JPH10155495A - 酵母のマンノース−１−リン酸転移酵素遺伝子を利用するリン酸含有酸性糖鎖の製造方法 - Google Patents
酵母のマンノース−１−リン酸転移酵素遺伝子を利用するリン酸含有酸性糖鎖の製造方法Info
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- JPH10155495A JPH10155495A JP9298158A JP29815897A JPH10155495A JP H10155495 A JPH10155495 A JP H10155495A JP 9298158 A JP9298158 A JP 9298158A JP 29815897 A JP29815897 A JP 29815897A JP H10155495 A JPH10155495 A JP H10155495A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 酵母（サッカロミセス・セレビシエ) の
マンノース−１−リン酸転移酵素遺伝子を導入したプラ
スミドＤＮＡによって形質転換された酵母細胞を培地に
培養し、培養物よりマンノース−１−リン酸転移酵素を
得、これを中性コア糖鎖に生体内または生体外で作用さ
せて得られるマンノース−１−リン酸含有酸性糖鎖を酸
処理することによってマンノース部分を切除することを
特徴とするリン酸含有酸性糖鎖の製造方法。 【効果】 本発明によれば、酵母を用いた遺伝子工学的
手法により、ヒトなど哺乳類細胞でリソゾームへ糖蛋白
質が輸送されるための標識マーカーとして機能しうる、
有用なヒト由来のリン酸含有コア糖鎖と同一の酸性糖鎖
を多量かつ純度よく生産することができる。
マンノース−１−リン酸転移酵素遺伝子を導入したプラ
スミドＤＮＡによって形質転換された酵母細胞を培地に
培養し、培養物よりマンノース−１−リン酸転移酵素を
得、これを中性コア糖鎖に生体内または生体外で作用さ
せて得られるマンノース−１−リン酸含有酸性糖鎖を酸
処理することによってマンノース部分を切除することを
特徴とするリン酸含有酸性糖鎖の製造方法。 【効果】 本発明によれば、酵母を用いた遺伝子工学的
手法により、ヒトなど哺乳類細胞でリソゾームへ糖蛋白
質が輸送されるための標識マーカーとして機能しうる、
有用なヒト由来のリン酸含有コア糖鎖と同一の酸性糖鎖
を多量かつ純度よく生産することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、酵母のマンノース
−１−リン酸転移酵素遺伝子を利用してヒトなど哺乳類
細胞でリソゾームへ糖蛋白質が輸送されるための標識マ
ーカーとして機能しうるリン酸含有酸性糖鎖を製造する
方法に関する。
−１−リン酸転移酵素遺伝子を利用してヒトなど哺乳類
細胞でリソゾームへ糖蛋白質が輸送されるための標識マ
ーカーとして機能しうるリン酸含有酸性糖鎖を製造する
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】生体内で重要な機能をもつ蛋白質の多く
は、単純蛋白質ではなく、糖鎖をもった糖蛋白質であ
る。糖鎖を除くと本来の生物活性を示さなくなること
が、エリスロポエチン（ＥＰＯ）や組織プラスミノゲン
活性化因子（ＴＰＡ）などで明らかにされており〔木幡
陽、蛋白質核酸酵素、Vol.36, p775 (1991) ；竹内誠、
生化学、Vol.62, p1272 (1990)] 、糖鎖は生物活性の発
現に重要な役割を担っていることが示唆される。ヒトな
ど哺乳類由来の糖蛋白質には多くの種類があるが、蛋白
質に付加する糖鎖の構造は蛋白質の種類、生物種、臓器
などで異なるうえ、糖鎖の鎖長は均一ではなく、一定の
鎖長分布をもった不均一なものである〔木幡陽、蛋白質
核酸酵素、Vol.36, p775 (1991) ；竹内誠、生化学、Vo
l.62, p1272 (1990)〕。このため、糖鎖の生物活性と糖
鎖構造との相関は明確ではなく、蛋白質部分に付加する
糖鎖の種類や構造については、蛋白質毎に試行錯誤を繰
り返しているのが現状である。よって蛋白質に付加する
糖鎖の構造（糖の種類、結合位置、鎖長など）を思い通
りに改変制御できる技術の開発が必要であり、また均一
な鎖長をもち、かつ化学構造の明確な糖鎖およびこの糖
鎖を付加した糖蛋白質の供給が学界だけでなく産業界か
らも期待されている。
は、単純蛋白質ではなく、糖鎖をもった糖蛋白質であ
る。糖鎖を除くと本来の生物活性を示さなくなること
が、エリスロポエチン（ＥＰＯ）や組織プラスミノゲン
活性化因子（ＴＰＡ）などで明らかにされており〔木幡
陽、蛋白質核酸酵素、Vol.36, p775 (1991) ；竹内誠、
生化学、Vol.62, p1272 (1990)] 、糖鎖は生物活性の発
現に重要な役割を担っていることが示唆される。ヒトな
ど哺乳類由来の糖蛋白質には多くの種類があるが、蛋白
質に付加する糖鎖の構造は蛋白質の種類、生物種、臓器
などで異なるうえ、糖鎖の鎖長は均一ではなく、一定の
鎖長分布をもった不均一なものである〔木幡陽、蛋白質
核酸酵素、Vol.36, p775 (1991) ；竹内誠、生化学、Vo
l.62, p1272 (1990)〕。このため、糖鎖の生物活性と糖
鎖構造との相関は明確ではなく、蛋白質部分に付加する
糖鎖の種類や構造については、蛋白質毎に試行錯誤を繰
り返しているのが現状である。よって蛋白質に付加する
糖鎖の構造（糖の種類、結合位置、鎖長など）を思い通
りに改変制御できる技術の開発が必要であり、また均一
な鎖長をもち、かつ化学構造の明確な糖鎖およびこの糖
鎖を付加した糖蛋白質の供給が学界だけでなく産業界か
らも期待されている。
【０００３】蛋白質に結合する糖鎖には蛋白質のアスパ
ラギン残基に結合するＮ−結合型とセリンまたはスレオ
ニンに結合するＯ−結合型の２種類がある。このうち、
Ｎ−結合型糖鎖の生合成経路については、多くの知見が
あり、詳しく解析されている。これによると、糖鎖の生
合成は、まず小胞体（ＥＲ）で始まり、その後ゴルジ体
でさらに糖鎖の修飾が起こる。このうち、ＥＲで生成す
る糖鎖は酵母も哺乳類細胞も基本的には同じであること
がわかっている。ここでは、以後、これをコア糖鎖と呼
ぶが、その糖鎖は８分子のマンノース（Man ）と２分子
のＮーアセチルグルコサミン（GlcNAc）から構成される
ことがわかっている（図１、化学式１）。このコア糖鎖
(Man8GlcNAc2）をもつ蛋白質はゴルジ体に輸送されて、
種々の修飾を受けるが、このゴルジ体での修飾は酵母と
哺乳類細胞で大きく異なっている〔Kukuruzinska et a
l, Ann. Rev. Biochem., Vol.56, p915 (1987) 〕。
ラギン残基に結合するＮ−結合型とセリンまたはスレオ
ニンに結合するＯ−結合型の２種類がある。このうち、
Ｎ−結合型糖鎖の生合成経路については、多くの知見が
あり、詳しく解析されている。これによると、糖鎖の生
合成は、まず小胞体（ＥＲ）で始まり、その後ゴルジ体
でさらに糖鎖の修飾が起こる。このうち、ＥＲで生成す
る糖鎖は酵母も哺乳類細胞も基本的には同じであること
がわかっている。ここでは、以後、これをコア糖鎖と呼
ぶが、その糖鎖は８分子のマンノース（Man ）と２分子
のＮーアセチルグルコサミン（GlcNAc）から構成される
ことがわかっている（図１、化学式１）。このコア糖鎖
(Man8GlcNAc2）をもつ蛋白質はゴルジ体に輸送されて、
種々の修飾を受けるが、このゴルジ体での修飾は酵母と
哺乳類細胞で大きく異なっている〔Kukuruzinska et a
l, Ann. Rev. Biochem., Vol.56, p915 (1987) 〕。
【０００４】哺乳類細胞では、糖鎖修飾を受ける蛋白質
の種類によって異なる以下の３種の経路をたどる。1)上
記のコア糖鎖が何等変化を受けない場合、2)UDP-N-アセ
チルグルコサミン（UDP-GlcNAc）のN-アセチルグルコサ
ミン−１−リン酸部分（GlcNAc-1-P）がコア糖鎖のMan
の６位に付加してMan-6-P-1-GlcNAcとなったのち、この
GlcNAc部分だけが除去されて、酸性糖鎖をもつ糖蛋白質
に変換される場合、3)コア糖鎖から５分子のMan が順次
除去されてMan3GlcNAc2 となり、これと相前後してGlcN
Ac、ガラクトース（Gal ）、Ｎーアセチルノイラミン
酸、別名シアル酸（NeuNAc）などが順次付加して、多様
な混成型および複合型糖鎖が混合物として生成する場合
の３通りである[R. Kornfeld and S. Kornfeld, Ann. R
ev. Biochem., Vol. 54, p.631-664 (1985)]。
の種類によって異なる以下の３種の経路をたどる。1)上
記のコア糖鎖が何等変化を受けない場合、2)UDP-N-アセ
チルグルコサミン（UDP-GlcNAc）のN-アセチルグルコサ
ミン−１−リン酸部分（GlcNAc-1-P）がコア糖鎖のMan
の６位に付加してMan-6-P-1-GlcNAcとなったのち、この
GlcNAc部分だけが除去されて、酸性糖鎖をもつ糖蛋白質
に変換される場合、3)コア糖鎖から５分子のMan が順次
除去されてMan3GlcNAc2 となり、これと相前後してGlcN
Ac、ガラクトース（Gal ）、Ｎーアセチルノイラミン
酸、別名シアル酸（NeuNAc）などが順次付加して、多様
な混成型および複合型糖鎖が混合物として生成する場合
の３通りである[R. Kornfeld and S. Kornfeld, Ann. R
ev. Biochem., Vol. 54, p.631-664 (1985)]。
【０００５】一方、酵母では、上記のコア糖鎖(Man8Glc
NAc2) にMan が多数付加して、いわゆる糖外鎖(outer c
hain) を生成する他、コア糖鎖部分および糖外鎖部分に
マンノース−１−リン酸が付加した酸性糖鎖も生成する
ことがわかっている（図２参照）。この修飾は、動物細
胞と異なり、酵母では液胞（動物細胞のリソゾームに相
当するオルガネラ）局在性糖蛋白質のsorting signalと
しては機能しないことが報告されている。従って、酵母
におけるこのリン酸化糖鎖の生理機能は不明のままであ
る [Kukuruzinska et al, Ann. Rev. Biochem., Vol.5
6, p915 (1987)]。
NAc2) にMan が多数付加して、いわゆる糖外鎖(outer c
hain) を生成する他、コア糖鎖部分および糖外鎖部分に
マンノース−１−リン酸が付加した酸性糖鎖も生成する
ことがわかっている（図２参照）。この修飾は、動物細
胞と異なり、酵母では液胞（動物細胞のリソゾームに相
当するオルガネラ）局在性糖蛋白質のsorting signalと
しては機能しないことが報告されている。従って、酵母
におけるこのリン酸化糖鎖の生理機能は不明のままであ
る [Kukuruzinska et al, Ann. Rev. Biochem., Vol.5
6, p915 (1987)]。
【０００６】酵母のマンノースリン酸含有糖鎖のリン酸
化部位は、図２、Ｇに示すように、小胞体で合成される
Man8GlcNAc2 のコア糖鎖のα-1,3- 分岐側とα-1,6- 分
岐側に付加する場合のほか、ゴルジ体で合成されるマン
ノース外鎖に多数存在するα-1,2- 分岐に付加する場合
とマンノース外鎖の非還元末端に付加する場合の、計４
つのタイプに分けることができる[A. Herscovics and
P. Orlean, FASEB J.,Vol. 7, p540-550 (1993)]。これ
らのマンノースリン酸含有糖鎖は、酵母の細胞表層に局
在するインベルターゼなど糖蛋白質の局在化や細胞間凝
集に関与している可能性が指摘されているが、確証のあ
るデータは得られていない。
化部位は、図２、Ｇに示すように、小胞体で合成される
Man8GlcNAc2 のコア糖鎖のα-1,3- 分岐側とα-1,6- 分
岐側に付加する場合のほか、ゴルジ体で合成されるマン
ノース外鎖に多数存在するα-1,2- 分岐に付加する場合
とマンノース外鎖の非還元末端に付加する場合の、計４
つのタイプに分けることができる[A. Herscovics and
P. Orlean, FASEB J.,Vol. 7, p540-550 (1993)]。これ
らのマンノースリン酸含有糖鎖は、酵母の細胞表層に局
在するインベルターゼなど糖蛋白質の局在化や細胞間凝
集に関与している可能性が指摘されているが、確証のあ
るデータは得られていない。
【０００７】酵母における糖外鎖の生合成は図２に示し
