HU218111B - Eljárás szteroidok többszörös oxidálására, valamint ehhez alkalmazható, genetikailag módosított sejtek - Google Patents

Eljárás szteroidok többszörös oxidálására, valamint ehhez alkalmazható, genetikailag módosított sejtek Download PDF

Info

Publication number
HU218111B
HU218111B HU066/89A HU606689A HU218111B HU 218111 B HU218111 B HU 218111B HU 066/89 A HU066/89 A HU 066/89A HU 606689 A HU606689 A HU 606689A HU 218111 B HU218111 B HU 218111B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
steroid
proteins
scc
cells
expression
Prior art date
Application number
HU066/89A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT53393A (en
Inventor
Gerardus Cornelis Maria Selten
Harmen Slijkhuis
Eric Bastiaan Smaal
Original Assignee
HOECHST Marion Roussel S.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by HOECHST Marion Roussel S.A. filed Critical HOECHST Marion Roussel S.A.
Publication of HUT53393A publication Critical patent/HUT53393A/hu
Publication of HU218111B publication Critical patent/HU218111B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y106/00—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C12Y106/02—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6) with a heme protein as acceptor (1.6.2)
    • C12Y106/02004—NADPH-hemoprotein reductase (1.6.2.4), i.e. NADP-cytochrome P450-reductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C12N9/0038—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6) with a heme protein as acceptor (1.6.2)
    • C12N9/0042—NADPH-cytochrome P450 reductase (1.6.2.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0095—Oxidoreductases (1.) acting on iron-sulfur proteins as donor (1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01053—3-Alpha (or 20-beta)-hydroxysteroid dehydrogenase (1.1.1.53)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/15—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with reduced iron-sulfur protein as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.15)
    • C12Y114/15004—Steroid 11-beta-monooxygenase (1.14.15.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/15—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with reduced iron-sulfur protein as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.15)
    • C12Y114/15006—Cholesterol monooxygenase (side-chain-cleaving) (1.14.15.6), i.e. cytochrome P450scc
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/99—Miscellaneous (1.14.99)
    • C12Y114/99009—Steroid 17-alpha-monooxygenase (1.14.99.9), i.e. cytochrome-P450-steroid-17-alpha-hydroxylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y118/00—Oxidoreductases acting on iron-sulfur proteins as donors (1.18)
    • C12Y118/01—Oxidoreductases acting on iron-sulfur proteins as donors (1.18) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.18.1)
    • C12Y118/01002—Ferredoxin-NADP+ reductase (1.18.1.2)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)

Abstract

A találmány olyan, genetikailag módosított gazdasejtekre vonatkozik,amelyek szteroidok szimultán oxidációjára képesek, főként pedig a 17?-hidroxicsoport és a C21-hidroxicsoport szimultán bevitelére.Nevezetesen: az oxidációt olyan sejtekkel végezhetik el, amelyekbelegalább két, olyan proteint kódoló DNS-t visznek be, amelyek egybiológiai átalakítási folyamatban a koleszterint hidrokortizonnáalakítják át. Alkalmas gazdasejtek a Bacillus, Saccharomyces vagyKluyveromyces fajok sejtjei. Az új gazdasejtek alkalmasak akoleszterin, pregnenolon, progeszteron és 17?-hidroxi-progeszteronbiokémiai oxidálására, mely vegyületek az említett biológiai folyamatköztitermékei. A gazdasejtek egy olyan multigénrendszer véglegeskialakítására is felhasználhatók, amelyben a koleszterin egy lépésbenkonvertálódik hidrokortizonná. ŕ

