CN118325858B - 一种茶树菇来源的非特异性过氧合酶突变体及其在催化甾族化合物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种茶树菇来源的非特异性过氧合酶突变体及其在催化甾族化合物中的应用。本发明的非特异性过氧合酶突变体是将非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列的第72位和/或第77位和/或第188位和/或第195位和/或第241位和/或第244位和/或第316位和/或第318位所示的氨基酸残基进行突变后得到的蛋白质。本发明运用定向进化的方法对AaeUPO进行了酶改造，获得了一系列对催化维生素D3和7‑脱氢胆固醇在C‑25位发生羟基化生产25‑羟基‑维生素D3具有较高活性的突变体，且区域选择性强，底物转化率高，对促进甾族化合物在C25位羟基化的生物合成和应用具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种非特异性过氧合酶突变体及其在催化甾族化合物中的应用。
背景技术
维生素D也称抗佝偻病维他命，是一类脂溶性维生素，属甾族化合物。在人类所需的维生素中，维生素D非常特殊，可在阳光充足的情况下，由皮肤中的7-脱氢胆固醇经过270-300 nm紫外线照射合成维生素D3。维生素D是一种激素原，本身无活性，需在体内转化为活性维生素D才能发挥其生物学效应。骨化二醇被称为第二代维生素D，是维生素D3的活性代谢物，具有更强的生理活性（骨化二醇比传统维生素D3的活性高出2个数量级以上），可高效调节体内钙磷代谢，维持血浆钙磷水平，从而保证各年龄段人群与动物的骨骼正常生长与发育，并且不需要经过肝脏的代谢，可作为维生素D3的替代产品在饲料、医药领域进行大规模应用。
目前该类化合物的工业化生产依然依赖于化学全合成，生产周期长、能耗高、三废排放量大，已逐渐无法满足可持续发展的时代要求。相对于化学合成法方面，酶催化反应步骤简单，其以维生素D3为起始原料，只需经过一步羟化反应就可以得到骨化二醇，转化率相对较高、分离纯化过程简单、反应条件温和、成本低廉、对环境友好，不会产生许多有毒有害物质等优点。CN115838695A筛选并改进了索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillus sonorensis)来源的P450酶，使其具有更高的活性，并克服其羟化位置单一性低的缺陷，专一生成骨化二醇，但由于大多数P450表达量较低（膜蛋白）、催化需要昂贵的辅因子，无法实现大规模的工业应用。
近20年来，一类与P450酶活性中心相同，催化机理相似的非特异性过氧合酶（unspecific peroxygenase，UPO，EC 1.11.2.1.）被不断发现与表征。原则上，UPO具有和P450单加氧酶相同的底物谱，同时避免P450的“氧困境”问题，仅需要廉价的过氧化氢即可驱动催化反应的发生，无需复杂的电子传递链等，大大节约了反应成本，因此具有更大的应用前景。CN115181758A介绍了一种固定化UPO催化合成活性维生素Ｄ的方法，通过维生素D3为原料，利用来源于茶树菇的非特异性过氧合酶作为催化剂，以过氧化氢（H2O2）作为氧化剂进行C-H键的活化及羟基化反应，可实现一步催化氧化方法制备骨化二醇。然而，目前该酶对C-25羟化的选择性仅为70%，较多副产物增加了下游处理的难度，因此需要利用酶工程的手段对UPO进行改造，提高对VD3催化的活性和对C25位羟化的专一选择性。进一步地，将这些突变体用于其他甾族化合物的氧化中，实现对这类结构相似底物的C-25位选择性官能团化。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何高选择性催化甾族化合物。本发明运用定向进化的方法对AaeUPO进行了酶改造，获得了一系列对催化甾族化合物在C-25位发生羟基化具有较高活性的突变体，且具有稳定性好、区域选择性强，底物转化率高的优点。
本发明首先提供了非特异性过氧合酶突变体，其相对于野生型非特异性过氧合酶而言具有更高的活性，且具有更好的稳定性、更强的区域选择性或更高的底物转化率，其是将非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列的第72位和/或第77位和/或第188位和/或第195位和/或第241位和/或第244位和/或第316位和/或第318位所示的氨基酸残基进行突变后得到的蛋白质。
其中，所述非特异性过氧合酶突变体包括如下M1）-M8）中至少一种突变：
M1）将非特异性过氧合酶AaeUPO氨基酸序列的第72位由谷氨酰胺突变为甲硫氨酸或苏氨酸或赖氨酸；
M2）将非特异性过氧合酶AaeUPO氨基酸序列的第77位由甘氨酸突变为异亮氨酸或缬氨酸；
M3）将非特异性过氧合酶AaeUPO氨基酸序列的第188位由苯丙氨酸突变为脯氨酸；
M4）将非特异性过氧合酶AaeUPO氨基酸序列的第195位由甘氨酸突变为丙氨酸；
M5）将非特异性过氧合酶AaeUPO氨基酸序列的第241位由甘氨酸突变为缬氨酸；
M6）将非特异性过氧合酶AaeUPO氨基酸序列的第244位由缬氨酸突变为亮氨酸；
M7）将非特异性过氧合酶AaeUPO氨基酸序列的第316位由丙氨酸突变为苯丙氨酸或丙氨酸；
M8）将非特异性过氧合酶AaeUPO氨基酸序列的第318位由甘氨酸突变为缬氨酸；
所述非特异性过氧合来源于茶树菇（Agrocybe aegerita），其名称为AaeUPO，其氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.2；所述非特异性过氧合酶AaeUPO突变体为对非特异性过氧合酶AaeUPO的第72位和/或第77位和/或第188位和/或第195位和/或第241位和/或第244位和/或第316位和/或第318位所示的氨基酸残基进行突变后得到的蛋白质。
其中，所述第72位、第77位、第188位和第195位氨基酸残基均位于催化中心的α螺旋上；第241位、第244位、第316位和第318位氨基酸残基则分别位于两个重要的柔性loop环——S240 - E245和G314-G318。这些氨基酸残基均是影响非特异性过氧合酶AaeUPO选择性和酶催化活性的关键位点，通过改造这些氨基酸残基可提高底物的转化率及选择性。
进一步的，所述非特异性过氧合酶突变体为如下N1）-N14）中任一种：
