JP4820055B2 - 哺乳動物型糖質構造を操作するための方法 - Google Patents

哺乳動物型糖質構造を操作するための方法 Download PDF

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Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、米国仮出願番号６０／３４４，１６９（２００１年１２月２７日）（本明細
書中に参考としてその全体を援用する）に優先権を主張する。
（発明の分野）
本発明は、一般的に、真菌または他の低級真核生物において発現される組換えタンパク
質のグリコシル化構造（より詳細には高等哺乳動物（特にヒト）のタンパク質のグリコシ
ル化）の改変に関する。
（発明の背景）
ＤＮＡが転写されそしてタンパク質へと翻訳された後の、さらなる翻訳後プロセッシン
グは、リコシル化として公知のプロセスである糖残基の結合を含む。異なる生物は、異な
るグリコシル化酵素（グリコシルトランスフェラーゼおよびグリコシダーゼ）を生産し、
そして利用可能な異なる基質（ヌクレオチド糖）を有し、その結果、個々のオリゴ糖のグ
リコシル化パターンならびに組成物は、１つでも同じタンパク質でさえも、特定のタンパ
ク質が発現される宿主系に依存して異なる。細菌は、代表的に、タンパク質をグリコシル
化せず、そうであれば、非常に非特異的な様式である（Ｍｏｅｎｓ，１９９７）。低級真
核生物（例えば、糸状菌および酵母）は、主なマンノースおよびリン酸マンノシル（ｍａ
ｎｎｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ）糖を添加するのに対して、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９
細胞）は、さらなる別の方法でタンパク質をグリコシル化する。例えば、（Ｂｒｅｔｔｈ
ａｕｅｒ，１９９９；Ｍａｒｔｉｎｅｔ，１９９８；Ｗｅｉｋｅｒｔ，１９９９；Ｍａｌ
ｉｓｓａｒｄ，２０００；Ｊａｒｖｉｓ，１９９８；およびＴａｋｅｕｃｈｉ，１９９７
）を参照のこと。
一連の反応からなる哺乳動物型オリゴ糖構造の合成は、その過程において、糖残基が、
タンパク質が、宿主生物における分泌経路に沿って移動する間に、添加されそして除去さ
れる。宿主生物または細胞のグリコシル化経路に沿って存在する酵素は、分泌されたタン
パク質の得られたグリコシル化パターンを決定する。あいにく、低級真核生物宿主細胞で
発現されるタンパク質の得られたグリコシル化パターンは、高級真核生物（例えば、ヒト
および他の哺乳動物）において見られるグリコシル化とは実質的に異なる（Ｂｒｅｔｔｈ
ａｕｅｒ，１９９９）。さらに、非常に異なるグリコシル化パターンは、いくつかの場合
において、ヒトにおけるこれらのタンパク質の免疫原性の増加およびそれらの半減期の減
少を示している（Ｔａｋｅｕｃｈｉ，１９９７）。非ヒト宿主細胞（特に、低級真核生物
細胞）中でヒト様糖タンパク質を生産することが所望される。
ヒトグリコシル化の初期段階は、２つの異なる相に分けられ得る：（ｉ）脂質連結Ｇｌ
ｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２オリゴ糖は、小胞体（ＥＲ）の膜で反応の経時的なセットに
よってアセンブリされ、そして（ｉｉ）脂質アンカードリコール（ｄｏｌｉｃｈｙｌ）ピ
ロリン酸から新規に合成されたタンパク質上へのこのオリゴ糖の移動。特異的な移動部位
は、配列Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（図１を参照のこと）中のアスパラギン（Ａｓ
ｎ）残基によって規定され、Ｘａａは、プロリンを除く任意のアミノ酸であり得る（Ｇａ
ｖｅｌ，１９９０）。グルコシダーゼおよびマンノシダーゼによるさらにプロセッシング
は、ＥＲ中で生じ、その後、新生の糖タンパク質が、初期のゴルジ装置に移動され、さら
なるマンノース残基は、ゴルジ特異的α（α）−１，２−マンノシダーゼによって除去さ
れる。プロセッシングは、ゴルジを通って進むタンパク質として続く。内側のゴルジにお
いて、多くの改変酵素（Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＧｎＴ Ｉ、
ＧｎＴ ＩＩ、ＧｎＴ ＩＩＩ、ＧｎＴ ＩＶ ＧｎＴ Ｖ ＧｎＴ ＶＩ）、マンノシ
ダーゼＩＩおよびフコシルトランスフェラーゼを含む）は、特定の糖残基を付加し、そし
て除去する（例えば、図２および図３を参照のこと）。最後に、ｔｒａｎｓ−ゴルジにお
いて、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼは、ゴルジか
ら放出される糖タンパク質構造を生産する。これらの構造において、ジアンテナ構造（ａ
ｎｔｅｎｎａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）、トリアンテナ構造およびテトラアンテナ構造
（ガラクトース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミンおよび糖タンパク質にそれらのヒ
ト特徴付けを与える末端シアル酸の高い程度を含む）によって特徴付けされる。
ほとんど全ての真核生物において、糖タンパク質は、一般的なコアオリゴ糖前駆体Ｇｌ
ｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−Ｄｏｌから誘導され、このＰＰ−Ｄｏｌは、ドリコ
ール−ピロリン酸を意味する（図１）。小胞体において、オリゴ糖に結合するドリコール
ピロリン酸の合成およびプロセッシングは、周知の真核生物の間で同一である。しかし、
酵母によるコアオリゴ糖のさらなるプロセッシングは、一旦ＥＲを離れそしてゴルジに侵
入するペプチドに移動されると、分泌経路に沿って移動し、そしていくつかのマンノース
糖の添加に関与するので、ヒトと有意に異なる。
酵母において、これらの工程は、Ｏｃｈｌｐ、ＭｎｔｌｐおよびＭｎｎｌｐのようなマ
ンノシルトランスフェラーゼに存在するゴルジによって触媒され、コアオリゴ糖にマンノ
ース糖を連続して添加する。得られた構造は、ヒューマノイドタンパク質の生産を所望せ
ず、従って、マンノシルトランスフェラーゼ活性を減少するか除去することを所望する。
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの変異体（マンノシルトランスフェラーゼ活性を欠損する）（
例えば、ｏｃｈ１変異体またはｍｎｎ９変異体）は、非致死であり、そして酵母糖タンパ
ク質のオリゴ糖中の減少したマンノース含量を提示することを示す。他のオリゴ糖プロセ
ッシング酵素（例えば、リン酸マンノシルトランスフェラーゼ）はまた、宿主の特定の内
因的なグリコシル化パターンに依存して除去され得る。
（脂質連結オリゴ糖前駆体）
本発明の特定の興味深いことは、Ｎ−グリコシル化の初期段階である（図１および図２
）。Ｇｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−Ｄｏｌの生合成が不完全であるａｌｇ（ア
スパラギン連結グリコシル化）変異体の研究は、Ｎ−グリコシル化の開始段階を明らかに
することを助ける。
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＬＧ３遺伝子は、首尾よくクローン化され、そして欠失
によってノックアウトされている（Ａｅｂｉ，１９９６）。ＡＬＧ３は、酵素Ｄｏｌ−Ｐ
−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−Ｄｏｌマンノシルトランスフェラーゼをコー
ドすることが示され、これは、ＥＲの管腔側で、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−Ｄｏｌ
からＭａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−Ｄｏｌまでの第１のＤｏｌ−Ｐ−Ｍａｎ依存性マン
ノシル化工程に関与する（Ｓｈａｒｍａ，２００１）（図１および２）。漏出ａｌｇ３−
１変異を有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−Ｄｏ
ｌ（構造Ｉ）を集積する（Ｈｕｆｆａｋｅｒ，１９８３）。
Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（構造Ｉ）およびＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２は、ｏｃｈ１ ｍｎｎ
１ ａｌｇ３変異体の全細胞マンノタンパク質を集積する（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ−Ｓｈｉ
ｎｄｏ，１９９３）。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｏｃｈ１、ｍｎｎ１、ａｌｇ３変
異体は、生存可能であるが、温度感受性であり、そしてα−１，６ポリマンノース外鎖（
ｏｕｔｅｒ ｃｈａｉｎ）を欠損することが示された。
別の研究において、ａｌｇ３を欠損した株（Δａｌｇ３バックグラウンド）中で発現さ
れた分泌タンパク質は、Ｅｎｄｏ−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ Ｈ（Ｅｎｄｏ
Ｈ）に対する耐性について研究された（Ａｅｂｉ，１９９６）。以前の観察は、Ｍａｎ
５ＧｌｃＮＡｃ２より長いこれらのオリゴ糖のみが、Ｅｎｄｏ Ｈによって切断されやす
いことを示している（Ｈｕｂｂａｒｄ，１９８０）。ａｌｇ３−１表現型において、いく
つかのグリコフォームは、その漏出（ｌｅａｋｉｎｅｓｓ）を確認するＥｎｄｏ Ｈ切断
に感受性であるが、Δａｌｇ３変異体において、全てのグリコフォームは耐性であるよう
であり、かつＭａｎ５−型であり（Ａｅｂｉ，１９９６）、密接な表現型および発生期の
ポリペプチド鎖上にＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２オリゴ糖構造の移動を示唆する。明らかな表
現型は、ＡＬＧ３遺伝子の不活性化と関係しない（Ａｅｂｉ，１９９６）。Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ａｌｇ３変異体中で生産された、分泌エクソグ
ルコナーゼ（ｅｘｏｇｌｕｃｏｎａｓｅ）は、３５〜４４％の間で過小グリコシル化（ｕ
ｎｄｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅ）形態および非グリコシル化形態ならびＥｎｄｏ Ｈ処
理に耐性のままである約５０％のみの移動オリゴ糖を含むことが見出された（Ｃｕｅｖａ
，１９９６）。エキソグルカナーゼ（Ｅｘｇ）（Ａｓｎ１６５およびＡｓｎ３２５での２
つの潜在的なＮ−グリコシル化部位を含む酵素）は、より詳細に分析された。２つのオリ
ゴ糖を受け取るＥｘｇ分子について、これは、第１のＮ−グリコシル化部位（Ａｓｎ１６
５）が、短縮型残基中で富化されたが、第２（Ａｓｎ３２５）は、規則的なオリゴ糖中で
富化されたことが示された。３５〜４４％の分泌エキソグルカナーゼは、非グリコシル化
または過小グルコシル化され、そして約７３〜７８％の全ての利用可能なＮ−グリコシル
化部位は、短縮型オリゴ糖または規則的なオリゴ糖のいずれかで占められた（Ｃｕｅｖａ
，１９９６）。
（グルコシル化脂質連結オリゴ糖の移動）
証拠は、哺乳動物細胞において、グルコシル化脂質連結オリゴ糖のみが、新生タンパク
質に移動される（Ｔｕｒｃｏ，１９７７）が、酵母ａｌｇ５変異体、ａｌｇ６変異体、お
よびｄｐｇ１変異体においては、非グルコシル化オリゴ糖が移動され得る（Ｂａｌｌｏｕ
，１９８６；Ｒｕｎｇｅ，１９８４）ことを示唆する。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ ａｌｇ８変異体において、過小グリコシル化のＧｌｃＭａｎ９Ｇｌ
ｃＮＡｃ２が移動される（Ｒｕｎｇｅ，１９８６）。Ｖｅｒｏｓｔｅｋおよび共同研究者
らは、ａｌｇ３変異体、ｓｅｃｌ８変異体、ｇｌｓｌ変異体を研究し、そしてＭａｎ５Ｇ
ｌｃＮＡｃ２構造（構造Ｉ、上記）のグルコシル化は、脂質連結Ｍａｎ９構造のグルコシ
ル化と比較して、比較的遅いことを提案する。さらに、このＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造
のタンパク質への移動は、Ｇｌｃ３Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２へのグルコシル化よりも約５
倍効率的であるようである。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グルコシル化の減少した速度は、比
較的早い速度のＭａｎ５構造と組み合わせて、ａｌｇ３変異体酵母中で観察された非グル
コシル化Ｍａｎ５構造の蓄積の原因であると考えられる新生タンパク質上に移動する（Ｖ
ｅｒｏｓｔｅｋ−ａ，１９９３；Ｖｅｒｏｓｔｅｋ−ｂ，１９９３）。
上記の研究に先行する研究は、グルコシル化オリゴ糖が、その非グルコシル化対応物よ
りも非常に早い速度で移動され、従って、単離するのがより困難であるという結果を認め
る、任意の脂質連結グルコシル化オリゴ糖を明らかにしなかった（Ｏｒｌｅａｎ，１９９
０；Ｈｕｆｆａｋｅｒ，１９８３）。最近の研究は、非グルコシル化オリゴ糖および低グ
ルコシル化オリゴ糖を有する酵母株の作製および研究を可能にし、そしてオリゴサッカリ
ルトランスフェラーゼ複合体による基質認識のための脂質連結オリゴ糖のアンテナに対す
るグルコースの付加の重要性をさらに確認した（Ｒｅｉｓｓ，１９９６；Ｓｔａｇｌｊａ
ｒ，１９９４；Ｂｕｒｄａ，１９９８）。ａｌｇ３変異体における脂質連結Ｍａｎ５オリ
ゴ糖のグルコシル化の減少程度は、新生タンパク質上の脂質連結オリゴ糖の移動の動力学
にネガティブに影響し、そしてこれは、ａｌｇ３ノックアウト株中の分泌タンパク質の強
い過小グリコシル化を引き起こすと考えられる（Ａｅｂｉ，１９９６）。
上記のように、脂質連結核オリゴ糖Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２のアセンブリは、小胞体（
ｅｎｄｏｐｌａｓｍａｔｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）の膜で生じる。３つのグルコース単
位の、脂質連結オリゴ糖のα−１，３−アンテナへの付加は、オリゴ糖アセンブリの最終
反応である。最初のα−１，４グルコース残基が付加され、その後別のα−１，３グルコ
ース残基および末端α−１，２グルコース残基を付加される。ドリコール連結Ｍａｎ９Ｇ
ｌｃＮＡｃ２を蓄積する変異体は、ＡＬＧ６座中で欠損していることが示され、そしてＡ
ｌｇ６ｐは、Ａｌｇ８ｐに対して類似性を有し、α−１，３−グルコシルトランスフェラ
ーゼは、第２のα−１，３−連結グルコースの付加を触媒する（Ｒｅｉｓｓ，１９９６）
。欠損ＡＬＧ８座を有する細胞は、ドリコール連結Ｇｌｃ１Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２を蓄
積する（Ｒｕｎｇｅ，１９８６；Ｓｔａｇｌｊａｒ，１９９４）。このＡＬＧ１０座は、
Ｇｌｃ２Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−Ｄｏｌへの単一の末端グルコースの付加に応答
性であるα−１，２グルコシルトランスフェラーゼをコードする（Ｂｕｒｄａ，１９９８
）。
（局在化した酵素活性の連続的なＮ−グリカンのプロセシング）
糖トランスフェラーゼおよびマンノシダーゼは、ＥＲおよびゴルジ装置の内側（管腔）
表面に並び、それによって糖タンパク質の連続的なプロセシングを可能にする「触媒」表
面を提供する。なぜなら、糖タンパク質は、ＥＲおよびゴルジのネットワークを介して進
むからである。実際、これらのシス、中間、およびトランスのゴルジならびにトランス−
ゴルジネットワーク（ＴＧＮ）の複数の区画は、順番に並べられたグリコシル化反応が起
こり得る、異なる局所性を提供する。糖タンパク質は、ＥＲ中の合成から、後期のゴルジ
またはＴＧＮにおける完全な成熟まで進められるので、異なるグリコシダーゼ、マンノシ
ダーゼおよびグリコシルトランスフェラーゼに順番に曝され、その結果、特異的糖質構造
が合成され得る。多くの研究は、これらの酵素がそれぞれのオルガネラに保持およびアン
カーされる、正確な機構を明らかにすることに奉げられていつ。画像を展開することは複
雑であるが、証拠は、幹領域、膜貫通領域および細胞質テイルが、個々にかまたは協力し
て、個々のオルガネラの膜に酵素を指向し、それによって関連する触媒ドメインをその座
に局在化する。
いくつかの場合において、これらの特異的な相互作用は、種をまたいで機能することが
見出された。例えば、ラット由来のα２，６−ＳＴの膜貫通ドメインは、動物のトランス
−ゴルジに局在化されることが知られている酵素であり、酵母ゴルジ中のレポーター遺伝
子（インベルターゼ）も局在化することが示された（Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋ，１９９５）
。しかし、全長α２，６ＳＴの一部と非常に同じ膜貫通ドメインは、ＥＲ中に保持され、
そして酵母のゴルジにさらに輸送されない（Ｋｒｅｚｄｏｒｎ，１９９４）。ヒト由来の
全長Ｇａｌ−Ｔｒは、明らかに高い転写レベルにも関わらず、酵母中でさえも合成されな
い。一方で、インベルターゼレポーターに融合されるＧａｌＴと同じヒトの膜貫通領域は
、低い生成レベルにも関わらず、酵母ゴルジに直接局在化され得た。Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅ
ｋおよび共同研究者は、ヒトＧａｌＴの触媒ドメインに対する酵母マンノシルトランスフ
ェラーゼ（Ｍｎｔ１）、細胞質テイルを含む領域、膜貫通領域の２８個のアミノ酸および
幹領域の８個のアミノ酸が、活性ＧａｌＴのゴルジ局在化のために十分であることを示し
ている。他のガラクトシルトランスフェラーゼは、酵素残基（特に、オルガネラ）との相
互作用に依存するようである。なぜなら、これらの膜貫通領域の除去後、これらは、適切
に局在化され得るからである。現在、より低級真核生物中で特定の非相同的に発現された
グリコシルトランスフェラーゼまたはマンノシダーゼが、（１）十分に翻訳されているか
、（２）触媒的に活性か、または（３）分泌経路内の適切なオルガネラに位置しているか
どうかを予測する信頼性の高い方法は存在しない。これらの３つ全てが、低級真核生物中
のグリコシル化パターンに影響するのに必要であり、所望の触媒機能および予測ツールの
非存在下での酵素の適切な保持を達成するための全体的なスキームは、現在利用可能では
なく、設計段階である。
（治療用糖タンパク質の製造）
ヒトまたは動物から単離される有意な数のタンパク質は、最も有意な改変の１つである
グリコシル化によって翻訳後に改変される。全ての治療用タンパク質の推定で７０％がグ
リコシル化され、従って、ヒトと類似の様式でグリコシル化し得る産生系（すなわち、宿
主細胞）に依存している。現在、多くの糖タンパク質は、哺乳動物宿主系で作製される。
いくつかの研究は、グリコシル化は、（１）免疫原性、（２）薬物動態学特性、（３）ト
ラフィック、および（４）治療用タンパク質の効果を決定するのに重要な役割を果たすこ
とが示されている。従って、製薬産業の実質的な労力は、可能であれば「ヒューマノイド
」または「ヒト様」のようなプロセスを開発し、糖タンパク質を得ることに向けられてい
る。これは、このような哺乳動物細胞を遺伝子操作して、細胞によって発現されたタンパ
ク質のシアリル化（すなわち、シアル酸の末端付加）（これは、このようなタンパク質の
薬物動態学特性を改善することが知られている）の程度を増加することを含み得る。ある
いは、公知のグリコシルトランスフェラーゼおよびそれぞれのヌクレオチド糖（例えば、
２，３シアリルトランスフェラーゼおよびＣＭＰ−シアル酸）を使用する、このような糖
のインビトロでの付加によってシアリル化の程度を改善し得る。
さらなる調査は、特定の糖形態の生物学的有意性および治療的有意性を明らかにし得、
従って、そのような望ましい特定の糖形態を生成するための能力を与える。現在までに、
十分に特徴付けられた糖化パターンを有するタンパク質を生成すること、および以下の高
等真核生物のタンパク質発現系の１つにおいて、そのようなタンパク質をコードするｃＤ
ＮＡを発現することに、努力が費やされている。：
１．高等真核生物（例えば、チャイニーズハムスターの卵細胞（ＣＨＯ）、マウス線維
芽細胞およびマウス骨髄腫細胞（Ｗｅｒｎｅｒ、１９９８）；
２．トランスジェニック動物（例えば、ヤギ、ヒツジ、マウスおよその他（Ｄｅｎｔｅ
、１９８８）；（Ｃｏｌｅ、１９９４）；（ＭｃＧａｒｖｅｙ、１９９５）；（Ｂａｒｄ
ｏｒ、１９９９）；
３．植物（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、ｔｈａｌｉａｎａ，ｔｏｂａｃｃｏなど）（Ｓｔ
ａｕｂ、２０００）；（ＭｃＧａｒｖｅｙ、１９９５）；（Ｂａｒｄｏｒ、１９９９）；
４．昆虫細胞（組換えバキュロウイルス（例えば、鱗翅目細胞に感染するＡｕｔｏｇｒ
ａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ多核ポリヒドローシスウイルス（Ａｌｔｍａｎｎ，１９
９９））との組み合わせで、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ Ｓｆ９，Ｓ
ｆ２１，Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉなど）。
最も高等な真核生物が、ヒトにおいて認められる糖化反応に類似する糖化反応を起こす
一方、上述の宿主系において発現される組換えヒトタンパク質は、不変的にそれらの「天
然の」ヒトの対応部分と異なる（Ｒａｊｕ、２０００）。従って、さらなる開発研究が、
これらの発現系において生成されるタンパク質の「ヒト特徴」を改善する方法を発見する
ことに向けられている。これは、発酵条件の最適化および、ヒト様糖形態の形成に関する
酵素をコードする遺伝子を導入することによる、タンパク質発現宿主の遺伝的改変を含む
（Ｗｅｒｎｅｒ、１９９８）；（Ｗｅｉｋｅｒｔ、１９９９）；（Ａｎｄｅｒｓｅｎ、１
９９４）；（Ｙａｎｇ、２０００）。全ての哺乳動物の発現系に関連する固有の問題は、
解決されていない。
例えば、哺乳動物の細胞培養に基づく発酵プロセス（例えば、ＣＨＯ細胞、マウス細胞
、またはヒト細胞）は、非常に遅い傾向があり（１週間を越える発酵時間は、まれではな
い）、しばしば、低い生成価を生じ、高価な栄養および補因子（例えば、ウシ胎児血清）
を要求し、プログラムされた細胞死（アポトーシス）によって制限され、しばしば、特定
の治療的価値のあるタンパク質の発現を不可能にする。より重要なことには、哺乳動物細
胞は、ヒト病原体となる能力を有するウイルスに感受性でありまた、厳密な質の制御が、
生成物安全を保証するために要求される。これは、多くのそのようなプロセスが、動物（
例えば、ウシ血清）由来の、複雑かつ温度感受性な培地成分の添加を必要とするので、特
定の関心事の内であり、ヒトに対する病原性因子（例えば、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）プリ
オンまたはウイルス）を保有し得る。さらに、治療的化合物の生成は、好ましくは、十分
に制御された滅菌環境において、実施される。動物飼育は、（どんなに清潔を保っていて
も）そのような環境を構築せず、従って、多量の治療的タンパク質を製造するためのトラ
ンスジェニック動物の使用におけるさらなる問題を与える。
そのため、全てではないにしても、最近産生された治療的糖タンパク質は、哺乳動物細
胞において発現され、また、これらの組換えタンパク質の糖化パターンを改善すること（
すなわち。「ヒト化」すること）に多くの努力が、向けられている。培地組成物における
変化ならびにヒト糖化に関する酵素をコードする遺伝子の共発現が、継続的に行われてい
る（例えば、Ｗｅｉｋｅｒｔ、１９９９を参照のこと）。
ヒト対応部分に類似する組換えタンパク質が、哺乳動物発現系において作製され得、下
等真核生物（菌類および酵母）におけるヒト様糖化パターンを有するタンパク質を作製す
ることは、近年不可能である。小包体中で、タンパク質に移行される、核となるオリゴ糖
構造は、基本的には、哺乳動物および下等な真核生物において、同一であり、実質的な差
異は、次のプロセッシング反応において認められ、それは、菌類および哺乳動物のゴルジ
体において起こる。実際、異なる下等な真核生物間でさえ、多くの種々の糖化構造が、存
在する。これは、以下の哺乳動物発現系にわたって別に留意すべき利点を除いて、組換え
ヒト糖タンパク質の生成のための宿主として、下等真核生物の使用を妨げている。例えば
、：（１）一般的に高い産生力価、（２）短い発酵時間、（３）哺乳動物細胞において乏
しく発現されるタンパク質のための代替を有すること、（４）化学的に規定された無タン
パク質培地中での増殖し、従って、複雑な動物由来の培地成分を要求しない能力、（５）
およびウイルスの非存在（特に、そのような宿主のロタウイルス感染の非存在）。
種々のメチル栄養性酵母（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ
ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａおよびＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａは、真核生物
発現系として、特に重要な役割を果たす。なぜなら、それらは、高い細胞密度まで増殖し
得、大量の組換えタンパク質を分泌するためである。しかし、上記のように、下等真核生
物（例えば、酵母）は、高等動物のように、タンパク質を糖化しない。例えば、小包体（
ＥＲ）中の異種性マンノシダーゼを開示するＭａｒｔｉｎｅｔら、（１９９８）Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔ．２０巻、１２号を参照のこと。
Ｃｈｉｂａら、（１９９８）は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが、１，６マンノシルトラ
ンスフェラーゼ（ＯＣＨ１）、１，３マンノシルトランスフェラーゼ（ＭＮＮ１）および
マンノシルトランスフェラーゼ（ＭＮＮ４）の調節因子を取り除くことによって、ならび
に、ＥＲ検索配列（Ｃｈｉｂａ，１９９８）を用いてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＲに
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉ由来のα−１，２−マンノシダーゼＩの酵素作用
ドメインを標的することによって、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２構造からＭａｎ５ＧｌｃＮＡ
ｃ２構造の範囲の構造を提供するために操作され得ることを示した。しかし、この試みは
、所望のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（例えば、インビボで生成され、また、ＧｎＴ１につい
ての基質（ヒト様グリカン構造を作製する上での次の工程）として働き得るもの）。のわ
ずかな生成か、または全く生成しないことを生じる。Ｃｈｉｂａら、（１９９８）は、Ｐ
．ｐａｓｔｏｒｉｓが、内在的に有用な量（５％より多くの）の、炭化水素を受け取るＧ
ｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩを生成し得えない。
Ｍａｒａｓおよび同僚は、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉにおいて、「十分な濃度のアクセプター基
質（すなわち、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２）が存在する」ことを主張するが、このアクセプ
ター基質をＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に、インビボで２％未満で転換すること
を試みる場合、従って複合体Ｎグリカン形態のための適切な前駆体でないＭａｎ５Ｇｌｃ
ＮＡｃ２構造の存在を示しことで変換された（Ｍａｒａｓ，１９９７；Ｍａｒａｓ，１９
９９）。現在まで、下等真核生物において、商業的に十分な量のＧｌｃＮＡｃＭａｎ５Ｇ
ｌｃＮＡｃ２の生成が可能である開示は存在しない。
このため、非ヒト宿主細胞において発現される組換え糖タンパク質の糖化をヒト化する
ためのシステムおよび方法を提供することが、本発明の目的である。
（発明の要旨）
