KR20090130029A - 푸코실화가 변형된 당단백질의 제조 - Google Patents

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KR20090130029A
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Abstract

본 발명은 당단백질의 N-글리칸을 푸코실화하기 위한 내인성 경로가 결핍된 숙주 세포를 유전자 조작하여 N-글리칸이 푸코실화된 당단백질을 생성시킬 수 있는 방법에 관한 것이다.
N-글리칸, 당단백질, 푸코실화

Description

푸코실화가 변형된 당단백질의 제조{Production of glycoproteins with modified fucosylation}
본 발명은 당생물학 분야 및 특히 당단백질의 N-글리칸을 푸코실화하기 위한 내인성 경로가 결핍된 숙주 세포를 유전자 조작하여 푸코실화된 N-글리칸을 갖는 당단백질을 생산할 수 있도록 하는 방법에 관한 것이다.
사람에게 사용하고자 하는 글리코실화된 치료학적 단백질은 복잡한 사람 N-글리코실화 패턴을 가져야만 한다. 일반적으로, 세균 또는 진핵 미생물을 사용하여 치료학적 단백질을 제조하는 것이 유리한데 그 이유는 (a) 고농도의 단백질을 신속하게 생산하는 능력; (b) 멸균되고 잘-통제된 생산 조건(예를 들어, GMP 조건)을 사용하는 능력; (c) 단순한 화학적 합성 배지를 사용하는 능력; (d) 유전자 조작의 용이함; (e) 오염시키는 사람 또는 동물 병원체의 부재; (f) 독성 등으로 인해 세포 배양물에서 불량하게 발현되는 것들을 포함하는 광범위한 단백질을 발현하는 능력; 및, (g) 단백질 회수(예를 들어, 배지로의 분비를 통해)의 용이함때문이다. 그러나, 원핵세포 및 하등 진핵세포는 통상적으로 복잡한 N-글리코실화 패턴을 갖는 단백질을 정상적으로 생산하지 못한다. 따라서, 동물 세포는 일반적으로 치료학적 단백질이 복잡한 사람 유형 N-글리코실화 패턴을 갖는 것이 요망되는 경우에 치료학적 단백질을 제조하기 위해 사용된다. 그러나, 치료학적 단백질을 제조하기 위해 동물 세포를 사용하는데 있어서 다수의 상당한 결점이 있다.
특정 치료학적 단백질만이 동물 세포에서 발현하는데 적합하고, 예를 들어, 임의의 세포독성 효과 또는 성장에 불리한 기타 효과가 없는 단백질들이 있다. 동물 세포 배양 시스템은 일반적으로 매우 느리고, 흔히 임의의 유용한 양의 목적하는 단백질을 제조하기 위해서는 주의깊게 조절된 조건하에서 1주 이상의 성장을 필요로 한다. 그럼에도 불구하고 단백질 수율은 미생물 발효 공정의 수율과 비교하여 좋지 않다. 또한, 세포 배양 시스템은 통상적으로 복잡한 고비용의 영양물 및 보조인자(예를 들어, 소 태아 혈청)를 필요로 한다. 추가로, 성장은 프로그램화된 세포 사멸(아폽토시스)에 의해 제한될 수 있다.
더욱이, 동물 세포(특히 포유동물 세포)는 바이러스 감염 또는 오염에 매우 민감하다. 몇몇 경우에 바이러스 또는 기타 감염성 제제는 배양물의 성장을 손상시킬 수 있고 다른 경우에 당해 제제는 치료학적 단백질 생성물이 이의 의도된 용도에 부적합하도록 하는 사람 병원체일 수 있다. 추가로, 많은 세포 배양 공정은 복잡하고 온도-민감성이고, 동물 유래의 성장 배지 성분의 사용을 필요로 하고 당해 성분들은 소해면상뇌증(bovine spongiform encephalopathy; BSE) 프리온과 같은 병원체를 함유할 수 있다. 당해 병원체는 검출하기가 어렵고/어렵거나 성장 배지를 손상시키는 것 없이 제거하거나 멸균시키기가 어렵다. 임의의 경우에, 치료학적 단 백질을 제조하기 위한 동물 세포의 사용은 생성물 안정성을 확보하기 위해 고비용의 품질 관리를 필요로 한다.
최근에, 하등 진핵세포, 특히 효모가 유전자 변형되어 이들이 사람 유형 또는 사람화된 복잡한 N-글리코실화 패턴을 갖는 단백질을 발현할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 당해 유전자 변형된 하등 진핵세포는 고함량 만노스 N-글리칸을 생성하는데 관여하는 선택된 내인성 글리코실화 효소를 제거하고 복잡한 N-글리칸을 생성하는데 관여하는 다수의 조합된 외인성 효소를 도입함에 의해 성취될 수 있다. 효모를 유전자 조작하여 복잡한 N-글리칸을 제조하는 방법은 미국 특허 제7,029,872호 및 미국 공개 특허원 제2004/0018590호, 제2005/0170452호, 제2006/0286637호, 제2004/0230042호, 제2005/0208617호, 제2004/0171826호, 제2005/0208617호, 및 제2006/0160179호에 기재되어 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 당단백질상의 N-글리칸상으로 만노스 잔기를 부가하는 1,6-만노실 트랜스퍼라제 활성이 결핍되도록 선택되거나 조작될 수 있고 이어서 복잡한 사람 유형 N-글리칸을 생성하는데 관여하는 각각의 효소를 포함하도록 추가로 조작될 수 있다.
동물 및 사람 세포는 단백질 상의 N-글리칸의 환원 말단에서 푸코스 잔기를 GlcNAc 잔기로 부가하는 푸코실트랜스퍼라제 경로를 갖는다. 사람에서 푸코실화 경로는 GDP-만노스 데하이드라타제 및 GDP-케토-데옥시-만노스-에피머라제/GDP-케토-데옥시-갈락토스-리덕타제 (FX 단백질)(이들 둘다는 세포질에 위치하고 서로 협력하여 GDP-만노스를 GDP-푸코스로 전환시킨다); GDP-푸코스를 골지체로 수송하고 골지체 막에 위치하는 GDP-푸코스 수송체; 및 1,6-결합에 의해 푸코스 잔기를 N-글 리칸의 환원 말단에서 GlcNAc 잔기의 6-위치로 이동시키는 푸코실트랜스퍼라제(Fut8)로 이루어진다. 고등 진핵세포와는 반대로 많은 하등 진핵세포, 예를 들어, 효모는 푸코실트랜스퍼라제 경로에 관여하는 효소가 결여되어 있고 푸코스를 함유하지 않는 당단백질을 생성한다(문헌참조: 예를 들어, Bretthauer/Catellino, Biotechnol. Appl. Biochem. 30: 193-200 (1999); Rabina et al, Anal. Biochem. 286: 173-178 (2000)). 그러나, 당단백질상의 푸코스 결여는 특정 경우에 이점을 갖는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 모노클로날 항체, 면역글로불린 분자 및 관련 분자의 제조에서, 면역글로불린의 N-글리칸으로부터 푸코스 당의 제거가 선택된 Ig 수용체로의 이의 결합을 증가시키거나 변화시키는 것으로 밝혀졌고 이는 항체 의존성 세포성 세포독성 또는 ADCC와 같은 성질을 변화시킨다(문헌참조: 예를 들어, 미국 공개 특허원 제2005/0276805호 및 제US2003/0157108호)
그러나, 면역글로불린의 N-글리칸으로부터 푸코스의 제거는 면역글로불린의 ADCC 활성을 증진시키는 것으로 나타났고 푸코실화된 N-글리칸은 다른 당단백질에 중요한 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 마우스에서 푸코실트랜스퍼라제 유전자의 결실은 심한 성장 지연, 출생후 발육동안에 조기 사망 및 폐에서 폐기종형 변화를 유발한다. 이들 Fut8-/- 널(null) 마우스는 외인성 TGF-베타1을 투여함에 의해 폐기종형 표현형으로부터 구제되었다. 추가로, 손상된 수용체-매개된 시그날 전달은 Fut8 유전자를 재도입함에 의해 구제되었고 이는 코어 푸코실화가 TGF-베타1 및 EGF와 같은 성장 인자 수용체의 적당한 기능에 중요함을 보여준다(문헌참조: Wang et al, Meth. Enzymol. 417: 11-22 (2006)). Fut8-/- 마우스로부터 유래된 폐 조직에서, 코어 푸코실화의 손실은 저밀도 지질단백질(LDL) 수용체 관련 단백질-1(LRP-1)의 기능을 손상시키고 이는 인슐린형 성장 인자(IGF)-결합 단백질-3(IGFBP-3)의 세포내이입(endocytosis)을 감소시킨다(문헌참조: Lee et al., J. Biochem. (Tokyo) 139: 391-8 (2006). Fut8-/- 마우스 배아 섬유아세포에서, α3β1 인테그린-매개된 세포 이동은 중지되고 세포 시그날 전달은 감소하여 이는 코어 푸코스가 단백질 기능을 위해 필수적임을 확인시켜준다(문헌참조: Zhao et al., J. Biol. Chem., 281 : 38343-38350 (2006). 추가로, 조성물중에 항체의 적어도 일부가 푸코실화되어 ADCC 활성이 감소된 항체 조성물의 제조가 바람직할 수 있는 상황이 있을 수 있다. 따라서, 특정 경우에 푸코실화된 당펩타이드를 제조할 수 있는 하등 진핵 유기체 및 세포를 제공하는 것이 유리할 것이다. 따라서, 하등 진핵 숙주 세포, 예를 들어, 진균류 및 효모 및 특히 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 케이.락티스(K. lactis) 등과 같은 효모를 제조하기 위한 방법 및 재료의 개발이 푸코실화된 당단백질의 재조합 생산을 위해 유전학적으로 증진된 효모 균주의 개발을 촉진시킬 것이다.
발명의 개요
따라서, 본 발명은 재조합 푸코실화된 당단백질을 제조하기 위해 사용될 수 있는 하등 진핵 발현 시스템을 제조하기 위한 방법 및 재료를 제공한다. 특히, 포 유동물 푸코실화 경로에 관여하는 하나 이상의 효소를 암호화하는 유전자를 함유하는 벡터 및 당해 벡터로 형질감염되어 푸코실화된 당단백질을 생산할 수 있는 숙주 세포가 되는 하등 진핵 숙주 세포가 제공된다. 벡터, 숙주 세포 및 방법은 특히 효모 및 진균 세포, 예를 들어, 피치아 파스토리스를 기초로 하는 발현 시스템에서의 사용에 매우 적합하다.
하나의 양태에서, 본 발명은 GDP-만노스의 GDP-푸코스로의 전환 및 숙주 세포에 의해 생성된 N-글리칸으로의 푸코스의 접착을 위한 효소적 활성을 암호화하는 하나 이상의 벡터로 하등 진핵 숙주 세포를 형질전환시키기 위한 방법 및 재료를 제공한다. 추가의 양태에서, 본 발명은 융합 펩타이드를 소포체, 조기 골지체 또는 후기 골지체내 적당한 위치로 표적화시키는 표적화 서열을 암호화하는 비-천연 리더 서열에 융합된 푸코실화 경로 효소의 촉매 도메인을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 하이브리드 벡터를 포함한다. 예를 들어, 푸코실트랜스퍼라제에 대한 촉매 도메인은 촉매 도메인을 소포체, 조기 골지체 또는 후기 골지체내 위치로 표적화하는 리더 펩타이드에 융합된다. 추가의 양태에서, 하등 진핵 숙주 세포는 GDP-푸코스를 세포질로부터 골지체의 내부로 이동시키는 GDP-푸코스 트랜스퍼라제를 암호화하는 벡터로 형질전환시킨다.
본 발명은 푸코실화 경로를 포함하는 재조합 하등 진핵 숙주 세포를 제공한다. 특정 측면에서 숙주 세포는 효모 또는 사상균, 예를 들어, 피치아 종, 예를 들어, 피치아 파스토리스의 효모이다.
추가의 측면에서, 숙주 세포는 추가로 당단백질상의 N-글리칸에 대하여 α 1,6-만노실트랜스퍼라제 활성을 나타내지 않고 통상적으로 촉매 도메인과 연합되지 않고 숙주 세포의 ER 또는 골지체에 대한 α1,2-만노시다제 활성을 표적화하도록 선택되어 이에 의해 숙주 세포의 ER 또는 골지체를 통한 재조합 당단백질의 통과시 푸코실화된 Man5GlcNAc2 당형태를 포함하는 재조합 당단백질이 생성되도록 하는 세포 표적화 시그날 펩타이드와 융합된 α1,2-만노시다제 촉매 도메인을 포함한다.
추가의 측면에서, 상기 숙주 세포는 추가로 통상적으로 촉매 도메인과 연합되지 않고 숙주 세포의 ER 또는 골지체에 대한 GlcNAc 트랜스퍼라제 I 활성을 표적화하도록 선택되어 이에 의해 숙주 세포의 ER 또는 골지체를 통한 재조합 당단백질의 통과시 푸코실화된 GlcNAcMan5GlcNAc2 당형태를 포함하는 재조합 당단백질이 생성되도록 하는 세포 표적화 시그날 펩타이드에 융합된 GlcNAc 트랜스퍼라제 I 촉매 도메인을 포함한다.
추가의 측면에서, 상기 숙주 세포는 추가로 촉매 도메인과 통상적으로 연합되지 않고 숙주 세포의 ER 또는 골지체에 대한 만노시다제 II 활성을 표적화하도록 선택되어 숙주 세포의 ER 또는 골지체를 통한 재조합 당단백질의 통과시 푸코실화된 GlcNAcMan3GlcNAc2 당형태를 포함하는 재조합 당단백질이 생성되도록 하는 세포 표적화 시그날 펩타이드에 융합된 만노시다제 II 촉매 도메인을 포함한다.
추가의 측면에서, 상기 숙주 세포는 추가로 통상적으로 촉매 도메인과 연합되지 않고 숙주 세포의 ER 또는 골지체에 대한 GlcNAc 트랜스퍼라제 II 활성을 표적화하도록 선택되어 숙주 세포의 ER 또는 골지체를 통한 재조합 당단백질의 통과 즉시 푸코실화된 GlcNAc2Man3GlcNAc2 당형태를 포함하는 재조합 당단백질이 생성되도록 하는 세포 표적화 시그날 펩타이드와 융합된 GlcNAc 트랜스퍼라제 II 촉매 도메인을 포함한다.
추가의 측면에서, 상기 숙주 세포는 추가로 통상적으로 촉매 도메인과 연합되지 않고 숙주 세포의 ER 또는 골지체에 대한 갈락토스 트랜스퍼라제 II 활성을 표적화하도록 선택되어 숙주 세포의 ER 또는 골지체를 통한 재조합 당단백질의 통과시 푸코실화된 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 당형태를 포함하는 재조합 당단백질이 생성되도록 하는 세포 표적화 시그날 펩타이드와 융합된 갈락토스 트랜스퍼라제 II 촉매 도메인을 포함한다.
추가의 측면에서, 상기 숙주 세포는 추가로 통상적으로 촉매 도메인과 연합되지 않고 숙주 세포의 ER 또는 골지체에 대한 시알릴트랜스퍼라제 활성을 표적화하도록 선택되어 숙주 세포의 ER 또는 골지체를 통한 재조합 당단백질의 통과시 푸코실화된 NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 당형태를 포함하는 재조합 당단백질이 생성되도록 하는 세포 표적화 시그날 펩타이드와 융합된 시알릴트랜스퍼라제 촉매 도메인을 포함한다.
특정 당단백질을 암호화하는 핵산으로 상기 숙주 세포를 형질전환시켜 다수의 당형태를 포함하는 당단백질의 조성물이 제조될 수 있고 당형태 각각은 여기에 부착된 하나 이상의 N-글리칸을 포함하고, 여기서, 당단백질 조성물은 다수의 N-글리칸을 포함하고 주요 당형태는 목적하는 푸코실화된 N-글리칸을 포함한다. 목적 하는 특이적인 당단백질에 따라 본 발명의 방법을 사용하여 당단백질 조성물을 수득할수 있고 이때 주요 N-당형태는 다음으로 주성분인 N-당형태 보다 5 내지 80몰% 큰 양으로 존재하고 추가의 양태에서 주요 N-당형태는 다음으로 주성분인 N-당형태 보다 10 내지 40몰%; 20몰 내지 50몰%; 30 내지 60몰%; 40 내지 70몰%, 50 내지 80몰% 큰 양으로 존재할 수 있다. 다른 양태에서, 주요 N-당형태는 목적하는 푸코실화된 N-당형태이고 N-글리칸 총수의 25몰% 초과; 35몰% 초과; 50몰% 초과; 60몰% 초과 또는 75몰% 초과의 양으로 존재한다.
따라서, 다수의 당형태를 포함하는 당단백질 조성물을 제조하기 위한 숙주 세포가 제공되고 각각의 당형태는 여기에 부착된 하나 이상의 N-글리칸을 포함하고, 여기서, 당단백질 조성물은 다수의 푸코실화된 N-글리칸을 포함하고 여기서, 주요 N-글리칸은 Man5GlcAc2, GlcNAcMan5GlcNAc2, Man3GlcNAc2, GlcNAcMan3GlcNAc2, GlcNAc2Man3GlcNAc2, GalGlcNAc2Man3GlcNAc2, Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2, NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2, 및 NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
추가의 측면에서, 25몰% 초과의 푸코실화된 다수의 N-글리칸은 필수적으로 푸코실화된 당형태로 이루어지고 여기서 당형태는 Man5GlcNAc2, GlcNAcMan5GlcNAc2, Man3GlcNAc2, GlcNAcMan3GlcNAc2, GlcNAc2Man3GlcNAc2, GalGlcNAc2Man3GlcNAc2, Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2, NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2, 및 NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
추가의 측면에서, 25몰% 초과, 35몰% 초과; 50몰% 초과; 60몰% 초과; 75몰% 초과; 또는 90몰% 초과의 다수의 N-글리칸은 필수적으로 푸코실화된 당형태로 이루어지고 여기서 당형태는 Man5GlcNAc2, GlcNAcMan5GlcNAc2, Man3GlcNAc2, GlcNAcMan3GlcNAc2, GlcNAc2Man3GlcNAc2, GalGlcNAc2Man3GlcNAc2, Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2, NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2, 및 NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
상기 당단백질 조성에서, 푸코스는 N-글리칸의 환원 말단에서 GlcNAc와 α1,3-결합되어 있거나 N-글리칸의 환원 말단에서 GlcNAc와 α1,6-결합되어 있거나 N-글리칸의 비-환원 말단에서 Gal와 α1,2-결합되어 있거나 N-글리칸의 비-환원 말단에서 GlcNAc와 α1,3-결합되어 있거나 N-글리칸의 비-환원 말단에서 GlcNAc와 α1,4-결합되어 있다.
