KR100637410B1 - 신규한 효모 변이주 및 포유류형 당쇄를 함유하는당단백질의 제조방법 - Google Patents

Abstract

포유류 세포가 생산하는 당쇄와 동일한 당쇄 구조를 가진 당쇄를 단백질의 아스파라긴 잔기에 부가시킨 당단백질을 생산할 수 있는 신규한 효모변이주 및 이 변이주를 이용하여 당쇄공학적수법에 의해 당쇄 및 당단백질을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에 의해 신규하게 육종된 영양요구성 삼중변이주, 영양요구성 사중변이주에 의하면, 인간 등 포유류 세포가 생산하는 고 만노오스형과 동일한 중성당쇄, 또는 동일한 중성당쇄를 갖는 당단백질을 다량으로 순도 좋게 생산할 수 있다. 또한 상기 변이주에 포유류형 당쇄의 생합성계 유전자를 도입하는 것에 의해 고 만노오스형, 혼성형, 복합형 등의 포유류형 당쇄 또는 포유류형 당쇄를 갖는 단백질을 효율적으로 생산할 수 있다.

Description

신규한 효모 변이주 및 포유류형 당쇄를 함유하는 당단백질의 제조방법{Novel yeast variants and process for producing glycoprotein containing mammalian type sugar chain}

본 발명은 포유류형 세포가 생산하는 당쇄와 동일한 당쇄구조를 갖는 당쇄를 단백질의 아스파라긴 잔기에 부가시킨 당단백질 생산능을 갖는 신규한 효모변이주 및 이 변이주를 이용하여 당쇄공학적수법에 의해 당쇄 및 당단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

천연계에 존재하는 단백질에는 아미노산만으로된 단순 단백질과 당쇄나 지질, 인산 등이 결합된 복합 단백질의 2종류가 있고, 사이토카인류에 관해서는 그의 대부분이 당단백질인 것이 알려져있다. 이중에서, 에리쓰로포이에틴(EPO)나 조직 플라스미노겐 활성화인자(TPA) 등에 관해서는 그 당쇄를 제외하면 본래의 생물활성을 나타내지 않게되는 것이 알려져 있었다(목번양(木幡陽), 단백질핵산효소, 36, 775-778 (1991) 참조). 당쇄가 생물활성의 발현에 중요한 역할을 담당하고 있는 것이 예상되지만, 당쇄의 구조와 생물활성과의 상관관계가 반드시 명확한 것은 아니기 때문에 단백질 부분에 부가하는 당쇄의 구조(당의 종류, 결합위치, 사슬길이 등)을 자유자재로 개변제어할 수 있는 기술의 개발이 필요로 하게된다.

당단백질의 당쇄에는 대별하여 Asn 결합형, 무친형, O-GlcNAc형, GPI 앵커형, 프로테오글리칸형 등이 있고(타케우치 마코토, 글리코바이올로지즈 5, 글리코테크놀로지, 목번양(木幡陽)·상수선일랑(箱守仙一郞)·영정극효(永井克孝) 편저, 고우담사 사이엔티픽, 191-208(1994)), 각각 고유의 생합성경로를 가지고 개별의 생리기능을 담당하고 있다. 이중에서, Asn결합형 당쇄의 생합성 경로에 관해서는 많이 알려져있고, 상세하게 해석되어 있다.

Asn결합형 당쇄의 생합성은 N-아세틸글리코사민, 만노오스 및 글루코오스로된 전구체가 지질 캐리어 중간체 상에 합성되고, 먼저 소포체(ER)에서 당단백질의 특정 서열(Asn-X-Ser 또는 Thr)로 전이된다. 다음에 프로세싱(글루코오스 잔기와 특정의 만노오스 잔기의 절단)을 받아, 만노오스 8 잔기와 N-아세틸글루코사민 2 잔기로된 M8 고 만노오스형 당쇄(Man₈GlcNAc₂)가 합성된다. 이 고 만노오스형 당쇄를 함유하는 단백질은 골지체로 수송되어 각종 수식을 받지만, 이 골지체에서의 수식은 효모와 포유류에서 크게 상이하다(Gemmill, T.R., Trimble, R.B., Biochim. Biophys.Acta., 1426, 227(1999)).

포유류세포에서는 많은 경우 고 만노오스형 당쇄에 α-만노시다제I이 작용하여 만노오스 잔기 수개를 절단한다. 이 과정에서 생성하는 당쇄(Man_5-8GlcNAc₂)는 고 만노오스형으로 불리우는 당쇄이다. 만노오스가 3잔기 절단된 M5 고 만노오스형 당쇄(Man₅GlcNAc₂)에 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제(GnT)I이 작용하여, N-아세틸글루코사민을 1 잔기 전이하여 GlcNAcMan₅GlcNAc₂로된 당쇄가 생성된다. 이와같이 하여 생성된 당쇄는 혼성(하이브리드)형으로 불린다. 또한 α-만노시다제 II, GnTII가 작용하면, GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂라하는 복합(콤플렉스)형으로 불리는 당쇄구조로되고, 그 이후 수십종을 초래하는 당전이효소군이 작용하여 N-아세틸글루코사민, 갈락토오스, 시알산 등을 부가하여 다양한 포유류형 당쇄를 형성한다(도 1). 포유류에서는 고 만노오스형, 혼성형, 복합형 어떤 당쇄도 발견되지만, 단백질에 따라그의 결합하는 당쇄가 상이하기도 하고, 또 한 개의 단백질내에서도 형이 상이한 당쇄가 결합되어 있기도 한다. 이들 당쇄는 그 형과 결합되어 있는 당쇄의 종류에 따라서 당단백질의 생합성, 세포내 소팅, 항원성 은폐, 생체내 안정성, 장기 타게팅 특성 등의 우수한 기능을 나타낸다(엔도우 타마오, 당쇄공학, 산업조사회, 64-72(1992)).

유전자전환체 동물세포를 숙주로하여 생산된 사상최초의 당단백질형 의약품으로된 에리쓰로포이에틴에 관해서는 그 당쇄의 중요성이 지적되어 있다. 에리쓰로포리에틴의 당쇄는 수용체와의 결합에는 저해적으로 작용하지만, 활성구조의 유지 및 체내동태의 개선에 결정적인 기여를 하고, 전체로서 약리활성의 발현에 필요불가결한 것이 알려져있다(타케우치 및 코바타, Glycobiology, 1, 337-346 (1991)). 또한 당쇄의 구조, 종류, 분지수(Man₃GlcNAc₂에 결합하는 GlcNAc에 의해 형성되는 분지 개수)와 에리쓰로포이에틴의 약리효과 사이에 강한 상관성이 발견되어 있다(타케우치 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 7819-7822 (1989)). 분지구조가 발달되어 있지 않은 에리쓰로포이에틴에서는 신장에서의 클리어런스가 빠르며, 결과 로서 체내 체류시간이 짧게되는 것이 이 현상의 주요 원인으로 보고되어 있다(미사이즈 등, Blood, 86, 4097-4104 (1995)). 이와 유사한 예는 페쯔인 등의 혈청당단백질에서도 발견되며, 당쇄 말단의 시알산을 제거하는 것으로 갈락토오스가 노출되면, 간세포 표면의 렉틴에 의해 인식되어 혈중으로부터 신속하게 소실되어 버리는 것이 알려져있다(애쉬웰 및 하포드, Annu. Rev. Biochem., 51, 531-554 (1982) ; 모렐 등, J. Biol. Chem., 243, 155-159(1968)).

또한, 인간의 리소좀에 국재하는 효소군의 대다수는 생합성되어 골지체로 수송되면, 그의 고 만노오스형 당쇄의 비환원성 말단의 만노오스 잔기의 6위치에 인산기가 부가되어, 이것이 리소좀 효소특이적 인식 마커로 된다. 그리고 그의 고친화성 수용체인 만노오스-6-인산수용체(MPR)와의 결합을 매개로하여 다른 단백질로부터 선별되며 프리리소좀으로 운반되어 산성 조건하에서 MPR로부터 해리된 후, 다시 리소좀으로 수송된다(von Figura and Hasilik, Annu. Rev. Biochem., 54, 167-193 (1984)). 이 리소좀 효소특이적 인산기의 부가반응은 2종의 효소반응에 의해 실시되며, 이들 유전자에 유전적 결함이 있는 경우, 리소좀으로의 타겟팅 메카니즘에 이상이 생겨 리소좀병으로 지칭되는 중대한 질환이 생기는 것이 알려져 있다(Leroy and DeMars, Science, 157, 804-806(1967)). 따라서, 포유류형 당쇄라고 한 마디로 말하더라도, 그 구조가 기능에 크게 관여하고 있다고 말 할 수 있다.

한편, 효모에서는 M8 고 만노오스형 당쇄에 만노오스가 수개 잔기로부터 100개 잔기 이상 부가된 만난형 당쇄(외당쇄)를 생성한다. 사카로마이세스(Saccharomyces)속 효모에서 외당쇄의 생합성은 도 2 및 도 3에 도시한 바와 같은 경로로 진행하는 것으로 추정된다(Ballou 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3368-3372(1990)). 즉, M8 고 만노오스형 당쇄에 우선 α-1,6결합으로 만노오스가 부가되는 연장개시반응이 실시된다(도 2, 반응 I, B). 이 반응을 실시하는 효소는 OCH1 유전자에의해 암호화되는 단백질인 것이 명확하게되어 있다(Nakayama 등, EMBO J.,11, 2511-2519 (1992)). 또한 α-1,6 결합으로 만노오스를 순차 연장하는 반응(도 2, II)이 일어나는 것에 의해, 외당쇄의 골격으로 되는 폴리 α-l,6결합 만노오스 결합이 형성된다(도 2, E). 이α-1,6결합의 만노오스에는, α-1,2결합된 만노오스의 분지가 존재하며(도 2, 3: C, F, H), 이 분지된 α-1,2결합의 만노오스 앞에는 또한 α-1,3결합된 만노오스가 부가되는 수가 있다(도 2, 3: D, G, H, I). 이α-1,3결합의 만노오스 부가는, MNN1 유전자 산물에 의한 것이다(Nakanishi-Shindo 등, J. Biol. Chem., 268, 26338-26345 (1993)). 또한 고 만노오스형 당쇄부분 및 외당쇄 부분에 만노오스-1-인산이 부가된 산성 당쇄도 생성되는 것이 알려져있다(도 2, * ; 상기 화학식(I)중의 *에 대응하는 인산화 가능부위). 이 반응은 MNN6 유전자가 암호화하는 유전자에 의한 것이 알려져있고(Wang 등, J. Bio1. Chem., 272, 18117-18124 (1997)), 또한 이 전위반응을 바르게 제어하는 단백질을 암호화하는 유전자(MNN4)도 명백하게되었다(Odani 등, Glycobiology, 6, 805-810 (1996); Odani 등, FEBS letters, 420, 186-190 (1997)).

많은 경우에, 외당쇄는 불균질 단백질산물을 생성하여, 단백질의 정제를 곤 란하게하거나, 비활성을 저하시키기도 한다(Bekkers 등, Biochim. Biophys. Acta, 1089, 345-351(1991)). 또한 당쇄의 구조가 크게 다르기 때문에, 효모에서 생산된 당단백질은 포유류 유래의 것과 동일한 생물활성이 검출되지 않거나 포유류 동물 등에 대하여 강한 면역원성을 갖는다. 이와 같이, 포유류 유래의 유용 당단백질을 생산시킬 경우의 숙주로서 효모는 부적당한 것으로 되어 있다. 포유류 유래의 것과 동등한 생물활성을 가진 당단백질, 즉 포유류형의 당쇄를 함유하는 당단백질을 생산할 수 있는 효모의 개발이 학회와 산업계로부터 요청되고 있다.

따라서, 효모를 사용하여 포유류형 당쇄를 생산하기 위해서는 먼저 상술한 바와 같은 효모 특유의 당단백질 당쇄의 수식인 만노오스를 다수 부가하는 것과 같은 반응이 일어나지 않고, 외당쇄가 부가되지 않으며, 당쇄 합성이 M8 고 만노오스형 당쇄로 정지하도록 당쇄 생합성계를 갖는 변이주를 단리하는 것이 중요하다. 이어, 이 포유류형 당쇄의 전구체인 M8 고 만노오스형 당쇄에 포유류형 당쇄의 생합성계 유전자를 상기 효모 변이주에 도입하는 것에 의해 달성되게된다.

그래서, 이전보다 외당쇄가 결실된 당단백질을 얻기 위해서는 효모 외당쇄 생합성계 효소군의 결손주의 사용이 검토되고 있다. 결손주를 얻기 위해서는, 약제나 자외선조사, 자연변이에 의해 유전자 돌연변이를 취득하는 경우와 인위적으로 표적유전자를 파괴하는 방법이 있다.

전자에 관해서는 지금까지 여러가지 보고가 있다. 예컨대, mmn2 변이주는 외당쇄의 α-1,6 골격으로부터α-1,2결합을 생성하는 분지공정에 결손이 있고, mmn1 변이주는 분지선단에 α-1,3결합의 만노오스를 생성하는 공정에 결손이 있다. 그러 나, 이들 변이주는 외당쇄 골격인 α-1,6 만노오스결합에는 결손이 없기 때문에 양자 모두 당쇄길이가 긴 외당쇄를 생성한다. 또한 mnn7, 8, 9, 10 변이주 등은 α-1,6 만노오스결합을 4-15 분자 정도밖에 가지지 않는 변이주로서 단리되지만, 이들 변이주도 외당쇄가 짧게 될 뿐이고, 고 만노오스형 당쇄로 당쇄 신장이 정지되는 것은 아니다(Ballou 등, J. Biol. Chem., 255, 5986-5991 (1980) ; Ballou 등, J. Bio1. Chem., 264, 11857-11864 (1989)). 외당쇄의 부가결손은 소포체로부터 골지체로의 단백질 수송이 온도 감수성으로 된 sec18 등의 분비변이주 등에서도 관찰된다. 그러나, sec 변이주에서는 단백질의 분비 그자체가 고온에서 저해되어 버리기 때문에, 당단백질의 분비생산이라는 목적에는 어울리지 않는다.

따라서, 이들 변이주는 목적하는 고 만노오스형 당쇄를 완전하게 생합성할 수 없기 때문 포유류 당쇄를 생성하기위한 숙주효모로서는 부적절하다고 생각된다.

한편, 효모에서 소포체(ER)에서의 당쇄 생합성 경로는 생합성이 각종 단계에서 결손된 변이주를 단리하고 이것을 생화학적으로 해석하는 것에 의해 분명하게 되었다. alg (아스파라긴-결합 글리코실화) 변이주는 당쇄로의 [³H] 만노오스의 취입이 당외쇄를 갖는 야생형 세포보다 적게되므로, 방사선에 의한 손상·사멸을 모면한 변이주를 농축하는 교묘한 선별법에 의해 단리되었다. 그중에서 alg3 변이는 비허용 온도하에서 Dol-pp-GlcNAc₂·Man₅ (Dol-pp는 돌리콜피롤린산)을 축적한다 (Tanner, W. 등, Biochim. Biophys. Acta., 906, 8199 (1987)). 또한 지가미(地神) 등은 △och1mnn1alg3 삼중변이주를 이용하여 해석하고 있다((지가미 등, 단백질 핵산 효소, Vol. 39, No.4, p.657 (1994)). 만난 단백질 당쇄를 PA(2 아미노피리딘)로 형광 라벨링후 분석하면 주성분은 Man₈GlcNA₂-PA 및 Man₅GlcNAc₂ -PA와 일치하는 2개의피크를 나타내었다. 이 중에서, 전자는 α-l,2-만노시다제 분해나 FAB-MS의 결과 등으로부터, ER 코어 당쇄와 동일한 것이 판명되었다. 한편, 후자는 α-1,2 만노시다제 분해에 의해 Man이 2분자 제거되어 Man₂GlcNAc₂-PA를 생산하고, α-1,6결합한 Man을 특이적으로 절단하는 처리(부분 아세토리시스)에 의해 Man이 1분자만 제거되었다. 이들 결과로부터, 이 3중변이주가 생산하는 Man₅GlcNAc₂-PA 당쇄는 상기 화학식(II)로 나타낸 불완전한 코어형 당쇄구조인 것이 판명되었다. 또한, 이 3중 변이주인 Man₅GlcNAc₂ 뿐만아니라 Man₈GlcNAc₂도 생성되는 이유로서는 돌리콜피롤린산상에서 Man₅GlcNAc₂-pp-Dol을 축적하는 alg3 변이의 성질이 리키(leaky)하기 때문이다.

한편, 후자에 관해서는 근년의 유전자공학적수법의 발달에 의해, 표적유전자를 복수개 파괴시킨 결손주를 구축할 수 있도록 되었다.

