val Glu Ala Thr Arg Gly Thr
1780 1785 1790
Gly Asp Glu Glu Val Thr Ala Ser Ile Gln Ala Asp Tyr Ala Ala Val
1795 1800 1805
Thr Cys Gly Met Thr Arg Pro Leu Pro Pro Gly Arg Ala Val Ala Arg
1810 1815 1820
Ser Gly Ser Gly Arg Ala Arg Pro Leu Gly Leu Val Leu Ala Ala Ala
1825 1830 1835 1840
Leu Ala Val Pro Leu Gly Val Pro Leu Ala Ala Pro Ala Gly Ala Leu
1845 1850 1855
Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ala Glu Pro Gly Asp Phe Ser Ser Ser
1860 1865 1870
Phe Glu Ser Gly Asp Pro Ala Ala Leu Pro Thr Thr Val Ala Glu Arg
1875 1880 1885
Asp Gly Ala Pro Trp Gln Ala Asn Val Gly Ser Phe Thr Ala Gly Leu
1890 1895 1900
Pro Gly Ser Val Leu Gly Gln Leu Lys Gly Val Thr Ala Ser Ala Gln
1905 1910 1915 1920
Asn Leu Pro Asn Glu Gly Ala Ala Asn Leu Ala Asp Gly Ser Ser Gly
1925 1930 1935
Thr Lys Trp Leu Ala Phe Ala Ser Thr Gly Trp Val Arg Tyr Glu Phe
1940 1945 1950
Ala Glu Pro Val Ser Phe Val Ala Tyr Thr Met Thr Ser Gly Asp Asp
1955 1960 1965
Ala Ala Gly Arg Asp Pro Lys Thr Trp Thr Val Glu Gly Ser Asn Asp
1970 1975 1980
Gly Ser Thr Trp Ala Ala Leu Asp Arg Arg Thr Asp Glu Asp Phe Pro
1985 1990 1995 2000
Asn Arg Gln Gln Thr Arg Thr Phe Glu Leu Glu Ala Pro Thr Ala Ala
2005 2010 2015
Tyr Thr Tyr Leu Arg Leu Asn Val Thr Ala Asn Ser Gly Asp Ser Ile
2020 2025 2030
Val Gln Leu Ala Gly Trp Asp Leu Ser Ala Asp Leu Ser Ala Gly Pro
2035 2040 2045
Ser Ala Ala Pro Met Thr Thr Lys Val Gly Thr Gly Pro Arg Val Ser
2050 2055 2060
Phe Thr Asn Lys Ala Gly Val Gly Phe Ser Gly Leu His Ser Leu Arg
2065 2070 2075 2080
Tyr Asp Gly Ser His Leu Ala Asp Gly Glu Thr Tyr Ala Thr Asn Val
2085 2090 2095
Leu Tyr Asp Asp Val Asp Val Val Val Gly Glu Asp Thr Arg Leu Ser
2100 2105 2110
Tyr Thr Ile Phe Pro Glu Leu Leu Asp Asp Leu Gln Tyr Pro Ser Thr
2115 2120 2125
Tyr Ala Ala Val Asp Val Leu Phe Thr Asp Gly Thr Tyr Leu Ser Asp
2130 2135 2140
Leu Gly Ala Arg Asp Ala His Glu Thr Val Ala Thr Ala Gln Ala Gln
2145 2150 2155 2160
Gly Glu Gly Lys Ile Leu Tyr Ala Asp Gln Trp Asn Ser Val Arg Val
2165 2170 2175
Asp Leu Gly Asp Val Ala Glu Gly Lys Thr Val Asp Gln Val Leu Leu
2180 2185 2190
Gly Tyr Asp Asn Pro Gly Gly His Ala Gly Thr Lys Phe Ala Gly Trp
2195 2200 2205
Leu Asp Asp Val Glu Ile Thr Ala Glu Pro Ala Thr Ile Asp Gly Ser
2210 2215 2220
Ser Leu Ala Asn Tyr Val Asp Thr Arg Arg Gly Thr Leu Ala Ser Gly
2225 2230 2235 2240
Ser Phe Ser Arg Gly Asn Asn Ile Pro Ala Thr Ala Thr Pro Asn Gly
2245 2250 2255
Phe Asn Phe Trp Thr Pro Tyr Thr Asn Ala Ser Ser Gln Ser Trp Leu
2260 2265 2270
Tyr Glu Tyr His Lys Ala Asn Asn Ala Asn Asn Lys Pro Val Leu Gln
2275 2280 2285
Gly Phe Gly Ile Ser His Glu Pro Ser Pro Trp Met Gly Asp Arg Asn
2290 2295 2300
Gln Leu Thr Phe Leu Pro Ser Thr Ala Ser Gly Thr Pro Asp Ala Thr
2305 2310 2315 2320
Leu Ser Thr Arg Gly Leu Glu Phe Asp His Ala Asp Glu Thr Ala Arg
2325 2330 2335
Pro Asp Tyr Tyr Gly Val Thr Phe Thr Asn Gly Ser Ala Ile Glu Ala
2340 2345 2350
Thr Pro Thr Asp His Gly Ala Val Leu Arg Phe Ser Tyr Pro Gly Ala
2355 2360 2365
Lys Gly His Val Leu Val Asp Lys Val Asp Gly Ser Ser Lys Leu Thr
2370 2375 2380
Tyr Asp Gln Ala Thr Gly Thr Ile Ser Gly Trp Val Glu Asn Gly Ser
2385 2390 2395 2400
Gly Leu Ser Val Gly Arg Thr Arg Met Phe Val Ala Gly Thr Phe Asp
2405 2410 2415
Arg Ser Pro Thr Ala Val Gly Thr Ala Ala Gly Asn Arg Ala Asp Ala
2420 2425 2430
Arg Phe Ala Thr Phe Glu Thr Ser Ser Asp Lys Thr Val Glu Leu Arg
2435 2440 2445
Val Ala Thr Ser Phe Ile Ser Leu Asp Gln Ala Arg Lys Asn Leu Asp
2450 2455 2460
Leu Glu Val Thr Gly Lys Thr Phe Thr Glu Val Lys Ala Ala Ala Ala
2465 2470 2475 2480
Gln Ala Trp Asn Asp Arg Leu Gly Val Ile Glu Val Glu Gly Ala Ser
2485 2490 2495
Glu Asp Gln Leu Val Thr Leu Tyr Ser Asn Leu Tyr Arg Leu Asn Leu
2500 2505 2510
Tyr Pro Asn Ser Gln Phe Glu Asn Thr Gly Thr Ala Gln Glu Pro Val
2515 2520 2525
Tyr Arg Tyr Ala Ser Pro Val Ser Ala Thr Thr Gly Ser Ala Thr Asp
2530 2535 2540
Thr Gln Thr Asn Ala Lys Ile Val Asp Gly Lys Ile Tyr Val Asn Asn
2545 2550 2555 2560
Gly Phe Trp Asp Thr Tyr Arg Thr Ala Trp Pro Ala Tyr Ser Leu Leu
2565 2570 2575
Tyr Pro Glu Leu Ala Ala Glu Leu Val Asp Gly Phe Val Gln Gln Tyr
2580 2585 2590
Arg Asp Gly Gly Trp Ile Ala Arg Trp Ser Ser Pro Gly Tyr Ala Asp
2595 2600 2605
Leu Met Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Ala Phe Ala Asp Ala Tyr Leu
2610 2615 2620
Lys Gly Ser Leu Pro Thr Gly Thr Ala Leu Glu Ala Tyr Asp Ala Ala
2625 2630 2635 2640
Leu Arg Asn Ala Thr Val Ala Pro Pro Ser Asn Ala Val Gly Arg Lys
2645 2650 2655
Gly Leu Gln Thr Ser Pro Phe Leu Gly Phe Thr Pro Glu Ser Thr His
2660 2665 2670
Glu Ser Val Ser Trp Gly Leu Glu Gly Leu Val Asn Asp Phe Gly Ile
2675 2680 2685
Gly Asn Met Ala Ala Ala Leu Ala Glu Asp Pro Ala Thr Pro Glu Glu
2690 2695 2700
Arg Arg Glu Thr Leu Arg Glu Glu Ser Ala Tyr Phe Leu Glu Arg Ala
2705 2710 2715 2720
Thr His Tyr Val Glu Leu Phe Asp Pro Glu Val Asp Phe Phe Val Pro
2725 2730 2735
