PT92543B

PT92543B - Processo para oxidacao multipla de esteroides e para a obtencao de celulas por meio de engenaria genetica para serem usadas na sua realizacao

Info

Publication number: PT92543B
Application number: PT92543A
Authority: PT
Inventors: Gerardus Cornelis Maria Selten; Hermen Slijkhuis; Eric Bastiaan Smaal
Original assignee: Roussel-Uclaf
Priority date: 1988-09-23
Filing date: 1989-12-12
Publication date: 1996-10-31
Also published as: IL91762A0; AU638218B2; FI101551B; FI101551B1; IE71166B1; DK108790D0; WO1990003428A1; EP0360361A1; PT92543A; FI902024A0; AU4428289A; DK175631B1; CN1042567A; JPH03501445A; KR900702029A; IE893054L; NZ230761A; HUT53393A; CA1340563C; IL91762A

Description

DESCRIÇÃO

A presente invenção refere-se a um processo de oxidação múltipla para a preparação de esteróides farmaceuticamente úteis.

ENQUADRAMENTO GERAL DA INVENÇÃO

O composto libeta, 17alfa, 21-tri-hidró xi-4-pregneno-3,20-diona (hidrocortisona) é um esterõide farmacêutico importante, utilizado pelas suas propriedades farmacoló gicas como corticosterõide e como composto de partida na preparação de numerosos esteróides úteis, particularmente outros co£ ticosteróides.

A hidrocortisona é produzida no córtex

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0(Λ

adrenal dos vertebrados e foi originalmente obtida, apenas em pe quenas quantidades, por uma extracção laboriosa ou partir de tecido do córtex adrenal. Só depois de se ter procedido ã elucidação da sua estrutura, se desenvolveram novas vias de produção, caracterizadas por uma combinação de operações de síntese química e de transformações microbiolõgicas.

Só por causa de os compostos de partida que são empregados, tais como esterõides, ácidos biliares e sapo geninas serem abundantes e baratos, os referidos processos proporcionam um produto menos dispendioso, mas são ainda complicados. Previram-se diversas possibilidades de melhorar os referidos processos e também se experimentaram métodos bioquímicos.

Uma tentativa consistiu em se obter um esterõide de partida apropriado transformado num sistema bioquímico in vitro, usando as proteínas do córtex adrenal que se sabe serem responsáveis pela transformação enzimãtica in vivo dos esterõides em hidrocortisona.

No entanto, o difícil isolamento das pro teínas e o elevado preço dos cofactores necessários pareceram ser proibitivos para tornar o processo em larga escala economica mente atraeente.

Outra tentativa foi conservar as proteínas que provocam a catálise no seu ambiente natural e ter as células do córtex adrenal a produzirem a hidrocortisona pretendida numa cultura de células. Mas, devido â pequena produtividade das células, na prática, pareceu ser impossível realizar esse proce£ so bioquímico de maneira economicamente atraente.

processo in vivo que tem lugar no córtex adrenal dos mamíferos e de outros vertebrados constitui um processo bioquímico que parte do colesterol e, por intermédio da passagem através de vários compostos intermediários, proporciona a hidrocortisona (ver Figura 1). Oito proteínas estão directamen te envolvidas neste método, cinco delas sendo enzimas, entre as quais quatro enzimas citocromo Ρ₄₅θ e sendo as outras três proteínas que transferem electrões.

A primeira fase é a transformação do colesterol em 3beta-hidróxi-5-pregnen-20-ona (pregnenolona). Nesta transformação, uma reacção de mono-oxigenase, são envolvidas

três proteínas: a enzima de clivagem da cadeia lateral (P^^qSCC, uma proteína que contém heme-Fe), adrenodoxina (ADX, uma proteína que contém ^Fe2^₂^ θ adrenodoxino-redutase (ADR, uma proteína que contém FAD). Além do colesterol como substrato, a reacção ne cessita ainda de oxigénio molecular e de NADPH.

Subsequentemente, a pregnenolona é trans^ formada por desidrogenação/isomerização em 4-pregneno-3,20-diona (progesterona). Esta reacção, catalisada pela proteína 3beta-hidróxi-esteróide desidrogenage/isomerase (3beta-HSD), necessita de pregnenolona e de NAD⁺.

Para se obter hidrocortisona, a progeste rona é subsequentemente hidroxilada em três posições, transforma ções essas que são catalisadas por mono-oxigenase. Na transforma, ção de progesterona em 17alfa-hidrõxi-progesterona, estão envolvidas duas proteínas: esteróide 17alfa-hidroxilase (P^glValfa, uma proteína que contém heme-Fe) e NADPH citocromo O₄^gredutase (RED, uma proteína que contém FAD e FMN). A reacção consome progesterona, oxigénio molecular e NADPH.

Para a transformação de 17alfa-hidróxi-progesterona em 17alfa,21-di-hidrõxi-4-pregneno-3,30-diona (cor texolona), são também necessárias duas proteínas: esteróide-21-hidroxilase (Ρ₄^θΟ21, uma proteína que contém heme-Fe) e a proteína acima mencionada RED. A reacção consome 17alfa-hidróxi-pro gesterona, oxigénio molecular e NADPH.