Description

A találmány gyógyászati célra alkalmazható szteroidok előállítására szolgáló többszörös oxidációs eljárásra vonatkozik.
A 11β, 17o.,21-trihidroxi-4-pregnén-3,20-dion (hidrokortizon) olyan gyógyászatilag fontos szteroid, amely farmakológiai tulajdonságai alapján kortikoszteroid gyanánt alkalmazható, és mint kiindulási anyag, számos hasznos szteroid - főként más kortikoszteroidok - előállítására használható fel. A hidrokortizon a gerincesek mellékvesekérgében termelődik, és eredetileg, bár kis mennyiségekben, mellékvesekéreg-szövetből vonták ki munkaigényes eljárásokkal. Csak szerkezetének megismerése után fejlesztettek ki új előállítási eljárásokat, amelyeket kémiai szintetikus lépések és mikrobiológiai konverziók kombinációja jellemeztek. Mivel a felhasznált kiindulási vegyületek - ilyenek a szterolok, epesavak és szapogeninek - bőven állnak rendelkezésre és olcsók, a jelenlegi eljárások, bár kevésbé költséges terméket eredményeznek, még mindig meglehetősen bonyolultak. A jelenlegi eljárások javítására számos lehetőséget vizsgáltak meg, és biokémiai megközelítésekkel is próbálkoztak.
Az egyik próbálkozás célja az volt, hogy egy alkalmas kiindulási szteroidot in vitro biokémiai rendszerben olyan izolált mellékvesekéreg-proteinekkel alakítsanak át, amelyek in vivő köztudottan felelősek a szteroidoknak hidrokortizonná történő enzimatikus konverziójáért. Azonban e proteinek izolálásának nehézsége és a szükséges kofaktorok magas ára meggátolta a gazdasági szempontból is vonzó nagybani előállítást. Egy másik próbálkozás szerint a katalizálóproteineket természetes környezetükben tartották, és a mellékvesekéregsejteket sejttenyészetben a kívánt hidrokortizon termelésére késztették. Mivel azonban a gyakorlatban e sejtek termelékenysége alacsony volt, úgy látszott, hogy egy ilyen biokémiai eljárás nem lehet gazdaságilag előnyös.
Az emlősök és más gerincesek mellékvesekérgében végbemenő in vivő folyamat olyan biokémiai reakciósorozatból áll, amely a koleszterinnel kezdődik, és különböző intermedier vegyületeken keresztül végül hidrokortizont eredményez (lásd az 1. ábrát). Ebben a folyamatban nyolc protein vesz részt közvetlenül, ezek közül öt enzim - ebből négy citokróm P45o enzim -, és a többi három elektronátvivő protein.
Az első lépés a koleszterinnek 3p-hidroxi-5-pregnén-20-onná (pregnenolon) való átalakulása. Ebben a konverzióban, mely egy monooxigenáz reakció, három protein vesz részt: oldallánchasító enzim (P450SCC, hem-Fe-tartalmú protein), adrenodoxin (ADX, Fe2S2tartalmú protein) és adrenodoxin-reduktáz (ADR, FADtartalmú protein). A reakcióhoz koleszterinen, mint szubsztrátumon kívül, molekuláris oxigén és NADPH is szükséges.
Ezt követően a pregnenolon dehidrogénezés/izomerizálás révén 4-pregnén-3,20-dionná (progeszteron) konvertálódik.
A reakcióhoz, amelyet a 3P-hidroxi-szteroid dehidrogenáz/izomeráz protein (3P-HSD) katalizál, pregnenolon és NAD+ szükséges.
A hidrokortizonhoz úgy jutunk, hogy a progeszteronhoz - egymást követően, három pozícióban - hidroxicsoportokat kapcsolunk. Ezeket a konverziókat monooxigenázok katalizálják. A progeszteronnak 17a-hidroxi-progeszteronná való átalakulásában két protein vesz részt: a szteroid-17a-hidroxiláz (P45017a, hemFe-tartalmú protein) és a NADPH citokróm P450-reduktáz (RED, FAD- és FMN-tartalmú protein). A reakció progeszteront, molekuláris oxigént és NADPH-t fogyaszt.
A 17a-hidroxi-progeszteronnak 17a,21-dihidroxipregnén-3,20-dionná (kortexolon) való átalakulásához szintén két protein szükséges: a szteroid-21-hidroxiláz (P450C21, hem-Fe-tartalmú protein) és az előbb említett protein, a RED. A reakció 17a-hidroxi-progeszteront, molekuláris oxigént és NADPH-t fogyaszt.
A kortexolonnak hidrokortizonná való konverziójában három protein vesz részt: a szteroid-1 Ιβ-hidroxiláz (P450l 1 β, hem-Fe-tartalmú protein) és a fent említett két protein, az ADX és ADR.
Mint fent említettük, a citokróm P450 proteinek enzimek, amelyek esszenciálisak a koleszterinnek hidrokortizonná való biokémiai konverziója szempontjából. Ezek az enzimek a citrokróm P450 proteinek (vagy röviden P450 proteinek) nagy csoportjához tartoznak. Ezek megtalálhatók a prokariótákban (különböző baktériumokban) és az eukariótákban (élesztőkben, penészekben, növényekben és állatokban). Az emlősöknél a mellékvesekéregben, a petefészekben, a herékben és a májban nagy mennyiségben találtak P450 proteineket.
E proteinek többségét ma már tisztították és megfelelően jellemezték. Specifikus aktivitásukat is meghatározták. Nemrég számos összefoglaló közlemény jelent meg ebben a témakörben, például K. Ruckpaul és H. Rein (szerkesztők), „Cytochrome P450” és P. R. Ortiz de Montellano (szerkesztő), „Cytochrome P450, structure, mechanism and biochemistry”. A citokróm P450 proteinekre jellemző abszorpciós maximum szén-monoxiddal való redukálás után 450 nm-nél van. Prokarióta szervezetekben a P450 proteinek vagy membránhoz kötöttek, vagy a citoplazmában helyezkednek el. A bakteriális P450 proteinek részletes tanulmányozása során (például P450meg és P450cam) kitűnt, hogy hidroxilező hatásukban egy ferredoxin és egy ferredoxinreduktáz vesz részt. Az eukarióta szervezeteknél két P45O típust (I. és II. típus) írtak le. Ezek két szempontból különböznek egymástól:
1. Sejten belüli helyzetük szempontjából: az I. típus a mikroszomális frakcióban, a II. típus a mitokondriumok belső membránjában helyezkedik el.
2. Elektronátvitel útja a P45o proteinre: az I. típust a NADPH egy P450-reduktáz révén reduktálja, míg a II. típust a NADPH egy ferredoxin-reduktáz (például adrenodoxin-reduktáz) és egy ferredoxin (például adrenodoxin) révén redukálja.
Az EP-A-0281245 számú európai szabadalmi bejelentés szerint a citokróm P450 enzimek előállíthatok Streptomyces fajokból, s ezek kémiai vegyületek hidroxilezésére felhasználhatók.
HU 218 111 Β
Ezeket az enzimeket izolált formában használják, s az izolálás meglehetősen hosszadalmas és költséges eljárás.
A JP-A-62236485 (Derwent 87-331234) számú szabadalmi bejelentés szerint a máj citokróm P450 enzimek génjeit be lehet vinni Saccharomyces cerevisiaebe, és a kifejeződő enzimek oxidatív hatásuk következtében használhatók fel.
A fent említett bejelentésekben azonban nincs utalás arra vonatkozóan, hogy a citokróm P450 enzimek szteroid vegyületek előállítására használhatók lennének.
Az 1989. május 8-án benyújtott 3289/89 számú magyar szabadalmi bejelentésünkben - amelynek 1-28. példáit referenciaként ez a leírás is tartalmazza - több expressziós kazettát is ismertetünk olyan multigénrendszer felépítéséhez szükséges proteinek előállítására, amelyben a nem költséges szteroid kiindulási anyagok oxidatív konverziója révén sokkal ritkább és drágább végtermékekhez jutunk. E bejelentés szerint a konverziót természetes rendszerekben hajtjuk végre, enzimek által katalizált, kofaktorok által közvetített konverziók sokaságán keresztül.
Ez a bejelentés olyan expressziós kazettákat ismertet, amelyek rekombináns gazdasejtben heterológ kódoló DNS-szekvencia kifejeződését eredményezik. Az említett kódolószekvencia olyan enzimet kódol, amely egyedül vagy más proteinnel együtt a koleszterin hidrokortizonná való konverziójának biológiai folyamatában egy külön oxidációs lépést katalizál. Tehát az expressziós kazetták olyan szekvenciákat tartalmaznak, amelyek - rekombináns gazdasejtben - a következő proteinek termelésére képesek: oldallánchasító enzim (P450SCC), adrenodoxin (ADX), adrenodoxin-reduktáz (ADR), 3P-hidroxi-szteroid dehidrogenáz/izomeráz (3P-HSD), szteroid-17a-hidroxiláz (P450 1 7a), NADPH citokróm R450-reduktáz (RED), szteroid-21-hidroxiláz (P450C21) és szteroid-11 β-hidroxiláz (P45o 11 β).
A szóban forgó bejelentés további tárgyát olyan rekombináns gazdasejtek képezik, amelyeket ezen vektorokkal vagy a találmány szerinti expressziós kazettákkal transzformálunk, továbbá olyan eljárások, amelyek a fenti enzimek előállítására, valamint az enzimek oxidációra való felhasználására szolgálnak. Vonatkozik továbbá a bejelentés olyan eljárásokra, amelyekben az említett gazdasejteket táptalajban használjuk fel specifikus oxidációra és olyan gyógyszerkészítményekre, amelyek az ezekkel az eljárásokkal előállított vegyületeket tartalmazzák.
A bejelentés főként olyan sejtek előállításával és tenyésztésével foglalkozik, amelyek alkalmasak nagyüzemi biokémiai termelőreaktorokban való alkalmazásra, valamint e sejteknek vegyületek oxidációjára való felhasználásával, különösen az 1. ábrán bemutatott szteroidok termelése céljából. A rajzon bemutatott reakciók mindegyike külön-külön elvégezhető. Egy soklépéses reakcióban a lépések felcserélése kivitelezhető. Előnyös gazdasejtek a mikroorganizmusok, de más sejtek is használhatók, mint a növényi vagy állati sejtek, amelyek adott esetben sejttenyészetben vagy élő, átvitt gént tartalmazó transzgenikus növények vagy állatok szöveteiben nyernek alkalmazást.
Ezeket a sejteket úgy kapjuk meg, hogy alkalmas receptor sejteket - előnyösen megfelelő mikroorganizmusokat - genetikailag transzformálunk olyan vektorokkal, amelyek a koleszterin hidrokortizonná való konverziójában részt vevő proteineket kódoló DNS-szekvenciákat tartalmazzák. A szóban forgó proteinek a következők: oldallánchasító enzim (P450SCC), andrenodoxin (ADX), adrenodoxin-reduktáz (ADR), 3p-hidroxiszteroid dehidrogenáz/izomeráz (3p-HSD), szteroid17a-hidroxiláz (P4501 7a), NADPH citokróm P450-reduktáz (RED), szteroid-21-hidroxiláz (P450C21) és szteroid-11 β-hidroxiláz (Ρ4501 1β). Lehet, hogy bizonyos gazdasejtek saját célra már eleve termelnek a szükséges proteinek közül egyet vagy többet, ez esetben csak a kiegészítő DNS-szekvenciákkal kell a transzformálást elvégezni. A lehetséges saját proteinek a következők: ferredoxin, ferredoxin-reduktáz, P450-reduktáz és 3β-ύίΰroxi-szteroid dehidrogenáz/izomeráz.
A koleszterinnek hidrokortizonná történő konverziójában részt vevő proteineket kódolószekvenciák kinyerése céljára megfelelő DNS-forrásokat választunk.
A koleszterin hidrokortizonná történő konverziójában részt vevő összes proteint kódoló DNS izolálásához megfelelő forrásul szolgál a gerincesek mellékvesekéreg-szövete, például a bovin (szarvasmarha) mellékvesekéreg-szövet. A kívánt DNS különböző mikroorganizmusokból is kinyerhető, például a 3p-hidroxi-szteroid dehidrogenáz/izomerázt kódoló DNS-t a Pseudomonas testosteroniból, Streptomyces griseocameusból vagy Brevibacterium sterolicumból és a kortexolon 1 Ιβ-hidroxilezésében részt vevő proteineket kódoló DNS-t a Curvularia lunatából vagy a Cunninghamella blakesleeanából izolálhatjuk. A bovin P450SCC, bovin Ρ4501 1β proteint vagy egy ennek megfelelő mikrobiális proteint, továbbá a bovin adrenodoxint, bovin adrenodoxin-reduktázt, a bovin vagy a mikrobiális eredetű 3P-hidroxi-szteroid dehidrogenáz/izomerázt, a bovin P450 1 7a-t, a bovin P450C21-et és a bovin vagy mikrobiális eredetű NADPH citokróm P450-reduktázt kódoló DNS-szekvenciákat a következő lépések szerint izoláljuk.
1. Eukarióta szekvenciák (cDNS-ek)
a) Össz-RNS-t izolálunk megfelelő szövetből.
b) A poliA+-tartalmú RNS-t kétszálú cDNS-sé írjuk át, és bakteriofág vektorokba ligáljuk.
c) A kapott cDNS-génkönyvtárat a kívánt cDNS-re specifikus 32P-vel jelzett oligomerekkel szüljük, vagy egy izopropil-P-D-tiogalaktopiranoziddal (IPTG-vel) indukált lambda-gtll cDNS-génkönyvtárat szűrünk specifikus 125I-dal jelzett antitesttel.
d) Pozitív plakk-képzést (pfu) mutató cDNS-inszertumokat építünk be megfelelő vektorokba, és a cDNS teljes hosszát nukleotidszekvenálással ellenőrizzük.
2. Prokarióta gének
a) Genomiális DNS-t izolálunk egy megfelelő mikroorganizmusból.
b) DNS-génkönyvtár előállítása céljából DNS-ffagmentumokat klónozunk be megfelelő vektorokba, és ezzel megfelelő E. coli gazdasejteket transzformálunk.
c) A DNS-génkönyvtárat a kívánt génre specifikus 32Pvel jelzett oligomerekkel szűrjük, vagy egy IPTG-vel
HU218 111 Β indukált lambda-gtl 1 DNS-génkönyvtárat szűrünk specifikus 125I-dal jelzett antitesttel.
d) A pozitív telepek plazmidjait izoláljuk, és az inszertált DNS-fragmentumokat újraklónozzuk megfelelő vektorokban, hogy meghatározzuk a gén teljes hosszát.
Megjegyzés: a javított módszer szerint a speciális cDNS-t (eukarióta szekvenciák esetén) vagy gént (prokarióta szekvenciák esetén) kibővítjük két specifikus oligomer használatával, a polimeráz láncreakció néven [PCR=polymerase chain reaction; Saiki és munkatársai, Science, 239, 487-491 (1988)] ismert módszerrel. Ezután a kibővített cDNS-t vagy DNS-t megfelelő vektorokba építjük be.
A bejelentésben olyan megfelelő expressziós kazettákat ismertetünk, amelyekben a fenti módszer szerint izolált heterológ DNS-t megfelelő szabályozószekvenciák közé építjük be a transzkripció és transzláció érdekében. Ez lehetővé teszi, hogy a DNS egy alkalmas gazdasejt környezetében fejeződjék ki, s így megkaphassuk a kívánt proteint vagy proteineket. Alkalmanként az iniciációs szabályozószekvenciákat egy szekréciós szignálszekvencia követi.
Az említett expressziós kazetták révén megfelelő szabályozószekvenciákat kell beépíteni a strukturális DNS-sel együtt. Az expresszió úgy valósul meg, hogy egy alkalmas gazdasejtet egy olyan vektorral transzformálunk, amely az aktuális gazdasejttel kompatibilis szabályozószekvenciákat tartalmaz, s ezek funkcionális kapcsolatban vannak azokkal a kódolószekvenciákkal, amelyeknek a kifejeződését kívánjuk.
Egy másik alternatíva szerint a gazdasejt genomjában lévő alkalmas szabályozószekvenciákat használjuk fel. Az expresszió úgy válik lehetővé, ha a megfelelő gazdasejtet a kívánt protein kódolószekvenciáit tartalmazó vektorral transzformáljuk, s ha e szekvenciákat olyan gazdasejt-szekvenciák határolják, amelyek lehetővé teszik a gazda genomjával való homológ rekombinációt olyan módon, hogy a gazdasejt szabályozószekvenciái helyesen szabályozzák a bevezetett DNS-expressziót.
Általánosan ismert, hogy szabályozószekvencia meghatározás alatt minden olyan DNS-szegmentumot értünk, amelyek a kódolószekvencia kifejeződésének megfelelő szabályozásához szükségesek - e szegmentumok a kódolószekvenciához funkcionálisan kapcsolódnak -, ilyenek az operátorok, az erősítőszekvenciák (enhancerek) és főként a promoterek, valamint azok a szekvenciák, amelyek a transzlációt irányítják.
A promoter környezetének szabályozása révén vagy irányítható, vagy nem. A prokarióták számára megfelelő promoterek közé tartozik például a trp promoter (triptofánelvonással indukálható), a lac promoter (a galaktózzal analóg IPTG-vel indukálható), a β-laktamáz promoter és a fág eredetű PL promoter (hőmérséklet-változtatással indukálható). Ezenkívül, főként Bacillusban való kifejeződéshez, a következő promoterek használhatók: az alfa-amiláz és proteáz promoterei, a Spo2, spac és 0/105, valamint a szintetikus promoter szekvenciák. Előnyös promoter a „Hpall” jelű promoter. Élesztőben való kifejeződéshez alkalmas promoterek között van a 3-foszfo-licerát kináz promoter, valamint más glükolitikus enzimek promoterei, továbbá az alkohol-dehidrogenáz és az élesztő-foszfatáz promoterei. A transzkripció elongációs faktor (TEF) és a laktázpromoterei szintén alkalmasak. Emlős expressziós rendszerekben általában vírus eredetű promotereket használunk, ilyenek az adenovírus promoterek és az SV40 promoter, de ezek a rendszerek regulálható promotereket is tartalmazhatnak, ilyen például a metallotionein promoter, amely nehézfémekkel vagy glükokortikoid koncentrációval irányítható. Jelenleg vírusra alapozott rovarsejt expreszsziós rendszerek is használatosak, valamint növényi sejt promotereken — ilyenek a nopalin szintetáz promoterek - alapuló expressziós rendszerek.
Prokarióta rendszerekben a transzlációt irányító szekvenciák riboszómakötő helyet (RBS=ribosome binding site) tartalmaznak, míg az eukarióta rendszerek transzlációját egy indítókodont - ilyen az AUG - tartalmazó nukleotidszekvencia irányíthatja.
A szükséges promoteren és a transzlációt irányító szekvenciákon kívül több különböző szabályozószekvenciát - beleértve azokat, amelyek a terminációt irányítják (például eukarióta rendszerekben poliadenilációs szekvenciák működnek) - lehet használni az expresszió szabályozásához. Néhány rendszer enhancer elemeket tartalmaz, amelyek ugyan kívánatosak, de legtöbbször nem elengedhetetlenek az expresszió létrejöttéhez.
A fent említett bejelentés - egy másik szempont szerint - különböző olyan vektorokat ismertet, amelyeket a gazdasejtek transzformálására használunk. A vektorok egy csoportját pGBSCC-n jelzéssel láttuk el, ahol „n” 1-től 17-ig bármely egész szám lehet, s ezeket a vektorokat speciálisan a P450SCC enzimet kódoló DNS számára fejlesztettük ki.
Egy speciális megvalósítás szerint a pGBSCC-7 vektort alkalmassá tettük egy további heterológ gén befogadására, amely az ADX proteint kódolja. A kapott új vektor, melyet pGBSCC/ADX-1-nek neveztünk el, mind a P450SCC, mind az ADX proteint kódolja, és mindkettő működőképes formában termelődik.
A vektorok egy másik csoportját pGB17a-n-nel jelöltük, ahol „n” 1-től 5-ig bármelyik egész szám lehet. Ezeket a vektorokat speciálisan a P4501 7a enzimet kódoló DNS számára fejlesztettük ki.
A vektorok egy további csoportjának jelzése pGBC21 -n, ahol „n” 1 -tői 9-ig bármely egész szám lehet, s ezeket a vektorokat speciálisan a P450C21 enzimet kódoló DNS számára fejlesztettük ki.
A vektoroknak még egy másik csoportját pGBl Ιβ-n-nek neveztük, ahol „n” 1-től 4-ig bármely egész szám lehet. Ezeket a vektorokat speciálisan a P4<ol 1β enzimet kódoló DNS számára fejlesztettük ki.
Alkalmas gazdasejteket választottunk ki, amelyek a találmány szerinti vektorokat befogadják, és lehetővé teszik, hogy a bevitt DNS kifejeződjék. Ha a transzformáit gazdasejteket tenyésztjük, a koleszterin hidrokortizonná történő konverziójában szereplő proteinek megjelennek a sejt tartalmában. A kívánt DNS jelenlétét DNS-hibridizációs eljárásokkal bizonyíthatjuk, transzkripciójukat RNS-hibridizálással, expressziójukat im4
HU 218 111 Β munológiai vizsgálatokkal, és hatásukat azzal, hogy kimutatjuk az oxidált termék jelenlétét a kiindulási anyaggal való in vitro vagy in vivő inkubálás után.
Előnyös gazdák a transzformált mikroorganizmusok, különösen a baktériumok (a legelőnyösebbek az E. coli, a Bacillus és a Streptomyces fajok) és az élesztők (mint a Saccharomyces és Kluyveromyces fajok). További alkalmas gazdasejtek találhatók növényekben és állatokban, ideértve a rovarokat is. Az innen izolált sejteket - ezek lehetnek COS sejtek, C127 sejtek, CHO sejtek és Spodoptera frugiperda (Sfg) sejtek - sejttenyészetben használjuk. Egyébként átvitt gént tartalmazó transzgenikus növényt vagy állatot is használhatunk.
A rekombináns gazdasejtek különleges típusát képviselik azok a sejtek, amelyekbe két vagy több, találmány szerinti expressziós kazettát vezetünk be, ilyen például a pGBSCC/ADX-1, vagy amelyeket egy olyan expressziós kazettával transzformáltunk, amely legalább két heterológ proteint kódol, s ezáltal alkalmassá tettük a sejtet két olyan protein termelésére, amelyek az
1. ábrán bemutatott folyamatban vesznek részt.
A kifejlesztett új sejtek nemcsak olyan proteinek termelésére képesek, amelyek a szteroidok oxidatív konverziójában - amelyben végül is hidrokortizon képződik - vesznek részt, hanem e proteinek a tápfolyadékhoz hozzáadott megfelelő szubsztrátumvegyület kívánt oxidatív konverziójára helyben is felhasználhatók. Az előnyös szubsztrátumok a szteroidok. A heterológ DNS-sel transzformált sejtek speciálisan alkalmasak arra, hogy az 1. ábrán látható szteroidokkal - ideértendők más szterolok is, mint a β-szitoszterol - együtt történjék a tenyésztésük. Eredményül oxidált szteroidokat kapunk.
Hogy hány biokémiai konverzió lehetősége áll fenn - például szterol oldallánc-hasítás és/vagy oxidatív módosulás a Cl 1, Cl7, C3 és C21 helyen -, az attól függ, hogy az 1. ábra szerinti folyamatban szereplő proteineket kódoló heterológ DNS-ből mennyi van jelen a gazdasejtben. Ennélfogva a találmány szerinti expressziós kazetták olyan multigénrendszerek szerkesztésére használhatók, amelyek az 1. ábrán bemutatott folyamatban a soklépéses intracelluláris transzformációk szimultán megtörténtét eredményezik. Szükségessé válhat, hogy a kívánt gazdasejtbe olyan expressziós kazettákat vezessünk be, amelyek a kívánt proteinek összességét kódolják. Bizonyos esetekben a folyamatban részt vevő egy vagy több protein eleve jelen lehet a gazdasejtben, mint természetes, azonos aktivitást kifejtő protein. Például a ferredoxin, ferredoxin-reduktáz és a P450-reduktáz már jelen lehet egy gazdasejtben. Ez esetben csak a hiányzó enzimekről kell gondoskodni rekombináns transzformáció révén.
Mostanáig nem sikerült olyan multigénrendszert felépíteni, amely lehetővé tette volna az 1. ábra szerinti biokémiai folyamat legalább két lépésének egyetlen biokémiai folyamatban való lezajlását.
A találmány alapján megvalósítható, hogy egy gazdasejtbe olyan géneket klónozzunk be, amelyek a szteroidmolekulán két külön oxidációs folyamatot katalizáló proteineket kódolnak, és amelyek főként az 1. ábrán bemutatott proteineket kódolják. Nevezetesen: megvalósítottuk a szteroid 17a-hidroxilezéséért és a szteroid C21-hidroxilezéséért felelős proteineknek ugyanazon gazdaszervezetbe való klónozását, és hogy az említett gazdaszervezet az említett proteineket funkcionális formában fejezze ki. Ezenkívül a találmány egy másik szempontja szerint egy olyan eljárást ismertetünk, amelyben az említett transzformált mikroorganizmus
- fermentációs táptalajban tenyésztve - a táptalajban jelen lévő szteroidszubsztrátumot a szteroidmolekula két különböző helyén egyszerre oxidálja. Lényegében tehát egy egylépéses eljárással érjük el mind a 17α-, mind a 21-hidroxilcsoport bevitelét.
Előnyös gazdaszervezet a Kluyveromyces lactis, de más gazdaszervezetek, főként mikroorganizmusok
- például az előbb említettek - is használhatók. Még részletesebben: azok a mikroorganizmusok alkalmasak az 1. ábrán bemutatott biokémiai folyamat génjeinek klónozására és kifejezésére, amelyeket előző bejelentésünkben írtunk le.
Az egyik mód, hogy egy olyan gazdasejthez jussunk, amely többszörös szteroidoxidációt tud végezni az, hogy a gazdasejtet két vagy több olyan vektorral transzformáljuk, amelyek mindegyike egy-egy oxidációs lépésért felelős gént tartalmaz.
Egy másik mód, hogy egy olyan vektorral transzformáljuk a gazdasejtet, amely a kívánt többszörös oxidációs reakcióhoz szükséges proteineket kódoló összes génnel ellátott expressziós kazettát tartalmazza.
A találmány szerinti expressziós kazetta legalább két strukturális gént tartalmaz, amelyekhez megfelelő szabályozószekvenciák csatlakoznak. Ilyen például a P450-17a és a P45o-C21 (pGB17-alpha/C21-l).
A találmány szerinti eljárásnak és a szakterület ismert módszereinek a használatával lehetővé válik olyan analóg expressziós kazetták és az ezeket tartalmazó gazdasejtek előállítása, amelyekkel másféle, többszörös szteroidoxidációkat is végezhetünk, és adott esetben a koleszterinnek hidrokortizonná való konvertálását egyetlen fermentációs eljárásban is elérhetjük.
Az alábbiakban az ábrák rövid leírása következik. Az ábrákon a következő rövidítéseket használjuk: R,=EcoRI, H=HindIII, Sc = ScaI, P=PstI, K=KpnI, St=StuI, Sp=SphI, X = XbaI, N=NdeI, S = SmaI, Ss = SstI, Rv =EcoRV, Sj =SacI, B=BamHI, Sn =SacII, Sal=SalI, Xh=XhoI, Pv=PvuII, Bg=BglII és M=MluI.
Az 1. ábra sematikus áttekintést ad azokról a proteinekről, amelyek részt vesznek a koleszterinnek hidrokortizonná való konverziójában, mely egymást követő lépésekben megy végbe emlősök mellékvesekérgében.
A 2. ábra a pGBSCC-1 plazmid szerkezetét mutatja be. A P450SCC-szekvenciákat a sraffozott keret (ESS) mutatja be.
A 3. ábra az 5’-P450SCC-szekvenciákat tartalmazó, szintetikusan előállított Pstl/HindlII fragmentumnak a pTZ18R plazmidba való beépítését és ennek eredményét, a pTZ synlead plazmidot ábrázolja.
A 4. ábra egy teljes hosszúságú P450SCCcDNS szerkesztését ábrázolja, melyet a szintetikusan előállított és pTZ18R-be klónozott <1:·:: .1 ~). valamint a cDNS-kló5
HU 218 111 Β nozással kapott (R<Si^l) P45oSCC-szekvenciák felhasználásával végzünk. A szerkesztés eredménye a pGBSCC-2.
Az 5. ábrán a pBHA-1 plazmid teljes nukleotidszekvenciája látható.
A 6. ábra a pGBSCC-3 szerkesztésének sematikus képét mutatja be. A P450SCCcDNS-szekvenciákat a pGBSCC-2 plazmidból bevezetjük a Bacillus/E. coli pBHA-1 ingázóplazmidba. A sraffozott keretek jelentése ugyanaz, mint a 4. ábrán.
A 7. ábrán bemutatjuk, hogy az Ndel restrikciós helyet az ATG startkodonnal kombinálva bevezetjük a pGBSCC-3-ban lévő P450SCC érési hely elé, s így kapjuk a pGBSCC-4-et.
A 8. ábrán a pGBSCC-5 fizikai térképe látható. A pGBSCC-5 plazmidot úgy kapjuk, hogy a pGBSCC-4 plazmidból eltávolítjuk az E. coli-szekvenciákat.