효모중에는 영양요구성 변이를 갖는 것이 알려져 있고, 영양요구성 변이로서는 leu2 변이, trp1 변이, ura3 변이, ade2변이, his3 변이 등이 있다(대조태치(大嶋泰治) 편저, 생물화학실험법39, 효모분자유전학실험법, l19-144 (1996)). 변이가 없는 원래의 유전자를 도입하면, 이들 영양요구성을 해제할 수가 있어, 배지중에 필요성분을 가하여도 생육이 가능하게된다. 이 원리를 기초로 효모의 유전자 파괴를 실시할 수 있다(도 4). 이 방법에서는, 먼저, 실험관내에서의 조작에 의해 플라 스미드상의 표적 유전자 DNA를 분단 또는 부분결실시키고 여기에 적당한 선택 마커 유전자 DNA를 삽입하여 표적 유전자의 상류부와 상류부 사이에 선택 마커가 샌드위치된 구조체를 작성한다. 이어서, 이 구조를 가진 선상 DNA를 효모 세포에 도입하는 것에 의해 도입 단편의 양단과 염색체상의 표적 유전자의 상동 부분 사이에 2회의 유전자조합을 유발하여 선택 마커를 삽입한 DNA 구성체로 치환하는 것이다(Rothstein, Methods Enzymol., 101, 202-2ll (1983)). 이 방법에서는 1개의 유전자를 파괴하는데 1개의 선택 마커가 필요로하게된다.

외당쇄를 결손한 효모주의 분자육종은 이미 일본 공개특허공보 평성6-277086호나 일본 공개특허공보 평성9-266792호에 기재되어 있다. 그러나, 일본 공개특허 공보 평성6-277086호에 기재된 2중변이주(△och1△mnn1)에서 생산된 당단백질 당쇄에는 인산 잔기를 갖는 산성 당쇄가 포함되어있는 것을 알았다. 이 산성당쇄는 인간 등 포유류 유래의 당쇄에는 존재하지 않는 구조이어서, 포유류의 체내에서 이물질로 인식되어 항원성을 나타내는 것으로 보여진다(Ballou, Methods Enzymo1., 185, 440-470 (1990)). 또한, 만노오스-1-인산 전이를 바르게 제어하는 유전자 (MNN4) 및 O-결합형 당쇄의 연장반응을 하는 만노오스 전이효소 유전자(KRE2)의 기능을 파괴시킨 4중 변이주(일본 공개특허공보 평성9-266792호에 기재)가 구축되었다. 여기에 기재된 효모주가 생산하는 당단백질의 당쇄는 목적하는 M8 고 만노오스형 당쇄를 갖고 있는 것이 밝혀졌다. 또한 이 파괴효모에 아스페르길루스 사이토이(Aspergillus saitoi) 유래의α-1,2-만노시다제 유전자를 도입한 주는 만노오스가 1∼수개 잔기 절단된 고 만노오스형 당쇄(Man_5-8GlcMc₂)를 갖는 것이 밝혀 졌다(Chiba 등, J. Bio1. Chem., 273, 26298-26304 (1998)).

또한, 심마(新間) 등은 또한 alg3 변이를 도입한 별종의 4중변이주를 작성하고 있다(Shimma Y. 등, Mol. Gen. Genet., 256, 469-480 (1997); Wang 등, J.Bio1. Chem. 272, l8117-18124 (1997); 신마 요이치(新間陽一), 지가미 요시후미(地神芳文), 제32회 효모유전학 포럼 요지집, p.64 (1999); Shimma Y. 등, Abstracts of XIX International Conference On Yeast Genetics and Molecular Biology, p.443 (1999)).

그런데, 이들 효모주가 생산하는 당단백질의 당쇄는 포유류에도 존재하여 항원성을 갖지 않지만, 에리쓰로포이에틴의 예로부터도 분명한 바와 같이 고 만노오스형 당쇄를 함유하는 당단백질은 그 당쇄 구조로부터 포유류 세포로부터 생산된 당단백질과 동등한 활성을 나타내지 않는 것이 예상된다. 또한 이 4중 변이주는 표적 유전자의 파괴에 의해 열성 유전자변이인 숙주의 4개의 선택 마커(leu2, ura3, lys2, trp1)의 이후의 사용이 불가능하게된다. 또한 남아있는 영양요구성 마커중 1개에 관해서는 돌연변이가 아닌 인위적으로 파괴되어 있기 때문에 염색체상의 이들 마커 유전자좌와의 상동성을 이용한 효모 염색체상으로 조합은 실시될 수 없다. 따라서, 이들의 효모주에 대하여 포유류형의 당쇄를 생산하는데 필요한 당쇄 가수분해효소 유전자군, 당전이효소 유전자군, 당 뉴클레오티드 수송체 유전자군에 속하는 유전자와 유용한 당단백질의 생산을 실시하기 위한 유전자를 복수개 도입하는 것은 곤란하다. 전술한 바와 같이, 포유류형의 당쇄를 생산하는 데 필요한 당전이효소군은 수십개인 것이 알려져 있고, 이 효소세포를 숙주로하는 것은 당쇄 구조를 생각한 대로 개조제어하기 위해서는 부적절한 것으로 생각된다.

본 발명의 과제는 Asn-결합형 당단백질의 효모에서의 생산에 따른 상기 문제를 극복하여, 인간 및 다른 포유류 세포가 생산하는 고 만노오스형, 혼성형, 복합형과 동일한 당쇄구조를 갖는 당쇄, 및 상기 당쇄를 함유하는 당단백질을 효모를 사용하여 제조하는 방법을 제공하는 것에 있다.

발명의 개시

본 발명자등은 상기 과제를 해결하도록 예의 연구한 결과, 선택 마커인 영양요구성 변이를 유지시키면서, 즉 영양요구성을 상보하는 유전자를 최종적으로 도입함없이 효모에 특이적인 외당쇄를 생합성하는 유전자중 최초의 연장부가반응을 실시하는 α-1,6 만노오스 트랜스퍼라제를 암호화하는 유전자(OCH1), 당쇄의 비환원 말단에 만노오스를 부가하는 α-1,3 만노실트랜스퍼라제를 암호화하는 유전자(MNN1) 및 만노오스-1-인산의 부가를 제어하는 유전자(MNN4)를 파괴시킨 신규한 효모변이주(영양요구성 삼중변이주)에 의하면, 포유류형 당쇄와 동일한 당쇄구조를 가진 당쇄를 생산할 수 있는 것과 상기 변이주에 포유류형 당쇄의 생합성계 유전자를 도입하는 것에 의해 각종 유전자형 당쇄를 생산할 수 있는 것을 발견하였다.

즉, 본 발명은, 이하의 (1)∼(14)에 관한 것이다.

(1) och1 변이, mnn1 변이, mnn4 변이의 변이형질과 적어도 4개 이상의 영양요구성 변이형질을 갖는 것을 특징으로 하는 하기 화학식(I)로 표시되는 올리고 당 쇄를 아스파라긴 결합형 당쇄로서 함유하는 당단백질 생산능을 갖는 효모변이주:

식중에서,

Man은 만노오스를 나타내고,

GlcNAc는 N-아세틸글루코사민을 나타내며,

*는 인산화 가능 부위를 나타낸다.

(2) 영양요구성을 상보하는 유전자를 최종적으로 도입함없이, OCH1 유전자를 파괴시킨 och1 변이(△och1), MNN1유전자를 파괴시킨 mnn1 변이(△mnnl), MNN4 유전자를 파괴시킨 mnn4 변이(△mnn4)의 변이형질과 적어도 1개 이상의 영양요구성 변이형질을 갖는 것을 특징으로 하는 상기 화학식(I)로 표시되는 올리고 당쇄를 아스파라긴 결합형 당쇄로서 함유하는 당단백질 생산응을 갖는 효모변이주.

(3) 영양요구성 변이형질이 ura3 변이, his3 변이, leu2 변이, ade2 변이, trp1 변이 및 can1 변이로부터 선택되는, 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 효모변이주.

(4) 사카로마이스세스(Saccharomyces)속에 속하는 효모인, 상기 (3)에 기재된 효모변이주.

(5) 사카로마이스세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)에 속하는 효모인, 상기 (4)에 기재된 효모변이주.

(6) 사카로마이스세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) TIY19주인, 상기 (5)에 기재된 효모변이주.

(7) 상기 (1) 내지 (6)중 어느 하나에 기재된 효모변이주를 배지에서 배양하고, 배양물중에 상기 화학식(I)로 표시되는 올리고 당쇄를 아스파라긴 결합형 당쇄로서 함유하는 당단백질을 생성축적시키며, 상기 배양물로부터 상기 당단백질을 채취하고, 채취한 당단백질로부터 상기 올리고 당쇄를 회수하는 것을 특징으로 하는 올리고당쇄의 제조방법.

(8) 상기 (1) 내지 (6)중 어느 하나에 기재된 효모변이주를 배지에서 배양하고, 배양물중에 상기 화학식(I)로 표시되는 올리고당쇄를 아스파라긴 결합형 당쇄로서 함유하는 당단백질을 생성축적시키며, 상기 배양물로부터 상기 당단백질을 채취하는 것을 특징으로 하는 당단백질의 제조방법.

(9) 포유류 유래의 아스파라긴 결합형 당단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드에 의해 형질전환시킨 상기 (1) 내지 (6)중 어느 하나에 기재된 효모변이주를 배지에서 배양하고, 배양물로부터 상기 화학식(I)로 표시되는 올리고 당쇄를 아스파라긴 결합형 당쇄로서 함유하는 당단백질을 생성축적시키며, 상기 배양물로부터 상기 당단백질을 채취하는 것을 특징으로 하는 당단백질의 제조방법.

(10) och1 변이, mnn1 변이, mnn4 변이의 변이형질을 갖는 효모변이주에 포유류형 당쇄의 생합성계 유전자를 적어도 2개 이상 도입시킨 효모변이주.

(11) 상기 (1) 내지 (6)중 어느 하나에 기재된 효모변이주에 포유류형 당쇄 의 생합성계 유전자를 적어도 1개 이상 도입시킨 효모변이주.

(12) 상기 (10) 또는 (11)에 기재된 효모변이주를 배지에서 배양하고, 배양물중에 올리고 당쇄를 아스파라긴 결합형 당쇄로서 함유하는 당단백질을 생성축적시키고, 상기 배양물로부터 상기 당단백질을 채취하며, 채취한 당단백질로부터 상기 올리고 당쇄를 회수하는 것을 특징으로 하는 올리고 당류의 제조방법.

(13) 상기 (10) 또는 (11)에 기재된 효모변이주를 배지에서 배양하고, 배양물중에 올리고 당쇄를 아스파라긴 결합형 당쇄로서 함유하는 당단백질을 생성축적시키고, 상기 배양물로부터 상기 당단백질을 채취하는 것을 특징으로 하는, 당단백질의 제조방법.

(14) 포유류 유래의 아스파라긴 결합형 당단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드에 의해 형질전환시킨 상기 (10) 또는 (11)에 기재한 효모변이주를 배지에서 배양하고, 배양물중에 올리고 당쇄를 아스파라긴 결합형 당쇄로서 함유하는 당단백질을 생성축적시키며, 상기 배양물로부터 상기 당단백질을 채취하는 것을 특징으로 하는 당단백질의 제조방법.

본 발명자 등은 또한 상기 효모α-1,6 만노실트랜스퍼라제를 암호화하는 유전자(OCH1), 당쇄의 비환원성 말단에 만노오스를 부가하는 α-1,3 만노실트랜스퍼라제를 암호화하는 유전자(MNN1) 및 만노오스-1-인산의 부가를 제어하는 유전자(MNN4)를 파괴시킨 상기 효모변이주(영양요구성 삼중변이주)에 ER에서의 당쇄 생합성에 관여하는 유전자(ALG3)를 파괴시킨 신규인 효모변이주(영양요구성 사중변이주)에의하면 포유류형 당쇄의 생합성계 유전자의 1개인 α-만노시다제 II 유 전자를 도입함없이 그 밖의 포유류형 당쇄의 생합성계 유전자를 도입하는 것에 의해 여러가지 포유류형 당쇄를 생산할 수 있는 것을 밝혀내었다.

즉, 본 발명은 또한 이하의 (15) 내지 (30)에 관한 것이다.

(15) och1 변이, mnn1 변이, mnn4 변이, alg3 변이의 변이형질과 적어도 5개이상의 영양요구성 변이형질을 갖는 것을 특징으로 하는, 하기 화학식 (II)로 표시되는 올리고 당쇄를 아스파라긴 결합형 당쇄로서 함유하는 당단백질 생산능을 갖는 효모변이주:

식중에서,

Man은 만노오스를 나타내고,

GlcNAc는 N-아세틸글루코사민을 나타낸다.

(16) 영양요구성을 상보하는 유전자를 최종적으로 도입함없이, OCH1 유전자를 파괴시킨 och1 변이(△och1), MNN1유전자를 파괴시킨 mnn1 변이(△mnnl ), MNN4 유전자를 파괴시킨 mnn4 변이(△mnn4), ALG3 유전자를 파괴시킨 alg3 변이(△alg3 )의 변이형질과 적어도 1개 이상의 영양요구성 변이형질을 갖는 것을 특징으로 하고, 상기 화학식(II)으로 표시되는 올리고 당쇄를 아스파라긴 결합형 당쇄로서 함유하는 당단백질 생산능을 갖는 효모변이주.

(17) 영양요구성 변이형질이 ura3 변이, his3 변이, leu2 변이, ade2 변이, trp1 변이, can1 변이로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 상기 (15) 또는 (16)에 기재된 효모변이주.

(18) 사카로마이스세스(Saccharomyces)속에 속하는 효모인, 상기 (17)에 기재된 효모변이주.

(19) 사카로마이스세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)에 속하는 효모인, 상기 (18)에 기재된 효모변이주.

(20) 사카로마이스세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) YS134-4A주인, 상기 (19)에 기재된 효모변이주.

(21) 상기 (15) 내지 (20)중 어느 하나에 기재된 효모변이주를 배지에서 배양하고, 배양물중에 상기 화학식(II)로 표시되는 올리고 당쇄를 아스파라긴 결합형 당쇄로서 함유하는 당단백질을 생성축적시키며, 상기 배양물로부터 상기 당단백질을 채취하고, 채취한 당단백질로부터 상기 올리고 당쇄를 회수하는 것을 특징으로 하는 올리고 당쇄의 제조방법.

(22) 상기 (15) 내지 (20)중 어느 하나에 기재된 효모변이주를 배지에서 배양하고, 배양물중에 상기 화학식(II)로 표시되는 올리고당쇄를 아스파라긴 결합형 당쇄로서 함유하는 당단백질을 생성축적시키며, 상기 배양물로부터 상기 당단백질을 채취하는 것을 특징으로 하는, 당단백질의 제조방법.

(23) 포유류 유래의 아스파라긴 결합형 당단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드에 의해 형질전환시킨 상기 (15) 내지 (20)중 어느 하나에 기재된 효모변이주를 배지에서 배양하고, 배양물로부터 상기 화학식(II)로 표시 되는 올리고 당쇄를 아스파라긴 결합형 당쇄로서 함유하는 당단백질을 생성축적시키며, 상기 배양물로부터 상기 당단백질을 채취하는 것을 특징으로 하는 당단백질의 제조방법.

(24) och1 변이, mnn1 변이, mnn4 변이, alg3 변이의 변이형질을 갖는 효모변이주에 포유류형 당쇄의 생합성계 유전자를 적어도 2개 이상 도입시킨 효모변이주.

(25) 상기 (15) 내지 (20)중 어느 하나에 기재된 효모변이주에 포유류형 당쇄의 생합성계 유전자를 적어도 1개 이상 도입시킨 효모변이주.

(26) 상기 (24) 또는 (25)에 기재된 효모변이주를 배지에서 배양하고, 배양물중에 올리고 당쇄를 아스파라긴 결합형 당쇄로서 함유하는 당단백질을 생성축적시키며, 상기 배양물로부터 상기 당단백질을 채취하며, 채취한 당단백질로부터 상기 올리고 당쇄를 회수하는 것을 특징으로 하는 올리고 당류의 제조방법.

(27) 상기 (24) 또는 (25)에 기재된 효모변이주를 배지에서 배양하고, 배양물중에 올리고 당쇄를 아스파라긴 결합형 당쇄로서 함유하는 당단백질을 생성축적시키고, 상기 배양물로부터 상기 당단백질을 채취하는 것을 특징으로 하는, 당단백질의 제조방법.

