JPH05317055A

JPH05317055A - 新規なウリカーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及びウリカーゼの製造法

Info

Publication number: JPH05317055A
Application number: JP4123898A
Authority: JP
Inventors: Taiji Koyama; 泰二小山; Toshio Ichikawa; 利夫市川; Eiichi Nakano; 衛一中野
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1992-05-15
Filing date: 1992-05-15
Publication date: 1993-12-03
Anticipated expiration: 2014-11-29
Also published as: JP2984143B2; DE4316505A1

Abstract

(57)【要約】【構成】キャンディダ・ウチリス由来のウリカーゼ遺
伝子の単離・構造決定し、これをベクターＤＮＡに挿入
した組み換え体ＤＮＡを得、この組み換え体をエッシェ
リシア属微生物を含ませたウリカーゼ生産能を有する菌
株を培養してウリカーゼを製造する。【効果】培地中に尿酸を添加することなく、ウリカー
ゼを効率よく生産できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ウリカーゼ遺伝子、新
規な組み換え体ＤＮＡ及びウリカーゼの製造法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】ウリカーゼは、尿酸を加水分解してアラ
ントイン、過酸化水素及び炭酸ガスの生成作用を触媒す
る酵素であり、血中又は尿中尿酸の定量用試薬として使
用され、生化学的診断に重要な役割を果たしている。従
来、ウリカーゼは、例えば、キャンディダ・ウチリス
(Candida utilis) を尿酸含有培地に接種、培養し、培
養物からウリカーゼを採取することにより製造されてい
る (特公昭42-5192号公報) 。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記の
ウリカーゼの製造法によるときには、ウリカーゼの収率
が不充分である等の問題点があった。

【０００４】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者等は、
上記問題点を解決すべく種々検討した結果、キャンディ
ダ・ウチリス由来のウリカーゼ遺伝子を初めて単離及び
構造決定することに成功し、また更に、ウリカーゼをコ
ードする遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した組み換え体
ＤＮＡを得、この組み換え体をエッシェリシア (Escher
ichia)属に属する菌株に含ませたウリカーゼ生産能を有
する菌株を培地に培養すると、培地中に尿酸を添加する
ことなく効率よくウリカーゼが生産されること等を知
り、本発明を完成した。

【０００５】即ち、本発明の第１は、配列表の配列番号
２のアミノ酸配列をコードする新規なウリカーゼ遺伝子
であり、本発明の第２は、前記本発明の第１の新規なウ
リカーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴
とする新規な組み換え体ＤＮＡであり、また、本発明の
第３は、前記本発明の第２の新規な組み換え体ＤＮＡを
含み、ウリカーゼ生産能を有するエッシェリシア属に属
する微生物を培地に培養し、培養物よりウリカーゼを採
取することを特徴とするウリカーゼの製造法である。

【０００６】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
ウリカーゼ遺伝子は、例えば、次のようにして得ること
ができる。先ず、キャンディダ・ウチリス(Candida uti
lis)ATCC9950( ブタペスト条約に基づく国際寄託 No.AT
CC74151)を、例えばCurrent Protocols in Molecular B
iology (WILEY Interscience, 1989) unit 13.11記載の
方法等により培養して得た菌株から染色体ＤＮＡを得
る。

【０００７】次いで、この染色体ＤＮＡをSau3AIにより
部分分解し、染色体ＤＮＡ断片混合物を得る。このよう
にして得たＤＮＡ断片混合物から、例えば、通常のアガ
ロースゲル電気泳動法により、好ましくは10〜20kbの大
きさのＤＮＡ断片混合物を得、これに必要によりアルカ
リ性ホスファターゼ処理等を行なった後、更に、必要に
より例えばフェノール抽出等の精製手段により精製し、
また更に、例えば、エタノール沈澱等の手段により濃縮
し、純化されたＤＮＡ断片混合物 (この中にウリカーゼ
をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片が含まれ
る。) を得る。

【０００８】一方、本発明において用いることのできる
ベクターＤＮＡとしては、例えば、バクテリオファージ
ベクターＤＮＡ、プラスミドベクターＤＮＡ等が挙げら
れるが、具体的にはλEMBL４ＤＮＡ (STRATAGENE社より
入手）等が好ましい。上記バクテリオファージベクター
ＤＮＡを、Sau3AI断片取り込み可能な状態にするため、
例えばBamHI (宝酒造社製) を作用させて消化し、更
に、必要によりエタノール沈澱処理等を行なうことによ
り、Sau3AI断片取り込み可能なバクテリオファージベク
ターＤＮＡを得る。

