RU2009136982A

RU2009136982A - Продукция гликопротеинов с модифицированным фукозилированием

Info

Publication number: RU2009136982A
Application number: RU2009136982/10A
Authority: RU
Inventors: Стефен ХЭМИЛТОН (US); Стефен ХЭМИЛТОН
Original assignee: Гликофи, Инк. (Us); Гликофи, Инк.
Priority date: 2007-03-07
Filing date: 2008-03-03
Publication date: 2011-04-20
Also published as: WO2008112092A2; EP2134834B1; JP2010519930A; ZA200905728B; KR20090130029A; RU2479629C2; CN101679934B; AU2008227024A1; SG187521A1; CN101679934A; US20100028951A1; WO2008112092A3; CA2679732A1; EP2134834A2

Abstract

1. Рекомбинантная клетка-хозяин, являющийся низшим эукариотом, включающая каскад реакций фукозилирования. !2. Клетка-хозяин по п.1, которая является дрожжами или нитчатым грибом. ! 3. Клетка-хозяин по п.2, где дрожжами является Pichia sp. ! 4. Клетка-хозяин по п.3, где Pichia sp.является Pichia pastoris. ! 5. Клетка-хозяин по п.1, которая дополнительно не демонстрирует активность α1,6-маннозилтрансферазы по отношению к N-гликану на гликопротеине и включает каталитический домен α1,2-маннозидазы, слитый с осуществляющим направленную клеточную доставку сигнальным пептидом, который обычно не связан с каталитическим доменом и выбирается для направленной доставки активности α1,2-маннозидазы в эндоплазматический ретикулум или аппарат Гольджи клетки-хозяина, посредством чего при прохождении рекомбинантного гликопротеина через эндоплазматический ретикулум или аппарат Гольджи клетки-хозяина продуцируется рекомбинантный гликопротеин, включающий фукозилированную гликоформу Man5GlcNAc2. ! 6. Клетка-хозяин по п.5, которая дополнительно включает каталитический домен GlcNAc-трансферазы I, слитый с осуществляющим направленную клеточную доставку сигнальным пептидом, который обычно не связан с каталитическим доменом и выбирается для направленной доставки активности GlcNAc-трансферазы I в эндоплазматический ретикулум или аппарат Гольджи клетки-хозяина, посредством чего при прохождении рекомбинантного гликопротеина через эндоплазматический ретикулум или аппарат Гольджи клетки-хозяина продуцируется рекомбинантный гликопротеин, включающий фукозилированную гликоформу GlcNAcMan5GlcNAc2. ! 7. Клетка-хозяин по п.6, которая дополнительно включает каталитический дом

Claims

1. Рекомбинантная клетка-хозяин, являющийся низшим эукариотом, включающая каскад реакций фукозилирования.

2. Клетка-хозяин по п.1, которая является дрожжами или нитчатым грибом.

3. Клетка-хозяин по п.2, где дрожжами является Pichia sp.

4. Клетка-хозяин по п.3, где Pichia sp.является Pichia pastoris.

5. Клетка-хозяин по п.1, которая дополнительно не демонстрирует активность α1,6-маннозилтрансферазы по отношению к N-гликану на гликопротеине и включает каталитический домен α1,2-маннозидазы, слитый с осуществляющим направленную клеточную доставку сигнальным пептидом, который обычно не связан с каталитическим доменом и выбирается для направленной доставки активности α1,2-маннозидазы в эндоплазматический ретикулум или аппарат Гольджи клетки-хозяина, посредством чего при прохождении рекомбинантного гликопротеина через эндоплазматический ретикулум или аппарат Гольджи клетки-хозяина продуцируется рекомбинантный гликопротеин, включающий фукозилированную гликоформу Man₅GlcNAc₂.

6. Клетка-хозяин по п.5, которая дополнительно включает каталитический домен GlcNAc-трансферазы I, слитый с осуществляющим направленную клеточную доставку сигнальным пептидом, который обычно не связан с каталитическим доменом и выбирается для направленной доставки активности GlcNAc-трансферазы I в эндоплазматический ретикулум или аппарат Гольджи клетки-хозяина, посредством чего при прохождении рекомбинантного гликопротеина через эндоплазматический ретикулум или аппарат Гольджи клетки-хозяина продуцируется рекомбинантный гликопротеин, включающий фукозилированную гликоформу GlcNAcMan₅GlcNAc₂.

7. Клетка-хозяин по п.6, которая дополнительно включает каталитический домен маннозидазы II, слитый с осуществляющим направленную клеточную доставку сигнальным пептидом, который обычно не связан с каталитическим доменом и выбирается для направленной доставки активности маннозидазы II в эндоплазматический ретикулум или аппарат Гольджи клетки-хозяина, посредством чего при прохождении рекомбинантного гликопротеина через эндоплазматический ретикулум или аппарат Гольджи клетки-хозяина продуцируется рекомбинантный гликопротеин, включающий фукозилированную гликоформу GlcNAcMan₃GlcNAc₂.