N1）为将非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列的第72位和第241位进行突变后得到的蛋白质；
N2）为将非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列的第77位和第244位进行突变后得到的蛋白质；
N3）为将非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列的第188位和第244位进行突变后得到的蛋白质；
N4）为将非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列的第241位和第244位进行突变后得到的蛋白质；
N5）为将非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列的第195位和第241位进行突变后得到的蛋白质；
N6）为将非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列的第241位和第318位进行突变后得到的蛋白质；
N7）为将非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列的第244位和第316位进行突变后得到的蛋白质；
N8）为将非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列的第72位、第241位和第318位进行突变后得到的蛋白质；
N9）为将非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列的第72位、第195位和第241进行突变后得到的蛋白质；
N10）为将非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列的第77位、第244位和第316位进行突变后得到的蛋白质；
N11）为将非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列的第195位、第241位和第318位进行突变后得到的蛋白质;
N12）为将非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列的第77位、第188位和第244位进行突变后得到的蛋白质；
N13）为将非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列的第72位、第195位、第241位和第318位进行突变后得到的蛋白质；
N14）为将非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列的第77位、第188位、第244位和第316位进行突变后得到的蛋白质。
更进一步的，所述非特异性过氧合酶突变体为如下任一种：
将非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列的第72位由谷氨酰胺突变为甲硫氨酸，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
将非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列的第72位由谷氨酰胺突变为赖氨酸，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
将非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列的第72位由谷氨酰胺突变为苏氨酸，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
将非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列的第77位由丙氨酸突变为缬氨酸，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
将非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列的第77位由丙氨酸突变为异亮氨酸，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
将非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列的第241位由甘氨酸突变为缬氨酸，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
将非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列的第244位由缬氨酸突变为亮氨酸，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
将非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列的第316位由丙氨酸突变为苯丙氨酸，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
将非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列的第316位由丙氨酸突变为甘氨酸，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
将非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列的第318位由甘氨酸突变为缬氨酸，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
将非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列的第77位由丙氨酸突变为异亮氨酸，第244位由缬氨酸突变为亮氨酸，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
将非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列的第77位由丙氨酸突变为缬氨酸，第244位由缬氨酸突变为亮氨酸，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