Arg His Glu Asp Gly Thr Trp Ala Val Asp Pro Glu Thr Tyr Asp Pro
2740 2745 2750
Glu Ala Trp Gly Gly Gly Tyr Thr Glu Thr Asn Gly Trp Asn Phe Ala
2755 2760 2765
Phe His Ala Pro Gln Asp Gly Gln Gly Leu Ala Asn Leu Tyr Gly Gly
2770 2775 2780
Lys Gln Gly Leu Glu Asp Lys Leu Asp Glu Phe Phe Ser Thr Pro Glu
2785 2790 2795 2800
Lys Gly Ala Gly Asn Gly Gly Ile His Glu Gln Arg Glu Ala Arg Asp
2805 2810 2815
Val Arg Met Gly Gln Trp Gly Met Ser Asn Gln Val Ser His His Ile
2820 2825 2830
Pro Trp Leu Tyr Asp Ala Ala Gly Ala Pro Ser Lys Ala Gln Glu Lys
2835 2840 2845
Val Arg Glu Val Thr Arg Arg Leu Phe Val Gly Ser Glu Ile Gly Gln
2850 2855 2860
Gly Tyr Pro Gly Asp Glu Asp Asn Gly Glu Met Ser Ser Trp Trp Ile
2865 2870 2875 2880
Phe Ala Ser Leu Gly Phe Tyr Pro Leu Gln Val Gly Ser Asp Gln Tyr
2885 2890 2895
Ala Val Gly Ser Pro Leu Phe Asp Lys Ala Thr Val His Leu Pro Asp
2900 2905 2910
Gly Asp Leu Val Val Asn Ala Glu Asn Asn Ser Val Asp Asn Val Tyr
2915 2920 2925
Val Gln Ser Leu Ala Val Asp Gly Glu Ala Arg Thr Ser Thr Ser Leu
2930 2935 2940
Ser Gln Ala Asp Leu Ser Gly Gly Thr Thr Leu Asp Phe Val Met Gly
2945 2950 2955 2960
Pro Glu Pro Ser Asp Trp Gly Thr Gly Glu Asp Asp Ala Pro Pro Ser
2965 2970 2975
Leu Thr Glu Gly Asp Glu Pro Pro Thr Pro Val Gln Asp Ala Thr Thr
2980 2985 2990
Ala Gly Leu Gly Thr Thr Thr Val Ala Asp Gly Asp Ala Thr Thr Ser
2995 3000 3005
Ala Ala Ala Leu Thr Asp Asn Thr Ser Gly Thr Arg Thr Thr Phe Ala
3010 3015 3020
Thr Thr Thr Pro Ser Ile Thr Trp Ala Gly Asn Gly Ile Arg Pro Thr
3025 3030 3035 3040
Val Gly Ser Tyr Thr Leu Thr Ser Gly Ala Ser Gly Thr Ala Ser Pro
3045 3050 3055
Ser Ala Trp Thr Leu Glu Gly Ser Asp Asp Gly Glu Thr Trp Thr Thr
3060 3065 3070
Leu Asp Glu Arg Ser Gly Glu Gln Phe Arg Trp Ala Leu Gln Thr Arg
3075 3080 3085
Pro Phe Thr Val Ala Glu Pro Thr Ala Phe Ala Arg Tyr Arg Val Thr
3090 3095 3100
Val Thr Ala Thr Ser Gly Ser Gly Ala Leu Ser Leu Ala Glu Val Glu
3105 3110 3115 3120
Leu Leu Ala Asp Pro Lys Glu Ser Gly Ala Glu Glu Leu Thr Leu Ser
3125 3130 3135
Ala Ala Pro Asp Arg Asp Gly Val Thr Gly Arg Glu Val Ser Gly Ser
3140 3145 3150
Phe Ala Thr Leu Thr Gly Val Glu Gly Asp Val Ala Ala Leu Asp Val
3155 3160 3165
Gln Val Ala Phe Gly Asp Gly Ser Glu Pro Val Ala Gly Thr Leu Arg
3170 3175 3180
Ala Gly Ala Phe Gly Gly Tyr Ala Val Asp Ala Ala His Thr Trp Thr
3185 3190 3195 3200
Ala Pro Gly Val Tyr Pro Val Thr Val Thr Val Ser Gly Glu Gly Ile
3205 3210 3215
Glu Thr Val Ser Ala Ser Ser Tyr Val Ser Val Ser Leu Leu Arg Glu
3220 3225 3230
Gly Ser Leu Leu Ala Ala Tyr Asp Asn Val Cys Ile Gly Asp Ala Gly
3235 3240 3245
Thr Thr Val Gly Ser Cys Asp Gly Gln Gly Val Phe Phe Asp Arg Ala
3250 3255 3260
Gln Leu Ala Ala Lys Gly Phe Val Gln Gly Glu Arg Ala Thr Val Pro
3265 3270 3275 3280
Gly Thr Asp Leu Ala Phe Asp Val Pro Ala Val Pro Ala Gly Gln Pro
3285 3290 3295
Asp Asn Ala Thr Gly Asp Gly Gln Thr Ile Glu Leu Asp Val Pro Ala
3300 3305 3310
Asp Ala Glu Gln Leu Ser Val Ile Gly Thr Gly Thr Glu Lys Asn Gln
3315 3320 3325
Gln Ala Thr Gly Thr Leu Thr Phe Asp Asp Gly Ser Thr Gln Pro Ile
3330 3335 3340
Asp Leu Ser Phe Gly Asp Trp Ser Gly Ala Ala Arg Asn Pro Val Phe
3345 3350 3355 3360
Gly Asn Ile Pro Val Ala Val Thr Asp Ser Arg Leu Arg Gly Gly Ser
3365 3370 3375
Pro Gln Thr Gly Thr Pro Ala Ala Phe Phe Ala Thr Ala Pro Ile Thr
3380 3385 3390
Leu Pro Glu Gly Lys Arg Pro Val Ser Leu Thr Leu Pro Asp Gln Pro
3395 3400 3405
Gly Glu Leu Ser Arg Asp Gly Arg Ile His Val Val Ala Val Ala His
3410 3415 3420
Asp Gly Thr Phe Ala Glu His Pro Ala Leu Glu Val Thr Ala Ala Glu
3425 3430 3435 3440
Gly Val Thr Leu Ala Val Gly Gln Thr Ser Asp Val Ala Leu Ala Gln
3445 3450 3455
Val Ala Gly Gly Arg Glu Gly Ala Asp Leu Arg Ala Ala Val Thr Trp
3460 3465 3470
Gly Asp Gly Ser Asp Val Ala Ala Gly Ala Val Thr Asp Gly Ser Val
3475 3480 3485
Ser Gly Ser His Ala Tyr Thr Ala Ala Gly Thr Tyr Thr Ala Tyr Val
3490 3495 3500
Val Val Asp Asp Gly Trp Thr Ser Gln Val Val Glu Val Pro Val Thr
3505 3510 3515 3520
Val Thr Glu Ala Glu Pro Ala Leu Ala Val Asp Val Thr Val Ser Thr
3525 3530 3535
Arg Cys Leu Ala Gly Lys Ala Tyr Val Ala Val Arg Ala Glu Asn Gly
3540 3545 3550
Glu Asp Val Pro Leu Ala Ile Arg Leu Val Thr Pro Phe Gly Thr Lys
3555 3560 3565
Glu Val Ala Ala Val Ala Pro Gly Ala Asn Ala Tyr Gln Ser Phe Ala
3570 3575 3580
Thr Arg Val Thr Ala Val Glu Ala Gly Thr Val Thr Val Glu Ala Thr
3585 3590 3595 3600
Arg Gly Thr Gly Asp Glu Glu Val Thr Ala Ser Ile Gln Ala Asp Tyr
3605 3610 3615
Ala Ala Val Thr Cys Gly
3620
<210> 11
<211> 513
<212> PRT
<213> Aspergillus saitoi
<400> 11
Met His Leu Pro Ser Leu Ser Leu Ser Leu Thr Ala Leu Ala Ile Ala
1 5 10 15
Ser Pro Ser Ala Ala Tyr Pro His Phe Gly Ser Ser Gln Pro Val Leu
20 25 30
His Ser Ser Ser Asp Thr Thr Gln Ser Arg Ala Asp Ala Ile Lys Ala
35 40 45
Ala Phe Ser His Ala Trp Asp Gly Tyr Leu Gln Tyr Ala Phe Pro His
50 55 60
Asp Glu Leu His Pro Val Ser Asn Gly Tyr Gly Asp Ser Arg Asn Gly
65 70 75 80