8. Клетка-хозяин по п.7, которая дополнительно включает каталитический домен GlcNAc-трансферазы II, слитый с осуществляющим направленную клеточную доставку сигнальным пептидом, который обычно не связан с каталитическим доменом и выбирается для направленной доставки активности GlcNAc-трансферазы II в эндоплазматический ретикулум или аппарат Гольджи клетки-хозяина, посредством чего при прохождении рекомбинантного гликопротеина через эндоплазматический ретикулум или аппарат Гольджи клетки-хозяина продуцируется рекомбинантный гликопротеин, включающий фукозилированную гликоформу GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂.

9. Клетка-хозяин по п.8, которая дополнительно включает каталитический домен галактозилтрансферазы, слитый с осуществляющим направленную клеточную доставку сигнальным пептидом, который обычно не связан с каталитическим доменом и выбирается для направленной доставки активности галактозотрансферазы II в эндоплазматический ретикулум или аппарат Гольджи клетки-хозяина, посредством чего при прохождении рекомбинантного гликопротеина через эндоплазматический ретикулум или аппарат Гольджи клетки-хозяина продуцируется рекомбинантный гликопротеин, включающий фукозилированную гликоформу GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ или Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂.

10. Клетка-хозяин по п.9, которая дополнительно включает каталитический домен сиалилтрансферазы, слитый с осуществляющим направленную клеточную доставку сигнальным пептидом, который обычно не связан с каталитическим доменом и выбирается для направленной доставки активности сиалилтрансферазы в эндоплазматический ретикулум или аппарат Гольджи клетки-хозяина, посредством чего при прохождении рекомбинантного гликопротеина через эндоплазматический ретикулум или аппарат Гольджи клетки-хозяина продуцируется рекомбинантный гликопротеин, включающий фукозилированную гликоформу NANAGal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ или NANA₂Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂.

11. Гибридный вектор, включающий (а) регуляторные элементы ДНК, которые являются функциональными в клетке-хозяине, являющемся низшим эукариотом, функционально связанные с (b) кодирующей последовательностью ДНК, кодирующей слитый белок, включающий (i) последовательность для направленной доставки и (ii) каталитический домен фермента каскада реакций фукозилирования.

12. Вектор по п.11, в котором ферментом каскада реакций фукозилирования является фукозилтрансфераза.

13. Клетка-хозяин по п.1, где каскад реакций фукозилирования включает ГДФ-маннозо-4,6-дегидратазу, ГДФ-кетодезоксиманнозо-эпимеразу/ГДФ-кетодезоксигалактозо-редуктазу, белок-переносчик ГДФ-фукозы и фукозилтрансферазу.

14. Клетка-хозяин по п.13, где фукозилтрансфераза выбрана из группы, состоящей из α1,2-фукозилтрасферазы, α1,3-фукозилтрасферазы, α1,4-фукозилтрасферазы и α1,6-фукозилтрасферазы.

15. Способ получения гликопротеина в низших эукариотах, включающего один или более фукозилированных N-гликанов, предусматривающий:

(а) обеспечение клетки-хозяина низших эукариот, содержащей каскад реакций фукозилирования и способной продуцировать сложные или комплексные N-гликаны, которую трансформировали молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей гликопротеин; и

(b) культивирование клетки-хозяина в условиях, сопутствующих экспрессии гетерологичного гликопротеина, с получением гликопротеина, включающего один или более фукозилированных N-гликанов.

16. Способ по п.15, где каскад реакций фукозилирования включает ГДФ-маннозо-4,6-дегидратазу, ГДФ-кетодезоксиманнозо-эпимеразу/ГДФ-кетодезоксигалактозо-редуктазу, белок-переносчик ГДФ-фукозы и фукозилтрансферазу.

17. Способ по п.16, где фукозилтрансфераза выбрана из группы, состоящей из α1,2-фукозилтрасферазы, α1,3-фукозилтрасферазы, α1,4-фукозилтрасферазы и α1,6-фукозилтрасферазы.

18. Способ по п.15, где гликопротеин является терапевтическим гликопротеином.

19. Способ по п.15, где гликопротеин выбран из группы, состоящей из эритропоэтина (ЕРО); цитокинов, таких как интерферон-α, интерферон-β, интерферон-γ, интерферон-(и гранулоцитарный CSF; факторов коагуляции, таких как фактор VIII, фактор IX и белок С человека; моноклональных антител, α-цепи растворимого рецептора IgE, IgG, IgM, IgG, урокиназы, химазы и ингибитора трипсина, IGF-связывающего белка, фактора роста эпидермиса, фактора выброса гормона роста, слитого с аннексином V белка, ангиостатина, фактора роста эндотелия сосудов 2, ингибиторного в отношении клеток-предшественников миелоидного ряда фактора 1, остеопротегерина, тканевого активатора плазминогена, G-CSF, GM-CSF и TNF-рецептора.

20. Способ по п.15, где клетка-хозяин представляет собой дрожжи или нитчатые грибы.

21. Способ по п.15, где клетка-хозяин представляет собой Pichia sp.

22. Способ по п.15, где клетка-хозяин представляет собой Pichia pastoris.

23. Композиция гликопротеинов, включающая один или более гликопротеинов, полученных способом по п.15.

24. Клетка-хозяин по пп.1-10, дополнительно включающая одну или более GlcNAc-трансфераз, выбранных из группы, состоящей из GnTIII, GnTIV, GnTV, GnTVI и GnTIX.