KR101744142B1 - 활성이고 높은 정도로 인산화된 인간 리소좀 술파타아제 효소의 제조 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 활성이고 높은 정도로 인산화된 리소좀 술파타아제 효소의 조성물, 그들의 약학적 조성물, 그러한 리소좀 술파타아제 효소 및 조성물을 생산하고 정제하는 방법 및 리소좀 술파타아제 효소의 결핍에 의해 야기되거나 관련된 특정 리소좀 저장 질병을 포함하는 진단, 예방 또는 질병 및 상태의 치료에서의 사용을 제공한다.

Description

활성이고 높은 정도로 인산화된 인간 리소좀 술파타아제 효소의 제조 및 그 용도{MANUFACTURE OF ACTIVE HIGHLY PHOSPHORYLATED HUMAN LYSOSOMAL SULFATASE ENZYMES AND USES THEREOF}
본 발명은 세포 및 분자 생물학과 약물, 구체적으로 활성이고 높은 정도로 인산화된 인간 리소좀 술파타아제 효소의 제조 및 리소좀 술파타아제 효소 결핍과 관련된 리소좀 저장 질환의 관리에 있어 그것의 용도에 대한 기술 분야와 관련한다. 구체적으로, 본 발명은 활성이고 높은 정도로 인산화된 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS) 및 점액 다당류증(Mucopolysaccharidosis) Ⅳa(MPS Ⅳa 또는 모르퀴오 A 증후군) 및 GLANS 결핍과 관련된 다른 리소좀 저장 질환의 관리에 있어 그것의 용도와 관련한다.
리소좀 저장 질환(LSDs)은 리소좀 내 세포 폐기물의 분해에 필수적인 세포 내 특정 리소좀 효소의 결핍으로 야기된다. 그러한 리소좀 효소의 결핍은 분해되지 않은 "저장 물질"의 리소좀 내 축적을 이끌고, 이는 리소좀의 부종과 기능 장애 및 궁극적으로 세포 및 조직 손상을 야기한다. 많은 리소좀 효소가 확인되었으며, 그들의 관련된 질병과의 연관성이 보여졌다. 일단 소실한 효소가 확인되면, 치료는 영향을 받은 환자의 조직에 대체 효소를 효과적으로 전달하는 유일한 문제로 줄어들 수 있다.
리소좀 저장 질환을 치료하는 한 가지 방법은 정맥 효소 대체 치료(ERT)이다(카키스, Expert Opin . Investig . Drugs 11(5): 675-685, 2002). ERT는 맥관 조직의 장점을 취하여, 하나의 투여 사이트에서 가장 많은 조직으로 효소를 전달한다. 일단 효소가 넓게 분포되면, 이것은 세포 내로 흡수되어야만 한다. 세포 내 흡수를 위한 기반은 리소좀 효소의 독특한 특징에서 발견된다. 리소좀 효소는 말단 만노즈 잔기의 6-위치에서 포스페이트에 의해 정의된 글리코단백질의 별개의 종류를 구성한다. 만노즈-6-포스페이트는 많은 세포의 표면상에 기반을 둔 수용체에 의한 높은 친화성 및 특이성을 가지고 결합된다(무니어-레만 등, Biochem . Soc . Trans. 24(1): 133-136, 1996; 마르넬 등., J. Cell . Biol . 99(6): 1907-1916, 1984). 폴리펩타이드 체인 당 두 개의 만노즈-6-포스페이트 결합 사이트를 가지는 (통 등, J. Biol . Chem. 264:7962-7969, 1989) 만노즈-6-포스페이트 수용체(MPR)는 혈액에서 조직으로 효소의 흡수를 지시하고, 이후 리소좀으로 세포 내 경로를 매개한다.
리소좀 효소의 대규모 생산은 포유류 세포 라인에서 발현과 관련한다. 목표는 수확을 위한 주변 성장 배지 및 처리 다음 단계로 재조합 효소를 우세하게 분비하는 것이다. 리소좀 효소의 대규모 생산을 위한 이상적인 시스템에서, 효소는 효율적으로 인산화될 것이고, 이후 주로 리소좀에 보다는 세포 표면을 향해 주로 지시(즉, 분비를 위해)하게 될 것이다. 상기 설명한 바와 같이, 인산화된 리소좀 효소의 본 분할은 정상 세포에서 일어나는 것의 정확한 반대이다. 리소좀 효소 생산에 사용되는 세포 라인의 제조는 효소 몰 당 만노즈-6-포스페이트의 농도를 최대화하는데 초점을 두지만, 낮은 특정 생산성으로 특징된다. 높은 농도의 만노즈-6-포스페이트 모이어티를 포함하는 리소좀 효소를 생산하는 체외 시도에서 혼합된 성공을 낳았다(캔필드 등, U.S. Patent No. 6,537,785). 체외에서 효소는 높은 농도의 만노즈-6-포스페이트뿐만 아니라, 높은 농도의 변형되지 않은 최종 만노즈를 나타낸다. 만노즈-6-포스페이트 및 리소좀 효소에 대한 만노즈 수용체 간의 경쟁은 유효성을 위해 효소의 고용량에 대한 필요성을 낳으며, 치료될 대상의 손상에 대한 더 큰 면역원성(immunogenicity)을 이끌 수 있었다.
술파타아제는 리소좀 효소의 독특한 하위 종류를 구성한다. 술파타아제는 예를 들어 스테로이드, 탄수화물, 프로테오글리칸(proteoglycans) 및 글리코지질을 포함하는 다양한 기질로부터 술페이트 에스터를 분해한다. 모든 알려진 진핵 생물 술파타아제는 그들의 촉매 사이트에서 시스테인 잔기를 포함한다. 술파타아제 활성은 본 시스테인 잔기에서 Cα-포밀글리신(FGly)으로의 번역 후 변형을 필요로 한다. 시스테인에서 FGly로의 번역 후 효소 활성은 술파타아제의 리소좀에 대한 타깃팅 전에, 번역 후 즉시 접히지 않은 술파타아제 상 소포체 내에서 일어난다(디에크스 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 94:11963-11968, 1997). 본 반응을 촉매하는 포밀글리신-생성 효소는 술파타아제 변형 인자 1(SUMF1)이다. 본 독특한 번역-후 변형에 대한 중요성의 하이라이트는 SUMF1의 돌연변이이며, 이는 리소좀 술파타아제 효소 내 손상된 FGly 형성을 야기하며, 인간에게 복합 술파타아제 결핍(MSD)을 야기한다(디에즈-루이즈 등, Annu . Rev . Genomics Hum . Genet . 6:355-379, 2005).
따라서, 리소좀 술파타아제 효소 제조물의 치료적 효과는 만노즈-6-포스페이트의 농도 및 그 제조물 내 활성 효소의 존재에 달려있다.
따라서, 그러한 리소좀 술파타아제 효소의 결핍에 의해 야기되거나 관련된 리소좀 저장 장애의 관리를 위한 치료학적으로 유효하며, 활성이고 높은 정도로 인산화된 리소좀 술파타아제 효소의 대규모 생산을 위한 효율적이고 생산적인 시스템에 대한 당업계의 요구가 존재한다.
도 1은 인간 술파타아제 변형 인자 1(SUMF1)의 뉴클레오티드 서열을 표현한다(SEQ ID NO:1).
도 2는 인간 술파타아제 변형 인자 1(SUMF1)의 아미노산 서열을 표현한다(SEQ ID NO:2).
도 3은 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS) 뉴클레오티드 서열을 표현한다(SEQ ID NO:3).
도 4는 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS) 아미노산 서열을 표현한다(SEQ ID NO:4). N-말단에서 26 아미노산의 신호 펩타이드는 처리된 GLANS에 존재하지 않는다.
도 5는 처리된 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS)의 구조 및 특징을 묘사한다(SEQ ID NO:5).
도 6은 인간 술파타아제 변형 인자 1(SUMF1) 및 인간 GLANS 발현 벡터와 공-도입(transfect)된 G71S 세포로부터 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS)의 발현을 보여준다. (A) 96-웰(well)에서 활성 GLANS를 위한 G71S 클론 스크린 (B) 하루 당 세포 당 피코그램의 G71S 클론 GLANS 생산성.
도 7은 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS) 및 그것의 변종을 발현하는 G71S 세포의 대규모 생산에 사용되는 웨이브(WAVE) 바이오반응기 조절기의 개략도를 설명한다.
도 8은 4℃(다이아몬드) 또는 -70℃(삼각형)에서 저장 중 정제된 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS) 효소의 안정성을 보여준다.
도 9는 (A) 블루 세파로오스 6 빠른 유동 크로마토그래피에 이어 (B) 프랙토겔(Fractogel) SE Hi-Cap 크로마토그래피에 의한 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS)의 정제를 보여준다. 순도는 SDS-PAGE의 쿠마시 블루 염색(왼쪽) 및 항-GLANS(IVA) 항체를 사용한 웨스턴 블로팅(오른쪽)에 의해 결정된다.
도 10은 초여과/이중여과(UF/DF), 프랙토겔 SE Hi-Cap 크로마토그래피, 아연-킬레이팅 세파로오스 크로마토그래피 및 토요펄 부틸 650M 크로마토그래피에 의한 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS)의 정제를 보여준다. 순도는 SDS-PAGE의 쿠마시 블루 염색(왼쪽 위) 및 항-GLANS 항체를 사용한 웨스턴 블로팅(오른쪽 위), 항-카텝신(Cathepsin) L 항체(왼쪽 아래) 및 항-CHOP(중국 햄스터 난소 세포 단백질)(오른쪽 아래)에 의해 결정된다.
도 11은 IDU-처리된 GM01391 세포에서 관찰되었던 덜마탄 술페이트 기질 양의 용량 의존 감소를 보여준다.
도 12는 ARSB-처리된 GM00519 세포에서 관찰되었던 덜마탄 술페이트 기질 양의 용량 의존 감소를 보여준다.
도 13은 배양된 윤활막 세포(synoviocyte)에 의해 표지되지 않음(원) 또는 A488(사각형) 또는 A555(삼각형)과 컨쥬게이트된 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS)의 흡수를 보여준다.
본 출원 청구항은 2008년 1월 18일 출원된 미국 가출원 제61/022,179호, 2008년 9월 23일 출원된 미국 가출원 제61/099,373호, 및 2008년 10월 31일 출원된 미국 가출원 제61/110,246호를 기초로 우선권을 향유하며, 이의 상세한 설명은 본 명세서에 참조 문헌으로 도입된다.
발명의 요약
본 발명은 엔도솜(endosomal) 산성화에 결함이 있는 CHO-K1 세포 라인 파생물(G71로 표시됨)이 재조합 인간 술파타아제 변형 인자 1(SUMF1)을 발현하도록 조작되었을 때, 변형된 G71 세포는 부분적으로 세포 라인을 제조하는 리소좀 구획으로 물질의 손실을 막음으로써, 활성이고 높은 정도로 인산화된 재조합 리소좀 술파타아제 효소를 높은 수득율로 생산한다는 발견과 관련한다. 일실시예에서, 상기 발명은 재조합 인간 SUMF1과 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS)를 함께 발현하여 활성이고 높은 정도로 인산화된 효소의 높은 수득을 낳는 END3 상보성 그룹 세포(END3 complementation group cell)를 제공한다. 예시적인 세포 라인은 G71, G71S 및 그들의 파생물이고, 이들은 G71의 바람직한 특성, 즉 활성이고 높은 정도로 인산화된 재조합 리소좀 술파타아제 효소를 높은 수득율로 생산하는 능력을 가진다. 본 출원의 재조합 인간 SUMF1 및 재조합 리소좀 술파타아제 효소를 함께 발현하는 END3 상보성 그룹 변형된 CHO-K1 세포 라인은, 특히 효소 대체 치료(ERT)에 의한 리소좀 저장 질환의 관리에 사용되는 활성이고 높은 정도로 인산화된 리소좀 술파타아제 효소의 제조에 유용하다.
일측면에서, 본 발명은 END3 상보성 그룹 CHO 세포 또는 그것의 파생물에서, 활성이고 높은 정도로 인산화된 재조합 인간 리소좀 술파타아제 효소 또는 생물학적으로 활성인 그것의 절편, 돌연변이, 변종 또는 파생물을 그것의 치료학적 사용을 가능하게 하는 양으로 생산하는 신규 방법임을 특징으로 한다. 넓은 실시예에서, 상기 방법은 (a) CHO-파생된 END3 상보성 그룹 세포 또는 그것의 파생물을 배양하는 단계; (b) CHO-파생된 END3 상보성 그룹 세포 또는 그것의 파생물에서, 활성이고 높은 정도로 인산화된 재조합 인간 리소좀 술파타아제 효소 또는 생물학적으로 활성인 그것의 절편, 돌연변이, 변종 또는 파생물을 발현할 수 있는 제1의 포유류 발현 벡터를 제조하는 단계; (c) CHO-파생된 END3 상보성 그룹 세포 또는 그것의 파생물에서, 재조합 인간 술파타아제 변형 인자 1(SUMF1) 또는 생물학적으로 활성인 그것의 절편, 돌연변이, 변종 또는 파생물을 발현할 수 있는 제2의 포유류 발현 벡터를 제조하는 단계; (d) 상기 제1 및 제2의 발현 벡터들을 CHO-파생된 END3 상보성 그룹 세포 또는 그것의 파생물에 도입(transfect)하는 단계; (e) 활성이고 높은 정도로 인산화된 재조합 인간 리소좀 술파타아제 효소 또는 생물학적으로 활성인 그것의 절편, 돌연변이, 변종 또는 파생물을 발현한 CHO-파생된 END3 상보성 그룹 세포 또는 그것의 파생물의 도입물(transfectant)을 선택하고 클로닝하는 단계; 및 (f) 높은 정도로 인산화된 재조합 인간 리소좀 술파타아제 효소 또는 생물학적으로 활성인 그것의 절편, 돌연변이, 변종 또는 파생물을 제조하기 위한 세포 배양 처리 방법을 최적화하는 단계를 포함한다. 상기 재조합 인간 리소좀 술파타아제 효소는 아릴술파타아제 A(arlysulfatase A, ARSA), 아릴술파타아제 B(ARSB), 이두로네이트-2-술파타아제(iduronate-2-sulfatase, IDS), 술파미다아제/헤파린-N-술파타아제(sulfamidase/heparin-N-sulfatase, SGSH), N-아세틸글루코사민-술파타아제(N-acetylglucosamine-sulfatase, G6S) 및 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(N-acetylgalactosamine-6-sulfatase, GALNS)로 이루어진 그룹에서 선택된다.
상기 방법은 CHO-파생된 END3 상보성 그룹 세포 또는 그것의 파생물 내로 전체 또는 부분의 리소좀 술파타아제 효소를 인코딩하는 cDNA 및 전체 또는 부분의 인간 SUMF1을 인코딩하는 cDNA를 도입(transfecting)하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시예에서, 제1 및 제2의 발현 벡터는 각각 활성이고 높은 정도로 인산화된 재조합 인간 리소좀 술파타아제 효소와 인간 SUMF1의 인코딩을 발현할 수 있고, CHO-파생된 END3 상보성 그룹 세포 또는 그것의 파생물 내로 동시에 도입된다. 몇몇 실시예에서, 제1 및 제2의 발현 벡터는 CHO-파생된 END3 상보성 그룹 세포 또는 그것의 파생물 내로 순차적으로 도입된다. 몇몇 실시예에서, 전체 길이의 인간 리소좀 술파타아제 효소를 인코딩하는 cDNA가 사용되는 반면, 다른 실시예에서 생물학적으로 활성인 그것의 절편(fragment), 돌연변이(mutant), 변종(variant) 또는 파생물을 인코딩하는 cDNA가 사용된다. 몇몇 실시예에서, 전체 길이의 인간 SUMF1을 인코딩하는 cDNA가 사용되는 반면, 다른 실시예에서 생물학적으로 활성인 그것의 절편, 돌연변이, 변종 또는 파생물을 인코딩하는 cDNA가 사용된다. 몇몇 실시예에서, 여러 발현 벡터들이 인간 리소좀 술파타아제 효소 및 인간 SUMF1 cDNA들을 CHO-파생된 상보성 그룹 세포 또는 그것의 파생물 내로 동시에 또는 순차적으로 도입하기 위해 사용된다. 몇몇 실시예에서, 단일 발현 벡터가 인간 리소좀 술파타아제 효소 및 인간 SUMF1 cDNA를 CHO-파생된 END3 상보성 그룹 세포 또는 그것의 파생물 내로 동시에 도입하기 위해 사용된다. 바람직한 실시예에서, CHO-파생된 END3 상보성 그룹 세포 또는 그것의 파생물은 G71 세포 라인, G71S 세포 라인, 또는 G71 또는 G71S 파생물이다.
바람직한 실시예에서, 상기 방법은 END3 상보성 그룹 CHO 세포 라인 또는 그것의 파생물로부터 활성이고 높은 정도로 인산화된 재조합 인간 리소좀 술파타아제 효소, 예를 들어 아릴술파타아제 A(ARSA), 아릴술파타아제 B(ARSB), 이두로네이트-2-술파타아제(IDS), 술파미다아제/헤파린-N-술파타아제(SGSH), N-아세틸글루코사민-술파타아제(G6S) 또는 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GALNS)를 생산하는 단계를 포함한다. 특히 바람직한 실시예에서, 상기 방법은 END3 상보성 그룹 CHO 세포 라인 또는 그것의 파생물로부터 활성이고 높은 정도로 인산화된 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS)를 생산하는 단계를 포함한다. END3 상보성 그룹 세포 라인은 결함이 있는 엔도좀 산성화와 같은 END3 상보성 그룹 세포 라인의 특성을 가지는 어떤 변형된 CHO-세포 라인이다. 바람직한 실시예에서, CHO-파생된 END3 상보성 그룹 세포 또는 그것의 파생물은 G71 세포 라인, G71S 세포 라인, 또는 G71 또는 G71S 파생물이다.
두 번째 측면에서, 본 발명은 치료학적으로 리소좀 술파타아제 효소의 사용을 가능하게 하는 양으로 활성이고 높은 정도로 인산화된 재조합 인간 리소좀 술파타아제 효소를 생산하는 능력으로 특징되는 엔도솜(endosomal) 산성화-결핍 포유류 세포 라인을 제공한다. 바람직한 실시예에서, 상기 발명은 G71, G71S 또는 그것의 파생물로 표시되는, 활성이고 높은 정도로 인산화된 재조합 인간 리소좀 술파타아제 효소를 높은 수득율로 생산하는 것을 가능하게 하여 그러한 치료학적 리소좀 술파타아제 효소의 대규모 생산을 가능하게 하는 CHO-K1-파생된 END3 상보성 그룹 세포 라인을 제공한다. 더 바람직한 실시예에서, 상기 세포 라인은 약 0.5 이상, 바람직하게 약 0.75 이상, 더 바람직하게 약 1.0 이상, 그리고 보다 더 바람직하게 약 1.25 피코그램(picogram)/세포/일의 양으로 재조합 인간 리소좀 술파타아제 효소를 발현하고 분비한다.
END3 상보성 그룹 세포 라인은 결함이 있는 엔도솜 산성화와 같은 END3 상보성 그룹 세포 라인의 특성을 보유하는 어떤 변형된 CHO 세포 라인이다. 일실시예에서, END3 상보성 그룹 CHO 세포 라인은 G71 또는 그것의 파생물로부터 파생되고, (a) 재조합 인간 술파타아제 변형 인자 1(SUMF1)에 대한 발현 벡터 및 (b) 재조합 인간 리소좀 술파타아제 효소에 대한 발현 벡터를 포함하며, 상기 재조합 인간 리소좀 술파타아제 효소는 아릴술파타아제 A(ARSA), 아릴술파타아제 B(ARSB), 이두로네이트-2-술파타아제(IDS), 술파미다아제/헤파린-N-술파타아제(SGSH), N-아세틸글루코사민-술파타아제(G6S) 및 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GALNS)로 이루어진 그룹에서 선택된다. 바람직한 실시예에서, END3 상보성 그룹 CHO 세포 라인은 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS)에 대한 발현 벡터를 포함한다. 더 바람직한 실시예에서, END3 상보성 그룹 CHO 세포 라인은 재조합 인간 GLANS를 발현하고 분비한다. 다른 바람직한 실시예에서, END3 상보성 그룹 CHO 세포 라인은 클론(clone) 4, 클론 5, 클론 C6, 클론 C2, 클론 C5, 클론 C7, 클론 C10, 클론 C11 및 클론 C30으로 이루어진 그룹에서 선택된다. 더 바람직한 실시예에서, END3 상보성 그룹 CHO 세포 라인은 클론 C2이다. 다른 바람직한 실시예에서, END3 상보성 그룹 CHO 세포 라인은 현탁액에서의 성장에 적응된다.
세 번째 측면에서, 상기 발명은 본 발명의 방법에 따라 생산되고 그렇게 함으로써 리소좀 술파타아제 효소를 치료학적으로 사용할 수 있게 하는 양으로 존재하는 재조합 인간 리소좀 술파타아제 효소를 제공한다. 상기 리소좀 술파타아제 효소는 전체-길이의 단백질, 또는 그것의 절편, 돌연변이, 변종 또는 파생물일 수 있다. 몇몇 실시예에서, 상기 발명에 따른 리소좀 술파타아제 효소 또는 그것의 절편, 돌연변이, 변종 또는 파생물은 그것의 안정성 또는 약동학적 특성(예를 들어, PEG화, 돌연변이 생성, 융합(fusion), 컨쥬게이션(conjugation))을 강화하도록 의도되어 변형될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 상기 효소는 인간 리소좀 술파타아제 효소, 본래 술파타아제 효소의 생물학적 활성을 가지는 인간 리소좀 술파타아제 효소의 절편, 또는 인간 리소좀 술파타아제 효소와 상동 관계에 있는 상당한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드이다. 몇몇 실시예에서, 상기 리소좀 술파타아제 효소는 인간 또는 포유류 서열, 기원 또는 파생의 단백질이다. 다른 실시예에서, 상기 리소좀 술파타아제 효소는 그것의 결핍이, 이염성 백질 이영양증(Metachromatic Leukodystrophy) 또는 MLD(즉, 아릴술파타아제 A(ARSA)), 마로토-라미(Maroteaux-Lamy) 증후군 또는 MPS VI(즉, 아릴술파타아제 A(ARSB)), 헌터 증후군 또는 MPS Ⅱ(즉, 이두로네이트-2-술파타아제(IDS)), 산필리포(Sanfilippo) A 증후군 또는 MPS Ⅲa(즉, 술파미다아제/헤파린-N-술파타아제(SGSH)), 산필리포 D 증후군 또는 MPS Ⅲd(즉, N-아세틸글루코사민-술파타아제(G6S)) 및 모르퀴오 A 증후군 또는 MPS Ⅳa(즉, N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS))와 같은 인간 질환을 야기하는 것이다. 특히 바람직한 실시예에서, 상기 리소좀 술파타아제 효소는 그것의 결핍이 모르퀴오 A 증후군 또는 MPS Ⅳa(즉, N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS))를 야기하는 것이다. 다른 특히 바람직한 실시예에서, 상기 리소좀 술파타아제 효소는 그것의 결핍이 복합 술파타아제 결핍 또는 MSD(즉, N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS))와 같은 인간 질환과 관련되는 것이다.
상기 리소좀 술파타아제 효소는 또한 인간 또는 포유류 서열 기원 또는 파생의 것일 수 있다. 상기 발명의 또 다른 실시예에서, 그것의 측면 각각에서, 상기 리소좀 술파타아제 효소는 인간 또는 포유류 리소좀 술파타아제 효소 아미노산 서열의 대응 부분에 대한 아미노산 서열과 동일하다. 다른 실시예에서, 상기 폴리펩타이드 모이어티(moiety)는 인간 또는 포유류에서 유래된 본래의 리소좀 술파타아제 효소이다. 다른 실시예에서, 상기 리소좀 술파타아제 효소 폴리펩타이드는 약 25, 50, 100, 150 또는 200 이상의 아미노산 길이 또는 폴리펩타이드 전체 길이 이상으로 인간 또는 포유류 효소의 본래 리소좀 술파타아제 효소 아미노산 서열에 대해 실질적으로 상응한다(즉, 아미노산 서열과 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일하다). 다른 실시예에서, 리소좀 술파타아제 효소가 투여되는 대상은 인간이다.
바람직한 실시예에서, 상기 리소좀 술파타아제 효소는, CHO-파생된 END3 상보성 그룹 세포 라인을 예로 들 수 있는 엔도솜 산성화-결핍 세포 라인에 의해 생산된 높은 정도로 인산화된 재조합 인간 리소좀 술파타아제 효소이다. END3 상보성 그룹 세포 라인은 결합이 있는 엔도솜 산성화와 같은 END3 상보성 그룹 세포 라인의 특성을 보유하는 어떤 변형된 CHO 세포 라인이다. 바람직한 실시예에서, CHO-파생된 END3 상보성 그룹 세포 또는 그것의 파생물은 G71 세포 라인, G71S 세포 라인, 또는 G71 또는 G71S 파생물이다.
더 바람직한 실시예에서, 상기 재조합 인간 리소좀 술파타아제 효소는 높은 정도의 인산화된 올리고당(즉, 단백질 체인 당 0.25 이상, 바람직하게 0.5 이상, 더 바람직하게 약 0.75 이상의 비스-인산화된 올리고만노즈(oligomannose) 체인)이다. 보다 더 바람직한 실시예에서, 상기 효소는 높은 정도로 인산화된 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS)이다.
더 바람직한 실시예에서, 상기 재조합 인간 리소좀 술파타아제 효소는 활성 사이트 시스테인 잔기에서 Cα-포밀글리신(FGly)으로의 전환 퍼센트가 높다(즉, 약 50% 이상, 바람직하게 약 70% 이상, 더 바람직하게 약 90% 이상, 보다 더 바람직하게 약 95% 이상). 보다 더 바람직한 실시예에서, 상기 효소는 활성 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS)이다.
더 특히 바람직한 실시예에서, 상기 재조합 인간 리소좀 술파타아제 효소는 높은 정도로 인산화된 올리고당(즉, 단백질 체인 당 약 0.25 이상, 바람직하게 0.5 이상, 그리고 더 바람직하게 약 0.75 이상의 비스-인산화된 올리고만노즈 체인) 및 활성 사이트 시스테인 잔기에서 Cα-포밀글리신(FGly)으로의 높은 전환 퍼센트(즉, 약 50% 이상, 바림작하게 약 70% 이상, 더 바람직하게 약 90% 이상, 보다 더 바람직하게 약 95% 이상)를 가진다. 가장 특히 언급된 실시예에서, 상기 효소는 활성이고 높은 정도로 인산화된 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS)이다.
네 번째 측면에서, 상기 발명은 본 발명의 방법에 의해 생산된 재조합 인간 리소좀 술파타아제 효소를 정제하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시예에서, 리소좀 술파타아제 효소는 적어도 5개의 정제 단계: (1) 수확물, 즉 인간 술파타아제 변형 인자 1(SUMF1) 및 재조합 인간 리소좀 술파타아제 효소를 발현하는 END3 상보성 그룹 CHO 세포 라인 또는 그것의 파생물에서 배양 배지를 여과하는 단계; (2) 여과된 수확물을 pH 4.5로 pH를 조정하는 단계(오염 단백질의 침전을 유도하기 위해); (3) pH 조정한 여과된 수확물을 염료-리간드 컬럼, 예를 들어 블루 세파로오스 컬럼으로 로딩하고, 컬럼을 세척하며, 컬럼으로부터 리소좀 술파타아제 효소를 용출하는 단계; (4) 염료-리간드 컬럼으로부터의 용출물을 음이온 교환 컬럼, 예를 들어 Se Hi-Cap 컬럼으로 로딩하고, 컬럼을 세척하며, 컬럼으로부터 리소좀 술파타아제 효소를 용출하는 단계; 및 (5) 초여과하고 음이온 교환으로부터의 용출물을 두 번 여과하는 단계를 포함하는 2-컬럼 처리(염료-리간드 크로마토그래피, 예를 들어 블루-세파로오스(Blue-Sepharose)와 음이온 교환 크로마토그래피, 예를 들어 SE Hi-Cap)를 사용하여 정제된다. 선택적으로, 단계 (1)에서 여과된 수확물은 pH 조정 전에 초여과에 의해 10-20배 농축된다. 선택적으로, 단계 (5)에서 초여과되고 이중 여과된 리소좀 술파타아제 효소는 제형 버퍼에서 제형화된다. 특히 바람직한 실시예에서, 상기 리소좀 효소는 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS)이다.
다른 바람직한 실시예에서, 리소좀 술파타아제 효소는 3-컬럼 처리(포획(capture) 크로마토그래피, 예를 들어 음이온 교환 SE Hi-Cap; 중간(intermediate) 크로마토그래피, 예를 들어 염료-리간드 캡토 블루진크(Capto BlueZinc, 킬레이팅 세파로오스(Chelating Sepharose) FF 또는 캡토 어드히어(Capto Adghere; 및 폴리싱(polishing) 크로마토그래피, 예를 들어 토요펄(ToyoPearl) 부틸 650M, 페닐 세파로오스 Hi-Sub 또는 페닐 세파로오스 Low-Sub)를 사용하여 정제되고, 이는 5개 이상의 정제 단계를 포함한다: (1) 수확물, 즉, 예를 들어 살툰 카세트(Sartoon Cassettes)에 의해 인간 술파타아제 변형 인자 1(SUMF1) 및 재조합 인간 리소좀 술파타아제 효소를 발현하는 END3 상보성 그룹 CHO 세포 라인 또는 그것의 파생물에서 배지를 초 여과하는 단계(10 kDa, 하이드로사르트(Hydrosart); (2) 여과된 수확물을 pH 4.5로 pH를 조정하는 단계(오염 단백질의 침전을 유도하기 위해); (3) pH 조정한 여과된 수확물을 포획 컬럼, 예를 들어 프랙토겔 EMD SE Hi-CAP으로 로딩하는 단계; (4) 포획 컬럼으로부터의 용출물을 중간 컬럼, 예를 들어 염료-리간드 캡토 블루진크, 킬레이팅 세파로오스 FF 또는 캡토 어드히어로 로딩하고, 컬럼을 세척하며, 컬럼으로부터 리소좀 술파타아제 효소를 용출하는 단계; 및 (5) 상기 용출물을 폴리싱 컬럼, 예를 들어 토요펄 부틸 650M, 페닐 세파로오스 Hi-Sub 또는 페닐 세파로오스 Low-Sub로 로딩하고, 컬럼을 세척하며, 컬럼으로부터 리소좀 효소를 용출하는 단계. 단계 (5)의 상기 용출된 리소좀 효소는 제형 버퍼에서 제형화된다. 선택적으로, 단계 (5)의 상기 용출된 리소좀 술파타아제 효소는 초여과되고 이후 제형 버퍼에서 제형화된다. 선택적으로, 단계 (4) 컬럼의 리소좀 술파타아제 효소는 단계 (5)의 폴리싱 컬럼으로 로딩되기 전, 낮은 pH 바이러스 불활성을 위해 pH 3.5에 노출된다. 특히 바람직한 실시예에서, 상기 리소좀 효소는 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS)이다.
다섯 번째 측면에서, 상기 발명은 GLANS 효소 결핍에 의하거나(예를 들어 점액 다당류증 타입 Ⅳa(MPS Ⅳa) 또는 모르퀴오 A 증후군) 이와 관련된(예를 들어 복합 술파타아제 결핍(MSD)) 리소좀 저장 질환을 앓는 환자들을 치료하기에 유용한 정제된, 활성이고 높은 정도로 인산화된 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS) 또는 생물학적으로 활성인 그것의 돌연변이, 변종 또는 파생물을 제공한다. 바람직한 실시예에서, 상기 정제된, 활성이고 높은 정도로 인산화된 재조합 인간 GLANS: (a) 비-환원 조건 하에서 SDS-PAGE로 수행되는 경우 쿠마시 블루 염색에 의해 결정될 때 약 90% 이상의 순도를 가지고; (b) 위치 53의 시스테인 잔기에서 Cα-포밀글리신(FGly)으로의 전환이 약 90% 이상이며; (c) 위치 178 및 397의 아스파라긴 잔기에서 N-연결된 글리코실화되고, 상기에서 위치 178의 아스파라긴 잔기에 부착된 올리고만노즈 체인의 약 50% 이상이 비스-인산화된다. 상기 정제된, 활성이고 높은 정도로 인산화된 재조합 인간 GLAMS는 환원 조건 하에서 SDS-PAGE로 수행되는 경우 약 55-60 kDa의 주요 밴드(즉, 전구체 인간 GLANS는 가시적인 단백질 중 약 75% 이상, 바람직하게 약 85% 이상, 더 바람직하게 약 90% 이상, 그리고 보다 더 바람직하게 약 95% 이상)로 구성되고, ~39 kDa 및 ~19 kDa에서 부수 밴드(즉, 성숙 또는 처리된 인간 GLANS는 가시적인 단백질의 약 25% 미만, 바람직하게 약 15% 미만, 더 바람직하게 약 10% 미만, 그리고 보다 더 바람직하게 약 5%)로 구성된다. 특히 바람직한 실시예에서, 상기 정제된, 활성이고 높은 정도로 인산화된 재조합 인간 GLANS는 환원 조건 하에 SDS-PAGE로 수행되는 경우 기본적으로 약 55-60 kDa의 단일 밴드(즉, 전구체 인간 GLANS)로 구성된다. 일실시예에서, 상기 정제된, 활성이고 높은 정도로 인산화된 재조합 인간 GLANS는 MPS Ⅳa 또는 모르퀴오 A 증후군을 치료하기에 유용하다. 일실시예에서, 상기 정제된, 활성이고 높은 정도로 인산화된 재조합 인간 GLANS는 MSD 치료에 유용하다.
여섯 번째 측면에서, 상기 발명은 전체 또는 부분적으로 리소좀 술파타아제 효소의 결핍에 의하거나 결핍과 관련된 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명의 방법에 의해 생산된 치료학적인 재조합 인간 리소좀 술파타아제 효소를 투여하는 단계를 포함하고, 상기 리소좀 술파타아제 효소는 MPR 수용체에 결합하며, 세포막을 거쳐 수송되고, 세포로 들어가서 세포 내 리소좀으로 전달된다.
일실시예에서, 상기 방법은 그것이 필요한 대상에게 치료학적으로 유효한 양의 리소좀 술파타아제 효소를 투여하는 단계를 포함하는 리소좀 술파타아제 효소 결핍을 앓는 대상을 치료하는 것을 포함하고, 상기 리소좀 술파타아제 효소는 CHO-파생된 END3 상보성 그룹 세포 또는 그것의 파생물에 의해 생산된 재조합 인간 리소좀 술파타아제 효소 또는 생물학적으로 활성인 그것의 절편, 돌연변이, 변종 또는 파생물이다. 몇몇 실시예에서, 상기 방법은 치료학적인 재조합 인간 리소좀 술파타아제 효소 또는 생물학적으로 활성인 그것의 절편, 돌연변이, 변종 또는 파생물을 단독으로 또는 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 첨가제와 함께 조합하여 투여하는 단계를 포함한다. 바람직한 실시예는 바람직하게 포유류 및 가장 바람직하게 인간에게 리소좀 술파타아제 효소 결핍을 가장 유효하게 개선하기 위해, 치료될 대상의 필요에 대한 용량을 최적화하는 단계를 포함한다.
그러한 치료학적인 리소좀 술파타아제 효소는 특히, 예를 들어 이염성 백질 이영양증(Metachromatic Leukodystrophy) 또는 MLD, 점액 다당류증 타입 Ⅵ(MPS VI) 또는 마로토-라미(Maroteaux-Lamy) 증후군, 점액 다당류증 타입 Ⅱ(MPS Ⅱ) 또는 헌터 증후군, 점액 다당류증 타입 Ⅲa(MPS Ⅲa) 또는 산필리포(Sanfilippo) A 증후군, 점액 다당류증 타입 Ⅲd(MPS Ⅲd) 또는 산필리포 D 증후군 및 점액 다당류증 타입 Ⅳa(MPS Ⅳa) 또는 모르퀴오 A 증후군을 앓는 환자들과 같은 리소좀 술파타아제 효소 결핍에 의해 야기된 리소좀 저장 질환을 앓는 환자들을 치료하기에 유용하다. 특히 바람직한 실시예에서, 상기 리소좀 저장 질환은 MPS Ⅳa 또는 모르퀴오 A 증후군이고, 상기 리소좀 술파타아제 효소는 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS)이다. 또 다른 실시예에서, 상기 발명은 또한 리소좀 저장 질환을 야기하는 결핍성 리소좀 술파타아제 효소 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 첨가제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
다른 실시예에서, 상기 방법은 그것을 필요로 하는 대상들에게 치료학적으로 유효한 양의 리소좀 술파타아제 효소를 투여하는 단계를 포함하는 하나 이상의 리소좀 술파타아제 효소 결핍과 관련된 리소좀 저장 질환을 앓는 대상을 치료하는 것을 포함하고, 상기 리소좀 술파타아제 효소는 CHO-파생된 END3 상보성 그룹 세포 또는 그것의 파생물에 의해 생산된 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS) 또는 생물학적으로 활성인 그것의 절편, 돌연변이, 변종 또는 파생물이다. 몇몇 실시예에서, 상기 방법은 치료학적인 재조합 인간 GLANS 효소 또는 생물학적으로 활성인 그것의 절편, 돌연변이, 변종 또는 파생물 단독으로 또는 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 첨가제와 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 특히 바람직한 실시예에서, 상기 리소좀 저장 질환은 복합 술파타아제 결핍(MSD)이다.
특히 바람직한 실시예에서, 상기 CHO-파생된 END3 상보성 그룹 세포 또는 그것의 파생물은 G71 세포 라인, G71S 세포 라인 또는 G71 또는 G71S 그들의 파생물이다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 효소 대체 치료가 필요한 대상에게 치료학적으로 유효한 양의 리소좀 술파타아제 효소를 투여함으로써 효소 대체 치료의 방법을 제공하고, 상기에서 환자의 세포는 세포의 손상을 막거나 감소시키기에 불충분한 양의 리소좀 술파타아제 효소를 포함하는 리소좀을 가지고, 충분한 양의 리소좀 술파타아제 효소가 세포의 손상을 막거나 감소시키기 위해 리소좀으로 들어간다. 상기 세포는 CNS 내부에 있거나 없을 수 있고 또는 그것의 내피 세포가 치밀 이음부(tight junction)로 활성 제제의 확산을 단단히 봉하고 있으며 모세혈관 벽에 의해 혈액으로부터 터트려질 필요가 없다.