(28) 포유류 유래의 아스파라긴 결합형 당단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드에 의해 형질전환시킨 상기 (24) 또는 (25)에 기재한 효모변이주를 배지에서 배양하고, 배양물중에 올리고 당쇄를 아스파라긴 결합형 당쇄로서 함유하는 당단백질을 생성축적시키며, 상기 배양물로부터 상기 당단백질을 채 취하는 것을 특징으로 하는 당단백질의 제조방법.

(29) α-만노시다제 II 유전자가 도입되어 α-만노시다제 II 활성을 갖는 효모주.

(30) 상기 (29)에 기재된 효모주를 배지에서 배양하고, 배양물중에 생성축적된 α-만노시다제 II를 채취하는 것을 특징으로 하는, α-만노시다제 II의 제조방법.

본 명세서는 본원의 우선권인 일본국 특허출원 평성 11년 제233215호의 명세서 및/또는 도면에 기재된 내용을 포함한다.

서열목록의 간단한 설명

서열번호 1은 MNN1 유전자의 5' 영역을 증폭하기위한 프라이머 A를 나타낸다.

서열번호 2는 MNN1 유전자의 5' 영역을 증폭하기위한 프라이머 B를 나타낸다.

서열번호 3은 MNN1 유전자의 3' 영역을 증폭하기위한 프라이머 C를 나타낸다.

서열번호 4는 MNN1 유전자의 3' 영역을 증폭하기위한 프라이머 D를 나타낸다.

서열번호 5는 MNN4 유전자의 3' 영역을 증폭하기위한 프라이머 E를 나타낸다.

서열번호 6은 MNN4 유전자의 3' 영역을 증폭하기위한 프라이머 F를 나타낸 다.

서열번호 7은 MNN4 유전자의 5' 영역을 증폭하기위한 프라이머 G를 나타낸다.

서열번호 8은 MNN4 유전자의 5' 영역을 증폭하기위한 프라이머 H를 나타낸다.

서열번호 9는 ALG3 유전자의 5' 영역을 증폭하기위한 프라이머 I를 나타낸다.

서열번호 10은 ALG3 유전자의 5' 영역을 증폭하기위한 프라이머 J를 나타낸다.

서열번호 11은 ALG3 유전자의 3' 영역을 증폭하기위한 프라이머 K를 나타낸다.

서열번호 12는 ALG3 유전자의 3' 영역을 증폭하기위한 프라이머 L을 나타낸다.

서열번호 l3은 α-만노시다제 Il 유전자의 N 말단측 영역을 증폭하기위한 프라이머 M을 나타낸다.

서열번호 14는 α-만노시다제 Il 유전자의 N 말단측 영역을 증폭하기위한 프라이머 N을 나타낸다.

서열번호 15는 α-만노시다제 Il 유전자의 중앙부 영역을 증폭하기위한 프라이머 0를 나타낸다.

서열번호 16은 α-만노시다제 II 유전자의 중앙부 영역을 증폭하기위한 프라 이머 P를 나타낸다.

서열번호 17은 α-만노시다제 Il 유전자의 C 말단측 영역을 증폭하기위한 프라이머 Q를 나타낸다.

서열번호 18은 α-만노시다제 II 유전자의 C 말단측 영역을 증폭하기위한 프라이머 R을 나타낸다.

서열번호 19는 HA-tag를 3회 반복시켜 결합시키는 유전자를 암호화하는 2중쇄 DNA의 서열 S를 나타낸다.

서열번호 20은 OCH1 유전자의 막통과 영역을 암호화하는 이중쇄 DNA의 서열 T를 나타낸다.

서열번호 21은 α-만노시다제 II 유전자의 촉매 영역의 일부를 증폭하기위한 프라이머 U를 나타낸다.

서열번호 22는 α-만노시다제 II 유전자의 촉매 영역의 일부를 증폭하기위한 프라이머 V를 나타낸다.

서열번호 23은 인간 UDP-GlcNAc 트랜스포터 유전자를 증폭하기위한 프라이머 W를 나타낸다.

서열번호 24는 인간 UDP-GlcNAc 트랜스포터 유전자를 증폭하기위한 프라이머X를 나타낸다.

서열번호 25는 인간 prepro α-팩터와 FGF 유전자를 증폭하기위한 프라이머 Y를 나타낸다.

서열번호 26은 인간 prepro α-팩터와 FGF 유전자를 증폭하기위한 프라이머 Z를 나타낸다.

발명을 실시하기위한 형태

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 효모변이주에 필요한 변이형질은 효모특유의 외당쇄 생합성계 유전자의 변이이고, 구체적으로는 och1 변이, mnn1 변이, mnn4 변이, 또는 och1 변이, mnn1 변이, mnn4 변이, alg3 변이이다.

즉, 상기 변이를 갖는 한, 자연변이주 또는 인위변이주일 수 있다.

또한, 본 발명의 효모변이주에 있어서의 외래유전자를 도입하기위한 영양요구성 변이형질은 사용하는 효모주에 규정되는 것이며, 구체적으로는 ura3 변이, his3 변이, leu2 변이, ade2 변이, trp1 변이 및 can1 변이로부터 선택된다. 영양요구성 변이형질의 수는 도입하는 유전자의 수에 따라 다르지만, 일반적으로 1개의 유전자를 도입하는데 1개의 영양요구성 변이형질이 필요하다. 복수의 유전자를 도입하는 경우는, 도입하는 유전자 단편이 길고 도입효율이 저하되며 또한 발현효율도 저하되기 때문에, 도입유전자의 수가 많을수록 다수의 영양요구성 변이형질이 필요로하게된다.

본 발명에 있어서, "영양요구성을 상보하는 유전자"라는 것은 아미노산, 핵산등의 생체성분 합성계의 유전자이다. 변이형질은 이들 유전자가 기능하지 않도록 변이가 들어가 있는 것이기 때문에 상보하는 유전자는 원래의 기능을 하는 유전자 그 자체이다. 따라서, 원래의 효모주 유래의 유전자가 바람직하다.

또한, "영양요구성을 상보하는 유전자를 최종적으로 도입함없이"라는 것은 1 개 또는 그 이상의 유전자를 파괴하는(변이형질을 도입하는)데 1개 또는 그 이상의 선택 마커, 즉 영양요구성 변이형질을 이용하지만, 파괴후에도 파괴 유전자 수와 동일한 수의 해당 형질이 남아있어 다시 유전자 파괴를 하는 경우에 반복하여 동일한 형질을 사용할 수 있는 것을 말한다(도 5 참조).

본 발명에 있어서, 외래유전자를 도입하기위한 영양요구성 변이형질을 유지하고 또 효모 특유의 외당쇄 합성계 유전자가 파괴된 효모변이주(이하, 영양요구성 변이주)는 이하와 같이 하여 작제할 수 있다.

우선, 표적유전자의 파괴에 필요한 DNA 유전자 단편의 단리는, 사카로마이세스 세레비새(Saccharomyces cerevisiae)의 게놈 프로젝트에 의해 염색체상의 배좌가 이미 공지(Goffbau 등, Nature, 387 (supp1.), 1-105 (1997))되어 있기 때문에 미국 ATCC (American Type Culture Collection) 등 공적인 기관으로부터 표적 유전자의 근방을 포함하는 유전자 단편을 분양받을 수 있다(ATCC Recombinant DNA materials, 3rd edition, 1993). 또한 일반적 수법에 의해 에스. 세레비새(S. cerevisiae)로부터 게놈 DNA를 추출하여, 목적 유전자를 선별하는 것에 의해 가능하다. 상기에 있어서, 에스. 세레비새(S. cerevisiae)로부터 게놈 DNA의 추출은 예컨대 크라이어 등의 방법(Methods in Cell Biology, 12, 39-44 (1975)) 및 피. 필립센 등의 방법(Methods Enzymo1., 194, 169-182 (1991))에 따라서 실시할 수 있다.

표적유전자는 PCR법에 의해 증폭시키고 나서 유전자파괴를 실시한다. PCR법은 시험관내(in vitro)에서 DNA의 특정 단편을 그 영역의 양단의 센스·안티센스 프라이머, 내열성 DNA 폴리머라제, DNA 증폭 시스템 등의 조합을 이용하여 약 2 내지 3시간 동안 수십만배 이상으로 증폭시킬 수 있는 기술이지만, 표적 유전자의 증폭에는 프라이머로서 25 내지 30mer의 합성 단일쇄 DNA를 사용하고, 주형으로서 게놈 DNA를 사용한다.

본 발명에 있어서 표적유전자의 파괴는 Rothstein, Methods Enzymol., 101, 202-211 (1983)에 개시되는 방법을 기본적으로 하여 실시할 수 있다. 본 방법은 우선 플라스미드상의 표적유전자 DNA를 절단 또는 부분결실시키고, 여기에 적당한 선택 마커 유전자 DNA를 삽입하여 표적유전자의 상류부와 하류부 사이에 선택 마커가 샌드위치된 구조체를 작성하고, 이어 이 구조체를 효모세포에 도입한다. 이상과 같은 조작에 의하여 도입 단편(선택 마커를 샌드위치시킨 DNA 구조체)의 양단과 염색체상의 표적유전자의 상동부분 사이에서 2회의 조합을 실시하고 염색체상의 표적 유전자가 도입단편에서 치환된다.

구체적으로, MNN1 유전자 파괴주의 작제를 예로 들어 설명한다. 알라니(Alani) 등에 의해서 구축된, 살모넬라균의 hisG 유전자 DNA 단편이 URA3 유전자의 양단에 결합되어 있는 플라스미드(Alani 등, Genetics, 116, 541-545 (1987))로부터 hisG-URA3-hisG의 카세트를 제한효소로 절단하고, 플라스미드상의 표적 유전자에 삽입하여 파괴된 대립유전자를 구축한다. 이 플라스미드를 사용하여 염색체의 표적 유전자와 치환시켜 유전자파괴주를 수득한다. 염색체에 삽입된 URA3 유전자는 hisG로 협지되어있고, hisG 서열 사이에서의 상동적 조합에 의해 1 카피(copy)의 hisG와 함께 염색체로부터 탈락된다. 염색체상의 표적유전자에는 1 카피의 hisG 단편이 나머지 파괴된 채로 있지만, 숙주세포는 Ura-표현형으로 된다(도 5). 이 hisG 사이에서의 상동적 조합은 5-플루오로오르토산(5-FOA)에 의해 실시될 수 있다. ura3 변이주는 5-FOA에 내성이고(Boeke 등, Mol. Gen. Genet., 197, 345-346 (1984); Boeke 등, Methods Enzymo1., 154, 165-174 (1987)), Ura3⁺ 표현형을 갖는 세포주는 5-FOA 배지에 생육할 수 없게 된다. 따라서, 5-FOA를 부가한 배지에서 내성 형질을 가진 주를 분리하면, 다시 한번 URA3을 사용한 조작이 가능하다.

이하, 상기 MNN1 유전자 파괴주에, 동일한 수법에 의해 MNN4 유전자 파괴, OCH1 유전자 파괴를 실시하는 것에 의해, 본 발명이 목적으로 하는 영양요구성 삼중변이주 (△och1△mnn1△mnn4)를 수득할 수 있다. 또한 동일한 수법에 의해 ALG3 유전자 파괴를 실시하는 것에 의해 본 발명이 목적으로 하는 영양요구성 사중변이주 (△och1△mnn1△mnn4△alg3)를 수득할 수 있다.

따라서, 상기 수법에 의해 인위적으로 유전자파괴를 실시한 "인위파괴주"에서는 원래의 효모주를 갖는 영양요구성 변이형질이 유전자파괴조작에 의해 손상되지 않는다.

따라서, 상기 인위변이주가 갖는 영양요구성 변이형질의 수는 3중변이주 또는 4중변이주이더라도 원래의 효모주가 갖는 영양요구성 변이형질의 수와 동일하게, 적어도 1개 이상 갖는 것으로 된다.

한편, 상기 수법에 의하지 않고 유전자파괴가 자연스럽게 일어나는 "자연변이주"로서는 상기 수법을 쓰지않기 때문에 영양요구성 변이형질의 수의 증감과는 관계가 없다.

본 발명에 있어서 M8 고 만노오스 당쇄를 생산하는 효모변이주를 작성하는 경우, 종래법에 근거하여 OCH1, MNN1, MNN4 유전자를 파괴하는데 6개의 영양요구성 변이형질을 보유하는 효모주를 사용하여 작성하면, 영양요구성 변이형질은 3개밖에 남아있지 않기 때문에 상기 변이주가 갖는 상기 영양요구성 변이형질의 수는 적어도 4개 이상으로된다.

또한, OCH1, MNN1, MNN4 유전자 변이에 또한 ALG3 유전자에 변이가 생긴 M8 고 만노오스 당쇄를 생산하는 효모변이주를 작성하는 경우, 종래법에 의한 작성으로는 mnn1 변이, alg3 변이의 자연변이주를 이용할 수 있지만, 또한 OCH1, MNN4 유전자를 파괴할 필요가 있기 때문에 2개의 영양요구성 변이형질을 사용하게된다. 따라서, 상기 6개의 영양요구성 변이형질을 보유하는 효모주를 이용하면, 영양요구성 변이형질은 4개 밖에 남지않기 때문에 변이주의 영양요구성 변이형질의 수는 적어도 5개 이상으로 된다.

상기 조작에서 선택 마커로서는 URA3 등의 영양요구성 마커 뿐만아니라 G418, 셀레닌, 올레오바시진, 제오신, 카나바닌, 시클로헥시미드, 테트라사이클린 등의 약제에 대하여 내성을 부여하는 마커 등을 사용할 수 있다. 또한 메탄올이나 에탄올 등에 대한 용매 내성과 글리세롤과 염 등에 대한 침투압 내성, 동 등의 금속 이온 내성 등을 부여하는 유전자를 마커로하는 것에 의해 유전자의 도입과 파괴를 실시할 수 있다.

상기 조작에 있어서, DNA의 세포도입 및 이것에 의한 형질전환방법으로서는 일반적인 방법, 예컨대 벡터로서 파아지를 사용하는 경우는 대장균 숙주에 이것을 감염시키는 방법 등에 의해 효율좋게 숙주에 DNA를 취입시킬 수 있다. 또한 플라스미드를 사용하여 효모를 형질전환하는 방법으로서는 리튬염으로 처리하여 자연적으로 DNA를 취입하기 쉬운 상태로하여 플라스미드를 취입시키는 방법, 또는 전기적으로 DNA를 세포내로 도입하는 방법을 채용할 수 있다(Becker and Guarente, Methods Enzymo1., 194, 182-187 (1991)).

또한 상기 조작에 있어서, DNA의 단리·정제 등은 모두 통상의 방법, 예컨대 대장균의 경우, 알칼리/SDS법과 에탄올 침전에 의한 DNA 추출, 또한 RNase 처리, PEG 침전법 등에 의해 DNA를 정제할 수 있다. 또한 유전자의 DNA 서열의 결정 등도 통상의 방법, 예컨대 디데옥시법(Sanger 등, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463-5467 (1977))등에 의해 실시할 수 있다. 또한 상기 DNA 염기서열의 결정은, 시판되는 서열결정 키트(sequence kit) 등을 사용하는 것에 의해서도 용이하게 실시할 수 있다.

이상과 같이하여 작제된 영양요구성 변이주는 고 만노오스형의 포유류형 당쇄를 생산할 수 있지만, 하이브리드형, 복합형의 당쇄 포유류형 당쇄를 생산시키기 위해서는 상기 변이주에 효모특유의 당쇄가수분해 효소 유전자군, 당전이효소 유전자군을 도입한다. 또한 본래 당쇄의 생합성은 상술한 바와 같이 ER, 골지체내에서 실시되기 때문에 당쇄의 원료로되는 당 뉴클레오티드가 이들의 기관에 존재할 필요가 있지만, 효모내에서는 이들 당 뉴클레오티드 수송체는 없던지, 있더라도 실제로 당쇄가 생합성되는 기관에는 미량밖에 존재하지않는다. 따라서, 세포질내에서 생합 성된 당뉴클레오티드를 세포질로부터 ER, 골지체내로 이동시키는 당뉴클레오티드 수송체 유전자군이 또한 필요하다.

따라서, 본 발명에 있어서는, 상기 당쇄가수분해 효소유전자군, 당전이효소 유전자군, 당뉴클레오티드 수송체 유전자군에 속하는 유전자를 "포유류형 당쇄의 생합성계 유전자"로 칭한다.

당쇄 가수분해 효소유전자군으로서는 α-만노시다제(α-만노시다제 I, α-만노시다제 II) 등의 유전자, 당전이효소 유전자군으로서는 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 (GnT-I, GnT-II, GnT-III, GnT-IV, GnT-V), 갈락토실트랜스퍼라제(GalT), 프럭토실트랜스퍼라제(FucT) 등의 유전자, 당뉴클레오티드 수송체 유전자군으로서는 UDP-GlcNAc Transporter, UDP-Gal Transporter 등의 유전자를 들 수 있다. 이들 유전자는 포유류 유래의 유전자를 단리시켜 이용할 수 있고, 또 유전자를 합성하는 것에 의해서도 가능하다.