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将非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列的第72位由谷氨酰胺突变为赖氨酸，第241位由甘氨酸突变为缬氨酸，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
将非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列的第72位由谷氨酰胺突变为苏氨酸，第241位由甘氨酸突变为缬氨酸，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
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将非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列的第244位由缬氨酸突变为亮氨酸，第316位由丙氨酸突变为苯丙氨酸，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
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将非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列的第77位由丙氨酸突变为缬氨酸，第244位由缬氨酸突变为亮氨酸，第316位由丙氨酸突变为甘氨酸，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
将非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列的第77位由丙氨酸突变为缬氨酸，第188位由苯丙氨酸突变为脯氨酸，第244位由缬氨酸突变为亮氨酸，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
将非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列的第195位由甘氨酸突变为丙氨酸，第241位由甘氨酸突变为缬氨酸，第318位由甘氨酸突变为缬氨酸，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质
将非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列的第72位由谷氨酰胺突变为甲硫氨酸，第195位由甘氨酸突变为丙氨酸，第241位由甘氨酸突变为缬氨酸，第318位由甘氨酸突变为缬氨酸，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
将非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列的第72位由谷氨酰胺突变赖氨酸，第195位由甘氨酸突变为丙氨酸，第241位由甘氨酸突变为缬氨酸，第318位由甘氨酸突变为缬氨酸，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
将非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列的第77位由丙氨酸突变为缬氨酸，第188位由苯丙氨酸突变为脯氨酸，第244位由缬氨酸突变为亮氨酸，第316位由丙氨酸突变为苯丙氨酸，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
将非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列的第77位由丙氨酸突变为缬氨酸，第188位由苯丙氨酸突变为脯氨酸，第244位由缬氨酸突变为亮氨酸，第316位由丙氨酸突变为甘氨酸，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质。
上述非特异性过氧合酶AaeUPO突变体中，所述非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
为解决上述技术问题，本发明还提供了与上述非特异性过氧合酶AaeUPO突变体相关的生物材料。
a1）编码上述非特异性过氧合酶AaeUPO突变体的核酸分子；
a2）含有a1）所述核酸分子的表达盒；
a3）含有a1）所述核酸分子或a2）所述表达盒的重组载体；
a4）含有a1）所述核酸分子或a2）所述表达盒或a3）所述重组载体的重组工程菌。
上述a1）中，所述编码上述非特异性过氧合酶突变体的核酸分子为如下所述的基因：
将非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因的第214位由碱基C突变为碱基A、第215位由碱基A突变为碱基T、第216位由碱基A突变为碱基G后得到的DNA分子；
将非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因的第214位由碱基C突变为碱基A后得到的DNA分子；
将非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因的第214位由碱基C突变为碱基A、第215位由碱基A突变为碱基C后得到的DNA分子；
将非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因的第230位由碱基C突变为碱基T后得到的DNA分子；
将非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因的第229位由碱基G突变为碱基A第230位由碱基C突变为碱基T后得到的DNA分子；
将非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因的第722位由碱基G突变为碱基T后得到的DNA分子；
将非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因的第730位由碱基G突变为碱基C后得到的DNA分子；
将非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因的第946位由碱基G突变为碱基T、第947位由碱基C突变为碱基T后得到的DNA分子；
