MXPA02001723A - Clasificacion para actividad de udp-glucosa: glucosiltransferasa de glicoproteina (uggt). - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a un metodo para determinar el efecto de una muestra de prueba sobre la actividad de UGGT. El metodo comprende los pasos de: a) exponer un aceptor-sustrato de UGGT, tal como fosfatasa de acido a un donador marcado tal como UDP-3H-glucosa en presencia de la muestra de prueba y UGGT; y b) detectar la cantidad de absorcion de donador que fue transferida al aceptor-sustrato, en donde una disminucion de la absorcion de donador cuando se comparo con un control significa que la muestra de prueba es un estimulante de UGGT y una reduccion o disminucion significa que la muestra de prueba es un inhibidor de UGGT. La presente invencion tambien revela un ADNc aislado de mamifero que codifica la UGGT de rata y a metodos para producir UGGT de mamifero utilizando vectores recombinantes.

Description

CLASIFICACIÓN PARA ACTIVIDAD DE UDP-GLUCOSA: GLUCOSILTRANSFERASA DE GLICOPROTE1NA (UGGT) ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN (a) Campo de la Invención La presente invención se refiere a métodos para detectar el efecto de muestras de prueba sobre la actividad de UDP-glucosa: glucosiltransferasa de glicoproteína (UGGT). La presente invención también se refiere al ácido nucleico que codifica para UGGT de mamífero y para UGGT de mamífero recombinante. (b) Descripción de la Técnica Anterior El sistema de control de calidad del retículo endoplásmico (ER) asegura que solamente las proteínas dobladas prosiguen además a lo largo de la trayectoria de secreción. Algunas de las proteínas del retículo endoplásmico abundantes son componentes de sistemas chaperones moleculares, los cuales se unen a proteínas no dobladas, reteniéndolas en el retículo endoplásmico. Las enzimas de doblez también son abundantes en el retículo endoplásmico y comprenden varias isomerasas del disulfuro e isomerasas de prolil peptidilo. Es desconocido como los chaperones y enzimas de doblez interactúan para facilitar el doblamiento de proteína el retículo endoplásmico. La calnexina y la calreticulina participan en un sistema chaperón molecular, el cual integra los procesos de N-glicosilación y calidad de control. Ambas son lectinas que unen N-glicanos de la forma GlcNAc2Man9Glc1 la cual resulta de la remoción de las dos otras glucosas de oligosacáridos GlcNAc2Man9Glc3 a través de la 5 acción secuencial de las glucosidasas I y II. La remoción de la glucosa a través de glucosidasa II evita la unión a través de calnexina y calreticulina. Después, si la glicoproteína no esta doblada, se agrega un residuo de glucosa al núcleo de alto contenido de mañosa a través de la enzima UDP-glucosa: 10 glucosiltransferasa de glicoproteína (UGGT) la cual reconoce proteínas no dobladas. Consecuentemente, durante el doblamiento las glicoproteínas experimentan ciclos de unión y se liberan d© calnexina y calreticulina, las cuales son accionadas a través de la adición y remoción de un residuo de glucosa. Como resultado del 15 carácter específico de UGGT, solamente las glicoproteinas no unidas se unen a calnexina y calreticulina in vivo, aunque estas lectinas no reconocen la conformación de sus sustratos de proteína. Las glicoproteínas monoglucosiladas, además de unirse a calnexina y calreticulina, también pueden ser entrelazadas a la 20 proteína del retículo endoplásmico ERp57 (también conocida como ER-60, EPp60, ERp61, GRP58, P58, HIP-70 o Q-2). ERp57 es homologa a la proteína de isomerasa de disulfuro (PDI) y se ha mostrado que exhibe actividad, in vitro, de tiol-d isulf uro óxido reductasa. 25 La UDP-glucosa: glucosiltransferasa de glicoproteína (UGGT) '***'**t*****?****«Í*. ¡aáMáíja- es una enzima soluble del retículo endoplásmico (ER) que cataliza la adición de un residuo de glucosa sobre los oligosacáridos enlazados a asparagina de la forma [GlcNAc]2-(Man)7-9 los cuales están presentes en glicoproteínas incorrectamente dobladas (Parodi, A.J. et al. (1984) J. Biol. Chem. 259: 6351-6357; Trombetta, S.E et al. (1989) Biochemistry 28:8108-8116; Sousa, M.C. et al, (1992) Biochemistry 31: 97-105). La UGGT ahora se cree que es responsable de la unión prolongada de glicoproteínas no dobladas a las lectinas del retículo endoplásmico, calnexina y calreticulina (Ou, W, J. et al. (1993) Nature 364:771-776; Peterson, J. R. et al. (1995) Mol. Biol. Cell 6:1173-1184), y, por lo tanto es un componente clave del sistema de control de calidad del retículo endoplásmico, el cual asegura que solamente se exportan proteínas correctamente dobladas y ensambladas. Los glicanos N-enlazados son sintetizados como una unidad anclada a dolicol de 14 residuos [GIcNAc] 2-(Man) 9-(Glc) 3 (Herscovics, A. et al. (1993) FASEB; J. 7:540-550). Después de la transferencia del oligosacárido a una proteína en el retículo endoplásmico, la glucosa terminal es removida a través de glucosidasa I (Bause, E. et al. (1986) FEBS Letters 206:208-212). Después, la glucosidasa II sucesivamente remueve los dos residuos de glucosa restantes (Hubbard, S. C:. et al. (1981) Annu, Rev. Biochem. 50:555-584) dejando el oligosacárido de núcleo [GlcNAc]2-(Man)9. Si la glicoproteína no está correctamente doblada, la glucosa más interna es agregada a través de UGGT, lo cual puede discriminar entre sustratos doblados y no doblados (Trombetta, S.E. et al. (1989) Biochemistry 28:8108-8116, Sousa, M. et al. (1995) EMBO J. 14:4196-4203). El carácter específico conocido de UGGT para proteínas no dobladas y la abrogación in vivo de la unión a 5 calnexina a través de inhibidores de las dos glucosidasas condujo a la formulación de un modelo, por lo que solamente las glicoproteínas monoglucosiladas se unen a calnexina o calreticulina (Hammond, C. et al (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:913-917; Helenius, A. et al. (1997) Trends Cell biol. 7:193-200). Las 10 glicoproteínas no dobladas se cree que experimentan ciclos de unión a y liberación de calnexina y calreticulina. La glucosidasa II no reconoce la conformación del polipéptido, pero remueve indiscriminadamente la glucosa que está presente (Rodan, A. R. et al. (1996) EMBO J. 15:6921-6930). Si la glicoproteína es doblada, 15 esta no es reglucosilada a través de UGGT y se escapa del ciclo. Si la glicoproteína sigue aún no doblada, esta es reglucosilada y permanece atrapada en el ciclo (Hébert, D.N. et al. (1995) Ceíl 81:425-433). El ensamble de UGGT, glucosilada II, calnexina y calreticulina se puede considerar como un sistema chaperoh 20 molecular ya que su interacción recíproca da como resultado ia unión y liberación de proteínas no dobladas. La unión de glicoproteínas no dobladas a calnexina y calreticulina se basa en el carácter específico de UGGT para sustratos no doblados, ya que se mostró que ambas lectinas no reconocen la conformación de sus 25 sustratos (Rodan, A. R. et al (1996) EMBO J. 15:6921-6930; Zapun, »« «üre-v* A. et al (1997) Cell 88:29-38). La UGGT ha sido purificada previamente a homogeneidad a partir de hígado de rata y ha mostrado tener un peso molecular aparente de aproximadamente 150 kDa en geles desde 5 desnaturalización y de 270 kDa en condiciones nativas (Trombetta, S.E. y Parodi, A.J. (1992) J. Biol. Chem. 267:9236-9240). Esta enzima cataliza la transferencia del residuo de glucosa a partir de UDP-glucosa en el residuo de mañosa distante de la ramificación más larga del oligosacárido de núcleo en un enlace a-1, 3 10 (Trombetta, S.E. et al. (1989) Biochemistry 28:8108-8116). Se encontró que [GlcNAc]2-(Man)9 es un mejor aceptor para la transferencia de glucosa que [GlcNAc]2-(Man)8 el cual a su vez es mejor que [GlcNAc]2-(Man)7 (Sousa, M.C. et al. (1992) biochemistry 31: 97-105). Los oligosacáridos con un contenido más bajo de 15 mañosa no son sustratos de UGGT. De manera importante, la reacción de glucosilación es mucho más eficiente si el sustrato de glicoproteína no está doblado. El efecto de desnaturalización no es exponer los oligosacáridos, sino que hacerlos determinante de proteína requeridos para actividad enzimática para que sean 20 accesibles a UGGT (Sousa, M.C. et al. (1992) biochemistry 31; 97- 105). La enzima también mostró tener algo de actividad para péptidos hidrofóbicos (Sousa, M. et al. (1995) EMBO J. 14:4196- 4023) y se sabe que las proteínas no dobladas exponen residuos hidrofóbicos que normalmente están enterrados en la conformación 25 doblada. Las glicoproteínas no dobladas tratadas con endo-ß-N- v* t acetilgluaosaminidasa H (EndoH) se encontraron como inhibidores competitivos de la reacción, mientras que las proteínas no glicosiladas desnaturalizadas no lo son. Este hallazgo indicó que el residuo N-acetilglucosamina más interno, el cual permanece unido al polipéptido desnaturalizado después del tratamiento con EndoH, presumiblemente es requerido para el reconocimiento de sustrato (Sousa, M.C. et al. (1992) Biochemistry 31: 97-105). El ADNc que codifica UGGT de Drosophila melanogaster ha sido clonado (Parker, C.G. et al (1995) EMBO J, 14:1294*1303; 10 Accession #U20554) así como a partir de GPT1 de Schizosaccharomyces pombe, de levadura de fisión (Fernández, F. et al. (1996) EMBO J. 15:705-713; Accession #U38417). La secuencia del gen que codifica UGGT a partir de Ceanorabditis elegans también está disponible como un resultado del proyecto de 15 secuenciaci?n de genoma de este organismo (Wilson, R. et al. (1994) Nature 368:32-38; Acceso #U28735). Estos genes todos codifican proteínas de aproximadamente 1500 aminoácidos con una secuencia de señal N-terminal y una seña de retención C-terminal, según esperado para las proteínas luminales del retículo 20 endoplásmico. El gen para UGGT no es esencial en S. pombe y ningún fenotipo aparente puede ser observado después de su separación (Fernández, F. et al. (1996) EMBO J. 15:705-713). Una de las principales dificultades en el estudio de UGGT es la escasez de sustratos apropiados para estudios detallados in vitro. 25 Los oligosacáridos con un alto contenido de mañosa son especies pasajeras en la célula ya que además son modificados a lo largo de la trayectoria de secreción siguiendo su salida desde el retículo endoplásmico. La mayoría de las glicoproteínas secretadas no contienen los glicanos aceptores [GlcNAc]2-(Man)7-9 y cuando los tienen, los oligosacáridos apropiados constituyen solamente una pequeña fracción del total, como es el caso para ribonucleasa B pancreática de bovino (RNase B) (Rudd, P.M. et al. 8194) Biochemistry 33:17-22; Zapun, A. et al. (1997) Cell 88:29-38). Ya que las trayectorias de biosíntesis de oligosacárido en Saccharomyces cerevisiae están bien caracterizadas, este organismo proporciona un medio para producir varias formas de glicanos a través de ingeniería genética. En levadura, la transferencia de ohgosacáridos N-enlazados sobre proteínas es análoga a aquella en mamíferos. Sin embargo, después de la separación de glucosa, el oligosacárido de núcleo [GlcNAc]2-(Man)9 restante es modificado en forma diferente (Herscovics, A. et al. (1993) FASES J. 7:540-550). Uno de los residuos de mañosa terminales es removido a través de la acción de una alfa-manosidasa del retículo endotelial, producto del gen NNS1 (Jelinek-Kelly, S. et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:14757-14763). Las unidades de mañosa terminal restante son los aceptores para la adición de otros residuos de mañosa a través de una a-1, 3-manosiltransferasa codificada por el gen MNN1 (Graham, T.R. et al. (1992) Yeasf 8:S458). Finalmente, uno de los residuos de GIcNAc también es el sitio de unión de un residuo de mañosa adicional a través de una a-1 ,6-manosiltransferasa codificada por el gen OCH1 (Nakayama, K. Et al. (1992) EMBO J. 11:2511-2519). Una cadena de polisacárido larga después es construida sobre este residuo de mañosa adicional para producir las proteínas de levadura típicamente hiperglicosiladas. Se espera que una cepa de levadura que tenga tres de estos genes separados produzca glicoproteínas que tengan solamente los oligosacáridos [GlcNAc]2-(Man)9.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN 10 Es un objeto de la presente invención proporcionar un método para determina la actividad de UGGT. También un objeto de la presente invención proporcionar un ácido nucleico aislado comprendiendo una secuencia de nucleótido 15 que codifica para una UGGT de mamífero. También es un objeto de la presente invención proporcionar una UGGT mamífero recombinante. De acuerdo con la presente invención se proporciona un método para determinar el efecto de una muestra de prueba sobre el 20 actividad de UGGT el cual comprende los pasos de: a) exponer un sustrato de UGGT a un donador marcado en presencia de la muestra de prueba y de UGGT; y b) detectar la cantidad del donador marcado que fue transferida al sustrato de UGG, en donde un incremento de la 25 absorción del donador cuando se compara con un medio de control que la muestra de prueba es un estimulante de UGGT y un medio de reducción que la muestra de prueba es un inhibidor de UGGT. De acuerdo con la presente invención, se proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótido o un análogo de la misma siempre que la secuencia de nucleótido o un análogo del mismo codifique para UGGT de mamífero.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 representa un análisis de tinción Western de extractos de célula totales (C) y un medio de sobrenadante (S) tomado en el Día 0 y el Día 3 de células del insecto Sf9 infectadas con un recombinante conteniendo RUGT, La tinción se sondeó con un antisuero de conejo desarrollado contra un 15mer péptido que corresponde al término C de RUGT. (M) estándares de peso molecular. La Figura 2 representa cromatogramas para la purificación de RUGT y un perfil de elución de fosfatasa de ácido de levadura (A) de RUGT a partir de la columna de superflujo NÍ + + -NTA. El medio de cultivo de célula de insecto se concentró, se intercambió con regulador de pH y se cargo sobre la columna en el regulador de pH conteniendo 10 mM de imidazol. Las proteínas fueron eluídas utilizando 200 mM de imidazol y 40mM de Tris-HCl, ph 7.5, 500 mm de NaCI, 5 mM de CaCI2. (B) Perfil de elución de RUGT a partir de la columna POROS 20HQ. Las fracciones de RUGT de la columna t *S*ffgf?®l*>3s* '•*:*&*¿.L-*i$.*? * t*e? f« 10 NÍ + + -NTA fueron combinadas, diluidas 10 veces y cargadas sobre POROS 20HQ. Se eluyó RUGT utilizando un gradiente de NaCI de 0- 600 mM sobre 30 volúmenes de columna. La cabeza de flecha índica el pico de RUGT. (C) Elución de fosfatasa de ácido de levadura a 5 partir de la columna POROS 20HQ. El medio de cultivo de levadura fue concentrado, intercambiado con regular de pH y cargado sobre POROS 20HQ. La enzima se eluyó a 30 volúmenes de columna utilizando un gradiente de NaCI de 0-200 mm. La cabeza de flecha indica el pico de la actividad de fosfatasa de ácido máxima). 10 La Figura 3 representa una SDS-PAGE teñida con azul de Coomassie mostrando muestras de RUGT (1) crudo y purificado, extracto de célula total (2) medio de cultivo de sobrenadante (3) medio de cultivo concentrado/dialfiltrado; carga de columna y (4) flujo a través de fracción a partir de la columna NÍ + + -NTA, (5) RUGT 15 purificado con NÍ + + -NTA, (6) RUGT purificado con POROS 20HQ, (M) estándares de peso molecular. La Figura 4 representa una comparación de fosfatasa de ácido producida en varias cepas de levadura desarrolladas en un medio YPD (Y) o un medio SD-pi (S), sobrenadantes crudos de 20 cultivos W303-1A, YNS-7A y DT111 fueron concentrados en Centriprep-30 (Amicon) y liofilizados. El total de proteínas (10 µg) de cada cultivo fue glicosilado con RUGT y cargado sobre SDS- PAGE para tinción con azul de Coomassie, fluorografía o TCA precipitado para cuantificar la incorporación de 3H-glucosa. Los 25 números por abajo del autoradiograma indican en porcentaje de tí incorporación de 3H-glucosa en cada una de las muestras de proteína con relación a la muestra que proporcionó una incorporación máxima (100%). La Figura 5 representa la incorporación de 3H-glucosa en varios aceptores-sustratos de glicoproteína. Se glicosilarón a través de RUGT fosfatasa de ácido nativa (n) y desnaturalizada (d) (AcP), RNasa B, aglutinina de soja (SBA) y tiroglobulina (Tg), 1 µg de cada uno. Nota: AcP nativo es totalmente desnaturalizado a un pH de 7.5.