상기 "포유류형 당쇄의 생합성계 유전자"는 상기 1종 또는 2종 이상의 유전자군에 속하는 유전자를 목적으로 하는 당쇄를 생산하는 데 필요한 수만큼 도입한다. 도입하는 유전자가 복수인 경우는 이들의 유전자가 동종의 유전자군에 속하여도 좋고, 상호 이종의 유전자군에 속하여도 좋다.

상기 영양요구성 변이주, 또는 상기 영양요구성 변이주에 상기 외래유전자군을 도입한 변이주를 배지에서 배양하면, 효모특유의 외당쇄의 함량이 저하되어, 포유류 세포가 생산하는 고 만노오스형 당쇄(Man_5-8GlcNAc₂), 혼성형 당쇄(GlcNAcMan₅GlcNAc₂), 복합형 당쇄(Ga1₂GlcNAc₂Man₃ GlcNAc₂ 등)과 동일한 Asn 결합형당쇄를 함유하는 당단백질을 효모세포내 또는 세포외에서 생산시킬 수 있다.

구체적으로는, 영양요구성 변이주로서 3중변이주(△och1△mnnl△mnn4)를 사용하는 경우는, 상기 변이주에α-만노시다제 I 유전자와 GnT-I 유전자를 도입하는 것에 의해 혼성형 당쇄를 생산시킬 수 있고, 또한 포유류형 당쇄의 생합성계 유전자(α-만노시다제 II, GnT-II, GalT, UDP-GlcNAc Transporter, UDP-Gal Transporter 유전자)를 도입하는 것에 의해 이중쇄 복합형 당쇄(Ga1₂GlcNAc₂Man₂GlcNAc₂)를 생산시킬 수 있다.

또한, GnT-IV, GnT-V 유전자를 도입하는 것에 의해 삼중쇄 복합형 당쇄, 4중쇄 복합형 당쇄를 생산시킬 수 있다.

또한, 영양요구성 변이주로서 사중변이주(△och1△mnnl△mnn4△alg3)를 사용하는 경우는, α-만노시다제 II 유전자를 도입함없이 포유류형 당쇄의 생합성계 유전자(α-만노시다제 I, GnT-I, GnT-II, Gal-T, UDP-GlcNAc Transporter, UDP-Gal Transporter 유전자)를 도입하는 것에 의해 이중쇄 복합형 당쇄(Gal₂GlcNAc₂Man₂GlcNAc₂)를 생산시킬 수 있다.

생성하는 당쇄 및 당단백질을 고수율로 수득하기 위해서는, 상기 효소를 적절한 기관(예컨대 골지체)으로 하여 고발현시킬 수 있는 것이 바람직하다. 따라서 효모의 코돈 사용빈도에 맞쳐서 유전자를 사용하는 것은 유효하다. 또한 효소를 적절한 기관에 편재화시키기 위해서는 효모의 시그날 서열 등을 부가하는 것도 유효 하다. 유전자의 도입에 관해서는 2 ㎛ 플라스미드 타입(YEp 타입), 염색체 조합형 타입(YIp 타입) 등 벡터를 사용하는 방법을 고려할 수 있지만, 목적에 따라서 구별하여 사용할 수 있다. YEp 타입의 벡터는 유전자를 복수 카피로 도입할 수 있기 때문에, 유전자를 대량 발현시킬 수 있다. 한편, YIp 타입의 벡터는 유전자를 염색체에 존재시킬 수 있기 위해서 그 유전자를 안정적으로 유지할 수 있다. 유전자를 박현시키기 위해서 필요한 프로모터는 GAPDH, PGK 등의 구성적 발현 프로모터, GALl, CUP1 등의 유도발현 프로모터 등 특별히 한정되지 않지만, 당쇄의 생산을 위해서는 구성적 발현 프로모터가 바람직하다. 그러나 당쇄 가수분해효소, 당전이효소, 당뉴클레오티드 수송체 유전자를 1종 또는 복수 발현시킨 경우에는 효모의 증식에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 그 경우에는 유도 프로모터의 사용이나 유전자를 도입하는 순서를 고려할 필요가 있다.

또한, 본 발명에 있어서 영양요구성 변이주에는 상기와 같이 인위적인 유전자파괴법에 의해서 얻어지는 변이주 이외에, 약제나 자외선조사, 자연변이에 의해 얻어지는 변이주도 포함된다. 이 자연변이주도 동일하게, 상술한 포유류형 당쇄의 생합성계 유전자(당쇄 가수분해효소 유전자군, 당전이효소 유전자군, 당 뉴클레오티드 수송체군에 속하는 유전자)를 도입하는 것에 의해, 포유류형 당쇄나 포유류형 당쇄를 갖는 당단백질을 생산할 수 있다.

또한 상기 당쇄를 갖는 이종생물 유래의 당단백질을 생산시키기 위해서는, 상기 효모변이주를 숙주로하고, 목적하는 당단백질을 암호화하는 유전자(cDNA 등)를 효모에서 발현할 수 있는 프로모터 하류에 접속시킨 유전자를 제작하고, 상동 재조합에 의해서 상기 효모숙주에 조합시키거나, 또는 플라스미드에 삽입하여 상기숙주를 형질전환하는 것에 의해, 상기숙주의 형질전환체를 제작하고, 이것을 공지방법에 의해 배양하는 것에 의해, 효모세포내 또는 세포외로 생산된 원하는 당단백질을 회수할 수 있다.

상기의 효모변이주의 배양은, 효모의 배양에 관용적으로 이용되는 통상의 방법에 따라 실시할 수 있다. 예컨대, Difco사로부터 공급되는 각종 배지 성분을 첨가하고 또 플라스미드의 복제. 유지에 필요한 마커에 의해 공급가능하게되는 아미노산을 제외한 합성배지(탄소원, 질소원, 무기염류, 아미노산, 비타민 등을 포함한다) 등을 이용할 수 있다(Sherman, Methods Enzymol., 194, 3-57 (1991)).

상기 배양물(배양액, 배양균체)로부터 당단백질을 단순 정제하기위해서는, 통상의 단백질의 단리, 정제수법을 이용할 수 있다.

예컨대, 배양 종료후, 세포를 원심분리에 의해 회수하여 수성 완충액에 현탁시킨 후, 초음파 파쇄기, 프렌치 프레스, 만톤가우린 균질기, 다이노 밀 등에 의해 세포를 파쇄하고, 무세포 추출액을 수득한다. 상기 무세포 추출액을 원심분리하는 것에 의해 수득한 상청액으로부터 통상의 단백질의 단순정제법, 즉, 용매추출법, 황산암모늄 등에의한 염석법, 탈염법, 유기용매에의한 침전법, 디에틸아미노에틸(DEAE)-세파로오스 등 수지를 사용한 음이온 교환 크로마토그래피법, S-세파로오스 FF (파마시아사제) 등의 수지를 사용한 음이온 교환 크로마토그래피법, 부틸 세파로오스, 페닐세파로오스 등의 수지를 사용한 소수성 크로마토그래피법, 분자체를 사용한 겔 여과법, His Bind 레진(Novagen사제) 등을 사용한 친 화성 크로마토그래피법, 크로마토포커싱법, 등전점전기영동법 등의 전기영동법 등의 수법을 단순 또는 조합하여 사용함으로써 정제품을 수득할 수 있다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 기술적 범위를 전혀 한정하지 않는다.

〔실시예 1〕 포유류형 당쇄 생산능을 갖는 효모변이주(△mnnl△mnn4△och1 영양요구성 삼중변이주)의 육종

(1) △mnn1 영양요구성 변이주의 제작과 그 성질

이미 보고되어 있는 pNK51(Alani 등, Genetics, 116, 541-545 (1987))로부터, URA3 유전자의 양단에 살모넬라균 hisG 유전자가 직접적으로 단단하게 결합되어 있는 카세트(HUH)를 BglII와 BamHI으로 절단하여, 대장균 플라스미드 pSP73의 BamHI 부위에 삽입시켰다. 이 플라스미드를 pSP73-HUH로 명명하였다.

MNN1 유전자는 효모 제5번 염색체 동원체 근방에 위치하고, MNN1 유전자의 DNA 염기서열은 GenBank 데이터 베이스에 L23753로 등록되어 있다(Yip 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 9, 2723-2727 (1994). MNN1 유전자의 5' 영역을 프라이머 A (GGATCCGAAGAAAACCTAATACATTGAAGT: 서열번호 1)와 프라이머 B (GCATGCCCTTTGGTTTAATATAAATCTCCGGAGTGC: 서열번호 2)를 사용하여, 또 3' 영역을 프라이머 C(GCATGCTACATAACTCCAATCAGCAGCAAATATGTC: 서열번호 3)와 프라이머 D (GCGGCCGCGTGTTCTGTTCGGGTAACGTTTAAACCAAT: 서열번호 4)를 사용하여, 각각 PCR로 증폭시켰다. 이들 DNA 단편을 HIS3 마커를 가진 플라스미드 pHYH의 SphI 부위에 삽 입하여, pHYH△mnn1을 제조하였다. MNN1 유전자를 HUH 카세트를 사용하여 파괴하기 위하여, 1.8 Kb의 SphI 단편을 pHYH△mnn1로부터 취득하고, pSP73-HUH의 SphI 부위에 삽입시킨 pSP73-△mnn1::HUH를 구축하였다. 이 플라스미드를 NotI 부위에서 절단하는 것에 의해 직쇄화하고, 야생주 W303-1A(MATa leu2-3, 112his3-11, 15 ade2-1 ura3-1 trp1-1 can1-100)을 아세트산리튬법(이토 등, J. Bacterio1., l53, 163-168(1983))을 사용하여 형질전환하였다. 형질전환후, SD-Ura (2% 글루코오스, 0.67% Yeast Nitrogen Base w/o amino acids (Difco 사제), 우라실을 제외한 핵산염기 및 아미노산 혼합물(20-400 mg/L) 배지의 플레이트에 뿌리고, 30℃에서 2일간배양하여 형질전환체를 얻었다.

형질전환체로부터 게놈DNA를 조제하여, PCR법에 의해 우라실 마커가 MNN1 영역인 염색체에 혼입되어 있는 것을 확인하고, TIY1주로 하였다.

상기 주를 5-FOA를 함유한 YSD 배지 (1% 효모추출액, 2% 글루코오스, 아데닌(40 mg/L), 우라실(20 mg/L))로써 선발을 실시하여 URA3 유전자 탈락주를 수득하였다. 상기 방법과 동일하게 PCR법을 이용하여 URA3 유전자를 탈락시킨 mnn1 파괴주를 확인하였다. △mnn1::hisG를 포함하는 상기 주를 TIY3주로 하였다.

MNN1파괴주는, 비환원성 말단인α-1,3결합의 만노오스를 결손하고 있기 때문에, N-결합형 수식을 받는 인버타제(Invertase)의 이동도가, 야생주보다 빠르게되는 것이 알려져있다. YPAD 배지에서 배양한 야생주 및 TIY3주를 각각 슈크로오스0.2%를 포함하는 영양배지 (1% 효모추출액, 2% Bacto 펩톤, 아데닌 (40 mg/L))에 재현탁하고, 3시간동안 배양하였다. 균체를 회수한 후, SDS 샘플 완충액 에 현탁시키고 유리 비드로써 분쇄한 후, 상청액을 사용하여 6% SDS 폴리아크릴아미드 전기영동을 실시하였다. 인버타제의 검출은 슈크로오스로 유도한 후, 트리페닐테트라졸륨을 사용하여 활성 염색을 실시하였다 (Ballou, Methods Enzymol., 185, 440-470 (1990)). 그 결과, TlY3주가 생산하는 인버타제는 야생주의 그것보다 이동도가 빠르다는 것을 확인하였다.

(2) △mnn1△mnn4 영양요구성 이중변이주의 제작과 그 성질

MNN4 유전자는 효모의 제11번 염색체에 위치하고, MNN4 유전자의 DNA 염기서열은 GenBank 데이터 베이스에 D83006으로 등록되어 있다 (Odani 등, Glycobiology, 6, 805-810 (1996)). MNN4 유전자의 3' 영역을 프라이머 E(AGATGCATACTAGTGGGCCCATTGTGATTGGAAT: 서열번호5)와 프라이머 F (CCCCCGAATTCGTGTGAAGGAATAGTGACG: 서열번호 6)를 사용하여, 또 5' 영역을 프라이머 G(CCCCCGAATTCAAGTCGGAGAACCTGACTG: 서열번호 7)와 프라이머 H(ATGGGCCCACTAGTATGCATCTCGCGTGGCATGG: 서열번호 8)를 사용하여, 각각 PCR로 증폭시켰다. 이들 DNA 단편을 HUH 카세트를 가진 상기 pSP73-HUH의 EcoRI 부위에 삽입하여 pSP73-△mnn4::HUH를 제작하였다. 이 플라스미드를 SpeI 부위에서 절단하는 것에 의해 직쇄화하고, TIY3주를 아세트산리튬법을 이용하여 형질전환시켰다. 형질전환후, SD-Ura 배지 플레이트에 뿌리고, 30℃에서 2일간 배양하여, 형질전환체를 수득하였다.

형질전환체로부터 게놈DNA를 조제하고, PCR 법에 의해 우라실 마커가 MNN4 영역의 염색체에 삽입되어 있는 것을 확인하고, TIY9주로 하였다.

상기 주를 5-FOA를 함유한 YSD 배지에서 선발을 실시하여, URA3 유전자 탈락주를 수득하였다. 상기 방법과 동일하게 PCR법을 실시하여 URA3 유전자를 탈락시킨 mnn4 파괴주를 확인하였다. △mnn1::hisG △mnn4::hisG를 포함하는 상기 주를 TIYl1주로 하였다.

당쇄중의 인산기의 유무는 알시안블루(alcian blue)로 염색분리하여 할 수 있다. 알시안블루는 정(positive)으로 하전되어 있어, 부(negative)의 하전과 결합하는 색소이다. 따라서, 효모세포를 pH3의 완충액에 현탁시켜 0.1% 알시안블루 8GX(시그마제, 코드 번호 A3157)를 부가하면, 당쇄중에 인산기를 갖는 것만이 푸르게 물들고, 인산기를 갖지 않는 것은 백색으로된다. △mnn4 파괴주는 세포 표층의 당쇄가 전혀 인산기를 갖지 않기 때문에 알시안블루에 염색되지 않는다. 야생주, TIY3 및 TIY11을 영양배지에서 배양하고 각각의 세포를 알시안블루에 의해 염색한 결과, TIY11만이 청색으로 염색되지 않는 것을 확인하였다.

(3) △mnn1△mnn4△och1 영양요구성 삼중변이주의 제작과 그 성질

OCH1 유전자는, 효모의 제7번 염색체에 위치하고, OCH1 유전자의 DNA 염기서열은 GenBank 데이터 베이스에 Dl1095로 등록되어 있다 (Nakayama 등, EMBOJ., 1l, 2511-2519 (1992)). 이미 구축되어 있는 OCH1 유전자 전체 길이를 포함하는 pBL-OCHl (Nakayama 등, EMBO J., 11, 251l-2519 (1992))의 OCH1 유전자 내부 AatII-HpaI 부위를 절단하여, 평활말단화된 pNKY51로부터 얻은 HUH 카세트를 삽입시킨 pBL-△ochl::HUH를 제작하였다. 이 플라스미드를 SalI 및 BamHI으로 절단하는 것에 의해 △ochl::HUH를 포함하는 영역을 절취해내고, TIYl1를 아세트산리튬법으로 형 질전환시켰다. △och1 파괴를 포함하는 주는 저침투압 감수성을 나타내기 때문에, 형질전환후, 0.3M KCl을 포함하는 SD-Ura 배지 플레이트에 뿌리고, 30℃에서 2일간 배양하여, 형질전환체를 얻었다.

형질전환체로부터 게놈DNA를 조제하고, PCR법에 의해 우라실 마커가 △OCH1 영역의 염색체에 삽입되어 있는 확인하고, TIY17주로 하였다.

상기 주를 5-FOA와 0.3M KCl을 포함하는 YSD 배지에서 선발을 실시하여 URA3 유전자 탈락주를 얻었다. 상기 방법과 동일하게 PCR법을 이용하여 RA3 유전자를 탈락시킨 och1 파괴주를 확인하였다. △mnnl::hisG △mnn4::hisG △ochl::hisG를 포함하는 상기 주를 TIY19주로 하였다.

