KR101105718B1 - 돌리칠 포스페이트 만노스 의존알파-1,3-만노실트랜스퍼라제를 코딩하는 한세눌라폴리모르파 기원의 신규 유전자와 상기 유전자가 결손된한세눌라 폴리모르파 변이주를 이용한 재조합 당단백질생산 방법 - Google Patents

돌리칠 포스페이트 만노스 의존알파-1,3-만노실트랜스퍼라제를 코딩하는 한세눌라폴리모르파 기원의 신규 유전자와 상기 유전자가 결손된한세눌라 폴리모르파 변이주를 이용한 재조합 당단백질생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 당쇄 형성에 관여하는 효소를 유전공학적으로 조작하여 당화가 감소된 인체형 당단백질을 한세눌라 폴리모르파 시스템을 이용하여 생산하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 한세눌라 폴리모르파의 돌리칠 포스페이트 만노스 의존 알파-1,3-만노실트랜스퍼라제(dolichyl-phosphate-mannose dependent α-1,3-mannosyltransferase) 유전자를 동정하고 상기 동정된 유전자를 결손시켜 당화가 감소된 당단백질을 생산하는 한세눌라 폴리모르파 변이주를 제조하고 상기 변이주의 다양한 조작을 통하여 인체형 당쇄를 가지는 당단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
효모, 한세눌라 폴리모르파, 재조합 당단백질, 당쇄 재설계

Description

돌리칠 포스페이트 만노스 의존 알파-1,3-만노실트랜스퍼라제를 코딩하는 한세눌라 폴리모르파 기원의 신규 유전자와 상기 유전자가 결손된 한세눌라 폴리모르파 변이주를 이용한 재조합 당단백질 생산 방법{A novel Hansenula polymorpha gene coding for dolichyl-phosphate-mannose dependent α-1,3-mannosyltransferase and process for the production of recombinant glycoproteins with Hansenula polymorpha mutant strain deficient in the same gene}
도 1은 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha : H. polymorpha) HpALG3 유전자의 염기 서열과 예상하는 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 막통과 부위는 4부분으로 추정되며 밑줄로 표시하였다.
도 2는 한세눌라 폴리모르파와 다른 효모 균주 유래의 Alg3 단백질 상동체들의 아미노산 서열을 비교한 것이다. S. pombe, 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) Alg3 단백질; H. polymorpha , 한세눌라 폴리모르파 Alg3 단백질; H. sapiens, 호모 사피엔스 (Homo sapiens) Alg3 단백질; P. pastoris, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) Alg3 단백질; S. cerevisiae, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) Alg3 단백질. 하단에 나타낸 표는 한세눌라 폴리모르파 Alg3 단백질과 다른 효모들 및 인간의 Alg3 단백질들 사이의 아미노산 서열의 동일성 (identity)과 유사성 (similarity)을 표시한 것이다.
도 3은 한세눌라 폴리모르파 HpALG3 유전자 파쇄를 유도하기 위한 세포내 유전자 재조합에 관한 모식도이다.
도 4는 한세눌라 폴리모르파 Hpalg3 Δ 변이주와 그에 대한 야생형 균주의 성장 곡선을 나타낸 도식이다. 배양 조건은 37 ℃에서 YPD (yeast extract 1%, Bacto-peptone 2%, dextrose 2%) 액상배지에서 진탕 배양하였다.
도 5는 한세눌라 폴리모르파 Hpalg3 Δ 변이주의 성장 특징에 관한 도식이다. 지수기에 있는 한세눌라 폴리모르파 야생형 균주와 Hpalg3 결손 균주들의 배양액 (O.D.600=1)을 10 배씩 연속적으로 희석하여 3 ㎕씩 스포팅 한 후 2 일간 배양하였다. A, 37 ℃에서의 YPD 배지; B, 45 ℃에서의 YPD 배지; C, 0.4 % 소듐 데옥시콜레이트 (Sodium deoxycholate)가 첨가된 YPD 배지; D, 40 ㎍/㎖의 하이그로마이신 B (Hygromycin B)가 첨가된 YPD 배지; E, 7 ㎎/㎖의 칼코플로우 화이트 (Calcofluor white)가 첨가된 YPD 배지. B를 제외한 모든 플레이트들은 37 ℃에서 배양하였다.
도 6은 한세눌라 폴리모르파 균주로부터 발현된 Yps1 단백질에 부착된 당쇄 구조의 변화를 HPLC로 분석한 도식이다. A와 D는 한세눌라 폴리모르파 야생형 균주와 Hpalg3 결손 균주로부터 분비 발현된 Yps1 단백질의 당쇄 프로파일이고, B와 E는 알파-1,2-만노시다제를 외부적으로 처리한 후의 당쇄 프로파일이며, C와 F는 알파-1,6-만노시다제를 외부적으로 처리한 후의 당쇄 프로파일이다.
도 7은 한세눌라 폴리모르파 Hpoch2 Δ alg3 Δ 이중결손 변이주 및 당쇄공학 적용 균주로부터 생합성된 당단백질의 당쇄를 HPLC로 분석한 도식이다. A는 야생형 균주의 당쇄 프로파일이고, B는 Hpoch2 Δ alg3 Δ 이중결손 변이주에 대한 당쇄 프로파일이며, C는 한세눌라 폴리모르파 Hpoch2Δalg3Δ 이중결손 변이주에 아스퍼질러스 사이토이 (Aspergillus saitoi)의 알파-1,2-만노시다제 (MsdS)를 발현시킨 재조합 변이주로부터 생합성된 당쇄 프로파일이다.
본 발명은 한세눌라 폴리모르파에서 당쇄 형성에 관여하는 효소를 유전공학적으로 조작하여 다양한 인체형 당쇄의 최소 핵심골격이 되는 트리만노스(trimannose) 핵심 당쇄 부착 당단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
의약용 단백질을 과발현시키는 경우, 숙주세포나 목적 단백질의 특징에 따라서 단백질의 발현량, 수용성 여부, 발현 장소, 수식(modification) 등이 달라지므로 목적 단백질에 가장 적합한 발현 시스템을 선택하여야 효율적인 생산 시스템을 구축할 수 있다. 현재, 재조합 의약품 시장은 제 2세대인 당단백질이 70% 가까이를 점유하며 시장을 주도하고 있다. 당단백질의 아스파라진(Asparagine) 아미노산의 잔기에 부착되는 N-결합형 당쇄의 성분 및 구조가 효능 및 안정성의 주요 결정 인자라는 사실이 밝혀지고 있으며 (Koury, M., Trends Botechnol. 21, 462-464 (2003)), 인간의 당쇄와 가장 유사한 당쇄가 부착된 당단백질을 생산할 수 있는 동물세포 배양 기술이 시장을 선도하고 있다. 그러나, 낮은 생산성, 고가의 배지 비용, 인간에게 유해한 바이러스와 프라이온 등의 감염 위험성을 비롯하여 안정된 세포주 제조에 요구되는 긴 시간 등은 동물세포 배양을 이용한 재조합 당단백질 생산에 큰 제한으로 작용한다.