La Figura 6 representa el análisis electroforético de fosfatasa de ácido glucosilada con RUGT de tipo silvestre y mutante. (Aproximadamente el 1 µg de fosfatasa de ácido fue glucosilada sin nada de RUGT (-), 0.25 µg (1) o 0.5 µg (2) de RUGT de tipo silvestre (WT) o mutante, Los números abajo del autoradiograma indican el porcentaje de incorporación de 3H-glucosa para cada mutante con relación a RUGT de tipo silvestre. La Figura 7 representa la determinación de Km de UDP-glucosa (A) y fosfatasa de ácido (B) para RUGT, Gráficas de régimen contra concentración de sustrato. La Figura 8 representa secuencias de ADN a partir de los extremos 5' y 3' de las construcciones de RUGT y mutantes en pFastBac-1 ; y Las Figuras 9A-G representan la alineación de secuencia de proteína de RUGT comparado con otra alineación de secuencia totat de UGGT de RUGT, D melanogaster UGGT, C. elegans UGGT, ß-pombe UGGT y S. cerevisiae KRE5. La cabeza de flecha abierta indica el sitio de escisión de peptidasa de señal de RUGT. Las cabezas de flecha cerradas indican sitios potencial de N- glicosilación de RUGT. Las Figuras 10A-B representan una alineación de secuencia de RUGT y otras glicosil transferasas entre los residuos 1324 y 1438. Se identificaron los residuos D1334, D1336, Q1429 y N1433.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN 10 Antes de presentar esta invención, puede ser útil primero definir ciertos términos que serán utilizados en la presente. "Muestra de prueba" significa una muestra que será analizada en el método de la presente invención. La muestra puede incluir uno o más compuestos y puede ser de un sólido seco o una solución La 15 muestra de prueba también puede ser formulada cuando sea necesario. "Un sustrato aceptor de UGGT" representa una proteína no doblada, la cual se encuentra en la forma de [GlcNAc]2 (Man) 7-9 y que puede ser glucosilada a través de UGGT a través de medios 20 bien conocidos en el campo. Por ejemplo, el sustrato puede ser marcado con glicoproteína [GlcNAC]2 (Man) 7-9 denatred + UDP- [3H]glucosa + UGGT. "Donador marcado" significa un difosfato de nucleosido, el cual es un sustrato donador adecuado para UGGT. 25 "Proteína doblada" representa una proteína de secreción en su forma biológicamente activa. "Proteína no doblada" representa una proteína de secreción en una forma no biológicamente activa o que ya no es más una forma bioactiva. En una modalidad preferida de la presente invención, el sustrato aceptor de UGGT se selecciona de un grupo que consiste de: fosfatasa de ácido de levadura RNAse B pancreática de bovino, tiroglobulina de bovino, aglutmina de soja, glucanasa exo (B-1,3) de levadura y una a-galactosidasa de levadura. Muy preferiblemente, el sustrato aceptor de UGGT es exo (B- 1,3) glucanasa de levadura, a-galactosidasa y RNase B. Muy preferiblemente, el sustrato aceptor de UGGT es fosfatasa de ácido. En una modalidad preferida de la presente invención, el donador marcado es UDP-3H-glucosa. Las condiciones generales necesarias para el método de la presente invención son como sigue: 10-20 mM Tris-HCl pH 7.5 5-10 mM CaCI2 2.5-20 µM UDP-[3H] Glucosa, 20-100 mM UGGT 0.5-1 µM aceptor-sustrato 37°C, 30 min - 4 horas. De acuerdo con la presente invención, se proporciona un ácido nucleico aislado comprendiendo un ADNc como se establece afe. en SEC ID No:1. De acuerdo con la presente invención se proporciona un vector recombinante comprendiendo el ácido nucleico aislado de la presente invención. De acuerdo con la presente invención se proporciona una célula huésped transfectada con un vector recombinante comprendiendo el ácido nucleico aislado de la presente invención. De acuerdo con la presente invención, se proporciona un procedimiento para preparar una UGGT de mamífero recombinante que comprende los pasos de: a) cultivar una célula huésped transfectada con un vector recombinante comprendiendo el ácido nucleico aislado de la presente invención bajo condiciones en donde el ácido nucleico es expresado; y b) recuperar la UGGT de mamífero así producida. Preferiblemente, las condiciones son perfil de elución de RUGT a partir de la columna de superflujo NÍ + + -NTA. El medio de cultivo de célula de insecto se concentró, se intercambio en regulador de pH y se cargó en la columna en regulador de pH conteniendo 10 mM de imidazol. Las proteínas fueron eluidas utilizando 200 mM de imidazol en 40 mM de Tris-HCl, ph 7.5, 500 mM NaCI, 5 mM CaCI2. (B) perfil de elución de RUGT a partir de la columna POROS 20HQ. Las fracciones de RUGT de la columna NÍ + + -NTA fueron combinadas, diluidas 10 veces y cargadas en POROS 20HQ. RUGT se eluyó utilizando un gradiente de NaCI de 0- s-4- * - *r 600 mM sobre 30 volúmenes de columna. La cabeza de flecha indica el pico de RUGT. Preferiblemente, la célula huésped es una célula de mamífero o una célula de insecto. Muy preferiblemente, la célula huésped es células de insecto SF9. Las células huésped eucarióticas apropiadas para utilizarse en la invención incluyen, preferiblemente, células de vertebrado y, muy preferiblemente células de mamífero. Las líneas de células de murino son especialmente preferidas. Sin embargo, además también se pueden emplear otros eucariotes tales como células de levadura.

Los elementos del vector recombinante son construidos utilizando técnicas de ADN recombinantes estándares. Los vectores recombinantes de la presente invención comprenden un promotor transcripcional, el cual está corriente arriba de y operablemente enlazado al ácido nucleico aislado de la presente invención. Por "operablemente enlazado" se quiere dar a entender que los elementos están ligados de tal forma que sus funciones pretendidas pueden ser satisfechas. De esta manera, el promotor "operablemente enlazado" al ácido nucleico aislado de la presente invención es ligado en dicha posición y forma con el fin de ser capaz de efectuar la transcripción de estos ADNs a ARNm. Típicamente, se construye un vector de expresión huésped, el cual incluye el promotor de transcripción operablemente enlazado al ácido nucleico aislado de la presente invención, seguido por secuencias de control de terminación tales como secuencias de terminador de transcripción y sitios de poliadenilación. Estos controles de terminación pueden ser suministrados a partir de fuentes de huésped apropiadas tales como aquellas que controlan la terminación de transcripción de ARNms eucarióticos tales cpmo ARNms de SV40. Las secuencias polienlazadoras típicas para la inserción de genes pueden ser construidas sintéticamente e incluirán una variedad de sitios de restricción. Los vectores de expresión construidos de acuerdo con el método de la invención son transfectados o transformados a células huésped recombinantes adecuadas, las cuales después son cultivadas bajo condiciones que permiten la producción regulada de UGGT de mamífero. La selección del huésped dependerá de la naturaleza de transcripción y elementos reguladores de traducción seleccionados para el sistema de expresión. Típicamente, las células transfectadas son cultivadas bajo condiciones en donde la expresión es representada hasta que se logra una alta densidad de células. Después, se superimponen condiciones apropiadas para la inducción de la expresión en el cultivo y se comienza la producción de proteínas. La UGGT de mamífero producida después es recuperada ya sea del sobrenadante o a través de lisis de célula y purificado utilizando medios convencionales. De acuerdo con la presente invención, se proporciona un ADNc o un análogo del mismo, en donde dicho ADNc o su análogo codifica para UGGT. - *? - ? 17 De acuerdo con la presente invención, se proporciona la primera UGGT de mamífero clonada exitosamente expresada en un sistema de baculovirus/célula del insecto. La RUGT activa fue purificada a homogeneidad y exhibe la misma preferencia para 5 glicoproteínas no doblada cargadas con glicanos [GlcNAc]2-(Man)9 N-enlazados como la enzima purificada de hígado de rata. La enzima muestra homología a otras UGGTs a través de la proteína, pero mucho más en los 300 residuos C-terminales de los productos de gen D. melanogaster, C. elegans y S. pombe. 10 La UGGT de hígado de rata es la primera UGGT de mamífero secuenciada. Muestra un alto grado de homología con las otras tres secuencias disponibles de Schizosaccharomyces pombe de levadura, los nemátodos Ceanorabditis elegans, y la mosca de la fruta Drosophilia melanogaster, con 31%, 43% y 43% de identidad 15 respectivamente, reflejando la distancia evolucionaría entre estos organismos (Figuras 9A-G). La homología de secuencia, aunque extendiéndose sobre toda la proteína, es particularmente alta en una región C-terminal de aproximadamente 300 residuos a partir del extremo de la proteína, en donde la identidad entre la secuencia de 20 RUGT y aquella de S. pombe UGGT es de 50%. Un dominio homólogo a este segmento C-terminal se encontró en otras glicosiltransferasas de varios organismos tales como lipopolisacáridos bacteriano, glucosil y galactosiltransferasas y glicogeninas de mamífero. Otras pocas proteínas de funciones 25 desconocidas también parecen contener un dominio similar. Las *9W#> UGTTs, el lipopolisacárido bacteriano, las transferasas de monosacárido y las glicogeninas todas catalizan la transferencia de un monosacárido a partir de un donador de difosfato de nucleósido en una variedad de diferentes sustratos. Por lo tanto, es muy 5 probable que sus regiones de homología puedan contener el sitio activo, en donde se une el sustrato donador, mientras que el resto de la proteína pueda estar involucrada en el reconocimiento del aceptor-sustrato. Dos estiramientos cortos particularmente son conservados, 10 correspondiendo a los residuos 1329 a 1351, y 1428 a 1435 de RUGT madura (Figuras 10A-10B). Cuatro residuos fueron completamente conservados sugiriendo un papel potencial en la función de estas varias proteínas. En RUGT, estos residuos son D1334, D1336, Q1429, y N1433. Para probar si estos residuos son 15 importantes para la función de RUGT, todos se mutaron individualmente para alaninas (Figura 8) y se determino la actividad de las proteínas resultantes. Estos cuatro residuos de aminoácido aparecen estar involucrados en varios grados en la actividad catalítica. Los primeros dos residuos completamente anulan la 20 actividad de enzima cuando son mutados a alaninas. Los otros dos mutantes retienen alrededor de 2% y 20% de la actividad del tipo silvestre. Estos residuos son responsables tanto de la unión de la UDP-glucosa de donador-sustrato a RUGT o en la transferencia catalítica actual del residuo de glucosa al aceptador-sustrato. 25 Dos modelos emergen por lo que RUGT podría glucosilar cada glicano N-enlazado en las perlas de tipo aceptor-sustrato bajo agitación o solo pueden ser reconocidos y glucosilados uno o muy pocos sitios clave a lo largo de la cadena de polipéptido desnaturalizado. El primer modelo puede explicar la posible inhibición de sustrato/producto observado en el experimento diseñado para determinar Km para fosfatasa de ácido ya que las moléculas de sustrato incompletamente glucosiladas podrían permanecer unidas a la enzima evitando así la unión de otras moléculas de sustrato. El segundo modelo es mucho más atrayente ya que implica que el oligosacárido solo no puede constituir un blanco completo para RUGT y que otros determinantes específicos en péptido expuestos en la cadena de polipéptido no doblada tienen que ser reconocidos también. Este modo de glucosilación selectivo podría implicar la existencia de sitios específicos/estratégicos para la unión de calnexina y/o calreticulina en el mecanismo de volver a doblar las glicoproteína en el retículo endoplásmico. De acuerdo con la presente invención, se proporciona una cepa de S. cerevisiae capaz de producir glicoproteínas [GlcNac]2-(Man)9 enlazadas a asparagina. La fosfatasa de ácido, una proteína de levadura naturalmente secretada, fue sobre expresada en esta cepa y constituye una excelente fuente de sustrato para UGGT. Para las expresiones en baculovirus/células de insecto, el ADNc completo que codifica RUGT fue subclonado en pFastBac-1. La secuencia de señal nativa de RUGT fue sustituida por el péptido de señal de melitina de cera de abeja para mejorar la secreción - -! 20 (Tessier, D.C. et al. (1991) Gene (Amst.) 98 -.177-183). Además, la HEEL de señal de retención del retículo endoplásmico en el extremo C-terminal de la proteína se reemplazo por seis residuos de histidina para permitir la liberación del retículo endoplásmico y 5 facilitar la purificación. A las 72 horas después de la infección, se secretó aproximadamente 50% de RUGT expresado en el medio de cultivo de células de insecto (Figura 8). La forma secretada de RUGT fue purificada para una homogeneidad aproximadamente de 40% mediante cromatografía de afinidad de metal-quelatador 10 inmovilizado y además mayor que 95% en la cromatografía de intercambio de aniones (Figura 3; carril 6). A partir de 400 mi del medio de cultivo, se pueden purificar 500 µg de RUGT cerca de homogeneidad según sea juzgado por la tinción de azul de Coomassie (Figura 3). Se obtuvieron levaduras similares con los 15 cuatro mutantes de RUGT, D1334A, D1336A, Q1429A y N1433A indicando que las mutaciones no parecen afectar la estabilidad de la enzima. Para producir un sustrato para RUGT, la cepa de S, cerevisiae YNS-7A se sabe que produce principalmente 20 oligosacáridos [GlcNAc]2-(Man)8 además fue eliminada de su gen NMS1 que codifica una a-manosidasa de retículo endoplas ático responsable de la separación de los oligosacáridos [GlcNAc]2- (Man)9 a [GlcNAc]2-(Man)8 (Jelmek-Kelly, S. et al. (1988) J. Biol. Chem, 263:14757-14763; Camirand, A. et al. (1991) J. Biol. Chem, 25 266:15120-15127). La cepa resultante fue denominada DT111 Las proteínas secretadas de YNS-7A se encontró que son sustratos mucho mejores para RUGT que las proteínas secretadas de la cepa W303-1A de tipo silvestre sin considerar las condiciones de crecimiento (Figura 4). Además, la incorporación de 3H-glucosa fue aún mejor en proteínas secretadas de DT 111 que de YNS-7A, ya que se sabe que los glicanos [GlcNac]2-(Man)9 son mejores aceptores que [GlcNAc]2-(Man)8 (Sousa, M.C. et al. (1992) Biochemistry 31. 97-105). Estas cepas deficientes de glicosilación finalmente pueden ser usados para producir proteínas recombinantes con oligosacáridos diseñados. La proteína de levadura, la fosfatasa de ácido, fue un buen candidato ya que está altamente glicosílado. Además, la fosfatasa de ácido pierde actividad a un pH neutro, sugiriendo que puede no ser doblada bajo estas condiciones, derivando así la necesidad de un paso de desnaturalización antes de la reacción de glucosilación. Se codificaron cuatro isoformas de fosfatasa de ácido a través de cuatro diferentes genes. PHO3, PHO5, PHO11 y PHO12 (Bajwa, W. (1984) Nucí. Acids Res. 12;7721-7739; Arima, K et al. (1983) Nucí. Acids Res. 11:1657-1612; Bussey, H. et al (1995) Proc. Nací. Acad. Sci. U.S.A. 92:3809-3813; Johnston, M., et al (1994) Science 265-2077-2082). PHO5 es responsable de la mayor parte de la fosfatasa de ácido sintetizada y además es reprimida cuando las célula son dejadas sin alimento para fosfato inorgánico (Tait-Kamradt, A.G et al (1966) Mol. Cell. Biol. 6:1855-1865) El producto de gen PHO5 tiene un peso molecular pronosticado de 51.1 kDa, un pi teórico de 4.60 y tiene 12 sitios de glicosilación potenciales. Bajo una inanición de fosfato inorgánico, la secreción de proteínas de alto peso molecular parece ser estimulada en la cepa W303-1A (Figura 4). Estas proteínas aparecen como una embarrada en SDS-PAGE y se esperan para la fosfatasa de ácido, ya que podría ser heterogéneamente hiperglicosilada en una cepa de tipo silvestre. En YNS-7A y DT 111, la secreción de una proteína de aproximadamente 80 KDA se incrementó bajo la inanición de fosfato inorgánico. Este peso molecular se puede esperar para la fosfatasa de ácido que tiene oligosacáridos de núcleo [GlcNAc]2-(Man)8 y [GlcNAc]2-(Man)9, respectivamente. Aunque los sobrenadantes de cultivo crudo de DT111 pueden ser usados como sustrato para RUGT, un simple cambio de regulador de pH a través de ultrafiltración seguido por cromatografía de intercambio de anionts puede producir una sola proteína de aproximadamente 80 kDa. La secuenciación N-terminal de la proteína purificada reveló la identidad de la fosfatasa de ácido. El tratamiento completo de fosfatasa de ácido purificada con EndoH dio como resultado una reducción de >20kDa de peso molecular aparente en SDS-PAGE indicativo de aproximadamente 12 sitios de glicosilación. Aproximadamente 7 mg de fosfatasa de ácido pura al >90% pueden ser obtenidos a partir de 14 litros de células DT111 desarrolladas en el medio SD-Pi en un bioreactor a un máximo de O.D. 600nm de 2.

