CN101056978A - 凝集性酒精发酵酵母的生产方法及凝集性酒精发酵酵母 - Google Patents

凝集性酒精发酵酵母的生产方法及凝集性酒精发酵酵母 Download PDF

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Abstract

非尿嘧啶需要性的凝集性酒精发酵酵母的生产方法，该方法具备仅在存在于酿酒酵母FSC27株(保藏编号FERM P－16023)的染色体上的2个LEU2基因位点中的1个导入来自于酿酒酵母的URA3基因的工序。

Description

凝集性酒精发酵酵母的生产方法及凝集性酒精发酵酵母
技术领域
本发明涉及凝集性酒精发酵酵母的生产方法及凝集性酒精发酵酵母。
背景技术
采用发酵法的酒精生产使用作为发酵酵母的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中酒精生产性特别高的株(以下称为酒精发酵酵母)、基于称作分批发酵法的方法进行。其中，使用凝集性酵母的反复分批发酵法可以使酒精生产中的作业效率和生产效率提高。
凝集性酵母是指具有各个细胞无性地相互作用形成凝集块而在静置状态的培养基中沉淀到液底的性质(以下，将该性质称为凝集性)的酵母。从自然界获得的凝集性酵母大多酒精生成能力不足，难以作为工业用酒精生产中的酵母实用化。因此，本发明人制成了在非凝集性酒精发酵酵母396-9-6V株(工业技术院微生物工业技术研究所(现产业技术综合研究所专利生物保藏中心；日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566))；保藏编号：FERMP-12804)中导入了凝集性基因FL01的自身克隆株FSC27株(保藏日：1997年1月7日；保藏编号：FERM P-16023)(专利文献1)。
专利文献1：日本专利第3040959号说明书
发明的揭示
FSC27株的生成乙醇浓度与亲株396-9-6V株同等，但存在发酵速度比396-9-6V株慢的问题。该问题是由于在URA3基因位点导入了FL01的FCS27株呈尿嘧啶需要性。通过以添加适量尿嘧啶的培养基培养FSC27株，虽然发酵速度与396-9-6V株同等，但该方法不实用。
因此，本发明的目的在于提供在不含尿嘧啶的培养基中显示出充分的乙醇生成能力和发酵速度的凝集性酒精发酵酵母。
为了实现上述目的，本发明提供非尿嘧啶需要性的凝集性酒精发酵酵母的生产方法，所述方法具备仅在存在于酿酒酵母FSC27株的染色体上的2个LEU2基因位点中的1个导入来自于酿酒酵母的URA3基因的工序。通过在LEU2基因位点上导入URA3基因，可以在维持高酒精生成能力的状态下使酵母转化为非尿嘧啶需要性。
本发明还提供仅在存在于酿酒酵母FSC27株的染色体上的2个LEU2基因位点中的1个导入了来自于酿酒酵母的URA3基因的非尿嘧啶需要性的凝集性酒精发酵酵母。在这里，凝集性酒精发酵酵母较好是酿酒酵母FSCU-L18株(产业技术综合研究所专利生物保藏中心；保藏日：2004年5月20日；保藏编号：FERMP-20055)。在LEU2基因位点上导入了URA3基因的酵母兼具高酒精生成能力和非尿嘧啶需要性。特别是FSCU-L18株显示出高酒精生成能力，因此适合作为工业用酒精生产中的酵母。
如果采用本发明，则可以提供具有比FSC27株更好的酒精生成能力和发酵速度的非尿嘧啶需要性的凝集性酒精酵母。
附图的简单说明
图1为双融合PCR的简图。
图2为表示向LEU2基因位点导入URA3的策略的图。
图3为表示396-9-6V株的Southern分析结果的图。泳道1：YRpGL10/BamH I，泳道2：EcoR V，泳道3：EcoR I，泳道4：HindIII，泳道5：BamH I，泳道6：Pst I。
图4为FSCU-L株的Southern分析结果的图。(a)表示使用URA3ORF作为探针时的结果，(b)表示使用LEU2 ORF作为探针时的结果，(c)表示使用pBR332/HindIII作为探针时的结果。泳道M：YRpGL10，泳道1：FSC27株，泳道2：FSCU-L18株，泳道3：FSCU-L20株，泳道4：FSCU-L21株。
图5为表示FSCU-L株的烧瓶发酵试验中的二氧化碳产生量的图。
图6为表示使用FSCU-L18株的反复分批发酵中的二氧化碳产生量的图。
图7为表示使用FSC27株的反复分批发酵中的二氧化碳产生量的图。
图8为表示使用FSCU-L18株和FSC27株的反复分批发酵中的发酵所需时间的图。
实施发明的最佳方式
以下，对本发明进行详细说明。
首先，对本发明的非尿嘧啶需要性的凝集性酒精发酵酵母的生产方法进行说明。本发明的非尿嘧啶需要性的凝集性酒精发酵酵母的生产方法具备仅在存在于酿酒酵母FSC27株的染色体上的2个LEU2基因位点中的1个导入来自于酿酒酵母的URA3基因的工序。
FSC27株中，URA3基因伴随凝集性基因FL01基因的导入而被破坏，是尿嘧啶需要性的。因此，通过仅在存在于酿酒酵母FSC27株的染色体上的2个LEU2基因位点中的1个导入来自于酿酒酵母的URA3基因，可以得到FSC27株的非尿嘧啶需要性的转化体。在这里，导入的URA3基因来自于酿酒酵母，所以该重组为自身克隆。因此，不是重组DNA实验指南等规定的对象，适合于实用，例如可以使用采用已知的设备的酒精生产中得到的转化体等。