A 9. ábrán egy P450SCC antitestekkel reagáltatott Western biot képe látható, amelyből kitűnik, hogy a B. subtilisbe (c sáv) és a B. licheniformisba (f sáv) bevezetett pGBSCC-5 plazmid P450SCC-t fejez ki. A B. subtilis és B. licheniformis kontrollkivonatokat az a, illetve d sáv mutatja. Összehasonlítás céljából tisztított mellékvesekéreg P450SCC-t (30 ng) adtunk e kontrollkivonatokhoz (b, illetve e sáv).
A 10. ábrán sematikusan ábrázoljuk a pGBSCC-17 szerkesztését. A pGBSCC-4 plazmidból a kódoló P450SCC-DNS-szekvenciákat bevezetjük a pTZISRN E. coli expressziós vektorba. A P450SCC-szekvenciákat sraffozott kerettel (KSSSSJ) ábrázoljuk.
All. ábra bemutatjuk, hogy E. coli JM101-ben a pGBSCC-17 P450SCC-t fejez ki.
A. E. coli kontrolltörzsből (3-as sáv) és transzformált E. coli SCC-301, illetve 302 törzsből (1-es, illetve 2-es sáv) készített sejtprotein-frakciók (20 pl) SDS/PAGE analízise Coomassie brilliant blue festéssel. Összehasonlításul 400 ng tisztított bovin P450SCC van a 4-es sávban.
Β. E. coli JM101 kontrolltörzsből (2-es sáv) és transzformáit E. coli SCC-301 (3-as sáv), illetve SCC-302 (4-es sáv) törzsből készített sejtprotein-frakciók (5 μΐ) P450SCC elleni antitestekkel végzett Western biot analízise. Összehasonlításul 100 ng tisztított bovin P450SCC van felvive az 1-es sávba.
A 12. ábra a pUCG418 plazmid szerkesztését ábrázolja.
A 13. ábra a pGB950 élesztő expressziós vektor szerkesztését ábrázolja. A vektort úgy kapjuk, hogy a laktázpromoterét és multiklónozóhelyeket tartalmazó terminátorát (^^H) beépítjük a pUCG418-ba. A pGBSCC-6-hoz úgy jutunk, hogy egy ATG startkodont tartalmazó szintetikus Sall/Xhol fragmentumot és a P450SCC első 8 aminosavát meghatározó kodonokat beépítjük a pGB950-be.
A 14. ábra sematikus ábrázolásban mutatja be a pGBSCC-7 élesztő P450SCC expressziós kazetta szerkesztését.
A 15. ábra egy P450SCC proteinre specifikus antitestekkel reagáltatott Western biot analízis képét mutatja be. Az A biot a következő kivonatokat tartalmazza: a pGBSCC—10-zel transzformált Saccharomyces cerevisiae 273- ΙΟΒ-ből származó kivonatot (1-es sáv), kontrollként az S. cerevisiae 273-10B kivonatát (2-es sáv), a pGBSCC-7-tel transzformált Kluyveromyces lactis CBS 2360-ból származó kivonatot (3-as sáv) és kontrollként a K. lactis CBS 2360 kivonatát (4-es sáv). A B biot a K. lactis CBS 2360-ból mint kontroliból származó kivonatot (1-es sáv) és a pGBSCC-15-tel (2-es sáv), a pGBSCC-12-vel (3-as sáv) vagy a pGBSCC-7-tel (4es sáv) transzformált K. lactis CBS 2360-ból származó kivonatokat tartalmazza. A C biot a kontroll S. cerevisiae 273- ΙΟΒ-ből származó kivonatot (1-es sáv) és ennek pGBSCC-16-tal (2-es sáv) vagy pGBSCC-13-mal (3-as sáv) transzformált sejtjeiből származó kivonatait taitalmazza.
A 16. ábra sematikusan ábrázolja az S. cerevisiaeből származó izocitokróm Cl (cyc— 1) promoterét tartalmazó pGBSCC-9 élesztő expressziós vektor szerkesztését.
A 17. ábra az S. cerevisiae-hez szolgáló P450SCCcDNS-t tartalmazó pGBSCC-10 expressziós vektor szerkesztését ábrázolja.
A 18. ábra a pGBSCC-12 P450SCC expressziós vektor szerkesztését ábrázolja. A vektorba egy preP450-szekvenciát (R\SS$1) kódoló szintetikus DNS-fragmentumot építünk be az érett P450SCC kódolószekvenciájához képest 5’ felé.
A 19. ábra a pGBSCC-13 szerkesztését mutatja be. Ez az S. cerevisiae-hez készített P450SCC expressziós kazetta tartalmazza a pre-P450SCCcDNS-szekvenciát az S. cerevisiae cyc-1 promoteréhez viszonyítva 3’-helyzetben.
A 20. ábra sematikusan ábrázolja a pGBSCC-14 és pGBSCC-15 plazmid szerkesztését. Ez utóbbi tartalmazza a P450SCC kódolószekvenciát a citokróm oxidáz VI (Cox VI) pre-szekvenciával (PSNSSii együtt egy keretben.
A 21. ábra a pGBSCC -16 plazmid szerkesztését ábrázolja. Ebben a plazmidban a kódoló P450SCC-szekvenciával fuzionált citokróm oxidáz VI pre-szekvencia (^) a cyc-1 promoterhez viszonyítva 3'-helyzetben van.
A 22. ábra a pGB17a-l (A) és pGB17a-2 (B) plazmidok fizikai térképét mutatja be. E plazmidok a P450 1 7acDNS 3’ 1,4 kb fragmentumát, illetve 5’ 345 bp fragmentumát tartalmazzák. A pGB17a-3-ban (C), amely a P45017acDNS teljes hosszúságú szekvenciát tartalmazza, az ATG startkodon helyzetét bejelöljük.
A 23. ábrán a pGB17cc-3 in vitro mutagenezissel végzett mutációja látható. A kapott pGB17a-4 plazmid egy Sáli restrikciós helyet tartalmaz - amelyet optimális élesztő transzlációs szignálok követnek - az ATG iniciációs kodontól 5’ felé.
A 24. ábra sematikusan ábrázolja a pGB 17a-5 élesztő P450 1 7a expressziós kazetta szerkesztését.
A 25. ábrán a pGB17a-3-nak in vitro mutagenezissel végzett mutációja látható. A kapott pGB17ct-6 plazmid egy Ndel restrikciós helyet tartalmaz az ATG iniciációs kodonnál.
HU 218 111 Β
A 26. ábra sematikusan ábrázolja a pGB17a-7 szerkesztését. A pGB17a-6 plazmidból származó P450 1 7cDNS-szekvenciákat bevezetjük a pBHA-1 Bacillus/E. coli ingázóplazmidba.
A 27. ábrán a pGB17a-8 fizikai térképe látható. E plazmidhoz úgy jutunk, hogy a pGB17a-7 plazmidból eltávolítjuk az E. coli-szekvenciákat.
A 28. ábrán a pGBC21 -1 és 2 fizikai térképe látható. Ezek egy 1,53 kb 3’-P450C21cDNS, illetve egy 540 bp 5’-P450C21cDNS fragmentumot tartalmaznak a pTZ18R klónozó vektor EcoRI helyén.
A 29. ábra a pGBC21-2-nek polimeráz láncreakcióval (PCR=polymerase chain reaction) végzett in vitro mutagenezisét mutatja, amelynek célja az EcoRV és Ndel restrikciós helyek beépítése a P450C21 ATG iniciációs kodonjától upstream, ezt követi molekuláris klónozása a pSP73 klónozó vektorba, s így kapjuk a pGBC21 -3 plazmidot.
A 30. ábra a teljes hosszúságú P450C21cDNS-szekvenciát tartalmazó pGBC21-4 szerkesztését ábrázolja sematikusan.
A 31. ábra sematikusan ábrázolja a pGBC21-5 szerkesztését. A pGBC21-4 plazmidból származó P450C21cDNS-szekvenciát bevezetjük a pBHA-1 Bacillus/E. coli ingázóplazmidba.
A 32. ábrán a pGBC21-6 fizikai térképe látható, melyet úgy kapunk, hogy a pGBC21 - 5 plazmidból eltávolítjuk az E. coli-szekvenciákat.
A 33. ábra a pGBC21 -2-nek in vitro mutagenezissel végzett mutációját ábrázolja. A kapott pGBC21-7 plazmid egy Sáli restrikciós helyet tartalmaz - ezt optimális élesztő transzlációs szignálok követik - az ATG iniciációs kodontól pontosan 5’ felé.
A 34. ábra a pGBC21-8 szerkesztését ábrázolja, mely egy teljes hosszúságú P450C21cDNS-t tartalmaz olyan módosított restrikciós helyekkel határolva, amelyek alkalmasak élesztő expressziós vektorba való klónozáshoz.
A 35. ábra sematikusan ábrázolja a pGBC21 -9 élesztő P45oC2 1 expressziós kazetta szerkesztését.
A 36. ábra a ρΟΒΙβ-1-nek polimeráz láncreakcióval (PCR) végzett in vitro mutagenezisét ábrázolja, amelynek célja, hogy megfelelő határoló restrikciós helyeket és egy ATG iniciációs kodont vezessünk be a teljes hosszúságú P450l lpcDNS-szekvenciába, ezt követi a pBHA-1 Bacillus-E. coli ingázóvektorba való molekuláris klónozás, melynek révén megkapjuk a pGBl 1 β—2 plazmidot.
A 37. ábra a ρΟΒΙΙβ-1-nek polimeráz láncreakcióval (PCR) végzett in vitro mutagenezisét ábrázolja, melynek célja, hogy megfelelő határoló restrikciós helyeket és egy ATG iniciációs kodont vezessünk be a teljes hosszúságú P450l ^cDNS-szekvenciába, ezt követi a pGB950 élesztő expressziós vektorba való molekuláris klónozás, s ennek révén jutunk a pGBl 1 β—4 plazmidhoz.
A 39. ábrán egy ADX elleni antitestekkel reagáltatott Western biot látható, mely bemutatja, hogy a K. lactis CBS 2360 transzformált ADX-101 és 102 sejtjeiben (4-es, illetve 5-ös sáv) lévő pGBADX plazmidokban ADX fejeződik ki. A K. lactis CBS 2360 kontrolitörzs kivonatát a 3-as sáv tartalmazza. Összehasonlításul tisztított mellékvesekéreg ADX-et (100 ng) is felvittünk a gél 1-es sávjába.
A 40. ábra a pGBADR-1-nek polimeráz láncreakcióval végzett in vitro mutagenezisét ábrázolja, melynek célja, hogy megfelelő határoló restrikciós helyeket és egy ATG iniciációs kodont vezessünk be a teljes hosszúságú ADRcDNS-szekvenciába, ezt követi a pGB950 élesztő expressziós vektorba való molekuláris klónozás, s így kapjuk a pGBADR-2 plazmidot.
A 41. ábra a pGB17a-5 expressziós kazetta fizikai térképét mutatja be.
A 42. ábra a pGBC21-9 expressziós kazetta fizikai térképét mutatja be.
A 43. ábra a pGB17a/C21-l expressziós kazetta szerkesztését ábrázolja. A szóban forgó kazetta a P45017a-t és a P450C21-et meghatározó kódolószekvenciát tartalmazza, s mindkét szekvenciát a laktázpromoter szabályozza.
A találmányt a következő példákkal szemléltetjük, anélkül azonban, hogy ezekkel a találmány oltalmi körét korlátoznánk.
1. példa
A szarvasmarha-citokróm P4S0 oldallánchasító enzimet (P15nSCC) kódoló teljes hosszúságú cDNS molekuláris klónozása
A T. Maniatis és munkatársai kézikönyvében (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981) leírt általános klónozási technikákat és DNS- és RNSanalíziseket használtunk. Hacsak másként nincs leírva, minden DNS-módosító enzimet, molekuláris klónozóhordozót és E. coli törzset kereskedőcégektől szereztünk be, és az előállítók előírásai szerint használtuk fel. A DNS és RNS elválasztásához és tisztításához szükséges anyagokat és készülékeket a szállítócégek előírásai szerint használtuk.
A szarvasmarhamellékvesekéreg-szövetet frissen kivett szarvasmarhavesékből nyeljük, gyorsan lefagyasztjuk folyékony nitrogénben, és -80 °C-on tároljuk.
A fagyasztott mellékvesekéreg teljes sejt-RNStartalmát Auffrey és Rougeon [Eur. J. Biochem., 107, 303-314 (1980)] leírása szerint izoláljuk. A mellékvese poliA+ RNS-t úgy kapjuk, hogy a teljes RNS-mintát 65 °C-on hevítjük, majd a poliA elválasztását oligo(dT) kromatográfiával végezzük el.
A szarvasmarha-mellékvesekéregből származó poliA+RNS-sel komplementer DNS-eket a következőképpen szintetizáljuk: metil-merkuri-hidroxiddal kezelt 10 pg poliA+RNS-t béta-merkapto-etanollal neutralizálunk. Ezt a keveréket 50 mM trisz-HCl (pH=8,3, 42 °C-on), 40 mM KC1, 6 mM MgCl2, 10 mM DTT, 3000 egység RNasin/ml, 4 mM Na4P2O7, 50 pg actinomycin D/ml, 0,1 mg oligo(dT1218)/ml, 0,5 mM dGTP, 0,5 mM dATP, 0,5 mM dTTP, 0,25 mM dCTP és 400 pCi a-32P-dCTP/ml tartalomra állítjuk be összesen 100 pl végtérfogatban. Az elegyet jégen tartjuk 10 percig, 2 percig 42 °C-on melegítjük, és a szintézist 150 egység AMV reverz transzkriptáz (Anglián Bio7
HU218 111 Β technology Ltd.) hozzáadásával indítjuk meg; az inkubálás 1 órán át 42 °C-on történik.
A második szál szintézisét úgy végezzük, hogy a reakcióelegyhez hozzáadunk DNS-polimerázt és RNázH-t, Gubler és Hoffman szerint [Gene, 25, 263-269 (1983)]. A kettős szálú DNS-t (ds DNS) T4 DNS-polimerázzal (BRL) kezeljük, hogy kialakítsuk a tompa végeket, majd dekamer (lOmer) EcoRI linkereket (Biolabs Inc.) ligálunk a ds DNS-ffagmentumokhoz. EcoRI-gyel (Boehringer) való emésztés után a kettős szálú cDNS fragmentumokat elválasztjuk a feleslegben lévő EcoRI linkerektől Biogel A15 m (Bio-Rád) kromatografálással. Körülbelül 200 ng EcoRI linkért tartalmazó kettős szálú cDNS-t ligálunk 10 pg EcoRI-gyel emésztett és borjúbélfoszfatázzal (Boehringer) kezelt lambda-gtl 1 vektor-DNS-sel (Promega), T4-ligáz (Boehringer) segítségével, amint ezt Huynh és munkatársai leírták („DNA cloning techniques: A practical approach” 49-78. oldal, Oxford IRL-press, 1985). A ligálókeverék in vitro pakolása révén kapott fágokat használjuk az E. coli Y1090 gazdasejtek (Promega) fertőzésére.
Ebből a cDNS-gyűjteményből körülbelül 106 plakkképző egységet (pfu=plaques forming unit) szűrünk ki 32P-vel végjelzett SCC-1 szintetikus oligomerrel (5’-GGC TG A AGT CCT GAG ACA CTG GAT TCA GCA CTGG-3’), amely szarvasmarha P450SCC DNSszekvenciákra specifikus, amint ezt Morohashi és munkatársai leírták [Proc. Natl. Acad. Sci., 81, 4647-4651 (1984)]. Hat hibridizáló pfu-t kaptunk, és ezeket tovább tisztítottuk két további ráfertőzést, lemezre öntést és hibridizálást jelentő menetben. A P450SCCcDNS EcoRI inszertumokat a pTZ18R (Pharmacia) EcoRI helyére szubklónoztuk. A legnagyobb EcoRI inszertumot (1,4 kb) tartalmazó pGBSCC-1 kiónt (2. ábra), mely a lambda-gtl 1 SCC-54-ből származott, tovább analizáltuk restrikciós enzimes térképezéssel és szekvenálással.
A szekvenciaadatok azt mutatták, hogy a pGBSCC-1 EcoRI inszertum identikus a P450SCCcDNS térképen a Morohashi és munkatársai leírása szerinti 251-1824. pozícióban lévő SCCcDNS nukleotidszekvenciával.
A fennmaradó 5’ -P450SCCcDNS nukleotidokat szintetikus úton alakítjuk ki úgy, hogy a 3. ábrán látható, szintetikusan előállított 177 bp Pstl/HindlII fragmentumot beklónozzuk a pTZ18R megfelelő helyére, így keletkezik a 3. ábrán látható pTZ/synlead, amely a 118-273. pozíciókban az érett P450SCC proteint kódoló nukleotidokon kívül - lásd Morohashi és munkatársai közlését - további restrikciós helyeket tartalmaz az Seal, AvrII és Stul számára anélkül, hogy ezek befolyásolnák a P450SCC protein előrelátható aminosav-szekvenciáját. A teljes hosszúságú P450SCCcDNS szerkesztését úgy végezzük, hogy egy ligáló keveréket, amely a 1372 bp HindlII/KpnI pGBSCC-1 fragmentumot, a 177 bp Pstl/HindlII pTZ/synlead fragmentumot és a Pstl-gyel és KpnI-gyel emésztett pTZ19R DNS-t tartalmazza, beklónozzuk az E. coli JMlOl-be (ATCC 33876).
A kapott plazmid, a pGBSCC-2, amely az érett bovin P450 oldallánchasító protein összes kódoló nukleotidszekvenciáját tartalmazza, a 4. ábrán látható.
2. példa
A P4SnSCC szerkesztése, transzformációja és expressziója Bacillus subtilis bakteriális gazdasejtben
Annak érdekében, hogy a citokróm P450SCC expresszióját Bacillus gazdasejtben elérhessük, a P450SCCcDNS-szekvenciákat átvisszük a pBHA-1 E. coli/Bacillus ingázóvektorba.
Az 5. ábra a pBHA-1 ingázóplazmid nukleotidszekvenciáját mutatja be. A plazmid a következőket tartalmazza: a 11-105. és 121-215. pozícióban: FD bakteriofág terminátor (dupla); a 221-307. pozícióban: a pBR322 plazmid egy része (mint a 2069-2153. pozíció); a 313-768. pozícióban: FI bakteriofág, replikációs origó (mint az 5482-5943. pozíció); a 772-2571. pozícióban: a pBR322 plazmid egy része, azaz a replikációs origó és a β-laktamázgén; a 2572-2685. pozícióban: a TN903 transzpozon, teljes genom; a 2719-2772. pozícióban: triptofán terminátor (dupla); a 2773-3729. pozícióban: Tn9 transzpozon, a kloramfenikol-acetil-transzferáz (cat) gén. A 3005. (A), 3038. (C), 3302. (A) és 3409. (A) pozícióban lévő nukleotidok különböznek a vad típusú cat kódolószekvenciától. Ezeket a mutációkat úgy vezetjük be, hogy elimináljuk az Ncol, Ball, EcoRI és PvuII helyeket; a 3730-7264. pozícióban: a pUBl 10 plazmid része, amely a Bacillus „Hpall” promotert, a replikációs funkciót meghatározó gént és a kanamicinrezisztencia-gént tartalmazza (EcoRI/PvuII fragmentum) [McKenzie és munkatársai, Plasmid, 15, 93-103 (1986) és McKenzie és munkatársai, Plasmid, 17, 83-85 (1987)]; a 7267-7331. pozícióban : sokszoros klónozóhely. A fragmentumokat ismert klónozótechnikák segítségével rakjuk össze, például: Klenow-val betölt) ük a ragadós helyeket, adapterklónozással stb. Minden adat a GenbankR-től (National Nucleic Acid Sequence Data Bank, NIH, USA) származik.
A pGBSCC—3-hoz E. coli JMlOl-ben végzett molekuláris klónozás révén jutunk úgy, hogy a pGBSCC-2ből a P450SCCcDNS KpnI/Sphl inszertumot (az 1. példa írja le) bevezetjük a 6. ábrán bemutatott módon a pBHA-1 (GenbankR) megfelelő helyére.
Molekuláris klónozással E. coli JM101 sejtekben visszük be pGBSCC-3-ba a metionin iniciációs kodont úgy, hogy az Stul/Sphl fragmentumot kicseréljük egy szintetikusan előállított SphI/StuI ffagmentunrmal.
Sphl Stul
CATATGATCAGTACTAAGACCCCTAGG
GTACGTATACTAGTCATGATTCTGGGGATCC Nde 1
A fragmentum egy NedI helyet tartalmaz az ATG iniciációs kodonnál. A kapott pGBSCC-4 plazmidot a 7. ábrán mutatjuk be. A „Hpall” Bacillus promotert a P45()SCCcDNS-szekvenciától upstream vezetjük be oly módon, hogy a pGBSCC-4-et Ndel restrikciós enzimmel emésztjük, az ingázóplazmid E. coli részét agarózgél-elektroforézissel elválasztjuk, ezután újból ligálás következik, és a Bacillus subtilis 1A40 (BGSC 1A40) kompetens sejtjeinek a transzformálása. A neomicin-rezisztens telepeket analizáljuk, és így kapjuk a
HU 218 111 Β pGBSCC-5 plazmidot (8. ábra). A bovin P450SCC expresszióját úgy vizsgáljuk, hogy egy 10 pg/ml neomicint tartalmazó TSB tápoldatban (Gibco) 37 °C-on végzett egy tenyésztésből sejtprotein-frakciót készítünk.
A tenyészet 100 μΐ-ében lévő sejteket - ez körülbelül ! 5-106 sejtnek felel meg - centrifügálással gyűjtjük össze és 10 mmólos trisz-HCl (pH=7,5) oldatban reszuszpendáljuk. A lizálást lizozim hozzáadásával (1 mg/ml) és 15 percig 37 °C-on való inkubálással végezzük.
A lizátumot 0,2 mg DNáz/ml hozzáadásával kezel- 1 jük 5 percig 37 °C-on, majd a keveréket 1 χ SB pufferrel úgy állítjuk be Laemmli szerint [Natúré, 227, 680-685 (1970)], hogy végső térfogata 200 pl legyen.
Az elegyet 5 percig hevítjük 100 °C-on, majd 15 pl-ét 7,5%-os SDS/poliakrilamid gélben elektroforetizáljuk. 1 A 9. ábrán látható, hogy egy 53 kD sáv (c sáv) volt kimutatható, amikor a gél immunoblotot P450SCC specifikus antitesttel reagáltattuk.
A specifikus bovin P450SCC antitesteket úgy kapjuk, hogy nyulakat immunizálunk bovin mellékveséké- 2 reg-szövetből izolált tisztított P450SCC proteinnel.
3. példa
A P450SCC expressziója Bacillus licheniformis bakteriális gazdasejtben 2
A szarvasmarha P450SCC expresszióját B. licheniformisban úgy valósítjuk meg, hogy a megfelelő B. licheniformis T5 (CBS 470,83) gazdatörzset
5’-CAG GAA ACA,CAT Nde
Ezt a szekvenciát használjuk, hogy egy Ndel restrikciós helyet létesítsünk a pTZ18R-ben, a lac Z gén ATG iniciációs kodonjánál.
A kapott pTZ18RN plazmidot Ndel-gyel és Kpnlgyel emésztjük, és a pGBSCC-4 Ndel/KpnI DNS-fragmentumát, amely a teljes hosszúságú SCCcDNS-t tartalmazza, molekuláris klónozással építjük össze az Ndel helynél a 10. ábrán ismertetett módon.
Az előállított pGBSCC-17 plazmidban lévő P450SCCcDNS-szekvenciák transzkripcióját az E. coli lac promoter fogja irányítani.
b) A P450SCC expressziója E. coli JM101 gazdasejtben
A pGBSCC-17 plazmidot E. coli JM101 kompetens sejtekbe visszük be ampicillinrezisztens telepek szelekciója segítségével. A citokróm P450SCC expressziójának tanulmányozásához sejtprotein-frakciót (lásd a 2. példát) készítünk az SCC-301 és 302 transzformáit sejtek egy éjszakás tenyészetéből. A tenyésztést 37 °C-on, 50 pg/ml ampicillintartalmú 2 χ TY tápoldatban végezzük, amely 1 liter ionmentes vízben 16 g Bacto Tryptont (Difco), 10 g élesztőkivonatot (Difco) és 5 g NaCl-ot tartalmaz.
A proteinfrakciókat Coomassie brilliant blue-val festett SDS/PAGE módszerrel analizáltuk (11 A. ábra) vagy Western blottal, melyet bovin P450SCC-re specifikus antitestekkel reagáltattunk (11B. ábra). Mindkét analízis a várt hosszúságú proteint mutatta ki (11 A.
pGBSCC-5 plazmiddal transzformáljuk. A 2. példában leírtak szerint sejtprotein-frakciót készítünk - a sejteket 10 pg/ml neomicint tartalmazó Trypton Soy Broth (TSB; Trypton-szója leves; Oxoid) táptalajban tenyésztjük 37 °C-on egy éjszakán át -, s a frakciót SDS/PAGE és Western blotting módszerrel analizáljuk. A 9. ábrán látható, hogy egy 53 kD proteinsáv (f sáv) jelenik meg, miután a nitro-cellulóz-szűrőt bovin P450SCC specifikus antitesttel inkubáltuk. Egy transzformált sejtet, az ) SCC 201 sejtet tovább vizsgáltuk in vivő P450SCC-aktivitásra nézve (lásd all. példát).
4. példa
A P45nSCC expressziója Escherichia coli bakteriális 5 gazdasejtben
a) Az expressziós kazetta szerkesztése
Annak érdekében, hogy a P450SCC számára az
E. coli gazdasejtben megfelelő expressziós vektorhoz jussunk, a pTZ18R-nél helyre irányuló mutagenezist ) végzünk Zoller és Smith [Methods in Enzymology, 100, 468-500 (1983) és Methods in Enzymology, 154, 329-350 (1987)], valamint Kramer és Fritz [Methods in Enzymology, 154, 350-367 (1987)] leírása szerint. Az in vitro mutageneziskísérletekhez szükséges j plazmidokat és törzseket a Pharmacia cégtől szereztük be.
Szintetikus oligomert állítunk elő, melynek szekvenciája az alábbi:
ATG,ACC ATG ATT-3’ ábra, 1-es és 2-es sáv; ll.B ábra, 3-as és 4-es sáv) az SCC-301, illetve SCC-302 transzformált sejteknél, de ez a protein nem volt jelen az E. coli JM101 kontrolitörzsben (11 A. ábra, 2-es sáv és 1 IB. ábra, 2-es sáv).
5. ábra
A P4SnSCC szerkesztése, transzformációja és expreszsziója Kluyveromyces lactis élesztősejtben
a) Geneticinrezisztencia-marker bevezetése a pUC19be
Egy Tn5 gént [Reiss és munkatársai, EMBO J., 3, 3317-3322 (1984)] tartalmazó DNS - fragmentumot beépítünk a pUC19 Smal helyére [Yanisch-Perron és munkatársai, Gene, 33, 103-119 (1985)]. A Tn5 gén geneticinnel szembeni rezisztenciát biztosít az S. cerevisiae-ből származó alkohol-dehidrogenáz I (ADHI) promoterének irányítása alatt, hasonlóan a Bennetzen és Hall [J. Bioi. Chem., 257, 3018-3025 (1982)] által leírtakhoz. A kapott pUCG418 plazmid a 12. ábrán látható.
A pUCG418-at tartalmazó E. colit letétbe helyeztük a Centraal Bureau voor Schimmelculturea intézménynél, CBS 872.87 letéti szám alatt.
b) Az expressziós kazetta szerkesztése
Vektort szerkesztünk, mely a következőket tartalmazza :
Xbal-gyel és HindlII-mal hasított pUCG418 [leírását lásd az 5. a) példában], a laktóz promotert tartalmazó
HU218 111 Β pGB901 Xbal-Sall fragmentuma (lásd J. A. van den Berg és munkatársai, US 494 3529 számú szabadalom, Kluyveromyces as a hőst strain) és a K. Lactis laktázgénje 3’ nem kódoló szakaszának részét tartalmazó
SÁL 1 szintetikus DNS. Ez a pGB950 plazmid, melyet a 13. ábrán mutatunk be.
A pGB950 plazmidot Sall-gyel és Xhol-gyel hasítjuk, beépítjük az alábbi szintetikus DNS-t,
STU 1 XHO 1
TCGACAAAAATGATCAGTACTAAGACTCCTAGGCCTATCGATTC GTTTTTACTAGTCATGATTCTGAGGATCCGGATAGCTAAGAGCT s így kapjuk a 13. ábrán látható pGBSCC-6 plazmidot.
A P450SCC kódoló szakaszát tartalmazó pGBSCC-2-ből (lásd az 1. példát) izoláljuk a StuI-EcoRI fragmentumot, és ragadós végeit betöltjük Klenow DNS-polimerázt használva. Ezt a fragmentumot építjük be a Stul-gyel hasított pGBSCC-6-ba, s azt a plazmidot, mely korrekt orientációban tartalmazza a fragmentumot, pGBSCC-7-nek neveztük el (lásd a 14. ábrát).
c) A K. lactis transzformálása
A K. lactis CBS 2360 törzset 100 ml YEPD táptalajban (1% élesztőkivonat, 2% pepton, 2% glükózmonohidrát) OD60=körülbelül 7-ig tenyésztjük. A táptalaj egy 6,7%-os (tömeg%) élesztő nitrogénbázisú oldatból (Difco, yeast nitrogén base) 2,5 ml-t tartalmaz. A tenyészet 10 ml-éből centrifugálással gyűjtjük össze a sejteket, TE pufferrel (10 ml trisz-HCl, pH=7,5, 0,1 mM EDTA) mossuk és 1 ml TE pufferben reszuszpendáljuk. Azonos térfogatú, 0,2 mólos lítium-acetátot adunk hozzá, és az elegyet 1 órán át 30 °C-os vízfürdőben, rázás mellett inkubáljuk. A pGBSCC-7 15 pg-ját a laktázpromoterben lévő egyetlen SacII helynél hasítjuk, etanollal kicsapjuk, és 15 μΐ TE pufferben reszuszpendáljuk. Ezt a DNS-készítményt adjuk az előinkubált sejtek 100 μΐ-éhez, és az inkubálást 30 percig tovább folytatjuk. Ezután azonos térfogatú, 70%-os PEG 4000-et adunk az elegyhez, melyet 1 órán át inkubálunk ugyanezen a hőmérsékleten, majd 5 percig 42 °C-on hősokkolást végzünk. Az elegyhez ezután hozzáadunk 1 ml YEPD tápoldatot, és a sejteket 1,5 órán át, rázás mellett 30 °C-on vízfürdőben inkubáljuk. Végül a sejteket centrifugálással gyűjtjük össze, 300 μΐ YEPD-en reszuszpendáljuk és agarlemezekre szélesztjük. A lemezek 300 pg/ml geneticintartalmú 15 ml YEPD agart tartalmaznak, s ezekre rétegezünk 1 órával a használat előtt 15 ml G418-at nem tartalmazó YEPD agart. A telepek 30 °C-on 3 napon át növekednek.
d) A transzformált sejtek vizsgálata
A transzformált sejteket és a CBS 2360 kontrolitörzset YEPD táptalajon tenyésztjük 64 órán át 30 °C-on. A sejteket centrifugálással gyűjtjük össze, fiziológiás sóoldatban reszuszpendáljuk OD610=300 sűrűségben, majd Vortex-keverőben, maximális sebességgel, üvegszemcsékkel való rázással tárjuk fel. A sejttörmelékeket úgy távolítjuk el, hogy GL minifugában (Haereus Christ) 4500 fordulat/perc mellett 10 percig centrifugálunk. A felülúszóból 40 μΐ-es mintákat analizálunk immunobiotokban (15A. ábra, 3-as sáv; 15B. ábra, 4-es sáv).
Az eredmények azt mutatják, hogy a pGBSCC-7tel transzformált K. lactis sejtekben a várt hosszúságú protein fejeződik ki. A transzformált sejt neve K. lactis SCC-101.
6. példa
A P4S0SCC szerkesztése, transzformációja és kifejeződése Saccharomyces cerevisiae élesztősejtekben
a) Az expressziós kazetta szerkesztése
A laktázpromoter törlése érdekében a pGB950-et [lásd a 4B. ábrát] Xbal-gyel és Sall-gyel hasítjuk, a ragadós végeket Klenow DNS-polimeráz segítségével betöltjük, majd ezután ligálunk. A kapott pGBSCC-8 plazmidban megsemmisült az Xbal hely, de a Sáli hely megmaradt.
A pGB161 Sáli fragmentumát (lásd: J. A. van den Berg és munkatársai, EP 96430), amely az S. cerevisiae-ből származó izocitokróm Cl promotert (cyc-1) tartalmazza, izoláljuk és részlegesen emésztjük Xholgyel. Izoláljuk a 670 bp Xhol-Sall fragmentumot és beklónozzuk a pGBSCC-8 Sáli helyére. A szelektált, pGBSCC-9 plazmidban megmarad a Sáli hely a cyc-1 promoter és a laktáz-gén 3’ nem kódoló szakasza között (16. ábra) (részlegesen emésztve a HindlIImal; <1 egység/pg DNS, 1. ábra).
