JPH119283A

JPH119283A - マルトースホスホリラーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及びマルトースホスホリラーゼの製造法

Info

Publication number: JPH119283A
Application number: JP9183195A
Authority: JP
Inventors: Taiji Koyama; 泰二小山
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1997-06-25
Filing date: 1997-06-25
Publication date: 1999-01-19

Abstract

(57)【要約】【解決手段】以下の(a)または(b)の蛋白質をコード
するマルトースホスホリラーゼ遺伝子、 (a)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質 (b)アミノ酸配列(a)において１もしくは複数のアミノ酸
が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からな
り、かつマルトースホスホリラーゼ活性を有する蛋白質上記マルトースホスホリラーゼ遺伝子をベクターＤＮＡ
に挿入したことを特徴とする新規な組み換え体ＤＮＡ、
上記組み換え体ＤＮＡを含む形質転換体または形質導入
体及び形質転換体または形質導入体を培地に培養し、培
養物からマルトースホスホリラーゼを採取することを特
徴とするマルトースホスホリラーゼの製造法。【効果】マルトースホスホリラーゼを効率よく生産で
きる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、マルトースまたは
無機リン酸量の測定に有用なマルトースホスホリラーゼ
遺伝子、新規な組み換え体ＤＮＡ及びマルトースホスホ
リラーゼの製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】マルトースホスホリラーゼは、マルトー
スの加リン酸分解を触媒する酵素であり、ヒトの血清中
又は食品中のマルトースまたは無機リン酸量の測定に用
いることができ、産業上有用な酵素である。従来、マル
トースホスホリラーゼは、例えばエンテロコッカス(Ent
erococcus)属、ロイコノストック(Leuconostoc)属また
はラクトコッカス(Lactococcus)属に属し、マルトース
ホスホリラーゼ生産能を有する微生物を培養し、培養物
からマルトースホスホリラーゼを採取することにより製
造されている。（特開平8-280382号公報参照）しかしながら、この方法ではマルトースホスホリラーゼ
の収率が充分でなく、効率よくマルトースホスホリラー
ゼを製造する方法の開発が望まれていた。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、遺伝子工学
的手法によりマルトースホスホリラーゼを生産すること
を目的として、その生産の元となるマルトースホスホリ
ラーゼ遺伝子、更に、該遺伝子を含む組み換え体ＤＮＡ
及び該組み換え体ＤＮＡを用いるマルトースホスホリラ
ーゼの製造法を提供することである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者は、上記
の従来技術の問題点を解決するため種々検討した結果、
エンテロコッカス由来のマルトースホスホリラーゼ遺伝
子を単離及び構造決定することに成功し、また更に、マ
ルトースホスホリラーゼをコードする遺伝子をベクター
ＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを得、この組み換え
体をエッシェリシア(Escherichia)属に属する菌株に含
ませたマルトースホスホリラーゼ生産能を有する菌株を
培地に培養すると、効率よくマルトースホスホリラーゼ
が生産されること等を見出し、本発明を完成した。

【０００５】即ち、本願の第１の発明は、以下の(a)ま
たは(b)の蛋白質をコードするマルトースホスホリラー
ゼ遺伝子であり、 (a)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質 (b)アミノ酸配列(a)において１もしくは複数のアミノ酸
が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からな
り、かつマルトースホスホリラーゼ活性を有する蛋白質本願の第２の発明は、上記のマルトースホスホリラーゼ
遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする新
規な組み換え体ＤＮＡであり、また本願の第３の発明
は、上記の組み換え体ＤＮＡを含む形質転換体または形
質導入体であり、更にまた本願の第４の発明は、上記の
形質転換体または形質導入体を培地に培養し、培養物か
らマルトースホスホリラーゼを採取することを特徴とす
るマルトースホスホリラーゼの製造法である。

