DE69918752T2

DE69918752T2 - Hefestämme mit unterbrochenem atf2-gen und deren verwendungen

Info

Publication number: DE69918752T2
Application number: DE69918752T
Authority: DE
Inventors: Tilman Achstetter; Gilles Cauet; Eric Degryse
Original assignee: Aventis Pharma SA
Current assignee: Aventis Pharma SA
Priority date: 1998-02-05
Filing date: 1999-02-04
Publication date: 2005-08-04
Anticipated expiration: 2019-02-05
Also published as: PL198376B1; CZ351299A3; DK0977868T3; HU226657B1; ME00670B; DE69918752D1; HUP0002858A1; CZ299506B6; ATE271610T1; US20010012630A1; KR100599346B1; US6503749B2; HRP990303A2; SI0977868T1; SK133199A3; WO1999040203A1; CA2285686C; AR015225A1; ES2221353T3; CN1263558A

Description

Die Bildung von 3-Oxo-delta⁴-steroiden, ausgehend von 3β-Hydroxy-delta⁵-Vorläufern wird in der Biosynthese aller Klassen der Steroidhormone bei den Säugern durch das enzymatische System 3β-Hydroxy-delta⁵-steroid-Dehydrogenase (EC 1.1.1.145) und delta⁵-delta⁴-Steroid-Isomerase (EC 5.3.3.1), 3β-HSD genannt, katalysiert. 3β-HSD katalysiert z. B. die Umwandlung von Pregnenolon in Progesteron, von 17α-Hydroxypregnenolon in 17α-Hydroxyprogesteron, von Dehydroepiandrosteron in delta⁴-Androstendion oder von 5-Androsten-3β-17β-diol in Testosteron (Simard et al., 1996).
Die 3β-HSD stellt somit eines der Schlüsselenzyme des Biosynthesewegs von Hydrocortison ausgehend von Cholesterin in der Nebennierenrinde der Säuger dar (1).
Die Verwendung von rekombinanten Mikroorganismen, insbesondere von transformierten Hefen, ermöglicht die heterologe Expression eines Enzyms oder mehrerer Enzyme der Säugetiere für diesen Biosyntheseweg, um Hydrocortison oder Zwischenprodukte dieser Biosynthese zu produzieren, und wurde z. B. in der europäischen Patentanmeldung EP 0 340 878 , dem US-Patent 5,137,822, Dumas et al., 1994 und Cauet et al., 1994, beschrieben.
Wenn die funktionelle 3β-HSD in der Hefe exprimiert wird, wandeln die transformierten Hefezellen die 3β-Hydroxysteroide nicht vollständig in entsprechende 3-Oxosteroide um, z. B. das Pregnenolon in Progesteron, sondern akkumulieren eine Verbindung, die ebenfalls im Fall der Zellen der nicht- transformierten Hefe beobachtet wird. Die Identifizierung der akkumulierten Verbindung als 3β-Essigsäureester des Ausgangssteroids und die Charakterisierung des Enzyms, das Acyltransferaseaktivität hat, die für diese Veresterung verantwortlich ist (später als APAT für "Acetylcoenzym A Pregnenolon-Acetyltransferase" bezeichnet) werden in der vorliegenden Anmeldung beschrieben. Andererseits wurde die Ansammlung von Pregnenolonacetat durch einen transformierten Hefestamm, der Pregnenolon produziert, in der europäischen Patentanmeldung EP 0 727 489 beschrieben. Diese Beobachtungen erlauben es davon auszugehen, dass die Veresterung der durch die Hefe produzierten 3β-Hydroxysteroide unerwünscht ist, da sie für Sekundärreaktionen und Nebenprodukte verantwortlich ist, die zu einer Verringerung der Ausbeute an akkumulierten 3β-Hydroxysteroiden führen, beispielsweise an Pregnenolon oder zu einer Verringerung der Ausbeute bei der Bioumwandlung von 3β-Hydroxy-delta⁵-steroiden in 3-Oxo-delta⁴-steroide führen und insbesondere bei der Produktion des Progesterons oder des 17α-Hydroxy-progesterons zu einer Verringerung der letztlichen Produktion des Hydrocortisons auf dem bereits genannten Biosyntheseweg führen.
Als Folge der erhaltenen Resultate, die oben genannt wurden, beschreibt die vorliegende Erfindung die Konstruktion von Hefestämmen, die die unerwünschte APAT-Aktivität verloren haben, durch Veränderung des Gens, das für diese Aktivität codiert, und führt demnach zu einer Stabilisierung der 3β-Hydroxysteroide in Gegenwart dieser. Diese Stämme sind demnach als Ausgangsstämme verwendbar, um rekombinante Stämme zu konstruieren, die fähig sind, 3β-Hydroxysteroide mit verbesserten Ausbeuten in Folgeprodukte umzuwandeln.
Die Erfindung beschreibt auch die Konstruktion von Hefestämmen, die die APAT-Aktivität durch Veränderung des Gens, das für diese Aktivität codiert, verloren haben und entweder 3β-HSD oder das Cytochrom P₄₅₀17α exprimieren oder 3β-HSD und das Cytochrom P₄₅₀17α des Biosynthesewegs des Hydrocortisons ausgehend von Cholesterin coexprimieren. Die Stämme, die z. B. 3β-HSD exprimieren, ermöglichen es, die Ausbeuten der Bioumwandlung der 3β-Hydroxy-delta⁵-steroide in 3-Οxo-delta⁴-steroide zu verbessern und sind somit in den verbesserten Herstellungsverfahren für Cortison oder seine Zwischenprodukte in der Hefe einsetzbar.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein modifizierter Hefestamm, bei dem die Acetyl-CoA-Pregnenolon-Acetyltransferase (APAT)-Aktivität durch Veränderung des Gens, das für diese Aktivität codiert, eliminiert ist und bei dem somit eine Stabilisierung der 3β-Hydroxysteroide resultiert.
Die Veränderung des Gens, das für die APAT-Aktivität codiert, kann z. B. durch Insertion, Deletion oder Substitution einer DNA-Sequenz in den funktionellen Elementen des Gens, z. B. der Promotor oder die Sequenz, die für das Protein mit der APAT-Aktivität codiert, realisiert werden. Der Einbau der so veränderten DNA-Sequenz in einen Hefewirtsstamm kann dann beispielsweise durch die Methodologie der homologen Rekombination durchgeführt werden und führt zur Erzeugung von Hefechromosomenmutanten, die den modifizierten Stämmen der Erfindung entsprechen, in denen das Verschwinden der APAT-Aktivität und die Stabilisierung der 3β-Hydroxysteroide sich bemerkbar machen, z. B. durch Kultur der Zellen in Gegenwart von Pregnenolon und durch Messung des Gehalts an Pregnenolon als Funktion der Zeit unter den später im experimentellen Teil beschriebenen Arbeitsbedingungen.
Als Wirtshefestämme, die für die Erfindung verwendet werden, kann man insbesondere die Saccharomyces-Stämme, wie S. cerevisiae, die Candida-Stämme wie C. maltosa, die Kluyveromyces-Stämme, wie K. lactis, oder die Pichia-Stämme, wie z. B. P. pastoris, nennen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist insbesondere ein modifizierter Hefestamm, in dem das veränderte Gen das Gen ATF2 von S. cerevisiae oder ein Homologes dieses ist.
Unter dem Gen ATF2 versteht man das Gen von S. cerevisiae, das in dem Genom der Hefe unter dem Locus ATF2 oder YGR177c, "Saccharomyces-Genome Database" (SGD); (Cherry et al. http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/) identifiziert ist, dessen offenes Leseraster (ORF), YGR177c genannt, in die Aminosäuresequenz in der Hinterlegungsbank Mips, zugänglich mit der Zugangsnummer 564491 (Hebling U., Hofmann B und Delius H. (Mai 1996)), deren Sequenz in 4 gezeigt ist, übersetzt wird. Dieses Gen codiert für ein Protein, das die APAT-Aktivität hat, wie es später im experimentellen Teil gezeigt wird.
Unter einem Gen, das zu dem Gen ATF2 homolog ist, versteht man ein Gen, das für ein Protein codiert, das APAT-Aktivität hat und das eine Sequenzidentität von etwa 60% und mehr mit der Sequenz des Proteins YGR177C hat.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist insbesondere ein modifizierter Hefestamm, in dem das veränderte Gen das Gen ATF2 von S. cerevisiae ist und der später mutanter Stamm atf2 genannt wird.
Gegenstand der Erfindung ist speziell ein Hefestamm, der wie oben modifiziert ist, in dem das Gen ATF2 durch Insertion einer DNA-Sequenz, die mindestens ein Nucleotid hat, verändert ist.
Die DNA-Sequenz, die in das Gen ATF2 derart insertiert ist, dass es die gesamte APAT-Aktivität verliert, ist z. B. ein auxotrophes Selektionsgen, das eine Nahrungserfordernis des Wirtsstamms ergänzt, z. B. das Gen URA3, das Gen LEU2, das Gen TΡP1, das Gen HIS3 oder das Gen ADE2, beispielsweise ein dominantes Selektionsgen, wie ein Resistenzgen für ein Antibiotikum, wie G418, Phleomycin oder Hygromycin oder z. B. ein Reportergen, wie das Gen βGAL.
Die DNA-Sequenz, die in das Gen ATF2 insertiert wird, kann auch ein Hefeexpressionsblock sein, der aus einem Promotor und einem Transkriptionsterminator besteht, z. B. ein Hefepromotor, wie PGK, TDH3, CYC1 oder TEF1, beispielsweise ein Hefeterminator, wie CYC1, TDH3, TEF1 oder PGK. Der Expressionsblock kann z. B. eine Kombination der oben angegebenen Elemente sein, z. B. der Block ΤΕF1_prom/PGK_term Gegenstand der Erfindung ist speziell ein modifizierter Hefestamm, in dem das Gen ATF2 durch Insertion des Selektionsgens URA3 oder des Expressionsblocks TEF1_prom/PGK_term verändert ist.
Gegenstand der Erfindung ist insbesondere ein modifizierter Hefestamm, in dem das Gen ATF2 durch Insertion des Selektionsgens URA3 verändert ist.
Die Mutantenstämme atf2 der Erfindung, die an APAT-Aktivität verarmt sind und in die das Gen URA3 insertiert ist, die später als atf2-Δ::URA3 bezeichnet werden, konnten durch Prototrophie für Uracil selektioniert werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind speziell die modifizierten Stämme von S. cerevisiae, die TGY156 und TGY158 genannt werden, deren detaillierte Konstruktionen später im experimentellen Teil angegeben werden.