Na transformação de cortexolona em hidro cortisona, estão envolvidas três proteínas: esteróide llbeta-hidroxilase (P^gllbeta, uma proteína que contém heme-Fe) e as pro teínas ADX e ADR acima mencionadas.

Como se descreveu acima, as proteínas ci_ tocromo Ρ^θ são enzimas que são essenciais para a transformação bioquímica de colesterol em hidrocortisona. Estas enzimas perten cem a um grupo mais vasto de proteínas citocromo P₄₅₀ (ou, abreviadamente, proteínas Ρ^^θ)· Elas foram encontradas em procariotes (várias bactérias) e eucariotes (leveduras, bolores, plantas e animais). Nos mamíferos, encontram-se elevados níveis de proteínas P45Q no córtex adrenal, nos ovários, nos testículos e no fígado.

Muitas destas proteínas foram purifica3

das e actualmente estão bem caracterizadas. A sua actividade específica foi determinada. Recentemente, um certo número de revisões de conhecimentos sobre este assunto foi publicado, tal como, por exemplo, K. Ruckpaul e H. Rein (Ed.), Cytochrome Ρ^^θ θ ^p· R. Ortiz de Montellano (Ed.) Cytochrome Ρ^^θ, structure, mechanism ando biochemistry.

As proteínas de citocromo P45Q caracteri^ zam-se pela sua absorvãncia específica máxima a 450 nm depois de redução com monóxido de carbono. Nos organismos procarióticos, as proteínas Ρ^θ são ligadas à membrana ou são citoplasmáticas. Na medida em que as proteínas Ρ^^θ bacterianas foram estuda das pormenorizadamente (por exemplo, P^j-gineg e P^_5Qcam) , demonstrou-se que uma ferredoxina e uma ferredoxino-redutase estão envolvidas na actividade de hidroxilação. Nos organismos eucarióti cos, descreveram-se dois tipos de proteínas Ρ^,-θ, I θ II» As suas diferenças consistem:

1) na localização subcelular; as do tipo I estão localizadas na fracção microssõmica e as do tipo II estão localizadas na membrana interior das mitocôndrias;

2) na maneira como os electrões são transferidos para a proteína P45Q· As proteínas do tipo I são reduzidas por NADPH atra vés de P45Q redutase, enquanto as de tipo II são reduzidas por NADPH por intermédio de uma ferredoxina-reductase (por exemplo, adrenodoxina-reductase) e de uma ferredoxina (por exemplo, adrenodoxina).

De acordo com a Patente de Invenção Euro peia EP-A-0281245, as enzimas citocromo P45Q podem preparar-se a partir da espécie Streptomyces e utilizadas para a hidroxilação de compostos químicos.

As enzimas são utilizadas sob a forma isolada, o que obriga a um procedimento bastante tedioso e caro.

A Patente de Invenção Japonesa JP-A-62236485 (Derwent 87-331234) refere que é possível introduzir em Saccharomyces cerevisiae os genes de enzimas de citocromo ^P450 ^{de e} expressá-las, fornecendo enzimas que podem ser usadas pela sua actividade de oxidação.

No entanto, nas referências acima meneio nadas, não há qualquer indicação relativamente à utilização de

enzimas de citocromo Ρ^θ para a preparação de compostos de este róides.

De acordo com o Pedido de Patente de Invenção copendente EP-A-89201173.5, depositado pela Requerente em 8 de Maio de 1989, com o título Processo para a Oxidação Bioqu_í mica de Esteróides e Células Tratadas por Engenharia Genética pa ra Serem Utilizadas para essa Finalidade, que se incorpora na presente memória descritiva como referência, proporciona-se uma multiplicidade de cassetes de expressão para a produção de proteínas necessárias ã construção de um sistema multigénico para a transformação por oxidação de materiais de partida de esteróides baratos em produtos finais mais raros e caros, caracterizado pelo facto de a referida transformação se realizar em sistemas naturais através de uma multiplicidade de transformações catalisadas por enzimas e mediadas por cofactores.

De acordo com o referido pedido de paten te, proporcionam-se cassetes de expressão que são eficazes numa célula de um hospedeiro recombinante para expressar uma sequência de ADN codificante heterõloga, em que a referida sequência de codificação codifica uma enzima que é capaz, sozinha ou em co operação com uma proteína adicional, de catalisar uma operação de oxidação separada no processo biológico para a transformação de colesterol em hidrocortisona.

Portanto, as cassetes de expressão inclu em as sequências capazes de produzir, no hospedeiro recombinante as seguintes proteínas: enzima de clivagem da cadeia lateral (P^^qSCC) ’· adrenodoxina (ADX) ; adrenodoxina-reductase (ADR) ; 3be ta-hidróxi-esterõide desidrogenase/isomerase (3beta-HSD); esteróide 17alfa-hidroxilase (P_45Q17alfa); NADPH citocromo P₄₅₀ redu tase (RED); esterõide-21-hidroxilase (P_45QC21); e esteróide libe ta-hidroxilase (P^^gllbeta).

referido pedido de patente menciona ainda células hospedeiras recombinantes transformadas com estes vectores ou com as cassetes de expressão de acordo com a invenção, processos para produzir as enzimas acima mencionadas e para usar estas enzimas para efectuar oxidações, processos para utili zar as citadas células de hospedeiros para oxidações especificas num caldo de cultura e composições farmacêuticas que contêm os

compostos preparados pelos referidos processos.