구체적인 실시예에서, 상기 발명은 타깃 리소좀에 감소된, 결핍된 또는 없는 생물학적 활성을 가지는 재조합 인간 리소좀 술파타아제 효소를 포함하고 대상에게 투여되는 조성물 및 약학적 조성물을 제공한다. 바람직한 활성 인간 리소좀 술파타아제 효소는 아릴술파타아제 A, 아릴술파타아제 B, 이두로네이트-2-술파타아제(iduronate-2-sulfatase), 술파미다아제/헤파린-N-술파타아제(sulfamidase/heparin-N-sulfatase), N-아세틸글루코사민-6-술파타아제(N-acetylglucosamine-6-sulfatase) 및 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(N-acetylgalactosamine-6-sulfatase)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 바람직한 실시예에서, N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제는 상기 활성 재조합 인간 리소좀 술파타아제 효소이다.
바람직한 실시예에서, 상기 발명은 대상에게 치료학적으로 유효한 양의 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS)을 투여함으로써 MPS Ⅳa 또는 모르퀴오 A 증후군, 또는 MSD를 앓는 대상을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 재조합 인간 GLANS는 높은 정도의 활성 사이트 시스테인 잔기에서 Cα-포밀글리신(FGly)으로의 전환(즉, 약 50% 이상, 바람직하게 약 70% 이상, 더 바람직하게 약 90% 이상, 보다 더 바람직하게 약 95% 이상의 전환) 및 높은 정도의 인산화(즉, 단백질 체인 당 약 0.25 이상, 바람직하게 0.5 이상, 더 바람직하게 약 0.75 이상의 비스-인산화된 올리고만노즈 체인)를 가진다.
보다 바람직한 실시예에서, 상기 발명은 대상에게 치료학적으로 유효한 양의 END3 상보성 그룹 세포에 의해 생산된 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS)을 투여함으로써 MPS Ⅳa 또는 모르퀴오 A 증후군, 또는 MSD를 앓는 대상을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 재조합 인간 GLANS는 높은 정도의 활성 사이트 시스테인 잔기에서 Cα-포밀글리신(FGly)으로의 전환(즉, 약 50% 이상, 바람직하게 약 70% 이상, 더 바람직하게 약 90% 이상, 보다 더 바람직하게 약 95% 이상의 전환) 및 높은 정도의 인산화(즉, 단백질 체인 당 약 0.25 이상, 바람직하게 0.5 이상, 더 바람직하게 약 0.75 이상의 비스-인산화된 올리고만노즈 체인)를 가진다.
특히 바람직한 실시예에서, 상기 발명은 대상에게 치료학적으로 유효한 양의 (a) 비-환원 조건 하에서 SDS-PAGE로 수행되는 경우 쿠마시 블루 염색에 의해 결정될 때 약 90% 이상의 순도를 가지고; (b) 위치 53의 시스테인 잔기에서 Cα-포밀글리신(FGly)으로의 전환이 약 90% 이상이며; (c) 위치 178 및 397의 아스파라긴 잔기에서 N-연결된 글리코실화되고, 상기에서 위치 178의 아스파라긴 잔기에 부착된 올리고만노즈 체인의 약 50% 이상이 비스-인산화된 정제된, 활성이고 높은 정도로 인산화된 재조합 인간 GLANS를 투여함으로써 MPS Ⅳa 또는 모르퀴오 A 증후군, 또는 MSD를 앓는 대상을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 정제된, 활성이고 높은 정도로 인산화된 재조합 인간 GLANS는 환원 조건 하에서 SDS-PAGE로 수행되는 경우 약 55-60 kDa의 주요 밴드(major band)(즉, 전구체 인간 GLANS는 가시적인 단백질 중 약 75% 이상, 바람직하게 약 85% 이상, 더 바람직하게 약 90% 이상, 그리고 보다 더 바람직하게 약 95% 이상)로 구성되고, ~39 kDa 및 ~19 kDa에서 부수 밴드(minor band)(즉, 성숙 또는 처리된 인간 GLANS는 가시적인 단백질 중 약 25% 미만, 바람직하게 약 15% 미만, 더 바람직하게 약 10% 미만, 그리고 보다 더 바람직하게 약 5%)로 구성된다. 더 특히 바람직한 실시예에서, 상기 정제된, 활성이고 높은 정도로 인산화된 재조합 인간 GLANS는 환원 조건 하에 SDS-PAGE로 수행되는 경우 기본적으로 약 55-60 kDa의 단일 밴드(single band)(즉, 전구체 인간 GLANS)로 구성된다.
몇몇 실시예에서, 상기 대상은 MPS Ⅳa 또는 모르퀴오 A 증후군을 앓는다. 몇몇 실시예에서, 상기 대상은 MSD를 앓는다.
상기 발명의 활성이고 높은 정도로 인산화된 리소좀 술파타아제 효소의 사용에 상응하여, 이는 바람직하게 상기 발명의 방법에 의해 생산되고, 상기 설명된 리소좀 저장 질환의 치료용 의약품 제조에 또한 고려된다.
일곱 번째 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 설명된 바와 같이 리소좀 술파타아제 효소 결핍에 의해 전체 또는 부분적으로 야기되거나, 그와 관련된 질환을 치료하기에 유용한 활성이고 높은 정도로 인산화된 재조합 인간 리소좀 술파타아제 효소및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 첨가제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 바람직한 실시예에서, 상기 약학적 조성물은 상기 발명의 방법에 의해 생산된 활성이고 높은 정도로 인산화된 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS) 또는 생물학적으로 활성인 그것의 절편, 돌연변이, 변종 또는 파생물 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 첨가제를 포함한다. 그러한 약학적 조성물은 경막내, 장관외, 국부, 비강, 흡입 또는 경구 투여와 같은 여러 경로에 의해 투여되기 적합할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 상기 약학적 조성물은 장관외 투여에 적합하다, 본 측면의 범위 내 실시예는 전체-길이의 리소좀 술파타아제 효소 또는 그것의 절편, 돌연변이, 변종을 인코딩하는 핵산 서열에 특징이 있으며, 이는 리소좀 효소 결핍에 영향을 받은 세포 내로 체내 투여될 수 있다.
다른 측면에서, 상기 발명은 (a) 리소좀 술파타아제 효소 결핍을 앓는 환자, 예를 들어 모르퀴오 증후군 환자의 연골 세포(chondrocyte cell)를 연골 세포 분화의 유지를 촉진하는 조건 하에서 배양하는 단계; (b) 케라탄 술페이트(keratan sulfate)를 분해하는 리소좀 술파타아제 효소와 연골 세포를 접촉시키는 단계; 및 (c) 세포 내 케라탄 술페이트의 농도를 탐지하는 단계, 상기에서 리소좀 술파타아제 효소와 접촉하지 않은 세포와 비교하였을 때 감소된 리소좀 술파타아제 효소와 접촉한 세포 내 케라탄 술페이트 농도는 리소좀 술파타아제 효소 활성의 표지이다. 몇몇 실시예에서, 상기 리소좀 술파타아제 효소는 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS)이다. 몇몇 실시예에서, 상기 배양은 인슐린 성장 인자 1(IGF1), 변환 성장 인자 베타(transforming growth factor beta, TGF-β), 트랜스페린(tranferrin), 인슐린 및 아스코르브산을 포함하는 배지에서 수행된다. 몇몇 실시예에서, 상기 케라탄 술페이트는 공초점 현미경 또는 항-케라탄 술페이트 항체에 결합함에 의해서 탐지된다. 상기 방법은 천연적으로 발생하거나 재조합 인간 효소를 포함하는 어떤 리소좀 술파타아제 효소, 또는 그것의 절편 또는 신호 서열 없이, 전구체 인간 효소 혹은 그것의 성숙 형(mature form)과 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변종을 포함하는 변종과 함께 수행될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 상기 발명은 천연 기질을 분해하는 재조합 인간 리소좀 효소의 활성 측정용 세포-기반 분석법을 제공한다. 상기 방법은 (a) 리소좀 효소에 대한 천연 기질이 축적된 조건 하에서, 분리되고 리소좀 효소가 결핍된 인간 세포를 배양하는 단계; (b) 상기 세포와 리소좀 효소를 접촉시키는 단계; (c) 상기 세포를 용해하는 단계; (d) 세포 용해물에 (ⅰ) 천연 기질에 대해 특정되고 (ⅱ) 천연 기질로부터 소 올리고당을 분해(cleave)하는 효소를 부가하는 단계; (e) 소 올리고당을 탐지 가능한 모이어티(moiety)로 표지하는 단계; (f) 선택적으로, 표지된 소 올리고당을 분리하는 단계; (g) 표지된 소 올리고당을 탐지하는 단계; 및 (h) (ⅰ) 리소좀 효소와 접촉한 세포로부터 표지된 소 올리고당의 양과 (ⅱ)리소좀 효소와 접촉하지 않은 세포로부터 표지된 소 올리고당의 양을 비교함으로써 천연 기질을 분해하는 리소좀 효소의 활성을 판정하는 단계를 포함하고, 상기에서 (h)(ⅱ)와 비교한 (h)(ⅰ)의 감소는 천연 기질을 분해하는 리소좀 효소의 활성을 나타낸다. 일실시예에서, 상기 소 올리고당은 단-, 이- 또는 삼-당이다. 관련된 실시예에서, 상기 소 올리고당은 이당이다. 몇몇 실시예에서, 상기 리소좀 효소는 아릴술파타아제 B(ARSB), 이두로네이트-2-술파타아제(IDS), 술파미다아제/헤파린-N-술파타아제(SGSH), N-아세틸글루코사민-술파타아제(G6S) 및 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GALNS)로 이루어진 그룹에서 선택된다. 몇몇 실시예에서, 상기 리소좀 효소는 α-L-이두로니다아제(IDU)이다. 몇몇 실시예에서, 상기 리소좀 효소는 산 α-글루코시다아제(GAA)이다. 몇몇 실시예에서, 상기 리소좀 효소는 β-글루코시다아제(GUSB)이다. 몇몇 실시예에서, 상기 리소좀 효소는 β-갈락토시다아제(GLB1)이다.
세포-기반 분석법에 사용될 수 있는 적합한 인간 세포는 테스트된 리소좀 효소에 결함이 있는 어떤 인간 세포를 포함하고, 그러한 것은 리소좀 효소에 대한 천연 기질을 축적할 수 있다. 예를 들어, 자연적으로 활성에 있어 전체(100%) 또는 부분적으로 결핍된, 예를 들어 활성에 있어 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상 감소를 나타내는 세포가 사용될 수 있다. 약해진 활성을 가지는 돌연변이 효소를 발현하는 세포 또는 점액 다당류증을 예로 들 수 있는 리소좀 저장 질환을 앓고 있는 환자들로부터 유래된 세포가 사용될 수 있다. 세포는 인코딩 유전자 또는 그것의 프로모터 또는 다른 조절 영역으로 돌연변이를 도입함을 통하는 것을 예로 들 수 있는 리소좀 효소 활성을 녹아웃 시키거나 감소시키도록 재조합으로 변화된 세포가 사용될 수 있다. 효소 발현을 감소시키기 위해 안티센스 또는 RNAi로 처리되는 것을 예로 들 수 있는 리소좀 효소 활성을 감소시키도록 처리된 세포가 사용될 수 있다.
탄수화물에서 소 올리고당을 분해(절단)하고 리소좀 효소의 천연 기질에 "특정"(즉, 우세하게 절단됨)되는 적합한 효소는 당업계의 통상의 기술자에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어, GLANS 또는 GLB1(케라탄 술페이트를 분해하는 효소)의 활성을 탐지하기 위해 단계 (d)의 효소는 케라타나제(Keratanase) Ⅱ 또는 케라탄 술페이트에 주로 작용하는 임의의 효소일 수 있다. 다른 실시예에 따르면, IDU, ARSB, IDS 또는 GUSB(덜마탄 술페이트(dermatan sulfate)를 분해하는 효소)의 탐지를 위해, 단계 (d)의 효소는 콘드로이티나아제(Chondroitinase) ABC 또는 덜마탄 술페이트에 주로 작용하는 임의의 효소일 수 있다. 다른 실시예에 따르면, IDU, IDS, SGHS, G6S 또는 GUSB(헤파란 술페이트(heparan sulfate)의 탐지를 위해, 단계 (d)의 효소는 헤파라나아제(Heparanase) Ⅰ 또는 헤파라나아제 Ⅱ, 또는 둘 다일 수 있다. 또 다른 실시예에서 따르면, GAA(글리코겐을 분해하는 효소)의 탐지를 위해, 단계 (d)의 효소는 α-아밀라아제 또는 글리코겐에 주로 작용하는 임의의 효소일 수 있다.
본 세포-기반 방법은 리소좀 효소 활성을 탐지하는데 있어 굉장한 민감도를 가질 수 있다. 몇몇 실시예에서, 리소좀 효소 활성을 리소좀 효소의 농도가 약 10 nM, 또는 약 5 nM, 또는 약 1 nM, 또는 약 0.75 nM, 또는 약 0.5 nM, 또는 약 0.25 nM, 또는 약 0.1 nM, 또는 약 0.05 nM, 또는 약 0.01 nM, 또는 약 0.005 nM, 또는 약 1 pM, 또는 약 0.5 pM 정도로 낮은 경우 탐지될 수 있다.
본 발명의 다른 특징 및 장점은 하기 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 본 발명의 본질 및 범위 이내에서의 다양한 변경 및 수정이 본 상세한 설명으로부터 당업계의 기술자에게 명백하게 될 것이므로, 상세한 설명 및 구체적인 실시예들은 본 발명의 바람직한 실시예를 나타내는 것이고 오직 설명하기 위한 방법으로 주어진 것으로 이해되어야 한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 재조합 리소좀 술파타아제 효소의 대규모 제조에 대한 요구와 타깃 리소좀에 효율적이고 그래서 치료학적으로 유효한, 활성이고 높은 정도로 인산화된 리소좀 술파타아제 효소 생산물에 대한 필요를 조화하는 방법의 발견과 관련한다.
리소좀 효소 제조물의 치료학적 효과는 그 제조물의 만노즈-6-포스페이트 농도에 의존한다. 포스페이트는 소포체와 초기 골지에서 번역 후 변형에 의해 타깃 글리코단백질에 부가된다. 접힌 리소좀 효소는 올리고당 변형 효소에 의해 인지되는 독특한 3차 결정 인자를 나타낸다. 결정 인자는 특별하게 위치된 라이신 세트로 구성되고 주요 서열 상동성이 없음에도 불구하고 가장 리소좀 효소가 많이 발견된다. 변형 효소, UDP-GlcNAc 포스포트랜스페라제(phosphotransferase)는 단백질 결정 인자에 결합하고 결합 사이트와 가장 가까운 올리고당 위의 말단 만노즈 잔기의 6-위치에 GlacNAc-1-포스페이트를 부가한다; 두 번째 효소, 인산디에스터 α-GlcNAcase는 이후 GlcNAc-포스페이트 결합을 분해(cleave)하여 만노즈-6-포스페이트 말단 올리고당에게 준다(캔필드 등, 미국 특허 제6,537,785호). 만노즈-6-포스페이트 변형의 목적은 세포 내에서 분비 통로에서 리소좀 통로로 리소좀 효소의 방향을 바꾸는 것이다. 만노즈-6-포스페이트-방향(bearing) 효소는 트랜스 골지에서 MPR에 의해 결합되고 세포 표면 대신 리소좀에 보내진다.
리소좀 효소 올리고당 위의 만노즈-6-포스페이트의 존재에 부가하여, 효소의 리소좀 운반은 트랜스 골지 더미의 끝에서 나타난 운반 엔도좀의 산성화에 의존한다. 확산성 염기 분자를 가진 이러한 엔도좀 내 산성 환경의 화학적 퀀치(quenching)는 리소좀 효소를 포함하는 소포성 내용물을 세포 외부로 쏟아내도록 한다(브라울케 등, Eur J. Cell Biol. 43(3): 316-321, 1987). 산성화는 엔도좀 막 내 도입된 특정 액포 ATPase를 필요로 한다(니쉬 등, Nat . Rev . Mol . Cell Biol . 3(2): 94-103, 2002). 본 ATPase의 불완전함은 리소좀 운반의 대가를 치르고 리소좀 효소의 분비를 강화한다고 예상된다. 액포 ATPase에 결함을 가진 세포 라인 제조는 세포 내 리소좀 구획으로 인산화된 재조합 효소의 비-생산적인 전환을 저지한다고 예상될 것이다.
1984년에, 엔도좀 산성화에 특히 결함이 있는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 돌연변이가 생산되고 특징화되었다(팍 등, Somat . Cell Mol . Genet . 17(2): 137-150, 1991). CHO-K1 세포는 화학적으로 돌연변이되었고, 독소의 존재 하에 높은 온도에서 생존한 것이 선택되었다. 이러한 독소는 그들의 치사율이 완전하게 발현되기 위해 엔도좀 산성화를 필요로 했다(마르넬 등, J. Cell . Biol . 99(6): 1907-1916, 1984). 이전 연구에서, 다른 메커니즘 작용을 가진 두 개 독소의 혼합물이 독소-특정 저항의 선택을 피하기 위해 선택되었다. 상기 원리는 하나의 특정 독소에 저항을 나타내는 뜻밖의 돌연변이의 가능성은 작은 반면, 두 개의 완전하게 다른 독소에 특정한 두 개가 동시에 일어나는 뜻밖의 돌연변이의 가능성은 존재하지 않는다. 선택은 온도-민감한 돌연변이를 유도하기 위해 높은 온도에서 수행되었다. 본 유전적 스크린은 높은 온도에서 독소에 저항성이 있었던 두 개의 돌연변이, 그 중 하나는 G.7.1(G71)로 명명되었던 돌연변이를 이끌었다. G71의 병변은 두 개 독소의 흡수 또는 작용의 메커니즘에 기인한 것은 아니었지만 높은 온도에서 엔도좀을 산성화하는 클론의 능력이 없음에 기인했다. 본 무능력은 비록 정도는 더 작았지만 허용 온도(34℃)에서도 증명되었다. G71 세포는 또한 배지에서 트랜스페린(transferrin)의 정상 흡수에도 불구하고 높은 온도에서 철을 위한 영양이 요구되는 것으로 발견되었다(팀책 등, J. Biol . Chem . 261(30): 14154-14159, 1986). 철은 낮은 pH에서만 트랜스페린으로부터 방출되기 때문에, 정상 트랜스페린 흡수에도 불구하고 철을 위한 영양이 필요한 것은 엔도좀 산성화가 불완전함을 나타내었다. 다른 연구는 산성화의 불완전함이 리소좀 보다는 엔도좀에서 주로 분명하다는 것을 보여준다(스톤 등, J. Biol . Chem . 262(20): 9883-9886, 1987). G71에 대한 데이터는 돌연변이가 엔도좀 산성화의 원인이 되는 액포 ATPase의 불안정성을 야기한다는 결론과 일치한다. 불안정성은 높은 온도(39.5℃)에서 가장 명확하지만 부분적으로는 더 낮은 온도(34℃)에서조차 발현되었다. G71 세포에서 두 개의 내인성 리소좀 효소, 카텝신(cathepsin) D와 알파-글루코시다아제 운반에 대한 연구(팍 등, Somat. Cell Mol . Genet . 17(2):137-150, 1991)는 두 개의 효소 모두 높은 온도에서 정량적으로 분비되었고, 효소의 글리코실화는 영향을 받지 않았다는 것을 보여주었다. 인산화된 산 알파-글루코시다아제의 분비는 불-허용 온도에서 상당히 강화되었다.
리소좀 술파타아제 효소 제조물의 치료학적 효과는 만노즈-6-포스페이트의 농도뿐만 아니라 제조물 내 활성 효소의 존재에도 의존한다. 모든 알려진 술파타아제는 그들의 촉매 작용 부위에 시스테인 잔기를 가진다; 본 시스테인 잔기는 Cα-포밀글리신(FGly)으로 번역 후 변형되어 효소를 활성화시킨다. 본 시스테인의 FGly로의 번역 후 효소 활성은 술파타아제 변형 인자 1(SUMF1)에 의해 촉매되고, 술파타아제의 리소좀으로의 타깃팅 이전에, 번역 후 즉시 소포체 내 접혀지지 않은 술파타아제 상 에서 일어난다(디에르크스 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 94:11963-11968, 1997). 본 독특한 후 번역 변형의 중요성은 SUMF1의 돌연변이가 리소좀 술파타아제 효소에서 손상된 FGly 형성을 낳고 인간의 복합 술파타아제 결핍(MSD)의 원인이 된다는 사실에 의해 강조된다 (디엔즈-루이즈 등, Annu . Rev . Genomics Hum. Genet . 6:355-379, 2005).
그러므로, 엔도좀 산성화에 결함이 있는 돌연변이 CHO 세포인 G71 세포의 재조합 인간 술파타아제 변형 효소(SUMF1)와 인간 리소좀 술파타아제 효소를 공동 발현하는 능력은 그러한 리소좀 술파타아제 효소의 결핍에 의해 야기되거나 이와 관련돤 리소좀 저장 질환의 관리에 유용한 활성이고 높은 정도로 인산화된 재조합 인간 리소좀 술파타아제 효소의 대규모 생산에 대한 메커니즘을 제공한다.
Ⅰ. 정의
다르게 정의되지 않은 이상, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 하기 참조 문헌은 본 발명에서 사용된 많은 용어의 일반적 정의와 함께 기술 중 하나를 제공한다: 싱글레톤 등, 미생물학 및 세포 생물학 사전(2d ed. 1994); 과학과 기술의 캠브리지 사전(워커 ed., 1988); 유전학 용어 사전, 5TH ED., R. 리거 등 (eds.), Springer Verlag (1991); 및 헤일 & 말햄, 하퍼 콜린스 생물학 사전(1991).
본 명세서에 인용된 각 간행물, 특허 출원, 특허 및 다른 참조 문헌은 본 개시와 불일치하지 않는 범위에서 전체가 참조 문헌으로 도입된다.
본 상세한 설명 및 첨부된 청구 범위에 사용된 단수형 "한", "하나의" 및 "그"는 문맥이 명백하게 다른 것을 지시하지 않는 한 복수의 대상들을 포함한다는 것을 유의한다.
본 명세서에 사용된 아래 용어들은 다른 것으로 특정되지 않는 한 그들에게 속하는 의미를 가진다.
"대립 형질 변종"은 임의의 동일한 유전자 자리를 점유하는 유전자의 두 개 이상의 다형성 형을 의미한다. 대립 형질 변종은 본래 돌연변이를 통해 나타나며, 모집단 이내에서 표현형 다형체를 야기할 수 있다. 유전자 돌연변이는 드러나지 않을 수 있고(즉, 인코딩된 폴리펩타이드에 변화 없음) 또는 변화된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있다. "대립 형질 변종"은 또한 유전적 대립 형질 변종뿐만 아니라 그들에 의해 인코딩된 단백질의 mRNA 전사로부터 유래된 cDNAs를 의미한다.
"증폭"은 폴리뉴클레오티드 서열이 복제되고 그래서 많은 수의 폴리뉴클레오티드 분자 내로 확장되는, 예를 들어 역전사, 폴리머라제 연쇄 반응 및 리가아제 연쇄 반응, 어떤 방법을 의미한다.
첫 번째 서열은 그것의 첫 번째 서열인 폴리뉴클레오티드가 그것의 두 번째 서열인 폴리뉴클레오티드와 특별히 하이드리드화되는 경우 두 번째 서열과 관련된 "안티센스 서열"이다.
"cDNA"는 단일 스트랜드 또는 이중 스트랜드 형인 경우 mRNA에 대해 상보적이거나 동일한 DNA를 의미한다.
종래 표기법은 폴리뉴클레오티드 서열을 설명하기 위해 본 명세서에 사용된다. 단일-스트랜드된 폴리뉴클레오티드 서열의 왼쪽 끝은 5'-끝이다; 이중 스트랜드된 폴리뉴클레오티드 서열의 왼쪽 방향은 5'-방향으로 언급된다. 초기 RNA 전사에 대한 뉴클레오티드 5' 내지 3' 부가의 방향은 전사 방향으로 언급된다. mRNA와 동일한 서열을 가지는 DNA 스트랜드는 "코딩 스트랜드"로 언급된다; DNA로부터 전사된 mRNA와 동일한 서열을 가지고, RNA 전사의 5' 내지 5'-끝에 위치한 DNA 스트랜드 상 서열은 "업스트림 서열"로 언급된다; RNA와 동일한 서열을 가지고 코딩 RNA 전사의 3' 내지 3' 끝인 DNA 스트랜드 상 서열은 "다운스트림 서열"로 언급된다.
"상보성"은 위상적인 호환성 또는 두 폴리뉴클레오티드의 상호 작용 표면과 함께 매칭하는 것을 의미한다. 그러므로, 두 분자들은 상보성이라고 설명될 수 있으며, 나아가, 접촉 표면 특징은 각각에 대해 상보성이다. 첫 번째 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 두 번째 폴리뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 결합 파트너의 뉴클레오티드 서열과 동일한 경우, 첫 번째 폴리뉴클레오티드는 두 번째 폴리뉴클레오티드에 대해 상보성이다. 그러므로, 5'-TATAC-3' 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드는 5'-GTATA-3' 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드와 상보성이다. 만일 대상 뉴클레오티드 서열에 대한 서열 상보성이 참조 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 동일한 경우, 뉴클레오티드 서열은 참조 뉴클레오티드 서열과 "실질적으로 상보성"이다.
"보존적 대체"는 폴리펩타이드의 아미노산에서 기능적으로 유사한 아미노산으로의 대체를 의미한다. 하기 6 그룹은 각각 서로를 위한 보존적 대체인 아미노산을 포함한다:
1) 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T);
2) 아스파트 산(D), 클루탐산(E);
3) 아스파라긴(N), 클루타민(Q);
4) 알기닌(R), 리신(K);
5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 및
6) 페닐알리닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W).
용어 "절편"은 폴리펩타이드와 관련하여 사용되는 경우, 단백질의 N--말단 또는 C-말단 중 하나 또는 모두에서 절단, 및/또는 단백질의 내부 부분 또는 영역의 소멸에 의해 전체-길이의 폴리펩타이드보다 짧은 폴리펩타이드를 의미한다. 폴리펩타이드의 절편은 당업계에 알려진 방법에 의해 생성될 수 있다.
용어 "돌연변이"는 폴리펩타이드와 관련하여 사용되는 경우, 다른 아미노산에 의해 대체된 단백질 중 하나 이상의 아미노산의 폴리펩타이드를 의미한다. 아미노산 대체는 상기 정의한 바와 같이, 보존적 대체, 또는 비-보존적 대체일 수 있다. 돌연변이 폴리펩타이드는 당업계에 알려진 방법에 의해 생성될 수 있다.
용어 "파생물"은 폴리펩타이드와 관련하여 사용되는 경우, 유비퀴틴(ubiquitination), 표지(labelling, 예를 들어 방사성핵종 또는 다양한 효소로), 페그화와 같은 공유 폴리머 부착(즉, 폴리에틸렌 글리콜과 파생) 및 오르니틴과 같은 아미노산의 화학적 합성에 의한 삽입 또는 대체를 예로 들 수 있으나 이에 제한되지 않는 기술에 의해 화학적으로 변형된 폴리펩타이드를 의미하고, 일반적으로 인간 단백질에서 발생하지 않는다. 파생 폴리펩타이드는 당업계에 알려진 방법에 의해 생성될 수 있다.
용어 "파생물"은 세포 라인과 관련하여 사용되는 경우, 모 세포 라인의 후손인 세포 라인을 의미한다; 예를 들어 본 용어는 모 세포로부터 패새지(passage)되거나 서브 클론되고 바람직한 특성을 보유한 세포, 돌연변이 되고 바람직한 특성의 보유를 위해 선택된 모 세포 라인의 후손, 다른 발현 벡터 또는 다른 외인성으로 부가된 핵산을 포함하기 위해 변화된 모 세포 라인의 후손을 포함한다.
"탐지"는 샘플에서 관심대상물(analyte)의 존재, 부존재 또는 양을 결정하는 것을 의미하고, 샘플 내 또는 샘플 내 세포 당 관심 대상물의 양을 정량하는 것을 포함할 수 있다.
"탐지 가능한 모이어티" 또는 "표지"는 분광기(spectroscopic), 광화학(photochemical), 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단에 의해 탐지 가능한 조성물을 의미한다. 예를 들어, 유용한 표지는 32P, 35S, 형광 염료, 전자 밀도 제제(electron-dense reagents), 효소(예를 들어 ELISA에 통상 사용되는 것과 같은), 비오틴-스트렙타바딘(streptavidine), 디곡시게닌(digoxigenin), 항 혈청 또는 모노 클로날 항체가 이용 가능한 헵텐(hapten) 및 단백질 또는 타깃에 대해 상보성인 서열을 가진 핵산 분자를 포함한다. 탐지 가능한 모이어티는 종종 방사성활성, 발색 또는 형광 신호와 같은 측정 가능한 신호를 종종 생산하고 이는 샘플에서 결합 탐지할 수 있는 모이어티의 양을 정량하는데 사용될 수 있다. 탐지 가능한 모이어티는 프라이머 또는 프로브에 공유적으로, 또는 이온, 반데르 발스 또는 수소 결합을 통해 도입되거나 부착될 수 있으며, 스트렙타바딘(streptavadine)에 의해 인지되는 방사성 활성 뉴클레오티드 또는 비오틴화된 뉴클레오티드의 도입을 예로 들 수 있다. 탐지 가능한 모이어티는 직접적 또는 간접적으로 탐지될 수 있다. 간접적 탐지는 탐지 가능한 모이어티에 2차적인 직접적으로 또는 간접적으로 탐지 가능한 모이어티의 결합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 탐지 가능한 모이어티는 비오틴과 같은 결합 파트너의 리간드가 될 수 있고, 이는 스트렙타바딘, 또는 뉴클레오티드 서열의 결합 파트너이고, 상보성 서열을 위한 결합 파트너이며, 이는 특히 하이브리드화 할 수 있다. 결합 파트너는 그 자신이 직접적으로 탐지될 수 있으며, 예를 들어 항체는 그 자신이 형광 분자로 표지될 수 있다. 결합 파트너는 또한 간접적으로 탐지될 수 있으며, 예를 들어 상보성 뉴클레오티드 서열을 가지는 핵산은 다른 표지된 핵산 분자와의 하이브리드화를 통해 차례로 탐지될 수 있는 분지된 DNA 분자의 부분이 될 수 있다(예를 들어, 파렌더 등, 바이오/테크놀로지 6:1165,1988을 보라). 신호의 정량은 예를 들어 신티레이션 계수(sciintillation counting), 농도 계측 또는 유세포 분석(flow cytometry)에 의해 달성된다.
"진단적"은 병리학적 상태의 존재 또는 본질을 확인하는 것을 의미한다. 진단 방법은 그들의 구체성 및 선택성에 있어 다르다. 특정 진단 방법은 상태의 명확한 진단을 제공할 수 없고, 이는 방법이 진단에 도움이 되는 양성 조짐을 제공하는 경우 충분하다.
용어 "유효한 양"은 대상의 건강 상태, 병리학 및 질병 또는 진단 목적에 따라 의도한 결과를 만들기에 충분한 용량을 의미한다. 의도한 결과는 용량을 받는 사람에 있어서 객관적 또는 주관적 개선을 포함할 수 있다. "치료학적으로 유효한 용량"은 건강상 의도된 이익의 결과를 만들기에 유효한 제제의 양을 의미한다.
"인코딩(encodong)"은 유전자, cDNA 또는 mRNA와 같은, 폴리뉴클레오티드 내 뉴클레오티드 특정 서열의 내재적 성질로, 뉴클레오티드의 정의된 서열(즉, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는 아미노산 및 그것으로부터 야기한 생물학적 성질의 정의된 서열 중 하나를 가지는 생물학적 처리에서 다른 폴리머 및 거대 분자의 합성을 위한 템플릿(tenplates)을 제공하기 위한 것을 의미한다. 그러므로, 유전자에 의해 생산된 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생산하는 경우 유전자는 단백질을 인코딩한다. mRNA 서열과 동일하고 서열 목록에서 대개 제공되는 뉴클레오티드 서열인 코딩 스트랜드(strand)와 전사를 위한 템플릿으로 사용되는, 유전자 또는 cDNA의 비-코딩 스트랜드의 양자는 단백질 또는 유전자 또는 cDNA의 다른 생산물을 인코딩하는 것을 의미할 수 있다. 다른 방법으로 특정되지 않는다면, "아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열"은 각각의 버전을 재생성하고 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 및 RNA를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 인트론을 포함할 수 있다.
"동등한 용량"은 동일한 양의 활성 제제를 포함하는 용량을 의미한다.
"발현 조절 서열"은 그곳에 가동적으로 연결된 뉴클레오티드 서열의 발현(전사 및/또는 번역)을 조절하는 폴리뉴클레오티드 내 뉴클레오티드 서열을 의미한다. "가동적으로 연결된"은 다른 부분(예를 들어 서열의 전사)의 활성을 야기하는 한 부분(예를 들어 전사를 조절하는 능력)의 활성에 있어서 두 부분 사이의 기능적 관계를 의미한다. 발현 조절 서열을 예를 들어 프로모터 서열(예를 들어, 유도 가능한 또는 구성 요소인), 인핸서, 전사 종결자, 시작 코돈(즉, ATG), 인트론을 위한 스프라이싱 신호 및 종결 코돈을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
"발현 벡터"는 발현되는 뉴클레오티드 서열에 가동적으로 연결된 발현 조절 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 의미한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스-작용 요소(cis-acting element)를 포함하고; 발현을 위한 다른 요소는 호스트 세포에 의해 또는 체외 발현 시스템에서 공급될 수 있다. 발현 벡터는 코스미드(cosmids), 플라스미드(예를 들어, 노출된 또는 리포좀에 포함된) 및 재조합 폴리뉴클레오티드를 도입하는 바이러스와 같은 당업계에 알려진 모두를 포함한다.
"높은 정도로 인산화된", "높은 정도의 인산화" 및 "높은 정도로 인산화된 올리고당"은 적어도 리소좀 술파타아제 효소의 50%가 인산화된 올리고당을 통해 양이온-독립적인 만노즈-6-포스페이트 수용체에 결합한 리소좀 술파타아제 효소의 제조물을 의미한다. 결합은 나아가 만노즈-6-포스페이트와 경쟁하는 민감도로 특징된다. 높은 정도로 인산화된 리소좀 술파타아제 효소는 또한 단백질 사슬 당 0.25 이상, 바람직하게 0.5 이상, 및 더 바람직하게 0.75 이상의 비스-인산화된 올리고만노즈 사슬을 가지는 리소좀 술파타아제 효소를 의미할 수도 있다.
본 명세서에 사용된 "비스-인산화된 올리고만노즈 사슬"은 리소좀 술파타아제 효소 내 아스파라긴 잔기에 N-연결되고 두 개의 만노즈-6-포스페이트 잔기를 포함하는 만노즈-포함 올리고당 사슬을 의미한다. 전형적으로, 비스-인산화된 올리고만노즈 사슬은 7개의 만노즈 잔기, 즉, 비스-포스페이트 만노즈 7(BPM7)을 가지고, 이는 두 개의 GlcNAc에 연결되며, 차례로 리소좀 술파타아제 효소 내 아스파라긴 잔기에 연결된다.
"활성", "활성된" 및 "높은 정도의 활성"은 적어도 50%, 바람직하게 적어도 70%, 더 바람직하게 적어도 90% 및 더욱 더 바람직하게 95%의 단백질 활성 시스테인 잔기가 Cα-포밀글리신(FGly)으로 후-번역 변형되어진 리소좀 술파타아제 효소의 제조물을 의미한다.
"활성이고 높은 정도로 인산화된"은 적어도 50%, 바람직하게 적어도 70%, 더 바람직하게 적어도 90% 및 더욱 더 바람직하게 95%의 단백질 활성 시스테인 잔기가 Cα-포밀글리신(FGly)으로 후-번역으로 변형되어지고, 단백질 사슬 당 0.25 이상, 바람직하게 0.5 이상, 및 더 바람직하게 0.75 이상의 비스-인산화된 올리고만노즈 사슬을 가지는 리소좀 술파타아제 효소의 제조물을 의미한다.
용어 "생물학적으로 활성"은 전체-길이 폴리펩타이드의 하나 이상의 생물학적 활성을 보유하는 적어도 실질적인 양(예를 들어 약 50% 이상, 바람직하게 약 70% 이상 및 더 바람직하게 약 90% 이상)의 그것의 폴리펩타이드(즉, 효소) 절편, 돌연변이, 변종 또는 파생물을 의미한다. 리소좀 술파타아제 효소와 관련하여 사용되는 경우, 그것의 생물학적으로 활성인 절편, 돌연변이, 변종 또는 파생물은 적어도 실질적인 양의 술파타아제 활성(즉, 그것의 타깃 기질로부터 술페이트 에스터의 분해)를 보유한다. 술파타아제 변형 인자 1(SUMF1)과 관련하여 사용되는 경우, 그것의 생물학적으로 활성인 절편, 돌연변이, 변종 또는 파생물은 적어도 실질적인 양의 포밀글리신-생성 활성(즉, 리소좀 술파타아제 효소의 활성 사이트 시스테인 잔기의 Cα-포밀글리신(FGly)으로의 변형)을 보유한다.
폴리펩타이드와 관련하여 사용되는 경우 용어 "순도" 또는 "순수한"은 특정 방법을 사용하여 탐지될 수 있는 임의의 오염된 성분과 대비하여 분석되는 폴리펩타이드의 양을 의미한다. 상기 발명의 재조합 리소좀 술파타아제 효소에 대해, "순도"는 환원 또는 비-환원 조건 하에서 SDS-PAGE에 의해 전기 영동 분리하고, 이후 쿠마시 블루 또는 실버로 염색하거나, HPLC 크로마토그래피 분리(예를 들어, C4 역상(RP))하거나, 사이즈 익스클루젼(size exclusion, SEC)을 예로 들 수 있는 다른 크로마토그래피 분석 등으로 대상 술파타아제 효소 제조물에 의해 결정될 수 있다. 이러한 방법을 사용하여, 상기 발명의 정제된 재조합 리소좀 술파타아제 효소는 약 80% 이상, 바람직하게 약 90% 이상, 더 바람직하게 약 95% 이상, 더욱 더 바람직하게 약 98% 또는 99% 이상의 순도를 가진다.