동물세포 발현 시스템의 대체 숙주로서, 진핵생물이며 고등 동물 세포의 N-결합형 당쇄 형성 과정과 초기 단계가 동일한 당쇄 생합성 경로를 지닌 효모 발현 시스템을 이용하여 의약용 재조합 당단백질을 생산하고자 하였다. 효모 발현 시스템은 경제적이고 단백질을 고농도로 신속하게 생성하며 조절이 용이한 생산 조건을 이용할 수 있고 유전자 조작이 용이하며 인간 또는 동물 병원체의 감염이 없고 단백질 회수가 용이하다는 이점이 있다. 그러나 효모에서 합성된 당쇄 구조는 인간의 당단백질에 부착되어 있는 당쇄 구조와 상이해서 인체 주입시 면역반응을 유발할 수 있다. 특히, 고농도 만노스 타입의 효모 특이적 당외쇄 당화에 의한 과당화는 재조합 단백질 산물의 이질성을 초래하여 단백질 정제를 곤란하고 복잡하게 할 뿐만 아니라 당쇄의 증가로 인해 효소의 특이적 활성을 감소시킨다 (Bekkers et al., Biochem. Biophy. Acta. 1089, 345-351 (1991)).
상기 문제점을 해결하기 위하여 효모의 당화 경로를 재설계하여 인간 유래의 것과 동등한 생물활성을 가진 당단백질을 발현시키기 위한 당쇄 공학이 대두되었다. 전통 효모인 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)에서 발 현되는 재조합 당단백질들의 경우 핵심당쇄 (core oligosaccharide)에 50개에서 200개의 만노스(mannose)가 연속적으로 부가되는 과당화(hypermannosylation)의 발생과 인체에 항원으로 인지될 수 있는 알파-1,3-결합형 말단 만노스 (α-1,3-linked terminal mannose)의 존재가 당단백질 생산을 위한 숙주로서의 큰 문제점으로 제기되었다. 반면, 메탄올자화 효모(methylotrophic yeast)인 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)와 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 발현된 재조합 당단백질들은 사카로마이세스 세레비지애에서 발현된 재조합 당단백질보다는 전체적인 만노스 당외쇄(mannose outer chain)의 길이가 상당히 짧다고 보고되었다 (Kim et al., Glycobiol. 14, 243-251 (2004)). 특히, 메탄올 자화 효모인 한세눌라 폴리모르파와 피키아 파스토리스에서 합성된 당쇄에는 인체에 면역원성으로 작용한는 알파-1,3-결합형 말단 만노스 (α-1,3-linked terminal mannose)가 존재하지 않는다는 점에서 인체 의료용 당단백질 생산 숙주로서 전통 효모인 사카로마이세스 세레비지애보다 우수한 발현 시스템으로 평가된다. 또한, 재조합 당단백질을 분비하는 능력도 메타놀 자화 효모인 한세눌라 폴리모르파와 피키아 파스토리스가 우수하므로 산업적 활용성이 높아 주목을 받고 있다.
피키아 파스토리스는 이를 생산 숙주로 하여 발현한 재조합 단백질들 중에 아직 의약품으로서 공식적인 승인을 받은 제품이 없는 완전히 검증 받지 않은 균주인 반면에, 한세눌라 폴리모르파는 독일의 라인 바이오텍 (Rhein Biotech)사가 이를 이용하여 제조한 B형 간염 백신, 히루딘 및 인슐린 등을 의약품으로 허가를 받아 이미 판매를 하고 있어서 재조합 의약품 생산 효모 숙주로서 각광을 받고 있다 (Kang and Gellissen, Production of Recombinant proteins. Ed. G. Gellissen, pp. 111-136 (2005)).
그러나, 인체형 당쇄 부착 당단백질 생산을 위한 효모의 당쇄경로 재설계 기술은 기반연구가 확보된 사카로마이세스 세레비지애와 발현 시스템이 상용화되어 있는 피키아 파스토리스를 주 대상으로 이루어지고 있으며(WO0114522, WO0200879, WO04003194, US2005/0170452, Wildt and Gerngross, Nature Rev. Microbiol. 3, 119-128 (2005)), 이에 반해 한세눌라 폴리모르파를 이용한 연구는 미미한 실정이다.
한세눌라 폴리모르파를 당쇄 공학에 이용한 연구로는, 본 발명자들이 한세눌라 폴리모르파의 당외쇄 합성에서 중요한 역할을 하는 HpOCH1과 HpOCH2 유전자를 클로닝하고 이 유전자들이 파쇄된 돌연변이주를 이용하여 과당화(hyperglycosylation)가 일어나지 않은 당쇄 구조를 지닌 재조합 당단백질을 생산하는 방법을 개발한 바 있다 (대한민국 특허출원 제2002-37717, 대한민국 특허출원 제2004-6352호, PCT 특허 출원 PCT/KR2004/001819호). 그러나, 하이브리드 및 복합 인체형 당쇄를 가지는 당단백질을 발현시키기 위해서는 최소 골격인 3개의 만노스가 부착된 트리만노스 핵심 당쇄 형태를 만들어야 하지만, 한세눌라 폴리모르파에서는 이에 대한 연구가 이루어지지 못한 실정이다.
이에 본 발명자는, 메탄올자화 효모인 한세눌라 폴리모르파에서 당단백질에 당쇄가 부착되기 전 단계인 지질 연결 당쇄 형성 과정의 초기에 관여하는 핵심 효 소인 돌리칠 포스페이트 만노스 의존 알파-1,3-만노실트랜스퍼라제를 코딩하는 신규 유전자(HpALG3)를 동정하고, 상기 유전자 단독 또는 당화 과정에 관여하는 하나 이상의 다른 효소를 조작할 경우, 한세눌라 폴리모르파에서 당화 경로의 다양한 조작이 가능하고 인체형 당쇄를 가지는 당단백질을 제조할 수 있다는 것을 밝히고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖고 돌리칠 포스페이트 만노스 의존 알파-1,3-만노실트랜스퍼라제(dolichyl-phosphate-mannose dependent α-1,3-mannosyltransferase) 효소 활성을 나타내는 단백질을 제공하기 위함이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 제공하기 위함이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 제공하기 위함이다.
본 발명의 또 다른 목적은 돌리칠 포스페이트 만노스 의존 알파-1,3-만노실트랜스퍼라제 유전자를 결손시켜 당화가 감소된 당단백질을 생산하는 한세눌라 폴리모르파 변이주를 제공하기 위함이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a)돌리칠 포스페이트 만노스 의존 알파-1,3-만노실트랜스퍼라제 유전자; (b)알파-1,6-만노실트랜스퍼라제 및 알파-1,2-만노실트랜 스퍼라제 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 결손시킨 한세눌라 폴리모르파 변이주를 제공하기 위함이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a)돌리칠 포스페이트 만노스 의존 알파-1,3-만노실트랜스퍼라제 유전자; (b)알파-1,6-만노실트랜스퍼라제 및 알파-1,2-만노실트랜스퍼라제 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 결손시키고; (c)하나 이상의 당쇄 수식 효소가 과발현되는 한세눌라 폴리모르파 변이주를 제공하기 위함이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 변이주를 이용하는 단계를 포함하는 인체형 당단백질을 제조하는 방법을 제공하기 위함이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 인체형 당단백질을 제공하기 위함이다.
본 발명은 의약용 단백질의 생산 숙주로 검증받은 한세눌라 폴리모르파에서 인체형 당쇄를 가지도록 조절하기 위한 시스템 구현에 관한 것이다.