Trp Gly Ala Ser Ala Val Asp Ala Leu Ser Thr Ala Val Ile Met Arg
85 90 95
Asn Ala Thr Ile Val Asn Gln Ile Leu Asp His Val Gly Lys Ile Asp
100 105 110
Tyr Ser Lys Thr Asn Thr Thr Val Ser Leu Phe Glu Thr Thr Ile Arg
115 120 125
Tyr Leu Gly Gly Met Leu Ser Gly Tyr Asp Leu Leu Lys Gly Pro Val
130 135 140
Ser Asp Leu Val Gln Asn Ser Ser Lys Ile Asp Val Leu Leu Thr Gln
145 150 155 160
Ser Lys Asn Leu Ala Asp Val Leu Lys Phe Ala Phe Asp Thr Pro Ser
165 170 175
Gly Val Pro Tyr Asn Asn Leu Asn Ile Thr Ser Gly Gly Asn Asp Gly
180 185 190
Ala Lys Thr Asn Gly Leu Ala Val Thr Gly Thr Leu Ala Leu Glu Trp
195 200 205
Thr Arg Leu Ser Asp Leu Thr Gly Asp Thr Thr Tyr Ala Asp Leu Ser
210 215 220
Gln Lys Ala Glu Ser Tyr Leu Leu Asn Pro Gln Pro Lys Ser Ala Glu
225 230 235 240
Pro Phe Pro Gly Leu Val Gly Ser Asn Ile Asn Ile Ser Asn Gly Gln
245 250 255
Phe Thr Asp Ala Gln Val Ser Trp Asn Gly Gly Asp Asp Ser Tyr Tyr
260 265 270
Glu Tyr Leu Ile Lys Met Tyr Val Tyr Asp Pro Lys Arg Phe Gly Leu
275 280 285
Tyr Lys Asp Arg Trp Val Ala Ala Ala Gln Ser Thr Met Gln His Leu
290 295 300
Ala Ser His Pro Ser Ser Arg Pro Asp Leu Thr Phe Leu Ala Ser Tyr
305 310 315 320
Asn Asn Gly Thr Leu Gly Leu Ser Ser Gln His Leu Thr Cys Phe Asp
325 330 335
Gly Gly Ser Phe Leu Leu Gly Gly Thr Val Leu Asn Arg Thr Asp Phe
340 345 350
Ile Asn Phe Gly Leu Asp Leu Val Ser Gly Cys His Asp Thr Tyr Asn
355 360 365
Ser Thr Leu Thr Gly Ile Gly Pro Glu Ser Phe Ser Trp Asp Thr Ser
370 375 380
Asp Ile Pro Ser Ser Gln Gln Ser Leu Tyr Glu Lys Ala Gly Phe Tyr
385 390 395 400
Ile Thr Ser Gly Ala Tyr Ile Leu Arg Pro Glu Val Ile Glu Ser Phe
405 410 415
Tyr Tyr Ala Trp Arg Val Thr Gly Gln Glu Thr Tyr Arg Asp Trp Ile
420 425 430
Trp Ser Ala Phe Ser Ala Val Asn Asp Tyr Cys Arg Thr Ser Ser Gly
435 440 445
Phe Ser Gly Leu Thr Asp Val Asn Ala Ala Asn Gly Gly Ser Arg Tyr
450 455 460
Asp Asn Gln Glu Ser Phe Leu Phe Ala Glu Val Met Lys Tyr Ser Tyr
465 470 475 480
Met Ala Phe Ala Glu Asp Ala Ala Trp Gln Val Gln Pro Gly Ser Gly
485 490 495
Asn Gln Phe Val Phe Asn Thr Glu Ala His Pro Val Arg Val Ser Ser
500 505 510
Thr
Claims (58)
- 만노스-1-포스포-6-만노스 반족(mannose-1-phospho-6-mannose moiety)의 캡핑 제거(uncapping) 및 당단백질(glycoprotein) 상의 인산화된 N-글리칸(phosphorylated N-glycan)들의 탈만노실화(demannosylating)를 위한 방법에 있어서,
a) 만노스-1-포스포-6-만노스 반족을 포함하는 인산화된 N-글리칸들을 포함하는 상기 당단백질을 제공하는 단계; 및
b) 상기 당단백질을 (i) 만노스-1-포스포-6-만노스 반족을 만노스-6-포스페이트(mannose-6-phosphate)로 가수분해하고, (ii) 말단(terminal) 알파-1,2 만노스(alpha-1,2 mannose), 알파-1,3 만노스(alpha-1,3 mannose) 또는 알파-1,6 만노스(alpha-1,6 mannose) 연결들을 가수분해하는 단일 효소로서 만노시다제(mannosidase)와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 만노시다제는 패밀리 38 글리코실 가수분해 효소(family 38 glycosyl hydrolase)인 것을 특징으로 하는 방법. - 인산화된 N-글리칸들을 탈만노실화하는 방법에 있어서,
a) 인산화된 N-글리칸들을 포함하는 당단백질을 제공하는 단계; 및
b) 상기 당단백질을 (i) 만노스-1-포스포-6-만노스 반족을 만노스-6-포스페이트로 가수분해하고, (ii) 말단 알파-1,2 만노스, 알파-1,3 만노스 또는 알파-1,6 만노스 연결들을 가수분해하는 단일 효소로서 만노시다제와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 만노시다제는 패밀리 38 글리코실 가수분해 효소인 것을 특징으로 하는 방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 만노시다제는 카나발리아 엔시포르미스(Canavalia ensiformis)로부터 얻어지거나, 상기 만노시다제는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 (a) 및 상기 (b) 단계 이후에, 인간 세포를 상기 탈만노실화되고 인산화된 N-글리칸(demannosylated phosphorylated N-glycan)들과 상기 당단백질을 접촉시키는 단계를 더 포함하며, 상기 접촉시키는 단계 후에, 상기 당단백질이 상기 인간 세포의 내부로 수송(transport)되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 포유류 세포의 내부로 당단백질을 안내(directing)하는 방법에 있어서,
a) 하지 만노스 잔기(underlying mannose residue)의 알파 1,2 연결(alpha 1,2 linkage)에 의하여 결합된 말단 만노스 잔기를 포함하는 인산화된 N-글리칸을 포함하는 당단백질을 제공하는 단계;
b) 상기 당단백질을 탈만노실화된 당단백질을 제조하기 위해 상기 하지 만노스가 인산화될 때에 말단 알파-1,2 만노스 결합을 가수분해하고, 상기 만노스 잔기의 6번 위치에 결합된 포스페이트 잔기(phosphate residue)를 캡핑 제거(uncapped)하는 단일 효소로서 만노시다제와 접촉시키는 단계; 및
c) 상기 세포를 상기 탈만노실화된 당단백질과 접촉시키는 단계를 포함하며,
상기 당단백질을 제공하는 단계에서, 상기 하지 만노스는 상기 6번 위치에서 인산화되고, 상기 하지 만노스에 결합되는 상기 포스페이트 잔기는 캡핑되지 않으며, 상기 당단백질은 상기 세포상의 만노스-6-포스페이트-수용체(mannose-6-phosphate receptor)에 결합되지 않고,
상기 당단백질과 상기 만노시다제를 접촉시키는 단계에서, 상기 당단백질이 탈만노실화 이후에 상기 세포상의 상기 만노스-6-포스페이트 수용체(mannose-6-phosphate receptor)에 결합되며,
상기 만노시다제는 패밀리 38 글리코실 가수분해 효소인 것을 특징으로 하는 방법. - 제 5 항에 있어서, 상기 만노시다제는 카나발리아 엔시포르미스(Canavalia ensiformis) 또는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 당단백질을 포유류 세포상의 만노스-6-포스페이트 수용체에 결합되지 않은 제1 형태(first form)로부터 포유류 세포상의 만노스-6-포스페이트 수용체에 결합되는 제2 형태(second form)로 변환하는 방법에 있어서, 상기 제1 형태에서, 상기 당단백질은 하나 이상의 N-글리칸들을 포함하고, 상기 N-글리칸들은 각기 6번 위치에 포스페이트 잔기를 포함하는 하지 만노스 잔기에 1번 위치에서 연결되는 하나 이상의 말단 만노스 잔기들을 포함하며, 상기 포스페이트 잔기는 캡핑 제거되고, 상기 방법은 상기 당단백질의 제1 형태를 상기 하나 이상의 만노스 잔기들을 제거하고, 상기 만노스 잔기의 6번 위치에 결합된 포스페이트 잔기를 캡핑 제거하는 단일 효소로서 만노시다제와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 만노시다제는 패밀리 38 글리코실 가수분해 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 7 항에 있어서, 상기 만노시다제는 카나발리아 엔시포르미스(Canavalia ensiformis) 또는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)로부터 얻어는 것을 특징으로 하는 방법.