따라서, 상기 당단백질 조성의 특정 측면에서, 당 형태는 푸코스가 α1,3 결합 또는 α1,6 결합되어 생성되는 Man5GlcNAc2(Fuc), GlcNAcMan5GlcNAc2(Fuc), Man3GlcNAc2(Fuc), GlcNAcMan3GlcNAc2(Fuc), GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc), GalGlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc), Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc), NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc), 및 NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 당 형태; 푸코스가 α1,3-결합 또는 α1,4-결합되어 생성되 는 GlcNAc(Fuc)Man5GlcNAc2, GlcNAc(Fuc)Man3GlcNAc2, GlcNAc2(Fuc1 -2)Man3GlcNAc2, GalGlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2, Gal2GlcNAc2(Fuc1 -2)Man3GlcNAc2, NANAGal2GlcNAc2(Fuc1 -2)Man3GlcNAc2, 및 NANA2Gal2GlcNAc2(Fuc1 -2)Man3GlcNAc2로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 당 형태; 또는 푸코스가 α1,2 결합되어 Gal(Fuc)GlcN Ac2Man3GlcNAc2, Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2, NANAGal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2, 및 NANA2Gal2(Fuc1 -2)GlcNAc2Man3GlcNAc2로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 당형태이다.
다른 측면에서, 본 발명의 당단백질 조성은 당해 N-당형태가 다음으로 주요성분인 N-당형태 보다 약 5 내지 80 몰% 초과 수준; 10 내지 40 몰% 초과 수준; 20 내지 50몰% 초과 수준; 30 내지 60몰% 초과 수준; 40 내지 70 몰% 초과 수준; 또는 50 내지 80 몰% 초과 수준으로 존재하는 조성을 포함한다.
정의
본원에 사용된 용어 "N-글리칸" 및 "당형태"는 상호교환적으로 사용되고 N-연결된 올리고사카라이드, 예를 들어, 아스파라긴-N-아세틸글루코사민 연결에 의해 폴리펩타이드의 아스파라긴 잔기에 부착된 올리고사카라이드를 언급한다. N-연결된 당단백질은 단백질내 아스파라긴 잔기의 아미드 질소에 연결된 N-아세틸글루코사민 잔기를 포함한다. 당단백질상에 주로 발견되는 당은 글루코스(Glc), 갈락토스(Gal), 만노스(Man), 푸코스(Fuc), N-아세틸갈락토사민(GalNAc), N-아세틸글루코 사민(GlcNAc) 및 시알산(예를 들어, N-아세틸-뉴라민산(NANA))이다. 당 그룹의 프로세싱은 ER의 루멘(lumen)에서 해독과 동시에 발생하고 N-연결된 당단백질을 위해 골지체에서 계속된다.
N-글리칸은 Man3GlcNAc2의 공통된 오당류의 코어를 갖는다. N-글리칸은 "트리만노스 코어", "오당류 코어" 또는 파우시만노스 코어"로서도 언급되는 Man3GlcNAc2 코어 구조에 부가되는 말단 당(예를 들어, GlcNAc, 갈락토스, 푸코스, 및 시알산)을 포함하는 분지쇄(안테나)의 수에 있어서 차이가 있다. N-글리칸은 이들의 분지된 성분(예를 들어, 고함량의 만노스, 복합체 또는 하이브리드)에 따라 분류된다. "고함량의 만노스" 유형 N-글리칸은 5개 이상의 만노스 잔기를 갖는다. "복합체" 유형 N-글리칸은 통상적으로 하나 이상의 GlcNAc가 1,3-만노스 암(arm)에 부착되어 있고 하나 이상의 GlcNAc가 "트리만노스" 코어의 1,6-만노스 암에 부착되어 있다. 복합체 N-글리칸은 또한 시알산 또는 유도체(예를 들어, "NANA" 또는 "NeuAc", 이때, "Neu"는 뉴라민산을 언급하고 "Ac"는 아세틸을 언급한다)로 임의로 변형된 갈락토스 또는 N-아세틸갈락토사민 잔기를 가질 수 있다. 복합체 N-글리칸은 또한 "이등분(bisecting)" GlcNAc 및 코어 푸코스("Fuc")를 포함하는 쇄내(intrachain) 치환을 가질 수 있다. 한 예로서, N-글리칸이 트리만노스 코어상에 이등분 GlcNAc을 포함하는 경우, 당해 구조는 Man3GlcNAc2(GlcNAc) 또는 Man3GlcNAc3로 나타낼 수 있다. N-글리칸이 트리만노스 코어에 부착된 코어 푸코스를 포함하는 경우, 당해 구조는 Man3GlcNAc2(Fuc)로 나타낼 수 있다. 복합체 N-글리 칸은 또한 "트리만노스" 코어상에 다중 안테나(흔히 "다중 안테나 글리칸으로 언급됨)를 가질 수 있다. "하이브리드" N-글리칸은 트리만노스 코어의 1,3 만노스 암의 말단상에 하나 이상의 GlcNAc 및 트리만노스 코어의 1,6 만노스 암상에 0개 이상의 만노스를 갖는다. 다양한 N-글리칸은 또한 "당형태"로서 언급된다.
본원에 사용된 약어는 당업계에서 공통적으로 사용되는 용어이다(예를 들어, 당의 약어에 대해 상기 참조). 기타 공통된 약어는 "PNGase", 또는 "글리카나제" 또는 "글루코시다제"를 포함하고 이 모두는 펩타이드 N-글리코시다제 F (EC 3.2.2.18)를 언급한다.
본원에 사용된 용어 "발현 조절 서열"은 작동가능하게 연결된 암호화 서열의 발현에 영향을 주는데 필요한 폴리뉴클레오타이드 서열을 언급한다. 발현 조절 서열은 핵산 서열의 전사, 전사후 반응 및 해독을 조절하는 서열이다. 발현 조절 서열은 적당한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 스플라이싱과 같은 효율적인 RNA 프로세싱 시그날 및 폴리아데닐화 시그날; 세포질 RNA를 안정화시키는 서열; 해독 효율을 증진시키는 서열(예를 들어, 리보솜 결합 부위); 단백질 안정성을 증진시키는 서열; 및 목적하는 경우, 단백질 분비를 증진시키는 서열을 포함한다. 당해 조절 서열의 특성은 숙주 유기체에 따라 상이하고 원핵 세포에서 당해 조절 서열은 일반적으로 프로모터, 리보솜 결합 부위 및 전사 종결 서열을 포함한다. 용어 "조절 서열"은 이의 존재가 적어도 발현에 필요한 모든 성분을 포함하는 것으로 의도되고 또한 이의 존재가 유리한 추가의 성분, 예를 들어, 리더 서열 및 융합 파트너 서열을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "재조합 숙주 세포"("발현 숙주 세포", "발현 숙주 시스템", "발현 시스템" 또는 단순히 "숙주 세포")는 재조합 벡터가 도입된 세포를 언급하는 것으로 의도된다. 당해 용어는 특정 대상 세포 뿐만 아니라 당해 세포의 후손을 언급하는 것으로 이해되어야만 한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 특정 변형이 후속 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 당해 후손은 실질적으로 모세포와 동일하지 않을 수 있지만 여전히 본원에 사용된 용어 "숙주 세포"의 범위내에 포함된다. 재조합 숙주 세포는 배양액에서 성장한 분리된 세포 또는 세포주일 수 있거나 생조직 또는 유기체에 존재하는 세포일 수 있다.
용어 "진핵 세포"는 핵을 가진 세포 또는 유기체를 언급하고 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 세포, 동물 세포 및 하등 진핵 세포를 언급한다.
당해 용어 "하등 진핵 세포"는 효모, 진균류, 칼라-편모충류(collar-flagellates), 미포자충, 유포생물(예를 들어, 와편모조류), 부등편모생물(예를 들어, 갈조류, 원생동물), 홍조식물문(예를 들어, 적조류), 식물(예를 들어, 녹조류, 식물 세포, 이끼) 및 기타 원생생물을 포함한다. 효모 및 진균류는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 피치아 핀란디카(Pichia finlandica), 피치아 트레할로필라(Pichia trehalophila), 피치아 코클라마에(Pichia koclamae), 피치아 멤브란에파시엔스(Pichia membranaefaciens), 피치아 미누타(Pichia minuta) (오가타에아 미누타(Ogataea minuta), 피치아 린드네리(Pichia lindneri)), 피치아 오푼티아에(Pichia opuntiae), 피치아 써모톨레란스(Pichia thermotolerans), 피치아 살릭타리아(Pichia salictaria), 피치아 구어쿰(Pichia guercuum), 피치아 지페 리(Pichia pijperi), 피치아 스티프티스(Pichia stiptis), 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica), 피치아 종(Pichia sp.), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 종(Saccharomyces sp.), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 클루이베로마이세스 종(Kluyveromyces sp.), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae), 트리코더마 레에세이(Trichoderma reesei), 크리소스포리움 루크노웬세(Chrysosporium lucknowense), 푸사리움 종(Fusarium sp.), 푸사리움 그라미네움(Fusarium gramineum), 푸사리움 베네나툼(Fusarium venenatum), 피스코미트렐라 파텐스(Physcomitrella patens) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa). 피치아 종(Pichia sp.), 임의의 사카로마이세스 종, 한세눌라 폴리모르파, 임의의 클루이베로마이세스 종, 캔디다 알비칸스, 임의의 아스퍼질러스 종, 트리코더마 레에세이(Trichoderma reesei), 크리소스포리움 루크노웬세(Chrysosporium lucknowense), 임의의 푸사리움 종(Fusarium sp.), 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "펩타이드"는 짧은 폴리펩타이드, 예를 들어, 길이가 약 50개 미만의 아미노산인 것과 보다 통상적으로는 길이가 약 30개 미만의 아미노산인 것을 언급한다. 본원에 사용된 용어는 구조 및 생물학적 기능을 모방하는 유사체 및 모사체를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "주로" 또는 이의 변형어구 "주요성분" 또는 "주요한"은 당단백질이 PNGase로 처리되고 방출된 글리칸이 질량 분광기(예를 들어, MALDI-TOF MS)로 분석된 후 최고 몰%의 총 N-글리칸을 갖는 글리칸 종을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 다른 말로, 용어 "주로"는 임의의 다른 개별 실체보다 초과 몰%로 존재하는 특정 당형태와 같은 개별 실체로서 정의된다. 예를 들어, 조성물이 40몰%의 A 종, 35몰%의 B 종 및 25몰%의 C 종으로 이루어진 경우, 당해 조성물은 주로 A 종을 포함한다.
달리 정의되지 않는 경우, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 기술자에 의해 공통적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 예시적인 방법 및 재료는 하기에 기재되지만 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 또한 본 발명의 수행에 있어 사용될 수 있고 이는 당업자에게 자명할 것이다. 본원에 인용된 모든 공개문헌 및 기타 참조문헌은 이의 전체 내용이 본원에 인용된다. 분쟁 소지가 있는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 중재할 것이다. 재료, 방법 및 실시에는 단지 설명을 위한 것이지 이를 제한하고자 한 것은 아니다.
도 1은 많은 고등 진핵 세포에 존재하는 푸코실화 경로를 설명한다.
도 2는 푸코실화된 당단백질을 생산할 수 있는 재조합 효모를 제조하기 위해 요구되는 당-조작 단계를 보여준다. 효모 세포질에 존재하는 내인성 GDP-만노스는 GDP-만노스-데하이드라타제(GMD) 및 이기능성 효소 FX에 의해 GDP-푸코스로 전환된다. 이어서, 당해 생성물은 GDP-푸코스 수송체(GFTr)에 의해 골지체로 수송되고 푸코스는 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제(FUT8)에 의해 수용자 글리칸상으로 전달된다. 효소는 청색 문자로 나타내고 대사 중간체는 검은 문자로 나타낸다지. GDP-kdMan (GDP-4-케토-6-데옥시-만노스) 및 GDP-kdGal (GDP-4-케토-6-데옥시-갈락토스)는 GDP-만노스에서 GDP-푸코스로의 전환에 있어서 중간체이다.
도 3A는 효모 균주가 푸코실화된 당단백질을 생산하도록 조작시키는데 사용되는 벡터를 보여준다. 푸코스 생합성 및 전달 유전자가 도입된 발현 벡터 pSH995를 나타낸다. 푸코스의 생합성 및 전달을 위해 요구되는 유전자를 pSH995로 도입하여 벡터 pSH1022를 제조하였다.
도 3B는 벡터 pSH1022를 보여준다. (B)에서는 유전자를 피치아 게놈으로 통합시키는데 사용되는 TRP2 좌의 플랭킹 영역; 주요 선택 마커 NATr; GAPDH-CYC 발현 카세트; 및 pUC19 플라스미드 골격을 보여준다.
도 4A는 래트 EPO로부터 방출된 N-글리칸의 MALDI-TOF 스캔을 보여주고 이는 피치아 파스토리스 균주 YSH661(푸코실화 경로 유전자를 포함하는 벡터 pSH1022로 형질전환된 균주 RDP974)가 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc) 및 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸을 포함하는 rEPO를 생성함을 입증한다. Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc) N-글리칸은 박스내에 있다.
도 4B는 단지 래트 EPO 조절 균주 YSH660(대조군 벡터 pSH995로 형질전환된 균주 RDP974) 생성된 푸코실화되어 있지 않거나 푸코스 부재 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸으로부터 방출된 N-글리칸의 MALDI-TOF 스캔을 보여준다.
본 발명은 푸코실화된 N-글리칸을 갖는 당단백질을 생산할 수 있는 숙주 세포를 유전자 조작하기 위한 방법 및 재료를 제공한다. 당해 방법 및 재료가 내인성 푸코실화 경로를 소유하지 않은 효모 피치아 파스토리스에서 예시되어 있지만 당해 방법 및 재료는 또한 내인성 푸코실화 경로를 갖지 않는 진균류와 같은 다른 하등 진핵 세포, 원핵 세포 및 다른 고등 진핵 세포, 예를 들어 곤충 세포를 유전자 조작시키는데 사용될 수 있다. 다른 양태에서, 당해 방법 및 재료를 사용하여 내인성 푸코실화 경로를 갖는 고등 진핵 세포를 유전자 조작시킬 수 있지만 경우에 따라 당해 숙주 세포에 의해 생성된 당단백질에 존재하는 푸코실화의 양을 증가시킬 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 방법은 푸코실화 경로에 포함되고 숙주 세포로 도입되는 경우 세포가 푸코실화된 당단백질을 생산할 수 있도록 하는 효소 또는 효소적 활성을 암호화하는 핵산을 숙주 세포에 도입함에 의해 푸코실화된 당단백질을 생산할 수 있는 숙주 세포를 제조함을 포함한다. 당해 핵산은 예를 들어, GDP-만노스-4,6-데하이드로게나제 활성, GDP-케토-데옥시-만노스-에피머라제 활성/GDP-케토-데옥시-갈락토스- 리덕타제 활성, GDP-푸코스 수송체 단백질, 및 푸코실트랜스퍼라제 활성을 암호화하는 핵산을 포함한다. 고등 진핵 세포에서 푸코실화 경로의 개요는 도 1에 나타낸다.
GDP-만노스-4,6-데하이드로게나제(GMD) (EC 4.2.1.47)는 NAD의 존재하에 GDP-만노스를 GDP-4-케토-6-데옥시-만노스로 전환시키고 이는 다수의 종에서 확인되었다. 사람 GMP (hGMD)는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되어 있고 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는다. GDP-만노스-데하이드라타제 활성을 갖는 상동성 유전자는 돼지 GMD(문헌참조: Broschat et al., Eur. J. Biochem., 153(2):397-401 (1985)), 카에노르하브디티스 엘레강스(Caenorhabditis elegans) GMD 및 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) GMD (문헌참조: Rhomberg et al, FEBS J.; 273:2244-56 (2006)); 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)(문헌참조: Nakayama et al., Glycobiology; 13:673-80 (2003)); 및 이.콜라이(E. coli)(문헌참조: Somoza et al.,Structure, 8:123-35 (2000))을 포함한다.
GDP-케토-데옥시-만노스-에피머라제/GDP-케토-데옥시-갈락토스-리덕타제(GDP-L-푸코스 신타제, EC 1.1.1.271)는 이기능성 효소이고 진핵세포 및 원핵세포 둘다에서 확인되었다. 사람 GDP-케토-데옥시-만노스-에피머라제/GDP-케토-데옥시-갈락토스-리덕타제는 FX 단백질(또한 hFX 또는 GER로서 공지됨)으로 호칭된다. hFX를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3으로 나타낸다. hFX 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는다.
GDP-푸코스 수송체는 몇몇 종에서 확인되었다. 사람 GDP-푸코스 수송체(hGFTr)는 글리코실화-II(CDG-II)의 선천성 장애와 관련하여 확인되었다(문헌참조: Lubke et al, Nat. Genet. 28: 73-6 (2001)). 또한 백혈구 접착 결핍 II(LAD II)으로서 공지되어 있는 당해 장애는 셀렉틴 리간드의 푸코실화에서의 장해로부터 비롯되는 것으로 나타난다[문헌참조: Roos and Law, Blood Cells Mol. Dis. 27: 1000-4 (2001)]. hGFTr을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 5로 나타내고 hGFTr의 아미노산 서열은 서열번호 6으로 나타낸다. GDP-푸코스 수송체 활성을 갖는 상동성 유전자는 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) (문헌참조: Ishikawa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102:18532-7 (2005)), 래트 간(문헌참조: Puglielli and Hirschberg; J. Biol. Chem. 274:35596-60 (1999)), 및 추정 CHO 상동체(문헌참조: Chen et al., Glycobiology; 15:259-69 (2005))와 같은 기타 종에서 확인되었다.
하기의 다수의 푸코실트랜스퍼라제가 확인되었다(문헌참조: Breton et al., Glycobiol. 8: 87-94 (1997); Becker , Lowe, Glycobiol. 13: 41R-53R (2003); Ma et al., Glycobiol. 16: 158R-184R (2006)): 예를 들어, α1,2-푸코실트랜스퍼라제(EC 2.4.1.69; FUT1 및 FUT2에 의해 암호화됨), α1,3-푸코실트랜스퍼라제(당단백질 3-α-L-푸코실트랜스퍼라제, EC 2.4.1.214; FUT3-FUT7 및 FUT9에 의해 암호화됨), α1,4-푸코실트랜스퍼라제(EC 2.4.1.65; FUT 3에 의해 암호화됨), 및 α1,6-푸코실트랜스퍼라제(당단백질 6-α-L-푸코실트랜스퍼라제, EC 2.4.1.68; FUTS에 의해 암호화됨). 일반적으로, α1,2-푸코실트랜스퍼라제는 푸코스를 α1,2 결합에 의해 N-글리칸내 말단 갈락토스 잔기로 전달한다. 일반적으로, α1,3-푸코실트랜스퍼라제 및 α 1,4-푸코실트랜스퍼라제는 푸코스를 N-글리칸의 비-환원 말단에서 GlcNAc 잔기로 전달한다.