た経路で進行すると考えられている[Ballou et al, Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.87, p3368 (1990)] 。
すなわち、コア糖鎖にα−1,6 結合でＭａｎが付加する
延長開始の反応（図２、Ｉ）に続いて、さらにα−1,6
結合でＭａｎを順次延長する反応（図２、II）がおこる
ことにより、糖外鎖の骨格となるポリ−α−1,6 Ｍａｎ
結合が形成される（図２、Ｅ）。このα−1,6 結合のＭ
ａｎには、α−1,2 結合したＭａｎの分枝が存在し、こ
の枝分れしたα−1,2 結合のＭａｎの先端には、通常さ
らにα−1,3 結合したＭａｎが付加している（図２、Ｇ
参照）。
た経路で進行すると考えられている[Ballou et al, Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.87, p3368 (1990)] 。
すなわち、コア糖鎖にα−1,6 結合でＭａｎが付加する
延長開始の反応（図２、Ｉ）に続いて、さらにα−1,6
結合でＭａｎを順次延長する反応（図２、II）がおこる
ことにより、糖外鎖の骨格となるポリ−α−1,6 Ｍａｎ
結合が形成される（図２、Ｅ）。このα−1,6 結合のＭ
ａｎには、α−1,2 結合したＭａｎの分枝が存在し、こ
の枝分れしたα−1,2 結合のＭａｎの先端には、通常さ
らにα−1,3 結合したＭａｎが付加している（図２、Ｇ
参照）。
【０００８】ただし、α−1,6 結合の先端のＭａｎには
α−1,2 結合したＭａｎが付加するだけであり、α−1,
3 結合のＭａｎがさらに付加することはない（図２、Ｆ
またはＧ）〔Gopal and Ballou, Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA, Vol.84, p8824 (1987)〕。従って、コア糖鎖を
生産するためには、この糖外鎖が付加しなくなり、糖鎖
合成がコア糖鎖（図２、Ａ）で停止するような変異株を
単離することにより達成される。、本発明者らは既にこ
の糖外鎖を欠損した変異株の作成に成功している( 特開
平6-277086) 。しかし、この方法により生産した糖蛋白
質糖鎖には、中性糖鎖（図１、化学式１）のほかに、酸
性糖鎖（図１、化学式２〜４）が含まれることが判明し
た（第１２回バイオテクノロジーシンポジウム予行集、
p.153-157 、平成６年１０月１４日発行、バイオテクノ
ロジー開発技術研究組合発行）。この酸性糖鎖はヒトな
ど哺乳類由来の糖鎖には存在しない構造である。すなわ
ち、哺乳類細胞では、上記の化学式２〜４記載のマンノ
ース−１−リン酸の付加部位に、Mannose-1-phosphate
ではなく、GlcNAc-1-phosphateが付加したのち、GlcNAc
部分だけがさらに除去されて、最終的に図１、化学式５
〜７記載の酸性糖鎖になるのに対して、酵母細胞では、
図１、化学式２〜４の酸性糖鎖からMan 部分だけが除去
されるという反応が起こらないため、化学式２〜４の糖
鎖は哺乳類の体内で異物と認識されて、抗原性を示すと
思われる〔Clinton E. Ballou, Methods in Enzymolog
y, Vol.185, p.440-470 (1990) 〕。
α−1,2 結合したＭａｎが付加するだけであり、α−1,
3 結合のＭａｎがさらに付加することはない（図２、Ｆ
またはＧ）〔Gopal and Ballou, Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA, Vol.84, p8824 (1987)〕。従って、コア糖鎖を
生産するためには、この糖外鎖が付加しなくなり、糖鎖
合成がコア糖鎖（図２、Ａ）で停止するような変異株を
単離することにより達成される。、本発明者らは既にこ
の糖外鎖を欠損した変異株の作成に成功している( 特開
平6-277086) 。しかし、この方法により生産した糖蛋白
質糖鎖には、中性糖鎖（図１、化学式１）のほかに、酸
性糖鎖（図１、化学式２〜４）が含まれることが判明し
た（第１２回バイオテクノロジーシンポジウム予行集、
p.153-157 、平成６年１０月１４日発行、バイオテクノ
ロジー開発技術研究組合発行）。この酸性糖鎖はヒトな
ど哺乳類由来の糖鎖には存在しない構造である。すなわ
ち、哺乳類細胞では、上記の化学式２〜４記載のマンノ
ース−１−リン酸の付加部位に、Mannose-1-phosphate
ではなく、GlcNAc-1-phosphateが付加したのち、GlcNAc
部分だけがさらに除去されて、最終的に図１、化学式５
〜７記載の酸性糖鎖になるのに対して、酵母細胞では、
図１、化学式２〜４の酸性糖鎖からMan 部分だけが除去
されるという反応が起こらないため、化学式２〜４の糖
鎖は哺乳類の体内で異物と認識されて、抗原性を示すと
思われる〔Clinton E. Ballou, Methods in Enzymolog
y, Vol.185, p.440-470 (1990) 〕。
【０００９】このように、酵母と哺乳類細胞では蛋白質
に付加する糖鎖の構造が大きく異なるため、遺伝子工学
的手法によりパン酵母でヒトなど哺乳類由来の有用糖蛋
白質を生産させても、哺乳類由来のものと同一の生物活
性が検出されなかったり、糖鎖の違いによる抗原性の相
違などが指摘されている。このため、哺乳類由来の糖蛋
白質をパン酵母で生産させることは従来困難であった。
に付加する糖鎖の構造が大きく異なるため、遺伝子工学
的手法によりパン酵母でヒトなど哺乳類由来の有用糖蛋
白質を生産させても、哺乳類由来のものと同一の生物活
性が検出されなかったり、糖鎖の違いによる抗原性の相
違などが指摘されている。このため、哺乳類由来の糖蛋
白質をパン酵母で生産させることは従来困難であった。
【００１０】上記のコア糖鎖より哺乳類細胞で変換され
る酸性糖鎖（図１、化学式５〜７）は、ヒトなど哺乳類
細胞でリソゾームへ糖蛋白質が輸送されるための標識マ
ーカーとして機能している。このため、この酸性糖鎖
は、この糖鎖を含有する糖蛋白質や種々の有効な薬剤を
リポソームなどに内包してドラッグ・デリバリー技術を
利用して細胞内の特定の小器官（リソゾーム）に局在化
させるための標識糖鎖として有益であるが、これらの酸
性糖鎖またはこの糖鎖を含有する糖蛋白質を均一かつ多
量に供給することは現状では困難である。したがって、
上述したようなヒトおよび他の哺乳類由来のＮ−結合型
蛋白質の生産における欠点を克服することが望まれると
ころである。
る酸性糖鎖（図１、化学式５〜７）は、ヒトなど哺乳類
細胞でリソゾームへ糖蛋白質が輸送されるための標識マ
ーカーとして機能している。このため、この酸性糖鎖
は、この糖鎖を含有する糖蛋白質や種々の有効な薬剤を
リポソームなどに内包してドラッグ・デリバリー技術を
利用して細胞内の特定の小器官（リソゾーム）に局在化
させるための標識糖鎖として有益であるが、これらの酸
性糖鎖またはこの糖鎖を含有する糖蛋白質を均一かつ多
量に供給することは現状では困難である。したがって、
上述したようなヒトおよび他の哺乳類由来のＮ−結合型
蛋白質の生産における欠点を克服することが望まれると
ころである。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、哺乳
類細胞において付加されるのと同一の糖鎖構造をもつ、
上記の有用なリン酸含有酸性糖鎖を、組み換えＤＮＡ技
術により大量に生産する方法を提供することにある。
類細胞において付加されるのと同一の糖鎖構造をもつ、
上記の有用なリン酸含有酸性糖鎖を、組み換えＤＮＡ技
術により大量に生産する方法を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決すべく鋭意研究を重ねた結果、酵母に特異的な糖鎖
の修飾反応であるマンノース−１−リン酸付加に関与す
るマンノース−１−リン酸酵素転移酵素遺伝子（ＭＮＮ
６遺伝子）を単離し、この遺伝子構造を明らかにすると
ともに、この遺伝子を利用することによって、抗原性を
もつマンノース−１−リン酸含有酸性糖鎖を含まず、ヒ
トなど哺乳類と同一の糖鎖構造をもつ高マンノース型中
性糖鎖にリン酸が１分子または２分子付加した酸性糖鎖
を生産することができることを見出し、本発明を完成す
るに到った。
解決すべく鋭意研究を重ねた結果、酵母に特異的な糖鎖
の修飾反応であるマンノース−１−リン酸付加に関与す
るマンノース−１−リン酸酵素転移酵素遺伝子（ＭＮＮ
６遺伝子）を単離し、この遺伝子構造を明らかにすると
ともに、この遺伝子を利用することによって、抗原性を
もつマンノース−１−リン酸含有酸性糖鎖を含まず、ヒ
トなど哺乳類と同一の糖鎖構造をもつ高マンノース型中
性糖鎖にリン酸が１分子または２分子付加した酸性糖鎖
を生産することができることを見出し、本発明を完成す
るに到った。
【００１３】すなわち、本発明は、 １．配列番号１に示したアミノ酸配列またはこの配列に
おいて１もしくは複数のアミノ酸残基が挿入、欠失もし
くは置換されたアミノ酸配列を有し、マンノース−１−
リン酸転移酵素の酵素活性をもたらすアミノ酸配列をコ
ードする酵母（サッカロミセス・セレビシエ) のマンノ
ース−１−リン酸転移酵素遺伝子の全部または一部を含
むプラスミドＤＮＡによって形質転換された酵母細胞を
培地に培養し、培養物よりマンノース−１−リン酸転移
酵素を得、これを中性コア糖鎖に生体内または生体外で
作用させて得られるマンノース−１−リン酸含有酸性糖
鎖を酸処理することによってマンノース部分を切除する
ことを特徴とするリン酸含有酸性糖鎖の製造方法； ２．上記マンノース−１−リン酸転移酵素遺伝子が配列
番号２に示した塩基配列で表されるマンノース−１−リ
ン酸転移酵素遺伝子である上記１．記載の製造方法であ
る。
おいて１もしくは複数のアミノ酸残基が挿入、欠失もし
くは置換されたアミノ酸配列を有し、マンノース−１−
リン酸転移酵素の酵素活性をもたらすアミノ酸配列をコ
ードする酵母（サッカロミセス・セレビシエ) のマンノ
ース−１−リン酸転移酵素遺伝子の全部または一部を含
むプラスミドＤＮＡによって形質転換された酵母細胞を
培地に培養し、培養物よりマンノース−１−リン酸転移
酵素を得、これを中性コア糖鎖に生体内または生体外で
作用させて得られるマンノース−１−リン酸含有酸性糖
鎖を酸処理することによってマンノース部分を切除する
ことを特徴とするリン酸含有酸性糖鎖の製造方法； ２．上記マンノース−１−リン酸転移酵素遺伝子が配列
番号２に示した塩基配列で表されるマンノース−１−リ
ン酸転移酵素遺伝子である上記１．記載の製造方法であ
る。
【００１４】本発明において、哺乳類と同一の糖鎖構造
をもつ高マンノース型中性糖鎖にマンノース−１−リン
酸を付加したマンノース−１−リン酸酸性糖鎖を酵母製
造する方法は、下記の工程よりなる。 (1) マンノース−１−リン酸転移酵素をコ−ドする遺伝
子（ＭＮＮ６遺伝子）を取得する； (2) 上記ＭＮＮ６遺伝子を酵母の発現用ベクター（ｐＲ
Ｓ３１６、ＹＥｐ３５２など）に導入し、ＭＮＮ６遺伝
子を発現するプラスミドを構築する；
をもつ高マンノース型中性糖鎖にマンノース−１−リン
酸を付加したマンノース−１−リン酸酸性糖鎖を酵母製
造する方法は、下記の工程よりなる。 (1) マンノース−１−リン酸転移酵素をコ−ドする遺伝
子（ＭＮＮ６遺伝子）を取得する； (2) 上記ＭＮＮ６遺伝子を酵母の発現用ベクター（ｐＲ
Ｓ３１６、ＹＥｐ３５２など）に導入し、ＭＮＮ６遺伝
子を発現するプラスミドを構築する；
【００１５】(3) 上記プラスミドを、ＯＣＨ１遺伝子を
破壊し、かつＭＮＮ１遺伝子の変異(mnn1)をもつ二重変
異株である酵母宿主に導入することによってＭＮＮ６遺
伝子を発現させ、生体内で図１、化学式１の中性糖鎖を
マンノース−１−リン酸含有酸性糖鎖に変換する； (4) 上記(3) の変異株の培養によって得た菌体の細胞表
層糖蛋白質（マンナン蛋白質）から糖鎖を単離・精製す
る。
破壊し、かつＭＮＮ１遺伝子の変異(mnn1)をもつ二重変
異株である酵母宿主に導入することによってＭＮＮ６遺
伝子を発現させ、生体内で図１、化学式１の中性糖鎖を
マンノース−１−リン酸含有酸性糖鎖に変換する； (4) 上記(3) の変異株の培養によって得た菌体の細胞表
層糖蛋白質（マンナン蛋白質）から糖鎖を単離・精製す
る。
【００１６】また、本発明において、哺乳類と同一の糖
鎖構造をもつ高マンノース型中性糖鎖にリン酸が付加し
たリン酸含有酸性糖鎖を製造する方法は、下記の工程よ
りなる。 (1) マンノース−１−リン酸転移酵素をコ−ドする遺伝
子（ＭＮＮ６遺伝子）を取得する； (2) 上記ＭＮＮ６遺伝子を酵母の発現用ベクター（ｐＲ
Ｓ３１６、ＹＥｐ３５２など）に導入し、ＭＮＮ６遺伝