- 포유류 세포의 내부로 당단백질을 안내하는 방법에 있어서, 상기 당단백질은 만노스-1-포스포-6-만노스 반족을 포함하고, 만노스 잔기는 말단 만노스 잔기의 1번 위치에서의 상기 말단 만노스 잔기에 6번 위치에서 연결되는 포스페이트 잔기를 가지며, 상기 방법은 상기 당단백질이 진행된 후에 상기 세포를 당단백질과 접촉시키는 단계를 포함하며,
(a) 상기 당단백질 상의 만노스-6-포스페이트에 대해 상기 만노스-1-포스포-6-만노스 반족을 캡핑 제거하는 단계; 및
(b) 상기 말단 만노스 잔기를 제거하는 단계를 포함하며,
상기 (b) 단계가 아닌 상기 (a) 단계 또는 상기 (a) 단계가 아닌 상기 (b) 단계로 진행된 상기 당단백질은 상기 세포상의 만노스-6-포스페이트 수용체에 결합되지 않고,
상기 (a) 단계 및 상기 (b) 단계로 진행된 상기 당단백질은 상기 세포상의 만노스-6-포스페이트 수용체에 결합되며,
상기 (a) 단계 및 상기 (b) 단계는 단일 만노시다제 효소에 의하여 반응 촉진(catalyzed)되고, 상기 만노시다제는 패밀리 38 글리코실 가수분해 효소인 것을 특징으로 하는 방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 당단백질은 인간 단백질이거나,
상기 당단백질은 병원체 단백질(pathogen protein), 리소좀 단백질(lysosomal protein), 성장인자(growth factor), 사이토카인(cytokine), 케모카인(chemokine), 항체(antibody) 또는 이들의 항원-결합 조각(antigen-binding fragment) 또는 융합 단백질(fusion protein)이거나,
상기 당단백질은 리소좀 효소인 리소좀 단백질이거나,
상기 당단백질은 리소좀 저장 질환(LSD)과 관련되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 10 항에 있어서, 상기 리소좀 효소는 산 알파 글루코시다제(acid alpha glucosidase), 알파 갈락토시다제(alpha galactosidase), 글루코세레브로시다제(glucocerebrosidase), 세레브로시다제(cerebrosidase) 또는 갈락토세레브로시다제(galactocerebrosidase)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 10 항에 있어서, 상기 리소좀 저장 질환(LSD)은 파프리병(Fabry's disease), 점액 다당류증 I(mucopolysaccharidosis I), 파버병(Farber disease), 고셰병(Gaucher disease), GM1-강글리오시드증(GM1-gangliosidosis), 타이-작스병(Tay-Sachs disease), 샌드호프병(Sandhoff disease), GM2 활성체병(GM2 activator disease), 크라베병(Krabbe disease), 이염백질이영양증(metachromatic leukodystrophy), 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 샤이에병(Scheie disease), 헌터병(Hunter disease), 산필립포(Sanfilippo disease), 모스키오병(Morquio disease), 마로토-라미증후군(Maroteaux-Lamy disease), 히알루론산분해효소결핍증(hyaluronidase deficiency), 아스파르틸글루코사민뇨(aspartylglucosaminuria), 푸코시드축적증(fucosidosis), 만노시도시스(mannosidosis), 쉰들러병(Schindler disease), 사이알리도시스 1형(sialidosis type 1), 폼피병(Pompe disease), 피크노디소토시스(Pycnodysostosis), 세로이드 리포푸신증(ceroid lipofuscinosis), 콜레스테롤 에스테르 저장병(cholesterol ester storage disease), 월만병(Wolman disease), 다종 술파타아제결핍증(Multiple sulfatase deficiency), 갈락토시알리도시스(galactosialidosis), 뮤코리피드증(mucolipidosis), 시스틴축적증(cystinosis), 시알산 저장 장해(sialic acidstorage disorder), 마리네스코-쇠그렌 증후군의 킬로미크론 축적증(chylomicron retention disease with Marinesco-Sjgren syndrome), 헤르만스키-푸드락증후군(Hermansky-Pudlak syndrome), 체디아크-히가시 증후군(Chediak-Higashi syndrome), 다논병(Danon disease), 또는 게레오피식 형성장애(Geleophysic dysplasia)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 상기 당단백질은 인간 단백질이거나,
상기 당단백질은 병원체 단백질(pathogen protein), 리소좀 단백질(lysosomal protein), 성장인자(growth factor), 사이토카인(cytokine), 케모카인(chemokine), 항체(antibody) 또는 이들의 항원-결합 조각(antigen-binding fragment) 또는 융합 단백질(fusion protein)이거나,
상기 당단백질은 리소좀 효소인 리소좀 단백질이거나,
상기 당단백질은 리소좀 저장 질환(LSD)과 관련되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 13 항에 있어서, 상기 리소좀 효소는 산 알파 글루코시다제(acid alpha glucosidase), 알파 갈락토시다제(alpha galactosidase), 글루코세레브로시다제(glucocerebrosidase), 세레브로시다제(cerebrosidase) 또는 갈락토세레브로시다제(galactocerebrosidase)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 13 항에 있어서, 상기 리소좀 저장 질환(LSD)은 파프리병(Fabry's disease), 점액 다당류증 I(mucopolysaccharidosis I), 파버병(Farber disease), 고셰병(Gaucher disease), GM1-강글리오시드증(GM1-gangliosidosis), 타이-작스병(Tay-Sachs disease), 샌드호프병(Sandhoff disease), GM2 활성체병(GM2 activator disease), 크라베병(Krabbe disease), 이염백질이영양증(metachromatic leukodystrophy), 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 샤이에병(Scheie disease), 헌터병(Hunter disease), 산필립포(Sanfilippo disease), 모스키오병(Morquio disease), 마로토-라미증후군(Maroteaux-Lamy disease), 히알루론산분해효소결핍증(hyaluronidase deficiency), 아스파르틸글루코사민뇨(aspartylglucosaminuria), 푸코시드축적증(fucosidosis), 만노시도시스(mannosidosis), 쉰들러병(Schindler disease), 사이알리도시스 1형(sialidosis type 1), 폼피병(Pompe disease), 피크노디소토시스(Pycnodysostosis), 세로이드 리포푸신증(ceroid lipofuscinosis), 콜레스테롤 에스테르 저장병(cholesterol ester storage disease), 월만병(Wolman disease), 다종 술파타아제결핍증(Multiple sulfatase deficiency), 갈락토시알리도시스(galactosialidosis), 뮤코리피드증(mucolipidosis), 시스틴축적증(cystinosis), 시알산 저장 장해(sialic acidstorage disorder), 마리네스코-쇠그렌 증후군의 킬로미크론 축적증(chylomicron retention disease with Marinesco-Sjgren syndrome), 헤르만스키-푸드락증후군(Hermansky-Pudlak syndrome), 체디아크-히가시 증후군(Chediak-Higashi syndrome), 다논병(Danon disease), 또는 게레오피식 형성장애(Geleophysic dysplasia)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 상기 당단백질은 인간 단백질이거나,
상기 당단백질은 병원체 단백질(pathogen protein), 리소좀 단백질(lysosomal protein), 성장인자(growth factor), 사이토카인(cytokine), 케모카인(chemokine), 항체(antibody) 또는 이들의 항원-결합 조각(antigen-binding fragment) 또는 융합 단백질(fusion protein)이거나,
상기 당단백질은 리소좀 효소인 리소좀 단백질이거나,
상기 당단백질은 리소좀 저장 질환(LSD)과 관련되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 16 항에 있어서, 상기 리소좀 효소는 산 알파 글루코시다제(acid alpha glucosidase), 알파 갈락토시다제(alpha galactosidase), 글루코세레브로시다제(glucocerebrosidase), 세레브로시다제(cerebrosidase) 또는 갈락토세레브로시다제(galactocerebrosidase)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 16 항에 있어서, 상기 리소좀 저장 질환(LSD)은 파프리병(Fabry's disease), 점액 다당류증 I(mucopolysaccharidosis I), 파버병(Farber disease), 고셰병(Gaucher disease), GM1-강글리오시드증(GM1-gangliosidosis), 타이-작스병(Tay-Sachs disease), 샌드호프병(Sandhoff disease), GM2 활성체병(GM2 activator disease), 크라베병(Krabbe disease), 이염백질이영양증(metachromatic leukodystrophy), 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 샤이에병(Scheie disease), 헌터병(Hunter disease), 산필립포(Sanfilippo disease), 모스키오병(Morquio disease), 마로토-라미증후군(Maroteaux-Lamy disease), 히알루론산분해효소결핍증(hyaluronidase deficiency), 아스파르틸글루코사민뇨(aspartylglucosaminuria), 푸코시드축적증(fucosidosis), 만노시도시스(mannosidosis), 쉰들러병(Schindler disease), 사이알리도시스 1형(sialidosis type 1), 폼피병(Pompe disease), 피크노디소토시스(Pycnodysostosis), 세로이드 리포푸신증(ceroid lipofuscinosis), 콜레스테롤 에스테르 저장병(cholesterol ester storage disease), 월만병(Wolman disease), 다종 술파타아제결핍증(Multiple sulfatase deficiency), 갈락토시알리도시스(galactosialidosis), 뮤코리피드증(mucolipidosis), 시스틴축적증(cystinosis), 시알산 저장 장해(sialic acidstorage disorder), 마리네스코-쇠그렌 증후군의 킬로미크론 축적증(chylomicron retention disease with Marinesco-Sjgren syndrome), 헤르만스키-푸드락증후군(Hermansky-Pudlak syndrome), 체디아크-히가시 증후군(Chediak-Higashi syndrome), 다논병(Danon disease), 또는 게레오피식 형성장애(Geleophysic dysplasia)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 9 항에 있어서, 상기 당단백질은 인간 단백질이거나,
상기 당단백질은 병원체 단백질(pathogen protein), 리소좀 단백질(lysosomal protein), 성장인자(growth factor), 사이토카인(cytokine), 케모카인(chemokine), 항체(antibody) 또는 이들의 항원-결합 조각(antigen-binding fragment) 또는 융합 단백질(fusion protein)이거나,
상기 당단백질은 리소좀 효소인 리소좀 단백질이거나,
상기 당단백질은 리소좀 저장 질환(LSD)과 관련되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 19 항에 있어서, 상기 리소좀 효소는 산 알파 글루코시다제(acid alpha glucosidase), 알파 갈락토시다제(alpha galactosidase), 글루코세레브로시다제(glucocerebrosidase), 세레브로시다제(cerebrosidase) 또는 갈락토세레브로시다제(galactocerebrosidase)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 19 항에 있어서, 상기 리소좀 저장 질환(LSD)은 파프리병(Fabry's disease), 점액 다당류증 I(mucopolysaccharidosis I), 파버병(Farber disease), 고셰병(Gaucher disease), GM1-강글리오시드증(GM1-gangliosidosis), 타이-작스병(Tay-Sachs disease), 샌드호프병(Sandhoff disease), GM2 활성체병(GM2 activator disease), 크라베병(Krabbe disease), 이염백질이영양증(metachromatic leukodystrophy), 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 샤이에병(Scheie disease), 헌터병(Hunter disease), 산필립포(Sanfilippo disease), 모스키오병(Morquio disease), 마로토-라미증후군(Maroteaux-Lamy disease), 히알루론산분해효소결핍증(hyaluronidase deficiency), 아스파르틸글루코사민뇨(aspartylglucosaminuria), 푸코시드축적증(fucosidosis), 만노시도시스(mannosidosis), 쉰들러병(Schindler disease), 사이알리도시스 1형(sialidosis type 1), 폼피병(Pompe disease), 피크노디소토시스(Pycnodysostosis), 세로이드 리포푸신증(ceroid lipofuscinosis), 콜레스테롤 에스테르 저장병(cholesterol ester storage disease), 월만병(Wolman disease), 다종 술파타아제결핍증(Multiple sulfatase deficiency), 갈락토시알리도시스(galactosialidosis), 뮤코리피드증(mucolipidosis), 시스틴축적증(cystinosis), 시알산 저장 장해(sialic acidstorage disorder), 마리네스코-쇠그렌 증후군의 킬로미크론 축적증(chylomicron retention disease with Marinesco-Sjgren syndrome), 헤르만스키-푸드락증후군(Hermansky-Pudlak syndrome), 체디아크-히가시 증후군(Chediak-Higashi syndrome), 다논병(Danon disease), 또는 게레오피식 형성장애(Geleophysic dysplasia)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 포유류 세포의 내부로 수송 가능한 당단백질에 있어서,
상기 당단백질은 제 1 항, 제 2 항 및 제 5 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 처리되며,
상기 당단백질은 하지 만노스 잔기에 연결된 포스페이트 잔기가 캡핑 제거되고, 상기 하지 만노스 잔기가 추가 만노스 잔기에 연결되지 않은 N-글리칸을 포함하고,
상기 당단백질은 리소좀 단백질인 것을 특징으로 하는 당단백질. - 제 22 항에 있어서, 상기 리소좀 단백질은 리소좀 효소인 것을 특징으로 하는 당단백질.