용어 "전구체" 또는 "전구체 형"은 포유류 세포로부터 분비되는 재조합 리소좀 술파타아제 효소의 형을 의미하며, 즉 신호 서열이 없음에도 단백질의 내부 분해를 예로 들 수 있는 특정 변형이 없는 것이고, 이는 리소좀에서 정상적으로 일어나는 것이다. 용어 "성숙한", "성숙한 형", "처리된" 또는 "처리된 형"은 리소좀에 정상적으로 존재하는 재조합 리소좀 술파타아제 효소의 형을 의미한다. 상기 발명의 리소좀 술파타아제 효소에 대해, 비교적 풍부한 "전구체" 또는 "전구체 형" 및 "성숙", "성숙한 형", "처리된" 또는 처리된 형"은 환원 또는 비-환원 조건 하에서 SDS-PAGE에 의해 전기 영동 분리하고, 이후 쿠마시 블루 또는 실버로 염색하거나, HPLC 크로마토그래피 분리(예를 들어, C4 역상(RP))하거나, 사이즈 익스클루젼(size exclusion, SEC)을 예로 들 수 있는 다른 크로마토그래피 분리 등으로 대상 술파타아제 효소 제조물에 의해 결정될 수 있다. 이러한 방법을 사용하여, 상기 발명의 정제된 재조합 리소좀 술파타아제 효소는 약 75% 이상, 바람직하게 약 85% 이상, 더 바람직하게 약 90% 이상, 더욱 더 바람직하게 약 95% 이상의 "전구체" 또는 "전구체 형"으로 구성된다. 선택적으로, 이러한 방법으로 사용하여, 상기 발명의 정제된 재조합 리소좀 술파타아제 효소는 약 25% 미만, 바람직하게 약 15% 미만, 더 바람직하게 약 10% 미만, 그리고 더욱 더 바람직하게 약 5% 미만의 "성숙한", "성숙한 형", "처리된" 또는 "처리된 형"으로 구성된다. 몇몇 실시예에서, 오직 "전구체" 또는 "전구체 형"만이 탐지된다(즉, 술파타아제 효소 제조물은 환원 조건 하에서 SDS-PAGE가 수행되는 경우의 단일 탐지 가능한 밴드 또는 HLPC에 의해 분석되는 경우의 단일 피크로 필수적으로 구성된다).
둘 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 서열의 내용에서, 용어 "동일한" 또는 퍼센트 "동일"은 아래 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하거나 외관 검사(visual inspection)에 의해 측정하여, 비교하고 최대 관련성에 따라 배열하였을 때, 동일한 둘 이상의 서열 또는 서브서열 또는 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 특정 퍼센트를 가진다는 것을 의미한다.
"링커"는 공유 결합적으로 또는 이온, 반데르발스 또는 수소 결합으로 통해서 두 개의 다른 분자를 연결하는 분자를 의미하며, 5' 말단에서 하나의 상보성 서열과, 그리고 3'말단에서 또 다른 상보성 서열과 하이브리드화하여 두 개의 비-상보성 서열을 연결하는 핵산 분자를 예로 들 수 있다.
"낮은 정도의 인산화" 또는 "낮은 인산화"는 섬유 아세포 내로 재흡수하는 리소좀 술파타아제 효소의 조제물을 의미하고, 이는 10 nM보다 큰 1/2 최대 농도를 가지거나 만노즈-6-포스페이트 수용체 컬럼에 결합하는 리소좀 술파타아제 효소의 분율이 약 25% 보다 작다.
대상에 적용될 때 "자연-발생하는"은 대상이 본래 발견될 수 있다는 사실을 의미한다. 예를 들어, 유기체(바이러스 포함) 내에 존재하는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 천연 원천으로부터 분리될 수 있고 실험실에서 사람에 의해 의도적으로 수정되지 않은 것이 자연 발생하는 것이다.
"약학적 조성물"은 인간 및 포유 동물을 포함하는 대상 동물에서 약학적으로 사용되기 적합한 조성물을 의미한다. 약학적 조성물은 치료학적인 리소좀 술파타아제 효소를 약물학적으로 유효한 양으로 포함하고, 또한 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 첨가제를 포함한다. 약학적 조성물은 활성 성분(들), 담체(, 희석제 또는 첨가제를 이루는 비활성 성분(들)뿐만 아니라 직접적 또는 간접적으로, 임의의 두 가지 이상 성분의 조합, 복합 또는 집합, 또는 하나 이상의 성분의 분리, 또는 하나 이상의 성분의 다른 유형의 반응 또는 상호 작용이 낳은 임의의 생산물을 포함하는 조성물을 아우른다. 따라서, 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 리소좀 술파타아제 효소 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 첨가제의 혼합에 의해 만들어진 어떤 조성물을 아우른다.
"약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 첨가제"는 포스페이트 완충된 생리 식염수, 5% 덱스트로즈 수용액 및 오일/물 또는 물/오일 에멀전과 같은 에멀전 및 다양한 유형의 습윤제 및/또는 보조제를 예로 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는 임의의 표준 약학적 담체, 희석제, 완충제 및 첨가제를 의미한다. 적합한 약학적 담체, 희석제 또는 첨가제 및 제형은 레밍턴 약학 과학, 19판(맥 출판사 Co. 이스톤, 1995)에 개시된다. 바람직한 약학적 담체, 희석제 또는 첨가제는 의도된 모드의 활성제 투여에 따른다. 전형적인 모드의 투여는 예를 들어, 장의(enteral)(예를 들어 경구) 또는 비 경구(예를 들어 피하, 근육 내, 정맥, 또는 복강 내) 주입; 또는 국소, 경피 또는 점막 투여를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
"약학적으로 허용 가능한 염"은 금속 염(소듐, 포타슘, 마그네슘, 칼슘 등) 및 암모니아 또는 유기 아민의 염을 포함하는 약학적 용도를 위한 리소좀 술파타아제 효소로 제형화될 수 있는 염이다.
"폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위를 구성하는 폴리머를 의미한다. 폴리뉴클레오티드는 데옥시리보핵산("DNA") 및 리보핵산("RNA")뿐만 아니라 핵산 유사체와 같이 자연적으로 발생한 핵산을 포함한다. 핵산 유사체는 비-자연적으로 발생한 염기, 자연적으로 발생한 포스포디에스터 결합이 아닌 다른 뉴클레오티드와 연결에 참여하는 뉴클레오티드 또는 포스포디에스터 결합이 아닌 연결을 통해 부착된 염기를 포함하는 것을 포함한다. 즉, 뉴클레오티드 유사체는 예를 들어 포스포로티오에이트(phosphorothioates), 포스포로디티오에이트(phosphorodithioates), 포스포로트리에스터(phosphorotriester), 포스포아미데이트(phosphoramidates), 보라노포스페이트(boranophosphates), 메틸포스포네이트(methylphosphnates), 키랄-메틸 포스포네이트(chiral-methly phosphonates), 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩타이드-핵산(PNAs) 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 그러한 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 자동화된 DNA 합성기를 사용하여 합성될 수 있다. 용어 "핵산"은 전형적으로 큰 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 용어 "올리고뉴클레오티드"는 전형적으로 짧은 뉴클레오티드, 일반적으로 약 50 뉴클레오티드를 넘지 않는 것을 의미한다. 뉴클레오티드 서열이 DNA 서열에 의해 나타나지는 경우(즉, A, T, G, C), 이는 "U"가 "T"로 대체한 RNA 서열(즉, A, U, G, C) 또한 포함하는 것으로 이해될 것이다.
"폴리펩타이드"는 아미노산 잔기, 관련된 자연적으로 발생한 구조적 변종 및 펩타이드 결합을 통해 연결된 합성 비-자연적으로 발생한 그것의 유사체, 관련된 자연적으로 발생한 구조적 변종 및 합성 비-자연적으로 발생한 그것의 유사체로 구성된 폴리머를 의미한다. 합성 폴리 펩타이드는 예를 들어 자동화된 폴리펩타이드 합성기를 사용하여 합성될 수 있다. 용어 "단백질"은 전형적으로 큰 폴리펩타이드를 의미한다. 용어 "펩타이드"는 전형적으로 짧은 펩타이드를 의미한다. 본 명세서에서 사용된 종래 표기법은 폴리펩타이드 서열을 묘사한다: 폴리펩타이드 서열의 왼쪽 끝은 아미노-말단이고; 폴리펩타이드 서열의 오른쪽 끝은 카르복실 말단이다.
"프라이머"는 의도된 폴리뉴클레오티드 템플릿을 특정하게 하이브리드화하고 상보성 폴리뉴클레오티드의 합성을 위한 개시점을 제공할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 그러한 합성은 폴리뉴클레오티드 프라이머가 합성이 유도되는, 즉 뉴클레오티드, 상보성 폴리뉴클레오티드 템플릿, 및 DNA 폴리머라제와 같은 폴리머화를 위한 제제가 존재하는 조건 하에 놓여지는 경우 일어난다. 프라이머는 전형적으로 단일-스트랜드(strand)이지만, 이중-스트랜드일 수도 있다. 프라이머는 전형적으로 디옥시리보핵산이지만, 넓고 다양한 합성 및 자연적으로 발생하는 프라이머는 많은 응용에서 유용하다. 프라이머는 합성의 개시를 위한 사이트를 제공하기 위해 하이브리드화하도록 의도된 템플릿과 상보성이지만 템플릿의 정확한 서열을 반영할 필요는 없다. 그러한 경우, 템플릿에 대한 프라이머의 특정 하이브리드화는 하이브리드화 조건의 엄중함에 좌우된다. 프라이머는 예를 들어 발색의, 방사성의 또는 형광 모이어티 및 탐지 가능한 모이어티로 사용되는 것을 예로 들 수 있는 것으로 표지될 수 있다.
"프로브(probe)"는 폴리뉴클레오티드와 관련하여 사용되는 경우, 다른 폴리뉴클레오티드의 의도된 서열에 특정하게 하이브리드화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 프로브는 타깃 상보성 폴리뉴클레오티드에 특정하게 하이브리드하지만, 템플릿의 정확한 상보성 서열을 반영할 필요는 없다. 그러한 경우, 타깃에 대한 프로브의 특정 하이브리드화는 하이브리드 조건의 엄중함에 좌우한다. 프로브는 예를 들어 발색의, 방사성의 또는 형광 모이어티 및 탐지 가능한 모이어티로 사용되는 것을 예로 들 수 있는 것으로 표지될 수 있다.
"예방적(prophylatic)" 치료는 질병의 증상을 나타내지 않거나 단지 초기 증상만을 나타내는 대상에게 발달 중인 병리학의 위험을 감소시킬 목적으로 투여하는 치료이다. 발명의 화합물은 발달 중인 병리의 가능성을 감소시키거나 만약 발달되었다면, 병리의 심각성을 최소화하기 위해 예방적 치료로서 주어질 수 있다.
"재조합 폴리뉴클레오티드"는 자연적으로 함께 하지 않은 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 증폭되거나 조립된 재조합 폴리뉴클레오티드는 적합한 벡터에 포함될 수 있고, 벡터는 적합한 호스트 세포를 변형시키기 위해 사용될 수 있다. 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 호스트 세포는 "재조합 호스트 세포"라고 언급된다. 유전자는 이후 재조합 호스트 세포에서 생산되어 발현되고, 예를 들어 "재조합 폴리펩타이드"이다. 재조합 폴리뉴클레오티드는 비-코딩 기능(예를 들어 프로모터, 복제의 기원, 리보솜-결합 사이트 등) 또한 제공할 수 있다.
"에 특정하게 하이브리드화", "특정 하이브리드화" 또는 "에 선택적으로 하이브리드화"는 서열이 복합 혼합물(예를 들어 총 세포의) DNA 또는 RNA에 존재하는 경우 엄중한 조건 하에서 우선적으로 구체적인 뉴클레오티드 서열에 대한 핵산 분자의 결합, 이중화 또는 하이브리드화를 의미한다.
용어 "엄중한 조건"은 프로브가 다른 서열에 대해서는 더 적은 정도로 또는 전혀 하지 않고, 그것의 타깃 서열에 대해 우선적으로 하이브리드하는 조건을 의미한다. 서던 및 노던(Southern and Northern) 하이브리드화와 같은 핵산 하이브리드화 실험의 내용에서 "엄중한 하이브리드화" 및 "엄중한 하이브리드화 세척 조건"은 서열 의존이고 다른 환경 파라미터 하에서는 다르다. 핵산의 하이브리드화에 대한 광범위한 가이드는 Tijssen(1993) 실험실 기술 생화학 및 분자 생물학-핵산 프로브와 하이브리드화 파트 Ⅰ 챕터 2 "하이브리드화 원리의 개관 및 핵산 프로브 분석 전략", Elsevier, 뉴욕에서 찾아진다. 일반적으로, 매우 엄중한 하이브리드화 및 세척 조건은 정의된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 용융점(Tm) 보다 약 5℃ 낮은 것으로 선택된다. Tm은 50%의 타깃 세포가 완전하게 매치된 프로브에 하이브리드하는 온도(정의된 이온 강도 및 pH 하에서)이다. 매우 엄중한 조건은 특정 프로브에 대한 Tm과 동등하도록 선택된다.
사우던 또는 노던 블랏에서 필터 상 100 상보성 잔기 보다 많이 가지는 상보성 핵산의 하이브리드화를 위한 엄중한 하이브리드화 조건의 예는 42℃에서 1mg의 헤파린과 50%의 포르말린이며, 하이브리드화는 밤새 수행된다. 매우 엄중한 세척 조건의 예는 약 15분 동안 72℃에서 0.15M NaCl이다. 예시적인 엄중한 세척 조건은 15분 동안 65℃에서 0.2×SSC 세척이다(SSC 버퍼 설명에 대한 샘브룩 등을 보라). 종종 높은 엄중한 세척은 배경 프로브 신호를 제거하기 위해 낮은 엄중한 세척 뒤에 이루어진다. 예를 들어 100 뉴클레오티드 이상의 이중화를 위한 예시적인 배지 엄중한 세척은 15분 동안 45℃에서 1 × SSC이다. 예를 들어 100 뉴클레오티드 이상의 이중화를 위한 예시적인 낮은 엄중한 세척은 15분 동안 40℃에서 4-6x SSC이다. 일반적으로, 특정 하이브리드화에서 관련되지 않은 프로브에 대해 관찰된 것보다 2x(또는 보다 높은) 신호 대 잡음비는 특정 하이브리드 탐지를 가리킨다.
진단 또는 치료의 "대상"은 인간 또는 포유류 또는 영장류를 포함하는 비-인간 동물이다.
2개의 핵산 또는 폴리펩타이드의 내용에서 문구 "실질적으로 균질한" 또는 "실질적으로 동일한"은 최대 대응성을 위해 비교되고 조정된 경우, 하기 서열 비교 알고리즘 중 하나 또는 외관 검사를 사용하여 측정하였을 때, 일반적으로 40%, 60%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 동일성을 가지는 두 개 이상의 서열 또는 서브서열을 의미한다. 바람직하게, 상당한 동일성이 약 50 잔기 길이 이상 이상인 서열의 영역 넘게, 더 바람직하게, 약 100 잔기 이상의 영역 넘게, 가장 바람직하게, 서열이 약 150 잔기 이상 넘게 실질적으로 동일하게 존재한다. 가장 바람직한 실시예에서, 서열은 비교 바이오폴리머 중 하나 또는 두 개의 전체 길이 넘게 실질적으로 동일하다.
서열 비교를 위해 전형적으로 하나의 서열이 참조 서열로서 작용하고, 테스트 서열이 비교된다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 테스트 및 참조 서열이 컴퓨터 내로 입력되고, 서열 좌표가 디자인되고, 필요한 경우 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 디자인된다. 서열 비교 알고리즘은 이후 참조 서열과 비교되는 테스트 서열의 서열 동일성 퍼센트를 디자인된 프로그램 파라미터를 기초로 계산한다.
예를 들어 스미스 & 워커만의 로칼 상동성 알고리즘, Adv . Appl . Math . 2:482, 1981, 니들맨 & 원치의 상동성 조정 알고리즘, J. Mol . Biol . 48:443, 1970, 펄손 & 리프만의 유사성 방법의 연구, Proc . Natl . Acad . Sci . 미국 85:2444, 1988, 이러한 알고리즘의 컴퓨터화된 실행(위스콘신 유전자 소프트웨어 패키지 내 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA, 유전자 컴퓨터 그룹, 575 사이언스 Dr., 매디슨, 위스콘신), 또는 외관 검사에 의해 비교를 위한 최적의 서열 조정이 행해질 수 있다.
유용한 알고리즘의 일예시는 PILEUP이다. PILEUP은 유용한 혁신적인 쌍체비교(pairwise) 알고리즘을 사용하여 관련된 서열 그룹으로부터 다수의 서열 조정을 창출하여 관련성과 서열 동일성 퍼센트를 보여준다. 이는 또한 배열 창출에 사용되는 클러스터링 관련성을 보여주는 트리 또는 덴도그램(dendogram)을 그린다. PILEUP은 펭 & 두리틀, J. Mol . Evol. 35:351-360, 1987의 혁신적인 배열 방법의 단순화를 사용한다. 상기 사용된 방법은 히기신 & 샤프, CABIOS 5:151-153, 1989에 설명된 방법과 유사하다. 프로그램은 각 최대 길이가 5,000 뉴클레오티드 또는 아미노산인 300 서열까지 조정할 수 있다. 다수의 배열 과정은 두 개의 가장 유사한 서열의 쌍체 비교로 시작되고, 두 개의 배열된 서열의 클러스터를 생산한다. 본 클러스터는 이후 다음 가장 관련된 서열 또는 배열된 서열의 클러스터로 배열된다. 서열 중 두 개의 클러스터는 두 개의 개별 서열의 쌍체비교 배열의 단순한 확대를 통해 조정된다. 최종 배열은 혁신적인, 쌍체비교 배열 시리즈에 의해 달성된다. 프로그램은 서열 비교의 영역을 위해 디자인한 특정 서열 및 그들의 아미노산 또는 뉴클레오티드 조정 및 디자인한 프로그램 파라미터에 의해 운영된다. 예를 들어 참조 서열은 하기 파라미터를 사용하여 퍼센트 서열 동일성 관련성을 결정하기 위해 다른 테스트 서열과 비교될 수 있다: 디폴트 갭 중량(3.00), 디폴트 갭 길이 중량(0.10) 및 중량된 최종 갭. 다수의 서열 배열을 생성하기에 유용한 다른 알고리즘은 클러스탈 W (톰슨 등, 핵산 연구 22: 4673-4680, 1994)이다.
퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하기에 적합한 알고리즘의 다른 예는 BLAST 알고리즘이고, 이는 알치출 등, J. Mol . Biol . 215:403-410, 1990에 개시된다. BLAST 분석을 수행하는 소프트웨어는 바이오테크놀로지 정보 국제 센터를 통해 대중이 이용 가능하다. 본 알고리즘은 먼저 의문 서열에서 길이 W의 짧은 단어를 확인함으로써 높은 스코어 서열 쌍(HSPs)을 확인하는 것을 포함하고, 이는 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 단어를 배열할 때 몇몇 양성-값의 역치 스코어 T를 매치하거나 만족한다. T는 근접 단어 스코어 역치를 의미한다(알치출 등, J. Mol . Biol . 215:403-410, 1990). 이러한 초기 근접 단어 맞춤(hits)은 그들을 포함하는 더 긴 HSPs를 발견하기 위한 초기 연구의 종자로서 작용한다. 단어 맞춤은 이후 누적 조정 스코어가 증가될 수 있는 만큼 각 서열을 따라 양 방향으로 연장된다. 누적 스코어는 뉴클레오티드 서열, 파라미터 M(매칭 잔기 쌍을 위한 보상 스코어: 항상 > 0) 및 N(미스매칭 잔기를 위한 페널티 스코어; 항상 < 0)을 위해 사용하여 계산된다. 아미노산 서열을 위해, 스코어 매트릭스는 누적 스코어를 계산하기 위해 사용된다. 각 방향에서 단어 맞춤의 연장은 다음 경우 중단된다: 누적 배열 스코어가 그것의 최대 달성 값으로부터 양 X만큼 하락하는 경우; 하나 이상의 음성-스코어 잔기 배열의 축적으로 인해 누적 스코어가 제로 또는 그 이하로 되는 경우; 또는 어느 한 서열의 말단에 도달하는 경우. BLAST 프로그램(뉴클레오티드 서열을 위한)은 디폴트로서 단어길이(W) 11, 예상(E) 10, M=5, N=-4 및 양 스트랜드의 비교를 사용한다. 아미노산 서열을 위해 BLASTP 프로그램은 디폴트로서 단어길이(W) 3, 예상(E) 10 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스를 사용한다(헤니코프 & 헤니코프, Proc . Natl . Acad . Sci . 미국89:10915, 1989를 보라).
퍼센트 서열 동일성 계산에 부가하여, BLAST 알고리즘은 두 서열 간 유사성의 통계적 분석 또한 수행한다(예를 들어, 칼린 & 알치출, Proc . Natl . Acad . Sci . 미국873-5787, 1993을 보라). BLAST 알고리즘에 의해 제공된 하나의 유사성 측정은 가장 작은 합계 확률(P(N))이고, 이는 두 개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이에 매치가 우연히 일어날 가능성의 징후를 제공한다. 예를 들어, 핵산은 참조 핵산에 대한 테스트 핵산의 비교에서 가장 작은 합계 확률이 약 0.1 보다 작은 경우, 더 바람직하게 약 0.01 보다 작은 경우, 가장 바람직하게 약 0.001 보다 작은 경우 참조 서열과 유사라고 여겨진다.
두 개의 핵산 서열 또는 폴리펩타이드가 실질적으로 동일하다는 추가적인 표시는 아래 설명된 바와 같이, 첫 번째 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드는 두 번째 펩타이드에 의해 인코딩된 폴리펩타이드와 면역학적으로 교차 반응성이라는 것이다. 즉, 폴리펩타이드는 두 번째 폴리펩타이드와 전형적으로 실질적으로 동일하고, 예를 들어, 두 개의 펩타이드는 보존적인 대체에 의해서만 다르다. 두 개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 다른 표시는 본 명세서에 설명된 것 같은 엄중한 조건 하에서 두 개의 분자가 서로 하이브리드된 것이다.
"실질적으로 순수한" 또는 "분리된"은 목적 종이 우세한 종(즉, 몰 기반 상, 조성물 내 어떤 다른 개별 고분자 종보다 더 많은) 존재이고, 실질적으로 정제된 분획은 목적 종이 모든 고분자 종 존재의 적어도 약 50% 이상(몰 기반)을 포함하는 조성물이다. 일반적으로, 실질적으로 순수한 조성물은 조성물의 약 80% 내지 90% 이상의 고분자 종 존재가 관심의 정제된 종이라는 것을 의미한다. 목적 종은 조성물이 본질적으로 단일 고분자 종으로 구성된 경우 필수적인 동종성(종래의 탐지 방법에 의해 조성물 내 오염 종이 탐지될 수 없다)으로 정제된다. 용매 종, 작은 분자(<500 달톤), 안정화제(예를 들어, BSA) 및 기본 이온 종은 본 정제의 목적을 위한 고분자 종으로 여겨지지 않는다. 몇몇 실시예에서, 상기 발명의 리소좀 술파타아제 효소는 실질적으로 순수하거나 분리된다. 몇몇 실시예에서, 상기 발명의 리소좀 술파타아제 효소는 그들의 합성에 사용되는 고분자 시작 물질과 관련하여 실질적으로 순수하거나 분리된다. 몇몇 실시예에서, 상기 발명의 약학 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 첨가제와 혼합된 실질적으로 순수하거나 분리된 치료적 리소좀 술파타아제 효소를 포함한다.
"치료적" 치료는 병리의 신호 또는 증상을 감소시키거나 제거하기 위한 목적으로 그러한 신호 또는 증상을 나타내는 환자에게 투여하는 치료이다. 상기 신호 또는 증상은 생화학, 세포, 조직학, 기능적, 객관적 또는 주관적일 수 있다. 상기 발명의 리소좀 술파타아제 효소는 치료적 치료 또는 진단을 위해 주어질 수 있다.
"치료 지수"는 최소 치료 양 이상 및 허용되지 않는 독성 양 아래의 용량 범위(양 및/또는 시간)을 의미한다.
"치료"는 예방 치료 또는 치료적 치료 또는 진단 치료를 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "단위 용량 형"은 인간 및 동물 대상을 위한 단일 용량으로 적합한 물리적으로 별개의 단위를 의미하며, 각 단위는 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 첨가제와 함께 연계하여 의도된 효과를 만들기에 충분한 양으로 계산된 본 발명의 리소좀 술파타아제 효소의 미리 결정된 양을 포함한다. 본 발명의 신규 단위 용량형에 대한 사양은 도입된 특정 리소좀 술파타아제 효소 및 달성되는 효과 및 호스트 내 각 리소좀 술파타아제 효소와 관련된 약력학에 따른다.
Ⅱ. 리소좀 술파타아제 효소의 생산
일측면에서, 본 발명은 치료학적 사용을 가능하게 하는 양의 활성이고 높은 정도로 인산화된 리소좀 술파타아제 효소를 생산하는 새로운 방법이라는 특징이 있다. 일반적으로, 상기 방법은 인간 술파타아제 변형 인자 1(SUMF1) 또는 생물학적으로 활성인 그것의 절편, 돌연변이, 변종 또는 파생물을 인코딩하는 cDNA 및 전체 길이의 리소좀 술파타아제 효소 또는 생물학적으로 활성인 그것의 절편, 돌연변이, 변종 또는 파생물을 인코딩하는 cDNA를 가진 적합한 세포 라인의 변형이라는 특징이 있다. 당업계의 기술자들은 그러한 리소좀 술파타아제 효소의 최적 생산을 위해 그것과 함께 적합한 도입된 세포 라인에서 본 명세서에 명확하게 설명된 것과는 다른 발현 구조를 제조할 수 있다. 게다가, 통상의 기술자는 전체-길이 효소를 천연적으로 발생시키는 것과 동일하거나 유사한 생물학적 활성을 가지는 SUMF1 또는 리소좀 술파타아제 효소를 천연적으로 발생시키는 생물학적으로 활성인 절편, 변종, 돌연변이 또는 파생물을 인코딩하는 cDNA의 절편을 쉽게 디자인할 수 있다.
숙주 세포
재조합 리소좀 술파타아제 효소의 생산에 사용되는 숙주 세포는 치료학적으로 효소의 사용을 가능하게 하는 양으로 그러한 리소좀 술파타아제 효소를 생산하는 능력을 특징으로 하는 엔도좀 산성화-결핍 세포 라인이다. 상기 발명은 G71이라고 명명된, CHO-K1-파생된, END3 상보성 그룹 세포 라인을 제공한다. 상기 발명은 또한 G71S라고 명명된, 세럼-없는(serum-free) 현탁액 배양에서 성장하도록 적응된 G71 세포 라인을 제공한다. 상기 발명은 또한 추가적으로 서브 클론되거나(subcloned) 다른 발현 플라스미드를 포함하는 G71 및 G71S 세포의 파생물을 제공한다.
재조합 단백질을 인코딩하는 DNA 또는 RNA를 포함하고 발현하는 세포는 본 명세서에서 유전학적으로 변형된 세포로 언급된다. 재조합 단백질을 인코딩하는 DNA 또는 RNA를 포함하고 발현하는 포유류 세포는 유전학적으로 변형된 포유류 세포로 언급된다. 세포 내로의 DNA 또는 RNA 도입은 전기 천공법(electroporation), 미량주사법(microinjection), 입자총방법(microprojectile bombardment), 인산 칼슘 침전법(calcium phosphate precipitation), 수정 인산 칼슘 침전법(calcium phosphate precipitation), 양이온성 지질 처리법(cationic lipid treatment), 포토포레이션(photoporation), 융합 방법론(fusion methodologies), 수용체 매개 전달(receptor mediated transfer) 또는 폴리브렌 침전법(polybrene precipitation)을 예로 들 수 있으나 이에 제한되지 않는 알려진 도입 방법에 의한다. 선택적으로, 상기 DNA 또는 RNA는 바이러스 벡터와 감염에 의해 도입될 수 있다. 재조합 단백질을 인코딩하는 DNA 또는 RNA를 발현하는 포유류 세포를 포함하는 세포를 생산하는 방법은 함께 계속 중인 특허 출원 미국 Ser. No. 08/334,797, 제목 "유전자 치료를 위한 생체 내 단백질 생산 및 전달 시스템", 출원인 리처드 F 셀던, 더글라스 A. 트레코와 마이클 W. 헐트레인(1994년 11월 4일 출원); 미국 Ser. No. 08/334,455, 제목 "유전자 치료를 위한 에리스로포이에틴 또는 인슐리노트로핀의 생산 및 전달", 출원인 리처드 F 셀던, 더글라스 A. 트레코와 마이클 W. 헐트레인(1994년 11월 4일 출원) 및 미국 Ser. No. 08/231,439, 제목 "1차 또는 2차 세포 내로 DNA의 타깃된 도입 및 유전자 치료를 위한 그들의 용도", 출원인 더글라스 A. 트레코, 마이클 W. 헐트레인 및 리처드 F 셀던(1994년 4월 20일 출원)에 개시된다. 상기 각 출원들의 교시는 그들 전체가 참조 문헌으로서 본 명세서에 명백히 도입된다.
바람직한 실시예에서, 재조합 리소좀 술파타아제 효소의 생산에 사용되는 숙주 세포는 치료학적으로 효소의 사용을 가능하게 하는 양으로 그러한 리소좀 술파타아제 효소를 생산하는 능력을 특징으로 하는 엔도좀 산성화-결핍 세포 라인이다. 바람직한 실시예에서, 상기 발명은 "정의"에서 구체화한 바와 같이, G71로 명명되고 CHO-K1 파생된 END2 상보성 그룹 세포 라인 및 G71S로 명명되고 세럼-없는 현탁액 배양에서 성장하도록 적응된 G71 세포 라인을 제공하고, 이는 인간 술파타아제 변형 인자 1(SUMF1)과 재조합 리소좀 술파타아제 효소를 함께 발현하여, 활성이고 높은 정도로 인산화된 리소좀 술파타아제 효소를 높은 수득율로 생산하는 것을 가능하게 하며, 그리하여 치료학적인 리소좀 술파타아제 효소를 대규모로 생산할 수 있게 한다. 가장 바람직한 실시예에서, G71 또는 G71S 세포 라인 또는 그들의 파생물은 약 0.5 이상, 바람직하게 약 0.75 이상, 더 바람직하게 약 1.0 이상, 그리고 보다 더 바람직하게 약 1.25 이상 피코그램/세포/일의 양으로 재조합 리소좀 술파타아제 효소를 발현하고 분비한다.
벡터 및 핵산 구조
인간 술파타아제 변형 인자 1(SUMF1) 또는 리소좀 술파타아제 효소 중 하나 또는 모두인, 재조합 단백질을 발현하는데 사용되는 핵산 구조는 도입된 포유류 세포 또는 받는 세포의 게놈 내로, 무작위거나 상응하는 재조합을 통해 미리 선택된 타깃된 부위 중 하나에, 통합된 것에서 염색체 외로(에피솜으로) 발현되는 것일 수 있다. 염색체 외로 발현되는 구조는 재조합 단백질-인코딩 서열에 부가하여 세포의 단백질 발현, 선택적으로 구조의 복제(replication)에 충분한 서열을 포함한다. 이는 전형적으로 프로모터, 재조합 단백질-인코딩 DNA 및 폴리아데닐화 사이트를 포함한다. 재조합 단백질을 인코딩하는 DNA는 그것의 발현이 프로모터의 제어 하에 있는 방법으로 구조에 위치된다. 선택적으로, 상기 구조는 다음 중 하나 이상: 스플라이스 사이트, 인핸서 서열, 적절한 프로모터 제어 하에 선택 가능한 마커 유전자, 적절한 프로모터 제어 하에 증폭 가능한 마커 유전자 및 매트릭스 부착 영역(MAR) 또는 삽입되는 영역의 발현을 강화한다고 당업계에 알려진 다른 요소와 같은 추가적인 구성 성분을 포함할 수 있다.
DNA 구조가 세포의 게놈 내로 통합하는 이러한 실시예에서, 이는 오직 재조합 단백질-인코딩 핵산 서열을 포함하는 것을 필요로 한다. 선택적으로, 이는 게놈 내 선택된 사이트로 DNA를 도입하는 것을 타깃(DNA 또는 DNA 서열을 타깃)하기 위한 프로모터와 인핸서 서열, 폴리아데닐화 사이트 또는 사이트들, 스플라이스 사이트 또는 사이트들, 선택 가능한 마커 또는 마커들을 인코딩하는 핵산 서열, 증폭 가능한 마커를 인코딩하는 핵산 서열, 매트릭스 부착 영역(MAR) 또는 도입된 영역의 발현을 강화한다고 당업계에 알려진 다른 요소, 및/또는 받는 세포 내 게놈의 DNA와 상동성인 DNA를 포함할 수 있다.
세포 배양 방법
재조합 단백질-인코딩 DNA 또는 RNA를 포함하는 포유류 세포는 세포의 성장 및 DNA 또는 RNA의 발현에 적절한 조건 하에서 배양된다. 재조합 단백질을 발현하는 세포들은 알려진 방법 및 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 동정될 수 있고, 상기 재조합 단백질은 알려진 방법 및 또한 본 명세서에 개시된 방법을 사용해서 분리되고 정제될 수 있으며, 재조합 단백질 생산의 증폭 중 하나와 함께 또는 없이 될 수 있다. 동정은 예를 들어 PCR 스크리닝, 사우던 블랏 분석(Southern blot analysis)에 의한 스크리닝 또는 재조합 단백질 발현용 스크리닝과 같이 재조합 단백질을 인코딩하는 DNA 또는 RNA 존재를 나타내는 표현형을 보여주는 유전적으로 변형된 포유류 세포 스크리닝을 통해서 수행될 수 있다. 도입된 재조합 단백질-인코딩 DNA를 포함하는 세포의 선별은, 선택 가능한 마커 유전자를 발현하는 이러한 세포만의 생존을 위한 적절한 조건 하에서, 선택 가능한 마커 유전자를 포함하는 도입된 또는 감염된 세포의 연속적인 배양으로 DNA 구조에 선택 가능한 마커를 포함함으로써 수행될 수 있다. 도입된 DNA 구조의 증폭은 적절한 조건 하에서 유전적으로 변형된 포유류 세포를 배양(예를 들어 증폭 가능한 마커 유전자의 다양한 카피를 포함하는 세포들만이 생존할 수 있는 농도 약물 존재 하에 증폭 가능한 마커 유전자를 포함하는 유전적으로 변형된 포유류 세포를 배양)함에 의해 영향을 받을 수 있다.
재조합 단백질을 발현하는 유전적으로 변형된 포유류 세포는 본 명세서에 설명된 바와 같이, 발현 산물을 탐지함으로써 동정될 수 있다. 예를 들어, 활성이고 높은 정도로 인산화된 리소좀 술파타아제 효소를 발현하는 포유류 세포는 샌드위치 효소 면역분석법(sandwich enzyme immunoassay)에 의해 동정될 수 있다. 항체는 활성제 분율에 대해 나타내어 질 수 있다.
리소좀 술파타아제 효소의 변종
특정 실시예에서, 활성이고 높은 정도로 인산화된 리소좀 술파타아제 효소 돌연변이 또는 변종은 제조될 수 있고 활성이고 높은 정도로 인산화된 리소좀 술파타아제 효소가 사용될 수 있는 다양한 응용 분야에서 유용할 것이다. 폴리펩타이드의 아미노산 서열 돌연변이 또는 변종은 돌연변이 또는 변종으로 대체되거나, 삽입되거나 소실될 수 있다. 소실 돌연변이 또는 변종은 기능 또는 면역성 활성에 필수적이지 않은 본래 단백질 중 하나 이상의 잔기가 부족하다. 소실 돌연변이 또는 변종의 일반 유형은 분비 신호 서열 또는 세포의 특정 부분에 결합하는 단백질을 나타내는 신호 서열이 부족한 것이다. 삽입 돌연변이 또는 변종은 전형적으로 폴리펩타이드 내 비 말단 지점에 물질의 부가를 포함한다. 이는 면역 활성 에피토프 또는 단순한 단일 잔기의 삽입을 포함할 수 있다. 융합 단백질로도 불리는 말단 부가는 아래 논의된다.
변종은 상기 설명한 바와 같이 변형되지 않은 리소좀 술파타아제 효소와 실질적으로 상등하거나 실질적으로 동일할 수 있다. 바람직한 변종은 술파타아제 활성을 예로 들 수 있는 리소좀 술파타아제 효소의 생물학적인 활성 중 적어도 몇몇을 보유하는 활성이고 높은 정도로 인산화된 리소좀 술파타아제 효소 폴리펩타이드의 변종이다. 다른 바람직한 변종은 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제의 술파타아제 활성 중 적어도 몇몇을 보유하는 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제 폴리펩타이드의 변종을 포함한다.
대체 돌연변이 또는 변종은 전형적으로 단백질 내 하나 이상의 사이트에서 다른 것을 위한 와일드-타입 폴리펩타이드의 한 아미노산을 교환하고, 다른 기능 또는 특성의 소실 없이, 단백질 가수 분해성 분해(cleave)에 대한 안정성을 예로 들 수 있으나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 폴리펩타이드의 특성을 조절하도록 디자인될 수 있다. 본 종류의 대체는 보존적인 것이 바람직하며, 즉, 하나의 아미노산은 유사한 모양과 전하의 것으로 대체된다. 보존적 대체는 당업계에 잘 알려져 있으며 예를 들어 알라닌에서 세린; 알기닌에서 라이신; 아스파라긴에서 글루타민 또는 히스티딘; 아스파테이트에서 글루타메이트; 시스테인에서 세린; 글루타민에서 아스파라긴; 글루타메이트에서 아스파테이트; 글리신에서 프롤린; 히스티딘에서 아스파라긴 또는 글루타민; 이소류신에서 류신 또는 발린; 류신에서 발린 또는 이소류신; 라이신에서 알기닌; 메티오닌에서 류신 또는 이소류신; 페닐알라닌에서 티로신, 류신 또는 메티오닌; 세린에서 트레오닌; 트레오닌에서 세린; 트립토판에서 티로신; 티로신에서 트립토판 또는 페닐알라닌; 및 발린에서 이소류신 또는 류신으로의 변화를 포함한다.