来自于酿酒酵母的URA3基因可以从染色体分离制备，也可以使用已分离到质粒上的基因。作为所述的质粒，可以使用例如YIp5等。此外，可以使用双融合PCR，制备包括全长URA3基因的LEU2破坏用DNA片段(对于双融合PCR的详细说明，参照实施例)。接着，将URA3通过乙酸锂法等公知的方法导入FSC27株。
接着，使得到的转化体经历在不含尿嘧啶的培养基中培养而对转化体进行筛选的工序，从而可以仅获得只在1个LEU2基因位点导入了URA3基因的转化体。
对于这样得到的只在1个LEU2基因位点导入了URA3基因的转化体，进行实施例所记载的酒精发酵试验，可以选出酒精生成能力特好的株。此外，得到的转化体的凝集性的确认也可以通过实施例所记载的方法进行。
以下，对本发明的非尿嘧啶需要性的凝集性酒精发酵酵母进行说明。本发明的非尿嘧啶需要性的凝集性酒精发酵酵母仅在存在于酿酒酵母FSC27株的染色体上的2个LEU2基因位点中的1个导入了来自于酿酒酵母的URA3基因。所述酵母可以通过前述的本发明的非尿嘧啶需要性的凝集性酒精发酵酵母的生产方法进行生产。
本发明的非尿嘧啶需要性的凝集性酒精发酵酵母在不含尿嘧啶的培养基进行培养时也表现出比FSC27株酵母更好的发酵速度和酒精生成量。因此，本发明的非尿嘧啶需要性的凝集性酒精发酵酵母可以用于工业的酒精生产。
本发明的非尿嘧啶需要性的凝集性酒精发酵酵母中，酿酒酵母FSCU-L18的酒精生成能力特别好，因此适合用于工业的酒精生产。
实施例
以下，例举实施例，对本发明进行更详细的说明，但本发明并不局限于这些实施例。
(实验方法)
(1)质粒
使用了YIp5和YRpGL10这2种质粒。YIp5为一般的酵母-大肠杆菌穿梭载体，具有酿酒酵母的URA3序列作为筛选标记，不具有酵母中的自我复制序列和着丝粒序列。YRpGL10为在一般的酵母-大肠杆菌穿梭载体YIp7中加入了酿酒酵母的LEU2序列和G418药剂耐性基因序列作为筛选标记的质粒。
(2)酵母
使用了396-9-6V株和FSC27株。396-9-6V株为非凝集性的酒精发酵用酵母。FSC27株为在396-9-6V株的染色体上的URA3基因位点导入了凝集性基因FL01的株，为凝集性的酒精发酵用酵母(参照日本专利第3040959号说明书)。
(3)培养基
酵母的培养在YPD培养基、SD培养基(葡萄糖极限培养基)和糖蜜培养基(糖浓度16～24％，发酵试验用)中进行。各培养基的组成如下所示。YPD培养基：10g/L细菌用酵母抽提物(Difco公司)、20g/L细菌用蛋白胨(Difco公司)、10g/L葡萄糖，pH5.5。YM培养基：3g/L细菌用酵母抽提物、3g/L细菌用麦芽抽提物(Difco公司)、3g/L细菌用蛋白胨(Difco公司)、10g/L葡萄糖，pH4.5。SD培养基(葡萄糖极限培养基)：6.7g/L无氨基酸酵母氮源(Difco公司)、20g/L葡萄糖，pH5.4。糖蜜培养基：将泰国或印度尼西亚产的糖蜜用水稀释至还原糖浓度为16～24％而得到。
除糖蜜培养基以外的培养基在制备后进行121℃、15分钟的高压灭菌锅处理。通过加入2％的琼脂制成平板，进行培养基的固体化。在上述培养基中加入氨基酸的情况下，制成适当浓度的氨基酸溶液(无菌)，在经高压灭菌锅处理的上述培养基冷却至60～70℃后添加，使其达到20μg/mL的浓度。
平板培养时，用铂丝划线或用涂布器涂抹，在30℃下倒置培养2～3天。液体培养时，在中试管中加入2mL培养基或在L形试管中加入10mL培养基，使用经灭菌的竹签或牙签取平板上的单一菌落进行接种，在30℃振荡培养1～2天。
(4)酵母的性状转化
通过乙酸锂法进行酵母的性状转化。更具体地，将10～100μg通过以下的(6)中所示的PCR法扩增了的PCR产物以乙酸锂法导入FSC27株，进行性状转化。性状转化后，通过将酵母在SD培养基中进行培养，筛选尿嘧啶需要性得到复原的株。
另外，乙酸锂法按照H.Ito等(Journal of Bacteriology，vol.153，pp.163-168(1983))的方法实施。具体来说，在加入了10mL的YPD培养基的L形试管中自平板接种1铂丝的宿主菌体，在30℃培养1晚。将该培养液移入经灭菌的离心管，以3000rpm离心5分钟，悬浮于TE缓冲液(10mM TRIS-HCl，1mM EDTA，pH7.5)，进行清洗。重复该清洗操作2次，将离心收集得到的菌体悬浮于0.25mL的TE缓冲液和0.25mL的0.2M乙酸锂，充分搅拌后，在30℃振荡2小时。将该悬浮液分别分取100μL到经灭菌的试管，加入10μL的DNA溶液，平缓地混合，在30℃静置30分钟。加入100μL的70％聚乙二醇4000(ナカライテスク公司)，充分搅拌，在30℃静置1小时。在42℃静置5分钟，放置至室温后，加入1mL的灭菌水进行搅拌，以8000rpm离心1分钟。除去上清，将沉淀以100μL的灭菌水悬浮，接种于筛选用的平板培养基。平板在30℃培养3～5天。
(5)酵母的全DNA的制备和Southern分析