- 제 23 항에 있어서, 상기 리소좀 효소는 산 알파 글루코시다제(acid alpha glucosidase), 알파 갈락토시다제(alpha galactosidase), 글루코세레브로시다제(glucocerebrosidase), 세레브로시다제(cerebrosidase) 또는 갈락토세레브로시다제(galactocerebrosidase)인 것을 특징으로 하는 당단백질.
- 제 22 항에 있어서, 상기 당단백질은 리소좀 저장 질환(LSD)과 관련되는 것을 특징으로 하는 당단백질.
- 제 25 항에 있어서, 상기 리소좀 저장 질환(LSD)은 파프리병(Fabry's disease), 점액 다당류증 I(mucopolysaccharidosis I), 파버병(Farber disease), 고셰병(Gaucher disease), GM1-강글리오시드증(GM1-gangliosidosis), 타이-작스병(Tay-Sachs disease), 샌드호프병(Sandhoff disease), GM2 활성체병(GM2 activator disease), 크라베병(Krabbe disease), 이염백질이영양증(metachromatic leukodystrophy), 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 샤이에병(Scheie disease), 헌터병(Hunter disease), 산필립포(Sanfilippo disease), 모스키오병(Morquio disease), 마로토-라미증후군(Maroteaux-Lamy disease), 히알루론산분해효소결핍증(hyaluronidase deficiency), 아스파르틸글루코사민뇨(aspartylglucosaminuria), 푸코시드축적증(fucosidosis), 만노시도시스(mannosidosis), 쉰들러병(Schindler disease), 사이알리도시스 1형(sialidosis type 1), 폼피병(Pompe disease), 피크노디소토시스(Pycnodysostosis), 세로이드 리포푸신증(ceroid lipofuscinosis), 콜레스테롤 에스테르 저장병(cholesterol ester storage disease), 월만병(Wolman disease), 다종 술파타아제결핍증(Multiple sulfatase deficiency), 갈락토시알리도시스(galactosialidosis), 뮤코리피드증(mucolipidosis), 시스틴축적증(cystinosis), 시알산 저장 장해(sialic acidstorage disorder), 마리네스코-쇠그렌 증후군의 킬로미크론 축적증(chylomicron retention disease with Marinesco-Sjgren syndrome), 헤르만스키-푸드락증후군(Hermansky-Pudlak syndrome), 체디아크-히가시 증후군(Chediak-Higashi syndrome), 다논병(Danon disease), 또는 게레오피식 형성장애(Geleophysic dysplasia)인 것을 특징으로 하는 당단백질.
- 제 24 항에 있어서, 상기 산 알파 글루코시다제는 QQGASRPGPRDAQAHPGRPRAVPTQCDVPPNSRFDCAPDKAITQEQCEARGCCYIPAKQGLQGAQMGQPWCFFPPSYPSYKLENLSSSEMGYTATLTRTTPTFFPKDILTLRLDVMMETENRLHFTIKDPANRRYEVPLETPHVHSRAPSPLYSVEFSEEPFGVIVRRQLDGRVLLNTTVAPLFFADQFLQLSTSLPSQYITGLAEHLSPLMLSTSWTRITLWNRDLAPTPGANLYGSHPFYLALEDGGSAHGVFLLNSNAMDVVLQPSPALSWRSTGGILDVYIFLGPEPKSVVQQYLDVVGYPFMPPYWGLGFHLCRWGYSSTAITRQVVENMTRAHFPLDVQWNDLDYMDSRRDFTFNKDGFRDFPAMVQELHQGGRRYMMIVDPAISSSGPAGSYRPYDEGLRRGVFITNETGQPLIGKVWPGSTAFPDFTNPTALAWWEDMVAEFHDQVPFDGMWIDMNEPSNFIRGSEDGCPNNELENPPYVPGVVGGTLQAATICASSHQFLSTHYNLHNLYGLTEAIASHRALVKARGTRPFVISRSTFAGHGRYAGHWTGDVWSSWEQLASSVPEILQFNLLGVPLVGADVCGFLGNTSEELCVRWTQLGAFYPFMRNHNSLLSLPQEPYSFSEPAQQAMRKALTLRYALLPHLYTLFHQAHVAGETVARPLFLEFPKDSSTWTVDHQLLWGEALLITPVLQAGKAEVTGYFPLGTWYDLQTVPVEALGSLPPPPAAPREPAIHSEGQWVTLPAPLDTINVHLRAGYIIPLQGPGLTTTESRQQPMALAVALTKGGEARGELFWDDGESLEVLERGAYTQVIFLARNNTIVNELVRVTSEGAGLQLQKVTVLGVATAPQQVLSNGVPVSNFTYSPDTKVLDICVSLLMGEQFLVSWC의 서열을 포함하는 인간 산 알파 글루코시다제인 것을 특징으로 하는 당단백질.
- 제 22 항에 따른 당단백질을 포함하는 인간 세포.
- 탈만노실화된 인산화 N-글리칸들을 포함하는 당단백질을 제조하기 위해 유전적으로 조작된(genetically engineered) 분리된 진균 세포(fungal cell)에 있어서, 상기 진균 세포는 만노시다제를 인코딩하는 핵산(nucleic acid)을 포함하고, 상기 만노시다제는 단일 효소로서 (i) 만노스-1-포스포-6-만노스 반족을 만노스-6-포스페이트로 가수분해하고, (ii) 말단 알파-1,2 만노스, 알파-1,3 만노스 또는 알파-1,6 만노스 연결을 가수분해할 수 있으며, 상기 만노시다제는 패밀리 38 글리코실 가수분해 효소인 것을 특징으로 하는 진균 세포.
- 제 29 항에 있어서, 상기 진균 세포는 만노실 인산화(mannosyl phosphorylation)를 촉진할 수 있는 폴리펩티드(polypeptide)를 인코딩하는 핵산을 더 포함하거나, 상기 진균 세포는 외측 사슬 신장(Outer CHain elongation: OCH)1 활성이 결핍되도록 유전적으로 조작되거나, 상기 진균 세포는 만노실 인산화를 촉진할 수 있는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 더 포함하고 OCH1 활성이 결핍되도록 유전적으로 조작되는 것을 특징으로 하는 진균 세포.
- 제 29 항 또는 제 30 항에 있어서, 상기 진균 세포는 표적 단백질(target protein)을 인코딩하는 핵산을 더 포함하며, 상기 표적 단백질은 당단백질인 것을 특징으로 하는 진균 세포.
- 제 31 항에 있어서, 상기 표적 단백질은 인간 단백질인 것을 특징으로 하는 진균 세포.
- 제 31 항에 있어서, 상기 표적 단백질은 병원체 단백질, 리소좀 단백질, 성장인자, 사이토카인, 케모카인, 항체 또는 이들의 항원-결합 조각 또는 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 진균 세포.
- 제 33 항에 있어서, 상기 리소좀 단백질은 리소좀 효소인 것을 특징으로 하는 진균 세포.
- 제 34 항에 있어서, 상기 리소좀 효소는 산 알파 글루코시다제(acid alpha glucosidase), 알파 갈락토시다제(alpha galactosidase), 글루코세레브로시다제(glucocerebrosidase), 세레브로시다제(cerebrosidase) 또는 갈락토세레브로시다제(galactocerebrosidase)인 것을 특징으로 하는 진균 세포.
- 제 31 항에 있어서, 상기 당단백질은 리소좀 저장 질환(LSD)과 관련되는 단백질인 것을 특징으로 하는 진균 세포.