子を発現するプラスミドを構築する；
鎖構造をもつ高マンノース型中性糖鎖にリン酸が付加し
たリン酸含有酸性糖鎖を製造する方法は、下記の工程よ
りなる。 (1) マンノース−１−リン酸転移酵素をコ−ドする遺伝
子（ＭＮＮ６遺伝子）を取得する； (2) 上記ＭＮＮ６遺伝子を酵母の発現用ベクター（ｐＲ
Ｓ３１６、ＹＥｐ３５２など）に導入し、ＭＮＮ６遺伝
子を発現するプラスミドを構築する；
【００１７】(3) 上記プラスミドを、ＯＣＨ１遺伝子を
破壊し、かつＭＮＮ１遺伝子の変異(mnn1)をもつ二重変
異株である酵母宿主に導入することによってＭＮＮ６遺
伝子を発現させ、生体内で図１、化学式１の中性糖鎖を
マンノース−１−リン酸含有酸性糖鎖に変換する； (4) 上記工程(3) にて取得した酵母菌体の菌体破砕物を
マンノース−１−リン酸酵素の酵素源として生体外で中
性コア糖鎖と反応させ、マンノース−１−リン酸の付加
した反応産物を回収する；
破壊し、かつＭＮＮ１遺伝子の変異(mnn1)をもつ二重変
異株である酵母宿主に導入することによってＭＮＮ６遺
伝子を発現させ、生体内で図１、化学式１の中性糖鎖を
マンノース−１−リン酸含有酸性糖鎖に変換する； (4) 上記工程(3) にて取得した酵母菌体の菌体破砕物を
マンノース−１−リン酸酵素の酵素源として生体外で中
性コア糖鎖と反応させ、マンノース−１−リン酸の付加
した反応産物を回収する；
【００１８】(5) 反応産物を酸処理（0.01N 塩酸を加
え、100 ℃で30分間処理）することにより、マンノース
−１−リン酸残基のマンノースのみを切断してリン酸含
有糖鎖に変換する。該リン酸含有酸性糖鎖はヒトなど哺
乳類細胞でリソゾームに薬剤または蛋白質を選別するた
めの標識マーカーとして有用である。 以下、本発明を詳細に説明する。本明細書において、ア
ミノ酸配列および塩基配列の略号による表示は、IUPAC-
IUB の規定および当該分野における通称または慣行に従
うものとする。
え、100 ℃で30分間処理）することにより、マンノース
−１−リン酸残基のマンノースのみを切断してリン酸含
有糖鎖に変換する。該リン酸含有酸性糖鎖はヒトなど哺
乳類細胞でリソゾームに薬剤または蛋白質を選別するた
めの標識マーカーとして有用である。 以下、本発明を詳細に説明する。本明細書において、ア
ミノ酸配列および塩基配列の略号による表示は、IUPAC-
IUB の規定および当該分野における通称または慣行に従
うものとする。
【００１９】
１．マンノース−１−リン酸転移酵素遺伝子の単離・精
製 本発明のマンノース−１−リン酸転移酵素遺伝子の取得
は、一般的手法に従ってサッカロミセス・セレビシエか
らゲノムＤＮＡを抽出し、遺伝子ライブラリーを作成
し、その中から目的ＤＮＡを選出し、これをマンノース
リン酸含有量が顕著に低下していることが報告されてい
る宿主酵母株に導入し、マンノースリン酸含有量が野生
型細胞のレベルに回復した形質転換酵母細胞を選別する
ことにより実施できる。
製 本発明のマンノース−１−リン酸転移酵素遺伝子の取得
は、一般的手法に従ってサッカロミセス・セレビシエか
らゲノムＤＮＡを抽出し、遺伝子ライブラリーを作成
し、その中から目的ＤＮＡを選出し、これをマンノース
リン酸含有量が顕著に低下していることが報告されてい
る宿主酵母株に導入し、マンノースリン酸含有量が野生
型細胞のレベルに回復した形質転換酵母細胞を選別する
ことにより実施できる。
【００２０】サッカロミセス・セレビシエからゲノムＤ
ＮＡの抽出は、例えば、D.R. Cryeret al. の方法[Meth
ods in Cell Biology, Vol.12, p.39 (1975)]およびP.P
hilippsen et al. [Methods in Enzymology, Vol. 194,
p.169 (1991)] に従うことができる。
ＮＡの抽出は、例えば、D.R. Cryeret al. の方法[Meth
ods in Cell Biology, Vol.12, p.39 (1975)]およびP.P
hilippsen et al. [Methods in Enzymology, Vol. 194,
p.169 (1991)] に従うことができる。
【００２１】遺伝子ライブラリーは、通常用いられてい
るプラスミドベクターまたはラムダファージ由来のベク
ター等を用いたり、ファージとプラスミドの両方の性質
を兼ね備えた大きいＤＮＡ断片がクローニングできるコ
スミドベクター等を用いて、通常の方法に従い作成する
ことができる。
るプラスミドベクターまたはラムダファージ由来のベク
ター等を用いたり、ファージとプラスミドの両方の性質
を兼ね備えた大きいＤＮＡ断片がクローニングできるコ
スミドベクター等を用いて、通常の方法に従い作成する
ことができる。
【００２２】ＤＮＡを導入する宿主細胞としては、マン
ノースリン酸含有量が顕著に低下しているサッカロミセ
ス・セレビシエのmnn6変異株が代表的であり、この変異
株は、Dr. Ballou, Department of Molecular and Cell
Biology, University of California, Berkeley, USA)
から、入手可能である [Clinton E. Ballou, Methodsin
Enzymology, Vol.185, p.440-470 (1990) 参照] 。糖
外鎖部分でのリン酸化が約90% 減少したパン酵母の変異
株が２種類、単離されている[E. M. Karson and C. E.
Ballou, J. Biol. Chem., Vol. 253, p.6484-6492 (197
8)] 。このうち、alcian blue のdye-binding assay
で、mnn4はdominant、mnn6はrecessive な、いずれも単
一の変異と判定されている。リン酸基は細胞壁の主要な
負荷電であり、塩基性のphthalocyanin 系色素であるal
cian blue はマンナン蛋白質のリン酸化の程度を評価す
る簡便な方法として有用である。YEPD培地で生育させた
条件下で、mnn6の一倍体細胞はalcian blue 色素を結合
しない[C. E. Ballou, Methods in Enzymology, Vol. 1
85, p.440-470 (1990)] 。
ノースリン酸含有量が顕著に低下しているサッカロミセ
ス・セレビシエのmnn6変異株が代表的であり、この変異
株は、Dr. Ballou, Department of Molecular and Cell
Biology, University of California, Berkeley, USA)
から、入手可能である [Clinton E. Ballou, Methodsin
Enzymology, Vol.185, p.440-470 (1990) 参照] 。糖
外鎖部分でのリン酸化が約90% 減少したパン酵母の変異
株が２種類、単離されている[E. M. Karson and C. E.
Ballou, J. Biol. Chem., Vol. 253, p.6484-6492 (197
8)] 。このうち、alcian blue のdye-binding assay
で、mnn4はdominant、mnn6はrecessive な、いずれも単
一の変異と判定されている。リン酸基は細胞壁の主要な
負荷電であり、塩基性のphthalocyanin 系色素であるal
cian blue はマンナン蛋白質のリン酸化の程度を評価す
る簡便な方法として有用である。YEPD培地で生育させた
条件下で、mnn6の一倍体細胞はalcian blue 色素を結合
しない[C. E. Ballou, Methods in Enzymology, Vol. 1
85, p.440-470 (1990)] 。
【００２３】よって、mnn6変異株は、上記色素への結合
能が野生型細胞に比べて顕著に低下しているため、これ
らの性質の差を利用すれば、変異に相当する野生型の遺
伝子が単離できる。ＤＮＡの細胞への導入およびこれに
よる形質転換の方法としては、一般的な方法、例えば、
ベクターとしてファージを用いる場合は、大腸菌宿主に
これを感染させる方法等により、効率よく宿主にＤＮＡ
を組み込ませて遺伝子を増幅することができる。またプ
ラスミドを用いて酵母に形質転換する方法としては、リ
チウム塩で処理して自然にＤＮＡを取り込みやすい状態
にして、プラスミドを取り込ませる方法または電気的に
ＤＮＡを細胞内に導入する方法等を採用できる。
能が野生型細胞に比べて顕著に低下しているため、これ
らの性質の差を利用すれば、変異に相当する野生型の遺
伝子が単離できる。ＤＮＡの細胞への導入およびこれに
よる形質転換の方法としては、一般的な方法、例えば、
ベクターとしてファージを用いる場合は、大腸菌宿主に
これを感染させる方法等により、効率よく宿主にＤＮＡ
を組み込ませて遺伝子を増幅することができる。またプ
ラスミドを用いて酵母に形質転換する方法としては、リ
チウム塩で処理して自然にＤＮＡを取り込みやすい状態
にして、プラスミドを取り込ませる方法または電気的に
ＤＮＡを細胞内に導入する方法等を採用できる。
【００２４】上記の各方法および引き続く各操作におけ
るＤＮＡの単離・精製等は何れも常法に従って行うこと
ができる。また、本発明遺伝子のＤＮＡ配列の決定等も
通常の方法、例えばジデオキシ法 [Sanger, F. et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463-5467 (197
7)] 等により行うことができる。更に、上記ＤＮＡ塩基
配列の決定は、市販のシークエンスキット等を用いるこ
とによっても容易に行ない得る。
るＤＮＡの単離・精製等は何れも常法に従って行うこと
ができる。また、本発明遺伝子のＤＮＡ配列の決定等も
通常の方法、例えばジデオキシ法 [Sanger, F. et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463-5467 (197
7)] 等により行うことができる。更に、上記ＤＮＡ塩基
配列の決定は、市販のシークエンスキット等を用いるこ
とによっても容易に行ない得る。
【００２５】本発明に係わるマンノース−１−リン酸転
移酵素遺伝子は、配列番号１に示したアミノ酸配列また
はこの配列において１もしくは複数のアミノ酸残基が挿
入、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を有し、マン
ノース−１−リン酸転移酵素の酵素活性をもたらすアミ
ノ酸配列をコードするか、または配列番号２に示した塩
基配列で表される。よって、上記アミノ酸のＮ末端に位
置するメチオニン(Met) が欠損したもの等や、翻訳後の
修飾または遺伝子工学的手法による配列の改変（付加、
欠損、置換等）がなされたマンノース−１−リン酸転移
酵素同効物およびそれらの遺伝子もまた上記遺伝子に包
含される。上記遺伝子工学的手法としては、公知の各種
方法、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネシス
によるＤＮＡの改変等が包含される。
移酵素遺伝子は、配列番号１に示したアミノ酸配列また
はこの配列において１もしくは複数のアミノ酸残基が挿
入、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を有し、マン
ノース−１−リン酸転移酵素の酵素活性をもたらすアミ
ノ酸配列をコードするか、または配列番号２に示した塩
基配列で表される。よって、上記アミノ酸のＮ末端に位
置するメチオニン(Met) が欠損したもの等や、翻訳後の
修飾または遺伝子工学的手法による配列の改変（付加、
欠損、置換等）がなされたマンノース−１−リン酸転移
酵素同効物およびそれらの遺伝子もまた上記遺伝子に包
含される。上記遺伝子工学的手法としては、公知の各種
方法、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネシス
によるＤＮＡの改変等が包含される。
【００２６】ＰＣＲ法は、インビトロ(in vitro)でＤＮ
Ａの特定領域をその領域の両端のセンス・アンタイセン
スプライマー、耐熱性のTaq ポリメラーゼ、DNA 増幅シ
ステム等の組み合わせを用いて、約２〜３時間で１０〜
１００万倍に特異的に増幅することができる技術である
が、本発明遺伝子およびその部分断片は、このＰＣＲ法
によって増幅可能であり、増幅されたＤＮＡを利用する
ことにより、マンノース−１−リン酸転移酵素遺伝子に
種々の改変または遺伝子破壊などを導入することが可能
である。