酵母的全DNA的制备按照P.Philippsen等(Methods in Enzymology，vol.194，pp.169-182(1990))的方法进行。在加入了10mL培养基的L形试管中接种500μL培养了1晚的菌液。在30℃振荡培养1晚，达到稳定期后，将培养基移入离心管，以3000rpm离心5分钟，去上清，将沉淀悬浮于1mL的1.2M山梨糖醇水溶液，移入eppendorf管。以15000rpm离心1分钟，去上清，将沉淀悬浮于500μL的1.2M山梨糖醇-50mM Tris-HCl溶液(pH7.5)。向该溶液中加入10μL的β-巯基乙醇和50μL的藤黄节杆菌酶(Zymolyase)溶液(5mg/mL藤黄节杆菌酶20T，50mM Tris-HCl，pH7.5)进行混合，在30℃静置1小时，使其原生质体化。以5000rpm离心1分钟，去上清，加入500μL的0.2％SDS-50mM EDTA溶液(pH8.0)进行混合，在70℃静置15分钟。加入适量的蛋白酶K进行混合，在37℃放置1小时。再加入100μL的5M乙酸锂(pH4.8)，平缓地混合，冰冷30分钟。以8000rpm离心1分钟，将上清移入其它的试管，加入500μL的TE饱和苯酚，充分悬浮，以4℃、15000rpm离心10分钟，将上层(水相)移入其它的试管。加入500μL的苯酚-三氯甲烷，充分悬浮，以15000rpm离心5分钟，将水相移入其它的试管。加入异丙醇至试管口，充分悬浮，放置30分钟后以15000rpm离心5分钟，去上清。将沉淀以70％乙醇清洗后，使其干燥，溶解于20μL含50μg/mL的RNA酶A的TE缓冲液。在室温下放置30分钟后，加入80μL的TE缓冲液、100μL的5M乙酸铵进行混合，在冰中静置30分钟。以4℃、15000rpm离心10分钟，将上清移入其它的试管，加入1mL的乙醇，在干冰中放置10分钟。以4℃、15000rpm离心10分钟，去上清，将沉淀以70％乙醇清洗后，使其干燥，溶解于20μL的TE缓冲液。
Southern分析按照ECL Direct核苷酸标记和检测系统(nucleic acid labeling and detection system)(Amersham公司)进行。杂交操作和探针的标记中，将作为探针的DNA以100℃处理5分钟后，在冰中快速冷却，使其变性，以DNA标记试剂和戊二醛在37℃反应10分钟，以过氧化物酶进行标记。将膜置于金杂交缓冲液(Gold hybridization buffer)中，在42℃进行预杂交20分钟以上。在其中加入探针，杂交1晚。将膜在清洗缓冲液(0.5×SSC，6M尿素，0.4％SDS)中以42℃、20分钟清洗2次。然后，以2×SSC进行2次5分钟的清洗，加入ECL检测试剂进行混合。探针中的过氧化物酶和检测试剂中的过氧化氢反应，结果使检测试剂中的鲁米诺氧化发光，使其在胶片上感光，从而作为信号检测出与探针形成了杂交的膜上的DNA。
Southern分析中，印迹操作使用VacuGene XL真空印迹系统(Vaccum Blotting System)(Pharmacia公司)。即，将电泳后的凝胶置于尼龙膜Hybond N+(Amersham公司)上，放置于印迹装置，在各种溶液中以50毫巴进行吸引印迹。使用的溶液和处理时间如下：(1)酸处理溶液：0.25M盐酸，7分钟；(2)变性溶液：含1.5M氯化钠的0.5M氢氧化钠水溶液，7分钟；(3)中和溶液：含1.5M氯化钠的1.0M Tris缓冲液(pH7.5)，7分钟；(4)转移溶液：20×SSC，30分钟。印迹后，进行膜的碱固定处理。
(6)PCR法
PCR使用GeneAmpTM PCR系统9600(PerkinElmer公司)进行。得到的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化后，用于性状转化等试验。每种PCR产物的具体PCR条件如下所示。
(6-1)URA3 ORF
模板：YIp5的Pst I片段(含来自实验室酵母的URA3)
引物：
URA3P1：ATGTCGAAAGCTACATATAAGGA(序列编号1)
URA3P2：TTAGTTTTGCTGGCCGCATC(序列编号2)
DNA聚合酶：ExpandTM高保真酶混合物(High Fidelity enzyme mix)(Boehringer Mannheim公司)
反应液组成(总计50μL)：
10mM PCR核苷酸混合物(Boehringer Mannheim)1μL
模板DNA(0.1μg/μL)1μL
50μM引物URA3P1 1μL
50μM引物URA3P2 1μL
10×PCR缓冲液5μL
DNA聚合酶0.75μL
水40.25μL
反应条件：
94℃，2分钟
  ↓
(94℃，15秒→60℃，30秒→72℃，90秒)×25循环
  ↓
72℃，7分钟
(6-2)LEU2 ORF
模板：YRpGL10BamH I片段(含来自实验室酵母的LEU2)
引物：
L2ORFP1：ATGTCTGCCCCTAAGAAGATCGT(序列编号3)
L2ORFP2：AAGCAAGGATTTTCTTAACTTCT(序列编号4)
DNA聚合物：TAKARA Ex Taq(宝酒造公司)
反应液组成(总计50μL)：
10mM PCR核苷酸混合物1μL
模板DNA(0.1μg/μL)1μL
