JP4932699B2 - 真菌および酵母におけるシチジンモノホスフェート−シアル酸合成経路を操作する方法 - Google Patents
真菌および酵母におけるシチジンモノホスフェート−シアル酸合成経路を操作する方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4932699B2 JP4932699B2 JP2007504144A JP2007504144A JP4932699B2 JP 4932699 B2 JP4932699 B2 JP 4932699B2 JP 2007504144 A JP2007504144 A JP 2007504144A JP 2007504144 A JP2007504144 A JP 2007504144A JP 4932699 B2 JP4932699 B2 JP 4932699B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- pichia
- cmp
- host cell
- sialic acid
- sia
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12Y207/07043—N-Acylneuraminate cytidylyltransferase (2.7.7.43)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y501/00—Racemaces and epimerases (5.1)
- C12Y501/03—Racemaces and epimerases (5.1) acting on carbohydrates and derivatives (5.1.3)
- C12Y501/03014—UDP-N-acetylglucosamine 2-epimerase (non-hydrolysing) (5.1.3.14)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
本出願は、2004年3月17日出願の米国仮特許出願第60/554,139号(この開示は、その全体が本明細書に参考として援用される)の利益を主張する。
本発明は、タンパク質のグリコシル化の分野に関する。本発明はさらに、シチジンモノホスフェート−シアル酸(CMP−Sia)経路において活性をコードする遺伝子を含む新規な宿主細胞に関する。この経路は、内因性CMP−Siaを欠く非ヒト宿主細胞における糖タンパク質のシアル化に特に有用である。
シアル酸(Sia)は、ヒトデからヒトにいたるまで、新口動物系統の動物において遍在するN−アセチルノイラミン酸(Neu5Ac)のN−置換型誘導体またはO−置換型誘導体の特有の群である。大部分の植物、原生生物、古細菌(Archaea)および真正細菌を含め、他の生物において、これらの化合物は、存在しないと考えられている(Warren,L.1994)。例外が同定されているものの、それらは全て、特定の細菌、原生動物および真菌を含む病原性生物においてである(Kelm,S.およびSchauer,R.1997)(Parodi,A.J.1993)(Alviano,C.S.,Travassos,L.R.ら,1999)。病原性真菌(Cryptococcus neoformansおよびCandida albicansが挙げられる)が、細胞表面糖タンパク質および糖脂質上でシアル酸を獲得する機構は、未確認のままである(Alviano,C.S.,Travassos,L.R.ら,1999)。しかし、これらの生物がシアル酸なしの培地中で増殖される場合、シアル酸残基は、細胞グリカンに見出されることが実証されている。このことは、シアル酸のデノボ合成を示唆している。これまで、シアル酸の生合成に関与する酵素は、真菌において同定されていなかった。原生動物が細胞表面グリカンをシアル化する機構は、十分に特徴づけられた。原生動物(例えば、Trypanosoma cruzi)は、CMP−Sia非依存性の機構で、シアル酸を細胞表面糖タンパク質および糖脂質に付加する外部のトランス−シアリダーゼを有する(Parodi,AJ.1993)。真菌における類似のトランス−シアリダーゼの同定は、細胞グリカンへのシアル酸転移の機構を解明する一助となるが、このようなタンパク質は、未だ同定されておらず、単離もされていない。
機能的CMP−シアル酸(CMP−Sia)生合成経路を、内因性CMP−Siaを欠く非ヒト宿主細胞(例えば、真菌宿主細胞)の中に遺伝子工学で作る方法が提供される。この方法は、哺乳動物起源、細菌起源またはその両方のいくつかの酵素を、宿主細胞(特に真菌宿主細胞)においてクローニングおよび発現することを包含する。この遺伝子工学で作られたCMP−Sia生合成経路は、シアル化糖脂質、シアル化O−グリカンおよびシアル化N−グリカンをインビボで生成するために有用である。よって、本発明は、内因性シアル化を欠く非ヒト宿主細胞(例えば、真菌宿主細胞)においてシアル化治療用糖タンパク質の生成を容易にするために有用である。
本発明は、CMP−Siaの細胞プールを含む組換え非ヒト宿主細胞を包含し、ここで該宿主細胞は、内因性CMP−Siaを欠いている。一実施形態において、このCMP−Siaは、Neu5Ac、N−グリコリルノイラミン酸(Neu5Gc)、およびケト−3−デオキシ−D−グリセロ−D−ガラクト−ノノン酸(KDN)から選択されるシアル酸を含む。
本発明はさらに、組換え非ヒト宿主細胞においてCMP−Siaを生成するための方法を包含し、この方法は、CMP−Sia生合成経路を発現する工程を包含する。
一実施形態において、本発明は、組換え糖タンパク質を生成するための方法を提供し、この方法は、内因性CMP−Siaを欠く組換え非ヒト宿主細胞において、CMP−Siaの細胞プールを生成する工程およびこの糖タンパク質をこの宿主において発現させる工程を包含する。一実施形態において、この宿主は、真菌宿主である。
本明細書で別段規定されなければ、本発明に関連して用いられる科学用語および技術用語は、当業者によって通常理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によって別段要求されなければ、単数形は、複数を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。本発明の方法および技術は、一般に、当該分野で周知の従来法に従って行われる。一般に、生化学、酵素学、分子生物学および細胞生物学、微生物学、遺伝学と関連して用いられる命名法およびこれらの技術と、本明細書で記載されるタンパク質および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションは、当該分野で周知でありかつ一般的に用いられているものである。本発明の方法および技術は、一般に、別段示されなければ、当該分野で周知の、そして本明細書全体を通して引用および議論されている種々の総括的な参考文献および具体的な参考文献において記載される、従来の方法に従って行われる。例えば、Sambrook,J.およびRussell,D.W.(2001);Ausubelら,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992,および補遺〜2002);Harlow and Lane Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990);Introduction to Glycobiology,Maureen E.Taylor,Kurt Drickamer,Oxford Univ.Press(2003);Worthington Enzyme Manual,Worthington Biochemical Corp.Freehold,NJ;Handbook of Biochemistry:Section A Proteins Vol I 1976 CRC Press;Handbook of Biochemistry:Section A Proteins Vol II 1976 CRC Press;Essentials of Glycobiology,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1999)を参照のこと。本明細書で記載される生化学および分子生物学と関連して使用される命名法、ならびにこれらの実験手技および技術は周知のものであり、当該分野で通常使用されているものである。
1つ以上のアミノ酸点置換(ある位置の1つのアミノ酸が、別のアミノ酸へと変化されている)、1つ以上の挿入および/または欠失(1つ異常のアミノ酸が、天然に存在するタンパク質の配列においてそれぞれ挿入または欠失されている)、ならびに/あるいはアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかもしくは両方におけるアミノ酸配列の短縮を含み得る。ムテインは、天然に存在するタンパク質と比較して、同じであるが好ましくは異なる生物学的活性を有し得る。
例示的な方法および材料が、下記に記載されるが、本明細書中に記載される方法および材料と類似するかまたは同等であるすべての方法および材料もまた、本発明の実施において使用され得、それらは当業者にとって周知である。本明細書中で言及されるすべての刊行物および他の参考文献は、その全体が参考として援用される。矛盾する場合には、本明細書(定義を含む)が、支配する。上記の材料、方法、および例は、例示に過ぎない。これらは、限定的なものであることは意図されない。
または変化形(例えば、「含んでいる(包含している、含有している)」とは、記載される整数または整数群を含むが他の整数も整数群も排除するわけではないことを意味することが、理解される。
