JP2007535317A - 下等真核生物におけるガラクトシル化された糖タンパク質の産生 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2003年2月20日に出願された米国特許出願第10/371,877号の一部継続出願であり、前記特許出願は、米国特許法第119(e)に基づいて、2000年6月28日に出願された米国仮出願第60/214,358号、及び2001年3月30日に出願された米国仮出願第60/279,997号の利益を主張する、2001年6月27日に出願された米国特許出願第09/892,591号の一部継続出願であり、これらは各々、その全体を参照により本明細書に組み込まれる。本願は、2001年12月27日に出願した米国仮出願第60/344,169号の利益を主張する、2002年12月24日に出願されたPCT/US02/41510の一部継続出願であり、前記出願は各々、その全体を参照により本明細書に組み込まれる。本願は、2004年4月15日に出願した米国仮出願第60/562,424号に対する優先権も主張し、前記出願は、その全内容が参考文献により本明細書に組み込まれる。
本発明は、下等真核生物におけるタンパク質のグリコシル化の分野、特に末端のガラクトース残基を有する糖タンパク質の産生に関する。本発明はさらに、グリカン上でのガラクトシル転移に関与する酵素をコード化する遺伝子を含む新規の宿主細胞及び、治療剤として特に有用な糖タンパク質の産生に関する。
本発明は、ヒト様糖タンパク質が末端β−ガラクトース残基を有し、フコース及びシアル酸を本質的に欠失することを特徴とする、前記糖タンパク質を産生する組換え型下等真核宿主細胞を提供する。ある実施態様において、本発明は、UDP−ガラクトース輸送体をコード化する少なくとも第二の単離された核酸分子、UDP−ガラクトース4−エピメラーゼをコード化する単離された核酸又はガラクトキナーゼ若しくはガラクトース−1−リン酸ウリジルトランスフェラーゼをコード化する単離された核酸との組み合わせでUDP−ガラクトース:β−N−アセチルグルコサミンβ1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼ(β1,4GalT)をコード化する単離された核酸分子を含む下等真核宿主細胞を提供する。別の実施態様において、β1,4GalTは、UDP−ガラクトース輸送体をコード化する単離された核酸分子及びUDP−ガラクトース4−エピメラーゼをコード化する単離された核酸分子との組み合わせで発現する。前述の酵素をコード化する前記核酸配列の変異体及び断片、組換えDNA分子、及び形質転換向けの前記酵素をコード化する核酸配列も提供される。
ヒトb−1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼI遺伝子(hGalTI、Genbank AH003575)を、プライマーRCD192(配列番号1)及びRCD186(配列番号2)を使用して、ヒト腎cDNA(マラソンレディcDNA、Clontech)からPCR増幅した。このPCR産物を、クローニングし配列決定したpCR2.1(Invitrogen)中にクローニングした。このクローンから、PCR重複変異誘発を実施した。前記遺伝子のNotI部位までの5’末端を、プライマーRCD198(配列番号3)及びRCD201(配列番号4)を使用して増幅し、前記3’末端を、プライマーRCD200(配列番号5)及びRCD199(配列番号6)を使用して増幅した。前記産物をプライマーRCD198(配列番号3)及びRCD199(配列番号6)と互いに重ねて、前記NotI部位を除去しながら(43個のアミノ酸のN末端欠失を除く)前記野生型アミノ酸配列を用いて前記ORFを再合成した。前記新たな切断したhGalTI PCR産物をpCR2.1中にクローニングし、配列決定した。次に、導入したAscI/PacI部位を使用して、前記断片を、pRCD260を作製するPpURA3/HYGRロールインベクターであるプラスミドpRCD259(図1)へとサブクローニングした(図1)(実施例4)。
β1,4GalT活性をコード化する遺伝子又はβ1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性をコード化する組換え型核酸分子、β1,4GalT活性をコード化する遺伝子融合体(例、pXB53)(図1)又はβ1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼをコード化する核酸分子(Genbank AH003575)からの発現を下等真核宿主細胞(例、P.パストリス(pastoris))へ導入して発現させ、ガラクトシル化した糖タンパク質を産生した。あるいは、β−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性の活性化によって、下等真核宿主細胞を遺伝子工学的に改変し、ガラクトシル化した糖形態を産生する。触媒活性のあるβ1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼドメイン又はその一部は、UDP−ガラクトースから、β1,4−Galグリコシド結合を形成するオリゴ糖受容体基質(例、GlcNAc2Man3GlcNAc2)の末端GlcNAc残基へのガラクトース残基の転移を触媒する。本発明に従って産生される複雑なガラクトシル化したN−グリカンはフコース及びシアル酸を本質的に欠失している(例、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2)。ガラクトシル化し、脱フコシル化し、脱シアル酸付加したこのような糖タンパク質組成物は、治療剤として有用である。
本発明に関連する態様において、β1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼ及び酵母指向性配列膜貫通ドメインのコンビナトリアルDNAライブラリを作製し、WO02/00879において記載されるていように下等真核宿主細胞において発現させる。
(48個のリーダー配列(WO02/00879)からなる)単離された酵母指向性配列膜貫通ドメインのライブラリを、hGalTI遺伝子の上流にあるpRCD260上のNotI/AscI部位に連結し、プラスミドpXB20−pXB67を作製した(各プラスミドは1つのリーダー配列を有する。)。
本発明の方法にしたがって産生されるヒト様ガラクトシル化糖タンパク質には、GalGlcNAcMan3GlcNAc2、GalGlcNAc2Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、GalGlcNAc3Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2、GalGlcNAc4Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc4Man3GlcNAc2、Gal3GlcNAc4Man3GlcNAc2、Gal4GlcNAc4Man3GlcNAc2、GalGlcNAcMan5GlcNAc2、GalGlcNAcMan5GlcNAc2、GalGlcNAc2Man5GlcNAc2、Gal2GlcNAc2Man5GlcNAc2、GalGlcNacMan5GlcNAc2、GalGlcNAc2Man5GlcNAc2、Gal2GlcNAc2Man5GlcNAc2、GalGlcNAc3Man5GlcNAc2、Gal2GlcNAc3Man5GlcNAc2及びGal3GlcNAc3Man5GlcNAc2が含まれる。
別の実施態様において、hGalTI及びhGalTIIは、順次に局在化し、中期ゴルジ体指向性配列及び後期ゴルジ体指向性配列をそれぞれ使用して発現される。例えば、前記hGalTIは、中期ゴルジ体において局在化するのに対し、前記hGalTIIは後期ゴルジ体において局在化する。あるいは、別の実施態様においてマンノシダーゼIIとの基質競合を回避するため、後期ゴルジ体リーダーをβ−ガラクトシルトランスフェラーゼについて使用する。
本発明の別の特徴において、異なるGalTを使用する複数のアンテナ性のガラクトシル化した糖タンパク質の産生は、異なるβ−グリコシド結合を生じる。ある実施態様において、好ましい所望のβ−グリコシド結合が、下等真核宿主細胞において作成される。例えば、β1,4GalTファミリーのいずれか1つ(例、hGalTI、hGalT2、hGalT3、hGalT4、hGalT5、hGalT6、hGalT7、bGalTI、XlCalT、CeGalTII)を、β1,4Galグリコシド結合を有することを特徴とするガラクトシル化した糖タンパク質の産生のために発現させる。
GalNAcによりキャップしたグリカンは、ヒトにおける特定のタンパク質で観察されてきた。本発明の別の態様において、GalNAcトランスフェラーゼ(GalNAcT)をコード化する遺伝子を下等真核宿主細胞において発現させ、それが末端GlcNAc残基を有する基質へとGalNAcを転移させる。ある実施態様において、線虫GalNAcTをコード化する遺伝子(Genbank AN NP_490872)は、宿主細胞において産生されるグリカンのオリゴ糖分岐鎖を伸長する末端GlcNAc残基を有する基質へのGAlNAc残基の転移を触媒する。
図12に示されるhGalTI発現の比較は、β−ガラクトシルトランスフェラーゼ発現単独では下等真核生物における受容体基質上でのβGal−グリコシド結合の形成に十分ではあり得ないことを示す。ガラクトース残基の転移は、エピメラーゼもしくはガラクトキナーゼ、ガラクトース−1−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、及び/又はUGTをコード化する遺伝子の追加によって強化される。ガラクトシル化した糖形態(例、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2)の十分量が治療用糖タンパク質として望ましい。したがって、輸送活性の追加の発現によってグリカンへのガラクトシル転移を強化し、及び/又は内在性UDP−ガラクトースレベルを上昇させることは、本発明の特徴である。ある実施態様において、UDP−ガラクトースレベルを強化させるため、宿主細胞にエピメラーゼ活性を導入する。別の実施態様において、UDP−ガラクトースレベルの強化は、ガラクトキナーゼ又はガラクトース−1−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ活性によって仲介される。本発明はそれゆえ、UDP−GAl輸送活性を使用して及び/又は、エピメラーゼ又はガラクトキナーゼ又はガラクトース−1−リン酸ウリジルトランスフェラーゼを介する内在性UDP−ガラクトースレベルを上昇させることによってのいずれかとの組み合わせでβ−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を導入及び発現させることによって、ガラクトシル転移を強化する方法を提供する。
本明細書には、ヒト様ガラクトシル化糖タンパク質の産生のための下等真核細胞(例、P.パストリス)におけるUDP−ガラクトース輸送体をコード化する遺伝子を導入及び発現する方法も開示される。