50μM引物L2ORFP1 1μL
50μM引物L2ORFP2 1μL
10×PCR缓冲液5μL
DNA聚合酶0.5μL
水40.5μL
反应条件：
94℃，2分钟
  ↓
(94℃，15秒→55℃，30秒→72℃，90秒)×25循环
  ↓
72℃，7分钟
(6-3)396-9-6V株的LEU2
模板：396-9-6V株的全DNA
引物
LEU2NP1：CGCCTGACGGATATACCTTN(序列编号5)
LEU2NP2：GCCTACCCTATGAACATATN(序列编号6)
DNA聚合物：ExpandTM高保真酶混合物
反应液组成(总计50μL)：
10mM PCR核苷酸混合物1μL
模板DNA(0.1μg/μL)1μL
50μM引物LEU2NP1 1μL
50μM引物LEU2NP2 1μL
10×PCR缓冲液5μL
DNA聚合酶0.75μL
水40.25μL
反应条件：
94℃，2分钟
  ↓
(94℃，15秒→46℃，30秒→68℃，90秒)×25循环
  ↓
72℃，7分钟
(6-4)含URA3全长的LEU2破坏用DNA片段
不采用重组DNA技术，而通过双融合PCR法(D.C.Amberg等，《酵母(Yeast)》，11卷，1275-1280页，1995年)，扩增标记DNA片段。PCR用DNA聚合酶使用延伸时不易产生差错的ExpandTM高保真酶混合物。扩增得到的中间PCR产物根据需要进行采用琼脂糖凝胶电泳的分离和自凝胶的DNA回收，进行采用苯酚·三氯甲烷处理和乙醇沉淀的纯化。
双融合PCR的大致内容如下(参照图1)。首先，在步骤1中进行3次常规的PCR反应，步骤2中进行第1次融合PCR，步骤3中进行第2次融合PCR。步骤1中，通过PCR扩增包括LEU2的上游250bp(LEU2的ORF之前的区域)和作为融合(fusion)的接头的URA3上游末端20bp的DNA片段(以下称作片段A)、包括URA3全长的DNA片段(以下称作片段B)、包括作为融合的接头的URA3上游末端20bp和LEU2下游250bp(LEU2的ORF内的C末端侧的区域)的DNA片段(以下称作片段C)这3种DNA片段。步骤2中，将片段B和C作为混合模板进行融合PCR，扩增融合片段BC。步骤3中，将片段A和融合片段BC作为混合模板进行融合PCR，扩增融合片段ABC。
各步骤中所用的模板DNA和引物(相对于URA3的序列以下划线表示)如下。
步骤1
片段A
模板：YRpGL10 BamH I片段
引物：
P1：TTTCAACTGAAAAATTGGGA(序列编号7)
P3： ATGAATTGAATTGAAAAGCTCATAGGGGCAGACATTAGAA(序列编号8)
退火温度：50℃
片段B
模板：YIp5 HindIII片段
引物：
P5： AGCTTTTCAATTCAATTCAT(序列编号9)
P6： AGCTTTTTCTTTCCAATTTT(序列编号10)
退火温度：46℃
片段C
模板：YRpGL10 BamH I片段
引物：
P2：TTTCAACTGAAAAATTGGGA(序列编号11)
P4：AAAATTGGAAAGAAAAAGCTTTTGTACGAACCATGCCACG(序列编号12)
退火温度：50℃
步骤2
模板：DNA片段B和C
引物：P2和P5
退火温度：50℃
步骤3
模板：DNA片段A和融合DNA片段BC
引物：P1和P2
退火温度：56℃
各步骤的反应液组成如下。
步骤1
反应液组成(总计50μL)：
10mM PCR核苷酸混合物1μL
模板DNA(0.1μg/μL)1μL
50μM正向引物1μL
50μM反向引物1μL
10×PCR缓冲液5μL
ExpandTM高保真酶混合物0.75μL
水40.25μL
步骤2和3
反应液组成(总计50μL)：
10mM PCR核苷酸混合物1μL
模板DNA(将0.5μg/μL各片段混合至等摩尔浓度)5μL
50μM正向引物0.5μL
50μM反向引物0.5μL
10×PCR缓冲液5μL
ExpandTM高保真酶混合物0.75μL
水37.25μL
各步骤中，除退火温度以外的反应条件是共通的，如下。
反应条件：
94℃，2分钟
  ↓
(94℃，15秒→退火温度，30秒→72℃，90秒)×25循环
  ↓
72℃，7分钟
(7)酵母的凝集性的稳定性确认试验
将酵母细胞在5mL的YPD培养基(2％葡萄糖)中振荡培养一晚后，反复将0.1mL的培养基继续接种到新的培养基，考察酵母的凝集性。凝集性的强弱通过肉眼观察进行评价，将FSC27株表现出的凝集性作为非常强的凝集性(级别5)，以到非凝集性(级别0)为止的6级进行评价。另外，培养分2组进行。
(8)试管发酵试验
在L形试管中加入10mL的YPD培养基(糖浓度24％)和糖蜜培养基，接种0.5mL培养了一晚的预培养液，以32℃、80rpm振荡培养144小时。培养结束后的乙醇浓度通过气相色谱法进行测定。
(9)烧瓶发酵试验
在带麦氏(マイセル氏)发酵管的锥形瓶内的285mL的24％糖蜜培养基(总糖50.68％)中接种15mL(酒母量5％)全培养液(YM培养基，32℃下培养24小时(仅FSC27株培养48小时))，在32℃进行6天采用搅拌棒的连续搅拌培养。另外，培养分2组进行。
