CN1201008C - 具有间断的atf2基因的酵母菌株及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种修饰过的酵母菌株，其中，通过改变编码乙酰-辅酶A孕烯醇酮乙酰转移酶活性(APAT)的基因，消除了所述活性，并导致了3β-羟基类固醇的稳定化。

Description

具有间断的ATF2基因的酵母菌株及其用途
在哺乳动物中，在所有类型的类固醇激素的生物合成中，由3β-羟基-Δ5前体生成3-氧-Δ4类固醇的过程是由被命名为3β-HSD的酶系统3β-羟基-Δ5类固醇脱氢酶(EC1.1.1.145)和Δ5-Δ4类固醇异构酶(EC5.3.3.1)催化的。例如，3β-HSD可以催化孕烯醇酮转化成孕酮，催化17α-羟基孕烯醇酮转化成17α-羟基孕酮，催化脱氢表雄酮转化成Δ4-雄烯二酮或催化5-雄烯-3β-17β-二醇转化成睾酮(Simarc等，1996)。
因此，3β-HSD是由哺乳动物肾上腺皮质中的胆甾醇开始，生物合成皮质醇的途径中的一种关键酶(图1)。
重组微生物，特别是修饰过的酵母的使用，可以对上述生物合成途径的一种或几种哺乳动物的酶进行异源表达，以便产生皮质醇或所述生物合成的中间产物，例如，以上内容披露在欧洲专利申请EP340878，US5,137,822中，Dumas等，1994，和Cauet等，1994。
当功能性3β-HSD是在酵母中表达时，转化过的酵母细胞不能将3β-羟基类固醇完全转化成相应的3-氧类固醇，例如，由孕烯醇酮转化成孕酮，而是积累一种化合物，这种化合物也存在于未转化过的酵母细胞中。在本申请中披露了以所述起始类固醇的3β-乙酸酯的形式积累的化合物的鉴定，和具有决定该酯化作用的乙酰转移酶活性的酶的鉴定(以下将“乙酰-辅酶A孕烯醇酮乙酰转移酶”称为APAT)。另外，在欧洲专利申请EP727489中披露了产孕烯醇酮的转化酵母细胞能积累乙酸孕烯醇酮。根据以上观察可以认为，由酵母所产生的3β-羟基类固醇是不希望的，因为它所决定的二级反应和副产物可导致积累的3β-羟基类固醇，例如孕烯醇酮的产量的降低，或降低由3β-羟基-Δ5-类固醇转化成3-氧-Δ4-类固醇的生物转化的产率，特别是在孕酮或17α-羟基-孕烯醇酮的生产过程中，导致在随后的通过上述生物合成途径生产皮质醇的减弱。
根据上面所提到的所获得的结果，本发明披露了酵母菌株的构建，该菌株通过改变编码有关活性的基因而丧失了不希望的APAT活性，导致了在有该基因存在的条件下3β-羟基类固醇的稳定化。因此，所述菌株可被用作构建重组菌株的出发菌株，所述重组菌株能够以较高的产率将3β-羟基类固醇转化成其它产物。
本发明还披露了酵母菌株的构建，该菌株通过改变编码APAT活性的基因而丧失了APAT活性，并能表达由胆甾醇生物合成皮质醇的途径的3β-HSD或细胞色素P45017α，或同时表达3β-HSD和细胞色素P45017α。表达诸如3β-HSD的菌株可以提高3β-羟基-Δ5-类固醇转化成3-氧-Δ4-类固醇的生物转化的产率，因此，可被用于提高在酵母中生产皮质醇或其中间产物产率的方法。
因此，本发明的一个主题是一种修饰的酵母菌株，其中，通过改变编码乙酰-辅酶A孕烯醇酮乙酰转移酶(APAT)活性的基因，消除了APAT活性，并导致了3β-羟基类固醇的稳定化。
改变编码APAT活性的基因，可以通过诸如在所述基因的功能因子，如启动子或编码具有APAT活性的蛋白的序列中插入、缺失或取代一个DNA序列而实现，然后可以通过同源重组的方法，将以上述方式改变的DNA序列整合到酵母宿主菌株中，并导致相当于本发明的修饰菌株的酵母染色体突变型的产生，其中，按照在以下的实验部分所披露的操作条件，通过在有孕烯醇酮的条件下进行细胞培养和通过测定孕烯醇酮含量随时间的变化，证实了APAT活性的消失，以及3β-羟基类固醇的稳定化。
以下菌株可以作为用于本发明的宿主酵母菌株：诸如酿酒酵母(S.cerevisiae)的酵母属菌株，诸如麦芽糖念珠菌(C.maltosa)的念珠菌属菌株，诸如乳克鲁维菌(K.lactis)的克鲁维属菌株，或诸如巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)的毕赤酵母属菌株。
本发明的一种具体主题是按上述方法修饰过的酵母菌株，其中，改变过的基因是酿酒酵母的ATF2基因，或该基因的同系物。
我们所说的ATF2基因是指在酵母基因组的基因座ATF2或YGR177c上鉴定的酿酒酵母的基因，“酵母属基因组数据库”(SGD)；(Cherry等，http：//genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/)，其中，被命名为YGR177c的开放读框(ORF)被翻译成Mips数据库中的氨基酸序列，该序列以保藏号S64491保藏(Hebling U.，Hofmann B.和DeliusH.(1996年5月))，该序列显示在图4中。该基因编码一种具有APAT活性的蛋白，正如在下面的实验部分所证实的。
至于作为ATF2基因同系物的基因，我们是指编码一种具有APAT活性并与蛋白YGR177c的序列有大约60％或更高序列相同性的基因。
本发明的一种更具体的主题是一种如上文所述的修饰过的酵母菌株，其中，所述改变了的基因是酿酒酵母的ATF2基因，以下被命名为atf2突变型菌株。
本发明的一个十分具体的主题是一种如上文所述的修饰过的酵母菌株，其中，所述ATF2基因是通过将一个具有至少一个核苷酸的DNA序列插入而改变过的。
例如，被插入ATF2基因的以便丧失所有APAT活性的DNA序列，可以是提供所述宿主菌株的营养需要的营养缺陷型选择基因，如基因URA3，基因LEU2，基因TRP1，基因HIS3或基因ADE2，例如，一个显性选择基因，如抗诸如G418、腐草霉素或潮霉素B的抗生素的基因，或诸如βGAL基因的报导基因。
插入ATF2基因中的DNA序列还可以是酵母表达嵌合体(block)，该嵌合体由一个启动子和一个转录终止子组成，例如，一个诸如PGK、TDH3、CYC1或TEF1的酵母启动子，例如，诸如CYC1、TDH3、TEF1或PGK的酵母终止子。所述表达嵌合体可以是上文提到的元件的组合，例如，嵌合的TEF1启动子/PGK终止子。
本发明的一个更具体的主题是一种如上文所述的修饰过的酵母菌株，其中，通过插入URA3选择基因或表达嵌合体TEF1启动子/PGK终止子改变了ATF2基因。
本发明的一个具体主题是一种如上文所述的修饰过的酵母菌株，其中，所述ATF2基因是通过插入URA3选择基因改变过的。
本发明的atf2突变菌株缺少APAT活性，而且业已将URA3基因插入其中，以下称之为atf2-Δ::URA3，因此可以利用尿嘧啶通过原养型进行选择。
本发明的一个具体的主题是被命名为TGY156和TGY158的修饰过的酿酒酵母菌株，以上菌株的详细结构在以下的实验部分给出。
本发明的一个具体主题是一种如上文所述的修饰过的酵母菌株，其中，所述ATF2基因是通过插入表达嵌合体TEF1启动子/PGK终止子而改变过的。本发明的atf2突变菌株缺少APAT活性，而且业已将表达嵌合体TEF1启动子/PGK终止子插入其中，以下称之为atf2-Δ::TEF1启动子/PGK终止子，可以通过其对5-氟-乳清酸(5-FO)的抗性，筛选由于被一个表达嵌合体取代而造成的功能性URA3基因的缺乏。
本发明的一个具体主题是，被命名为TGY186的酿酒酵母的修饰过的菌株，该菌株的详细结构在以下的实验部分中给出。
本发明的一个主题是一种转化过的酵母菌株，其中，通过改变编码乙酰-辅酶A孕烯醇酮乙酰转移酶(APAT)活性的基因，消除了该活性，并表达由胆甾醇开始的皮质醇生物合成途径的至少一种哺乳动物酶，所述酶选自：
-胆甾醇侧链裂解酶(P450SCC)，
-3β-羟基-Δ5-类固醇脱氢酶/Δ5-Δ4-类固醇异构酶(3β-HSD)和
-17α-类固醇羟化酶(P45017α)。
例如，本发明的转化过的酵母菌株可以通过已知方法转化本发明的atf2突变菌株而得到，例如，通过用表达载体P450SCC以及ADX和ADR进行转化，通过表达载体3β-HSD或通过表达载体P45017α进行转化。如果必要，atf2也可以是共转化的，例如，通过表达载体3β-HSD和通过表达载体P45017α共转化或通过共表达载体3β-HSD和P45017α进行转化，并用于诸如将孕烯醇酮转化成17α-羟基孕酮的生物转化过程中。