일반적으로, α1,6-푸코실트랜스퍼라제는 푸코스를 α1,6-결합을 통해 N-글리칸의 환원 말단에서 GlcNAc 잔기(아스파라긴-결합된 GlcNAc)로 전달한다. 통상적으로, α1,6-푸코실트랜스퍼라제는 환원 말단에서 GlcNAc로 푸코스를 부가할 수 있기 위해서는 하나 이상의 분지된 트리만노스 코어의 비-환원 말단에서 말단 GlcNAc 잔기를 필요로 한다. 그러나, α1,6-푸코실트랜스퍼라제는 환원 말단에서 푸코스를 GlcNAc로 부가할 수 있기 위해서는 비-환원 말단에서 말단 갈락토사이드 잔기를 필요로 하는 것으로 확인되었고(문헌참조: Wilson et al, Biochm. Biophys. Res. Comm. 72: 909-916 (1976)) 린 등(Lin et al.)(문헌참조: Glycobiol. 4: 895-901 (1994))은 GlcNAc 트랜스퍼라제 I 결핍 중국 햄스터 난소 세포에서 α1,6-푸코실트랜스퍼라제가 Man4GlcNAc2 및 Man5GlcNAc2 N-글리칸을 푸코실화함을 보여주었다. 유사하게, α1,3-푸코실트랜스퍼라제가 N-글리칸의 환원 말단에서 GlcNAc 잔기로 전달하지만 α1,3-결합을 통해 일어나고 일반적으로 하나의 비치환된 비-환원 말단 GlcNAc 잔기를 갖는 N-글리칸에 대해 특이성을 갖는다. 당해 효소의 N-글리칸 생성물은 식물, 곤충 및 몇몇 다른 무척추동물(예를 들어, 주혈흡충, 염전위충, 애기물달팽이)에 존재한다. 그러나, 미국 특허 제7,094,530호는 사람 단핵구 세포주 THP-1로부터 분리된 α1,3-푸코실트랜스퍼라제를 기재하고 있다.
사람 α1,6-푸코실 트랜스퍼라제 (hFUT8)은 야마쿠치 등(Yamaguchi et al.,)에 의해 확인되었다(문헌참조: Cytogenet. Cell. Genet. 84: 58-6 (1999)). 사람 FUT8을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 7로 나타낸다. hFUT8의 아미노산 서열은 서열번호 8로 나타낸다. FUT8 활성을 갖는 상동성 유전자는 다른 종에서 확인되었고 이의 예는 다음과 같다: 래트 FUT8(rFUT8)(이는 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖고 서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되어 있다); 마우스 Fut8 (mFUT8)(이는 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖고 서열번호 11의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되어 있다) 및 돼지 FUT8(pFUT8)(이는 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖고 서열번호 13의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되어 있다). FUT8은 또한 CHO 세포(Yamane-Ohnuki et al., Biotechnol. Bioeng. 87: 614-622 (2004)), 원숭이 신장 COS 세포(Clarke and Watkins, Glycobiol. 9: 191-202 (1999)), 및 닭 세포(Coullin et al, Cytogenet. Genome Res. 7: 234-238 (2002))에서 확인되었다. 문헌[참조: Paschinger et al, Glycobiol. 15: 463-474 (2005)]은 씨.엘레강스 및 디.멜라노가스터, 시오나 인테스티날리스(Ciona intestinalis), 드로소필라 슈도오브스쿠라(Drosophila pseudoobscura), 제노푸스 라에비스(Xenopus laevis) 및 다니오 레리오(Danio rerio)로부터의 푸코실트랜스퍼라제의 클로닝 및 특징 분석을 기재하고 있고 추정 1,6-푸코실트랜스퍼라제가 확인되었다(각각 GenBank 등록번호 AJ515151, AJ830720, AJ514872, 및 AJ781407).
상기 언급된 푸코실화 경로 효소 또는 활성은 핵산에 의해 암호화되어 있다. 당해 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있지만 통상적으로 핵산은 DNA인데 그 이유는 푸코실화 경로 효소 또는 활성을 암호화하는 핵산이 숙주 세포의 게놈으로 안정하게 통합되는 것이 바람직할 수 있기 때문이다. 푸코실화 경로 효소 또는 활성을 암호화하는 핵산은 각각 푸코실화 경로 효소 또는 활성의 발현을 허용하는 조절 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 당해 조절 서열은 푸코실화 경로 효소 또는 활성을 암호화하는 핵산의 상류에 있는 프로모터 및 인핸서를 포함하고 푸코실화 경로 효소 또는 활성의 하류에 있는 전사 종결 부위를 포함한다. 당해 핵산은 또한 통상적으로 리보솜 결합 부위를 갖는 5' 비해독 영역 및 폴리아데닐화 부위를 갖는 3' 비해독 영역을 추가로 포함한다. 당해 핵산은 흔히 푸코실화 경로 효소 또는 활성이 발현되는 세포에서 복제 가능한 플라스미드와 같은 벡터의 성분이다. 당해 벡터는 또한 마커를 포함하여 당해 벡터로 형질전환된 세포의 선별이 가능하다. 그러나, 일부 세포 유형, 특히 효모는 벡터 서열이 결핍된 핵산으로 성공적으로 형질전환될 수 있다.
일반적으로, 하나 이상의 푸코실화 경로 효소 또는 활성을 암호화하는 핵산으로 형질전환된 숙주 세포는 목적하는 당단백질을 암호화하는 하나 이상의 핵산을 추가로 포함한다. 푸코실화 경로 효소와 관련하여 당단백질을 암호화하는 핵산은 조절 서열에 작동가능하게 연결되어 당단백질의 발현이 가능하다. 당단백질을 암호화하는 핵산은 당단백질의 보존 영역에 대한 프라이머를 사용하여 당단백질을 발현하는 것으로 공지된 세포주로부터 증폭될 수 있다(문헌참조: Marks et al., J. Mol. Biol. : 581-596 (1991)). 핵산은 또한 과학 문헌에서 서열을 기초로 드 노보(de novo) 합성될 수 있다. 핵산은 또한 목적하는 서열 범위를 포함하는 중첩 올리고뉴클레오타이드를 연장하여 합성될 수 있다(문헌참조: Caldas et al., Protein Engineering, 13: 353-360 (2000)).
숙주 세포에 의해 생성되는 푸코실화된 N-글리칸 구조 유형은 숙주 세포에서의 글리코실화 경로 및 특정 푸코실트랜스퍼라제에 따라 다양할 것이다. 예를 들어, α1,2-푸코실트랜스퍼라제는 일반적으로 푸코스를 N-글리칸상의 말단 갈락토스에 부가한다. 이와 같이, α1,2-푸코실트랜스퍼라제를 사용하는 경로는 바람직하게 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 당형태를 갖는 N-글리칸을 생성할 수 있는 숙주 세포로 도입된다. 생성된 N-글리칸은 말단 갈락토스 잔기에 1,2 결합되어 있는 푸코스를 갖는다. α1,3-푸코실트랜스퍼라제 및 α1,4-푸코실트랜스퍼라제는 각각 α1,3- 또는 α1,4-결합을 통해 비-환원 말단에서 또는 이의 근방에서 푸코스를 하나 이상의 GlcNAc 잔기에 부가하거나 일부 α1,3-푸코실트랜스퍼라제는 α1,3-결합을 통해 당단백질의 아스파라긴 잔기에 연결된 코어 GlcNAc에 푸코스를 부가한다. 이와 같이, α1,3/4-푸코실트랜스퍼라제를 사용하는 경로는 바람직하게 하나 이상의 GlcNAcMan5GlcNAc2 당형태를 갖는 N-글리칸을 생산할 수 있는 숙주 세포로 도입된다. 최종적으로, α1,6-푸코실트랜스퍼라제는 일반적으로 푸코스를 α1,6-결합을 통해 푸코스를 당단백질의 아스파라긴 잔기에 연결된 코어 GlcNAc에 전달한다. 일반적으로, α1,6-푸코실트랜스퍼라제를 사용하는 경로는 바람직하게 하나 이상의 GlcNAcMan5GlcNAc2, Man5GlcNAc2, 또는 Man4GlcNAc2 당형태를 갖는 N-글리칸을 생성할 수 있는 숙주 세포로 도입된다.
본원에 기재된 방법에 따라 생성될 수 있는 당단백질은 당단백질을 제조하기 위한 핵산 서열의 기원에 상관없이 치료 또는 진단용의 임의의 목적하는 단백질을 포함한다. 예를 들어, N-글리칸이 푸코실화되지 않은 모노클로날 항체는 ADCC 활성을 증가시켰지만 증가된 ADCC 활성은 ADCC 활성을 유발시키지 않으면서 장애의 치료를 위해 수용체 리간드와 결합하도록 의도된 모노클로날 항체에 대해서는 바람직하지 못하다. 푸코실화 경로를 포함하는 본원에 기재된 숙주 세포에서 제조된 모노클로날 항체는 푸코실화된 N-글리칸을 갖고 감소된 ADCC 활성을 가질 것으로 예상된다. 또 다른 예로서, 푸코실화 경로를 포함하는 본원에 기재된 숙주 세포에서 생성된 항체의 Fc 부분에 융합된 막 결합 수용체의 세포외 부분을 포함하는 면역부착(문헌참조: 미국 특허 5,428,130, 5,116,964, 5,514,582, 및 5,455,165; Capon et al. Nature 337:525 (1989); Chamow and Ashkenazi, Trends Biotechnol. 14: 52-60 (1996); Ashkenazi and Chamow, Curr. Opin. Immunol. 9: 195-200 (1997))은 푸코실화된 N-글리칸을 갖고 감소된 ADCC 활성을 가질 것으로 예상된다. 본원의 방법에 따라 생성될 수 있는 푸코실화된 N-글리칸을 갖는 당단백질의 예는 에리트로포이에틴(EPO); 사이토카인(예를 들어, 인터페론-α, 인터페론-β., 인터페론-γ, 인터페론-ω, 및 과립구-CSF); 응고 인자(예를 들어, 인자 VIII, 인자 IX, 및 사람 단백질 C); 모노클로날 항체, 가용성 IgE 수용체 α-쇄, IgG, IgM, IgG, 우로키나제, 키마제, 및 우레아 트립신 억제제, IGF-결합 단백질, 상피 성장 인자, 성장 호르몬 방출 인자, 어넥신 V 융합 단백질, 안지오스타틴, 혈관 내피 성장 인자-2, 골수 선조체 억제 인자-1, 오스테오프로테게린 조직, 플라스미노겐 활성화인자, G-CSF, GM-CSF, 및 TNF-수용체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
특정 양태에서, 하나 이상의 핵산은 융합 단백질을 세포내의 특정 영역으로 표적화시키는 표적화 펩타이드에 융합된 푸코실화 경로 단백질의 촉매 도메인을 포함하는 융합 단백질을 암호화한다. 통상적으로, 표적화 펩타이드는 융합 단백질을 분비 경로내의 위치로 표적화시킬 것이다. 당해 용어 "분비 경로"는 따라서 분비를 위해 당단백질이 변형된 세포내의 기관 및 성분들을 언급한다. 당해 분비 경로는 소포체(ER), 골지체, 트랜스-골지 네트워크 및 분비 소포체를 포함한다. 예를 들어, 적합한 세포 표적화 펩타이드는 촉매 도메인을 ER, 골지체, 트랜스-골지 네트워크 또는 분비 소포체로 표적화시킬 수도 있다. 본 발명에 유용할 수 있는 표적화 펩타이드는 미국 특허 제7,029,872호에 기재된 것들을 포함한다. 하나의 양태에서, 푸코실트랜스퍼라제의 촉매 도메인은 융합 단백질을 골지체로 지시하는 표적화 펩타이드에 융합된다. 푸코실트랜스퍼라제 촉매 도메인에 융합된 특정 표적화 펩타이드는 숙주 세포, 특정 푸코실트랜스퍼라제 및 생성될 당 단백질에 따라 다양할 것이다. 푸코실트랜스퍼라제를 표적화하기 위해 사용될 수 있는 표적화 펩타이드의 예는 예를 들어, 미국 특허 7,029,872호 및 미국 공개 특허원 제2004/0018590호, 제2004/0230042호, 제2005/0208617호, 제2004/0171826호, 제2006/0286637호, 및 제2007/0037248호에 기재되어 있다.
푸코실화 경로에 관여하는 효소 또는 활성을 암호화하는 핵산은 숙주 세포를 형질감염시키는데 사용될 수 있는 벡터에 연결한다. 통상적으로, 당해 벡터는 의도된 숙주 세포와 동일한 종의 세포로부터 분리되거나 다른 종으로부터 분리되었지만 의도된 숙주 세포로 삽입되는 경우 기능하는 것으로 공지된 조절 요소들을 포함한다. 통상적으로, 이들 조절 요소들은 전사 종결인자 서열과 같은 3' 조절 서열 뿐만 아니라 프로모터와 같은 5' 조절 서열을 포함한다. 벡터는 통상적으로 또한 하나 이상의 선별가능한 마커 요소를 포함하여 벡터로 성공적으로 형질감염된 숙주 세포의 선별을 가능하게 한다. 당해 벡터는 의도된 숙주 세포로 전달되고 수득한 세포는 선별가능한 마커의 존재에 대해 스크리닝하여 벡터로 성공적으로 형질감염됨에 따라서 융합 단백질을 암호화하는 벡터를 갖는 숙주 세포를 확인한다.
효모와 같은 하등 진핵 세포는 흔히 이들이 저렴하게 배양될 수 있고 고수율의 단백질을 수득할 수 있고 적절히 변형되는 경우 특정 주요 N-글리칸 구조를 갖는 당단백질을 생성할 수 있기 때문에 당단백질의 발현을 위해 바람직하다. 특히, 효모는 신속한 형질전환, 시험된 단백질 위치화 전략 및 손쉬운 유전자 녹아웃 기술을 가능하게 하는 확립된 유전자 정보를 갖고 있다. 케이.락티스, 피치아 파스토리스, 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica), 및 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)와 같은 다양한 효모는 이들이 고세포 밀도까지 성장하고 산업적 규모로 재조합 단백질을 대량으로 분비할 수 있기 때문에 세포 배양 및 단백질의 생산을 위해 공통적으로 사용된다. 또한, 사상균, 예를 들어, 아스퍼질러스 나이거, 푸사리움 종, 뉴로스포라 크라사등을 사용하여 산업적 규모로 당단백질을 제조할 수 있다.
하등 진핵 세포, 특히 효모는 글리코실화 패턴이 복합형 또는 사람형 또는 사람화된 당단백질을 발현하도록 유전자 변형될 수 있다. 당해 유전자 변형된 하등 진핵세포는 고 만노스 N-글리칸을 생성하는데 관여하는 선택된 내인성 글리코실화 효소를 제거하고 복합 N-글리칸을 제조하는데 관여하는 외인성 효소의 다양한 조합을 도입함에 의해 성취될 수 있다. 효모를 유전자 조작하여 복합 N-글리칸을 제조하는 방법은 미국 특허 제7,029,872호 및 미국 공개 특허원 제2004/0018590호, 제2005/0170452호, 제2006/0286637호, 제2004/0230042호, 제2005/0208617호, 제2004/0171826호, 제2005/0208617호, 및 제2006/0160179호에 기재되어 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 만노스 잔기를 당단백질상의 N-글리칸상으로 부가하는 1,6-만노실 트랜스퍼라제 활성이 고갈되도록 선택되거나 조작된다. 예를 들어, 효모에서, OCH1 유전자는 1,6-만노실 트랜스퍼라제 활성을 암호화한다. 이어서 당해 숙주 세포는 복합 사람형 N-글리칸을 생성하는데 관여하는 하나 이상의 효소를 포함하도록 조작된다.
하나의 양태에서, 숙주 세포는 추가로 통상 촉매 도메인과 연합되어 있지 않고 숙주 세포의 ER 또는 골지체로 α1,2-만노시다제 활성을 표적화하도록 선택된 세포 표적화 시그날 펩타이드에 융합된 α1,2-만노시다제 촉매 도메인을 포함한다. 숙주 세포의 ER 또는 골지체를 통한 재조합 당단백질의 통과는 푸코실화된 Man5GlcNAc2 당형태, 예를 들어, Man5GlcNAc2(Fuc) 당형태를 포함하는 재조합 당단백질을 생성시킨다. 미국 특허 제7,029,872호 및 미국 공개 특허원 제2004/0018590호 및 제2005/0170452호는 Man5GlcNAc2 당형태를 포함하는 당단백질을 생성할 수 있는 하등 진핵 숙주 세포를 기재하고 있다.
추가의 양태에서, 바로 앞에서 기술한 숙주 세포는 통상적으로 촉매 도메인과 연합되어 있지 않고 숙주 세포의 ER 또는 골지체로 GlcNAc 트랜스퍼라제 I 활성을 표적화하도록 선택된 세포 표적화 시그날 펩타이드에 융합된 GlcNAc 트랜스퍼라제 I(GnTI) 촉매 도메인을 추가로 포함한다. 숙주 세포의 ER 또는 골지체를 통한 재조합 당단백질의 통과는 푸코실화된 GlcNAcMan5GlcNAc2 당형태, 예를 들어, GlcNAcMan5GlcNAc2(Fuc) 당형태를 포함하는 재조합 당단백질을 생성시킨다. 미국 특허 제7,029,872호 및 미국 공개 특허원 제2004/0018590호 및 제2005/0170452호는 GlcNAcMan5GlcNAc2 당형태를 포함하는 당단백질을 생성할 수 있는 하등 진핵 숙주 세포를 기재하고 있다. 상기 세포에서 제조된 생성된 당단백질은 헥사미니다제로 시험관내 처리하여 푸코실화된 Man5GlcNAc2(Fuc) 당형태를 포함하는 재조합 당단백질을 제조할 수 있다.
추가의 양태에서, 바로 앞에서 기재된 숙주 세포는 추가로 통상적으로 촉매 도메인과 연합되어 있지 않고 숙주 세포의 ER 또는 골지체로 만노시다제 II 활성을 표적화하도록 선택된 세포 표적화 시그날 펩타이드에 융합된 만노시다제 II 촉매 도메인을 포함한다. 숙주 세포의 ER 또는 골지체를 통한 재조합 당단백질의 통과는 푸코실화된 GlcNAcMan3GlcNAc2 당형태, 예를 들어, GlcNAcMan3GlcNAc2(Fuc) 당형태를 포함하는 재조합 당단백질을 생성시킨다. 미국 특허원 제2004/0230042호는 주로 GlcNAc2Man3GlcNAc2 당형태를 갖는 당단백질을 생성할 수 있고 만노시다제 II 효소를 발현하는 하등 진핵 숙주 세포를 기재하고 있다. 상기 세포에서 생성된 당단백질은 헥사미니다제로 시험관내 처리하여 Man3GlcNAc2(Fuc) 당형태를 포함하는 재조합 당단백질을 생성할 수 있다.
추가의 양태에서, 바로 앞에 기재한 숙주 세포는 추가로 통상적으로 촉매 도메인과 연합되지 않고 숙주 세포의 ER 또는 골지체로 GlcNAc 트랜스퍼라제 II 활성을 표적화하도록 선택된 세포 표적화 시그날 펩타이드에 융합된 GlcNAc 트랜스퍼라제 II(GnTII) 촉매 도메인을 추가로 포함한다. 숙주 세포의 ER 또는 골지체를 통한 재조합 당단백질의 통과는 푸코실화된 GlcNAc2Man3GlcNAc2 당형태, 예를 들어, GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc) 당형태를 포함하는 재조합 당단백질을 생성시킨다. 미국 특허 제7,029,872호 및 미국 공개 특허원 제2004/0018590호 및 제2005/0170452호는 GlcNAc2Man3GlcNAc2 당형태를 포함하는 당단백질을 생성할 수 있는 하등 진핵세포 숙주 세포를 기재하고 있다. 상기 세포에서 생성된 당단백질은 헥사미니다제로 시험관내 처리하여 Man3GlcNAc2(Fuc) 당형태를 포함하는 재조합 당단백질을 생성할 수 있다.