A pGBSCC-7 Sall-HindlII fragmentumát, amely a P450SCC kódolószakaszt tartalmazza, beépítjük a Sall-gyel és HindlII-mal emésztett pGBSCC-9-be. A kapott pGBSCC -10 nevű plazmidban a P450SCC kódolószakasz a cyc-1 promotertől downstream helyezkedik el (17. ábra).
b) Az S. cerevisiae transzformálása
Az S. cerevisiae D273-10B törzset (ATCC 25657) 100 ml YEPD tápoldatban tenyésztjük egy éjszakán át 30 °C-on, ezután friss tápoldattal hígítjuk (1:10 000) és tovább tenyésztjük OD610 = 6 értékig. A tenyészet 10 ml-ből centrifugálással gyűjtjük össze a sejteket. A sejteket 1 ml TE pufferben szuszpendáljuk, és hozzáadunk 1 ml 0,2 mólos lítium-acetátot. A sejteket 1 órán át rázás mellett 30 °C-os vízfürdőben inkubáljuk. A pGBSCC-10 15 pg-ját a cacl promoterben lévő egyetlen Miül helynél hasítjuk, etanollal kicsapjuk, és 15 ml TE pufferben reszuszpendáljuk. Ezt a DNS-készitményt 100 pl előinkubált élesztősejthez adjuk, és 30 percig 30 °C-on (rázás közben) inkubáljuk. Ekkor hozzáadunk 115 pl 70%-os PEG 4000 oldatot, és az inkubálást tovább folytatjuk 60 percen át, rázás nélkül. Ekkor 5 perces hősokkot adunk a sejteknek 42 °Con. hozzáadunk 1 ml YEPD tápoldatot, majd másfél órát inkubáljuk rázás közben, 30 °C-os vízfürdőben. Végül a sejteket centrifugálással gyűjtjük össze, 300 pl YEPD tápoldatban reszuszpendáljuk, majd ge10
HU218 111 Β neticintartalmú (300 pg/ml) YEPD agarlemezekre öntjük.
A telepeket 3 napon át 30 °C-on hagyjuk növekedni,
c) A transzformált sejtek analízise
A transzformált és a kontrolitörzset YEPD tápoldatban [1% élesztőkivonat, 2% Bacto pepton, 3,48% K.2HPO4 és 2,2% 90%-os L(+)-tejsavoldat; sterilizálás előtt az oldat pH-ját 25%-os ammóniaoldattal 6,0-ra állítjuk be], tenyésztjük 64 óra hosszat 30 °C-on. Ezután az 5. d) példában leírt módon végezzük a vizsgálatokat.
Immunoblot-analízissel bizonyítjuk a P450SCC kifejeződését S. cerevisiae-ben (15A. ábra, 1-es sáv).
7. példa
A pre-P4SgSCC-t kódoló DNS szerkesztése, transzformálása és kifejeződése Kluyveromyces lactis élesztősejtekben a) Az expressziós kazetta szerkesztése
A pGB950 plazmidot [lásd az 5. b) példát] Sallgyel és Xhol-gyel hasítjuk, majd beépítjük a következő sz intetikus DNS-t:
SÁL I
TCGACAAAAATGTTGGCTCGAGGTTTGCCATTGAGATCCGCTTTGGTTAAGGCTTGTCC
GTTTTTACAACCGAGCTCCAAACGGTAACTCTAGGCGAAACCAATTCCGAACAGG
ACCAATCTTGTCCACTGTTGGTGAAGGTTGGGGTCACCACAGAGTTGGTACTGGTGAAGG
TGGTTAGAACAGGTGACAACCACTTCCAACCCCAGTGGTGTCTCAACCATGACCACTTCC
STU 1 XHO 1
TGCTGGTATCAGTACTAAGACTCCTAGGCCTATCGATTC
ACGACCATAGTCATGATTCTGAGGATCCGGATAGCTAAGAGCT.
A beépítés eredményeként kapjuk a pGBSCC-11 plazmidot (18. ábra). A pGBSCC-2 P450SCC kódolószakaszát beépítjük a Stul-gyel hasított pGBSCC-11be, az 5. b) példában leírtakkal analóg módon. A fragmentumot korrekt orientációban tartalmazó plazmidot pGBSCC-12-nek neveztük el.
b) A K. lactis transzformálása és a transzformált sejtek analízise
A K. lactist a pGBSCC-12-vel úgy transzformáljuk, ahogy azt az 5. c) példában leírtuk. A transzformált sejtek analízise az 5. d) példában leírtak szerint történt. Az analízis kimutatta, hogy a K. lactis P450SCC-t termel (15B. ábra, 3-as sáv).
8. példa
A pre-P4}fíSCC-t kódoló DNS szerkesztése, transzformálása és kifejeződése Saccharomyces cerevisiae élesztősejtekben
a) Az expressziós kazetta szerkesztése
A pGBSCC-12 Sall-HindlII (HindlII-mal részlegesen emésztve) fragmentumát, amely a pre- P450SCC-t kódoló szakaszt tartalmazza, beépítjük a Sall-gyel és
HindlII-mal hasított pGBSCC-9-be. A kapott plazmidot pGBSCC- 13-nak neveztük el (19. ábra), b) Az S. cerevisiae transzformálása és a transzformált sejtek analízise
Az S. cerevisiae D273-10B törzset pGBSCC-13mal transzformáljuk a 6. b) példában leírtak szerint. A transzformált sejteket az 5. c) példában leírtak szerint analizáljuk. Az eredmény, mely a 15C. ábrán (3-as sáv) látható, azt mutatja, hogy az S. cerevisiae P450SCC-t fejez ki. Az egyik transzformált sejtet - SCC-105 tovább analizáltuk P450SCC-aktivitásra (lásd a 12. példát).
9. példa
A Saccharomyces cerevisiae-ből származó citokrómoxidáz VI pre-régiójával fuzionált P450SCC-szekvenciák szerkesztése, transzformálása és kifejeződése Kluyveromyces lactisban
a) Az expressziós kazetta szerkesztése
A pGB950 plazmidot [lásd a 6. b) példát] Sall-gyel és Xhol-gyel hasítjuk, s beépítjük a következő szintetikus DNS-t:
SÁL I
TCGACAAAAATGTTGTCTCGAGCTATCTTCAGAAACCCAGTTATCAACAGAACTTTGTT GTTTTTACAACAGAGCTCGATAGAAGTCTTTGGGTCAATAGTTGTCTTGAAACAA
GAGAGCTAGACCAGGTGCTTACCACGCTACTAGATTGACTAAGAACACTTTCATCCAATC
CTCTCGATCTCGTCCACGAATGGTGCGATGATCTAACTGATTCTTGTGAAAGTAGGTTAG
STU 1 XHO 1
CAGAAAGTACATCAGTACTAAGACTCCTAGGCCTATCGATTC
GTCTTTCATGTAGTCATGATTCTGAGGATCCGGATAGCTAAGAGCT.
Az eredmény a pGBSCC-14 plazmid.
A citokróm oxidáz VI (COX VI) pre-szekvenciájából származó aminosavszekvenciát Wright és munkatársai [J. Bioi. Chem., 259, 15 401-15 407 (1984)] köz- 60 leményéből vettük át. Megterveztük a szintetikus DNS-t, előnyös élesztőkodonok használatával. A pGBSCC-2ből a P450SCC kódolószakaszát beépítjük a Stul-gyel hasított pGBSCC- 14-be, ahogyan ezt az 5. b) példában le11
HU 218 111 Β írtuk. A plazmidot, amely a P450SCC kódolószekvenciát a COX VI pre-szekvenciával egy keretben tartalmazza, pGBSCC- 15-nek neveztük el (20. ábra), b) A K. lactis transzformálása és a transzformált sejtek analízise
A K. lactis transzformálása a pGBSCC-15-tel az 5. c) példában leírtak szerint történt. A transzformált sejtek analízisét az 5. d) példában leírtak szerint végeztük. Az eredményekből kitűnt, hogy a P450SCC fejeződik ki (15B. ábra, 2-es sáv).
10. példa
Saccharomyces cerevisiae-ből származó citokróm oxidáz VI pre-régiójával fuzionált P450SCC-szekvenciák szerkesztése, transzformálása és kifejeződése Saccharomyces cerevisiae-ben
a) Az expressziós kazetta szerkesztése
A pGBSCC-15 Sall-HindlII (részlegesen emésztve HindlII-mal) fragmentumát, amely a COX VI preszekvenciával fuzionált P450SCC kódolószakaszát tartalmazza, beépítjük a Sall-gyel és HindlII-mal hasított pGBSCC-9-be. A kapott plazmid neve: pGBSCC-16 (21. ábra).
b) Az S. cerevisiae transzformálása és a transzformált sejtek analízise
Az S. cerevisiae D273-10B törzset a 6. b) példában leírtak szerint transzformáljuk. A transzformált sejteket a 6. c) példában leírtak szerint analizáljuk. Az eredmény, amely a 15C. ábrán (2-es sáv) látható, bizonyítja, hogy az S. cerevisiae-ben P450SCC fejeződik ki.
11. példa
A P45fSCC in vivő aktivitása Bacillus licheniformis SCC-201-ben
A B. licheniformis SCC-201 törzset a 3. példában leírtak szerint állítjuk elő. A sejtekkel 100 ml A táptalajt oltunk be. Az A táptalaj összetétele:
Kalcium-klorid 6H2O 1 g
Ammónium-szulfát 5 g
Magnézium-klorid 6H2O 2,25 g
Mangán-szulfát 4H2O 20 mg
Kobalt-klorid 6H2O 1 mg
Citromsav-monohidrát 1,65 g
Desztillált víz 600 ml
Nyomelem törzsoldat 1 ml
Habzásgátló SÁG (5693) 0,5 mg
Nyomelem törzsoldat összetétele 1 liter desztillált vízben:
CuSO4.5H2O 0,75 g
H3BO3 0,60 g
KJ 0,30 g
FeSO4(NH4)2SO4.2H2O 27 g
ZnSO4.7H2O 5 g
Citromsav.H2O 15 g
MnSO4.H2O 0,45 g
Na2MoO4.H2O 0,60 g
H2SO4 (96%) 3 ml
Sterilizálás után 30 °C-ra hűtjük az oldatot, s a táptalajt úgy készítjük el, hogy hozzáadunk 60 g maltóz monohidrátot 200 ml desztillált vízben oldva (sterilizálva 120 °C-on 20 percig), 200 ml 1 mólos káliumfoszfát-puffert (pH = 6,8; sterilizálva 120 °C-on 20 percig), 1,7 g Difco-féle élesztő nitrogénbázis 100 ml desztillált vízben oldva (sterilizálva membránszűréssel).
A tenyésztést 54 órán át 37 °C-on folytatjuk, majd ebből a tenyészetből 2 ml-t adunk inokulum gyanánt 100 ml A tápoldathoz, mely 10 mg koleszterint tartalmaz. A koleszterint a következő összetételű oldat formájában adagoljuk: 10 mg koleszterin, Tergitol™/etanol (1:1, térfogat/térfogat), 0,75 ml Tween 80 20 pl. A tenyésztést 48 órán át 37 °C-on folytatjuk, és ekkor a tenyészetet 100 ml metilén-dikloriddal extraháljuk. Az elegyet centrifugálással választjuk el, és a szerves, oldószeres fázist gyűjtjük össze. Az extrakciót még kétszer ismételjük, és a 3x100 ml metilén-diklorid-frakciót egyesítjük. A metilén-dikloridot vákuumdesztillálással távolítjuk el, és a száraz kivonatot (körülbelül 450 mg) pregnenolonra analizáljuk gázkromatográfia (GC)-tömegspektrometer (MS) kombinációjával.
GC-MS analízis
A száraz kivonatból meghatározott mennyiségű mintát veszünk ki, majd piridin-bisz(trimetil-szilil)trifluor-acetamid és trimetil-klór-szilán keverékével szililezzük. A szililezett mintát GL-MS-DS kombinációval (Carlo Erba MEGA 5160—Finnigan MÁT 311A-Kratos DS 90) analizáljuk szelektált ion alakban. A gázkromatográfiát a következő feltételek mellett végeztük: az adagolótű 300 °C-on injektál; oszlop: M. cpsil29 0,35 belső átmérő df 0,2 pm 300 °C izoterma; közvetlen átvezetés MS-re.
A mintákat 800-as felbontás mellett pregnenolonból származó ionok (m/z 298) észlelésével analizáltuk. A mérések világosan mutatták, hogy a B. licheniformis T5 gazdatörzsben nem lehetett pregnenolont kimutatni (a kimutathatósági határ 1 pikogramm), míg a B. licheniformis SCC-201 esetében könnyen megfigyelhető volt a pregnenolontermelés.
12. példa
A Saccharomyces cerevisiae SCC- 105-ből izolált P4 f)SCC in vitro aktivitása
A 8. példában leírtak szerint kapott S. cerevisiae SCC-105 sejteket 100 ml B tápoldatba oltottuk. A B táptalaj összetétele 1 liter desztillált vízben a következő:
Élesztőkivonat 10 g
Bacto pepton (Oxoid) 20 g
Tejsav (90%) 20 g
Dikálium-foszfát 35 g
A pH = 5,5 [25%-os (tömeg) ammóniával beállítva].
A tenyészetet 48 órán át 30 °C-on inkubáljuk, majd ez után ezt a tenyészetet használjuk a C táptalajt tartalmazó fermentorhoz inokulumként. A C táptalaj összetétele a következő:
Élesztőkivonat 100 g
Bacto pepton (Oxoid) 200 g
Tej sav (90%) 220 ml
Dikálium-foszfát 35 g
Desztillált víz 7800 ml
HU218 111 Β
ApH-t 25%-os ammóniaoldattal 6,0-ra állítjuk be, és a fermentort a táptalajjal együtt sterilizáljuk 1 órán át 120 °C-on.
Lehűtés után 25 ml desztillált vízben oldott és membránszűréssel sterilizált geneticint adunk a táptalajhoz. A beoltott táptalajt keverővei (800 fordulat/perc) ellátott reaktorban tenyésztjük 30 °C-on. Steril levegőt vezetünk át a fermentleven 300 liter/óra sebességgel, és a pH-t 6,0-ra állítjuk 4 n H2SO4 és 5%-os NH40H automatikus adagolásával (az 5%-os NH4OH-oldatot desztillált vízzel készítjük és membránszűréssel sterilizáljuk). 48 óra múlva tejsav- (90%-os oldat, membránszűréssel sterilizálva) betáplálást kezdünk 20 g/óra sebességgel. A fermentálást ezután még 40 órán át folytatjuk, s ekkor a sejteket centrifugálással gyűjtjük össze (4000 g, 15 perc).
Az üledéket 0,9%-os (tömeg) NaCl-dal mossuk, majd centrifugálunk (4000 g, 15 perc), az üledéket foszfátpufferrel (60 mM, pH=7,0) mossuk, és a sejteket centrifugálással (4000 g, 15 perc) gyűjtjük össze. Az üledéket annyi foszfátpufferben (50 mM, pH = 7,0) vesszük fel, hogy a kapott szuszpenzió ml-enként 0,5 g nedves tömeget tartalmazzon. A szuszpenziót DynoR készülékben (Willy A. Bachofen Maschinenfabrik, Bázel, Svájc) tárjuk fel. Az ép sejteket centrifugálással (4000 g, 15 perc) távolítjuk el. A sejtmentes kivonatot (2250 ml, 15-20 mg protein/ml) -20 °C-on tároljuk.
A P450SCC-t durva tisztításnak vetjük alá a következő eljárással. A felolvasztott sejtmentes kivonat 50 miéből kapott nyersmembrán-frakciót ultracentrifugában (12 500 g, 30 perc) ülepítjük, az üledéket 50 ml 1% nátrium-kolát-tartalmú, 75 mmólos kálium-foszfátoldatban (pH=7,0) reszuszpendáljuk. A diszperz elegyet óvatosan kevertetjük 1 órán át 0 °C-on, s ezután lecentrifúgáljuk (12 500 g, 60 perc). Az így kapott felülúszóhoz, amely a szolubilizált membránproteineket tartalmazza, ammónium-szulfátot adunk (3% tömeg/térfogat), s pH-ját 7,0-en tartjuk 6 n ammónium-hidroxidoldat kis mennyiségeinek adagolásával. A szuszpenziót 20 percig 0 °C-on kevertetjük, s ezután a kicsapódott proteinfrakciót centrifugálással (15 000 g, 10 perc) gyűjtjük össze. Az üledéket 0,1 mM ditiotreitolt és 0,1 mM EDTA-t tartalmazó 100 mM kálium-foszfátpufferben (pH=7,0) reszuszpendáljuk úgy, hogy térfogata 2,5 ml legyen. A szuszpenziót gélszűrésre alkalmas oszlopról (PD10, Pharmacia) oldjuk le, amikor is 3,5 ml sótalanított proteinfrakciót kapunk (6 mg/ml), melyet P450SCC-aktivitásra vizsgálunk.
A P450SCC-aktivitás meghatározását lényegében Doering módszerén [Methods in Enzymology, 15, 591-596 (1969)] eljárással végezzük el. A vizsgálati anyag a következő oldatokból áll:
A oldat (természetes P45()SCC elektrondonor-rendszer), mely egy 10 mM kálium-foszfát-puffer (pH=7,0) a következő összetétellel: 3 mM EDTA, 3 mM fenilmetil-szulfonil-fluorid (PMSF), 20 μΜ adrenodoxin és 1 μΜ adrenodoxin-reduktáz (elektronhordozók; mindkettő szarvasmarha-mellékvesekéregből tisztítva), 1 mM NADPH (elektrondonor) és 15 mM glükóz-6-foszfát és egység/ml glükóz-6-foszfát dehidrogenáz (NADPH regeneráló rendszer).
B oldat (szubsztrátum): 37,5 μΜ koleszterintartalmú oldat, melyben a koleszterinrészecskék kétszeresen jelzettek {[26,27-14C] koleszterin (40 Ci/mol) és [7a-3H] koleszterin (400 Ci/mol)}, oldószere 10%-os (terfogat/térfogat) Tergitol™-ben NP40/etanol (1:1, térfogat/térfogat).
A vizsgálatot úgy kezdjük, hogy 75 μΐ A oldatot összekeverünk 50 μΐ B oldattal és 125 μΐ durván tisztított P450SCC-frakcióval (vagy pufferrel, kontroll gyanánt). Mintákat (50 μΐ) veszünk a nulladik, 30-adik és 180-adik percben, s 100 μΐ vízzel hígítjuk e mintákat. A hígított mintákhoz 100 μΐ metanolt és 150 μΐ kloroformot adunk. Extrahálás és centrifugálás után (5000 g, 2 perc) a kloroformos fázist gyűjtjük össze és szárítjuk. A száraz maradékot 0,5 mg szteroidkeveréket [koleszterin, pregnenolon és progeszteron (1:1:1, tömeg)] tartalmazó 50 μΐ acetonban oldjuk fel, s az oldathoz 110 μΐ koncentrált hangyasavat adunk. A szuszpenziót 15 percig 120 °C-on hevítjük. Ezután meghatározzuk a 14(3/3H arányt a kettős jelölés folyadékszcintillációs számolásával. Ez az arány az oldallánc-hasítási reakció közvetlen mértéke, mivel a 14C-vel jelzett oldallánc izokaprilsav formájában elpárolog a keverékből a hevítés folyamán.
A vizsgálattal megállapítottuk, hogy az S. cerevisiae SCC-105-ből nyers tisztítással nyert P450SCCfrakciónak oldallánchasító aktivitása van. Három óra inkubálással a koleszterin 45%-a konvertálódott. Vékonyréteg-kromatográfiával megállapítottuk, hogy a termék pregnenolon.
példa
A bovin citokróm P4$0 szteroid 17a.-hidroxilázt (P f5nl 7a) kódoló teljes hosszúságú cDNS molekuláris klonozása
Az 1. példában leírt mellékvesekéreg cDNSgyűjteményből körülbelül 106 plakk-képző egységet (pfu) szelektálunk P4501 7a-cDNS-szekvenciákat illetően oly módon, hogy két P4501 7acDNS-re specifikus 32P-végjelzett szintetikus oligomerrel szűrjük a gyűjteményt. A 17α-1 oligomer (5’-AGT GGC CAC TTT GGG ACG CCC AGA GAA TTC-3’) és a 17a-2 oligomer (5’-GAG GCT CCT GGG GTA CTT GGO ACC AGA GTG CTT GGT-3’) komplementer a Zuber és munkatársai [J. Bioi. Chem., 261, 2475-2482 (1986)] szerinti P45017a-cDNS-szekvenciával a 349-320., illetve 139-104. pozíciókban.
A 17a- l-gyel való szelekció ± 1500 hibridizáló pfút eredményezett. Számos hibridizáló pfú-t szelektáltunk, tisztítottunk és szaporítottunk fel fág-DNS preparatív izolálása céljából. A rekombináns lambda-gtll DNS-ek EcoRI inszertumait a pTZ18R EcoRI helyére szubklónoztuk. Egy kiónt, a pGB17a-l kiónt tovább vizsgáltunk restrikciós endonukleáz térképezéssel és DNS-szekvenálással. A pGB17a-l plazmid egy olyan 1,4 kb EcoRI inszertumot tartalmaz, amely komplementer a Zuber és munkatársai által leírt P450 1 7a 3’ részével a 320-as pozíciónál lévő EcoRI helytől az 1721-es pozí13
HU 218 111 Β ciónál lévő poliadenilációs helyig. A pGB17a-l térképét a 22A. ábra mutatja be.
A 17a-2 oligomerrel nyolc hibridizáló pfíi-t kapunk a cDNS-gyűjtemény szűrésekor. A rekombináns fágok tisztítása, felszaporítása, majd a rec lamb- 5 da-gtl 1 DNS-ek izolálása után az EcoRl inszertumokat a pTZ18R EcoRl helyére szubklónoztuk. Az EcoRl inszertumok hossza 270 bp-től 1,5 kb-ig váltakozott. Csak egy kiónt, a 345 bp EcoRl fragmentumot tartalmazó pGB17a-2 kiónt vizsgáltuk tovább nukleotid- 10 szekvenálással, és ezt hasonlítottuk a Zuber és munkatársai által publikált P450 1 7acDNS-szekvencia-adatokhoz. A 22B. ábrán látható, hogy a pGB17a-2-ben lévő P4501 7acDNS-szekvencia az előre látott AUG startkodontól 72 bp-al upstream a 42-es pozíciónál kezdő- 15 dik, és teljes homológiát mutat a P45017acDNS 5’ részével a 320-as pozíciónál lévő EcoRl helyig, mint ezt Zuber és munkatársai leírták.
A teljes hosszúságú szarvasmarha P4501 7acDNS-t úgy szerkesztjük meg, hogy a pGB17a-t EcoRI-gyel 20 való részleges emészetét és a pGB17a-2 345 bp EcoRl fragmentumát tartalmazó ligációs keveréket bevisszük az E. coli JM101 sejtekbe molekuláris klónozással. A kapott pGB17a-3 klón tartalmazza a teljes hosszúságú szarvasmarha P450 1 7acDNS-t, amelyet a 22C. ábra mutat be.
14. példa
Egy teljes hosszúságú P45fí17acDNS-klón szerkesztése és transzformálása Kluyveromyces lactis élesztősejtekbe
a) Az expressziós kazetta szerkesztése
Annak érdekében, hogy a bovin P450 1 7a számára élesztősejtekben alkalmas expressziós vektort készítsünk, a pGB17a-3-ban helyre irányuló mutagenezissel mutációt hajtunk végre Zoller és Smith [Methods in Enzymol., 100, 468-500 (1983); Methods in Enzymol., 154, 329-350 (1987)] és Kramer és Fritz [Methods in Enzymol., 154, 350-367 (1987)] leírása szerint. Az in vitro mutagenezises kísérletekhez a plazmidot és törzseket a Pharmacia cégtől szereztük be.
A 23. ábrán látható, hogy az ATG iniciációs kodontól közvetlen upstream 9 bp-t megváltoztattunk, hogy egy Sáli restrikciós helyet kapjunk, és optimális élesztő transzlációs szignálokat az alábbi 17a-3 szintetikus oligomer segítségével:
SÁL 1
5’-TCTTTGTCCTGACTGCTGCCAGTCGACAAAAATGTGGCTGCTC-3’.
A kapott pGB17a-4 plazmidot Sall-gyel és Smalgyel emésztjük; a teljes hosszúságú P45017acDNS-t tartalmazó DNS-fragmentumot gélelektroforézissel választjuk el, izoláljuk, és E. coli JM101 sejtekben való molekuláris klónozással visszük be a pGB950 vektorba (lásd az 5. példát), amelyet először Xhol-gyel emésztettünk, a ragadós végeket Klenow DNS-polimerázzal betöltöttük, majd ezután Sall-gyel emésztettük, miáltal a
24. ábra szerinti pGB17a-5 plazmidhoz jutottunk,
b) A K. lactis transzformálása
A pGB17a-5-ből, melyet a laktázpromoterben lévő egyetlen SacII helynél elhasítottunk, 15 pg-ot használunk a K. lactis (CBS 2360) törzs transzformálására az 5. példa szerint. A transzformált sejteket Southemanalízissel vizsgáljuk a gazda genomjába integrált pGB17a-5-szekvenciák jelenlétére. Egy transzformált sejtet, a 17a-101 sejtet, amely a pGB17a-5-ből leg5 ’ -GCT GCC ACC CAG AC,C A Nde I
A kapott pGB 17a - 6 plazmidot részlegesen emésztjük EcoRI-gyel (<1 egység/pg DNS, 1 óra): a teljes hosszúságú P450 1 7acDNS-t tartalmazó DNS-fragmentumot gélelektroforézissel elválasztjuk, izoláljuk, és az EcoRI-gyel emésztett pBHA-1 DNS-hez ligáljuk, mint ezt a 26. ábrán bemutatjuk. A ligátumot molekuláris klónozással - ligációs keverék formájában - átvisszük E. coli JM101 sejtekbe, s így jutunk a pGB17a-7-hez.
b) AB. subtilis és B. licheniformis transzformálása
A „Hpall” Bacillus promotert a P45017acDNSszekvenciáktól upstream vezetjük be a következőképalább három másolatot tartalmazott a gazda genomiális DNS-ében, tovább vizsgáltunk P450 1 7a in vivő aktivitására (lásd a 16. példát).
példa
A P45/)17a szerkesztése és transzformálása Bacillus subtilis és Bacillus licheniformis bakteriális gazdasejtekben
a) Az expressziós vektor szerkesztése
Annak érdekében, hogy Bacillus gazdasejtekben alkalmas expressziós vektorhoz jussunk szarvasmarha P45017a-3-ban, helyre irányuló mutagenezissel mutációt hajtunk végre a 14. példában leírtak szerint.
A 25. ábrán látható, hogy az ATG iniciációs kodonnál egy Ndel restrikciós helyet vezettünk be az alábbi 17a-4 szintetikus oligomer használatával:
TGT GGC TGC TCC T-3’ pen: a pGB17a-6-ot az Ndel restrikciós enzimmel emésztjük, az ingázóplazmid E. coli részét agarózgél-elektroforézissel választjuk el, és ezután religáljuk és transzformáljuk a B. subtilis 1A40 (BGSC 1A40) kompetens sejteket. A neomicinrezisztens telepeket analizáljuk, és így jutunk a pGB17a-8 plazmidhoz (217. ábra).
A B. licheniformis T5 (CBS 470.83) gazdasejteket a pGB17a-8 plazmiddal transzformáljuk. A plazmid stabilan fennmarad a megfelelő Bacillus gazdasejtekben, amint ezt számos generáció után is megállapítottuk a pGB17a-8 restrikciós analízisével.
HU 218 111 Β
16. példa
A P45017a in vivő aktivitása Kluyveromyces lactis 17a~101-ben
A K. lactis 17a-101 törzset a 14. példában leírtak szerint kapjuk meg. A mikroorganizmussal 100 ml táptalajt oltunk be. A D táptalaj összetétele 1 liter desztillált vízben a következő:
Élesztőkivonat (Difco) 10 g
Bacto pepton (Oxoid) 20 g
Glükóz 20 g
Sterilizálás és 30 °C-ra való lehűtés után 40 ml desztillált vízben oldott 2,68 g élesztő nitrogénbázist (Difco: yeast nitrogén base; membránszűréssel sterilizálva) és 1 ml desztillált vízben oldott 50 mg neomicint (membránszűréssel sterilizálva) adunk a táptalajhoz. Ezután 1,5 ml dimetil-formamidban feloldott 50 mg progeszteront adunk 100 ml táptalajhoz. A tenyésztést 120 órán át 30 °C-on végezzük, majd 50 ml metilén-dikloriddal extrahálunk. Az elegyet lecentrifugáljuk, és elválasztjuk az organikus oldószerrétegeket. A metilén-dikloridot vákuumdesztillálással elpárologtatjuk, és a száraz kivonatot (körülbelül 200 mg) 0,5 ml kloroformban vesszük fel. Ez a kivonat 17a-hidroxi-progeszteront tartalmaz vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálat szerint. A vegyület szerkezetét H-MMR- és 13C-MMR-méréssel erősítettük meg. Az MMR-analízis azt is kimutatta, hogy a kivonatban a 17a-hidroxi-progeszteron/progeszteron arány körülbelül 0,3 volt.
17. példa
A bovin P4Slj szteroid 21-hidroxilázt (P4SnC21) kódoló teljes hosszúságú cDNS molekuláris klónozása
Az 1. példában leírtak szerint előállított bovin mellékvesekéreg cDNS-gyűjteményből körülbelül 106 plakkképző egységet (píu) hibridizálunk egy 32P-végjelzett oligo C21-l-gyel. Ez az oligomer, mely az 5’-GAT GAT GCT GCA GGT AAG CAG AGA CAA TTC-3’ szekvenciát tartalmazza, a szarvasmarha P45OC21 gén specifikus szondája. A gén a P450C21cDNS-szekvenciában lévő EcoRI helytől downstream helyezkedik el, amint ezt Yoshika és munkatársai [J. Bioi. Chem., 261, 4106-4107 (1986)] leírták. A szűrés egy hibridizáló pfu-t eredményezett. E rekombináns lambda-gtl 1 DNSből az EcoRI inszertumot a pTZ18R EcoRI helyére szubklónozzuk, s így kapjuk a pGBC21-l elnevezésű szerkezetet. A 28. ábra bemutatja, hogy ez a plazmid egy 1,53 kb EcoRI inszertumot tartalmaz, amely komplementer a P450C21cDNS-szekvenciával a Yoshika és munkatársai szerint 489-es EcoRI pozíciótól a poliadenilációs helyig, s ezt nukleotidszekvenálással mutattuk ki.
A P450C21cDNS fennmaradt 5’ részének (490 bp) izolálása céljából egy új szarvasmarha-mellékvesekéreg cDNS-gyűjteményt készítettünk az 1. példában leírt eljárás szerint, egyetlen módosítással. Az első cDNS-szál szintézise érdekében primerként egy kiegészítő oligomert használtunk, a C21-2 oligomert. Az 5’-AAG CAG AGA GAA TTC-3’ nukleotidszekvenciájú oligomer a P450C21cDNS EcoRI helyétől downstream, az 504-490. pozícióban helyezkedik el.
Ennek a cDNS-nek a szűrése a 32P-végjelzett C21 - 3 oligomerrel körülbelül 100 hibridizáló pfu-t eredményezett. A C21-3 oligomer az 5’-CTT CCA CCG GCC CGA TAG CAG GTG AGC GCC ACT GAG-3’ (72-37. pozíciók) P450C21-re specifikus szekvenciát tartalmazza. Csak egy rekombináns lambda-gtl 1 DNS EcoRI inszertumát szubklónoztuk a pTZ18R EcoRI helyére, melynek eredménye a pGBC21 -2 elnevezésű szerkezet lett.
Ez a plazmid (28. ábra) egy olyan 540 bp inszertumot tartalmaz, amely komplementer a P450C21cDNSszekvenciával a -50. pozíciótól a 489-es pozíciónál lévő EcoRI helyig, s ezt nukleotidszekvenálással igazoltuk.
18. példa
Egy P450C21cDNS Bacillus expressziós vektor szerkesztése és a Bacillus subtilis és Bacillus licheniformis bakteriális gazdasejtek transzformálása e vektorral a) Az expressziós vektor szerkesztése
Annak érdekében, hogy egy olyan teljes hosszúságú P450C21cDNS-t szerkesszünk, amelyet a pBHA-1 Bacillus expressziós vektor számára specifikus szekvenciák határolnak, a P450C21 gén 5’ részét először polimeráz láncreakció (PCR=Polymerase Chain Reaction) módszer segítségével módosítjuk, templátként a pGBC21-2-t és primerek gyanánt a P450C21 oligomereket használva. A C21-4 oligomer (5’-CTG ACT GAT ATC CAT ATG GTC CTC GCA GGG GTG CTG-3’) 21 olyan nukleotidot tartalmaz, amelyek a C21 szekvenciával az 1-21. pozícióban komplementerek és 18 kiegészítő bázist, hogy egy EcoRV restrikciós helyet és egy Ndel restrikciós helyet képezzenek az ATG iniciációs kodonnal.
A C21-5 oligomer (5’-AGC TCA GAA TTC CTT CTG GAT GGT CAC-3’) 21 bázisa a 489-es pozícióban lévő EcoRI helytől upstream lévő mínuszszállal komplementer.