본 발명의 일 측면은 리소좀 술파타아제 효소의 O- 또는 N-연결된 글리코실화 사이트에서 돌연변이 되는 글리코실화 사이트 돌연변이 또는 변종이 생성되는 것을 고려한다. 그러한 돌연변이 또는 변종은 활성이고 높은 정도로 인산화된 리소좀 술파타아제 효소의 생물학적 활성, 물리적 구조 및 기질 결합 잠재력이 존재하는 중요 정보를 넘겨줄 것이다. 구체적인 측면에서, 활성이고 높은 정도로 인산화된 리소좀 술파타아제 효소 폴리펩타이드의 다른 돌연변이 또는 변종은 생물학적 활성을 보유하지만 증가되거나 감소된 기질 결합 활성을 가지는 것으로 생성될 수 있다는 것이 고려된다. 이와 같이, 활성 사이트 또는 촉매 영역의 돌연변이는 변경된 기질 결합 활성을 가지는 단백질 돌연변이 또는 변종을 생성하기 위해서 특히 고려된다. 그러한 실시예에서, 상기 활성이고 높은 정도로 인산화된 리소좀 술파타아제 효소의 서열은 특별히 돌연변이된 다른 관련된 효소 및 선별된 잔기의 그것과 비교된다.
아미노산 번호 1로 추정한 아미노 말단으로부터 성숙한 단백질의 아미노산의 번호를 매길 때, 유용할 수 있는 예시적인 변이는 예를 들어 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GALNS)의 위치 178과 397을 포함하는, 잠재적으로 글리코실화된 아스파라긴 모두 또는 일부의 대체를 포함한다(도 5 참조).
기질 결합은 리소좀 술파타아제 효소의 활성 사이트에/근처의 돌연변이에 의해 변형될 수 있다. 그러한 돌연변이를 참작하는 것은 예시이며, 당업계의 기술자는 효소 서열의 다른 변이가 본 단백질 및 그것의 활성에 관한 추가적인 구조 및 기능 정보를 제공하도록 만들어질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
상기 설명된 것 같이 구조 돌연변이 또는 변종을 위해서, 당업계의 기술자 중 하나는 잘 알려진 표준 기술을 채용할 수 있다, 특별히 고려된 것은 N-말단 소실, C-말단 소실, 내부 소실뿐만 아니라 무작위 및 점 돌연변이이다.
N-말단 및 C-말단 소실은 예를 들어 C- 또는 N-말단 영역 끝 근처의 적합한 단일 제한 사이트의 존재의 이점을 가지는 소실 돌연변이의 형태이다. DNA는 그 사이트에서 분해(cleave)되고, 잘린 끝은 BAL31, 엑소뉴클레아제(exonuclease) Ⅲ, DNase Ⅰ 및 S1 뉴클레아제와 같은 뉴클레아제에 의해 분해된다. 두 개의 끝을 다시 합하면 제한 사이트 주변에 다양한 크기의 소실을 가진 DNA 시리즈를 생산한다. 그러한 돌연변이로부터 발현된 단백질은 효소 활성을 예로 들 수 있는 적절한 생물학적 기능이, 당업계에서의 기술 표준 및 상세한 설명에 개시된 기술을 사용하여 분석될 수 있다. 유사한 기술이 내부 소실 돌연변이를 위해, 두 개의 적절하게 위치된 제한 사이트를 사용하고, 그럼으로써 만들어진 정확히 정의된 소실 및 상기와 같이 재 리개이션(religation)된 끝을 이끔으로써 채용될 수 있다.
또한 고려되는 것은 부분적인 절단(digestion) 돌연변이이다. 그러한 예에서, 당업계의 기술자는 반응 시간의 길이에 따라 여러 장소에서 DNA를 자르는 "빈번한 커터(frequent cutter)"를 채용할 것이다. 그러므로, 다양한 반응 조건에 의해 다양한 크기의 돌연변이 시리즈를 생성할 수 있을 것이고, 이후 활성이 스크린될 수 있다.
무작위 삽입 돌연변이는 또한 DNase Ⅰ으로 DNA 서열을 자르고, 예를 들어, 3, 6, 9, 12 등 아미노산을 인코딩하는 뉴클레오티드 스트레치를 삽입하고 끝을 재리개이션(religation)함으로써 수행될 수 있다. 일단 그러한 돌연변이가 만들어지면 상기 돌연변이는 와일드-타입 단백질에 의해 나타나는 여러 활성이 스크린될 수 있다.
점 돌연변이는 또한 아미노산 잔기가 리소좀 술파타아제 효소 생물학적 활성과 관련된 특정 활성에 중요하다는 독특성을 확인하기 위해 도입될 수 있다. 그러므로, 임의의 당업계 기술자는 DNA 스트랜드(strand)의 단일 염기 변화를 생성하고 변경된 코돈 및 미스센스(missense) 돌연 변이를 야기할 수 있다.
특정 단백질의 아미노산은 등가물, 또는 보다 향상되고, 2차-생성 분자를 제작하기 위해 변경될 수 있다. 그러한 변경은 상호적인 결합 능력의 주목할만한 손실 없이, 예를 들어 항체의 항원-결합 영역 또는 분자나 수용체의 기질 상 결합 사이트와 같은 구조를 가지는 주어진 단백질의 아미노산으로 대체하는 것을 고려한다. 이것은 상호적인 능력 및 단백질의 생물학적 기능 활성을 규명하는 단백질의 본성이기 때문에, 특정 아미노산 대체는 단백질 서열 및 그것의 근원적인 DNA 코딩 서열 내에서 만들어지고, 그럼에도 불구하고 비슷한 특성을 가지는 단백질을 얻을 수 있다. 그러므로, 아래 논의되는 것처럼, 그들의 생물학적인 이용이나 활성의 주목할만한 손실 없이 다양한 변화가 DNA 유전자의 서열 내에 만들어질 수 있다.
그러한 변화를 만들면서, 아미노산의 수치 요법(hydropathic) 색인이 고려될 수 있다. 이는 아미노산의 상대적인 수치 요법 특질이 결과 단백질의 2차 구조에 기여하며, 이는 차례로 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등을 예로 들 수 있는 다른 분자와 단백질의 상호 작용을 규명한다는 점에서 허용된다. 각 아미노산은 그들의 소수성 및 전하 특질을 기초로 수치 요법 색인이 할당된다(키이트 & 두리틀, J. Mol . Biol ., 157(1):105-132, 1982, 참조로서 본 명세서에 도입됨). 일반적으로, 아미노산은 유사한 수치 요법 색인이나 스코어를 가지는 다른 단백질에 의해 대체될 수 있고, 여전히 유사한 생물학적 활성을 가지는 단백질을 낳으며, 즉 여전히 생물학적으로 기능적으로 동등한 단백질을 얻는다.
부가적으로, 비슷한 아미노산의 대체는 친수성 기초로 할 때 효과적으로 만들어질 수 있다. 본 명세서에 참조로서 도입된 미국 특허 4,554,101은 단백질의 가장 큰 국부(local) 평균 친수성은, 그것의 가까운 아미노산의 친수성에 의해 지배될 때, 단백질의 생물학적인 특성과 연관된다고 서술한다. 이와 같이, 아미노산은 유사한 친수성 값을 가지는 다른 것으로 대체될 수 있고 여전히 생물학적으로 동등하고 면역학적으로 동등한 단백질을 얻는다.
상기 발명의 본 내용에서 사용될 수 있는 예시적인 아미노산 대체물은 알기닌과 라이신; 글루타메이트와 아스파테이트; 세린과 트레오닌; 글루타민과 아스파라긴; 및 발린, 류신과 이소류신의 교환을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 단백질의 2차 구조를 변경하면서도 몇몇 또는 모든 생물학적인 활성을 보유가 필요하다는 것을 고려하는 다른 그러한 대체는 당업계의 기술자에게 잘 알려진 것일 것이다.
상기 발명에 따라 폴리펩타이드의 제조에 고려되는 변종의 다른 유형은 펩타이드 모방물의 사용이다. 모방물은 단백질 2차 구조의 요소를 모방하는 펩타이드-포함 분자이다. 예를 들어, 존슨 등., 바이오테크놀로지와 약학의 "펩타이드는 모방물로 돌리다", 페주토 등., Eds., 채프만과 홀, 뉴욕(1993)을 참조하라. 펩타이드 모방물 사용 뒤의 근본적인 이유는 단백질의 펩타이드 골격이 항체 및 항원의 것과 같은 분자 상호 작용을 가능하게 하는 것과 같은 방식으로 본래의 아미노산 체인에 주로 존재한다는 것이다. 펩타이드 모방물은 천연 분자와 유사하게 분자 상호 작용을 가능하게 할 것으로 예상된다. 이러한 원리는 상기 설명된 원리와 결합하여, 리소좀 술파타아제 효소의 많은 본연의 특성을 가지지만, 변경되고 보다 향상된 특성을 가지는 2차 생성 분자를 제작하기 위해 사용될 수 있다.
리소좀 술파타아제 효소의 변형된 글리코실화
활성이고 높은 정도로 인산화된 리소좀 술파타아제 효소의 변종은 또한 하나 이상의 탄수화물 모이어티(moieties)의 삭제, 및/또는 본래 펩타이드에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 사이트의 부가를 예로 들 수 있는, 모(parent) 폴리펩타이드에 비해 변형된 글리코실화 패턴을 가지는 것으로 생산될 수 있다.
글리코실화는 전형적으로 N-연결되거나 O-연결되는 것 중 하나이다. N-연결된 것은 아스파라긴 잔기의 사이드 체인에 탄수화물 모이어티가 부착되는 것을 의미한다. 트립펩타이드 서열 아스파라긴-X-세린과 아스파라긴-X-트레오닌은, 상기에서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다, 아스파라긴 사이드 체인에로의 탄수화물 모이어티의 효소적 부착에 대한 인식 서열이다. 폴리펩타이드 내 이러한 트리펩타이드 서열 중 하나의 존재는 잠재적인 글리코실화 사이트를 만든다. 그러므로, N-연결된 글리코실화 사이트는 아미노산 서열을 변경함으로써 폴리펩타이드로 부가될 수 있고 그래서 하나 이상의 이러한 트리펩타이드 서열을 포함한다. O-연결된 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토오스 또는 자일로오스 중 하나가 비록 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시라이신 또한 사용될 수 있지만, 하이드록시아미노산, 가장 일반적으로 세린 또는 트레오닌에 부착되는 것을 의미한다. O-연결된 글리코실화 사이트는 본래 폴리펩타이드의 서열 내로 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기가 삽입되거나 대체되는 것에 의해 부가될 수 있다.
도메인 전환( switching )
리소좀 술파타아제 효소 단백질의 많은 부분은 매우 많은 서열 상동성을 가진다. 돌연변이는 그것의 기능을 변경할 수 있는 리소좀 술파타아제 효소 폴리펩타이드에서 확인될 수 있다. 이러한 연구는 적어도 2 가지 이유 때문에 잠재적으로 중요하다. 첫째, 그들은 여전히 본 유전자의 다른 상등물, 대립 형질 변종 및 돌연변이가 쥐, 토끼, 원숭이, 긴팔 원숭이, 침팬지, 유인원, 개코 원숭이, 소, 돼지, 말, 양 및 고양이와 같은 관련된 종에 존재할 수 있다는 타당한 예상을 제공한다. 이러한 상등물, 변종 및 돌연변이가 분리되고 다른 분석물과 연관되면, 특정 활성 또는 기능적 도메인이 확인될 수 있다. 둘째, 이는 상기 설명한 바와 같이 분자의 추가적인 돌연변이 분석을 위한 시작점을 제공할 것이다. 본 정보가 활용될 수 있는 한 방법은 "도메인 전환"에 있다.
도메인 전환은 다르지만 관련된 폴리펩타이드를 사용하는 재조합 분자의 생성과 관련한다. 예를 들어, 리소좀 술파타아제 효소, 예를 들어 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제의 서열을 다른 소스의 유사한 리소좀 술파타아제 효소의 것 및 이러한 폴리펩타이드의 돌연변이 및 대립형질 변종과 비교함으로써, 이러한 분자의 기능적으로 중요한 영역에 대한 것과 같은 예측을 할 수 있다. 이후, 리소좀 저장 장애에서 효소 기능 및 효과에 대한 이러한 영역의 중요성을 결정하려는 노력으로 이러한 분자의 관련된 도메인을 전환하는 것이 가능하다. 이러한 "키메라"가 천연 분자들과 구별될 수 있다는 점에서 이러한 분자들은 부가적인 가치를 가질 수 있음과 동시에, 동일하거나 보다 강화된 기능을 제공하는 것이 가능하다.
많은 리소좀 술파타아제 효소가 현재 확인되고 있다는 것에 기초하여, 돌연변이에 대한 추가적인 분석 및 2차 구조에 대한 예측된 영향이 본 이해에 추가될 것이다. 리소좀 술파타아제 효소 간 도메인을 전환하는 돌연변이가 그들이 상호작용하는 분자 및 폴리펩타이드의 구조/기능 관계에 관한 유용한 정보를 제공할 것이라는 것이 고려된다.
융합( fusion ) 단백질
상기 설명된 돌연변이에 부가하여, 본 발명은 융합 단백질로 알려진 삽입 변종의 구체적인 종류의 생성을 더 고려한다. 본 분자는 일반적으로 2차 폴리펩타이드의 전체 또는 부분과 N- 또는 C-말단에서 연결된 본래 분자의 전체 또는 실질적인 부분을 가진다. 예를 들어, 융합은 전형적으로 다른 종으로부터의 리더 서열을 채용하여 이종의(heterologous) 숙주에서 단백질의 재조합 발현을 가능하게 한다. 다른 유용한 융합은 항체 에피토프(epitope)와 같은 면역학적으로 활성인 도메인의 부가를 포함하여, 융합 단백질의 정제를 가능하게 한다. 융합 연결 부위 또는 근처에 분해(cleave) 사이트를 포함하는 것은 정제 후 관련 없는 폴리펩타이드의 제거를 가능하게 할 것이다. 다른 유용한 융합은 효소, 글리코실화 도메인, 세포 타깃팅 신호 또는 트랜스막 영역에서 활성 사이트와 같은 기능 도메인의 연결을 포함한다.
본 발명에서 사용될 수 있는 많은 상업적으로 이용 가능한 융합 단백질 발현 시스템이 있다. 구체적으로 유용한 시스템은 글루타치온 S-트랜스페라제(GST) 시스템(파마시아, 피스카타웨이, NJ), 말토오스 결합 단백질 시스템(NEB, 비버리, MA), FLAG 시스템(IBI, 뉴 헤븐, CT), 6×히스 시스템(키아겐, 채츠월스, CA)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이러한 시스템은 재조합 폴리펩타이드의 항원 능력에 영향을 줄 것 같지 않은 적은 수의 부가적인 아미노산만을 가지는 재조합 폴리펩타이드를 생산할 수 있다. 예를 들어, FLAG 시스템과 6×히스 시스템은 오직 짧은 서열만을 부가하고, 둘 다 항원성이 열악한 것으로 알려져 있으며 그것의 본래 형태에 대한 폴리펩타이드의 접힘에 불리하게 영향을 주지 않는다. 유용하다고 고려되는 다른 N-말단 융합은 단백질 또는 펩타이드의 N-말단 영역에서의 Met-Lys 디펩타이드 융합이다. 그러한 융합은 단백질 발현 또는 활성에서 유리한 증가를 만들 수 있다.
특히 유용한 융합 구조는 리소좀 술파타아제 효소 융합 구조의 면역성을 강화하기 위해 활성이고 높은 정도로 인산화된 리소좀 술파타아제 효소 폴리펩타이드 또는 그것의 절편이 헵텐(hapten)으로 융합되는 것일 수 있다. 다른 실시예에서, 융합 구조는 특정 사이트 또는 세포에 대해 리소좀 술파타아제 효소-관련된 조성물의 타깃팅을 강화할 것으로 만들어질 수 있다.
예를 들어 특정 기관, 조직 또는 세포 유형에 대해 리소좀 술파타아제 효소를 타깃하는 모티프(motif)와 같은 의도된 특성을 가지는 이종(heterologous)의 펩타이드를 포함하는 다른 융합 구조. 바람직한 실시예에서, 리소좀 술파타아제 효소에 융합된 6 아스파트 산 잔기(6×Asp 또는 6D)를 예로 들 수 있는 뼈 타깃팅 펩타이드를 포함하는 융합 구조는 뼈의 특정 사이트로 효소를 타깃할 수 있다.
세럼 반감기를 연장하는 Ig 연속(constant) 영역을 예로 들 수 있는 의도된 특성을 가지는 이종의 폴리펩타이드를 포함하는 다른 융합 구조 또는 그것의 항체 또는 절편 또한 고려된다. 다른 융합 시스템은 의도된 폴리펩타이드로부터 융합 파트너를 잘라내도록 의도된 폴리펩타이드 하이브리드를 생산한다. 일실시예에서, 융합 파트너는 프로테아제(protease)에 대한 특정 인식 서열을 포함하는 펩타이드 서열에 의해, 재조합 활성이고 높은 정도로 인산화된 리소좀 술파타아제 효소 폴리펩타이드에 연결된다. 적합한 서열의 예시는 타바코 에치 바이러스 프로티아제(Tabacco Etch Virus protease)(라이프 테크놀로지, 개이더스버그, MD) 또는 인자 Xa(뉴 잉글랜드 바이오랩, 비버리, MA)에 의해 인식되는 것이다.
파생물
상기 서술한 바와 같이, 파생물은 표지법(labelling)(예를 들어, 방사선핵종(radionuclide) 또는 다양한 효소), 페그화(PEGylation)와 같은 공유 폴리머 부착법(폴리에틸렌 글리콜과 파생법(derivatization)) 및 오르니틴과 같은 아미노산의 화합 합성에 의한 삽입 또는 대체법을 예로 들 수 있으나 이에 제한되지 않는 기술에 의해 화학적으로 변형된 폴리펩타이드를 의미한다. 리소좀 술파타아제 효소의 파생물은 또한 치료제로 유용하며 상기 발명의 방법에 의해 생산될 수 있다.
폴리에틸렌 글리콜(PEG)는 상기 발명의 방법에 의해 생산된 리소좀 술파타아제 효소에 부착되어 생체 내에서 더 긴 반감기를 제공할 수 있다. PEG 그룹은 분자량에 가까운 임의의 것이 될 수 있고 직선이거나 분지형일 수 있다. PEG의 평균 분자량은 바람직하게 약 2 킬로달톤("kDa") 내지 약 100 kDa, 더 바람직하게 약 5 kDa 내지 약 50 kDa, 가장 바람직하게 약 5 kDa 내지 약 10 kDa의 범위일 것이다. PEG 그룹은 일반적으로 PEG 모이어티(moiety)의 반응 그룹(예를 들어 알데히드, 아미노, 티올 또는 에스터 그룹)을 통한 단백질의 모이어티의 반응 그룹(예를 들어 알데히드, 아미노 또는 에스터 그룹)에 아실화 또는 환원성 알킬화를 통하여 상기 발명의 리소좀 술파타아제 효소에 부착될 것이다. 관심 대상의 폴리펩타이드에 대한 PEG 모이어티의 부착은 당업계에 잘 알려진 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어 국제 출원 제WO 96/11953호 및 미국 특허 제4,179,337호를 참고한다.
PEG와 리소좀 술파타아제 효소 폴리펩타이드의 리개이션(ligation)은 대개 수용성 상에서 일어나며, 역상 분석 HPLC에 의해 쉽게 모니터링될 수 있다, PEG화 펩타이드는 예비 HPLC에 의해 쉽게 정제될 수 있으며, 분석 HPLC, 아미노산 분석 및 레이저 탈착 질량 분광법(laser desorption mass spectrometry)에 의해 묘사된다.
표지( Label )
몇몇 실시예에서, 치료학적 리소좀 술파타아제 효소는 표지되어 그것의 탐지가 용이해진다. "표지" 또는 "탐지 가능한 모이어티"는 분광기(spectroscopic), 광화학(photochemical), 생화학, 면역화학, 화학 또는 다른 물리적 수단에 의해 탐지될 수 있는 조성물이다. 예를 들어, 본 발명에 사용하기 적합한 표지는 방사성 표지(예를 들어 32P), 형광단(예를 들어 플루오레스인(fluorescein)), 전자 밀도 제제(electron-dense reagents), 효소(예를 들어 ELISA에서 주로 사용되는 것과 같은), 비오틴, 디곡시게닌(digoxigenin), 또는 헵텐(hapten) 뿐만 아니라 탐지 가능하게 만들 수 있는 단백질, 예를 들어 헵텐이나 펩타이드 내로 방사성 표지를 도입하거나 헵텐이나 펩타이드와 특정하게 반응하는 항체를 탐지하기 위해 사용되는 것을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 사용하기 적합한 표지의 예는 형광 염료(예를 들어 플루오레스인 이소티오시아네이트, 텍사스 레드, 로다민 등), 방사성 표지(예를 들어 3H, 125I, 35S, 14C 또는 32P), 효소(예를 들어 호올스 래디시 펄옥시다제, 알칼라인 포스파타제 및 ELISA에서 일반적으로 사용되는 다른 것) 및 콜로이달(colloidal) 골드, 색상 글래스 또는 플라스틱 비즈(예를 들어 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등)와 같은 색상 표지를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
표지는 당업계에 잘 알려진 방법에 따라 리소좀 술파타아제 효소의 의도된 성분에 직접 또는 간접적으로 결합될 수 있다. 바람직하게, 일실시예에서 표지는 상기 발명에 따라 활성제의 컨쥬게이션(conjugation)을 위한 이소시안네이트 제제를 사용하여 리소좀 술파타아제 효소에 공유적으로 결합된다. 상기 발명의 일측면에서, 발명의 이기능성 이소시아네이트 제제는 그 위에 부착된 활성제 없는 표지 리소좀 술파타아제 효소 컨쥬게이트를 형성하기 위해 리소좀 술파타아제 효소에 표지를 결합하는데 사용될 수 있다. 표지 리소좀 술파타아제 효소 컨쥬게이트는 상기 발명에 따라 표지된 컨쥬게이트의 합성을 위한 중간물로서 사용되거나, 리소좀 술파타아제 효소 컨쥬게이트를 탐지하기 위해 사용될 수 있다. 상기 나타낸 바와 같이, 요구되는 민감도, 리소좀 술파타아제 효소의 의도된 성분과 결합의 용이, 안정도 요구 정도, 이용 가능한 기기 및 처리 대비에 따라 선택한, 넓고 다양한 표지가 사용될 수 있다. 비-방사성 표지는 종종 간접적 수단에 의해 부착된다. 일반적으로, 리간드 분자(예를 들어 비오틴)는 리소좀 술파타아제 효소에 공유적으로 결합된다. 이후 리간드는 다른 분자(예를 들어 스트렙타비딘(streptavidin))에 결합하고, 이는 내재적으로 탐지 가능하거나 탐지 가능한 효소, 형광 화합물 또는 화학 발광 화합물과 같은 신호 시스템에 공유적으로 결합되는 것 중 하나이다.
상기 발명의 리소좀 술파타아제 효소는 또한 신호-생성 화합물에 직접, 예를 들어 효소 또는 형광단과 컨쥬게이션함에 의해 컨쥬게이트될 수 있다. 표지로 사용되기 적합한 효소는 하이드로라제(hydrolases), 구체적으로 포스파타제, 에스터라제 및 글루코시다제, 또는 옥시도타제(oxidotases), 구체적으로 펄옥시다제를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 표지로 사용되지 적합한 형광 화합물, 즉 형광단은 플루오레세인 및 그것의 파생물, 로다민 및 그것의 파생물, 단실(dansyl), 엄벨리페론(umbelliferone) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 적합한 형광단의 추가적인 예는 에오신, TRITC-아민, 퀴닌, 플루오세인 W, 아크리딘 옐로우, 리사민(lissamine) 로다민 B, 설포닐 클로라이드 에리스로세인, 루테늄(트리스, 바이리피리디늄), 텍사스 레드, 니코틴아마이드 아데닌 디뉴클레오티드, 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다, 표지로 사용되지 적합한 화학 발광 화합물은 루시페린 및 2,3-디하이드로프탈라진디온, 예를 들어 루미놀을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 다양한 표지 또는 신호 생산 시스템을 검토하기 위해, 미국 특허 제4,391,904호를 참고한다.
표지를 탐지하는 수단은 당업계의 기술자에게 잘 알려져 있다. 그러므로, 예를 들어 표지가 방사성인 때, 탐지 수단은 신틸레이션 계수기(scintillation counter) 또는 방사성 사진 촬영술(autoradiography)에서 사진 필름을 포함한다. 표지가 형광 표지인 경우, 이는 적절한 빛의 파장으로 형광 색소(fluorochrome)를 여기시키고(exciting) 결과 형광을 탐지함으로써 탐지될 수 있다. 상기 형광은 전자 결합 소자(charge coupled devices)(CCDs)와 같은 전자 탐지기 또는 광전자 증배관(photomultipliers) 등의 사용에 의해 시각적으로 탐지될 수 있다. 유사하게, 효소 표지는 효소에 적절한 기질을 제공하고, 결과 반응 산물을 탐지함으로써 탐지될 수 있다. 비색 또는 화학 발광 표지는 표지와 관련된 색을 관찰함으로써 간단하게 탐지될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되기 적합한 다른 표지 및 탐지 시스템은 당업계의 기술자에게 쉽게 명백할 것이다. 그러한 표지된 조절자 및 리간드는 질환 또는 건강 상태의 진단에 사용될 수 있다.
바람직한 실시예에서, 상기 방법은 엔도좀 운반에 결함이 있는 세포 라인으로부터 활성이고 높은 정도로 인산화된 리소좀 술파타아제 효소를 생산하는 단계를 포함한다. 특히 바람직한 실시예에서, 상기 방법은 CHO 세포 라인 G71 또는 그것의 파생물로부터 활성이고 높은 정도로 인산화된 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS)를 생산하는 단계를 포함한다. GLANS을 예로 들 수 있으나 이에 제한되지 않는 리소좀 술파타아제 효소의 생산은 (a) N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS)를 예로 들 수 있는 재조합 인간 리소좀 술파타아제 효소와 재조합 인간 술파타아제 변형 인자 1(SUMF1)을 함께 발현하는 G71 또는 G71 파생물을 성장시키는 단계; (b) 인간 리소좀 술파타아제 효소와 SUMF1을 함께 발현한 세포 라인을 배양하는 단계; 및 (c) 리소좀 술파타아제 효소의 생산을 위해 바이오반응기(bioreactor)에서 인간 리소좀 술파타아제 효소와 SUMF1을 함께 발현한 세포 라인을 확장시키는 단계를 포함한다. 바람직한 실시예에서, N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS)를 예로 들 수 있는, 인간 리소좀 술파타아제와 인간 SUMF1 cDNAs는 본 명세서 아래 설명된 바와 같이 기본적으로 포유류 발현 벡터 내로 서브클론된다.
세포 라인 성장에서, G71 또는 G71S, 세럼-없는 현탁액 배지에서 성장하기 적합한 G71 클론은 인간 GLANS 포유류 발현 벡터, 인간 SUMF1 포유류 발현 벡터 및 선택 가능한 마커 유전자가 함께 도입(transfect)되었고 안정한 형질 전환주가 선택되었다. 안정한 도입물(transfectant)의 서브클론 첫 라운드 후, 형광 기질을 사용하여 세포 라인이 선택되었고 특정하게 의도되었다. G71 또는 G71S 세포 라인은 각각 마이크로전달체(microcarrier)를 가진 스피너(spinner) 또는 현탁액 배지에서 세포-특정 생산성(생산물의 pg/세포)에 대해 분석되었다. 인간 GLANS의 최고 생산자가 확인되었고, 전임상 물질의 생산을 위해 바이오반응기에서 확장되었다.
다른 실시예에서, 상기 발명은 천연 기질을 분해하는 재조합 인간 리소좀 효소의 활성을 측정하는 세포-기반 분석법을 제공한다. 상기 방법은 (a) 리소좀 효소에 대한 천연 기질이 축적된 조건 하에서, 분리되고 리소좀 효소가 결핍된 인간 세포를 배양하는 단계; (b) 상기 세포와 리소좀 효소를 접촉시키는 단계; (c) 상기 세포를 용해하는 단계; (d) 세포 용해물에 (ⅰ) 천연 기질에 대해 특정되고 (ⅱ) 천연 기질로부터 소 올리고당을 분해(cleave)하는 효소를 부가하는 단계; (e) 소 올리고당을 탐지 가능한 모이어티(moiety)로 표지하는 단계; (f) 선택적으로, 표지된 소 올리고당을 분리하는 단계; (g) 표지된 소 올리고당을 탐지하는 단계; 및 (h) (ⅰ) 리소좀 효소와 접촉한 세포로부터 표지된 소 올리고당의 양과 (ⅱ)리소좀 효소와 접촉하지 않은 세포로부터 표지된 소 올리고당의 양을 비교함으로써 천연 기질을 분해하는 리소좀 효소의 활성을 판정하는 단계를 포함하고, 상기에서 (h)(ⅱ)와 비교할 때 (h)(ⅰ)의 감소는 천연 기질을 분해하는 리소좀 효소의 활성을 나타낸다. 일실시예에서, 소 올리고당은 단-, 이-, 또는 삼-당류이다. 관련된 실시예에서, 소 올리고당은 이당류이다.
몇몇 실시예에서, 리소좀 효소는 아릴술파타아제 B(ARSB), 이두로네이트-2-술파타아제(iduronate-2-sulfatase, IDS), 술파미다아제/헤파린-N-술파타아제(sulfamidase/heparin-N-sulfatase, SGSH), N-아세틸글루코사민-술파타아제(N-acetylglucosamine-sulfatase, G6S) 및 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(N-acetylgalactosamine-6-sulfatase, GALNS)로 이루어진 그룹에서 선택된다. 몇몇 실시예에서, 리소좀 효소는 α-L-이두로니다아제(IDU)이다. 몇몇 실시예에서, 리소좀 효소는 산 α-글루코시다아제(GAA)이다. 몇몇 실시예에서, 리소좀 효소는 β-글루코로니다아제(GUSB)이다. 몇몇 실시예에서, 리소좀 효소는 β-갈락토시다아제(GLB1)이다.
세포-기반 분석법에 사용될 수 있는 적합한 인간 세포는 테스트된 리소좀 효소에 결함이 있고, 리소좀 효소에 대한 천연 기질을 축적할 수 있는 임의의 인간 세포를 포함한다. 예를 들어, 완전히(100%) 또는 부분적인 활성의 결함, 예를 들어 활성의 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상의 감소를 본래 나타내는 세포들이 사용될 수 있다. 감소된 활성을 가지는 돌연변이 효소를 발현하는 세포 또는 점액 다당류증을 예로 들 수 있는 리소좀 저장 질환을 앓는 환자들에서 유래된 세포가 사용될 수 있다. 예를 들어 인코딩 유전자 또는 그것의 프로모터 또는 다른 조절 영역에 돌연 변이를 도입함을 통해 리소좀 효소 활성이 녹아웃되거나 감소되도록 재조합적으로 변경된 세포가 사용될 수 있다. 예를 들어 효소 발현을 감소시키기 위해 안티센스 또는 RNAi로 처리된 리소좀 효소 활성이 감소되도록 처리된 세포가 사용될 수 있다.
탄수화물로부터 소 올리고당을 분해(절단)하고 리소좀 효소의 천연 기질에 "특정"(즉 우세하게 절단)하는 적합한 효소가 당업계의 통상의 기술자에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어, GLANS 또는 GLB1(케라탄 술페이트를 분해하는 효소)의 활성을 탐지하기 위해 단계 (d)의 효소는 케라타나아제 Ⅱ 또는 케라탄 술페이트에 주로 작용하는 임의의 효소가 될 수 있다. 다른 실시예에 따르면, IDU, ARSB, IDS 또는 GUSB(덜마탄 술페이트를 분해하는 효소)를 탐지하기 위해, 단계 (d)의 효소는 콘드로이티나아제 ABC 또는 덜마탄 술페이트에 주로 작용하는 임의의 효소일 수 있다. 다른 실시예에 따르면, IDU, IDS, SGHS, G6S 또는 GUSB(헤파란 술페이트를 분해하는 효소)를 탐지하기 위해, 단계 (d)의 효소는 헤파라나아제 Ⅰ 또는 헤파라나아제 Ⅱ 또는 양자 모두가 될 수 있다. 또 다른 실시예에 따르면, GAA(글리코겔을 분해하는 효소)를 탐지하기 위해, 단계 (d)의 효소는 α-아밀라아제 또는 글리코겐에 주로 작용하는 임의의 효소일 수 있다.
본 세포-기반 방법은 리소좀 효소 활성을 탐지하는데 있어 굉장한 민감도를 가질 수 있다. 몇몇 실시예에서, 리소좀 효소 활성을 리소좀 효소의 농도가 약 10 nM, 또는 약 5 nM, 또는 약 1 nM, 또는 약 0.75 nM, 또는 약 0.5 nM, 또는 약 0.25 nM, 또는 약 0.1 nM, 또는 약 0.05 nM, 또는 약 0.01 nM, 또는 약 0.005 nM, 또는 약 1 pM, 또는 약 0.5 pM 정도로 낮은 경우 탐지될 수 있다.
Ⅲ. 리소좀 술파타아제 효소의 정제
재조합 인간 GLANS를 포함하는 바이오반응기 물질은 0.2㎛ 멸균 여과되었고 4℃에서 유지되었다. 바이오반응기 물질은 포획 컬럼에 직접 로드되거나 포획 컬럼에 로드되기 전에 초여과에 의해 10 내지 20배 농축되었다. 바이오 반응기 물질 또는 농축된 바이오 반응기 물질은 pH 4.5로 조정된 pH였고 이후 블루-세파로오스 컬럼으로 로드되었으며, 20 mM 아세테이트/포스페이트, 50 mM NaCl, pH 4.5와 20nM 아세테이트/포스페이트, 50mM NaCl, pH 6.0으로 연속 세척되었고, 20 mM 아세테이트/포스페이트, 100 mM NaCl, pH 7.0으로 용출되었다. 상기 블루-세파로오스 컬럼 용출물은 이후 프랙토겔 SE Hi-Cap으로 로드되었으며, 20 mM 아세테이트/포스페이트, 50 mM NaCl, pH 5.0과 20nM 아세테이트/포스페이트, 50mM NaCl, pH 5.5로 연속 세척되었고, 20 mM 아세테이트/포스페이트, 50-350 mM NaCl 구배, pH 5.5로 용출되었다. 프랙토겔 SE Hi-Cap 용출물은 10 mM NaOAc, 1mM NaH2PO4, 0.005% 트윈-80, pH 5.5에서 제형화되었다.
선택적으로, 재조합 인간 GLANS를 포함하는 바이오 반응기 물질은 포획 컬럼 상에 로드되기 전에 초-여과에 의해 20-배 농축되었다. 농축된 바이오 반응기 물질은 pH 4.5로 pH 조정되었으며, 여과되고, 이후 프랙토겔 SE-HiCap 컬럼으로 로드되었으며, 10 mM 아세테이트/포스페이트, 50 mM NaCl, pH 4.5와 10nM 아세테이트/포스페이트, 50mM NaCl, pH 5.0으로 연속 세척되었고, 10 mM 아세테이트/포스페이트, 140 mM NaCl, pH 5.0으로 용출되었다. 프랙토겔 SE Hi-Cap 컬럼 용출물은 이후 500 mM NaCl, pH 7.0으로 조정되었으며, 아연-킬레이틸 세파로오스(Zn-IMAC) 컬럼으로 로드되었고, 10 mM 아세테이트/포스페이트, 125 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, pH 7.0으로 세척되었으며, 10 mM 아세테이트/포스페이트, 125 mM NaCl, 90 mM 이미다졸, pH 7.0으로 용출되었다. 상기 아연-킬레이팅 세파로오스(Zn-IMAC) 컬럼 용출물은 낮은 pH 바이러스 불황성을 위해 pH 3.5로 조정되었고, 10 mM 아세테이트/포스페이트, 2M NaCl, pH 5.0으로 조정되었으며, 이후 토요펄 부틸 650M 컬럼으로 로드되었고, 10 mM 아세테이트/포스페이트, 2M NaCl, pH 5.0으로 세척되었으며, 10 mM 아세테이트/포스페이트, 0.7 M NaCl, pH 5.0으로 용출되었다. 토요펄 부틸 650M 용출물은 20 mM 아세테이트, 1 mM 포스페이트, 150 mM NaCl, pH 5.5에서 초-여과 및 이중-여과되었으며, 이후 20 mM 아세테이트, 1 mM 포스페이트, 150 mM NaCl, 0.01% 트윈-20, pH 5.5에서 제형화되었다.
재조합 인간 GLANS 효소의 정제는 상술한 아래에서 설명되고, 상기 프로토콜로부터 변형된 처리에 따른 재조합 인간 GLANS 정제는 상술한 아래에서 설명된다.
재조합 인간 GLANS 효소는 실시예 Ⅲ에서 설명된 바와 같이 G71S 세포에서 발현되었고 실시예 Ⅴ에서 설명된 바와 같이 정제되었다. 상기 발명의 정제된 재조합 인간 GLANS는 다른 기록된 GLANS 제조와 비교될 수 있다. 마수 등, J. Biochem. 110:965-970, 1991은 인간 태반의 GLANS 정제 및 특성을 설명했다. 정제된 효소는 120 kDa 분자량을 가지고, 40 kDa 및 15 kDa의 폴리펩타이드로 구성되며, 후자는 글리코단백질로 나타나는 것으로 밝혀졌다. 그러므로 마수 등 GLANS 효소는 도 5에서 묘사된 처리 형과 상응하는 것으로 나타난다. 비에리키 등, Biochem . J. 279:515-520, 1991은 인간 간(liver) GLANS의 정제 및 특성을 설명했다. SDS-PAGE로 분석되는 경우, 효소는 비-환원 조건 하에서 70 kDa의 분자량을 가지고, 환원 조건 하에서 57 kDa, 39 kDa 및 19 kDa의 분자량을 가졌다. 비에리키 등, Biochem J. 311: 333-339, 1995는 중국 햄스터 난소 세포의 재조합 인간 GLANS 정제 및 특성을 설명했다. SDS-PAGE로 정제된 효소는 비-환원 조건 하에서 58-60 kDa의 분자량을 가지고, 환원 조건 하에서 55-57 kDa, 39 kDa 및 38 kDa의 분자량을 가지는 것으로 밝혀졌다. 그러므로, 비에리키 등 GLANS 효소는 효소의 전-처리된(전구체) 형과 도 5에 묘사된 처리된 형의 혼합물에 상응하는 것으로 나타난다. 반대로, 상기 발명의 재조합 인간 GLANs 효소는 거의 대부분 효소의 전구체 형(도 9 참조) 또는 우세하게(즉, 약 85% 이상) 효소의 전구체 형(도 10 참조)으로 이루어진다.