遺伝子特異的プライマーをS.ポムベUDP−ガラクトース輸送体遺伝子(Genbank AL022598)の相同性領域を補完するようデザインし、S.ポムベゲノムDNA(ATCC24843)からPCR増幅し、単一イントロンを排除した。前記遺伝子の5’の96塩基対を増幅するために、プライマーRCD164(配列番号7)及びRCD177(配列番号8)を使用した。前記3’の966塩基対を増幅するために、プライマーRCD176(配列番号9)及びRCD165(配列番号10)を使用した。前記末端で導入されるNotI部位及びPacI部位を有する1つの連続したオープン・リーディング・フレームを含有する単一PCR断片へと前記2つの増幅した産物を重ねるために、プライマーRCD164(配列番号7)及びRCD165(配列番号10)を使用した。前記PCR産物をpCR2.1TA(Invitrogen)へとクローニングし、配列決定した。前記遺伝子産物を、P.パストリスGAPDHプロモーターを含有するプラスミドpJN335へとサブクローニングした(実施例2)。
好ましい実施態様において、キイロショウジョウバエ(D.melanogaster)UDP−ガラクトース輸送体をコード化する遺伝子を下等真核宿主細胞において導入及び発現させる。キイロショウジョウバエUGTをキイロショウジョウバエcDNAライブラリ(UC Berkeleyキイロショウジョウバエゲノムプロジェクト、卵巣λ−ZAPライブラリ GM)からPCR増幅し、pCR2.1PCRクローニングベクターへとクローニングし、配列決定した。NotI部位及びPacI部位を導入する遺伝子を増幅するため、プライマーDmUGT−5’(配列番号11)及びDmUGT−3’(配列番号12)を使用した。pSH263をつくるpRCD393における前記NotI部位及びPacI部位でPpOCH1プロモーターの下流へ融合したこの遺伝子を増幅するため、前記NotI部位及びPacI部位を使用した(図3B)。実施例2は、多様な他のUDPガラクトース輸送体のクローニングを示す。
本発明は、下等真核宿主細胞(例、P.パストリス)において発現する輸送体−トランスフェラーゼ融合体の多様な組み合わせを提供する。したがって、ある実施態様において、本発明は、触媒活性のあるβ−ガラクトシルトランスフェラーゼドメインへフレーム内に融合したUDP−ガラクトース輸送体を含む下等真核宿主を提供する。別の実施態様において、ヒト様等タンパク質を産生する宿主細胞は、hGalTI触媒ドメインへフレーム内に融合したS.ポムベ及びS.セレビシエMnn2(s)指向性ペプチドから単離されるUDP−ガラクトース輸送体を含む。
本発明の別の態様において、β1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性及び少なくともUDP−ガラクトース4−エピメラーゼ活性(酵素、ホモログ、変異体、誘導体及び触媒活性のあるそれらの断片)を発現させることによって下等真核生物(例、P.パストリス(pastoris))においてヒト様糖タンパク質を産生するための方法が提供される。エピメラーゼは、UDP−ガラクトース及びUDP−グルコースの相互変換を触媒する酵素である。本分野で周知の技術を使用して、エピメラーゼ遺伝子(例、ScGAL10、SpGALE、hGALE)の相同性領域を補完するよう遺伝子特異的プライマーをデザインし、PCR増幅する(実施例3)。ある実施態様において、S.セレビシエGal10活性をコード化する遺伝子、又はエピメラーゼをコード化する組換え型核酸分子、又はエピメラーゼ活性をコード化する核酸分子からの発現を下等真核宿主細胞(例、P.パストリス)において導入及び発現させ、末端β−ガラクトース残基を有することを特徴とするヒト様糖タンパク質を産生させる。あるいは、エピメラーゼ活性の活性化によって、宿主細胞を遺伝子工学的に改変し、ガラクトシル化した糖形態のレベルを上昇させる。
ある実施態様において、UDP−グルコースをUDP−ガラクトースへ変換するためにエピメラーゼ活性をコード化する遺伝子を発現させ、宿主細胞におけるガラクトシル転移のためにUDP−ガラクトースのレベルを上昇させる。β−1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性に加えてエピメラーゼ活性の発現は、ガラクトシル化したN−グリカンの産生を強化する。図9Bは、ScCal10をコード化するプラスミドであるpRCD395と組み合わせたMnn2(s)/hGalTI融合体で形質転換した複雑なグリカンを産生する酵母系(例、P.パストリスYSH−44)を示す。ScGal10エピメラーゼの付加は、ガラクトース転移のための入手可能なUDP−ガラクトースを上昇させる。1501m/z[B]でのピークは、グリカンGlcNAc2Man3GlcNAc2上の1つのガラクトース残基の転移に対応し、1663m/z[C]でのピークは、グリカンGlcNAc2Man3GlcNAc2上の2つのガラクトース残基の転移に対応する。好ましくはガラクトースの少なくとも60モル%が中性グリカン全体の%に関して転移する。したがって、ある実施態様において、エピメラーゼ活性との組み合わせでのβ−1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性が、宿主細胞において発現され、ガラクトシル化した糖タンパク質を産生する(実施例7)。
別の実施態様において、ScGAL10の導入及び発現は、下等真核生物におけるハイブリッド糖タンパク質に関するガラクトース転移を強化する(実施例6)。図10Aは、ハイブリッドガラクトシル化N−グリカンを生成するScGal10エピメラーゼと組み合わせてMnn2(m)/hGalTI融合体を発現するP.パストリス株RDP39−6を示す。前記N−グリカン分析によって、1つのガラクトース残基の転移を確立するグリカンGalGlcNAcMAn5GlcNAc2の質量に対応する1622m/z[K]でのピーク、及びハイブリッドグリカンGlcNAcMan5GlcNAc2の質量に対応する1460m/z[H]でのピークが示される。その後のβ1,4−ガラクトシダーゼ切断によって単一ガラクトース残基の存在が確立される(図10B)。好ましくはガラクトース転移の少なくとも70モル%が中性グリカン全体の%に関して検出される。
本発明はさらに、S.ポムベ由来のGALE遺伝子及びその変異体を含む単離された核酸分子を提供する。酵素UDP−ガラクトース4−エピメラーゼをコード化するこの遺伝子についての全長の核酸配列はすでに配列決定されており、Genbank NC_003423に示されるように同定されている。S.ポムベゲノムdNAからSpGALEを増幅するのに使用されるプライマーは、除去された175塩基対のイントロンを明らかにした(実施例3)。前記クローニングしたゲノム配列内に含まれるのは、S.ポムベUDP−ガラクトース4−エピメラーゼについてのコード化配列である。前記コード化したアミノ酸配列は配列番号13にも示される。前記SpGALE遺伝子は、宿主細胞におけるN−グリカンへのガラクトース転移のためのUDP−ガラクトースの十分なプールを生じる上で特に有用である。下等真核生物におけるSpGALE遺伝子の発現は、N結合したオリゴ糖合成における強化された及び効率のよいガラクトース転移を提供する。
S.ポムベ、ヒト、大腸菌由来のエピメラーゼと、S.セレビシエの最初の362個のアミノ酸残基との配列比較は、いくつものモチーフ及び潜在的な活性部位の存在を示す非常に保存された領域を示す(図7)(実施例11)。ある実施態様において、本発明は、潜在的なUDP−ガラクトース又はUDP−グルコース結合モチーフを以下の箇所で有する配列番号13のアミノ酸配列を含むポリペプチドを包含する。すなわち、
9−VLVTGGXGYIGSHT−22(配列番号48)、
83−VIHFAGLKAVGESXQXPLXYY−103(配列番号49)、
127−FSSSATVYGX−136(配列番号50)、
184−LRYFNPXGAHXSGXXGEDPXGIPNNLXPYXXQVAXGRX−221(配列番号51)、又は
224−LXXFGXDYXXXDGTXXRDYIHVXDLAXXHXXAX−256(配列番号52)
である。
本発明の別の態様にしたがって、本発明の核酸分子によってコード化される(変異タンパク質、対立形質、変異体、断片、誘導体、及びアナログを含む)単離されたポリペプチドが提供される。ある実施態様において、前記単離されたポリペプチドは、配列番号13に対応するポリペプチド配列を含む。本発明のある代替的な実施態様において、前記単離されたポリペプチドは配列番号13と少なくとも60%同一のポリペプチド配列を含む。好ましくは、本発明の前記単離されたポリペプチドは配列番号13との少なくとも70%、75%又は80%同一性を有する。より好ましくは、前記同一性は85%、90%又は95%であるが、配列番号13との同一性は98%、99%、99.9%又はさらにより高くありうる。
本発明の更なる態様において、エピメラーゼ及びガラクトシルトランスフェラーゼ活性を含むポリペプチドをコード化する遺伝子融合が生成される。ある実施態様において、UDP−ガラクトース4−エピメラーゼ及びβ1,4−GalTIを含む融合ポリペプチドが生成され、宿主細胞に導入される。より好ましい実施態様において、前記融合ポリペプチドはさらに、リーダー配列を含む。例えば、指向性ペプチドをコード化するリーダー配列のライブラリが、SpGalE/hGalTI融合にフレーム内に連結される。さらにより好ましい実施態様において、前記融合ポリペプチドは、ScMnn2(s)リーダー、SpGalEエピメラーゼ及びhGalTIを含む。前記融合ポリペプチドは、HYGマーカーを含む酵母組み込みプラスミドに挿入される。pRCD461と命名されるエピメラーゼ−ガラクトシルトランスフェラーゼ組み込みプラスミドの例は図5に示されている(実施例8)。前記エピメラーゼ−ガラクトシルトランスフェラーゼ融合形質転換体は、約70%ガラクトシル化したヒト様糖タンパク質Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2を生成する(図15B)。
本発明の別の態様において、β−ガラクトシルトランスフェラーゼ、エピメラーゼ及びUDP−ガラクトース輸送体の活性を含むポリペプチドをコード化する単一構築物が生成される。ある実施態様において、ヒトβ1,4−GalT、SpGalE及びDmUGT(「三重」)を含むプラスミドを構築する(実施例9)。好ましい実施態様において、前記トランスフェラーゼポリペプチドはさらに、リーダー配列、例えばhGalTIへフレーム内に凍結されたScMnn2(s)を含む。3つのポリペプチドはすべて、好ましくは自らのプロモーター及び終結因子とともにKANRマーカーを含有する酵母組み込みプラスミドへと挿入される。pRCD465と命名されるこの「三重」組み込みプラスミドの例は図4に示されている。ある実施態様において、前記融合ポリペプチドを含む「三重」組み込みプラスミドが、宿主細胞において導入及び発現され、末端GlcNAc残基を産生する。P.パストリスYSH−44を前記「三重」組み込みプラスミドで形質転換し、RDP80と命名した。
前述のように、ガラクトース残基のN−グリカンへの転移は、活性化されたガラクトース(UDP−Gal)のプールを要する。下等真核生物における内在性レベルを上回るこのようなプールを形成するある方法は、UDP−ガラクトース4エピメラーゼの発現である。代替的な経路には、3つの個別の遺伝子(UDP−ガラクトース4エピメラーゼのない状態での形質膜ガラクトースパーミアーゼ、ガラクトキナーゼ、及びガラクトース−1−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ)の発現が含まれる。前記UDP−ガラクトース4エピメラーゼのない状態で、ガラクトースの外来源を有するルロワ(LeLoir)経路のその他の3つの遺伝子の発現は、UDP−ガラクトースの内在性レベルを上昇するのに機能するであろう(Rossほか、2004)。さらに、本実施態様において、前記生じたUDP−ガラクトースがN−グリカンなどの基質への添加と離れては代謝できないため、UDP−ガラクトース4エピメラーゼのないことによってUDP−ガラクトースのレベルは、ガラクトースの外来性濃縮を調節することで調節できるようになる。