将非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因的第947位由碱基C突变为碱基G后得到的DNA分子；
将非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因的第953位由碱基G突变为碱基T后得到的DNA分子；
将非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因的第229位由碱基G突变为碱基A第230位由碱基C突变为碱基T，第730位由碱基G突变为碱基C后得到的DNA分子；
将非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因的第230位由碱基C突变为碱基T、第730位由碱基G突变为碱基C后得到的DNA分子；
将非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因的第214位由碱基C突变为碱基A、第215位由碱基A突变为碱基T、第216位由碱基A突变为碱基G、第722位由碱基G突变为碱基T后得到的DNA分子；
将非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因的第214位由碱基C突变为碱基A、第722位由碱基G突变为碱基T后得到的DNA分子；
将非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因的第214位由碱基C突变为碱基A、第215位由碱基A突变为碱基C、第722位由碱基G突变为碱基T后得到的DNA分子；
将非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因的第562位由碱基T突变为碱基C、第563位由碱基T突变为碱基C、第730位由碱基G突变为碱基C后得到的DNA分子；
将非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因的第722位由碱基G突变为碱基T、第730位由碱基G突变为碱基C后得到的DNA分子；
将非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因的第584位由碱基G突变为碱基C、第722位由碱基G突变为碱基T后得到的DNA分子；
将非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因的第722位由碱基G突变为碱基T后得到的DNA分子、第953位由碱基G突变为碱基T后得到的DNA分子；
将非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因的第730位由碱基G突变为碱基C、第946位由碱基G突变为碱基T、第947位由碱基C突变为碱基T后得到的DNA分子；
将非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因的第730位由碱基G突变为碱基C、第947位由碱基C突变为碱基G后得到的DNA分子；
将非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因的第214位由碱基C突变为碱基A、第215位由碱基A突变为碱基T、第216位由碱基A突变为碱基G、第584位由碱基G突变为碱基C、第722位由碱基G突变为碱基T后得到的DNA分子；
将非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因的第214位由碱基C突变为碱基A、第584位由碱基G突变为碱基C、第722位由碱基G突变为碱基T后得到的DNA分子；
将非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因的第214位由碱基C突变为碱基A、第215位由碱基A突变为碱基T、第216位由碱基A突变为碱基G、第722位由碱基G突变为碱基T后得到的DNA分子、第953位由碱基G突变为碱基T后得到的DNA分子；
将非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因的第214位由碱基C突变为碱基A、第722位由碱基G突变为碱基T后得到的DNA分子、第953位由碱基G突变为碱基T后得到的DNA分子；
将非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因的第230位由碱基C突变为碱基T、第730位由碱基G突变为碱基C、第946位由碱基G突变为碱基T、第947位由碱基C突变为碱基T后得到的DNA分子；
将非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因的第230位由碱基C突变为碱基T、第730位由碱基G突变为碱基C、第947位由碱基C突变为碱基G后得到的DNA分子；
将非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因的第230位由碱基C突变为碱基T、第562位由碱基T突变为碱基C、第563位由碱基T突变为碱基C、第730位由碱基G突变为碱基C后得到的DNA分子；
将非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因的第195位由甘氨酸突变为丙氨酸，第241位由甘氨酸突变为缬氨酸，第953位由碱基G突变为碱基T后得到的DNA分子；
将非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因的214位由碱基C突变为碱基A、第215位由碱基A突变为碱基T、第216位由碱基A突变为碱基G、第584位由碱基G突变为碱基C、第722位由碱基G突变为碱基T、第953位由碱基G突变为碱基T后得到的DNA分子；
将非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因的第214位由碱基C突变为碱基A、第584位由碱基G突变为碱基C、第722位由碱基G突变为碱基T、第953位由碱基G突变为碱基T后得到的DNA分子；
将非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因的第230位由碱基C突变为碱基T、第562位由碱基T突变为碱基C、第563位由碱基T突变为碱基C、第730位由碱基G突变为碱基C、第946位由碱基G突变为碱基T、第947位由碱基C突变为碱基T后得到的DNA分子；或者