De maneira particular, aquele pedido de patente trata da preparação e da cultura de células que são apro priadas para serem empregadas em reactores de produção bioquímica em grande escala e da utilização destas células para oxidação de compostos e, particularmente, para a produção de esteróides, representados na Figura 1.

Cada uma das reacções referidas pode rea lizar-se separadamente. Inclui-se a permuta das operações numa reacção em fases múltiplas. Os hospedeiros preferidos são microorganismos, mas também podem utilizar-se outras células, tais co mo células de plantas ou de animais, opcionalmente aplicadas numa cultura de células ou no tecido de plantas ou animais transgé nicos vivos.

Estas células são obtidas por transforma ção genética de células receptoras apropriadas, preferivelmente, células de microorganismos apropriados, com vectores que contêm sequências de ADN que codificam as proteínas envolvidas na trans^ formação de colesterol em hidrocortisona e que compreendem a enzima de clivagem da cadeia lateral (P^^qSCC), adrenodoxina (ADX) adrenodoxina-redutase (ADR), 3beta-hidróxi-esteróide desidrogena se/isomerase (3beta-HSD), esterõide-17alfa-hidroxilase (P._cn17al 4o(J — fa), NADPH citocromo Ρ^θ redutase (RED), esterõide-2-hidroxilase (P_45qC21) e esteróide-llbeta-hidroxilase (P^^gllbeta).

Algumas células hospedeiras podem já pro duzir por si próprias uma ou mais das proteínas necessárias a um nível suficiente e, portanto, terem de ser transformadas apenas com sequências de ADN suplementares. Essas proteínas possivelmen te próprias são ferredoxina, ferredoxina-redutase, P_45Q-redutase e 3beta-hidróxi-esteróide disedrogenase/isomerase.

Para encontrar quais as sequências que codificam as proteínas que estão envolvidas na transformação de colesterol em hidrocrotisona, escolheram-se fontes de ADN apropriadas. Uma fonte apropriada para se encontrar o ADN que codifi. ca todas as roteínas envolvidas na transformação de colesterol em hidrocrotisona é o tecido do córtex adrenal de vertebrados, por exemplo, tecido de córtex adrenal de bivinos.

Também em vários microorganismos se pode

encontrar o ADN relevante, por exemplo, Pseudomonas testosteroni, Streptomyces griseocarneus ou Brevibacterium sterolicum, relativamente ao ADN que codifica a 3beta-hidrõxi-esteróide desidrogenase/isomerase, e Curvularia lunata ou Cunninghamella blakesleeana, para o ADN que codifica proteínas envolvidas na llbeta-hidroxilação de cortexolona.

As sequências de ADN que codificam as proteínas P^^qSCC bovinas, P^gllbeta bovinas ou uma proteína m_i crobianamente equivalente, adrenodoxina bovina, adrenodoxina-redutase bovina, 3beta-hidrõxi-esteróide desidrogenase/isomerase de origem bovina ou microbiana, P^glValfa bovina, Ρ^θΟΣΙ bovina e NADPH citobromo Ρ^θ redutase de origem bovina ou microbiana, foram isoladas de acordo com as seguintes operações:

1. Sequências eucarióticas (cADN)

a) preparou-se ARN total a partir de tecido apropriado;

b) transcreveu-se ARN contendo poliA⁺ em cADN de dupla cadeia lateral e ligou-se a vectores bacteriófagos;

c) escolheu-se a biblioteca do cADN assim obtida com oligóme ros marcados com p específicos do cADN pretendido ou se leccionado uma biblioteca de cADN lâmbda-gtll induzido por isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) usando um anticorpo específico (marcado com I);

d) inseriram-se insertos de cADN de unidades positivas de formação de placas (pfu) em vectores apropriados para verificar qual o comprimento total de cADN por sequenciamen to de nucleótidos.

2. Genes procariõticos

a) preparou-se ADN genõmico a partir de um microorganismo apropriado.

b) para se obter uma biblioteca de ADN, clonaram-se fragmentos de ADN em vectores apropriados e transformaram-se num hospedeiro E. coli apropriado.

c) Seleccionou-se a biblioteca de ADN com oligõmeros marca32 dos com p específicos do gene que interessa ou por se7

leccionamento de uma biblioteca de ADN lâmbda-gtll induzi^ do por IPTG usando um anticorpo específico (marcado com ¹²⁵I).

d) Isolaram-se plasmídios de colónias positivas e inseriram-se fragmentos de ADN subclonados em vectores apropriados para verificar qual o comprimento completo do gene.

NOTA: De acordo com um método aperfeiçoado,„ amplificou-se o cADN particular (sequências eucariõticas) ou o gene (sequências procarióticas) usando dois oligómeros específicos pelo método co nhecido por reacção da cadeia de polimerase (PCR) (Saiki e col., Science 239, 487 - 491, 1988). Subsequentemente, inseriu-se o cADN ou ADN amplificados nos vectores apropriados.