酵母及び菌の宿主におけるヒト様N−グリカンを産生する方法は、WO00200879A3及びWO03056914A1において提供され、本明細書に組み込まれる。当業者は、前述の方法と組み合わせて本明細書で開示された手段の決まりきった改変が対象の糖タンパク質の産生における改善された結果を提供し得ることを認識する。
WO02/00879に記載されているように、ヒトにおいて、ヌクレオチド糖前駆体(例えばUDP−N−アセチルグルコサミン、UDP−N−アセチルガラクトサミン、CMP−N−アセチルノイラミン酸、UDP−ガラクトース等)は、一般にサイトゾル中で合成され、ゴルジ体へと輸送され、そこでヌクレオチド糖前駆体はグリコシルトランスフェラーゼによって中心オリゴ糖に結合する。このプロセスを下等真核生物において複製するため、糖ヌクレオシド特異的輸送体が、ヌクレオシド糖前駆体の適切なレベルを確実にするため、ゴルジ体において発現されなければならない(Sommers,1981; Sommers,1982; Perez,1987)。糖のN−グリカンへの転移の副産物は、ヌクレオシド二リン酸又はヌクレオシド一リン酸のいずれかである。一リン酸塩がアンチポートメカニズムによってヌクレオシド三リン酸糖との交換において直接放出されることができる一方で、二リン酸ヌクレオシド(例えばGDP)は、放出される前に、リン酸分解酵素(例、GDPase)によって開裂され、ヌクレオシド一リン酸及び無機リン酸が産生されなければならない。この反応は、S.セレビシエ由来のGDPaseがマンノシル化に必要であることがわかっているため、効率のよいグリコシル化に重要であるように見える。しかしながら、前記酵素はUDPに対して活性が10%しかない(Berninsone,1994)。下等真核生物は、ゴルジ体において糖タンパク質合成のためのUDP−糖前駆体を利用しないため、ゴルジ体においてUDP特異的ジホスファターゼ活性をしばしば有していない。
本発明の別の特徴は、脱シアル酸付加した糖タンパク質を除去し、循環器系における治療タンパク質の半減期を低下させることがわかっているASGRに対する結合親和性の低下を提供する。先行研究により、二アンテナ性構造を有するグリカンは、三アンテナ性又は四アンテナ性構造を有するグリカンよりもあまり迅速には除去されないことが示されている(Stockert、Physiol Rev.1995年7月号;75(3): 591−609)。本発明のある態様において、末端ガラクトース残基を有することを特徴とする単一糖形態(例えば二アンテナ性構造)を有する対象のタンパク質上のグリカンを提供する。このような二アンテナ性構造は、三アンテナ性及び四アンテナ性分岐反応を触媒する他のGnTのため、哺乳類細胞において容易に生成されない。ガラクトース残基を備えた末端GlcNAc残基を有する基質をキャッピングすることによって、ガラクトシル化した基質へのGlcNAcの転移を触媒する他のGnT(例、GnT IV、GnT V)は存在しない。したがって、本発明は、哺乳類宿主において産生される前記糖タンパク質と比較して、ASGRに対する結合親和性がほとんどない脱シアル酸した糖タンパク質を生成するための方法を提供する。より好ましい実施態様において、脱シアル酸した糖タンパク質は、哺乳類において産生される異種性の糖タンパク質と比較して、増加した体内における循環上の半減期及び生物活性によって特徴付けられる。
例えば1,3マンノシルトランスフェラーゼ(例えばS.セレビシエにおけるMNN1)(Graham,1991)、1,2マンノシルトランスフェラーゼ(例えばS.セレビシエ由来のKTR/KREファミリー)、1,6マンノシルトランスフェラーゼ(S.セレビシエ又はP.パストリス由来のOCH1)、マンノシルリン酸トランスフェラーゼ及びその制御因子(S.セレビシエ由来のMNN4、PNO1及びMNN6)、細胞内プロテアーゼA(PEP4)、細胞内プロテアーゼB(PRB1)GPIにより固定されたアスパラギン酸プロテアーゼ(YPS1)、及び異常で、免疫原性の(即ち、ヒト以外でのグリコシル化反応に関与する)他の酵素などのマンノシルトランスフェラーゼに対応する遺伝子座においてUGT、エピメラーゼ及びβ1,4GalTをコード化する核酸を組み込むことが好ましい。
本実施態様の方法は、核酸、例えば宿主へ形質転換されるDNAライブラリが多様な配列を含有するとき最も効果的であり、それにより少なくとも1つの形質転換体が望ましい表現型を呈する確率を増大させる。例えば、単一のアミノ酸突然変異が、糖タンパク質加工酵素の活性を劇的に変更させ得る(Romeroほか、2000)。したがって、形質転換の前に、DNAライブラリ又はサブライブラリ成分は、更なる配列多様性を作成するための1つ以上の技術へ供され得る。例えば、遺伝子シャフリング、エラープロンPCR、試験管内変異誘発又は配列多様性を作成するための他の方法が、融合構築物のプール内で配列のより大きな多様性を得るために実施し得る。
本発明の核酸が、保存的なアミノ酸置換、付加、欠失又はその組み合わせなどの一次アミノ酸配列における1つ以上の変化を生じるようにコドンの最適化がされてもよいことも意図される。
各ライブラリ構築物を、前述のオープン・リーディング・フレーム配列に加えて、(例えばプロモーター、転写終結因子、エンハンサー、リボソーム結合部位、及び宿主生物体への融合構築物の形質転換に際し融合タンパク質の効果的な転写及び翻訳を確実にするのに必要であり得る他の機能的配列などの)発現調節配列と共に提供することが一般に好ましい。
薬物耐性を付与し又は宿主の代謝上の破壊された部分を補完するための遺伝子などの、少なくとも1つの選択可能なマーカーを各構築物に提供することがまた好ましい。前記マーカーの存在は、形質転換体のその後の選択において有用であり、例えば酵母においては、URA5、URA3、HIS4、SUC2、G418、BLA又はSH BLEといった遺伝子が使用され得る。選択可能なマーカーの多くは公知であり、酵母、菌、植物、昆虫、哺乳類及びその他の真核宿主細胞において使用するために利用可能である。
酵母において、電気穿孔法、塩化リチウム法又はスフェロプラスト法などのDNA導入法のいずれかの従来の方法を使用し得る。糸状菌及び植物細胞において、従来の方法は、粒子照射、電気穿孔法及びアグロバクテリウムにより仲介される形質転換を含む。高密度培養(例えば酵母における発酵)に適した安定した株を作製するため、宿主染色体へ融合構築物に組み込むことが望ましい。好ましい実施態様において、組み込みは本分野で周知の技術を使用して相同的組換えを介して行われる。好ましくは、P.パストリスの安定した遺伝的修飾は、二重のクロスオーバー事象を介して行われる(Nettほか、Yeast、2003年11月号;20(15): 1279−1290)。例えば、異種性の酵素活性は宿主生物の配列と相同的な側面配列によって提供され、次いで、単一マーカーを拾いだすことにより形質転換が行われる。このような方法により、組み込みが、再利用可能なマーカーを使用する宿主ゲノムの特定の部位において行われる。
宿主株を異種性の酵素で形質転換した後、望ましいグリコシル化表現型を示す形質転換体が選択される。選択は、単一段階において又は多様なアッセイ又は検出方法のいずれかを使用する一連の表現型の濃縮段階及び/又は枯渇段階によって実施され得る。表現型の特徴付けは、手動で又は自動化した高処理量のスクリーニング装置を使用して実施し得る。共通して、宿主微生物は、細胞表面上にタンパク質N−グリカンを示し、それにより細胞表面上に多様な糖タンパク質が局在する。
本発明はP.パストリスを宿主生物体として使用して例示するが、酵母宿主及び菌宿主の他の種を含む他の真核宿主細胞に、ヒト様糖タンパク質を産生するために、本明細書に記載されるように替えることができることが当業者によって理解される。このような宿主には、好ましくはピキアフィンランディカ(Pichia finlandica)、ピキアトレハロフィラ(Pichia trehalophila)、ピキアコクラマエ(Pichia koclamae)、ピキアメンブラナエファシエンス(Pichia membranaefaciens)、ピキアミニュータ(Pichia minuta)(オガタエアミニュータ(Ogataea minuta)、ピキアリンドネリ(Pichia lindneri))、ピキアオプンティアエ(Pichia opuntiae)、ピキアサーモトレランス(Pichia thermotolerans)、ピキアサリクタリア(Pichia salictaria)、ピキアグエルキューム(Pichia guercuum)、ピキアピジュペリ(Pichia pijperi)、ピキアスティプティス(Pichia stiptis)、ピキアメタノリカ(Pichia methanolica)、ピキア種(Pichia sp.)、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセス種(Saccharomyces sp.)、ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、クルイベロミセス種(Kluyveromyces sp.)、クルイベロミセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、アスペリギルス・ニドウランス(Aspergillus nidulans)、アスペリギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリゼ(Aspergills oryzae)、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)、クリソスポリウム・ラックノウエンス(Chrysosporium lucknowense)、フサリウム種(Fusarium sp.)、フザリウム・グラミネウム(Fusarium gramineum)、フザリウム・ベネナツム(Fusarium venenatum)、フィスコミトレラ・パテンス(Physcomitrella patens)及びノイロスポラ・クロッサ(Neurospora crossa)が含まれる。
本明細書に記載の方法は、糖タンパク質、特にヒトにおいて治療上使用される糖タンパク質を産生するのに有用である。特異的糖形態を有する糖タンパク質は、例えば、治療用タンパク質の指向性において特に有用であり得る。例えば、マンノース−6−リン酸は、リソソームへタンパク質を指向することが示されており、マンノース−6−リン酸は、少しだけ述べれば、ゴーシェ病、ハンター病、ハーラー病、シャイエ病、ファブリー病及びテイ・サックス病などのリソソーム貯蔵疾患に関連したいくつもの酵素の適切な機能に不可欠であり得る。同様に、グリカン側鎖への1つ以上のシアル酸残基の付加は、投与後の生体内治療用糖タンパク質の寿命を延長させ得る。したがって、宿主細胞(例、下等真核細胞又は哺乳類細胞)は、前記細胞において発現される糖タンパク質中の末端シアル酸の程度を増大するよう遺伝子工学的に改変され得る。あるいは、シアル酸は、シアル酸トランスフェラーゼ及び適切な基質を使用する投与の前に、インビトロで対象のタンパク質に結合させてもよい。生育培地組成物の変化が、ヒトの形態をより密接に模倣する糖タンパク質を産生するために、ヒト様グリコシル化に関与する酵素活性の発現に加えて、採用されてもよい(S.Weikertほか、Nature Biotechnology,1999,17,1116−1121; Werner,Noeほか 1998 Arzneimittelforschung 48(8): 870−880; Weikert,Papacほか、1999; Andersen及びGoochee 1994 Cur.Opin.Biotechnol.5: 546−549; Yang及びButler 2000 Biotechnol.Bioengin.68(4): 370−380)。モノクローナル抗体に特異的なグリカンの修飾(例、二分するGlcNAcの付加)は、抗体依存性細胞の細胞毒性を改善することが示されており(Umana P.ほか、1999)、このことは抗体又は他の治療用タンパク質の産生のために望ましいことであり得る。