本発明は、内因性CMP−Siaを欠く宿主細胞(例えば、真菌細胞)において機能的CMP−Sia生合成経路を生成するための方法を提供する。本発明はまた、CMP−Sia経路を発現するように改変された宿主を作製するための方法を提供する。本発明は、細胞CMP−Siaプールを含む宿主細胞を作製するための方法をさらに提供する。
本発明の一実施形態において、内因性CMP−Siaを欠く宿主細胞において哺乳動物CMP−シアル酸経路を合成するための方法が、提供される。哺乳動物および高等真核生物において、CMP−シアル酸の合成は、細胞質において開始され、その酵素活性(UDP−N−アセチル−グルコサミン−2−エピメラーゼ/N−アセチルマンノサミンキナーゼ、N−アセチルノイラミネート−9−ホスフェートシンターゼ、N−アセチルノイラミネート−9−ホスファターゼ)がUDP−GlcNAcがシアル酸へと変化させる(図1A)。その後、そのシアル酸は、核に入り、核において、そのシアル酸は、CMP−シアル酸シンターゼによってCMP−シアル酸へと変換される。
代謝中間体であるUDP−GlcNAcは、真核生物および原核生物に共通し、これは、CMP−Siaの合成を開始するための内因性基質である(図1)。この共通中間体の存在に基づいて、上記CMP−Sia生合成経路は、細菌UDP−GlcNAcエピメラーゼをコードする遺伝子、シアル酸シンターゼをコードする遺伝子、およびCMP−Siaシンターゼをコードする遺伝子を組み込むことによって、内因性CMP−Siaを欠く非ヒト宿主細胞中へと操作され得る。従って、本発明の別の局面は、内因性CMP−Sia経路を欠く宿主細胞中へと上記細菌性CMP−Sia生合成経路を操作することを包含する。内因性CMP−Sia生合成経路を欠く細胞における細菌Neu遺伝子の発現は、細胞CMP−Siaプールの生成を可能にする。この細胞CMP−Siaプールは、その後、目的タンパク質(例えば、組換え発現される糖タンパク質)における検出可能なレベルのシアル化を有する組換えN−グリカンの生成を促進し得る。CMP−Siaの合成に関与する上記細菌酵素としては、UDP−GlcNacエピメラーゼ(NeuC)、シアル酸シンターゼ(NeuB)、およびCMP−Siaシンターゼ(NeuA)が挙げられる。一実施形態において、これらの機能的酵素(そのホモログ、改変体、および誘導体を含む)をそれぞれコードするNeuC遺伝子、NeuB遺伝子、およびNeuA遺伝子が、クローニングされ、そして内因性CMP−Sia経路を欠く非ヒト宿主(例えば、真菌宿主)において発現される。NeuC遺伝子、NeuB遺伝子、およびNeuA遺伝子の配列は、図2〜図4においてそれぞれ示される。これらの遺伝子の発現は、CMP−シアル酸の生合成経路における中間体分子を生成する(図1B)。
哺乳動物および細菌の両方のCMP−Sia生合成経路は、CTPおよびシアル酸の両方が、CMP−Siaシンターゼに利用可能であることを必要とする。酵素の機能は対応する細菌酵素に類似するものの、哺乳動物のCMP−Siaシンターゼは、核への正確な局在化を確実にする、1以上の内因性のシグナル伝達モチーフを含み得る。真核生物は、CTPの核局在化プールを有し、そして、原核生物のCMP−Siaシンターゼは、この区画に局在化し得ないので、哺乳動物の酵素および細菌の酵素の両方を組合せたハイブリッドCMP−Sia生合成経路は、非ヒト宿主細胞(例えば、真菌宿主細胞)において、シアル酸およびその中間体を生成するための好ましい方法である。この目的のために、経路は、宿主細胞において操作され得、この操作は、NeuCおよびNeuBの両方、ならびに、哺乳動物のCMP−Siaシンターゼの組み込みを包含する。CMP−Siaシンターゼ酵素は、クローニングされ、そして特徴付けられた、数種の哺乳動物ホモログ(Genbank:AJ006215;配列番号19)(Munster,A.K.,Eckhardt,M.ら、1998)(例えば、マウスCMP−Siaシンターゼを参照のこと)(図5)から選択され得る。好ましくは、宿主細胞は、マウスCMP−Siaシンターゼとの組み合わせたUDP−GlcNAcエピメラーゼ(E.coliのNeuC)およびシアル酸シンターゼ(E.coliのNeuB)で、形質転換される。このハイブリッドCMP−Sia生合成経路で操作された宿主は、ドナー分子であるCMP−Siaの細胞プールを生成する(図12)。1つのより好ましい実施形態において、宿主において発現される酵素の組み合わせは、ドナー分子であるCMP−Siaの生成を亢進する。
本発明のなお別の局面において、CMP−シアル酸生合成の代替的な経路に関与する酵素は、非ヒト宿主細胞(例えば、真菌宿主細胞)において操作される。例えば、中間体が、上に概説した方法のうちの1つの間に制限される場合、代替的な機構を用いてこの中間体を生成する酵素の導入が、CMP−シアル酸またはこの経路に沿ったあらゆる中間体の生成において十分な置換物として機能することが企図される。中間体ManNAcおよびSiaを生成するための実施形態が、本明細書中に記載されるが、このアプローチは、他の中間体を生成するために拡大され得る。さらに、これらの酵素のうちの任意のものは、以前に記載された酵素(すなわち、同じ中間体を生成する酵素)の非存在下、もしくは以前に記載された酵素(すなわち、全体的な生成を亢進することが記載された酵素)の存在下のいずれかで、哺乳動物経路、細菌経路またはハイブリッド経路のいずれかへと組み込まれ得る。
哺乳動物細胞において、CMP−シアル酸の生成は、高度に調節される。CMP−シアル酸は、フィードバックインヒビターとして機能し、UDP−GlcNAcエピメラーゼ/ManNAcキナーゼに作用して、CMP−Siaのさらなる生成を防止する(Hinderlich,S.,Stasche,R.ら、1997)(Keppler,O.T.,Hinderlich,S.ら、1999)。対照的に、細菌のCMP−Sia生合成経路(図1B)は、CMP−Siaの生成を制限する、フィードバック阻害による制御機構を有さないようである(Ringenberg,M.,Lichtensteiger,C.ら、2001)。しかし、E.coliのシアル酸アルドラーゼを、上記の経路の1つに組み込むことにより、平衡バランスに依存して、この酵素が触媒する反応の方向をシフトさせ、こうして、SiaをManNAcへと戻す加水分解を起こす可能性を有し得る。従って、上に概説したようなシアル酸アルドラーゼが関与する方法は、SiaをCMP−Siaへと迅速に変換するCMP−シアル酸シンターゼの存在を仮定すると、この逆反応が生じることを防止する。
本発明の方法は、内因性のCMP−Sia生合成経路がない非ヒト宿主細胞において、CMP−Siaの細胞プールを生成するための、操作された経路を提供する。この経路における各中間体の生成を評価するために、これらの中間体は、検出可能でなければならない。従って、本発明はまた、このような中間体を検出するための方法も提供する。例えば、CMP−Siaの細胞プールを検出するための方法は、実施例10に提供される。現在、細胞内CMP−Siaおよびその前駆体を測定するための方法はほんの少数が文献に記載されている。初期の方法は、ペーパークロマトグラフィーおよびチオバルビツール酸分析を包含し、そして、複雑であり、かつ時間がかかることが見出された(Briles,E.B.,Li,E.ら、1977)(Harms,E.,Kreisel,W.ら、1973)。HPLC(高圧液体クロマトグラフィー)もまた使用されるが、初期の方法は、CMP−Siaの迅速な加水分解をもたらす、酸性の溶出を採用した(Rump,J.A.,Phillips,J.ら、1986)。より近年、パルス電流測定検出と組み合せてアルカリ性の溶出プロトコールを用いる、高性能アニオン交換クロマトグラフィー(HPAEC−PAD)を用いる、より頑強な方法が記載されている(Fritsch,M.,Geilen,CCら、1996)。この方法はまた、CMP−Siaを検出することに加えて、前駆体であるシアル酸も検出し得、従って、これらの化合物のいずれかまたは両方の細胞内での合成を確認するために有用である。
本発明の方法は、特定の宿主(例えば、真菌宿主)におけるコードされるタンパク質の効率的な転写/翻訳のための、塩基組成の最適化と組み合せて行なわれ得る。例えば、真菌宿主に導入されたNeu遺伝子は、細菌起源であるので、塩基対組成を最適化することは必須であり得る。この最適化は、tRNAの細胞内プールが十分であることを確実にするための、コドンの最適化を包含する。外来遺伝子(外来ORF)は、真菌宿主における完全な転写/翻訳に対して有害なモチーフを含み得、従って、より多くの従順な配列(amenable sequence)に対する置換を必要とし得る。導入されたタンパク質の各々の発現は、転写の段階および翻訳の段階の両方で、それぞれ、周知のノザンブロッティング技術およびウェスタンブロッティング技術(Sambrook,J.およびRussell,D.W.,2001)によって、追跡され得る。
別の局面において、本発明は、CMP−Sia生合成経路を促進する活性をコードする遺伝子、プロモーター、ターミネーター、選択マーカーおよび標的化隣接領域(targeting flanking region)を含むベクター(発現ベクターを含む)を提供する。このようなプロモーター、ターミネーター、選択マーカーおよび隣接領域は、当該分野において容易に利用可能である。好ましい実施形態において、各場合におけるプロモーターは、所望の酵素反応の十分な触媒を可能にするために、特定のORFによりコードされるタンパク質の最適な発現を提供するように選択される。この工程は、恒常的であるかまたは誘導性のいずれかであるプロモーターを選択することを必要とし、そして、転写の制御されたレベルを提供する。別の実施形態において、選択されるターミネーターは、転写の十分な終結を可能にする。なお別の実施形態において、使用される選択マーカーは、各ORFに対して固有のものであり、導入されるべきORFの特定の組み合わせを含む真菌株のその後の選択を可能にする。さらなる実施形態において、各融合構築物(プロモーター、ORFおよびターミネーターをコードする)が局在化する遺伝子座は、隣接する領域を選択することにより決定される。本発明は、本明細書中に開示されるベクターの使用に制限されない。