Proporcionam-se cassetes de expressão apropriadas em que o ADN heterólogo isolado de acordo com a maneira de proceder anteriormente referida é colocado entre sequên cias de controlo apropriadas para a transcrição e a translação, o que permite que o ADN seja expresso no ambiente celular de um hospedeiro apropriado, fornecendo a proteína ou proteínas preten didas. Opcionalmente, as sequências de controlo de iniciação são seguidas por uma sequência de sinal de segregação.

Sequências de controlo apropriadas têm de ser introduzidas conjuntamente com o ADN estrutural por meio das mencionadas cassetes de expressão. A expressão é tornada po_s sível por transformação de uma célula de hospedeiro apropriado com um vector que contém sequências de controlo que são compatíveis com o hospedeiro relevante e estão em ligação operável com sequências de codificação de que se pretende realizar a expressão .

De acordo com uma variante, empregam-se sequências de controlo apropriadas presentes no genoma hospedeiro. A expressão é possibilitada pela transformação de uma célula do hospedeiro apropriado com um vector que contém sequências de codificação da proteína pretendida flanqueadas pelas sequências do hospedeiro que permitem a recombinação homóloga com o genoma do hospedeiro, de tal maneira que as sequências de controlo do hospedeiro controlam apropriadamente a expressão do ADN introduzido .

Como se compreende geralmente, a expres8

são sequência de controlo compreende todos os segmentos de ADN que são necessários para a regulação apropriada da expressão da sequência de codificação a que eles são operavelmente ligados, tais como operadores, reforçadores e, particularmente, promotores e sequências que controlam a translação.

promotor pode ou não ser controlável regulando o seu ambiente. Os promotores apropriados para procariotes incluem, por exemplo, o promotor trp (induzível) por desprivação de triptofano), o promotor lac (que pode ser induzido com IPTG análoga da galactose), o promotor beta-lactamase e o fa go derivado do promotor P^ (que pode ser induzido por variação de temperatura).

Adicionalmente, especialmente para a expressão em Bacillus, os promotores úteis incluem os promotores para alfa-amilase, protease, Spo2, spac e 0/105 e sequências pro motoras sintéticas. Um promotor preferido ê o representado na Fi gura 5 e designado por Hpall. Os promotores apropriados para expressão em leveduras incluem o promotor de 3-fosfoglicerato quinase e os promotores para outras enzimas glicolíticas, assim como promotores para álcool desidrogenase e levedura fosfatase. São também apropriados os promotores para o factor de alongamento de transcrição (TEF) e lactase.

Os sistemas de expressão em mamíferos em pregam geralmente promotores derivados de vírus, tais como promo tores de adenovírus e o promotor SV40, mas incluem também promotores reguláveis, tais como o promotor de metalotionina, que é controlado pela concentração de metais pesados ou de gluco-corti. cóide. Presentemente, os sistemas de expressão de células de insectos baseados em vírus são também apropriados, assim como os sistemas de expressão baseados em promotores de células de plantas, tais como os promotores de nopalina sintetase.

As sequências de controlo da translação incluem um sítio de ligação de ribosoma (RBS) em sistemas procarióticos, enquanto, nos sistemas encariõticos, a translação pode ser controlada por uma sequência de nucleotidos que contém um co dão de iniciação tal como AUG.

Além do promotor necessário e das sequên cias de controlo da translação, pode usar-se, no controlo da ex9

pressão, uma variedade de outras sequências de controlo que incluem as que regulam a terminação (por exemplo, resultando nas sequências de poliadenilação em sistemas eucarióticos). Alguns sistemas contêm elementos reforçadores que são desejáveis, mas, na maior parte das vezes, não obrigatórios na efectivação da expressão .

De acordo com outro aspecto do pedido acima mencionado, descrevem-se vários vectores que são úteis para transformar as células hospedeiras. Um grupo de vectores, designado por pGBSCC-n, em que n é qualquer inteiro desde 1 a 17, é especialmente desenvolvido para o ADN que codifica a enzima ^P450^SCC’

De acordo com uma forma de realização es pecial, o vector pGBSCC-7 é adaptado para compreender um outro gene heterólogo, que codifica a proteína ADX. 0 novo vector assim obtido, pGBSCC/ADX-1, codifica P_45QSCC, assim como a proteína ADX, ambos os quais são produzidos numa forma funcional.

Outro grupo de vectores, designado por pGB17alfa-n, em que n é qualquer número inteiro desde 1 até 5, é especialmente desenvolvido para o ADN que codifica a enzima ^P450^17alfa*

Um outro grupo de vectores, designado por pGBC21-n, em que n ê qualquer número inteiro desde 1 até 9 é especialmente desenvolvido para o ADN que codifica a enzima ^P450^C21·

Ainda outro grupo de vectores, designado pGBllbeta-n, em que n é qualquer número inteiro desde 1 a especialmente desenvolvido para o ADN que codifica a enzima llbeta.

por 4, é

P

450

Foram desenvolvidas células hospedeiras apropriadas que aceitam vectores de acordo com a presente invenção e permitem que o ADN introduzido seja expressado. Quando se cultivam as células hospedeiras transformadas, as proteínas envolvidas na transformação de colesterol em hidrocortisona parecem nos conteúdos das células. A presença do ADN pretendido pode ser demonstrada por processos de hibridização de ADN, pela sua transcrição por hibridização de ARN, pela sua expressão por ensaios imunológicos e pela sua actividade, verificando a presença

de produtos oxidados depois de incubação com o composto de parti da in vitro ou in vivo.

