PL198376B1 - Zmodyfikowany szczep drożdży, transformowany szczep drożdży, szczepy S. cerevisiae oraz sposób utleniania in vivo substratu z wykorzystywaniem transformowanego szczepu drożdży - Google Patents

Abstract

1. Zmodyfikowany szczep dro zd zy pozbawiony aktywno sci acetylotransferazy acetylo-CoA: pregnenolon (APAT) z uzyskaniem stabilizacji 3 ß-hydroksysteroidów ze zmienionym genem koduj a- cym t e aktywnosc. 10. Transformowany szczep dro zd zy pozbawiony aktywno sci acetylotransferazy acetylo-CoA: pregnenolon (APAT) ze zmienionym genem koduj acym t e aktywno sc, który wyra za przynajmniej jeden spo sród enzymów szlaku biosyntezy hydrokortyzonu z cholesterolu, wybrany z grupy obejmuj acej: - enzym rozszczepiaj acy lancuch boczny cholesterolu (P 450 SCC), - dehydrogenaz e 3 ß-hydroksy-delta 5 -steroidow a/izomeraz e delta 5 -delta 4 -steroidow a (3 ß-HSD) i - 17 a-hydroksylaz e steroidow a (P 450 17 a). 23. Sposób utleniania in vivo wed lug zastrz. 22, znamienny tym, ze substratem jest 3 ß- -hydroksysteroid, przy czym stosuje si e transformowany szczep dro zd zy okre slony w zastrz. 15 i izo- luje si e, je zeli to konieczne, otrzymany 3-okso-delta 4 -steroid. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zmodyfikowany szczep drożdży, transformowany szczep drożdży, szczepy S. cerevisiae oraz sposób utleniania in vivo substratu z wykorzystaniem transformowanego szczepu drożdży.

Tworzenie 3-okso-delta⁴-steroidów z prekursorów 33-hydroksy-delta⁵ w biosyntezie wszystkich klas hormonów steroidowych u ssaków jest katalizowane przez układ enzymatyczny dehydrogenazy 3e-hydroksy-delta⁵-steroidowej (EC 1.1.1.145) i izomerazy delta⁵-delta⁴-steroidowej (EC 5.3.3.1), oznaczony 3e-HSD. Przykładowo, 3e-HSD katalizuje transformację pregnenolonu do progesteronu, 17a-hydroksypregnenolonu do 17a-hydroksyprogesteronu, dehydroepiandrosteronu do delta4-androstenodionu albo 5-androsteno-3e-17e-diolu do testosteronu (Simard i in., 1996).

Tak więc, 3e-HSD jest jednym z kluczowych enzymów w szlaku biosyntezy hydrokortyzonu, rozpoczynającego się od cholesterolu w korze nadnerczy ssaków (figura 1).

Zastosowanie rekombinowanych mikroorganizmów, zwłaszcza modyfikowanych drożdży, umożliwiające heterologiczną ekspresję jednego albo wielu enzymów ssaków tego szlaku biosyntezy, do wytwarzania hydrokortyzonu albo produktów pośrednich tej biosyntezy opisano, na przykład, w europejskim zgłoszeniu patentowym EP nr 340 878, patencie USA nr 5 137 822, Dumas i in., 1994 i Cauet i in., 1994.

Gdy funkcjonalny 3eHSD wyrażany jest w drożdżach, transformowane komórki drożdży nie przekształcają całkowicie 3e-hydroksysteroidów do odpowiednich 3-oksosteroidów, przykładowo pregnenolonu do progesteronu, ale gromadzą związek, który obserwowano również w przypadku komórek nie transformowanych drożdży. W niniejszym zgłoszeniu opisano identyfikację gromadzonego związku jako estru 3e-octanowego wyjściowego steroidu i charakterystykę enzymu posiadającego aktywność acylotransferazy, który jest odpowiedzialny za tę estryfikację (określany dalej jako APAT od „acylotransferaza acetylo-CoA: pregnenolon”). Ponadto, gromadzenie octanu pregnenolonu przez transformowane drożdże wytwarzające pregnenolon opisano w europejskim zgłoszeniu patentowym EP 727 489. Na podstawie tych obserwacji należy sądzić, że estryfikacja 3e-hydroksysteroidów produkowanych przez drożdże jest niepożądana, ponieważ jest odpowiedzialna za drugorzędne reakcje i powstawanie produktów ubocznych, co prowadzi do zmniejszenia uzysku gromadzonych 3e-hydroksysteroidów, przykładowo pregnenolonu, albo zmniejszenia wydajności biokonwersji 3e-hydroksydelta⁵-steroidów do 3-okso-delta⁴-steroidów, szczególnie podczas wytwarzania progesteronu albo 17a-hydroksyprogesteronu, co prowadzi do zmniejszenia produkcji hydrokortyzonu we wspomnianym szlaku biosyntezy.

W oparciu o wyżej przedstawione wyniki, twórcy niniejszego wynalazku ujawnili konstrukcję szczepów drożdży, które utraciły niepożądaną aktywność APAT, przez zmianę genu kodującego tę aktywność, co powoduje stabilizację 3e-hydroksysteroidów w jego obecności. Szczepy te można więc zastosować jako szczepy wyjściowe do konstruowania rekombinowanych szczepów, które są zdolne do konwertowania 3e-hydroksysteroidów do dalszych produktów poprawiających uzysk.

Dalej opisano również konstruowanie szczepów drożdży, które utraciły aktywność APAT przez zmianę genu kodującego tę aktywność i wyrażającego 3e-HSD albo cytochrom P4₅o17a, albo równocześnie wyrażającego 3e-HSD i cytochrom P4₅o17a ze szlaku biosyntezy hydrokortyzonu z cholesterolu. Szczepy wyrażające przykładowo 3e-HSD umożliwiają polepszenie uzysku w biokonwersji 3e-hydroksy-delta⁵-steroidów do 3-okso-delta4-steroidów, a więc można je zastosować w procesach ulepszonej produkcji hydrokortyzonu albo jego związków pośrednich w drożdżach.

Przedmiotem wynalazku jest więc zmodyfikowany szczep drożdży pozbawiony aktywności acetylotransferazy acetylo-CoA: pregnenolon (APAT) z uzyskaniem stabilizacji 3e-hydroksysteroidów ze zmienionym genem kodującym tę aktywność.

Korzystnie zmienionym genem jest gen ATF2 S. cerevisiae albo jego homolog, bardziej korzystnie jest gen ATF2 S. cerevisiae.

Korzystnie gen ATF2 jest zmieniony przez wprowadzenie sekwencji DNA, obejmującej przynajmniej jeden nukleotyd, korzystniej przez wprowadzenie genu selekcyjnego URA3 albo bloku ekspresji TEF1p_ro_m/PGKterm, bardziej korzystnie przez wprowadzenie genu selekcyjnego URA3.

Korzystnie wynalazek dotyczy zmodyfikowanego szczepu S. cerevisiae oznaczonego TGY156 i TGY158.

Zmianę genu kodującego aktywność APAT można przeprowadzić przykładowo przez insercję, delecję albo substytucję sekwencji DNA w funkcjonalnych elementach genu, przykładowo promotorze

PL 198 376 B1 albo sekwencji kodującej białko o aktywności APAT. Integrowanie sekwencji DNA zmienionej w ten sposób ze szczepem drożdży można przeprowadzić, przykładowo, techniką rekombinacji homologicznej, która prowadzi do wytworzenia mutantów chromosomalnych odpowiadających modyfikowanym szczepom według wynalazku, w których wykazuje się zniknięcie aktywności APAT i stabilizację 3p-hydroksysteroidów, przykładowo, przez hodowlę komórkową w obecności pregnenolonu i przez pomiar zawartości pregnenolonu jako funkcji czasu, w warunkach działania opisanych niżej w części opisu dotyczącej przykładów.

Jako szczepy drożdżowe zastosowane w wynalazku można wymienić w szczególności: szczepy Saccharomyces, takie jak S. cerevisiae, szczepy Candida, takie jak C. maltosa, szczepy Kluyveromyces, takie jak K. lactis albo szczepy Pichia, takie jak P. pastoris.

Przez określenie „gen ATF2” rozumie się gen S. cerevisiae zidentyfikowany w genomie drożdży w locus ATF2 albo YGR177c „Saccharomyces Genome Database (SGD); (Cherry i in., http://genome-www.stanford.edu /Saccharomyces/), którego otwarta ramka odczytu (ORF) oznaczona YGR177c ulega translacji do sekwencji aminokwasowej dostępnej w bazie danych Mips pod numerem S64491 (Hebling, Hofmann i Delius (Maj 1996)), którego sekwencję przedstawiono na figurze 4. Gen ten koduje białko o aktywności APAT, co wykazane jest w części doświadczalnej.

Przez określenie „gen, który jest homologiczny z genem ATF2” rozumie się gen, który koduje białko o aktywności APAT i wykazujące identyczność sekwencji z sekwencją białka YGR177C około 60% albo więcej.

Szczep drożdży zmodyfikowany jak wyżej, w którym zmienionym genem jest gen ATF2 S. cerevisiae, oznaczony jest dalej jako zmutowany szczep atf2.

Sekwencja DNA, którą wprowadzono do genu ATF2 w taki sposób, że utracił on całkowicie aktywność APAT, może być, przykładowo, genem selekcji auksotroficznej uzupełniającym żywieniowe wymagania szczepu gospodarza, takim jak gen URA3, gen LEU2, gen TRP1, gen HIS3 albo gen ADE2, przykładowo dominującym genem selekcyjnym, takim jak gen oporności na antybiotyk, taki jak G418, fleomycyna albo higromycyna, albo przykładowo genem reporterowym, takim jak gen pGAL.

Sekwencja DNA, którą się wprowadza do genu ATF2 może stanowić również blok ekspresji w drożdżach, obejmując promotor i terminator transkrypcji, przykładowo promotor drożdżowy, taki jak PGK, TDH3, CYC1 albo TEF1, przykładowo terminator drożdżowy, taki jak CYC1, TDH3, TEF1 albo PGK. Blok ekspresji może być kombinacją elementów wymienionych wyżej, przykładowo blok ^TEF1 prom^/PGKterm.

Przykładowym zmodyfikowanym szczepem według wynalazku jest szczep, w którym gen ATF2 jest zmieniony przez insercję selekcyjnego genu URA3 lub bloku ekspresji TEF1p_ram/PGKterm.

Zmutowany szczep atf2, który pozbawiony jest aktywności APAT, do którego włączono gen URA3, dalej określony jako atf2-A: :URA3, można selekcjonować na podstawie prototrofii względem uracylu.

Konstrukcja zmodyfikowanych szczepów drożdży S. cerevisiae oznaczonych jako TGY156 i TGY158, jest dalej szczegółowo przedstawiona w części dotyczącej przykładów.

Zmodyfikowanym szczepem drożdży, w którym gen ATF2 jest zmieniony przez wprowadzenie bloku ekspresji TEF1p_rom/PGKterm, jest przykładowo zmutowany szczep atf2 według wynalazku, pozbawiony aktywności APAT, w którym wprowadzono blok ekspresji TEF1p_ram/PGKterm i oznaczony dalej jako atf2-A: :TEF1p_ram/PGKte-m. Szczep ten można wyselekcjonować pod względem nieobecności funkcjonalnego genu URA3, zastąpionego przez blok ekspresji, dzięki jego odporności na kwas 5-fluoroorotowy (5-FO).