分泌シグナルをコード化する核酸配列を、糖タンパク質をコード化する対象の配列と結合させることがまた好ましい。「分泌シグナル配列」という語は、より大きなポリペプチドの構成成分として、合成された細胞の分泌経路を通じてより大きなポリペプチドを向わせるポリペプチド(「分泌ペプチド」)をコード化するDNA配列を示す。前記より大きなポリペプチドは、分泌経路を通じての移行の間、前記分泌ペプチドを除去するよう共通して開裂される。宿主細胞の分泌経路へとポリペプチドを向わせるため、(リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても公知の)分泌シグナル配列が発現ベクターにおいて提供される。前記分泌シグナル配列は、制限を加えることなく、糖タンパク質に関連した野生型配列、S.セレビシエSuc2シグナル配列をコード化する配列、ピキアPho2シグナル配列をコード化する配列、ピキアPrc1シグナル配列をコード化する配列、S.セレビシエα接合因子(αMF)シグナル配列をコード化する配列、ウシリゾチームCシグナル配列をコード化する配列の分泌シグナル配列であり得る。前記分泌シグナル配列は、核酸配列へ機能できるよう結合され、すなわち、前記2つの配列は正確な読み枠において接続され、新規に合成されるポリペプチドを宿主細胞の分泌経路へと向わせるよう置かれ得る。分泌シグナル配列は、興味の対象のポリペプチドをコード化するDNA配列に対して5’にどれも置かれるが、特定の分泌シグナル配列は、対象のDNA配列におけるほかのどこかに置かれてもよい(例、Welchほか、米国特許第5,037,743号;Hollandほか、米国特許第5,143,830号)。
PpOCH1遺伝子についての800塩基対プロモーターを、プライマーRCD48(配列番号15)(5’−TATGCGGCCGCGGCTGATGATATTTGCTACGA−3’)及びプライマーRCD134(配列番号16)(5’−CCTCTCGAGTGGACACAGGAGACTCAGAAACAG−3’)を使用して増幅し、PpSEC4遺伝子についての400塩基対プロモーターを、プライマーRCD156(配列番号17)(5’−CTTCTCGAGGAAGTAAAGTTGGCGAAACTT−3’)及びプライマーRCD157(配列番号18)(5’−CTTAGCGGCCGCGATTGTTCGTTTGAGTAGTTT−3’)を使用して増幅した。前記PCR産物をpCR2.1クローニングベクター(Invitrogen)へとクローニングし、配列決定した。次に、プラスミドpRCD360及びプラスミドpRCD362をそれぞれ作製するために導入されたXhoI/NotI制限部位を使用してGAPDHプロモーターの替わりにベクターpJN261(Nettほか、Yeast、2003年11月号;20(15): 1279−1290)へとOCH1プロモーター及びSEC4プロモーターをサブクローニングした。
S.ポムベUDPガラクトース輸送体
単一イントロンを除去するために、SpUGTと呼ばれるUDPガラクトース輸送体をコード化するS.ポムベ遺伝子(SpGMS1+、Genbank AL022598)を、S.ポムベゲノムDNA(ATCC24843)から2つのピースへとPCR増幅した。前記遺伝子の5’の96塩基対を増幅するために、プライマーRCD164(配列番号7)(5’−CCTTGCGGCCGCATGGCTGTCAAGGGCGACGATGTCAAA−3’)及びプライマーRCD177(配列番号8)(5’−ATTCGAGAATAGTTAAGTGTCAAAATCAATGCACTATTTT−3’)を使用し、3’の966塩基対を増幅するために、プライマーRCD176(配列番号9)(5’−AAAATAGTGCATTGATTTTGACACTTAACTATTCTCGAAT−3’)及びプライマーRCD165(配列番号10)(5’−CCTTTTAATTAATTAATGCTTATGATCAACGTCCTTAGC−3’)を使用した。その後、プライマーRCD164(配列番号7)及びプライマー165(配列番号10)を使用して、これら2つの増幅した産物を重ね合わせ、1つの連続したオープン・リーディング・フレームを含み、末端に導入されたでNotI部位及びPacI部位を有する単一のPCR断片とした。このPCR産物をpCR2.1ベクター(Invitrogen)へとクローニングし、配列決定した。次に、NotI部位及びPacI部位を使用して、この遺伝子を、P.パストリスGAPDHプロモーターの下流の遺伝子を融合しているカセットを含有するプラスミドpJN335へとサブクローニングした。次に、400塩基対のPpOCH1転写終結因子を、プライマーRCD202(配列番号25)(5’−TCCTTAATTAAAGAAAGCTAGAGTAAAATAGAT−3’)及びプライマーRCD203(配列番号26)(5’−TCCCTCGAGGATCATGTTGATCAACTGAGACCG−3’)を使用してPCR増幅し、pCR2.1へとクローニングした。その後、プラスミドpRCD257を作製するために、前記GAPDHプロモーター/SpUGT遺伝子融合体をXhoI/PacI断片として、及びPpOCH1−TTをPacI/XhoI断片としてプラスミドpTA18における単一XhoI部位へと挿入するよう、三重ライゲーションを実施した。前記新規のプラスミドpRCD257はNATRであり、このNATRはGAPDH−SpGALE−OCH1TT融合体を、PpPMAIプロモーターによって駆動されるScVAN1膜貫通ドメインへ融合されたヒトGnTII遺伝子の切断バージョンを含有する第二カセットに沿って含有するベクターを含有している。
DmUGTと呼ばれるUDPガラクトース輸送体をコード化するキイロショウジョウバエ遺伝子(Genbank BAB62747)を、キイロショウジョウバエcDNAライブラリ(UC Berkeleyショウジョウバエゲノムプロジェクト、卵巣1−ZAPライブラリGM)からPCR増幅し、pCR2.1PCRクローニングベクターへとクローニングし、配列決定した。5’末端及び3’末端でそれぞれNotI部位及びPacI部位を導入した前記遺伝子を増幅するため、プライマーDmUGT−5’(配列番号11)(5’−GGCTCGAGCGGCCGCCACCATGAATAGCATACACATGAACGCCAATACG−3’)及びプライマーDmUGT−3’(配列番号12)(5’−CCCTCGAGTTAATTAACTAGACGCGCGGCAGCAGCTTCTCCTCATCG−3’)を使用した。次に、プラスミドpSH263を作製するため、pRCD393においてNotI/PacI部位でPpOCH1及びプロモーターの下流へ融合した前記遺伝子をサブクローニングするため、NotI部位及びPacI部位を使用した。
hUGT1及びhUGT2とそれぞれ呼ばれるUDPガラクトース輸送体1をコード化するヒト遺伝子(Genbank BAA95615番)及びUDPガラクトース輸送体2をコード化するヒト遺伝子(Genbank BAA95614番)をヒト前立腺cDNA(マラソンレディdDNA、Clontech)から増幅した。前記UGT1遺伝子を、プライマーhUGT1−5’(配列番号27)(5’−GGCTCGAGCGGCCGCCACCATGGCAGCGGTTGGGGCTGGTGGTTC−3’)及びhUGT1−3’(配列番号28)(5’−CCCTCGAGTTAATTAATCACTTCACCAGCACTGACTTTGGCAG−3’)を使用して増幅し、hUGT2遺伝子を、プライマーhUGT2−5’(配列番号29)(5’−GGCTCGAGCGGCCGCCACCATGGCAGCGGTTGGGGCTGGTGGTTC)及びプライマーhUGT2−3’(配列番号30)(5’−CCCTCGAGTTAATTAACTAGGAACCCTTCACCTTGGTGAGCAAC−3’)を使用して増幅した。前記PCR産物をpCR2.1ベクター(Invitrogen,Carlsbad,CA)へとクローニングし、配列決定した。その後、プラスミドpSH264及びプラスミドpSH262をそれぞれ作製するため、NotI/PacIを使用するPpOCH1プロモーターの下流のpRCD393へと前記hUGT1遺伝子及びhUGT2遺伝子を挿入した。
S.セレビシエUDP−ガラクトース4−エピメラーゼ
UDP−ガラクトース4−エピメラーゼをコード化するS.セレビシエ遺伝子(ScGAL10)を、プライマーRCD270(配列番号31)(5’−TAGCGGCCGCATGACAGCTCAGTTACAAAGTGAAAG−3’)及びRCD271(配列番号32)(5’−CGTTAATTAATCAGGAAAATCTGTAGACAATCTTGG−3’)を使用してS.セレビシエゲノムDNAからPCR増幅した。生じたPCR産物をpCR2.1へとクローニングし、配列決定した。
hGALEと呼ばれるUDP−ガラクトース4−エピメラーゼをコード化するヒト遺伝子(Thodenほか、(2001)JBC,276巻(18) 15131−15136)を、それぞれNotI部位及びPacI部位を有するプライマーGD7(配列番号33)及びプライマーGD8(配列番号34)を使用して、ヒト腎cDNA(マラソンレディcDNA、Clontech)からPCR増幅した。次に、プラスミドpRCD427及びプラスミドpRCD428をそれぞれ作製するため、NotI/PAcI部位を使用してプラスミドpRCD406及びプラスミドpRCD407へとhGALE遺伝子をサブクローニングした。
S.ポムベ(ATCC24843)ゲノムDNA由来のSpGALE遺伝子を増幅するため、プライマーGALE2−L(配列番号35)及びプライマーGALE2−R(配列番号36)を使用した。前記増幅した産物をpCR2.1へとクローニングし、配列決定した。配列決定は、+66の位置でのイントロン(175塩基対)の存在を明らかにした。
ヒトb−1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼI
ヒトb−1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼI遺伝子(hGalTI、Genbank AH003575)を、プライマーRCD192(配列番号1)(5’−GCCGCGACCTGAGCCGCCTGCCCCAAC−3’)及びプライマーRCD186(配列番号2)(5’−CTAGCTCGGTGTCCCGATGTCCA−3’)を使用してヒト腎cDNA(マラソンレディcDNA、Clontech)からPCR増幅した。このPCR産物をpCR2.1ベクター(Invitrogen,Carlsbad,CA)へとクローニングし、配列決定した。このクローンから、PCR重複変異誘発を次の3つの目的のために実施した。すなわち、1)野生型タンパク質配列を維持しながらオープン・リーティング・フレーム内のNotI部位を除去するため、2)内在性膜貫通ドメインのすぐ下流のタンパク質を切断するため、及び3)モジュールクローニングのために5’末端及び3’末端にAscI部位及びPacI部位を導入するため、である。これを実施するため、前記NotI部位までの前記遺伝子の5’末端を、プライマーRCD198(配列番号3)(5’−CTTAGGCGCGCCGGCCGCGACCTGAGCCGCCTGCCC−3’)及びプライマーRCD201(配列番号4)(5’−GGGGCATATCTGCCGCCCATC−3’)を使用して増幅し、前記3’末端を、プライマーRCD200(配列番号5)(5’−GATGGGCGGCAGATATGCCCC−3’)及びプライマーRCD199(配列番号6)(5’−CTTCTTAATTAACTAGCTCGGTGTCCCGATGTCCAC−3’)を使用して増幅した。前記NotI部位を除去しながら、前記オープン・リーディング・フレームを野生型アミノ酸配列で再合成するために、前記産物をプライマー198及びプライマー199を用いて重ね合せた。前記新規の切断したhGalTI PCR産物をpCR2.1ベクター(Invitrogen,Carlsbad,CA)へとクローニングし、配列決定した。次に、pRCD260を作製するため、PpURA3/HYGRロールインベクターであるプラスミドpRCD259へと前記断片をサブクローニングするため、前記導入したAscI/PacI部位を使用した。プラスミドpXB20−pXB67を作製するため、参照によって組み込まれるWO02/00879に記載の酵母指向性配列膜貫通ドメインのライブラリを、hGalTI遺伝子の上流にあるNotI/AscI部位に連結した。
ヒトb−1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼII遺伝子(hGalTII、Genbank AF038660)の切断した形態を、プライマーRCD292(配列番号39)(5’−CTTAGGCGCGCCCAGCACCTGGCCTTCTTCAGC−3’)及びプライマーRCD293(配列番号40)(5’−CTTGTTAATTAATCAGCCCCGAGGGGGCCACGACGG−3’)を使用してヒト腎cDNA(マラソンレディcDNA、Clontech)からPCR増幅し、プラスミドpCR2.1へとクローニングし、配列決定した。プラスミドpRCD378を作製するため、N末端膜貫通ドメインをコード化する遺伝子の一部を除去したこの切断したクローンを、hGalTIの替わりにベクターpXB53へと導入されたAscI/PacI部位を使用してサブクローニングした。切断したhGalTIIと、S.セレビシエMNN2遺伝子の膜貫通ドメイン/リーダー配列をコード化する部分との遺伝子融合物を含有する、このプラスミドは、PpGAPDHプロモーターにより駆動される。
ヒトb−1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼIII遺伝子(hGalTIII、Genbank AF038661)の切断した形態を、プライマーRCD294(配列番号41)(5’−CTTAGGCGCGCCCGAAGTCTCAGTGCCCTATTTGGC−3’)及びRCD295(配列番号42)(5’−CTTGTTAATTAATCAGTGTGAACCTCGGAGGGCTGT−3’)を使用してヒト腎cDNA(マラソンレディcDNA、Clontech)からPCR増幅し、プラスミドpCR2.1へとクローニングし、配列決定した。プラスミドpRCD381を作製するため、hGalTIの替わりにベクターpXB53へと導入されたAscI/PacI部位を使用して、N末端膜貫通ドメインをコード化する遺伝子の一部を除去したこの切断したクローンをサブクローニングした。このプラスミドはいまや、前記切断したhGalTIIIと、PpGGAPDHプロモーターによって駆動されるS.セレビシエMNN2遺伝子の膜貫通ドメイン/リーダー配列をコード化する部分との遺伝子融合を含有する。
ヒトGnTII遺伝子及びSpGMS1+遺伝子(SpUGT)を含有するpRCD257プラスミドをRDP27株に導入した。RDP27は、P.パストリスの変異株であり、och1及びalg3の欠失を有していて、プラスミドpSH49及びプラスミドpPB104で形質転換されたものである。プラスミドpSH49及びプラスミドpPB104は、それぞれマウスマンノシダーゼIBとびヒトGnTIとの活性ある融合構築物を含有し、またプラスミドpPB103を含有する。プラスミドpPB103は、K.ラクティスUPD−GlcNAcトランスポーターを含有し及びリポータータンパク質K3(Choiほか、2003)を含有するプラスミドpBK64を含有する。ナーセオスリシン(nourseothricin)上での選択後、16個の形質転換体を選抜し、発現されたリポータータンパク質K13のグリコシル化を測定した。これら形質転換株のうち2つにおいて、期待される複雑なヒトグリコシル化構造GlcNAc2Man3GlcNAc2を観察し、これらの株をRDP30−10(図8A)及びRDP30−13と命名した。hGalTI遺伝子/リーダー融合プラスミドライブラリの一部を、RDP30−10株へと形質転換し、ハイグロマイシンを含有する最小培地上で形質転換株を選択した。生じた株によって分泌されたK3から放出されたN−グリカンをMALDI−TOF MSで分析した。1個のガラクトース糖の追加に一致する質量における分子レベルのシフトを、2つの異なるリーダー構築物pXB53及びpXB65の形質転換株由来のN−グリカンに関して観察した。第一のpXB53は、ScMnn2(s)リーダーへ融合させた(本明細書でScMnn2(s)/hGalTIと呼ばれる)hGalTIからなり、もう一方はScMnn1(m)リーダーとの融合体であった。MALDI−TOFによる、RDP37(pXB53で形質転換したRDP30−10)からのK3から放出されたN−グリカンの分析は、約10%ないし20%のGlcNAc2Man3GlcNAc2がGalGlcNAc2Man3GlcNAc2へ変換され、より少量(1%ないし2%)がGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(pXB53,図8B)へ変換されることを示した。GalGlcNAc2Man3GlcNAc2への変換のより少量(3%ないし5%)が(しかしGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2はできなかった。)第二融合体(pXB65)で観察された。
NotI/PacIを用いて、hGnTIIに替えて、NATRベクターpTA18及びpRCD351へ、UDP−ガラクトース4−エピメラーゼをコード化するScGAL10遺伝子をサブクローニングした。これにより、強力なPMAIプロモーター及びより弱いPpHIS3プロモーターの前にエピメラーゼ遺伝子が挿入され、プラスミドpRCD331(PPMAI−ScGAL10)及びpRCD352(PHIS3−ScGAL10)がそれぞれ作製される。前記プラスミドを直鎖状にし(PpPMA1プロモーターにおいてSacIを有するpRCD331及びPpHIS3プロモーターにおいてBglIIを有するpRCD352)、PBP−3(米国特許出願第20040018590号)へと形質転換した。PBP−3株はP.パストリスの変異株である。この変異株は、Och1の欠失を有しており、プラスミドpSH49及びプラスミドpPB104で形質転換されている。プラスミドpSH49及びプラスミドpPB104は、それぞれマウスマンノシダーゼIBとヒトGnTIとの活性融合構築物を含有し、またプラスミドpPB103を含有している。pPB103は、K.ラクティスUDP−GlcNAcトランスポーターを含有し、リポータータンパク質K3(Choiほか)を含有するプラスミドpBK64を含有している。この株は、分泌されたタンパク質上の構造GlcNAcMan5GlcNAc2のハイブリッドN−グリカンを産生する。ナーセオスリシンを含有するYPD培地上で選択された、得られた形質転換株を、プライマーRCD285(配列番号43)(5’−TACGAGATTCCCAAATATGATTCC−3’)及びプライマーRCD286(配列番号44)(5’−ATAGTGTCTCCATATGGCTTGTTC−3’)を使用するPCRによって、及び前記リポータータンパク質K3を発現させ、放出されたN−グリカンを分析して、前記株がハイブリッドGlcNAcMan5GlcNAc2グリカン構造を維持していることを確認することによって、分析した。pRCD352(PHIS3−ScGAL10)構築物によって形質転換したある株をRDP38−18と命名した。この株をプラスミドpXB53(Mnn2(s)hGalTI融合構築物並びにHYGR遺伝子及びPpURA3遺伝子を含有する。)により、SalI(PpURA3にある。)で直鎖状にした後、形質転換した。形質変換株を、ハイグロマイシンを有するYPD培地上で選択し、K3を発現させ、N−グリカンのサイズを決定することによってスクリーニングした。RDP39−6株(図10A)から精製され、K3から放出されたN−グリカンの大部分(〜2/3)は、主としてGlcNAcMan5GlcNAc2であるRDP38−38由来のものと比較して、1個の追加のヘキソース(HexGlcNAcMan5GlcNAc2)を含有していた。さらに、前記追加のヘキソース残基は、可溶性b−1,4−ガラクトシダーゼとの(しかし、a−1,3−ガラクトシダーゼまたはa−1,2−マンノしダーゼとではない。)その後のインキュベーションにより除去でき、このことは、特異的結合(b−1,4)による、末端GlcNAcへの単一ガラクトースの付加はこの株のhGalTIによって触媒されたことを示している。
GlcNAc2Man3GlcNAc2構造を有する複雑なN−グリカンを表示するP.パストリスYSH−44株を構築した。YSH−44は、P.パストリスの変異株であり、och1を欠失していて、プラスミドpSH49、pPB104、pKD53及びpTC53で形質転換される。プラスミドpSH49、pPB104、pKD53及びpTC53は、それぞれマウスマンノシダーゼIB、ヒトGnTI、キイロショウジョウバエマンノシダーゼII及びヒトGnTIIの活性融合構築物を含有し、またpPB103を含有する。pPB103は、K.ラクティス(lactis)UDP−GlcNAcトランスポーターを含有し、およびリポータータンパク質K3(Hamiltonほか、Science 2003年8月29日号;301(5637): 1244−1246)を含有するプラスミドpBK64を含有している。この株を、Mnn2(s)/hGalTI融合構築物を含有するpXB53プラスミドで形質転換し、形質転換体を、ハイグロマイシンを有するYPD培地上で選択した。K3を精製し、MALDI−TOF MSによって、放出されたN−グリカンを分析することによって、いくつかの形質転換株を分析した。分析した形質変換株のそれぞれは、GlcNAc2Man3GlcNAc2構造を有するN−グリカンの主要部分及び単一ヘキソース追加と一致した少数部分(〜5%)(YSH−71)を与えた。しかしながら、このピークは常にhGAlTIの導入と相関していたが、b−1,4−ガラクトシダーゼに対して完全に不応性であった。次いで、これらの株のいくつかを、プラスミドpRCD395及びプラスミドpRCD396(POCH1−ScGAL10及びPSEC4−ScGAL10をそれぞれ含有するPpHIS3/G418Rプラスミド)で、BglIIで直鎖状にした後、形質転換し、G418上で選択した、得られた株をそれぞれYSH−83及びYSH−84と命名した。分泌されたK3から放出されたN−グリカンをMALDI−TOF MSにより分析した。得られた形質転換体を、G418を含有するYPD培地上で選択した。これらの株から分泌され精製されたK3から放出されたN−グリカンをMALDI−TOF MSにより分析した。これらの形質転換体由来N−グリカンの大部分は、3つの構造、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(〜0%ないし25%)又はGalGlcNAc2Man3GlcNAc2(〜40%ないし50%)からなり、残りのN−グリカンは、親YSH−44株により表示されるGlcNAcMan3GlcNAc2構造を保持していた。N−グリカンの相対的な量は、前記ScGAL10エピメラーゼ遺伝子をPpOCH1プロモーター(YSH−83)又はPpSEC4プロモーター(YSH−84)によって駆動したかどうかとは無関係に変化しないままであった。図9Bは、YSH−84から放出されたN−グリカンのMALDI−TOF MSを示す。