分析项目及分析方法如下。
酒精浓度：气相色谱法
总糖浓度：廉-爱农(Lane-Eynon)(レ一ン法)法
残糖浓度：萨氏(Somogyi)(ソモギ一)改进法
酸度：采用0.1N氢氧化钠水溶液的滴定
pH：采用pH计的测定
酵母浓度：采用血球计数器的计数
发酵速度：采用气量计的二氧化碳产生量的经时变化(重量测定)
试馏液中的杂质：气相色谱法
(10)反复分批发酵试验
自斜面培养基接种1铂丝菌株到20mL的YM培养基中，在32℃振荡培养24小时(仅FSC27株为48小时)，对其进行前预培养。将10mL前预培养液接种到230mL糖液(糖浓度16％)中，在32℃振荡培养24小时(仅FSC27株为48小时)，对其进行预培养。接着，使用容量3L的发酵罐(实际量2L)作为发酵容器，将全培养液接种到糖蜜培养基(全糖：50.68％，仅第10循环为48.41％)中，以30℃、150rpm进行正式培养。
正式培养如下所示。另外，第1循环以0.05VVM通气30小时，第2～10循环以0.05VVM通气2小时。
第1循环：在1800mL糖液(糖浓度18％)中接种200mL预培养液，培养48小时。
第2循环：取20％酒母残量，添加1600mL糖液(糖浓度18％)，培养24小时。
第3循环：取20％酒母残量，添加1600mL糖液(糖浓度20％)，培养24小时。
第4～10循环：取20％酒母残量，添加1600mL糖液(糖浓度22％)，培养24小时。
各循环中，对以下的项目进行分析。
酒精浓度：气相色谱法，酒精计
总糖浓度：廉-爱农法
残糖浓度：萨氏改进法
酸度：采用0.1N氢氧化钠水溶液的滴定
pH：采用pH计的测定
总酵母数：采用血球计数器的计数
活菌率：亚甲蓝染色法
发酵速度：采用气量计的二氧化碳产生量的经时变化(重量测定)
(实施例1：向FSC27株的LEU2基因位点的URA3的导入)
对向FSC27株的除URA3基因位点以外的位置的含URA3全长的DNA片段的导入进行了研究，选择LEU2作为靶位点。FSC27株为多倍体，因此被认为具有多个LEU2基因。本实施例中，通过URA3的导入破坏多个LEU2基因中的1个，将FSC27株的尿嘧啶需要性复原。预计基因导入后会发生基因转化，考虑通过以SD极限培养基保持转化体，从而进行防止。另外，图2中表示本实施例的策略。
a.396-9-6V株和FSC27株中的多个LEU2基因的存在的确认以及与来自于实验室酵母的LEU2的同源性的确认
基于实验室酵母的LEU2的碱基序列，设计用于扩增LEU2 ORF的引物(L2ORFP1和L2ORFP2)。使用该引物以质粒YRpGL10上的LEU2(来自于实验室酵母)为模板进行PCR后，扩增得到约1kb的DNA片段。将该PCR产物用各种限制性酶(EcoRI、EcoR V、Hinf I)进行消化后，得到与目标大致同样大小的片段，确认该PCR产物为含LEU2 ORF的DNA片段。
将该PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化，将得到的片段作为探针，进行对经各种限制性酶消化的396-9-6V株和FSC27株的全DNA的Southern分析。396-9-6V株的分析结果示于图3(由于两株呈同样的图案，因此仅表示了396-9-6V株的结果)。两株中，发现与LEU2ORF杂交的信号，确认两株中存在LEU2同源基因。此外，两株的信号图案相同。以在实验室酵母的LEU2ORF内具有1个剪切位点的限制性酶EcoR I(泳道3)和EcoR V(泳道2)进行了消化的情况下，发现3～4条信号；另一方面，以在实验室酵母的LEU2ORF内不具有剪切位点的限制性酶进行了消化的情况下，发现1～2条信号。如果396-9-6V株和FSC27株的LEU2为单拷贝，则以EcoR I和EcoR V进行了消化的情况下，应该出现1～2条信号，不会出现3条以上的信号。因此，推断396-9-6V株和FSC27株的LEU2存在2个以上的拷贝。本策略的前提是，FSC27株的LEU2与实验室酵母的LEU2具有同源性，而且存在2个以上的拷贝。由该结果确认了实施的可能性，因此进行了后续的实验。
b.采用PCR的含URA全长的LEU2破坏用DNA片段的扩增
使用双融合PCR法，构建含URA3全长的LEU2破坏用DNA片段。将最终的PCR产物以限制性酶(Pst I、Sma I和两者的混合物)进行消化后，得到与目标一致的剪切图案，确认了含URA3全长的LEU2破坏用DNA片段的扩增。
c.FSC27株的性状转化及所获得的转化体的筛选
使用0、10、50、100μg的b中构建的DNA片段，通过乙酸锂法进行FSC27株的性状转化。2次的实验中，获得共计147株的尿嘧啶需要性得到复原的转化体(称作FSCU-L株)。性状转化的频度总结于表1。
[表1]
  导入DNA量   获得的转化体数(菌落)
  (μg)   第1次   第2次   合计
  0   0   0   0
  10   1   5   6
  50   10   41   51
  100   21   69   90
将得到的147株中任意选择的25株在SD培养基中进行培养后，发现所有的株都具有凝集性。凝集性的强弱与亲株FSC27株同等，为非常强的凝集性(级别5)。