Ⅳ. 리소좀 술파타아제 효소 및 리소좀 저장 질환
리소좀 술파타아제 효소는 전체-길이의 효소 또는 효소의 치료학적 또는 생물학적 활성(예를 들어, 술파타아제 활성)을 실질적인 양 이상(예를 들어 약 50% 이상, 바람직하게 약 75% 이상, 더 바람직하게 약 90% 이상), 실질적으로 전부 또는 전부를 보유하는 그것의 임의의 절편, 돌연변이, 변종 또는 파생물이다.
몇몇 실시예에서, 리소좀 술파타아제 효소가, 만일 발현 또는 생산되지 않거나, 발현 또는 생산이 실질적으로 감소된다면, 리소좀 저장 질환을 포함하나 이에 제한되지 않는 질환을 일으킬 것이다. 몇몇 실시예에서, 리소좀 술파타아제 효소가 만일 발현 또는 생산되지 않거나, 발현 또는 생산이 실질적으로 감소된다면, 질환을 일으키지 않을 수 있으나, 그것의 발현 또는 생산 부재 또는 감소는 리소좀 저장 질환을 포함하나 이에 제한되지 않는 질환과 관련된다. 바람직하게, 리소좀 술파타아제 효소는 인간으로부터 유래되거나 수득된다.
바람직하게, 리소좀 저장 질환의 치료에 있어, 리소좀 술파타아제 효소는 만일 발현 또는 생산되지 않거나, 발현 또는 생산이 실질적으로 감소되는 경우, 리소좀 저장 질환을 일으킬 것으로 세포에서 발견된 효소이다. 선택적으로, 리소좀 저장 질환의 치료에 있어, 리소좀 술파타아제 효소는 비록 그것의 부재 또는 실질적으로 감소된 발현 또는 생산 그 자체가 질환을 일으킬 수는 없지만, 그것의 부재 또는 실질적으로 감소된 발현 또는 생산이 질환과 관련 있는 효소이다. 바람직하게, 리소좀 술파타아제 효소는 인간으로부터 유래되거나 수득된다.
바람직하게, 효소는 아릴술파타아제 A(ARSA)(Genbank Accession No. NP_000478 (이소폼 a(isoform a)), Genbank Accession No. NP_001078897 (이소폼 b) 및 다른 변종), 아릴술파타아제 B/N-아세틸글루코사민 4-술파타아제(ARSB)(Genbank Accession No. P15848), 이두로네이트-2-술파타아제(IDS)(Genbank Accession No. NP_000193 (이소폼 a), Genbank Accession No. NP_006114 (이소폼 b)), 술파미다아제/헤파린-N-술파타아제(SGSH)(Genbank Accession No. NP_000190), N-아세틸글루코사민-술파타아제(G6S)(Genbank Accession No. NP_002067) 및 갈락토오스 6-술파타아제/N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS)(Genbank Accession No. NP_000503)과 같은 리소좀 술파타아제 효소이다. 리소좀 저장 질환 및 그의 결핍 리소좀 술파타아제 효소에 대한 표는, 치료제로서 유용하고, 다음과 같다:
리소좀 저장 질환 리소좀 술파타아제 결핍
점액다당류증 타입 Ⅱ 헌터 증후군 이두로네이트-2-술파타아제
점액다당류증 타입 ⅢA 산필리포 증후군 술파미다아제/헤파린-N-술파타아제
점액다당류증 타입 ⅢD 산필리포 증후군 N-아세틸글루코사민 6-술파타아제
점액다당류증 타입 ⅣA 모르퀴오 증후군 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제
점액다당류증 타입 Ⅵ N-아세틸갈락토사민 4-술파타아제
이염성 백질 이영양증(MLD) 아릴술파타아제 A
복합 술파타아제 결핍(MSD) 복합 술파타아제
바람직한 실시예에서, 리소좀 술파타아제 효소는 엔도좀 산성화 결핍 세포라인에 의해 생산된 재조합 인간 리소좀 술파타아제 효소이다. 더 바람직한 실시예에서, 재조합 인간 리소좀 술파타아제 효소는 "정의"에서 구체화된 바와 같이 활성이고 높은 정도로 인산화된 올리고당을 가진다. 가장 바람직한 실시예에서, 리소좀 술파타아제 효소는 활성이고 높은 정도로 인산화된 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS)이다.
그러므로, 본 발명의 방법을 사용하여 치료되거나 예방될 수 있는 리소좀 저장 질환은 이염성 백질 이영양증(Metachromic Leukodystrophy) 또는 MLD, 마로토-라미(Maroteaux-Lamy) 증후군 또는 MPS Ⅳ, 헌터 증후군 또는 MPS Ⅱ, 산필리포 A 증후군 또는 MPS Ⅲa, 산필리포 D 증후군 또는 MPS Ⅲd 및 모르퀴오 A 증후군 또는 MPS Ⅳa를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특히 바람직한 실시예에서, 리소좀 술파타아제 효소는 그것의 결핍이 모르퀴오 A 증후군 또는 MPS Ⅳa를 야기하는 것이다. 다른 특히 바람직한 실시예에서, 리소좀 술파타아제 효소는 그것의 결핍이 복합 술파타아제 결핍 또는 MSD와 같은 인간 리소좀 저장 질환과 관련된 것이다.
그러므로, 상기 표에서, 각 질환에 대한 리소좀 술파타아제 효소는 바람직하게 질환에서 결핍인 특정 활성 리소좀 술파타아제 효소를 포함한다. 예를 들어, MPS Ⅱ와 관련된 방법에서, 바람직한 효소는 이두로네이트-2-술파타아제이다. MPS ⅢA와 관련된 방법에서, 바람직한 효소는 술파미다아제/헤파린-N-술파타아제이다. MPS ⅢD와 관련된 방법에서, 바람직한 효소는 N-아세틸글루코사민 6-술파타아제이다. MPS ⅣA와 관련된 방법에서, 바람직한 효소는 갈락토오스 6-술파타아제/N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제이다. MPS Ⅵ와 관련된 방법에서, 바람직한 효소는 N-아세틸갈락토사민 4-술파타아제이다. 이염성 백질 이영양증(MLD)와 관련된 방법에서, 바람직한 효소는 아릴술파타아제 A이다. 복합 술파타아제 결핍(MSD)와 관련된 방법에서, 효소는 아릴술파타아제 A, 아릴술파타아제B/N-아세틸글루코사민 4-술파타아제, 이두로네이트-2-술파타아제, 술파미다아제/헤파린-N-술파타아제, N-아세틸글루코사민-술파타아제 또는 갈락토오스 6-술파타아제/N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제이고, 바람직한 효소는 갈락토오스 6-술파타아제/N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제이다.
Ⅴ. 점액 다당류증 타입 ⅣA( 모르퀴오 증후군, MPS ⅣA)
점액 다당류증 타입 ⅣA(모르퀴오 증후군, MPS ⅣA)은 점액 다당류 저장 질환 그룹에 속하고, 유전되는 상염색체 열성 질환이다. 모르퀴오 증후군은 두 개의 글리코사미노글리칸(GAGs), 케라탄 술페이트(KS) 및 콘드로이틴-6-술페이트(C6S)의 분해에 필요한 리소좀 효소의 결핍에 의해 야기된다. 구체적으로, MPS Ⅳa는 효소 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS)의 부재 및 뇨에서 KS의 배설로 특징된다. GLANS의 부족은 히알린 연골, 주요 골격 조직 성분에 비정상적으로 많은 양의 점액 다당류의 축적을 낳는다. 모든 환자들은 전신 골격 형성 장애를 가진다. 다른 증상은 환자마다 심각도가 다양하고, 다른 것들 중 청력 상실, 백내장, 척추 불안정성, 심장 판막 질환 및 호흡 문제를 포함할 수 있다.
GLANS는 KS로부터의 갈락토오스-6-술페이트를, C6S로부터 N-아세틸갈락토사민-6-술페이트의 술페이트 에스터 결합을 가수 분해한다. 인간 GLANS는 단지 2 잠재적 아스파라긴-연결된 글리코실화 사이트를 가진 55-60 kDa 전구체 단백질로서 발현된다. 만노즈-6-포스페이트(M6P)는 GLANS 분자 위에 존재하는 올리고당의 부분이다. M6P는 리소좀 세포 표면에서 수용체에 의해 인지되고, 결과적으로 GLANS의 효과적인 재흡수에 중요하다.
모든 술파타아제와 같이, GLANS는 활성을 얻기 위해 술파타아제 변형 인자 1(SUMF1)에 의해 인코딩된 포밀글리신-활성 효소(FGE)에 의해 처리될 필요가 있다. 본 활성 단계 때문에, Cα-포밀글리신(FGly)으로 활성 사이트 시스테인 잔기의 후-번역 변형과 관련하여, 재조합 술파타아제의 과-발현은 낮은 특정 활성(즉, 활성화되고 비활성화된 술파타아제의 혼합) 및 낮은 생산 역가(titer)(즉, 분해 및/또는 비-활성화된 효소의 비-분비)를 가진 술파타아제 효소 두 가지의 생산을 야기할 수 있다.
본 발명의 목적은 모르퀴오 증후군 및 복합 술파타아제 결핍(MSD)을 예로 들 수 있는 효소 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제 결핍에 의하거나 그와 관련된 다른 질환의 치료에 유용한 활성이고 높은 정도로 인산화된 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제 효소를 제공하고자 하는 것이다. 그러한 활성이고 높은 정도로 인산화된 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제 효소는 KS 및 C6S가 축적하는 조직에 국지화될 수 있는 능력을 가지고, 효과적인 재흡수를 위해 적절한 M6P 농도를 가지며, 효소 활성에 있어 충분히 높은 퍼센트의 FGly를 가지고, 상대적으로 높은 생산 수준을 가진다.
본 명세서에 설명된 발명의 방법은 아릴술파타아제 A(ARSA), 아릴술파타아제 B/N-아세틸글루코사민 4-술파타아제(ARSB), 이두로네이트-2-술파타아제(IDS), 술파미다아제/헤파린-N-술파타아제(SGSH) 및 N-아세틸글루코사민-술파타아제(G6S)를 예로 들 수 있는 다른 리소좀 술파타아제 효소의 결핍에 의해 야기되거나 특징지워지는 리조좀 저장 질환의 치료에 유용한 리소좀 술파타아제 효소의 생산에 적용될 수 있다.
Ⅵ. 약학적 조성물 및 투여
상기 발명의 리소좀 술파타아제 효소는 다양한 경로에 의해 투여될 수 있다. 경구 조제용으로, 리소좀 술파타아제 효소는 단독으로 또는 정제, 분말, 과립, 또는 캡슐을 만들기에 적절한 첨가제, 예를 들어 락토오스, 만니톨, 옥수수 전분 또는 감자 전분과 같은 종래의 첨가제; 크리스탈린 셀룰로오스, 셀룰로오스 유도체, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴과 같은 결합제; 옥수수 전분, 감자 전분 또는 소듐 카르복시메틸셀룰로오스와 같은 분해제; 탈크 또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제; 및 바람직한 경우 희석제, 완충제, 보습제, 보존제 및 착향료와 조합하여 사용될 수 있다.
상기 발명의 리소좀 술파타아제 효소는 수성 또는 식물성 또는 다른 유사 오일, 합성 지방족 산 글리세라이드, 더 고급 지방족 산의 에스터 또는 프로필렌 글리콜과 같은 비수성 용매에, 바람직한 경우, 용해제, 등장성 제제, 현탁제, 에멀전화 제제, 안정화제 및 보존제와 같은 종래의 첨가제와 함께, 용해, 현탁 또는 에멀전화됨으로써 주입용 조제물로 제형화될 수 있다.
상기 발명의 리소좀 술파타아제 효소는 흡입 경로로 투여되는 에어로졸 제형으로 사용될 수 있다. 상기 발명의 리소좀 술파타아제 효소는 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 등과 같은 압축된 허용 가능한 압축 가스 내로 제형화될 수 있다.
더욱이, 상기 발명의 리소좀 술파타아제 효소는 에멀전화 베이스 또는 수용성 베이스와 같은 다양한 베이스와 함께 혼합되어 좌약으로 만들어질 수 있다. 상기 발명의 리소좀 술파타아제 효소는 좌약을 통해 직장으로 투여될 수 있다. 좌약은 코코아 버터, 카르보왁스 및 폴리에틸렌 글리콜과 같이 체온에서는 녹으나 실온에서는 고형화되는 운반체(vehicle)를 포함할 수 있다.
시럽, 엘릭시어(elixir) 및 현탁액과 같은 경구 또는 직장 투여용 상기 발명의 리소좀 술파타아제 효소의 단위 투약형은 티스푼, 테이블 스푼 또는 정제 또는 좌약을 예로 들 수 있는 각 투여 단위가 활성제를 포함하는 리소좀 술파타아제 효소의 미리 결정된 양을 포함하는 것으로 제공될 수 있다. 유사하게, 주입 또는 정맥 투여용 단위 투약형은 증류수, 일반 식염수 또는 다른 약학적으로 허용 가능한 담체의 용액으로 리소좀 술파타아제 효소를 포함할 수 있다.
실제 사용에서, 상기 발명의 리소좀 술파타아제 효소는 종래 약학적 화합 기술에 따라 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 첨가제와 긴밀한 혼합물에서 활성 구성 요소로서 혼합될 수 있다. 담체, 희석제 또는 첨가제는 경구 또는 비 경구(정맥 포함)를 예로 들 수 있는 투여를 위한 조제물의 의도된 바람직한 형에 따라 넓고 다양한 형을 취할 수 있다. 경구 투약형을 위한 리소좀 술파타아제 효소 조성물을 제조함에 있어, 현탁액, 엘릭시어 및 용액을 예로 들 수 있는 경구 액체 조제물의 경우 물, 글리콜, 오일, 알코올, 착향제, 보존제, 색소 등; 또는 분말, 경 연질 캡슐 및 정제를 예로 들 수 있는, 액체 조제물에 비해 경구 고형 조제물과 함께인 것이 바람직한 경우 전분, 당, 마이크로크리스탈린 셀룰로오스, 희석제, 과립제, 윤활제, 결합제, 분해제(disintegrating agent) 등과 같은 담체를 예로 들 수 있는 임의의 통상적인 약학적 매개물이 도입될 수 있다.
투여의 경피 경로의 관점에서, 약물의 경피 투여 방법은 레밍턴 약학 과학, 17판,(겐나로 등, Eds. Mack Publishing Co., 1985)에 개시된다. 진피(dermal) 또는 피부 패치가 상기 발명의 리소좀 술파타아제 효소의 경피 전달을 위해 바람직한 수단이다. 패치는 바람직하게 리소좀 술파타아제 효소의 흡수를 증가시키는 DMSO와 같은 흡수 강화제를 제공한다. 경피 약물 전달을 위한 다른 방법은 미국 특허 제5,962,012호, 제6,261,595호 및 제6,261,595호에 개시되며, 각각은 그 전체에서 참조로서 도입된다.
운반체, 보조제, 담체 또는 희석제와 같은 약학적으로 허용 가능한 첨가제는 상업적으로 이용 가능하다. 더욱이, pH 조정 및 완충제, 등장 조정제, 안정화제, 습윤제 등과 같은 약학적으로 허용 가능한 보조 성분 역시 상업적으로 이용 가능하다.
각 측면에서, 리소좀 술파타아제 효소 조성물은, 비록 주어진 경우에서 가장 적합한 경로가 치료될 상태의 본질 및 심각도와 활성 구성 성분의 본질에 부분적으로 의존할 것이지만, 경구, 직장, 국소, 비경구(피하, 근육 내 및 정맥을 포함), 폐(코 또는 구강 흡입) 또는 코 투여에 적합한 조성물을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예시적인 투여의 경로는 경구 및 정맥 경로이다. 리소좀 술파타아제 효소 조성물은 단위 투약형으로 알맞게 나타날 수 있고 약학 분야에서 잘 알려진 방법 중 하나에 의해 조제될 수 있다.
투약이 용이하기 때문에, 정제 및 캡슐은 고형 약학적 담체가 명백히 도입되는 경우에서 가장 유리한 경구 투약 단위 형을 나타낸다. 바람직한 경우, 정제는 표준 수성 또는 비-수성 기술에 의해 코팅될 수 있다. 이러한 조성물에서 활성 리소좀 술파타아제 효소의 퍼센트는, 물론, 다양하고, 알맞게 단위 중량의 약 2 퍼센트 내지 약 60 퍼센트 사이일 수 있다.
상기 발명의 리소좀 술파타아제 효소 조성물은 바이러스 인벨로프(envelope) 또는 운반체에 캡슐화 되거나 부착되어 투여될 수 있고, 세포 내로 도입될 수 있다. 운반체는 통상 구형이고 종종 지질인 미셀룰라(micellular) 입자이다. 리포좀은 이중층 막으로부터 형성된 운반체이다. 적합한 운반체는 단일라멜라(unilamellar) 운반체 및 멀티라멜라(multilamellar) 지질 운반체 또는 리포솜을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 그러한 운반체 및 리포솜은 예를 들어 미국 특허 제4,394,448호에 개시된 것과 같은 표준 기술을 사용하여 포스파티딜콜린, 포스파티드산, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 스핑고미엘린, 글라이코리피드, 갱글리오사이드(gangliosides) 등과 같은 넓은 범위의 지질 또는 포스포리피드 화합물로부터 만들어질 수 있다. 그러한 운반체 또는 리포솜은 세포 내로 리소좀 술파타아제 효소를 투여하고, 타깃 기관에 리소좀 술파타아제 효소를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 관심의 리소좀 술파타아제 효소의 조절된 방출은 캡슐화를 사용하여 달성될 수도 있다(예를 들어 미국 특허 제5,186,941호를 보라).
리소좀 술파타아제 효소 조성물을 혈류 내로, 또는 바람직하게, 적어도 뇌혈관 장벽 밖에 희석하는 어떤 경로의 투여가 사용될 수 있다. 바람직하게, 리소좀 술파타아제 효소 조성물은 국소로, 가장 바람직하게 정맥 또는 심장 카테터(catheter)에 의해 투여된다. 경정맥(intrajugular) 및 경동맥(intracarotid) 주입 또한 유용하다. 리소좀 술파타아제 효소 조성물은 복막으로, 피하로 또는 근육 내로와 같은 국부적으로(locally) 또는 영역적으로(regionally) 투여될 수 있다. 일측면에서, 리소좀 술파타아제 효소 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 첨가제와 함께 투여된다.
당업자들은 용량 수준이 특정 리소좀 술파타아제 효소의 기능, 증상의 심각도 및 대상의 부작용에 대한 민감도에 따라 다양할 수 있다는 것을 쉽게 인식할 것이다. 주어진 리시좀 술파타아제 효소에 대한 바람직한 용량은 용량 반응 및 환자, 동물 및 체외에서 수행된 약력학적 평가를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 수단을 통해 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
투여될 용량은 또한 개인적인 필요, 바람직한 효과 상, 사용되는 구체적인 리소좀 술파타아제 효소 및 선택된 투여 경로에 의존할 수 있다. 리소좀 술파타아제 효소의 용량 범위는 약 0.2 pmol/kg 내지 약 20 nmol/kg, 바람직한 용량 범위는 2 pmol/kg 내지 2 nmol/kg, 그리고 특히 바람직한 용량 범위는 2 pmol/kg 내지 200 pmol/kg이다. 선택적으로, 리소좀 술파타아제 효소의 용량은 0.01 내지 1000 mg/kg의 범위일 수 있고, 바람직한 용량은 0.1 내지 100mg/kg일 수 있으며, 특히 바람직한 용량 범위는 0.1 내지 10 mg/kg일 수 있다. 이러한 용량은 구체적인 리소좀 술파타아제 효소, 약학 조성물의 형, 투여 경로 및 구체적인 리소좀 술파타아제 효소의 작용 사이트를 예로 들 수 있으나 이에 제한되지 않는 것에 영향을 받을 것이다.
상기 발명의 리소좀 술파타아제 효소는 동물 및 특히 인간에게 있어 치료적, 예방적 및 진단적 개입을 위해 유용하다. 리소좀 술파타아제 효소는 특정 조직에 있어 우선적인 축적을 보여줄 수 있다. 진단적 사용을 위한 바람직한 의학적 지시는 예를 들어 관심의 타깃 기관(예를 들어 폐, 간, 신장, 비장)과 관련된 어떤 상태를 포함한다.
대상 방법은 다양한 다른 질병 상태 치료에의 사용을 발견한다. 어떤 실시예에서, 구체적인 관심의 것은 바람직한 활성을 가지는 리소좀 술파타아제 효소가 이전에 확인되었지만 리소좀 술파타아제 효소가 충분히 만족스런 치료 결과를 낳기에는 타깃 사이트, 지역 또는 구획에 적절하게 전달되지 않은 질병 상태에 대한 대상 방법의 사용이다. 그러한 리소좀 술파타아제 효소와 함께, 활성이고 높은 정도로 인산화된 리소좀 술파타아제 효소를 생산하는 대상 방법은 치료적 효과 및 리소좀 술파타아제 효소의 치료 지수를 강화하는데 사용될 수 있다.
치료는 질병을 얻을 가능성의 감소, 질병의 예방, 늦춤, 중지 또는 반전, 질병의 진행 또는 호스트를 괴롭히는 질병 상태와 관련된 증상의 개선을 포함하는 리소좀 술파타아제 효소의 투여와 관련된 대상에 대한 유익한 결과를 망라하는 것을 의미하고, 개선 또는 이익은 적어도 그와 관련된 염증 및 통증과 같은 치료될 병리학적 상태와 관련된 증상을 예로 들 수 있는 파라미터의 규모의 감소를 의미하는 넓은 의미로 사용된다. 이와 같이, 치료는 또한 병리학적 상태 또는 적어도 그와 관련된 증상이 발생이 방지되거나 중단되는 것을 예로 들 수 있는 완전하게 저해된, 호스트가 더 이상 병리학적 상태를 앓지 않거나 적어도 병리학적 상태로 특징되는 증상을 앓지 않는 것과 같은 종료된 것을 예로 들 수 있는 상황을 포함한다.
다양한 호스트 또는 대상은 대상 방법에 따라 치료될 수 있다. 일반적으로 그러한 호스트는 "포유 동물" 또는 "포유류"이고, 이러한 용어는 육식 동물목(예를 들어 개와 고양이), 설치류(예를 들어, 생쥐, 기니아 피그 및 쥐) 및 영장류(예를 들어 인간, 침팬지 및 원숭이)를 포함하는 포유류 강 내에 있는 유기체를 설명하는 것으로 널리 사용된다. 많은 실시예에서, 호스트는 인간일 수 있다.
지금까지 일반적으로 설명된 상기 발명은, 마찬가지로 하기 참조 문헌 내지 아래 실시예를 통해 더욱 쉽게 이해될 수 있고, 이는 생산을 위한 예시적인 프로토콜 및 활성이고 높은 정도로 인산화된 리소좀 술파타아제 효소의 정제 및 리소좀 저장 질환의 치료에 있어 그들의 사용을 제공한다. 실시예들은 단지 예시의 목적으로 제공되고 본 발명의 범위를 어떤 방법으로든 제한하기 위한 의도가 아니다. 사용된 숫자와 관련하여(예를 들어 양, 온도 등) 정확도를 보장하기 위한 노력이 이루어질 수 있지만 몇몇 실험적 에러 및 편차도 물론 참작되어야 한다.
실시예
실시예 Ⅰ
인간 술파타아제 변형 인자 1( SUMF1 ) 및 인간 N- 아세틸갈락토사민 -6-술파타아제( GLANS )를 위한 포유류 발현 벡터
목적은 향상된 인산화 정도를 가지는 활성 리소좀 술파타아제 효소의 적절한 양이 안정적으로 도입된 세포를 생산하기에 적절한 포유류 발현 벡터를 구성하기 위한 것이었다.
전체-길이의 인간 술파타아제 변형 인자 1(SUMF1) cDNA(미국 특허 출원 제2005/0123949호, 2005년 6월 9일 공개 및 제2004/0229250호, 2004년 11월 8일 공개, 양자 모드 본 명세서에 그들 전체가 참조로서 도입된다)는 374 아미노산 폴리펩타이드를 인코딩하고, 포유류 발현 벡터 cDNA4(인비트로겐, 칼스배드, 캘리포니아) 내로 클론되었으며, 인간 CMV 인핸서-프로모터 및 다수의 클로닝 사이트를 포함한다. 유효한 전사 종말은 보빈(bovine) 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열의 존재에 의해 보증되었다. 선택 마커는 EM-7 프로모터 및 SV40 초기 폴리아데닐화 서열의 제어 아래 제오신(zeocin) 내성 유전자였다. 결과 플라스미드는 의도된 pcDNA4 SUMF1이었다. 인간 SUMF1 폴리뉴클레오티드(서열 목록 번호:1) 및 폴리펩타이드(서열 목록 번호:2) 서열은 각각 도 1 및 도 2에 보여진다.
26 아미노산 신호 펩타이드를 포함하는 522 아미노산 폴리펩타이드를 인코딩하는 전체-길이 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS) cDNA(토마츄 등, Biochem. Biophys . Res . Commun . 181(2):677-683, 1991을 보라)는 포유류 발현 벡터 pCIN(바이오 마린) 내로 클론되고, 이는 토끼 β-글로빈 IVS2 인크론 및 복합 클로닝 사이트에 연결된 인간 CMV 인핸서-프로모터를 포함한다. 효율적인 전사 종결은 보빈 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열의 존재에 의해 보증되었다. 선택 마커는 효소 효율성을 감소시키는 점 돌연변이를 전달하는 네오마이신 포스포트랜스페라제(neonmycin phosphotransferase) 유전자였다. 약화된 마커는 약한 HSV-tk 프로모터로 더 불리하게 되었다. 결과 플라스미드는 pCIN4A로 디자인되었다. 인간 GLANS 폴리뉴클레오티드(서열 목록 번호:3) 및 폴리펩타이드(서열 목록 번호:4) 서열은 각각 도 3과 도 4에 보여진다.
SUMF1 및 GLANS의 발현 정도를 증가시키기 위해, 스캐폴드/매트릭스(scaffold/matrix) 부착 영역(MAR) 요소(멀모드 등, U.S. Patent No. 7,129,062를 보라)는 SUMF1 및 GLANS 발현 플라스미드 내로 클론되었다.
BMAR SUMF1은 BamHI와 HincⅡ로 P<168 X_X NcoⅠ채워진 MAR(셀렉시스, Selexis)을 절단(digest)하고, 이후 BalⅡ와 NruⅠ으로 절단된 pcDNA4 SUMF1 내로 방출된 MAR 절편을 삽입함으로써 제조되었다.
PMAR SUMF1은 HindⅢ과 XbaⅠ을 P<1_68 NcoⅠ 채워진 (MAR) SV40 EGFP(셀렉시스)를 절단하여 EGFP 유전자를 제거하고, 이후 SUMF1 유전자를 제거하여 제조되었으며, 이는 HindⅢ과 XbaⅠ으로 절단함에 의해 pcDNA4 SUMF1으로부터 방출된 것이었다.
BMAR 4A는 PmeⅠ과 SpeⅠ으로 BMAR SUMF1을 절단하여 SUMF1 유전자를 제거하고, 이후 GLANS 유전자를 삽입하여 제조되었으며, 이는 PmeⅠ과 SpeⅠ으로 절단함에 의해 pCIN 4A로부터 방출된 것이었다.
PMAR 4A는 HindⅢ와 XbaⅠ으로 P<1_68 NcoⅠ 채워진 (MAR) SV40 EGFP(셀렉시스)를 절단하여 EGFP 유전자를 제거하고, 이후 GLANS 유전자를 삽입하여 제조되었으며, 이는 HindⅢ와 XbaⅠ로 절단함에 의해 pCIN 4A로부터 방출된 것이었다.
전체-길이 인간 GLANS cDNA는 또한 포유류 발현 벡터 pcDNA4(인비트로겐, 칼스배드, 캘리포니아) 내로 클론되었다. pcCDNA4 SUMF1은 HindⅢ와 XbaⅠ로 절단되어 SUMF1 cDNA를 제거하였고, pCIN 4A는 HindⅢ와 XbaⅠ로 절단되어 GLANS cDNA를 분리하였다. GLANS cDNA HindⅢ/XbaⅠ절편은 pcDNA4 벡터 HindⅢ/XbaⅠ절편 내로 리개이션 되었다. 결과 플라스미드는 의도된 pcDNA4-4A이었다.
pCIN 4A, BMAR 및 pCDNA4-4A 발현 벡터 내 GLANS 유전자의 완전성은 뉴 잉글랜드 바이오랩으로부터 얻은 효소를 사용한 제한 맵핑에 의해 확인되었다. PMAR 4A발현 벡터는 맵핑되지 않았다.
인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS)의 완전히 처리된 형 구조는 도 5에 나타난다. GLANS는 26 아미노산 신호 펩타이드 서열을 가진 522 아미노산 폴리펩타이드로서 발현된다. 496 아미노산 GLANS 폴리펩타이드는 약 55-60 kDa의 분자량을 가지는 효소의 처리-전(전구체) 형으로서 분비된다. 활성 GLANS에서, 전구체 또는 완전히 처리된 GLANS 폴리펩타이드(전체-길이 GLANS 폴리펩타이드의 위치 79와 대응)의 위치 53의 시스테인 잔기는 술파타아제 변형 인자 1(SUMF1)에 의해 Cα-포밀글리신(FGly)로 전환된다. 리소좀에서, GLANS는 완전히 처리된 GLANS 펩타이드의 위치 325 후에 분해되고, 약 40 kDa 및 19 kDa의 GLANS 펩타이드 절편을 낳는다. 이러한 GLANS 펩타이드는 완전히 처리된 GLANS 폴리펩타이드의 위치 282 및 393에서 시스테인 (C) 잔기 사이에 디설파이드 연결(bridge)에 의해 합쳐진다. 2개의 표준 N-연결된 글리코실화 사이트, 완전히 처리된 GLANS 폴리펩타이드의 위치 178 및 397이 있다. 2 만노즈-6-포스페이트 잔기를 포함하는 비스-인산화된 만노즈 7(BPM7)는 N397이 아닌 N178에서 발견된다.
실시예 Ⅱ
인간 술파타아제 변형 인자 1( SUMF1 ) 및 인간 N- 아세틸갈락토사민 -6-술파타아제( GLANS )를 공-발현하는 G71S 세포 라인
목적은 향상된 인산화 정도를 가지는 활성 리소좀 술파타아제 효소를 생산할 수 있는 세포 라인을 개발하는 것이었다.
G71 세포(록포드 케이, 드라퍼)는 CHO-K1(ATCC CCL-61)로부터 직접 유래되었다. G71 세포 라인은 엔도좀의 산성화 관련하여 온도-민감한 CHO-K1 돌연변이이고, 이는 여러 효소에 있어 높은 온도에서 만노즈 잔기 상 총 단백질 분비 및 인산화에서 차이점을 낳는 것이 관찰되었다(박 등, Somat . Cell Mol . Genet . 17(2): 137-150, 1991; 마르넬 등, J. Cell . Biol . 99(6): 1907-1916, 1984).
G71 세포는 2.5% 소 태아 혈청, 2mM 글루타민, 겐타마이신 및 암포테리신으로 보충된 바이오휘태커 울트라 CHO 배지에서 34℃로 유지되었다.
단백질 생산을 위한 세포 라인의 보다 용이한 사용을 위해, 착생(adherent) G71 세포는 고밀도 세럼-없는 현탁액 배양에 앵커리지-의존, 세럼-의존 포유류 세포를 적응하기 위한 프로토콜을 사용하여 세럼-없는 성장 배지에 전-적응되었고(시나코르 등, Mol . Biotechnol. 15(3):249-257, 2000), 세럼-없는 현탁액 배양 적응된 세포 라인 G71S를 낳았다. 선택적으로, 착생 G71 세포는, 아래 개시된 바와 같이 안정하게 도입된 후에, 시나코르 등에 개략된 것처럼 세럼-없는 성장 배지에 적응될 수 있다.
인간 SUMF1과 인간 GLANS 발현 벡터의 쌍 조합(실시예 1)은, pcDNA4 SUMF1 플러스 pCIN4 4A, BMAR SUMF1 플러스 BMAR 4A 또는 PMAR SUMF1 플러스 PMAR 4A 중 하나는 안티바이오틱-안티미코틱(antimycotic) 용액(100 IU 페니실린, 10 mg 스트렙토마이신, 25㎍ 암포테리신 B, 셀그로)으로 보충된 배양 배지에서 자란 G71S 세포 내로 셀렉시스에 설명된 것처럼 MARtech Ⅱ 프로토콜을 따라 도입되었다. 도입 풀은 5% γ-방사능 처리된 소 태아 혈청(FBS, JRH), 200㎍/mL G418(AG 사이언티픽) 및 200㎍/mL 제오신(인비트로겐)으로 보충된 UltraCHO 배지(캠브렉스)에서 성장되었고, 동일한 성장 배지 내 96-웰 플레이트에서 제한 희석에 의해 클론되었다. 클론 성장은 셀 스크린(이노바티스) 이미징에 의해 모니터링 되었다. 모든 클론은 활성 GLANS(실시예 Ⅳ를 보라)용 효소 포획 활성 ELISA를 사용하여 스크리닝되었다. 세포 생산성은 4일 넘게 동안 GLANS 활성에 대한 효소 포획 활성 ELISA를 하루 당 세포 성장으로 나눔으로써(Vi-Cell, 베크만 코울터) 계산되었다.
202 G71S 클론은 활성 GLANS를 위해 생성되었고 스크리닝되었다: 86 클론은 pcDNA4 SUMF1 플러스 pCIN 4A와 공-도입되었고, 65 클론은 BMAR SUMF1 플러스 BMAR 4A와 공-도입되었으며, 51 클론은 PMAR SUMF1 플러스 PMAR 4A와 공-도입되었다. 클론은 96-웰 조직 배양 플레이트로부터 활성 GLANS의 높은 농도를 기준으로 초기에 선택되었다(도 6A). GLANS 활성은 효소 포획 활성 ELISA를 사용하여 측정되었고 ng/mL로 나타내어졌다(y-축). x-축은 SUMF1과 GLANS 발현에 사용된 3가지 공-도입 조건을 보여준다: MAR 없는 hCMV 프로모터, MAR 가진 hCMV 프로모터 및 MAR 가진 SV40 프로모터. 각 바는 각각의 집단으로부터의 단일 클론을 나타낸다. 세포 밀도는 본 96-웰 클론 스크린에서 확인되지 않았고 모든 공-도입된 G71S가 본 도면에 나타나는 것은 아니다.
가장 높은 활성 GLANS를 생산하는 G71S 클론이 생산성 분석을 위해 선택되었다(도 6B). 일일 세포 생산성은 pg/세포/일로 측정되었고, 그 날의 세포 밀도로 GLANS 활성을 나눔으로써 얻어졌다. 본 도면은 5×105 세포/플라스크로 씨드(seed)한 후 4 번째 날(96시간)을 보여준다. 클론은 효소 포획 활성 ELISA를 사용하여 pg/세포/일(y-축)로 GLANS에 대해 분석되었다. 양성 대조군은 BHK 및 CHO 클론(바이오마린)을 발현하는 GLANS로 구성되었다. 각 세로의 바는 단일 클론을 나타낸다. 활성 GLANS는 pCIN 4A 클론에서 의해 생산되었지만, 단지 분석의 배경을 미미하게 상회할 뿐이다.
96-웰 스크린에 의한 클론 분석 및 4-일 생산성 분석은 MAR 요소를 가진 발현 벡터의 공-도입이 MAR 요소가 없는 발현 벡터의 공-도입과 비교했을 때 G71S 클론의 생산성을 증가시켰다는 것을 보여주었다. BMAR 4A + BMAR SUMF1 공-도입된 클론은 빠른 풀 생성, 급속한 클론 성장과 가장 높게 생산하는 PMAR 4A 클론보다 더 활성인 GLANS 보다 2-배 넘게 생산하는 능력 및 MAR 요소가 부족한 CHO 4A 및 BHK 4A 클론보다 10-배까지의 증가를 보여주었다.
GLANS 발현 G71S 클론은 시나코어 등, Mol . Biotechnol. 15(3):249-257, 2000에 개략된 프로토콜을 사용하여 세럼-없는 배지에 적응되었다. 전체 적응은 양 선택 제제(200 ㎍/mL 제오신 및 200 ㎍/mL 네오마이신)의 존재 하에 이루어졌다. T-플라스크에서 배양된 GLANS 발현 G71S 클론은 다음과 같이 유출되었다: (1) 캠브렉스 UltraCHO 배지 및 5% FBS(롯 # 8L2242)와 함께 125 mL 쉐이커 내; (2) JRH 302M 배지(생산 배지) 및 5% FBS와 함께 125 mL 쉐이커 내; 및 (3) 백-업으로 T-플라스크 내(UltraCHO, 5% FBS). 일단 현탁액 배양이 성립되면, 착생 세포는 버려졌고, FBS로부터 없애는 것이 시작되었다. 성장 속도가 3 패새지(passages) 당 >0.5(1/일)로 돌아오고 생육력이 >95%가 되었을 때, FBS 농도는 50%로 감소되었다. 세포는 최소 3 패새지를 위해 어떤 주어진 FBS 농도에 남겨졌다. 일단 2.5% FBS의 성장에 적응되면, 세포는 직접 세럼-없는 배지 내로 취해졌다. 세포는 10% (v/v) DMSO를 가진 신선한 배지에 쌓여졌다. 해빙 실험이 세포가 냉동 처리에서 살아남는지를 보증하기 위해 테스트되었다. BMAR 4A + BMAR SUMF1 도입으로부터의 두 개의 GLANS 발현 G71S 클론, 클론 4와 5가 세럼-없는 현탁액 배양에 적응하기 위해 약 15 패새지를 취했다. pcDNA4 SUMF1 플러스 pCIN 4A 도입으로부터 GLANS 발현 클론, C6은 또한 분리되었으며 세럼-없는 배양에 적응되었다.
인간 SUMF1 및 인간 GLANS 발현 벡터의 쌍 조합(실시예 Ⅰ), pcDNA4 SUMF1 플러스 pCDNA4-4A는 기본적으로 상기 설명된 바와 같이 G71S 세포 내로 도입되었고, 200 ㎍/mL 제오신(인비트로겐)을 제외하고 선택에 사용되었다. 6개의 GLANS 발현 클론, C2, C5, C7, C10, C11 및 C30은 기본적으로 상기 설명된 바와 같이 분리되었고 세럼-없는 현탁액 배양에 적응되었다.