추가의 양태에서, 바로 앞에서 기재한 숙주 세포는 통상적으로 촉매 도메인과 연합되지 않고 숙주 세포의 ER 또는 골지체로 갈락토스 트랜스퍼라제 II 활성을 표적화하도록 선택된 세포 표적화 시그날 펩타이드에 융합된 갈락토스 트랜스퍼라제 II 촉매 도메인을 포함한다. 숙주 세포의 ER 또는 골지체를 통한 재조합 당단백질의 통과는 푸코실화된 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 당형태, 예를 들어, Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc) 당형태를 포함하는 재조합 당단백질을 생성시킨다. 미국 공개 특허원 제2006/0040353호는 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 당형태를 포함하는 당단백질을 생성할 수 있는 하등 진핵 숙주 세포를 기재한다. 상기 세포에서 제조된 당단백질은 갈락토시다제로 시험관내 처리하여 푸코실화된 GlcNAc2Man3GlcNAc2 당형태, 예를 들어, GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc) 당형태를 포함하는 재조합 당단백질을 생성할 수 있다.
추가의 양태에서, 바로 앞에서 기재한 숙주 세포는 추가로 통상적으로 촉매 도메인과 연합되지 않고 숙주 세포의 ER 또는 골지체로 시알리트랜스퍼라제 활성을 표적화하도록 선택된 세포 표적화 시그날 펩타이드에 융합된 시알리트랜스퍼라제 촉매 도메인을 포함한다. 숙주 세포의 ER 또는 골지체를 통한 재조합 당단백질의 통과는 푸코실화된 NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 당형태, 예를 들어, NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc) 당형태를 포함하는 재조합 당단백질을 생성시킨다. 효모 및 사상균과 같은 하등 진핵 숙주 세포에 대해 숙주 세포가 추가로 N-글리칸으로의 전달을 위해 CMP-시알산을 제공하는 수단을 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 미국 공개된 특허원 제2005/0260729호는 하등 진핵 세포를 유전자 조작하여 CMP-시알산 합성 경로를 갖도록 하는 방법을 기재하고 있고 미국 공개된 특허원 제2006/0286637호는 하등 진핵 세포를 유전자 조작하여 시알화된 당단백질을 제조하는 방법을 기재하고 있다. 상기 세포에서 생성된 당단백질은 뉴라미니다제로 시험관내 처리하여 푸코실화된 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 당형태, 예를 들어, Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc) 당형태를 포함하는 재조합 당단백질을 생성시킬 수 있다.
이전에 기재한 숙주 세포들중 임의의 하나는 GnTIII, GnTIV, GnTV, GnTVI, 및 GnTIX로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 GlcNAc 트랜스퍼라제를 추가로 포함하여 미국 공개 특허원 제2004/074458호 및 제2007/0037248호에 기재된 바와 같은 이등분되고/되거나 다중 안테나의 N-글리칸 구조를 갖는 당단백질을 생성할 수 있다. 이전에 기재된 다양한 숙주 세포는 UDP-GlcNAc 수송체(예를 들어, 클루이베로마이세스 락티스 및 무스 무스쿨루스(Mus musculus) UDP-GlcNAc 수송체), UDP-갈락토스 수송체(예를 들어, 드로소필라 멜라노가스터 UDP-갈락토스 수송체), 및 CMP-시알산 수송체(예를 들어, 사람 시알산 수송체)와 같은 하나 이상의 당 수송체를 추가로 포함할 수 있다. 효모 및 사상균과 같은 하등 진핵 숙주 세포는 당해 수송체가 결핍되어 있기 때문에 효모 및 사상균과 같은 하등 진핵 숙주 세포는 유전자 조작하여 당해 수송체를 포함하도록 하는 것이 바람직할 수 있다.
상기 숙주 세포의 추가의 양태에서, 당해 숙주 세포는 추가로 유전자 조작하여 β-만노실트랜스퍼라제 유전자(BMT2)를 결실시키거나 파괴함으로써 α-만노시다제-내성 N-글리칸을 갖는 당단백질(문헌참조: 미국 공개 특허원 제2006/0211085호)을 제거하고 포스포만노실 트랜스퍼라제 유전자 PNO1 및 MNN4B중 하나 또는 둘다를 결실시키거나 파괴함으로써 포스포만노스 잔기를 갖는 당단백질(문헌참조: 미국 공개 특허원 제2006/0160179호 및 제2004/0014170호)를 제거한다. 상기 숙주 세포의 추가의 양태에서, 숙주 세포는 추가로 유전자 변형시켜 하나 이상의 Dol-P-Man:단백질 (Ser/Thr) 만노실 트랜스퍼라제 유전자(PMT)를 결실시키거나 파괴함으로써 당단백질의 O-글리코실화를 제거한다(문헌참조: 미국 특허 제5,714,377호).
특정 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자 또는 전사 단위체의 코돈 최적화가 암호화된 폴리펩타이드의 발현을 증가시키는, 즉 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA의 해독을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본원에 기재된 숙주 세포의 경우, 암호화된 효소의 증가된 발현은 푸코실화된 N-글리칸의 생성을 증가시킬 수 있는 암호화된 효소를 보다 많이 생성할 것이다. 코돈 최적화와 관련하여 용어 "발현" 및 이의 변형 어구는 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA의 해독을 언급하는 것이지 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 전사를 언급하는 것이 아니다. 본원에 사용된 용어 "유전자"는 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈 DNA 또는 RNA 둘다 및 폴리펩타이드를 암호화하는 cDNA를 언급한다.
코돈 최적화는 유전자 본래의 유전자 환경과는 상이한 뉴클레오타이드 코돈 사용을 나타내는 외래 유전자 환경으로 유전자가 이동되는 경우 유전자의 이종 발현을 개선시키거나 유전자가 본래에 고도로 발현되는 유전자를 암호화하는 유전자 환경에 고유한 유전자에 통상 사용되지 않는 하나 이상의 뉴클레오타이드 코돈을 포함하는 경우 이의 본래의 유전자 환경에서 유전자의 비정규적 발현을 개선시키고자 추구하는 과정이다. 다른 말로, 코돈 최적화는 특정 유전자 환경 또는 유기체에서 비교적 낮은 빈도로 사용되는 유전자의 뉴클레오타이드 코돈을 당해 유전자 환경 또는 유기체에서 보다 높은 빈도로 발현되는 유전자에서 사용되는 뉴클레오타이드 코돈으로 대체함을 포함한다. 이러한 방식으로, 유전자 생성물(폴리펩타이드)의 발현(해독)은 증가한다. 고발현된 유전자에서 높은 빈도로 나타나는 뉴클레오타이드 코돈이 낮은 빈도로 나타나는 뉴클레오타이드 코돈보다 효율적으로 해독되는 것으로 추정된다.
일반적으로, 특정 유전자에 대한 뉴클레오타이드 코돈을 최적화시키는 방법은 유기체에서 고도로 발현되는 유전자에 사용되는 아미노산 각각에 대한 뉴클레오타이드 코돈의 빈도를 확인함에 이어서 고도로 발현되는 유전자에서 낮은 빈도로 사용되는 목적하는 유전자내 뉴클레오타이드 코돈을 고도로 발현된 유전자에서 사용되는 것으로서 확인된 뉴클레오타이드 코돈으로 대체하는 것에 의존한다(문헌참조: Lathe, Synthetic Oligonucleotide Probes Deduced from Amino Acid Sequence Data: Theoretical and Practical Considerations, J. Molec. Biol.: 183: 1-12 (1985); Nakamura et al., Nuc. Acid Res. 28: 292 (2000); Fuglsang, Protein Expression & Purification 31 : 247-249 (2003)). 유전자를 암호화하는 유기체의 핵산의 뉴클레오타이드 코돈을 자동으로 분석하고 유기체에서 낮은 빈도로 존재하는 뉴클레오타이드 코돈을 유기체에서 고도로 발현되는 유전자에서 발견되는 뉴클레오타이드 코돈으로 대체하기 위한 뉴클레오타이드 코돈을 제안하는 많은 컴퓨터 프로그램이 있다.
하기의 실시예는 본 발명의 추가의 이해를 촉진시키기 위해 의도된 것이다.
실시예 1
본 실시예는 당단백질의 N-글리칸 구조에서 푸코스를 포함하는 당단백질을 생성할 수 있는 피치아 파스토리스 균주의 작제를 보여준다.
에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 균주 TOPl0 또는 XLlO-Gold를 재조합 DNA 작업을 위해 사용한다. PNGase-F인 제한효소 및 변형 효소들을 제조사(New England BioLabs (Beverly, MA))로부터 구입하고 제조업자에 의해 지시된 바와 같이 사용한다. α-1,6-푸코시다제를 제조사(Sigma-Aldrich (St. Louis, MO))로부터 구입하고 제조업자에 의해 권장된 바와 같이 사용한다. 올리고뉴클레오타이드는 제조사(Integrated DNA Technologies (Coralville, IA))로부터 구입한다. 금속 킬레이팅 "HisBind" 수지는 제조사(Novagen (Madison, WI))로부터 구입한다. 96-웰 용해물-세정 플레이트를 제조사(Promega (Madison, WI))로부터 구입한다. 단백질 결합 96-웰 플레이트는 제조사(Millipore (Bedford, MA))로부터 구입한다. 염 및 완충제는 제조사(Sigma-Aldrich (St. Louis, MO))로부터 구입한다.
푸코실화 경로 유전자의 증폭
푸코실화 경로의 개요는 도 1에 나타낸다. hGMD의 개방 판독 프레임(ORF)은 제조업자에 의해 권장된 과정에 따라 어드밴티지(Advantage) 2 폴리머라제를 사용하여 사람 간 cDNA(제조원: BD Biosciences, Palo Alto, CA)로부터 증폭시킨다. 간략하게, 프라이머 SH415 및 SH413 (각각, 5'-GGCGG CCGCC ACCAT GGCAC ACGCA CCGGC ACGCT GC-3' (서열번호 15) 및 5'- TTAAT TAATC AGGCA TTGGG GTTTG TCCTC ATG-3' (서열번호 16)를 사용하여 하기의 조건에 따라 사람 간 cDNA 기원의 1,139bp 생성물을 증폭시킨다: 3분동안 97℃; 30초동안 97℃의 35회 사이클, 30초동안 50℃, 2분동안 72℃; 및 10분동안 72℃. 이이서 당해 생성물을 pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA)에 클로닝하고 서열분석하고 수득한 작제물을 pSH985로 명명한다.
상기 명시된 조건에 따라, 프라이머 SH414 및 SH411 (각각 5'-GGCGG CCGCC ACCAT GGGTG AACCC CAGGG ATCCA TG-3' (서열번호 17) 및 5'-TTAAT TAATC ACTTC CGGGC CTGCT CGTAG TTG-3' (서열번호 18))을 사용하여 사람 FX 유전자의 ORF에 상응하는 사람 신장 cDNA(BD Biosciences, Palo Alto, CA)로부터 986 bp 단편을 증폭시킨다. 이어서, 당해 단편을 pCR2.1에 클로닝하고, 서열분석하고 pSH988로 명명한다.
사람 GFTr의 ORF는 상기 명시된 조건 및 프라이머 RCD679 및 RCD680 (각각, 5'-GCGGC CGCCA CCATG AATAG GGCCC CTCTG AAGCG G-3' (서열번호 19) 및 5'-TTAAT TAATC ACACC CCCAT GGCGC TCTTC TC-3' (서열번호 20))을 사용하여 사람 비장 cDNA(BD Biosciences, Palo Alto, CA)로부터 증폭시킨다. 수득한 1,113 bp 단편을 pCR2.1에 클로닝하고 서열분석함에 이어서 pGLY2133로 명명한다.
아미노산 32번 내지 575번을 암호화하고, 내인성 막관통 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드가 결핍된 절단된 형태의 마우스 FUT8 ORF는 상기 명시된 조건 및 프라이머 SH420 및 SH421 (각각, 5'- GCGGC GCGCC GATAA TGACC ACCCT GATCA CTCCA G-3' (서열번호 21) 및 5'- CCTTA ATTAA CTATT TTTCA GCTTC AGGAT ATGTG GG-3' (서열번호 22))을 사용하여 마우스 뇌 cDNA(BD Biosciences, Palo Alto, CA)로 부터 증폭시킨다. 수득한 1,654 bp 단편을 pCR2.1에 클로닝하고 서열분석하고 pSH987로 명명한다.
효모 발현 카세트에서 푸코실화 유전자의 생성
GMD, FX 및 GFTr에 대한 개방 판독 프레임은 당해 벡터를 NotI 및 PacI 제한 효소로 분해하여 NotI 호환성 5'말단 및 PacI 호환성 3' 말단을 갖는 DNA 단편을 생성시킴으로써 제조한다. FUT8 단편은 AscI 및 PacI 제한 효소로 분해시켜 AscI 호환성 5' 말단 및 PacI 호환성 3' 말단을 갖는 DNA를 생성시킴으로써 제조한다.
GMD 발현 카세트를 생성시키기 위해, GMD를, 피.파스토리스 GAPDH 프로모터 및 에스.세레비지애 CYC 전사 종결인자 서열을 포함하고 피치아 게놈의 Trp2 ORF 하류에 통합되도록 디자인된 효모 발현 벡터 pSH995에 누르세오트리신 내성 마커를 사용하여 클로닝시킨다. 당해 벡터는 도 3A에서 설명한다. 벡터 pSH985를 NotI 및 PacI를 사용하여 분해시켜 GMD ORF를 함유하는 1.1 Kb 단편을 절단해내고 이는 이어서 동일한 효소로 사전에 분해된 pSH995로 서브클로닝시킨다. GAPDH 프로모터의 조절하에 GMD를 포함하는 수득한 벡터는 pSH997로 명명한다.
FX 발현 카세트를 제조하기 위해, 벡터 pSH988를 NotI 및 PacI로 분해시켜 FX ORF를 함유하는 1.0Kb 단편을 절단해내고 이는 T4 DNA 폴리머라제로 처리하여 일본쇄 오버행을 제거한다(문헌참조: J. Sambrook , D. W. Russell, Molecular Cloning: A laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, ed. 3rd, 2001)). 이어서 당해 단편을 이전에 NotI 및 AscI로 분해되고 T4 DNA 폴리머라제로 처리된 벡터 pGLY359 (Hamilton et al., Science 313, 1441 (2006))에 서브클로닝한다. 수득한 벡터 pSH994는 FX ORF가 5' 말단에서 작동가능하게 피.파스토리스 PMA1 프로모터(PpPMA1 Prom)에 연결되고 3' 말단에서 피.파스토리스 PMA 전사 종결인자 서열(PpPMA1 tt)에 연결되어 이루어진 FX 발현 카세트를 함유한다. 당해 발현 카세트는 SwaI 제한 효소로 플랭킹한다.
GFTr 발현 카세트는 pGLY2133을 NotI 및 PacI로 분해시켜 GFTr ORF를 함유하는 1.1kb 단편을 절단해내고 이를 T4 DNA 폴리머라제로 처리함으로써 제조한다. 이어서 당해 단편을 이전에 NotI 및 PacI로 분해되고 T4 DNA 폴리머라제로 처리된 벡터 pGLY363 (Hamilton, supra.)에 서브클로닝시킨다. 수득한 벡터 pGLY2143는 GFTr ORF가 작동가능하게 5' 말단에서 PpPMA1prom과 연결되고 3'말단에서 PpPMA1tt에 연결되어 이루어진 GFTr 발현 카세트를 함유한다. 당해 발현 카세트는 RsrII 제한 부위에 의해 플랭킹시킨다.
효모 위치화 시그날에 융합된 FUT8 촉매 도메인을 생성하기 위해, Mnn2의 에스.세레비지애 표적화 영역의 처음 36개 아미노산을 GeneOptimizer 소프트웨어로 분석하고 피.파스토리스 발현을 위해 코돈 최적화시킨다(GeneArt, Regensburg, Germany). ScMnn2 아미노산 1번 내지 36번에 대해 수득한 합성 DNA를 5' NotI 및 3' AscI 제한 효소 호환성 말단을 갖도록 생성시키고 셔틀벡터에 클로닝하여 플라스미드 벡터 pSH831를 제조한다. 이어서, 당해 벡터 pSH987를 AscI 및 PacI로 분해시켜 FUT8 촉매 도메인 ORF를 암호화하는 1.6 Kb 단편을 분리하고 이어서 이전에 동일한 효소로 분해된 벡터 pSH831내의 ScMnn2 표적화 펩타이드를 암호화하는 DNA 로 프레임내 서브클로닝한다. 수득한 벡터를 pSH989로 명명한다. FUT8-ScMnn2 발현 카세트를 제조하기 위해, pSH989를 NotI 및 PacI로 분해하여 1.8kb 단편을 분리해내고 이를 동일한 효소로 분해된 벡터 pGLY361 (Hamilton et al., Science 313, 1441 (2006))에 서브클로닝한다. 수득한 벡터 pSH991는 FUT8-Mnn2 융합 ORF가 작동가능하게 5' 말단에서 피.파스토리스 TEF 프로모터(PpTEFprom)에 연결되고 3'말단에서 피.파스토리스 TEF 전사 종결인자 서열(PpTEFtt)로 연결되어 이루어진 FUT8-Mnn2 융합 단백질을 함유한다. 발현 카세트는 SgfI 제한 부위에 의해 플랭킹시킨다.
푸코실화 조작 벡터의 생성
벡터 pSH994를 SwaI로 분해사여 FX 발현 카세트를 함유하는 2.5kb 단편을 분리하고 이는 PmeI로 분해된 pSH997(GMD 발현 카세트 함유)에 서브클로닝한다. PMA-FX 및 GAPDH-GMD 발현 카세트가 동일한 방향으로 정렬된 수득한 벡터는 pSH1009로 명명한다. PMA-GFTr 발현 카세트를 함유하는 2.7Kb 단편을 제한 효소 RsrII을 사용하여 pGLY2143로부터 절단해 내고 당해 동일한 효소로 분해된 pSH1009에 서브클로닝한다. PMA-GFTr 및 GAPDH 발현 카세트가 동일한 방향으로 정렬된 수득한 벡터를 SH1019로 명명한다. 최종적으로, 1.8 Kb TEF-FUT8 카세트를 SgfI를 사용하여 pSH991로부터 절단해 내고 동일한 효소로 분해된 pSH1019에 서브클로닝한다. TEF-FUT8 및 GAPDH 발현 카세트가 동일한 방향으로 정렬된 수득한 벡터를 pSH1022로 명명한다. 당해 벡터를 도 2B에서 설명한다.
래트 EPO 발현 벡터의 생성
아미노산 27번 내지 192번을 암호화하는 절단된 형태의 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus) 에리트로포이에틴 유전자(rEPO)를 제조업자에 의해 권장된 바와 같이 어드밴티지 2 폴리머라제를 사용하여 래트 신장 cDNA(BD Biosciences, Palo Alto, CA)로부터 증폭시킨다. 간략하게, 프라이머 rEPO-정방향 및 rEPO-역방향(각각 5'-GGGAA TTCGC TCCCC CACGC CTCAT TTGCG AC-3' (서열번호 23) 및 5'-CCTCT AGATC ACCTG TCCCC TCTCC TGCAG GC-3' (서열번호 24))을 사용항 하기의 사이클링 조건에 따라 래트 신장 cDNA로부터 516 bp 생성물을 증폭시킨다: 1분동안 94℃에서 1회 사이클; 30초동안 94℃에서, 1분동안 72℃에서 5회 사이클; 30초동안 94℃에서, 1분동안 70℃에서 5회 사이클; 20초동안 94℃에서, 1분동안 68℃에서 25회 사이클. 이어서, 당해 생성물을 pCR2.1(Invitrogen, Carlsbad, CA)로 서브클로닝하고 서열분석하고 수득한 작제물을 pSH603로 명명한다. 효모 발현 벡터를 생성하기 위해, pSH603을 EcoRI 및 XbaI로 분해하여 506 bp 단편을 분리하고 이는 당해 동일한 효소로 사전에 분해된 pPICZαA (Invitrogen, Carlsbad, CA)로 서브클로닝한다. 수득한 발현 벡터를 pSH692로 명명한다. pSH692내 rEPO를 AOX 메탄올 유도성 프로모터의 조절하에 있도록 한다.