将非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因的第230位由碱基C突变为碱基T、第562位由碱基T突变为碱基C、第563位由碱基T突变为碱基C、第730位由碱基G突变为碱基C、第947位由碱基C突变为碱基G后得到的DNA分子。
其中，所述非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因如SEQ ID No.1所示。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码上述非特异性过氧合酶AaeUPO的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的核酸分子90%或者更高同一性的核苷酸，只要编码上述非特异性过氧合酶AaeUPO突变体且具有相同功能，均是衍生于本发明的核酸分子并且等同于本发明的序列，均属于本发明的保护范围。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有90%或更高，或95%或更高，或98%或更高，或99%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比（%）表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述a2）中，所述含有编码上述非特异性过氧合酶AaeUPO突变体的核酸分子的表达盒是指能够在宿主细胞中表达上述非特异性过氧合酶AaeUPO突变体的DNA，该DNA不但可包括启动非特异性过氧合酶AaeUPO突变体编码基因转录的启动子，还可包括终止非特异性过氧合酶AaeUPO突变体编码基因转录的终止子。
上述a3）中，所述重组载体可为携带有所述非特异性过氧合酶AaeUPO突变体编码基因或上述表达盒的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒（如pPIC9K系列载体等）或逆转录病毒包装质粒。
上述a4）中，所述重组微生物可为携带有所述非特异性过氧合酶AaeUPO突变体编码基因或上述表达盒或上述重组载体的酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌等。
本发明进而提供所述的非特异性过氧合酶突变体作为生物催化剂在制备25-羟基维生素D3和/或25-羟基-7脱氢胆固醇中的应用。
本发明因而提供一种制备25-羟基维生素D3的方法，其以维生素D3为原料，所述非特异性过氧合酶突变体利用H2O2催化维生素D3在C-25位发生羟基化反应生成25-羟基维生素D3即骨化二醇。
具体地，维生素D3的浓度为0.15 mM-13 mM，反应在丙酮-磷酸盐缓冲溶液中进行，且所述丙酮体积分数为10-50%，磷酸盐缓冲溶液的pH为6～9、过氧化氢浓度为1-10 mM，温度为25-35℃。
本发明也提供一种制备25-羟基7-脱氢胆固醇的方法，其以7-脱氢胆固醇为原料，所述非特异性过氧合酶突变体利用H2O2催化7-脱氢胆固醇在C-25位发生羟基化反应生成25-羟基7-脱氢胆固醇。
优选地，7-脱氢胆固醇的浓度为0.15 mM-13 mM，反应在丙酮-磷酸盐缓冲溶液中进行，且所述丙酮体积分数为10-50%，磷酸盐缓冲溶液的pH为6～9、过氧化氢浓度为1-10mM，温度为25-35℃。
具体地，所述生物催化剂的形式为细胞、粗酶液、纯酶液、酶粉或固定化酶；所述细胞由所述重组工程菌培养得到。
进一步的，所述非特异性过氧合酶AaeUPO突变体粗酶液可按照包括如下步骤的方法制备得到：
在宿主细胞中表达所述非特异性过氧合酶突变体为分泌表达，通过离心将重组细胞分离，上清液为所述粗酶液；将所述粗酶液冷冻干燥后获得所述粗酶液冻干粉（粗酶粉）。
本发明运用定向进化的方法对AaeUPO进行了酶改造，获得了一系列对催化甾族化合物在C-25位发生羟基化具有较高活性的突变体，且区域选择性强，底物转化率高，对促进甾族化合物在C25位羟基化的生物合成和应用具有重要意义。
附图说明
图1为本发明实施例1中第72位饱和突变体质粒库。
图2为本发明实施例4中发酵罐发酵野生型过程图。
图3为本发明实施例5中维生素D3和骨化二醇标准品的HPLC图
图4为本发明实施例6中7-脱氢胆固醇和25-羟基-7-脱氢胆固醇标准品的HPLC图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1、非特异性过氧合酶AaeUPO突变体的构建
根据NCBI收录的茶树菇(Agrocybe aegerita)非特异性过氧合酶的氨基酸序列(GenBank：5OXU)合成经过毕赤酵母密码子优化的基因序列（SEQ ID No.1），通过同源重组技术，获得质粒pPIC9K-AaeUPO。进一步地，以pPIC9K-AaeUPO为模板，通过定点饱和突变技术构建突变体文库。
非特异性过氧合酶AaeUPO的基因序列(SEQ ID NO.1): GAACCAGGATTGCCACCAGGACCATTGGAAAATTCTTCTGCTAAATTGGTTAATGATGAAGCTCATCCATGGAAACCATTGAGACCAGGAGATATTAGAGGACCATGTCCAGGATTGAATACTTTGGCTTCTCATGGATATTTGCCAAGAAATGGAGTTGCTACTCCAGCTCAAATTATTAATGCTGTTCAAGAAGGATTTAATTTTGATAATCAAGCTGCTATTtTtGCTACTTATGCTGCTCATTTGGTTGATGGAAATTTGATTACTGATTTGTTGTCTATTGGAAGAAAAACTAGATTGACTGGACCAGATCCACCACCACCAGCTTCTGTTGGAGGATTGAATGAACATGGAACTTTTGAAGGAGATGCTTCTATGACGAGAGGAGATGCTTTTTTTGGAAATAATCATGACTTTAACGAAACGCTCTTTGAACAATTGGTTGATTATTCTAATAGATTTGGAGGAGGAAAATATAATTTGACTGTTGCTGGTGAGTTGAGATTTAAGAGAATACAGGATTCTATTGCTACTAATCCAAACTTTTCTTTCGTGGATTTCAGATTTTTTACTGCTTATGGAGAAACTACTTTTCCAGCTAATTTGTTTGTTGATGGAAGAAGAGATGATGGACAATTGGATATGGATGCTGCTAGATCTTTTTTTCAATTTTCTAGAATGCCAGATGATTTTTTTAGAGCTCCATCTCCAAGATCTGGAACTGGAGTTGAAGTTGTTGTTCAAGCTCATCCAATGCAACCAGGAAGAAATGTTGGAAAAATTAATTCTTATACTGTTGATCCAACCAGCTCTGACTTCTCTACTCCATGCCTAATGTATGAGAAGTTTGTGAACATCACGGTTAAATCTTTGTATCCAAATCCAACTGTTCAATTGAGAAAAGCTTTGAATACTAATTTGGATTTTTTGTTTCAAGGAGTTGCTGCTGGATGTACTCAAGTTTTTCCATATGGAAGAGATTGA。