실시예 Ⅲ
인간 N- 아세틸갈락토사민 -6- 술파타아제(GLANS)을 발현하는 G71S 세포 라인의 대-규모 배양
목적은 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS)를 발현하는 G71S 클론으로부터 효소 생산을 측정하는 것이었다. 세럼-없는 현탁액 배양 적응된 인간 SUMF1 및 인간 GLANS를 공-발현하는 G71S 세포 라인이 대-규모로 배양되었고 활성 GLANS 효소 생산을 평가하였다.
세럼-없는 현탁액 배양으로 적응은 G71S 호스트 세포 라인에 대해 상대적으로 빨랐기 때문에, 살포(perfusion) 모드로 작동된 WAVE 바이오 반응기에서 생산이 행해질 수 있었다고 결정되었다. 규모 상향은 백에서 직접적으로 행해질 수 있고 오염 위험의 감소 및 물질 생산의 더 신속한 처리 때문에 WAVE 바이오 반응기는 접중물 부피에서 더 큰 융통성을 가지게 한다. 도 7은 WAVE 바이오 반응기 구성의 개략도를 보여준다. 도해는 살포 모드에서, 로드 세포가 의도된 부피를 유지하기 위해 백의 중량을 결정하고 피드 및 수확 속도를 조정함으로써 백 내 배지 부피를 모니터하는 것을 보여준다. 10L 백에서, pH 또한 백 내로 삽입된 프로브에 의해 의도된 셋-포인트로 조절된다.
GLANS를 발현하는 G71S 클론 4와 5로부터의 물질은 1L 규모에서 생산되었다. 배양 pH는 이러한 가동 중에서 조절되지 않았다. WAVE 백의 작동상 제한은 3 베셀 부피 일(VV/일)의 처리량이다. 어떤 물질의 불활성을 막기 위해, 타깃 세포 특정 살포 속도(CSPR)은 0.3 nl/세포/일이었고, GLASN 효소에 대한 8시간의 평균 체류 시간을 낳았다. 그러므로, 백 내 세포 밀도는 약 10-12 ×106 세포/mL에서 유지되었다. GLANS 발현 G71S 클론 4와 5의 성장 속도는 각각 0.16 및 0.20이었다. 타깃 세포 밀도를 유지하기 위한 블리드는 백으로부터 직접적으로 행해졌다.
GLANS는 예전에 pH 6에서 안정하게 되는 것을 보여주었기 때문에, 수확 유동체 pH는 효소 활성을 유지하기 위해 5.5 내지 6.5 사이의 pH로 조정되었다. 이는 수확물을 제거한 반응기와 함께 라인에서 혼합된 부피 당 5%의 pH 4.0 소듐 시트레이트 버퍼의 정기적인 한 회분을 부가함으로써 수행되었다. 조정된 수확 유동체는 다운스트림 처리에 앞서 4℃에서 저장되었다. 두 개의 GLANS 발현 G71S 클론 4와 5는 약 1.25 pg/세포/일의 관련된 특정 생산성을 지닌 약 4.2 mg/L의 역가(titer)로 평균되었다.
GLANS 발현 G71S 클론, C2, C5, C6, C7, C10, C11 및 C30은 유사하게 대-규모로 배양되었고 활성 GLANS 효소 생산을 위해 평가되었다.
실시예 Ⅳ
인간 N- 아세틸갈락토사민 -6- 술파타아제(GLANS)의 농도 및 활성 측정
효소 연관된 면역솔반트 분석(Enzyme linked immunosorbant assays, ELISAs)는 인간 SUMF1 및 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS)를 공-발현하는 G71S로부터 GLANS 효소의 농도 및 활성을 측정하기 위해 개발되었다.
효소 포획 활성 ELISA
효소 포획 활성 ELISA는 고체상에서 GLANS 효소의 활성을 측정하고, 이후 항-GLANS 특정 항체에 의한 포획은 ELISA 플레이트에 결합한다.
버퍼. 버퍼 A(카보네이트 버퍼): 900 mL의 탈이온된(DI) H2O 내에 3.09 그램의 Na2CO3와 5.88 그램의 NaHCO3를 용해하고, 이후 DI H2O를 부가하여 최종 부피 1000mL가 되게 한다. pH가 9.4 내지 9.6 사이인지 점검하고 필터-멸균한다. 웰 당 100 ㎕를 가진 하나의 96-웰 마이크로플레이트를 완전하게 코팅하기 위해, 19 ㎕의 항-GLANS 항체를 하나의 튜브(12 mL) 내로 희석한다. 버퍼 B(ELISA 블록킹 버퍼 및 연속 희석 버퍼): 1× 산성 PBS, 0.05% 트윈-20 및 2% BSA, 아세트산으로 pH 6.5에 조정됨. 버퍼 C(기질 버퍼): 25 mM 소듐아세테이트, 1mM NaCl, 0.5 mg/mL 탈염된 BSA 및 0.01% 소듐 아자이드, 냉랭한 아세트산으로 pH 4.0에 조정됨. 버퍼 D(β-갈락토시다아제 버퍼): 300mM 소듐 포스페이트 이염기, 0.1 mg/ml BSA, 0.01% 소듐 아자이드 및 0.01% 트윈-20, 인산으로 pH 7.2로 조정됨. 버퍼 E(스탑 버퍼): 350 mM 글리신 및 440 mM 카보네이트 버퍼, 6M NaOH로 pH 10.7에 조정됨.
시약. 항-GLANS IgG 항체: 폴리클로날 토끼 항체는 세럼으로부터 정제된 단백질 G이다. D-PBS에서, 총 단백질 = 3.17 mg/mL(BCA). 부분 표본(19 ㎕)는 각 한 번 사용을 위해 -20℃에서 보관된다. 4MU-Gal-6-S 기질(고체; 440 MW): 100 mM 스톡이 DI 워터에서 제조되었고 4℃에서 보관되었다. β-갈락토시다아제(시그마 G4155): 사용 전에 버퍼 D에서 12 ㎍/mL로 희석한다.
프로토콜: 플레이트로 항-GLANS 항체의 결합: Nunc MaxiSorp ELISA 플레이트(Nalge/Nunc 인터내셔날, 피셔 # 12-565-135)는 5 ㎍/mL의 최종 단백질 농도 버퍼 A에서 항-GLANS 항체로 코팅된다. 본 용액을 제조하기 위해, 하나의 19 ㎕ 부분 표본을 해동하고, 마이크로원심분리기 내에서 짧게(10초) 회전하여 액체를 수집한다. 12 mL의 버퍼 A 내로 모든 19 ㎕를 이동한다. 도치에 의해 격렬하게 혼합하고, 이후 저장소에 부은 다음, 멀티-채널 피펫터를 사용하여 플레이트 로딩(웰 당 100 ㎕)한다. 플레이트를 덮고 4℃에서 밤새 배양한다. 결합하지 않은 항-GLANS 항체를 제거한다: 버퍼 Bw로 3회 침수시킴에 의해 플레이트를 세척한다. 블록: 버퍼 B(웰 당 320 ㎕)로 플레이트를 블록하며, 이후 플레이트를 덮고 1시간 동안 37℃에서 배양한다. 블록 단계 동안 정제된 GLANS 표준 및 테스트 샘플(알려지지 않은)의 희석 연속을 제조한다: 표준은 직선 범위의 분석의 높은 종말로 버퍼 B에서 희석되고 (로우(Row) A 내 128 ng/mL), 이후 96-웰 플레이트 상 로우 B-G 내에서 연속적으로 희석된다(2-배). 레인 H는 버퍼 블랭크(blank)이다(즉, GLANS 효소 없음). 먼저, 버퍼 B 내 128 ng/mL에서 500 ㎕ 농도를 제조한다. 다음, 2 ng/mL에 이를 때까지 버퍼 B에서 연속 2-배 희석한다(250 ㎕ 내 250 ㎕). 블록킹 버퍼를 제거한다: 블록킹 단계 후에, 버퍼 B는 버려진다. GLANS 효소 표준과 테스트 샘플을 항-GLANS 항체에 결합시킨다: 100 ㎕/웰의 연속적으로 희석된 표준 및 테스트 샘플로 플레이트를 로드한다(두 번 가동). 플레이트를 덮고 1시간 동안 37℃에서 배양한다. GLANS 저해제를 제거한다: 버퍼 Bw로 3회 침수시킴으로써 플레이트를 세척한다. GLANS 기질을 부가한다(첫 번째 반응): 웰 당 100 ㎕ 로딩을 위해 충분한 최종 기질 용액을 제조한다(사용 전 1시간 안에 제조됨). 4MU-Gal-6-S 스톡 용액(100 mM)을 버퍼 C에서 1mM으로 희석한다. 웰 당 100 ㎕ 로드한다. 플레이트를 덮고 30분 동안 37℃에서 배양한다. β-갈락토시다아제를 부가한다(두 번째 반응): 각 웰로 버퍼 D 내 12 ㎍/ml β-갈락토시다아제 50 ㎕를 부가한다. 플레이트를 덮고 15분 동안 37℃에서 배양한다. 반응을 종결한다: 100 ㎕ 버퍼 E(스탑 버퍼)를 각 웰로 부가하여 유출된 4MU를 이온화한다. 플루오로플레이트로 이동한다: ELISA 플레이트의 각 웰로부터 검은 처리되지 않은 플랫-바텀 마이크로타이터 플레이트(플루오로플레이트, Costar #3915)로 250 ㎕의 200 ㎕를 이동한다(한 번에 8웰). 형광을 읽는다: SOFTmax PRO 프로그램(366 nm 여기 446 nm 배출, 435 nm 컷오프)을 사용하여 Gemini 플레이트 리더에서 플레이트를 읽는다.
GLANS ELISA
GLANS ELISA는 샌드위치 면역 분석법을 사용하여 세포 배양 조절된 배지 또는 다른 처리 샘플 내 GLANS 효소의 농도를 측정한다.
버퍼. 버퍼 A(카보네이트 버퍼): 3.09 그램의 Na2CO3와 5.88 그램의 NaHCO3를900 mL의 탈이온화된 (DI) H2O에 용해하고, 이후 최종 부피 1000 mL가 되도록 DI H2O를 부가한다. pH가 9.4 내지 9.6인지 점검하고, 다음 필터 멸균한다. 하나의 96-웰 마이크로플레이트를 웰 당 100 ㎕로 완전하게 코팅하기 위해, 19 ㎕의 항-GLANS 항체를 하나의 튜브(12 mL) 내로 희석한다. 버퍼 B(ELISA 블록킹 버퍼 및 연속 희석 버퍼): 1× 산성 PBS, 0.05% 트윈-20 및 2% BSA, 아세트산으로 pH 6.5로 조정됨. 버퍼 Bw(세척 버퍼): 100mM NaOAc 및 0.05% 트윈-20, 아세트산으로 pH 6.5로 조정됨. 버퍼 F(스탑 버퍼): 2N H2SO4: 총 600 mL 내, 100 mL의 12 N H2SO4와 500 mL의 MilliQ 워터를 부가한다.
시약. 항-GLANS IgG 항체: 토끼 폴리클로날 항체는 세럼으로부터 정제된 단백질 G이다. D-PBS에서 총 단백질 = 3.17 mg/mL(BCA). 부분 표준(19 ㎕)는 각 1회 사용을 위해 -20℃에서 보관된다. HRP-컨쥬게이트된 탐지 항체(RIVAH): 최종 컨쥬게이트된 항체는 D-PBS/1% BSA 내로 희석된 1: 100이고 1회 사용을 위해 -20℃에서 120 ㎕ 부분 표준 내에 보관된다. TMB EIA 기질 키트(BioRad #172-1067).
프로토콜. 항-GLANS 항체를 플레이트에 결합한다: Nunc MaxiSorp ELISA 플레이트(Nalge/Nunc 인터내셔널, 피셔 #12-565-135)는 버퍼 A 내 최종 단백질 농도 5 ㎍/mL에서 항-GLANS 항체로 코팅된다. 본 용액을 제조하기 위해, 하나의 19 ㎕ 부분 표준을 냉동하고, 마이크로원심분리기에서 짧게(10초) 회전하여 액체를 수집한다. 모든 19 ㎕를 12 mL의 버퍼 A로 이동한다. 도치에 의해 격렬하게 혼합하고, 이후 저장소 내로 부은 다음 멀티-채널 피펫터를 사용하여 플레이트 로딩(웰 당 100 ㎕)한다. 플레이트를 덮고 2시간 동안 37℃에서 배양(대류 배양기)한다. 뜨거운 블록을 사용하지 않는다. 결합하지 않은 항-GLANS 항체를 제거한다: 버퍼 Bw로 3회 침수함으로써 플레이트를 세척한다. 블록: 버퍼 B(웰 당 320 ㎕)로 플레이트를 블록하며, 이후 플레이트를 덮고 1시간 동안 37℃에서 배양한다. 블록 단계 동안 정제된 GLANS 표준 및 테스트 샘플(알려지지 않은)의 연속 희석을 제조한다: 표준은 버퍼 B에서 직선 범위의 분석의 높은 종말까지(로우 A에서 40 ng/mL) 희석되고, 이후 96-웰 플레이트 상 로우 B-G에서 연속적으로 희석된다(2-배). 레인 H는 버퍼 블랭크이다(즉, GLANS 효소 없음). 먼저, 버퍼 B 40 ng/mL에서 500 ㎕의 농도를 제조한다. 이후, 0.625 ng/mL에 다다를 때까지 버퍼 B에서 연속 2-배 희석한다(250 ㎕ 내로 250 ㎕). 블록킹 버퍼를 제거한다: 블록킹 단계 후에, 버퍼 B는 버려진다. GLANS 표준 및 테스트 샘플을 항-GLANS 항체에 결합한다: 100 ㎕/웰의 연속적으로 희석된 표준 및 테스트 샘플로 플레이트를 로드한다(두 번 가동). 플레이트를 덮고 1시간 동안 37℃에서 배양한다. 세척: 버퍼 Bw로 3회 침수함으로써 플레이트를 세척한다. 탐지 항체 컨쥬게이트를 결합한다: 항체 RIVAH 중 하나의 부분 표준(120 ㎕㎕)을 해동하고, 마이크로원심분리기 내로 짧게(10초) 회전하여 액체를 수집한다. 모든 120 ㎕를 11.9 mL 버퍼 B로 희석하고, 혼합하기 위해 튜브를 격렬하게 도치한다. 저장소에 붓고 멀티채널 피펫터로 웰 당 100 ㎕를 부가한다. 플레이트를 덮고 30분 동안 37℃에서 배양한다. 세척: 버퍼 Bw로 3회 침수하여 플레이트를 세척한다. TMB 기질: 1.2 mL 용액 B와 10.8 mL 용액 A를 혼합함으로써 최종 기질 용액을 제조한다. 저장소에 붓고 멀티채널 피펫터로 웰 당 100 ㎕를 부가한다. 플레이트를 덮고 15분 동안 37℃에서 배양한다. 스탑 용액: 12 mL의 2N H2SO4 스탑 용액을 저장소 내로 피펫하고 멀티채널 피펫터로 웰 당 100 ㎕를 부가한다. 부드럽게 두드려 혼합한다. A450을 읽는다: 플레이트 리더에서 플레이트를 읽는다.
GLANS 특정 활성 분석
GLANS 특정 활성 분석은 GLANS-특정 기질을 사용하여 용액에서 GLANS의 효소 활성을 측정한다.
버퍼. MilliQ H2O는 모든 버퍼에 사용된다. 용액 버퍼(DB): 1L의 DB를 위해, 1.74 mL 아세트산, 0.75g 소듐 아세테이트, 233.6 mg NaCl, 2 mL의 50% 트윈-20 및 10 mL의 1% 소듐 아자이드를 MilliQ H2O로 용해하고, 만일 pH가 3.95 보다 작은 경우 0.1 M NaOH을 가지고, pH가 4.05보다 큰 경우 0.1 M 아세트산을 가지고 pH 4.0 +/-0.5로 조정한다. 최종 농도는 19.5 mM 아세트산, 5.5 mM 소듐 아세테이트, 1 mM NaCl, 0.1% 트윈-20 및 0.01% 소듐 아자이드이다. 포스페이트 버퍼(PB): 1L의 PB를 위해, 13.9 g NaH2PO4-H2O 및 55 g NaHPO4-7H2O를 MilliQ H2O에 용해하고 pH를 7.2로 조정한다. 최종 농도는 300 mM NaPi이다. 스탑 버퍼(SB): 1L의 SB를 위해, 26.2 g 글리신 및 46.6 g 소듐 카보네이트를 MilliQ H2O에 용해하고, NaOH를 가지고 pH 10.6으로 조정한다. 분석 버퍼(AB): 4MU-Gal-6S 스톡을 DB 내 1:50 희석한다(2 mM 최종). β-갈락토시다아제 버퍼(β-GB): 300 mM NaPi 내 25 ㎍/mL β-갈락토시다아제, pH 7.2.
시약. 4MU-Gal-6S: H2O 내 100 mM(토론토 리서치 케미칼 Cat. #M334480). β-갈락토시다아제: 시그마 G-4155. 4-메틸엄벨리페론(methylumbelliferone)(4MU 표준): 시그마 M-1381(DMSO 내 10 mM 스톡).
프로토콜. GLANS 효소의 연속 희석을 수행한다. 정제되고 제형화된 GLANS(~1.5 mg/mL)를 위해, 1:1 연속 희석 전에, DB를 포함하는 낮은 단백질 접착 마이크로원심분리 튜브(미국 사이언티픽 Cat# 1415-2600)에서 샘플을 1:10,000 희석한다. 낮은 단백질-결합 96-웰 플레이트에 100 ㎕ GLANS를 둔다. 첫 번째 로우에, 100 ㎕의 GLANS 샘플을 피펫팅한다. 이제 플레이트 아래로(96-웰 플레이트 상 A-G) 연속적으로 희석(1:1)한다. 웰 H에는 아무 샘플도 부가하지 않는다(블랭크). 본 분석의 직선 범위는 1-75 ng/mL이다. 4MU 표준 곡선을 만들기 위해 동일한 절차를 사용한다. DB 내 DMSO 1:100에서 10 mM 4MU 스톡을 희석한다. 첫 번째 웰에 50 ㎕의 50 μM 4MU를 부가함으로써 4MU 표준 곡선을 시작한다. AB(DB 내 2 mM 4MU-갈락토오스-6S) 내 희석된 50 ㎕ 기질을 96-웰 형광 플레이트에 부가한다. 37℃에서 10분 동안 기질을 미리 배양한다. 50 ㎕의 100 ㎕ 연속 희석 GLANS 및 4MU 표준을 AB 내 50 ㎕의 기질에 부가한다. 30분 동안 37℃에서 배양하고(본 첫 번째 반응은 기질로부터 술페이트를 제거한다), 첫 번째 반응을 퀀치(quench)하며, 50 ㎕의 β-갈락토시다아제를 부가함으로써 두 번째 반응을 시작한다(β-갈락토시다아제 스톡을 βGB 내 25 ㎕/mL로 희석한다. 포스페이트는 GLANS를 저해하고 pH의 증가가 또한 GLANS 반응을 중단한다. 결과 pH는 이제 β-갈락토시다아제의 최적 pH 범위에 있다. 본 두 번째 반응을 37℃에서 15분 동안 배양한다. 유출된 4MU는 100 ㎕ SB를 부가함으로써 이온화한다. 96-웰 형광 플레이트 리더 상 Ex355 Em460을 읽는다. 효소 활성 계산(pH 4.0 버퍼 내 37℃에서): 1 유닛 = 유출된 4MU μmol/분; 활성 = μmol 4MU/분/mL; 특정 활성 = μmol 4MU/분/mg. 단백질 농도 계산: GLANS의 소멸 계수를 사용(1 mg/mL = 280 nm에서 1.708 흡수 유닛).
실시예 Ⅴ
인간 N- 아세틸갈락토사민 -6- 술파타아제(GLANS)의 정제
목적은 많은 분량의 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS)를 얻는 것이었다. 인간 SUMF1 및 인간 GLANS를 공-발현하는 안정하게 도입된 G71 세포는 바이오 반응기 배양 조건 하에서 성장되었고, 활성 GLANS 효소는 세포 배지로부터 정제되었다.
액체 크로마토그래피 장치. 아머샴 파마시아 바이오테크 AKTA 익스플로로 900 시스템, 유니콘 제어 소프트웨어를 이용함.
단백질 분석 방법. 표준 절차는 SDS-PAGE, 쿠마시 블루 염색(B101-02-COOM), 웨스턴 블랏팅 및 브래드포드 단백질 분석을 따랐다. 정제 가동은 활성 수득에 의해 평가되었고, GLANS 생산물의 순도는 SDS-PAGE에 의해 시각적으로 평가되었다. 처리된 불순물의 존재는 항-GLANS 항체를 사용하여 웨스턴 블랏팅에 의해 탐지되었다. 단백질 농도는 브래드포드 단백질 분석을 사용하여 측정되었다. 최종 정제된 GLANS 단백질의 농도는 1.708의 소멸 계수를 사용하여 A280 측정에 의해 측정되었다.
크로마토그래피 수지. 블로 세파로오스 6 FF(GE 헬스케어, 롯 #306346) 및 프랙토겔 SE Hi-Cap(머크 KgaA, FC040894449).
GLANS 효소 활성 결정인자. GLANS 특정 활성은 작은 형광 기질 4-메틸엄벨리페릴-6-S-GAL(4-MU-6-S-GAL)을 사용하여 결정되었다. GLANS 특정 활성 분석은 두-단계 반응을 포함하며, 상기에서 β-갈락토시다아제의 부가는 형광 태그를 방출하는 특정 시간 동안 기질과 함께 GLANS 배양 후 필수적이다. 측정은 형광 플레이트 리더를 사용하여 이루어진다.
10DG 탈염 컬럼(Bio-RAD)는 평형 버퍼(EQB, 50 mM NaOAc, 10 mM NaCl, pH 5.8)로 평형되었다. MilliQ H2O는 모든 버퍼에 사용된다. 삼(3) mL의 정제된 GLANS(0.5 - 2 mg/mL)가 탈염 컬럼 상으로 로드되었고, 용출되었으며 EQB를 사용하여 테스트 튜브에 분리한 4 mL 부분 표준에 수집되었다. 단백질 농도는 GLANS의 소멸 계수(1 mg/mL = 280 nm에서 1.708 흡수 유닛)를 사용하여 계산되었다.
탈염된 GLANS 샘플은 희석 버퍼(DB, 50 mM NaOAc, 1 mM NaCl, pH 4.0 + 0.5 mg/mL BSA)에서 연속적으로 희석(1:1)되었다. BSA 스톡은 MilliQ H2O로 미리 평형된 G25 컬럼 상으로 50 mg/mL BSA 스톡(5% 이상 CV 없음)을 로딩하는 사용 전에 탈염되었다. 100 ㎕의 탈염된 GLANS 샘플은 낮은 단백질 결합 96-웰 플레이트의 첫 번 째 로우에 피펫팅되었고, 연속적으로 희석된 GLANS 샘플은 플레이트 아래로 피펫팅되었다(96-웰 플레이트 상 로우 A-G). 100 ㎕의 DB는 마지막 웰(H) 내로 피펫팅되었다. 본 분석 직선 범위의 맨 위 종말은 200 ng/mL이고, 직선 범위는 3-200 ng/mL이다. 동일한 절차가 4-메틸엄벨리페론(4MU)(시그마 M-118, DMSO 내 10 mM 스톡)을 가지고 표준 곡선을 만들기 위해 수행되었다. 50 ㎕의 100 ㎕ 연속 희석 GLANS 및 4MU는 새로운 96-웰 형광 플레이트(검은 바닥 플레이트)로 이동되었다. 50 ㎕의 2 mM 4MU-갈락토오스-6S(milliQ H2O 내)가 분석되는 샘플에 부가되었으며, 30분 동안 37℃에서 배양되었다. 본 첫 번째 반응은 퀀치되었고, 두 번째 반응은 50 ㎕의 β-갈락토시다아제(시그마 G-4155, 300 mM NaPi 내 12 ㎕/mL로 희석된 스톡, pH 7.2)를 부가함에 의해 시작되었으며, 15분 동안 37℃에서 배양되었다. 방출된 4MU는 100 ㎕의 스탑 버퍼(글리신/카보네이트, pH 10.6)을 부가함으로써 이온화되었다. 플레이트는 96-웰 형광 플레이트 리더 상에서 읽어졌다(여기 355 nm, 방출 460 nm). 1 유닛은 1 μmol 4MU 방출된/분으로 정의되고, 효소 활성은 μmol 4MU/분/mL에서 주어지며, 특정 활성은 μmol 4MU/분/mg으로 주어지고 모두 pH 4.0 버퍼 내 37℃에서이다.
첫 번째 정제 과정. 첫 번째 정제 과정은 초정제(UF) 단계 이후 2-컬럼 정제 과정을 포함했다.
1. 수확물 여과(HF): 바이오 반응기 물질은 0.2 ㎛ 멸균 여과되었다.
2. 초여과(UF): 바이오 반응기 물질은 30 kD 살토콘(Sartocon) 막을 통한 초여과에 의해 10-20X 농축되었다.
3. pH 4.5 조정: 농축된 바이오반응기 물질(UF(20X))은 pH 조정 버퍼(1.75 M NaOAC, pH 4.0)을 가지고 실온에서 pH 4.5로 조정되었으며 블루 세파로오스 컬럼으로 로딩하기 전에 멸균 여과되었다.
4. 블루 세파로오스 6 빠른 유동(FF): pH 4.5 조정된 UF(20X)는 블루 세파로오스 컬럼으로 로딩되었고 GLANS 단백질은 표 1 및 도 9A에 보이는 바와 같이 용출되었다.
블루 세파로오스 6 빠른 유동 크로마토그래피
단계 CV * 버퍼
평형 5 10 mM 아세테이트/포스페이트, 50 mM NaCl, pH 4.5
로드 UF 생산물, pH 4.5로 조정됨, 여과됨
세척 1 4 20 mM 아세테이트/포스페이트, 50 mM NaCl, pH 4.5
세척 2 8 20 mM 아세테이트/포스페이트, 50 mM NaCl, pH 6.0
용출 8 20 mM 아세테이트/포스페이트, 100 mM NaCl, pH 7.0
스트립 5 20 mM 아세테이트/포스페이트, 1 M NaCl, pH 7.0
살균 4 0.1N NaOH, 0.5 시간
재생성 5 H2O
보관 3 20% ETOH
*CV: 컬럼 부피. 유동 속도 = 92 cm hr-1
5. 프랙토겔 SE Hi-Cap: 블루 세파로오스 컬럼으로부터의 용출물은 pH 4.3으로 조정되었고 프랙토겔 SE Hi-Cap 컬럼 상으로 로드되었으며 GLANS 단백질은 표 2 및 도 9B에 보이는 바와 같이 용출되었다
프랙토겔 SE Hi-Cap 크로마토그래피
단계 CV * 버퍼
평형 5 20 mM 아세테이트/포스페이트, 50 mM NaCl, pH 4.3
로드 pH 4.3으로 조정되고 MQ 워터로 1:1 희석된 블루 세파로오스 용출물
세척 1 5 20 mM 아세테이트/포스페이트, 50 mM NaCl, pH 5.0
세척 2 5 20 mM 아세테이트/포스페이트, 50 mM NaCl, pH 5.5
용출 20 20 mM 아세테이트/포스페이트, 50 - 350 mM NaCl 구배, pH 5.5
재생성 1 5 20 mM 아세테이트/포스페이트, 500 mM NaCl, pH 5.5
재생성 2 5 20 mM 아세테이트/포스페이트, 50 mM NaCl, pH 4.3
살균 5 0.5 N NaOH, 0.5 시간
재생성 3 4 H2O
보관 3 20% ETOH
*CV: 컬럼 부피. 유동 속도 = 150 cm hr-1
용출물 내 GLANS 단백질은 분별, 전-용출 어깨 및 후-용출 꼬리를 버림으로써 수집되었다.
6. 최종 UF/HF: 프랙토겔 SE Hi-Cap 컬럼으로부터의 용출물은 초여과에 의해 농축되었고 상기 설명된 바와 같이 멸균 여과되었다.
제형화. 정제된 GLANS 단백질은 10 mM NaOAc, 1 mM NaH2PO4, 0.005% 트윈-80, pH 5.5에서 제형화되었다.
안정성 연구. 최종 제형화되고 정제된 GLANS의 안정성은 각각의 온도에서 GLANS 샘플의 작은 부분 표본을 저장함에 의한 작용 시간만큼 4℃ 및 -70℃에서 모니터링되었다. 특정 시간점에서, 냉동 샘플의 부분 표준은 활성 측정 전 37℃ 워터 배쓰에서 빠르게 해동되었다. 도 8은 정제된 GLANS가 제형 버퍼에서 적어도 79일 넘게 4℃ 및 -70℃에서 안정했다는 것을 보여준다.
첫 번째 정제 처리 결과. 표 3은 현탁액 배양 바이오 반응기 내 G71S 클론 4로부터 생산된 GLANS 단백질 3개 제조물의 정제 수율을 보여준다. 순도는 모든 경우 약 95%가 되도록 SDS-PAGE에 의해 시각적으로 평가되었다.
WAVE 반응기에서 G71S 클론으로부터의 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS) 정제 수율
수율
단계 제조물 1 제조물 2 제조물 3 평균 Std Dev
UF N/A 100 100 100 0
블루 세파로오스 6 FF 93 103 101 99 5.3
SE Hi-Cap 90 87 90 89 1.7
도 9는 (A) 블루 세파로오스 6 빠른 유동 크로마토그래피 이후 (B) 프랙토겔 SE Hi-Cap 크로마토그래피에 의해 분리된 GLANS 단백질의 SDS-PAGE를 보여준다. 겔은 쿠마시 블루(왼쪽) 또는 항-GLANS 항체(오른쪽)으로 염색되었다. 웨스턴 블랏을 위해, 항-GLANS 토끼 항체는 1:5000으로 희석되었고, 두 번째 항체는 항-알칼라인 포스파타아제 토끼 항체였다. GLANS 단백질은 SDS-PAGE 상에 ~55-60 kDa의 명백한 분자량을 가지고, 26 아미노산 잔기 신호 펩타이드가 없으며 또한 위치 325 후 분해가 없는 효소의 분비되고 전-처리된(전구체) 형의 기대되는 크기와 일치한다.
N-말단 특성. 정제된 GLANS 단백질의 N-말단은 LC/MS에 의해 결정된다. N-말단 서열은 APQPPN이고, 이는 26 아미노산 잔기 신호 펩타이드가 결여된 GLANS의 분비된 형의 예측된 N-말단과 상응한다(도 4 및 도 5의 인간 GLANS 폴리펩타이드 서열과 비교).
두 번째 정제 처리. 두 번째 정제 처리는 초여과/이중여과(UF/DF) 단계 이후 3-컬럼 정제 처리를 포함했다.
1. 초여과(UF/DF): 바이오 반응기 물질은 pH 5.5에서 30 kDa 살토콘(Sartocon) 막을 통한 초여과/이중여과에 의해 20X 농축되었다.
2. pH 4.5 조정: 농축된 바이오 반응기 물질(UF/DF(20X))은 pH 조정 버퍼(1.75 M NaOAc, pH 4.0)로 실온에서 pH 4.5로 조정되었고 프랙토겔 EMD SE Hi-Cap 컬럼 상으로 로딩되기 전에 멸균 여과되었다.
3. 프랙토겔 EMD SE Hi-Cap: pH 4.5로 조정된 UF/DF(20X)가 프랙토겔 EMD SE Hi-Cap 컬럼 상으로 로드되었고, 10 mM 아세테이트/포스페이트, 50 mM NaCl, pH 4.5 및 10 mM 아세테이트/포스페이트, 50 mM NaCl, pH 5.0으로 순차적으로 세척되었고, GLANS 단백질은 10 mM 아세테이트/포스페이트, 140 mM NaCl, pH 5.0으로 용출되었다.
5. Zn-킬레이팅 세파로오스 FF: 프랙토겔 EMD SE HiCap 컬럼으로부터의 용출물은 500 mM NaCl, pH 7.0으로 조정되었고 Zn-킬레이팅 세파로오스 FF(Zn-IMAC) 컬럼 상으로 로드되었으며, 10 mM 아세테이트/포스페이트, 125 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, pH 7.0으로 세척되었고, GLANS 단백질은 10 mM 아세테이트/포스페이트, 125 mM NaCl, 90 mM 이미다졸, pH 7.0으로 용출되었다.
6. pH 3.5 조정: GLANS 단백질을 포함하는 Zn-킬레이팅 세파로오스 FF 컬럼으로부터의 용출물은 낮은 바이러스 불활성을 위해 pH 3.5로 조정되었고, 이후 10 mM 아세테이트/포스페이트, 2M NaCl, pH 5.0으로 조정되었다.
7. 토요펄 부틸 650M: 낮은 pH 조정된 Zn-킬레이팅 세파로오스 FF 컬럼으로부터의 용출물은 토요펄 부틸 650M 컬럼 상으로 로드되었고, 10 mM 아세테이트/포스페이트, 2M NaCl, pH 5.0으로 세척되었으며, GLANS 단백질은 10 mM 아세테이트/포스페이트, 0.7 M NaCl, pH 5.0으로 용출되었다.
8. 최종 UF/DF: 토요펄 부틸 650M 용출물로부터의 용출물은 20 mM 아세테이트, 1 mM 포스페이트, 150 mM NaCl, pH 5.5에서 초여과 및 이중 여과되었다.
제형화. 정제된 GLANS 단백질은 10 mM NaOAc/HOAc, 1 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, 0.01% 트윈-20, pH 5.5에서 제형화되었다.
두 번째 정제 처리 결과. 표 4는 두 번째 정제 처리를 사용하여 현탁액 배양 바이오 반응기에서 G71 클론 C2로부터 생산된 GLANS 단백질에 대한 회복을 보여준다. 제형화된 GLANS 효소의 순도(즉, 전구체 및 성숙체 또는 함께 처리된 형)는 C3 RP-HPLC에 의해 결정될 때 약 98%이었다. GLANS 효소 전구체 형의 퍼센트는 SDS-모세관 겔 전기영동에 의해 결정될 때 약 85%이었다.
G71S 클론 C2에 대한 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS) 회복
처리 단계 회복(%)
pH 조정 96
프랙토겔 SE Hi-Cap 컬럼 98
Zn-IMAC 컬럼 89
낮은 pH 바이러스 불활성화 89
토요펄 부틸 650M 컬럼 99
제형화 99
전체 70
도 10은 초여과/이중 여과(UF/DF), 프랙토겔 SE Hi-Cap 크로마토그래피, Zn-킬레이팅 세파로오스 FF 크로마토그래피 및 토요펄 부틸 650M 크로마토그래피에 의해 분리된 GLANS 효소의 SDS-PAGE를 보여준다. 겔은 쿠마시 블루(왼쪽 상단), 항-GLANS 항체(오른쪽 상단), 항-카텝신 L(왼쪽 하단) 및 항-CHO 단백질(CHOP, 오른쪽 하단)으로 염색되었다. 웨스턴 블랏을 위해, 항-GLANS 토끼 폴리클로날 항체는 1:5000으로 희석되었고, 두 번째 항체는 항-토끼 AP 컨쥬게이트였다; 항-카텝신 L 염소 폴리클로날 항체는 1:1000으로 희석되었고, 두 번째 항체는 항-염소 HRP 컨쥬게이트였다; 항-CHOP 토끼 폴리클로날 항체는 1:1000으로 희석되었고, 두 번째 항체는 항-토끼 HRP 컨쥬게이트였다. 전구체 GLANS 효소는 SDS-PAGE 상 ~55-60 kDa의 명백한 분자량을 가지며, 성숙하거나 처리된 GLANS 효소의 형은 SDS-PAGE 상 ~39 kDA 및 ~19 kDa의 명백한 분자량을 가진다.
첫 번째 정제 과정의 요약. GLANS 효소는 표준 트레인으로부터 변형된 정제 트레인을 사용하여 정제되었다(표 5를 보라). 바이오 반응기 수확 물질은 0.2 ㎛ 멸균 여과된 것이고 블루-세파로오스 포획 컬럼 상으로 로딩되기 전에 4℃에서 유지되었다. 여과된 바이오 반응기 물질은 직접 로드되거나 초여과에 의해 15X까지 농축되었다. 정제 트레인의 변형은 다운스트림 정제 단계, SP 세파로오스 크로마토그래피에 뒤이은 페닐 세파로오스 크로마토그래피가 충분히 순수한 GLANS를 수득하지 않았기 때문에 필수적이었다. 두 개의 다운스트림 정제 컬럼의 대체로서 SE Hi-Cap 크로마토그래피를 사용하는 것은 2-컬럼 정제 처리를 낳았고, 상당히 향상된 최종 물질의 순도를 가지고, 전체 GLANS 회복은 ~22%에서 ~80%로 상당히 증가했다. GLANS 효소의 순도는(전구체 형으로 필수적으로 구성, 도 9를 보라), C4-RP 크로마토그래피에 의해 결정될 때, >95%로 대강 평가되었고, 정제된 GLANS 효소는 4℃ 및 -70℃ 모두에서 79일 이상 제형 버퍼에 안정하게 남아있었다.
첫 번째 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS) 정제 트레인
단계 정상 처리 변형된 처리
1 HF(1X) HF(1X)
2* UF(5X) UF(15X)
3 pH 4.5 조정 pH 4.5 조정
4 블루-세파로오스 6 FF 블루-세파로오스 6 FF
5 SP 세파로오스 SE Hi-Cap
6 페닐 세파로오스 Hi-Cap 최종 UF/DF
7 최종 UF/DF
* 본 단계는 선택적이다.
두 번째 정제 과정의 요약. GLANS 효소는 또한 두 번째 정제 트레인을 사용하여 정제되었다(표 6을 보라). 전체 GLANS 회복은 약 70%이었고 GLANS 효소의 순도는(전구체 및 성숙체 또는 처리된 형을 포함, 도 10을 보라), C4-RP 크로마토그래피로 결정될 때, 약 97%로 대강 평가되었다.
두 번째 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS) 정제 트레인
단계 처리
1 HF(1X)
2 UF/DF(20X)
3 pH 4.5 조정
4 SE Hi-Cap
5 Zn-킬레이팅 세파로오스
6 pH 3.5 조정
7 토요펄부틸 650M
8 최종 UF/DF
이러한 분석은 재조합 리소좀 술파타아제 효소의 제조를 위해 상기 설명된 프로토콜이 매우 정제된 효소, 구체적으로 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GALNS)의 분비되고 전-처리된(전구체) 형의 많은 양을 생산하기에 효율적인 방법을 제공한다는 것을 나타낸다.