Ａの特定領域をその領域の両端のセンス・アンタイセン
スプライマー、耐熱性のTaq ポリメラーゼ、DNA 増幅シ
ステム等の組み合わせを用いて、約２〜３時間で１０〜
１００万倍に特異的に増幅することができる技術である
が、本発明遺伝子およびその部分断片は、このＰＣＲ法
によって増幅可能であり、増幅されたＤＮＡを利用する
ことにより、マンノース−１−リン酸転移酵素遺伝子に
種々の改変または遺伝子破壊などを導入することが可能
である。
【００２７】このようにしてＭＮＮ６遺伝子を変異し、
マンノース−１−リン酸転移酵素活性を持たない酵母変
異株（ｍｎｎ６）を作成できる。また、当該変異株は、
LB1425-1B （MATa mnn6 ）としてカリフォルニア大学、
バークレー校、Ballou教授より入手することもできる。
マンノース−１−リン酸転移酵素活性を持たない酵母変
異株（ｍｎｎ６）を作成できる。また、当該変異株は、
LB1425-1B （MATa mnn6 ）としてカリフォルニア大学、
バークレー校、Ballou教授より入手することもできる。
【００２８】さらに、上記の変異株を糖鎖合成の種々の
段階で欠損のある公知の酵母変異株と公知の方法により
交雑することにより、糖鎖合成の種々の段階に欠損のあ
る複数の変異を１つの細胞株に収斂させることが可能で
ある。例えば、本発明者らにより既に提案している、Ｏ
ＣＨ１遺伝子を破壊し、かつｍｎｎ１変異を有する酵母
変異株〔△och1 mnn1 （FERM P-13219) ：特開平６−２
７７０８６参照〕と接合型の異なる上記ｍｎｎ６変異株
（mnn6）とを接合させて生成する２倍体細胞をさらに窒
素源を欠乏させた胞子形成培地〔例えば、F. Sherman,
Methods in Enzymology, Vol. 194, p.17 (1991)参照〕
に移すことにより、減数分裂させ、これによって生成す
る４つの胞子を顕微鏡下で個別に分離し、その表現型を
調べることによって、△och1 mnn1 mnn6の三重変異株を
作成することができる〔例えば、F. Sherman and J. Hi
cks, Methods in Enzymology, Vol. 194, p.21-37 (199
1)〕。
段階で欠損のある公知の酵母変異株と公知の方法により
交雑することにより、糖鎖合成の種々の段階に欠損のあ
る複数の変異を１つの細胞株に収斂させることが可能で
ある。例えば、本発明者らにより既に提案している、Ｏ
ＣＨ１遺伝子を破壊し、かつｍｎｎ１変異を有する酵母
変異株〔△och1 mnn1 （FERM P-13219) ：特開平６−２
７７０８６参照〕と接合型の異なる上記ｍｎｎ６変異株
（mnn6）とを接合させて生成する２倍体細胞をさらに窒
素源を欠乏させた胞子形成培地〔例えば、F. Sherman,
Methods in Enzymology, Vol. 194, p.17 (1991)参照〕
に移すことにより、減数分裂させ、これによって生成す
る４つの胞子を顕微鏡下で個別に分離し、その表現型を
調べることによって、△och1 mnn1 mnn6の三重変異株を
作成することができる〔例えば、F. Sherman and J. Hi
cks, Methods in Enzymology, Vol. 194, p.21-37 (199
1)〕。
【００２９】２．マンノース−１−リン酸含有酸性糖鎖
（図１、化学式２〜４）の製造およびリン酸含有酸性糖
鎖（図１、化学式５〜７）への変換 本発明によれば、上記のマンノース−１−リン酸転移酵
素遺伝子を含むプラスミドによって形質転換された酵母
細胞の培養によって、所望のマンノース−１−リン酸転
移酵素を生産、蓄積が可能であるほか、中性コア糖鎖に
マンノース−１−リン酸が付加した酸性糖鎖を取得する
ことができる。形質転換した酵母の培養は、酵母の培養
に慣用される常法に従って行うことができる。例えば、
Difco 社から供給される各種の培地成分を添加し、かつ
プラスミドの複製・保持に必要なマーカー（例えばウラ
シル合成に関与するURA3遺伝子）によって供給可能とな
るアミノ酸や核酸塩基（上記の例ではウラシル）を除い
た合成培地（炭素源、窒素源、無機塩類、アミノ酸、ビ
タミン等を含む）等を利用できる〔F. Sherman, Method
s in Enzymology, Vol. 194, p.14 (1991)参照〕。
（図１、化学式２〜４）の製造およびリン酸含有酸性糖
鎖（図１、化学式５〜７）への変換 本発明によれば、上記のマンノース−１−リン酸転移酵
素遺伝子を含むプラスミドによって形質転換された酵母
細胞の培養によって、所望のマンノース−１−リン酸転
移酵素を生産、蓄積が可能であるほか、中性コア糖鎖に
マンノース−１−リン酸が付加した酸性糖鎖を取得する
ことができる。形質転換した酵母の培養は、酵母の培養
に慣用される常法に従って行うことができる。例えば、
Difco 社から供給される各種の培地成分を添加し、かつ
プラスミドの複製・保持に必要なマーカー（例えばウラ
シル合成に関与するURA3遺伝子）によって供給可能とな
るアミノ酸や核酸塩基（上記の例ではウラシル）を除い
た合成培地（炭素源、窒素源、無機塩類、アミノ酸、ビ
タミン等を含む）等を利用できる〔F. Sherman, Method
s in Enzymology, Vol. 194, p.14 (1991)参照〕。
【００３０】上記培養により、形質転換体の細胞内に生
産される所望のマンノース−１−リン酸転移酵素はその
アミノ酸配列および機能などから、ゴルジ体の膜画分に
局在していると考えられるため、酵母細胞を破砕したの
ち、遠心分離〔例えば、100,000 xg, 60 min）などによ
り調製した膜画分をその酵素源として利用できる（Naka
yama et al, EMBO J., Vol. 11, p.2511-2519 (1992)参
照〕。
産される所望のマンノース−１−リン酸転移酵素はその
アミノ酸配列および機能などから、ゴルジ体の膜画分に
局在していると考えられるため、酵母細胞を破砕したの
ち、遠心分離〔例えば、100,000 xg, 60 min）などによ
り調製した膜画分をその酵素源として利用できる（Naka
yama et al, EMBO J., Vol. 11, p.2511-2519 (1992)参
照〕。
【００３１】上記により調製した膜画分を酵素源とし
て、GDP-mannose を供与体基質、種々の中性糖鎖を受容
体基質とし、かつ、既報の種々のMnイオンまたは界面活
性剤など公知の種々の酵素活性安定剤などを含む反応液
中で反応させることにより、マンノース−１−リン酸の
付加した糖鎖（図１、化学式２〜４）を製造することが
できる〔E.M. Karson and C. E. Ballou, J. Biol. Che
m., Vol.253, p.6484-6492, (1978)参照〕。また、上記
の如く製造された糖鎖は穏和な酸分解など公知の方法に
より、ヒト由来の酸性糖鎖と同一のリン酸含有糖鎖（図
１、化学式５〜７）に容易に置換が可能である。
て、GDP-mannose を供与体基質、種々の中性糖鎖を受容
体基質とし、かつ、既報の種々のMnイオンまたは界面活
性剤など公知の種々の酵素活性安定剤などを含む反応液
中で反応させることにより、マンノース−１−リン酸の
付加した糖鎖（図１、化学式２〜４）を製造することが
できる〔E.M. Karson and C. E. Ballou, J. Biol. Che
m., Vol.253, p.6484-6492, (1978)参照〕。また、上記
の如く製造された糖鎖は穏和な酸分解など公知の方法に
より、ヒト由来の酸性糖鎖と同一のリン酸含有糖鎖（図
１、化学式５〜７）に容易に置換が可能である。
【００３２】
【発明の効果】本発明により、酵母を用いて遺伝子工学
的手法により、ヒトなど哺乳類細胞の生産する高マンノ
ースと同一の中性コア糖鎖にマンノース−１−リン酸を
付加した酸性糖鎖を多量かつ純度よく生産することがで
きる。さらには、ヒトのリソゾーム酵素の欠損症の治療
などに有効な薬剤を、リポソームに包み込んで、細胞内
のリソゾームに集中させる際にリン酸含有コア糖鎖を共
存させることにより、効率的なドラッグ・デリバリーが
期待されるが、本発明はこのために有用なヒト由来のリ
ン酸含有コア糖鎖と同一の酸性糖鎖を多量かつ純度よく
生産することができる。以下、実施例により本発明を具
体的に説明するが、本発明はもちろん以下の実施例にの
み限定されるものではない。
的手法により、ヒトなど哺乳類細胞の生産する高マンノ
ースと同一の中性コア糖鎖にマンノース−１−リン酸を
付加した酸性糖鎖を多量かつ純度よく生産することがで
きる。さらには、ヒトのリソゾーム酵素の欠損症の治療
などに有効な薬剤を、リポソームに包み込んで、細胞内
のリソゾームに集中させる際にリン酸含有コア糖鎖を共
存させることにより、効率的なドラッグ・デリバリーが
期待されるが、本発明はこのために有用なヒト由来のリ
ン酸含有コア糖鎖と同一の酸性糖鎖を多量かつ純度よく
生産することができる。以下、実施例により本発明を具
体的に説明するが、本発明はもちろん以下の実施例にの
み限定されるものではない。
【００３３】
〔実施例１〕Δoch1、mnn1変異、およびmnn6変異を持つ
三重変異株（Δoch1 mnn1 mnn6) の作成 パン酵母の△och1変異株は糖蛋白質のコア糖鎖にマンノ
ース外鎖付加に必要な最初のα-1,6結合したマンノース
を付加する反応が、またmnn1変異株はコア糖鎖および外
糖鎖分枝の非還元末端にα-1,3結合したマンノースを付
加する反応が、各々欠損している。これらの変異を両方
もつ二重変異株（△och1 mnn1 ）は、既に発明者らが提
案したように、Man8GlcNAc2 の中性コア糖鎖を生産する
が（特開平6-277086）、この中性糖鎖以外に、マンノー
ス-1- リン酸を含む酸性糖鎖も副生することが判明し
た。そこで、マンノース-1- リン酸を含まない均一な中
性コア糖鎖のみを生産する株を開発するため、△och1、
mnn1、mnn6の３変異を持つ三重変異株を作成した。三重
変異株は、△och1 mnn1 二重変異株よりもマンノース-1
- リン酸の量が減少すると期待されるため、酸性基に結
合しやすい性質を持つ塩基性色素Alcian Blue-8GX （Si
gma 製、Code No. A3157）で、細胞が青く染色されにく
いという性質を調べることによって選択した。
三重変異株（Δoch1 mnn1 mnn6) の作成 パン酵母の△och1変異株は糖蛋白質のコア糖鎖にマンノ
ース外鎖付加に必要な最初のα-1,6結合したマンノース
を付加する反応が、またmnn1変異株はコア糖鎖および外
糖鎖分枝の非還元末端にα-1,3結合したマンノースを付
加する反応が、各々欠損している。これらの変異を両方
もつ二重変異株（△och1 mnn1 ）は、既に発明者らが提
案したように、Man8GlcNAc2 の中性コア糖鎖を生産する
が（特開平6-277086）、この中性糖鎖以外に、マンノー
ス-1- リン酸を含む酸性糖鎖も副生することが判明し
た。そこで、マンノース-1- リン酸を含まない均一な中
性コア糖鎖のみを生産する株を開発するため、△och1、
mnn1、mnn6の３変異を持つ三重変異株を作成した。三重
変異株は、△och1 mnn1 二重変異株よりもマンノース-1
- リン酸の量が減少すると期待されるため、酸性基に結
合しやすい性質を持つ塩基性色素Alcian Blue-8GX （Si
gma 製、Code No. A3157）で、細胞が青く染色されにく
いという性質を調べることによって選択した。
【００３４】Saccharomyces cerevisiae YN3-1D (MATα
△och1 mnn1 his1 and/or his3) （特開平6-277086参
照）より、5'フルオロオロチン酸を用いてura3変異を導
入し、YNS3-7A 株（MAT α△och1 mnn1 his1 and/or hi
s3 ura3 ）を作成した。この株とmnn6変異株LB1425-1B
（MATa mnn6 ）（カリフォルニア大学、バークレー校、
Ballou教授研究室より分与）を交雑し、減数分裂して得
た一倍体の中から目的の三重変異株TO5-2B（MAT α△oc
h1 mnn1 mnn6 his1 and/or his3 ura3）、TO5-6C（MAT
α△och1 mnn1 mnn6 ura3 ）を得た。また、上記と同様
の方法により、３重変異株TO3-6D (MATa leu2 ura3 his
1 and/or his3 mnn1 mnn6)、さらには、２重変異株TO5-