Os microorganismos transformados são os hospedeiros preferidos, particularmente bactérias (mais preferivelmente, Escherichia coli e espécies Bacillus e Strptomyces)e leveduras (tais como Saccharomyces e Kluyveromyces). Outros orga nismos hospedeiros apropriados encontram-se entre as plantas e animais, compreendendo insectos, cujas células isoladas são utilizadas numa cultura de células, tais como células COS, células ^C127' células CHO e células de Spodoptera frugiperda (Sfg). Como variante, utiliza-se uma planta ou um animal transgénico.

Um tipo particular de células hospedeiras recombinantes é constituído pelas células em que ou duas ou mais cassetes de expressão de acordo com a presente invenção foram introduzidas, tais como pGBSCC/ADX-1 ou que foram transforma das por uma cassete de expressão que codifica pelo menos duas proteínas heterólogas, permitindo que a célula produza pelo menos duas proteínas envolvidas no processo de acordo com a Figura

1.

As novas células preparadas não só são aptas para produzir as proteínas envolvidas na transformação ox_i dante de esteróides, resultando eventualmente em hidrocortisona, mas também são aptas para utilizar as proteínas na transformação oxidante pretendida do correspondente composto de substrato adicionado â cultura líquida. Os esteróides são os substratos prefe ridos. As células transformadas com o ADN heterólogo são especialmente apropriadas para serem cultivadas com os esteróides mencionados na Figura 1, incluindo outros esteróis, tais como beta-sitosterol. Como resultado, obtêm-se esteróides oxidados.

Dependendo da presença na célula hospedeira de uma multiplicidade de proteínas que codificam ADM heterólogo envolvidas no processo da Figura 1, são possíveis diversas transformações bioquímicas que compreendem a clivagem da cadeia lateral de um esterol e/ou de modificações oxidantes em Cll C17, C3 e C21.

Portanto, as cassetes de expressão de acordo com a presente invenção são úteis na construção de um sis; tema multigénico que pode simultaneamente efectuar sucessivas

transformações intracelulares das operações múltiplas na sequência, como se pode ver na Figura 1. Pode ser necessário introduzir no hospedeiro pretendido cassetes de expressão que codificam completamente as proteínas necessárias. Em alguns casos, uma ou mais proteínas envolvidas no processo podem já estar presentes no hospedeiro como proteína natural que exerce a mesma actividade. Por exemplo, ferredoxina, ferredoxina-redutase e Ρ^,-θ reduta se podem já estar presentes no hospedeiro. Nestas circunstâncias, só as enzimas restantes têm de ser fornecidas por transformação recombinante.

Até recentemente, não tinha sido possível obter êxito na preparação de um sistema multigénico que permite, num processo bioquímico, pelo menos, duas operações do pro cesso bioquímico da Figura 1.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

De acordo com a presente invenção, conse guiu-se clonar num organismo hospedeiro os genes que codificam as proteínas que são capazes de catalisar duas oxidações separadas na molécula de esteróide e, particularmente, as proteínas re presentadas na Figura 1.

Em particular, conseguiu-se clonar as pro teínas responsáveis pela 17alfa-hidroxilação do esteróide e a C21-hidroxilação do esteróide num ínico e mesmo organismo hospedeiro a expressar as referidas proteínas de uma forma funcional.

Além disso, de acordo com outro aspecto da presente invenção, proporciona-se um processo em que os mencionados microorganismos transformados quando desenvolvidos num meio de fermentação oxidam um substrato de esteróide presente no meio simultaneamente em duas posições diferentes da molécula de esteróide. Em particular, consegue-se um processo de uma operação para a introdução do grupo 17alfa, assim como 21-hidroxilo.

Como organismo hospedeiro preferido, cita-se Kluyveromyces lactis, mas outros organismos hospedeiros e, em particular microorganismos, especialmente os anteriormente mencionados, podem ser utilizados. Mais particularmente, são

apropriados os microorganismos que foram descritos em para clonar e expressar os genes do processo bioquímico representado na Figura 1.

Uma maneira para preparar um hospedeiro capaz de realizar uma oxidação múltipla de esterõides consiste em transformar o hospedeiro com dois ou mais vectores contendo cada um o gene para uma operação de oxidação.

Outra maneira consiste em ter o hospedei^ ro transformado por um vector que contém uma cassete de expressão com todos os genes que codificam as proteínas necessárias pa ra a reacção de oxidação múltipla.

De acordo com a presente invenção, a cas sete de expressão contém pelo menos dois genes estruturais, cada um flanquado por sequências de controlo apropriadas. Uma cassete de expressão que se indica como exemplo contém ADN que codifica as proteínas Ρ^θ-17-alfa e P_45Q-C21 (pGBl7-alfa/C21-l).

Usando o método de acordo com a presente invenção, é possível, empregando processos conhecidos da técnica preparar cassetes de expressão análogas e células hospedeiras contendo as mesmas, com que é possível realizar outras oxidações múltiplas de esterõides e, eventualmente, a transformação de colesterol em hidrocortisona, num único processo de fermentação.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Em todas as Figuras se utilizaram as seguintes abreviaturas: , EcoRl; H, HindIII; K, Xbal; R_v, EcoRV;

Sj, Saci; B, BamHI; Sjj, SacII; Sal, Sall e Xh, Xhol.