本発明は、改変された脂質連結オリゴ糖を有する菌株のような宿主細胞に関し、この宿主細胞は、グリコシルトランスフェラーゼのセット、糖輸送体、およびマンノシダーゼの異種発現によってされに改変され、哺乳動物の生成物（例えば、ヒト治療的糖タンパク質）についての宿主株とされ得る。タンパク質生成方法は、以下を用いて開発されている；（１）下等な真核生物宿主（例えば、単細胞真菌または繊維状真菌）または（２）ヒト由来の異なる糖化パターンを有する、あらゆる非ヒト真核生物（ヒトタンパク質中に見出される炭化水素構造により類似するように、宿主生物（「宿主細胞」）中で生成される糖化の組成およびタンパク質の構造が改変される。このプロセスは、科学文献およびタンパク質発現の当業者に公知の、十分確立された方法によって、糖化に関する任意の所望の遺伝子を発現および標的化するために使用され得る、操作された宿主細胞を得ることを可能にする。本明細書に記載のように、改変された脂質連結オリゴ糖を有する宿主細胞は、作成または選択される。操作された宿主細胞中のＮ−グリカンは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２コア構造を有し、次いで、これは１つ以上の酵素（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、糖輸送体およびマンノシダーゼ）の異種発現によって、さらに改変され、ヒト様糖タンパク質を産生し得る。治療的タンパク質の生成のために、この方法が、あらゆる所望の糖化構造を得ることができる細胞株を操作するために適合され得る。
（発明の詳細な説明）
本明細書中で他に規定されない限り、本発明に関連して使用される科学的用語および技
術用語は、当業者により一般的に理解される意味を有する。さらに、文脈により他に必要
とされなければ、単数形の用語は、複数形を含み、そして複数形の用語は、単数形を含む
。本発明の方法および技術は、当該分野において周知の従来の方法に従って一般的に実施
される。一般的に、本明細書中に記載される生化学、酵素学、分子生物学および細胞生物
学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質化学および核酸化学、ならびにハイブリダイゼ
ーションに関連して使用される名称、およびこれらの技術は、周知のものであり、そして
当該分野で一般的に使用される。本発明の方法および技術は、他に示されなければ、一般
的に、当該分野で周知の従来の方法に従って、そして本明細書の全体にわたって引用され
そして考察される種々の一般的な参考文献およびより具体的な参考文献に記載されるとお
りに実施される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ
．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ
ｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２および２００２までの補遺）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎ
ｄ Ｌａｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ
Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｕｒｅｅｎ Ｅ．Ｔａｙｌｏｒ，ＫｕｒｔＤｒｉｃｋａ
ｍｅｒ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ （２００３）；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ
Ｅｎｚｙｍｅ Ｍａｎｕａｌ，Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏｒｐ．Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
：Ｓｅｃｔｉｏｎ Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＶｏｌＩ １９７６ ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；
Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ Ａ Ｐｒｏｔｅ
ｉｎｓ Ｖｏｌ ＩＩ １９７６ ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ
Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９９９）を参照のこと。本明細書中に記載される生化学および分
子生物学に関連して使用される名称、ならびにこれらの研究室手順および技術は、当該分
野で周知でありかつ一般的に使用されるものである。
本明細書中に記述される全ての刊行物、特許および他の参考文献は、参考として援用さ
れる。
以下の用語は、他に示されなければ、以下の意味を有すると解釈される。
本明細書中において使用される場合、用語「Ｎ−グリカン」とは、Ｎ−連結オリゴ糖を
いい、例えば、アスパラギン−Ｎ−アセチルグルコサミン結合でポリペプチドのアスパラ
ギン残基に結合されるものである。Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ
」は、マンノースを指し；「Ｇｌｃ」は、グルコースを指し；そして「ＮＡｃ」は、Ｎ−
アセチルを指し；ＧｌｃＮＡｃは、Ｎ−アセチルグルコサミンを指す）の共通のペンタサ
ッカリドコアを有する。Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ３」）コア
構造に付加される抹消糖（例えば、フコースおよびシアル酸）を含む分枝（アンテナ）の
数に関して異なる。Ｎ−グリカンは、それらの分枝構造（高マンノース、複合（ｃｏｍｐ
ｌｅｘ）またはハイブリッド）に従って分類される。「高マンノース」型Ｎ−グリカンは
、５個以上のマンノース残基を有する。「複合」型Ｎ−グリカンは、代表的には、１，３
マンノースアームに結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃ、および「トリマンノース」
コアの１，６マンノースアームに結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃを有する。「ト
リマンノースコア」は、Ｍａｎ３構造を有するペンタサッカリドコアである。複合Ｎ−グ
リカンはまた、必要に応じてシアル酸または誘導体（「ＮｅｕＡｃ」、ここで「Ｎｅｕ」
は、ノイラミン酸を指し、「Ａｃ」は、アセチルを指す）で改変されたガラクトース（「
Ｇａｌ」）残基を有し得る。複合Ｎ−グリカンはまた、「分岐する（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ
）」ＧｌｃＮＡｃおよびコアフコース（「Ｆｕｃ」）を含む鎖内置換を有し得る。「ハイ
ブリッド」Ｎ−グリカンは、トリマンノースコアの１，３マンノースアームの末端に少な
くとも１つのＧｌｃＮＡｃ、およびトリマンノースコアの１，６マンノースアームの０以
上のマンノースを有する。
本明細書中で使用される略語は、当該分野で共通して利用される。例えば、上記の糖の
略語を参照のこと。他の共通の略語としては、以下が挙げられる：「ＰＮＧａｓｅ」、こ
れは、ペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（ＥＣ ３．２．２．１８）を指す；「ＧｌｃＮＡ
ｃ Ｔｒ（Ｉ−ＩＩＩ）」、３つのＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ酵素
のうちの１つを指す；「ＮＡＮＡ」は、Ｎ−アセチルノイラミン酸を指す。
本明細書中で使用される場合、用語「分泌経路」とは、細胞質から小胞体および（ＥＲ）およびゴルジ装置の区画への発生期ポリペプチド鎖の分子フローに沿って、脂質連結オリゴ糖前駆体およびＮ−グリカン基質が、連続的に暴露される、種々のグリコシル化酵素の集合ラインをいう。酵素は、この経路に沿って局在化されるといわれる。酵素Ｙの前に、脂質連結グリカンまたはＮ−グリカンに対して作用する酵素Ｘは、酵素Ｙの「上流」にある、または「上流」で作用するといわれる；同様に、酵素Ｙは、酵素Ｘから「下流」で作用する。
本明細書中で使用される場合、用語「ａｌｇ Ｘ活性」とは、「ａｌｇ Ｘ」遺伝子に
よりコードされる酵素活性、および相同遺伝子もしくは遺伝子産物（以下を参照のこと）
または非関連遺伝子もしくは遺伝子産物によりコードされる酵素活性を有する酵素をいう
。
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、完全な抗体（２つの重鎖および２つ
の軽鎖からなる）またはそのフラグメントをいう。このようなフラグメントとしては、種
々のプロテアーゼで消化することにより産生されるフラグメント、化学的切断および／ま
たは化学的解離、ならびにそのフラグメントが抗原に特異的に結合し得るままである限り
、組み換えにより産生されるフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。これ
らのフラグメントには、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フ
ラグメントおよび単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントがある。用語「抗体」の範囲内には
、配列を改変されているが、抗原に特異的に結合し得るままである抗体もある。改変され
た抗体の例は、種間キメラ抗体およびヒト化抗体；抗体融合物；およびヘテロマー抗体複
合体（例えば、二価抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）（二重特異性抗体）、単鎖二価抗体、および
細胞内発現抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ））（例えば、Ｍａｒａｓｃｏ（編），Ｉｎｔｒａ
ｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｉ
ｎｃ．（１９９８）（ＩＳＢＮ：３５４０６４１５１３）（その開示は、本明細書中にそ
の全体が参考として援用される）を参照のこと）。
本明細書中で使用される場合、用語「変異」とは、遺伝子産物（例えば、グリコシル化
関連酵素）の核酸配列またはアミノ酸配列における任意の変化をいう。
用語「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」とは、少なくとも１０塩基長のヌクレオ
チドのポリマー形態をいう。この用語は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤ
ＮＡもしくは合成ＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡまたは合成ＲＮＡ）、な
らびにＤＮＡまたはＲＮＡ含有非天然ヌクレオチドアナログ、非ネイティブヌクレオシド
間結合、またはその両方を含む。核酸は、任意のトポロジー的コンホメーションである得
る。例えば、核酸は、一本鎖、二本鎖、三本鎖、四重、部分的に二本鎖、分枝、ヘアピン
、環状または南京錠型のコンホメーションであり得る。この用語は、ＤＮＡの一本鎖形態
および二本鎖形態を含む。
他に示さなければ、「配列番号Ｘを含む核酸」とは、その核酸の少なくとも一部が、（
ｉ）配列番号Ｘの配列、または（ｉｉ）配列番号Ｘに相補的な配列のいずれかを有する核
酸をいう。これら２つの間の選択は、状況により必然的に決められる。例えば、核酸がプ
ローブとして使用される場合、２つの間の選択は、そのプローブが所望の標的に相補的で
ある必要性により必然的に決められる。
「単離された」または「実質的に純粋な」核酸またはポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは混合ポリマー）は、天然の宿主細胞においてネイティブポリヌクレオチドに自然に付随する他の細胞成分（例えば、リボソーム、ポリメラーゼ、およびそれが天然で関連するゲノム配列）から実質的に分離された、核酸またはポリヌクレオチドをいう。この用語は、（１）その天然に存在する環境から除去されたか、（２）その「単離されたポリヌクレオチド」が天然に見出されるポリヌクレオチドの全てまたは一部を伴わないか、（３）天然では連結されていないポリヌクレオチドに作動可能に連結されているか、または（４）天然には存在しない、核酸またはポリヌクレオチドを包含する。用語「単離された」または「実質的に純粋な」はまた、組み換え体もしくはクローン化されたＤＮＡ単離物、化学的に合成されたポリヌクレオチドアナログ、または異種系により生物学的に合成されたポリヌクレオチドアナログを言及する際に使用され得る。
しかし、「単離された」は、そのように記載される核酸またはポリヌクレオチド自体が
、そのネイティブ環境から物理的に除去されたことを必ずしも必要とするわけではない。
例えば、生物のゲノム中の内因性核酸配列は、異種配列（すなわち、この内因性核酸配列
に天然では隣接していない配列）が、内因性核酸配列に隣接して配置されて、その結果こ
の内因性核酸配列の発現が変更される場合に、本明細書中で「単離された」とみなされる
。例として、非ネイティブプロモーター配列は、ヒト細胞のゲノムにおいて遺伝子のネイ
ティブプロモーターと（例えば、相同組み換えにより）置換され得、その結果、この遺伝
子が変更された発現パターンを有する。この遺伝子は、ここで「単離された」となる。な
ぜなら、これは、天然で隣接する配列の少なくとも一部から分離されているからである。
核酸はまた、ゲノム中の対応する核酸に対する、天然に存在しない任意の改変を含む場
合に「単離された」とみなされる。例えば、内因性コード配列は、例えばヒトの介入によ
り人工的に導入された、挿入、欠失または点変異を含む場合に、「単離された」とみなさ
れる。「単離された核酸」はまた、異種部位において宿主細胞染色体に組み込まれた核酸
、エピソームとして存在する核酸構築物を含む。さらに、「単離された核酸」は、他の細
胞物質を実質的に含み得ないか、または組み換え技術により産生された場合に培養培地を
実質的に含み得ないか、または化学的に合成された場合に化学的前駆体もしくは他の化学
物質を実質的に含み得ない。
本明細書中で使用される場合、用語、参照核酸配列の「縮重改変体」は、標準の遺伝子
コードに従って翻訳され得、参照核酸配列から翻訳されるアミノ酸配列と同一のアミノ酸
配列を提供する核酸配列を包含する。
核酸配列の関係で、用語「パーセント配列同一性」または「同一な」は、最大一致で整
列された場合に同一である２つの配列中の残基をいう。配列同一性比較の長さは、少なく
とも約９ヌクレオチド、通常は少なくとも約２０ヌクレオチド、より通常は少なくとも約
２４ヌクレオチド、代表的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より代表的には少なくと
も約３２ヌクレオチド、および好ましくは少なくとも約３６以上のヌクレオチドのストレ
ッチにわたり得る。ヌクレオチド配列同一性を測定するのに使用され得る多くの異なるア
ルゴリズムが、当該分野で公知である。例えば、ポリヌクレオチド配列は、ＦＡＳＴＡ、
Ｇａｐ、またはＢｅｓｔｆｉｔを用いて比較され得、これらは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐ
ａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒ
ｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎのプログラムである。ＦＡＳＴ
Ａは、問い合わせ（ｑｕｅｒｙ）配列と検索（ｓｅａｒｃｈ）配列との間の最良の重複領
域のアラインメントおよびパーセント配列同一性を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ，１９９０
（本明細書中で参考として援用される））。例えば、核酸配列間のパーセント配列同一性
は、本明細書中で参考として援用される、ＧＣＧバージョン６．１に提供されるように、
ＦＡＳＴＡを用いて（そのデフォルトパラメーター（ワードサイズ６およびスコアリング
マトリクスについてのＮＯＰＡＭ因子）を用いて）決定され得るかまたはＧａｐを用いて
（そのデフォルトパラメーターを用いて）決定され得る。
用語「実質的に相同」または「実質的に同一」は、上記のような任意の周知の配列同一
性アルゴリズム（例えば、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、またはＧａｐ）により測定される場
合、核酸またはそのフラグメントを参照する場合、別の核酸（またはその相補鎖）と、適
切なヌクレオチド挿入または欠失と共に最適に整列される場合、少なくとも約５０％、よ
り好ましくは６０％のヌクレオチド塩基、通常は少なくとも約７０％、より通常は少なく
とも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、およびより好ましくは少なくとも約９５
％、９６％、９７％、９８％または９９％のヌクレオチド塩基においてヌクレオチド配列
同一性が存在することを示す。
あるいは、実質的な相同性または類似性は、核酸またはそのフラグメントが、別の核酸
、別の核酸の鎖、またはその相補鎖に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
下でハイブリダイズする場合に存在する。核酸のハイブリダイゼーション実験の文脈にお
ける、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」および「ストリンジェントな
洗浄条件」は、多数の異なる物理的パラメーターに依存する。核酸ハイブリダイゼーショ
ンは、当業者によって容易に理解されるように、塩濃度、温度、溶媒、ハイブリダイズす
る種の塩基組成、相補領域の長さ、およびハイブリダイズする核酸の間のヌクレオチド塩
基のミスマッチの数のような条件によって、影響を受ける。当業者は、どのようにこのよ
うなパラメーターを変更して、特定のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションを達
成するかを知っている。
一般に、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、特定のＤＮＡハイブリッ
ドについての熱的融点（Ｔｍ）より約２５℃低い温度で、特定のセットの条件下で実施さ
れる。「ストリンジェントな洗浄」は、特定のＤＮＡハイブリッドについてのＴｍより約
５℃低い温度で、特定のセットの条件下で実施される。Ｔｍとは、標的配列の５０％が、
完全にマッチするプローブにハイブリダイズする温度である。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出
）、９．５１頁（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。本明細書中での目
的のために、「高ストリンジェンシーの条件」とは、溶液相でのハイブリダイゼーション
について、６×ＳＳＣ（ここで、２０×ＳＳＣは、３．０Ｍ ＮａＣｌおよび０．３Ｍク
エン酸ナトリウムを含有する）、１％ＳＤＳ中６５℃で８〜１２時間の水性ハイブリダイ
ゼーション（すなわち、ホルムアミドを含まない）、続いて０．２×ＳＳＣ、０．１％Ｓ
ＤＳ中６５℃で２０分間の２回の洗浄と定義される。６５℃でのハイブリダイゼーション
は、ハイブリダイズする配列の長さおよび同一性の百分率を含む、多数の要因に依存して
、異なる速度で起こることが、当業者によって理解される。
本発明の核酸（ポリヌクレオチドともまた称される）は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤ
ＮＡ、ならびに上記のものの合成形態および混合ポリマーの、センス鎖とアンチセンス鎖
との両方を包含し得る。これらは、当業者によって容易に理解されるように、化学的にか
もしくは生化学的に改変され得るか、または非天然もしくは誘導体化されたヌクレオチド
塩基を含み得る。このような改変としては、例えば、標識、メチル化、１つ以上の天然に
存在するヌクレオチドのアナログでの置換、ヌクレオチド間改変（例えば、非荷電結合（
例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバミドな
ど）、荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、ペンダン
ト部分（例えば、ポリペプチド）、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレン
など）、キレーター、アルキレーター、および改変された結合（例えば、αアノマー核酸
など））が挙げられる。水素結合および他の化学的相互作用を介して、指定された配列に
結合する能力において、ポリヌクレオチドを模倣する合成分子もまた含まれる。このよう
な分子は、当該分野において公知であり、そして例えば、分子の骨格においてペプチド結
合がホスフェート結合を置換する分子が挙げられる。
用語「変異した」とは、核酸配列に対して適用される場合、核酸配列におけるヌクレオ
チドが、参照核酸配列と比較して、挿入、欠失、または変化し得ることを意味する。単一
の変化が、遺伝子座においてなされ得るか（点変異）、または複数のヌクレオチドが、単
一の遺伝子座において、挿入、欠失、または変化され得る。さらに、１つ以上の変更が、
核酸配列における任意の数の遺伝子座においてなされ得る。核酸配列は、当該分野におい
て公知の任意の方法によって変異され得、この方法としては、変異誘発技術（例えば、「
誤りやすいＰＣＲ」（ＤＮＡポリメラーゼのコピーの忠実度が低く、その結果、高い割合
の点変異が、ＰＣＲ産物の全長に沿って得られる条件下でＰＣＲを実施するためのプロセ
ス、例えば、Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．Ｗ．ら，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１，１１−１５頁（１９８
９）およびＣａｌｄｗｅｌｌ，Ｒ．Ｃ．およびＪｏｙｃｅ Ｇ．Ｆ．，ＰＣＲ Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ．，２，２８−３３頁（１９９２）を参照のこと）；および「オリ
ゴヌクレオチド特異的変異誘発」（目的の任意のクローニングされたＤＮＡセグメントに
おける部位特異的変異の発生を可能にするプロセス。例えば、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓ
ｏｎ，Ｊ．Ｆ．およびＳａｕｅｒ，Ｒ．Ｔ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１，５３−５７頁
（１９８８）を参照のこと））が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「ベクター」とは、本明細書中で使用される場合、核酸分子が結合していた別の核酸を移動し得る核酸分子をいうことが意図される。１つの型のベクターは、「プラスミド」であり、これは、内部にさらなるＤＮＡセグメントが連結され得る、環状の二重鎖ＤＮＡループをいう。他のベクターとしては、コスミド、細菌性人工染色体（ＢＡＣ）および酵母人工染色体（ＹＡＣ）が挙げられる。別の型のベクターは、ウイルスベクターであり、ここで、さらなるＤＮＡセグメントが、ウイルスゲノム内に連結され得る（以下にさらに詳細に議論される）。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において、自律的に複製し得る（例えば、宿主細胞において機能する複製起点を有するベクター）。他のベクターは、宿主細胞への導入の際に、宿主細胞のゲノムに統合され得、そしてこれによって、宿主ゲノムとともに複製され得る。さらに、特定の好ましいベクターは、それらが作動可能に連結した遺伝子の発現を導き得る。このようなベクターは、本明細書中で、「組換え発現ベクター」（または単に、「発現ベクター」）と称される。
「作動可能に連結された」発現制御配列とは、発現制御配列が、目的の遺伝子を制御す
るために、この目的の遺伝子と連続的である結合、およびこの目的の遺伝子を制御するた
めに、トランスでかまたはある距離で働く発現制御配列をいう。
用語「発現制御配列」とは、本明細書中で使用される場合、それらが作動可能に連結し
たコード配列の発現に影響を与えるために必要な、ポリヌクレオチド配列をいう。発現制
御配列とは、核酸配列の転写、転写後事象および翻訳を制御する配列をいう。発現制御配
列は、適切な転写開始配列、終結配列、プロモーター配列およびエンハンサー配列；スプ
ライシングおよびポリアデニル化シグナルのような、効率的なＲＮＡプロセシングシグナ
ル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増強する配列（例えば、リボソーム結
合部位）；タンパク質安定性を増強する配列；ならびに望ましい場合、タンパク質分泌を
増強する配列を含む。このような制御配列の性質は、宿主生物に依存して異なる；原核生
物においては、このような制御配列は、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、お
よび転写終結配列を含む。用語「制御配列」は、最低でも、その存在が発現のために必須
である全ての成分を含むことを意図され、そしてまた、その存在が有利であるさらなる成
分（例えば、リーダー配列および融合パートナー配列）を含み得る。
用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）とは、本明細書中で使用される場
合、組換えベクターが導入された細胞をいうことが意図される。このような用語は、特定
の被験体細胞のみでなく、そのような細胞の子孫をもまたいうことが意図されることが、
理解されるべきである。特定の改変が、変異または環境の影響のいずれかに起因して、引
き続く世代において起こり得るので、このような子孫は、実際に、親細胞と同一ではない
かもしれないが、本明細書中において使用される場合の用語「宿主細胞」の範囲内に依然
として含まれる。組換え宿主細胞は、培養中で増殖された、単離された細胞または細胞株
であり得か、あるいは生存組織または器官内に存在する細胞であり得る。
用語「ペプチド」とは、本明細書中で使用される場合、短いポリペプチド（例えば、代
表的に約５０アミノ酸長未満、そしてより代表的には約３０アミノ酸長未満のポリペプチ
ド）をいう。この用語は、本明細書中において使用される場合、構造および従って生物学
的機能を模倣する、アナログおよび模倣物を包含する。
用語「ポリペプチド」は、天然に存在するタンパク質および天然には存在しないタンパ
ク質の両方、ならびにそのフラグメント、変異体、誘導体およびアナログを包含する。ポ
リペプチドは、モノマーであってもポリマーであってもよい。さらに、ポリペプチドは、
多数の異なるドメインを含み得、これらのドメインの各々は、１つ以上の異なる活性を有
する。
用語「単離されたタンパク質」または「単離されたポリペプチド」とは、その誘導の起
源または供給源のおかげで、（１）ネイティブな状態で付随する天然に会合する成分と会
合していないか、（２）天然には見出されない純度で存在する場合、純度が他の細胞材料
の存在に関して調節され得る（例えば、同じ種由来の他のタンパク質を含まない）か、（
３）異なる種由来の細胞によって発現されるか、あるいは（４）天然には存在しない（例
えば、天然に見出されるポリペプチドのフラグメントであるか、または天然には見出され
ないアミノ酸のアナログもしくは誘導体または標準的なペプチド結合以外の結合を含む）
タンパク質またはポリペプチドである。従って、化学的に合成されるかまたは天然に起源
とする細胞とは異なる細胞系において合成されるポリペプチドは、その天然に会合する成
分から「単離される」。ポリペプチドまたはタンパク質はまた、当該分野において周知の
タンパク質精製技術を使用する単離によって、天然に会合する成分を実質的に含まなくさ
れ得る。このように定義される場合、「単離された」とは、このように記載されるタンパ
ク質、ポリペプチド、ペプチドまたはオリゴペプチドが、そのネイティブの環境から物理
的に取り出されていることを、必ずしも必要としない。
用語「ポリペプチドフラグメント」とは、本明細書中において使用される場合、全長ポ
リペプチドと比較して、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を有するポリペ
プチドをいう。好ましい実施形態において、ポリペプチドフラグメントとは、そのフラグ
メントのアミノ酸配列が、天然に存在する配列における対応する部分と同一である、連続
的な配列である。フラグメントは、代表的に、少なくとも５アミノ酸長、６アミノ酸長、
７アミノ酸長、８アミノ酸長、９アミノ酸長、または１０アミノ酸長であり、好ましくは
、少なくとも１２アミノ酸長、１４アミノ酸長、１６アミノ酸長または１８アミノ酸長で