단백질의 프로세싱에 관여하는 효소를 조작하여 유전적으로 변형된 당화과정을 보유하는 균주 제작을 위해서는 당쇄 형성의 초기 단계에 작용하는 효소를 조작하여 한세눌라 폴리모르파의 당쇄 수식경로를 초기 단계에서부터 재설계하는 것이 효율적이다. 모든 진핵 생물과 마찬가지로 소포체에서 일어나는 N-당쇄의 초기 생합성 경로는 크게 두 부분으로 나눌 수 있다. 먼저, 소포체 막에서 돌리칠 포스페이트 (Dolichyl phosphate)라 불리는 지질 전달체에 연결된 형태로 순차적으로 효소들이 당을 덧붙여서 최초 당쇄 (Glc3Man9GlcNAc2)가 합성된다. 그리고, 이렇게 합성된 최초 당쇄는 소포체 안에 존재하는 단백질의 적절한 아스파라긴 (Asn) 잔기에 전달되고, 추가로 당 절단 과정이 일어나서 골지체로 운반될 핵심 당쇄 (Man8GlcNAc2)가 만들어 진다.
본 발명자는 폴리모르파 DL-1 균주에서 초기 소포체 막에서 일어나는 지질 연결 당쇄 합성의 핵심 효소인 돌리칠 포스페이트 만노스 의존 알파-1,3-만노실 트랜스퍼라제를 처음으로 규명하고 상기 유전자가 파쇄된 변이주(Hpalg3 △)를 제조하였다. 그리고, 상기 변이주가 당단백질의 당화를 효율적으로 감소시키는 것을 확인하고, 상기 변이주를 조작하여 다양한 인체형 당쇄의 최소 핵심 골격이 되는 트리만노스(trimannose) 핵심 당쇄 부착 당단백질을 효과적으로 제조할 수 있다는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라, 한세눌라 폴리모르파의 변이주(Hpalg3 △)가 피키아 파스토리스의 변이주(Ppalg3 △) 보다 부착된 만노스 당의 수가 적고, 당쇄 프로파일링의 형태가 단순하고 균일하여서, 인체형 당단백질 제조에 훨씬 더 적합하다는 사실도 확인하였다.
본 명세서에서 용어 “당단백질 (glycoprotein)”이란 하나 이상의 아스파라긴 잔기 또는 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기 상에서 당화되거나 아스파라긴 및 세린 또는 트레오닌 잔기상에서 당화된 단백질을 의미한다. 본 명세서에서 용어 “당화가 감소된 (reduced glycosylation)”이란 메틸 요구성 효모 균주내에서 당단백질이 발현될 때 변형되지 않은 야생형의 메틸요구성 효모와 비교하여 당단백질 에 결합하는 탄수화물의 수가 감소된 것, 특히 보다 적은 만노스 잔기를 갖는 것을 의미한다.
하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖고 돌리칠 포스페이트 만노스 의존 알파-1,3-만노실트랜스퍼라제(dolichyl-phosphate-mannose dependent α-1,3-mannosyltransferase) 효소 활성을 나타내는 단백질에 관한 것이다.
본 발명자는, 한세눌라 폴리모르파의 돌리칠 포스페이트 만노스 의존 알파-1,3-만노실트랜스퍼라제는 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열을 가진다는 것을 밝혔다. 야생형의 서열을 가지는 돌리칠 포스페이트 만노스 의존 알파-1,3-만노실트랜스퍼라제 뿐만 아니라, 효소 활성을 가지는 한 90% 이상의 상동성을 가지는 단백질도 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명에서 한세눌라 폴리모르파 기원의 돌리칠 포스페이트 만노스 의존 알파-1,3-만노실트랜스퍼라제 유전자에 대해 사용된 용어 “상동성”이란 야생형 (wild type) 아미노산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 돌리칠 포스페이트 만노스 의존 알파-1,3-만노실트랜스퍼라제를 코딩하는 아미노산 서열과 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상 동일할 수 있는 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열간의 상동성을 백분율(%) 로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 제공하기 위함이다.
한세눌라 폴리모르파의 돌리칠 포스페이트 만노스 의존 알파-1,3-만노실트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산 서열은 바람직하게는 서열번호 1로 기재되는 핵산 서열을 가진다. 본 발명자는 서열번호 1로 기재되는 핵산 서열을 가지는 한세눌라 폴리모르파 유래의 돌리칠 포스페이트 만노스 의존 알파-1,3-만노실트랜스퍼라제 (dolichyl-phosphate-mannose dependent α-1,3-mannosyltransferase: HpALG3) 유전자를 GeneBank에 기탁번호 DQ193533로 기탁하였으며, 또한 이러한 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pGEM-T Easy-HpALG3를 제작한 후 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli) JM109 균주에 형질전환으로 도입하여 2005년 08월 17일에 KCTC (Korean Collection for Type Cultures, 한국 대전광역시 유성구 어은동 52번지 한국생명공학연구원)에 기탁번호 제KCTC 10835BP호로 기탁하였다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖고 돌리칠 포스페이트 만노스 의존 알파-1,3-만노실트랜스퍼라제(α-1,3-mannosyltransferase) 효소 활성을 나타내는 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.
이러한 재조합 벡터는 바람직하게는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖고 돌리칠 포스페이트 만노스 의존 알파-1,3-만노실트랜스퍼라제(α-1,3-mannosyltransferase) 효소 활성을 나타내는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
본 발명에서 용어, “벡터”는 숙주 세포에 DNA를 도입하고자 하는 통상의 모든 수단을 의미하며, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함한 통상의 모든 벡터를 포함한다.
적합한 벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인해서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기한 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하며, 바람직하게는 기탁번호 제KCTC 10835BP호로 기탁된 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
본 발명자는 효모, 보다 구체적으로 한세눌라 폴리모르파로부터 인체형 당쇄를 가지는 당단백질을 생산하기 위해서는 상기에서 밝힌, 핵심 당쇄 생합성에 중요한 역할을 하는 돌리칠 포스페이트 만노스 의존 알파-1,3-만노실트랜스퍼라제 유전자(HpALG3)를 중합효소 연쇄반응을 통하여 확보한 후, 세포내 유전자 재조합 기작을 이용하여 HpALG3의 파쇄를 시도하여 당화가 감소된 당단백질을 생산하는 한세눌라 폴리모르파 변이주를 제조하고자 하였다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 돌리칠 포스페이트 만노스 의존 알파-1,3-만노실트랜스퍼라제를 결손시켜 당화가 감소된 당단백질을 생산하는 한세눌라 폴리모르파 변이주에 관한 것이다.
게놈상에서 목적한 유전자만의 특이적 불활성화는 당 분야에서 확립된 방법을 통하여 수행할 수 있으며, 방법은 특별히 제한되지 않는다. 본 발명자는 돌리칠 포스페이트 만노스 의존 알파-1,3-만노실트랜스퍼라제를 특이적으로 결손시키기 위하여, 상동 재조합 (homologous recombination)법을 사용하였다. 돌리칠 포스페이트 만노스 의존 알파-1,3-만노실트랜스퍼라제의 N 말단과 C 말단에 사이에 선별마커를 포함하는 벡터로 한세눌라 폴리모르파를 형질전환시켜 게놈과 벡터사이에 재조합을 유도하였다. 사용되는 선별마커(selection marker)는 특별히 제한되지 않고, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있고, 본 발명에서는 URA2를 선별마커로 사용하였다.