이 영양요구성 삼중변이주 TIYl9주는, 공업기술원생명공학공업기술연구소(일본 이바라기켄 쯔꾸바시 토우 1-1-3)에 평성11년 7월27일부로 수탁번호 FERM BP-6802으로서 국제기탁되어 있다.

och1 파괴를 포함하는 상기 TIY19주는 고 만노오스형 당쇄를 형성하기 위해인버타제의 이동도가 야생주, TIY3주, TIYl1주에 비교하여 신속하게되는 것이 알려져있다. 따라서, och1 파괴주의 당쇄 길이에 따른 효과를 확인하기 위해 각각 야생주, TIY3, TIYl1, TIY19주로부터 상기 표시한 방법으로 인버타제를 검출한 결과, 야생주, TIY3, TIYl1, TIY19 순으로 이동도가 신속하게되는 것을 확인하였다.

〔실시예 2〕 포유류형 당쇄 생산능을 갖는 효모변이주(△mnn1△mnn4△och1△alg3 영양요구성 사중변이주)의 제작과 그 성질

ALG3 유전자는 효모의 제2번 염색체에 위치하고, ALG3 유전자의 DNA 염기서 열은 GenBank 데이터 베이스에 Z35844로 등록되어 있다(Feldmann 등, EMBO J., 13, 5795-5809 (1994)). ALG3 유전자의 5' 영역을 프라이머 I

및

프라이머 J

를 사용하여, 또 3' 영역을 프라이머 K

와 프라이머 L

을 사용하여, 각각 PCR로 증폭시켰다. 이들 DNA 단편을 HUH 카세트를 가진 pSP73-HUH의 EcoRI 부위에 삽입하여, pSP73-alg3::HUH를 제작하였다. 이 플라스미드를 NotI 부위에서 절단하는 것에 의해 직쇄화하고, TIY19주를 아세트산 리튬법을 사용하여 형질전환시켰다. 형질전환후, SD-Ura 배지 플레이트에 뿌려, 30℃에서 2일간 배양하여 형질전환체를 얻었다.

형질전환체로부터 게놈DNA를 조제하여 PCR법에 의해 우라실 마커가 ALG3 영역의 염색체에 삽입되어 있는 것을 확인하고 YS134주로 하였다.

상기 주를 5-FOA를 함유한 SD 배지에서 선발을 실시하여 URA3 유전자 탈락주를 얻었다. 상기 방법과 동일한 PCR법을 사용하여 URA3 유전자를 탈락시킨 alg3 파괴주를 확인하였다. △mnn1::hisG △mnn4::hisG △och1::hisG △alg3::hisG를 포함하는 상기 주를 YS134-4A주로 하였다.

이 영양요구성 사중변이주 YS134-4A주는, 공업기술원생명공학공업기술연구소(일본 이바라기켄 쯔꾸바시 토우 1-1-3)에 평성11년 7월27일부로 수탁번호 FERM BP-6801로서 국제기탁되어 있다.

alg3 파괴를 포함하는 상기 YS134-4A주는 당쇄 길이가 짧아서 인버타제의 이동도가 야생주, TIY3주, TIYll주, TIY19주에 비하여 빨리되는 것이 알려져있다. alg3 파괴주의 당쇄 길이에 따른 효과를 확인하기 위해 각각 야생주, TIY3주, TIYl1주, TIY19주, YS134-4A주로부터 실시예 1(1)에 나타낸 방법으로 인버타제를 검출한 결과, 야생주, TIY3주, TIYl1주, TIY19주, YS134-4A주 순으로 이동도가 빠르게되어 있는 것을 확인하였다.

〔실시예 3〕△mnn1△mnn4△och1 영양요구성 삼중변이주로부터의 세포 표층 만난 단백질의 분리와 그 함유 당쇄의 구조해석

콘카나바린 A는 C-3, C-4, C-6위의 수산기가 미치환의α-D-Man을 2잔기 이상포함하는 당쇄에 대하여 친화성을 나타내는 렉틴이고, 이것을 컬럼에 고정하는 것에 의해 효모세포벽 다당인 글루칸이나 키틴 등과 만난 단백질을 분리할 수 있다. 먼저, TIY19주의 균체로부터 세포 표층의 만난 단백질을 분리하였다 (Peat 등, J. Chem. Soc., 29 (1961)).

0.3 M KCl을 포함하는 YPAD 배지 50 ml를 500 m1용 반구 플라스크에 넣고, 30℃에서 24시간 동안 배양하여 균체를 원심분리시켜 모으고, 10 m1의 100 mM 시트르산나트륨 완충액(pH 7.0)에 현탁시키고, 오토클레이브에서 121℃, 1시간 동안 가열하였다. 냉각후, 원심분리하여 상청액을 취하고, 고형물은 다시 한번 10 ml의 물을 가하여 동일하게 가열, 원심분리하여, 상청액을 수집하였다. 전체 추출액을 모아서 3배량의 에탄올중에 주입하였다. 생긴 백색 침전물을 건조시켰다. 이것을 콘 카나바린 A(ConA) 컬럼용 완충액(0.15M 염화나트륨, 0.5mM 염화칼슘을 포함하는 0.l M 인산나트륨 완충액(pH 7.2))에 용해시키고, ConA-아가로오스 컬럼(0.6 x 2 cm, 호넨코포레이션 사제)에 걸고, ConA 컬럼용 완충액으로 세정후, 0.2 M의α-메틸만노시드를 포함하는 ConA 컬럼용 완충액으로 용출을 실시하였다. 수득한 분획을 투석하고, 동결건조를 실시하여 만난 단백질을 수득하였다.

다음에 얻어진 만난 단백질에 대하여, 효소처리를 실시하여 Asn 결합형 당쇄를 절취하였다. 즉, 동결건조물을 100μ1의 N-글리코시다제 F용 완충액(0.5% SDS, 0.35% 2-메탑토에탄올을 포함하는 0.l M 트리스-HCl 완충액(pH8.0))에 용해시키고, 5분간 가열처리를 실시하였다. 실온까지 되돌린 후, 50μl의 7.5% Nonidet P-40, 138μ1의 H₂O, 12μ1의 N-글리코시다제 F (베링거 사제)를 부가하고, 37℃에서 16시간 동안 처리하였다. BioRad AG501-X8 컬럼으로 탈염시킨 후, 등량의 페놀: 클로로포름(1:1)을 가하여 세게 진탕시켜 계면활성제와 단백질을 제거하여, 당쇄 조제품으로 하였다.

얻어진 당쇄를 형광표식(피리딜아미노화, PA화라고 칭함)하기 위해, 이하의 조작을 실시하였다. 당쇄 조제품을 농축건조후, 40 ㎕의 커플링 시약(552 mg의 2-아미노피리딘을 200 ㎕의 아세트산에 용해시켰다)을 부가하고 밀봉하여 90℃에서 60분간 처리하였다. 실온까지 되돌린 후, 140 ㎕의 환원시약(200 mg의 보란·디메틸아민 복합체를 50 ㎕의 H₂O와 80㎕의 아세트산에 용해시켰다)을 부가하고 밀봉하여 80℃에서 80분간 처리하였다. 반응후, 암모니아수를 200 ml 부가한 후, 동량으 로 되도록 페놀:클로로포름(1:1)을 가하고 격하게 진탕하여 PA화 올리고당을 포함하는 수층을 회수하였다. 이것을 7회 반복하고 미반응의 2-아미노피리딜을 제거하였다. 상청에 관하여 0.22 ㎖의 필터로 여과하고, PA화 올리고당 조제품으로 하였다.

아미드컬럼을 이용한 HPLC에서는 PA화 올리고당을 그 당쇄 길이에 의해 분리할 수 있다. 컬럼은 TSKGel Amide-80 (4.6 x 250 mm, 토소 제)을 사용하고 용매는 200 mM 아세트산 트리에틸아민 완충액(pH 7.0)과 아세토니트릴의 35:65 혼합액(A액), 200 mM 아세트산-트리에틸아민 완충액(pH7.0)과 아세토니트릴과 50:50 혼합액(B액)을 조제하였다.

미리 용액 A를 유속 1.0 ml/분으로 흐르게하는 것에 의해 컬럼을 평형화하고, 시료주입 직후부터 용매 B의 비율을 25분에 걸쳐 50% 까지 직선적으로 상승시키고, 그후 용매 A와 용매 B를 50:50인채로 5분간 흘려서 PA화 올리고당을 용출시켰다. 그 결과를 도 6에 나타낸다. △och1△mnn1△mnn4 영양요구성 삼중변이주인 TIY19주가 생산하는 만난 단백질의 당쇄는 아미드컬럼에서는 주로 1개의 피크였다. 이 피크는 Man₈GlcNAc₂-PA 표준품(다카라슈조 제조)의 용출위치와 일치하였다. 따라서, TIY19주가 생산하는 만난단백질에는 Man₈GlcNAc₂의 고 만노오스형 당쇄가 부가되어 있는 것이 분명하였다.

〔실시예 4〕 △ochl△mnn1△mnn4 영양요구성 삼중변이주로 α-만노시다제 I 유전자의 도입

보다 포유류형에 근접한 당쇄를 효모에서 생합성하기 위해서는 그 초기반응을 담당하는 α-만노시다제 l (α-1,2-만노시다제)의 유전자를 영양요구성 삼중변이주에 도입하여 발현시키면 좋다. 이것에 의해 고 만노오스형 당쇄가 더욱 짧게된, 포유류 혼성형 또는 포유류 복합형의 전구체인 Man₅GlcNAc₂ 당쇄를 생합성할 수 있다.

이미 발현실적이 있는 아스페르길루스 사이토이(Aspergillus saitoi) 유래의 α-1,2-만노시다제의 소포체형 발현플라스미드 pGAMHl (치바 등, J. Biol. Chem., 273, 26298-26304(1998))을 사용하여 TIY19주를 아세트산리튬법으로 형질전환시켰다. 대조용으로서, α-1,2-만노시다제 유전자를 포함하지 않은 벡터 pG3만으로 형질전환시킨 것을 사용하였다. 형질전환후, SD-Trp (2% 글루코오스, 0.67% Yeast Nitrogen Base w/o amino acids (Difco 사제), 트립토판을 제외한 핵산염기 및 아미노산 혼합물 (20-400 mg/L)) 배지 플레이트에 뿌려, 30℃에서 2일간 배양하여 형질전환체를 얻었다. 얻어진 형질전환체를 TlY19pGAMH1로 하였다.

얻어진 형질전환체로부터 실시예 3과 동일하게 당쇄를 조제하여 HPLC에서 분석을 실시하였다.

아미드컬럼에 의한 분석결과를 도 7에 도시하였다. 대조용의 벡터만으로된 것에서는 실시예 3의 결과와 동일하게, 주로 1개의 피크이고(도 7, a), Man₈GlcNAc₂-PA 표준품(다카라슈조제)의 용출위치와 일치하였다. 한편, α-1,2-만노시다제 유전자를 포함하는 TIY19pGAMH1에서는 주로 4개의 피이크가 발견되었다(도 7, b). 이들 피크는 용출이 빠른순으로 Man₅GlcNAc₂-PA, Man₆GlcNAc₂ -PA, Man₇GlcNAc₂-PA, Man₈GlcNAc₂-PA 표준품과 용출위치가 일치하였다. 이들은 인간형의 고 만노오스형 당쇄로 불리는 것이다.

이어, 용출이 가장 빨랐던 Man₅GlcNAc₂-PA 분획을 분취하고, 역상 컬럼에 공급하였다.

역상 컬럼을 사용한 HPLC에서는, PA화 올리고당을 그 구조에 따라서 분리할 수 있다. 컬럼은 TSKGel ODS-80T_M (4.6 x 150 mm, 토소제)를 사용하고, 용매는 100 mM 아세트산 암모늄 완충액(pH 4.0) (A액), 0.5% 1-부탄올을 포함하는 100 mM 아세트산 암모늄 완충액(pH 4.0) (B액)을 조제하였다.

미리 용매 A와 용매 B를 95:5로 혼합한 것을 유속 1.2 m1/min으로 흘리는 것에 의해 컬럼을 평형화시키고, 시료주입 직후로부터 용매 B의 비율을 20분에 걸쳐서 50% 까지 직선적으로 상승시켜 PA화 올리고당을 용출시켰다. 그 결과를 도 8에 도시한다. 분취한 당쇄분획은 역상 컬럼에서는 주로 1개의 피크이고(도 8, a), 이 피크는 하기 화학식(III)으로 표시되는 구조를 갖는 Man₅GlcNAc₂-PA 표준품(다카라슈조제)의 용출위치와 일치하였다(도 8, b):

식중에서,

Man은 만노오스를 나타내고,

GlcNAc는 N-아세틸글루코사민을 나타내며,

#는 GnT-I 작용부위를 나타낸다. 따라서, TIY19pGAMH1주가 생산하는 만난단백질에는 혼성형·복합형의 전구체인 Man₅GlcNAc₂형의 당쇄가 포함되고 있는 것이 분명하였다.

[실시예 5〕혼성형 당쇄(GlcNAcMan₅GlcNAc₂) 표준품의 합성

먼저, 혼성형 당쇄(GlcNAcMan₅GlcNAc₂)의 생합성의 확인검토를 위해, 세포외에서 GnT-I의 효소반응을 이용하여 목적하는 당쇄의 합성을 실시하였다. GnT-I는 그 기질특이성이 대단히 엄밀하고 상기 화학식(III)으로 표시되는 당쇄 구조에 대하여는 # 위치의 만노오스 잔기에만 β-1,2 결합으로 GlcNAc를 전이하는 것이 알려져 있다.

랫트 GnT-I 유전자의 효모에서의 발현은 요시다 등에 의해서 성공하였다(Yoshida 등, Glycobio1ogy 9, 53-58 (1999)). 이 유전자를 다수복제 플라스미드인 pG3의 GAP-DH 프로모터의 하류에 접속한 후, SmaI-NaeI로 절단하고, 프로모터와 이것에 이어지는 GnT-I의 ORF, 터미네이터를 포함하는 영역을 절취하였다. 이어서, 이 단편을 다수복제 플라스미드인 pYO354의 SmaI 부위에 도입하였다. 이 플라스미드를 pYOG4로 명명하였다. 이 플라스미드를 사용하여 야생형 효모 YPH500주를 아세트산리튬법으로 형질전환시켰다. 형질전환후, SD-Trp (2% 글루코오 스, 0.67% Yeast Nitrogen Base w/o amino acids (Difco 사제), 트립토판을 제외한 핵산염기 및 아미노산 혼합물(20-400 mg/L)) 배지 플레이트에 뿌려, 30℃에서 2일간 배양하여 형질전환체를 얻었다. 얻어진 형질전환체를 YPH500/pYOG4로 하였다.

이것을 500 mI의 SD-Trp (2% 글루코오스, 0.67% Yeast Nitrogen Base w/o amino acids (Difco 사제), 트립토판을 제외한 핵산염기 및 아미노산 혼합물(20-400 mg/L))용액에서 액체 배양하여, 집균하였다. 냉수로 세정한 후, 스페로플라스트 배지(1M 소르비톨을 포함하는 50 mM 인산 칼륨 (pH 7.5)) 5.7 ml에 현탁하고, 2-메탑토에탄올 9μ1와 12 mg의 Zymolyase l00T를 300μ1의 스페로플라스트 배지에 용해 부가하고, 30℃에서 45분간 보온시켰다. 1M 소르비톨 15 ml를 부가하고, 원심분리후, 침전을 다시 1M 소르비톨 15 ml로 세정하여 집균하였다. 이 침전에 용균 완충액 (250 mM 소르비톨, 2 μg/ml 안티파인, 2 μg/ml 키모스타틴, 3μg/m1 로이펩틴, 3μg/ml 펩스타틴, 1 mM 벤즈아미딘, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM PMSF를 포함하는 10 mM 트리에탄올아민 (pH 7.2 용액)을 4 ml 가하고, 균질기로 세포를 파괴하고 220 xg에서 원심분리하여 상청액을 회수하였다. 이 상청액을 100,000 xg으로 원심분리하고 이 침전분획을 용균 완충액 150 ㎕에 현탁시켜 GnT-I의 효소용액으로 하였다. 이 표준품에는 다른 GnT 활성은 검출되지 않았다.

이어, 목적하는 당쇄의 합성을 실시하였다. PA로 라벨링된 Man₅GlcNAc₂ 당쇄(다카라슈조로부터 구입)를 수용체 기질로 하고, 이것을 200 pmo1씩 튜브에 나누어서 주입하였다. 증발건조후, 이 튜브에 상기에서 제조한 GnT-I 효소용액 8.2 μl, 0.2 M MnC1₂ 2μl, GnT-I 반응 완충액 (0.17 M MES(pH 6.0), 1.7% 트리톤 X-100, 0.34% 소혈청 알부민, 8.47 mM AMP, 1.69 mM UDP-GlcNAc, 169 mM GlcNAc) 9.8 μl를 부가하고, 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 5분간 끓여서 반응 정지시킨 후 0.22 μm의 필터로 여과하고, HPLC에 공급하였다.

