KR100888316B1 - 당단백질 및 그의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 효모의 당쇄 생합성계 효소 유전자 변이주에 리소좀 효소 유전자를 도입한 효모 세포를 배지에 배양하여, 배양물로부터 인산 함유 당쇄를 갖는 리소좀 효소를 얻고, 여기에 α-만노시다아제를 작용시키는 것을 특징으로 하는 만노오스-6-인산 함유 산성 당쇄를 갖는 리소좀 효소의 제조 방법을 제공한다. 또한, 이 방법에 의해 제조되는 인간의 리소좀 효소 결손증 치료를 위한 의약 조성물을 제공한다. 본 발명에 의한 효모를 이용하는 유전자 공학적 수법에 의해, 인간 등 포유류 세포의 리소좀으로 수송시키기 위한 표지 마커로서 기능할 수 있는 인산 함유 산성 당쇄를 갖는 당단백질을 다량이면서 양호한 순도로 제조할 수 있다. 본 발명에서의 인산 함유 산성 당쇄를 갖는 당단백질은 인간의 리소좀 효소의 결손증 치료 등에 유효한 약제로 만들어 이용할 수 있다.

당단백질, 만노오스-6-인산, 산성 당쇄, 리소좀 효소

Description

당단백질 및 그의 제조 방법 {Glycoprotein and Process for Producing the Same}

본 발명은 인간 등 포유류 세포에서 리소좀으로 당단백질을 수송시키기 위한 표지 마커로서 기능할 수 있는 만노오스-6-인산 함유 산성 당쇄를 갖는 당단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

천연계에 존재하는 단백질 등에 대해서는, 그의 당쇄를 제거하면 원래의 생물 활성을 나타내지 않게 되는 것이 밝혀졌다[기하따요, 단백질 핵산 효소, 36, 775-788(1991)]. 이로부터 당쇄가 생물 활성의 발현에 중요한 역할을 담당하고 있는 것으로 예상되지만, 당쇄의 구조와 생물 활성과의 상관이 반드시 명확하지는 않기 때문에, 단백질 부분에 부가되는 당쇄의 구조(당의 종류, 결합 위치, 쇄 길이 등)을 자유 자재로 개변 제어할 수 있는 기술의 개발이 필요해진다.

당단백질의 당쇄는 크게 구별하여, Asn 결합형, 뮤신형, O-GlcNAc형, GPI 앵커형, 프로테오글리칸형 등이 있고[다케우찌 마꼬또, 글리코바이알러지 시리즈 5, 글리코테크놀러지, 기하따요ㆍ하꼬모리 센이찌로ㆍ나가이가쯔다까편, 고단사 사이언티픽, 191-208(1994)], 각각 고유의 생합성 경로를 가지며, 개별적인 생리 기능을 담당하고 있다. 이 중, Asn 결합형 당쇄의 생합성 경로에 대해서는 많은 지견 이 있고, 상세하게 해석되어 있다.

Asn 결합형 당쇄의 생합성은, N-아세틸글루코사민, 만노오스 및 글루코오스로 이루어지는 전구체가 지질 캐리어 중간체 상에 합성되어, 우선 소포체(ER)에서 당단백질의 특정 서열(Asn-X-Ser 또는 Thr)로 전이된다. 다음으로, 프로세싱(글루코오스 잔기와 특정 만노오스 잔기의 절단)되어, 만노오스 8 잔기와 N-아세틸글루코사민 2 잔기로 이루어지는 M8 고(high) 만노오스형 당쇄(Man8GlcNAc2)가 합성된다. 상기 고 만노오스형 당쇄를 함유하는 단백질은 골지체로 수송되어 다양하게 수식되지만, 이 골지체에서의 수식은 효모와 포유류에서 크게 다르다[Kukuruzinska et al., Annu. Rev. Biochem., 56, 915-944(1987)].

포유류 세포에서는, 당쇄로 수식되는 단백질의 종류에 따라서 상이한 이하의 3종의 경로를 경유한다. 즉, 1) 상기 코어 당쇄가 전혀 변화를 받지 않는 경우, 2) UDP-N-아세틸글루코사민(UDP-GlcNAc)의 N-아세틸글루코사민-1-인산 부분(GlcNAc-1-P)이 코어 당쇄의 Man의 6위치에 부가되어 Man-6-P-1-GlcNAc이 된 후, 이 GlcNAc 부분만이 제거되어 산성 당쇄를 갖는 당단백질로 변환되는 경우, 3) 코어 당쇄로부터 5분자의 Man가 차례로 제거되어 Man3GlcNAc2가 되고, 이것의 앞쪽과 뒤쪽에 GlcNAc, 갈락토오스(Gal), N-아세틸뉴라민산, 별명 시알산(NeuNAc) 등이 차례로 부가되어 다양한 혼성형 및 복합형 당쇄가 혼합물로서 생성되는 경우의 3 가지 경로를 경유한다[R. Kornfeld and S. Kornfeld, Ann. Rev. Biochem., Vol. 54, p.631-664(1985)](도 1). 따라서, 포유류형 당쇄라고 해도 구조는 다양하여 이들 구조가 당단백질의 기능에 크게 관여하고 있는 것으로 알려져 있다.

한편, 효모에서는, 상기 코어 당쇄(Man8GlcNAc2)에 만노오스가 수개 잔기 내지 100 잔기 이상 부가된, 만난형 당쇄, 소위 당외쇄(outer chain)를 생성하는 것 이외에, 코어 당쇄 부분 및 당외쇄 부분에 만노오스-1-인산이 부가된 산성 당쇄도 생성하는 것으로 알려져 있다(도 2 참조). 이 수식은 동물 세포와는 다르고, 효모에서는 액포(동물 세포의 리소좀에 상당하는 세포소기관) 국재성 당단백질의 소팅 시그날(sorting signal)로서는 작용하지 않는 것이 보고되어 있다. 따라서, 효모에서의 상기 인산화 당쇄의 생리 기능은 아직 명확하지 않다[Kukuruzinska et al. Ann. Rev. Biochem., Vol.56, p915-944(1987)].

효모의 만노오스 인산 함유 당쇄의 인산화 부위는, 도 2에 나타낸 바와 같이 소포체에서 합성되는 Man8GlcNAc2의 코어 당쇄의 α-1,3-분지측과 α-1,6-분지측에 부가하는 경우 이외에, 골지체에서 합성되는 만노오스 외쇄에 다수 존재하는 α-1,2-분지에 부가하는 경우와 만노오스 외쇄의 비환원 말단에 부가하는 경우가 있다[A. Herscovics and P. 0rlean, FASEB J., Vol. 7, p540-550(1993)].

사카로마이세스(Saccharomyces)속 효모에서의 당외쇄의 생합성은 도 2에 나타낸 경로로 진행된다고 생각된다[Ballou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 87, p3368(1990)].

즉, M8 고 만노오스형 당쇄에 우선 α-1,6 결합으로 만노오스가 부가되는 연장 개시 반응이 일어난다(도 2, 반응 I, B). 이 반응을 행하는 효소가 OCH1 유전자로 코딩되는 단백질인 것이 밝혀졌다[Nakayama et al., EMBO J., 11, 2511-2519(1992)]. 또한, α-1,6 결합으로 만노오스를 차례차례 연장시키는 반응(도 2, II)이 일어남으로써, 당외쇄의 골격이 되는 폴리α-1,6 결합 만노오스 결합이 형성된다(도 2, E). 이 α-1,6 결합의 만노오스에는 α-1,2 결합된 만노오스의 분지가 존재하고(도 2: C, F, H), 이 분지된 α-1,2 결합의 만노오스 앞에는 또한 α-1,3 결합된 만노오스가 부가되어 있다(도 2: D, G, H, I). 이 α-1,3 결합의 만노오스의 부가는 MNN1 유전자 산물에 의한 것이다[Nakanishi-Shindo et al., J. Biol. Chem. 268, 26338-26345(1993)]. 또한, 고 만노오스형 당쇄 부분(도 2, *) 및 당외쇄 부분에 만노오스-1-인산이 부가된 산성 당쇄도 생성되는 것을 알았다. 이 반응은 MNN6 유전자가 코딩하는 유전자에 의한 것임을 알았고[Wang et al., J. Biol. Chem., 272, 18117-18124(1997)], 또한 이 전위 반응을 플러스로 제어하는 단백질을 코딩하는 유전자(MNN4)도 밝혀졌다[Odani et al., Glycobiology, 6, 805-810(1996); Odani et al., FEBS letters, 420, 186-190(1997)].

많은 경우에, 당외쇄는 불균질한 단백질 산물을 생성하여, 단백질의 정제를 곤란하게 하거나 비(比)활성을 저하시키기도 한다[Bekkers et al., Biochim-Biophys. Acta, 1089. 345-351(1991)]. 또한, 당쇄의 구조가 크게 다르기 때문에, 효모에서 생산된 당단백질은 포유류 유래의 것과 동일한 생물 활성이 검출되지 않거나, 포유류 동물 등에 반해 강한 면역원성을 갖는다. 예를 들면, 효모(S. cerevisiae)의 경우, MNN1 유전자에 의해 생성되는 α-1,3-만노시드 결합은 강한 면역원성을 갖는 것이 알려져 있고[Ballou, C. E., Methods Enzymol., 185, 440-470(1990)], 또한 효모는 원래 만노오스-6-인산(Man-6-P)을 만노오스-6-인산-α-1-만노오스(Man-6-P-1-Man)의 형태로 가지고 있으며, 그 때문에 Man-6-P 수용체에 결 합하지 않는 것이 보고되어 있다[Kukuruzinska et al., Annu. Rev. Biochem., 56, 915-944(1987); Faust and Kornfeld, J. Bio1. Chem., 264, 479-488(1989); Tong et al., J. Biol. Chem., 264, 7962-7969(1989)]. 이와 같이, 포유류 유래의 유용 당단백질을 생산시킬 때의 숙주로서는, 효모가 부적당한 것으로 되어 있다. 포유류 유래의 것과 동등한 생물 활성을 갖은 당단백질, 즉 포유류형 당쇄를 함유하는 당단백질을 생산할 수 있는 효모의 개발이 학회나 산업계에서 요망되고 있다. 본 발명자들은 이 당외쇄를 이미 결손시킨 변이주, 및 포유류형 당쇄를 함유하는 효모의 제조에 성공하였다(일본 특허 출원(평)11-233215).

또한, 상술한 바와 같이 효모에서는, 상기 코어 당쇄 부분 및 당외쇄 부분에 MNN4 유전자 및 MNN6 유전자의 작용에 의한 만노오스-1-인산이 부가된 산성 당쇄도 생성한다. 그 중 코어 당쇄를 생산하는 당외쇄 생합성 효소 유전자의 결손 변이주가 생산한 당단백질 당쇄에는, 중성 당쇄(도 3, 구조식 I) 이외에 산성 당쇄(도 3, 구조식 II 내지 IV)가 포함되는 것을 알았다[제12회 바이오테크놀로지 심포지움 예비 요약 원고집, p.153-l57, 평성 6년 10월 14일 발행, 바이오테크놀로지 개발 기술 연구 조합].

이 산성 당쇄는 인간 등 포유류 유래의 당쇄에는 존재하지 않는 구조이다. 즉, 포유류 세포에서는 만노오스-1-인산이 아니라 N-아세틸글루코사민-1-인산이 부가된 후, N-아세틸글루코사민 부분만이 더 제거되어, 최종적으로 도 1 중에서 *로 표시된 기재의 산성 당쇄가 된다. 하기와 같이 이 당쇄는 포유 동물 세포에서는 리소좀 수송 시그널로서 기능하는 것이 문헌[Method in Enzymology, Vol. 185, p440-470(1990)]에 기재되어 있다.

그런데, 세포 내 소기관 중 하나인 리소좀에는, 수많은 산성 가수분해 효소가 존재하고, 세포 내외로부터 리소좀에 받아들인 물질의 분해를 담당하고 있다.

인간 리소좀에 국재하는 효소군의 대부분은, 생합성되어 골지체로 수송되면, 그의 고 만노오스형 당쇄의 비환원 말단의 만노오스 잔기의 6위치에 인산기가 부가되어, 산성 당쇄를 갖는 당단백질로 변환되고, 이것이 리소좀 효소 특이적인 인식 마커가 된다. 또한, 그의 고친화성 수용체인 만노오스-6-인산 수용체(MPR)와의 결합을 통해, 다른 단백질로부터 선별되어 프리리소좀(prelysosome)으로 운반되고, 산성 조건하에 MPR로부터 해리된 후, 또한 리소좀으로 수송된다[von Figura and Hasilik, Annu. Rev. Biochem., 54, 167-193(1984)]. 만노오스-6-인산 수용체(MPR)와의 결합을 위해서는, 만노오스-6-인산을 1개의 당쇄 내에 1분자 이상 포함해야 한다. 이 리소좀 효소 특이적인 인산기의 부가 반응은 2종의 효소 반응에 의해 행해지고 있다. 더블유. 캔필드(W. Canfield) 등은 만노오스-6-인산 합성에 관여하는 2종의 효소(GlcNAc-포스포트랜스퍼라아제, GlcNAc-포스포디에스테르-GlcNAc'ase)의 유전자 클로닝에 성공하였다[Abstract of the XV International Symposium on Glycoconjugates. Glycoconjugate Journal Vol. 16 No. 4/5 S41(1999)].