- 제 36 항에 있어서, 상기 리소좀 저장 질환(LSD)은 파프리병(Fabry's disease), 점액 다당류증 I(mucopolysaccharidosis I), 파버병(Farber disease), 고셰병(Gaucher disease), GM1-강글리오시드증(GM1-gangliosidosis), 타이-작스병(Tay-Sachs disease), 샌드호프병(Sandhoff disease), GM2 활성체병(GM2 activator disease), 크라베병(Krabbe disease), 이염백질이영양증(metachromatic leukodystrophy), 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 샤이에병(Scheie disease), 헌터병(Hunter disease), 산필립포(Sanfilippo disease), 모스키오병(Morquio disease), 마로토-라미증후군(Maroteaux-Lamy disease), 히알루론산분해효소결핍증(hyaluronidase deficiency), 아스파르틸글루코사민뇨(aspartylglucosaminuria), 푸코시드축적증(fucosidosis), 만노시도시스(mannosidosis), 쉰들러병(Schindler disease), 사이알리도시스 1형(sialidosis type 1), 폼피병(Pompe disease), 피크노디소토시스(Pycnodysostosis), 세로이드 리포푸신증(ceroid lipofuscinosis), 콜레스테롤 에스테르 저장병(cholesterol ester storage disease), 월만병(Wolman disease), 다종 술파타아제결핍증(Multiple sulfatase deficiency), 갈락토시알리도시스(galactosialidosis), 뮤코리피드증(mucolipidosis), 시스틴축적증(cystinosis), 시알산 저장 장해(sialic acidstorage disorder), 마리네스코-쇠그렌 증후군의 킬로미크론 축적증(chylomicron retention disease with Marinesco-Sjgren syndrome), 헤르만스키-푸드락증후군(Hermansky-Pudlak syndrome), 체디아크-히가시 증후군(Chediak-Higashi syndrome), 다논병(Danon disease), 또는 게레오피식 형성장애(Geleophysic dysplasia)인 것을 특징으로 하는 진균 세포.
- 제 29 항 또는 제 30 항에 있어서, 상기 진균 세포는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 또는 악설라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans) 세포인 것을 특징으로 하는 진균 세포.
- 제 30 항에 있어서, 상기 만노실 인산화를 촉진할 수 있는 폴리펩티드는 MNN4 폴리펩티드이거나, 상기 만노실 인산화를 촉진할 수 있는 폴리펩티드는 P. 파스토리스 PNO1(P. pastoris PNO1) 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 진균 세포.
- 제 39 항에 있어서, 상기 MNN4 폴리펩티드는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), S. 세레비시에(S. cerevisiae), 오가타에아 미누타(Ogataea minuta), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 또는 C. 알비칸스(C. albicans) 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 진균 세포.
- 제 29 항 또는 제 30 항에 있어서, 상기 만노시다제는 분비 신호(secretion signal)를 포함하거나, 상기 만노시다제는 상기 만노시다제를 세포내 구간(intracellular compartment)을 표적으로 하기 위하여 표적 신호(targeting signal)를 포함하는 것을 특징으로 하는 진균 세포.
- 제 29 항 또는 제 30 항에 있어서, 상기 만노시다제는 카나발리아 엔시포르미스(Canavalia ensiformis)로부터 얻어지거나, 상기 만노시다제는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 분리된 진균 세포.
- 제 22 항에 따른 당단백질을 필요로 하는 대상에 투여하는 단계를 포함하는 방법에 사용되기 위한 것을 특징으로 하는 당단백질.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US38794010P | 2010-09-29 | 2010-09-29 | |
US61/387,940 | 2010-09-29 | ||
US201161477014P | 2011-04-19 | 2011-04-19 | |
US61/477,014 | 2011-04-19 | ||
PCT/IB2011/002770 WO2012042386A2 (en) | 2010-09-29 | 2011-09-29 | Mannosidases capable of uncapping mannose-1-phospho-6-mannose linkages and demannosylating phosphorylated n-glycans and methods of facilitating mammalian cellular uptake of glycoproteins |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20140093602A KR20140093602A (ko) | 2014-07-28 |
KR101983572B1 true KR101983572B1 (ko) | 2019-05-29 |
Family
ID=45349242
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020137011110A KR101983572B1 (ko) | 2010-09-29 | 2011-09-29 | 만노스-1-포스포-6-만노스 결합의 캡핑제거 및 인산화 n-글리칸의 탈만노실이 가능한 만노시다제 및 당단백질의 활용을 통한 포유류 세포의 촉진방법 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US9347050B2 (ko) |
EP (1) | EP2622088A2 (ko) |
JP (1) | JP6151183B2 (ko) |
KR (1) | KR101983572B1 (ko) |
CN (1) | CN103328646B (ko) |
BR (1) | BR112013007616B1 (ko) |
CA (1) | CA2812870C (ko) |
SG (1) | SG189108A1 (ko) |
WO (1) | WO2012042386A2 (ko) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20180128945A (ko) * | 2016-03-30 | 2018-12-04 | 아미쿠스 세라퓨틱스, 인코포레이티드 | 고 m6p 재조합 단백질의 선택 방법 |
Families Citing this family (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2508612B1 (en) * | 2007-04-03 | 2017-11-29 | Oxyrane UK Limited | Glycosylation of molecules |
JP5990102B2 (ja) | 2009-09-29 | 2016-09-07 | ユニフェルシテイト ヘント | ホスホ−6−マンノースへのマンノース−1−ホスホ−6−マンノース結合の加水分解 |
BR112012011980A2 (pt) | 2009-11-19 | 2021-09-08 | Oxyrane Uk Limited | Métodos de produzir células transformadas de yarrowia lipolytica e proteínas-alvocompreendendo n-glicanos, células transformadas de yarrowia lipolytica e suas culturas, bem como composição compreendendo glicoproteínas |
JP6131190B2 (ja) | 2010-09-29 | 2017-05-17 | オキシレイン ユーケー リミテッド | リン酸化n−グリカンの脱マンノシル化 |
CA2812870C (en) | 2010-09-29 | 2020-06-09 | Oxyrane Uk Limited | Mannosidases capable of uncapping mannose-1-phospho-6-mannose linkages and demannosylating phosphorylated n-glycans and methods of facilitating mammalian cellular uptake of glycoproteins |
AU2013234042B2 (en) | 2012-03-15 | 2017-11-02 | Oxyrane Uk Limited | Methods and materials for treatment of Pompe's disease |
WO2014136065A2 (en) | 2013-03-05 | 2014-09-12 | Oxyrane Uk Limited | Production of catalytically active type i sulfatase |
FI3201320T3 (fi) * | 2014-09-30 | 2024-01-08 | Amicus Therapeutics Inc | Erittäin tehokas hapan alfa-glukosidaasi parannetuilla hiilihydraateilla |
GB201508025D0 (en) | 2015-05-11 | 2015-06-24 | Ucl Business Plc | Fabry disease gene therapy |
WO2016195394A1 (ko) * | 2015-06-02 | 2016-12-08 | 한국생명공학연구원 | 효모 세포벽 만노단백질 유래의 당사슬을 이용한 만노스-6-인산 당사슬이 부가된 당단백질의 제조방법 |
PT3782639T (pt) * | 2015-12-08 | 2022-08-10 | Regeneron Pharma | Composições e métodos para a internalização de enzimas |
CN105420212B (zh) * | 2015-12-15 | 2020-02-14 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 一种新型的结核分枝杆菌胞外核酸酶及其用途 |
US11040114B2 (en) | 2015-12-24 | 2021-06-22 | Oxyrane Uk Limited | Human alpha-N-acetylgalactosaminidase polypeptide |
EP3510149A1 (en) | 2016-09-12 | 2019-07-17 | Genethon | Acid-alpha glucosidase variants and uses thereof |
EA039750B1 (ru) * | 2017-03-30 | 2022-03-10 | Амикус Терапьютикс, Инк. | Способ отбора рекомбинантных белков с высоким содержанием m6p |
BR112019025888A2 (pt) | 2017-06-07 | 2020-06-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | polinucleotídeo que codifica uma proteína terapêutica multidomínio, vetor de terapia gênica, proteína terapêutica multidomínio recombinante, método de expressão, métodos para reduzir o acúmulo de glicogênio em um tecido em um paciente em necessidade, para reduzir o acúmulo de glicogênio em um tecido em um paciente em necessidade epara tratar a deficiência enzimática em um paciente em necessidade e/ou tolerar o paciente à enzima para a qual é deficiente, anticorpo anti-cd63 ou fragmento de ligação a antígeno, e, composição farmacêutica |
KR102167388B1 (ko) * | 2020-01-15 | 2020-10-19 | 코스맥스 주식회사 | 신규 로도스포리디움 토룰로이데스 균주 및 그 균주 배양액을 포함하는 화장료 조성물 |
CN111450020A (zh) * | 2020-04-21 | 2020-07-28 | 上海普缇康生物技术有限公司 | 一种利用酵母菌发酵产物制作皮肤健康护理制剂的制备方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002369692A (ja) | 2001-06-14 | 2002-12-24 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 糖蛋白質およびその製造方法 |
WO2004074498A3 (en) | 2003-02-20 | 2005-06-23 | Stephen R Hamilton | Expression of class 2 mannosidase and class iii mannosidase in lower eukaryotic cells |
WO2008120107A2 (en) | 2007-04-03 | 2008-10-09 | Oxyrane (Uk) Limited | Glycosylation of molecules |
Family Cites Families (85)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4307717A (en) | 1977-11-07 | 1981-12-29 | Lectec Corporation | Sterile improved bandage containing a medicament |
US4704362A (en) | 1977-11-08 | 1987-11-03 | Genentech, Inc. | Recombinant cloning vehicle microbial polypeptide expression |