あり、最も好ましくは、少なくとも２０アミノ酸長であり、より好ましくは、少なくとも
２５アミノ酸長、３０アミノ酸長、３５アミノ酸長、４０アミノ酸長または４５アミノ酸
長であり、なおより好ましくは、少なくとも５０アミノ酸長または６０アミノ酸長であり
、そしてなおより好ましくは、少なくとも７０アミノ酸長である。
「改変された誘導体」とは、一次構造の配列において実質的に相同であるが、例えば、インビボまたはインビトロで、化学的改変および生化学的改変を含む、ポリペプチドまたはそのフラグメント、あるいはネイティブなポリペプチドにおいては見出されないアミノ酸を組み込むポリペプチドまたはそのフラグメントをいう。このような改変としては、例えば、当業者によって容易に理解されるような、アセチル化、カルボキシル化、ホスホリル化、グリコシル化、ユビキチン化、標識（例えば、放射性核種を用いる）、および種々の酵素的改変が挙げられる。ポリペプチドを標識するための種々の方法、およびこのような目的に有用な置換基または標識は、当該分野において周知であり、そして放射性同位体（例えば、１２５Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、および３Ｈ）、標識された抗リガンドに結合するリガンド（例えば、抗体）、発蛍光団、化学発光剤、酵素、および標識されたリガンドに対する特異的結合対メンバーとして働き得る抗リガンドが挙げられる。標識の選択は、必要とされる感度、プライマーとの結合体化の容易さ、安定性の要件、および利用可能な機器に依存する。ポリペプチドを標識するための方法は、当該分野において周知である。Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９２（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
用語「融合タンパク質」とは、異種アミノ酸配列に結合したポリペプチドまたはフラグメントを含む、ポリペプチドをいう。融合タンパク質は、有用である。なぜなら、これらは、２つ以上の異なるタンパク質由来の２つ以上の所望の機能的エレメントを含むように構築され得るからである。融合タンパク質は、目的のポリペプチド由来の少なくとも１０個の連続したアミノ酸、より好ましくは、少なくとも２０個または３０個のアミノ酸、なおより好ましくは、少なくとも４０個、５０個、または６０個のアミノ酸、なおより好ましくは、少なくとも７５個、１００個、または１２５個のアミノ酸を含む。融合タンパク質は、ポリペプチドまたはそのフラグメントを、異なるタンパク質またはペプチドをコードする核酸配列とインフレームでコードする核酸配列を構築し、次いで、融合タンパク質を発現させることによって、組換え的に産生され得る。あるいは、融合タンパク質は、ポリペプチドまたはそのフラグメントを、別のタンパク質に架橋させることによって、化学的に産生され得る。
用語「非ペプチドアナログ」とは、参照ポリペプチドの特性に類似の特性を有する化合
物をいう。非ペプチド化合物はまた、「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉ
ｃ）」または「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）」と称され得る。例え
ば、Ｊｏｎｅｓ（１９９２）Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔ
ｈｅｓｉｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｊｕｎｇ（１９９７）
Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｎｏｎｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂ
ｒａｒｉｅｓ：Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ；Ｂａｄａｎｓｚｋｙら（
１９９３）Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−−Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｔｅｘｔ
ｂｏｏｋ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ；「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ
：Ａ Ｕｓｅｒｓ Ｇｕｉｄｅ」、Ｇ．Ａ．Ｇｒａｎｔ編、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａ
ｎｄ Ｃｏ．，１９９２；Ｅｖａｎｓら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９（１９
８７）；Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．１５：２９（１９８６）；
ＶｅｂｅｒおよびＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ ＴＩＮＳ ３９２頁（１９８５）；ならびに上
記のものの各々において引用される参考文献（これらは、本明細書中に参考として援用さ
れる）を参照のこと。このような化合物は、しばしば、コンピュータ化された分子モデリ
ングの補助によって開発される。本発明の有用なペプチドに構造的に類似のペプチド模倣
物を使用して、等価な効果を生じ得、従って、これらのペプチド模倣物は、本発明の一部
であると意図される。
「ポリペプチド変異型」または「ムテイン」は、ネイティブタンパク質または野生型タ
ンパク質のアミノ酸配列に比べて、１つ以上のアミノ酸の挿入、重複、欠失、再配置また
は置換を含むポリペプチド配列をいう。ムテインは、アミノ末端またはカルボキシ末端の
いずれかまたは両方で、天然に存在するタンパク質および／またはアミノ酸配列の短縮型
の配列において、１つの位置で単一アミノ酸が、別のアミノ酸に変化される１つ以上のア
ミノ酸点変異を有し得、１つ以上のアミノ酸が、それぞれ、挿入されるか、もしくは欠失
される１つ以上の挿入および／または欠失を有し得る。ムテインは、天然に存在するタン
パク質に比べて、同じ生物学的活性を有し得るが、おそらく異なる生物学的活性を有し得
る。例えば、ムテインは、増加したニューロン結合活性もしくは減少したニューロン結合
活性またはＮｇＲ結合活性を有し得る。本発明の好ましい実施形態において、（例えば、
ＭＡＧ Ｉｇ様ドメイン５中の）ムテインであるＭＡＧ誘導体は、内因性ＭＡＧまたは可
溶性野生型ＭＡＧに比べて、減少したニューロン成長阻害活性を有する。
ムテインは、その野生型対応物に対して少なくとも７０％の全配列相同性を有する。野
生型タンパク質に対して８０％、８５％または９０％の全配列相同性を有するムテインは
、さらにより好ましい。さらにより好ましい実施形態において、ムテインは、９５％の配
列同一性、なおより好ましくは９７％の、さらにより好ましくは９８％の、およびさらに
より好ましくは９９％の全配列同一性を示す。配列相同性は、任意の共通配列分析アルゴ
リズム（例えば、ＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔ）によって測定され得る。
好ましいアミノ酸置換は、以下のものである：（１）タンパク質分解に対する感受性を減少する置換、（２）酸化に対する感受性を減少する置換、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変更する置換、（４）結合親和性または酵素活性を変更する置換、および（５）このようなアナログの他の物理化学的特徴または機能的特徴を付与するかまたは改変する置換。
本明細書中で使用する場合、２０の従来のアミノ酸およびこれらの省略形は、従来の慣
例に従う。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版，Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕ
ｂおよびＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ編，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌ
ａｎｄ，Ｍａｓｓ．（１９９１））（これは、参考として本明細書中に援用される）を参
照のこと。２０の従来のアミノ酸、非天然アミノ酸（例えば、α−，α−二置換アミノ酸
、Ｎ−アルキルアミノ酸）、および他の非従来的なアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−
アミノ酸）はまた、本発明のポリペプチドのための適切な成分であり得る。非従来的なア
ミノ酸の例としては、以下：４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε
−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−ア
セチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン
、ｓ−Ｎ−メチルアルギニン、および他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、４−
ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書中で使用されるポリペプチド表記において
、標準的な使用および慣例に従って、左手方向は、アミノ末端方向であり、右手方向は、
カルボキシ末端方向である。
タンパク質は、このタンパク質をコードする核酸配列が、第２のタンパク質をコードす
る核酸配列に類似する配列を有する場合、「相同性」を有するか、または第２のタンパク
質に対して「相同」である。あるいは、タンパク質は、２つのタンパク質が、「類似する
」アミノ酸配列を有する場合、第２のタンパク質に対して相同性を有する。（従って、用
語「相同性タンパク質」は、２つのタンパク質が、類似するアミノ酸配列を有することを
意味するように規定される）。好ましい実施形態において、相同タンパク質は、野生型タ
ンパク質に対して６０％の配列相同性を示し、より好ましくは、７０％の配列相同性を示
す。野生型タンパク質に対して８０％、８５％または９０％の配列相同性を示す相同タン
パク質が、さらにより好ましい。さらにより好ましい実施形態において、相同タンパク質
は、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を示す。本明細書中で使用される
場合、アミノ酸配列の２つの領域の間の相同性（特に予測された構造類似性に関して）は
、機能が類似することを意味するとして解釈される。
「相同」が、タンパク質またはペプチドに関して使用される場合、同一ではない残基位
置が、保存的アミノ酸置換によってしばしば異なることが理解される。「保存的アミノ酸
置換」は、類似する化学的特性（例えば、電荷または疎水性度）を有する側鎖（Ｒ基）を
有する別のアミノ酸残基によって置換される置換である。一般的に、保存的アミノ酸置換
は、タンパク質の機能特性を実質的には変更しない。２つ以上のアミノ酸配列が、保存的
置換によって互いに異なる場合において、パーセント配列同一性または相同性の程度は、
置換の保存的性質を修正するように上方に調整され得る。この調整をするための手段は、
当業者に周知である（例えば、Ｐｅａｒｓｏｎら、１９９４（本明細書中に参考として援
用される）を参照のこと）。
以下の６つの群は、各々互いに対して保存的な置換であるアミノ酸を含む：１）セリン
（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アス
パラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロ
イシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、お
よび６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
ポリペプチドに対する配列相同性（パーセント配列同一性としても参照される）は、代
表的に、配列分析ソフトウェアを使用して決定される。例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎ
ａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎ
ｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ，９１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ５３７０５を参照のこと。タンパ
ク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む、種々の置換、欠失および他の改変
に対して割り当てられる相同性の尺度を使用して類似の配列を符合させる。例えば、ＧＣ
Ｇは、「Ｇａｐ」および「Ｂｅｓｔｆｉｔ」のようなプログラムを備え、これは、デフォ
ルトパラメーターと共に使用され、密接に関連するポリペプチド（例えば、異なる生物種
からの相同性ポリペプチド）の間、あるいは野生型タンパク質とその変異型との間の配列
相同性または配列同一性を決定し得る。例えば、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１を参照
のこと。
阻害性分子配列を異なる生物由来の膨大な配列を含むデータベースと比較する場合、好
ましいアルゴリズムは、コンピュータープログラムＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．
Ｆ．ら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；ＧｉｓｈおよびＳ
ｔａｔｅｓ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２；Ｍａｄｄｅｎ
，Ｔ．Ｌ．ら（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１；Ａｌｔ
ｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３
８９−３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．およびＭａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．（１９９７）Ｇｅｎｏ
ｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９−６５６）、特に、ｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｔｎ（Ａｌｔ
ｓｃｈｕｌら、１９９７）である。ＢＬＡＳＴｐについての好ましいパラメーターは、
期待値：１０（デフォルト）
フィルター：ｓｅｇ（デフォルト）
ギャップを開くためのコスト：１１（デフォルト）
ギャップを伸長するためのコスト：１（デフォルト）
最大整列：１００（デフォルト）
ワードサイズ：１１（デフォルト）
記述の数：１００（デフォルト）
ペナルティーマトリクス：ＢＬＯＷＳＵＭ６２
である。
相同性について比較されるポリペプチド配列の長さは、一般的に、少なくとも約１６ア
ミノ酸残基であり、通常には、少なくとも約２０残基であり、より通常には、少なくとも
約２４残基であり、代表的には、少なくとも約２８残基であり、好ましくは、約３５残基
を超える。膨大な数の異なる生物由来の配列を含むデータベースを検索する場合、アミノ
酸配列を比較することが好ましい。使用するアミノ酸配列を検索するデータベースは、当
該分野で公知のｂｌａｓｔｐ以外のアルゴリズムによって決定され得る。例えば、ポリペ
プチド配列は、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１中のプログラムＦＡＳＴＡを使用して比
較され得る。ＦＡＳＴＡは、アライメントおよび質問配列と検索配列との間の最良の重複
の領域のアライメントおよびパーセント配列同一性を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ，１９９
０（参考として本明細書中に援用される））。例えば、アミノ酸配列間の間のパーセント
配列同一性は、ＧＣＧ ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１（本明細書中に参考として援用される）
に提供されるようなそのデフォルトパラメーター（２のワードサイズおよびＰＡＭ２５０
スコアリングマトリクス）を用いてＦＡＳＴＡを使用して決定され得る。
「特異的な結合」は、その環境における他の分子に対する結合に優先して、互いに結合
する２つの分子の能力をいう。代表的には、「特異的結合」は、少なくとも２倍、より代
表的には少なくとも１０倍、しばしば少なくとも１００倍、反応中の偶然の結合に対して
区別する。代表的には、特異的な結合反応の親和性または親和力は、少なくとも約１０−
７Ｍ（例えば、少なくとも約１０−８Ｍまたは１０−９Ｍ）である。
用語「領域」は、本明細書中で使用される場合、生体分子の一次構造の物理的に連続し
た部分をいう。タンパク質の場合において、領域は、このタンパク質のアミノ酸配列の連
続的領域によって規定される。
用語「ドメイン」は、本明細書中で使用される場合、生体分子の公知の機能または推測
の機能に寄与する生体分子の構造をいう。ドメインは、その領域ま
たは部分と同程度に広
がり得；ドメインはまた、生体分子の別個の非連続的な領域を含み得る。タンパク質ドメ
インの例としては、Ｉｇドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメ
インが挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書中で使用される場合、用語「分子」は、任意の化合物を意味し、これとしては
、低分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチド、核酸、脂質などが挙げられるがこ
れらに限定されず、このような化合物は、天然であっても合成であってもよい。
他に定義されない場合、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本
発明に関する分野の当業者によって通常理解される意味と同じ意味を有する。例示的な方
法および材料は、以下に示されるが、本明細書中に記載される方法および材料と類似する
かまたは等価な方法および材料はまた、本発明の実施において使用され得、そして、これ
らは、当業者に明らかである。全ての刊行物および本明細書中に記載される他の参考は、
その全体を参考として援用される。矛盾する場合、定義を含む本明細書は、制御する。材
料、方法、および実施例は、例示のみであり、そして、限定を意図されない。
本明細書および特許請求の範囲の全体にわたって、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」
またはバリエーション（例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｃｏｍ
ｐｒｉｓｉｎｇ）」）は、示された整数または整数の群の含入を意味するが、任意の他の
整数または整数の群の排除を意図されないことが理解される。
（ヒト様Ｎ−グリカンの生成に対して改変された脂質連結オリゴ糖を有する宿主の操作
または選択）
本発明は、非ヒト真核生物宿主細胞において、ヒト様糖タンパク質を産生するための方法を提供する。本発明は、ａｌｇ遺伝子活性（すなわち、ａｌｇ活性（非真菌宿主細胞中の等価な酵素活性を含む））を低下するかまたは激減する非ヒト真核生物宿主細胞を作製する工程または使用する工程、および宿主細胞に少なくとも１つのグリコシダーゼ活性を導入する工程を包含する。好ましい実施例において、グリコオシダーゼ活性は、宿主細胞内の１つ以上のマンノシダーゼ活性の発現によって、例えば、マンノシダーゼ活性の活性化によって、または宿主細胞におけるマンノシダーゼ活性の核酸分子からの発現によって、導入される。
別の実施形態において、本方法は、糖残基を、脂質連結オリゴ糖前駆体の１，６アーム
に転位する１つ以上の酵素の活性を低下されたか、または激減された宿主細胞を作製する
工程またはそれを使用する工程を包含する（図１）。本発明の宿主細胞は、糖残基（例え
ば、マンノシレート）を、脂質連結オリゴ糖前駆体の１，６アームに転位する酵素をコー
ドする１つ以上の遺伝子中に変異を導入することについて選択されるかまたはそのことに
よって操作される。糖残基は、より好ましくはマンノースであり、好ましくはグルコース
、ＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、シアル酸、フコースまたはＧｌｃＮＡｃリン酸残基であ
る。好ましい実施形態において、脂質連結オリゴ糖前駆体の１，６アームをマンノシル化
する１つ以上の酵素の活性は、低下するかまたは激減する。本方法は、少なくとも１つの
グリコシダーゼ活性を宿主細胞に導入する工程をさらに包含し得る（以下を参照のこと）
。
なお別の実施形態において、本発明は、非ヒト宿主においてヒト様糖タンパク質を産生
するための方法を提供し、ここで、糖タンパク質は、トリマンノースコア構造に結合され
る少なくとも２つのＧｌｃＮＡｃを有するＮ−グリカンを含む。
上記の各々の実施形態において、本方法は、宿主細胞を作製する工程に関し、ここで、脂質連結オリゴ糖前駆体は、ＭａｎＸＧｌｃＮＡｃ２構造中で濃縮され、ここで、Ｘは、３、４、または５である（図２）。これらの構造は、宿主細胞のＥＲ中で、オリゴサッカリルトランスフェラーゼによって新生ポリペプチド鎖上に転位され、次いで、グリコシダーゼ（例えば、α−マンノシダーゼ）およびグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ＧｎＴ１）での処理によってプロセスされ、ＧｌｃＮＡｃＭａｎＸＧｌｃＮＡｃ２コア構造を有するＮ−グリカンを生成し、ここで、Ｘは、３、４または５であり、そして好ましくは３である（図２および図３）。図２に示されるように、ＧｌｃＮＡｃＭａｎＸＧｌｃＮＡｃ２コア構造を有し、Ｘが３を超えるＮ−グリカンは、適用可能な場合、例えば、α−１，３マンノシダーゼ活性および／またはα−１，２−１，３マンノシダーゼ活性で処理することによって、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に転換され得る。
グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ＧｎＴＩＩ）での処理によるＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２のさらなるプロセシングは、ＧｌｃＮＡｃ ２ Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２コア構造を生成し、これは次いで、所望の場合、例えば、エキソビボ処理によって、または一連のグリコシル化酵素（グリコシルトランスフェラーゼ、糖トランスポーターおよびマンノシダーゼを含む（以下を参照のこと））の宿主細胞内での異種発現によって、改変されて、ヒト様Ｎ−グリカンになり得る。本発明に従って生成され得る好ましいヒト様糖タンパク質であって、７個以下、または３個以下のマンノース残基を有するＮ−グリカンを含む糖タンパク質は、ガラクトース、ＧｌｃＮＡｃ、シアル酸およびフコースからなる群から選択される１つ以上の糖を含み；そしてＮｅｕＮＡｃ−Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎを含む少なくとも１つのオリゴ糖分枝を含む。
一実施形態において、宿主細胞は、減退されたかまたは減少されたＤｏｌ−Ｐ−Ｍａｎ
：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−Ｄｏｌマンノシルトランスフェラーゼ活性を有し、こ
の活性は、ＥＲのルミナル（ｌｕｍｉｎａｌ）側におけるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ
−ＤｏｌからＭａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−Ｄｏｌへの第１のマンノシル化工程に関与
する（例えば、ＡＬＧ３ 図１；図２）。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、この酵素
は、ＡＬＧ３遺伝子によってコードされる。上記のように、漏出ａｌｇ３−１変異を有す
るＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−Ｄｏｌを蓄積し、
そしてａｌｇ３における欠失を有するＳ．ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞は、Ｍａｎ５Ｇｌｃ
ＮＡｃ２構造をＥＲ内の新生ポリペプチド鎖上に移動させるようである。従って、この実
施形態において、宿主細胞は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造に富化されたＮ−グリカンを
蓄積し、これは次いで、グリコシダーゼを用いる（例えば、α−１，２−マンノシダーゼ
、α−１，３マンノシダーゼ、またはα−１，２−１，３マンノシダーゼ活性を用いる）
処理によってＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に変換され得る（図２）
実施例１に記載されるように、縮重プライマーを、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｄ．ｍ
ｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒおよびヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）由来のＡｌｇ３タンパク質配
列の整列に基づいて設計し（図４および５）、そしてこれを使用して、Ｐ．ｐａｓｔｏｒ
ｉｓゲノムＤＮＡ由来の産物を増幅した。得られたＰＣＲ産物を、プローブとして使用し
て、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＬＧ３遺伝子に対して３５％の全配列同一性および５
３％の配列類似性を有するタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲ
Ｆ）を含むＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムクローンを同定しそして単離した（図６および７
）。このＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ遺伝子を、本明細書中で、「ＰｐＡＬＧ３」と呼ぶ。ＡＬ
Ｇ３遺伝子を、同様に同定し、そしてＫ．ｌａｃｔｉｓから単離した（実施例１；図８お
よび９）。
従って、別の実施形態において、本発明は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＡＬＧ３遺伝子（
図６）およびＫ．ｌａｃｔｉｓ ＡＬＧ３遺伝子（図８）ならびにそれらのホモログ、改
変体および誘導体の、少なくとも４５、好ましくは少なくとも５０、より好ましくは少な
くとも６０、最も好ましくは７５以上のヌクレオチド残基を含むか、これらからなる核酸
配列を有する単離された核酸分子を提供する。本発明はまた、ストリンジェントな条件下
で、上記の核酸分子にハイブリダイズする核酸分子を提供する。同様に、本発明の核酸分
子によってコードされる単離されたポリペプチド（ムテイン、対立遺伝子改変体、フラグ
メント、誘導体およびアナログを含む）が、提供される（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＫ
．ｌａｃｔｉｓのＡＬＧ３遺伝子産物は、図６および８に示される）。さらに、本明細書
中にさらに記載されるように、本発明の核酸分子を含むベクター（発現ベクターを含む）
もまた提供される。
遺伝子特異的プライマーを使用して、構築物を作製して、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのゲノ
ムからＰｐＡＬＧ３遺伝子を欠失させた（実施例１）。この株を使用して、Ｄｏｌ−Ｐ−
Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−Ｄｏｌマンノシルトランスフェラーゼ活性を欠
失した宿主細胞を作製し、そして脂質連結Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−Ｄｏｌ前駆体