Konstrukcja zmodyfikowanego szczepu S. cerevisiae według wynalazku oznaczonego jako TGY186, została przedstawiona w części opisu dotyczącej doświadczeń.

Przedmiotem wynalazku jest również transformowany szczep drożdży pozbawiony aktywności acetylotransferazy acetylo-CoA: pregnenolon (APAT) ze zmienionym genem kodującym tę aktywność, który wyraża przynajmniej jeden spośród enzymów szlaku biosyntezy hydrokortyzonu z cholesterolu, wybrany z grupy obejmującej:

- enzym odcinający łańcuch boczny cholesterolu (P450SCC),

- dehydrogenazę 3p-hydroksy-delta⁵-steroidową/izomerazę delta⁵-delta⁴-steroidową (3p-HSD) i

- hydroksylazę 17a-steroidową (P₄₅₀1 7a).

Transformowane szczepy drożdży według wynalazku można otrzymać, przykładowo, przez transformowanie zmutowanych szczepów atf2 według wynalazku znanymi sposobami, przykładowo przez transformowanie wektorem wyrażającym P450SCC, jak również ADX i ADR, wektorem wyrażają4

PL 198 376 B1 cym 33-HSD albo wektorem wyrażającym P₄₅₀1 7a. Zmutowany szczep atf2 można również współtransfekować, jeżeli to konieczne, przykładowo wektorem wyrażającym 33-HSD i wektorem wyrażającym P₄₅₀1 7a albo transformować wektorem wyrażającym równocześnie 33-HSD i P₄₅₀1 7a i zastosować w procesie biokonwersji pregnenolonu do 17a-hydroksyprogesteronu.

Wektory skonstruowane do ekspresji w szczepach drożdży P₄₅₀SCC, jak również ADX i ADR, 3-HSD albo P4₅₀1 7a pochodzenia bydlęcego albo ludzkiego opisano, przykładowo, w Dumas i in., 1994, europejskim zgłoszeniu patentowym EP nr 340 878 albo w patencie USA nr 5 137 822.

W korzystnym transformowanym szczepie drożdży zmienionym genem jest gen ATF2 S. cerevisiae albo jego homolog. Korzystniej transformowanym szczepem drożdży jest szczep, w którym zmienionym genem jest gen ATF2 S. cerevisiae, który odpowiada transformowanemu szczepowi atf2.

Korzystnym transformowanym szczepem drożdży jest szczep, w którym gen ATF2 jest zmieniony przez wprowadzenie sekwencji DNA posiadającej przynajmniej jeden nukleotyd, a zwłaszcza przez wprowadzenie genu selekcyjnego URA3. Taki szczep odpowiada zmodyfikowanemu szczepowi atf2-A: :URA3 i korzystnie wyraża 3-HSD. Konkretny taki transformowany szczep S. cerevisiae oznaczony jako TGY158/pTG10862.

Szczegółową konstrukcję szczepu drożdży atf2-A: : URA3 wyrażającego 33-HSD, w szczególności transformowanego szczepu S. cerevisiae oznaczonego TGY158/pTG10862 opisano niżej w części dotyczącej przykładów.

Korzystny jest również transformowany szczep drożdży, w którym gen ATF2 jest zmieniony przez wprowadzenie bloku ekspresji TEF1p_ram/PGKterm, bardziej korzystnie, który wyraża P4₅₀1 7a, w szczególności szczep oznaczony TGY186/pTG10435.

Korzystnym transformowanym szczepem drożdży jest szczep, który równocześnie wyraża 3-HSD i P45o17a, w szczególności transformowany szczep S. cerevisiae oznaczony TGY186/pTG10417. Przykładowo będą to odpowiednie transformowane szczepy atf2-A: :TEFlp_ratT1/PGKterm.

Wynalazek dotyczy również sposobu utleniania in vivo substratu wybranego z grupy obejmującej endogenny sterol, egzogenny sterol albo egzogenny steroid, w którym stosuje się transformowany szczep według wynalazku, przy czym gdy szczep wytwarza endogenny sterol, hoduje się sam szczep albo inkubuje się ze sterolem, albo egzogennym steroidem, zaś otrzymany utleniony związek izoluje się, jeżeli jest to konieczne.

Za endogenny sterol uważa się sterol, który gromadzi się w szczepie drożdży i który jest substratem enzymu odcinającego łańcuch boczny sterolu (P450SCC) gdy drożdże po transformacji, np. wektorem ekspresyjnym dla P450SCC, ADX oraz ADR, hoduje się pod nieobecność egzogennego sterolu. Endogennymi sterolami zastosowanymi w sposobie według wynalazku mogą być przykładowo, ergosta-5-en-3-ol, ergosta-5,24(28)-dien-3-ol albo ergosta-5,22-dien-3-ol. W europejskim zgłoszeniu patentowym EP 727 489 opisano gromadzenie tych steroli w szczepie drożdży i odcinanie łańcuchów bocznych w hodowli szczepu po transformacji wektorem wyrażającym P450SCC ADX i ADR. Taki szczep drożdży, w którym również występuje aktywność APAT, można modyfikować wcześniej w celu otrzymania mutanta atf2 według wynalazku i następnie transformować wektorem ekspresyjnym dla P450SCC ADX i ADR, w celu otrzymania stransformowanego szczepu atf2 według wynalazku.

Przez egzogenny sterol rozumie się sterol, który jest substratem dla enzymu tnącego P450SCC, podczas inkubacji ze szczepem drożdży transformowanym wektorem ekspresyjnym dla P450SCC ADX i ADR, przykładowo będzie to cholesterol albo sitosterol. Takim szczepem może być, przykładowo, zmutowany szczep atf2 transformowany wektorem wyrażającym P450SCC, ADX i ADR.

33-hydroksysteroid otrzymany przez odcięcie łańcucha bocznego w endogennym albo egzogennym sterolu zastosowanego jako substrat jest całkowicie w wolnej postaci, tj. nie towarzyszy mu odpowiedni ester 33-octanowy, w hodowli transformowanych szczepów atf2 wyrażających P4₅₀SCC, ADX i ADR.

Za steroid uważa się steroid, który jest substratem dla enzymu 33-HSD podczas inkubacji ze szczepem drożdży transformowanym np. wektorem wyrażającym 3p-HSD, takim steroidem przykładowo jest pregnenolon, 17a-hydroksypregnenolon albo dehydroepiandrosteron. Za steroid uważa się steroid, który jest substratem dla enzymu P4₅₀1 7a podczas inkubacji ze szczepem drożdży transformowanym wektorem wyrażającym P4501 7a, takim steroidem przykładowo jest progesteron albo pregnenolon. Szczepem może być, przykładowo, zmutowany szczep atf2, transformowany wektorem ekspresyjnym dla 33-HSD albo wektorem ekspresyjnym dla P4₅₀1 7a.

PL 198 376 B1

W korzystnym sposobie utleniania substratu in vivo substratem jest 33-hydroksysteroid, zaś zastosowanym transformowanym szczepem drożdży jest szczep według wynalazku przykładowo atf2-A:

:URA3, wyrażający 33-HSD, zaś otrzymany 3-okso-delta⁴-steroid jest izolowany jeżeli to konieczne, zaś szczególnie sposób, w którym 3e-hydroksysteroid jest wybrany z grupy obejmującej pregnenolon i 17a-hydroksypregnenolon.

3e-hydroksysteroid zastosowany jako substrat jest stabilny, gdy jest inkubowany ze szczepem atf2-A: :URA3, transformowanym wektorem wyrażającym 3e-HSD. Tak więc, ulepszony sposób wytwarzania 3-okso-delta⁴-steroidu w drożdżach, umożliwia utlenienie wszystkich substratów 3e-hydroksy do 3-okso-delta⁴-steroidu, jak to opisano niżej w części dotyczącej przykładów.

Równie korzystny jest sposób utleniania in vivo, w którym substratem jest steroid, zaś zastosowanym transformowanym szczepem drożdży jest szczep według wynalazku wyrażający P4₅₀1 7a, np. atf2-A: :TEF1p_ram/PGKterm, zaś otrzymany 17a-hydroksylosteroid izoluje się jeżeli to konieczne. Korzystniej steroidowym substratem jest pregnenolon albo progesteron.

Pregnenolon zastosowany jako substrat jest stabilny podczas inkubacji ze szczepem atf2-A: :TEF1p_ram/PGKterm transformowanym wektorem ekspresyjnym dla P4₅₀1 7a. Tak więc, jest to ulepszony sposób wytwarzania 17a-hydroksysteroidów, w którym wychodzi się od 3e-hydroksysteroidów, ponieważ można hydroksylować w pozycji 17α wszystkie 3e-hydroksysubstraty.

Korzystny jest również sposób utleniania in vivo, w którym substratem jest 3e-hydroksysteroid, zaś zastosowanym szczepem jest szczep równocześnie wyrażający 3e-HSD i P4₅₀1 7a, przykładowo atf2-A: :TEF1p_rom/PGKterm, w którym otrzymany 17a-hydroksylo-3-okso-delta4-steroid izoluje się, o ile to konieczne. Korzystniej substratem steroidowym jest pregnenolon.

Transformowany szczep zmutowanych drożdży atf2 i sposób według wynalazku sugeruje ich korzystne zastosowanie w ulepszonym sposobie wytwarzania hydrokortyzonu albo jego produktów pośrednich w drożdżach.

Przykłady konstruowania szczepów według wynalazku i zastosowania sposobów według wynalazku opisane są poniżej w sekcji doświadczalnej.

Materiały i metody ogólne

1. Szczepy i pożywki

Szczepami S. cerevisiae zastosowanymi do przeprowadzenia wynalazku są: szczep TGY73.4 (MATa, URA3-A5, pra1-1, prb1-1, prc1-1, cps1-3, his), izogeniczna pochodna Leu+ C13ABYS86, opisana przez Achstetter i in., 1992 oraz szczep Fy1679 (MATa, URA3-52, trpl-A63, Ieu2-A1, his3-A200, fen1, GAL) opisany przez Thierry i in., 1990. Szczepy hodowano w kompletnej pożywce YPD (Diffco Laboratories) zawierającej 2% glukozy w 28°C, w warunkach opisanych przez F. Sherman, 1991.

Do transformacji S. cerevisiae, komórki ukompetentniano metodą z wykorzystaniem octanem litu (Ito i in., 1983). Drożdże hodowano rutynowo na minimalnej pożywce syntetycznej SD zawierającej 2% glukozy (F. Sherman, 1991) z dodatkiem koniecznych substancji odżywczych w stężeniu 100 pg/ml.

Szczep E. coli BJ5183 (D. Hanahan, 1983) zastosowano do rekombinacji in vivo, zaś szczep E. coli C600, hsdR (Hubacek i in., 1970) zastosowano do otrzymania szczepu biorcy produktu klasycznej reakcji ligacji.

2. Manipulacja DNA i rekombinacja in vivo w E. coli

Zastosowano ogólne metody biologii molekularnej opisane przez Sambrook i in., 1989. Sposób rekombinacji in vivo opisano w E. Degryse, 1995 i E. Degryse, 1996.