상기 방법으로 돌리칠 포스페이트 만노스 의존 알파-1,3-만노실트랜스퍼라제 유전자를 결손시킨 한세눌라 폴리모르파 Hpalg3 Δ 변이주 (한세눌라 폴리모르파 DL-1 Hpalg3 Δ)에서 발현되는 당단백질의 당쇄는 5개 내지 8개의 만노스가 부착된 당쇄 (Man5 -8GlcNAc2)를 가졌다. 이는 7개 내지 12개의 만노스가 부착된 당쇄를 가지는 야생형 한세눌라 폴리모르파에 비하여 부착된 만노스 수가 현저하게 감소된 것이다. 또한, 본 발명에서 제조한 한세눌라 폴리모르파 Hpalg3Δ 변이주에서 발 현되는 당단백질에 알파 1,2-만노시다제와 알파 1,6-만노시다제를 순차적으로 처리하면, 인체형 당쇄의 최소 핵심 골격인 트리만노스 핵심당쇄 (Man3GlcNAc2) 구조로 전환된다는 사실을 관찰하였다. 이는 경쟁 효모 숙주인 피키아 파스토리스 Ppalg3 Δ 변이주에서 발현된 당단백질이 만노스 등을 포함하는 육탄당이 6개에서 15개 까지 부착된 당쇄 (Hex6 -15GlcNAc2)를 지닐 뿐만 아니라, 이 중에는 만노시다제에 의해서 제거되지 않는 육탄당이 존재한다는 사실과 비교하면 (Davidson et al., Glycobiol. 14, 399-407, (2004)), 한세놀라 폴리모파가 인체 하이브리드형 및 복합형 당단백질 생산을 위한 당쇄 공학 적용 균주로서 피키아 파스토리스 보다 적합하다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 용어, “인체 복합형”이란 트리만노스 핵심 당쇄의 말단에 있는 두 개의 만노즈에 각각 N-아세틸글루코자민, 갈락토즈 및 시알산 등이 순차적으로 부가되어 나가는 구조들을 총칭하며, 때문에 두 개 이상의 안테나 구조를 갖는다. 본 명세서에서 용어, “인체 하이브리드형”이란 트리만노스 핵심 당쇄에서 뻗어나간 안테나들 중 하나 이상이 만노스 잔기들로만 신장이 되었거나 끝나고, 나머지 안테나들은 N-아세틸글루코자민, 갈락토즈 및 시알산 등이 순차적으로 부가되어 나가는 구조를 의미한다.
Hpalg3 Δ 변이주를 추가로 당쇄 수식 경로를 재설계하여 다양한 형태의 당쇄를 가지도록 조작할 수 있다.
이런 시도의 일환으로, Hpalg3 Δ 변이주를 이용하여 당쇄 형성에 관여하는 유전자의 추가적인 조작이 가능하다. 예들 들어, 추가로 알파-1,6-만노실트랜스퍼라제, 알파-1,2-만노실트랜스퍼라제 또는 두 유전자 모두를 결손시킬 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시에서는 알파-1,6-만노실트랜스퍼라제 유전자인 HpOCH2와 돌리칠 포스테이트 만노스 의존 알파-1,3-만노실트랜스퍼라제 유전자인 HpALG3가 함께 결손 된 Hpoch2 Δ alg3 Δ 이중결손 변이주를 제조하였다. Hpoch2 Δ alg3 Δ 이중결손 변이주는 만노스가 4 내지 6개로 Man4 -6GlcNAc2 만노스 수가 현저히 감소한 당쇄를 가지는 것을 확인할 수 있었다 (도 7B).
또한, 상기의 변이주를 당쇄 수식에 관련된 효소 활성을 갖는 하나 이상의 단백질을 발현시킬 수 있는 발현 벡터로 상기한 변이주를 형질전환시킴으로서, 인체형 당쇄를 효과적으로 합성할 수 있다. 알파 1,2-만노시다제, 만노시다제 IA, 만노시다제 IB, 만노시다제 IC, 그리고 만노시다제 II 등으로 트리만노스 핵심당쇄 (Man3GlcNAc2)를 만들 수 있으나 반드시 이들로 한정되는 것은 아니며 만노스를 절단하는 활성을 가진 유전자 및 유전자의 단편으로도 가능하다. 본 발명의 구체적인 실시에서는 한세눌라 폴리모파 Hpoch2 Δ alg3 Δ 이중결손 변이주에서 알파1,2-만노시다제를 발현시켜 트리만노스 핵심당쇄가 부착된 재조합 당단백질을 생성하였다 (도 7C). 트리만노스 핵심당쇄는 인체형 당쇄들의 공통적인 핵심 골격으로서 여기에 N-아세틸글루코자민, 갈락토즈, 푸코즈 및 시알산 등이 부가되어서 여러 다양한 인체 하이브리드형 및 복합형 당단백질이 생산될 수 있다.
따라서, 추가로 N-아세틸글루코자미닐트랜스퍼라제 I 및 N-아세틸글루코자미 닐트랜스퍼라제 II 등으로 N-아세틸글루코자민을 부가할 수 있으며, 갈락토실트랜스퍼라제로 갈락토스를 부가하고 시알릴트랜스퍼라제로 시알산을 부가하며 퓨코실트랜스퍼라제로 퓨코스를 부가할 수 있으나 반드시 이들로만 한정되는 것은 아니고 당쇄 변형에 일조할 수 있는 다양한 유전자들을 사용할 수 있다. 또한, 이들의 기질이 되는 UDP-아세틸글루코자민, UDP-갈락토스 및 CMP-시알산 등을 생합성 하는 경로의 유전자들 및 이들을 골지체 또는 소포체로 전이하는 트랜스포터(transporter) 유전자들도 포함한다. 상기한 형질전환에 사용되는 발현 벡터에 포함되는 당쇄 수식 효소 유전자들 및 그 대상 기질 대사 관련 유전자들에는 이러한 효소 및 전이 단백질들을 코딩하는 전체 유전자 서열만이 아니라 이들의 기능성 부분을 코딩하는 단편 서열도 가능하다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 한세눌라 폴리모르파 변이주를 이용하는 단계를 포함하는 인체형 당단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
인체형 당단백질 제조에 사용될 수 있는 변이주는 상기한 모든 형태의 변이주를 포함한다. 본 발명의 한세눌라 폴리모르파 Hpalg3 Δ 변이주, Hpoch2 Δ alg3 Δ 이중결손 변이주 또는 Hpoch2 Δ alg3 Δ 균주에 하나 이상의 당쇄 수식 효소 및 이의 기질 대사 관련 유전자가 발현되는 변이주를 사용하여 인체 만노즈형 또는 하이브리드형 및 복합형 당쇄가 부착된 재조합 당단백질을 제조할 수 있다.
인체 하이브리드형 및 복합형 등과 같은 복잡한 당쇄 구조를 보유하도록 하기 위해서는 특정 당 형태가 추가되도록 조작할 수 있다. 예들 들어, 인간의 당단 백질에서 전형적으로 확인되는 시알산, 갈락토스, 퓨코스 등의 당은 일반적으로 효모 시스템에서는 결여되어 있다. 상기한 한세눌라 폴리모르파 변이주와 하나 이상의 당쇄 수식 효소 및 이의 기질 대사 관련 유전자를 이용하여 당단백질에 시알산, 갈락토즈, 푸코즈 등을 첨가하여 인간세포에서 형성된 당쇄와 유사한 구조를 가지는 인체 하이브리드형 및 복합형 당쇄가 부착된 다양한 인체형 당단백질들을 생산할 수 있다.