宿主細胞の染色体に複数の遺伝子を組み込むことが必要とされる可能性があり、これは、思慮深い戦略を必要とする。操作された株が、ある範囲の異なる遺伝子で形質転換され、そして、これらの遺伝子は、発酵プロセスの間中、所望の活性が維持されることを確実にする安定な様式で形質転換される。以前に記載された酵素活性の任意の組み合わせが、宿主内に操作される必要がある。さらに、非ヒトのグリコシル化反応に特徴的であることが公知の酵素をコードする多数の遺伝子が、非ヒト宿主細胞から欠失される必要がある。真菌宿主における非ヒトグルコシル化反応に特徴的であることが公知の酵素をコードする遺伝子およびその対応するタンパク質は、多数の下等な真核生物(例えば、Saccharomyces cerevisiae、Trichoderma reesei、Aspergillus nidulans、P.pastorisなど)において、広範に特徴的であり、それによって、下等な真核生物における公知のグリコシルトランスフェラーゼ、その活性、およびそのそれぞれの遺伝子配列のリストを提供する。これらの遺伝子は、マンノシルトランスフェラーゼ(例えば、1,3マンノシルトランスフェラーゼ(例えば、S.cerevisiaeにおけるMNN1)(Graham,T.およびEmr,S.1991)、1,2マンノシルトランスフェラーゼ(例えば、S.cerevisiaeに由来するKTR/KREファミリー)、1,6マンノシルトランスフェラーゼ(S.cerevisiaeに由来するOCH1)、マンノシルリン酸トランスフェラーゼおよびそのレギュレーター(S.cerevisiaeに由来するMNN4およびMNN6)、ならびに、異常な(すなわち、非ヒトの)グリコシル化反応に関与するさらなる酵素からなる群より選択されるようである。
内因性のCMP−Sia生合成経路がなく、機能的なCMP−Sia生合成経路を発現する宿主細胞が提供される。1つの実施形態において、機能的なCMP−Sia生合成経路を発現する真菌宿主細胞が提供される。好ましくは、この宿主は、シアル化反応において、シアリルトランスフェラーゼおよびグリカンアクセプター(例えば、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2)の存在下で、ドナー分子として使用され得る、CMP−Siaの細胞プールを生成する。本発明の方法を用いることにより、CMP−Siaを生成する種々の異なる宿主が生成され得る。好ましくは、産業的な発酵プロセスにおいて十分に実施可能な真菌宿主の頑強なタンパク質生成株が選択される。例えば、グリコシル化されるアクセプターグリカンを生成するこれらの株としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:Pichia pastoris、Pichia finlandica、Pichia trehalophila、Pichia koclamae、Pichia membranaefaciens、Pichia minuta(Ogataea minuta、Pichia lindneri)、Pichia opuntiae、Pichia thermotolerans、Pichia salictaria、Pichia guercuum、Pichia pijperi、Pichia stiptis、Pichia methanolica、Pichia種、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces種、Hansenula polymorpha、Kluyveromyces種、Kluyveromyces lactis、Candida albicans、Aspergillus nidulans、Aspergillus niger、Aspergillus oryzae、Trichoderma reesei、Chrysosporium lucknowense、Fusarium種、Fusarium gramineum、Fusarium venenatumおよびNeurospora crassa。好ましくは、本発明の改変された株は、WO 02/00879、WO 03/056914およびUS2004/0018590(この各々は、その全体が、本明細書により参考として援用される)に提供される方法に従ってヒト様のシアル化糖タンパク質を生成するために使用される。
WO 02/00879、WO 03/056914およびUS2004/0018590に記載される技術と組み合せて、本発明の方法に従って生成される真菌宿主株は、異種性の治療用タンパク質の高い力価を生成し、このタンパク質において、目的のタンパク質(例えば、組換えタンパク質)における広範種々のシアル化グリカンは、真菌宿主のような、内因性のCMP−Siaを欠失した宿主において生成される。上記タンパク質としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:エリスロポエチン、サイトカイン(例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターフェロン−ω、TNF−α、顆粒球−CSF、GM−CSF、IL−1raのようなインターロイキン)、凝固因子(たとえば、第VIII因子、第IX因子)、ヒトプロテインC、アンチトロンビンIIIおよびトロンボポエチン、抗体;IgG、IgA、IgD、IgE、IgMおよびこれらのフラグメント、Fc領域およびFab領域、可溶性IgEレセプターα鎖、ウロキナーゼ、カイメース、および尿トリプシンインヒビター、IGF結合タンパク質、上皮成長因子、成長ホルモン放出因子、FSH、アネキシンV融合タンパク質、アンギオスタチン、血管内皮増殖因子−2、骨髄前駆体阻害因子−1(myeloid progenitor inhibitory factor−1)、オステオプロテゲリン、α−1アンチトリプシン、DNaseII、α−フェトタンパク質およびグルコセレブロシダーゼ。これらおよび他のシアル化糖タンパク質が、治療用の投与のために特に有用である。
CMP−シアル酸生合成経路を、真菌宿主細胞にクローニングするための1つの方法は、E.coliのゲノムDNAから、オープンリーディングフレーム(ORF)の各々に特異的なプライマー対を用いるポリメラーゼ連鎖反応を使用して、E.coliのNeuA遺伝子、NeuB遺伝子およびNeuC遺伝子を増幅する工程を包含する(それぞれ、以下の表1、ならびに図4、3および2)。
NeuC遺伝子の1176bpのPCR増幅フラグメントを、酵母組み込みベクターpJN348(GAPDHプロモーター、NotI AscI PacI制限部位カセット、CycII転写ターミネーター、ポジティブ選択マーカーとしてのURA3を含む、改変されたpUC19ベクター)中のNotI−AscI部位に連結して、pSH256を生成した。同様に、NeuB遺伝子のPCR増幅フラグメント(1041bp)を、ADEをポジティブ選択マーカーとして用いて、GAPDHプロモーターの制御下で、酵母組み込みベクターpJN335中のNotI−PacI部位に連結して、pSH255を生成した。NeuA遺伝子の1260bpのPCR増幅フラグメントを、ARGをポジティブ選択マーカーとして用いて、GAPDHプロモーターの制御下で、酵母組み込みベクターpJN346中のNotI−PacI部位に連結して、pSH254を生成した。P.pastorisをエレクトロポレーションにより各ベクターで形質転換した後、これらの細胞を、新しく導入されたベクターのポジティブ選択を容易にするために、対応する脱落寒天プレート(drop−out agar plate)の上にプレーティングした。各遺伝子の導入を確認するために、数百クローンを、それぞれの脱落プレート上に再度接ぎ、そして、26℃において2日間増殖させた。一旦十分な材料が増殖すると、各クローンを、導入された遺伝子に特異的なプライマーを用いるコロニーPCRによりスクリーニングした。Takara製のポリメラーゼExTaqを用いるコロニーPCRのための条件は、以下の通りであった:97℃で3分間を1サイクル;97℃で20秒間、50℃で30秒間、72℃で1kbあたり2分間を30サイクル;72℃で10分間を1サイクル。その後、コロニーPCRからの数個のポジティブクローンを、200mlの増殖培地を含むバッフルフラスコ内で増殖させた。2.68g/lの酵母窒素ベース、200mg/lのビオチン、および2g/lのデキストロースを含む増殖培地の基本組成に、使用した株に依存して、アミノ酸を補充した。細胞を、20mMのManNAcの存在下または非存在下で、この培地中で増殖させた。30℃にて4〜6日間バッフルフラスコ内で増殖させた後、細胞をペレット状にし、そして、実施例10に記載されるように、シアル酸経路の中間体について分析した。
ブタGlcNAcエピメラーゼ遺伝子のPCR増幅フラグメントを、URA3をポジティブ選択マーカーとして用いて、GAPDHプロモーターの制御下で、酵母組み込みベクターpJN348中のNotI−PacI部位に連結した。内因性のGlcNAcを生成するP.pastoris株を、GlcNAcエピメラーゼ遺伝子フラグメントを保有するベクターで形質転換して、形質転換体をスクリーニングした。