非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列(SEQ ID NO.2): EPGLPPGPLENSSAKLVNDEAHPWKPLRPGDIRGPCPGLNTLASHGYLPRNGVATPAQIINAVQEGFNFDNQAAIFATYAAHLVDGNLITDLLSIGRKTRLTGPDPPPPASVGGLNEHGTFEGDASMTRGDAFFGNNHDFNETLFEQLVDYSNRFGGGKYNLTVAGELRFKRIQDSIATNPNFSFVDFRFFTAYGETTFPANLFVDGRRDDGQLDMDAARSFFQFSRMPDDFFRAPSPRSGTGVEVVVQAHPMQPGRNVGKINSYTVDPTSSDFSTPCLMYEKFVNITVKSLYPNPTVQLRKALNTNLDFLFQGVAAGCTQVFPYGRD。
具体包括以下步骤：
1、引物设计
为了减少筛选转化子的数量，利用22c trick策略，针对72、77、188、195、241、244、316、318设计并合成相关的引物。
2、PCR引入突变
各突变体的突变如下：1.第72位由谷氨酰胺突变为甲硫氨酸；2.第72位由谷氨酰胺突变为赖氨酸；3.第72位由谷氨酰胺突变为苏氨酸；4.第77位由丙氨酸突变为缬氨酸；5.第77位由丙氨酸突变为异亮氨酸；6.第241位由甘氨酸突变为缬氨酸；7.第244位由缬氨酸突变为亮氨酸；8.第316位由丙氨酸突变为苯丙氨酸；9.第316位由丙氨酸突变为甘氨酸；10.第318位由甘氨酸突变为缬氨酸；11.第77位由丙氨酸突变为异亮氨酸，第244位由缬氨酸突变为亮氨酸；12.第77位由丙氨酸突变为缬氨酸，第244位由缬氨酸突变为亮氨酸；13.第72位由谷氨酰胺突变为甲硫氨酸，第241位由甘氨酸突变为缬氨酸；14.第72位由谷氨酰胺突变为赖氨酸，第241位由甘氨酸突变为缬氨酸；15.第72位由谷氨酰胺突变为苏氨酸，第241位由甘氨酸突变为缬氨酸；16.第188位由苯丙氨酸突变为脯氨酸，第244位由缬氨酸突变为亮氨酸；17.第241位由甘氨酸突变为缬氨酸，第244位由缬氨酸突变为亮氨酸；18.第195位由甘氨酸突变为丙氨酸，第241位由甘氨酸突变为缬氨酸；19.第241位由甘氨酸突变为缬氨酸，第318位由甘氨酸突变为缬氨酸；20.第244位由缬氨酸突变为亮氨酸，第316位由丙氨酸突变为苯丙氨酸；21.第244位由缬氨酸突变为亮氨酸，第316位由丙氨酸突变为甘氨酸；22.第72位由谷氨酰胺突变为甲硫氨酸，第195位由甘氨酸突变为丙氨酸，第241位由甘氨酸突变为缬氨酸；23.第72位由谷氨酰胺突变为赖氨酸，第195位由甘氨酸突变为丙氨酸，第241位由甘氨酸突变为缬氨酸；24.第72位由谷氨酰胺突变为甲硫氨酸，第241位由甘氨酸突变为缬氨酸，第318位由甘氨酸突变为缬氨酸；25.第72位由谷氨酰胺突变为赖氨酸，第241位由甘氨酸突变为缬氨酸，第318位由甘氨酸突变为缬氨酸；26.第77位由丙氨酸突变为缬氨酸，第244位由缬氨酸突变为亮氨酸，第316位由丙氨酸突变为苯丙氨酸；27.第77位由丙氨酸突变为缬氨酸，第244位由缬氨酸突变为亮氨酸，第316位由丙氨酸突变为甘氨酸；28.第77位由丙氨酸突变为缬氨酸，第188位由苯丙氨酸突变为脯氨酸，第244位由缬氨酸突变为亮氨酸；29.第195位由甘氨酸突变为丙氨酸，第241位由甘氨酸突变为缬氨酸，第318位由甘氨酸突变为缬氨酸；30.第72位由谷氨酰胺突变为甲硫氨酸，第195位由甘氨酸突变为丙氨酸，第241位由甘氨酸突变为缬氨酸，第318位由甘氨酸突变为缬氨酸；31.第72位由谷氨酰胺突变赖氨酸，第195位由甘氨酸突变为丙氨酸，第241位由甘氨酸突变为缬氨酸，第318位由甘氨酸突变为缬氨酸；32.第77位由丙氨酸突变为缬氨酸，第188位由苯丙氨酸突变为脯氨酸，第244位由缬氨酸突变为亮氨酸，第316位由丙氨酸突变为苯丙氨酸；33.第77位由丙氨酸突变为缬氨酸，第188位由苯丙氨酸突变为脯氨酸，第244位由缬氨酸突变为亮氨酸，第316位由丙氨酸突变为甘氨酸。
PCR体系如下：
表1
PCR程序如下：
表2
3、酶切、纯化PCR产物
酶切去除含有甲基化的DNA质粒模板，酶切体系如下：
表3
酶切2 h后，80℃热失活20 min，并进行纯化，将纯化产物转化至大肠杆菌感受态细胞，涂布于LB（含氨苄）平板。
4、质粒提取
待上述平板中转化子长成，用涂布棒刮取全部转化子，质粒提取按照TIANGEN公司质粒小提试剂盒（DP103）说明书进行，将提取质粒测序，以第72位为例，如图1为第72位饱和突变体质粒库。
5、线性化质粒转化毕赤酵母GS115感受态
表4
将质粒用SalI酶切2h，然后电转至毕赤酵母GS115菌株，并涂布于MD平板。
实施例2、非特异性过氧合酶AaeUPO突变体的筛选
将实施例1步骤5制备的非特异性过氧合酶AaeUPO单点饱和突变体文库进行诱导表达，每个突变体文库筛选288个转化子，具体步骤如下：
1、将MD平板上的单克隆用牙签挑入含有400微升YPD培养基（1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖）的96孔深孔板中，于600rpm，30℃孔板摇床培养2天；
2、取100微升菌液保存于装有100微升甘油（50%）的96孔浅孔板中，剩下的菌液离心，于超净台中倒掉上清，保留菌体；
3、向每孔菌体中加入300微升BMM2培养基（100 mM 磷酸钾缓冲液(pH 6)，3.5 g/LYNB，400 μg/L 生物素，2% 甲醇，3 mM 硫酸镁），放入孔板摇床(600rpm，30℃)培养12h；