3. Test aktywności enzymatycznej APAT

Aktywność acetylotransferazy APAT oznaczano przez pomiar włączania [³H] octanu do pregnenolonu z [³H] acetylo-CoA (New England Nuclear). Ośrodek reakcji (500 pl) zawierał [³H] acetylo-CoA (20 pM, 25 Ci/mol) i pregnenolon (Sigma) (30 pM). Pregnenolon dodano w ilości 2 pl do mieszaniny tyloksapolu (Sigma)/etanolu (1:1) w buforze fosforanu potasu (20 mM), pH 7,0. Po inkubacji przez 15 minut w 30°C, reakcję zatrzymano przez dodanie 2 ml dichlorometanu.

Steroidy ekstrahowano dichlorometanem, następnie rozdzielano przez wysokowydajną chromatografię cieczowa o odwróconej fazie (dalej RP-HPLC) w warunkach izokratycznej elucji z acetonitrylem w kolumnie Ultrashepre ODS (Beckman) w 45°C na chromatografie HP 1090 (Hewlett-Packard) podłączonym do radiodetektora FLO-One 500 (Packard), który umożliwia pomiar ilości wytworzonego [³H]octanu pregnenolonu.

Jedną jednostkę APAT określono jako ilość enzymu, która daje 1 mmol octanu pregnenolonu na minutę w 30°C, w opisanych wyżej warunkach.

PL 198 376 B1

4. Oznaczanie stężenia białka

Stężenie białka oznaczano stosując zestaw do oznaczania stężenia białka (Bio-Rad) jako standard stosując albuminę surowicy bydlęcej.

Niektóre aspekty wynalazku przedstawiono na załączonych figurach.

Na figurze 1 pokazano szlak biosyntezy hydrokortyzonu z cholesterolu u ssaków.

Na figurach 2A i 2B pokazano biokonwersję pregnenolonu do octanu pregnenolonu w S. cerevisiae. Analizę przeprowadzono przez RP-HPLC przy 205 nm.

Na figurze 2A pokazano kinetykę tworzenia octanu pregnenolonu i znikanie pregnenolonu w odstępach czasu w ciągu 12 godzin inkubacji.

Na figurze 2B pokazano profil steroidów w t = 0 i w t = 10 godz. względem profilu standardów pregnenolonu i octanu pregnenolonu.

Na figurze 3 pokazano oczyszczanie APAT przez chromatografię na MonoP HR 5/20:

(A) pokazuje profil aktywności APAT występującej we frakcjach 10 do 20;

(B) pokazuje analizę SDS-PAGE połączonych i zatężonych frakcji 14, 15 i 16 barwionych błękitem Coomassie (ścieżka 2) w obecności znaczników ciężaru cząsteczkowego (ścieżka 1). Strzałka wskazuje prążek o ciężarze cząsteczkowym 62 kDa.

Na figurze 4 pokazano sekwencję aminokwasową, w kodzie jednoliterowym, białka YGR177c. Podkreślono peptydy sekwencjonowane w oparciu o białko APAT oczyszczone i trawione trypsyną.

Na figurze 5 pokazano strategię dysrupcji genu ATF2 przez połączenie z genem URA3 w podwójnej fuzji przez PCR. Słupki puste i zakreskowane pokazują, odpowiednio, sekwencje ATF2 i URA3.

Na figurze 6 pokazano wpływ dysrupcji genu ATF2 w S. cerevisiae na acetylację pregnenolonu. Obecność octanu pregnenolonu wykrywa się przez RP-HPLC przy 205 nm w oparciu o 16-godzinną hodowlę szczepu rodzicielskiego TGY73.4 (A) albo zmutowanego szczepu TGY158 (B).

Na figurach 7A, 7B i 7C przedstawiono schemat konstruowania plazmidów ekspresyjnych pTG10832 i pTG10862 ludzkiego 33-HSD w drożdżach.

Na figurze 7A opisano wytwarzanie fragmentu Mscl-Mlul zawierającego sekwencję kodującą ludzki 3e-HSD.

Na figurze 7B opisano wytwarzanie fragmentu Notl zawierającego blok ekspresji CYCp/3e-HSD/PGKt.

Na figurze 7C opisano wytwarzanie plazmidu pTG10832 i plazmidu pTG10862.

Na figurze 8 pokazano mapę restrykcyjną plazmidu pTG10832.

Na figurze 9 pokazano mapę restrykcyjną plazmidu pTG10862.

Na figurze 10 pokazano schemat konstrukcji plazmidu ekspresyjnego pTG10435.

Na figurze 11 pokazano schemat konstrukcji plazmidu ekspresyjnego pTG10058.

Na figurze 12 pokazano mapę restrykcyjną plazmidu pTG10058.

Na figurze 13 pokazano mapę restrykcyjną plazmidu pTG10293.

Na figurze 14 pokazano mapę restrykcyjną plazmidu pTG10435.

Na figurze 15A i 15B pokazano schemat konstruowania plazmidu pTG10274.

Figura 15A opisuje wytwarzanie plazmidu pTG10214.

Na figurze 16 przedstawiono mapę restrykcyjną plazmidu pTG10274.

Na figurze 17 przedstawiono mapę restrykcyjną plazmidu PTG10401.

Na figurze 18 przedstawiono schemat konstrukcji wektora ekspresyjnego pTG10262.

Na figurze 19 pokazano mapę restrykcyjną plazmidu pTG10262.

Na figurze 20 pokazano mapę restrykcyjną plazmidu pTG10403.

Na figurze 21 pokazano mapę restrykcyjną plazmidu pTG10417.

(Skróty oznaczeń enzymów restrykcyjnych: S, Sall; N, Notl; Bll, Bglll; M, Mlul; C, Cial; N°, utrata miejsca Notl; Xbal°, utrata miejsca Xbal; E, EcoRl).

P r z y k ł a d 1. ldentyfikacja aktywności APAT w drożdżach

A - Acetylacja in vivo pregnenolonu przez drożdże

Szczep TGY73.4 hodowano w 28°C w 10 ml pożywki YDP (Difco) zaszczepionej w A600 = 0,1, z 24-godzinnej hodowli wyjściowej, do której dodano 100 pl roztworu pregnenolonu w stężeniu 10 mg/ml w mieszaninie tergitolu (Sigma)/etanolu (1:1). Wytworzone steroidy identyfikowano w porcjach 250 pl pożywki pobranej w odstępach czasowych przez 10 godzin. Po ekstrakcji 2 ml dichlorometanu, fazy organiczne odparowano pod azotem, następnie pozostałość rozpuszczono w acetonitrylu. Steroidy analizowano przez RP-HPLC na kolumnie Ultrasphere ODS (Beckman) z następującymi kolejno eluenPL 198 376 B1 tami: 60% acetonitrylem w wodzie przez 10 minut, acetonitrylem 60-80% w wodzie przez 5 minut, 80% acetonitrylem przez 5 minut przy prędkości przepływu l ml/min, w 45°C z wykrywaniem przy 205 nm.

Otrzymane chromatogramy (fig. 2B) pokazują, że pregnonolon ulega metabolizmowi do bardziej niepolarnego produktu, który wykazuje TR identyczny ze standardem octanu pregnenolonu. Na figurze 2A pokazano, że pregnenolon ulega błyskawicznej konwersji do metabolitu w drożdżach.

Po traktowaniu zasadą (KOH w 6% metanolu), metabolit uwalniał produkt o TR identycznym z pregnenolonem. Identyfikację metabolitu jako octanu pregnenolonu potwierdzono przez spektrometrię mas.

B - Oczyszczanie enzymu o aktywności APAT

Szczep TGY73.4 hodowano w 10-litrowym fermentatorze w pożywce Kappeli (Fiechter i in., 1981) wzbogaconej 160 g/l glukozy w 30°C do A600 = 30. Komórki oddzielono przez wirowanie, płukano wodą, a następnie zawieszono w 4 litrach buforu 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 w 4°C (bufor A) zawierającym 1 mM PMSF. Komórki rozrywano w homogenizatorze Manton Gaulin przy ciśnieniu 1000 psi. Otrzymany lizat komórkowy odwirowano przy 12000 x g przez 15 minut w 40°C, a następnie dodano do nadsączu chlorek cynku w stężeniu końcowym 40 mM. pH ustalono na 5,5 przy użyciu 1N HCl i prowadzono precypitację przez 30 minut w 4°C. Po odwirowaniu przy 10000 x g przez 10 minut w 4°C, osad wyizolowano i zawieszono w 3 litrach buforu A zawierającego 100 mM EDTA i 1 mM PSMF. Po usunięciu EDTA przez diafiltrację na wkładzie Y10S10 (Amicon) wobec 30 litrów buforu A, pozostałość wprowadzono z szybkością 35 ml/min w 4°C do kolumny 1,5 l DEAE-Sephacel (Pharmacia) zrównoważonej uprzednio buforem A. Po przepłukaniu kolumny buforem A, a następnie buforem A zawierającym 0,15 M NaCl, aktywność APAT eluowano buforem A zawierającym 0,4 M NaCl. Połączono frakcje DEAE-Sephacel zawierające aktywność APAT, co zmierzono jak to opisano wyżej w „materiałach i metodach ogólnych”, dodano NaCl w stężeniu końcowym 2M, następnie wprowadzono z szybkością 15 ml/min, w 4°C do kolumny 500 ml Phenyl-Sepharose (Pharmacia) zrównoważonej uprzednio w buforze A, zawierającym 2 M NaCl. Po płukaniu kolumny buforem A zawierającym 0,5 M NaCl, aktywność APAT eluowano przy użyciu 1,5 litra liniowego gradientu cholanu sodu, od 0 do 1% w buforze A. Frakcje zawierające aktywność APAT połączono, a następnie zatężono przez ultrafiltrowanie na membranie YM10 (Amicon), a następnie przechowywano w -80°C do wykorzystania.

Cały proces powtórzono jeszcze raz, aby wytworzyć odpowiednią ilość materiału do prowadzenia oczyszczania.

Materiał oczyszczony z dwóch wspomnianych preparatów roztopiono, wprowadzono z szybkością 4 ml/min, w 4°C do kolumny 100 ml Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) zrównoważonej buforem A. Po płukaniu kolumny tym samym buforem, aktywność APAT eluowano w 500 ml liniowego gradientu NaCl od 0 do 1M w tym samym buforze. Frakcje Q-Sepharose zawierające aktywność APAT połączono i wprowadzono bezpośrednio z szybkością 2,5 ml/min. w 4°C do kolumny 7 ml cholanu sodu unieruchomionego na perełkach Sepharose (Pharmacia) uprzednio zrównoważonych buforem A zawierającym 0,5 M NaCl. Po przepłukaniu kolumny tym samym buforem, aktywność APAT eluowano 100 ml liniowego gradientu cholanu sodu od 0 do 1% w tym samym buforze. Frakcje zawierające aktywność APAT połączono, zatężono przez ultraf iltrację na membranie YM10 (Amicon) do stężenia 1,8 mg/ml, a następnie przechowywano w -80°C.

Aktywność APAT oczyszczono około 500-krotnie, w oparciu o aktywność właściwą z wydajnością 16%, jak pokazano w tabeli 1, poniżej.

T a b e l a 1

Etap	Aktywność APAT Qedn.)	Białko (mg)	Aktywność właściwa (jedn./mg)	Oczyszczenie	Wydajność
Nadsącz po 12000 x g	8,057	42,242	0,19	1,0	100
Precypitacja cynkiem	10,453	28,040	0,37	1,9	129
DEAE-Sephacel	6,399	5,009	1,28	6,7	79
Phenyl-Sepharose	3,316	489	6,78	35,7	41
Q-Sepharose	1,712	39	43,9	231	21
Cholan-Sepharose	1,300	13	100	526	16

PL 198 376 B1

Połowę częściowo oczyszczonego materiału otrzymanego jak wyżej (około 6 mg białka) rozmrożono i dodano PEG 4000 (Prolabo) do końcowego stężenia 20% (wag./obj.) w celu wyeliminowania cholanu i NaCl. Po mieszaniu przez 30 minut w 4°C, zebrano precypitat przez wirowanie przy 12000 x g przez 30 minut w 4°C i ponownie rozpuszczono w 4 ml buforu A. Otrzymany roztwór wprowadzono z szybkością 1 ml/min do kolumny MonoP HR5/20 (Pharmacia) uprzednio zrównoważonej buforem 25 mM bis-Tris pH 6,3. Aktywność APAT eluowano przy użyciu buforu Polybuffer 74 pH 4,0 (Pharmacia). Pobierano po 1 ml z frakcji, każdą w obecności 50 μΙ buforu 2M Tris-HCI, pH 8,0 w celu ograniczenia inaktywacji enzymu w kwaśnym pH. Frakcje 14, 15 i 16 (figura 3(A)) zawierające najwyższą aktywność APAT połączono, zatężono na membranie YM10, a następnie przechowywano do momentu wykorzystania w -80°C. Aktywną frakcję poddano SDS-PAGE na 10% żelu poliakryloamidowym. Po zabarwieniu błękitem Coomassie wykazano kilka prążków, przy czym główny prążek o ciężarze cząsteczkowym 62 kDa (figura 3(B)), identyczny z ciężarem cząsteczkowym określonym podczas filtracji na żelu Superose 6 (Pharmacia) i odpowiadającym aktywności APAT.

C - Właściwości APAT a) Swoistość substratowa

Według opisanej wyżej metody dla acetylo-CoA i pregnenolonu, stosując różnych donorów acylu i różne substraty steroidowe wpół oczyszczona APAT przenosiła resztę octanu na 3p-ol, delta⁴- albo delta⁵-steroidy z porównywalną skutecznością, podczas gdy transfer na estrogeny był niewielki, zaś niewykrywalny w przypadku steroli, oraz z zaznaczoną preferencją dla Acetylo-CoA jako donora grupy acylowej.

Tabela 2 poniżej, w której dla a) testy przeprowadzono z 30 μM steroidami i 100 μM [³H]acetylo-CoA i dla b) przeprowadzono z 100 μM każdego z donorów acylu i 30 μM [³H]pregnenolonu, przedstawia otrzymane wyniki.

T a b e l a 2

Substrat a)	Aktywność względna (%)	Substrat b)	Aktywność względna (%)
pregnenolon	100	acetylo-CoA	100
17a-OH pregnenolon	89	propionylo-CoA	33
DHEA	104	butyrylo-CoA	16
4-pregnen-3pol-20-on	70	heksanoilo-CoA	18
5p-pregnan-3pol-20-on	1,8	oleilo-CoA	nie wykryto
17p-estradiol	5,0
estron	2,5
cholesterol	0,6
ergosterol	0,4

b) Inhibicja

Aktywność APAT jest silnie hamowana przez reagenty z grupy sulfhydryli, jak NEM albo DTNB. Zahamowanie jest całkowite w obecności chlorku cynku (1 mM).

D - Częściowa sekwencja aminokwasowa

Częściową sekwencję aminokwasowa określono po trawieniu trypsyną skrawków żelu sposobem opisanym przez Rosenfeld i in., 1992.

Wychodząc od dwóch trzecich stężonego roztworu otrzymanego wyżej, a następnie rozdzielonego przez SDS-PAGE, prążek 62 kDa wycięto, a następnie inkubowano z trypsyną (Promega). Wytworzone peptydy rozdzielono przez RP-HPLC na kolumnie Vydac 218TP (1,5 x 125 mm) z szybkością 100 μl/min., stosując gradient liniowy acetonitrylu od 0 do 60% w 80 minut, następnie 60-100% w 20 minut w roztworze 0,1% TFA w wodzie, a następnie poddano sekwencjonowaniu aminokwasów.

Sekwencję końca N określono na sekwenatorze białek model 477A połączonym z analizatorem HPLC aminokwasów PTH (Applied Biosystems). Wśród sekwencjonowanych próbek dwa szczyty x i y dawały niewątpliwą sekwencję tworzącą następujące peptydy 10- i 16-aminokwasowe:

szczyt x: ISEQFKKDDF szczyt y: LIELISPYIIPLGNPK

PL 198 376 B1

Dwie sekwencje peptydowe zastosowano do badania przesiewowego bazy danych genomu

S. cerevisiae. Ziddntyfikkwano białkk wielkkści 62 kDa, któregg sskwencja zzwierała ddkłaanie sskwencje pokazane wyżej (Mips, nr dostępu S24491, Hebling i in., 1992). Białko, którego sekwencję pokazano na fig. 4 i którego funkcji jeszcze nie opisano, najprawdopodobniej jest kodowane przez gen w loeus YGR177c. Na podstawie identyczności rzędu około 37% sekwencji aminokwasowej, pomiędzy białkiem według wynalazku o aktywności acetylotransferazy oraz produktem genu AFT1 S. evevvisiev, opisanego przez Fuji i in. (1994), któremu przypisuje się aktywność dehydrogenazy alkoholowej, należy zastosować oznaczenie AFT2 dla genu kodującego białko o aktywności APAT w S. evevvisiev.

P r z y k ł a d 2. Konstruowanie szczepów drożdży z dysrupcją genu AFT2 przez gen URA3, które wykazują brak aktywności APAT (atf2-A: :URA3)

A) kierowanie do genu ATF2

Gen URA3 S. cerevisiae wprowadzono przez zastąpienie wybranej części genu AFT2 S. cerevisiae, co umożliwia następnie selekcję zmutowanych szczepów przez prototrofię z uracylem.

Znacznik selekcyjny URA3 połączono z genem ATF2 przez podwójną fuzję PCR według metody opisanej przez Amberga i in., 1995. Stosowaną strategię, przedstawioną na figurze 5, stanowiły 4 reakcje PCR. Pierwsze dwie reakcje (oznaczone PCR1) umożliwiły, odpowiednio, amplifikację regionów 5' i 3' flankujących miejsce wprowadzenia znacznika URA3 w docelowym genie ATF2, który uległ dysrupcji, zaś trzecia reakcja (oznaczona PCR2) umożliwiła amplifikację genu znacznikowego URA3. Podwójna fuzja (oznaczona PCR3) umożliwiła połączenie regionów 5' i 3' docelowego genu ATF2 z genem znacznikowym URA3 (oznaczone 5 ' ATF2-URA3-3'ATF2).

Najpierw, próbkę komórek szczepu Fyl279 zastosowanych jako źródło DNA docelowego genu ATF2 amplifikowano w buforze PCR zawierającym 2 mM dNTP (Pharmacia) w następujących warunkach: 25 cykli; 93°C, 30 sek.; 54°C, 2 min.; 28°C, 3 min., a następnie wydłużanie przez 5 minut w 72°C; z polimerazą Ampli Taq (Perkin Elmer).

Z jednej strony, region 5' genu ATF2 amplifikowano przez PCR stosując jako startery bezpośrednie i pośrednie oligonukleotydy o następującej sekwencji:

OTG10841 (Id. Sekw. nr 1):

AAAAGTCGACAAAATGGAAGATATAGAAGGATACGAACCACATATCACTC i

OTG10844 (Id. Sekw. nr 2):

ATCAATCTCCAATTAGGCCTCTTCGGATTACCC, które obejmowały region homologiczny do regionu 5' sekwencji genu ATF2 (SGD: YGR177c) oraz przez dodanie miejsca restrykcyjnego Sali do OTG10841.

Z drugiej strony, region 3' genu ATF2 amplifikowano przez PCR stosując jako startery bezpośrednie i pośrednie oligonukleotydy o następujących sekwencjach:

OTG10842 (Id. Sekw. nr 3)

CATTCGACATTCCCGAAGGTGACAATGACAAG i

OTG10842 (Id. Sekw. nr 4)

AAAAACGCGTAACTATTAAAGCGACGCAAATTCGCCGATGGTTTGG, które obejmowały region homologiczny do regionu 3' sekwencji genu ATF2 (SGD: YGR177c) i przez dodanie miejsca restrykcyjnego Mlul do OTG10842.

Po drugie, gen URA3 S. evevvisiev amplifikowano przez PCR stosując jako starter bezpośredni oligonukleotyd o sekwencji:

OTG10843 (Id. Sekw. nr 5)

GGGTAATCCGAAGAGGCCTAATTGGAGATTGATAAGCTTTTCAATTCAATTCATCATTTTTTT

-TTTATTCTTTTTTTTTTG, który obejmował sekwencję homologiczną do regionu 5' opublikowanej sekwencji genu URA3 (Rose i in., 1984; GENBANK: YSCODCD dostęp: K02207; SGD: YEL021w) połączoną z sekwencją homologiczną z regionem 5' genu ATF2 (komplementarną do OTG10844) oraz jako starter pośredni oligonukleotyd o sekwencji:

OTG10845 (Id. Sekw. nr 2)

CTTGTCATTGTCACCTTCGGGAATGTCGAATGGGGTAATAACTGATATAATTAAATTGAACTC, który obejmował sekwencję homologiczną do regionu 3' genu URA3 połączoną z sekwencją homologiczną z regionem 3' genu ATF2 (komplementarną do OTG10842). 20 ng próbkę DNA genu URA3, wyizolowaną z wektora wahadłowego E. eoli-drożdże pTG10021 (Degryse i in., 1995) przez trawienie enzymem restrykcyjnym Hindlll amplifikowano w warunkach podanych wyżej.

PL 198 376 B1

Otrzymane produkty PGR odpowiednio oczyszczono stosując zestaw GeneClean (Bio 101 Inc.,

La Jolla, USA), poddano następnie reakcji podwójnej fuzji stosując jako startery wspomniane uprzednio oligonukleotydy OTG10841 i OTG10842 w warunkach amplifikacji zastosowanych do poprzednich reakcji PGR z programem 20 cykli.

Po oczyszczeniu końcowego produktu fuzji, który zawierał regiony flankujące gen ATF2 poddany fuzji z funkcjonalnym genem URA3, obecność genu URA3 potwierdzono przez trawienie enzymem restrykcyjnym EcoRV, który wykazał obecność tego miejsca w amplifikowanym materiale.

B) Wytworzenie szczepu drożdży atf2-A: :URA3

Produkt fuzji otrzymany jak wyżej transformowano bezpośrednio do komórek kompetentnych szczepu Fy1679 albo TGY73.4 i selekcjonowano transformanty przez wzrost na pożywce SD (F. Sherman, 1991) w obecności koniecznych substancji odżywczych i pod nieobecność uracylu.

Wychodząc od izolowanych klonów, wykazano nowe kombinacje pomiędzy regionem 5' genu ATF2 i genu URA3 (5'ATF2-URA3-3'ATF2) przez amplifikację PGR całych komórek przy użyciu opisanych starterów OTG10841 i OTG10845. Nieobecność aktywności APAT wykazano in vitro według testu opisanego na podstawie homogenatu komórkowego, w porównaniu z rodzicielskim szczepem, który wykazywał znaczną aktywność APAT.

Szczepy spełniające te kryteria charakteryzowano jako zmutowane szczepy atf2 i oznaczono atf2-A: :URA3. Otrzymany w ten sposób szczep pochodzący od szczepu rodzicielskiego Fy1679 oznaczono TGY156, zaś zmutowany szczep pochodzący od szczepu rodzicielskiego TGY73.4 oznaczono TGY158.

Próbkę szczepu TGY156 zdeponowano w Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, Francja 2 lutego, 1998 roku pod numerem 1-1977.

Próbkę szczepu TGY158 zdeponowano w Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, Francja 2 lutego, 1998 roku pod numerem 1-1976.

C) Stabilizacja pregnenolonu in vivo w hodowlach szczepów drożdży atf2-A: :URA3

Komórki szczepu TGY158 otrzymane jak wyżej zaszczepiono przy A600 = 0,1 w pożywce YPD (Difco) zawierającej 100 (0,g/ml pregnenolonu. Po 16 godzinach inkubacji w 28°C, steroidy ekstrahowano dichlorometanem i analizowano przez RP-HPLC, jak to opisano wyżej. Figura 6(B) pokazuje, że zmutowane TGY158 utraciły zdolność do estryfikacji pregnenolonu, podczas gdy w tych samych warunkach hodowli szczep rodzicielski TGY73.4 przekształcał pregnenolon w octan pregnenolonu (figura 6(A)).

Na podstawie tych wyników można wywnioskować, że produkt genu ATF2 jest odpowiedzialny za estryfikację pregnenolonu przez drożdże, podczas gdy przerwanie genu ATF2 nie prowadzi do wyraźnej zmiany wzrostu komórki w normalnych warunkach.

P r z y k ł a d 3. Konstruowanie szczepu drożdży z dysrupcją genu ATF2 przez gen URA3 wyrażającego 3p-HSD

Do zmutowanych szczepów drożdży atf2-A: :URA3 transformowano plazmidy 2 μ, niosące sekwencję cDNA kodującą ludzki 3p-HSD pod kontrolą promotora CYC1 S. cerevisiae albo promotora TEF1 S. cerevisiae i niosących gen oporności na G418, które zostały skonstruowano według schematu przedstawionego na figurach 7A do 7C.

Najpierw, wektor transferowy pTG10095, zawierający sekwencję cDNA kodującą 3p-HSD typu II, opisaną przez Rheaume i in., 1991, oflankowaną przez miejsca SalI i Mlul i położoną poniżej promotora drożdżowego GAL10/CYC1, wytworzono w następujący sposób.

Sekwencję kodującą 3p-HSD opisaną przez Rheaume i in., 1991, klonowano jako fragment restrykcyjny Sall-Notl w tych samych miejscach wektora pBluescript II (Stratagene). Otrzymany wektor, opisany przez Rheaume i in., 1991, zawierał miejsce Notl położone na końcu 3' sekwencji kodującej 3p-HSD. Wektor ten trawiono enzymem Notl i traktowano fragmentem Klenowa w obecności dNTP w celu wypełnienia lepkich końców, a następnie poddano ligacji w obecności oligonukleotydu o następującej sekwencji:

OTG4461 (Id. Sekw. nr 7)

CACACGCGTGTG uprzednio fosforylowanego i hybrydyzowanego ze sobą, w taki sposób, że wprowadzono miejsce Mlul. Tak otrzymany wektor pTG10082 (figura 7A) zawierał sekwencję kodującą 3p-HSD zawierającą miejPL 198 376 B1 sce Bglll i zakończony miejscami Sali i Mlul, podczas gdy usunięto miejsce Notl. Wektor ten zawierał naturalny, nie kodujący region 5' zidentyfikowany przez obecność miejsca Bglll.

W celu doprowadzenia miejsca Sali w pobliże początku ATG, powyżej którego zamierzano wprowadzić promotor GAL10/CYC1, wektor pTG10082 trawiono enzymem MscI, którego miejsce położone jest w niekodującym regionie 5', tuż powyżej początku ATG i przy miejscu Mlul. Fragment MscI-MluI wielkości 1,8 kb, zawierający sekwencję kodującą 33-HSD (figura 7A) wyizolowano, a następnie poddano ligacji z plazmidem pTG10033 (Degryse i in., 1995) zawierającym promotor GAL10/CYC1, uprzednio trawiony enzymem restrykcyjnym Sali, a następnie trawionym enzymem restrykcyjnym Mlul. W ten sposób otrzymano wektor pTG10095 (figura 7B).

Następnie, skonstruowano wektor rekombinacyjny pTG10268 zawierający plazmid 2 μ drożdży, replikon E. coli, kasetę ekspresji CYC1p_rom-PGKterm oraz znacznik selekcyjny LEU2 (figura 7B). Wektor ten jest identyczny z opisanym wektorem pTG10159 (Degryse i in., 1995), oprócz tego, że miejsce Xbal zawarte w regionie 2 μ, który zastąpiono przez znacznik Xbal° otrzymany przez wypełnienie naturalnego miejsca Xbal w obecności fragmentu Klenowa, a następnie przez ligację.

Plazmid ekspresyjny pTG10268 wytworzono przez rekombinację homologiczną, przez wprowadzenie bloku ekspresji zawierającego promotor GAL10/CYC1p, otrzymany z plazmidu pTG10095 wytworzonego jak wyżej, a następnie trawionego enzymem Notl, w plazmidzie pTG10260 trawionym enzymami restrykcyjnymi Sali i Mlul. Plazmid pTG10268 (figura 7B) zawierał sekwencję kodującą ludzką 33-HSD typu II pod kontrolą promotora CYC1.

Plazmid ekspresyjny pTG10862 zawierający sekwencję kodującą 33-HSD pod kontrolą promotora TEF1 skonstruowano w następujący sposób (figura 7C).

Plazmid pTG10832 (figura 8) skonstruowano przez rekombinację homologiczną pomiędzy fragmentem Notl otrzymanym z plazmidu pTG10268 wytworzonego jak wyżej, następnie trawiono enzymem Notl i rekombinowany plazmid pTG10164 (Degryse i in., 1995) trawiony uprzednio enzymami Sali i Mlul.

Plazmid ekspresyjny pTG10862 otrzymano przez wprowadzenie promotora TEF1, zawartego we fragmencie Clal-Sall wyizolowanym z plazmidu pTG10085 (Degryse i in., 1995) w miejsce CYC1 wyciętego przez trawienie plazmidu pTG10832 skonstruowanego jak wyżej przez enzymy restrykcyjne CiaI i SalI.

Tak otrzymany plazmid pTG10862 (figura 9) i zawierający sekwencję cDNA kodującą ludzką 33-HSD typu II transformowano, odpowiednio, do szczepu rodzicielskiego TGY73.4 albo jego mutanta atf2-A: :URA3 odpowiadającego szczepowi TGY158 otrzymanemu w przykładzie 2, jak również do szczepu rodzicielskiego FY1679 albo do jego mutanta atf2-A: :URA3, odpowiadającemu szczepowi TGY156 otrzymanemu w przykładzie 2. Transformaty wyizolowano jak opisano wyżej na pożywce YPD (Difco) zawierającej G418 w stężeniu 250 gg/ml.

Otrzymane w ten sposób potencjalne kolonie hodowano na podłożu SD zawierającym składniki odżywcze niezbędne dla każdego ze szczepów (histydyna albo uracyl dla szczepu TGY73,4; histydyna dla TGY158; tryptofan, histydyna, leucyna i uracyl dla szczepu FY1679; tryptofan, histydyna i leucyna dla szczepu TGY156, w stężeniu 100 gg/ml), zaszczepiono w pożywce zawierającej 100 gg/ml pregnenolonu. Po 24 godzinach wzrostu i biokonwersji w 28°C, steroidy ekstrahowano i oznaczano przez RP-HPLC, jak to opisano uprzednio. Otrzymane wyniki, zmierzone na 3 klonach z każdego szczepu, przedstawiono w tabeli 3, poniżej.

T a b e l a 3

Szczep	Plazmid	Pregnenolon (gg/ml)	Progesteron (gg/ml)
TGY73.4	pTG10862	1	0,0
TGY158		94	15,2
FY1679		1	1,3
TGY156		100	13,0

Przedstawione wyniki pokazują, że substrat, pregnenolon, jest odzyskiwany niemal ilościowo w przypadku zmutowanych szczepów TGY156 albo TGY158, w których obserwuje się występowanie biokonwersji pregnenolonu do progesteronu podczas gdy obserwuje się całkowite znikanie pregneno12

PL 198 376 B1 lonu w rodzicielskim szczepie TGY73.4 albo FY1679, który wytwarza niewiele, jeżeli w ogóle, progesteronu, ale gromadzi octan pregnenolonu jak pokazano w przykładzie 2.

Zmodyfikowany szczep TGY158/pTG10862 zdeponowano w Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, Francja 2 lutego, 1998 roku pod numerem 1-1978.

P r z y k ła d 4. Konstruowanie szczepu drożdży z dysrupcją genu ATF2 przez TEF1p_rOm/PGKterm (atf2-A: :TEF2/PGK)

Szczep TGY186, który pochodzi ze szczepu TGY156 (atf2-A: :TEF2/PGK) opisanego w przykładzie 2, w którym gen URA3 w locus ATF2 zastąpiono przez blok ekspresji TEF1p_ram/PGKterm skonstruowano w następujący sposób.

Połączono blok ekspresji TEF1p_rom/PGKterm z genem ATF2 przez podwójną fuzję PGR w warunkach opisanych w przykładzie 2, ale stosując blok ekspresji TEF1p_rom/PGKterm S. cerevisiae opisany przez Degryse i in., 1995, zamiast znacznika selekcji URA3.

Pierwsze dwie reakcje PGR (PCR1) umożliwiające, odpowiednio, amplifikację regionów 5' i 3' flankujących miejsce wprowadzenia TEF1p_ram/PGKterm w przerwanym genie ATF2, przeprowadzono stosując, jako startery bezpośrednie i pośrednie, dla regionu 5' oligonukleotydy o następującej sekwencji:

OTG11049 (Id. Sekw. nr 8):

CTCTCTGTCGACATGGAAGATATAGAAGGATACGAACCACATATCACTC i

OTG10844 (Id. Sekw. nr 9)

ATCAATCTCCAATTAGGCCTCTTCGGATTACCC oraz dla regionu 3' oligonukleotydy o sekwencji:

OTG10846 (Id. Sekw. nr 10)

CATTCGACATTCCCGAAGGTGACAATGACAAG i

OTG11050 (Id. Sekw. nr 11)

AACAACACGCGTAACTATTAAAGAGACGCAAATTCGCCGATGCTTTGG

Startery OTG11049 i OTG11050 zaprojektowano do wprowadzenia, odpowiednio, miejsca restrykcyjnego SalI i Mlul.

Trzecią reakcję PGR (PCR2) umożliwiającą amplifikację bloku TEF1p_ram/PGKterm przeprowadzono przy użyciu starterów, odpowiednio bezpośrednich i pośrednich, oligonukleotydów o następujących sekwencjach:

OTG11052 (Id. Sekw. nr 12)

GGGTAATCCGAAGAGGCCTAATTGGAGATTGATATCGATCACACACCATAGCTTCAAAATG-TTTCTAC i

OTG11053 (Id. Sekw. nr 13)

CTTGTCATTGTCACCTTCGGGAATGTCGAATCTTCGAAACGCAGAATTTTCGAAGTTATTAA-CTTAA, które wprowadzały miejsca restrykcyjne CiaI i Hindlll.

Na koniec, przeprowadzono połączenie przez podwójną fuzję otrzymanych produktów PGR, stosując jako startery oligonukleotydy o sekwencji OTG11049 (Id. Sekw. nr 8) i OTG11050 (Id. Sekw. nr 11), które wprowadzały miejsca restrykcyjne Sali i Mlul w miejsca połączeń.

Po oczyszczaniu, końcowy produkt fuzji rekombinowano z genem ATF2 zawartym w plazmidzie pTG10885, skonstruowanym jak to opisano wyżej i trawionym enzymami restrykcyjnymi Bstl i Stul. Tak skonstruowano plazmid pTG10888, zawierający blok TEF1p_ram/PGKterm zakończony miejscami CiaI i Hindlll, otaczającymi regiony flankujące genu ATF2.

Wytworzenie plazmidu pTG10885 obejmuje amplifikację genu ATF2 wychodząc od szczepu FY1679 w oparciu o warunki opisane w przykładzie 2, ale z zastosowaniem jako starterów, odpowiednio, bezpośredniego i pośredniego, oligonukleotydów o sekwencji OTG11049 (Id. Sekw. nr 8) i OTG11050 (Id. Sekw. nr 11), które wprowadzały miejsca restrykcyjne SalI i Mlul. W otrzymanym produkcie PGR miejsca te zostały wyeliminowane przez trawienie enzymami restrykcyjnymi SalI i Mlul i traktowanie fragmentem Klenowa polimerazy I E. coli, w celu wypełnienia lepkich końców. Otrzymany fragment poddano ligacji z wektorem ekspresyjnym pTG10031 opisanym przez Degryse i in., 1995, trawionym uprzednio enzymami CiaI i Hindlll, a następnie traktowanym fragmentem Klenowa. Przez transformację E. coli otrzymano plazmid pTG10031, powstały z ligacji miejsca SalI produktu PGR, wypełniono przy użyciu fragmentu Klenowa w taki sposób, że otrzymano sekwencję AGCTT aby zrekonstruować miejsce Hindlll (GTCGAAGCTT) (Id. Sekw. nr 14) i usunąć miejsce CiaI. Miejsce CiaI

PL 198 376 B1 wektora wypełniono fragmentem Klenowa w taki sposób, aby otrzymać zniszczenie sekwencji ATCG po ligacji z produktem PCR.

Następnie, z plazmidu pTG10888 wycięto sygnał TEF1p_ram/PGKterm w postaci fragmentu Notl wielkości 1,8 kb, a następnie wymieniono ze markerem URA3 w szczepie TGY156 (atf2-A: :URA3).

Szczep TGY156, wytworzony w przykładzie 2 zastosowano jako szczep gospodarza i poddano równoczesnej transfekcji DNA wyciętym z plazmidu pTG10888 i wektorem drożdżowym zawierającym początek ARS, oznaczonym jako Yrp7 i opisanym przez Struhl i in., 1979, który to umożliwiał uzupełnienie zapotrzebowania szczepu TGY156 na tryptofan oraz selektywne wykrywanie kolonii na podstawie ich oporności na kwas 5-fluoroorotowy (5-FO).

do 5 pg DNA wyciętego z plazmidu pTG10888 przez trawienie enzymem restrykcyjnym Notl i z plazmidu Yrp7 wprowadzono do szczepu TGY156 metodą z wykorzystaniem octanu litu (Ito i in., 1983). Selekcja pod względem uzupełnienia zapotrzebowania na tryptofan szczepu przeprowadzona została po rozsianiu na szalkach agarowych z pożywką YNGB (Difco) wzbogaconą histydyną i leucyną (100 pg/ml). Potencjalne kolonie zebrano przy użyciu wykałaczek i umieszczono na pożywce zawierającej 5-FO wytworzony jak to opisano w Boeke i in., 1984, a następnie potwierdzono oporność na 5-Fow na tej samej pożywce, przy czym utrata wektora Yrp7 w klonie opornym na 5-FO wskazywana była utratą zapotrzebowania na tryptofan. Wśród wyselekcjonowanych klonów, kombinację genu ATF2 z TEF1p_ro_m/PGKterm badano przez PGR. W ten sposób otrzymano szczep TGY186.

P r z y k ł a d 5. Konstruowanie szczepu drożdży posiadającego gen ATF2 zniszczony przy użyciu TEF1p_ram/PGKterm i wyrażającego P₄₅₀1 7a

Plazmid (pTG10435) zawierający drożdżowy początek replikacji ARSH4/CEN6, znacznik selekcyjny URA3 i niosący sekwencję cDNA kodującą bydlęcy cytochrom P₄₅₀1 7a pod kontrolą promotora TEF1 S. cerevisiae skonstruowano według schematu na figurze 10, a następnie transformowano do zmutowanego szczepu drożdży atf2-A: :TEF1/PGK (TGY186). Najpierw, plazmid pTG10058 zawierający sekwencję cDNA kodującą bydlęcy cytochrom P4₅₀1 7a opisany przez Zuber i in., 1986, flankowany przez miejsca SalI i Mlul i położony poniżej promotora drożdżowego CYC1 wytworzono według schematu z figury 11. Plazmid pGB17a-5 opisany w zgłoszeniu patentowym WO 89/10963 i zawierający sekwencję kodującą bydlęcy cytochrom P4₅₀1 7a otworzono przez trawienie enzymem restrykcyjnym Xhol, a następnie traktowano fosfatazą alkaliczną. Po fosforylacji i hybrydyzacji, oligonukleotydy o następujących sekwencjach:

OTG4511 (Id. Sekw. nr 15) TCGACGGACGCGTGG i

OTG4512 (Id. Sekw. nr 16) TCGACCACGCGTCCG wprowadzono w miejsce Xhol tworząc plazmid pTG10104. Plazmid pTG10104 traktowano enzymami restrykcyjnymi SalI i Mlul, wprowadzono do plazmidu pTG10031 opisanego przez Degryse i in., 1995, zawierającego promotor drożdżowy CYC1, uprzednio trawionego enzymami restrykcyjnymi SalI i Mlul, a następnie traktowano fosfatazą alkaliczną. Otrzymano w ten sposób wektor pTG10058 zawierający cDNA kodujący bydlęcy cytochrom P4₅₀1 7a (figura 12). Następnie plazmid pTG10058 trawiono enzymami restrykcyjnymi SalI i Mlul i traktowano fosfatazą alkaliczną. Wyizolowano fragment Sall-MluI wielkości 1,7 kb, zawierający sekwencję kodującą bydlęcy cytochrom P4₅₀1 7a, poddano ligacji z wektorem ekspresyjnym pTG10085 opisanym przez Degryse i in., 1995 i zawierającym drożdżowy promotor TEF1, uprzednio trawiony enzymami SalI i Mlul. Otrzymano plazmid pTG10293 (figura 13), w którym sekwencja kodująca cytochrom P4₅₀1 7a znajduje się pod kontrolą promotora TEF1.

Następnie, wytworzono plazmid ekspresyjny pTG10435, przez rekombinację homologiczną pomiędzy plazmidem rekombinacyjnym pTG10434 opisanym przez Degryse i in., 1995 i zawierającym sekwencję ARSH4/CEN6, uprzednio trawiony enzymami SalI i Mlul i fragment Notl wielkości 2,8 kb otrzymany z plazmidu pTG10293.

Tak otrzymany plazmid pTG10435 (figura 14), który zawiera sekwencję kodującą bydlęcy cytochrom P4₅₀1 7a pod kontrolą promotora TEF1 transformowano do szczepu rodzicielskiego FY1679 albo szczepu TGY186 (atf2-A: :TEF1/PGK) wytworzonego według przykładu 4. Transformanty wyizolowano w opisany wyżej sposób na podłożu YNBG (Difco) wzbogaconym tryptofanem, histydyną i leucyną (100 pg/ml). Tak otrzymane kolonie hodowano przez 16 godzin na podłożu YNB (Difco) zawierającym 2% glukozę i 0,5% aminokwasów (ang. casaaminoacids), rozcieńczone świeżą pożywką do A600 = 0,2. Po 6 godzinach hodowli dodano 100 pl/ml pregnenolonu albo progesteronu. Po 48 godzinach hodowli i biokonwersji w 28°C steroidy ekstrahowano i mierzono przez RP-HPLC, jak to opisano w przykładzie 1 stosując, odpowiednio, wzorce pregnenolonu i 17a-hydroksypregnenolonu albo progesteronu i 17a-hydroksyprogesteronu.

PL 198 376 B1

Otrzymane wyniki wyrażone w pg/ml pokazano w tabeli 4, niżej.

T a b e l a 4

Szczep	FY1679/pTG10435	TGY186/pTG10435
Substrat: Pregnenolon
Pregnenolon	0	67,1
17a-hydroksypregnenolon	0	42,0
Substrat: Progesteron
Progesteron	46,5	41,4
17a-hydroksyprogesteron	29,3	33,1

Wyniki te pokazują, że zdolność cytochromu P₄₅c)17a wyrażanego z wektora pTG10435 do biokonwersji jest niemal taka sama jak tego ze szczepu typu dzikiego (FY) albo zmutowanego szczepu atf2 (TGY186) z progesteronem jako substratem. Z drugiej strony, przy użyciu pregnenolonu jako substratu, w porównaniu z progesteronem, biokonwersja jest identyczna, ale wyłącznie w przypadku mutanta atf2 (TGY186). W szczepie typu dzikiego FY, oba substraty i produkty ulegają acetylacji i nie stwierdza się wolnego hydroksyprogesteronu.

Szczep TGY186/pTG10435 zdeponowano w Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, Francja 20 stycznia, 1999 roku pod numerem 1-2119.

Pr zyk ład 6. Konstruowanie szczepu drożdży z dysrupcją genu ATF2 przez TEF1p_ram/PGKterm i wyrażającego równocześnie 3p-HSD i P₄₅o17a

Plazmid pTG10417 (figura 21) zawierający drożdżowy replikon 2 μ i dwa bloki ekspresji, jeden kodujący ludzką 3p-HSD, zaś drugi kodujący bydlęcy cytochrom P₄₅o17a, oba pod kontrolą promotora CYC1 S. cerevisiae i niosące znacznik selekcyjny UKA3-d, skonstruowano w oparciu o kolejne etapy 1 do 3 opisane niżej (figury 15A i B), a następnie etapy 4 do 6 opisane niżej, a następnie transformowane do zmutowanego szczepu drożdży atf2-A: :TEF1p_rom/PGKterm (TGY186).

Etap 1: Konstruowanie plazmidu pTG10210

Wektor ekspresyjny pTG10033 opisany przez Degryse i in., 1995 i zawierający hybrydowy promotor drożdżowy GAL10/CYC1 trawiono enzymem restrykcyjnym PvuII, po czym traktowano fosfatazą alkaliczną i poddano ponownej ligacji w obecności oligonukleotydu o następującej sekwencji:

OTG1050 (Id. Sekw. nr 17):

CCCGAATTCGGG uprzednio fosforylowanego i hybrydyzowanego ze sobą w celu wytworzenia miejsca EcoRI na końcach bloku ekspresji zawierającego promotor GAL10/CYC1.

Etap 2: Konstruowanie plazmidu pTG10214

Blok ekspresji zawierający promotor GAL10/CYC1 w wektorze pTG10210 wprowadzono do wektora wahadłowego E. co/i-drożdże pTG10013 opisanego przez Degryse i in., 1995 i zawierającego znacznik selekcyjny URA3-d. Wektor pTG10013, po trawieniu EcoRI i traktowaniu fosfatazą alkaliczną poddano ligacji z wektorem pTG10210 wytworzonym w etapie 1, trawionym EcoRI. Otrzymany wektor pTG10214 zawierał blok ekspresji zawierający promotor GAL10/CYC1 skierowany w kierunku replikonu 2 μ.

Etap 3: Konstruowanie plazmidu pTG10274

W plazmidzie pTG10214, promotor GAL10/CYC1 zastąpiono promotorem CYC1 przez rekombinację homologiczną po wycięciu plazmidu enzymami CiaI i SalI. Wektor ekspresyjny pTG10031 opisany przez Degryse i in., 1995 i zawierający promotor CYC1 trawiono Hindlll i Fspl, a następnie poddano rekombinacji z plazmidem pTG10214 wytworzonym w etapie 2 i trawionym enzymami restrykcyjnymi CiaI i SalI tworząc plazmid pTG10274 (figura 16).

Etap 4: Konstruowanie plazmidu pTG10401

Wychodząc z plazmidu pTG10274 zawierającego promotor CYC1 i plazmidu pTG10293 zawierającego sekwencję kodującą cytochrom P4₅01 7a pod kontrolą promotora TEF1 wytworzono przez rekombinację homologiczną nowy plazmid pTG10401 zawierający sekwencję kodującą cytochrom P450 17a pod kontrolą promotora TEF1. Promotor CYC1 i część replikonu E. co/i wycięto z plazmidu

PL 198 376 B1 pTG10274, wytworzonego w etapie 3, przez trawienie NiluI i Dral. Plazmid pTG10293, wytworzony w przykładzie 5, trawiono Hindlll i PvuII, rekombinowano z plazmidem pTG10274 trawionym enzymami Mlul i Dral, tworząc plazmid pTG10401 (figura 17).

Etap 5: Konstruowanie plazmidu pTG10403 cDNA kodujący ludzką 33-HSD typu II wprowadzono do plazmidu pTG10401 pod kontrolą promotora CYC1. Najpierw, wektor ekspresyjny pTG10262 zawierający cDNA kodujący ludzką 33-HSD typu II skonstruowano według schematu na figurze 18, zaczynając od wektora transferowego pTG10095 wytworzonego według przykładu 3 i wektora rekombinacyjnego pTG10257 zawierającego drożdżowy replikon 2 μ, replikon z E. coli, kasetę ekspresji drożdżowej CYC1p_ro_m/PGKterm oraz znacznik selekcyjny URA3-d. Wektor ten pTG10257 jest identyczny z wektorem rekombinacyjnym pTG10042 opisanym przez Degryse i in., 1995, z takim wyjątkiem, że miejsce Xbal w regionie 2 μ zostało zastąpione znacznikiem Xbal°, otrzymanym przez wypełnienie naturalnego miejsca Xbal fragmentem Klenowa i ponowną ligację. Blok ekspresji ludzkiej 33-HSD typu II wycięto z wektora transferowego pTG10095 przez trawienie Notl, następnie wprowadzono do wektora rekombinacyjnego pTG10257 uprzednio trawionego enzymami restrykcyjnymi SalI i Mlul, tworząc wektor ekspresyjny pTG10262 (figura 19). Należy zaznaczyć, że rekombinacja bloku cDNA GAL10/CYC1 pochodzącego z plazmidu pTG10095 w wektorze rekombinacyjnym pTG10257, zawierającym promotor CYC1 dała wektor ekspresyjny zawierający blok cDNA CYC1. Następnie, wektor ekspresyjny pTG10262 wytworzony jak wyżej, trawiono enzymem restrykcyjnym Xmnl. Otrzymany fragment zawierający cDNA kodujący 33-HSD rekombinowano z fragmentem plazmidu pTG10401 z etapu 4 zawierającym cDNA kodujący cytochrom P₄₅₀1 7a otrzymanym przez trawienie Scal. Plazmid pTG10403 (figura 20) zawierał dwa bloki ekspresji, jeden kodujący 33-HSDH pod kontrolą promotora CYC1 i drugi kodujący cytochrom P₄₅₀1 7a pod kontrolą promotora TEF1.

Etap 6: Konstruowanie plazmidu pTG10417

Na koniec, w plazmidzie pTG10403 promotor TEF1 zastąpiono promotorem CYC1. Z jednej strony, plazmid pTG10058 opisany w przykładzie 5 trawiono enzymem PvuII, który umożliwił uwolnienie części sekwencji kodującej cytochrom P4₅₀1 7a połączony z promotorem CYC1, jak również większość replikonu E. coli. Z drugiej strony, część replikonu E. coli wyeliminowano z plazmidu pTG10403 wytworzonego w etapie 5, przez trawienie Dral. Przez rekombinację obu plazmidów otrzymano w końcu plazmid pTG10417. Plazmid pTG10417 zawierał replikon drożdżowy 2 μ, znacznik selekcyjny URA3-d oraz dwa bloki ekspresji, jeden kodujący ludzki 33-HSD, drugi kodujący cytochrom P4₅₀1 7a pochodzenia bydlęcego, pod kontrolą promotora drożdżowego CYC1 (figura 21). Plazmid pTG10417 transformowano odpowiednio do szczepu rodzicielskiego FY1679 albo szczepu TGY186 (atf2-A: :TEF1p_ro_m/PGKterm) wytworzonego w etapie 4. Transformanty wyizolowano w opisany wyżej sposób na podłożu YNB (Difco) z dodatkiem 0,5% glukozy i wzbogaconym tryptofanem, histydyną i leucyną (100 pg/ml). Tak otrzymane kolonie hodowano przez 24 godzin na podłożu YNB (Difco) zawierającym 0,5% glukozę i 0,1% aminokwasów (casaamino acids), rozcieńczone świeżą pożywką do A600 = 0,1, z dodatkiem 100 pg/ml pregnenolonu w tej samej świeżej pożywce (pożywka 1) albo w pożywce YNB (Difco) zawierającej 0,1% glucol, 2% glicerynę i 0,2% aminokwasów (pożywka 2). Po 48 godzinach hodowli i biokonwersji w steroidy ekstrahowano i mierzono przez RP-HPLC, jak to opisano w przykładzie 1 stosując, odpowiednio, wzorce pregnenolonu i 17a-hydroksypregnenolonu albo progesteronu i 17a-hydroksyprogesteronu.

Otrzymane wyniki wyrażone w pg/ml pokazano w tabeli 5 (pożywka 1) i tabeli 6 (pożywka 2) niżej.

T a b e l a 5

Szczep	FY1679/pTG10417	TGY186/pTG10417
Pregnenolon	0	58,1
Octan pregnenolonu	87,3	0
17a-hydroksypregnenolon	0	3,1
Octan 17a-hydroksypregnenolonu	0	0
Progesteron	10,6	1,4
17a-hydroksyprogesteron	1,3	23,4

PL 198 376 B1

T a b e l a 6

Szczep	FY1679/pTG10417	TGY186/pTG10417
Pregnenolon	0	54,0
Octan pregnenolonu	52,1	0
17a-hydroksypregnenolon	0	3,4
Octan 17a-hydroksypregnenolonu	12,8	0
Progesteron	0	1,4
17a-hydroksyprogesteron	1,3	31,4

Wyniki te pokazują, że biokonwersja w szczepie typu dzikiego (FY) transformowanym plazmidem pTG10417 prowadzi do gromadzenia octanu pregnenolonu i octanu 17a-pregnenolonu, które nie ulegają transformacji przez enzymy 3p-HSD albo P₄₅₀1 7a oraz że balans biokonwersji jest niższy niż obserwowany z transformowanym mutantem atf2 (TGY186)

Próbkę szczepu TGY186/pTG10417 zdeponowano w Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, Francja 2 stycznia, 1999 roku pod numerem 1-2118.

Bibliografia

- Achstetter T., Nguyen-Juilleret M., Findeli A., Merkamm M. and Lemoine Y. (1992), Gene 110, 25-31.

- Amberg D. C., Botstein D. and Beasley E. M., (1995), Yeast 11: 1275-1280.

- Boeke Jef D., Lacroute F. and Fink G. R., (1984) Mol. Gen. Genet. 197: 345-346.

- Cauet G., Dumas B., Degryse E., Spagnoli R. and Achstetter T. (1994) in Cytochrome P-450 biochemistry, biophysics and molecular biology (Lechner M. C., ed.) pp. 583-586, John Libbey Eurotext.

- Cherry J. M., Adler C., Ball C., Dwight S., Chervitz S., Jia Y., Juvik G., Roe T., Weng S. and Botstein D., “Saccharomyces Genome Database” http://genome-www.stanford.edu/ Saccharomyces/.

- Degryse E., J. Biotech. 39 (1995) 181-187.

- Degryse E., Dumas B., Dietrich M., Laruelle L. and Achstetter T. (1995). Yeast 11 : 629-640.

- Degryse E. (1996), Gene 170, 45-50.

- Dumas Caue^t G De^gr^yse ^E^ ^Spa^gnoN ^R. & AcMetter ^T. O⁹⁹⁴). C^ytoc^hrome ^P450. ⁸‘^h Mternational Conference. Ed. M. C. Lechner. John Libbey Eurotext, Paris pp. 527-530.

- Fiechter A., Fuhrmann G. F. and Kappeli O., (1981). Adv. Microb. Physiol. 22, 123-183.

- Fujii T., Nagasawa N., Iwamatsu A., Bogaki T., Tamai Y. and Hamachi M. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60, 2786-2792.

- Hanahan D., J. Mol. Biol. 166 (1983) 557-580.

- Hubacek J. and Glover S. W., (1970), J. Mol. Biol. 50: 111-127.

- Ito H., Fukuda Y., Murata K. and Kimura A., 1983, Journal of Bacteriology, 163-168.

- Rheaume E., Lachance Y., Zhao H.-F., Breton N., Dumont M., de Launoit Y., Trudel C., Luu-The V., Simard J. & Labrie F. (1991). Mol. Endocrinol. 5, 1147-1157.

- Rose M., Grisafi P. and Botstein D., Gene 29, 113-124 (1984).

- Rosenfeld J., Capdevielle J., Guillemot J.C. and Ferrara P. (1992) Anal. Biochem. 203, 173-179.

- Sambrook J., Fritsch E. F. and Maniatis T., (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor University Press, 2^nd edition, Cold Spring Harbor.

- Sherman F. (1991) Methods in Enzymology 194, 3-21.

- Simard J., Durocher F., Mebarki F., Turgeon C., Sanchez R., Labrie Y., Couet J., Trudel C., Rheaume E., Morel Y., Luu-The V. And Labrie F. (1996) J. Endocrinol. 150, 5189-5207.

- Struhl K., Stinchomb D. T., Scherer S. and Davis R. W., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 76, N° 3, 1035-1039.

- Thierry A., Fairhead C. and Dujon B., Yeast ; Vol. 6 : 521-534 (1990).

- Zuber M. X., Simpson E. R. and Waterman M. R., (1986a) Science 234, 1258-1261.

PL 198 376 B1

LISTA SEKWENNJI <110> Hoechst Marion Roussel <120> Szczepy drożdży z przerwanym genem ATF2 i ich zastosowanie <130> 2462 PCT Sekwencje w jeżyku angielskim <14 Ł>

<I60> 1?' <170> Patent In Ke·:. 2.1 <2100 1 <211> 50 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> OLIGONUKLEOTYD <400> 1 aaaagtcgac aaaatggaag atatagaagg atacgaacca catatcactc 50 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> OLIGONUKLEOTYD <220>

<221> Inna cecha <222> Uzupełnienie ((1)..(33)) <400> 2 atcaatctcc aattaggcct cttcggatta ccc 33 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> OLIGONUKLEOTYD <400> 3 32 ^cattc^gacat tcccg^aaggt g^{acaatgaca ag} <2)100 4 <211> 46 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <22Q>

<223> OLIGONUKLEOTYD <220>

<221> Inna cecha <222> Uzupełnienie (.(1)..(46)) <4000 4

PL 198 376 B1 aaaaacgcgt aactattaaa gcgacgcaaa ttcgccgatg gtttgg 46 <210> 5 <211> 79 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> OLIGONUKLEOTYD <400> 5 gggtaatccg aagaggccta attggagatt gataagcttt tcaattcaat tcatcatttt 60 ttttttattc ttttttttg 79 <210> 6 <211> 63 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> OLIGONUKLEOTYD <220>

<221> Inna cecha <222> Uzupełnienie ((1)..(63)) <400> 6 cttgtcattg tcaccttcgg gaatgtcgaa tggggtaata actgatataa ttaaattgaa 60

ctc
<210>	7
<211>	12
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	OLIGONUKLEOTYD

<400> 7 cacacgcgtg tg 12 <210> 8 <211> 52 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> OLIGONUKLEOTYD <400> 8 ctctctgtcg acaaaatgga agatatagaa ggatacgaac cacatatcac tc 52 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<22 3> OLIGONUKLEOTYD <220>

<221> Inna cecha <222> Uzupełnienie ((1)..(33)) <400> 9 atcaatctcc aattaggcct cttcggatta ccc

PL 198 376 B1 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> OLIGONUKLEOTYD <400> 10 catt_ga_at tcc-gaaggt gacaatgaca ag -^2 <210> 11 <211> 49 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> OLIGONUKLEOTYD <220>

<221> Inna cecha <222> Uzupełnienie ({1)..(48)) <400> 11 /o a^acaacacgc gtaac^ta^tta a^agcg^ac^{gca aat}tcgcc^{ga tgctt}tg^{g 48} <210> 12 <211> 68 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> OLIGONUKLEOTYD <400> 12 gggtaatccg aagaggccta attggagatt gatatcgatc acacaccata gcttcaaaat 60 gtttctac 68 <210> 13 <211> 67 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> OLIGONUKLEOTYD <220>

<221> Inna cecha <222> Uzupełnienie ({1)..(67)) <400> 13 cttgtcattg tcaccttcgg gaatgtcgaa gcttcgaaac gcagaatttt cgagttatta 60 aacttaa 67

<210>	14
<211>	10
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	OLIGONUKLEOTYD

<400> 14 gtcgaagctt

PL 198 376 B1

<210>	15
<211>	15
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<22 0 >
<223>	OLIGONUKLEOTYD
<400>	15
tcgacggacg cgtgg
<210>	16
<211>	15
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	oligonukleotyd
<220>
<221>	Inna cecha
<222>	Uzupełnienie ( (1) . . (15)
<4OO>	16
tcgaccacgc gtccg
<210>	17
<211>	12
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	OLIGONUKLEOTYD
<400>	17

cccgaattcg gg

Claims (28)

1. Zmodyfikowany szczep drożdży pozbawiony aktywności acetylotransferazy acetylo-CoA: pregnenolon (APAT) z uzyskaniem stabilizacji 3p-hydroksysteroidów ze zmienionym genem kodującym tę aktywność.

2. Zmodyfikowany szczep drożdży według zastrz. 1, znamienny tym, że zmienionym genem jest gen ATF2 S. cerevisiae albo jego homolog.

3. Zmodyfikowany szczep drożdży według zastrz. 2, znamienny tym, że zmienionym genem jest gen ATF2 S. cerevisiae.

4. Zmodyfikowany szczep drożdży według zastrz. 3, znamienny tym, że gen ATF2 jest zmieniony przez wprowadzenie sekwencji DNA obejmującej przynajmniej jeden nukleotyd.

5. Zmodyfikowany szczep drożdży według zastrz. 4, znamienny tym, że gen ATF2 jest zmieniony przez wprowadzenie genu selekcyjnego URA3 albo bloku ekspresji TEF1p_rom/PGKterm.

6. Zmodyfikowany szczep drożdży według zastrz. 5, znamienny tym, że gen ATF2 jest zmieniony przez wprowadzenie genu selekcyjnego URA3.

PL 198 376 B1

7. Szczep S. cerewsiae zmodyfikowany jak określono w zastrz. 6 i oznaczony TGY156 i-TGY158.

8. ZmodyfikowanyszczcpdyoddyywaPługzcntrz.5. znamiennytym. że geśATG2jaśt zmiep oizoy pecpc wpedwcycpoip blzOg pOzpoezji TE21p_rom/PGKtpem.

9. Zczcpp S. erervisier cmzyyfiOzwcoy jcO zOepślzoz w castrz. 8 i zcoczczoy TGY186.

10. Tranoformowany szczep drożdży pozbawiony akOywnoZci acepylottanofepacc acepylo-CoA: pepeopozlzo (TPTT) cp cmipaizaym epopm Ozygjązym tę cOtywazść, Otóey wyecdc pecyacjmaipj jpypa zpzśeóy pacymów zcIcOg bizzyatpcy hyyezOzetyczag c zhzlpztpezlg, wybecay c grupy zbpjmgjązpj:

- pocym ezczczcppicjązy łcńzuzh bzzcoy zhzlpztpezlg (P450ZCC),

- yphyyezepoccę 3p-hyyezOzy-ypltc6-ztpeziyzwą/iczmpeccę ypltc6-ypltc⁴-ztpeziyzwą (33-HZD) i

- 17k-hyyedOzyIccę ztpeziyzwą ^4601 70.

11. Tecozfzemzwcoy zczcpp yezdydy wpyłge ccztec. 10, naaminaay tym, dp cmipoizoym epypm jpzt epo TT22 S. erervisier clbz jpez hzmzlze.

12. Tecozfzemzwcoy zczcpp yezdydy wpyłge ccztec. 11, naaminaay tym, dp cmipoizoym epopm jpzt epo TT22 S. erervisier.

13. Tecozfzemzwcoy zczcpp yezdydy wpyłge ccztec. 12, naaminaay tym, dp epo TT22 jpzt cmipoizoy pecpc wpezwcycpoip zpOwpozji DNT zbpjmgjązpj pecyocjmoipj jpypo ogOlpztyy.

14. Tecozfzemzwcoy zczcpp yezdydy wpyłge ccztec. 12, naaminaay tym, dp epo TT22 jpzt cmipoizoy pecpc wpezwcycpoip epou zplpOzyjopez URT3.

15. Tecozfzemzwcoy zczcpp yezdydy wpyłge ccztec. 14, naaminaay tym, dp wyecdc 3p-HZD.

16. Zczcpp S. erervisier tecozfzemzwcoy jcO zOepślzoz w ccztec. 15 i zcoczczoy TGY158/pTG10862.

17. Tecozfzemzwcoy zczcpp yezdydy wpyłge ccztec. 12, naaminaay tym, dp epo TT22 jpzt cmipoizoy pecpc wpezwcycpoip blzOg pOzpepzji TE21p_rom/PGKtpem.

18. Tecozfzemzwcoy zczcpp yezdydy wpyłge ccztec. 17, naaminaay tym, dp wyecdc Pz^^c.

19. Zczcpp S. erervisier tecozfzemzwcoy jcO zOepślzoz w ccztec. 18 i zcoczczoy TGY186/pTG10435.

20. Tecozfzemzwcoy zczcpp yezdydy wpyłge ccztec. 17, naaminaay tym, dp wyecdc 3p-HZD i P46o17k.

21. Zczcpp S. erervisier tecozfzemzwcoy jcO zOepślzoz w ccztec. 20 i zcoczczoy TGY186/pTG10417.

22. Zpzzób gtlpoicoic in vivo zubztectg wybecopez c eegpy zbpjmgjązpj poyzepooy ztpezl, peczepooy ztpezl clbz peczepooy ztpeziy, naaminaay tym, dp ztzzgjp zię tecozfzemzwcoy zczcpp yezdydy zOepślzoy w ccztec. 10-21, pecy zcym eyy zczcpp wytwcecc poyzepooy ztpezl, hzygjp zię zcm zczcpp clbz ioOgbgjp zię c peczepooym ztpezlpm lgb ztpeziypm i iczlgjp zię, jpdpli tz Ozoipzcop, gtlpoizoy pezygOt.

23. Zpzzób gtlpoicoic in vivo wpyłge ccztea. 22, naaminaay tym, dp zgbztectpm jpzt 33-hyyezOzyztpeziy, pecy zcym ztzzgjp zię tecozfzemzwcoy zczcpp yezdydy zOepślzoy w ccztec. 15 i iczlgjp zię, jpdpli tz Ozoipzcop, ztecymcoy 3-zOzz-ypltc⁴-ztpeziy.

24. Zpzzób gtlpoicoic in vivo wpyłge ccztec. 23, naaminaay tym, dp 3p-hyyezOzyztpeziy jpzt wybecoy c eegpy zbpjmgjązpj pepeopozlzo clbz 17k-hyyed0zypepeopodldo.

25. Zpzzób gtlpoicoic in vivo wpyłge ccztec. 22, naaminaay tym, dp zgbztectpm jpzt ztpeziy, pecy zcym ztzzgjp zię tecozfzemzwcoy zczcpp yezdydy zOepślzoy w ccztec. 18 i iczlgjp zię, jpdpli tz Ozoipzcop, ztecymcoy 17k-hyyedOzyIdztpediy.

26. Zpzzób gtlpoicoic in vivo wpyłge ccztec. 25, naaminaay tym, dp zgbztectpm ztpeziypm jpzt pepeopozlzo clbz pezepztpezo.

27. Zpzzób gtlpoicoic in vivo wpyłge ccztea. 22, naaminaay tym, dp zgbztectpm jpzt 3p-hyyezOzyztpeziy, ztzzgjp zię tecozfzemzwcoy zczcpp yezdydy zOepślzoy w ccztea. 20 i iczlgjp zię, jpdpli tz Ozoipzcop, ztecymcoy 17k-hyyedOzyId-3-dOzd-ypItc4-ztpediy.

28. Zpzzób gtlpoicoic in vivo wpyłge ccztea. 27, naaminaay tym, dp zgbztectpm ztpeziypm jpzt pepeopozlzo.