E.coliのシアル酸アルドラーゼ遺伝子のPCR増幅フラグメントを、ADEをポジティブ選択マーカーとして用いて、GAPDHプロモーターの制御下で、酵母組み込みベクターpJN335中のNotI−PacI部位に連結して、pSH275を生成した。内因性のManNAcを生成するP.pastoris株を、シアル酸アルドラーゼ遺伝子フラグメントを保有するベクターで形質転換して、形質転換体をスクリーニングした。
マウスの二機能性UDP−N−アセチルグルコサミン−2−エピメラーゼ/N−アセチルマンノサミンキナーゼ酵素をコードする遺伝子のPCR増幅フラグメントを、URAをポジティブ選択マーカーとして用いて、GAPDHプロモーターの制御下で、酵母組み込みベクターpJN348中のNotI−PacI部位に連結して、pSH284を生成した。内因性のManNAcを生成するP.pastoris株を、上記遺伝子フラグメントを保有するベクターで形質転換して、形質転換体をスクリーニングした。
マウスのN−アセチルノイラミン酸−9−リン酸シンターゼ遺伝子のPCR増幅フラグメントを、ADEをポジティブ選択マーカーとして用いて、GAPDHプロモーターの制御下で、酵母組み込みベクターpJN335中のNotI−PacI部位に連結して、pSH285を生成した。ManNAc−6−Pを生成するP.pastoris株を、上記遺伝子フラグメントを保有するベクターで形質転換して、形質転換体をスクリーニングした。
N−アセチルノイラミン酸−9−ホスファターゼ活性は、ラットの肝細胞のサイトゾルフラクションにおいて検出されている(Van Rinsum,J.,Van Dijk,W.1984)。本発明者らは、この方法を繰返し、NeuAc−9−Pのみに対するホスファターゼ活性を含む細胞抽出フラクションを単離した。このフラクションのSDS−PAGE電気泳動は、単一のタンパク質バンドを同定する。その後、このサンプルを、PDVFメンブレン上に電気ブロッティングし、そして、N末端のアミノ酸配列を、エドマン分解法により同定した。同定された配列は、単離されたタンパク質のORFの5’末端に、縮重オリゴヌクレオチドを生成することを可能にする。これらの縮重プライマーを、ラットの肝臓Marathon−ready cDNAライブラリー(Clontech)において供給されるAP1プライマーと組み合せて用いることによって、製造業者の指示書に従って、全長ORFを単離した。完全なORFを、その後、HIS遺伝子をポジティブ選択マーカーとして用いて、GAPDHプロモーターの制御下で、酵母組み込みベクターpJN347(WO 02/00879)中に連結した。NeuAc−9−Pを生成するP.pastoris株を、所望の遺伝子フラグメントを保有するベクターで形質転換して、形質転換体を実施例2に記載したようにスクリーニングした。
マウスのCMP−Siaシンターゼ遺伝子をコードする遺伝子のPCR増幅フラグメントを、ARG遺伝子をポジティブ選択マーカーとして用いて、GAPDHプロモーターの制御下で、酵母組み込みベクターpJN346中のNotI−PacI部位に連結した。シアル酸を生成するP.pastoris株を、上記遺伝子フラグメントを保有するベクターで形質転換して、形質転換体を実施例2に記載したようにスクリーニングした。同様にして、ヒトのCMP−Siaシンターゼ遺伝子(Genbank:AF397212)をコードする遺伝子を、酵母組み込みベクターpJN346中のNotI−PacI部位に連結して、ベクターpSH257を生成した。シアル酸を生成し得るP.pastoris株を、エレクトロポレーションによりpSH257で形質転換して、CMP−Siaを生成し得る株を生成した。
P.pastoris株JC308(Cereghino,2001 Gene 263,159−164)を、エレクトロポレーションにより、各20mgのNeuCを含むベクター(pSH256)、NeuBを含むベクター(pSH255)およびhCMP−Siaシンターゼを含むベクター(pSH257)で多重形質転換(super−transform)した。得られた細胞を、ヒスチジンを補充した最小培地(1.34g/lの酵母窒素ベース、200mg/lのビオチン、2g/lのデキストロース、20g/lの寒天および20mg/lのL−ヒスチジンを含有する)上にプレーティングした。30℃にて4日間インキュベートした後、数百のクローンを、ヒスチジンを補充した最小培地プレート(組成については上記を参照のこと)上に再度接ぐことによって単離した。接がれたクローンを、(実施例2に記載されたように)クローンについてコロニーPCRを行なう前に、2日間増殖させた。NeuC、NeuBおよびhCMP−Siaシンターゼに特異的なプライマーを用いて、形質転換したクローン中の各ORFの存在を確認した。3つ全てのORFについてポジティブな12のクローン(YSH99a−Iと名付けた)を、200mlの増殖培地(2.68g/lの酵母窒素ベース、200mg/lのビオチン、20mg/lのL−ヒスチジンおよび2g/lのデキストロースを含む)を含むバッフルフラスコ内で増殖させた。増殖培地にManNAcを補充する効果を、20mMのManNAcの存在下または非存在下で、細胞を増殖させることにより調べた。30℃において4〜6日間、バッフルフラスコ内で増殖させた後、細胞を、ペレット状にし、そして、実施例10に記載されるように、シアル酸経路の中間体の存在について分析した。
酵母細胞を、冷PBS緩衝液で3回洗浄し、そして、100mMの重炭酸アンモニウム(pH8.5)中に懸濁し、そして、氷上に置いた。この細胞を、French圧力セル(pressure cell)、その後に、超音波処理を用いて、溶解した。可溶性の細胞内容物を、超遠心分離により細胞片から分離した。氷冷エタノールを60%の最終濃度までこの上清に加えて、そして、15分間氷上に置き、その後、超遠心分離により不溶性のタンパク質を除去した。この上清を凍結し、凍結乾燥により濃縮した。乾燥したサンプルを、水(pHが8.0であることを保証する)中に再懸濁し、次いで、あらかじめリンスした10,000 MWCO Centriconカートリッジを通して濾過した。この濾液を、Mono Qイオン交換カラム上で分離し、そして、標準のCMP−シアル酸と同時に溶出した溶出フラクションをプールし、そして、凍結乾燥する。
シアリルトランスフェラーゼの存在下で、P.pastoris YSH99a株からの抽出物と共に、二触角のガラクトシル化N−グリカンをインキュベートすることにより、シアル化されたN−グリカンが生成した。その後、このシアル化N−グリカンを、以下のようにして脱シアル化した:シアル化されたサンプルを、10,000分子量カットオフのMicroconカートリッジを通して、トランスフェラーゼを取り除いた。このカートリッジを、100μLの水で2回洗浄し、これを、元の溶離液と共にプールした。この溶離液のHPLCによる分析(図13)は、Microcon処理前のHPLCスペクトルと類似するスペクトルを生じた。残りのサンプルを乾燥状態まで凍結乾燥して、25μlの1×NEB G1緩衝液に再懸濁した。100Uのシアリダーゼ(New England Biolabs #P0720L,Beverley,MA)を加えた後、この再懸濁したサンプルを、37℃にて一晩インキュベートし、その後、以前に記載されたようにHPLC分析を行なった。
Claims (21)
- E.coli NeuC酵素、
E.coli NeuB酵素、及び
哺乳動物CMP−シアル酸シンターゼ、またはE.coli CMP−シアル酸シンターゼ(NeuA)触媒ドメインと宿主細胞の核へと触媒ドメインを標的化するように選択される細胞ターゲティングシグナルペプチド(通常は、前記触媒ドメインと結合していない)とを含む融合タンパク質
から成るCMP−シアル酸生合成経路、並びに
シアリルトランスフェラーゼ
を含む、組換え真菌宿主細胞であって、前記宿主細胞は、シアル化糖脂質、シアル化O−グリカンおよびシアル化N−グリカンを生成することができる、組換え真菌宿主細胞。 - 前記宿主は、Pichia pastoris、Pichia finlandica、Pichia trehalophila、Pichia koclamae、Pichia membranaefaciens、Pichia minuta、Ogataea minuta、Pichia lindneri、Pichia opuntiae、Pichia thermotolerans、Pichia salictaria、Pichia guercuum、Pichia pijperi、Pichia stiptis、Pichia methanolica、Pichia sp.、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces sp.、Hansenula polymorpha、Kluyveromyces sp.、Kluyveromyces lactis、Candida albicans、Aspergillus nidulans、Aspergillus niger、Aspergillus oryzae、Aspergillus sp、Trichoderma reesei、Chrysosporium lucknowense、Fusarium sp.、Fusarium gramineum、Fusarium venenatumおよびNeurospora crassaからなる群より選択される、請求項1に記載の組換え宿主細胞。