Die Erfindung hat außerdem insbesondere einen modifizierten Hefestamm zum Gegenstand, in dem das Gen ATF2 durch Insertion des Expressionsblocks ΤΕF1_prom/PGK_term verändert ist. Die Mutantenstämme atf2 der Erfindung, die an APAT-Aktivität verarmt sind und in die Expressionsblock ΤΕF1_prom/PGK_term eingesetzt wurde, später als atf2-Δ::ΤΕF1_prom/PGK_term bezeichnet, konnten wegen des funktionellen Gens URA3, das durch einen Expressionsblock ersetzt war, durch ihre Resistenz gegenüber 5-Fluor-orotsäure (5-FO) selektioniert werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist in spezieller Weise der modifizierte Stamm von S. cerevisiae, TGY186 bezeichnet, dessen detaillierter Aufbau später im experimentellen Teil angegeben ist.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein transformierter Hefestamm, in dem die Acetyl-CoA-Pregnenolon-Acetyltransferase (APAT)-Aktivität durch Veränderung des Gens, das für diese Aktivität codiert, und der mindestens eines der Säugerenzyme des Biosynthesewegs von Hydrocortison, ausgehend von Cholesterin, ausgewählt unter folgenden exprimiert:

– das Enzym zur Spaltung der Seitenkette des Cholesterins ( P₄₅₀SCC),
– 3β-Hydroxy-delta⁵-steroid-Dehydrogenase/delta⁵-delta⁴-Steroid-Isomerase (3β-HSD) und
– 17α-Steroidhydroxylase (P₄₅₀17α).

Die transformierten Hefestämme der Erfindung können z. B. durch Transformation der Mutantenstämme atf2 der Erfindung nach bekannten Methoden, z. B. Transformation eines Expressionsvektors von P₄₅₀SCC wie auch von ADX und ADR, durch einen Expressionsvektor der 3β-HSD oder durch einen Expressionsvektor der P₄₅₀17α erhalten werden. Die Mutantenstämme atf2 können gegebenenfalls auch co-transformiert werden, z. B. durch einen Expressionsvektor der 3β-HSD und durch einen Expressionsvektor der P₄₅₀17α, oder können durch einen Co-Expressionsvektor der 3β-HSD und der P₄₅₀17α transformiert werden und werden z. B. in einem Verfahren der Bioumwandlung von Pregnenolon in 17α-Hydroxyprogesteron verwendet.
Vektoren, die zur Expression von P₄₅₀SCC sowie von ADX und ADR, 3β-HSD oder P₄₅₀17α vom Rind oder vom Menschen in Hefezellen konstruiert sind, wurden z. B. von Dumas et al., 1994, in der europäischen Patentanmeldung EP 0 340 878 oder im US-Patent 5,137,822 beschrieben.
Die Erfindung betrifft insbesondere einen transformierten Hefestamm, in dem das veränderte Gen das Gen ATF2 von S.cerevisiae oder ein Homologes dieses ist. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist insbesondere ein transformierter Hefestamm, in dem das veränderte Gen das Gen ATF2 von S. cerevisiae ist und der einem transformierten Stamm atf2 entspricht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist insbesondere ein transformierter Hefestamm, in dem das Gen ATF2 durch Insertion einer DNA-Sequenz, die mindestens ein Nucleotid hat, verändert ist; und ein spezieller Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein tranformierter Hefestamm, in dem das Gen ATF2 durch Insertion des Selektionsgens URA3 verändert ist, und der einem transformierten Stamm atf2-Δ::URA3 entspricht.
Die Veränderung des Gens derart, dass es jede APAT verliert, das Gen ATF2 oder ein Homologes davon, sowie die Wirtsstämme haben die Bedeutungen, die vorstehend gegeben wurden.
Die vorliegende Erfindung betrifft in ganz spezieller Art den transformierten Hefestamm atf2-Δ::URA3, der 3β-HSD exprimiert, und insbesondere den transformierten Stamm von S. cerevisiae, der TGY158/pTG10862 genannt wird, dessen detaillierte Konstruktion später im experimentellen Teil beschrieben wird.
Die vorliegende Erfindung hat speziell als Gegenstand einen transformierten Hefestamm, in dem das Gen ATF2 durch Insertion des Expressionsblocks ΤΕF1_prom/PGK_term verändert ist, und der dem transformierten Stamm atf2-Δ::ΤΕF1_prom/PGK_term entspricht.
Die Erfindung betrifft in ganz spezieller Weise einen transformierten Stamm atf2-Δ::ΤΕF1_prom/PGK_term der P₄₅₀17α exprimiert, und insbesondere den transformierten Stamm von S. cerevisiae, der TGY186/pTG10435 genannt wird.
Die Erfindung betrifft besonders einen transformierten Hefestamm atf2-Δ::ΤΕF1_prom/PGK_term der 3β-HSD und P₄₅₀17α gleichzeitig exprimiert, und in ganz besonderer Weise den transformierten Stamm von S. cerevisiae, der TGY186/pTG10417 genannt wird.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur in vivo-Oxidation eines Substrats, das aus einem endogenen Sterol, einem exogenen Sterol und einem exogenen Steroid ausgewählt ist, wobei man einen transformierten Hefestamm verwendet, den man entweder allein kultiviert, wenn der Stamm das endogene Sterol bildet, oder den man mit dem Sterol oder dem exogenen Steroid inkubiert und gegebenenfalls die erhaltene oxidierte Verbindung isoliert.
Unter endogenem Sterol versteht man ein Sterol, das im Hefestamm akkumuliert wird und das ein Substrat für das Enzym zur Spaltung der Seitenkette (P₄₅₀SCC) ist, wenn die Hefe nach Transformation beispielsweise durch einen Expressionsvektor von P₄₅₀SCC, ADX und ADR in Abwesenheit von exogenem Sterol kultiviert wird. Die endogenen Sterole, die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden, können z. B. Ergosta-5-en-3-ol, Ergosta-5,24(28)-dien-3-ol oder Ergosta-5,22-dien-3-ol sein. Die europäische Patentanmeldung EP 0 727 489 beschreibt die Akkumulation solcher Sterole in einem Hefestamm und die Spaltung ihrer Seitenkette in einer Kultur des Stamms nach Transformation durch einen Expressionsvektor von P₄₅₀SCC, ADX und ADR. Ein derartiger Hefestamm, in dem auch die APAT-Aktivität vorhanden ist, kann vorher modifiziert werden, um einen Mutantenstamm atf2 gemäß der Erfindung zu erhalten, kann dann durch einen Expressionsvektor von P₄₅₀SCC, ADX und ADR transformiert werden, um einen transformierten Mutantenstamm atf2 gemäß der Erfindung zu erhalten.
Unter exogenem Sterol versteht man ein Sterol, das ein Substrat für das Spaltungsenzym P₄₅₀SCC durch Inkubation mit einem Hefestamm ist, welcher durch einen Expressionsvektor von P₄₅₀SCC, ADX und ADR transformiert wurde, z. B. Cholesterin und Sitosterol. Ein solcher Stamm kann z. B. ein mutanter Stamm atf2 sein, der durch einen Expressionsvektor von P₄₅₀SCC, ADX und ADR transformiert ist.
Das 3β-Hydroxysteroid, das durch Spaltung der Seitenkette des endogenen oder exogenen Sterols, das als Substrat verwendet wird, erhalten wird, liegt in den Kulturen der transformierten Stämme atf2, die P₄₅₀SCC, ADX und ADR exprimieren, in vollständig freier Form vor, d. h. es ist nicht von dem entsprechenden 3β-Essigsäureester begleitet.
Unter Steroid versteht man ein Steroid, das ein Substrat des Enzyms 3β-HSD durch Inkubation mit einem Hefestamm, der z. B. durch einen Expressionsvektor der 3β-HSD transformiert ist, ist, z. B. Pregnenolon, 17α-Hydroxypregnenolon oder Dehydroepiandrosteron, oder ein Steroid, das ein Substrat des Enzyms P₄₅₀17α durch Inkubation mit einem Hefestamm, der z. B. durch einen Expressionsvektor von P₄₅₀17α transformiert ist, ist, wie z. B. Progesteron oder Pregnenolon. Ein derartiger Stamm kann z. B. ein mutanter Stamm atf2 sein, der durch einen Expressionsvektor der 3β-HSD oder durch einen Expressionsvektor von P₄₅₀17α gemäß der Erfindung transformiert ist.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist insbesondere das Verfahren zur in vivo-Oxidation, wobei das Substrat ein β-Hydroxysteroid ist und wobei man den transformierten Hefestamm atf2-Δ::URA3, der 3β-HSD exprimiert, verwendet und gegebenenfalls das erhaltene 3-Oxo-delta⁴-steroid isoliert; Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist insbesondere ein Verfahren, in dem das 3β-Hydroxysteroid unter Pregnenolon und 17α-Hydroxypregnenolon ausgewählt wird.
Das als Substrat verwendete 3β-Hydroxysteroid ist stabil, wenn man es mit dem erfindungsgemäßen Stamm atf2-Δ::URA3, der durch einen Expressionsvektor von 3β-HSD transformiert ist, inkubiert. Somit liefert die Erfindung ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von 3-Oxo-delta⁴-steroid in einer Hefe, da das gesamte 3β-Hydroxysubstrat in 3-Oxo-delta⁴-steroid oxidiert werden kann, wie es später im experimentellen Teil gezeigt wird.
Die Erfindung hat insbesondere das obige Verfahren zur in vivo-Oxidation zum Gegenstand, wobei das Substrat ein Steroid ist und wobei man den transformierten Hefestamm atf2-Δ::ΤΕF1_prom/PGK_term verwendet, der P₄₅₀17α exprimiert, und gegebenenfalls das erhaltene 17α-hydroxylierte Steroid isoliert; Gegenstand ist insbesondere ein Verfahren, in dem das Steroidsubstrat Pregnenolon oder Progesteron ist.
Das als Substrat verwendete Pregnenolon ist stabil, wenn man es mit dem Stamm atf2-Δ::ΤΕF1_prom/PGK_term, der durch einen Expressionsvektor von P₄₅₀17α tranformiert ist, inkubiert.
Die vorliegende Erfindung liefert somit auch ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von 17α-Hydroxysteroiden, ausgehend von 3β-Hydroxysteroiden, da die Gesamtheit des 3β-Hydroxysubstrats 17α-hydroxyliert werden kann.
Die Erfindung hat insbesondere das obige Verfahren zur in vivo-Oxidation zum Gegenstand, wobei das Substrat ein 3β-Hydroxysteroid ist und wobei man den transformierten Hefestamm atf2-Δ::ΤΕF1_prom/PGK_term verwendet, der 3β-HSD und P₄₅₀17α co-exprimiert, und wobei man gegebenenfalls das erhaltene 17α-hydroxylierte 3-Oxo-delta⁴-steroid isoliert. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist insbesondere das obige Verfahren, in dem das Steroidsubstrat Pregnenolon ist.
Die transformierten Mutantenhefestämme atf2 und das erfindungsgemäße Verfahren erlauben es, ihre vorteilhafte Verwendung in der verbesserten Produktion von Hydrocortison oder seinen Zwischenprodukten in der Hefe vorauszusagen.
Im später aufgeführten experimentellen Teil sind Beispiele des Aufbaus der erfindungsgemäßen Hefen und der Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens beschrieben.