생산된 당단백질은 통상적인 방법에 의해 정제될 수 있으며, 정제될 특정 단백질의 특성에 따라 정제 프로토콜을 결정한다. 이러한 결정은 당업자에게 통상적인 기술에 속한다. 예를 들어 침전, 면역흡착, 분획화 또는 다양한 크로마토그래피와 같은 전형적인 분리 기술에 의해 정제할 수 있다.
본 발명에 따라 생산될 수 있는 당단백질은 예를 들어 사이토카인 (예: EPO, 인터페론-알파, 인터페론-베타, 인터페론-감마, G-CSF 등), 응집인자 (예: VIII 인자, IX 인자, 인간 단백질 C), 치료용 항체류 (예: 면역글로블린, Fab, 이중특이 항체, 단일체인 항체, diabody 등) 및 Fc 융합 단백질, 효소 치료제 (예: 글루코세레브로시데이즈, 알파-갈락토시데이즈, 알파-L-이듀로니데이즈, 알파-글루코시데이즈 등), 내피성장인자, 성장호르몬 방출인자, 티파노소마크루지 트랜스-시알리다제 (Typanosoma cruzi trans-sialidase), HIV 외피 단백질(HIV envelope protein), 인플루엔자 바이러스 A 헤마글루티닌 (influenza virus A haemagglutinin), 인플루엔자 뉴라미니다제 (influenza neuraminidase), 소의 엔테로카이네이즈 (enterokinase) 활성인자, 소의 포진 바이러스 타입-1 당단백질 D (Bovine herpes virus type-1 glycoprotein D), 인간 안지오스타틴(human angiostatin), 인간 B7-1, B7-2 및 B-7 수용체 CTLA-4, 인간 조직 인자 (human tissue factor), 성장인자 (예: 혈소판-유래 성장인자), 인간 알파-앤티트립신(human alpha-antitrypsin), 조직 플라즈미노겐활성화인자 (tissue plasminogen activator), 플라즈미노겐 활성화인자 억제인자-1(plasminogen activator inhibitor-1), 우로키나제 (urokinase), 플라즈미노겐, 트롬빈 등을 포함한다.
또 다른 양태로서, 본 발명의 한세눌라 폴리모르파 변이주를 이용하여 제조된 다양한 인체형 당단백질에 관한 것이다.
본 발명의 방법으로 제조된 인체형 당쇄를 가지는 당단백질은 인체 내에서 면역반응을 덜 유발할 뿐만 아니라, 용해도, 단백질 분해효소에 대한 감수성, 트래픽킹, 트랜스포트, 분비, 다른 단백질 또는 인자에 의한 인식 등의 반응이 인간에서 생성된 단백질과 동일하거나 유사하므로 인체에 적합하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적일 뿐 본 발명의 권리 범위는 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 한세눌라 폴리모르파 HpALG3 유전자 확보 및 아미노산 서열 분석
한세눌라 폴리모르파 DL-1 균주 (Levine and Cooney, Appl. Microbiol., 26, 982-990, (1973))에서 추출한 염색체 DNA를 주형으로 한 쌍의 프라이머 (AL3-N과 AL3-C; 표 1)를 사용하여 중합효소 연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction; PCR)을 통해 ALG3가 포함된 1.36 kb 크기의 DNA 절편을 확보하고 아미노산 서열을 분석하였다.
HpALG3는 1,362 bp 크기로 454개의 아미노산으로 구성된 단백질을 암호화한다. 상기 HpAlg3 단백질은 아미노산 서열상에 4개의 막 통과 부위 (transmembrane spanning region)로 예측되는 부분이 있어서 막단백질 (membrane protein)로 사료된다 (도 1). 도 1에서 막 통과 부위는 아미노산 42번째에서 58번째까지, 아미노산 176번째에서 192번째까지, 아미노산 221번째에서 237번째까지, 아미노산 425번째에서 441번째까지 밑줄로 표시하였다. HpAlg3 단백질의 아미노산 서열은 인간인 호모사피엔스의 Alg3 단백질과는 30%의 동일성(identity)과 44%의 유사성(similarity)을 보이고 효모인 사카로마이세스 세레비지애, 쉬조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) 및 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) 등과는 각각 36%와 54%, 29%와 45%, 42%와 64%의 동일성과 유사성을 보이고 피키아 파스토리스의 Alg3 단백질과 가장 가깝다는 것을 알 수 있었다(도 2).
Figure 112005061542096-pat00001
실시예 2: 한세눌라 폴리모르파 HpALG3 유전자 결손 균주 제작 및 특성 분석
한세눌라 폴리모르파 ALG3 유전자가 파쇄된 변이주를 제작하기 위해 표 1에 기술된 프라이머 (HpALG3 유전자 클로닝과 파쇄를 위한 중합효소 연쇄반응에 사용된 프라이머들)들을 사용하여 융합 중합효소 연쇄반응 (fusion PCR)과 세포내 유전자 재조합 (in vivo DNA recombination)이라는 두 가지 기술을 도입하여 유전자 파쇄를 시도하였다 (Oldenburg et al., Nucleic Acid Res., 25, 451, 1997). 일차 PCR에서 네 쌍의 프라이머를 이용하여 각각의 URA3 유전자 (N-말단; UN-S, UN-A, C-말단; UC-S, UC-A)와 HpALG3 유전자 (N-말단; AL3N-S, AL3N-A, C-말단; AL3C-S, AL3C-A)의 N-말단과 C-말단을 증폭한 후, 이차 융합 중합효소 연쇄반응에서 두 쌍의 프라이머를 이용하여 HpALG3 유전자의 N-말단과 URA3 유전자의 N-말단을 연결(AL3N-S, UN-A)시키고 URA3 유전자의 C-말단과 HpALG3 유전자의 C-말단을 연결(UC-S, AL3C-A)하였다. 확보한 각각의 DNA 조각 두 개를 효모 세포내로 도입한 후 세포내 유전자 재조합에 의해서 HpALG3 유전자가 파쇄된 형질전환체를 선별하였다 (도 3). 일차적으로 URA3 선별 표지로 유라실 (Uracil)이 결핍된 최소배지에서 성장하는 형질전환체들을 선별한 후 중합효소 연쇄반응에 의해서 야생형 균주와 다르게 증폭된 DNA 조각을 확인하여 HpALG3 유전자가 파쇄된 한세눌라 폴리모르파 변이주인 Hpalg3 Δ (leu2 ; alg3 :: URA3) 균주를 제작하였다. HpALG3 유전자가 결손된 한세눌라 폴리모르파 변이주인 Hpalg3 Δ를 2005년 10월 27일에 KCTC (Korean Collection for Type Cultures, 한국 대전광역시 유성구 어은동 52번지 한국생명공학연구원)에 기탁번호 제KCTC 10867BP호로 기탁하였다. 확보한 Hpalg3 Δ 균주의 성장 특성을 살펴보면, 일반적으로 효모의 당외쇄 합성이 결손된 돌연변이주들이 나타내는 온도나, 하이그로마이신 B (Hygromycin B)와 같은 항생제, 칼코플루오 화이트 (Calcofluor white), 소듐 데옥시콜레이트 (Sodium deoxycholate)에 민감성을 나타내는 성장 저해 현상은 나타나지 않았으며(도 4와 5) Hpalg3Δ 균주의 성장 특성은 야생형 균주와 큰 차이가 없었다.