컬럼은 TSKGel ODS-80T_M (4.6 x 250 mm, 토소제)를 사용하고, 용매는 0.15% 1-부탄올을 포함하는 100 mM 아세트산암모늄 완충액(pH 6.0)을 사용하였다. 미리 용매를 유속 1.2 m1/min으로 흘리는 것에 의해 컬럼을 평형화하고, 시료를 주입하여, PA화 올리고당을 용출하였다. 그 결과를 도 9에 도시한다. 반응물은 역상 컬럼에서는 주로 2개의 피크이고, 빠르게 용출된 피크는 Man₅GlcNAc₂-PA 표준품(다카라슈조제, 상기 화학식(III)에 구조를 나타낸다)의 용출위치와 일치하였다. 따라서 이것은 미반응의 수용체 기질인 것으로 생각되었다.

한편, 늦게 용출된 피크에 관해서는 이것을 분취하고, 정제한 후 TOF-MS에 의해 질량분석을 실시하였다. ThermoQuest사제 LASERMAT2000을 사용하고, 매트릭스로서 2.5%의 2,5-디히드록시벤조산, 40% 아세토니트릴을 포함하는 0.01% 인산 2나트륨을 사용하여 해석을 실시하였다. 그 결과, 전술한 피크 분획의 질량은 예상되는 분자질량(m/z= 1521 (H+); m/z= 1541 (Na+))에 상당하였다. GnT-I의 엄밀한 기질 특이성으로부터 얻어진 당쇄는 하기 화학식(IV)로 표시되는 구조를 갖는 목적하는 혼성형 당쇄 GlcNAcMan₅GlcNAc₂로 추정되었다:

식중에서,

Man은 만노오스를 나타내고,

GlcNAc는 N-아세틸글루코사민을 나타낸다.

[실시예 6〕△och1△mnn1△mnn4 영양요구성 삼중변이주로 α-만노시다제 I 유전자와 GnT-I 유전자의 도입

혼성형 당쇄를 효모에서 생합성하기 위해서는 실시예 4에서 제작한 효모주에또한 GnT-I 유전자를 도입하고 발현시킬 수 있다. 이것에 의해 포유류 혼성형 GlcNAcMan₅GlcNAc₂ 당쇄를 생합성할 수 있다.

실시예 4에서 사용한 아스페르길루스 사이토이(Aspergillus saitoi) 유래의 α-1,2-만노시다제의 소포체형 발현 플라스미드 pGAMHl (치바등, J. Bio1. Chem., 273, 26298-26304 (1998))로부터 SmaI-NaeI로 절단하고, 프로모터와 그것에 연속하는 α-1,2-만노시다제의 ORF, 터미네이터를 포함하는 영역을 절단하였다. 이어, 이 단편을 pYOG4의 SmaI 부위에 도입하였다. 이 플라스미드를 pYOMG4로 명명하였다. 이 플라스미드를 사용하여 TIY19주를 아세트산리튬법으로 형질전환하였다. 대조용으로서, pYO354만으로 형질전환한 것을 사용하였다. 형질전환 후, SD-Trp (2% 글루코오스, 0.67% Yeast Nitrogen Base w/o amino acids (Difco 사제), 트립토판을 제외한 핵산염기 및 아미노산 혼합물(20-400 mg/L)) 배지 플레이트에 뿌려, 30℃에 서 2일간 배양하고, 형질전환체를 수득하였다. 수득한 형질전환체를 TIY19pYOMG4로 하였다.

이α-만노시다제 I 유전자와 GnT-I 유전자가 도입되어 혼성형 당쇄를 생산하는 영양요구성 삼중변이주 TIY19pYOMG4주는, 공업기술원생명공학공업기술연구소(일본 이바라기켄 쯔꾸바시 토우 1-1-3)에 평성 1l년 7월 2일부로 수탁번호 FERM BP-6775으로서 국제기탁되어 있다.

얻어진 형질전환체로부터 실시예 3과 동일하게 당쇄를 조제하여, HPLC에 의한 분석을 실시하였다.

아미드컬럼에 의한 분석 결과를 도 l0에 도시하였다. 대조용의 벡터만의 것으로는 실시예 3의 결과와 동일하게, 주로 1개의 피크이고, Man₈GlcNAc₂-PA 표준품 (다카라슈조제) 용출위치와 일치하였다(도 10, A). α-1,2-만노시다제 유전자와 GnT-l 유전자를 포함하는 TIY19pYOMG4에서는 주로 5개의 피이크가 발견되었다(도 10, B). 이들 피이크중, 4개(도 10, B; 피이크 a, c, d, e)는 Man₅GlcNAc₂-PA, Man₆GlcNAc₂-PA, Man₇GlcNAc₂-PA, Man₈GlcNAc₂ -PA 표준품과 용출위치가 일치하였다. 이들은 인간형 고 만노오스형 당쇄로 불리는 것이다. 또한 α-1,2-만노시다제 유전자만을 도입하였을 때에는 보이지 않았던 새로운 피이크(도 10, B; 피이크 b)가 출현하였다. 이 피이크의 용출위치는 실시예 5에서 작제한 혼성형 GlcNAcMan₅GlcNAc₂당쇄 표준품의 용출위치와 일치하였다. 또한 이 피이크를 분취하고, 실시예 3과 동일하게 역상 컬럼에 공급하였다. 컬럼, 용매 및 조건은 실시예 5에 도시한 방법으 로 실시하였다. 분취한 당쇄분획은 역상 컬럼에서는 주로 1개의 피이크이고(도 11), 이 피이크는 다시 GlcNAcMan₅GlcNAc₂-PA 표준품의 용출위치와 일치하였다. 따라서, TIY19pYOMG4주가 생산하는 만난 단백질에는 혼성형인 GlcNAcMan₅GlcNAc₂형의 당쇄가 포함되어 있는 것이 분명하였다.

〔실시예 7〕 인간의 간장α-만노시다제 II의 효모에서의 발현

α-만노시다제 II는 골지체내에서 혼성형 당쇄를 단일쇄 복합형 당쇄로 변환하는 효소이다.

인간 간장 α-만노시다제 II 유전자 서열은 GenBank 데이터 베이스에 U31520으로 등록되어 있다 (Misago 등, Proc. Natl. Acad. Sci., 92, 11766-11770(1995) ). 클론테크사의 Human Liver Marathon-Ready cDNA를 주형으로하고, α-만노시다제 II의 N 말단측 영역을 암호화하는 부분을 프라이머 M

과 프라이머 N

을 사용하여, 중앙을 암호화하는 부분을 프라이머 O

와 프라이머 P

를 사용하여, C 말단측 영역을 암호화하는 부분을 프라이머 Q

와 프라이머 R

을 사용하여, 각각 PCR에 의해 증폭시켰다. 수득한 DNA 단편을 pCRScript의 SrfI 부위에 도입하고, 서열을 확인한 후, BglII 부위에서 연결되어 조합된 모든 영역을 암호화하는 바른 서열로 되도록 하였다. 이 플라스미드를 pCRMAN2로 명명하였다.

목적하는 단백질의 발현을 확인하기 위해, α-만노시다제 II 유전자의 3' 말단에 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 에피토프를 암호화하는 30 bp로 이루어진 HA tag를 3회 반복하도록 결합시키는 유전자를 제작하여, 벡터를 구축하였다. 즉, 서열 S (서열번호 19)로된 이중쇄 DNA를 화학합성하여, 발현용 플라스미드의 pYEX-BX의 BamHI와 EcoRI 부위 사이에 삽입하였다. 이 플라스미드를 pYEX-BX-3HA로 명명하였다. 다음에 pCRMAN2로부터 BamHI과 EcoRI으로 α-만노시다제 II를 암호화하는 부분을 절취하여, pYEX-BX-3HA의 SacI과 NotI 부분 사이에 삽입하였다. 이 플라스미드를 pYEMAN2-HA로 명명하였다.

다음에 효모에서의 발현량을 향상시키기 위해, α-만노시다제 II의 막관통 영역을 암호화하는 부분을 효모의α-1,6-만노실트랜스퍼라제를 암호화하는 유전자(OCH1)의 막관통 영역 부분으로 치환하였다. 즉, 서열 T (서열번호 20)로된 이중쇄 DNA를 화학합성하고, pBluescript의 SacI과 EcoR I 부위 사이에 삽입하였다. 이 플라스미드를 pBOCH1로 명명하였다. 한편, pYMAN2-HA를 주형으로하고, α-만노시다제 II의 촉매 영역을 암호화하는 부분의 일부를 프라이머 U

과 프라이머 V

를 사용하여 증폭시켰다. 이 서열을 확인한 후, NcoI과 HindIII에서 절단하여, pBOCH1의 NcoI과 HindIII 부위 사이에 삽입하였다. 이어 이 플라스미드로부터 SacI과 PstI로 단편을 절취하여 pYEMAN2-HA의 SacI과 PstI 사이와 치환하였다. 이 플라스미드를 pYEOM2-HA로 명명하였다.

숙주로서 에스. 세레비새(S. cerevisiae) 야생형 효모 YPH500를 사용하고, 형질전환은 아세트산리튬법을 이용하여 실시하였다. 대조용으로서, pYEX-BX-3HA를 사용하였다. 형질전환한 후, SD-Ura (2% 글루코오스, 0.67% Yeast Nitrogen Base w/o amino acids(Difco사제), 우라실을 제외하는 핵산염기 및 아미노산 혼합물(20-400 mg/L)) 배지 플레이트에 뿌려, 30℃에서 2일간 배양하여 형질전환체를 얻었다.

형질전환된 효모는 30℃에서 OD660= 0.8까지 SD-Ura 배지에서 배양한 후, 황산구리를 적당량 첨가하여 2시간 동안 배양하였다. 집균후, SDS 샘플 완충액중에서 유리 비이드에 의해 세포를 파쇄하고, 그 세포추출액을 사용하여 웨스턴블럿 해석을 실시하였다. 웨스턴 블럿 해석은 일차 항체로서 랫트 항HA 항체를 사용하고, 이차항체로서 항 랫트 IgG 항체 퍼옥시다제 복합체를 사용하며, 검출은 Super Signal Ultra를 기질로 하여 X선 필름에 노광시키는 것에 의해 실시하였다. 그 결과, 대조용에서는 시그널이 전혀 발견되지 않음에 반하여, pYEOM2-HA로 형질전환된 세포추출액에서는 분자량 약 140000의 위치에 시그널이 확인되었다(도 12).

다음에 실시예 5에서 제작한 혼성형 당쇄(화학식(IV)로 구조를 나타낸다)를 기질로하여, α-만노시다제 II의 효소활성을 측정하였다. 혼성형 당쇄(화학식(IV)으로 구조를 나타낸다) 100 pmol을 샘플 튜브내에서 건조시킨 후 동일 튜브에 0.2 M MnC1₂, 1M GlcNAc, lM 아세트산나트륨 완충액(pH 5.6)을 2μl씩, H₂0를 8μ1 가한 후, 세포추출액을 8μl 가하여 효소반응을 개시하였다. 37℃에서 하룻밤 보온한 후, 비등시켜 반응을 정지시키고, 원심분리에 의해 불용성 분획을 제거한 후, HPLC에 의해 해석을 실시하였다. HPLC 분석의 조건은 실시예 5에 따랐다. 그 결과, α-만노시다제 II를 발현시킨 효모의 세포추출액을 효소원으로 한 경우, 대조용과 비교하여 40분의 피이크가 명백하게 증가하였다(도 13, B). 이 40분의 피이크는 PA0당쇄 표준품(다카라슈조사제 PA-Sugar Chain 022)의 산소 분해물로부터 수득한 하기 화학식(V)로 표시되는 단일쇄 복합형 당쇄(Oguri 등, J. Biol. Chem., 272, 22721-22727 (1997))의 용출위치와 일치하고 있기 때문에, α-만노시다제 II의 활성인 것을 확인하였다:

식중에서,

Man은 만노오스를 나타내고,

GlcNAc는 N-아세틸글루코사민을 나타낸다.

〔실시예 8〕이중쇄 복합형 당쇄를 생산하는데 필요한 유전자를 도입한 영양요구성 삼중변이주의 제작

인간 GnT-II의 효모에서의 발현은 요시다 등에 의해서 보고되어 있다 (Yoshida S. 등, Abstracts of the meeting on Yeast Cell Biology, p.279, Cold Spring Harbor Laboratory (1997)). 이 발현용 벡터 pSYl14-GnT-II로부터 프로모터 를 포함하는 GnT-II 유전자 영역을 XbaI로 절단하고, pBluescript SK의 XbaI 부위에 삽입하였다. 이 플라스미드를 pBlueGT2로 명명하였다. 다음에 실시예 6에 나타낸 플라스미드 pYOG4로부터 프로모터를 포함하는 GnT-I 유전자 영역을 BamHl, XbaI으로 절단하고, pBlueGT2의 BamHl, XbaI 부위에 삽입하였다. 이 플라스미드로부터 BssHII로 목적하는 단편을 절단한 후, DNA T4 폴리머라제로 말단을 평활화시킨 후, ADE2를 마커로 갖는 pASZ10 플라스미드(Stotz & Linder, Gene, 95, 91-98 (1990))의 SmaI 부위에 단편을 삽입하였다. 이 플라스미드를 pASZGN12로 명명하였다. pASZGN12를 HpaI으로 직쇄상으로 하고, 실시예 1에서 작성한 영양요구성 삼중변이주 TIY19주의 형질전환을 아세트산리튬법으로 실시하였다. 형질전환한 후, 0.3 M KCl을 포함하는 SD-Ade (2% 글루코오스, 0.67% Yeast Nitrogen Base w/o amino acids (Difco 사제), 아데닌을 제외한 핵산염기 및 아미노산 혼합물 (20-400 mg/L)) 배지 플레이트에 뿌려, 30℃에서 2일간 배양하여 형질전환체를 얻었다. 형질전환체로부터 게놈 DNA를 조제하고, PCR 법에 의해 GnT-I 및 GnT-II 유전자가 ADE2영역의 염색체에 삽입되어 있는 것을 확인하고, YCY22주로 하였다. YCY22주의 세포추출액을 사용하여 각각의 효소활성을 측정함으로써 GnT-I 및 GnT-II의 발현을 확인하였다.

한편, 인간 β-1,4-GalT의 효모에서의 발현은 전술한 요시다 등에 의해 보고되어 있다 (Yoshida S. 등, Abstracts of the meeting on Yeast Cell Biology, p.279, Cold Spring Harbor Laboratory (1997)). 이 발현용 벡터 pGalT13C로부터 프로모터를 포함하는 β-1,4-GalT 유전자 영역을 SalI, XhoI로 절단하고, pRS403 의 SalI, XhoI 부위에 삽입하였다. 이 플라스미드를 pRSGAL1로 명명하였다. 또한 인간 UDP-Gal 트랜스포터 (Ugt2p)의 효모에서의 발현은 카이누마 등에 의해서 보고되어 있다(Kainuma 등, Glycobiology, 9, 133-141 (1999)). 이 유전자(UGT2)의 발현용 플라스미드 YEp352-GAP-UGT2로부터 프로모터를 포함하는 유전자 영역을 BamHI으로 절단하고, pRSGAL1의 BamHI 부위에 삽입하였다. 이 플라스미드를 pRSGATP1로 명명하였다. pRSGATP1를 NdeI으로 직쇄상으로 만들고, YCY22주의 형질전환을 아세트산리튬법으로 실시하였다. 형질전환한 후, 0.3 M KCl을 포함하는 SD-His (2% 글루코오스, 0.67% Yeast Nitrogen Base w/o amino acids (Difco 사제), 히스티딘을 제외한 핵산염기 및 아미노산 혼합물(20-400 mg/L)) 배지 플레이트에 뿌려, 30℃에서 2일간 배양하여 형질전환체를 얻었다. 형질전환체로부터 게놈DNA를 조제하고, PCR법에 의해 β-1,4-GalT 및 UGT2 유전자가 HIS3 영역의 염색체에 삽입되어 있는 것을 확인하고, YCY42주로 하였다. YCY42주의 세포추출액을 사용하여 각각의 효소 활성을 측정하여 β-1,4-GalT 및 Ugt2p의 발현을 확인하였다.