La actividad del RUGT recombinante purificado se probó hacia varios sustratos. Como se esperaba, la enzima mostró una actividad mayor hacia RNase B no doblada, reducida que hace a la proteína nativa. Similarmente la aglutinina de soja tratada con calor y la tiroglobulina de bovino tratada con urea fueron mejores sustratos que las proteínas nativas (Figura 5). Estos resultados demuestran que la enzima recombinante tiene el mismo carácter específico para las proteínas incorrectamente dobladas como la enzima purificada a partir de hígado de rata. La fosfatasa de ácido desnaturalizada purificada a partir de DT111 es un aceptor-sustrato mucho mejor para RUGT que la tiroglobulina de bovino y aglutinina de soja, previamente utilizadas. Asumiendo un MW de 14kDa, 31kDa y 303 kDa para RNasa B, SBA y Tg, la fosfatasa de ácido puede incorporar 3H-glucosa en una base molar 130 X mejor que RNasa B, 100 X mayor que SBA y 4 veces más que tg. Cuando se utilizó UDP-glucosa en un gran exceso, y la reacción de glucosilación se dejó proseguir al término, la incorporación máxima indicó que casi los doce sitios de glicosilación de fosfatasa de ácido son utilizados para la glucosilación. Esto sugiere que la completa desnaturalización de la fosfatasa de ácido a través de la reducción de sus enlaces de disulfuro en presencia de 6M de clorhidrato de guanidinio (Zapun, 1998) seguido por desalación antes de la glucosilación, no dio como resultado una mejor incorporación de 3H-glucosa (Figura 5). De esta manera, podría hacerse que todos los glicanos N-enlazados en la fosfatasa de ácido sean reconocidos y usados como blancos para la glucosilación mediante RUGT. La actividad de los cuatro mutantes de RUGT se comparó que aquella de la enzima de tipo silvestre utilizando fosfatasa de ácido purificada. Los mutantes D1334A y D1336a no exhibieron ninguna actividad, mientras que los mutantes N1433A y Q1429A mostraron aproximadamente 2% y 20% de la actividad de la enzima de tipo silvestre (Figura 6). El autoradiograma fue sobre expuesto para mostrar la marcación débil de fosfatasa de ácido mediante RUGT - Q1429A y N1433A. Se condujo la caracterización cinética preliminar de RUGT y se determinó su Km para UDP-glucosa y fosfatasa de ácido. En presencia 0.5 µM de fosfatasa ácido, la enzima exhibió una clásica cinética de Michaelis-Mente (Figura 7A) y fue posible calcular un valor para Km de 44 µM para UDP-glucosa. El valor de Km de 18 µm fue previamente obtenido a través de Trombetta, utilizando tanto aglutinina de soja como ti roglubu lina de bovino como aceptador- sustrato para UGGT purificada de hígado de rata en 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM CaCI2. Sin embargo, en presencia de 5µM de UDP- glucosa, se observó un valor Vmax aparente a 1.0 µM de fosfatasa de ácido (Figura 7B). Ya que la concentración de fosfatasa de ácido se incremento a 2.0 y 4.0 µM, la velocidad de glucosilación continuó disminuyendo tal vez indicativa de la inhibición de sustrato y/o producto. En cualquier caso, el valor de Km aparente para fosfatasa de ácido se calculó para ser 0.3 µM. Este resultado puede ser explicado si la fosfatasa de ácido no se liberó de RUGT después de la glucosilación. Aunque se ha mostrado, in vivo, que la asociación de una variante incompetente de secreción de a1-ant?trips?na para UGGT es evitada en presencia de UDP-glucosa (Choudhury, P. et al (1997) J. Biol. Chem. 272 : 13446-13451 ). Otros características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir del siguiente ejemplo. El siguiente ejemplo está destinado a documentar la invención sin limitar su alcance.

EJEMPLO I Clonación y Expresión en Células de Insecto de Glicoproteína de UDP-Glucosa.Glucosiltransferasa de Hígado de Rata Activa y Desarrollo de un Sustrato Adecuado para esta Enzima Clonación de RUGT Se obtuvieron enzimas de restricción y modificación de Pharmacia Biotech Inc., New England BioLabs and MBI Fermentas Inc. El plásmido pFastBad, E. coli DHIOBac y el Sistema RACE 5' para una rápida amplificación de los extremos de ADNc (versión 2.0) todos se compraron Gibco/Life Technologies Inc. El equipo de amplificación de ADNc de Marathón y ADNc de Maratón Listo se compraron en Clontech. Los plásmidos fueron propagados en MC1061 de E. coli (Casadaban, M., et al. (1980) J. Mol. Biol, 138:179-207) y se preparó como se describió previamente (Holmes, D. S. et al. (1981) Anal. Biochem. 114:193-197). Los >*w^- 26 oligonucleótidos fueron sintetizados en un sintetizador de ADN expedito. (PerSeptive Biosystems, Inc.) y se realizó la secuenciación a través de terminación de colorante de didesoxi en un secuenciador de ADN ABI Prism 377 (Applied Biosystems Inc ) 5 Con el fin de obtener la secuencia de codificación de UGGT de rata, primero se siguió una estrategia de ADNc "caminante" Con base en la información de secuencia del péptido y un estiramiento de 300 bp de secuencia en el extremo 3' del gen, se diseñaron sondas de oligonucleótido y se utilizaron para clasificar una 10 colección de ADNc de hígado de rata en Lambda ZAP (Stratagene). Se aislaron dos clones similares de 3.3 kb los cuales contuvieron un marco de lectura abierto codificando los 385 aminoácidos C- terminales, incluyendo una secuencia de retención de retículo endoplásmico y un extremo o cola poli(A) en el extremo 3' La 15 clasificación de una nueva colección de ADNc de hígado de rata en ?gt 10 (Clontech) con una segunda sonda correspondiendo al extremo 5' del clon de 3.3 kb aislado en la primera clasificación, proporcionó varios clones traslapantes. Lo más interesante, es que se diseño un clon de 3.3 kb extendido además 'con 1.7 kb de 20 secuencia a partir de la cual se diseño una tercera sonda. En esta tercera clasificación, solamente se obtuvo un clon positivo, el cual se extendió en el marco de lectura abierto por 540bp a 3360bp. Una cuarta sonda se diseño con base en esta información de secuencia adicional, pero falló para producir clones útiles. Subsecuentemente, 25 no se encontró ninguna secuencia de longitud completa de ORF de *,. .

RUGT en ninguna colección utilizada. Para completar la secuencia, se utilizó en sistema 5' RACE en los ARNms de hígado de rata. La reacción de transcriptasa inversa se inicio con un oligonucleótido correspondiendo al extremo 5' de 540bp de información de secuencia revelado en la tercera clasificación. El primer ADNc de estructura de cadena después fue diseñado con poli (dC) utilizando desoxinucleotidil transferasa terminal. Un fragmento amplificado de 1.4 kb fue clonado y secuenciado. La secuencia 5' de este clon consistió de un estiramiento poli-dG seguido por un segmento rico en GC de 39bp prosiguiendo el marco de lectura abierto. Utilizando esta información de secuencia, se realizó la RT-PCR utilizando equipos de ADNc de Clontech's Marathón para clonar el ADNc de longitgd completa como un solo fragmento de 4.6kb utilizando iniciadores inmediatamente flanqueando la región de codificación. Se secuenciaron dos clones a partir de reacciones independientes. Para expresión, el gen se clono en los sitios Rsrll y Kpnl le pFastBad utilizando la siguiente estrategia. En el extremo 5' de! gen, la secuencia que codifica para los primeros 18 aminoácidos de RUGT fue reemplazada por la secuencia que codifica para los 21 aminoácidos del péptido de señal de melitina de cera de abeja para facilitar la secreción de la proteína a partir de vaculovirus-células de insecto infectadas (Tessier, D.C. et al. 81991) Gene (Amst.) 98:177-183). En el extremo 3' del gen, la secuencia que codifica para HEEL individual de localización de retículo endoplásmico se reemplazo por la secuencia que codifica una etiqueta terminal (His)6 para facilitar la purificación de la proteína (Figura 8). Basándose en alineaciones de secuencia con otras glicosiltransferasas de difosfato de nucleósido, se diseñaron cuatro mutantes RUGT independientes, D1334A, D1336a, Q1429A y N1433A, amplificados mediante PCR, clonados y secuenciados para confirmar la presencia de sitios Pstl, BsrBI, Xbal y Nael de diagnósticos, respectivamente (Figura 8).

Producción y Expresión de Baculovirus Recombinante en Células de Insecto Se transformaron las construcciones de RUGT recombinante en pFastBad en DHIOBac de E. coli para producir bacmidos recombinantes como se describe por el fabricante. La presencia del gen fue verificada a través de PCR. Se transfectaron células de insecto Sf9 durante 3 días con el ADN de bacmido recombinante utilizando CelIFectin (Gibco/Life Technologies Inc.) como se describe por el fabricante para producir pilas de baculovirus de RUGT recombinante. Se desarrollaron células de insecto Sf9 durante 3-4 días en un medio libre de suero de SMF de Sf900 II (Gibco/Life Technologies Inc.) a una densidad de 2-3x106 células/ml en 500 mi de matraces de Spinner microportadores de 500 mi (Bélico Glass Inc.) y se infectaron con 1/2O del medio de cultivo de un material de baculovirus de RUGT recombinante representando un valor aproximado de 2-5 pfu/cell. Las células infectadas después fueron incubadas a 27°C durante 3 días. Las alícuotas de las células infectadas y del sobrenadante de cultivo se analizaron en geles de SDS-poliacrilamida de resolución de 8%/apilamiento 5% (SDS-PAGE) seguido por tinción Western.

Purificación de RUGT Las células fueron removidas a través de centrifugación a 3,000xg durante 10 minutos. El medio sobrenadante se recogió en hielo y se ajusto a 40 mM de Tris-HCl. PH 7.5, 0.5M de NaCl. El medio se concentró aproximadamente 20 veces a 4°C sobre membranas YM30 (Amicon) en presencia de 2 mg/ml de los inhibidores de proteasa a protinina, leupeptina, pepstatma A y E-64 (Boehringer Mannheim Canadá). Se realizaron dos intercambios de regulador de pH utilizando regulador de pH ATC/PI (40 mM de Tris-HCl pH 7.5, 0.5 NaCI, 5 mM de CaCI2 con inhibidores de proteasa) El medio concentrado/diafiltrado se centrifugó a 3,000xg durante 10 minutos para remover algunas proteínas precipitadas y se agregaron 10 mM de imidazol al sobrenadante antes de cargar doblemente por flujo de gravedad en una columna de NÍ + + -NTA Superflow de 1 mi (Qiagen Inc.) en un ensamble de columna de tipo Pharmacia FPLC C. La resina de NÍ + + -NTA se lavó previamente con 20 volúmenes de columna de ddH2O y se equilibró en el regulador de pH de ATC/PI + 10 mM de imidazol. Después de la carga, la columna se lavó a través de flujo de gravedad con 20 volúmenes de HH columna de Buffer ATC/PI + 10 mM imidazol. La elución se realizó en una estación de trabajo de cromatografía de perfusión BioCAD (PerSeptive Biosystems. Inc.). La columna primero se lavó con 10 volúmenes de columna de regulador de pH ATC/PI + 10 mM a 2 ml/minuto y las proteínas se eluyeron con regulador de pH de ATC/PI + 200 mM de imidazol para 20 volúmenes de columna a la misma velocidad de flujo. Se tomaron fracciones de 1 mi y las alícuotas se analizaron a través de SDS-PAGE y tinción Western para confirmar la presencia de la proteína. Las fracciones que contienen RUGT de la columna N?++NTA fueron diluidas 10 veces con regulador de pH de HQ (40 mM*Tr?§- HCI pH 7.5, 2mM CaCI2) antes de inyectarse sobre una columna de 1 mi de POROS 20 HQ (PerSeptive Biosystem, Inc.) en un ensamble de columna de Pharmacia FPLC HR5/5 en un BioCAO. Las velocidades de flujo para la unión y la elución se fijaron en 1 ml/minuto, mientras que los lavados se realizaron a 3 ml/minuto. La proteína se eluyó con un gradiente de NaCI de 0-750 mM en regulador de pH HQ en 30 volúmenes de columna. Las RUGT se eluyó a aproximadamente 350 mM de NaCl. Se tomaron fracciones de 1 mi y las alícuotas se analizaron a través de SDS-PAGe para determinar la pureza de la proteína y para tratar la actividad RUGT.

Producción de fosfatasa de ácido Las cepas de levadura de Saccharomyces cerevisiae utilizadas en este estudio fueron: W303-1A (MATa, ade2, his3, Ieu2, trpl. ura3, canl) (Parlati, F., et al. (1995) J Biof. Chem. 270:244- 253), YNS-7A (MAT a, och1::LEU2, mnnl, his 1 , his3, ura3; generous gift de Y. Jigami) (Nakayama, K., et al. (1992) EMBO J, 11*2^11- 2519) y DT111 (MAT a, och1::LEU2, mnnl, mnsl, hisl, his3, ura3^ Se produjo la fosfatasa de ácido a partir de DT111, el cual secrfeta glicoproteínas con glicanos [GlcNAc]2-(Man)9 enlazados con asparagina. Se contruyo DT111 separando el gen MNS1 de YN-7A utilizando un cásete de mns1::URA3 (Camirand, A. et al. (191) J. biol. Chem. 266:15120-15127) de pBHE5 de plásmido. El gen URA3 después fue eliminado seleccionado las colonias resistentes a 5» FOA (Rose, M,D. et al. (1990) in Methods in Yeast Genetics: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Se desarrollo DT111 en un medio YPD suplementado con 150 mM de KCl como un estabilizador osmótico a 30°C hasta que O.D. 600nm llegó a aproximadamente 5. El inoculo fue diluido 50 veces en el medio SD-Pi suplementado con 150 mM de KCl y 2% de glucosa y se desarrollaron a 30°C a un O.D. de 600 nm de 2. El medio SD fue preparado sin fosfato inorgánico para inducir la expresión de fosfatasa de ácido endógena. La fosfatasa de ácido se purificó a partir del medio de cultivo en una concentración/diafiltración de 50 veces contra 10 mM de acetato de sodio, pH 5.0 seguido por cromatografía de intercambio de anión en una columna de 1 mi de POROS 20HQ (PerSeptive Biosystems, Inc.) un ensamble de Pharmacia HR5/5 en 20 mM de acetato de sodio, pH 5.0 en un BioCAD. Las velocidades de flujo se fijaron a 1 ml/minuto para la unión y 3 ml/min para los lavados. Las proteínas se eluyeron a 1 ml/minuto en 30 volúmenes de columna utilizando un gradiente lineal de 0-600 mM de NaCl. La fosfatasa de ácido se eluyó aproximadamente 100 nM de NaCl. Se tomaron fracciones de 1 mi y las alícuotas se analizaron a través de SDS-PAGE para conformar la presencia de la proteína. Se verificó la actividad de fosfatasa de ácido a O.D. 405 nm seguido de hidrólisis de 1 mg/ml de fosfato de p-nitrofenilo (pNPP; Sigma 104) a 37°C durante 10-60 minutos en 25 mM de citrato de sodio a un pH de 4.0.