- 前記宿主細胞は、エリスロポエチン、サイトカイン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターフェロン−ω、腫瘍壊死因子−α(TNF−α)、顆粒球−CSF、顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、インターロイキン、IL−1ra、凝固因子類、第VIII因子、第IX因子、ヒトプロテインC、アンチトロンビンIIIおよびトロンボポエチン、IgA抗体もしくはそのフラグメント、IgG抗体もしくはそのフラグメント、IgD抗体もしくはそのフラグメント、IgE抗体もしくはそのフラグメント、IgM抗体およびそのフラグメント、可溶性IgEレセプターα鎖、ウロキナーゼ、カイメース、尿素トリプシンインヒビター、IGF結合タンパク質、上皮増殖因子、成長ホルモン放出因子、卵胞刺激ホルモン(FSH)、アネキシンV融合タンパク質、アンジオスタチン、血管内皮細胞増殖因子−2、骨髄前駆細胞阻害因子−1、オステオプロテゲリン、α−1アンチトリプシン、DNase II、α−フェトプロテインおよびグルコセレブロシダーゼからなる群より選択される異種治療用タンパク質を発現する、請求項1に記載の組換え宿主細胞。
- 真菌宿主細胞においてシアル化糖脂質、シアル化O−グリカンまたはシアル化N−グリカンを生成するための方法であって、該方法は、
E.coli NeuC酵素、
E.coli NeuB酵素、及び
哺乳動物CMP−シアル酸シンターゼ、またはE.coli CMP−シアル酸シンターゼ(NeuA)触媒ドメインと宿主細胞の核へと触媒ドメインを標的化するように選択される細胞ターゲティングシグナルペプチド(通常は、前記触媒ドメインと結合していない)とを含む融合タンパク質
から成るCMP−シアル酸生合成経路、並びに
シアリルトランスフェラーゼ
を発現する工程を含む、方法。 - 前記宿主は、Pichia pastoris、Pichia finlandica、Pichia trehalophila、Pichia koclamae、Pichia membranaefaciens、Pichia minuta、Ogataea minuta、Pichia lindneri、Pichia opuntiae、Pichia thermotolerans、Pichia salictaria、Pichia guercuum、Pichia pijperi、Pichia stiptis、Pichia methanolica、Pichia sp.、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces sp.、Hansenula polymorpha、Kluyveromyces sp.、Kluyveromyces lactis、Candida albicans、Aspergillus nidulans、Aspergillus niger、Aspergillus oryzae、Aspergillus sp、Trichoderma reesei、Chrysosporium lucknowense、Fusarium sp.、Fusarium gramineum、Fusarium venenatumおよびNeurospora crassaからなる群より選択される、請求項4に記載の方法。
- 前記CMP−シアル酸シンターゼ酵素活性は、前記宿主細胞の核中に位置している、請求項4または5に記載の方法。
- 前記酵素活性は、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下で発現される、請求項4または5に記載の方法。
- 前記発現される酵素活性は、該酵素活性をコードする部分的ORFに由来する、請求項4または5に記載の方法。
- 前記発現される酵素は、別のタンパク質またはペプチドへの融合物である、請求項4または5に記載の方法。
- 前記宿主細胞は、エリスロポエチン、サイトカイン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターフェロン−ω、腫瘍壊死因子−α(TNF−α)、顆粒球−CSF、顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、インターロイキン、IL−1ra、凝固因子類、第VIII因子、第IX因子、ヒトプロテインC、アンチトロンビンIIIおよびトロンボポエチン、IgA抗体もしくはそのフラグメント、IgG抗体もしくはそのフラグメント、IgD抗体もしくはそのフラグメント、IgE抗体もしくはそのフラグメント、IgM抗体およびそのフラグメント、可溶性IgEレセプターα鎖、ウロキナーゼ、カイメース、尿素トリプシンインヒビター、IGF結合タンパク質、上皮増殖因子、成長ホルモン放出因子、卵胞刺激ホルモン(FSH)、アネキシンV融合タンパク質、アンジオスタチン、血管内皮細胞増殖因子−2、骨髄前駆細胞阻害因子−1、オステオプロテゲリン、α−1アンチトリプシン、DNase II、α−フェトプロテインおよびグルコセレブロシダーゼからなる群より選択される異種治療用タンパク質を発現する、請求項4または5に記載の方法。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の宿主細胞において糖タンパク質を該宿主において発現させる工程を含む、組み換え糖タンパク質を生成する方法。
- 前記組換え糖タンパク質は、エリスロポエチン、サイトカイン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターフェロン−ω、腫瘍壊死因子−α(TNF−α)、顆粒球−CSF、顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、インターロイキン、IL−1ra、凝固因子類、第VIII因子、第IX因子、ヒトプロテインC、アンチトロンビンIIIおよびトロンボポエチン、IgA抗体もしくはそのフラグメント、IgG抗体もしくはそのフラグメント、IgD抗体もしくはそのフラグメント、IgE抗体もしくはそのフラグメント、IgM抗体およびそのフラグメント、可溶性IgEレセプターα鎖、ウロキナーゼ、カイメース、尿素トリプシンインヒビター、IGF結合タンパク質、上皮増殖因子、成長ホルモン放出因子、卵胞刺激ホルモン(FSH)、アネキシンV融合タンパク質、アンジオスタチン、血管内皮細胞増殖因子−2、骨髄前駆細胞阻害因子−1、オステオプロテゲリン、α−1アンチトリプシン、DNase II、α−フェトプロテインおよびグルコセレブロシダーゼからなる群より選択される治療用タンパク質である、請求項11に記載の方法。
- 酵母宿主細胞内でCMP−シアル酸を生成するための方法であって、
(a)前記酵母宿主細胞にE.coli NeuC、E.coli NeuB、及び哺乳動物CMP−シアル酸シンターゼから成るシアル化経路の酵素をコードする核酸分子を導入する工程、および
(b)前記酵母宿主細胞を増殖させてCMP−シアル酸を生成する工程を含む方法。 - 前記宿主細胞は、Pichia sp.、Pichia pastoris、Pichia finlandica、Pichia trehalophila、Pichia koclamae、Pichia membranaefaciens、Pichia opuntiae、Pichia thermotolerans、Pichia salictaria、Pichia guercuum、Pichia pijperi、Pichia stiptis、Pichia methanolica;Saccharomyces sp.、Saccharomyces cerevisiae、Hansenula polymorpha、 Kluyveromyces sp.、Kluyveromyces lactis、又はCandida albicansである、請求項13に記載の方法。
- 前記酵母宿主細胞は、Pichia pastorisである、請求項13に記載の方法。
- CMP−シアル酸を生成できる酵母宿主細胞であって:
E.coli NeuC、E.coli NeuB、及び哺乳動物CMP−シアル酸シンターゼから成るシアル化経路を含み、前記酵母宿主細胞は、CMP−シアル酸を生成することができる酵母宿主細胞。 - 前記宿主細胞は、Pichia sp.、Pichia pastoris、Pichia finlandica、Pichia trehalophila、Pichia koclamae、Pichia membranaefaciens、Pichia opuntiae、Pichia thermotolerans、Pichia salictaria、Pichia guercuum、Pichia pijperi、Pichia stiptis、Pichia methanolica;Saccharomyces sp.、Saccharomyces cerevisiae、Hansenula polymorpha、 Kluyveromyces sp.、Kluyveromyces lactis、又はCandida albicansである、請求項16に記載の酵母宿主細胞。
- 前記酵母宿主細胞は、Pichia pastorisである、請求項16に記載の酵母宿主細胞。
- CMP−シアル酸を生成するための方法であって、
(a)E.coli NeuC、E.coli NeuB、及び哺乳動物CMP−シアル酸シンターゼから成るCMP−シアル酸生合成経路を含む酵母宿主細胞を提供する工程、および
(b)前記酵母宿主細胞を増殖させてCMP−シアル酸を生成する工程を含む方法。 - 前記宿主細胞は、Pichia sp.、Pichia pastoris、Pichia finlandica、Pichia trehalophila、Pichia koclamae、Pichia membranaefaciens、Pichia opuntiae、Pichia thermotolerans、Pichia salictaria、Pichia guercuum、Pichia pijperi、Pichia stiptis、Pichia methanolica;Saccharomyces sp.、Saccharomyces cerevisiae、Hansenula polymorpha、 Kluyveromyces sp.、Kluyveromyces lactis、又はCandida albicansである、請求項19に記載の方法。