【０００６】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のマルトースホスホリラーゼ遺伝子は、例えば、
次のようにして得ることができる。先ず、エンテロコッ
カス・ヒラエ(Enterococcus hirae)ＩＦＯ３１８１株
を、特開平８−２８０３８２号公報記載の方法に従い培
養し、得られた菌株から、例えば、Current Protocols
in Molecular Biology(WILEY Intersciense,1989)記載
の方法等により染色体ＤＮＡを抽出する。

【０００７】次いで、この染色体ＤＮＡを、例えば、Sa
u3AIにより部分分解し、染色体ＤＮＡ断片混合物を得
る。このようにして得たＤＮＡ断片混合物から、例え
ば、通常のアガロースゲル電気泳動法により、好ましく
は３〜６Kbの大きさのＤＮＡ断片混合物（この中にマル
トースホスホリラーゼをコードする遺伝子を含有するＤ
ＮＡ断片が含まれる）を得る。

【０００８】上記で得られたSau3AI切断ＤＮＡ断片を常
法に従いベクターＤＮＡに組み込む。本発明において用
いることのできるベクターＤＮＡとしては、例えば、pU
C119（宝酒造社製）、pBR322（宝酒造社製）、pBluescr
ipt SK+（Stratagene社製）、pACYC184（ニッポンジー
ン社製）等のプラスミドベクターＤＮＡ、λEMBL4（Str
atagene）等のバクテリオファージベクターＤＮＡ等が
挙げられる。

【０００９】このようにして得られた組み換え体ＤＮＡ
の中から、マルトースホスホリラーゼ遺伝子を含むＤＮ
Ａは、ハイブリダイゼーション等の方法により得ること
ができるが、次のようにして得ることもできる。

【００１０】大腸菌は、マルトースを唯一の炭素源とす
る最少培地で生育することができる。これは細胞内に取
り込んだマルトースから、マルトデキストリンホスホリ
ラーゼ（malP遺伝子産物）またはアミロマルターゼ（ma
lQ遺伝子産物）の作用によりグルコースが生じ、それを
炭素源として生育するためである。従って、malP及びma
lQの両方を欠損する大腸菌は、マルトースを唯一の炭素
源とする最少培地で生育することができない。マルトー
スホスホリラーゼは、マルトデキストリンホスホリラー
ゼと同様の反応を行なうことができる。そこで、マルト
ースホスホリラーゼ遺伝子が、malP及びmalQを欠損した
大腸菌に導入されるとマルトース最少培地で生育が可能
になることが予想される。malPとmalQの両方を欠損して
いる大腸菌を探したところ、国立遺伝学研究所の微生物
保存研究室が所有するME8264株が目的にかなうことが判
明した。そこで、この大腸菌を宿主として、上記で作製
した組み換え体ＤＮＡで形質転換を行ない、マルトース
最少培地で生育してきたコロニーを選択する。

【００１１】上記形質転換体より、純化されたプラスミ
ドＤＮＡを得るには、例えば、超遠心CsCl濃度勾配分離
法等の方法を用いることができる。上記の純化されたプ
ラスミドＤＮＡを用いて、マルトースホスホリラーゼ遺
伝子の全塩基配列の解析を行ない、次いで、前記塩基配
列を有する遺伝子によって翻訳されるポリペプチドのア
ミノ酸配列を確定する。このアミノ酸配列は、配列番号
２に示されるとおりである。このようにして確定された
アミノ酸配列をコードする遺伝子が本発明のマルトース
ホスホリラーゼ遺伝子である。

【００１２】なお、配列番号２に示されるアミノ酸配列
において、１もしくは複数、好ましくは数個のアミノ酸
が欠失、置換もしくは付加されており、かつ、マルトー
スホスホリラーゼ活性をもたらすアミノ酸配列をコード
するマルトースホスホリラーゼ遺伝子は、全て本発明に
含まれる。

【００１３】そして、配列番号２に示されるアミノ酸配
列において、１もしくは複数、好ましくは数個のアミノ
酸が欠失、置換もしくは付加されており、かつ、マルト
ースホスホリラーゼ活性をもたらすアミノ酸配列をコー
ドするマルトースホスホリラーゼ遺伝子を得るには、如
何なる方法でもよく、例えば、遺伝子に点変異又は欠失
変異を生じさせるための周知技術である部位特異変異誘
導法；遺伝子を選択的に開裂し、次いで、選択されたヌ
クレオチドを除去又は付加し、遺伝子を連結する方法；
オリゴヌクレオチド変異誘導法等があげられる。

【００１４】上記のようにして得られた形質転換体また
は形質導入体、即ち、マルトースホスホリラーゼ生産能
を有するエッシェリシア属に属する菌株を用いてマルト
ースホスホリラーゼを生産するには、下記のようにして
行なうことができる。上記微生物を培養するには、通常
の固体培養法で培養してもよいが、なるべく液体培養法
を採用して培養するのが好ましい。

【００１５】また、上記微生物を培養する培地として
は、例えば、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーン
ステイープリカーあるいは大豆もしくは小麦麹の浸出液
等の１種以上の窒素源に、リン酸二水素カリウム，リン
酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第２鉄、硫
酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上
を添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜
添加したものが用いられる。

【００１６】なお、培地の初発pHは、７〜９に調整する
のが適当である。また培養は、30〜42℃、好ましくは37
℃前後で６〜24時間、通気撹拌深部培養、振とう培養、
静置培養等により実施するのが好ましい。培養終了後、
該培養物よりマルトースホスホリラーゼを採取するに
は、通常の酵素採取手段を用いることができる。

【００１７】培養物から、例えば、濾過、遠心分離等の
操作により菌体を分離し、洗菌する。この菌体からマル
トースホスホリラーゼを採取することが好ましい。この
場合、菌体をそのまま用いることもできるが、超音波破
砕機、フレンチプレス、ダイナミル等の種々の破壊手段
を用いて菌体を破壊する方法、リゾチームの如き細胞壁
溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方法、トリトン
Ｘ-100等の界面活性剤を用いて菌体から酵素を抽出する
方法等により、菌体からマルトースホスホリラーゼを採
取するのが好ましい。

【００１８】このようにして得られた粗酵素液からマル
トースホスホリラーゼを単離するには、通常の酵素精製
に用いられる方法が使用できる。例えば、硫安塩析法、
有機溶媒沈澱法、イオン交換クロマトグラフ法、ゲル濾
過クロマトグラフ法、吸着クロマトグラフ法、電気泳動
法等を適宜組み合わせて行なうのが好ましい。

【００１９】得られたマルトースホスホリラーゼは、特
開平8−280382号公報記載のエンテロコッカス・ヒラエI
FO3181株の生産するマルトースホスホリラーゼの理化学
的性質を有する。

【００２０】酵素活性測定法本酵素の活性の測定は、特開平8−280382号公報記載の
方法で行なった。なお、１分間に２マイクロモルのグル
コースを生成する酵素量を１単位とする。

【００２１】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明する。

【００２２】（実施例１） (1)エンテロコッカス・ヒラエIFO3181の染色体の調製エンテロコッカス・ヒラエIFO3181株をTY培地（１％バ
クト−トリプトン、0.5％ペプトン、0.5％NaCl）200ml
に接種して、30℃で20時間振とう培養し培養物を得た。
この培養物を6000rpmで10分間遠心分離することにより
集菌して菌体を得た。この菌体を9.5 mlのTEバッファー
(10 mM トリス塩酸 pH7.5、1 mM EDTA)に懸濁した後、C
urrent Protocols in Molecular Biology(WILEY Inters
ciense,1989)記載の方法に従い、染色体ＤＮＡ300μｇ
を得た。

【００２３】(2)形質転換株大腸菌ME8264（pMPL2）の作
製上記染色体ＤＮＡ100μｇを常法に従いSau3AI（宝酒造
社製）により部分分解した後、アガロースゲル電気泳動
により3〜6kb画分の断片を10μｇを得た。プラスミドＤ
ＮＡベクター pACYC184(ニッポンジーン社より入手)１
μｇのBamHI消化物と上記で得られた染色体ＤＮＡのSau
3AI 消化物２μｇとをＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガ
ーマンハイム社製）１ユニットで連結し、得られたプラ
スミドをD.M.Morrisonの方法(Method in Enzymology,6
8,326-331,1979)に従って大腸菌ME8264株を形質転換
し、クロラムフェニコール20 μg／mlを含むマルトース
最少寒天培地（マルトース 0.2％、(NH₄)₂SO₄ 0.1
％、KH₂PO₄ 0.45％、K₂HPO₄ 1.05％、クエン酸ナトリ
ウム 0.05％、1 mM MgSO₄、ビタミンB1 0.00005％、
カザミノ酸 0.1％）にプレーティングしたところ、２
株生育してきた。そのうちの１株を大腸菌ME8264（pMPL
2）とした。該形質転換株は、工業技術院生命工学工業
技術研究所にFERM BP-５９９１として寄託されている。

【００２４】(3)マルトースホスホリラーゼ遺伝子の解
析上記で得られたプラスミドＤＮＡpMPL2について370 DNA
Sequencing System（アプライドバイオシステム社製）
を用いて塩基配列の決定を行なった。決定した塩基配列
を配列番号１に、また、該ＤＮＡ配列から翻訳されるポ
リペプチドのアミノ酸配列を配列番号２に夫々示した。
マルトースホスホリラーゼ遺伝子は、2292塩基のコーデ
ィング領域をもち、764のアミノ酸をコードしていた。

【００２５】(4)活性の確認得られた大腸菌ME8264（pMPL2）を、TY培地（１％バク
ト−トリプトン、0.5％バクト−イースト・エクストラ
クト、0.5％NaCl、pH7.0）にて37℃で16時間振とう培養
した後、前述した酵素活性測定法によりマルトースホス
ホリラーゼ活性を測定したところ、0.2 U/mlであった。

【００２６】

【発明の効果】本発明によれば、マルトースホスホリラ
ーゼを効率よく生産することができる。

【００２７】

【配列表】

配列番号１配列の長さ：2292 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic ＤＮＡ起源生物名：エンテロコッカス・ヒラエ（Enterococcus hir
ae）株名：IFO3181 配列： 48 ATG AAA CAA ATC AAG CGC CTA TTT CAA ATT GAT CCT TGG AAG ATC AGC 96 ACC AAC ACA TTA GAT CGG GAA AAT CTC CGT TTA CAG GAA TCT TTA ACT 144 AGT ATT GGT AAC GGA TAC ATG GGC ATG CGA GGG AAT TTT GAA GAA GCC 192 TAT TCA GGT GAT CAT CAT CAA GGA ACT TAT TTA GCT GGG GTT TGG TAC 240 CCC GAT AAG ACT CGT GTT GGT TGG TGG AAA AAT GGC TAT CCC GAA TAT 288 TTT GGC AAA GTG ATT AAT GCA ATC AAT TTT ATT GCC ATG GAT ATC TAT 336 ATC GAT GAG CAA TTA TTA GAC CTT GCT ACA ATC GAA CCA GAA GAC TTT 384 TAT TGG GAA TTG AAT ATG AAA AAC GGT GTG TTA TCA CGT AGT TAC ACA 432 GTA ACG ACT GCA ACT AAC AAA CTA AAG ATC ACC TTT GAA CGT TTT TTA 480 AGT ATC GTC AAA AGC GAA GCT GCT TAT ATT CGT TTA ACA GTT ACG ATG 528 CTC GAA GGA AAT GGC ACG GTC AAA GTC ATC TCT AAA TTG GAT AGT AAC 576 GTT CAA AAT GAA GAT AGT AAC TAT GAT GAA CAT TTT TGG AAT GAA ATC 624 GGT CGA GGT ACT TCT GAT GAA ACA GCC TAC TTA ATG ACC AAA ACG ATT 672 CCA AAT AAT TTT GCG ATC GAA CAA TTT ACC GTA ACA GCT GCC ATG AGA 720 CAT TTC GTG AAT GAA GAA TTA GCG CAA CCA ATT TAC CAC GAA GAT ACA 768 TTA GCC GTC CTT GGG GAA TTT TCT TTC GAC TTA ACA ACG AAT CAA TCC 816 GTG ACA CTT GAT AAA GAA GTG CTT GTA TTG ACG AGC CGT AAC ATC CCC 864 GAA GCA CAG CAA GTC CAA CAG ATC CTC CAA GAA TTT AGT GAC TTA CAA 912 AGT CAT TAT CTG CAA GCA AAA GCA GAA CAA ACC ACT GCT TGG AGC AAA 960 CGC TGG GCA CTG GCT GAT GTG GTG ATC GAA GGT GAC GAG GAA GCA CAG 1008 CAA GGG ATT CGT TTC AAT CTT TTC CAA CTA TTT TCT ACT TAT TAC GGC 1056 GAA GAT GAA CGT TTG AAT ATT GGA CCC AAA GGC TTT ACA GGA GAA AAA 1104 TAC GGT GGT GCT ACT TAT TGG GAT ACG GAA GCT TAC GCT GTC CCC TTA 1152 TAT CTT GCT TTA GCA AAA CCT GAA GTG ACA AAA AAT CTC CTT AAA TAT 1200 CGC CAT AAT CAA TTG CCT CAA GCT ATT CAT AAT GCC CAA CAA CAA GGT 1248 TTA AAA GGC GCC TTG TAC CCA ATG GTT ACT TTT ACA GGG GTC GAA TGC 1296 CAC AAC GAA TGG GAA ATT ACC TTT GAA GAG ATC CAT CGT AAC GGT GCG 1344 ATC GCT TAT GCG ATT TAC AAC TAT ACG AAC TAT ACA GGT GAC ACC GCT 1392 TAT TTG AAA AAA GAA GGA TTA GAA GTA TTA GTT GAG ATT GCT CGT TTT 1440 TGG GCA GAT CGG GTT CAT TTT TCA AAA CGT CAT AAC AAA TAT ATG ATC 1488 CAT GGC GTG ACT GGT CCG AAT GAA TAT GAA AAC AAC ATC AAT AAC AAC 1536 TGG TAT ACC AAT ACG ATA GCT TGC TGG GTA TTA ACG TAT ACC CGG GAA 1584 AAC TAT TTA AAA TTC CAA ACA GAA ACT GCT ATA ACG GTC ACT GAC GAA 1632 GAA CTA ACG AAT TGG CAA ACC ATT GCA GAA AAT ATG TAT TTT CCT AAA 1680 GAT GAA GAA TTA GGT ATT TTT GTC CAA CAT GAT ACA TTT TTG GAT AAA 1728 GAA TTA TTG CCG GTA TCA GAG CTA TCT CCT AGC GAG CTT CCA TTA AAC 1776 CAA CAT TGG TCT TGG GAC AAA ATC TTG CGT TCT TGT TTC ATT AAG CAG 1824 GCG GAT GTG CTA CAA GGA ATC TAT TTC TTC AAC GAC TCG TTT AGC AAA 1872 GAA GAA AAA CAA CGA AAC TTT GAT TTT TAC GAA CCA ATG ACC GTT CAT 1920 GAG TCT TCC CTT TCA CCA AGT ATC CAT GCC ATT TTA GCT GCT GAA TTA 1968 GGT ATG GAG GAT AAG GCA GTG GAA ATG TAT CAA CGG ACA GCC CGC CTT 2016 GAT TTA GAT AAT TAT AAT AAC GAT ACC GAA GAC GGC TTA CAC ATC ACG 2064 TCG ATG ACT GGT AGT TGG CTC GCA ATC GTC CAA GGA TTC GCT CAA ATG 2112 AAA ACA GAT CAC GAA CAG TTA CGT TTT GCT CCT TTC TTA CCA AAC ACG 2160 TGG ACA GCC TAC TCC TTC CAT GTG AAT TAT CGT GGT CGT TTA TTA TTT 2208 GTT TCG GTG TCT AGT GAA CAG GTG CAA TTG ACC TTA GTA TCA GGC GAA 2256 AGT TGC CCA TTA AAG GTG TAC GAA AAA ACG TAT CTT TTA GAA GAC CAG 2292 TTA AAG GTA CCT TTG CGT AAG GAG GAA TTA GAT GTT

【００２８】配列番号２配列の長さ：764 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質配列： 15 Met Lys Gln Ile Lys Arg Leu Phe Gln Ile Asp Pro Trp Lys Ile 30 Ser Thr Asn Thr Leu Asp Arg Glu Asn Leu Arg Leu Gln Glu Ser 45 Leu Thr Ser Ile Gly Asn Gly Tyr Met Gly Met Arg Gly Asn Phe 60 Glu Glu Ala Tyr Ser Gly Asp His His Gln Gly Thr Tyr Leu Ala 75 Gly Val Trp Tyr Pro Asp Lys Thr Arg Val Gly Trp Trp Lys Asn 90 Gly Tyr Pro Glu Tyr Phe Gly Lys Val Ile Asn Ala Ile Asn Phe 105 Ile Ala Met Asp Ile Tyr Ile Asp Glu Gln Leu Leu Asp Leu Ala 120 Thr Ile Glu Pro Glu Asp Phe Tyr Trp Glu Leu Asn Met Lys Asn 135 Gly Val Leu Ser Arg Ser Tyr Thr Val Thr Thr Ala Thr Asn Lys 150 Leu Lys Ile Thr Phe Glu Arg Phe Leu Ser Ile Val Lys Ser Glu 165 Ala Ala Tyr Ile Arg Leu Thr Val Thr Met Leu Glu Gly Asn Gly 180 Thr Val Lys Val Ile Ser Lys Leu Asp Ser Asn Val Gln Asn Glu 195 Asp Ser Asn Tyr Asp Glu His Phe Trp Asn Glu Ile Gly Arg Gly 210 Thr Ser Asp Glu Thr Ala Tyr Leu Met Thr Lys Thr Ile Pro Asn 225 Asn Phe Ala Ile Glu Gln Phe Thr Val Thr Ala Ala Met Arg His 240 Phe Val Asn Glu Glu Leu Ala Gln Pro Ile Tyr His Glu Asp Thr 255 Leu Ala Val Leu Gly Glu Phe Ser Phe Asp Leu Thr Thr Asn Gln 270 Ser Val Thr Leu Asp Lys Glu Val Leu Val Leu Thr Ser Arg Asn 285 Ile Pro Glu Ala Gln Gln Val Gln Gln Ile Leu Gln Glu Phe Ser 300 Asp Leu Gln Ser His Tyr Leu Gln Ala Lys Ala Glu Gln Thr Thr 315 Ala Trp Ser Lys Arg Trp Ala Leu Ala Asp Val Val Ile Glu Gly 330 Asp Glu Glu Ala Gln Gln Gly Ile Arg Phe Asn Leu Phe Gln Leu 345 Phe Ser Thr Tyr Tyr Gly Glu Asp Glu Arg Leu Asn Ile Gly Pro 360 Lys Gly Phe Thr Gly Glu Lys Tyr Gly Gly Ala Thr Tyr Trp Asp 375 Thr Glu Ala Tyr Ala Val Pro Leu Tyr Leu Ala Leu Ala Lys Pro 390 Glu Val Thr Lys Asn Leu Leu Lys Tyr Arg His Asn Gln Leu Pro 405 Gln Ala Ile His Asn Ala Gln Gln Gln Gly Leu Lys Gly Ala Leu 420 Tyr Pro Met Val Thr Phe Thr Gly Val Glu Cys His Asn Glu Trp 435 Glu Ile Thr Phe Glu Glu Ile His Arg Asn Gly Ala Ile Ala Tyr 450 Ala Ile Tyr Asn Tyr Thr Asn Tyr Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Leu 465 Lys Lys Glu Gly Leu Glu Val Leu Val Glu Ile Ala Arg Phe Trp 480 Ala Asp Arg Val His Phe Ser Lys Arg His Asn Lys Tyr Met Ile 415 His Gly Val Thr Gly Pro Asn Glu Tyr Glu Asn Asn Ile Asn Asn 510 Asn Trp Tyr Thr Asn Thr Ile Ala Cys Trp Val Leu Thr Tyr Thr 525 Arg Glu Asn Tyr Leu Lys Phe Gln Thr Glu Thr Ala Ile Thr Val 540 Thr Asp Glu Glu Leu Thr Asn Trp Gln Thr Ile Ala Glu Asn Met 555 Tyr Phe Pro Lys Asp Glu Glu Leu Gly Ile Phe Val Gln His Asp 570 Thr Phe Leu Asp Lys Glu Leu Leu Pro Val Ser Glu Leu Ser Pro 585 Ser Glu Leu Pro Leu Asn Gln His Trp Ser Trp Asp Lys Ile Leu 600 Arg Ser Cys Phe Ile Lys Gln Ala Asp Val Leu Gln Gly Ile Tyr 615 Phe Phe Asn Asp Ser Phe Ser Lys Glu Glu Lys Gln Arg Asn Phe 630 Asp Phe Tyr Glu Pro Met Thr Val His Glu Ser Ser Leu Ser Pro 645 Ser Ile His Ala Ile Leu Ala Ala Glu Leu Gly Met Glu Asp Lys 660 Ala Val Glu Met Tyr Gln Arg Thr Ala Arg Leu Asp Leu Asp Asn 675 Tyr Asn Asn Asp Thr Glu Asp Gly Leu His Ile Thr Ser Met Thr 690 Gly Ser Trp Leu Ala Ile Val Gln Gly Phe Ala Gln Met Lys Thr 705 Asp His Glu Gln Leu Arg Phe Ala Pro Phe Leu Pro Asn Thr Trp 720 Thr Ala Tyr Ser Phe His Val Asn Tyr Arg Gly Arg Leu Leu Phe 735 Val Ser Val Ser Ser Glu Gln Val Gln Leu Thr Leu Val Ser Gly 750 Glu Ser Cys Pro Leu Lys Val Tyr Glu Lys Thr Tyr Leu Leu Glu 764 Asp Gln Leu Lys Val Pro Leu Arg Lys Glu Glu Leu Asp Val

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の(a)または(b)の蛋白質をコードす
るマルトースホスホリラーゼ遺伝子。 (a)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質 (b)アミノ酸配列(a)において１もしくは複数のアミノ酸
が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からな
り、かつマルトースホスホリラーゼ活性を有する蛋白質
【請求項２】請求項１記載のマルトースホスホリラー
ゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする
新規な組み換え体ＤＮＡ。
【請求項３】請求項２記載の組み換え体ＤＮＡを含む
形質転換体または形質導入体。
【請求項４】請求項３記載の形質転換体または形質導
入体を培地に培養し、培養物からマルトースホスホリラ
ーゼを採取することを特徴とするマルトースホスホリラ
ーゼの製造法。