실시예 3: 한세눌라 폴리모르파 Hpalg3 결손 변이주로부터 합성된 당쇄의 크기 및 구조 분석
실시예 2에서 개발된 한세눌라 폴리모르파 Hpalg3 Δ 변이주에서 합성되는 당쇄의 크기와 구조를 분석하기 위하여 한세눌라 폴리모르파 유래의 당단백질인 앱신1 (yapsin 1; Yps1p)을 한세눌라 폴리모르파 야생형 균주와 Hpalg3 Δ 변이주에서 분비 발현시켰다. 당단백질인 Yps1p에는 N-결합형 당화가 일어날 수 있는 4개의 아미노산 서열이 존재한다. 6개의 히스티딘 (histidine)이 말단에 부착된 Yps1p를 발현하는 벡터 pDLMOX-YPS1(H) (김은중, “Biosynthesis and maturation of yapsins in the methylotropic yeast Hansenula polymorpha” 석사학위논문, 충남대 (2005))로 형질 전환된 한세눌라 폴리모르파 야생형 균주 및 Hpalg3 Δ 변이주를 YPM (yeast extract 1%, Bacto-peptone 2%, methanol 2%) 액상 복합배지에서 배양하여 Yps1p를 분비 발현하였다. 배양액으로 분비된 Yps1p를 니켈 컬럼 (nickel column)을 통과시켜 C-말단 부분에 6개의 히스티딘이 존재하는 Yps1p만을 선택적으로 분리하고, Yps1p의 당쇄를 분리 회수하기 위해서 PNGase F를 처리한 뒤, 2-아미노피리딘 (2-aminopyridine; PA)으로 형광표지하여 HPLC로 분석하였다. 도 6의 A와 D에 나타낸 바와 같이 7개 내지 12개의 만노스가 부착된 당쇄 (Man7-12GlcNAc2)가 골고루 분포되어 있는 야생형 균주에 비해서 Hpalg3 Δ 변이주에서 분비 발현된 Yps1p에 부착되어 있는 당쇄는 만노스 5개가 부착된 것 (Man5GlcNAc2)이 가장 많고, 6개에서 8개까지 부착된 당쇄 (Man6 -8GlcNAc2)도 일부 존재하였다. Hpalg3 Δ 변이주가 야생형 균주보다 만노스 수가 2내지 4개가 적게 부착된 당단백질을 발현한다는 사실은 HpALG3 유전자의 결손으로 돌리칠 포스페이트 만노스 의존 알파-1,3-만노실트랜스퍼라제 활성이 사라져서 Man6GlcNAc2-Dol-pp이 생성되지 못하고 이후 이를 기질로 하는 지질 연결 당쇄의 생합성 과정이 제거 되어 4개의 만노스가 부가될 기회를 잃어버려서 Glc3Man9GlcNAc2 대신에 Glc3Man5GlcNAc2이 당단백질로 전이되어 이후 N-당쇄 생합성 과정이 진행되는 것으로 판단된다.
Yps1p에서 분리된 당쇄에 알파-1,2-만노시다제와 알파-1,6-만노시다제를 순차적으로 처리한 후 당쇄 프로파일의 변화를 분석한 결과, 야생형 균주로부터 확보된 당쇄는 만노스 5개와 6개에 해당하는 당쇄 (Man5 -6GlcNAc2)로 전환된 후(도 6B), 알파-1,6-만노시다제 처리에 의하여 모두 만노스 5개 당쇄 (Man5GlcNAc2)로 전환되었다(도 6C). 반면에, Hpalg3 Δ 변이주로부터 얻어진 당쇄는 알파-1,2-만노시다제를 처리했을 경우 만노스 3개와 4개에 해당하는 당쇄 (Man3 -4GlcNAc2)로 전환되었고(도 6E), 알파-1,6-만노시다제 처리에 의하여 모두 만노스 3개를 가진 트리만노스(trimannose) 핵심 당쇄 (Man3GlcNAc2)로 전환되었다 (도 6F). 이 트리만노스 핵심당쇄는 인체형 당쇄의 최소 핵심골격으로 여기에 N-아세틸글루코자민과 갈락토스 및 시알산이 순차적으로 부가되어 전형적인 인체형 당쇄 구조가 완성된다. 종합해보면, HpALG3 유전자의 산물은 돌리칠 포스테이트 만노스 의존 알파-1,3-만노실트랜스퍼라제 활성을 가지며, Hpalg3 Δ 변이주는 지질 연결 당쇄 생합성의 후반부가 제거되므로 인체형 당쇄의 핵심 골격인 트리만노스 핵심당쇄의 합성에 유용하게 사용될 수 있다.
실시예 4: 한세눌라 폴리모르파 Hpoch2 Δ alg3 Δ 이중결손 변이주를 이용한 당쇄공 학
한세눌라 폴리모르파의 당화 과정에서 본 발명자는 이미 알파-1,6-만노실트랜스퍼라제를 코딩하는 HpOCH2 유전자가 결손된 변이주로 당외쇄 결합을 제한하는데 성공한 바 있다(대한민국 특허출원 제2004-6352호). 이를 더욱 발전시켜 본 발명자는 HpOCH2 유전자가 결손된 변이주를 모 균주로 하여 실시예 2에서 기술한 융합 중합효소 연쇄 반응과 세포내 유전자 재조합 방법을 사용하여 돌리칠 포스테이트 만노스 의존 알파-1,3-만노실트랜스퍼라제 유전자인 HpALG3 를 결손시켜 Hpoch2Δalg3Δ 이중결손 변이주를 제조하였다. HpALG3 유전자와 HpOCH2 유전자가 이중결손된 한세눌라 폴리모르파 변이주인 Hpoch2 Δ alg3 Δ를 2005년 10월 27일에 KCTC (Korean Collection for Type Cultures, 한국 대전광역시 유성구 어은동 52번지 한국생명공학연구원)에 기탁번호 제KCTC 10868BP호로 기탁하였다. 그 후, 실시예 3에서 기술한 방법으로 앱신1 유전자를 도입하여 Yps1p 단백질을 분비 발현하고 정제하여 이로부터 당쇄를 분리 회수한 후 형광표지하여 HPLC로 분석하였다. 도 7의 A에서 야생형 균주의 당쇄는 만노스가 7개에서 12개까지 결합되어 있는 반면(도 7A), Hpoch2Δalg3Δ 이중결손 변이주의 당쇄에는 만노스가 4개, 5개 및 6개가 결합되어 (Man4 -6GlcNAc2) 만노스 수가 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었다 (도 7B).