다음에, 인간 간장 α-만노시다제 II의 발현용 벡터 pYEOM2-HA로부터 SacI, SphI로 HA-tag를 포함하는 유전자 단편을 절단하고, DNA T4 폴리머라제로 말단을 평활화하였다. 이 단편을 pAUR123의 SmaI 부위에 삽입하였다. 프로모터에 바른 방향으로 이어져 있는 것을 확인한 후, 프로모터를 포함하는 α-만노시다제 II 유전자 영역을 BamHI 으로 절단하여 pRS406의 BamHI 부위에 삽입하였다. 이 플라스미드를 NdeI으로 직쇄상으로 만들고, 상기 YCY42주의 형질전환을 아세트산리튬법으로 실시하였다. 형질전환한 후, 0.3 M KC1을 포함하는 SD-His (2% 글루코오스, 0.67% Yeast Nitrogen Base w/o amino acids (Difco 사제), 우라실을 제외한 핵산염기 및 아미노산 혼합물 (20-400 mg/L) 배지 플레이트에 뿌려, 30℃에서 2일간 배양하여형질전환체를 얻었다. 형질전환체로부터 게놈DNA를 조제하고, PCR법에 의해 유전자가 URA3 영역의 염색체에 삽입되어 있는 것을 확인하고, YCY52주로 하였다. YCY52주의 세포추출액을 사용하여 효소활성을 측정하여 α-만노시다제 II의 발현을 확인하였다.

실시예 4에 나타낸 α-1,2-만노시다제의 발현용 벡터 pGAMH1로부터 NaeI과 SmaI으로 프로모터 영역을 포함하는 α-1,2-만노시다제 유전자 단편을 절단하여, pYO325 벡터의 SmaI 부위에 삽입하였다. 이 플라스미드를 pYOM5로 명명하였다. 또한 골지체로 기질을 공급하기 위해 필요한 UDP-GlcNAc 트랜스포터 유전자의 도입을 실시하였다. 인간 UDP-GlcNAc 트랜스포터 유전자의 효모에서의 발현은 이시다 등에 의해서 보고되어 있다 (Ishida 등, J. Biochem., 1261, 68-77 (1999)). 이 발현용 벡터를 주형으로 하고, 프라이머 W

와 프라이머 X

로 PCR법에 의해 UDP-GlcNAc 트랜스포터 유전자 영역을 증폭하였다. 이 서열을 확인한 후, NotI과 SalI으로 절단하여, pG3-N의 NotI과 SalI 부위 사이로 치환하였다. 이어 이 플라스미드로부터 NaeI과 SmaI으로 프로모터 영역을 포함하는 UDP-GlcNAc 트랜스포터 유전자 단편을 절단하여, pYOM5의 SmaI 부위에 삽입하였다. 이 플라스미드를 pYOMR5로 명명하였다. 이 플라스미드를 사용하여 상기 YCY52주의 형질전환을 아세트산리 튬법으로 실시하였다. 형질전환한 후, 0.3 M KCl을 포함하는 SD-Leu (2% 글루코오스, 0.67% Yeast Nitrogen Base w/o amino acids (Difco 사제), 로이신을 제외한 핵산염기 및 아미노산 혼합물 (20-400 mg/L)) 배지 플레이트에 뿌려, 30℃에서 2일간 배양하여 형질전환체를 얻었다. 이 형질전환체를 YCY73주로 하였다. YCY73주의 세포추출액을 사용하여 효소활성을 측정하여 α-1,2-만노시다제와 UDP-GlcNAc 트랜스포터의 발현을 확인하였다.

또한, msdS와 hUGTrel2를 삽입시키기 위하여 플라스미드를 제작하였다. PGAMH를 SmaI, Nae I으로 절단하여 GAP 프로모터와 msdS 서열을 절취하여, pRS404의 PvuII 부위에 삽입하였다. 이 플라스미드를 msdS-pRS404로 명명하였다. hUGTrel2가 GAP 프로모터의 하류에 삽입되어 있는 플라스미드, hUGTrel2-pG3을 SmaI, NaeI로 절단하여 GAP 프로모터와 hUGTre12 서열을 절단하여 msdS-pR404의 PstI 부위에 삽입하였다. 이 플라스미드를 HM-pRS404로 명명하였다. HM-pRS404의 TRP1 내의 BstXI 으로 절단하고, YCY42주를 아세트산리튬법을 이용하여 형질전환시켰다. 형질전환체를 5 ml의 YPAD+0.3M KCl로 30℃에서 2일간 배양하여 PCR에 의해 msdS와 hUGTrel2가 TRP1의 염색체에 삽입되어 있는 것을 확인하였다. 또한 세포추출액을 사용하여 효소활성을 측정하여, 양주의α-1,2-만노시다제 및 UDP-GlcNAc 트랜스포터의 발현을 확인하였다. YCY42주에 msdS와 hUGTrel2를 통합시킨 주를 TIY63주로 하였다.

인간 간장 α-만노시다제 II의 발현용 벡터 pYEOM2-HA로부터 SacI, SphI로 HA-tag를 포함하는 유전자 단편을 절단하고, DNA T4 폴리머라제로 말단을 평활화시 켰다. 이 단편을 pAUR123의 SmaI 부위에 삽입하였다. 프로모터에 바른 방향으로 연결되어 있는 것을 확인하고, 프로모터를 포함하는 α-만노시다제 II 유전자 영역을 BamHI으로 절단하여 pRS406의 BamHI 부위에 삽입하였다. 이 플라스미드를 NdeI으로 직쇄상으로 만들고, TIY63주의 형질전환을 아세트산리튬법으로 실시하였다. 형질전환시킨 후, 0.3 M KCl을 포함하는 SD-Ura (2% 글루코오스, 0.67% Yeast Nitrogen Base w/o amino acids (Difco 사제), 우라실을 제외한 핵산염기 및 아미노산 혼합물(20-400 mg/L)) 배지 플레이트에 뿌려, 30℃에서 2일간 배양시켜 형질전환체를 얻었다. 형질전환체로부터 게놈 DNA를 조제하여 PCR법에 의해 유전자가 URA3 영역의 염색체에 삽입되어 있는 것을 확인하여, MSY3주로 하였다. MSY3주의 세포추출액을 사용하여 효소활성을 측정하여, α-만노시다제 II의 발현을 확인하였다.

[실시예 9〕 이중쇄 복합형 당쇄를 생산하는데 필요한 유전자를 도입한 영양요구성 사중변이주의 제조

실시예 8에서 제조한 플라스미드 pASZGN12를 HpaI으로 직쇄상으로 만들고, 실시예 2에서 제조한 영양요구성 사중변이주 YS134-4A주의 형질전환을 아세트산리튬법으로 실시하였다. 형질전환한 후, 0.3 M KCl을 포함하는 SD-Ade (2% 글루코오스, 0.67% Yeast Nitrogen Base w/o amino acids (Difco 사제), 아데닌을 제외한 핵산염기 및 아미노산 혼합물(20-400 mg/L)) 배지 플레이트에 뿌려, 30℃에서 2일간배양하여 형질전환체를 얻었다. 형질전환체로부터 게놈DNA를 조제하고, PCR법에 의해 GnT-I 및 GnT-II 유전자가 ADE2 영역의 염색체에 삽입되어 있는 것을 확인하고 YCY122주로 하였다. YCY122주의 세포추출액을 사용하여 각각의 효소활성을 측정 하여, GnT-I 및 GnT-II의 발현을 확인하였다.

이어, 실시예 8에서 제조한 플라스미드 pRSGATP1를 NdeI으로 직쇄상으로 만들어, YCY122주의 형질전환을 아세트산리튬법으로 실시하였다. 형질전환한 후, 0.3 M KCl을 포함하는 SD-His (2% 글루코오스, 0.67% Yeast Nitrogen Base w/o amino acids(Difco 사제), 히스티딘을 제외한 핵산염기 및 아미노산 혼합물 (20-400 mg/L)) 배지 플레이트에 뿌려, 30℃에서 2일간 배양하여, 형질전환체를 얻었다. 형질전환체로부터 게놈 DNA를 제조하여, PCR법에 의해 β-1,4-GalT 및 UGT2 유전자가 HIS3 영역의 염색체에 삽입되어 있는 것을 확인하여, YCY142주로 하였다. YCY142주의 세포추출액을 사용하여 각각의 효소활성을 측정하여, β-1,4-GalT 및 Ugt2p의 발현을 확인하였다.

또한 실시예 8에 나타낸 플라스미드 pYOMR5를 사용하여 YCY142주의 형질전환을 아세트산리튬법으로 실시하였다. 형질전환한 후, 0.3 M KC1을 포함하는 SD-Leu (2% 글루코오스, 0.67% Yeast Nitrogen Base w/o amino acids (Difco 사제), 로이신을 제외한 핵산염기 및 아미노산 혼합물 (20-400 mg/L)) 배지 플레이트에 뿌려, 30℃에서 2일간 배양하여 형질전환체를 얻었다. 이 형질전환체를 YCY163주로 하였다. YCY163주의 세포추출액을 사용하여 효소활성을 측정하여, α-1,2-만노시다제와 UDP-GlcNAc 트랜스포터의 발현을 확인하였다.

이 YCY163주에 관해서, 효모의 세포 표층의 만난 단백질의 당쇄 구조의 변화를 보기위해서, 렉틴 염색성의 평가를 실시하였다. 콘카나바린 A는 특정의 만노오스 3잔기를 포함하는, 고 만노오스형, 혼성형, 이중쇄 복합형 당쇄 등과 결합하는 것이 알려져있지만, 그 친화성은 혼성형, 이중쇄 복합형 당쇄와 비교하여 고 만노오스형 당쇄 쪽이 높은 것이 알려져있다. 따라서, Texas-red 표식 콘카나바린 A 용액을 집균한 효모세포와 혼합하고, 때때로 교반하면서 4℃, 2시간 동안 방치하였다. PBS로 세정한 후, 10 mM α-메틸만노시드를 포함하는 PBS로 세정하여, 형광현미경하에서 관찰하였다. 그 결과, YS134-4A주에서는 세정후에도 세포 주변이 형광염색되어 있지만, YCY163주에서는 세포의 주변에 보인 형광이 명백하게 감소되어 있는 것을 확인하였다. 이 점으로부터 YCY163주에서는 고 만노오스형의 당쇄가 감소되며, 복합형 당쇄가 생성되어 있는 것이 시사되었다.

[실시예 l0〕 포유류형 당쇄 생산능을 갖는 효모변이주에서의 인간 섬유아 세포 성장인자(FGF)의 생산과 당쇄구조의 변경

FGF6-1 키메라유전자(secFGF (N35))는 생명공학공업기술연구소의 요네다(米田敦子)씨로부터 공급받았다(Yoneda 등, BioTechniques, 27, 576-590 (1999)). SecFGF(N35)/pBS를 SmaI, NaeI로 절단하여 FGF를 절취하여, pGEM2-α36의 HindIII 부위에 삽입하였다. 이 플라스미드를 pFGFα23으로 명명하였다. pFGFα23를 EcoRI으로 절단하고, prepro α-팩터와 FGF 영역을 절취해내어 pUC1l9 플라스미드의 EcoRI 부위에 삽입하였다. 이 플라스미드를 FGF-pUC119로 명명하였다. α-팩터의 EAEA 서열을 제외하기 위하여, 프라이머 Y

및 프라이머 Z

를 사용하여 PCR로 증폭하였다. 이 DNA 단편을 pUC18의 EcoRI 부위에 삽입하여 pAF02 플라스미드를 제조 하였다. pFGF01를 NaeI, Sma I으로 절단하여 FGF를 절취하여 pAF02의 Nae I, Sma I 부위에 삽입하였다. 이 플라스미드를 pAF03으로 명명하였다. RAF03를 EcoRI 으로 절단하여 preproα-팩터와 FGF 영역을 절취하여 YEp352GAP 플라스미드의 GAP 프로모터 하류에 삽입한 플라스미드 pAFF2를 제조하였다. pAFF2를 Aat II, Hpa I로 절단하고 2μm 영역을 절취하여 효모 삽입용 플라스미드 pAFF3를 구축하였다. 다음에, pAFF3를 ApaL I, Acc I로 절단하여 GAP 프로모터와 FGF의 서열을 절취하여 LEU2 마커를 가진 플라스미드 pYO325의 Pvu II 부위에 삽입하였다. 또한 플라스미드의 2μm 영역을 Spe I로 절단하여 제거하였다. 이 플라스미드를 pAFF9로 명명하였다. pAFF9내에 있는 EcoR V로 절단하여 직쇄화하고, 효모(TIY19주, YCY42주)를 아세트산리튬법을 이용하여 형질전환시켰다. 형질전환 후, SD-Leu (2% 글루코오스, 0.67% Yeast Nitrogen Base w/o amino acids (Difco 사제), 로이신을 제외한 핵산염기 및 아미노산 혼합물 (20-400 mg/L)) 배지 플레이트에 뿌려, 30℃에서 2일간 배양하여 각각 형질전환체를 얻었다.

이들 형질전환체를 5 ml의 YPAD+0.3M KCl에서, 30℃에서 3일간 배양하고, 배양상청액에 50 μl 베드(bed)의 헤파린세파로오스 현탁액 (파마시아사제)을 가하여, 4℃에서 하룻밤동안 진탕하여 FGF를 헤파린 세파로오스에 흡착시키었다. 그 후, 원심분리에 의해 헤파린 세파로오스를 회수하여, SDS 샘플 완충액으로 비등시킨 후, 상청액을 SDS-PAGE에 공급하였다. 항 FGF 항체를 사용하여 웨스턴블러팅을 실시하여 FGF가 발현하고 있는 것을 확인하였다. 또한 PCR 법에 의해, FGF가 LEU2의 염색체에 삽입되어 있는 것을 확인하고, TIY19주에 FGF를 삽입시킨 주를 TIY48 주로하고, YCY42주에 FGF를 삽입한 주를 TIY49주로 하였다.

또한 단백질이 안정적 효율적으로 발현하기 위해, msdS를 통합시키기 위한 플라스미드를 제조하였다. msdS가 GAP 프로모터의 하류에 삽입되어 있는 플라스미드 pGAMH를 EcoR I으로 절단하고, 2μm 영역을 제외한 플라스미드를 제조하였다. 이 플라스미드를 pImsdS로 명명하였다. pImsdS의 TRP1 내의 Xba I으로 절단하고, TIY48(△mnn1::hisG △mnn4::hisG △och1::hisG FGT::LEU2), TIY49 (△mnn1::hisG △mnn4::hisG △och1::hisG FGT::LEU2 ade2::[GnT-I 및 GnT-II] his3::[β-1,4-GalT 및 UGT2])를 아세트산리튬법을 이용하여 형질전환시켰다. 얻어진 형질전환체를 5 ml의 YPAD+0.3M KCl에서, 30℃에서 3일간 배양하고, 배양액에 50μl의 헤파린세파로오스(파마시아제)를 가하여 4℃에서 하룻밤동안 진탕시켜 FGF를 헤파린세파로오스에 흡착시켰다. 그 후, 헤파린세파로오스를 회수하여, FGF의 항체로 웨스턴블러팅을 실시하여 msdS가 발현하고 있는 것을 확인하였다. TIY48주에 msdS를 통합시킨 주를 TIY53주로하고, TIY49주에 msdS를 통합시킨 주를 TIY54주로 하였다.

다음에, msdS와 hUGTrel2를 통합하기 위한 플라스미드를 제조하였다. PGAMH를 Sma I, Nae I 으로 절단하여 GAP 프로모터와 msdS 서열을 절취해내고, pRS404의 Pvu II 부위에 삽입하였다. 이 플라스미드를 msdS-pRS404로 명명하였다. hUGTre12가 GAP 프로모터의 하류에 삽입되어 있는 플라스미드, hUGTrel2-pG3를 Sma I, Nae I으로 절단하여 GAP 프로모터와 hUGTrel2서열을 절취해내어, msdS-pRS404의 Pst I 부위에 삽입하였다. 이 플라스미드를 HM-pRS404로 명명하였다. HM-pRS404 의 TRP1 내의 BstX I으로 절단하고, TIY48주, TIY49주를 아세트산리튬법을 이용하여 형질전환시켰다. 형질전환체를 5 m1의 YPAD+0.3M KCl에서, 30℃에서 3일간 배양하고, 배양 상청액에 50μl 베드(bed)의 헤파린세파로오스현탁액(파마시아제)를 가하여, 4℃에서 하룻밤동안 진탕시켜 FGF를 헤파린세파로오스에 흡착시켰다. 그 후, 원심분리에 의해 헤파린세파로오스를 회수하여, SDS 샘플 완충액에서 끓인 후, 상청액을 SDS-PAGE에 공급하였다. 항 FGF 항체를 사용하여 웨스턴블럿팅을 실시하여 FGF가 발현하고 있는 것을 확인하였다. 또한 PCR 법에 의해 msdS 와 hUGTrel2가 TRP1의 염색체에 조합되어 있는 것을 확인하였다. 또한 세포추출액을 사용하여 효소활성을 측정하여, 양쪽 주의α-l,2-만노시다제 및 UDP-GlcNAc 트랜스 포터의 발현을 확인하였다. TIY48주에 msdS 와 hUGTrel2를 통합시킨 주를 TIY59주라하고, TIY49주에 msdS 와 hUGTrel2를 통합시킨 주를 TIY60주로 하였다.