を生成した。この脂質連結Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−Ｄｏｌ前駆体は、新生ポリペ
プチド鎖上に移動され、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２糖質構造を有するＮ−グリカンを生成す
る。
実施例２に記載されるように、このような宿主細胞は、所望のＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２
コア糖質構造を有するＮ−グリカンを生成するように、適切なマンノシダーゼの発現によ
って操作され得る。宿主細胞におけるＧｎＴの発現（例えば、下記のように、核酸分子ま
たは核酸分子のライブラリーを標的化することによって）により、改変された宿主細胞は
、Ｍａｎ３コア構造（すなわち、ＧｌｃＮＡｃ１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２またはＧｌｃＮ
Ａｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；図３を参照のこと）の各アームに結合した１つまたは２
つのＧｌｃＮＡｃ構造を有するＮ−グリカンを生成し得る。これらの構造は、本発明の方
法を使用してさらに処理されて、宿主細胞の分泌経路に入るヒト様Ｎ−グリカンまたはタ
ンパク質を生成し得る。
別の実施形態において、宿主細胞は、減退されたかまたは欠失されたドリチル（ｄｏｌ
ｉｃｈｙｌ）−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリチルα１，２−マンノ
シルトランスフェラーゼ活性を有し、この活性は、ＥＲのルミナル側においてＭａｎ６Ｇ
ｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ＤｏｌをＭａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−Ｄｏｌへ変換するマンノ
シル化工程に関与する（上記ならびに図１および図２を参照のこと）。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅにおいて、この酵素は、ＡＬＧ９遺伝子によってコードされる。ａｌｇ９変異を
有する細胞は、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−Ｄｏｌを蓄積し（図２）、そしてＭａｎ
６ＧｌｃＮＡｃ２構造をＥＲ内の新生ポリペプチド鎖上に移動させる。従って、この実施
形態において、宿主細胞は、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２構造に富化されたＮ−グリカンを蓄
積し、これは次いで、α−１，２−マンノシダーゼおよびα−１，３マンノシダーゼを用
いる処理によってコアＭａｎ３構造にプロセスダウンされ得る（図３ならびに実施例３お
よび４を参照のこと）。
ａｌｇ９遺伝子（または等価な活性をコードする遺伝子）が欠失された宿主細胞を構築する（実施例３を参照のこと）。ＡＬＧ９（または、ＡＬＧ１２；以下を参照のこと）の欠失は、１，６アーム上の、それぞれ、１つまたは２つのさらなるマンノースを有するＮ−グリカンを生成する宿主細胞を作製する（図２）。Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ（Ｇｎ ＴＩＩ）に接近可能な１，６−コアマンノースを作製するために、これらのマンノースは、グリコシダーゼによって除去される必要がある。ＥＲマンノシダーゼは、代表的に、１，６アーム上の末端１，２マンノースを除去し、続いてマンノシダーゼＩＩ（α１−３，６マンノシダーゼ）または他のマンノシダーゼ（例えば、α１，２マンノシダーゼ、α１，３マンノシダーゼまたはα１−２，３マンノシダーゼ（例えば、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｓ由来；実施例４を参照のこと））が、１，６アームに作用し得、続いて、ＧｎＴＩＩが、Ｎ−アセチルグルコサミンを移動させて、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３を生成する（図２）。
ａｌｇ９ｐ活性を欠く得られた宿主細胞を、１つ以上の酵素由来のα１，２−マンノシ
ダーゼ活性およびα１，３マンノシダーゼ活性を発現するように、好ましくは、宿主細胞
に導入される核酸分子からの発現によって、操作され、そしてこれは、好ましい細胞成分
に標的化される酵素を発現する（以下を参照のこと）。実施例４は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎ
ａｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｓ由来のこのような酵素のクローニングおよび発現を記載する。
別の実施形態において、宿主細胞は、減退されたかまたは欠失されたドリチル−Ｐ−Ｍ
ａｎ：Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリチルα１，６−マンノシルトランスフェラー
ゼ活性を有し、この活性は、ＥＲのルミナル側においてＭａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−
ＤｏｌをＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−Ｄｏｌ（これはコアマンノース構造の１，６ア
ーム上のα−１，６マンノースをマンノシル化する）へ変換するマンノシル化工程に関与
する（上記ならびに図１および図２を参照のこと）。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて
、この酵素は、ＡＬＧ１２遺伝子によってコードされる。ａｌｇ１２変異を有する細胞は
、Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−Ｄｏｌを蓄積し（図２）、そしてＭａｎ７ＧｌｃＮＡ
ｃ２構造をＥＲ内の新生ポリペプチド鎖上に移動させる。従って、この実施形態において
、宿主細胞は、Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２構造に富化されたＮ−グリカンを蓄積し、これは
次いで、α−１，２−マンノシダーゼおよびα−１，３マンノシダーゼを用いる処理によ
ってコアＭａｎ３構造にプロセスダウンされ得る（図３ならびに実施例３および４を参照
のこと）。
ａｌｇ９変異体宿主について上で記載されるように、ａｌｇ１２ｐ活性を欠く得られた宿主細胞を、（例えば、１つ以上の酵素由来の）α１，２−マンノシダーゼ活性およびα１，３マンノシダーゼ活性を発現するように、好ましくは、宿主細胞に導入される１つ以上の核酸分子からの発現によって、操作され、そしてこれは、好ましい非細胞成分に標的化される酵素活性を発現する（以下を参照のこと）。
（必要に応じて減少した開始α−１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性を有する宿
主の操作または選択）
好ましい実施形態において、本発明の方法は、（ａ）ａｌｇ遺伝子の活性またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ３」）コア糖質構造上のα−１，６アームのＮ−グリカンをマンノシル化する１つ以上の活性が減退または減少しており、かつ（ｂ）（Ｍａｎ３コア構造のα−１，３アーム上の）開始α−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ（すなわち、外側鎖マンノシル化を開始する開始特異的酵素）の活性が減退または欠失している、宿主細胞を作製または使用することを包含する。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、この酵素は、ＯＣＨ１遺伝子によってコードされる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるｏｃｈ１遺伝子の破壊は、Ｎ連結糖がポリマンノース外側鎖を完全に欠く表現型を生じる。真菌株における哺乳動物型グリコシル化を得るための以前のアプローチは、ＯＣＨ１の不活性化を必要とした（例えば、Ｃｈｉｂａ，１９９８を参照のこと）。しかし、Ｏｃｈ１ｐ酵素が、有効なマンノース外側鎖開始についてインタクトなＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃを必要とする場合、本発明の宿主細胞における開始α−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性の破壊は、任意である（選択された宿主細胞に依存して）。従って、本発明に従って選択または生成された宿主細胞（これは、７個以下のマンノース残基を有する脂質連結オリゴ糖を蓄積する）は、移動の後、Ｏｃｈ１ｐに対する乏しい基質の可能性のある低グリコシル化Ｎ−グリカンを生成する（例えば、Ｎａｋａｙａｍａ，１９９７を参照のこと）。
（増加したグリコシルトランスフェラーゼ活性を有する宿主の操作または選択）
上記のように、グリコシル化オリゴ糖は、それらの非グリコシル化対応物よりもはるか
に高い割合で新生ポリペプチド鎖に移動されると考えられる。オリゴ糖トランスフェラー
ゼ複合体による基質認識は、脂質連結オリゴ糖のアンテナへのグルコースの付加によって
増大するようである。従って、脂質連結オリゴ糖を最適にグリコシル化し得る宿主細胞を
作製または選択することが望まれる。このような宿主細胞において、過小グリコシル化（
ｕｎｄｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）は、グリコシル化Ｍａｎ５構造の新生ポリペプ
チド鎖上へのより速くより効率的な移動に起因して、実質的に減少されるかまたは消滅さ
れさえする。
従って、本発明の別の実施形態において、この方法は、脂質連結Ｎグリカン前駆体がＥ
Ｒ中の新生ポリペプチド鎖に効率的に移動される宿主細胞を作製することに関する。好ま
しい実施形態において、移動は、脂質連結オリゴ糖の分枝上のグリコシル化レベルを増加
することによって増大され、このことにより、このオリゴ糖は、オリゴサッカリルトラン
スフェラーゼに対するより良い基質となる。
１つの好ましい実施形態において、本発明は、ヒト様糖タンパク質を作製するための方
法を提供し、この方法は、ＥＲ中の脂質連結オリゴ糖のグリコシル化を担う１つ以上の酵
素が増加した活性を有する宿主細胞を使用する。脂質連結オリゴ糖のグリコシル化の程度
を増大するための１つの方法は、脂質連結オリゴ糖のアンテナ上へのグルコース残基の移
動を担う１つ以上の酵素を過剰発現させることである。特に、α−１，３グルコシルトラ
ンスフェラーゼ活性の増加により、グルコシル化脂質連結Ｍａｎ５構造の量が増加し、そ
して分泌タンパク質の過小グリコシル化を減少させるかまたは排除する。Ｓ．ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅにおいて、この酵素は、ＡＬＧ６遺伝子によってコードされる。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＬＧ６およびそのヒト対応物
は、クローニングされている（Ｉｍｂａｃｈ，１９９９；Ｒｅｉｓｓ，１９９６）。グリ
コシル化の初期工程の進化的保存に起因して、ＡＬＧ６座は、種間で相同であると予測さ
れ、そして当業者によって、配列類似性に基づいてクローニングされ得る（同じことが、
異なる種由来のＡＬＧ８およびＡＬＧ１０座のクローニングおよび同定にあてはまる）。
さらに、異なる種由来の異なるグルコシルトランスフェラーゼが、次いで、最適な活性を
有するグルコシルトランスフェラーゼを同定するために試験され得る。
強力なプロモーター（例えば、ＧＡＰＤＨプロモーター）の制御下でのＡＬＧ６遺伝子
のさらなるコピーの導入および／またはＡＬＧ６の発現は、グルコシル化脂質連結オリゴ
糖の程度を増加するためのいくつかの方法の１つである。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ由来のＡ
ＬＧ６遺伝子を、クローニングしそして発現する（実施例５）。ＡＬＧ６核酸およびアミ
ノ酸配列を、図２５（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および図２６（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ
）について示す。これらの配列を、図２７の他の真核生物ＡＬＧ６配列と比較する。
従って、本発明の別の実施形態は、脂質連結オリゴ糖のグリコシル化の程度を増大する方法を提供し、この方法は、宿主細胞におけるα−１，３グルコシルトランスフェラーゼ活性を増大する工程を包含する。この活性の増加は、例えば、この活性をコードする核酸を１つ以上の異種発現制御配列と作動可能に連結することによって、この活性をコードする核酸配列を過剰発現することによって、達成され得る。好ましい発現制御配列としては、転写開始配列、転写終結配列、プロモーター配列およびエンハンサー配列；ＲＮＡスプライスドナーおよびポリアデニル化シグナル；ｍＲＮＡ安定化配列；リボソーム結合部位；タンパク質安定化配列；ならびにタンパク質分泌配列が挙げられる。
別の実施形態において、α−１，３−グルコシルトランスフェラーゼ活性の増加は、当
業者に周知の技術を使用して、マルチコピープラスミド上に、活性をコードする核酸分子
を導入することによって達成される。さらに別の実施形態において、脂質連結オリゴ糖の
グルコシル化の程度は、宿主細胞中のオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ｏｌｉｇｏ
ｓａｃｃｈａｒｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）活性の基質特異性を低下することを含む
。このことは、例えば、活性をコードする少なくとも１つの核酸を、遺伝子シャッフリン
グ、インビトロ変異誘発、および誤りがちのポリメラーゼ連鎖反応のような技術（これら
の全ては、当業者に周知である）に供することによって達成される。当然、ＡＬＧ８およ
びＡＬＧ１０は、宿主細胞中で過剰発現され、同様の様式で試験され得る。
従って、好ましい実施形態において、本発明は、ＥＲ中の脂質連結オリゴ糖のグリコシル化を担う１つ以上の酵素が、活性を増加するように操作されたかまたは選択された宿主細胞を使用してヒト様糖タンパク質を作製するための方法を提供する。より好ましい実施形態において、本発明は、以下：
（ａ）１つ以上のａｌｇ遺伝子活性またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ３」）コア糖質構造のα−１，６アームで、Ｎ−グリカンをマンノシル化する活性の活性が低下または激減し、かつ（ｂ）ＥＲ中での脂質連結オリゴ糖のグリコシル化を担う１つ以上の酵素が活性を増加するように操作されるかまたは選択される宿主細胞を使用する。しかし、ａｌｇ３変異型バックグラウンドにおいて見出される脂質連結Ｍａｎ５構造は、Ａｌｇ６ｐに対する好ましい基質ではない。従って、当業者は、例えば、当業者に周知の分子生物学および遺伝子選択技術を使用して、基質特異性が増加した酵素をコードする核酸を、１以上のラウンドの遺伝子シャッフリング、誤りがちのＰＣＲ、またはインビトロ変異誘発アプローチに供することによって、そして目的の宿主細胞中で基質特異性の上昇について選択することによって、基質特異性が上昇したＡｌｇ６ｐ、Ａｌｇ８ｐおよびＡｌｇ１０ｐを同定し得る（Ｇｉｂｂｓ，２００１）。選択された宿主株において酵素基質特異性を改善するためのこのような技術が、本発明のこの特定の実施形態に限定されないが、非ヒト宿主細胞においてヒト様Ｎ−グリカンの産生をさらに最適化する任意の実施形態において使用され得ることは、当業者に理解される。
記載されるように、Ｍａｎ５は、新生ポリペプチド鎖に移されると、適切なα−１，２
−マンノシダーゼの発現は、本発明によって提供されるように、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２
構造をさらに小さくし、所望のコアＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を生じる。α−１，２−
マンノシダーゼは、末端α−１，２−結合マンノース残基のみを除去し、ａｌｇ３、ａｌ
ｇ９およびａｌｇ１２変異型宿主細胞およびこれらの遺伝子に対するホモログが変異され
た宿主細胞中で作られたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２特異的構造を
認識すると予想される。
図３に概略的に示されるように、適切なＵＤＰ−糖−輸送体およびＵＤＰ−糖−トラン
スフェラーゼの共発現は、末端α−１，６残基およびα−１，３残基をＧｌｃＮＡｃでキ
ャップし、このことは、哺乳動物型複合体およびハイブリッドＮ−グリコシル化に必要な
前駆体（ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２）を生じる。次いで、ペプチドが結合し
たＮ−連結オリゴ糖鎖（ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（図３）は、哺乳動物型
オリゴ糖構造へのさらなる改変のための前駆体として働く。続いてのガラクトシルトラン
スフェラーゼの発現およびシアル酸（ｓｉａｌｙｌｉｃ ａｃｉｄ）を転位する能力を遺
伝子操作することは、哺乳動物型（例えば、ヒト様）Ｎ−グリカン構造を生じる。
本発明に従う所望の宿主細胞は、１つの酵素または１つを超える酵素を同時に操作し得
る。さらに、潜在的に有用な酵素をコードする遺伝子のライブラリーが、作製され得、最
適な活性を有する１つ以上の酵素を有する株または最も「ヒト様」糖タンパク質を産生す
る株は、ライブラリーの１つ以上のメンバーを用いて標的宿主細胞を形質転換することに
よって選択される。コアＮ−グリカンＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を有する糖タンパク質を産
生し得る下等真核生物は、遺伝子操作の実施の容易さ、ならびに安全性および効率特性に
起因して、特に有用である。好ましい実施形態において、少なくとも１つのさらなるグリ
コシル化反応が、エキソビボまたはインビボで実施され、ヒト様Ｎ−グリカンを産生する
。より好ましい実施形態において、グリコシル化酵素の活性型は、宿主細胞の小胞体およ
び／またはゴルジ装置において発現され、所望のヒト様糖タンパク質を産生する。
（宿主細胞）
本発明の好ましい非ヒト宿主細胞は、下等真核生物細胞（例えば、単細胞真菌または線
維状真菌）であり、これは、１つ以上のａｌｇ遺伝子活性（ａｌｇ活性に対して相同であ
るか、または等価である酵素活性を含む）が減少しているか、または激減している。本発
明の別の好ましい宿主細胞は、脂質連結オリゴ糖構造のα−１，６アームをマンノシル化
する１つ以上の酵素の活性（ａｌｇ活性以外）が低下されるか、または激減する。
下等真核生物宿主細胞が、好ましくある、一方で、前述の特徴を有する広く種々の宿主
細胞は、本発明の方法において有用であるとして構想される。例えば、植物細胞は、本発
明に従って、ヒト様糖タンパク質を発現するように操作され得る。同様に、種々の非ヒト
哺乳動物宿主細胞は、本発明の方法を使用して、よりヒト様の糖タンパク質を発現するよ
うに変更され得る。適切な宿主細胞が、操作され得るか、または酵母において既に記載さ
れる多くのこのような変異型の１つが、使用され得る。本明細書中に例示される場合、本
発明の好ましい宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ中の過剰マンノシル化欠損
（ＯＣＨ１）変異型であり、この変異型は、ａｌｇ３遺伝子をさらに改変し、欠失する。
他の好ましい宿主は、ｏｃｈ１変異およびａｌｇ９変異またはａｌｇ１２変異を有するＰ
ｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ変異型である。
（複合Ｎ−グリカンの形成）
改変された、新生Ｎ−グリカン構造に糖を連続的に添加することは、グルコシルトランスフェラーゼのゴルジ装置への首尾よい標的化および首尾よい発現を含む。このプロセスは、例えば、機能的発現（例えば、初期ゴルジ装置または中期ゴルジ装置におけるＧｎＴＩの機能的発現）を必要とし、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（例えば、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体の発現による）の十分な供給を保証する。
糖タンパク質を特徴づけ、そして所望されるグリコシル化を確認するために、糖タンパ
ク質を精製し、Ｎ−グリカンを、ＰＮＧａｓｅ−Ｆ放出し、次いで、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ
−ＭＳによって分析した（実施例２）。ヒトプラスミノゲンのクリングル３ドメインを、
レポータータンパク質として使用した。この可溶性糖タンパク質を、ａｌｇ３、ｏｃｈ１
ノックアウトのバックグラウンドで、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ中で産生した（実施例２）。
ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を、ヒトＧｎＴＩおよび図１６のＫ．ｌａｃｔｉｓ ＵＤＰ−ＧｌｃＮａｃ輸送体の添加後、優勢なＮ−グリカンとして提供した（実施例２）。このＮ−グリカンの質量は、１４６３（ｍ／ｚ）であるＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２質量と一致する。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２へのＧｌｃＮＡｃの付加を確認するために、β−Ｎ−ヘキソサミニダーゼ消化を実施し、これは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の質量と一致する１２６０（ｍ／ｚ）のピークを明らかにした（図１７）。
１つの株ＰＢＰ３（実施例２）中のａｌｇ３ ｏｃｈ１欠失由来のＮ−グリカンは、１
１３８（ｍ／ｚ）および１３００（ｍ／ｚ）に、２つの異なるピークを提供した。これは
、構造（ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＧｌｃＮＡｃＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ
２）に一致する（図１８）。多くのマンノースに対するインビトロα１，２−マンノシダ
ーゼ消化の後、ピークは、１１３８（ｍ／ｚ）に溶出された。これは、ＧｌｃＮＡｃＭａ
ｎ３ＧｌｃＮＡｃ２と一致する（図１９）。ＧｌｃＮＡｃのＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造
に対する付加を確認するために、β−Ｎ−ヘキソサミニダーゼ消化を実施し、これは、９
３４（ｍ／ｚ）にピークを示し、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の質量と一致した（図２０）。
ＧｌｃＮＡｃのＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造に対する第２の付加を、図２
１に示す。１３５７（ｍ／ｚ）のピークは、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に対
応する。コアマンノース構造（Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）への２つのＧｌｃＮＡｃの付加
を確認するために、別のβ−Ｎ−ヘキソサミニダーゼ消化を、実施し、これは、９３４（
ｍ／ｚ）にピークを示し、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の質量と一致した（図２２）。これは
、酵母細胞中で作られる複合型糖タンパク質を示す決定的なデータである。
ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に対するＵＤＰ−ガラクトースおよびβ１，４
−ガラクトシルトランスフェラーゼのインビトロ付加は、１６６４（ｍ／ｚ）にピークを
生じた。これは、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の質量と一致する（図
２３）。最終的に、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸およびシアリルトランスフェラー
ゼのインビトロ付加は、２２４８（ｍ／ｚ）にピークを生じた。これは、ＮＡＮＡ２Ｇａ
ｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の質量と一致する（図２４）。上記のデータ
は、複雑なヒト様糖タンパク質を産生し得る非哺乳動物宿主細胞の使用を支持する。
（グルコシルトランスフェラーゼおよびガラクトシルトランスフェラーゼの特定の細胞
小器官への標的化）
多くの研究が、これらの酵素が、これらのそれぞれの細胞小器官に保持され、そして固
定される正確な機構を示すために、提供されてきた。複雑ではあるが、証拠は、幹領域、
膜貫通領域、および細胞質テイルが、個々にまたは一斉に、酵素を個々の細胞小器官の膜
に指向し、それによって、結合する触媒領域が、その位置に局在化することを示唆する。
活性なグリコシルトランスフェラーゼが、発現され得、そして適切な細胞小器官に指向され得、その結果、連続した順番の反応が生じ得、複合Ｎ−グリカン形成を導く方法は、以下の通りである：
（Ａ）分泌経路中の特定の位置（ＥＲ、ゴルジおよびトランスゴルジネットワーク）への局在化を媒介するタンパク質／ペプチドをコードすることが既知である領域のＤＮＡライブラリーを確立すること。これらの酵素の限られた選択物およびこれらのそれぞれの位置を、表１に示す。これらの配列は、操作される宿主および他の関連する生物または関連しない生物から選択され得る。一般的に、このような配列は、以下の３つの範疇に分類される：
（１）細胞質テイル（ｃｔ）、膜貫通ドメイン（ｔｍｄ）およびいくらかよりあいまいに規定された幹領域（ｓｒ）の一部をコードするＮ−末端配列。これらは、一緒にかまたは個々にタンパク質をゴルジの内（内腔）膜に固定する、
（２）一般的にＣ−末端で見出される回収シグナル（例えば、ＨＤＥＬまたはＫＤＥＬテトラペプチド）、および
（３）膜貫通ヌクレオチド糖輸送体（これは、ゴルジに局在化することが公知である）。
第１の場合において、局在化領域が種々の要素（ｃｔ、ｔｍｄおよびｓｒ）からなる場合、ライブラリーは、ｃｔ、ｔｍｄおよび幹領域の種々の部分が示されるように設計される。これは、細胞質領域をコードするＤＮＡの５’末端に結合するＰＣＲプライマーを使用すること、および幹領域の種々の部分に結合する対向する一連のプライマーを使用することによって達成され得る。さらに、糖ヌクレオチド輸送体および公知の回収シグナルをコードする融合タンパク質構築物を作製する。
（Ｂ）第２工程は、一連の融合タンパク質構築物の作製を包含し、この構築物は、上記の局在化配列およびこのような局在化配列にインフレームでクローン化された特定のグリコシルトランスフェラーゼの触媒ドメインをコードする（例えば、ＧｎＴＩ、ＧａｌＴ、フコシルトランスフェラーゼまたはＳＴ）。触媒ドメインに融合された糖ヌクレオチド輸送体の場合において、このような構築物を設計し、その結果、触媒ドメイン（例えば、ＧｎＴＩ）が、得られたポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端のいずれかに存在し得る。局在化配列と同様に、触媒ドメインは、種々の異なる供給源に由来し得る。このような触媒ドメインの選択は、触媒ドメインが活性である特定の環境の知見によって左右される。例えば、特定のグリコシルトランスフェラーゼが、後期ゴルジにおいて活性である場合、宿主生物の後期ゴルジ中の全ての公知の酵素が、７．０の最適ｐＨを有する場合、または後期ゴルジが、特定のｐＨを有することが公知である場合、そのｐＨで最適の活性を有する触媒ドメインを選択することを試行する。特定の宿主において、このような酵素の活性に対する現