- 前記酵母宿主細胞は、Pichia pastorisである、請求項19に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US55413904P | 2004-03-17 | 2004-03-17 | |
US60/554,139 | 2004-03-17 | ||
PCT/US2005/009095 WO2005090552A2 (en) | 2004-03-17 | 2005-03-17 | Method of engineering a cytidine monophosphate-sialic acid synthetic pathway in fungi and yeast |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2007529228A JP2007529228A (ja) | 2007-10-25 |
JP4932699B2 true JP4932699B2 (ja) | 2012-05-16 |
Family
ID=34964692
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007504144A Expired - Fee Related JP4932699B2 (ja) | 2004-03-17 | 2005-03-17 | 真菌および酵母におけるシチジンモノホスフェート−シアル酸合成経路を操作する方法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US20050260729A1 (ja) |
EP (2) | EP2365089B1 (ja) |
JP (1) | JP4932699B2 (ja) |
AU (1) | AU2005224672B2 (ja) |
CA (1) | CA2558635A1 (ja) |
WO (1) | WO2005090552A2 (ja) |
Families Citing this family (39)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003056914A1 (en) * | 2001-12-27 | 2003-07-17 | Glycofi, Inc. | Methods to engineer mammalian-type carbohydrate structures |
US7029872B2 (en) * | 2000-06-28 | 2006-04-18 | Glycofi, Inc | Methods for producing modified glycoproteins |
US20060034828A1 (en) * | 2000-06-28 | 2006-02-16 | Gerngross Tillman U | Immunoglobulins comprising predominantly a GlcNAcMAN5GLCNAC2 glycoform |
US7598055B2 (en) * | 2000-06-28 | 2009-10-06 | Glycofi, Inc. | N-acetylglucosaminyltransferase III expression in lower eukaryotes |
US7449308B2 (en) * | 2000-06-28 | 2008-11-11 | Glycofi, Inc. | Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes |
US8697394B2 (en) * | 2000-06-28 | 2014-04-15 | Glycofi, Inc. | Production of modified glycoproteins having multiple antennary structures |
US7625756B2 (en) * | 2000-06-28 | 2009-12-01 | GycoFi, Inc. | Expression of class 2 mannosidase and class III mannosidase in lower eukaryotic cells |
US20060024304A1 (en) * | 2000-06-28 | 2006-02-02 | Gerngross Tillman U | Immunoglobulins comprising predominantly a Man5GlcNAc2 glycoform |
US20060029604A1 (en) * | 2000-06-28 | 2006-02-09 | Gerngross Tillman U | Immunoglobulins comprising predominantly a GlcNAc2Man3GlcNAc2 glycoform |
US7863020B2 (en) | 2000-06-28 | 2011-01-04 | Glycofi, Inc. | Production of sialylated N-glycans in lower eukaryotes |
US20060024292A1 (en) * | 2001-12-27 | 2006-02-02 | Gerngross Tillman U | Immunoglobulins comprising predominantly a Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 glycoform |
US20060034829A1 (en) * | 2001-12-27 | 2006-02-16 | Gerngross Tillman U | Immunoglobulins comprising predominantly a MAN3GLCNAC2 glycoform |
US6964784B2 (en) * | 2002-03-07 | 2005-11-15 | Optigenex, Inc. | Method of preparation and composition of a water soluble extract of the bioactive component of the plant species uncaria for enhancing immune, anti-inflammatory, anti-tumor and dna repair processes of warm blooded animals |
US7332299B2 (en) | 2003-02-20 | 2008-02-19 | Glycofi, Inc. | Endomannosidases in the modification of glycoproteins in eukaryotes |
WO2007006570A2 (en) * | 2005-07-12 | 2007-01-18 | Greenovation Biotech Gmbh | Improvements in or relating to protein production |
US20090136525A1 (en) * | 2005-09-02 | 2009-05-28 | Tillman Gerngross | Immunoglobulins Comprising Predominantly a Glcnacman3Glcnac2 Glycoform |
WO2007029054A1 (en) * | 2005-09-09 | 2007-03-15 | Glycofi, Inc. | Immunoglobulin comprising predominantly a man7glcnac2, man8glcnac2 glycoform |
JP5284789B2 (ja) * | 2005-11-15 | 2013-09-11 | グライコフィ, インコーポレイテッド | O−グリコシル化を減少している糖タンパク質の生成 |
DK1987137T3 (da) | 2006-02-09 | 2011-10-10 | Medicago Inc | Syntese af sialinsyre i planter |
ES2456292T3 (es) | 2006-03-09 | 2014-04-21 | Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) | Procedimiento de producción de oligosacáridos sialilados |
JP5424871B2 (ja) | 2006-05-19 | 2014-02-26 | グライコフィ, インコーポレイテッド | 組換えベクター |
CA2665332A1 (en) * | 2006-10-03 | 2008-04-10 | Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) | High yield production of sialic acid (neu5ac) by fermentation |
US8637435B2 (en) * | 2007-11-16 | 2014-01-28 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Eukaryotic cell display systems |