d.转化体的确认
对于确认了凝集性的25株FSCU-L株中的3株，进行了以LEU2 ORF为探针的Southern分析。Southern分析的结果示于图4。与FSC27株和396-9-6V株中发现的信号相同大小的信号强度变弱，检测到移动至与之不同大小的信号。这表明多个存在的LEU2中的1个导入了目标基因。此外，以URA3ORF为探针进行了Southern分析，结果FSCU-L株中检测出未在FSC27株中发现的信号。即，表明外源的URA3被导入了。以pBR322为探针进行了Southern分析，结果在FSCU-L株中未与FSC27株和396-9-6株同样地检测出信号。即，表明这些株是未导入来自于大肠杆菌的DNA的自身克隆类株。由以上的结果可知，FSCU-L株中发生了与目标一致的基因的整合，而且该整合为自身克隆类。
e.转化体的凝集性保持的确认
将确认了凝集性的25株FSCU-L株中任意选择的3株在SD培养基和YPD培养基中进行培养，重复继代20次，考察了继代前后的酵母的凝集性。结果示于表2。
[表2]
  株                     凝集性
  SD培养基   YPD培养基
  继代前   继代后   继代前   继代后
  FSC27   5   5   5   5
  FSCU-L1   5   5   5   5
  FSCU-L2   5   5   5   5
  FSCU-L3   5   5   5   5
在任一种培养基中进行培养的情况下，20次的继代后，酵母的凝集性也都依然保持。
(试验例1：FSCU-L株的发酵性能评价试验)
试验糖浓度24％的YPD培养基，对确认了凝集性的25株FSCU-L株进行试管发酵试验，选择生成酒精浓度高的10株。另外，使用糖浓度24％的糖蜜培养基，对这10株进行试管发酵试验，测定了生成酒精浓度。各培养基中，最终选择总体上生成酒精浓度高的3株(FSCU-L18、20和21株)。
对于这3株，进行使用糖蜜培养基的烧瓶发酵试验，评价了具体的发酵性能。二氧化碳产生量的经时变化示于图5，发酵粗制酒的分析结果示于表3，试馏酒中的杂质的分析结果示于表4。
[表3]
  菌   酒精浓度(体积％)   残糖(wt％)   酵母数(×108/mL)   酸度   pH   发酵比率(％)
  FSCU-L18   12.33   2.41   1.27   9.23   5.07   82.62
  FSCU-L20   12.21   2.41   1.37   9.37   5.09   81.81
  FSCU-L21   12.23   2.42   1.14   9.15   5.09   81.96
  FSC27   12.13   2.47   0.79   10.54   4.99   81.29
  396-9-6V   12.08   2.79   1.46   9.23   5.05   80.93
[表4]
  杂质   FSCU-L18   FSCU-L20   FSCU-L21   FSC27   396-9-6V
  甲醇   7.7   7.3   8.1   7.8   7.2
  乙醛   53.8   29.0   20.7   41.5   32.5
  丙酮   1.5   1.3   1.7   1.2   1.7
  异丙醇   -   -   -   -   -
  乙酸甲酯   -   -   -   -   -
  正丙醇   54.9   57.9   54.9   54.1   35.0
  丁二酮   13.4   12.2   12.7   11.9   10.9
  乙酸   481.5   450.1   511.7   485.9   417.3
  乙酸乙酯   10.2   12.8   13.1   10.5   6.2
  异丁醇   37.2   38.7   37.0   67.0   41.5
  正丁醇   1.4   1.6   1.8   1.3   1.3
  3-羟基-2-丁酮   31.2   33.0   23.7   35.2   20.8
  异戊醇   126.1   170.3   161.8   147.7   174.2
  2，3-丁二醇   210.6   221.9   233.9   201.9   118.8
  总杂质量   1029.5   1035.2   1081.1   1066.0   867.4
  乙醇   12.33   12.21   12.23   12.13   12.08
单位：ppm(仅乙醇为体积％)，-：检测极限以下
由图5可知，3株FSCU-L株的发酵速度与396-9-6V株大致同等，尿嘧啶需要性引起的FSC27株的发酵速度的低下在作为FSC27株的改良株的FSCU-L株中得到了改善。此外，由表3可知，酵母数在FSCU-L株中也得到了改善。对于生成乙醇浓度，FSCU-L株比FSC27株和396-9-6V株都高，FSCU-L18株最高。对于糖蜜中的凝集性，3株FSCU-L株都显示出强凝集性。另外，由表4可知，试馏液中的杂质在所有的株中为大致相同的组成。由以上结果可知，FSCU-L株的发酵性能稍高于396-9-6V株。