Materialien und allgemeine Verfahren
1. Stämme und Milieu
Die zur Durchführung der Erfindung verwendeten Stämme von S. cerevisiae sind der Stamm TGY73.4 (MATα, URA3-Δ5, pral-1, prbl-1, prcl-1, cpsl-3, his)isogenes Leu⁺-Derivat von c13ABYS86, beschrieben von Achstetter et al., 1992, und der Stamm Fy1679 (MATa, URA3-52, trpl-Δ63, leu2-Δ1, his3-Δ200, fen1, GAL), beschrieben von Thierry et al., 1990. Das Wachstum der Stämme wird in vollständigem YPD-Milieu (Difco Laboratories), das 2% Glucose enthält, bei 28°C unter den Bedingungen, die von F. Sherman, 1991, beschrieben wurden, durchgeführt.
Für die Transformation von S. cerevisiae werden die Zellen durch das Lithiumacetatverfahren kompetent gemacht (Ito et al., 1983). Die Hefen werden in Routinekulturen auf synthetischem Minimalmedium SD, das 2% Glucose enthält (F. Sherman, 1991), unter Zusatz von Nährstoffbedarf in einer Konzentration von 100 μg/ml kultiviert.
Der Stamm E. coli BJ5183 (D. Hanahan, 1983) wurde für die in vivo-Rekombination verwendet und der Stamm E. coli C600, hsdR (Hubacek et al., 1970) wurde als Stamm für die klassischen Ligationsreaktionen verwendet.
2. Manipulation der DNA und in vivo-Rekombination in E. coli
Die allgemeinen Verfahren der Molekularbiologie, die verwendet wurden, sind bei Sambrook et al., 1989, beschrieben. Das Verfahren zur in vivo-Rekombination wurde von E. Degryse, 1995 und E. Degryse, 1996, beschrieben.
Test auf enzymatische APAT-Aktivität
Die Acetyltransferase-Aktivität der APAT wurde durch Messung des Einbaus von [³H]Acetat in Pregnenolon, ausgehend von [³H]Acetyl-CoA (New England Nuclear) bestimmt. Das Reaktionsmilieu (500 μl) enthielt [³H]Acetyl-CoA (20 μM, 25 Ci/mol) und Pregnenolon (Sigma) (30 μM). Das Pregnenolon wird in Lösung in 2 μl des Gemisches Tyloxapol (Sigma)/Ethanol (1 : 1) in Kaliumphosphatpuffer (20 mM) mit pH 7,0 zugesetzt. Nach 15 min Inkubation bei 30°C wird die Reaktion durch Zusatz von 2 ml Dichlormethan gestoppt.
Die Steroide werden mit Dichlormethan extrahiert, mit Hochdruckflüssigkeitschromatographie mit Umkehrphase (im Folgenden als RP-HPLC bezeichnet) unter Bedingungen einer isokratischen Elution mit Acetonitril an einer Ultrasphere ODS-Säule (Beckman) mit 45°C getrennt, wobei ein HP 1090 (Hewlett Packard)-Chromatograph, kombiniert mit einem Radiodetektor FLO-One 500 (Packard) verwendet wurde, der die Messung von gebildetem Pregnenolon-[³H]acetat ermöglicht.
Eine Einheit APAT ist als die Enzymmenge definiert, die 1 nmol Pregnenolonacetat pro Minute bei 30°C unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen produziert.
4. Bestimmung der Proteinkonzentration
Die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung des "Proteinassaykits" (Bio-Rad) mit Rinderserumalbumin als Standard gemessen.
Die angefügten Figuren erläutern bestimmte Aspekte der Erfindung.
1 stellt den Biosyntheseweg von Hydrocortison, ausgehend von Cholesterin, bei Säugetieren dar.
Die 2A und 2B erläutern die biologische Umwandlung des Pregnenolons in Pregnenolonacetat bei S. cerevisiae. Die Analyse wird durch RP-HPLC bei 205 nm durchgeführt:
Die 2A zeigt die Kinetik der Bildung des Pregnenolonacetats und des Verschwindens des Pregnenolons in Zeitintervallen während der 12-stündigen Inkubation.
Die 2B zeigt das Profil der Steroide bei t = 0 und bei t = 10 h, bezogen auf ein Profil der Standards Pregnenolon und Pregnenolonacetat.
3 veranschaulicht die Reinigung der APAT durch Chromatographie an MonoP HR 5/20:

(A) zeigt das Profil der APAT-Aktivität, die in den Fraktionen 10 bis 20 vorliegt;
(B) zeigt die Analyse der Fraktionen 14, 15 und 16, die vereinigt und konzentriert worden waren, durch SDS-PAGE unter Färbung mit Coomassie-Blau (Bande 2) in Gegenwart von Molekulargewichtsmarkern (Bande 1). Der Pfeil zeigt die MG-Bande, die bei 62 kDa auftritt.

Die 4 stellt die Aminosäuresequenz des Proteins YGR177c im Einbuchstabencode dar. Die Peptide, die ausgehend vom gereinigten und durch Trypsin verdauten Protein APAT sequenziert wurden, sind unterstrichen.
Die 5 stellt die Strategie der Unterbrechung des Gens ATF2 durch Assoziation mit dem Gen URA3 durch das Verfahren der Doppelfusions-PCR dar. Die leeren Balken und die ausgefüllten Balken stellen die Sequenzen von ATF2 bzw. URA3 dar.
Die 6 erläutert die Wirkung der Unterbrechung des Gens ATF2 in S. cerevisiae auf die Acetylierung des Pregnenolons. Das Vorliegen von Pregnenolonacetat wird durch RP-HPLC bei 205 nm, ausgehend von 16 h-Kulturen des Elternstamms TGY73.4 (A) oder des Mutantenstamms TGY158 (B), deutlich gemacht.
Die 7A, 7C und 7C stellen das Konstruktionsschema der Expressionsplasmide der humanen 3β-HSD bei der Hefe pTG10832 und pTG10862 dar. Die 7A beschreibt den Erhalt des Fragments MscI-MluI, das die Sequenz enthält, die für die humane 3β-HSD codiert. Die 7B beschreibt den Erhalt des Fragments NotI, das den Expressionsblock CYCl_p/3β-HSD/PGK_t enthält. Die 7C beschreibt den Erhalt des Plasmids pTG10832 und des Plasmids pTG10862.
Die 8 stellt eine Restriktionskarte des Plasmids pTG10832 dar.
Die 9 stellt eine Restriktionskarte des Plasmids pTG10862 dar.
Die 10 stellt das Konstruktionsschema des Expressionsplasmids pTG10435 dar.
Die 11 stellt das Konstruktionsschema des Plasmids pTG10058 dar.
Die 12 stellt eine Restriktionskarte des Plasmids pTG10058 dar.
Die 13 stellt eine Restriktionskarte des Plasmids pTG10293 dar.
Die 14 stellt eine Restriktionskarte des Plasmids pTG10435 dar.
Die 15A und 15B stellen das Konstruktionsschema des Plasmids pTG10274 dar:
Die 15A beschreibt den Erhalt des Plasmids pTG10214.
Die 15B beschreibt den Erhalt des Plasmids pTG10274.
Die 16 stellt eine Restriktionskarte des Plasmids pTG10274 dar.
Die 17 stellt eine Restriktionskarte des Plasmids pTG10401 dar.
Die 18 stellt das Konstruktionsschema des Expressionsvektors pTG10262 dar.
Die 19 stellt eine Restriktionskarte des Plasmids pTG10262 dar.
Die 20 stellt eine Restriktionskarte des Plasmids pTG10403 dar.
Die 21 stellt eine Restriktionskarte des Plasmids pTG10417 dar.
(Abkürzungen der Restriktionsenzyme: S, SalI; N,NotI; BII,BglII; M,MluI, C,ClaI; N°, NcoI-Stelle verloren; XbaI°, XbaI-Stelle verloren; E,EcoR).
Beispiel 1: Identifizierung der APAT-Aktivität der Hefe
A – in vivo-Acetylierung von Pregnenolon durch die Hefe
Der Stamm TGY73.4 wurde bei 28°C in 10 ml YPD-Milieu (Difco), das mit A600 = 0,1 beimpft war, ausgehend von einer Vorkultur von 24 h und unter Zusatz von 100 μl einer Lösung von Pregnenolon mit 10 mg/ml in einem Gemisch aus Tergitol (Sigma)/Ethanol (1 : 1) kultiviert. Die gebildeten Steroide wurden an 250 μl-Aliquots der Brühe, die in Zeitintervallen während 10 h entnommen wurde, identifiziert. Nach Extraktion mit 2 ml Dichlormethan wurden die organischen Phasen unter Stickstoff eingeengt, dann wurden die erhaltenen Rückstände in Acetonitril wieder aufgelöst. Die Steroide wurden durch RP-HPLC an einer Ultrasphere ODS-Säule (Beckman) analysiert, wobei wie folgt eluiert wurde: 60% Acetonitril in Wasser während 10 min, dann Acetonitril, variierend von 60 bis 80 in Wasser, während 5 min, dann 80% Acetonitril während 5 min mit einem Durchfluss von 1 ml pro min bei 45°C und bei Detektion bei 205 nm.
Die erhaltenen Chromatogramme (2B) zeigen, dass Pregnenolon zu einem Produkt metabolisiert wird, das apolarer ist und das eine RT hat, die identisch mit der des Pregnenolonacetat-Standards ist. 2A zeigt, dass Pregnenolon durch die Hefe schnell in seinen Metaboliten umgewandelt wird.
Nach Behandlung mit Alkali (6% KOH in Methanol) setzt der beobachtete Metabolit ein Produkt frei, das eine RT hat, die mit der des Pregnenolons identisch ist. Die Identifizierung des Metaboliten als Pregnenolonacetats wurde dann durch Massenspektrometrie bestätigt.
B – Reinigung des Enzyms, das APAT-Aktivität hat
Der Stamm TGY73.4 wurde in einem 10 l-Fermentator in Käppeli-Medium (Fiechter et al., 1981), das mit 160 g/l Glucose angereichert war, bei 30°C bis A600 = 30 kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation abgetrennt, mit Wasser gewaschen, dann in 4 l 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, mit 4°C (Puffer A), der 1 mM PMSF enthielt, in Suspension gebracht. Die Zellen wurden einem Bersten unter einem Druck von 1000 psi in einem Manton Gaulin-Homogenisator unterworfen. Das erhaltene Zelllysat wurde mit 12.000 g während 15 min bei 4°C zentrifugiert, dann wurde Zinkchlorid dem Überstand zu einer Endkonzentration von 40 mM zugesetzt. Der pH wurde mit 1 N HCl auf 5,5 eingestellt und die Präzipitation wurde während 30 min bei 4°C durchgeführt. Nach Zentrifugation bei 10.000 g während 10 min bei 4°C wurde das isolierte Präzipitat in 3 l Puffer A, der 100 mM EDTA und 1 mM PSFM enthielt, wieder in Suspension gebracht. Nach Eliminierung des EDTA durch Diafiltration mit einer Y10S10-Kartusche (Amicon) gegen 30 l Puffer A wurde das Retentat mit einer Geschwindigkeit von 35 ml/min und bei 4°C auf eine Säule mit 1,5 l DEAE-Sephacel (Pharmacia), die vorher mit dem Puffer A äquilibriert worden war, geladen. Nach Waschen der Säule mit Puffer A, dann mit Puffer A, der 0,15 M NaCl enthielt, wurde die APAT-Aktivität mit dem Puffer A, der 0,4 M NaCl enthielt, eluiert. Die DEAE-Sephacel-Fraktionen, die die APAT-Aktivität enthielten, welche wie in "Materialien und allgemeine Verfahren" angegeben gemessen worden war, wurden vereinigt, mit NaCl zu einer Endkonzentration von 2 M versetzt, dann mit einer Geschwindigkeit von 15 ml pro min und mit 4°C auf eine Säule mit 500 ml Phenyl-Sepharose (Pharmacia) geladen, die vorher mit dem Puffer A, der 2 M NaCl enthielt, äquilibriert worden war. Nach Waschen der Säule mit dem Puffer A, der 0,5 M NaCl enthielt, wurde die APAT-Aktivität mit 1,5 l eines linearen Gradienten von Natriumcholat, der von 0 bis 1% in Puffer A variierte, eluiert. Die Fraktionen, die die APAT-Aktivität enthielten, wurden vereinigt, dann durch Ultrafiltration über eine YM10-Membran (Amicon) konzentriert, danach bis zur Verwendung bei –80°C konserviert.