A PCR-t Saiki és munkatársai [Science, 239, 487-491 (1988)] leírása szerint, kisebb módosításokkal végeztük el. A PCR 100 pl térfogatban ment végbe, melynek összetétele a következő volt: 50 mM KC1, 10 mM trisz-HCl (pH=8,3), 1,6 mM MgCl2, 0,01% (tömeg/térfogat) zselatin, 200-200 μΜ a dNTP-kből, 1-1 μΜ a C21 primerekből és 10 ng pGBC21-2 templát. Denaturálás után (7 perc, 100 °C) és 2 egység Taqpolimeráz (Cetus) hozzáadása után a reakciót 25 amplifikációs cikluson (mindegyik ciklusban 2’ 55 °C, 3’ 72 °C és 1 ’ 94 °C) keresztül visszük végbe DNS-amplifier készülékben (Perkin-Elmer).
Az utolsó ciklusban kihagyjuk a denaturációs lépést. A P450C21cDNS megnövelésének (amplification) sematikus képét a 29. ábrán mutatjuk be.
A megnövelt fragmentumot EcoRV-tel és EcoRIgyel emésztjük, és molekuláris klónozás révén beépítjük a pSP73 (Promega) megfelelő helyére. A kapott plazmid pGBC21 -3 elnevezést kapott. A 30. ábrán látható, hogy a 3’ P450C21-EcoRI fragmentum jobb oldali irányítottsággal van beépítve a pGBC21 -3 EcoRI helyére. A kapott pGBC21-4 vektort EcoRV-tel és Kpnl15
HU 218 111 Β gyei (a KpnI és pSP73 többszörös klónozóhelyén található) emésztjük, és a teljes hosszúságú P450C21 cDNS-t tartalmazó fragmentumot gélelektroforézissel izoláljuk, és molekuláris klónozással beépítjük a pBHA-1 megfelelő helyére. A kapott pGBC21 - 5 plazmidot a 31. ábra ábrázolja.
b) A Bacillus transzformálása
A „Hpall” Bacillus promotert a P450C21cDNS géntől upstream vezetjük be azáltal, hogy a pGBC21-5 plazmidot Ndel restrikciós enzimmel emésztjük, az ingázóplazmid E. coli-részét elválasztjuk agarózgélelektroforézissel, majd religálunk, és transzformáljuk a B. subtilis 1A40 (BGSC 1A40) kompetens sejteket. A neomicinrezisztens kolóniák vizsgálata révén jutunk a pGBC21 -6 plazmidhoz (32. ábra).
A B. licheniformis T5 (CBS 470.83) gazdasejtek transzformálását szintén pGBC21-6-tal végezzük. A plazmid stabilan fennmarad a Bacillus gazdasejtekben, s ezt restrikciós analízissel mutattuk ki.
19. példa
P4S0C21cDNS élesztő expressziós vektor szerkesztése és a Kluyveromyces lactis élesztögazdasejtek transzformálása
a) Az expressziós vektor szerkesztése
Annak érdekében, hogy a bovin P450C21 számára élesztőgazdasejtekben alkalmas expressziós vektorhoz jussunk, a pGBC21-2 plazmidban helyre irányuló mutagenezissel mutációt végzünk a 14. példában leírtak szerint. A mutációhoz a C216 oligomert (5’-CCT CTG CCT GGG TCG ACA AAA ATG GTC CTC GCA GGG-3’) használjuk, melynek révén egy Sáli restrikciós helyet hozunk létre, és optimális élesztő transzlációs szignálokat az ATG iniciációs kodontól upstream, amint ezt a 33. ábrán bemutatjuk.
A kapott pGBC21-7 plazmid Sall/EcoRI fragmentumát a pGBC21-l 3’ P450C21-EcoRI fragmentumához ligáljuk, és ezt molekuláris klónozás révén beépítjük a pSP73 megfelelő helyére (lásd a 34. ábrát). Az így kapott pGBC21-8 plazmidot Sall-gyel és EcoRV-tel (az EcoRV hely a pSP73 sokszoros klónozóhelyén található) hasítjuk, és a teljes hosszúságú P450C21 cDNS-t tartalmazó DNS - fragmentumot beépítjük a pGB950 élesztő expressziós vektorba. A kapott pGBC21-9 plazmid a
35. ábrán látható.
b) A K. lactis transzformálása
A pGBC21-9 15 pg-ját SacII-vel emésztjük, s a K. lactis CBS 2360 transzformálását az 5. c) példában leírt módon végezzük el.
20. példa
A szarvasmarha-citokróm P450 szteroid 1 lfi-hidroxilázt (P4S0l Ifi) kódoló teljes hosszúságú cDNS molekuláris klónozása
Az 1. példában leírtak szerint szarvasmarha-mellékvesekéreg cDNS-gyűjteményt hozunk létre egy módosítással. Az első cDNS-szál szintézisének reakcióelegyéhez egy további P450l Ιβ-specifikus prímért (11β— 1 oligomer) adunk, melynek nukleotidszekvenciája a következő: 5’-GGC AGT GTG CTG ACA CGA-3’.
A 11β— 1 oligomer a transzlációs stopkodontól közvetlenül downstream helyezkedik el, az 1530-1513. pozíciókban. Az említett Ρ4501 1β oligomerek nukleotidszekvenciáit és térképi elhelyezkedését a Morohashi és munkatársai [J. Biochem., 102, 559-568 (1987)] által a P450l ^cDNS-re leírt szekvencia-adatokból származtatjuk. A cDNS-gyűjteményt egy olyan 32P-vel jelzett 11 β-2 oligomerrel (5’-CCG CAC CCT GGC CTT TGC CCA CAG TGC CAT-3’) szűrjük, amely a Ρ45011β cDNS 5’ végénél helyezkedik el, az 1-36. pozíciókban.
A 11 β-2-vel való szűrés 6 hibridizáló pfu-t eredményezett. Ezeket tovább tisztítottuk, és a 11β—3 oligomerrel (5’-CAG CTC AAA GAG AGT CAT CAG CAA GGG GAA GGC TGT-3’; 990-955. pozíciók) analizáltuk. A hat közül kettő adott pozitív hibridizációs szignált a 32P-vel jelzett 11 β—3 oligomerrel.
A két 1 Ιβ-lambda-gtl 1 rekombináns plazmid EcoRl inszertumát a pTZ18R EcoRI helyére szubklónoztuk. Egy 2,2 kb EcoRI inszertumot tartalmazó kiónt (pGB 11 β-1) tovább vizsgáltunk restrikciós enzimes térképezéssel (lásd a 36. ábrát). A ρϋΒΙΙβ-Ι minden olyan kódolószekvenciát tartalmaz, amelyet Morohashi és munkatársai a P450l l[icDNS-re meghatároztak.
példa
A P450C21cDNS Bacillus expressziós vektor szerkesztése és a Bacillus subtilis és Bacillus licheniformis bakteriális gazdasejtek transzformálása
a) Az expressziós vektor szerkesztése
A pBHA-Ι Bacillus expressziós vektorhoz teljes hosszúságú P450l ^cDNS-t készítünk, módosított határszekvenciákkal. A 18. példában leírt PCR-módszert alkalmaztuk, templátként a pGB 11 β -1 és primerként két specifikus P450l 1β oligomer használatával.
A 11 β-4 oligomer (5’-TTT GAT ATC GAA TTC CAT ATG GGC ACA AGA GGT GCT GCA GCC-3’) 21 olyan bázist tartalmaz, amelyek komplementerek az érett P450l ^cDNS-szekvenciával a 72-93. pozíciókban és 21 bázist az EcoRV, EcoRI és Ndel restrikciós helyek és ATG iniciációs kodon létesítése céljára.
A 11 β-5 oligomer (5’-TAA CGA TAT CCT CGA GGG TAC CTA CTG GAT GGC CCG GAA GGT-3 ’) 21 olyan bázist tartalmaz, amelyek a P450l^cDNS mínuszszálával komplementerek az 1511-es pozícióban lévő transzlációs stopkodontól upstream, és 21 bázist az EcoRV, Xhol és KpnI restrikciós helyek létesítése céljára.
A fent említett templáttal és P4S0l 1β primerekkel végzett PCR-amplifikáció után a megnövelt fragmentumot (1,45 kb) EcoRI-gyel és KpnI-gyel emésztjük, és molekuláris klónozással bevisszük az EcoRI-gyel és KpnI-gyel hasított pBHA-1 Bacillus expressziós vektorba, miáltal a pGBl 1β-2 vektorhoz jutunk (lásd a
36. ábrát).
b) Bacillus-transzformálás
A „Hpall” Bacillus promotert a P450l^cDNSszekvenciáktól upstream építjük be oly módon, hogy a ρϋΒ11β-2-ί Ndel-gyel emésztjük, az ingázóplazmid E. coli-részét elválasztjuk agarózgél-elektroforézissel,
HU218 111 Β majd religálunk (ahogyan a 18. példában leírtuk) és B. subtilis 1A40 (BGSC 1A40) kompetens sejteket transzformálunk. Neomicinrezisztens telepeket analizálunk, és így kapjuk a pGB! Ιβ-3 plazmidot. A kapott ρΰΒ11β-3 plazmidot bevisszük B. lichaniformis T5 (CBS 470.83) gazdasejtekbe is.
22. példa
P4Sfjl IficDNS élesztő expressziós vektor szerkesztése és Kluyveromyces lactis élesztőgazdasejtek transzformálása
a) Az expressziós kazetta szerkesztése
A pGB950 élesztő expressziós vektor számára úgy kapunk módosított szekvenciákkal határolt teljes hosszúságú P450l ^cDNS-t, hogy a PCR-módszert (a 18. példában írtuk le) alkalmazzuk, templátként használva a pGB 11 β -1 -et és primerekként a két specifikus P450l 1β oligomert.
A 11 β-6 oligomer (5’-CTT CAG TCG ACA AAA ATG GGC ACA AGA GGT GCT GCA GCC-3’) 21 olyan bázist tartalmaz, melyek komplementerek az érett P450l l^cDNS-szekvenciával a 72-93. pozíciókban, és 18 további bázist egy Sáli restrikciós hely, egy optimális élesztő transzlációs szignál és egy ATG iniciációs kodon képzése céljából.
A 11 β-5 oligomert a 21. a) példa írja le. A fent említett templáttal és a P450l 1β primerekkel való PCR-amplifikáció után a megnövelt fragmentumot (1,45 kb) Sall-gyel és Xhol-gyel emésztjük, majd molekuláris klónozással beépítjük a Sall-gyel hasított pGB950 élesztő expressziós vektorba. így kapjuk a ρΟΒ11β-4 vektort (37. ábra).
b) A K. lactis transzformálása
A ρΟΒ11β-4 15 pg-ját elhasítjuk a laktázpromoterben lévő egyetlen SacII helynél, és a K. lactis CBS 2360 sejteket az 5. c) példában leírtak szerint transzformáljuk.
23. példa
A szarvasmarha-adrenodoxint (ADX) kódoló teljes hosszúságú cDNS molekuláris klónozása és szerkesztése, s ezt követően Kluyveromyces lactis élesztősejtek transzformálása ADXcDNS-sel
a) Az ADX molekuláris klónozása
A pGB950 élesztő expressziós vektor számára módosított 5’ és 3’ határolószekvenciákkal rendelkező teljes hosszúságú ADXcDNS-t közvetlenül szarvasmarha-mellékvesekéreg mRNS/cDNS poolból állítjuk elő (részletes leírását lásd az 1. példában) PCR-módszerrel végzett amplifikációval (lásd a 18. példát).
Az ADXcDNS megnöveléséhez két szintetikus oligomert szintetizálunk.
Az ADX-1 oligomer (5’-CTT CAG TCG ACA AAA ATG AGC AGC TCA GAA GAT AAA ATA-3’) 21 bázist tartalmaz, amelyek az Okamura és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 5705-5709 (1985)] által leírt érett ADXcDNS-szekvencia 5’-végével a 173-194. pozíciókban komplementerek. Az ADX-1 oligomer 18 további nukleotidot tartalmaz 5’végénél, egy Sáli restrikciós hely, egy optimális élesztő transzlációs szignál és egy ATG iniciációs kodon kialakítása érdekében.
Az ADX-2 oligomer (5’-TGT AAG GTA CCC GGG ATC CTT ATT CTA TCT TTG AGG AGT T--3 ’) az ADXcDNS mínuszszálának 3’-végével komplementer az 561-540. pozíciókban, és további nukleotidokat tartalmaz BamHI, Smal és Kpnl restrikciós helyek képzése végett.
A PCR-t a 18. példában leírtak szerint végezzük 1-1 pmol ADX primer és 10 pl mRNS/cDNS keverék (lásd az 1. példát) mint templát felhasználásával.
Az ADXcDNS amplifikációjának sematikus ábrázolása a 38. ábrán látható.
A megnövelt fragmentum módosított határolószekvenciákkal ellátott teljes hosszúságú ADXcDNS-szekvenciát tartalmaz, amelyet restrikcióshely-analízissel és nukleotidszekvenálással azonosítottunk.
b) Az expressziós vektor szerkesztése
A megnövelt ADXcDNS fragmentumot Sall-gyel és Smal-gyel emésztjük, és molekuláris klónozással beépítjük a Sall-gyel és EcoRV-tel hasított pGB950 élesztő expressziós vektorba. A kapott pGBADX-1 plazmidot a 38. ábra mutatja be.
c) A K. lactis transzformálása
A pGBADX-1 15 pg-ját a laktázpromoterben lévő egyetlen SacII helynél hasítjuk, és a K. lactis CBS 2360 transzformálását az 5. c) példában leírtak szerint végezzük el.
d) A transzformált sejtek vizsgálata
Két transzformált sejtet, az ADX-101 és ADX-102 sejtet, valamint a kontroll CBS 2360 törzset választottuk a további vizsgálathoz. A törzseket YEPD táptalajban tenyésztjük körülbelül 64 órán át 30 °C-on. A sejtek összproteinjét izoláljuk az 5. d) példában leírtak szerint. A felülúszókból 8 pl-es mintákat veszünk immunobiot vizsgálathoz (lásd a 39. ábrán a 3-as, 4-es és 5-ös sávot).
Az eredmények azt mutatják, hogy a pGBADX-1 gyei transzformált K. lactis sejtek a várt hosszúságú proteint (14 kD) fejezik ki.
Az ADX-2 transzformált sejt in vitro aktivitásának vizsgálatát a 24. példa írja le.
24. példa
A Kluyveromyces lactis ADX-2-ből kapott adrenodoxin in vitro aktivitása
A 23. példában leírtak szerint előállított K. lactis ADX-102 sejteket és a kontroll K. lactis CBS 2360 törzset 100 ml YEPD táptalajban (1% élesztőkivonat, 2% glükóz-monohidrát) tenyésztjük, amely 6,7% (tömeg) élesztő nitrogénalapot (Difco; yeast nitrogén base) és 100 mg/1 geneticint (G418 szulfát, Gibco Ltd.) tartalmaz. A tenyésztést 56 órán át, 30 °C-on végezzük. A sejteket centrifügálással gyűjtjük össze (4000 g, 15 perc), fiziológiás sóoldatban reszuszpendáljuk és foszfátpufferrel (pH=7,0, 50 mM) mossuk. Centrifugálás után az üledéket foszfátpufferben (pH=7,0, 50 mM) reszuszpendáljuk úgy, hogy egy 0,5 g nedves tömeg/ml-t tartalmazó sejtszuszpenziót kapjunk. A sejteket egy Braunféle MSK homogenizátorban tárjuk fel (6x15 másodperc, 0,45-0,50 mm-es üvegszemcsék). Az el nem ron17
HU218 111 Β csolódott sejteket centrifugálással (4000 g, 15 perc) távolítjuk el. A sejtmentes kivonatot (40 mg protein/ml) -20 °C-on tároljuk.
A sejtmentes kivonat ADX aktivitását, azaz az adrenodoxin-reduktáz elektrontranszfer kapacitását a citokróm P450SCC-vel szemben egy P450SCC-aktivitás assay-vel határoztuk meg. Az assay-ben használt reakcióelegy a következő oldatokat tartalmazza:
A oldat (természetes P450SCC elektrondonor-rendszer ADX nélkül): 50 mM kálium-foszfát-puffer (pH=7,0), amely 3 mM EDTA-t, 2 μΜ adrenodoxinreduktázt (szarvasmarha-mellékvesekéregből tisztítva), 15 mM glükóz-6-foszfátot és 16 egység/ml glükóz-6foszfát-dehidrogenázt (NADPH regeneráló-rendszer) tartalmaz.
B oldat (szubsztrátum és enzim): 75 μΜ összmennyiségben kettős radioizotópos jelöléssel koleszterinrészecskéket {[26,27-14C] koleszterin (40 Ci/mol) és [7a-3H] koleszterin (400 Ci/mol)} és 1,5 μΜ P450SCC-t (szarvasmarha-mellékvesekéregből tisztítva) tartalmazó 10% (térfogat/térfogat) Tergitol™-tartalmú NP40/etanol (1:1, térfogat/térfogat) oldat.
A vizsgálatot úgy kezdjük, hogy összekeverünk 75 μΐ A oldatot, 50 μΐ B oldatot és 125 μΐ sejtmentes kivonatot vagy 125 μΐ kálium-foszfát-puffert (50 mM, pH = 7,0), mely 10 μΜ ADX-et (szarvasmarha-mellékvesekéregből tisztítva) tartalmaz. A keveréket óvatosan kevertetjük 30 °C-on. Mintákat veszünk 15 perc inkubálás után, s a mintákat 100 μΐ vízzel hígítjuk. Egy mintából 100 μΐ metanollal és 150 μΐ kloroformmal extraháljuk a szubsztrátumot és a terméket (termékeket). Centrifugálás (5000 g, 2 perc) után a kloroformos fázist összegyűjtjük és szárítjuk. A száraz maradékot 0,5 mg szteroidkeveréket [koleszterin, pregnenolon és progeszteron (1:1:1, tömeg)] tartalmazó 50 μΐ acetonban oldjuk fel, majd hozzáadunk 110 μΐ koncentrált hangyasavat. A szuszpenziót 15 percig 120 °C-on hevítjük. Ezután megmérjük a 14C/3H arányt kettős jelölésű folyadékszcintillációs számolással. Az arány közvetlen mértéke az oldallánc-hasítási reakciónak, mivel a l4C-vel jelzett oldallánc izokaprilsav alakjában elpárolog a keverékből a hevítési lépés folyamán.
Ezzel a vizsgálattal könnyen kimutatható az ADX elektronhordozó aktivitása a K. lactis ADX-102 sejtmentes kivonatában. A K. lactis sejtmentes kivonatával vagy a tiszta ADX-szel végzett vizsgálatokban a koleszterin oldallánca 15 percen belül 50%-os hozammal lehasadt, míg a kontroll K. lactis CBS 2360 törzs sejtmentes kivonatával végzett vizsgálatban nem volt észlelhető oldallánc-hasítás.
25. példa
A szarvasmarha-adrenodoxin oxidoreduktázt (ADR) kódoló teljes hosszúságú cDNS molekuláris klónozása és szerkesztése, és ezt követően a Kluyveromyces lactis élesztősejtek transzformálása ADRcDNS-sel
a) Az adrenodoxin oxidoreduktáz molekuláris klónozása
Az 1. példa szerint szarvasmarha-mellékvesekéreg cDNS-gyűjteményt készítünk egy módosítással. Egy kiegészítő ADR-specifikus prímért (ADR-1 oligomer) adunk az első cDNS-szál szintézisének reakcióelegyéhez. Az ADR-1 oligomer nukleotidszekvenciája a következő: 5’-GGC TGG GAT CTA GGC-3’. Az ADR-1 oligomer a transzlációs stopkodontól éppen downstream helyezkedik el, az 1494-1480. pozíciókban. Az említett ADR oligomerek nukleotidszekvenciait és térkép szerinti helyzetét a Nonaka és munkatársai [Biochem. Biophys. Rés. Comm., 145, 1239-1247 (1987)] által leírt ADRcDNS-szekvencia-adatokból vettük.
A kapott cDNS-gyűjteményt a 32P-vel jelzett ADR-2 oligomerrel (5’-CAC CAC ACA GAT CTG GGG GGT CTG CTC CTG TGG GGA-3’) szűrjük.
Négy hibridizáló pfü-t azonosítottunk, majd tisztítottunk. Azonban csak 1 pfu adott pozitív jelet az ADR-3-mal (5’-TTC CAT CAG CCG CTT CCT CGG GCG AGC GGC CTC CCT-3’) is, amely az ADRcDNS közepén (840-805. pozíciók) helyezkedik el. Az ADRcDNS inszertumot (körülbelül 2 kb) molekuláris klónozással a pTZ18R EcoRI helyére klónozzuk be.
A kapott pGBADR-1 plazmid egy teljes hosszúságú ADRcDNS-t tartalmaz, amint ezt restrikciós enzimes térképezéssel és nukleotidszekvenálással kimutattuk. A pGBADR-1 fizikai térképét a 40. ábrán mutatjuk be.
b) Az expressziós kazetta szerkesztése
Teljes hosszúságú ADRcDNS-t kapunk a pGB950 élesztő expressziós vektor számára módosított határolószekvenciákkal, PCR-módszerrel (lásd a 18. példát), a pGBADR-1-nek mint templátnak és a két specifikus ADR oligomemek mint primereknek a felhasználásával.
Az ADR-4 oligomer (5’-CGA GTG TCG ACA AAA ATG TCC ACA CAG GAG CAG ACC-3’) 18 olyan bázist tartalmaz, amelyek az érett ADRcDNSszekvenciával komplementerek a 96-114. pozíciókban, és 18 bázist abból a célból, hogy bevezessünk egy Sáli restrikciós helyet, egy optimális élesztő transzlációs szignált és egy ATG iniciációs kodont.
Az ADR-5 oligomer (5’-CGT GCT CGA GGT ACC TCA GTC CCC CAG CAG CCG CAG-3’) 18 olyan bázist tartalmaz, amelyek az ADRcDNS mínuszszálával komplementerek az 1479-es pozíciójú stopkodontól upstream és 15 bázist tartalmaz KpnI és Xhol restrikciós hely megteremtése érdekében, különböző expressziós vektorokba való molekuláris klónozás céljára.
A fent említett templáttal és ADR primerekkel végzett amplifikáció után a megnövelt fragmentumot (1,4 kb) Sall-gyel és Xhol-gyel emésztjük, és beépítjük molekuláris klónozással a Sall-gyel és Xhol-gyel hasított pGB950 élesztő expressziós vektorba.
A kapott pGBADR-2 plazmidot a 40. ábra ábrázolja.
c) A K. lactis transzformálása
A pGBADR-2 15 pg-ját a laktáz promoterben lévő egyetlen SacII helynél hasítjuk, és a K. lactis CBS 2360 sejtek transzformálását az 5. c) példában leírtak szerint hajtjuk végre.
HU 218 111 Β
26. példa
A szarvasmarha NADPH citokróm P45n-reduktázt (RED) kódoló teljes hosszúságú cDNS molekuláris klónozása
Az 1. példában leírtak szerint szarvasmarha-mellékvesekéreg cDNS-gyűjteményt a 32P-vel jelzett 5’-TGC CAG TTC GTA GAG CAC ATT GGT GCG TGG CGG GTT AGT GAT GTC CAG GT-3’ szintetikus oligomerrel szűrjük, amely specifikus a patkány, disznó és nyúl RED-ben lévő egy állandó aminosavszakaszra Katagari és munkatársai [J. Biochem., 100, 945-954 (1986)] és Murakami és munkatársai [DNA, 5, 1-10 (1986)] leírása szerint.
Öt hibridizáló pfu-t kaptunk, amelyeket tovább vizsgáltunk restrikciós enzimes térképezéssel és nukleotidszekvenálással. Egy teljes hosszúságú REDcDNS-t építettünk be expressziós vektorokba, és megfelelő gazdasejteket transzformáltunk a 2., 3. és 6. példában említettek szerint.
27. példa
A P45fisCC és ADXproteint kódoló expressziós kazetta szerkesztése, transzformálása és kifejeződése Kluyveromyces lactis élesztősejtekben
a) Az expressziós kazetta szerkesztése
A pGBADX-1 expressziós kazettát (lásd a 23. példát) SacII-vel és HindlII-mal emésztjük (részlegesen) (<1 egység/pg DNS, 1 óra), és a ragadós végeket Klenow DNS-polimeráz segítségével töltjük be. A laktázpromoter egy részét (mely még működőképes), a kódoló ADX-szekvenciát és a laktázterminátort tartalmazó DNS-fragmentumot elválasztjuk agarózgél-elektroforézissel, izoláljuk, majd beépítjük a pGBSCC-7be, amelyet először Xbal-gyel való emésztéssel linearizáltunk [lásd az 5. b) példát], és ragadós végeit Klenow DNS-polimerázzal betöltöttük. A szerkezetet úgy állítottuk össze, hogy egyetlen olyan restrikciós helyet (Sacll) kapjunk, amely ahhoz szükséges, hogy a plazmidot a K. lactisba vigyük át.
Ez az egyetlen Sacll restrikciós hely az SCC szekvenciát határoló laktázpromoter-szekvenciában helyezkedik el, minthogy az ADX-szekvenciát határoló laktázpromoterben lévő Sacll restrikciós hely a betöltési reakció révén tönkrement.
A kapott pGBSCC/ADX-1 expressziós kazetta mind az SCC-t, mind az ADX-et kódolószekvenciát tartalmazza, mindkettőt a laktázpromoter irányítása alatt.
b) A K. lactis transzformálása
A K. lactis CBS 2360 transzformálását az 5. c) példában leírt módon végezzük 15 pg pGBSCC/ADX-1gyel, amelyet egyetlen Sacll helyénél linearizáltunk. Egy transzformált sejtet (SCC/ADX-101) szelektáltunk SCC és ADX expressziós vizsgálatok céljára.
c) A K. lactis SCC/ADX-101 transzformált sejtek analízise
Az SCC/ADX-101 és a CBS 2360 kontrolltörzs tenyészetéből sejtprotein-frakciókat izolálunk az 5. d) példában leírt módon, amelyeket SDS/PAGE és Western blotting segítségével analizálunk. A biotokat SCC-re, illetve ADX-re specifikus antitestekkel szondázzuk.
Az SCC/ADX-101 transzformált sejtekből származó sejtprotein-frakció a kontrolltörzshöz viszonyítva plusz két sávot adott a várt méretekkel (53, illetve kD), ami mindkét protein - SCC és ADX - expresszióját jelenti. A két protein expressziójának szintje az SCC/ADX-101 transzformált sejtekben a csupán egy proteint kifejező transzformált sejtekben megfigyelt szintekhez hasonlítható (SCC-re vonatkozóan lásd a 15A. ábrán a 3-as sávot és az ADX-re vonatkozóan a 39. ábrán az 5-ös sávot).
Az SCC/ADX-101 transzformált sejtek in vitro SCC és ADX aktivitását a 28. példában írjuk le.
példa
A Kluyveromyces lactis SCC/ADX- 101-ből kapott P45fíSCC és adrenodoxin in vitro aktivitása
A 27. példában leírtak szerint kapott K. lactis SCC/ADX-101 sejteket és az 5. d) példa szerinti kontroll K. lactis SCC-101 törzset 1 liter 100 mg/1 geneticint (418-szulfát, Gibco Ltd.) tartalmazó YEPD táptalajban (1% élesztőkivonat, 2% pepton, 2% glükóz-monohidrát) tenyésztjük 72 órán át 30 °C-on. A sejteket centrifugálással (4000 g, 15 perc) gyűjtjük össze, fiziológiás sóoldatban reszuszpendáljuk és foszfátpufferrel (pH = 7,5, 75 mM) mossuk. Centrifugálás (4000 g, perc) után az üledéket foszfátpufferben (pH=7,5, 75 mM) reszuszpendáljuk úgy, hogy a kapott szuszpenzió ml-enkénti nedves tömege 0,5 g sejt legyen. A sejtekei Braun-féle MSK-homogenizátorban (6x15 másodperc, 0,45-0,50 mm-es üvegszemcsék) tárjuk fel. Az el nem roncsolt sejteket centrifugálással (4000 g, 15 perc) távolítjuk el.
A sejtmentes kivonatban vizsgáljuk a P450SCC/ADX proteinkomplex aktivitását olyan módon, hogy meghatározzuk a koleszterin oldallánc-hasítási reakciót NADPH és ADR jelenlétében. A reakcióelegy a következő oldatokból áll:
A oldat (természetes P450SCC elektrondonor-rendszer ADX nélkül): 3 mM EDTA-t, 2 pM adrenodoxinreduktáz (szarvasmarha-mellékvesekéregből tisztítva), mM NADPH-t (elektrondonor), 15 mM glükóz-6foszfátot és 16 egység/ml glükóz-6-foszfát dehidrogenázt (NADPH regeneráló-rendszer) tartalmazó 50 mM kálium-foszfát-puffer (pH=7,0).
B oldat (szubsztrátum): 37,5 pM összmennyiségben kettős radioizotópos jelölésű koleszterinrészecskéket {[26,27-14C] koleszterin (40 Ci/mol) és [7a-3H] koleszterin (400 Ci/mol)} tartalmazó 10% (térfogat/térfogat) Tergitol™-tartalmú NP40/etanol (1:1, térfogat/térfogat) oldat.
A vizsgálatot úgy kezdjük, hogy összekeverünk 75 pl A oldatot, 50 pl B oldatot és 125 pl sejtmentes kivonatot. Az elegyet óvatosan kevertetjük 30 °C-on. Hatvan perc inkubálás után mintákat veszünk, melyeket 100 pl vízzel felhígítunk. Egy mintából 100 pl metanollal és 15 pl kloroformmal extraháljuk a szubsztrátumot és a terméket (termékeket). Centrifugálás (5000 g, perc) után a kloroformréteget levesszük és szárítjuk. A száraz maradékot 50 pl acetonban oldjuk fel, amely 0,5 mg szteroidkeveréket [koleszterin, pregnenolon és
HU 218 111 Β progeszteron (1:1:1 tömegarány)] tartalmaz, és ezután 110 μΐ koncentrált hangyasavat adunk a reakcióelegyhez.
A szuszpenziót 15 percig 120 °C-on melegítjük. Ezután meghatározzuk a ,4C/3H viszonyt kettős jelölésű folyadékszcintillációs számlálással. Az arányszám az oldallánc-hasítási reakció közvetlen mértékét adja meg, mivel a 14C-vel jelzett oldallánc izokaprilsav formájában elpárolog a keverékből a melegítés során.
Ezzel a vizsgálattal a K. lactis SCC/ADX-101 sejtmentes kivonatában oldallánc-hasítási aktivitást mutattunk ki, míg a K. lactis SCC-101 sejtmentes kivonatában nem volt észlelhető aktivitás.
HPLC-analízissel kimutattuk, hogy a K. lactis SCC/ADX-101 sejtmentes kivonata által produkált reakciótermék pregnenolon.
29. példa
A szarvasmarha P450 szteroid-17a-hidroxilázt és a szarvasmarha-citokróm P450 szteroid C21-hidroxilázt kódoló expressziós kazetta szerkesztése Kluyveromyces lactis élesztősejtben és transzformálás
a) Az expressziós kazetta szerkesztése
A pGB17a-5 expressziós kazettát (24. ábra) - amelyet a 14. példában írunk le - SacII-vel és részlegesen HindlII-mal (<1 egység/pg DNS, 1 óra) emésztjük, majd a ragadós végeket Klenow DNS-polimeráz segítségével töltjük fel. Azt a DNS-fragmentumot, amely a laktázpromoter egy részét, a P45()17a kódolószekvenciáját és a laktázterminátort tartalmazza, agarózgélelektroforézissel választjuk el és izoláljuk, ezután beépítjük a pGBC21-9-be (35. ábra) - leírását lásd a 14. példában -, amelyet először Xbal-gyel való emésztéssel linearizáltunk, majd ragadós végeit Klenow DNS-polimeráz segítségével töltöttük be. A kapott pGB17a/C21-l expressziós kazettában (54. ábra) egyetlen SacII restrikciós hely van, mivel a P450 1 7ahoz kapcsolódó laktázpromoterben lévő SacII restrikciós hely a betöltési reakció következtében megszűnt.
b) A K. lactis transzformálása
A K. lactis CBS2360 transzformálását az 5. c) példában leírtak szerint végezzük el 15 pg pGB17a/21-lgyel, melyet előzőleg egyetlen SacII restrikciós helyénél linearizáltunk. Az egyik transzformált sejtet, a 17a/C21 -101 jelű sejtet tovább analizáltuk, hogy meghatározzuk P450 1 7a és P450C21 aktivitását in vitro és in vivő (lásd a 30. és 31. példát).
30. példa