효모 균주의 생성 및 래트 EPO 의 제조
주로 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸을 갖는 재조합 당단백질을 생성할 수 있는 피.파스토리스 당조작된 세포주 YGLYl062(Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸을 갖는 당단백질을 생성하는, 미국 공개 특허원 제2006/0040353호에 기재된 균주와 유사함)를 벡터 PSH692로 형질전환시켜 균주 RDP974를 수득하고 이는 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸을 갖는 재조합 래트 EPO(rEPO)를 생성한다. 균주 RDP974는 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸을 갖는 래트 EPO를 생성하는, 문헌[참조: Hamilton et al., Science 313, 1441-1443 (2006)]에 기재된 균주 RDP762와 유사하다.
RPD974 균주는 OCH1, PNO1, MNN4B, 및 BMT2 유전자가 결실되어 있고 전장 클루이베로마이세스 락티스 UDP-GlcNAc 수송체, 엠.무스쿨루스 UDP-GlcNAc 수송체, 에스.세레비지애 UDP-갈락토스 4-에피머라제 및 디.멜라노가스터 UDP-갈락토스 수송체를 암호화하는 DNA; 및 에스.세레비지애 MNN2 리더 서열의 아미노산 1번 내지 36번을 암호화하는 DNA에 융합된 엠.무스쿨루스 α1,2-만노시다제 I 촉매 도메인을 암호화하는 DNA; 에스.세레비지에 MNN2 리더 서열의 아미노산 1번 내지 36번을 암호화하는 DNA에 융합된 에이치.사피엔스 β1,2-GlcNAc 트랜스퍼라제 I(GnTI) 촉매 도메인을 암호화하는 DNA; 에스.세레비지애 MNN2 리더 서열의 아미노산 1번 내지 36번을 암호화하는 DNA에 융합된 드로소필라 멜라노가스터 만노시다제 II 촉매 도메인을 암호하하는 DNA; 에스.세레비지애 MNN2 리더 서열의 아미노산 1번 내지 97번을 암호화하는 DNA로 융합된 래투스 노르베기쿠스 β1,2-GlcNAc 트랜스퍼라제 II(GnTII) 촉매 도메인을 암호화하는 DNA; 및 에스.세레비지애 KRE2(MNTI) 리더 서 열의 아미노산 1번 내지 58번을 암호화하는 DNA로 융합된 에이치.사피엔스 β1,4-갈락토실트랜스퍼라제(GalTI)를 암호화하는 DNA를 포함한다. 미국 공개 특허원 제2006/0040353호는 하등 효모에서 갈락토실화된 당단백질을 생성하는 피치아 파스토리스 세포주를 제조하는 방법을 기재하고 있다[문헌참조: 미국 특허 제7,029,872호, 미국 공개 특허원 제2004/0018590호, 제2004/0230042호, 제2005/0208617호, 제2004/0171826호, 제2006/0286637호, 및 제2007/0037248호, 및 Hamilton et al., Science 313, 1441-1443 (2006)].
이어서 균주 RDP974는 벡터 pSH1022에서 푸코실화 경로를 도입하기 위한 숙주 균주로서 사용한다. 간략하게, 10㎍의 조절 플라스미드 pSH995 또는 푸코실화 경로 플라스미드 pSH1022를 제한 효소 SfiI로 분해하여 벡터를 선형화하고 전기천공에 의해 숙주 균주 RDP974에 형질전환시킨다. 형질전환된 세포를 100 ng/mL의 누르세오트리신을 함유하는 YPD상에 도말하고 5일동안 26℃에서 배양한다. 이어서 여러 클론을 선별하고 rEPO의 N-글리칸상으로의 푸코스 전달에 대해 분석한다. 대조군 벡터로 형질전환된 균주를 YSH660로 명명하고, pSH1022로 형질전환되고 푸코스 전달을 입증하는 균주는 YSH661로 명명한다.
통상적으로, 단백질 발현은 형질전환된 균주를 1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 100 mM 인산칼륨 완충액, pH 6.0, 1.34% 효모 질소 염기, 4 X 10-5% 비오틴, 및 1% 글리세롤로 이루어진 성장 배지로서의 50ml의 완충 글리세롤-복합 배지(BMGY)중에서 26℃에서 성장시킴으로써 수행한다. 단백질 발현의 유도는 BMGY에서 글리세롤 대신 1.5% 메탄올로 이루어진 5ml의 완충 메탄올-복합 배지(BMMY)에서 수행한다.
재조합 rEPO는 상기된 바와 같이 발현시키고 Ni-킬레이트 칼럼으로 문헌[참조: Choi et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 100, 5022 (2003) and Hamilton et al. (Science 301, 1244 (2003)]에 기재된 바와 같이 정제한다. 수득한 단백질을 SDS-PAGE (Laemmli, Nature 227, 680 (1970))로 분석하고 가시화하기 위해 쿠마시 블루로 염색한다. 푸코스를 제조업자에 의해 권장된 바와 같이 α-1,6-푸코시다제(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 처리로 시험관내 분해하여 제거한다.
글리칸 분석을 위해, 글리칸을 PNGase-F (Choi et al. (2003); Hamilton et al. (2003))로 처리함에 의해 rEPO로부터 유리시킨다. 방출된 글리칸을 MALDI/타임-오브-플라이트(Time-of-flight)(TOF) 질량 분광기로 분석하여 글리칸 구조를 확인한다(Choi et al. (2003)). 존재하는 푸코실화된 글리칸의 양을 정량하기 위해, N-글리코시다제 F 방출된 글리칸을 2-아미노벤지딘(2-AB)으로 표지시키고 HPLC로 분석한다(Choi et al. (2003)). 푸코실화되고 비-푸코실화된 글리칸의 %는 푸코시다제 처리 전후 각각의 종의 피크 면적을 비교함으로써 계산한다.
필수적으로 상기된 바와 같이 제조된 균주 YSH661에서 생성된 N-글리칸의 분석은 당해 균주가 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc) N-글리칸을 포함하는 재조합 rEPO를 생성함을 보여준다. 균주 YSH661에서 생성된 rEPO상의 N-글리칸의 MALDI-TOF 분석 결과를 보여주는 도 4A는 균주가 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc) Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸으로 이루어진 N-글리칸을 생성함을 보여준다. Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc) N-글리칸은 박스내에 있다. 대조군 균주 YSH660(푸코실 화 경로 없음)에서 생성된 rEPO 상의 N-글리칸의 MALDI-TOF 분석을 보여주는 도 4B는, 균주가 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2만을 포함하는 푸코실화되지 않은 N-글리칸만을 생성함을 보여준다.
실시예 2
NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc) N-글리칸을 갖는 당단백질을 생성할 수 있는 피치아 파스토리스 균주는 벡터 pSH1022를 NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸을 갖는 당단백질을 생성할 수 있는 피치아 파스토리스 균주로 도입함에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 푸코실화 경로의 성분을 암호화하는 유전자를 함유하는 벡터 pSH1022를 사용하여 NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸을 갖는 래트 EPO를 생성하고 미국 임시특허원 제60/801,688호 및 문헌[Hamilton et al. Science 313, 1441-1443 (2006)]에 기재된 균주 YSH597를 형질전환시킬 수 있다. 유도 즉시 균주에서 생성되는 래트 EPO는 NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc) N-글리칸을 포함한다.
다음은 시알릴화 경로를 암호화하는 효소를 실시예 1의 균주 YSH661로 도입하는 추정 방법을 제공한다.
호모 사피엔스 UDP-N-아세틸글루코사민-2-에피머라제/N-아세틸만노사민 키나제(GNE), 에이치.사피엔스 N-아세틸뉴라미네이트-9-포스페이트 신타제 (SPS), 에이치.사피엔스 CMP-시알산 신타제(CSS), 무스 무스쿨루스 CMP-시알산 수송체(CST), 및 엠.무스쿨루스 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제(ST)의 아미노산 40번 내지 403번에 대한 개방 판독 프레임은 GeneOptimizer 소프트웨어로 분석하고 피.파스토리스 발현을 위해 코돈 최적화한다(GeneArt, Regensburg, Germany). GNE, SPS, CSS 및 CST에 대해 수득한 합성 DNA는 5' BsaI 및 3' HpaI 제한 부위를 갖도록 생성시키고 셔틀 벡터로 클로닝하고 각가 pGLY368, 367, 366 및 369로 명명한다. ST에 대한 합성 DNA는 5' AscI 및 3' PacI 제한 부위를 갖도록 생성시키고 셔틀 벡터에 클로닝시키고 pS660로 명명한다. SPS, CSS 및 CST 발현 카세트를 제조하기 위해, 벡터 pGLY367, 366 및 369를 BsaI 및 HpaI로 분해하여 1.1, 1.3, 및 1.0 Kb 단편들을 절단해내고 이들을 T4 DNA 폴리머라제로 처리하여 일본쇄 오버행을 제거한다. 이어서, 이들 단편을 벡터 pGLY359, 17, 및 363(이들은 T4 DNA 폴리머라제로 처리되고 앞의 하나의 벡터는 NotI 및 AscI로 사전에 분해시키고, 뒤의 2개의 벡터는 NotI 및 PacI로 사전에 분해시킴)에 서브클로닝한다. PpPMA1prom-PpPMAltt 카세트에서 SPS를 함유하는 수득한 벡터 pSH819는 PacI 제한 부위에 의해 플랭킹되고; PpGAPDH-ScCYCtt 카세트에서 CSS를 함유하는 pSH824는 5' BglII 및 3' BamHI 제한 부위에 의해 플랭킹되고; PpPMA1prom-PpPMAltt 카세트에서 CST를 함유하는 pGLY372는 RsrII 제한 부위에 의해 플랭킹된다. 효모 위치화 시그날에 융합된 ST 촉매 도메인을 생성시키기 위해, Mnt1의 에스.세레비지애 표적화 영역은 Taq DNA 폴리머라제(Promega, Madison, WI) 및 프라이머 ScMntl-for 및 ScMntl-rev (각각 5'-GGGCGGCCGCCACCATGGCCCTCTTTCTC AGTAAGAGACT GTTGAG-3' (서열번호 25) 및 5'-CCGGCGCGCCCGATGACTTGTTG TTCAGGGGATATAGATCCTG-3' (서열번호 26))를 사용하여 게놈 DNA로부터 증폭시킨다. 사용되는 조건은 다음과 같다: 3분동안 94℃, 1회 사이 클; 30초동안 94℃, 20초동안 55℃, 1분동안 68℃, 30회 사이클; 5분동안 68℃, 1회 사이클. 5' NotI 및 3' AscI 제한 부위를 함유하는 수득한 174bp 단편은 코돈 최적화된 ST에 5' 프레임내 서브클로닝하여 vector pSH861를 작제한다. 이어서 당해 벡터를 NotI 및 PacI로 분해하여 ST-융합을 함유하는 1.3Kb 단편을 절단해 내고 T4 DNA 폴리머라제로 처리하고 NotI 및 PacI로 분해시켜 제조된 pGLY361로 서브클로닝하고, T4 DNA 폴리머라제로 처리한다. SgfI 제한 부위에 의해 플랭킹된 PpTEFprom-PpTEFtt 카세트에서 ST-융합을 함유하는 수득한 벡터를 pSH893으로 명명한다.
피.파스토리스 GAPDH 프로모터 및 에스.세레비지애 CYC 전사 종결인자를 함유하는 효모 발현 벡터 pSH823은 Trp2 ORF의 하류에서 피치아 게놈으로 통합되도록 디자인되어 있다. PMA-CST 발현 카세트를 암호화하는 2.6Kb 단편은 제한 효소 RsrII를 사용하여 pGLY372로부터 절단해내고 동일한 효소로 분해된 pSH823으로 서브클로닝한다. PMA-CST 및 GAPDH 발현 카세트가 동일한 방향으로 정렬된 수득한 벡터를 pSH826로 명명한다. 이어서 당해 벡터를 제한 효소 NotI 및 PacI로 분해하고 일본쇄 오버행을 T4 DNA 폴리머라제로 제거한다. 당해 선형화된 작제물에 BsaI 및 HpaI로 분해하여 pGLY368로부터 분리된 GNE의 2.2Kb 단편을 T4 DNA 폴리머라제로 처리하여 일본쇄 오버행을 제거하고 서브클로닝한다. 당해 벡터를 pSH828로 명명한다. 이어서 당해 벡터를 PacI로 분해하고 여기에 PMA-SPS 발현 카세트를 암호화하는 pSH819의 2.7Kb PacI 단편을 서브클로닝한다. PMA-SPS 발현 카세트가 GAPDH 발현 카세트에 반대 배향으로 정렬된, 수득된 벡터를 pSH830로 명명한다. 이러한 단 계에서, XhoI를 사용하여 pSH830으로부터 2.4Kb URA5 단편을 절단해내고 이를 동일한 효소로 분해된 pSH842 기원의 HIS1의 1.8Kb 단편으로 대체함으로써 URA5 마커를 HISl으로 대체한다. HIS1 ORF가 GAPDH-GNE 발현 카세트와 동일한 방향으로 정렬된 수득한 벡터를 pSH870로 명명한다. 이어서, 당해 벡터를 BamHI으로 분해하고 BamHI 및 BglII로 분해함에 의해 분리된, GAPDH-CSS 발현 카세트를 함유하는 pSH824 기원의 2.1 Kb의 단편을 서브클로닝한다. 새롭게 도입된 발현 카세트가 GAPDH-GNE 카세트와 반대 방향으로 배향된 생성된 벡터를 pSH872로 명명한다. 이어서, TEF-ST를 함유하는 2.2Kb 발현 카세트를 pSH893 기원의 SgfI으로 분해시키고 동일한 효소로 분해된 pSH872로 서브클로닝한다. TEF-ST 카세트가 GAPDH-GNE 카세트와 반대 방향으로 배향된 생성된 벡터를 pSH926으로 명명한다.
pSH926 벡터를 사용하여 균주 YSH661를 형질전환시키고 당해 균주는, NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸을 갖는 래트 EPO를 생성할 수 있다.
실시예 3
NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc) N-글리칸을 갖는 사람 EPO를 생성할 수 있는 피치아 파스토리스 균주는 NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸을 갖는 사람 EPO를 생성할 수 있는 피치아 파스토리스 균주로 벡터 pSH1022를 도입함에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어, 푸코실화 경로의 성분을 암호화하는 유전자를 함유하는 벡터 pSH1022를 사용하여, NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸을 갖는 당단백질을 생성할 수 있는 균주, 예를 들어, 문헌[참조: Hamilton et al., Science 313, 1441-1443 (2006)]에 기재된 균주 YSH597 또는 시알릴화 경로 효소를 암호화하는 유전자를 포함하지만 래트 EPO를 암호화하는 DNA가 사람 EPO를 암호화하는 DNA로 대체된 실시예 2의 YSH661를 형질전환시킬 수 있다. 당해 균주는 이어서 NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc) N-글리칸을 갖는 사람 EPO를 생성한다.
본 발명은 본원에서 예시적인 양태를 참조로 기재되었지만 이는 본 발명이 여기로 제한되지 않는 것으로 이해되어야만 한다. 당업자는 이의 범위 내에서 추가의 변형 및 양태를 인지할 것이다. 따라서, 본 발명은 본원에 첨부된 청구항에 의해서만 제한된다.