4、向每孔中补加100微升BMM10培养基（100 mM 磷酸钾缓冲液(pH 6)，3.5 g/LYNB，400 μg/L 生物素，10% 甲醇），并且每24h补加一次，共加三次。离心，收集上清酶液；
5、ABTS法检测过氧化物酶活性：反应液包含0.5 mM ABTS，2 mM H2O2，100 mM pH 4柠檬酸-磷酸缓冲液。取20微升上清酶液加入180微升反应液，室温放置5 min，检测420 nm吸光度；
6、NBD法检测过氧合酶活性：反应液包含0.5 mM NBD，2 mM H2O2，100 mM pH 7 磷酸缓冲液。取20微升上清酶液加入180微升反应液，室温放置5 min，检测425 nm吸光度；
7、将具有ABTS活性或NBD活性的突变体用于VD3催化反应，高活性催化VD3突变体菌株进行菌落PCR并测序；
8、按照实施例1和实施例2步骤1-7进行组合突变体构建与筛选。
实施例3、摇瓶条件下非特异性过氧合酶AaeUPO及其突变体的表达
挑取一株重组毕赤酵母工程菌(实施例2步骤2制备)于MD平板上划线，2天后挑取单克隆接种于3mL YPD液体培养基，16 h后按照1%转接于100mL BMGY培养基（1％甘油、1％酵母提取物、2％蛋白胨，pH6.5磷酸缓冲液），于30℃、220rpm振荡培养24 h，4000rpm、5min离心收集菌体，往菌体中新加入50 mL BMMY培养基(2％甲醇、1％酵母提取物、2％蛋白胨，pH6.5磷酸缓冲液)，在28℃、220rpm振荡培养。每24h加入终浓度为2％的甲醇，诱导表达培养4天。诱导结束后，离心收集上清液，即为非特异性过氧合酶AaeUPO的粗酶液。于-80℃冷冻后用真空干燥仪冷冻干燥，得到粗酶粉。
实施例4、发酵罐条件下非特异性过氧合酶AaeUPO及其突变体的表达
在3 L机械搅拌式罐体中，将实施例2步骤2制备的重组毕赤酵母工程菌在MD平板上划线，2天后挑取单克隆接种于50 mL YPD液体培养基，16 h后转接至1 L BSM培养基（27g85％H3PO4，0.7 g CaSO4，18 gK2SO4，24 g MgSO4·7H2O，4gKOH，40 g甘油，4.4 mL PMT1，5g酵母提取物，氨水调pH至6；其中，PTM1的配方为：6.0g/L CuSO4·5H2O，0.08g/L碘化钠，3.0g/L MnSO4·H2O，0.2g/L Na2MoO4·2H2O，0.02 g/L H3BO3，0.5g/L CoCl2，20.0g/LZnCl2，65.0g/L FeSO4·7H2O，0.2g/L生物素，5.0mL/L硫酸），补料培养至OD600达200左右(补料培养基：50％甘油+6mL/L PTM1)，饥饿1.0h，开始甲醇诱导，间隔时间取样，如图2，检测OD和对ABTS的活性，甲醇诱导160 h后停止发酵，5000rpm离心20 min收集上清液，得到粗酶液。
实施例5、非特异性过氧合酶AaeUPO突变体在催化0.4mM维生素D3羟基化反应中的应用
为了鉴定非特异性过氧合酶AaeUPO突变体羟化维生素D3的选择性，按照实施例3表达野生型及突变体，取200微升离心后的粗酶液催化0.4 mM维生素D3，1mL催化体系为：40%丙酮、0.15 mg维生素D3、40% 100 mM磷酸缓冲液（pH 7.5）、20%粗酶液、2mM/h 过氧化氢。为了充分反应维生素D3，并展示选择性差异，反应1 h和5h取样，并通过HPLC检测，HPLC液相色谱分析：取100 μL反应液，加入200 μL乙酸乙酯萃取，然后在35 ℃下真空干燥。向上述反应瓶中加入200 μL乙醇，通过有机膜过滤后，采用C18（250×4.6 mm，5 μm）柱上样检测，流速保持在1.0 mL/min，柱温箱温度为35℃，采用梯度洗脱，流动相分别为水和甲醇：0-10 min甲醇由88%升至95%，10-12 min甲醇由95%升至98%，12-15 min甲醇由98%降至88%，甲醇以88%的比例保持5 min，检测波长为265 nm。如图3，维生素D3的保留时间为15.603min，骨化二醇的保留时间为6.904min。
相较于野生型，选择性从反应1h的74%降至59%，大多数突变体在5 h内选择性没有明显下降，且突变体4、突变体14、突变体20、突变体29和突变体31对C25位羟化选择性达到90%。
表5
实施例6、非特异性过氧合酶AaeUPO突变体在催化0.4 mM7-脱氢胆固醇羟基化反应中的应用
为了鉴定非特异性过氧合酶AaeUPO突变体羟化维生素D3前体——7-脱氢胆固醇的选择性，按照实施例3表达野生型及突变体，取200微升离心后的粗酶液催化0.4 mM7-脱氢胆固醇，1mL催化体系为：40%丙酮、0.15 mg维生素D3、40% 100 mM磷酸缓冲液（pH 7.5）、20%粗酶液、2mM/h 过氧化氢。为了充分反应7-脱氢胆固醇，并展示选择性差异，反应1 h和5h取样，并通过HPLC检测，HPLC液相色谱分析：取100 μL反应液，加入200 μL乙酸乙酯萃取，然后在35 ℃下真空干燥。向上述反应瓶中加入200 μL乙醇，通过有机膜过滤后，采用C18（250×4.6 mm，5 μm）柱上样检测，流速保持在1.0 mL/min，柱温箱温度为35℃，采用梯度洗脱，流动相分别为水和甲醇：0-10 min甲醇由88%升至95%，10-12 min甲醇由95%升至98%，12-15 min甲醇由98%降至88%，甲醇以88%的比例保持5 min，检测波长为281 nm。如图4，7-脱氢胆固醇的保留时间为16.501 min，25-羟基-7-脱氢胆固醇的保留时间为7.362 min。
表6
综上所述，相比野生非特异性过氧合酶AaeUPO，本发明构建筛选的突变体能专一地催化甾族化合物，如维生素D3和7-脱氢和胆固醇，其C25位羟化特异性即产物特异性有了明显提高，增强了工业化应用的可行性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (12)
1.一种茶树菇来源的非特异性过氧合酶突变体，其特征在于，其为下述任意一种：
将非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列的第72位由谷氨酰胺突变为甲硫氨酸、赖氨酸或苏氨酸；
将非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列的第72位由谷氨酰胺突变为甲硫氨酸、赖氨酸或苏氨酸，且第241位由甘氨酸突变为缬氨酸；