SpGALE遺伝子を、プライマーRCD326(配列番号45)(5’−CTTGGCGCGCCATGACTGGTGTTCATGAAGGGACT)及びプライマーRCD329(配列番号46)(5’−CCTGGATCCCTTATATGTCTTGGTATGGGTCAG−3’)を使用して増幅し、pCR2.1ベクター(Invitrogen)へとクローニングし、配列決定した。最初の43個のアミノ酸を除去するhGalTI遺伝子の切断した部分(hGalTIΔ43)を、プライマーRCD328(配列番号47)(5’−CTTGGATCCGGTGGTGGCCGCGACCTGAGCCGCCTGCCC−3’)及びプライマーRCD199(配列番号48)(5’−CTTCTTAATTAACTAGCTCGGTGTCCCGATGTCCAC−3’)を使用して増幅し、pCR2.1ベクター(Invitrogen)へとクローニングし、配列決定した。次に、SpGALEクローンをAscI/BamHIで切断し、hGalTIクローンをBamHI/PacIで切断し、両者を、AscI/PacIで切断したpRCD452へと挿入した。プラスミドpRCD452は、G418耐性マーカー、及びScMNN2(S)/hGalTI融合体を有するGAPDH/CYC1カセットを含有している。AscI/BamHISpGALE断片及びBamHI/PacIhGalTIΔ43断片を、AscI/PacIにより放出されたhGalTIに置き換えて連結し、pRCD461を作製した。この新規プラスミドpRCD461は、ScMNN2(s)/SpGALE/hGalTI融合体を含有していて、SpGalEタンパク質及びhGalTIタンパク質は、Bam HI部位を含有する4つのアミノ酸(GSGG)リンカーによって分離されていて、PpGAPDHプロモーターによって駆動される単一のポリペプチドにおいてコード化されている。
活性のあるhGalTI−53遺伝子融合体を含有するプラスミドpXB53、及びhGalTII−53融合体を含有するpRCD378を、HYGRマーカー近くのXhoIで直鎖状にし、T4DNAポリメラーゼ(New England Biolabs,Beverly,MA)で平滑末端化した。hGalTIII−53遺伝子融合体を含有するプラスミドpRCD381をURA3遺伝子近くのHindIIIで直鎖状にし、T4ポリメラーゼで平滑末端化した。次に、3つのエピメラーゼ遺伝子ScGAL10、SpGALE及びhGALEをプラスミドpRCD404、pRCD406、及びpRCD427からそれぞれXhoI/SphIで切断し、T4DNAポリメラーゼで平滑末端化し、前記3つの直鎖状にしたトランスフェラーゼプラスミドへと挿入した。これにより9つの新規二重トランスフェラーゼ/エピメラーゼHYGRプラスミドが生じた。すなわち、hGalTI−53及びScGAL10を有するpRCD424、hGalTI−53及びSpGALEを有するpRCD425、hGalTI−53及びhGALEを有するpRCD438、hGalTII−53及びScGAL10を有するpRCD439、hGalTII−53及びSpGALEを有するpRCD440、hGalTII53及びhGALEを有するpRCD441、hGalTIII−53及びScGAL10を有するpRCD442、hGalTIII−53及びSpGALEを有するpRCD443並びにhGalTIII−53及びhGALEを有するpRCD447である。その後、YSH44系を、これらの(XbaIで直鎖状にした)二重HYGRプラスミド、及び(AgeIで直鎖状にした)SpUGT、hUGT2、DmUGT及びhUGT1 UDP−Galトランスポーターコード化遺伝子をそれぞれ含有するG418RプラスミドpRCD393、pSH262、pSH263及びpSH264で順次形質転換した。このように、一連の株は、それぞれがトランスフェラーゼ、エピメラーゼ及びトランスポーターの異なる組み合わせを含有するよう作製された。第一に、異なるUDP−Galトランスポーターを、hGalTI−53及びSpGALEを含有する株において比較した。DmUGT遺伝子の導入は、2つの末端ガラクトース残基(Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2)を有する複雑なグリカンをすべて実質的に生じたのに対し、その他の3つのトランスポーターは、前記トランスフェラーゼ及びエピメラーゼのみで得られたものと実質的に同一の複雑なグリカンの特性を生じた(図11Aないし図11E)。第二に、前記エピメラーゼ遺伝子を、pRCD424、pRCD425又はpRCD438と共にpSH263を株に導入することによって、hGalTI−53融合体及び活性のあるDmUGT遺伝子を有する株において比較した。前記3つのそれぞれのエピメラーゼ遺伝子とGal遺伝子との組み合わせは、分泌されたK3に関してGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2の複雑なN−グリカンを生じる上で等価であった。最後に、前記3つのヒトトランスフェラーゼ融合構築物hGalTI−53、hGalTII−53及びhGalTIII−53を、pSH263で形質転換した株へpRCD425、pRCD440及びpRCD443を導入することによって、DmUGT及びSpGAKEを有する株において比較した。ここで、hGalTII−53は、Galを転移させる上でわずかに効率がよくなく、hGalTI053を有する株における複雑なN−グリカンの約10%であり、単一のがラクトース(GalGlcNAc2Man3GlcNAc2)のみを有していた一方、他の観察可能な、hGalTII−53を有する株における複雑なN−グリカンは二ガラクトシル化したGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2であった(図12Aないし図12B)。さらに、hGalTIII−53は、前記複雑なN−グリカンの60%ないし70%が0個ないし1個のガラクトース残基(GlcNAc2Man3GlcNAc2又はGalGlcNAc2Man3GlcNAc2)を含有するのに対し、30%ないし40%はGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2であり、hGalTI−53又はhGalTII−53のいずれかよりも有意に効率が劣っていた(図12Aないし図12C)。
POCH1−DmUGTを含有するG418RプラスミドであるpSH263を、SacIで切断することによって直鎖状にした後、T4DNAポリメラーゼ(New England Biolabs)で平滑末端化した。PSEC4−SpGALE遺伝子をプラスミドpRCD405からXhoI/SphI切り出し、T4DNAポリメラーゼで平滑末端化した。次に、平滑末端化したSpGALEをpSH263の平滑末端化したSacI部位へと挿入し、二重トランスポーター/エピメラーゼG418RプラスミドであるプラスミドpRCD446を作製した。次に、pRCD446をEcoRIで直鎖状にし、T4DNAポリメラーゼで平滑末端化した。PGAPDHScMNN2(s)/hGalTI融合コンストラクトをpXB53からBglII/BamHIにより放出させ、T4DNAポリメラーゼで平滑末端化した。次に、平滑末端化したScMNN2(s)/hGalTIをpRCD446の平滑末端化したEcoRI部位へと挿入し、ScMNN2(s)/hGalTI、SpGALE及びDmUGTを含有する三重G418RプラスミドであるプラスミドpRCD465を作製した。pRCD465で形質転換したP.パストリスYSH−44をRDP80と命名した。N−グリカン特性はGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2[C]の質量に対応する1663m/zで単一のピークを示した(図14A)。
P.パストリスRDP80株由来のN−グリカン(2μg)を、50mM NH4HCO3(pH6.0)中の3mU β1,4ガラクトシダーゼ(QA bio,San Mateo,CA)とともに37℃で16時間ないし20時間インキュベートした。図14BにおけるN−グリカン分析は、N−グリカンGlcNAc2Man3GlcNAc2の質量に対応する1430m/z[A]での優勢なピークを示し、図14Aにおいてガラクトース転移を確認する。
RDP80株から精製したK3(200μg)を、50mM NH4HCO3(pH6.0)中の50mgCMP−シアル酸及び15mUラット組換え型a□(2,6−)−(N)−シアリルトランスフェラーゼ(Calbiochem)とともに、37℃で16時間ないし20時間インキュベートした。次に、N−グリカンをPNGaseF切断によって放出させ、MALDI−TOF MSで検出した。前記グリカンのスペクトルは、RDP80由来のもの(図14A)と比較したとき、シアリルトランスフェラーゼ処置後の質量における増加を示した(図14C)。図14Cに示されるスペクトルは、N−グリカンNANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2の質量に対応する2227m/z[X]での優勢なピークを示し、RDP80株によって産生されたN−グリカンがヒト型Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2であることを確認する。
エピメラーゼの配列比較を、CLUSTALを使用して実施した。GenBank、SwissProt、BLOCKS及びPimaIIのデータベースにおける配列を問い合わせるため、配列リストのヌクレオチド配列及び/又はアミノ酸配列を使用した。すでに同定され注釈のついた配列を含有するこれらのデータベースを、BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)を使用して相同性の領域について検索した(例、Altschul,S.F.(1993)J.Mol.Evol 36: 290−300及びAltschulほか(1990)J.Mol.Biol.215: 403−410を参照してほしい。)。BLASTは、配列類似性を決定するためにヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の両者の配列比較を生じた。一次配列パターン及び二次構造間隙罰則を取り扱う場合、他のアルゴリズムを使用できた(例、Smith,Tほか(1992)Protein Engineering 5: 35−51を参照してほしい。)。
MOPS、カコジル酸ナトリウム、塩化マンガン、UDP−ガラクトース及びCMP−N−アセチルノイラミン酸はSigma社製であった。TFAはAldrich社製であった。ウシ乳由来のb1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼはCalbiochem社製であった。タンパク質N−グリコシダーゼF、マンノシダーゼ、及びオリゴ糖はGlyko社(San Rafael,CA)製であった。DEAEトヨパール樹脂はTosoHaas社製であった。金属キレート「HisBind」樹脂はNovagen社(Madison,WI)製であった。タンパク質結合96穴プレートはMillipore社(Bedford,MA)製であった。塩及び緩衝剤はSigma社(St.Louis,MO)製であった。MALDIマトリクスはAldrich社(Milwaukee,WI)製であった。