2C (Δoch1 mnn1 ura3) を作成した。上記３重変異株TO
5-2B（MAT α△och1 mnn1 mnn6 his1 and/or his3 ura
3）は、S. cerevisiae TO5-2Bと命名され、工業技術院
生命工学工業技術研究所に受託番号 FERM BP-5294 で寄
託されている。
△och1 mnn1 his1 and/or his3) （特開平6-277086参
照）より、5'フルオロオロチン酸を用いてura3変異を導
入し、YNS3-7A 株（MAT α△och1 mnn1 his1 and/or hi
s3 ura3 ）を作成した。この株とmnn6変異株LB1425-1B
（MATa mnn6 ）（カリフォルニア大学、バークレー校、
Ballou教授研究室より分与）を交雑し、減数分裂して得
た一倍体の中から目的の三重変異株TO5-2B（MAT α△oc
h1 mnn1 mnn6 his1 and/or his3 ura3）、TO5-6C（MAT
α△och1 mnn1 mnn6 ura3 ）を得た。また、上記と同様
の方法により、３重変異株TO3-6D (MATa leu2 ura3 his
1 and/or his3 mnn1 mnn6)、さらには、２重変異株TO5-
2C (Δoch1 mnn1 ura3) を作成した。上記３重変異株TO
5-2B（MAT α△och1 mnn1 mnn6 his1 and/or his3 ura
3）は、S. cerevisiae TO5-2Bと命名され、工業技術院
生命工学工業技術研究所に受託番号 FERM BP-5294 で寄
託されている。
【００３５】〔実施例２〕alcian blue 色素への吸着能
を利用するＭＮＮ６遺伝子の単離 mnn6変異株TO3-6D (MATa leu2 ura3 his1 and/or his3
mnn1 mnn6)（作成法は〔実施例１〕参照）の1.1 x 108
個の細胞に、URA3マーカーを持つシングルコピーベクタ
ーYCp50 上に構築されている酵母のゲノムDNA ライブラ
リー〔"CEN BANK" AおよびB 、American Type Culture
Collection (ATCC) より購入〕を110 μg 、リチウム法
(Ito et al., J. Bacteriol., Vol.153, p.163-168, 19
83) を用いて形質転換した。形質転換後、SD-Ura [2%グ
ルコース, 0.67% Yeast NitrogenBase w/o amino acids
(Difco社製), 0.3M ソルビトール, ウラシルを除く核
酸塩基及びアミノ酸混合物 (20-400μg/ml)]のプレート
にまいて、30℃で２日間培養し、1.2 x 104 個のコロニ
ーを得た。これらのコロニーをニトロセルロース膜へ写
し取り、このニトロセルロース膜をSD-Uraのプレート上
にのせ、更に1 日間、30℃で培養した。ニトロセルロー
スに写し取ったコロニーは、120 ℃、1 時間、オートク
レーブをかけ、膜上に固定した。このニトロセルロース
膜を、10mlの0.02N 塩酸に溶解した0.1% alcian blue溶
液で20〜30分間室温で染色した (Ballou, C. E., Meth
ods in Enzymology, Vol.185, 440-470, 1990)。この染
色で、大半は白色のコロニーであるが、青く染色される
2 つのコロニーをポジティブクローンとして単離した。
を利用するＭＮＮ６遺伝子の単離 mnn6変異株TO3-6D (MATa leu2 ura3 his1 and/or his3
mnn1 mnn6)（作成法は〔実施例１〕参照）の1.1 x 108
個の細胞に、URA3マーカーを持つシングルコピーベクタ
ーYCp50 上に構築されている酵母のゲノムDNA ライブラ
リー〔"CEN BANK" AおよびB 、American Type Culture
Collection (ATCC) より購入〕を110 μg 、リチウム法
(Ito et al., J. Bacteriol., Vol.153, p.163-168, 19
83) を用いて形質転換した。形質転換後、SD-Ura [2%グ
ルコース, 0.67% Yeast NitrogenBase w/o amino acids
(Difco社製), 0.3M ソルビトール, ウラシルを除く核
酸塩基及びアミノ酸混合物 (20-400μg/ml)]のプレート
にまいて、30℃で２日間培養し、1.2 x 104 個のコロニ
ーを得た。これらのコロニーをニトロセルロース膜へ写
し取り、このニトロセルロース膜をSD-Uraのプレート上
にのせ、更に1 日間、30℃で培養した。ニトロセルロー
スに写し取ったコロニーは、120 ℃、1 時間、オートク
レーブをかけ、膜上に固定した。このニトロセルロース
膜を、10mlの0.02N 塩酸に溶解した0.1% alcian blue溶
液で20〜30分間室温で染色した (Ballou, C. E., Meth
ods in Enzymology, Vol.185, 440-470, 1990)。この染
色で、大半は白色のコロニーであるが、青く染色される
2 つのコロニーをポジティブクローンとして単離した。
【００３６】単離した2 つのコロニーよりプラスミドを
回収し、そのままでは青く染色しないTO3-6D株に再度導
入して、alcian blue による染色性を調べた。alcian b
lue染色は、1.5ml のSD-Ura培地中で増殖させた酵母培
養液を15,000rpm で遠心し、沈殿した酵母を水で洗った
後、0.5ml の0.02N 塩酸に溶解した0.1% alcian blue溶
液を加え、撹拌の後、15分間、室温で静置した。その
後、15,000rpm で遠心して沈殿した菌体のalcian blue
色素による染色を観察することにより判定した。その結
果、プラスミドを導入したTO3-6D株は、再度、alcian b
lue で青く染色されるようになった。そこで、この2 つ
のプラスミドの挿入断片の構造を調べたところ、どちら
も全く同じ制限酵素部位をもつ約10kbp の断片が挿入さ
れていることが分かった（図３）。この挿入断片を更に
切断して、種々の断片によるmnn6変異の相補能をalcian
blue の染色性で調べた結果、HpaI-NruI の約2.6kbpが
mnn6変異を相補する最小の断片であることが分かった
（図３）。
回収し、そのままでは青く染色しないTO3-6D株に再度導
入して、alcian blue による染色性を調べた。alcian b
lue染色は、1.5ml のSD-Ura培地中で増殖させた酵母培
養液を15,000rpm で遠心し、沈殿した酵母を水で洗った
後、0.5ml の0.02N 塩酸に溶解した0.1% alcian blue溶
液を加え、撹拌の後、15分間、室温で静置した。その
後、15,000rpm で遠心して沈殿した菌体のalcian blue
色素による染色を観察することにより判定した。その結
果、プラスミドを導入したTO3-6D株は、再度、alcian b
lue で青く染色されるようになった。そこで、この2 つ
のプラスミドの挿入断片の構造を調べたところ、どちら
も全く同じ制限酵素部位をもつ約10kbp の断片が挿入さ
れていることが分かった（図３）。この挿入断片を更に
切断して、種々の断片によるmnn6変異の相補能をalcian
blue の染色性で調べた結果、HpaI-NruI の約2.6kbpが
mnn6変異を相補する最小の断片であることが分かった
（図３）。
【００３７】〔実施例３〕ＭＮＮ６遺伝子の塩基配列の
決定 MNN6遺伝子約2.6kbpを各種制限酵素で切り出し、酵母お
よび大腸菌シャトルベクターであるpRS316へ挿入した。
この種々のMNN6遺伝子断片が挿入されたプラスミドを、
蛍光色素の結合したM13 のユニバーサルプライマーおよ
びライカ社のSequiThermTM Long-Read Cycle Sequencin
g Kit-LCを用いてシークエンスの反応を行い（図４）、
ライカ社の自動シークエンサー（LI-COR Model 4000L）
を用いて塩基配列を解析した。得られた塩基配列の結
果、MNN6遺伝子はアミノ酸446 残基からなる蛋白質をコ
ードする事が予想された。この蛋白質はN 末端付近に膜
を貫通する可能性のある疎水性領域を１カ所持っていた
（図５）。本発明のMNN6遺伝子を組み込んだプラスミド
pRS-MNN6を導入した大腸菌JM109は、E. coli JM109/pRS
-MNN6と命名され、工業技術院生命工学工業技術研究所
に受託番号 FERM BP-5295 で寄託されている。
決定 MNN6遺伝子約2.6kbpを各種制限酵素で切り出し、酵母お
よび大腸菌シャトルベクターであるpRS316へ挿入した。
この種々のMNN6遺伝子断片が挿入されたプラスミドを、
蛍光色素の結合したM13 のユニバーサルプライマーおよ
びライカ社のSequiThermTM Long-Read Cycle Sequencin
g Kit-LCを用いてシークエンスの反応を行い（図４）、
ライカ社の自動シークエンサー（LI-COR Model 4000L）
を用いて塩基配列を解析した。得られた塩基配列の結
果、MNN6遺伝子はアミノ酸446 残基からなる蛋白質をコ
ードする事が予想された。この蛋白質はN 末端付近に膜
を貫通する可能性のある疎水性領域を１カ所持っていた
（図５）。本発明のMNN6遺伝子を組み込んだプラスミド
pRS-MNN6を導入した大腸菌JM109は、E. coli JM109/pRS
-MNN6と命名され、工業技術院生命工学工業技術研究所
に受託番号 FERM BP-5295 で寄託されている。
【００３８】〔実施例４〕ＭＮＮ６遺伝子発現ベクター
の作成およびこのプラスミドを含む酵母形質転換体の作
成 MNN6遺伝子を含む約2.6kbpの断片（HpaI-NruI ）を切り
出し、酵母および大腸菌のシャトルベクターでURA3マー
カーを持つpRS316のSmaI部位に挿入し、pRS-MNN6を構築
した。このpRS-MNN6を、酵母のN-結合型糖鎖の外鎖形成
を行うマンノース転移酵素の遺伝子(OCH1)が欠損してお
り、かつ末端のα-1,3- マンノースを転移するマンノー
ス転移酵素の遺伝子(MNN1)にも変異が入っている２重変
異株に更にmnn6変異を導入した３重変異株TO5-2B（△oc
h1 mnn1 mnn6 his1 and/or his3ura3）（〔実施例１〕
参照）に形質転換し、得られた形質転換体をTO5-2B/pRS
-MNN6 と命名した。
の作成およびこのプラスミドを含む酵母形質転換体の作
成 MNN6遺伝子を含む約2.6kbpの断片（HpaI-NruI ）を切り
出し、酵母および大腸菌のシャトルベクターでURA3マー
カーを持つpRS316のSmaI部位に挿入し、pRS-MNN6を構築
した。このpRS-MNN6を、酵母のN-結合型糖鎖の外鎖形成
を行うマンノース転移酵素の遺伝子(OCH1)が欠損してお
り、かつ末端のα-1,3- マンノースを転移するマンノー
ス転移酵素の遺伝子(MNN1)にも変異が入っている２重変
異株に更にmnn6変異を導入した３重変異株TO5-2B（△oc
h1 mnn1 mnn6 his1 and/or his3ura3）（〔実施例１〕
参照）に形質転換し、得られた形質転換体をTO5-2B/pRS
-MNN6 と命名した。
【００３９】〔実施例５〕ＭＮＮ６遺伝子形質転換体の
ミクロソーム膜画分を用いるマンノース−１−リン酸転
移酵素活性の測定 上記で得られたTO5-2B/pRS-MNN6 、 mnn6 変異をもつ３
重変異株にコントロールプラスミドを形質転換した株 T
O5-2B/pRS316、およびmnn6変異をもたない２重変異株TO
5-2C (Δoch1 mnn1 ura1) それぞれの株を、200ml の合
成培地SD-UraもしくはYPD(2% Bacto pepton, 1% yeast
extract, 2% glucose)(Difco社製) で対数増殖中期（Kl
ett 値200 ）まで25℃で生育させた後、遠心操作 (5000
xg、10分) で酵母細胞を集め、1% KClで洗い、Lysis Bu
ffer (50mM Tris-HCl pH7.5, 10mM MnCl2, 5% glycero
l, 1mM PMSF, 2 μg/mlのantipain, chymostatin, leup
eptin, pepstatin A) 5mlを加えて懸濁し、ガラスビー
ズ (直径0.45-0.50mm)を全体の容積の半分になるまで加
えた後、容器ごと-20 ℃で1 時間冷却した。この後、B.