서열
서열번호 1
DNA
호모 사피안
GDP-만노스-데하이드라타제(hGMD)
Figure 112009061353685-PCT00001
서열번호 2
단백질
호모 사피안
GDP-만노스-데하이드라타제(hGMD)
Figure 112009061353685-PCT00002
서열번호 3
DNA
호모 사피안
GDP-케토-데옥시-만노스-에피머라제/GDP-케토-데옥시-갈락토스-리덕타제 (FX 단백질)
Figure 112009061353685-PCT00003
서열번호 4
단백질
호모 사피안
GDP-케토-데옥시-만노스-에피머라제/GDP-케토-데옥시-갈락토스-리덕타제 (FX 단백질)
Figure 112009061353685-PCT00004
서열번호 5
DNA
호모 사피안
사람 GDP-푸코스 수송체
Figure 112009061353685-PCT00005
서열번호 6
단백질
호모 사피안
사람 GDP-푸코스 수송체
Figure 112009061353685-PCT00006
서열번호 7
DNA
호모 사피안
알파 1,6 푸코실트랜스퍼라제(hFuT8)
Figure 112009061353685-PCT00007
서열번호 8
단백질
호모 사피안
알파 1,6 푸코실트랜스퍼라제(hFuT8)
Figure 112009061353685-PCT00008
서열번호 9
DNA
래트
알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제(rFuT8)
Figure 112009061353685-PCT00009
Figure 112009061353685-PCT00010
서열번호 10
단백질
래트
알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제(rFuT8)
Figure 112009061353685-PCT00011
서열번호 11
DNA
마우스
알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제(mFuT8)
Figure 112009061353685-PCT00012
Figure 112009061353685-PCT00013
서열번호 12
단백질
마우스
알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 (mFuT8)
Figure 112009061353685-PCT00014
서열번호 13
DNA
돼지
알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제(pFuT8)
Figure 112009061353685-PCT00015
서열번호 13
단백질
돼지
알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제(pFuT8)
Figure 112009061353685-PCT00016
서열번호 15
DNA
합성
PCR 프라이머 SH415
Figure 112009061353685-PCT00017
서열번호 16
DNA
합성
PCR 프라이머 SH413
Figure 112009061353685-PCT00018
서열번호 17
DNA
합성
PCR 프라이머 SH414
Figure 112009061353685-PCT00019
서열번호 18
DNA
합성
PCR 프라이머 SH411
Figure 112009061353685-PCT00020
서열번호 19
DNA
합성
PCR 프라이머 RCD679
Figure 112009061353685-PCT00021
서열번호 20
DNA
합성
PCR 프라이머 RCD680
Figure 112009061353685-PCT00022
서열번호 21
DNA
합성
PCR 프라이머 SH420
Figure 112009061353685-PCT00023
서열번호 22
DNA
합성
PCR 프라이머 SH421
Figure 112009061353685-PCT00024
서열번호 23
DNA
합성
PCR 프라이머 rEPO-정방향
Figure 112009061353685-PCT00025
서열번호 24
DNA
합성
PCR 프라이머 rEPO-역방향
Figure 112009061353685-PCT00026
서열번호 25
DNA
합성
PCR 프라이머 ScMnt1-정방향
Figure 112009061353685-PCT00027
서열번호 26
DNA
합성
PCR 프라이머 ScMnt1-역방향
Figure 112009061353685-PCT00028
<110> Glycofi, Inc. <120> Production of glycoproteins with modified fucosylation <130> GF0028Y <150> US 60/905,345 <151> 2007-03-07 <160> 26 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1119 <212> DNA <213> Homo sapians <220> <221> CDS <222> (1)...(1119) <223> GDP-Mannose-dehydratase (hGMD) <400> 1 atg gca cac gca ccg gca cgc tgc ccc agc gcc cgg ggc tcc ggg gac 48 Met Ala His Ala Pro Ala Arg Cys Pro Ser Ala Arg Gly Ser Gly Asp 1 5 10 15 ggc gag atg ggc aag ccc agg aac gtg gcg ctc atc acc ggt atc aca 96 Gly Glu Met Gly Lys Pro Arg Asn Val Ala Leu Ile Thr Gly Ile Thr 20 25 30 ggc cag gat ggt tcc tac ctg gct gag ttc ctg ctg gag aaa ggc tat 144 Gly Gln Asp Gly Ser Tyr Leu Ala Glu Phe Leu Leu Glu Lys Gly Tyr 35 40 45 gag gtc cat gga att gta cgg cgg tcc agt tca ttt aat acg ggt cga 192 Glu Val His Gly Ile Val Arg Arg Ser Ser Ser Phe Asn Thr Gly Arg 50 55 60 att gag cat ctg tat aag aat ccc cag gct cac att gaa gga aac atg 240 Ile Glu His Leu Tyr Lys Asn Pro Gln Ala His Ile Glu Gly Asn Met 65 70 75 80 aag ttg cac tat ggc gat ctc act gac agt acc tgc ctt gtg aag atc 288 Lys Leu His Tyr Gly Asp Leu Thr Asp Ser Thr Cys Leu Val Lys Ile 85 90 95 att aat gaa gta aag ccc aca gag atc tac aac ctt gga gcc cag agc 336 Ile Asn Glu Val Lys Pro Thr Glu Ile Tyr Asn Leu Gly Ala Gln Ser 100 105 110 cac gtc aaa att tcc ttt gac ctc gct gag tac act gcg gac gtt gac 384 His Val Lys Ile Ser Phe Asp Leu Ala Glu Tyr Thr Ala Asp Val Asp 115 120 125 gga gtt ggc act cta cga ctt cta gat gca gtt aag act tgt ggc ctt 432 Gly Val Gly Thr Leu Arg Leu Leu Asp Ala Val Lys Thr Cys Gly Leu 130 135 140 atc aac tct gtg aag ttc tac caa gcc tca aca agt gaa ctt tat ggg 480 Ile Asn Ser Val Lys Phe Tyr Gln Ala Ser Thr Ser Glu Leu Tyr Gly 145 150 155 160 aaa gtg cag gaa ata ccc cag aag gag acc acc cct ttc tat ccc cgg 528 Lys Val Gln Glu Ile Pro Gln Lys Glu Thr Thr Pro Phe Tyr Pro Arg 165 170 175 tca ccc tat ggg gca gca aaa ctc tat gcc tat tgg att gtg gtg aac 576 Ser Pro Tyr Gly Ala Ala Lys Leu Tyr Ala Tyr Trp Ile Val Val Asn 180 185 190 ttc cgt gag gcg tat aat ctc ttt gca gtg aac ggc att ctc ttc aat 624 Phe Arg Glu Ala Tyr Asn Leu Phe Ala Val Asn Gly Ile Leu Phe Asn 195 200 205 cat gag agt ccc aga aga gga gct aat ttc gtt act cga aaa att agc 672 His Glu Ser Pro Arg Arg Gly Ala Asn Phe Val Thr Arg Lys Ile Ser 210 215 220 cgg tca gta gct aag att tac ctt gga caa ctg gaa tgt ttc agt ttg 720 Arg Ser Val Ala Lys Ile Tyr Leu Gly Gln Leu Glu Cys Phe Ser Leu 225 230 235 240 gga aat ctg gat gcc aaa cga gat tgg ggc cat gcc aag gac tat gtg 768 Gly Asn Leu Asp Ala Lys Arg Asp Trp Gly His Ala Lys Asp Tyr Val 245 250 255 gag gct atg tgg ttg atg ttg cag aat gat gag ccg gag gac ttc gtt 816 Glu Ala Met Trp Leu Met Leu Gln Asn Asp Glu Pro Glu Asp Phe Val 260 265 270 ata gct act ggg gag gtc cat agt gtc cgg gaa ttt gtc gag aaa tca 864 Ile Ala Thr Gly Glu Val His Ser Val Arg Glu Phe Val Glu Lys Ser 275 280 285 ttc ttg cac att gga aaa acc att gtg tgg gaa gga aag aat gaa aat 912 Phe Leu His Ile Gly Lys Thr Ile Val Trp Glu Gly Lys Asn Glu Asn 290 295 300 gaa gtg ggc aga tgt aaa gag acc ggc aaa gtt cac gtg act gtg gat 960 Glu Val Gly Arg Cys Lys Glu Thr Gly Lys Val His Val Thr Val Asp 305 310 315 320 ctc aag tac tac cgg cca act gaa gtg gac ttt ctg cag ggc gac tgc 1008 Leu Lys Tyr Tyr Arg Pro Thr Glu Val Asp Phe Leu Gln Gly Asp Cys 325 330 335 acc aaa gcg aaa cag aag ctg aac tgg aag ccc cgg gtc gct ttc gat 1056 Thr Lys Ala Lys Gln Lys Leu Asn Trp Lys Pro Arg Val Ala Phe Asp 340 345 350 gag ctg gtg agg gag atg gtg cac gcc gac gtg gag ctc atg agg aca 1104 Glu Leu Val Arg Glu Met Val His Ala Asp Val Glu Leu Met Arg Thr 355 360 365 aac ccc aat gcc tga 1119 Asn Pro Asn Ala * 370 <210> 2 <211> 372 <212> PRT <213> Homo sapians <400> 2 Met Ala His Ala Pro Ala Arg Cys Pro Ser Ala Arg Gly Ser Gly Asp 1 5 10 15 Gly Glu Met Gly Lys Pro Arg Asn Val Ala Leu Ile Thr Gly Ile Thr 20 25 30 Gly Gln Asp Gly Ser Tyr Leu Ala Glu Phe Leu Leu Glu Lys Gly Tyr 35 40 45 Glu Val His Gly Ile Val Arg Arg Ser Ser Ser Phe Asn Thr Gly Arg 50 55 60 Ile Glu His Leu Tyr Lys Asn Pro Gln Ala His Ile Glu Gly Asn Met 65 70 75 80 Lys Leu His Tyr Gly Asp Leu Thr Asp Ser Thr Cys Leu Val Lys Ile 85 90 95 Ile Asn Glu Val Lys Pro Thr Glu Ile Tyr Asn Leu Gly Ala Gln Ser 100 105 110 His Val Lys Ile Ser Phe Asp Leu Ala Glu Tyr Thr Ala Asp Val Asp 115 120 125 Gly Val Gly Thr Leu Arg Leu Leu Asp Ala Val Lys Thr Cys Gly Leu 130 135 140 Ile Asn Ser Val Lys Phe Tyr Gln Ala Ser Thr Ser Glu Leu Tyr Gly 145 150 155 160 Lys Val Gln Glu Ile Pro Gln Lys Glu Thr Thr Pro Phe Tyr Pro Arg 165 170 175 Ser Pro Tyr Gly Ala Ala Lys Leu Tyr Ala Tyr Trp Ile Val Val Asn 180 185 190 Phe Arg Glu Ala Tyr Asn Leu Phe Ala Val Asn Gly Ile Leu Phe Asn 195 200 205 His Glu Ser Pro Arg Arg Gly Ala Asn Phe Val Thr Arg Lys Ile Ser 210 215 220 Arg Ser Val Ala Lys Ile Tyr Leu Gly Gln Leu Glu Cys Phe Ser Leu 225 230 235 240 Gly Asn Leu Asp Ala Lys Arg Asp Trp Gly His Ala Lys Asp Tyr Val 245 250 255 Glu Ala Met Trp Leu Met Leu Gln Asn Asp Glu Pro Glu Asp Phe Val 260 265 270 Ile Ala Thr Gly Glu Val His Ser Val Arg Glu Phe Val Glu Lys Ser 275 280 285 Phe Leu His Ile Gly Lys Thr Ile Val Trp Glu Gly Lys Asn Glu Asn 290 295 300 Glu Val Gly Arg Cys Lys Glu Thr Gly Lys Val His Val Thr Val Asp 305 310 315 320 Leu Lys Tyr Tyr Arg Pro Thr Glu Val Asp Phe Leu Gln Gly Asp Cys 325 330 335 Thr Lys Ala Lys Gln Lys Leu Asn Trp Lys Pro Arg Val Ala Phe Asp 340 345 350 Glu Leu Val Arg Glu Met Val His Ala Asp Val Glu Leu Met Arg Thr 355 360 365 Asn Pro Asn Ala 370 <210> 3 <211> 966 <212> DNA <213> Homo sapians <220> <221> CDS <222> (1)...(966) <223> GDP-ketoxy-deoxy-mannose-epimerase/GDP-keto-deoxy- galactose-reductase (FX protein) <400> 3 atg ggt gaa ccc cag gga tcc atg cgg att cta gtg aca ggg ggc tct 48 Met Gly Glu Pro Gln Gly Ser Met Arg Ile Leu Val Thr Gly Gly Ser 1 5 10 15 ggg ctg gta ggc aaa gcc atc cag aag gtg gta gca gat gga gct gga 96 Gly Leu Val Gly Lys Ala Ile Gln Lys Val Val Ala Asp Gly Ala Gly 20 25 30 ctt cct gga gag gac tgg gtg ttt gtc tcc tct aaa gac gcc gat ctc 144 Leu Pro Gly Glu Asp Trp Val Phe Val Ser Ser Lys Asp Ala Asp Leu 35 40 45 acg gat aca gca cag acc cgc gcc ctg ttt gag aag gtc caa ccc aca 192 Thr Asp Thr Ala Gln Thr Arg Ala Leu Phe Glu Lys Val Gln Pro Thr 50 55 60 cac gtc atc cat ctt gct gca atg gtg ggg ggc ctg ttc cgg aat atc 240 His Val Ile His Leu Ala Ala Met Val Gly Gly Leu Phe Arg Asn Ile 65 70 75 80 aaa tac aat ttg gac ttc tgg agg aaa aac gtg cac atg aac gac aac 288 Lys Tyr Asn Leu Asp Phe Trp Arg Lys Asn Val His Met Asn Asp Asn 85 90 95 gtc ctg cac tcg gcc ttt gag gtg ggg gcc cgc aag gtg gtg tcc tgc 336 Val Leu His Ser Ala Phe Glu Val Gly Ala Arg Lys Val Val Ser Cys 100 105 110 ctg tcc acc tgt atc ttc cct gac aag acg acc tac ccg ata gat gag 384 Leu Ser Thr Cys Ile Phe Pro Asp Lys Thr Thr Tyr Pro Ile Asp Glu 115 120 125 acc atg atc cac aat ggg cct ccc cac aac agc aat ttt ggg tac tcg 432 Thr Met Ile His Asn Gly Pro Pro His Asn Ser Asn Phe Gly Tyr Ser 130 135 140 tat gcc aag agg atg atc gac gtg cag aac agg gcc tac ttc cag cag 480 Tyr Ala Lys Arg Met Ile Asp Val Gln Asn Arg Ala Tyr Phe Gln Gln 145 150 155 160 tac ggc tgc acc ttc acc gct gtc atc ccc acc aac gtt ttc ggg ccc 528 Tyr Gly Cys Thr Phe Thr Ala Val Ile Pro Thr Asn Val Phe Gly Pro 165 170 175 cac gac aac ttc aac atc gag gat ggc cac gtg ctg cct ggc ctc atc 576 His Asp Asn Phe Asn Ile Glu Asp Gly His Val Leu Pro Gly Leu Ile 180 185 190 cac aag gtg cac ctg gcc aag agc agc ggc tcg gcc ctg acg gtg tgg 624 His Lys Val His Leu Ala Lys Ser Ser Gly Ser Ala Leu Thr Val Trp 195 200 205 ggt aca ggg aat ccg cgg agg cag ttc ata tac tcg ctg gac ctg gcc 672 Gly Thr Gly Asn Pro Arg Arg Gln Phe Ile Tyr Ser Leu Asp Leu Ala 210 215 220 cag ctc ttt atc tgg gtc ctg cgg gag tac aat gaa gtg gag ccc atc 720 Gln Leu Phe Ile Trp Val Leu Arg Glu Tyr Asn Glu Val Glu Pro Ile 225 230 235 240 atc ctc tcc gtg ggc gag gaa gat gag gtc tcc atc aag gag gca gcc 768 Ile Leu Ser Val Gly Glu Glu Asp Glu Val Ser Ile Lys Glu Ala Ala 245 250 255 gag gcg gtg gtg gag gcc atg gac ttc cat ggg gaa gtc acc ttt gat 816 Glu Ala Val Val Glu Ala Met Asp Phe His Gly Glu Val Thr Phe Asp 260 265 270 aca acc aag tcg gat ggg cag ttt aag aag aca gcc agt aac agc aag 864 Thr Thr Lys Ser Asp Gly Gln Phe Lys Lys Thr Ala Ser Asn Ser Lys 275 280 285 ctg agg acc tac ctg ccc gac ttc cgg ttc aca ccc ttc aag cag gcg 912 Leu Arg Thr Tyr Leu Pro Asp Phe Arg Phe Thr Pro Phe Lys Gln Ala 290 295 300 gtg aag gag acc tgt gct tgg ttc act gac aac tac gag cag gcc cgg 960 Val Lys Glu Thr Cys Ala Trp Phe Thr Asp Asn Tyr Glu Gln Ala Arg 305 310 315 320 aag tga 966 Lys * <210> 4 <211> 321 <212> PRT <213> Homo sapians <400> 4 Met Gly Glu Pro Gln Gly Ser Met Arg Ile Leu Val Thr Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Leu Val Gly Lys Ala Ile Gln Lys Val Val Ala Asp Gly Ala Gly 20 25 30 Leu Pro Gly Glu Asp Trp Val Phe Val Ser Ser Lys Asp Ala Asp Leu 35 40 45 Thr Asp Thr Ala Gln Thr Arg Ala Leu Phe Glu Lys Val Gln Pro Thr 50 55 60 His Val Ile His Leu Ala Ala Met Val Gly Gly Leu Phe Arg Asn Ile 65 70 75 80 Lys Tyr Asn Leu Asp Phe Trp Arg Lys Asn Val His Met Asn Asp Asn 85 90 95 Val Leu His Ser Ala Phe Glu Val Gly Ala Arg Lys Val Val Ser Cys 100 105 110 Leu Ser Thr Cys Ile Phe Pro Asp Lys Thr Thr Tyr Pro Ile Asp Glu 115 120 125 Thr Met Ile His Asn Gly Pro Pro His Asn Ser Asn Phe Gly Tyr Ser 130 135 140 Tyr Ala Lys Arg Met Ile Asp Val Gln Asn Arg Ala Tyr Phe Gln Gln 145 150 155 160 Tyr Gly Cys Thr Phe Thr Ala Val Ile Pro Thr Asn Val Phe Gly Pro 165 170 175 His Asp Asn Phe Asn Ile Glu Asp Gly His Val Leu Pro Gly Leu Ile 180 185 190 His Lys Val His Leu Ala Lys Ser Ser Gly Ser Ala Leu Thr Val Trp 195 200 205 Gly Thr Gly Asn Pro Arg Arg Gln Phe Ile Tyr Ser Leu Asp Leu Ala 210 215 220 Gln Leu Phe Ile Trp Val Leu Arg Glu Tyr Asn Glu Val Glu Pro Ile 225 230 235 240 Ile Leu Ser Val Gly Glu Glu Asp Glu Val Ser Ile Lys Glu Ala Ala 245 250 255 Glu Ala Val Val Glu Ala Met Asp Phe His Gly Glu Val Thr Phe Asp 260 265 270 Thr Thr Lys Ser Asp Gly Gln Phe Lys Lys Thr Ala Ser Asn Ser Lys 275 280 285 Leu Arg Thr Tyr Leu Pro Asp Phe Arg Phe Thr Pro Phe Lys Gln Ala 290 295 300 Val Lys Glu Thr Cys Ala Trp Phe Thr Asp Asn Tyr Glu Gln Ala Arg 305 310 315 320 Lys <210> 5 <211> 1095 <212> DNA <213> Homo sapians <220> <221> CDS <222> (1)...