存するインビボデータはまた、有用であり得る。例えば、Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋおよび共同研究者らは、ＧａｌＴ活性をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゴルジに操作し得ることを示し、そしてこのような活性が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのａｌｇ変異型において、いくつかのＧａｌの存在するＧｌｃＮＡｃ２への転位を示すことによって存在したことを示した。さらに、数ラウンドの遺伝子シャッフリングまたは誤りがちのＰＣＲを実施し、融合構築物のプール内に大きな多様性を得る。なぜなら、単一アミノ酸変異は、糖タンパク質保有酵素の活性を劇的に変更し得ることが示されたからである（Ｒｏｍｅｒｏら、２０００）。グリコシルトランスフェラーゼおよびこれらの内因性固定配列（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の全長配列がまた、使用され得る。好ましい実施形態において、このような局在化／触媒ドメインライブラリーは、より高等な真核生物におけるグリコシル化反応の一連の性質に対する現存する情報を組込むように設計される。言い換えると、糖タンパク質のプロセシングの過程の初期に起こることが公知である反応は、このような反応を触媒する酵素の、ゴルジまたはＥＲの初期部分への標的化を必要とする。例えば、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２からＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２へのトリミングは、複合Ｎ−グリカンの形成における初期段階である。タンパク質プロセシングが、ＥＲにおいて開始し、次いで、初期ゴルジ、中期ゴルジおよび後期ゴルジの間進行するので、ＥＲまたは初期ゴルジにおいて起こるこのトリミング反応を有することが、所望される。マンノシダーゼＩ局在化についてのライブラリーを設計する場合、マンノシダーゼＩの触媒ドメインを有するＥＲ標的化シグナルと初期ゴルジ標的化シグナルとを一致することを試行する。
融合構築物ライブラリーを用いて宿主株を形質転換する際に、選択プロセスを使用して
、どの特定の局在化配列と触媒ドメインとの組み合わせが、実際に、そのような宿主株に
おいて見出される糖質構造に対して最大の効果を有するかを、同定する。そのような選択
は、多数のアッセイ方法または検出方法に基づき得る。それらの方法は、手動により行わ
れ得るか、または高スループットスクリーニング機器を使用することを介して自動化され
得る。
別の例において、ＧｎＴＩ活性が、複合Ｎ−グリカンの成熟のために必要である。なぜ
なら、末端α１，３マンノース残基へのＧｌｃＮＡｃの付加後のみ、そのような構造から
続く中間体ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造へのさらなる調整が生じ得るからで
ある。マンノシダーゼＩＩは、末端β１，２−ＧｌｃＮＡｃの非存在下で末端α１，３−
マンノース残基およびα１，６−マンノース残基を多分除去することができず、従って、
複合Ｎ−グリカンの形成は、ＧｎＴＩ活性の非存在下では進行しない（Ｓｃｈａｃｈｔｅ
ｒ，１９９１）。あるいは、充分な量の本発明に記載されるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を生
じる株を、Ａｌｇ３Ｐ活性が欠損した株を操作または選択することにより、まず操作また
は選択し得る。十分なＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター活性の存在下で、このよう
なＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター活性を有する株を操作または選択することによ
り達成し得るように、ＧｌｃＮＡｃが、ＧｎＴＩにより末端α−１，３残基に付加され得
る。なぜなら、インビトロでのＭａｎ３構造は、ラット肝臓ＧｎＴＩにより認識されるか
らである（Ｍｏｌｌｅｒ，１９９２）。
別のアプローチにおいて、上記のライブラリー中にＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポー
ターの発現を組込み得、望ましい構築物が、以下を含むようにする：（１）形質転換構築
物が細胞中に維持される領域（例えば、複製起点、または染色体組み込みを媒介する領域
）、（２）形質転換された細胞の選択を可能にするマーカー遺伝子（対比選択可能で再利
用可能なマーカー（例えば、ｕｒａ３もしくはＴ−ｕｒｆ１３（Ｓｏｄｅｒｈｏｌｍ，２
００１）、または充分に特徴付けられた他の選択マーカー（例えば、ｈｉｓ４、ｂｌａ、
Ｓｈ ｂｌｅなど）を含む）、（３）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターをコードす
る遺伝子（例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ由来（Ａｂｅｉｊｏｎ，１９９６）またはＨ．ｓａ
ｐｉｅｎｓ由来（Ｉｓｈｉｄａ，１９９６）、および（４）上記局在化ドメイン／触媒ド
メイン融合構築物ライブラリーの発現を活性化するプロモーター。
上記の融合構築物のライブラリーを用いる宿主の形質転換の後、細胞表面上に最高濃度
の末端ＧｌｃＮＡｃを有する細胞、または最高の末端ＧｌｃＮＡｃ含量を有するタンパク
質を分泌する細胞について、スクリーニングし得る。そのようなスクリーニングは、視覚
的方法（染色手順など）、特異的末端ＧｌｃＮＡｃ結合抗体に結合する能力、またはマー
カーに結合体化したレクチンに結合する能力（そのようなレクチンは、Ｅ．Ｙ．Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｍａｔｅｏ，ＣＡから入手可能である）、特定の
レクチンが末端マンノース残基に結合する能力の減少、インビトロで放射性標識糖を組込
む能力、色素もしくは荷電表面への結合の変化に基づき得るか、または発蛍光団標識レク
チンもしくは抗体と組み合わせて蛍光補助細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）デバイスを使用
することにより達成され得る（Ｇｕｉｌｌｅｎ，１９９８）。形質転換集団内の特定の表
現型を、細胞傷害性レクチンを用いて富化することは、有利であり得る。米国特許第５，
５９５，９００号は、望ましい細胞外糖質構造を有する細胞が同定され得るいくつかの方
法を教示する。このストラテジーを繰返し実行することにより、下等真核生物においてま
すます複雑なグリカンを連続して操作することが可能である。
形質転換後、インビトロアッセイにおいて、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩによ
るＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからのＧｌｃＮＡｃの最も効率的な移動を可能にする形質転換体
について、選択し得る。このスクリーニングは、上記形質転換ライブラリーを保有する細
胞を、寒天プレート上にて選択圧下で増殖させること、そして個々のコロニーを９６ウェ
ルマイクロタイタープレートへと移すことによって、実行され得る。細胞を増殖させた後
、その細胞を遠心分離し、その細胞を緩衝液中に再懸濁し、そしてＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ
およびＧｎＴ Ｖを添加した後、ＵＤＰの放出を、ＨＰＬＣか、またはＵＤＰについての
酵素結合アッセイのいずれかによって、測定する。あるいは、放射性標識したＵＤＰ−Ｇ
ｌｃＮＡｃおよびＧｎＴ Ｖを使用し、その細胞を洗浄し、その後、Ｎ−アセチルグルコ
サミニダーゼによる放射性ＧｌｃＮＡｃの放出を探索し得る。これはすべて、手動により
行われ得るか、または高スループットスクリーニング機器の使用を介して自動化され得る
。
第１のアッセイにおいてより多くのＵＤＰを放出するかまたは第２のアッセイにおいて
より多くの放射標識ＧｌｃＮＡｃを放出する形質転換体は、その表面上により高い程度の
ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を有し（図３）、従って、望ましい表現型を構成す
ると、予測される。あるいは、形質転換細胞の表面上の変化したグリコシル化パターンを
明らかにし得る、レクチン結合アッセイのような他の任意の適切なスクリーニングを使用
し得る。この場合、末端マンノースに特異的なレクチンの結合の減少が、適切な選択ツー
ルであり得る。Ｇａｌａｎｔｕｓ ｎｉｖａｌｉｓレクチンは、末端α−１，３マンノー
スに特異的に結合し、このことは、ゴルジ装置中に充分なマンノシダーゼＩＩ活性が存在
する場合には、減少すると予期される。高末端マンノース含量を含む細胞の除去を可能に
するクロマトグラフィー分離工程を実行することによってもまた、望ましい形質転換体を
富化し得る。この分離工程は、低末端マンノース含量を有する細胞よりも、高末端マンノ
ース含量を有する細胞に特異的に結合するレクチンカラム（例えば、アガロースに結合し
たＧａｌａｎｔｕｓ ｎｉｖａｌｉｓレクチン、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）
を用いて、実行される。さらに、このような融合タンパク質構築物を直接作製し得る。な
ぜなら、種々の下等真核生物宿主における活性糖質改変酵素の局在化に関するさらなる情
報が、科学文献にて利用可能であるからである。例えば、先行技術は、ヒトβ１，４−Ｇ
ａｌＴｒが、ＭＮＴ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のマンノシルトランスフェラーゼ）
の膜ドメインに融合され得、かつその触媒活性を保持しながらゴルジ装置へと局在化され
得ることを、本発明者らに教示する（Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋら、１９９５）。Ｓ．ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅまたは関連生物が、操作されるべき宿主である場合、そのような宿主由来
の複合Ｎ−グリカンを得るために、全体的ストラテジーにこのような知見を直接組込み得
る。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中のグリコシルトランスフェラーゼに関連する、Ｐ．ｐａ
ｓｔｏｒｉｓ中のいくつかのそのような遺伝子フラグメントが、同定されており、従って
、その目的のために使用され得る。
（表１）
（組み込み部位）
この遺伝子操作の試みの１つの最終的な目的は、工業的発酵プロセスにおいて充分に実
施可能である頑丈なタンパク質産生株であるので、宿主（例えば、真菌）染色体中に複数
の遺伝子を組込むことは、注意深い計画を伴う。操作された株は、多分、一定範囲の異な
る遺伝子で形質転換される必要があり、これらの遺伝子は、望ましい活性が発酵プロセス
全体にわたり維持されるのを確保するために、安定な様式で形質転換される必要がある。
以下の酵素活性の任意の組み合わせが、タンパク質発現真菌宿主中に操作される必要があ
る：シアリルトランスフェラーゼ、マンノシダーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、ガラ
クトシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、ＧｌｃＮＡｃトランスフ
ェラーゼ、ＥＲおよびゴルジ特異的トランスポーター（例えば、ＵＰＤ−ガラクトースお
よび他の前駆体についての共輸送トランスポーターおよび対向輸送トランスポーター）、
オリゴ糖のプロセシングに関与する他の酵素、ならびに活性化オリゴ糖前駆体（例えば、
ＵＤＰ−ガラクトース、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸）の合成に関与する酵素。同
時に、非ヒトグリコシル化反応の特徴であることが公知である酵素をコードする多数の遺
伝子が、欠失されなければならない。そのような遺伝子および対応するタンパク質は、多
数の下等真核生物（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ、Ａ．ｎｉｄ
ｕｌａｎｓなど）において広範に特徴付けられており、それにより、下等真核生物におけ
る公知のグリコシルトランスフェラーゼ、その活性、およびその個々の遺伝子配列のリス
トが提供される。これらの遺伝子は、マンノシルトランスフェラーゼの群（例えば、１，
３−マンノシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中のＭＮＮ１）
（Ｇｒａｈａｍ，１９９１）、１，２−マンノシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｓ．ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＫＴＲ／ＫＲＥファミリー）、１，６−マンノシルトランスフ
ェラーゼ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＯＣＨ１）、マンノシルホスフェートトラン
スフェラーゼ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＭＮＮ４およびＭＮＮ６）、および異所
性（すなわち、非ヒト）グリコシル化反応に関与するさらなる酵素）から選択される。こ
れらの遺伝子の多くは、実際に、欠失されており、変化したグリコシル化プロフィールを
有する生存可能な表現型を個別に生じる。例が、表２に示される。
（表２）
下等真核生物中への複合Ｎ−グリカンの形成を操作するためのどのストラテジーも、グリ
コシルトランスフェラーゼ活性の排除および付加の両方を包含するので、包括的スキーム
は、両方の要件を協調することを試みる。望ましくない酵素をコードする遺伝子は、望ま
しい遺伝子について可能な組み込み部位として役立つ。例えば、１，６−マンノシルトラ
ンスフェラーゼ活性は、公知の多くの下等真核生物におけるグリコシル化の特徴である。
α−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ（ＯＣＨ１）をコードする遺伝子は、Ｓ．ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅからクローン化されており、その遺伝子中の変異は、マンノシル化が
減少した生存可能な表現型を生じる。そのα−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活
性をコードする遺伝子座は、グリコシルトランスフェラーゼ活性をコードする遺伝子を組
込むための主要な標的である。同様な様式で、その座における遺伝子破壊事象に基づいて
、（１）よりヒトと類似する様式でグリコシル化する細胞能力を改善し、（２）タンパク
質を分泌する細胞能力を改善し、（３）外来タンパク質のタンパク質分解を減少し、そし
て（４）精製または発酵プロセス自体を促進するプロセスの他の特徴を改善することが予
測される、他の染色体組み込み部位の範囲を選択し得る。
（糖ヌクレオチド前駆体の提供）
高等真核生物グリコシル化の特徴は、糖タンパク質におけるガラクトース、フコース、
および高い程度の末端シアル酸の存在である。これらの糖は、酵母および繊維状真菌にお
いて生成される糖タンパク質においては一般的に見出されず、上記の方法により、望まし
いオルガネラにおいてグリコシルトランスフェラーゼが局在化する株の操作が可能である
。複合Ｎ−グリカン合成の形成は、特定の糖残基が除去されそしてコアオリゴ糖構造に結
合される、連続的プロセスである。高等真核生物において、これは、基質を、種々の処理
酵素に連続的に曝露させることによって達成される。これらの酵素は、処理カスケード全
体における特定の位置に依存して、特定の反応を行う。この「アセンブリライン」は、Ｅ
Ｒ、初期ゴルジ、中期ゴルジ、および後期ゴルジ、ならびにトランスゴルジネットワーク
すべてと、その特定の処理環境からなる。下等真核生物のゴルジおよびＥＲにおいてヒト
糖タンパク質の処理を再生するために、多数の酵素（例えば、グリコシルトランスフェラ
ーゼ、グリコシダーゼ、ホスファターゼ、およびトランスポーター）が、発現され、これ
らのオルガネラに特異的に標的付けられなければならず、好ましくは、それらがその環境
およびその経路中の他の酵素と関連して最も効率的に機能するような位置に、標的付けら
れなければならない。いくつかの個々のグリコシルトランスフェラーゼが、クローン化さ
れ、そしてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＧａｌＴ、ＧｎＴ Ｉ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ（ＧｎＴ Ｉ）および他の真菌において発現されているが、その生
物のグリコシル化パターンにおける望ましい「ヒト化」の結果は示さない（Ｙｏｓｈｉｄ
ａ，１９９５；Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋ，１９９５；Ｋａｌｓｎｅｒ，１９９５）。このよ
うなグリコシルトランスフェラーゼの作用により糖を受容するのに必要な糖質構造は、充
分な量存在しないと、推測された。このことは、おそらく、複合Ｎ−グリカン形成の欠如
に寄与し、一方、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を供給し、ＧｎＴ Ｉ活性を有し、そして
真菌注に操作されたＵＤＰ−Ｇｎトランスポーター活性を有する真菌についての報告は現
在存在しない。ハイブリッドな複合Ｎ−グリカン形成のために必要なのは、これらの３つ
の生化学的事象の組み合わせである。
ヒトにおいて、ヌクレオチド糖前駆体（例えば、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、
ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸、ＵＤＰ−ガ
ラクトースなど）の全範囲は、一般的に、サイトゾルにおいて合成され、そしてゴルジに
輸送され、このゴルジにおいて、これらは、グリコシルトランスフェラーゼによりコアオ
リゴ糖に結合される。下等真核生物においてこのプロセスを繰り返すために、糖ヌクレオ
シドに特異的な輸送体は、適切なレベルのヌクレオシド糖前駆体を確実にするために、ゴ
ルジにおいて発現されなければならない（Ｓｏｍｍｅｒｓ，１９８１；Ｓｏｍｍｅｒｓ，
１９８２；Ｐｅｒｅｚ，１９８７）。この反応の副生成物は、ヌクレオシドジホスフェー
トまたはヌクレオシドモノホスフェートのいずれかである。モノホスフェートが、交互輸
送機構によるヌクレオシドトリホスフェート糖の交換において直接的に輸送され得るが、
ジホスホヌクレオシド（例えば、ＧＤＰ）は、輸送される前に、ヌクレオシドモノホスフ
ェートおよび無機ホスフェートを生じるために、ホスファターゼ（例えば、ＧＤＰａｓｅ
）によって切断されなければならない。この反応は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＧ
ＤＰａｓｅが、マンノシル化に必要であることが見出されているので、効率的なグリコシ
ル化に重要であるようである。しかし、酵素のみが、ＵＤＰに対して１０％の活性を有す
る（Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅ，１９９４）。下等真核生物は、しばしば、ゴルジにおいてＵ
ＤＰ特異的ジホスファターゼ活性を有さない。なぜなら、これらは、ゴルジにおける糖タ
ンパク質合成のためにＵＤＰ−糖前駆体を利用しないからである。
Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ（細胞壁多糖類へガラクトース
残基を付加することが見出された酵母（ＵＤＰ−ガラクトース由来））は、このような酵
素に対する要件をさらに示唆する特異的なＵＤＰａｓｅ活性を有することを見出した（Ｂ
ｅｍｉｎｓｏｎｅら、１９９４）。ＵＤＰは、グリコシルトランスフェラーゼの強力なイ
ンヒビターであることが公知であり、このグリコシル化副産物の除去は、ゴルジの内腔に
おけるグリコシルトランスフェラーゼ阻害を妨げるために重要である。（Ｋｈａｔａｒａ
ら，１９７４）。従って、ＵＤＰの除去を提供する必要があり得、これは、このような操
作された株のゴルジにおいて蓄積することが予期される（Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅ，１９９
５；Ｂｅａｕｄｅｔ，１９９８）。
別の例において、２，３シアリルトランスフェラーゼおよび２，６シアリルトランスフェラーゼは、ヒトのトランス−ゴルジおよびＴＧＮにおいてシアル酸でガラクトース残基をキャップし、糖タンパク質の成熟形態を導く。代謝的に操作された酵母または真菌に、このプロセシング工程を再操作することは、（１）２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性および（２）酵母の後期（ｌａｔｅ）ゴルジにおけるＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の十分な供給を必要とする。後期ゴルジにおける十分な２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性を得るために、公知のシアリルトランスフェラーゼ（例えば、ヒト由来）の触媒性ドメインは、真菌において後期ゴルジに指向されなければならない（上記を参照のこと）。同様に、輸送体は、後期ゴルジへのＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の輸送を可能にするように操作されなければならない。現在、真菌が、十分な量のＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を合成することを指摘するものはなく、このような糖−ヌクレオチドのゴルジへの輸送を言及しない。結果として、対応するグリコシルトランスフェラーゼに対する基質の適切な供給を確実にするために、真菌に対してＣＭＰ−シアル酸の産生を代謝的に操作しなければならない。
（ゴルジ装置に糖ヌクレオチド前駆体を提供するための方法）
（ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−グルコサミン）
ヒトＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン輸送体のｃＤＮＡ（これは、発現配列タグデー
タベース（ｄｂＥＳＴ）における相同性検索によって認識された）は、Ｉｓｈｉｄａおよ
び共同研究者（Ｉｓｈｉｄａ，１９９９）によってクローニングされた。Ｇｕｉｌｌｅｎ
および共同研究者は、上記ヌクレオチド糖のゴルジ輸送体において欠損した、最近特徴付
けられたＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ変異体のイヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）由
来のｃＤＮＡとの表現型相関によって、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンに対する哺乳
動物ゴルジ膜輸送体をクローニングした（Ｇｕｉｌｌｅｎ、１９９８）。それらの結果は
、哺乳動物ゴルジ ＵＤＰ−Ｎ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体遺伝子が、このタンパク質が、発現
しそして酵母のゴルジ装置に機能的に標的化されるのに必要な情報の全てを有すること、
および非常に異なるアミノ酸配列を有する２つのタンパク質が、同じゴルジ膜内に同じ溶
質を輸送し得ることを実証する。（（Ｇｕｉｌｌｅｎ、１９９８）。
（ＧＤＰ−フコース）
ラット肝臓ゴルジ膜ＧＤＰ−フコース輸送体が、Ｐｕｇｌｉｅｌｌｉ，Ｌ．およびＣ．Ｂ．Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ（Ｐｕｇｌｉｅｌｌｉ，１９９９）によって同定および精製された。対応する遺伝子は、同定されていないが、Ｎ−末端配列決定を、対応する遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブの設計のために使用し得る。これらのオリゴヌクレオチドをプローブとして使用して、ＧＤＰ−フコース輸送体をコードする遺伝子をクローニングし得る。
（ＵＤＰ−ガラクトース）
２つの異種遺伝子（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ由来のα１
，２−ガラクトシルトランスフェラーゼ（α１，２ ＧａｌＴ）をコードするｇｍａｌ２
（＋）およびヒトＵＤＰ−ガラクトース（ＵＤＰ−Ｇａｌ）輸送体をコードする（ｈＵＧ
Ｔ２））は、ガラクトシル化に必要とされる細胞内条件を調べるために、Ｓ． ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅにおいて機能的に発現された。タンパク質ガラクトシル化とＵＤＰ−ガラク
トース輸送体活性との間の相関は、α１，２−ＧａｌＴよりも、ＵＤＰ−Ｇａｌ輸送体の
外因的な供給が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける効率的なガラクトシル化に重要な役
割を果たすことを示した（Ｋａｉｎｕｍａ，１９９９）。同様に、Ｓ．ｐｏｍｂｅ由来の
ＵＤＰ−ガラクトース輸送体は、クローニングされた（Ａｏｋｉ，１９９９；Ｓｅｇａｗ
ａ，１９９９）。
（ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−シアル酸））
ヒトＣＭＰ−シアル酸輸送体（ｈＣＳＴ）をクローニングし、そしてＬｅｃ ８ ＣＨ
Ｏ細胞において発現させた（Ａｏｋｉ，１９９９；Ｅｃｋｈａｒｄｔ，１９９７）。マウ
スＣＭＰ−シアル酸輸送体の機能的発現は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅにおいて達成された（Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅ，１９９７）。シアル酸は、いくら
かの真菌において見出されたが、選択された宿主系が、十分なレベルのＣＭＰ−シアル酸
を供給し得るか否かは、明確でない。シアル酸は、培地において供給され得るか、あるい
は、シアル酸合成に関係する真菌経路がまた宿主ゲノム内に組み込まれ得るかのいずれか
である。
（ジホスファターゼ）
糖が糖タンパク質上に輸送される場合、ヌクレオシドジホスフェートまたはヌクレオシ
ドモノホスフェートのいずれかが、糖ヌクレオチド前駆体から放出される。モノホスフェ
ートが交互輸送機構によるヌクレオシドトリホスフェート糖の交換において直接的に輸送
され得るが、ジホスホノモノヌクレオシド（例えば、ＧＤＰ）は、輸送される前に、ヌク
レオシドモノホスフェートおよび無機ホスフェートを生じるために、ホスファターゼ（例
えば、ＧＤＰａｓｅ）によって切断されなければならない。この反応は、Ｓ．ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ由来のＧＤＰａｓｅが、マンノシル化に必要であることが見出されているので
、効率的なグリコシル化に重要であるようである。しかし、酵素のみが、ＵＤＰに対して
１０％の活性を有する（Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅ，１９９４）。下等真核生物は、しばしば
、ゴルジにおいてＵＤＰ特異的ジホスファターゼ活性を有さない。なぜなら、これらは、
ゴルジにおける糖タンパク質合成のためにＵＤＰ−糖前駆体を利用しないからである。Ｓ
ｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ（細胞壁多糖類へガラクトース残基
を付加することが見出された酵母（ＵＤＰ−ガラクトース由来））は、このような酵素に
対する要件をさらに示唆する特異的なＵＤＰａｓｅ活性を有することを見出した（Ｂｅｍ
ｉｎｓｏｎｅら、１９９４）。ＵＤＰは、グリコシルトランスフェラーゼの強力なインヒ
ビターであることが公知であり、このグリコシル化副産物の除去は、ゴルジの内腔におけ
るグリコシルトランスフェラーゼ阻害を妨げるために重要である。（Ｋｈａｔａｒａら，
１９７４）。
（複合体Ｎ−グリカンを産生するためのＧｎＴの発現）
（抗体機能をブーストするためのＧｎＴ−ＩＩＩの発現）
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩおよびＩＩＩによるＧｌｃＮＡｃ
１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造へのＮ−アセチルグルコサミンの付加は、いわゆる分岐し
たＮ−グリカンＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を生じる（図３）。この構造は、
より大きな抗体依存性の細胞性の細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関係している（Ｕｍａｎａら、
１９９９）。哺乳動物細胞によって発現される免疫グロブリンの糖形態を再操作すること