Kluyveromyces lactis 17a/C21-101 sejtekből izolált P45t,17 és P45OC21 in vitro aktivitása
A 29. példa szerint kapott K. lactis 17a/C21 -101 sejteket, a 14. példában leírt K. lactis 17a-101 sejteket és a K. lactis CBS2360 sejteket 100 ml D táptalajban tenyésztjük.
A D táptalaj összetétele 1 liter desztillált vízben: Élesztőkivonat (Difco) 10 g
Bacton pepton (Oxoid) 20 g
Glükóz 20 g pH=6,5
Sterilizálás és 30 °C-ra való hűtés után 1 ml desztillált vízben feloldott (membránszűréssel sterilizált) 25 mg geneticint (G418-szulfát, Gibco Ltd.) adunk a táptalajhoz.
A sejteket 72 órán át 30 °C-on tenyésztjük, majd centrifugálással (4000 g, 15 perc) gyűjtjük össze. Az üledéket foszfátpufferrel (50 mM, pH = 7,0) mossuk, és a sejteket centrifugáljuk (4000 g, 15 perc). Az üledéket foszfátpufferben (50 mM, pH = 7,0) felvéve a kapott szuszpenzió tartalma 0,5 g nedves tömeg/ml. A szuszpenziót ultrahanggal (Braun Labsonic 1510, 12 χ 1 perc, 50 watt) tárjuk fel. A nem roncsolt sejteket centrifugálással (12 000 g, 15 perc) távolítjuk el.
A sejtmentes kivonatokat P45017a-aktivitásra és R450C21-aktivitásra vizsgáljuk úgy, hogy meghatározzuk a 17a,21-dihidroxi-progeszteron-termelést NADPH jelenlétében. A reakciókeverék a következő oldatokból áll:
A oldat 50 mM kálium-foszfát-puffer (pH=7,0), mely 3 mM EDTA-t, 2 mM NADPH-t, 50 mM glükóz6-foszfátot és 16 egység/ml glükóz-6-foszfát-dehidrogenázt (NADPH regeneráló-rendszer) tartalmaz.
B oldat (szubsztrátum): 80 pM [4-l4C] progeszteron (30 Ci/mol) részecskéket tartalmazó oldat, mely 10% (térfogat/térfogat) Tergiton NP40/etanol (1:1, térfogat/térfogat) elegyet tartalmaz kálium-foszfát-pufferben (75 mM, pH=7,5).
A vizsgálatot úgy kezdjük meg, hogy 75 pl A oldathoz hozzákeverünk 125 pl B oldatot és 125 pl sejtmentes kivonatot. Az elegyet óvatosan keverjük 30 °C-on. Mintákat (50 pl) veszünk 60 perces inkubálás után. A mintákat 100 pl metanol és 50 pl kloroform keverékéhez adjuk hozzá. A kloroformos fázist centrifugálással (5000 g, 2 perc) választjuk el, és a víz-metanol réteget újra extraháljuk 100 pl kloroformmal. A két klorofoimos réteget egyesítjük és szárítjuk. A száraz maradékot 100 pl acetonitril/H2O (9:1, térfogat/térfogat) elegyben oldjuk fel és HPLC-oszlopról (Chrompack LIchr. 10RP18, 250x4,6 mm) 50 pl-es mintákat eluálunk acetonitril/H2O (58:42, térfogat/térfogat) elegyével. Az eluátumban lévő szteroidszubsztrátumot és a terméket folyadékszcintillációs számláló és UV-detektor segítségével mutatjuk ki. A gyűjtött frakciók radioaktivitását folyadékszcintillációs számlálással határozzuk meg.
Ezzel a vizsgálómódszerrel megállapítottuk, hogy a K. lactis 17a/C21-101 eredetű sejtmentes kivonat 17a,21- dihidroxi-progeszteront termelt, ugyanakkor a K. lactis 17a-101 és K. lactis CBS2360 eredetű sejtmentes kivonatok ezt a vegyületet nem termelték. A K. lactis 17a-101 terméke a 17a-hidroxi-progeszteron.
példa
A P43ol 7a és P45nC21 in vivő aktivitása Kluyveromyces lactis 17a/C21-101 sejtben
A 29. példában leírtak szerint kapott K. lactis 17a/C21-101 sejtekkel és K. lactis CBS2360 sejtekkel beoltunk 25 ml D táptalajt.
HU218 111 Β
A D táptalaj összetétele 1 liter desztillált vízben: Élesztőkivonat (Difco) 10 g
Bacto pepton (Oxoid) 20 g
Glükóz 20 g pH=6,5
Sterilizálás és 30 °C-ra való hűtés után membránszűréssel sterilizált 1 ml desztillált vízben feloldott 25 mg geneticint adunk 1 liter D táptalajhoz.
Ezután [4-l4C] progeszteronszubsztrátum oldatából 100 μΐ-t adunk 25 ml kiegészített táptalajhoz. A szubsztrátumoldat ml-enként 800 pg [4-14C] progeszteront (8 Ci/mol) tartalmaz 10%-os (térfogat/térfogat) Tergitol™NP40/etanol (1:1, térfogat/térfogat) elegyében.
A sejteket 30 °C-on, rotációs rázógépen (240 fordulat/perc) tenyésztjük, majd a 0. és a 68. órában 2 ml-es mintákat veszünk. A mintákat 2 ml metanollal keverjük el. Az extrakciót 4 °C-on 24 órán át végezzük, és ezután a mintákat lecentrifugáljuk (4000 g, 15 perc). Az itt kapott felülúszóminták 200 μΐ-ét HPLC-oszlopról (Chrompack Lichr. 10 RP18, 250x4,6 mm) acetonitril/H2O (52:42, térfogat/térfogat) elegyével eluáljuk.
Az eluátumban a szteroidszubsztrátumot és a termékeket detektáljuk. A leoldott frakciók radioaktivitását folyadékszcintillációs számlálóval határozzuk meg. A K. lactis 17a/C21-101 68 órás tenyészetéből kapott egyik frakcióban világosan ki lehetett mutatni a 17a,21-dihidroxi-progeszteron jelenlétét, ugyanakkor ez a vegyület nem termelődött a kontroll K.. lactis CBS2360 törzs tenyészetében.
32. példa
A humán 3P-HSD-t kódoló expressziós kazetta szerkesztése, transzformálása és kifejezése Saccharomyces cerevisiae élesztőben.
A 3p-hidroxi-szteroid-5-én dehidrogenáz és szteroid-5-én-4-én izomeráz (3p~HSD) bifunkciós enzim, amely pregnenolont progeszteronná átalakító két független reakciót katalizál. A 42 kD molekulatömegű proteint egyetlen nyitott leolvasási keret kódolja. cDNSeket és/vagy géneket emberből [J. Bioi. Chem.,
265, 20 469-20 475 (1990); DNA Cell Bioi., 10, 701-711 (1991)], szarvasmarhából [FEBS Lett., 259, 153-157 (1989)] és patkányból [J. Bioi. Chem.,
266, 583-593 (1990); J. Bioi. Chem., 266, 14 842-14 845 (1991)] klónoztak. A meghatározott Nteiminális rész megfelel a kikövetkeztetett aminosavszekvenciának. Emberben két típust írtak el: az I. típusú 3p-HSD-t méhlepényből izolálták és a bőrben is kifejeződik; a II. típusú 3P-HSD-t mellékveséből és nemi mirigyekből izolálták. Az 1 -4. exonok közötti homológia 77,1%, 91,8%, 94%, illetve 94%, az aminosavszinten pedig 94%. A megfelelő cDNS-ek HeLa sejtekben való kifejezése után azt találták, hogy az I. típusú enzim aktívabb (V^/K^,) pregnenolonra, dehidroepiandroszteronra (DHEA) és dihidrotesztoszteronra (DHT). Ez elsődlegesen az alacsonyabb Km - például pregnenolonra 0,24 1,2 μΜ-nál - következménye. A 3P-HSD enzimek még a mitokondriális célzószekvencia távollétében is membránasszociált proteinekként ismertek, amelyek mikroszomális, valamint mitokondriális membránokban találhatók.
- Anyagok és módszerek
A GÁL 10/CYC1 promoter esetében: értelmes (sense) primer: OTG4535;
CCATCGATGGGCTTCGCTGATTAATTATCCCCAGAAATAAGGC reverz primer:
ACCCGGGGTCGACTAATTTATGCTACAAAGGACCTAATG
- Adapterek új BamHl-SstI polilinker bevitele
OTG2792: GATCCGCAGATATCATCTAGATCCCGGGTAGAT OTG2794: CTTGAGCTCTACGCAGCTGGTCGACACCTAGGAG OTG2795: AATTCTCCTAGGTGTCGACCAGCTGCGT
Mlul/Avrll polilinker bevitele:
OTG2919: CAACGCGTCCTAGG OTG2920: AATTCCTAGGACGCGTTGAGCT
SnaBI/NotI polilinker bevitele:
OTG2793: AATTGCGGCCGCGTACGTATG és OTG2796: AATTCATACGTACGCGGCCGC
Piac promoter deléciója:
OTG4470: GGCCGCAAAACCAAA OTG4471: AGCTTTTGGTTTTGC
Notl/Clal helyek bevitele:
OTG4478: GATCTATCGATGCGGCCGCG 55
OTG4479: CGCGCGCGGCCGCATCGATA Miül helyek bevitele:
EcoRI-be: OTG4539: AATTGGACGCGTCC Xhol-be: OTG4433: TCGACGGACGCGTGG
OTG4434: TCGACCACGCGTCC
Oligonukleotidok helyre irányuló mutagenezishez:
NotI lacl-be
OTG2 8 0 5:GCGCTCAGCGGCCGCTTTCCAGTCG
HU218 111 Β lacZ-szekvenciák csökkentése:
OTG4431:TGGCCGTCGTTTTACTCCTGCGCCTGATGCGGTAT Xhol/Mlul eltávolítása:
OTG4410:GCGGATCTGCTCGAAGATTGCCTGCGCGTTGGGCTTGATC
Eredmények
1. Új polilinkerhelyekkel rendelkező pUC-származékok előállítása
M13mpl9-et [Gene, 33, 103-119 (1985)] mutagenizálunk OTG2805-tel, és egy NotI helyet viszünk be a 10 lacl gén megmaradó szekvenciájába (M13TG724). Utána egy EcoRI, SnaBI és NotI helyeket tartalmazó polilinkert (OTG2793, OTG2796) viszünk be az M13TG724 EcoRI helyére. A klónozási lépés alatt azonban az inszertum multiplikációja és módosulása 15 fordul elő. A kapott M13TG7244 szekvenciája a következő: GAATTCATACGTACGCGGCCGCAATT GCGGCCGGTACGTATAATTCACTGGCCGT.
A szekvenciával kapcsolatban megjegyzendő, hogy az EcoRI, SnaBI és NotI helyeket aláhúzás jelöli, míg a 20 pUC19 lacZ-szekvenciáját (az utolsó 10 bázist) vastagított betűk jelölik.
Az M13TG7244-et EcoRI-gyel és Sstl-gyel hasítjuk, és az OTG2919 és OTG2920 felhasználásával egy linkért viszünk be, így az M13TG7246-ot kapjuk. Ez a 25 linker Miül és AvrII hasítási helyeket biztosít. Egy, az M13TG7246 megfelelő restrikciós helyeit tartalmazó PvuII fragmentumot szubklónozunk pUC 19-be, így a pTG7457-hez (lásd 41. ábra) jutunk.
PUC19-et [Gene, 33, 103-119 (1985)] emésztünk 30 BamHI és EcoRI restrikciós enzimekkel, és OTG2792, OTG2797, OTG2794 és OTG2795 használatával egy polilinkert viszünk be, így a pTG7453-hoz jutunk (43. ábra).
A terminátorok szubklónozása 35
PGK terminátor
A pTG7453 BamHI és SstI hasítási helyei között lévő polilinker hasítási helyeket bevisszük egy pTG7457 származékba, és az új plazmidot BglII-vei és HindlII-mal hasítjuk, és egy, a PGK terminátort [Nuc- 40 leic Acids Rés., 10, 7791-7808 (1982)] tartalmazó, hasonlóképpen hasított fragmentumot klónozunk bele. Az új plazmidot pTG 10014-nek nevezzük (lásd a 44. ábrát). A pTG10014-et Clal-gyel hasítjuk, és a ragadós végeket Klenow-polimerázzal feltöltve a pTG 10015-höz 45 jutunk.
A promoterek szubklónozása a) A CYC1 promoter
A pTG7453 BamHI és SstI hasítási helyei között lévő polilinker hasítási helyeket bevisszük egy 50 pTG7457 származékba, és az új plazmidot SnaBI-gyel felnyitjuk, majd a pEMBL8-nak [Nucleic Acids Rés.,
11, 1654-1655 (1983)] az fi fág replikációs origóját tartalmazó, 456 nukleotid hosszúságú Rsal/Dral fragmentumának bevitelével a pTG7503-hoz jutunk. 55
A 6. példa szerint előállított pGBSCC-9-nek egy, a Saccharomyces cerevisiae CYC1 promoterét tartalmazó 0,78 kb méretű BamHI/HindlII fragmentumát pTG7503-ban szubklónozva jutunk a pTG10004-hez (lásd a 44. ábrát). 60
A CYC1 promoter Xhol és Miül hasítási helyeit a pTG 10004 ssDNS-én OTG4410 alkalmazásával végzett helyre irányuló mutagenezissel elimináljuk. A kapott pTG 10005 plazmidot Sall-gyel és Xhol-gyel emésztjük, és egy Miül hasítási helyet viszünk be OTG4433 és OTG4434 használatával, így a pTG 10006-hoz jutunk, b) A GÁL 10/CYC1 promoter:
A pYeDPl/8-2 plazmidot [Gene, 65, 203-217 (1988)] Xhol-gyel felnyitjuk, a ragadós végeket Klenow-polimerázzal feltöltjük, és a plazmidot religáljuk. A kapott pTGIOOlO-ben a GAL10/CYC1 promoter nem tartalmazza az Xhol hasítási helyet, és ez a plazmid szolgál templátként egy PCR-sokszorozáshoz.
2. Az expressziós vektorok szerkesztése
Az expressziós vektorok egy (az élesztő CYC1 génből származó) erős élesztőpromotert vagy egy szabályozott promotert (egy GAL10/CYC1 hibridet, amely a CYC1 és GAL10 élesztőgénekből származik) és egy PGK transzkripciós terminátort tartalmaznak. Az élesztőben működő expressziós szignálok NotI expressziós kazettákon vannak. A plazmidokból, amelyek az expressziós kazettákat tartalmazzák, hiányzik az élesztőreplikon, tartalmazzák a DNS-szekvenálásnál és -mutagenezisnél sok előnyt nyújtó FI fág replikációs origót.
A pTG7503-ban a megmaradt lacZ kódolószekvencia részét OTG4431 alkalmazásával végzett helyre irányuló mutagenezissel eliminálva a pTG7549-hez jutunk. A pTG7549-ben meglévő lacZ promotert OTG4470 és OTG4471 alkalmazásával töröljük, amelyeket egy Notl/HindlII restrikció után inszertálunk, helyreállítva mindkét hasítási helyet. Az új szerkezetet pTG7553-nak nevezzük el.
A pTG 10006 egy BamHI/MluI fragmentumát (amely a CYC1 promotert tartalmazza) és a pTG10015 egy MluI/HindlII fragmentumát (amely a PGK terminátort tartalmazza) ligáljuk egymással. A ligációs anyagot utána előzetesen Miül és HindlII restrikciós enzimekkel emésztett pTG7553-hoz adjuk. Végül OTG4479-cel hibridizált OTG4478-at (Clal/NotI hasítási helyeket tartalmazó BamHI/MluI linkerek) adunk hozzá és ligáljuk egymással. A kapott plazmidot pTG 10031-nek nevezzük (lásd a 45. ábrát).
A pYeDP 1/8-2-vel kapott PCR-sokszorozott fragmentumot Clal-gyel és Sall-gyel emésztjük, és ugyanezen enzimekkel emésztett pTG 10031-be visszük be, így a pTG 10033-hoz jutunk (lásd a 46. ábrát).
3. Az alapvektor szerkesztése
Az alapvektorok a 2 μιη-es episzómának a replikációt és az élesztőben való kiválasztást lehetővé tevő fragmentumát és egy, a ColEl replikációs origót tartalmazó E. coli replikont, egy szelekciós markert (ampiciHinnél szembeni rezisztenciát) és az FI fág replikációs origóját tartalmazzák. Az élesztő szelekciós markért mindegyik alapvektor a két lehetséges orientáció egyikében tartalmazza.
HU 218 111 Β pTG3828-at [Gene, 110, 25-31 (1992)] emésztünk BglII-vel és BamHI-gyel és bevisszük pPOLYIII-nak [Gene, 57, 193-201 (1987)] egy, a BglII/BamHI hasítási helyeket fedő szegmensét. Azt az orientációt választjuk, amelyben elvesznek a BglII és BamHI hasítási helyek (pTG10012). A pTG10012-t Notl-gyel és EcoRIgyel hasítjuk, és a pTG7549 nagy EcoRI/NotI fragmentumához ligáljuk, így a pTG 10013 keletkezik (lásd a 47. ábrát). Az ezen a plazmidon lévő URA3-D fragmentum Hindin hasítási helyekkel van határolva.
4. A rekombinációs vektorok szerkesztése
Az előbbiekben leírt élesztőpromoterek egyikét (a két lehetséges orientáció egyikében) és egy terminátort tartalmazó expressziós kazettának egy bázisvektorba való inszertálása eredményez egy rekombinációs vektort.
A CYC1 vagy a GAL10/CYC1 promotert és a PGK. terminátort tartalmazó Notl kazettákat az URA3-d gént tartalmazó vektorokba szubklónozzuk mindkét irányban, így a pTG 10041-10042, illetve a pTG 10045-10046 vektorokhoz jutunk:
pTG 10013-at hasítunk Notl-gyel és a pTG 10031 expressziós blokkját tartalmazó Notl fragmentumokat ligálunk bele két irányban, így a pTG10041 (48. ábra) és a pTG 10042 (49. ábra) plazmidokat kapjuk.
Hasonlóképpen kapjuk a pTG 10045 (50. ábra) és a pTG10046 (51. ábra) plazmidokat pTG10033-ból és pTG 10013-ból.
5. Transzfer vektorok szerkesztése
A transzfer vektorok olyan vektorok, amelyek a cDNS-eket az expressziós vektor expressziós kazettájába klónozva tartalmazzák. Az ilyen vektorokból hiányzik az élesztőreplikon is.
Az I. típusú humán 33-HSD-t kódoló cDNS a pT7T3 vektor EcoRI hasítási helyein belül is található. A kódolószekvencia megfelel a V. Luu The és munkatársai által korábban közölt [Mól. Endocrinol., 3, 1310-1312 (1989)] szekvenciának, azzal az eltéréssel, hogy az 5’-vég egy további GGG triplettet tartalmaz. Ezt a plazmidot módosítottuk, hogy lehetővé váljon a mi expressziós vektorainkban való közvetlen klónozás.
Először egy Miül hasítási helyet tartalmazó linkért (OTG4539) viszünk be a pTG 10036 részleges EcoRI emésztése után a kódolószekvencia 3’-végére. A pTG10036 EcoRI hasítási helyét mung-bab (mung bean) nukleázzal kezeljük, és a kapott DNS-t Mlul-gyel emésztjük. Másrészt egy 1,7 kb méretű Sall/Mlul inszertumot klónozunk a pTG 10031 Sall/Mlul hasítási helyeire. A kapott pTG10058 (amely a CYC1 promotert tartalmazza) Sáli helyét Klenow-polimerázzal feltöltjük, és a keletkező plazmidot Mlul-gyel emésztjük. Ezen fragmentumok ligálásával jutunk a pTG 10064 plazmidhoz (52. ábra), amely a 3[3-HSD kódolószekvenciáját Sáli és Miül hasítási helyekkel határolva tartalmazza. A pTG 10064-ből kapott Sall/Mlul fragmentumot pTG 10033-ba szubklónozva kapjuk a pTG10065-öt (lásd az 53. ábrát; a 3p-HSD a GAL10/CYC1 ellenőrzése alatt).
6. 3(3-HSD kifejezése S. cerevisiae-ben
Az ebben a kísérletben modelltörzsként használt törzs a W303-1B [Λ/47α, +, ura3—l, leu2-3, -112, his3-ll, -15, trpl—1, ade2—l, canR(?), cyr+(?)] törzs [J. Bioi. Chem., 263, 14 323-14 333 (1988)]. A W303-1B törzs auxotróf uracilra, leucinra, hisztidinre, triptofánra, adeninre és rezisztens kanavaninra.
a) Élesztő-E. coli ingázó (shuttle) vektor szerkesztése a 3P-HSD kifejezéséhez
A kívánt expressziós plazmid összeállítása rekombinációs vektorok használatával in vivő rekombináció útján végezhető. Az élesztőt elektrokompetenssé tesszük, és 100 ng (Sall-gyel és Mlul-gyel hasított) pTG 10042 és (Notl-gyel hasított) pTG10065 használatával transzformáljuk. Elektroporáció után a sejteket adenint, triptofánt, leucint, hisztidint tartalmazó, de uracilt nem tartalmazó szelektív YNBG táptalajon szélesztjük. 3-4 nap növekedés után a telepeket ugyanezen a táptalajon tisztítjuk.
SCREP pTG10201 plazmidokat (PromCKC/-3pHSD-PGWterm) törzsben (W303-1B) kapunk. Az utóbbi SCREP-et a GAL10/CYC1 promoter és a CYC1 promoter közötti rekombinációval kapjuk, helyreállítva a GYC1 promotert.
(SCREP a Saccharomyces cerevisiae rekombináns expressziós plazmid rövidítése, és egy olyan rekombináns vektort jelöl, amely in vivő rekombinációval kapott egy cDNS-t tartalmazó expressziós kazettát.)
b) 3P-HSD antigén detektálása élesztőben Western blotting segítségével
Antitestek
A humán 3P-HSD elleni nyúl anti-3p antitestet használjuk [Mól. Endocrinol., 3, 1310-1312 (1989)].
Western blotting
A Western blotting kivitelezését az irodalomban leírtak szerint [Gene, 118, 47-53 (1992)] végezzük, azzal az eltéréssel, hogy anti-33-HSD antitesteket használunk.
c) Szerkezeti vizsgálat
A szerkezeti vizsgálatot SCREP pTG 1020l-gyel (CTC7+3p-HSD) transzformált W3O3-1B törzsön végeztük. A sejteket szétválasztjuk Cullin és Pompon módszere szerint [Gene, 65, 203-217 (1988)] citoszolra, mitokondriumokra és mikroszómákra. Western biot vizsgálatokat és aktivitási méréseket végzünk a transzformálatlan és két transzformált törzsön. A kontrollt (transzformálatlan törzs) teljesen negatívnak találtuk. A többi törzs esetében az aktivitás legnagyobb részét a mitokondriális és a mikroszomális frakciókban találtuk. Ezeket az eredményeket megerősítette a Western biot is, mutatva a kifejezett géntermék helyes méretét.
d) 3p-HSD in vitro aktivitása minimáltáptalajban végzett indukció és sejtfrakcionálás után
A sejteket kazaminosavakkal (0,5%) és triptofánnal, továbbá adeninnel, hisztidinnel és leucinnal kiegészített YBNG táptalajon addig növesztjük, amíg a 600 nm-nél mért optikai denzitás 2 és 5 közötti értékel ér el. A sejtek centrifugálással való learatása után Cullin és Pompon előbb említett módszere [Gene, 65, 203-217 (1988)] szerint mikroszómákat preparálunk. A 3 β-HSD-akti vitást Bauer és Bauer módszerével [J. Steroid Biochem., 33, 643-646 (1989)] mérjük.
HU218 111 Β
A mikroszómákat 50 mM trisz-HCl-t (pH=7,4), 2 mM EDTA-t, 20% glicerint tartalmazó oldatban szuszpendáljuk, és felhasználásig -20 °C-on tároljuk. A proteinkoncentráció 3,75 mg/ml. Az aktivitást DPBS+BSA (0,175 ml)+pregnenolont (0,005 ml, 1 pCi=40 nmol/ml) és csövenként 19 pg mikroszomális extraktumot tartalmazó elegyben mérjük.
A reakciót 10 mM NAD (0,015 pl) hozzáadásával indítjuk, és 37 °C-on 60 percig folytatjuk. Kontrollként olyan oldatokat használunk, amelyekben a reakciót a szubsztrátnak a teljes reakcióelegyhez való hozzáadása után (t=Oh) vagy az NAD-ot nem tartalmazó reakcióelegyhez való hozzáadása után (t=0h-NAD) azonnal leállítjuk.
A 3p-HSD in vitro aktivitását radioaktív pregnenolon alkalmazásával mérjük. A 37 °C-on végzett inkubálás után a pregnenolon főtömegét digitoninnal kicsapjuk, és az oldható terméket (progeszteron) szcintillációs számlálóval mérjük. A W303-lB/pTG10201 (ΟΎ7 + 3β-HSD) egy mikroszomális frakciója mutatott aktivitást csak NAD jelenlétében.
A 3p-HSD-aktivitás NAD-függése
t=0h-(t=0h-NAD) 60’-(t=0h-NAD)
+NAD 17 000 463 000
-NAD 0 0
Mértünk aktivitást sejtfrakcionálás után is (lásd előbb). Az aktivitást DPBS+BSA (0,077 ml)+pregnenolon (0,002 ml, 1 pCi=40 nmol/ml)+NAD (0,010 pl, 10 mM) és csövenként 7 pg citosol extraktumot, 9 pg mitokondriális extraktumot és 6 pg mikroszomális extraktumot tartalmazó elegyben mértük.
W3O3 Nettó CPM/157ug
Citoszol 213
Mikrokondriumok 297
Mikroszómák 178
W303/pTG 10201 (CYC1 prom, 3 β-HSD, PGK. terminátor) Százalék
Citoszol 6 577 9,7%
Mitokondriumok 42 308 62,7%
Mikroszómák 18 590 27,5%
Az aktivitásmérések jól egyeznek a Western biot eredményeivel: aktivitást a mitokondriális és a mikroszomális frakciókban találtunk. Nem volt aktivitás sem a citoszolban, sem pedig transzformálatlan élesztőből kapott bármely frakcióban. A pregnenolon progeszteronná való konverzióját 15 perc 37 °C-on végzett inkubálás során 0,8 pM oldatban a következőkben felsorolt frakciók 1 pg mennyiségeinek jelenlétében mérve a következő eredményeket kaptuk: mitokondriumok, 60% konverzió; mikroszómák, 15% konverzió; citoszol, 3% konverzió. A reakció nem lineáris az idővel, de ezt a kérdést tovább nem vizsgáltuk.
A pregnenolon progeszterinné való konverzióját in vivő is bemutattuk (lásd alább),
e) 3P-HSD in vivő aktivitása
Pregnenolon biokonverziója progeszteronná
Transzformált élesztősejteket tenyésztünk 100 pg/ml pregnenolon jelenlétében, és a mintákat extraháljuk és fordított fázisú HPLC-vel analizáljuk progeszteronná való átalakításra. Az eredmények progeszteronnak a transzformált élesztő tenyészetében való felhalmozódását mutatják. A pregnenolon 15%-a alakul át progeszteronná 2 nap alatt.
33. példa
33.1. Humán 3ft-HSD-t és szarvasmarha P4Sn17a-t (szteroid-17a-hidroxilázt) kódoló expressziós kazetta szerkesztése, transzformálása és kifejezése Saccharomyces cerevisiae-ben.
a) A szarvasmarha P45017a-t kódoló cDNS szubklónozása:
A 14. példában leírtak szerint előállított pGB17a-5 plazmidban (24. ábra) lévő, a szarvasmarha P4501 7a-t kódoló cDNS-t Sall/Mlul restrikciós fragmensre átalakítjuk egy Miül hasítási helynek a vektor Xhol helyére való bevitelével. A Sall/Mlul fragmentumot a pTG10031-be (lásd 45. ábra) szubklónozzuk a CYC1 promoter irányítása alá. Ezt a vektort pTG 10058-nak nevezzük el.
b) Az I. típusú humán 3P-HSD szubklónozása
Az I. típusú humán 3p-HSD-t a GallO/CYCl irányítása alatt kódoló cDNS-t tartalmazó pTG 10065 vektort (53. ábra) a 32. példa 5. pontja szerint kapjuk.
33.2. Élesztő-E. coli ingázóvektor szerkesztése I. típusú humán 33-HSD és szarvasmarha P450l 7a kifejezésére
A kívánt expressziós plazmid összeállítása rekombinációs vektorokat használva in vivő rekombinációval elvégezhető. A CYClprom-PGKterm-et és a szarvasmarha P45()17a-t vagy I. típusú humán 3p-HSD-t kódoló cDNS-t tartalmazó plazmidokat használunk. Ezeket LEU2-vel vagy URA3-d-vel mint szelekciós markerekkel kapcsoljuk. Az élesztő 2 pm-t, egy replikont, egy CYClprom-PGKterm-et tartalmazó expressziós kazettát és az URA3-d-től vagy LEU2-től eltérő szelekciós markért tartalmazó rekombináns vektorokat (pTG10259, illetve pTG 10260) állítunk elő.
A pTG 10259 csaknem azonos az előbbiekben leírt pTG 10042 rekombináns vektorral (49. ábra), azzal az eltéréssel, hogy a 2 pm régióban lévő egyetlen Xbal hasítási helyet egy Klenow-polimerázzal való feltöltéssel és religálással kapott Xbal hasítási hellyel helyettesítjük.
A LEU2-t tartalmazó rekombináns vektort a következőképpen szerkesztjük. Egy olyan plazmidba, amely LEU2 géneket tartalmaz (Genbank locus YSCLEU2, letéti szám: J01333) HindlII hasítási helyeket viszünk be (OTG4464: CACAAGCTTGTG-t használva adapterként az YSCLEU2-ben a 241. helyzetben lévő) Hpal és (adapterként OTG4463: TCGAGGGAAGCT-t használva az YSCLEU2-ben a 2213. helyzetben lévő) Sáli hasítási helyekre. A HindlII fragmentumot HindlII-mal
HU 218 111 Β hasított és foszfatázzal kezelt pTG10013-ba (47. ábra) klónozzuk. Ez mindkét orientációban végbemegy, és a pTG 10023 és pTG10024-et kapjuk. A pTG 10023-ba a pTG 10031 expressziós blokkot tartalmazó NotI fragmentumot (lásd a 45. ábrát) szubklónozva kapjuk a pTG10158-at. A szelekciós marker és az expressziós blokk orientációja a pTGIOl58-ban hasonló ahhoz, ahogy a pTG 10042-ben (lásd 49. ábra) vannak jelen. A pTGIOl58-ból a 2 pm régióban lévő egyetlen Xbal hasítási helynek az előbb leírtakhoz hasonlóan végzett egyszerű eliminálásával kapjuk a pTG10260-at. Ezután bevisszük a pTG10065-ből (I. típusú humán 3P*HSD) és a pTG 1005 8-ból (szarvasmarha Ρ45θ17α) származó expressziós blokkokat, így kapjuk a pTG 10261 és pTG 10269 végső expressziós plazmidokat.
33.3. Saccharomyces cerevisiae transzformálása
A W303-1B törzset transzformáljuk a Lauermann, V. által leírt transzformációs módszer [Curr. Genetics, 20, 1-3 (1991)] felhasználásával. Az intakt élesztősejtek transzformálásának hatásosságát etanol fokozza. Az élesztősejtek transzformálását 1 pg pTG 10261 + pTG10269 felhasználásával hajtjuk végre (carrier DNSt nem használunk). Transzformálás és agarlemezeken (amelyek YNBG+0,01% kazaminosav+WAH vagy YNBG+0,01% kazaminosav+WAHL tartalmúak) való szélesztés után a megfelelő törzseket szelektív táptalajon válogatjuk ki. A szelekciót YNBG+0,01% kazaminosav+WAH tartalmú táptalajon végezzük. (A rövidítések jelentése: W=Trp, A=adenin, H=His, L=Leu.)
PCR-t használunk a szelektív marker és a vele aszszociált cDNS egyidejű jelenlétének biztosítására.
33.4. P4501 7a és 33-HSD in vivő aktivitása Saccharomyces cerevisiae-ben
Biokonverziót mérünk 100 pg/ml pregnenolonnak a sejtekkel YNB+glicerin+WAH táptalajon 30 °C-on végzett inkubálásával. Mintákat veszünk 2 nap múlva, majd extraháljuk és RP-HPLC-vel analizáljuk. A 17ahidroxi-progeszteronra (17OH-PROG) és progeszteronra (PROG) kapott értékeket különböző kiónokkal kapott két párhuzamos mérésből számítottuk. A következő eredményeket kaptuk:
W303-1B Termék Termék
PROG 17OH- PROG PROG 17OH PROG
pTG 10261 + pTG 10269 L6 3,2 0,6 4,6
A pregnenolon 17a-hidroxi-progeszteronná való biológiai átalakítását 3fi-HSD és P450 1 7a élesztőben való együttes kifejezésével érjük el.