Die Gesamtheit des Verfahrens wurde einmal wiederholt, so dass Material in ausreichender Menge hergestellt wurde, um die Reinigung fortzusetzen.
Das gereinigte Material aus den zwei Herstellungen oben wurde aufgetaut, dann mit einer Geschwindigkeit von 4 ml/min und mit 4°C auf eine 100 ml Säule Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) gegeben, die vorher im Puffer A äquilibriert worden war. Nach Waschen der Säule mit dem selben Puffer wurde die APAT-Aktivität mit 500 ml eines linearen NaCl-Gradienten, steigend von 0 bis 1 M in dem selben Puffer, eluiert. Die Q-Sepharose-Fraktionen, die APAT-Aktivität enthielten, wurden vereinigt, dann mit einer Geschwindigkeit von 2,5 ml/min und mit 4°C auf eine Säule mit 7 ml Natriumcholat, das an Sepharose-Perlen immobilisiert ist (Pharmacia) aufgeladen, wobei diese vorher mit Puffer A, der 0,5 M NaCl enthielt, äquilibriert worden war. Nach Waschen der Säule mit dem selben Puffer wurde die APAT-Aktivität mit 100 ml eines linearen Natriumcholat-Gradienten, der von 0 bis 1% in dem selben Puffer variierte, eluiert. Die Fraktionen, die APAT-Aktivität enthielten, wurden vereinigt, durch Ultrafiltration an einer YM10-(Amicon)-Membran bis zu einer Proteinkonzentration von 1,8 mg/ml konzentriert, dann bei –80°C konserviert.
Die APAT-Aktivität war so etwa 500-fach, bezogen auf die spezifische Aktivität, gereinigt worden, und zwar mit einer Ausbeute von etwa 16%, wie es in der folgenden Tabelle 1 angegeben ist:
Tabelle 1
Die Hälfte des halb-gereinigten Materials, das oben erhalten worden war (etwa 6 mg Protein), wurde dann aufgetaut, danach mit PEG 4000 (Prolabo) zu einer Endkonzentration von 20 (G/V) versetzt, um das Cholat und NaCl zu eliminieren. Nach 30-minütigem Rühren bei 4°C wurde das Präzipitat durch Zentrifugation mit 12.000 g während 30 min bei 4°C gesammelt, dann in 4 ml Puffer A erneut aufgelöst. Die so erhaltene Lösung wurde dann mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min auf eine MonoP HR 5/20-Säule (Pharmacia) aufgebracht, die vorher mit 25 mM bis-Tris-Puffer, pH 6,3, äquilibriert worden war. Die APAT-Aktivität wurde mit dem Puffer Polypuffer 74, pH 4,0, (Pharmacia) eluiert. 1 ml-Fraktionen wurden in Gegenwart von je 50 μl 2 M Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, derart gesammelt, dass die Inaktivierung des Enzyms bei saurem pH begrenzt wurde. Die Fraktionen 14, 15 und 16 (3(A)), die eine erhöhte APAT-Aktivität enthielten, die wie oben angegeben gemessen worden war, wurden vereinigt, durch Ultrafiltration mit einer YM10-Membran konzentriert, danach vor Verwendung bei –80°C konserviert. Die so erhaltene aktive Fraktion wurde einer SDS-PAGE an 10% Polacrylamid-Gel unterzogen. Durch Färbung mit Coomassie-Blau wurden mehrere Banden sichtbar gemacht, und zwar mit einer Hauptbande mit einem scheinbaren MG von 62 kDa (3(B)), das mit dem MG identisch war, das durch Superose 6-Gelfiltration (Pharmacia) bestimmt worden war und der APAT-Aktivität entsprach.
C – Eigenschaften der APAT
a) Substratspezifität
Nach dem oben für Acetyl-CoA und Pregnenolon angegebenen Verfahren unter Verwendung verschiedener Acyl-Donatoren oder unterschiedlicher Steroidsubstrate überträgt halb-gereinigte APAT Acetat auf 3β-Ol-delta⁴- oder -delta⁵-steroide mit vergleichbarer Wirksamkeit, während der Transfer auf die Östrogene schwach ist und auf die Sterole nicht nachweisbar ist und wobei eine deutliche Präferenz für Acetyl-CoA als Acyldonator besteht.
Die folgende Tabelle 2 zeigt die erhaltenen Resultate, wobei für a) die Versuche mit 30 μM jedes getesteten Steroids und 100 μM [³H]Acetyl-CoA durchgeführt wurden und für b) die Versuche mit 100 μM jedes Acyldonators und 30 μM [³H]Pregnenolon durchgeführt wurden:
Tabelle 2
b) Inhibierung
Die APAT-Aktivität wird durch die Reagenzien mit Sulfhydryl-Gruppierungen, wie z. B. NEM und DTNB, stark inhibiert. Die Inhibierung ist in Gegenwart von Zinkchlorid (1 mM) vollständig.
D – Partielle Aminosäuresequenz
Die partielle Aminosäuresequenz wurde nach Abbau mit Trypsin an den Gelschnitten nach dem Verfahren, das von Rosenfeld et al. (1992) beschrieben wurde, bestimmt.
Ausgehend von zwei Drittel des oben erhaltenen Konzentrats, das dann durch SDS-PAGE getrennt worden war, wurde die 62 kDa-Bande ausgeschnitten, dann mit Trypsin (Promega) inkubiert. Die erzeugten Peptide wurden dann durch RP-HPLC an einer Vydac 218TP-Säule (1,5 × 125 mm) mit einer Geschwindigkeit von 100 μl/min getrennt, wobei ein linearer Acetonitrilgradient, der von 0 bis 60% in 80 min, dann von 60 bis 100% in 20 min in einer 0,1% TFA-Lösung in Wasser, verwendet wurde; dann wurden sie einer Aminosäuresequenzierung unterworfen.
Die N-terminale Sequenz wurde an einem Proteinsequenzanalysator Modell 477A, der mit einem HPLC-Analysator für PTH-Aminosäuren verbunden war (Applied Biosystems), bestimmt.
Unter den sequenzierten Proben lieferten zwei Peaks x und y eine eindeutige Sequenz, die aus den folgenden 10 bzw. 16 Aminosäuren bestehen:
Für den Peak x: ISEQFKKDDF
für den Peak y: LIELISPVIIPLGNPK.
Die zwei so erhaltenen Peptidsequenzen wurden verwendet, um die Datenbank des Genoms von S. cerevisiae durchzumustern. Es konnte ein Protein mit 62 kDa identifiziert werden, dessen Sequenz genau die Sequenz der zwei oben genannten enthält (Mips, Zugangsnummer S64491, Hebling et al., Mai 1996). Dieses Protein, dessen Sequenz in 4 gezeigt ist und dessen Funktion noch nicht beschrieben wurde, wird durch ein Gen am Locus YGR177c codiert. Auf der Grundlage einer Aminosäureidentität von etwa 37% zwischen dem erfindungsgemäßen Protein, das Acyltransferase-Aktivität hat, und dem Produkt des Gens ATF1 bei S. cerevisiae, das von Fujii et al. (1994) beschrieben wurde und dem Alkohol-Acetyltransferase-Aktivität zugeschrieben wurde, verwenden wir die Bezeichnung ATF2 für das Gen, das für das Protein codiert, welches für APAT-Aktivität bei S. cerevisiae verantwortlich ist.
Beispiel 2: Konstruktion von Hefestämmen, die das Gen ATFS, unterbrochen durch das Gen URA3 haben, und die die APAT-Aktivität verloren haben (atf2-Δ::URA3)
A) Targeting des Gens ATF2
Das Gen URA3 von S. cerevisiae wurde durch Substitution eines ausgewählten Teils des Gens ATF2 von S. cerevisiae eingeführt, was eine anschließende Selektion der Mutantenstämme durch Prototrophie für Uracil erlaubt.
Der Selektionsmarker URA3 wurde durch Doppelfusions-PCR nach dem Verfahren, das von Amberg et al., 1995, beschrieben wurde, mit dem Gen ATF2 assoziiert. Die in 5 gezeigte verfolgte Strategie umfasst insgesamt 4 PCR-Reaktionen. Die beiden ersten Reaktionen (PCR1 genannt) erlauben es, die Regionen 5' und 3', die die Insertionsstelle des URA3-Markers in dem unterbrochenen Zielgen ATF2 flankieren, zu amplifizieren und die dritte Reaktion (PCR2 genannt), erlaubt es, das Markergen URA3 zu amplifizieren. Die Doppelfusion (PCR3 genannt) erlaubt schließt die Assoziation der Regionen 5' und 3' des Zielgens ATF2 an das Markergen URA3 (4'ATF2-URA3-3'ATF2 genannt).
Im ersten Verfahrensschritt wurde eine Probe ganzer Zellen des Stamms Fy1679, der als DNA-Quelle des Zielgens ATF2 verwendet wurde, im PCR-Puffer, der 2 mM dNTP (Pharmacia) enthielt, unter den folgenden Bedingungen amplifiziert: 25 Zyklen; 93°C, 30 s; 54°C, 2 min; 68°C, 3 min, gefolgt von einer Verlängerung von 5 min bei 72°C; Polymerase Ampli Taq (Perkin Elmer).
Einerseits wurde die Region 5' des Gens ATF2 durch PCR amplifiziert, wobei die Oligonucleotide mit den folgenden Sequenzen als direkte oder indirekte Primer verwendet wurden:
OTG10841: AAAAGTCGACAAAATGGAAGRTATAGAAGGATACGAACCACRTATCACTC (SEQ ID No: 1)
und
OTG10844: ATCAATCTCCAATTAGGCCTCTTCGGATTACCC (SEQ ID NO: 2),
die eine homologe Region zu der Region 5' der Sequenz des Gens ATF2 (SGD : YGR177c) enthalten, und wobei eine Restriktionsstelle SalI für OTG10841 angefügt wurde.
Andererseits wurde die Region 3' des Gens ATF2 durch PCR amplifiziert, wobei als direkte und indirekte Primer die Oligonucleotide mit den folgenden Sequenzen verwendet wurden:
OTG10846: CATTCGACATTCCCGAAGGTGACAATGACAAG (SEQ ID NO: 3)
und
OTG10842: AAAAACGCGTAACTATTAAAGCGACGCAAATTCGCCGATGGTTTGG (SEQ ID NO: 4)
die homologe Regionen der Region 3' der Sequenz des Gens ATF2 (SGD : YGR177c) enthielten, und wobei eine Restriktionsstelle MluI für OTG10842 angefügt wurde.
In einem zweiten Verfahrensschritt wurde das Gen URA3 von S. cerevisiae durch PCR amplifiziert, wobei als direkter Beginn das Oligonucleotid mit der folgenden Sequenz verwendet wurde:
OTG10843:
GGGTAATCCGAAGAGGCCTAATTGGAGATTGATAAGCTTTTCAATTCAATTCATCATTTTTTTTTTATTCTTTTTTTTG (SEQ ID NO: 5).
Diese enthält eine Sequenz, die zur Region 5' der publizierten Sequenz des Gens URA3 homolog ist (Rose et al., 1984; GenBank: YSCODCD-Zugangsnummer: K02207; SGD : YEL021w), und zwar assoziiert mit einer Sequenz, die zur Region 5' des Gens ATF2 homolog ist (komplementär zu OTG10844); als indirekter Primer wurde das Oligonucleotid mit der folgenden Sequenz verwendet:
OTG10845:
CTTGTCATTGTCACCTTCGGGAATGTCGAATGGGGTAATAACTGATATAATTAAATTGAACTC (SEQ ID NO: 6)
Diese enthält eine Sequenz, die zur Region 3' des Gens URA3 homolog ist, assoziiert mit einer Sequenz, die zur Region 3' des Gens ATF2 homolog ist (komplementär zu OTG10846). Eine 20 ng-Probe von DNA des Gens URA3, die ausgehend vom Pendelvektor E. coli-Hefe pTG10021 (Degryse et al., 1995) durch Verdauung mit dem Restriktionsenzym HindIII isoliert worden war, wurde unter den oben angegebenen Bedingungen amplifiziert.
Die entsprechend erhaltenen PCR-Produkte wurden gereinigt, indem der "Geneclean Kit" (Bio 101 Inc., La Jolla, USA) verwendet wurde, dann wurden sie der Doppelfusionsreaktion unterworfen, wobei als Primer die oben genannten Oligonucleotide OTG10841 und OTG10842 unter den Amplifikationsbedingungen, welche für die früheren PCR-Reaktionen verwendet wurden, mit einem Programm aus 20 Zyklen verwendet wurden.
Nach Reinigung des Fusionsendproduktes, das die flankierenden Regionen des Gens ATF2 fusioniert an das funktionelle Gen URA3 enthielt, wurde das Vorliegen des Gens URA3 durch Verdauung mit dem Restriktionsenzym EcoRV bestätigt, welches das Vorliegen dieser Stelle im amplifizierten Material zeigt.
B) Bildung der Hefestämme atf2-Δ::URA3
Das oben erhaltene Fusionsprodukt wurde direkt in die kompetenten Zellen des Stamms Fy1679 oder des Stamms TGY73.4 transformiert und die Transformanten wurden durch Wachstum auf dem Milieu SD (F. Sherman, 1991) in Gegenwart des Nährstoffbedarfs des Stamms und in Abwesenheit von Uracil selektioniert.
Ausgehend von den isolierten Klonen wurde die neue Verbindung zwischen der Region 5' des Gens ATF2 und dem Gen URA3 (5'ATF2-URA3-3'ATF2) durch Amplifikation durch PCR an den ganzen Zellen gezeigt, wobei die oben genannten Primer OTG10841 und OTG10845 verwendet wurden. Die Abwesenheit der APAT-Aktivität wurde dann nach dem beschriebenen Test, ausgehend vom Zellhomogenat, im Vergleich zum Elternstamm, der eine deutliche APAT-Aktivität aufweist, gezeigt.
Die Stämme, die auf diese Kriterien ansprechen, wurden so als die Mutantenstämme atf2 charakterisiert und als atf2-Δ::URA3 bezeichnet. Ein mutanter Stamm, der so ausgehend vom Elternstamm Fy1679 erhalten worden war, wurde TGY156 genannt, und ein mutanter Stamm, der ausgehend vom Elternstamm TGY73.4 erhalten worden war, wurde TGY158 genannt.
Eine Probe des Stamms TGY156 wurde bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) INSTITUT PASTEUR, 25, Rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, Frankreich, am 02. Februar 1998 unter der Nummer I-1977 hinterlegt.
Eine Probe des Stamms TGY158 wurde bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) INSTITUT PASTEUR, 25, Rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, Frankreich, am 02. Februar 1998 unter der Nummer I-1976 hinterlegt.
C) Stabilisierung von Pregnenolon in vivo in den Kulturen der Hefestämme atf2-Δ::URA3
Die Zellen des Stamms TGY158, die oben erhalten worden waren, wurden mit A600 = 0,1 in YPD (Difco)-Medium, das 100 μg/ml Pregnenolon enthielt, inokuliert. Nach 16-stündiger Inkubation bei 28°C wurden die Steroide mit Dichlormethan extrahiert und durch RP-HPLC, wie oben angegeben, analysiert. Die 6(B) zeigt, dass die Mutante TGY158 die Fähigkeit, Pregnenolon zu verestern, verloren hat, während der Elternstamm TGY73.4 unter denselben Bedingungen Pregnenolon in Pregnenolonacetat umwandelt (6(A)).
Diese Resultate lassen den Schluss zu, dass das Produkt des Gens ATF2 für die Veresterung von Pregnenolon durch die Hefe verantwortlich ist, während die Unterbrechung des Gens ATF2 zu keinen offensichtlichen Modifikationen des Zellwachstums unter normalen Bedingungen geführt hat.
Beispiel 3: Konstruktion eines Hefestamms, der das Gen ATF2 durch das Gen URA3 unterbrochen hat und 3β-HSD exprimiert
Plasmide 2μ, die eine cDNA, die für die humane 3β-HSD codiert, unter der Kontrolle des Promotors CYC1 von S. cerevisae oder des Promotors TEF1 von S. cerevisae tragen und das Resistenzgen für G418 tragen, wurden nach dem Schema der 7A bis 7C aufgebaut, dann in die Mutantenhefestämme atf2-Δ::URA3 transformiert.
Im ersten Arbeitsgang wurde ein Transfervektor pTG10095, der die cDNA-Sequenz, die für die humane 3β-HSD, Typ II, beschrieben von E. Rheaume et al., 1991, codiert, flankiert von den SalI- und MluI-Stellen und stromabwärts vom Hefepromotor GAL10/CYC1 gelegen, enthält, wurde in folgender Weise gebildet:
Die Sequenz, die für die 3β-HSD codiert, wurde nach E. Rheaume et al., 1991, als SalI-NotI-Restriktionsfragment in dieselben Stellen des Vektors Bluescript II (Stratagene) subkloniert. Der erhaltene Vektor, der von E. Rheaume et al., 1991, beschrieben wurde, enthält eine NotI-Stelle am 3'-Ende der Sequenz, welche für 3β-HSD codiert, lokalisiert. Dieser Vektor wurde dann durch das Restriktionsenzym NotI verdaut, danach durch das Klenow-Fragment in Gegenwart von dNTP behandelt, um die kohäsiven Enden aufzufüllen, danach in Gegenwart des Oligonucleotids mit der folgenden Sequenz:
OTG4461: CACACGCGTGTG (SEQ ID NO: 7),
die vorher phosphoryliert und mit sich selbst hybridisiert worden war, um eine MluI-Stelle einzuführen, religiert. Der so erhaltene Vektor pTG10082 (7A) enthält die Sequenz, die für 3β-HSD codiert, welche eine BglII-Stelle enthält und durch die SalI- und MluI-Stellen begrenzt wird, während die NotI-Stelle verloren wurde. Dieser Vektor enthält noch die nicht-codierende natürliche Region 5', welche durch das Vorliegen einer BglII-Stelle identifiziert worden war.
Um die Stelle SalI des ATG-Initiators stromaufwärts, zu der, an der man den Promotor GAL10/CYC1 einführen möchte, anzunähern, wurde der Vektor pTG10082 durch das Restriktionsenzym MscI, dessen Stelle in der nicht-codierenden Region 5' und genau stromaufwärts des ATG-Initiators gelegen ist, und durch das Restriktionsenzym MluI verdaut. Das Fragment MscI-MluI mit 1,8 kb, das die codierende Sequenz für 3β-HSD enthält (7A), wurde isoliert und dann in das Plasmid pTG10033 (E. Degryse et al., 1995), das den Promotor GAL10/CYC1 enthält, der vorher durch das Restriktionsenzym SalI verdaut worden war, dann in Gegenwart von dNTP durch das Klenow-Fragment behandelt, danach durch das Restriktionsenzym MluI verdaut. Auf diese Weise wird der Vektor pTG10095 (7B) erhalten.
In einem zweiten Verfahrensschritt wird der Rekombinationsvektor pTG10268, der das Plasmid 2μ von Hefe, ein Replikon von E. coli, eine Expressionskassette CYCl_prom-PGK_term und den Selektionsmarker LEU2 (7B) enthält, konstruiert. Dieser Vektor ist mit dem beschriebenen Vektor pTG10159 (E. Degryse et al., 1995) identisch, außer dass die Stelle XbaI, die in der Region 2μ enthalten war, durch einen Marker XbaI°, welcher durch Auffüllen der natürlichen Stelle XbaI in Gegenwart des Klenow-Fragments, danach Religation erhalten worden war, ersetzt war.
Das Expressionsplasmid pTG10268 wurde dann durch homologe Rekombination durch Einführung des Expressionsblocks, der den Promotor Gal10/CYClp enthält, welcher ausgehend vom Plasmid pTG10095, welches oben hergestellt worden war, dann durch das Restriktionsenzym NotI verdaut worden war, erhalten worden war, in das Plasmid pTG10260, welches vorher durch die Restriktionsenzyme SalI und MluI verdaut worden war, erzeugt. Das Plasmid pTG10268 (7B) enthält die Sequenz, die für humane 3β-HSD, Typ II, codiert, unter der Kontrolle des Promotors CYC1.
Expressionsplasmid pTG10862, das die codierende Sequenz für 3β-HSD unter der Kontrolle des Promotors TEF1 enthält, wurde danach in folgender Weise konstruiert (7C):
Zunächst wurde das Plasmid pTG10832 (8) durch homologe Rekombination zwischen dem Fragment NotI, welches ausgehend vom Plasmid pTG10268, das oben hergestellt worden war, dann durch das Restriktionsenzym NotI verdaut worden war, erhalten worden war, und dem Rekombinationsplasmid pTG10164 (E. Degryse et al., 1995), das vorher durch die Restriktionsenzyme SalI und MluI verdaut worden war, hergestellt.
Das Expressionsplasmid pTG10862 wurde danach durch Einführung des Promotors TEF1 erhalten, welcher in dem Fragment ClaI-SalI enthalten war, welches, ausgehend vom Plasmid pTG10085 (E. Degryse et al., 1995), isoliert worden war, an die Stelle des Promotors CYC1, der durch Verdau des Plasmids pTG10832, das oben konstruiert worden war, durch die Restriktionsenzyme ClaI und SalI ausgeschnitten worden war, erhalten.
Das Plasmid pTG10862, das so erhalten worden war (9) und die cDNA-Sequenz enthält, die für humane 3β-HSD, Typ II, codiert, wurde in den Elternstamm TGY73.4 oder in seine Mutante atf2-Δ::URA3, die dem Stamm TGY158, der in Beispiel 2 erhalten worden war, entspricht, sowie in den Elternstamm FY1679 oder seine Mutante atf2-Δ::URA3, die dem Stamm TGY156, der in Beispiel 2 erhalten worden war, entspricht, transformiert. Die Transformanten wurden wie oben angegeben auf YPD-Medium (Difco), das 250 μg/ml G418 enthielt, isoliert.
Die so erhaltenen Kolonienkandidaten wurden dann auf SD-Medium, das die für jeden Stamm notwendigen Nährstoffe enthielt (Histidin und Uracil für den Stamm TGY73.4; Histidin für TGY158; Tryptophan, Histidin, Leucin und Uracil für den Stamm FY1679; Tryptophan, Histidin und Leucin für den Stamm TGY156; jeweils in einer Konzentration von 100 μg/ml) vorkultiviert, dann in ein Medium inokuliert, das 100 μg/ml Pregnenolon enthielt. Nach 24 h Wachstum und Bioumwandlung bei 28°C wurden die Steroide extrahiert und wie oben angegeben durch RP-HPLC gemessen. Die erhaltenen Resultate, die für jeden Stamm an drei Klonen gemessen wurden, sind in der folgenden Tabelle 3 angegeben:
Tabelle 3
Diese Resultate zeigen, dass das Substrat Pregnenolon in den Mutantenstämmen TGY156 oder TGY158 fast quantitativ wiedergewonnen wird, wobei in diesen das Auftreten einer Bioumwandlung von Pregnenolon in Progesteron beobachtet wird, während in den Elternstämmen TGY73.4 oder FY1679 das Verschwinden von Pregnenolon fast vollständig ist, wobei diese kein oder sehr wenig Progesteron produzieren, das Pregnenolonacetat allerdings akkumulieren, wie es in Beispiel 2 gezeigt wurde.
Eine Probe des transformierten Stamms TGY158/pTG10862 wurde bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) (INSTITUT PASTEUR, 25, Rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, Frankreich, am 02. Februar 1998 unter der Nummer I-1978 hinterlegt.
Beispiel 4: Konstruktion eines Hefestamms, der das Gen ATF2, das durch TEF1_prom/PGK_term unterbrochen ist, hat (atf2-Δ::ΤΕF1/PGK)
Der Stamm TGY186, der ein Stamm ist, der vom Stamm TGY156 abgeleitet ist (atf2-Δ::URA3) und der in Beispiel 2 beschrieben ist, wobei das Gen URA3 am Locus ATF2 durch den Expressionsblock ΤΕF1_prom/PGK_term ersetzt wurde, wurde wie folgt konstruiert:
In einem ersten Verfahrensschritt wurde der Expressionsblock ΤΕF1_prom/PGK_term mit dem Gen ATF2 durch Doppelfusions-PCR unter den in Beispiel 2 beschriebenen Bedingungen assoziiert, wobei allerdings der Expressionsblock ΤΕF1_prom/PGK_term von S. cerevisiae, der von E. Degryse et al., 1995, beschrieben wurde, anstelle des Selektionsmarkers URA3 verwendet wurde. Die zwei ersten PCR-Reaktionen (PCR1), die die Amplifikation der codierenden Regionen 5' und 3' des Gens ATF2, die die Insertionsstelle des Blocks ΤΕF1_prom/PGK_term im unterbrochenen Zielgen ATF2 flankieren, wurden durchgeführt, indem als direkte oder indirekte Primer für die Region 5' die Oligonucleotide verwendet wurden, die die folgenden Sequenzen haben:
OTG11049:
CTCTCTGTCGACAAAATGGAAGATATAGAAGGATACGAACCACATATCACTC (SEQ ID NO: 8) und
OTG10844: ATCAATCTCCAATTAGGCCTCTTCGGATTACCC (SEQ ID NO: 9)
und für die Region 3', die Oligonucleotide mit den folgenden Sequenzen verwendet wurden:
OTG10846: CATTCGACATTCCCGAAGGTGACAATGACAAG. (SEQ ID NO: 10) und
OTG11050: AACAACACGCGTAACTATTAAAGCGACGCAAATTCGCCGATGCTTTGG (SEQ ID NO: 11).
Die Primer OTG11049 und OTG11050 wurden entwickelt, um jeweils die Restriktionsstellen SalI und MluI einzuführen.
Die dritte PCR-Reaktion (PCR2), die die Amplifikation des Blocks ΤΕF1_prom/PGK_term ermöglicht, wurde durchgeführte, indem als direkte oder indirekte Primer die Oligonucleotide verwendet wurden, die die folgenden Sequenzen haben:
OTG11052:
GGGTAATCCGAAGAGGCCTAATTGGAGATTGATATCGATCACACACCATAGCTTCAAAATGTTTCTAC (SEQ ID NO: 12) und
OTG11053:
CTTGTCATTGTCACCTTCGGGAATGTCGAAGCTTCGAAACGCAGAATTTTCGAGTTATTAAACTTAR (SEQ ID NO: 13),
welche die Restriktionsstellen ClaI und HindIII einführen. Schließlich wurde die Verbindung durch Doppelfusion der oben erhaltenen PCR-Produkte realisiert, wobei als Primer die Oligonucleotide mit den Sequenzen OTG11049 (SEQ ID NO: 8) und OTG11050 (SEQ ID NO: 11) verwendet wurden, welche die Restriktionsstellen SalI und MluI an ATF2-junction-Stellen einführen.
Nach Reinigung wurde das Fusionsendprodukt mit dem Gen ATF2, welches in dem Plasmid pTG10885 enthalten war und wie oben angegeben konstruiert und vorher mit den Restriktionsenzymen BstI und StuI verdaut worden war, rekombiniert. Auf diese Weise wird das Plasmid pTG10888, das das Signal ΤΕF1_prom/PGK_term an den Stellen ClaI und HindIII enthält, welche durch die flankierenden Regionen des Gens ATF2 begrenzt werden.
Die Herstellung des Plasmids pTG10885 umfasst die Amplifikation des Gens ATF2, ausgehend vom Stamm FY1679, nach den in Beispiel 2 beschriebenen Bedingungen, aber unter Verwendung als direkte und indirekte Primer, der Oligonucleotide, die die Sequenzen OTG11049 (SEQ ID NO: 8) und OTG11050 (SEQ ID NO: 11), die oben angegeben sind, haben, welche die Restriktionsstellen SalI und MluI einführen. In dem erhaltenen PCR-Produkt werden diese Stellen dann durch Verdauung mit den Restriktionsenzymen SalI und MluI, danach Behandlung mit dem Klenow-Fragment der Polymerase I von E. coli, um die klebrigen Enden aufzufüllen, eliminiert. Das erhaltene Fragment wurde dann in den Expressionsvektor pTG10031, der von E. Degryse et al., 1995, beschrieben wurde und der vorher mit den Enzymen ClaI und HindIII verdaut, danach mit dem Klenow-Fragment behandelt worden war, ligiert. Durch Transformation in E. coli wird das Plasmid pTG10885 erhalten, das aus der Ligation der SalI-Stelle des PCR-Produktes, das unter Verwendung des Klenow-Fragments derart aufgefüllt wurde, dass die Sequenz GTCGA erhalten wurde, mit der HindIII-Stelle des Vektors, die derart unter Verwendung des Klenow-Fragments aufgefüllt wurde, dass die Sequenz AGCTT erhalten wurde, resultiert, und zwar derart, dass die Stelle HindIII (GTCGAAGCTT) (SEQ ID NO: 14) wieder aufgebaut wurde und die Stelle ClaI verloren ging. Die Stelle ClaI des Vektors, die unter Verwendung des Klenow-Fragments so aufgefüllt wurde, dass die Sequenz ATCG erhalten wurde, geht nach Ligation des PCR-Produktes verloren.
Das Signal ΤΕF1_prom/PGK_term wurde dann in Form eines Fragments NotI mit 1,8 kb aus dem Plasmid pTG10888 ausgeschnitten, danach wurde es mit dem Marker URA3 in dem Stamm TGY156 (atf2-Δ::URA3) ausgetauscht.
Der in Beispiel 2 hergestellte Stamm TGY156, der als Wirtsstamm verwendet wurde, wurde mit der DNA, die aus dem Plasmid pTG10888 ausgeschnitten worden war, und mit dem Hefevektor, der einen ARS-Ursprung enthält, Yrp7 genannt, beschrieben von Struhl et al., 1979, co-transformiert, was es ermöglicht, den Tryptophanbedarf des Stamms TGY156 zu ergänzen, und eine selektive Detektion der Kolonien durch ihre Resistenz gegenüber der 5-Fluororotsäure (5-FO) ermöglicht.
2 bis 5 μg der DNA, die durch Verdau mit dem Restriktionsenzym NotI aus dem Plasmid pTG10888 und dem Plasmid Yrp7 ausgeschnitten worden war, wurden durch das Lithiumacetatverfahren (Ito et al., 1983) in den Stamm TGY156 eingeführt. Die Selektion auf Komplementation des Bedarfs an Tryptophan des Stamms wurde dann nach Ausbreitung in Agarschalen in YNGB-Medium (Difco), das mit Histidin und Leucin angereicht war (jeweils mit 100 μg/ml) durchgeführt. Die Kandidatenkolonien, die mit Hilfe eines cure-dent entnommen wurden, wurden dann auf ein Medium gegeben, das 5-FO enthielt und das nach Boeke et al., 1984, hergestellt worden war; dann wurde die Resistenz gegenüber 5-FO auf demselben Medium bestätigt, wobei der eventuelle Verlust des Vektors Yrp7 in den gegenüber 5-FO resistenten Kolonien durch einen Bedarf an Tryptophan angezeigt wurde. Unter den so selektionierten Klonen wurde die Assoziation des Gens ATF2 mit ΤΕF1_prom und PGK_term durch PCR gesteuert. Auf diese Weise wird der Stamm TGY186 erhalten.
Beispiel 5: Konstruktion eines Hefestamms, der das Gen ATF2, unterbrochen durch ΤΕF1_prom/PGK_term, hat und P₄₅₀17α exprimiert
Ein Plasmid (pTG10435), das einen Hefereplikationsursprung ARSH4/CEN6, den Selektionsmarker URA3 enthält und eine cDNA-Sequenz, die für das bovine Cytochrom P₄₅₀17α codiert, unter der Kontrolle des Promotors TEF1 von S. cerevisiae trägt, wurde nach dem Schema der 10 aufgebaut, dann in den Mutantenhefestamm atfs-Δ::ΤΕF1/PGK (TGY186) transformiert. In einer ersten Stufe wurde das Plasmid pTG10058, das die cDNA-Sequenz, die für das bovine Cytochrom P₄₅₀17α codiert, das von Zuber et al., 1986, beschrieben wurde, flankiert von den Stellen SalI und MluI und stromabwärts des Hefepromotors CYC1 gelegen, enthält, nach dem Schema der 11 gebildet: das Plasmid pGB17α-5, das in der Patentanmeldung WO 89/10963 beschrieben ist und die Sequenz, die für das bovine Cytochrom P₄₅₀17α codiert, enthält, wurde durch Verdau mit dem Restriktionsenzym XhoI geöffnet, dann mit alkalischer Phosphatase behandelt. Nach Phosphorylierung und Hybridisierung wurden die Oligonucleotide, die die folgenden Sequenzen haben:
OTG4511: TCGACGGACGCGTGG (SEQ ID NO: 15) und
OTG4512: TCGACCACGCGTCCG (SEQ ID NO: 16)
in die Stelle XhoI eingeführt, wodurch das Plasmid pTG10104 gebildet wurde. Das Plasmid pTG10104 wurde dann durch die Restriktionsenzyme SalI und MluI behandelt, dann in das von E. Degryse et al., 1995, beschriebene Plasmid pTG10031 eingeführt, das den Hefepromotor CYC1 enthielt, der vorher mit den Restriktionsenzymen SalI und MluI verdaut worden war und mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war. Auf diese Weise wird der Vektor pTG10058, der die cDNA, die für das bovine Cytochrom P₄₅₀17α codiert, enthält, erhalten (12). Das Plasmid pTG10058 wurde dann durch die Restriktionsenzyme SalI und MluI verdaut und mit alkalischer Phosphatase behandelt. Das Fragment SalI-MluI mit 1,7 kb, das die für das bovine Cytochrom P₄₅₀17α codierende Sequenz enthält, wurde isoliert, dann in den Expressionsvektor pTG10085, der von E. Degryse et al., 1995, beschrieben wird und den Hefepromotor TEF1 enthält, vorher mit den Enzymen SalI und MluI verdaut worden war, ligiert. Auf diese Weise wird das Plasmid pTG10293 (13), in dem die für das Cytochrom P₄₅₀17α codierende Sequenz unter der Kontrolle des Promotors TEF1 ist, erhalten. In einer zweiten Stufe wurde das Expressionsplasmid pTG10435 durch homologe Rekombination zwischen dem Rekombinationsplasmid TG10434, das von E. Degryse et al., 1995, beschrieben wurde, und die Sequenz ARSH4/CEN6 enthält, das vorher durch die Enzyme SalI und MluI verdaut worden war, und dem Fragment NotI mit 2,8 kb, das ausgehend von dem wie oben beschrieben hergestellten Plasmid pTG10293 erhalten worden war, gebildet. Das so erhaltene Plasmid pTG10435 (14), das die für das bovine Cytochrom P₄₅₀17α codierende Sequenz unter der Kontrolle des Promotors TEF1 enthielt, wurde dann in den Elternstamm FY1679 oder in den in Beispiel 4 hergestellten Stam TGY186 (atf2-Δ::TEF1/PGK) transformiert. Die Transformanten wurden wie oben angegeben auf YNBG-Medium (Difco), das mit Tryptophan, Histidin und Leucin (jeweils 100 μg/ml) angereichert worden war, isoliert. Die so erhaltenen Kolonien wurden dann während 16 h im YNB-Medium (Difco), das 2% Glucose und 0,5% Casaminosäuren enthielt, vorkultiviert, dann in frischem Medium auf A600 = 0,2 verdünnt. Nach 6 h Wachstum wurden 100 μ/ml Pregnenolon oder Progesteron zugesetzt. Nach 48 Stunden Wachstum und Bioumwandlung bei 28°C wurden die Steroide extrahiert und durch RP-HPLC, wie in Beispiel 1 angegeben, gemessen, wobei jeweils Standards von Pregnenolon und 17α-Hydroxypregenolon oder Progesteron und 17α-Hydroxyprogesteron verwendet wurden.
Die erhaltenen Resultate sind in μg/ml ausgedrückt und werden in der folgenden Tabelle 4 gezeigt:
Tabelle 4
Die Resultate zeigen, dass das Bioumwandlungsvermögen des Cytochroms P₄₅₀17α, das vom Vektor pTG10435 exprimiert wird, etwas das gleiche wie das im Wildstamm (FY) oder in seiner Mutante atf2 (TGY186) mit Progesteron als Substrat ist. Andererseits wird mit Pregnenolon als Substrat dieselbe Bioumwandlung wie bei Progesteron erreicht, allerdings nur mit der Mutante atf2 (TGY186). Im Wildstamm FY werden das Substrat und das Produkt gleichzeitig acetyliert, und es wird kein freies Hydroxyprogesteron nachgewiesen.
Eine Probe des transformierten Stamms TGY186/pTG10435 wurde bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) INSTITUT PLASTEUR, 25, Reu du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, Frankreich, am 20. Januar 1999 unter der Nummer I-2119 hinterlegt.
Beispiel 6: Konstruktion eines Hefestamms, der das Gen ATF2, das durch TEF1_prom/PKG_term unterbrochen ist, hat und der 3β-HSD und P₄₅₀17α gleichzeitig exprimiert
Das Plasmid pTG10417 (21), das das Hefereplikon 2μ und zwei Expressionsblöcke, der eine, der für humane 3β-HSD codiert, der andere, der für das bovine Cytochrom P₄₅₀17α codiert, wobei beide unter der Kontrolle des Promotors CYC1 von S. cerevisiae stehen, enthält und das den Selektionsmarker URA3-d trägt, wurde aufgebaut, indem sukzessive die Stufen 1 bis 3, die unten beschrieben werden (15A und B), danach die unten beschriebenen Stufen 4 bis 6 durchgeführt werden, dann wird es in den Mutantenhefestamm atf2-Δ::TEF1_prom/PKG_term (TGY186) transformiert.
Stufe 1: Konstruktion des Plasmids pTG10210
Der Expressionsvektor pTG10033, der von E. Degryse et al., 1995, beschrieben wurde und der den Hefehybridpromotor GAL10/CYC1, der vorher durch das Restriktionsenzym pvuII verdaut worden war, enthielt, wurde mit alkalischer Phosphatase behandelt und dann in Gegenwart des Oligonucleotids, das die folgende Sequenz hat:
OTG1050: CCCGAATTCGGG (SEQ ID NO: 17),
das vorher phosphoryliert und mit sich selbst hybridisiert worden war, um die Stellen EcoRI am Rand des Expressionsblocks, der den Promotor GAL10/CYC1 enthält, einzuführen, religiert. Auf diese Weise wird der Vektor pTG10210 erhalten.
Stufe 2: Konstruktion des Plasmids pTG10214
Der Expressionsblock, der den Promotor GAL10/CYC1 enthält, der im Vektor pTG10210 vorliegt, wird dann in den Pendelvektor E. coli-Hefe pTG10013 eingeführt, der von E. Degryse et al., 1995, beschrieben wurde und den Selektionsmarker URA3-d enthält.
Der Vektor pTG10013 wurde nach Behandlung mit dem Restriktionsenzym EcoRI und Behandlung mit alkalischer Phosphatase in den in Stufe 1 hergestellten Vektor pTG10210, der vorher mit dem Enzym EcoRI verdaut worden war, ligiert. Der so erhaltene Vektor pTG10214 enthält den Expressionsblock, der den Promotor GAL10/CYC1 enthält, welcher zum Replikon 2μ verdaut worden war.
Stufe 3: Konstruktion des Plasmids pTG10274
In Plasmid pTG10214 wurde dann der Promotor GAL10/CYC1 durch homologe Rekombination nach Ausschneiden des Plasmids durch Behandlung mit den Restriktionsenzymen ClaI und SalI durch den Promotor CYC1 ausgetauscht. Der Expressionsvektor pTG100312, der von E. Degryse et al., 1995, beschrieben worden war und den Promotor CYC1 enthält, wurde durch die Restriktionsenzyme HindIII und FspI verdaut, dann mit Plasmid pTG10214, das in Stufe 2 hergestellt worden war und vorher mit den Restriktionsenzymen ClaI und SalI verdaut worden war, rekombiniert; auf diese Weise wurde das Plasmid pTG10274 (16) gebildet.
Stufe 4: Konstruktion des Plasmids pTG10401
Ausgehend vom Plasmid pTG10274, das den Promotor CYC1 enthält, und vom Plasmid pTG10293, das die Sequenz enthält, die für das Cytochrom P₄₅₀17α unter der Kontrolle des Promotors TEF1 codiert, wurde dass durch homologe Rekombination neues Plasmid pTG10401, das die Sequenz enthält, die unter der Kontrolle des Promotors TEF1 für das Cytochrom P₄₅₀17α codiert, gebildet.
Der Promotor CYC1 und ein Teil des Replikons von E. coli wurden aus dem Plasmid pTG10274, das in sTufe 3 hergestellt worden war, durch Verdau mit den Restriktionsenzymen MluI und DraI ausgeschnitten. Das in Beispiel 5 hergestellte Plasmid pTG10293 wurde mit den Restriktionsenzymen HindIII und PvuII verdaut, dann mit dem Plasmid pTG10274, das mit den Restriktionsenyzen MluI und DraI verdaut worden war, rekombiniert; auf diese Weise wurde das Plasmid pTG10401 (17) gebildet.
Stufe 5: Konstruktion des Plasmids pTG10403
Die cDNA, die für die humane 3β-HSD des Typs II codiert, wurde dann in das Plasmid pTG10401 unter der Kontrolle des Promotors CYC1 eingeführt.
In einem ersten Arbeitsschritt wurde der Expressionsvektor pTG10262, der die cDNA enthielt, die für die humane 3β-HSD des Typs II codiert, nach dem Schema der 18 aufgebaut, und zwar ausgehend vom Transfervektor pTG10095, der in Beispiel 3 hergestellt worden war, und vom Rekombinationsvektor pTG10257, der das Hefereplikon 2μ, ein E. coli-Replikon, die Hefe-Expressionskassette CYC1_prom-PGK_term und den Selektionsmarker URA3-d enthielt. Dieser Vektor pTG10257 ist identisch mit dem von E. Degryse et al., 1995, beschriebenen Rekombinationsvektor pTG10042, mit der Ausnahme der Stelle XbaI, die in der Region 2μ enthalten ist, und die durch einen Marker XbaI°, der durch Auffüllen der natürlichen Stelle XbaI mit dem Klenow-Fragment und anschließender Religation erhalten worden war, ersetzt wurde.
Der Expressionsblock der humanen 3β-HSD des Typs II wurde durch Verdau mit dem Restriktionsenzym NotI aus dem Transfervektor pTG10095 ausgeschnitten, dann in den Rekombinationsvektor pTG10257, der vorher mit den Restriktionsenzymen SalI und MluI verdaut worden war, eingeführt; auf diese Weise wurde der Expressionsvektor pTG10262 (19) gebildet. Es ist zu betonen, dass die Rekombination der cDNA des Blocks GAL10/CYC1, die vom Plasmid pTG10095 stammt, im Rekombinationsvektor pTG10257, der den Promotor CYC1 enthält, einen Expressionsvektor produziert, der den Block CYC1-cDNA enthält.
In einem zweiten Verfahren wird der oben hergestellte Expressionsvektor pTG10262 mit dem Restriktionsenzym XmnI verdaut. Das erhaltene Fragment, das die cDNA enthält, welche für 3β-HSD codiert, wurde mit dem Fragment des in Stufe 4 hergestellten Plasmids pTG10401, das die cDNA enthält, welche für das Cytochrom P₄₅₀17α codiert, das durch Verdau mit dem Restriktionsenzym ScalI erhalten worden war. Das so erhaltene Plasmid pTG10403 (20) enthält zwei Expressionsblöcke, der eine, der für 3β-HSDH unter der Kontrolle des Promotors CYC1 codiert, der andere, der für das Cytochrom P₄₅₀17α unter der Kontrolle des Promotors TEF1 codiert.
Stufe 6: Konstruktion des Plasmids pTG10417
Schließlich wurde in dem obigen Plasmid pTG10403 der Promotor TEF1 durch den Promotor CYC1 ausgetauscht.
Einerseits wurde das in Beispiel 5 beschriebene Plasmid pTG10058 mit dem Restriktionsenzym PvuII verdaut, was es ermöglicht, einen Teil der für das Cytochrom P₄₅₀17α codierenden Sequenz, die mit dem Promotor CYC1 assoziiert ist, sowie den Hauptteil des Replikons von E. coli freizusetzen. Andererseits wurde ein Teil des Replikons von E. coli aus dem in Stufe 5 hergestellten Plasmid pTG10403 durch Verdau mit dem Restriktionsenzym DraI eliminiert. Durch Rekombination der zwei Plasmide, die vorher so verdaut worden waren, wird schließlich das Plasmid pTG10417 erhalten. Das Plasmid pTG10417 enthält das Hefereplikon 2μ, den Selektionsmarker URA3-d und die zwei Expressionsblöcke, von denen einer für die humane 3β-HSD codiert, der andere für das Cytochrom P₄₅₀17α vom Rind codiert, wobei die beiden unter der Kontrolle des Hefepromotors CYC1 sind (21).
Das Plasmid pTG10417 wurde dann in den Elternstamm FY1679 oder in den in Beispiel 4 hergestellten Stamm TGY186 (atf2-Δ::ΤΕF1_prom/PGK_term) transformiert.
Die Transformanten wurden auf einem gelierten YNB-Medium (Difco), das 0,5% Glucose enthielt, mit Tryptophan, Histidin und Leucin angereichert war (100 μg/ml jeweils) isoliert.
Die so erhaltenen Kolonien wurden 24 h lang bei 28°C im YNB-Medium (Difco), das 0,5% Glucose und 0,1% Casaminosäuren enthält, vorkultiviert, dann auf A600 = 0,1 verdünnt und mit 100 μg/ml Pregnenolon ergänzt, entweder im selben frischen Medium (Medium 1) oder im YNB-Medium (Difco), das 0,1% Glucose, 2% Glycerin und 0,2% Casaminosäuren enthielt (Medium 2). Nach 48 Stunden Wachstum und Umwandlung wurden die Steroide extrahiert und durch RP-HPLC, wie in Beispiel 1 beschrieben, gemessen, wobei die Standards Pregnenolon, 17α-Hydroxypregnenolon, Progesteron und 17α-Hydroxyprogesteron verwendet wurden.
Die erhaltenen Resultate, die in μg/ml ausgedrückt sind, werden in Tabelle 5 (Medium 1) und Tabelle 6 (Medium 2), die folgen, gezeigt:
Tabelle 5
Tabelle 6
Diese Resultate zeigen, dass die Bioumwandlung in den Wildstamm (FY), der durch das Plasmid pTG10417 transformiert war, zu einer Akkumulierung von Pregnenolonacetat und 17α-Hydroxypregnenolonacetat führt, die letztlich durch die Enzyme 3β-HSDH oder P₄₅₀17α nicht transformiert werden, und dass die Bilanz der Bioumwandlung schlechter ist als die, die mit der transformierten Mutante atf2 (TGY186) beobachtet wird.
Eine Probe des transformierten Stamms TGY186/pTG10417 wurde bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) INSTITUT PASTEUR, 25, Rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, Frankreich, am 20. Januar 1999 unter der Nummer I-2118 hinterlegt.
Literaturstellen

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Modifizierter Hefestamm, bei dem die Acetyl-CoA-Pregnenolon-Acetyltransferase (APAT)-Aktivität durch Veränderung des Gens ATF2 von S. cerevisiae oder eines Gens, das für ein Protein kodiert, welches APAT-Aktivität hat und mit der Sequenz des Proteins YGR177C eine Sequenzidentität von 60% und mehr hat, eliminiert ist.
Modifizierter Hefestamm gemäß Anspruch 1, bei dem das veränderte Gen das Gen ATF2 von S. cerevisiae ist.
Modifizierter Hefestamm gemäß Anspruch 2, bei dem das Gen ATF2 durch Insertion einer DNA-Sequenz, die mindestens ein Nucleotid hat, verändert ist.
Modifizierter Hefestamm nach Anspruch 3, in dem das Gen ATF2 durch Insertion des Selektionsgens URA3 oder des Expressionsblocks von Hefe, der aus dem Promotor TEF1 und dem Terminator PGK besteht, verändert ist.
Modifizierter Hefestamm nach Anspruch 4, bei dem das Gen ATF2 durch Insertion des Selektionsgens URA3 verändert ist.
Modifizierte Stämme von S. cerevisiae nach Anspruch 5, als TGY156 bezeichnet und bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) INSTITUT PASTEUR, 25, Rue du Docteur Roux 75724 PARIS CEDEX 15, Frankreich, am 2. Februar 1998 unter der Nummer I-1977 hinterlegt.
Modifizierter Stamm von S. cerevisiae gemäß Anspruch 5, TGY158 genannt und bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) INSTITUT PASTEUR, 25, Rue du Docteur Roux 75724 PARIS CEDEX 15, Frankreich, am 02. Februar 1998 unter der Nummer I-1976 hinterlegt.
Modifizierter Hefestamm nach Anspruch 4, bei dem das Gen ATF2 durch Insertion des Expressionsblocks von Hefe verändert ist, welcher aus dem Promotor TEF1 und dem Terminator PGK besteht.
Transformierter Hefestamm, bei dem die Acetyl-CoA-Pregnenolon-Acetyltransferase (APAT)-Aktivität durch Veränderung des Gens ATF2 von S. cerevisiae oder eines Gens, das für ein Protein kodiert, welches APAT-Aktivität hat und mit der Sequenz des Proteins YGR177C eine Sequenzidentität von 60% und mehr hat, eliminiert ist und der mindestens eines der Enzyme des Biosynthesewegs von Hydrocortison, ausgehend von Cholesterin, exprimiert, das ausgewählt ist aus: – dem Enzym zur Spaltung der Seitenkette des Cholesterins (P₄₅₀SCC), – 3β-Hydroxy-delta⁵-steroid-Dehydrogenase/delta⁵-delta⁴-steroid-Isomerase (3β-HSD) und – 17α-Steroidhydroxylase (P₄₅₀17α).
Transformierter Hefestamm nach Anspruch 9, bei dem das veränderte Gen das Gen ATF2 von S. cerevisiae oder ein Homologes desselben ist.
Transformierter Hefestamm nach Anspruch 10, bei dem das veränderte Gen das Gen ATF2 von S. cerevisiae ist.
Transformierter Hefestamm nach Anspruch 11, bei dem das Gen ATF2 durch Insertion einer DNA-Sequenz, die mindestens ein Nucleotid hat, verändert ist.
Transformierter Hefestamm nach Anspruch 11, bei dem das Gen ATF2 durch Insertion des Selektionsgens URA3 verändert ist.
Transformierter Hefestamm nach Anspruch 13, der 3β-HSD exprimiert.
Transformierter S. cerevisiae-Stamm nach Anspruch 14, TGY158/pTG10862 genannt und bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) INSTITUT PASTEUR, 25, Rue du Docteur Roux 75724 PARIS CEDEX 15, Frankreich, am 2. Februar 1998 unter der Nummer I-1978 hinterlegt.
Transformierter Hefestamm nach Anspruch 11, bei dem das Gen ATF2 durch Insertion des Expressionsblocks von Hefe verändert ist, welcher aus dem Promotor TEF1 und dem Terminator PGK besteht.
Transformierter Hefestamm nach Anspruch 16, der P₄₅₀17α exprimiert.
Transformierter S. cerevisiae-Stamm nach Anspruch 17, TGY186/pTG10435 genannt und bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) INSTITUT PASTEUR, 25, Rue du Docteur Roux 75724 PARIS CEDEX 15, Frankreich, am 20. Januar 1999 unter der Nummer I-2119 hinterlegt.
Transformierter Hefestamm nach Anspruch 16, der 3β-HSD und P₄₅₀17α co-exprimiert.
Transformierter S. cerevisiae-Stamm nach Anspruch 19, TGY186/pTG10417 genannt und bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) INSTITUT PASTEUR, 25, Rue du Docteur Roux 75724 PARIS CEDEX 15, Frankreich, am 20. Januar 1999 unter der Nummer I-2118 hinterlegt.
Verfahren zur in vivo-Oxidation eines Substrats, das aus einem endogenen Sterol, einem exogenen Sterol oder einem exogenen Steroid ausgewählt ist, wobei man einen transformierten Hefestamm nach einem der Ansprüche 9 bis 20 verwendet, den man entweder allein kultiviert, wenn der Stamm das endogene Sterol bildet, oder den man mit dem Sterol oder dem exogenen Steroid inkubiert und gegebenenfalls die erhaltene oxidierte Verbindung isoliert.
Verfahren zur in vivo-Oxidation nach Anspruch 21, wobei das Substrat ein 3β-Hydroxysteroid ist und wobei man einen transformierten Hefestamm nach Anspruch 14 verwendet und gegebenenfalls das erhaltene 3-Οxo-delta⁴-steroid isoliert.
Verfahren zur in vivo-Oxidation nach Anspruch 22, wobei das 3β-Hydroxysteroid unter Pregnenolon und 17α-Hydroxy-Pregnenolon ausgewählt wird.
Verfahren zur in vivo-Oxidation nach Anspruch 21, wobei das Substrat ein Steroid ist und wobei man einen transformierten Hefestamm nach Anspruch 17 verwendet und gegebenenfalls das erhaltene 17α-hydroxylierte Steroid isoliert.
Verfahren zur in vivo-Oxidation nach Anspruch 24, wobei das Steroidsubstrat Pregnenolon oder Progesteron ist.
Verfahren zur in vivo-Oxidation nach Anspruch 21, wobei das Substrat ein 3β-Hydroxysteroid ist und wobei man einen transformierten Hefestamm nach Anspruch 19 verwendet und gegebenenfalls das erhaltene 17α-hydroxylierte 3-Οxo-delta⁴-steroid isoliert.
Verfahren zur in vivo-Oxidation nach Anspruch 26, wobei das Steroidsubstrat Pregnenolon ist.