は、冗漫で厄介な作業である。特に、ＧｎＴ ＩＩＩ（この酵素の過剰発現は、増殖阻害
に関係している）の場合、調節された（誘導性の）遺伝子の発現を含む方法が、分岐した
Ｎ−グリカンを有する免疫グロブリンを作製するために使用されなければならい（Ｕｍａ
ｎａら、１９９９ａ、１９９９ｂ）。
従って、別の実施形態において、本発明は、コアマンノース構造上に、分岐したＮ−ア
セチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を有するヒト様Ｎ−グリカンを作製するためのシス
テムおよび方法を提供する。好ましい実施形態において、本発明は、分岐したＮ−グリカ
ンを有する免疫グロブリンを産生するためのシステムおよび方法を提供する。本明細書中
に記載されるシステムおよび方法は、先の問題（例えば、ＧｎＴ ＩＩＩまたはＡＤＣＣ
の過剰発現に関連する細胞傷害性）を被らない。なぜなら、本発明の宿主細胞は、実質的
に改変されたヒト型糖形態（例えば、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）を有する
Ｎ−グリカンを産生する、生存可能であり好ましくは、頑強な細胞であるように操作およ
び選択されるからである。従って、本発明の宿主細胞における分岐したＮ−アセチルグル
コサミンの付加は、増殖−表現型またはそれらの宿主細胞の生存能力に対して、無視し得
る効果を有する。
さらに、以前の研究（Ｕｍａｎａ）は、ＧｎＴ ＩＩＩ発現レベルとＡＤＣＣの程度との間に直線的な関係がないことを示した。哺乳動物細胞における最適な発現レベルを見つけ出すこと、およびＦＤＡが許可した発酵プロセス全体にわたってそれを維持することは、挑戦であるようである。しかし、本発明の細胞（例えば、真菌細胞）において、頑強で、信頼性があり、かつ最適なＧｎＴ ＩＩＩ発現レベルを確立するための適切な強度のプロモーターを発見することは、当業者には比較的簡単な作業である。
分岐したＮ−グリカンを用いて糖タンパク質を産生し得る酵母菌株のような宿主細胞は、宿主細胞内にＧｎＴ ＩＩＩ活性を導入することによって、本発明に従って操作される（実施例６）。好ましくは、宿主細胞は、ＧｎＴ ＩＩＩ（例えば、図３２を参照のこと）をコードする核酸または酵素活性を有するそのドメイン（（例えば、本発明のライブラリーおよび関連する方法を使用して）必要に応じて、異種細胞シグナル標的化ペプチドに融合される）を用いて形質転換される。ＧｎＴ ＩＩＩを発現するように操作された宿主細胞は、哺乳動物細胞が可能であるよりも高い抗体力価を生じる。これらはまた、ＡＤＣＣに関してより高い効力を有する抗体を産生する。
ＧｎＴ ＩＩＩをトランスフェクトされた哺乳動物細胞株によって産生された抗体は、非トランスフェクト細胞株によって産生された抗体と同様に効果的であるが、１０〜２０倍低い濃度であることが示された（Ｄａｖｉｅｓら、２００１）。本発明の産生ビヒクルの生産性の、哺乳動物系に対する２０倍の増加、および１０倍の効力の増加は、２００倍の正味の生産性の改善を生じる。従って、本発明は、高い効力（例えば、現在生産され得るものよりも数桁より強力）を有する高い力価の抗体を作製するための系および方法を提供する。この系および方法は、安全であり、高い効力の抗体を短い時間で低コストで提供する。本発明に従って、ＧｎＴ ＩＩＩを発現するように操作された宿主細胞は、少なくとも５０ｍｇ／リットル／日〜少なくとも５００ｍｇ／リットル／日の速度で分岐した（ｂｉｓｅｃｔｅｄ） Ｎ−グリカンを有する免疫グロブリンを産生する。さらに、各免疫グロブリン（Ｉｇ）分子（分岐したＧｌｃＮＡｃを含む）は、分岐したＧｌｃＮＡｃを含まないで産生された同じＩｇ分子よりも強力である。
（ＧｎＴ−ＩＶおよびＧｎＴ−Ｖのクローニングおよび発現）
複合体Ｎ−グリカンの全ての分枝構造を、Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼ（ＧｎＴ）−Ｉ〜−ＶＩにより、共通のコア五糖（Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２またはＭａｎα−６（Ｍａｎ α１−３）Ｍａｎ β１−４ ＧｌｃＮＡｃ β１−４ ＧｌｃＮＡｃ β１−４またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）上に合成した（Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ Ｈら（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｅ；１７９：３５１−９７）。より高度に分枝したＮ−グリカンの生合成ついての現在の理解は、ＧｎＴ ＩＩの作用（ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造の作製）の後に、ＧｎＴＩＶが、ＧｌｃＮＡｃを、β１，４−連結のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンのＭａｎ α１，３ Ｍａｎ β１，４アームに移動させ（Ａｌｌｅｎ ＳＤら（１９８４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃ１１ｅｍ．Ｊｕｎ １０；２５９（１１）：６９８４−９０；ならびにＧｌｅｅｓｏｎ ＰＡおよびＳｃｈａｃｈｔｅｒ Ｈ．Ｊ（１９８３）；Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５；２５８ （１０）：６１６２−７３）、トリアンテナリアガラクト（ｔｒｉａｎｔｅｎｎａｒｙ ａｇａｌａｃｔｏ）糖鎖を生じることを示唆する。このＮ−グリカン（ＧｌｃＮＡｃ β１−２ Ｍａｎ α１−６（ＧｌｃＮＡｃ β１−２ Ｍａｎ α１−３）Ｍａｎ β１−４ ＧｌｃＮＡｃ β１−４ ＧｌｃＮＡｃ β１，４ Ａｓｎ）は、ＧｎＴ−ＩＩＩおよびＧｎＴ−Ｖに対する共通の基質であり、分岐したトリアテナリー構造およびテトラアテナリー構造の合成を導く。ＧｎＴ ＩＩＩの作用が、分岐したＮ−グリカンを生じる場合、およびＧｎＴＶが、β１−６ＧｌｃＮＡｃのα１−６マンノシルコアへの付加を触媒する場合、β１−６分枝を生じる。ガラクトースおよびシアル酸のこれらの分枝への付加は、完全にシアル化された複合Ｎ−グリカンの生成を導く。
分枝した複合型Ｎ−グリカンは、治療タンパク質の生理学的活性に関連している（例え
ば、ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ））。バイアンテナリー構造を有するヒトＥＰＯは
、低い活性を有することが示されているのに対し、テトラアンテナリー構造を有するｈＥ
ＰＯは、血流からのよりゆっくりとしたクリアランスを生じ、従って、より高い活性を生
じた（Ｍｉｓａｉｚｕ Ｔら（１９９５）Ｂｌｏｏｄ Ｄｅｃ １；８６（１１）：４０
９７−１０４）。
ＤＮＡ配列情報を用いて、当業者は、ＧｎＴ ＩＶおよび／またはＧｎＴ Ｖ活性をコ
ードするＤＮＡ分子をクローニングし得る（実施例６；図３３および３４）。当業者に周
知の標準的な技術を使用して、ＧｎＴ ＩＶまたはＧｎＴ Ｖをコードする（または触媒
的に活性なそのフラグメントをコードする）核酸分子は、本発明の選択された宿主細胞（
例えば、本明細書中に記載のＰｉｃｈｉａ ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ
．およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．のような真菌宿主）において転写を駆動し得る
プロモーターおよび他の発現制御配列の転写制御下にある適切な発現ベクターに挿入され
得、その結果、これらの哺乳動物ＧｎＴ酵素のうちの１つ以上が、ヒト様複合型糖タンパ
ク質の生成のために選択された宿主細胞において活性に発現され得る。
以下は、本発明の組成物および方法を例示する実施例である。これらの実施例は、限定
として解釈されるべきではなく、この実施例は、単に例示目的で含まれる。
（実施例１：Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＫ．ｌａｃｔｉｓにおけるＡＬＧ３遺伝子の
同定、クローニングおよび欠失）
縮重プライマーを、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ、およびＤ．ｍｅ
ｌａｎｏｇａｓｔｅｒ由来のＡｌｇ３タンパク質配列のアラインメントに基づいて作製し
、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムＤＮＡ由来の８３ｂｐ産物を増幅するために使用した：
５’−ＧＧＴＧＴＴＴＴＧＴＴＴＴＣＴＡＧＡＴＣＴＴＴＧＣＡＹＴＡＹＣＡＲＴＴ−３
’および
５’−ＡＧＡＡＴＴＴＧＧＴＧＧＧＴＡＡＧＡＡＴＴＣＣＡＲＣＡＣＣＡＹＴＣＲＴＧ−
３’。得られたＰＣＲ産物を、ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌ
ｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングしたところ、配列分析により、公知のＡＬＧ３／ＲＨＫ
１／ＮＯＴ５６ホモログ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＣ＿００１１３４．２、ＡＦ３０９６８９
、ＮＣ＿００３４２４．１）に対する相同性が示された。その後、始めのＰＣＲ産物の１
９２９ｂｐ上流および２７３８ｂｐ下流を、以下の内部オリゴヌクレオチド：
を使用して、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムＤＮＡライブラリーから増幅した（Ｂｏｅｈｍ
，Ｔ．Ｙｅａｓｔ １９９９ Ｍａｙ；１５（７）：５６３−７２）。得られたフラグメ
ントを、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、
配列決定した。この配列から、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＬＧ３遺伝子に対して３５
％同一性および５３％類似性を有するタンパク質をコードする１３９５ｂｐ ＯＲＦを、
（ＢＬＡＳＴプログラムを使用して）同定した。この遺伝子を、ＰｐＡＬＧ３と名付けた
。
ＰｐＡＬＧ３の配列を使用して、プライマーのセットを作製し、ＰｐＡＬＧ３遺伝子の欠失構築物を、ＰＣＲ重複（Ｄａｖｉｄｓｏｎら，２００２ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４８（Ｐｔ ８）：２６０７−１５）により生成した。以下のプライマーを使用して、ＰｐＡＬＧ３ ＯＲＦおよびＫＡＮＲ遺伝子の５’側および３’側の１ｋｂ領域を、それぞれ増幅した：
引き続いて、プライマーＲＣＤ１４２およびＲＣＤ１４７を使用して、３つの得られた
ＰＣＲ産物を、単一の３．６ｋｂ ａｌｇ３：：ＫＡＮＲの欠失対立遺伝子に重ねた。
（Ｋ．ｌａｃｔｉｓにおけるＡＬＧ３遺伝子の同定、クローニングおよび欠失）
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｈｏ
ｍｏ ｓａｐｉｅｎｓなどに由来するＡＬＧ３ｐ配列を、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ配列（ＰＥＮ
ＤＡＮＴ ＥＳＴデータベース）と整列させた。共通ホモログ中に存在するが、それらの
ホモログにおいて正確な配列は異なる、高い相同性の領域を使用して、株ＭＧ１／２（Ｂ
ｉａｎｃｈｉら，１９８７）に由来するゲノムＤＮＡに対して指向する縮重プライマーの
対を作製した。ＡＬＧ３の場合において、プライマー：
を用いるＰＣＲ増幅は、クローニングされ、配列決定された産物を生じ、推定翻訳産物は
、Ａｌｇ３ｐタンパク質（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａｌｇ３ｐに対して＞５０％）に
対して高い程度の相同性を有することが示された。
そのＰＣＲ産物を使用して、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ株（ＭＧ１／２）由来のゲノムＤＮＡの
サザンブロットを、高いストリンジェンシー下でプローブした（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１
９８９）。ハイブリダイゼーションは、単一の遺伝子と一致したパターンで観察された。
このサザンブロットを使用して、ゲノム遺伝子座をマッピングした。ゲノムフラグメント
を、ゲノムＤＮＡを消化し、適切なサイズ範囲にあるこれらのフラグメントをｐＵＣｌ９
に連結することによってクローニングして、Ｋ．ｌａｃｔｉｓサブゲノムライブラリーを
作製した。このサブゲノムライブラリーを、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換し、数百のクローン
を、プライマーＫＡＬ−１およびＫＡＬ−２を使用するコロニーＰＣＲによって試験した
。推定ＫｌＡＬＧ３遺伝子および推定ＫｌＡＬＧ６１遺伝子を含むクローンを、配列決定
し、オープンリーディングフレームを同定した。
ＰＣＲ重複法（Ｄａｖｉｄｓｏｎら，２００２）を使用する、ａｌｇ３：：ＮＡＴＲ欠
失対立遺伝子の構築物のためのプライマーを設計し、得られた欠失対立遺伝子を、２つの
Ｋ．ｌａｃｔｉｓ株に形質転換し、ＮＡＴ耐性コロニーを選択した。これらのコロニーを
、ＰＣＲによってスクリーニングし、ＡＬＧ３ ＯＲＦがｏｃｈ１：：ＮＡＴＲ変異対立
遺伝子で置換された形質転換体を得た。
（実施例２：ヒト様糖タンパク質の生成のための、α−１，２−マンノシダーゼ、Ｇｎ
ＴＩおよびＧｎＴＩＩを発現するａｌｇ３／ｏｃｈｌ変異株の生成）
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＣＨ１遺伝子の１２１５ｂｐオープンリーディングフレーム
、ならびに２６８５ｂｐ上流および１１７５ｂｐ下流を、ＰＣＲによって増幅し（Ｂ．Ｋ
．Ｃｈｏｉら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００２に投稿）；Ｗ
Ｏ０２／００８７９もまた参照のこと；これらの各々は、本明細書中に参考として援用さ
れる）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、
ｐＢＫ９と名付けた。複数の栄養要求マーカーを含むｏｃｈ１ノックアウト株を作製する
ために、１００μｇのｐＪＮ３２９（ＳｆｉＩ制限部位と隣接したｏｃｈ１：：ＵＲＡ３
変異対立遺伝子を含むプラスミド）を、ＳｆｉＩで消化し、これを使用して、Ｐ．ｐａｓ
ｔｏｒｉｓ株ＪＣ３０８（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら、Ｇｅｎｅ ２６３（２００１）１５９
−１６９）をエレクトロポレーションにより形質転換した。ウラシルを欠く規定の培地上
で１０日間室温でインキュベートした後、１０００個のコロニーを拾い上げ、再び画線し
た。３７℃で増殖できないが、室温では増殖するＵＲＡ＋クローンを、コロニーＰＣＲに
供して、ｏｃｈ１：：ＵＲＡ３変異対立遺伝子の正確な組み込みについて試験した。予測
されるＰＣＲパターンを示した１つのクローンを、ＹＪＮ１５３と名付けた。ヒトプラス
ミノゲンのＫｒｉｎｇｌｅ ３ドメイン（Ｋ３）を、モデルタンパク質として使用した。
Ｋ３遺伝子を含むＮｅｏＲマーカーを挿入した（ＮｅｏＲ ｍａｒｋｅｄ）プラスミドを
、ＹＪＮ１５３株に形質転換し、Ｋ３を発現する得られた株を、ＢＫ６４−１と名付けた
（Ｂ．Ｋ．Ｃｈｏｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００２に投
稿）。
ゴルジＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン輸送体をコードするプラスミドｐＰＢ１０３
（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ ＭＮＮ２−２遺伝子を含む）を、ベクタ
ーｐＤＬ０２（Ａｂｅｉｊｏｎら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：５９６３−５９６８）由来の平滑ＢｇｌＩＩ−ＨｉｄＩＩＩフラグメ
ントを、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＡＤＥ１遺伝子を含む、ＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩ消
化した平滑末端のｐＢＬＡＤＥ−ＳＸ（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら（２００１）Ｇｅｎｅ ２
６３：１５９−１６９）にクローニングすることによって構築した。このプラスミドをＥ
ｃｏＮＩで線状にし、エレクトロポレーションによりＢＫ６４−１株に形質転換し、ＰＣ
Ｒ分析によりＭＮＮ２−２を含むことが確認された１つの株を、ＰＢＰ１と名付けた。
ヒト、マウス、ハエ、線虫（worm）および酵母供給源由来のいくつかのα−１，２−マンノシダーゼ遺伝子の触媒ドメインと融合した、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ由来のいくつかのＩ型またはＩＩ型膜タンパク質のリーダードメインのインフレーム融合物を含むマンノシダーゼ構築物のライブラリーを、作製した（例えば、ＷＯ０２／００８７９（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。このライブラリーを、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＨＩＳ４組み込みベクター中に作製し、ＳａｌＩで線状にし、ＰＢＰ１株にエレクトロポレーションにより形質転換し、Ｋ３レポータータンパク質から放出されたグリカンを分析することにより、スクリーニングした。選択した１つの活性な構築物は、マウスα−１，２−マンノシダーゼＩＡ（ＭｍＭａｎｎＩＡ）遺伝子のＮ末端欠失物（これは、１８７個のヌクレオチドを欠いている）と融合した、酵母ＳＥＣ１２遺伝子の９８８〜１２９６のヌクレオチド（Ｃ末端）のキメラであった。この構築物を発現するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株を、ＰＢＰ２と名付けた。
ヒト、線虫、カエルおよびハエ供給源由来のＧｎＴＩ遺伝子の触媒ドメインを有する同
じリーダーライブラリーのインフレーム融合物を含むＧｎＴＩ構築物のライブラリーを作
製した（ＷＯ０２／００８７９）。このライブラリーを、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＡＲＧ
４組み込みベクター中に作製し、ＡａｔＩＩで線状にし、ＰＢＰ２株へのエレクトロポレ
ーションにより形質転換し、Ｋ３から放出されたグリカンを分析することによって、スク
リーニングした。選択した１つの活性な構築物は、ヒトＧｎＴＩ遺伝子の欠失物（これは
、最初の１５４ｂｐを欠いている）に融合したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ９遺伝
子の最初の１２０ｂｐのキメラであった。この構築物を発現するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株
を、ＰＢＰ３と名付けた。
引き続いて、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ａｌｇ３：：ＫＡＮＲ欠失構築物を、上記のよう
に作製した。得られたＰＣＲ産物の約５μｇを、ＰＢＰ３株に形質転換し、コロニーを、
２００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含むＹＰＤ培地上で選択した。ＰＣＲによってスクリーニ
ングした２０株のうちの１株が、ａｌｇ３：：ＫＡＮＲ変異対立遺伝子の正確な組み込み
を含み、野生型対立遺伝子を欠くことを確認した。この株を、ＲＤＰ２７と名付けた。
最後に、ヒトおよびラット供給源由来のＧｎＴＩＩ遺伝子の触媒ドメインを有するリー
ダーライブラリーのインフレーム融合物から構成されるＧｎＴＩＩ構築物のライブラリー
を作製した（ＷＯ０２／００８７９）。このライブラリーを、薬物ノールセオスリシン（
ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）に対する耐性を付与するＮＳＴＲ遺伝子を含むＰ．ｐａ
ｓｔｏｒｉｓ組み込みベクター中に作製した。このライブラリープラスミドを、ＥｃｏＲ
Ｉで線状にし、ＲＤＰ２７株にエレクトロポレーションにより形質転換し、得られた株を
、精製Ｋ３から放出されたグリカンの分析によりスクリーニングした。
（材料）
ＭＯＰＳ（カコジル酸ナトリウム）、塩化マンガン、ＵＤＰ−ガラクトースおよびＣＭ
Ｐ−Ｎ−アセチルノイラミン酸は、シグマ製であった。ＴＦＡは、Ａｌｄｒｉｃｈ製であ
った。Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来の組換えラットα２，６−シア
リルトランスフェラーゼおよびウシ乳汁由来のβ１，４−ガラクトシルトランスフェラー
ゼは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ製であった。タンパク質Ｎ−グリコシダーゼＦ、マンノシダ
ーゼ、およびオリゴ糖は、Ｇｌｙｋｏ（Ｓａｎ Ｒａｆａｅｌ，ＣＡ）製であった。ＤＥ
ＡＥ ＴｏｙｏＰｅａｒｌ樹脂は、ＴｏｓｏＨａａｓ製であった。金属キレート「Ｈｉｓ
Ｂｉｎｄ」樹脂は、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）製であった。９６ウェル溶
解液除去プレートは、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）製であった。タンパク質
結合９６ウェルプレートは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）製であった。
塩および緩衝剤は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）製であった。ＭＡＬＤＩマト
リクスは、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）製であった。
（タンパク質精製）
Ｋｒｉｎｇｌｅ３を、Ｂｅｃｋｍａｎ ＢｉｏＭｅｋ ２０００サンプル処理ロボット
（Ｂｅｃｋｍａｎ／Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｒａｎｃｈ Ｃｕｃａｍｏｎｇａ，ＣＡ）で、９６
ウェル形式を使用して精製した。Ｋｒｉｎｇｌｅ３を、Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグを使
用して、発現培地から精製した。このロボット精製は、そのＨｉｓＢｉｎｄ樹脂について
Ｎｏｖａｇｅｎによって提供されたプロトコルの適応である。簡潔には、１５０ｕＬ（μ
Ｌ）の固定容積の樹脂を、９６ウェルの溶解物結合プレートのウェル中に注ぎ、３容積の
水で洗浄し、そして５容積の５０ｍＭ ＮｉＳＯ４を充填し、そして３容積の結合緩衝液
（５ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．９
））で洗浄する。タンパク質発現培地を、培地／ＰＢＳ（６０ｍＭ ＰＯ４、１６ｍＭ
ＫＣ１、８２２ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４））で３：２希釈し、そしてカラムに充填し
た。吸引後、カラムを１０容積の結合緩衝液および６容積の洗浄緩衝液（３０ｍＭイミダ
ゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９））で洗浄し、
そしてタンパク質を、６容積の溶出緩衝液（１Ｍイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９））で溶出する。溶出された糖タンパク質を、凍
結乾燥によって、乾燥するまでエバポレートする。
（Ｎ連結グリカンの放出）
グリカンを、以前に報告された方法（Ｐａｐａｃら、Ａ．Ｊ．Ｓ．（１９９８）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ８，４４５−４５４）の改変によって、糖タンパク質から放出および分離する。９６ウェルのＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ ＩＰ（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐメンブレン）プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）のウェルを、１００ｕＬのメタノールで湿らせ、３×１５０ｕＬの水および５０ｕＬのＲＣＭ緩衝液（８Ｍ尿素、３６０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３．２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．６））で洗浄し、各添加後に、穏やかな減圧で吸引する。乾燥したタンパク質サンプルを、３０ｕＬのＲＣＭ緩衝液中に溶解し、そして１０ｕＬのＲＣＭ緩衝液を含むウェルに移す。ウェルを吸引し、そしてＲＣＭ緩衝液で２回洗浄する。タンパク質を、６０ｕＬの、ＲＣＭ緩衝液中の０．１Ｍ ＤＴＴを、３７℃で１時間に亘って添加して、還元した。ウェルを、３００ｕＬの水で３回洗浄し、そして６０ｕＬの０．１Ｍヨード酢酸を、暗中での室温にて３０分間で添加して、カルボキシメチル化する。ウェルを、水で再度３回洗浄し、そしてメンブレンを、１００ｕＬの水中１％ＰＶＰ ３６０の、室温で１時間の添加によって、ブロッキングする。ウェルを吸引し、そして３００ｕＬの水で３回洗浄し、そして３０ｕＬの１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ８．３）（１ミリ単位のＮ−グリカナーゼ(ｇｌｙｃａｎａｓｅ)（Ｇｌｙｋｏ）を含む）の添加によって、脱グリコシル化する。３７℃１６時間の後、グリカンを含む溶液を、遠心分離によって取り出し、そして乾燥するまで蒸発させる。
（飛行質量分析の、マトリクス補助レーザー脱離イオン化時間）
グリカンの分子量を、遅延抽出を使用して、Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ ＰＲＯ線形ＭＡＬ
ＤＩ−ＴＯＦ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）質量分析機を用いて決定した
。各ウェル由来の乾燥グリカンを、１５ｕＬの水中に溶解し、そして０．５ｕＬを、ステ
ンレス鋼サンプルプレート上にスポットし、そして０．５ｕＬのＳ−ＤＨＢマトリクス（
９ｍｇ／ｍＬのジヒドロキシ安息香酸、１ｍｇ／ｍＬの５−メトキシサリチル酸（１：１
の水／アセトニトリル ０．１％ ＴＦＡ中））と混合し、そして乾燥させた。
パルス窒素レーザー（３３７ｎｍ）を、４ｎｓのパルス時間で照射することによって、
イオンを発生させた。この機器を、１２５ｎｓの遅延を用いる遅延抽出モードおよび２０
ｋＶの加速電圧で操作した。格子電圧は、９３．００％であり、ガイドワイヤ電圧は、０
．１０％であり、内部圧力は、５×１０−７トル未満であり、そして低質量ゲートは、８
７５Ｄａであった。スペクトルを、合計１００〜２００のレーザーパルスから発生させ、
そして２ＧＨｚのディジタイザーを用いて獲得した。Ｍａｎ５オリゴ糖を、外部分子量標
準として使用した。全てのスペクトルを、陽イオンモードでこの機器を用いて発生させた
。このスペクトルの概算の質量精度は、０．５％であった。
（材料）
ＭＯＰＳ、カコジル酸ナトリウム、塩化マグネシウム、ＵＤＰ−ガラクトースおよびＣ
ＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸は、Ｓｉｇｍａ，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ製であ
った。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）は、Ｓｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓａｉｎｔ Ｌｏ
ｕｉｓ，ＭＯ製であった。Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来の組換えラ
ットα−２，６−シアリルトランスフェラーゼおよびウシ乳汁由来のβ−１，４−ガラク
トシルトランスフェラーゼは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ製であ
った。
（β−Ｎ−アセチルヘキソサミニナーゼ設計）