이러한 리소좀 효소, 상술한 인산기의 부가 반응에 관여하는 효소, 또는 효소의 활성화 및 안정화에 관여하는 인자의 유전적 결함에 의해, 효소 반응이 진행하지 않고, 세포 내에 기질이 축적되어 발생하는 일련의 질환군이 「리소좀병」이 라 불리고 있다[Leroy and DeMars, Science, 157, 804-806(1967)]. 리소좀병에 관해서는, 인간에서는 30 종류 이상의 것이 알려져 있고, 소아과나 내과 영역에서 중요한 질환군의 하나로 되어 있다. 이들 질환에 대한 근본적 치료법의 개발에 대해서는 골수 이식, 유전자 치료 등이 시도되어 왔다. 또한, 리소좀 효소를 이용한 효소 보충 요법이 이전부터 실시되고 있지만, 이 때 표적 장기로의 삽입이 큰 장해가 되고, 현재 고셔(Gaucher)병에 대한 효소 보충 요법 이외에 양호한 성적은 거두지 못하였다.

고셔병은 리소좀 효소의 하나인 글루코실세라미드의 분해 효소 글루코세레브로시다아제의 유전자 변이에 의해, 주로 골수의 대식세포 유래 세포에 그의 기질인 글루코실세라미드가 축적되고, 저명한 간비종 이외에 빈혈, 출혈 등의 조혈 장해를 동반하는 질환이다. 상술한 바와 같이 본 질환의 치료법으로서 효소 보충 요법이 행해지고 있고, 높은 치료 성적을 거두고 있지만, 한편으로 본 요법은 평생 계속하지 않으면 안되고, 효소 제제가 매우 고가인 등의 문제점도 있다. 이 글루코세레브로시다아제 제제는 CH0 세포에서 생산된 인간 재조합 글루코세레브로시다아제의 당쇄 말단을, 만노오스를 노출시킨 형태로 수식한 것이다. 본 질환은 주된 이환(罹患) 세포가 대식세포이기 때문에, 글루코세레브로시다아제는 대식세포 상의 만노오스 수용체를 통해 세포 내로 받아들인 후에 리소좀으로 운반된다. 글루코세레브로시다아제는 그의 당쇄에 만노오스-6-인산을 갖지 않음에도 불구하고 리소좀으로 수송되는 것이 알려져 있다. 따라서, 본 효소는 만노오스-6-인산 수용체(MPR) 비의존성 수송 기구에 의해 리소좀으로 수송되고 있다고 생각된다.

그러나, 다른 리소좀 질환의 대부분은, 그의 결손 효소의 리소좀으로의 수송이 만노오스-6-인산 수용체를 통한 계이기 때문에, 효소 보충 요법에 이용되는 리소좀 효소는 만노오스-6-인산 수용체(MPR)와의 결합에 필요한 리소좀 이행 시그널인 만노오스-6-인산을 포함하는 당쇄를 가지고 있어야 한다. 따라서, 이들 리소좀 효소의 당쇄에의 만노오스-6-인산 부가가 중요하다.

현재, 리소좀 효소는, 태반으로부터 정제하는 방법, 섬유아세포, 흑색종 세포 등의 배양 세포를 이용한 생산법, 곤충 세포, 챠이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 등의 배양 세포를 이용한 재조합법, 트랜스제닉 토끼의 젖으로부터 얻는 방법이 보고되어 있지만, 1) 인산이 부가된 당쇄를 갖는 리소좀 효소의 함유량이 낮기 때문에 리소좀에의 삽입 효율이 나쁘고, 2) 생산성이 낮아 배양 비용이 높다. 이 때문에 1) 대량 투여가 필요하고, 2) 치료 비용이 높다는 등의 문제점이 있다. 또한, 효모 세포를 이용한 재조합법에 의한 생산예는 없다. 따라서, 만노오스-6-인산을 당쇄에 포함하는 리소좀에의 삽입 활성이 높은 효소가 요구되고 있다.

한편, 리소좀병의 일종인 파브리(Fabry)병은, α-갈락토시다아제의 활성이 저하되어 생체내 기질인 글로보트리아오실세라미드가 체내에 축적되는 X 염색체의 유전병이다. 전형적인 경과를 밟는 「고전형」 파브리병 환자는 소년기에서 청년기에 사지 통증, 피각 혈관종이나 저한증이 출현하고, 연령이 들어가면 신장 장해나 심장 및 뇌혈관 장해를 일으킨다. 최근, 비교적 경증으로 장년기 이후에 심근 장해를 주요 특징으로 하는 「아형」 파브리병의 존재가 알려지게 되고, 이들 환자가 「심근증」으로 보이는 환자군 중에 숨어 있는 것이 보고되어 주목받고 있다.

α-갈락토시다아제는 상술한 글루코세레브로시다아제와 다르고, 만노오스-6-인산 수용체를 통한 계에서 리소좀으로 수송된다. 따라서, 표적 세포에 효율적으로 삽입하기 위해서는 만노오스-6-인산을 함유하는 당쇄를 가져야 한다. 그러나, 만노오스-6-인산을 함유하는 당쇄를 갖는 α-갈락토시다아제를 치료 용도로서 이용할 정도의 고순도 표준품을 대량으로 생산하는 기술은 존재하지 않았다. 예를 들면, 인간에게 투여시 10 사람 중 9 사람이 효소 보충 요법에서의 우위성이 확인되었다. 섬유아세포 유래의 당단백질(α-갈락토시다아제)의 당쇄는, 만노오스-6-인산형 당쇄의 비율이 20 ％ 정도로 되어 있다[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 365-370(2000)].

이상과 같이, 효모와 포유류 세포에서는 단백질에 부가하는 당쇄의 구조가 크게 다르기 때문에, 유전자 공학적 수법에 의해 효모에서 인간 등 포유류 유래의 유용 당단백질을 생산시켜도, 포유류 유래의 것과 동일한 생물 활성이 검출되지 않거나, 당쇄의 차이에 의한 항원성의 차이 등이 지적되고 있다. 이 때문에, 포유류 유래의 당단백질을 효모에서 생산시키는 것은 종래에는 곤란하였다. 또한, 인간 및 다른 포유류 세포에서 부가되는 것과 동일한 당쇄 구조를 갖는, 유용한 인산 함유 산성 당쇄는 인간 등 포유류 세포에서 리소좀으로 당단백질이 수송되기 위한 표지 마커로서 기능하고 있어 유익하지만, 이들 산성 당쇄를 함유하는 당단백질을 균일하면서 다량으로 공급하는 것은 현실적으로 곤란하다. 따라서, 이러한 기술의 개발이 요구되는 바이다.

본 발명자들은 당쇄 합성 변이주(△0CH1 mnn1)를 이용하여 당단백질을 생산 시키고, 여기에 MNN6 유전자 산물을 생체내 또는 생체외에서 작용시킴으로써, 만노오스-1-인산이 부가된 산성 당쇄를 얻고, 이것을 산 처리함으로써 리소좀 수송 시그널로서 유효한 포유류와 동일한 당쇄를 얻는 방법을 제안하고 있다(일본 특허 공개 (평)9-135689). 그러나, 이 방법에서는 극도의 변성 조건 하(0.01N 염산 중, 100 ℃, 30 분간)에 두기 때문에, 대부분의 당단백질은 변성되어 버린다. 따라서, 생리 활성을 갖는 당단백질을 얻는 방법으로서는 충분하지 않았다.

<발명의 개시>

본 발명의 과제는, 효모에서의 당단백질의 생산에 있어서 상기한 문제를 극복하고, 인간 및 다른 포유류 세포에서 부가되는 것과 동일한 당쇄 구조를 갖는 유용한 인산 함유 산성 당쇄, 및 이 당쇄를 함유하는 당단백질을, 효모를 이용하여 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 당쇄 생합성 효모 변이주를 이용하여 인산 함유 당쇄를 많이 갖는 당단백질을 얻고, 여기에 α-만노시다아제를 작용시킴으로써, 항원성을 갖지 않고 인간을 비롯한 포유류 세포의 리소좀으로 수송시키기 위한 표지 마커로서 기능할 수 있는 만노오스-6-인산 함유 산성 당쇄를 갖는 당단백질을 다량이면서 양호한 순도로, 또한 생리 활성을 유지한 상태로 제조할 수 있음을 발견하였다. 또한, 이 인산 함유 산성 당쇄를 갖는 당단백질이 인간 리소좀 효소의 결손증 치료 등에 유효한 약제로서 이용할 수 있음을 발견하여, 본 발명을 완성하는데 이르렀다.

즉, 본 발명은, 고인산화 코어 당쇄를 생산하는 당쇄 생합성 변이 효모주를 이용하여, 여기에 목적하는 당단백질을 코딩하는 유전자를 도입 발현시키고, 얻어진 만노오스-1-인산 부가 산성 당쇄 함유 당단백질을 α-만노시다아제 처리에 의해 만노오스 부분을 절제하는 것을 특징으로 하는, 만노오스-6-인산 함유 당쇄 함유 당단백질의 제조 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명의 효모를 이용한 생산법에 의해 제조되는 인산 함유 산성 당쇄를 갖는 인간의 리소좀 효소를 비롯한 당단백질에 관한 것이다.

또한, 본 발명에 의해 생산된 인간의 리소좀 효소를 이용한 리소좀병 치료용 조성물에 관한 것이다.

보다 구체적으로는, 본 발명은 이하의 (1) 내지 (27)을 제공한다.

(1) 효모를 이용하여, 만노오스-6-인산을 비환원 말단에 함유하는 산성 당쇄를 갖는 활성형 당단백질을 제조하는 방법.

(2) 상기 (1)에 있어서, 만노오스-6-인산 함유 산성 당쇄가 만노오스-6-인산 수용체와 결합할 수 있는 당쇄인 방법.

(3) 효모를 이용하여, 하기 구조식 I 내지 VIII로 표시되는, 만노오스-6-인산을 비환원 말단에 함유하는 고 만노오스형 당쇄를 갖는 활성형 당단백질을 제조 하는 방법.

(4) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 효모가 산성 당쇄를 포함하면서 적어도 α-1,6-만노실 트랜스퍼라아제 유전자를 파괴한 효모주를 이용하는 것 을 특징으로 하는 방법.

(5) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 효모가 산성 당쇄를 포함하면서 적어도 α-1,6-만노실 트랜스퍼라아제 유전자 및 α-1,3-만노실 트랜스퍼라아제 유전자를 파괴한 효모주를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.

(6) 상기 (4) 또는 (5)에 있어서, α-1,6-만노실 트랜스퍼라아제 유전자가 에스. 세레비지애(S. cerevisiae)의 OCH1 유전자이고, α-1,3-만노실 트랜스퍼라아제 유전자가 에스. 세레비지애의 MNN1 유전자인 방법.

(7) 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 있어서, 효모가 고인산화 당쇄 함유 변이주인 방법.

(8) 상기 (7)에 있어서, 효모가 에스. 세레비지애 HPY21주인 방법.

(9) 상기 (1) 내지 (8) 중 어느 하나에 있어서, 만노오스-6-인산 함유 산성 당쇄를 갖는 활성형 당단백질이 리소좀 효소인 방법.

(10) 상기 (9)에 있어서, 리소좀 효소가 α-갈락토시다아제인 방법.

(11) 상기 (10)에 있어서, α-갈락토시다아제의 구조 유전자가 인간 유래 유전자인 방법.

(12) 상기 (11)에 있어서, α-갈락토시다아제의 구조 유전자가 서열 5로 표시되는 염기 서열을 갖는 것인 방법.

(13) 상기 (10) 내지 (12) 중 어느 하나에 있어서, α-갈락토시다아제를 생산하는 효모가 HPY21G주인 방법.

(14) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 상기 (4) 내지 (8) 중 어느 하나에 기재된 효모에서 생산된 당단백질에 α-만노시다아제를 작용시켜, 당쇄 중의 만노오스-1-인산 결합의 만노오스 잔기를 제거하는 것을 특징으로 하는 방법.

(15) 상기 (14)에 있어서, α-만노시다아제가 만노오스-1-인산 결합의 만노오스 잔기를 제거하는 활성을 갖는 것인 방법.