将非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列的第72位由谷氨酰胺突变为甲硫氨酸或赖氨酸，第195位由甘氨酸突变为丙氨酸，第241位由甘氨酸突变为缬氨酸；
将非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列的第72位由谷氨酰胺突变为甲硫氨酸或赖氨酸，第241位由甘氨酸突变为缬氨酸，第318位由甘氨酸突变为缬氨酸；
将非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列的第72位由谷氨酰胺突变为甲硫氨酸或赖氨酸，第195位由甘氨酸突变为丙氨酸，第241位由甘氨酸突变为缬氨酸，第318位由甘氨酸突变为缬氨酸；
所述非特异性过氧合酶AaeUPO的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示氨基酸序列。
2.一种编码权利要求1所述非特异性过氧合酶突变体的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列为如下任一种：
将非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因的第214位由碱基C突变为碱基A、第215位由碱基A突变为碱基T、第216位由碱基A突变为碱基G后得到的DNA分子；
将非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因的第214位由碱基C突变为碱基A后得到的DNA分子；
将非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因的第214位由碱基C突变为碱基A、第215位由碱基A突变为碱基C后得到的DNA分子；
将非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因的第214位由碱基C突变为碱基A、第215位由碱基A突变为碱基T、第216位由碱基A突变为碱基G、第722位由碱基G突变为碱基T后得到的DNA分子；
将非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因的第214位由碱基C突变为碱基A、第722位由碱基G突变为碱基T后得到的DNA分子；
将非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因的第214位由碱基C突变为碱基A、第215位由碱基A突变为碱基C、第722位由碱基G突变为碱基T后得到的DNA分子；
将非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因的第214位由碱基C突变为碱基A、第215位由碱基A突变为碱基T、第216位由碱基A突变为碱基G、第584位由碱基G突变为碱基C、第722位由碱基G突变为碱基T后得到的DNA分子；
将非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因的第214位由碱基C突变为碱基A、第584位由碱基G突变为碱基C、第722位由碱基G突变为碱基T后得到的DNA分子；
将非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因的第214位由碱基C突变为碱基A、第215位由碱基A突变为碱基T、第216位由碱基A突变为碱基G、第722位由碱基G突变为碱基T后得到的DNA分子、第953位由碱基G突变为碱基T后得到的DNA分子；
将非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因的第214位由碱基C突变为碱基A、第722位由碱基G突变为碱基T后得到的DNA分子、第953位由碱基G突变为碱基T后得到的DNA分子；
将非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因的214位由碱基C突变为碱基A、第215位由碱基A突变为碱基T、第216位由碱基A突变为碱基G、第584位由碱基G突变为碱基C、第722位由碱基G突变为碱基T、第953位由碱基G突变为碱基T后得到的DNA分子；
将非特异性过氧合酶AaeUPO野生型基因的第214位由碱基C突变为碱基A、第584位由碱基G突变为碱基C、第722位由碱基G突变为碱基T、第953位由碱基G突变为碱基T后得到的DNA分子。
4.一种插入有权利要求3所述的基因的重组表达载体。
5.一种转化有权利要求4所述的重组表达载体的重组工程菌。
6.如权利要求5所述的重组工程菌，其特征在于，其是毕赤酵母重组工程菌。
7.如权利要求1所述的非特异性过氧合酶突变体作为生物催化剂在制备25-羟基维生素D3和/或25-羟基-7脱氢胆固醇中的应用。
8.一种制备25-羟基维生素D3的方法，其特征在于，以维生素D3为原料，如权利要求1所述的所述非特异性过氧合酶突变体作为生物催化剂利用H2O2催化维生素D3在C-25位发生羟基化反应生成25-羟基维生素D3即骨化二醇。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，维生素D3的浓度为0.15 mM-13 mM，反应在丙酮-磷酸盐缓冲溶液中进行，且所述丙酮体积分数为10-50%，磷酸盐缓冲溶液的pH为6～9、过氧化氢浓度为1-10 mM，温度为25-35℃。
10.一种制备25-羟基7-脱氢胆固醇的方法，其特征在于，以7-脱氢胆固醇为原料，如权利要求1所述的所述非特异性过氧合酶突变体作为生物催化剂利用H2O2催化7-脱氢胆固醇在C-25位发生羟基化反应生成25-羟基7-脱氢胆固醇。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，7-脱氢胆固醇的浓度为0.15 mM-13 mM，反应在丙酮-磷酸盐缓冲溶液中进行，且所述丙酮体积分数为10-50%，磷酸盐缓冲溶液的pH为6～9、过氧化氢浓度为1-10 mM，温度为25-35℃。
12.如权利要求8至11任一项所述的方法，其特征在于，所述生物催化剂的形式为细胞、粗酶液、纯酶液、酶粉或固定化酶；所述细胞由如权利要求5或6所述重组工程菌培养得到。
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