A Figura 1 representa uma vista esquemática das proteínas envolvidas nas operações sucessivas na transformação de colesterol em hidrocortisona, como ocorre no córtex adrenal de mamíferos.

A Figura 2 representa um mapa físico da cassete de expressão pGB17alfa-5.

A Figura 3 representa um mapa físico da cassete de expressão pGBC21-9.

A Figura 4 representa a construção da

cassete de expressão pGBl7alfa/C21-l, que contém a sequência de codificação de P^^gl7alfa e P^^qC21, ambas accionadas pelo promo tor de lactase.

A invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos, que, no entanto, não devem ser considerados co mo constituindo uma limitação da presente invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Construção e Transformação de uma Cassete de Expressão que Codifica 17alfa-Hidroxilase de Esterõide de Citocromo Ρ^θ Bovino e C21-Hidroxilase de Esterõide Ρ^θ de Letocromo Bovino na Levedura Kluyveromyces lactis

a) Construção da Cassete de Expressão

Digeriu-se a cassete de expressão pGB17alfa-5 (Figura 2), descrita em EP-A-89201173.5 (Exemplo 14), com SacII e HindIII (parcialmente) e preencheram-se as extremida des pegajosas usando ADN polimerase de Klenow. 0 fragmento de ADN que compreende uma parte do promotor de lactase, a sequência que codifica P_45Q17alfa e separou-se e isolou-se o terminador de lactase por electroforese em gel de agarose e subsequentemente inseriu-se em pGBC21-9 (Figura 3), descrito em EP-A-89201173.5 (Exemplo 19) e que foi primeiramente linearizada por digestão com Xbal e preencheram-se as extremidades pegajosas usando ADN polimerase de Klenow.

A cassete de expressão assim obtida, pGB17alfa/C21-l (Figura 4), tem um único sítio de restrição, SacII, porque o sítio de restrição SacII no promotor de lactase que flanqueia a sequência P_45Q17alfa é destruído pela reacção de preenchimento.

b) Transformação de K. lactis

Realizou-se a transformação de K. lactis CBS2360 como se descreveu em EP-A-89201173.5 (Exemplo 5c)), com

microgramas de pGB17alfa/C21-l, linearizado no único sítio de restrição SacII. Analisou-se um outro transformante, 17alfa/C21-101, relativamente ã actividade in vitro e in vivo de ambos P^^gl7alfa e P^glValfa e P^^qC21 (vejam-se Exemplos 2 e 3).

Exemplo 2

Actividade in vitro de P._cn17alfa e de 450

P450C2I obtidas a Partir de Kluyveromyces lactis 17alfa/C21-101

Desenvolveram-se K. lactis 17alfa/C21-101 obtida como se descreveu no Exemplo 1, K. lactis 17alfa-101, como se descreveu em EP-A-98201173.5 (Exemplo 14) e K. lactis CBS2360 em 100 ml de meio D. 0

O meio D continha, por litro de água de£ tilada:

Extracto de levedura (Difco) Bacto-peptona (Oxoid) Dextrose g 20 g 20 g pH = 6,5.

Depois de esterilização e de arrefecimen to até 30QC, adicionaram-se 25 mg de geneticina (sulfato de G418 Gibco, Ltd.), dissolvidos em 1 ml de água destilada (esterilizada por filtração em filtro de membrana).

Desenvolveram-se as culturas durante setenta e duas horas a 30SC. Colectaram-se as células por centrifu gação (4000 x g, quinze minutos), lavou-se o pelete com tampão de fosfato (50 mM, pH = 7,0) e colectaram-se as células por centrifugação (4000 x g, 15 minutos). Tomou-se o pelete em tampão de fosfato (50 mM, pH = 7,0), obtendo-se como resultado uma suspensão contendo 0,5 grama de peso húmido/ml. Rompeu-se esta suspensão por tratamento com ultra-sons (Braun Labsonic 1510; 12 x x 1 minuto, 50 watts). As células que não foram rompidas foram separadas por centrifugação (12000 x g, quinze minutos).

Ensaiaram-se os extractos isentos de células relativamente à actividade de P. ,.,,17alfa e de P„^C21 de450 450

terminando a produção de 17alfa,21-di-hidróxi-progesterona na presença de NADPH. A mistura usada no ensaio consistia nas seguin tes soluções:

Solução A: um tampão de fosfato de potássio 50 mM (pH = 7,0), contendo 3 mM de EDTA, 2 mM de NADPH, 50 mM de glucose-6-fosfato e 16 unidades/ml de glucose-6-fosfato-desidrogenase (sistema NADPH-regenerante).

- ~ 14

Solução B: (substrato): uma solução micelar de 80 M de (4- C)TM

-progesterona (30 Ci/mole) em 10% (volume/volume) de Tergitol NP40/etanol (1:1; volume/volume) num tampão de fosfato de potássio (75 mM, pH = 7,5).