(16) 상기 (14) 또는 (15)에 있어서, α-만노시다아제가 α-1,2-만노시드 결합, α-1,3-만노시드 결합, α-1,6-만노시드 결합을 비특이적으로 분해하는 활성을 갖는 것인 방법.

(17) 상기 (16)에 있어서, α-만노시다아제 활성이 엑소형 활성이고, 엔도형 활성은 없는 것인 방법.

(18) 상기 (17)에 있어서, 셀룰로모나스(Cellulomonas)속 세균 유래의 α-만노시다아제인 방법.

(19) 상기 (18)에 있어서, 셀룰로모나스속 세균이 셀룰로모나스 SO-5인 방법.

(20) 효모에 의해 만들어지는 만노오스-6-인산을 비환원 말단에 함유하는 산성 당쇄를 갖는 당단백질.

(21) 상기 (20)에 있어서, 리소좀 효소인 당단백질.

(22) 상기 (20) 또는 (21)에 있어서, 상기 (1) 내지 (19) 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 생산되는 당단백질.

(23) 상기 (21) 또는 (22)에 있어서, α-갈락토시다아제인 당단백질.

(24) 상기 (23)에 있어서, 인간 유래 유전자에 의해 코딩된 α-갈락토시다아 제인 당단백질.

(25) 상기 (20)에 있어서, 하기 구조식 I 내지 VIII로 표시되는, 만노오스-6-인산을 비환원 말단에 함유하는 고 만노오스형 당쇄 구조를 갖는 당쇄를 함유하 는 당단백질.

(26) 상기 (20) 내지 (25) 중 어느 하나에 기재된 당단백질을 함유하는 것을 특징으로 하는, 리소좀병의 치료 및(또는) 예방을 위한 의약 조성물.

(27) 상기 (26)에 있어서, 당단백질이 인간 α-갈락토시다아제인, 파브리병 치료를 위한 의약 조성물.

본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본 특허 출원 제2001-180907호의 명세서 및(또는) 도면에 기재된 내용을 포함한다.

도 1은 포유류 동물에서의 일반적인 N-결합형 당쇄의 생합성 경로를 나타낸다[konfeld 등].

도 2는 효모(에스. 세레비지애)에서의 N-결합형 당쇄의 생합성 경로를 나타낸다.

도 3은 효모 HPY21주(△och1 △mnn1)에서 생성되는 코어 당쇄 및 산성 당쇄의 구조를 나타낸다.

도 4는 본 발명에서의 전략을 나타내는 도면이다.

도 5는 α-갈락토시다아제 유전자를 도입한 HPY21G주의 배양 상청액을 이용한 웨스턴 블롯 분석을 나타내는 사진이다.

1) 벡터만을 도입한 주(HPY21주)

2) α-갈락토시다아제 유전자를 도입한 주(HPY21G주)

도 6은 α-갈락토시다아제 유전자를 도입한 HPY21G주의 배양 상청 농축액으로부터 블루 세파로오스로 분리한 α-갈락토시다아제 당쇄의 당쇄 구조 분석 결과를 나타낸다.

도 7은 α-갈락토시다아제 유전자를 도입한 HPY21G주의 배양 상청 농축액으 로부터 정제한 α-갈락토시다아제 당쇄의 Asahi-Pak NH2-P 칼럼에서의 당쇄 구조 분석 결과를 나타낸다.

1) 배양 상청액 정제 α-갈락토시다아제의 당쇄(인산을 당쇄 내에 1분자 포함하는 것)

2) 1)의 α-만노시다아제 처리 후의 당쇄

3) 2)의 알칼리 포스파타아제 처리 후의 당쇄

4) 배양 상청액 정제 α-갈락토시다아제의 당쇄 부분(인산을 당쇄 내에 2분자 포함하는 것)을 α-만노시다아제, 알칼리 포스파타아제 처리한 당쇄

도 8은 정제 α-갈락토시다아제를 셀룰로모나스 SO-5주가 생산하는 α-만노시다아제로 처리한 후의 웨스턴 블롯 분석을 나타내는 사진이다.

1) α-만노시다아제 미처리한 것

2) α-만노시다아제 처리한 것

도 9는 셀룰로모나스 SO-5주가 생산하는 α-만노시다아제로 처리한 α-갈락토시다아제로부터 얻어진 당쇄의 Asahi-Pak NH2-P 칼럼에서의 구조 분석을 나타낸다.

도 10은 파브리병 환자로부터 얻어진 배양 피부 섬유아세포를 이용한 본 발명에서 얻어진 정제 α-갈락토시다아제의 삽입 실험(효소 활성 측정)의 결과이다.

도 11은 파브리병 환자로부터 얻어진 배양 섬유아세포에 본 발명에서 얻어진 정제 α-갈락토시다아제를 투여하였을 때의 축적된 기질에 대한 효과를 나타내는 사진이다(형광 항체법에 의한 현미경도).

<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>

GlcNAc, GN: N-아세틸글루코사민

Man, M: 만노오스

PA: 2-아미노피리딜화

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명에 있어서 리소좀으로 수송시키기 위한 표지 마커로서 기능할 수 있는 인산 함유 산성 당쇄를 갖는 당단백질의 제조법은, 기본적으로는 하기의 공정에 의해 이루어진다.

1) 인산화 코어 당쇄를 생산하는 당쇄 생합성 변이 효모주를 이용하여, 여기에 목적하는 당단백질을 코딩하는 유전자를 도입하여 만노오스-1-인산 부가 산성 당쇄 함유 당단백질을 발현시키는 공정.

2) 얻어진 만노오스-1-인산 부가 산성 당쇄 함유 당단백질을 α-만노시다아제 처리에 의해 만노오스 부분을 절제하여, 만노오스-6-인산 함유 당쇄 함유 당단백질을 생성시키는 공정.

본 발명에서 효모 특유의 당외쇄 생합성계 유전자가 파괴된 효모 변이주는 이하와 같이 하여 제조할 수 있다. 우선, 표적 유전자의 파괴에 필요한 DNA 유전자 단편의 단리는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 게놈 프로젝트에 의해 그의 염색체 상의 배좌가 이미 알려져 있기 때문에[Goffeau et al., Nature, 387(suppl.), 1-105(1997)], 미국 ATCC(American Type Culture Collection) 등 공적인 기관으로부터 표적 유전자의 근방을 포함하는 유전자 단편의 분배 공급을 받는 것이 가능하다[ATCC Recombinant DNA materials, 3rd edition, 1993]. 또한, 일반적인 수법에 따라서 에스. 세레비지애(S. cerevisiae)에서 게놈 DNA를 추출하여, 목적 유전자를 선별함으로써 얻는 것도 가능하다. 상기에 있어서, 에스. 세레비지애에서의 게놈 DNA의 추출은, 예를 들면 크라이어(Cryer) 등의 방법[Methods in Cell Biology, 12, 39-44(1975)] 및 피. 필립센(P. Philippsen) 등의 방법[Methods Enzymol., 194, 169-182(1991)]에 따라서 행할 수 있다.

표적 유전자는 PCR법에 의해 증폭시키고 나서 유전자 파괴를 행한다. PCR법은 시험관 내(in vitro)에서 DNA의 특정 단편을 그 영역의 양끝의 센스ㆍ안티센스 프라이머, 내열성 DNA 중합효소, DNA 증폭 시스템 등의 조합을 이용하여 약 2 내지 3 시간에 수십만배 이상으로 증폭할 수 있는 기술이지만, 표적 유전자의 증폭에는, 프라이머로서 25 내지 30 mer의 단일가닥 합성 DNA를, 주형으로서 게놈 DNA를 이용한다.

본 발명에 있어서 표적 유전자의 파괴는 기본적으로 문헌[Rothstein, Methods Enzymol., 101, 202-211(l983)]에 개시된 방법에 따라서 행할 수 있다. 이 방법은 우선 플라스미드 상의 표적 유전자 DNA를 분단 또는 부분 결손시키고, 여기에 적당한 선택 마커 유전자 DNA를 삽입하여 표적 유전자의 상류부와 하류부 사이에 선택 마커가 샌드위치된 구조체를 제조하고, 다음으로 이 구조체를 효모 세포에 도입한다. 이상의 조작에 의해, 도입 단편(선택 마커가 삽입된 DNA 구조체) 의 양끝과 염색체 상의 표적 유전자와의 상동 부분 사이에서 2회의 재조합을 일으켜, 염색체 상의 표적 유전자가 도입 단편으로 치환된다.

구체적으로, OCH1 유전자 파괴주의 제조를 예로 들어 설명한다. 알라니(Alani) 등에 의해 구축된, 살모넬라균의 hisG 유전자 DNA 단편이 URA3 유전자의 양끝에 결합되어 있는 플라스미드[Alani et al., Genetics, 116, 541-545(1987)]로부터 hisG-URA3-hisG의 카세트를 제한효소로 잘라내고, 플라스미드 상의 표적 유전자에 삽입하여 파괴된 대립 유전자를 구축한다. 이 플라스미드를 이용하여 염색체의 표적 유전자와 치환하여 유전자 파괴주를 얻는다. 염색체에 삽입된 URA3 유전자는 hisG 사이에 끼워져 있으며, hisG 서열 사이에서의 상동성 재조합에 의해 1 카피의 hisG와 함께 염색체로부터 탈락된다. 염색체 상의 표적 유전자에는 또한 1 카피의 hisG 단편이 남아 파괴된 채로 있는데, 숙주 세포는 Ura-표현형이 된다. 이 hisG 사이에서의 상동성 재조합은 5-플루오로오로토산(5-FOA)에 의해 행할 수 있다. ura3 변이주는 5-FOA에 내성이고(Boeke et al., Mol. Gen. Genet., 197, 345-346 (1984); Boeke et al., Methods Enzymol., 154, 165-174(1987)), Ura3+ 표현형을 갖는 세포주는 5-FOA 배지에서 생육할 수 없게 된다. 따라서, 5-FOA를 첨가한 배지에서 내성 형질을 갖는 주를 분리하면, 다시 URA3 마커를 이용한 조작이 가능하다.

이하, 이 OCH1 유전자 파괴주에 동일한 수법으로 MNN1 유전자를 유전자 파괴시킴으로써 목적하는 이중 변이주(ΔochlΔmnnl)를 얻을 수 있다.

효모의 Δoch1 변이주는 당단백질의 코어 당쇄에 만노오스 외쇄 부가에 필요 한 최초의 α-1,6 결합된 만노오스를 부가하는 반응이, 또한 Δmnn1 변이주는 코어 당쇄 및 당외쇄 분지의 비환원 말단에 α-1,3 결합된 만노오스를 부가하는 반응이 각각 결손되어 있다. 이들 변이를 모두 갖는 이중 변이주(Δoch1Δmnn1)는 이미 발명자들이 제안(특허 3091851)한 바와 같이 Man8GlcNAc2의 중성 코어 당쇄를 생산함과 동시에, 이 중성 당쇄 외에 만노오스-1-인산을 포함하는 산성 당쇄도 부생된다(제12회 바이오테크놀로지 심포지움 예비 요약 원고집, p.153-l57, 평성 6년 10월 14일 발행, 바이오테크놀로지 개발 기술 연구 조합 발행).

또한, 본 발명에서 사용되는 효모주는 만노오스-6-인산을 함유하는 당쇄를 가져야 한다. 이 당쇄는 효모에서도 꽤 보편적으로 존재함이 알려져 있다. 이 당쇄의 생성에 관여하는 유전자로서는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)에서 도 2에 표시되는 당쇄 구조식의 *로 표시된 만노오스의 6 위치에 만노오스-1-인산의 부가 반응을 촉매하는 유전자(MNN6)와, 이 만노오스-1-인산의 부가를 제어하는 유전자 (MNN4)가 해당된다.

인산 함유 당쇄는 대수 증식기보다 배양 후기(정상기)에 많이 검출된다. 이것은 만노오스-1-인산의 부가를 제어하는 유전자(MNN4)의 발현 패턴과 일치한다. MNN4, MNN6 유전자의 발현을 증강시킴으로써 만노오스-6-인산을 함유하는 당쇄를 많이 포함하는 효모를 육종할 수 있다고 여겨진다.

사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) KK4주는 MNN4 유전자의 프로모터 부분이 변이되어 있으며, MNN4 유전자가 구성적으로 발현되는 주이다. 따라서, 인산 부가 당쇄를 많이 함유한다. 만노오스-6-인산을 함유하는 당단백질 을 생산하는 데에는 적합하다고 여겨진다.