グリカンを、以前に報告された方法（Ｐａｐａｃら、Ａ．Ｊ．Ｓ．（１９９８）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ８，４４５−４５４）の改変によって、糖タンパク質から放出および分離した。タンパク質を還元およびカルボキシメチル化し、そしてメンブレンをブロッキングした後、ウェルを、水で３回洗浄した。タンパク質を、３０μｌの１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ８．３）（１ミリ単位のＮ−グリカナーゼ（ｇｌｙｃａｎａｓｅ）（Ｇｌｙｋｏ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）を含む）の添加によって、脱グリコシル化した。３７℃１６時間の後、グリカンを含む溶液を、遠心分離によって取り出し、そして乾燥するまでエバポレートした。次いで、グリカンを、ＳＣ２１０Ａスピード減圧（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓａｖａｎｔ，Ｈａｌｂｒｏｏｋ，ＮＹ）中で乾燥させた。乾燥したグリカンを、５０ｍＭ ＮＨ４Ａｃ（ｐＨ５．０）中に３７℃で一晩置き、そして１ｍＵのヘキソース（ｈｅｘｏｓ）（Ｇｌｙｋｏ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）を添加した。
（ガラクトシルトランスフェラーゼ反応）
約２ｍｇのタンパク質（ｒ−Ｋ３：ｈＰｇ［ＰＢＰ６−５］）を、ニッケル親和性クロ
マトグラフィーによって精製し、０．１％ ＴＦＡに対して広範に透析し、そして乾燥す
るまで凍結乾燥した。このタンパク質を、１５０μｌの５０ｍＭ ＭＯＰＳ、２０ｍＭ
ＭｎＣ１２（ｐＨ７．４）中に再溶解した。３２．５μｇ（５３３ｎｍｏｌ）のＵＤＰ−
ガラクトースおよび４ｍＵのβ １，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの添加後、サ
ンプルを、３７℃で１８時間インキュベートした。次いで、これらのサンプルを、ＭＡＬ
ＤＩＴＯＦ質量分析による分析のために、０．１％ ＴＦＡに対して透析した。
ガラクトシルトランスフェラーゼと反応したタンパク質のスペクトルは、酵素なしでイ
ンキュベートした類似のタンパク質サンプルのスペクトルと比較して、２つのガラクトー
ス部分の付加と一致する、質量の増加を示した。次に、タンパク質サンプルを還元し、カ
ルボキシメチル化し、そしてＰＮＧａｓｅ Ｆで脱グリコシル化した。回収したＮ−グリ
カンを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって分析した。タンパク質と反応したガラクト
シルトランスフェラーゼ由来の優勢なグリカンの質量は、２つのガラクトース部分の付加
と一致する質量分（３２５．４Ｄａ）だけ、コントロールグリカンの質量より多かった。
（シアリルトランスフェラーゼ反応）
（ガラクトシルトランスフェラーゼ反応した）タンパク質を、１０μｌの５０ｍＭ カ
コジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中に再懸濁した後、１５μＬの同じ緩衝液中に
溶解された３００μｇ（４８８ｎｍｏｌ）のＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ
−ＮＡＮＡ）および５μｌ（２ｍＵ）の組換えα−２，６ シアリルトランスフェラーゼ
を添加した。３７℃で１５時間のインキュベート後、さらに２００μｇのＣＭＰ−ＮＡＮ
Ａおよび１ｍＵのシアリルトランスフェラーゼを添加した。これらのタンパク質サンプル
を、さらに８時間インキュベートし、次いで、透析し、上記のようにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ
−ＭＳによって分析した。
シアリルトランスフェラーゼと反応した糖タンパク質のスペクトルは、出発物質（ガラ
クトシルトランスフェラーゼ反応後のタンパク質）の質量と比較して、質量の増加を示し
た。Ｎ−グリカンを、上記のように放出および分析した。優勢なグリカンの２つのイオン
付加物の質量の増加は、２つのシアル酸残基の付加と一致した（５８０Ｄａおよび５８３
Ｄａ）。
（実施例３）
（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＡＬＧ９遺伝子およびＡＬＧ１２遺伝子の同定、クロ
ーニングおよび欠失）
実施例１と同様に、ＡＬＧ９ｐ配列およびＡＬＧ１２配列（それぞれ、Ｓ．ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅ
ｎｓなどに由来する）を整列し、そして高い相同性の領域を、縮重プライマーを設計する
ために使用する。これらのプライマーを、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ由来のゲノムＤＮＡに対
するＰＣＲ反応において使用する。得られた最初のＰＣＲ産物をサブクローニングし、配
列決定し、そして高いストリンジェンシーで、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ由来のゲノムＤＮＡ
のサザンブロットをプローブするために使用した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）。ハ
イブリダイゼーションを観察する。このサザンブロットを使用して、遺伝子座位のマッピ
ングを行った。ゲノムフラグメントを、ゲノムＤＮＡを消化し、そして適切なサイズ範囲
のフラグメントをｐＵＣｌ９に連結して、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓサブゲノムライブラリー
を作製することによって、クローニングした。このサブゲノムライブラリーを、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ中に形質転換し、そして数百個のクローンを、最初のＰＣＲ産物の配列に基づいて設
計されたプライマーを使用して、コロニーＰＣＲによって試験する。予測された遺伝子を
含むクローンを配列決定し、そしてオープンリーディングフレームを同定する。ａｌｇ９
：：ＮＡＩＲ欠失対立遺伝子の構築のためのプライマーを、ＰＣＲ重複法（Ｄａｖｉｄｓ
ｏｎら、２００２）を使用して設計する。得られた欠失対立遺伝子を、２つのＰ．ｐａｓ
ｔｏｒｉｓ株に形質転換し、そしてＮＡＴ耐性コロニーを選択する。これらのコロニーを
、ＰＣＲによってスクリーニングし、そしてＡＬＧ９ ＯＲＦがｏｃｈｌ：：ＮＡＴＲ変
異体対立遺伝子で置換された形質転換体を得る。一般に、以下を参照のこと：Ｃｉｐｏｌ
ｌｏら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００２（１２）１１：７４９−７６２；Ｃｈａｎ
ｔｒｅｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｊｕｌ．１２，２００２（２７７）２８：２５８
１５−２５８２２；Ｃｉｐｏｌｌｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｆｅｂ．１１，２００
０（２７５）６：４２６７−４２７７；Ｂｕｒｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｊｕｌｙ １９９６（９３）：７１６０−７１６５；Ｋａｒａｏｇ
ｌｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙｙ ２００１，４０，１２１９３−１２２０６；Ｇｒｉ
ｍｍｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｊｕｌｙ ２０，２００１（２７６）２９：２７７
３１−２７７３９；Ｖｅｒｏｓｔｅｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｊｕｎｅ ５，１９
９３（２６８）１６：１２０９５−１２１０３；Ｈｕｆｆａｋｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｄｅｃ．１９８３（８０）：７４６６−７４７０。
（実施例４）
（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ Ｍａｎｉｈｏｔｉｓ由来のα１，２−３マンノシダーゼの
同定、クローニングおよび発現）
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ Ｍａｎｉｈｏｔｉｓ由来のα１，２−３マンノシダーゼは、
２つの活性（α−１，２マンノシダーゼおよびα−１，３ マンノシダーゼ）を有する。
本発明の方法はまた、これらの活性を有する２つの独立したマンノシダーゼを使用し得、
これらは、選択された目的の生物から同様に同定およびクローニングされ得る。
Ｌａｎｄｒｙら、によって記載されるように、α−マンノシダーゼは、Ｘａｎｔｈｏｍ
ｏｎａｓ ｓｐ．（例えば、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｓ）から精製さ
れ得る。Ｘ．ｍａｎｉｈｏｔｉｓは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣカタログ番号４９７６４）（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａ
ｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ＳｔａｒｒおよびＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｓ
（Ａｒｔｈａｕｄ−Ｂｅｒｔｈｅｔ）Ｓｔａｒｒとして寄託されたＧａｒｃｅｓ ｐａｔ
ｈｏｖａｒ ｍａｎｉｈｏｔｉｓ）から購入され得る。酵素を、粗細胞抽出物から、以前
に記載されたように精製する（Ｗｏｎｇ−Ｍａｄｄｅｎ，Ｓ．Ｔ．およびＬａｎｄｒｙ，
Ｄ．（１９９５）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏ
ｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉ
ａｌ ｇｅｎｕｓ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ；およびＬａｎｄｒｙ，Ｄ．米国特許第６，
３００，１１３ Ｂ１号、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ
ｎｏｖｅｌ Ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅｓ）。マンノシダーゼの精製後、いくつかの方法
のうちの１つを使用して、ペプチド配列タグを得る（例えば、Ｗ．Ｑｕａｄｒｏｎｉ Ｍ
ら、（２０００）．Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｇｅｎｅｒ
ａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ
ｓ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ａｎａｌ
Ｃｈｅｍ（２０００）Ｍａｒ １；７２（５）：１００６−１４；Ｗｉｌｋｉｎｓ ＭＲ
ら、Ｒａｐｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ Ｎ−ｔ
ｅｒｍｉｎａｌ”ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ”ａｎｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎａｌ
ｙｓｉｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９６）Ａｐ
ｒ ２５；２２１（３）：６０９−１３；およびＴｓｕｇｉｔａ Ａ．（１９８７）Ｄｅ
ｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｃｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ａｄ
ｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ（１９８７）２３：８１−１１３を参照のこと）。
次いで、上記方法を使用して作製された配列タグを使用して、当業者に周知の方法を使
用して、縮重プライマーのセットを作製する。縮重プライマーを使用して、ポリメラーゼ
連鎖反応（例えば、Ｔａｑポリメラーゼキットを、製造者の指示に従って使用する）にお
いてＤＮＡ増幅をプライムして、ＤＮＡフラグメントを増幅する。増幅されたＤＮＡフラ
グメントをプローブとして使用して、例えば、目的の酵素をコードするゲノム片を同定お
よび単離（クローニング）するための、標準的なサザンＤＮＡハイブリダイゼーション技
術を使用して、所望のマンノシダーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ分子を単離する。
ゲノムＤＮＡ分子を配列決定し、推定オープンリーディングフレームおよびコード配列を
同定する。次いで、目的のグリコシダーゼをコードする適切な発現構築物を、本明細書中
に記載される方法および当該分野で周知の方法を使用して、作製し得る。
α１，２−３ マンノシダーゼ活性（またはその触媒的に活性なフラグメント）をコー
ドする配列を含む核酸フラグメントを、本明細書中に示される方法に従って、適切な宿主
細胞でのこれらの活性の発現（好ましくは、標的化された発現）のために、適切な発現ベ
クター中にクローニングする。
（実施例５）
（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＡＬＧ６遺伝子の同定、クローニング、および発現）
実施例１と同様に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉａ ｍｅｌａｎｏｇ
ａｓｔｅｒ、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓなどに由来するＡＬＧ６ｐ配列を整列し、、そし
て高い相同性の領域を変性プライマーを産生するために使用する。これらのプライマーは
、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ由来のゲノムＤＮＡにおけるＰＣＲ反応に用いられる。得られた
初めのＰＣＲ産物をサブクローン化し、配列を決定して、そして高ストリンジェンシーを
有するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ由来のゲノムＤＮＡのサザンブロットのプローブとして使用
する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）。ハイブリダイゼーションが観察される。このサ
ザンブロットを、ゲノム座位をマップするために使用する。ゲノムＤＮＡを消化し、そし
てそれらのフラグメントを、適切なサイズ範囲で、ｐＵＣ１９中にライゲーションして、
ゲノムフラグメントをクローン化することで、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓサブゲノムライブラ
リーを産生する。このサブゲノムライブラリーを、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換し、そして、
初めのＰＣＲ産物の配列に基づいて設計されたプライマーを用いて、コロニーＰＣＲによ
って、数百クローンをテストする。予想した遺伝子を含むクローンの配列を決定し、そし
てオープンリーディングフレームを同定する。ＰＣＲ重複法（Ｄａｖｉｄｓｏｎら、２０
０２）を用いて、ａｌｇ６：：ＮＡＴＲ欠失アレルの構築のためのプライマーを設計し、
その結果得られた欠失対立遺伝子を２つのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株および選択されたＮＡ
Ｔ抵抗性コロニー中に形質転換した。これらのコロニーを、ＰＣＲによってスクリーニン
グし、ＡＬＧ６ ＯＲＦが，ｏｃｈ１：：ＮＡＴＲ変異対立遺伝子に置換される形質転換
体を得る。例えば、Ｉｍｂａｃｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
Ｊｕｎｅ １９９９（９６）６９８２−６９８を参照のこと。
Ａｌｇ６ｐ（またはその触媒活性フラグメント）をコ−ドする配列を含む核酸フラグメントが、本明細書中に記載された方法で、適切な宿主細胞におけるこれらの活性の発現および、好ましくは標的発現のための適切な発現ベクター中にクローン化する。クローン化ＡＬＧ６遺伝子は、任意の適切なプロモーターの制御で得られ、過剰発現を達成し得る。その遺伝子自体のプロモーターの制御下にある遺伝子の発現さえも可能である。マルチコピープラスミドの発現は、高レベルの発現（「過剰発現」）を生じる。
（実施例６）
（抗体機能性を高める分岐したＧｌｃＮＡｃｓを産生するためのＧｎＴＩＩＩのクローニングおよび発現）
（Ａ．背景）
Ｎ−アセチルグルコサミルトランスフェラーゼＩＩＩによるＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造へのＮ−アセチルグルコサミンの付加によって、いわゆる分岐したＮグリカンを生じる（図３を参照のこと）。この構造は、より大きな抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）に関係する（Ｕｍａｎａら、１９９９）。
宿主細胞（例えば、分岐したＮグリカンを用いて糖タンパク質を産生できる酵母株）は、宿主細胞中にＧｎＴＩＩＩ活性を導入することによって、本発明に従って操作される。好ましくは、宿主細胞は、異種の細胞シグナル標的ペプチドに（例えば、本発明のライブラリーおよび関連した方法を使用して必要に応じて融合されたＧｎＴＩＩＩ活性（例えば、図３２に示したマウスＧｎＴＩＩＩのような哺乳動物）またはその酵素活性を有するドメインコードする核酸を用いて、形質転換される。
ＩｇＧは、３つのジスルフィド架橋を介するヒンジ領域で相互結合した、２つの重鎖（
図３０におけるＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）、および２つの軽鎖（図３０におけ
るＶＬ、ＣＬ）からなる。軽鎖（ドメインＶＬおよびドメインＣＬ）は、別のジスルフィ
ド架橋によって、重鎖のＣＨ１部分に結合し、そしてＣＨ１フラグメントおよびＶＨフラ
グメントと一緒になって、いわゆるＦａｂ領域を形成する。抗原は、Ｆａｂ領域の末端部
分に結合する。ＩｇＧのＦｃ領域は、ＣＨ３、ＣＨ２およびヒンジ領域からなり、いわゆ
るエフェクター機能の発揮に関連する（下記を参照のこと）。
抗体の第１機能は抗原との結合である。しかし、抗原との結合が、その抗原を直接的に不活化しない限り（例えば、細菌毒素の場合）、いわゆるエフェクター機能が増強されなければ、単なる結合は意味を成さない。ＩｇＧサブクラスの抗体は、以下の２つの主要なエフェクター効果を発揮する：補体系の活性化および貪食作用の導入。補体系は、貪食作用の活性化および細胞膜の溶解による破壊において、炎症の制御に関係する血清タンパク質の複雑な群からなる。補体活性化は、Ｃ１複合体の近接した２つのＩｇＧのＦｃ部分との結合で開始する。Ｃ１は、１つの分子（Ｃ１ｑ）および２つの分子（Ｃ１ｒおよびＣ１ｓ）からなる。貪食作用は、ＩｇＧのＦｃフラグメントとＦｃ−γ−レセプター（図３０におけるＦｃγＲＩ、ＩＩおよびＩＩＩ）との間における相互作用を介して起こる。Ｆｃレセプターは、第１に免疫システムのエフェクター細胞表面、特にマクロファージ、単核細胞、骨髄細胞および樹状細胞の表面に、主に発現する。
ＣＨ２部分は、アスパラギン２９７（Ａｓｐ２９７）における保存されたＮグリコシレーション部位を有する。Ａｓｐ２９７ Ｎグリカンは、高度に異種性であり、Ｆｃレセプター結合および補体活性に影響することが知られている。ＩｇＧの少数のみ（すなわち、約１５％〜２０％）が、ジシアリル化を受け、そしてＩｇＧの３％〜１０％がモノシアリル化したＮグリカンを有する（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，Ｒ．，Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ＢｉｏＯｈｒａ，２００１の総説を参照のこと）。興味深いことに、補体活性およびＦｃレセプター結合が可能な十分機能的な抗体にとって必要であることが示された最小のＮグリカン構造は、末端Ｎアセチルグルコサミン残基（ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３）を有する五単糖類である（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，Ｒ．，Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． ＢｉｏＰｈａｒｍ，２００１の総説を参照のこと）。ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３Ｎグリカン以下またはＡｓｐ２９７の位置にＮグリコシル化を有さない抗体は、それでも抗原と結合することが可能なようであるが、重要な下流の作用（例えば、貪食作用および補体活性化）を活性化しない可能性がある。さらに、Ａｓｐ２９７に結合した真菌型のＮグリカンを有する抗体は、おそらく哺乳動物において免疫応答を誘導し、治療的糖タンパク質としてその抗体を役に立たないものにする。
（Ｂ．ＧｎＴＩＩＩのクローニングおよび発現）
ＴＭドメインを欠くマウスＧｎＴＩＩＩタンパク質の一部をコードするＤＮＡフラグメ
ントは、以下のプライマーを用いて、マウス（あるいは他の哺乳動物）のゲノムＤＮＡか
らＰＣＲ増幅される：順方向 ５’−ＴＣＣＴＧＧＣＧＣＧＣＣＴＴＣＣＣＧＡＧＡＧＡ
ＡＣＴＧＧＣＣＴＣＣＣＴＣ−３’および５’−ＡＡＴＴＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＡＧＣＣ
ＣＴＣＣＧＣＴＧＴＡＴＣＣＡＡＣＴＴＧ−３’逆方向プライマー。それらのプライマー
は、リーダーライブラリーとの融合に適したベクターへのクローニングに使用されるＡｓ
ｃＩおよびＰａｃＩ制限部位を含む。マウスＧｎＴＩＩＩの核酸配列およびアミノ酸配列
を。図３２に示す。
（Ｃ．免疫グロブリンコード配列のクローニング）
抗体の可変領域（プライマー配列を含む）のクローニングのためのプロトコルは、以前
公開されている。抗体およびコ−ド遺伝子の供給源は、とりわけ、インビトロ免疫化ヒト
Ｂ細胞（例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｃｋ，Ｃ．Ａ．ら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５，３９９５−３９９９、末梢血リンパ球細胞または単一ヒト
Ｂ細胞（例えば、Ｌａｇｅｒｋｖｉｓｔ，Ａ．Ｃら（１９９５） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ １８，８６２−８６９；およびＴｅｒｎｅｓｓ，Ｐ．ら（１９９７） Ｈｕｍ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．５６，１７−２７を参照のこと）またはハイブリドーマ細胞株の産生
を可能にする、ヒト免疫グロブリン部位を含むトランスジェニックマウスであり得る。
標準的な組み換えＤＮＡ技術を用いて、抗体をコードする核酸配列がクローン化され得
る。目的の免疫グロブリンをコードする遺伝情報の供給源は、代表的に、目的の細胞（例
えば、血液リンパ球細胞またはハイブリドーマ細胞株）由来の総ＲＮＡ調製物である。例
えば、特異的プライマーを用いたプロトコルに基づいたＰＣＲを用いて、可変領域は、Ｉ
ｇＧＣＨ１ドメインとハイブリダイズする配列特異的プライマー、およびマウスκ定常領
域のアミノ酸１１１〜１１８をコードする第２プライマーから開始される逆転写を解して
クローン化され得る。さらに、ＤＮＡをコードするＶＨおよびＶｋは、以前公開された方
法で増幅される（例えば、Ｇｒａｚｉａｎｏ，Ｒ．Ｆら、（１９９５） Ｊ Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ． １５５（１０）：ｐ．４９９６−５００２；Ｗｅｌｓｃｈｏｆ，Ｍら（１９９５
） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １７９，２０３−２１４；および Ｏｒ
ｌａｎｄｉ，Ｒら（１９８８ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：
３８３３）を参照のこと）。全免疫グロブリンのクローニング手順（重鎖および軽鎖）も
また公開されている（例えば、Ｂｕｃｋｅｌ，Ｐ．ら（１９８７） Ｇｅｎｅ ５１：１
３−１９；Ｒｅｃｉｎｏｓ Ａ３ｒｄら（１９９４） Ｇｅｎｅ １４９：３８５−３８
６；（１９９５） ＧｅｎｅＪｕｎ ９；１５８（２）：３１１−２；および Ｒｅｃｉ
ｎｏｓ Ａ３ｒｄら（１９９４） Ｇｅｎｅ Ｎｏｖ １８；１４９（２）３８５−６を
参照のこと）。抗体フラグメントおよび抗体発現構築物のクローニングおよび産生のさら
なるプロトコルは、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｒ．Ｋｏｎｔｅｒｍａ
ｎｎおよびＳ． Ｄｕｂｅｌ（２００１），Ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒ
ｌａｇ：Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。
免疫グロブリンの重鎖および軽鎖をコードする真菌発現プラスミドは、記載されている
（例えば、Ａｂｄｅｌ−Ｓａｌａｍ，Ｈ．Ａ．ら（２００１）Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ５６：１５７−１６４；および Ｏｇｕｎｉｊｉｍｉ
，Ａ．Ａら（１９９９） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２１：５６１
−５６７を参照のこと）。従って、免疫グロブリンの定常領域を有する発現プラスミドを
産生し得る。
これらの発現ベクター中への可変領域のクローニングを促進するために、適切な制限部位
が可変領域の末端に非常に近い位置に配置され得る。定常領域は、単一制限酵素消化／ラ
イゲーション実験によって定常領域にインフレームで融合するような様式で、可変領域を
構築され得る。図３１は、そのような発現構築の体系的概要を示す。その発現構築は、プ
ロモーター、転写ターミネーター、組込み標的ドメイン、および選択マーカーさえも容易
に変更できるように、非常に修正可能な方法で設計された。
図３１に示すように、選択したＶＬドメインおよびＶＨドメインは、それぞれ、ＣＬ領
域およびＣＨ領域に、インフレームで容易にクローン化され得る。第１の組込みは、Ｐ．
ｐａｓｔｏｒｉｓ ＡＯＸ部位（または別の真菌細胞の相同部位）に標的化され、そして
メタノール誘導性ＡＯＸプロモーターは発現を誘導する。あるいは、任意の他の所望の構
成的または誘導的プロモーターカセットが使用され得る。このように、所望の場合、５’
ＡＯＸ領域および３’ＡＯＸ領域、ならびに転写ターミネーター（ＴＴ）フラグメントが
、異なったＴＴ、プロモーターおよび組込み標的ドメインで容易に置換され、発現を最適
化し得る。第１に、標準ＫＥＸプロテアーゼ部位を有するα因子分泌シグナルは、重鎖お
よび軽鎖の分泌を促進するために使用される。さらに、発現ベクターの特性は、標準技術
を用いてさらに精製され得る。
Ｉｇ発現ベクター（例えば、上述のベクター）は、好ましくは宿主細胞のゴルジ装置内にＧｎＴＩＩＩを発現する本発明の宿主細胞中に導入される。そのような宿主細胞において発現されるＩｇ分子は、分岐したＧｌｃＮａｃｓを有するＮグリカンを含む。
（実施例７）
ＧｎＴ−ＩＶ（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ：α−１，３−Ｄ−マンノシドβ−１，４−Ｎ−
アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＶ）およびＧｎＴ−Ｖ（β−１−６−Ｎ−
アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼのクローニングおよび発現）
ＧｎＴＩＶをコードするｃＤＮＡを、ウシおよびヒト細胞から単離した（Ｍｉｎｏｗａ
、Ｍ．Ｔ．ら（１９９８） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（１９），１１５５６−１
１５６２；）およびＹｏｓｈｉｄａ，Ａ．ら（１９９９） Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ
９（３），３０３−３１０）。ＴＭドメインを欠くヒトＧｎＴ−ＩＶタンパク質（図３３
）の全長および一部をコードするＤＮＡフラグメントを、各々以下のプライマーを用いて
、ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ増幅した：順方向 ５’−ＡＡＴＧＡＧＡＴＧＡＧＧ
ＣＴＣＣＧＣＡＡＴＧＧＡＡＣＴＧ−３’，
５’−ＣＴＧＡＴＴＧＣＴＴＡＴＣＡＡＣＧＡＧＡＡＴＴＣＣＴＴＧ−３’，および逆方
向５’−ＴＧＴＴＧＧＴＴＴＣＴＣＡＧＡＴＧＡＴＣＡＧＴＴＧＧＴＧ−３’プライマー
。
その結果生じるＰＣＲ産物をクローン化し、配列を決定した。
同様に、ＧｎＴ−Ｖたんぱく質をコードする遺伝子は、いくつかの哺乳動物（マウスを
含む）から単離された（例えば、Ａｌｖｅｒｅｚ，Ｋら Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １
２（７），３８９−３９４（２００２）を参照のこと）。ＴＭドメインを欠くマウスＧｎ
Ｔ−Ｖたんぱく質（図３４）の全長および一部をコードするＤＮＡフラグメントを、各々
以下のプライマーを用いて、ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ増幅した：順方向５’−Ａ
ＧＡＧＡＧＡＧＡＴＧＧＣＴＴＴＣＴＴＴＴＣＴＣＣＣＴＧＧ−３’，５’−ＡＡＡＴＣ
ＡＡＧＴＧＧＡＴＧＡＡＧＧＡＣＡＴＧＴＧＧＣ−３’、および逆方向
５’−ＡＧＣＧＡＴＧＣＴＡＴＡＧＧＣＡＧＴＣＴＴＴＧＣＡＧＡＧ−３プライマー。’
その結果生じるＰＣＲ産物をクローン化し、配列を決定した。
ＧｎＴ ＩＶまたはＶ（またはその触媒活性フラグメント）をコードする配列を含む核
酸フラグメントは、本明細書中に記載された方法で、適切な宿主細胞におけるこれらの活
性の発現および、好ましくは標的発現のための適切な発現ベクター中にクローン化する。
図１は、ドリチルピロホスフェート結合オリゴ糖の構造の概略図を示す。 図２は、ａｌｇ３活性、ａｌｇ９活性またはａｌｇ１２活性を欠く真菌宿主細胞由来のＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンの生成の概略図を示す。 図３は、ａｌｇ３、ｏｃｈ１遺伝子型を有する真菌宿主細胞中の哺乳動物型のオリゴ糖構造を生成するために要求されるプロセッシング反応の概略図を示す。 図４は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａｌｇ３配列比較（Ｂｌａｓｔ）を示す。 図４は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａｌｇ３配列比較（Ｂｌａｓｔ）を示す。 図４は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａｌｇ３配列比較（Ｂｌａｓｔ）を示す。 図４は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａｌｇ３配列比較（Ｂｌａｓｔ）を示す。 図５は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａｌｇ３およびＡｌｇ３ｐ配列を示す。 図６は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ Ａｌｇ３およびＡｌｇ３ｐ配列を示す。 図７は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ Ａｌｇ３配列比較（Ｂｌａｓｔ）を示す。 図７は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ Ａｌｇ３配列比較（Ｂｌａｓｔ）を示す。 図７は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ Ａｌｇ３配列比較（Ｂｌａｓｔ）を示す。 図８は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ Ａｌｇ３およびＡｌｇ３ｐ配列を示す。 図９は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ Ａｌｇ３配列比較（Ｂｌａｓｔ）を示す。 図１０は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａｌｇ９およびＡｌｇ９ｐ配列を示す。 図１１は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ Ａｌｇ９およびＡｌｇ９ｐ配列を示す。 図１２は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ Ａｌｇ９配列比較（Ｂｌａｓｔ）を示す。 図１２は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ Ａｌｇ９配列比較（Ｂｌａｓｔ）を示す。 図１３は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａｌｇ１２およびＡｌｇ１２ｐ配列を示す。 図１４は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ Ａｌｇ１２およびＡｌｇ１２ｐ配列を示す。 図１５は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ Ａｌｇ１２配列比較（Ｂｌａｓｔ）を示す。 図１５は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ Ａｌｇ１２配列比較（Ｂｌａｓｔ）を示す。 図１６は、優位なＮ−グリカンが、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２であることを示すＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ中に生成されるｋｒｉｎｇｌｅ３糖タンパク質から単離されるＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である。 図１７は、図１６の優位なＮ−グリカンが、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２であること確認するために、β−Ｎ−ヘキサミニダーゼ（Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に一致するピーク）を用いて処理されるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（図１６）中に生成されるｋｒｉｎｇｌｅ３糖タンパク質から単離されるＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である。 図１８は、優位なＮ−グリカンが、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＧｌｃＮＡｃＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２であること示すＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ａｌｇ３欠損変異体中に生成されるｋｒｉｎｇｌｅ３糖タンパク質から単離されるＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である。 図１９は、図１８のＧｌｃＮＡｃＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２が、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に変換されることを示す、α１，２マンノシダーゼを用いて処理されるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ａｌｇ３欠損変異体中に生成されるｋｒｉｎｇｌｅ３糖タンパク質から単離されるＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である。 図２０は、図１９のＮ−グリカンが、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２であること確認するために、β−Ｎ−ヘキサミニダーゼ（Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に一致するピーク）を用いて処理される図１９のＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である。 図２１は、図１９のＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２が、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に変換されることを示す、α１，２マンノシダーゼおよびＧｎＴＩＩを用いて処理されるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ａｌｇ３欠損変異体中に生成されるｋｒｉｎｇｌｅ３糖タンパク質から単離されるＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である。 図２２は、図２１のＮ−グリカンが、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２であること確認するために、β−Ｎ−ヘキサミニダーゼ（Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に一致するピーク）を用いて処理される図２１のＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である。 図２３は、図２１のＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２が、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に変換されることを示す、α１，２マンノシダーゼおよびＧｎＴＩＩを用いて、ＵＤＰ−ガラクトースおよびβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの存在下で処理されるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ａｌｇ３欠損変異体中に生成されるｋｒｉｎｇｌｅ３糖タンパク質から単離されるＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である。 図２４は、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２が、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に変換されることを示す、α１，２マンノシダーゼおよびＧｎＴＩＩを用いて、ＵＤＰ−ガラクトースおよびβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの存在下で処理され、さらにＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸およびシアリルトランスフェラーゼを用いて処理される、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ａｌｇ３欠損変異体中に生成されるｋｒｉｎｇｌｅ３糖タンパク質から単離されるＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である。 図２５は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡｌｇ６配列およびＡｌｇ ６ｐ配列を示す。 図２６は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＡｌｇ６配列およびＡｌｇ ６ｐ配列を示す。 図２７は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ Ａｌｇ ６配列の比較（Ｂｌａｓｔ）を示す。 図２７は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ Ａｌｇ ６配列の比較（Ｂｌａｓｔ）を示す。 図２７は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ Ａｌｇ ６配列の比較（Ｂｌａｓｔ）を示す。 図２７は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ Ａｌｇ ６配列の比較（Ｂｌａｓｔ）を示す。 図２８は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓのＡｌｇ６配列およびＡｌｇ ６ｐ配列を示す。 図２９は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ Ａｌｇ ６配列の比較（Ｂｌａｓｔ）を示す。 図２９は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ Ａｌｇ ６配列の比較（Ｂｌａｓｔ）を示す。 図３０ ＩｇＧ免疫グロブリンのモデル。重鎖および軽鎖は、類似の二次構造および三次構造に基づいて、ドメインに細分される。２つの重鎖（ドメインＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）は、３つのジスルフィド架橋により連結される。軽鎖（ドメインＶＬおよびＣＬ）は、別のジスルフィド架橋により重鎖のＣＨ１部分に連結され、そしてＣＨ１フラグメントおよびＶＨフラグメントと共に、Ｆａｂ領域を構成する。抗原は、Ｆａｂ領域の末端部分に結合する。エフェクター機能（例えば、Ｆｃ−γ−レセプター結合）は、ヒンジ領域の直ぐ下流のＣＨ２ドメインに局在化し、そして重鎖におけるアスパラギン２９７のＮ−グリコシル化により影響を受ける。 図３１は、モジュラーＩｇＧ１発現ベクターの模式図である。 図３２は、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｉｓ ＧｎＴ ＩＩＩの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。 図３３は、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ ＧｎＴ ＩＶの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。 図３４は、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｉｓ ＧｎＴ Ｖの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。

Claims (42)

  1. α−１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性を欠く酵母宿主細胞または繊維状真菌宿主細胞において組換え糖タンパク質を産生するための方法であって、該方法は、
    ドリチル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリチルα−１，３マンノシルトランスフェラーゼの活性が減退または減少された宿主細胞に、
    （ｉ）宿主細胞中の小胞体（ＥＲ）またはゴルジ装置を標的とする標的ペプチドがＮ末端で融合したα−１，２−マンノシダーゼ触媒ドメイン、
    （ｉｉ）宿主細胞中のＥＲまたはゴルジ装置を標的とする標的ペプチドがＮ末端で融合したＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴ Ｉ）触媒ドメイン、および
    （ｉｉｉ）組換え糖タンパク質
    をコードする１以上の核酸分子を導入する工程を包含し、
    この方法によって生じる宿主細胞内で産生された組換え糖タンパク質は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎＸＧｌｃＮＡｃ２（式中、Ｘは３または４である）のコア構造を結合したＮ−グリカンを有する、前記方法。
  2. 請求項１に記載の方法であって、前記宿主細胞内でＧｎＴ ＩＩ活性をコードする核酸を発現させて、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖質構造を作製する工程をさらに包含する、方法。
  3. 請求項２に記載の方法であって、前記宿主細胞内でガラクトシルトランスフェラーゼ活性をコードする核酸を発現させて、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖質構造を作製する工程をさらに包含する、方法。
  4. 請求項２に記載の方法であって、前記宿主細胞内でガラクトシルトランスフェラーゼ活性をコードする核酸を発現させて、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖質構造を作製する工程をさらに包含する、方法。
  5. 請求項１に記載の方法であって、前記宿主が、ドリチル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリチルα−１，２マンノシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素、およびドリチル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリチルα−１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素からなる群より選択される少なくとも１種の減退または減少された酵素をさらに含む、方法。
  6. 前記酵素は、該酵素活性をコードする宿主細胞遺伝子の変異によって減退されるかまたは減少される、請求項１に記載の方法。
  7. 前記変異は、前記酵素活性をコードする宿主細胞遺伝子の部分的な欠損または全体的な欠損である、請求項６に記載の方法。
  8. 前記糖タンパク質は、ガラクトース、ＧｌｃＮＡｃ、シアル酸、およびフコースからなる群より選択される１種以上の糖を含む、請求項１に記載の方法。
  9. 前記糖タンパク質は、構造ＮｅｕＮＡｃ−Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎを含む少なくとも１つのオリゴ糖分枝を含む、請求項１に記載の方法。
  10. 請求項１に記載の方法であって、前記宿主細胞は、以下：Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、 Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ、 Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、 Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａからなる群より選択される、方法。
  11. 前記宿主細胞は、開始α−１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性の発現をさらに欠損している、請求項１に記載の方法。
  12. 前記宿主細胞は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＯＣＨ１変異体である、請求項１に記載の方法。
  13. 前記宿主細胞は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター活性をさらに発現する、請求項１に記載の方法。
  14. 前記宿主細胞は、ＵＤＰ特異的ジホスファターゼ活性またはＧＤＰ特異的ジホスファターゼ活性をさらに発現する、請求項１に記載の方法。
  15. 前記宿主から前記糖タンパク質を単離する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
  16. 請求項１５に記載の方法であって、宿主から糖タンパク質を単離した後に、インビトロにおいて、前記単離された糖タンパク質を、少なくとも１種のさらなるグリコシル化反応に供する工程をさらに包含する、方法。
  17. 請求項１に記載の方法であって、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖質構造の産生に関与する１種以上のグリコシル化酵素をコードする核酸分子を、前記宿主に導入する工程をさらに包含する、方法。
  18. 請求項１に記載の方法であって、前記α−１，２−マンノシダーゼ活性は、マウス、ヒト、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ、 Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、またはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．に由来する、方法。
  19. 前記宿主細胞は、α−１，３−マンノシダーゼ活性をコードする核酸分子をさらに有する、請求項１に記載の方法。
  20. 前記少なくとも１種のグリコシル化酵素は、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する、請求項１７に記載の方法。
  21. 前記グリコシルトランスフェラーゼ活性は、ＧｎＴ ＩおよびＧｎＴ ＩＩからなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記少なくとも１種の酵素は、該酵素の触媒ドメインと細胞標的シグナルペプチドとの間で融合タンパク質を形成することによって局在化される、請求項１または１７に記載の方法。
  23. 請求項２２に記載の方法であって、前記融合タンパク質は、少なくとも１つの遺伝子構築物によってコードされ、該遺伝子構築物は、細胞標的シグナルペプチドをコードするＤＮＡフラグメントと、グリコシル化酵素またはその触媒活性フラグメントをコードするＤＮＡフラグメントとのインフレームでの結合によって形成される、方法。
  24. 請求項２２に記載の方法であって、前記コードされた標的シグナルペプチドは、マンノシルトランスフェラーゼ、ジホスファターゼ、プロテアーゼ、ＧｎＴ Ｉ、ＧｎＴ ＩＩ、ＧｎＴ ＩＩＩ、ＧｎＴ ＩＶ、ＧｎＴ Ｖ、ＧｎＴ ＶＩ、ＧａｌＴ、ＦＴ、およびＳＴからなる群のメンバーに由来する、方法。
  25. 請求項２２に記載の方法であって、前記触媒ドメインは、ＧｎＴ Ｉ、ＧｎＴ ＩＩ、ＧｎＴ ＩＩＩ、ＧｎＴ ＩＶ、ＧｎＴ Ｖ、ＧｎＴ ＶＩ、ＧａｌＴ、フコシルトランスフェラーゼおよびＳＴからなる群のメンバーに由来する、グリコシダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼをコードし、かつ該触媒ドメインは、細胞小器官内の他の代表的な酵素の平均最適ｐＨの、１．４ｐＨ単位内に最適ｐＨを有し、該細胞小器官において、該酵素は、局在化されるか、または該触媒ドメインは、５．１と８．０との間のｐＨにて最適な活性を有する、方法。
  26. 請求項２２に記載の方法であって、前記核酸分子は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ−フコシルトランスフェラーゼ、ＣＭＰ−シアリルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター、ＵＤＰ−ガラクトーストランスポーター、ＧＤＰ−フコーストランスポーター、ＣＭＰ−シアル酸トランスポーター、およびヌクレオチドジホスファターゼからなる群より選択される１種以上の酵素をコードする、方法。
  27. 前記宿主は、ＧｎＴ Ｉ活性およびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター活性を発現する、請求項２２に記載の方法。
  28. 前記宿主は、ＵＤＰ特異的ジホスファターゼ活性またはＧＤＰ特異的ジホスファターゼ活性を発現する、請求項２２に記載の方法。
  29. 前記宿主細胞が、α−１，２マンノシダーゼ、ＵＤＰ ＧｌｃＮＡｃトランスポーターおよびＧｎＴ Ｉからなる群より選択される少なくとも１種の酵素をコードする核酸分子をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  30. 請求項１に記載の方法であって、前記欠損している宿主細胞に、ＧｌｃＮＡｃ１Ｍａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２構造をＧｌｃＮＡｃ１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造に転換するためのα−１，３マンノシダーゼ活性またはα−１，２／α−１，３マンノシダーゼ活性をコードする核酸分子を導入する工程をさらに包含する、方法。
  31. 請求項１に記載の方法であって、前記宿主に、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖質構造を作製するための１種以上の酵素をコードする核酸分子を導入する工程をさらに包含する、方法。
  32. 前記少なくとも１種の酵素は、ＧｎＴ ＩＩである、請求項３１に記載の方法。
  33. 請求項１に記載の方法であって、前記宿主細胞に、グリコシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼおよびスルホトランスフェラーゼからなる群より選択される少なくとも１種の哺乳動物グリコシル化酵素をコードする少なくとも１種の核酸分子を導入する工程をさらに包含する、方法。
  34. 請求項１に記載の方法であって、該方法は、宿主細胞をＤＮＡライブラリーで形質転換して、該ライブラリーから誘導された少なくとも１種のグルコシル化酵素を発現する、遺伝学的に混合された細胞集団を作製する工程を包含し、該ライブラリーは、少なくとも２つの異なる遺伝子構築物を含み、該構築物のうちの少なくとも一方は、細胞標的シグナルペプチドをコードするＤＮＡフラグメントを含み、該細胞標的シグナルペプチドは、グリコシル化酵素またはその触媒活性フラグメントをコードするＤＮＡフラグメントと、インフレームで結合される、方法。
  35. α−１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性を欠く酵母宿主細胞または繊維状真菌宿主細胞であって、該細胞は、ドリチル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリチルα−１，３マンノシルトランスフェラーゼの活性が減退または減少しており、さらに、
    （ｉ）宿主細胞中の小胞体（ＥＲ）またはゴルジ装置を標的とする標的ペプチドがＮ末端で融合したα−１，２−マンノシダーゼ触媒ドメイン、
    （ｉｉ）宿主細胞中のＥＲまたはゴルジ装置を標的とする標的ペプチドがＮ末端で融合したＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴ Ｉ）触媒ドメイン、および
    （ｉｉｉ）組換え糖タンパク質
    をコードする１以上の核酸分子を含む、前記宿主細胞。
  36. 請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法によって産生される単離されたヒト様糖タンパク質であって、該糖タンパク質は、フコースを欠く、ヒト様糖タンパク質。
  37. 請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法によって産生される単離されたヒト様糖タンパク質であって、前記宿主は、酵母細胞または繊維状真菌細胞であり、そして該糖タンパク質は、フコースを欠く、ヒト様糖タンパク質。
  38. 請求項３５に記載の酵母宿主細胞または繊維状真菌宿主細胞において分岐したＧｌｃＮＡｃを有するポリペプチドを産生するための方法であって、該方法は、該宿主細胞内でＧｎＴ ＩＩＩ活性を発現させて、分岐したＧｌｃＮＡｃを有するポリペプチドを作製する工程を包含する、方法。
  39. 前記ポリペプチドが免疫グロブリンであるか、または免疫グロブリンを含む、請求項３８に記載の方法。
  40. ＧｎＴ ＩＩＩ活性を発現し、分岐したＧｌｃＮＡｃを含むＮ−グリカンを有するポリペプチドを産生する、請求項３５に記載の酵母宿主細胞または繊維状真菌宿主細胞。
  41. 前記ポリペプチドが免疫グロブリンである、請求項４０に記載の酵母宿主細胞または繊維状真菌宿主細胞。
  42. 請求項３８に記載の方法または請求項４０に記載の酵母宿主細胞もしくは繊維状真菌宿主細胞によって産生される免疫グロブリン。
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