Broun 社製の細胞ホモジナイザーを用いて、1 分間の細
胞破砕処理の後、1 分間のインターバルをおいて、合計
3 回、細胞破砕処理を行った。細胞破砕後、G1のグラス
フィルターを通してグラスビーズを除き、得られた細胞
破砕液を3,000xg で5 分間遠心し、破砕されなかった細
胞および核画分を除いた。上清を更に10,000xgで20分遠
心し、その沈殿をlow speed pellet (LSP)として分取す
るとともに、この時の上清を、更に100,000xg で1 時間
遠心し、得られた沈殿画分をhighspeed pellet (HSP)
として分取した。これらのLSP およびHSP 画分をLysis
Bufferで懸濁し、Pierce社のBCA 蛋白質定量キットによ
り蛋白質量を測定した。同量の蛋白質を含むHSP 画分を
用いてマンノースリン酸転移酵素の活性を測定するとと
もに、その活性を比較した。活性測定は、酵母のマンノ
ース転移酵素であるOch1p の活性測定法に準じて行った
[Nakayama et al, EMBO J., Vol. 11, p2511-2519 (199
2)] 。
ミクロソーム膜画分を用いるマンノース−１−リン酸転
移酵素活性の測定 上記で得られたTO5-2B/pRS-MNN6 、 mnn6 変異をもつ３
重変異株にコントロールプラスミドを形質転換した株 T
O5-2B/pRS316、およびmnn6変異をもたない２重変異株TO
5-2C (Δoch1 mnn1 ura1) それぞれの株を、200ml の合
成培地SD-UraもしくはYPD(2% Bacto pepton, 1% yeast
extract, 2% glucose)(Difco社製) で対数増殖中期（Kl
ett 値200 ）まで25℃で生育させた後、遠心操作 (5000
xg、10分) で酵母細胞を集め、1% KClで洗い、Lysis Bu
ffer (50mM Tris-HCl pH7.5, 10mM MnCl2, 5% glycero
l, 1mM PMSF, 2 μg/mlのantipain, chymostatin, leup
eptin, pepstatin A) 5mlを加えて懸濁し、ガラスビー
ズ (直径0.45-0.50mm)を全体の容積の半分になるまで加
えた後、容器ごと-20 ℃で1 時間冷却した。この後、B.
Broun 社製の細胞ホモジナイザーを用いて、1 分間の細
胞破砕処理の後、1 分間のインターバルをおいて、合計
3 回、細胞破砕処理を行った。細胞破砕後、G1のグラス
フィルターを通してグラスビーズを除き、得られた細胞
破砕液を3,000xg で5 分間遠心し、破砕されなかった細
胞および核画分を除いた。上清を更に10,000xgで20分遠
心し、その沈殿をlow speed pellet (LSP)として分取す
るとともに、この時の上清を、更に100,000xg で1 時間
遠心し、得られた沈殿画分をhighspeed pellet (HSP)
として分取した。これらのLSP およびHSP 画分をLysis
Bufferで懸濁し、Pierce社のBCA 蛋白質定量キットによ
り蛋白質量を測定した。同量の蛋白質を含むHSP 画分を
用いてマンノースリン酸転移酵素の活性を測定するとと
もに、その活性を比較した。活性測定は、酵母のマンノ
ース転移酵素であるOch1p の活性測定法に準じて行った
[Nakayama et al, EMBO J., Vol. 11, p2511-2519 (199
2)] 。
【００４０】蛋白質量として400 μg の上記膜画分を用
いて、50μl の溶液〔50 mM Tris-HCl pH 6.0, 10 mM M
nCl2, 0.06 % Triton X 100, 1μM Man8GlcNAc2-PA, 1
mM GDP-mannose, 0.5 mM 1-deoxy-mannojirimycinを含
む〕中で30℃、 1時間、反応させた。反応液は100 ℃で
5 分間処理して酵素を失活させた後に、ウルトラフリー
C3LGC ( 分子量10000 カット) を用いて高分子量の物質
を除き、ろ液を下記のHPLCにより分析した。HPLCは、ア
ミノカラムAsahipak NH2P-50 (4.6 x 250 mm) を用い、
溶媒はA 液としてアセトニトリルと200 mM酢酸- トリエ
チルアミン (pH 7.3) の7:3 の混合液を、B 液としてア
セトニトリルと200 mM酢酸- トリエチルアミン(pH 7.3)
の3:7 の混合液を用いた。溶出は、1 ml/minの流速で、
B 液20% から始まり、40分でB 液100%となるリニアグラ
ジエントをかけることで行った。マンノース-1- リン酸
転移酵素の活性は、糖受容体であるMan8GlcNAc2-PA（Ta
KaRa製、Code No,4119) （ピーク１）に対する反応産物
（ピーク２および３）（図６）の面積比から、計算し
た。
いて、50μl の溶液〔50 mM Tris-HCl pH 6.0, 10 mM M
nCl2, 0.06 % Triton X 100, 1μM Man8GlcNAc2-PA, 1
mM GDP-mannose, 0.5 mM 1-deoxy-mannojirimycinを含
む〕中で30℃、 1時間、反応させた。反応液は100 ℃で
5 分間処理して酵素を失活させた後に、ウルトラフリー
C3LGC ( 分子量10000 カット) を用いて高分子量の物質
を除き、ろ液を下記のHPLCにより分析した。HPLCは、ア
ミノカラムAsahipak NH2P-50 (4.6 x 250 mm) を用い、
溶媒はA 液としてアセトニトリルと200 mM酢酸- トリエ
チルアミン (pH 7.3) の7:3 の混合液を、B 液としてア
セトニトリルと200 mM酢酸- トリエチルアミン(pH 7.3)
の3:7 の混合液を用いた。溶出は、1 ml/minの流速で、
B 液20% から始まり、40分でB 液100%となるリニアグラ
ジエントをかけることで行った。マンノース-1- リン酸
転移酵素の活性は、糖受容体であるMan8GlcNAc2-PA（Ta
KaRa製、Code No,4119) （ピーク１）に対する反応産物
（ピーク２および３）（図６）の面積比から、計算し
た。
【００４１】その結果、mnn6変異をもつ３重変異株にコ
ントロールプラスミドを形質転換した株（TO5-2B/pRS31
6)より調製した膜画分を酵素源とした時には、マンノー
ス-1- リン酸転移酵素の活性は観察されなかった（図
６，Ａ）のに対し、mnn6変異をもたない２重変異株(TO5
-2C)（図６，Ｂ）およびMNN6遺伝子を1 コピー持つプラ
スミドで形質転換した３重変異株（TO5-2B/pRS-MNN6)
（図６，Ｃ）では、ピーク２および３の反応産物が観察
された。このときの酵素活性は約５ pmol mannose-1-ph
osphate / mg protein /hrであった。従って、MNN6遺伝
子のコピー数に比例してマンノース-1- リン酸転移酵素
の活性が回復することから、MNN6遺伝子の導入によりマ
ンノース-1- リン酸転移酵素そのものをコードしている
遺伝子であることが明らかとなった。
ントロールプラスミドを形質転換した株（TO5-2B/pRS31
6)より調製した膜画分を酵素源とした時には、マンノー
ス-1- リン酸転移酵素の活性は観察されなかった（図
６，Ａ）のに対し、mnn6変異をもたない２重変異株(TO5
-2C)（図６，Ｂ）およびMNN6遺伝子を1 コピー持つプラ
スミドで形質転換した３重変異株（TO5-2B/pRS-MNN6)
（図６，Ｃ）では、ピーク２および３の反応産物が観察
された。このときの酵素活性は約５ pmol mannose-1-ph
osphate / mg protein /hrであった。従って、MNN6遺伝
子のコピー数に比例してマンノース-1- リン酸転移酵素
の活性が回復することから、MNN6遺伝子の導入によりマ
ンノース-1- リン酸転移酵素そのものをコードしている
遺伝子であることが明らかとなった。
【００４２】〔実施例６〕マンノース−１−リン酸転移
酵素の反応産物の構造解析 上記の活性測定で得られた２つの反応産物（ピーク２お
よび３）（図６）が目的通り、マンノース-1- リン酸が
転移した産物であるかどうかを解析した。まず、すでに
NMR でその構造が確認できている化合物（図７、構造式
B およびC ）について、上記の活性測定系と同じ条件で
HPLCにより分析したところ、構造式B のものは、活性測
定で検出したピーク３と全く同じ位置に溶出された。従
って、活性測定で現れたピーク３は構造式B の糖鎖と同
じものと考えられた。また、マンノース-1- リン酸が２
つ結合している構造式C の溶出位置は、ピーク２および
３よりもかなり遅れて溶出する位置であったことから、
ピーク２は構造式B とは異なる位置にマンノース-1- リ
ン酸が１つ結合している構造式A と推定された。
酵素の反応産物の構造解析 上記の活性測定で得られた２つの反応産物（ピーク２お
よび３）（図６）が目的通り、マンノース-1- リン酸が
転移した産物であるかどうかを解析した。まず、すでに
NMR でその構造が確認できている化合物（図７、構造式
B およびC ）について、上記の活性測定系と同じ条件で
HPLCにより分析したところ、構造式B のものは、活性測
定で検出したピーク３と全く同じ位置に溶出された。従
って、活性測定で現れたピーク３は構造式B の糖鎖と同
じものと考えられた。また、マンノース-1- リン酸が２
つ結合している構造式C の溶出位置は、ピーク２および
３よりもかなり遅れて溶出する位置であったことから、
ピーク２は構造式B とは異なる位置にマンノース-1- リ
ン酸が１つ結合している構造式A と推定された。
【００４３】さらに、ピーク２および３がマンノース-1
- リン酸が１つ結合した糖鎖であることを直接確認する
ため、ピーク２および３を分取し、マンノース-1- リン
酸残基のマンノース部分のみを特異的に切り出す温和な
酸加水分解処理を行った。分取したピークの溶媒を凍結
乾燥で除き、これに0.01N HCl を0.5ml 加え、100 ℃で
30分間の条件で処理を行い、溶媒およびHCl を凍結乾燥
で除いた後、HPLCで分析したところ、ピーク２および３
はともに非常に遅い位置に溶出してきた（図８, B)。こ
れは、マンノース-1- リン酸残基のマンノースのみが切
断されたために、リン酸の電荷が増え、アミノカラムへ
の吸着性が増加したためと考えられた。そこで次に、こ
れらのピークについて、さらにアルカリフォスファター
ゼ処理を行った。溶媒を凍結乾燥で除いた後、40μl の
50mM Tris-HCl(pH9.5)にサンプルを溶解した後、0.2 un
its のアルカリフォスファターゼを加え、室温で4 時間
反応させた。この後、溶媒を凍結乾燥により除去し、HP
LCにより分析した結果、これらのピークは糖受容体とし
て用いたMan8GlcNAc2-PA（ピーク１）と同じ位置に溶出
してきた（図８, C ）。これらの結果より、ピーク２お
よび３（図８, A ）は、Man8GlcNAc2-PAにマンノース-1
- リン酸残基が１分子の結合したものであり、ピーク２
は図７の構造式A に示される酸性糖鎖、ピーク３は図７
の構造式B に示される酸性糖鎖であることが明らかとな
った。
- リン酸が１つ結合した糖鎖であることを直接確認する
ため、ピーク２および３を分取し、マンノース-1- リン
酸残基のマンノース部分のみを特異的に切り出す温和な
酸加水分解処理を行った。分取したピークの溶媒を凍結
乾燥で除き、これに0.01N HCl を0.5ml 加え、100 ℃で
30分間の条件で処理を行い、溶媒およびHCl を凍結乾燥
で除いた後、HPLCで分析したところ、ピーク２および３
はともに非常に遅い位置に溶出してきた（図８, B)。こ
れは、マンノース-1- リン酸残基のマンノースのみが切
断されたために、リン酸の電荷が増え、アミノカラムへ
の吸着性が増加したためと考えられた。そこで次に、こ
れらのピークについて、さらにアルカリフォスファター
ゼ処理を行った。溶媒を凍結乾燥で除いた後、40μl の
50mM Tris-HCl(pH9.5)にサンプルを溶解した後、0.2 un
its のアルカリフォスファターゼを加え、室温で4 時間
反応させた。この後、溶媒を凍結乾燥により除去し、HP
LCにより分析した結果、これらのピークは糖受容体とし
て用いたMan8GlcNAc2-PA（ピーク１）と同じ位置に溶出
してきた（図８, C ）。これらの結果より、ピーク２お
よび３（図８, A ）は、Man8GlcNAc2-PAにマンノース-1
- リン酸残基が１分子の結合したものであり、ピーク２
は図７の構造式A に示される酸性糖鎖、ピーク３は図７
の構造式B に示される酸性糖鎖であることが明らかとな
った。
【００４４】