상기 조작에 있어서, DNA 세포로의 도입 및 그에 따른 형질전환의 방법으로서는 일반적인 방법, 예를 들면 벡터로서 파지를 사용하는 경우에는 대장균 숙주에 이것을 감염시키는 방법 등에 의해 효율적으로 숙주에 DNA를 삽입시킬 수 있다. 또는, 플라스미드를 사용하여 효모를 형질전환하는 방법으로서는 리튬염으로 처리하여 자연스럽게 DNA를 삽입하기 쉬운 상태로 하여 플라스미드를 삽입시키는 방법이나, 또는 전기적으로 DNA를 세포 내에 도입하는 방법을 이용할 수 있다(Becker and Guarente, Methods Enzymol., 194, 182-187(1991)).

또한, 상기 조작에서의 DNA 단리ㆍ정제 등은 모두 통상법, 예를 들면 대장균인 경우, 알칼리/SDS법과 에탄올 침전에 의한 DNA 추출, 또한 RNase 처리, PEG 침전법 등에 의해 DNA를 정제할 수 있다. 또한, 유전자의 DNA 서열의 결정 등도 통상의 방법, 예를 들면 디데옥시법(Sanger et al., Proc. Nat1. Acad. Sci., USA, 74, 5463-5467(1977)) 등에 의해 행할 수 있다. 또한, 상기 DNA 염기 서열의 결정은 시판되고 있는 시퀀스 키트 등을 사용함으로써 쉽게 행할 수 있다.

또한, 상기 당쇄를 갖는 이종 생물 유래의 당단백질을 생산하기 위해서는, 상기 효모 변이주를 숙주로 하여 목적의 당단백질을 코딩하는 유전자(cDNA 등)을 효모에서 발현가능한 프로모터의 하류에 접속된 유전자를 제조하고, 상동성 재조합에 의해 상기 효모 숙주에 삽입하거나, 또는 플라스미드에 삽입하여 상기 숙주를 형질전환함으로써 상기 숙주의 형질전환체를 제조하고, 이것을 공지된 방법에 의해 배양함으로써 효모 세포 내 또는 세포 바깥에 생산된 목적의 당단백질을 회수할 수 있다.

이 때의 목적하는 당단백질을 코딩하는 유전자는 번역되는 아미노산 서열이 동일하면 된다. 인간은 효모와 비교하여 코돈 이용도(codon usage)가 다르기 때문에 인간 유래 유전자는 효모 내에서의 발현이 낮은 경우가 많다. 따라서, 유전자를 효모형의 코돈 이용도로 변환한 유전자를 합성하여 사용함으로써 고발현이 기대된다. 사용하는 유전자는 기본적으로 인간 유래 효소와 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 유전자여야 한다. 즉, 다른종의 효소인 경우, 항원성을 갖는 것이 염려되기 때문이다.

상기의 효모 변이주의 배양은 효모 배양에 관용되는 통상법에 따라 행할 수 있다. 예를 들면, 디프코(Difco)사에서 공급되는 각종 배지 성분을 첨가하고, 플라스미드의 복제ㆍ유지에 필요한 마커에 의해 공급 가능한 아미노산을 제외한 합성 배지(탄소원, 질소원, 무기 염류, 아미노산, 비타민 등을 포함함) 등을 이용할 수 있다(Sherman, Methods Enzymol., 194, 3-57(1991)). 외래 유전자를 플라스미드 상이 아니라 염색체에 삽입한 경우, 유전자가 탈락하는 경우는 없기 때문에 통상의 영양원이 풍부한 배지에 의해 배양할 수 있다.

상기 배양물(배양액, 배양 균체)로부터 당단백질을 단리 정제하기 위해서는, 통상의 단백질 단리, 정제법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 균체 내에 존재하는 당단백질에 대해서는 배양 종료 후, 세포를 원심분리에 의해 회수하여 수계 완충액에 현탁한 후, 초음파 파쇄기, 프렌치 프레스, 만톤 가우린 균질기, 다이노밀 등에 의해 세포를 파쇄하여 무세포 추출액을 얻고, 이것을 원심분리함으로써 상청액을 얻는다. 한편, 배양 상청액에 존재하는 당단백질에 대해서는 배양 종료 후, 세포를 원심분리에 의해 분리하여 한외 여과, 염석법 등에 의해 농축한다. 이후의 조작은 통상적인 단백질 단리 정제법, 즉 용매 추출법, 황산암모늄 등에 의한 염석법, 탈염법, 유기 용매에 의한 침전법, 디에틸아미노에틸(DEAE) 세파로오스 등을 이용한 음이온 교환 크로마토그래피법, 술포프로필(SP) 세파로오스(파마시아사 제조) 등을 이용한 양이온 교환 크로마토그래피법, 페닐세파로오스 등을 이용한 소수성 크로마토그래피법, 세파크릴 등을 이용한 분자체를 사용한 겔 여과법, 군 특이성 담체, 렉틴 리간드, 금속 킬레이트 등을 이용한 친화도 크로마토그래피법, 크로마토 포커싱법, 등전점 전기 영동 등의 전기 영동법 등의 방법을 단독으로 또는 조합하여 사용하여 정제 표준품을 얻을 수 있다.

본 발명에서는 친화도 크로마토그래피를 이용함으로써 인산화 당쇄를 갖는 α-갈락토시다아제와 인산화 당쇄를 갖지 않는 α-갈락토시다아제를 분리하는 데에도 성공하였다. 즉, 블루 세파로오스 크로마토그래피를 이용함으로써 목적하는 당단백질의 분리에 성공하였다. 블루 세파로오스에 사용되는 친화도 리간드는 클로로트리아진 색소의 일종인 시바클론 블루 F3GA이며, 이러한 인산화 당쇄를 분리할 수 있는 색소를 리간드로 한 친화도 크로마토그래피로 만노오스-6-인산 함유 산성 당쇄를 갖는 당단백질을 정제하는 방법도 응용할 수 있을 것이다.

또한, 인산에 의한 당쇄의 하전 차이를 이용하여 이온 교환, 크로마토 포커싱법, 등전점 전기 영동을 본 방법에 사용함으로써 만노오스-6-인산 함유 당쇄를 갖는 당단백질, 보다 상세하게는 하기의 효모 특유의 만노오스-1-인산 중의 만노오 스가 제거된 당단백질을 정제, 농축할 수 있다.

또한, 만노오스 인식 렉틴으로서 알려져 있는 콘케나발린 A(Concanavalin A; ConA)의 결합 특이성의 차이를 이용함으로써, 즉 인산을 포함하지 않는 당쇄를 갖는 효모 유래의 당단백질은 α-만노시다아제에 의해 당쇄가 절단되어 ConA로의 결합성이 저하 또는 결손된다. 한편, 인산을 함유하는 당쇄의 경우, 만노오스-6-인산을 기질로서 인식하지 않기 때문에 당쇄의 제거가 그 이상 진행되지 않으며, ConA로의 결합성이 저하되지 않는다. 이것을 이용함으로써 생물적으로 보다 고활성인, 즉 세포로의 삽입 활성이 높은, 보다 상세하게는 만노오스-6-인산 수용체로의 결합 활성이 높은 리소좀 효소 표준품만을 얻을 수 있어 고기능 의약품으로서의 응용을 기대할 수 있다.

본 발명의 효모 특유의 만노오스 제거에 사용되는 α-만노시다아제는, 만노오스-1- 인산 결합을 분해하여 엑소형으로 작용하고, 당단백질에 작용하며, 처리하는 당단백질이 안정한 pH 범위에서 작용하는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 이들 α-만노시다아제는 α-1,2, α-1,3, α-1,6 결합 등의 만노시드 결합에 작용하는 것 외에, p-니트로페닐-α-만노피라노시드나 4-메틸움벨리페릴-α-만노시피라노시드 등의 합성 기질에도 작용하는 등, 폭 넓은 기질 특이성을 갖는 것이다. 그러한 α-만노시다아제로서는 작두콩(Jack Bean) α-만노시다아제, 효모 액포 유래 만노시다아제 등을 이용할 수 있다고 여겨진다. 그러나, 작두콩 유래의 α-만노시다아제는 당단백질의 당쇄 그 자체에 대해서는 비교적 효소 활성이 약하여 장시간 반응이 필요하고, 또한 약산성측에 적정 pH(pH=4.5)를 가져서 약산성측에서 불안정한 단백질은 실활될 우려가 있기 때문에, 당단백질의 당쇄 부분을 제거한 구조 안정적인 단백질의 회수에는 부적절하다고 여겨진다. 따라서, 효소 활성이 더욱 강하고 정제도 용이하며, 당단백질이 안정된 중성의 pH에서 작용할 수 있는 신규한 α-만노시다아제가 필요하게 되었다. 본 발명자들에 의해 취득된 셀룰로모나스 SO-5주가 생산하는 α-만노시다아제는 상기한 조건을 만족하며, 본 발명에 유효한 효소라고 할 수 있을 것이다. 또한, 상기 셀룰로모나스 SO-5주는 일본 이바라끼껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1반지 1주오 다이6 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁 센터에 2001년 6월 12일자로 FERM BP-7628이라는 수탁 번호로 국제 기탁되어 있다.

또한, 본 발명의 효소 생산 효모는 최종적으로 α-만노시다아제 처리에 의해 만노오스-6-인산이 생성되고, 항원성이 없는 당쇄를 생산할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)는 만노오스-1-인산 함유 당쇄를 갖는 당단백질을 생산하는 메탄올 효모이고, α-만노시다아제 처리에 의해 출아 효모 유래의 것과 동등한 당쇄가 되는 것을 기대할 수 있다.

또한, 본 발명에서 생산되는 리소좀 효소가 α-갈락토시다아제로 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 테이-삭스(Tay-Sachs)병의 치료약이 되는 b-헥소사미니다아제 A, 샌드호프(Sandhoff)병의 치료약이 되는 b-헥소사미니다아제 A 및 B, 크라베(Krabbe)병의 치료약이 되는 갈락토세레브로시다아제, 헐러(Hurler)병의 치료약이 되는 a-이듀로니다아제, 슬라이(Sly)병의 치료약인 b-글루쿠로니다아제, 푸코시드 축적증(fucosidosis)의 치료약인 a-푸코시다아제, 쉰들러(Schindler)병ㆍ칸사 키병의 치료약인 a-N-아세틸갈락토사미니다아제 등의 유전자를 동일하게 발현, 정제함으로써 각종 리소좀병의 치료 및(또는) 예방을 위한 의약으로서 응용할 수 있다.

α-갈락토시다아제의 경우, 치료 용도로서의 사용법은 치료에 필요한 양의 α-갈락토시다아제를 제공함으로써 파브리병의 치료에 사용된다. 이 경우, 치료에 필요한 양이란 파브리병의 증상을 현저하게 완화시키는 α-갈락토시다아제의 양이다. α-갈락토시다아제는 본 발명과 같이 만노오스-6-인산 함유 당쇄를 하나 이상 가지며, 인간 만노오스-6-인산 수용체에 결합하는 활성을 갖는 것이다. α-갈락토시다아제는 표준적인 의료상 허용될 수 있는 안정화제, 등장액 등을 함유한 의약 조성물로서 투여되며, 예를 들면 정맥내 주사에 의해 통상법으로 투여된다. 본 발명에 의해 생산되는 α-갈락토시다아제는 인간 조직으로부터 얻어지는 정제 효소 표준품, 동물 배양 세포, 트랜스제닉 동물 등에 의해 생산되는 재조합 효소 표준품과 비교하여, 만노오스-6-인산 함유 당쇄를 동등량 이상 함유하기 때문에 보다 적은 투여량으로 효과를 발휘할 수 있고, 인간, 동물 조직을 이용한 의약품에서 문제가 되는 바이러스 등의 혼입도 없기 때문에 안전하고 기능이 높은 의약 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에 있어서, 의약 조성물은 본 발명의 당단백질 외에 제약상 허용될 수 있는 안정화제, 완충제, 부형제, 결합제, 붕해제, 교미제, 착색제, 향료 등을 적절하게 첨가하여 주사제, 정제, 캡슐제, 과립제, 세립제, 산제 등의 제형으로 할 수 있다. 또한, 본 발명에서의 의약 조성물의 투여 형태는 경구 투여, 또는 정맥 내 주사, 근육 내 주사 등의 비경구 투여 중 어느 하나일 수 있다. 투여량은 환자의 연령, 체중, 증상, 투여 경로 등에 따라 다르지만, 통상 성인 1인 당 유효 성분의 양은 경구 투여의 경우에는 1회 1 내지 10 mg의 범위이고, 비경구 투여의 경우에는 1회 10 내지 50 mg의 범위로 투여하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 리소좀병 치료약으로 한정되지 않으며, 리소좀에 당단백질을 수송하기 위한 기술로서 이용할 수 있다. 이것을 이용하여 리소좀 효소의 수송 메카니즘이나, 리소좀 내에서의 노폐물 분해 메카니즘이 해명되어 이 분야의 연구 발전이 기대된다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 기술적 범위를 전혀 한정하지 않는다.