실시예 Ⅵ
정제된 인간 N- 아세틸갈락토사민 -6- 술파타아제(GLANS)의 특성
G71 세포 라인은 평균 포유류 세포 라인에서 주목되는 것보다 더 큰 정도의 높은-만노즈 인산화 및 이에 대응하게 낮은 정도의 인산화되지 않은 높은-만노즈 올리고당을 가지는 단백질(예를 들어, 리소좀 효소)을 생산한다. 본 명세서에 정의된 바와 같이, 높은 정도의 비스-인산화된 높은-만노즈 올리고당을 포함하는 리소좀 술파타아제 효소(예를 들어, 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS))는 칸필드 등., 미국 특허 6,537,785에서 수득된 분자와 비교되고, 이는 복합 올리고당을 포함하지 않으며 오직 높은 만노즈 올리고당을 나타낸다.
리소좀 술파타아제 효소 상 인산화되지 않은 높은-만노즈의 정도를 결정하기 위해, 당업계의 당업자는 방출된 올리고당의 엑소글라이코시다아제(exoglycosidase) 서열을 사용할 수 있고("FACE 서열"), 인산화되지 않은 높은-만노즈 올리고당 체인의 퍼센트를 정확히 집어낸다. 정상 롯-방출 FACE 프로파일링 겔 상, 인산화되지 않은 높은 만노즈는 특정 복합 올리고당(예를 들어, 올리고만노즈 6 및 완전하게 시알산화된(sialylate) 바이안테너리(biantennary) 복합체)과 함께 공-이동한다. 인산화되지 않은 높은 만노즈는 이후 효소 서열에 의해 다른 올리고당과 구별된다.
G71S 세포에 발현된 정제된 리소좀 술파타아제 효소(예를 들어, 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS))가 증가된 인산화를 나타내는지 여부를 결정하기 위해, 리소좀 술파타아제 효소 상 만노즈-6-포스페이트(M6P)의 정도뿐만 아니라 M6P 수용체(MPR)에 결합하는 효소의 능력이 결정되었다.
G71S 세포에 발현되고 정제된, 재조합 인간 GLANS 효소는 형광 보조된 탄수화물 전기영동(fluorescence assisted carbohydrate electrophoresis, FACE) 및 MPR-세파로오스 수지 상 크로마토그래피에 의해 분석되었다. FACE 시스템은 글라이코단백질로부터 방출된 올리고당을 분리하고, 정량하고 결정하기 위해 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 사용한다. FACE 상 올리고만노즈 7 비스-포스페이트(O7P) 밴드의 상대적 강도(하구 등, 전기 영동 19(15): 2612-20, 1998) 및 MPR 컬럼 상 보유된 퍼센트 활성(카시아 등.,생화학 37(43): 15154-61, 1998)은 단백질 몰 당 인산화 정도의 믿을만한 측정을 제공한다.
특정 활성. 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS)의 특정 활성은 작은 형광 기질 4-메틸엄벨리페릴-6-S-GAL(4MU-Gal-6S)를 사용하여 37℃에서 결정되었다. 본 분석을 사용할 때, 정제된 GLANS의 특정 활성은 165 μmol/분/mg(0.165 U/mg)이었다.
인간 세럼 안정성. GLANS의 생체 외 세럼 안정성이 결정되었다. 인간 세럼(시그마 H-4522)는 0.2 ㎛ PES 필터를 통해 필터 멸균되었고 4 mL의 필터 멸균된 인간 세럼이 T-25 세포 배양 플라스크에서 1시간 동안 37℃, 10% CO2 대기(본 포인트에서 pH는 7.4±0.1)에서 전-배양되었다. 0.4 mL의 탈염되고 정제된 GLANS(2 mg/mL 정제된 GLANS는 Bio-RAD 10DG 컬럼을 사용해서 PBS 내로 탈염되었다)는 전-배양된 인간 세럼 또는 0.5 mg/L BSA를 포함하는 PBS 대조군에 부가되었다. 100 ㎕ 샘플은 의도된 시간 점(예를 들어, 0, 1, 3.5, 7.5 및 26시간)에서 철회되었고 900 mL의 퀀치 버퍼(QB, 50 mM NaOAC, pH 5.6 + 150 mM NaCl + 0.5 mg/mL BSA + 0.001% 트윈-80)에 부가되었다. 샘플은 GLANS 효소 활성을 측정할 준비가 될 때까지 4℃에서 보관되었다.
GLANS 효소 활성은 효소 포획 활성 ELISA를 사용하여 측정되었다. % 잔여 GLANS 효소 활성의 지수함수형 붕괴 곡선을 추론함으로써, 정제된 GLANS의 생체 외 세럼 반감기가 217 시간으로 평가되었다.
윤활막 세포( Synoviocytes )(연골세포, Chondrocytes )내 재흡수. GLANS의 윤활막 세포로 재흡수 되는 능력이 결정되었다.
연골세포(ATCC 번호 CRL-1832)가 37℃, 5% CO2, 12-웰 디쉬의 성장 배지(Ham's F12 + 10% FBS)에서 배양된다. 세 샘플의 재흡수 분석은 4 × 12 웰 플레이트를 필요로 한다. 정제된 GLANS 샘플 및 GLANS 참조는 acPBS/BSA(산성 PBS + 200 ㎍/mL BSA)에서 1 μM로 희석되었다. 1 μM 스톡으로부터 GLANS 샘플 및 참조의 재흡수 희석 곡선이 만들어졌다: 5 mL 재흡수 분석 희석물(UAD, DMEM + 2 mM L-글루타민 + 0.5 mg/mL BSA) 내로 50.5 ㎕(1 μM rhASB), 10 nM GLANS 샘플 및 참조를 낳으며, 이는 UAD 내 연속 2-배 희석에 의해 5, 2.5, 1.25, 0.62, 0.31 및 0.16 nM으로 더 연속적으로 희석되었다. 융합 연골세포의 12-웰 디시로부터의 성장 배지는 흡입되었고, UAD(블랭크) 또는 GLANS 샘플 또는 참조의 연속 희석 중 1 mL가 웰에 부가되었고 10% CO2 배양기에서 4시간 동안 37℃ 배양되었다. 재흡수 배지는 흡입되었고, 완전함을 위해 각 디쉬를 기울이고, 각 웰은 1 mL PBS로 한 번 헹구어졌다. PBS는 흡입되었고 연골세포는 웰 당 0.5 mL 트립신/EDTA(0.25% 트립신/0.1% EDTA(미디아테크 25-053-CI, 롯 25053025))를 부가함에 의해 분리되었다. 플레이트로부터의 분리 후에, 연골세포는 얼음 위에서 미리 냉각된 에펜도르프(Eppendorf) 튜브(총 30 튜브) 내로 부분 표본화되었다. 트립신화된 연골 세포는 냉각되었고 이후 마이크로퓨즈(microfuse)에서 낮은 속도(3분당 4000rpm)로 펠렛되었다. 트립신은 완전하게 흡입되었고, 세포 펠렛은 1 mL PBS로 헹구어졌으며, 마이크로퓨즈와 흡입 단계가 한 번 반복되었다. 200 ㎕의 세포 라이시스 버퍼(CLB, 50 mM 소듐 아세테이트, pH 5.6 + 0.1% 트립톤 X-100)가 각 튜브에 부가되었다. 세포 펠렛은 펄스-보텍싱(pulse-vortexing)에 의해 3회 재현탁되었다. 재현탁 후에 세포 라이시스 혼합물은 밤새 -80℃에서 보관되거나, 바로 분석되었다.
세포 용해물(lysate)은 실온에서 해동되었고 해동될 때 얼음으로 이동되었다. 세포 용해물은 보텍스되어 어떤 가시적인 고체 물질을 재현탁하였고, 이후 마이크로퓨즈에서 10분 동안 4℃에서 14 Krpm로 회전되어 불용성 물질을 펠렛으로 하였다. 상청액(supertanant)은 신선한 튜브 세트로 이동되었고 펠렛은 버려졌다. 이후 GLANS 활성 분석이 상청액에 대해 수행되었다. 7-포인트 희석 곡선(10 nM 에서 시작하여 0.16 nM에서 끝나는 연속 2-배 희석)이 대개 수행되며 괄호는 양 끝에서 상당히 고른 기대된 K재흡수이다. 시작 샘플의 몰 농도는 오직-단백질 분자량을 사용하여 계산된다.
정제된 GLANS는 4.9 nM의 단일-사이트 리간드 결합을 기초로 윤활막 세포 내로 재흡수한 Kd를 가진다.
만노즈 -6- 포스페이트 ( M6P ) 수용체 플레이트 결합 분석. 만노즈-6-포스페이트(M6P) 수용체로 결합하는 GLANS의 능력은 플레이트 결합 분석에서 결정되었다. FluoroNunc 높은 결합 플레이트는 4 ㎍/mL M6P 수용체로 코팅되었다. 코팅된 플레이트는 250 ㎕/웰의 세척 버퍼(WB, TBS + 0.05% 트윈 20)으로 두 번 세척되었고 비특정 결합은 200 ㎕/웰의 블록킹 및 희석 버퍼(BDB, Pierce SuperBlock 버퍼, 롯 #CA46485)로 블록되었다. 플레이트는 실온에서(RT) 1시간 동안 배양되었다. 본 블록 단계 동안 정제된 GLANS 샘플(2주 동안 4℃에서 보관된 0.5 - 2 mg/mL)이 BDB에서 10 nM로 희석되었고, 이후 희석 버퍼(DB, 50 mM NaOAc, 1 mM NaCl, pH 4.0 + 0.5 mg/mL BSA)(250 ㎕ + 250 ㎕)로 5, 2.5, 1.25, 0.62, 0.31 및 0.16 nM의 아래로 연속해서 희석되었다. 블록된 플레이트는 상기와 같이 WB로 세척되었고, 희석된 GLANS 샘플은 100 ㎕/웰에서 중복하여 웰 내로 나누어졌으며 RT에서 1시간 배양되었다. 배양 단계 동안, 2 mM 활성 기질이 0.1 mL의 100 mM 6S-갈락토오스-4MU 스톡(H2O, -20℃에서 보관됨)를 5 mL DB 내로 희석하고 37℃ 워터 배쓰에서 미리 따뜻하게 함에 의해 제조되었다. 배양 후, 플레이트는 상기와 같이 WB로 두 번 세척되었고, 100 ㎕ 희석된 기질이 부가되었으며 GLANS 특정 활성이 결정되었다.
상기 분석을 이용하여, 정제된 GLANS는 2.4 nM의 단일-사이트 결합을 기초로 M6P 수용체 결합에 대한 Kd를 가졌다.
만노즈 -6- 포스페이트(M6P)수용체 컬럼 결합. 만노즈-6-포스페이트(M6P) 수용체에 결합하는 GLANS의 능력은 컬럼 결합 분석에서 결정되었다. M6P 수용체 컬럼은 제조사의 지시대로 제조되었다. M6P 수용체는 피터 로벨의 실험실에서 왔으며, 컬럼 수지는 NHS 활성된 수지(Bio-RAD Affi-Gel 15)였고, 컬럼 크기는 0.7 mL였다. M6P 수용체 컬럼은 10 컬럼 부피(CV)의 평형 버퍼(5 mM β-글리세로포스페이트, 0.05% 트윈 20, 5 mM 글루코즈-1-포스페이트 및 0.02% NaN3를 포함하는 EQ, 산성 PBS, pH 6.0)로 유동 속도 0.25 mL/분에서 평형되었다. 6 ㎍의 정제된 GLANS(200 ㎕ 당)가 0.1 mL/분의 유동 속도에서 M6P 수용체 컬럼 상으로 로드되었다. 결합하지 않은 GLANS는 유동 속도 0.25 mL/분에서 10 CV의 EQ로 컬럼 밖으로 세척되었다. 결합 GLANS는 0-100% 용출 버퍼(5 mM β-글리세로포스페이트, 0.05% 트윈 20, 5 mM 만노즈-6-포스페이트 및 0.02% NaN3를 포함하는 EL, 산성 PBS, pH 6.0) 구배(10CV), 뒤이어 2 CV의 100% EL을 사용하여 컬럼 밖으로 용출되었다. 컬럼은 3 CV의 EQ로 재평형되었다.
GLANS ELISA를 사용하여, M6P 수용체에 결합한 정제된 GLANS의 퍼센트는 56%로 결정되었다.
모세관 전기 영동( CE )에 의한 총 올리고당 분석. GLANS 상 만노즈-6-인산화 정도를 결정하기 위해, GLANS 상 총 올리고당의 N-연결된 탄수화물 프로필이 마 등, Anal . Chem. 71(22):5185-5192, 1999에 설명된 바와 같이 모세관 전기 영동(capillary electrophoresis)에 의해 결정되었다. 상기 방법은 아르파라긴 N-연결된 올리고당을 분해하기 위해 PNGase F를 사용했다. 분해된 올리고당이 분리되었고 형광 염색으로 파생되었으며, G10 스핀 컬럼을 적용하여 과도한 염색이 제거되었다. 정제되고, 형광으로 표지된 올리고당은 전기 영동적으로 분리되었고 피크는 순차적으로 MDQ-CE 소프트웨어(32 Karat Ver. 7.0)을 사용하여 정량되었다.
본 분석을 사용하여, 정제된 GLANS에 대한 올리고당을 포함하는 비스-인산화된 만노즈 7(BPM7), 모노-인산화된 만노즈 6(MPM6) 및 시알산의 양은 각각 0.58 mol/mole 효소, 0.08 mol/mole 효소 및 탐지되지 않았다. BPM7을 포함하는 GLANS 단백질의 퍼센트는 29%로 평가되었다.
비스7 올리고당 특성. GLANS 상 비스-인산화된 만노즈 7(BPM7)의 위치가 결정되었다. 위치 178의 아스파라긴(Asn) 잔기는 BPM7으로 N-연결된 글리코실화되었다. 위치 397의 Asn 잔기는 BPM7에 N-연결된 클리코실화되지 않았지만, 올리고만노즈-타입 당이 우세한 것으로 발견되었다.
하이드록시아파타이트 친화성. GLANS가 뼈를 타깃으로 하는 능력을 가지는지 여부를 결정하는 체외 뼈 모델이 개발되었다. 4 mg/mL HTP-DNA 등급 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite)(Bio-RAD) 현탁액이 제조되었고 DBS + 50 ㎕/mL BSA, pH 7.4에서 평형되었다. 정제된 GLANS는, 50 ㎍/mL BSA 부가 후에, DBS, pH 7.4에서 탈염되었다. 탈염된 GLANS는, 약 2 mg/mL의 최종 농도에서, DBS + 50 ㎍/mL BSA, pH 7.4로 96-웰 플레이트에서 연속적으로 희석되었다. 50 ㎕의 연속적으로 희석된 GLANS는 96-웰 필터 플레이트(Millipore #MSGVN2210, 친수성 PVDF, 낮은 단백질 결합, 22 ㎛ 구멍 크기)로 이동되었다. 50 ㎕의 하이드록시아파타이트 현탁액은 연속적으로 희석된 GLANS를 포함하는 필터 플레이트의 웰에 부가되었고, 온화한 쉐이킹과 함께 1시간 동안 37℃에서 배양되었다. 플레이트는 진공 여과되었다.
진공 필터 상청액은 HPLC 또는 상기 설명된 바와 같은 GLANS 효소 활성에 의해 분석되었다. 정제된 GLANS는 3-4.0 μM의 하이드록시아파타이트에 대한 Kd를 가졌다.
인간 술파타아제 변형 인자 1(SUMF1)를 발현하는 G71S 세포 라인은 더 많은 양의 활성(즉, 활성 사이트 시스테인 잔기에서 Cα-포밀글라이신(FGly)으로의 전환)을 가지는 리소좀 술파타아제 효소를 생산한다.
G71S 세포에서 SUMF1과 공-발현된 정제된 재조합 리소좀 술파타아제 효소(예를 들어, 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS))가 증가된 활성을 나타내는지 여부를 결정하기 위해, 정제된 리소좀 술파타아제 효소 상 활성 사이트 시스테인 잔기의 FGly로의 전환량이 결정되었다.
GLANS 활성. GLANS의 퍼센트 활성, 즉 활성 사이트 시스테인(Cys) 시스테인 잔기 Cα-포밀글라이신(FGly)의 전환 퍼센트는 LC/MS(TFA)에 의해 결정되었다. Cys, FGly 및 Gly에 대한 TIC/1000는 각각 39, 1840 및 183이었고, 정제된 GLANS의 약 90%가 활성(즉, FGly) 형이라는 것을 가리킨다.
요약. 표 7은 G71S 클론 4 세포에서 발현된 재조합 GLANS의 특성 요약을 보여준다. 표 8은 G71S 클론 C2 세포에서 발현된 재조합 GLANS의 특성 요약을 보여준다.
G71S 클론 4에서 생산된 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS)의 특성
분석 카테고리 GLANS
특정 활성:ELISA에 의한 활성/항원 0.165 U/mg
특정 활성: 활성/단백질 7.7 U/mg
C4-RP에 의한 순도 >95% (테스트된 6 롯)
SEC에 의한 크기 115 kDa(호모다이머)
37℃에서 세럼 안정성 217 시간
재흡수: 연골세포 4.9 nM
재흡수: 섬유아세포 5.0 nM
재흡수: 조골세포(osteoblast) 7.8 nM
생산성 1.3 pg/세포/일
역가(titer) 4.2 mg/L
M6P 수용체 플레이트 결합 2.4 nM
M6P 수용체 컬럼 결합: % 결합 56%
CE에 의한 M6P 함량: 총 탄수화물의 % 29%
M6P의 함량: mol M6P/mol GLANS 0.58
CE에 의한 시알산 함량 1%
하이드록시아파타이트 친화성 4 μM
활성: % FGly 90%
G71S 클론 C2로부터 생산된 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS)의 특성
분석 카테고리 GLANS
특정 활성: 활성/단백질 6.4 U/mg
C4-RP에 의한 순도 97%
SEC에 의한 크기 115 kDa(호모다이머)
재흡수: 섬유아세포 3.4 nM
역가 6.4 mg/L (테스트된 4 롯)
M6P 수용체 플레이트 결합 5.7 nM
CE에 의한 M6P 함량: 총 탄수화물의 % 34.5%
M6P 함량: mol/M6P/mol GLANS 0.69
이러한 결과는 정제돤 재조합 인간 GLANS가 높은 정도의 활성 및 높은 정도의 만노즈 6-포스페이트 인산화를 가진다는 것을 나타낸다. 그러므로, SUMF1과 리소좀 술파타아제 효소(즉, GLANS)를 공-발현하는 G71S 세포는 활성이고 높게 인산화된 리소좀 술파타아제 효소를 효율적으로 생산한다. 그러한 리소좀 술파타아제 효소 상 증가된 정도의 높은 만노즈 잔기는 세포 상 MPR에 의해 증가된 재흡수를 야기한다.
실시예 Ⅶ
체외 모르퀴오 연골 세포에서 재조합 인간 N- 아세틸갈락토사민 -6-술파타아제( GLANS)의 재흡수 및 활성
모르퀴오 연골 세포의 리소좀에 의한 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS)의 재흡수 및 케라탄 술페이트(KS)를 분해하는 GLANS의 능력이 체외 평가되었다.
점액 다당류증 타입 Ⅳa(MPS Ⅳa, 모르퀴오 증후군)를 가진 환자의 연골 세포는 감소된 GLANS 활성을 가지고 KS의 리소좀 축적을 나타낸다. MPS Ⅳa의 체외 모델은 MPS Ⅳa 환자의 엉덩뼈 능선(iliac crest) 생체 검사로부터 분리된 연골 세포를 사용하여 성립되었다. 그러나, 주요 연골 세포는 분화되지 않았고 배양에서 그들의 연골 세포 특성을 상실한다. 그러므로, 배양 조건은 체외 연골 세포 분화를 유도하도록 성립되었다.
MPS Ⅳa 환자로부터 분리된 연골 세포는, MQCH로 명명되었고, IGF-1, TGF-β, 트랜스페린, 인슐린 및 아스코르브산(연골세포 성장 배지, Lonza #CC-3225)의 존재 아래 알지네이트 비즈(alginate beads)에서 배양되었다. 배양 배지는 6에서 15주의, 실험기간 동안 주당 두 번씩 바뀌었다. 이러한 배양 조건은 연골 세포 표현형 및 분화를 유도했다. 이러한 MQCH 세포는 연골 세포 마커를 발현했으며, 이는 성 결정 영역 Y-박스 9(Sox 9), 콜라겐 Ⅱ, 콜라겐 X, 연골 올리고머릭 매트릭스 단백질 및 아그레간(aggregan) mRNA를 포함하고, MQCH 세포의 배양으로부터 분리된 RNA를 사용하여 정량적 RT-PCR 분석에 의해 측정된다. 이러한 배양된 MQCH 세포는 또한 세포 외 매트릭스를 정교히 만들었다.
공초점 마이크로스코피는 MQCH 세포가 KS를 축적했다는 것을 확인하기 위해 수행되었다. 8-주 배양에서 MQCH 세포는 트립신화되었고, 글라스 슬라이드 상으로 사이토스핀되었으며(cytospun), 아세톤에 고정되고, 사용 때까지 냉동되었다. 해동 후에, 세포는 재-수화되었고(rehydrated), 첫 번째 및 두 번째 항체로서, 각각 염소 항-토끼 항체에 컨쥬게이트된 항-KS 모노클로날 항체(Chemicon) 및 Alexa-488(그린)을 사용하여 염색되었다. MQ-CH 세포들은 리소좀 KS 축적과 일치하는 반점의 세포 내 염색을 나타냈다.
정제된 재조합 인간 GLANS가 MQCH 세포에 의해 리소좀 내로 자리를 잡고 KS를 분해할 수 있었는지 여부를 결정하기 위해, 6-주 MQCH 세포 배양이 9주 동안 주 당 두 번의 10 nM 재조합 인간 GLANS와 함께 배양되었다. GLANS 재흡수 및 KS 클리어런스는 공초점 마이크로스코피에 의해 측정되었다. 사용된 첫 번째 항체는: (a) 항-GLANS 토끼 폴리클로날 항체 및 항-리소좀 관련된 막 단백질-1(LAMP-1) 모노클로날 항체, 또는 (b) 항-KS 모노클로날 항체 및 항-LAMP-1 폴리클로날 항체이었다. 사용된 두 번째 항체는: 항-GLANS 또는 항-KS 항체를 탐지하는 항체와 컨쥬게이트된 Alexa-488(그린) 또는 항-LAMP-1 항체를 탐지하는 항체와 컨쥬게이트된 Alexa-555 또는 -594(레드)이었다. MQCH 세포 제조물은 DAPI를 포함하는 마운턴트(mountant)에서 고정되었고, 이는 핵을 염색한다.
리소좀 마커, LAMP-1과 GLANS 효소 및 KS의 상당한 공-국지화(localization)가 GLANS-처리된 MQCH 세포에서 관찰되었다. 일단 MQCH가 재조합 인간 GLANS에 노출되면, 세포 내 KS의 양은 감소되었다.
GLANS 재흡수는 또한 GLANS 효소 포획 ELISA 및 GLANS 특정 활성 ELISA를 사용하여 측정되었고, 둘은 상기 실시예 Ⅳ에 설명되었다. GLANS를 발현하는 정상 인간 연골세포(NHKC)가 양성 대조군으로 사용되었다. 표 9 및 10에서 보여지는 바와 같이, 처리되지 않은 MQCH 세포는 탐지 가능한 GLANS 효소 또는 활성을 가지지 않은 반면, 10 nM GLANS로 9주 동안 처리된 MQCH 세포는 상당한 GLANS 효소 및 활성을 가졌다.
MQCH 세포를 사용한 GLANS 효소 포획 ELISA
MQCH 세포 NHKC
처리 않음 N.D.a 0.12b
9주 동안 10 nM GLANS 3.99 0.88
a 탐지되지 않음; b ng/GLANS 항원/㎍ 총 단백질
MQCH 세포를 사용한 GLANS 특정 활성 분석
MQCH 세포 NHKC
처리 않음 N.D.a 2.76b
9주 동안 10 nM GLANS 3.68 5.15
a 탐지되지 않음; b GLANS 활성/ng 항원
이러한 결과는 체외에서 정제된 재조합 인간 GLANS가 모르퀴오 연골 세포에 의해 리소좀 내로 흡수되고 리소좀 KS를 분해할 수 있다는 것을 나타낸다. 이러한 모르퀴오 연골 세포는 KS를 분해하는 GLANS와 같은 리소좀 술파타아제 효소를 테스트하기에 체외 효능적인 모델로서 유용하다.
실시예 Ⅷ
체외 세포-기반 분석에서 천연 기질을 분해하는 재조합 인간 리소좀 효소의 활성
세포-기반 체외 분석은 재조합 인간 리소좀 효소, 예를 들어 리소좀 술파타아제 효소가 천연 기질을 분해하는 활성을 측정하기 위해 개발되었다.
리소좀 술파타아제 효소를 예로 들 수 있는 재조합 인간 리소좀 효소의 효소적 활성은 전형적으로 인공 형광 생성 기질을 사용하는 세포-없는 체외 분석에 의해 측정된다(GLANS에 대한 실시예 4를 보라). 그러나, 측정된 효소 활성은 인공 기질의 크기, 즉 단당류 단위의 수에 의존적이다. 게다가, 효소 활성은 생체 내 상황을 반영하지 않는 환경에서 측정된다. 그러므로, 세포-없는 체외 분석은 천연 기질을 분해하는 리소좀 효소의 능력 또는 그것의 타깃 세포 내로 흡수되고 리소좀으로 국지화되는 능력을 고려하지 않는다.
세포-기반 체외 분석은 두 개의 재조합 인간 리소좀 효소, 알파-L-이두로니다아제(IDU) 및 아릴술파타아제 B(ARSB)의 천연 기질, 즉 기질을 포함하는 세포 내 더마탄 술페이트(DS)를 분해하는 활성을 측정하기 위해 개발되었다. DS는 술페이트화된 이두론산 β(1-3)-N-아세틸-갈락토사민 β(1-4) 이단당 단위를 다양하게 포함한다.
ARSB-결핍 GM00519 인간 섬유아세포 또는 IDU-결핍 GM01391 인간 섬유아세포가 12-웰 플레이트에서 증식을 측정하기(confluency) 위해 배양되었고, 배양은 세포 내 DS의 축적을 유도하기 위해 증식 측정 후 3-6주 동안 유지되었다.
증식 측정 후 GM00519 또는 GM01391 세포는 이후 각각 포화 용량의 재조합 인간 ARSB(10 nM) 또는 재조합 인간 IDU(25 nM)에 4-5일 동안 노출되었다. 처리되지 않고 리소좀 술파타아제 효소-처리된 세포가 수확되었고, 라이시스되었으며, 원심분리되었다.
세포 용해물 내 리소좀 효소 활성은 (1) 세포를 라이시스하고; (2) 세포 용해물 내 콘드로이틴(chondroitin) ABC 리아제(EC 4.2.2.4)를 사용하여 이당류 내로 DS-포함 기질을 절단하며; (3) 형광 염색(예를 들어, 2-아미노-아크리돈, AMAC)로 DS 이당류를 표지하고; (4) DS 이당류를 분리하고(예를 들어 모세관 존 전기 영동, CZE에 의해); (5) 표지된 DS 이당류를 탐지(예를 들어 레이저-유도된 형광, LIF에 의해)함으로써 세포의 잔여 DS 함량을 결정함에 의해 측정되었다. 그러한 방법은 예를 들어 지넬루 등, 전기 영동 2:2439-2447, 2007, 및 라마리 등, J. Chromatogr . B 730:129-133, 1999 (볼피 등., 전기 영동 29:3095-3106, 2008에서 리뷰됨)에 설명된다.
표 11은 N-아세틸갈락토사민-4-술페이트(4S 이당류)를 포함하는 이당류의 양을 측정함으로써 결정되는 ARSB로 처리된 GM00519 세포를 사용한 DS 분해 퍼센트를 보여주며, 이는 우세한 DS 이당류이다. 유사한 결과가 IDU로 처리된 GM01391 세포를 사용하여 얻어졌다.
세포-기반 체외 분석에서 ARSB에 의한 DS 감소
세포의 나이(주) GM00519 세포(% 분해)a
3 86
4 92
5 92
6 89
a 분해 퍼센트는 처리되지 않은 세포와 비교할 때 ARSB 처리된 세포 용해물의 CZE-LIF 스캔에서 탐지된 4S 이당류의 곡선 하 면적을 측정함으로써 계산되었다.
상기 분석은 타깃 세포가 재조합 인간 ARSB 및 IDU를 흡수하였으며, 이는 이후 그들이 그들의 천연 기질, 세포 내 DS를 분해하는 리소좀으로 국지화된다는 것을 나타낸다.
용량 결과 실험이 본 세포-기반 분석에서 IDU가 속도 한계로 되는 농도를 결정하기 위해 수행되었다. GM01391 세포가 12-웰 플레이트에서 배양되었다. 증식 측정 후 4주째에, 세포는 0.8 nM 내지 25 nM의 다양한 농도의 IDU에 6 또는 26시간 동안 노출되었다. 세포 용해물이 상기 설명된 바와 같이 제조되었고 처리되었다. IDU는 1 nM 아래에서 속도 한계로 되는 것이 아니라고 판정되었다.
두 번째 용량 결과 실험에서, 증식 측정 후 3주째에 GM01391 세포는 0.01 내지 0.2 nM의 다양한 농도의 IDU에 2일 동안 노출되었다. 세포 용해물이 상기 설명된 바와 같이 제조되었고 처리되었다. 본 실험에서, 알려진 양의 내부 표준 단당류, GlcNAc-6S가 처리 동안 회복 조절하기 위해 세포 용해물 내로 섞여졌다. 도 11에서 보이듯이, DS 기질의 양에서 용량 의존 감소가 IDU-처리된 GM01391 세포에서 관찰되었다.
유사한 용량 결과 실험에서, 증식 측정 후 3주째에 GM00519 세포는 0.001 내지 0.06 nM의 다양한 농도의 ARSB에 5일 동안 노출되었다. 세포 용해물은 상기 설명된 바와 같이 제조되었고 처리되었다. 본 실험에서, 알려진 양의 내부 표준 단당류, GlcNAc-6S가 처리 동안 회복 조절하기 위해 세포 용해물 내로 섞여졌다. 도 12에서 보이듯이, DS 기질의 양에서 용량 의존 감소가 ARSB-처리된 GM00519 세포에서 관찰되었다.
세포-기반 체외 분석은 재조합 인간 리소좀 술파타아제 효소, GLANS, 그것의 천연 기질, 즉 세포 내 케라탄 술페이트(KS)-포함 기질을 분해하는 활성을 측정하기 위해 개발되었다.
GLANS-결핍 MQCH 세포는 상기 실시예 7에 설명된 바와 같이 배양되었고 1 또는 10 nM에서 재조합 인간 GLANS로 처리되었다. 처리 후, MQCH 세포 용해물은 제조되었고 케라타나제 Ⅱ(EC 3.2.1)로 절단되었으며, 이는 더 큰 KS 올리고당을 KS 이당류로 부수는 것이다. KS 이당류는 DS 이당류에 대해 상기 설명된 바와 같이, AMAC로 표지되었고, CZE에 의해 분리되었으며, LIF에 의해 탐지되었다. GlcNAc-6S, KS 단당류는 처리 동안 회복 조절하기 위해 내부 표준으로 세포 용해물 내로 섞여졌다. 두 개의 특징적인 KS 이당류, Gal6S-GlcNAc6S 및 Gal-GlcNAc6S의 양이 측정되었고, 얻은 데이터는 회복된 GlcNAc6S의 양에 의해 보정되었다. 표 12는 두 개의 특징적인 KS 이당류의 양을 측정함으로써 결정된, GLANS로 처리된 MQCH 세포를 사용한 KS 분해 퍼센트를 보여준다.
세포-기반 체외 분석에서 GLANS에 의한 KS 감소
Gal6S-GlcNAc6S Gal-GlcNAc6S
1 nM GLANS 85.7a 78.5b
10 nM GLANS 88.6 81.5
a,b 분해 퍼센트는 처리되지 않은 MQCH 세포와 비교할 때 GLANS-처리된 용해물의 CZE-LIF 스캔에서 탐지된 Gal6S-GlcNAc6S 및 Gal-GlcNAc6S의 곡선 하 면적을 측정함에 의해 계산되었으며, 섞은 조절 GlcNAc6S의 곡선 하 면적으로 조정되었다.
상기 분석은 타깃 세포가 재조합 인간 GLANS를 흡수하며, 이후 GLANS가 그것의 천연 기질, 세포 내 KS를 분해했던 리소좀으로 국지화된다는 것을 나타낸다.
전체적으로, 이러한 결과는 세포-기반 체외 분석에서 재조합 인간 리소좀 효소, ARSB, IDU 및 GLANS, 그들의 천연 기질을 분해하는 활성이 측정되고 정량될 수 있다는 것을 나타낸다. 이는 본 세포-기반 체외 분석이 다른 리소좀 술파타아제 효소뿐만 아니라 넓고 다양한 재조합 리소좀 효소의 활성을 측정하고 정량하도록 용이하게 변형될 수 있으므로 진가가 인정되어야 할 것이다.
실시예 Ⅸ
재조합 인간 N- 아세틸갈락토사민 -6- 술파타아제(GLANS)의 특정 조직으로의 전달
G71 세포에서 발현되고 정제된 것으로, GLANS 결핍에 의해 영향을 받거나 관련된 특정 조직으로 전달되는 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS)의 능력은 일단 마우스에게 투여되어 평가되었다.
케라탄 술페이트의 높은 특정 분배는 매우 특징적인 점액 다당류증 타입 Ⅳa(MPS ⅣA) 또는 모르퀴오 증후군의 표현형을 제공한다. 케라탄 술페이트는 연골(관절 뼈 성장판, 심장 판막, 후두 및 비중격) 및 각막에서 주로 발견되고, 이러한 조직은 MPS ⅣA 환자에서 케라탄 술페이트 축적을 나타내는 곳이다. 그러므로, N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS)에 대해, 이는 MPS ⅣA 또는 모르퀴오 증후군에서 결핍된 것이고, 긴 뼈의 성장판, 심장 판막, 각막, 후두 및 코에 GLANS 효소 전달을 보여줌에 있어 중요하다. 악하게 혈관이 발달된 타깃인 이러한 특정 조직을 보기 위해 형광 GLANS의 전달이 마우스에게서 조사되었다.
두 가지 면역조직화학 염색 방법이 마우스에게서 테스트되었다: (1) Alexa 488과 컨쥬게이트된 인간 GLANS 및 (2) 컨쥬게이트되지 않은 인간 GLANS. Alexa 488에로의 인간 GLANS 컨쥬게이션은 Molecular Probes Alexa Fluor 488 C5 말레이미드 표지 키트(A-10254)를 사용하여 수행되었다. 말레이미드 컨쥬게이션 화학은 단백질 비율에 대해 1:1 표지를 낳았다.
형광 태그가 GLANS의 재흡수를 간섭하지 않았다는 것을 확인하기 위해, 면역세포화학 실험이 배양된 윤활막 세포(ATCC #CRL-1832)를 사용하여 행해졌다. 표준 재흡수 분석이 컨쥬게이트되지 않은 GLANS와 컨쥬게이트된 GLANS(GLANS-A488 또는 GLANS-A555)를 비교하는데 사용되었다. 세포는 GLANS 효소와 4시간 동안 그리고 뒤이어 α-L-이두로니다아제(IDU)와 2시간 동안 배양되었다. 그 결과는 Alexa 488 컨쥬게이션이 세포 재흡수를 간섭하지 않았다는 것을 보여준다. 도 13은 GLANS, GLANS-A488 및 GLANS-A555에 대한 평가된 Kd를 보여준다. 재흡수는 불활성화된 효소를 표지하기 때문에 효소 활성보다는 세포 용해물의 항원 ELISA에 의해 측정되었다. 컨쥬게이션되지 않은 것과 컨쥬게이션 된 GLANS 효소의 Kd는 대략 동등하다고 결정되었다.
일단 GLANS 효소가 세포 내로 도입되면 형광 태그의 안정성을 결정하기 위해, 컨쥬게이션되지 않은 것과 컨쥬게이션된 GLANS 효소에 대한 면역 염색이 수행되었다. 염색에 사용된 주요 항체는 농도 1 ㎍/mL에서 단백질 G-정제된 항-GLANS 토끼 항체였다. 모든 이미지는 메타몰프(MetaMorph) 소프트웨어를 사용하여 Leica IRE2 와일드필드 epi-형광 현미경 상에서 찍혔다. 이미지 스택의 디콘볼루션(deconvolution)이 아웃 오브 플레인(out of plane) 빛의 존재 때문에 이러한 이미지에서 공-국지화를 측정하기 위해 필요했다. 디콘볼루션은 이론적인 점 분산 기능(블라인드 알고리즘)을 사용한 AutoQuant/AutoDeblur 시각화 소프트웨어를 사용하여 행해졌다.
면역염색은 GLANS-A488 물질보다 증폭된 신호와 상당히 우수한 겹침을 보여주었다. 감도에서 관찰된 증가는 첫 번째 및 두 번째 항체 모두 폴리클로날이기 때문이었다.
GLANS 효소가 리소좀에 타깃되었는지 여부를 결정하기 위해, 분자 프로브 리소트랙커(Molecular Probes Lysotracker) 또는 리소좀에 국지화되는 다른 효소와 배양된 윤활막 세포의 면역 염색이 수행되었다. 리소트랙커는 GLANS-488 효소와 몇몇 겹침을 보여주는 것으로 나타냈지만; 염색은 균일하지 않았다. 재조합 인간 N-아세틸갈락토오스 아민-4-술파타아제(rhASB), 리소좀 효소와 2 시간의 추적은 GLANS의 어떤 공-국지화를 보여주지 않았다.
상기 실험은 GLANS-A488 효소가 세포에 의해 흡수되고 리소좀으로 국지화되며, 생체 내 바이오 분포(biodistribution)를 결정하는데 사용될 수 있다는 것을 보여주었다.
두 가지 생체 내 연구가 수행되었다. 첫 번째 실험한 연구는 정상 Bal/c 마우스의 꼬리 정맥에 단일 용량(10 mg/kg) 한 회분 주입이었고, 정상 Balb/c 마우스의 꼬리 정맥에 매 다른 날의 10 mg/kg 멀티(5) 주입의 두 번째 연구가 뒤이었다. 표 13 및 표 14는 각각 첫 번째 및 두 번째 연구의 실험 계획을 설명한다.