単一コロニーを、興味の対象の系を含有するYPDプレート(2週齢未満)から拾い上げ、50ml「ファルコン」遠心チューブの中のBMGY培地の10mlへと接種した。前記培養物を24℃で飽和するまで生育させた(約48時間)。種培養物を、BMGY培地の150mlを含有する500mlの調節されたメスフラスコへと移し、24℃で5±2のOD600になるまで生育させた(約18時間)。前記細胞の生育速度を、時間に対するOD600の自然対数のプロットの傾斜として決定した。前記細胞を、3000gで10分間遠心分離することによって前記生育培地(BMGY)から回収し、BMMYで洗浄し、250mlの調節したメスフラスコ中のBMMYの15ml中に懸濁した。24時間後、前記発現培地フラスコを遠心分離(3000gで10分間)することによって回収し、前記上清をK3産生について分析した。
BMGY培地の150mlの入った500mlの調節されたメスフラスコを種培養物(フラスコ培養参照)の1mlで接種した。前記接種体を24℃で4ないし6のOD600になるよう生育させた(約18時間)。次に、前記接種培養物由来の細胞を遠心分離し、発酵培地(培地1lあたり:CaSO4・2H2O 0.30g、K2SO4 6.00g、MgSO4・7H2O 5.00g、グリセロール40.0g、PTM1塩2.0ml、ビオチン4×10−3g、H3PO4(85%)30ml、1lあたりのPTM1塩:CuSO4・H2O 6.00、NaI 0.08g、MnSO4・7H2O 3.00g、NaMoO4・2H2O 0.20g、H3BO3 0.02g、CoCl2・6H2O 0.50g、ZnCl2 20.0g、FeSO4・7H2O 65.0g、ビオチン0.20g、H2SO4(98%)5.00ml)の50mlへと再懸濁した。
アルコールオキシダーゼ1(AOX1)プロモーターの調節下でのK3ドメインをモデルタンパク質として使用し、6×ヒスチジンタグを使用してすでに報告されているように精製した(Choiほか、Proc Natl Acad Sci USA 2003年4月29日号;100(9): 5022−5027)。グリカンを糖タンパク質から、すでに報告された方法の修正によって放出させ及び分離した(Papac及びBriggs 1998)。前記タンパク質を還元及びカルボキシメチル化した後、膜をブロッキングし、ウェルを水で3回洗浄した。前記タンパク質を、N−グリカナーゼ(Glyko)の1ミリ単位を含有する10mM NH4HCO3、pH8.3の30mlの添加によって脱グリコシルした。37℃で16時間後、グリカンを含有する溶液を遠心分離によって除去し、乾燥させるために蒸発させた。
Beckman BioMek2000試料取り扱いロボット(Beckman/Coulter Ranch Cucamonga,CA)で96穴フォーマットを使用してクリングル3を精製した。C末端6−ヒスチジンタグを使用してクリングル3を発現培地から精製した。ロボット精製は、NovagenのHisBind樹脂についてのNovagenによって提供されるプロトコールの応用である。簡潔に説明すれば、樹脂の150μl(μl)に設定された容積を96穴細胞溶解液結合プレートのウェルへと注入し、水の3容積で洗浄し、50mM NiSO4の5容積を負荷し、結合緩衝液(5mMイミダゾール、0.5M NaCl、20mMトリス−HCl、pH7.9)の3容積で洗浄する。タンパク質発現培地を3:2の培地:PBS(60mM PO4、16mM KCl、822mM NaCl、pH7.4)に希釈し、カラムへ負荷する。排水後、前記カラムを結合緩衝液の10容積及び洗浄緩衝液(30mMイミダゾール、0.5M NaCl、20mMトリス−HCl、pH7.9)の6容積で洗浄し、前記タンパク質を溶出緩衝液(1Mイミダゾール、0.5M NaCl、20mMトリス−HCl、pH7.9)の6容積で溶出する。前記溶出した糖タンパク質を凍結乾燥により乾燥するまで蒸発させる。
グリカンをすでに報告された方法(Papacほか、A.J.S.(1998)Glycobiology 8、445−454)の修正によって糖タンパク質から放出させ及び分離する。96穴MultiScreen IP(Immobilon P膜)プレート(Millipore)のウェルをメタノールの100μlで湿らせ、水の3×150μl及びRCM緩衝液(8M尿素、360mMトリス、3.2mM EDTA、pH8.6)の50μlで洗浄し、各添加後にゆるく真空にしながら排水する。前記乾燥したタンパク質試料をRCM緩衝液の30μlに溶解し、RCM緩衝液の10μlを含有するウェルへと移す。前記ウェルを排水し、RCM緩衝液で2回洗浄する。前記タンパク質をRCM緩衝液中の0.1M DTTの60μlの37℃での1時間の添加によって還元する。前記ウェルを水の300μlで3回洗浄し、0.1Mヨード酢酸の60μlの暗所における室温での30分間の添加によってカルボキシメチル化する。前記ウェルを水で再度3回洗浄し、膜を水中の1%PVP360の100μlの室温での1時間の添加によってブロッキングする。前記ウェルを排水し、水の300μlで3回洗浄し、N−グリカナーゼ(Glyko)の1ミリ単位を含有する10mM NH4HCO3、pH8.3の30μlの添加によって脱グリコシルした。37℃で16時間後、前記グリカンを含有する溶液を遠心分離により除去し、乾燥するまで蒸発させた。
前記グリカンの分子量を、抽出の遅延を使用するVoyager DE PRO線形MALDI−TOF(Applied Biosciences)質量分析法を使用して決定した。各ウェル由来の乾燥したグリカンを水の15μlに溶解し、0.5μlをステンレス鋼試料プレート上に点状に置き、S−DHBマトリクス(ジヒドロキシ安息香酸の9mg/ml、水とアセトニトリル0.1%TFAの1:1中の5−メトキシサリチル酸の1mg/ml)の0.5μlと混合し、乾燥させた。
Claims (38)
- 末端β−ガラクトース残基を有すること及びヒト様糖タンパク質においてフコース残基及びシアル酸残基が本質的に欠失していることを特徴とするヒト様タンパク質を産生する組換え型下等真核宿主細胞。
- 前記宿主細胞がβ1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を発現する、請求項1に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞がUDP−ガラクトース輸送活性を発現する、請求項1に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞がUDP−ガラクトースの上昇したレベルを呈する、請求項1に記載の宿主細胞。
- β−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性をコード化する単離された核酸分子と、UDP−ガラクトース輸送活性、UDP−ガラクトースC4エピメラーゼ活性又はガラクトキナーゼ活性又はガラクトース−1−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ活性をコード化する少なくとも1つの単離された核酸分子とを含む、ヒト様糖タンパク質を産生する組換え型下等真核宿主細胞。
- 前記UDP−ガラクトース輸送活性がSpUGT、hUGT1、hUGT2及びDmUGTからなる群から選択される遺伝子によってコード化されている、請求項3又は請求項5に記載の宿主。
- 前記UDP−ガラクトースC4エピメラーゼ活性がSpGALE、ScGAL10及びhGALEからなる群から選択される遺伝子によってコード化されている、請求項4又は請求項5に記載の宿主。
- ヒト様糖タンパク質を産生する組換え型下等真核宿主細胞であり、前記宿主細胞は末端GlcNAc残基を含む糖タンパク質のN結合したオリゴ糖分岐鎖へとβ−ガラクトース残基を転移でき、前記N−結合したオリゴ糖分岐鎖は、トリマンノース中心上にあるGlcNAcβ1,2−Manα1,3、GlcNAcβ1,4−Manα1,3、GlcNAcβ1,2−Manα1,6、GlcNAcβ1,4−Manα1,6、及びGlcNAcβ1,6−Manα1,6からなる群から選択される、前記宿主細胞。
- シアル酸に対する受容体基質である糖タンパク質を産生される、請求項1において生じる組換え型下等真核宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、前記糖タンパク質上のグリカンに関して1,6マンノシルトランスフェラーゼ活性を惹起する点において弱められている、請求項1、請求項5又は請求項8のいずれか1項に記載の宿主。
- 前記宿主細胞が、ドリチル−P−Man:Man5GlcNAc2−PP−ドリチルα−1,3−マンノシルトランスフェラーゼ活性において低下されている又は欠失されている、請求項1、請求項5又は請求項8の何れか1項に記載の宿主。
- 該宿主細胞がα1,2−マンノシダーゼI活性、マンノシダーゼII活性、マンノシダーゼIIx活性及びクラスIIIマンノシダーゼ活性から選択されるマンノシダーゼ活性を発現する、請求項1、請求項5又は請求項8のいずれか1項に記載の宿主。
- 該宿主細胞がGnTI、GnTII、GnTIII、GnTIV、GnTV、GnTVI及びGnTIXからなる群から選択されるGnT活性を発現する、請求項1、請求項5又は請求項8のいずれか1項に記載の宿主。
- 前記宿主細胞が、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、ピキアフィンランディカ(Pichia finlandica)、ピキア・トレハロフィラ(Pichia trehalophila)、ピキア・コクラマエ(Pichia koclamae)、ピキア・メンブラナエファシエンス(Pichia membranaefaciens)、ピキア・ミニュータ(Pichia minuta)(オガタエア・ミニュータ(Ogataea minuta)、ピキア・リンドネリ(Pichia lindneri))、ピキア・オプンティアエ(Pichia opuntiae)、ピキアサーモトレランス(Pichia thermotolerans)、ピキア・サリクタリア(Pichia salictaria)、ピキア・グエルキューム(Pichia guercuum)、ピキアピジュペリ(Pichia pijperi)、ピキア・スティプティス(Pichia stiptis)、ピキア・メタノリカ(Pichia methanolica)、ピキア種(Pichia sp.)、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセス種(Saccharomyces sp.)、ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、クルイベロミセス種(Kluyveromyces sp.)、クルイベロミセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、アスペリギルス・ニドウランス(Aspergillus nidulans)、アスペリギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリゼ(Aspergills oryzae)、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)、クリソスポリウム・ラックノウエンス(Chrysosporium lucknowense)、フサリウム種(Fusarium sp.)、フザリウム・グラミネウム(Fusarium gramineum)、フザリウム・ベネナツム(Fusarium venenatum)、フィスコミトレラ・パテンス(Physcomitrella patens)及びノイロスポラ・クロッサ(Neurospora crossa)からなる群から選択される、請求項1、請求項5又は請求項8のいずれか一項に記載の宿主。