<실시예 1> 고인산화 당쇄 함유 당쇄 생합성 이중 변이 효모주(사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) Δoch1Δmnn1주)의 제조

이미 보고되어 있는 pNK51(Alani et al., Genetics, 116, 541-545(1987))에 의해 URA3 유전자의 양끝에 살모넬라균 hisG 유전자가 직접 반복서열로 결합되어 있는 카세트(HUH)를 BglII와 BamHI로 절단하고, 대장균 플라스미드 pSP73의 BamHI 부위에 삽입하였다. 이 플라스미드를 pSP73-HUH라고 명명하였다.

OCH1 유전자는 효모 제7번 염색체에 위치하며, OCH1 유전자의 DNA 염기 서열은 진뱅크(GenBank) 데이타베이스에 D11095로 등록되어 있다(Nakayama et al., EMBO J., 11, 2511-2519(1992)). 이미 구축되어 있는 OCH1 유전자 파괴용 벡터 pochl:: LEU2-1(Nakayama et al., EMBO J., 11, 2511-2519(1992))을 SalI 및 HindIII으로 절단함으로써 Δoch1::LEU2를 포함하는 영역을 잘라내고, 이것을 이용하여 고인산화 당쇄 생산 효모인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) KK4주(MATa ura3 his1 or his3 trp1 leu2 ga180; Nogi et al., Mol. Gen. Genet. 1195, 29-34(1984))를 아세트산 리튬법(Ito et al,, J. Bacteriol., 153, 163-168(1983))으로 형질전환하였다. Δoch1 파괴를 포함하는 주는 저침투압 감수성을 나타내기 때문에, 0.3 M KCl을 포함하는 SD-Ura(2 ％ 글루코오스, 아미노산이 없는 0.67 ％ 효모 질소 염기(Difco사 제조), 우라실을 제외한 핵산 염기, 및 아미노산 혼합물(20 내지 400 mg/L)) 배지의 플레이트에 뿌려 30 ℃에서 2 일간 배양하여 형질전환체를 얻었다.

형질전환체로부터 게놈 DNA를 제조하고, PCR법에 의해 우라실 마커가 Δoch1 영역의 염색체에 삽입되어 있는 것을 확인하여 HPY11주로 하였다.

한편, MNN1 유전자는 효모 5번 염색체 동원체 근방에 위치하며, MNN1 유전자의 DNA 염기 서열은 진뱅크 데이타베이스에 L23753으로 등록되어 있다(Yip et al., Proc. Nat1. Acad. Sci. USA, 9, 2723-2727(1994)). MNN1 유전자의 3' 영역을 프라이머 A(GGATCCGAAGAAAACCTAATACATTGAAGT: 서열 1)와 프라이머 B(GCATGCCCTTTGGTTTAATATAAATCTCCGGAGTGC: 서열 2)를 사용하여, 또한 5' 영역을 프라이머 C(GCATGCTACATAACTCCAATCAGCAGCAAATATGTC: 서열 3)와 프라이머 D(GCGGCCGCGTGTTCTGTTCGGGTAACGTTTAAACCAAT: 서열 4)를 사용하여 각각 PCR로 증폭시켰다. 이들 DNA 단편을 HIS3 마커를 갖는 플라스미드 pHYH의 SphI 부위에 삽입 하여 pHYHΔmnn1을 제조하였다. MNN1 유전자를 HUH 카세트를 사용하여 파괴하기 위해 1.8 kb의 SphI 단편을 pHYHΔmnn1로부터 취득하여 pSP73-HUH의 SphI 부위에 삽입한 pSP73-Δmnn1::HUH를 구축하였다. 본 플라스미드를 NotI 부위로 절단함으로써 직쇄화하고, HPY11주를 아세트산 리튬법을 이용하여 형질전환하였다. 형질전환 후, 0.3 M KCl을 포함하는 SD-Ura 배지의 플레이트에 뿌려 30 ℃에서 2 일간 배양하여 형질전환체를 얻었다.

형질전환체로부터 게놈 DNA를 제조하고, PCR법에 의해 우라실 마커가 MNN1 영역의 염색체에 삽입되어 있는 것을 확인하여 HPY22주로 하였다. 이 주를 0.3 M KCl과 5-FOA를 함유한 YSD 배지(1 ％ 효모 추출액, 2 ％ 글루코오스, 아데닌(40 mg/L), 우라실(20 mg/L))에서 선발하여 URA3 유전자 탈락주를 얻었다. 상기의 방법과 동일하게 PCR법을 이용하여 URA3 유전자를 탈락시킨 mnn1 파괴주를 확인하였다. Δoch1::LEU2 Δmnnl::hisG를 포함하는 이 주를 고인산화 당쇄 함유 이중 변이 효모주 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) HPY21주로 하였다.

<실시예 2> Δoch1Δmnn1 이중 파괴주로의 α-갈락토시다아제 유전자의 도입

인간 α-갈락토시다아제 유전자 서열은 진뱅크 데이타베이스에 NM000169로 등록되어 있다(Nucleic Acids Res. 17(8), 3301-3302(1989)). 이미 보고되어 있는 pCXN2(Ishii et al., Hum. Genet. 89, 29-32(1992))에 의해 EcoRI로 절단하고, 인간 α-갈락토시다아제의 cDNA 영역(-16 내지 +1290; 서열 5)을 잘라내었다. 이어서, 효모에서의 발현을 행하기 위해 효모 발현 벡터인 플라스미드 YEp352-GAP의 EcoRI 부위에 삽입하였다. 이 플라스미드를 YEp352-GAP-GLN이라고 명명하였다. 이어서, 이 플라스미드로부터 BamHI로 프로모터, 터미네이터 영역을 포함하는 인간 α-갈락토시다아제의 cDNA 영역을 잘라내고, 융합 벡터인 pRS404의 BamHI 부위에 삽입하였다. 이 플라스미드 pRS-GLN-4를 Bst1107I로 절단한 후, 실시예 1에서 제조한 에스. 세레비지애(S. cerevisiae) HPY21주를 형질전환하였다. 형질전환은 아세트산 리튬법을 이용하여 행하였다. 형질전환 후, 0.3 M KCl을 포함하는 SD-Trp(2 ％ 글루코오스, 아미노산이 없는 0.67 ％ 효모 질소 염기(Difco사 제조), 트립토판을 제외한 핵산 염기 및 아미노산 혼합물(20 내지 400 mg/L)) 배지의 플레이트에 뿌려 30 ℃에서 2 일간 배양하여 형질전환체 에스. 세레비지애 HPY21G주를 얻었다.

이어서, 에스. 세레비지애 HPY21G주를 5 ml의 0.3 M의 KCl을 포함하는 YPAD 배지(2 ％ 폴리펩톤, 1 ％ 효모 추출액, 2 ％ 글루코오스, 아데닌(40 mg/L))에서 30 ℃로 3 일간 배양한 후, 원심분리에 의해 배양 상청액을 얻었다. 한외 여과막(울트라 프리 C3LGC(분자량 10000 컷트), 밀리포어사)으로 약 5배로 농축한 것을 조효소액으로 하였다. 조효소액을 SDS 샘플 완충액으로 변성시킨 후, 통상법으로 웨스턴 블롯 분석을 행하였다. 웨스턴 블롯 분석은 1차 항체로서 토끼 항α-갈락토시다아제 항체를 사용하고, 2차 항체로서 항 토끼 Ig 항체 알칼리 포스파타아제 복합체를 사용하였으며, 검출은 CDP-Star 시스템(Pierce사)을 이용하여 X선 필름에 노광함으로써 행하였다.

그 결과, 대조군의 HPY21주에서는 시그널이 전혀 보이지 않은 데 반하여, HPY21G주로 형질전환된 것의 배양 상청액에서는 분자량 약 50 kDa의 위치에 시그널이 확인되었다(도 5).

이어서, 조효소액 중의 α-갈락토시다아제 효소 활성을 측정하였다. 5 mM의 4-메틸움벨리페릴-D-갈락토피라노시드가 들어간 0.15 M 아세트산 완충액(pH 4.6) 60 ㎕에 효소액 10 ㎕를 첨가하여 37 ℃에서 30 분간 반응시켰다. 여기에 0.2 M 글리신/수산화나트륨 완충액(pH 10.7) 700 ㎕를 첨가하여 반응을 정지하였다. 이것을 형광 광도계(Ex: 365 nm, Em: 450 nm)로 측정하였다. 그 결과, HPY21G주의 조효소액을 효소원으로 했을 경우, 대조군인 HPY21주의 조효소액과 비교하여 형광이 확실히 증가되어 있었다(표 1).

조효소액 중의 α-갈락토시다아제 효소 활성

균주	활성(nmol/분/ml)
HPY21주(대조군)	0
HPY21G주(α-갈락토시아아제 유전자 도입주)	24.8

<실시예 3> α-갈락토시다아제 유전자를 도입한 주의 배양 상청액으로부터의 α-갈락토시다아제 정제, 및 정제 효소의 당쇄 구조 분석

α-갈락토시다아제 유전자를 도입한 HPY21G주의 배양, 조효소액의 제조는 실시예 2에 준하여 행하였다. 조효소액을 pH 4.5로 조정하여 블루-세파로오스 CL-6B(파마시아사) 칼럼 크로마토그래피에 제공하였다. 아세트산나트륨 완충액(pH 4.5)으로 세정한 후, 4 M NaCl를 포함하는 MES 완충액(pH 6.0)으로 용출하였다. 각 분획의 효소 활성을 측정한 결과, α-갈락토시다아제 활성은 칼럼 통과 분획, 용출 분획 모두에 존재하였다. 각각의 분획을 ConA 세파로오스에 제공하였다. 0.15 M 염화나트륨, 0.5 mM 염화칼슘, 0.5 mM 염화망간을 포함하는 MES 완충액(pH 6.0)으로 세정한 후, 0.15 M 염화나트륨, 0.5 mM 염화칼슘, 0.5 mM 염화망간 및 0.2 M의 α-메틸만노시드를 포함하는 MES 완충액(pH 6.0)으로 α-갈락토시다아제를 용출하였다. 또한, 용출 분획을 MonoQ에 제공하였다. MES 완충액(pH 6.0)으로 세정한 후, 1 M NaCl를 포함하는 MES 완충액으로 구배 용출을 행하였다. 효소 활성이 강한 분획을 투석한 후, 농축하여 정제 α-갈락토시다아제 표준품을 얻었다.

얻어진 α-갈락토시다아제에 대하여 효소 처리를 실시하여 아스파라긴 결합형 당쇄를 잘라내었다. 동결 건조품을 100 ㎕의 N-글리코시다아제 F용 완충액(0.5 ％ SDS, 0.35 ％ 2-머캅토에탄올을 포함하는 0.1 M Tris-HCl 완충액(pH 8.0))에 용해하여 5 분간 자비(煮沸) 처리하였다. 실온까지 되돌린 후, 50 ㎕의 7.5 ％ Nonidet P-40, 138 ㎕의 H₂O, 12 ㎕의 N-글리코시다아제 F(베링거사 제조)를 첨가하여 37 ℃에서 16 시간 처리하였다. BioRad AG50W-X8 칼럼으로 탈염시켜 당쇄 제조품으로 하였다.

얻어진 당쇄를 형광 표지(피리딜아미노화, "PA화"라고 함)하기 위해 이하의 조작을 행하였다. 당쇄 제조품을 농축 건고한 후, 40 ㎕의 커플링 시약(552 mg의 2-아미노피리딘을 200 ㎕의 아세트산에 용해함)을 첨가하여 밀봉하고 90 ℃에서 60 분간 처리하였다. 실온까지 되돌린 후, 140 ㎕의 환원 시약(200 mg의 보란ㆍ디메 틸아민 복합체를 50 ㎕의 H₂O과 80 ㎕의 아세트산에 용해함)을 첨가하여 밀봉하고 80 ℃에서 80 분간 처리하였다. 반응 후, TOYOPEARL HW-40F(도소)로 겔 여과를 행하여 미반응된 2-아미노피리딘을 제거하였다. 당쇄 분획에 대하여 0.22 ㎛의 필터로 여과하여 PA화 올리고당 제조품으로 하였다.