Ensayo de glucosiltransferasa y mediciones de cinética Una fosfatasa de ácido fue la glicoproteína de sustrato principal utilizada para determinar la actividad de RUGT en este estudio. Se preparó RNasa como se describió anteriormente y en cualquier parte (Zapun, 1998). Se desnaturalizó aglutinma de soj'a (Sigma) calentando a 100°C durante 15 minutos. Se desnaturalizó la tiroglobulina de bovino (Sigma) con 8 M de urea y se dializó contra ddH2O.- El aceptor-sustrato de fosfatasa de ácido (-1µg) se mezcló con RUGT en una mezcla de 20 µl conteniendo regulador de pH TC (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM CaCI2) y 5 µM de difosfo-D-[6-3H]-glucosa de uridina (2-15Ci/mmol; Amersham Life Science Inc.) y se incubó a 37°C durante 2 horas. Las reacciones fueron tanto analizadas a través de SDS-PAGE seguido por fluorografía utilizando Amplify (Amersham Life Science Inc.) o precipitado con ácido tricloroacético (TCA) al 10% enfriada con hielo, se lavó dos veces con TCA y las pellas se volvieron a suspender en 50 µl 1M Tris-HCl pH 8.0 antes de continuar en un contador beta para cuantificar la incorporación de 3H-glucosa en fosfatasa de ácido Para la determinación del valor de Km de UDP-glucosa, se mezclaron 46 nM de RUGT con 1 µM de fosfatasa de ácido purificado y 5-800 µm de UDP-glucosa (mezcla de marcada y no marcada) en regulador de pH TC a un volumen final de 20ml. Para la determinación del valor de Km para fosfatasa de ácido, se mezclaron 10 nM de RUGT con 100 µm de UDP-glucosa (mezcla de marcada y no marcada) y 0.1-4 µM de fosfatasa de ácido purificada en regulador de pH TC a un volumen final de 20 µl. Se incubaron las reacciones de glucosilación a 37°C y la TCA se precipitó en varios tiempos hasta 120 minutos para determinar la velocidad de incorporación de 3H-glucosa en fosfatasa de ácido.

Producción de anticuerpos policlonales dirigidos contra el termino C de RUGT El péptido 15mer EEKELGTLHEEETQE (residuos de aminoácido 1505-1519) fue sintetizado en un núcleo de MAP de 8 ramificaciones (Applied Biosystem) en un sintetízador de Pépttdo MPS 396 (Advanced Chemtech) utilizando la química Fmoc y se dessaló en cartuchos de cromatografía de fase inversa C18 Sep-Pak (Millipore/Waters). Los conejos fueron inmunizados como se describió previamente (Cooper, H.M. et al. (1995) in Current Protocols in Immunology, 2nd Ed. (Coligan, J.E. et al. eds), Volumen 1, Sección 2, John Wiley and Sons, Inc., Nueva York). Se probaron sangrados periódicos para inmunoreactividad a RUGT a través de tinción Western y se visualizaron por la quimioluminisencia mejorada (ECL; Amersham Life Science Inc.). Los anticuerpos generados para este estudio mostraron reactividad cruzada para dos proteínas de célula de insecto de aproximadamente 62 y 70 kDa respectivamente (Figura 1). Aunque la invención ha sido descrita con relación a sus modalidades específicas, se entenderá que es capaz de otras modificaciones y esta solicitud está destinada a cubrir cualesquiera variaciones, usos, o adaptaciones de la invención siguiendo, en general los principios de la invención e incluyendo dichas aberturas de las descripción de la presente como que son conocidas o son de práctica común dentro del técnica a la cual pertenece la invención y como se puede aplicar a las características esenciales anteriormente establecidas, y como sigue en el alcance de las reivindicaciones anexas.