US4352883A (en) | 1979-03-28 | 1982-10-05 | Damon Corporation | Encapsulation of biological material |
JPS5754588A (en) | 1980-09-19 | 1982-04-01 | Eiji Ichijima | Alpha-mannosidase |
US4353888A (en) | 1980-12-23 | 1982-10-12 | Sefton Michael V | Encapsulation of live animal cells |
US4407957A (en) | 1981-03-13 | 1983-10-04 | Damon Corporation | Reversible microencapsulation of a core material |
US4837148A (en) | 1984-10-30 | 1989-06-06 | Phillips Petroleum Company | Autonomous replication sequences for yeast strains of the genus pichia |
US4879231A (en) | 1984-10-30 | 1989-11-07 | Phillips Petroleum Company | Transformation of yeasts of the genus pichia |
US4882279A (en) | 1985-10-25 | 1989-11-21 | Phillips Petroleum Company | Site selective genomic modification of yeast of the genus pichia |
US4883666A (en) | 1987-04-29 | 1989-11-28 | Massachusetts Institute Of Technology | Controlled drug delivery system for treatment of neural disorders |
US4929555A (en) | 1987-10-19 | 1990-05-29 | Phillips Petroleum Company | Pichia transformation |
US5158881A (en) | 1987-11-17 | 1992-10-27 | Brown University Research Foundation | Method and system for encapsulating cells in a tubular extrudate in separate cell compartments |
US5283187A (en) | 1987-11-17 | 1994-02-01 | Brown University Research Foundation | Cell culture-containing tubular capsule produced by co-extrusion |
DE3829766A1 (de) | 1988-09-01 | 1990-03-22 | Akzo Gmbh | Verfahren zur herstellung von membranen |
DE3829752A1 (de) | 1988-09-01 | 1990-03-22 | Akzo Gmbh | Integrale asymmetrische polyaethersulfonmembran, verfahren zur herstellung und verwendung zur ultrafiltration und mikrofiltration |
US5530101A (en) | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
US5084350A (en) | 1990-02-16 | 1992-01-28 | The Royal Institution For The Advance Of Learning (Mcgill University) | Method for encapsulating biologically active material including cells |
US5272070A (en) | 1991-03-08 | 1993-12-21 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Method for the preparation of cell lines producing Man3 GlcNac 2 asparagine-linked gylcans and cell lines produced thereby |
CA2109085C (en) | 1991-04-25 | 2003-03-11 | Keith E. Dionne | Implantable biocompatible immunoisolatory vehicle for delivery of selected therapeutic products |
US5968502A (en) | 1991-11-05 | 1999-10-19 | Transkaryotic Therapies, Inc. | Protein production and protein delivery |
US6042828A (en) | 1992-09-07 | 2000-03-28 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Humanized antibodies to ganglioside GM2 |
DE69430824T2 (de) | 1993-08-12 | 2003-01-23 | Neurotech Sa | Biokompatible immunoisolatorische Kapseln, die genetisch veränderte Zellen enthalten |
US5589359A (en) | 1994-08-05 | 1996-12-31 | Chiron Corporation | Chimeric proteins |
US5834251A (en) | 1994-12-30 | 1998-11-10 | Alko Group Ltd. | Methods of modifying carbohydrate moieties |
WO1997044470A1 (en) | 1996-05-21 | 1997-11-27 | Novo Nordisk A/S | Novel yeast promoters suitable for expression cloning in yeast and heterologous expression of proteins in yeast |
US6699658B1 (en) | 1996-05-31 | 2004-03-02 | Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Yeast cell surface display of proteins and uses thereof |
US6300065B1 (en) | 1996-05-31 | 2001-10-09 | Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Yeast cell surface display of proteins and uses thereof |
ES2187782T3 (es) | 1996-07-05 | 2003-06-16 | Novo Nordisk As | Procedimiento para la produccion de polipeptidos. |
AU3255397A (en) | 1996-07-05 | 1998-02-02 | Novo Nordisk A/S | Method for the production of precursors of insulin, precursors of insulin analogues, and insulin like peptides |
US6110703A (en) | 1996-07-05 | 2000-08-29 | Novo Nordisk A/S | Method for the production of polypeptides |
JP2001526533A (ja) | 1997-04-23 | 2001-12-18 | フラームス・インテルウニフェルシタイル・インスティチュート・フォール・ビオテヒノロヒー | λ様プロモーターを有する遺伝子の誘導性発現のための調節系 |
US7442772B2 (en) | 1997-12-03 | 2008-10-28 | Genentech, Inc. | Antibodies to PRO361 polypeptide |
AU2241699A (en) | 1998-01-27 | 1999-08-09 | Board Of Regents Of The University And Community College System Of Nevada, The | Expression of proteolytically-sensitive peptides |
WO2001042462A2 (en) | 1999-12-08 | 2001-06-14 | National University Of Singapore | Phospholipase a2 inhibitory peptides from python reticulatus |
US20020127219A1 (en) | 1999-12-30 | 2002-09-12 | Okkels Jens Sigurd | Lysosomal enzymes and lysosomal enzyme activators |
AU2352201A (en) | 1999-12-30 | 2001-07-16 | Maxygen Aps | Improved lysosomal enzymes and lysosomal enzyme activators |
DE60139467D1 (de) | 2000-05-17 | 2009-09-17 | Mitsubishi Tanabe Pharma Corp | Verfahren zur herstellung von proteinen unter reduktion von mannosephosphat in der zuckerkette und dadurch hergestelltes glykoprotein |
US7795002B2 (en) | 2000-06-28 | 2010-09-14 | Glycofi, Inc. | Production of galactosylated glycoproteins in lower eukaryotes |
US7598055B2 (en) | 2000-06-28 | 2009-10-06 | Glycofi, Inc. | N-acetylglucosaminyltransferase III expression in lower eukaryotes |
US8697394B2 (en) | 2000-06-28 | 2014-04-15 | Glycofi, Inc. | Production of modified glycoproteins having multiple antennary structures |
US7029872B2 (en) | 2000-06-28 | 2006-04-18 | Glycofi, Inc | Methods for producing modified glycoproteins |
US7863020B2 (en) | 2000-06-28 | 2011-01-04 | Glycofi, Inc. | Production of sialylated N-glycans in lower eukaryotes |
WO2003056914A1 (en) | 2001-12-27 | 2003-07-17 | Glycofi, Inc. | Methods to engineer mammalian-type carbohydrate structures |
US7449308B2 (en) | 2000-06-28 | 2008-11-11 | Glycofi, Inc. | Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes |
EP1294910B1 (en) | 2000-06-30 | 2008-11-19 | VIB vzw | Protein glycosylation modification in pichia pastoris |
KR100386836B1 (ko) | 2000-08-31 | 2003-06-09 | 동국제약 주식회사 | 재조합 인체 부갑상선 호르몬을 생산하는 형질전환효모 및재조합 인체 부갑상선 호르몬의 생산방법 |
US7001994B2 (en) | 2001-01-18 | 2006-02-21 | Genzyme Corporation | Methods for introducing mannose 6-phosphate and other oligosaccharides onto glycoproteins |
JP4774496B2 (ja) | 2001-06-14 | 2011-09-14 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | α−マンノシダーゼ |
EP2093286B1 (en) | 2001-10-01 | 2013-02-27 | Dyax Corporation | Multi-chain eukaryotic display vectors and uses thereof |
US7473680B2 (en) | 2001-11-28 | 2009-01-06 | Neose Technologies, Inc. | Remodeling and glycoconjugation of peptides |
MXPA04009418A (es) | 2002-03-29 | 2005-06-08 | Schering Corp | Anticuerpos monoclonales humanos par interleucina-5, y metodos y composiciones que comprenden los mismos. |
ATE420198T1 (de) | 2002-04-26 | 2009-01-15 | Kirin Pharma Kk | Methylotrophe hefe,die eine zuckerkette eines säugers herstellt |
IL165717A0 (en) | 2002-06-26 | 2006-01-15 | Flanders Interuniversity Inst | A strain of methylotrophic yeast for producing proteins |
US7262287B2 (en) | 2002-06-29 | 2007-08-28 | Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology | Hansenula polymorpha yapsin deficient mutant strain and process for the preparation of recombinant proteins using the same |
KR100470978B1 (ko) | 2003-01-02 | 2005-03-10 | 한국생명공학연구원 | 앱신 다중 결손 효모 변이 균주 및 이를 이용한 재조합 단백질의 생산 방법 |
AU2012206984B2 (en) | 2003-02-11 | 2015-07-09 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Diagnosis and treatment of multiple sulfatase deficiency and other using a formylglycine generating enzyme (FGE) |