당쇄 구조 분석은 본 발명자들이 제안한 방법(일본 특허 공개 (평)9-135689)에 준하여 행하였다. 아미노 칼럼을 이용한 HPLC에서는 PA화 올리고당을 그 쇄 길이에 의해 분리하는 것이 가능하다. 또한, 인산화 당쇄와 비인산화 당쇄도 분리할 수 있다. 이것은 인산이 아미노 칼럼에 강하게 흡착되기 때문에 용출 시간이 지연되는 것에 기인한다. 칼럼은 아미노 칼럼 Asahipak NH2P-50(4.6×250 mm)을 사용하고, 용매는 A액으로서 200 mM 아세트산-트리에틸아민(pH 7.2)을, B액으로서 아세토니트릴을 사용하였다. 미리 용매 A를 30 ％, 용매 B를 70 ％로 유속 1.0 ml/분으로 유동시킴으로써 칼럼을 평형화하고, 용출은 1.0 ml/분의 유속으로 B 액 70 ％부터 시작하여 50 분만에 B액 20 ％가 되는 선형 구배를 적용함으로써 PA화 올리고당을 용출하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다. 블루-세파로오스 용출 분획의 α-갈락토시다아제로부터 제조된 당쇄는 20 분 부근(피크 A)에서 용출되는 한편, 블루-세파로오스를 바로 통과한 분획의 α-갈락토시다아제로부터 제조된 당쇄는 30 분 부근(피크 B)과 38 분 부근(피크 C)의 두군데에서 용출되었다.

피크 A는 Man8GlcNAc2-PA와 동일한 위치에서 용출되는 점으로부터 인산이 부가되어 있지 않은 Man8GlcNAc2 구조를 갖는 당쇄인 것을 알았다. 피크 B 및 피크 C는 용출 위치로부터, 피크 B는 만노오스-1-인산이 1개 결합되어 있는 당쇄, 피크 C는 만노오스-1-인산이 2개 결합되어 있는 당쇄인 것이 시사되었다. 피크 B 및 피크 C에 대해서는 하기의 방법에 따라 알칼리 포스파타아제 처리에 의해 구조를 더 확인하였다.

이상의 점으로부터 α-갈락토시다아제 유전자를 도입한 고인산화 당쇄 함유 당쇄 생합성 이중 변이 효모주 HPY21G주로 생산된 α-갈락토시다아제의 당쇄는, (Man-P)2-Man8GlcNAc2, (Man-P)-Man8GlcNAc2의 인산 부가 고 만노오스형 당쇄, 및 Man8GlcNAc2의 고 만노오스형 당쇄인 것이 밝혀졌다. 그 양의 비율은 약 1:1:1이었다.

또한 블루-세파로오스 크로마토그래피를 이용함으로써 인산화 당쇄를 갖는 α-갈락토시다아제와 인산화 당쇄를 갖지 않는 α-갈락토시다아제를 분리하는 것이 가능한 것을 알았다.

반응 산물(피크 B 및 C)(도 6)이 만노오스-1-인산이 부가된 산물인가를 분석하였다. 우선, 이미 NMR로 그 구조가 확인된 화합물(도 3, 구조식 II, III 및 IV)에 대하여 HPLC에 의해 분석했더니, 구조식 II, III의 것은 30 분 부근에서 용출되었다. 따라서, 활성 측정으로 나타난 피크 B는 만노오스-1-인산이 1개 결합되어 있는 당쇄와 동일한 것을 포함하고 있다고 여겨졌다. 또한, 만노오스-1-인산이 2개 결합되어 있는 구조식 IV의 용출 위치는 피크보다 꽤 지연되어 용출된 점으로부터 피크 C는 만노오스-1-인산이 2개 결합되어 있는 당쇄라고 추정되었다.

또한, 피크 B가 만노오스-1-인산이 1개 결합된 당쇄인 것을 직접 확인하기 위해 피크 B를 분취하고, 만노오스-1-인산 잔기의 만노오스 부분을 잘라내기 위해 작두콩 α-만노시다아제에 의해 분해하였다. 분취된 피크의 용매를 동결 건조로 제거하고, 작두콩 α-만노시다아제(세이가가꾸 고교사 제조) 60 mU를 포함하는 아세트산나트륨 완충액(pH 4.5)을 첨가하여 37 ℃에서 하룻밤 반응시켰다. 그 결과, 도 7b에 도시한 바와 같이 원래의 당쇄보다 느린 위치에서 용출되었다. 또한, 알칼리 포스파타아제 처리를 행했더니, Man4GlcNAc2-PA와 동일한 위치에서 용출되었기 때문에 작두콩 α-만노시다아제로 처리된 당쇄는 PO4-Man4GlcNAc2-PA의 구조를 갖는 것을 알았다. 동일하게 하여 피크 C에 대해서도 작두콩 α-만노시다아제 처리, 알칼리 포스파타아제 처리를 행한 결과, 피크 B와 동일하게 느린 위치에서 용출되었다. 또한, 알칼리 포스파타아제 처리에서는 Man6GlcNAc2-PA와 동일한 위치에서 용출된 점(도 7d) 으로부터 피크 C는 도 3의 구조식 IV에 표시되는 산성 당쇄인 것이 밝혀졌다.

이상의 결과로부터, 이 주는 유효한 만노오스-6-인산 부가 산성 당쇄 함유 당단백질의 전구체로서의 만노오스-1-인산 부가 산성 당쇄 함유 당단백질의 생산에 적합하다는 것이 시사되었다.

<참고예 1> 셀룰로모나스 SO-5 유래 효소의 α-만노시다아제 및 불순 효소의 활성 측정법

본 발명자들은 토양 중 세균으로부터 신규 α-만노시다아제를 생성하는 세균을 스크리닝할 때의 만난 분해 활성 측정을 α-만난을 기질로 하여 반응시켜 유리된 당의 환원력을 측정함으로써 행하였다. 즉, α-만난(최종 농도 0.1 ％)과 효소 액을 포함하는 반응액(0.4 M 인산 완충액, pH 7.0) 중에서 37 ℃로 10 분간 반응을 행하고, 반응 후 만노오스를 표준으로 하여 환원당을 넬슨ㆍ소모지(NelsonㆍSomogi)법에 의해 측정하였다(후꾸이 사꾸조, 생물 화학 실험법 시리즈 1, 환원당의 정량법(학회 출판 센타), p.10(1979)).

정제된 각 단계의 조효소 및 부분 정제 효소의 α-만노시다아제 활성의 측정은 4-메틸움벨리페릴(MU)-α-만노피라노시드를 기질로 하여 반응시켜 유리되는 4-MU를 측정함으로써 행하였다. 즉, 0.5 mM 4-MU-α-만노피라노시드와 효소액을 포함하는 반응액 70 ㎕(0.15 M NaCl를 포함하는 20 mM 인산 완충액, pH 7.5) 중에서 37 ℃로 30 분간 반응시킨 후, 0.2 M 글리신 완충액(pH 10.7)을 700 ㎕ 첨가하여 반응을 정지하였다. 그 중 100 ㎕를 취하여, 유리된 4-MU의 형광량을 마이크로 플레이트 판독기(Ex: 385 nm, Em: 450 nm)로 측정하였다. 효소 활성의 단위는 상기 반응에서 1 분간 1 μmole의 4-MU를 유리하는 효소량을 1 유닛(이하, "U"라고 함)이라고 하였다.

공존하는 불순 효소의 측정법은 이하와 같이 행하였다.

엔도-α-만노시다아제 활성의 측정은 α-1,6-만난을 기질로 하여 반응시켜 유리된 당의 환원력을 측정함으로써 행하였다. 즉, α-1,6-만난(최종 농도 0.1 ％)과 효소액을 포함하는 반응액(0.4 M 인산 완충액, pH 7.0) 중에서 37 ℃로 10 분간 반응을 행하고, 반응 후 만노오스를 표준으로 하여 환원당을 넬슨ㆍ소모지 (NelsonㆍSomogi)법에 의해 측정하였다(후꾸이 사꾸조, 생물 화학 실험법 시리즈 1, 환원당의 정량법(학회 출판 센타), p.10(1979)).

β-만노시다아제 활성의 측정은 p-니트로페닐(pNP)-β-D-만노피라노시드를 기질로 하여 반응시켜 유리된 pNP를 측정함으로써 행하였다. 즉, 5 mM pNP-β-D-만노피라노시드와 효소액을 포함하는 반응액 70 ㎕(0.15 M NaCl을 포함하는 20 mM 인산 완충액, pH 7.5) 중에서 37 ℃로 24 시간 반응시킨 후, 0.2 M 글리신 완충액(pH 10.7)을 700 ㎕ 첨가하여 반응을 정지하였다. 그 중 100 ㎕를 취하여 유리된 4-MU의 형광량을 마이크로 플레이트 판독기(Ex:385 nm, Em:450 nm)로 측정하였다. 효소 활성의 단위는 상기 반응에서 1 분간 1 μmole의 4-MU를 유리하는 효소량을 1 유닛(이하, "U"라고 함)이라고 하였다.

<참고예 2> α-만노시다아제 생산균의 스크리닝

만노시다아제를 유도 생산하기 위한 배지(만난 액체 배지)는 이하와 같이 하여 제조하였다. 빵 효모 만난 2 g, 황산암모늄[(NH₄)₂SO₄] 500 mg, 황산제2철[Fe₂SO₄] 20 mg, 황산마그네슘[MgSO₄ㆍ7H₂O] 400 mg, 염화칼슘[CaCl₂ㆍ2H₂O] 60 mg, 효모 엑기스 1 g, 제2인산칼륨[K₂HPO₄] 7.54 g, 제1인산칼륨[KH₂PO ₄] 2.32 g에 물을 첨가하여 1 L로 하였다. 또한, 만노시다아제 생산균을 단리하기 위한 평판 배지는 상기 만난 액체 배지에 한천 분말을 1.5 ％가 되도록 첨가한 것을 사용하였다.

시험관에 들어간 2 ml의 만난 액체 배지에 토양 현탁수로부터 식균이로 식균시켜 30 ℃에서 이틀밤 진탕 배양하였다. 이 배양액을 식균이로 새로운 2 ml의 만난 액체 배지에 옮기고, 다시 30 ℃에서 이틀밤 진탕 배양하였다. 이틀밤의 진탕 배양을 총 3회 행한 후, 하룻밤의 진탕 배양을 2회 행하였다. 배양액을 원심분리하고, 배양 상청액을 10 mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0)에 대하여 투석한 조효소액을 만난 분해 효소 활성 측정에 사용하였다. 활성이 있던 토양 샘플에 대하여 α-만노시다아제 생산균의 스크리닝을 더 진행하였다.

활성이 있던 배양액을 스트리킹(streaking)법, 희석법으로 평판 플레이트에 식균시켜 30 ℃에서 배양하였다. 몇일 후, 나타난 콜로니를 취하여 만난 액체 배지에 식균시켜 30 ℃에서 2 일간 진탕 배양하였다. 배양액을 원심분리하고, 배양 상청액을 10 mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0)에 대하여 투석한 조효소액에 대하여 α-만난과 합성 기질을 사용하여 효소 활성을 측정하였다.

이 조작을 몇회 반복하고, 확실한 단독 콜로니를 취하여 완전한 α-만노시다아제 생산균의 단리를 행하였다. 이 생산균을 SO-5라고 명명하였다. 또한, 이 SO-5주는 일본 이바라끼껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1반지 1주오 다이6 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁 센터에 2001년 6월 12일자로 FERM BP-7628이라는 수탁 번호로 국제 기탁되어 있다.

<참고예 3> 신규한 α-만노시다아제 생산균 SO-5의 동정

리보솜 RNA 유전자의 염기 서열의 상동성은 분자 계통, 분류상 중요하며, 유전자의 카피수, 구성은 종에 따라 상이하다. 따라서, 리보솜 RNA의 염기 서열에 의해 세균의 동정이 가능하다.

SO-5주로부터 위자드 게놈 DNA 정제 키트(Wizard Genomic DNA Purification Kit; 프로메가사 제조)를 사용하여 게놈 DNA를 단리하였다. 이것을 주형 DNA로 하 여 리보솜 RNA 영역을 코딩하는 부분의 염기 서열을 PCR로 증폭하였다. 프라이머는 SPF1 (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG: 서열 5)과 SPR1(GGTTACCTTGTTACGACTT: 서열 6)을 사용하고, 얻어진 약 1.5 kb의 단편을 pGEM-T 벡터(프로메가사 제조)에 클로닝한 후, 디데옥시법에 의해 부분 염기 서열을 결정하였다. 그 결과를 서열 7에 나타내었다.

이 서열을 닛본 DNA 데이타 뱅크의 웹 사이트에서 이용할 수 있는 BLAST 시스템을 이용하여 상동성 검색을 행했더니, 외르스코비아 크산티네올리티카(0erskovia xanthineolytica) 및 셀룰로모나스속과 높은 상동성을 보였다. 외르스코비아(0erskovia)속은 나무가지 모양으로 성장하지만, SO-5주는 보통의 둥근 콜로니를 형성하였다. 이들의 결과로부터 SO-5주는 셀룰로모나스 종(Cellulomonas sp.)인 것이 추정되었다.