(试验例2：FSCU-L株的针对实用化的研究)
为了研究FSCU-L18株的实用化，进行了采用发酵罐的反复分批发酵试验(作为对照使用FSC27株)。二氧化碳产生量示于图6和图7，发酵粗制酒的分析结果示于表5，发酵所需时间示于图8。
[表5]
  循环数           1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   平均
  24h   48h
FSCU-L18   TSpHAV   18.315.213.93   18.095.223.84   20.265.194.39   21.945.184.72   21.735.184.63   21.695.174.88   22.035.154.96   21.885.174.79   21.895.174.79   22.625.135.57   21.045.184.65
  ALC(GC)ALC(试)RTSTYLCRpHAVSRFR(GC)FR(试)   6.971.77   9.829.352.061.37100.005.017.1188.6184.3680.32   9.539.202.202.03100.005.057.1085.2281.6278.79   10.8310.102.102.45100.005.047.2787.3984.8379.12   11.6711.102.363.42100.005.107.4486.8783.8979.79   11.3911.052.243.68100.005.117.6587.4681.2578.82   11.4310.952.193.4798.905.107.6487.7081.8178.37   11.5311.052.163.8898.305.108.0988.0481.5378.14   11.1210.852.053.9798.305.108.3988.5778.8276.91   11.2910.902.124.3498.805.108.1088.1780.1177.34   11.7811.202.424.3498.305.099.4986.9381.4077.40   11.0410.582.193.3099.265.087.8387.4981.9678.50
FSC27   TSpHAV   18.315.213.93   18.095.223.84   20.265.194.39   21.945.184.72   21.735.184.63   21.695.174.88   22.035.154.96   21.885.174.79   21.895.174.79   22.625.135.57   21.045.184.65
  ALC(GC)ALC(试)RTSTYLGRpHAVSRFR(GC)FR(试)   5.371.65   8.878.403.351.52100.004.957.7981.4776.2072.16   8.798.453.231.92100.005.017.5278.6775.2872.37   10.319.702.642.53100.005.008.1184.3480.7675.98   11.4710.902.543.02100.005.078.2985.9582.4578.36   11.5811.052.303.58100.005.097.9687.1582.8078.82   11.4711.002.233.9697.705.078.1287.4881.0078.73   11.2911.052.184.3097.605.088.7587.9479.8478.14   11.2610.802.114.5597.605.068.6488.2479.8176.55   11.4910.902.174.4197.205.058.6987.9081.5377.34   11.6111.102.464.6097.305.0410.0486.7280.2376.71   10.8110.342.523.4498.745.048.3985.5980.0376.52
TS：供给糖浓度(％)，ALC(GC)：基于GC分析的乙醇浓度(体积％)，ALC(试)：试馏液的基于酒精计分析的乙醇浓度(体积％)
RTS：残糖(％)，TY：总酵母数(×10E+8/mL)，LCR：活菌率(％)，AV：酸度，SR：糖消费率(％)
FR(GC)：由GC分析值算出的发酵比率(％)，FR(试)：由酒精计分析值算出的发酵比率(％)
FSCU-L18株的生成乙醇浓度、发酵比率和发酵速度比亲株FSC27株高，确认了尿嘧啶需要性得到复原的效果。FSCU-L18株的酵母数和活菌率高，而且凝集性也强(凝集块的大小：直径0.5～2mm；凝集块的状态：结块紧密，形成粒)。
产业上利用的可能性
本发明可以提供具有良好的酒精生成能力和发酵速度的非尿嘧啶需要性的凝集性酒精酵母。
                                    序列表
<110>札幌啤酒株式会社(sapproro Breweries Limited)
<120>凝集性酒精发酵酵母的生产方法及凝集性酒精发酵酵母
<130>FP05-0267-00
<150>JP2004-296,638
<151>2004-10-08
<160>12
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>URA3 P1
<400>1
atgtcgaaag ctacatataa gga                                            23
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>URA3 P2
<400>2
ttagttttgc tggccgcatc                                                20
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>L2ORF P1
<400>3
atgtctgccc ctaagaagat cgt                                            23
<210>4
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>L2ORF P2
<400>4
aagcaaggat tttcttaact tct                                            23
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>LEU2N P1
<220>
<221>misc_feature
<222>(20)..(20)
<223>n代表任何碱基
<400>5
cgcctgacgg atataccttn                                                20
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>LEU2N P2
<220>
<221>misc_feature
<222>(20)..(20)
<223>n代表任何碱基
<400>6
gcctacccta tgaacatatn                                                20
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>P1
<400>7
tttcaactga aaaattggga                                                20
<210>8
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>P3
<400>8
atgaattgaa ttgaaaagct cataggggca gacattagaa                          40
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>P5
<400>9
agcttttcaa ttcaattcat                                                20
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>P6
<400>10
agctttttct ttccaatttt                                                20
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>P2
<400>11
tttcaactga aaaattggga                                                20
<210>12
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>P4
<400>12
aaaattggaa agaaaaagct tttgtacgaa ccatgccacg                          40

Claims (3)

1.非尿嘧啶需要性的凝集性酒精发酵酵母的生产方法，其特征在于，具备仅在存在于酿酒酵母FSC27株(保藏编号FERM P-16023)的染色体上的2个LEU2基因位点中的1个导入来自于酿酒酵母的URA3基因的工序。
2.非尿嘧啶需要性的凝集性酒精发酵酵母，其特征在于，仅在存在于酿酒酵母FSC27株(保藏编号FERM P-16023)的染色体上的2个LEU2基因位点中的1个导入了来自于酿酒酵母的URA3基因。
3.如权利要求2所述的凝集性酒精发酵酵母，其特征在于，前述凝集性酒精发酵酵母是酿酒酵母FSCU-L18株(保藏编号FERM P-20055)。
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