O ensaio foi iniciado misturando 75 microlitros de solução A com 50 microlitros de solução B e 125 microlitros de extracto isento de células. Agitou-se a mistura ligeiramente a 30QC. Retiraram-se amostras (50 microlitros) depois de sessenta minutos de incubação e adicionaram-se a uma mistura de 100 microlitros de metanol e 50 microlitros de clorofórmio. Seguidamente, adicionaram-se 100 microlitros de clorofórmio e 100 microlitros de água. Colectou-se a fase clorofórmica por cen trifugação (5000 x g, dois minutos) e re-extraiu-se a fase água/ /metanol com 100 microlitros de clorofórmio. Combinaram-se as duas fases clorofórmicas e secaram-se. Dissolveu-se o resíduo se co em 100 microlitros de acetonitrilo/H₂0 (9:1; volume/volume) e eluiram-se amostras (50 microlitros) com acetonitrilo/H₂0 (58:42 volume/volume), usando uma coluna de HPLC (Chrompack lichr. 10RP18, 250 x 4,6 mm). No líquido eluido, detectou-se o substrato de esteróide e os produtos por um contador de cintilações de passagem e um detector de ultravioletas. Determinou-se a radioac tividade das fracções colectadas por contagem de cintilações da fase líquida.

Verificou-se que o extracto isento de cé lulas obtido a partir de K. lactis 17alfa/C21-101 originou 17alfa,21-di-hidróxi-progesterona, enquanto que extractos isentos de células obtidos a partir de K. lactis 17alfa-101 e de K. lactis CBS2360 não eram radioactivos. O produto principal produzido por K. lactis 17alfa-101 pareceu ser 17alfa-hidrõxi-progesterona.

EXEMPLO 3

Actividade in vivo de P.^„17alfa e P._cn450 450

C21 em Kluyveromyces lactis 17alfa/C21-101

Inocularam-se K. lactis 17alfa/C21-101, obtida como se descreveu no Exemplo 1, e K. lactis CBS2360, em 25 ml .

O meio D continha por litro de água destilada :

Extracto de levedura (Difco) 10 g

Bacto-peptona (Oxoid) 20 g

Dextrose 20 g pH = 6,5.

Depois de se esterilizar e arrefecer até 302C, adicionaram-se 25 mg de geneticina dissolvida em 1 ml de água destilada esterilizada por filtração através de filtro de membrana a 1 litro de meio D.

Seguidamente, adicionaram-se 100 microli.

- - 14 tros de uma solução que contem o substrato de (4- C)-progestero na a 25 ml de meio completado. A solução de substrato continha, por mililitro, 800 microgramas de (4- C)-progesterona (8 Ci/moR le) em 10% (volume/volume) de Tergitol NP40/etanol (1:1, volume/ volume) .

Desenvolveram-se as culturas a 30QC em sacudidor rotativo (240 rotações por minuto) e retiraram-se amos tras de 2 ml depois de 0 e sessenta e oito horas. Cada amostra foi misturada a 2 ml de metanol. Depois de vinte e quatro horas de extracção a 4QC, centrifugaram-se as misturas (4000 x g, quin ze minutos). Amostras de 200 microlitros do sobrenadante assim obtido foram eluídas com acetonitrilo/ãgua (58:42, volume/volume usando uma coluna de HPLC (Chrompack Lichr. 10 RP18, 250 x 4,6mnx

No eluído, detectaram-se o substrato de esteróide e os produtos. Determinou-se a radioactividade das frac ções colectadas por contagem de cintilações em líquido. Uma das fracções obtidas de um meio de cultura de K. lactis 17alfa/C21* -101 foi desenvolvida durante sessenta e oito horas e mostrou • claramente a presença de 17alfa,21-di-hidrõxi-progesterona, en17

quanto que este pe de controlo composto não foi produzido numa cultura da estir lactis CBS2360.

Proteínas envolvidas nas fases sucessivas

Enzima de clivagem da cadeia lateral (P₄₅₀SCC> H,

Adrenodoxina (ADX) Adrenodoxina-redutase (ADR)

Colesterol ^CH3

Z 3 β-hidroxi-5-pregne

C=0 no-20-ona (pregnenolona)

HO

3$ -Hidroxi-esteróide desidrogenase/isomerase

CH/ ³ c=o (3β -HSD)

4-pregneno-3,20-diona (progesterona)

Esteróide-17PC - 0

-hidroxilase <^P450¹⁷*>

NADPH citocromo P₄ ç. ^redutase (RED)

··* OH

170C -hidroxi-4-pregneno-3,20-diona 17*-hidroxi-progesterona

Esteróide-11£ -hidroxilase (Ρ₄₅θ1ΐβ) Adrenodoxina (ADX) Adrenodoxina-redutase (ADR)

Esteróide-21-hidroxilase <Ρ₄₅„«1)

NADPH citocromo P450^redutase (RED) ch₂oh

FIG. 1

17oC , 21-di-hidroxi-4-pregneno-3,20-dio na (cortexolona) β ,17oC ,21-tri-hi droxi-4-pregneno-3, 20-diona (hidrocortisona)