<참고예 4> α-만노시다아제의 생산과 부분 정제

α-만노시다아제를 유도 생산하기 위해 실시예 2에서 얻어진 SO-5를 만난 액체 배지에서 30 ℃로 하룻밤 배양하였다. 배양 후, 4 ℃, 15,000×g으로 10 분간 원심분리하여 균체를 제거하였다. 상청액을 2 mM의 염화칼슘을 포함하는 10 mM HEPES -Na 완충액(pH 7.0)으로 투석하여 조효소액으로 하였다.

이어서, 이 조효소액에 최종 농도가 1.2 M이 되도록 황산암모늄을 첨가한 후, 4 ℃에서 하룻밤 혼합하였다. 이것을 원심분리하고, 침전물을 제거한 상청액에 대하여 최종 농도가 1.7 M이 되도록 황산암모늄을 더 첨가한 후, 4 ℃에서 하룻밤 혼합하였다. 이어서, 4 ℃, 15,000×g으로 10 분간 원심분리하여 침전되는 단 백질을 회수하였다. 얻어진 침전물을 H₂O에 용해하여 2 mM의 염화칼슘을 포함하는 10 mM HEPES-Na 완충액(pH 7.0)으로 투석하였다. 이것을 2 mM의 염화칼슘을 포함하는 10 mM HEPES-Na 완충액(pH 7.0)으로 평형화한 HiTrap Q 칼럼에 제공하였다. NaCl의 농도를 1 M까지 증가시키는 구배 용출을 행하여 활성 분획을 얻었다. 이것을 2 mM의 염화칼슘을 포함하는 10 mM HEPES-Na 완충액(pH 7.0)으로 투석하여 부분 정제 표준품으로 하였다.

부분 정제 표준품은 <참고예 1>에 따라 α-만노시다아제 활성, 엔도-α-만노시다아제 활성, β-만노시다아제 활성을 측정하였다. 비활성은 31.9 mU/mg이고, 엔도- α-만노시다아제 활성, β-만노시다아제 활성은 검출되지 않았다.

<참고예 5> 셀룰로모나스속 유래의 α-만노시다아제의 효소학적 성질

측정은 참고예 4에서 얻어진 정제 효소를 사용하여 행하였다.

(a) 적정 pH: 본 효소에 대하여 아세트산나트륨 완충액(pH 4.0 내지 6.5), 인산 완충액(pH 6.0 내지 8.0), 트리스 완충액(pH 7.5 내지 10.0)을 사용하여 37 ℃에서 30 분간 효소 반응을 행하여 적정 pH를 조사했더니 pH 7 내지 8, 특히 7.5 부근이었다.

(b) 적정 온도: 본 효소에 대하여 20 내지 80 ℃의 각 온도에서 인산 완충액 (pH 7.5) 중에서 30 분간 반응시켜 적정 온도를 조사했더니 35 내지 45 ℃, 특히 40 ℃ 부근이었다.

(c) 안정 온도: 본 효소에 대하여 0.1 M 인산 완충액(pH 7.5) 중에서 0 내지 80 ℃의 범위로 30 분간 처리한 후, 37 ℃, 30 분간의 효소 반응에 의해 잔존 활성(상대 활성)을 조사했더니 40 ℃까지 안정하였다.

(d) 금속 이온의 영향: 본 효소에 대하여 무기 이온 및 조해제에 의한 영향을, 반응계에 첨가하여 37 ℃에서 30 분간의 효소 반응에 의해 조사하였다. Ca²⁺에 의해 약간(10 ％) 활성화되었다. 또한, Hg²⁺, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)에 의해 활성이 100 ％ 저해되었지만, Ca²⁺의 첨가에 의해 활성이 회복되었다.

(e) 미켈리스(Michaelis) 상수: 본 효소의 4-MU-α-만노피라노시드에 대한 미켈리스 상수(Km)를 기질 농도의 역수와 반응 속도의 역수를 플롯팅하여 구했더니 Km=0.32 mM^-1이었다. 또한, 고농도의 기질(1 mM 이상)에서는 기질 저해가 보였다.

(f) 고 만노오스형 당쇄에 대한 작용: 아미노 칼럼을 이용한 HPLC에서는 형광 표지된(PA화) 올리고당을 그 쇄 길이에 의해 분리하는 것이 가능하다. 칼럼은 SHODEX AsahiPak NH2P-50(4.6×250 mm, 쇼와 덴꼬 제조)을 사용하고, 용매로서는 200 mM 아세트산-트리에틸아민 완충액(pH 7.0)과 아세토니트릴의 30:70의 혼합액(A액), 200 mM 아세트산-트리에틸아민 완충액(pH 7.0)과 아세토니트릴의 50:50의 혼합액(B액)을 제조하였다. 미리 용매 A를 유속 1.0 ml/분으로 유동시킴으로써 칼럼을 평형화하고, 시료 주입 직후부터 용매 B의 비율을 50 분에 걸쳐 100 ％까지 선형으로 상승시켜 PA화 올리고당을 용출하였다. PA화 당쇄는 형광 검출기(여기 파장: 320 nm, 형광 파장: 400 nm)로 검출하였다. 반응은 당쇄 100 pmol에 대하여 본 발명 효소 분획 20 μU를 첨가하고, 0.1 M 인산칼륨 완충액(pH 7.0) 중에서 37 ℃로 10 분 내지 2 시간 반응시켰다. 하기 구조식의 Man8GlcNAc2-PA(M8)

를 기질로 했을 경우, Man5GlcNAc2-PA(M5)까지 비교적 빠르게 분해된 후, Man4GlcNAc2-PA(M4)가 서서히 생성되며, Man2GlcNAc2-PA(M2)도 약간이지만 생성되었다. 2 시간 반응 후에는 Man4GlcNAc2-PA 외에 Man3GlcNAc2-PA(M3), Man2GlcNAc2-PA(M2), ManlGlcNAc2-PA(M1)의 3개의 피크가 보였다. 이러한 점으로부터 본 효소는 α-1,2-만노시드 결합, α-1,3-만노시드 결합, α-1,6-만노시드 결합에 상관없이 비환원 말단으로부터 비특이적으로 α-만노시드 결합에 작용하는 것을 알았다. 또한, 이 결과로부터 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제 활성은 공존하지 않는 것이 예상되었다.

(g) β-만노시드 결합을 갖는 당쇄에 대한 작용: p-니트로페닐-β-D-만노시드를 기질로 했을 때 활성이 보이지 않았기 때문에, β-만노시드에는 작용하지 않는 것이 밝혀졌다.

(h) 효모 인산 함유 산성 당쇄에 대한 작용: 효모가 생산하는 당쇄 중에는 만노오스인산을 함유하는 당쇄가 알려져 있다(Kukuruzinska et al, Ann. Rev. Biochem., 56, 915-944(1987)). 하기 구조식

에 나타낸 구조를 갖는 당쇄에 대한 작용을 조사하였다. 또한, 분석에는 SuperQ5PW(도소 제조)를 사용하고, 용매로서는 2 mM 아세트산나트륨 완충액(pH 5.0)(A액), 0.25 M 아세트산나트륨 완충액(pH 5.0)(B 액)을 제조하였다. 미리 용매 A를 유속 1.0 ml/분으로 유동시킴으로써 칼럼을 평형화하고, 시료 주입 직후부터 용매 B의 비율을 30 분에 걸쳐 100 ％까지 선형으로 상승시켜 PA화 올리고당을 용출하였다. 반응은 당쇄 100 pmol에 대하여 본 효소 분획 20 μU를 첨가하고, 0.1 M 인산칼륨 완충액(pH 7.0) 중에서 37 ℃로 하룻밤 반응시켰다. 인산에 결합된 만노오스가 절단된 당쇄는 인산의 음전하가 증가되기 때문에 느린 유지 시간에 용출된다. 대조군(효소없음)의 당쇄가 10 분 부근에서 용출된 데 반하여, 본 효소를 작용시킨 것은 12 분이 지나 새로운 피크가 보였다. 이 용출 위치는 <구조식 6>의 당쇄를 화학적으로 처리하고, 인산에 결합된 만노오스를 제거한 당쇄의 용출 위치와 일치하는 점으로부터, 본 효소는 포스포디에스테르 결합의 α-만노오스도 절단할 수 있다는 것이 밝혀졌다.

<참고예 6> 당단백질에 대한 작용

리보뉴클레아제 B(RNase B)는 고 만노오스형 당쇄를 갖는 당단백질로서 알려져 있다. 리보뉴클레아제 B 20 ㎍에 대하여 <참고예 2>에서 얻어진 α-만노시다아제 분획을 100 μU 첨가하고, 0.1 M 인산칼륨 완충액(pH 7.0)의 존재하에서 37 ℃로 14 시간 반응시켰다. 또한, 대조군으로서 α-만노시다아제 분획 대신에 완충액만을 등량 첨가하였다. 각각을 SDS-PAGE로 분석했더니, 대조군에 대하여 α-만노시다아제 분획을 첨가한 것에서는 겉보기 분자량이 감소되어 있었다. 이 분자량은 펩티드 부분의 서열이 동일하고, 당쇄만이 결손된 리보뉴클레아제 A(RNase A)의 그것과 근사하였다. 이들 리보뉴클레아제 활성을 측정했더니, 반응 전과 비교하여 활성의 감소는 거의 보이지 않았다. 따라서, 이러한 점으로부터 본 효소 분획을 첨가한 것에서는 고 만노오스형 당쇄의 α-만노시드 결합 부분만이 절단되고, 당쇄의 근원 부분에 해당하는 Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc가 잔존하기는 하지만, 단백질 부분에는 영향을 주지 않는 것이 시사되었다.

<실시예 4> 각종 α-만노시다아제에 의한 분해 실험

실시예 3에서 얻어진 α-갈락토시다아제를 각종 α-만노시다아제로 처리하고, 당단백질에 α-만노시다아제가 작용하여 당쇄 중의 만노오스-1-인산 결합이 분해될 수 있는가를 검토하였다.

실시예 3에서 정제한 α-갈락토시다아제 1 mg에 대하여 작두콩 α-만노시다아제(세이가가꾸 고교사 제조) 2 mU를 포함하는 아세트산나트륨 완충액(pH 4.5)을 첨가하여 37 ℃에서 하룻밤 반응시켰다. 이 α-갈락토시다아제의 웨스턴 블롯 분석을 행했더니, α-만노시다아제 미처리된 것과 이동도가 바뀌지 않았다. 또한, 당쇄 구조 분석의 결과에서도 당쇄 중의 만노오스-1-인산 결합은 절단되지 않았다. 따라서, 이 조건에서는 당쇄 중의 만노오스-1-인산 결합은 절단되지 않는다고 여겨졌다.

이러한 점으로부터 새로운 만노시다아제의 스크리닝이 필요하다고 여겨졌다. 따라서, 상기 셀룰로모나스 SO-5주 유래의α-만노시다아제를 사용하여 만노오스-1-인산 결합의 절단을 시도하였다.

실시예 3에서 정제한 α-갈락토시다아제 1 mg에 대하여 상기 셀룰로모나스 SO-5주 유래의 α-만노시다아제 90 μU를 포함하는 생리 식염수 완충액(PBS; pH 7.5)을 첨가하여 37 ℃에서 하룻밤 반응시켰다. 이 α-갈락토시다아제의 웨스턴 블롯 분석을 행했더니 α-만노시다아제 미처리된 것과 비교하여 이동도가 증가하였다(도 8). 이 α-갈락토시다아제의 당쇄 구조 분석을 실시예 3에 따라 행했더니, 당쇄 중의 만노오스-1-인산 결합은 절단되어 있고, 인산이 노출되었을 때와 동일한 용출 위치에서 보여졌다(도 9).

또한, 알칼리 포스파타아제 처리를 행했더니 Man6GlcNAc2-PA와 동일한 위치에서 용출되었기 때문에, α-만노시다아제로 처리된 당쇄는 (PO4)2Man6GlcNAc2-PA와 PO4-Man4GlcNAc2-PA의 구조를 갖는 것을 알았다.

<실시예 5> 고인산화 당쇄 함유 α-갈락토시다아제의 대량 제조

고인산화 당쇄 함유 α-갈락토시다아제의 대량 제조를 행하였다. 실시예 3에서 정제한 α-갈락토시다아제 300 ㎍에 대하여 상기 셀룰로모나스 SO-5주 유래 α-만노시다아제 30 mU를 포함하는 인산 완충액(pH 7.5)을 첨가하여 37 ℃에서 6 시간 반응시킨 후, 30 mU의 α-만노시다아제를 더 첨가하여 12 시간 반응시켰다. 반응 후에 MonoQ 칼럼을 사용하여 정제하였다. α-갈락토시다아제 활성은 15 내지 18번째의 분획에서, α-만노시다아제 활성은 26 내지 29번째의 분획에서 회수되었다.