첫 번째 실험 연구의 실험 디자인
그룹 총 1시간 시간 점 24시간 시간 점
PBS 대조군 4 2 2
GLANS-A488 4 2 2
표지되지 않은 GLANS 4 2 2
표지되지 않은 ASB 1 1 0
두 번째 연구의 실험 디자인
그룹 총 2시간 시간 점 4시간 시간 점 8시간 시간 점
PBS 대조군 2 1 0 1
PBS/Cys 대조군 4 2 0 2
GLANS-A488 9 3 3 3
표지되지 않은 GLANS 6 3 0 3
표지되지 않은 ASB 3 2 0 1
첫 번째 실험 연구에서, 심장, 간, 및 경골/대퇴골 관절이 2시간 및 24시간 시간점에서 수확되었다. 두 번째 연구에서, 심장, 신장, 간 및 사두근과 가자미근을 가진 뼈가 2시간, 4시간 및 8시간 시간점에서 수확되었다. 두 연구에서, 심장, 신장 및 간은 4일 동안 4% 파라포름알데히드(PFA)에서 담금 고정되었고, 파라핀 도입되었으며, 이후 7 ㎛ 두께로 구획되었다. 두 번째 연구에서 근육을 포함하는 뼈는 8일 동안 4% PFA에 담금 고정되었고, 탈칼슘되었으며, 파라핀 도입되었고, 7 ㎛ 두께로 구획되었다.
GLANS-A488 주입된 마우스의 이미지는 Zeiss 레이져 스캐닝 공초점 현미경 상에서 획득되었다. 첫 번째 실험 연구 분석을 위해, 샘플당 하나의 공초점 스택(stack)이 심장 판막 및 간에 대해 획득되었고 부피 분석에 사용되었다. 두 개의 공초점 스택/샘플이 성장판에 대해 획득되었고 부피 분석에 사용되었다. 두 번째 연구에서, 심장 판막, 신장 및 간에 대한 하나의 공초점 스택/샘플이 획득되었고 부피 분석에 사용되었다; 성장판에 대한 두 개의 공초점 스택/샘플 및 나머지 연골 구역이 획득되었고 부피 분석에 사용되었다.
공초점 현미경 이미지 연구로부터의 결론은: (1) 생체 내 형광 GLANS를 탐지하는 것이 가능했다; (2) 신호는 특정되었고(배경 없음) 국지화는 리소좀이었다; (3) GLANS의 존재는 간의 동모양(sinusoidal) 세포에서 나타내어졌다; (5) 심장에서, GLANS 효소는 격막 및 심방에 존재했지만, 더 중요한 것은 심장 판막의 정도에서 명백히 시각적이었다는 것이고, 이는 멀티 주입 후에 더 깊게 분포되었다; (6) 대퇴골/경골 교차점(junction)에서, GLANS 효소는 뼈(골단)의 미네랄된 부분뿐만 아니라 골수에도 존재했다는 것이다. GLANS는 성장판에 존재했다. 더 구체적으로, GLANS는 나머지 구역(또는 비축 연골 구역)의 연골 세포에 풍부했고, 증식 구역의 시작에 존재했으며, 성장판 끝의 골형성 구역에 풍부하게 다시 나타났다. 비록 멀티 주입의 누적 효과를 정량하기는 어렵지만, 두 번째 연구는 더 넓은 분포를 나타내는 것 같다. 표 15는 공초점 현미경 이미지 연구의 요약을 보여준다.
마우스에서 GLANS의 바이오분포
조직 국지화
뼈(대퇴골)
미네랄화된 영역 예
골수 예
성장판 예
심장
심장 판막 예
심방 예
격막 예
간
간세포 아니오
동모양 세포 예
두 번째 염색을 위한, 첫 번째 단계는 GLANS 제1 항체의 최적화이다. 다양한 조직이 단백질 G-정제된 항-GLANS 토끼 항체와 함께 1:100 내지 1:400의 희석으로 염색되었다. 첫 번째 실험 연구의 결과는 1:100의 희석이 높은 신호 대 잡음비에서 최적이었음을 나타냈다. 본 결과는 두 번째 연구에서 확인되었다. 남은 슬라이드는 1:100의 제1 항체 희석 및 1:1000의 두 번째 항체 희석에서 처리되었다.
GLANS 투약된 Balb/c 마우스에 대한 신호는 단백질 G-정제된 항-GLANS 항체로 염색되었을 때 대조군(즉, PBS-Cys 투약된 마우스) 위의 신호를 가졌다. GLANS 효소가 리소좀에 국지화되었다는 것을 확인하게 위해, 구획이 항-LAMP1 항체로 염색되었다. LAMP1은 리소좀을 위한 마커이다. 이미지는 항-LAMP1과 항-GLANS 항체 사이의 겹침을 보여주었고, GLANS 효소가 리소좀에서 국지화되었음을 나타낸다.
전체적으로, 두 가지 생체 내 연구는 GLANS 바이오분포가 혈관신생과 연관되어 있다는 것, 즉 더 많은 혈관화된 조직이 더 많은 형광 신호를 보유한다는 것을 가리킨다. 더 중요한 것은, 연구들은 이러한 사이트들이 열악하게 혈관화되어 있다 하더라도 모르퀴오 증후군에서 케라탄 술페이트 축적 사이트의 GLANS 존재를 나타낸다는 것이다.
실시예 Ⅹ
리소좀 술파타아제 효소 활성이 결핍된 마우스 에서 재조합 인간 N- 아세틸갈락토사민 -6- 술파타아제(GLANS ) 및 다른 리소좀 술파타아제 효소의 효과
리소좀 술파타아제 효소 활성이 결핍된 마우스에서, 상기 발명의 활성이고 높게 인산화된 인간 리소좀 술파타아제 효소, 즉 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS)의 효과가 평가된다.
재조합 인간 GLANS 단백질은 G71S 세포에서 발현되고 정제된다. 다른 재조합 인간 리소좀 술파타아제 효소는 본 명세서에 설명된 방법 또는 당업계에 알려진 절차에 따라 기본적으로 발현되고 정제될 수 있다.
이염성 백질 이영양증(MLD)(아릴술파타아제 A 결핍)(헤스 등, Proc . Natl . Acad. Sci . USA 93:14821-14826, 1996), 점액 다당류증 타입 Ⅵ(MPS Ⅵ) 또는 마로토-라미(Maroteaux-Lamy) 증후군(아릴술파타아제 B 결핍)(에버스 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93:8214-8219, 1996), 점액 다당류증 타입 Ⅱ(MPS Ⅱ) 또는 헌터 증후군(이두로네이트-2-술파타아제 결핍)(뮤엔저 등, Acta Paediatr . Suppl. 91(439):98-99, 2002; Cardone et al ., Hum . Mol . Genet. 15:1225-1236, 2006), 점액 다당류증 타입 Ⅲa(MPS Ⅲa) 또는 산필리포(Sanfilippo) A 증후군(술파미다아제/헤파란-N-술파타아제 결핍)(하우믹 등, Glycobiology 9(12):1389-1396, 1999), 점액 다당류증 타입 Ⅳa(MPS Ⅳa) 또는 모르퀴오 A 증후군(N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제 결핍)(토마츄 등, Hum . Mol . Genet. 12:3349-3358, 2003), 복합 술파타아제 결핍(MSD)(술파타아제 변형 인자 1 결핍)(세템브레 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 104:4506-4511, 2007)을 포함하는 인간 리소좀 술파타아제 효소 결핍의 여러 마우스 모델이 설명된다. 점액 다당류증 타입 Ⅲd(MPS Ⅲd) 또는 산필리포 D 증후군(N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제 결핍)의 마우스 모델은 아직 설명되지 않는다.
인간 리소좀 술파타아제 효소 결핍의 마우스 모델은 리소좀 저장 장애를 치료하는 수단으로써 효소 대체 치료(ERT)의 실행 가능성을 평가하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, MPS Ⅳa 녹아웃 마우스(GLANS-/- 마우스; 토마츄 등, Hum . Mol . Genet. 12:3349-3358, 2003)는 탐지할 수 없는 GLANS 효소 활성을 가지며 증가된 뇨 글라이코사미노글리칸(GAGs), 즉 케라탄 술페이트 및 콘드로이틴-6-술페이트를 나타내고, 간, 신장, 비장, 심장, 뇌, 골수 및 연골을 예로 들 수 있는 여러 조직 및 기관에 GAGs의 축적을 나타낸다. GLANS-/- 마우스는, 그러나, 인간 질환과 관련된 골격 이상을 보이지는 않는다. 다른 MPS Ⅳa 마우스 모델은 불활성 인간 GLANS 및 돌연변이되고 불활성인 내인성 마우스 GLANS(GLANStm ( hC79 . mC76S )slu 마우스; 토마츄 등., Hum . Mol . Genet. 14:3321-3335, 2005)를 발현하도록 개발되었다. GLANStm( hC79 . mC76S )slu 마우스에서, 탐지할 수 없는 GLANS 효소 활성을 가지고, 뇨 GAGs 배설이 증가되며, 내장 기관, 뇌, 각막, 뼈, 인대 및 골수를 포함하는 여러 조직에서 GAGs가 축적되고, 리소좀 저장이 여러 조직에 표시되며, 뼈 저장이 분명하다. GLANStm ( hC79 . mC76S )slu 마우스에서의 병리학적 변화는 GLANS-/- 마우스에서 관찰되는 것과 다르다. 그러나 GLANS-/- 마우스와 같이, GLANStm ( hC79 . mC76S )slu 마우스는 인간 질환과 관련된 골격 이상을 나타내지 않는다. 그러므로, GLANS-/- 또는 GLANStm ( hC79 . mC76S )slu 마우스는 증가된 뇨 GAGs 및 조직에서의 GAGs 축적으로 재조합 인간 GLANS 투여의 효과를 조사하는데 사용될 수 있다.
4주령 GLANS-/- , GLANStm ( hC79 . mC76S )slu 또는 와일드-타입 마우스에게 다양한 용량의 재조합 인간 GLANS(예를 들어, 0.1, 0.3, 1, 3, 10 mg/kg) 또는 16-20주령에 걸친 운반체 대조군에게 주 간격 정맥 투여가 주어졌고, 이후 조직학적인 실험을 위해 희생되었다. 마우스 및 뇨 GAG 배설로부터 수집된 뇨가 설명된 것(토마츄 등, Hum . Mol. Genet. 12:3349-3358, 2003)처럼 결정된다. 다양한 조직의 병리학적 실험은 설명된 것(토마츄 등., Hum . Mol . Genet. 12:3349-3358, 2003)처럼 수행된다.
GLANS-/- 또는 GLANStm ( hC79 . mC76S )slu 마우스를 사용하여, 상기 발명의 재조합 인간 GLANS는 (1) 뇨 GAG 배설; (2) 내장 기관, 뇌, 각막, 뼈, 인대 및 골수를 예로 들 수 있는 여러 조직에서 GAGs의 축적; (3) 다양한 조직에서 리소좀 저장; 및 (4) 뼈 저장을 감소하는 능력을 나타낼 것으로 기대된다.
재조합 인간 GLANS의 효과는 복합 술파타아제 결핍(MSD)(SUMF1-/- 마우스; 세템브레 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 104:4506-4511, 2007)의 마우스 모델에서 조사된다. SUMF1-/- 마우스가 종종 조기 사망을 나타내기 때문에, 재조합 인간 GLANS를 가진 이러한 마우스의 주입은 상기 GLANS-/- 마우스에서 설명된 것보다 일찍 개시된다.
당업계에 알려진 과정을 따라, 다른 재조합 인간 리소좀 술파타아제 효소, 즉, 아릴술파타아제 A, 아릴술파타아제 B, 이두로네이트-2-술파타아제, 술파미다아제/헤파린-N-술파타아제 및 N-아세틸글루코사민-6-술파타아제의 효과가 MLD 마우스 모델(ASA-/- 마우스; 헤스 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93:14821-14826, 1996), MPS VI(As1 -s -/- 마우스; 에버스 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93:8214-8219, 1996), MPS II(ids y /- 마우스; 카르돈 등, Hum . Mol . Genet. 15:1225-1236, 2006), MPS IIIa(하우믹 등, Glycobiology 9(12):1389-1396, 1999) 및 MSD(SUMF1 -/- 마우스; 세템브레 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 104:4506-4511, 2007)에서 조사된다.
실시예 ⅩⅠ
재조합 인간 N- 아세틸갈락토사민 -6- 술파타아제 ( GLANS ) 및 다른 리소좀 술파 타아제 효소로 점액 다당류증 타입 ⅣA(또는 모르퀴오 증후군) 또는 다른 리소좀 술파타아제 효소 결핍을 가진 인간 환자의 치료
점액 다당류증 타입 ⅣA(MPS Ⅳa 또는 모르퀴오 증후군)으로 진단된 환자와 같은 리소좀 술파타아제 효소 결핍의 임상적 표현형을 나타내는 인간 환자는 재조합 효소, 즉 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제(GLANS)로의 효소 대체 치료가 고려된다. 리소좀 술파타아제 효소 결핍을 앓는 모든 환자는 구체적 리소좀 저장 질환과 관련된 다양한 정도의 기능적 장애 또는 악화된 건강 상태에 의해 나타내어지는 그들의 리소좀에 저장 물질의 과도하거나 해로운 내장 및 연조직 축적의 몇몇 임상적 증거를 나타낸다. 모든 MPS Ⅳa 환자는 뼈 기형, 작은 키 및 비정상적 걸음걸이 및/또는 혈액 또는 뇨에 글라이코사미노글리칸(GAG) 축적의 몇몇 임상적 증거를, 다양한 정도의 기능적 장애를 가지면서 나타낸다.
바람직하게, 리소좀 술파타아제 효소 결핍을 앓는 환자들에게서 효소 정도를 모니터링하여 그들의 조직에서 리소좀 술파타아제 효소의 결여되거나 감소된 활성을 확인한다. 정상 대상과 달리 10% 미만, 바람직하게 5% 미만, 더 바람직하게 2% 미만, 더욱 더 바람직하게 1% 미만의 리소좀 효소 활성을 가지는 환자들은 적절한 리소좀 술파타아제 효소로 치료되기 적합한 후보들이다. 데이터는 치료 전, 동안 및 후에 환자의 리소좀 술파타아제 효소 활성을 결정하기 위해 수집될 수 있다.
효능은 시간에 걸친 기질, 즉 리소좀 술파타아제 효소의 글라이코사미노글리칸(GAG) 뇨 배설에서의 퍼센트 감소를 측정함으로써 결정된다. 리소좀 술파타아제 효소 결핍을 앓는 환자들의 뇨 GAG 정도는 정상 배설 정도 및/또는 치료되지 않은 동일한 리소좀 술파타아제 효소 결핍을 앓는 환자들 및/또는 동일한 환자의 리소좀 술파타아제 효소로 치료 전 정도와 대비된다. 리소좀 술파타아제 효소의 치료 후 분해되지 않은 GAGs의 배설이 25% 이상 감소, 바람직하게 50% 이상 감소하는 것은 개인의 치료 반응을 측정하는 유효한 수단이다.
효능은 또한 리소좀 저장 질환과 관련된 병리학적 신호 및 증상의 감소에 따라 결정될 수 있다. 효능은 리소좀, 세포 또는 조직에서 GAGs가 감소된 정도를 결정하는 조직 생체 검사 및 세포 및/또는 리소좀 실험에 의해 결정될 수 있다. 효능은 주관적 또는 객관적일 수 있는(예를 들어, 감소된 고통 또는 기능상 곤란성, 증가된 근육 강도 또는 체력, 증가된 심박출량, 운동 인내력, 체중, 키 또는 외모 변화 등) 기능적 평가에 의해 결정될 수 있다.
약학적 조성물은 G71S 세포에서 발현되고 정제된 인간 GLANS를 포함하며, 당업계에 알려진 방법에 따라 제형화된다. 상기 발명의 약학적 조성물은 정맥으로 투여되는 것이 바람직하다.
MPS Ⅳa 환자들에게 재조합 인간 GLANS 투여의 효과를 조사하는 초기 임상 연구의 기본 디자인은 오픈 라벨, 다양한 용량의 효소가 주간 효소 주입을 예로 들 수 있으나 이에 제한되지 않는 고정된 간격으로, 환자에게 정맥 투여되는 용량 단계적 증가 안전성/효능 연구를 포함한다.
MPS Ⅳa 환자들에게, 효능은 예를 들어 몇 주의 ERT 이내에 관찰될 것 같은 감소된 혈액 또는 뇨 GAG, 몇 달의 ERT 이내에 관찰될 것 같은 심장, 폐 및/또는 운동 기능 테스트에서의 증가된 인내력 및/또는 몇 년의 ERT 이내에 관찰될 것 같은 골격 변화 및/또는 신체 성장을 측정함으로써 결정된다.
뇨 GAG 측정은 시간에 걸친 뇨 GAG 배설의 퍼센트 감소를 측정함으로써, 적절한 용량 용법을 수립하는 것뿐만 아니라 효능을 결정하는 것에도 유용하다.
걷기 테스트(6분 또는 12분 동안 걸은 거리), 계단 오르기(분당 오른 계단) 및 심장 기능(ECG, 심장초음파), 폐 기능(FVC, FEV1, 피크 플로우)을 포함하는 폐/호흡 기능을 예로 들 수 있으나 이에 제한되지 않는 것을 포함하는 다양한 인내력 테스트가 도입될 수 있다.
연장된 기간 동안 치료를 받은 어린 환자들에게 있어 성장(키)이 측정될 수 있다.
본 발명의 방법을 사용하여 치료되거나 예방될 수 있는 리소좀 술파타아제 효소 활성 결핍과 관련된 리소좀 저장 질환은: 이염성 백질 이영양증(Metachromatic Leukodystrophy, MLD), 점액 다당류증 타입 Ⅵ(Mucopolysaccharidosis type VI, MPS VI) 또는 마로토-라미(Maroteaux-Lamy) 증후군, 점액 다당류증 타입 Ⅱ(MPS Ⅱ) 또는 헌터 증후군, 점액 다당류증 타입 Ⅲa(MPS Ⅲa) 또는 산필리포(Sanfilippo) A 증후군, 점액 다당류증 타입 Ⅲd(MPS Ⅲd) 또는 산필리포 D 증후군, 점액 다당류증 타입 Ⅳa(MPS Ⅳa) 또는 모르퀴오 A 증후군 또는 복합 술파타아제 결핍(MSD)이다. 각 리소좀 저장 질환에 대해, 재조합 리소좀 술파타아제 효소는 특정 리소좀 술파타아제 효소를 포함할 것이다.
MLS와 관련한 방법에 있어, 바람직한 리소좀 술파타아제 효소는 아릴술파타아제 A이다. MPS VI와 관련한 방법에 있어, 바람직한 리소좀 술파타아제 효소는 아릴술파타아제 B이다. MPS Ⅱ와 관련한 방법에 있어, 바람직한 리소좀 술파타아제 효소는 이두로네이트-2-술파타아제이다. MPS ⅢA와 관련한 방법에 있어, 바람직한 리소좀 술파타아제 효소는 술파미다아제/헤파란-N-술파타아제이다. MPS ⅢD와 관련한 방법에 있어, 바람직한 리소좀 술파타아제 효소는 N-아세틸글루코사민-6-술파타아제이다. MPS ⅣA와 관련한 방법에 있어, 바람직한 리소좀 술파타아제 효소는 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제이다. MSD와 관련한 방법에 있어, 바람직한 리소좀 술파타아제 효소는 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제이다.
*****
상기 예시적인 실시예에 설명된 상기 발명의 수많은 변형과 변동이 당업자에 의해 일어나는 것으로 생각된다. 결론적으로, 상기 발명에는 첨부된 청구항에 나타나는 그러한 제한만이 있어야만 한다.
SEQUENCE LISTING <110> BIOMARIN PHARMACEUTICAL INC. <120> MANUFACTURE OF ACTIVE HIGHLY PHOSPHORYLATED HUMAN LYSOSOMAL SULFATASE ENZYMES AND USES THEREOF <130> IF10P081US <150> 61/022,179 <151> 2008-01-18 <150> 61/099,373 <151> 2008-09-23 <150> 61/110,246 <151> 2008-10-31 <160> 5 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 1125 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Human Sulfatase Modifying Factor 1 (SUMF1) Polynucleotide Sequence <400> 1 atggctgcgc ccgcactagg gctggtgtgt ggacgttgcc ctgagctggg tctcgtcctc 60 ttgctgctgc tgctctcgct gctgtgtgga gcggcaggga gccaggaggc cgggaccggt 120 gcgggcgcgg ggtcccttgc gggttcttgc ggctgcggca cgccccagcg gcctggcgcc 180 catggcagtt cggcagccgc tcaccgatac tcgcgggagg ctaacgctcc gggccccgta 240 cccggagagc ggcaactcgc gcactcaaag atggtcccca tccctgctgg agtatttaca 300 atgggcacag atgatcctca gataaagcag gatggggaag cacctgcgag gagagttact 360 attgatgcct tttacatgga tgcctatgaa gtcagtaata ctgaatttga gaagtttgtg 420 aactcaactg gctatttgac agaggctgag aagtttggcg 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10 15 Gly Leu Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu Cys Gly Ala Ala 20 25 30 Gly Ser Gln Glu Ala Gly Thr Gly Ala Gly Ala Gly Ser Leu Ala Gly 35 40 45 Ser Cys Gly Cys Gly Thr Pro Gln Arg Pro Gly Ala His Gly Ser Ser 50 55 60 Ala Ala Ala His Arg Tyr Ser Arg Glu Ala Asn Ala Pro Gly Pro Val 65 70 75 80 Pro Gly Glu Arg Gln Leu Ala His Ser Lys Met Val Pro Ile Pro Ala 85 90 95 Gly Val Phe Thr Met Gly Thr Asp Asp Pro Gln Ile Lys Gln Asp Gly 100 105 110 Glu Ala Pro Ala Arg Arg Val Thr Ile Asp Ala Phe Tyr Met Asp Ala 115 120 125 Tyr Glu Val Ser Asn Thr Glu Phe Glu Lys Phe Val Asn Ser Thr Gly 130 135 140 Tyr Leu Thr Glu Ala Glu Lys Phe Gly Asp Ser Phe Val Phe Glu Gly 145 150 155 160 Met Leu Ser Glu Gln Val Lys Thr Asn Ile Gln Gln Ala Val Ala Ala 165 170 175 Ala Pro Trp Trp Leu Pro Val Lys Gly Ala Asn Trp Arg His Pro Glu 180 185 190 Gly Pro Asp Ser Thr Ile Leu His Arg Pro Asp His Pro Val Leu His 195 200 205 Val Ser Trp Asn Asp Ala Val Ala Tyr Cys Thr Trp Ala Gly Lys Arg 210 215 220 Leu Pro Thr Glu Ala Glu Trp Glu Tyr Ser Cys Arg Gly Gly Leu His 225 230 235 240 Asn Arg Leu Phe Pro Trp Gly Asn Lys Leu Gln Pro Lys Gly Gln His 245 250 255 Tyr Ala Asn Ile Trp Gln Gly Glu Phe Pro Val Thr Asn Thr Gly Glu 260 265 270 Asp Gly Phe Gln Gly Thr Ala Pro Val Asp Ala Phe Pro Pro Asn Gly 275 280 285 Tyr Gly Leu Tyr Asn Ile Val Gly Asn Ala Trp Glu Trp Thr Ser Asp 290 295 300 Trp Trp Thr Val His His Ser Val Glu Glu Thr Leu Asn Pro Lys Gly 305 310 315 320 Pro Pro Ser Gly Lys Asp Arg Val Lys Lys Gly Gly Ser Tyr Met Cys 325 330 335 His Arg Ser Tyr Cys Tyr Arg Tyr Arg Cys Ala Ala Arg Ser Gln Asn 340 345 350 Thr Pro Asp Ser Ser Ala Ser Asn Leu Gly Phe Arg Cys Ala Ala Asp 355 360 365 Arg Leu Pro Thr Met Asp 370 <210> 3 <211> 1569 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Human N-Acetylgalactosamine-6_Sulfatase (GALNS) Polynucleotide Sequence <400> 3 atggcggcgg ttgtcgcggc gacgaggtgg tggcagctgt tgctggtgct cagcgccgcg 60 gggatggggg cctcgggcgc cccgcagccc cccaacatcc tgctcctgct 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Pro Gln Pro Pro Asn 20 25 30 Ile Leu Leu Leu Leu Met Asp Asp Met Gly Trp Gly Asp Leu Gly Val 35 40 45 Tyr Gly Glu Pro Ser Arg Glu Thr Pro Asn Leu Asp Arg Met Ala Ala 50 55 60 Glu Gly Leu Leu Phe Pro Asn Phe Tyr Ser Ala Asn Pro Leu Cys Ser 65 70 75 80 Pro Ser Arg Ala Ala Leu Leu Thr Gly Arg Leu Pro Ile Arg Asn Gly 85 90 95 Phe Tyr Thr Thr Asn Ala His Ala Arg Asn Ala Tyr Thr Pro Gln Glu 100 105 110 Ile Val Gly Gly Ile Pro Asp Ser Glu Gln Leu Leu Pro Glu Leu Leu 115 120 125 Lys Lys Ala Gly Tyr Val Ser Lys Ile Val Gly Lys Trp His Leu Gly 130 135 140 His Arg Pro Gln Phe His Pro Leu Lys His Gly Phe Asp Glu Trp Phe 145 150 155 160 Gly Ser Pro Asn Cys His Phe Gly Pro Tyr Asp Asn Lys Ala Arg Pro 165 170 175 Asn Ile Pro Val Tyr Arg Asp Trp Glu Met Val Gly Arg Tyr Tyr Glu 180 185 190 Glu Phe Pro Ile Asn Leu Lys Thr Gly Glu Ala Asn Leu Thr Gln Ile 195 200 205 Tyr Leu Gln Glu Ala Leu Asp Phe Ile Lys Arg Gln Ala Arg His His 210 215 220 Pro Phe Phe Leu Tyr Trp Ala Val Asp Ala Thr His Ala Pro Val Tyr 225 230 235 240 Ala Ser Lys Pro Phe Leu Gly Thr Ser Gln Arg Gly Arg Tyr Gly Asp 245 250 255 Ala Val Arg Glu Ile Asp Asp Ser Ile Gly Lys Ile Leu Glu Leu Leu 260 265 270 Gln Asp Leu His Val Ala Asp Asn Thr Phe Val Phe Phe Thr Ser Asp 275 280 285 Asn Gly Ala Ala Leu Ile Ser Ala Pro Glu Gln Gly Gly Ser Asn Gly 290 295 300 Pro Phe Leu Cys Gly Lys Gln Thr Thr Phe Glu Gly Gly Met Arg Glu 305 310 315 320 Pro Ala Leu Ala Trp Trp Pro Gly His Val Thr Ala Gly Gln Val Ser 325 330 335 His Gln Leu Gly Ser Ile Met Asp Leu Phe Thr Thr Ser Leu Ala Leu 340 345 350 Ala Gly Leu Thr Pro Pro Ser Asp Arg Ala Ile Asp Gly Leu Asn Leu 355 360 365 Leu Pro Thr Leu Leu Gln Gly Arg Leu Met Asp Arg Pro Ile Phe Tyr 370 375 380 Tyr Arg Gly Asp Thr Leu Met Ala Ala Thr Leu Gly Gln His Lys Ala 385 390 395 400 His Phe Trp Thr Trp Thr Asn Ser Trp Glu Asn Phe Arg Gln Gly Ile 405 410 415 Asp Phe Cys Pro Gly Gln Asn Val Ser Gly Val Thr Thr His Asn Leu 420 425 430 Glu Asp His Thr Lys Leu Pro Leu Ile Phe His Leu Gly Arg Asp Pro 435 440 445 Gly Glu Arg Phe Pro Leu Ser Phe Ala Ser Ala Glu Tyr Gln Glu Ala 450 455 460 Leu Ser Arg Ile Thr Ser Val Val Gln Gln His Gln Glu Ala Leu Val 465 470 475 480 Pro Ala Gln Pro Gln Leu Asn Val Cys Asn Trp Ala Val Met Asn Trp 485 490 495 Ala Pro Pro Gly Cys Glu Lys Leu Gly Lys Cys Leu Thr Pro Pro Glu 500 505 510 Ser Ile Pro Lys Lys Cys Leu Trp Ser His 515 520 <210> 5 <211> 496 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ala Pro Gln Pro Pro Asn Ile Leu Leu Leu Leu Met Asp Asp Met Gly 1 5 10 15 Trp Gly Asp Leu Gly Val Tyr Gly Glu Pro Ser Arg Glu Thr Pro Asn 20 25 30 Leu Asp Arg Met Ala Ala Glu Gly Leu Leu Phe Pro Asn Phe Tyr Ser 35 40 45 Ala Asn Pro Leu Cys Ser Pro Ser Arg Ala Ala Leu Leu Thr Gly Arg 50 55 60 Leu Pro Ile Arg Asn Gly Phe Tyr Thr Thr Asn Ala His Ala Arg Asn 65 70 75 80 Ala Tyr Thr Pro Gln Glu Ile Val Gly Gly Ile Pro Asp Ser Glu Gln 85 90 95 Leu Leu Pro Glu Leu Leu Lys Lys Ala Gly Tyr Val Ser Lys Ile Val 100 105 110 Gly Lys Trp His Leu Gly His Arg Pro Gln Phe His Pro Leu Lys His 115 120 125 Gly Phe Asp Glu Trp Phe Gly Ser Pro Asn Cys His Phe Gly Pro Tyr 130 135 140 Asp Asn Lys Ala Arg Pro Asn Ile Pro Val Tyr Arg Asp Trp Glu Met 145 150 155 160 Val Gly Arg Tyr Tyr Glu Glu Phe Pro Ile Asn Leu Lys Thr Gly Glu 165 170 175 Ala Asn Leu Thr Gln Ile Tyr Leu Gln Glu Ala Leu Asp Phe Ile Lys 180 185 190 Arg Gln Ala Arg His His Pro Phe Phe Leu Tyr Trp Ala Val Asp Ala 195 200 205 Thr His Ala Arg Val Tyr Ala Ser Lys Pro Phe Leu Gly Thr Ser Gln 210 215 220 Arg Gly Arg Tyr Gly Asp Ala Val Arg Glu Ile Asp Asp Ser Ile Gly 225 230 235 240 Lys Ile Leu Glu Leu Leu Gln Asp Leu His Val Ala Asp Asn Thr Phe 245 250 255 Val Phe Phe Thr Ser Asp Asn Gly Ala Ala Leu Ile Ser Ala Pro Glu 260 265 270 Gln Gly Gly Ser Asn Gly Pro Phe Leu Cys Gly Lys Gln Thr Thr Phe 275 280 285 Glu Gly Gly Met Arg Glu Pro Ala Leu Ala Trp Trp Pro Gly His Val 290 295 300 Thr Ala Gly Gln Val Ser His Gln Leu Gly Ser Ile Met Asp Leu Phe 305 310 315 320 Thr Thr Ser Leu Ala Leu Ala Gly Leu Thr Pro Pro Ser Asp Arg Ala 325 330 335 Ile Asp Gly Leu Asn Leu Leu Pro Thr Leu Leu Gln Gly Arg Leu Met 340 345 350 Asp Arg Pro Ile Phe Tyr Tyr Arg Gly Asp Thr Leu Met Ala Ala Thr 355 360 365 Leu Gly Gln His Lys Ala His Phe Trp Thr Trp Thr Asn Ser Trp Glu 370 375 380 Asn Phe Arg Gln Gly Ile Asp Phe Cys Pro Gly Gln Asn Val Ser Gly 385 390 395 400 Val Thr Thr His Asn Leu Glu Asp His Thr Lys Leu Pro Leu Ile Phe 405 410 415 His Leu Gly Arg Asp Pro Gly Glu Arg Phe Pro Leu Ser Phe Ala Ser 420 425 430 Ala Glu Tyr Gln Glu Ala Leu Ser Arg Ile Thr Ser Val Val Gln Gln 435 440 445 His Gln Glu Ala Leu Val Pro Ala Gln Pro Gln Leu Asn Val Cys Asn 450 455 460 Trp Ala Val Met Asn Trp Ala Pro Pro Gly Cys Glu Lys Leu Gly Lys 465 470 475 480 Cys Leu Thr Pro Pro Glu Ser Ile Pro Lys Lys Cys Leu Trp Ser His 485 490 495

Claims (42)

  1. 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제 효소 조성물로서,
    상기 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제 효소는 효소 기능 도메인을 포함하고, 상기 효소 기능 도메인은 SEQ ID NO:4의 27 내지 522 의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 효소 결핍에 의해 야기되거나 그와 관련된 리소좀 저장 질환을 앓고 있는 대상을 치료하기에 유용하고,
    상기 효소는:
    (a) 비-환원 조건 하에서 SDS-PAGE로 수행되는 경우 쿠마시 블루(Coomassie Blue) 염색에 의해 결정될 때 95% 이상의 순도를 가지고;
    (b) 위치 53에서 시스테인 잔기의 Cα-포밀글리신(formylglycine, FGly)으로의 전환이 50% 이상이며;
    (c) 위치 178 및 397의 아스파라긴 잔기에서 N-연결된 글리코실화되며, 상기 위치 178의 아스파라긴 잔기에 부착된 올리고만노즈(oligomannose) 체인의 50% 이상은 비스(bis)-인산화된 것인 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제 효소 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 리소좀 저장 질환은 점액 다당류증(Mucopolysaccharidosis) 타입 Ⅳa(MPS Ⅳa) 또는 모르퀴오(Morquio) A 증후군인 것을 특징으로 하는 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제 효소 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 리소좀 저장 질환은 복합 술파타아제 결핍(Multiple Sulfatase Deficiency)인 것을 특징으로 하는 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제 효소 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 효소는 환원 조건 하에서 SDS-PAGE로 수행되는 경우 쿠마시 블루 염색에 의해 결정될 때 가시적인 단백질이 75% 이상인 55-60 kDa의 주요 밴드로 이루어진 것을 특징으로 하는 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제 효소 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 효소는 환원 조건 하에서 SDS-PAGE로 수행되는 경우 쿠마시 블루 염색에 의해 결정될 때 가시적인 단백질이 85% 이상인 55-60 kDa의 주요 밴드로 이루어진 것을 특징으로 하는 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제 효소 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 효소는 환원 조건 하에서 SDS-PAGE로 수행되는 경우 쿠마시 블루 염색에 의해 결정될 때 가시적인 단백질이 90% 이상인 55-60 kDa의 주요 밴드로 이루어진 것을 특징으로 하는 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제 효소 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 효소는 위치 53에서 시스테인 잔기의 Cα-포밀글리신(formylglycine, FGly)으로의 전환이 70% 이상인 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제 효소 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 효소는 위치 53에서 시스테인 잔기의 Cα-포밀글리신(formylglycine, FGly)으로의 전환이 90% 이상인 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제 효소 조성물.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 효소는 상기 효소의 N- 또는 C-말단에 위치하는 세포 타깃팅 신호를 포함하는 융합 단백질인 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제 효소 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 세포 타깃팅 신호는 뼈 타깃팅 펩타이드를 포함하는 것인 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제 효소 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 뼈 타깃팅 펩타이드는 6개의 아스파트 산 잔기로 구성된 것인 재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제 효소 조성물.
  12. 리소좀 저장 질환 치료용 약학적 조성물로서,
    재조합 인간 N-아세틸갈락토사민-6-술파타아제 효소 조성물을 포함하고,
    상기 리소좀 저장 질환은 점액 다당류증 타입 IVa(MPS IVa) 또는 모르퀴오 A증후군, 또는 복합 술파타아제 결핍(MSD)을 포함하며,
    상기 효소는 효소 기능 도메인을 포함하고, 상기 효소 기능 도메인은 SEQ ID NO:4의 27 내지 522 의 아미노산 서열로 이루어지고,
    상기 효소는:
    (a) 비-환원 조건 하에서 SDS-PAGE로 수행되는 경우 쿠마시 블루(Coomassie Blue) 염색에 의해 결정될 때 95% 이상의 순도를 가지고;
    (b) 위치 53에서 시스테인 잔기의 Cα-포밀글리신(formylglycine, FGly)으로의 전환이 50% 이상이며;
    (c) 위치 178 및 397의 아스파라긴 잔기에서 N-연결된 글리코실화되며, 상기 위치 178의 아스파라긴 잔기에 부착된 올리고만노즈(oligomannose) 체인의 50% 이상은 비스(bis)-인산화된 것인 리소좀 저장 질환 치료용 약학적 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 효소는 환원 조건 하에서 SDS-PAGE로 수행되는 경우 쿠마시 블루 염색에 의해 결정될 때 가시적인 단백질이 75% 이상인 55-60 kDa의 주요 밴드로 이루어진 것을 특징으로 하는 리소좀 저장 질환 치료용 약학적 조성물.
  14. 제 12 항에 있어서,
    상기 효소는 환원 조건 하에서 SDS-PAGE로 수행되는 경우 쿠마시 블루 염색에 의해 결정될 때 가시적인 단백질이 85% 이상인 55-60 kDa의 주요 밴드로 이루어진 것을 특징으로 하는 리소좀 저장 질환 치료용 약학적 조성물.
  15. 제 12 항에 있어서,
    상기 효소는 환원 조건 하에서 SDS-PAGE로 수행되는 경우 쿠마시 블루 염색에 의해 결정될 때 가시적인 단백질이 90% 이상인 55-60 kDa의 주요 밴드로 이루어진 것을 특징으로 하는 리소좀 저장 질환 치료용 약학적 조성물.
  16. 제 12 항에 있어서,
    상기 효소는 위치 53에서 시스테인 잔기의 Cα-포밀글리신(formylglycine, FGly)으로의 전환이 70% 이상인 리소좀 저장 질환 치료용 약학적 조성물.
  17. 제 12 항에 있어서,
    상기 효소는 위치 53에서 시스테인 잔기의 Cα-포밀글리신(formylglycine, FGly)으로의 전환이 90% 이상인 리소좀 저장 질환 치료용 약학적 조성물.
  18. 제 12 항에 있어서,
    상기 효소는 상기 효소의 N- 또는 C-말단에 위치하는 세포 타깃팅 신호를 포함하는 융합 단백질인 리소좀 저장 질환 치료용 약학적 조성물.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 세포 타깃팅 신호는 뼈 타깃팅 펩타이드를 포함하는 것인 리소좀 저장 질환 치료용 약학적 조성물.
  20. 제 19 항에 있어서,
    상기 뼈 타깃팅 펩타이드는 6개의 아스파트 산 잔기로 구성된 것인 리소좀 저장 질환 치료용 약학적 조성물.
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