配列番号：１ 配列の長さ：446 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met His Val Leu Leu Ser Lys Lys Ile Ala Arg Phe Leu Leu Ile Ser 1 5 10 15 Phe Val Phe Val Leu Ala Leu Met Val Thr Ile Asn His Pro Lys Thr 20 25 30 Lys Gln Met Ser Glu Gln Tyr Val Thr Pro Tyr Leu Pro Lys Ser Leu 35 40 45 Gln Pro Ile Ala Lys Ile Ser Ala Glu Glu Gln Arg Arg Ile Gln Ser 50 55 60 Glu Gln Glu Glu Ala Glu Leu Lys Gln Ser Leu Glu Gly Glu Ala Ile 65 70 75 80 Arg Asn Ala Thr Val Asn Ala Ile Lys Glu Lys Ile Lys Ser Tyr Gly 85 90 95 Gly Asn Glu Thr Thr Leu Gly Phe Met Val Pro Ser Tyr Ile Asn His 100 105 110 Arg Gly Ser Pro Pro Lys Ala Cys Phe Val Ser Leu Ile Thr Glu Arg 115 120 125 Asp Ser Met Thr Gln Ile Leu Gln Ser Ile Asp Glu Val Gln Val Lys 130 135 140 Phe Asn Lys Asn Phe Ala Tyr Pro Trp Val Phe Ile Ser Gln Gly Glu 145 150 155 160 Leu Asp Gly Met Lys Gln Glu Met Ile Arg Gln Ala Ile Thr Asp Ser 165 170 175 Met Asn Gly Asp Pro Glu Leu Ile Asn Ile Lys Phe Ala Glu Ile Pro 180 185 190 Ala Asp Glu Trp Val Tyr Pro Glu Trp Ile Asp Glu Asn Lys Ala Ala 195 200 205 Glu Ser Leu Ile Ser Leu Ala Asn Val Pro Asp Gly Asp Ser Arg Ala 210 215 220 Val Arg Tyr Gln Ala Arg Tyr Phe Ala Gly Phe Phe Trp Arg His Pro 225 230 235 240 Val Leu Asp Glu Phe Asp Trp Tyr Trp Arg Val Asp Pro Gly Ile Lys 245 250 255 Leu Tyr Cys Asp Ile Asp His Asp Leu Phe Arg Trp Met Gln Asp Glu 260 265 270 Gly Lys Val Phe Gly Phe Thr Leu Ser Met Ser Glu Ala Lys Glu Ala 275 280 285 Asn Glu Lys Ile Trp Asp Val Thr Lys Lys Phe Ala Lys Asp Phe Pro 290 295 300 Lys Phe Ile Ser Glu Asn Asn Phe Lys Ser Phe Ile Thr Lys Lys Asp 305 310 315 320 Ser Glu Asp Phe Asn Asn Cys Glu Phe Thr Ser Asn Phe Glu Ile Gly 325 330 335 Asn Leu Asn Phe Tyr Arg Ser Pro Ala Tyr Arg Lys Phe Phe Asn Tyr 340 345 350 Ile Asp Glu Glu Gly Gly Ile Phe Tyr Trp Lys Trp Ser Asp Ser Ile 355 360 365 Ile His Thr Ile Gly Leu Ser Met Leu Leu Pro Lys Asp Lys Ile His 370 375 380 Phe Phe Glu Asn Ile Gly Phe His Tyr Asp Lys Tyr Asn Asn Cys Pro 385 390 395 400 Leu Asn Asp Asp Ile Trp Asn Gln Tyr Asn Cys Asn Cys Asp Gln Gly 405 410 415 Asn Asp Phe Thr Phe Arg Ser Gly Ser Cys Gly Gly His Tyr Phe Asp 420 425 430 Ile Met Lys Lys Asp Lys Pro Glu Gly Trp Asp Arg Leu Pro 435 440 445
【００４５】配列番号：２ 配列の長さ：1380 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：サッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyce
s cerevisiae） 株名： 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1 ．．1338 特徴を決定した方法：E 配列 ATG CAC GTA CTG CTG AGC AAA AAA ATA GCA CGC TTT CTG TTG ATT TCG 48 Met His Val Leu Leu Ser Lys Lys Ile Ala Arg Phe Leu Leu Ile Ser 1 5 10 15 TTT GTT TTC GTG CTT GCG CTA ATG GTG ACA ATA AAT CAT CCA AAA ACA 96 Phe Val Phe Val Leu Ala Leu Met Val Thr Ile Asn His Pro Lys Thr 20 25 30 AAG CAG ATG TCT GAA CAG TAT GTT ACA CCA TAC CTT CCG AAA TCT TTG 144 Lys Gln Met Ser Glu Gln Tyr Val Thr Pro Tyr Leu Pro Lys Ser Leu 35 40 45 CAA CCT ATT GCA AAA ATT AGT GCA GAG GAA CAA AGG CGT ATA CAA AGT 192 Gln Pro Ile Ala Lys Ile Ser Ala Glu Glu Gln Arg Arg Ile Gln Ser 50 55 60 GAA CAG GAA GAA GCC GAA TTG AAG CAA TCT TTA GAG GGA GAG GCC ATT 240 Glu Gln Glu Glu Ala Glu Leu Lys Gln Ser Leu Glu Gly Glu Ala Ile 65 70 75 80 AGA AAT GCC ACC GTG AAT GCC ATT AAG GAA AAG ATC AAA TCT TAT GGT 288 Arg Asn Ala Thr Val Asn Ala Ile Lys Glu Lys Ile Lys Ser Tyr Gly 85 90 95 GGT AAT GAA ACG ACG CTA GGG TTC ATG GTG CCA TCG TAT ATC AAT CAT 336 Gly Asn Glu Thr Thr Leu Gly Phe Met Val Pro Ser Tyr Ile Asn His 100 105 110 AGA GGA TCA CCA CCA AAG GCG TGC TTT GTC TCA CTA ATT ACT GAA AGG 384 Arg Gly Ser Pro Pro Lys Ala Cys Phe Val Ser Leu Ile Thr Glu Arg 115 120 125 GAT TCC ATG ACC CAA ATC TTA CAA TCT ATT GAT GAA GTG CAG GTG AAG 432 Asp Ser Met Thr Gln Ile Leu Gln Ser Ile Asp Glu Val Gln Val Lys 130 135 140 TTT AAC AAA AAT TTT GCT TAT CCT TGG GTT TTT ATT AGT CAG GGG GAG 480 Phe Asn Lys Asn Phe Ala Tyr Pro Trp Val Phe Ile Ser Gln Gly Glu 145 150 155 160 CTT GAC GGA ATG AAG CAA GAA ATG ATT CGT CAA GCC ATA ACT GAT TCT 528 Leu Asp Gly Met Lys Gln Glu Met Ile Arg Gln Ala Ile Thr Asp Ser 165 170 175 ATG AAT GGT GAT CCT GAG TTA ATT AAT ATT AAA TTT GCT GAA ATT CCT 576 Met Asn Gly Asp Pro Glu Leu Ile Asn Ile Lys Phe Ala Glu Ile Pro 180 185 190 GCA GAC GAA TGG GTA TAC CCT GAA TGG ATT GAT GAA AAT AAA GCA GCA 624 Ala Asp Glu Trp Val Tyr Pro Glu Trp Ile Asp Glu Asn Lys Ala Ala 195 200 205 GAA TCG CTA ATT TCA TTA GCA AAT GTA CCG GAT GGT GAT TCT AGA GCT 672 Glu Ser Leu Ile Ser Leu Ala Asn Val Pro Asp Gly Asp Ser Arg Ala 210 215 220 GTA AGA TAT CAA GCT AGA TAT TTT GCA GGG TTT TTT TGG AGG CAT CCA 720 Val Arg Tyr Gln Ala Arg Tyr Phe Ala Gly Phe Phe Trp Arg His Pro 225 230 235 240 GTT CTG GAT GAG TTT GAT TGG TAC TGG AGA GTA GAC CCT GGT ATT AAA 768 Val Leu Asp Glu Phe Asp Trp Tyr Trp Arg Val Asp Pro Gly Ile Lys 245 250 255 TTG TAC TGT GAT ATT GAT CAT GAC CTT TTT AGG TGG ATG CAA GAT GAA 816 Leu Tyr Cys Asp Ile Asp His Asp Leu Phe Arg Trp Met Gln Asp Glu 260 265 270 GGC AAA GTG TTT GGT TTC ACA TTG AGT ATG AGT GAA GCT AAG GAA GCC 864 Gly Lys Val Phe Gly Phe Thr Leu Ser Met Ser Glu Ala Lys Glu Ala 275 280 285 AAT GAG AAG ATT TGG GAT GTT ACG AAA AAA TTT GCA AAG GAT TTT CCA 912 Asn Glu Lys Ile Trp Asp Val Thr Lys Lys Phe Ala Lys Asp Phe Pro 290 295 300 AAG TTT ATT TCC GAG AAT AAT TTC AAG TCA TTT ATT ACA AAA AAG GAC 960 Lys Phe Ile Ser Glu Asn Asn Phe Lys Ser Phe Ile Thr Lys Lys Asp 305 310 315 320 TCT GAA GAT TTT AAC AAC TGT GAA TTC ACA TCA AAT TTT GAA ATT GGT 1008 Ser Glu Asp Phe Asn Asn Cys Glu Phe Thr Ser Asn Phe Glu Ile Gly 325 330 335 AAT TTG AAC TTT TAT AGA TCG CCA GCT TAC AGG AAA TTT TTT AAT TAC 1056 Asn Leu Asn Phe Tyr Arg Ser Pro Ala Tyr Arg Lys Phe Phe Asn Tyr 340 345 350 ATC GAC GAA GAG GGC GGT ATT TTC TAC TGG AAA TGG TCT GAT TCC ATC 1104 Ile Asp Glu Glu Gly Gly Ile Phe Tyr Trp Lys Trp Ser Asp Ser Ile 355 360 365 ATC CAC ACA ATT GGG TTA TCG ATG CTG TTG CCA AAG GAT AAA ATA CAT 1152 Ile His Thr Ile Gly Leu Ser Met Leu Leu Pro Lys Asp Lys Ile His 370 375 380 TTT TTC GAA AAT ATA GGA TTC CAT TAT GAC AAG TAC AAT AAC TGT CCC 1200 Phe Phe Glu Asn Ile Gly Phe His Tyr Asp Lys Tyr Asn Asn Cys Pro 385 390 395 400 CTA AAC GAT GAT ATA TGG AAC CAA TAT AAT TGT AAC TGT GAC CAG GGT 1248 Leu Asn Asp Asp Ile Trp Asn Gln Tyr Asn Cys Asn Cys Asp Gln Gly 405 410 415 AAC GAT TTC ACG TTT AGA AGT GGT TCA TGT GGC GGA CAT TAC TTC GAC 1296 Asn Asp Phe Thr Phe Arg Ser Gly Ser Cys Gly Gly His Tyr Phe Asp 420 425 430 ATT ATG AAG AAA GAT AAG CCA GAA GGT TGG GAT AGG TTA CCA 1338 Ile Met Lys Lys Asp Lys Pro Glu Gly Trp Asn Arg Leu Pro 435 440 445 TAAATCAAAA CACTGATGTA TAAGAACAAT AATCTTCTAC AT 1380