(1095) <223> GDP-fucose transporter <400> 5 atg aat agg gcc cct ctg aag cgg tcc agg atc ctg cac atg gcg ctg 48 Met Asn Arg Ala Pro Leu Lys Arg Ser Arg Ile Leu His Met Ala Leu 1 5 10 15 acc ggg gcc tca gac ccc tct gca gag gca gag gcc aac ggg gag aag 96 Thr Gly Ala Ser Asp Pro Ser Ala Glu Ala Glu Ala Asn Gly Glu Lys 20 25 30 ccc ttt ctg ctg cgg gca ttg cag atc gcg ctg gtg gtc tcc ctc tac 144 Pro Phe Leu Leu Arg Ala Leu Gln Ile Ala Leu Val Val Ser Leu Tyr 35 40 45 tgg gtc acc tcc atc tcc atg gtg ttc ctt aat aag tac ctg ctg gac 192 Trp Val Thr Ser Ile Ser Met Val Phe Leu Asn Lys Tyr Leu Leu Asp 50 55 60 agc ccc tcc ctg cgg ctg gac acc ccc atc ttc gtc acc ttc tac cag 240 Ser Pro Ser Leu Arg Leu Asp Thr Pro Ile Phe Val Thr Phe Tyr Gln 65 70 75 80 tgc ctg gtg acc acg ctg ctg tgc aaa ggc ctc agc gct ctg gcc gcc 288 Cys Leu Val Thr Thr Leu Leu Cys Lys Gly Leu Ser Ala Leu Ala Ala 85 90 95 tgc tgc cct ggt gcc gtg gac ttc ccc agc ttg cgc ctg gac ctc agg 336 Cys Cys Pro Gly Ala Val Asp Phe Pro Ser Leu Arg Leu Asp Leu Arg 100 105 110 gtg gcc cgc agc gtc ctg ccc ctg tcg gtg gtc ttc atc ggc atg atc 384 Val Ala Arg Ser Val Leu Pro Leu Ser Val Val Phe Ile Gly Met Ile 115 120 125 acc ttc aat aac ctc tgc ctc aag tac gtc ggt gtg gcc ttc tac aat 432 Thr Phe Asn Asn Leu Cys Leu Lys Tyr Val Gly Val Ala Phe Tyr Asn 130 135 140 gtg ggc cgc tca ctc acc acc gtc ttc aac gtg ctg ctc tcc tac ctg 480 Val Gly Arg Ser Leu Thr Thr Val Phe Asn Val Leu Leu Ser Tyr Leu 145 150 155 160 ctg ctc aag cag acc acc tcc ttc tat gcc ctg ctc acc tgc ggt atc 528 Leu Leu Lys Gln Thr Thr Ser Phe Tyr Ala Leu Leu Thr Cys Gly Ile 165 170 175 atc atc ggg ggc ttc tgg ctt ggt gtg gac cag gag ggg gca gaa ggc 576 Ile Ile Gly Gly Phe Trp Leu Gly Val Asp Gln Glu Gly Ala Glu Gly 180 185 190 acc ctg tcg tgg ctg ggc acc gtc ttc ggc gtg ctg gct agc ctc tgt 624 Thr Leu Ser Trp Leu Gly Thr Val Phe Gly Val Leu Ala Ser Leu Cys 195 200 205 gtc tcg ctc aac gcc atc tac acc acg aag gtg ctc ccg gcg gtg gac 672 Val Ser Leu Asn Ala Ile Tyr Thr Thr Lys Val Leu Pro Ala Val Asp 210 215 220 ggc agc atc tgg cgc ctg act ttc tac aac aac gtc aac gcc tgc atc 720 Gly Ser Ile Trp Arg Leu Thr Phe Tyr Asn Asn Val Asn Ala Cys Ile 225 230 235 240 ctc ttc ctg ccc ctg ctc ctg ctg ctc ggg gag ctt cag gcc ctg cgt 768 Leu Phe Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Gly Glu Leu Gln Ala Leu Arg 245 250 255 gac ttt gcc cag ctg ggc agt gcc cac ttc tgg ggg atg atg acg ctg 816 Asp Phe Ala Gln Leu Gly Ser Ala His Phe Trp Gly Met Met Thr Leu 260 265 270 ggc ggc ctg ttt ggc ttt gcc atc ggc tac gtg aca gga ctg cag atc 864 Gly Gly Leu Phe Gly Phe Ala Ile Gly Tyr Val Thr Gly Leu Gln Ile 275 280 285 aag ttc acc agt ccg ctg acc cac aat gtg tcg ggc acg gcc aag gcc 912 Lys Phe Thr Ser Pro Leu Thr His Asn Val Ser Gly Thr Ala Lys Ala 290 295 300 tgt gcc cag aca gtg ctg gcc gtg ctc tac tac gag gag acc aag agc 960 Cys Ala Gln Thr Val Leu Ala Val Leu Tyr Tyr Glu Glu Thr Lys Ser 305 310 315 320 ttc ctc tgg tgg acg agc aac atg atg gtg ctg ggc ggc tcc tcc gcc 1008 Phe Leu Trp Trp Thr Ser Asn Met Met Val Leu Gly Gly Ser Ser Ala 325 330 335 tac acc tgg gtc agg ggc tgg gag atg aag aag act ccg gag gag ccc 1056 Tyr Thr Trp Val Arg Gly Trp Glu Met Lys Lys Thr Pro Glu Glu Pro 340 345 350 agc ccc aaa gac agc gag aag agc gcc atg ggg gtg tga 1095 Ser Pro Lys Asp Ser Glu Lys Ser Ala Met Gly Val * 355 360 <210> 6 <211> 364 <212> PRT <213> Homo sapians <400> 6 Met Asn Arg Ala Pro Leu Lys Arg Ser Arg Ile Leu His Met Ala Leu 1 5 10 15 Thr Gly Ala Ser Asp Pro Ser Ala Glu Ala Glu Ala Asn Gly Glu Lys 20 25 30 Pro Phe Leu Leu Arg Ala Leu Gln Ile Ala Leu Val Val Ser Leu Tyr 35 40 45 Trp Val Thr Ser Ile Ser Met Val Phe Leu Asn Lys Tyr Leu Leu Asp 50 55 60 Ser Pro Ser Leu Arg Leu Asp Thr Pro Ile Phe Val Thr Phe Tyr Gln 65 70 75 80 Cys Leu Val Thr Thr Leu Leu Cys Lys Gly Leu Ser Ala Leu Ala Ala 85 90 95 Cys Cys Pro Gly Ala Val Asp Phe Pro Ser Leu Arg Leu Asp Leu Arg 100 105 110 Val Ala Arg Ser Val Leu Pro Leu Ser Val Val Phe Ile Gly Met Ile 115 120 125 Thr Phe Asn Asn Leu Cys Leu Lys Tyr Val Gly Val Ala Phe Tyr Asn 130 135 140 Val Gly Arg Ser Leu Thr Thr Val Phe Asn Val Leu Leu Ser Tyr Leu 145 150 155 160 Leu Leu Lys Gln Thr Thr Ser Phe Tyr Ala Leu Leu Thr Cys Gly Ile 165 170 175 Ile Ile Gly Gly Phe Trp Leu Gly Val Asp Gln Glu Gly Ala Glu Gly 180 185 190 Thr Leu Ser Trp Leu Gly Thr Val Phe Gly Val Leu Ala Ser Leu Cys 195 200 205 Val Ser Leu Asn Ala Ile Tyr Thr Thr Lys Val Leu Pro Ala Val Asp 210 215 220 Gly Ser Ile Trp Arg Leu Thr Phe Tyr Asn Asn Val Asn Ala Cys Ile 225 230 235 240 Leu Phe Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Gly Glu Leu Gln Ala Leu Arg 245 250 255 Asp Phe Ala Gln Leu Gly Ser Ala His Phe Trp Gly Met Met Thr Leu 260 265 270 Gly Gly Leu Phe Gly Phe Ala Ile Gly Tyr Val Thr Gly Leu Gln Ile 275 280 285 Lys Phe Thr Ser Pro Leu Thr His Asn Val Ser Gly Thr Ala Lys Ala 290 295 300 Cys Ala Gln Thr Val Leu Ala Val Leu Tyr Tyr Glu Glu Thr Lys Ser 305 310 315 320 Phe Leu Trp Trp Thr Ser Asn Met Met Val Leu Gly Gly Ser Ser Ala 325 330 335 Tyr Thr Trp Val Arg Gly Trp Glu Met Lys Lys Thr Pro Glu Glu Pro 340 345 350 Ser Pro Lys Asp Ser Glu Lys Ser Ala Met Gly Val 355 360 <210> 7 <211> 1728 <212> DNA <213> Homo sapians <220> <221> CDS <222> (1)...(1728) <223> alpha-1,6-fucosyltransferase (hFuT8) <400> 7 atg cgg cca tgg act ggt tcc tgg cgt tgg att atg ctc att ctt ttt 48 Met Arg Pro Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met Leu Ile Leu Phe 1 5 10 15 gcc tgg ggg acc ttg ctg ttt tat ata ggt ggt cac ttg gta cga gat 96 Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His Leu Val Arg Asp 20 25 30 aat gac cat cct gat cac tct agc cga gaa ctg tcc aag att ctg gca 144 Asn Asp His Pro Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser Lys Ile Leu Ala 35 40 45 aag ctt gaa cgc tta aaa caa cag aat gaa gac ttg agg cga atg gcc 192 Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Asn Glu Asp Leu Arg Arg Met Ala 50 55 60 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20 25 30 aat gac cac cct gat cac tcc agc aga gaa ctc tcc aag att ctt gca 144 Asn Asp His Pro Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser Lys Ile Leu Ala 35 40 45 aag ctt gaa cgc tta aaa cag caa aat gaa gac ttg agg cga atg gct 192 Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Asn Glu Asp Leu Arg Arg Met Ala 50 55 60 gag tct ctc cga ata cca gaa ggc ccc att gac cag ggg aca gct aca 240 Glu Ser Leu Arg Ile Pro Glu Gly Pro Ile Asp Gln Gly Thr Ala Thr 65 70 75 80 gga aga gtc cgt gtt tta gaa gaa cag ctt gtt aag gcc aaa gaa cag 288 Gly Arg Val Arg Val Leu Glu Glu Gln Leu Val Lys Ala Lys Glu Gln 85 90 95 att gaa aat tac aag aaa caa gct aga aat ggt ctg ggg aag gat cat 336 Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Gln Ala Arg Asn Gly Leu Gly Lys Asp His 100 105 110 gaa atc tta aga agg agg att gaa aat gga gct aaa gag ctc tgg ttt 384 Glu Ile Leu Arg Arg Arg Ile Glu Asn Gly Ala Lys Glu Leu Trp Phe 115 120 125 ttt cta caa agc gaa ctg aag aaa tta aag cat tta gaa gga aat gaa 432 Phe Leu Gln Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys His Leu Glu Gly Asn Glu 130 135 140 ctc caa aga cat gca gat gaa att ctt ttg gat tta gga cac cat gaa 480 Leu Gln Arg His Ala Asp Glu Ile Leu Leu Asp Leu Gly His His Glu 145 150 155 160 agg tct atc atg aca gat cta tac tac ctc agt caa aca gat gga gca 528 Arg Ser Ile Met Thr Asp Leu Tyr Tyr Leu Ser Gln Thr Asp Gly Ala 165 170 175 ggg gat tgg cgt gaa aaa gag gcc aaa gat ctg aca gag ctg gtc cag 576 Gly Asp Trp Arg Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Leu Val Gln 180 185 190 cgg aga ata aca tat ctc cag aat cct aag gac tgc agc aaa gcc agg 624 Arg Arg Ile Thr Tyr Leu Gln Asn Pro Lys Asp Cys Ser Lys Ala Arg 195 200 205 aag ctg gtg tgt aac atc aat aaa ggc tgt ggc tat ggt tgt caa ctc 672 Lys Leu Val Cys Asn Ile Asn Lys Gly Cys Gly Tyr Gly Cys Gln Leu 210 215 220 cat cac gtg gtc tac tgt ttc atg att gct tat ggc acc cag cga aca 720 His His Val Val Tyr Cys Phe Met Ile Ala Tyr Gly Thr Gln Arg Thr 225 230 235 240 ctc atc ttg gaa tct cag aat tgg cgc tat gct act ggt gga tgg gag 768 Leu Ile Leu Glu Ser Gln Asn Trp Arg Tyr Ala Thr Gly Gly Trp Glu 245 250 255 act gtg ttt aga cct gta agt gag aca tgt aca gac aga tct ggc ctc 816 Thr Val Phe Arg Pro Val Ser Glu Thr Cys Thr Asp Arg Ser Gly Leu 260 265 270 tcc act gga cac tgg tca ggt gaa gta aat gac aaa aac att caa gtg 864 Ser Thr Gly His Trp Ser Gly Glu Val Asn Asp Lys Asn Ile Gln Val 275 280 285 gtc gag ctc ccc att gta gac agc ctc cat cct cgg cct cct tac tta 912 Val Glu Leu Pro Ile Val Asp Ser Leu His Pro Arg Pro Pro Tyr Leu 290 295 300 cca ctg gct gtt cca gaa gac ctt gca gac cga ctc cta aga gtc cat 960 Pro Leu Ala Val Pro Glu Asp Leu Ala Asp Arg Leu Leu Arg Val His 305 310 315 320 ggt gac cct gca gtg tgg tgg gtg tcc cag ttt gtc aaa tac ttg att 1008 Gly Asp Pro Ala Val Trp Trp Val Ser Gln Phe Val Lys Tyr Leu Ile 325 330 335 cgt cca caa cct tgg ctg gaa aag gaa ata gaa gaa gcc acc aag aag 1056 Arg Pro Gln Pro Trp Leu Glu Lys Glu Ile Glu Glu Ala Thr Lys Lys 340 345 350 ctt ggc ttc aaa cat cca gtt att gga gtc cat gtc aga cgc aca gac 1104 Leu Gly Phe Lys His Pro Val Ile Gly Val His Val Arg Arg Thr Asp 355 360 365 aaa gtg gga aca gaa gca gcc ttc cac ccc atc gag gag tac atg gta 1152 Lys Val Gly Thr Glu Ala Ala Phe His Pro Ile Glu Glu Tyr Met Val 370 375 380 cac gtt gaa gaa cat ttt cag ctt ctc gca cgc aga atg caa gtg gat 1200 His Val Glu Glu His Phe Gln Leu Leu Ala Arg Arg Met Gln Val Asp 385 390 395 400 aaa aaa aga gta tat ctg gct act gat gat cct act ttg tta aag gag 1248 Lys Lys Arg Val Tyr Leu Ala Thr Asp Asp Pro Thr Leu Leu Lys Glu 405 410 415 gca aag aca aag tac tcc aat tat gaa ttt att agt gat aac tct att 1296 Ala Lys Thr Lys Tyr Ser Asn Tyr Glu Phe Ile Ser Asp Asn Ser Ile 420 425 430 tct tgg tca gct gga cta cac aat cgg tac aca gaa aat tca ctt cgg 1344 Ser Trp Ser Ala Gly Leu His Asn Arg Tyr Thr Glu Asn Ser Leu Arg 435 440 445 ggt gtg atc ctg gat ata cac ttt ctc tca cag gct gac ttt cta gtg 1392 Gly Val Ile Leu Asp Ile His Phe Leu Ser Gln Ala Asp Phe Leu Val 450 455 460 tgt act ttt tca tcc cag gtc tgt cgg gtt gct tat gaa atc atg caa 1440 Cys Thr Phe Ser Ser Gln Val Cys Arg Val Ala Tyr Glu Ile Met Gln 465 470 475 480 acc ctg cat cct gat gcc tct gcg aac ttc cat tct ttg gat gac atc 1488 Thr Leu His Pro Asp Ala Ser Ala Asn Phe His Ser Leu Asp Asp Ile 485 490 495 tac tat ttt gga ggc caa aat gcc cac aat cag att gct gtt tat cct 1536 Tyr Tyr Phe Gly Gly Gln Asn Ala His Asn Gln Ile Ala Val Tyr Pro 500 505 510 cac aaa cct cga act gaa gag gaa att cca atg gaa cct gga gat atc 1584 His Lys Pro Arg Thr Glu Glu Glu Ile Pro Met Glu Pro Gly Asp Ile 515 520 525 att ggt gtg gct gga aac cat tgg gat ggt tat tct aaa ggt atc aac 1632 Ile Gly Val Ala Gly Asn His Trp Asp Gly Tyr Ser Lys Gly Ile Asn 530 535 540 aga aaa ctt gga aaa aca ggc tta tat ccc tcc tac aaa gtc cga gag 1680 Arg Lys Leu Gly Lys Thr Gly Leu Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Arg Glu 545 550 555 560 aag ata gaa aca gtc aag tat ccc aca tat cct gaa gct gaa aaa tag 1728 Lys Ile Glu Thr Val Lys Tyr Pro Thr Tyr Pro Glu Ala Glu Lys * 565 570 575 <210> 12 <211> 575 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Met Arg Ala Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met Leu Ile Leu Phe 1 5 10 15 Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His Leu Val Arg Asp 20 25 30 Asn Asp His Pro Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser Lys Ile Leu Ala 35 40 45 Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Asn Glu Asp Leu Arg Arg Met Ala 50 55 60 Glu Ser Leu Arg Ile Pro Glu Gly Pro Ile Asp Gln Gly Thr Ala Thr 65 70 75 80 Gly Arg Val Arg Val Leu Glu Glu Gln Leu Val Lys Ala Lys Glu Gln 85 90 95 Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Gln Ala Arg Asn Gly Leu Gly Lys Asp His 100 105 110 Glu Ile Leu Arg Arg Arg Ile Glu Asn Gly Ala Lys Glu Leu Trp Phe 115 120 125 Phe Leu Gln Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys His Leu Glu Gly Asn Glu 130 135 140 Leu Gln Arg His Ala Asp Glu Ile Leu Leu Asp Leu Gly His His Glu 145 150 155 160 Arg Ser Ile Met Thr Asp Leu Tyr Tyr Leu Ser Gln Thr Asp Gly Ala 165 170 175 Gly Asp Trp Arg Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Leu Val Gln 180 185 190 Arg Arg Ile Thr Tyr Leu Gln Asn Pro Lys Asp Cys Ser Lys Ala Arg 195 200 205 Lys Leu Val Cys Asn Ile Asn Lys Gly Cys Gly Tyr Gly Cys Gln Leu 210 215 220 His His Val Val Tyr Cys Phe Met Ile Ala Tyr Gly Thr Gln Arg Thr 225 230 235 240 Leu Ile Leu Glu Ser Gln Asn Trp Arg Tyr Ala Thr Gly Gly Trp Glu 245 250 255 Thr Val Phe Arg Pro Val Ser Glu Thr Cys Thr Asp Arg Ser Gly Leu 260 265 270 Ser Thr Gly His Trp Ser Gly Glu Val Asn Asp Lys Asn Ile Gln Val 275 280 285 Val Glu Leu Pro Ile Val Asp Ser Leu His Pro Arg Pro Pro Tyr Leu 290 295 300 Pro Leu Ala Val Pro Glu Asp Leu Ala Asp Arg Leu Leu Arg Val His 305 310 315 320 Gly Asp Pro Ala Val Trp Trp Val Ser Gln Phe Val Lys Tyr Leu Ile 325 330 335 Arg Pro Gln Pro Trp Leu Glu Lys Glu Ile Glu Glu Ala Thr Lys Lys 340 345 350 Leu Gly Phe Lys His Pro Val Ile Gly Val His Val Arg Arg Thr Asp 355 360 365 Lys Val Gly Thr Glu Ala Ala Phe His Pro Ile Glu Glu Tyr Met Val 370 375 380 His Val Glu Glu His Phe Gln Leu Leu Ala Arg Arg Met Gln Val Asp 385 390 395 400 Lys Lys Arg Val Tyr Leu Ala Thr Asp Asp Pro Thr Leu Leu Lys Glu 405 410 415 Ala Lys Thr Lys Tyr Ser Asn Tyr Glu Phe Ile Ser Asp Asn Ser Ile 420 425 430 Ser Trp Ser Ala Gly Leu His Asn Arg Tyr Thr Glu Asn Ser Leu Arg 435 440 445 Gly Val Ile Leu Asp Ile His Phe Leu Ser Gln Ala Asp Phe Leu Val 450 455 460 Cys Thr Phe Ser Ser Gln Val Cys Arg Val Ala Tyr Glu Ile Met Gln 465 470 475 480 Thr Leu His Pro Asp Ala Ser Ala Asn Phe His Ser Leu Asp Asp Ile 485 490 495 Tyr Tyr Phe Gly Gly Gln Asn Ala His Asn Gln Ile Ala Val Tyr Pro 500 505 510 His Lys Pro Arg Thr Glu Glu Glu Ile Pro Met Glu Pro Gly Asp Ile 515 520 525 Ile Gly Val Ala Gly Asn His Trp Asp Gly Tyr Ser Lys Gly Ile Asn 530 535 540 Arg Lys Leu Gly Lys Thr Gly Leu Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Arg Glu 545 550 555 560 Lys Ile Glu Thr Val Lys Tyr Pro Thr Tyr Pro Glu Ala Glu Lys 565 570 575 <210> 13 <211> 1728 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> CDS <222> (1)...