Claims (13)

1. Eljárás rekombináns gazdasejtben működőképes olyan expressziós kazetta előállítására, amely a koleszterin hidrokortizonná való biológiai átalakítási folyamatának, azaz a koleszterin pregnenolonná, a pregnenolon progeszteronná, a progeszteron 17a-hidroxi-progeszteronná, a 17a-hidroxi-progeszteron kortexolonná, a kortexolon hidrokortizonná való átalakításának legalább két oxidációs lépését önmagában vagy egy vagy több további proteinnel együtt katalizálni képes proteineket, azaz a szteroid oldallánchasító enzim (P450SCC), adrenodoxin (ADX), adrenodoxin-reduktáz (ADR), 3p-hidroxi-szteroid-dehidrogenáz/izomeráz (3β-Η SD), szteroid-17a-hidroxiláz (P450l7a),
NADPH citokróm P450-reduktáz (RED), szteroid-21-hidroxiláz (P450C21) és szteroid-11 β-hidroxiláz (P45o 11 β) proteinek közül legalább két, előbb meghatározott oxidációs lépés katalizálására képes proteineket kódoló heterológ DNS-szekvenciát és az illető gazdasejtben működőképes megfelelő szabályozószekvenciákat tartalmaz, azzal jellemezve, hogy az illető oxidációs lépéseket katalizáló proteineket kódoló heterológ DNS-szakaszokat megfelelő szabályozószekvenciákkal ligáljuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás a pGB17a/C21-l expressziós kazetta előállítására, azzal jellemezve, hogy a P45017a és a P450C21 proteineket kódoló heterológ DNS-szekvenciákat megfelelő szabályozószekvenciákkal és a szükséges többi enzimet kódolószekvenciákkal ligáljuk.
3. Eljárás a koleszterin hidrokortizonná való biológiai átalakítási folyamatának egy vagy több oxidációs lépését, azaz a koleszterin pregnenolonná, a pregnenolon progeszteronná, a progeszteron 17a-hidroxi-progeszteronná, a 17a-hidroxi-progeszteron kortexolonná, a kortexolon hidrokortizonná való átalakításának legalább két oxidációs lépését önmagában vagy egy vagy több további proteinnel együtt katalizálni képes proteinek, azaz a szteroid oldallánchasító enzim (P450SCC), adrenodoxin (ADX), adrenodoxin-reduktáz (ADR), 3p-hidroxi-szteroid-dehidrogenáz/izomeráz ββ-HSD), szteroid-17α-hidroxiláz (P450 1 7a),
NADPH citokróm P450-reduktáz (RED), szteroid-21-hidroxiláz (P450C21) és szteroid-11 β-hidroxiláz (P45011 β) proteinek közül legalább két, előbb meghatározott oxidációs lépés katalizálására képes proteinek termelésére képes rekombináns gazdasejt előállítására, azzal jellemezve, hogy egy alkalmas gazdasejtet egy 1. igénypont szerint előállított expressziós kazettát működőképesen tartalmazó vektorral transzformálunk.
4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alkalmas gazdasejtet szarvasmarha eredetű kódoló heterológ DNS-szekvenciákat tartalmazó vektorral transzformáljuk.
HU218 111 Β
5. A 3. vagy 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alkalmas gazdasejtet legalább a Ρ45θ17α és a P450C21 proteineket kódoló heterológ DNS-szekvenciákat tartalmazó vektorral transzformáljuk.
6. A 3-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy alkalmas gazdasejtként egy mikroorganizmussejtet transzformálunk.
7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy Saccharomyces, Kluyveromyces, Bacillus vagy Escherichia coli törzsbe tartozó sejtet transzformálunk.
8. Eljárás a koleszterin hidrokortizonná való biológiai átalakítási folyamatának legalább két oxidációs lépését katalizáló proteinkeverék termelésére, azzal jellemezve, hogy egy 3. igénypont szerint előállított rekombináns sejtet alkalmas táptalajban a proteinkeverék kifejezéséhez megfelelő körülmények között tenyésztünk, és a felhalmozódott proteineket ismert módszerekkel kinyerjük a tenyészetből.
9. Eljárás egy kiválasztott szteroidvegyület in vitro legalább kétszeres szelektív oxidálására, azzal jellemezve, hogy az oxidálandó vegyületet a 8. igénypont szerint előállított, legalább két oxidációs lépés katalizálására képes proteineket tartalmazó proteinkeverékkel, a kívánt oxidáció végbemenetelére alkalmas körülmények között inkubáljuk, majd az inkubációs elegyből ismert mószerrel kinyerjük az oxidált terméket.
10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oxidálandó vegyületet a szteroid oldallánchasitása, a 3-hidroxi-5(6)-dehidroszteroid 3-oxo-4(5)-dehidroszteroiddá való oxidációja és izomerizációja, egy 17a-hidroxicsoport, egy 21-hidroxicsoport vagy egy 11 β-hidroxicsoport bevitele közül legalább két oxidációs lépés katalizálására képes proteineket tartalmazó proteinkeverékkel inkubáljuk.
11. Eljárás egy kiválasztott szteroidvegyület legalább kétszeres szelektív oxidálására, azzal jellemezve, hogy egy, a 3-7. igénypontok valamelyike szerint előállított rekombináns gazdasejtet az oxidálandó szteroid jelenlétében, a kívánt oxidációs lépések végbemenetelét biztosító körülmények között tenyésztünk, az oxidált terméket hagyjuk felhalmozódni a tenyészetben, majd onnan ismert módszerrel kinyerjük.
12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oxidálandó vegyület jelenlétében a szteroid oldallánchasítása, a 3-hidroxi-5(6)-dehídroszteroid 3-oxo-4(5)-dehidroszteroiddá való oxidációja és izomerizációja, egy 17a-hidroxicsöpört, egy 21hidroxicsoport vagy egy 11 β-hidroxicsoport bevitele közül legalább két oxidációs lépés katalizálására képes proteineket termelő rekombináns gazdasejtet tenyésztünk.
13. Eljárás hatóanyagként a 9-12. igénypontok bármelyike szerint előállított oxidált szteroidot tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy a hatóanyagot önmagában vagy adott esetben más hatóanyaggal és/vagy a gyógyszerkészítési technológiában szokásosan használt hordozóval, hígítóval és/vagy egyéb segédanyaggal keverjük, és a keveréket gyógyszerkészítménnyé formázzuk.
HU066/89A 1988-09-23 1989-09-25 Eljárás szteroidok többszörös oxidálására, valamint ehhez alkalmazható, genetikailag módosított sejtek HU218111B (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP88202080 1988-09-23
PCT/NL1989/000072 WO1990003428A1 (en) 1988-09-23 1989-09-25 Process for the multiple oxidation of steroids and genetically engineered cells to be used therefor