LlSTA DE SECUENCIAS <110> Tessier, Daniel C. Dignará, Daniel Bergeron, John J.M. Thomas, David Y. <120> CLASIFICACIÓN PARA ACTIVIDAD DE UDP-GLUCOSA: GLUCOSILTRANSFREAS DE GLICOPROTEINA (UGGT) <130> 2139-9"US" <140> 09/376,330 <141> 1999-08-18 <160> 35 <170> FastSEQ for Windows Versión 3.0 <210> 1 <211> 5053 <212> ADN <213> RUGT de Rata <220> <221> CDS <222> (40) ... (4623) <400> 1 tgcgcggctg cgcggcgggt gacagggctc tgttacaac atg gga etc ctg att 54 Met Gly Leu Leu lie 1 5 gca ctg gcc tta ctg tgc ctg ttt tec tta gca gaa gcc aat tea aaa 102 Ala Leu Ala Leu Leu Cys Leu Phe Ser Leu Ala Glu Ala Asn Ser Lys 10 15 20 gcc att acc acc tet etc acc act aag tgg ttt tet gct cea ctg ctg 150 Ala lie Thr Thr Ser Leu Thr Thr Lys Trp Phe Ser Ala Pro Leu Leu 25 30 35 cta gaa gcc agt gag ttc cta gca gaa gac agt caá gag aaa ttt tgg 198 Leu Glu Ala Ser Glu Phe Leu Ala Glu Asp Ser Gln Glu Lys Phe Trp 40 45 50 agt ttt gta gaa gcc agt caá aac att gga tea tea gat caá cat gat 246 Ser Phe Val Glu Ala Ser Gln Asn lie Gly Ser Ser Asp Gln His Asp 55 60 65 acc gac cgt tec tat tat gat gcc ata ttg gaa gct gcg ttt cgg ttc 294 Thr Asp Arg Ser Tyr Tyr Asp Ala lie Leu Glu Ala Ala Phe Arg Phe 70 75 80 85 ctg tea ect ctg cag cag aat ttg ttg aag ttt tgt etc tet etc cgt 342 Leu Ser Pro Leu Gln Gln Asn Leu Leu Lys Phe Cys Leu Ser Leu Arg 90 95 100 tec tac tea gcc tea att caá gcc ttc cag cag ata gca gtc gac gag 390 Ser Tyr Ser Ala Ser lie Gln Ala Phe Gln Gln lie Ala Val Asp Glu 105 110 115 ect cea cea gaa gga tgc aag tea ttt etc tea gtg cat gga aag cag 438 Pro Pro Pro Glu Gly Cys Lys Ser Phe Leu Ser Val His Gly Lys Gln 120 125 130 act tgt gat ctg ggc act ctt gag age ctt ctg ctg act gca ect gac 48S Thr Cys Asp Leu Gly Thr Leu Glu Ser Leu Leu Leu Thr Ala Pro Asp 135 140 145 aga ect aaa ect tta ttg ttc aaa gga gat cae aga tat ccc tea tea 534 Arg Pro Lys Pro Leu Leu Phe Lys Gly Asp His Arg Tyr Pro Ser Ser 150 155 160 165 aat ect gaa agt cea gtg gtc att ttt tat tet gag att ggc cat gaa 582 Asn Pro Glu Ser Pro Val Val lie Phe Tyr Ser Glu lie Gly His Glu 170 175 180 gaa ttt tet aat att cae cae caá ctt ata tea aaa age aat gaa gga 630 Glu Phe Ser Asn lie His His Gln Leu lie Ser Lys Ser Asn Glu Gly 185 190 195 aaa att aat tat gtg ttc aga cat tat ata tet aat ccc agg aag gag 678 Lys lie Asn Tyr Val Phe Arg His Tyr lie Ser Asn Pro Arg Lys Glu 200 205 210 ceg gtc cae ctt tet ggc tat ggt gta gaa ttg gcc att aag age acg 726 Pro Val His Leu Ser Gly Tyr Gly Val Glu Leu Ala He Lys Ser Thr 215 220 225 gag tac aag gcc aag gat gat act cag gtg aaa ggg acc gag gta aac 774 Glu Tyr Lys Ala Lys Asp Asp Thr Gln Val Lys Gly Thr Glu Val Asn 230 235 240 245 acc acá gtc att ggg gag aac gat ect att gat gaa gtt cag ggg ttc 822 Thr Thr Val He Gly Glu Asn Asp Pro He Asp Glu Val Gln Gly Phe 250 255 260 etc ttt gga aaa tta aga gaa ctg tac ccc age ttg gaa gga cag ttg 870 Leu Phe Gly Lys Leu Arg Glu Leu Tyr Pro Ser Leu Glu Gly Gln Leu 265 270 275 aaa gag ttc cgg aag cat etc gtg gag age acc aat gaa atg gcc ccc 918 Lys Glu Phe Arg Lys His Leu Val Glu Ser Thz Asn Glu Met Ala Pro 280 285 290 ttg aaa gtc tgg cag ctg caá gac etc agt ttc cag act gct gcc cgc 9€€ Leu Lys Val Trp Gln Leu Gln Asp Leu Ser Phe Gln Thr Ala Ala Arg 295 300 305 ate ttg gct gct ect gtg gag tta gct ctg gtg gtg atg aag gac att 1014 He Leu Ala Ala Pro Val Glu Leu Ala Leu Val Val Met Lys Asp He 310 315 320 325 agt cag aac ttt ect acc aaa gcc aga gca ata acá aaa acá gct gtg 1062 Ser Gln Asn Phe Pro Thr Lys Ala Arg Ala He Thr Lys Thr Ala Val 330 335 340 age gca cag ctt aga gcg gaa gtg gaa gag aac cag aag tat ttc aag 1110 Ser Ala Gln Leu Arg Ala Glu Val Glu Glu Asn Gln Lys Tyr Phe Lys 345 350 355 gga act ata gga tta cag ect gga gac tea gct etc ttc ate aac gga 1158 Gly Thr He Gly Leu Gln Pro Gly Asp Ser Ala Leu Phe He Asn Gly 360 365 370 ctt cat att gat tta gac acc cag gat ate ttc agt ctg ttt gat act 1206 Leu His He Asp Leu Asp Thr Gln Asp He Phe Ser Leu Phe Asp Thr 375 380 385 ctg aga aat gaa gcc cgg gta atg gag ggt cta cat aga cta gga ata 1254 Leu Arg Asn Glu Ala Arg Val Met Glu Gly Leu His Arg Leu Gly He 390 395 400 405 gaa ggc ctt tet cta cat aat att ttg aag etc aac ate cag ceg tet 1302 Glu Gly Leu Ser Leu His Asn He Leu Lys Leu Asn He Gln Pro Ser 410 415 420 gag act gac tac gca gta gac ate agg agt ect gct att tec tgg gtc 1350 Glu Thr Asp Tyr Ala Val Asp He Arg Ser Pro Ala He Ser Trp Val 425 430 435 aac aac cta gag gtt gat age cga tat aac tea tgg ect tea agt tta 1398 Asn Asn Leu Glu Val Asp Ser Arg Tyr Asn Ser Trp Pro Ser Ser Leu 440 445 450 caá gag tta ctt cgc ccc acg ttt ect ggc gtt ata cgg cag ate aga 1446 Gln Glu Leu Leu Arg Pro Thr Phe Pro Gly Val He Arg Gln He Arg 455 460 465 aag aac cta cat aac atg gtt ttc att gtt gat ect gtt cat gag acc 1494 Lys Asn Leu His Asn Met Val Phe He Val Asp Pro Val His Glu Thr 470 475 480 485 acg gca gag ctg gtt age ata gcc gag atg ttc etc age aat cat ata 1542 Thr Ala Glu Leu val Ser He Ala Glu Met Phe Leu Ser Asn His He 490 495 500 cea cta agg att ggt ttt ate ttt gtg gtc aat gat tet gaa gat gtt 1590 Pro Leu Arg He Gly Phe He Phe Val Val Asn Asp Ser Glu Asp Val 505 510 515 gat ggg atg caá gat gct gga gtc gct gtt ctg aga gca tat aat tat 1638 Asp Gly Met Gln Asp Ala Gly Val Ala Val Leu Arg Ala Tyr Asn Tyr 520 525 530 gtg ggt cag gaa gtg gat ggc tac cat gcc ttc cag act etc acc cag 1686 Val Gly Gln Glu Val Asp Gly Tyr His Ala Phe Gln Thr Leu Thr Gln 535 540 545 ate tac aac aaa gtg agg act gga gaa aag gtg aaa gtt gag cat gtg 1734 He Tyr Asn Lys Val Arg Thr Gly Glu Lys Val Lys Val Glu His Val 550 555 560 565 gtc agt gtc ttg gag aag aag tac ceg tat gtt gaa gtg aat age att 1782 Val Ser Val Leu Glu Lys Lys Tyr Pro Tyr Val Glu Val Asn Ser He 570 575 580 ctg ggg att gat tet gct tat gat cag aat cgg aag gaa gcc aga ggc 1830 Leu Gly He Asp Ser Ala Tyr Asp Gln Asn Arg Lys Glu Ala Arg Gly 585 590 595 tac tat gag cag act ggt gta ggc ccc ttg ect gtt gtc ttg ttc aat 1878 Tyr Tyr Glu Gln Thr Gly Val Gly Pro Leu Pro Val Val Leu Phe Asn 600 605 610 ggg atg ccc ttt gaa aag gag cag tta gac ccc gac gag ctg gaa acc 1926 Gly Met Pro Phe Glu Lys Glu Gln Leu Asp Pro Asp Glu Leu Glu Thr 615 620 625 ate acá atg cae aag ate ttg gag acg acc acc ttc ttc caá aga gcc 1974 He Thr Met His Lys He Leu Glu Thr Thr Thr Phe Phe Gln Arg Ala 630 635 640 645 gtg tat ttg ggt gaa ctg tea cat gat caá gac gtg gta gag tac ate 2022 Val Tyr Leu Gly Glu Leu Ser His Asp Gln Asp Val Val Glu Tyr He 650 655 660 atg aat cag ceg aat gtt gtt cea aga ate aac tet agg att ttg acá 2070 Met Asn Gln Pro Asn Val Val Pro Arg He Asn Ser Arg He Leu Thr 665 670 675 gct aag cga gag tat ctg gat cta acá gca age aat aat ttt tat gtg 2118 Ala Lys Arg Glu Tyr Leu Asp Leu Thr Ala Ser Asn Asn Phe Tyr Val 680 685 690 gat gac ttt gcc aga ttt tet gcc ttg gac tet cgg ggc aag act gct 2166 Asp Asp Phe Ala Arg Phe Ser Ala Leu Asp Ser Arg Gly Lys Thr Ala 695 700 705 gct att gcc aac agt atg aac tat ctg acá aaa aaa gga atg tec tec 2214 Ala He Ala Asn Ser Met Asn Tyr Leu Thr Lys Lys Gly Met Ser Ser 710 715 720 725 aag gaa ate tat gat gat tec ttt att agg cea gtg act ttt tgg att 2262 Lys Glu He Tyr Asp Asp Ser Phe He Arg Pro Val Thr Phe Trp He 730 735 740 gtt gga gat ttt gat age ect tet ggg cgg cag tta tta tat gac gcc 2310 Val Gly Asp Phe Asp Ser Pro Ser Gly Arg Gln Leu Leu Tyr Asp Ala 745 750 755 att aaa cat cag aaa acc agt aac aat gtt agg ata agt atg ate aat 2358 He Lys His Gln Lys Thr Ser Asn Asn Val Arg He Ser Met He Asn 760 765 770 aac ccc age cga gag ata agt gac tea age acc ccc gtc tec aga gcc 2406 Asn Pro Ser Arg Glu He Ser Asp Ser Ser Thr Pro Val Ser Arg Ala 775 780 785 ate tgg gca gct etc cag acá cag acc tec aac tet gct aag aac ttc 2454 He Trp Ala Ala Leu Gln Thr Gln Thr Ser Asn Ser Ala Lys Asn Phe 790 795 800 805 ate acc aag atg gtc aaa gag gag acg gca gag gcc ctg gcc gca gga 2502 He Thr Lys Met Val Lys Glu Glu Thr Ala Glu Ala Leu Ala Ala Gly 810 815 820 gtg gac att ggg gaa ttc tet gtc ggg ggc atg gat gtc agt ctt ttt 2550 Val Asp He Gly Glu Phe Ser Val Gly Gly Met Asp Val Ser Leu Phe 825 830 835 aaa gag gtc ttt gag tet tec aga atg gat ttc att ttg tet cat gcc 2598 Lys Glu Val Phe Glu Ser Ser Arg Met Asp Phe He Leu Ser His Ala 840 845 850 ctg tac tgc agg gat gtt ctg aaa ctg aag aag gga cag aga gtg gtg 2646 Leu Tyr Cys Arg Asp Val Leu Lys Leu Lys Lys Gly Gln Arg Val Val 855 860 865 ate age aac gga agg ate att ggg cea ctg gag gac agt gag etc ttc 2694 He Ser Asn Gly Arg He He Gly Pro Leu Glu Asp Ser Glu Leu Phe 870 875 880 885 aac caá gat gat ttc cae etc ctg gaa aat ate att ctg aaa acá teg 2742 Asn Gln Asp Asp Phe His Leu Leu Glu Asn He He Leu Lys Thr Ser 890 895 900 gga cag aaa ate aag tet cat ate caá cag ctt cgc gta gaa gaa gat 2790 Gly Gln Lys He Lys Ser Hxs He Gln Gln Leu Arg Val Glu Glu Asp 905 910 915 gtg gcc agt gat ttg gta atg aag gtg gat gct etc ctg tea gcg ca 2838 Val Ala Ser Asp Leu Val Met Lys Val Asp Ala Leu Leu Ser Ala Gln 920 925 930 ccc aaa gga gag gcg agg ate gag tac cag ttc ttt gaa gat aag cae 2886 Pro Lys Gly Glu Ala Arg He Glu Tyr Gln Phe Phe Glu Asp Lys His 935 940 945 agt gca att aaa ctg aag ccc aaa gaa ggg gag acá tac tat gat gtg 2934 Ser Ala He Lys Leu Lys Pro Lys Glu Gly Glu Thr Tyr Tyr Asp Val 950 955 960 965 gta gct gtt gtc gac ect gtc acá aga gaa gca cag agg etc gcc ccc 2982 Val Ala Val Val Asp Pro Val Thr Arg Glu Ala Gln Arg Leu Ala Pro 970 975 980 ttg etc ttg gtt ttg gct cag ctg ata aac atg agt ctg aga gta ttc 3030 Leu Leu Leu Val Leu Ala Gln Leu He Asn Met Ser Leu Arg Val Phe 985 990 995 atg aat tgc caá tec aag ctt tec gac atg ect tta aaa age ttt tac 3078 Met Asn Cys Gln Ser Lys Leu Ser Asp Met Pro Leu Lys Ser Phe Tyr 1000 1005 1010 cgt tat gtc tta gag ceg gag att tet ttc act gca gac aac age ttt 3126 Arg Tyr Val Leu Glu Pro Glu He Ser Phe Thr Ala Asp Asn Ser Phe 1015 1020 1025 gcc aag gga cea ata gca aag ttt ctg gat atg ect cag tet ceg ctg 3174 Ala Lys Gly Pro He Ala Lys Phe Leu Asp Met Pro Gln Ser Pro Leu 1030 1035 1040 1045 ttt act ttg aat ttg aac acá ccc gag agt tgg atg gta gaa tet gtc 3222 Phe Thr Leu Asn Leu Asn Thr Pro Glu Ser Trp Met Val Glu Ser Val 1050 1055 1060 aga acá ccc tat gat ctt gat aat att tac cta gaa gag gtg gac agt 3270 Arg Thr Pro Tyr Asp Leu Asp Asn He Tyr Leu Glu Glu Val Asp Ser 1065 1070 1075 ata gtg gct gct gag tat gag ctg gag tat ctg tta ctg gaa ggt cat 3318 He Val Ala Ala Glu Tyr Glu Leu Glu Tyr Leu Leu Leu Glu Gly Hís 1080 1085 1090 tgt tac gac ate acc acá ggc cag ccc ect cga gga ctg cag ttc acg 3366 Cys Tyr Asp He Thr Thr Gly Gln Pro Pro Arg Gly Leu Gln Phe Thr 1095 1100 1105 tta gga act tea gcc aac cea acá act gtg gac acá ate gtg atg gcc 3414 Leu Gly Thr Ser Ala Asn Pro Thr Thr Val Asp Thr He Val Met Ala 1110 1115 1120 1125 aat ctg gga tat ttt cag etc aaa gcc aac cea gga gcc tgg att ctg 3462 Asn Leu Gly Tyr Phe Gln Leu Lys Ala Asn Pro Gly Ala Trp He Leu 1130 1135 1140 aga ctg agg aag ggg cgc teg gat gac att tat agg ate tac age cat 3510 Arg Leu Arg Lys Gly Arg Ser Asp Asp He Tyr Arg He Tyr Ser His 1145 1150 1155 gac gga acá gat tec ect ect gat gca aat gac gtt gtt gtc ate etc 3558 Asp Gly Thr Asp Ser Pro Pro Asp Ala Asn Asp Val Val Val He Leu 1160 1165 1170 aat aac ttc aag age aag ate ate aaa gtg aag gtt cag aag aag gcc 3606 Asn Asn Phe Lys Ser Lys He He Lys Val Lys Val Gln Lys Lys Ala 1175 1180 1185 gac atg gct aat gaa gac ttg ctg age gac ggg acg aat gag aat gag 3654 Asp Met Ala Asn Glu Asp Leu Leu Ser Asp Gly Thr Asn Glu Asn Glu 1190 1195 1200 1205 tet gga ttc tgg gac tea ttc aag tgg ggc ttc tea gga cag aag act 3702 Ser Gly Phe Trp Asp Ser Phe Lys Trp Gly Phe Ser Gly Gln Lys Thr 1210 1215 1220 gag gaa gta aag caá gat aag gac gac ata ate aat att ttc tet gtt 3750 Glu Glu Val Lys Gln Asp Lys Asp Asp He He Asn He Phe Ser Val 1225 1230 1235 gca tet ggt cat etc tac gaa agg ttt ctt cgc ate atg atg cta tea 3798 Ala Ser Gly His Leu Tyr Glu Arg Phe Leu Arg He Met Met Leu Ser 1240 1245 1250 gtc ctg aag aat acc aaa act ect gtg aaa ttc tgg ttc ttg aag aat 3846 Val Leu Lys Asn Thr Lys Thr Pro Val Lys Phe Trp Phe Leu Lys Asn 1255 1260 1265 tat ttg tec ccc acá ttt aag gag ttt ata ect tac atg gcc aaa aaa 3894 Tyr Leu Ser Pro Thr Phe Lys Glu Phe He Pro Tyr Met Ala Lys Lys 1270 1275 1280 1285 tac aat ttc cag tat gag ctt gtt cag tac aaa tgg cea cgg tgg ctt 3942 Tyr Asn Phe Gln Tyr Glu Leu Val Gln Tyr Lys Trp Pro Arg Trp Leu 1290 1295 1300 cae cag cag acc gag aag cag cga att ate tgg ggc tac aag ate etc 3990 His Gln Gln Thr Glu Lys Gln Arg He He Trp Gly Tyr Lys He Leu 1305 1310 1315 ttc ctg gat gtg ctt ttc ceg ttg gtt gtt gac aaa ttc etc ttt gtg 4038 Phe Leu Asp Val Leu Phe Pro Leu Val Val Asp Lys Phe Leu Phe Val 1320 1325 1330 gat gct gat cag att gtg cgg acá gat ctg aag gag tta aga gat ttc 4 Otó Asp Ala Asp Gln He Val Arg Thr Asp Leu Lys Glu Leu Arg Asp Phe 1335 1340 1345 aat ttg gat ggt gca ect tac ggt tac acg ccc ttc tgc gac age agg 4134 Asn Leu Asp Gly Ala Pro Tyr Gly Tyr Thr Pro Phe Cys Asp Ser Arg 1350 1355 1360 1365 aga gag atg gat ggc tac cgc ttc tgg aag tea ggc tac tgg gcc agt 4182 Arg Glu Met Asp Gly Tyr Arg Phe Trp Lys Ser Gly Tyr Trp Ala Ser 1370 1375 1380 cat ttg gct gga cga aag tat cae ate agt gcg ctg tat gtc gtg gat ,4230 His Leu Ala Gly Arg Lys Tyr His He Ser Ala Leu Tyr Val Val Asp 1385 1390 1395 ctg aag aag ttt agg aaa ata gct gct ggt gac aga etc aga gga cag 4278 Leu Lys Lys Phe Arg Lys He Ala Ala Gly Asp Arg Leu Arg Gly Gln 1400 1405 1410 tac caá ggt ctg agt cag gat ccc aac agt ctt tea aat ctt gat caá 4326 Tyr Gln Gly Leu Ser Gln Asp Pro Asn Ser Leu Ser Asn Leu Asp Gln 1415 1420 . 1425 gat ttg ccc aat aac atg ate cat cag gtg cea ate aaa teg etc ect 4374 Asp Leu Pro Asn Asn Met He His Gln Val Pro He Lys Ser Leu Pro 1430 1435 1440 1445 cag gag tgg ctt tgg tgt gag acg tgg tgt gat gat gcc tet aag aag 442.2 Gln Glu Trp Leu Trp Cys Glu Thr Trp Cys Asp Asp Ala Ser Lys Lys 1450 1455 1460 cgg gcc aag acc ate gac ctg tgt aat aat ccc atg act aag gag ccc 447,0 Arg Ala Lys Thr He Asp Leu Cys Asn Asn Pro Met Thr Lys Glu Pro 1465 1470 1475 aaa ctg gag gct gct gtg cgg ate gtc ect gag tgg caá gac tac gac 4518 Lys Leu Glu Ala Ala Val Arg He Val Pro Glu Trp Gln Asp Tyr Asp 1480 1485 1490 cag gag ate aag cag ttg cag acc etc ttc caá gag gag aaa gag ttg 4566 Gln Glu He Lys Gln Leu Gln Thr Leu Phe Gln Glu Glu Lys Glu Leu 1495 1500 1505 ggg acc ctg cat gaa gag gag acá cag gaa gga tet cag aag cat gaa 4614 Gly Thr Leu His Glu Glu Glu Thr Gln Glu Gly Ser Gln Lys His Glu 1510 1515 1520 1525 gaa tta tga tctctggagg aagatagggg acccacgtct gacagttttg 4663 Glu Leu * tactaaatgc tgtttctttc tgatcttttg aaacaactgc tgatgaactg actgattggg 4723 caggtgtatc acaectattg atctgagcat ttgattagac tactgcaccc tagtgggtgc 4783 tagatcettg gggctaaggc tctgttggat ttgtacctca gaggaagaca agtgaccgat 4843 cttctgggac tctcttctcg ccagagggaa ctgaaagaag cccagtcttc ggtgcccaca 4903 tcccagagca cacattgttg tgctggtcca ggagctggcc agaaaggtca ccatgctctt 4963 ccttacctca gtttacctgc agccctcgct gcagtgcaga tgcccacctg taccaggtca 5023 ggccggcaga tgcttcatcc atgcctcgag 5053 <210> 2 <211> 1527 <212> PRT <213> RUGT de Rata <' 100> 2 Met Gly Leu Leu He Ala Leu Ala Leu Leu Cys Leu Phe Ser Leu Ala 1 5 10 15 Glu Ala Asn Ser Lys Ala He Thr Thr Ser Leu Thr Thr Lys Trp Phe 20 25 30 Ser Ala Pro Leu Leu Leu Glu Ala Ser Glu Phe Leu Ala Glu Asp Ser 35 40 45 Gln Glu Lys Phe Trp Ser Phe Val Glu Ala Ser Gln Asn He Gly Ser 50 55 60 Ser Asp Gln His Asp Thr Asp Arg Ser Tyr Tyr Asp Ala He Leu Glu 65 70 75 80 Ala Ala Phe Arg Phe Leu Ser Pro Leu Gln Gln Asn Leu Leu Lys Phe 85 90 95 Cys Leu Ser Leu Arg Ser Tyr Ser Ala Ser He Gln Ala Phe Gln Gln 100 105 110 He Ala Val Asp Glu Pro Pro Pro Glu Gly Cys Lys Ser Phe Leu Ser 115 120 125 Val His Gly Lys Gln Thr Cys Asp Leu Gly Thr Leu Glu Ser Leu Leu 130 135 140 Leu Thr Ala Pro Asp Arg Pro Lys Pro Leu Leu Phe Lys Gly Asp His 145 150 155 160 Arg Tyr Pro Ser Ser Asn Pro Glu Ser Pro Val Val He Phe Tyr Ser 165 170 175 Glu He Gly His Glu Glu Phe Ser Asn He His His Gln Leu He Ser 180 185 190 Lys Ser Asn Glu Gly Lys He Asn Tyr Val Phe Arg His Tyr He Ser 195 200 205 Asn Pro Arg Lys Glu Pro Val His Leu Ser Gly Tyr Gly Val Glu Leu 210 215 220 Ala He Lys Ser Thr Glu Tyr Lys Ala Lys Asp Asp Thr Gln Val Lys 225 230 235 240 Gly Thr Glu Val Asn Thr Thr Val He Gly Glu Asn Asp Pro He Asp 245 250 255 Glu Val Gln Gly Phe Leu Phe Gly Lys Leu Arg Glu Leu Tyr Pro Ser 260 265 270 Leu Glu Gly Gln Leu Lys Glu Phe Arg Lys His Leu Val Glu Ser Thr 275 280 285 Asn Glu