(1728) <223> alpha-1,6-fucosyltransferase (pFuT8) <400> 13 atg cgg cca tgg act ggt tcg tgg cgt tgg att atg ctc att ctt ttt 48 Met Arg Pro Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met Leu Ile Leu Phe 1 5 10 15 gcc tgg ggg acc ttg cta ttt tac ata ggt ggt cac ttg gta cga gat 96 Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His Leu Val Arg Asp 20 25 30 aat gac cac tct gat cac tct agc cga gaa ctg tcc aag att ttg gca 144 Asn Asp His Ser Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser Lys Ile Leu Ala 35 40 45 aag ctg gaa cgc tta aaa caa caa aat gaa gac ttg agg aga atg gct 192 Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Asn Glu Asp Leu Arg Arg Met Ala 50 55 60 gaa tct ctc cga ata cca gaa ggc ccc att gat cag ggg cca gct tca 240 Glu Ser Leu Arg Ile Pro Glu Gly Pro Ile Asp Gln Gly Pro Ala Ser 65 70 75 80 gga aga gtt cgt gct tta gaa gag caa ttt atg aag gcc aaa gaa cag 288 Gly Arg Val Arg Ala Leu Glu Glu Gln Phe Met Lys Ala Lys Glu Gln 85 90 95 att gaa aat tat aag aaa caa act aaa aat ggt cca ggg aag gat cat 336 Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Gln Thr Lys Asn Gly Pro Gly Lys Asp His 100 105 110 gaa atc cta agg agg agg att gaa aat gga gct aaa gag ctc tgg ttt 384 Glu Ile Leu Arg Arg Arg Ile Glu Asn Gly Ala Lys Glu Leu Trp Phe 115 120 125 ttt cta caa agt gag ttg aag aaa tta aag aat tta gaa gga aat gaa 432 Phe Leu Gln Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys Asn Leu Glu Gly Asn Glu 130 135 140 ctc caa aga cat gca gat gaa ttt cta tca gat ttg gga cat cat gaa 480 Leu Gln Arg His Ala Asp Glu Phe Leu Ser Asp Leu Gly His His Glu 145 150 155 160 agg tct ata atg acg gat cta tac tac ctc agt caa aca gat ggg gca 528 Arg Ser Ile Met Thr Asp Leu Tyr Tyr Leu Ser Gln Thr Asp Gly Ala 165 170 175 ggt gat tgg cgt gaa aag gag gcc aaa gat ctg aca gag ctg gtc cag 576 Gly Asp Trp Arg Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Leu Val Gln 180 185 190 cgg aga ata aca tat ctt cag aat ccc aag gac tgc agc aaa gcc aag 624 Arg Arg Ile Thr Tyr Leu Gln Asn Pro Lys Asp Cys Ser Lys Ala Lys 195 200 205 aag cta gtg tgt aat atc aac aaa ggc tgt ggc tat ggc tgt cag ctc 672 Lys Leu Val Cys Asn Ile Asn Lys Gly Cys Gly Tyr Gly Cys Gln Leu 210 215 220 cat cat gta gtg tac tgc ttt atg att gca tat ggc acc cag cga aca 720 His His Val Val Tyr Cys Phe Met Ile Ala Tyr Gly Thr Gln Arg Thr 225 230 235 240 ctc gcc ttg gaa tct cac aat tgg cgc tac gct act ggg gga tgg gaa 768 Leu Ala Leu Glu Ser His Asn Trp Arg Tyr Ala Thr Gly Gly Trp Glu 245 250 255 act gtg ttt aga cct gta agt gag acg tgc aca gac aga tct ggc agc 816 Thr Val Phe Arg Pro Val Ser Glu Thr Cys Thr Asp Arg Ser Gly Ser 260 265 270 tcc act gga cat tgg tca ggt gaa gta aag gac aaa aat gtt cag gtg 864 Ser Thr Gly His Trp Ser Gly Glu Val Lys Asp Lys Asn Val Gln Val 275 280 285 gtt gag ctc ccc att gta gac agt gtt cat cct cgt cct cca tat tta 912 Val Glu Leu Pro Ile Val Asp Ser Val His Pro Arg Pro Pro Tyr Leu 290 295 300 ccc ctg gct gtc cca gaa gac ctt gca gat cga ctt gta cga gtc cat 960 Pro Leu Ala Val Pro Glu Asp Leu Ala Asp Arg Leu Val Arg Val His 305 310 315 320 ggt gat cct gca gtg tgg tgg gta tcc cag ttt gtc aag tac ttg att 1008 Gly Asp Pro Ala Val Trp Trp Val Ser Gln Phe Val Lys Tyr Leu Ile 325 330 335 cgc cca caa ccc tgg ctg gaa aag gaa ata gaa gag gcc acc aag aag 1056 Arg Pro Gln Pro Trp Leu Glu Lys Glu Ile Glu Glu Ala Thr Lys Lys 340 345 350 cta ggc ttc aaa cat cca gtt att gga gtc cat gtt aga cgc aca gac 1104 Leu Gly Phe Lys His Pro Val Ile Gly Val His Val Arg Arg Thr Asp 355 360 365 aaa gtg gga gcg gaa gca gcc ttc cat ccc att gag gaa tac acg gtg 1152 Lys Val Gly Ala Glu Ala Ala Phe His Pro Ile Glu Glu Tyr Thr Val 370 375 380 cac gtt gaa gaa gac ttt cag ctt ctt gct cgc aga atg caa gtg gat 1200 His Val Glu Glu Asp Phe Gln Leu Leu Ala Arg Arg Met Gln Val Asp 385 390 395 400 aaa aaa agg gtg tat ttg gcc aca gat gac cct gct ttg tta aaa gag 1248 Lys Lys Arg Val Tyr Leu Ala Thr Asp Asp Pro Ala Leu Leu Lys Glu 405 410 415 gca aaa aca aag tac ccc agt tat gaa ttt att agt gat aac tct atc 1296 Ala Lys Thr Lys Tyr Pro Ser Tyr Glu Phe Ile Ser Asp Asn Ser Ile 420 425 430 tct tgg tca gct gga cta cat aat cga tat aca gaa aat tca ctt cgg 1344 Ser Trp Ser Ala Gly Leu His Asn Arg Tyr Thr Glu Asn Ser Leu Arg 435 440 445 ggt gtg atc ctg gat ata cac ttt ctc tcc cag gca gac ttc cta gtg 1392 Gly Val Ile Leu Asp Ile His Phe Leu Ser Gln Ala Asp Phe Leu Val 450 455 460 tgt act ttt tca tcg cag gtc tgt aga gtt gct tat gaa atc atg caa 1440 Cys Thr Phe Ser Ser Gln Val Cys Arg Val Ala Tyr Glu Ile Met Gln 465 470 475 480 gcg ctg cat cct gat gcc tct gcg aac ttc cgt tct ttg gat gac atc 1488 Ala Leu His Pro Asp Ala Ser Ala Asn Phe Arg Ser Leu Asp Asp Ile 485 490 495 tac tat ttt gga ggc cca aat gcc cac aac caa att gcc att tat cct 1536 Tyr Tyr Phe Gly Gly Pro Asn Ala His Asn Gln Ile Ala Ile Tyr Pro 500 505 510 cac caa cct cga act gaa gga gaa atc ccc atg gaa cct gga gat att 1584 His Gln Pro Arg Thr Glu Gly Glu Ile Pro Met Glu Pro Gly Asp Ile 515 520 525 att ggt gtg gct gga aat cac tgg gat ggc tat cct aaa ggt gtt aac 1632 Ile Gly Val Ala Gly Asn His Trp Asp Gly Tyr Pro Lys Gly Val Asn 530 535 540 aga aaa ctg gga agg acg ggc cta tat ccc tcc tac aaa gtt cga gag 1680 Arg Lys Leu Gly Arg Thr Gly Leu Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Arg Glu 545 550 555 560 aag ata gaa aca gtc aag tac ccc aca tat ccc gag gct gac aag taa 1728 Lys Ile Glu Thr Val Lys Tyr Pro Thr Tyr Pro Glu Ala Asp Lys * 565 570 575 <210> 14 <211> 575 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 14 Met Arg Pro Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met Leu Ile Leu Phe 1 5 10 15 Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His Leu Val Arg Asp 20 25 30 Asn Asp His Ser Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser Lys Ile Leu Ala 35 40 45 Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Asn Glu Asp Leu Arg Arg Met Ala 50 55 60 Glu Ser Leu Arg Ile Pro Glu Gly Pro Ile Asp Gln Gly Pro Ala Ser 65 70 75 80 Gly Arg Val Arg Ala Leu Glu Glu Gln Phe Met Lys Ala Lys Glu Gln 85 90 95 Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Gln Thr Lys Asn Gly Pro Gly Lys Asp His 100 105 110 Glu Ile Leu Arg Arg Arg Ile Glu Asn Gly Ala Lys Glu Leu Trp Phe 115 120 125 Phe Leu Gln Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys Asn Leu Glu Gly Asn Glu 130 135 140 Leu Gln Arg His Ala Asp Glu Phe Leu Ser Asp Leu Gly His His Glu 145 150 155 160 Arg Ser Ile Met Thr Asp Leu Tyr Tyr Leu Ser Gln Thr Asp Gly Ala 165 170 175 Gly Asp Trp Arg Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Leu Val Gln 180 185 190 Arg Arg Ile Thr Tyr Leu Gln Asn Pro Lys Asp Cys Ser Lys Ala Lys 195 200 205 Lys Leu Val Cys Asn Ile Asn Lys Gly Cys Gly Tyr Gly Cys Gln Leu 210 215 220 His His Val Val Tyr Cys Phe Met Ile Ala Tyr Gly Thr Gln Arg Thr 225 230 235 240 Leu Ala Leu Glu Ser His Asn Trp Arg Tyr Ala Thr Gly Gly Trp Glu 245 250 255 Thr Val Phe Arg Pro Val Ser Glu Thr Cys Thr Asp Arg Ser Gly Ser 260 265 270 Ser Thr Gly His Trp Ser Gly Glu Val Lys Asp Lys Asn Val Gln Val 275 280 285 Val Glu Leu Pro Ile Val Asp Ser Val His Pro Arg Pro Pro Tyr Leu 290 295 300 Pro Leu Ala Val Pro Glu Asp Leu Ala Asp Arg Leu Val Arg Val His 305 310 315 320 Gly Asp Pro Ala Val Trp Trp Val Ser Gln Phe Val Lys Tyr Leu Ile 325 330 335 Arg Pro Gln Pro Trp Leu Glu Lys Glu Ile Glu Glu Ala Thr Lys Lys 340 345 350 Leu Gly Phe Lys His Pro Val Ile Gly Val His Val Arg Arg Thr Asp 355 360 365 Lys Val Gly Ala Glu Ala Ala Phe His Pro Ile Glu Glu Tyr Thr Val 370 375 380 His Val Glu Glu Asp Phe Gln Leu Leu Ala Arg Arg Met Gln Val Asp 385 390 395 400 Lys Lys Arg Val Tyr Leu Ala Thr Asp Asp Pro Ala Leu Leu Lys Glu 405 410 415 Ala Lys Thr Lys Tyr Pro Ser Tyr Glu Phe Ile Ser Asp Asn Ser Ile 420 425 430 Ser Trp Ser Ala Gly Leu His Asn Arg Tyr Thr Glu Asn Ser Leu Arg 435 440 445 Gly Val Ile Leu Asp Ile His Phe Leu Ser Gln Ala Asp Phe Leu Val 450 455 460 Cys Thr Phe Ser Ser Gln Val Cys Arg Val Ala Tyr Glu Ile Met Gln 465 470 475 480 Ala Leu His Pro Asp Ala Ser Ala Asn Phe Arg Ser Leu Asp Asp Ile 485 490 495 Tyr Tyr Phe Gly Gly Pro Asn Ala His Asn Gln Ile Ala Ile Tyr Pro 500 505 510 His Gln Pro Arg Thr Glu Gly Glu Ile Pro Met Glu Pro Gly Asp Ile 515 520 525 Ile Gly Val Ala Gly Asn His Trp Asp Gly Tyr Pro Lys Gly Val Asn 530 535 540 Arg Lys Leu Gly Arg Thr Gly Leu Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Arg Glu 545 550 555 560 Lys Ile Glu Thr Val Lys Tyr Pro Thr Tyr Pro Glu Ala Asp Lys 565 570 575 <210> 15 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer SH415 <400> 15 ggcggccgcc accatggcac acgcaccggc acgctgc 37 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer SH413 <400> 16 ttaattaatc aggcattggg gtttgtcctc atg 33 <210> 17 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer SH414 <400> 17 ggcggccgcc accatgggtg aaccccaggg atccatg 37 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer SH411 <400> 18 ttaattaatc acttccgggc ctgctcgtag ttg 33 <210> 19 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer RCD679 <400> 19 gcggccgcca ccatgaatag ggcccctctg aagcgg 36 <210> 20 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer RCD680 <400> 20 ttaattaatc acacccccat ggcgctcttc tc 32 <210> 21 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer SH420 <400> 21 gcggcgcgcc gataatgacc accctgatca ctccag 36 <210> 22 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer SH421 <400> 22 ccttaattaa ctatttttca gcttcaggat atgtggg 37 <210> 23 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer rEPO-forward <400> 23 gggaattcgc tcccccacgc ctcatttgcg ac 32 <210> 24 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer rEPO-reverse <400> 24 cctctagatc acctgtcccc tctcctgcag gc 32 <210> 25 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer ScMntI-forward <400> 25 gggcggccgc caccatggcc ctctttctca gtaagagact gttgag 46 <210> 26 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer ScMnt1-reverse <400> 26 ccggcgcgcc cgatgacttg ttgttcaggg gatatagatc ctg 43

Claims (21)

  1. 푸코실화 경로를 포함하는 재조합 하등 진핵 숙주 세포.
  2. 제1항에 있어서, 효모 또는 사상균(filamentous fungus)인 숙주 세포.
  3. 제2항에 있어서, 효모가 피치아 종(Pichia sp.)인 숙주 세포.
  4. 제3항에 있어서, 피치아 종이 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)인 숙주 세포.
  5. 제1항에 있어서, 당단백질상의 N-글리칸에 대해 α1,6-만노시트랜스퍼라제 활성을 추가로 나타내지 않고, 통상적으로 촉매 도메인과 연합되어 있지 않고 α1,2-만노시다제 활성을 숙주 세포의 ER 또는 골지체로 표적화하도록 선택된 세포 표적화 시그날 펩타이드에 융합된 α1,2-만노시다제 활성 촉매 도메인을 추가로 포함하여, 숙주 세포의 ER 또는 골지체를 통한 재조합 당단백질의 통과시, 푸코실화된 Man5GlcNAc2 당형태를 포함하는 재조합 당단백질이 생성되는 숙주 세포.
  6. 제5항에 있어서, 통상적으로 촉매 도메인과 연합되어 있지 않고 GlcNAc 트랜스퍼라제 I 활성을 숙주 세포의 ER 또는 골지체로 표적화하도록 선택된 세포 표적 화 시그날 펩타이드에 융합된 GlcNAc 트랜스퍼라제 I 촉매 도메인을 추가로 포함하여, 숙주 세포의 ER 또는 골지체를 통한 재조합 당단백질의 통과시, 푸코실화된 GlcNAcMan5GlcNAc2 당형태를 포함하는 재조합 당단백질이 생성되는 숙주 세포.
  7. 제6항에 있어서, 통상적으로 촉매 도메인과 연합되어 있지 않고 숙주 세포의 ER 또는 골지체로 만노시다제 II 활성을 표적화하도록 선택된 세포 표적화 시그날 펩타이드에 융합된 만노시다제 II 촉매 도메인을 추가로 포함하여, 숙주 세포의 ER 또는 골지체를 통한 재조합 당단백질의 통과시, 푸코실화된 GlcNAcMan3GlcNAc2 당형태를 포함하는 재조합 당단백질이 생성되는 숙주 세포.
  8. 제7항에 있어서, 통상적으로 촉매 도메인과 연합되어 있지 않고 숙주 세포의 ER 또는 골지체로 GlcNAc 트랜스퍼라제 II 활성을 표적화하도록 선택된 세포 표적화 시그날 펩타이드에 융합된 GlcNAc 트랜스퍼라제 II 촉매 도메인을 추가로 포함하여, 숙주 세포의 ER 또는 골지체를 통한 재조합 당단백질의 통과시, 푸코실화된 GlcNAc2Man3GlcNAc2 당형태를 포함하는 재조합 당단백질이 생성되는 숙주 세포.
  9. 제8항에 있어서, 통상적으로 촉매 도메인과 연합되어 있지 않고 숙주 세포의 ER 또는 골지체로 갈락토스 트랜스퍼라제 II 활성을 표적화하도록 선택된 세포 표적화 시그날 펩타이드에 융합된 갈락토스 트랜스퍼라제 II 촉매 도메인을 추가로 포함하여, 숙주 세포의 ER 또는 골지체를 통한 재조합 당단백질의 통과시, 푸코실화된 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 당형태를 포함하는 재조합 당단백질이 생성되는 숙주 세포.
  10. 제9항에 있어서, 통상적으로 촉매 도메인과 연합되어 있지 않고 숙주 세포의 ER 또는 골지체로 시알릴트랜스퍼라제 활성을 표적화하도록 선택된 세포 표적화 시그날 펩타이드에 융합된 시알릴트랜스퍼라제 촉매 도메인을 추가로 포함하여, 숙주 세포의 ER 또는 골지체를 통한 재조합 당단백질의 통과시, 푸코실화된 NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 당형태를 포함하는 재조합 당단백질이 생성되는 숙주 세포.
  11. 다수의 당형태를 포함하는 당단백질 조성물로서, 이때 각각의 당형태는 당형태에 부착된 하나 이상의 N-글리칸을 포함함으로써, 상기 당단백질 조성물이 다수의 N-글리칸을 포함하고, 이때 상기 다수의 N-글리칸 중의 25몰% 초과가 Man5GlcNAc2, GlcNAcMan5GlcNAc2, Man3GlcNAc2, GlcNAcMan3GlcNAc2, GlcNAc2Man3GlcNAc2, GalGlcNAc2Man3GlcNAc2, Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2, NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2, 및 NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 푸코실화된 N-글리칸으로 필수적으로 이루어진 당단백질 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 푸코실화된 N-글리칸이 다수의 N-글리칸의 50몰% 초과인 당단백질 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 푸코실화된 N-글리칸이 다수의 N-글리칸의 75몰% 초과인 당단백질 조성물.
  14. 제11항에 있어서, 푸코실화된 N-글리칸이 다수의 N-글리칸의 80몰% 초과인 당단백질 조성물.
  15. 제11항에 있어서, 푸코스가 N-글리칸의 환원 말단에서 GlcNAc와 α1,3-결합되어 있는 당단백질 조성물.
  16. 제11항에 있어서, 푸코스가 N-글리칸의 환원 말단에서 GlcNAc와 α1,6-결합되어 있는 당단백질 조성물.
  17. 제11항에 있어서, 푸코스가 N-글리칸의 비-환원 말단에서 Gal과 α1,2-결합되어 있는 당단백질 조성물.
  18. 제11항에 있어서, 푸코스가 N-글리칸의 비-환원 말단에서 GlcNAc와 α1,3-결합되어 있는 당단백질 조성물.
  19. 제11항에 있어서, 푸코스가 N-글리칸의 비-환원 말단에서 GlcNAc와 α1,4-결합되어 있는 당단백질 조성물.
  20. 표적화 서열(i) 및 푸코실화 경로 효소의 촉매 도메인(b)를 암호화하는 융합 단백질을 암호화하는 DNA 암호화 서열(b)에 작동가능하게 연결된, 하등 진핵 숙주 세포에서 작용하는 DNA 조절 요소들(a)을 포함하는 하이브리드 벡터.
  21. 제17항에 있어서, 푸코실화 경로 효소가 푸코실트랜스퍼라제인 벡터.
KR1020097020933A 2007-03-07 2008-03-03 푸코실화가 변형된 당단백질의 제조 KR20090130029A (ko)

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