또한, 본 발명자는 인체형 복합 당쇄 생합성을 위한 최소 골격인 트리만노스 핵심 당쇄(Man3GlcNAc2)를 합성하는 한세눌라 폴리모르파 균주를 얻어내기 위하여 전통효모 사카로마이세스 세레비시애를 대상으로 수행된 선행 연구(Chiba et al., J. Biol. Chem., 273, 26298-26304, (1998))에서 기술된 아스퍼질러스 사이토이 (A. saitoi) 유래의 알파-1,2-만노시다제를 소포체에서 발현되도록 하는 방법을 이용하였다. 한세눌라 폴리모르파 Hpoch2 Δ alg3 Δ 이중결손 변이주에 상기 알파-1,2-만노시다제 유전자 발현 카세트를 지닌 벡터 pDUMOX-MsdS(HA-HDEL) (김무웅, “Characterization of biosynthetic pathway of N-linked oligosaccharides in the methylotropic yeast Hansenula polymorpha” 박사학위논문, 충남대 (2004))를 도입하여 당쇄공학적으로 조작된 재조합 균주 Hpoch2 Δ alg3 Δ-MsdSp를 제작하였다. 당쇄공학적으로 조작된 한세눌라 폴리모르파 균주 Hpoch2 Δ alg3 Δ-MsdSp가 트리만노스 핵심 당쇄(Man3GlcNAc2)를 실제 합성하는지 조사하기 위해서, 이 균주에 YPS 1 유전자를 도입시키고 이로부터 분비 발현된 Yps1p에 부착된 당쇄 구조를 실시예 3에 기술한 방법으로 관찰하였다. 당쇄공학적으로 조작된 재조합 균주로부터 생산된 당단백질의 당쇄의 프로파일링 (도 7C)은 만노스 3개가 결합된 트리만노스 (trimannose) 핵심당쇄 (Man3GlcNAc2)가 주 형태로 생성되었다. 상기 당쇄 구조는 인체형 당단백질 생산을 위한 최소 골격 핵심 당쇄로서, 본 균주를 활용하여 당쇄공학적 응용에 이용하면 인체형 당쇄 부착 당단백질의 발현이 가능하다.
차세대 고부가가치 재조합 의약품인 당단백질이 바이오 의약품 시장의 주력으로 자리 잡아가고 있어서 이들을 고품질, 고효율로 생산하기 위한 발현 시스템에 대한 시장의 요구가 급격히 증가하고 있다. 메탄올자화 효모인 한세눌라 폴리모르파는 재조합 간염 백신 대량 생산 시스템으로 이미 국제적으로 인정받고 있는 우수한 재조합 단백질 분비 발현 숙주로서, 본 숙주에서 발현된 재조합 단백질들은 바이오 의약품으로 개발될 전망이 매우 높으나, 효모 특이적 고농도 만노스 타입의 당쇄 구조로 인하여 인체 유래의 의약용 당단백질의 발현 시스템으로 널리 사용되고 있지는 못하다. 상기 실시예들을 통하여 살펴본 바와 같이, 본 발명에서 개발된 HpALG3 유전자가 결손된 Hpalg3Δ 변이주와 Hpoch2 Δ alg3 Δ 이중결손 변이주는 만노스 부착이 크게 감소된 당쇄를 합성할뿐만 아니라, 알파 1,2-만노시다제 발현에 의해서 손쉽게 인체형 당쇄의 최소 골격인 트리만노스 (trimannose) 핵심당쇄 (Man3GlcNAc2) 형태로 전환될 수 있다. 따라서, 상기 변이주들 또는 추가로 당쇄 수식 경로가 재설계된 변이주들을 이용하면 야생형 효모 균주에 비해서 인체 하이브리드형 및 복합형 당쇄 구조와 보다 가까운 형태로 당단백질을 생산할 수 있다. 즉, 본 발명은 인체 유래의 의약용 당단백질 생산을 위한 기반 숙주를 개발하여 의약용 당단백질들을 고품질, 고효율로 대량 생산할 수 있는 숙주 시스템을 제공한다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> A novel Hansunula polymorpha gene coding for dolichyl-phosphate dependent mannose alpha-1,3-mannosyltransferase and process for the production fof recombinat glycoproteins with Habsebyka polymorpha mutant strain deficient in the same gene <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1362 <212> DNA <213> Hansenula polymorpha <220> <221> CDS <222> (1)..(1362) <223> alpha-1,3-mannosyltransferase <400> 1 atg gca gat gca aat gcg gat ata cag ccc gaa aca cgg ccg gag ctc 48 Met Ala Asp Ala Asn Ala Asp Ile Gln Pro Glu Thr Arg Pro Glu Leu 1 5 10 15 aac tta gga aat gtc ctg ggc gat atc aag ttt gga ttg ttg tcg ctg 96 Asn Leu Gly Asn Val Leu Gly Asp Ile Lys Phe Gly Leu Leu Ser Leu 20 25 30 ttc aac aac cct gag ttc tgc gcg cca atc gcc gtc ttt ctg acc atc 144 Phe Asn Asn Pro Glu Phe Cys Ala Pro Ile Ala Val Phe Leu Thr Ile 35 40 45 gca gag tcg ctt ctc ctc aag gcc gtg atc cat ttt gtc ccc tac acc 192 Ala Glu Ser Leu Leu Leu Lys Ala Val Ile His Phe Val Pro Tyr Thr 50 55 60 gag att gac tac agc acg tac atg cag cag atc gac caa att gag gct 240 Glu Ile Asp Tyr Ser Thr Tyr Met Gln Gln Ile Asp Gln Ile Glu Ala 65 70 75 80 gga gag ctt gac tac gcc aaa att agc ggc gac aca ggc cca att gtg 288 Gly Glu Leu Asp Tyr Ala Lys Ile Ser Gly Asp Thr Gly Pro Ile Val 85 90 95 tat ccc ggc gga cat gtc tac ata tac tcg tgg atg aag tgg ttc acc 336 Tyr Pro Gly Gly His Val Tyr Ile Tyr Ser Trp Met Lys Trp Phe Thr 100 105 110 aac ggg atg gac aac gtg cac gct ggc cag cag att ttc agg tat cta 384 Asn Gly Met Asp Asn Val His Ala Gly Gln Gln Ile Phe Arg Tyr Leu 115 120 125 tat ctg gcg aca ttt gtg cta act ctg gtt gcg tat ttc cag aca aat 432 Tyr Leu Ala Thr Phe Val Leu Thr Leu Val Ala Tyr Phe Gln Thr Asn 130 135 140 gtg cgg ttc aag ccg tac ctg ctc tac ttt ctg tgt ctg tcc aaa cgg 480 Val Arg Phe Lys Pro Tyr Leu Leu Tyr Phe Leu Cys Leu Ser Lys Arg 145 150 155 160 ttg cac tcc atc tac gtg ctg cgg ctg ttc aac gac tgc ttt gcc acg 528 Leu His Ser Ile Tyr Val Leu 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Gln Phe Leu Ala Trp Tyr Met Tyr Ser Leu Pro Met Leu Leu Gln Leu 385 390 395 400 ggc ggg ctg ccg tgg tac gca cag acg gcg ctc gtg gtg gtc cac gag 1248 Gly Gly Leu Pro Trp Tyr Ala Gln Thr Ala Leu Val Val Val His Glu 405 410 415 tgg tgc tgg aac gtg tac ccc agc aca gcg gcc agc tcg ttg ggc ctg 1296 Trp Cys Trp Asn Val Tyr Pro Ser Thr Ala Ala Ser Ser Leu Gly Leu 420 425 430 gtg gca gtg ctt gcg aca gtg gtt ttg tcg cag ctc