Τ3

Φ

C

•Η ε

φ

-Ρ

Ο

Εη ι—I <3 (0 ω

φ ω

(Ú

4J υ

<ΰ

Γ

Ο

4J

Ο «2

Λ

Φ ω

(0 +J u

(0 ιη

I

ΓCÕ⁷ cn '«η cn ι—I u

D

Cb

U

Λ <Ν

Ο

Η (2

20

Claims

REIVINDICAÇÕES

- lâ Processo para a obtenção de células hospedeiras recombinantes e sua progénie, caracterizado pelo facto de as células obtidas serem células de microorganismos, plantas ou animais contendo, além de sequências de controlo apropriadas, ADN heterólogo codificando proteínas ou do grupo que compreende proteínas que são funcionais, sozinhas ou em cooperação com uma ou mais proteínas adicionais, para catalizar uma operação de oxi dação no processo biológico para a transformação de colesterol em hidrocortisona, operação essa que é escolhida do grupo que consiste em

- a transformação de colesterol em pregnolona;

- a transformação de pregnolona em progesterona;

- a transformação de progesterona em 17OC-hidroxi-progesterona;

- a transformação de 17o<-hidroxi-progesterona em cortexolona;

- a transformação de cortexolona em hidrocortisona, ou do grupo que compreende as proteínas naturais do processo bio lógico para a transformação de colesterol em hidrocortisona e são

- enzima de clivagem da cadeia lateral (P^^qSCC);

- adrenodoxina (ADX);

- adrenodoxina redutase (ADR);

- 3^-hidroxi-esteróide desidrogenase/isomerase (3^3-HED);

- esteróide-170C-hidroxilase (P._cn17);

- NADPH citocrómio Ρ^θ redutase (RED);

- esteróide-21-hidroxilase (Ρ₄^θΟ21); e

- esteróide-11 β -hidroxilase (Ρ^θΐΐ) , codificando o ADN pelo menos duas proteínas expressáveis que catalisam pelo menos duas operações de oxidação separadas.

-
2â 23

- 2ã Processo para a obtenção de células hospedeiras recombinantes, de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado pelo facto de o ADN que codifica sequência ser originado pela espécie bovina.

- 3â Processo para a obtenção de células recombinantes, de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracteriza do pelo facto de o ADN heterólogo codificar pelo menos as prote_í ^{nas Ρ}450^17βί θ ^P450^C21‘

- 42 Processo para a obtenção de células hospedeiras recombinantes e da sua progénie, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo facto de o hospede^ ro ser um microrganismo.

- 5ã Processo para a obtenção de células hospedeiras recombinantes e da sua progénie, de acordo com a reivin dicação 4, caracterizado pelo facto de o hospedeiro ser uma espé cie de Saccharomyces, Kluyveromyces ou Bacillus ou ser Escherichia coli.

- 6§ 24

- 6â Processo para a preparação de uma mistura de proteínas por meios de células hospedeiras recombinantes compreendendo cultivarem-se células do hospedeiro recombinante num meio nutritivo sob condições que permitem que as proteínas se formem e se acumulem na cultura, caracterizado pelo facto de o hospedeiro recombinante ser como se define em uma qualquer das reivindicações 1 a 5.

- 7S Processo para a oxidação selectiva múlt_i pia de um composto in vitro, compreendendo a incubação do compos^ to a ser oxidado na presença de pelo menos duas proteínas sob condições que permitem a referida oxidação e a acumulação do com posto oxidado no líquido de cultura, seguida pela recuperação do composto oxidado, caracterizado pelo facto de as proteínas terem sido produzidas pelo processo de acordo com a reivindicação 6.

- 8â Processo para a oxidação múltipla selectiva de um composto, compreendendo cultivar-se células hospedeiras recombinantes na presença do mencionado composto sob condições em que a pretendida oxidação ocorre e o composto oxidado se acumula no caldo de cultura, seguida pela recuperação do composto oxidado, caracterizado pelo facto de as células hospedeiras recombinantes serem as células de acordo com qualquer das reivin dicações 1 a 5.

- 93 Processo de acordo com as reivindicações 7 ou 8, caracterizado pelo facto de se realizarem duas operações de oxidação escolhidas do grupo que consiste na clivagem da cadeia lateral de um composto de esterol, oxidação e isomerização do grupo 3-hidroxi-5(6)-desidro de maneira a obter-se um grupo
3-oxo-4(5)-desiro, introdução de um grupo 17 -hidroxilo, um gru po 21-hidroxilo ou um grupo 11/3-hidroxilo.

- 10â Processo de acordo com as reivindicações 7 ou 8, caracterizado pelo facto de a oxidação ter como resultado a introdução simultânea de um grupo C21-hidroxilo assim como de um grupo Cl7-hidroxilo e pregnenolona ou progesterona.

- lis Processo para a obtenção de uma cassete de expressão, operável num hospedeiro recombinante de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, contendo pelo menos dois genes que codificam as proteínas como se definiram na reivindicação 1.

- 12ã Processo para a obtenção de uma cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pe lo facto de o ADN heterólogo codificar as enzimas P_45Q-17alfa e P_45QC21 e a cassete de expressão ser pGB!7alfa/C21-l.

133

Processo para a preparação de composições farmacêuticas, caracterizado pelo facto de se incorporar co mo ingrediente activo um composto que foi preparado de acordo com qualquer das reivindicações 9 a 12, nas substâncias veiculares e/ou auxiliares farmaceuticamente aceitáveis.

A requerente reivindica a prioridade do pedido de patente Europeia apresentado em 23 de Setembro de 1988, sob o nO. 88202080.3.