Met Ala Pro Leu Lys Val Trp Gln Leu Gln Asp Leu Ser Phe 290 295 300 Gln Thr Ala Ala Arg He Leu Ala Ala Pro Val Glu Leu Ala Leu Val 305 310 315 320 Val Met Lys Asp He Ser Gln Asn Phe Pro Thr Lys Ala Arg Ala He 325 330 335 Thr Lys Thr Ala Val Ser Ala Gln Leu Arg Ala Glu Val siu Glu Asn 340 345 350 Gln Lys Tyr Phe Lys Gly Thr He Gly Leu Gln Pro Gly Asp Ser Ala 355 360 365 Leu Phe He Asn Gly Leu His He Asp Leu Asp Thr Gln Asp He Phe 370 375 380 Ser Leu Phe Asp Thr Leu Arg Asn Glu Ala Arg Val Met Glu Gly Leu 385 390 395 400 His Arg Leu Gly He Glu Gly Leu Ser Leu His Asn He Leu Lys Leu 405 410 415 Asn He Gln Pro Ser Glu Thr Asp Tyr Ala Val Asp He Arg Ser Pro 420 425 430 Ala He Ser Trp Val Asn Asn Leu Glu Val Asp Ser Arg Tyr Asn Ser 435 440 445 Trp Pro Ser Ser Leu Gln Glu Leu Leu Arg Pro Thr Phe Pro Gly Val 450 455 460 He Arg Gln He Arg Lys Asn Leu His Asn Met Val Phe He Val Asp 465 470 475 480 Pro Val His Glu Thr Thr Ala Glu Leu Val Ser He Ala Glu Met Phe 485 490 495 Leu Ser Asn His He Pro Leu Arg He Gly Phe He Phe Val Val Asn 500 505 510 Asp Ser Glu Asp Val Asp Gly Met Gln Asp Ala Gly Val Ala Val Leu 515 520 525 Arg Ala Tyr Asn Tyr Val Gly Gln Glu Val Asp Gly Tyr His Ala Phe 530 535 540 Gln Thr Leu Thr Gln He Tyr Asn Lys Val Arg Thr Gly Glu Lys Val 545 550 555 560 Lys Val Glu His Val Val Ser Val Leu Glu Lys Lys Tyr Pro Tyr Val 565 570 575 Glu Val Asn Ser He Leu Gly He Asp Ser Ala Tyr Asp Gln Asn Arg 580 585 590 Lys Glu Ala Arg Gly Tyr Tyr Glu Gln Thr Gly Val Gly Pro Leu Pro 595 600 605 Val Val Leu Phe Asn Gly Met Pro Phe Glu Lys Glu Gln Leu Asp Pro 610 615 620 Asp Glu Leu Glu Thr He Thr Met Has Lys He Leu Glu Thr Thr Thr 625 630 635 640 Phe Phe Gln Arg Ala Val Tyr Leu Gly Glu Leu Ser His Asp Gln Asp 645 650 655 Val Val Glu Tyr He Met Asn Gln Pro Asn Val Val Pro Arg He Asn 660 665 670 Ser Arg He Leu Thr Ala Lys Arg Glu Tyr Leu Asp Leu Thr Ala Ser 675 680 685 Asn Asn Phe Tyr Val Asp Asp Phe Ala Arg Phe Ser Ala Leu Asp Ser 690 695 700 Arg Gly Lys Thr Ala Ala He Ala Asn Ser Met Asn Tyr Leu Thr Lys 705 710 715 720 Lys Gly Met Ser Ser Lys Glu He Tyr Asp Asp Ser Phe He 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Phe Glu Asp Lys His Ser Ala He Lys Leu Lys Pro Lys Glu Gly Glu 945 950 955 960 Thr Tyr Tyr Asp Val Val Ala Val Val Asp Pro Val Thr Arg Glu Ala 965 970 975 Gln Arg Leu Ala Pro Leu Leu Leu Val Leu Ala Gln Leu He Asn Met 980 985 990 Ser Leu Arg Val Phe Met Asn Cys Gln Ser Lys Leu Ser Asp Met Pro 995 1000 1005 Leu Lys Ser Phe Tyr Arg Tyr Val Leu Glu Pro Glu He Ser Phe Thr 1010 1015 1020 Ala Asp Asn Ser Phe Ala Lys Gly Pro He Ala Lys Phe Leu Asp Met 1025 1030 1035 1040 Pro Gln Ser Pro Leu Phe Thr Leu Asn Leu Asn Thr Pro Glu Ser Trp 1045 1050 1055 Met Val Glu Ser Val Arg Thr Pro Tyr Asp Leu Asp Asn He Tyr Leu 1060 1065 1070 Glu Glu Val Asp Ser He Val Ala Ala Glu Tyr Glu Leu Glu Tyr Leu 1075 1080 1085 Leu Leu Glu Gly His Cys Tyr Asp He Thr Thr Gly Gln Pro Pro Arg 1090 1095 1100 Gly Leu Gln Phe Thr Leu Gly Thr Ser Ala Asn Pro Thr Thr Val Asp 1105 1110 1115 1120 Thr He Val Met Ala Asn Leu Gly Tyr Phe Gln Leu Lys Ala Asn Pro 1125 1130 1135 Gly Ala Trp He Leu Arg Leu Arg Lys Gly Arg Ser Asp Asp He Tyr 1140 1145 1150 Arg He Tyr Ser His Asp Gly Thr Asp Ser Pro Pro Asp Ala Asn Asp 1155 1160 1165 Val Val Val He Leu Asn Asn Phe Lys Ser Lys He He Lys Val Lys 1170 1175 1180 Val Gln Lys Lys Ala Asp Met Ala Asn Glu Asp Leu Leu Ser Asp Gly 1185 1190 1195 1200 Thr Asn Glu Asn Glu Ser Gly Phe Trp Asp Ser Phe Lys Trp Gly Phe 1205 1210 1215 Ser Gly Gln Lys Thr Glu Glu Val Lys Gln Asp Lys Asp Asp He He 1220 1225 1230 Asn He Phe Ser Val Ala Ser Gly His Leu Tyr Glu Arg Phe Leu Arg 1235 1240 1245 He Met Met Leu Ser Val Leu Lys Asn Thr Lys Thr Pro Val Lys Phe 1250 1255 1260 Trp Phe Leu Lys Asn Tyr Leu Ser Pro Thr Phe Lys Glu Phe He Pro 1265 1270 1275 1280 Tyr Met Ala Lys Lys Tyr Asn Phe Gln Tyr Glu Leu Val Gln Tyr Lys 1285 1290 1295 Trp Pro Arg Trp Leu His Gln Gln Thr Glu Lys Gln Arg He He Trp 1300 1305 1310 Gly Tyr Lys He Leu Phe Leu Asp Val Leu Phe Pro Leu Val Val Asp 1315 1320 1325 Lys Phe Leu Phe Val Asp Ala Asp Gln He Val Arg Thr Asp Leu Lys 1330 1335 1340 Glu Leu Arg Asp Phe Asn Leu Asp Gly Ala Pro Tyr Gly Tyr Thr Pro 1345 1350 1355 1360 Phe Cys Asp Ser Arg Arg Glu Met Asp Gly Tyr Arg Phe Trp Lys Ser 1365 1370 1375 Gly Tyr Trp Ala Ser His Leu Ala Gly Arg Lye Tyr His He Ser Ala 1380 1385 1390 Leu Tyr Val Val Asp Leu Lys Lys Phe Arg Lys He Ala Ala Gly Asp 1395 1400 1405 Arg Leu Arg Gly Gln Tyr Gln Gly Leu Ser Gln Asp Pro Asn Ser Leu 1410 1415 1420 Ser Asn Leu Asp Gln Asp Leu Pro Asn Asn Met He His Gln Val Pro 1425 1430 1435 1440 He Lys Ser Leu Pro Gln Glu Trp Leu Trp Cys Glu Thr Trp Cys Asp 1445 1450 1455 Asp Ala Ser Lys Lys Arg Ala Lys Thr He Asp Leu Cys Asn Asn Pro 1460 1465 1470 Met Thr Lys Glu Pro Lys Leu Glu Ala Ala Val Arg He Val Pro Glu 1475 1480 1485 Trp Gln Asp Tyr Asp Gln Glu He Lys Gln Leu Gln Thr Leu Phe Gln 1490 1495 1500 Glu Glu Lys Glu Leu Gly Thr Leu His Glu Glu Glu Thr Gln Glu Gly 1505 1510 1515 1520 Ser Gln Lys His Glu Glu Leu 1525 <210> 3 <211> 76 <212> ADN <213> Secuencia de Péptido de Señal de Melitina <220> <221> CDS <222> (14) ... (76) <221> varios_aspectos <222> (1) ... (7) <223> Sito de restricción Rsr II <221> varios_aspectos <222> (37) ... (42) <223> Sitio de REstricción I de Spe <400> 3 cggtccgcac aag atg aaa ttc tta gtc aac gtt gca cta gtt ttt atg 49 Met Lys Phe Leu Val Asn Val Ala Leu Val Phe Met 1 5 10 gtc gtg tac att tet tac ate tat gcg 76 Val Val Tyr He Ser Tyr He Tyr Ala 15 20 <210> 4 <211> 21 <212> PRT <213> Secuencia de Péptido de Señal de Melitina <400> 4 Met Lys Phe Leu Val Asn Val Ala Leu Val Phe M«t Val Val Tyr He 1 5 10 15 Ser Tyr He Tyr Ala 20 <210 > 5 <211> 48 <212 > ADN <213 > C- terminal (His ) 6 tag <220> <221> CDS <222> (1) . (36) <221> varios_aspectos <222> (43) ... (48) <223> Sitio de Restricción de Kpn <400> 5 cag gaa gga tet cag aag cat cae cat cae cat cae tgataaggta 46 Gln Glu Gly Ser Gln Lys His His His His His His 1 5 10 ce 48 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> C-terminal (His) 6 tag <400> 6 Gln Glu Gly Ser Gln Lys His His His His His His 1 5 10 <210> 7 <211> 57 <212> ADN <213> D1334A RUGT Mutante <220> <221> CDS <222> (1) . (57) <221> varios_aspectos <222> (32) ... (37) <223> Sitio de Restricción de Pet I <400> 7 ceg ttg gtt gtt gac aaa ttc etc ttt gtg gct gca gat cag att gtg 48 Pro Leu Val Val Asp Lys Phe Leu Phe Val Ala Ala Asp Gln He Val 1 5 10 15 cgg acá gat 57 Arg Thr Asp <210> 8 <211> 19 <212> PRT <213> D1334A RUGT Mutante <400> 8 Pro Leu Val Val Asp Lys Phe Leu Phe Val Ala Ala Asp Gln He Val 1 5 10 15 Arg Thr Asp <210> 9 <211> 57 <212> ADN <213> D1336A RUGT Mutante <220> <221> CDS <222> (1) ... (57) <221> varios_aspectos <222> (35) ... (40) <223> Sitio de Restricción de BsrBI <400> 9 ceg ttg gtt gtt gac aaa ttc etc ttt gtg gat gcc gct cag att gtg 48 Pro Leu Val Val Asp Lys Phe Leu Phe Val Asp Ala Ala Gln He Val 1 5 10 15 cgg acá gat 57 Arg Thr Asp <210> 10 <211> 19 <212> PRT <213> D1336A RUGT Mutante <400> 10 Pro Leu Val Val Asp Lys Phe Leu Phe Val Asp Ala Ala Gln He Val 1 5 10 15 Arg Thr Asp <210> 11 <211> 57 <212> ADN <213> Q1429A RUGT Mutante <220> <221> CDS <222> (1) ... (57) <221> varios_aspectos <222> (3) ... (8) <223> Sitio de restricción de BamHI <221> varios_aspectos <222> (24) ... (29) <223> Sitio de Restricción de Xba I <400> 11 cag gat ccc aac agt ctt tea aat cta gat gca gat ttg ccc aat aac Gln Asp Pro Asn Ser Leu Ser Asn Leu Asp Ala Asp Leu Pro Asn Asn 1 5 10 15 atg ate cat 57 Met He His <210> 12 <211> 19 <212> PRT <213> Q1429A RUGT Mutante <400> 12 Gln Asp Pro Asn Ser Leu Ser Asn Leu Asp Ala Asp Leu Pro Asn Asn 1 5 10 15 Met He His <210> 13 <211> 57 <212> ADN <213> N1433A RUGT Mutante <220> <221> CDS <222> (1) ... (57) <221> varios_aspectos <222> (3) ... (8) <223> Sitio de restricción de Bam Hl <221> vapos_aspectos <222> (39) ... (44) <223> Sitio de Restricción de Nae I <400> 13 cag gat ccc aac agt ctt tea aat ctt gat caá gat ttg ceg gct aac 48 Gln Asp Pro Asn Ser Leu Ser Asn Leu Asp Gln Asp Leu Pro Ala Asn 1 5 10 15 atg ate cat 57 Met He His <210> 14 <211 > 19 <212 > PRT <213 > N1433A RUGT Mutante <400 > 14 Gln Asp Pro Asn Ser Leu Ser Asn Leu Asp Gln Asp Leu Pro Ala Asn 1 5 10 15 Met He His <210 > 15 <211> 1548 <212> PRT <213> Secuenc.ia afét-Uif;icia! 1 <220> <223> D. melanogaster' UGGT <400> 15 Met Leu Arg Ala Val Ala Leu Cys Val Ser Val Val Leu He Ala Leu 1 5 10 15 Tyr Thr Pro Thr Ser Gly Glu Ser Ser Gln Ser Tyr Pro He Thr Thr 20 25 30 Leu He Asn Ala Lys Trp Thr Gln Thr Pro Leu Tyr Leu Glu He Ala 35 40 45 Glu Tyr Leu Ala Asp Glu Gln Ala Gly Leu Phe Trp Asp Tyr Val Ser 50 55 60 Gly Val Thr Lys Leu Asp Thr Val Leu Asn Glu Tyr Asp Thr Glu Ser 65 70 75 80 Gln Gln Tyr Asn Ala Ala Leu Glu Leu Val Lys Ser His Val Ser Ser 85 90 95 Pro Gln Leu Pro Leu Leu Arg Leu Val Val Ser Met His Ser Leu Thr 100 105 110 Pro Arg He Gln Thr His Phe Gln Leu Ala Glu Glu Leu Arg Ser Ser 115 120 125 Gly Ser Cys Gln Ser Phe Thr Phe Ala Gln Val Gly Ser Glu Leu Ala 130 135 140 Cys Ser Phe Asn Glu Leu Gln Lys Lys Leu Glu Val Pro Leu Ala Lys 145 150 155 160 Asp Ser Leu Asp Ala Pro Val Val Thr Tyr Ser Phe Asp His He Phe 165 170 175 Pro Gly Ser Glu Asn Asn Thr Arg Thr Val Val Leu Tyr Gly Asp Leu 180 185 190 Gly Ser Ser Gln Phe Arg Thr Tyr His Lys Leu Leu siu Lys Glu Ala 195 200 205 Asn Ala Gly Arg He Arg Tyr He Leu Arg His Gln Leu Ala Lys Lys 210 215 220 Asp Lys Arg Pro Val Arg Leu Ser Gly Tyr Gly Val Glu Leu His Leu 225 230 235 240 Lys Ser Thr Glu Tyr Lys Ser Gln Asp Asp Ala Pro Lys Pro Glu Ala 245 250 255 Gly Ser Thr Ser Asp Glu Asp Leu Ala Asn Glu Ser Asp Val Gln Gly 260 265 270 Phe Asp Phe Lys Val Leu Lys Gln Lys His Pro Thr Leu Lys Arg Ala 275 280 285 Leu Asp Gln Leu Arg Gln Arg Leu Leu Gln Gly Asn Asp siu He Ala 290 295 300 Gln Leu Lys Ala Trp Glu Phe Gln Asp Leu Gly Leu Gln Ala Ala Ala 305 310 315 320 Ala He Ala Glu He Gln Gly Asp Glu Thr Leu Gln He Leu Gln Tyr 325 330 335 Thr Ala His Asn Phe Pro Met Leu Ala Arg Thr Leu Leu Ala His Lys 340 345 350 Val Thr Asp Cly Leu Arg Ala Glu Val Lys His Asn Thr Glu Ala Phe 355 360 365 Gly Arg Ser Leu Asn Val Ala Pro Pro Asp Gly Ala Leu Phe He Asn 370 375 380 Gly Leu Phe Phe Asp Ala Asp Thr Met Asp Leu Tyr Ser Leu He Glu 385 390 395 400 Thr Leu Arg Ser Glu Met Arg Val Leu Glu Ser Leu His Ser Asn Asn 405 410 415 ? j 1 ( 1 ií Val Arg Gly Ser Leu Ala Ser Ser Leu Leu Ala Leu Asp Leu Thr Ala 420 425 430 Ser Ser Lys Lys Glu Phe Ala He Asp He Arg ASp Thr Ala Val Gln 435 440 445 Trp Val Asn Asp He Glu Asn Asp Val Gln Tyr Arg Arg Trp Pro Ser 450 455 460 Ser Val Met Asp Leu Leu Arg Pro Thr Phe Pro Gly Met Leu Arg Asn 465 470 475 480 He Arg Lys Asn Val Phe Asn Leu Val Leu Val Val Asp Ala Leu Gln 485 490 495 Pro Thr Ala Arg Ser Val He Lys Leu Ser Glu Ser Phe Val He His 500 505 510 Gln Ala Pro He Arg Leu Gly Leu Val Phe Asp Ala Arg Asp Ala Asn 515 520 525 Glu Asp Asn Leu Ala Asp Tyr Val Ala He Thr Cys Ala Tyr Asn Tyr 530 535 540 Val Ser Gln Lys Lys Asp Ala Arg Ala Ala Leu Ser Phe Leu Thr Asp 545 550 555 560 He Tyr Ala Ala Val Gly Glu Thr Lys Val Val Thr Lys Lys Asp He 565 570 575 Val Lys Gln Leu Thr Lys Glu Phe Thr Ser Leu Ser Phe Ala Lys Ala 580 585 590 Glu Glu Phe Leu Glu Glu Asp Ser Thr Tyr Asp Tyr Gly Arg Glu Leu 595 600 605 Ala Ala Glu Phe He Gln Arg Leu Gly Phe Gly Asp Lys Glu Gln Pro 610 615 620 Gln Ala Leu Leu Asn Gly Val Pro Met Pro Ser Asn Val Val Thr Ala 625 630 635 640 Asp Ser Asp Phe Glu Glu Ala He Phe Thr Glu He Met Thr His Thr 645 650 655 Ser Asn Leu Gln Lys Ala Val Tyr Lys Gly Glu Leu Thr Asp Asn Asp 660 665 670 Val Ala He Asp Tyr Leu Met Asn Gln Pro His Val Met Pro Arg Leu 675 680 685 Asn Gln Arg He Leu Ser Gln Glu Asp Val Lys Tyr Leu Asp He Asn 690 695 700 Gly Val Ala Tyr Lys Asn Leu Gly Asn Val Gly Val Leu Asn Arg Leu 705 710 715 720 Ser Asn Arg Asp Met Thr Ala Thr Leu Met Asp Asn Leu Lys Tyr Phe 725 730 735 Gly Gly Lys Lys Ser 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He Tyr Ala He Ser His He Glu Gly Thr Asn Thr His His 1155 1160 1165 Ser Ala Gly Ser Ser Glu Val Gln Val Leu He Thr Ser Leu Arg Ser 1170 1175 1180 His Val Val Lys Leu Arg Val Ser Lys Lys Pro Gly Met Gln Gln Ala 1185 1190 1195 1200 Glu Leu Leu Ser Asp Asp Asn Glu Gln Ala Ala Gln Ser Gly Met Trp 1205 1210 1215 Asn Ser He Ala Ser Ser Phe Gly Gly Gly Ser Ala Asn Gln Ala Ala 1220 1225 1230 Ser Asp Glu Asp Thr Glu Thr He Asn He Phe Ser Val Ala Ser Gly 1235 1240 1245 His Leu Tyr Glu Arg Leu Leu Arg He Met Met Val Ser Leu Leu Lys 1250 1255 1260 His Thr Lys Ser Pro Val Lys Phe Trp Phe Leu Lys Asn Tyr Leu Ser 1265 1270 1275 1280 Pro Gln Phe Thr Asp Phe Leu Pro His Met Ala Ser Glu Tyr Asn Phe 1285 1290 1295 Gln Tyr Glu Leu Val Gln Tyr Lys Trp Pro Arg Trp Leu His Gln Gln 1300 1305 1310 Thr Glu Lys Gln Arg Thr He Trp Gly Tyr Lys He Leu Phe Leu Asp 1315 1320 1325 Val Leu Phe Pro Leu Asn Val Arg Lys He He Phe Val Asp Ala Asp 1330 1335 1340 Ala He Val Arg Thr Asp He Lys Glu Leu Tyr Asp Met Asp Leu Gly 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Artificial <220> <223 > C elegans UGGT << 100> 16 Met Asn Leu Thr Gly Leu Leu He Phe Phe Cys His He Ala Val Leu 1 5 10 15 Ala Ala Leu Glu Lys Lys Gly Val His Thr Ser Leu Lys Ala Asn Trp 20 25 30 Asp Ser Thr Ser Leu Leu Ala Glu Ala Ser Glu Phe He Ala Glu Glu 35 40 45 Asn Glu Lys Leu Phe Val Lys Phe He Asp He Val Asn Lys Asp Val 50 55 60 Gly Thr Leu Asn Trp Glu Lys Leu Thr Asp Glu Gln Lys Tyr Glu Tyr 65 70 75 80 Thr He Lys Thr Ala Gly Lys Val Leu Ser Thr Ser Ser Val Asp Leu 85 90 95 Leu Lys Phe Ala Leu Ala Leu Arg Gln Tyr Ser Pro Arg Val Gln Ser 100 105 110 Phe Gln Gln He Ala Val Glu Tyr Gly Glu Lys Cys Asp Val Phe Val 115 120 125 Val Val Gly Glu Gln Val Ser Cys Glu Tyr Thr Lys Leu Glu Lys Met 130 135 140 He Lys Asp Ala Lys Thr Asn Ser Gln Val Leu Glu Ser Asp His He 145 150 155 160 Phe Gly Glu Lys Asp Leu Lys Gln Ala Ala He Leu Tyr Gly Glu Leu 165 170 175 Gly Thr Thr Ser Phe Ala Lys Ala Trp Glu Lys Leu Ser Lys Leu Gln 180 185 190 Lys Thr Lys Leu He Phe Arg His Phe Ser Lys Lys Thr Asp Ser 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Arg 405 410 415 Glu Gly Tyr Pro Phe Phe He Asn Asn Leu Asp Thr Asp Lys Lys Tyr 420 425 430 Lys Gln Trp Gly Asn Ser Val Lys Leu Met Leu Gln Pro Tyr Tyr Pro 435 440 445 Gly Met He Arg Pro He Ala Arg Asn Leu Phe Ser Leu Val Phe Val 450 455 460 Val Asp Pro Ser Thr Ser Glu Gly Arg Lys Phe Leu Arg He Gly Gln 465 470 475 480 Thr Phe Asn Ser His Asp He Ala Met Arg He Gly Tyr He Phe Ala 485 490 495 Val Asn Gln Asp Thr Lys Ala Ser Gly Glu Thr Asp Leu Gly Val Ala 500 505 510 Leu Leu Asn Leu Phe Asn Phe Val Ser He Asp Ser Ser Asn Ala Asp 515 520 525 Ala Leu Lys Val Leu Asn Asn Phe Leu Asp Asp Tyr Arg Ser Lys Asp 530 535 540 Pro Thr He Glu Asp He Lys Glu Phe Phe Glu Ala Lys Phe Ser Asp 545 550 555 560 Ala Ser Phe Ser Asp Val Phe Gly Val Asn Ser Asp Tyr Asp Lys Gly 565 570 575 Arg Lys His Gly Phe Glu Phe Val Gln Lys Thr Gly Leu Asn Ser Ala 580 585 590 Pro Lys Val Leu Leu Asn Gly Phe He Leu Asp Asp Glu Gly Val Arg 595 600 605 Gly Asp Asn He Glu Glu Thr He Met Met Glu Val Met Lys He Ser 610 615 620 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Tyr Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Leu Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Leu Xaa Phe 65 70 75 80 Xaa Leu Ser Leu Xaa Ser Xaa Xaa Pro Xaa He Gln Xaa Phe Xaa Gln 85 90 95 He Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Cys Xaa Ser Xaa Xaa 100 105 110 Phe Xaa Xaa Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Leu 115 120 125 Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 130 135 140 Val Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Asp His Xaa Xaa Xaa Gly Ser Xaa Xaa Xaa 145 150 155 160 Xaa Pro Xaa Xaa He Leu Tyr Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Phe Xaa Xaa Xaa Xaa His Xaa Leu Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Asn Xaa Glu 180 185 190 Gly Lys Xaa Xaa Tyr He Xaa Arg His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 195 200 205 Xaa Xaa Xaa Pro Val Xaa Leu Ser Gly Tyr Gly Val Glu Leu Xaa Xaa 210 215 220 Lys Ser Thr Glu Tyr Lys Xaa Xaa Asp Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 225 230 235 240 Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 245 250 255 Xaa Gly Phe Xaa Phe Xaa Xaa Leu Lys Xaa Leu Xaa Pro Xaa Leu Xaa 260 265 270 Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Glu 