US20100311122A1 (en) * | 2008-02-20 | 2010-12-09 | Glycofi, Inc | Vectors and yeast strains for protein production |
EP2263089B1 (en) * | 2008-03-03 | 2015-01-28 | GlycoFi, Inc. | Surface display of recombinant proteins in lower eukaryotes |
US8067339B2 (en) * | 2008-07-09 | 2011-11-29 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Surface display of whole antibodies in eukaryotes |
AU2009282228A1 (en) | 2008-08-12 | 2010-02-18 | Glycofi, Inc. | Improved vectors and yeast strains for protein production: Ca2+ ATPase overexpression |
KR20110122134A (ko) | 2009-02-25 | 2011-11-09 | 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 | 글리코공학처리된 효모 피키아 파스토리스에서 갈락토스 동화 경로의 대사 공학 |
MX2012004994A (es) | 2009-10-30 | 2012-06-12 | Merck Sharp & Dohme | Metodo para producir proteinas terapeuticas en pichia pastoris que carecen de actividad de dipeptidil aminopeptidasa. |
CA2777487A1 (en) | 2009-10-30 | 2011-05-05 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Methods for the production of recombinant proteins with improved secretion efficiencies |
JP5976549B2 (ja) | 2010-02-24 | 2016-08-24 | メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション | ピチア・パストリスにおいて産生される治療用糖タンパク質上のn−グリコシル化部位占拠を増加させるための方法 |
BR112012030179A8 (pt) | 2010-05-27 | 2023-03-14 | Merck Sharp & Dohme | Polipeptídeo contendo fc |
AT510299B1 (de) * | 2010-12-22 | 2012-03-15 | Univ Wien Tech | Verfahren und mittel zur herstellung von n-acetylneuraminsäure (neunac) |
JP2014518608A (ja) | 2011-02-25 | 2014-08-07 | メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーション | 修飾o−グリコシル化を有するタンパク質の製造のための酵母株 |
AU2012258907A1 (en) | 2011-05-25 | 2013-11-07 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Method for preparing Fc-containing polypeptides having improved properties |
GB201121615D0 (en) * | 2011-12-15 | 2012-01-25 | Glycom As | Synthesis of n-acetyl-d-neuraminic acid |
CN103451205B (zh) * | 2013-08-03 | 2016-04-06 | 内蒙古大学 | 亚麻脂肪酸脱氢酶基因及其应用 |
WO2016012468A1 (en) | 2014-07-21 | 2016-01-28 | Novartis Ag | Production of glycoproteins with mammalian-like n-glycans in filamentous fungi |
WO2017093291A1 (en) * | 2015-11-30 | 2017-06-08 | Limmatech Biologics Ag | Methods of producing glycosylated proteins |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002530087A (ja) * | 1998-11-18 | 2002-09-17 | ネオーズ テクノロジーズ, インコーポレイテッド | オリゴ糖の安価な産生 |
JP2003514512A (ja) * | 1999-09-10 | 2003-04-22 | ウィメンズ アンド チルドレンズ ホスピタル | オリゴ糖レセプター模倣物を発現する組換え微生物 |
JP2003524395A (ja) * | 1999-03-02 | 2003-08-19 | ヒューマン ジノーム サイエンシーズ, インコーポレイテッド | 細胞内シアリル化経路の操作 |
JP2004501642A (ja) * | 2000-06-28 | 2004-01-22 | グライコフィ, インコーポレイテッド | 改変された糖タンパク質を生成するための方法 |
Family Cites Families (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5834251A (en) * | 1994-12-30 | 1998-11-10 | Alko Group Ltd. | Methods of modifying carbohydrate moieties |
US6949372B2 (en) * | 1999-03-02 | 2005-09-27 | The Johns Hopkins University | Engineering intracellular sialylation pathways |
US6333182B1 (en) * | 1999-03-02 | 2001-12-25 | Human Genome Sciences, Inc. | Human glycosylation enzymes |
CA2704600C (en) * | 1999-04-09 | 2016-10-25 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | A method for producing antibodies with increased adcc activity |
US7795002B2 (en) * | 2000-06-28 | 2010-09-14 | Glycofi, Inc. | Production of galactosylated glycoproteins in lower eukaryotes |
WO2003056914A1 (en) | 2001-12-27 | 2003-07-17 | Glycofi, Inc. | Methods to engineer mammalian-type carbohydrate structures |
US7863020B2 (en) * | 2000-06-28 | 2011-01-04 | Glycofi, Inc. | Production of sialylated N-glycans in lower eukaryotes |
US20060024304A1 (en) * | 2000-06-28 | 2006-02-02 | Gerngross Tillman U | Immunoglobulins comprising predominantly a Man5GlcNAc2 glycoform |
US20060029604A1 (en) * | 2000-06-28 | 2006-02-09 | Gerngross Tillman U | Immunoglobulins comprising predominantly a GlcNAc2Man3GlcNAc2 glycoform |
US7625756B2 (en) * | 2000-06-28 | 2009-12-01 | GycoFi, Inc. | Expression of class 2 mannosidase and class III mannosidase in lower eukaryotic cells |
US20060034828A1 (en) * | 2000-06-28 | 2006-02-16 | Gerngross Tillman U | Immunoglobulins comprising predominantly a GlcNAcMAN5GLCNAC2 glycoform |
US20060034830A1 (en) * | 2000-06-28 | 2006-02-16 | Gerngross Tillman U | Immunoglobulins comprising predominantly a GalGlcNAcMan5GLcNAc2 glycoform |