당쇄의 제조를 위해, FGF를 LEU2의 염색체상에 통합시킨 TIY48주와 TIY53주를 사용하여 3L의 배양액으로부터 FGF를 정제하였다. 3L의 YPAD+0.3M KC1에서 30℃에서 3일간 배양한 후, 원심분리하여 세포를 제외한 배양액에 2 m1의 헤파린세파로오스를 가하여, 4℃에서 하룻밤동안 진탕시켜 FGF를 헤파린세파로오스에 흡착시켰다. 헤파린세파로오스를 회수하여, 컬럼에 걸고, PBS+0.01% CHAPS, PBS+2.5M NaC1+ 0.01% CHAPS를 용매로하여 염농도 상승에 의해 FGF를 헤파린세파로오스로부터 용출시켰다.

제조한 FGF 약 150μg을 역상 컬럼에 거는 것에 의해 탈염시켰다. 컬럼은 μRPC C2/C18 PC3.2/3 컬럼(파마시아사제)을 사용하고 0.1% 트리플루오로아세트산 과 0.1% 트리플루오로아세트산-60% 아세토니트릴을 용매로하여 역상 컬럼으로부터 용출시켰다.

컬럼으로부터 용출시킨 샘플을 건조시켜 히드라진 분해를 실시하였다. 진공상태에서 2 ml의 히드라진을 가하고, 110℃에서 60분간 처리하였다. 그후, 실온까지 냉각시키고, N-아세틸화를 실시하였다. 250 μ1의 0.2M 아세트산암모늄과 25 μl의 무수아세트산을 가하여 잘 교반하고, 30분간 실온에서 방치하였다. 반응액을 농축건조시키고, 당쇄 조정품으로 하였다.

얻어진 당쇄를 형광표식(피리딜아미노화)하기 위해, 이하의 조작을 실시하였다. 당쇄 조정품을 농축건조후, 20μl의 커플링 시약(300 mg의 2-아미노피리딘을 100 μ1의 아세트산에 용해시켰다)을 가하고, 밀봉하여 90℃에서 60분간 처리하였다. 그 후, 20μ1의 환원시약(10 mg의 보란·디메틸아민 복합체를 50μl의 아세트산에 용해시켰다)을 가하고, 밀봉하여 80℃에서 60분간 처리하였다. 반응 후, 20 μl의 트리에틸아민·메탄올을 첨가하여 잘 교반한 후 40μl의 톨루엔을 가하여 잘 교반하고, 60℃에서 10분간 질소기류하에서 진공건조시켰다. 그 후, 반응액에 20μ1의 메탄올을 가하여 잘 교반한 후 40μl의 톨루엔을 가하여 잘 교반하고 60℃에서 10분간 질소기류하에서 농축건조시켰다. 이것을 삼회 반복하고 잔사에 50μl의 톨루엔을 가하여, 60℃에서 10분간 질소기류하에서 농축건조시켰다. 반응 후, HW-40 겔 여과 컬럼 처리를 실시하여 미반응 2-아미노피리딘을 제거하였다.

아미노 컬럼을 이용한 HPLC에 의해 당쇄 구조를 해석하였다. 컬럼은 Asahipak NH2P-50 (4.6 mm× 250 mm)을 사용하고, 용매는 200 mM 아세트산-트리에 틸아민 완충액 (pH 7.3)과 아세토니트릴의 7:3 혼합액(A액), 200 mM 아세트산-트리에틸아민 완충액 (pH 7.3)과 아세토니트릴의 2:8 혼합액(B액)을 이용하였다.

미리 용매 A를 유속 1.0 ml/min으로 흘리는 것에 의해 컬럼을 평형화시키고, 시료주입 직후로부터 용매 B의 비율을 50분에 걸쳐 100% 까지 직선적으로 상승시키며, 그 후 용매 B의 비율을 100% 그대로 20분간 흘려서, PA화 올리고당을 용출시켰다. 그 분석 결과를 도 14에 도시하였다. TIY48 유래의 것으로서는, 실시예 2의 결과와 동일하게, 주로 1개의 피이크이고(도 14, 상단), Man₈GlcNAc₂-PA 표준품(다카라슈조제)의 용출위치와 일치하였다. 한편, α-1,2-만노시다제 유전자를 포함하는 TIY53주로서는, 주로 1개의 피이크가 보였다(도 14, 하단). 이 피이크는 Man₅GlcNAc₂-PA 표준품의 용출위치와 일치하였다. 따라서, TIY53주에서 발현시킨 인간 당단백질인 FGF는, 거의 100% 혼성형·복합형의 전구체인 Man₅GlcNAc₂형 당쇄를 갖는 것이 분명하여 졌다.

또한, 인간 간장α-만노시다제 II의 발현용 벡터 pYEOM2-HA로부터 SacI, SphI 로 HA-tag를 포함하는 유전자 단편을 절취해내고, DNA T4 폴리머라제로 말단을 평활화시켰다. 이 단편을 pAUR123의 SmaI 부위에 삽입하였다. 이 프로모터에 바른 방향으로 연결되어 있는 것을 확인한 후, 프로모터를 포함하는 α-만노시다제II 유전자 영역을 BamHI 으로 절취해내어 pRS406의 BamHI 부위에 삽입하였다. 이 플라스미드를 NdeI으로 직쇄상으로 만들고, TIY60주의 형질전환을 아세트산리튬법으로 실시하였다. 형질전환한 후, 0.3M KC1을 포함하는 SD-Ura (2% 글루코오스, 0.67% Yeast Nitrogen Base w/o amino acids (Difco 사제), 우라실을 제외한 핵산염기 및 아미노산 혼합물 (20-400 mg/L)) 배지 플레이트에 뿌려, 30℃에서 2일간 배양하여 형질전환체를 얻었다. 형질전환체로부터 게놈DNA를 조제하여, PCR법에 의해 유전자가 URA3 영역의 염색체에 조합되어 있는 것을 확인하고, MSY1주로 하였다. MSY1주의 세포추출액을 사용하여 효소활성을 측정하고, α-만노시다제 II의 발현을 확인하였다.

도 1은 포유류동물에서의 일반적인 N-결합형 당쇄의 생합성 경로를 도시,

도 2는 효모(S. cerevisiae)에서의 N-결합형 당쇄의 생합성 경로를 도시하며, 도에서 H, C, E는 각각 도 3의 I, D, F에 연속되며,

도 3은 효모(S. cerevisiae)에서의 N-결합형 당쇄의 생합성 경로를 도시,

도 4는 종래의 효모 유전자의 파괴법을 도시,

도 5는 영양요구성을 상보하는 유전자를 최종적으로 도입함없이 유전자를 파괴하는 방법을 도시,

도 6은 TIY19주 세포표층 만난 단백질 당쇄의 구조해석을 도시,

도 7은 α-1,2-만노시다제 유전자를 도입한 TIY19주의 세포표층 만난 단백질당쇄의 Amide-80 컬럼에서의 구조해석을 도시,

a: TIY19주의 만난 당단백질의 당쇄

b:α-1,2-만노시다제를 도입한 TIY19주의 만난 당단백질의 당쇄

도 8은 α-1,2-만노시다제 유전자를 도입한 TIY19주의 세포표층 만난 단백질 당쇄의 ODS-80 T_M 컬럼에서의 구조해석을 도시,

a: 화학식(III)으로 표시되는 구조의 표준 당쇄

b: 도 6에서 분취한 분획

도 9는 GnT-I 활성측정의 결과를 도시,

도 10은 α-1,2-만노시다제 유전자와 GnT-I 유전자를 도입한 TIY19주의 세포표층 만난 단백질 당쇄의 Amide-80 컬럼에서의 구조해석을 도시,

A: 벡터만을 도입한 TIY19주의 당쇄 구조해석

B:α-1,2-만노시다제 유전자와 GnT-1 유전자를 도입한 TIY19주의 당쇄 구조해석

a: Man₅GlcNAc₂-PA

b: GlcNAcMan₅GlcNAc₂-PA

c: Man₆GlcNAc₂-PA

d: Man₇GlcNAc₂-PA

e: Man₈GlcNAc₂-PA

도 11은 α-1,2-만노시다제 유전자와 GnT-I 유전자를 도입한 TIY19주의 세포표층 만난 단백질 당쇄의 ODS-80T_M 컬럼에서의 구조해석을 도시,

A: 표준품의 혼합물

B: 도 l0. B에서 분취한 분획

도 12는 α-만노시다제 II 유전자를 도입한 YPH500주의 세포 추출액을 사용한 웨스턴블럿 해석을 도시,

A: 벡터(pYEX-BX-3HA)만을 도입한 YPH500주로부터의 세포추출액의 웨스턴블럿 해석결과

B: 키메라 α-만노시다제-II 유전자를 포함하는 벡터(pYEOM2-HA)를 도입한 YPH500주의 세포추출액의 웨스턴블럿 해석결과

도 13은 α-만노시다제 II 유전자를 도입한 YPH500주의 세포추출액을 사용한 α-만노시다제 II 활성측정의 결과를 도시,

A: 벡터(pYEX-BX-3HA)만을 도입한 YPH500주에서의 활성측정 결과

B: 키메라-만노시다제 II 유전자를 포함하는 벡터(pYEOM2-HA)를 도입한 YPH500주에서의 활성측정 결과

a: GlcNAcMan₅GlcNAc₂-PA

b: GlcNAcMan₃GlcNAc₂-PA

도 14는 FGF 유전자를 도입한 TIY48주(상단) 및 FGF 유전자와α-1,2-만노시다제 유전자를 도입한 TIY53주(하단)의 FGF 당쇄의 Amido-80 컬럼에서의 구조해석을 도시.

부호의 설명

GlcNAc, GN: N-아세틸글루코사민

Man, M: 만노오스

PA: 2-아미노피리딜화

본 발명에 의해 신규하게 육종된 영양요구성 삼중변이주, 영양요구성 사중변이주에 의하면, 인간 등 포유류 세포가 생산하는 고 만노오스형과 동일한 중성 당쇄 또는 동일한 중성 당쇄를 갖는 당단백질을 다량으로 순도 좋게 생산할 수 있다. 또한 해당 변이주에 포유류형 당쇄의 생합성계 유전자를 도입하는 것에 의해 고 만노오스형, 하이브리드형, 복합형 등의 포유류형 당쇄 또는 포유류형 당쇄를 갖는 단백질을 효율적으로 생산할 수 있다.

<110> Kirin Beer Kabushiki Kaisha <120> Novel yeast mutant strain and method for preparing glycoprotein with mammalian-typed sugar chains <150> JP11/233215 <151> 1999-08-19 <160> 26 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 1 ggatccgaag aaaacctaat acattgaagt 30 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 2 gcatgccctt tggtttaata taaatctccg gagtgc 36 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 3 gcatgctaca taactccaat cagcagcaaa tatgtc 36 <210> 4 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 4 gcggccgcgt gttctgttcg ggtaacgttt aaaccaat 38 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 5 agatgcatac tagtgggccc attgtgattg gaat 34 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 6 cccccgaatt cgtgtgaagg aatagtgacg 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 7 cccccgaatt caagtcggag aacctgactg 30 <210> 8 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 8 atgggcccac tagtatgcat ctcgcgtggc atgg 34 <210> 9 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 9 gcggccgcga gacctgaatc ttcgacacgc aagaaaaa 38 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 10 gaattcgctt tcgaacaaaa tcaaaagggg cataac 36 <210> 11 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 11 gaattcctat ccaccaaact cacaagcaag ca 32 <210> 12 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 12 gcggccgccg agagggtgaa cggtgctaac tcaggatt 38 <210> 13 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 13 cgccgccgag ctctaaaaaa atgaagttaa gccgcc 36 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 14 atcccaccac tttgaaaggt 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 15 gaagactcac ggaggaagtt 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 16 atggcggtat atgtgctcga 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 17 cgcagtttgg gatacagcaa 20 <210> 18 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 18 attattatta gcggccgccc ctcaactgga ttcg 34 <210> 19 <211> 162 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 19 ggatccgagc tccaccgcgg tggcggccgc atgttttacc catacgatgt tcctgactat 60 gcgggctatc cctatgacgt cccggactat gcaggatatc catatgacgt tccagattac 120 gcagctacta gtgggcatgc ttcacgcgtc tagtgagaat tc 162 <210> 20 <211> 176 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 20 gagctcaaaa agaaagcaag taaaagaaag aagagatcat gtctaggaag ttgtcccacc 60 tgatcgctac aaggaaatca aaaacaatag tcgtaaccgt acttcttatt tattctttgt 120 tgacatttca cttgtcaaac aaaaggctgc tttctcagtt ttacccatgg gaattc 176 <210> 21 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 21 ttagactacc catggaaccc gcgccgcgag ggctccttc 39 <210> 22 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 22 caggagaact ttggttcgaa aaagctttga cttctt 36 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 23 agagcggccg caaaatgttc gccaacctaa 30 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 24 ttttgtcgac tagacgcgtg aagcatgccc 30 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 25 cgccagggtt ttcccagtca cgac 24 <210> 26 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 26 atgggccggc tcttttatcc aaagatac 28

Claims (42)

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31. MNN1 유전자, MNN4 유전자 및 OCH1 유전자를 야생형 효모에서 파괴시키는 단계; 및

    α-만노시다제 I 유전자 및 GnT-I 유전자를 상기 효모에 도입하는 단계를 포함하는,

    하기 화학식(IV)로 표시되는 당쇄를 갖는 당단백질을 생산하는 효모변이주의 제조 방법:

    

    (IV)

    식중에서,

    Man은 만노오스를 나타내고,

    GlcNAc는 N-아세틸글루코사민을 나타낸다.
32. 제 31항에 있어서, α-만노시다제 II 유전자 및 GnT-II 유전자를 상기 효모에 도입하는 것을 더 포함하는 방법.
33. ALG3 유전자, MNN1 유전자, MNN4 유전자 및 OCH1 유전자를 야생형 효모에서 파괴시키는 단계; 및

    α-만노시다제 I 유전자를 상기 효모에 도입하는 단계를 포함하는 효모 변이주의 제조 방법.
34. 제 33항에 있어서, GnT-I 유전자 및 GnT-II 유전자를 상기 효모에 도입하는 것을 더 포함하는 방법.
35. 제 31항 내지 제 34항중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 변이주가 ura3 변이, his3 변이, leu2 변이, ade2 변이, trp1 변이 및 can1 변이로부터 선택되는 1 이상의 영양요구성 변이형질을 갖는 방법.
36. 제 31항 내지 제 34항중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 변이주가 ura3 변이를 갖는 방법.
37. 제 31항 내지 제 34항중 어느 한 항에 있어서, α-만노시다제 I 유전자가 아스페르길루스 사이토이(Aspergillus saitoi)로부터 유래된 것인 방법.
38. 우라실 마커를 사용하여 OCH1 유전자를 파괴시키는 것을 포함하는 효모 변이주의 제조 방법.
39. 제 38항에 있어서, 상기 우라실 마커는 ura3인 방법.
40. 제 31항에 따른 방법으로 생산한 효모 변이주를 배지에서 배양하는 단계,

    배양물중에 하기 화학식(IV)로 표시되는 당쇄를 갖는 당단백질을 생성 축적시키는 단계, 및

    상기 배양물로 부터 상기 당단백질을 채취하는 단계를 포함하는, 하기 화학식(IV)로 표시되는 당쇄를 갖는 당단백질의 제조 방법:

    

    (IV)

    식중에서,

    Man은 만노오스를 나타내고,

    GlcNAc는 N-아세틸글루코사민을 나타낸다.
41. MNN1 유전자, MNN4 유전자 및 OCH1 유전자가 작용하지 않고 α-만노시다제 I 유전자 및 GnT-I 유전자가 도입된 효모 변이주를 배지에서 배양시키는 단계,

    배양물중에 하기 화학식(IV)로 표시되는 당쇄를 갖는 당단백질을 생성 축적시키는 단계, 및

    상기 당단백질을 배양물로 부터 채취하는 단계를 포함하는, 하기 화학식(IV)로 표시되는 당쇄를 갖는 당단백질의 제조 방법:

    

    (IV)

    식중에서,

    Man은 만노오스를 나타내고,

    GlcNAc는 N-아세틸글루코사민을 나타낸다.
42. 제 31항 내지 제 34항, 제 38항 또는 제 39항중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된 효모 변이주.

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