cgg tgt ggc ttc 1344 Val Ala Val Leu Ala Thr Val Val Leu Ser Gln Leu Arg Cys Gly Phe 435 440 445 ggc aaa ccc aaa cag gaa 1362 Gly Lys Pro Lys Gln Glu 450 <210> 2 <211> 454 <212> PRT <213> Hansenula polymorpha <400> 2 Met Ala Asp Ala Asn Ala Asp Ile Gln Pro Glu Thr Arg Pro Glu Leu 1 5 10 15 Asn Leu Gly Asn Val Leu Gly Asp Ile Lys Phe Gly Leu Leu Ser Leu 20 25 30 Phe Asn Asn Pro Glu Phe Cys Ala Pro Ile Ala Val Phe Leu Thr Ile 35 40 45 Ala Glu Ser Leu Leu Leu Lys Ala Val Ile His Phe Val Pro Tyr Thr 50 55 60 Glu Ile Asp Tyr Ser Thr Tyr Met Gln Gln Ile Asp Gln Ile Glu Ala 65 70 75 80 Gly Glu Leu Asp Tyr Ala Lys Ile Ser Gly Asp Thr Gly Pro Ile Val 85 90 95 Tyr Pro Gly Gly His Val Tyr Ile Tyr Ser Trp Met Lys Trp Phe Thr 100 105 110 Asn Gly Met Asp Asn Val His Ala Gly Gln Gln Ile Phe Arg Tyr Leu 115 120 125 Tyr Leu Ala Thr Phe Val Leu Thr Leu Val Ala Tyr Phe Gln Thr Asn 130 135 140 Val Arg Phe Lys Pro Tyr Leu Leu Tyr Phe Leu Cys Leu Ser Lys Arg 145 150 155 160 Leu His Ser Ile Tyr Val Leu Arg Leu Phe Asn Asp Cys Phe Ala Thr 165 170 175 Phe Leu Met Val Ala Thr Ile Val Val Leu Gln Gln Ala Ala Val Leu 180 185 190 Arg Arg Arg Lys Ser Ala Leu Gly Ala Val Leu Thr Phe Phe Ser Ala 195 200 205 Gln Leu Phe Ser Ser Ala Val Ser Val Lys Met Asn Ala Leu Leu Tyr 210 215 220 Leu Pro Gly Tyr Leu Val Val Val Tyr Met Ile Leu Gly Glu Asn Leu 225 230 235 240 Leu His Thr Leu Ala Val Ile Gly Phe Gly Cys Ala Val Gln Ala Gly 245 250 255 Ile Asn Trp Asp Phe Leu Ala Ala Ser Glu Thr Thr Arg Ala His Phe 260 265 270 Leu Gln Asn Ala Phe Asp Phe Ser Arg Ala Phe Leu Tyr Arg Trp Thr 275 280 285 Val Asn Trp Lys Phe Val Pro Glu Pro Ile Phe Arg Ser Arg Glu Phe 290 295 300 His Thr Leu Leu Leu Leu Ala His Thr Ala Ala Leu Thr Phe Phe Ala 305 310 315 320 Val Tyr Lys Trp Ser Ser Lys Ser Val Thr Gly Lys Pro Ser Thr Lys 325 330 335 Phe Ile Arg Asp Ala Leu Ile Phe Tyr Lys Asp Thr Ile Gly Pro Glu 340 345 350 Asn Val Ile Leu Ser Pro Glu Ser Gly Arg Tyr Ile Phe Trp Val Met 355 360 365 Ala Thr Ser Asn Leu Ile Gly Val Leu Phe Ala Arg Ser Leu His Tyr 370 375 380 Gln Phe Leu Ala Trp Tyr Met Tyr Ser Leu Pro Met Leu Leu Gln Leu 385 390 395 400 Gly Gly Leu Pro Trp Tyr Ala Gln Thr Ala Leu Val Val Val His Glu 405 410 415 Trp Cys Trp Asn Val Tyr Pro Ser Thr Ala Ala Ser Ser Leu Gly Leu 420 425 430 Val Ala Val Leu Ala Thr Val Val Leu Ser Gln Leu Arg Cys Gly Phe 435 440 445 Gly Lys Pro Lys Gln Glu 450 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer AL3-N <400> 3 atggcagatg caaatgcgg 19 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer AL3-C <400> 4 ttattcctgt 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Claims (13)

  1. 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖고 돌리칠 포스페이트 만노스 의존 알파-1,3-만노실트랜스퍼라제(dolichyl-phosphate-mannose dependent α-1,3-mannosyltransferase) 효소 활성을 나타내는 단백질.
  2. 제1항의 단백질을 코딩하는 핵산.
  3. 제2항에 있어서, 서열번호 1로 기재되는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산.
  4. 서열번호 1로 기재되는 핵산을 포함하는 재조합 벡터.
  5. 제1항의 돌리칠 포스페이트 만노스 의존 알파-1,3-만노실트랜스퍼라제 유전자를 결손시켜 당화가 감소된 당단백질을 생산하는 한세눌라 폴리모르파 변이주.
  6. 제5항에 있어서, 추가로 알파-1,6-만노실트랜스퍼라제 및 알파-1,2-만노실트랜스퍼라제 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 결손시킨 한세눌라 폴리모르파 변이주.
  7. 제5항에 있어서, 알파1,2-만노시다제, 만노시다제 IA, 만노시다제 IB, 만노시다제 IC, 만노시다제 Ⅱ, N-아세틸글루코자미닐트랜스퍼라제 Ⅰ, N-아세틸글루코자미닐트랜스퍼라제 Ⅱ, 갈락토실트랜스퍼라제, 사이알릴트랜스퍼라제 및 퓨코실트랜스퍼라제로 이루어진 그룹중에서 선택되는 하나 이상의 당쇄 수식 효소가 과발현되는 한세눌라 폴리모르파 변이주.
  8. 제5항에 있어서, 상기 변이주는 Hpalg3△(기탁번호 제KCTC 10867BP호), Hpoch2△alg3△(기탁번호 제KCTC 10868BP호) 및 Hpoch2△alg3△-MsdSp로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인 한세눌라 폴리모르파 변이주.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 한세눌라 폴리모르파 변이주를 이용하는 단계를 포함하는, 인체형 당단백질을 제조하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 한세눌라 폴리모르파 변이주로 Hpalg3△ 변이주를 이용하여 5개 내지 8개의 만노스 잔기를 가지는 Man5-8GlnNac2의 당화골격을 갖는, 인체형 당단백질을 제조하는 방법.
  11. 제9항의 방법에 의해 제조된 인체형 당단백질.
  12. 제9항에 있어서, 상기 한세눌라 폴리모르파 변이주로 Hpoch2△alg3△ 변이주를 이용하여 4개 내지 6개의 만노스 잔기를 가지는 Man4-6GlnNac2의 당화골격을 갖는, 인체형 당단백질을 제조하는 방법.
  13. 제9항에 있어서, 상기 한세눌라 폴리모르파 변이주로 Hpoch2△alg3△-MsdSp 변이주를 이용하여 3개의 만노스 잔기를 가지는 Man3GlnNac2의 당화골격을 갖는, 인체형 당단백질을 제조하는 방법.
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