【０００９】次いで、上記のようにして得た C.utilis
ATCC9950由来でウリカーゼをコードする遺伝子を含有す
るＤＮＡ断片と、同じく上記のようにして得たSau3AI断
片取り込み可能なバクテリオファージベクターＤＮＡを
混合し、これに、例えばＴ4ＤＮＡリガーゼ (ベーリン
ガーマンハイム社製) を作用させて組み換えファージＤ
ＮＡを得る。このようにして得られた組み換えファージ
ＤＮＡについては、通常のインビトロパッケージング法
により、ファージ粒子を形成させることができ、更に、
該ファージは、例えば大腸菌 (E.coli) P2 392 (STRATA
GENE社より入手) に感染させ、種々のＤＮＡ断片を保有
する組み換えファージのプラークを得ることができる。

【００１０】このようにして得たプラークの中より、ウ
リカーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を保有する組み換えフ
ァージを検索するには、例えば［γ‐³²Ｐ］ＡＴＰ (ア
マシャム・ジャパンより入手) で標識したオリゴヌクレ
オチドをプロープとして、前記 Current Protocols in
Molecular Biology (WILEY Interscience, 1989)unit6.
3 記載の方法によりプラークハイブリダイゼーションを
行なうことができる。

【００１１】このようにして得られた組み換え体ファー
ジ (その中にウリカーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を含有
している。) より、純化されたファージＤＮＡを得るに
は、例えば、Molecular Cloning p.77-85(Cold Spring
Harbor Laboratory, 1982)記載の方法を用いることがで
きる。以上のようにして得られ、かつ純化された組み換
え体ファージＤＮＡの中にはウリカーゼをコードする遺
伝子以外に不用なＤＮＡが大量に存在するので、以下の
操作により該不用なＤＮＡを除去する。

【００１２】このようにして得られ、かつ純化された組
み換えＤＮＡに、ウリカーゼ遺伝子上に切断部位を有し
ていない制限酵素、例えば、StuI、EcoT22I を作用させ
て消化し、ＤＮＡ断片混合物を得る。このようにして得
たＤＮＡ断片混合物中の、いずれのＤＮＡ断片にウリカ
ーゼをコードする遺伝子が含有されているかは、上述の
放射性オリゴヌクレオチドプローブを用いたサザンハイ
ブリダイゼーションにより判定できる。次いで、上記の
ように消化して得られたＤＮＡ断片混合物について、通
常のアガロースゲル電気泳動を行ない、例えば、上記の
ようにウリカーゼをコードする遺伝子を含有するものと
判定されたＤＮＡ断片のみを、GENECLEAN II( フナコシ
(株) より入手) を用いて精製し、純化されたStuI-Eco
T22I消化断片 (この中にウリカーゼをコードする遺伝子
が含有されている。) を得る。

【００１３】一方、本発明において用いることのできる
ベクターＤＮＡとしては、如何なるものでもよく、例え
ば、プラスミドベクターＤＮＡ、バクテリオファージベ
クターＤＮＡ等が挙げられ、プラスミドpUC118、 pUC11
9 ＤＮＡ等が好ましい。上記ベクターＤＮＡに制限酵
素、例えばSmaI、PstI等 (宝酒造社製) を作用させて消
化し、切断されたベクターＤＮＡを得る。

【００１４】次いで、上記のようにして得た C.utilis
ATCC9950由来でウリカーゼをコードする遺伝子を含有す
るＤＮＡ断片と切断されたベクターＤＮＡを混合し、こ
れに例えばＴ4 ＤＮＡリガーゼ (ベーリンガーマンハイ
ム社製) を作用させて組み換えＤＮＡを得る。この組み
換えＤＮＡを用いて、例えば大腸菌K-12、好ましくは大
腸菌JM109(宝酒造より入手) 、XLl-Blue (フナコシ
(株) より入手) 等を形質転換して夫々の菌株を得る。
この形質転換は D.M.Morrison の方法 (Methods in Enz
ymology,68, 326-331, 1979)により行なうことができ
る。

【００１５】上記ウリカーゼ遺伝子を含有するＤＮＡを
用いて、実施例の項目 (４) に示すような方法によっ
て、ウリカーゼ遺伝子の全塩基配列の解析を行ない、次
いで前記塩基配列を有する遺伝子によって翻訳されるポ
リペプチドのアミノ酸配列を確定する。このようにして
確定されたアミノ酸配列をコードする遺伝子が本発明の
ウリカーゼ遺伝子である。