275 280 285 Xaa Ala Xaa Leu Lys Xaa Trp Glu Leu Gln Asp Leu Xaa Xaa Gln Ala 290 295 300 Ala Xaa Xaa He Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 305 310 315 320 Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Asn Phe Pro Xaa Xaa Ala 325 330 335 Arg Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Ser Xaa Xaa Leu Arg Xaa Glu 340 345 350 Val Xaa Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 355 360 365 Gly Xaa Xaa Xaa Leu Xaa He Asn Gly Leu Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Xaa 370 375 380 Xaa Asp Xaa Phe Ser Leu Xaa Xaa Xaa Leu Lys Xaa Glu Xaa Xaa Xaa 385 390 395 400 Xaa Xaa Xaa Xaa His Xaa Leu Gly He Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 405 410 415 He Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Ala Xaa 420 425 430 Asp Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp He Arg Xaa Xaa 435 440 445 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Trp Val Asn Xaa He Glu Xaa Asp 450 455 460 Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Trp Pro Xaa Ser Val Gln Xaa Leu Leu Xaa Pro 465 470 475 480 Xaa Xaa Pro Gly Xaa Leu Arg Xaa He Xaa Lys Asn Leu Xaa Xaa Xaa 485 490 495 Val Phe Val Val Asp Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 500 505 510 Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Arg Xaa Gly Xaa 515 520 525 Val Phe Ala Val Asn Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Xaa 530 535 540 Xaa Val Ala Xaa Leu Xaa Xaa Phe Asn Tyr Val Ser Xaa Xaa Ser Asp 545 550 555 560 Xaa Xaa Xaa Ala Leu Xaa Xaa Leu Xaa Xaa He Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa 565 570 575 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Glu Xaa 580 585 590 Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa 595 600 605 Xaa Xaa Ser Xaa Tyr Asp Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 610 615 620 Xaa Xaa Leu Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Val Leu Xaa Asn 625 630 635 640 Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Asn Xaa Glu 645 650 655 Xaa Xaa He Xaa Xaa Xaa He Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Gln Xaa 660 665 670 Ala Val Xaa Xaa Gly Xaa Leu Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa 675 680 685 Xaa Xaa Leu Xaa Gln Xaa Xaa Val Xaa Pro Arg Xaa Asn Xaa Arg He 690 695 700 Leu Xaa Ser Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Asp He Xaa Xaa Xaa 705 710 715 720 Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu 725 730 735 Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Tyr Xaa 740 745 750 Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 755 760 765 Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Trp Val Ala Asp Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Gly 770 775 780 Arg Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 785 790 795 800 Val Arg Xaa Xaa Xaa He Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 805 810 815 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Ala Leu Xaa Xaa Xaa 820 825 830 Pro Xaa Xaa Xaa Ala Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Lys Xaa Xaa 835 840 845 Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 850 855 860 Val Gly Gly Met Asp Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 865 870 875 880 Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa * i t t * 885 890 895 Xaa Xaa Val Leu Xaa Leu "Xa Lys Xaa sln Arg Xaa Val He Xaa Asn 900 905 910 Gly Arg Xaa He Gly Pro Leu Xaa Ser Xaa Glu Xaa Phe Xaa Xaa Ala 915 920 925 Asp Phe Xaa Leu Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys 930 935 940 He Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Asn Xaa Xaa Xaa 945 950 955 960 Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 965 970 975 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Pro 980 985 990 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Xaa His Ser Val Xaa Xaa Xaa Thr Leu Xaa 995 1000 1005 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Val Xaa Ala Val Leu Asp 1010 1015 1020 Pro Leu Xaa Xaa Xaa Ala Gln Lys Leu Xaa Xaa He Leu Xaa Xaa Xaa 1025 1030 1035 1040 Xaa Xaa Leu Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Asn Pro Xaa Xaa 1045 1050 1055 Xaa Leu Ser Xaa Xaa Pro Leu Lys Arg Phe Tyr Arg Tyr Xaa Xaa Xaa 1060 1065 1070 Xaa Glu Xaa Xaa Phe Asp Ala Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1075 1080 1085 Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Leu Pro Xaa Xaa Pro Leu Leu Thr Xaa Xaa Leu 1090 1095 1100 Xaa Xaa Pro Xaa Ser Xaa Trp Val Glu Xaa Val Xaa Xaa Xaa Tyr Asp 1105 1110 1115 1120 Leu Asp Asn He Lys Leu Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1125 1130 1135 Xaa Val Xaa Ala Glu Phe Xaa Leu Xaa Xaa Leu Leu Leu Xaa Gly Xaa 1140 1145 1150 Cys Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Pro Pro Arg Gly Leu Gln Leu Xaa 1155 1160 1165 Leu Gly Thr Xaa Xaa Asn Pro Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Thr He Val Met 1170 1175 1180 Ala Asn Leu Gly Tyr Phe Gln Leu Xaa Xaa Xaa Lys Ala Asn Pro Gly 1185 1190 1195 1200 Ala Xaa Trp Leu Xaa Xaa Arg Asp Gly Arg Ser Xaa Xaa He Tyr Xaa 1205 1210 1215 He Xaa Ser His Xaa Xaa Gly Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Xaa 1220 1225 1230 Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Val Xaa Xaa Xaa Ser Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1235 1240 1245 Xaa Val Xaa Val Xaa Lys Lys Pro Gly Met Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Leu 1250 1255 1260 Ser Asp Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Gly Xaa Xaa Trp Ser 1265 1270 1275 1280 Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1285 1290 1295 Xaa Asp Xaa Xaa Xaa He Asn He Phe Ser Val Xaa Ala Ser Gly Xaa 1300 1305 1310 His Leu Tyr Glu Arg Phe Leu Arg He Met Xaa Xaa Ser Val Leu Lys 1315 1320 1325 Xaa Xaa Xaa Thr Lys Xaa Pro Val Lys Phe Trp Phe Leu Lys Asn Xaa 1330 1335 1340 Tyr Leu Ser Pro Xaa Phe Lys Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Ala Lys Xaa 1345 1350 1355 1360 Tyr Asn Phe Xaa Tyr Glu Leu He Xaa Xaa Xaa Tyr Lys Trp Pro Arg >* ' 65 'i '4' m 1365 * 1370 1375 Trp Leu His QgA Gln Xaa Xaa Xaa Glu Lys Gln Arg Xaa He Trp Gly 1380 1385 1390 Tyr Lys He Leu Phe Leu Asp Val Leu Phe Pro ^ Xaa Val Xaa Lys 1395 1400 1405 Val He Phe Val Asp Ala Asp Gln He Val Arg Xaa ftsp Leu Xaa Glu 1410 1415 1420 Leu Xaa Asp Phe Asp Xaa Leu Xaa Gly Ala Pro Tyr Gly Tyr Thr Pro 1425 1430 1435 1440 Phe Cys Asp Ser Arg Xaa Glu Met Asp Gly Phe Arg Phe Trp Lys Xaa 1445 1450 1455 Gly Tyr Xaa Xaa Trp His Leu Xaa Gly Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr His 1460 1465 1470 He Ser Ala Leu Tyr Val Val Asp Leu Xaa Arg Phe Arg Lys He Ala 1475 1480 1485 Ala Gly Asp Arg Leu Arg Gly Gln Tyr Gln Xaa Leu Ser Xaa Asp Pro 1490 1495 1500 Asn Ser Leu Ser Asn Leu Asp Gln Asp Leu Pro Asn Asn Met He His 1505 1510 1515 1520 Gln Val Pro He Lys Ser Leu Pro Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Leu Trp 1525 1530 1535 Cys Glu Thr Trp Cys Xaa Asp Xaa Ser Lys Lys Xaa Ala Lys Thr He 1540 1545 1550 Asp Leu Cys Asn Asn Pro Xaa Thr Lys Glu Xaa Lys Leu Xaa Xaa Ala 1555 1560 1565 Xaa Arg He Val Xaa Glu Xaa Trp Asp Tyr Asp Xaa Glu He Xaa Xaa 1570 1575 1580 Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1585 1590 1595 1600 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1605 1610 1615 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His Xaa Glu Leu 1620 1625 <210> 20 <211> 115 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> UGGT-H. sap <400> 20 Pro Leu Ala Val Asp Lys He He Phe Val Asp Ala Asp Gln He Val 1 5 10 15 Arg His Asp Leu Lys Glu Leu Arg Asp Phe Asp Leu Asp Gly Ala Pro 20 25 30 Tyr Gly Tyr Thr Pro Phe Cys Asp Ser Arg Arg Glu Met Asp Gly Tyr 35 40 45 Arg Phe Trp Lys Thr Gly Tyr Trp Ala Ser His Leu Leu Arg Arg Lys 50 55 60 Tyr His He Ser Ala Leu Tyr Val Val Asp Leu Lys Lys Phe Arg Arg 65 70 75 80 He Gly Ala Gly Asp Arg Leu Arg Ser Gln Tyr Gln Ala Leu Ser Gln 85 90 95 Asp Pro Asn Ser Leu Ser Asn Leu Asp Gln Asp Leu Pro Asn Asn Met 100 105 110 He His Gln 115 <210> 21 <211> 73 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> UGGT-A. tha <400> 21 Pro Leu Ser Leu Glu Lys Val He Phe Val Asp Ala Asp Gln He He 1 5 10 15 Arg Xaa Asp Met Gly Glu Leu Tyr Asp Met Asp He Lys Gly Arg Pro 20 25 30 Leu Ala Tyr Thr Pro Phe Cys Asp Asn Asn Arg Xaa Met Asp Gly Tyr 35 40 45 Lys Phe Trp Lys Gln Gly Phe Trp Lys Glu His Leu Arg Gly Arg Pro 50 55 60 Tyr His He Gln Cys Ser He Arg Cys 65 70 <210> 22 <211> 115 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> UGGT-0. sat <400> 22 Pro Leu Ser Leu Arg Lys Val He Phe Val Asp Ala Asp Gln He Val 1 5 10 15 Arg Ala Asp Met Gly Glu Leu Tyr Asp Met Asn Leu Lys Gly Arg Pro 20 25 30 Leu Ala Tyr Thr Pro Phe Cys Aep Asn Asn Lys Glu Met Asp Gly Tyr 35 40 45 Arg Phe Trp Lys Gln Gly Phe Trp Lys Asp His Leu Arg Gly Arg Pro 50 55 60 Tyr His He Ser Ala Leu Tyr Val Val Asp Leu Ala Lys Phe Arg Gln 65 70 75 80 Thr Ala Ser Gly Asp Thr Leu Arg Val Phe Tyr Glu Thr Leu Ser Lys 85 90 95 Asp Pro Asn Ser Leu Ser Asn Leu Asp Gln Asp Leu Pro Asn Tyr Ala 100 105 110 Gln His Thr 115 <210> 23 <211> 110 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> GALT-E. col <400> 23 He Asn Lys Ala Pro Lys Val Leu Tyr Leu Asp Ala Asp He He Cys 1 5 10 15 Gln Gly Thr He Glu Pro Leu He Asn Phe Ser Phe Pro Asp Asp Lys 30 Val Ala Met Val Val Thr Glu Gly Gln Ala Asp Trp Trp Glu Lys Arg 35 40 45 Ala His Ser Leu Gly Val Ala Gly He Ala Lys Gly Tyr Phe Asn Ser 50 55 60 Gly Phe Leu Leu He Asn Thr Ala Gln Trp Ala Ala Gln Gln Val Ser 65 70 75 80 Ala Arg Ala He Ala Met Leu Asn Glu Pro Glu He He Lys Lys He 85 90 95 Thr His Pro Asp Gln Asp Val Leu Asn Met Leu Leu Ala Asp 100 105 110 < 210> 24 < 211> 110 < 212> PRT < 213> Secuenc:ia Artif:icia! 1 < 220> < 223> GALT-S. typ < 400> 24 Gln He Lys Gln He Lys Val Leu Tyr Leu Asp Ala Asp He Ala Cys 1 5 10 15 Lys Gly Ser He Gln Glu Leu He Asp Leu Asn Phe Ala Glu Asn Glu 20 25 30 He Ala Ala val Val Ala Glu Gly Glu Leu Glu Trp Trp Thr Asn Ala 35 40 45 Arg Leu Ser Leu Ala Thr Pro Gly Leu Val Ser Gly Tyr Phe Asn Ala 50 55 60 Gly Phe He Leu He Xaa He Pro Leu Trp Thr Ala Glu Asn He Ser 65 70 75 80 Lys Lys Ala He Glu Met Leu Lys Asp Pro Glu Val Val Gln Arg He 85 90 95 Thr His Leu Asp Gln Asp Val Leu Asn He Phe Leu Val Asn 100 105 110 <: 210> 25 <:211> 106 <:212> PRT <: 213> Secuencia Artificial <; 220> <! 223> GLUT-E. col o 400> 25 Gly Leu Thr Leu Asp Arg Leu Leu Tyr Leu Asp Ala Asp Val Val Cys 1 5 10 15 Lys Gly Asp He Ser Gln Leu Leu His Leu Gly Leu Asn Gly Ala Val 20 25 30 Ala Ala Val Val Lys Asp Val Glu Pro Met Gln Glu Lys Ala Val Ser 35 40 45 Arg Leu Ser Asp Pro Glu Leu Leu Gly Gln Tyr Phe Asn Ser Gly Val 50 55 60 Val Tyr Leu Asp Leu Lys Lys Trp Ala Asp Ala Lys Leu Thr Glu Lys 65 70 75 80 Ala Leu Ser He Leu Met Ser Lys Asp Asn Val Tyr Lys Tyr Pro Asp 85 90 95 Gln Asp Val Met Asn Val Leu Leu Lys Gly 100 105 <210> 26 <211> 107 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> GLUT-S. typ <400> 26 Ser Lys Lys Val Asn Thr Leu Leu Tyr Leu Asp Ala Asp Val Val Cys 1 5 10 15 Lys Gly Ser Leu Ala Asp Leu Leu Gln Leu Asp Leu Thr Glu Lys He 20 25 30 Ala Ala Val Val Lys Asp Val Asp Ser He Gln Asn Lys Val Asn Glu 35 40 45 Arg Leu Ser Ala Phe Asn Leu Gln Gly Gly Tyr Phe Asn Ser Gly Val 50 55 60 Val Phe Val Asn Leu Lys Leu Trp Lys Glu Asn Ala Leu Thr Lys Lys 65 70 75 80 Ala Phe Leu Leu Leu Ala Gly Lys Glu Ala Asp Ser Phe Lys Tyr Pro 85 90 95 Asp Gln Asp Val Leu Asn He Leu Leu Gln Asp 100 105 <210> 27 <211> 106 <212> PRT <213> Secuenc:?a Artificial <220> <223> GLUT-H. inf <400> 27 He Lys Asn He Glu Lys Ala He Tyr He Asp Val Asp Thr Leu Thr 1 5 10 15 Asn Ser Ser Leu Gln Glu Leu Trp Aen He Asp He Thr Asn Tyr Tyr 20 25 30 Leu Ala Ala Cys Arg Asp Thr Phe He Asp Val Lys Asn Glu Ala Tyr 35 40 45 Lys Lys Thr He Gly Leu Glu Gly Tyr Ser Tyr Phe Asn Ala Gly He 50 55 60 Leu Leu He Asn Leu Asn Lye Trp Lye Glu Glu Asn He Phe Gln Lys 65 70 75 80 Ser He Asn Trp Met Asn Lys Tyr Asn Asn Val Met Lys Tyr Gln Asp 85 90 95 Gln Asp He Leu Asn Gly He Cys Lys Gly 100 105 <210> 28 <211> 106 <212> PRT <213> Secuenc: La Artificial <220> <223> GLYT-N. gon <400> 28 He Ala Asp Cys Asp Lys Val Leu Tyr Leu Asp Thr Asp Val Leu Val 1 5 10 15 Arg Asp Gly Leu Lys Pro Leu Trp Asp Thr Asp Leu Gly Gly Asn Trp kíii-l 20 *'*"l .'$5 30 Val Gly Ala Cys He Asp Le?f Í Val Glu Arg Gln Glu Gly Tyr Lys 35 40 45 Gln Lys He Gly Met Ala Asp Gly Glu Tyr Tyr Phe Asn Ala Gly Val 50 55 60 Leu Leu He Asn Leu Lys Lys Trp Arg Arg His Asp He Phe Lys Met 65 70 75 80 Ser Cys Glu Trp Val Glu Gln Tyr Lys Asp Val Met Gln Tyr Gln Asp 85 90 95 Gln Asp He Leu Asn Gly Leu Phe Lys Gly 100 105 <210> 29 <211> 105 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> GSPA-B. sub <400> 29 Asp Glu Ser He Lys Arg Met He Tyr He Asp Cys Asp Ala Leu Val 1 5 10 15 Leu Glu Asp He Ser Lys Leu Trp Asp Leu Asp He Ala Pro Tyr Thr 20 25 30 Val Ala Ala Val Glu Asp Ala Gly Gln His Glu Arg Leu Lys Glu Met 35 40 45 Asn Val Thr Asp Thr Gly Lys Tyr Phe Asn Ser Gly He Met He He 50 55 60 Asp Phe Glu Ser Trp Arg Lys Gln Asn He Thr Glu Lys Val He Asn 65 70 75 80 Phe He Asn Glu His Pro Asp Glu Asp Phe Leu Val Leu His Asp Gln 85 90 95 Asp Ala Leu Asn Ala He Leu Tyr Asp 100 105 <210> 30 <211> 121 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Q48480-K. p <400> 30 Phe Arg Arg Tyr Asp Lys Val Val Phe He Asp Ser Asp Thr Val Val 1 5 10 15 Lys Ala Asp Leu Gly Glu Leu Leu Asp Val Pro Leu Gly Asn Asn Leu 20 25 30 Val Ala Ala Val Lys Asp He Val Met Glu Gly Phe Val Lys Phe Ser 35 40 45 Ala Met Ser Ala Ser Asp Asp Gly Val Met Pro Ala Gly Glu Tyr Leu 50 55 60 Gln Lys Thr Leu Asn Asn Asn Asn Pro Asp Glu Tyr Phe Gln Ala Gly 65 70 75 80 He He Val Phe Asn Val Lys Gln Met Val Glu Glu Asn Thr Phe Ala 85 90 95 Glu Leu Met Arg Val Leu Lys Ala Lys Lys Tyr Trp Phe Leu Asp Gln 100 105 110 Asp He Met Asn Lys Val Phe Tyr Ser 115 120 <210> 31 <211> 82 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> GLYC-H. sap <400> 31 Leu Thr Gln Tyr Ser Lys Cys Val Phe Met Asp Ala Asp Thr Leu Val 1 5 10 15 Leu Ala Asn He Asp Asp Leu Phe Asp Arg Glu Glu Leu Ser Ala Ala 20 25 30 Pro Asp Pro Gly Trp Pro Asp Cys Phe Asn Ser Gly Val Phe Val Tyr 35 40 45 Gln Pro Ser Val Glu Thr Tyr Asn Gln Leu Leu His Leu Ala Ser Glu 50 55 60 Gln Gly Ser Phe Asp Gly Gly Asp Gln Gly He Leu Asn Thr Phe Phe 65 70 75 80 Ser Ser <210> 32 <211> 82 <212> PRT <213> GLYC-0. cun Secuencia Artificial <220> <223> GLYC-0. cun <400> 32 Leu Thr Gln Tyr Ser Lys Cys Val Phe Met Asp Ala Asp Thr Leu Val 1 5 10 15 Leu Ala Asn He Asp Asp Leu Phe Glu Arg Glu Glu Leu Ser Ala Ala 20 25 3ó Pro Asp Pro Gly Trp Pro Asp Cys Phe Asn Ser Gly Val Phe Val Tyr 35 40 45 Gln Pro Ser Val Glu Thr Tyr Asn Gln Leu Leu His Val Ala Ser Glu 50 55 60 Gln Gly Ser Phe Asp Gly Gly Asp Gln Gly Leu Leu Asn Thr Phe Phe 65 70 75 80 Asn Ser <210> 33 <211> 82 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> GLYC-C. ele <400> 33 Leu Thr Gln Tyr Thr Lys Cys Val Phe Leu Asp Ala Asp Thr Leu Val 1 5 10 15 Leu Arg Asn Ala Asp Glu Leu Phe Thr Arg Pro Asp Phe Ser Ala Ala 20 25 30 Ser Asp He Gly Trp Pro Asp Ser Phe Asn Ser Gly Val Phe Val Tyr 35 40 45 Val Pro Asn Asn Glu Thr Tyr Arg Gln Leu Val Asp Phe Ala Val Thr 50 55 60 His Gly Ser Tyr Asp Gly Gly Asp Gln Gly Leu Leu Asn Asp Phe Phe 65 70 75 80 Ser Asn < 210> 34 < 211> 117 < 212> PRT < 213> Secuencia Artif: Leía! L < 220> < 223> WSIP-0. sat < 400> 34 Phe Val Glu Tyr Glu Arg Met Val Tyr Leu Asp Ala Asp He Gln Val 1 5 10 15 Phe Asp Asn He Asp His Leu Phe Asp Leu Asp Lys Gly Ala Phe Tyr 20 25 30 Ala Val Lys Asp Cys Phe Cys Glu Lys Thr Trp Ser Has Thr Pro Gln 35 40 45 Tyr Asp He Gly Tyr Cys Gln Gln Arg Pro Asp Glu Val Ala Trp Pro 50 55 60 Glu Arg Glu Leu Gly Pro Pro Pro Pro Leu Tyr Phe Asn Ala Gly Met 65 70 75 80 Phe Val His Glu Pro Gly Leu Gly Thr Ala Lys Asp Leu Leu Asp Ala 85 90 95 Leu Val Val Thr Pro Pro Thr Pro Phe Ala Glu Gln Asp Phe Leu Asn 100 105 110 Met Phe Phe Arg Glu 115 <: 210> 35 <:211> 87 <:212> PRT <: 213> Secuencia Artificial <: 220> <: 223> Q12096-S. c <' 100> 35 Gln Thr Glu Phe Asp Arg Val He Tyr Leu Asp Asn Asp Ala He Leu 1 5 10 15 Arg Ser Ser Leu Asp Glu Leu Phe Phe Leu Pro Asn Tyr He Lys Phe 20 25 30 Ala Ala Pro Leu Thr Tyr Trp Phe Leu Ser Asn Ser Asp Leu Glu Lys 35 40 45 Ser Tyr His Glu Thr Arg His Arg Glu Lys Gln Pro He Asn Leu Gln 50 55 60 Ser Tyr Thr Lys Val Leu Thr Lys Arg He Gly Lys Gly Gln Met He 65 70 75 80 Tyr Asn His Leu Pro Ser Leu 85