例如，为了在酵母菌株中表达源于牛或人的P450SCC以及ADX和ADR，3β-HSD或P45017α而构建的载体披露于以下专利文献中：Dumas等，1994，欧洲专利申请EP340878或US5,137,822。
本发明的一个具体主题是一种如上文所述的转化过的酵母菌株，其中，所述改变过的基因是酿酒酵母的ATF2基因或该基因的同系物。本发明的一个更具体的主题是一种如上文所述的转化过的酵母菌株，所述改变过的基因是酿酒酵母的ATF2基因，并相当于转化过的atf2菌株。
本发明的一个具体的主题是上文所述的转化过的酵母菌株，其中，所述ATF2基因是通过插入一个具有至少一个核苷酸的DNA序列而改变过的，特别是一种转化过的酵母菌株，其中，所述ATF2基因是通过插入URA3选择基因而改变的，并相当于修饰过的atf2-Δ::URA3菌株。
改变所述基因以便丧失所有APAT活性，所述ATF2基因或该基因的同系物以及宿主菌株具有上文所述的含义。
本发明的一个具体主题是一种如上文所述的表达3β-HSD的转化过的酵母菌株atf2-Δ::URA3，特别是被命名为TGY158/pTG10862的转化过的酿酒酵母菌株，其具体构建在以下的实验部分披露。
本发明的一个具体的主题是一种如上文所述的转化过的酵母菌株，其中，所述ATF2基因是通过插入表达嵌合体TEF1启动子/PGK终止子而改变的，并相当于转化过的菌株atf2-Δ::TEF1启动子/PGK终止子。
本发明的一个具体主题是一种如上文所述的表达P45017α的转化过的菌株atf2-Δ::TEF1启动子/PGK终止子，特别是被命名为TGY186/pTG10435的转化过的酿酒酵母菌株。
本发明的一个具体主题是一种如上文所述共表达3β-HSD和P45017α的修饰过的酵母菌株atf2-Δ::TEF1启动子/PGK终止子，特别是被命名为T6Y186/pTG10417的转化过的酿酒酵母菌株。
本发明的一个主题是一种在活体内氧化选自内源固醇、外源固醇或外源类固醇的底物的方法，其中，使用了上文所述的转化过的酵母菌株，当该菌株产生所述内源固醇时，单独培养该菌株，或者与固醇或外源类固醇一起培养，如果需要的话，提取所获得的氧化的化合物。
我们所说的内源固醇是指积累于酵母菌株中的固醇，而且当所述酵母在通过诸如表达载体P450SCC、ADX和ADR转化之后在缺乏内源固醇的条件下进行培养时，是侧链裂解酶(P450SCC)的底物。例如，用于实施本发明方法的内源固醇可以是麦角-5-烯-3-醇，麦角-5，24(28)-二烯-3-醇或麦角-5，22-二烯-3-醇。欧洲专利申请EP727489披露了以上固醇在酵母菌株中的积累，以及在利用表达载体P450SCC、ADX和ADR转化之后在所述菌株的培养物中对其侧链的裂解。这样的酵母菌株其中也存在着APAT活性，可以事先进行修饰，以便获得本发明的atf2突变菌株，然后通过表达载体P450SCC、ADX和ADR进行转化，以获得按本发明方法转化过的atf2突变菌株。
我们所说的外源固醇是指P450SCC裂解酶的底物，例如，胆固醇或谷固醇，所述裂解是通过培养用表达载体P450SCC、ADX和ADR转化过的酵母菌株进行的。例如，所述菌株可以是用表达载体P450SCC、ADX和ADR转化过的atf2突变菌株。
通过裂解被用作底物的内源或外源固醇的侧链所获得的3β-羟基类固醇，完全是游离形式的，即在能表达P450SCC、ADX和ADR的转化过的atf2菌株的培养物中没有伴随的相应3β-乙酸酯。
我们所说的类固醇是指在培养一种用表达载体3β-HSD转化过的酵母菌株时作为3β-HSD酶的底物的类固醇，如孕烯醇酮、17α-羟基孕烯醇酮或脱氢表雄酮，或在培养用诸如表达载体P45017α转化过的酵母菌株时作为P45017α酶的底物的类固醇，如孕酮或孕烯醇酮。例如，所述菌株可以是按照本发明方法用表达载体3β-HSD或表达载体P45017α转化过的atf2突变菌株。
本发明的一个具体主题是如上文所述的体内氧化方法，其中，所述底物是3β-羟基类固醇，其中，使用能表达3β-HSD的转化过的酵母菌株atf2-Δ::URA3，如果必要的话，提取所获得的3-氧-Δ4-类固醇，特别是这样一种方法，其中所述3β-羟基类固醇选自孕烯醇酮或17α-羟基孕烯醇酮。
被用作底物的3β-羟基类固醇在与本发明的用表达载体3β-HSD转化过的atf2-Δ::URA3菌株一起培养时是稳定的。因此，本发明提供了一种在酵母中生产3-氧-Δ4-类固醇的改进方法，因为所有的3β-羟基底物都能被氧化成3-氧-Δ4-类固醇，正如在以下的实验部分所证实的。
本发明的一个具体主题是，如上文所述的体内氧化方法，其中，所述底物是一种类固醇，其中，使用了能表达P45017α的转化酵母菌株atf2-Δ::TEF1启动子/PGK终止子，而且如果必要的话，提取所获得的17α-羟基类固醇，特别是这样一种方法，其中，所述类固醇底物是孕烯醇酮或孕酮。
被用作底物的孕烯醇酮在与用表达载体P45017α转化过的菌株atf2-Δ::TEF1启动子/PGK终止子一起培养时是稳定的。因此，本发明还提供了一种由3β-羟基类固醇生产17α-羟基类固醇的改进方法，因为所有的3β-羟基底物均可以被17α-羟基化。
本发明的一个具体主题是上述体内氧化方法，其中，所述底物是3β-羟基类固醇，其中，使用能共表达3β-HSD和P45017α的转化过的酵母菌株atf2-Δ::TEF1启动子/PGK终止子，如果必要的话，提取所获得的17α-羟基3-氧-Δ4-类固醇。本发明的一个具体主题是上述方法，其中，所述类固醇底物是孕烯醇酮。
本发明的转化过的atf2突变酵母菌株以及所述方法表明，它们在利用酵母进行皮质醇或其中间产物的生产中具有优势。
构建本发明菌株和利用本发明方法的例子披露于以下的实验部分。
一般材料和方法
1. 菌株和培养基
用于实施本发明的酿酒酵母菌株是由Achstetter等(1992)披露的c13ABYS86的同基因衍生物Leu+菌株TGY73.4(MATα，URA3-Δ5，pral-1，prbl-1，prcl-1，cpsl-3，his)，和由Thierry等(1990)披露的菌株Fy1679(MATα，URA3-52，trp1-Δ63，leu2-Δ1，his3-Δ200，fen1，GAL)。在28℃下按照由F.Sherman(1991)披露的条件，让所述菌株生长在含有2％葡萄糖的完全培养基(DifcoLaboratories)中。
为了转化酿酒酵母，通过乙酸锂方法(Ito等，1983)使所述细胞变成感受态。按常规方法在含有2％葡萄糖的合成基本培养基SD(S.Sherman，1991)上培养所述酵母，所述培养基中添加了浓度为10μg/ml的所需养分。
将大肠杆菌菌株BJ5183(D.Hanahan，1983)用于体内重组，并将大肠杆菌C600，hsdR(Hubacek等，1970)用作经典连接反应的受体菌株。
2. DNA操作和在大肠杆菌中进行体内重组
所使用的一般分子生物学方法由Sambrook等披露(1989)。用于在体内进行重组的方法由E.Degryse(1995)和E.Degryse(1996)披露。
3. 测定APAT酶活性
通过测定由[3H]乙酰辅酶A(New England Nuclear)掺入孕烯醇酮中的[3H]乙酸确定APAT乙酰转移酶活性。反应培养基(500μl)含有[3H]乙酰辅酶A(20μM，25Ci/mol)和孕烯醇酮(Sigma)(30μM)。将孕烯醇酮加入用pH7.0磷酸钾缓冲液(20mM)配制的2μl泰洛沙泊(Sigma)/乙醇混合物(1∶1)溶液中。在30℃下温育15分钟，然后通过添加2ml二氯甲烷终止反应。
用二氯甲烷萃取所述类固醇，然后通过反相高效液相层析(以下称之为RP-HPLC)进行分离，以上分离是在45℃下，在HP1090色谱仪(Hewlett-Packard)上，在Ultrasphere ODS柱(Beckman)中，在等度洗脱条件下用乙腈进行的，所述色谱仪与FLO-One500放射性检测仪(Packard)连接，该检测仪可以测定所形成的孕烯醇酮[3H]乙酸的量。
一个APAT单位被定义为在上述条件下，在30℃下每分钟产生1nmol乙酸孕烯醇酮的酶量。
4. 测定蛋白浓度
用牛血清白蛋白作为标准物，利用“蛋白测定试剂盒”(Bio-Rad)测定蛋白浓度。
本发明的某些方面是通过本文所附的附图说明的。
图1表示在哺乳动物体内由胆甾醇生物合成皮质醇的途径。
图2A和2B表示在酿酒酵母中进行的由孕烯醇酮到孕烯醇酮乙酸酯的生物转化。在205nm波长下进行RP-HPLC分析：