【００１６】次に、上記のようにして得られたウリカー
ゼ遺伝子は、大腸菌で発現するためのプロモーターを持
たないので、組み換えＤＮＡを保有する形質転換株は、
ウリカーゼを生産しない、そこで、以下の操作によりウ
リカーゼ生産株を得る。上記の操作で得られた塩基配列
に基づき、ウリカーゼ遺伝子のＮ末端及びＣ末端各10ア
ミノ酸に対応する30塩基のオリゴヌクレオチド (Ｃ末端
側は相補鎖である。) を合成して、これをプライマーと
し、更に上記で得られた組み換えプラスミドの EcoRI切
断消化物を鋳型として、ポリメラーゼ連鎖反応法 (以下
「ＰＣＲ法」と略す。)を行ないウリカーゼをコードする
領域のみからなるＤＮＡを得る。得られたＤＮＡを大腸
菌ラクトースオペロン等に由来するプロモーター、オペ
レーター及びリボソーム結合部位等の発現調節領域を含
むＤＮＡ配列 (The Operon, p.227, Cold Spring Harbo
r Laboratory, 1980年を参照) を保有するベクターＤＮ
Ａに挿入する。用いられるベクターＤＮＡはプラスミド
ＤＮＡでもバクテリオファージＤＮＡでもよい。得られ
た組み換えＤＮＡを用いて、例えば大腸菌K-12、好まし
くは大腸菌JM109(宝酒造より入手) 、大腸菌XLl-Bleu、
大腸菌DH１ (ATCC33849)等を形質転換又は形質導入して
夫々の菌株を得る。この形質転換は、D.M.Morrisonの方
法(Methods in Enzymology, 68, 326-331, 1979)により
行なうことができる。また形質導入はB.Hohnの方法(Met
hods in Enzymology, 68, 299-309, 1979)により行なう
ことができる。

【００１７】次に、上記のようにして得られたウリカー
ゼ生産能を有するエッシェリシア属に属する菌株を用い
てウリカーゼを生産するには、下記のように培養し培養
物を得る。上記微生物を培養するには、通常の固体培養
法で培養してもよいが、なるべく液体培養法を採用して
培養するのが好ましい。

【００１８】また、上記微生物を培養する培地として
は、例えば酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンス
ティープリカーあるいは大豆もしくは小麦麹の浸出液等
の１種以上の窒素源に、リン酸二水素カリウム、リン酸
水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第二鉄、硫酸
第二鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を
添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添
加したものが用いられる。

【００１９】なお、培地の初発pHは７〜９に調節するの
が適当がある。また培養は、30〜42℃、好ましくは37℃
前後で６〜24時間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置
培養等により実施するのが好ましい。培養終了後、該培
養物よりウリカーゼを採取するには、通常の酵素採取手
段を用いることができる。このようにして得られたウリ
カーゼの理化学的性質は、 Agr. Biol. Chem.,Vol.31,
No.11, p.1256-1264, 1967記載のものと同様である。

【００２０】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定されるも
のではない。実施例 (１) C.utilis ATCC9950(ブタペスト条約に基づく国際
寄託 No.ATCC 74151) 染色体ＤＮＡの調製 C.utilis ATCC9950(ブタペスト条約に基づく国際寄託 N
o.ATCC 74151) をＹＰＤ培地 (１％酵母エキス、２％ペ
プトン、２％グルコース) 200ml に接種し、30℃で40時
間振盪培養し、 3000rpmで10分間遠心分離することによ
り集菌した。この菌体を25mlのソルビトール溶液 (0.９
M ソルビトール、0.１M トリス塩酸 pH8.0、0.1M EDTA)
に懸濁した後、Current Protocols in Molecular Biolo
gy (WILEY Interscience, 1989) unit 13.11記載の方法
に従い、染色体ＤＮＡ約300μgを得た。

【００２１】(２) ｃＤＮＡライブラリーの作製上記染色体ＤＮＡ 100μg を常法に従いSau3AI (宝酒造
社製) により部分分解した後、アガロースゲル電気泳動
により10〜20kb画分のＤＮＡ断片を10μg 得た。バクテ
リオファージベクターλEMBL４ＤＮＡ(STRATAGENE社よ
り入手) １μgのBamHI 消化物と上記で得られたC.utili
s染色体ＤＮＡ Sau3AI 消化物２μg とを、Ｔ4 ＤＮＡ
リガーゼ (ベーリンガーマイハイム社製) １ユニットで
連結し、invitro packaging kit (Gigapack Gold, STRA
TAGENE 社製) でパッケージングを行ない、大腸菌 (E.c
oli) P2 392 (STRATAGENE社より入手) に感染させ、約
５0000個のプラークを得た。得られたプラークをナイロ
ンメンブレンフィルター Hybond-N⁺( アマシャム社製)
に、アマシャム社のプロトコールに従いブロッティング
した。

【００２２】(３) プラークハイブリダイゼーションに
よるウリカーゼ遺伝子の単離 C.utilis ATCC9950 の培養菌体からＤＥＡＥセルロー
ス、ヒドロキシアパタイトＨＰＬＣ及び逆相ＨＰＬＣを
使用して精製したウリカーゼを、 GrossとWitkopの方法
(Journal of Biological Chemistry, 237, 1856, 196
2) に従い、臭化シアン処理して、ペプチド断片化し
た。これを逆相ＨＰＬＣで分取した後、プロテインシー
ケンサー (アプライドバイオシステム社製、モデル470
A) により、アミノ酸配列を決定した。得られたアミノ
酸配列 Pro Gln Asn Pro Lys Lysに対応するポリヌクレ
オチドＣＣＮＣＡＡ／ＧＡＡＴ／ＣＣＣＮＡＡＡ／ＧＡ
Ａ (Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔは
チミン、Ａ／Ｇはアデニン又はグアニン、Ｔ／Ｃはチミ
ン又はシトシンを示し、Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれ
でもよい) をＤＮＡシンセサイザー (アプライドバイオ
システム社製、モデル392)で合成した。この合成ＤＮＡ
１μg を［γ‐³²Ｐ］ＡＴＰ (アマシャム・ジャパン社
製) とＴ4 ポリヌクレオチドキナーゼ (宝酒造社製) で
末端標識し、プラークハイブリダイゼーションのプロー
ブとした。 Current Protocols in MolecularBiology
(WILEY Inter-science, 1989) unit 6.3に記載の方法に
従いプラークハイブリダイゼーションを行ない、ポジテ
ィブクローン１株を得た。

【００２３】(４) ウリカーゼ遺伝子の解析単離したポジティブクローンのファージＤＮＡを常法
(Molecular Cloning,ed. Maniatis et al., p.77 〜85,
Cold Spring Harbor Laboratory, USA, 1982) に従っ
て調製し、上記合成オリゴヌクレオチドをプローブとし
てサザンハイブリダイゼーション (J. Mol. Biol, 98,
503, 1975)を行なったところ、StuIとEcoT22I で切り出
される約1.６kbのＤＮＡ断片上にウリカーゼ遺伝子が含
まれることがわかったので、この断片をアガロースゲル
電気泳動後、GENECLEAN II ( フナコシ (株) より購
入) により精製し、PstIとSmaIで切断したpUC118及びpU
C119に挿入した。得られた組み換えプラスミドをKilo-S
equence 用deletion kit (宝酒造より購入) 及び 370 D
NA Sequencing System (アプライドバイオシステム社よ
り購入) を用いて塩基配列の決定を行なった。決定した
塩基配列を配列番号１に、また、該ＤＮＡから翻訳され
るポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２に夫々示し
た。ウリカーゼ遺伝子は 909塩基のコーティング領域を
もち、 303個のアミノ酸をコードしていた。

【００２４】(５) 発現ベクターpUTE100の作製プラスミドベクターpBR322 ＤＮＡをEcoRI 及びNruIで
切断消化後、ＤＮＡ Blunting kit (宝酒造 (株) から
購入) で平滑末端とした後、常法に従いアガロースゲル
電気泳動を行ない、GENECLEAN II (フナコシ (株) より
購入) により複製起点を含む約3.４kbのＤＮＡ断片を取
得した。得られたＤＮＡ断片はＴ4 ＤＮＡリガーゼによ
り環状にした後、 EcoRI切断を行ない直鎖にした。次い
で、以下に示すような大腸菌ラクトースオペロン等に由
来するプロモーター、オペレーター及びリボソーム結合
部位等の発現調節領域及びHpaI切断部位を含むＤＮＡ配
列(The Operon, p.227, Cold Spring Harbor Laborator
y, 1980年を参照) :