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT53393A HUT53393A (en) 1990-10-28
HU218111B true HU218111B (hu) 2000-06-28

Family

ID=8199859

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU066/89A HU218111B (hu) 1988-09-23 1989-09-25 Eljárás szteroidok többszörös oxidálására, valamint ehhez alkalmazható, genetikailag módosított sejtek

Country Status (14)

Country Link
EP (1) EP0360361A1 (hu)
JP (1) JPH03501445A (hu)
KR (1) KR900702029A (hu)
CN (1) CN1042567A (hu)
AU (1) AU638218B2 (hu)
CA (1) CA1340563C (hu)
DK (1) DK175631B1 (hu)
FI (1) FI101551B (hu)
HU (1) HU218111B (hu)
IE (1) IE71166B1 (hu)
IL (1) IL91762A (hu)
NZ (1) NZ230761A (hu)
PT (1) PT92543B (hu)
WO (1) WO1990003428A1 (hu)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5420027A (en) * 1991-01-10 1995-05-30 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for the expression of biologically active fusion proteins comprising a eukaryotic cytochrome P450 fused to a reductase in bacteria
US5240831A (en) * 1991-01-10 1993-08-31 Board Of Regents, The University Of Texas Methods and compositions for the expression of biologically active eukaryotic cytochrome p45os in bacteria
WO1993008260A1 (en) * 1991-10-22 1993-04-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Yeasts containing multiple mammalian cytochromes for degrading complex chemical mixtures
US5705400A (en) * 1992-03-07 1998-01-06 Rsr Limited Assay for adrenal autoantigen
GB2256046A (en) * 1992-07-31 1992-11-25 R S R Limited Assay for adrenal autoantibodies useful in the diagnosis of addison's disease
IL116872A (en) * 1995-02-15 2004-12-15 Aventis Pharma Sa Delta 5,7-Strol Reductase from Arbidopsis Thaliana
FR2812884B1 (fr) 2000-08-08 2002-11-08 Aventis Pharma Sa Levures modifiees et utilisations, notamment pour la production de derives steroidiens
FR2820145B1 (fr) * 2001-01-31 2004-01-23 Aventis Pharma Sa Souche de levure produisant des steroides de facon autonome
FR2976949B1 (fr) * 2011-06-21 2015-08-28 Sanofi Sa Procede de preparation de levures genetiquement transformees capables de produire une molecule d'interet a haut titre
WO2024131933A1 (en) * 2022-12-23 2024-06-27 Hangzhou Enhe Biotechnology Co., Ltd. Engineered microbes for production of progesterone and ursodeoxycholic acid by fermentation

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4720454A (en) * 1984-04-18 1988-01-19 White Perrin C Genetic probe used in the detection of adrenal hyperplasia
IL90207A (en) * 1988-05-06 1994-07-31 Roussel Uclaf Biochemical oxidation of steroids and genetically engineered cells to be used therefor

Also Published As

Publication number Publication date
EP0360361A1 (en) 1990-03-28
KR900702029A (ko) 1990-12-05
IL91762A (en) 1995-03-30
PT92543B (pt) 1996-10-31
NZ230761A (en) 1992-06-25
AU638218B2 (en) 1993-06-24
CN1042567A (zh) 1990-05-30
JPH03501445A (ja) 1991-04-04
FI101551B1 (fi) 1998-07-15
FI902024A0 (fi) 1990-04-23
DK175631B1 (da) 2004-12-27
AU4428289A (en) 1990-04-18
IE71166B1 (en) 1997-01-29
CA1340563C (en) 1999-05-25
HUT53393A (en) 1990-10-28
FI101551B (fi) 1998-07-15
IE893054L (en) 1990-03-23
DK108790A (da) 1990-05-02
IL91762A0 (en) 1990-06-10
PT92543A (pt) 1990-03-30
WO1990003428A1 (en) 1990-04-05
DK108790D0 (da) 1990-05-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Duport et al. Self-sufficient biosynthesis of pregnenolone and progesterone in engineered yeast
US7977065B2 (en) Yeast strains autonomously producing steroids
HU218111B (hu) Eljárás szteroidok többszörös oxidálására, valamint ehhez alkalmazható, genetikailag módosított sejtek
HU220587B1 (hu) A delta-7-Red elnevezésű A. thaliana fehérjét kódoló DNS-szekvencia, a delta-7-Red-fehérje, eljárás előállításukra, a szekvenciával transzformált élesztőtörzsek, és felhasználásuk
HU217411B (hu) Eljárás szteroidok biokémiai oxidációját katalizáló enzimeket kódoló DNS-eket tartalmazó expressziós kazetták, ezeket tartalmazó transzformált sejtek és az enzimek előállítására
EP0340878B1 (en) Process for the biochemical oxidation of steroids and genetically engineered cells to be used therefor
US5869283A (en) Expression cassette operable in a recombinant host
JP2001524838A (ja) 中断されたａｔｆ２遺伝子を有する酵母株及びそれらの利用
IE83307B1 (en) Process for the biochemical oxidation of steroids and genetically engineered cells to be used therefor
US20030108982A1 (en) Process for oxidation of steroids and genetically engineered cells used therein
US20040067579A1 (en) Process for oxidation of steroids and genetically engineered cells used therein
AU7672600A (en) Method for preparing steroids modified by yeast fermentation

Legal Events

Date Code Title Description
DGB9 Succession in title of applicant

Owner name: ROUSSEL UCLAF, FR

DGB9 Succession in title of applicant

Owner name: HOECHST MARION ROUSSEL S.A., FR

HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: AVENTIS PHARMA S.A., FR