JP4259169B2 (ja) | 2003-04-16 | 2009-04-30 | 昭和産業株式会社 | 新規α−1,2−マンノシダーゼおよびその遺伝子、ならびに該酵素を用いたα−マンノシル糖化合物の製造方法 |
US7259255B2 (en) | 2003-06-25 | 2007-08-21 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and phosphoglycerate mutase promoters for gene expression in oleaginous yeast |
US7259007B2 (en) | 2003-12-24 | 2007-08-21 | Glycofi, Inc. | Methods for eliminating mannosylphosphorylation of glycans in the production of glycoproteins |
WO2005078077A2 (en) | 2004-02-10 | 2005-08-25 | Zystor Therapeutics, Inc. | Acid alpha-glucosidase and fragments thereof |
WO2005089047A2 (en) | 2004-03-18 | 2005-09-29 | Glycofi, Inc. | Glycosylated glucocerebrosidase expression in fungal hosts |
JP2007535317A (ja) | 2004-04-15 | 2007-12-06 | グライコフィ, インコーポレイテッド | 下等真核生物におけるガラクトシル化された糖タンパク質の産生 |
CA2501422C (en) | 2004-04-29 | 2014-08-12 | University Of Rochester | Lymphoid chemokines in the diagnosis, monitoring and treatment of autoimmune disease |
AU2005238308B8 (en) | 2004-04-29 | 2009-10-08 | Glycofi, Inc. | Methods for reducing or eliminating alpha-mannosidase resistant glycans in the production of glycoproteins |
US20060014264A1 (en) | 2004-07-13 | 2006-01-19 | Stowers Institute For Medical Research | Cre/lox system with lox sites having an extended spacer region |
US7431927B2 (en) | 2005-03-24 | 2008-10-07 | Epitomics, Inc. | TNFα-neutralizing antibodies |
EP1910514A4 (en) | 2005-04-14 | 2010-03-03 | Oxyrane Uk Ltd | RECOMBINANT HEEDS FOR SYNTHETIZING EPOXY HYDROLASES |
CA2623197A1 (en) | 2005-09-22 | 2007-03-29 | Prosci Incorporated | Glycosylated polypeptides produced in yeast mutants and methods of use thereof |
US20080081035A1 (en) | 2006-10-03 | 2008-04-03 | National Enzyme Company | Therapeutic protease compositions |
EP2068914A4 (en) | 2007-02-09 | 2011-07-20 | Medimmune Llc | PRESENTATION OF ANTIBODY BANK BY PLASMA MEMBRANES OF YEAST CELLS |
US8569032B2 (en) | 2007-05-18 | 2013-10-29 | Tokyo Metropolitan Institute Of Medical Science | Proteins having acquired A-galactosidase activity |
WO2009033507A1 (en) | 2007-09-14 | 2009-03-19 | Telefonaktiebolaget Lm Ericsson (Publ) | User data notification in a mobile communications system |
KR101744142B1 (ko) | 2008-01-18 | 2017-06-07 | 바이오마린 파머수티컬 인크. | 활성이고 높은 정도로 인산화된 인간 리소좀 술파타아제 효소의 제조 및 그 용도 |
US20100311122A1 (en) | 2008-02-20 | 2010-12-09 | Glycofi, Inc | Vectors and yeast strains for protein production |
DK2279210T3 (en) | 2008-05-07 | 2017-07-24 | Biomarin Pharm Inc | Lysosomal targeting peptides and uses thereof |
EP2921551A3 (en) | 2009-02-26 | 2015-12-02 | GlaxoSmithKline LLC | Host cells and methods of use |
JP5990102B2 (ja) | 2009-09-29 | 2016-09-07 | ユニフェルシテイト ヘント | ホスホ−6−マンノースへのマンノース−1−ホスホ−6−マンノース結合の加水分解 |
BR112012011980A2 (pt) | 2009-11-19 | 2021-09-08 | Oxyrane Uk Limited | Métodos de produzir células transformadas de yarrowia lipolytica e proteínas-alvocompreendendo n-glicanos, células transformadas de yarrowia lipolytica e suas culturas, bem como composição compreendendo glicoproteínas |
FR2954349A1 (fr) | 2009-12-22 | 2011-06-24 | Agronomique Inst Nat Rech | Sulfatase modifiant selectivement les glycosaminoglycanes |
CA2787677A1 (en) | 2010-01-21 | 2011-07-28 | Oxyrane Uk Limited | Methods and compositions for displaying a poypeptide on a yeast cell surface |
US20120135461A1 (en) | 2010-07-30 | 2012-05-31 | William James Cook | Production of glycoproteins with reduced o-glycosylation comprising the use of an alpha-1,2-mannosidase |
JP6131190B2 (ja) | 2010-09-29 | 2017-05-17 | オキシレイン ユーケー リミテッド | リン酸化n−グリカンの脱マンノシル化 |
CA2812870C (en) | 2010-09-29 | 2020-06-09 | Oxyrane Uk Limited | Mannosidases capable of uncapping mannose-1-phospho-6-mannose linkages and demannosylating phosphorylated n-glycans and methods of facilitating mammalian cellular uptake of glycoproteins |
BR112014015933A2 (pt) | 2011-12-30 | 2019-09-24 | Oxyrane Uk Ltd | métodos e materiais para reduzir a degradação das proteínas recombinantes |
AU2013234042B2 (en) | 2012-03-15 | 2017-11-02 | Oxyrane Uk Limited | Methods and materials for treatment of Pompe's disease |
-
2011
- 2011-09-29 CA CA2812870A patent/CA2812870C/en active Active
- 2011-09-29 CN CN201180057437.3A patent/CN103328646B/zh active Active
- 2011-09-29 KR KR1020137011110A patent/KR101983572B1/ko active IP Right Grant
- 2011-09-29 EP EP11796810.7A patent/EP2622088A2/en active Pending
- 2011-09-29 WO PCT/IB2011/002770 patent/WO2012042386A2/en active Application Filing
- 2011-09-29 US US13/876,769 patent/US9347050B2/en active Active
- 2011-09-29 SG SG2013022496A patent/SG189108A1/en unknown
- 2011-09-29 BR BR112013007616-0A patent/BR112013007616B1/pt active IP Right Grant
- 2011-09-29 JP JP2013530817A patent/JP6151183B2/ja active Active
-
2016
- 2016-03-31 US US15/087,201 patent/US10011857B2/en active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002369692A (ja) | 2001-06-14 | 2002-12-24 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 糖蛋白質およびその製造方法 |
WO2004074498A3 (en) | 2003-02-20 | 2005-06-23 | Stephen R Hamilton | Expression of class 2 mannosidase and class iii mannosidase in lower eukaryotic cells |
WO2008120107A2 (en) | 2007-04-03 | 2008-10-09 | Oxyrane (Uk) Limited | Glycosylation of molecules |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20180128945A (ko) * | 2016-03-30 | 2018-12-04 | 아미쿠스 세라퓨틱스, 인코포레이티드 | 고 m6p 재조합 단백질의 선택 방법 |
KR102343162B1 (ko) | 2016-03-30 | 2021-12-23 | 아미쿠스 세라퓨틱스, 인코포레이티드 | 고 m6p 재조합 단백질의 선택 방법 |
KR20210157477A (ko) * | 2016-03-30 | 2021-12-28 | 아미쿠스 세라퓨틱스, 인코포레이티드 | 고 m6p 재조합 단백질의 선택 방법 |
KR102455821B1 (ko) | 2016-03-30 | 2022-10-18 | 아미쿠스 세라퓨틱스, 인코포레이티드 | 고 m6p 재조합 단백질의 선택 방법 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US10011857B2 (en) | 2018-07-03 |
CA2812870C (en) | 2020-06-09 |
CN103328646A (zh) | 2013-09-25 |
SG189108A1 (en) | 2013-05-31 |
CA2812870A1 (en) | 2012-04-05 |
WO2012042386A2 (en) | 2012-04-05 |
WO2012042386A3 (en) | 2012-05-31 |
BR112013007616A2 (pt) | 2021-09-08 |
CN103328646B (zh) | 2021-06-18 |
JP6151183B2 (ja) | 2017-06-21 |
JP2013539974A (ja) | 2013-10-31 |
EP2622088A2 (en) | 2013-08-07 |
US9347050B2 (en) | 2016-05-24 |
BR112013007616B1 (pt) | 2023-01-24 |
US20130267473A1 (en) | 2013-10-10 |
KR20140093602A (ko) | 2014-07-28 |
US20160251693A1 (en) | 2016-09-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR101983572B1 (ko) | 만노스-1-포스포-6-만노스 결합의 캡핑제거 및 인산화 n-글리칸의 탈만노실이 가능한 만노시다제 및 당단백질의 활용을 통한 포유류 세포의 촉진방법 | |
US10392609B2 (en) | Hydrolysis of mannose-1-phospho-6-mannose linkage to phospho-6-mannose | |
US10344310B2 (en) | De-mannosylation of phosphorylated N-glycans | |
RU2644258C2 (ru) | Способы и материалы для лечения болезни помпе | |
KR20130055555A (ko) | 효모 스트레인 생성용 포유류 유사 복합 n-글리칸들 | |
US20220204952A1 (en) | Production of catalytically active type i sulfatase |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A201 | Request for examination | ||
AMND | Amendment | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
AMND | Amendment | ||
E601 | Decision to refuse application | ||
AMND | Amendment | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
AMND | Amendment | ||
X701 | Decision to grant (after re-examination) | ||
GRNT | Written decision to grant |