US7598055B2 (en) * | 2000-06-28 | 2009-10-06 | Glycofi, Inc. | N-acetylglucosaminyltransferase III expression in lower eukaryotes |
US7449308B2 (en) | 2000-06-28 | 2008-11-11 | Glycofi, Inc. | Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes |
US7064191B2 (en) * | 2000-10-06 | 2006-06-20 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for purifying antibody |
US20060034829A1 (en) * | 2001-12-27 | 2006-02-16 | Gerngross Tillman U | Immunoglobulins comprising predominantly a MAN3GLCNAC2 glycoform |
US20060024292A1 (en) * | 2001-12-27 | 2006-02-02 | Gerngross Tillman U | Immunoglobulins comprising predominantly a Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 glycoform |
JP2006333701A (ja) * | 2003-01-15 | 2006-12-14 | Kazuhito Fujiyama | 動物型糖鎖をもつ糖タンパク質の生産方法 |
US7332299B2 (en) * | 2003-02-20 | 2008-02-19 | Glycofi, Inc. | Endomannosidases in the modification of glycoproteins in eukaryotes |
US7259007B2 (en) * | 2003-12-24 | 2007-08-21 | Glycofi, Inc. | Methods for eliminating mannosylphosphorylation of glycans in the production of glycoproteins |
AU2005238308B8 (en) * | 2004-04-29 | 2009-10-08 | Glycofi, Inc. | Methods for reducing or eliminating alpha-mannosidase resistant glycans in the production of glycoproteins |
-
2005
- 2005-03-17 US US11/084,624 patent/US20050260729A1/en not_active Abandoned
- 2005-03-17 EP EP10184678.0A patent/EP2365089B1/en active Active
- 2005-03-17 AU AU2005224672A patent/AU2005224672B2/en not_active Ceased
- 2005-03-17 JP JP2007504144A patent/JP4932699B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2005-03-17 WO PCT/US2005/009095 patent/WO2005090552A2/en active Application Filing
- 2005-03-17 EP EP05732104A patent/EP1730293A2/en not_active Withdrawn
- 2005-03-17 CA CA002558635A patent/CA2558635A1/en not_active Abandoned
-
2007
- 2007-10-26 US US11/977,978 patent/US20080085540A1/en not_active Abandoned
-
2008
- 2008-02-06 US US12/012,950 patent/US20080199942A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002530087A (ja) * | 1998-11-18 | 2002-09-17 | ネオーズ テクノロジーズ, インコーポレイテッド | オリゴ糖の安価な産生 |
JP2003524395A (ja) * | 1999-03-02 | 2003-08-19 | ヒューマン ジノーム サイエンシーズ, インコーポレイテッド | 細胞内シアリル化経路の操作 |
JP2003514512A (ja) * | 1999-09-10 | 2003-04-22 | ウィメンズ アンド チルドレンズ ホスピタル | オリゴ糖レセプター模倣物を発現する組換え微生物 |
JP2004501642A (ja) * | 2000-06-28 | 2004-01-22 | グライコフィ, インコーポレイテッド | 改変された糖タンパク質を生成するための方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2005090552A2 (en) | 2005-09-29 |
CA2558635A1 (en) | 2005-09-29 |
WO2005090552A3 (en) | 2006-01-26 |
US20050260729A1 (en) | 2005-11-24 |
JP2007529228A (ja) | 2007-10-25 |
US20080085540A1 (en) | 2008-04-10 |
US20080199942A1 (en) | 2008-08-21 |
EP1730293A2 (en) | 2006-12-13 |
AU2005224672B2 (en) | 2011-06-02 |
AU2005224672A1 (en) | 2005-09-29 |
EP2365089A1 (en) | 2011-09-14 |
EP2365089B1 (en) | 2014-05-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4932699B2 (ja) | 真菌および酵母におけるシチジンモノホスフェート−シアル酸合成経路を操作する方法 | |
EP1597379B3 (en) | Endomannosidases in the modification of glycoproteins in eukaryotes | |
AU2007248485B2 (en) | Production of sialylated N-glycans in lower eukaryotes | |
EP1737969B1 (en) | Production of galactosylated glycoproteins in lower eukaryotes | |
KR20090130029A (ko) | 푸코실화가 변형된 당단백질의 제조 | |
CA2731504A1 (en) | Combinatorial dna library for producing modified n-glycans in lower eukaryotes | |
US8936918B2 (en) | Yeast strain for the production of proteins with modified O-glycosylation | |
US20140308702A1 (en) | Yeast recombinant cell capable of producing gdp-fucose |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20080117 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20101005 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20101216 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20101224 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110405 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110913 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20111206 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120110 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120117 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20120207 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120215 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150224 Year of fee payment: 3 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |