JP3874775B2

JP3874775B2 - 凝集性アルコール発酵酵母の生産方法及び凝集性アルコール発酵酵母

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Publication number: JP3874775B2
Application number: JP2004296638A
Authority: JP
Inventors: 桂子藤井; 慎吾後藤
Original assignee: Sapporo Breweries Ltd
Current assignee: Sapporo Breweries Ltd
Priority date: 2004-10-08
Filing date: 2004-10-08
Publication date: 2007-01-31
Anticipated expiration: 2024-10-08
Also published as: WO2006040955A1; BRPI0518167A; EP1813670A1; EP1813670A4; JP2006101836A; US20080268543A1; CN101056978A

Description

本発明は、凝集性アルコール発酵酵母の生産方法及び凝集性アルコール発酵酵母に関する。

発酵法によるアルコール生産は、発酵酵母であるサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の中で、特にアルコール生産性の高い株（以下、アルコール発酵酵母という）を用いて、回分発酵法という手法に基づき実施されている。その中でも、凝集性酵母を用いた繰り返し回分発酵法は、アルコール生産における作業効率及び生産効率を向上させることが可能である。

凝集性酵母とは、個々の細胞が非性的に相互作用して凝集塊を形成し、静置状態の培地中で液底に沈降する性質（以下、この性質を凝集性という）を有する酵母である。自然界から得られる凝集性酵母は、アルコール生成能が不十分であることが多く、工業用アルコール生産における酵母として実用化するのは困難であった。そこで、本発明者らは、非凝集性アルコール発酵酵母である３９６−９−６Ｖ株（工業技術院微生物工業技術研究所（現・産業技術総合研究所内特許生物寄託センター）受託番号：ＦＥＲＭＰ−１２８０４）に凝集性遺伝子ＦＬＯ１を導入したセルフクローニング株であるＦＳＣ２７株（同受託番号：ＦＥＲＭＰ−１６０２３）を作成した（特許文献１）。

特許第３０４０９５９号明細書

ＦＳＣ２７株の生成エタノール濃度は、親株の３９６−９−６Ｖ株と同等であったが、発酵速度が３９６−９−６Ｖ株よりも遅いという問題点があった。この問題点は、ＵＲＡ３座位にＦＬＯ１を導入したＦＣＳ２７株がウラシル要求性となったことに起因するものである。適切な量のウラシルを添加した培地でＦＳＣ２７株を培養することにより、発酵速度は３９６−９−６Ｖ株と同等になるものの、この方法は実用的ではない。

したがって、本発明の目的は、ウラシルを含まない培地中で充分なエタノール生成能及び発酵速度を示す凝集性アルコール発酵酵母を提供することにある。

上記目的を達成するため、本発明は、サッカロマイセス・セレビシエＦＳＣ２７株の染色体上に２つ存在するＬＥＵ２座位の一方のみに、サッカロミセス・セレビシエ由来のＵＲＡ３遺伝子を導入する工程を備える、ウラシル非要求性の凝集性アルコール発酵酵母の生産方法を提供する。ＵＲＡ３遺伝子をＬＥＵ２座位に導入することで、高いアルコール生成能を維持したまま、酵母をウラシル非要求性に形質転換させることが可能となる。

本発明は、また、サッカロマイセス・セレビシエＦＳＣ２７株の染色体上に２つ存在するＬＥＵ２座位の一方のみに、サッカロミセス・セレビシエ由来のＵＲＡ３遺伝子が導入された、ウラシル非要求性の凝集性アルコール発酵酵母を提供する。ここで、凝集性アルコール発酵酵母はサッカロマイセス・セレビシエＦＳＣＵ−Ｌ１８株（受託番号ＦＥＲＭＰ−２００５５）であることが好ましい。ＵＲＡ３遺伝子がＬＥＵ２座位に導入された酵母は、高いアルコール生成能とウラシル非要求性とを兼ね備える。特に、ＦＳＣＵ−Ｌ１８株は、高いアルコール生成能を示すため、工業用アルコール生産における酵母として適している。

本発明によれば、ＦＳＣ２７株よりも優れたアルコール生成能及び発酵速度を有する、ウラシル非要求性の凝集性アルコール酵母を提供することが可能である。

以下、本発明について詳細に説明する。

まず、本発明のウラシル非要求性の凝集性アルコール発酵酵母の生産方法について説明する。本発明のウラシル非要求性の凝集性アルコール発酵酵母の生産方法は、サッカロマイセス・セレビシエＦＳＣ２７株の染色体上に２つ存在するＬＥＵ２座位の一方のみに、サッカロミセス・セレビシエ由来のＵＲＡ３遺伝子を導入する工程を備えている。

ＦＳＣ２７株は、凝集性遺伝子ＦＬＯ１遺伝子の導入に伴いＵＲＡ３遺伝子が破壊されており、ウラシル要求性である。したがって、ＦＳＣ２７株の染色体上に２つ存在するＬＥＵ２座位の一方のみに、サッカロミセス・セレビシエ由来のＵＲＡ３遺伝子を導入することにより、ＦＳＣ２７株のウラシル非要求性の形質転換体が得られる。ここで、導入するＵＲＡ３遺伝子はサッカロミセス・セレビシエ由来であるため、この組換えはセルフクローニングとなる。したがって、組換えＤＮＡ実験指針等の規制の対象外となり、既存の設備を利用したアルコール生産に得られた形質転換体を利用できるなど、実用に適している。

サッカロミセス・セレビシエ由来のＵＲＡ３遺伝子は、染色体から単離して調製するか、又は既にプラスミド上に単離されたものを利用することもできる。かかるプラスミドとしては、例えば、ＹＩｐ５などが利用可能である。また、ダブルフュージョンＰＣＲを用いて、全長ＵＲＡ３遺伝子を含むＬＥＵ２破壊用ＤＮＡ断片を調製することが可能である（ダブルフュージョンＰＣＲの詳細については、実施例を参照）。次に、ＵＲＡ３遺伝子を酢酸リチウム法などの公知の方法でＦＳＣ２７株に導入する。

そして、得られた形質転換体を、ウラシルを含まない培地で培養して形質転換体を選択する工程を経ることにより、ＬＥＵ２座位の一方のみにＵＲＡ３遺伝子を導入した形質転換体のみを得ることができる。

このようにして得られたＬＥＵ２座位の一方のみにＵＲＡ３遺伝子が導入された形質転換体に対して、実施例に記載したアルコール発酵試験を行い、特にアルコール生成能に優れた株を選び出すことが可能である。また、得られた形質転換体の凝集性の確認も、実施例に記載した方法により行うことが可能である。

次に、本発明のウラシル非要求性の凝集性アルコール発酵酵母について説明する。本発明のウラシル非要求性の凝集性アルコール発酵酵母は、サッカロマイセス・セレビシエＦＳＣ２７株の染色体上に２つ存在するＬＥＵ２座位の一方のみに、サッカロミセス・セレビシエ由来のＵＲＡ３遺伝子が導入されている。かかる酵母は、前述の本発明のウラシル非要求性の凝集性アルコール発酵酵母の生産方法により生産することが可能である。

本発明のウラシル非要求性の凝集性アルコール発酵酵母は、ウラシルを含まない培地中で培養した場合もＦＳＣ２７株酵母よりも優れた発酵速度及びアルコール生成量を示す。したがって、本発明のウラシル非要求性の凝集性アルコール発酵酵母は工業的アルコール生産に利用することが可能である。

本発明のウラシル非要求性の凝集性アルコール発酵酵母の中でもサッカロマイセス・セレビシエＦＳＣＵ−Ｌ１８株は、特にアルコール生成能が優れているため、工業的アルコール生産への利用が適している。

以下、実施例を挙げて本発明について更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（実験方法）
（１）プラスミド
ＹＩｐ５及びＹＲｐＧＬ１０の２種類のプラスミドを使用した。ＹＩｐ５は、一般的な酵母−大腸菌シャトルベクターであり、サッカロマイセス・セレビシエのＵＲＡ３配列を選択マーカーとして持つが、酵母での自律複製配列やセントロメア配列は持たない。ＹＲｐＧＬ１０は、一般的な酵母−大腸菌シャトルベクターであるＹＲｐ７にサッカロマイセス・セレビシエのＬＥＵ２配列及びＧ４１８薬剤耐性遺伝子配列を選択マーカーとして加えたものである。

（２）酵母
３９６−９−６Ｖ株及びＦＳＣ２７株を使用した。３９６−９−６Ｖ株は、非凝集性のアルコール発酵用酵母である。ＦＳＣ２７株は、３９６−９−６Ｖ株の染色体上のＵＲＡ３座位に凝集性遺伝子ＦＬＯ１を導入した株であり、凝集性のアルコール発酵用酵母である（特許第３０４０９５９号明細書を参照）。

（３）培地
酵母の培養は、ＹＰＤ培地、ＳＤ培地（グルコース最小培地）及び糖みつ培地（１６〜２４％糖濃度、発酵試験用）で行った。各培地の組成を以下に示す。ＹＰＤ培地：１０ｇ／Ｌバクトイーストエキス（Ｄｉｆｃｏ社）、２０ｇ／Ｌバクトペプトン（Ｄｉｆｃｏ社）、１０ｇ／Ｌグルコース、ｐＨ５．５。ＹＭ培地：３ｇ／Ｌバクトイーストエキス、３ｇ／Ｌバクトモルトエキス（Ｄｉｆｃｏ社）、３ｇ／Ｌバクトペプトン（Ｄｉｆｃｏ社）、１０ｇ／Ｌグルコース、ｐＨ４．５。ＳＤ培地（グルコース最小培地）：６．７ｇ／ＬＹｅａｓｔｎｉｔｒｏｇｅｎｂａｓｅｗｉｔｈｏｕｔａｍｉｎｏａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社）、２０ｇ／Ｌグルコース、ｐＨ５．４。糖みつ培地：タイまたはインドネシア産糖みつを還元糖濃度１６〜２４％になるように水で希釈したもの。

糖みつ培地以外の培地は、調製後、１２１℃、１５分間オートクレーブ処理した。培地の固形化は、２％の寒天を加えてプレートを作成することにより行った。上記培地にアミノ酸を加える場合は、適当濃度のアミノ酸溶液（無菌）を作成し、オートクレーブ処理した上記培地が６０〜７０℃に冷えたところで、２０μｇ／ｍＬの濃度になるように添加した。

プレート培養の場合、白金耳を用いて画線して、あるいはスプレッダーを用いて塗抹して、３０℃で２〜３日間倒置培養した。液体培養の場合、中試験管に２ｍＬあるいはモノー試験管に１０ｍＬの培地を入れ、滅菌した竹串あるいは爪楊枝を用いてプレート上の単一のコロニーを拾って植菌し、３０℃で１〜２日間振とう培養した。

（４）酵母の形質転換
酢酸リチウム法により酵母の形質転換を行った。より詳細には、以下の（６）に示すＰＣＲ法により増幅したＰＣＲ産物１０〜１００μｇを、酢酸リチウム法によりＦＳＣ２７株に導入して形質転換した。形質転換後、酵母をＳＤ培地で培養することにより、ウラシル要求性が回復した株を選択した。

なお、酢酸リチウム法は、H. Itoら（Journal of Bacteriology, vol. 153, pp. 163-168 (1983)）の方法に従った。詳細には、１０ｍＬのＹＰＤ培地を入れたモノー試験管にプレートから１白金耳の宿主菌体を植菌し、３０℃で１晩培養した。この培養液を滅菌した遠心チューブに移し、３０００ｒｐｍで５分間遠心してＴＥバッファー（１０ｍＭＴＲＩＳ−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）に懸濁して洗浄した。この洗浄操作を２回繰り返し、遠心集菌した菌体を０．２５ｍＬのＴＥバッファー及び０．２５ｍＬの０．２Ｍ酢酸リチウムに懸濁し、よく撹拌後、３０℃で２時間振とうした。この懸濁液を１００μＬずつ滅菌したチューブに分取し、１０μＬのＤＮＡ溶液を加え穏やかに混和し、３０℃で３０分間静置した。１００μＬの７０％ポリエチレングリコール４０００（ナカライテスク社）を加えてよく撹拌し、３０℃に１時間静置した。４２℃で５分間静置し、室温に放置後、１ｍＬの滅菌水を加えて撹拌し、８０００ｒｐｍで１分間遠心した。上清を取り除き、沈殿を１００μＬの滅菌水で懸濁し、選択用のプレート培地に撒いた。プレートは３０℃で３〜５日間培養した。

（５）酵母の全ＤＮＡの調製並びにサザン解析
酵母の全ＤＮＡの調製は、P. Philippsenら（Methods in Enzymology, vol. 194, pp. 169-182 (1990)）の方法に従って行った。１０ｍＬの培地を入れたＬ字型試験管に、１晩培養した菌液を５００μＬ植菌した。定常期になるまで３０℃で１晩、振とう培養した後、培地を遠心チューブに移し、３０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨て、沈殿を１ｍＬの１．２Ｍソルビトール水溶液に懸濁し、エッペンドルフチューブに移した。１５０００ｒｐｍで１分間遠心し、上清を捨て、沈殿を５００μＬの１．２Ｍソルビトール−５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ７．５）に懸濁した。これに１０μＬのβ−メルカプとエタノールと５０μＬのＺｙｍｏｌｙａｓｅ溶液（５ｍｇ／ｍＬＺｙｍｏｌｙａｓｅ２０Ｔ、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を加え混和し、３０℃で１時間静置し、プロトプラスト化させた。５０００ｒｐｍで１分間遠心して上清を捨て、５００μＬの０．２％ＳＤＳ−５０ｍＭＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）を加えて混和し、７０℃で１５分間静置した。適当量のプロテイナーゼＫを加え混和し、３７℃で１時間放置した。１００μＬの５Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ４．８）を加え穏やかに混合し、３０分間氷冷した。８０００ｒｐｍで１分間遠心し、上清を別のチューブに移し、５００μＬのＴＥ飽和フェノールを加えてよく懸濁し、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上層（水相）を別のチューブに移した。５００μＬのフェノール−クロロホルムを加えてよく懸濁し、１５０００ｒｐｍで５分間遠心し、水相を別のチューブに移した。チューブの口までイソプロパノールを加えよく懸濁し、３０分間放置後１５０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨てた。沈殿を７０％エタノールで洗浄後、乾燥させ、５０μｇ／ｍＬのＲＮａｓｅＡを含むＴＥバッファー２０μＬに溶解した。３０分間室温に放置後、８０μＬのＴＥバッファー、１００μＬの５Ｍ酢酸アンモニウムを加えて混和し、氷中に３０分間静置した。４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を別のチューブに移し１ｍＬのエタノールを加えてドライアイス中に１０分間置いた。４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を捨て、沈殿を７０％エタノールで洗浄後、乾燥させ、２０μＬのＴＥバッファーに溶解した。

サザン解析は、ECL direct nucleic acid labelling and detection system（アマシャム社）に従って行った。ハイブリダイゼーション操作及びプローブの標識は、プローブとするＤＮＡを１００℃で５分間処理した後、氷中で急冷して変性させ、ＤＮＡ標識試薬及びグルタルアルデヒドで３７℃にて１０分間反応させ、ペルオキシダーゼで標識した。Gold hybridization buffer中にメンブランを置き、４２℃で２０分間以上プレハイブリダイゼーションを行った。これにプローブを加え１晩ハイブリダイゼーションを行った。メンブランを洗浄バッファー（０．５×ＳＳＣ、６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳ）中、４２℃、２０分間で２回洗浄した。さらに２×ＳＳＣで５分間の洗浄を２回行い、ＥＣＬ検出試薬を加え混和した。プローブとハイブリッドを形成したメンブラン上のＤＮＡは、プローブ中のペルオキシダーゼと検出試薬中の過酸化水素との反応の結果、検出試薬中のルミノールを酸化、発光させ、これをフィルムに感光させることによりシグナルとして検出した。

サザン解析において、ブロッティング操作は、ＶａｃｕＧｅｎｅＸＬＶａｃｃｕｍＢｌｏｔｔｉｎｇＳｙｓｔｅｍ（ファルマシア社）を用いた。すなわち、電気泳動後のゲルをナイロンメンブランＨｙｂｏｎｄＮ＋（アマシャム社）の上に載せ、ブロッティング装置にセットし、各種溶液中、５０ミリバールで吸引ブロッティングを行った。使用した溶液及び処理時間は、（１）酸処理溶液：０．２５Ｍ塩酸、７分、（２）変性溶液：１．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液、７分、（３）中和溶液：１．５Ｍ塩化ナトリウムを含む１．０Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．５）、７分、（４）トランスファー溶液：２０×ＳＳＣ、３０分である。ブロッティング後、メンブランのアルカリ固定処理を行った。

（６）ＰＣＲ法
ＰＣＲは、ＧｅｎｅＡｍｐ^ＴＭＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９６００（パーキンエルマー社）を用いて行った。得られたＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動により精製した後、形質転換等の試験に用いた。以下に、ＰＣＲ産物ごとの詳しいＰＣＲの条件を以下に示す。

（６−１）ＵＲＡ３ＯＲＦ
鋳型：ＹＩｐ５のＰｓｔＩ断片（実験室酵母由来ＵＲＡ３を含む）
プライマー：
ＵＲＡ３Ｐ１：ATGTCGAAAGCTACATATAAGGA（配列番号１）
ＵＲＡ３Ｐ２：TTAGTTTTGCTGGCCGCATC（配列番号２）
ＤＮＡポリメラーゼ：Ｅｘｐａｎｄ^ＴＭＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙｅｎｚｙｍｅｍｉｘ（ベーリンガーマンハイム社）
反応液組成（合計５０μＬ）：
１０ｍＭＰＣＲヌクレオチドミックス（ベーリンガーマンハイム）１μＬ
鋳型ＤＮＡ（０．１μｇ／μＬ）１μＬ
５０μＭプライマーＵＲＡ３Ｐ１１μＬ
５０μＭプライマーＵＲＡ３Ｐ２１μＬ
１０×ＰＣＲバッファー５μＬ
ＤＮＡポリメラーゼ０．７５μＬ
水４０．２５μＬ
反応条件：
９４℃、２分間
↓
（９４℃、１５秒間→６０℃、３０秒間→７２℃、９０秒間）×２５サイクル
↓
７２℃、７分間

（６−２）ＬＥＵ２ＯＲＦ
鋳型：ＹＲｐＧＬ１０ＢａｍＨＩ断片（実験室酵母由来ＬＥＵ２を含む）
プライマー：
Ｌ２ＯＲＦＰ１：ATGTCTGCCCCTAAGAAGATCGT（配列番号３）
Ｌ２ＯＲＦＰ２：AAGCAAGGATTTTCTTAACTTCT（配列番号４）
ＤＮＡポリメラーゼ：ＴＡＫＡＲＡＥｘＴａｑ（宝酒造社）
反応液組成（合計５０μＬ）：
１０ｍＭＰＣＲヌクレオチドミックス１μＬ
鋳型ＤＮＡ（０．１μｇ／μＬ）１μＬ
５０μＭプライマーＬ２ＯＲＦＰ１１μＬ
５０μＭプライマーＬ２ＯＲＦＰ２１μＬ
１０×ＰＣＲバッファー５μＬ
ＤＮＡポリメラーゼ０．５μＬ
水４０．５μＬ
反応条件：
９４℃、２分間
↓
（９４℃、１５秒間→５５℃、３０秒間→７２℃、９０秒間）×２５サイクル
↓
７２℃、７分間

（６−３）３９６−９−６Ｖ株のＬＥＵ２
鋳型：３９６−９−６Ｖ株の全ＤＮＡ
プライマー
ＬＥＵ２ＮＰ１：CGCCTGACGGATATACCTTN（配列番号５）
ＬＥＵ２ＮＰ２：GCCTACCCTATGAACATATN（配列番号６）
ＤＮＡポリメラーゼ：Ｅｘｐａｎｄ^ＴＭＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙｅｎｚｙｍｅｍｉｘ
反応液組成（合計５０μＬ）：
１０ｍＭＰＣＲヌクレオチドミックス１μＬ
鋳型ＤＮＡ（０．１μｇ／μＬ）１μＬ
５０μＭプライマーＬＥＵ２ＮＰ１１μＬ
５０μＭプライマーＬＥＵ２ＮＰ２１μＬ
１０×ＰＣＲバッファー５μＬ
ＤＮＡポリメラーゼ０．７５μＬ
水４０．２５μＬ
反応条件：
９４℃、２分間
↓
（９４℃、１５秒間→４６℃、３０秒間→６８℃、９０秒間）×３０サイクル
↓
７２℃、７分間

（６−４）ＵＲＡ３全長を含んだＬＥＵ２破壊用ＤＮＡ断片
組換えＤＮＡ技術ではなく、ダブルフュージョンＰＣＲ法（Ｄ．Ｃ．Ａｍｂｅｒｇら、Ｙｅａｓｔ、１１巻、１２７５−１２８０頁、１９９５年）により、標記ＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲ用ＤＮＡポリメラーゼは、伸長時にエラーを生じにくいＥｘｐａｎｄ^ＴＭＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙｅｎｚｙｍｅｍｉｘを用いた。増幅した中間ＰＣＲ産物は必要に応じて、アガロースゲル電気泳動による分画及びゲルからのＤＮＡ回収を行い、フェノール・クロロホルム処理及びエタノール沈殿による精製を行った。

ダブルフュージョンＰＣＲの概略は次の通りである（図１を参照）。まず、ステップ１において通常のＰＣＲ反応を３回行い、ステップ２において１回目のフュージョンＰＣＲを行い、ステップ３において２回目のフュージョンＰＣＲを行った。ステップ１では、ＬＥＵ２の上流２５０ｂｐ（ＬＥＵ２のＯＲＦ以前の領域）と融合（フュージョン）の糊代となるＵＲＡ３上流末端２０ｂｐとを含むＤＮＡ断片（以下、断片Ａという）、ＵＲＡ３全長を含むＤＮＡ断片（以下、断片Ｂという）、融合の糊代となるＵＲＡ３下流末端２０ｂｐとＬＥＵ２下流２５０ｂｐ（ＬＥＵ２のＯＲＦ内のＣ末端側の領域）とを含むＤＮＡ断片（以下、断片Ｃという）の３種類のＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した。ステップ２では、断片Ｂ及びＣを混合鋳型としてフュージョンＰＣＲを行って融合断片ＢＣを増幅した。ステップ３では、断片Ａ及び融合断片ＢＣを混合鋳型としてフュージョンＰＣＲを行って融合断片ＡＢＣを増幅した。

各ステップで使用した鋳型ＤＮＡ及びプライマー（ＵＲＡ３に相当する配列を下線で示す）は以下の通りである。

ステップ１
断片Ａ
鋳型：ＹＲｐＧＬ１０ＢａｍＨＩ断片
プライマー：
Ｐ１：TTTCAACTGAAAAATTGGGA（配列番号７）
Ｐ３：ATGAATTGAATTGAAAAGCTCATAGGGGCAGACATTAGAA（配列番号８）
アニーリング温度：５０℃
断片Ｂ
鋳型：ＹＩｐ５ＨｉｎｄＩＩＩ断片
プライマー：
Ｐ５：AGCTTTTCAATTCAATTCAT（配列番号９）
Ｐ６：AGCTTTTTCTTTCCAATTTT（配列番号１０）
アニーリング温度：４６℃
断片Ｃ
鋳型：ＹＲｐＧＬ１０ＢａｍＨＩ断片
プライマー：
Ｐ２：TTTCAACTGAAAAATTGGGA（配列番号１１）
Ｐ４：AAAATTGGAAAGAAAAAGCTTTTGTACGAACCATGCCACG（配列番号１２）
アニーリング温度：５０℃

ステップ２
鋳型：ＤＮＡ断片Ｂ及びＣ
プライマー：Ｐ２及びＰ５
アニーリング温度：５０℃

ステップ３
鋳型：ＤＮＡ断片Ａ及び融合ＤＮＡ断片ＢＣ
プライマー：Ｐ１及びＰ２
アニーリング温度：５６℃

各ステップの反応液組成は以下の通りである。

ステップ１
反応液組成（合計５０μＬ）：
１０ｍＭＰＣＲヌクレオチドミックス１μＬ
鋳型ＤＮＡ（０．１μｇ／μＬ）１μＬ
５０μＭフォワードプライマー１μＬ
５０μＭリバースプライマー１μＬ
１０×ＰＣＲバッファー５μＬ
Ｅｘｐａｎｄ^ＴＭＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙｅｎｚｙｍｅｍｉｘ０．７５μＬ
水４０．２５μＬ

ステップ２及び３
反応液組成（合計５０μＬ）：
１０ｍＭＰＣＲヌクレオチドミックス１μＬ
鋳型ＤＮＡ（各断片０．５μｇ／μＬを等モル濃度に混合）５μＬ
５０μＭフォワードプライマー０．５μＬ
５０μＭリバースプライマー０．５μＬ
１０×ＰＣＲバッファー５μＬ
Ｅｘｐａｎｄ^ＴＭＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙｅｎｚｙｍｅｍｉｘ０．７５μＬ
水３７．２５μＬ

各ステップにおいて、アニーリング温度以外の反応条件は共通であり、以下の通りである。
反応条件：
９４℃、２分間
↓
（９４℃、１５秒間→アニーリング温度、３０秒間→７２℃、９０秒間）×２５サイクル
↓
７２℃、７分間

（７）酵母の凝集性の安定性確認試験
酵母細胞を５ｍＬのＹＰＤ培地（２％グルコース）中で一晩振とう培養した後、０．１ｍＬの培地を新しい培地に植え継ぐことを繰り返し、酵母の凝集性を調べた。凝集性の強さは目視で評価し、ＦＳＣ２７株の示す凝集性を非常に強い凝集性（レベル５）とし、非凝集性（レベル０）までの６段階で評価した。なお、培養は２連で行った。

（８）試験管発酵試験
Ｌ字型試験管に１０ｍＬのＹＰＤ培地（糖濃度２４％）及び糖みつ培地を加え、一晩培養した前培養液０．５ｍＬを植菌し、３２℃、８０ｒｐｍにて１４４時間振とう培養した。培養終了後のエタノール濃度はガスクロマトグラフィーで測定した。

（９）フラスコ発酵試験
マイセル氏発酵管付三角フラスコ内の２４％糖みつ培地（全糖５０．６８％）２８５ｍＬに、全培養液（ＹＭ培地、３２℃で２４時間培養（ＦＳＣ２７株のみ４８時間培養））を１５ｍＬ（酒母量５％）接種し、３２℃でスターラーバーによる連続撹拌培養を６日間行った。なお、培養は２連で行った。

分析項目及び分析方法は以下の通りである。
アルコール濃度：ガスクロマトグラフィー
全糖濃度：レーン法
残糖濃度：ソモギー変法
酸度：０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液による滴定
ｐＨ：ｐＨメーターによる測定
酵母濃度：血球計数器による計測
発酵速度：ガスメーターによる二酸化炭素発生量の経時変化（重量測定）
試留液中の不純物：ガスクロマトグラフィー

（１０）繰り返し回分発酵試験
ＹＭ培地２０ｍＬに、斜面培地から菌株を１白金耳植菌し、３２℃で２４時間（ＦＳＣ２７株のみ４８時間）振とう培養を行い、これを前々培養した。糖液２３０ｍＬ（糖濃度１６％）に前々培養液１０ｍＬを植菌し、３２℃で２４時間（ＦＳＣ２７株のみ４８時間）振とう培養を行い、これを前培養とした。次に、発酵容器として容量３Ｌのジャーファーメンター（実量２Ｌ）を用い、糖みつ培地（全糖：５０．６８％、第１０サイクルのみ４８．４１％）に全培養液を植菌して、３０℃、１５０ｒｐｍにて本培養を行った。

本培養は以下の通りである。なお、第１サイクルは０．０５ＶＶＭで３０時間、第２〜１０サイクルは０．０５ＶＶＭで２時間、通気を行った。
第１サイクル：糖液１８００ｍＬ（糖濃度１８％）に前培養液２００ｍＬを植菌し、４８時間培養した。
第２サイクル：酒母残量２０％とし、糖液１６００ｍＬ（糖濃度１８％）を添加し、２４時間培養した。
第３サイクル：酒母残量２０％とし、糖液１６００ｍＬ（糖濃度２０％）を添加し、２４時間培養した。
第４〜１０サイクル：酒母残量２０％とし、糖液１６００ｍＬ（糖濃度２２％）を添加し、２４時間培養した。

各サイクルにおいて、以下の項目について分析を行った。
アルコール濃度：ガスクロマトグラフィー、酒精計
全糖濃度：レーン法
残糖濃度：ソモギー変法
酸度：０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液による滴定
ｐＨ：ｐＨメーターによる測定
総酵母数：血球計数器による計測
生菌率：メチレンブルー染色法
発酵速度：ガスメーターによる二酸化炭素発生量の経時変化（重量測定）

（実施例１：ＦＳＣ２７株のＬＥＵ２座位へのＵＲＡ３の導入）
ＦＳＣ２７株のＵＲＡ３座位以外の場所にＵＲＡ３全長を含むＤＮＡ断片を導入することを検討し、ＬＥＵ２を標的に選んだ。ＦＳＣ２７株は倍数性であるため、ＬＥＵ２遺伝子を複数もつと考えられる。本実施例では、複数のＬＥＵ２遺伝子のうち１つをＵＲＡ３導入により破壊し、ＦＳＣ２７株のウラシル要求性を回復することとした。遺伝子導入後に遺伝子変換を起こすことが予想されたが、形質転換体をＳＤ最小培地で維持することにより防げると考えた。なお、図２に本実施例のストラテジーを表した。

ａ．３９６−９−６Ｖ株及びＦＳＣ２７株における複数のＬＥＵ２遺伝子の存在の確認及び実験室酵母由来ＬＥＵ２との相同性の確認
実験室酵母のＬＥＵ２の塩基配列を基に、ＬＥＵ２ＯＲＦを増幅するようにプライマーを設計した（Ｌ２ＯＲＦＰ１及びＬ２ＯＲＦＰ２）。このプライマーを用いてプラスミドＹＲｐＧＬ１０上のＬＥＵ２（実験室酵母由来）を鋳型としてＰＣＲを行ったところ、約１ｋｂのＤＮＡ断片が増幅された。このＰＣＲ産物を各種制限酵素（ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｆＩ）で消化したところ、ほぼ目的通りの大きさの断片が得られ、このＰＣＲ産物がＬＥＵ２ＯＲＦを含むＤＮＡ断片であることが確認された。

このＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動法により精製したものをプローブとして用い、各種制限酵素で消化した３９６−９−６Ｖ株及びＦＳＣ２７株の全ＤＮＡに対するサザン解析を行った。３９６−９−６Ｖ株の解析結果を図３に示す（両株は同じパターンを示したため、３９６−９−６Ｖ株の結果のみを示す）。両株において、ＬＥＵ２ＯＲＦにハイブリダイズするシグナルが認められ、両株にＬＥＵ２相同遺伝子が存在することが確認された。また、両株のシグナルパターンは同一であった。実験室酵母のＬＥＵ２ＯＲＦ内に切断部位を１つ持つ制限酵素であるＥｃｏＲＩ（レーン３）及びＥｃｏＲＶ（レーン２）で消化した場合３〜４本のシグナルが認められ、一方、実験室酵母のＬＥＵ２ＯＲＦ内に切断部位を持たない制限酵素で消化した場合１〜２本のシグナルが認められた。３９６−９−６Ｖ株及びＦＳＣ２７株のＬＥＵ２が１コピーである場合は、ＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＶで消化した場合に１〜２本のシグナルが出現するはずであり、３本以上のシグナルが出現することはない。よって、３９６−９−６Ｖ株及びＦＳＣ２７株のＬＥＵ２は２コピー以上存在すると推察された。本ストラテジーは、ＦＳＣ２７株のＬＥＵ２が実験室酵母のＬＥＵ２と相同性があり、かつ、２コピー以上存在することを前提としている。この結果より、実施の可能性を確認できたため、以後の実験を行った。

ｂ．ＰＣＲによるＵＲＡ全長を含んだＬＥＵ２破壊用ＤＮＡ断片の増幅
ダブルフュージョンＰＣＲ法を用いて、ＵＲＡ３全長を含んだＬＥＵ２破壊用ＤＮＡ断片を構築した。最終的なＰＣＲ産物を制限酵素（ＰｓｔＩ、ＳｍａＩ及び両者の混合物）で消化したところ目標通りの切断パターンが得られ、ＵＲＡ３全長を含んだＬＥＵ２破壊用ＤＮＡ断片の増幅が確認できた。

ｃ．ＦＳＣ２７株の形質転換及び得られた形質転換体の選択
ｂで構築したＤＮＡ断片を０、１０、５０、１００μｇ用い、酢酸リチウム法によりＦＳＣ２７株の形質転換を行った。２回の実験で、合計１４７株のウラシル要求性が回復した形質転換体（ＦＳＣＵ−Ｌ株と名付けた）を取得できた。形質変換の頻度を表１にまとめた。

得られた１４７株のうち任意に選んだ２５株をＳＤ培地で培養したところ、すべての株で凝集性が認められた。凝集性の強さは、親株であるＦＳＣ２７株と同程度の、非常に強い凝集性（レベル５）であった。

ｄ．形質転換体の確認
凝集性を確認した２５のＦＳＣＵ−Ｌ株のうち３株について、ＬＥＵ２ＯＲＦをプローブとするサザン解析を行った。サザン解析の結果を図４に示す。ＦＳＣ２７株及び３９６−９−６Ｖ株において認められるシグナルと同じ大きさのシグナル強度が弱まり、それと異なる大きさにシフトしたシグナルが検出された。これは、複数あるＬＥＵ２のうちの一つに目的遺伝子が導入されたことを示している。また、ＵＲＡ３ＯＲＦをプローブとしてサザン解析を行ったところ、ＦＳＣＵ−Ｌ株において、ＦＳＣ２７株には認められないシグナルが検出された。すなわち、外来のＵＲＡ３が導入されたことを示している。ｐＢＲ３２２をプローブとしてサザン解析を行ったところ、ＦＳＣＵ−Ｌ株において、ＦＳＣ２７株及び３９６−９−６Ｖ株と同様にシグナルが検出されなかった。すなわち、これらの株が大腸菌由来のＤＮＡが導入されていないセルフクローニング系であることを示している。以上の結果から、ＦＳＣＵ−Ｌ株において目的どおりの遺伝子の組込が生じたこと、また、その組込がセルフクローニング系であることを確認できた。

ｅ．形質転換体の凝集性の維持の確認
凝集性を確認した２５のＦＳＣＵ−Ｌ株の中から任意に選んだ３株を、ＳＤ培地及びＹＰＤ培地に培養し、植え継ぎを２０回繰り返し、継代前後の酵母の凝集性を調べた。結果を表２に示す。

いずれの培地で培養した場合も、２０回の継代後においても酵母の凝集性は維持されたままであった。

（試験例１：ＦＳＣＵ−Ｌ株の発酵性能評価試験）
糖濃度２４％のＹＰＤ培地を用いて、凝集性を確認したＦＳＣＵ−Ｌ株２５株について試験管発酵試験を行い、生成アルコール濃度が高い１０株を選択した。さらに、糖濃度２４％の糖みつ培地を用いて、これら１０株について試験管発酵試験を行って生成アルコール濃度を測定した。各培地において総合的に生成アルコール濃度が高い３株（ＦＳＣＵ−Ｌ１８，２０及び２１株）を最終的に選択した。

この３株について、糖みつ培地を用いたフラスコ発酵試験を行い、詳細な発酵性能を評価した。二酸化炭素発生量の経時変化を図５に示し、発酵もろみの分析結果を表３に示し、試留液中の不純物の分析結果を表４に示した。

図５から明らかなように、３株のＦＳＣＵ−Ｌ株の発酵速度は、３９６−９−６Ｖ株とほぼ同等であり、ウラシル要求性に起因するＦＳＣ２７株の発酵速度の低下が、ＦＳＣ２７株の改良株であるＦＳＣＵ−Ｌ株で改善された。また、表３から分かるように、酵母数についてもＦＳＣＵ−Ｌ株で改善された。生成エタノール濃度については、ＦＳＣＵ−Ｌ株はいずれもＦＳＣ２７株及び３９６−９−６Ｖ株を上回り、ＦＳＣＵ−Ｌ１８株が最も高かった。糖みつ中での凝集性についても、ＦＳＣＵ−Ｌ株３株全てが強い凝集性を示した。さらに、表４から分かるように、試留液中の不純物については、全ての株でほぼ同様の組成であった。以上の結果から、ＦＳＣＵ−Ｌ株の発酵性能は、３９６−９−６Ｖ株を若干上回ることが確認された。

（試験例２：ＦＳＣＵ−Ｌ株の実用化への検討）
ＦＳＣＵ−Ｌ１８株の実用化を検討するため、ジャーファーメンターによる繰り返し回分発酵試験を行った（対照としてＦＳＣ２７株を使用）。二酸化炭素発生量を図６及び７に示し、発酵もろみ分析結果を表５に示し、発酵所要時間を図８に示す。

ＦＳＣＵ−Ｌ１８株の生成エタノール濃度、発酵歩合及び発酵速度は、親株であるＦＳＣ２７株を上回っており、ウラシル要求性が回復した効果が認められた。ＦＳＣＵ−Ｌ１８株の酵母数及び生菌率は高く、また、凝集性も強かった（凝集フロックの大きさ：直径０．５〜２ｍｍ；凝集フロックの状態：しっかり固まり粒を形成している）。

ダブルフュージョンＰＣＲの概略図である。ＬＥＵ２座位へＵＲＡ３を導入するストラテジーを表す図である。３９６−９−６Ｖ株のサザン解析の結果を表す図である。レーン１：ＹＲｐＧＬ１０／ＢａｍＨＩ、レーン２：ＥｃｏＲＶ、レーン３：ＥｃｏＲＩ、レーン４：ＨｉｎｄＩＩＩ、レーン５：ＢａｍＨＩ、レーン６：ＰｓｔＩ。ＦＳＣＵ−Ｌ株のサザン解析の結果を表す図である。（ａ）はＵＲＡ３ＯＲＦをプローブとして用いた場合、（ｂ）はＬＥＵ２ＯＲＦをプローブとして用いた場合、（ｃ）はｐＢＲ３２２／ＨｉｎｄＩＩＩをプローブとして用いた場合の結果を表す。レーンＭ：ＹＲｐＧＬ１０、レーン１：ＦＳＣ２７株、レーン２：ＦＳＣＵ−Ｌ１８株、レーン３：ＦＳＣＵ−Ｌ２０株、レーン４：ＦＳＣＵ−Ｌ２１株。ＦＳＣＵ−Ｌ株のフラスコ発酵試験における、二酸化炭素発生量を表すグラフである。ＦＳＣＵ−Ｌ１８株を用いた繰り返し回分発酵における、二酸化炭素発生量を表すグラフである。ＦＳＣ２７株を用いた繰り返し回分発酵における、二酸化炭素発生量を表すグラフである。ＦＳＣＵ−Ｌ１８株及びＦＳＣ２７株を用いた繰り返し回分発酵における、発酵所要時間を表すグラフである。

Claims

サッカロマイセス・セレビシエＦＳＣ２７株（受託番号ＦＥＲＭＰ−１６０２３）の染色体上に２つ存在するＬＥＵ２座位の一方のみに、サッカロミセス・セレビシエ由来のＵＲＡ３遺伝子を導入する工程を備える、ウラシル非要求性の凝集性アルコール発酵酵母の生産方法。
サッカロマイセス・セレビシエＦＳＣ２７株（受託番号ＦＥＲＭＰ−１６０２３）の染色体上に２つ存在するＬＥＵ２座位の一方のみに、サッカロミセス・セレビシエ由来のＵＲＡ３遺伝子が導入された、ウラシル非要求性の凝集性アルコール発酵酵母。
前記凝集性アルコール発酵酵母がサッカロマイセス・セレビシエＦＳＣＵ−Ｌ１８株（受託番号ＦＥＲＭＰ−２００５５）であることを特徴とする、請求項２に記載の凝集性アルコール発酵酵母。