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1.- Un método para determinar el efecto de una muestra de prueba sobre la actividad de UGGT que comprende los pasos de; a) exponer un aceptor-sustrato para UGGT a un donador marcado en presencia de la muestra de prueba y UGGT de la secuencia de aminoácido como se estableció en SEC ID No: 2; y b) detectar la cantidad de absorción de donador que fue transferida al aceptor-sustrato de UGGT, en donde una reducción de la absorción de donador cuando se comparó con un control significa que la muestra de prueba es un estimulante de UGGT y una disminución significa que la muestra de prueba es un inhibidor de UGGT.

2.- El ácido nucleico aislado que comprende un ADNc como se presentó en SEC ID. No:1.

3.- Un vector recombinante que comprende un ácido nucleico aislado como se describe en la reivindicación 2.

4.- Una célula huésped transfectada con un vector recombinante como se define en la reivindicación 3.

5.- Un procedimiento para preparar una UGGT de mamífero recombinante que comprende los pasos de: a) cultivar la célula huésped transfectada como se definió en la reivindicación 4 bajo condiciones en donde se expresa el ácido nucleico; y b) recuperar la UGGT de mamífero así producida. "«s. 73

6.- Una cepa «||,.S« cerevisiae que carece del gen MNS1 y * *>4$> produce glicoproteínal de [GlcNac]2-(Man)9 enlazadas a asparagina.

7.- El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el 5 aceptor-sustrato para UGGT es producido por una cepa de S. cerevisiae, la cual carece del gen MNS1 y produce glicoproteínas de [GlcNac]2-(Man)9 enlazadas a asparagina.

8.- El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el aceptor-sustrato para UGGT es fosfatasa de ácido. 10

9.- Un ácido nucleico aislado que codifica una UGGT teniendo una secuencia de aminoácido como se establece en SEC. ID No: 2.

10.- Una UGGT aislada que tiene la secuencia de aminoácido establecida en SEC. ID. No: 2. aM La presente invención se refiere a un método para determinar el efecto de una muestra de rueba sobre la actividad de UGGT. El método comprende los pasos de : a ) exponer un aceptor-sustrato de U GGT, tal como fosfatasa d e ácido a un donador marcado tal como U DP-3H-glucosa en presencia de la muestra de prueba y UGGT; y b) detectar la cantidad de absorción de donador q ue fue transferida al aceptor-sustrato, en donde una d isminución de la absorción de donador cuando se comparó con un control significa que la muestra de prueba es u n esti mu lante de U GGT y una red ucción o disminución significa que la m uestra de prueba es un inhibidor de UGGT. La presente invención también revela un ADNc aislado de mamífero q ue codifica la UGGT de rata y a métodos para producir UGGT de mamífero utilizando vectores recombinantes. ot/