【００２５】

【外１】

【００２６】を DNA Synthesizer Model 392 (Applied
Biosystems社製) で合成し、上記で得られたEcoRI 断片
と連結して発現ベクターpUTE100 を作製した。ウリカー
ゼのＮ末端及びＣ末端アミノ酸配列に対応するそれぞれ
配列番号３及び配列番号４の塩基配列のオリゴヌクレオ
チドをDNA Synthesizer Model 392(Applied Biosystems
社製) で合成してプライマーとし、上記で得られた組み
換えプラスミドＤＮＡのEcoRI 消化物を鋳型にして、Ge
neAmp DNA Amplification Reagent Kit with AmpliTaq
(宝酒造より購入) を用いたＰＣＲ法によりウリカーゼ
遺伝子のコーティング領域のみを合成した後、上記発現
プラスミドベクターpUTE100 ＤＮＡのHpaI部位に挿入
し、組み換え体プラスミドpUOX101 ＤＮＡを得た。D.M.
Morrison の方法 (Methods in Enzymology, 68, 326-
331, 1979)に従い、組み換え体プラスミドpUOX101 ＤＮ
Ａで大腸菌JM109 を形質転換し、形質転換株、大腸菌JM
109 (pUOX101) を得た。なお、該株は工業技術院微生物
工業技術研究所に微工研条寄第3842号 (FERM BP-3842)
として寄託されている。得られた組み換え体大腸菌JM10
9 (pUOX101) を、1mM イソプロピル−β−Ｄ−ガラクト
シドを含むＴＹ培地 (１％バクト−トリプトン、0.５％
バクト−イースト・エキストラクト、0.５％ NaCl 、pH
7.0) にて37℃で16時間振盪培養した後、ウリカーゼ活
性を Agri. Biol. Chem., Vol.31, No.11, p.1256-126
4, 1967記載の方法により測定したところ、0.165U/ml
であった。

【００２７】

【発明の効果】本発明によれば、培地中に尿酸を添加す
ることなく、ウリカーゼを効率よく生産することができ
る。

【００２８】

【配列表】

配列番号１配列の長さ：909 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：キャンディダ・ウチリス (Candida utilis) 株名：ATCC 9950 配列： ATG TCA ACA ACG CTC TCA TCA TCC ACC TAC GGC AAG GAC AAC GTC AAG TTC CTC AAG GTC AAG AAG GAC CCG CAA AAC CCA AAG AAG CAG GAG GTT ATG GAG GCC ACC GTC ACG TGT CTG CTT GAA GGT GGG TTC GAC ACC TCG TAC ACG GAG GCT GAC AAC TCG TCC ATC GTG CCA ACA GAC ACC GTG AAG AAC ACC ATT CTC GTG TTG GCA AAG ACC ACG GAG ATT TGG CCA ATT GAG AGA TTT GCA GCC AAG CTG GCC ACG CAC TTT GTT GAG AAG TAC TCG CAC GTC TCT GGC GTC TCC GTC AAG ATT GTC CAG GAC AGA TGG GTC AAG TAC GCC GTT GAT GGC AAG CCA CAC GAC CAC TCT TTT ATC CAC GAA GGT GGT GAG AAG AGA ATC ACT GAC CTG TAC TAC AAG AGA TCC GGT GAT TAC AAG CTG TCG TCT GCC ATC AAG GAC TTG ACG GTG CTG AAG TCC ACC GGC TCG ATG TTC TAC GGC TAC AAC AAG TGT GAC TTC ACC ACC TTG CAA CCA ACA ACT GAC AGA ATC TTG TCC ACC GAC GTC GAT GCC ACC TGG GTT TGG GAT AAC AAG AAG ATT GGC TCT GTC TAC GAC ATC GCC AAG GCT GCA GAC AAG GGA ATC TTT GAC AAC GTT TAC AAC CAG GCT AGA GAG ATC ACC TTG ACC ACC TTT GCT CTC GAG AAC TCT CCA TCT GTG CAG GCC ACG ATG TTC AAC ATG GCT ACT CAG ATC TTG GAA AAG GCA TGC TCT GTC TAC TCG GTT TCA TAC GCC TTG CCA AAC AAG CAC TAC TTC CTC ATT GAC TTG AAA TGG AAA GGT TTG GAG AAC GAC AAC GAG TTG TTC TAC CCA TCT CCA CAT CCA AAT GGG TTG ATC AAG TGT ACT GTT GTC CGT AAG GAG AAG ACC AAG TTG 配列番号２配列の長さ：303 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質配列： Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 配列番号３配列の長さ：30 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列の特徴：合成ＤＮＡプライマー配列： ATG TCA ACA ACG GTC TCA TCA TCC ACC TAC 配列番号 4 配列の長さ：30 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列の特徴：合成ＤＮＡプライマー配列： TTA CAA CTT GGT CTT CTC CTT ACG GAC AAC

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/06 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列表の配列番号２のアミノ酸配列をコ
ードする新規なウリカーゼ遺伝子。
【請求項２】請求項１記載のウリカーゼ遺伝子をベク
ターＤＮＡに挿入したことを特徴とする新規な組み換え
体ＤＮＡ。
【請求項３】請求項２記載の新規な組み換え体ＤＮＡ
を含み、ウリカーゼ生産能を有するエッシェリシア属に
属する微生物を培地に培養し、培養物よりウリカーゼを
採取することを特徴とするウリカーゼの製造法。