- 末端β−ガラクトース残基を有し、前記糖タンパク質上にフコース残基及びシアル酸残基が本質的に欠失していることを特徴とするヒト様糖タンパク質を含む組成物。
- 前記糖タンパク質が、GalGlcNAcMan3GlcNAc2、GalGlcNAc2Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、GalGlcNAc3Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2、GalGlcNAc4Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc4Man3GlcNAc2、Gal3GlcNAc4Man3GlcNAc2、Gal4GlcNAc4Man3GlcNAc2、GalGlcNAcMan5GlcNAc2、GalGlcNAc2Man5GlcNAc2、Gal2GlcNAc2Man5GlcNAc2、GalGlcNAc3Man5GlcNAc2、Gal2GlcNAc3Man5GlcNAc2及びGal3GlcNAc3Man5GlcNAc2からなる群から選択されるN結合したオリゴ糖を含む、請求項15に記載の組成物。
- 前記糖タンパク質が、エリスロポエチン、例えば、サイトカイン、インターフェロン−a、インターフェロン−b、インターフェロン−g、インターフェロン−w及び顆粒球−CSF、GM−CSF、例えば、凝固因子、第VIII因子、第IX因子及びヒトタンパク質C、抗トロンビンIII、トロンビン、可溶性IgE受容体a鎖、IgG、IgG断片、IgG融合体、IgM、インターロイキン、ウロキナーゼ、キマーゼ、及び尿素トリプシン阻害剤、IGF結合タンパク質、上皮成長因子、成長ホルモン放出因子、アネキシンV融合タンパク質、アンジオスタチン、血管内皮増殖因子−2、骨髄系前駆体阻害因子−1、オステオプロテジェリン、a−1−抗トリプシン、a−胎児タンパク質、DNaseII、ヒトプラスミノーゲンのクリングル3、グルコセレブロシダーゼ、TNF結合タンパク質1、卵胞刺激ホルモン、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4−Ig、膜貫通活性化因子及びカルシウム調節因子及びサイクロフィリンリガンド、可溶性TNF受容体Fc融合体、グルカゴン様タンパク質1、IL−2受容体アゴニストからなる群から選択される、請求項15に記載の組成物。
- 内在性レベルを上回ってUDP−ガラクトースを産生する段階を含む、下等真核宿主細胞におけるヒト様糖タンパク質を産生するための方法。
- 請求項18に記載の方法によって作製された宿主細胞。
- フコース残基及びシアル酸残基のない状態においてハイブリッド又は複雑な糖タンパク質上にガラクトース残基を転移させる段階を含む、下等真核宿主細胞においてヒト様糖タンパク質組成物を作製するための方法。
- 前記ガラクトース残基が、GlcNAcMan3GlcNAc2、GlcNAc2Man3GlcNAc2、GlcNAc3Man3GlcNAc2、GlcNAc4Man3GlcNAc2、GlcNAc5Man3GlcNAc2GlcNAc6Man3GlcNAc2、GlcNAcMan4GlcNAc2、GlcNAcMan5GlcNAc2、GlcNAc2Man5GlcNAc2及びGlcNAc3Man5GlcNAc2からなる群から選択される糖タンパク質上へ転移される、請求項20に記載の方法。
- 前記転移段階が、β−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性をコード化する遺伝子又はβ−ガラクトシルトランスフェラーゼの触媒作用活性のある断片を発現させることをさらに含む、請求項20に記載の方法。
- 前記ガラクトシルトランスフェラーゼ活性がヒトGalTI、GalTII、GalTIII、GalTIV、GalTV、GalTVI、GalTVII、ウシGalTI、アフリカツメガエル(X.leavis)GalT及び線虫(C.elegans)GalTIIからなる群から選択される、請求項22に記載の方法。
- 前記転移段階が、UDP−ガラクトース輸送活性を発現させることをさらに含む、請求項20に記載の方法。
- 前記UGTがS.ホムベ(S.pombe)UGT、ヒトUGT1、ヒトUGT2、及びキイロショウジョウバエ(D.melanogaster)UGTからなる群から選択される、請求項24に記載の方法。
- 前記転移段階が、UDP−ガラクトースC4エピメラーゼ活性をコード化する遺伝子を発現させることをさらに含む、請求項20に記載の方法。
- 前記エピメラーゼ活性がS.ポムベ(S.pombe)GalE、S.セレビシエ(S.cerevisiae)Gal10及びヒトGalEからなる群から選択される、請求項26に記載の方法。
- 少なくとも33%ガラクトシル化された糖タンパク質組成物が作製される、請求項20ないし請求項27のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも60%ガラクトシル化された糖タンパク質組成物が作製される、請求項20ないし請求項27のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも90%ガラクトシル化された糖タンパク質組成物が作製される、請求項20ないし請求項27のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項20ないし請求項27の何れか1項によって作製された糖タンパク質組成物。
- 前記糖タンパク質組成物がシアル酸に対する受容体基質である、請求項20ないし請求項27の何れか1項によって作製される糖タンパク質組成物。
- 前記糖タンパク質がエリスロポエチン、サイトカイン、例えば、インターフェロン−a、インターフェロン−b、インターフェロン−g、インターフェロン−w及び顆粒球−CSF、GM−CSF、凝固因子、例えば、第VIII因子、第IX因子、及びヒトタンパク質C、抗トロンビンIII、トロンビン、可溶性IgE受容体a鎖、IgG、IgG断片、IgG融合体、IgM、インターロイキン、ウロキナーゼ、キマーゼ、及び尿素トリプシン阻害剤、IGF結合タンパク質、上皮成長因子、成長ホルモン放出因子、アネキシンV融合タンパク質、アンジオスタチン、血管内皮増殖因子−2、骨髄系前駆体阻害因子−1、オステオプロテジェリン、a−1−抗トリプシン、a−胎児タンパク質、DNaseII、ヒトプラスミノーゲンのクリングル3、グルコセレブロシダーゼ、TNF結合タンパク質1、卵胞刺激ホルモン、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4−Ig、膜貫通活性化因子及びカルシウム調節因子及びサイクロフィリンリガンド、可溶性TNF受容体Fc融合体、グルカゴン様タンパク質1、IL−2受容体アゴニストからなる群から選択される、請求項31によって作成される糖タンパク質組成物。
- 前記糖タンパク質が、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、ピキア・フィンランディカ(Pichia finlandica)、ピキア・トレハロフィラ(Pichia trehalophila)、ピキア・コクラマエ(Pichia koclamae)、ピキア・メンブラナエファシエンス(Pichia membranaefaciens)、ピキア・ミニュータ(Pichia minuta)(オガタエア・ミニュータ(Ogataea minuta)、ピキア・リンドネリ(Pichia lindneri))、ピキア・オプンティアエ(Pichia opuntiae)、ピキア・サーモトレランス(Pichia thermotolerans)、ピキア・サリクタリア(Pichia salictaria)、ピキア・グエルキューム(Pichia guercuum)、ピキア・ピジュペリ(Pichia pijperi)、ピキア・スティプティス(Pichia stiptis)、ピキア・メタノリカ(Pichia methanolica)、ピキア種(Pichia sp.)、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセス種(Saccharomyces sp.)、ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、クルイベロミセス種(Kluyveromyces sp.)、クルイベロミセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、アスペリギルス・ニドウランス(Aspergillus nidulans)、アスペリギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリゼ(Aspergills oryzae)、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)、クリソスポリウム・ラックノウエンス(Chrysosporium lucknowense)、フサリウム種(Fusarium sp.)、フザリウム・グラミネウム(Fusarium gramineum)、フザリウム・ベネナツム(Fusarium venenatum)、フィスコミトレラ・パテンス(Physcomitrella patens)及びノイロスポラ・クロッサ(Neurospora crossa)からなる群から選択される宿主細胞から産生される、請求項31において作製される糖タンパク質組成物。
- GalNAcトランスフェラーゼ活性を発現する組換え型下等真核宿主細胞。
- 異種性UDPase活性をコード化する遺伝子を発現する組換え型下等真核宿主細胞。
- (a)配列番号14、(b)配列番号13のドナーヌクレオチド結合部位のアミノ酸残基と少なくとも約90%類似しているもの、(c)配列番号14と少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%又は少なくとも99.9%同一である核酸配列、(d)配列番号13のアミノ酸配列を有する保存されたポリペプチドをコード化する核酸配列、(e)配列番号13と少なくとも78%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%又は少なくとも99.9%同一のポリペプチドをコード化する核酸配列、(f)緊縮な条件下で配列番号13とハイブリダイズする核酸配列、及び(g)長さにおいて少なくとも60個の連続したヌクレオチドである(a)ないし(f)のうちのいずれか1つの断片を含む核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含むか又は前記核酸配列からなる単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号48ないし配列番号52の保存された領域からなる群から選択される核酸配列を含むか又は前記核酸配列からなり、コード化されたポリペプチドがガラクトシル化した糖タンパク質の産生のためのUDP−グルコース及びUDP−ガラクトースの相互変換を触媒することに関与している、修飾されたポリヌクレオチド。
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