<실시예 6> 파브리병 환자로부터 얻어진 배양 피부 섬유아세포를 이용한 정제 α-갈락토시다아제로의 삽입 실험

파브리병 환자 유래의 배양 피부 섬유아세포(F377, F87)를 10 ％가 되도록 FCS를 첨가한 Ham's F10 배지에서 직경 3.5 cm의 패트리 접시 중에 5 ％ C0₂하에서 37 ℃로 배양하였다. 이어서, 실시예 5에서 만노시다아제 처리를 행하거나, 또는 미처리된 α-갈락토시다아제를 최종 농도 0.1 ㎍/ml 또는 1 ㎍/ml로 배양액 중에 첨가하고, 18 시간 후에 세포를 채취하여 세포 추출액 중의 α-갈락토시다아제 활성을 측정하였다. 또한, 대조군으로서 정상인 유래의 배양 피부 섬유아세포(F592)의 세포내 활성도 측정하였다. 또한, 만노오스-6-인산 수용체에 의존적인 삽입인 것을 확인하기 위해 상기한 계에 다시 최종 농도가 5 mM가 되도록 만노오스-6-인산을 배양액 중에 첨가하여 저해 실험을 행하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.

최종 농도 1 ㎍/ml로 α-갈락토시다아제를 첨가한 경우, 만노시다아제 미처리된 효소에 대하여 처리 후의 효소의 투여에 의해 파브리병 환자 유래 세포 내의 α-갈락토시다아제 활성은 약 3 배의 증가를 보였다. 또한, 이 효소 활성의 증가는 만노오스-6-인산에 의해 저해를 받기 때문에 만노시다아제 처리 후의 α-갈락토 시다아제는 만노오스-6-인산 수용체에 의존적으로 세포에 삽입되는 것을 알았다. 즉, 만노시다아제 처리 후의α-갈락토시다아제는 인간과 동일한 만노오스-6-인산 함유 당쇄 구조를 갖는 것을 시사하는 것이다.

이어서, 눈크사 제조의 8웰 챔버 슬라이드를 사용하여 1 챔버당 5×10³ cells의 파브리병 환자 유래의 배양 피부 섬유아세포(F377)를 뿌려 24 시간 배양한 후, α-갈락토시다아제를 1 ㎍/ml가 되도록 첨가하였다. 또한, 대조군으로서 정상인 유래의 배양 피부 섬유아세포(F592)에 대해서도 동일하게 행하였다. 18 시간 또는 5일 배양한 후, 축적물인 글로보트리아오실세라미드(CTH)에 대한 항체를 1차 항체로 하여 면역 형광 염색을 행하였다(도 11).

파브리병 환자 유래의 배양 피부 섬유아세포의 배양액 중에 α-갈락토시다아제를 첨가하고, 세포 내에 축적되어 있는 CTH에 대한 효과를 면역 염색법으로 분석하였다(도 11의 우측-효소(+)). CTH의 검출에 대해서는 1차 항체로서 항 CTH 항체로 처리하고, 이어서 FITC-항 마우스 IgG 항체를 2차 항체로서 사용하여 염색하여 녹색으로 가시화하였다. 세포 내의 α-갈락토시다아제에 대해서는 1차 항체로서 항 α-갈락토시다아제 항체로 처리한 후, 2차 항체로서 Cy3-항 토끼 IgG 항체로 염색하여 적색으로 가시화하였다. 두가지가 혼재하는 영역은 황색으로 표현되었다. 비교를 위해 정상인 유래의 배양 피부 섬유아세포를 α-갈락토시다아제로 미처리한, 파브리병 환자 유래의 배양 피부 섬유아세포의 염색성을 도면 좌측에 나타내었다(효소(-)).

그 결과, 만노시다아제 처리 후의 α-갈락토시다아제를 첨가한 경우, 5 일만에 항 CTH 항체에 의한 염색성이 명확하게 감소되었다. 또한, α-갈락토시다아제는 투여 후 18 시간만에 세포 내에 삽입되고, 5 일 후에도 여전히 염색되었기 때문에 매우 안정하다고 여겨졌다. 축적된 CTH가 분해되었기 때문에, 본 발명에서 제조한 α-갈락토시다아제가 리소좀병 치료약으로서 유효한 것이 시사되었다.

본 발명에 의한 효모를 사용하는 유전자 공학적 방법에 의해, 인간 등 포유류 세포의 리소좀으로 수송되기 위한 표지 마커로서 기능할 수 있는 인산 함유 산성 당쇄를 갖는 당단백질을 고순도로 다량 제조할 수 있다. 본 발명에서의 인산 함유 산성 당쇄를 갖는 당단백질은 인간의 리소좀 효소의 결손증 치료 등에 유효한 약제로서 이용할 수 있다.

본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로 하여 본 명세서에 삽입된 것으로 간주한다.

<110> National Institute of Advanced Industrial Science and Technology 　　　Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research <120> Pharmaceutical composition and method for producing the same <130> PH-1592-PCT <160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer A for amplifying 3' reg ion of MNN1 gene <400> 1 ggatccgaag aaaacctaat acattgaagt　　　　　　　　　　　　　　　　　30　　 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer B for amplifying 3' reg ion of MNN1 gene <400> 2 gcatgccctt tggtttaata taaatctccg gagtgc　　　　　　　　　　　　　 36　　 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer C for amplifying 5' reg ion of MNN1 gene <400> 3 gcatgctaca taactccaat cagcagcaaa tatgtc　　　　　　　　　　　　　 36　　 <210> 4 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer D for amplifying 5' reg ion of MNN1 gene <400> 4 gcggccgcgt gttctgttcg ggtaacgttt aaaccaat　　　　　　　　　　　　 38　　 <210> 5 <211> 1306 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (17)(1306) <400> 5 tccggtcacc gtgacaatgc agctgaggaa cccagaacta catctgggct gcgcgcttgc 60　　 gcttcgcttc ctggccctcg tttcctggga catccctggg gctagagcac tggacaatgg 120　 attggcaagg acgcctacca tgggctggct gcactgggag cgcttcatgt gcaaccttga 180　 ctgccaggaa gagccagatt cctgcatcag tgagaagctc ttcatggaga tggcagagct 240　 catggtctca gaaggctgga aggatgcagg ttatgagtac ctctgcattg atgactgttg 300　 gatggctccc caaagagatt cagaaggcag acttcaggca gaccctcagc gctttcctca 360　 tgggattcgc cagctagcta attatgttca cagcaaagga ctgaagctag ggatttatgc 420　 agatgttgga aataaaacct gcgcaggctt ccctgggagt tttggatact acgacattga 480　 tgcccagacc tttgctgact ggggagtaga tctgctaaaa tttgatggtt gttactgtga 540　 cagtttggaa aatttggcag atggttataa gcacatgtcc ttggccctga ataggactgg 600　 cagaagcatt gtgtactcct gtgagtggcc tctttatatg tggccctttc aaaagcccaa 660　 ttatacagaa atccgacagt actgcaatca ctggcgaaat tttgctgaca ttgatgattc 720　 ctggaaaagt ataaagagta tcttggactg gacatctttt aaccaggaga gaattgttga 780　 tgttgctgga ccagggggtt ggaatgaccc agatatgtta gtgattggca actttggcct 840　 cagctggaat cagcaagtaa ctcagatggc cctctgggct atcatggctg ctcctttatt 900　 catgtctaat gacctccgac acatcagccc tcaagccaaa gctctccttc aggataagga 960　 cgtaattgcc atcaatcagg accccttggg caagcaaggg taccagctta gacagggaga 1020　 caactttgaa gtgtgggaac gacctctctc aggcttagcc tgggctgtag ctatgataaa 1080　 ccggcaggag attggtggac ctcgctctta taccatcgca gttgcttccc tgggtaaagg 1140　 agtggcctgt aatcctgcct gcttcatcac acagctcctc cctgtgaaaa ggaagctagg 1200　 gttctatgaa tggacttcaa ggttaagaag tcacataaat cccacaggca ctgttttgct 1260　 tcagctagaa aatacaatgc agatgtcatt aaaagactta ctttaa　　　　　　　　1306　 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer SPF1 <400> 6 agagtttgat cctggctcag　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 20　　 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer SPR1 <400> 7 ggttaccttg ttacgactt　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　19　　 <210> 8 <211> 619 <212> DNA <213> Cellulomonas sp. <400> 8 ggatgaaggc cttcgggttg taaacctctt tcagcaggga agaagcgcaa gtgacggtac 60　　 ctgcagaaga agcgccggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt agggcgcaac 120　 gttgtccgga attattgggc gtaaagagct cgtaggcggt ttgtcgcgtc tggtgtgaaa 180　 actcgaggct caacctcgag cttgcatcgg gtacgggcag actagagtgc ggtaggggag 240　 actggaattc ctggtgtagc ggtggaatgc gcagatatca ggaggaacac cgatggcgaa 300　 ggcaggtctc tgggccgcaa ctgacgctga ggagcgaaag catggggagc gaacaggatt 360　 agataccctg gtagtccatg ccgtaaacgt tgggcactag gtgtggggct cattccacga 420　 gttccgtgcc gcagcaaacg cattaagtgc cccgcctggg gagtacggcc gcaaggctaa 480　 aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggcggag catgcggatt aattcgatgc 540　 aacgcgaaga accttaccaa ggcttgacat gcacgggaag ccaccagaga tggtggtctc 600　 tttggacact cgtgcacag　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　619　

Claims (27)

1. 효모에 도입한 당단백질을 코딩하는 유전자로부터 발현된 당단백질을 셀룰로모나스(Cellulomonas)속 세균 유래의 α-만노시다아제로 처리하여 상기 당단백질의 당쇄 중의 만노오스-1-인산 결합으로부터 만노오스 잔기를 제거하는 것을 포함하고, 상기 효모가 α-1,6-만노실 트랜스퍼라아제 유전자 및 α-1,3-만노실 트랜스퍼라아제 유전자가 파괴된 효모인, 만노오스-6-인산을 비환원 말단에 함유하는 산성 당쇄를 갖는 당단백질을 제조하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 만노오스-6-인산을 비환원 말단에 함유하는 산성 당쇄를 갖는 당단백질이, 만노오스-6-인산 수용체에의 결합 활성을 갖는 방법.
3. 제1항에 있어서, 만노오스-6-인산을 비환원 말단에 함유하는 산성 당쇄를 갖는 당단백질이, 하기 구조식 I 내지 VII로 표시되는, 만노오스-6-인산을 비환원 말단에 함유하는 고 만노오스형 당쇄 중 하나 이상을 갖는 당단백질인 방법.

   
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6. 제1항에 있어서, α-1,6-만노실 트랜스퍼라아제 유전자가 에스. 세레비지애(S. cerevisiae)의 OCH1 유전자이고, α-1,3-만노실 트랜스퍼라아제 유전자가 에스. 세레비지애의 MNN1 유전자인 방법.
7. 제1항에 있어서, 효모가 고인산화 당쇄 함유 변이주인 방법.
8. 제1항에 있어서, 효모가 에스. 세레비지애 HPY21주인 방법.
9. 제1항에 있어서, 당단백질이 리소좀 효소인 방법.
10. 제9항에 있어서, 리소좀 효소가 α-갈락토시다아제인 방법.
11. 제9항에 있어서, 리소좀 효소가 인간 리소좀 효소인 방법.
12. 제1항에 있어서, 당단백질을 코딩하는 유전자가 서열 5로 표시되는 염기 서열을 갖는 인간 α-갈락토시다아제 유전자인 방법.
13. 제1항에 있어서, 효모가 MNN4 유전자 및/또는 MNN6 유전자의 발현이 증강된 에스. 세레비지애주인 방법.
14. 삭제
15. 제1항에 있어서, 셀룰로모나스속 세균 유래의 α-만노시다아제가 당쇄 중의 만노오스-1-인산 결합으로부터 만노오스 잔기를 제거하는 활성을 갖는 것인 방법.
16. 제1항에 있어서, 셀룰로모나스속 세균 유래의 α-만노시다아제가 당쇄 중의 α-1,2-만노시드 결합, α-1,3-만노시드 결합 및 α-1,6-만노시드 결합을 비특이적으로 분해하는 활성을 갖는 것인 방법.
17. 제1항에 있어서, 셀룰로모나스속 세균 유래의 α-만노시다아제가 엑소형 활성을 갖지만, 엔도형 활성은 갖지 않는 것인 방법.
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19. 제1항에 있어서, 셀룰로모나스속 세균이 셀룰로모나스 SO-5주(수탁번호 FERM BP-7628)인 방법.
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