图2A表示孕烯醇酮乙酸酯生成的动力学，和以12小时温育为间隔的孕烯醇酮的消失。
图2B表示当t＝0和t＝10小时时，类固醇的曲线与孕烯醇酮和孕烯醇酮乙酸酯标准物的曲线的比较。
图3表示通过在MonoP HR5/20上层析进行的APAT纯化。
(A)表示存在于组分10-20中的APAT活性的曲线。
(B)表示合并浓缩的组分14、15和16的SDS-PAGE分析，在有分子量标记(第1道)存在的条件下，用考马斯兰染色(第2道)进行。箭头表示表观分子量为62kDa的带。
图4表示YGR177c的单字母代码的氨基酸序列。在基于纯化的APAT蛋白的并用胰蛋白酶消化过的肽序列下面画线。
图5表示破坏ATF2基因的方案，该方案是通过双融合PCR技术通过与URA3基因结合而实现的。空心线条和实心线条分别表示ATF2序列和URA3序列。
图6表示在酿酒酵母中破坏ATF2基因对孕烯醇酮乙酰化的影响。孕烯醇酮乙酸酯的存在是通过在205nm波长下进行RP-HPLC检测的，检测是基于亲代菌株TGY73.4(A)或突变菌株TGY158(B)的16小时培养物进行的。
图7A、7B和7C表示在酵母中构建人3β-HSD表达质粒pTG10832和pTG10862的方案。图7A说明了含有编码人3β-HSD序列的MscI-MluI片段的制备。图7B说明了含有CYClp/3β-HSD/PGKt表达嵌合体的NotI片段的制备。图7C说明了pTG10832质粒和pTG10862质粒的制备。
图8表示质粒pTG10832的限制图。
图9表示质粒pTG10862的限制图。
图10表示构建表达质粒pTG10435的示意图。
图11表示构建表达质粒pTG10058的示意图。
图12表示质粒pTG10058的限制图。
图13表示质粒pTG10293的限制图。
图14表示质粒pTG10435的限制图。
图15A和15B表示构建质粒pTG10274的方案。
图15A表示质粒pTG10214的制备。
图15B表示质粒pTG10274的制备。
图16表示质粒pTG10274的限制图。
图17表示质粒pTG10401的限制图。
图18表示构建表达载体pTG10262的方案。
图19表示质粒pTG10262的限制图。
图20表示质粒pTG10403的限制图。
图21表示质粒pTG10417的限制图。
(限制酶的简称：S，SalI；N，NotI；BII，BglII；M，MluI；C，ClaI；N°，丧失的NcoI位点；XbaI°，丧失的XbaI位点；E，EcoRI)。
例1：鉴定酵母的APAT活性
A-由酵母进行的孕烯醇酮的体内乙酰化。
在28℃下，在10ml YPD培养基(Difco)中培养TGY73.4菌株，所述菌株用24小时的预培养物以A600＝0.1的密度接种，向所述预培养物中添加了100μl孕烯醇酮溶液，孕烯醇酮以10mg/ml的浓度溶解在tergitol(Sigma)/乙醇混合物(1∶1)中。用250μl的培养液等分试样鉴定所生成的类固醇，所述试样是以10小时为间隔取样的。用2ml二氯甲烷萃取，然后在氮气下蒸发有机相，再将所获得的残余物重新溶解在乙腈中。在Ultrasphere ODS柱(Beckman)上通过RP-HPLC对类固醇进行分析，连续使用以下洗脱剂：溶于水中的60％的乙腈10分钟，然后用溶于水中的60到80％变化的乙腈5分钟，然后用80％的乙腈5分钟，流速为1ml/分钟，在45℃下进行，并在205nm下检测。
所获得的层析谱(图2B)表明，孕烯醇酮被代谢成一种极性更弱的产物，该产物所具有的TR与孕烯醇酮乙酸酯标准物的TR相同。图2A表明所述孕烯醇酮被酵母迅速转化成其代谢物。
在用碱(6％KOH，溶于甲醇中)处理之后，所观察到的代谢产物释放出一种其TR与孕烯醇酮的TR相同的产物。然后通过质谱法鉴定所述代谢产物是孕烯醇酮乙酸酯。
B-纯化具有APAT活性的酶。
在30℃下，在装有Kappeli培养基(Fiechter等，1981)的10ml发酵罐中培养TGY73.4菌株至A600＝30，所述培养基含有160g/l的葡萄糖。通过离心分离所述细胞，用水洗涤，然后重新悬浮在含有1mM PMSF的温度为4℃pH8.0的4ml Tris-HCl缓冲液20mM(缓冲液A)中。在Manton Gaulin匀浆器中以1000psi的压力破碎所述细胞。在40℃下以12,000xg的速度离心所获得的细胞裂解物15分钟，然后以40mM的终浓度将ZnCl2加入上清液中。用1N HCl将pH调至5.5，并在4℃下进行沉淀30分钟。在4℃下以10,000xg的速度离心10分钟，分离沉淀物并重新悬浮在含有100mM EDTA和1mM PSFM的3ml缓冲液A中。通过在Y10S10柱体(Amicon)上用30ml缓冲液A进行渗滤除去EDTA，然后在4℃下将保留物以35ml/分钟的流量加样到预先用缓冲液A平衡过的1.5升DEAE-Sephacel(Pharmacia)柱中。用缓冲液A洗涤所述柱，再用含有0.15M NaCl的缓冲液A洗涤，然后用含有0.4M NaCl的缓冲液A洗脱APAT活性。合并通过在“一般材料和方法”部分所述的方法测定其含有APAT活性的DEAE-Sephacel的组分，加入NaCl至终浓度为2M，然后在4℃下以15ml/分钟的速度将其加样到预先用含有2MNaCl的缓冲液A平衡过的500ml苯基-琼脂糖凝胶柱中(Pharmacia)在用含有0.5M的NaCl洗涤所述柱之后，APAT活性被1.5升的线性梯度的胆酸钠洗脱，所述胆酸钠以0-1％的浓度溶解在缓冲液A中。合并含有APAT活性的组分，然后通过在YM10膜(Amicon)上超滤进行浓缩，然后在-80℃下保存待用。
将整个过程重复一次，以便制备足够数量的材料进行纯化。
将以上两次制备的纯化材料解冻，然后在4℃下以4ml/分钟的流量加样到预先用缓冲液A平衡过的Q-琼脂糖凝胶速流柱(Pharmacia)用相同的缓冲液洗涤该柱之后，用500ml的线性梯度的NaCl洗脱APAT活性，所述线性梯度的NaCl以0-1M的浓度溶解在相同的缓中液中。合并含有APAT活性的Q-琼脂糖凝胶组分，然后在4℃下以2.5ml/分钟的流量直接加样到固定在琼脂糖凝胶珠(Pharmacia)上的7ml胆酸钠柱中，所述琼脂糖凝胶珠预先用含有0.5M NaCl的缓冲液A平衡过，在用相同的缓冲液洗涤该柱之后，APAT被100ml的线性梯度胆酸钠洗脱，所述线性梯度胆酸钠以0-1％的浓度溶解在相同的缓冲液中。合并含有APAT活性的组分，通过在YM10膜(Amicon)上超滤浓缩至蛋白浓度为1.8mg/ml，然后在-80℃下保存。
然后根据其比活性将APAT活性纯化大约500倍，产率为大约16％，如下面的表1所示：
                                 表1
    步骤     APAT活性(单位)   蛋白(mg) 比活性(单位/mg) 纯化 产率
上清液12,000g用锌沉淀DEAE-Sephacel苯基-琼脂糖凝胶Q-琼脂糖凝胶胆酸-琼脂糖凝胶  8.05710.4536.3993.3161.7121.300  42.24228.0405.0090.4890.390.13  0.190.371.286.7843.9100  11.96.735.7231526  10012979412116
然后将上面所获得的半纯化材料的一半(大约6mg蛋白)解冻，并加入PEG4000(Prolabo)至终浓度为20％(w/v)，消除胆酸钠和氯化钠。在4℃下搅拌30分钟，然后通过在4℃下以12,000xg的速度离心30分钟收集沉淀，再将沉淀重新溶解在4ml缓冲液A中。然后将所获得的溶液以1ml/分钟的流量加样到预先用pH6.3的缓冲液bis-Tris25mM平衡过的MonoP HR5/20柱(Pharmacia)中。用pH4.0的缓冲液Polybuffer 74(Pharmacia)洗脱APAT活性。收集1ml的组分，其中均含有50μl pH8.0的缓冲液Tris-HCl 2M，以便在酸性pH下限制所述酶的失活。合并按上述方法测定的含有最大APAT活性的组分14、15和16(图3(A))，通过在YM10膜上超滤进行浓缩，然后在-80℃下保存待用。由此获得的活性组分在10％的聚丙烯酰胺凝胶上进行SDS-PAGE。通过考马斯兰染色发现了若干条带，其主要带的表观分子量为62kDa(图3(B))，与通过Superose 6凝胶(Pharmacia)过滤所测定的分子量相同，并相应于APAT活性。
C-APAT特性。
a) 底物专一性
按照上述用于乙酰-辅酶A和孕烯醇酮的方法，使用不同的乙酰供体或不同的类固醇底物，所述半纯化的APAT能以相当的效率转移位于3β-醇、Δ4或Δ5-类固醇上的乙酸酯，而在雌激素上很微弱，并且在固醇上是不可检测的，而且优选将乙酰-辅酶A作为乙酰供体。
下面的表2显示了所获得的结果，其中，a)用每一种测试的类固醇30μM和100μM[3H]乙酰-辅酶A进行测试，b)用每一种乙酰供体100μM和30μM[3H]孕烯醇酮进行试验：
                          表2
底物a)相对活性(％) 底物b)相对活性(％)
 孕烯醇酮                 10017α-OH孕烯醇酮          89DHEA                     1044-孕烯-3β醇-20-酮       705β-孕烯-3β醇-20-酮     1.817β-雌二醇              5雌酮                     2.5胆甾醇                   0.6麦角甾醇                 0.4 乙酰辅酶A    100丙酰辅酶A    33丁酰辅酶A    16己酰辅酶A    18油酰辅酶A    未测定
b) 抑制
所述APAT活性受到诸如NEM和DTNB的巯基试剂的有效抑制。抑制作用是在有ZnCl2(1mM)的条件下实现的。
D-部分氨基酸序列。
按照由Rosenfeld等(1992)所披露的方法用胰蛋白酶消化凝胶切片，然后测定部分氨基酸序列。
通过SDS-PAGE分离三分之二的上文所获得的浓缩物，切除62kDa的带，并与胰蛋白酶(Promega)一起培养。然后通过在Vydac218TP柱(1.5×125mm)上以100μl/分钟的流量进行RP-HPLC分离所产生的肽，用80分钟时间使用浓度为0-60％的线性梯度乙腈，然后用20分钟时间使用60-100％的乙腈，所述乙腈溶液是用0.1％TFA水溶液配制的，然后进行氨基酸测序。
在一台与PTH-氨基酸的HPLC分析仪连接的Model 477A蛋白测序仪(Applied Biosystems)上测定N-末端序列。
在进行测序的样品中，两个峰x和y提供了一种明确的序列，该序列分别由下面的10个和16个氨基酸组成：
峰x：ISEQFKKDDF
峰y：LIELISPVIIPLGNPK
将由此所获得的两个肽序列用于筛选酿酒酵母基因组的数据库。鉴定了一种其序列中恰好含有以上两种肽序列的62kDa蛋白(Mips，保藏号S64491，Hebling，1996年5月)。该蛋白的序列如图4所示，其功能尚未披露，该蛋白是由位于基因座YGR177c上的一个基因编码的。基于具有乙酰转移酶活性的本发明蛋白和由Fujii等(1994)所披露的酿酒酵母中ATF1基因产物的氨基酸序列的相同性大约为37％，而且它构成一种醇乙酰转移酶，我们将ATF2的名称用于编码酿酒酵母中决定APAT活性的蛋白的基因。
例2：构建具有被URA3基因中断的ATF2基因的酵母菌株，该菌株丧失了APAT活性(atf2-Δ::URA3)。
A)ATF2基因的定向。
通过取代酿酒酵母ATF2基因的特定部分，导入酿酒酵母的URA3基因，以便随后可以用尿嘧啶通过原养型筛选突变菌株。
通过由Amberg等(1995)所披露的双融合PCR将URA3选择标记与ATF2基因结合。所采用的方法如图5所示，共包括4个PCR反应。头两个反应(命名为PCR1)分别能够扩增位于URA3标记在受到破坏的ATF2靶基因上的插入位点旁侧的5’和3’区，而第三个反应(被命名为PCR2)能够扩增URA3标记基因。双融合(命名为PCR3)最终能结合ATF2靶基因的5’和3’区和URA3标记基因(命名为5’ATF2-URA3-3’ATF2)。
首先，在含有2mM dNTP(Pharmacia)的PCR缓冲液中扩增被用作ATF2靶基因的DNA来源的Fy1679菌株的完整细胞样品：25轮；93℃，30秒；54℃，2分钟；68℃，3分钟，然后在72℃下延伸5分钟；聚合酶AmpliTaq(Perkin Elmer)。
另一方面，通过PCR扩增ATF2基因的5’区，将具有以下序列的寡核苷酸用作直接和间接引物：
OTG10841：
AAAAGTCGACAAAATGGAAGATATAGAAGGATACGAACCACATATCACTC(序列1)和
OTG10844：ATCAATCTCCAATTAGGCCTCTTCGGATTACCC(序列2)
该序列含有一个与ATF2基因序列的5’区同源的片段(SGD：YGR177c)，并为OTG10841增加一个限制位点SalI。
另一方面，通过PCR扩增ATF2基因的3’区，将具有以下序列的寡核苷酸用作直接和间接引物：
OTG10846：CATTCGACATTCCCGAAGGTGACAATGACAAG(序列3)和
OTG10842：AAAAACGCGTAACTATTAAAGCGACGCAAATTCGCCGATGGTTTGG(序列4)
该引物含有一个与ATF2基因序列的3’区同源的片段(SGD：YGR177c)，并为OTG10842增加一个限制位点MluI。
其次，通过PCR扩增酿酒酵母的URA3基因，将具有以下序列的寡核苷酸用作直接引物：
OTG10843：
GGGTAATCCGAAGAGGCCTAATTGGAGATTGATAAGCTTTTCAATTCAATTCATCATTTT
TTTTTTATTCTTTTTTTTG(序列5)
该引物含有一个与公开的URA3基因序列的5’区(Rose等，1984；GenBank：YSCODCD保藏号：K02207；SGD：YEL021w)同源的序列，将其与一个ATF2基因的5’区同源的序列(互补于OTG10844)结合，而作为间接引物的寡核苷酸具有以下序列：
OTG1085：
CTTGTCATTGTCACATTCGGGAATGTCGAATGGGGTAATAACTGATATAATTAAATTGAA
CTC(序列6)，
该引物含有一个与URA3基因的3’区同源的序列，该序列与一个和ATF2基因的3’区同源的序列结合(互补于OTG10846)。通过用限制酶HindIII消化从穿梭载体大肠杆菌-酵母pTG10021(Degryse等，1995)中提取20ng URA3基因的DNA样品，在上述条件下进行扩增。
用“Geneclean试剂盒”(Bio101公司，La Jolla，美国)纯化分别获得的PCR产物，然后进行双融合反应，将上文所述的寡核苷酸OTG10841和OTG10842用作引物，在前面的PCR反应所使用的扩增条件下进行20个轮次的扩增。
纯化最终的融合产物，该产物含有与功能性URA3基因融合的ATF2基因的旁侧区，然后通过用EcoRV限制酶消化证实URA3基因的存在，它证实了该位点在扩增材料中的存在。
B)制备酵母菌株atf2-Δ::URA3。
将上面所获得的融合产物直接转化到菌株Fy1679或菌株TGY73.4的感受态细胞中，并通过在有所述菌株需要的养分的条件下，和在缺少尿嘧啶的条件下在SD培养基(F.Sherman，1991)上筛选转化体。
从所分离的克隆出发，通过利用上述引物OTG10841和OTG10845对完整细胞进行的PCR扩增证实了ATF2基因的5’区和URA3基因之间的新的组合(5’ATF2-URA3-3’ATF2)。根据所披露的实验用细胞匀浆物在体外证实了APAT活性的缺乏，与具有显著APAT活性的亲代菌株进行比较。
将符合以上标准的菌株鉴定为atf2突变菌株，命名为atf2-Δ::URA3。通过以上方法由亲代菌株Fy 1679出发获得的突变菌株被命名为TGY156，而由亲代菌株TGY73.4出发获得的突变菌株被命名为TGY158。
菌株TGY156的样品于1998年2月2日保藏在国立微生物保藏中心(CNCM)，巴斯德研究所，25，Rue du Docteur Roux 75724PARIS CEDEX15法国，保藏号为I-1977。
菌株TGY158的样品于1998年2月2日保藏在国立微生物保藏中心(CNCM)，巴斯德研究所，25，Rue du Docteur Roux 75724PARIS CEDEX15法国，保藏号为I-1976。
C)在酵母菌株atf2-A::URA3培养物中体内稳定孕烯醇酮。
将上面所获得的菌株TGY158的细胞以A600＝0.1的密度接种到含有100μg/ml的孕烯醇酮的YPD培养基(Difco)中。在28℃下培养16小时，然后用二氯甲烷萃取类固醇，并按照上述方法通过RP-HPLC进行分析。图6(B)表示突变TGY158已丧失了酯化孕烯醇酮的能力，而在相同的培养条件下，亲代菌株TGY73.4能将孕烯醇酮转化成孕烯醇酮乙酸酯(图6(A))。
根据以上结果可以得出这样的结论，ATF2基因的产物决定酵母对孕烯醇酮的酯化，而中断ATF2基因不会导致在正常条件下细胞生长的明显变化。
例3：构建具有被URA3基因中断的ATF2基因的并能表达3β-HSD的酵母菌株
按照图7A-7C中的方案构建2μ质粒，该质粒具有编码人3β-HSD的cDNA序列，该序列受酿酒酵母CYC1启动子或酿酒酵母TEF1启动子的控制，并具有G418抗性基因，然后转化到突变酵母菌株atf2-Δ::URA3。
首先，按如下方法制备转移载体pTG10095，该载体含有编码由E.Rheaume等(1991)披露的II型人3β-HSD的cDNA序列，其旁侧为SalI和MluI位点，该基因位于酵母启动子GAL10/CYC1下游：
E.Rheaume等(1991)将编码3β-HSD的序列以限制片段SalI-NotI的形式克隆到载体BluescriptII(Stratagene)上的相同位点。据E.Rheaume等(1991)披露，所获得的载体含有一个位于编码3β-HSD的序列的3’末端的NotI位点。然后用NotI限制酶消化该载体，并在有dNTP的条件下用Klenow片段处理，以便补平粘性末端，然后在有具有下列序列的寡核苷酸的条件下重新连接：
OTG4461：CACACGCGTGTG(序列7)
预先对它本身进行磷酸化和杂交，以便引入一个MluI位点。由此获得的载体pTG10082(图7A)含有编码3β-HSD的序列，该序列含有一个BglII位点，其两端为SalI和MluI位点，而失去了NotI位点。该载体仍然含有天然非编码区5’，这一点通过BglII位点的存在而得到证实。
为了使SalI位点更接近其上游的起始密码子ATG，我们希望引入GAL10-CYC1启动子，用MscI限制酶消化载体pTG10082，其位点位于非编码的5’区，正好位于起始密码子ATG的上游，并通过MluI限制酶消化。提取含有编码3β-HSD的序列的1.8kb Msc-MluI片段(图7A)然后连接在预先用SalI限制酶消化过的含有GAL10/CYC1启动子的pTG10033质粒上(E.Degrys等，1995)，然后用MluI限制酶消化。由此获得pTG10095载体(图7B)。
其次，构建重组载体pTG10268含有酵母的2μ质粒、大肠杆菌的复制子、CYC1启动子/PGK终止子表达框和选择标记LEU2(图7B)。该载体与公开的载体pTG10159(E.Degryse等，1995)相同，所不同的是，2μ片段中所包含的XbaI位点被一个标记XbaI°所取代，这是通过在有Klenow片段的条件下补平天然XbaI位点，然后重新连接而实现的。
然后，通过将含有启动子GAL10/CYC1p的表达嵌合体引入预先用限制酶SalI和MluI消化过的质粒pTG10260，通过同源重组制备pTG10268表达质粒，表达嵌合体是通过用NotI限制酶消化上面所制备的质粒pTG10095获得的。质粒pTG10268(图7B)含有编码II型人3β-HSD的序列，该序列受启动子CYC1的控制。
表达质粒pTG10862含有编码3β-HSD的序列，该序列受启动子TEF1的控制，该质粒是按以下方法构建的(图7C)。
通过同源重组首先构建质粒pTG10832(图8)，所述同源重组是在获自上面制备的质粒pTG10268的NotI片段(用NotI限制酶消化)和预先用限制酶SalI和MluI消化过的重组质粒pTG10164(E.Degryse等，1995)之间的同源重组构建的。
然后，通过引入启动子TEF1获得表达质粒pTG10862，该启动子包含在从质粒pTG10085(E.Degryse等，1995)中提取的ClaI-SalI片段中，用所述启动子取代通过用限制酶ClaI和SalI消化上面所构建的质粒pTG10832而切除的启动子CYC1。
由此获得的质粒pTG10862(图9)含有编码II型人3β-HSD的cDNA序列，分别将该质粒转入亲代菌株TGY73.4或其突变型atf2-Δ::URA3(相当于在例2中所获得的菌株TGY158)，和亲代菌株FY1679或其突变型atf2-Δ::URA3(相当于在例2中所获得的菌株TGY156)。按上述方法在含有250μl/ml的G418的YPD培养基(Difco)上分离转化体。
然后在含有每一种菌株所必需的营养元素的SD培养基上预培养由此获得的候选菌落(组氨酸和尿嘧啶为菌株TGY73.4所必需；组氨酸为TGY158所必需；色氨酸、组氨酸、亮氨酸和尿嘧啶为菌株FY1679所必需；色氨酸、组氨酸和亮氨酸为菌株TGY156所必需；每一种成分的浓度分别为100μg/ml)，然后接种到含有100μl/ml孕烯醇酮的培养基中。在28℃下生长和生物转化24小时之后，提取类固醇，并按照上述方法通过RP-HPLC测定。通过测定一个菌株的三个克隆所获得的结果在下面的表3中给出：
                          表3
菌株     质粒   孕烯醇酮(μg/ml)     孕酮(μg/ml)
 TGY73.4TGY158FY1679TGY156   pTG10862pTG10862pTG10862pTG10862     1941100     015.21.313
以上结果表明，在突变型菌株TGY156或TGY158中底物孕烯醇酮几乎是定量回收的，其中，观察到了孕烯醇酮向孕酮生物转化的开始，而在亲本菌株TGY73.4或FY1679中孕烯醇酮完全消失，它能产生极少(如果有的话)的孕酮，但会积累孕烯醇酮乙酸酯，如在例2中所证实的。
将修饰过的菌株TYG158/pTG10862的样品于1998年2月2日保藏在国立微生物保藏中心(CNCM)，巴斯德研究所，25，Rue du DocteurRoux 75724PARIS CEDEX15法国，保藏号为I-1978。
例4：构建具有被TEF1启动子/PGK终止子中断的ATF2基因的酵母菌株(atf2-Δ::TEF1/PGK)
按如下方法构建菌株TGY186，该菌株源于例2中所披露的菌株TGY156(atf2-Δ::URA3)，其中，位于ATF2基因座上的URA3基因业已被表达嵌合体TEF1启动子/PGK终止子所取代：
首先，按照在例2中所披露的条件，通过双融合PCR将表达嵌合体TEF1启动子/PGK终止子与ATF2基因结合，不过，使用由E.Degryse等(1995)所披露的酿酒酵母的表达嵌合体TEF1启动子/PGK终止子取代URA3选择标记。
头两轮PCR反应(PCR1)可以分别扩增ATF2基因的5’和3’编码区，所述编码区位于ATF2中断靶基因中TEF1启动子/PGK终止子嵌合体插入位点的旁侧，在进行扩增时，分别将具有以下序列的寡核苷酸用作5’区的直接和间接引物：
OTG11049：
CTCTCTGTCGACATGGAAGATATAGAAGGATACGAACCACATCTCACTC(序列8)和
OTG10844：ATCAATCTCCAATTAGGCCTCTTCGGATTACCC(序列9)
对于3’区，使用具有以下序列的寡核苷酸：
OTG10846：CATTCGACATTCCCGAAGGTGACAATGACAAG(序列10)和
OTG11050：AACAACACGCGTAACTATTAAAGCGCAAATTCGCCGATGCTTTGG(序列11)。
设计引物OTG11049和OTG11050是为了分别引入限制位点SalI和MluI。
第三轮PCR反应(PCR2)可以扩增TEF1启动子/PGK终止子嵌合体，该扩增反应是分别将具有下列序列的寡核苷酸用作直接和间接引物而进行的：
OTG11052：
GGGTAATCCGAAGAGGCCTAATGGAGATTGATATCGATCACACACCATAGCTTCAAAATGTTTCTAC(序列12)和
OTG11053：
CTTGTCATTGTCACCTTCGGGAATGTCGAATCTTCGAAACGCAGAATTTTCGAGTTATTAAACTTAA(序列13)
它可以引入限制位点ClaI和HandII。
最后，通过上面所获得的PCR产物的双组合实现结合，将具有上述序列OTG11049(序列8)和OTG11050(序列11)的寡核苷酸用作引物，该引物可以将限制位点SalI和MluI引入ATF2接合位点。
在纯化之后，将最终的融合产物与包含在质粒pTG10885中的ATF2基因重组，该质粒是按照下述方法构建的，并预先用限制酶BstI和StuI消化过。由此获得质粒pTG10888，该质粒在ClaI和HandII位点含有TEF1启动子/PGK终止子信号，其两端为ATF2基因的旁侧区。
质粒pTG10885的制备包括由FY1679菌株开始扩增ATF2基因，并按照例2中所披露的条件进行，不过，分别将具有序列OTG11049(序列8)和OTG11050(序列11)的寡核苷酸用作直接和间接引物，该引物能引入限制位点SalI和MluI。在所获得的PCR产物中，通过用限制酶SalI和MluI消化消除这些位点，然后用大肠杆菌聚合酶I的Klenow片段处理，以便补平粘性末端。然后将所获得的片段连接在E.Degryse等(1995)所披露的表达载体pTG10031上(该载体事先用酶ClaI和HandIII消化过)，然后用Klenow片段处理。通过在大肠杆菌上转化，获得质粒pTG10885，所述质粒是通过以下方法获得的，连接所述PCR产物的SalI位点，用Klenow片段补平，以便获得具有该载体的HandIII位点的序列GTCGA，用Klenow片段补平，以便获得序列AGCTT，以便重建HandIII位点(GTCGAAGCTT)(序列14)，并失去ClaI位点。用Klenow片段补平该载体的ClaI位点，以便获得在与PCR产物连接之后失去的序列ATCG。
然后将TEF1启动子/PGK终止子信号以1.8kbNotI片段的形式从质粒pTG10888中切除，然后与菌株TGY156(atf2-Δ::URA3)上的URA3标记进行交换。
将例2中制备的菌株TGY156用作宿主菌株用从质粒pTG10888上切除的DNA和含有ARS起点的被Struhl等(1979)命名为YRp7的酵母载体共同转化，这样可以满足菌株TGY156对色氨酸的需求，并根据其对5-氟-乳清酸(5-FO)的抗性对菌落进行选择性检测。
通过乙酸锂方法(Ito等，1983)将通过用NotI限制酶消化从质粒pTG10888上切除的2-5μg DNA和从质粒YRp7上切除的DNA引入菌株TGY156。将所述菌株铺平板于YNGB培养基(Difco)的琼脂培养皿上，所述培养基富含组氨酸和亮氨酸(各为100μg/ml)，然后筛选补充了色氨酸需求的菌株。然后，将用牙签收集到的候选菌落接种到按照Boeke等(1984)的方法制备的含有5-F0的培养基上，然后在相同的培养基上证实了对5-FO的抗性，在抗5-FO的菌株中YRp7载体的任何损失由对色氨酸的需要证实。在由此筛选的克隆中，通过PCR检测ATF2基因与TEF1启动子和PGK终止子的组合。由此获得了菌株TGY186。
例5：构建具有被TEF1启动子/PGK终止子中断的ATF2基因的并能表达P45017α的酵母菌株。
按照图10所示方案构建一种质粒(pTG10435)，该质粒含有一个酵母复制起点ARSH4/CEN6，URA3选择标记，并具有编码牛细胞色素P45017α的cDNA序列，该序列受酿酒酵母TEF1启动子的控制，然后转化到突变酵母菌株atf2-Δ::TEF1/PGK(TGY186)中。首先，按照图11所示方案制备质粒pTG10058，该质粒含有编码由Kuber等(1986披露的牛细胞色素P45017α的cDNA序列，其旁侧为SalI和MluI位点，并位于酵母启动子CYC1的下游：通过用XhoI限制酶消化打开在专利申请WO89/10963中所披露的质粒pGB17α-5，该质粒含有编码牛细胞色素P45017α的序列，然后用碱性磷酸酶处理。在磷酸化和杂交之后，将具有以下序列的寡核苷酸引入其XhoI位点，以制备质粒pTG10104：
OTG4511：TCGACGGACGCGTGG(序列15)和
OTG4512：TCGACCACGCGTCCG(序列16)
然后用限制酶SalI和MluI处理质粒pTG10104，再导入由E.Degryse等(1995)所披露的酵母启动子CYC1的质粒pTG10031中，该质粒预先用限制酶SalI和MluI消化过，并用碱性磷酸酶处理过。由此获得了含有编码牛细胞色素P45017α的cDNA的pTG10058载体(图12)。然后用限制酶SalI和MluI消化质粒pTG10058，并用碱性磷酸酶处理。提取含有编码牛细胞色素P45017α的1.7kb的SalI-MluI片段，然后连接到预先用酶SalI和MluI消化过的由E.Degryse等(1995)所披露的表达载体pTG10085上，该载体含有酵母启动子TEF1。由此获得了质粒pTG10293(图13)，其中编码细胞色素P45017α的序列受启动子TEF1的控制。
其次，通过由E.Degryse等(1995)披露的重组质粒pTG10434，与由质粒pTG10293出发按上述方法制备的2.8kb的NotI片段之间的同源重组，制备表达质粒pTG10435，所述pTG10434含有序列ARSH4/CEN6，该质粒预先用酶SalI和MluI消化过。
由此获得的质粒pTG10435(图14)含有受启动子TEF1控制的编码P45017α的序列，分别将该质粒转化到亲代菌株FY1679或在例4中制备的菌株TGY186(atf2-Δ::TEF1/PGK)。按上述方法在富含色氨酸、组氨酸和亮氨酸(各100μl/ml)的YNBG培养基(Difco)上分离转化体。然后将由此获得的菌落在含有2％葡萄糖和0.5％酪蛋白氨酸的YNB培养基(Difco)上预培养16小时，然后用新鲜培养基稀释到A600＝0.2，生长6小时之后，加入100μg/ml的孕烯醇酮或孕酮。在28℃下进行48小时的生长和生物转化之后，按照例1所述方法提取类固醇并通过RP-HPLC测定，分别使用孕烯醇酮和17α-羟基孕烯醇酮标准物或孕酮和17α-羟基孕酮的标准物。
在下面的表4中给出了所获得的以μg/ml为单位的结果：
                               表4
菌株 FY1679/pTG10435  TGY186/pTG10435
底物：孕烯醇酮孕烯醇酮17α-羟基孕烯醇酮 00 67.142.0
底物：孕酮孕酮17α-羟基孕酮 46.529.3 41.433.1
以上结果表明，在野生型菌株(FY)或其突变型atf2(TGY186)中，在以孕酮为底物时，由载体pTG10435表达的细胞色素P45017G的生物转化能力几乎相同。另一方面，在以孕烯醇酮为底物时，仅在突变体atf2(TGY186)上获得了与孕酮相同的生物转化率。在野生型菌株FY中，底物和产物被乙酰化，并且不含游离羟基孕酮。
1999年1月20日将修饰过的菌株TGY186/pTG10435的样品保藏在国立微生物保藏中心(CNCM)，巴斯德研究所，25，Rue du DocteurRoux 75724PARIS CEDEX15法国，保藏号为I-2119。
例6：构建具有被TEF1启动子/PGK终止子中断的ATF2基因并共表达3β-HSD和P45017α的酵母菌株。
依次按下文所述的步骤1-3(图15A和B)、以及下文所述的步骤4-6构建质粒pTG10417(图21)，该质粒含有酵母复制子2μ和两个表达嵌合体，一个表达嵌合体编码人3β-HSD，另一个编码牛细胞色素P45017α，它们均受酿酒酵母启动子CYC1的控制，并具有URA3-d选择标记，然后将其转入突变型酵母菌株atf2-Δ::TEF1启动子/PGK终止子(TGY186)。
步骤1：构建质粒pTG10210
由E.Degryse等(1995)披露的表达载体pTG10033含有杂合的酵母启动子GAL10/CYC1，预先用限制酶PvuII消化该载体，用碱性磷酸酶处理，然后在有具有以下序列的寡核苷酸的条件下重新连接：
OTG1050：CCCGAATTCGGG(序列17)
该寡核苷酸本身预先进行磷酸化和杂交，以便在含有启动子GAL10/CYC1的表达嵌合体的末端引入EcoRI位点。由此获得载体pTG10210。
步骤2：构建质粒pTG10214
将含有存在于载体pTG10210上的启动子GAL10/CYC1的表达嵌合体引入由E.Degryse等(1995)披露的大肠杆菌-酵母穿梭载体pTG10013上，该载体含有选择标记URA3-d。用EcoRI限制酶消化载体pTG10013，并用碱性磷酸酶处理，然后将其连接到预先用酶EcoRI消化过的、在步骤1中制备的载体pTG10210上。由此获得的载体pTG10214所含有的表达嵌合体带有针对2μ复制子的启动子GAL10/CYCl。
步骤3：构建质粒pTG10274
在质粒质粒pTG10214上通过用限制酶ClaI和SalI处理切除该质粒之后通过同源重组用启动子CYC1置换启动子GAL10/CYC1。用限制酶HindIII和FspI消化由E.Degryse等(1995)披露的含有启动子CYC1的表达载体pTG10031，然后与在步骤2中制备的并且用限制酶ClaI和SalI消化过的质粒pTG10214进行重组，由此产生质粒pTG10274(16图)。
步骤4：构建质粒pTG10401
由含有启动子CYC1的质粒pTG10274和含有受启动子TEF1控制的细胞色素P45017α编码序列的质粒pTG10293出发通过同源重组制备含有受启动子TEF1控制的细胞色素P45017α编码序列的新的质粒pTG10401。通过用限制酶MluI和DraI消化将启动子CYC1和大肠杆菌复制子的一部分从在步骤3中制备的质粒pTG10274上切除。用限制酶HandIII和PvuII消化例5中制备的质粒pTG10293，然后与用限制酶MluI和DraI消化过的质粒pTG10274重组，产生质粒pTG10401(图17)。
步骤5：构建质粒pTG10403
然后将编码II型人3β-HSD的cDNA导入质粒质粒pTG10401，使其受启动子CYC1的控制。首先，按照图18所示的方案构建含有编码II型人3β-HSD的cDNA的表达载体pTG10262，由例3中制备的转移载体pTG10095和重组载体pTG10257开始构建，pTG10257含有酵母复制子2μ，源于大肠杆菌的复制子，酵母CYC1启动子/PGK终止子表达框，和一个URA3-d选择标记，该载体pTG10257与由E.Degryse等(1995)所披露的重组载体pTG10042相同，包含在2μ片段上的XbaI位点除外，该位点被标记XbaI°所取代，该标记是通过用Klenow片段补平天然XbaI位点并进行重新连接而获得的。
通过用限制酶NotI消化将II型人3β-HSD的表达嵌合体从转移载体pTG100095上切除，然后导入预先用限制酶SalI和MluI消化过的重组载体pTG10257上，产生表达载体pTG10262(图19)。应当指出的是，源于质粒pTG10095的嵌合体GAL10/CYC1-cDNA在含有启动子CYC1的重组载体pTG10257中重组产生一种含有嵌合的CYC1-cDNA的表达载体。
其次，用限制酶XmnI消化上面所制备的表达载体pTG10262。将所获得的含有编码3β-HSD的cDNA的片段与在步骤4中制备的质粒pTG10401的片段进行重组，后一种片段是通过用限制酶ScalI消化获得的，它含有编码细胞色素P45017α的cDNA。因此获得的质粒pTG10403(图20)含有两个表达嵌合体，其中的一个编码3β-HSDH，受启动子CYC1的控制，另一个编码细胞色素P45017α，受启动子TEF1的控制。
步骤6：构建质粒pTG10417
最后，在上述质粒pTG10403中，用启动子CYC1取代启动子TEF1。
另一方面，用限制酶PvuII消化例5中所披露的的质粒pTG10058，这样可以释放出与启动子CYC1结合的编码细胞色素P45017α的序列的一部分和大肠杆菌复制子的大部分。另一方面，通过用限制酶DraI消化将大肠杆菌复制子的一部分从在步骤5中制备的质粒pTG10403上消除。通过重组用上述方法预先消化过的两种质粒，最终获得了质粒pTG10417。质粒pTG10417含有酵母复制子2μ，URA3-d选择标记和两个表达嵌合体，其中的一个编码人3β-HSD，另一个编码源于牛的细胞色素P45017α，这两个表达嵌合体都受酵母启动子CYC1的控制(图21)。
然后将质粒pTG10417分别转化到亲代菌株FY1679或在例4中制备的菌株TGY186(atf2-Δ::TEF1启动子/PGK终止子)中。
在琼脂处理过的YNB培养基(Difco)上分离转化体，该培养基含有0.5％的葡萄糖，富含色氨酸、组氨酸和亮氨酸(各自100μg/ml)。
然后在28℃下在含有0.5％的葡萄糖和0.1％的酪蛋白氨基酸的YNB培养基(Difco)中将所获得的菌落预培养24小时，然后稀释到A600＝0.1，并补充浓度为100μg/ml的孕烯醇酮，稀释使用相同的新鲜培养基(培养基1)或含有0.1％的葡萄糖，2％甘油和0.2％的酪蛋白氨基酸的YNB培养基(Difco)(培养基2)。在进行48小时的生长和生物转化之后，提取类固醇，并通过例1中所述的RP-HPLC进行测定，使用标准物孕烯醇酮、17α-羟基孕烯醇酮、孕酮和17α-羟基孕酮。
在下面的表5(培养基1)和表6(培养基2)中给出了以μg/ml表示的结果：
                                表5
菌株 FY1679/pTG10417  TGY186/pTG10417
孕烯醇酮孕烯醇酮乙酸酯17α-羟基孕烯醇酮17α-羟基孕烯醇酮乙酸酯孕酮17α-羟基孕酮  087.30010.61.3  58.103.101.423.4
                               表6
菌株 FY1679/pTG10417  TGY186/pTG10417
孕烯醇酮孕烯醇酮乙酸酯17α-羟基孕烯醇酮17α-羟基孕烯醇酮乙酸酯孕酮17α-羟基孕酮  052.1012.808.6  54.003.401.431.4
以上结果表明，在用质粒pTG10417转化过的野生型菌株(FY)中的生物转化会导致孕烯醇酮乙酸酯和17α-羟基孕烯醇酮乙酸酯的积累，这些酯随后不能被酶3β-HSDH或P45017α转化，而且，其生物转化的平衡低于在转化atf2突变体(TGY186)中所观察到的结果。
转化过的菌株TGY186/pTG10417的样品于1999年1月20日保藏在国立微生物保藏中心(CNCM)，巴斯德研究所，25，Rue du DocteurRoux 75724PARIS CEDEX15法国，保藏号为I-2118。
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<120>具有间断的ATF2基因的酵母菌株及其用途
<130>2482 PCT序列
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<141>
<160>17
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>1
aaaagtcgac aaaatggaag atatagaagg atacgaacca catatcactc                50
<210>2
<211>33
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<220>
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<220>
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<222>互补((1)..(33))
<400>2
atcaatctcc aattaggcct cttcggatta ccc                                  33
<210>3
<211>32
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<220>
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cattcgacat tcccgaaggt gacaatgaca ag                                   32
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<210>5
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<220>
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 gggtaatccg aagaggccta attggagatt gataagcttt tcaattcaat tcatcatttt    60
 ttttttattc ttttttttg                                                 79
<210>6
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<220>
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<220>
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<222>互补((1)..(63))
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cttgtcattg tcaccttcgg gaatgtcgaa tggggtaata actgatataa ttaaattgaa     60
ctc                                                                   63
<210>7
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<220>
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<220>
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<222)互补((1)..(48))
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aacaacacgc gtaactatta aagcgacgca aattcgccga tgctttgg                  48
<210>12
<211>68
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<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>12
gggtaatccg aagaggccta attggagatt gatatcgatc acacaccata gcttcaaaat     60
gtttctac                                                              68
<210>13
<211>67
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>互补((1)..(67))
<400>13
cttgtcattg tcaccttcgg gaatgtcgga gcttcgaaac gcagaatttt cgagttatta     60
aacttaa                                                               67
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<211>10
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<210>15
<211>15
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<213>人工序列
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<223>寡核苷酸
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tcgacggacg cgtgg                                                      15
<210>16
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
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<222>互补((1)..(15))
<400>16
tcgaccacgc gtccg                                                      15
<210>17
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>14
cccgaattcg gg                                                        12

Claims (26)

1.一种修饰过的酵母菌株，其中，通过在编码乙酰辅酶A孕烯醇酮乙酰转移酶(APAT)的基因的功能因子中插入、缺失或取代DNA序列而改变该基因，从而消除该酶活性，导致3β-羟基类固醇的稳定化。
2.如权利要求1的修饰过的酵母菌株，其中，所述改变过的基因是酿酒酵母的ATF2基因。
3.如权利要求2的修饰过的酵母菌株，其中，所述ATF2基因是通过插入营养缺陷型选择基因或酵母表达嵌合体而改变的，所述营养缺陷型选择基因向宿主菌株提供营养需求，所述酵母表达嵌合体由启动子和转录终止子组成。
4.如权利要求3的修饰过的酵母菌株，其中，所述ATF2基因是通过插入URA3选择基因或表达嵌合体TEF1启动子/PGK终止子而改变的。
5.如权利要求4的修饰过的酵母菌株，其中，所述ATF2基因是通过插入URA3选择基因而改变的。
6.如权利要求5的修饰过的酿酒酵母菌株，其保藏号为I-1977或I-1976。
7.如权利要求4的修饰过的酵母菌株，其中，所述ATF2基因是通过插入表达嵌合体TEF1启动子/PGK终止子而改变的。
8.如权利要求7的修饰过的酿酒酵母菌株，其为atf2-Δ∷TEF1启动 子/PGK终止子。
9.一种转化的酵母菌株，其中，通过在编码乙酰辅酶A孕烯醇酮乙酰转移酶(APAT)的基因的功能因子中插入、缺失或取代DNA序列而改变该基因，从而消除该酶活性，并能表达由胆甾醇生物合成皮质醇的途径中的至少一种酶，所述酶选自：
-胆甾醇的侧链裂解酶(P450SCC)，
-3β-羟基-Δ5-类固醇脱氢酶/Δ5-Δ4-类固醇异构酶(3β-HSD)和
-17α-类固醇羟化酶(P45017α)。
10.如权利要求9的转化的酵母菌株，其中，所述改变了的基因是酿酒酵母的ATF2基因。
11.如权利要求10的转化的酵母菌株，其中，所述ATF2基因是通过插入营养缺陷型选择基因或酵母表达嵌合体而改变的，所述营养缺陷型选择基因向宿主菌株提供营养需求，所述酵母表达嵌合体由启动子和转录终止子组成。
12.如权利要求10的转化过的酵母菌株，其中，所述ATF2基因是通过插入URA3选择基因而改变的。
13.如权利要求12的转化过的酵母菌株，它能表达3β-HSD。
14.如权利要求13的转化过的酿酒酵母菌株，其保藏号为I-1978。
15.如权利要求10的转化过的酵母菌株，其中，所述ATF2基因是通过插入表达嵌合体TEF1启动子/PGK终止子而改变的。
16.如权利要求15的转化过的酵母菌株，它能表达P45017α。
17.如权利要求16的转化过的酿酒酵母菌株，其保藏号为I-2119。
18.如权利要求15的转化过的酵母菌株，它能共表达3β-HSD和P45017α。
19.如权利要求18的转化过的酿酒酵母菌株，其保藏号为I-2118。
20.一种在活体内氧化选自内源固醇、外源固醇或外源类固醇的底物的方法，其中，使用了如权利要求9的转化过的酵母菌株，当该菌株产生内源固醇时，对该菌株进行单独培养，或者与外源固醇或类固醇一起培养。
21.如权利要求20的体内氧化方法，其中，所述底物是3β-羟基类固醇，其中，使用如权利要求13的转化过的酵母菌株。
22.如权利要求21的体内氧化方法，其中，所述3β-羟基类固醇选自孕烯醇酮或17α-羟基孕烯醇酮。
23.如权利要求20的体内氧化方法，其中，所述底物是一种类固醇，其中，使用如权利要求16所述的转化过的酵母菌株。
24.如权利要求23的体内氧化方法，其中，所述类固醇底物是孕烯醇酮或孕酮。
25.如权利要求20的体内氧化方法，其中，所述底物是3β-羟基类固醇，其中，使用如权利要求18所述的转化过的酵母菌株。
26.如权利要求25的体内氧化方法，其中，所述类固醇底物是孕烯醇酮。
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