s cerevisiae） 株名： 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1 ．．1338 特徴を決定した方法：E 配列 ATG CAC GTA CTG CTG AGC AAA AAA ATA GCA CGC TTT CTG TTG ATT TCG 48 Met His Val Leu Leu Ser Lys Lys Ile Ala Arg Phe Leu Leu Ile Ser 1 5 10 15 TTT GTT TTC GTG CTT GCG CTA ATG GTG ACA ATA AAT CAT CCA AAA ACA 96 Phe Val Phe Val Leu Ala Leu Met Val Thr Ile Asn His Pro Lys Thr 20 25 30 AAG CAG ATG TCT GAA CAG TAT GTT ACA CCA TAC CTT CCG AAA TCT TTG 144 Lys Gln Met Ser Glu Gln Tyr Val Thr Pro Tyr Leu Pro Lys Ser Leu 35 40 45 CAA CCT ATT GCA AAA ATT AGT GCA GAG GAA CAA AGG CGT ATA CAA AGT 192 Gln Pro Ile Ala Lys Ile Ser Ala Glu Glu Gln Arg Arg Ile Gln Ser 50 55 60 GAA CAG GAA GAA GCC GAA TTG AAG CAA TCT TTA GAG GGA GAG GCC ATT 240 Glu Gln Glu Glu Ala Glu Leu Lys Gln Ser Leu Glu Gly Glu Ala Ile 65 70 75 80 AGA AAT GCC ACC GTG AAT GCC ATT AAG GAA AAG ATC AAA TCT TAT GGT 288 Arg Asn Ala Thr Val Asn Ala Ile Lys Glu Lys Ile Lys Ser Tyr Gly 85 90 95 GGT AAT GAA ACG ACG CTA GGG TTC ATG GTG CCA TCG TAT ATC AAT CAT 336 Gly Asn Glu Thr Thr Leu Gly Phe Met Val Pro Ser Tyr Ile Asn His 100 105 110 AGA GGA TCA CCA CCA AAG GCG TGC TTT GTC TCA CTA ATT ACT GAA AGG 384 Arg Gly Ser Pro Pro Lys Ala Cys Phe Val Ser Leu Ile Thr Glu Arg 115 120 125 GAT TCC ATG ACC CAA ATC TTA CAA TCT ATT GAT GAA GTG CAG GTG AAG 432 Asp Ser Met Thr Gln Ile Leu Gln Ser Ile Asp Glu Val Gln Val Lys 130 135 140 TTT AAC AAA AAT TTT GCT TAT CCT TGG GTT TTT ATT AGT CAG GGG GAG 480 Phe Asn Lys Asn Phe Ala Tyr Pro Trp Val Phe Ile Ser Gln Gly Glu 145 150 155 160 CTT GAC GGA ATG AAG CAA GAA ATG ATT CGT CAA GCC ATA ACT GAT TCT 528 Leu Asp Gly Met Lys Gln Glu Met Ile Arg Gln Ala Ile Thr Asp Ser 165 170 175 ATG AAT GGT GAT CCT GAG TTA ATT AAT ATT AAA TTT GCT GAA ATT CCT 576 Met Asn Gly Asp Pro Glu Leu Ile Asn Ile Lys Phe Ala Glu Ile Pro 180 185 190 GCA GAC GAA TGG GTA TAC CCT GAA TGG ATT GAT GAA AAT AAA GCA GCA 624 Ala Asp Glu Trp Val Tyr Pro Glu Trp Ile Asp Glu Asn Lys Ala Ala 195 200 205 GAA TCG CTA ATT TCA TTA GCA AAT GTA CCG GAT GGT GAT TCT AGA GCT 672 Glu Ser Leu Ile Ser Leu Ala Asn Val Pro Asp Gly Asp Ser Arg Ala 210 215 220 GTA AGA TAT CAA GCT AGA TAT TTT GCA GGG TTT TTT TGG AGG CAT CCA 720 Val Arg Tyr Gln Ala Arg Tyr Phe Ala Gly Phe Phe Trp Arg His Pro 225 230 235 240 GTT CTG GAT GAG TTT GAT TGG TAC TGG AGA GTA GAC CCT GGT ATT AAA 768 Val Leu Asp Glu Phe Asp Trp Tyr Trp Arg Val Asp Pro Gly Ile Lys 245 250 255 TTG TAC TGT GAT ATT GAT CAT GAC CTT TTT AGG TGG ATG CAA GAT GAA 816 Leu Tyr Cys Asp Ile Asp His Asp Leu Phe Arg Trp Met Gln Asp Glu 260 265 270 GGC AAA GTG TTT GGT TTC ACA TTG AGT ATG AGT GAA GCT AAG GAA GCC 864 Gly Lys Val Phe Gly Phe Thr Leu Ser Met Ser Glu Ala Lys Glu Ala 275 280 285 AAT GAG AAG ATT TGG GAT GTT ACG AAA AAA TTT GCA AAG GAT TTT CCA 912 Asn Glu Lys Ile Trp Asp Val Thr Lys Lys Phe Ala Lys Asp Phe Pro 290 295 300 AAG TTT ATT TCC GAG AAT AAT TTC AAG TCA TTT ATT ACA AAA AAG GAC 960 Lys Phe Ile Ser Glu Asn Asn Phe Lys Ser Phe Ile Thr Lys Lys Asp 305 310 315 320 TCT GAA GAT TTT AAC AAC TGT GAA TTC ACA TCA AAT TTT GAA ATT GGT 1008 Ser Glu Asp Phe Asn Asn Cys Glu Phe Thr Ser Asn Phe Glu Ile Gly 325 330 335 AAT TTG AAC TTT TAT AGA TCG CCA GCT TAC AGG AAA TTT TTT AAT TAC 1056 Asn Leu Asn Phe Tyr Arg Ser Pro Ala Tyr Arg Lys Phe Phe Asn Tyr 340 345 350 ATC GAC GAA GAG GGC GGT ATT TTC TAC TGG AAA TGG TCT GAT TCC ATC 1104 Ile Asp Glu Glu Gly Gly Ile Phe Tyr Trp Lys Trp Ser Asp Ser Ile 355 360 365 ATC CAC ACA ATT GGG TTA TCG ATG CTG TTG CCA AAG GAT AAA ATA CAT 1152 Ile His Thr Ile Gly Leu Ser Met Leu Leu Pro Lys Asp Lys Ile His 370 375 380 TTT TTC GAA AAT ATA GGA TTC CAT TAT GAC AAG TAC AAT AAC TGT CCC 1200 Phe Phe Glu Asn Ile Gly Phe His Tyr Asp Lys Tyr Asn Asn Cys Pro 385 390 395 400 CTA AAC GAT GAT ATA TGG AAC CAA TAT AAT TGT AAC TGT GAC CAG GGT 1248 Leu Asn Asp Asp Ile Trp Asn Gln Tyr Asn Cys Asn Cys Asp Gln Gly 405 410 415 AAC GAT TTC ACG TTT AGA AGT GGT TCA TGT GGC GGA CAT TAC TTC GAC 1296 Asn Asp Phe Thr Phe Arg Ser Gly Ser Cys Gly Gly His Tyr Phe Asp 420 425 430 ATT ATG AAG AAA GAT AAG CCA GAA GGT TGG GAT AGG TTA CCA 1338 Ile Met Lys Lys Asp Lys Pro Glu Gly Trp Asn Arg Leu Pro 435 440 445 TAAATCAAAA CACTGATGTA TAAGAACAAT AATCTTCTAC AT 1380
【図１】コア糖鎖ならびに酵母および哺乳類細胞で生成
される糖鎖修飾の構造を示す。
される糖鎖修飾の構造を示す。
【図２】酵母のＮ−結合型糖鎖におけるコア糖鎖へのマ
ンノース付加経路を示す。
ンノース付加経路を示す。
【図３】単離したＭＮＮ６遺伝子を含むＤＮＡ断片の制
限酵素地図およびＤＮＡ断片のｍｎｎ６変異の相補能を
示す。
限酵素地図およびＤＮＡ断片のｍｎｎ６変異の相補能を
示す。
【図４】ＭＮＮ６遺伝子を含むＤＮＡ塩基配列の決定法
を示す。
を示す。
【図５】ＭＮＮ６遺伝子を含む塩基配列およびアミノ酸
配列を示す。
配列を示す。
【図６】各種酵母変異株によるマンノース−１−リン酸
転移酵素活性を示す。 A.三重変異株 (△och1 mnn1 mnn6 his1 and/or his3 ur
a3）にコントロールプラスミドを導入した株(TO5-2B/pR
S316) B.二重変異株 TO5-2C （Δoch1 mnn1 ura3) C.三重変異株（Δoch1 mnn1 mnn6 his1 and/or his3 ur
a3）にＭＮＮ６遺伝子を１コピー含むプラスミドを導入
した株(TO5-2B/pRS-MNN6)
転移酵素活性を示す。 A.三重変異株 (△och1 mnn1 mnn6 his1 and/or his3 ur
a3）にコントロールプラスミドを導入した株(TO5-2B/pR
S316) B.二重変異株 TO5-2C （Δoch1 mnn1 ura3) C.三重変異株（Δoch1 mnn1 mnn6 his1 and/or his3 ur
a3）にＭＮＮ６遺伝子を１コピー含むプラスミドを導入
した株(TO5-2B/pRS-MNN6)
【図７】酵素反応産物のＨＰＬＣ分析および構造を示
す。
す。
【図８】酵素反応産物の酸処理物およびアルカリホスフ
ァターゼ処理物のＨＰＬＣ分析を示す。 A. 反応産物 B. 酸処理物 C. アルカリホスファターゼ処理物
ァターゼ処理物のＨＰＬＣ分析を示す。 A. 反応産物 B. 酸処理物 C. アルカリホスファターゼ処理物
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 王 暁輝 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技術 院 生命工学工業技術研究所内
Claims (2)
- 【請求項１】 配列番号１に示したアミノ酸配列または
この配列において１もしくは複数のアミノ酸残基が挿
入、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を有し、マン
ノース−１−リン酸転移酵素の酵素活性をもたらすアミ
ノ酸配列をコードする酵母（サッカロミセス・セレビシ
エ) のマンノース−１−リン酸転移酵素遺伝子の全部ま
たは一部を含むプラスミドＤＮＡによって形質転換され
た酵母細胞を培地に培養し、培養物よりマンノース−１
−リン酸転移酵素を得、これを中性コア糖鎖に生体内ま
たは生体外で作用させて得られるマンノース−１−リン
酸含有酸性糖鎖を酸処理することによってマンノース部
分を切除することを特徴とするリン酸含有酸性糖鎖の製
造方法。 - 【請求項２】 マンノース−１−リン酸転移酵素遺伝子
が配列番号２に示した塩基配列で表されるマンノース−
１−リン酸転移酵素遺伝子である請求項１記載の製造方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9298158A JP2826636B2 (ja) | 1997-10-30 | 1997-10-30 | 酵母のマンノース−１−リン酸転移酵素遺伝子を利用するリン酸含有酸性糖鎖の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9298158A JP2826636B2 (ja) | 1997-10-30 | 1997-10-30 | 酵母のマンノース−１−リン酸転移酵素遺伝子を利用するリン酸含有酸性糖鎖の製造方法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7299509A Division JP2767401B2 (ja) | 1995-11-17 | 1995-11-17 | 酵母のマンノース−１−リン酸転移酵素遺伝子およびこれを利用するマンノース−１−リン酸含有酸性糖鎖の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10155495A true JPH10155495A (ja) | 1998-06-16 |
| JP2826636B2 JP2826636B2 (ja) | 1998-11-18 |
Family
ID=17855958
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9298158A Expired - Lifetime JP2826636B2 (ja) | 1997-10-30 | 1997-10-30 | 酵母のマンノース−１−リン酸転移酵素遺伝子を利用するリン酸含有酸性糖鎖の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2826636B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002369692A (ja) * | 2001-06-14 | 2002-12-24 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 糖蛋白質およびその製造方法 |
-
1997
- 1997-10-30 JP JP9298158A patent/JP2826636B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002369692A (ja) * | 2001-06-14 | 2002-12-24 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 糖蛋白質およびその製造方法 |
| WO2002103027A1 (fr) * | 2001-06-14 | 2002-12-27 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Glycoprotéine et procédé de production |
| CN1298862C (zh) * | 2001-06-14 | 2007-02-07 | 独立行政法人产业技术综合研究所 | 糖蛋白及其制备方法 |
| KR100888316B1 (ko) | 2001-06-14 | 2009-03-11 | 내셔날 인스티튜트 오브 어드밴스드 인더스트리얼 사이언스 앤드 테크놀로지 | 당단백질 및 그의 제조 방법 |
| JP4742191B2 (ja) * | 2001-06-14 | 2011-08-10 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 糖蛋白質およびその製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2826636B2 (ja) | 1998-11-18 |
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